BRPI0614184A2 - redução de células b com o uso de moléculas de ligação especìficas para cd37 e especìficas para cd20 - Google Patents

redução de células b com o uso de moléculas de ligação especìficas para cd37 e especìficas para cd20 Download PDF

Info

Publication number
BRPI0614184A2
BRPI0614184A2 BRPI0614184-6A BRPI0614184A BRPI0614184A2 BR PI0614184 A2 BRPI0614184 A2 BR PI0614184A2 BR PI0614184 A BRPI0614184 A BR PI0614184A BR PI0614184 A2 BRPI0614184 A2 BR PI0614184A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
val
variable region
chain variable
thr
pro
Prior art date
Application number
BRPI0614184-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Laura Sue Grosmaire
Martha S Hayden-Ledbetter
Jeffrey A Ledbetter
Peter A Thompson
Sandy Alexander Simon
William Brady
Original Assignee
Trubion Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37683960&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0614184(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Trubion Pharmaceuticals Inc filed Critical Trubion Pharmaceuticals Inc
Publication of BRPI0614184A2 publication Critical patent/BRPI0614184A2/pt
Publication of BRPI0614184A8 publication Critical patent/BRPI0614184A8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

REDUçAO DE CELULAS B COM O USO DE MOLECULAS DE LIGAçAO ESPECIFICAS PARA CD37 E ESPECIFICAS PARA CD2O A presente invenção fornece de forma geral métodos para a redução de células B em um indivíduo com o uso de moléculas de ligação específicas para CD37. Em particular, a invenção fornece métodos para a redução de células B com a utilização de moléculas de ligação específicas para CD37 isoladamente ou uma combinação de moléculas de ligação específicas para CD37 e moléculas de ligação específicas para CD2O e, em alguns casos, uma combinação sinérgica. A invenção ainda fornece materiais e métodos para o tratamento de doenças que envolvem atividade aberrante de célula B. Além disso, a invenção fornece moléculas de ligação humanizadas específicas para CD37.

