KR20010034512A - 림프구 활성화 조절을 위한 조성물 및 그 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 림프구 활성 조절에 관한 것이다. 구체적으로는 림프구에 의해 발현되는 여러 세포 표면 항원에 선택적으로 결합함으로써 림프구 활성화를 조절하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

림프구 활성화 조절을 위한 조성물 및 그 방법{Compositions and methods for regulating lymphocyte activation}
1. T세포 수용체/CD3 복합체
성숙한 T 림프구(T 세포)는 T세포 항원 수용체(TCR) 복합체에 의해 항원을 인지한다. 일반적으로, 각 TCR/CD3 복합체는 클론 타입의 이황화결합된 TCRα/β 또는 TCRγ/δ 및 불변의(invariant) CD3 복합체를 포함하는 6개의 소단위로 구성된다(M.M. Davis, Annu. Rev. Biochem., 59:475, A. C. Chan et al., Annu. Rev. Immunol., 10:555). TCR α, β,및 γ 사슬은 항체처럼 가변(V), 결합(J), 및 불변(C) 영역을 함유하는 T 세포 특이적 유전자에 의해 암호화되는 40 내지 50 kDa의 당단백질이다(S. M. Hedrick et al., nature, 308: 149; S. M. Hedrick et al., Nature, 308:153). TCR 이형이합체(heterodimer)는 항원결합 소단위로 개개의 T 세포 특이성을 결정한다. α/β 이형이합체(heterodimer)를 발현하는 세포는 사람과 마우스에 있어서 peripheral T 세포의 90% 이상을 차지하며, 전형적인 helper 또는 cytotoxic T 세포반응에 관여한다(M. M. Davis, Annu. Rev. Biochem., 59: 475; A. C. Chan et al., Annu. Rev. Immunol., 10:555). 대부분의 경우에 있어서, TCRα/β 리간드는 주요조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 의해 제공되는 펩타이드 항원이다. 반대로, TCRβ/γ리간드는 잘 규명되지 않았으며, MHC 단백질에 의한 제공에 관여하지 않을 수도 있다(T.-H. Chien et al., Annu. Rev. Immunol., 15:511).
불변의 CD3 복합체는 4개의 비교적 작은 폴리펩티드, CD3δ(20kDa), CD3ε(20kDa), CD3γ(25kDa), CD3ζ(16kDa)로 구성된다. CD3δ,ε, γ 사슬은 아미노산 서열에 있어서 상당한 유사성을 보여준다. 이들은 면역글로불린(Ig) 수퍼유전자 패밀리의 구성원이며, 각 구성원은 하나의 세포외 Ig-양(extracellular Ig-like) 도메인을 가진다. 반면에 CD3ζ만 9개의 아미노산 세포외 도메인을 가지며 CD3δ,ε및 γ에 비해 이들보다 더 긴 세포질 도메인을 가진다. CD3 사슬의 세포질 도메인은 세포 활성화를 매개하는 면역 수용체 타이로신-기초 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation mortif; ITAM)로 불리는 보전된 1개 내지 3개의 모티프를 가진다. 펩타이드-MHC 리간드에 의한 TCR/CD3 복합체 결합의 한가지 결과는 여러가지 신호 인자들을 CD3 사슬의 ITAMs로 끌어모은다는 것이다. 이것이 여러개의 신호전달경로의 활성화를 개시시켜, 유전자 발현, 세포의 증식 및 효과기 T 세포 기능의 생성을 유도한다(A. Weiss and D. R. Littman, Cell, 76: 263; R. Wange and L. E. Samelson, Immunity, 5 : 197).
TCR 복합체의 결집 및 발현은 복합하고 정교하게 조절되는 과정이다; 정확하게는 수용체 복합체의 다른 사슬들이 어떻게 이들에 기여하는가는 아직도 해명되어야 할 일이다. 그럼에도 불구하고, TCR 복합체의 표면 발현은 TCRα/β 또는 TCRγ/δ 및 CD3δ, CD3ε, CD3γ, 및 CD3ζ 사슬의 존재를 필요로 한다(Y. Minami et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84; 2688; B. Alaracon et al., J. Biol. Chem., 263:2953). 어떤 한 사슬의 부재는 복합체가 세포질에 트랩되어 빠른 단백질 분해를 받게 된다(C. Chen et al., J. Cell Biol. 107:2149; J. s. Bonifacino et al., J. Cell Biol. 109: 73). TCR/CD3 복합체의 정확한 구성원관계는 알려져 있지 않다. 여러가지 증거가 하나의 TCR/CD3 복합체가 두개의 TCR 이형이합체, CD3ε/δ 이형이합체, CD3 ε/β이형이합체 및 CD3ζζ동형이합체를 포함하여 12개 복합체를 형성할 수 있다는 것을 암시한다(R. S. Blumberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87;7220; M. Exley et al., Mol. Immunol., 32:829). 상기 복합체에 있어서, CD3ε/δ 및 CD3ε/γ이형이합체는 이중결합을 하고 있지 않은데 반해, TCR 이형이합체 및 CD3ζ 동형이합체는 이황화결하벵 의해 이중결합을 하고있다. 게다가, CD3ε/δ, CD3ε/γ, CD3ζζ, 및 TCRα/β 또는 TCRγ/δ 사슬들 간의 상호작용은 이중결합이 아닌 것으로 나타났다.
TCR/CD3 복합체의 결집은 CD3 사슬과 결합한 한개의 TCR 사슬로 구성된 중간체 형성을 이루도록 소포제(ER)내에서 독립적인 TCRα및 TCRβ 사슬과 CD3 복합체 사이에 짝짓기 방식의 상호작용으로 시작된다(B. Alarcon et al., J. Biol. Chem., 263:2953; N. Manolios et al., EMBO J., 10: 1643). 비림프구 세포에 행해진 형질전환 연구는 TCRα가 CD3δ및 CD3ε과 결합할 수 있으나, CD3ζ과는 결합할 수 없음을 보여주었다(N. Manolios et al., EMBO J., 10:1643; T. Wileman et al., J. Cell Biol., 122:67). CD3ζ 사슬의 투입이 성숙한 TCR/CD3 복합체 형성의 속도제한단계인 것으로 보인다. TCRα/β, CD3δ/ε, 및 γ 사슬은 CD3ζ사슬이 부분적인 TCR/CD3 복합체와 결합하여 표면 발현을 위한 최종산물을 형성하기 전에 ER에 존재할 필요가 있다(Y. Minami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:26880). TCR 및 CD3 사슬간의 결합은 막통과 도메인내 전하를 띤 아미노산에 매우 의존한다. 양전하를 띤 아미노산(TCRα에 있어서 아르기닌 및 라이신, TCRβ에 있어서 라이신)은 TCRα/β 사슬의 막통과 도메인에 존재한다. 음전하를 띤 아미노산(CD3γ에 있어서 글루탐산 및 CD3ε, δ 및 ζ에 있어서 아스파르트산)은 CD3 사슬의 막통과 도메인에서 발견된다. 이들 전하를 띤 아미노산간의 염다리 형성이 TCRα/β 사슬 및 CD3 사슬간의 결합의 주요 구동력(driving force)인 것으로 보인다(C. Hall et al., Int. Immunol., 3:359; P. Cosson et al., Nature, 351:414). 상기 형질전환 및 생화학 데이타에 상응하는 성숙한 TCR/CD3 복합체를 위한 모델이 제안되었다. 이 모델에 있어서, 각 CD3ε/δ, CD3εγ 및 CD3ζ/ζ의 한 카피는 외부 두개의 TCRα/β 카피와 수용체 복합체의 코어를 형성한다. TCRα 및 TCRβ사슬은 CD3δ, ε또는 γ와 결합할 수 있다. 이황화결합된 CD3ζζ는 TCRα의 막통과 도메인내 음전하를 띤 아미노산 때문에 TCRα와 바람직하게 결합할 수 있다.
TCR/CD3 복합체의 결집 및 발현이 매우 연구되었음에도 불구하고, CD3δ, ε 또는 γ사슬의 세포외 도메인의 잠재적 기능에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. TCR-항-TCR 복합체에 관한 최근의 연구는 TCRβ사슬내 결합 포켓의 존재이 CD3ε세포외 도메인을 수용할 정도로 충분히 커다는 증거를 제공하였다(J. H. Wang. et al., EMBO J., 17:10; Y. Ghendler et al., J. Exp. Med., 187:1529). 반대로, 결실 분석을 사용한 결과, 보존된 Cys-X-X-Cys 모티프를 가진 CD3δ, ε또는 γ 사슬의 막통과 도메인에 가까운 영역은 CD3 사슬 이형-이합체형성을 중개하는 것으로 나타났다(A. Borroto et al., J. Biol. Chem., 273:12807). Ig 수퍼유전자 패밀리 구성원은 어드헤신(adhesion) 분자로 잘 알려져 있다. 그러므로, Ig-양 도메인의 CD3 세포외 도메인을 위한 리간드가 존재할 수 있는 것은 이상한 일이 아니다. 또한, CD3 사슬과 그들 잠재적 리간드간의 상호작용은 T 림프구 활성화 조절에 중요한 역할을 담당할 수 있다.
천연적인 구조의 수용성 CD3 복합체를 형성하기 위한 시스템 결여는 Cd3 도메인의 세포외 도메인의 기능에 있어서의 정보부재에 대한 한가지 이유가 되어왔다. 수많은 단일클론항체(mAbs)가 TCR/CD3 복합체에 대해 만들어졌다; 그들 중 다수는 피상적으로 CD3 복합체를 인지한다. 게다가, 대부분 항-CD3 mAbs의 반응성은 두 가지 범주에 속한다: CD3ε사슬만을 인지할 수 있는 항-CD3 mAbs 및 구조적 에피토프만 인지할 수 있는 항-CD3 mAbs 가 CD3ε사슬 및 CD3δ 또는 CD3γ사슬의 하나간의 상호작용에 의해 생성되는 것으로 보여진다(A. Salmeron et al., J. Immunol., 147:3047). 후자는 상응하는 cDNA 클론 사슬로 형질전환된 비림프구 세포의 세포질내 천연의 CD3ε/δ 및 CD3ε/γ이형이합체의 형성을 가시화하기 위해 이용될 수 있다(A. Salmeron et al., J. Immunol., 147: 3047).
2. 표면 수용체의 자극에 의한 림프구 활성화
림프구에 대한 mAbs의 생산은 많은 수의 림프구 표면 항원 동정이 가능하게 하였다. 림프구 서브세트에 의한 이들 항원 발현은 T 세포와 B 세포를 특이적 기능성 아세포집단 및 다른 분화단계로 분류하는데 사용되었다. 보다 최근에는, 이들 표면 항원의 일부가 활성화 신호를 매개할 수 있는 것으로 알려졌다. 가장 현저하게는, CD3에 대한 항체가 항원부재 하에 T 세포를 활성화시키는데 사용되었다 (Leo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:1374). 게다가, T 세포 활성화 연구는 특이적 복합수용체(coreceptor)에의 리간드 결합이 TCR/CD3 복합체 자극에 의해 개시되는 T 세포 증식 및 시토키닌 생산을 중개한다는 것을 보여주었다.
복합수용체로의 일부 표면 항원의 결집(clustering)은 증강된 T세포 활성화를 유도하였다. 수용체 결집을 중개하기 위하여 리간드를 사용한 몇몇 실험들이 개발되었다. 예컨대, 리간드는 비드(bead) 또는 플라스틱 표면에 고정화되어, 결합된 수용체가 세포와 인공 표면간의 접촉 부위에 결집하도록 하였다. 수용체는 또한 이중특이적(bispecific) 분자 형태의 수용성 리간드를 사용하거나 또는 결집을 중개하기 위하여 수용체에 결합한 후에 2개 이상의 일특이적(monospecific) 리간드와 반응하는 2-단계 시약을 사용하여 결집되었다. 이들 접근방법을 이용한 신호전달 실험 및 생체내 세포활성화 실험은 기능적인 수용체-복합수용체 상호작용의 증거를 찾아냈다. 그러나, 생체내 치료를 위한 어떠한 허용성있는 조성물은 만들어지지 않았다.
CD2와 CD3와의 응집(aggregation) 또는 CD4와 CD3와의 응집은 CD3 단독에 의한 응집보다는 훨씬 강력하게 T 세포를 활성화시키는 것으로 나타났다(Ledbetter et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18:525-532; Wee et al., 1993, J. Exp. Med. 177:219). 유사하게는, CD18 또는 CD18과 CD3을 포함하여 다른 수용체들의 결집은 CD3 단독의 결집에 비해 신호전달 및 활성화를 증강시켰다.
다중 복합자극(multiple costimulatory) 수용체가 동정되었지만, 서로간의 관계에 대한 지식, 및 CD3 활성화에 대한 복합자극의 공간적 및 시간적 요구성은 제한적이다. 한 연구에서는, CD18, CD28, 및 TCR을 위한 리간드 공동-고정화가 연구되었다(Damle et al., 1992, J. Immunol. 149:2541). 플라스틱 플레이트상에 코팅된 항-Ig를 사용한 ICAMI-Ig, B7-Ig 및 항-TCR의 간접적인 고정화는 ICAMI-Ig 또는 B7-Ig 개별적인 고정화보다도 항-TCR 의존성 증식을 강화시켰다. 그러나, B7-Ig가 이전에 활성화된 T 세포에 훨씬 효과적인데 반해 ICAMI-Ig는 나머지 T 세포들에 훨씬 더 효과적이어서, 이들 복합수용체간의 상호작용이 물리적이라기보다는 시간적인 것임을 암시하고 있다.
다중 복합수용체가 TCR 복합체를 통해 활성화 반응을 변경시킬지라도, 이들 복합수용체가 응집상태로 어떻게 함께 작용하는가에 대한 제한된 정보가 있다. 3개 이상의 수용체 각각이 활성화 신호 및 전체적인 세포 반응에 기능적으로 기여하도록 결집하는 것은 잘 연구되어 있지 않다.
B 세포 활성화 연구는 또한 B 세포 항원 수용체 복합체에의 결합에 의해 개시되는 활성화 신호 및 반응을 변경시키는 다중 복합수용체의 존재를 밝혀내었다. 이들 수용체들의 대표적인 예로는 CD19, CD20, CD21, CD22, CD40 및 표면 면역글로불린(Ig)이 있다. 수용체-복합수용체 상호작용은 이형접합된(heteroconjugated) 항체와 같은 2단계 시약 또는 고체 표면에 고정화된 리간드의 조합을 사용하여 세포 표면에 교차결합시킨 수용성 리간드를 사용하여 증명되었다.
비록 다중 복합수용체가 알려져 있을지라도, B세포 상에서 세가지 이상 수용체의 상호작용은 보고된 바 없다.
본 발명은 림프구 활성화를 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세가지 이상의 세포 표면 항원을 응집시킴으로써 T 및 B 세포를 활성화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 활성화 신호는 면역 증강 또는 면역억제로 귀결될 수 있다.
본 발명은 또한 다중 표면 수용체에 동시적 결합에 의한 림프구 활성화의 억제 및 차단 또는 다른 세포에 대한 수용체에 결합하여 활성화시키는 능력을 방해함으로써 활성화 신호 전달능을 저해하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 3개 이상의 표면 항원을 응집시킴으로써 시험관내 및 생체내에서 많은 수의 T세포 및/또는 B세포를 확장시키는 것이다. 확장된 T 및 B 세포는 암과 후천성 면역결핍증과 같은 감염성 질병의 적응 면역요법에 사용될 수 있다. 시험관내에서 다중 세포 표면 항원을 응집시키는 바람직한 방법은 세포 표면 항원 및/또는 항원에 특이적인 항체 또는 가변 도메인 및 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDRs)과 같은 그들의 항원 결합 유도체에 결합하는 리간드의 배양 접시 또는 현탁성 비드와 같은 고체 기질 상의 흡착에 의한 것이다.
리간드, 항체 또는 이들의 항원-결합 유도체는 생체내 투여를 위해 생분해성 기질 상에 흡착될 수 있는 반면에, 이들 분자들이 화학적 결합 또는 재조합 발현 방법에 의한 단일 수용성 다가 분자를 형성하도록 결합되는 것이 바람직하다. 그러므로, 또한 본 발명의 목적은 다중 세포 표면 항원에 동시적으로 결합할 수 있는 다중특이적 분자를 제조하는 것이다. 그러한 다중특이적 분자는 시험관내 림프구 활성화를 위하여 고정화될 수 있거나, 또는 생체내에서 림프구 활성화 조절을 위한 대상에 약학적 조성물로 투여될 수 있다. 다중특이적 분자는 다중 세포 수용체를 응집시키거나 T 및 B 세포 또는 림프구와 항원제공세포간의 리간드/수용체 상호작용을 방해함으로써 림프구를 활성화시킬 수 있다. 자가면역 억제, 과민반응, 혈관성 질환 및 이식거부 등 뿐만 아니라, 면역결핍 치료, 감염성 질병 및 암에 제한 되지 않고 이들을 포함하여 다양한 용도가 본 발명에 포함된다.
본 발명은 부분적으로, 두개의 고정화된 항체에 의한 촉진에 비해 사람 T 세포를 세가지 T 세포 표면 항원에 대해 특이적인 고정화 항체로 자극시 증강된 증식이 가능하다는 출원인의 발명에 기초한다. 이들 중쇄만의 항체(heavy chain-only antibody)는 사람 세포 표면 항원에 대항해서 엘라마(llamas)에서 생성될 수 있으므로, 항원 결합에 경쇄의 부재가 경쇄 또는 경쇄 가변부위를 포함할 필요성을 배제시키기 때문에 이들 항체 및 이들의 항원-결합 유도체는 다중특이적 분자의 제조에 바람직하다. 그러므로, 다중특이적 분자의 제조에 있어서 중쇄만의 항체 사용은 그들 결합부위를 덜 복잡하게 만든다. 게다가, 그러한 항체는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항체보다도 더 길다란 CDRs, 특히 CD3를 포함하여, 다중특이적 분자의 제조에 있어서 중쇄만의 항체로부터 유래된 CDR 펩타이드가 사용을 위해 더 높은 친화성 및 안정성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 목적은 카멜리대 과(Camelidae family)로부터 획득된 중쇄만의 항체, VHH또는 이들로부터 유래된 항원-결합 CDRs로 알려진 이들의 가변 도메인를 사용하여 다중특이적 분자를 제조하는 것이다. 그러한 다중특이적 분자들은 림프구 활성화의 촉진 또는 억제에 기초하여 면역조절에 유용하다. 이러한 클래스의 VHH-함유 항체를 제조하는 B 세포를 농화시키기 위한 노력에 있어서, 본 발명자들은 또한 엘라마 B 세포가 항-사람 CD40 항체와 교차반응하는 사람 CD40 에피토프를 발현한다는 것을 발견하였고, CD40+엘라마 세포 아집단이 중쇄만의 항체를 발현한다는 것을 발견하였다. 게다가, CD40+세포들은 항-CD40 항체에 의해 증식하도록 활성화될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 목적은 CD40 및 경쇄없는 면역글로불린의 공동발현에 기초하여 중쇄만의 항체를 발현하는 엘라마 B 세포를 농화(enrichment)시키고, CD40 자극에 의해 그들 수를 확장시키는 것이다. 확장된 세포들은 특히 VHH도메인의 라이브러리를 제조 및 항원-결합 특이성을 설별하기 위한 mRNA 공급원으로 유용하다. L.Ilama 유래의 그러한 VHH신규 서브클래스는 CH1 도메인이 없는 실시예에 개시되었고, 그들의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 이황화결합에 의해 결합되지 않는다.
본 발명의 목적은 또한 엘라말리재이션(llamalization)으로 통칭되는 과정에 있어서 쥐과(murine) 항체와 같은 통상적인 항체를 중쇄만의 항체로 전환시키는 것이다. 엘라마이즈된 항체는 경쇄와는 결합없이 원래의 항체결합 특이성을 보유한다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체 가변부위 또는 사람 항원 및 엘라마 불변부위간의 융합단백질을 제조하는 것이다. 그러한 융합단백질은 비-엘라마 에피토프에 대한 VHH를 생성하기 위한 엘라마 면역화에 있어서 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 수용성 사람 CD3 이형이합체를 제조하는 것이다.
본 발명은 림프구 활성화 조절에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 림프구에 의해 발현되는 다중(multiple) 세포표면 항원에 선택적으로 결합함으로써 동일한 림프구의 활성화를 조절하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 항원 응집은 시험관내에서 고정화된 리간드 또는 항체 또는 표적 항원에 특이적인 항체 단편과 림프구를 배양함으로써 달성될 수 있다. 게다가, 단일 수용성 분자 내에 다중 결합 특이성 (multiple binding specificities)을 지닌 다중특이적 분자(multispecific molecules)는 특히 생체내에서 다중 항원을 응집시켜 림프구를 활성화시키는데 매우 유용하다. 다중특이적 분자는 또한 활성화 신호를 세포내로 전달화는 과정을 차단함으로써 림프구 활성화를 억제하도록 제조될 수도 있다. 그러므로 본 발명은 시험관내 및 생체내에서 T 세포 및 B 세포를 조절하는데 매우 유용하다.
도 1은 세포 표면 항원에 결합하는 엘라마 VHH폴리펩티드 분리과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 세가지 T 세포 표면 항원에 특이적인 고정화 mAbs가 사람 혈액 T 세포의 증가된 증식을 유도하는 것을 나타내는 그림이다.
도 3은 고정화 항-CD3, 항-CD28 및 항-CD40 mAbs가 증가된 T 세포 증식을 유도하는 것을 나타내는 그림이다.
도 4는 CD8+T 세포의 활성화에 비해 정제된 CD4+T 세포의 CD2, CD3 및 CD28 활성화간의 시너지를 나타내는 그림이다.
도 5는 고정화된 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 가지고 T 세포를 자극한 결과3H-티미딘 세포내 유입측정(A)과 직접적인 상관관계가 있는 세포 성장(B)을 나타내는 그림이다.
도 6은 "DYNAL" 비드에 함께 고정화된 CD3, CD2 및 CD28에 대한 mAbs의 시너지 효과를 나타내는 그림이다.
