JP2002520021A

JP2002520021A - ヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用する免疫学的試薬

Info

Publication number: JP2002520021A
Application number: JP2000559237A
Authority: JP
Inventors: レイター，クリスティアン
Original assignee: コネックス・ゲーエムベーハー
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2002-07-09
Also published as: WO2000003016A1; TR200100039T2; NO20010148L; CN1230538C; CN1308675A; EP1097210B1; CA2335090A1; IL140698A0; ATE330012T1; DE69931926T2; KR20010074697A; US20050163770A1; AU4909199A; PT1097210E; NO20010148D0; AU767443B2; NZ509232A; ES2267275T3; ID28117A; DE69931926D1

Abstract

(57)【要約】本発明は，抗体の可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする核酸配列を含む核酸分子に関し，前記抗体はヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用し，前記抗体は，ラットをＪｕｒｋａｔ細胞で，次に担体分子およびラットゼータ鎖のＮ末端の１１アミノ酸を含むペプチドを含むコンジュゲートで免役することにより得ることができる。好ましくは，本発明の核酸分子によりコードされる（ポリ）ペプチドは一特異性または二特異性抗体である。本発明はまた，本発明の核酸分子または抗体を含む医薬組成物，ならびに上述の化合物を含むキットに関する。さらに，本発明は，本発明の抗体を用いて，ＮＫ細胞，Ｔ細胞またはそれらの前駆体におけるゼータ鎖またはイータ鎖の発現を測定する方法に関する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は，抗体の可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコ
ードする核酸配列を含む核酸分子に関し，前記抗体は，無傷の（ｉｎｔａｃｔ）
細胞の表面上のヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用し，前記抗体
は，ラットをＪｕｒｋａｔ細胞で，次に担体分子およびラットゼータ鎖のＮ末端
の１１アミノ酸を含むペプチドを含むコンジュゲートで免疫することにより得る
ことができる。好ましくは，本発明の核酸分子によりコードされる（ポリ）ペプ
チドは，一特異性抗体または二特異性抗体である。本発明はまた，本発明の核酸
分子または抗体を含む医薬組成物，ならびに上述の化合物を含むキットに関する
。さらに，本発明は，本発明の抗体を用いて，ＮＫ細胞，Ｔ細胞またはそれらの
前駆体上でのゼータ鎖またはイータ鎖の発現を測定する方法に関する。

【０００２】ゼータ鎖は，構造的におよび機能的に関連するシグナル伝達分子のファミリー
の一部である。このファミリーにはさらに，イータ鎖（ゼータ鎖の選択的スプラ
イシング型）および高親和性ＩｇＥ−Ｆｃ−レセプターであるＦｃεＲＩのガン
マ鎖が含まれる。この貫膜蛋白質のファミリーの共通の特徴は，１つまたはいく
つかのＩＴＡＭ配列モチーフ（免疫レセプターチロシン系活性化モチーフ；ゼー
タ：３，イータ：２，ガンマ：１），ならびに９（ゼータ，イータ，配列同一）
アミノ酸または４（ＦｃεＲＩ−ガンマ）アミノ酸から構成される，非常に短い
細胞外ドメインを含む，長い細胞内ドメインである。これらの蛋白質の細胞外ド
メインの配列は，マウス，ラットおよびヒトの間で１００％保存されており，お
そらくは他の種でも同様であろう。

【０００３】ゼータ鎖は，ホモダイマーとしてＴリンパ球，ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
，およびそれらの前駆体ではある程度，またはもっぱらイータ鎖とともにヘテロ
ダイマーとして発現される。成熟Ｔリンパ球の表面では，ゼータ鎖は，Ｔ細胞レ
セプター（ＴＣＲ）およびＣＤ３−複合体と構造的および機能的に密接に会合し
ている。ＴＣＲの動員（動作）により誘導されるシグナルは，ＣＤ３およびゼー
タ鎖を介して，Ｔ細胞の細胞質内に伝達される。ここで，ゼータ鎖の３つのＩＴ
ＡＭは，ＣＤ３−複合体を構成するイプシロン鎖，デルタ鎖およびガンマ鎖（Ｆ
ｃεＲＩ−ガンマとは異なる）の単一のＩＴＡＭと比較して，シグナル増幅効果
の主要な部分を提供する。

【０００４】ＮＫ細胞の表面においては，ゼータ鎖はＩｇＧ−Ｆｃ−レセプター（ＦｃγＲ
ＩＩＩＡ）と類似する会合を示す。抗体でコーティングした標的細胞がＦｃγＲ
ＩＩＩＡを介してＮＫ細胞により認識されるとき，その結果生ずるシグナルは，
ゼータ鎖および／またはガンマ鎖を介して細胞質に伝達され，このことによりＮ
Ｋ細胞を活性化し，引き続いて認識した標的細胞を溶解させる（ＡＤＣＣ，抗体
依存性細胞性細胞傷害性）。

【０００５】すなわち，成熟Ｔリンパ球上のＴＣＲ複合体は，多数の鎖（ＣＤ３ε，ＣＤ３
δ，ＣＤ３γおよびゼータ鎖またはその選択的スプライシング産物であるイータ
鎖と会合したＴＣＲ−α／βまたはＴＣＲ−γ／δ）から構成されるオリゴマー
構造である（Ｋｅｅｇａｎ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１３（１９９
２）６３−６８）。抗原認識は，細胞質内シグナル伝達ドメインを欠失する多型
ＴＣＲ−α／β−ヘテロダイマーまたはＴＣＲ−γ／δ−ヘテロダイマーにより
行われる。不変ＣＤ３蛋白質（α／β−ヘテロダイマーおよびδ／ε−ヘテロダ
イマー）およびゼータ鎖またはイータ鎖（ゼータ−ホモダイマーまたはゼータ−
イータ−ヘテロダイマー）は，ＴＣＲ複合体全体の正確なアセンブリ，輸送およ
び有効な細胞表面発現，およびＴＣＲシグナルの伝達に必要である（Ｃｌｅｖｅ
ｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（１９８８）６２９−６６２，Ａ
ｓｈｗｅｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（１９９０）１３９−１
６７）。シグナリングには，免疫レセプターチロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡ
Ｍ）と称される，保存された１８アミノ酸の配列が必要である（Ｒｅｔｈ，Ｎａ
ｔｕｒｅ３３８（１９８９）３８３−３８４，Ｓａｍｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）２４９１３−２４９１６）。これは，ゼータ
鎖に３つ，イータ鎖に２つ，およびＣＤ３サブユニット（γ，δおよびε）のそ
れぞれに１つ見いだされる。各ＩＴＡＭは，１０または１１アミノ酸で分離され
た１対のチロシン−Ｘ−Ｘ−ロイシン／イソロイシン（Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｌ／Ｉ）モ
チーフを含む（Ｃａｍｂｉｅｒ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１６（１
９９５）１１０）。各ＩＴＡＭ中のチロシン残基は，ＴＣＲのライゲーションの
後に迅速にリン酸化され，ｓｒｃ−ホモロジー−２（ＳＨ２）ドメインによりホ
スホチロシン残基に結合しうるシグナリング蛋白質のドッキング部位として働く
（Ｃｏｏｋｅ，Ｃｅｌｌ６５（１９９１）２８１−２９１，Ｇｌａｉｓｃｈｅ
ｎｈａｕｓ，Ｃｅｌｌ６４（１９９１）５１１−５２０，Ｓａｍｅｌｓｏｎ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７（１９９０）４３５８−
４３６２，Ｓｔｒａｕｓ，Ｃｅｌｌ７０（１９９２）５８５−５９３，Ｓｏｎ
ｇｙａｎｇ，Ｃｅｌｌ７２（１９９３）７６７−７７８，Ｓｏｎｇｙａｎｇ，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４（１９９４）２７７７−２７８５，Ｉｓａｋ
ｏｖ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１（１９９５）３７５−３８０）。ＴＣＲ媒介
性シグナリングにおけるゼータ鎖の必要性は，抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ
のゼータ欠損変異誘導体の研究により示された。変異株は，抗原に応答すること
ができず，抗ＣＤ３抗体に対してはわずかに応答性であるにすぎなかった（Ｓｕ
ｓｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ５２（１９８８）８５−９５）。抗ＣＤ３抗体刺激に応
答するある程度の活性が残っていることは，ＴＣＲ複合体の他の鎖がゼータ鎖の
欠如を補償しうることを示唆するが，トランスフェクションによりゼータ鎖と再
構築したときに，変異株が抗原を認識するかまたは抗ＣＤ３抗体に応答する能力
を再び獲得することを示した研究は，シグナル伝達におけるゼータ鎖の重要な役
割を明らかに示す（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，ＥＭＢＯＪ．８（１９８９）３６５
１−３６５６）。その特異なコンフィギュレーションのため，ゼータ鎖は支配的
なＴＣＲシグナリング構造として機能し，その三重のＩＴＡＭは主としてＴＣＲ
シグナル増幅を容易にするよう働くのであろう。

【０００６】一般にＴＣＲ複合体は，特にゼータ鎖媒介性シグナル伝達は，成熟Ｔリンパ球
の活性化およびプログラムされた細胞死（アポトーシス）の両方に関与する。ゼ
ータ鎖の細胞質テイルを無関係なレセプターに結合させた実験は，このようなキ
メラレセプターを発現する細胞株が，抗体に応答して，ＩＬ−２放出および他の
活性化パラメータのアップレギュレーションと連鎖しうることを示した（Ｉｒｖ
ｉｎｇ，Ｃｅｌｌ６４（１９９１）８９１−９０１）。さらに，キメラのゼー
タ鎖誘導体を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が，キメラのゼータレセ
プターにより認識される表面分子を有する標的細胞を特異的に溶解することが示
された（Ｒｏｍｅｏ，Ｃｅｌｌ６４（１９９１）１０３７−１０４６，Ｒｏｍ
ｅｏ，Ｃｅｌｌ６８（１９９２）８８９−８９７）。しかし，このことは活性
化Ｔ細胞の場合にのみあてはまることが証明された。これは，キメラのゼータ鎖
分子を発現する休止Ｔリンパ球は，これらのキメラレセプターにより刺激された
とき，活性化もされず，標的細胞に対して細胞傷害性も示さなかったためである
（Ｂｒｏｃｋｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１（１９９５）１６５３−１６５
９）。これは，生化学的分析によれば，外来性ＴＣＲ−サブユニットと会合せず
，したがって物理的に独立したシグナリング分子として作用する（Ｓｈｉｎｋａ
ｉ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２（１９９５）４０１−４１１）。すなわち，これらの
データは，キメラのゼータ鎖誘導体は，活性化Ｔ細胞においてのみ完全なＴＣＲ
複合体を置き換えることができるが，休止Ｔ細胞においてはできないことを示す
。

【０００７】細胞が活性化され増殖しているときに強いＴＣＲ再動作（ｒｅｅｎｇａｇｅｍ
ｅｎｔ）が生じれば，成熟Ｔリンパ球のＴＣＲ媒介性アポトーシスが誘導される
かもしれない（Ｌｅｎａｒｄｏ，Ｎａｔｕｒｅ３５３（１９９１）８５８−８
６１，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８
（１９９１）２１５１−２１５７，Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６０（１９９５）７１−７８）。成熟Ｔ細胞の死は，末梢免疫ホメ
オスタシスおよび寛容において重要な役割を果たす。最近の実験は，ＴＣＲの動
作（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）によるＴ細胞アポトーシスの有効な誘導にゼータ鎖
が必要であること，およびＣＤ３のシグナリングドメインは，ＴＣＲ媒介性アポ
トーシスに対してわずかに影響するか（ＣＤ３ε）または影響しない（ＣＤ３γ
およびδ）ことを示している（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
８３（１９９６）２１０９−２１１７）。さらに，ゼータ鎖の３つのＩＴＡＭは
，Ｔ細胞アポトーシスの誘導に対して異なるように寄与する。最もＮ末端のもの
が支配的な影響を有し，次に，Ｃ−末端のＩＴＡＭはＣＤ３εと類似する低い寄
与を有し，真中のものは全くアポトーシスを誘導することができない。

【０００８】Ｔ細胞の成長は主として胸腺で起こり，ここではＴ細胞前駆体が胎児肝臓また
は成人骨髄から移入する。胸腺中に移入したとき，これらの初期先祖Ｔ細胞は，
トリプルネガティブ（ＴＮ：ＴＣＲ^-，ＣＤ４^-，ＣＤ８^-）（Ｓｈｏｒｔｍａｎ
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（１９９６）２９−４７）であるが
，すでにゼータ鎖およびＣＤ３鎖を発現している（Ｗｉｅｓｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８０（１９９４）１３７５−１３８２，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．７（１９９５）１６５９−１６６４）。胸腺の誘導的環境中で，これ
らは一連の成長段階を経た後，ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細
胞へと分化する（Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４（１９９
３）５４７−５５３）。最も非成熟のＣＤ４４⁺ＣＤ２５^-−ＴＮ−胸腺細胞およ
びこれに由来するＣＤ４４⁺ＣＤ２５⁺−ＴＮ−胸腺細胞は，依然としてＴＣＲ−
遺伝子の生殖細胞系コンフィギュレーションを示す。しかし，表面表現型ＣＤ４
４^-/loＣＤ２５⁺により特徴づけられる次の成熟段階のＴＮ−胸腺細胞は，ＴＣ
Ｒβ遺伝子座を再構築し始める。この段階まで，ゼータ鎖は発現されているがお
そらくは胸腺細胞成熟には必要ではない（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）１９０３−１９０７）。続くＴＮ−胸腺細胞の成
熟段階は，ＣＤ４４^-/loＣＤ２５⁺からＣＤ４４^-ＣＤ２５^-への表現型のスイッ
チにより特徴づけられる。しかし，これはゼータ鎖が存在しなければ阻害され（
Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）１９０３−
１９０７），ＴＣＲβ鎖の再構築および発現を必要とする（Ｋｉｓｈｉ，ＥＭＢ
ＯＪ．１０（１９９１）９３−１００，Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ
３６０（１９９２）２２５−２３１，Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９
（１９９３）８２２−８２５）。ＴＣＲβ鎖はｐｒｅ−Ｔα（ｐＴα）と称され
る不変鎖と会合し（Ｇｒｏｅｔｔｒｕｐ，Ｃｅｌｌ７５（１９９３）２８３−
２９４），これはまだ再構築されていないＴＣＲα鎖を置き換えて，おそらくは
ゼータ鎖およびＣＤ３鎖とともに会合しているｐｒｅ−ＴＣＲを形成する（Ｖａ
ｎＯｅｒｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２（１９９５）１５８５−１５９０）
。ｐｒｅ−ＴＣＲに媒介されるシグナルの結果として，胸腺細胞は，ＤＰ段階へ
と成長が進行する。この段階において，胸腺細胞はそのＴＣＲα遺伝子の再構築
を開始し，ｐＴαの発現を停止し，成熟Ｔリンパ球上のＴＣＲ複合体の多重鎖組
成物に類似する，低レベルのＴＣＲ複合体を発現し始める（ＶｏｎＢｏｅｈｍ
ｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６６（１９９５）５２−６１，Ｒ
ｏｂｅｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９４）２６５−７０
５）。

【０００９】ＣＤ４４^-ＣＤ２５^-−ＴＮ胸腺細胞の成長および続くＤＰ胸腺細胞の成長は，
ゼータ鎖の非存在下では阻害され，かつ機能的ＩＴＡＭを有しないシグナリング
不全変異体ゼータ鎖の発現により復帰させることができるため（Ｓｈｏｒｅｓ，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５９（１９９７）２２２−２３０，Ｓｈｏｒｅｓ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２６６（１９９４）１０４７−１０５０），ゼータ鎖のｐｒｅ−Ｔ
ＣＲの表面発現の促進に関連する重要性は，そのシグナリング能力に関連するも
のより高いであろう。

【００１０】ＤＰ胸腺細胞は，そのＴＣＲの特異性に基づいて，さらに選択される。自己Ｍ
ＨＣ分子に対する特異性が無視しうる程度であるＴＣＲを発現する胸腺細胞は，
どのペプチドがＭＨＣ−蛋白質により結合されるかにかかわらず，胸腺中で死ぬ
。これは，おそらくは，そのＴＣＲを通して生存シグナルを受け取ることができ
ないためであろう（Ｒｏｂｅｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１
９９４）２６５−７０５，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１３（１９９５）９３−１２６）。これに対し，適切なリガンド特異性を有す
るＴＣＲを発現する胸腺細胞は生存し，ＣＤ４⁺−またはＣＤ８⁺−シングルポジ
ティブ（ＳＰ）Ｔ細胞のいずれかに成熟して，高レベルのＴＣＲ発現を示す。し
かし，自己反応性（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）またはその可能性のあるＴＣＲ
を発現する胸腺細胞は抹消される（Ｒｏｂｅｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１２（１９９４）２６５−７０５，Ｊａｍｅｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１９９５）９３−１２６）。すなわち，ＤＰ胸腺細胞上
でのＴＣＲの動作は，２つの劇的に異なる細胞の運命，すなわち，生存およびさ
らなる成熟（正の選択）またはアポトーシスによる死（負の選択）のいずれかに
つながる。