Description

REDUÇÃO DE CÉLULAS B COM O USO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃOESPECÍFICAS PARA CD37 E ESPECÍFICAS PARA CD20
O presente pedido reivindica benefício sob 35 U.S.C. §119 do Pedido de Patente U.S. N0 60/702.499, que foidepositado em 25 de julho de 2005, Pedido de Patente U.S.N0 60/798.344, que foi depositado em 16 de maio de 2006,cada um deles aqui incorporado por referência em suatotalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece de forma geral métodospara a redução de células B em um indivíduo com autilização de moléculas de ligação específicas para CD37.
Em particular, a invenção fornece métodos para a redução decélulas B com o uso de moléculas de ligação específicaspara CD37 isoladamente, ou uma combinação de moléculas deligação específicas para CD37 e moléculas de ligaçãoespecíficas para CD20 e, em alguns casos, uma combinaçãosinérgica. A invenção ainda fornece materiais e métodospara o tratamento de doenças que envolvem atividadeaberrante de células B.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Em seu papel normal, o sistema imunológico humanoprotege o corpo de danos decorrentes de substânciasestranhas e patógenos. Uma forma pela qual o sistemaimunológico protege o corpo é por produção de célulasespecializadas denominadas linfócitos B ou células B. Ascélulas B produzem anticorpos que se ligam e, em algunscasos, medeiam a destruição de uma substância estranha oupatógeno.
No entanto, em alguns casos, há uma alteração dosistema imunológico humano, e especificamente doslinfócitos B do sistema imunológico humano, e surge umadoença. Há vários cânceres que envolvem a proliferaçãodescontrolada de células B. Também há várias doençasautoimunes que envolvem a produção por células B deanticorpos que, em vez de se ligarem às substânciasestranhas e aos patógenos, ligam-se a partes do corpo. Taisanticorpos são algumas vezes denominados auto-anticorpos.
Além disso, há várias doenças autoimunes e inflamatóriasque envolvem células B em sua patologia, por exemplo,através da apresentação inadequada de antígeno de célula Bàs células T, ou através de outras vias que envolvemcélulas B. Por exemplo, camundongos com tendência autoimunedeficientes em células B não desenvolvem doença renalautoimune, vasculite ou auto-anticorpos. Veja Shlomchik ecols., J. Exp. Med., 180: 1.295-306 (1994). Curiosamente,esses mesmos camundongos com tendência autoimune quepossuem células B, mas são deficientes na produção deimunoglobulinas, desenvolvem doenças autoimunes quandoinduzidos experimentalmente, como descrito por Chan ecols., J. Exp. Med., 189: 1.639-48 (1999), o que indica queas células B têm uma participação integral nodesenvolvimento de doença autoimune.
As células B podem ser identificadas por moléculas nasua superfície celular. CD20 foi a primeira molécula desuperfície específica para a linhagem de célula B humanaidentificada por um anticorpo monoclonal. Ela é umafosfoproteína transmembrana de célula B não glicosiladahidrofóbica de 35 kDa que tem tanto a sua extremidade aminoquanto a extremidade carbóxi situadas dentro da célula.Veja Einfeld e cols., EMBO J., 7:711-17 (1998). CD20 éexpressa por todas as células B maduras normais, mas não éexpressa por células B precursoras ou células plasmáticas.Não foram identificados ligantes naturais para CD20, e afunção de CD20 na biologia das células B ainda não écompletamente compreendida.
Outra molécula da superfície celular específica para alinhagem de células B é CD37. CD37 é uma proteína altamenteglicosilada de 40-52 kDa que pertence à família detetraspanina transmembrana de antígenos da superfíciecelular. Ela atravessa a membrana celular quatro vezes,formando duas alças extracelulares e expondo suasextremidades amino e carbóxi ao citoplasma. CD37 éaltamente expressa em (slg+)células B normais produtoras deanticorpo, mas não é expressa em pré-células B ou emcélulas plasmáticas. A expressão de CD3 7 em células T emrepouso e ativadas, monócitos e granulócitos, é baixa, enão há expressão detectável de CD37 em células NK (naturalkiller), plaquetas ou eritrócitos. Veja Belov e cols.,CancerRes., 61(11): 4.483-4.489 (2001); Schwartz-Albiez ecols., J. Iwmunol., 140(3): 905-914 (1988); e Link e cols.,J. Iwmunol., 137(9): 3.013-3.018 (1988). Além das células Bnormais, quase todas as malignidades originadas de célulasB são positivas para expressão de CD37, incluindo leucemialinfocítica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) eleucemia de células pilosas [Moore e cols., Journal ofPathology, 152: 13-21 (1987); Merson e Brochier, IwmunologyLetters, 19: 269-272 (1988); e Faure e cols., AmericanJournal of Dermatopathology, 12 (3): 122-133 (1990)]. CD37participa da regulação da função das células B, uma vez quefoi constatado que camundongos desprovidos de CD37 possuemníveis baixos de IgGl sérica e têm deficiência da respostahumora1 a antígenos virais e a antígenos modelares. Pareceque ela atua como uma molécula co-estimuladora não clássicaou influencia diretamente a apresentação de antígeno pormeio da formação de complexo com moléculas do complexoprincipal de histocompatibilidade (MHC) da classe II. VejaKnobeloch e cola., Mol. Cell. Biol., 20 (15): 5.363-5.369(2000). Parece que CD37 também participa da sinalizaçãoTCR. Veja Van Spriel e cols., J. Iwmunol., 172: 2.953-2.961(2004).
Houve pesquisas e desenvolvimento de fármacos com baseno conceito de que as próprias moléculas da superfíciecelular específicas para a linhagem de células B, porexemplo, CD37 ou CD20, podem ser alvos para anticorpos quese ligariam e mediariam a destruição de células Bcancerosas e causadoras de doença autoimune que possuemCD37 ou CD20 em suas superfícies. Na denominada"imunoterapia", anticorpos feitos (ou com base emanticorpos feitos) em um animal não humano que se ligam aCD3 7 ou CD20 são administrados a um paciente para eliminarcélulas B cancerosas ou causadoras de doença autoimune.
Um anticorpo para CD37 foi marcado com 131I e testadoem testes clínicos para terapia de linfoma não Hodgkin(NHL). Veja Press e cols., J. Clin. Oncol., 7(3): 1.027-1.038 (1989); Bernstein e cols., Câncer Res. (Supl.), 50:1.017-1.021 (1990); Press e cols., Front. Radiat. Ther.Oncol., 24: 204-213 (1990); Press e cols., Adv. Exp. Med.Biol., 303: 91-96 (1991) e Brown e cols., Nucl. Med. Biol.,24: 657-663 (1997). 0 anticorpo, MB-I, é um anticorpomonoclonal murídeo IgGl desprovido de funções efetoras deFc, por exemplo, citotoxicidade celular dependente deanticorpos (ADCC), e MB-I não inibiu o crescimento tumoralem um modelo de xenoenxerto in vivo, a menos que tenha sidomarcado com um isótopo (Buchsbaum e cols., Câncer Res.,52(83): 6.476-6.481 (1992)). A biodistribuição favorável de131I-MB-I foi observada em pacientes com linfoma que tinhamcargas tumorais menores (<1 kg), e a terapia dessespacientes resultou em remissões completas do tumor queduram de 4 a 11 meses (Press e cols. , 1989 e Bernstein ecols. 1990).
Além disso, um imunoconjugado composto pelo fármacoadriamicina ligado a G28-1, outro anticorpo anti-CD37, foiavaliado em camundongos e mostrou efeitos através deinternalização e liberação intracelular do fármaco. VejaBraslawsky e cols., Câncer Iwmunol. Immunother., 33(6):367-374 (1991).
Vários grupos investigaram o uso de anticorpos anti-CD20 para o tratamento de doenças relacionadas às célulasB. Um tratamento consiste em anticorpos anti-CD20preparados na forma de radionuclídeos para o tratamento delinfoma de células B (por exemplo, anticorpo anti-CD20marcado com 131I) , além de uma forma marcada com 89Sr para aatenuação de dor óssea causada por metástases de câncer depróstata e mama [Endo, Gan To Kagaku Ryoho, 26: 744-748(1999)].
Outro grupo desenvolveu um anticorpo monoclonalquimérico específico para CD20, que consiste em regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve originárias decamundongos fundidas às regiões constantes da cadeia pesadade IgGl humana e da cadeia leve kappa humana. De acordo como relatado, o anticorpo quimérico reteve a habilidade parase ligar a CD20 e a habilidade para mediar ADCC e parafixar complemento. Veja Liu e cols. , J. Iwmunol. 139:3.521-26 (1987). Ainda outro anticorpo quimérico anti-CD20foi feito a partir de IDEC hibridoma C2B8, e foi denominadorituximab. Acredita-se que o mecanismo da atividadeantitumoral de rituximab seja uma combinação de váriasatividades, incluindo ADCC, fixação de complemento edesencadeamento de sinais que promovem apoptose em célulasB malignas, embora o grande tamanho do anticorpo quiméricoimpeça a difusão ótima da molécula em tecidos linfóides quecontêm células B malignas limitando, dessa forma, suasatividades antitumorais. ADCC é uma reação mediada porcélulas na qual células citotóxicas inespecíficas queexpressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, célulasNatural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecemanticorpo ligado em uma célula-alvo e, subseqüentemente,causam a lise da célula-alvo. A fixação de complemento, oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC), é ahabilidade de uma molécula para efetuar a Iise de um alvona presença de complemento. A via de ativação decomplemento é iniciada pela ligação do primeiro componentedo sistema de complemento (Clq) a uma molécula (porexemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato.O grande tamanho de rituximab impede a difusão ótima damolécula em tecidos linfóides que contêm células Bmalignas, limitando, dessa forma, essas atividadesantitumorais.
Rituximab, administrado tipicamente em infusões 4vezes por semana, é usado atualmente para tratar Iinfornanão Hodgkin de célula B de grau baixo ou folicular[McLaughlin e cols., Oncology, 12: 1.763-1.777 (1998);Leget e cols., Curr. Opin. Oncol.,10: 548-551 (1998)] e nolinfoma folicular recidivado de estágio III/IV [White ecols., Pharm. Sei. Technol. Today, 2: 95-101 (1999)].Outros distúrbios tratáveis com rituximab incluem linfomade célula do centro folicular (FCC), linfoma de célula domanto (MCL), linfoma difuso de célula grande (DLCL) elinfoma linfocítico pequeno (SLL) [Nguyen e cols., Eur. J.Haematol., 62:76-82 (1999)]. Rituximab administrado eminfusões semanais também é usado para tratar CLL [Lin ecols., Sem. Oncol., 30:483-92 (2003)].
Anticorpos anti-CD20 também foram usados para tratarpacientes que sofrem de doenças autoimunes associadas àprodução de auto-anticorpos por células B. Por exemplo,rituximab demonstrou benefícios clínicos significativos naeliminação de células B CD20+ em pacientes com múltiplasdoenças autoimunes/inflamatórias, incluindo Artritereumatóide (AR) [Edwards, N. Engl. J. Med., 3 50: 2.546-2.548 (2004); Cambridge e cols., Arthritis Rheum., 48:2.146-54 (2003)]. Os pacientes com AR receberam dosescontínuas de metotrexato (MTX) e um esquema de 4 doses deinfusão de rituximab (Edwards, supra). Esses pacientesapresentaram melhora das respostas da "American College ofRheumatology" (ACR) comparados com grupos de controle.
Em um experimento para o tratamento de lúpuseritematoso sistêmico (LES) [Leandro e cols., ArthritisRheum., 46: 2.673-2.677 (2002)], os pacientes receberam aadministração de duas infusões de rituximab em alta dose, edemonstraram redução de células B e melhora do estado dadoença. Em um segundo estudo de redução de células B no LES[Looney e cola., Arthritis Rheum., 50: 2.580-2.589 (2004)],os pacientes receberam uma infusão única de 100 mg/m2 (dosebaixa), uma infusão única de 375 mg/m2 (dose intermediária)ou como 4 infusões (com intervalo de 1 semana) de 375 mg/m2(dose alta) de rituximab. Esses pacientes demonstraramredução de células B e melhora das pontuações da doença,mas o tratamento não alterou o nível de auto-anticorpos.
Também foram realizados experimentos de rituximab namacroglobulinemia de Waldenstrom [Treon e cols.,Immunother., 24: 272-279 (2000)], nos quais os pacientesapresentaram aumento do hematócrito (HCT) e das contagensde plaquetas (PLT) após 4 infusões de rituximab.
Relatos recentes de tratamento com rituximab empacientes que sofrem de esclerose múltipla, uma doença^autoimune que afeta o sistema nervoso central, indicam queum esquema de tratamento elimina células B periféricas, mastem pouco efeito sobre células B em líquidocefalorraquidiano. Veja Monson e cols., Arch. Neurol., 62:258-264 (2005).
Publicações adicionais em relação ao uso de rituximabincluem: Stashi e cols. "Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronicidiopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98: 952-957(2001); Matthews, R. "Medicai Heretics" New Scientist (7,abril de 2001) ; Leandro e cols. "Clinicai outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion" Ann. Rheum. Dis. 61: 833-888 (2002);Leandro e cols. "Lymphocyte depletion in rheumatoidarthritis: early evidence for safety, efficacy and doseresponse". Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001);Leandro e cols. "An open study of B lymphocyte depletion insystemic lupus erythematosus", Arthritis Rheum. 46: 2.673-2.677 (2002); Edwards e cols., "Sustained improvement inrheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes" Rheumatology 40: 205-211 (2001);Edwards e cols. "B-lymphocyte depletion therapy inrheumatoid arthritis and other autoimmune disorders"Biochem. Soe. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards e cols."Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targetedchimeric monoclonal antibody: A randomized, placebocontrolled trial in patients with rheumatoid arthritis".Arthritis Rheum. 46: S197 (2002); Levine e cols., "IgMantibody-related polineuropathies: B-cell depletionchemotherapy using rituximab" Neurology 52: 1.701-1.704(1999); DeVita e cols. "Efficacy of selective B-cellblockade in the treatment of rheumatoid arthritis"Arthritis Rheum. 46: 2.029-2.033 (2002); Hidashida e cols."Tratamento of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis withrituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology"; 24-29 de outubro;Nova Orleans, La. 2002; Tuscano, J. "Successful treatmentof Infliximab-refractory rheumatoid arthritis withrituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology"; 24-29 de outubro;New Orleans, La. 2 002.
Ainda persistem problemas associados à terapia comrituximab. Por exemplo, a maioria dos pacientes com câncertratados com rituximab apresenta recidiva, geralmente ematé cerca de 6-12 meses, e foram relatadas reações fatais àinfusão em até 24 horas após a infusão de rituximab. Essasreações fatais ocorreram após uma reação ã infusão complexaque incluía hipóxia, infiltrados pulmonares, síndrome dosofrimento respiratório agudo, infarto do miocárdio,fibrilação ventricular, ou choque cardiogênico. Ainsuficiência renal aguda com necessidade de diálise comcasos de resultados fatais também foi relatada no quadro desíndrome de Iise tumoral após o tratamento com rituximab,bem como reações mucocutâneas graves, algumas comresultados fatais. Adicionalmente, são necessárias dosesaltas de rituximab para a injeção intravenosa, pois amolécula é grande, de aproximadamente 150 kDa, e, comoobservado acima, a difusão nos tecidos linfóides, onderesidem muitas células tumorais reside, é limitada.
Como as células B maduras normais também expressamCD37 e CD20, as células B normais são eliminadas pelaterapia com anticorpo anti-CD37 (Press e cola., 1989) ouanti-CD2 0 [Reff e cols., Blood, 83: 435-445 (1994)]. Após otérmino do tratamento, no entanto, as células B normaispodem ser regeneradas a partir de precursores de células BCD37- e CD20-negativos; portanto, os pacientes tratados comterapia anti-CD37 ou anti-CD20 não apresentamimunossupressão significativa.
A tecnologia de anticorpo monoclonal e métodos deengenharia genética levaram ao desenvolvimento de moléculasde imunoglobulina para diagnóstico e tratamento de doençashumanas. Foi feita a criação de proteínas por engenhariagenética para aumentar a afinidade de um anticorpo por seuantígeno cognato, para reduzir os problemas relacionados àimunogenicidade, e para alterar as funções efetoras de umanticorpo. A estrutura do domínio de imunoglobulinas épassível de ser submetida à engenharia genética, uma vezque os domínios de ligação de antígeno e os domínios queconferem funções efetoras podem ser trocados entre classese subclasses de imunoglobulinas. A estrutura e a função dasimunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow ecols., Eds., "Antibodies: A Laboratory Manual", Capítulo14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(1988) . Uma introdução extensa, além de informaçõesdetalhadas sobre todos os aspectos da tecnologia deanticorpo recombinante, podem ser encontradas no livro-texto "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY,1999) . Uma coleção abrangente de protocolos de laboratóriodetalhados sobre o projeto de anticorpos por engenhariagenética pode ser encontrada em R. Kontermann e S. Dübel(eds.), "The Antibody Engineering Lab Manual" (SpringerVerlag, Heidelberg/Nova York, 2000).
Recentemente, foram construídas moléculas menores deimunoglobulina para superar problemas associados à terapiacom imunoglobulina inteira. Fv de cadeia única (scFv)compreende um domínio variável da cadeia pesada deanticorpo unido através de um peptídeo vinculador curto aum domínio variável da cadeia leve de anticorpo [Huston ecols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5.879-5.883 (1988)].
Além de regiões variáveis, cada uma das cadeias doanticorpo tem uma ou mais regiões constantes. Cadeias levespossuem um único domínio da região constante. Dessa forma,cadeias leves possuem uma região variável e uma regiãoconstante. Cadeias pesadas possuem vários domínios daregião constante. As cadeias pesadas nos anticorpos IgG,IgA e IgD possuem três domínios da região constante, quesão designados CHI, CH2 e CH3, e as cadeias pesadas nosanticorpos IgM e IgE possuem quatro domínios da regiãoconstante, CHI, CH2, CH3 e CH4. Dessa forma, as cadeiaspesadas possuem uma região variável e três ou quatroregiões constantes.
As cadeias pesadas de imunoglobulinas também podem serdivididas em três regiões funcionais: a região Fd (umfragmento que compreende V.sub.H e CHI, ou seja, os doisdomínios do terminal N da cadeia pesada), a região dedobradiça, e a região Fc (a região do "fragmentocristalizável", derivada de regiões constantes e formadaapós digestão com pepsina). A região Fd em combinação com acadeia leve forma um Fab (o "fragmento de ligação deantígeno"). Como um antígeno reagirá estereoquimicamentecom a região de ligação de antígeno no terminal amino decada Fab, a molécula de IgG é divalente, ou seja, ela podese ligar a duas moléculas de antígeno. O Fc contém osdomínios que interagem com receptores de imunoglobulina nascélulas e com os elementos iniciais da cascata docomplemento. Dessa forma, o fragmento Fc é geralmenteconsiderado responsável pelas funções efetoras de umaimunoglobulina, por exemplo, fixação de complemento eligação aos receptores Fc.
Por causa do pequeno tamanho das moléculas de scFv,elas exibem uma depuração muito rápida do plasma e dostecidos, e uma penetração mais eficaz em tecidos do que aimunoglobulina inteira. Um scFv antitumoral mostroupenetração tumoral mais rápida e uma distribuição maisequilibrada pela massa tumoral do que o anticorpo quiméricocorrespondente [Yokota e cols., Câncer Res., 52, 3.402-3.408 (1992)]. A fusão de um scFv com outra molécula, porexemplo, uma toxina, se beneficia da atividade específicade ligação de antígeno e do pequeno tamanho de um scFv paraliberar a toxina a um tecido-alvo. [Chaudary e cols.,Nature, 339: 394 (1989); Batra e cols., Mol. Cell. Biol.,11: 2.200 (1991)].
Apesar das vantagens das moléculas de scFv, há váriasdesvantagens associadas ã sua utilização. Embora adepuração rápida de scFv possa reduzir seus efeitos tóxicosem células normais, essa depuração rápida pode impedir aliberação de uma dose eficaz mínima ao tecido-alvo. Afabricação de quantidades adequadas de scFv paraadministração a pacientes foi desafiadora, em função dasdificuldades na expressão e isolamento de scFv que afetamide forma adversa o rendimento. Durante a expressão, asmoléculas de scFv não possuem estabilidade e freqüentementese agregam por causa do pareamento de regiões variáveis demoléculas diferentes. Além disso, os níveis de produção demoléculas de scFv em sistemas de expressão mamíferos sãobaixos, limitando o potencial para a fabricação eficientede moléculas de scFv para terapia [Davis e cols., J. Biol.Chem., 265: 10.410-10.418 (1990); Traunecker e cols., EMBOJ., 10: 3.655-3.659 (1991)]. Foram exploradas estratégiaspara aumento da produção, incluindo a adição de sítios deglicosilação nas regiões variáveis [Jost, C. R. PatenteU.S. N0 5.888.773, Jost e cols., J. Biol. Chem., 69:26.267-26.273 (1994)].
Outra desvantagem do uso de scFv para terapia é aausência de função efetora. Um scFv sem as funçõescitolíticas, ADCC e citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) associadas à região constante de umaimunoglobulina pode ser ineficaz para o tratamento dedoença. Muito embora o desenvolvimento da tecnologia descFv tenha começado há mais de 12 anos, atualmente não háprodutos de scFv aprovados para terapia.
Alternativamente, foi proposto que a fusão de um scFva outra molécula, por exemplo, uma toxina, poderia sebeneficiar da atividade específica de ligação de antígeno edo pequeno tamanho de um scFv para liberar a toxina a umtecido-alvo. Chaudary e cols., Nature 339: 394 (1989);Batra e cols., Mol. Cell. Biol. 11: 2.200 (1991). Aconjugação ou fusão de toxinas a scFvs foi, desse modo,oferecida como uma estratégia alternativa para fornecermoléculas potentes, com especificidade de antígeno, mas adosagem com tais conjugados ou quimeras pode ser limitadapor toxicidade excessiva e/ou inespecífica em função daporção de toxina de tais preparações. Os efeitos tóxicospodem incluir elevação suprafisiológica das enzimashepáticas e síndrome de vazamento vascular, e outrosefeitos indesejados. Além disso, as próprias imunotoxinassão altamente imunogênicas quando administradas a umhospedeiro, e os anticorpos do hospedeiro gerados contra aimunotoxina limitam a utilidade potencial para tratamentosterapêuticos repetidos de um indivíduo.
Outras proteínas de fusão projetadas, denominadaspequenos produtos imunofarmacêuticos modulares (SMIP™) ,são descritas nas Publicações de Patente U.S. de co-propriedade 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049, e nasPublicações de Patente Internacional de co-propriedade WO02/056910, WO 2005/037989 e WO 2005/017148, que são todasaqui incorporadas por referência. Os produtos SMIP sãoproteínas de fusão de domínio de ligação-imunoglobulinainéditas que apresentam um domínio de ligação para umaestrutura cognata, por exemplo, um antígeno, um contra-receptor ou outros mais; um polipeptídeo da região dedobradiça de IgGl, IGA ou IgE ou um polipeptídeo da regiãode dobradiça de IgGl mutante que possui zero, um ou doisresíduos de cisteína; e domínios CH2 e CH 3 deimunoglobulina. Os produtos SMIP são capazes de ADCC e/ou CDC.
Embora tenha sido realizada uma pesquisa intensa sobreterapias baseadas em anticorpos, ainda existe a necessidadena técnica de métodos aprimorados para o tratamento dedoenças associadas à atividade aberrante de células B. Osmétodos da presente invenção aqui descritos e reivindicadosfornecem esses métodos aprimorados, além de outrasvantagens.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece métodos para a redução decélulas B com a utilização de moléculas de ligaçãoespecíficas para CD37. Em alguns métodos da invenção, o usode combinações de moléculas de ligação específicas paraCD37 (uma ou mais moléculas de ligação específicas paraCD37) e moléculas de ligação específicas para CD20 (uma oumais moléculas de ligação específicas para CD20) resulta emum aumento da redução de células B. Em alguns dessesmétodos, as combinações são sinérgicas. Em um aspectorelacionado, a invenção fornece um método de tratamento deum indivíduo que possui, ou com suspeita de ter, uma doençaassociada à atividade aberrante de células B.
A presente invenção também fornece moléculas deligação humanizadas específicas para CD37 (por exemplo,construções humanizadas de TRU-016) e métodos para aredução de células B com o uso dessas moléculas. Em algumasmodalidades dos métodos da invenção, é contemplado o uso decombinações de construções humanizadas de TRU-016 com umaou mais moléculas de ligação específicas para CD20. Emoutro aspecto, a invenção fornece métodos de tratamento deindivíduos que possuem, ou com suspeita de terem, umadoença associada à atividade aberrante de células B.
Aspectos relacionados da invenção dizem respeito aosmétodos de prevenção de qualquer doença como essa e métodosde atenuação de um sintoma associado a uma doença como essaque compreende a administração de uma dose de uma moléculade ligação humanizada específica para CD3 7 eficaz paratratar ou evitar tal doença, ou para atenuar um sintoma detal doença.
"Atividade aberrante de células B" refere-se àatividade de células B que se devia da evolução normal,adequada ou esperada. Por exemplo, atividade aberrante decélulas B pode incluir a proliferação inadequada de célulascujo DNA ou outros componentes celulares se tornaramdanificados ou defeituosos. Atividade aberrante de célulasB pode incluir a proliferação celular cujas característicasestão associadas a uma doença causada, mediada ou queresulta em níveis inadequadamente elevados de divisãocelular, níveis inadequadamente baixos de apoptose, ouambos. Tais doenças podem ser caracterizadas, por exemplo,por proliferações anormais locais únicas ou múltiplas decélulas, grupos de células ou tecido(s), sejam elascancerosas ou não cancerosas, benignas ou malignas. Aatividade aberrante de células B também pode incluirprodução de anticorpo aberrante, por exemplo, a produção deauto-anticorpos ou a superprodução de anticorpostipicamente desejável quando produzida em níveis normais.Contempla-se que a atividade aberrante de células B podeocorrer em certas subpopulações de células B e não emoutras subpopulações. A atividade aberrante de células Btambém pode incluir estimulação inadequada de células T,por exemplo, por apresentação inadequada de antígeno decélula B às células T ou por outras vias que envolvemcélulas B.
"Tratamento" ou "tratamento de" refere-se a umtratamento terapêutico ou a um tratamentoprofilático/preventivo. Um tratamento terapêutico podemelhorar pelo menos um sintoma de uma doença em umindivíduo que recebe o tratamento, ou pode retardar a piorade uma doença progressiva em um indivíduo, ou evitar osurgimento de doenças adicionais associadas.
Uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" deuma molécula de ligação específica para CD20 refere-seàquela quantidade do composto suficiente para resultar naatenuação de um ou mais sintomas da doença tratada. Quandoaplicada a um ingrediente ativo individual, administradoisoladamente, uma dose terapeuticamente eficaz refere-seàquele ingrediente isoladamente. Quando aplicada a umacombinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àsquantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultamno efeito terapêutico, sejam elas administradas serial ousimultaneamente. A invenção especificamente contempla queuma ou mais moléculas de ligação específicas podem seradministradas de acordo com métodos da invenção, cada umaem uma dose eficaz.
"Um indivíduo que possui, ou com suspeita de ter, umadoença associada à atividade aberrante de células B" é umindivíduo no qual uma doença ou um sintoma de um distúrbiopode ser causado por atividade aberrante de células B, podeser exacerbado por atividade aberrante de células B, oupode ser aliviado por regulação da atividade de células B.
Exemplos de tais doenças são um câncer de células B (porexemplo, Iinfoma de células B, uma leucemia de célula B ouum mieloma de célula Β) , uma doença caracterizada porprodução de auto-anticorpo ou uma doença caracterizada porestimulação inadequada de células T causada porapresentação inadequada de antígeno de célula B às célulasT ou causada por outras vias que envolvem células B.
Em um aspecto exemplar, um indivíduo tratado pelosmétodos da invenção demonstra uma resposta ao tratamentoque é melhor do que, ou aumentada em relação à resposta aotratamento com rituximab. Uma resposta que é superior emrelação ao tratamento com rituximab refere-se a umaresposta clínica em que o tratamento por um método dainvenção resulta em uma resposta clínica em um paciente queé melhor do que uma resposta clínica em um pacientesubmetido à terapia com rituximab, por exemplo, rituximab.
Uma resposta superior é avaliada por comparação decritérios clínicos bem conhecidos na técnica e aquidescritos. Critérios exemplares incluem, sem limitação,duração da eliminação de células B, redução dos númerosglobais de células B, redução dos números de células B emuma amostra biológica, redução do tamanho do tumor, reduçãodo número de tumores, existentes e/ou que surgem após otratamento, e melhora da resposta global, como avaliadapelos próprios pacientes e pelos médicos, por exemplo, como uso do índice Prognóstico Internacional. A melhora podeser em um ou mais de um dos critérios clínicos. Umaresposta superior com o método da invenção pode ser causadapor uma resposta inadequada a tratamento prévio ouconcomitante com rituximab, por exemplo, por causa datoxicidade e/ou eficácia inadequada do tratamento comrituximab.
Cânceres de células B incluem linfomas de célula B[por exemplo, as várias formas de doença de Hodgkin,linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfomas do sistema nervosocentral], leucemias [por exemplo, leucemia linfoblásticaaguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemiade célula pilosa e leucemia mieloblástica crônica] emielomas (por exemplo, mieloma múltiplo). Cânceres decélulas B adicionais incluem linfoma linfocítico pequeno,leucemia prolinfocítica de células B, linfomaIinfoplasmocítico, linfoma da zona marginal esplênica,mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitário dosossos, plasmocitoma extra-ósseo, linfoma de células B dazona marginal extranodal de tecido linfóide associado àmucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal,linfoma folicular, linfoma de célula do manto, linfomadifuso de células B grandes, linfoma mediastinal (tímico)de células B grandes, linfoma intravascular de células Bgrandes, Iinfoma de efusão primária, Iinfoma/leucemia deBurkitt, proliferações de células B de potencial malignoincerto, granulomatose linfomatóide e distúrbiolinfoproliferativo pós-transplante.
Distúrbios caracterizados por produção de auto-anticorpo são freqüentemente considerados doençasautoimunes. Doenças autoimunes incluem, sem limitação:artrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil,osteoartrite, policondrite, artrite psoriática, psoríase,dermatite, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo deinclusão, miosite inflamatória, necrólise epidérmicatóxica, esclerodermia e esclerose sistêmicas, síndrome deCREST, respostas associadas à doença inflamatória dointestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome dosofrimento respiratório, síndrome do sofrimentorespiratório do adulto (ARDS), meningite, encefalite,uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas,eczema, asma, condições que envolvem a infiltração decélulas T e respostas inflamatórias crônicas,aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesãode leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpuseritematoso cutâneo subagudo, lúpus discóide, mielite dolúpus, cerebrite do lúpus, diabetes de surgimento juvenil,esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, neuromieliteóptica, febre reumática, coréia de Sydenham, respostasimunológicas associadas à hipersensibilidade aguda eretardada mediada por citocinas e linfócitos T,tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindogranulomatose de Wegener e doença de Churg-Strauss,agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite/angeíte porhipersensibilidade, ANCA e vasculite reumatóide), anemiaaplásica, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolíticaimune, incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemiaperniciosa, aplasia pura de células vermelhas (PRCA),deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropeniaautoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvemdiapedese leucocitária, distúrbios inflamatórios do sistemanervoso central (SNC), síndrome de lesão de múltiplosórgãos, miastenia grave, doenças mediadas por complexoantígeno-anticorpo, doença da membrana basalantiglomerular, síndrome do anticorpo anti-fosfolipídeo,neurite alérgica, doença de Behcet, síndrome de Castleman,síndrome de Goodpasture, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjórgen, síndromede Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgãosólido, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigóidebolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias autoimunes,espondilo-artropatias soronegativas, doença de Reiter,síndrome da pessoa rígida (stiff-man), arterite de célulagigante, nefrite por complexo imune, nefropatia por IgA,polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM,púrpura trombocitopênica idiopática (PTI), púrpuratrombocitopênica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoimune, doença autoimune dotestículo e do ovário, incluindo orquite e ooforiteautoimunes, hipotireoidismo primário; doenças endócrinasautoimune, incluindo tireoidite autoimune, tireoiditecrônica (tireoidite de Hashimoto), tireoidite subaguda,hipotireoidismo idiopático, doença de Addison, doença deGrave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromesde endocrinopatia poliglandular), diabetes do Tipo I,também denominado diabetes melito insulino-dependente(IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite autoimune,pneumonite intersticial linfóide (HIV), bronquioliteobliterante (não-transplante) vs NSIP1 síndrome deGuillain-Barré, vasculite de grandes vasos (incluindopolimialgia reumática e arterite de célula gigante (deTakayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença deKawasaki e poliarterite nodosa), poliarterite nodosa (PAN)espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia porIgA), glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrosebiliar primária, doença celíaca (enteropatia por glúten),crioglobulinemia, crioglobulinemia associada à hepatite,esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença arterialcoronariana, febre familiar do Mediterrâneo, poliangeítemicroscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich e tromboangeíte obliterante.
A artrite reumatóide (AR) é uma doença crônicacaracterizada por inflamação das articulações, causandoedema, dor e perda da função. Pacientes que possuem AR porum período prolongado normalmente exibem destruição,deformidade, incapacidade articulares progressivas, e atémesmo morte prematura.
A doença de Crohn e uma doença relacionada, a coliteulcerativa, são as duas dois categorias principais dedoenças que pertencem a um grupo de patologias denominadodoença inflamatória do intestino (IBD). A doença de Crohn éum distúrbio crônico que causa inflamação do tratodigestivo ou gastrointestinal (GI) . Embora possa envolverqualquer área do trato GI, da boca ao ânus, afeta maiscomumente o intestino delgado e/ou cólon. Na coliteulcerativa, o envolvimento GI é limitado ao cólon.
A doença de Crohn pode ser caracterizada poranticorpos contra antígenos de neutrófilos, ou seja, o"anticorpo perinuclear anti-neutrófilos" (pANCA), eSaccharomyces cervisiae, ou seja o "anticorpo anti-Saccharomyces cervisiae" (ASCA). Muitos pacientes comcolite ulcerativa possuem o anticorpo pANCA no sangue, masnão o anticorpo ASCA, enquanto muitos pacientes com doençade Crohn exibem anticorpos ASCA, e não anticorpos pANCA. Ummétodo de avaliação da doença de Crohn é a utilização doíndice da Atividade da Doença de Crohn (CDAI), baseado em18 pontuações variáveis indicadoras coletadas por médicos.Os valores CDAI de 150 ou menos estão associados à doençaquiescente; valores acima daquele indicam doença ativa, evalores acima 450 são observados na doença extremamentegrave [Best e eols., "Development of an Crohn's diseaseactivity index", Gastroenterology 70: 439-444 (1976)]. Noentanto, desde o estudo original, alguns pesquisadoresutilizam um "valor subjetivo" de 200 a 250 como umapontuação saudável.
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doençaautoimune causada por lesões recorrentes dos vasossangüíneos em vários órgãos, incluindo o rim, a pele e asarticulações. Em pacientes com LES, uma interaçãodefeituosa entre células T e células B causa a produção deauto-anticorpos que atacam o núcleo das células. Há umaconcordância geral de que os auto-anticorpos sãoresponsáveis pelo LES e, portanto, novas terapias queeliminam a linhagem de células B, permitindo que o sistemaimunológico seja reinicializado à medida que são geradasnovas células B a partir de precursores, dariam esperançade benefícios duradouros nos pacientes com LES.
A esclerose múltipla (EM) também é uma doençaautoimune. Caracteriza-se por inflamação do sistema nervosocentral e destruição de mielina, que isola as fibras dascélulas nervosas no cérebro, medula espinhal e no corpo.
Embora a causa da EM seja desconhecida, acredita-seamplamente que células T autoimunes sejam os fatoresprimários para a patogênese da doença. No entanto, estãopresentes níveis elevados de anticorpos no líquidocefalorraquidiano de pacientes com EM, e algumas teoriasprevêem que a resposta de células B que leva à produção deanticorpos é importante para o desenvolvimento da doença.
A doença autoimune da tireóide resulta da produção deauto-anticorpos que tanto estimula a tireóide para causarhipertireoidismo (doença de Graves) quanto destrói atireóide causando hipotireoidismo (tireoidite deHashimoto). A estimulação da tireóide é causada por auto-anticorpos que se ligam e ativam o receptor do hormônioestimulante da tireóide (TSH). A destruição da tireóide écausada por auto-anticorpos que reagem com outros antígenostireoidianos.
A síndrome de Sjògren é uma doença autoimunecaracterizada por destruição das glândulas do corpoprodutoras de umidade.
A púrpura trombocitopênica imune (PTI) é causada porauto-anticorpos que se ligam às plaquetas sangüíneas ecausam sua destruição.
A Miastenia grave (MG) é um distúrbio neuromuscularautoimune crônico caracterizado por auto-anticorpos que seligam a receptores de acetilcolina expressos nas junçõesneuromusculares causando fraqueza dos grupos muscularesvoluntários.
A psoríase é caracterizada por inflamação autoimune napele e também está associada à artrite em 30% dos casos,esclerodermia, doença inflamatória do intestino, incluindodoença de Crohn e colite ulcerativa.
Também é contemplado o tratamento de miopatiainflamatória idiopática (MII), incluindo dermatomiosite(DM) e polimiosite (PM) . As miopatias inflamatórias foramcaracterizadas com o uso de diversos esquemas declassificação. 0 esquema de classificação de Miller(Miller, Rheum. Dis. Clin. North Am. 20: 811-826, 1994)identifica 2 miopatias inflamatórias idiopáticas (MII),polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM).
A polimiosite e a dermatomiosite são doençasinflamatórias crônicas, debilitantes, que envolvem osmúsculos e, no caso de DM, a pele. Esses distúrbios sãoraros, com uma incidência anual relatada de aproximadamente5 a 10 casos por milhão de adultos, e de 0,6 a 3,2 casospor milhão de crianças por ano nos Estados Unidos (Targoff,Curr. Probl. Dermatol. 1991, 3: 131-180). A miopatiainflamatória idiopática está associada a uma morbidade euma mortalidade significativas, com até metade dos adultosafetados apresentando um grau de invalidez importante(Gottdiener e cols., Am. J. Cardiol. 1978, 41: 1.141-49).Miller (Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994, 20: 811-826 e"Arthritis and Allied Conditions", Capítulo 75, Eds.Koopman e Moreland, Lippincott Williams e Wilkins, 2005)definem cinco grupos de critérios usados para o diagnósticode MII, ou seja, avaliação dos Critérios para MiopatiaInflamatória Idiopática (IIMC), incluindo fraquezamuscular, evidências de degeneração na biópsia, elevaçãodos níveis séricos de enzimas associadas aos músculos,tríade eletromagnética de miopatia, evidências de erupçõesna dermatomiosite, e também incluem evidências de auto-anticorpos como critérios secundários.
Fatores associados à MII, incluindo enzimas associadasaos músculos e auto-anticorpos, incluem, sem limitação,creatina quinase (CK), lactato desidrogenase, aldolase,proteína C-reativa, aspartato aminotransferase (AST),aIanina aminotransferase (ALT) e auto-anticorpo antinuclear(ANA), anticorpos específicos para miosite (MSA), eanticorpo para antígenos nucleares passíveis de extração.
Uma "molécula de ligação" de acordo com a invençãopode ser, por exemplo, uma proteína (uma "proteína" podeser um polipeptídeo ou um peptídeo), um ácido nucléico, umcarboidrato, um lipídeo ou um composto de pequena moléculaque se liga a um alvo. Um tipo de molécula de ligaçãoproteinácea contemplada pela invenção é um anticorpo ou umfragmento de anticorpo que retém a atividade de ligação.Uma molécula de ligação pode ser modificada de acordo commétodos padronizados na técnica para melhorar sua afinidadede ligação, diminuir sua imunogenicidade, alterar suasfunções efetoras e/ou aumentar sua disponibilidade no corpode um indivíduo. Tais modificações podem incluir, porexemplo, modificações da seqüência de aminoácidos ouexpressão como uma proteína de fusão. Essas proteínas defusão também são moléculas de ligação de acordo com ainvenção. Uma molécula de ligação exemplar da invenção é umpequeno produto imunofarmacêuticos modular (SMIP™) .
Uma molécula de ligação que é "específica" para umalvo se liga àquele alvo com uma afinidade maior do que aqualquer outro alvo. Por exemplo, uma molécula de ligaçãoespecífica para CD3 7 se liga a CD3 7 com uma afinidade maiordo que a qualquer outro alvo e uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20 se liga a CD20 com uma afinidade maiordo que a qualquer outro alvo. As moléculas de ligação dainvenção podem ter afinidades por seus alvos de um Ka maiorou igual a cerca de IO4 M"1, de preferência, maior ou iguala cerca de IO5 M"1, mais preferivelmente, maior ou igual acerca de IO6 M"1 e, ainda mais preferivelmente, maior ouigual a cerca de IO7 M"1. Afinidades ainda maiores do quecerca de IO7 M"1 são ainda mais preferidas, por exemplo,afinidades iguais ou maiores do que cerca de IO7 M"1, cercade IO8 M"1 e cerca de IO9 M"1, e cerca de IO10 M"1. Asafinidades das moléculas de ligação de acordo com apresente invenção podem ser facilmente determinadas com ouso de técnicas convencionais, por exemplo, aquelasdescritas por Scatchard e cols. , Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1949).
Certas moléculas de ligação específicas para CD37contempladas pela invenção possuem afinidades por CD37 decerca de 0,5 a cerca de 10 nM. Certas moléculas de ligaçãoespecíficas para CD20 contempladas pela invenção possuemafinidades por CD20 de cerca de 1 a cerca de 30 nM.
Outra característica de certas moléculas de ligação aCD37 e moléculas de ligação a CD20 contempladas pelainvenção é que elas exibem uma meia-vida na circulação decerca de 7 a cerca de 3 0 dias.
Os anticorpos específicos para CD37 que caracterizaramo antígeno CD37 no "Terceiro Seminário de HLDA" foram HD28,G28-1, HHl, BI14, WR17 e F93G6. Veja, Ling e MacLennan, pp.302-335 em wLeucocyte Typing III. White CellDifferentiation Antigens", Oxford University Press (1987).
Outros anticorpos específicos para CD3 7 que foram descritosincluem RFB-7, Y29/55, MB-1, M-B371, M-B372 e IPO-24. VejaMoldenhaurer, J. Biol., Regul. Homeost. Agents, 14: 281-283(2000), que estabelece que todos esses anticorposreconhecem apenas um epitopo de CD37. Schwartz-Albiez ecols., 14: 905-914 (1988) indicam que o epitopo estásituado na porção de carboidrato do CD37. Outro anticorpoespecífico para CD37 é S-B3 (Biosys).
Patentes e publicações de patentes que descrevemanticorpos de CD20 incluem Patentes U.S. Nos 5.776.456,5.736.137, 6.399.061 e 5.843.439, bem como os pedidos depatente U.S. Nos US 2002/0197255 Al e US 2003/0021781 Al(Anderson e cols.); Patente U.S. N0 6.455.043 Bl e WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez eWhite); WO 00/27433 (Grillo-Lopez e Leonard); WO 00/44788(Braslawsky e cols.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter e White) ; WO 01/10460 (White e Grillo-Lopez) ; Pedido U.S. N0 US 2002/0006404 e WO 02/04021 (Hannae Hariharan) ; pedido U.S. N0 US 2002/0012665 Al e WO01/74388 (Hanna, N.); pedido U.S. N0 US 2002/0009444 Al, eWO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.);pedido U.S. N0 US 2002/0128488 Al e WO 02/34790 (Reff, M.);WO 02/060955 (Braslawsky e cols.); WO 02/096948 (Braslawskye cols.); WO 02/079255 (Reff e Davies) ; Patentes U.S. NoS6.171.586 Bl e WO 98/56418 (Lam e cols.); W098/58964 (Raju,S.); WO 99/22764 (Raju, S.);W0 99/51642, Patente U.S. N06.194.551 Bli Patente U.S. N0 6.242.195 BI, Patente U.S. N06.528.624 Bl e Patente U.S. N0 6.538.124 (Idusogie eCOlS.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd ecols.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez e cols.); pedido U.S. N0US 2002/0004587 Al e WO 01/77342 (Miller e Presta); pedidoU.S. No US 2002/0197256 (Grewal, I.); Patentes U.S. Nos6.090.365 BI, 6.287.537 BI, 6.015.542, 5.843.398 e5.595.721, (Kaminski e cols.); Patentes U.S. Nos 5.500.362,5.677.180, 5.721.108 e 6.120.767 (Robinson e cols.);Patente U.S. N0 6.410.391 Bl (Raubitschek e cols.);Patentes U.S. NoS 6.224.866 Bl e WO 00/20864 (Barbera-Gui liem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg e Hansen);WO 00/76542 (Golay e cols.); WO 01/72333 (Wolin eRosenblatt); Patente U.S. N0 6.368.596 Bl (Ghetie e cols.);Pedido U.S. N0 US 2002/0041847 Al, (Goldenberg, D.); PedidoU.S. N° US 2003/0026801 Al (Weiner e Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.), cada um deles é expressamenteaqui incorporado por referência. Veja também, Patente U.S.N0 5.849.898 e Pedido E.P. N0 330.191 (Seed e cols.);Patente U.S. N0 4.861.579 e EP 332.865 A2 (Meyer e Weiss);e WO 95/03770 (Bhat e cols.).
Rituximab foi aprovado para uso clínico humano comoRituxan®. Rituxan® é considerado como sendo uma molécula deligação específica para CD20 da invenção.
Produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs)são considerados como sendo um tipo de molécula de ligaçãoda invenção. Métodos para a fabricação de SMIPs foramdescritos previamente no pedido U.S. de co-propriedade N010/627.556 e nas Publicações de Patente U.S. 20030133939,20030118592 e 20050136049, que são aqui incorporadas porreferência em sua totalidade. SMIPs são proteínas de fusãode domínio de ligação-imunoglobulina inéditas quegeralmente apresentam um domínio de ligação para umaestrutura cognata, por exemplo, um antígeno, um contra-receptor ou outros mais, um polipeptídeo da região dedobradiça de IgGl7 IGA ou IgE ou um polipeptídeo da regiãode dobradiça de IgGl mutante que possui zero, um ou doisresíduos de cisteína, e domínios CH2 e CH3 deimunoglobulina. Em uma modalidade, a molécula do domínio deligação tem um ou dois resíduos de cisteína (Cys) na regiãode dobradiça. Em uma modalidade relacionada, quando amolécula do domínio de ligação compreende dois resíduosCys, o primeiro Cys, que está envolvido na ligação entre acadeia pesada e a cadeia leve, não é eliminado ousubstituído por um aminoácido.
As moléculas do domínio de ligação úteis nos métodosda invenção são contempladas como tendo uma ou mais regiõesde ligação, tais como regiões de ligação variáveis dacadeia leve e regiões de ligação variáveis da cadeia pesadaderivadas de um ou mais membros da superfamília dasimunoglobulinas, por exemplo, uma imunoglobulina. Alémdisso, essas regiões estão tipicamente separadas porpeptídeos vinculadores, que podem ser qualquer peptídeovinculador conhecido na técnica para ser compatível com ajunção do domínio ou região em uma molécula de ligação.Vinculadores exemplares são vinculadores que se baseiam nomotivo vinculador Gly4Ser, por exemplo, (Gly4Ser)n, em quen = 1-5. As moléculas para uso nos métodos da invençãotambém contêm seqüências de aminoácidos suficientesderivadas de uma região constante de uma imunoglobulinapara fornecer uma função efetora, de preferência, ADCC e/ouCDC. Dessa forma, as moléculas terão uma seqüência derivadade um domínio CH2 de uma imunoglobulina ou domínios CH2 eCH3 derivados de uma ou mais imunoglobulinas. SMIPs sãocapazes de ADCC e/ou CDC, mas têm sua habilidade paraformar multímeros ligados por dissulfeto comprometida.
A invenção inclui polipêptídeos SMIP humanizadosespecíficos para CD37 que exibem pelo menos 80 por cento deidentidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ.N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específicopara CD37 se liga a CD37. Em um aspecto, os polipeptídeosSMIP humanizados específicos para CD37 compreendem qualquerseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenos IDS. DE SEQ. Nos: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54,56, 58, 60, 80, 82, 84, 86 e 88. Em outro aspecto, ospolipeptídeos SMIP humanizados específicos para CD37compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido em umaregião determinante de complementaridade (CDR) selecionadado grupo que consiste em: CDRl da cadeia leve, CDRl dacadeia pesada, CDR2 da cadeia leve, CDR2 da cadeia pesada,CDR3 da cadeia leve e CDR3 da cadeia pesada.
Em uma modalidade, a invenção inclui um polipeptídeoSMIP humanizado específico para CD37, em que a CDRl dacadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DESEQ. N°: 61 (RASENVYSYLA) . A invenção também inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que aCDRl da cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidosdo ID. DE SEQ. N°: 62 (RTSENVYSYLA). A invenção aindainclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a CDRl da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 63 (GYMNM).
Em outra modalidade, a invenção inclui um polipeptídeoSMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR2 dacadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DESEQ. N° : 64 (FAKTLAE) . A invenção também inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que aCDR2 da cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidosdo ID. DE SEQ. N°: 65 (NIDPYYGGTTTYNRKFKG).
Em uma modalidade adicional, a invenção inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que aCDR3 da cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidosdo ID. DE SEQ. N°: 66 (QHHSDNPWT). A invenção ainda incluium polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, emque a CDR3 da cadeia pesada compreende a seqüência deaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 67 (SVGPFDY) . A invençãoainda inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específicopara CD37, em que a CDR3 da cadeia pesada compreende aseqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 68 (SVGPFDS). Ainvenção também inclui um polipeptídeo SMIP humanizadoespecífico para CD3 7, em que a CDR3 da cadeia pesadacompreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 69(SVGPMDY).
Em outro aspecto, a invenção inclui um polipeptídeoSMIP humanizado específico para CD3 7 que compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou pelo menos três seqüênciasdas seqüências de aminoácidos da CDR da cadeia leveselecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos:61, 62, 64 e 66. Ainda em outra modalidade, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado especifico para CD37que compreende uma seqüência de aminoácidos da CDRl dacadeia leve dos IDS. DE SEQ. Nos: 61 ou 62, ou uma variantedesta, na qual um ou dois aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos:61 ou 62 foram alterados; uma seqüência de aminoácidos daCDR2 da cadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 64, ou uma variantedesta, em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 64foram alterados; e uma seqüência de aminoácidos da CDR3 dacadeia leve do ID. DE SEQ. N°: 66, ou uma variante desta,em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 66 foramalterados.
Ainda em outro aspecto, a invenção inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7 quecompreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menostrês seqüências de aminoácidos da CDR da cadeia pesadaselecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos:63, 65 e 67-69. Em uma modalidade adicional, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7que compreende uma seqüência de aminoácidos da CDRl1 dacadeia pesada do ID. DE SEQ. N°: 63, ou uma variante desta,em que um ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 63 foramalterados; uma seqüência de aminoácidos da CDR2 da cadeiapesada do ID. DE SEQ. N°: 65, ou uma variante desta, em queum ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 65 foramalterados; e uma seqüência de aminoácidos da CDR3 da cadeiapesada selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ.Nos: 67-69, ou uma variante desta na qual um ou doisaminoácidos de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 67-69foram alterados.
A invenção também inclui polipeptídeos SMIPhumanizados específicos para CD37 que compreendem pelomenos uma modificação de aminoácido em uma regiãoestrutural (FR) selecionada do grupo que consiste em: FRlda cadeia leve, FRl da cadeia pesada, FR2 da cadeia leve,FR2 da cadeia pesada, FR3 da cadeia leve, FR3 da cadeiapesada, FR4 da cadeia leve e FR4 da cadeia pesada. Em umamodalidade, a invenção inclui um polipeptideo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a primeira regiãoestrutural (FRl) da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 70(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC). Em outra modalidade, a invençãoinclui um polipeptideo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FRl da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 71(EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT). Ainda em outramodalidade, a invenção inclui um polipeptideo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a FR2 da cadeialeve compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ.N°: 72 (WYQQKPGQAPRLLIY). Em uma modalidade adicional, ainvenção inclui um polipeptideo SMIP humanizado específicopara CD37, em que a FR2 da cadeia pesada compreende aseqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 73(WVRQMPGKGLEWMG). Ainda em outra modalidade, a invençãoinclui um polipeptideo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR3 da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 74(GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC). Ainda em outramodalidade, a invenção inclui um polipeptideo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a FR3 da cadeiapesada compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ.N0 : 75 (QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR) . Ainda em outramodalidade, a invenção inclui um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a FR4 da cadeialeve compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ.N°: 76 (FGQGTKVEIK). Ainda em outra modalidade, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR4 da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 77 (WGQGTLVTVSS) . Aindaem outra modalidade, a invenção inclui um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a FR4 da cadeiapesada compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ.N0: 78 (WGRGTLVTVS S).
A invenção ainda inclui polipeptídeos SMIP humanizadosespecíficos para CD3 7 que compreendem pelo menos uma, pelomenos duas ou pelo menos três seqüências das seqüências deaminoácidos da FR da cadeia leve selecionadas do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 70, 72, 74 e 76. Em umamodalidade, a invenção inclui um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD3 7 que compreende umaseqüência de aminoácidos da FRl da cadeia leve do ID. DESEQ. N°: 70, ou uma variante desta, em que um ou doisaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 70 foram alterados; umaseqüência de aminoácidos da FR2 da cadeia leve do ID. DESEQ. N°: 72, ou uma variante desta, em que um ou doisaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 72 foram alterados; umaseqüência de aminoácidos da FR3 da cadeia leve do ID. DESEQ. N°: 74, ou uma variante desta, em que um ou doisaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 74 foram alterados; e umaseqüência de aminoácidos da FR4 da cadeia leve do ID. DESEQ. N°: 76, ou uma variante desta, em que um ou doisaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 76 foram alterados.
Além disso, a invenção inclui polipeptídeos SMIPhumanizados específicos para CD3 7 que compreendem pelomenos uma, pelo menos duas ou pelo menos três seqüênciasdas seqüências de aminoácidos da FR da cadeia pesadaselecionadas do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos:71, 73, 75, 77 e 78. Em uma modalidade, a invenção incluium polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37 quecompreende uma seqüência de aminoácidos da FRl da cadeiapesada do ID. DE SEQ. N°: 71, ou uma variante desta, em queum ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 71 foramalterados; uma seqüência de aminoácidos da FR2 da cadeiapesada do ID. DE SEQ. N°: 73, ou uma variante desta, em queum ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 73 foramalterados; uma seqüência de aminoácidos da FR3 da cadeiapesada do ID. DE SEQ. N°: 75, ou uma variante desta, em queum ou dois aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 75 foramalterados; e uma seqüência de aminoácidos da FR4 da cadeiapesada dos IDS. DE SEQ. Nos: 77 ou 78, ou uma variantedesta, na qual um ou dois aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos:77 ou 78 foram alterados.
A invenção também inclui uma molécula de ácidonucléico isolado que compreende uma seqüência denucleotídeos que codifica um polipeptídeo SMIP humanizadoespecífico para CD37 que exibe pelo menos 80 por cento deidentidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ.N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizado específicopara CD37 se liga a CD37. Uma molécula de ácido nucléicoisolado como essa pode compreender uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,79, 81, 83, 85 e 87. Em uma modalidade, a invenção incluivetores que compreendem essas moléculas de ácido nucléico ecélulas hospedeiras que compreendem os vetores.
A invenção também inclui processos de produção dospolipeptídeos aqui descritos, que compreendem o cultivo dascélulas hospedeiras sob condições adequadas para expressaros polipeptídeos e, opcionalmente, o isolamento dospolipeptídeos da cultura.
Ainda em outro aspecto, a invenção inclui composiçõesque compreendem os polipeptídeos SMIP humanizadosespecíficos para CD37 da invenção e um veículofarmaceuticamente aceitável.
A invenção ainda inclui o uso do SMIP específico paraCD3 7 ou das moléculas de ligação específicas para CD3 7 aquidescritos em qualquer um dos métodos da invenção. Taismétodos incluem o uso de qualquer SMIP específico para CD37ou molécula de ligação específica para CD3 7 que compreendeuma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48,50, 52, 54, 56, 58, 60, 80, 82, 84, 86 e 88.
Ainda em outro aspecto, a invenção inclui kits para aredução de células B que compreendem as composições dainvenção; e protocolos para a utilização dos kits parareduzir células B. Tais kits podem ainda compreender uma oumais moléculas de ligação específica para CD20. A invençãocontempla que uma molécula de ligação específica para CD20como essa é TRU-015.
A invenção também inclui polipeptídeos SMIPhumanizados específicos para CD37 que compreendem uma CDRl,uma CDR2 e uma CDR3, que exibem pelo menos 80 por cento deidentidade para o polipeptídeo apresentado no ID. DE SEQ.N°: 2. Polipeptídeos SMIP específicos para CD37 como essespodem ainda compreender um domínio estrutural humanoseparando cada uma das CDRl, CDR2 e CDR3.
Em outro aspecto, a invenção inclui um polipeptídeoSMIP humanizado específico para CD37 que exibe pelo menos80 por cento de identidade para o polipeptídeo apresentadono ID. DE SEQ. N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizadoespecífico para CD37 se liga a CD37 e compreende umpolipeptídeo da região de dobradiça que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenos IDS. DE SEQ. Nos: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,106, 108 110, 112, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 126 e 127.
A invenção também contempla um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD37 que exibe pelo menos 80 porcento de identidade para o polipeptídeo apresentado no ID.DE SEQ. N°: 2, em que o polipeptídeo SMIP humanizadoespecífico para CD37 se liga a CD37 e compreende umvinculador que compreende (Gly4Ser)n, em que n é 1, 2, 3,4, 5 ou 6.
Ainda em um aspecto adicional, a invenção inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que aCDRl da cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 128(RTSQNVYSYLA) , 129 (RTSESVYSYLA) , 130 (RASQSVYSYLA) f 131(RASQSVSSYLA) e 132 (RASQSVSYYLA). Em outra modalidade, ainvenção inclui um polipeptídeo SMIP humanizado específicopara CD37, em que a CDRl da cadeia pesada compreende aseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistenos IDS. DE SEQ. Nos: 133 (SYMNM) e 134 (SYWIG) . Em umamodalidade adicional, a invenção inclui um polipeptídeoSMIP humanizado específico para CD37, em que a CDR2 dacadeia leve compreende a seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 135(AASSLQS) , 136 (GASTRAT) e 137 (DASNRAT) . Ainda em outramodalidade, a invenção inclui um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a CDR2 da cadeiapesada compreende a seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 13 8(IIYPGDSDTRYSPSFQG) e 13 9 (RIDPSDSYTNYSPSFQG).
A invenção também inclui um polipeptídeo SMIPhumanizado específico para CD37, em que a CDR3 da cadeialeve compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ.N°: 220 (QHHSDNPWT). Em outra modalidade, a invenção incluium polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, emque a CDR3 da cadeia pesada compreende a seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 211 (SVGPMDY) , 212 (SVGPFDY) , 213 (SVGPMDV) , 214(SVGPFDS), 215 (SVGPFDP), 216 (SVGPFQH), 217 (SVGPFDV), 218(SVGPFDI) e 219 (SVGPFDL).
Ainda em um aspecto adicional, a invenção incluipolipeptídeos SMIP específicos para CD37 com regiõesestruturais alternativas. Em um aspecto, a invenção incluium polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, emque a FRl da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 170-181. Em outro aspecto, a invenção inclui umpolipeptídeo SMIP humanizado específico para CD37, em que aFRl da cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos:140-146. Ainda em um aspecto adicional, a invenção incluium polipeptídeo SMIP humanizado específico para CD3 7, emque a FR2 da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 182-193. Ainda em outro aspecto, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR2 da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS.DE SEQ. Nos: 147-153. Em um aspecto adicional, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR3 da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 194-205. Ainda em outro aspecto, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR3 da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS.DE SEQ. Nos: 154-160. Em um aspecto adicional, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD37, em que a FR4 da cadeia leve compreende a seqüência deaminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 206-210. Ainda em outro aspecto, a invençãoinclui um polipeptídeo SMIP humanizado específico paraCD3 7, em que a FR4 da cadeia pesada compreende a seqüênciade aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos IDS.DE SEQ. Nos: 161-169.
SMIPs específicos para CD37 exemplares úteis nainvenção incluem, sem limitação: G28-1 scFv (SSS-S) H WCH2WCH3, que consiste em um G28-1 Fv de cadeia única no qualtodos os três resíduos de cisteína nas regiões de conexãoou de dobradiça são mutados para resíduos de serina, edomínios CH2 e CH3 do tipo selvagem; G28-1 scFv IgAH WCH2WCH3, que compreende uma dobradiça de IgA e domínios WT deIgGl; G28-1 scFv VHLllS (SSS-S) H WCH2 CH3, em que todos ostrês resíduos de cisteína nas regiões de conexão ou dedobradiça são mutados para resíduos de serina, e a leucinana posição 11 da região variável da cadeia pesada ésubstituída por uma serina; G28-1 scFv VHLllS (CSS-S) HWCH2 CH3, em que os resíduos de cisteína foram substituídosna segunda e na terceira posições por serina; G28-1 scFvVHLll S (CSC-S) H WCH2 CH3, em que os resíduos de cisteínaforam substituídos na segunda posição por serina; G28-1scFv VHllS (SSC-P) H WCH2 WCH3 (aqui denominado TRU-016) ,em que o primeiro e o segundo resíduos de cisteína nasregiões de conexão ou de dobradiça são mutados pararesíduos de serina, e a leucina na posição 11 da regiãovariável da cadeia pesada é substituída por uma serina;G28-1 scFv VHllS (SCS-S) H WCH2 WCH3, em que o primeiro e oterceiro resíduos de cisteína nas regiões de dobradiça sãomutados para resíduos de serina; G28-1 scFv VHLll S (CCS-P)H WCH2 WCH3, em que o terceiro resíduo de cisteína naregião de dobradiça é substituído por uma serina; G28-1scFv VHLll S (SCC-P) H WCH2 WCH3, em que a primeiracisteína é substituída por uma serina; G28-1 scFv VHLllSmlgE CH2 CH3 CH4, que compreende regiões CH 2-4 de IgE decamundongo nas quais a leucina na posição 11 da regiãovariável da cadeia pesada é substituída por uma serina;G28-1 scFv VHLllS mlgA WIgACH2 T4CH3, que compreende umadobradiça de IgA de camundongo com uma CH2 de IgA do tiposelvagem e um domínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4aminoácidos carbóxi GTCY; G28-1 scFv VHLll S hlgE CH2 CH3CH4, que compreende regiões CH de IgE nas quais a leucinana posição 11 da região variável da cadeia pesada ésubstituída por uma serina; e G28-1 scFv VHLll S hlgAHWIgACH2 TCH3, que compreende uma dobradiça de IgA, uma CH2de IgA do tipo selvagem e uma CH2 de IgA truncada e umdomínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4 aminoácidoscarbóxi GTCY.
SMIPs exemplares específicos para CD20 úteis nainvenção incluem SMIPs derivados do anticorpo monoclonalanti-CD20 2H7 descrito nas Publicações de Patente U.S.2003133939 e 20030118592. Os SMIPs incluem 2H7scFv-Ig ou umderivado deste. Derivados incluem CytoxB-MHWTGlC, que temum domínio Fc de IgGl humana, e um domínio de dobradiça deIgGl mutante; CytoxB-MHMGlC, que compreende um domínio Fcmutado; MG1H/MG1C, que compreende um receptor Fc com umresíduo de leucina mutado 234; CytoxB-IgAHWTHGlC, quecompreende uma porção da dobradiça de IgA humana fundida aodomínio Fc humano do tipo selvagem; 2H7 scFv-lhama IgGl,que compreende a dobradiça de IgGl de lhama e regiõesCH2CH3, 2H7 scFv-lhama IgG2, que compreende as regiões dedobradiça e CH2CH3 de IgG2 de lhama; 2H7 scFv-lhama IgG3,que compreende as regiões de dobradiça e CH2CH3 de IgG3 delhama.
2H7 scFv MTH (SSS) WTCH2CH3, em que todos os trêsresíduos de cisteína nas regiões de conexão ou de dobradiçasão mutados para resíduos de serina, e domínios CH2 e CH3do tipo selvagem; 2H7 scFv MTH (SSC) , em que os doisprimeiros resíduos de cisteína foram substituídos porresíduos de serina; 2H7 scFv MTH (SCS), em que a primeira ea terceira cisteínas foram substituídas por resíduos deserina; 2H7 scFv MTH (CSS) WTCH2CH3, em que os resíduos decisteína foram substituídos na segunda e na terceiraposições por serina; 2H7 scFv VH 11 SER IgG MTH (SSS)WTCH2CH3, em que a leucina na posição 11 na região variávelda cadeia pesada é substituída por serina; 2H7 scFv IgAhinge-IgGl CH2-CH3, que compreende uma região de dobradiçade IgA e domínios WT de IgGl; 2H7 scFv IgA hinge - CH2-CH3,que compreende uma dobradiça de IgA, regiões CH2-3; 2H7IgAWH IgACH2-T4CH3, que compreendem uma dobradiça de IgA,uma CH2 de IgA do tipo selvagem e um domínio CH3 de IgAtruncado desprovido dos 4 aminoácidos carbóxi GTCY.
Derivados com mutações na região CH3 de IgG incluem2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, no qual o resíduo defenilalanina na posição 4 05 (numeração de acordo com Kabate cols. supra) foi substituído por tirosina; 2H7 scFv MTHWTCH2 MTCH3 A405, em que a fenilalanina na posição 405 foisubstituída por uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 A4 07, emque o resíduo de tirosina na posição 407 foi substituídopor uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y4 05A4 07, quecompreende as duas mutações; e scFv MTH WTCH 2 MTCH3A405A407, que compreende duas mutações.
2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 é uma construção com oterceiro resíduo de cisteína na região de dobradiça de IgGlsubstituído por um resíduo de serina. 0 SMIP 2H7 scFv IgGMTH (SSS) MTCH2WTCH3 compreende um domínio de dobradiçamutante (MT (SSS)) e um domínio CH2 mutante, em que aprolina no resíduo 238 (de acordo com Ward e cols.) foisubstituída por uma serina.