도 7(A, B)은 T 세포 증식에 대한 공동고정화된 그리고 개별적으로 고정화된 mAbs의 비교그림이다. CD3 X CD28 = 동일한 비드에 공동으로 고정화된 항-CD3 및 항-CD28 mAbs. CD3 X CD2 = 동일한 비드에 공동고정화된 항-CD3 및 항-CD2 mAbs. CD3 + CD28 = 항-CD3 또는 항 CD-28 mAb로 코팅된 비드의 혼합물. CD3 + CD2 = 항-CD3 또는 항-CD2 mAb로 코팅된 비드의 혼합물.
도 8은 용액내 또는 별개의 비드에 코팅된 항-CD2가 T 세포 활성화에 있어서 공동고정화된 항-CD3 및 항-CD28을 억제하는 것을 나타내는 그림이다.
도 9(A-F)는 Vβ TCR 사슬을 발현하는 T 세포의 선택적인 성장을 나타내는 그림이다.
도 10은 엘라마(Llama) B 세포가 CD40 및 표면 면역글로불린(Ig)을 발현하며, 일부 CD40+세포는 경쇄를 포함하지 않는 Ig를 발현하는 것을 나타내는 그림이다. 엘라마 peripheral 혈액 림프구는 염색되지 않거나(10A) 또는 항체로 염색되었다: 항-CD40(10B), 항-CD40 및 항-경쇄(10C), 항 경쇄(10D), 항-CD40 및 항-Ig(10E) 및 항-Ig(10F).
도 11은 엘라마 B 세포가 항-CD40 항체 및 CD86(또는 B7.2)-발현 형질전환된 CHo 세포 + PMA 자극에 대한 반응으로 증식하는 것을 나타내는 그림이다. 다른 두가지 엘라마에서의 결과가 보여진다.
도 12는 분획된 엘라마 항체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 그림이다. 레인 1은 IgG1D(DEAE flowthrough), 레인 2는 IgG1G(단백질 G-결합 항체는 pH2.7에서 용출됨), 레인 3은 IgG2 및 IgG3(단백질 G-결합 항체는 pH 3.5에서 용출됨), 레인 4는 IgG3(Protein G flow through)를 함유하고 있다. 레인 3 및 레인 4는 경쇄가 없는 항체 중쇄를 보여준다.
도 13은 사람 T 세포 표면 항원에 결합된 엘라마 중쇄만의 항체(IgG2 및 IgG3)를 나타내는 그림이다. 저캣 T 세포는 IgG1 G(13A0, IgG1 D(13C), IgG2 + IgG3(13E) 또는 IgG3(13G)로 염색한 후 2단계 항-Ig reagent 처리를 받았다. 저캣 T 세포는 또한 동일한 항체 분획(13B, 13D, 13F 및 13H)으로 염색한 후 2단계 항-경쇄 reagent 처리를 받았다.
도 14는 카멜리드(Camelid) VHH파아지 디스플레이 벡터를 나타내는 그림이다.
도 15는 파지 클론 L10 및 L11이 CHO 세포 표면에 발현된 고분자량의 단백질과 반응하는 것을 나타내는 그림이다.
도 16은 엘라마 VHH폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다. A는 서너가지 독특한 하이브리드 서열(서열번호 1-9)를 나타내고, B는 전에 보고된 낙타의 가변부위에 유사한 서너개의 완전한 서열(서열번호 10-15)을 나타낸다.
도 17은 엘라마 불변부위 서열(서열번호 16-21)을 나타낸다.
도 18은 항체 9.3 엘라말리재이션(서열번호 22-46)를 위한 올리고뉴클레오티드를 나타내는 그림이다. 중첩되는 올리고뉴클레오티드는 9.3 VH야생형을 재합성하고 version 1(LV 1) 및 version 2(LV 2)를 일라말라이재이션하기 위해 사용되었다. 엘라마이즈된 올리고뉴클레오티드의 공백부분은 야생형과 동일하여, 변형된 부분만 표시하였다.
도 19는 엘라말라이즈드 9.3VH에 의해 염색된 저캣 T 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 20은 다양한 CD3-Ig 융합단백질이 항-CD3 mAbs, G19-4에 대한 결합활성을 나타내는 그림이다.
림프구에 의해 발현되는 다중 항원(또는 수용체)은 세포 활성화를 조절하기 위해서 공동으로 작용한다. 많은 경우에 있어서, 수용체는 근접함으로써 함께 작용을 나타내거나 활성화 신호를 총체적으로 중개하기 위해 서로간에 접촉을 시도한다. 생리적인 조건 하에서, 이들 과정은 세포-세포 접촉에 의해 조절될 수 있으며, 이 때 한 세포에 의해 발현되는 리간드는 다른 세포에 의해 발현된 수용체와 접촉하며, 수용체는 교차결합하여 세포-세포 접촉 부위에 밀집한다. 수용체 접촉의 정확한 배열 및 순서는 리간드의 공간적인 배향 및 수용체가 특정 부위에서 특정한 순서로 서로 접촉할 수 있는 내재된 능력에 의해 조절될 수 있다. 밀집된 수용체에 의해 매개되는 활성화 신호는 수용체 또는 상기 수용체와 직간접적으로 결합(링커 분자를 통해)하는 분자들의 내재적인 효소 활성에 의존한다. 밀집된 수용체는 신호 복합체가 세포막에 형성되도록 하여 밀집된 수용체의 정확한 구성 및 배향성에 의존적인 복잡한 신호를 만들게 된다. 수용체 밀집의 패턴 변화는 내주(resident) 세포의 변화된 활성화 상태로 귀결된다.
하기 섹션은 림프구 항원을 응집시켜 활성화 신호를 재생함으로써 수용체 밀집을 모방하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 비록 세 가지 T 세포 항원에 특이적인 고정화 항체를 사용하여 특이적인 과정 및 방법을 예시하였으나, 이들은 단순히 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 개시된 발명의 상세한 설명에 기초하여 당업자에게 명백한 기능적으로 등가인 조성물뿐만 아니라, 유사한 과정 및 기술이 또한 본 발명에 속한다.
1. 림프구 표면 항원
T 세포 및 B 세포 활성화 연구 결과 활성화 신호를 직간접적으로 매개하는 다양한 세포 표면 항원을 동정하였다. 본 명세서에 사용된 "활성화 신호 (activation signal)"란 개념은 시토키닌 분비, 시토키닌 프로필의 변화, 발현수준의 변화 또는 세포표면 수용체의 분포, 항체 생산 및 항체 클래스 스위칭뿐만 아니라, 증식, 분화, 세포독성, 세포예정사와 같은 측정가능한 세포 활성에 있어서 명백한 분자적 일을 나타낸다. 게다가, "활성화 신호"는 세포내 칼슘 유동화 및 수용체의 타이로신 인산화에 의해 정량화될 수 있다.(Ledbetter et al., 1991, Blood 77:1271).
TCR/CD3뿐만 아니라, 활성화 신호를 매개하는 T 세포에 의해 발현되는 다른 분자들은 CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD25, CD27, CD28, CD40, CD43, CD45, CD45RA, CD45RO, CDw150, CD152(CTLA-4), CD154, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, CDw137(401BB), (The Leucocyte Atigen Facts Book, 1993, Barclay et al., Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernard et al.(eds.), Springer-Verlag; Leucocyte Typing II, 1986, Reinherz et al.(eds.), Springer-Verlag; Leucocyte Typing III, 1987, McMichael(ed.), Oxford University Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knapp et al.(eds.), Oxford University Press; CD Antigens, 1996, VI Internat, Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens. http://www.nebi.nlm.nih.gov/prow), ICOS(Hutloff et al., 1999, Nature 397:263-266), 시토키닌 수용체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. TCR/CD3 와 반응하는 세포 표면 항원은 종종 당업계에서 복합수용체 (coreceptor)라 불리어진다.
특이적인 항체가 상기 설명한 모든 T 세포 표면 항원에 대해 생성되었으며, 상업적으로 이용 가능하다. 상기 설명한 T 세포 표면 항원에 결합하는 다른 분자들은 가변부위, 펩타이드, 수퍼항원, 및 이들 원래의 리간드 또는 CD2에 대한 CD58(LFA-3), CD4에 대한 HIV gp120, CD27에 대한 CD27L, CD28 또는 CD152에 대한 CD80 또는 CD86, CI11a/CD18에 대한 ICAMI, ICAM2 및 ICAM3, CDw137에 대한 4-1BBL과 같은 리간드 융합 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 표면항원의 "결합 파트너 (binding partner)"로 총체적으로 명명되는 그러한 분자들은 활성화 신호를 T 세포로 전달하거나 억제하는데 사용될 수 있다. 어떤 항원의 활성화를 위하여, 다중 리간드가 동일한 결과를 얻기 위하여 사용될 수 있다. 예컨대, B7.1(CD80), B7.2(CD86) 및 B7.3은 CD28을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. B7.3은 최근에 동정된 CD80/CD86 패밀리의 구성원이다(GenBank Database Accession No. Y07827). B7.3의 아미노산 배열은 다른 패밀리 구성원의 그것과 함께 B7.1이 B7.2에 유사한 것처럼 B7.1 및 B 7.2에 유사하다는 것을 보여준다.
B 세포에 의해 발현되는 활성화 분자들은 표면 Ig, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD40, CD45, CD80, CD86 및 ICAM1를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유사하게, 이들 분자들의 원래 리간드, 이들에 작용하는 항체 뿐만 아니라 항체 유도체는 B 세포로의 활성화 신호 전달 또는 억제에 사용될 수 있다.
실시예 1에 의해 예시된 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 CD2와 CD3 및 CD28 또는 CD4 또는 CD5의 응집이 T 세포 증식을 증강시킨다는 것을 증명한다. 본 발명의 이러한 점과 관련하여, 어떠한 세가지 또는 10개 까지의 상기 설명한 T 및 B 세포 항원은 결합되고 응집되어 T 세포 및 B 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 위하여, 바람직한 항원 조합은 CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD27, CD28, CD45RO, CD45, CDw137, CDw150, CD152 또는 CD154를 포함하여 가변적인 세번째 항원을 갖는 CD2 및 CD3를 포함한다. 게다가, CD2 및 CD3가 이들 표면 항원 중의 두가지 또는 세가지와 어떠한 조합으로 응집하는 것이 바람직하다. 이들 조합은 예컨대 CD2와 CD3 + CD4 및 CD5 또는 CD4 및 CD28 또는 CD5 및 CD28 또는 CD8 및 CD28 또는 CDw137 및 CD28 또는 CD4 및 CD5 및 CD28 포함한다. B 세포 활성화를 위하여, 바람직한 조합은 CD40 또는 CD56을 포함하여, CD80 및 가변적인 세번째 항원을 갖는 CD80을 포함한다. 게다가, CD40은 CD45 및 CD86과 또는 CD19및 CD20과 응집될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에 있어서, 항원 조합은 CD3 또는 TCR 및 CD28 + 상기 설명된 세번째 항원을 포함한다.
2. 다중 림프구 표면 항원을 응집시키는 방법
본 발명의 한가지 면은 3가지 이상의 항원 조합의 특정 세트를 응집시킴으로써 림프구 활성화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 다중 세포 표면 항원을 응집시키는 통상적인 방법은 공유 또는 비공유 결합에 의한 배양 접시, 비드, 또는 생분해성 매트릭스 상의 흡착과 같이 고체 기질 상에 항원의 "결합 파트너"를 고정화함에 의한 것이다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 결합 파트너는 비드 상에 코팅되고, 상기 비드는 크기 여과 또는 자기장에 의해 세포로부터 쉽게 분리될 수 있다. 그러한 "결합 파트너"는 원래의 리간드, 리간드의 결합 도메인 및 리간드 융합 단백질을 포함하는 반면에, 본 발명의 이러한 면을 실행하기 위한 바람직한 구현예는 항체 및 Fab(Fab')2, Fv, 단일사슬 항체, 중쇄만의 항체, VHH및 CDRs (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, Cold Spring Harbor Press; WO94/04678)와 같은 이들의 항원-결합 유도체이다. 이들 분자들은 재조합 방법, 화학적 합성 방법 또는 천연재료로부터의 정제에 의해 제조될 수 있다. 고정화를 위한 선택적인 방법은 세가지 이상의 항체 또는 이들의 항원결합 유도체를 보통 공유되는 에피토프에 결합하는 제2항체에 교차결합시키는 것이다. 분자에 바이오틴이 결합되는 경우에 아비딘 또는 스트렙트아비딘이 제2단계 교차결합 시약으로 사용될 수 있다.
적절한 항체 또는 이들의 항원결합 유도체를 고체 기질에 흡착시키기 위하여, 분자들은 1-100μg/ml 농도에서 PBS와 같은 염완충액에 현탁된다. 농도는 10μg/ml으로 맞추어지는 것이 바람직하다. 4-37에서 1-24시간 동안 고체 기질 상에서 배양 후, 세포에 첨가 전에 세척을 세게 하여 유리 분자들을 제거한다. 선택적으로는, 항체가 비드에 공유결합될 수 있다.
최근에, 델라마르쉐 등(Delamarche et al., 1997, Science 276:779)은 다양한 기질에 단백질을 패턴화하기 위하여 미세유동 네트워크(microfluidic network)의 사용을 개시하였다. 그러한 네트워크는 항체가 기질의 특정 부위에 한정되도록 하여 그 위에 첨가된 세포가 기질을 통해 움직일 때 정렬된 방식으로 다른 항체에 노출되도록 하는데 사용될 수 있다. 그 결과로, 세포 표면 항원은 순차적인 방식으로 항체에 의해 응집되어 최적의 활성화를 달성한다. 에컨대, T 세포는 항체에 노출되어 CD2-CD3-CD4의 순서로 표면 항원의 응집을 이룰 수 있다.
CD2 및 CD4는 CD3 다음에 위치하기 때문에, 응집의 이러한 순서는 최적의 T 세포 활성화를 유발한다. 반대로, CD2-CD4-CD3 또는 CD4-CD2-CD3 응집 순서는 이들 순서로 CD2와 CD4와의 응집이 CD3와 상호작용하는 것을 방해할 수 있기 때문에 덜 최적인 것으로 보인다. 결합 파트너의 비율, 순서 및 공간적인 배향은 원하는 결과에 따라 조정가능하다.
본 발명의 이러한 면은 특히 배양액 내에서 림프구를 확장시키는데 유용하다. 림프구의 제조를 위하여, peripheral 혈액 단핵세포는 표준적인 방식에 의해 분리되고 고정화 항체를 포함하는 배양접시에 첨가된다. 게다가, T 또는 B 세포 조제물은 세포 소팅 및 패닝(sorting and panning), 상보적인 세포독성 및 플라스틱 결착 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 자극 전에 농화될 수 있다. 유사하게는, 독특한 T 및 V 서브세트는 이들 과정에 의거하여 정제될 수 있다. 일반적으로, 수일 내지 일주 기간동안 자극되고 잠깐의 휴식기를 거친 후에 재자극된다. 선택적으로는, 확장된 세포들은 매 3 내지 14일 동안 재자극될 수 있다. 세포수 증가를 위하여, IL2 및 IL3와 같은 성장인자들이 배양액에 첨가될 수 있다. mAbs가 고체 표면 또는 비드에 첨가될 때, 촉진성 사이토킨이 또한 동일한 고체 지지체에 유사하게 첨가될 수 있다.
다중 림프구 항원을 생체내에서 응집시키기 위하여, 항체 및 이들의 항원결합 유도체가 고양이 장 봉합사와 같은 자연재료로 만들어진 생분해성 기질 또는 폴리글리콜산과 같은 합성재료에 흡착될 수 있다. 그러나, 다중 항원결합 특이성을 갖는 단일 수용성 분자가 생체내 투여에 사용될 수 있다. 사실, 그러한 수용성 다중특이적 분자는 이들이 고정화되면 또한 시험관내 림프구 활성화를 위해 바람직하다. 하기 섹션은 그러한 분자들의 제조방법에 관해 개시한다.
3. 다중 림프구 표면 항원을 응집시키는 다중특이적 분자
다중 세포 표적 항원에 결합하는 수용성 분자는 면역시스템의 생체내 조절을 위해 특정 매트릭스 상에 고정화된 분자들에 대해 잇점을 가진다. 이들 잇점은 수용성 분자들이 면역시스템을 빠르게 확산해 나갈 수 있는 능력, 및 고정화 매트릭스 없이 약학적 조성물을 제제화하는 것을 포함한다. 수용성 다중특이적 분자들은 특이성 및 애비디티(avidity)에 있어서 증가된 잠재성 및 효율성으로 단특이적 (monospecific) 분자들의 조합에 비해 잇점이 있다. 다중특이적 분자는 또한 비록 개개의 구성분이 어떤 특정 세포 타입에 대한 특이성이 결여될지라도, 표적 세포에 대한 증가된 특이성을 가진다. 특정 표적 항원에 특이적인 서너개의 낮은 친화성 (＜50nm) 결합 부위는 직렬적으로 융합되어 모든 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 증가된 결합 애비디티를 가진 다중 특이적 단백질을 형성할 수 있다. 예컨대, CD18은 모든 림프구에 의해 발현될지라도, CD18 결합 파트너로 구성된 다중특이적 분자는 CD18을 발현하고 다중 특이적 분자의 다른 표적 항원을 발현하지 않는 림프구 세브세트가 높은 애비디티로 상기 분자와 결합하지 않기 때문에 림프구 서브세트 특이성을 나타낼 수 있다.
면역시스템의 조절은 림프구 활성화, 완전한 활성화를 유도하지 못해 세포예정사 또는 림프구의 애너지(anergy), 다중 수용체-리간드 상호작용의 동시적인 블로킹에 이르는 불완전한 자극신호까지 포함한다. 게다가, 억제성 시토키닌을 분비하는 세포의 활성화는 특정 반응의 활성적 억제로 귀결될 수 있다. 그 점에 있어서, T 세포는 "TH2"-양 세포가 되도록 활성화되며 IL-4 생산 + TCR/CD3에 의한 면역반응을 억제하는 TGFβ및 IL-10을 분비하도록 유도될 수 있다. IL-4와 같은 시토키닌은 고체 지지체에 공유결합적으로 결합되거나 아니면 항체 또는 리간드와 함께 고정화되어 TH2T 세포 분화를 유도할 수 있다. 다중특이적 분자는 그러한 목적을 위하여 낮은 친화성(＜100nm) CD3 결합부위 및 CD2와 CD4를 위한 결합부위 간에 제조될 수 있다. T 세포 활성화를 위하여, 바람직한 다중특이적 분자는 CD2, CD3 및 CD28을 응집하는 결합 파트너로 구성된다. 다른 T 세포 활성화 다중특이적 분자는 CD2 및 CD3 또는 CD3 및 상기 설명한 것과 같은 세번째 가변 항원을 가진 CD28을 응집시키는 결합 파트너로 구성된다.
또한 T 세포 및 B 세포 활성화를 억제하는 수용성 다중특이적 분자도 본 발명의 권리범위에 속한다. 그러한 억제성 분자들은 동일한 표면에 존재하는 두개, 세개 및 10개까지의 항원에 동시적으로 결합할 수 있으며 이들 항원을 통한 활성화 신호의 전달을 억제한다. 그러한 한가지 다중특이적 분자는 항원제공세포 및 B 세포의 CD80, CD86 및 CD40에 결합하고, CD28 경로 및 CD40 경로의 활성화를 동시적으로 방해한다. CD28 및 CD40 경로의 이중특이적 저해제는 T 세포 상의 CD28 및 CD154(CD40 리간드)에 결합하여, CD28의 활성화를 억제하고 CD154를 CD40을 활성화시키는 것으로부터 배제시킨다. 다른 T 세포 억제성 이중특이적 분자들은 CD20 및 CD40 또는 CD2 및 CD4 또는 CD28 및 CD45 또는 CD2 및 CD154를 표적으로 한다. 삼중특이적 억제성 분자는 CD2 및 CD28 및 CD45 또는 CD2 및 CD4 및 CD28 또는 CD2 및 CD27 및 CD28을 표적으로 한다.
다중 B 세포 수용체에 결합하여 활성화 신호를 증강시키는 수용성 다중특이적 분자는 특히 악성 B 세포의 세포예정사 유도에 특히 잇점이 있다. 그러한 다중특이적 분자들은 또한 모든 수용체를 발현하는 세포에 훨씬 강하게 결합할 수 있고 다중특이적 분자에 의해 인지되는 수용체의 오직 하나 또는 어떤 서브세트만 발현하는 세포에는 훨씬 덜 결합하기 때문에 특이적 타겟팅에 유리하다. 바람직한 다중특이적 분자는 CD19, CD20, 및 CD40 수용체에 동시적으로 결합하고, 이들 수용체를 통해 활성화 신호를 생성하여 악성 B 세포의 세포예정사를 유발한다. 이중특이적 및 다중특이적 B 세포 억제성 분자들은 B 세포 또는 항원제공세포 상의 CD80 및 CD40 또는 CD86 및 CD40 또는 CD80 및 CD86 또는 CD80 및 CD86 및 B7-3을 표적으로 할 수 있다.
다중특이적 분자는 세포 표면 항원에 결합하는 다중 결합 파트너의 화학적 접합에 의하거나 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 또는 이들을 암호화하는 서열상에서 보여지는 것과 같은 결합 다중 폴리펩타이드 사슬의 복잡성을 감소시킬려는 노력에 있어서, 저분자량의 단일 사슬 폴리펩타이드가 다중특이적 분자를 제조하기 위한 결합 파트너로 이용될 수 있다. 이러한 연결에 있어서, 낙타가 경쇄가 없는 항체를 분비한다는 보고(WO94/04678)가 있다. 그러한 중쇄만의 항체의 가변 도메인(VHH로 명명됨)은 CH2 및 CH3 도메인에 결합된 힌지 영역에 직접적으로 융합된다. 중쇄에서의 CH1 도메인의 부재는 경쇄 사슬과의 이황화결합 형성을 방해한다.