【００１１】ゼータ鎖のＩＴＡＭは，胸腺における成熟ＳＰＴ細胞の成長（Ｓｈｏｒｅｓ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６（１９９４）１０４７−１０５０）およびＭＨＣ−制
限選択（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９５）２８７−２
９３）には必須ではないが，これらは，胸腺細胞選択の間のＴＣＲの動作により
生成するシグナリング応答を増幅することにより，Ｔ細胞レパートリーの形状に
寄与しているようである。実際，最近の研究の結果は，個々のＩＴＡＭは特に要
求されないが，ＴＣＲ複合体中のゼータ鎖ＩＴＡＭの数と，正の選択および負の
選択の両方の効率との間には直接の関係があることを明らかにした（Ｓｈｏｒｅ
ｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（１９９７）８９３−９００）。これらの結果
は，正の選択および負の選択が主としてＴＣＲシグナリング閾値により指図され
ており，かつ胸腺細胞の成長の運命を決定するのに重要な，異なる親和性のリガ
ンドに対するシグナリング応答の大きさが，天然のゼータ鎖の三重のＩＴＡＭに
より増幅されるか，またはゼータ鎖変異体中の減少した数のＩＴＡＭにより，よ
り少なく増幅される場合に，予測することができるであろう。

【００１２】すなわち，天然のゼータ鎖の存在下で正に選択された胸腺細胞のレパートリー
は，シグナリング不全ゼータ鎖誘導体の存在下で選択されたものと著しく異なる
こと，および後者のレパートリーが，さもなければ負に選択されたであろうＴ細
胞を含有することが予測される（Ｓｈｏｒｅｓ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏ
ｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９（１９９７）３８０−３８９）。

【００１３】ＮＫ細胞は，末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の１０−１５％を構成する大きな顆
粒性リンパ球である。ＮＫ細胞は，主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）により制限
されない様式で腫瘍細胞およびある種のウイルス感染細胞を殺すことができる（
Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（１９８９）１８７−３
７６，Ｒｉｔｚ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８１−２１１）。こ
の細胞溶解性エフェクター機能は，あらかじめ感作すること，またはアクセサリ
細胞による抗原提示を必要としない。これらの特徴により，ＮＫ細胞は，抗原特
異的免疫応答の顕在化の前に，生来の宿主防御を行うことができる。ＮＫ細胞は
，２つの型の細胞溶解活性，すなわち天然の細胞傷害性，および天然の細胞傷害
性に対して耐性の標的細胞をも殺すＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害活性）をもた
らすことが知られている。

【００１４】クロノタイプＴＣＲの動作により生成する活性化シグナルにより誘発されるＴ
細胞の細胞傷害活性とは異なり，ＮＫ細胞の天然の細胞傷害性は，主として阻害
性シグナルにより制御される（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６
（１９９７）１８０３−１８０８）。標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子への特異
的結合による阻害性ＮＫ細胞レセプターの動作は，標的細胞のＭＨＣクラスＩの
発現がない場合に放出される天然の細胞傷害性の阻害を導き，したがって，天然
の殺生が活性化される。ＮＫ細胞レセプターは，レセプター動作により誘導され
るチロシンリン酸化の後に阻害性シグナルを媒介する，細胞質内免疫レセプター
チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ，コンセンサス配列Ｉ／Ｖ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｘ
−Ｌ）を含有する（Ｍｕｔａ，Ｎａｔｕｒｅ３６８（１９９４）７０−７３，
Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１（１９９５）１９５３−１９５６）
。

【００１５】ＡＤＣＣは，低い親和性のＩｇＧＦｃ−レセプターであるＦｃγＲＩＩＩＡ
により媒介され，ＮＫ細胞を抗体でコーティングした標的細胞とともにインキュ
ベートすることにより，インビトロで示すことができる。ＦｃγＲＩＩＩＡのリ
ガンド結合および架橋はＮＫ細胞の活性化を誘導し，その結果，細胞溶解活性，
表面活性化分子のアップレギュレーションおよびサイトカイン分泌が生ずる（Ｃ
ｈｅｈｉｍｉ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．７５（１９９２）７８９，Ｒａｖｅｔｃｈ
，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７）。ＦｃγＲＩＩ
ＩＡは，貫膜リガンド結合レセプター糖蛋白質ＣＤ１６と２つの膜スパニング鎖
であるガンマおよびゼータを含む複合体として発現され，これはレセプターのア
センブリおよびシグナル伝達の両方の原因となる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７（１９９０）２２７４−２２７８
，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７
）。ガンマ鎖は，元々ＩｇＥの高親和性レセプターのサブユニットとして同定さ
れたものであり，ゼータ鎖およびイータ鎖と同じシグナル伝達分子のファミリー
に属する。ＮＫ細胞上でのＦｃγＲＩＩＩＡの動作により，ゼータ鎖およびガン
マ鎖のＩＴＡＭ内でチロシンのリン酸化が生じ，このことにより，特異的Ｓｒｃ
ホモロジー（ＳＨ）２ドメインを含有する蛋白質のＦｃγＲＩＩＩＡ−複合体へ
の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を含むさらなるシグナル伝達事象が誘導され
る。最近の研究が示したように，ＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性のＮＫ細胞活性化は，
ＮＫ細胞中にトランスフェクトしたキメラのゼータ鎖レセプターの動作により模
倣されるようであり，すなわち，Ｔ細胞における同様の方法に類似している（Ｔ
ｒａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１９９５）１０００−１００９）。

【００１６】上の記載から，無傷の細胞の表面上のヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的
に相互作用するかこれを認識する抗体は，種々の目的，例えば腫瘍の治療におけ
るＴ細胞またはＮＫ細胞への人工的シグナル伝達のために強く要求されているこ
とが明らかになる。しかし，これまで，実験の成功は報告されていない。この要
求を満たす抗体を製造することに成功しなかったのは，主として，このドメイン
の長さが比較的短い（９アミノ酸）こと，そしておそらくは，ゼータ鎖が，Ｔ細
胞上のＴ細胞レセプターおよびＣＤ３複合体と，またはＮＫ細胞上のＩｇＧ−Ｆ
ｃ−レセプターと会合しているためであろう。

【００１７】したがって，本発明の基礎となる技術的課題は，上述の要求に応えるように適
用しうる道具を提供することである。この技術的課題は，特許請求の範囲により
特徴づけられる態様を提供することにより解決される。

【００１８】したがって，本発明は，抗体の可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（
ＣＤＲ）をコードする核酸配列を含む核酸分子に関し，前記抗体は，無傷の細胞
の表面においてヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用し，前記抗体
は，Ｊｕｒｋａｔ細胞で，次に担体分子およびラットゼータ鎖のＮ末端の１１ア
ミノ酸を含むペプチドを含むコンジュゲートで，ラットを免疫することにより得
ることができる。

【００１９】前記無傷の細胞は，好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞またはそれらの前駆体で
あるが，人工的にトランスフェクトした細胞であってもよい。

【００２０】本発明にしたがえば，前記ＣＤＲを含む抗体は，ラットをＪｕｒｋａｔ（ＡＴ
ＣＣＴＩＢ−１５２）細胞でプライミングし，これを担体分子および上述した
ペプチドを含むコンジュゲートでブーストすることにより得ることができる。注
射，例えばラットに１またはそれ以上の用量のコンジュゲートを注射する代替の
免疫法も有効であると考えられる。抗体の生成においてはＫＬＨを担体として用
いたが，異なる担体を首尾よく用いることができる。異なる担体の例はＢＳＡで
ある。

【００２１】ゼータ鎖分子は，ＴＣＲおよびＣＤ３と，もしくはＦｃγ−ＲＩＩＩＡと会合
してそれぞれＴ細胞およびＮＫ細胞の表面に存在し，または遊離の浮遊するホモ
ダイマーまたはヘテロダイマーとして存在するかもしれないため，前記相互作用
は，ゼータのこれらの形のいずれかと，またはそれらのすべてのとの間に生ずる
であろう。同様に，抗体は，単一のゼータ鎖と相互作用してもよく，またはダイ
マー構造と特異的に相互作用してもよい。ヒトにおいてイータはゼータと同じ細
胞外ドメインを有するため，本発明の抗体はまたゼータ鎖と同じコンフォメーシ
ョンおよび／または会合のイータを認識する。さらに，抗体は，ラットおよびマ
ウスのゼータ／イータ鎖の細胞外ドメインとも特異的に相互作用するであろう。

【００２２】本発明の抗体の特に有利な特性は，これがＴ細胞およびＮＫ細胞の両方におい
て，ならびにこれらの前駆体においてゼータ／イータを認識することである。ゼ
ータ鎖の構造および会合に関して知られていることに鑑みて，そのような抗体を
開発することは実際に驚くべきことであると考えなければならない。非常に短い
９アミノ酸のペプチド上のエピトープは，必然的に細胞膜に非常に近接して位置
する。細胞表面上の多分子の蛋白質複合体との構造的なしたがって空間的な密接
な会合のため，これらのエピトープもまた，抗体のような大きな構造によっては
立体的にアクセス不可能でありそうである。さらに，ゼータ鎖はＴリンパ球上と
ＮＫ細胞上とでは異なる多分子の蛋白質複合体と会合しているため，Ｔ細胞上で
意外にも抗体分子によりアクセス可能である細胞外ゼータ鎖エピトープは，ＮＫ
細胞上のものと同一ではありそうにない。さらに，ヒト，ラットおよびマウスに
おける配列同一性のため，細胞外ゼータ鎖ドメインはこれらの３種すべてにおけ
る自己抗原であり，したがって，マウスおよびラットを免疫することによっては
これに対する特異的抗体は得られそうもない。

【００２３】この抗体の開発が非常に驚くべきことだと考えるべきであるという上述の概念
は，そのような抗体を得るための最も有望な方法が失敗であったという事実によ
り確認される。すなわち，ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで免疫したマウスの
脾臓細胞のＲＮＡからクローニングされたコンビナトリアル抗体ライブラリを，
繊維性ファージ上で提示させ，ペプチド−ＢＳＡコンジュゲート，精製ＣＤ８⁺
−Ｔリンパ球および精製ＮＫ細胞での交互の選別により，インビトロで選択した
。ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球での最後の選別工程において，ペプチド−ＢＳＡコンジ
ュゲートと反応性のＦａｂ−抗体フラグメントを提示するファージクローンが濃
縮されたが，これらのほとんどは，続く精製ＮＫ細胞での選別工程の間に失われ
た。すなわち，Ｔリンパ球およびＮＫ細胞上の共通する細胞外ゼータ鎖エピトー
プを認識する抗体はレパートリー中には存在しないことが示された。このことは
，ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートと反応性の多数のクローンを試験することに
より確認され，これらのクローン中で，Ｔリンパ球およびＮＫ細胞に対して交差
反応性結合活性を有するものを同定することはできなかった。

【００２４】発明者らがそのような抗体を生成するために旧式の比較的面倒な方法を適用し
た場合にのみ，最終的に成功した。この方法は，以下の工程を含む。ゼータ鎖の
Ｎ末端の最初の１１アミノ酸を含むペプチドを合成し，システイン１１のＳＨ基
を介してＫＬＨに結合させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞であらかじめ免疫したラット，
およびマウスを，それぞれこのコンジュゲートで免疫し，得られたハイブリドー
マ細胞株を，ＢＳＡに結合させた１１アミノ酸のペプチドからなる別のコンジュ
ゲートに対してスクリーニングした。ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを認識す
る，１５０のネズミハイブリドーマ細胞株および４５のラットハイブリドーマ細
胞株が得られ，このうち，１つのラットＩｇＭ抗体のみが，フローサイトメトリ
により判定して，Ｔリンパ球とＮＫ細胞との両方に結合活性を示すものとして同
定することができた。

【００２５】本発明の抗体またはその対応するイムノグロブリン鎖は，当該技術分野におい
て知られる慣用的な技術を用いて，例えばアミノ酸の欠失，挿入，置換，付加，
および／または組換えおよび／または当該技術分野において知られる任意の他の
改変を，単独でまたは組み合わせて，さらに改変することができる。イムノグロ
ブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような改変を導入する方
法は当業者によく知られており，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙを参照の
こと。抗体はまた，キメラ抗体であってもよい。

【００２６】エピトープの認識がしばしば単一のＣＤＲにより，好ましくは重鎖のＣＤＲに
より支配されていることは当該技術分野においてよく知られているため，上で概
説したスケジュールにしたがって得ることができる抗体の１つのＣＤＲは，少な
くとも弱いが有意な結合に寄与するのに十分であると考えられる。これは，好ま
しくは，上述した方法により実際に得られた抗体についてあてはまる。しかし，
好ましくは，前記核酸分子は，前記可変領域の少なくとも２つのＣＤＲをコード
する核酸配列を含む。

【００２７】本発明の核酸分子の別の好ましい態様においては，前記核酸分子は，前記可変
領域の３つのＣＤＲをコードする核酸配列を含む。

【００２８】本発明の核酸分子のさらに好ましい態様は，前記核酸配列がＶ_H鎖をコードす
ることを特徴とする。

【００２９】本発明の核酸分子の別の好ましい態様においては，前記核酸配列はＶ_L鎖をコ
ードする。

【００３０】本発明の核酸分子は，例えば，ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であってもよい。
別の好ましい態様においては，本発明の核酸分子はＤＮＡ分子である。特に好ま
しいものは，合成または半合成ＤＮＡ分子である。

【００３１】本発明の核酸分子のさらに別の好ましい態様においては，前記ＣＤＲは，以下
のヌクレオチド配列のいずれかを有する：（ａ）配列番号１（ｂ）配列番号３（ｃ）配列番号５（ｄ）配列番号７（ｅ）配列番号９（ｆ）配列番号１１。

【００３２】本発明の核酸分子の特に好ましい態様においては，前記Ｖ_H鎖は配列番号１３
のヌクレオチド配列を有するか，または配列番号１４のアミノ酸配列をコードす
る。

【００３３】本発明の核酸分子の別の特に好ましい態様においては，前記Ｖ_L鎖は配列番号
１５のヌクレオチド配列を有するか，または配列番号１６のアミノ酸配列をコー
ドする。

【００３４】本発明はまた，ＣＤＲが配列番号２，４，６，８，１０または１２のアミノ酸
配列のいずれかをコードする，本発明の上述のいずれかの核酸分子に関する。

【００３５】本発明はまた，本発明の核酸分子を含むベクターに関する。

【００３６】本発明のベクターは，追加の遺伝子，例えば適当な宿主細胞中で適当な条件下
で前記ベクターの選択を可能とするマーカー遺伝子を含んでいてもよい。好まし
くは，本発明のポリヌクレオチドは，原核生物または真核生物細胞における発現
を可能とする発現制御配列に，動作可能なように連結する。前記ポリヌクレオチ
ドの発現には，ポリヌクレオチドを翻訳可能なｍＲＮＡに転写することが含まれ
る。真核生物細胞，好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする制御要素
は，当業者にはよく知られている。これらは通常，転写の開始を確実にする制御
配列を含み，転写の終止および転写産物の安定化を確実にするポリ−Ａシグナル
を任意に含む。別の制御要素としては，転写ならびに翻訳のエンハンサー，およ
び／または自然に関連しているまたは異種のプロモーター領域が含まれる。この
点において，当業者は，少なくとも軽鎖および／または重鎖の可変ドメインをコ
ードするポリヌクレオチドは，両方のイムノグロブリン鎖または片方のみの可変
ドメインをコードしてもよいことを容易に理解するであろう。同様に，前記ポリ
ヌクレオチドは，同じプロモーターの制御下にあってもよく，または発現につい
て別々に制御されてもよい。原核生物宿主細胞において発現を可能とする制御要
素としては，Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはＰＬ，ｌａｃ，ｔｒｐまたはｔａｃプロモ
ーターが挙げられる。真核生物宿主細胞において発現を可能とする制御要素の例
は，酵母においてはＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーターであり，哺乳動物およ
び他の動物細胞においてはＣＭＶ−，ＳＶ４０−，ＲＳＶ−プロモーター（ラウ
ス肉腫ウイルス），ＣＭＶ−エンハンサー，ＳＶ４０−エンハンサーまたはグロ
ビンイントロンである。転写の開始を担う要素の他に，そのような制御要素はま
た，ポリヌクレオチドの下流に，転写終止シグナル，例えばＳＶ４０−ポリ−Ａ
部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位を含む。さらに，用いられる発現系に依存して，
ポリペプチドを細胞区画に向かわせるかまたはこれを培地中に分泌しうるリーダ
ー配列を，本発明のポリヌクレオチドのコーディング配列に付加することができ
，これは当該技術分野においてよく知られている。リーダー配列（１つまたはそ
れ以上）は，適当な位相で翻訳，開始および終止配列とともに組み立てられ，好
ましくは，リーダー配列は，翻訳された蛋白質またはその一部をペリプラズム空
間または細胞外培地中に分泌することができる。任意に，異種配列は，所望の特
性，例えば，発現された組換え産物の安定性または精製の単純化を付与するＣ−
またはＮ末端識別ペプチドを含む融合蛋白質をコードすることができる。このよ
うな状況において，適切な発現ベクターが当該技術分野において知られており，
例えばオカヤマ・バーグｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
），ｐＣＤＭ８，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔ
ｒｏｇｅｎｅ），またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）が挙げられる。

【００３７】好ましくは，発現制御配列は，真核生物宿主細胞をトランスフォームまたはト
ランスフェクトしうるベクター中の真核生物プロモーター系であるが，原核生物
宿主用の制御配列もまた用いることができる。ベクターが適当な宿主中に取り込
まれると，宿主はヌクレオチド配列の高レベルの発現に適した条件下に維持され
，所望に応じて，イムノグロブリン軽鎖，重鎖，軽鎖／重鎖ダイマーまたは完全
な抗体，結合フラグメントまたは他の形のイムノグロブリンの回収および精製を
行うことができる。Ｂｅｙｃｈｏｋ，ＣｅｌｌｓｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂ
ｕｌｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（
１９７９）を参照のこと。