Derivados 2H7scFv-Ig também incluem mutantes 2H7 scFvcom mutações pontuais na região variável da cadeia pesada.Todas as construções a seguir compreendem mutações em que aleucina na posição 11 na região variável da cadeia pesada ésubstituída por serina; 2H7 scFv VHI ISER IgG MTH (SSS-S)WTCH2CH3, 2H7scFv VHLllS (CSS-S) H WCH2 WCH3, quecompreende uma região de dobradiça mutada como apresentadaacima; 2H7scFv VHLllS (CSC-S) H WCH2 WCH3, que compreendeuma região de dobradiça mutada como apresentada acima; 2H7scFv VHLllS IgAH IgACH2 T4CH3, que compreende a dobradiçade IgA, WT IgA CH2 e CH3 truncada de IgA; 2H7 scFv VHLllSIgECH2 CH3 CH4, que compreende as regiões CH 2-4 de IgE;2H7 VHLllS scFv (SSS-S) IgECH3CH4, que compreende umaregião de dobradiça mutada e regiões CH3 e CH4 de IgE; 2H7scFv VHLllS mlgE CH2 CH3 CH4, que compreende regiões de IgEde camundongo; 2H7 scFv VHLllS mlgAH WIGACH2 T4CH3, quecompreende as mutações descritas acima e uma regiãoconstante de IgA de camundongo que consiste em uma regiãoCH2 do tipo selvagem e uma região CH3 mutada; 2H7 scFvVHLllS (SSS-S) H K322S CH2 WCH3, que compreende uma mutaçãona região CH2 de IgGl humana no resíduo 322, em que lisinafoi trocada por serina; 2H7 scFv VHLllS (CSS-S) H K322S CH2WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada comodescrito acima e uma região CH2 mutada como descritopreviamente; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H P331S CH2 WCH3, quecompreende uma região de dobradiça mutada como descritoacima, e uma região CH2 mutada em que a prolina no resíduo331 foi trocada por uma serina; 2H7 scFv VHLllS (CSS-S) HP331S CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiçamutada e uma mutação de prolina por serina no resíduo 331na região CH2; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H T256N CH2 WCH3,que compreende uma região de dobradiça mutada e uma mutaçãode treonina por asparagina no resíduo 256 na região CH2 ;2H7 SCFv VHLllS (SSS-S) H RTPE/QNAK (255-258) CH2 WCH3, quecompreende uma região de dobradiça mutada e uma série demutações nas quais os resíduos 255-258 foram mutados dearginina, treonina, prolina, ácido glutâmico paraglutamina, asparaginas, alanina e lisina, respectivamente;2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3, que compreenderegiões de dobradiça mutadas e uma troca de lisina porglutamina na posição 290; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H A339PCH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiça mutada euma troca de alanina por prolina na posição 339; SMIP 2H7scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, que compreende uma região dedobradiça mutada e uma troca de prolina por serina naposição 238 em CH2, que é a mesma que 2H7 scFv IgG MTH(SSS) MTCH2WTCH3 . 2H7 scFv IgAH IGAHCH2 T18CH3, quecompreende uma região de dobradiça de IgA do tipo selvageme uma região CH2 e uma região CH3 com uma truncagem de 18aminoácidos na extremidade carbóxi.
Uma molécula de ligação da invenção pode compreenderum domínio extracelular nativo ou projetado de outraproteína, o que aumenta a atividade da molécula de ligação.Em uma modalidade, o domínio extracelular é selecionado dogrupo que consiste em CD154 e CTLA4.
Uma "combinação sinérgica" de moléculas de ligaçãoespecíficas para CD37 e de moléculas de ligação específicaspara CD2 0 é uma combinação que tem um efeito que é maior doque a soma dos efeitos das moléculas de ligação quandoadministradas isoladamente.
Em um aspecto da invenção, as moléculas de ligação sãoadministradas em uma ou mais composições farmacêuticas.Para administrar as moléculas de ligação a um ser humano oua animais de teste, é preferível formular as moléculas deligação em uma composição que compreende um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis. A frase"farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere-se às entidades moleculares e composições que não produzemreações alérgicas ou outras reações adversas quandoadministradas com a utilização de vias bem conhecidas natécnica, como descrito abaixo. "Veículos farmaceuticamenteaceitáveis" incluem qualquer um e todos os solventes, meiosde dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorçãoclinicamente úteis, e semelhantes.
Além disso, os compostos podem formar solvatos comágua ou solventes orgânicos comuns. Esses solvatos tambémsão contemplados.
As composições de molécula de ligação podem seradministradas por via oral, tópica, transdérmica,parenteral, por spray de inalação, vaginal, retal ou porinjeção intracraniana. 0 termo parenteral, como aqui usado,inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares,injeção intracisterna ou técnicas de infusão. Aadministração por injeção intravenosa, intradérmica,intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal,retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em umlocal específico também é contemplada. Geralmente, ascomposições são essencialmente livres de pirogênios, alémde outras impurezas que podem ser prejudiciais ao paciente.
Prefere-se a injeção, especialmente a injeção intravenosa.
As composições farmacêuticas da presente invenção quecontêm moléculas de ligação usadas em um método da invençãopodem conter veículos ou aditivos farmaceuticamenteaceitáveis, dependendo da via de administração. Exemplosdesses veículos ou aditivos incluem água, um solventeorgânico farmacêutico aceitável, colágeno, álcoolpolivinílico, polivinilpirrolidona, um polímero decarboxivinil, carboximetilcelulose sódica, poliacrílicosódico, alginato de sódio, dextrana hidrossolúvel,carboximetil amido sódico, pectina, metil celulose, etilcelulose, goma xantana, goma arábica, caseína, gelatina,ágar, diglicerina, glicerina, propileno glicol, polietilenoglicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácidoesteárico, albumina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol,lactose, um tensoativo farmaceuticamente aceitável, esemelhantes. Os aditivos usados são escolhidos entre, semlimitação, os acima citados, ou combinações destes, comoadequado, dependendo da forma de dosagem da presenteinvenção.
A formulação da composição farmacêutica irá variar deacordo com a via de administração selecionada (por exemplo,solução, emulsão). Uma composição apropriada que compreendeo anticorpo a ser administrado pode ser preparada em umveículo ou transportador fisiologicamente aceitável. Parasoluções ou emulsões, veículos adequados incluem, porexemplo, soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsõesou suspensões, incluindo soro fisiológico e meiostamponados. Veículos parenterais podem incluir solução decloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto desódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosospodem incluir vários aditivos, conservantes ou renovadoresde líquidos, nutrientes ou eletrólitos.
Diversos veículos aquosos, por exemplo, água, águatamponada, soro fisiológico 0,4%, glicina 0,3% oususpensões aquosas, podem conter o composto ativo misturadocom excipientes adequados para a fabricação de suspensõesaquosas. Tais . excipientes são agentes de suspensão, porexemplo, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose,hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio,polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia;agentes dispersantes ou umidificantes podem ser umafosfatida de ocorrência natural, por exemplo, lecitina ouprodutos de condensação de um óxido de alquileno com ácidosgraxos, por exemplo, estearato de polioxietileno ouprodutos de condensação de óxido de etileno com alcoóisalifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetil-eneoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido deetileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos eum hexitol, por exemplo, monooleato de polioxietilenosorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etilenocom ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridosde hexitol, por exemplo, monooleato de polietilenosorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um oumais conservantes, por exemplo, etil, ou n-propil, p-hidroxibenzoato.As composições de molécula de ligação podem serliofilizadas para estocagem, e reconstituídas em um veículoadequado, antes de serem utilizadas. Essa técnicademonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais.
Qualquer técnica de liofilização e reconstituição adequadapode ser empregada. Será observado por aqueles habilitadosna técnica que a liofilização e a reconstituição podemproduzir graus variáveis de perda de atividade doanticorpo, e os níveis de uso podem ser ajustados paracompensar.
Pós e grânulos dispersíveis adequados para apreparação de uma suspensão aquosa pela adição de águafornecem o composto ativo misturado com um agentedispersante ou umidificante, agente de suspensão e um oumais conservantes. Agentes dispersantes ou umidificantes eagentes de suspensão adequados são exemplificados poraqueles já mencionados anteriormente.
A concentração de molécula de ligação nessasformulações pode variar amplamente, por exemplo, de menosde cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1%alcançando até 15 ou 2 0% por peso, e será selecionadaprimariamente com base nos volumes de líquido, viscosidadesetc., de acordo com o modo de administração em particularselecionado. Dessa forma, uma composição farmacêuticatípica para injeção parenteral poderia ser constituída paraconter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de anticorpo.
Uma composição típica para infusão intravenosa poderia serconstituída para conter 250 ml de solução de Ringer estérile 150 mg de anticorpo. Métodos atuais para a preparação decomposições administráveis por via parenteral sãoconhecidos ou ficarão evidentes para aqueles habilitados natécnica, e são descritos com mais detalhes, por exemplo, em"Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., MackPublishing Company, Easton, Pa. (1980). Uma dosagem eficazde anticorpo está dentro da faixa de 0,01 mg a 1.000 mg porkg de peso corporal por administração.
As composições farmacêuticas podem estar na forma deuma suspensão aquosa estéril injetável, suspensãooleaginosa, dispersões ou pós estéreis para a preparaçãoextemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.
A suspensão pode ser formulada de acordo com a técnicaconhecida com o uso daqueles agentes dispersantes ouumidificantes e agentes de suspensão adequados que forammencionados anteriormente. A preparação injetável estériltambém pode ser uma solução ou suspensão injetável estérilem um diluente ou solvente atóxico parenteralmenteaceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol.
0 veículo pode ser um meio solvente ou de dispersãocontendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo,glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, esemelhantes), mistura adequadas destes, óleos vegetais,solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio.
Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmenteempregados como um meio solvente ou de suspensão. Para essafinalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado,incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso,ácidos graxos, por exemplo, ácido oléico, podem ser usadosna preparação de injetáveis.
Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve serfluida a ponto de permitir uma fácil introdução emseringas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento, por exemplo, lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula necessário, no caso dedispersão, e pelo uso de tensoativos. Ela deve ser estávelsob as condições de fabricação e estocagem, e deve serpreservada contra a ação contaminante de microorganismos,tais como bactérias e fungos. A prevenção da ação demicroorganismos pode ser produzida por vários agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos,clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, esemelhantes. Em muitos casos, será desejável incluiragentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto desódio. A absorção prolongada das composições injetáveispode ser produzida com o uso, nas composições, de agentesque retardam a absorção, por exemplo, monoestearato dealumínio e gelatina.
Composições úteis para administração podem serformuladas com intensificadores da captação ou da absorçãopara aumentar sua eficácia. Esses intensificadores incluem,por exemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato,aprotinina, bacitracina, SDS, caprato e semelhantes. Veja,por exemplo, Fix (J. Pharm. Sci., 85: 1.282-1.285, 1996) eOliyai e Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 521-544, 1993) .
Além disso, as propriedades de hidrofilicidade ehidrofobicidade das composições contempladas para uso nainvenção são bem equilibradas, aumentando, dessa forma, suautilidade para usos tanto in vitro quanto, especialmente,in vivo, enquanto outras composições que não possuem esseequilíbrio têm uma utilidade substancialmente menor.Especificamente, as composições contempladas para uso nainvenção possuem um grau apropriado de solubilidade emmeios aquosos que permite a absorção e biodisponibilidadeno corpo, ao mesmo tempo em que também possuem um grau desolubilidade em lipideos que permite que os compostosatravessem a membrana celular até um suposto local de ação.Dessa forma, as composições de anticorpo contempladas sãomaximamente eficazes quando podem ser liberadas no local daatividade antigênica-alvo.
Em um aspecto, os métodos da invenção incluem umaetapa de administração de uma composição de molécula deligação.
Os métodos da invenção são realizados com o uso dequalquer meio medicamente aceito para a introdução de umasubstância terapêutica direta ou indiretamente em umindivíduo mamífero, incluindo, sem limitação, injeções,ingestão oral, administração intranasal, tópica,transdérmica, parenteral, spray de inalação, administraçãovaginal ou retal. 0 termo "parenteral", como aqui usado,inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramuscularese intracisterna, além de cateter ou técnicas de infusão. Aadministração por injeção intradérmica, intramamária,intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonare/ou implantação cirúrgica em um local específico também écontemplada.
Em uma modalidade, a administração é realizada nolocal de um câncer ou tecido afetado que necessita detratamento por injeção direta no local ou por meio deliberação sustentada ou por um mecanismo de liberaçãosustentada, que pode liberar a formulação internamente. Porexemplo, microesferas ou cápsulas biodegradáveis ou outrasconfigurações de polímero biodegradável capazes deliberação sustentada de uma composição (por exemplo, umpolipeptídeo, anticorpo ou pequena molécula solúvel) podemser incluídas nas formulações da invenção, implantadaspróximo ao câncer.
Composições terapêuticas também podem ser liberadas aopaciente em múltiplos locais. As administrações múltiplaspodem ser administradas simultaneamente, ou podem seradministradas ao longo de um período de tempo. Em certoscasos, é benéfico fornecer um fluxo contínuo da composiçãoterapêutica. A terapia adicional pode ser administrada emum intervalo determinado, por exemplo, de hora em hora,diariamente, semanalmente ou mensalmente.
As composições de molécula de ligação da invençãopodem compreender uma, ou podem compreender mais de umamolécula de ligação. Também é contemplada pela presenteinvenção a administração de composições de molécula deligação em conjunto com um segundo agente. Os segundosagentes contemplados pela invenção serão listados emparágrafos abaixo.
Um segundo agente pode ser uma molécula associada àcélula B. Outras moléculas associadas à célula Bcontempladas pela invenção incluem moléculas de ligação quese ligam às moléculas de superfície das células B que nãosejam CD37 ou CD20. Moléculas associadas às células Bincluem, sem limitação, CD19 (antígeno de linfócito B CD19,também denominado antígeno de superfície de linfócito B B4,ou Leu-12), CD21, CD22 (receptor de célula B CD22, tambémdenominado Leu-14, molécula de adesão celular de linfócitoB, ou BL-CAM), CD23, CD40 (antígeno de superfície de célulaB CD4 0, também denominado membro 5 da superfamília doreceptor do Fator de Necrose Tumoral, receptor CD4 0L, ouBp50), CD80 (antígeno de ativação de linfócito T CD80,também denominado antígeno de ativação B7-1, B7, B7-1, ouBBl) , CD86 (antígeno de ativação de linfócito T CD86,também denominado antígeno de ativação B7-2, B70, FUN-I ouBU63), CDl37 (também denominado membro 9 da superfamília doreceptor do Fator de Necrose Tumoral), CD152 (tambémdenominado proteína 4 de linfócito T citotóxico ou CTLA-4),L6 (antígeno associado a tumores L6, também denominadomembro 1 da superfamília Transmembrana 4, marcador docomponente de superfície da membrana 1, ou M3S1), CD3 0(antígeno de ativação de linfócitos CD30, também denominadomembro 8 da superfamília do receptor do Fator de NecroseTumoral, receptor CD30L, ou Ki-1), CD50 (também denominadomolécula de adesão intercelular-3 (ICAM3) ou ICAM-R), CD54(também denominado molécula de adesão intercelular-1(ICAMl), ou receptor de rinovírus do grupo principal) , B7-Hl (ligante para um receptor imunoinibidor expresso porcélulas T ativadas, células B e células mielóides, tambémdenominado PD-Ll; veja Dong, e cols., "B7-H1, a thirdmember of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferationand interleukin-10 secretion", Nat. Med., 5: 1.365-1.369(1999)), CD134 (também denominado membro 4 da superfamíliado receptor do Fator de Necrose Tumoral, 0X4O, receptor0X4OL, antígeno ACT35, ou receptor de glicoproteínalativadopor transcrição por TAX), 4IBB (receptor de ligante4 -IBB, antígeno de célula T 4-1BB, ou antígeno de célula TILA), CDl53 (também denominado membro 8 da superfamília doligante do Fator de Necrose Tumoral, ligante CD3 0 ou CD3 0-L) , CDl54 (também denominado membro 5 da superfamília doligante do Fator de Necrose Tumoral, proteína de ativaçãorelacionada ao TNF, TRAP ou antígeno de célula T Gp3 9) ereceptores Toll. A lista acima de alvos de construção e/ouantígenos-alvo é apenas exemplar e não é definitiva.
Citocinas e fatores de crescimento são segundosagentes contemplados pela invenção e incluem, semlimitação, um ou mais de TNF, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, G-CSF7 Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de célula-tronco, eeritropoietina. Composições farmacêuticas de acordo com ainvenção também podem incluir outras angiopoietinasconhecidas, por exemplo, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y e/ou opolipeptídeo humano angiopoietina-Iike e/ou fator decrescimento vascular endotelial (VEGF). Fatores decrescimento para uso em composições farmacêuticas dainvenção incluem angiogenina, proteína óssea morfogênica-1,proteína óssea morfogênica-2, proteína óssea morfogênica-3,proteína óssea morfogênica-4, proteína óssea morfogênica-5,proteína óssea morfogênica-6, proteína óssea morfogênica-7,proteína óssea morfogênica-8, proteína óssea morfogênica-9,proteína óssea morfogênica-10, proteína óssea morfogênica-11, proteína óssea morfogênica-12, proteína ósseamorfogênica-13, proteína óssea morfogênica-14, proteínaóssea morfogênica-15, receptor IA de proteína ósseamorfogênica, receptor IB da proteína óssea morfogênica,fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotróficociliar, receptor a do fator neurotrófico ciliar, fatorquimiotático de neutrófilos induzido por citocina 1, fatorquimiotático de neutrófilos induzido por citocina 2a, fatorquimiotático de neutrófilos induzido por citocina 2J3, fatorde crescimento de células endoteliais p, endotelina 1,fator de crescimento epidérmico, atrativo de neutrófilosderivado de células epiteliais, fator de crescimento defibroblastos 4, fator de crescimento de fibroblastos 5,fator de crescimento de fibroblastos 6, fator decrescimento de fibroblastos 7, fator de crescimento defibroblastos 8, fator de crescimento de fibroblastos 8b,fator de crescimento de fibroblastos 8c, fator decrescimento de fibroblastos 9, fator de crescimento defibroblastos 10, fator de crescimento de fibroblastosácido, fator de crescimento de fibroblastos básico,receptor do fator neurotrófico derivado de linhagem decélulas gliais al, receptor do fator neurotrófico derivadode linhagem de células gliais a2, proteína relacionada aocrescimento, proteína relacionada ao crescimento a,proteína relacionada ao crescimento J3, proteína relacionadaao crescimento y> fator de crescimento epidérmico deligação de heparina, fator de crescimento de hepatócitos,receptor do fator de crescimento de hepatócitos, fator decrescimento insulina-Iike I, receptor do fator decrescimento insulina-Iikel fator de crescimento insulina-Iike II, proteína de ligação do fator de crescimentoinsulina-1i/ce, fator de crescimento de ceratinócitos, fatorinibidor de leucemia, receptor do fator inibidor deleucemia a, fator de crescimento de nervos, receptor dofator de crescimento de nervos, neurotrofina-3,neurotrofina-4, fator de crescimento placentário, fator decrescimento placentário 2, fator de crescimento de célulasendoteliais derivado de plaquetas, fator de crescimentoderivado de plaquetas, cadeia de fator de crescimentoderivado de plaquetas A, fator de crescimento derivado deplaquetas AA, fator de crescimento derivado de plaquetasAB, cadeia de fator de crescimento derivado de plaquetas B,fator de crescimento derivado de plaquetas BB, receptor ade fator de crescimento derivado de plaquetas, receptor J3de fator de crescimento derivado de plaquetas, fatorestimulante do crescimento de pré-células B, fator decélula-tronco, receptor do fator de célula-tronco, fator detransformação de crescimento a, fator de transformação decrescimento p, fator de transformação de crescimento J31,fator de transformação de crescimento J31.2, fator detransformação de crescimento £2, fator de transformação decrescimento J33, fator de transformação de crescimento ]35,fator de transformação de crescimento latente J31, proteínade ligação I do fator de transformação de crescimento |3,proteína de ligação II do fator de transformação decrescimento J3, proteína de ligação III do fator detransformação de crescimento ]3, receptor do fator denecrose tumoral do tipo I, receptor do fator de necrosetumoral do tipo II, receptor do ativador de plasminogêniodo tipo uroquinase, fator de crescimento vascularendotelial e proteínas quiméricas e fragmentos biológicosou imunologicamente ativos destes.
Exemplos de agentes quimioterápicos contemplados comosegundos agentes incluem, sem limitação, agentesalquilantes, tais como mostardas nitrogenadas (por exemplo,mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan eclorambucil); nitrosouréias (por exemplo, carmustina(BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU));etilenoiminas e metil-melaminas (por exemplo,trietilenomelamina (TEM), trietileno tiofosforamida(tiotepa) e hexametilmelamina (HMM, altretamina));sulfonatos de alquila (por exemplo, bussulfan); e triazinas(por exemplo, dacabazina (DTIC)); antimetabólitos, taiscomo análogos de ácido fólico (por exemplo, metotrexato,trimetrexato, e pemetrexed (antifolato multidirecionado) ) ;análogos de pirimidina (por exemplo, 5-fluoruracil (5-FU),fluordesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinosida(AraC, citarabina), 5-azacitidina, e 2,2'-difluordesoxicitidina); e análogos de purina (por exemplo,6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina(EHNA), fosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina(cladribina, 2-CdA)); inibidores da topoisomerase do TipoI, por exemplo camptotecina (CPT), topotecan e irinotecan;produtos naturais, tais como epipodofilotoxinas (porexemplo, etoposida e teniposida); e alcalóides da vinca(por exemplo, vinblastina, vincristina e vinorelbina);antibióticos antitumorais, tais como actinomicina D,doxorrubicina e bleomicina; radiossensibilizantes, taiscomo 5-bromodesoxiuridina, 5-iododesoxiuridina ebromodesoxicitidina; complexos de coordenação de platina,tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina; uréiassubstituídas, por exemplo, hidroxiuréia; e derivados demetilhidrazina como, por exemplo, N-metilhidrazina (MIH) eprocarbazina.
Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicos,agentes radioterápicos e outros agentes ativos e agentessecundários também são mostrados na Tabela 1.
TABELA 1
<table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>
Os segundos agentes contemplados pela invenção para otratamento de doenças autoimunes são denominados agentesimunossupressores, que atuam para suprimir ou mascarar osistema imunológico do indivíduo tratado. Agentesimunossupressores incluem, por exemplo, fármacosantiinflamatórios não esteróides (NSAIDs), analgésicos,glicocorticóides, fármacos anti-reumáticos modificadores dedoença (DMARDs) para o tratamento de artrite oumodificadores da resposta biológica. Composições nadescrição de DMARD também são úteis no tratamento de váriasoutras doenças autoimunes além de AR.
NSAIDs exemplares são escolhidos do grupo que consisteem ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inibidores daCox-2, tais como Vioxx e Celebrex e sialilatos. Analgésicosexemplares são escolhidos do grupo que consiste emacetaminofeno, oxicodona, tramadol de cloridrato depropoxifeno. Glicocorticóides exemplares são escolhidos dogrupo que consiste em cortisona, dexametasona,hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona ouprednisona. Modificadores da resposta biológica exemplaresincluem, sem limitação, moléculas dirigidas contramarcadores da superfície celular (por exemplo, CD4, CD5etc.), inibidores de citocina, tais como os antagonistas doTNF (por exemplo, etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira)e infliximab (Remicade)) , inibidores de quimiocina einibidores de moléculas de adesão. Os modificadores daresposta biológica incluem anticorpos monoclonais, bem comoformas recombinantes de moléculas. DMARDs exemplaresincluem, sem limitação, azatioprina, ciclofosfamida,ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida,sulfasalazina, hidroxicloroquina, Ouro [oral (auranofin) eintramuscular] e minociclina.Contempla-se que a composição de molécula de ligação edo segundo agente pode ser dada simultaneamente na mesmaformulação. Alternativamente, os agentes são administradosem uma formulação separada, mas concomitantemente, comconcomitantemente referindo-se aos agentes dados com umintervalo de até 3 0 minutos entre eles.
Em outro aspecto, o segundo agente é administradoantes da administração da composição de molécula deligação. Antes da administração refere-se à administraçãodo segundo agente em um intervalo de até uma semana antesdo tratamento com o anticorpo, até 3 0 minutos antes daadministração do anticorpo. Contempla-se ainda que osegundo agente é administrado subseqüente à administraçãoda composição de molécula de ligação. Administraçãosubseqüente visa a descrever a administração de 3 0 minutosapós o tratamento com anticorpo até uma semana após aadministração do anticorpo.
Contempla-se ainda que, quando a molécula de ligaçãofor administrada em combinação com um segundo agente, emque o segundo agente é uma citocina ou um fator decrescimento, ou um agente quimioterápico, a administraçãotambém poderá incluir o uso de um agente radioterápico ouradioterapia. A radioterapia administrada em combinação comum anticorpo composição é administrada da forma determinadapelo médico responsável, e nas doses tipicamenteadministradas a pacientes em tratamento de câncer.
As quantidades de molécula de ligação em certa doseirão variar de acordo com o tamanho do indivíduo que recebea administração da terapia, bem como com as característicasdo distúrbio tratado. Em tratamentos exemplares, pode sernecessário administrar cerca de 1 mg/dia, cerca de 5mg/dia, cerca de 10 mg/dia, cerca de 20 mg/dia, cerca de 50mg/dia, cerca de 75 mg/dia, cerca de 100 mg/dia, cerca de150 mg/dia, cerca de 200 mg/dia, cerca de 250 mg/dia, cercade 500 mg/dia ou cerca de 1.000 mg/dia. As doses tambémpodem ser administradas com base no peso paciente, em umadose de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg. Em umamodalidade relacionada, a molécula de ligação pode seradministrada em uma faixa de dose de cerca de 0,015 a cercade 30 mg/kg. Em uma modalidade adicional, a molécula deligação é administrada em uma dose de cerca de 0,015, cercade 0,05, cerca de 0,15, cerca de 0,5, cerca de 1,5, cercade 5, cerca de 15 ou cerca de 3 0 mg/kg.
Essas composições podem ser administradas em uma doseúnica ou em várias doses. Estudos padronizados de dose-resposta, inicialmente em modelos animais e depois emtestes clínicos, revelam dosagens ótimas para estados dedoença e populações de pacientes específicos.
A administração da composição de molécula de ligaçãodiminui a população de células B em pelo menos 2 0% após adose única de tratamento. Em uma modalidade, a população decélulas B é diminuída em pelo menos cerca de 20, cerca de30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70,cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100%. A redução decélulas B é definida como uma diminuição na contagemabsoluta de células B abaixo do limite inferior da faixanormal. A recuperação de células B é definida como oretorno da contagem absoluta de células B a um dosseguintes: 70% do valor basal ou faixa normal do indivíduo.
A administração de moléculas de ligação específicaspara CD20 também resulta em aumento da apoptose emsubconjuntos específicos de células B. Apoptose refere-se áintrodução da morte celular programada de uma célula,manifestada e avaliada por fragmentação de DNA,encolhimento da célula, fragmentação celular, formação devesículas na membrana ou alteração da composição lipídicada membrana, avaliada por coloração com anexina V.
Além disso, a administração de composições de moléculade ligação da invenção resulta na produção de efeitosclínicos desejados na doença ou distúrbio tratado. Porexemplo, em pacientes que possuem artrite reumatóide, em umaspecto, a administração melhora a condição do paciente emuma quantidade clinicamente significativa [por exemplo,alcança a "American College of Rheumatology PreliminaryDetection of Improvement" (ACR20) ] e/ou em uma melhora de20% da sensibilidade e do edema articulares e uma melhorade 20% nos 3/5 das medidas ACR restantes (Felson e cols.,Arthritis Rheum. 1995, 38: 727-35). Medidas biológicas paramelhora em um paciente com AR após a administração demoléculas de ligação específicas para CD37 e específicaspara CD20 incluem a medida das alterações dos níveis decitocina, medidos através dos níveis de proteína ou RNA.Citocinas de interesse incluem, sem limitação, TNF- a, IL-1, interferons, Blys e APRIL. Alterações da citocina podemser causadas por números reduzidos de células B oudiminuição de células T ativadas. Em pacientes com AR,marcadores relevantes para o turnover ósseo (reabsorção ouerosão ósseas) são medidos antes e depois da administraçãode moléculas de ligação específicas para CD20. Marcadoresrelevantes incluem, sem limitação, fosfatase alcalina,osteocalcina, fragmentos da degradação de colágeno,hidroxiprolina, fosfatase ácida resistente a tartarato eligante de RANK (RANKL). Outros indicadores relevantes paraa melhora da AR incluem a medida dos níveis de proteína C-reativa (CRP), velocidade de hemossedimentação (VHS), fatorreumatóide, anticorpos CCP (peptídeo cíclico citrulinado) eavaliação dos níveis sistêmicos de células B e contagem delinfócitos através de citometria de fluxo. Fatoresespecíficos também podem ser medidos a partir da sinóvia depacientes com AR, incluindo avaliação dos níveis de célulasB na sinóvia de biópsia sinovial, níveis de RANKL e outrosfatores e citocinas ósseos apresentados acima.
Em um aspecto relacionado, os efeitos da administraçãoda combinação sobre outras doenças são medidos de acordocom padrões conhecidos na técnica. Por exemplo, contempla-se que pacientes com doença de Crohn tratados de acordo coma invenção obtêm uma melhora no índice de Atividade daDoença de Crohn (CDAI) na faixa de cerca de 50 a cerca de70 unidades, em que a remissão se situa em 150 unidades(Simonis e cols., Scand. J Gastroent. 1998, 33: 283-8). Umapontuação de 150 ou 200 é considerada normal, enquanto umapontuação de 450 é considerada uma pontuação da doençagrave. Deseja-se ainda que a administração das moléculas deligação específicas para CD37 e específicas para CD20resulte em uma redução em anticorpo perinuclear anti-neutrófilos (pANCA) e anticorpo anti-Saccharomycescervisiae (ASCA) em indivíduos que sofrem de doençainflamatória do intestino.
Contempla-se ainda que pacientes adultos e jovens commiosite tratados de acordo com a invenção obtêm uma melhorano conjunto central de avaliações, por exemplo, 3 de 6 dosindicadores do conjunto central medidos melhoraram emaproximadamente 20%, com piora de no máximo 2 dessasmedidas de indicadores centrais em aproximadamente 25%(veja Rider e cols., Arthritis Rheum. 2004, 50: 2.281-90).
Contempla-se ainda que pacientes com LES tratados deacordo com a invenção obtêm uma melhora na pontuação pelaMedida de Atividade do Lúpus Sistêmico (SLAM) ou peloíndice de Atividade de Doença por LES (SLEDAI) de pelomenos 1 ponto (Gladman e cols., J. Rheumatol. 1994, 21:1.468-71) (Tan e cols., Arthritis Rheum. 1982, 25: 1.271-7) . Uma pontuação SLAM >5, ou pontuação SLEDAI >2, éconsiderada doença clinicamente ativa. Uma resposta aotratamento pode ser definida como melhora ou estabilizaçãopelas 2 medidas de atividade da doença (o índice deAtividade de Doença por LES [SLEDAI] e a Medida deAtividade do Lúpus Sistêmico) e 2 medidas da qualidade devida (avaliação global do paciente e a Escala de Gravidadede Fadiga de Krupp) (Petri e cols., Arthritis Rheum. 2004,50: 2.858-68). Contempla-se ainda que a administração damolécula de ligação a pacientes com LES resulte em umaredução em anticorpos anti-DNA de fita dupla.
Alternativamente, a melhora pode ser estimada com autilização dos Critérios do Grupo de Avaliação do Lúpus dasIlhas Britânicas (BILAG).
Contempla-se ainda que pacientes com esclerosemúltipla tratados de acordo com a invenção obtêm umamelhora da pontuação clínica na escala do estado deIncapacidade Expandida de Kurtzke (EDSS) (Kurtzke, F.,Neurology 1983, 33: 1.444-52) de pelo menos 0,5, ou umretardo na piora da doença clínica de pelo menos 1,0 naescala de Kurtzke (Rudick e cols., Neurology 1997, 49: 358-63).
Contempla-se ainda que pacientes que sofrem de MII querecebem moléculas de ligação específicas para CD3 7 eespecíficas para CD20 obtêm uma redução em pelo menos um decinco critérios apresentados na avaliação dos Critériospara Miopatia Inflamatória Idiopática (IIMC) (Miller, F.,supra). Contempla-se ainda que a administração a pacientescom MII resulte em uma redução dos fatores associados à MIIselecionados do grupo que consiste em creatina quinase(CK), lactato desidrogenase, aldolase, proteína C-reativa,aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase(ALT), e auto-anticorpo antinuclear (ANA), anticorposespecíficos para miosite (MSA), e anticorpo para antígenosnucleares passíveis de extração. Alternativamente, ospacientes atingem 3 de 6 dos critérios apresentados emRider e cols., Arthritis Rheum., 50 (7) :2.281-2.290 (2004),com piora em no máximo 2 critérios.
Em algumas modalidades, pacientes que sofrem de umcâncer de células B recebem tratamento de acordo com ainvenção, e demonstram uma resposta benéfica global aotratamento, com base em critérios clínicos bem conhecidos ecomumente usados na técnica, e como descrito abaixo, porexemplo, uma diminuição do tamanho do tumor, diminuição donúmero de tumores e/ou uma melhora dos sintomas da doença.
Critérios clínicos exemplares são fornecidos pelo"U.S. National Câncer Institute" (NCI), que dividiu algumasdas classes de cânceres nas categorias clínicas de linfomas"indolentes" e "agressivos". Linfomas indolentes incluemlinfomas de célula folicular, separados em "graus"citológicos, Iinforna linfocítico difuso pequeno/leucemialinfocítica crônica (CLL), macroglobulinemialinfoplasmocitóide/de Waldenstrom, linfoma de zona marginale leucemia de célula pilosa. Linfomas agressivos incluemlinfoma difuso de células mistas e grandes, linfoma deBurkitt/linfoma difuso de célula pequena não clivada,linfoma linfoblástico, linfoma de célula do manto e linfomarelacionado à AIDS. Em alguns casos, o índice PrognósticoInternacional (IPI) é usado nos casos de linfoma agressivoe folicular. Fatores que devem ser considerados no IPIincluem a idade (<60 anos de idade ver sus >6 0 anos deidade), lactato desidrogenase sérica (níveis normais versuselevados), estado do desempenho (0 ou 1 versus 2-4) (vejadefinição abaixo), estágio da doença (I ou II versus III ouIV) e o envolvimento de local extranodal (0 ou 1 versus 2-4). Pacientes com 2 ou mais fatores de risco possuem umaprobabilidade menor do que 50% de sobrevida sem recidivas eglobal em 5 anos.
O estado do desempenho no IPI agressivo é definido daseguinte forma: Descrição do Grau: 0 Totalmente ativo,capaz de realizar todo o desempenho pré-doença, restrições;1 Restrito em atividades fisicamente extenuantes, masambulatório e capaz de realizar trabalho de natureza leveou sedentária, por exemplo, trabalho doméstico leve,trabalho de escritório; 2 Ambulatório e capaz de realizaros cuidados pessoais, mas incapaz de realizar quaisqueratividades de trabalho, até e em torno de 50% das horas devigília; 3 Capaz apenas de efetuar ou cuidados pessoais,confinado ao leito ou à cadeira em mais de 50% das horas devigília; 4 Completamente incapaz, incapaz de realizar oscuidados pessoais, totalmente confinado ao leito ou àcadeira; e, 5 Morto (veja, "The International Non-Hodgkin1SLymphoma Prognostic Factors Project. A predictive model foraggressive Non-Hodgkin1S Lymphoma". N. Engl. J. Med. 329:987-94, 1993).
Tipicamente, o grau de Iinfoma é avaliado clinicamentecom o uso do critério de que linfoma de grau baixonormalmente se apresenta como uma doença nodal, e éfreqüentemente indolente ou de crescimento lento. A doençade grau intermediário e elevado normalmente se apresentacomo uma doença bem mais agressiva, com grandes tumoresvolumosos extranodais.
O sistema de classificação de Ann Arbor também é usadopara medir a progressão de tumores, especialmente dolinfoma não Hodgkins. Nesse sistema, os estágios I, II, IIIe IV do linfoma não Hodgkin do adulto pode ser classificadonas categorias AeB, dependendo de se o paciente temsintomas generalizados bem definidos (B) ou não (A) . Adesignação B é dada a pacientes com os seguintes sintomas:perda inexplicada de mais de 10% do peso corporal nos 6meses antes do diagnóstico, febre inexplicada comtemperaturas acima de 38°C e suores noturnos abundantes. Asdefinições dos estágios são as seguintes: Estágio I -envolvimento da região de um único linfonodo, ouenvolvimento localizado de um único órgão ou localextralinfático. Estágio II - envolvimento de duas ou maisregiões de linfonodo do mesmo lado do diafragma, ouenvolvimento localizado de um único órgão ou localextralinfático associado e de seus linfonodos regionais,com ou sem outras regiões de linfonodos do mesmo lado dodiafragma. Estágio III - envolvimento de regiões delinfonodos em ambos os lados do diafragma, possivelmenteenvolvimento localizado associado de um órgão ou localextralinfático, envolvimento do baço, ou ambos. Estágio IV- envolvimento disseminado (multifocal) de um ou maislocais extralinfáticos, com ou sem envolvimento associadode linfonodos ou envolvimento isolado de órgãoextralinfático, com envolvimento nodal distante (nãoregional). Para mais detalhes, veja "The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictivemodel for aggressive non-Hodgkin's lymphoma", New EnglandJ. Med. (1993) 329: 987-994.
Em um aspecto, um efeito terapêutico dos métodos deacordo com a invenção é determinado pelo nível de resposta,por exemplo, uma resposta parcial é definida como reduçãotumoral a menos da metade de seu tamanho original. Umaresposta completa é definida como a eliminação total dadoença, confirmada por avaliação clínica ou radiológica. Emuma modalidade, o indivíduo que recebe o tratamento deacordo com a invenção demonstra pelo menos uma respostaparcial ao tratamento.
De acordo com os critérios de Cheson para avaliação delinfoma não Hodgkin desenvolvidos em colaboração com o"National Câncer Institutew (Cheson e cols., J. Clin.Oncol. 1999, 17: 1.244; Grillo-Lopez e cols., Ann. Oncol.2000, 11: 399-408), uma resposta completa é obtida quandohá um desaparecimento completo de todas as evidênciasclínicas e radiográficas detectáveis de doença e desintomas relacionados à doença, todos linfonodos retornaramao tamanho normal, o baço regrediu de tamanho e a medulaóssea não possui Iinfoma.
Uma resposta completa não confirmada é obtida quandoum paciente exibe desaparecimento completo da doença e obaço regride de tamanho, mas os linfonodos regridem mais de75% e a medula óssea é indeterminada. Uma resposta completanão confirmada preenche e excede os critérios para respostaparcial. Uma resposta global é definida como uma redução depelo menos 50 por cento na carga tumoral global.
Critérios similares foram desenvolvidos para váriasoutras formas de cânceres ou doenças hiperproliferativas, esão facilmente disponíveis por aqueles habilitados natécnica. Veja, por exemplo, Cheson e cola., Clin. Adv.Hematol. Oncol. 2006, 4:4 -5, que descreve critérios paraavaliação de CLL; Cheson e cols., J. Clin. Oncol. 2003, 21:4.642-9, que descreve critérios para AML; Cheson e cols.,Blood 2000, 96: 3.671-4, que descreve critérios parasíndromes mielodisplásicas.
Em outro aspecto, uma resposta terapêutica empacientes que apresentam um câncer de células B manifesta-se como uma progressão mais lenta da doença, comparada coma de pacientes que não recebem a terapia. A medida daprogressão mais lenta da doença ou de qualquer um dosfatores acima pode ser realizada com o uso de metodologiasbem conhecidas na técnica, incluindo varredura óssea,varredura por TC, varredura com gálio, linfangiograma, MRI,varreduras PET, ultra-som, e semelhantes.
Também ficará evidente que a dosagem pode sermodificada caso sejam administradas substânciasterapêuticas tradicionais em combinação com as substânciasterapêuticas da invenção.
Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits quecompreendem um ou mais compostos ou composições úteis nosmétodos da invenção, embalados de uma forma que faciliteseu uso para a prática dos métodos da invenção. Namodalidade mais simples, um kit como esse inclui umcomposto ou uma composição aqui descrita como útil para aprática de um método da invenção embalada em um recipiente,por exemplo, uma garrafa ou um vaso lacrado, com um rótuloafixado no recipiente ou incluído na embalagem que descreveo uso do composto ou da composição para a prática do métododa invenção. De preferência, o composto ou a composição éembalado em uma forma de dosagem unitária. 0 kit pode aindaincluir um dispositivo adequado para a administração dacomposição de acordo com uma via de administraçãopreferida, ou para a realização de um ensaio derastreamento. O kit pode incluir um rótulo que descreve ouso da composição de molécula(s) de ligação em um método dainvenção.
A presente invenção também compreende produtosmanufaturados. Esses artigos compreendem moléculas deligação específicas para CD37 ou moléculas de ligaçãoespecíficas para CD37 e específicas para CD20,opcionalmente junto com um veículo ou diluentefarmacêutico, e pelo menos um rótulo que descreve um métodode uso das moléculas de ligação de acordo com a invenção.Esses produtos manufaturados também podem opcionalmentecompreender pelo menos um segundo agente para administraçãoem conexão com as moléculas de ligação.
A presente invenção também reivindica o uso de umacomposição que compreende uma molécula de ligaçãoespecífica para CD37 ou moléculas de ligação específicaspara CD37 e específicas para CD20 na fabricação de ummedicamento para o tratamento ou a profilaxia de uma doençaque envolve atividade aberrante de células B.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura IA representa a estrutura da molécula de TRU-016; a Figura IB mostra os resultados da análise SDS-PAGE,demonstrando que a proteína expressa migra em um Mr deaproximadamente 110 kDa sob condições não redutoras, e deaproximadamente 52 kDa quando submetida às condiçõesredutoras; e a Figura IC mostra que a molécula de TRU-016demonstra ligação específica de nível elevado paralinfócitos B do sangue periférico humano, e um nível deligação bem menor para outras subpopulações de células napopulação diferente de linfócitos B (população CD19-negativa) quando analisada por citometria de fluxo.
A Figura 2A-E mostra inibição da ligação pordiferentes reagentes dirigidos a CD37.
A Figura 3A demonstra a ligação de FITC Clq às formasmoleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos nosoro humano normal, com e sem fator de veneno de cobra(CVF); a Figura 3B mostra a atividade de CDC de formasmoleculares de TRU-016 incubadas com células B Ramos nosoro humano normal, com e sem CVF; e a Figura 3C mostra aatividade de CDC de formas moleculares de TRU-016 incubadascom células B Ramos e complemento humano ou de coelho.
A Figura 4 mostra os traços de cromatografia porexclusão de tamanho (SEC) HPLC obtidos da purificação deGPC do TRU-016, colocando em um gráfico a absorbânciaversus o tempo de retenção para as diferentes fraçõescoletadas.
A Figura 5A mostra as propriedades de ligação defrações de SEC; a Figura 5B mostra a atividade de CDC defrações de SEC; e a Figura 5C mostra a atividade de ADCC defrações de SEC.
A Figura 6 mostra a atividade de CDC de TRU-015,rituxan, TRU-016, ou uma combinação destes, em células BRamos.
A Figura 7 mostra o efeito de TRU-016 sobre aatividade de CDC de TRU-015 em células B DHL-4.
A Figura 8 mostra o efeito de TRU-016 sobre aatividade de CDC de TRU-015 e rituxan.
A Figura 9 mostra o efeito de TRU-016 em TRU-015 em umensaio da CDC.
A Figura 10 mostra o efeito de TRU-016 em rituxan emum ensaio da CDC.
A Figura 11 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 emum ensaio da ADCC usando células BJAB.
A Figura 12 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 emum ensaio da ADCC usando células Daudi.
A Figura 13 mostra a interação de TRU-015 e TRU-016 emum ensaio da ADCC usando células Ramos.
A Figura 14 mostra o efeito de rituxan, TRU-016, e umacombinação destes, sobre a morte específica de célulasBJAB.
A Figura 15 mostra o efeito de rituxan, TRU-016, e umacombinação destes, sobre a morte específica de célulasBJAB.
A Figura 16 mostra o efeito de TRU-015, TRU-016, e umacombinação destes, sobre a morte específica de célulasBJAB.
A Figura 17 mostra o efeito de TRU-015, TRU-016, e umacombinação destes, sobre a morte específica de célulasBJAB.
A Figura 18A-D mostra que formas diméricas de TRU-016não medeiam CDC isoladamente, mas potencializam a atividadede CDC de Rituximab in vitro.
A Figura 19A-B demonstra que TRU-016 purificado porproteína A induz apoptose de células Ramos e Daudi,enquanto as formas diméricas necessitam de entrecruzamento.
A Figura 20 mostra que TRU-016 preferencialmenteelimina células B normais de culturas de PBMC.
A Figura 21 demonstra a eficácia de TRU-016 comparadocom hulgG, rituxan e o tratamento combinado de TRU-016 erituxan sobre o volume tumoral em animais.
As Figuras 22A e B mostram que formas diméricas deTRU-016 exibem atividade antitumoral significativa, medidapelo efeito sobre o volume tumoral e percentual desobrevida em um modelo de autoenxerto tumoral emcamundongo.
A Figura 23 demonstra que dímeros de TRU-016 nãoaumentam a atividade de CDC resultante do tratamento comreagentes específicos para MHCII, CD19, CD80/86 ou CD45.
A Figura 24 mostra o percentual de sobrevida decamundongos com tumores Ramos (até 90 dias) após tratamentocom TRU-016, rituximab ou uma combinação destes.
As Figuras 25 e 26 mostram o percentual de sobrevidade camundongos com tumores Daudi (até 90 dias) apóstratamento com TRU-016 ou rituximab.A Figura 27 mostra que TRU-016 reduziu eficazmente aviabilidade celular relativa em células tratadas comfludarabina potencializando, dessa forma, o efeitocitotóxico de fludarabina isoladamente.
A Figura 28 mostra que TRU-016 induziu toxicidadecelular maior do que herceptina ou rituximab em linhagenscelulares resistentes a rituximab.
A Figura 29 mostra que TRU-016 induziu fosforilação detirosina em células B CD19+ primariamente CLL.
A Figura 30A mostra a seqüência de aminoácidos deconsenso da construção humanizada de TRU-016 n° 019001 (ID.DE SEQ. N°: 6) e TRU-016 (ID. DE SEQ. N°: 2) com numeraçãode Kabat; a Figura 3OB mostra os alinhamentos de seqüênciasde aminoácidos de três construções humanizadas de TRU-16(019001, 019008 e 109009).
A Figura 31 mostra o DNA e alinhamentos de seqüênciasde aminoácidos de três construções humanizadas de TRU-016(019001, 019041 e 019044).
A Figura 32 mostra os alinhamentos de seqüênciasformatados por FASTA das mesmas três construçõeshumanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e 019044).
EXEMPLOS
Aspectos e detalhes adicionais da invenção ficarãoevidentes a partir dos exemplos seguintes, os quais visam ailustrá-la, e não limitá-la. O Exemplo 1 descreve aprodução de uma molécula de ligação específica para CD37; oExemplo 2 demonstra que TRU-016 e vários anticorposespecíficos para CD3 7 reconhecem os mesmos epitopos ouepitopos superpostos; o Exemplo 3 mostra que TRU-016 édeficiente na ligação de Clq e na ativação da via clássicade ativação de complemento; o Exemplo 4 demonstra aatividade e a ligação de multimeros de TRU-016; o Exemplo 5descreve a produção de uma molécula de ligação específicapara CD20; o Exemplo 6 mostra que combinações de TRU-016com TRU-015 ou rituxan aumentam sinergicamente a apoptoseem células Β; o Exemplo 7 mostra que combinações de TRU-016com anticorpos específicos para CD20 ou SMIPs aumentamsinergicamente a CDC; o Exemplo 8 demonstra que TRU-016aumenta a atividade de ADCC e CDC de anticorpos específicospara CD20 e SMIPS; o Exemplo 9 demonstra que TRU-016 induzapoptose em células Β; o Exemplo 10 mostra que combinaçõesde um SMIP específico para CD37 com um anticorpo específicopara CD20 reduzem sinergicamente o volume tumoral em ummodelo de xenoenxerto tumoral murídeo; o Exemplo 11 mostraque um SMIP específico para CD37 isoladamente também reduzo volume tumoral em um modelo de xenoenxerto tumoralmurídeo; o Exemplo 12 demonstra que TRU-016 não afeta aatividade de CDC de outros receptores de superfície decélulas Β; o Exemplo 13 demonstra que TRU-016 não aumenta aatividade de CDC de vários receptores-alvo, incluindoMHCII, CDl9, CD80/86 e CD40; o Exemplo 14 fornece dadosadicionais que mostram que TRU-016 aumenta a sobrevida invivo em camundongos com tumores; o Exemplo 15 demonstra queTRU-016 potencializa a morte celular induzida porfludarabina em células CLL in vitro; o Exemplo 16 mostraque TRU-016 induz citotoxicidade direta em célulasresistentes ao rituximab; o Exemplo 17 mostra que TRU-016induz fosforilação de tirosina em células B CD19+primariamente CLL; e o Exemplo 18 fornece moléculashumanizadas de TRU-016.Exemplo 1
Produção de uma molécula de ligação específica para CD37
SMIPs específicos para CD37 são descritos no PedidoU.S. de co-propriedade N0 10/627.556 e nas Publicações dePatente U.S. Nos 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049.Um SMIP exemplar, TRU-016, é produzido como descritoabaixo.
TRU-016 [G28-1 scFv VHllS (SSC-P) H WCH2 WCH3] é umaproteína recombinante de cadeia única que se liga aoantígeno CD37. O domínio de ligação era baseado naseqüência do anticorpo G28-1 revelada previamente naspublicações de patentes listadas no parágrafo precedente,cuja revelação é aqui incorporada por referência. O domíniode ligação está conectado ao domínio efetor, os domíniosCH2 e CH3 de IgGl humana, através de uma região dedobradiça modificada. TRU-016 existe como um dímero emsolução, e o dímero tem um peso molecular teórico deaproximadamente 106.000 dáltons.
O RNA total do hibridoma de G28-1 foi isolado com ouso de reagente de RNA Trizol (Gibco) de acordo com asinstruções do fabricante. 0 cDNA foi preparado com o uso de5 pg RNA, iniciadores aleatórios e Transcriptase ReversaSuperscript II (GIBCO BRL) . Os domínios variáveis foramclonados usando pools de iniciadores degenerados paradiferentes famílias de gene de VK ou VH murídeo. Osdomínios variáveis do hibridoma de G28-1 foram clonados emPCR 2.1 TOPO vetores de clonagem (Invitrogen) , e o DNA dostransformantes com insertos de tamanho correto foiseqüenciado. Regiões variáveis de cadeia pesada e leve declones corretos foram então usadas como modelos para arealização de amplificação por PCR de um G28-1 scFv unidona orientação VL-VH com um vinculador de 15 aa (gly4ser)3.
O scFv anti-CD37 foi anexado a uma dobradiça de IgGl humanamodificada, domínios de CH2 e CH3 (veja Figura IA) . A fimde assegurar a expressão adequada por células mamíferas,foram selecionadas modificações das regiões variáveis quepermitissem aumentos significativos na expressão porcélulas mamíferas. Especificamente, uma leucina foi trocadapor uma serina na posição 11 do scFV. O peptídeo maduroprevisto tem comprimento de 473 aminoácidos.
A seqüência de polinucleotídeos que codifica TRU-016 ea seqüência de aminoácidos de TRU-016 são apresentadas,respectivamente, nos IDS. DE SEQ. Nos: 1 e 2.
TRU-016 foi produzido por tecnologia de DNArecombinante em um sistema de expressão de célulasmamíferas de ovário de hamster chinês (CHO). As células CHOtransfectadas que produzem o SMIP foram cultivadas em umbiorreator com o uso de meios proprietários.
SMIPs de TRU-016 foram purificados dos sobrenadantesda cultura de CHO por cromatograf ia de afinidade porProteína A. Com o uso de dPBS, uma coluna de sefaroserProteína A FF de 5 0 ml (GE Healthcare rProtein A SepharoseFF, N0 de Catálogo 170974-04) foi equilibrada a 5,0 ml/min(150 cm/h) para 1,5 volume de coluna (CV) . 0 sobrenadanteda cultura foi carregado à coluna rProteína A Sefarose FFem uma taxa de fluxo de 1,7 ml/min usando o AKTA Explorer100 Air (GE healthcare AKTA Explorer 100 Air, N0 deCatálogo 18-1403-00), que captura o TRU-016 recombinante. Acoluna foi lavada com dPBS por 5 volumes de coluna (CV) , edepois 1,0 M de NaCl, 20 mM de fosfato de sódio, pH 6,0, edepois com 25 mM de NaCl, 25 mM de NaOAc, pH 5,0. Essasetapas de lavagem removeram as proteínas da célula CHOhospedeira ligadas inespecificamente da coluna de rProteínaA que contribuem para a precipitação de produto apóseluição.
0 TRU-016 recombinante foi eluído da coluna com 100 mMde glicina, pH 3,5. Frações de 10 ml do produto eluídoforam recuperadas, e o produto eluído foi então levado atéo pH 5,0 com 20% do volume eluído de 0,5 M de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) pH 6,0. Esse produto eluídofoi preparado para purificação de GPC por concentração daamostra até aproximadamente 25 mg/ml de TRU-016, e depoisesterilizado por filtração na preparação para a purificaçãode GPC.
A proteína purificada foi então submetida àcromatograf ia por exclusão de tamanho GPC (SEC) para seobter uma purificação adicional da molécula de TRU-016(dímero) de agregados de maior peso molecular. Com o uso dedPBS, uma coluna XK 50/100 (GE healthcare XK 50/100cromatografia em coluna vazia, N0 de Catálogo 18-8753-01)contendo 1 1 de Superdex 200 FF sefarose foi equilibrada a12,6 ml/min (38 cm/h) para 1,5 volume de coluna (CV) . Umvolume máximo de 54 ml (3% CV) de amostra foi aplicado àcoluna. A coluna continuou a ser executada a 12,6 ml/min, ea proteína eluída foi fracionada em frações de 40 ml. Cadafração foi analisada quanto à qualidade do produto com ouso de uma HPLC analítica, e as frações eluídas foramreunidas em pool para TRU-016 com >95% POI (não agregado) .Esse pool resultante foi esterilizado por filtração a 0,22um. O material foi então concentrado e formulado com 20 mMde fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pHresultante de 6,0. A composição é filtrada antes de serpreenchida em ampolas de vidro em uma concentração de 10mg/ml. Cada ampola de vidro contém 5 ml de TRU-016 (50mg/ampola).
A proteína de TRU-016 também foi submetida à análiseSDS-PAGE em géis Tris-glicina Novex 420% (Invitrogen, SanDiego, CA). As amostras foram carregadas usando tampão deamostra Tris-glicina SDS Novex (2X) sob condições redutoras(adição de 1/10 volume de agente redutor de amostra NuPAGE)ou não redutoras após aquecimento a 950C por 3 minutos,seguindo por eletroforese a 150 V por 90 minutos. Aeletroforese foi realizada com o uso de tampão de execuçãoTris-glicina SDS Novex IX (Invitrogen) . Os géis foramcorados após eletroforese em coloração Coomassie SDS PAGER-250 por 30 minutos com agitação, e descorados por pelomenos uma hora. 0 peso molecular previsto do peptídeomaduro é de 51,5 kDa. Sob condições redutoras, a proteínade fusão migra no peso molecular esperado. Sob condiçõesnão redutoras, a molécula migra em aproximadamente 150 kDa(Figura IB).
Também foram realizados experimentos para determinarse a especificidade de ligação do anticorpo original aoreceptor de superfície celular de CD37 está preservada emTRU-016. PBMCs humanas foram isoladas sobre gradientes dedensidade LSM, e incubadas com TRU-016 não conjugado e CDl9anti-humano conjugado a PE. As células foram lavadas eincubadas com IgG GAH 1:100 FITC (específica para Fc) por45 minutos no gelo. As células foram lavadas e analisadaspor citometria de fluxo bicolor em um instrumentoFACsCalibur usando o programa de computador Cell Quest. Ascélulas foram agrupadas em linfócitos B ou não linfócitos Bpor coloração de CD19.
Com concentrações crescentes de TRU-016, o sinal deFITC nos linfócito B (agrupamento CD19-positivo) aumentourapidamente de 0,01-1,0 pg/ml, até ter alcançado asaturação em aproximadamente 1 pg/ml ou uma intensidademédia de fluorescência (MFI) de 1.000. Em contraste, acoloração da população de não linfócitos B é detectável,mas muito baixa, e aumenta lentamente com concentraçãocrescente de scFvlg. Dessa forma, o padrão de coloração doanticorpo monoclonal G28-1 murídeo é preservado com TRU-016(Figura 1C).
As moléculas de ligação a CD3 7 de acordo com ainvenção descrevem estruturas (domínios de ligaçãoderivados de anticorpos, variantes de dobradiça, regiõesCH2CH3 iguais ou diferentes, e vários isótipos).
Exemplo 2
TRU-016 e vários anticorpos específicos para CD37 se ligamaos mesmos epitopos ou a epitopos superpostos em CD37Foram realizados experimentos para identificar oepitopo de CD37 ligado por TRU-016 e por outros anticorposdescritos previamente específicos para CD37.
MB371 não conjugado (n° 555457) e MB371 conjugado aFITC (n° 555456) foram obtidos de BD Pharmingen (San Jose,CA), BL14 conjugado a FITC (n° 0457) de Immunotech/BeckmanCoulter (Fullerton, CA), NMN46 conjugado a FITC (n° RDI-CBL136FT) e NMN46 não conjugado (n° RDI-CBL 136) de RDI(Flanders, NJ), IP024 conjugado a FITC (n° 186-040) e IP024não conjugado (n° 186-020) de Ancell Corporation (Bayport,MN) , HHl conjugado a FITC (n° 3081) e HHl não conjugado (n°3080) de Diatec.com (Oslo, Noruega) e WR17 conjugado a FITC(YSRTMCA4 8 3 F) e WRl 7 não conjugado (YSRTMCA4 8 3 S) deAccurate Chemical & Scientific (Westbury, NY) . A proteínade TRU-016 foi produzida como descrito no Exemplo 1.
TRU-016 foi conjugado a FITC em Trubion com o uso deum Kit "Molecular Probes Fluororeporter FITC Labeling"(F6434) de acordo com as instruções do fabricante daseguinte forma: o pico de interesse da proteína de TRU-016(POI) a 13,5 mg/ml foi ajustado até 5 mg/ml com PBS. Um mg(2 00 μΐ) foi adicionado aos tubos do kit com uma barra deagitação, e 1 M de NaHCO3 (ajustado até o pH 8,5 com 6 N deNaOH) foi adicionado até uma concentração final de 0,1 M.Foram adicionados 50 μΐ de DMSO a 370 pg de FITC, e foramadicionados aos tubos em proporções molares de 15, 20, 3 0 e40 de FITC: proteína com o uso da fórmula seguinte paradeterminar os μΐ de FITC a serem adicionados: [μΐ desolução de FITC a serem adicionados = 5 mg/ml de proteína χ0,2 ml χ 389 χ 100 χ proporção molar/peso moleculardesejado de TRU-016 (110.000)].
As reações eram protegidas da luz e agitadascontinuamente por 75 minutos em temperatura ambiente. Asreações foram adicionadas às colunas giratórias preparadascomo descrito no kit, e giradas a 1.100 g por 5 minutospara troca de tampão em PBS com azida e remoção do FITC nãoconjugado. A OD a 280 nM e 4 94 nM foi determinada com gotasde 2 μΐ no Nanodrop; o coeficiente de extinção para TRU-016foi determinado experimentalmente para esse instrumento porleitura de diluições do SMIP não conjugado de partida, aconcentração de cada um dos conjugados foi de 4,25 mg/ml, eforam determinadas as seguintes proporções FITC:proteína:2,7 FITC/TRU-016 em uma proporção de 15; 3,7 FITC/TRU-016em uma proporção de 20; 4,4 FITC/TRU-016 em uma proporçãode 30; e 5,1 FITC/TRU-016 em uma proporção de 40.
Foi adicionado BSA até 3 mg/ml para ajudar aestabilizar a proteína. A ligação de cada fração foiavaliada em diluições que variam de 100-24.300 χ em PBMCRamos e 3.200-25.600 em PBMC humana. Todas se ligaram, masa proporção MR3 0 foi escolhida para uso posterior, uma vezque gerou uma MFI elevada que foi mantida ao longo dointervalo de titulação usado, indicando que a avidez deligação era menos afetada nessa reação.
Os conjugados de anticorpo marcado por FITC foramtitulados de 10 ng/ml a 10 pg/ml em um estudo de ligaçãoinicial para determinar as quantidades ótimas para seremusadas nos estudos de bloqueio. 0 nível escolhido eraimediatamente abaixo das quantidades de saturação, e foimantido constante nos ensaios subseqüentes, enquanto osníveis de anticorpo de bloqueio foram aumentados em umintervalo de 10 vezes. Os dados foram colocados em umgráfico como percentual de ligação máxima versusconcentração de anticorpo de bloqueio, de forma que níveismaiores indicam bloqueio menos eficiente, enquanto níveismenores indicam atividade de bloqueio mais eficiente. Todosos anticorpos testados mostraram atividade de bloqueio daligação máxima observada sem reagentes não marcados (Figura 2) .
As células BJAB, uma linhagem de célula B delinfoblastóide B (cortesia de Ed Clark, Universidade deWashington), foram então coradas com um painel de váriosclones de MAbs anti-CD37, incluindo MB371, BL14, NMN4 6,ΙΡ024, HHl, WRl7 e ο SMIP de TRU-016.
Para ensaios de ligação competitiva, 2,5 X IO5 célulasBJAB foram incubadas em placas de 96 poços com fundo em "V"em meio de coloração (PBS com soros de camundongo 2%) comos MAbs anti-CD37 conjugados a FITC a 1,25 pg/ml napresença de MAb anti-CD37 não conjugado nas concentraçõesindicadas (2,5, 1,25, 0,6 ou 0,3 pg/ml) ou meio decoloração por 45 minutos no gelo no escuro. Anticorpos debloqueio e conjugados de anticorpo marcado por FITC foramadicionados às reações, antes da adição de células. Ascélulas foram então lavadas 2^ vezes com PBS, e fixadas comparaformaldeído 1% (n° 19943, USB, Cleveland, Ohio). Ascélulas foram analisadas por citometria de fluxo com o usode um instrumento FACsCalibur e o programa de computadorCell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA).
Para o ensaio de bloqueio cruzado de FACs, 2,5 X IO5células BJAB foram incubadas em placas de 96 poços comfundo em "V" em meio de coloração (PBS com soros decamundongo 2%) na presença de MAb anti-CD37 não conjugado a5 pg/ml de meio de coloração por 45 minutos em temperaturaambiente no escuro. MAbs anti-CD3 7 conjugados a FITC foramentão adicionados até uma concentração final de 2 pg/ml,resultando em uma diluição dos reagentes não rotulados até3,3 pg/ml. As reações foram então adicionalmente incubadaspor 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. Asreações foram lavadas 2,5 vezes com PBS, e fixadas emparaformaldeído 1% em PBS (n° 19943, USB, Cleveland, Ohio).As células foram analisadas por citometria de fluxo em uminstrumento FACsCalibur com o uso do programa de computadorCell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA) .Para ensaios de ligação celular, as células foramsuspensas em PBS (n° 14040133, Gibco/Invitrogen, GrandIsIand, NY) contendo FBS 2% (n°16140-071, Gibco/Invitrogen,Grand Island, NY) (meio de coloração) em uma concentraçãode aproximadamente 4 χ IO6 células/ml. As células foramentão plaqueadas, e amostras de teste, diluídas em meio decoloração, foram então adicionadas 1:1 até as concentraçõesfinais designadas. As reações foram incubadas por 45minutos no gelo. As amostras foram centrifugadas e lavadas2 vezes com PBS. IgG anti-humana de cabra com FITC (n°H10501,CalTag, Burlingame CA) foi adicionada em umadiluição final de 1:50, e incubada 45 minutos no gelo. Asamostras foram centrifugadas, lavadas em PBS, e depoisfixadas em 200 μΐ paraformaldeído 1% em PBS (n° 19943, USB,Cleveland, Ohio). As células foram analisadas porcitometria de fluxo em um instrumento FACs Calibur com ouso do programa de computador Cell Quest (BD Biosciences,San Jose, CA).
Cada anticorpo mostrou inibição dose-dependente daligação, indicando que todas as moléculas testadas seligaram a um epitopo idêntico ou intimamente relacionado.Uma potência diferente para inibição da ligação foiobservada para cada anticorpo. SMIP de TRU-016 teve o maiornível de atividade de bloqueio de todas as moléculastestadas, enquanto HHl gerou um nível intermediário deatividade de bloqueio, e WR17 e IP024 bloquearam melhor doque MB371, mas mostraram bloqueio menos eficaz do que asoutras duas moléculas não marcadas (Figura 2).
Além da análise da atividade de bloqueio, uma sériesimilar de experimentos foi realizada, nos quais váriosanticorpos dirigidos a CD37 foram testados quanto à suahabilidade para competir uns com os outros pela ligação aoreceptor CD37. Os resultados desses experimentos, como osresultados obtidos nos estudos de bloqueio para todas asmoléculas testadas, indicaram que os vários anticorposdirigidos a CD37 e TRU-016 possuem os mesmos epitopos ouepitopos intimamente superpostos.
Exemplo 3
TRU-016 é deficiente na ligação de Clq e ativação da viaclássica de ativação de complemento
Foram realizados experimentos para explorar por que opico de dímero de TRU-016 não medeia níveis significativosde morte dependente de complemento de células B-alvo. Umapossibilidade era que o dímero de TRU-016 mostra ligaçãoreduzida aos componentes da cascata do complemento emrelação ao anticorpo normal de IgGl humana. Dessa forma,foram feitos experimentos para determinar se TRU-016 ativaa via clássica de ativação de complemento verificando-se aligação de TRU-016 a Clq. Clq é uma subunidade do complexoenzimático Cl que ativa o sistema de complemento sérico, eé o componente de reconhecimento da via clássica deativação de complemento.
Os estudos de ligação de Clq foram realizados comodescrito previamente (Cragg e cols., Blood 2004, 103:2.738-2.743). Resumidamente, células B Ramos em meioIscoves (n° 12440-053, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY)sem soro foram plaqueadas em placas de 96 poços com fundoem "V" a 5 X IO5 células/poço em 100 μΐ. As células foramincubadas com reagentes por 15 minutos a 37 °C, e sorohumano normal (NHS, n° A113, Quidel Corp., San Diego, CA)diluído em Iscoves foi então adicionado em um volume de 50μl a cada poço para uma concentração final de 10, 5, 2,5,ou 1,25% de soro humano. Cinqüenta μl de meio foramadicionados ao poço de controle. Para experimentos comfator de veneno de cobra (CVF), CVF foi adicionado aamostras de complemento de soro humano a 20 Unidades CVF/mlde soro por 90 minutos a 37°C, antes da adição de soro aosensaios de complemento, e a diluição de soro por CVFocorria quando se faziam as diluições da amostra.
A fonte de células mais complemento foi incubada pormais 5 minutos a 37°C, e lavada 2 vezes com PBS gelado (n°14040-133, Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) através decentrifugação, e ressuspensa em 100 μΐ de PBS. Cinqüenta μΐde cada poço foram transferidos para uma segunda placa parauma segunda coloração de controle. Ambas as placas foramcoradas por 15 minutos no escuro no gelo, com anti-Clq HUde carneiro com FITC (n° C7850-06A, US Biological,Swampscott, Mass) ou IgG de carneiro com FITC (n° 11904-56P, US Biological, Swampscott, Mass). As amostras foramlavadas, ressuspensas em PBS gelado, e lidas imediatamenteem um citômetro de fluxo FACsCalibur e analisadas com oprograma de computador Cell Quest (Becton Dickinson, SanJose, CA).
FITC Clq não se liga bem a quaisquer subfrações deTRU-016 purificado por SEC, embora a fração agregada demaior peso molecular (HMW) ou A2 exiba mais ligação do queas outras formas (Figura 3A). Em contraste, Rituxan mostrouum nível significativo de ligação de Clq, particularmenteem níveis menores de NHS. A presença de CVF não bloqueoucompletamente essa ligação, embora os níveis de MFI estejamsignificativamente reduzidos comparados com meioisoladamente.
Foram então efetuados ensaios da CDC para comparar ahabilidade das diferentes subfrações das formas purificadasde TRU-016 e Rituxan para mediar a morte celular napresença ou ausência de CVF e complemento de soro humano(Figura 3B) . Os ensaios da CDC foram realizados com o usode coloração com iodeto de propidio para discriminar entrecélulas vivas e mortas após incubações de células-alvo comanticorpo, proteínas de fusão, líquido aseitico, formasmoleculares de TRU-016 ou meio, e uma fonte de complemento,por exemplo, soro humano. Resumidamente, 3 χ IO5 células BRamos foram pré-incubadas com reagentes de teste por 30-45minutos a 37°C, antes da adição de complemento. As amostraspré-ligadas foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas emIscoves com soro humano (n° A113, Quidel, San Diego, CA)nas concentrações indicadas, e depois incubadas por 90minutos a 37°C. As amostras foram lavadas e foi adicionadoiodeto de propidio (n° P-16063, Molecular Probes, Eugene,OR) até uma concentração final de 0,5 pg/ml em PBS. Ascélulas foram incubadas com o iodeto de propidio por 15minutos em temperatura ambiente no escuro, e depoisanalisadas por citometria de fluxo em um instrumentoFACsCalibur com o programa de computador Cell Quest (BectonDickinson).
A morte celular mediada tanto por fração A2 de TRU-016quanto por Rituxan foi significativamente reduzida napresença de CVF, apesar de seu fracasso em bloquearcompletamente a ligação de Clq (Figura 3B).
Complementos humano e de coelho foram então comparadosquanto à sua atividade de CDC na presença do TRU-016. Aatividade de CDC de formas moleculares de TRU-016 incubadascom células B Ramos e complemento humano ou de coelho foimedida (Figura 3C). Células B Ramos foram adicionadas aospoços em meio sem soro. Rituxan ou o dímero, HMW A2, ou asfrações pA de TRU-016, foram adicionados às células paragerar uma concentração final de 10 pg/ml, e incubados por15 minutos a 37°C, antes da lavagem com meio sem soro 1,5Xe adição de soro humano normal (NHS) ou complemento decoelho (Pelfreez) a 10, 5 ou 2,5%. A fonte de células maiscomplemento foi incubada por 90 minutos a 37°C. As célulasforam lavadas uma vez com PBS gelado, e foi adicionadoiodeto de propídio (Molecular Probes n°P3566) até umaconcentração final de 0,5 pg/ml em PBS gelado. As célulascom PI foram incubadas no escuro em temperatura ambientepor 15 minutos, e analisadas por citometria de fluxo.