중쇄만의 항체는 경쇄에 의한 항원 결합 관여가 없기 때문에 특히 다중특이적 분자의 제조에 유용하다. 이들 항체의 VHH도메인은 이들 불변 도메인을 제거하는 것이 Fc 수용체에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 때문에 심지어는 훨씬 더 적합하다. 실시예 3에서는 L.llama의 VHH도메인이 통상적인 항체의 CDRs보다 더 길다란 CDR3를 함유하며, 이들 VHH서열의 특정 서브클래스(하이브리드 서브클래스)의 CDR이 동일한 가변 도메인내 다른 CDRs과 이황화 결합을 형성하지 않는다는 것을 증명한다. 그러므로, 이들 CDRs은 항원 결합에 있어서 훨씬 더 안정하고 독립적이며, 적합한 폴딩이 이루어지도록 쉽게 발현되어진다. CDR의 이들 클래스의 독특한 특징은 다중 특이적 분자를 제조하는데 적합한 유용성을 제공한다. 이들 항체내의 CDRs는 답업계에 공지된 방법(U.S. patent No. 5,637,677)에 따라 결정되며, 다중 특이적 분자의 제조에 사용될 수 있다.
L.llama 유래의 가변영역 서열은 사람 가변 도메인의 VH3패밀리 서열과 유사하다(Schroeder et al., 1989, Int. Immunol. 2:41-50). 사람 수여자에 사용할 VHH분자의 면역성을 감소시키기 위하여, 비-CDR 또는 노출된 프레임워크 부위의 아미노산 서열이 사람 VH3잔기(residue)에 근거하여 변경될 수 있다. 낙타 VHH의 결정 구조는 노출 정도에 근거를 둔 잔기 변화에 우선적으로 적용할 수 있는 안내자료로 이용될 수 있다(Desmyter et al., 1996, Nat. Struct. Biol. 3:803-811). 잔기의 면역성을 예측할 수 있는 다른 방법은 또한 잔기 치환 선택의 안내자료로 이용될 수 있다(친수성 또는 MHC 결합 모티프). 항원 결합에 필수적인 CDRs내 또는 이웃한 잔기는 결합 애비디티의 감소를 막도록 유지되어져야 한다. 유사하게는, 소수성 VL-VH인터페이스를 제거하는데 중요한 것으로 밝혀진 프레임워크 잔기들은 최적의 폴딩 및 VHH분자의 발현을 위해 유지되어져야 한다.
실시예 2에서 예시된 특정 구현예에 있어서, 엘라마로부터 정제된 중쇄만의 항체가 T 세포 표면 항원에 결합된 사람 T 세포를 면역화시켰다. 도 1은 세포 표면 항원 결합 특이성을 갖는 VHH도메인을 빠르게 선별하기 위한 개략적인 과정을 제공한다. VHH도메인을 생성하기 위하여, 카멜리대 과에 속하는 동물들이 정제된 항원, 즉 사람 세포 표면 항원 및 엘라마 항체 불변 영역간의 융합 단백질, 또는 관심대상인 항원을 발현하는 세포를 사용한 면역화의 숙주로 사용되었다. 이들 숙주들은 Camelus bactrianus, C.dromaderius와 같은 구세계 가멜리드 (camelid), Llama paccos, L.glama, L.vicugna 및 L.llama와 같은 신세계 카멜리드를 포함하나, 이에 제한적이지는 않다. 면역화 후에, 림프절 및 비장과 같은 림프기관 유래의 peripheral 혈액 류코사이트 또는 단핵세포들은 농도구배 원심분리에 의해 분리되어지고 이들의 cDNA는 역전사/중합효소연쇄반응에 의해 획득되어졌다(하기 실시예 3에 설명). 파지 디스플레이 기법이 항원특이적 결합 VHH를 선별하기 위하여 분리된 VHH절편을 발현하도록 사용될 수 있다(U.S. patent. 5,223,409; 5,403,484 및 5,571,698). L.llama로부터 분리된 VHH서열은 실시예 3에 개시된다.
중쇄만의 항체는 또한 Koehler 및 Milstein에 의해 개시된 종래의 하이브리도마 기술(Nature, 1975, 256:495-497)에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 중쇄만의 항체는 단백질가수분해를 받아 VHH도메인을 생성할 수 있다.
분리된 VHH도메인 또는 VHH도메인으로 구성된 다중특이적 분자는 생물학적 효과기 기능을 갖는 두번째 분자와 함께 융합될 수 있다. 예컨대, 이들은 암세포 또는 자가반응성 T 세포와 같은 원하지 않는 세포롤 죽이도록 특이적 전달을 위해 슈도모나스 외독소 40(PE40)과 같은 독소와 융합될 수 있다. 이들은 또한 특이적 세포 타입에 신호를 전달하는 시토키닌 또는 VHH특이성을 수용체 특이성과 결합시키기 위하여 수용체의 세포외 도메인 또는 수용체 결합 도메인에 융합될 수 있다. 게다가, 이들은 키메라 항체 유도체를 제조하기 위하여 Ig Fc 도메인, 특정 돌연변이를 지닌 Ig Fc 도메인(U.S. Patent No. 5,624,821), 또는 Fc 도메인 부분과 융합될 수 있다. 이들은 세포내 존재하는 항원에 대해 특이적 결합이 가능하도록 세포내 타겟팅 신호와 융합될 수 있다. 이들은 효소로 작용하는 단백질 또는 효소 반응을 촉매하는 단백질과 융합될 수 있다. 게다가, 다중특이적 분자는 유전자 치료 벡터를 개선하고 및.또는 단순화시키기 위한 유전자로 발현될 수도 있다.
3-1. 다중특이적 분자의 제조
수용성 다중특이적 분자를 제조하는 바람직한 방법은 선택된 세포 표적 항원에 각각 특이적인 다중 카멜리드 VHH영역들의 융합이다. 엘라마는 쉽게 입수할 수 있기 때문에 그러한 가변 영역의 공급원으로 유용한 바람직한 카멜리드 종이다. 다중특이적 분자의 기능적 활성은 가변 영역들 결합부위의 조성, 스페이싱, 및 순서에 의존적이다. 결합부위의 조성은 사용된 개별적 VHH의 특이성 및 분자 내의 각 VHH수에 의존적일 수 있다. VHH표적 특이성은 두번째 또는 세번째 수용체에 표적화된 다른 VHH도메인에 융합된 단일 수용체에 대한 하나 이상의 VHH결합 도메인을 포함할 수 있다. 오직 한 수용체상의 두개 이상의 에피토프에 표적화된 분자는 본 발명의 권리범위에 속한다. 이들 분자들은 표적에 대한 증가된 결합 애비디티를 가지며 다중 에피토프에 결합함으로써 세포 표면 상의 단일 수용체를 교차결합시킨다. VHH도메인의 순서(ordering) 및 수용체 에피토프는 수용체내(intra-receptor) 또는 수용체간(inter-receptor) 결합 패턴을 이끄는데 중요하다. 결합 부위의 스페이싱은 VHH도메인간에 사용된 링커의 선택에 의존적일 수 있다. 링커의 길이 및 유동성은 결합 도메인간의 스페이싱을 조절하는 요소들이다. 결합 부위의 순서는 융합 단백질 제조체내 VHH도메인의 순서에 의해 조절될 수 있다.
림프구 항원 또는 이들로부터 유래된 CDRs에 결합 특이성을 가진 카멜리드 VHH도메인은 유전적 또는 화학적으로 직렬적 배열로 서로 결합될 수 있다. 만약 배열이 유전적으로 결합된다면, 융합 단백질은 단일 분자 내에 다중 항원 결합 특이성을 가질 수 있다. 바람직한 다중특이적 구조에 있어서, 결합된 분자는 동일한 활성 스펙트럼을 지녀, 블로킹, 억제성 분자가 훨씬 더 잠재적인 면역억제성 물질을 만들도록 결합될 수 있다. 유사하게는, 수용성 또는 고정화된 분자를 이용한 생체 외 세포 요법에 잠재적으로 응용하기 위하여 결합된 수용체를 응집시키고 자극하는 길항물질이 수용체를 통해 결합된 림프구의 훨씬 더 강력한 활성화를 달성하도록 결합될 수 있다.
억제성 또는 활성화 물질에 사용된 링커는 서너가지 형태를 지닐 수 있는데, 바람직하게는 글리신 및 세린을 반복적으로 포함한다. 한가지 예로써, (gly4ser)3또는 (gly3ser2)3는 항원결합 도메인간의 두 개의 바람직한 선택적인 링커이다. 이들 링커는 세포 표면의 표적 항원의 크기 및 스페이싱에 따라 플랭킹 VHH도메인의 최적 결합을 달성할 수 있도록 신장될 수 있다.
VHH도메인의 배열은 어떤 구조가 최적의 생물학적 활성을 제공하는지 결정하기 위한 일련의 구현예에서 변경되어진다. 삼중특이적 분자에 있어서, 분자의 중앙에 위차한 VHH도메인은 가장 구조적 압력을 받아 두 개의 플랭킹 도메인에 비해 그것의 표적에 대한 애비디티가 상당히 감소할 수 있다. 유사하게는, 일부 VHH도메인은 아미노 말단 대 카르복실 말단 융합에 훨씬 민감할 수 있다. CD80-CD86-CD40 구조의 억제성 효과는 CD80-CD40-CD86, CD40-CD80-CD86, CD40-CD86-CD80, 또는 CD86-CD40-CD80 타입의 분자와는 다를 수 있다.
3-2 화학적 접합 방식에 의한 다중특이적 분자의 제조
다중특이적 분자는 2개 이상의 개별적 분자들을 화학적으로 접합 (conjugation)함으로써 제조될 수 있다. Glennie ＆ Trutt(1990, Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, pp. 185, Romet-Lemonne(eds.))는 화학적 방법을 사용하여 다중특이적 항체를 제조하는 방법을 개시하였다. 요약하자면, 삼중특이적 F(ab')3는 우선적으로 두 개의 Fab' 암을 가진 이중특이적 F(ab')2를 제조하고, 세번째 Fab' 암에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 두 개의 항체 유래 F(ab')2는 먼저 환원되어 Fab'(SH)를 생성하고 하나의 항체 Fab'(SH)상의 모든 이용가능한 설프하이드릴기는 SH-기의 재산화를 최소화하면서도 SH-기와 말레이미드기(maleimide group)간의 반응을 촉진하는 조건 하에서 이중기능성 교차링커((bifunctional cross-linker) o-페닐렌디말레이미드(o-phenylenedimaleimide; o-PDM)로 말레이미데이티드(maleimidated) Fab'(SH)를 가진 Fab'(mal)과 반응한다. 이중특이적 F(ab)2를 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리한 후에, 그것은 환원되고 세번째 항체 유래의 Fab'(mal)에 결합된다. 모든 유도체는 환원되고 알킬화되어 밤새 인큐배이션되는 동안 이황화 교환 또는 SH-기의 산화에 의해 형성될 수 있는 어떠한 사소한 부적당한 산물에 대해 안전할 수 있다. 모든 다중특이적 Fab' 유도체는 고도로 특이적인 항-마우스 Fcγ면역흡착제를 통해 통과되어 분해 혼합물의 분획화 후의 모 F(ab')2절편을 가지고 빠져나갈 수 있는 모 단일클론 IgG가 제거된다.
상기 설명한 프로토콜은 교차링커 o-PDM을 사용하여 힌지 영역 설프하이드릴기의 직렬적 티오에테르 결합을 통해 삼중특이적 (Fab')3를 형성하도록 마우스 유래 IgG 유래의 Fab 절편을 위해 원래 고안되어졌다. 그러나, 이러한 방법은 리간드, 리간드의 결합 도메인, 항체, Fv, VHH및 CDR을 포함하고 이에 제한적이지 않고 다중특이적 분자 제조를 위해 어떠한 세 개 이상의 분자를 결합시키도록 조정될 수 있다.
3-3 재조합 방법에 의한 다중특이적 분자의제조
VHH도메인을 지니는 다중특이적 분자는 세균 발현시스템, 효모 발현시스템, 곤충 발현시스템 및 포유동물 발현시스템를 포함하여 많은 세포 시스템에서 발현 효율 증가를 보여줄 것이다. VHH도메인의 특징적인 변화는 강한 소수성 상호작용을 통해 경쇄 가변영역과의 결합을 요구함이 없이 발현이 가능하다는 것이다. 통상적인 가변영역은 제2 가변영역과 결합하여 소수성 가변영역 인터페이스를 가리는 것 없이는 세포 표면에 발현되거나 분비되지 않는다. 그러므로, 가변영역의 발현은 제2 가변영역과의 결합을 통제하는 소수성 인터페이스에 결합되어야 한다. VHH도메인은 개별적으로 발현되며 발현을 제한하는 소수성 잔기내 변화로 인해 훨씬 더 높은 수준으로 발현되어야 한다.
VHH도메인을 포함하는 다중특이적 분자는 또한 이들이 그들의 활성적인 구조로 보다 쉽게 폴딩하기 때문에 훨씬 더 잘 발현될 것이다. 이것은 활성적인 분자가 변성된 단백질 발현 후에 시험관내 리폴딩 과정을 요하지 않고 발현되어지는 세균 발현계에 있어서 상당히 잇점이 있다. 개선된 폴딩은 또한 포유동물 세포에서의 발현 개선에 도움이 된다.
발현율의 증가는 항체-기초의 치료제를 제조해야 할 중요한 요구성을 만족시킬 것이다. 상품의 고단가는 분자가 생체내에서 활성적이나 치료 효율성을 위해 높은 수준의 단백질을 요구한다는데 있어서 항체 결합 부위에 근거한 산물의 상업화에 중요한 제한요소가 되어왔다(때때로 환자당 1 gram을 초과함). 사실, 현재의 발현과 관련된 고단가는 항체에 근거한 산물의 성공에 커다란 장애물이 되고 있다.
재조합 생산을 위하여, 다중 결합 파트너의 암호화 서열을 포함하는 연속적인 폴리뉴클레오티드 서열이 적당한 발현벡터, 즉, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역을 위한 필수적 요소를 구비한 벡터, 또는 바이러스 벡터의 경우에 있어서는 복제 및 번역에 필수적인 요소를 구비한 벡터에 삽입되어져야 한다. 발현 비히클은 그 다음 암호화된 산물을 발현할 수 있는 적당한 표적 세포에 형질전환된다. 사용된 발현시스템에 따라, 발현되는 산물은 그 다음 당업계에 공지된 방법에 따라 분리된다. 재조합 단백질 및 펩타이드 제조를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
간행물(Desmyter et al., 1996, Nat. Struct. Biol. 3:803-811)에 개시된 카멜리드 VHH분자의 결정구조를 보면 VHH분자의 아미노 말단 및 카르복실 말단이 다중특이적 융합 단백질을 제조하는데 바람직한 구조인 분자의 다른 쪽 용매에 노출된 것을 알 수 있다. 다중 VHH분자는 하나의 VHH를 암호화하는 cDNA를 아미노산 링커 분자를 암호화하는 스페이서 cDNA를 통해 두번째 VHH에 연결함으로써 제조된다. 또 다른 VHH및 링커를 상기 이중특이적 분자에 첨가하고, 결합부위의 배열을 점차적으로 만들어가는 이러한 과정을 계속하는 것은 다중특이적 분자 제조로 이루어진다. 적절한 독특한 제한효소 부위를 VHH및 링커 카세트의 각 말단에 포함시킴으로써, 분자는 순차적인 삽입을 위한 적절한 제한효소 폴리링커를 가진 어떠한 플라즈미드 분자에도 통합될 수 있다. 선택적으로, 새로운 폴리뉴클레오티드는 VHH분자간의 적어도 두개의 연접부를 위한 아미노산 링커를 암호화하는 DNA가 끼어들어간 서너 개의 제한효소 부위를 암호화하는 기존 플라스미드에 만들어질 수 있다. 일부 링커는 (gly4ser)3, (gly3ser2)3, 또는 글리신과 세린의 다른 타입의 조합, (glyxsery), 엘라마 VHH도메인에 결합된 것과 유사하고 링커의 부분으로 교대적인 PQ 모티프(대개 4-6개)의 다양한 길이를 암호화하는 서열을 포함(아미노산 146-170간의 일부분 또는 전체 영역을 포함)하는 엘라마 VHH도메인에 결합된 것들과 유사한 힌지-양(hinge-like) 링커, 다중특이적 분자의 친수성을 개선하기 위한 훨씬 많은 전하를 띤 잔기를 갖는 링커, 또는 분자의 탐지, 동정, 및 정제를 위한 분자적 태그와 같은 작은 에피토프를 암호화하는 링커를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예는 cDNAs 말단에 독특하고 드문 제한효소 부위를 갖는 CD80, CD86, 및 CD40을 표적으로 하는 VHH분자의 PCR 증폭을 포함한다. 발현 플라스미드는 상기 설명한 바와 같은 두개 이상의 아미노산 링커를 암호화하는 상보적인 올리고뉴클레오티드를 삽입하고 어닐링시킨 폴리링커를 가지고 제조한다. 삽입된 올리고뉴클레오티드의 각 말단, 제한효소부위는 VHH카세트 중 하나의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 나타나는 것과 합치한다. 다중특이적 분자는 그 다음 개별적인 VHH카세트를 갖는 올리고뉴클레오티드-폴리링커 플라스미드의 연속적인 절단 및 결합에 의해 제조될 수 있다.
다양한 종류의 숙주발현벡터 시스템이 다중특이적 분자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이들은 적절한 암호화 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현벡터로 형질전환된 세균; 적절한 암호화 서열을 포함하는 효모 또는 곰팡이 재조합 발현벡터로 형질전환된 효모 또는 사상 곰팡이; 적절한 암호화 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현벡터(예. 배큘로바이러스)로 형질전환된 곤충세포 시스템; 적절한 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현벡터(예. Ti 플라스미드)로 형질전환되거나 재조합 바이러스 발현벡터(예. cauliflower mosasic virus or tobacco mosasic virus)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물세포 시스템과 같은 미생물을 포함하나, 이에 제한적이지는 않다.
발현시스템의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터를 포함하여 많은 적당한 전사 및 번역인자의 어떤 것들이 발현벡터에 이용될 수 있다. 예컨대, 세균 시스템에서 클로닝할때 박테리오파지λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac hybrid promoter) 등의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다; 곤충세포 시스템에서 클로닝할 때, 배큘로바이러스 다각체단백질 프로모터와 같은 프로모터가 사용될 수 있다; 식물세포시스템으로 클로닝할 때, 식물세포 게놈유래의 프로모터(예. heat shock promoter; RUBISCO 소단위체에 대한 프로모터; 클로로필 a/b 결합단백질에 대한 프로모터) 또는 식물 바이러스 유래의 프로모터(예. CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 코트 단백질 프로모터)가 사용될 수 있다. 포유동물세포 시스템에 클로닝할 때, 포유동물세포 유래의 프로모터(예. 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터(예. 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 바이러스)가 사용될 수 있다. 발현산물의 많은 카피를 포함하는 세포주를 제조할 때는, SV40-, BPV- 및 EBV-기초 벡터가 적절한 선택마커를 가지고 사용될 수 있다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우에, 다중특이적 분자를 암호화하는 서열의 발현은 수많은 프로모터들 중의 어느 하나에 의해 이루어질 수 있다. 예컨대, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터와 같은 바이러스 프로모터(Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), 또는 TMV의 코트단백질 프로모터(Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311)가 사용될 수 있다; 선택적으로, RUBISCO의 소단위체와 같은 식물 프로모터(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843) 또는 열충격 프로모터, 예컨대 soybean hsp 17.5E 또는 hsp17.3-B(Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565)가 사용될 수 있다. 이들 제조체는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세주입, 일렉트로포레이션 등을 사용하여 식물세포 내로 도입될 수 있다. 상기 기법들에 관해서는 문헌(Weissbach ＆ Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp.421-463; and Grierson ＆ Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9)를 참조하기 바란다.
본 발명의 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있는 한가지 곤충발현시스템에 있어서, Autograph californica 핵 폴리히드로시스 바이러스(AcNPV)는 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 이용될 수 있다. 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포에서 자란다. 암호화 서열은 바이러스의 비필수적 영역(예컨대, 다각체 유전자)에 클로닝되어 AcNPV 프로모터(예컨대, 다각체 단백질 프로모터) 조절 하에 놓이게 된다. 암호화 서열의 성공적인 삽입은 다각체 단백질 유전자의 불활성화 및 비-오클루디드(non-occluded) 재조합 바이러스(즉. 다각체 유전자에 의해 암호화되는 단백질성 코트가 결여된 바이러스)의 생산으로 귀결된다. 이들 재조합 바이러스는 그 다음 삽입된 유전자가 발현된 Spodoptera frugoperda 세포를 감염시키는데 사용된다. 이러한 발현 시스템의 추가적인 예는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. ＆ Wiley Interscience)을 참조하라.
포유동물 숙주 세포에 있어서, 많은 수의 바이러스 기초 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현벡터로 이용되는 경우에, 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 즉 후기 프로모터 및 트리파타이트 리더 서열 (tripartite leader sequence)에 결합될 수 있다. 이들 키메라 유전자는 그 다음 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수적 영역(예. E1 또는 E3 영역)으로의 삽입은 활성이 있고 감염된 숙주에서 펩타이드를 발현하는 재조합 바이러스 제조가 가능하게 한다(예. Logan ＆ Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 81:3655-3659). 선택적으로, 백시니아 7.5K 프로모터도 사용될 수 있다(Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
다중특이적 분자는 HPLC, 이온교환크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다. 특정 분자를 정제하는 실제적인 조건은 부분적으로는 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자들에 좌우되며, 이는 당업자에게 명백하다.
친화성 크로마토그래피 정제를 위하여, 그 분자에 특이적으로 결합하는 항체가 사용된다. 항체 생산을 위하여, 다중특이적 분자 또는 그의 일부분을 래빗, 마우스, 랫트 등을 포함하나 이에 제한적이지 않게 여러가지 숙주 동물에 주사함으로써 면역화시킨다. 분자 또는 그들의 펩타이드는 곁사슬 기능기 또는 곁사슬 기능기를 가진 링커에 의해 BSA와 같은 적당한 캐리어에 결합될 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 수산화알류미늄(Aluminum hydroxide)과 같은 금속 겔, 라이소레시틴(lysolecithin)과 같은 계면활성물질, 플루로닉 폴리올(pluonic polyols), 폴리음이온(polyanions), 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), DNP, 및 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 Corynebacterium parvum과 같은 잠재적으로 유용한 사람 어주번트를 포함하나 이에 제한적이지 않게 여러가지 어주번트가 면역학적 반응을 증가시키도록 사용될 수 있다.