【００３８】本発明のベクターは，例えばプラスミド，コスミド，ウイルスまたはバクテリ
オファージであることができ，好ましくは発現ベクターである。ウイルス，例え
ばレトロウイルス，ワクシニアウイルス，アデノ関連ウイルス，ヘルペスウイル
ス，またはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の
ポリヌクレオチドまたはベクターを標的とする細胞集団に輸送することができる
。当業者によく知られている方法，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およ
びＡｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９
）に記載される技術を用いて，組換えウイルスベクターを構築することができる
。あるいは，本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを再構築してリポソーム
を形成し，標的細胞に輸送することができる。本発明のポリヌクレオチドを含有
するベクター（例えば，イムノグロブリン鎖の重鎖および／または軽鎖可変ドメ
インをコードする配列および発現制御配列）は，よく知られる方法により宿主細
胞に伝達することができるが，その方法は細胞宿主のタイプにより様々であろう
。例えば，原核生物細胞については塩化カルシウムトランスフェクションが慣用
的に用いられ，他の細胞宿主については，リン酸カルシウム処理またはエレクト
ロポレーションが用いられる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照のこと。

【００３９】本発明はさらに，本発明のベクターでトランスフォームまたはトランスフェク
トされた宿主に関する。

【００４０】前記宿主細胞は，原核生物または真核生物細胞でありうる。宿主細胞中に存在
する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは，宿主細胞のゲノム中にインテ
グレートされていてもよく，または染色体外で維持されていてもよい。

【００４１】宿主細胞は，任意の原核生物または真核生物細胞であることができ，例えば，
細菌，昆虫，真菌，植物，動物またはヒト細胞でありうる。好ましい真菌細胞は
，例えば，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のものであり，特にＳ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅの種である。"原核生物"との用語は，本発明の抗体または対応するイム
ノグロブリン鎖の発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子でトランスフォームまた
はトランスフェクトしうる全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主とし
ては，グラム陰性ならびにグラム陽性菌，例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓ．ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ，ＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。"真核生物"との用語は，酵母，高等植物
，昆虫，および好ましくは哺乳動物細胞を含むことを意味する。組換え生産方法
において用いられる宿主に依存して，本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れる（ポリ）ペプチド／抗体またはイムノグロブリン鎖は，グリコシル化されて
いてもよく，グリコシル化されていなくてもよい。本発明の抗体または対応する
イムノグロブリン鎖はまた，開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチドを用いて，当業者に一般に知られる任意の技術を用い
て，宿主をトランスフォームまたはトランスフェクトすることができる。さらに
，融合した，動作可能なように連結された遺伝子を調製し，これを例えば哺乳動
物細胞および細菌内で発現させる方法は，当該技術分野においてよく知られてい
る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。こ
こに記載される遺伝的構築物および方法を用いて，本発明の（ポリ）ペプチド／
抗体または対応するイムノグロブリン鎖を，真核生物または原核生物宿主中で発
現させることができる。一般に，挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を
可能とするプロモーター配列を含む発現ベクターを，宿主とともに用いる。発現
ベクターは，典型的には，複製起源，プロモーターおよびターミネーター，なら
びにトランスフォームした細胞の発現型による選択を行いうる特定の遺伝子を含
む。さらに，本発明の細胞を含むトランスジェニック動物，好ましくは哺乳動物
を，本発明の（ポリ）ペプチドの大量生産のために用いることができる。

【００４２】トランスフォームした宿主は，発酵装置中で成長させ，当該技術分野において
知られる技術にしたがって培養して，最適な細胞成長を達成することができる。
本発明の全（ポリ）ペプチド／抗体，それらのダイマー，個々の軽鎖および重鎖
，または他の形のイムノグロブリンは，発現させた後，当該技術分野において標
準的な方法にしたがって，例えば，硫酸アンモニウム沈殿，アフィニティーカラ
ム，カラムクロマトグラフィー，ゲル電気泳動等により精製することができる。
Ｓｃｏｐｅｓ，"ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ"，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。次に，本発明の抗体ま
たはその対応するイムノグロブリン鎖は，成長培地，細胞溶解物，または細胞膜
画分から単離することができる。例えば微生物により発現された本発明の抗体ま
たはイムノグロブリン鎖の単離および精製は，任意の慣用の手段，例えば，調製
的クロマトグラフィー分離および，例えば本発明の抗体の不変領域に対するモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体を用いるような免疫的分離により行うこと
ができる。本発明の抗体はさらに別の成分と組み合わせて，例えば薬剤標的化お
よび画像化の用途に用いることができることが，当業者には明らかであろう。そ
のような組み合わせは，（ポリ）ペプチド／抗体または抗原の発現の後に結合部
位に化学的に行ってもよく，組み合わせ産物をＤＮＡレベルで本発明の（ポリ）
ペプチド／抗体中に遺伝子工学処理してもよい。次に，ＤＮＡを適当な宿主系で
発現させ，発現した蛋白質を回収して，必要に応じて再生することができる。

【００４３】本発明はさらに，本発明の核酸分子によりコードされる（ポリ）ペプチドの製
造方法に関する。該方法は，本発明の宿主を適当な条件下で培養し，そして前記
（ポリ）ペプチドを培養物から単離することを含む。

【００４４】前記宿主細胞の培養は，一般に上述されており，確立されたプロトコルにした
がって行うことができる。（ポリ）ペプチドの単離についても同様である。

【００４５】さらに，本発明は，本発明の核酸分子によりコードされるか，または本発明の
方法により製造される（ポリ）ペプチドに関する。

【００４６】本発明はまた，少なくとも１つの本発明の（ポリ）ペプチドを含む抗体または
そのフラグメントもしくは誘導体に関する。

【００４７】好ましくは，本発明の抗体は，上述の完全なＶ_HおよびＶ_L鎖の両方を，適切な
不変領域，例えばμ，γ，α，κまたはλ鎖とともに含む。

【００４８】本発明の抗体またはフラグメントまたは誘導体の特定の用途としては以下のも
のが挙げられる。

【００４９】成熟Ｔリンパ球は，ゼータ鎖に特異的に結合した抗体または抗体誘導体の結果
としての構造的または機能的ＴＣＲ−ブロックにより，または抗ゼータ鎖抗体ま
たは抗体フラグメント／誘導体によりＴ細胞表面に標的化された生物学的または
薬学的に活性な分子により，機能的に影響を受けることができる。さらに，胸腺
細胞の成長および選択は，ゼータ鎖に特異的に結合した抗体または抗体フラグメ
ント／誘導体の結果として，構造的または機能的ＴＣＲ−またはｐｒｅ−ＴＣＲ
−ブロックにより影響を受けることができる。

【００５０】ゼータ鎖は最も非成熟の胸腺細胞から成熟Ｔリンパ球へのＴ細胞の全成長の間
一貫して発現されるため，分子は広範囲のＴ細胞悪性腫瘍を標的とするのに有用
であろう。

【００５１】ＮＫ細胞もまた，ゼータ鎖に特異的に結合した抗体または抗体誘導体の結果と
しての構造的または機能的ＦｃγＲＩＩＩＡ−ブロックにより，または抗ゼータ
鎖抗体または抗体フラグメントまたはそれらの誘導体によりＮＫ細胞表面に標的
化された生物学的または薬学的に活性な分子により，機能的に影響を受けること
ができる。

【００５２】抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は，とりわけ，（半）合成の，ま
たは伝統的方法により生成されたモノクローナル抗体である。フラグメントには
，Ｆａｂ'またはＦ（ａｂ）₂フラグメントが含まれる。

【００５３】本発明の抗体は別のドメインを含んでいてもよく，前記ドメインは，共有結合
または非共有結合により連結される。連結は，当該技術分野において知られ，上
述される方法にしたがう遺伝的融合に基づくものであってもよく，または例えば
ＷＯ９４／０４６８６等に記載される化学的架橋により行うことができる。本発
明の抗体を含む融合蛋白質中に存在する追加のドメインは，好ましくは柔軟なリ
ンカーにより，有利にはポリペプチドリンカーにより連結される。ここで，前記
ポリペプチドリンカーは，前記追加のドメインのＣ−末端と本発明の抗体のＮ末
端との，またはその逆の間の距離にまたがるのに十分な長さの，複数の，親水性
の，ペプチド−結合アミノ酸を含む。上述の融合蛋白質は，さらにプロテイナー
ゼのための切断可能なリンカーまたは切断部位を含んでいてもよい。これらのス
ペーサー成分は，不溶性でも可溶性でもよく（Ｄｉｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２３１：１４８，１９８６），標的部位において抗原からの薬剤放
出を可能とするように選択することができる。免疫治療のために本発明の抗体と
組み合わせることができる治療用薬剤の例は，薬剤，放射性同位体，レクチン，
およびトキシンである。本発明の抗体とともにコンジュゲート化することができ
る薬剤としては，伝統的に薬剤として言及されている化合物，例えばマイトマイ
シンＣ，ダウノルビシンおよびビンブラスチンが挙げられる。

【００５４】放射性同位体とコンジュゲートした本発明の抗体を，例えば免疫治療に用いる
場合，白血球の分布ならびに安定性および放出などの因子に依存して，ある種の
同位体が他のものより好ましい。自己免疫応答に依存して，ある種の放出体は他
のものより好ましいであろう。一般に，αおよびβ粒子放出放射性同位体が免疫
治療においては好ましい。好ましいものは，飛程の短い，高エネルギーのα放出
体，例えば²¹²Ｂｉである。治療目的のために本発明の抗体，抗原またはエピト
ープに結合することができる放射性同位体の例としては，¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ，⁹⁰Ｙ， ⁶⁷ Ｃｕ，²¹²Ｂｉ，²¹²Ａｔ，²¹¹Ｐｂ，⁴⁷Ｓｃ，¹⁰⁹Ｐｄおよび¹⁸⁸Ｒｅが挙げら
れる。本発明の抗体，抗原またはエピトープと組み合わせることができる他の治
療剤，ならびにエクスビボおよびインビボ治療プロトコルは，当業者には知られ
ており，または容易に確かめることができる。当業者は，適当な場合にはいずれ
においても，上述の抗体，抗原またはエピトープまたは対応するベクターのいず
れかをコードする本発明のポリヌクレオチドを，蛋白質性物質それ自体の代わり
に使用することができる。

【００５５】好ましい態様においては，本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

【００５６】本発明の別の好ましい態様においては，本発明の抗体は二特異性抗体である。

【００５７】本発明の二特異性抗体の好ましい態様においては，第１の特異性は無傷の細胞
の表面上のヒトゼータ鎖の細胞外ドメインに対するものであり，第２の特異性は
，Ｔリンパ球，ナチュラルキラー細胞またはそれらの前駆体の表面上の，任意に
異なっていてもよい分子に対するものである。

【００５８】本発明の二特異性抗体は，同じ細胞に存在するかまたは異なる細胞に存在する
上述の標的に結合することができる。前記異なる細胞は，例えば，同じタイプの
２つの異なるＴリンパ球またはＴリンパ球とナチュラルキラー細胞，またはそれ
ぞれ上述の前駆体でありうる。

【００５９】本発明の二特異性抗体の別の好ましい態様においては，第１の特異性は，無傷
の細胞の表面上のヒトゼータ鎖の細胞外ドメインに対するものであり，第２の特
異性は，異なる細胞，好ましくはＴ細胞，ＮＫ細胞またはそれらの前駆体ではな
い細胞の表面上の異なる分子に対するものである。好ましくは，この分子は，ウ
イルスがコードする抗原，腫瘍関連抗原，または抗原提示細胞（ＡＰＣ）（最も
好ましくは樹状細胞）または非ＡＰＣのいずれかの表面抗原である。

【００６０】本発明の二特異性抗体の好ましい用途は，キメラゼータ鎖レセプターでトラン
スフェクトすることによりＴリンパ球を標的細胞に指向させるのではなく（Ｒｏ
ｍｅｏ，Ｃｅｌｌ６４（１９９１）１０３７−１０４６），二特異性抗体でゼ
ータ鎖と標的細胞表面抗原を同時に標的化することにより，Ｔリンパ球を標的細
胞に対して再指向（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）させることである。二特異性抗体は，他
のＴＣＲ−サブユニットと会合している天然のゼータ鎖に結合するため，全体の
ＴＣＲ複合体のシグナリング機構が動員される。これに対し，キメラゼータ鎖レ
セプターは内因性ＴＣＲ−サブユニットと会合せず，したがってゼータ鎖の単離
されたシグナリング効果のみを動員する。これは，休止Ｔ細胞を活性化するのに
は不十分であるように見え，または，Ｔリンパ球の活性化対アポトーシスの誘導
についての機能的状態の，平衡を欠いた変更を引き起こすかもしれない。

【００６１】Ｔ細胞の再標的化の好ましい用途は，細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性を
標的細胞に向かわせることにより，標的細胞を溶解させることを含む。Ｔ細胞の
再標的化の別の好ましい用途は，天然のＴリンパ球のゼータ鎖分子を，十分な共
刺激シグナルを提供するよう改変されている抗原提示細胞（ＡＰＣ）または非Ａ
ＰＣの表面抗原と架橋することにより，天然のＴリンパ球をプライミングさせる
ことを含む。一方，天然のＴ細胞は，十分な共刺激シグナルを提供しない細胞へ
のゼータ鎖媒介性再標的化により，アネルギー化されるかまたは枯渇するであろ
う。

【００６２】Ｔ細胞再標的化の別の好ましい用途は，強いゼータ鎖媒介性のＴＣＲ再動作に
より成熟活性化Ｔリンパ球においてアポトーシスを誘導し，このことにより末梢
Ｔ細胞耐性を媒介し，末梢免疫ホメオスタシスに寄与するメカニズムを模倣する
ことを含む。

【００６３】Ｔ細胞成長の間の胸腺細胞の胸腺選択は，胸腺細胞のゼータ鎖を正および負の
選択工程に直接関与する胸腺抗原提示細胞の表面分子と架橋することにより，二
特異性抗体により変更させることができる。

【００６４】本発明の二特異性抗体のさらに別の好ましい用途には，キメラゼータ鎖レセプ
ターのトランスフェクションによりＮＫ細胞を標的細胞に向かわせるのではなく
（Ｔｒａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１９９５）１０００−１００９），
ゼータ鎖と標的細胞表面抗原とを二特異性抗体で同時に標的化することにより，
ＮＫ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に対して再標的化することが含まれる。

【００６５】別の好ましい態様においては，本発明の抗体の誘導体はｓｃＦｖ鎖である。

【００６６】本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様においては，前記抗体はＩｇＭで
ある。

【００６７】本発明はさらに，本発明の（ポリ）ペプチド，および同じまたは別の細胞の表
面分子と相互作用する天然のレセプター，天然のリガンドまたはそれらの誘導体
を含む二特異性レセプターに関する。好ましくは，前記レセプターまたはリガン
ドは，ＣＤ４，ＣＴＬＡ−４，Ｂ７−１，Ｂ７−２，ＬＦＡ−３，ＩＣＡＭ−１
，−２，−３，またはＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＲＡＮＴＥＳもしくはＳＤ
Ｆ−１等のケモカインである。

【００６８】本発明の二特異性抗体の用途は，本発明二特異性レセプターについても適用す
ることが企図される。

【００６９】さらに本発明は，本発明の核酸分子，ベクター，宿主，（ポリ）ペプチド，抗
体またはそのフラグメントもしくは誘導体および／または本発明の二特異性レセ
プターを含む医薬組成物に関する。

【００７０】本発明の医薬組成物はさらに薬学的に許容しうる担体を含んでいてもよい。適
当な薬学的担体の例は当該技術分野においてよく知られており，例えば，リン酸
緩衝化食塩水溶液，水，エマルジョン，例えば油／水エマルジョン，種々のタイ
プの湿潤剤，無菌溶液等が挙げられる。そのような担体を含む組成物は，よく知
られた慣用的な方法により処方することができる。これらの医薬組成物は，適当
な用量で患者に投与することができる。適当な組成物の投与は，種々の方法，例
えば静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，局所または皮膚内投与により行うことがで
きる。治療計画用量は，担当の臨床医および臨床的因子により決定される。医学
の分野においてよく知られているように，任意の患者についての用量は，多くの
因子，例えば，患者のサイズ，体表面積，年齢，投与すべき特定の化合物，性別
，投与の時間および経路，一般的健康状態，および同時に投与されている他の薬
剤に依存する。典型的な用量は，例えば，０．００１−１０００μｇ（またはこ
の範囲での発現または発現の阻害のための核酸）の範囲でありうる。しかし，特
に上述の因子を考慮して，この例示的範囲より低いまたは高い用量も企図される
。一般に医薬組成物の定期的投与としての治療計画は，１日あたり１μｇ−１０
ｍｇ単位であるべきである。治療計画が連続注入である場合，これは体重１ｋｇ
あたり１分間に１μｇ−１０ｍｇの単位の範囲であるべきである。進行は定期的
な評価によりモニターすることができる。用量は様々であろうが，ＤＮＡの静脈
内投与のための好ましい用量は，約１０⁶−１０¹²コピーのＤＮＡ分子である。
本発明の組成物は，局所的にまたは全身的に投与することができる。投与は，一
般に，非経口，例えば静脈内であろう。ＤＮＡはまた，標的部位に直接，例えば
，内部または外部の標的部位にバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）輸送
によりまたは動脈内の部位にカテーテルにより輸送することにより，投与するこ
とができる。非経口投与のための調製物としては，無菌の水性または非水性溶液
，懸濁液，およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は，プロピレング
リコール，ポリエチレングリコール，植物油，例えばオリーブ油，および注射可
能な有機エステル，例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては，水，ア
ルコール性／水性溶液，乳濁液または懸濁液が挙げられ，例えば生理食塩水およ
び緩衝化媒体である。非経口ベヒクルは，塩化ナトリウム溶液，リンゲルデキス
トロース，デキストロースおよび塩化ナトリウム，乳酸化リンゲルまたは不揮発
性油を含む。静脈内ベヒクルとしては，液体および栄養補充物，電解質補充物（
例えば，リンゲル・デキストロースに基づくもの）等が挙げられる。保存料およ
び例えば，抗菌剤，抗酸化剤，キレート剤，および不活性ガス等の他の添加物が
存在していてもよい。さらに，本発明の医薬組成物は，医薬組成物の意図される
用途に応じて，インターロイキンまたはインターフェロン等の別の薬剤を含んで
いてもよい。