A origem da fração do complemento afeta os resultadosde CDC obtidos (Figura 3C). 0 complemento de coelho mediouníveis de CDC maiores do que o complemento humano napresença de formas moleculares de TRU-016. Curiosamente, aforma dimérica do TRU-016 mediou boa CDC com o uso decomplemento de coelho, mas atividade de CDC muito baixa napresença de complemento humano.
Exemplo 4
Atividade e ligação de multímeros de TRU-016
Foram realizados experimentos para examinar aatividade biológica de formas multiméricas de TRU-016(multímeros de TRU-OÍ6) em solução. Inicialmente, paradeterminar o tamanho de proteína de fusão de TRU-016 emsolução, o material purificado por proteína A foi analisadopor SEC HPLC e revelou que TRU-016 existe em múltiplasformas em solução (Figura 4).
Foram obtidos traços de cromatografia por exclusão detamanho (SEC) HPLC de purificação de GPC de TRU-016,formando-se um gráfico de absorbância versus tempo deretenção para as diferentes frações coletadas (Figura 4).TRU-016 foi purificado a partir de sobrenadantes de culturade células inicialmente por cromatografia de afinidade como uso de Sefarose Proteína A. A molécula recombinante foieluída da coluna com 100 mM de glicina, pH 3,5. Frações de10 ml do produto eluído foram recuperadas, e o produtoeluído foi levado até o pH 5,0 com 20% do volume eluído de0,5 M de ácido 2- (N-Morfolino)etanossulfônico (MES), pH6,0. 0 eluído foi preparado para purificação de GPC porconcentração da amostra até aproximadamente 25 mg/ml deTRU-016, e depois esterilizado por filtração na preparaçãopara a purificação de GPC. A cromatografia por exclusão detamanho foi realizada em um aparelho GE Healthcare AKTAExplorer 100 Air, usando uma coluna GE healthcare XK eSuperdex 200 de grau preparatório (GE Healthcare).
Os pools de HMW ou A2 exibiram um tempo de retenção deaproximadamente 6,23 minutos, enquanto a forma maisproeminente exibiu um tempo de retenção de 8,38 minutos. 0padrão de referência utilizado aqui (padrão pA ou std) é omaterial purificado por proteína A contendo tanto as formasdiméricas quanto multiméricas HMW, como mostrado noprimeiro painel da Figura 4. A forma mais proeminente, quemigra em um tempo de retenção de 8,38 minutos, maisprovavelmente corresponde à molécula dimérica observada emSDS-PAGE não reduzida, e várias formas menores maisprovavelmente correspondem aos multímeros que se associamatravés de interações não covalentes, na medida em que sãomenos evidentes em SDS-PAGE não redutora. Para separaressas formas diferentes de TRU-016, o material obtido dacromatografia de afinidade com proteína A sefarose dossobrenadantes da cultura foi adicionalmente purificado porGPC e fracionamento por HPLC para isolar a forma dimérica(identificada como "dímeros" ou "pico de dímeros") dosmultímeros de peso molecular mais elevado (identificadoscomo HMW ou fração A2 agg). Cada uma dessas três subfraçõesfoi então analisada separadamente quanto à atividadefuncional in vitro com o uso de ensaios de ligação, da ADCCe da CDC.
Para explorar se as frações isoladas de SEC exibiamdiferentes propriedades de ligação, cada fração de TRU-016SEC foi testada quanto à ligação a células Ramos. Paradeterminar as propriedades de ligação de frações de SEC, ascélulas foram suspensas em meio de coloração em umaconcentração de aproximadamente 4 χ IO6 células/ml, edepois plaqueadas a 50 μΐ/poço (2 χ IO5 células/poço) emmeio de coloração. Diluições seriais de frações de SECforam então adicionadas aos poços seqüenciais, incubadaspor 45 minutos, lavadas, e a atividade de ligação foidetectada com a utilização de IgG anti-humana de cabra comFITC. As amostras foram fixadas em 200 μΐ deparaformaldeído 1% em PBS. As células foram analisadas porcitometria de fluxo em um instrumento FACsCalibur com o usodo programa de computador Cell Quest (BD Biosciences, SanJose, CA) (Figura 5A).
Para determinar a atividade de CDC de frações de SEC,as células foram suspensas a 5 χ IO5 células/poço em 75 μΐde IMDM. As frações de SEC de TRU-016 (75 μΐ) foramadicionadas às células no dobro das concentraçõesindicadas. Foi permitido que as reações de ligaçãoprosseguissem por 45 minutos, antes da centrifugação elavagem em Iscoves sem soro. As células foram ressuspensasem Iscoves com soro humano (n° A113, Quidel, San Diego, CA)nas concentrações indicadas. As células foram incubadas por60 minutos a 37°C, lavadas e ressuspensas em meio decoloração com 0,5 pg/ml de iodeto de propídio (PI, n° P-16063, Molecular Probes, Eugene 0R) . As amostras foramincubadas 15 minutos em temperatura ambiente no escuro,antes da análise por citometria de fluxo com o uso de uminstrumento FACsCalibur e do programa de computador CellQuest (Becton Dickinson) (Figura 5B).
Para determinar a atividade de ADCC de frações de SEC,células BJAB, Ramos e linfoblastõides B Daudi (IO7) forammarcadas com 500 pCi/ml de 51Cr cromato de sódio por 2horas a 37°C em IMDM/FBS 10%. PBMCs foram isoladas desangue humano total heparinizado por fracionamento sobreMeio de Separação de Linfócitos (LSM, ICN Biomedical)gradientes. Foram adicionadas amostras de reagente ao meioRPMI com FBS 10%, e foram preparadas cinco diluiçõesseriais para cada reagente. Para combinações, os reagentesforam pré-misturados e diluídos, antes da adição aos poços.As BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas a (2 χ IO4células/poço). As PBMCs foram então adicionados a (5 χ IO5células/poço) para uma proporção final de 25:1 de efetores(PBMC):alvos (BJAB). As reações foram preparadas em poçosem quadruplicata de uma placa de 96 poços. As frações deSEC de TRU-016 foram adicionadas aos poços em umaconcentração final que varia de 10 ng/ml to 20 pg/ml, comoindicado nos gráficos. Cada série de dados mostra umafração de SEC diferente nas faixas de titulação descritas.
Foi permitido que as reações prosseguissem por 6 horas a370C em CO2 5%, antes da coleta e contagem. A CPM liberadafoi medida em um Packard TopCounNXT de 50 μΐ desobrenadante de cultura seco. 0 percentual de morteespecífica foi calculado subtraindo-se (cpm [média deamostras em quadruplicata] da amostra - cpm liberaçãoespontânea)/ (cpm liberação máxima - cpm liberaçãoespontânea) χ 100 (Figura 5C).
A Figura 5A mostra as curvas de titulação da ligaçãode diferentes frações de SEC às células Ramos. Todas asmoléculas fracionadas ligaram-se a CD37 com curvas deligação similares, exceto nas maiores concentraçõestestadas, em que o material HMW exibiu melhor ligação(maior intensidade de fluorescência) do que o padrão pA eas formas de pico de dímero.
Também foram realizados experimentos para determinarse as frações de SEC de TRU-016 exibiam níveis diferentesde atividade funcional, por exemplo, morte de célula-alvomediada por CDC e ADCC. 0 gráfico mostrado na Figura 5Bindica que apenas a fração purificada de multímero HMWmediou níveis significativos de atividade de CDC contracélulas B Ramos com o uso de complemento humano. 0 padrãopA exibiu alguma atividade de CDC em concentrações maiores,enquanto a forma de pico de dímero mostrou muito pouca ounenhuma atividade de CDC em todas as concentraçõestestadas.Foram realizados ensaios da ADCC em diluições seriaisde frações de TRU-016 de vários tamanhos usando células BBJAB marcadas como alvos e PBMC humana como célulasefetoras. As frações de SEC de TRU-016 estavam presentesnos poços em uma concentração final que varia de 10 ng/mlto 20 pg/ml, como indicado no gráfico mostrado na Figura5C. Cada série de dados mostrava uma fração de SECdiferente nas faixas de titulação descritas. Os dados foramcolocados em um gráfico como % de morte específica versusconcentração de proteína. Todas as subfrações de SEC,incluindo o padrão pA, fração HMW ou A2 e o pico de dímero,mediaram ADCC potente, dose-dependente, contra célulasBJAB-alvo. Resultados similares também foram obtidos com ouso de células Ramos como alvos marcados (dados não mostrados).
Exemplo 5
Produção de uma molécula de ligação específica para CD20
SMIPs específicos para CD20 são descritos nasPublicações de Patente U.S. de co-propriedade 2003/133939,2003/0118592 e 2005/0136049. A produção de um SMIPespecífico para CD20 exemplar, TRU-015, é descrita abaixo.
TRU-015 é uma proteína de cadeia única recombinante(murídea/humana) que se liga ao antígeno CD20. 0 domínio deligação foi baseado em uma seqüência de anticorpo CD20humano disponível publicamente. 0 domínio de ligação estáconectado ao domínio efetor, os domínios CH2 e CH3 de IgGlhumana, através de uma região de dobradiça CSS modificada.TRU-015 existe como um dímero em solução, e o dímero tem umpeso molecular teórico de aproximadamente 106.000 dáltons.A seqüência de nucleotídeos que codifica TRU-015 e aseqüência de aminoácidos de TRU-015 são apresentadas,respectivamente, nos IDS. DE SEQ. Nos: 3 e 4.
Em relação à seqüência de aminoácidos apresentada noID. DE SEQ. N°: 4, TRU-015 compreende a seqüência declonagem do peptideo-líder 2el2 dos aminoácidos 1-23; a 2H7região variável da cadeia leve de CD20 murídea anti-humanacom uma substituição aminoácidos de lisina para serina(VHLllS) no resíduo 11 na região variável, que é refletidana posição 34; um vinculador asp-gly3-ser-(gly4ser)2 quecomeça no resíduo 129, com o vinculador tendo uma serinaadicional na extremidade para incorporar o sítio derestrição SacI para embaralhamento do cassete; a regiãovariável da cadeia pesada de CD20 murídea anti-humana 2H7,que não possui um resíduo de serina na extremidade daregião da cadeia pesada, ou seja, alterada de VTVSS paraVTVS; um domínio de Fc de IgGl humana, incluindo uma regiãode dobradiça modificada que compreende uma seqüência (CSS) ,e domínios CH2 e CH3 do tipo selvagem.
As células CHO que produzem TRU-015 foram cultivadasem um biorreator com o uso de meios proprietários. TRU-015foi purificado com o uso de uma série de etapas decromatografia e filtração, incluindo um filtro de reduçãode vírus. O material foi então concentrado e formulado com20 mM de fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pHresultante de 6,0. A composição é filtrada antes de serpreenchida em ampolas de vidro em uma concentração de 10mg/ml. Cada ampola de vidro continha 5 ml de TRU-015 (50mg/ampola).
Exemplo 6
Combinações de TRU-016 com TRU-015 ou Ritiixanalimentam sinergicamente a apoptose em células B
Foram efetuados experimentos que examinam o efeito deSMIPS dirigidos às células B sobre a apoptose da linhagemde células B. Cada SMIP foi testado individualmente, edepois em combinação. As amostras foram analisadas 24 e 48horas após o início das reações de incubação. A análise deanexina/PI foi realizada da seguinte forma: células BJAB(cortesia de Ed Clark, Universidade de Washington), célulasRamos (ATCC n° CRL-1596) e células Daudi foram incubadas 24ou 48 horas a 37°C em 5% CO2 em meio Iscoves completo(Gibco) com FBS 10% a 3 X 10^5 células/ml e 20 pg/ml deproteína de SMIP. Além disso, 20 pg/ml IgG de cabra anti-humana foram adicionados às reações a fim de entrecruzar osreagentes na superfície celular. As células foram entãocoradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio usando o"BD Pharmigen Apoptose Detection Kit I" (n° 556547), eprocessadas de acordo com as instruções do kit.Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBSgelado, e ressuspensas em "tampão de ligação" a 1 X IO6células/ml. Cem microlitros das células em tampão deligação foram então corados com 5 μΐ de anexina V-FITC e 5μl de iodeto de propídio. As células foram gentilmenteturbilhonadas e incubadas no escuro em temperatura ambientepor 15 minutos. Quatrocentos microlitros do tampão deligação foram então adicionados a cada amostra. Elas foramentão lidas e analisadas em um instrumento FACsCalibur(Becton Dickinson) com o uso do programa de computador CellQuest (Becton Dickinson).
A Tabela 2 abaixo mostra que, na presença deentrecruzamento, o tratamento com TRU-016 teve um efeitomais significativo sobre a apoptose de linhagens celularesdo que TRU-015 isoladamente, embora ambas as moléculas,quando usadas isoladamente, induzem alguma apoptose. 0aumento varia, dependo da linhagem celular.
TABELA 2
<table>table see original document page 100</column></row><table>
Exemplo 7
Combinações de TRU-016 com anticorpos ou SMIPs específicospara CD20 aumentam sinergicamente a CDC
Foram realizados experimentos para determinar aatividade de CDC de combinações de TRU-016 com anticorposespecíficos para CD20 ou SMIPS contra células Β. Aquantidade de reagentes escolhida para os experimentos decombinação foi de 0,5 pg/ml de TRU-016, enquanto a de TRU-015 também foi de 0,5 pg/ml. A concentração de rituxan foinormalmente de 0,04-0,06 pg/ml, por causa de sua maioratividade em experimentos de CDC de reagente único. Emalguns experimentos, a concentração de reagente CD20 foimantida constante em uma concentração subótima, enquanto aconcentração de TRU-016 era variada para explorar os níveismínimos de reagente dirigido a CD37 necessários paraobservar o aumento dos efeitos sobre a CDC.
As células foram suspensas em Iscoves (n° 12440-053,Gibco/Invitrogen, Grand Island, NY) a 5 χ IO5 células/poçoem 75 μΐ. TRU-016 (75 μΐ) , TRU-015, rituxan ou combinaçõesdesses reagentes foram adicionadas às células no dobro dasconcentrações indicadas. Foi permitido que as reações deligação prosseguissem por 45 minutos, antes dacentrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As célulasforam ressuspensas em Iscoves com soro humano (n° A113,Quidel, San Diego, CA) nas concentrações indicadas. Ascélulas foram incubadas por 60 minutos a 37°C. As célulasforam lavadas por centrifugação e ressuspensas em 125 μΐ dePBS com FBS 2% (n° 1614 0-071, Gibco, Invitrogen, GrandIsland, NY), meio de coloração. As células foramtransferidas para tubos agrupados de FACS (n° 4410, CoStar,Corning, NY) e 125 μΐ de meio de coloração com 5 μΐ deiodeto de propídio (PI, n°P-16063, Molecular Probes, EugeneOR) foram adicionados. As amostras foram incubadas por 15minutos em temperatura ambiente no escuro, antes da análisepor citometria de fluxo com o uso de um instrumentoFACsCalibur e do programa de computador CellQuest (BectonDickinson).
A Figura 6 mostra que, em concentrações subótimas paraa morte como agente único, TRU-015 e rituxan exibiramníveis maiores de atividade de CDC quando combinados comTRU-016. TRU-016 isoladamente não mediou CDC, a menos queestejam presentes agregados. A eliminação de Clq dasreações causa a eliminação de toda a atividade de CDCobservada.
A Figura 7 mostra um experimento de combinaçãorealizado em células B DHL-4. A adição de TRU-016 àsreações de CDC produz uma mudança para baixo na curva demorte por TRU-015, demonstrando morte mais eficaz em cadaconcentração testada, embora TRU-016 exiba pouca ou nenhumaatividade isoladamente.
A Figura 8 mostra outro experimento de CDC no qual osreagentes da amostra foram misturados nas seguintesproporções: 0,5 pg/ml de TRU-015, 0,5 pg/ml de TRU-016 e0,06 pg/ml de rituxan. Novamente, os agentes únicos sãousados em concentrações subótimas a fim de observar osfeitos de aumento na presença de TRU-016. Tanto para TRU-015 quanto para rituxan, TRU-016 aumenta o nível de mortepor CDC quando adicionado aos ensaios.
As Figuras 9 e 10 mostram representações gráficas dosdados para os ensaios da CDC nos quais a concentração deTRU-015 ou rituxan foi mantida constante, e a concentraçãode TRU-016 foi aumentada. Novamente, a atividade de CDC foimaior quando TRU-016 foi adicionado às reações, mas oaumento da concentração de TRU-016 até 2,5 pg/ml a partirde 0,5 pg/ml não aumenta significativamente a morte mediadapor CDC nesses experimentos.
Exemplo 8
TRU-016 aumenta a atividade de ADCC e CDC de anticorpos eSMIPs específicos para CD20
Foram realizados experimentos para determinar secombinações de TRU-016 SMIP com anticorpos específicos paraCD20 ou SMIPs poderiam aumentar a atividade de ADCC e deCDC contra células B-alvo.
Células BJAB Ramos e células linfoblastóides B Daudi(10E7) foram marcadas com 500 pCi/ml de 51Cr cromato desódio por 2 horas a 37°C em IMDM/FBS 10%. As células BJABmarcadas foram lavadas três vezes em RPMI/FBS 10% eressuspensas a 4 χ IO5 células/ml em RPMI. Sangue humanototal heparinizado foi obtido de doadores internadosanônimos e as PBMCs isoladas por fracionamento sobregradientes de Meio de Separação de Linfócitos (LSM, ICNBiomedical). As camadas de células brancas foram coletadase lavadas duas vezes em RPMI/FBS 10%, antes da ressuspensãoem RPMI/FBS 10% em uma concentração final de 3 χ 10E6células/ml. As células foram contadas por exclusão de azultripano usando um hemocitômetro antes de serem utilizadasem ensaios subseqüentes. Foram adicionadas amostras dereagente ao meio RPMI com FBS 10% a 4 vezes a concentraçãofinal, e foram preparadas cinco diluições seriais para cadareagente. Para as combinações, os reagentes foram pré-misturados e diluídos, antes da adição aos poços. Essesreagentes foram então adicionados a placas de 96 poços comfundo em "U" a 50 μΐ/poço para as concentrações finaisindicadas. As células BJAB marcadas com 51Cr foramadicionadas às placas a 50 μΐ/ροςο (2 χ 10E4 células/poço).As PBMCs foram então adicionadas às placas a 100 μΐ/poço (3χ 10E5 células/poço) para uma proporção final de 15:1 deefetores (PBMC) raivo (BJAB).
Os efetores e os alvos foram adicionados ao meioisoladamente para medir a morte de fundo. As células BJABmarcadas com 51Cr foram adicionadas ao meio isoladamentepara medir a liberação espontânea de 51Cr e ao meio comNP40 5% (n° 28324, Pierce, Rockford, IL) para medir aliberação máxima de 51Cr. As reações foram preparadas empoços em quadruplicata em uma placa de 96 poços. SMIPsforam adicionadas aos poços em uma concentração final quevaria de 12 ng/ml a 10 pg/ml, como indicado nos gráficos.
Para combinações de SMIP, os reagentes foram misturadosantes da adição aos poços. Cada série de dados representaum único SMIP diferente ou a combinação nas faixas detitulação descritas. Foi permitido que as reaçõesprosseguissem por 6 horas a 37°C em CO2 5%, antes da coletae contagem. Cinqüenta μΐ do sobrenadante de cada poço foramentão transferidos para uma Placa Luma 96 (n° 6006633,Perkin Elmer, Boston, Mass) e secos de um dia para o outroem temperatura ambiente. A CPM liberada foi medida em umPackard TopCounNXT. O percentual de morte específica foicalculado subtraindo-se (cpm {média de amostras emquadruplicata} da amostra - cpm liberação espontânea)/(cpmliberação máxima-cpm liberação espontânea) χ 100.
Os dados foram colocados em um gráfico como % de morteespecífica versus concentração de SMIP. A proporção deefetor para alvo é indicada em cada figura, e a linhagem decélula-alvo também foi indicada. As Figuras 11, 12 e 13mostram dados para experimentos em diferentes linhagenscelulares (BJAB, Daudi e Ramos) nos quais foi utilizado omesmo doador.
Nas Figuras 14 e 15 (rituxan + TRU-016) e nas Figuras16 e 17 (TRU-015 + TRU-016), são apresentados os dados paraexperimentos nos quais a linhagem de célula-alvo usada foiBJAB. A morte específica observada para cada combinação foimaior do que com um reagente único isoladamente na mesmaconcentração, indicando que os SMIPs dirigidos a CD20 eCD3 7 aumentam a morte mediada pelo outro, embora o efeitode aumento não seja completamente aditivo.
Dessa forma, TRU-016 pode aumentar a morte por ADCC decélulas B mediada por SMIP específico para CD2 0 ouanticorpo específico para CD20.
Foram projetados experimentos iniciais para exploraros efeitos de combinações de TRU-016 com anticorposdirigidos a CD20 para determinar as quantidades relativasde cada reagente a serem usadas de forma que a sinergia deCDC possa ser detectável. Células Ramos foram suspensas emIMDM, e TRU-016, Rituxan ou combinações desses reagentesforam adicionadas às células até as concentrações finaisindicadas na Figura 18. Foi permitido que as reações deligação prosseguissem por 45 minutos, antes dacentrifugação e lavagem em Iscoves sem soro. As célulasforam ressuspensas em Iscoves com 10% NHS. As células foramincubadas por 60 minutos a 37°C. Nos experimentos mostradosna Figura 18A-C, as células foram lavadas porcentrifugação, e ressuspensas em meio de coloração contendo0,5 pg/ml de iodeto de propídio (PI, n°P-16063, MolecularProbes, Eugene 0R). As amostras foram incubadas por 15minutos em temperatura ambiente no escuro, antes da análisepor citometria de fluxo com o uso de um instrumentoFACsCalibur e do programa de computador Cell Quest (BectonDickinson).
0 pico de dímero de TRU-016 mais altamente purificadoé um mediador pobre da CDC quando usado isoladamente, comomostrado na Figura 18A pela curva de dose-resposta plana,até mesmo em concentrações elevadas. Como os reagentesdirigidos a CD20 foram indutores eficientes da atividade deCDC, eram desejáveis quantidades não saturantes dosreagentes dirigidos a CD20 em experimentos de combinação,de tal forma que a sinergia entre os reagentes pudesse serdetectada. A partir desses estudos iniciais, a quantidadenormal de reagente escolhida para os experimentos decombinação foi de 0,5 pg/ml ou 2 pg/ml de TRU-016. Aconcentração de Rituxan foi normalmente de 0,04-0,06 pg/ml,por causa de sua atividade maior em experimentos de CDC dereagente único. Em alguns experimentos, a concentração dereagente CD20 foi mantida constante em uma concentraçãosubótima, enquanto a concentração de TRU-016 foi variadapara explorar os níveis mínimos de reagente dirigido a CD37necessários para observar efeitos de aumento sobre a CDC.Dessa forma, TRU-016 isoladamente não medeia CDC, a menosque estejam presentes agregados.
A Figura 18B mostra um gráfico da percentagem decélulas vivas (PI-negativas) observada ao longo da faixa detitulação indicada (0,06-0,5 pg/ml) quando Rituxan é usadoisoladamente ou em combinação com TRU-016 a 2,5 pg/ml.Rituxan, quando usado em uma faixa de doses subótimas paramorte como agente único, exibe níveis maiores de atividadede CDC EM cada concentração quando combinado com TRU-016(Figura 18B) . A eliminação de Clq das reações causa aeliminação de toda a atividade de CDC observada (Figura3B).
Na Figura 18C, as amostras também foram incubadas comFITC anti-Clq por 45 minutos no gelo, antes da análise porcitometria de fluxo. A separação de linfócitos ocorreu emcélulas comprometidas. A percentagem de células nessaseparação aumentava com concentrações crescentes deRituxan, e a MFI relativa para essa população de célulasfoi colocada em um gráfico. A Figura 18C mostra osresultados de um experimento de CDC em que os reagentes daamostra foram misturados nas seguintes proporções: 0,5pg/ml para TRU-016, e concentrações de Rituxan que variamde 0,06 pg/ml a 0,5 pg/ml, e as células foram coradas comPI antes da citometria de fluxo. Os resultados mostram umaumento dose-dependente da MFI com doses crescentes deRituxan. A adição de formas diméricas de TRU-016 resultouem um aumento adicional da MFI em cada concentração deRituxan. Uma série similar de ensaios da CDC foi realizada,mantendo a concentração de Rituxan constante e aumentando aconcentração de TRU-016. Novamente, a atividade de CDC foimaior quando TRU-016 foi adicionada às reações de Rituxan,mas o aumento da concentração de TRU-016 até 2,5 pg/ml apartir de 0,5 pg/ml não aumentou significativamente a mortemediada por CDC nesses experimentos (dados não mostrados).
Rituxan e as proteínas de TRU-016 usados isoladamentee em combinação entre eles foram comparados quanto à suaatividade de ADCC in vitro com o uso de uma faixa deconcentração similar à usada para os ensaios da CDC. AFigura 18D mostra os resultados de um ensaio da ADCC comcélulas Ramos marcadas como alvo e células PBMC humanascomo efetoras em uma proporção efetorralvo de 25:1, usandoTRU-016 ou Rituxan, isoladamente e em combinação entre siao longo das faixas de concentração indicadas. Foramobtidos dados similares em uma proporção efetor:alvo de12,5:1. Tanto a forma dimérica de TRU-016 quanto Rituxanmedeiam níveis significativos de ADCC contra células Ramosque expressam os antigenos-alvo CD20 e CD37; no entanto, acombinação dos dois reagentes não resulta em aumentosignificativo do nível de morte.
Exemplo 9
TRU-016 induz apoptose em células B
Foram feitos experimentos que examinam o efeito deTRU-016 sobre a apoptose da linhagem de células B. Osensaios iniciais dos efeitos sobre a apoptose de moléculasde TRU-016 dirigidas a diferentes receptores de célula Bforam realizados com o uso de material purificado porproteína A que ainda continham agregados de ordem superior.
Após tratamento de 24 horas com anticorpos CD37 oumoléculas projetadas de TRU-016, foram observados padrõessimilares de apoptose aumentada em vários experimentos como uso de percentagens de células positivas para anexina Vcomo uma medida da atividade aptotótica, e tanto célulasRamos quanto células BJAB como alvos de ligação (dados nãomostrados).
A Figura 19A demonstra que a apoptose ésignificativamente aumentada após incubação de linhagens decélulas B com TRU-016 não fracionado. A Figura 19A mostraum dot plot de coloração com anexina V-PI de células Ramosapós incubação for 24 horas com o TRU-016 (10 pg/ml) . O %de células anexina V-PI duplamente positivas aumentou de11,3% da população total para 32,8%, e o % de célulasanexina V positive-PI-negativas aumentou de 8,5% para19,7%, indicando que a apoptose é induzida após exposição aTRU-016. Foram obtidos dados similares com o uso células deRamos ou BJAB como alvos de ligação nesses ensaios.
Foram realizados experimentos adicionais que examinamo efeito de TRU-016 sobre a apoptose da linhagem de célulasB com o uso da forma dimérica mais altamente purificada deTRU-016 (Figura 19B). As amostras foram analisadas tanto em24 e 48 horas após o início das reações de incubação. Aanálise de anexina/PI foi efetuada em vários tipos decélulas com a utilização de 20 pg/ml de proteína de TRU-016. Como a apoptose era reduzida com o uso da formadimérica de TRU-016, 20 pg/ml de IgG anti-humana de cabraforam adicionados às reações a fim de entrecruzar osreagentes na superfície celular. As células foram entãocoradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio. Os dadosmostrados na Figura 19B demonstram que o pico de dímero deTRU-016 induz apoptose de células Daudi após 24-48 horas,mas que a presença de um agente de entrecruzamento, porexemplo, IgG anti-humana, resulta em uma aumentosignificativo do nível de apoptose dirigida a CD37.
Também foram realizados experimentos para determinar oefeito de TRU-016 sobre células B humanas normais emcultura com o uso de PBMCs humanas. As Figuras 20A e 20Bmostram resultados de um desses experimentos, com gráficosde coluna da percentagem de linfócitos CD19- ou CD40-positivos (células B) presente em culturas de PBMCstratadas por 48-72 horas somente com meio, TRU-016 ouRituxan.
As PBMCs humanas foram isoladas de sangue total porcentrifugação de densidade LSM. As células foram incubadaspor 48 ou 72 horas com 1 μg/ml de Rituxan ou TRU-016. Umaporção da reação de incubação foi coletada em 4 8 horas enovamente em 72 horas após inicio do experimento. As PBMCsforam lavadas e incubadas com FITC anti-CD19, FITC anti-CD4 0 ou FITC anti-CD3 por 45 minutos no gelo. A percentagemtotal de linfócitos que coram com esses reagentes foi entãotabulada e comparada com amostras de PBMCs incubadas sobcondições similares, mas sem reagentes de teste, e coradascomo as amostras tratadas. As Figuras 20A e B mostramgráficos de colunas da fração da população total delinfócitos (%) que gerou um sinal FACS positivo após 4 8 e72 horas com os reagentes indicados. A Figura 20C mostra umgráfico composto de um experimento similar, que mostra aredução percentual a partir do número original delinfócitos que expressam o antígeno CD indicado (ou seja,CDl 9, CD4 0 ou CD3-positivos) após incubação de PBMCs comTRU-016 (a 1 pg/ml) por 24 e 72 horas.
Na presença de entrecruzamento, o tratamento com aforma dimérica de TRU-016 ou Rituxan resultou em umaredução na percentagem de linfócitos B em culturas de PBMCsmedida PR coloração positiva para CD19 e CD40. Embora apercentagem de linfócitos B em cultura fosse baixa noinício do experimento, a co-cultura com Rituxan ou TRU-016diminuiu o número de linfócitos CD19 e CD4 0-positivos nacultura de PBMCs em aproximadamente 1,5-2 vezes após 4 8horas, e em mais de 3 vezes após 72 horas. Esse padrãogeral de eliminação de células B após 48-72 horas erareprodutível em todas as culturas de PBMCs normaistestadas, independentemente da percentagem de partidainicial de linfócitos B nessas culturas, que variou deaproximadamente 3% alcançando até 7% dos linfócitos totais,dependendo da amostra.
A Figura 2OC mostra um gráfico de colunas dapercentagem de eliminação de linfócitos B, comparada comlinfócitos T em culturas de PBMCs de curto prazo incubadascom TRU-016 por 24 a 72 horas. Esses dados indicam que oTRU-016 é capaz de eliminação especifica de linfócitos BCD37-positivos de culturas do sangue periférico normal, eque o nivel baixo de ligação por TRU-016 a não linfócitos B(Figura 1C) é insuficiente para mediar eliminaçãosignificativa desses linfócitos da população de células.
Exemplo 10
Combinações de TRU-016 e rituximab reduzemsignificativamente o volume tumoral em um modelo murídeo dexenoenxerto tumorais
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral emcamundongo que exploram terapias de combinação com o uso decamundongos atímicos (nude) (Harlan) e linhagens tumoraishumanas Ramos ou Daudi. Células tumorais Ramos ou Daudicresceram em ampolas T150 em IMDM/FBS 10% até quealcançassem 80% de confluência. Foram usados cinco milhões(5 χ 10^6) de células como inóculo tumoral por camundongo.As células foram injetadas subcutaneamente no flançodireito usando PBS em um volume total de 0,1 ml ou 5,0 χ107/ml. Foi permitido que os camundongos atímicosdesenvolvessem os tumores, e eles foram divididos em gruposcom base no tamanho/volume do tumor. Para cada grupo detratamento, foram usados 12 camundongos com um volumetumoral médio de aproximadamente 222 mm3 (variação = 152-296 mm3). Alguns volumes tumorais médios que variam de 237-251 mm3 também foram utilizados. Os animais foram injetadospor via intravenosa (IV) nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 com um dosseguintes reagentes: TRU-016 GPC POI (pico de interesse),200 pg/camundongo; rituxan, 200 pg/camundongo ou IgG humana(controle) a 200 ou 400 pg/camundongo como reagentesúnicos, ou como as seguintes combinações de reagentes:Rituxan + TRU-016 a 100 pg de cada por camundongo; ouRituxan + TRU-016 a 200 pg de cada por camundongo. 0 volumetumoral foi medido diariamente com compassos até o términodo experimento (sacrifício ou regressão). Foi feito umgráfico do volume tumoral em função do tempo de tratamentopara cada animal, e também foram calculados os resultadosmédios dentro de cada grupo.
Também foram feitos estudos similares com a utilizaçãode tumores menores, com os camundongos divididos em gruposcom volume tumoral médio menor que varia entre 153-158 mm3,e com tumores maiores, mas com o uso de células Daudi aoinvés de células Ramos. Esses estudos foram realizados nasinstalações para animais aprovada pela AAALAC e o programade uso dos animais de acordo com as diretrizes de um"Institutional Animal Care and Use Committee" (IACUC).
A Figura 21 mostra gráficos da eficácia de TRU-016comparado com hulgG, rituxan e as combinações a 100 pg e200 pg de cada média em cada grupo de 12 animais. Foi feitoum gráfico do volume tumoral em função do tempo apóstratamento com a(s) injeção (injeções) IV. 0 volume tumoralmédio após tratamento com TRU-016 foi menor do que aqueleobservado com o uso do controle negativo (hulgG). Quando secolocou em um gráfico o % de sobrevida ou o % de animaissem tumor, a terapia de combinação de dose maior exibiu amaior atividade antitumoral nesse modelo de tumor in vivo.No entanto, na dose menor (100 pg de cada) , a terapia decombinação não foi tão eficaz quanto cada reagente único emuma dose maior.
Esses dados indicam que a terapia com TRU-016, quandousada em combinação com rituxan nas doses apropriadas, terámaior eficácia no tratamento dos tumores do paciente do quea terapia de rituxan isoladamente.
Exemplo 11
TRU-016 reduz o volume tumoral e aumenta a sobrevida em ummodelo de xenoenxerto tumoral murídeo
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral decamundongo com o uso de camundongos atímicos (Harlan) elinhagens tumorais humanas Ramos ou Daudi. Foram feitostrês estudos diferentes com base no tipo de tumor e tamanhodo tumor no momento do tratamento com o TRU-016 ou comoutro reagente de teste. Células tumorais Ramos ou Daudicresceram até 5 χ IO6 células, e foram injetadassubcutaneamente no flanco direito para inocular cadacamundongo tratado com o tumor. Foi permitido que oscamundongos atímicos desenvolvessem os tumores, e elesforam divididos em grupos com base no tamanho/volume dotumor. No primeiro estudo, para cada grupo de tratamento,foram utilizados 12 camundongos com um volume tumoral médiode 155-237 mm3. Os animais foram injetados por viaintravenosa (IV) nos dias 0, 2, 4 6, e 8 com um dosseguintes reagentes: Rituximab, 200 pg/camundongo; pico dedimero de TRU-016 GPC, 200 pg/camundongo; ou IgG humana(controle), 4 00 pg/camundongo. 0 volume tumoral foi medidodiariamente com compassos até o término do experimento(sacrifício ou regressão). Foi feito um gráfico do volumetumoral em função do tempo de tratamento para cada animal,e também foram calculados os resultados médios dentro decada grupo. As médias dos grupos são mostradas na Figura22A, enquanto a Figura 22B mostra uma comparação dos dadosde percentual de sobrevida para cada grupo de camundongosem função do tempo.
A Figura 22A mostra a eficácia de TRU-016 comparadocom hulgG e Rituxan no modelo tumoral Ramos, com média aolongo de cada grupo de 12 animais. Foi feito um gráfico dovolume tumoral em função do tempo após tratamento com a(s)injeção (injeções) IV. O volume tumoral médio apóstratamento com o TRU-016 foi menor do que aquele observadocom o uso do controle negativo (hulgG). A Figura 22B mostraum gráfico das curvas de sobrevida para os diferentesgrupos de tratamento, comparando hulgG, Rituxan e TRU-016.
A administração de TRU-016, utilizando o modelo tumoralRamos mais exigente com volume tumoral de base aumentado,resultou em uma inibição da taxa de crescimento tumoral emrelação à IgG humana (dados não mostrados). A administraçãode TRU-016 aos camundongos com os tumores Ramos menoresresultou tanto na inibição do crescimento tumoral quantonos aumento dos tempos médios de sobrevida.
Exemplo 12TRU-016 não afeta a atividade de CDC de outros receptoresde superfície de células B
Para determinar se a molécula de TRU-016 aumenta onível de atividade de CDC que resulta do tratamento comanticorpos para outros receptores de superfície de célulasB, além de CD20, por exemplo, MHCII, CD19, CD80/86 e CD40,foi feito um painel de experimentos similar àquele descritopara combinações dirigidas a CD20-CD37.
Células Ramos foram adicionadas aos poços em meioIscoves completo com FBS 10%. Os MAbs (reagente B: HD37-anti-CD19, reagente C: 9.4-anti-CD45), proteína de fusão(reagente D: CTLA-4 mulg-IgG2a, Ancell n° 501-820) elíquido ascítico (reagente A: HBlOa-anti-MHCII), foramadicionadas nas diluições indicadas (veja Figura 23) , eforam preparadas reações em duplicata com e sem a adição deRituximab (a 0,05 pg/ml) ou TRU-016 (a 2 pg/ml). As reaçõesforam incubadas por 30 minutos a 3 7 °C. As células foramlavadas, e foi adicionado NHS até uma concentração final de10% em meio sem soro. As células foram incubadas por 90minutos a 370C com a fonte de complemento. As células foramlavadas, foi adicionado iodeto de propídio até umaconcentração final de 0,5 pg/ml em PBS; as células foramincubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos;e depois as células foram testadas por citometria de fluxo.
Cada gráfico nos painéis A-D da Figura 23 tabula o % decélulas PI-positivas ao longo das faixas de titulaçãoindicadas.
Em geral, os dados indicam que não houve uma diferençasignificativa no nível de atividade de CDC quandoanticorpos dirigidos a esses receptores foram usadosisoladamente ou em combinação com o TRU-016 (Figura 2 3 A-D). Pode haver um ligeiro aumento nos níveis de CDC para osreagentes dirigidos a CD19 e CD45 quando usados com TRU-016em concentrações subótimas. No entanto, as diferenças nosníveis de CDC não são tão significativas quanto aquelasobservadas para a combinação CD20-CD37. Além do aumento daCDC quando reagentes dirigidos a CD20 e CD37 são usados emcombinação, parece haver um aumento no nível de morteobservado com o uso de combinações de anti-classe II(HBlOa), anti-CD19, anti-CD45 (9.4) ou CTLA4Ig com Rituxanna dose subótima.
Exemplo 13
TRU-016 não aumenta a atividade de CDC de outrosreceptores-alvo, incluindo MHCII, CD19, CD80/86 e CD40
Para determinar se a molécula de TRU-016 aumenta onível de atividade de CDC que resulta do tratamento comanticorpos para outros receptores de superfície de célulasB, além de CD20, foi feito um painel de experimentossimilar àquele descrito para combinações dirigidas a CD20-CD37 (veja Exemplo 8). Os resultados desses experimentossão mostrados na Figura 23. Em geral, não houve umadiferença significativa no nível de atividade de CDC quandoanticorpos dirigidos a esses receptores foram usadosisoladamente ou em combinação com o TRU-016. Os níveis deCDC aumentaram ligeiramente em resposta aos reagentesdirigidos a CDl 9 e CD45 quando usados com TRU-016 emconcentrações subótimas. No entanto, as diferenças nosníveis de CDC não foram tão significativas quanto aquelasobservadas para a combinação CD20-CD37 (veja Exemplo 8) .
Além do aumento da CDC quando reagentes dirigidos a CD20 eCD37 são usados em combinação, parece haver um aumento nonível de morte observado com o uso de combinações de anti-MHCII (HBlOa), anti-CD19, anti-CD45 (9.4) ou CTLA4Ig comRituxan na dose subótima.
Exemplo 14
TRU-016 aumenta a sobrevida em um modelo de xenoenxertotumoral murídeo
Foram realizados estudos de xenoenxerto tumoral decamundongo além daqueles descritos no Exemplo 11 paraexaminar a eficácia de TRU-016 no aumento da sobrevida delongo prazo com o uso de camundongos atímicos (Harlan) elinhagens de células tumorais humanas Ramos ou Daudi.
Células tumorais Ramos e Daudi cresceramseparadamente, e 5 χ IO6 células foram injetadassubcutaneamente no flanco direito de camundongos parainiciar a formação de camundongo xenoenxertos tumorais.Após o desenvolvimento do tumor, os camundongos foramdivididos em grupos com base no tamanho/volume do tumor(dia 0). Os animais foram injetados por via intravenosa(IV) nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 com um dos seguintesreagentes: rituximab, 200 pg/camundongo; TRU-016, 200pg/camundongo; rituximab + TRU-016 a 100 ou 200pg/camundongo; ou IgG humana (controle), 400 pg/camundongo.
O volume tumoral foi medido às cegas três vezes por semanacom compassos até o término do experimento (sacrifício ouregressão). Foi feito um gráfico do volume tumoral emfunção do tempo de tratamento para cada animal, e tambémforam calculados os resultados médios dentro de cada grupo.
A Figura 24 mostra o percentual de sobrevida de camundongoscom tumores Ramos (até 90 dias) após tratamento com TRU-016, rituximab ou uma combinação destes. O tratamentocombinado com TRU-016 + rituximab aumentousignificativamente tempo médio de sobrevida versustratamento com terapia com agente único isoladamente. AsFiguras 25 e 26 mostram o percentual de sobrevida decamundongos com tumores Daudi (até 90 dias) após tratamentocom TRU-016 ou rituximab. O tratamento com TRU-016 aumentouo tempo médio de sobrevida em tumores Daudi estabelecidos(Figura 25). TRU-016 foi mais eficaz do que rituximab namanutenção da sobrevida em camundongos com tumores Daudi(Figura 26).
A administração de TRU-016 como agente único emcamundongos com tumores Ramos estabelecidos demonstrou umainibição do crescimento tumoral e aumento dos tempos desobrevida equivalentes ao rituximab administrado comoagente único, e foi superior aos camundongos de controletratados com HuIgG. Os dados reunidos de 3 experimentosdemonstraram que a terapia de combinação com TRU-016 erituximab resultou em uma melhora estatisticamentesignificativa do tempo de sobrevida comparado commonoterapias com TRU-016 (p = 0,028) ou rituximab (p =0,045). As regressões tumorais completas também aumentarampara os grupos de combinação de TRU-016 e rituximab.Quarenta e dois por cento do grupo de combinação de TRU-016+ rituximab 200 μg foram capazes de obter regressãocompleta de longo prazo de seus tumores, comparados com umataxa de regressão tumoral de 20% em camundongos tratadoscom TRU-016 ou rituximab isoladamente (veja a Tabela 3 e aFigura 24).
TABELA 3. Sobrevida após tratamento em tumores Ramosestabelecidos
<table>table see original document page 119</column></row><table>
Foram constatados redução do crescimento tumoral eaumento do tempo de sobrevida após tratamento com TRU-016no modelo de xenoenxerto tumoral Daudi (veja Tabela 4 eFiguras 25 e 26). A administração de TRU-016 aumentousignificativamente o tempo de sobrevida comparado com ogrupo de controle. Também foi observado um aumento dapercentagem de camundongos sem tumor com o tratamento comSMIP-016 nesse modelo, comparado tanto com os grupos decontrole quanto com os grupos de rituximab.
TABELA 4. Sobrevida após tratamento em tumores Daudiestabelecidos
<table>table see original document page 119</column></row><table>
O tratamento com um SMIP dirigido a CD37 (TRU-016) étão eficaz quanto a monoterapia com rituximab na redução dovolume tumoral e no aumento do tempo de sobrevida no modelode xenoenxerto tumoral Ramos. A terapia de combinação deTRU-016 + rituximab demonstrou um benefício aumentado naredução do volume tumoral e no aumento significativo dotempo de sobrevida, comparado com monoterapia de rituximabou TRU-016 no modelo de xenoenxerto tumoral Ramos. Nomodelo de xenoenxerto Daudi, camundongos tratados com TRU-016 demonstraram um aumento estatisticamente significativono tempo médio de sobrevida, comparado com os controles deHuIgG. 0 tratamento com rituximab não prolongou os temposde sobrevida, comparado com camundongos de controle. Essesdados reforçam a eficácia de uma terapia dirigida a CD3 7nesses modelos de xenoenxerto de Iinfoma não Hodgkin.
Exemplo 15
TRU-016 potencializa a morte celular induzida porfludarabina em células CLL in vitro
A fludarabina é um fármaco quimioterápico usado notratamento de malignidades hematológicas. Fludarabina é umanálogo de purina que inibe a síntese de DNA porinterferência na ribonucleotídeo redutase e DNA polimerase.Fludarabina é ativa tanto contra células em divisão quantocélulas em repouso. Ela é altamente eficaz no tratamento deleucemia linfocítica crônica (CLL), produzindo taxas deresposta mais elevadas do que os agentes alquilantes, porexemplo, clorambucil isoladamente (Rai e cols. N. Engl. J.Med. 343: 1.750-1.757, 2000). Fludarabina é usada em váriascombinações com ciclofosfamida, mitoxantrona, dexametasonae rituximab no tratamento de linfoma e linfoma não Hodgkinindolentes. No entanto, também foi observada resistência àfludarabina no tratamento. A fludarabina induz apoptosedependente de caspase em células CLL, e a apoptose mediadapor TRU-016 parece ser independente da ativação de caspase.O presente estudo examinou o efeito de TRU-016 comfludarabina em células CLL.
As células foram tratadas com TRU-016 em dosagens quevariam de 0,1-100 pg/ml, e com fludarabina em dosagens quevariam de 0-20 μΜ (veja Figura 27) . TRU-016 foi fornecidopor Trubion Pharmaceuticals (Seattle, WA) . Fludarabina (Ρ-ara A) foi adquirida de SIGMA (St. Louis, MO) . RPMI 1640media foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Anexina Vmarcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC e iodeto depropídio (PI) foram adquiridos de BD Pharmingen, San Diego,CA. Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi adquirido de Sigma (St. Louis,MO). As células B-CLL foram isoladas imediatamente após adoação usando centrifugação por gradiente de densidade deficoll (Ficoll-Paque Plus, Amersham Biosciences,Piscataway, NJ) . As células mononucleares isoladas foramincubadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetalbovino inativado por aquecimento 10% (FBS, HycloneLaboratories, Logan, UT), 2 mM de L-glutamina (Invitrogen,Carlsbad, CA) e penicilina (1.000/ml)/estreptomicina (100pg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis) a 37°C em uma atmosfera deCO2 5%. Células B-CLL recém isoladas foram usadas em todosos experimentos aqui descritos, exceto para a coloração desuperfície. Para as amostras com menos de 90% de células B,foi aplicada seleção negativa para eliminar células não Bcom o uso do "B Cell Isolation Kit II" (Miltenyi Biotec,Auburn, CA) ou pelo kit "Rosette-Sep" de Stem CellTechnologies (Vancouver, Columbia Britânica, Canadá) deacordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A linhagemcelular Raji (linhagem celular de linfoma de Burkitthumano) foi adquirida de ATCC, e mantida em meio RPMI 1640contendo FBS 10%, suplementado com penicilina,estreptomicina e glutamina. As células foram divididas 1:3quando a densidade celular alcançava 1 χ 106/ml. O meio foitrocado na noite anterior de cada estudo para assegurar queestavam sendo usadas células frescas.
As células foram tratadas in vitro como aqui descrito.Foi preparada uma diluição serial 1:4 de fludarabina (44,11, 2,8, 0,7, 0,17 e 0,04 μΜ) em uma placa de 6 poços portransferência de 2 ml de meio contendo fármaco para o poçoseguinte contendo 6 ml de meio puro. Em uma placa de 6poços separada, foi preparada uma diluição serial 1:4 deTRU- 016 (44, 11, 2,8, 0,7, 0,17 e 0,04 pg/ml) em meiousando o mesmo método de diluição. De cada uma das placas,0,45 ml de meio foi transferido para um poço designado emuma placa de 4 8 poços para formar uma solução mista defármaco em meio (0,9 ml no total em cada poço) . As célulasCLL suspensas em meio em uma densidade de 1 χ IO7células/ml (0,1 ml) foram então adicionadas ao 0,9 ml demeio em cada poço para formar uma densidade final de 1 χIO6 células/ml. Para células Raji, a densidade celularfinal foi de 5 χ IO4 células/ml. Dessa forma, a suspensãode células usada foi de 5 χ IO5 células/ml. Para os ensaiosde MTT, foram preparadas diluições seriais de fármaco emplaca de 96 poços, e transferidas para outra placa de 96poços para incubação com células. O volume total paraincubação é de 200 μΐ (90 μΐ de solução de fludarabina, 90μΐ de solução de TRU-016 e 20 μΐ suspensão de células) . Aviabilidade celular foi avaliada com o uso dos ensaios deMTT em 4 8 horas, e a apoptose foi medida com o uso deanexina V/PI em 24 horas.
Foram feitos ensaios de MTT para medir a viabilidadecelular como aqui descrito. Resumidamente, IO6 células CLLforam semeadas na placa de 96 poços. As células foramincubadas por 4 8 horas. Cinqüenta μΐ de solução de trabalhode MTT (2 mg/ml, preparados a partir de 5 mg/ml de reagenteMTT misturado com RPMI 1640 2:3 v/v), foram adicionados acada poço, e as células foram incubadas por 8 horas. Asplacas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido edissolvido em 100 μΐ de solução de Iise. As amostras forammedidas com uma leitora de placas em O.D. 540. Aviabilidade celular foi expressa como a percentagem deviabilidade comparada com controle de meio.
A apoptose de células CLL após incubação comanticorpos foi medida com o uso de coloração de anexina V-FITC/iodeto de propídio (PI) com análise FACS. Foramcoradas 5 χ IO5 células em 200 μΐ de tampão de ligação 1 χ(BD Pharmingen) com 5 μΐ de anexina V (BD Pharmingen) e 5μΐ de PI (BD Pharmingen) , e mantidas no escuro emtemperatura ambiente por 15 minutos, antes da suspensão com3 00 μΐ de tampão 1 x, e analisadas por citometria de fluxo.Foram preparadas células sem coloração, células coradasapenas com anexina V e células coradas apenas com PI. Paratodos os experimentos de citometria de fluxo, foi feita aanálise FACS com o uso de um citômetro Beckman-CoulterEPICS XL (Beckman-Coulter, Miami, FL). Os fluoróforos foramexcitados a 488 nm. A fluorescência de FITC foi medida comFLl, enquanto a fluorescência de PI e PE foi medida comFL3. 0 pacote de programas de computador System II(Beckman-Coulter) foi aplicado para analisar os dados. Onúmero de células contadas foi ajustado em 10.000 para cadaamostra.
Um efeito sinérgico foi determinado pelo uso do métododo isobolograma. Para identificar sinergia, o efeito de umacombinação de fármacos foi comparado com o efeito de cadafármaco isoladamente. Isso se baseia na equação: Ca/Ca,b +Cb/Cb,a = Cl, em que Ca e Cb são a concentração de fármacoA e fármaco B isoladamente, respectivamente, para produzirum efeito desejado (por exemplo, 50% de morte celular).Ca,b e Cb,a são as concentrações de fármaco A e de fármacoB em uma combinação, respectivamente, para produzir o mesmoefeito. CI é o índice de combinação. As concentrações defludarabina e TRU-016, que despertam 50% de morte (IC50),foram determinadas e são mostradas na Figura 27C [IC50 deFludarabina (I) e IC50 de TRU-016 (II)]. A linha reta entreesses dois pontos nos eixos é a linha de efeito aditivo.Subseqüentemente, combinações diferentes de fludarabina eTRU-016 que obtêm 50% de morte celular também foramdeterminadas a partir do estudo de viabilidade e tabuladasno mesmo gráfico. Quando os pontos caem abaixo da linha deaditividade, a sinergia é indicada. Quando surgem pontosacima da linha, o antagonismo é indicado. Quando os pontosestão sobre a linha, a aditividade é indicada.
A Figura 27 mostra que TRU-016 reduziu eficazmente aviabilidade celular relativa em células tratadas comfludarabina potencializando, dessa forma, o efeitocitotóxico de fludarabina isoladamente. Dessa forma, esseestudo fornece evidências de que TRU-016 pode ser co-administrado com fludarabina, resultando em aumento daeficácia (ou seja, redução sinérgica de células CLL) notratamento de malignidades hematológicas.
Exemplo 16
TRU-016 induz citotoxicidade direta em células resistentesao rituximab
Como aqui revelado, rituximab é um anticorpomonoclonal usado no tratamento de linfoma não Hodgkin(NHL) , FCC, MCL, DLCL, SLL e CLL. O presente estudo foirealizado para determinar a eficácia de TRU-016 na induçãode citotoxicidade direta em células resistentes aorituximab.
Células resistentes ao rituximab (1 X IO6 células)(Raji 4RH e RL 4RH, fornecidas por Dr. Myron S. Czuczman,Roswell Park Câncer Institute, Buffalo, NY) foram tratadascom herceptina (10 μg/ml), rituximab (10 pg/ml) ou TRU-016(5 pg/ml) na presença de um excesso de cinco vezes de IgGanti-humana de cabra por 24 horas. A citotoxicidade diretafoi medida por coloração com anexina/PI, e a viabilidadecelular (percentual) foi calculada em relação às células decontrole (células tratadas com herceptina).
TRU-016 induziu maior toxicidade celular do querituximab em linhagens celulares resistentes ao rituximab(veja Figura 28). Dessa forma, TRU-016 é um agente eficazpara a indução de citotoxicidade em células resistentes aorituximab, o que o torna útil como agente terapêutico emdoenças caracterizadas ou que envolvem células resistentesao rituximab, por exemplo, algumas células B.
Exemplo 17TRU-O16 induz fosforilação de tirosina em células Bprimariamente CD19+
Para determinar como TRU-016 induz transdução de sinalem células Bf foram feitos experimentos para examinar oefeito de TRU-016 sobre a fosforilação de tirosina.
Células CDl9+ recém isoladas (-50-100 χ IO6) depacientes com CLL foram suspensas em uma concentração de 5X 106/ml de PBS. As células foram então incubadas por 10minutos a 37°C, CO2 5%, com controle, trastuzumab(herceptina) ou TRU-016 em uma concentração final de 5pg/ml. As células foram então precipitadas porcentrifugação, o sobrenadante foi removido, e as célulasforam ressuspensas em PBS fresco do volume inicial.Vinculador cruzado específico para fragmento Fc anti-humanode cabra (25 pg/ml) foi adicionado, e as células foramincubadas por mais 5 minutos. As células foram novamenteprecipitadas por centrifugação, o sobrenadante foiremovido, e as células foram lisadas em 1 ml de tampão deIise RIPA com inibidores de protease e fosfatase (10 mM deTris, ph 7,4, 150 mM de NaCl, Triton X-100 1%, ácidodesoxicólico 1%, SDS 0,1% e 5 mM de EDTA em todas asconcentrações finais. Coquetel de inibidores de proteaseSigma cat n° P-8340; coquetel de inibidores de fosfataseSigma: coquetel de inibidores de serina/treonina fosfataseCa tn° P-2850; e inibidor de tirosina fosfatase cat n° P-5726; PMSF (100 mM) foram usados. Os inibidores foramadicionados ao tampão de Iise, imediatamente antes do uso,em uma diluição 1:100. A concentração de proteína noslisados foi quantificada pelo método do ácido bicinaconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL) . O controle e asamostras tratadas de proteína (50 de proteína total)foram separados por eletroforese bidimensional em gel(faixa de pH: 3-10) (Ia Dimensão) e SDS 10%-PAGE (2aDimensão). A proteína foi transferida para membranas denitrocelulose de 0,2 Nm (Schleicher & Schuell, Keene, NH) esubmetida à análise imunoblot usando clone de anticorpoanti-fosfotirosina 4G10 (Upstate Biotechnology), com autilização do protocolo-padrão. IgG de cabra anti-coelhoconjugada a peroxidase de raiz forte (HRP) foi usada comoanticorpo secundário. A detecção da fosfoproteína foi feitacom substrato quimioluminescente (SuperSignal, Pierce Inc.Rockford, IL).
TRU-016 induziu fosforilação de tirosina em células BCDl9+ primariamente CLL, como mostrado por análise de gelbidimensional (veja Figura 29) . Dessa forma, essesexperimentos mostram que uma forma pela qual TRU-016 atua éatravés de uma via de fosforilação de tirosina.
Exemplo 18
Moléculas humanizadas de TRU-016
Como apresentado no Exemplo 1, SMIPs específicos paraCD37 (por exemplo, TRU-016) são descritos no Pedido U.S. deco-propriedade N0 10/627.556 e nas Publicações de PedidoPatente U.S. Nos 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049.Aquelas descrições são aqui incorporadas por referência. UmSMIP exemplar específico para CD37, o polipeptídeo TRU-016(ID. DE SEQ. N°: 2), foi nelas produzido e descrito. 0presente exemplo fornece SMIPs humanizado de TRU-016.
Anticorpos humanizados são conhecidos na técnica e sãodiscutidos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N02006/0153837. O presente pedido usa as técnicas envolvidasna humanização de anticorpos (discutidas abaixo) parahumanizar SMIPs e, particularmente, para humanizar TRU-016.
Espera-se que a "humanização" resulte em um anticorpoque seja menos imunogênico, com retenção completa daspropriedades de ligação de antigeno da molécula original. Afim de reter todas as propriedades de ligação de antigenodo anticorpo original, a estrutura de seu sitio de ligaçãode antigeno deve ser reproduzida na versão "humanizada".
Isso pode ser obtido enxertando-se apenas as CDRs nãohumanas em domínios variáveis estruturais e regiõesconstantes humanas, com ou sem retenção de resíduosestruturais críticos (Jones e cols., Nature 321: 522(1986); Verhoeyen e cols., Science 23 9: 1.539 (1988)) oupor recombinação dos domínios variáveis não humanosinteiros (para preservar as propriedades de ligação deligante), mas "ocultando-os" com uma superfície humana-Iikeatravés da substituição criteriosa de resíduos expostos(para reduzir a antigenicidade) (Padlan, Molec. Iwmunol.28: 489 (1991) ).
Essencialmente, a humanização por enxerto de CDRenvolve a recombinação apenas das CDRs de um anticorpo nãohumano em uma estrutura central de uma região variávelhumana e uma região constante humana. Teoricamente, issodeve reduzir substancialmente ou eliminar a imunogenicidade(exceto se existirem diferenças alotípicas ou idiotípicas).No entanto, foi relatado que alguns resíduos estruturais doanticorpo original também podem ter que ser preservados(Reichmann e cols., Nature, 332: 323 (1988); Queen e cols.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86: 10, 029 (1989)).
Os resíduos estruturais que precisam ser preservadossão passíveis de identificação através de modelagem porcomputador. Alternativamente, resíduos estruturais críticospodem potencialmente ser identificados comparando-seestruturas conhecidas de sítio de ligação de antígeno(Padlan, Molec. Iimun., 31(3): 169-217 (1994)), aquiincorporado por referência.
Os resíduos que potencialmente afetam a ligação deantígeno se enquadram em vários grupos. 0 primeiro grupocompreende resíduos que são contíguos com a superfície dosítio de antígeno, e que poderiam, portanto, fazer contatodireto com antígenos. Esses resíduos incluem os resíduos doterminal amino e aqueles adjacentes às CDRs. 0 segundogrupo inclui resíduos que poderiam alterar a estrutura ou oalinhamento relativo das CDRs, tanto por contato das CDRsquanto por outra cadeia peptídica no anticorpo. 0 terceirogrupo compreende aminoácidos com cadeias lateraissepultadas que poderiam influenciar a integridadeestrutural dos domínios variáveis. Os resíduos nessesgrupos são normalmente encontrados nas mesmas posições(Padlan, 1994, supra), embora suas posições identificadaspossam diferir, dependendo do sistema de numeração (vejaKabat e cols., "Sequences of proteins of imunologicalinterest", 5a ed. , Pub. No. 91-3.242, U.S. Dept. Health &Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991).
Embora a presente invenção seja dirigida à humanizaçãode SMIPs e não de anticorpos, o conhecimento de anticorposhumanizados na técnica é aplicável aos SMIPs de acordo coma invenção. Alguns exemplos de moléculas humanizadas deTRU-016 são apresentados na Tabela 5 abaixo.
Para a produção de construções humanizadas de TRU-016da invenção, as regiões estruturais de TRU-016 decamundongo foram alinhadas aos resíduos estruturais VHl eVH5 humanos para a cadeia pesada e VKl e VK3 para a cadeialeve. As melhores combinações foram analisadas quanto àcompatibilidade estrutural com as CDRs das regiõesvariáveis de camundongo. Embora houvesse várias combinaçõesigualmente compatíveis para serem escolhidas, tivemossucesso anteriormente com o uso da combinação VK3 (X01668),VH5-51(Z12373) e, portanto, os SMIPs humanizados anti-CD37foram designados com o uso dessas estruturas centraishumanas unidas por um vinculador Gly4Ser ((g4s)3) scFv de15 aa. A construção VK3 foi construída com JKl como umacombinação FR4 preferida e a VH5 foi construída com JH2codificando FR4, como as construções descritas previamente.Os SMIPs foram construídos de novo usando PCR porsuperposição de oligonucleotídeos. Produtos de comprimentototal foram clonados no vetor de expressão SMIP alinhadocom a dobradiça de IgGl humana, CH2 e CH3. Esses clonestiveram suas seqüências verificadas, foram transfectados emcélulas COS-7, e o meio condicionado de 3 dias foi testadoquanto à ligação à linhagem de Iinfoma de células B, Ramos.
A fim de aumentar a humanização, foram incorporadasalterações na CDRl da cadeia leve nas posições L25, L27 eL28, e todas foram bem toleradas, mostrando igual atividadede ligação com a molécula humanizada original 019001. Foramfeitas construções de DNA adicionais de modo similar paraalterar a CDR3 da região VH por incorporação de aminoácidosda linhagem germinativa, H100-H102, codificados por váriasregiões JH humanas. As construções foram examinadas quantoao nível de expressão e ao grau de ligação a CD37 emcélulas Ramos.
TABELA 5. Construções humanizadas de TRU-016
<table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table>
A seqüência de aminoácidos de consenso da construçãohumanizada de TRU-016 N0 019001 (ID. DE SEQ. N°: 6; H016-019001) e TRU-016 não humanizado (ID. DE SEQ. N°: 2; 016-G28-1) é mostrada com numeração de Kabat na Figura 30A. aFigura 30 B mostra os alinhamentos de seqüências deaminoácidos das construções humanizadas de TRU-016 Nos019001 (ID. DE SEQ. N° : 6), 019008 (ID. DE SEQ. N°: 86) e019009 (ID. DE SEQ. N°: 88).
DNA e alinhamentos de seqüências de aminoácidos detrês construções humanizadas de TRU-016 (019001, 019041 e019044), que demonstram ligação específica para CD37elevada às células B Ramos são mostrados na Figura 31.
DNA formatado por FASTA e alinhamentos de seqüênciasde aminoácidos das mesmas três construções humanizadas deTRU-016 (019001, 019041 e 019044) são mostrados na Figura 32.
Regiões de dobradiça adicionais (Tabela 6) e regiõesestruturais (Tabela 7) que podem ser usadas nas moléculashumanizadas de TRU-016 da invenção são apresentadas abaixo.
TABELA 6. Regiões de dobradiça para SMIPs humanizados deTRU-016
<table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table>
TABELA 7. Regiões estruturais para SMIPs humanizados deTRU-016
<table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table><table>table see original document page 140</column></row><table>
São esperadas várias modificações e variações nainvenção apresentada nos exemplos ilustrativos acima poraqueles habilitados na técnica. Conseqüentemente, somenteas limitações apresentadas nas reivindicações em anexodevem ser consideradas na invenção.
Seqüências de DNA e de aminoãcidos para os IDS. DE SEQ. Nos 79-88
<table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table><table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table>Listagem de seqüência
<110> Grosmaire et ai-
<120> Redução de células B com o uso de moléculas de ligação específicas para CD-37 e específicaspara CD20
<130> 30906/41324PCT
<150> US 60/702,4 99
<1S1> 25/07/2005
<150> US 60/800,595
<151> 16/05/2006
<160> 78
<170> Patentln versão 3.3
<210> 1
<211> 15X0
<212> DMA
<213> Seqüencia Artificial
<220>
<223> Polinucleotídeo TRU-016
<400> 1
aagcfctgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggagt cgacatccag atgactcagt ctccagcctc cctatetgca 120tctgtgggag agactgtcac catcacatgt cgaacaagtg aaaatgttta cagttatttg 180gcttggtatc ageagaaaca gggaaaatct cctcagctcc tggtctcttt tgcaaaaacc> 240ttagcagaag gtgtgccatc aaggttcagt ggcagtggat caggcacaca gttttctctg 300aagatcagca gcctgcagcc tgaagattct ggaagttatt tctgtcaaca tcattccgat 360aatccgtgga cgtfccggtgg aggeaccgaa ctggagatca aaggtggcgg tggetcgggc 420ggtggtgggt cgggtggcgg cggatcgtca gcggtccagc tgcagcagtc tggacctgag 460tcggaaaagc ctggcgcttc agtgaagatt tcctgcaagg cttctggtta etcatteact 540ggctacaata tgaactgggt gaagcagaat aatggaaaga gc cttgagtg gattggaaat 600attgatcctt attatggtgg tactacctac aaccggaagt tcaagggcaa ggceaeattg 660actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcagctca agagtctgac atctgaggac 720tctgcagtct attactgtgc aagatcggtc ggccctatgg actactgggg tcaaggaacc 780tcagtcaccg tctcttcaga tctggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatctcca 840ccgtgcccag cacctgaact cttgggtgga ccgtcagtct tcctc.ttccc eccaaaaccc 900aaggacacee tcatgatctc ceggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt geataatgcc 1020aagacaaaac cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080ccccgcacc aggaccggcc gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc aagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcaaccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 13BO
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1500
tgagtctaga 1510
<210> 2
«211> 496
<212> PRT
<213> seqüência Artificial
c220>
<223 > polipeptídeo TRU-016<400> 2
Met Asp Phe Qln Val Gln Ile Phe Ser Phe teu Leu lie Ser Ala Ser. I 5 10 15
Val Xle lio Ala Arg Qly Val Asp Ile Gln Met Thr Qln Ser Pro Ala20 25 30
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr35 40 45
Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly50 55 . 60
Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Ser Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu85 90 95
Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Aap Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gln100 105 110
His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr GIu Leu Glu115 120 125
Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly130 135 140Ser Ser Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu Lye Pro145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lya Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr165 170 175
Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu180 185 ISO
Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg195 200 205
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr210 215 220
Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr225 230 235 240
Tyr Gys Ala Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr245 250 255
Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr260 265 270
His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser275 280 285
Vãl Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val340 345 350
Ser Val l.eu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu385 390 395 400Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Qln Val Ser Leu Thr Cys
Leu Val LyB Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Qlu Trp Glu Ser
Asn Gly Gln Pro Glu Aan Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu.Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 3
<211> 1518
<212 > DMA
<213> Seqüência Artificial
<22 0>
<223> Polinucleotídeo TRU-015c400> 3
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cágcaatcct gtcfcgcatct 120
ccaggggaga aggtcacaat gacttgeagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg .180
taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct 240
tctggagtcc ctgctcgcfct cagtggeagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300
agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt 420
ggatctggag gaggtgggág ctctcaggct fcatctacagc agtctggggc tgagtcggtg 4Θ0
aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540
aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggccfcgg aatggatfcgg agctatttafc 6OO
ccággaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta 650
gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg 720
gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg 780
ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttgtga caaaactcac 840
acatctccac cgtgctcagc acctgaactc cfcgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc 900ccaaaaccca aQgacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcage 1080gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260ctgaccfcgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320gggcagcogg agaacaaefca caagaccacg cctcccgtge tggactccga cggctccttc 1360ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500ccgggtaaat gatctaga 1516
<210> 4
<211> 499<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> polipeptídeo TRU-016
<400> 4
Met Asp Phe Gln Val Qln Xle Phe Ser Phe Leu Leu Ile Sesr Ala Ser1 5 10 15
Val Ile Mefc Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Olu Lys Val Thr Met Tfer Cys Arg Ala Ser35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asii Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Qly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Qly Gly Gly Gly Ser Ser130 13S 140
Gln Ala Tyr Leu Gln Glti Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr165 170 175
Asn Met Hie Trp Val Lys Gla Tkr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr210 215 220
Met Gln Beu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys260 265 270
Asp Lys Thr Ris Thr Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu teu Gly275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met290 295 300
Ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu VaI325 3 30 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tfar Tyr340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly3SS 360 365
Lys Glu Tyr Lye Ciys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Prõ Ile370 375 380Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Aep Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Aen Val Phe Ser Cys Ser Val Met455 470 475 480
Hie GIu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser485 490 495
Pro Gly Bys
<210> 5
<211> 1482
<212> DHA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 5
atggaagccc eagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctccfcgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacfctag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggetc Ctaggctcct catctaçttt gcaaaaacct tagcagaagg aatCccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaaeat catfccCgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaá aSStggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420gggaccggfcg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtct 480ctgaagatfct cctgfcaaggg atccggtfcac teattcactg gctacaatat gaactgggtg 54 0cgccagatgc ccgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacetaca accggaagtt caagggccag gfccácfcatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780caggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 640Ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccet catgatctcc 900cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320cctcccgtgc tgga.ct.ccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380agçaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cactacacgc agaagagcet ctccctgtct ccgggtaaat 1482
<2Ι0> 6<211> 493<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220=·
<223> TRU-016 humanizado<400> 6
Met Qlu Aía Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro-15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Glri ser Pro Ala Tiir Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Axg Thr Ser Glu Asii35 * 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glri Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerBB 90 95Ser Leu OIu Pro Glu Asp Phe AXa Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Aan Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xle Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cya Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Mefe ASn Txp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