4. 다중 표면항원 응집 후 활성화된 림프구의 사용
림프구는 본 발명의 방법에 따라 다중 표면 항원의 응집에 따라 배양액내에서 활성화된다. 활성화된 세포는 감염성 질병, 특히 AIDS와 같은 바이러스 감염 및 암의 치료요법에 사용될 수 있다. 활성화된 세포는 시토키닌을 분비하거나 자가항원 또는 이식조직에 대한 반응을 억제하기 위한 다른 효과기 메카니즘을 보유하기 때문에 자가면역질환 및 조직거부에 매우 유용하다. 게다가, 다중 항원을 응집시키는 다중특이적 분자는 바이러스와 같은 감염원 또는 종양세포에 대해 면역반응을 증강시키기 위해 환자에 직접 투여될 수 있다. 또한, 그러한 분자들은 T 및 B 세포 종양에 세포자살 신호를 보내어 종양 파괴를 직접적으로 유도할 수 있다. 선택적으로, 다중특이적 분자들은 항원 제공 또는 T세포/B세포 상호작용을 방해함으로써 면역반응의 저해제로 작용할 수 있다. 이들 분자들은 조직이식거부반응의 방지뿐만 아니라, 자가면역의 치료, 과민성반응의 치료에 유용하다.
4-1 제제화 및 투여경로
본 발명 다중특이적 분자는 약학적 조성물 형태로 환자에게 투여된다. 본 발명 다중특이적 분자를 포함하는 약학적 조성물은 통상적인 혼합화(mixing), 용해(dissolving), 그래뉼화(granulating), 당의정화(dragee-making), 분말화 (levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), entrapping 또는 동결건조화 방법에 의해 제조될 수 있다, 약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제내로 유효성분의 처리를 용이하게 하기 위하여 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 엑시피언트(excipients) 또는 부가제(auxiliaries) 를 사용하여 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다. 적절한 제제화는 선택된 투여경로에 따라 달라진다.
국소적 투여를 위하여, 본 발명 다중특이적 분자는 당업계에 공지된 용액, 겔, 연고, 크림, 서스펜션 등으로 제제화될 수 있다.
전신적 제제는 에어로졸, 인할러(inhaler), 네뷸라이저(nebulizer)와 같이 피부, 점액, 구강, 또는 폐 투여가 가능하도록 제조된 것 뿐만 아니라 피하지방, 정맥, 근육내, intrathecal, 복강내 주사와 같은 주사 투여가 가능하도록 제조된 것을 포함한다.
주사를 위하여, 본 발명 다중특이적 분자는 수용액, 바람직하게는 행크스액, 링거액, 또는 생리적 식염완충액과 같은 생리적으로 양립가능한 완충액으로 제조될 수 있다. 용액은 서스펜션제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 공식적인 작용제를 포함할 수 있다.
선택적으로, 다중특이적 분자는 사용 전에 예컨대 파이로젠-프리(pyrogen-free) 멸균수와 같은 적적한 비히클을 포함할 수 있다.
점막투여를 위하여, 장벽을 스며들 수 있는 투과제(penetrants)가 제제에 사용될 수 있다. 그러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
구강투여를 위하여, 다중특이적 분자는 당업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 결합시켜 쉽게 제제화될 수 있다. 그러한 담체는 치료할 환자의 구강 복용이 가능하도록 본 발명 다중특이적 분자가 정제, 좌제, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 서스펜션 등으로 제조될 수 있도록 해준다. 예컨대, 분말, 캡슐, 정과 같은 구강 고체 제제를 위해, 적절한 부형제는 설탕, 락토스, 설탕, 만니톨 및 소비톨과 같은 같은 충진제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자전분, 젤라틴, 검 트라가칸쓰, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸-셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 같은 셀룰로스 제제; 입제; 결합제 등을 포함한다. 필요하다면, 교차결합된 폴리비닐프롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이들의 염 등이 분산제(disintegrating agent) 로 첨가될 수 있다.
원한다면, 고상복용 형태는 표준기법을 이용하여 당으로 코팅되거나 장코팅 될 수 있다.
예컨대, 서스펜션, 일릭서 및 용액, 적당한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 구강 액상 제제는 물, 글리콜, 오일, 알코올 등을 포함한다. 추가로, 향미제, 보존제, 착색제 등도 첨가될 수 있다.
구강 투여를 위하여, 다중특이적 분자는 통상적인 방법에 의해 제조된 정제, 로젠지 등의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 사용을 위한 다중특이적 분자는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 가진 압력(pressurized) 팩 또는 네불라이저로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 운반될 수 있다. 압력 에어로졸에 있어서 복용단위는 정량을 운반하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정된다. 흡입제 또는 인서플래이터에 사용된 예컨대 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말 기제를 포함하도록 제조될 수 있다.
다중특이적 분자는 또한 코코아 완충액 또는 다른 글리서라이드와 같은 좌제 기제를 함유한 좌제 또는 리텐션 에네마(retention enema)와 같은 항문 또는 질 조성물로 제조될 수 있다.
상기 설명한 제제뿐만 아니라, 다중특이적 분자는 또한 디포트(depot) 제제로 만들어질 수 있다. 이러한 장기간 작용 제제는 이식(예컨대 피하지방 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러므로, 예컨대 다중특이적 분자는 적절한 폴리머 또는 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일형태의 에멀젼) 또는 이온교환수지를 가지고 드물게 녹는 유도체, 예컨대 드물게 녹는 염으로 제조될 수 있다.
선택적으로, 다른 약학적 전달 시스템이 적용될 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 본 발명 다중특이적 분자를 운반하기 위해 사용될 수 있는 운반 비히클의 공지된 예이다. 비록 높은 독성의 가격에도 불구하고 디메틸설폭사이드와 같은 유기용매가 또한 사용될 수 있다. 게다가, 다중특이적 분자는 치료제를 함유한 고체 폴리머의 반투과성 메트릭스와 같은 방출(sustained-release) 시스템을 사용하여 운반될 수 있다. 여러가지 방출 물질이 확립되었고 당업계에 공지되어 있다. 방출 캡슐은 그들 화학물질의 특성에 따라 수 주 내지 100일 동안 다중특이적 분자를 방출한다. 치료제의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라 단백질 안정화를 위한 추가적인 전략이 요구될 수 있다.
본 발명 다중특이적 분자가 전하를 띤 사슬 또는 말단을 함유함으로써 유리산 또는 염기 또는 약학적으로 허용되는 염으로 상기 설명한 제제의 어떤 형태에도 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하고 무기염과 반응시켜 제조된 염이다. 약학적 염은 수용성 및 다른 프로토닉 용액(protonic solution)에서 상응하는 유리 염기 형태보다도 더 용해가 잘되는 경향이 있다.
4-2 유효투여량
본 발명 다중특이적 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기 위해 유효한 양으로 사용된다. T 세포 및/또는 B 세포에 의해 매개되는 면역반응을 활성화시키거나 억제하기 위하여, 본 발명 다중특이적 분자 또는 이들의 약학적 조성물은 치료적 유효량(therapeutically effective) 투여되거나 적용된다. 치료적 유효량이란 치료될 환자의 병의 증상을 개선하거나 생존을 지속시킬 수 있는 유효량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은 본 발명 명세서에 상세히 개시된 관점에서 당업자의 능력 범위내에서 잘 결정될 수 있다.
전신 투여를 위해, 치료적 유효량은 처음에 시험관내 분석에 의해 평가될 수 있다. 예컨대, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도범위를 달성하기 위해 동물모델에서 투여량이 결정될 수 있다. 그러한 정보는 사람에서 유용한 투여량을 훨씬 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
초기 투여량은 또한 당업계에 공지된 기법을 사용하여 예컨대, 동물모델 생체내 데이타에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 동물 데이타에 근거하여 인간에 대한 투여량을 쉽게 최적화할 수 있다.
투여량과 투여기간은 치료적 효과를 유지하기에 충분한 혈장 다중특이적 분자 수준에 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 보통 환자의 투여량은 약 0.1 내지 5mg/kg/day, 바람직하게는 0.5 내지 1mg/kg/day이다. 치료적 으로 유효한 혈청 수준은 매일 여러번의 투여를 통해 달성될 수 있다.
국소적 투여 또는 선택적 흡수를 위하여, 다중특이적 분자의 효과적인 국소농도는 혈장 농도와는 관련이 없다. 당업자는 과도한 실험없이 치료적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
투여되는 분자의 양은 물론 치료할 환자, 환자의 체중, 병의 중증도, 투여 방법 및 치료 의사의 판단 등에 따라 달라질 수 있을 것이다.
병의 증상이 탐지가능하거나 심지어는 탐지가능하지 않을 때라도 치료는 간헐적으로 반복될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 다른 약물과의 조합으로 제공될 수 있다.
4-3 독성
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 다중특이적 분자의 치료적 유효량은 실질적인 독성 유발없이 치료적 이익을 제공할 것이다.
본 명세서에 기재된 다중특이적 분자의 독성은 세포배양 또는 실험동물에서 LD50(집단의 50% 치사량) 또는 LD100(집단의 100% 치사량)을 결정함으로써 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성효과 및 치료효과 간의 투여량 비율이 치료지수이다. 높은 치료지수를 나타내는 분자가 바람직하다. 이들 세포배양 분석 및 동물연구로부터 얻은 데이타는 사람에 사용시 독성이 없는 투여범위를 결정하는데 사용된다. 본 발명에 개시된 다중특이적 분자의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 투여량을 포함하는 순환 농도 범위내가 바람직하다. 투여량은 제공되는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위내에서 변화가 가능하다. 정확한 제제, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 따라 개별적인 의사의 판단에 의해 선택될 수 있다. 이에 대해서는 문헌(Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1)을 참조하라.
5. 엘라마 VHH발현 형질전환동물
본 명세서에 개시된 방법에 따라 분리된 VHH유전자 서열은 형질전환기술에 의해 동물내에 발현되어 엘라마 VHH를 발현하는 시조 동물(founder animal)을 제조할 수 있다(미국특허출원번호 제5,545,806호; WO98/24893). 마우스, 랫트, 래빗, 기니아피그, 돼지, 마이크로-피그(micro-pig), 염소, 양, 및 인간을 제외한 영장류, 예컨대 개코원숭이, 원숭이, 및 침팬지를 포함하나 이에 제한적이지 않게 어떠한 종의 동물도 엘라마 VHH를 발현하는 형질전환 동물을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "형질전환(transgenic)"이란 개념은 다른 종 유래의 암호화 서열을 발현하는 동물을 말한다(예컨대, 마우스가 엘라마 유전자 서열을 발현한다).
당업계에 공지된 어떠한 기법도 VHH이식유전자를 동물에 도입하는데 사용되어 형질전환 동물 시조 계(founder line)를 제조할 수 있다. 그러한 기술은 전핵미세주입법(pronuclear microinjection; Hoppe and Wagner, 1989, U.S. Patent No. 4,873,191); 점 라인으로의 레트로바이러스-매개성 유전자 전달(Van der Putten, et al., 1985, proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); 배 간세포에서의 유전자 타겟팅(Thompson, et al., 1989, Cell 56:313-321); 배의 일렉트로포레이션(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814); 및 정자-매개성 유전자 전달(Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723; Gordon, 1989, Transgenic animals, Intl. Rev. Cytol. 115, 171-229). 예컨대, 휴면상태로 유도된 배양된 배, 태아 또는 성인 세포로부터 핵이 제거된 난자 핵으로의 핵이식과 같이 당업계에 공지된 어떠한 방법도 VHH이식유전자를 함유한 형질전환동물을 제조하는데 사용될 수 있다 (Campbell, et al., 1996, Nature 380:64-66; Wilmut, et al., nature 385:810-813).
본 발명은 모든 세포가 아닌 일부 세포에 이식 유전자를 운반하는, 예컨대 모자이크 동물뿐만 아니라, 모든 세포에 VHH유전자를 함유하는 형질전환동물을 제공한다. VHH는 개별적인 유전자 절편 또는 예컨대, 머리-머리 직렬(head-to-head tandem) 또는 머리-꼬리 직렬(head-to-tail tandem) 방식의 콘카테머(concatamer)로 통합될 수 있다. VHH이식유전자는 또한 예컨대, 문헌(Lasko et al. 1992, proc. natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236)에 교시된 바에 따라 림프구와 같은 특정 세포 타입내로 선택적으로 도입될 수 있다. 그러한 세포 타입 특이적 활성화를 위해 필요한 조절성 서열은 관심을 갖는 특정 세포 타입에 의존적일 것이며, 당업자에게 명백할 것이다. 이식유전자가 내재적인 가변영역 유전자의 염색체 부위내로 통합되기를 바란다면, 유전자 타겟팅이 바람직하다. 요약하자면, 그러한 기술이 사용될 때 내재적인 유전자에 상동성이 있는 일부 뉴클레오티드 서열이 염색체 서열과 상동 재조합에 의해 끼어들고 내재적 유전자의 기능을 파괴할 목적으로 디자인된다. 이식유전자는 또한 문헌(Gu et al. 1994, Science 265:103-106)에 교시된 바에 따라 특정 세포 타입에 선택적으로 도입되어, 그 세포 타입에서만 내재적인 유전자를 불황성화시킬 것이다. 그러한 세포타입 특이적 불활성화에 필요한 조절성 서열은 특정 세포 타입에 의존적이고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
일단 형질전환동물이 제조되면, 엘라마 VHH발현은 표준기법을 이용하여 평가될 수 있다. 초기 스크리닝은 VHH삽입이 일어났는지를 평가하기 위해 동물 조직을 분석하는 서던 블롯팅 분석이나 PCR 기법을 통해 이루어질 수 있다. 항원의 면역화 후 형질전환 동물 조직의 VHHmRNA 발현 레벨은 또한 그 동물로부터 유래된 조직 샘플의 노던 블롯팅 분석, 인사이투 하이브리다이제이션 분석, 및 RT-PCR 을 포함하나 이에 제한되지 않는 기법들을 사용하여 평가할 수 있다. VHH발현 조직 샘플은 또한 엘라마 가변영역 에피토프에 특이적 항체를 사용하여 면역세포화학적으로평가될 수 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법이 항원으로 형질전환동물을 면역화시킴으로써 어떠한 항원에 대한 VHH를 제조하는데 사용될 수 있다. 반응시약의 취급이 간편하고 풍부하기 때문에 마우스가 바람직하다. 그러한 항체는 폴리클론항체, 단일클론항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, 항-이디오타이프 항체, 항원-결합 항체 절편 및 가변영역 발현 라이브러리로부터 제조된 절편 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
숙주 종에 따라 프로인트 어주번트(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 금속 젤, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, DNP와 같은 계면활성물질, 및 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 Corynebacterium parvum과 같은 사람 어주번트 등의 다양한 어주번트가 면역반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
배양한 계대 세포주에 의한 항체분자의 제조를 위하여 제공되는 어떠한 방법들을 사용하여 MAbs가 제조될 수 있다. 이들은 콜러 등(Kohler and Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497)에 의해 개시된 하이브리도마 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러한 항체는 중쇄만의 항체 및 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 어떠한 서브클래스를 포함하나 이에 제한적이지 않는 어떠한 면역글로불린일 수 있다.
설명된 본 발명 및 하기 실시예는 예시적이나, 제한적이지 않는 것으로 해석된다.
실시예 1 : 세가지 T 세포 표면 항원에 특이적인 고정화 항체의 사람 T 세포 증식 강화 효과
1. 실험재료 및 방법
(1) 사람 T 세포 증식의 자극
"FICOL"에서 원심분리에 의해 사람 peripheral 혈액으로부터 단핵세포를 분리하였다. 모노사이트는 플라스틱에 두번의 부착과정을 거쳐 제거하였다. 그 다음 단핵세포를 고정화 항체를 함유한 월당 50,000 세포로 96-웰 Costar-flat-bottom 마이크로티터 플레이트에서 자극시켰다. 인산완충염용액(PBS)에 100㎕/웰, 37℃, 세시간 동안 정제된 항체 혼합물을 인큐베이션시킨 후에, 세포 첨가전 세척하여 결합되지 않은 항체를 웰로부터 제거시켰다. 항체농도는 항-CD3 ㎕/ml, 항-CD2 10㎕/ml였고, 제3 항체는 다양한 농도로 사용하였다. 4일간 배양의 마지막 18시간 동안 quadruplicate 웰에서3H-티미딘의 세포내 이행을 통해 세포 증식을 측정하였다. 평균을 나타내었고, 표준오차는 각 포인트 평균의 15%이하였다.
(2) 항-T 세포 항체
MAb 항-CD3, OKT3를 ATCC(ATCC CRL-8001)로부터 획득하였다. MAb 항-CD3, B-T3는 디아클론(DIaclone, Besancon, France)으로부터 구입하였다. MAb 항-CD2, 9.6, 및 항-CD28 항체, 9.3은 존 한센(John Hansen, FHCRC, Seatle, WA)으로부터 제공받았다. 항-CD4, OKT4는 ATCC(ATCC CRL-8002)로부터 구입하였다. MAb 항-CD5, 10.2는 존 한센(John Hansen, FHCRC, Seatle, WA)으로부터 제공되었다. 대조구 mAb는 L6였다. 항-CD40 mAb는 클라크 및 레드베터(Clark and Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 83:4494-4498)에 의해 개시되었다. 항-CD18 mAb는 비틀리 등(Beatly et al., 1983, J. Immunol. 131:2913-2918)에 의해 개시되었다.
(3) T 세포 서브세트 분리
peripheral 혈액으로부터 "FICOL" 원심분리에 의해 T 세포를 분리한 다음, 모노사이트, B 세포, NK 세포, 및 CD4 또는 CD8 세포를 제거하여 CD4+또는 CD8+서브세트로 분리하였다. 세포 제거는 CD14, CD20, CD11b, 및 CD8 또는 CD8에 대한 mAbs를 사용하고, 항체 결합 세포들 항-마우스 IgG가 코팅된 마그네틱 비드로 제거하였다. CD4+또는 CD8+T 세포들은 제거 단계 후 플로우 사이토메트리 수행결과 ＞95% 순도였다. 항체-코팅된 마이크로티터 플레이트에서 4일 동안 5 X 104로 세포를 배양하였으며, 배양의 마지막 12시간동안3H-티미딘의 세포이행에 의해 증식을 측정하였다. 마이크로티터 플레이트는 고정화를 위해 총 단백질 농도를 평형화하기(equalize) 위한 일부 웰의 비결합(nonbinding) L20 항체(대조구)를 포함하여, 고정화된 항체를 포함하였다. 37℃에서 18시간 동안 매 10㎕/ml 배양하여 항체를 고정화하고, 강력세척에 의해 비결합 항체를 제거하였다.
(4) 항-TCR 가변영역 항체
TCR Vβ 8(Pharmingen 3313 1A), Vβ9(Pharmingen 3313 1B), Vβ14(Coulter Im. 1557), 및 Vβ20(Coulter Im. 1561)을 두 단계 과정에 의해 배양 플레이트에 고정화하였다. 정제된 염소 항-마우스(Capel) 항체를 먼저 고정화시키고 난 다음 항-VβmAb + 항-CD28의 첨가 전에 세척하고 블로킹하였다. 세포 성장을 관찰하고, 9일 후에 증식 세포는 5U/ml 인터루이킨-2(R＆D, Inc., Minneapolis, MN)을 함유한 새로운 배양 플레이트에 옮겼다. 그로부터 5일 후인 14일째 되는 날 제2차 플루오레신-접합된 항-마우스 IgG 시약(Biosource)을 사용하여 TCR Vβ특이성 발현에 대한 플로우 사이토메트리로 세포를 분석하였다.
(5) 세포자극을 위하여 비드에 항체 결합
완충액 제거를 위해 마그네트를 이용하면서 2.8 ml "DYNAL" 비드(Oslo, Norway)의 현탁액(M-450 tosyl activated, 4X108beads/ml)을 매번 4ml의 0.1M 소디움 보레이트(sodium borate)로 세번 세척하였다. 그 다음 비드를 1.5ml의 보레이트 완충액에 현탁시켯다. 200㎕(1.8 X 108beads)의 비드 서스펜션에 140㎕ 보레이트 완충액, 결합될 어떤 주어진 항체 30㎍, 및 PBS 혼합물을 첨가하였다. 첨가된 PBS의 부피는 반응혼합물의 최종 부피가 400 ㎕되도록 첨가하였다. CD3(OKT-3), CD28(9.3), 및 CD2(9.6)에 대한 항체의 모든 가능한 조합으로 결합시켰다. 항체는 회전기(rotator)에서 거의 20시간 37℃에서 비드와 반응시켰다. 그 다음 마그네트로 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 비드 제조물은 그 다음 0.1%(wt:vol) 소디움 아자이드를 함유한 1 ml의 PBS로 세번, 3%(vol:vol) 사람 혈청, 5mM EDTA, 및 0.1%(wt:vol) 소디움 아자이드(저장 완충액)을 함유한 PBS로 세번 세척하였다. 저장 완충액에서 세번째 세척의 마지막은 회전기에서 실온에서 30분 동안 수행하였다. 모든 비드 제조물을 저장 완충액을 가지고 4℃, 회전기에서 거의 31시간 동안 배양하였다. 그 다음 1.0ml 저장 완충액내 각 제조물을 재현탁시켰다.
peripheral 혈액 림프구를 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. 그 다음 림프구를 2% FCS 함유 RPMI내 플라스틱에 접착시켰다. 세포를 펠릿화시킨 다음 2.5X105/ml의 밀도로 96-웰 flat-bottom 플레이트에 도말하였다. mAb가 접합된 Dyanl 비드를 웰에 첨가하고 밤새도록 인큐배이션시켰다. 배양은 유리 필터 매트에서 수확하고 cpm을 측정하였다.