【００７１】本発明により，本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターを，単体でま
たは任意の組み合わせで，任意に薬学的に許容しうる担体または賦形剤とともに
，標準的なベクターおよび／または遺伝子輸送系を用いて投与することが企図さ
れる。投与の後，前記ポリヌクレオチドまたはベクターは，患者のゲノム中に安
定にインテグレートされるであろう。一方，特定の細胞または組織に特異的なウ
イルスベクターを用いて，前記細胞に残留させることができる。適当な薬学的担
体および賦形剤は当該技術分野においてよく知られている。

【００７２】さらに，本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む本発明の医薬組成物
は，遺伝子治療に用いることが可能である。適当な遺伝子輸送系としては，特に
，リポソーム，レセプター媒介性輸送系，裸のＤＮＡ，およびウイルスベクター
，例えばヘルペスウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，およびアデノ関
連ウイルスが挙げられる。上述を参照のこと。遺伝子治療のための核酸の体内の
特定の部位への輸送は，Ｗｉｌｌｉａｍｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８８（１９９１），２７２６−２７２９）により記載されている
ようなバイオリスティック輸送系を用いて行うこともできる。

【００７３】本発明の医薬組成物，方法および使用は，望ましくはヒトにおいて用いられる
が，動物の治療もまた本明細書に記載される方法および使用に包含される。

【００７４】本発明はまた，第１の特異性がヒトゼータ鎖の細胞外ドメインに対するもので
あり，第２の特異性がＴリンパ球，ナチュラルキラー細胞またはそれらの前駆体
の表面上の異なる分子に対するものである，本発明の抗体の，自己免疫疾患，免
疫不全，Ｔ細胞悪性腫瘍，感染性疾患の治療または予防のための，または免疫応
答の抑制，特に臓器移植後の移植片拒絶を回避するための医薬組成物の製造にお
ける使用に関する。

【００７５】標的細胞（例えば腫瘍細胞またはウイルス感染細胞）の除去の他，本発明にお
いて記載される，ゼータ鎖の細胞外標的化によるＴ細胞直線性の細胞（正常また
は悪性腫瘍）を動作させる本発明のモードを治療に用いて，免疫応答を増強する
かまたは抑制し，および／または自己免疫疾患，免疫不全またはＴ細胞悪性腫瘍
に関連するＴ細胞疾患に影響を与えることができる。ゼータ（およびイータ）鎖
の細胞外標的化に基づく免疫抑制は，好ましくは移植後の移植片拒絶の予防に用
いられる。

【００７６】本発明において記載される，ゼータ鎖の細胞外標的化によりＴ細胞の成長およ
び胸腺細胞選択の間にシグナル伝達を変化させるモードを治療に用いて，感染性
疾患，腫瘍および免疫不全の場合に望ましい免疫応答を増強させるか，または例
えば自己免疫疾患または移植後の移植片拒絶の場合に望ましくない免疫応答を抑
制することができる。

【００７７】さらに，本発明は，本発明の抗体の，悪性腫瘍，ウイルス感染および他の感染
性疾患の治療または予防用の医薬組成物の製造における使用に関し，ここで，第
１の特異性は，ヒトゼータ鎖の細胞外ドメインに対するものであり，第２の特異
性は，異なる細胞の表面の異なる分子に対するものである。

【００７８】さらに，本発明は，本発明の（ポリ）ペプチドまたは抗体またはそれらのフラ
グメントもしくは誘導体，または二特異性レセプターの，ＮＫ細胞依存性免疫の
増強または抑制のための，またはＮＫ細胞由来悪性腫瘍の治療のための医薬組成
物の製造における使用に関する。

【００７９】標的細胞（例えば腫瘍細胞またはウイルス感染細胞）を除去する他，ゼータ鎖
の細胞外標的化によるＮＫ細胞を動作させる本発明のモードを治療に用いて，Ｎ
Ｋ細胞依存性免疫を増強または抑制するか，ＮＫ細胞由来悪性腫瘍に影響を与え
ることができる。ゼータ鎖はまたＮＫ細胞由来悪性腫瘍においても発現すること
が予測されるため，分子はさらに悪性腫瘍ＮＫ細胞の標的化に有用であろう。

【００８０】さらに，本発明は，ＮＫ細胞，Ｔリンパ球またはそれらの前駆体におけるゼー
タ鎖またはイータ鎖発現の測定の方法に関する。該方法は，

【００８１】（ａ）本発明の（ポリ）ペプチドまたは抗体またはフラグメントまたはそれら
の誘導体を前記ＮＫ細胞，Ｔリンパ球またはそれらの前駆体と接触させ；そして
（ｂ）結合した（ポリ）ペプチド，抗体または誘導体の量を評価することを含む。

【００８２】接触は，好ましくは氷上で，前記（ポリ）ペプチドまたは前記抗体またはそれ
らのフラグメントもしくは誘導体を，前記ＮＫ細胞，Ｔリンパ球またはそれらの
前駆体とともに，生理学的条件に似た生物学的緩衝液（例えばリン酸緩衝化食塩
水，ＰＢＳ）中で２０−４０分間インキュベートすることにより行うことができ
る。ＰＢＳで２回洗浄した後，結合した（ポリ）ペプチド，抗体またはそのフラ
グメントもしくは誘導体は，例えば適当な蛍光標識二次抗体を用いて検出し，実
施例４に記載されるようにフローサイトメトリ分析により定量することができる
。

【００８３】本発明はさらに，本発明の核酸分子，ベクター，宿主，（ポリ）ペプチド，抗
体またはそのフラグメントもしくは誘導体および／または二特異性レセプターを
含むキットに関する。

【００８４】さらに，本発明は，その生殖細胞系中に，少なくとも１コピーの本発明の核酸
分子またはベクターを含むトランスジェニック動物に関する。

【００８５】トランスジェニック動物は，記載されるような慣用的なプロトコル，例えば，
ＰａｌｍｉｔｅｒＲ．Ｄ．，ＢｒｉｎｓｔｅｒＲ．Ｌ．：Ｇｅｒｍｌｉｎｅ
ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｅ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ
．２０（１９８６），４６５−４９９およびＣａｐｅｃｃｉＭ．：Ａｌｔｅｒ
ｉｎｇｔｈｅｇｅｎｏｍｅｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４（１９９１）１２８８−１２９２を用い
て製造することができる。本発明のトランスジェニック動物の好ましい例は，ウ
シ，ヒツジ，ウサギ，マウスまたはラットである。

【００８６】表１は，ネズミＩｇ−重鎖および軽鎖−ＤＮＡ−フラグメントのＰＣＲ増幅の
ためのプライマーセットを示す。

【００８７】図１は，ＴＣＲの構造およびＴ細胞活性化における初期の事象を示す。ＴＣＲ
は，クロノタイプ鎖（α＋β）およびインバリアント鎖（ζ，ＣＤ３γ，ＣＤ３
δ，およびＣＤ３ε）とから構成され，考えられるサブユニット組成は，ＴＣＲ
α＋β，ＣＤ３εδγε，ζζである。ＣＤ３およびζ鎖の細胞質ドメイン中の
ＩＴＡＭの位置は，小さい黒長円として示される。Ａ）休止Ｔ細胞においては，
ＩＴＡＭは，リン酸化されていないか，または部分的にのみリン酸化されている
。蛋白質チロシンキナーゼＬｃｋは，ＣＤ４またはＣＤ８の細胞質ドメインと会
合している。Ｂ）ＭＨＣ−ペプチド−複合体との相互作用により，ＴＣＲはＣＤ
４またはＣＤ８のいずれかと共に集合し，ＣＤ３およびζ鎖中のＩＴＡＭは，Ｓ
ｒｃキナーゼＬｃｋおよび／またはＦｙｎによりリン酸化される。ＺＡＰ−７０
または関連するキナーゼであるＳｙｋは，両方のチロシン残基がリン酸化されて
いるＩＴＡＭに特異的に結合する。ＺＡＰ−７０は，ＴＣＲ複合体への動員の後
，Ｌｃｋにより活性化され，次に他の分子がＴＣＲ複合体に動員され，さらに下
流の分子へと活性化が進行する（示さず）。丸をつけたＰは，リン酸化されたチ
ロシン残基を表す。

【００８８】図２は，ヒトゼータ鎖の細胞外部分への結合についてファージディスプレイに
より選択されたネズミＦａｂ−抗体−フラグメントのＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｅ
．ｃｏｌｉにおいて発現した可溶性Ｆａｂ−フラグメントのペリプラズム調製物
を固定化ゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートとともにインキュベートし
た。特異的に結合したＦａｂ−フラグメントは，ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗
体の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化Ｆ（ａｂ'）₂フラグメントを
用いて検出した。ＡＢＴＳ基質溶液を加えることによりＥＬＩＳＡを発色させた
。１ラウンドのインビトロ選択につき８個のクローンがｘ軸に示されている。Ｏ
Ｄ値は，ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定し，ｙ軸に示されている。負の
対照として，ウエルをペリプラズム調製物のかわりにＰＢＳとともにインキュベ
ートした。

【００８９】図３は，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の表面における２−Ｂ−５抗体
のゼータ鎖特異的結合活性のフローサイトメトリ分析を示す。二人の異なる健康
なドナーの末梢血液からの１００，０００個の単核細胞を，２−Ｂ−５ハイブリ
ドーマの希釈していない細胞培養上清とともにインキュベートした。結合したゼ
ータ鎖特異的ラット抗体は，ＰＢＳ中で１：１００に希釈したフルオレセイン（
ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ抗ラットＩｇ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体により検
出した。ＣＤ８⁺（トリカラー）について正のゲートを，ＣＤ１６⁺（ＰＥ）細胞
について負のゲートを適用して三色蛍光分析を実施することにより，ＣＤ８⁺−
Ｔリンパ球（表現型：ＣＤ８⁺，ＣＤ１６^-）にのみ起因し，ＣＤ８⁺−ＮＫ細胞
からの夾雑シグナルのないＦＩＴＣ媒介性蛍光（実線）を検出することができた
。同様に，ＣＤ５６⁺−（ＰＥ）について正のゲートを，ＣＤ３⁺−細胞（トリカ
ラー）について負のゲートを適用して三色蛍光分析を実施することにより，ＮＫ
細胞（表現型：ＣＤ５６⁺，ＣＤ３^-）にのみ起因し，ＣＤ５６⁺−Ｔリンパ球か
らの夾雑シグナルのないＦＩＴＣ媒介性蛍光（実線）を検出することができた。
アイソタイプ対照（波線）として，同じアイソタイプであるが無関係な特異性を
有する抗体（ラットＩｇＭ）の培養上清を用いた。標識細胞の固定のためには，
ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドを用いた。細胞は，ＦＡＣＳ−スキャン（Ｂ
ｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリにより分析した。

【００９０】図４は，抗体２−Ｂ−５の，ＣＤ８⁺−Ｔ細胞リンパ球の溶解物中に存在する
天然のゼータ鎖との反応性を確認するサンドウィッチ−ＥＬＩＳＡの結果を示す
。ヒトゼータ鎖のカルボキシ末端のアミノ酸１４４−１６３を認識するゼータ鎖
特異的抗体を，９６Ｕ底プレートのウエルに１２時間コーティングし，次にＰＢ
Ｓ／３％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。次に，ＣＤ８⁺−細胞の溶解
物を，希釈せずにまたは何段階かの希釈で加え，室温で１時間インキュベートし
た。負の対照として，ウエルを細胞溶解物の代わりにＰＢＳとともにインキュベ
ートした。続く工程において，精製抗体２−Ｂ−５を１μｇ／ｍｌの濃度で加え
，１時間インキュベートした。結合した２−Ｂ−５抗体は，ビオチニル化マウス
−抗ラットＩｇＭ抗体，続いてアビジン−ペルオキシダーゼ−コンジュゲートに
より検出した。最後にＡＢＴＳ基質溶液を加えてＥＬＩＳＡを発色させた。着色
沈殿物をＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。

【００９１】図５は，Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に発現したラットモノクローナル抗体
２−Ｂ−５の組換えＦａｂ−フラグメントの，ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コン
ジュゲートへの特異的結合のＥＬＩＳＡに基づく分析を示す。ゼータ−ペプチド
−ＫＬＨ−コンジュゲートのコーティングは，４℃で１２時間行い，続いてＰＢ
Ｓ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで１回洗浄した。ウエルをＰＢＳ／３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングし，再び１回洗浄した。次に，Ｆａｂ−
含有ペリプラズム調製物を，希釈せずにまたは何段階かの希釈で加え，２時間イ
ンキュベートした。負の対照として，ウエルをペリプラズム調製物の代わりにＰ
ＢＳとともにインキュベートした。ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲート
に結合したＦａｂ−フラグメントの検出のためには，ネズミ抗Ｈｉｓ−タグ抗体
を用い，続いてペルオキシダーゼコンジュゲート化ポリクローナルヤギ抗マウス
ＩｇＧ抗体を用いた。最後にＡＢＴＳ基質溶液を加えることによりＥＬＩＳＡを
発色させた。着色した基質のターンオーバーは，ＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ４０
５ｎｍで測定した。

【００９２】図６は，抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５のＶＨ−領域のＤＮＡ配列および蛋白質−
配列を示す。数字はヌクレオチド（ｎｔ）位置を示し，アミノ酸（ａａ）は一文
字コードで表される。ボックスは３つのＣＤＲを示す。

【００９３】図７は，抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５のＶＫ−領域のＤＮＡ配列および蛋白質配
列を示す。数字は，ヌクレオチド（ｎｔ）位置を示し，アミノ酸（ａａ）は一文
字コードで表される。ボックスは３つのＣＤＲを示す。

【００９４】図８は，抗ゼータ鎖−抗体２−Ｂ−５により誘導されるＣＤ８⁺−Ｔ細胞，Ｎ
Ｋ細胞およびＰＢＭＣの刺激を測定するために行った，細胞増殖を検出するＥＬ
ＩＳＡに基づくＢｒｄＵ−取り込みアッセイの結果を示す。９６−ウエル平底マ
イクロタイタープレートを，何段階かの希釈の精製２−Ｂ−５抗体で４℃で一夜
コーティングした。１００，０００個のＣＤ８⁺−Ｔリンパ球，ＮＫ細胞および
未分離ＰＢＭＣを，マイクロタイタープレートのウエルにそれぞれ三重で加えた
。２−Ｂ−５により媒介される刺激の特異性の対照とするため，無関係な特異性
を有する同じアイソタイプの抗体（ラットＩｇＭ）を同じ濃度で用いた。ヒトＣ
Ｄ３−複合体を認識する抗体ＯＫＴ３（アイソタイプＩｇＧ２ａ）を，それぞれ
Ｔ細胞および未分離ＰＢＭＣの刺激についての特異的陽性対照として適用した。
無関係な特異性を有するネズミＩｇＧ２ａ−抗体を，ＯＫＴ３のアイソタイプ対
照として用いた。ブランク対照（細胞なしのウエル）およびバックグラウンド対
照（ＢｒｄＵなしのウエル）もまた含まれていた。３日間のインキュベーション
期間の後，ＢｒｄＵ−標識溶液を２４時間加えた。次に，細胞を溶解し，固定し
た後，新たに合成された細胞性ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵに結合する抗Ｂ
ｒｄＵ−抗体を加えた。このペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体は，続く基
質反応により検出した。反応生成物は，ＥＬＩＳＡリーダーにより，波長４５０
ｎｍで定量した。

【００９５】図９は，抗ゼータ鎖抗体の結合により誘導されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体の内在
化のフローサイトメトリ分析を示す。２００，０００個の単核細胞を１μｇ／ｍ
ｌの濃度の抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５とともに，４℃または３７℃で３０または
６０分間インキュベートした。ラット−抗ヒトＣＤ３抗体を用いて平行実験を行
った。冷ＰＢＳで２回洗浄することにより，キャッピング工程を終了させた。細
胞表面に結合した抗体を標識するため，細胞を，ＰＢＳ中で１：１００に希釈し
たフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ−抗ラットＩｇ（ＩｇＧ＋
ＩｇＭ）抗体とともにインキュベートした。負の対照としては，二次抗体のみを
用いた。