180 ias 190
Aan Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Xle Ser Ala Asp Lye Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu I»ys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 25B
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Kis Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Vai, Asp Gly Val GIu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350Thr Val Leu His Glil Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 3S0 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gla Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser3SS 390 395 400
Axg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln VaI Ser Leu Thr Gys Leu Val Lys4OS 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Mis GIu Ala Leu His Asn465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lya ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys485 490
<:210> 7
<21X> 14 82
<2X2> DNA
c2l3> Seqüência Artificial
«22 Q >
<223> TRU-016 humanizado<4hOO> 7
atggaagecc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taecaecgga 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120
ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agcfcacttag cctggtacca acagaaacct IBO
ggccaggctc etaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240
aggttcagtg geagtggatc cgggacagac ttcactctca ccafccagcag cctagagcct 300
gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 3 60
gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420
gggagctctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagfcct 480
Ctgaagattt cctgtaaggg atccggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtg 540cgccagatgc cegggaàagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacetaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780caggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 840ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accafcetcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320cctcccgtgc Itggaetccga cggctccttc tfccctctaca gcaagctcac cgtggacaag 13 80agcaggfcggc agcaggggaa cgtcttetca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482
<210> β
<211> 493
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223 > TRU-016 humanizado<400> 8
Met Qlu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Lea Leu Trp Leu Pro1 S 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lya Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tlir Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Xle Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Ket Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly GlTJ Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr24S 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lye355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 415
Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Asn iEyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu ABp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Kis Asn465 470 473 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 9
<211> 1482
<212> DHA
<213> Seqüência Artificial<220>
<22 3 > TRU-016 humanizado
<400> 9
atggaagccc cagctcagct tctcttccte ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagceaçc 120ctctcctgcc gaaeaagtga aaatgfcttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaaeat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggfcggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420gggaccggtg aggtgcagefc ggtgcagtct ggagcagagt egaaaaagcc cggagagtct 480ctgaagattt cctgtaaggg atccggttac tcattcactg gctaeaatat gaactgggtg 540cgceagatgc ccgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780Gaggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 84 0ctgggtggâc ogtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900cggaccectg aggtcacatg cgfcggtggfcg gacgtgagcc acgastgaccc tgaggfccaag 960tfccaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaecg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggCctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaecacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaá ccaggfccagc cfcgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgfcggagfcg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320ectcccgtge tggaçtçcga cggctcctto ttcctctaca gcaagctcac cgtggaeaag 1380agcaggtggc agcaggggaa cgtctfcctca tgctccgtga tgeatgaggc tctgcacaac 1440cacfcacacgc agaagagect ctecctgtct ccgggtaaat gá 1482
<210> 10
<211> 493
<212 > PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<40 O > 10
Met Glu Ala Pro Ala Qln Leu Leu Pha Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 S 10 15
Asp thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Θΐϋ Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Qly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Tkr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Glii Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lye Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pró Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Kis Ser100 105 110
Asp Asa Pro Trp Thr Phe <31y Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ser Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Xle Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 * 230 235 240
Arg ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320Phe Asn Trp Tyr Val Asp Qly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asa Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ila Glu Lys Thr Ile Sar Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser305 390 395 400
Arg Aep Glu Leu 1Fhr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg frp Gln450 455 4 60
Gln Gly Asb Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 11
<211> 1482
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 11
atggaagdcc eagcteagct tctcttcctc ctgcfcactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgfcgt tgacacagtc tccagccaee ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gaacaagtca aaatgtctac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggotcct catctatttt gcaaaaacct tageagaagg aattccagce 24 0aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 3 00gaagattttg cagtttatta ctgtc.aacat cattccgata atccgtggaò attcggccaa 360gggaecaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420gggaccggtg aggtgcagct ggCgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtct 480ctgaagattt cctgtaaggg atccggttac tcattcaetg gctacaatat gaactgggtg 540cgecagatgc ccgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcetta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagccfcgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780caggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 8 40ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900cggaccccfcg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960tteaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcetgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaecacagg tgtacaccct geccccatcc 1200cgggatgagc tgaceaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagageaat gggcagccgg agaacãaota caagaccacg 1320CCtcccgtgc tggactccga eggetccttc ttcetctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgetccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cactacacgc agaagagcct ctcectgtct ccgggtaaat ga 1482
<2!0> 12<211> 493<212 > PST
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 12
Met Glu Ala Pro 7vla Qln Leu Leu Phe Leu Ieu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Tiir Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Oly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Tiir Ser Gln Asn35 40 4SVal Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Kls His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Giy Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Giy Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Glv Gly Thr Thr Tyr Asn. Arg Lys Phe Lys19S 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Glti Trp ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 2 95 300Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Txp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu His Sln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 355
Val Ser Asn Lys AIa Leii Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 3B0
AIa Lys Gly Gla Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 3S0 395 · 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 41S
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Qln420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 44S
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 450
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn4,65 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lye485 490
<210> 13
<211> 1482
<212> DMA
<213> Seqüência Artificial<220s>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 13
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120
ctctcctgcc gaacaagtga aagtgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420gggaccggtg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtct 460ctgaagattt ccfcgtaaggg atccggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtg 540cgecagatgc êcgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt €00actacctaea accggáagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660aecgcctacc tgcããtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780caggagccca aatcttctga caaaacteac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 640Ctgggtggae cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900cggaeccctg aggtcacafcg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960ttcaactggfc acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagec gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tccfcgcacea ggactggctg lOBOaatggcaagg agtacaagtg caaggtcfccc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcageegg agaacaactá caagaçcacg 1320ectcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcccctaca gcaagctcac cgt.ggacaag 1380agcaggfcggc agcaggggaa cgfccttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaa.at ga 1482
<210> 14
<211> 493
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 14
Met Glu Ala Pro Ala Gln teu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pxo1 5 10 IS
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Beu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Ser35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Glix Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly lie Pro Ala65 70 75 BO
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Zle Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 17 5
Met Asn Trp Val Arg Gln MeC Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly160 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asa Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr AIa Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225' 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Aep Lys Thr Hls Thr Ser260 . 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle ser Arg Thr Pro Glu290 2 95 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lye305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu Hia Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn465 470 475 480
Hie Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 15
<211> 1482
<212> DWA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<100> IS
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggagaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gagcaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac tteactetcá ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggafcc tggaggaggt 420gggaccggtg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtct 480ctgaagattt cctgtaaggg atccggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtg 540cgccagatgc ccgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgaeaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgea 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcetctgat 780caggagccca aatcttctga caaaactcac acatcteeac cgtgcccagc acctgaactc 840ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctec 900cggacccctg aggtcacatg cgtggtggfeg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc categagaaa 1140accatctcca aagccaaagg geagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcceecatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc cggtcaaagg cttctatcca 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320cctcccgtgc tggactccgo cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380agcaggtggc agcaggggaa egtcttctca tgctecgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482
<210> 16
<211> 493
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial
c220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> IS
Met Glu Ala Pró Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 ISAsp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu lie Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 - 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Alã Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Aan Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Olu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Oly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 14 0
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Acn163 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Glia Trp, Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr IIis Thr Ser260 265 270Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Oly Pro ser vai Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val ASp Val Ser Hls Glu Asp Pro Glu Val Lys305 33.0 315
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Qly Val Glu Val Kis Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pró Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu Hls Gln Asp Trp Leu Asn Gly.Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
Val Ser Asn Lya Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys370 375 36°
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390
Arg Asd Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 *
Gly Phe Tyr Pro Ser Ae3? Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln42 0 425
Pro Glu ABh Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
43S
44 0 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn465 470 475
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 17
<2ll> 1479
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<22 0>
<223> TRU-016 humanizadoatggaagcac cagcgcagct tctcttcctc cfcgctactct ggetcceaga taccaccggtgacatccaga tgactcagtc tccagcotcc ctatctgcat ctgtgggaga gactgtcaccatcacatgtc gaacaagtga aaatgtttac agttatttgg cttggtatca gcagaaacagggaaaatctc ctcagctcct ggtctctttt gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatcaaggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcagcag cctgcagcctgaagattctg gaagttattt ctgtcaacat catteegafca atccgtggac gttcggtggaggcaccgaac tggagatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggcggagctagcg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtctctgaggattt cctgtaaggg atccggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtgcgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggtactacctacá accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagcâccgcctacc tgcaatggag cagccfcgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcacgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgc ctcctcgagcgãgcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaactcctgggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccggacccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttcaactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcagtacaacagcâ cgtaccgtgt ggtcagcgte ctcaccgtcc tgcaccagga ctggetgaatggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccáfc cgagaaaaccatctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgggatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctâtccaagcgacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcctcccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggaeaagagcaggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccactacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga
<210> 18
<211> 492
<212i> PRT
«t213> Seqüência Artificial<23 0>
<223> TRU-016 humanizado
<400> IS
Met Qlu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu tóu Leu Leu Trp Leu Pro
601201602403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201380144 014791 5 10 15
Aso Thr Thr Glv Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu SerP 20 25 30
Ala Ser vai Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
vai Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Qly Lys Ser Pro50 55 60
Gln Leu Leu Val Ser Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser
65
70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser3 05 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gln Hxb I-Iis ser100 105 HO
ASP Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys Gly115 120 12S
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glú130 135 14
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
145
150 155 160
Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 I70 1
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Ly8 Gly Leu Glu Trp Met Gly
16 0 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Pho Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Tte Ala Ket Tyr Tyr Cys Ala225 230
A-g Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 25bVal Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lya Thr Kis Thr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Ovs Val Val Val Asp Val Ser Kis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val GlU Val Eis Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 33° 335
Am Glu Glu Glii Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr3t0 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 ■ 360 365
Ser Aen Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Ly3 Gly em Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys GlyF 405 «IO 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 «O
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 4^5
Phe Phe Iieu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Gly ABn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Kis Glu Ala Leu His Asn His4ê$ 470 475
Tvr Thr Gln Lys Sex Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys7 485 490
<210> 19<211> 1479<212> CNA<213> Seqüência Artificial<220>
<223 > TRU-016 humanizado
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggtgaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccaccctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacctggceaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagccaggttcagtg gcagtggatc qgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcctgaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggocaagggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtagtggatc tggaggaggtggagctagcg cggcccagct gcagcagtct ggacctgagt cggaaaagcc tggcgcttcagtgaagattt cctgcaaggc ttctggttac tcattcactg gctacaatat gaáctgggtgaagcagaata atggaaagag ccttgagtgg attggaaata ttgatcctta ttatggtggtactacctaca accggaagtt caagggcaag gccacattga ctgtagacaa atcctccagcacagcctaca tgcagctcaa gagtctgaca tctgaggact ctgeagtcta ttactgtgcaagatcggtcg gccctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcgagcgagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaacfccctgggtggaccgt cagtcttcct ettcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccggacccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttcaactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcagtaeaacagca cgtaccgtgt ggtcagegtc otcaocgtoc tgcaccagga ctggctgaatggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgggatgagctga ccaagaacca ggtcagcotg acctgcctgg toaaaggctt ctatccaagcgacâtcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcctcccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagcaggtggcagc aggggaacgt cttcteatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga
<210> 20
<211> 492<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
60120180240300360420480540600660720780840900960102010B0
1200126013201380
1479
<220>30/87
<223> TRU-016 humanizado<400> 20
Met Glu AXa Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asd Thr Thr Glv Qlu Ile Val teu Thr Qln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arq Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lye Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 8 0
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Glu His His Ser100 IOS 110
ASP Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 12 0 125
Glv Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ala130 135 14Ό
vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu Lys Pro Gly Ala Ser145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 "O 175
Met Asn Trp Val Lys Gln Asa Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Glv Lvs Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met210 215 220
Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Tbr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Kie Thr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu vai290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Aap Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 33° 335
Arq Glu Glu Glh Tyr ABil Ser Thr Tyr Arg Vai. Val Ser Val Leu Thr3 340 345 350
Val Leu His Gln Asp Tro Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 ' 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Sex Lys Ala370 375 380
Lvs Glv GlB Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg305 390 395 400
Αβό Giu Leu Thr Lys Asa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Bys Gly' 405 410 41S
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Kis Asn His
Tvr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pró Gly Lys485 490<210> 21
<211> 1479
<212> DNA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 21
atggaagcac cagcgcagct tefccttccfcc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc
ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct
ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tageagaagg aatfcccagcc
aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctoa ccatcagcag cctagagcct
gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa
gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt
ggagctagcc aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc
ctgagactct cctgtgcagc ctctggatte accttcagtg gctacaatafc gaactgggtc
egccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt
actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc
accgcccacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca
cgctcagtcg gccctafcgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgfc ctcctcgagc
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaactcctg
ggtggaccgt cagtcttcct ettcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
cccgtgctgg actccgacgg otccttctfcc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc afcgaggctct gcacaaccac
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga
€0120180240300360420480540SOO6607207 BO840900960102010801140120012601320138014401479
<210> 22<21X=> 492<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 22
Met GXu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn3S 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Qln Gln Lya Pro Gly Gln Ala Pro50 SS 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 SO
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Hls His Ser100 3-05 I"
Asp ABn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lye Gly115 120
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly vai vai Gln Pro Gly Arg Ser145 150 I55
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn165 170 I73
Mat Asn Tro Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly' ~ 180 185 "O
Asn lie Asp Sro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asii Arg Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Aia Aep Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Aep Thr Ala Met Tyr Tyr Cye Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Qly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Gln Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr CVS Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Tro Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lya Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
vai Leu His GlB Asp Trp Leu Asii Gly Lys Glu Tyr LyS Cys Lys Val355 360
ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Itys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395
ABP Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 415
Phe Tvr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 42S 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Glv Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His465 470 475 480Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 23
<211> IS03
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223 > TRU-016 humanizado
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggtgcggtccagc tgcagcagtc tggacctgag tcggaaaagc ctggcgcttc agtgaagatttcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctaeaata tgaactgggt gaagcagaataatggaaaga gcettgagtg gattggaaat attgatcctt attatggtgg Cactacctacaaccggaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagectacatgcagctca agagtctgac atctgaggac tetgcagtct attactgtgc aagateggtcggccctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcttctgg tggcggtggcfccgggcggtg gtgggtcggg tggeggegga tcaggaggag gcgggagtgc tagcgaaattgtgttgacac agfcctccagc caccctgtct ttgtctccag gcgaaagagc caccctctcctgcogaacaa gtgaaaatgt ttacagctac ttagcctggt aecaacagaa acetggccaggctcctaggc tcctcatcca ttttgcaaaa accttagcag aaggaattcc agccaggttcagtggcagtg gatccgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagattttgcagttt attactgtca acatcattcc gataatccgt ggacattcgg ecaagggaccaaggtggaaa tcaaaggctc gagcgagccc aaatcttctg acaaaactca cacatctccaccgtgcceag cacctgaact cetgggtgga ccgtcagtct tcctcttccc cccàaaacccaaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggaeg gcgtggaggt gcataatgccaagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggteag egtcctcaccgtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagccctcccagccc ccafccgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacaggtgtacacce tgeccccatc ecgggatgag etgaccaaga aceaggtcag cctgacctgcctggtcaaag gcttctatcc aagegacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccggagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg aeggctcctt cttectctacagcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgetccgtgatgcatgagg ctctgcacaa ecactacacg cagaagagcc tctecctgtc tccgggtaaa
60120180240300360420480540600660720780840900$601020108011401200126013201380144015001503
tga
<210> 24
<211> 500
<212> PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 24
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu1 5
Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro10
Asp Thr Thr Gly Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu20 25 30
Lys Pro Qly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser35 40 ^5
Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly LyB Ser
SO 55 60
Leu Glu Tro He Gly Asn Ile Asp Pro -Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr65 * 70 75
Asn Arg Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Aeρ Lys Ser Ser
Ser Thr Ala Tyr Met Oln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
100
105
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Gly Pro Net Asp Tyr Trp Gly Gln
115
120
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly* ------14 0
130
135
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Glu Ile145 150 15? 16°
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
*"Λ 175
165
170
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala. iao 185 Ι90
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Pheα95 200 205Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly210 215 220
Ser Glv Thr Aap Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr CYs Gln Kis His Ser Asp Aan Pro Trp Thr Phe245 250 2 55
Glv Glti Glv Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser260 265 270
Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lye Asp Thr Leu290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser305 310 315 320
His Glu ASP Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr340 345 350
Tvr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn355 360 365
Glv Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro370 37S 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lya Gly Plie Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr450 455 460Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val465 470 475 480
Met Kis Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu4B5 490 495
Ser Pro Gly Lys500
<210> 2S
<211> 1488
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 25 . .
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc etgctaatca gtgcttcagt eataattgcc
agaggagtcg aaattgtgtt gacacagtct ccagccaccc tgtctttgtc tocaggcgaa
agagccaccc fcctcctgccg aacaagtgaa aatgtttaca gctacttagc ctggtaccaa
cagaaacctg gccaggctcc taggctcctc atctattttg caaaaacctt agcagaagga
atfcceagcca ggttcagtgg cagtggatcc gggacagact tcactctcac catcagcagc
ctagagcctg aagattttgc agtttattac tgtcaacatc attccgataa tccgtggaca.
ttcggccaag ggaecaaggt ggaaatcaaa ggfcggcggtg gctcgggcgg tggtggatct
ggaggaggtg gagctagcgc ggtccagctg eagcagtctg gacetgagtc ggaaaagcct
ggcgcttcag tgaagatttc ctgoaaggct tctggttact cafctcactgg ctacaatatg
aactgggtga agcagaataa fcggaaagagc cttgagtgga ttggaaatat tgatccttat
tatggtggta ctacctacaa ccggaagttc aagggcaagg ccacattgac tgtagacaaa
tcctccagca oagcctacat gcagctcaag agtctgacat ctgaggactc tgcagtctat
tactgtgcaa gatcggtcgg cccfcatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc
tcctcgagcg agoccaaatc ttctgacaaa actcacacat ctccaccgtg' cccagcacct
gaactcctgg gtggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg
gaggagcagt acaacageae gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttctatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tcctfccttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1488
<210> 26<211> 495<212> PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 26
Met Asp Phe Gln Val Qln Ile Phe Ser Pha Leu Leu Ile Ser Ala Ser15 15
Val Ile Ile Ala Arg Gly Val Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala20 25 30
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr35 40 45
Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lya Thr Leu Ala Glu Gly65 70 75 80
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluHS 120 125
Ile Lys Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly130 135 "O
Ala Ser Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu Lys Pro145 150 155 16«
Glv Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr165 170 175Gly Tyr Asii Met Asn Trp Val Lys Qln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu180 185 190
Trp He Gly Asn Ile Aso Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg195 200 205
Lvs Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr210 215 220
Alá TVr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr225 230 235 240
Tyr Cye Ala Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr245 250
Seir Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His260 265 270
Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Aep Val Ser His Glu Asp Pro Glu325 330 335
305 310 315
Val Lys Phé Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser340 345 350
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Dys355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Xle Glu Lys Thr Ile370 375 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro385 390 395
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn420 425 430Gly GXn Pro Glu Asn Aan Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg450 455 460
Tt> Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490 495
<210> 27
<211> 1503
<2125- DiIA
<213> Seqüência Artificial
<220»
<223> TRU-016 humanizado
atggaagcL cagcgcagct tetctfccctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggtgcggtccagc tgeagcagtc tggacctgag tcggaaaagc ctggcgcttc agtgaagatttcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacaata tgaactgggt gaagcagaataatggaaaga gccttgagtg gattggaaat attgatcctt accatggtgg tactacctacaaccggaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctacatgcagctca agagfcctgac atctgaggac tctgcagfcct attactgtgc aagatcggtcggccctatgg actaetgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcttctgg tggcggtggctcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcaggaggag gcgggagtgc tagcgaaattgtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gcgaaagagc caccctctcctgccgaacaa gtgaaaatgt tfcacagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccaggctcctaggc tcctcatcta ttttgcaaaa accttagcag aaggaattcc agccaggttcagtggcagtg gatccgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagattttgcagttt attactgtca acatcattcc gataatccgt ggacattcgg ccaagggaccaaggtggaaa fccaaaggctc gagcgagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgcccaccgtgcccag cacctgaact cctgggtgga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaacccaaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaa gttcaácCgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgccaagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc
60120180240300360420480540600660720780840900960102010B01140ctcceagcce ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc aagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccae gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccaotacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1500
tga
<210> 28
<21Χ> 500
<212> PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 28
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
PhG Thr Gly Tyr Aen Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser50 55 60
Leu Glu Trp lie Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr65 70 7S 80
Asn Arg Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lya Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala100 105 HO
Val Tvr Tvr Cys Ala Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln115 120 125
Glv Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140
Gly Ser Gly Gly Qly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Ala Ser Glu Ile!45 150 155 1*0Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu ArgISS 170 175
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala180 185
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe195 200 205
Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala Arg Phe ser Gly Ser Gly210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His I-Iis Ser Asp Asn Pro Trp Thr Phc245 250 255
Gly Gln Gly Thr Bya Val Glu Ile Lys Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser260 265 270
Ser Abp Lys Thr Hia Thr Cys Pro Pro Cye Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 205
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu290 295 300
Ket Ile S^r Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu3 25 330 335
Val His Aen Ala Lys Thr LyS Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr340 345 350
Tyr Arg VaI vai Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn3SS 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lye Cys Lys Val Ser. Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val405 410 415Ser Leu Tlir Cys Leu Val LyB Gly Phe Tyr Pro Ser Aap Ile Ala Val420 «5 430
Glu Trp Olu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr450 455 160
Val Aso Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cya Ser Val465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu485 490 495
Ser Pro Gly Lys500
<210> 29<211» 1479<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 29
atggaagcac cagcgcagct tctcttcetc ctgctactct ggctcccaga taccaccggtgaaafctgtgt cgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccaccctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacotggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagccaggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcctgaagatCfceg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaagggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggtggagctagcg cggtccagct gcagcagtct ggacetgagt cggaaaagcc tggcgcttcagtgaagattt cctgcaaggc ttcfcggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtgaagcagaata atggaaagag ccttgagtgg attggaaata ttgatcctta ttatggtggtactacctaca accggaagtt caagggcaag gccacafctga ctgtagacaa atcctccagcacagcctaca tgcagctcaa gagfcctgaca tctgaggact ctgcagtcta ttactgtgcaagatcggtcg gccctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcgagcgagcccaaat cttctgacaa aacucacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaactcctgggtggaccgt cagtcCtcct ctt.cccccca aaacccáagg acaccctcat gatctcccgg
60-120180240300360420480540600660720780840900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagcgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaage 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccae 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479
<210> 30
<211> 492
<212 > PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 30
Mct Qlu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Aso Thr Thr Oly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu lie Tyr Phe Ala Lye Thr Leu Ala Glu Gly He Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Oln His His Ser100 105 11°
Aea Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lye Val Glu Ile Lys Gly115 120 125GIv Glv Glv Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala ser Ala130 135 140
Val Gln Leu Gln Gln- Ser Gly Pro Glu Ser Glu Lys Pro Gly Ala Ser145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Bys Phe Lya19S 200 205
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met210 215 220
Gln Leu Lye Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lya Thr His Thr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Plte Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Tiir Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Aan Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu GIu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg
Asp Slu Leu Thr Lys Aan Qln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lye Gly
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly se.r
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Mee His Glu Ala Leu His Asn HJLs
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys
<210> 31<211> 147S
<212> ONA
<2i3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400» 31
atggaagcac cagcgcagct tctctfccctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60
gaaattgtgt fcgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggega aagagccacc 120
ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180
ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240
aggttcagfcg gcagtggatc cgggacagac tfccactctca ccatcagcag cctagagcct 300
gaagattfctg cagtttatta ctgtcaacat cattoegata atccgtggac attcggccaa 360
gggaccaagg tggaaaeeaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggfcggatc tggaggaggt 42 0
ggagctagcg cggtccagct gcagcagtct ggaccfcgagt cggaaaagcc tggcgcttca 4BO
gtgaagattt cctgeaaggc ttcfcggfetac tcattcactg gctacaatat gaaetgggtg 540
aagcagaata acggaaagag ccttgagtgg actggaaata tfcgatccfcta ttacggtggt 600
actacctaca accggaagtt caagggcaag gccacattga cfcgtagacaa atcctccagc 660
acagcctaca tgcagctcaa gagtctgaca tctgaggact ctgcagtcta ttactgtgca 720
agatcggtcg gccctatgga ctactggggt caaggaaccfc cagtcaccgt ctcctcgage 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840Sgtggaccgt cagtcttccfc cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaafcggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgcgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479
<210> 32
<211> 492
<212 > PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400 > 32
Ket Glu Ala Pro Ala Gln J»eu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 IO 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Α3η35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Qln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser35 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ris His Ser100 IOS 110Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vâl Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ala130 135 140
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu Lys Pro Gly Ala Ser345 150 155 160
Val Lys 2Ie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Aen Trp Val Lys Gln Asn Aen Gly Lys Ser Leu Glu Trp Xle Gly180 185 ISO
Asn Ile Asp 3Pro Tyr Tyr Gly Gly Tlir Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met210 215 220
Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pxo Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Kis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn AIa Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
Val Leu Kis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu tyr Lys Cys LyB Val355 360 365Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Xle Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Beu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Oly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Olu Ala Leu Hie Asn Hls46S 470 475 400
Tyr Thr Qln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<2Í0> 33 <211> 1479 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> TRU-016 humanizado <400> 33 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggetceeaga taccaccggt 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 12 0ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggcfcc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aatfcccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat câttccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggagctagcc aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc 480ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 54.0cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 7Θ0gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgágctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg CtCCttCttC ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 13A0aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479
<210> 34,<211> 492<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 34
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Tlir Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser CyB Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Zle Pro Ala65 70 75 ' BO
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Tbr Ile Ser85 90 95Ser Leu QXu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Tbr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xle Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln130 13S 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser145 150 ÍS5 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn155 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Qln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln írp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala22S 2 30 235 24 0
Arg Ser Val Glv Pro Mat Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hie Thr Cys Pro260 265 270
Pro Cys PiO Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val200 29B 3 00
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Qly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 360 365
Ser Asn Jjys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lye Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Aen Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Jro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe LeU Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Gly Aszi Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Kis465 470 475 4 80
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys465 490
<210> 35
<211> 1479
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223 > TRU-OI6 humanizado
<4Ó0> 35
afcggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60gaaatfcgtgt tgacacagfcc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gaacaagtga aaatgttfcac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc cfcaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaágg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggagctagcc aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc 4B0ctgagactct cctatgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 540cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg' acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtaeg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtetccaac aaagccctec cagcccccat cgagaaaacc 114 0atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 13 80aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1479
<210> 36
<211> 492
<212> PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 36
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Tlir Hir Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Qlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Giy Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr the Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser145 150 155 160
Iseu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Gly Tyr Asn1S5 170 175
Met Asa Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Glii Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cya Ala225 230 235 240
Arg Sex Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lya Ser Ser Asp LyB Thr Mia Thr Ser Pro260 2S5 " 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Fro LyB Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 3S0
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His465 470 475 480
Tyr Thr Gln LyB Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 37
<2ll> 1476
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 37
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctdctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggggctagcg aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggct tggtccagcc tggagggtcc 480ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 540cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600aetacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggáca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgfcc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1476
<210> 38
<211> 492
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 33
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 IS
Aap Thr Thr Gly Glu Xle Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 SS 60Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala55 70 75 -80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser05 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cye Gln His His Ser100 105 110
ABp Aan Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Olu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn TUrg Lye Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 ~ 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 - 25S
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Kis Thr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phé Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cye Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320Asn Txp Tyr Val Asp Gly Val Qlu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 350 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thx Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 4X0 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Aap Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln• 450 455 4SO
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Ket His Glu Ala Leu HÍ3 Asn His465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 39
<2ll> 3.47 S
<212> DKA
<2i3> Seqüência Artificial
c220>
<223> TRU-016 humanizado
<400» 39
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct IBOggccaggctc ctaggctcct eatctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagce 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggggctagcg aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggct tggtccagcc tggagggtcc 460ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 540cgccagatgc cçgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaátggag cagccbgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggfccaagttc 96 Oaactggtacg tggacggcgt ggaggtgcafc aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020Lacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacággtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ecaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgccU 1320cccgfcgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtetccg ggtaaa 1476
<210> 40
<211> 492
<212 > PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 40
Met Qlu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn3S 40 45
aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr GIn Gln Lys Pro Gly Gln Ala ProSO 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Hia Hie Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cy3 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Giy Lys Gly Leu Glu Trp Met Qly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr' Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 ~ 250 .255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val290 2 95 300Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Iiys Phe305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp GlyVal Glu Val Hls Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Glxi Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
Val Leu His Qln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Xle Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Axg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Aep Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thx Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 4SS 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Kis Glu Ala Leu His Asn His465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 41
<211> 1476
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<2.23> TRU-016 humanizado<400> 41
atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggtgaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccaccctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacctggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaãaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggggctagcg aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggct ctgtccagcc tggagggtcc 4Θ0ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 540cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 840ggtggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 102 0tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagcfcga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc. 1260gacatcgccg tsgagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tcegtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1476
<210> 42
<211> 492
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 42
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
ι
ιLeu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 eo
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thx Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser145 150 155 160
Leu Arg Lexi Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
GIy Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Ly3 Ser Ser Asp Lys Thr His Ihr Ser Pro260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe275 280 285Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Híb Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Asn Tro Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Sex Val Leu Thr340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg3Θ5 390 395 400
Asp Glu Beu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lya Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Hia465 470 475 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 43
c2:il> 1476
<2.12 > DKA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
, <223> TRU-016 humanizado
<400> 43
atggaagcac cagegcagcfc Ectcttcctc cfcgctactct ggctcccaga taccaccggtgaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gaacaagtga aaatgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ctaggctcct catctatttt gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420ggggetâgcg aggtgcagct ggtggagtct ggtggaggct ctgtccagcc tggagggtcc 480ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg gctacaatat gaactgggtc 540cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggcaata ttgatcctta fcfcafcggtggfc 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccafcgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctcgagc 780gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 040ggtggaccgt cagtcttcct ctfccccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 900acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 960aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat áatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1020tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1080ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1140atctccaaag ccaaagggca gceccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1200gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc 1260gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1320cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1380aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1440tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1476
<210> 44
<231> 492
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<40> 44
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Asp Thr Thr Gly Glu Xle Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Glii Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Aap Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu130 135 140
Val Glti Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Aap Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Aap Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lye Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 24 0
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Ser Glu Pro Bys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro260 265 270Pro Gys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ifeu Phe275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lya Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Tlrr Pro Glu Val290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe305 310 315 320
Aen Tirp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val3S5 360 355
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Glii Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Tro Glu Ser Asn Gly. Gln Pro420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser435 440 445
Phe Phe Lau Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln450 455 450
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His463 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210> 45
<211> 1482
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 45 atggaagccc cagctcagcfc tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggcga aagagccacc 120ctctcctgcc gagcaagtca aagtgtttac agctacttag cctggtacca acagaaacct ISOggccaggctc ctaggctcct catctatett gcaaaaacct tagcagaagg aattccagcc 240aggttcagtg gcagtggatc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcaacat cattccgata atccgtggac attcggccaa 360gggaccaagg tggaaatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 420gggaccggtg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggagagtct 480ctgaagattt cctgtaaggg atccggttac tcattcactg gctacaatat gaactgggtg 540cgccagatgc ccgggaaagg cctcgagtgg atgggcaata ttgatcctta ttatggtggt 600actacctaca accggaagtt caagggccag gtcactatct ccgccgacaa gtccatcagc 660accgcctacc tgcaatggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgca 720cgctcagtcg gccctatgga ctactggggc cgcggcaccc tggtcactgt ctcctctgat 780caggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccagc acctgaactc 840ctgggtggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 900cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 960ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1020cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1080aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1140accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1200cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca ' 1260agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1320cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1380agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1440cáctacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1482
<210> 46
<211> 493
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 46
Het Glu Ala Pro Ala Gln I»eu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr GXy Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr LeU Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Gys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Oln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
GXy Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly ser Gly Tyr ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 · 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Sér Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr245 * 250 255Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
VaI Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Aen Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly ABn Val Phe Ser Cys Ser Val Met IIis Glu Ala Leu His Asn465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys485 490
<210><211><212>
47
1500DNA<2i3> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 47
aagcttgccg ccatggaagc cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60gataccaccg gagaaattgt gttgacacag tctccagcca ccctgtcttt gtctccaggc 120gaaagagcca ccctctcctg ccgagcaagt gaaaatgttt acagctactt agcctggtac 180caacagaaac ctggccaggc tcctaggctc ctcatctatt ttgeaaaaac cttagcagaa 240ggaattccag ccaggttcag tggcagtgga tccgggacag acttcaotct caccatcagc 300agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcaac atcattccga taatccgtag 360acattcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaaggtggcg gcggctcggg cggtggtgga 420tctggaggag gtgggaccgg Ugaggtgcag etggtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag «aocccggagagt ctctgaagat ttcctgtaag ggatccggtt actcatteac tggctacaat 540atgaactggg tgcgccagat gcccgggaaa ggcctcgagt ggatgggcaa tattgatect 600tattatggtg gtactaccta caaccggaag ttcaagggcc aggtcactat ctccgcegac £60aagtccatca gcaccgccta cctgcaatgg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg 720tattacbgtg cacgctcagt cggccctttc gactactggg gccagggcac cctggtcact 780gtctcctctg atcaggagcc caaatcttct gacaaaactc acacatctcc accgtgccca 840gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc ttccfcctfccc ccccaaaacc caaggacacc 900ctcatgatct cccggaccce tgaggtcaca tgegtggtgg Cggacgtgag ccacgaagac 960cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 90gcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200ctgcecccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgefcccgt gatgcatgag 1440gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atgatctaga 1500
<210> 48
<211> 493
<212> PRT
<213> Seqüência Artitlciai
<220><223> TRU-016 humanizado<400> 48
Met Glu AIa Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro AlaSS 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser8S 90 35
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Xle Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Giy Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser145 ISO ISS 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 17 0 175
Met Asa Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys -Phe Lys195 20 0 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 22 0
GIn Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240Arg Ser Val Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Aap Lys Thr His Thr Ser260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr LyS325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Αεη Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lye Leu Thr Val Asp LyB Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn4 65 470 475 4 80
His Tyr Thr Gln Lye Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys4 85 490<210> 49
<211> 356
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 49
gctagcgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg agagtctctg 60aagatttccfc gtaagggatc cggttactca ttcactggct acaatatgaa ctgggtgcgc 120cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg ggcaatattg atccttatta tggtggtact íaoacctacaacc ggaagttcaa gggccaggtc actatctccg ccgacaagtc catcagcacc 240gcctacctgc aatggagcag cctgaaggcc tcggacaccg ccatgtatta ctgtgcgcge 300tcagtcggcc ctatggacgt ctggggccaa ggcaccactg tcactgtctc ctcgag 356
<210> 50
<211> 143
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
c223> TRU-016 humanizado
<400> 50
Met Glu Ala Pro Ala Õln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 3.0 15
Aap Thr Ttir Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cye Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lya Pro Gly Gln Ala Pro50 SS 60
Arg Leu Leu lie Tyr Phe Ala Lya Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 ) 95
Ser Leu Glu Pro Glu A3p Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly130 135 140
<210> 51
<211> 1381
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> Sl
aagcttgccg ccatggaagc cccagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca SOgataccaccg gagaaattgt gttgacacag tctccagcca ccctgtcttt gtctccaggc 120gaaagagcca ccctctcctg ccgagcaagt gaaaatgttt acagctactt agcctgçjtac 180caacagaaac ctggccagge tcctaggctc ctcatctatt ttgcaaaaac cttagcagaa 240ggaattccag ccaggttcag tggcagtgga tccgggacag acttcacfcct caccatcagc 300agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcaac atcattccga taatccgtgg 360acattoggco aagggaccaa ggtggaaatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtgga 420tctggaggag gtgggaccgg tgaggtgcag ctggtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag 480cccggagagt ctctgaagat ttcctgtaag ggatccggtt acecattcac tggcfcacaat 540atgaactggg tgcgccagat gcccgggaaa ggcctcgagt ggatgggcaa tattgatcct SOOtattatggtg gtactaccta caaccggaag ttcaagggcc aggtcactat ctccgccgac 660aagtccatca gcaccgccta cctgcaatgg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg 720tattactgtg cacgctcagt cggccctttc gactcctggg gccagggcac cctggtCact 780gtctcctctg atcaggagcc caaatcttct gacaaaactc acacatctcc accgtgccca 840gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacd tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960ccfcgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020ccgcgggagg agcaguaeaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctçccagcc 1140cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccácá ggtgtacacc 1200ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380a 1381115 120 125
<210> 52<211> 493<2X2> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 52
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu I»eu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Axg Pbe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lye Lys Pro Gly Glu Ser145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lye Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn165 170 175
Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly180 185 190
Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu210 215 220Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala225 230 235 240
Arg Ser Val Gly Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr245 250 255
Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser260 26S 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu290 295 300
Vãl Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu340 345 3S0
Thr Val Leu His Gla Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser385 390 39S 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys405 410 4,15
Gly Phe Tyr Pro Ser Aep Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thar Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn465 470 475 480His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Qly Lys485 490
<210> 53
<211> 356
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 53
gctagcgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg agagtctctg 60aagatttcct gtaagggatc cggttactca ttcactggct acaatatgaa ctgggtgcgc 120cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg ggcaatattg atccttatta tggtggtact 180acctacaacc ggaagttcaa gggccaggtc actatctccg ccgacaagtc catcagcacc 240gcctacctgc aatggagcag cctgaaggcc tcggacaccg ccatgtatta ctgtgcgcgc 300tcágtcggcc cttttgaccc ctggggccaa ggcaccctgg tcactgtctc ctcgag 356
<210> 54
<211> 143
<212> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizada<4Ó0> 54
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 3 0
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 SS 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser35 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser3.00 105 110Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Qly GIy Gly Ser Gjy Gly Gly Qly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly130 135 140
<210> 55
<211> 3S6
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<22 0>
<223> TRü-016 humanizado
<400> SS
getagcgagg tgcagctggt gcjagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg agagtctctg 60aagatttcct gtaagggatc cggttactca ttcactggct acaatatgaa ctgggtgcgc 120cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg ggcaatattg atccttatta tggtggtact 180acctacaacc ggaagttcaa gggccaggtc actatctccg ccgacaagtc catcagcacc 240gcctacctgc aatggagcag cctgaaggcc tcggacaccg ccatgtatta ctgtgcgcgc 300tcagtcggcc cttttcagca ctggggccaa ggcaccctcg tcactgtctc ctcgag 356
<210> 56
<211> 143
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 56
Met Glii Ma Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Xle Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys aln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly130 135 140
<210> 57<211> 356<212> DNA
<213> Artificial sequence<220>
<223> Humanized TRU-016<400> S7
gctagcgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg agagtctctg 60aagatttcct gtaagggatc cggttactca ttcactggct acaatatgaa ctgggtgcgc 120cagatgcccg ggaasggcct ggagtggatg ggcaatattg atccttatta tggtggtact 130acctacaacc ggaagttcaa gggccaggtc actatcfcceg ccgacaagtc catcagcacc 240gcctacctgc aatggagcag cctgaaggcc tcggacaccg ceatgtatta ctgtgcgcgc 30ctcagtcggcc cttttgacgt ctggggccaa ggcaccatgg tcactgtctc ctcgag 35e
<210> 58
<211> 143
<212> PST
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<4Ó0> 56
Met Glu Ala Pro A,la Gln teu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Xle Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro-50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu A3p Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Glti Hia His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly130 135 140
<210> 59
<211> 356
<212> DNA
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 59
gctagcgagg tgcagctggt gcagtctgga gcagaggtga aaaagcccgg agagtctctg 60aagatttcct gtaagggatc cggttactca ttcactggct acaatatgaa ctgggtgcgc 120cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg ggcaatattg atccttatta tggtggtact íaoacctacaacc ggaagttcaa gggccaggte actatctccg ccgacaagtc catcagcacc 240gcctacctgc aatggagcag cctgaaggcc tcggacaccg ccatgtafcta ctgtgcgcgc 300tcagtcggcc cttttgacat ctggggccaa ggcaccatgg tcactgtctc ctcgag 356
<210> 60
<211> 143
<212> PRT
<2i3» Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado<400> 60
Het Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Alá Lys Thr Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His His Ser100 105 110
Asp Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly130 135 140
<210> Sl<211> 11<212> PRT<213> Seqüência Artificiai<220> <223> TRU-016 humanizado<40O> 61
Arg Ala Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 62<211> 11<212> PRT<213> Seqüência Artificiai<220> <223> TRU-016 humanizado<400> 62
Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 63
<21.1 > 5
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 63
Gly Tyr Met Asii Met1 5<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
c223> TRU-016 humanizado
<400> 64
Phe Ala IjyiS Thr ij^ti AXs GXu1 5
<210> 6S<211> 18<2%2> mr<213> Seqüência Artificial<220> <223> TRU-016 humanizado<400> 65
Asa Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Thr Tyr Aen Arg Lye Phe1 S 10 15
Lys Gly
<21O> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificiai
<22 0>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 66
Gln His Hia Ser Asp Asn Pro Trp Thr1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213 > Seqüência Artificiai
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 67
ser Val Gly Pro Phe Asp Tyr1 5
<210> 68<211> 7<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> TRU-016 humanizado<400> 68Ser Val Gly Pro Phe Asu Ser 1 S<210> 69<211> 7 PRT Artificial sequence<220> <223> Huraanized TRÜ-016<400> 69Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr 1 5c210> 70<211> 23<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> TRU-016 humanizado<400> 70Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser 1 5Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20<210> 71<211> 30<212> PRT<2l3> Seqüência Artificial<220> <223> TRU-016 humanizado
10 IS
<c40Q> 71
Olu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val hye Lys Pro Gly Glu1 5 XO 15
Ser hext Lys Ile Ser Cye hys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30
<210;> 72<211> IS<222> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 72
Trp Tyr Gln Gln Lye Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 73<211> 14<212> PRT<213> Artificial sequence<220> <223> Humanized TRU-O16«too> 73
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly15 XO
<210> 74
<211> 32
<212> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<4G0> 74
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cya20 25 30
<210> 7S
<211> 32
<212> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 75
Gln vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Trp Ser Ser Leu Lya Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30
<210> 76<211> 10
<212 > PET
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<4G0> 76
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys1 5 10
<210> 77
<211> 11
<212 > PRT
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 77
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 S 10
<210> 78
<21I> 11
<2!2> PHT
<2!3> Seqüência Artificial
<220>
<223> TRU-016 humanizado
<400> 78
Trp Gly Arg Gly Thr Lgd Val Thr Val Ser Ser1 5 10

