KR20010074697A - 인간 제타사슬의 세포외 도메인과 특이적으로상호반응하는 면역 반응물질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체의 가변영역의 적어도 하나의 상보적 결정영역(CDR)을 인코딩한 핵산 서열을 포함한 핵산 분자에 관한 것으로서,
상기 항체는 특이적으로 온전한 세포의 표면에 인간 제타-사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응하고, 주르캇(주르캇) 세포에 의한 쥐의 면역화 이후에, 쥐 제타-사슬의 11개의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드와 담체 분자를 포함한 결합체에 의해 쥐를 면역화함으로써 얻을 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩된 (폴리)펩티드는 단일특이적 또는 이특이적 항체이며, 본 발명은 또한 핵산 분자 또는 본 발명의 항체를 포함한 약학조성물 뿐만 아니라 상기 화합물을 포함하는 킷, 마지막으로, NK-세포, T-세포 또는 본 발명의 항체를 이용한 그의 전구물질상에서 제타-사슬 또는 에타-사슬 발현을 측정하는 방법에 관한 것이다
Description
본 발명은 항체의 가변영역의 적어도 하나의 상보적인 결정영역(CDR)을 인코딩한 핵산 서열을 포함한 핵산 분자에 관한 것이고, 상기 항체는 특이적으로 온전한 세포의 표면에 인간 제타-사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응하고, 주르캇(주르캇) 세포에 의한 쥐의 면역화 이후에, 쥐 제타-사슬의 11개의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드와 담체 분자를 포함한 결합체에 의해 쥐를 면역화함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩된 (폴리)펩티드는 단일특이성 또는 이특이성 항체이다. 본 발명은 또한 핵산 분자 또는 본 발명의 항체를 포함한 약학조성물 뿐만 아니라 상기 화합물을 포함하는 킷에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 NK-세포, T-세포 또는 본 발명의 항체를 이용한 그의 전구물질상에서 제타-사슬 또는 에타-사슬 발현을 측정하는 방법에 관한 것이다.
제타-사슬은 구조적 및 기능적으로 관련된 신호 형질 도입 분자 계열의 일부이고, 추가로 에타-사슬 (선택적으로 제타-사슬의 접합한 형태) 및 높은 친화도 IgE-Fc-수용체 FcεRI의 감마-사슬을 포함한다. 막횡단 단백질의 상기 계열에 통상적인 특징은 하나 또는 여러 개의 ITAM 서열 모티프(면역수용체 티로신-기초의 활성 모티프; 제타: 3, 에타: 2, 감마: 1) 뿐만 아니라 과도하게 짧은 세포외 도메인을 포함한 긴 세포내 도메인이고, 9 (제타, 에타, 서열 확인의) 또는 4 (FcεRI-감마)아미노산으로 구성된다. 상기 단백질의 세포외 도메인의 서열은 마우스, 쥐와 인간 및 유사한 다른 종 사이에도 역시 100% 보존된다.
제타-사슬은 배타적으로 T-림프구상의 에타-사슬, 자연 킬러-(NK-)세포 및, 어느 정도까지 그의 전구물질과 함께 호모이량체 또는 헤테로이량체로 발현된다. 성숙한 T-림프구의 표면에서 제타 사슬은 T-세포 수용체(TCR) 및 CD3-복합체와 구조적 및 기능적으로 밀접하게 연관되어 있다. TCR의 진입을 통해 유발된 신호는 CD3과 제타사슬을 경유하여 T-세포의 세포질로 형질도입되고, 제타-사슬의 세개 ITAMs는 CD3-복합체를 구성하는 윕실론-, 델타- 및 감마-사슬 (FcεRI-감마와 다름)상의 단일 ITAM과 비교된 신호 증폭 효과의 주된 역할을 제공한다.
NK-세포의 표면에서, 제타-사슬은 IgG-Fc-수용체(FcγRⅢA)와 유사한 결합을 보인다. 항체-코팅된 표적 세포가 FcγRⅢA를 통해 NK-세포에 의해 인식되고, 결과 신호는 제타- 및/또는 감마-사슬을 통해 세포질로 도입되어, 인식된 표적 세포를 연속적으로 분해시키는 NK-세포를 활성화시킨다(ADCC, 항체 의존성 세포독성).
성숙한 T-림프구에서 TCR-복합체는 올리고머 구조이고, 다수의 사슬(CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 제타 사슬 또는 그것의 선택적인 결합-생성물 에타와 결합된 TCR-α/β 또는 TCR-γ/δ)으로 구성된다(Keegan, Immunology Today 13 (1992) 63-68). 항원 인식은 세포질내의 신호 형질도입 도메인이 빠진 다형체의 TCR-α/β- 또는TCR-γ/δ-헤테로이량체에 의해 이루어진다. 불변의 CD3 단백질 (γ/ε- 및 δ/ε-헤테로이량체) 및 제타 또는 에타 사슬 (제타-호모이량체 또는 제타-에타-헤테로이량체)은 전체 TCR-복합체의 옳은 조립, 이동 및 효과적인 세포 표면 발현에 필요하며, TCR 신호를 형질도입한다(Clevers, Annu. Rev. Immunol. 6 (1988) 629-662, Ashwell, Annu. Rev. Immunol. 8 (1990) 139-167). 신호화는 제타 사슬에서 세번, 에타 사슬에서 두번, CD3 서브유닛(γ, δ 및 ε)의 각각에서 한번씩 발견되는 면역수용체 티로신-계 활성 모티프(ITAM)인, 보존된 18-아미노산 서열을 필요로 한다(Reth, Nature 338 (1989) 383-384, Samelson, J. Biol. Chem. 267 (1992) 24913-24916). 각 ITAM은 티로신-X-X-류신/이소류신 (Y-X-X-L/I) 모티프를 쌍으로 포함하고, 10 또는 11개의 아미노산으로 분리된다(Cambier, Immunology Today 16 (1995) 110). 각 ITAM내 티로신 잔기는 TCR 결찰 후에 빠르게 인산화되고 src-상동-2 (SH2) 도메인에 의한 포스포티로신 잔기에 결합할 수 있는 신호화 단백질에 대한 도킹자리로서 이용한다(Cooke, Cell 65 (1991) 281-291, Glaischenhaus, Cell 64 (1991) 511-520, Samelson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (1990) 4358-4362, Straus, Cell 70 (1992) 585-593, Songyang, Cell 72 (1993) 767-778, Songyang, Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 2777-2785, Isakov, J. Exp. Med. 181 (1995) 375-380). TCR-매개 신호화에서 제타-사슬의 필요성은 항원-특이 T 세포 히브리도마의 제타-결핍 돌연변이 유도체의 연구로 설명된다; 돌연변이 라인은 항원에 반응할 수 없고 단지 항-CD3 항원에 약하게 반응한다(Sussman, Cell 52 (1988) 85-95). TCR-복합체의 다른 사슬을 제안하는 항-CD3 항원 자극의 반응에서 활성의 유지가 제타의 부재를 보충할 수 있어도, 트랜스펙션에 의해 제타-사슬로 복원될 때 항원을 인식하고 또는 항-CD3 항체에 반응하는 능력을 다시 얻는 것을 보여주는 돌연변이 라인의 연구는 신호 형질 도입에서 제타-사슬에 대한 중요한 역할을 명백히 보여준다(Weissman, EMBO J. 8 (1989) 3651-3656). 단일 배치에 따라, 제타 사슬은 우세한 TCR 신호화 구조로 작용하고, 삼중의 ITAM은 본래 TCR 신호 증폭을 촉진하는데 이용된다.
일반적으로 특히 신호형질도입을 매개한 제타-사슬과 TCR-복합체는 성숙한 T-림프구의 활성화와 계획된 세포 죽음 (세포자멸사) 둘 다에 포함된다. 제타-사슬 세포질 꼬리가 관련 없는 수용체에 부착되는 실험은 상기 키메릭 수용체를 발현하는 세포계가 IL-2 방출 및 다른 활성화 매개 변수의 상향조정과 함께 항체가교에 반응할 수 있다는 것을 보였다(Irving, Cell 64 (1991) 891-901). 또한, 키메릭 제타-사슬 유도체를 발현하는 세포 독성의 T 림프구(CTL)는 키메릭 제타-수용체에 의해 인식되는 표면 분자를 키우는 표적세포를 특이적으로 분해하는 것을 보인다(Romeo, Cell 64 (1991) 1037-1046, Romeo, Cell 68 (1992) 889-897). 그러나, 이것은 활성화된 T 세포의 경우에만 사실로 증명되는데, 키메릭 제타-사슬 분자를 발현하는 휴지의 T 림프구는 활성화할 수도 없거나, 또는 상기 키메릭 수용체에 의해 자극되어졌을 때 표적세포에 대해 세포 독성도 나타내지 않기 때문이고(Brocker, J. Exp. Med. 181 (1995) 1653-1659), 생화학적 분석에 따르면 내인성 TCR-서브유닛과 결합되어 있지 않으므로 물리적으로 독립적인 신호화 분자처럼 작용한다(Shinkai, Immunity 2 (1995) 401-411). 이 자료는 키메릭 제타-사슬 유도체가 휴지의 T세포에서가 아닌 단지 활성화된 T세포에서, 완벽한 TCR-복합체를 치환할 수 있다는 것을 나타낸다. 세포가 활성화되고 증식될 때 강한 TCR 재진입이 발생하면 성숙한 T 림프구의 TCR-매개된 세포자멸사가 유발된다(Lenardo, Nature 353 (1991) 858-861, Russell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (1991) 2151-2157, Critchfield, Cell. Immunol. 160 (1995) 71-78). 성숙한 T 세포의 죽음은 주위의 면역 항상성과 내성에 중요한 역할을 한다. 최근 실험은 제타-사슬이 TCR의 진입을 통한 T-세포 세포자멸사의 효과적인 유도가 요구된다는 것과 CD3의 신호화 영역이 TCR-매개된 세포자멸사에 대한 단지 마이너(CD3ε)효과, 또는 (CD3γ 및 δ) 효과를 내지 않는다는 것을 보여준다(Combadiere, J. Exp. Med. 183 (1996) 2109-2117). 또한, 세개의 제타-사슬 ITAM은 우수한 효과를 가진 대부분의 N-말단 하나와 CD3ε의 낮은 기여와 비슷한 C-말단 ITAM 및 세포자멸사 유도를 완벽하게 할 수 없는 중간 하나와 함께 T-세포 세포자멸사의 유도에 다르게 기여한다.
T-세포 발달은 본래 흉선에서 일어나고, 여기에서 T 세포 전구물질은 태아의 간 또는 성인 척수에서 나온다. 흉선으로 이동시에, 상기 조기 T 세포 전구물질은 세개의 음성 (TN: TCR-CD4-CD8-)이지만(Shortman, Annu. Rev. Immunol. 14(1996)29-47), 이미 제타 사슬 및 CD3 사슬을 발현한다(Wiest, J. Exp. Med. 180 (1994) 1375-1382, Wilson, Int. Immunol. 7 (1995) 1659-1664). 흉선의 유도성 환경에서, 이들은 CD4+CD8+이중 양성 (DP)의 흉선세포로 분화하기 전에 발달 단계시리즈로 이동한다(Godfrey, Immunol. Today 14 (1993) 547-553). 그로부터 유도된 대부분의 미성숙 CD44+CD25--TN-흉선세포 및 CD44+CD25+-TN-흉선세포는 TCR-유전자의 생식계열 구조를 여전히 보여준다. 그러나, 표면 표현형 CD44-/IoCD25+을 특징으로 하는 다음 성숙 단계의 TN-흉선세포는 TCRβ 유전자좌를 재배치하기 시작한다. 비록 발현되지만, 이 단계에서 제타 사슬은 아마 흉선세포 성숙에 필요하지 않을 것이다Crompton, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 1903-1907). TN-흉선세포의 다음 성숙 단계는 CD44-/IoCD25+에서 CD44-CD25-로 표현형 전환하는 것을 특징으로 하지만, 제타-사슬의 부재하에서 차단될 수 있으며(Crompton, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 1903-1907), TCRβ 사슬의 재배열과 발현을 필요로 한다(Kishi, EMBO J. 10(1991) 93-100, Mombaerts, Nature 360 (1992) 225-231, Shinkai, Science 259 (1993) 822-825). TCRβ 사슬은 pre-Tα (pTα)로 일컬어지는 불변 사슬과 결합되고(Groettrup, Cell 75 (1993) 283-294), 이는 재배열되지 않은 TCRα 사슬을 치환하여 제타-사슬 및 CD3-사슬과 결합된 pre-TCR을 형성할 것이다(Van Oers, J. Exp. Med. 182 (1995) 1585-1590). pre-TCR에 의해 매개된 신호의 결과로서, 흉선세포는 DP 단계로 발달을 진행시킨다. 상기 단계에서, 흉선세포는 TCRα 유전자의 재배열을 개시하고, pTα 발현을 중지시키고, 낮은 수준의 TCR 복합체를 발현하기 시작하고, 성숙한 T-림프구에서 TCR-복합체의 다중 사슬 조성물과 비슷하다(Von Boehmer, Ann. N. Y. Acad. Sci. 766(1995) 52-61, Robey, Annu. Rev. Immunol.12(1994)265-705). CD44-CD25--TN 흉선세포의 발달 및 이어지는 DP 흉선세포의 발달이 제타-사슬의 부재하에서 억제되고, 기능성 ITAMs 없이 신호화 결함 돌연변이 제타-사슬의 발현에 의해 복구될 수 있기 때문에, pre-TCR 표면 발현의 촉진과 연관된 제타-사슬의 중요성은 신호화 포텐셜에 관한 것 이상이다(Shores, J Immunol 159 (1997) 222-230, Shores, Science 266 (1994) 1047-1050).
DP 흉선세포는 TCRs의 특이성을 기초로 하여 선택하기 위해 추가로 사용된다. 자기-MHC 분자에 대한 사소한 특이성을 갖는 TCRs를 발현하고, MHC-단백질에 의해 결합된 펩티드와 관련없는 흉선세포는 흉선 안에서 죽는데, 추측컨데 그들의 TCR을 통한 생존 신호를 받지 못하기 때문이다(Robey, Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 265-705, Jameson, Annu. Rev. Immunol. 13 (1995) 93-126). 반대로, 적당한 리간드 특이성을 가진 TCRs을 발현하는 흉선세포는 생존하여, 높은 수준의 TCR-발현을 보이는 CD4+- 또는 CD8+-단일 양성 (SP) T-세포로 성숙한다. 그러나, 자가반응 또는 잠재적으로 자가반응하는 TCRs을 발현하는 흉선세포는 결실된다(Robey, Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 265-705, Jameson, Annu. Rev. Immunol. 13 (1995) 93-126). DP 흉선세포상에 TCR을 진입시키면 두개의 상당히 다른 세포 운명, 즉 생존 후 추가성숙 (긍정적 선택) 또는 세포자멸사에 의한 죽음 (부정적 선택)을 이끈다.
비록 제타-사슬 ITAMs가 흉선에서 성숙한 SP T-세포의 발달과 MHC-제한된 선택에 필요하지 않아도, 그들은 흉선세포 선택동안 TCR-진입에 의해 생성된 신호화반응을 증폭시킴으로 T-세포 레퍼토리의 구체화에 기여하는 것 같다.
사실, 최근 연구 결과는 비록 개별적 ITAM이 특히 필요하지 않아도, TCR복합체 안의 제타-사슬 ITAMs의 수와 긍정적 및 부정적 선택 둘 다의 효율사이의 직접적인 관계가 있다는 것을 밝혔다(Shores, J. Exp. Med. 185 (1997) 893-900). 만약 긍적적, 부정적 선택이 TCR 신호화 경계에 의해 본래 기술되어지고, 만약 흉선세포의 발달운명을 결정하는데 중요한 다른 친화도의 리간드에 대한 신호화 반응의 양이 원래 제타-사슬의 삼중된 ITAMs 또는 제타-사슬 돌연변이주내 ITAMs의 감소한 수에 의해 각각 다소 증가된다면, 상기 결과는 기대될 수 있다.