【００９６】図１０は，抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ二特異性一本鎖抗体のＤＮＡ配列および
蛋白質−配列を示す。数字は，ヌクレオチド（ｎｔ）位置を示し，得られるアミ
ノ酸配列はヌクレオチド配列の下に示される。抗体をコードするＤＮＡ配列は，
６７位で始まり１６０５位で終わる。ヌクレオチド１０−６６は，哺乳動物細胞
における二特異性抗体の分泌を媒介するリーダーペプチドをコードする。最初の
６ｎｔ（１位−６位）および最後の６ｎｔ（１６３２位−１６３７位）は，それ
ぞれＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩの制限酵素認識部位を含む。

【００９７】図１１は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐＣＡＭ陽性Ｋａ
ｔｏ細胞に対して再指向させたＰＢＭＣおよびＣＤ８⁺−Ｔリンパ球の細胞傷害
活性を示す。１００μｌの容量の２００，０００個の未刺激ＰＢＭＣまたはＣＤ
８⁺Ｔリンパ球を，１００μｌの容量の１０，０００個のクロム−５１標識Ｋａ
ｔｏＩＩＩ細胞に加えた。二特異性抗体を５０μｌの容量で４０ｎｇ／ｍｌ−５
μｇ／ｍｌの濃度で加えた。マイクロタイタープレートを３７(Ｃ，５％ＣＯ２
で１６時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了後，各ウエルか
ら５０μｌの上清を採取し，放出された５１Ｃｒをガンマカウンターでアッセイ
した。

【００９８】図１２は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐＣＡＭ陽性標的
細胞に対して再指向させたＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。１００μｌの容量の
１００，０００個のＮＫ細胞を，１００μｌの容量の１０，０００個のクロム−
５１標識ＫａｔｏＩＩＩ細胞に加えた。二特異性抗体を５０μｌの容量で１μｇ
／ｍｌの濃度で加えた。マイクロタイタープレートを３７(Ｃ，５％ＣＯ２で４
時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了後，各ウエルから５０
μｌの上清を採取し，放出された５１Ｃｒをガンマカウンターでアッセイした。

【００９９】これらのおよび他の態様は，本発明の詳細な説明および実施例により開示され
包含される。本発明にしたがって用いるべき抗体，方法，使用および化合物のい
ずれかに関する別の文献は，例えば電子装置を用いて，公共図書館およびデータ
ベースから検索することができる。例えば，インターネット，例えばｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎ
ｅ．ｈｔｍｌで入手可能な公共のデータベース"Ｍｅｄｌｉｎｅ"を用いることが
できる。別のデータベースおよびアドレス，例えば，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇ
ｅｎ．ｆｒ／，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ
／，は当業者に知られており，また，例えば，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏ
ｓ．ｃｏｍを用いて得ることができる。バイオテクノロジーについての特許情報
および過去の検索および現在の知識に役立つ関連する特許情報源の調査の概要は
，Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ１２（１９９４），３５２−３６４に記載され
ている。

【０１００】上述の開示は本発明を一般的に記述する。より完全な理解は，以下の特定の実
施例を参照して得ることができるが，これらは例示のためにのみ提供され，本発
明の範囲を限定することを意図するものではない。

【０１０１】以下に，実施例により本発明を説明する。

【０１０２】実施例１：ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートによるマウスの免疫およびゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートを用いる血清タイターの測定ｂａｌｂ／ｃとＣ５７ｂｌａｃｋとの交配からの１０週齢のＦ１マウスを，ゼ
ータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲート（ＪｅｒｉｎｉＢｉｏＴｏｏｌｓ
，Ｂｅｒｌｉｎ）で免疫した。ゼータ鎖Ｎ−末端のアミノ酸配列（ＱＳＦＧＬＬ
ＤＰＫＬＣ）を有するペプチドを，Ｃ−末端のシステインのメルカプト基を介し
てマレインイミド活性化ＫＬＨに直接カップリングさせた。コンジュゲートを０
．９％ＮａＣｌに１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。次に溶液を１：２で完全
フロインドアジュバントとともに乳化し，マウス１匹あたり５０μｌを腹膜内注
射した。マウスは，４，８，および１２週後に，完全フロインドアジュバントを
不完全フロインドアジュバントで置き換えた以外は同様にしてブースター免疫を
行った。第１のブースター免疫の１０日後，血液サンプルを採取してゼータ−ペ
プチド−ＢＳＡ−コンジュゲートに対する抗体血清タイターをＥＬＩＳＡにより
試験した。免役した動物の血清タイターは，免疫していない動物より１０００倍
以上高かった。第２のブースターの３日後，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａ
ｒｇｕｌｉｅｓ，ＳｈｅｖａｃｈａｎｄＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎ
ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）に記載される標準的プロトコルを用いて，脾
臓細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）と融合
させて，ハイブリドーマ細胞株を作成した。ＰＥＧ融合の後，細胞をウエルあた
り１００，０００細胞でマイクロタイタープレートに播種し，１０％ウシ胎児血
清，３００ユニット／ｍｌの組換えヒトインターロイキン６および選択用のＨＡ
Ｔ添加物を補充したＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌ中で成長させた。高い密度
に成長したウエルからの培養上清を，１：２０の希釈でＥＬＩＳＡ分析により試
験した。ハイブリドーマ上清がゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートに結
合する能力は，以下のＥＬＩＳＡにより測定した。ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−
コンジュゲート（ＪｅｒｉｎｉＢｉｏＴｏｏｌｓ，Ｂｅｒｌｉｎ）について
記載したものと同様に，ウシ血清アルブミンにコンジュゲート化したゼータ−ペ
プチド１００μｌを，５μｇ／ｍｌの濃度で９６Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａ
ｘｉｓｏｒｂ）のウエルにコーティングした。コーティングは４℃で一夜行い，
洗浄緩衝液（０．１ＭＮａＣｌ，０．０５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７．３，０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．０５％ＮａＮ₃）で３回洗浄した後，２％スキ
ムミルク粉末を加えた洗浄緩衝液２００μｌを用いて室温で１時間，続くブロッ
キングを行った。次の工程においては，ハイブリドーマ上清を，純粋なまままた
は何段階かの希釈で室温で２時間インキュベートした。検出系としては，希釈し
た，西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウスイムノグロブリ
ンに対するポリクローナル抗体を用いた。５回洗浄した後，最後にＴＭＢ基質溶
液（テトラメチルベンジジン，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を加
えることによりＥＬＩＳＡを発色させた。１５分後，着色した沈殿物を，ＥＬＩ
ＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。

【０１０３】強いＥＬＩＳＡのシグナルを示す１５０個のクローンからの上清を選択して，
フローサイトメトリ分析を行った。

【０１０４】ハイブリドーマ上清のＴリンパ球およびＮＫ細胞への結合活性を調べるために
，フローサイトメトリ分析を行った。１ｘ１０⁶個のＰＢＭＣを，それぞれ１５
０個の異なるクローンからの５０μｌの非希釈上清中で，氷上で３０分間インキ
ュベートし，次に結合した抗体を，ＰＢＳ中で１：１００に希釈したウサギ抗マ
ウスＩｇ抗体のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化Ｆ（ａｂ'）₂フラ
グメント（ＤａｋｏＨａｍｂｕｒｇ，ＣｏｄｅＮｏ．Ｆ０３１３）により検
出した。続く標識工程における非特異的結合を回避するために，１：１０に希釈
したマウス血清５０μｌ（Ｓｉｇｍａｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｅ
ｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｍ−５９０５）を３０分間加えることにより，ＦＩＴＣ−
コンジュゲート化抗体の遊離基をブロックした。２つのＰＢＭＣ−サブセットを
区別するために，あらかじめ標識した細胞を分割した。半分は，１：１００に希
釈したトリカラーコンジュゲート化抗ＣＤ８抗体（ＣａｌｔａｃＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ；ＵＳＡ，ＣｏｄｅＮｏ．ＭＨＣＤ０３
０６）で染色し，残りの半分は，１：２５に希釈したフィコエリスリン（ＰＥ）
コンジュゲート化抗ＣＤ５６抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４７７４７）で染色した。負の対照として，
ハイブリドーマ上清の代わりに無関係な特異性のネズミモノクローナル抗体を用
いた。一次標識工程の対照として，ＮＫ細胞またはＴリンパ球の特異的染色のた
めにそれぞれ非標識抗ＣＤ１６および抗ＣＤ６抗体を用いた。

【０１０５】細胞は，ＦＡＣＳ−スキャン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ）で，フローサイトメトリにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍
光強度の測定は，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｓｈｅｖ
ａｃｈａｎｄＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９
２）に記載のように行った。

【０１０６】二色蛍光分析は，ＣＤ８⁺−およびＣＤ５６⁺−細胞にそれぞれ陽性ゲートを適
用して行ったため，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞上でＦＩＴＣ媒介性蛍
光を別々に検出することができた。ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞がそれ
ぞれの陽性対照抗体により明確に染色されたのに対し，１５０のハイブリドーマ
上清はいずれも，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞に対して結合活
性を示さなかった。

【０１０７】実施例２：ファージディスプレイ法によるネズミコンビナトリアル抗体ライブラリの抗ゼータ−抗体についてのインビトロ選択ｂａｌｂ／ｃとＣ５７ｂｌａｃｋとの交配によるＦ１マウスを，１０週齢で実
施例１に記載のように免疫した。第１のブースター免疫の１０日後，血液サンプ
ルを採取し，ゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートに対する抗体血清タイ
ターをＥＬＩＳＡにより試験した（実施例１を参照）。免疫したマウスの血清タ
イターは，免疫していないマウスの１０００倍以上高かった。３回目の注射の３
日後，ネズミの脾臓細胞を回収した。全ＲＮＡの単離には，Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓ
ｋｉ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６２（１９８７）１
５６−１５９）によるプロトコルを用いた。

【０１０８】ネズミ脾臓ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲにより，ネズミイムノグロブリン（Ｉｇ）
カッパ軽鎖およびＩｇ重鎖Ｆｄ−フラグメント（＝ＶＨ＋ＣＨ１）をコードする
ＤＮＡライブラリをそれぞれ構築した。ｃＤＮＡは，標準的プロトコル（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ１９８９，第２版）にしたがって合成した。

【０１０９】プライマーのセット（表１に示される）は，重鎖フラグメントについては５'
−ＸｈｏＩおよび３'−ＳｐｅＩ認識部位を，軽鎖フラグメントについては５'−
ＳａｃＩおよび３'−ＸｂａＩ認識部位を生じさせるように選択した。ＨＣＤ
ＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅には，８つの異なる５'−ＶＨ−ファミリー特異
的プライマーをそれぞれ，異なるＩｇＧ−サブクラスのＨＣ−ＣＨ１−ドメイン
の３’−領域にハイブリダイズする４つの３'プライマーと組み合わせた。カッ
パ軽鎖フラグメントのＰＣＲ増幅には，７つの異なる５'−ＶＫ−ファミリー特
異的プライマーをそれぞれ，カッパ不変領域（ＣＫ）の３’−末端にハイブリダ
イズする１つの３'−プライマーと組み合わせた。

【０１１０】増幅には以下のＰＣＲプログラムを用いた。初期変性，９４℃，２分間；４０
サイクルの増幅：変性，９４℃，２０秒間；プライマーアニーリング，５２℃，
５０秒間およびプライマー伸長，７２℃，６０秒間，続いて１０分間の最終伸長
，７２℃。

【０１１１】４５０ｎｇのカッパ軽鎖フラグメント（ＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化）を１４００
ｎｇのファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ（ＳａｃＩ−ＸｂａＩ消化；大フラグメント
）（Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
８８，７９７８−８２（１９９１））とライゲーションした。次に，得られた軽
鎖ライブラリをエレクトロポレーションにより（２．５ｋＶ，０．２ｃｍギャッ
プキュベット，２５ＦＤ，２００Ｏｈｍ，Ｂｉｏｒａｄｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅ
ｒ）３００μｌの電気的コンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ
１Ｂｌｕｅにトランスフォームして，６ｘ１０⁸個の独立したクローンの大き
さのライブラリを得た。１時間の表現型発現の後，カルベニシリン耐性をコード
するベクターについて陽性のトランスフォーマントを，１００ｍｌの液体ＳＢ−
培地中で一夜選択した。次に遠心分離により細胞を回収し，プラスミドは市販の
プラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。

【０１１２】カッパ軽鎖ライブラリ（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化；大フラグメント）を含む２
８００ｎｇのプラスミドＤＮＡを９００ｎｇのＨＣ−Ｆｄ−ＤＮＡ−フラグメン
ト（ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化）とライゲーションさせ，エレクトロポレーション
により（２．５ｋＶ，０．２ｃｍギャップキュベット，２５ＦＤ，２００Ｏｈｍ
）２つの３００μｌのアリコートの電気的コンピテントＥ．ｃｏｌｉＸＬ１
Ｂｌｕｅに再びトランスフォームして，４ｘ１０⁸個の独立したクローンからな
る抗体Ｆａｂ−フラグメントのコンビナトリアルライブラリを得た。

【０１１３】１時間の表現型発現の後，カルベニシリン耐性について陽性のトランスフォー
マントを選択した。この適合の後，これらのクローンを感染用量１ｘ１０¹²粒子
のヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させて，糸状Ｍ１３ファージを産生させ
分泌させた。各ファージ粒子は，１つのネズミ抗体Ｆａｂ−フラグメントをコー
ドするファージミドベクターの一本鎖コピーを含有し，対応するＦａｂ−蛋白質
をファージ表面に提示する。Ｆａｂ−フラグメントは，ＨＣ−Ｆｄ−フラグメン
トをファージコート蛋白質ＩＩＩに翻訳融合させ，Ｉｇ−軽鎖は自発的にＨＣ−
フラグメントと会合することによりファージ表面に固定された。

【０１１４】クローン化されたＦａｂ−レパートリーを有するこのファージライブラリを，
ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ沈殿および遠心分離により培養上清から回収し，１０
％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に再溶解し，固定化ゼータ−ペプチド
−ＢＳＡ−コンジュゲートまたは単離したＣＤ８⁺−リンパ球もしくはＮＫ細胞
のいずれかとともに，１日交代でインキュベートした。ヒトＰＢＭＣの２つの亜
集団を，免疫磁性分離法によりあらかじめ単離した。末梢血液からフィコール密
度勾配遠心分離により得た単核細胞を，最初にヒトＣＤ８またはＣＤ５６に対す
るネズミ由来の特異的一次抗体とともにインキュベートし，次に，ヒツジ抗マウ
スＩｇＧ抗体とコンジュゲートした常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏ
ｒｗａｙ）でロゼット化（ｒｏｓｅｔｔａｔｉｏｎ）した。ＣＤ８⁺−Ｔ細胞お
よびＣＤ５６⁺−ＮＫ細胞は，細胞懸濁物を含む管の壁に取り付けた磁石を用い
て単離した。ファージライブラリを精製ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球またはＮＫ細胞と
ともに，４℃で２時間連続的に撹拌しながらインキュベーションした後，細胞に
結合したファージ粒子を，細胞に結合したままの常磁性ビーズにより未結合ファ
ージ粒子から分離した。

【０１１５】したがって，磁界への暴露はまた，選別の各ラウンドの間に細胞を再懸濁して
ファージバックグラウンドを低下させるために数回適用された洗浄溶液を除くた
めにも実施した。特異的に結合したファージ粒子は，最後にＨＣｌ−グリシン，
ｐＨ２．２により細胞から溶出させ，２ＭＴｒｉｓｐＨ１２で中和した後，
溶出物を用いて新たな非感染Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅ培養物を感染させ
た。ネズミＦａｂ−フラグメントをコードするｐＣｏｍｂ３Ｈファージミドのコ
ピーの導入に成功した細胞は，再びカルベニシリン耐性について選択し，次にＶ
ＣＭＳ１３ヘルパーファージを感染させて，次のラウンドの抗体ディスプレイお
よびインビトロ選択を開始した。

【０１１６】固定化ゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートでの選別の２つの初期ラウ
ンドからなる完全なインビトロ選択方法の後，それぞれ１ラウンドのＣＤ８⁺−
Ｔリンパ球および続いてＣＤ５６⁺−ＮＫ細胞での選別を行った。次に，固定化
ゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートについて別の２ラウンドの選択を行
い，次に再び，それぞれ１ラウンドのＣＤ８⁺−Ｔ細胞上での選別および最後に
ＣＤ５６⁺−ＮＫ細胞での選別を行った。固定化抗原での選別は，さもなくばフ
ァージ粒子の非特異的溶出によりゼータ鎖の他に多数の異なる抗原を含有する細
胞表面から失われてしまうであろうゼータ鎖特異的Ｆａｂ−フラグメントに対す
る選択圧力を維持するために，記載されたように行った（Ｂａｒｂａｓｅｔ
ａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８８，７９７８−８２
（１９９１）。選別の各ラウンドの後，得られたＥ．ｃｏｌｉ培養物からプラス
ミドＤＮＡを調製した。

【０１１７】可溶性Ｆａｂ−蛋白質の製造のため，ｇｅｎｅＩＩＩＤＮＡフラグメントをこ
れらのプラスミドＤＮＡの調製物から切り出し（ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ），ｇｅｎ
ｅＩＩＩ蛋白質とＦａｂ−セグメントとの翻訳融合を破壊した。再ライゲーショ
ン後，このプラスミドＤＮＡのプールを１００μｌの熱ショックコンピテントＥ
．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅにトランスフォームし，カルベニシリンＬＢ−寒
天上に播種した。単一コロニーを１０ｍｌのＬＢ−Ｃａｒｂ−培地／２０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂で成長させ，６時間後にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（
ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で加えることによりＦａｂ発現を誘導した。

【０１１８】２０時間後に，遠心分離によりこれらの細胞を回収し，−７０℃での凍結およ
び３７℃での融解を４回繰り返すことにより，細菌の外膜を温度ショックにより
破壊して，Ｆａｂ抗体−フラグメントを含む可溶性ペリプラズム蛋白質を液体中
に放出させた。遠心分離により無傷の細胞および細胞破片を除去した後，ＥＬＩ
ＳＡによりＦａｂ−抗体−フラグメントのゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュ
ゲートへの結合について上清を分析した。

【０１１９】固定化ゼータ−ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートに結合したＦａｂ−フラグ
メントの検出は，ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体の西洋ワサビペルオキシダー
ゼコンジュゲート化Ｆ（ａｂ'）₂フラグメント（０．１６μｇ／ｍｌ）（Ｐｉｅ
ｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ，Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．３１１４４８）を用いて
行った。２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホ
ン酸）および過ホウ酸ナトリウムを含有する基質溶液を加えることによりシグナ
ルを発色させ，波長４０５ｎｍで検出した。

【０１２０】インビトロ選択の前にライブラリから取得したクローンと比較して，数ラウン
ドの選別の後のこれらのクローンは，ゼータ−ペプチド−ＥＬＩＳＡにおいて陽
性であり，精製ＣＤ８⁺−Ｔ細胞（図２）を用いて実施した選別の７ラウンドま
で頻度は全体的に増加したことが証明された。しかし，第７ラウンドから第８ラ
ウンドへの選別においては，第８ラウンドは精製ＮＫ細胞を用いて実施し，陽性
のクローンの数は顕著に減少した。このことは，Ｔ細胞への結合活性により濃縮
することができるクローンは，ほとんどがＮＫ細胞に関しては正しくないことを
示し，例外としてクローン９０のみがＮＫ細胞に対する最終選別工程の後にも保
持された。

【０１２１】ゼータ−ペプチド−反応性Ｆａｂ−フラグメントのＣＤ８⁺−Ｔ細胞およびＮ
Ｋ細胞に対する結合活性を試験するため，フローサイトメトリ分析を行った。１
ｘ１０⁶個のＰＢＭＣを５０μｌの非希釈ペリプラズム調製物中で氷上で３０分
間インキュベートし，次にＰＢＳ中で１：１００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ
＋ＩｇＭ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＵＳＡＣｏｄｅＮｏ．１１５−０９
６−０６８）のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化Ｆ（ａｂ'）₂−フ
ラグメントとともにインキュベートした。続く標識工程の間の非特異的結合を回
避するため，５０μｌの１：１０に希釈したマウス血清（Ｓｉｇｍａｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｍ−５９０５）を３０分間
加えることにより，ＦＩＴＣ−抗体の遊離結合基をブロックした。２つのＰＢＭ
Ｃサブセットを区別するため，あらかじめ標識した細胞を分割した。半分は１：
１００に希釈したトリカラーコンジュゲート化抗ＣＤ８抗体（ＣａｌｔａｃＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＵＳＡ，ＣｏｄｅＮｏ．ＭＨＣＤ０３０６）で染色
し，残りの半分は，１：２５に希釈したフィコエリスリンコンジュゲート化抗Ｃ
Ｄ５６抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．３４７７４７）で染色した。負の対照として，無関係な特異性を有す
るＦａｂ−抗体ペリプラズム調製物を用いた。ＮＫ細胞およびＣＤ８⁺−Ｔリン
パ球についての正の対照として，それぞれ非標識抗ＣＤ１６および抗ＣＤ６抗体
を用いた。

【０１２２】二色蛍光分析は，ＦＡＣＳスキャン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）で
，ＣＤ８⁺−およびＣＤ５６⁺−細胞にそれぞれ陽性ゲートを適用して行ったため
，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞上でＦＩＴＣ媒介性蛍光を別々に検出す
ることができた。細胞の標識および蛍光測定は，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，
Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＳｈｅｖａｃｈａｎｄＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）に記載のように実施した。

【０１２３】上述のプロトコルを用いて，ＥＬＩＳＡ分析によりゼータ−ペプチド−ＢＳＡ
−コンジュゲートと反応することが証明された６０個の異なるクローンをＰＢＭ
Ｃで分析した。陽性対照により明確な陽性のＦＡＣＳ−シグナルが示されたにも
かかわらず，抗ゼータ鎖Ｆａｂ−抗体−フラグメントのペリプラズム調製物はい
ずれもＣＤ８⁺−Ｔリンパ球またはＮＫ細胞の表面に結合することを示すことが
できなかった。この結果は，Ｔ細胞の表面を用いる選別方法により選択されたＦ
ａｂ−フラグメントが低い親和性の相互作用を示すことにより説明することがで
きる。これは，インビトロ選択の間に濃縮するのに十分であるが，フローサイト
メトリ分析の感度より低いのであろう。しかし，ＮＫ細胞において行われた最終
選択工程の間にゼータ−ペプチド反応性クローンが消失したことは，これらの潜
在的Ｔ細胞反応性クローンがＮＫ細胞の表面に全く結合しなかったことを強く示
す。一方，ＮＫ細胞での選別の最終ラウンドの間に最初に出現したクローン９０
は，その可変領域配列をより初期のインビトロ選択において出現した他のゼータ
−ペプチド−反応性クローンの配列と比較することにより判定して，おそらくは
Ｔ細胞と相互作用することなくＮＫ細胞表面に対して低い親和性の結合を示した
のであろう。したがって，クローン９０は，ＮＫ細胞での第２ラウンドの選別の
前には現れず，対応するＦａｂ−抗体フラグメントのフローサイトメトリ分析に
より，Ｔ細胞またはＮＫ細胞のいずれに対しても結合シグナルが検出されなかっ
た。

【０１２４】実施例３：ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートによるラットの免疫およびハイブリドーマ技術による抗ゼータ抗体の製造月齢３月のスプラグ・ドーリーラットをヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ−１５２）により，１ｘ１０⁷個の細胞を腹膜内注射することにより免疫
した。３ヶ月後，動物をゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートで免疫した
。コンジュゲートを２００μｇ／ｍｌの濃度で０．９％ＮａＣｌに溶解した。溶
液を完全フロインドアジュバントとともに１：２で乳化し，１００μｌを腹膜内
および皮下に注射した。４週間後，同様に，ただしアジュバントを加えずに，ラ
ットをブースター免疫した。ブースターの３日後，動物を殺し，標準的プロトコ
ルにしたがって，脾臓細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１５８０）と融合させて，ハイブリドーマ細胞株を作成した。ＰＥＧ−融合の
後，細胞をウエルあたり１００，０００細胞でマイクロタイタープレートに播種
し，１０％ウシ胎児血清および選択用のＨＡＴ添加物を補充した２００μｌのＲ
ＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。８日後，培養上清を完全に除去し，新鮮な
培地で置き換えた。さらに４日後，各ウエルからの培養上清を１：１に希釈し，
ＥＬＩＳＡにより分析した（実施例１を参照）。固定化ゼータ−ペプチド−ＢＳ
Ａ−コンジュゲートに対して最も強い反応を示す４５のウエルからの上清を選択
して，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞でのＦＡＣＳ分析を行った。これは
，実施例１においてネズミモノクローナル抗体について記載したように，ただし
，ウサギ抗マウスＩｇ抗体のＦＩＴＣ−コンジュゲート化Ｆ（ａｂ'）₂−フラグ
メントの代わりにＦＩＴＣ−標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ＋Ｉｇ
Ｍ）（Ｄｉａｎｏｖａ／Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１
２−０１６−０４４）を用いて実施した。試験した４５の異なるラットモノクロ
ーナル抗体のうち，２−Ｂ−５と名付けた１つのクローンのみがＣＤ８⁺−Ｔリ
ンパ球とＮＫ細胞との両方に結合することが証明された。したがって，このクロ
ーンを，実施例４−７に記載されるように，より詳細に分析した。

【０１２５】実施例４：ＣＤ８⁺−Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５のフ
ローサイトメトリ分析ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の表面における２−Ｂ−５抗体の結合活
性を試験するために，二人の異なる健康なドナーの末梢血液からの単核細胞を，
フィコール密度勾配遠心分離により単離した。マイクロタイタープレートの各ウ
エルで，１００，０００個の単核細胞を２−Ｂ−５ハイブリドーマの非希釈また
はいくつかに希釈した細胞培養上清とともにインキュベートした。負の対照とし
て，同じアイソタイプであるが無関係の特異性を有する抗体の培養上清（ラット
ＩｇＭ）を用いた。細胞は，氷上で３０分間インキュベーションした後，ＰＢＳ
で２回洗浄し，次に２つの異なる抗体標識混合物で染色した。ＣＤ８⁺−Ｔ細胞
は，ＰＢＳ中で１：１００に希釈したフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲー
ト化ヤギ抗ラットＩｇ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ／Ｊａｃｋｓｏ
ｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１２−０１６−０４４），ＰＢＳ中で１
：２５に希釈したフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート化ＣＤ５６抗体（Ｂ
ｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４
７７４７）およびＰＢＳ中で１：５０に希釈したトリカラーコンジュゲート化Ｃ
Ｄ３抗体（ＣａｌｔａｃＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，
ＵＳＡ，Ｃｏｄ．Ｎｏ．ＭＨＣＤ０３０６）とともに，氷上で３０分間同時にイ
ンキュベートした。この標識混合物に，マウス血清（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃ
ｈ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０５４Ｈ−８９５８）を１：１
０の希釈で加えて，抗ラット抗体のマウス抗体への非特異的結合反応を回避した
。

【０１２６】ＮＫ細胞画分は，ＰＢＳ中で１：１００に希釈した同じヤギ抗ラットＩｇ抗体
，ＰＢＳ中で１：１００に希釈したトリカラーコンジュゲート化ＣＤ８抗体（Ｃ
ａｌｔａｃＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｄ．Ｎｏ．ＭＨＣＤ０８０６）お
よびＰＢＳ中で１：２５に希釈したフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート化
ＣＤ１６抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．３４７６１７）とともにインキュベートした。この混合物も同様に
マウス血清を補足した。標識した細胞をＰＢＳで２回洗浄し，次にＰＢＳ／１％
パラホルムアルデヒドで固定した。

【０１２７】細胞は，ＦＡＣＳ−スキャン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ）でフローサイトメトリにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光
強度の測定は，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｓｈｅｖａｃ
ｈａｎｄＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）
に記載のように実施した。

【０１２８】ＣＤ８⁺（トリカラー）について正のゲートを，ＣＤ１６⁺（ＰＥ）細胞につい
て負のゲートを適用することにより三色蛍光分析を実施したため，ＣＤ８⁺−Ｔ
リンパ球（表現型：ＣＤ８⁺，ＣＤ１６^-）にのみ起因し，ＣＤ８⁺−ＮＫ細胞か
らの夾雑シグナルのないＦＩＴＣ媒介性蛍光を検出することができた。同様に，
ＣＤ５６⁺−細胞（ＰＥ）について正のゲートを，ＣＤ３⁺−細胞（トリカラー）
について負のゲートを適用することにより三色蛍光分析を実施したため，ＮＫ細
胞（表現型：ＣＤ５６⁺，ＣＤ３^-）にのみ起因し，ＣＤ５６⁺−Ｔリンパ球から
の夾雑シグナルのないＦＩＴＣ媒介性蛍光を検出することができた。

【０１２９】図３に示されるように，２−Ｂ−５ハイブリドーマ抗体は，異なるドナーから
のＴリンパ球およびＮＫ細胞の両方の表面に特異的に結合する。

【０１３０】実施例５：サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡによる２−Ｂ−５抗体のゼータ鎖特異性の確認モノクローナル抗体２−Ｂ−５のゼータ鎖特異性を確認するために，サンドウ
ィッチＥＬＩＳＡを実施した。

【０１３１】この目的のために，ゼータ鎖を発現することが知られている精製ＣＤ８⁺−Ｔ
リンパ球からの細胞溶解物を調製し，細胞内ゼータ鎖ドメインを認識する固定化
抗体とともにインキュベートした。次に，細胞溶解物からのゼータ鎖分子をこの
抗体により捕獲し，続いてゼータ鎖の短い細胞外部分に対して生成した２−Ｂ−
５抗体により検出することができる。ＣＤ８⁺−リンパ球の単離は，実施例１に
記載のように，常磁性ビーズを用いて実施した。詳細な工程は，製造元の指針に
したがって実施した（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）。精製ＣＤ８⁺−
細胞を，プロテアーゼ阻害剤であるフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ
）（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）の存在下で，界面活性剤ＮＰ−４０（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）により溶解させた。詳細な緩衝液の処方に
ついては，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨｏｂａｒｔ，ＮＹ（１９８９）を参照のこと。

【０１３２】サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡは以下のように実施した。

【０１３３】ゼータ鎖のカルボキシ末端のアミノ酸１４４−１６３を認識するゼータ鎖特異
的抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ−Ｎｏ１
１２４）を，９６Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウエルに５μ
ｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。コーティングは４℃で一夜行い，続いてＰ
ＢＳ中３％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングを実施した。次に，ＣＤ８⁺−細
胞の溶解物を希釈せずにまたは何段階かの希釈で加え，１時間インキュベートし
た。負の対照として，ウエルを細胞溶解物の代わりにＰＢＳとともにインキュベ
ートした。続く工程においては，精製したモノクローナル抗体２−Ｂ−５を１μ
ｇ／ｍｌの濃度で加え，１時間インキュベートした。結合した２−Ｂ−５抗体は
，ビオチニル化マウス抗ラットＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ，ＳａｎＦｒａｎｃｉ
ｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；Ｃａｔ−Ｎｏ０３−９８４０；使用濃度４００ｎｇ／ｍ
ｌ），続いてアビジン−ペルオキシダーゼ−コンジュゲート（Ｄａｋｏ，Ｈａｍ
ｂｕｒｇ；Ｃｏｄｅ−ＮｏＰ０３３４７；使用濃度１μｇ／ｍｌ）を用いて検出
した。最後に，ＡＢＴＳ基質溶液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ−Ｎｏ．１６８２００８）を加えることにより，ＥＬ
ＩＳＡを発色させた。着色した析出物をＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍ
で測定した。

【０１３４】ラットＩｇＭ抗体２−Ｂ−５は，ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡｂｘカラム（Ｊ．Ｔ
．Ｂａｋｅｒ，Ｇｒｅｉｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて，製造元のマニ
ュアルにしたがって，イオン交換クロマトグラフィーによりハイブリドーマ培養
上清から精製した。

【０１３５】図４に示されるように，モノクローナル抗体２−Ｂ−５は，細胞内ゼータ鎖ド
メインを認識する固定化抗体により捕獲されたＴ細胞溶解物からのゼータ鎖分子
に結合し，ここで，ゼータ特異的ＥＬＩＳＡシグナルは，溶解物の希釈率に厳密
に依存し，負の対照と明確に区別される範囲であった。

【０１３６】実施例６：ゼータ抗体２−Ｂ−５の可変領域のクローニングおよび対応するＦａｂ−フラグメントのＥ．ｃｏｌｉにおける発現ＲＮＡは，Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉｅｔａｌ．（ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅ
ｍ，ｖｏｌ．１６２，ｐ１５６−９１９８９）により記載された方法にしたがっ
て，ラットハイブリドーマ細胞株２−Ｂ−５の５ｘ１０⁶個の細胞から単離した
。全ＲＮＡを，ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）を用いて標準的プロトコ
ル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９，第２版）にしたがって逆転写させた。ｃＤ
ＮＡの特異的プライミングは，２つのオリゴヌクレオチド：ラットμ鎖の不変領
域の短い配列とマッチするｒａｔｃｍｕＲＴ（ＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡ
ＡＧＧＣＡＴＣ）および軽（カッパ）鎖の３’−非翻訳領域の一部に相補的なｒ
ａｔｃｋＲＴ（ＧＴＡＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＣ）を用いて
実施した。各プライマーは，それぞれ転写産物ＩｇＭ−ＣＨ１−重鎖ドメインま
たはカッパ軽鎖の不変領域をコードするヌクレオチド配列の末端から約７０塩基
対（ｂｐ）下流に位置している。いずれの場合においても，ヌクレオチド情報は
，Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースから入手した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂ
ｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／Ｅｎｔｒｅｚ／）：カッ
パ鎖については，ＳｈｅｐａｒｄａｎｄＧｕｔｍａｎ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．Ｊ０２５７４，ミュー鎖については，Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ａｃｃ
ｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ６８３１２。次に，ターミナルトランスフェラーゼ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を用いて，標準的なプロトコルにしたが
って，ｃＤＮＡの第１鎖にポリ−Ｇテールを付加した。テールを付加したｃＤＮ
Ａを，Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｌ．Ｋ．ｅｔａｌ．，（ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉ
ｇｅｎｓ４７，１−２０，１９９６）により公表され，５’−ＡｎｃＴａｉｌ
と称されるアンカープライマー配列（ＣＧＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴ
ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤ）に基づいて，ポリ−Ｃストレッチを含有する
センスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。このアンカープライマーを，それぞ
れ，カッパ軽鎖不変領域またはＩｇＭ−ＣＨ１重鎖ドメインのＣ末端をコードす
るヌクレオチド配列に特異的なアンチセンスプライマーと組み合わせた。プライ
マーは，３’ｒａｔｃｋ（ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴ
ＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ）および３’ｒａｔｃｍｕ（ＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＴＣ
ＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴ）と称される。ＰＣＲは以下のように行っ
た。一次変性：９４℃，４分間，３０サイクルの増幅：９３℃，３０秒間；５５
℃，３０秒間．；７２℃，３０秒間；最終伸長：７２℃，３分間。これらのプラ
イマーのそれぞれは，制限酵素切断部位（５’−ＡｎｃＴａｉｌ：ＥｃｏＲＩ；
３’ｒａｔｃｋ：ＸｂａＩ；３’ｒａｔｃｍｕ：ＳｐｅＩ）を含み，このことに
より，対応するＰＣＲフラグメントを，それぞれＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩまたはＥ
ｃｏＲＩ／ＳｐｅＩで消化したプラスミドベクター中にクローニングすることが
できる。この目的のために，ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋プラスミドベクター
（ＧｅｎｅｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏＸ５２３２７）を用いた。こ
れは，得られた挿入物を共通の配列決定プライマーを用いて簡単に配列分析をす
ることができるためである。重鎖（ＶＨ）の可変領域中の内部ＳｐｅＩ切断部位
のため，ＶＨ−ドメインの完全な配列情報を得るためには，部分消化，および続
く完全長フラグメントのクローニングが必要であった。部分消化は，標準的プロ
トコルにしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９，第２版）。重鎖お
よび軽鎖フラグメントのいくつかのクローンは，それぞれ同一の配列を有するこ
とが証明され，機能的ＶＬ−またはＶＨ−領域のいずれかをコードすると同定す
ることができた（図６および７を参照）。

【０１３７】両方の可変鎖の成熟Ｎ−末端は，これらの配列と，Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベ
ース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ
−ｐｏｓｔ／Ｅｎｔｒｅｚ／）に見いだされる配列とを比較するとにより同定し
，続いて第２の組のＰＣＲプライマーを設計して，適当な制限酵素切断部位を，
２−Ｂ−５Ｆａｂ−抗体フラグメントのコーディング配列にインフレームで，か
つ細菌発現ベクターへのサブクローニングの必要に応じて導入した。５’ＲＶＨ
ＺＸｈｏＩ（ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧ
ＣＴＡＧ）および５’ＲＶＫＺＳａｃＩ（ＧＴＡＡＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧ
ＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧ）と称される２つのプライマーを，それぞれ
３’ｒａｔｃｍｕおよび３’ｒａｔｃｋプライマーと組み合わせて用いた。ＰＣ
Ｒ増幅および適当な制限酵素の組み合わせ（重鎖フラグメントについてはＸｈｏ
Ｉ／ＳｐｅＩ，カッパ軽鎖についてはＳａｃＩ／ＸｂａＩ）による消化の後，得
られたＤＮＡフラグメントを，対応するよう調製したｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラ
スミドベクターに別々にクローニングし，確認のために配列決定した（配列決定
の結果については，図６および７を参照）。

【０１３８】Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの２−Ｂ−５−Ｆａｂ−フラグメントの発現の
ために，対応するカッパ軽鎖を制限酵素ＳａｃＩ／ＸｂａＩを用いてＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＫＳ＋から切り出し，同じ酵素で消化することにより調製したベク
ターｐＣｏｍｂ３ＨＨｉｓ中にサブクローニングした。次に，得られたプラスミ
ドを制限酵素ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化し，２−Ｂ−５重鎖Ｆｄ−フラグメント
（ＶＨ＋ＣＨ１）のサブクローニングのためのベクターとして用いた。このＤＮ
Ａフラグメントを対応するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋クローンから制限酵素
ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩにより切り出した。

【０１３９】ｐＣｏｍｂ３ＨＨｉｓは，それぞれｐＣｏｍｂ３ＨおよびｐＣｏｍｂ３（Ｂａ
ｒｂａｓｅｔａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８８
，７９７８−８２（１９９１））から以下の改変により得た。ｐＣｏｍｂ３Ｈベ
クターをＮｈｅＩで切断し，適当な末端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドをラ
イゲーションにより挿入した。二本鎖オリゴマーは，２つの５’−リン酸化プラ
イマーＨｉｓ６ｓ（ＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡ）およ
びＨｉｓ６ａｓ（ＣＴＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧ）をアニ
ーリングすることにより作成した（９４℃，１０分間；６５(Ｃ，３０分間；５
２(Ｃ，３０分間および３０(Ｃ，１０分間）。プライマー末端は，ベクターと融
合した後に３’ＮｈｅＩ制限部位が破壊されるが，５’ＮｈｅＩ切断部位がその
まま残るように設計した。最後に，挿入物を配列決定してクローニングが成功し
たことを確認した。

【０１４０】ペリプラズムの調製はオスモティック・ショックにより行い，ＥＬＩＳＡによ
りＦａｂ−フラグメントのゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートへの結合
について試験した。この目的のために，２−Ｂ−５の重鎖Ｆｄ−フラグメントお
よびカッパ軽鎖を含むｐＣｏｍｂ３ＨＨｉｓでトランスフォームしたＥ．ｃｏｌ
ｉＸＬ１Ｂｌｕｅの単一コロニーを，カルベニシリンおよび２０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂を補充した１０ｍｌのＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地で成長させ，６時間後
にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で
加えることにより，Ｆａｂ−発現を誘導した。２０時間後に細胞を回収し，１ｍ
ｌのＰＢＳに再溶解した。−７０℃での凍結および３７℃での融解を４回繰り返
すことにより，細菌の外膜を破壊し，Ｆａｂ−フラグメントを含む可溶性ペリプ
ラズム蛋白質を上清中に放出させた。無傷の細胞と細胞断片を遠心分離により除
去した後，ゼータ−Ｆａｂ−抗体−フラグメントを含有する上清を回収し，以下
の実験に用いた。

【０１４１】ペリプラズム中に発現したクローン化モノクローナル抗体２−Ｂ−５のＦａｂ
−フラグメントの，ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートへの結合は，以
下のＥＬＩＳＡを用いて分析した。抗原を，９６ＵウエルＥＬＩＳＡプレート（
ｎｕｎｃｍａｘｉｓｏｒｂ）に，ウエルあたり５０μｌのリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）中，２００μｇ／ｍｌの濃度で固定化した。コーティングは，４℃で
１２時間行い，次にＰＢＳ／０，０５％Ｔｗｅｅｎで１回洗浄した。次に，ＥＬ
ＩＳＡをＰＢＳ／３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングし，
１回洗浄した。次に，Ｆａｂ−含有ペリプラズム調製物を希釈せずにおよび何段
階かに希釈して加え，２時間インキュベートした。ゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−
コンジュゲートに結合したＦａｂ−フラグメントの検出のために，１：２００に
希釈したネズミ抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ｃａｔ．
ｎｏＤＩＡ９００）を，続いて１：５０００に希釈したペルオキシダーゼコン
ジュゲート化ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ−ガンマ特異的）（Ｄｉ
ａｎｏｖａ／Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ｃａｔ．ｎｏ．１１５−０３５
−０７１）抗体を用いた。最後に，ＡＢＴＳ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ−Ｎｏ．１６８２００８）を加え
ることによりＥＬＩＳＡを発色させた。発色した基質のターンオーバーは，ＥＬ
ＩＳＡリーダーでＯＤ４０５ｎｍで測定した。結果は図５に示される。負の対照
としては，ペリプラズム調製物の代わりに，ウエルをＰＢＳとともにインキュベ
ートした。

【０１４２】いくつかのクローンのゼータ−ペプチド−ＫＬＨ−コンジュゲートに対する特
異的結合は，図５に示されるクローン８および９の結果を用いて検出することが
できた。シグナル強度は，負の対照より明確に高い範囲にあり，試料の希釈によ
り滴定することができた。すなわち，クローン化の２−Ｂ−５−Ｆａｂ−フラグ
メントのゼータ鎖特異性が確認された。

【０１４３】実施例７：抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５によるＴリンパ球およびＮＫ細胞の刺激この実験の目的は，抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５により誘導された，Ｔ細胞，Ｎ
Ｋ細胞およびＰＢＭＣの刺激および増殖を分析することである。この目的のため
に，ＤＮＡ合成の間に取り込まれたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の測定
に基づく比色イムノアッセイを用いた（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９）。

【０１４４】このアッセイの第１工程は，９６ウエル平底マイクロタイタープレートを精製
２−Ｂ−５抗体で何段階かの希釈でコーティングすることであった（２−Ｂ−５
の精製については実施例５を参照）。コーティングは４℃で一夜実施した。ＰＢ
Ｓで３回洗浄した後，それぞれ１００，０００個のＣＤ８⁺−Ｔリンパ球，ＮＫ
細胞および未分離ＰＢＭＣを，マイクロタイタープレートのウエルに三重で加え
た。ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞は，実施例２の記載にしたがって，磁
気ビーズおよびそれぞれ一次抗体抗ＣＤ８（ＭＴ−８１１）および抗ＣＤ１６（
３Ｇ８，マウスＩｇＧ１，Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ０８
１３）を用いて分離した。

【０１４５】２−Ｂ−５媒介性刺激の特異性の対照として，無関係の特異性を有する同じア
イソタイプの抗体（ラットＩｇＭ）を同じ濃度で用いた。ヒトＣＤ３複合体を認
識する抗体ＯＫＴ３（アイソタイプＩｇＧ２ａ，Ｏｒｔｈｏ．，Ｐｒｏｄ．Ｃｏ
ｄｅ７１０３２０，Ｊｏｈｎｓｏｎ＋Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｕ
ＳＡ）を，Ｔ細胞および未分離ＰＢＭＣの刺激の特異的陽性対照として，１μｇ
／ｍｌのコーティング濃度で加えた。無関係の特異性を有するネズミＩｇＧ２ａ
−抗体をＯＫＴ３のアイソタイプ対照として用いた。ブランク対照（細胞なしの
ウエル）およびバックグラウンド対照（ＢｒｄＵなしのウエル）もまた含まれて
いた。３日間のインキュベーション期間の後，ＢｒｄＵ−標識溶液を２４時間加
えた。この標識の間に，増殖している細胞のＤＮＡ中にチミジンの代わりにピリ
ミジン類似体ＢｒｄＵが取り込まれる。培地を除去した後，細胞を固定し，変性
溶液を加えることによりＤＮＡを一段階で変性した。ＤＮＡの変性は，ペルオキ
シダーゼとコンジュゲート化した抗ＢｒｄＵ抗体による検出のために，取り込ま
れたＢｒｄＵのアクセス可能性を向上させるために必要である。この抗体は新た
に合成された細胞ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵに結合する。結合した抗Ｂｒ
ｄＵ−抗体は，続く基質反応により検出した。反応生成物はＥＬＩＳＡリーダー
により定量した。波長４５０ｎｍでの吸収により測定される着色基質のターンオ
ーバーは，ＤＮＡ合成のレベルと，したがって，増殖している細胞の数と直接相
関する。すべての工程は，キット製造元のマニュアルに記載のように実施した。

【０１４６】図８に示されるように，このアッセイの結果は，抗体２−Ｂ−５が，Ｔリンパ
球およびＮＫ細胞の両方のゼータ鎖の短い細胞外領域に結合するのみならず，こ
の相互作用により両方の細胞タイプの強い刺激を誘導することを明らかに示す。

【０１４７】実施例８：抗ゼータ鎖抗体の結合により誘導されるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の内在化のフローサイトメトリ分析多くのレセプターについて，リガンド結合による活性化の後，レセプターの内
在化が迅速に生ずる。したがって，Ｔ細胞におけるＴＣＲ複合体の迅速な内在化
は，典型的には抗ＣＤ３抗体の結合の後に観察される。したがって，２−Ｂ−５
抗体が細胞外ゼータ鎖エピトープを介するＴＣＲ複合体に結合した後に内在化す
ることにより，本発明の抗体の特有の特異性が確認されるであろう（Ｂｏｙｅｒ
，Ｃ．，Ａｕｐｈａｎ，Ｎ．，Ｌｕｔｏｎ，Ｆ．，Ｍａｌｂｕｒｅｔ，Ｊ．Ｍ．
，Ｂａｒａｄ，Ｍ．，Ｂｉｚｏｚｚｅｒｏ，Ｊ．Ｐ．，Ｒｅｇｇｉｏ，Ｈ．，ａ
ｎｄＳｃｈｍｉｔｔ−Ｖｅｒｈｕｌｓｔ，Ａ．Ｍ．（１９９１），Ｔｃｅｌ
ｌｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＣＤ３ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉ
ｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｃｙｔｏｌｙｔ
ｉｃＴｃｅｌｌｃｌｏｎｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｐｒｏ
ｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｔａｕｒｏｓｐｏｒ
ｉｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔｅｐ．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ
ＯｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２１，１６２３−３４）。

【０１４８】２−Ｂ−５抗体のＴ細胞の表面への結合後のレセプター内在化を試験するため
に，異なる温度でフローサイトメトリアッセイを行い，表面に結合した抗ゼータ
鎖抗体の消失を観察した。

【０１４９】この目的のために，健康なドナーの末梢血液からの単核細胞を，フィコール密
度勾配遠心分離により単離した。マイクロタイタープレートの各ウエルで，２０
０，０００個の単核細胞を１μｇ／ｍｌの濃度の抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５とと
もに４℃または３７℃で，３０分間または６０分間インキュベートして，キャッ
ピングが生ずるのに十分な時間を与えた。正の対照として，ラット抗ヒトＣＤ３
抗体（ラットＩｇＧ２Ｂ）（クローン２６−ＩＩ６−５）を用いて平行実験を行
った。冷ＰＢＳで２回洗浄することによりキャッピング工程を終了させた。細胞
表面結合抗体を標識するために，細胞を，ＰＢＳ中で１：１００に希釈したフル
オレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化ヤギ抗ラットＩｇ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）
抗体（Ｄｉａｎｏｖａ／Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１
２−０１６−０４４）とともにインキュベートした。負の対照としては，二次抗
体のみを用いた。標識した細胞をＰＢＳで２回洗浄し，次にＰＢＳ／０．１％パ
ラホルムアルデヒドで固定した。

【０１５０】細胞は，ＦＡＣＳ−スキャン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ）でフローサイトメトリにより分析した。ＦＡＣＳ染色および蛍光
強度の測定は，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｓｈｅｖａ
ｃｈａｎｄＳｔｒｏｂｅｒ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２
）に記載のように実施した。

【０１５１】結果が明らかに示すように，抗ゼータ鎖抗体２Ｂ５で結合した後，３７℃でイ
ンキュベートした細胞サンプルと４℃でインキュベートした細胞サンプルとの間
に明確な蛍光強度のシフトが認められた。同様の内在化パターンは，抗ＣＤ３抗
体で結合した後にも認められた。３７℃で内在化させたレセプターに対し，キャ
ッピング事象を許容しない温度である４℃でインキュベートしたサンプルは，変
化のない蛍光パターンを示した。

【０１５２】実施例９：本発明の抗ゼータ鎖特異性に基づく二特異性抗体の構築抗ゼータｓｃＦｖ−フラグメントを得るために，別々のプラスミドベクター中
にクローニングした対応するＶＬ−およびＶＨ−領域を，それぞれ，オリゴヌク
レオチドプライマーの対５’ＶＬ２Ｂ５ＢｓｒＧＩ−ＥｃｏＲＶ／３’ＶＬ２Ｂ
５ＧＳ１５および５’ＶＨ２Ｂ５ＧＳ１５／３’ＶＨ２Ｂ５ＢｓｐＥＩを用いる
ＶＬ特異的およびＶＨ特異的ＰＣＲのテンプレートとして用いた。このことによ
り，重複する相補配列をＰＣＲ産物中に導入し，続く融合ＰＣＲにおいてこれを
組み合わせて１５−アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３−リンカーのコーディング
配列を形成した。この増幅工程は，プライマー対５’ＶＬ２Ｂ５ＢｓｒＧＩ−Ｅ
ｃｏＲＶ／３’ＶＨ２Ｂ５ＢｓｐＥＩを用いて行い，得られた融合産物（または
抗ゼータ鎖ｓｃＦｖ−フラグメント）を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢｓｐＥＩで
切断し，これを，同じ制限酵素で消化することにより調製したプラスミド（ＰＣ
Ｔ／ＥＰ９８／０７３１３に記載）中にクローニングした。これは，ＥｐＣＡＭ
抗原に対して結合特異性を有するｓｃＦｖ−フラグメントならびに，精製および
分析の目的でＣ−末端にヒスチジンタグをを含む。次に，ドメイン配置ＶＬ_anti _Zeta −ＶＨ_antiZeta−ＶＨ_antiEpCAM−ＶＬ_antiEpCAMを有する抗ゼータ鎖／抗Ｅ
ｐＣＡＭ二特異性一本鎖抗体をコードするＤＮＡフラグメントを，哺乳動物発現
ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ，Ｍ．，Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，
ａｎｄＫｕｆｅｒ，Ｐ．（１９９５）．Ａｓｍａｌｌｂｉｓｐｅｃｉｆｉ
ｃａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓａ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎｍｏｌｅｃｕｌｅｗｉｔ
ｈｈｉｇｈｔｕｍｏｒｃｅｌｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．（Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２，７０２１−５）のＥｃｏＲＩ／
ＳａｌＩにサブクローニングした。

【０１５３】配列を確認した後（図１０），得られたプラスミドＤＮＡをエレクトロポレー
ションによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。安定なトランス
フェクト体の選択，遺伝子増幅および蛋白質産生は，先に記載されたように実施
した（Ｍａｃｋｅｔａｌ）。二特異性抗体は，先に記載されたように（Ｍａ
ｃｋｅｔａｌ），そのＣ−末端ヒスチジンタグにより，Ｎｉ−ＮＴＡ−カラ
ムでアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。

【０１５４】プライマーの一覧

【表１】

【０１５５】実施例１０：二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に再指向させたＰＢＭＣおよびＣＤ８⁺−Ｔリンパ球の細胞傷害活性この実験においては，標的細胞を⁵¹Ｃｒで標識し，洗浄し，エフェクター細胞
と２０：１のエフェクター−対−標的比で混合し，次に異なる濃度の二特異性抗
ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体とともにインキュベートした。標的細胞死により上
清に放出された⁵¹Ｃｒの量を定量し，各抗体濃度について特異的溶解の比率を計
算した。

【０１５６】このアッセイのため，ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または細胞傷害性Ｔ
リンパ球を，エフェクター細胞として，健康なドナーの軟膜から単離した。ＰＢ
ＭＣはフィコール密度勾配遠心分離により分離し，次に遠心分離工程（１００ｇ
）により血小板を除去した。細胞傷害性Ｔリンパ球を単離するために，ＣＤ８⁺
サブセットカラムキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｃａ
ｔ−Ｎｏ．ＨＣＤ８Ｃ１０００）を製造元のプロトコルにしたがって用いた。２
００，０００個の非刺激ＰＢＭＣまたはＣＤ８⁺Ｔリンパ球を，それぞれ丸底マ
イクロタイタープレートの各ウエルの，１０％ＦＣＳを補充した１００μｌの容
量のＲＰＭＩ１６４０培地に加えた。標的細胞として，クロム−５１（ＮＥＮ−
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｋｏｌｎ；Ｃａｔ−ＮｏＮＥＺ０３０Ｓ）（約１
００μＣｉ）で１時間標識したＫａｔｏＩＩＩ（ＡＴＣＣＨＴＢ−１０３）（
ＥｐＣＡＭ陽性胃癌細胞株）を用いた。容量１００μｌ中の１０，０００個の標
的細胞をマイクロタイタープレートの各ウエルに加えた。二特異性抗体を４０ｎ
ｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌの容量で加えた。マイクロタイター
プレートを３７(Ｃ，５％ＣＯ₂で１６時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン期間の終了時，各ウエルから５０μｌの上清を採取し，ガンマカウンター（
Ｗａｌｌａｃ，１４８０Ｗｉｚａｒｄ３"，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）で放出され
た⁵¹Ｃｒについてアッセイした。最大⁵¹Ｃｒ放出は，Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（
ＰＢＳ中１．０％）を含む緩衝液で標的細胞を溶解することにより決定した。自
発的⁵¹Ｃｒ放出は，標的細胞をエフェクター細胞および二特異性抗体を加えずに
インキュベートすることにより決定した。標的細胞を二特異性抗体とともにイン
キュベートしたとき，測定可能な溶解は認められなかった。特異的溶解は，以下
のように計算した。特異的放出（％）＝［（ｃｐｍ，実験放出）−（ｃｐｍ，自
発放出）］／［（ｃｐｍ，最大放出）−（ｃｐｍ，自発放出）］ｘ１００。すべ
ての試験は三重に行った。三重試験のＳＤは，すべての実験において６％未満で
あった。

【０１５７】単離されたＣＤ８⁺エフェクター細胞の純度は，フローサイトメトリにより分
析した。ＮＫ細胞のコンタミネーションは，ＰＥコンジュゲート化抗ヒトＣＤ５
６抗体で染色することにより排除した。ＦＡＣＳ分析は，実施例１に記載のよう
に実施した。以下の抗体コンジュゲートを用いた。ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３；（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎＣａｔ−Ｎｏ３０１０４Ｘ）１：５０；ＰＥ抗ヒトＣＤ
５６；（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＣａｔ−Ｎｏ３４７７４７）１：
２０；トリカラーマウス抗ヒトＣＤ８（ＣａｌｔａｃＬａｂＣｏｄｅＮｏ
ＭＨＣＤ０８０６）１：１００（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＦＡ
ＣＳ分析の結果から，ＣＤ８⁺細胞集団の純度が高いことが確認された（＞９９
％）。

【０１５８】クロム放出アッセイの結果（図１１）は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ
抗体が，非刺激ＰＢＭＣまたはＣＤ８⁺細胞傷害性Ｔリンパ球をＥｐＣＡＭ陽性
ＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対して再指向させることができることを明らかに示した。
未分離ＰＢＭＣと単離された細胞傷害性Ｔリンパ球により媒介される特異的溶解
の差異は，ＮＫ細胞の細胞傷害性の寄与により説明される。

【０１５９】実施例１１：二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に対して再指向させたＮＫ細胞の細胞傷害活性この実験は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体がＮＫ細胞をＥｐＣＡＭ
陽性標的細胞に再指向させる能力を示すために設計された。このアッセイを実施
するために，ＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇ
ｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ；ＯｒｄｅｒＮｏ４６５−０２）を用いて，ヒ
ト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からＮＫ細胞を単離した。単離の方法は，非Ｎ
Ｋ細胞の磁気的涸渇化に基づくものである。Ｔ細胞，Ｂ細胞，単球，好塩基球，
樹状細胞および血小板を，ハプテン−コンジュゲート化ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ
１９，ＣＤ３６および抗ＩｇＥ抗体のカクテルを，続いて抗ハプテンモノクロー
ナル抗体とカップリングさせた常磁性ビーズを用いて，間接的に標識した。磁界
を用いて磁性ビーズと会合した細胞を保持した。非標識ＮＫ細胞はカラムを通し
て洗い出され，接触しないままである。３つの別々の健康なドナーそれぞれから
の１００，０００個のＮＫ細胞を，それぞれ丸底マイクロタイタープレートの各
ウエルの，１０％ＦＣＳを補充した１００μｌの容量のＲＰＭＩ１６４０培地に
加えた。標的として，⁵¹Ｃｒ−標識Ｋａｔｏ細胞を各ウエルに加えた（ウエルあ
たり１０，０００個の標的細胞，容量各１００μｌ）。二特異性抗体を容量５０
μｌで１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。マイクロタイタープレートを３７(Ｃ，５
％ＣＯ₂で４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了後，５０
μｌの上清を採取して，ガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ，１４８０Ｗｉｚａ
ｒｄ３"，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）で放出された⁵¹Ｃｒについてアッセイした。．
最大⁵¹Ｃｒ放出は，界面活性剤（１．０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，ＰＢＳ中）
を含有する緩衝液で標的細胞を溶解することにより決定した。自発⁵¹Ｃｒ放出は
，エフェクター細胞および二特異性抗体を加えずに標的細胞をインキュベートす
ることにより決定した。標的細胞を二特異性抗体のみとともにインキュベートし
た場合，測定可能な溶解は得られなかった。特異的溶解は以下のように計算した
。特異的放出（％）＝［（ｃｐｍ，実験放出）−（ｃｐｍ，自発放出）］／［（
ｃｐｍ，最大放出）−（ｃｐｍ，自発放出）］ｘ１００。すべての試験は三重に
行った。三重試験のＳＤは，すべての実験について６％未満であった。

【０１６０】単離されたＮＫエフェクター細胞の純度は，フローサイトメトリにより分析し
た。ＣＤ８⁺細胞のコンタミネーションは，トリカラーコンジュゲート化マウス
抗ヒトＣＤ８抗体で染色することにより排除した。実施例１に記載のようにＦＡ
ＣＳ分析を実施した。以下の抗体コンジュゲートを用いた。ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ
３；（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＣａｔ−Ｎｏ３０１０４Ｘ）１：５０；ＰＥ抗
ヒトＣＤ５６；（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＣａｔ−Ｎｏ３４７７
４７）１：２０；トリカラーマウス抗ヒトＣＤ８（ＣａｌｔａｃＬａｂＣｏ
ｄｅＮｏＭＨＣＤ０８０６）１：１００（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）。ＦＡＣＳ分析の結果から，ＮＫ細胞集団の純度が高いことが確認された（
＞９８％）。

【０１６１】クロム放出アッセイの結果（図１２）は，３つの場合すべてにおいて，ＮＫ細
胞をＥｐＣＡＭ陽性標的細胞に対して再指向させる再現性のある能力を示した。

【０１６２】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は，ＴＣＲの構造およびＴ細胞活性化における初期の事象を
示す。

【図２】図２は，ヒトゼータ鎖の細胞外部分への結合についてファージデ
ィスプレイにより選択されたネズミＦａｂ−抗体−フラグメントのＥＬＩＳＡ分
析を示す。

【図３】図３は，ＣＤ８⁺−Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の表面における２
−Ｂ−５抗体のゼータ鎖特異的結合活性のフローサイトメトリ分析を示す。

【図４】図４は，抗体２−Ｂ−５の，ＣＤ８⁺−Ｔ細胞リンパ球の溶解物
中に存在する天然のゼータ鎖との反応性を確認するサンドウィッチ−ＥＬＩＳＡ
の結果を示す。

【図５】図５は，Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に発現したラットモノク
ローナル抗体２−Ｂ−５の組換えＦａｂ−フラグメントの，ゼータ−ペプチド−
ＫＬＨ−コンジュゲートへの特異的結合のＥＬＩＳＡに基づく分析を示す。

【図６】図６は，抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５のＶＨ−領域のＤＮＡ配列お
よび蛋白質−配列を示す。

【図７】図７は，抗ゼータ鎖抗体２−Ｂ−５のＶＫ−領域のＤＮＡ配列お
よび蛋白質配列を示す。

【図８】図８は，抗ゼータ鎖−抗体２−Ｂ−５により誘導されるＣＤ８⁺
−Ｔ細胞，ＮＫ細胞およびＰＢＭＣの刺激を測定するために行った，細胞増殖を
検出するＥＬＩＳＡに基づくＢｒｄＵ−取り込みアッセイの結果を示す。

【図９】図９は，抗ゼータ鎖抗体の結合により誘導されたＴＣＲ／ＣＤ３
複合体の内在化のフローサイトメトリ分析を示す。

【図１０】図１０は，抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ二特異性一本鎖抗体のＤ
ＮＡ配列および蛋白質−配列を示す。

【図１１】図１１は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐ
ＣＡＭ陽性Ｋａｔｏ細胞に対して再指向させたＰＢＭＣおよびＣＤ８⁺−Ｔリン
パ球の細胞傷害活性を示す。

【図１２】図１２は，二特異性抗ゼータ鎖／抗ＥｐＣＡＭ抗体によりＥｐ
ＣＡＭ陽性標的細胞に対して再指向させたＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月１０日（２０００．８．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 31/12 37/02 35/00 37/06 37/02 43/00 １１１ 37/06 Ｃ０７Ｋ 16/28 43/00 １１１ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/46 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 ＺＮＡ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 21/08 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 33/68 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体の可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ
）をコードする核酸配列を含む核酸分子であって，前記抗体は，ヒトゼータ鎖の
細胞外ドメインと特異的に相互作用し，前記抗体は，ラットをＪｕｒｋａｔ細胞
で，次に担体分子およびラットゼータ鎖のＮ末端の１１アミノ酸を含むペプチド
を含むコンジュゲートで免疫することにより得ることができることを特徴とする
核酸分子。
【請求項２】前記核酸分子が，前記可変領域の少なくとも２つのＣＤＲを
コードする核酸配列を含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】前記核酸分子が，前記可変領域の３つのＣＤＲをコードする
核酸配列を含む，請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】前記核酸配列がＶ_H鎖をコードする，請求項１−３のいずれ
かに記載の核酸分子。
【請求項５】前記核酸配列がＶ_L鎖をコードする，請求項１−３のいずれ
かに記載の核酸分子。
【請求項６】ＤＮＡ分子である，請求項１−５のいずれかに記載の核酸分
子。
【請求項７】前記ＣＤＲが，以下のいずれかのヌクレオチド配列：（ａ）配列番号１（ｂ）配列番号３（ｃ）配列番号５（ｄ）配列番号７（ｅ）配列番号９（ｆ）配列番号１１を有する，請求項１−６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８】前記Ｖ_H鎖が，配列番号１３のヌクレオチド配列を有するか
，または配列番号１４のアミノ酸配列をコードする，請求項４記載の核酸分子。
【請求項９】前記Ｖ_L鎖が，配列番号１５のヌクレオチド配列を有するか
，または配列番号１６のアミノ酸配列をコードする，請求項５記載の核酸分子。
【請求項１０】ＣＤＲが以下のいずれかのアミノ酸配列：（ａ）配列番号２（ｂ）配列番号４（ｃ）配列番号６（ｄ）配列番号８（ｅ）配列番号１０（ｆ）配列番号１２をコードする，請求項１−６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１１】請求項１−１０のいずれかに記載の核酸分子を含むベクタ
ー。
【請求項１２】請求項１１記載のベクターでトランスフォームまたはトラ
ンスフェクトされた宿主。
【請求項１３】請求項１−１０のいずれかに記載の核酸分子によりコード
される（ポリ）ペプチドを製造する方法であって，請求項１２記載の宿主を適当
な条件下で培養し，そして培養物から前記（ポリ）ペプチドを単離することを含
む方法。
【請求項１４】請求項１−１０のいずれかに記載の核酸分子によりコード
されるか，または請求項１３記載の方法により製造される（ポリ）ペプチド。
【請求項１５】少なくとも１つの請求項１４記載の（ポリ）ペプチドを含
む抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体。
【請求項１６】モノクローナル抗体である，請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】二特異性抗体である，請求項１５記載の抗体。
【請求項１８】第１の特異性が無傷の細胞の表面上のヒトゼータ鎖の細胞
外ドメインに対するものであり，および第２の特異性がＴリンパ球，ナチュラル
キラー細胞またはそれらの前駆体の表面上の異なっていてもよい分子に対するも
のである，請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】第１の特異性が，無傷の細胞の表面上のヒトゼータ鎖の細
胞外ドメインに対するものであり，第２の特異性が，異なる細胞，好ましくはＴ
細胞，ＮＫ細胞またはそれらの前駆体ではない細胞の表面上の異なる分子に対す
るものであり，ここで，好ましくは前記異なる分子が，ウイルスによりコードさ
れる抗原，腫瘍関連抗原または抗原提示細胞（ＡＰＣ）（最も好ましくは樹状細
胞）または非ＡＰＣのいずれかの上の表面抗原である，請求項１７記載の抗体。
【請求項２０】ｓｃＦｖ鎖である，請求項１５記載の誘導体。
【請求項２１】ＩｇＭである，請求項１６記載の抗体。
【請求項２２】請求項１４記載の（ポリ）ペプチド，および同じ細胞また
は別の細胞上の表面分子と相互作用する天然レセプター，天然リガンドまたはそ
れらの誘導体を含む二特異性レセプターであって，ここで，好ましくは前記レセ
プターまたはリガンドがＣＤ４，ＣＴＬＡ−４，Ｂ７−１，Ｂ７−２，ＬＦＡ−
３，ＩＣＡＭ−１，−２，−３またはＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＲＡＮＴＥ
ＳまたはＳＤＦ−１等のケモカインであることを特徴とする二特異性レセプター
。
【請求項２３】請求項１−１０のいずれかに記載の核酸分子，請求項１１
記載のベクター，請求項１２記載の宿主，請求項１４記載の（ポリ）ペプチド，
請求項１５−２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導
体，および／または請求項２２記載の二特異性レセプターを含む医薬組成物。
【請求項２４】請求項１８記載の抗体の，自己免疫疾患，免疫不全，Ｔ細胞
悪性腫瘍，感染性疾患の治療または予防のための，または免疫応答の抑制のため
の，好ましくは臓器移植後の移植片拒絶を回避するための，医薬組成物の製造に
おける使用。
【請求項２５】請求項１９記載の抗体の，悪性腫瘍，ウイルス感染，また
は他の感染性疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造における使用。
【請求項２６】請求項１４記載の（ポリ）ペプチド，または請求項１５−
２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体，または請
求項２２記載の二特異性レセプターの，ＮＫ細胞依存性免疫の増強または抑制の
ための，またはＮＫ細胞由来悪性腫瘍の治療のための医薬組成物の製造における
使用。
【請求項２７】ＮＫ細胞，Ｔリンパ球またはそれらの前駆体におけるゼー
タ鎖またはイータ鎖の発現を測定する方法であって，（ａ）請求項１４記載の（ポリ）ペプチドまたは請求項１５−２１のいずれか
に記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を，前記ＮＫ細胞，Ｔリン
パ球またはそれらの前駆体と接触させ；そして（ｂ）結合した（ポリ）ペプチド，抗体または誘導体の量を評価する，ことを含む方法。
【請求項２８】請求項１−１０のいずれかに記載の核酸分子，請求項１１
記載のベクター，請求項１２記載の宿主，請求項１４記載の（ポリ）ペプチド，
請求項１５−２１のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導
体，および／または請求項２２記載の二特異性レセプターを含むキット。
【請求項２９】その生殖細胞系中に，少なくとも１コピーの請求項１−１
０のいずれかに記載の核酸分子または請求項１１記載のベクターを含むトランス
ジェニック動物。