Claims (42)

1. Molécula de ligação de imunoglobulina específicapara CD37 caracterizada pelo fato de compreender uma regiãovariável da cadeia leve e uma região variável da cadeiapesada, em que:(i) a molécula de ligação liga o CD3 7 humano, e(ii) (a) a região variável da cadeia leve compreende acadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 6ou 48, ou(b) a região variável da cadeia pesada compreendea cadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQN0: 48 OU 52.
2. Molécula de ligação de imunoglobulina específicapara CD37, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a região variável da cadeia leve decompreende a seqüência de aminoácido da região variável dacadeia leve apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
3. Molécula de ligação de imunoglobulina específicapara CD37, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a região variável da cadeia pesadacompreende a seqüência de aminoácido da região variável dacadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 48 ou 52.
4. Molécula de ligação de imunoglobulina específicapara CD37, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que:(a) a região variável da cadeia leve compreende acadeia leve CDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 6ou 48; e(b) a região variável da cadeia pesada de compreende acadeia pesada CDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°:-48 ou 52.
5. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N0: 6 e aregião variável da cadeia pesada compreende a cadeia pesadaCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
6. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada em ID DE SEQ N°: 48 e aregião variável da cadeia pesada compreende a cadeia pesadaCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
7. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N°: 6 e aregião variável da cadeia pesada compreende a cadeia pesadaCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 52.
8. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N°: 48 e aregião variável da cadeia pesada compreende a cadeia pesadaCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 52.
9. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a cadeia leveCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 6 e a regiãovariável da cadeia pesada compreende a região variável dacadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
10. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a cadeia leveCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 48 e a regiãovariável da cadeia pesada compreende a região variável dacadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
11. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a cadeia leveCDRl, CDR2 e CDR3 apresentadas na ID DE SEQ N°: 6 e a regiãovariável da cadeia pesada compreende a região variável dacadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 52.
12. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a cadeia leveCDRl, CDR2 e CDR3 apresentada na ID DE SEQ N°: 4 8 e a regiãovariável da cadeia pesada compreende a região variável dacadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N0 : 52.
13. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N0: 6 e aregião variável da cadeia pesada compreende a regiãovariável da cadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
14. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N°: 48 e aregião variável da cadeia pesada compreende a regiãovariável da cadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 48.
15. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N0: 6 e aregião variável da cadeia pesada compreende a regiãovariável da cadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N°: 52.
16. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea região variável da cadeia leve compreende a regiãovariável da cadeia leve apresentada na ID DE SEQ N°: 48 e aregião variável da cadeia pesada compreende a regiãovariável da cadeia pesada apresentada na ID DE SEQ N0: 52.
17. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea molécula de ligação é um polipeptídeo Fv de cadeia única(scFv), um anticorpo ou um fragmento de ligação deste, ou umpequeno polipeptídeo imunofarmacêutico modular (SMIP).
18. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato deque a molécula de ligação é quimérica ou humanizada.
19. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quea molécula de ligação é um polipeptídeo SMIP, e a regiãovariável da cadeia leve é ligada à região variável da cadeiapesada por um peptídeo de ligação compreendendo (Gly4Ser)n,em que nél, 2, 3, 4, 5 ou 6.
20. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de queregiões variáveis de cadeias leve e pesada ligadas estãoconectadas a um domínio efetor por meio de uma dobradiçacompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo que consiste em ID DE SEQ Nos. 90, 92, 94, 96, 98, 100,-102, 104, 106, 108, 110, 112, 115, 116, 118, 120, 122, 124,-126 e 127.
21. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato deque a dobradiça compreende uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo que consiste em ID DE SEQ N°: 92 ou IDDE SEQ N°: 106.
22. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato deque o domínio efetor é um domínio IgGl.
23. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de quea molécula de ligação é um polipeptídeo SMIP compreendendouma seqüência de aminoácido de ID DE SEQ N° : 16, 80, 82 ou 84.
24. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de quea molécula de ligação é um polipeptídeo SMIP compreendendouma seqüência de aminoácido de ID DE SEQ N°: 48 ou ID DE SEQN°: 52.
25. Molécula de ligação específica para CD37, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6,-7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,-23 ou 24, caracterizada pelo fato de que a molécula deligação tem um afinidade de ligação pelo CD37 humano decerca de 0,5 nM a cerca de 10 nM.
26. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizadapelo fato de compreender uma seqüência de nucleotídeo quecodifica uma molécula de ligação de imunoglobulinaespecífica para CD37 de qualquer uma das reivindicações 1,-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,-19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25.
27. Vetor caracterizado pelo fato de compreender amolécula de ácido nucléico isolada da reivindicação 27.
28. Célula de hospedeiro caracterizada pelo fato decompreender o vetor da reivindicação 27.
29. Método para produzir uma molécula de ligação deimunoglobulina específica para CD37 caracterizado pelo fatode compreender fazer a cultura da célula hospedeira dareivindicação 28 para expressar a molécula de ligação deimunoglobulina específica para CD37, e opcionalmente isolara molécula de ligação de imunoglobulina específica para CD37da cultura.
30. Composição caracterizada pelo fato de compreendera molécula de ligação de imunoglobulina específica paraCD37, definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3,-4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,-20, 21, 22, 23, 24 ou 25, e um veículo farmaceuticamenteaceitável.
31. Uso de uma quantidade efetiva da molécula deligação de imunoglobulina específica para CD37, definida emqualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24ou 25, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento para o tratamento de uma doença associada coma atividade aberrante de célula B.
32. Uso, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a doença associada com aatividade aberrante de célula B é um câncer de célula B ouuma doença auto-imune.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a doença auto-imune é artritereumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico,doença de Crohn, síndrome de Sjogren, doença de Grave,diabetes melito tipo I, psoriase, púrpura trombocitopênicaimune, pênfigo, miopatia inflamatória idiopática oumacroglobulinemia de Waldenstrom.
34. Uso, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o câncer de célula B éIinfoma não-Hodgkin ou leucemia linfocxtica crônica.
35. Uso, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação éadministrada em uma faixa de dose de cerca de 0,01 mg/kg acerca de 50 mg/kg.
36. Uso, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação éadministrada em uma faixa de dose de cerca de 5 mg/kg acerca de 15 mg/kg.
37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato decompreender a administração ao sujeito humano de umaquantidade efetiva de uma molécula de ligação CD20especifica.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação CD20específica é um anticorpo ou um fragmento de ligação deste,ou um SMIP.
39. Uso, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação CD20específica é um anticorpo monoclonal rituximab ou um SMIPapresentado na ID DE SEQ N0 4.
40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de aindacompreender a administração ao sujeito humano de umaquantidade efetiva de um anticorpo específico para CD37 ouum fragmento de ligação deste.
41. Uso, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico paraCD37 tem um domínio de ligação humanizado de um anticorposelecionado do grupo G28-1, MB371, BL14, NMN46, IP024, HHl e WR17.
42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de aindacompreender a administração ao sujeito humano de umaquantidade efetiva de uma citocina, uma quimiocina, um fatorde crescimento, um agente quimioterápico, um agenteradioterápico ou um agente imunossupressor.
BRPI0614184A 2005-07-25 2006-07-25 Redução de células b com o uso de moléculas de ligação específicas para cd37 e específicas para cd20 BRPI0614184A8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70249905P 2005-07-25 2005-07-25
US60/702,499 2005-07-25
US80059506P 2006-05-16 2006-05-16
US60/800,595 2006-05-16
PCT/US2006/029038 WO2007014278A2 (en) 2005-07-25 2006-07-25 B-cell reduction using cd37-specific and cd20-specific binding molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0614184A2 true BRPI0614184A2 (pt) 2011-03-15
BRPI0614184A8 BRPI0614184A8 (pt) 2017-10-10