원래 제타-사슬의 존재에 긍정적으로 선택된 흉선세포의 레퍼토리는 신호화 부족 제타 사슬 유도체의 존재하에서 선택된 것과 현저하게 다르고, 후자의 레퍼토리는 그렇지 않으면 다르게 부정적으로 선택된 T-세포를 포함하는 것이 기대된다(Shores, Current Opinion in Immunology 9 (1997) 380-389).
NK 세포는 말초 혈액 림프구(PBT)의 10 내지 15%을 제조된 큰 알갱이의 림프구이다. 이들은 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제한되지 않는 방법으로 암세포 및 어떤 바이러스 감염된 세포를 죽일 수 있다(Trinchieri, Adv. Immunol. 47 (1989) 187-376, Ritz, Adv. Immunol. (1988) 181-211). 상기 세포분해성 효과기 기능은 민감화 또는 부속 세포에 의한 항원 제공을 필요로 하지 않는다. 이 특징은 NK-세포가 항원-특이 면역 반응을 알기 전에 선천적 숙주 방어를 실시할 수 있게 한다. NK-세포는 두가지 형태의 세포융해 활성을 실시하는 것으로 공지되어 있는데, 자연적인 세포독성 및 또한 자연적인 세포 독성에 대해 내성이 있는 표적 세포 저항을 죽이는 ADCC (항체의존성 세포독성)이다.
클론형태의 TCR의 진입을 통해 생성된 활성 신호에 의해 유발된 T-세포의 세포독성 활성과 다르게, NK-세포의 자연 세포 독성은 본래 억제하는 신호에 의해 규정된다(Yokoyama, J. Exp. Med. 186(1997) 1803-1808). 표적세포 MHC 구분 Ⅰ에 특히 결합함으로 억제하는 NK-세포 수용체의 진입은 자연 세포 독성의 억제를 이끌고, 표적세포 MHC 구분 Ⅰ 발현의 부재하에서 자유롭고 이렇게 자연사의 활성이 허용된다. NK-세포 수용체는 티로신 인산화가 수용체 진입에 의해 유발된 후 억제 신호를 매개하는 상호세포질의 면역수용체 티로신-기초의 억제 모티브(ITIM, 일치 서열 I/V-X-Y-X-X-L)를 포함한다(Muta, Nature 368 (1994) 70-73, Thomas, J. Exp. Med. 181 (1995) 1953-1956).
ADCC는 낮은 친화도 IgG Fc-수용체 FcγRⅢA에 의해 매개되고 항체-코팅된 표적세포의 NK-세포를 배양함으로 인 비트로(in vitro)로 보여질 수 있다. 리간드 결합과 FcγRⅢA의 가교는 세포 융해 활성, 표면 활성 분자의 상기-규정제 및 사이토킨 분비의 결과를 낳는 NK-세포 활성을 유발한다(Chehimi, J. Exp. Med. 75 (1992) 789, Ravetch, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457). FcγRⅢA는 수용체 조립 및 신호 변환 둘 다에 반응하는 수용체 글리코단백질 CD16 및 두개의 막-걸친 사슬, 감마 및 제타의 막횡단 리간드-결합을 포함한 복합체로 발현된다(Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (1990) 2274-2278, Ravetch, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457). 감마 사슬은 처음에는 IgE에 대한 고친화도 수용체의 서브유닛으로 확인되었고 제타- 및 에타-사슬과 함께 신호 도입 분자들 모두의 같은 계열에속한다. NK-세포상에 FcγRⅢA이 진입시에 티로신 인산화는 이특이적인 FcγRⅢA-복합체에 대한 단백질을 함유하는 특이적인 Src 상동 (SH)2 도메인의 보강을 포함한 신호 도입 현상을 유도하는 제타- 및 감마-사슬의 ITAM내에서 일어난다. 최근 입증되는 연구에 의하면, FcγRⅢA-매개된 NK-세포 활성화는 NK-세포로 트랜스펙션된 키메릭 제타-사슬 수용체의 진입에 의해 모방되는 것 같고, 따라서 T-세포에서 유사한 접근방법과 닮는다 (Tran, J. Immunol. 155 (1995) 1000-1009).
온전한 세포의 표면에서 인간 제타 사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응/인식하는 항체들이 예를 들면 보고된 성공적 실험이 없다고 기록된 종양 치료에서, T 세포 또는 NK-세포의 인공 신호 도입과 같이 다양한 목적에 요구된다는 것이 상기로부터 명확해진다. 이 필요를 실행할 항체를 제조하는데 있어서 성공에 필요한 것은 본래 이 도메인의 더 짧은 길이(9 아미노산)이어야하고, 가능하게 T-세포상에 T-세포 수용체 및 CD3 복합체 또는 NK-세포상에 IgG-Fc-수용체를 가진 제타-사슬과 연관된 결합에서 가능하다.
본 발명에 내재하는 기술적 문제는 상기-확인된 필요성에 성공적으로 적용될 기구를 제공하는 것이다. 이 기술적 문제의 해결책은 청구범위에서 특징되어진 구체화를 제공함으로 얻어진다.
따라서, 본 발명은 항체의 가변영역의 적어도 하나의 상보적 결정영역(CDR)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 상기 항체는 온전한 세포의 표면상에서 인간 제타-사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응하고, 상기 항체는 주르캇 세포 및 뒤이어 담체 분자 및 쥐 제타-사슬의 11개의 N-말단 아미노산을 포함한 펩티드를 포함하는 결합체에 의해 쥐를 면역화함으로써 얻어질 수 있다.
상기 온전한 세포는 바람직하게는 T-세포 또는 NK-세포 또는 전구물질이지만, 또한 인공적으로 트랜스펙션된 세포일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 CDR이 포함된 항체는 주르캇 (ATCC TIB-152) 세포에의해 쥐를 프라이밍하고, 담체 분자와 상기 펩티드를 포함한 결합체에 의해 부스팅함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 결합체를 쥐에 주사하는 것과 같은 선택적 면역화 계획은 성공적일 수 있다고 또한 고찰된다. 항체 KLH가 담체로 사용되어져 온 반면에, 다른 담체가 성공적으로 사용된다. 다른 담체의 예는 BSA이다.
제타-사슬 분자는 T-세포 및 TCR과 CD3, 또는 Fcγ-RⅢA 또는 가능하게 자유 흐름 호모- 또는 헤테로이량체와 결합된 NK-세포 및 T-세포의 표면에서 일어나기 때문에, 상기 상호반응은 상기 형태의 제타 또는 상기 전부와 될 수도 있다. 비슷하게, 항체는 단일 제타 사슬 또는 특히 이형 구조와 상호반응할 수도 있다. 에타는 제타처럼 인간과 같은 세포외 도메인을 갖기 때문에, 본 발명의 항체는 또한 제타 사슬과 같은 형태 및/또는 관계에서 에타를 인식한다. 또한, 항체는 또한 쥐 및 마우스의 제타/에타-사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응할 것이다.
본 발명의 항체의 특히 유리한 특징은 T-세포 및 NK-세포 둘 다 뿐만 아니라 전구물질에서 제타/에타를 인식한다는 사실이다. 제타 사슬의 구조 및 결합에 대해 공지된 것의 관점에서, 상기 항체의 발달은 정말로 놀랍게 검토되어야만 한다.매우 짧은 에피토프, 9개의 아미노산 펩티드는 세포막에 매우 가까이 위치된다. 세포 표면상 다중분자 단백질 복합체와의 밀접한 구조적 및 공간적 관계는 상기 에피토프가 또한 항체로서 큰 구조에 입체적으로 접근하기 어렵다는 것을 가능하게 보여준다. 또한, T-림프구와 NK-세포의 다른 다분자 단백질 복합체의 제타-사슬과 관련하여, T-세포의 항체 분자에 뜻밖에 접근할 수 있는 세포외 제타 사슬 에피토프가 NK-세포에서 그것들이 확인되는 것이 불가능하다. 또한, 인간, 쥐 및 마우스에서 서열 확인에 있어서, 세포외 제타-사슬의 도메인은 세 종 모두에서 자기-항원을 나타내고 마우스와 쥐를 면역화함으로써 그에 대한 특별한 항체를 얻는 것이 쉽지 않게 한다.
매우 놀랍게 간주되어야 할 상기 항체의 발달에 대한 상기 언급은 상기 항체를 얻는 대부분의 약속한 방법이 실패했다는 사실로 확인된다. 즉, 펩티드-KLH 결합체로 면역화된 마우스의 비장 세포의 RNA에서 무성생식한 조합한 항체 라이브러리는 가는 박테리아파지에서 보이고 펩티드-BSA 결합체, 정제된 CD8+-T-림프구 및 정제된 NK-세포에서 선택적으로 씻어냄으로 인 비트로에서 선별된다. 비록 펩티드-BSA 결합체와 반응하는 Fab-항원 단편을 나타내는 박테리아파지 클론의 풍부함이 CD8+-T-림프구에서 마지막 패닝 단계(panning step)에서 얻어지고, 그것들 대부분은 정제된 NK-세포에서 뒤이어지는 패닝 단계에서 잃고, T-림프구 및 NK-세포의 보통 세포외 제타-사슬 에피토프를 인식하는 레퍼토리안에서 항체의 부족을 나타낸다. 펩티드-BSA 결합체와 반응하는 많은 수의 클론을 실험함으로써 확신되고, T-림프구 및 NK-세포에서 교차반응 결합하는 활성을 확인할 수 없다.
단지 본 발명이 상기 항체의 생성에 시대에 뒤떨어지고 거추장스런 방법이 적용되었을 때, 결국은 성공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함했다: 제타-사슬의 11개의 첫 N-말단 아미노산을 포함한 펩티드는 합성되고 시스테인 11에서 SH-기를 통해 KLH에 결합된다. 주르캇 세포로 미리 면역화된 쥐 및 마우스는 상기 결합체에 면역화되고, 개별적으로 얻어진 히브리도마 세포계는 BSA에 결합된 11-아미노산 펩티드로 구성된 다른 결합체에 대해 선별된다. 150 설균목 및 45 쥐 히브리도마 세포계는 인식된 펩티드-BSA 결합체를 얻어졌고 그 중 단지 하나의 쥐 IgM 항체는 흘림세포계측에 의해 결정되는 T-림프구 및 NK-세포 둘다 결합 활성을 나타낸다는 것이 확인될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그와 유사한 면역글로불린 사슬은 당분야에 공지된 종래의 기술, 예를 들면 당 분야에 공지된 하나 또는 조합에 의한 아미노산 결실, 삽입, 치환, 첨가 및/또는 재조합 및/또는 수정을 사용하여 수정될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열을 기초로 하는 DNA 서열에서 상기 수정을 사용하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다; 예를 들면, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.를 참조한다. 항체는 또한 키메릭 항체일 수도 있다.
에피토프의 인식은 종종 단일 CDR, 바람직하게 H 사슬의 CDR에 의해 결정된다는 것이 당분야에 잘 공지되어 있기 때문에 상기 개요적인 계획에 따라 얻을 수 있는 항체의 CDR 하나가 적어도 약하지만 중요한 결합에 기대하는 것이 중요하다고생각된다. 이것은 바람직하게 상기 언급된 방법에 의해 실제로 얻을 수 있는 항체에 대해 진실을 말한다. 그러나, 바람직하게, 상기 핵산 분자는 상기 가변영역의 적어도 두개의 CDR에 인코딩한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 바람직한 구체화에서, 상기 핵산 분자는 상기 가변영역의 세가지 CDRs를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 더 바람직한 구체화는 상기 핵산 서열이 VH사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 핵산 분자의 바람직한 구체화에서, 상기 핵산 서열이 VL사슬을 인코딩한다.
본 발명의 핵산 분자는 가령, RNA 분자 또는 DNA 분자일 수도 있다. 첨가된 바람직한 구체화에서 본 발명의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 특히 바람직한 것은 합성 또는 반합성 DNA 분자이다.
본 발명의 핵산 분자의 더 좋은 구체화에서 상기 CDR은 하기 뉴클레오티드 서열 중 하나를 갖는다:
(a) 서열번호 1
(b) 서열번호 3
(c) 서열번호 5
(d) 서열번호 7
(e) 서열번호 9
(f) 서열번호 11
본 발명의 핵산 분자의 특히 바람직한 구체화에서 상기 VH-사슬은 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명의 핵산 분자의 특히 바람직한 구체화에서 상기 VL-사슬은 서열번호 15의 뉴크레오티드 서열을 갖거나 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명은 또한 청구항 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 관한 것이고, 상기 CDR은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 아미노산 서열중 하나를 인코딩한다.
본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함한 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는 적당한 숙주 세포 안에서 및 적당한 조건하에서 상기 벡터를 선별하기 위한 라벨된 유전자와 같은 유전자를 포함할 수도 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 세포에서 발현을 허용하는 제어 서열 발현에 작용하게 결합된다.
상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 해독가능한 mRNA로 폴리뉴클레오티드 전사를 포함한다. 진핵 세포에서 바람직하게 포유동물 세포에서 발현을 확실하게 하는 조절요소는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그것들은 보통 전사의 시작을 확신하는 조절서열 및 선택적으로 전사의 종결과 전사물을 안정화하는 폴리-A 신호를 포함한다. 첨가된 조절요소는 전사 뿐만 아니라 해독 향상, 및/또는 자연적-결합된 또는 이종 유도 촉진제 영역을 포함할 수도 있다. 이 점에서, 당업자는 L 및/또는 H 사슬의 적어도 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 둘 다의 면역 글로불린 사슬 또는 단지 하나의 가변영역을 인코딩할 수도 있다는 것을 쉽게 평가할 것이다. 또한, 상기 폴리뉴클레티드는 같은 촉진제의 제어하에 있을 수도 있고 또는 분리하여 발현에 대해 제어 될 수도 있다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절요소는 예를 들면, E.coli에서 PL, lac, trp 또는 tac 촉진제를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서 발현 허용하는 조절요소의 예는 효소의 AOX1 또는 GAL1 촉진제 또는 포유류의 CMV-, SV40-, RSV-촉진제 (Rous sarcoma virus), CMV-강화제, SV40-강화제 또는 글로빈 인트론 및 다른 동물 세포이다. 상기 조절요소 전사의 시작에 반응하는 부가의 요소들은 또한 전사 종결 신호 가령, SV40-폴리-A 사이트 또는 tk-폴리-A 사이트, 폴리뉴클레오티드의 다운스트림을 포함한다. 또한, 세포 구역에 폴리펩티드를 인도하거나 매개물로 분비할 수 있는 리더 서열을 사용한 발현 시스템의 의존은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열을 코딩하는데 첨가될 수도 있고 당분야에 잘 공지되어 있다. 리더 서열은 해독, 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게, 해독된 단백질의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열, 주변세포질 공간 또는 세포외 매개체의 부분으로 조립된다. 선택적으로, 이종 유도된 서열은 요구된 특징 가령, 안정화 또는 발현된 재조합 생성물의 간결한 정제를 알리는 C- 또는 N-말단 확인 펩티드를 포함한 혼합 단백질을 인코딩할 수 있다. 이러한 관계에 있어서, 적당한 발현 벡터는 가령, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1(Pharmacia), pCDM8,pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), 또는 pSPORT1(GIBCO BRL)로 당분야에서 공지되어 있다.
바람직하게, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 변형하거나 트랜스펙션할 수 있는 벡터에서 원핵의 촉진제 시스템일 수 있지만, 원핵의 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수도 있다. 일단 벡터가 적당한 숙주에 포함되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현에 대해 적당한 조건하에서 유지되고, 요구되듯이, 면역 글로불린 L 사슬, H 사슬, L/H 사슬 이량체 또는 온전한 항체, 결합하는 단편 또는 다른 면역 글로불린 형태의 수집 및 정제가 뒤따른다; Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)을 참조한다.