2. 결과
정상적인 수여자의 혈액으로부터 peripheral 혈액으로부터 사람 T 세포를 분리하여 세가지 T 세포 표면 항원에 반응하는 고정화된 mAbs로 시험관내에서 자극시켰다. CD2 및 CD3에 특이적인 항체와 항-CD28, 항-CD4 또는 항-CD5와 같은 제3 항체를 배양 플레이트의 표면에 흡착에 의해 함께 고정화시키고, 배양배지에 T 세포를 배양하였다. T 세포 활성화 정도로 T 세포 증식을 분석하였다. 고정화된 항-CD2, 항-CD3 항체 및 제3 대조구 항체인 T 세포에 의해 발현되지 않는 항원에 특이적인 L6의 조합 사용에 비해 세가지 고정화 항체의 조합이 T 세포의 증식을 강화하였다(도 2). 특히, 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28의 조합이 조사된 모든 농도에서 가장 높은 수준의 T 세포 증식을 나타내었다. 세가지 고정화된 항체는 용액내 존재하는 동일한 항체, 또는 두가지 고정화 항체 및 용액내의 제3 항체에서의 경우보다도 훨씬 세포증식을 크게 유도하였다. 함께 고정화된 항-CD3 및 항-CD28 + 항-CD18 mAbs가 또한 정제된 T 세포의 증식을 강화하였다(도 3). CD40은 활성화된 T 세포뿐만 아니라 항원제공세포에서도 발현된다. 그러므로, 함께 고정화된 항체에 의한 세가지 T 세포 표면 항원의 응집은 T 세포 활성화를 증가시켰다. 고정화 항체는 세포 분화를 유도할 뿐만 아니라, 배양액 내 T 세포 및 B 세포수의 확장에도 사용될 수 있다. 활성화된 세포는 용액상에 첨가된 항체로부터 분리하는 경우보다도 고정화 항체로부터 분리하는 것이 훨씬 쉽게 분리될 수 있기 때문에 치료 (adoptive theraphy)에 사용하기 위하여 세포를 수확할 때 세포에 결합된 항체를 수용체(recipient)에 주사하는 것은 최소화될 수 있다.
정제된 CD4+또는 CD8+T 세포를 고정화된 항-CD3 항체와 함께 배양할 때, 상기 항체가 단독으로 30㎕/ml로 고정화되거나 또는 대조구 항체 L20과 함께 고정화(10㎍/ml 항-CD3 + 20㎍/ml L20))되거나 관계없이 세포 증식은 최소이다. 그러나, 항-CD28 mAb를 항-CD3와 고정화시킬 때, CD4+및 CD8+T 세포의 증식이 관찰되었으며, 그러한 효과는 훨씬 더 많은 CD28 mAb를 첨가해도 더 증가되지 않았다(도 4). 유사하게, 항-CD2 mAb 및 항-CD3 mAb를 함꼐 고정화시키는 것이 항-CD3 단독에 의해 유도된 레벨보다도 더 높게 CD4+및 CD8+세포의 증식을 증가시켰다. 항체 고정화 단계 동안에 항-CD2 및 항-CD28를 항-CD3에 첨가하면, CD8+세포의 증식은 항-CD3 + 항-CD28 또는 항-CD3 + 항-CD2에 의해 유도된 것보다 더 높은 수준으로 증가되지 않은 반면 CD4+T 세포의 증식은 현저하게 증가하였다(도 4). 이러한 결과들은 함께 고정화된 항-CD3, 항-CD28 및 항-CD2 항체의 조합이 항-CD3+ 및 항-CD28의 조합, 또는 항-CD3 및 항-CD2의 조합보다도 CD4+T 세포의 증식을 증가시켰다는 것을 나타낸다.전체 T 세포 증식에 있어서, 항-CD3, 항-CD28 및 항-CD2의 조합은 CD4+T세포에 의한 훨씬 더 많은 양의 림포카인 생산을 유도하며, 이것이 그 다음 CD8+T 세포 활성화를 자극하는 것으로 보여진다. 이러한 관계에 있어서, 함께 고정화된 항체들은 3개 이상 항체의 어떤 특이적 조합이 사용되었는가에 따라 활성화된 T 세포에 의한 특징적인 사이토카인 프로필을 자극한다. 그러한 활성화된 T 세포는 모노사이트, 수상돌기세포와 같은 다른 세포 타입과 시험관내에서 공배양 될 수 있어 외부적인 사이토카인이 없어도 생장 또는 분화를 촉진할 수 있다.
게다가, 도 5 a 및 도 5b는 T 세포 증식의3H-티미딘 세포이행 측정은 고정화된 항체를 이용한 자극 후의 세포 성장과 상관관계가 있음을 보여주고 있다. 정제된 CD4+T 세포의 증식은3H-티미딘의 12hr 펄스로 7일 째에 측정하였으며, 세포 수는 8일째 날에 헤모사이토메터를 이용한 직접적 세포계수에 의해 측정하였다. 이러한 결과는3H-티미딘의 세포이행에 의한 T 세포 증식 측정이 배양시 T 세포수를 확장시키는 함께 고정화된 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28 항체의 능력을 직접적으로 반영한다는 것을 나타낸다.
T 세포 활성화에 있어서 다른 형태의 고체 지지체 상에 고정화된 항체의 능력을 시험하기 위하여, mAb를 "DYNAL" 비드에 함께 고정화시킨 후에 사람 T 세포와 배양하였다. 도 6은 비드 상에 함께 고정화된 항-CD3, 항-CD2 및 항-CD28 항체의 조합이 항-CD3 단독 또는 두가지 항체의 조합에 비해 모든 조사된 환자에게서 계속적으로 높은 수준의 T 세포 증식을 유도한 것을 보여준다. 그러므로, 비드 상에 항체를 함께 고정화시키는 것이 T 세포 활성화를 월등히 높인다. 게다가, 도 7a 및 b는 동일한 비드 상에 항체를 함께 고정화시키는 것이 개별적으로 고정화된 항체를 갖는 비드의 혼합물에 비해 보다 높은 수준의 T 세포 증식을 달성한다는 것을 증명하여, T 세포 상의 다중 표면 분자의 응집이 항체를 서로 가까이 위치시킴으로써 최적으로 달성됨을 나타낸다. 그러한 관계에 있어서, 도 8은 별개의 비드에 고정화되거나 용액에 첨가된 항-CD2가 동일한 비드 상에 함께 고정화된 항-CD3 및 항-CD28에 의해 자극된 T 세포 증식을 억제함을 보여준다.
또 다른 실험에서, 배양된 세포의 Vβ특이성 분석 결과, T 세포는 항-CD28과 함께 배양 플레이트에 고정화된 항-TCR 가변영역 항체에 의해 선택적으로 자극되었다. 함께 고정화된 항-TCR Vβ8 및 항-CD28에 의해 자극된 세포는 Vβ8의 발현에 있어 75% 양성으로 나타났으며, 대조구 항-마우스 IgG 제2단계 시약 단독에 의해 측정되는 수준 이상으로 Vβ9, Vβ14, 또는 Vβ20을 발현하지 않았다(도 9b, d, 및 f). 반면에, 동일한 수여자 샘플로부터 유래한 함께 고정화된 항-TCR Vβ8 및 항-CD28로 자극된 세포는 항-Vβ8, 항-Vβ14, 또는 항-Vβ20 항체와 반응하지 않았으나, 항-Vβ9 mAb와는 현저하게 반응(65% 양성)하였다(도 9a, c, 및 e). 항체 자극 전에 분석된 이러한 수용자 유래의 세포는 이들 V β 각 특이성의 발현이 5% 이하임을 나타내었다.
이들 데이타는 고체 표면에 함께 고정화된 개개의 TCR Vβ 에피토프 및 항-CD28 mAb에 특이적인 mAbs를 사용하여 T 세포의 매우 작은 소집단이 선택적으로 확장될 수 있음을 보여준다. TCR Vβ사용은 T 세포의 항원특이적 반응과 상당한 상관관계를 보여주고, TCR Vβ사용이 자가면역 질환 및 암 환자에서 매우 왜곡되어 있기 때문에, 항원-특이적 T 세포 또는 특정 항원 인지에 매우 경력해진 T 세포가 항-CD28 mAb와 고정화된 적당한 Vβ mAb 사용으로 선택적으로 확장될 수 있을 것이다. 게다가, CD2, CD150, CD5, 또는 ICOS와 같은 추가적인 T 세포 항원에 제3 mAb를 고정화하는 것은 특이적 Vβ를 발현하는 T 세포의 선택적인 확장을 강화할 것이다. 2개 이상의 Vβ 사슬에 대한 항체가 또한 항-CD28 및 추가적인 mAbs와 함꼐 고정화되어 사용되어 다른 서브세트의 T 세포 서브세트를 확장시키는 일 없이 원하는 Vβ 폴리펩티드 사슬을 발현하는 T 세포를 확장시킬 수 있다. 게다가, γδTCR을 발현하는 T 세포는 또한 다른 항체와 함께 고정화된 γδ이형이합체에 대한 mAb에 의해 선택적으로 확장될 수 있다. CD3 폴리펩티드 사슬 또는 TCR 알파/베타의 에피토프 또는 CDR과 같은 감마/델타 이합체를 포함하여 TCR/CD3 복합체의 어떠한 성분하고도 반응하는 항체는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
실시예 2 : 엘라마 B 세포의 CD40 발현 및 사람 세포 표면 항원 결합 중쇄만의 항체 생산
1. 실험재료 및 방법
(1) 엘라마의 면역화
Llama llama는 JJJ 농장(JJJ Farms, Redmond, WA)으로부터 입수하여 PBS 및 프로인트 완전 어주번트내에 든 사람 세포로 면역화시키고 난후, 적어도 3번 프로인트 불완전 어주번트 내에 든 동일한 세포로 복강내에 부스팅(boosting)을 하였다. 면역화를 위해 사용된 세포는 정상 비자극된 또는 활성화된 사람 peripheral 혈액 림프구(PBL), 저캣 및 HPB-ALL과 같은 T 세포주, Daudi 및 Ramos와 같은 B 세포주 또는 EBV-형질전환된 라인 CESS 등을 포함하였다. 엘라마는 또한 세포에 대하여 상기 설명한 바와 같은 어주번트와 혼합된 PBS내에 든 100-500㎍ 정제 융합 단백질로 면역화시켰다. 혈청이 표적 세포에 대해 반응성이 있는 항체를 포함한지 여부를 결정하기 위하여 각 부스트 후 4-7일간 동물로부터 혈액을 채취하였다. 동물의 항체 반응에 따라 3번째 부스트 또는 후기 부스트 후에 많은 혈액(200ml)을 채취하였다. 혈액채취는 경정맥(jugular vein) 천자(venipuncture)에 의해 이루어졌으며 전체 혈액은 시트르산 항응고제로 처리하였다.
(2) 엘라마 peripheral 혈액의 준비
엘라마 전체 혈액(200ml)을 900rpm에서 20분 동안 원심분리 한 후에 peripheral 혈액 단핵세포를 포함한 세포의 윗 층을 흡입(aspiration)하여 제2 튜브에 담았다. 그 다음 이들 분획을 PBS로 1:1 희석시키고 30ml를 림프구 분리 배지(Lymphocyte Separation Media, LSM, Organon Teknika)의 15 ml 큐션에 로딩하였다. 소발 테이블탑 원심분리기(Sovall tabletop centrifuge)에서 2000rpm, 20분 동안 원심분리하여 버피 코트(buffy coat)를 분획화시킨 후에, 혈청/LSM 계면으로부터 흡입에 의해 분리하였다. 세포를 PBS 또는 RPMI가 없는 혈청에 3번 세척한 후에 1200-1400rpm에서 10분 동안 회전시키고 최종 회전(spin) 후 계수하였다. 최종 세포 펠릿을 드라이아이스-에탄올 배쓰내 108세포/튜브로 액체 없이 순간 냉동시킨 후에 mRNA 분리 전까지 -70℃에서 보존하였다. 선택적으로, 세포를 RPMI/10% 우태아혈청에 재현탁시켜 시험관내 결합 분석 또는 기능적 연구를 위한 용도로 106세포/ml의 세포 농도로 밤새도록 배양하였다. 또한 세포를 나중의 기능적 분석을 위한 용도로 혈청/10% DMSO내에 2X107세포 함량으로 냉동시켰다.
(3) 세포 염색 및 플로우 사이토메트리
L.llama 유래의 PBL을 LSM상에서 원심분리에 의해 분리하고 세포를 항-CD40 mAb, G28-5(미국특허 제5,182,368호), 항-엘라마 면역글로불린(Ig), 및 항-경쇄 항체로 염색하였다. 항-CD40 항체(G28-5)를 바이오틴으로 라벨링하고, 그것의 결합은 피코에리트린-접합된 스트렙아비딘으로 탐지하였다. 항-경쇄 사슬 염색은 플루오레신-접합된 항-사람 카파 + 항-사람 람다 시약(Caltag, Burlingane, CA)을 사용하여 수행하였다. 세포 염색은 FACSCAN 플로우 사이토메터를 이용하여 분석하였다.
(4) 엘라마 림프구의 증식
L.llama 유래의 PBL은 LSM 상에서 원심분리에 의해 분리하였다. 림포사이트를 포볼-12-미리스트산(PMA, 10ng/ml), 항-CD40 mAb(G28-5, 1㎍/ml), CD86-발현 차이니즈 햄스터 난자(CHO) 세포, 대조구 CHO 세포 또는 상기 설명한 시약의 조합물로 자극하였다. CHO 세포는 CHO 세포 증식을 방지하기 위하여 분석 전에 조사하였다. 림프구 증식은 3일간 배양기간의 마지막 12시간 동안3H-티미딘 세포 이행에 의해 각각 50,000 림프구를 함유한 마이크로타티어 플레이트의 quadruplicate 웰에서 측정하였다. 두 다른 엘라마 유래의 림프구 증식 결과로부터 평균을 구하였다.
(5) 엘라마 항체의 정제
저캣 T 세포를 여러 번 주사하여 면역화시킨 엘라마 혈청으로부터 다단계 과정에 의해 통상적인 중쇄만의 IgG 아이소타입(isotype)으로 분획화하였다. 먼저 혈청을 단백질 A에 결합시키고, 용출시켜 DEAE 이온교환 크로마토그래피로 분리하였다. 단백질 A 용출액을 단백질 G에 결합시키고, pH 2.7 또는 pH 3.5에서 용출시킴으로써 독립적으로 분획화하였다. 분획물을 환원시킨 후 SDS-PAGE로 분석하였다.
2. 결과
분리된 엘라마 PBL을 항-CD40 및 항-Ig 또는 항-경쇄 항체와 반응시키고, 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 도 10a 및 도 10b는 엘라마 peripheral 혈액세포 집단이 항-사람 CD40 항체와 반응하였다는 것을 보여준다. 나아가 두가지 색채 염색은 모든 CD40+세포가 표면 Ig를 발현하였다는 것을 보여주어, 이들 세포가 항체-생산 B 세포임을 나타내고 있다(도 10e 및 도 10f). 그러나, CD40+세포의 일부분만이 탐지가능한 경쇄를 발현하였다(도 10c 및 도 10d). 이들 결과들은 엘라마 B 세포가 중쇄 및 경쇄로 구성된 통상적인 항체, 및 경쇄가 없는 중쇄만의 항체를 생산한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 중쇄만의 항체를 발현하는 엘라마 B 세포는 항-CD40과의 반응성 및 항-경쇄 시약과의 반응성 결여에 의해 다른 B 세포와 분리가능하다.
두 엘라마로부터 유래된 PBL을 분리하여 다른 시약으로 자극한 후, 세포 증식을 측정하였다. 항-CD40 항체는 엘레마 B세포 증식을 자극하였으며, 그것이 그 다음 PMA에 의해 증강되었다(도 11). CD86(B7.2)-발현 CHO 세포 단독으로는 L.llama B 세포 증식을 유도하지 못한 반면에, PMA와의 조합 사용은 유의적인 증식을 유도하였다(도 11). CD40 자극은 또한 엘라마 B 세포 분화를 유도하고 배양시 Ig 친화성 성숙을 유도할 수 있다. 그러므로, CD40 자극은 또한 중쇄만의 항체 및 이들 특이적 VHH영역의 분리를 용이하게 하기 위하여 중쇄만의 항체를 발현하는 엘라마 B 세포를 선택적으로 확장시키는데 사용될 수 있다. 게다가, 항-CD40 항체는 VHH를 생산하는 B 세포의 수를 증가시키기 위하여 엘라마에 도입되어 생체내에서 B 세포를 자극할 수 있다. 특이적 가변영역을 발현하는 세포는 적혈구 세포에 결합된 특이적 항원을 갖는 로제팅(rosetting)을 포함한 여러가지 방법에 의해 분리될 수 있다.
사람 T 세포를 이용하여 엘라마를 면역화시키고 혈청을 분획화하여 경쇄와 중쇄로 구성된 통상의 항체로부터 중쇄만의 항체를 분리하였다. 정제된 항체 분획은 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 도 12는 IgG1D(DEAE flowthrough in lane 1), IgG1 G(Protein G, pH 2.7 elution in lane 2), IgG2 + IgG3(Protein G, pH 3.5 elution in lane 3), 및 IgG3(protein G flowthrough in lane 4)를 포함하여 정제된 Ig 아이소타입을 보여준다. IgG2 및 IgG3 아이소타입(lane 3 및 4)는 탐지가능한 경쇄가 없는 중쇄밴드를 포함하였다.
세포 표면 항원에 결합하는 항체를 탐지하기 위하여 중쇄만의 항체(IgG2 + IgG3, 및 IgG3 분획)을 저캣 T 세포와 함께 배양하였다. 플루오레신-접합된 항-엘라마 Ig 또는 항-경쇄 제2단계 시약을 사용하여 특이적 결합을 탐지한 후, 플로우 사이토메트리로 분석하였다(도 13a-h). 음성 대조구는 면역화되지 않은 엘라마로부터 동일한 농도로 분리정제된 IgG 아이소타입이다. 항-경쇄 시약은 저캣 세포에의 IgG1 분획 결합을 탐지한 반면에(도 13b 및 d), 경쇄를 함유하지 않은 IgG2 및 IgG3 분획은 항-경쇄 시약으로 탐지되지 않았다(도 13f 및 h). 그러나, 저캣 세포를 중쇄만의 분획으로 염색하고 항-Ig 제2단계 시약으로 탐지하면 저캣 세포 표면 항원에 결합된 항체를 관찰할 수 있었다(도 13e 및 도 13g). 이로부터 경쇄가 없는 엘라마 항체가 사람 세포 표면 항원에 대해 생성되었다는 결론을 도출하였다.
실시예 3 : L.llama VHH라이브러리의 제조 및 엘라마 VHH서열의 특성조사
1. 실험재료 및 방법
(1) 엘라마 mRNA의 분리
엘라마 PBL mRNA를 촘진스키 등의 구아니디움-티오시아네이트 산-페놀 변형 방법(Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem. 162:156-159)에 의해 제조하였다. RNA 제조를 위하여 108세포에 5-10 ml의 변성/라이시스 용액을 첨가하였다. 올리고 dT 셀룰로스를 사용하여 폴리A RNA를 분리하고, 75% 에탄올/DEPC 처리된 물로 세척한 후, 재원심분리하고 DEPC 처리된 물에 재현탁하였다.
(2) 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)
수퍼스크립트 II 역전사효소(GIBCO-BRL)을 이용한 무작위 헥사머 프라임드 역전사반응에 의해 cDNA를 제조하였다. 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다; forward 프라이머(primer)는 LVH5'-1로 이는 VHH단백질의 아미노-말단 서열로부터 디자인된 20-mer 배터리 중의 하나이며 그 서열은 5'CTC GTG GAR TCT GGA GGA GG3'(서열번호 47)이었으며, reverse 프라이머는 이전에 결정된 낙타 및 사람 VH서열로부터 고안된 44-mer인 LVH3RS를 사용하였다. PCR 산물을 6% 아크릴아마이드/0.5X TBE 겔상에서 전기영동하고, 에티디움 브로마이드 염색 후에 밴드를 가시화하였다. DNA 밴드는 제작자 매뉴얼에 따라 2% NuSieve GTG 젤(FMC)로부터 분리하였고 Qiaex 비드(QIAGEN)을 사용하여 정제하였다. PCR 후 정제된 DNA는 pT-Adv 플라스미드 벡터(Clontech, Palo Alto, CA)에 리게이션시켜, 대장균 TOP10F' (Clontech)에 형질전환시켰다. VH및 VHH서열의 대표적 샘플을 결정한 후에, VHH절편내 CH1 도메인의 부재에 근거하여 VH-함유 절편과는 별개인 절편 길이를 갖는 VHH-함유 절편의 증폭을 위한 선별을 위하여 새로운 프라이머를 고안하였다. 이들 그 다음 이들 절편을 정제하여, 파지 디스플레이 벡터 XPDNT에 클로닝하고, 대부분의 VHH서열을 함유하는 엘라마 가변영역 라이브러리를 제조하는데 있어서의 템플레이트로 사용하였다.
엘라마 VHH영역 서열의 클로닝을 위한 추가적인 방법은 하기와 같다. 엘라마 PBL로부터 제조된 cDNA로부터 엘라마 IgG2-특이적 VHH영역을 클로닝하고 사람 Vh1 패밀리-특이적 5' 프라이머 및 3' 엘라마 IgG2힌지 영역 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이들 프라이머의 서열은 각각
AGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(서열번호 49) 및 GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(서열번호 50)이었다.
게다가, 엘라마 IgG2-특이적 VHH영역을 또한 엘라마 PBL로부터 제조된 cDNA로부터 클로닝하여 사람 Vh4 패밀리-특이적 5' 프라이머 및 엘라마 IgG2힌지 영역 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 이들 프라이머의 서열은 각각
AGGTGCAGCAGGAGTCGG(서열번호 52) 및 GGTTGTGGTTTTGGTGCTTGGGG이었다.