Family

ID=37683960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0614184A BRPI0614184A8 (pt) 2005-07-25 2006-07-25 Redução de células b com o uso de moléculas de ligação específicas para cd37 e específicas para cd20

Country Status (29)

Country Link
US (7) US10307481B2 (pt)
EP (4) EP2295080A3 (pt)
JP (3) JP5740076B2 (pt)
KR (1) KR101251157B1 (pt)
CN (2) CN101282745B (pt)
AU (1) AU2006272555B2 (pt)
BR (1) BRPI0614184A8 (pt)
CA (1) CA2616395C (pt)
CO (1) CO6160337A2 (pt)
CR (1) CR9761A (pt)
DK (2) DK2298815T3 (pt)
EC (1) ECSP088133A (pt)
ES (2) ES2460517T3 (pt)
HK (3) HK1155761A1 (pt)
HR (2) HRP20140338T1 (pt)
HU (1) HUE026303T2 (pt)
IL (2) IL188345A (pt)
NI (1) NI200800032A (pt)
NO (1) NO20080217L (pt)
NZ (3) NZ606294A (pt)
PL (2) PL2298815T3 (pt)
PT (2) PT1912675E (pt)
RS (2) RS53318B (pt)
RU (1) RU2423381C2 (pt)
SG (2) SG10201403526YA (pt)
SI (2) SI2298815T1 (pt)
UA (1) UA97469C2 (pt)
WO (1) WO2007014278A2 (pt)
ZA (1) ZA200800692B (pt)

Families Citing this family (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US8563592B2 (en) 2001-11-01 2013-10-22 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Bladder cancer treatment and methods
AU2002350115A1 (en) 2001-11-01 2003-05-12 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Medical compositions for intravesical treatment of bladder cancer
ES2460517T3 (es) 2005-07-25 2014-05-13 Emergent Product Development Seattle, Llc Reducción de células b mediante el uso de moléculas de unión específica a cd37 y de unión específica a cd20
EP1986641A1 (en) * 2006-02-09 2008-11-05 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Bladder cancer treatment involving determination of tumor enzyme level
ATE509033T1 (de) 2006-03-20 2011-05-15 Univ California Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting
KR101571027B1 (ko) * 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
MX2009004170A (es) * 2006-10-24 2009-06-26 Trubion Pharmaceuticals Inc Materiales y metodos para inmunoglicoproteinas mejoradas.
US7846434B2 (en) * 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
RU2010100638A (ru) * 2007-06-12 2011-07-20 УАЙТ ЭлЭлСи (US) Композиции и способы лечения, направленные против cd20
PE20120259A1 (es) * 2007-08-09 2012-04-04 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-cd37
US8940298B2 (en) * 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
BRPI0817250A2 (pt) 2007-09-26 2014-06-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorpo anti-receptor da il-6.
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
EP2740490A1 (en) * 2007-10-03 2014-06-11 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to PSMA
US20090169550A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
CN102099377A (zh) * 2008-04-11 2011-06-15 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合
EP3521311A1 (en) 2008-04-11 2019-08-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US20090269339A1 (en) * 2008-04-29 2009-10-29 Genentech, Inc. Responses to immunizations in rheumatoid arthritis patients treated with a cd20 antibody
EP2313435A4 (en) * 2008-07-01 2012-08-08 Aveo Pharmaceuticals Inc FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (FGFR3) BINDING PROTEINS
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
KR20110083730A (ko) * 2008-11-13 2011-07-20 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 Ｃｄ37 면역치료제 병용 요법 및 이의 용도
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
EP3495000A1 (en) * 2009-02-17 2019-06-12 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
IL297588A (en) 2009-11-02 2022-12-01 Univ Washington Therapeutic nuclease preparations and methods
MX354143B (es) 2009-12-02 2018-02-14 Imaginab Inc Minicuerpos j591 y diacuerpos-cys para apuntar con especificidad de objetivo a un antígeno de membrana específico para próstata de humano (psma) y métodos para su uso.
NO331080B1 (no) * 2010-01-29 2011-09-26 Nordic Nanovector As Radioimmunkonjugater, farmasøytiske sammensetninger og kit omfattende det samme og anvendelse derav
US9260529B2 (en) 2010-02-24 2016-02-16 The University Of Washington Through Its Center For Commercialization Molecules that bind CD180, compositions and methods of use
BR112012023010A8 (pt) * 2010-03-12 2017-12-26 Immunogen Inc Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a cd37, imunoconjugado compreendendo os mesmos, uso dos referidos anticorpo, fragmento e imunoconjugado, composição compreendendo os mesmos, kit, célula isolada, bem como método in vitro para inibir o crescimento de uma célula que expressa cd37
US20120189618A1 (en) * 2010-07-16 2012-07-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Superior efficacy of cd37 antibodies in cll blood samples
US8637641B2 (en) 2010-07-29 2014-01-28 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EA201391342A1 (ru) * 2011-04-01 2014-11-28 Иммьюноджен, Инк. Cd37-связывающие молекулы и их иммуноконъюгаты
AU2012245260B2 (en) 2011-04-22 2016-09-08 Aptevo Research And Development Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
EP2704737B1 (en) 2011-04-29 2018-01-10 University of Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
BR112014014258A2 (pt) * 2011-12-13 2020-10-27 Nordic Nanovector As. molécula de anticorpo que se liga a cd37 humano; anticorpo; molécula de dna; vetor de expressão; célula hospedeira; método para produzir um anticorpo; composição farmacêutica; método de esgotamento de células b que expressam cd37 dentre uma população de células; radioimunoconjugado que se liga a cd37 humano; método de tratamento de uma malignidade de célula b; kit para a produção do radioimunoconjugado; e preparação injetável de anticorpo hh1 quimérico ou humanizado para uso no pré-tratamento de uma malignidade de célula b
JP2015516980A (ja) * 2012-04-26 2015-06-18 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｄ３７抗体とベンダムスチンとの併用
US8992915B2 (en) 2012-05-16 2015-03-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of CD37 antibodies with ICE
JP2015517512A (ja) * 2012-05-16 2015-06-22 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｄ３７抗体の更なる薬剤との併用
CN105492023A (zh) * 2012-12-21 2016-04-13 加利福尼亚大学董事会 Tspan 33是用于治疗b细胞霍奇金淋巴瘤的抗体靶向疗法的候选物
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10544187B2 (en) 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP6335284B2 (ja) * 2013-06-07 2018-05-30 ノルディック ナノベクター エーエスエー 抗原発現を上方制御するための方法
US10228452B2 (en) 2013-06-07 2019-03-12 Hand Held Products, Inc. Method of error correction for 3D imaging device
AU2014296219A1 (en) 2013-08-01 2016-02-25 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to CD37 proteins
CN114004655A (zh) * 2013-10-30 2022-02-01 环联公司 用于度量营销与广告活动的有效性的系统及方法
SI3063275T1 (sl) 2013-10-31 2020-02-28 Resolve Therapeutics, Llc Terapevtske fuzije nukleaza-albumin in postopki
AP2016009475A0 (en) 2014-03-28 2016-09-30 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
MX2016016617A (es) * 2014-06-16 2017-03-23 Mayo Foundation Tratamiento de mielomas.
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PE20171324A1 (es) 2014-11-26 2017-09-11 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y a antigenos tumorales
MX2017006918A (es) 2014-11-26 2018-01-25 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38.
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US20170000900A1 (en) 2015-06-08 2017-01-05 Immunogen, Inc. Anti-cd37 immunoconjugate and anti-cd20 antibody combinations
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
EP3341414A4 (en) 2015-08-28 2019-03-27 Debiopharm International SA ANTIBODIES AND ASSAYS FOR DETECTION OF CD37
CA2999138C (en) 2015-09-21 2024-05-21 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
CN108602889A (zh) * 2015-12-22 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 医治急性成淋巴细胞性白血病的双特异性抗cd20/抗cd3抗体
RU2767357C2 (ru) 2016-06-14 2022-03-17 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018071919A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. IL15/IL15Rα HETERODIMERIC FC-FUSION PROTEINS
WO2018083633A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-cd37 immunoconjugate therapy
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN110366564B (zh) * 2016-12-23 2023-07-07 瑞美德生物医药科技有限公司 使用与程序性死亡1(pd-1)结合的抗体的免疫疗法
US11578115B2 (en) 2017-01-10 2023-02-14 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EP3600416B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US20200270359A1 (en) * 2017-03-31 2020-08-27 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
CN111132733A (zh) 2017-06-30 2020-05-08 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白
CN112272563A (zh) 2017-11-08 2021-01-26 Xencor股份有限公司 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200100098A (ko) 2017-12-19 2020-08-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
WO2019195623A2 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
ES2714952B2 (es) * 2018-05-18 2020-07-10 Productos Agrovin S A Procedimiento y equipo para el remontado durante la maceracion de la vendimia
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
WO2019246546A1 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting cd37 and cd19
WO2020004337A1 (ja) * 2018-06-27 2020-01-02 国立大学法人名古屋大学 Ｃｄ３７特異的キメラ抗原レセプター
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
WO2020106754A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CN113980130B (zh) * 2020-07-27 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
IL305736A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
CA3235358A1 (en) * 2021-10-18 2023-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-cd37 antibody-drug conjugate
WO2023133488A1 (en) * 2022-01-06 2023-07-13 The General Hospital Corporation Methods of cell ablation