본 발명의 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 박테리오파지는 바람직하게 발현 벡터이다. 레트로바이러스, 백신 바이러스, 아데노-결합된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 보빈 파필로마 바이러스 같은 바이러스에서 유도된 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드의 운반 또는 표적세포 집단에서 본 발명의 벡터로 사용될 수도 있다. 당업자에게 공지된 방법은 제조합 바이러스 벡터를 만들기 위해 사용될 수 있다; 예를 들면, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)에서 서술한 기술을 참조한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 벡터는 표적세포에 운반을 위해 리포솜으로 다시 만들어 질 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터 (예를 들면, 서열 및 발현제어 서열을 인코딩하는 면역 글로불린 사슬의 H 및/또는 L 가변영역)는 세포 숙주의 형태에 의존을 다양하게 하는 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 트랜스펙션이 원핵 세포에 대해 흔히 이용되고, 상기 인산염 칼슘 처리 또는 전자비율이 다른 세포 숙주를 위해 사용될 수도 있다; Sambrook, supra를 참조한다.
본 발명은 추가로 본 발명 벡터로 형성되거나 또는 트랜스펙션된 숙주에 관한 것이다.
상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수도 있다. 숙주 세포에서 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈으로 통합되거나 또는 염색체이외로 유지되어질 수도 있다.
숙주세포는 어떤 원핵 또는 진핵 세포, 가령 박테리아, 곤충, 균류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 바람직한 균류 세포는 예를 들면, 사카로마이세스 속, 특히 S. 세레비지애 종이다. "원핵"이라는 용어는 본 발명의 항체의 발현 또는 면역 글로불린 사슬과 일치한 것에 대한 DNA 또는 RNA 분자로 형성될 수 있거나 또는 트랜스펙션될 수 있는 모든 박테리아를 포함하여 의미한다. 원핵 숙주는 그램 음성 뿐만 아니라 그램 양성 박테리아 가령, 예를 들면, E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens 및 Bacillus subtilis를 포함할 수도 있다. 용어 "진핵"은 효모, 더 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는 포유류 세포를 포함하여 의미한다. 재조합 생성 과정에서 적용된 숙주 의존에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 (폴리)펩티드/항체 또는 면역 글로불린 사슬이 글리코실화될 수도 있거나 안 될 수도 있다. 발명의 항체 또는 면역 글로불린 사슬과 일치하는 것은 또한 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다. 발명의 폴리뉴클레오티드는 당분야의 일반적 기술자에 흔히 알려진 기술을 사용하여 숙주를 형성하거나 또는 트랜스펙션하는데 사용될 수도 있다. 또한, 혼합되고, 사용할 수 있게 결합된 유전자를 제조하고 그것들을 예를 들면, 포유류 세포 및 박테리아 같은 것을 발현하는 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 유전자 구조 및 기술된 방법은 본 발명의 (폴리)펩티드/항체발현 또는 진핵 또는 원핵 숙주에서 면역 글로불린 사슬과 일치하는 것의 발현에 대해 이용될 수 있다. 일반적으로, 삽입된 폴리뉴클레오티드의 효과있는 전사를 이용한 촉진제 서열을 포함한 발현 벡터는 숙주와 결합되어 사용된다. 전형적으로 발현 벡터는 복사, 촉진제, 및 종결제의 원본 뿐만 아니라 형성된 세포의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특별한 유전자를 포함한다. 또한, 발명의 세포를 포함한 형질 전환 동물, 바람직하게 본 발명의 세포를 포함하는 포유류는 본 발명의 (폴리)펩티드의 대규모 크기로 제조하는데 사용될 수도 있다.
변형된 숙주는 발효기에서 배양될 수 있고 최선의 세포 성장을 얻을 수 있는 당분야에 공지된 기술에 따라 배양될 수 있다. 일단 발현되면, 전체 (폴리)펩티드/항체, 그것들의 이량체, 개별적 L 및 H 사슬, 또는 본 발명의 다른 면역 글로불린 형태가 당분야의 기본적인 과정에 따라 정제될 수 있고, 황산암모늄 침전, 친화력 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기이동 등을 포함한다; 보라,Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). 항체 또는 본 발명의 면역 글로불린 사슬과 일치하는 것은 성장 매개체, 세포 여액, 또는 세포막 단편으로부터 격리된다. 예를 들면, 미생물로 발현된 항체 또는 발명의 면역 글로불린 사슬의 분리 및 정제는 예를 들면, 본 발명의 항체의 변함없는 영역에 대해서 가령 방향지워진 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 포함한 예를 들면, 예비 크로마토그래피 분리 및 면역학 분리의 종래 방법에 의해서이다. 발명의 항체는 예를 들면, 약 목표제 및 이미지 적용의 다른 성분과 결합할 수 있다는 것이 당업자에 명백할 것이다. 상기 결합은 부속 영역의 (폴리)펩티드/항체 또는 항원의 발현 또는 결합 생성물이 DNA 수준에서 본 발명의 (폴리)펩티드/항원으로 지도된 후에 화학적으로 처리될 수도 있다. DNA가 적당한 숙주 시스템에서 발현되고, 필요하다면 발현된 단백질이 수집되고 재활력을 갖는다.
본 발명은 추가로 적당한 조건하에서 (폴리)펩티드를 배양으로부터 배제시키고 본 발명의 숙주 배양을 포함하는 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩된 (폴리)펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 숙주 세포의 배양은, 일반적으로, 상기에 기술되고 출간된 프로토콜에 따라 영향을 받을 수도 있다. (폴리)펩티드의 격리에 대해 똑같이 들어맞는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산분자에 의해 인코딩되고 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 (폴리)펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 (폴리)펩티드를 포함한 항체 또는 단편 또는 그 유도체에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 μ, γ, α, κ, 또는 λ 사슬같이 적당한 불변 영역의 결합에서 완벽한 상기-참조된 VH및 VL사슬 둘 다를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 단편 또는 유도체의 특별한 적용은 하기를 포함한다:
성숙한 T-림프구는 기능적으로 항체 또는 항체 유도체의 결과가 특히 제타-사슬 또는 항-제타 사슬 항체 또는 항체 단편/유도체에 의해 T-세포 표면에 목표된 생물학적 또는 약리학적 활동 분자의 장점에 의해 결합되듯이 구조적 또는 기능적 TCR-방어에 의해 작용될 수도 있다. 또한, 흉선세포의 발달 및 선택은 항체 또는 항체 단편/유도체의 결과가 특히 제타 사슬에 결합되듯이 구조적 또는 기능적 TCR- 또는 pre-TCR-방어에 의해 영향을 받을 수도 있다.
제타 사슬이 대부분의 미성숙 흉선세포로부터 성숙한 T-림프구의 전체 T-세포 발달 동안 일치하게 발현될 때 분자는 T-세포 종양의 넓은 범위를 목표로 하는데 사용된다.
NK-세포는 또한 항체 또는 항체 유도체의 결과가 특히 제타-사슬 또는 항-제타 사슬 항체 또는 항체 단편 또는 유도체에 의해 NK-세포에 목표된 생물학적 또는 약리학적 활성 분자의 장점에 의해 결합되듯이 구조적 또는 기능적 FcγRⅢA-방어에 의해 기능적으로 영향을 받는다.
항체 또는 단편 또는 유도체는, 내부의 다른 경우에, (반)합성 또는 고전적으로 발달된 단일클론항체가다. 단편은 Fab' 또는 F(ab)2단편을 포함한다.
본 발명의 항체는 추가된 영역을 포함하고, 상기 영역은 공유 또는 non-공유결합에 의해 결합된다. 결합은 당 분야에 공지되고, 상기 기술된 방법에 의해서 유전자 혼합에 기초할 수 있고 또는 예를 들면, 가령, WO 94/04686에 기술된 것 같이 화학적 교차-결합에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 항체를 포함한 혼합 단백질에 존재하는 첨가된 영역은 바람직하게 깨지기 쉬운 결합체, 우월하게 폴리펩티드 결합체에 의해 결합되고, 상기 폴리펩티드 결합체는 상기 추가된 영역의 C-말단 끝과 본 발명의 항체의 N-말단 끝 사이의 충분한 간격의 또는 반대의 경우의 복수, 친수성, 펩티드-결합의 아미노산을 포함한다. 상기 기술된 혼합 단백질은 단백질분해효소에 대한 쪼개지는 결합체 또는 쪼개진 영역을 포함한다. 상기 공간 성분, 순서대로, 불용성 또는 가용성일 수 있고(Diener, et al., Science, 231:148, 1986) 목표 영역에서 약이 항원으로부터 자유롭게 할 수 있도록 선택될 수 있다. 면역 치료용 본 발명의 항체에 결합될 수 있는 치료제의 예는 약, 방사성 동위 원소, 렉틴(lectin) 및 독소이다. 본 발명의 항체와 결합될 수 있는 약은 미토미신(mitomycin) C, 다우노루비신(daunorubicin) 및 빈블라스틴(vinblastine)과 같은 약에 구분하여 간주되는 화합물을 포함한다.
예를 들면, 면역 치료용 본 발명의 방사성 동위 원소로 결합한 항체의 사용에 있어서, 어떤 동위 원소는 백혈구 분포 뿐만 아니라 안정성 및 방출과 같은 요소에 의존하는 다른 것들보다 더 바람직할 수도 있다. 자동 면역 반응에 의존할 때 어떤 방출물질은 다른 것에 바람직할 수도 있다. 일반적으로, α와 β 조각-방출 방사선 동위원소는 면역치료에 바람직하다. 바람직한 것은 짧은 범위, 높은 에너지 α 방출물질 가령212Bi이다. 치료 목적용 본 발명의 항체, 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 방사성 동위 원소의 예는125I,131I,90Y,67Cu,212Bi,212At,211Pb,47Sc,109Pd 및181Re이다. 본 발명의 항체, 항원 또는 에피토프에 결합될 수 있고 또는 쉽게 확인될 수 있는 다른 치료제가 엑스 비보(ex vivo)뿐만 아니라 인 비보(in vivo) 치료 프로토콜에서 당분야의 일반적 기술자에 의해 공지된다. 어디서나 당분야의 적당한 기술자는 상기 기술된 항체, 항원 또는 에피토프 중 어느 하나를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질같은 물질 자체를 대신하는 일치하는 벡터를 사용할 수도 있다.
바람직한 구체화에서, 본 발명의 항체는 단일클론항체가다.
본 발명의 다른 바람직한 구체화에서 본 발명의 항체는 이특이성 항체이다.
본 발명의 이특이성 항체의 바람직한 구체화에서, 첫번째 특이성은 온전한 세포의 표면에서 인간 제타-사슬의 세포외 도메인에 대해서이고 두번째 특이성은 T-림프구, 자연사 세포 또는 그의 전구물질의 표면에서 선택적으로 다른 분자에 대해서이다.
본 발명의 이특이성 항체는 같은 세포 또는 다른 세포에 위치될 수도 있는 상기-참조된 목표에 결합될 수도 있다. 상기 다른 세포는 예를 들면 같은 형태의 두개의 다른 T-림프구 또는 T-림프구와 자연사 세포 또는 개별적으로 상기의 전구물질들이다.
본 발명의 이특이성 항체의 또 다른 바람직한 구체화에서 첫번째 특이성은온전한 세포의 표면에 인간 제타-사슬의 세포외 도메인에 대해서이고 두번째 특이성은 다른 세포, 바람직하게 T-세포, NK-세포 또는 그의 전구물질과 다른 세포의 표면에 다른 분자에 대해서이다. 바람직하게 상기 분자는 항원, 항원과 결합된 종양 또는 항원 발현 세포 (APCs), 가장 바람직하게 수지상 세포, 또는 non-APCs에서 표면 항원을 인코딩한 바이러스이다.
본 발명의 이특이성 항체의 바람직한 용도는 키메릭 제타-사슬 수용체로 트랜스펙션함으로 표적 세포에 T-림프구를 인도하는 대신 동시에 제타 사슬과 이특이성 항체를 가진 표적 세포 표면 항원에 목표화함으로 표적 세포에 대해 T-림프구를 재인도하는 것이다(Romeo, Cell 64 (1991) 1037-1046). 상기 이특이성 항체가 다른 TCR-서브유닛과 결합된 원 제타 사슬에 결합하기 때문에, 전체 TCR-복합체의 신호화 기계가 보충될 수도 있다. 반대로, 키메릭 제타-사슬 수용체는 내생 TCR-서브유닛과 결합되지 않고 단지 휴지의 T-세포를 활동시키는데 부적당하게 보이고 또는 세포자멸사에 대해 활성 유발에 관련한 T-림프구의 작용 상태의 불균형 수정을 일으킬 수 있는 제타-사슬의 격리된 신호화 영향을 보충할 수도 있다.
T-세포 재목표화의 바람직한 적용은 세포독성의 T-림프구의 세포 독성 활성으로 인도함으로 표적 세포의 융해를 포함한다. T-세포 재목표화의 또 다른 바람직한 적용은 충분한 costimulatory 신호를 제공하는 것을 수정하여온 항원 발현 세포 (APC) 또는 non-APCs에 표면 항원을 갖는 그들의 제타-사슬의 가교로 실험 받지 않은 T-림프구의 제조를 포함한다. 반면 실험 받지 않은 T 세포는 활력을 갖거나 또는 충분한 costimulatory 신호를 제공하지 않는 세포에 재목표하는 매개된 제타-사슬에 의해 격감될 수도 있다.
T-세포 재목표화의 또 다른 바람직한 적용은 말초 T-세포 내성을 매개하고 말초 면역 항상성에 기여하는 구조를 모사하는 TCR 재진입을 매개한 강한 제타 사슬에 의한 성숙한 활동 T-림프구에서 세포자멸사의 유발을 포함한다.
흉선세포의 사향초 선택은 긍정적 및 부정적 선택 과정에 직접 포함된 사향 항원 발현 세포에 표면 분자의 흉선세포에 제타 사슬의 가교를 통해 T-세포 발달 동안 이특이성 항체에 의해 수정되어질 수도 있다. 본 발명의 이특이성 항체의 추가된 바람직한 적용은 키메릭 제타-사슬 수용체의 트랜스펙션에 의한 표적 세포에 NK-세포를 인도하는 대신 이특이성 항체를 갖는 표적 세포 표면 항원과 제타-사슬을 동시에 목표화함으로 표적 세포에 대한 NK-세포의 세포 독성 활성의 재목표화를 포함한다(Tran, J. Immunol. 155 (1995) 1000-1009).
추가된 바람직한 실제화에서 본 발명의 항체 유도체는 scFv 사슬이다.
본 발명의 단일클론항체의 바람직한 실제화에서, 상기 항체는 IgM이다.
본 발명은 추가로 같은 또는 또 다른 세포의 표면 분자와 상호반응하는 자연 리간드 또는 그의 유도체, 본 발명의 (폴리)펩티드와 자연 수용체를 포함한 이특이성 수용체에 관한 것이다; 바람직하게 상기 수용체 또는 리간드는 CD4, CTLA-4, B7-1, B7-2, LFA-3, ICAM-1, -2, -3 또는 MIP-1α, MIP-1β, RANTES 또는 SDF-1와 같은 케모킨(chemokine)이다.
본 발명의 이특이성 항체의 적용은 본 발명의 이특이성 수용체를 또한 적용하는 것을 꾀하는 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 숙주, (폴리)펩티드, 본 발명의 항체 또는 단편 또는 그의 유도체 및/또는 이특이성 수용체를 포함한 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학조성물은 약리학적으로 만족하는 담체를 추가로 포함할 수도 있다. 적당한 약리 담체의 예는 당분야에 잘 공지되어 있고 인산염 완충 염 용액, 물, 가령 기름/물 에멀젼(emulsion)와 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습식제, 살균 용액 등이다. 상기 담체를 포함한 조성물은 잘 공지된 종래 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 약학조성물은 적당한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 적당한 조성물의 투여는 다른 방법, 예를 들면, 정맥, 복강, 피하, 근육, 국소 또는 피내의 투여 방법으로 할 수도 있다. 투여양 방법은 참여 의사와 임상 요소에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에 잘 공지된 것처럼, 어떤 한 환자에 대한 투여양은 환자의 신장, 체표면적, 나이, 투여된 특별한 화합물, 성, 투여 시간과 경로, 일반적 건강 및 현재 투여되고 있는 다른 약을 포함한 많은 요소에 의존한다. 전형적인 투여량은 예를 들면, 0.001 내지 1000㎍(또는 발현 또는 상기 범위에서 발현의 억제에 대해 핵산의) 범위일 수 있다; 그러나, 특히 전술한 요소들을 고려하는 상기 예의 범위 아래 또는 위 투여량은 특히 생각된다. 일반적으로, 약학조성물의 규정된 투여는 하루에 1 ㎍ 내지 10 ㎎ 단위의 범위이다. 만약 투여가 계속적인 주입이면, 개별적으로, 분당 체중의 킬로그램 당 1 ㎍ 내지 10 ㎎ 단위의 범위이다. 과정은 주기적 확인으로 감독될 수 있다. 투여량은 다양할 것이지만 DNA의 정맥 투여의 바람직한 양은 DNA 분자의 대략 106내지 1012카피이다. 본 발명의 조성물은 국소적 또는 체계적으로 투여될 수도 있다. 투여는 일반적으로 비경구적일 것이다, 예를 들면, 정맥; DNA는 또한 직접 목표 지점에 투여될 수도 있고, 예를 들면 내부 또는 외부 목표 지점에 biolistic 운반에 의해 또는 동맥에서 지점에 카테테르(catheter)에 의해서이다. 비경구적 투여에 대한 제조는 살균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용액의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유 및 에틸 올레산에스테르와 같은 주입하는 유기 에스테르이다. 수용성 담체는 염과 완충 매개를 포함하는 물, 알콜/수용성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구적 담체는 식염수, 링거 덱스트로즈(Ringer's dextrose), 덱스트로즈와 염화나트륨, 젓산 링거 또는 비휘발성 기름이다. 정맥 담체는 유체와 영양 보충액, 전해액 보충액 (링거 덱스트로즈를 기본으로 하는 것)등이다. 방부제와 다른 첨가제는 또한 예를 들면, 항미생물성, 산화방지제, 킬레이트제 및 불활성 기체등과 같이 존재한다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 추가로 약학조성물의 의도된 용도에 의존하는 인터류킨(interleukin) 또는 인터페론 같은 약물을 포함할 수도 있다.
본 발명의 다양한 폴리뉴클레오티드와 벡터는 홀로 또는 표준 벡터 및/또는 유전자 운반 시스템을 이용하는 조합으로 및 선택적으로 약리학적으로 허용하는 담체 또는 부형제를 함께 투여된다는 것이 본 발명에 의해 고찰된다. 투여에 뒤이은, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 안전하게 환자의 게놈을 통합한다. 반면,바이러스 벡터는 어떤 세포 또는 조직에 한정하여 사용되고 상기 세포에서 상존한다. 적당한 약리 담체와 부형제는 당분야에 잘 공지되어있다.
또한, 유전자 치료에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함한 본 발명의 약학조성물을 사용하는 것이 가능하다. 적당한 유전자 운반 시스템은 리포솜, 수용체-매개된 운반 시스템, 네이키드(naked) DNA 및 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합된 바이러스 같은 바이러스 벡터를 포함할 수도 있다; 또한 상기를 보라. 유전자 치료에 대한 몸의 특정한 지점에 핵산의 운반이 또한 윌리암(Williams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729)에 의해 기술된 것과 같은 biolistic 운반 시스템을 이용하여 수행될 수도 있다.
비록 동물 치료에 상기 기술된 방법과 용도가 포함되고, 약학조성물, 본 발명의 방법과 용도는 인간에게 바람직하게 적용될 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이고 상기 첫번째 특이성은 인간 제타-사슬의 세포외 도메인에 대해서이고 두번째 특이성은 자기 면역 질병, 면역 결핍, T-세포 종양, 전염병의 치료 또는 예방에 대해서 또는 장기 이식 후 이식 거부반응을 피하기 위해 특히 면역 반응의 억제에 대해서 약학조성물의 제조를 위해 T-림프구, 자연사 세포 또는 그의 전구물질 표면의 다른 분자에 대해서이다. 표적세포 (예를 들면, 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포)의 제거 후에 제타 사슬의 세포외 목표화함으로 T-세포계의 관여한 (보통의 또는 유해한) 세포의 본 발명에서 기술한 방법은 치료로 면역 반응을 강화 또는 억제하는 것 및/또는 자기 면역질병, 면역결핍 또는 T-세포 종양에 관한 T-세포 질환에 영향을 주는 것에 사용될 수도 있다. 제타- (및 에타-) 사슬의 세포외 목표화에 기초한 면역 억제는 이식 후 이식 거부반응을 예방하기 위해 바람직하게 이용될 수도 있다.
T 세포 발달과 제타 사슬의 세포외 목표화에 의한 흉선세포 선택 동안 신호 변환 수정의 본 발명에서 기술된 방법은 유리한 면역 반응 예를 들면, 전염병, 종양 및 면역 결핍의 경우를 강화하기 위해 또는 불리한 면역 반응 예를 들면, 자기 면역 질병 또는 이식 후 이식 거부를 억제하기 위해 치료로 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이고 상기 첫 특이성은 인간 제타-사슬의 세포외 도메인을 위한 것이고 두번째 특이성은 종양, 바이러스 감염 및 다른 전염병의 치료 또는 예방의 약학조성물의 제조에 대한 다른 세포의 표면에 다른 분자를 위한 것이다.
본 발명은 또한 NK-세포 의존 면역성의 강화 또는 억제를 위한 또는 종양이 유도된 NK-세포의 치료를 위한 약학조성물의 제조를 위한 본 발명의 (폴리)펩티드 사용 또는 항체 또는 단편 또는 그의 유도체 또는 이특이성 수용체에 관한 것이다.
표적 세포 (예를 들면, 종양 세포 및 바이러스 감염 세포)의 제거 옆에 제타 사슬의 세포외 목표화함으로 관여한 NK-세포의 상기 기술된 방법은 NK-세포 의존 면역을 강화 또는 억제하기 위해 또는 종양이 유도된 NK-세포에 영향을 주기 위해 치료로 사용될 수도 있다. 제타-사슬이 또한 종양이 유도된 NK-세포로 발현되는 것이 기대된다면, 분자는 또한 종양 NK-세포를 목표화하는데 이용될 수도 있다.
또한 본 발명은
(a) 상기 NK-세포, T-림프구 또는 그의 전구물질을 갖는 본 발명의 (폴리)펩티드 또는 항체 또는 단편 또는 그의 유도체와 접촉; 및
(b) 결합된 (폴리)펩티드, 항체 또는 유도체의 양을 확인하는 것을 포함하는
NK-세포, T-림프구 또는 그의 전구물질로 발현하는 제타-사슬 또는 에타-사슬의 결정을 위한 방법에 관한 것이다.
접촉하는 것은 상기 (폴리)펩티드 또는 상기 NK-세포, T-림프구 또는 그의 전구물질을 갖는 상기 항체 또는 단편 또는 그의 유도체를 생물학적 완충 비슷한 생리학적 조건 (예를 들면, 인산-완충 염, PBS)에서 20 내지 40 분간 얼음에서 바람직하게 배양함으로 실행할 수 있다. PBS를 갖는 두번의 패닝 단계 후 결합된 (폴리)펩티드, 항체 또는 단편 또는 그의 유도체는 예를 들면, 적당한 형광-라벨된 2차 항체로 발견될 수도 있고 실시예 4에서 기술된 것처럼 흘림세포계측 분석에 의해 양을 측정할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 숙주, (폴리)펩티드, 항체 또는 단편 또는 그의 유도체 및/또한 이특이성 수용체를 포함하는 킷에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터의 적어도 하나의 카피 생식계열을 포함하는 형질전환 동물에 관한 것이다.
형질전환 동물은 기술된 것과 같이 종래의 프로토콜, 예를 들면, Palmiter R.D., Brinster R.L.: Germline transformation of mice. Ann. Rev. Genet.20 (1986), 465-499 and Capecci M.: 상동 재조합에 의해 게놈을 수정. Science 244 (1991) 1288-1292 이다. 본 발명의 형질전환 동물의 바람직한 예는 소, 양, 토끼,마우스 또는 쥐이다.
표 1은 설균목 Ig-H와 L 사슬-DNA-단편의 PCR-증폭에 대한 단량체 세트를 보여준다.
도면참고:
도 1: TCR의 구조와 T-세포 활성에서 빠른 현상. TCR은 유망한 서브유닛 조성물 TCRα+β, CD3εδγε, ζζ를 갖는 클론타입의 사슬 (α+β)와 불변의 사슬 (ζ, CD3γ, CD3δ 및 CD3ε)으로 구성한다. CD3과 ζ 사슬의 세포질 영역안에서 ITAMs의 위치는 작고 검은 달걀처럼 보인다. A) 휴지 T-세포에서, ITAMs는 non-인산화 또는 단지 부분적으로 인산화된다. 단백질 티로신 키나제 Lck는 CD4 또는 CD8의 세포질 영역에 결합된다. B) MHC-펩티드-복합체와 상호반응에서, TCR과 CD4 또는 CD8는 공집합되고 CD3과 ζ 사슬안의 ITAMs는 Src 키나제 Lck 및/또는 Fyn에 의해 인산화된다. ZAP-70 또는 관련된 키나제 Syk는 티로신 잔기 둘다 인산화되어 온 곳에서 ITAMs에 특히 결합된다. TCR-복합체에 보충되기 전, ZAP-70은 Lck에 의해 활성되고, 뒤이어 후에 다른 분자들이 TCR-복합체에 보충되고 활성이 추가의 다운스트림 분자 (보이지 않는)에 나아간다. 순환 P는 인산염 티로신 잔기를 나타낸다.
도 2: 설균목 Fab-항체-단편의 ELISA-분석이 인간 제타-사슬의 세포외 부분에 결합하는 박테리오파지 발현에 의해 선택된다. E.coli에 발현된 가용성 Fab-단편의 주변세포질 제조는 고정 제타-펩티드-BSA-결합체로 배양된다. 특히 결합된Fab-단편은 염소 항-마우스 IgG + IgM 항체의 F(ab')2단편을 결합한 말(horse) 무(radish) 과산화효소로 감응된다. ELISA는 ABTS-기질 용액을 첨가함으로 발달된다. 인 비트로 선택의 한 순환당 8개의 클론이 x축에 라벨되고; OD-값은 405㎚에서 ELISA-기록기로 측정되고 y축에 라벨된다. 부정적 제어에 대해, 웰(well)은 주변세포질 제조 대신 PBS로 배양된다.
도 3: CD8+-T-림프구와 NK-세포의 표면에 2-B-5 항체의 활성을 특히 결합하는 제타-사슬의 흘림세포계측-분석. 두명의 다른 건강한 헌혈자의 말초 혈액으로부터 100,000 단핵 세포가 2-B-5 잡종세포의 희석되지 않은 세포 배양 상층액으로 배양된다. 결합된 제타-사슬 특히 쥐 항체는 PBS에서 1:100으로 희석된 염소-항-쥐 Ig (IgG + IgM) 항체를 결합하는 형광(FITC)에 의해 감응된다. 세가지 색 형광 분석은 CD8+(세가지색)에 대한 양성 문과 CD8+-NK-세포로부터 어떤 오염시키는 신호없이 CD8+-T-림프구(표현형: CD8+, CD16-)에 배타적으로 기여하는 FITC-매개된 형광 (차여진 라인)의 감응이 허용되는 CD16+(PE) 세포에 대한 음성 문을 적용함으로 실행된다. 비슷하게, 세가지 색 형광 분석은 CD56+-(PE)에 대한 양성 문과 CD56+-T-림프구로부터 어떤 오염시키는 신호 없이 NK-세포 (표현형: CD56+, CD3-)에 배타적으로 기여하는 FITC-매개된 형광 (차여진 라인)의 감응이 허용되는 CD3+-세포에 대한 음성 문을 적용함으로 실행된다. 관계없는 특이성이 제외된 같은 동형 (쥐IgM)을 가진 항체의 동형 제어 (깨진 라인) 배양 상층액이 이용된다. 라벨된 세포의 고정에 대해 PBS에서 1% 파라포름알데히드가 사용되었다. 세포는 FACS-스캔 (Becton Dickinson)에서 흘림세포계측에 의해 분석된다.
도 4: CD8+-T-세포 림프구의 여액에 존재하는 음성의 제타-사슬을 갖는 항체 2-B-5의 반응을 확인하는 샌드위치-ELISA의 결과. 인간 제타 사슬의 카르복시-말단에서 아미노산 144-163을 인식하는 제타-사슬 특이성 항체는 96 U-병 판의 웰에 12 시간동안 코팅되고 PBS/3% BSA로 실온에서 한시간 동안 봉쇄함으로 받아들여진다. 뒤이어 CD8+-세포의 여액은 희석되지 않은 것과 몇개의 희석이 첨가되고 실온에서 한시간 동안 배양된다. 다음 단계에서 정제된 항체 2-B-5는 1㎍/㎖의 농도에서 첨가되고 한시간 동안 배양된다. 결합된 2-B-5 항체는 아비딘-과산화효소-결합체에 의해 받아들여진 비오틴화 마우스-항-쥐 IgM 항체로 감응된다. ELISA는 마지막으로 ABTS-기질 용액의 첨가로 발달된다. 유색 침전물은 ELISA-기록기를 사용하여 405㎚에서 측정된다.
도 5: E.coli.의 주변세포질에서 발현된 쥐 단일클론항체 2-B-5의 재조합 Fab-단편의 제타-펩티드-KLH-결합체에 특별한 결합에 대한 ELISA-기초 분석. 제타-펩티드-KLH-결합체의 코팅은 PBS/0.05% 사이에서 단일 패닝 단계로 허용되는 12시간동안 4℃에서 실행된다. 웰은 PBS/3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 한시간 동안 봉쇄되고 다시 한번 씻겨진다. 그후 Fab-포함 주변세포질 제조는 희석되지 않은 것과 몇개의 희석제에서 첨가되고 2 시간동안 배양된다. 부정적 제어로, 웰은 주변세포질 대신 PBS로 배양된다. 제타-펩티드-KLH-결합체에 결합된 Fab-단편의 감응을 위해 설균목 항-His-tag 항체가 폴리클로날 염소 항-마우스 IgG 항체가 결합한 과산화효소에 의해 허용되어 사용된다. ELISA는 마지막으로 ABTS-기질 용액의 첨가로 발달된다. 유색 기질의 변형은 OD 405㎚에서 ELISA-기록기로 측정된다.
도 6: 항-제타-사슬 항체 2-B-5의 VH-영역의 DNA- 및 단백질 서열. 숫자는 뉴클레오티드 (nt) 위치를 나타내고, 아미노산 (aa)은 단일 문자 코드로 발현된다. 상자는 세개의 CDR's를 나타낸다.
도 8: 항-제타-사슬-항체 2-B-5에 의해 유발된 CD8+-T-세포, NK-세포 및 PBMC의 자극을 결정하기 위해 실행된 세포 증식을 감응하는 ELISA-기초한 BrdU-합병-시험의 결과. 96-웰 편평한-바닥 마이크로티터플레이트(microtiterplate)는 4℃에서 밤새도록 몇개의 희석제에서 정제된 2-B-5 항체로 코팅된다. 100,000 CD8+-T-림프구, NK-세포 및 분리되지 않은 PBMC는 개별적으로 마이크로티터플레이트의 웰에 삼배수로 첨가되었다. 2-B-5에 의해 매개된 자극의 특이성을 제어하기 위해 관련없는 특이성을 갖는 같은 동형 (쥐 IgM)의 항체는 같은 농도에서 사용되었다. 인간 CD3-복합체를 인식하는 항체 OKT3 (동형 IgG2a)는 개별적으로 T-세포 및 분리되지 않은 PBMC의 자극에 대한 특별한 긍정적 제어로 적용된다. 관련없는 특이성의 설균목 IgG2a-항체는 OKT3에 대해 동형 제어로 사용되었다. 빈 제어(세포 없는 웰) 와 배경 제어 (BrdU없는 웰)는 또한 포함된다. 3일의 배양기간 후 BrdU-라벨된 용액은 24 시간동안 첨가되었다. 뒤이어 세포는 융해되고 고정되고 새롭게 합성된 세포 DNA에 합병된 BrdU에 결합하는 항-BrdU-항체의 첨가에 의해 받아진다. 항체와 결합한 상기 과산화효소는 다음의 기질 반응에 의해 감응된다. 반응 생성물은 450㎚의 파장에서 ELISA 기록기로 양을 잴 수 있었다.
도 9: 항-제타-사슬 항체의 결합으로 유도된 TCR/CD3 복합체 내재의 흘림세포계측 분석. 200,000 단핵 세포는 1㎍/㎖의 농도에서, 4℃ 또는 37℃에서 30 또는 60분 동안 항-제타-사슬 항체로 배양된다; 평행한 실험이 쥐-항-인간 CD3 항체로 실행되었다. 캡핑(capping) 과정은 찬 PBS로 두번 씻음으로 종결되었다. 항체와 결합된 세포 표면에 라벨을 하기 위해, 세포는 PBS에 1:100으로 희석된 염소-항-쥐 Ig(IgG + IgM) 항체와 결합한 형광 (FITC)로 배양되었다. 부정적 제어로 단지 2차 항체가 사용되었다.
도 10: 항-제타-사슬/항-EpCAM 이특이성 단일-사슬 항체의 DNA- 및 단백질-서열. 숫자는 뉴클레오티드 (nt) 위치를 나타내고, 아미노산 서열 결과는 하기 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 항체를 인코딩하는 DNA 서열은 67 위치에서 개시하여 1605 위치에서 끝난다. 뉴클레오티드 10 내지 66은 포유류 세포에서 이특이성 항체의 비밀화를 매개하는 앞선 펩티드를 인코딩한다. 첫 6개 nt (위치 1 내지 6)와 마지막 6개 nt (위치 1632 내지 1637)는 개별적으로 EcoRI 와 Sall에 대한 제한 효소 인식 지점을 포함한다.
도 11: PBMC와 CD8+-T-림프구의 세포독성 활성이 이특이성 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체에 대해 EpCAM-양성 카토(Kato) 세포로 재인도했다. 100㎕의 부피에 200,000 자극되지 않은 PBMCs 또는 CD8+ T-림프구는 100㎕의 부피에 카토 Ⅲ 세포를 라벨된 10,000 크로뮴(Chromium)-51에 첨가된다. 이특이성 항체는 50㎕ 부피에서 40 ng/㎖ 내지 5㎍/㎖ 농도에 첨가된다. 마이크로티터플레이트는 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 4시간동안 배양된다. 배양기간 후 50 ㎕ 상층액이 각 웰로부터 제거되고 감마 카운터(counter)에서 자유로운 51Cr에 대해 시험된다.
상기와 다른 실제화는 본 발명의 상세 설명과 실시예에 의해 나타나고 이루어진다. 본 발명과 일치하는데 적용된 항체, 방법, 용도 및 화합물중 어느 하나와 관련된 추가의 문헌이 공공 도서관 및 데이타베이스로부터 예를 들면, 전자 장치를 사용하여 얻을 수도 있다. 예를 들면 대중적 데이타베이스 "Medline"은 인터넷상에서 예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.에서 유용하게 이용될 수도 있다. 추가의 데이타베이스와 주소는 가령 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/가 당분야의 기술자에게 공지되고 또한 예를 들면 http://www.lycos.com을 이용하여 얻을 수 있다. 생물공학에서 특허 정보의 개관과 소급적용 찾기와 현재 알려진 것에 대한 유용한 특허 정보의 관련 출처의 조사는 Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364에서 주어진다.
상기 설명서는 일반적으로 본 발명을 기술한다. 더 완벽한 이해는 여기서 단지 설명의 목적을 제공하지 발명의 범위를 한정하려는 의도는 없는 하기 특별한 예에 참조하여 얻을 수 있다.
실시예는 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 제타-펩티드-KLH-결합체를 갖는 마우스의 면역화와 제타-펩티드-BSA-결합체를 이용한 혈청 규정농도의 결정
balb/c x C57black 교배로 10주된 F1 마우스를 제타-펩티드-KLH-결합체 (Jerini Bio Tools, Berlin)로 면역화된다. 제타-사슬 N-말단의 아미노산 서열 (QSFGLLDPKLC)를 갖는 펩티드는 C-말단 시스테인(Cystein)의 머캅토기를 통해 방향지워진 방법에서 말레인이미드(maleinimide) 활성화된 KLH에 결합된다. 결합체는 100 ㎍/㎖의 농도에서 0.9% 염화나트륨(NaCl)에서 융해된다. 용액은 뒤이어 완벽한 프로인드(Freund)의 보조약을 1:2로 에멀젼화하고 50㎕를 복강으로 마우스 한마리당 주사한다. 완벽한 프로인드의 보조약이 불완전한 프로인드 보조약을 대신하는 것을 제외하고, 같은 방법으로 4, 8 및 12 주후에 마우스는 추가 면역 면역화된다. 첫 추가 면역 면역화후 10일, 혈액 견본을 취해서 제타-펩티드-BSA-결합체에 대한 항체 혈청 규정농도는 ELISA에 의해 시험된다. 혈청 규정농도는 면역되지 못한 동물에서보다 부여받은 동물에서 1000 배이상 높다. 두번째 추가 면역후 3일, 비장 세포는 면역학의 현재 프로토콜 (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992)에 기술된 것과 같은 표준 프로토콜을 따르는 히브리도마 세포계를 생성하기 위해 P3X63Ag8.653 세포(ATCC CRL-1580)로 융해된다. PEG-융해이후, 세포는 웰당 100,000 세포로 마이크로티터플레이트에 씨뿌려지고 10% 태아 젓소 혈청, 300 단위/㎖ 재조합 인간 인터로킨(interleukin) 6와HAT-선택 첨가제로 보충된 200 μl RPML 1640 매개에서 배양된다. 진하게 배양된 웰의 배양 상층액은 1:20 희석에 ELISA-분석으로 시험되었다. 제타-펩티드-BSA-결합체를 결합하는 히브리도마 상층액의 능력은 하기 ELISA에 의해 시험되었다:
제타-펩티드-KLH-결합체(Jerini Bio Tools, Berlin)에 대해 기술된 것과 같은 방법에서 젓소 혈청 알부민에 결합된 100μl 제타-펩티드는 5㎍/㎖의 농도에서 96 U-바닥 플레이트(Nunc, maxisorb)의 웰에 코팅되었다. 코팅은 4℃에서 밤새 이루어졌고, 씻는 완충용액(0.1M NaCl, 0.05M Na2HPO4pH 7.3, 0.05% 사이 20, 0.05% NaN3)으로 세번 씻은 후, 하기 장애가 실온에서 한시간 동안 씻는 완충용액에 첨가된 2% 걷어낸 우유 가루의 200μl에서 이루어졌다. 다음 단계에서 히브리도마 상층액은 순수하게 배양되었고 실온에서 2 시간동안 몇개의 희석제에서 배양되었다. 감응 시스템이 고추냉이를 희석할 때 마우스 면역 글로불린에 대한 폴리클로날 항체에 결함된 산화방지효소가 사용되었다. 씻기를 5번 한 후 ELISA는 마지막으로 TMB-기질 용액 (테트라메틸벤지딘, 베링거 만하임(Boehringer Mannheim))의 첨가로 발전되었다. 유색 침전물은 15분 후에 ELISA-기록기를 사용하여 104㎚에서 측정되었다.
강한 ELISA-신호를 나타내는 150 클론으로부터 상층액은 흘림세포계측 분석에 대해 선택되었다.
T-림프구와 NK-세포의 히브리도마 상층액의 결합 활성을 점검하기 위해 흘림세포계측 분석이 이루어졌다. 1×106PBMC가 30분동안 개별적으로 150 다른 클론으로부터 50μl 희석되지 않은 상층액에서 얼음에 배양되었고 결합된 항체는 뒤이어 PBS에서 1:100으로 희석된 토끼 항체-마우스 Ig 항체(Dako Hamburg, Code No. F0313)의 F(ab')2단편에 결합된 형광(FITC)에 의해 감응되었다. 하기 라벨된 단계에서 불특정의 결합을 피하기위해 FITC-결합된 항체의 자유 발렌스가 50μl 1:10-희석된 마우스 혈청 (Sigma immunochemicals, Deisenhofen, M-5905)의 첨가를 30분동안 함으로 방해되었다. 두개의 PBMC-서브세트을 구별하기위해 분명하게 라벨된 세포가 분리되었다. 반이 1:100으로 희석된 세가지 색 결합된 항-CD8 항체 (Caltac Laboratories; Burlingame; USA, Code No. MHCD0306)로 착색되었다; 다른 반은 1:25 희석된 피코에리트린 (PE) 결합된 항-CD56 항체 (Becton Dickinson, Heidelberg, Cat. No. 347747)로 착색되었다. 부정적 제어 설균목에서 관련없는 특이성의 단일클론항체가 히브리도마 상층액 대신 사용되었다. 개별적으로 NK-세포 또는 T-림프구의 특이한 착색에 대해 라벨되지 않은 항-CD16과 항-CD6 1차 라벨 단계를 제어하는데 사용되었다.
세포는 FACS-스캔 (Becton Dickinson, Heidelberg)으로 흘림세포계측함으로 분석되었다. FACS-착색과 형광양의 측정은 면역학에서 현재 프로토콜에 기술된데로 이루어졌다(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992).
두가지-색 형광 분석은 CD8+-와 CD56+-세포에 대해 개별적으로 양성 문을 적용함으로 실행되었고 따라서 CD8+-T-림프구와 NK-세포에 분리하여 FITC-매개된 형광의 감응을 허용한다. 개별적 긍정적 제어 항체에 의해 CD8+-T-림프구와 NK-세포의 깨끗한 착색에도 불구하고, 150 히브리도마 상층액은 CD8+-T-림프구 및/또는 NK-세포에서 결합 활성을 보이지 않았다.
실시예 2: 박테리오파지 발현 방법에 의해 설균목 조합 항체의 항-제타-항체에 대한 인 비트로 선택
balb/c x C57blck 교배로부터 F1 마우스는 실시예 1에서 기술된 것처럼 10주 나이에 면역화되었다. 첫 추가 면역화 후 10일 혈액 견본을 취하고 제타-펩티드-BST-결합체에 대한 항체 혈청 규정농도가 ELISA (실시예 1를 보라)로 시험되었다. 혈청 규정농도는 면역화되지 않은 동물과 비교하면 면역화된 동물이 1000배 더 높다. 세번째 주입후 3일, 설균목 비장 세포가 얻어졌다. 전체 RNA 격리에 대한 촘진스키(Chomczynski, 분석 생화학 162 (1987) 156-159)에 따른 프로토콜이 사용되었다. DNA-라이브러리 인코딩 설균목 면역 글로불린 (Ig) 카파(kappa) L 사슬과 Ig H 사슬 Fd-단편(=VH+CH1)이 설균목 비장 RNA에 개별적으로 RT-PCR 함으로 구성되었다. cDNA는 표준 프로토콜(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, second edition)에 따라 합성되었다.
단량체 세트 (표 1에 보이는)는 선택되었고, H 사슬-에 대한 5'-Xhol과 3'-Spel 인식 지점 및 L 사슬 단편에 대한 5'-Sacl과 3'-Xbal 인식 지점에 나타난다. HC DNA-단편의 PCR-증폭에 대해 여덟 개의 다른 5'-VH-계열 특성의 단량체가 다른 IgG-하부 계열의 HC-CH1-영역의 3'-영역에 하이브리다이징하는 네개의 3' 단량체로각각 결합되었다; 카파 L 사슬 단편의 PCR-증폭에 대해 일곱개의 다른 5'-VK-계열 특성의 단량체는 카파 불변의 영역 (CK)의 3'-끝에 하이브리다이징하는 하나의 3'-단량체로 각각 결합되었다.
하기 PCR 프로그램은 증폭에 사용되었다: 94℃에서 2분동안 개시 변성.; 증폭을 40회: 94℃에서 20초동안 변성.; 52℃에서 50초동안 단량체 담금질과 72℃에서 20초동안 단량체 확장., 72℃에서 마지막 확장이 10분간 뒤따른다.
카파 L 사슬 단편의 450ng이 파그미드(phagmid) pComb3H(Sacl-Xbal 분류된; 큰 단편)의 1400ng으로 결찰되었다(Barbas et al, Proc Natl Acad Sci USA 88, 7978-82 (1991)). 결과로 L 사슬 라이브러리가 electoporation (2.5 kV, 0.2 ㎝ 갭(gap) 큐벳(cuvette), 25 FD, 200 옴(Ohm), Biorad gene-pulser)로 인해 electrocompetent Escherichia coli XL1 Blue의 300μl로 변형되었고 라이브러리 크기의 6×108독립적 클론이 결과되었다. 표현형 발현 한시간 후, 긍정적 변형체가 밤새 액체 SB-배양의 100㎖에서 카베니실린 저항 인코딩된 벡터에 대해 선택되었다. 세포는 원심분리로 얻어졌고 플라스미드 제조는 상업적으로 유용한 플라스미드 제조 킷 (Qiagen)을 이용하여 이루어졌다.
카파 L 사슬 라이브러리를 포함한 2800ng의 상기 플라스미드-DNA가 900ng의 HC-Fd-DNA-단편에 결찰되고 electroporation (2.5kV, 0.2 ㎝ 갭 큐벳, 25FD, 200O옴)에 의해 electrocompetent E.coli XL1 Blue의 두개의 300㎕의 추출물로 다시 변형되었고 4×108독립적 클론을 포함한 항체 Fab-단편의 조합 라이브러리가 결과되었다.
표현형 발현 한시간 후, 긍정적 변형이 카베니실린 저항에 의해 선택되었다. 상기 적용후 상기 클론은 헬퍼 박테리아파지 VCSM13의 1×1012조각 감염양으로 감염되었고 filamentous M13 박테리아파지의 생성과 분비의 결과를 낳았고, 상기 각 박테리아파지 조각은 단일 설균목 항체 Fab-단편을 인코딩하고 박테리아파지 표면에 일치하는 Fab-단백질을 나타내는 페이지미드 (phagemid) 벡터의 단일-가닥 카피를 포함한다. Fab-단편은 HC-단편에 동시에 결합하는 IG-L 사슬을 가진 박테리아파지 코트 단백질 Ⅲ에 HC-Fd-단편의 해독 통합에 의해 박테리아파지 표면에 고정되었다.
클론 Fab-레퍼토리를 실행하는 상기 박테리아파지 라이브러리가 PEG8000/NaCl 침전과 원심분리에 의해 배양 상층액으로부터 얻어졌고, 10% FCS로 보충된 RPMI 1640-보존액에서 다시 용해되었고 고정된 제타-펩티드-BSA-결합체 또는 매일 교차하는 순서의 격리된 CD8+-림프구나 NK-세포로 배양되었다. 인간 PBMC의 두개의 특정 생물형군은 면역자성 분리 방법으로 미리 분리되었다. 피콜(Ficoll)-밀도 중력 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 얻은 단핵세포는 인간 CD8 또는 CD56으로 인도된 설균목 원조의 특이한 1차 항체로 첫번째 배양되었고 뒤이어 양-항-마우스 IgG 항체로 결합된 상자성체 비즈(beads, Dynal, Oslo, Norway)로 rosettation에 지배되었다. CD8+-T-세포와 CD56+-NK-세포는 세포 현탁액을 포함한 시험관의 벽에 붙은 자석으로 분리되었다. 정제된 CD8+-T-림프구 또는 NK-세포로 2시간동안 4℃에서 계속적인 교반하에 개별적으로 박테리아파지 라이브러리의 배양후, 박테리아파지 조각이 결합된 세포가 아직 세포에 붙어있는 상자성체 비즈로 결합하지 않은 박테리아파지 조각으로부터 지켜진다.
따라서, 세포를 다시 부유하게 하여 박테리아파지 배경을 줄이는 씻는 각 순환시에 몇번을 적용하는 씻는 용액을 제거하기 위해 자기장에 노출시킨다. 특히 결합된 박테리아파지 조각은 마지막으로 HCl-글리신 pH 2.2로 세포로부터 추출되고 2 M Tris pH 12로 중화후, 추출물은 새로운 감염되지 않은 E.coli XL1 Blue 배양의 감염에 사용되었다. 설균목 Fab-단편을 인코딩하는 pComb3H 파그미드 카피로 성공적으로 전환된 세포가 카베니실린 저항에 대해 다시 선택되었고 뒤이어 항체 발현과 인 비트로 선택의 다른 순환을 개시하기위해 VCMS13 헬퍼로 감염되었다.
완벽한 인 비트로 선택 과정은 각각 CD8+-T-림프구에서와 뒤이어 CD56+-NK-세포에서 씻는 하나의 순환에 의한 고정된 제타-펩티드-BSA-결합체에 씻는 두개의 개시 순환을 포함한다. 그후 또 다른 두개의 씻는 순환이 하나는 CD8+-T-세포에서 마지막으로는 CD56+-NK-세포에서 개별적으로 다시 씻는 순환에 의해 고정된 제타-펩티드-BSA-결합체에서 이루어졌다. 고정된 항원에서 씻는 것은 그렇지 않으면 제타 사슬에 첨가한 많은 수의 다른 항원을 포함한 세포 표면으로부터 박테리아파지 조각의 특정치 않은 추출에 의해 잃어버릴 지도 모르는 제타-사슬 특이한 Fab-단편에선택 압력을 유지하기 위해 기술된 것(Barbas et al, Proc Natl Acad Sci USA 88, 7978-82 (1991))과 같이 행해졌다. 씻는 각 순환 후에, 플라스미드-DNA는 E.coli 배양 결과로부터 제조되었다.
가용성 Fab-단백질의 제조에 대해 유전자 Ⅲ DNA 단편은 플라스미드-DNA (Spel/Nhel)의 상기 제조에서 제거되어, 유전자 Ⅲ 단백질을 갖는 Fab-절편의 해독 통합을 파괴한다. 결찰 후에, 플라스미드 DNA의 상기 도구는 100㎕ 열 충격 충분한 E.coli XL1 Blue로 변형되었고 카베니실린 LB-아가에 평편하게 펼쳐졌다. 단일 콜로니는 10 ㎖ LB-Carb-배양/20 mM MgCl2에서 배양되고 Fab-발현은 1mM의 마지막 농도에 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 6시간 후에 유도되었다.
상기 세포는 원심분리에 의해서 및 -70℃에서 응고의 4회 순환을 통해 20 시간 후 얻어지고 37℃에서 박테리아의 외부 막을 녹이는 것이 열 충격에 의해 파괴되어 Fab 항체-단편을 포함한 가용성 주변세포질 단백질은 액체가 된다. 온전한 세포와 원심분리에 의한 세포-파편의 제거후, 상층액은 제타-펩티드-BSA-결합체에 결합한 Fab-항체-단편에 대해 ELISA에 의해 시험되었다.
고정된 제타-펩티드-BSA-결합체에 결합된 Fab-단편의 감응은 염소 항-마우스 IgG + IgM 항체 (0.16㎍/㎖)(Pierce, Rockford, USA, Prod. No. 311448)의 F(ab')2단편에 결합된 horse radish 과산화효소를 사용하여 실행되었다. 상기 신호는 2,2'아지노-비스(3-에틸벤즈-티아졸린-6-술폰산)와 Na-과붕산염을 포함한 기질 용액을 첨가하여 발달되었고 405nm의 파장에서 감응되었다.
인 비트로 선택에 앞서 라이브러리에서 취한 클론에 반대로, 씻는 다른 순환후에 시험된 상기 클론은 정제된 CD8+-T-세포(도 2)로 실행되는 씻는 순환이 일곱번째 이상에서 전체적으로 증가하는 횟수를 갖는 제타-펩티드-ELISA에서 긍정적인 것으로 증명되었다. 그러나, 씻는 순환의 일곱 번째와 여덟 번째에서, 정제된 NK-세포로 행하는 후자, 양의 클론의 수가 심각하게 떨어졌다. 상기는 T-세포에서 그들의 결합 활성에 의해 풍부해질 수 있는 클론이 NK-세포에서 마지막 패닝 단계 후 여전히 존재하는 클론 90을 단지 제외하는 NK-세포에 대부분 옳지 않다는 것을 나타낸다.
CD8+-T-세포와 NK-세포의 제타-펩티드-반응성 Fab-단편의 결합 활성을 점검하기 위해 흘림세포계측 분석이 행해졌다. 1×106PBMC는 PBS에 1:100으로 희석된 염소 항-마우스 IgG + IgM 항체 (Jackson Immunoresearch laboratories, West Grove, USA Code No. 115-096-068)의 F(ab')2-단편을 결합한 형광 (FITC)로 배양함으로 30분 동안 얼음에서 50㎕ 희석하지 않은 주변세포질 제조에 배양되었다. 하기 라벨되는 단계 동안 특정치 않은 결합을 피하기 위해 FITC-항체에서 자유 발런스가 50 ㎕ 1:10로 희석한 마우스 혈청 (Sigma immunochemicals, Deisenhofen, M-5905)을 30분동안 첨가하여 방해했다. 두개의 PBMC-서브세트를 구별하기 위해 분명히 라벨된 세포를 분리했다. 반은 항-CD8 항체를 결합한 1:100으로 희석한 세가지 색으로 착색하고(Caltac Laboratories; USA, Code No. MHCD0306); 나머지 반은항-CD56 항체를 결합한 1:25 희석한 피코에리트린으로 착색했다(Becton Dickinson, Heidelberg, Cat. No. 347747). 부정적 제어로 관련없는 특이성의 Fab-항체 주변세포질 제조가 포함되었다. 라벨되지 않은 항-CD16과 항-CD6 항체는 NK-세포와 CD8+-T-림프구에 대해 개별적으로 긍정적 제어로 사용되었다.
두가지-색 형광 분석은 CD8+-와 CD56+-세포에 대해 양성의 문을 적용함으로 FACS 스캔 (Becton Dickinson)에서 실행되었고 CD8+-T-림프구와 NK-세포에서 분리하여 FITC-매개된 형광의 감응이 개별적으로 허용된다. 세포의 라벨링과 형광의 측정은 면역학에서 현재 프로토콜에 기술된 것과 같이 행하였다(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992).
상기 언급된 프로토콜을 사용하여 ELISA-분석에서 제타-펩티드-BSA-결합체에 반응하는 것이 증명된 60 다른 클론이 PBMC에서 분석되었다. 깨끗한 양의 FACS-신호가 긍정적 제어에 의해 나타나도, 항-제타 사슬 Fab-항체-단편의 주변세포질 제조중 어느 것도 NK-세포의 CD8+-T-림프구의 표면에 결합하는 것이 보여질 수 없다. 상기 결과는 T-세포의 표면의 씻는 과정에 의해 선택된 Fab-단편의 낮은 친화성 상호반응에 의해 설명될 수도 있고, 인 비트로 선택 동안 단지 흘림세포계측 분석의 감도 이하에서만 충분히 강화될 수도 있다. 그러나 NK-세포에서 실행된 마지막 선택 단계동안 제타-펩티드-반응성 클론의 소멸은 상기 잠재적으로 T-세포 반응성 클론이 NK-세포의 표면에 모두 결합하지 않는다는 것을 강하게 나타낸다. 반면, 인비트로 선택동안 더 일찍 나타나는 다른 제타-펩티드-반응성 클론과 가변영역 서열을 비교함으로 결정되는 것처럼 NK-세포에서 씻는 마지막 순환동안 처음 나타난 클론 90은 대부분 쉽게 T-세포와 상호반응없이 NK-세포 표면에 결합하는 낮은 친화성을 나타냈다. 따라서, 클론 90은 NK-세포에서 씻는 두번째 순환에 앞서 나타나지 않고 결합신호가 T-세포 또는 NK-세포에서 일치하는 Fab-항체 단편의 흘림세포계측 분석에 의해 감응되지 않았다.
실시예 3: 제타-펩티드-KLH-결합체에 의한 쥐의 면역화 및 히브리도마 기술에 의한 항-제타-항체의 생성
3개월된 스파그 덜리 쥐(Spargue Dawley rat)에 1×107세포를 복강내 주사함으로써 인간 T-세포계 주르캇(ATCC TIB-152)으로 면역화하였다. 3개월후에, 상기 동물을 제타-펩티드-KLH-결합체로 면역화하였다. 상기 결합체를 200㎍/㎖의 농도에서 0.9% NaCl내에 용해시켰다. 상기 용액을 완전한 프로인트 보조액과 100㎕로 1:2 유화되고, 복강내 및 피하내에 주사하였다. 보조액이 첨가되지 않는 것외에는, 상기와 같은 방법으로 4주후에 상기 쥐를 추가면역화하였다. 추가면역화후 3일후에, 상기 동물을 희생시키고, P3X63Ag8.653-세포(ATCC CRL-1580)에 의해 비장세포를 융합시켜 표준 프로토콜에 따른 히브리도마 세포계를 발생시켰다. PEG-융합후, 세포를 미량역가판에서 웰당 100,000개의 세포에 심고, 선별을 위해 HAT-첨가제 및 10% 소 태아혈청을 보충한 RPMI 1640 배지 200㎕내에서 배양하였다. 배양 8일후, 상층액을 완전히 제거하고, 새 배지로 교체하였다. 추가 4일후, 각 웰로부터 배양 상층액을 1:1로 희석하고, ELISA 시험하였다(실시예 1 참조). 토끼 항-마우스 Ig 항체의 FITC-결합된 F(ab')2-단편 대신에 FITC-라벨된 항-쥐 면역글로불린 항체(IgG + IgM)(Dianova/Jackson, Hamburg, Cat. No. 112-016-044)가 사용된 것외에는, 설균목 단일클론항체에 대해 실시예 1에 기술된 바와 같이 실시된 CD8+-T-림프구 및 NK-세포상에서의 FACS-분석을 위해 면역화된 제타-펩티드-BSA-결합체와의 가장 강한 반응을 나타내는 상기 45개의 웰로부터의 상층액을 선별하였다. 시험된 45개의 다른 쥐 단일클론항체 중에 단 한개의 클론만 CD8+-T-림프구 및 NK-세포 모두와 결합하는 것으로 입증된 2-B-5를 나타냈다. 그러므로, 상기 클론은 실시예 4-7에 따라 보다 상세히 분석되었다.
실시예 4: CD8+-T-림프구 및 NK-세포 상에서 항-제타-사슬 항체의 흘림세포계측법 분석
CD8+-T-림프구 및 NK-세포의 표면상에서 2-B-5 항체의 결합활성을 시험하기 위해, 피콜-밀도 구배 원심분리에 의해 2개의 다른 건강한 공여체의 말초혈액으로부터 단핵세포를 분리하였다. 미량역가판의 각 웰에서, 100,000개의 단핵세포를 2-B-5 히브리도마의 희석되지 않은 세포배양 상층액 및 그의 여러 희석액과 함께 각각 배양하였다. 음성대조군으로서, 부적절한 특이성외에 같은 아이소타입을 갖는 항체(쥐 IgM)의 배양상층액을 사용하였다. 얼음위 배양 30분후, 세포를 PBS에 의해 2회 세척하고, 그후에 2개의 다른 항체 라벨된 혼합물에 의해 염색하였다.PBS내에서 1:100 희석된 플루오레신(FITC)포합 염소-항-쥐 Ig(IgG + IgM) 항체(Dinova/Jackson, Hamburg, Cat. No. 112-016-044), PBS내에서 1:25 희석된 피코에리트린(PE)포합 CD56 항체(Becton Dickinson, Heidelberg, Cat. No. 347747) 및 PBS내에서 1:50 희석된 삼색(Tricolor) 포합 CD3 항체(Caltac Laboratoris, Burlingame, USA, Cod. No. MHCD0306)과 함께 CD8+-T-세포를 얼음위에서 30분동안 동시배양하였다. 마우스 항체에 대한 항-쥐 항체의 비특이적 결합반응을 피하기 위해 상기 라벨혼합물에 마우스 혈청(Sigma Aldrich, St Louis, USA, Cat. No. 054H-8958)을 1:10의 희석으로 첨가하였다.
NK-세포 프랙션을 PBS내에서 1:100 희석된 같은 염소-항-쥐 Ig 항체, PBS내에서 1:100 희석된 삼색 결합된 CD8 항체(Caltac Laboratories, Cod. No. MHCD0806) 및 PBS내에서 1:25 희석된 피코에리트린(PE) 포합 CD16 항체(Becton Dickinson, Heidelberg, Cat. No. 347617)와 함께 배양하였다. 상기 혼합물에 마찬가지로 마우스 혈청을 보충하였다. PBS/1% 파라포름알데히드에 의해 고정하기 전에 라벨된 세포를 PBS로 2회 세척하였다.
세포를 FACS-스캔상에서 흘림세포계측법에 의해 분석하였다(Becton Dickinson, Heidelberg). FACS 염색 및 형광세기의 측정은 Current Protocols in Immunology에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992).
CD8+(삼색)을 위한 양성 게이트 및 CD16+(PE) 세포를 위한 음성 게이트를 사용하고, CD8+-NK-세포로부터 오염신호없이 CD8+-T-림프구(표현형: CD8+, CD16+)에 전적으로 기여하는 FITC-매개 형광을 검출함으로써 삼색 형광분석을 실시하였다. 유사하게, CD56+(PE)을 위한 양성 게이트 및 CD3+--세포(삼색)를 위한 음성 게이트를 사용하고, CD56+-T-림프구로부터 오염신호없이 NK-세포(표현형: CD56+, CD3-)에 전적으로 기여하는 FITC-매개 형광을 검출함으로써 삼색 형광분석을 실시하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 2-B-5 히브리도마 항체는 다른 공여체로부터의 T-림프구 및 NK-세포 모두의 표면에 특이적으로 결합한다.
실시예 5: 샌드위치-ELISA에 의한 2-B-5 항체의 제타 사슬 특이성 확인
샌드위치 ELISA는 단일클론항체 2-B-5의 제타-사슬-특이성을 확인하기 위해 실시하였다.
상기 목적을 위해, 제타-사슬을 발현하는 것으로 알려진 정제된 CD8+-T-림프구로부터의 세포용해물을 제조하고, 세포내 제타-사슬 도메인을 인식하는 고정화 항체와 함께 배양하였다. 세포용해물로부터의 제타-사슬 분자는 상기 항체에 의해 포합될 수 있었으며, 그후에 제타-사슬의 짧은 세포외 일부에 대한 2-B-5 항체에 의해 검출될 수 있었다. CD8+-림프구의 분리는 실시예 1에 기술된 바와 같이 상자성체 비드에 의해 실시하였다. 상세한 단계는 제조사 지시(Dynal, Oslo, Norway)에 따라 수행되었다. 프로테아제 억제인자 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)(Merck, Darmstadt)의 존재하에서 세척제 NP-40(Sigma, Deisenhofen)에 의해 정제된 CD8+-세포를 분해하였다. 완충배합물을 보다 상세히 하기 위해, Sambrrok, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Hobart, NY(1989)를 참고한다.
샌드위치-ELISA는 하기와 같이 실시하였다:
제타 사슬의 카르복시=말단에서 아미노산 144-163을 인식하는 제타-사슬 특이항체(Santa Cruz Biotechnology, Cat-No 1124)는 5㎍/㎖의 농도에서 96U-바닥판(Nunc, maxisorb)의 웰에 코팅하였다. 코팅은 4℃에서 밤새 실시되었으며, 실온에서 1시간동안 PBS내 3% BSA에 의해 하기 차단을 실시하였다. 그후에, CD8+-세포의 용해물을 희석하지 않은채 첨가하고, 수차례 희석한후, 1시간동안 배양하였다. 음성대조군으로서, 세포용해물 대신에 PBS와 함께 웰을 배양하였다. 하기 단계에서, 정제된 단일클론항체 2-B-5를 1㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 1시간동안 배양하였다. 결합된 2-B-5 항체를 비오틴화 마우스-항-쥐 IgM 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA; Cat-No 03-9840; 작업농도 400ng/㎖) 및 아비딘-퍼옥시다아제-결합물(Dako, Hamburg; Code-No P 03347; 작업농도 1㎍/㎖)에 의해 검출하였다. ABTS-기질 용액을 첨가함으로써 ELISA를 최종발달시켰다(Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat-No. 1682008). 착색된 침전물은 ELISA-해독기를 사용하여 405㎚에서 측정하였다.
쥐 IgM 항체 2-B-5는 제조사의 매뉴얼에 따라 베이커본드(Bakerbond) Abx 컬럼(J.T. Baker, Greisheim, Germany)을 사용한 이온교환크로마토그래피에 의해 히브리도마 배양상층액으로부터 정제하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 단일클론항체 2-B-5는 세포내 제타-사슬 도메인을 인식하는 부동화 항체에 의해 포획된 T-세포용해물로부터의 제타-사슬 분자에 결합하며, 제타-특이적 ELISA-신호는 용해물 희석에 따라 엄격히 다르며, 음성 대조군의 범위 이상으로 구별된다.
실시예 6: 제타 항체 2-B-5의 가변영역의 클로닝 및 E.coli내 대응 Fab-단편의 발현
콤친스키(Chomczynski)외 다수의 방법(Anal Biochem, vol. 162, p. 156-9, 1989)에 따라 쥐 히브리도마 세포계 2-B-5의 5×106세포로부터 분리하였다. 전체 RNA는 표준 프로토콜(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 제2판)에 따라 MMLV 역전사효소 슈퍼스크립트(Superscript) Ⅱ(Gibco BRL, Eggenstein)에 의해 역전사되었다. cDNA의 특이적 프라이밍(priming)은 쥐 μ-사슬의 정상부의 짧은 서열과 매칭하는 2개의 올리고뉴클레오티드된 ratcmuRT(GTGCAGGGCCAGAGAAGGCATC) 및 L(카파) 사슬의 3'-비해독 영역의 일부에 상보적인 ratckRT(GTAGGTCGCTTGTGGGGAAGTCTC)에 의해 실시하였으며, 각 프라이머는 전사물 IgM-CH1-H 사슬 도메인 또는 카파 L 사슬의 정상부를 각각 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 말단으로부터 약 70염기쌍(bp) 하류에 위치되어 있다. 상기 두 경우에, 뉴클레오티드 정보는 카파사슬에 대한 유전자은행 데이터베이스(GenebackDatabase)(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez): Shepard and Gutman, Accession No. J02574 and for the mu chain: Parker, K.E., Accession No. X68312로부터 얻었다. 그후, cDNA의 첫번째 가닥은 표준 프로토콜에 따른 말단 전이효소(Pharmacia, Freiburg)를 사용하여 폴리-G가 테일되어(tailed) 있었다. 테일된 cDNA는 Gilliland, L.K.외 다수의(Tissue Antigens 47, 1-20, 1996)에 개시된 앵커 프라이머 서열에 기초한 폴리-C 스트렛치를 함유하는 센스 프라이머를 사용하여 PCR-증폭되고, 5'-AncTail(CGTCGATGAGCTCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCD)이 되었다. 상기 앵커 프라이머는 카파 L 사슬 일정영역 또는 IgM-CH1 H 사슬 도메인의 C-말단을 각각 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적인 안티센스 프라이머와 조합되었다. 상기 프라이머는 3' ratch(GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA) 및 3'ratcmu(ATTGGGACTAGTCTCAACGACAGCTGGAAT)로 라벨된다. PCR은 하기와 같이 실시되었다: 일차 변성: 94℃에서 4분; 증폭 30주기: 93℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초; 최종 신장: 72℃에서 3분. 각 프라이머는 EcoRI/XbaI 또는 EcoRI/SpeI에 의해 각각 소화되는 플라스미드 벡터로 대응 PCR-단편을 클로닝하는 제한효소 절단부위(5'-AncTail: EcoRI; 3'ratck: XbaI; 3'ratcmu: SpeI)를 포함하며; 이를 위해, 블루스크립트 KS+ 플라스미드 벡터(Genebank Accession No X52327)가 사용되었으며, 이는 상기 벡터로 인해 통상적인 시퀀싱 프라이머를 사용하여 결과 삽입물의 서열분석이 용이해지기 때문이다. H 사슬의 변화가능한 영역(VH)내 내부 SpeI 절단부위로 인해, VH-도메인의 완전한 서열정보를 얻기 위해 전체길이의 단편의 클로닝이 필요했다. 일부 소화는 표준 프로토콜에 따라 실시되었다(Sambrook, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, 제2판). H 및 L 사슬 단편의 여러 클론은 각각 동일한 서열을 가지는 것으로 입증되었으며, 기능성 VL- 또는 VH-영역 중 하나를 코딩하는 것으로 확인되었다(도 6 및 7 참조).
두 변성가능한 사슬의 성숙한 N-말단은 Genebank database에서 발견된 서열과 비교함으로써 확인되었으며(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/), 그 후에 PCR-프라이머의 제2 셋트는 2-B-5 Fab-항체 단편의 코딩서열을 갖고, 세균발현벡터로 서브클로닝하기 위한 조건과 관련된 프레임내에 적당한 제한효소 절단부위를 도입하기 위해 디자인되었다. 2개의 프라이머가 5'RVHZXhoI (CAGGTACAGCTGCTCGAGTCTGGGGCTGACGTAG) 및 5'RVKZSacI (GTAAATGTGAGCTCCAGATGACACAGTCTCCTG)로 라벨되며, 3' ratcmu 및 3' ratck 프라이머와 각각 조합하여 사용되었다. 적당한 제한효소 조합(H 사슬단편에 대한 XhoI/SpeI 및 카파 L 사슬에 대한 SacI/XbaI)에 의한 PCR-증폭 및 소화후에, 결과 DNA-단편을 대응하여 제조된 블루스크립트 플라스미드 벡터로 따로 클론되었으며, 확인을 위해 서열화되었다(서열화 결과는 도 6 및 7을 참조함).
E.coli의 주변세포질에서 2-B-5-Fab-단편을 발현시키기 위해, 제한효소 SacI/XbaI를 사용하여 블루스크립트 KS+로부터 대응하는 카파 L 사슬이 제거되고, 같은 효소로 소화시킴으로써 제조된 벡터 pComb3HHis로 서브클론되었다. 그후, 결과 플라스미드를 제한효소 XhoI/NheI로 소화시키고, 2-B-5 H 사슬 Fd-단편(VH+CH1)을 위한 벡터로서 사용하고; 상기 DNA-단편을 제한효소 XhoI/SpeI에 의해 대응하는 블루스크립트 KS+-클론으로부터 제거하였다.
pComb3HHis는 하기의 변형에 의해 pComb3H 및 pComb3으로부터 유도되었다(Barbas 외 다수, Proc Natl Acad Sci USA 88, 7978-82(1991)): pComb3H 벡터가 NheI에 의해 절단되고, 적당한 말단을 갖는 이중가닥 올리고뉴클레오티드가 결찰에 의해 삽입되었다. 이중가닥 올리고머는 2개의 5'-인산화 프라이머 His6s(CTAGCCATCACCATCACCATCACA) 및 His6as(CTAGTGTGATGGTGATGGTGATGG)를 어닐링함으로써 제조되었다(94℃에서 10분; 65℃에서 30분; 52℃에서 30분; 및 30℃에서 10분). 벡터와의 융합후, 3'NheI 제한위치가 파괴되는 반면, 5'NheI 절단부위가 그대로 남아있는 방법으로 디자인되었다. 마지막으로, 삽입물은 성공적인 클로닝을 확인하기 위해 서열화되었다.
주변세포질 제조예는 삼투압 쇼크에 의해 실시되었으며, 제타-펩티드-KLH-결합체에 대한 Fab-단편 결합에 대해 ELISA 시험되었다. 상기 목적을 위해, 2-B-5의 카파 L 사슬 및 H 사슬 Fd-단편을 포함하는 pComb3HHis에 의해 형질전환된 E.coli XL1 Blue의 단일 콜로니를 카르베니실린(Carbenicilline) 및 20mM MgCl2가 보충된 슈퍼 브로쓰-매질 10㎖내에서 배양하고, 1mM의 최종농도로 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가함으로써 6시간후에 Fab-발현을 유도하였다. 상기 세포를 20시간후에 채취하고, PBS 1㎖에 재용해하였다. -70℃에서 동결시키고, 37℃에서 해동시키는 것을 4회함으로써 세균의 외막을 파괴하고, Fab-단편을 포함한 가용성 주변세포질 단백질을 상층액으로 방출시켰다. 원심분리에 의해 온전한 세포 및 세포잔해를 제거한후, 제타-Fab-항체-단편을 함유하는 상층액을 수집하고, 추가의 시험을 위해 사용하였다.
클론된 단일클론항체 2-B-5의 주변세포질에서 발현된 Fab-단편을 제타-펩티드-KLH-결합체에 결합시키는 것은 하기의 ELISA에 의해 분석되었다: 항체를 웰당 인산완충식염수(PBS) 50㎕내 200㎍/㎖의 농도로 96U 웰 ELISA 플레이트상(nunc maxisorb)에 고정시켰다. 코팅은 4℃에서 12시간동안 실시되었으며, PBS/0.05% Tween에 의해 1회 세척되었다. ELISA는 PBS/3% 소혈청 알부민(BSA)에 의해 1시간동안 지속적으로 블록되었으며, 1회 더 세척되었다. 그후, 희석되지 않고, 그리고 여러번 희석된 Fab-함유 주변세포질 제조물을 첨가하고, 2시간동안 배양하였다. 제타-펩티-KLH-결합체에 결합된 Fab-단편을 검출하기 위해, 1:200으로 희석된 설균목 항-His-tag 항체(Dianova, Hamburg, cat. no DIA900)를 사용하고, 1:5000으로 희석된 퍼옥시다제 결합된 폴리클론 염소 항체-마우스 IgG(Fc-감마 특이적(Dianova/Jackson, Hamburg, cat no. 115-035-071)을 사용하였다. ABTS-기질 용액을 첨가함으로써 ELISA를 마지막으로 개발하였다(Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat-No. 1682008). 착색된 기질의 교체수는 OD 405㎚에서 ELISA-리더에 의해 측정되었으며; 그 결과는 도 5에 도시되어 있다. 음성대조군으로서, 주변세포질 제조물대신에 PBS와 함께 웰을 배양하였다.
제타-펩티드-KLH-결합체에 대한 여러 클론의 특이적 결합은 도 5에 도시된 클론 8 및 9의 결과에 의해 검출될 수 있었다. 신호 강도는 음성대조군 이상으로 구별되며, 샘플 희석액에 의해 적정될 수 있었다. 클론된 2-B-5-Fab-단편의 제타-사슬 특이성을 확인하였다.
실시예 7: 항-제타-사슬 항체 2-B-5에 의한 T-림프구 및 NK-세포의 자극
본 실험의 목적은 항-제타-사슬 항체 2-B-5에 의해 유도된 T-세포, NK-세포 및 PBMC의 자극 및 증식을 분석하기 위함이다. 상기 목적을 위해, DNA-합성동안 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입의 측정에 기초한 비색측정 면역분석을 사용하였다(Boehriner Mannheim, Mannheim, Cat. No. 1647229).
상기 첫번째 분석단계는 여러 희석액내 2-B-5 항체의 정제물(실시예 5의 2-B-5의 정제)에 의해 96-웰 바닥이 평평한 미량역가판을 코팅하는 것이다. 코팅은 4℃에서 밤새 수행하였다. PBS에 의한 세척 3회후, 100,000개의 CD8+-T-림프구, NK-세포 및 비분리 PBMC를 각각 미량역가판의 웰에 첨가하고, 자성 비드 및 일차항체 항-CD8(MT-811) 및 항-CD16(3GB, 마우스 IgG1, Dianova, Hamburg, Cat. No 0813)을 사용하여 실시예 2에 제공된 바에 따라 CD8+-T-림프구 및 NK-세포를 각각 분리하였다.
2-B-5 매개된 자극의 특이성을 조절하기 위해, 부적절한 특이성을 갖는 동형 항체(rat IgM)를 같은 농도로 사용하였다. 인간 CD3-결합체를 인식하는 항체 OKT3(동형 IgG2a, Ortho., Prod. Code 710320, Johnson + Johnson, New York, USA)을 T-세포 및 비분리된 PBMC를 각각 자극하기 위한 1㎍/㎖의 코팅농도에서 특이적 양성대조군으로서 사용되었다. 부적절한 특이성의 설균목 IgG2a-항체는 OKT3을 위한 동형대조군으로서 사용되었다. 블랭크 대조군(세포없는 웰) 및 배경대조군(BrdU 없는 웰)도 또한 포함되었다. 3일 배양후, BrdU-라벨 용액을 24시간동안 첨가하였다. 상기 라벨기간동안, 피리미딘 유사물질 BrdU를 증식세포의 DNA에 티미딘의 위치에서 혼입하였다. 배양배지를 제거한후, 세포를 고정시키고, 변성용액 첨가에 의해 DNA를 1단계로 변성시켰다. 상기 DNA의 변성은 퍼옥시다아제와 결합된 항-BrdU-항체에 의해 검출하기 위해 혼입된 BrdU의 반응성을 향상시키기 위해 필요하다. 상기 항체는 새로 합성된 세포 DNA내에 혼입된 BrdU에 결합한다.
결합된 항-BrdU-항체는 지속적인 기질반응에 의해 검출되었다. 반응생성물은 ELISA 리더에 의해 정량화되었다. 450㎚의 파장에서 흡광도 값에 의해 측정되는, 착색된 기질의 교체수는 DNA-합성 수준 및 증식세포 수와 직접 결합되어 있다. 모든 단계들은 킷 제조회사의 매뉴얼에 기술된 바에 따라 수행되었다.
도 8에 도시된 상기 분석결과는 항체 2-B-5가 T-림프구 및 NK-세포 모두상의 제타-사슬의 짧은 세포외 도메인에 결합할 뿐만 아니라, 상기 상호반응에 의해 두 세포형의 강한 자극을 유도한다는 것을 분명하게 입증해준다.
실시예 8: 항-제타-사슬 항체를 결합시킴으로써 유도된 TCR/CD3 복합체 내부이행의 흘림세포계측법 분석
많은 수용체에 대해, 리간드 결합에 의한 활성화후에 수용체 내부이행을 실시하였다. 따라서, T-세포상의 TCR-복합체의 신속한 내부이행은 항-CD3-항체의 결합후에 전형적으로 발견된다. 따라서, 그의 세포외 제타-사슬 에피토프를 통한 TCR-결합체에 결합한후 2-B-5 항체의 내부이행은 본 발명의 항체의 고유 특이성을 확인시켜준다(Boyer, C., Auphan, N., Luton, F., Malburet, J.M., Barad, M.,Bizozzero, J.P., Reggio, H., and Schmitt-Verhulst, A. M. (1991)). T-세포 수용체/CD3 결합체 내부이행후 세포용해성 T 세포 클론의 활성화는 단백질 키나아제 C-독립성 스타우로스포린-민감성 단계에 대한 증거이다(European Journal Of Immunology 21, 1623-34).
T-세포 표면에 대한 2-B-5 항체의 결합후 수용체 내부이행을 시험하기 위해, 다른 온도에서 흘림세포계측 분석을 실시하여, 표면-결합된 항-제타-사슬 항체가 사라짐을 확인하였다.
상기 목적을 위해, 건강한 공여체의 말초혈액으로부터 단핵세포를 피콜-밀도 구배 원심분리에 의해 분리하였다. 미량역가판의 각 웰에서 200,000개의 단핵세포를 4℃ 또는 37℃에서, 캡핑이 일어나기에 충분한 30분 또는 60분동안 1㎍/㎖의 농도로 항-제타-사슬 항체 2-B-5와 함께 배양되었다. 양성대조군으로서, 쥐-항-인간 CD3 항체(쥐 IgG2B)에 의해 평행실험을 실시하였다(클론 26Ⅱ 6-5). 캡핑 과정은 냉 PBS에 의해 2회 세척함으로써 종결되었다. 세포표면 결합항체를 라벨하기 위해, 세포는 PBS내에서 1:100 희석된 플루오레세인(FITC) 결합된 염소-항-쥐 Ig(IgG + IgM) 항체(Dianova/Jackson, Hamburg, Cat. No. 112-016-044)와 함께 배양되었다. 음성대조군으로서, 2차 항체만 사용하였다. 라벨된 세포는 PBS/0.1% 파라포름알데히드에 의해 고정하기 전에, PBS로 2회 세척하였다.
FACS-scan상에서 흘림세포계측법에 의해 세포를 분석하였다(Becton Dickinson, Heidelberg). FACS 염색 및 형광강도의 측정은 Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992)에 기술된 바에 따라 수행되었다.
분명하게 증명된 결과로서, 37℃에서 배양된 세포샘플과 4℃에서 배양된 세포샘플사이의 형광강도의 명백한 상승은 항 제타 사슬 항체 2B5의 결합후에 관찰될 수 있었다. 유사한 내부이행 패턴은 항-CD3 항체의 결합후에 관찰될 수 있었다. 37℃에서의 수용체 내부이행과 대조적으로, 캡핑을 위한 비허용온도인 4℃에서 배양된 샘플은 변형되지 않은 형광패턴을 나타냈다.
실시예 9: 본 발명의 항-제타 사슬 특이성에 기초한 이특이적 항체의 제조
항-제타 scFv-단편을 얻기 위해, 별개의 플라스미드 벡터로 클론된 대응 VL- 및 VH-영역은 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 5'VL2B5BsrGI-EcoRV/3'VL2B5GS15 및 5'VH2B5GS15/3'VH2B5BspEI 각각을 사용한 VL- 및 VH-특이적 PCR을 위한 주형으로서 제공되었다. 그럼으로써, 오버랩핑 상보서열을 PCR-생성물에 도입하고, 조합시켜 지속적인 융합-PCR동안 15-아미노산(Gly4Ser1) 3-링커의 코딩서열을 형성하였다.
상기 증폭단계는 프라이머 쌍 5'VL2B5BsrGI-EcoRV/3'VH2B5BspEI에 의해 수행되었으며, 결가 융합생성물(또는 항-제타-사슬 scFv-단편)은 제한효소 EcoRV 및 BspEI에 의해 제거되므로, 플라스미드로 클론되어(PCT/EP98/07313에 기술됨), 정제 및 분석목적을 위해 C-말단에서 히스티딘 태그 뿐만 아니라 EpCAM 항원에 대한 결합특이성을 갖는 scFv-단편을 함유하는 같은 제한효소에 의해 소화됨으로써 제조되었다. 그 후에, 도메인 서열 VL항제타-VH항제타-VH항EpCAM-VL항EpCAM을 갖는 항-제타-사슬/항-EpCAM 이특이적 단일사슬 항체를 코딩하는 DNA-단편은 EcoRI/SalI을 포유동물발현벡터 pEF-DHFR로 서브클론시켰다(Mack, M., Riethmuller, F., and Kufer, P. (1995)). 작은 이특이적 항체 구조물은 높은 암세포 세포독성을 갖는 기능성 단일-사슬 분자로서 발현되었다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7021-5).
서열확인후(도 10), 결과 플라스미드-DNA는 전기천공법에 의해 DHFR-결핍 CHO-세포로 형질도입되었으며; 안정한 형질도입체 선별, 유전자 증폭 및 단백질 생성은 Mack외 다수에 따라 수행되었다. 이특이적 항체는 Mack외 다수에 따라 Ni-NTA-컬럼상 친화도 크로마토그래피에 의해 그의 C-말단 히스티딘 태그를 통해 정제되었다.
프라이머 목록
5'VL2B5BsrGI/EcoRV 5'-AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GAT GAC ACA GTC
TAA-3'
3'VL 2B5 GS15 5'-GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT
CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3'
5'VH 2B5 GS15 5'-GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG
GTA CAG CTG CAG CAA TCT GG-3'
3'VH 2B5 BspEI 5'AAT CCG GAA GAG ACA GTG ACC AGA GTG-3'
실시예 10: 이특이적 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체에 의한, EpCAM-양성 표적 세포에 대해 변경된 PBMC 및 CD8+-T-림프구의 세포독성 활성
본 실험에서, 표적 세포를51Cr로 라벨하고, 20:1의 작동체:타겟 비율로 작동체 세포와 혼합하고, 그 후에 다른 농도의 이특이적 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체와 함께 배양하였다. 표적 세포 킬링을 통해 상층액에 방출된51Cr의 양을 정량화하고, 각 항체 농도에 대해 특이적 세포용해의 속도를 계산하였다. 상기 분석을 위해, 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 세포독성 T-림프구를 건강한 공여체의 새 버피코트로부터 작동체 세포로서 분리하였다. PBMC를 피콜 밀도-구배 원심분리, 그후에 원심분리 단계에 의해 분리하여(100g), 혈소판을 제거하였다. 세포독성 T-림프구를 분리하기 위해, CD8+ 서브셋 컬럼 킷(R&D systems, Wiesbaden, Cat-No. HCD8C-1000)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 200,000개의 자극되지 않은 PBMC 또는 CD8+ T-림프구를 둥근바닥 미량역가판의 각 웰에 10% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지 100㎕의 부피로 첨가하였다. 표적 세포로서, 카토(Kato) Ⅲ(ATCC HTB-103), 즉 크롬-51로 1시간동안 라벨된 EpCAM 양성 위암세포계(NEN-Life Science, Koeln; Cat-No NEZ030S)(대략 100μCi와 함께)를 사용하고; 100㎕의 부피내에 10,000개의 표적 세포를 미량역가판의 각 웰에 첨가하였다. 이특이적 항체를 50㎕의 부피내에서 40ng/㎖ 내지 5㎍/㎖의 농도로 첨가되었다. 미량역가판은 37℃에서 16시간동안 5% CO2에서 배양하였다. 배양주기 종반에, 상층액 50㎕를 각 웰로부터 제거하고, 감마 계수에서 방출된51Cr에 대해 분석하였다(Wallac, 1480 Wizard 3", Freiburg). 최대51Cr 방출은 트리톤-X 100을 함유하는 완충액(PBS내 1.0%)에 의해 표적 세포를 분해함으로써 측정되었다. 자발적51Cr 방출은 작동체 세포 및 이특이적 항체없이 표적 세포를 배양함으로써 측정되었다. 표적 세포와 이특이적 항체와의 배양은 측정가능한 분해를 얻지 못했다. 특이적 분해는 하기와 같이 계산하였다: 특이적 방출(%) = [(실험적 방출(cpm))-(자발적 방출(cpm))]/[(최대방출(cpm))-(자발적 방출(cpm))]×100. 모든 실험은 3회 반복실시되었다. 3회결과내 SD는 모든 실험에서 6% 이하였다.
분리된 CD8+작동체 세포의 순도는 흘림세포계측법에 의해 분석하였으며, NK-세포에 의한 오염은 PE 결합된 항 인간 CD56 항체에 의해 염색함으로써 배제되었다. FACS-분석은 실시예 1에 기술된 바대로 수행되었다. 하기 항체 결합체가 사용되었다: FITC 항 인간 CD3; (Pharmingen Cat-No 30104X) 1:50; PE 항 인간 CD56; (Becton Dickinson Cat-No 347747) 2:10; 삼색 마우스 항 인간 CD8(Caltac Lab Code NoMHCD0806) 1:100(Becton Dickinson). FACS 분석결과는 CD8+세포군집의 높은 순도를 확인시켜주었다(＞99%).
크롬 방출 분석의 결과(도 11)는 EpCAM 양성 카토 Ⅲ 세포에 대한 비자극성 PBMC 또는 CD8+ 세포독성 T-림프구를 변경시키기 위한 이특이적 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체의 능력을 분명하게 입증한다. 분리되지 않은 PBMC에 의해 매개된 특이적 분해와 분리된 세포독성 T-림프구 사이의 차이는 NK-세포의 세포독성 기여에 의해 설명된다.
실시예 11: 이특이적 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체에 의한 EpCAM-양성 표적 세포에 대해 변경된 NK-세포의 세포독성 활성
본 실험은 EpCAM 양성 표적 세포에 대한 NK-세포를 변경시키기 위한, 이특이적 항-제타-사슬/항-EpCAM 항체의 능력을 입증하기 위해 고안되었다. 상기 분석을 수행하기 위해, NK-세포 분리 킷을 사용하여 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 분리하였다(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach; Order No 465-02). 분리계획은 비-NK-세포의 자성 소실에 기초한다. T 세포, B 세포, 단핵구, 호염기성 세포, 수상 세포 및 혈소판은 합텐-결합된 CD3, CD14, CD19, CD36 및 항-IgE 항체의 칵테일을 사용하여 간접라벨되며, 그후 상자성 비드가 항-합텐 단일클론 항체에 결합되었다. 자성 비드와 결합된 세포는 자기장에 의해 보유되었다. 라벨되지 않은 NK-세포는 컬럼을 통해 세척되고, 접촉되지 않은 상태로 유지되었다. 둥근바닥 미량역가판의 각 웰에 10% FCS이 보충된 RPMI 1640 배지 100㎕에 3개의 다른 건강한 공여체 각각으로부터 100,000개의 NK-세포를 첨가하였다. 타겟으로서, 각 웰(각 100㎕의 부피로 웰당 표적 세포 10,000개)에51Cr-라벨된 카토 세포를 첨가하였다. 이특이적 항체는 50㎕의 부피에서 1㎍/㎖의 농도로 첨가되었다. 미량역가판은 37℃에서 5% CO2에서 4시간동안 배양하였다. 배양 종반에, 상층액 50㎕를 제거하고, 감마 계수에서 방출된51Cr에 대해 분석하였다(Wallac, 1480 Wizard 3", Freiburg). 최대51Cr 방출은 세정제를 함유하는 버퍼(PBS내 1.0% 트리톤-X 100에 의해 표적 세포를 분해함으로써 측정되었다. 자발적51Cr 방출은 작동체 세포 및 이특이적 항체 없이 표적 세포를 배양함으로써 측정되었다. 이특이적 항체와 표적 세포의 배양은측저가능한 분해를 얻어내지 못했다. 특이적 분해는 하기와 같이 계산하였다: 특이적 방출(%) = [(실험적 방출(cpm))-(자발적 방출(cpm))]/[(최대방출(cpm))-(자발적 방출(cpm))]×100. 모든 실험은 3회 반복실시되었다. 3회결과내 SD는 모든 실험에서 6% 이하였다.
분리된 NK-작동체 세포의 순도는 흘림세포계측법에 의해 분석하였으며, CD8+세포에 의한 오염은 삼색 결합된 마우스 항 인간 CD8 항체에 의해 염색함으로써 배제되었다. FACS-분석은 실시예 1에 기술된 바대로 수행되었다. 하기 항체 결합체가 사용되었다: FITC 항 인간 CD3; (Pharmingen Cat-No 30104X) 1:50; PE 항 인간 CD56; (Becton Dickinson Cat-No 347747) 1:20; 삼색 마우스 항 인간 CD8(Caltac Lab Code NoMHCD0806) 1:100(Becton Dickinson). FACS 분석결과는 NK-세포군집의 높은 순도를 확인시켜주었다(＞98%).
크롬방출 분석결과(도 12)는 모든 세 경우에, EpCAM 양성 표적 세포에 대한 NK-세포를 변경시킬 수 있는 재생력을 입증한다.
Claims (29)
- 항체의 가변영역의 적어도 1개의 상보적 결정영역(CDR)을 인코딩하는 핵산서열을 포함하며, 상기 항체는 인간 제타-사슬의 세포외 도메인과 특이적으로 상호반응하며, 상기 항체는 주르캇 세포에 의한 쥐의 면역화 이후에, 쥐 제타-사슬의 11개의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드와 담체 분자를 포함하는 결합체에 의해 면역화함으로써 얻어질 수 있는 핵산분자.
- 제 1 항에 있어서,상기 핵산분자는 상기 가변영역의 적어도 2개의 CDR을 인코딩하는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 핵산분자는 상기 가변영역의 3개의 CDR을 인코딩하는 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 핵산서열은 VH사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 핵산서열은 VL사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산분자는 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 CDR은 하기 뉴클레오티드 서열 중 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산분자:(a)서열번호 1(b)서열번호 3(c)서열번호 5(d)서열번호 7(e)서열번호 9(f)서열번호 11
- 제 4 항에 있어서,상기 VH-사슬은 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지거나, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 5 항에 있어서,상기 VL-사슬은 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가지거나, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 CDR은 하기 아미노산 서열 중 하나를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자:(a)서열번호 2(b)서열번호 4(c)서열번호 6(d)서열번호 8(e)서열번호 10(f)서열번호 12
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
- 제 11 항의 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 숙주.
- 적당한 조건하에서 제 12 항의 숙주를 배양하는 단계와 배양액으로부터 상기 (폴리)펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자에 의해 인코딩된 (폴리)펩티드를 제조하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자에 의해 인코딩되거나, 또는 제 13 항의 방법에 의해 제조되는 (폴리)펩티드.
- 제 14 항의 적어도 하나의 (폴리)펩티드를 포함하는 항체 또는 단편 또는 그의 유도체.
- 단일클론 항체인 제 15 항의 항체.
- 이특이적 항체인 제 15 항의 항체.
- 제 17 항에 있어서,제1 특이성은 온전한 세포의 표면상에서 인간 제타-사슬의 세포외 도메인에 대한 것이며, 제2 특이성은 T-림프구, 자연 킬러세포 또는 그의 전구물질의 표면상에서 선택적으로 다른 분자에 대한 것임을 특징으로 하는 항체.
- 제 17 항에 있어서,제1 특이성은 온전한 세포의 표면상에서 인간 제타-사슬의 세포외 도메인에 대한 것이며, 제2 특이성은 다른 세포, 바람직하게는 T-세포, NK-세포 또는 그의 전구물질과 다른 세포의 표면상에서 다른 분자에 대한 것이며, 상기 다른 분자는 항원존재세포(APC), 가장 바람직하게는 수지 세포상 또는 비-APC상 바이러스 인코딩 항원, 암관련 항원 또는 표면 항원인 것을 특징으로 하는 항체.
- scFv 사슬인 제 15 항의 유도체.
- IgM인 제 16 항의 항체.
- 같거나 다른 세포상 표면분자와 상호반응하는 제 14 항의 (폴리)펩티드 및 자연 수용체, 자연 리간드 또는 그의 유도체를 포함하며, 상기 수용체 또는 리간드는 CD4, CTLA-4, B7-1, B7-2, LFA-3, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 또는 MIP-1α, MIP-1β, RANTES 또는 SDF-1과 같은 케모킨인 것을 특징으로 하는 이특이적 수용체.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자, 제 11 항의 벡터, 제 12 항의 숙주, 제 14 항의 (폴리)펩티드, 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 또는 그의 유도체 및/또는 제 22 항의 이특이적 수용체를 포함하는 약학조성물.
- 자가면역질병, 면역결핍, T-세포 악성종양, 전염병을 치료 또는 예방하거나, 또는 조직이식후 이식편거절반응을 피하기 위해 면역반응을 억제하기 위한 약학조성물을 제조하는데 사용되는 제 18 항의 항체의 용도.
- 악성종양, 바이러스 감염 또는 기타 전염병을 치료 또는 예방하기 위한 약학조성물을 제조하는데 사용되는 제 19 항의 항체의 용도.
- NK-세포 의존성 면역을 향상 또는 억제하거나, 또는 NK-세포 유도성 악성종양을 치료하기 위한 약학조성물을 제조하기 위해 사용되는 제 14 항의 (폴리)펩티드 또는 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체 또는 단편 또는 그의 유도체, 또는 제 22 항의 이특이적 수용체의 용도.
- (a)제 14 항의 (폴리)펩티드 또는 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 항체 또는 단편 또는 그의 유도체를 상기 NK-세포, T-림프구 또는 그의 전구물질과 접촉시키는 단계; 및(b)결합된 (폴리)펩티드, 항체 또는 유도체의 양을 평가하는 단계를 포함하는, NK-세포, T-림프구 또는 그의 전구물질상의 제타-사슬 또는 에타-사슬 발현을 측정하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자, 제 11 항의 벡터, 제 12항의 숙주, 제 14 항의 (폴리)펩티드, 제 15 항 내지 제 21 항의 항체 또는 단편 또는 그의 유도체 및/또는 제 22 항의 이특이적 수용체를 포함하는 킷.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 핵산분자의 적어도 1개의 복제물 또는 제 11 항의 벡터를 생식계열내에 포함하는 유전자도입 동물.
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