증폭으로부터 얻은 엘라마 VHH서열을 모아 SacI 및 BamH1으로 절단한 다음, 변형된 파지 디스플레이 벡터 XPDNT에 도입하여, 유전자 III 융합 카세트를 제조하였다. VHH라이브러리를 일렉트로포레이션에 의해 대장균 XL1BLUE 세균에 형질전환시키고 SB/amp/ter 배지를 함유한 커다른 NUNC 생분석 디쉬에 도말하였다. 이 단계에서, 형질전환 효율을 측정하기 위하여 연속적으로 희석된 샘플의 도말을 또한 수행하였다. 20% 글리세롤 함유 SB/amp/ter에 라이브러리를 긁어낸 후에 -70℃에서 1-2ml 분량 냉동시켰다. 라이브러리를 서너시간동안 37℃에서 액체 2XYT/amp/tet + 포도당 내에서 증폭시킨 후, 헬퍼 파아지에 감염시키고 파지 타이터를 측정하기 위하여 도말하고 포도당이 결핍된 배지에서 선택적인 조건 하에서 밤새도록 성장시켰다. 이들 배양물로부터 세균을 펠릿화하기 위한 원심분리에 의해 파아지를 분리하고, 배양 상층액의 PEG 침전을 수행한 후 파지 침전물을 회수하기 위해 제2 원심분리를 수행하였다. 침전되지 않은 배양 상층액의 일부를 PEG/NaCL 첨가 전에 또한 수확하였다. 침전물을 1/100 부피의 PBS/1%BSA에 재현탁시키고 2000-5000 RCF에서 몇 분동안 회전시켜 불용성 물질을 펠릿화시켰다. 사전 블로킹된 사람 항원 또는 세포에 대한 panning 전에 파지 스탁 또는 상층액을 얼음 상의 10% nonfat milk/PBS에 1시간 동안 배양함으로써 사전블로킹 시켰다. 비특이적 결합자 빈도를 줄이기 위하여 여러 번의 panning으로 형질전환되지 않은 또는 정상 사람 세포, 또는 관계없는 -Ig 융합 단백질을 미리 제거(preclearing)하였다. 사전 제거 및 panning은 블로킹된 파아지와 항원 또는 세포를 1 시간 동안 얼음 상에서의 공배양 및 결합된 파아지를 펠릿화시키기 위해 원심분리를 통해 이루어졌다. -Ig 융합 단백질 항원을 이용한 panning에 있어서, 원심분리 전에 파지-항원 복합체를 포획하기 위하여 단백질 A 세파로스를 사용하였다. 용출 전에 결합 세포 또는 단백질 A를 적어도 6번 세척하고 10% milk/PBS, PBS/1% BSA 또는 PBS/blocker /0.05% Tween로 12번 세척하였다. 결합된 파아지의 용출은 서너가지 다른 완충액 중의 하나에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킴으로써 수행되었다. 용출 용액은 0.1N HCl(pH2.5 in PBS), 0.1M 구연산(pH 2.8), 0.5% NP-40 in PBS, 또는 100MM 트리에틸아민을 포함한다. 세포/세파로스를 펠릿화하고 용출된 파아지를 함유한 상층액은 새 튜브에 담았다. 용출액을 지수기의 XL1BLUE 세포에 감염 전, 1M Tris(pH 9.5)에서 중화시켰다. 감염 후, 일정량을 따서 용출된 파아지 타이터를 결정하였다. 그 다음 삽입 빈도 및 각 라운드의 panning에서 DNA 서열을 결정하기 위하여 이들 도말물로부터 무작위 클론을 증폭하였다. 초기 라이브러리로부터 그리고 무작위 클론으로부터 각 라운드의 panning 후에 엘라마 VHH서열을 결정하였다.
(3) 파아지 디스플레이 벡터
절단된 형태의 박테리오파아지 M13 코트 단백질 III에 결합된 사람 항원에 특이적인 엘라마 면역글로불린 VHH도메인을 암호화하는 하이브리드 융합 단백질을 제조하기 위하여 파지 디스플레이 벡터를 제조하였다. 파지미드(phagemid) 벡터는 pUC 벡터 골격, 및 유전자 III 융합 단백질의 발현 및 헬퍼 파이지와의 공감염(coinfection) 후 파지미드의 패키징을 위한 서너개의 M13 파아지 유래 서열을 함유하였다. 두 단백질 도메인 간의 융합이 달성되는 방식이 구별되는 두 가지 방식으로 벡터를 제조하였다. 첫번째 형태는 기능적인 융합 단백질의 정제 및 탐지를 위한 잠재적 툴로 두 개의 도메인 사이에 his6 태그를 함유하였다. 두번째 형태는 이러한 태그가 없으며 두 개의 카세트 간에 오직 하나의 (gly4ser) 소단위만을 포함하였다. 벡터의 두 가지 형태는 VHH가 리더 펩타이드 도메인과 유전자 III 도메인 사이에 삽입되면 프레임이 벗어나고 기능적이지 못하는 유전자 III 융합체를 가지고 제조하였다. 모든 VHH분자들은 ompA 리더 펩타이드 (EcoRI-SacI) 및 Spel에서 시작하는 유전자 III 융합체간에 삽입을 위하여 SacI-BamHI 말단을 가지도록 PCR 증폭시켰다. 사람 항원 또는 세포에 결합 활성을 갖는 VHH카세트가 탐지 분리되어, SacI-BamHI 절편은 양립적인 부위를 가진 포유동물 발현벡터에 직접 이전할 수 있었다. 포유동물 벡터는 HindIII-SacI 리더 펩타이드 및 사람, 엘라마, 또는 마우스 Ig 융합 단백질을 발현하는 BamHI-XbaI 면역글로불린 도메인을 함유하였다. 이렇게 변형된 벡터는 기능적 분석을 받기 쉬운 시스템 내로 원하는 항원 결합 VHH의 빠른 셔틀링이 가능하게 하였다.
표적 항원을 갖고 3-5 라운드의 panning 후 개별적인 파지 클론을 분리하였다. panning 각 라운드로부터 나온 유출액으로 숙주 세균을 감염시키고 분리된 콜로니를 위한 LB/amp/tet 플레이트에 나누어 도말하였다. 개별적인 클론들을 2XYT/amp/tet 액체 배지에 수 시간 동안 배양하고, 헬퍼 파아지로 감염시킨 후 30℃, 선택적인 조건에서 밤새도록 배양하였다. 그 다음 세포를 펠릿화하기 위한 원심분리에 의해 파아지 상층액을 준비하고 배양 상층액을 새로운 튜브에 담았다. 침전된, 농축 파아지(100X)를 배양 상층액의 PEG 침전에 의해 준비하여 PBS/1%BSA에 나누어 재현탁시켰다.
실험적인 파아지 상층액, 침전, 또는 헬퍼 파아지는 10% nonfat milk/PBS 1:1로 얼음 상에서 30분 동안 예비블로킹(preblocking)시켰다. 사람 PBL 또는 모노사이트를 계수하고 5% nonfat milk/PBS에 재현탁시킨 후에 얼음 상에서 30분 동안 예비블로킹시켰다. 그 후에, 세포를 펠릿화시켜 5% nonfat milk/PBS에 재현탁시키고, 샘플당 25㎕의 예비블로킹된 파아지에 첨가하여, 얼음 상에서 1시간 동안 배양하였다. 결합 후에, 5% milk/PBS 및 1% BSA/PBS를 교대로 사용하여 3번 세척하였다. 염색배지(2% FBS/RPMI + 0.1% 소디움 아자이드)내 10㎕/ml 마우스 항-M13 항체를 샘플 당 100㎕인 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 세포를 3번 세척하였다. 염색 배지에 1:100의 FITC-접합된 염소 F(ab')2 항-마우스 Ig(gamma and light, AMI4408 BioSource Int.)를 샘플 당 100㎕인 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 배양하였다. 그 다음 표준 샘플을 세척하고 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다.
(4) DNA 절편의 서열결정
서브클론된 DNA 절편을 96℃에서 10초동안 변성(denaturation), 50℃에서 30분 동안 어닐링(annealing), 및 72℃에서 4분 동안 신장(extension)시키는 25 싸이클 프로그램을 사용하여 PE2400 써모싸이클러에서 순환 서열결정을 실시하였다. 사용된 서열결정 프라이머는 T7 프로모터 프라이머 5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA3'(서열번호 51) 및 M13 역 염기서열 프라이머 5' AAC AGC TAT GAC CAT G3'(서열번호 54)(Genosy Biotechnologies, The Woodlands, Texas)였다. 제조사의 지시에 따라 Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 반응을 수행하였다. 샘플을 에탄올 침전, 변성시키고 ABI 310 Genetic Analyzer(PE-Applied Biosystems) 상에서 모세관 전기영동으로 분석하였다. 서열을 편집하여 Sequencer 3.0(Genecodes)를 사용하여 번역하였다.
2. 결과
상기 실시예 2에 설명한 바와 같이 림프구 표면 항원에 대항한 항체반응을 일으키기 위하여 사람 림프구 또는 융합 단백질로 엘라마를 면역화시켰다. 면역화 후에, 엘라마 PBL을 준비하고 VHH라이브러리 제조를 위하여 RT/PCR에 의해 VHH-함유 DNA 절편을 수득하였다.
사람 림프구로 면역화된 엘라마로부터 세포-결합 VHH서열을 클로닝하기 위해 파지 디스플레이 벡터를 제조하였다(도 14). 하기 표 1은 서너가지 분리된 파지 클론을 나타내며, 각 클론은 사람의 다른 세포 타입에 결합하는 특징적인 패턴을 나타내었다.
다른 세포 타입에 대한 VHH파아지 클론의 결합 패턴
CCA3 CCA6 CCA13 CCA16 CCA17 CNP5 CNP6 CNP8 CNP15
림프구 29%+ 36%+ 11%+ 26%+ 34%+ 20%+ 13%+ 26%+ 12%+
모노사이트 + + - + + - - + -
T51 ++ ++ + +++ ++ ++ + + +
616 ++ ++ + +++ ++ ++ + + +
CESS + + - + + + - + -
서열결정 결과 각 클론은 독자적인 VHH를 암호화함이 밝혀졌다. 게다가, 두 개의 VHH클론, 즉 L10 및 L11을 분리하여 CHO 세포에서 발현되는 150-200K Da 항원인 고분자량 당단백질과 반응시켰다(도 15). CHO 세포를 트립신으로 예비처리하면 이들 클론이 표적 항원에 결합하는 것은 완전히 폐기되었다. 뉴라미다제 또는 다른 엔도클리코시다제로 세포를 처리 한 후에 VHH결합은 오직 부분적으로만 감소되었다. 그러므로, VHH클론은 CHO 세포 표면에 발현되는 당단백질과 반응하였다.
많은 수의 엘라마 VHHDNA 클론을 분리하여, 서열결정하고 번역하였다. 항원 또는 항원-발현 세포를 포함하는 디쉬 상에 서너 라운드의 panning에 의해 파아지 클론을 선택적으로 선별할 때, 5번째 라운드의 panning 후에 클론의 서열 다양성은 감소하였다. VHH의 결정된 단백질 서열을 L.llama 유래의 이러한 항체 가변영역 패밀리내 존재하는 서열 모티프를 동정하기 위하여 배열(alignment)시켰다. 서열 배열로부터 L.llama내에 두가지 서브클래스의 VHH서열이 있음을 알 수 있었는데, 본 명에서에서는 하이브리드(서열번호 1-9) 및 완전(서열 10-15) VHH서열로 명명되었다. 어떤 서브클래스도 통상적인 중쇄의 CH1 도메인을 포함하지 않았으며, 둘 다 항체의 도메인 내 존재하는 힌지-CH2-CH3에 직접 융합되도록 발현되었다. 대부분의 항체 가변영역에 존재하는 초가변 도메인(hypervariable domain) CDR1, CDR2 및 CDR3는 두 타입의 VHH분자에 나타난다(도 16a 및 b). L.llama VHH도메인 내 CDR3 서열은 중쇄 및 경쇄로 구성된 통상적인 항체의 대부분의 CDR3 도메인보다도 평균적으로 더 길며, 26개 아미노산 잔기를 포함하는 가장 긴 CDR3를 도 16b에 도시하였다. 낙타(camel)에서 CDR3 및 CDR2(또는 가끔 CDR1 도메인)는 보통 두 개의 CDR 도메인 간에 이황화결합을 형성하는데 관여하는 것으로 생각되어진 시스테인 잔기를 함유한다는 것이 이미 보고되었다(Muyldermans et al., 1994, Prot. Engin. 7:1129-1135). 이 잔기는 완전 VHH(도 16b)로 분류된 분자의 CDR에서 발견되지만, 하이브리드 서브클래스의 서열은 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 도메인(도 16a)에 시스테인을 포함하지 않는다. 그러므로, L.llama 유래의 VHH분자의 이러한 클래스는 독특하고 단봉낙타 종과는 구별된다. 이러한 서브클래스 유래의 CDRs은 그들간에 이황화결합 없이 독립적으로 기능을 하므로 안정성에 있어서 월등하다.
상기 설명한 서열 정보에 근거하여, 11, 37, 44, 45, 및 47번 잔기를 포함하여 가변 영역 내의 여러가지 아미노산 잔기가 VL-VH경계 형성에 중요한 것으로 동정되었다(표 2).
엘라마 항체 가변영역내 독특한 아미노산 잔기
아미노산 위치 11 37 44 45 47
마우스 L V G Q C
L V G L W
기보고된 낙타 S Y E R F
S F E R G
기보고된 엘라마 S F E R G
L F E R G
신규 VHH엘라마 클론 S F E R G
S F D R G
K F E R G
L F E R G
L F E R F
L F E R S
L F E R A
L F D R G
L F D R F
L F K R F
L F K R P
L F Q R L
L Y E R L
L Y T R L
L Y Q R L
L Y A R F
L Y E R I
L Y E R G
L L E R G
L V E R G
L Y K R R
L V G L W
L V E L W
L V E I W
L I E R R
L I D R R
L I D R L
L I E I G
L A P L W
S I E R F
S Y Q R W
S Y Q R F
V F E R F
T F E R Y
E Y L R M
4번 위치에서의 아미노산 잔기는 낙타 항체에 있어서 수용성 잔기인 것으로 보고되었다. 잔기의 변화는 또한 엘라마 VHH도메인 내에서도 발견되며, 이들이 짝짓지 않은 폴리펩티드의 수영성을 변화시킬 수 있다. 그러나, 비록 11번 잔기인 루이신이 배대 낙타에서는 세린으로 치환될지라도, L.llama 서열의 대부분은 이 위치에 루이신을 포함한다. 엘라마 서열은 이 위치에 대개 라이신, 세린, 발린, 트레오닌 또는 글루탐산을 포함한다는 것을 보여주었다.
낙타 항체의 44, 45, 및 47번 위치에 있는 아미노산은 통상적인 VH도메인에서 발견되는 보통의 소수성 잔기(각각, 44-Gly, 45-Leu, 및 47-Trp)에 대해 친수성 아미노산 치환을 포함하는 것으로 보고된 바 있다. VHH도메인의 하이브리드 서브클래스내 친수성 치환의 일반적인 발견에 대한 일부 예외가 존재한다. 모든 낙타 및 엘라마 종에서 45 잔기는 통상적인 VH도메인에서 발견되는 Leu 잔기를 치환한 불변의 Arg 잔기를 포함하는 유일한 위치이다. 이 위치에 이소루이신을 포함하는 어떤 드문 서열이 밝혀진 바 있다. 잔기 47(Trp)은 보다 가변적이고, L.llama 완전 VHH서열내에서 Gly 또는 Arg를 암호화하나, 하이브리드 VHH서열에서는 소수성 잔기인 Leu 또는 Phe를 암호화한다. 다른 클론들은 트립토판, 이소루이신, 세린 또는 알라닌도 포함하는 것으로 나타났다. 잔기 44(Gly)도 또한 가변적이고, 하이브리드 그룹에서는 이 위치에 Glu, Lys, 및 Gln이 나타나는 반면에, 완전 VHH서브클래스에서는 Gly에 대신해 Glu 또는 Asp이 치환하고 있다. 44번 위치에 트레오닌을 포함하는 클론이 또한 분리되었다.
요약하자면, VHH서열의 하이브리드 서브클래스는 하기와 같은 특징을 가진다:
(a) 이들 가변 영역 폴리펩티드는 경쇄(CH1 도메인이 없는)가 없는 항체로부터 유래한다.
(b) 이들은 CDRs간의 이황화결합을 가지지 않는다.
(c) 11번 위치의 아미노산 잔기는 보통 세린 대신에 루이신이다.
실시예 4 : 엘라마 면역글로불린 불변 영역 암호화 서열의 클로닝
1. 엘라마 혈청 분석
엘라마 IgG 융합 단백질로 발현되는 항원에 대한 혈청 반응성을 조사하기 위하여, 항원-엘라마 IgG 융합 단백질을 "DYNAL" 비드에 결합시키고 면역화된 엘라마 유래의 혈청 샘플과 인큐베이션시켰다. 그 다음 항원-비드 복합체를 용액으로부터 회전 제거하고, 세척한 후 혈청 인큐베이션 동안 결합된 어떠한 항원-반응성 단백질을 제거 하기 위하여 얼음 상의 0.1 M 시트르산(pH 2.3)에서 인큐베이션시켰다. 용액 회전시켜 항원-비드 복합체를 다시 뽑아내고 상층액을 부피의 절반인 0.1M Tris(pH 9.5)으로 중화시켰다. 2-머캡토에탄올을 환원제로 포함하는 동일 부피의 SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하여 단백질을 중화시키고 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 그 다음 샘플은 10% Tris-글리신 폴리아크릴아미드 젤에서 전개시키고 니트로셀룰로스 필터에 이전시켰다. 필터를 PBS + 5% nonfat dry milk + 0.01% NP 40에서 블로킹시킨 다음, 블로킹 완충액 + 1:5000배 희석 염소 항-카멜리드 IgG-HRP 접합체에서 인큐베이션시켰다. 그 다음 필터를 PBS + 0.01% NP 40에서 세척하고 ECL 시약에서 인큐베이션시켰다. 오토래디오그래피에 의해 단백질을 가시화하였다.
2. 결과
일련의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 엘라마 불변 영역 암호화 서열을 클로닝하였다. 엘라마 PBL 유래의 RNA를 분리하여 올리고 dT 또는 랜덤 프라이머를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 항체 중쇄 영역의 불변 도메인을 증폭하기 위하 고안된 특이적 프라이머를 사용하여 다른 엘라마 아이소타입을 PCR하였다.
엘라마 중쇄 유전자로부터 수득된 클로닝된 불변 영역 서열의 배열을 도 17에 도시하였다. IgG2및 IgG3는 CH1 도메인이 없기 때문에, 오직 힌지 영역으로부터 CH3 도메인까지의 서열만이 비교되었다. 힌지 도메인은 길이 및 서열에 있어서 가장 변이가 많다. 다른 서열의 변이는 분자 전체에 분산된 몇 개의 잔기에 제한적이다.
융합 단백질 발현을 위해 엘라마 불변 영역 서열을 여러가지 사람 류코사이트 항원 암호화 서열에 리게이션시켰다. 하기 표 3은 엘라마 불변 영역 및 사람 림프구 표면 항원간의 여러가지 표면 항원 결합 활성을 보유한 재조합 융합 단백질을 보여준다.
엘라마 Ig 불변 영역과 사람 류코사이트 항원간의 재조합 융합 단백질
융합단백질 불변 영역 발현 단백질 A에의한 정제 활성
사람 (hu)CD28 llama(L1)IgG1(hinge, CH2, CH3) 양성(by SDS-PAGE) 예 CD80+CD86+세포에 결합 양성
huCTLA-4(CD152) L1IgG1(hinge, CH2, CH3) 양성(by SDS-PAGE) 예 CD80+CD86+세포에 결합 양성
huCD40 L1IgG1(hinge, CH2, CH3) 양성(by SDS-PAGE) 예 CD154+, 활성 T세포에 결합 양성
huCD80 L1IgG1(hinge, CH2, CH3) 양성(by SDS-PAGE) 예 CD28+세포에결합 양성
huCD86 L1IgG1(hinge, CH2, Ch3) 양성(by SDS-PAGE) ? ?
huB7-3 L1IgG1(hinge, CH2, CH3) 양성(by SDS-PAGE) ? ?
huCD2 L1IgG, IgG3 L1IgG2 융합시 음성, otherspending? ? ?
엘라마 IgG1, IgG2및 IgG3의 다른 힌지 영역은 천연 분자가 모노머(monomer)나 이합체(dimer)인가에 따라 융합 단백질의 다른 타입 디자인을 가능하게 해 준다. 엘라마 불변 영역을 갖는 융합 단백질은 특히 엘라마를 면역화시키기 위한 면역원으로 특히 유용한데, 이는 왜냐하면 이들이 항-불변 영역 면역반응을 자극하지 않음으로써 분자의 비-면역글로불린 부분에 대한 항체 반응을 최대화하기 때문이다.
한 실험에서, 사람 CD40/엘라마 IgG1융합 단백질(PBS내 250㎍)로 엘라마를 면역화시켰다. 면역화 전에 예비-면역 혈청을 채취하였다. 혈청은 또한 첫번째 면역화 후 2주일 지난 엘라마로부터 채취한 후 두번째 면역화를 시켰다. 그 다음 혈청을 다시 2주 후에 채취하였다. 다른 시간대에서 채취한 엘라마 혈청을 SDS-PAGE로 분석하였을 때, 항-CD40 IgG1반응이 첫번째 면역화 후 발견되었다. 두번째 면역화 후, 항-CD40 활성이 IgG1 및 IgG2 분획에서 탐지되었다. 그러므로, CD40/Ig 융합 단백질은 엘라마에서 강력한 면역원이었다; 그리고 면역화 동안에 숙주의 혈청 반응을 탐지하기 위한 툴로 이용될 수 있었다.
실시예 5 : 마우스 항체 가변 영역의 엘라말리재이션
1. 실험재료 및 방법
(1) 엘라말리재이션을 위한 올리고뉴클레오티드
항체 가변 영역 암호화 서열의 거의 중간지점에 상보적인 올리고뉴클레오티드 짝을 제조하였다. 이러한 어닐링된 올리고뉴클레오티드에 의해 제조되는 DNA 이중쇄는 양 말단에서 18-24 염기만큼의 출발 올리고뉴클레오티드의 길이에 해당하는 오버래핑 단일 표준 프라이머를 사용하여 V-영역의 나머지를 제조하는 출발점이었다. 이 단계에서 DNA는 매우 짧기 때문에, PCR 동안의 싸이클링 시간은 매우 짧게 유지되었고(첫번째 여섯 반응에 있어서 어닐링에 10초 및 신장에 20초, 그리고 나머지 반응 세트에서는 신장시간을 30초로 증가) 오버래핑 프라이머의 양은 낮에 유지되었다. 각 프라이머 짝의 스탁 용액을 농도 범위 1μM 내지 32μM로 제조하였다. 이들 스탁 용액을 PCR 믹스로 1:20 희석시키고 각 일련의 10 싸이클 단계에서의 반응에 첨가하였다. 각 연속적인 증폭단계에 있어서, 새로이 첨가되는 프라이머의 몰 농도는 증가하였고 싸이클링 시간은 다소 긴 신장시간으로 조정되었다. 이러한 방식으로, 원하는 암호화 서열의 de novo 제조가 양쪽 방향으로 진행되었고 클로닝을 용이하게 하기 위해 각 말단에 독특한 제한효소 부위가 첨가된 최종 PCR 산물로 종결되었다.
마우스 항체 9.3에 이러한 방법을 적용하여, 64μM의 최종농도로 TE에서 모든 프라이머를 희석시킴으로써 9.3VH를 재합성하였다. 그 다음 출발 짝과 마찬가지로 동일한 양으로 함께 상보적 프라이머를 혼합함으로써 프라미어 세트를 제조하였다. 모든 다른 프라이머들은 5' 및 3' 방향 둘다에서 전 세트와 중첩되는 짝 세트로 조합되었다. 그 다음 이들 프라이머 세트를 희석시켜 프라이머의 최종 농도가 TE에서 1μM내지 32μM 범위가 되도록 하였다. 첫번째 PCR 싸이클 반응은 다음과 같이 실시하였다: 12ng의 프라이머 짝 H31-47(서열번호 28) 및 HAS47-31(서열번호 31)을 반응 혼합물에 첨가하여 최종 농도가 0.6ng/㎕ 되게 하고, 제조사의 지시에 따라 프라이머 H22-36(서열번호 27) 및 H54-40(서열번호 34)(최종농도는 50nM)를 포함하는 프라이머 짝 2(primer 2) 1μM 스탁 1㎕, 및 ExTaq(TaKaRa Biomedicals, Siga, Japan) 희석 완충액, dNTPs, 증류수와 ExTaq DNA 중합효소(1 유니트)를 포함하는 17㎕ PCR 혼합물을 첨가하였다. 반응은 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 10초 동안 어닐링 및 72℃에서 20초 동안 신장되도록 10 싸이클 동안 인큐베이션하였다. 선택적으로, VH를 엘라말리재이션하기 위하여, 사용된 첫번째 프라이머는 (LV1 및 L1HAS)(서열번호 29 및 32) 또는 (LV2 및 L2HAS)(서열번호 30 및 33)이었고 프라이머 짝 H22-36(서열번호 27) 및 L1H54-40(서열번호 35)(또는 L2H54; 서열번호 36)의 1μM 스탁 1㎕를 첫번째 반응에 첨가하였다. 두번째 10 싸이클 반응도 10㎕ PCR mix 및 1㎕의 프라이머 짝 H22-36(서열번호 27) 및 H62-49(서열번호 37)(2μM 스탁) 첨가 후에 동일한 싸이클링 조건에서 수행하였다. 세번째 10 싸이클 PCR은 19㎕ PCR mix 및 1㎕의 프라이머 짝 H13-27(서열번호 26) 및 H70-57(서열번호 38)(4μM 스탁) 첨가 후에 수행하였다. 네번째 라운드의 PCR은 동일한 조건 및 1㎕의 프라이머 짝 H4-18(서열번호 25) 및 H78-65(서열번호 39)(8μM 스탁)를 사용하여 수행하였다. 다섯번째 라운드의 PCR은 19㎕의 PCR mix 및 1㎕의 프라이머 짝 HRS-10(서열번호 24) 및 H84-73(서열번호 40)(16μM 스탁) 첨가 후에 동일한 조건을 이용하였다. PCR 8 마이크로리터를 아가로스 젤 전기영동하여 증폭을 체크하였다. PCR의 나머지는 제조사의 지시에 따라 PCR 퀵 컬럼(PCR quick column, QIAGEN)에서 정제하여 50㎕ TE로 용출시켰다.
그 다음 프라이머 농도 및 신장시간을 증가시키는 조건에서 전체 반응 세트의 시리즈를 시작하여 새로운 PCR을 전개하였다. 18㎕ PCR mix에 1㎕ PCR 산물 용출액 및 1㎕의 프라이머 짝 HRS-10 및 H100-87(서열번호 42)를 첨가하였다. 반응은 94℃에서 1분 동안 변성시키고, 94℃에서 30초 변성 단계, 55℃에서 10초 동안 어닐링 단계, 및 72℃에서 25초 동안 신장단계를 사용하는 10 싸이클 프로그램이 뒤따랐다. 다음 PCR은 동일한 조건에서 수행되었으나, 19㎕의 PCR mix에 1㎕의 프라이머 짝 HRS-10 및 H104-95(서열번호 43)(2μM)을 사용하였다. 세번째 라운드의 PCR은 신장시간을 72℃에서 30초로 증가, 19㎕의 PCR mix 및 1㎕의 프라이머 짝 HRS1-10 및 H111-100(서열번호 44)(44 μM) 첨가하는 것을 제외하고는 다른 것들과 동일한 10 싸이클 프로그램을 이용하여 수행하였다. 네번째 라운드의 PCR은 19㎕의 PCR mix 및 1㎕의 프라이머 짝 HRS1-10 및 H3RS-104(서열번호 46)(8μM ) 첨가 후에 수행하였다. 엘라말리재이션을 위하여, 프라이머 짝 HRS-10 및 93VH3'-BAM(서열번호 45)(8μM) 을 사용하였다. 80㎕ PCR 반응물은 PCR-Quick로 정제하고 30㎕ TE에서 용출시켰다. 최종 PCR 반응은 0.5㎕ PCR 용출액(eluate), 5㎕의 10 X ExTaq 완충액, 4㎕의 2.5μM dNTPs, 40㎕ dH2O, 1㎕ 의 프라이머 짝 HRS-10 및 H3RS-104(또는 93VH3-BAM)을 사용하여 확립하였다. 반응 조건은 94℃에서 60초 동안 변성 단계, 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 10초간 어닐링, 및 72℃에서 40초 동안 신장시키는 30 싸이클 프로그램, 최종적으로 72℃에서 2분간 신장시키는 단계, 및 회수 전까지 4℃에서 유지하는 단계를 포함하였다. 리더 펩타이드는 궁극적으로 템플레이트처럼 상기 서브클로닝된 PCR 산물을 사용하여 두번의 PCR 싸이클을 반복함으로써 첨가시켰다. 프라이머 짝 OKT3/9.3HYB(서열번호 23) 및 93VH3-BAM(또는 H3RS-104)를 72℃에서 신장시간 30초로 하는 첫번째 10 싸이클 반응에 포함시켰다. 두번째 10 싸이클 PCR은 처음 PCR을 설명한 것과 같은 반응 조건 하에서 프라이머 짝 OKT3VHLP-S(서열번호 22) 및 93VH3-BAM(또는 H3RS-104)를 첨가함으로써 을 수행하였으나, 신장시간을 더 길게 하였다. 마지막으로, 30 싸이클 PCR은 템플레이트로써 PCR-quick 정제된 산물, 프라이머로써 마지막 프라이머 짝 OKT3VHLP-S 및 93VH3-BAM(또는 H3RS-104)를 이용하여 attached OKT3 VH유래의 리더 펩타이드를 갖는 새로운 VH를 제조하였다.
(2) 엘라마이즈드(llamalized) 항체 생산 및 FACS 분석
성숙한 VH내 37, 44, 45, 47번 잔기에서의 서열 변이가 있는 올리고 짝을 이용하여 9.3VH의 재유도(rederivation)에 대해 설명한 대로 엘라마이즈드 9.3VH분자 LV1 및 LV2를 제조하였다(도 18). 이들 PCR 산물을 HindIII 및 BamHI으로 절단하고 pXD 발현벡터에 서브클로닝하였다. 벡터는 또한 엘라마 IgG2불변 영역을 암호화하는 BamHI-XbaI 융합 단백질 카세트를 포함하였다. 또한 엘라마 IgG1 및 IgG3 불변 영역을 사용하여 유사한 제조체를 만들었다. 그 다음 융합 단백질 발현 카세트를 일시적으로 무혈청 배지에서 COS세포로 형질도입시키고 상층액은 48시간 후에 수확하였다. 배양 상층액은 AMICON 여과 유닛을 사용하여 10배 농축시켰고, 100㎕를 106저캣 T 세포와 얼음 상에서 2시간동안 배양하였다. 세포를 1300rpm에서 5분 동안 회전시킨 후에, 상층액을 흡입하고, 1:40 FITC 항-llama(Kent Labs) 또는 FITC-항 마우스 시약(BioSource International)을 포함하는 10㎕의 염색 완충액 (PBS, 2% FBS)에 얼음 상에서 1시간 동안 재현탁시켰다. 세포를 다시 1300rpm에서 5분 동안 회전시키고, 상층액은 흡입하고, 염색 완충액 200㎕로 세척하였다. 최종 세포 펠릿을 400㎕의 염색 완충액에 재현탁시키고 FACS 세포 소터로 분석을 하였다.
2. 결과
엘라마 VHH도메인의 관찰된 특징에 근거하여, 본 명세서에서 엘라말라이재이션(llamalization)이라 정의되는 과정에서 비-엘라마 항체 중쇄를 경쇄와 짝짓기를 요하지 않는 것으로 변환시킬 수 있는 방법을 개발하였다. 분리된 mAb 유래의 VH서열을 결정하였고, 진뱅크 DNA 데이타베이스로부터 입수가능한 서열 데이타를 사용하여 동정하였다. 이러한 서열을 VH도메인의 짧은 펩타이드를 암호화하는 짧은, 오버래핑 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 사용하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 적절한 조합을 이용하여 VH도메인의 de novo 합성을 가능하게 하는 accompanying PCR 싸이클링 방법을 개발하였다. 서열 변이는 엘라마 VHH구조 안정성에 중요한 것으로 동정된 잔기-11, 37, 44, 45, 및 47(표 2)-에 걸쳐 도입되었다. 그 점에 있어서, 어떤 항체의 11번 위치는 S, K, V, T 또는 E로 변화될 수 있다; 37번 위치는 Y, F, L, V, A, 또는 I로 변화될 수 있다; 44번 위치는 E, D, K, T, Q, P, A 또는 L로 변화될 수 있다; 45번 위치는 R, L, 또는 I로 변화될 수 있다; 47번 위치는 F, G, S, A, L, I, R, Y, M 또는 W로 변화될 수 있다.
엘라마이즈드 VH도메인은 서열분석을 위하여 pUC19 내로 HindIII + XbaI 절편을 클로닝한 것처럼 서브클로닝하였다. 일단 서열변이가 확립되자, 발현 연구를 위하여 카세트를 리더 펩타이드 및 Ig 융합 도메인을 암호화하는 발현 벡터로 셔틀링하였다. 그 다음 일시적 형질전환 실험으로부터 나온 배양 상층액에 수용성 Ig 융합 단백질 발현 및 항원 결합 능력을 스크리닝하였다.
도 18에 도시된 오버래핑 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 설명한 방법을 항-CD28 항체 9.3에 적용하였다. 항체 V-영역 암호화 서열의 거의 중간지점에서 상보적 올리고뉴클레오티드 짝을 디자인하였다. 이러한 annealed 올리고뉴클레오티드에 의해 만들어진 DNA 이중쇄는 양 말단에서 24 염기만큼의 출발 올리고뉴클레오티드의 길이에 달하는 오버래핑 단일 표준 프라이머를 사용하여 V-영역의 나머지를 제조하는 출발점이었다. 이 단계에서 DNA는 매우 짧기 때문에 PCR 동안의 싸이클링 시간은 매우 짧게 유지하고, 오버래핑 프라이머의 양도 낮게 유지하였다.
각 연속적인 증폭단계에 있어서, 새로이 첨가되는 프라이머의 몰 농도는 증가하였고 싸이클링 시간은 다소 긴 신장시간을 위해 조정되었다. 이러한 방식으로, 원하는 암호화 서열의 de novo 제조가 양쪽 방향으로 진행되었고 클로닝을 용이하게 하기 위해 각 말단에 독특한 제한효소 부위가 첨가된 최종 PCR 산물로 종결되었다.
도 19는 제2단계 FITC-접합된 항-엘라마 항체 단독에 비해 9.3 항체 배양 상층액(x10)의 엘라말라이즈드 버전2로 염색된 저캣 세포에 대한 히스토그램 디스플레이를 보여준다. 실험결과로부터 엘라말라이즈드 마우스 항-CD28 항체는 중쇄만의 항체로써 그것의 세포 표적 항원과 결합할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6 : 표적 항원에 결합된 항-CD3 및 항-CD28 항체 유래의 CDR 펩타이드
본 실시예는 CD3 δ,ε또는 γ소단위체의 세포외 도메인을 포함하는 수용성 재조합 융합 단백질의 제조에 관해 개시한다. CD3γ 또는 CD3δ 및 CD3ε 와의 공동 발현(coexpression)은 천연의 구조적 에피토프에만 결합하는 것들을 포함하여 높은 친화성을 가지고 많은 수의 항-CD3 mAbs와 상호작용하는 융합 단백질을 만들어 낸다. 그러므로, 본 실시예는 천연의 CD3ε/δ 또는 CD3ε/γ 이형이합체를 제조하기 위한 방법을 나타낸다. CD3 이형이합체에 대한 잠재적 리간드를 동정할 수 있는 툴, 즉 T 세포 상의 CD3 복합체 및 TCR 간의 상호작용을 잠재적으로 방해할 수 있는 분자의 스크리닝이 제공된다면 본 시스템은 CD3 이형이합체 형성에 필요한 조건을 규정하는데 적합하다.
1. 실험재료 및 방법
(1) 펩타이드 합성
항-CD3 및 항-CD298 mAbs의 전체 CDR3 영역에 상응하는 펩타이드를 합성하였으며, Tyr/Phe-Cys 잔기를 아미노 말단 및 카르복시 말단에 첨가하였다. 펩타이드의 변형은 말단으로부터 한번에 CDR3 영역의 한 개 아미노산을 제거함으로써 이루어졌다. Fmoc chemistry(HBTU/DIEA 활성화 및 TFA 분해)를 사용함으로써 고체 상에서 펩타이드 합성을 수행하였다. 조 펩타이드(crude peptide)를 3-5 펩타이드의 배치(batch)에서 조합하고 pH 8.5에서 공기 산화에 의해 고리화시켰다(cyclized). 조 고리형 펩타이드를 역상 PHLC로 정제하여 동결건조하고 HPLC 분석 및 매스 스펙트로스코피 분석에 의해 특성화하였다.
(2) BIACORE
BIACORE는 표면 플라즈몬 웨이브가 금속/액체 계면에서 흥분될 때 일어나는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SRP)을 이용한다. 빛 경로는 경로가 지정되고, 분석물(용액 내)과 리간드(고정화된) 간의 이분자성 상호작용 (biomolecular interaction) 때문에 반사된다. CD3εδhuIg, CDεεhuIg 및 CD28huIg를 EDC/NHS 화학을 사용하여 카르복시메틸 덱스트란 칩 상에 공유결합 고정화시키고 난 후, 에탄올아민으로 블로킹시켰다. 1% DMSO가 있거나 없는 HBS 완충액(pH7.2)내 펩타이드를 용해하였으며, 이들 융합 단백질-고정화 표면을 통과하도록 하였다. EDC/NHS 단독으로 고정화하고 에탄올아민 처리에 의해 제조된 조절된 표면 위로 이들 펩타이드를 통과시킴으로써 비특이적 결합을 배제시켰다.
(3) CD3 이합체의 제조
CD3ε-Ig 융합 제조체(pHCD3ε-Ig)를 만들기 위하여, 원래의 개시코돈 및 리더 서열을 포함하여 CD3ε 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 하기 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 방법에 의해 항-CD3 + 항-CD28-활성화된 T 세포의 전체 RNA로부터 증폭시켰다(72시간);
정방향(Forward) 프라이머 : 5'GGG[CTC GAG] CCC ACC ATG CAG TCG GGC ACT CAC TGG(서열번호 55),
역방향(reverse) 프라이머 : 5'GGC C[GG ATC C]GG ATC CAT CTC CAT GCA GTT CTC ACA(서열번호 56).
괄호 내의 뉴클레오티드는 클로닝을 위해 고안된 XhoI(CTC GAG) 및 BamHI (GGA TCC) 부위를 나타낸다. PCR 산물을 XhoI 및 BamHI으로 절단시켰다. 절단된 절편을 정제하였다. 사람 IgG1 힌지-CH2-CH3를 암호화하는 게놈 절편을 가진 CDM8 발현벡터를 XhoI 및 BamHI으로 처리하였다. 절단된 벡터 및 PCR 산물의 리게이션은 CD3ε 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA를 IgG1힌지-CH2-CH3를 암호화하는 게놈 절편의 앞쪽에 프레임으로(in-frame)으로 위치시켰다. 상기 벡터에 있어서 CMV 프로모터는 포유동물 세포에서 CD3-Ig 융합단백질의 발현을 조절하였다.
사람 IgG1 힌지-CH2-CH3를 암호화하는 cDNA 절편을 게놈 절편 대신에 CD3δ-(phCD3δ01g) 및 CD3γ-Ig(phCD3γ-Ig) 제조체를 위한 융합 파트너로 사용하였다. 상기 절편을 단백질 발현을 위해 CMV 프로모터를 포한하는 pD18 발현벡터의 BamHI 및 XbaI 부위에 클로닝하였다. 원래의 개시 코돈 및 리더 서열을 포함하는 CD3δ 및 CD3γ의 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA의 절편을 상기 설명한 동일한 전체 RNA로부터 RT-PCR에 의해 분리하였다. 프라이머는 다음과 같다;
CD3δ forward, 5'GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAA AGC ACG TTT CTC(서열번호 57),
CD3δ reverse, 5'GCG[GGA TCC]ATC CAG CTC CAC ACA GCT CTG(서열번호 58),
CD3γ forward, 5'GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAA CAG GGG AAG GGC CTG(서열번호 59),
CD3γ reverse, 5'GCG[GGA TCC} ATT TAG TTC AAT GCA GTT CTG AGA C(서열번호 60).
괄호 안의 뉴클레오티드는 클로닝을 위한 HindIII(AAG CTT) 및 BamHI(GAA TTC) 부위이다. PCR 산물을 HindIII 및 BamHI으로 절단시켰다. 그 다음 정제한 PCR 절단 절편을 HindIII 및 BamHI 절단된 힌지-CH2-CH3 함유 pD18 벡터에 클로닝하였다. CD3δ및 CD3γ 세포외 도메인 암호화 cDNA를 IgG1힌지-CH2-CH3 암호화하는 게놈 절편의 앞쪽에 프레임으로(in-frame)으로 위치시켰다.
이황화 결합을 형성할 수 있는 IgG1힌지-CH2-CH3 의 힌지 영역 내 2개 시스테인 잔기의 존재로 인해, 융합 단백질은 보통 이합체로 벌현되었다.
COS-7 세포에서의 일시적인 발현을 이용하여 다른 CD3-Ig 융합 단백질을 생성하였다. 플라스미드 phCD3ε-Ig, phCD3γ-Ig를 개별적으로 또는 phCD3ε-Ig + phCD3δ-Ig 및 phCD3ε-Ig + phCD3γ-Ig 조합으로 DEAE-덱스트란 방법에 의해 COS-7 세포내로 형질전환 시켰다. 형질전환된 세포를 낮은 농도로 0.5% FBS 및 인슐린이 보충된 배지에서 유지하였다. 소모된 배지를 3일 간격으로 감염 후부터 3주 동안 수집하였다. 그 다음 융합단백질을 소모된 배지로부터 단백질 A-세파로스 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 융합단백질 발현은 항-CD3 mAb를 이용하여 SDS-PAGE 및 ELISA에 의해 확인하였다.
2. 결과
CD-3-Ig 융합 단백질을 G19-4, OKT3, BC3, 및 64.1을 포함하는 많은 수의 항-CD3 mAbs를 사용하여 ELISA 방법에 의해 특성화하였다. CD3-Ig를 붙잡기 위해 하였다. 사람 IgG 힌지-CD2-CD3에 특이적인 항체-사양고추냉이 페옥시다제 접합체를 사용하여 항-CD3 mAbs에 CD3-Ig의 결합을 측정하였다. 대조구 CD4-Ig와 마찬가지로, 100㎍/ml의 융합 단백질에서 조차도 CD3δ-Ig에 G19-4의 어떠한 결합도 측정되지 않았다(도 20). 비록 CD3ε-Ig 및 CD3γ-Ig가 G19-4에 결합하는 것이 측정될 지라도, 100ml보다 높은 농도에서조차도 포화에 도달하지 않았다. 반면에 CDεδ-Ig 및 CDεγ-Ig 이합체는 G19-4에 보다 높은 친화도로 결합하였다(도 20). 본 시험에서 CD3εδ-Ig 및 CD3εγ-Ig를 각각 4㎕/ml 및 20㎕/ml로 포화시켰다. 유사하게는, OKT3, BC3, 및 64.1 항-CD3 mAbs는 또한 CD3εγ-Ig보다도 CD3εδ-Ig 이형이합체에 훨씬 더 잘 결합하였다. 이들 데이타는 COS 세포에서 CD3ε-Ig와 CD3εδ-Ig 또는 어느 정도는 CD3εγ-Ig와 CD3ε-Ig의 공동 발현이 항-CD3 mAbs에 의해 규정된 그들의 원래 구조로 폴딩되는 이형이합체 CD3-Ig 융합단백질이 되었다는 것을 나타낸다. 게다가, 다른 항-CD3 항체에 대한 CD3-Ig 융합단백질의 결합 친화력은 BIACORE에 의해 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
BIACORE에 의해 측정된 CD3-Ig 융합단백질에 대한 항-CD3 항체의 결환 친화력
항-CD3 항체 친화력
CD3εδ-Ig CD3εε-Ig
G19.4 1.28 μM*
OKT-3 10.6 μM*
BC-3 5.7 μM*
64.1 7.58 μM*
MOPC(대조구) 측정 불가 측정 불가
μM* = 결합은마이크로몰 또는 그 이하였다.
항-CD3 mAb 및 항-CD28 mAb의 CDR3 영역을 결정하고, 이들 영역에 상응하는 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드의 말단에 시스테인 잔기를 부착한 후 방향족 잔기 타이로신 또는 트립토판(Greene, WO95/34312)을 첨가하였다. 공기 산화시, 상기 펩타이드는 시스테인간의 이황화결합 형성으로 고리화된다. 그 결과, 방향족 잔기는 고리화된 CDR 펩타이드의 고리외부에 존재하였다.
Ig 융합 단백질 형태로 그들 표적 항원에 다양한 펩타이드의 결합 친화력을 BIACORE를 사용하여 측정하였다. 하기 표 5는 서녀개의 펩타이드가 CD28-Ig에 대한 결합친화력을 나타내는데 반해, 많은 수의 펩타이드가 CD3εδ-Ig에 대해 높은 친화력을 나타냄을 보여준다. 그러므로, 작은 CDR 펩타이드는 항체를 대신하여 림프구의 활성화에 사용될 수 있다.
두 mAbs CDR3 영역 유래 펩타이드의 결합 친화력
펩타이드 결합 친화력
CD3εδIg** CD28Ig
YCRSAYYDYDGIAYCW(서열번호 61)YCSAYYDYDGIAYCW(서열번호 62)YCAYYDYDGIAYCW(서열번호 63) 7μM 166μM
YCRYYDDHYSLDYCW(서열번호 64)YCYYDDHYSLDYCW (서열번호 65)YCYDDHYSLDYCW (서열번호 66)YCDDHYSLDYCW (서열번호 67)YCDHYSLDYCW (서열번호 68) nd nd
YCARDSDWYFDVCW(서열번호 69)YCARSDWYFDVCW(서열번호 70)YCARDWYFDVCW(서열번호 71) 50μM nd
YCGYSYYYSMDYCW(서열먼호 72)YCYSYYYSMDYCW(서열번호 73)YCSYYYSMDYCW(서열먼호 74) nd 1.0μM
YCYDYDGCY(서열번호 75) 10μM nd
YCYDYDYCY(서열번호 76) nd nd
YCYDYDFCY(서열번호 77) nd nd
YCYDDHTCY(서열번호 78) nd nd
YCYDDHQCY(서열번호 79) nd nd
YCFDWKCY(서열번호 80) 0.5μM nd
본 발명은 본 발명의 한 면을 예시하기 위한 목적으로 의도된 예시화된 구현예에 의해 권리범위가 제한되지 않으며 기능적으로 동등한 어떠한 서열도 본 발명의 권리범위에 속한다. 실제, 본 발명에서 도시되고 개시된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 변형도 첨부된 특허청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 그 전체로 참고자료로 편입된 것이다.
＜110＞ XCYTE THERAPHIES, INC
＜120＞ Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
＜150＞ US 60/075,274
＜151＞ 1998-02-19
＜150＞ US 60/108,683
＜151＞ 1998-11-16
＜160＞ 80
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 225
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 1
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Gln Glu Gly Leu Asp
20 25 30
Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Thr Asn Ile Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asp Lys Arg Gly Pro Val Ile Thr Val Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln
115 120 125
Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro
130 135 140
Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
145 150 155 160
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val
165 170 175
Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe
180 185 190
Asn Gly Thr Leu Met Ala Arg Gly Val Trp Arg Gly Leu Val Gln Pro
195 200 205
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Val Asn Leu Asp Leu Leu Arg Leu Tyr
210 215 220
Ser
225
＜210＞ 2
＜211＞ 183
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 2
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val
35 40 45
Ala Asp Ile Ser Gly Ser Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Leu Leu Lys Phe Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Ser Glu Asp Arg Arg Thr Glu Leu Lys Lys Glu Arg Ala Asn Ser Trp
100 105 110
Phe Pro Ala Arg Lys Phe Met Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Gln Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln
130 135 140
Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro
145 150 155 160
Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ser Ser
165 170 175
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val
180
＜210＞ 3
＜211＞ 204
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 3
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Thr Ile Arg
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Ile Gln Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Thr Ala Asp Gly Ser Gln Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Phe Gly Asp Asn Asp Lys Lys Thr Val Trp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ile Ile Thr Thr Asp Trp Arg Ser Ser Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln
115 120 125
Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys
130 135 140
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro
165 170 175
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val
180 185 190
Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Ala Glu Phe
195 200
＜210＞ 4
＜211＞ 208
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 4
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Asp Phe Gly Ser Ser
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Val Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Val Arg Thr Arg Gln Arg Leu Asn Ile Arg Ala Asp Glu Asp Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys
115 120 125
Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro
130 135 140
Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
195 200 205
＜210＞ 5
＜211＞ 206
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 5
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Ile Lys Phe Gly Ile Thr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Leu Asn Glu Pro Glu Leu Val
35 40 45
Ala Val Val Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Tyr Glu Gly Arg Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Ser Ile Leu Ala Ala Ser Ser Ala Glu Thr Val Gln Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Leu Glu Pro Lys Thr Pro
115 120 125
Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr
130 135 140
Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser
165 170 175
Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
195 200 205
＜210＞ 6
＜211＞ 208
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 6
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Arg Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Ile Phe Val Asp Arg Trp
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Lys Pro Leu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ala Trp Asp Gly Asp Glu Thr Trp Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Val Ala Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Leu Asn Gly Ala Trp Pro Ser Ser Ile Ala Thr Met Thr Pro
100 105 110
Asp Leu Gly Trp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Leu Glu
115 120 125
Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro
130 135 140
Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
195 200 205
＜210＞ 7
＜211＞ 204
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 7
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Asn Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
His Met Ala Trp Phe Arg Gln Thr Pro Asp Lys Glu Pro Glu Phe Val 35 40 45
Ala Val Ser Trp Lys Gly Gly Ser Glu Tyr Tyr Lys Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Gly Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Asp His Val Thr Arg Gly Ala Ser Lys Ala Ser Tyr Arg Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro
115 120 125
Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser
130 135 140
Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu
180 185 190
Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
195 200
＜210＞ 8
＜211＞ 211
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 8
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Ser Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Arg Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asn Ile Ala Ala Gly Trp Asp Thr Leu Ser Arg Asp Trp Arg
100 105 110
Asp Lys Arg Thr Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln
130 135 140
Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu
145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
165 170 175
Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
180 185 190
Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala
195 200 205
Lys Pro Asn
210
＜210＞ 9
＜211＞ 205
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 9
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ser Arg Val Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Met Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Asp Tyr Gly Pro Gly Arg Arg Ser Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr
115 120 125
Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu
130 135 140
Ser Lys Cys Pro Lys Arg Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly
165 170 175
Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
195 200 205
＜210＞ 10
＜211＞ 209
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 10
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Gly Asp
20 25 30
Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Leu Ser Arg Tyr Gly Gly Pro Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Ser Asp Ala Ala Lys Thr Lys Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Ala His Ile Ser Cys Asp Trp Asn Ile Ile Asn Pro Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
115 120 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn
130 135 140
Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
145 150 155 160
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly
180 185 190
Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Ser Arg
195 200 205
Ile
＜210＞ 11
＜211＞ 217
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 11
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Val Phe Thr Leu Asp Asp
20 25 30
Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ile Cys Met Ser Ala Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Glu Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asn Tyr Leu Gly Arg Val Arg Gly Ser Ala Ile Arg Ala
100 105 110
Ala Asp Tyr Cys Ser Gly Ser Gly Ser Val Val Tyr His Phe Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro
130 135 140
Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys
145 150 155 160
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
165 170 175
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu
180 185 190
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser
195 200 205
Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Glu Phe
210 215
＜210＞ 12
＜211＞ 219
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 12
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Phe Thr Arg Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Ile Ser Thr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Gly Asp Asn Asp Lys Met Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Ala Leu Ile Asn Trp Tyr Ser Pro Pro Asn Thr Asp Tyr Asp Ser
100 105 110
Ala Trp Cys Arg Gly Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys
130 135 140
Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys
145 150 155 160
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
165 170 175
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro
180 185 190
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val
195 200 205
Ser Phe Asn Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
210 215
＜210＞ 13
＜211＞ 216
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 13
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Phe Thr Phe Asp Asp
20 25 30
Tyr Ala Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Ile Ser Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Val Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Pro Arg Ile Trp Leu His Ser Val Val Gln Gly Thr
100 105 110
Glu Arg Cys Leu Thr Asn Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro
130 135 140
Gln Pro Gln Pro Gln Leu Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys
145 150 155 160
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
165 170 175
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr
180 185 190
Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn
195 200 205
Gly Thr Leu Met Ala Lys Pro Asn
210 215
＜210＞ 14
＜211＞ 214
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 14
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Thr Phe Gly Val Ser Thr Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Arg
35 40 45
Val Ser Cys Ile Ser Gly Arg Asp Gly Thr Ala Ala Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Ala Asn Leu Gly Leu Arg Pro Ser Asp Phe Asn Arg Gly Tyr
100 105 110
Lys Cys Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro
130 135 140
Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Gly Thr
195 200 205
Leu Met Ala Ser Arg Ile
210
＜210＞ 15
＜211＞ 204
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 15
Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Leu Thr Phe Asp Asp
20 25 30
Tyr Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Asp Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Ile Ser Ala Thr Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asn Asn Ala Glu Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His
85 90 95
Cys Ala Ala Val Arg Ser Trp Val Lys Ser Ile Tyr Ser Arg Thr Trp
100 105 110
Cys Thr Asp Leu Tyr Leu Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro
130 135 140
Gln Pro Leu Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Ser Arg Ile
195 200
＜210＞ 16
＜211＞ 231
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 16
Glu Pro His Gly Gly Cys Thr Cys Pro Gln Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Val Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val
20 25 30
Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Gly Lys Glu Asp Pro Glu Val Asn Phe Asn Trp Tyr Ile Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val Arg Thr Ala Asn Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala
100 105 110
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr
130 135 140
Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ala Asp Ile Asn
145 150 155 160
Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala
165 170 175
Asn Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Arg Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Arg Gly Glu Thr Leu Thr
195 200 205
Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
225 230
＜210＞ 17
＜211＞ 231
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 17
Glu Pro His Gly Gly Cys Thr Cys Pro Gln Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Val Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val
20 25 30
Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Gly Lys Glu Asp Pro Glu Val Asn Phe Asn Trp Tyr Ile Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val Arg Thr Ala Asn Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Val
100 105 110
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr
130 135 140
Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ala Asp Ile Asn
145 150 155 160
Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala
165 170 175
Asn Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Arg Gly Glu Thr Leu Thr
195 200 205
Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
225 230
＜210＞ 18
＜211＞ 246
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 18
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn
1 5 10 15
Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
20 25 30
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
35 40 45
Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly
50 55 60
Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Trp Tyr Ile Asp Gly Ala Glu
65 70 75 80
Val Arg Thr Ala Asn Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
85 90 95
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Thr
100 105 110
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
115 120 125
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln
130 135 140
Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr Val
145 150 155 160
Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val
165 170 175
Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala Thr
180 185 190
Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
195 200 205
Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu Thr Phe Thr Cys
210 215 220
Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
225 230 235 240
Thr Gln Ser Ser Gly Lys
245
＜210＞ 19
＜211＞ 248
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 19
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu
20 25 30
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
35 40 45
Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
50 55 60
Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Trp Tyr Ile Asp Gly
65 70 75 80
Ala Glu Val Arg Thr Ala Asn Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
85 90 95
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
100 105 110
Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp
145 150 155 160
Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
165 170 175
Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr
180 185 190
Ala Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr
195 200 205
Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu Thr Phe
210 215 220
Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
225 230 235 240
Ser Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
245
＜210＞ 20
＜211＞ 250
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 20
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Ala
20 25 30
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
35 40 45
Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val Thr Cys Val Val
50 55 60
Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Asn Trp Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Gly Ala Glu Val Arg Thr Ala Asn Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln
85 90 95
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
100 105 110
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
115 120 125
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
130 135 140
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala
145 150 155 160
Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro
165 170 175
Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
180 185 190
Thr Tyr Ala Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe
195 200 205
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
210 215 220
Thr Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
225 230 235 240
Gln Lys Ser Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
245 250
＜210＞ 21
＜211＞ 234
＜212＞ PRT
＜213＞ Llama llama
＜400＞ 21
Ala His His Ser Glu Asp Pro Thr Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ala
20 25 30
Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Asn Phe Ser Trp Ser Val
50 55 60
Asp Gly Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala
130 135 140
Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala
145 150 155 160
Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
165 170 175
Thr Tyr Ala Asn Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
195 200 205
Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
225 230
＜210＞ 22
＜211＞ 81
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ primer
＜400＞ 22
tgtaagcttg ccaccatgga ttgggtgtgg accttgctat tcctgttgtc agtaactgca 60
ggtgtccact cccaggtgca g 81
＜210＞ 23
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 23
gcaggtgtcc actcccaggt gcagctgaag gagtcagg 38
＜210＞ 24
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 24
tcttctaagc ttagttgtct tgagctccag ctgaaggagt caggacct 48
＜210＞ 25
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 25
ctgaaggagt caggacctgg cctggtgacg ccctcacaga gcctg 45
＜210＞ 26
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 26
acgccctcac agagcctgtc catcacttgt actgtctctg ggttt 45
＜210＞ 27
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 27
acgccctcac agagcctgtc catcacttgt actgtctctg ggttt 45
＜210＞ 28
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 28
gactatggtg ttcattgggt tcgccagtct ccaggacagg gactggagtg c 51
＜210＞ 29
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 29
gactatggtg ttcattggtt ccgccagtct ccaggacagg agcgcgaggg t 51
＜210＞ 30
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 30
gactatggtg ttcattggta ccgccagtct ccaggacagg agcgcgagtt c 51
＜210＞ 31
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 31
gcactccagt ccctgtcctg gagactggcg aacccaatga acaccatagt c 51
＜210＞ 32
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 32
accctcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gaaccaatga acaccatagt c 51
＜210＞ 33
＜211＞ 51
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 33
gaactcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gtaccaatga acaccatagt c 51
＜210＞ 34
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 34
ccagcccata ttactcccag gcactccagt ccctgtcctg gaga 44
＜210＞ 35
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 35
ccagcccata ttactcccag accctcgcgc tcctgtcctg gaga 44
＜210＞ 36
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 36
ccagcccata ttactcccag gaactcgcgc tcctgtcctg gaga 44
＜210＞ 37
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 37
gagagccgaa ttataattcg tgcctccacc agcccatatt ac 42
＜210＞ 38
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 38
tttgctgatg ctctttctgg acatgagagc cgaattataa tt 42
＜210＞ 39
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 39
gaaaacttgg cccttggagt tgtctttgct gatgctcttt ct 42
＜210＞ 40
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 40
agcttgcaga ctcttcattt ttaagaaaac ttggcccttg ga 42
＜210＞ 41
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 41
acagtaatac acggctgtgt catcagcttg cagactcttc at 42
＜210＞ 42
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 42
ataggagtat cccttatctc tggcacagta atacacggct gt 42
＜210＞ 43
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 43
accccagtag tccatagaat agtaatagga gtatccctta tc 42
＜210＞ 44
＜211＞ 42
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 44
gacggtgact gaggttcctt gaccccagta gtccatagaa ta 42
＜210＞ 45
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 45
tcttctggat ccagaggaga cggtgactga ggttcc 36
＜210＞ 46
＜211＞ 57
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Primer
＜400＞ 46
ctgtctagac ctgctagcag aggagacggt gactgaggtt ccttgacccg agtagtc 57
＜210＞ 47
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ primer
＜400＞ 47
ctcgtggart ctggaggagg 20
＜210＞ 48
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 48
cgtcatgtcg acggatccaa gctttgagga gacggtgacy tggg 44
＜210＞ 49
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ primer
＜400＞ 49
caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23
＜210＞ 50
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ primer
＜400＞ 50
ggttgtggtt ttggtgtctt g 21
＜210＞ 51
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 51
caggtcaact taaagggagt ctgg 24
＜210＞ 52
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 52
aggtgcagct gcaggagtcg g 21
＜210＞ 53
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 53
taatacgact cactataggg aga 23
＜210＞ 54
＜211＞ 16
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 54
aacagctatg accatg 16
＜210＞ 55
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 55
gcgctcgagc ccaccatgca gtcgggcact cactgg 36
＜210＞ 56
＜211＞ 36
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 56
ggccggatcc ggatccatct ccatgcagtt ctcaca 36
＜210＞ 57
＜211＞ 38
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 57
gcgataaagc tgccaccatg gaacatagca cgtttctc 38
＜210＞ 58
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 58
gcgggatcca tccagctcca cacagctctg 30
＜210＞ 59
＜211＞ 39
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 59
gcgataaagc ttgccaccat ggaacagggg aagggcctg 39
＜210＞ 60
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Artificial sequence
＜400＞ 60
gcgggatcca tttagttcaa tgcagttctg agac 34
＜210＞ 61
＜211＞ 16
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 61
Tyr Cys Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp
1 5 10 15
＜210＞ 62
＜211＞ 15
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 62
Tyr Cys Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp
1 5 10 15
＜210＞ 63
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 63
Tyr Cys Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 64
＜211＞ 15
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 64
Tyr Cys Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp
1 5 10 15
＜210＞ 65
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 65
Tyr Cys Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 66
＜211＞ 13
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 66
Tyr Cys Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 67
＜211＞ 12
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 67
Tyr Cys Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 68
＜211＞ 11
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 68
Tyr Cys Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 69
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 69
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 70
＜211＞ 13
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 70
Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 71
＜211＞ 12
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 71
Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 72
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 72
Tyr Cys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 73
＜211＞ 13
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 73
Tyr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 74
＜211＞ 12
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 74
Tyr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp
1 5 10
＜210＞ 75
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 75
Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Gly Cys Tyr
1 5
＜210＞ 76
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 76
Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Tyr Cys Tyr
1 5
＜210＞ 77
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 77
Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Phe Cys Tyr
1 5
＜210＞ 78
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 78
Tyr Cys Tyr Asp Asp His Thr Cys Tyr
1 5
＜210＞ 79
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 79
Tyr Cys Tyr Asp Asp His Gln Cys Tyr
1 5
＜210＞ 80
＜211＞ 9
＜212＞ PRT
＜213＞ Mus musculus
＜400＞ 80
Tyr Cys Phe Asp Trp Lys Asn Cys Tyr
1 5

Claims (49)

  1. 림프구에 의해 발현되는 3개 이상의 항원을 응집시키고, 림프구를 활성화시키는 것을 포함하는 림프구 활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 림프구가 T 세포임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4를 발현함을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  4. 제2항에 있어서, 3개 이상의 항원이 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD25, CD27, 28, CD40, CD43, CD45RA, CD45RO, CDw137, CDW150, CD152, ICOS, TCR 알파, TCR 베타, TCR 델타, 및 사이토키닌 수용체의 조합으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항원이 하나의 다중특이적 분자에 의해 응집됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항원이 하나 이상의 항체 또는 이들의 항원-결합 유도체에 의해 응집됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체가 중쇄만 또는 그의 항원-결합 유도체만 포함하는 것을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항원-결합 유도체가 VHH임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 항원이 펩타이드에 의해 응집됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩타이드가 항체 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 항원이 그들의 상응하는 리간드에 의해 응집됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 유도체가 고체 표면에 고정화된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 유도체가 입자성 기질 (particulate substrate)에 접합된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 유도체가 연속적인 순서로 배열된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 활성화되어 증식됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 활성화되어 사이토키닌을 생산함을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  17. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 활성화되어 세포 표면 항원의 발현을 변경하는 것을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  18. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 활성화되어 사이토키닌 발현을 변경하는 것을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  19. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 세포자살(apoptosis)을 일으킴을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  20. 제2항에 있어서, 상기 림프구가 B 세포임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세가지 이상의 항원이 표면 Ig, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD40, CD45, CD80, CD86, B7.3, 및 ICAMI의 조합으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 B 세포가 활성화되어 증식됨을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 B 세포가 활성화되어 세포자살을 일으킴을 특징으로 하는 림프구 활성화 방법.
  24. 림프구의 표면에 발현되는 세가지 이상의 항원에 특이적인 결합 부위들을 포함하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 T 세포를 활성화시키는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  26. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 T 세포의 활성화를 억제하는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  27. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 B 세포를 활성화시키는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  28. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 B 세포의 활성화를 억제시키는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  29. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 VHH도메인을 포함하는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  30. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것임을 특징으로 하는 다중특이적(multispecific) 단백질.
  31. 제24항의 다중특이적 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
  32. 림프구 표면에 발현되는 두가지 항원에 특이적인 결합 부위를 포함하고, 림프구의 활성화를 억제시키는 이중특이적(bispecific) 단백질.
  33. 제32항에 있어서, 상기 림프구가 T 세포임을 특징으로 하는 이중특이적 (bispecific) 단백질.
  34. 제32항에 있어서, 상기 림프구가 B 세포임을 특징으로 하는 이중특이적 (bispecific) 단백질.
  35. 제32항에 있어서, 상기 단백질이 VHH영역을 포함하는 것임을 특징으로 하는 이중특이적(bispecific) 단백질.
  36. 제32항에 있어서, 상기 단백질이 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것임을 특징으로 하는 이중특이적(bispecific) 단백질.
  37. 제32항의 이중특이적(bispecific) 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
  38. 세포 표면 항원에 결합하는 분리된 중쇄만의 항체(heavy chain-only antibody) 또는 그들의 항원-결합 유도체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항원-결합 유도체가 VHH영역임.
  40. 세포 혼합물로부터 CD40을 발현하고 면역글로불린 경쇄를 발현하지 않는 B 세포를 분리하는 것을 포함하는 중쇄만의 항체를 발현하는 B세포의 분리방법.
  41. 엘라마(llama) VHH영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 cDNA 라이브러리.
  42. 제41항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 중쇄만의 항체를 암호화하는 것임을 특징으로 하는 cDNA 라이브러리.
  43. 서열번호 1 내지 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  44. 도 8에 도시된 바와 같은 변형된 파아지 디스플레이 벡터.
  45. 제44항의 벡터를 이용한 사람 림프구 표면 항원에 결합하는 엘라마 VHH의 클로닝 및 발현방법.
  46. (a) 중쇄 가변 영역 암호화 서열의 대략 중간지점에서 두개의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하는 단계; 및
    (b) 상기 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응에 의해 오버래핑 단일 표준 프라이머로 신장시키는 단계를 포함하고, 이 때 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 중쇄 가변 영역 암호화 서열내에 존재하지 않는 11, 37, 44, 45 또는 47번 위치 아미노산 잔기를 암호화하는 것을 특징으로 하는 중쇄 가변 영역 암호화 서열의 엘라말라이징(llamalizing) 방법.
  47. 엘라마 CH1의 불변 도메인, 힌지, CH2, CH3 또는 이들의 조합 및 이질적 비-엘라마 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  48. 서열번호 61 내지 63, 69 내지 71, 72 내지 74, 75 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  49. 수용성 사람 CD3 이형이합체(heterodimeric) 폴리펩티드.
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