Family Cites Families (418)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA737247B (en) 1972-09-29 1975-04-30 Ayerst Mckenna & Harrison Rapamycin and process of preparation
US3927193A (en) 1973-05-18 1975-12-16 Hoffmann La Roche Localization of tumors by radiolabelled antibodies
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
US4348376A (en) 1980-03-03 1982-09-07 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled anti-CEA antibody
US4460561A (en) 1980-03-03 1984-07-17 Goldenberg M David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4460559A (en) 1980-03-03 1984-07-17 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4316885A (en) 1980-08-25 1982-02-23 Ayerst, Mckenna And Harrison, Inc. Acyl derivatives of rapamycin
US4468457A (en) 1981-06-01 1984-08-28 David M. Goldenberg Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4818709A (en) 1983-01-21 1989-04-04 Primus Frederick J CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay
US4460459A (en) 1983-02-16 1984-07-17 Anschutz Mining Corporation Sequential flotation of sulfide ores
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4624846A (en) 1983-07-29 1986-11-25 Immunomedics, Inc. Method for enhancing target specificity of antibody localization and clearance of non-target diagnostic and therapeutic principles
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4782840A (en) 1984-03-02 1988-11-08 Neoprobe Corporation Method for locating, differentiating, and removing neoplasms
US4906562A (en) 1984-12-21 1990-03-06 Oncogen Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas
US4935495A (en) 1984-12-21 1990-06-19 Oncogen Monoclonal antibodies to the L6 glycolipid antigenic determinant found on human non-small cell lung carcinomas
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5656266A (en) 1985-11-19 1997-08-12 Schering Corporation Method of using interleukin-4
US4650803A (en) 1985-12-06 1987-03-17 University Of Kansas Prodrugs of rapamycin
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US6121424A (en) 1991-11-25 2000-09-19 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US4932412A (en) 1986-12-18 1990-06-12 Immunomedics, Inc. Intraoperative and endoscopic tumor detection and therapy
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5217713A (en) 1988-12-27 1993-06-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cytotoxic bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
US5098833A (en) 1989-02-23 1992-03-24 Genentech, Inc. DNA sequence encoding a functional domain of a lymphocyte homing receptor
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5897861A (en) 1989-06-29 1999-04-27 Medarex, Inc. Bispecific reagents for AIDS therapy
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
US5980896A (en) 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
EP0487587A1 (en) 1989-08-18 1992-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
ATE152174T1 (de) 1989-09-20 1997-05-15 Abbott Lab Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen
US6018031A (en) 1989-10-20 2000-01-25 Trustees Of Dartmouth College Binding agents specific for IgA receptor
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0512064B1 (en) 1990-01-23 1997-06-18 Tanox Biosystems, Inc. Extracellular segments of human ige immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor
CA2077348A1 (en) 1990-03-02 1991-09-03 Stephen D. Gillies Antibody constructs with enhanced binding affinity
US6641809B1 (en) 1990-03-26 2003-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
US20030219446A1 (en) 1990-03-26 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Ligand for CD28 receptor on B cells and methods
GB9009106D0 (en) 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
WO1992000092A1 (en) 1990-07-02 1992-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Ligand for cd28 receptor on b cells and methods
US5023264A (en) 1990-07-16 1991-06-11 American Home Products Corporation Rapamycin oximes
US5023263A (en) 1990-08-09 1991-06-11 American Home Products Corporation 42-oxorapamycin
US5130307A (en) 1990-09-28 1992-07-14 American Home Products Corporation Aminoesters of rapamycin
US5221670A (en) 1990-09-19 1993-06-22 American Home Products Corporation Rapamycin esters
US5233036A (en) 1990-10-16 1993-08-03 American Home Products Corporation Rapamycin alkoxyesters
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
WO1992017198A1 (en) 1991-03-28 1992-10-15 The Regents Of The University Of Minnesota Dna and amino acid sequence specific for natural killer cells
US5120842A (en) 1991-04-01 1992-06-09 American Home Products Corporation Silyl ethers of rapamycin
US5100883A (en) 1991-04-08 1992-03-31 American Home Products Corporation Fluorinated esters of rapamycin
US5118678A (en) 1991-04-17 1992-06-02 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5118677A (en) 1991-05-20 1992-06-02 American Home Products Corporation Amide esters of rapamycin
WO1992021755A1 (en) 1991-05-31 1992-12-10 Genentech, Inc. Treatment of hiv-associated immune thrombocytopenic purpura
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
AU661854B2 (en) 1991-06-27 1995-08-10 Bristol-Myers Squibb Company CTL4A receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
WO1993003709A1 (en) 1991-08-16 1993-03-04 Vical, Inc. Composition and method for treating cystic fibrosis
US5162333A (en) 1991-09-11 1992-11-10 American Home Products Corporation Aminodiesters of rapamycin
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5151413A (en) 1991-11-06 1992-09-29 American Home Products Corporation Rapamycin acetals as immunosuppressant and antifungal agents
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US6472510B1 (en) 1992-02-14 2002-10-29 Bristol-Myers Squibb Company CD40 receptor ligands
IL104684A0 (en) 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
US5177203A (en) 1992-03-05 1993-01-05 American Home Products Corporation Rapamycin 42-sulfonates and 42-(N-carboalkoxy) sulfamates useful as immunosuppressive agents
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
EP0644946A4 (en) 1992-06-10 1997-03-12 Us Health VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION.
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5256790A (en) 1992-08-13 1993-10-26 American Home Products Corporation 27-hydroxyrapamycin and derivatives thereof
ES2144440T3 (es) 1992-08-18 2000-06-16 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen.
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
ZA936260B (en) 1992-09-09 1994-03-18 Smithkline Beecham Corp Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man
US6066718A (en) 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
GB9221220D0 (en) 1992-10-09 1992-11-25 Sandoz Ag Organic componds
ZA937553B (en) 1992-10-12 1994-05-03 Agen Ltd Clot directed anticoagulant process for making same and methods of use
US5480988A (en) 1992-10-13 1996-01-02 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5302584A (en) 1992-10-13 1994-04-12 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5434260A (en) 1992-10-13 1995-07-18 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5489680A (en) 1992-10-13 1996-02-06 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5411967A (en) 1992-10-13 1995-05-02 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5480989A (en) 1992-10-13 1996-01-02 American Home Products Corporation Carbamates of rapamycin
US5262423A (en) 1992-10-29 1993-11-16 American Home Products Corporation Rapamycin arylcarbonyl and alkoxycarbonyl carbamates as immunosuppressive and antifungal agents
US5258389A (en) 1992-11-09 1993-11-02 Merck & Co., Inc. O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynylrapamycin derivatives
ATE196606T1 (de) 1992-11-13 2000-10-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörpern, die gegen ein differenzierung-antigen gerichtet sind, dessen expression auf menschliche b lymphozyt beschränkt ist, für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5260300A (en) 1992-11-19 1993-11-09 American Home Products Corporation Rapamycin carbonate esters as immuno-suppressant agents
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
US6482919B2 (en) 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5597707A (en) 1993-04-15 1997-01-28 Bristol-Myers Squibb Company Tumor associated antigen recognized by the murine monoclonal antibody L6, its oligonucleotide sequence and methods for their use
US5504091A (en) 1993-04-23 1996-04-02 American Home Products Corporation Biotin esters of rapamycin
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
US5795572A (en) 1993-05-25 1998-08-18 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies and FV specific for CD2 antigen
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
DK0721469T3 (da) 1993-09-02 2000-05-01 Dartmouth College Anti-gp39-antistoffer og anvendelse deraf
US5869049A (en) 1993-09-02 1999-02-09 Trustees Of Dartmouth College Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
GB9412166D0 (en) 1993-09-22 1994-08-10 Medical Res Council Retargetting antibodies
CA2169620A1 (en) 1993-09-22 1995-03-30 Gregory Paul Winter Retargeting antibodies
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5373014A (en) 1993-10-08 1994-12-13 American Home Products Corporation Rapamycin oximes
US5391730A (en) 1993-10-08 1995-02-21 American Home Products Corporation Phosphorylcarbamates of rapamycin and oxime derivatives thereof
US5385910A (en) 1993-11-22 1995-01-31 American Home Products Corporation Gem-distributed esters of rapamycin
US5385908A (en) 1993-11-22 1995-01-31 American Home Products Corporation Hindered esters of rapamycin
US5385909A (en) 1993-11-22 1995-01-31 American Home Products Corporation Heterocyclic esters of rapamycin
CN1046944C (zh) 1993-12-17 1999-12-01 山道士有限公司 雷怕霉素类衍生物
US5389639A (en) 1993-12-29 1995-02-14 American Home Products Company Amino alkanoic esters of rapamycin
US6380369B1 (en) 1994-01-27 2002-04-30 Human Genome Sciences, Inc. Human DNA mismatch repair proteins
JPH09509054A (ja) 1994-02-01 1997-09-16 アメリカ合衆国 抗体部分および非抗体部分を含む融合タンパク質
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
RU2170257C2 (ru) 1994-03-17 2001-07-10 Мерк Патент Гмбх Анти-эфрр одноцепочечный fv, химерное анти-эфрр антитело и способ его получения, фармацевтическая композиция для лечения опухолей, средство для диагностики локализации или оценки роста опухоли
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
ATE228166T1 (de) 1994-05-02 2002-12-15 Bernd Groner Bifunktionelles protein, herstellung und verwendung
US5945273A (en) 1997-06-03 1999-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Human oxalyl-coa decarboxylase
US5463048A (en) 1994-06-14 1995-10-31 American Home Products Corporation Rapamycin amidino carbamates
US5888773A (en) 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
DK0807183T3 (da) 1994-08-26 2001-03-05 Aventis Pharma Gmbh Genterapi af sygdomme, der fremkaldes af immunsystemet, ved hjælp af et cellespecifikt aktivt stof, der reguleres af cellec
US6380169B1 (en) 1994-08-31 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Metal complex containing oligonucleoside cleavage compounds and therapies
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5491231A (en) 1994-11-28 1996-02-13 American Home Products Corporation Hindered N-oxide esters of rapamycin
US5563145A (en) 1994-12-07 1996-10-08 American Home Products Corporation Rapamycin 42-oximes and hydroxylamines
US6383814B1 (en) 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
CZ292233B6 (cs) 1995-06-09 2003-08-13 Novartis Ag Deriváty rapamycinu a jejich použití jako léčiv
GB9518220D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Checkpoint gene
US5866330A (en) 1995-09-12 1999-02-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for serial analysis of gene expression
JPH11513669A (ja) 1995-10-13 1999-11-24 アメリカ合衆国 ジスルフィド安定化抗体フラグメントを含む免疫毒素
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
US6379966B2 (en) 1999-02-26 2002-04-30 Mirus Corporation Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US5780462A (en) 1995-12-27 1998-07-14 American Home Products Corporation Water soluble rapamycin esters
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
GB2310894A (en) 1996-03-06 1997-09-10 Clive William Efford Multi-engine drive unit
EP1186300A1 (en) 1996-03-20 2002-03-13 Bristol-Myers Squibb Company Pharmaceutical compositions useful for inhibiting an immune response by blocking the GP39/CD40 and CTLA4/CD28/B7 pathways
DK0892643T4 (da) 1996-03-20 2009-12-14 Bristol Myers Squibb Co Fremgangsmåder til inhibering af et immunrespons ved blokering af GP39/CD40- og CTLA4/CD28/B7-banerne og præparater til anvendelse derved
DE19613691A1 (de) 1996-04-05 1997-10-09 Boehringer Ingelheim Int Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
DE69740038D1 (pt) 1996-07-12 2010-12-16 Genentech Inc
WO1998002441A2 (en) 1996-07-12 1998-01-22 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Non immunosuppressive antifungal rapalogs
ATE253593T1 (de) 1996-07-16 2003-11-15 Plueckthun Andreas Prof Dr Immunglobulin-superfamilie domainen und fragmente mit erhöhter löslichkeit
US5846948A (en) 1996-08-30 1998-12-08 Arch Development Corporation Herpes simplex virus ORF P is a repressor of viral protein synthesis
GB9618477D0 (en) 1996-09-04 1996-10-16 Univ Leeds Gene therapy
US6368598B1 (en) 1996-09-16 2002-04-09 Jcrt Radiation Oncology Support Services, Inc. Drug complex for treatment of metastatic prostate cancer
US5972361A (en) 1996-10-25 1999-10-26 The Procter & Gamble Company Cleansing products
US5858753A (en) 1996-11-25 1999-01-12 Icos Corporation Lipid kinase
DE19651443A1 (de) 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
EP0860445A1 (en) 1997-02-18 1998-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft New nucleotide sequences for the cell cycle regulated expression of structural genes
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
IL131701A (en) 1997-03-11 2005-03-20 Aeterna Zentaris Inc Compositions for treating tumors containing shark cartilage extracts and anti-neoplastic agents
CA2284211A1 (en) 1997-03-20 1998-09-24 University Of Washington Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6384203B1 (en) 1999-05-12 2002-05-07 Immunex Corporation Family of immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-like receptors (LIR)
US6217900B1 (en) 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
TW557297B (en) 1997-09-26 2003-10-11 Abbott Lab Rapamycin analogs having immunomodulatory activity, and pharmaceutical compositions containing same
US6383746B1 (en) 1997-10-23 2002-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Functional promoter for CCR5
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6383811B2 (en) 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
DK1049787T3 (da) 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
KR20010034512A (ko) 1998-02-19 2001-04-25 베렌슨, 론 림프구 활성화 조절을 위한 조성물 및 그 방법
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
BR9908226A (pt) 1998-02-25 2000-10-24 Lexigen Pharm Corp Melhoramento da meia vida de circulação de proteìnas de fusão com base em anticorpo
US6383481B1 (en) 1998-03-30 2002-05-07 Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. Method for transplantation of hemopoietic stem cells
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054484A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
HUP0102209A2 (hu) 1998-04-22 2001-09-28 Genvec, Inc. Eljárás adenovírus hatékony tisztítására
GB9809280D0 (en) 1998-04-30 1998-07-01 Rpms Technology Ltd Immunosupression
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
WO1999061630A2 (en) 1998-05-26 1999-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric molecules comprising an extracellular ligand binding domain of a receptor and an ige fc or constant region, and their use in an assay system
US7052872B1 (en) 1999-06-22 2006-05-30 Immunomedics, Inc. Bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
IL140700A0 (en) 1998-07-13 2002-02-10 Univ Texas Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US6818213B1 (en) 1998-07-13 2004-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
AU5728999A (en) 1998-07-28 2000-02-21 Micromet Ag Heterominibodies
HU228180B1 (hu) 1998-08-11 2013-01-28 Biogen Idec Inc Anti-CD20-ellenanyag alkalmazása B-sejtes limfómák kombinációs terápiájára
US6383794B1 (en) 1998-08-24 2002-05-07 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
US6472179B2 (en) 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6197294B1 (en) 1998-10-26 2001-03-06 Neurotech S.A. Cell surface molecule-induced macrophage activation
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
MXPA01004649A (es) 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamiento con anticuerpo quimerico anti-cd20 para pacientes que reciben transplantes de medula osea o celulas madre de sangre periferica.
DK1616572T3 (da) 1998-11-09 2010-12-06 Biogen Idec Inc Kimært anti-CD20-antistof, rituxan, til anvendelse i behandling af kronisk lymfatisk leukæmi
US6380371B1 (en) 1998-12-10 2002-04-30 The Regents Of The University Of California Endoglycan: a novel protein having selectin ligand and chemokine presentation activity
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
EP1151002A4 (en) 1999-01-29 2002-05-02 Imclone Systems Inc KDR-SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF
US6383276B1 (en) 1999-03-12 2002-05-07 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
US6383753B1 (en) 1999-03-31 2002-05-07 Regents Of The University Of Michigan Yeast mammalian regulators of cell proliferation
WO2000064954A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Vanderbilt University Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis
GB9909925D0 (en) 1999-04-29 1999-06-30 Pharmacia & Upjohn Spa Combined preparations comprising anthracycline derivatives
US6358596B1 (en) * 1999-04-27 2002-03-19 The Standard Register Company Multi-functional transparent secure marks
AU777970C (en) 1999-05-07 2006-08-17 F. Hoffman-La Roche Ag Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
US8119101B2 (en) 1999-05-10 2012-02-21 The Ohio State University Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
MXPA01011845A (es) 1999-05-19 2002-06-21 Lexigen Pharm Corp Expresion y exportacion de proteinas de interferon-alfa como proteinas de fusion fc.
EP1194167B1 (en) 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
US6380382B1 (en) 1999-06-30 2002-04-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Gene encoding a protein having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
JP2003528805A (ja) 1999-07-12 2003-09-30 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｃｄ２０に結合するアンタゴニストを用いた異種抗原に対する免疫応答のブロッキング
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
IL147638A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen
CN1268645C (zh) 1999-07-30 2006-08-09 米德列斯公司 含有抗－fc受体结合剂的治疗化合物
AU784971B2 (en) 1999-08-11 2006-08-10 Biogen Inc. Treatment of patients having non-Hodgkins lymphoma with bone marrow involvement with anti-CD20 antibodies
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
WO2001013945A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Biocrystal Ltd. Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion of a disease condition comprising multiple sclerosis
AU783158B2 (en) 1999-08-24 2005-09-29 Ariad Pharmaceuticals, Inc. 28-epirapalogs
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
WO2002004021A1 (en) 2000-07-12 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of b cell malignancies using combination of b cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
IL149500A0 (en) 1999-11-08 2002-11-10 Idec Pharma Corp Treatment of b cell malignancies using anti-cd40l antibodies in combination with anti-cd20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
EP1257197A4 (en) 2000-02-25 2008-07-16 Health Research Inc METHOD FOR THE TRANSDERMAL SAMPLING OF ANALYTES
JP2003528155A (ja) 2000-03-24 2003-09-24 カイロン コーポレイション Ｃｄ２０に対する抗体とインターロイキン−２との組み合わせを用いる非ホジキンリンパ腫の治療方法
US6896885B2 (en) 2000-03-31 2005-05-24 Biogen Idec Inc. Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-CD20 for treatment of B cell lymphoma
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6667300B2 (en) 2000-04-25 2003-12-23 Icos Corporation Inhibitors of human phosphatidylinositol 3-kinase delta
KR100785363B1 (ko) 2000-04-25 2007-12-18 이코스 코포레이션 인간 포스파티딜-이노시톨 3-키나제 델타의 억제제
EP1939203B1 (en) 2000-04-25 2014-11-19 ICOS Corporation Inhibitors of human phosphatidyl-inositol 3-kinase delta isoform
CN101130078A (zh) 2000-04-25 2008-02-27 拜奥根Idec公司 瑞图希单抗的鞘内施用,用于中枢神经系统淋巴瘤的治疗
US20040180046A1 (en) 2000-04-26 2004-09-16 Jeff Himawan Bispecific molecules and uses thereof
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
JP5007409B2 (ja) 2000-05-08 2012-08-22 セルデックス リサーチ コーポレーション 樹状細胞に対するヒトモノクローナル抗体
CA2409991A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Imclone Systems Incorporated Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
JP2003535907A (ja) 2000-06-22 2003-12-02 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 抗体誘導性細胞溶解を促進し、そして癌を処置するための方法
JP4955185B2 (ja) 2000-06-29 2012-06-20 アボット・ラボラトリーズ 二重特異性抗体ならびに作製方法および使用方法
IL152940A0 (en) 2000-07-19 2003-06-24 Orbotech Ltd Apparatus and method for electrical testing of electrical circuits
US20020025317A1 (en) 2000-07-20 2002-02-28 Schering Ag Bispecific monoclonal antibodies to IL-12 and IL-18
WO2002007925A1 (en) 2000-07-24 2002-01-31 Florida State University Research Foundation Method and apparatus for removal of minute particles from a surface using thermophoresis to prevent particle redeposition
US20050054000A1 (en) 2000-08-11 2005-03-10 Stefan Dubel Fv constructs with an influenceable affinity for a substance that is to be linked
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
CN101684158A (zh) 2001-01-17 2010-03-31 特鲁比昂药品公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
NZ527283A (en) 2001-01-29 2006-03-31 Biogen Idec Inc Modified antibodies and methods of use
JP4463475B2 (ja) 2001-01-31 2010-05-19 バイオジェン アイデック インコーポレイテッド 腫瘍疾患の治療における免疫調節性抗体の使用
CA2437814C (en) 2001-02-12 2008-05-13 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to fc alpha receptor (cd89)
PL206701B1 (pl) 2001-03-07 2010-09-30 Merck Patent Gmbh Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego
AU2002240751A1 (en) 2001-03-09 2002-09-24 William Herman Targeted ligands
JP2005500018A (ja) 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション ＧｎＴＩＩＩと同時発現する組換え抗体
ATE507839T1 (de) 2001-04-02 2011-05-15 Genentech Inc Kombinationstherapie
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
US20030008923A1 (en) 2001-06-01 2003-01-09 Wyeth Antineoplastic combinations
CZ200438A3 (cs) 2001-06-13 2004-06-16 Genmab A/S Název neuveden
JP2005515161A (ja) 2001-06-14 2005-05-26 インターミューン インコーポレイテッド γ−インターフェロンおよびＢ細胞特異的抗体の併用療法
US20020196854A1 (en) 2001-06-15 2002-12-26 Jongil Kim Fast video encoder using adaptive hierarchical video processing in a down-sampled domain
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US20030026780A1 (en) 2001-07-18 2003-02-06 Hood Leroy E. Innate immunity mediated methods of treating pathological conditions
EP1427829A4 (en) 2001-08-31 2005-10-12 Abmaxis Inc MULTIVALENT PROTEIN CONJUGATE WITH SEVERAL LIGANDEN BINDING RECORDORDOMAS
ATE346866T1 (de) 2001-09-14 2006-12-15 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, tandem-fv- antikörper
EP1448584B1 (en) 2001-09-26 2010-05-19 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of Health and Human Services Mutated anti-cd22 antibodies with increased affinity to cd22-expressing leukemia cells
JP2005510470A (ja) 2001-09-28 2005-04-21 エリューシス セラピューティクス，インコーポレーテッド 二重特異性分子を用いた癌の予防、診断、および治療の方法ならびに組成物
US20030077282A1 (en) 2001-10-12 2003-04-24 Bigler Michael Eric Use of bispecific antibodies to regulate immune responses
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
ES2283368T3 (es) 2001-11-14 2007-11-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos biespecificos anti-cd19 y anti-cd16 y usos de los mismos.
KR20040091616A (ko) 2001-12-26 2004-10-28 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 Ｖｈ 및 ｖｌ 도메인으로부터 멀티특이성, 다원자가제제를 제조하는 방법
CA2476166C (en) 2002-02-14 2011-11-15 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US8361464B2 (en) 2002-03-01 2013-01-29 Immunomedics, Inc. Anthracycline-Antibody Conjugates for Cancer Therapy
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US20030219436A1 (en) 2002-03-15 2003-11-27 Ledbetter Jeffrey A. Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein
US7332580B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
CA2379586A1 (en) 2002-04-10 2003-10-10 William Herman Fluid targeted ligands
WO2003091424A1 (fr) 2002-04-26 2003-11-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de criblage d'un anticorps agoniste
WO2003106622A2 (en) 2002-05-30 2003-12-24 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods for treatment of acute lymphocytic leukemia
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
US7425619B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
JP4790413B2 (ja) 2002-10-08 2011-10-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 抗体療法
MXPA05003796A (es) 2002-10-10 2006-02-22 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anti-erb-b biespecificos y su uso en terapia de tumor.
RS20050300A (en) 2002-10-16 2007-08-03 Euro-Celtique S.A., Antibodies that bind cell-associated ca 125/0772p and methods of use thereof
ES2744275T3 (es) 2002-10-17 2020-02-24 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20 para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple
SI1572744T1 (sl) 2002-12-16 2010-09-30 Genentech Inc Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
EP1583503A4 (en) 2002-12-20 2006-08-09 Biogen Idec Inc POLYVALENT LYMPHOTOXIN BETA RECEPTOR AGONISTS AND THERAPEUTIC USE THEREOF
JP4898120B2 (ja) 2002-12-20 2012-03-14 アボット バイオセラピューティクス コーポレイション Ｇｐｒ６４に対する抗体とその利用法
BR0316882A (pt) 2002-12-23 2005-10-25 Bristol Myers Squibb Co Melhora na qualidade de produtos em processos de cultura de células de mamìferos para a produção de proteìnas
CA2414148A1 (en) 2002-12-30 2004-06-30 William Herman Targeted ligands
WO2004072266A2 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
JP3803790B2 (ja) 2003-02-17 2006-08-02 株式会社東北テクノアーチ 新規なダイアボディ型二重特異性抗体
AU2004215489B2 (en) 2003-02-25 2010-07-15 Nykode Therapeutics ASA Modified antibody
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
WO2005021710A2 (en) 2003-06-02 2005-03-10 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
CN1279056C (zh) 2003-06-06 2006-10-11 马菁 肿瘤相关抗原sm5－1的特异性抗体及其应用
JP5091476B2 (ja) 2003-06-27 2012-12-05 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 均質な抗体溶液の生成のための疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはヒンジ領域改変の使用
KR20060041205A (ko) 2003-07-01 2006-05-11 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 양특이성 항체들의 다가 담체들
US6864837B2 (en) 2003-07-18 2005-03-08 Ems Technologies, Inc. Vertical electrical downtilt antenna
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
WO2005018671A1 (ja) 2003-08-21 2005-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 癌転移阻害剤
ATE493441T1 (de) 2003-10-16 2011-01-15 Micromet Ag Multispezifische deimmunisierte cd3-bindende moleküle
AU2004282984B2 (en) 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
EP1718677B1 (en) 2003-12-19 2012-04-18 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
RU2006126541A (ru) 2003-12-22 2008-01-27 Новартис АГ (CH) Биомаркеры чуствительности пролиферативных заболеваний к ингибиторам mtor
ES2364147T3 (es) 2004-01-16 2011-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polipéptidos de fusión capaces de activar receptores.
KR20060131892A (ko) 2004-02-16 2006-12-20 마이크로메트 에이지 덜 면역원성인 결합 분자
AR047988A1 (es) 2004-03-11 2006-03-15 Wyeth Corp Combinaciones antineoplásicas de cci-779 y rituximab
WO2005095460A2 (en) 2004-03-30 2005-10-13 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Bi-specific antibodies for targeting cells involved in allergic-type reactions, compositions and uses thereof
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
JP2008508860A (ja) 2004-06-03 2008-03-27 メダレツクス・インコーポレーテツド Ｆｃγ受容体１（ＣＤ６４）に対するヒトモノクローナル抗体
AR049200A1 (es) 2004-06-04 2006-07-05 Genentech Inc Metodo para tratar esclerosis multiple con una composicion que contiene un anticuerpo cd20
AU2005251764A1 (en) 2004-06-04 2005-12-22 Genentech, Inc. Method for treating lupus
US20060008415A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
PT2311874T (pt) 2004-07-22 2017-08-25 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Moléculas de ligação
US20080181892A1 (en) 2004-08-11 2008-07-31 Trubion Pharmaceuticals Binding Domain Fusion Protein
JP2008511337A (ja) 2004-09-02 2008-04-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド ヘテロ多量体分子
US7393662B2 (en) 2004-09-03 2008-07-01 Centocor, Inc. Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses
EP1812060A2 (en) 2004-10-05 2007-08-01 Genentech, Inc. Method for treating vasculitis
ATE525400T1 (de) 2004-12-01 2011-10-15 Trion Pharma Gmbh Verwendung trifunktionaler antikörper zur risikoreduzierung von gvhd in einer allogenetischen anti-tumor zelltherapie
EP1819731A4 (en) 2004-12-08 2013-02-13 Immunomedics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR IMMUNOTHERAPY AND FOR THE DETECTION OF INFLAMMATORY AND DYSEGRATIVE IMMUNE DISEASES, INFECTION DISEASES, PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND CANCER
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
US8436190B2 (en) 2005-01-14 2013-05-07 Cephalon, Inc. Bendamustine pharmaceutical compositions
KR100616666B1 (ko) 2005-01-27 2006-08-28 삼성전기주식회사 카본나노튜브에 구아니딘기를 형성하는 방법,구아니딘기가 형성된 카본나노튜브를 기판에 부착하는방법 및 이에 따라 제조된 카본나노튜브 및 기판
DOP2006000029A (es) 2005-02-07 2006-08-15 Genentech Inc Antibody variants and uses thereof. (variantes de un anticuerpo y usos de las mismas)
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
AR053579A1 (es) 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
EP1885396A2 (en) 2005-05-04 2008-02-13 Quark Pharmaceuticals, Inc. Recombinant antibodies against cd55 and cd59 and uses thereof
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
BRPI0611220A2 (pt) 2005-06-02 2010-08-24 Astrazeneca Ab anticorpos direcionados para cd20 e usos dos mesmos
ES2460517T3 (es) 2005-07-25 2014-05-13 Emergent Product Development Seattle, Llc Reducción de células b mediante el uso de moléculas de unión específica a cd37 y de unión específica a cd20
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
AU2006272597A1 (en) 2005-07-25 2007-02-01 Emergent Product Development Seattle Llc Single dose use of CD20-specific binding molecules
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP4641476B2 (ja) 2005-09-15 2011-03-02 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造装置
CN101389655B (zh) 2005-12-20 2013-05-22 莫佛塞斯公司 新的hcdr3区域集合及其应用
BRPI0707824A2 (pt) 2006-02-15 2011-05-10 Imclone Systems Inc proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno
KR101571027B1 (ko) 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
MX2009004170A (es) 2006-10-24 2009-06-26 Trubion Pharmaceuticals Inc Materiales y metodos para inmunoglicoproteinas mejoradas.
US7846434B2 (en) 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
EP2137325A1 (en) 2007-04-02 2009-12-30 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to b-cell antagonists
WO2008153636A1 (en) 2007-05-04 2008-12-18 Cellsignaling Technology, Inc. Phospho-specific antibodies to p13k regulatory subunit and uses thereof
MX2009012066A (es) 2007-05-09 2009-11-19 Novartis Ag Imidazopirinas sustituidas como inhibidoras de cinasa de lipido p13k.
US20090252729A1 (en) 2007-05-14 2009-10-08 Farrington Graham K Single-chain Fc (scFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
WO2008152387A1 (en) 2007-06-12 2008-12-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Quinazoline derivatives as pi3 kinase inhibitors
WO2008152394A1 (en) 2007-06-12 2008-12-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compounds
EP2158207B1 (en) 2007-06-12 2011-05-25 F. Hoffmann-La Roche AG Thiazoliopyrimidines and their use as inhibitors of phosphatidylinositol-3 kinase
AU2008287195A1 (en) 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
PE20120259A1 (es) 2007-08-09 2012-04-04 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-cd37
RU2523890C2 (ru) 2007-09-12 2014-07-27 Дженентек, Инк. Комбинации ингибиторов фосфоинозитид 3-киназы и химиотерапевтических агентов и способы применения
US20100204222A1 (en) 2007-09-17 2010-08-12 GlaxoSmithKline, LLC Pyridopyrimidine derivatives as p13 kinase inhibitors
CA2704711C (en) 2007-09-24 2016-07-05 Genentech, Inc. Thiazolopyrimidine p13k inhibitor compounds and methods of use
ES2548768T3 (es) 2007-09-27 2015-10-20 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii Imidazolotiadiazoles para su uso como inhibidores de proteína quinasa
WO2009046448A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Intellikine, Inc. Chemical entities and therapeutic uses thereof
RU2681081C2 (ru) 2007-10-05 2019-03-04 Верастэм, Инк. Пиримидинзамещенные производные пурина, фармацевтическая композиция на их основе, способ ингибирования протеинкиназ, способ лечения или профилактики заболеваний, чувствительных к ингибированию протеинкиназ, и способ лечения пролиферативных заболеваний
US20110009403A1 (en) 2007-10-05 2011-01-13 S*Bio Pte Ltd. 2-morpholinylpurines as inhibitors of pi3k
KR20100083170A (ko) 2007-10-16 2010-07-21 와이어쓰 엘엘씨 티에노피리미딘 및 피라졸로피리미딘 화합물 및 이의 ｍＴＯＲ 키나제 및 ＰＩ3 키나제 억제제로서의 용도
EP2211615A4 (en) 2007-10-22 2010-10-13 Glaxosmithkline Llc PYRIDOSULFONAMIDE DERIVATIVES AS PI3 KINASE INHIBITORS
CA2703138A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Purine derivatives useful as pi3 kinase inhibitors
GB0721095D0 (en) 2007-10-26 2007-12-05 Piramed Ltd Pharmaceutical compounds
WO2009059030A1 (en) 2007-10-31 2009-05-07 Burnham Institute For Medical Research Pyrazole derivatives as kinase inhibitors
US20090131512A1 (en) 2007-10-31 2009-05-21 Dynavax Technologies Corp. Inhibition of type I in IFN production
AU2008321099A1 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Icos Corporation Inhibitors of human phosphatidyl-inositol 3-kinase delta
WO2009066084A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag 2 -morpholinopyrimidines and their use as pi3 kinase inhibitors
WO2009068482A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Cellzome Limited Amino triazoles as pi3k inhibitors
WO2009070524A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Wyeth Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine compounds and their use as pi3 kinase and mtor kinase inhibitors
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
CN102099377A (zh) 2008-04-11 2011-06-15 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合
KR20110083730A (ko) 2008-11-13 2011-07-20 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 Ｃｄ37 면역치료제 병용 요법 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
PL1912675T3 (pl) 2014-10-31
EP2586798A2 (en) 2013-05-01
PT1912675E (pt) 2014-05-09
RU2008106893A (ru) 2009-09-10
NZ564764A (en) 2011-08-26
RS54088B1 (en) 2015-10-30
HRP20140338T1 (hr) 2014-06-20
UA97469C2 (uk) 2012-02-27
US10143748B2 (en) 2018-12-04
US20130266561A1 (en) 2013-10-10
SG10201403526YA (en) 2014-10-30
NO20080217L (no) 2008-04-16
IL188345A0 (en) 2008-04-13
EP2295080A3 (en) 2011-06-22
CO6160337A2 (es) 2010-05-20
JP2009502171A (ja) 2009-01-29
EP2295080A2 (en) 2011-03-16
KR101251157B1 (ko) 2013-04-10
ZA200800692B (en) 2011-10-26
CN101282745A (zh) 2008-10-08
ES2539250T3 (es) 2015-06-29
EP2298815B1 (en) 2015-03-11
PT2298815E (pt) 2015-07-16
SI2298815T1 (sl) 2015-08-31
US20140004117A1 (en) 2014-01-02
CN105012953B (zh) 2018-06-22
CA2616395C (en) 2016-10-04
NZ606294A (en) 2014-09-26
WO2007014278A3 (en) 2007-08-30
JP5740076B2 (ja) 2015-06-24
HK1115820A1 (en) 2008-12-12
RS53318B (en) 2014-10-31
EP1912675A2 (en) 2008-04-23
NI200800032A (es) 2009-03-23
ES2460517T3 (es) 2014-05-13
KR20080032192A (ko) 2008-04-14
HK1125288A1 (en) 2009-08-07
NZ594275A (en) 2013-04-26
US20090214539A1 (en) 2009-08-27
EP2586798A3 (en) 2013-08-07
CN101282745B (zh) 2015-04-29
IL188345A (en) 2015-04-30
AU2006272555A1 (en) 2007-02-01
JP2014196350A (ja) 2014-10-16
HUE026303T2 (hu) 2016-06-28
ECSP088133A (es) 2008-02-20
DK1912675T3 (en) 2014-03-24
IL237881A0 (en) 2015-05-31
US10307481B2 (en) 2019-06-04
AU2006272555B2 (en) 2012-03-08
HRP20150591T1 (hr) 2015-07-31
CN105012953A (zh) 2015-11-04
US20140072562A1 (en) 2014-03-13
JP2012165760A (ja) 2012-09-06
US20190290755A1 (en) 2019-09-26
EP2298815A1 (en) 2011-03-23
SG155912A1 (en) 2009-10-29
DK2298815T3 (en) 2015-06-15
CA2616395A1 (en) 2007-02-01
SI1912675T1 (sl) 2014-07-31
RU2423381C2 (ru) 2011-07-10
PL2298815T3 (pl) 2015-08-31
CR9761A (es) 2008-05-21
US20140010813A1 (en) 2014-01-09
BRPI0614184A8 (pt) 2017-10-10
WO2007014278A2 (en) 2007-02-01
EP1912675B1 (en) 2014-02-12
US20070059306A1 (en) 2007-03-15
HK1155761A1 (en) 2012-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK1912675T3 (en) B-cell reduction using specific and cd37-cd20-specific binding molecules
CA2719924C (en) Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
KR102493282B1 (ko) Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
KR102473028B1 (ko) 항-tim-3 항체 및 조성물
CN108137687B (zh) 抗ox40抗体及其用途
CN111954680B (zh) IL2Rβ/共同γ链抗体
KR102215405B1 (ko) 인간 pac1 항체
CN114984209A (zh) 靶向pd-1、tim-3及lag-3的组合疗法
TW201237165A (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
KR20150023811A (ko) 암의 치료를 위한 lsr 항체 및 그의 용도
BRPI0713000A2 (pt) proteÍnas de ligaÇço de cadeia énica multivalente com funÇço efetiva
KR20110043643A (ko) 인터루킨 6 면역치료제
KR102604433B1 (ko) 항-icos 항체
KR20220040483A (ko) 칼리크레인 관련 펩티다제 2 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
KR20200108870A (ko) Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
KR20230017815A (ko) 항-sars-cov-2 스파이크 당단백질 항체 및 항원-결합 단편
TW202216743A (zh) Ｉｌ－１０突變蛋白及其融合蛋白
KR20230017841A (ko) Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도
RU2795232C2 (ru) Комбинированные лекарственные средства, нацеленные на pd-1, tim-3 и lag-3
KR20240007760A (ko) 항-icos 항체의 용도
KR20240017054A (ko) 항-icos 항체를 사용한 pd-l1 음성 또는 저발현 암의 치료
CN117460747A (zh) 靶向CD79b、CD20和CD3的三特异性抗体
NZ789986A (en) Antibodies against tim3 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: EMERGENT PRODUCT DEVELOPMENT SEATTLE, LLC (US)

Free format text: TRANSFERIDO DE: TRUBION PHARMACEUTICALS, INC.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: APTEVO RESEARCH AND DEVELOPMENT LLC (US)

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL