CN1308675A - 与人ζ链胞外域特异性相互作用的免疫制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核酸分子,其序列编码一种抗体的可变区的至少一个互补决定区(CDR),该抗体特异性地与人ζ链的胞外域反应,该抗体可以通过先用Jurkat细胞,接着用载体分子与含有大鼠ζ链N末端11个氨基酸的肽构成的偶联物免疫大鼠来制取。较好的是,本发明核酸分子所编码的肽或多肽是一种单特异性或双特异性抗体。本发明还涉及包含本发明的核酸分子或抗体的药物组合物,还涉及包含上述化合物的试剂盒。最后,本发明还涉及用本发明抗体测定NK细胞、T细胞或其前体细胞上ζ链或η链表达的方法。

Description

与人ζ链胞外域特异性相互作用的免疫制剂

本发明涉及一种核酸分子，它含有编码一种抗体的可变区的至少一个互补决定区(CDR)的核酸序列，该抗体特异性地与完整细胞表面的人ζ(zeta)链的胞外域相互作用，该抗体可以通过先用Jurkat细胞，接着用载体分子与含有大鼠ζ链N末端11个氨基酸的肽构成的偶联物免疫大鼠来制取。较好的是，本发明核酸分子所编码的肽或多肽是一种单特异性或双特异性抗体。本发明还涉及含有本发明核酸分子或抗体的药物组合物，还涉及含上述化合物的试剂盒。最后，本发明还涉及用本发明抗体测定NK细胞、T细胞或它们前体细胞上ζ链或η(eta)链表达的方法。

ζ链属于一族结构功能相关的信号转导分子，该家族还包括η链(ζ链的另一种剪接形式)和高亲合性IgE-Fc-受体FcεRI的γ链。这一族跨膜蛋白的共同特征是它们的长胞内域，该结构域包含一个或数个ITAM基序(免疫受体的酪氨酸活化基序；ζ：3，η：2，γ：1)和9(ζ，η，序列相同)或4(FcεRI-γ)个氨基酸的极短的胞外域。这些蛋白的胞外域序列在小鼠、大鼠和人之间100％保守，而且可能还与其他物种之间保守。

ζ链仅在T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞以及(一定程度上)在它们的前体细胞上表达为同源二聚体或与η链的异二聚体。在成熟T淋巴细胞表面上，ζ链在结构和功能上与T细胞受体(TCR)和CD3-复合物密切相关。通过TCR参与诱导的信号经CD3和ζ链转导入T细胞的细胞质，其中，与构成CD3-复合物的ε、δ和γ链(不是FcεRI-γ)上的单个ITAM相比，ζ链上的三个ITAM提供了主要的信号放大作用。

在NK细胞表面，ζ链与IgG-Fc-受体(FcγRIIIA)表现出相似的关联性。当抗体覆盖的靶细胞通过FcγRIIIA被NK细胞识别时，产生的信号通过ζ链和/或γ链转导给细胞质，于是激活NK细胞裂解被识别的靶细胞(ADCC，依赖于抗体的细胞毒性)。

因此，成熟T淋巴细胞上的TCR复合物是一种由多条链(TCR-α/β或TCR-γ/δ与CD3ε、CD3δ、CD3γ和ζ链或它的另一剪接产物η)偶联构成的寡聚结构(Keegan，今日免疫学Immunology Today)13(1992)，63-68)。由缺乏胞质内信号转导域的多形TCR-α/β或TCR-γ/δ异二聚体识别抗原。不变的CD3蛋白(γ/δ和δ/ε异二聚体)和ζ或η链(ζ同源二聚体或ζ-η异二聚体)是正确装配、运输和在细胞表面有效表达完整TCR复合物，以及转导TDR信号所必需的(Clevers，免疫学评论年报(Annu.Rev.Immunol.)6(1988)629-662，Ashwell，免疫学评论年报8(1990)，139-167)。信号的传递必需一段保守的18氨基酸序列(Reth，自然(Nature)338(1989)383-384，Samelson，J.，生物化学(Biol.Chem.)267(1992)24913-24916)，称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，它在ζ链中有三份，η链中有两份，各CD3亚基中(γ、δ和ε)中有一份。每个ITAM都含有一对酪氨酸-X-X-亮氨酸/异亮氨酸(Y-X-X-L/I)基序，相隔10或11个氨基酸(Cambier，今日免疫学16(1995)110)。TCR连接后，每个ITAM内的酪氨酸残基迅速磷酸化，并起着信号蛋白停靠位点的作用，信号蛋白通过src-同源性-2(SH2)结构域与磷酸酪氨酸结合(Cooke，细胞(Cell)65(1990)281-291，Glaischenhaus，细胞64(1991)511-520，Samelson，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87(1990)，Straus，细胞70(1992)585-593，Songyan，细胞72(1993)767-778，Songyan，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)14(1994)2777-2785，Isakov，实验医学杂志(J.Exp.Med.)181(1995)375-380)。对抗原特异性T细胞杂交瘤的ζ链缺陷突变株(该突变株不能应答抗原，对抗CD-3抗体只有弱应答)进行的研究证实ζ链是TCR介导的信号传递所必需的(Sussman，细胞52(1988)85-95)。虽然在CD-3抗体刺激应答种部分活性的保留表明TCR复合物的其他链能够补偿ζ的缺失，但其他研究显示，当突变系通过转染ζ链重建时，重新获得了识别抗原或应答抗CD3抗体的功能，这清楚地表明了ζ链在信号转导中的重要作用(Weissman，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)8(1989)3651-3656)。由于其单一构形，ζ链可能是主要的TCR信号传递结构，而它的一式三份ITAM主要起促进TCR信号放大的作用。

一般信号转导和特定的ζ链介导的信号转导中，TCR复合物既参与成熟T淋巴细胞的活化又参与其程序性死亡(凋亡)。有些实验中，ζ链的细胞质尾部附着于不相关的受体，实验证明，表达此类嵌合受体的细胞系能对与IL-2释放和上调其他活化参数的交联抗体作出应答(Irving，细胞64(1991)891-901)。而且，已证明，表达嵌合ζ链衍生物的细胞毒T淋巴细胞(CTL)特异性地裂解带有嵌合ζ受体所识别表面分子的靶细胞(Romeo，细胞64(1991)1037-1046，Romeo，细胞68(1992)889-897)。然而，以上结果被发现仅限于活化的T细胞，因为其余表达嵌合ζ链分子的T淋巴细胞既不是活化的，当通过嵌合受体被激活时，对靶细胞也没有任何细胞毒性(Brocker，实验医学杂志181(1995)1653-1659)，所述的嵌合受体，根据生物化学分析，不与内源性TCR亚基结合，因此是物理上独立的信号分子(Shinkai，免疫(Immunity)2(1995)401-411)。因此，以上信息表明，嵌合ζ链衍生物只能取代活化的完全TCR复合物，而不能取代静息T细胞的TCR。如果当细胞被活化或增殖时发生强烈的TCR重新接合(reengagement)，将诱导TCR介导的成熟T淋巴细胞的凋亡(Lenardo，自然353(1991)858-861，Russell，美国科学院院报88(1991)2151-2157，Critchfield，细胞免疫(Cell. Immunol.)160(1995)71-78)。成熟T细胞的死亡在外周免疫系统稳定和耐受性中起着重要作用。最近的实验显示，ζ链是通过TCR结合有效诱导T细胞凋亡所必需的，而CD3的信号结构域对TCR介导的凋亡只有微弱的作用(CD3ε)或根本没有作用(CD3γ和δ)(Combadiere，J.Exp.Med.183(1996)2109-2117)。此外，ζ链的三个ITAM对诱导T细胞凋亡具有不同贡献，最近N末端的那个起着主要作用，其次，C末端的ITAM近似于CD3ε的微弱作用，中间的一个则完全不能诱导凋亡。

T细胞主要在胸腺内发育，其中的T细胞前体来自胎儿的肝脏或成人的骨髓。刚进入胸腺时，这些早期祖先T细胞是三阴性的(TN：TCR-CD4-CD8-)(Shortman，免疫学评论年报14(1996)29-47)，但已表达ζ链和CD3链(Wiest，实验医学杂志180(1994)1375-1382，Wilson，国际免疫学(Int.Immunol.)7(1995)1659-1664)。在胸腺的诱导性环境中，它们经过一系列发育阶段，然后分化成CD4⁺CD8⁺双阳性(DP)胸腺细胞(Godfrey，今日免疫学14(1993)547-553)。最不成熟的CD44⁺CD25^--TN-胸腺细胞和由它衍生的CD44⁺CD25⁺-TN-胸腺细胞仍表现出TCR基因的种系构形。然而，以表面表型CD44^-/10CD25⁺为特征的下一成熟阶段的TN胸腺细胞开始重排TCRβ基因座。在此阶段以前，ζ链虽被表达，但可能不是胸腺细胞成熟所必需的(Crompton，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24(1994)1903-1907)。TN胸腺细胞的下一步成熟以CD44^-/10CD25⁺转变为CD44^-CD25⁺为特征，但在缺乏ζ链时受到抑制(Crompton，欧洲免疫学杂志24(1994)1903-1907)，而且必需TCRβ链的重排和表达(Kishi，欧洲分子生物学杂志10(1991)93-100，Mombaerts，自然360(1992)225-231，Shinkai，科学259(1993)822-825)。TCRβ与不变链前Tα(pTα)结合(Groettrup，细胞75(1993)283-294)，后者取代仍未重排的TCRα链形成前TCR，可能与ζ链和CD3链结合(Van Oers，实验医学杂志182(1995)1585-1590)。作为前TCR介导的信号的结果，发育中的胸腺细胞进化到DP期。在此阶段，胸腺细胞启动它们TCRα基因的重排，停止表达pTα，开始低水平表达TCR复合物，后者的多链组成与成熟T淋巴细胞上的TCR复合物相似(Von Boehmer，Ann.N.Y.Acad.Sci.766(1995)52-61，Robdy，免疫学评论年报12(1994)265-705)。

CD44^-CD25^--TN胸腺细胞的发育和其后DP胸腺细胞的发育在缺乏ζ链时受到抑制，并可通过表达无功能性ITAM的信号缺陷突变ζ链来恢复(Shores，免疫学杂志(J.Immunol.)159(1997)222-230，Shores，科学266(1994)1047-1050)，因此，ζ链促进前TCR表面表达的重要性可能超过其信号功能的重要性。

进一步根据TCR特异性选择DP胸腺细胞。表达对自身MHC分子(不管MHC蛋白结合的是什么肽)几乎没有特异性的TCR的胸腺细胞在胸腺内死亡，可能是因为它们未能通过它们的TCR收到存活信号(Robey，免疫学评论年报12(1994)265-705，Jameson，免疫学评论年报13(1995)93-126)。相反，表达具有适当配体特异性的TCR的胸腺细胞存活下来，并成熟为CD4⁺或CD8⁺的单阳性(SP)T细胞，表现出高水平的TCR表达。然而，表达自身反应性或潜在自身反应性TCR的胸腺细胞被去除了(Robey，免疫学评论年报12(1994)265-705，Jameson，免疫学评论年报13(1995)93-126)。因此，TCR在DP胸腺细胞上的结合导致了两种截然不同的细胞命运，或者存活并继续成熟(阳性选择)，或者凋亡(阴性选择)。

虽然，ζ链的ITAM不是胸腺内成熟SP T细胞的发育(Shores，科学266(1994)1047-1050)和MHC-限制性选择(Simpson，国际免疫学7(1995)287-293)所必需的，但它们似乎通过在胸腺选择过程中放大TCR结合所产生的信号应答对T细胞群落的形成起作用。

实际上，最近的一项研究揭示，虽然不特别需要任一单独ITAM，但TCR复合物内ζ链ITAM的数量与阳性和阴性选择都直接相关(Shores，实验医学杂志185(1997)893-900)。以上结果可能是预料中的，如果阳性和阴性选择主要由TCR信号阈值决定，如果对不同亲合性的配体的信号应答(在决定发育胸腺细胞命运中是致关重要的)的程度或多或少地分别受到自然ζ链内一式三份的ITAM或ζ链突变体内ITAM减少的放大。

因此预计，天然ζ链存在下阳性选择的胸腺细胞群落明显不同于信号缺陷性ζ链衍生物存在下所选，后一种群落含有可能阴性选择的T细胞(Shores，当代免疫学观点(Current Opinion in Immunology)9(1997)380-389)。

NK细胞是大型粒性淋巴细胞，占外周血淋巴细胞(PBL)的10-15％。它们能够以一种非主组织相容性复合体(MHC)限制性方式杀死肿瘤细胞和某些被病毒感染的细胞(Trinchieri，高级免疫学(Adv.Immunol.)47(1989)187-376，Ritz，高级免疫学(1988)181-211)。这种溶胞效应器功能不需要事先敏化或由辅佐细胞呈递抗原。这些特性使得NK细胞能在激发抗原特异性免疫应答之前引发自发性宿主防御。已知NK细胞有两种形式的溶胞活性，自然细胞毒性和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，后者还能杀死抗自然细胞毒性的靶细胞。

T细胞的细胞毒性是通过克隆型(clonotypic)TCR结合而产生的活化信号所引发的，与之不同，NK细胞的自然细胞毒性则主要受抑制信号调节(Yokoyama，实验医学杂志186(1997)1803-1808)。抑制性的NK细胞受体通过与靶细胞上MHCI类分子的特异性结合而被结合，从而抑制在缺乏靶细胞MHCI类表达时才释放的天然细胞毒性，于是激活自然杀伤作用。NK细胞受体具有胞质内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITM，共有序列I/V-X-Y-X-X-L)，这些基序在受体结合诱导的酪氨酸磷酸化后介导抑制性信号(Muta，自然368(1994)70-73，Thomas，实验医学杂志181(1995)1953-1956)。

ADCC是由低亲合性IgG Fc-受体FcγRIIIA诱导的，并可在体外通过NK细胞与抗体覆盖的靶细胞共培养来证明。FcγRIIIA的配体结合和交联诱导NK细胞的活化，产生溶胞活性，表面活化分子和细胞因子分泌的上调(Chehimi，实验医学杂志75(1992)789，Ravetch，免疫学评论年报9(1991)457)。FcγRIIIA表达为一种复合物，包含跨膜的配体结合性受体糖蛋白CD16和γ及ζ两条跨膜链，这两链负责受体的装配和信号的转导(Anderson，美国科学院院报87(1990)2274-2278，Ravetch，免疫学评论年报9(1991)457)。起初，γ链曾被鉴定为IgE的高亲合性受体的一个亚基，并与ζ链和η链属于同一信号转导分子家族。当NK细胞上的FcγRIIIA被结合后，ζ链和γ链的ITAM内发生酪氨酸磷酸化，于是诱导进一步的信号转导，这包括含有FcγRIIIA复合物特异性Src同源性(SH)2结构域的蛋白的征集。最近的研究证明，转染到NK细胞内的嵌合ζ链受体的结合似乎与FcγRIIIA介导的NK细胞活化相似，因此方式也与T细胞内的相似(Tran，免疫学杂志155(1995)1000-1009)。

虽然以上所述表明，与完整细胞表面上人ζ链胞外域特异性相互作用/识别该胞外域的抗体为多种目的所需要，例如癌症治疗中，T细胞或NK细胞上的人工信号转导，目前还没有成功实验的报道。未能成功产生满足上述需要的抗体可能主要是因为参与ζ链结合T细胞受体和T细胞上的CD3复合物或结合NK细胞上IgG-Fc-受体的该结构域相当短(9个氨基酸)。

因此，本发明的技术课题是提供一种可成功满足以上需要的工具。该课题是通过权利要求所述实施方式解决的。

所以，本发明涉及一种核酸分子，它含有编码一种抗体的可变区的至少一个互补决定区(CDR)的核酸序列，该抗体特异性地与完整细胞表面上的人ζ(zeta)链的胞外域相互作用，该抗体可以通过先用Jurkat细胞，接着用载体分子与含有大鼠ζ链N末端11个氨基酸的肽构成的偶联物免疫大鼠来制取。

所述的完整细胞最好是T细胞或NK细胞，或他们的前体细胞，但也包括人工转染的细胞。

根据本发明，用Jurkat细胞(ATCC TIB-152)免疫原初大鼠，然后用含有载体分子和上述肽的偶联物加强免疫，由此获得具有所述CDR的抗体。而且估计，其他免疫策略可能也行，例如给大鼠注射一次或多次偶联物。虽然在产生抗体时用KLH作为载体，但其他载体也可以。其他载体的例子如BSA。

由于T细胞和NK细胞表面的ζ链分子或与TCR和CD3结合，或与FcγRIIIA结合，或呈自由漂浮的同源或异二聚体，所以，所述的相互作用可能是与以上ζ链形式之一，或与其全部。同样，抗体可能与单ζ链相互作用，也可能特异性地与二聚体结构相互作用。因为人的η链具有与ζ链相同的胞外域，本发明的抗体也识别与ζ链相同构像和/或结合形式的η链。而且，抗体还特异性地与大鼠和小鼠的ζ/η链胞外域相互作用。

本发明抗体的一个独特优良特性是，它识别T细胞和NK细胞两种细胞以及他们前体细胞上的ζ/η链。根据对ζ链结构和结合形式的了解来看，开发出这样的抗体可以认为是出人意料的。这极短的9氨基酸肽上的表位必定十分靠近细胞膜。这样紧密的结构以及因而与细胞表面上多分子蛋白复合物的空间结合，使得象抗体这样的大结构，在空间上似乎不可能接触到这些表位。而且，因为ζ链在T淋巴细胞和NK细胞上与不同多分子蛋白复合物结合，估计不可能被抗体接触到的T细胞上的ζ链胞外表位不可能与NK细胞上的完全相同。此外，因为人、大鼠和小鼠间的序列一致性，ζ链胞外域代表着上述三物种内的一种自身抗原，因此不可能通过免疫小鼠和大鼠来获得它的特异性抗体。

本发明抗体的开发必然被认为是出人意料的理由，除以上所述之外，还因为最可能获得此类抗体的方法没有成功。即，用肽-KLH偶联物免疫小鼠，从它的脾细胞RNA克隆一个组合抗体文库，展示在丝状噬菌体上，交替地在肽-BSA偶联物、纯化的CD8⁺-T-淋巴细胞和纯化的NK细胞上进行体外选择。虽然最后在CD8⁺-T-淋巴细胞上筛选时富集了展示与肽-BSA偶联物反应的Fab抗体片段的噬菌体克隆，但其中大多数在下一步纯化NK细胞上筛选时丢失了，说明该克隆集中没有识别T淋巴细胞和NK细胞上共同的ζ链胞外表位的抗体。测试大量与肽-BSA偶联物反应的克隆，证实都没有与T淋巴细胞和NK细胞的交叉结合活性。

只有当本发明用一种过时的，而且相当烦琐的方法来生产这样的抗体时，才获得了成功。这一方法包括：合成含ζ链N末端前11个氨基酸的肽，通过半胱氨酸11上的SH基团将它与KLH偶联。分别用Jurkat细胞初免疫大鼠，用上述偶联物免疫小鼠，获得的杂交瘤细胞系用11氨基酸肽与BSA的偶联物筛选。获得了150个小鼠杂交瘤细胞系和45个大鼠杂交瘤细胞系，它们识别肽-BSA偶联物，但通过流式细胞计数，只鉴定到一种与T淋巴细胞和NK细胞都结合的大鼠IgM抗体。

本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链还可以用本领域已知的技术进一步修饰，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加和/或重组和/或其他修饰，可以单独进行，也可以联合进行。将上述修饰导入免疫球蛋白氨基酸序列的DNA序列内的方法是本领域众所周知的，可参见，例如Sambrook的分子克隆实验室手册，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所述抗体也可以是嵌合抗体。

本领域众所周知的是，通常一个CDR，特别是重链上的CDR，就能识别一个表位，所以推测，上述方法所得抗体的一个CDR就足以造成至少微弱但明显的结合。用以上策略产生的抗体证实，该推测完全正确。然而，较好的是，所述核酸分子含有编码所述可变区至少两个CDR的核酸序列。

本发明核酸分子的另一优选实施例中，所述核酸分子含有编码所述可变区三个CDR的核酸序列。

本发明核酸分子另一优选实施例的特征在于所述核酸序列编码V_H链。

本发明核酸分子的另一优选实施例中，所述核酸序列编码V_L链。

本发明的核酸分子可以是例如RNA分子或DNA分子。另一优选实施例中，本发明的核酸分子是DNA分子。特别好的是合成或半合成的DNA分子。

本发明核酸分子的另一优选实施例中，所述CDR具有以下核苷酸序列之一：

(a)SEQ ID No.1；

(b)SEQ ID No.3；

(c)SEQ ID No.5；

(d)SEQ ID No.7；

(e)SEQ ID No.9；

(f)SEQ ID No.11。

本发明核酸分子的一个特别优选的实施例中，所述V_H链具有核苷酸序列SEQID No.13，或编码氨基酸序列SEQ ID No.14。

本发明核酸分子另一优选的实施例中，所述V_L链具有核苷酸序列SEQ IDNo.15，或编码氨基酸序列SEQ ID No.16。

本发明还涉及权利要求1-6中任一项所述的核酸分子，其中的CDR编码氨基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10或12之一。

本发明还涉及一种载体，它包含本发明的核酸分子。

本发明的载体可含有其他基因，例如标记基因，它们可在合适的条件下在合适的宿主细胞内对所述载体进行选择。较好的是，本发明的聚核苷酸与允许在原核或真核细胞内表达的表达调控序列操作性连接。所述聚核苷酸的表达包括该聚核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞(以哺乳动物细胞为佳)内表达的调控元件已为本领域所熟知。通常包括确保转录起始的调控序列，可能还包括确保转录终止并稳定转录产物的聚A信号。其他调控元件可能还包括转录和翻译的增强子，和/或天然结合的或异源的启动子区域。在这方面，本领域熟练技术人员很容易理解，编码至少轻链和/或重链可变区的聚核苷酸可能编码这两种免疫球蛋白链的可变区，也可能只编码其中一种的可变区。类似的，所述聚核苷酸的表达可能受同一启动子的调控，也可能受分别调控。允许在原核宿主细胞内表达的调控元件可能包括，例如，用于大肠杆菌的PL、lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞内表达的调控元件的例子是用于酵母的AOX1或GAL1启动子，或用于哺乳动物或其他动物细胞的CMV-、SV40-、RSV-启动子(Rous肉瘤病毒，CMV增强子，SV40增强子或球蛋白内含子)。除了负责启动转录的元件之外，所述调控元件还可能包括转录终止信号，例如聚核苷酸下游的SV40-聚A位点或tk-聚A位点。而且，根据所用的表达系统，还可以给本发明聚核苷酸编码序列加上前导序列，用于将多肽导入某细胞区室或分泌到培养基中，这些前导序列是本领域所熟知的。前导序列的装配与翻译、起始和终止序列成正确的相位关系，较好的是，前导序列能够引导所翻译的蛋白或其一部分进入周质间隙或胞外培养基。或选的是，异源序列可编码一个融合蛋白，该蛋白包括C末端或N末端标志肽以赋予所需特征，例如简化所表达重组产物的纯化或稳定化。本文中，合适的表达载体是本领域所熟知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNA1，pcDNA3(In-vitrogen)或pSPORT1(GIBCO BRL)。

较好的是，表达调控序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体内的真核启动子系统，但也可使用针对原核宿主的调控序列。载体进入合适的宿主后，将宿主维持在适合高表达核苷酸序列的条件下，根据需要收集并纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体，然后可收集并纯化结合片段或其他免疫球蛋白形式；参见，Beychok，免疫球蛋白合成细胞，Academic Press，N.Y.(1979)。

本发明的载体可以是例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体，它们最好是表达载体。可用来自逆病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的病毒表达载体将本发明的聚核苷酸或载体送入靶细胞群。可用本领域熟练技术人员熟知的方法构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook的分子克隆实验室手册，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，现代分子生物学方法，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。或者，可将本发明的聚核苷酸和载体重构成脂质体送入靶细胞。可根据细胞宿主的类型，用熟知的方法，将含本发明聚核苷酸(例如免疫球蛋白重链和/或轻链可变区的编码序列以及表达调空序列)的载体导入宿主细胞。例如，常用氯化钙转染原核细胞，对其他细胞宿主则采用磷酸钙处理或电穿孔；参见，Sambrook，同上。

本发明还涉及用本发明载体转化或转染的宿主。

所述宿主可以是原核或真核细胞。本发明的聚核苷酸或载体在宿主细胞内可能整合到宿主细胞的基因组内，也可能仍在染色体外。

宿主细胞可以是原核或真核细胞，例如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人的细胞。较好的真菌细胞例如酵母属细胞，具体的如酿酒酵母。“原核”包括所有可用DNA或RNA分子转化或转染，从而表达本发明抗体或相应免疫球蛋白链的细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性和阳性菌，例如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌和枯草杆菌。“真核”包括酵母，高级植物，昆虫，和较好的哺乳动物细胞。根据重组生产过程所用的宿主，本发明聚核苷酸所编码的肽或多肽/抗体或免疫球蛋白链可能是糖基化的，也可能是非糖基化的。本发明的抗体或相应的免疫球蛋白链还可能包括起始的甲硫氨酸残基。可用各种本领域熟知的技术，以本发明的聚核苷酸转化或转染宿主。而且，在哺乳动物细胞和细菌内制备并表达融合的操作性连锁基因的方法，也是本领域所熟知的(Sambrook的分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。可用其中所述的基因构建物和方法，在真核或原核宿主内表达本发明的肽或多肽/抗体或相应的免疫球蛋白链。通常，根据宿主选用含有促进所需聚核苷酸有效转录的启动子序列的表达载体。该表达载体通常含有一个复制起始点，一个启动子和一个终止子，以及供转化细胞表型选择的特殊基因。而且，可用含有本发明细胞的转基因动物，最好是哺乳动物，进行本发明肽或多肽的大规模生产。

可将转化后宿主培养在发酵罐中，并根据本领域的已知技术培养，以获得最佳的细胞生长。表达后，可按照本领域的标准方法纯化本发明的全肽或多肽/抗体、它们的二聚体，单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，所述方法例如硫酸铵沉淀，亲合柱层析，柱层析，凝胶电泳等；参见，Scopes，“蛋白质纯化”Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然后可从培养基、细胞裂解物或细胞膜组分中分离本发明的抗体或其相应免疫球蛋白链。可用各种常规方法分离和纯化(例如)微生物表达的本发明抗体或免疫球蛋白链，所述方法例如制备性层析分离和免疫学分离法，例如用到相关(例如抗本发明抗体恒区的)单克隆或多克隆抗体的免疫学分离法。对本领域熟练技术人员来说显而易见的是，本发明抗体还可以与其他分子偶联，用于例如药物定向和造影。这样的偶联，可以在肽或多肽/抗体或抗原表达后用化学方法将它们偶联于结合位点，或通过基因工程在DNA水平上与本发明的肽或多肽/抗体偶联。然后在合适的宿主系统内表达该DNA，收集表达的蛋白，并根据需要进行复性。

本发明还涉及产生本发明核酸分子所编码肽或多肽的方法，包括，在合适的条件下培养本发明的宿主，从培养物中分离所述的肽或多肽。

前文已对所述宿主细胞的培养进行了论述，还可按照公知的方法进行。分离肽和多肽的也一样。

此外，本发明还涉及本发明核酸分子所编码，或用本发明方法产生的肽或多肽。

本发明还涉及抗体或其片段或衍生物，其中包含至少一种本发明的肽或多肽。

较好的是，本发明的抗体包含完整的上述V_H和V_L两链，具有合适的恒区，例如μ、γ、α、κ或λ链。

本发明抗体或其片段或衍生物的具体应用包括：由于抗体或抗体衍生物特异性地与ζ链结合，或生物活性或药理活性的分子通过抗ζ链抗体或抗体片段/衍生物定向于T细胞表面，结果造成TCR的结构性或功能性抑制，从而影响成熟T淋巴细胞的功能。而且，抗体或抗体片段/衍生物特异性结合ζ链造成的TCR或前TCR的结构性或功能性抑制，影响到胸腺细胞的发育和选择。

在整个T细胞发育过程中，即从最不成熟的胸腺细胞到成熟T淋巴细胞，ζ链一直在表达，所以，该分子可用于定向于多种T细胞性恶性肿瘤。

由于抗体或抗体衍生物特异性地与ζ链结合，或生物活性或药理活性的分子通过抗ζ链抗体或抗体片段/衍生物定向于NK细胞表面，结果造成FcγRIIIA的结构性或功能性抑制，从而还可以影响NK细胞的功能。

所以，所述的抗体或片段或衍生物可以是但不限于合成或半合成或经典方法生成的单克隆抗体。所述片段包括Fab′或F(ab′)₂片段。

本发明抗体可具有另一结构域，所述结构域通过共价或非共价键连接。所述连接可以基于用本领域已知的前文所述方法进行的基因融合，也可以通过化学交连，例如WO94/04686所述。在含本发明抗体的融合蛋白中，该另一结构域最好通过柔性接头连接，以多肽接头为佳，所述的多肽接头含有多个亲水性肽键氨基酸，其长度足以跨越所述另一结构域的C末端至本发明抗体N末端(或反过来)之间的距离。上述融合蛋白还可以具有一个蛋白酶的可剪切接头或剪切位点。这些间隔部分可以是不溶性的或可溶性的(Diener等，科学，232：148，1986)，并选择能在靶位置使药物从抗原上释放的那些。可与本发明抗体偶联用于免疫治疗的治疗性制剂是：药物，放射性同位素，凝集素和毒素。可与本发明抗体偶联的药物包括那些经典药物，例如丝裂霉素C、柔毛霉素和长春碱。

当用放射性偶联的本发明抗体进行例如免疫治疗时，根据白细胞分布以及稳定性和发射性等因素，有些同位素可能比另一些更合适。根据自身免疫应答，有些发射性物质可能比另一些好。一般说来，发射α和β粒子的放射性同位素适用于免疫治疗。较好的是幅距短的高能α发射性物质，例如²¹²Bi。可与本发明抗体、抗原或表位结合而用于治疗的放射性同位素的例子是：¹²⁵I，¹³¹I，⁹⁰Y，⁶⁷Cu，²¹²Bi，²¹²At，²¹¹Pb，⁴⁷Sc，¹⁰⁹Pd和¹⁸⁸Re。其他可与本发明抗体、抗原或表位结合的治疗剂，以及体外和体内的治疗方法，都是已知的，本领域熟练技术人员可方便的获知。只要合适，本领域技术人员可使用编码上述抗体、抗原或表位的本发明聚核苷酸或相应载体，而不是蛋白质物质本身。

一优选实施例中，本发明的抗体是单克隆抗体。

本发明另一优选实施例中，本发明的抗体是双特异性抗体。

在本发明双特异性抗体的一优选实施例中，第一特异性针对完整细胞表面上的人ζ链的胞外域，第二特异性针对T淋巴细胞、自然杀伤细胞或它们前体细胞的表面上可能不同的另一分子。

本发明的双特异性抗体可与上述位于相同或不同细胞上的靶结合。所述不同细胞可以是，例如，相同种类的两个不同T淋巴细胞，或一个T淋巴细胞和一个自然杀伤细胞，或它们的前体细胞。

在本发明双特异性抗体的另一优选实施例中，第一特异性针对完整细胞表面上的人ζ链的胞外域，第二特异性针对不同细胞表面的一不同分子，该细胞最好不是T细胞、自然杀伤细胞或它们的前体细胞。较好的是，该分子是病毒编码的抗原，肿瘤相关抗原，或抗原呈递细胞(APC)(最好是树状细胞)或非APC上的表面抗原。

本发明双特异性抗体的一种较好的应用是将T淋巴细胞再定向于靶细胞，这是通过用双特异性抗体同时定向于ζ链和一种靶细胞表面抗原，而不是通过用嵌合ζ链受体转染T淋巴细胞(Romeo，细胞64(1991)1037-1046)。因为双特异性抗体结合天然ζ链，ζ链则与其他TCR亚基结合，所以可利用整个TCR复合物的信号机制。相反，嵌合ζ链受体不结合内源性TCR亚基，所以可能只改变ζ链的信号作用，就活化和凋亡来说，这似乎尚不足以活化静息T细胞，却可能引起T淋巴细胞功能状态的非平衡改变。

T细胞再定向的一个较好的应用包括，将细胞毒T淋巴细胞的细胞毒性定向于靶细胞，从而将其裂解。另一个较好的应用是，通过原初T淋巴细胞的ζ链与已修饰抗原呈递细胞(APC)或非APC上的表面抗原交连，提供充分的协同刺激信号，从而引发幼稚T淋巴细胞。另一方面，通过ζ链介导重定向于不能提供充足信号的细胞，可使原初T细胞无能应答或缺失。

T细胞再定向的另一个较好的应用是在成熟的活化T淋巴细胞内诱导凋亡，这是通过ζ链介导强TCR重新结合，类似于介导外周T细胞耐受性并提供外周免疫系统稳定性的机制。

可用双特异性抗体，通过胸腺细胞上的ζ链与直接参与阳性或阴性选择过程的胸腺抗原呈递细胞上的表面分子交连，改变T细胞发育过程中对胸腺细胞的胸腺选择。

本发明双特异性抗体的另一种较好的应用是将NK细胞的细胞毒性再定向于靶细胞，这是通过用双特异性抗体同时定向于ζ链和一种靶细胞表面抗原，而不是通过用嵌合ζ链受体转染NK细胞使之定向于靶细胞(Tran，免疫学杂志155(1995)1000-1009)。

另一优选实施例中，本发明的抗体衍生物是scFv链。

本发明单克隆抗体的一优选实施例中，所述抗体是IgM。

本发明还涉及一种双特异性受体，它包含本发明的肽或多肽和与同一细胞或另一细胞上表面分子的天然受体、天然配体或其衍生物；较好的是，所述受体或配体是CD4，CTLA-4，B7-1，B7-2，LFA-3，ICAM-1、-2、-3，或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趋化因子。

据推测，本发明的双特异性抗体也可用于本发明的双特异性受体。

本发明还涉及一种药物组合物，它含有本发明的核酸分子，载体，宿主，肽或多肽，抗体或其片段或衍生物和/或本发明的双特异性受体。

本发明的药物组合物还可含有一种药学上认可的运载体。合适的药学上认可的运载体的例子是本领域所熟知的，包括磷酸盐缓冲液，水，乳液(例如油/水乳液)，各类润湿剂，无菌溶液等。含上述运载体的组合物可用常规方法来配制。可以合适的剂量给予这些药物组合物。给予合适的组合物可通过各种不同的途径，例如，静脉内、腹腔内、皮下、肌内、局部或透皮给药。剂量决定于医生和临床因素。正如医学界所熟知的，任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者体形，身体表面积，年龄，具体使用的化合物，性别，用药时间和途径，总体健康状况，和目前正在使用的其他药物。典型剂量可以是，例如，0.001-1000μg(或是用于该水平表达或抑制该水平表达的核酸)；然而，具体考虑上述因素时，剂量也可能低于或超过该例举的范围。通常，所述药物组合物的规律给药方式是每日1μg-10mg。如果是连续输液，也应在每分钟每kg体重1μg-10mg的范围内。可通过定期检查来监测进展。剂量可以不同，但静脉给予DNA的优选剂量约为10⁶-10¹²份DNA分子拷贝。本发明的组合物可局部给予或全身给予。通常采用肠胃外给予，例如静脉内；还可以(例如)通过生物弹射法(biolistic)递送到一内部或外部靶部位或通过导管递送到动脉内某部位，将DNA直接给药到靶部位。用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油，和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外媒质包括氯化钠溶液，Ringer葡萄糖，葡萄糖与氯化钠，乳糖化的Ringer试剂，或固化油。静脉媒质包括液态营养补充剂，电解质补充剂(例如基于Ringer葡萄糖的那些)，等等。还可以有防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物、抗氧化、螯合试剂，和惰性气体等。而且，根据用途，本发明的药物组合物还可以含有白介素或干扰素等其他试剂。

本发明设想，用标准载体和/或基因递送系统将本发明的各种聚核苷酸和载体单独或联合，并可以与药学上认可的运载体或赋形剂一起进行给药。给药后，所述聚核苷酸或载体可能稳定地整合到受主的基因组内。另一方面，可用病毒载体，它们对特定的细胞或组织具有特异性，并能在所述细胞内存活。合适的药物运载体和赋形剂是本领域所熟知的。

而且，还可以将本发明的药物组合物，含本发明的聚核苷酸或载体，用在基因治疗中。合适的基因递送系统有，脂质体，受体介导的递送系统，裸DNA和病毒载体，例如疱疹病毒、逆病毒、腺病毒和腺相关病毒等；参见前文所述的文献。还可以用例如Williams(美国科学院院报88(1991)2726-2729)所述的生物弹射递送系统，将核酸送到体内特定部位以进行基因治疗。

本发明的药物组合物，方法和用途可较好地适用于人类，虽然本文描述的方法和用途还包括对其他动物的治疗。

本发明还涉及本发明抗体用于制备药物组合物的用途，该抗体的第一特异性针对人ζ链的胞外域，第二特异性针对T淋巴细胞、自然杀伤细胞或它们前体细胞表面上的另一不同分子，所述组合物用于治疗自身免疫病，免疫缺陷，T细胞性恶性肿瘤，感染性疾病，或用于抑制免疫应答，特别是为了避免器官移植后移植物排斥。

消灭靶细胞(例如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞)之外，本发明描述了通过ζ链细胞外定向结合T细胞系(正常或恶性)细胞的方式，这些方式可在治疗上用于增强或抑制免疫应答和/或影响与自身免疫病、免疫缺陷或T细胞性恶性肿瘤相关的T细胞性疾病。较好的是，采用基于ζ链(和η链)细胞外定向的免疫抑制来预防移植后移植物排斥。

本发明在T细胞发育和胸腺细胞选择过程中，通过ζ链胞外定向改变信号的转导，这样的模式可在治疗上用于增强有意的免疫应答，例如在感染性疾病、肿瘤和免疫缺陷中，或用于抑制不利的免疫应答，例如在自身免疫病或移植后移植物排斥中。

而且，本发明还涉及本发明抗体用于制备治疗或预防恶性肿瘤、病毒感染和其他感染性疾病的药物组合物的用途，该抗体的第一特异性针对人ζ链胞外域，第二特异性针对另一细胞表面上的另一不同分子。

本发明还涉及本发明肽或多体或抗体或其片段或衍生物或双特异性受体用于制备药物组合物的用途，即用于增强或抑制NK细胞依赖性免疫或治疗NK细胞衍生的恶性肿瘤。

通过ζ链胞外定向促进NK细胞结合，消灭靶细胞(例如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞)之外，该模式还可在治疗上用于增强或抑制NK细胞依赖性免疫，或影响NK细胞来源的恶性肿瘤，因为ζ链可能在NK细胞来源的恶性肿瘤上也表达，该分子还可能被用于定向于恶性NK细胞。

此外，本发明还涉及一种测定NK细胞、T淋巴细胞或它们的前体细胞上ζ链或η链表达的方法，包括：

(a)使本发明的肽或多肽或抗体或其片段或衍生物与NK细胞、T淋巴细胞或它们的前体细胞接触；

(b)测定被结合的肽或多肽，抗体或其衍生物的量。

接触的进行可以是：在类似生理条件的缓冲液(例如磷酸盐缓冲溶液，PBS)中，最好在冰上，所述肽或多肽或所述抗体或其片段或衍生物与所述NK细胞、T淋巴细胞或它们的前体细胞一起孵育20-40分钟。用PBS洗涤两次后，可(例如)用合适的荧光标记的第二抗体检测被结合的肽或多肽，抗体或其片段或衍生物，并通过流式细胞计数分析来定量，如实施例4所述。

本发明还涉及含本发明核酸分子、载体、宿主、肽或多肽、抗体或其片段或衍生物和/或双特异性受体的试剂盒。

最后，本发明还涉及一种转基因动物，其种系含有本发明核酸分子或载体的至少一份拷贝。

可用常规发产生转基因动物，参见，例如，Palmiter R.D.，Brinster R.L.：小鼠的种系转化(Germline transformation of mice)，遗传学评论年报(Ann.Rev.Genet)20(1986)，465-499和Capecci M.：通过同源重组改变基因组(Altering the genomeby homologous recombination)，科学244(1991)1288-1292。本发明转基因动物的优选例是母牛，绵羊，家兔，小鼠或大鼠。

表1列举了PCR扩增鼠Ig重链和轻链DNA片段所用的引物。

附图显示的是：

图1：TCR的结构：T细胞活化的早期活动。TCR由克隆型链(α+β)和恒链(ζ，CD3γ，CD3δ和CD3ε)构成，其亚基的组成可能是TCRα+β，CD3εδγε和ζζ。CD3和ζ链的胞质域内的ITAM以小的黑色椭圆表示。A)在静息T细胞内，ITAM是非磷酸化或部分磷酸化的。蛋白酪氨酸激酶Lck与CD4或CD8的胞质域结合。B)与MHC-肽复合物相互作用时，TCR和CD4或CD8共聚集，CD3和ζ链内的ITAM被Src激酶Lck和/或Fyn磷酸化。ZAP-70或相关激酶Syk与其中两个酪氨酸残基已磷酸化的ITAM特异性结合。当ZAP-70加入到TCR-复合物中时，它被Lck激活，然后，其他分子这样地加入TCR复合物，并使活化过程向下游分子推进(未显示)。圆环P表示磷酸化的酪氨酸残基。

图2：通过噬菌体展示选择与人ζ链结合所得Fab抗体片段的ELISA分析。大肠杆菌内表达的可溶性Fap片段的周质制剂与固定化的ζ肽-BSA偶联物一起孵育。用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG+IgM抗体的F(ab′)₂片段检测特异性结合的Fab片段。加入ABTS底物溶液进行ELISA显色。在X轴上显示每轮体外选择中的8个克隆；用ELISA读数仪在405nm处测定OD值，在Y轴上表示。作为阴性对照，测试格与PBS而不是与周质制剂一起孵育。

图3：CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞表面上2-B-5抗体的ζ链特异性结合活性的流式细胞计数分析。来自两位健康供者外周血的100.000个单核细胞与2-B-5杂交瘤的细胞培养上清液原液一起孵育。用与荧光素(FITC)偶联的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗体1∶100 PBS稀释液检测结合的ζ链特异性大鼠抗体。进行三色荧光分析，对CD8⁺细胞(三色(tricolor))施加一正栅极(gate)，对CD16⁺细胞(PE)施加一负栅极，这样，检测到的只有CD8⁺T淋巴细胞(表型：CD8⁺，CD16⁺)的FITC荧光(实线)，而没有来自CD8⁺NK细胞的任何干扰信号。类似地进行三色荧光分析，对CD56⁺PE细胞施加一正栅极，对CD38⁺细胞(三色)施加一负栅极，这样，只检测到NK细胞(表型：CD56⁺，CD3^-)的FITC荧光(实线)，而没有来自CD56⁺T淋巴细胞的任何干扰信号。作为同型对照(虚线)，使用的是同型但特异性不相关的抗体(大鼠IgM)的培养物上清液性。用1％的聚甲醛PBS溶液固定标记细胞。在FACS扫描仪(Becton Dickinson)上通过流式细胞计数分析细胞。

图4：证明抗体2-B-5与CD8⁺T淋巴细胞裂解物内天然ζ链反应性的夹心ELISA结果。用一种ζ链特异性抗体覆盖96格U形底测试板，该抗体识别人ζ链羧基末端的氨基酸144-163，12小时后，用PBS/3％BSA在室温下封闭1小时。接着，加入CD8⁺细胞裂解物原液和数种浓度稀释液，室温下孵育1小时。阴性对照是与PBS而不是细胞裂解液一起孵育的格。下一步，加入1μg/ml纯化抗体2-B-5，孵育1小时。先用生物素化的小鼠抗大鼠IgM抗体，然后用亲合素-过氧化物酶偶联物检测结合的2-B-5抗体。最后，加入ABTS底物溶液进行ELISA显色。用ELISA读数仪在405nm处测定有色的沉淀。

图5：基于ELISA的分析：大肠杆菌周质内表达的大鼠单克隆抗体2-B-5的重组Fab片段与ζ肽-KLH偶联物的特异性结合。4℃，以ζ肽-KLH偶联物覆盖，12小时后，用PBS/0.05％ Tween洗涤一次。各格用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，然后再次洗涤。然后，加入含Fab片段的周质制剂原液和数种浓度的稀释液，孵育2小时。阴性对照是与PBS而不是周质制剂一起孵育的格。先用小鼠抗His尾抗体，接着用与过氧化物酶偶联的多克隆山羊抗小鼠IgG抗体，检测与ζ肽-KLH偶联物结合的Fab片段。最后，加入ABTS底物溶液进行ELISA显色。用ELISA读数仪在405nm处测定底物颜色的改变。

图6：抗ζ链抗体2-B-5的VH区的DNA序列和蛋白质序列。数字表示核苷酸(nt)位置，氨基酸(aa)用单字母码表示。框内显示三个CDR。

图7：抗ζ链抗体2-B-5的VK区的DNA序列和蛋白质序列。数字表示核苷酸(nt)位置，氨基酸(aa)用单字母码表示。框内显示三个CDR。

图8：检测细胞增殖的基于ELISA的BrdU-掺入试验结果：为了测定抗ζ链抗体2-B-5诱导的CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞和PBMC的激活。用纯化抗体2-B-5的数种浓度稀释液覆盖96格平底微滴板，4℃过夜。在微滴板的格中加入100.000个CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞和未分离的PBMC，分别一式三格。作为2-B-5介导的激活作用特异性的对照，使用同浓度的同型(大鼠IgM)但特异性不相关的抗体。识别人CD3复合物的抗体OKT3(IgG2a同型)被用作T细胞和未分离PBMC激活的特异性阳性对照。特异性不相关的小鼠IgG2a抗体被用做OKT3的同型对照。还包括一空白对照(没有细胞的格)和背景对照(没有BrdU的格)。孵育3天后，加入BrdU标记溶液24小时。接着，裂解细胞并固定，然后加入抗BrdU抗体，该抗体与新合成的细胞DNA内掺入的BrdU结合。然后用底物反应检测该与过氧化物酶偶联的抗体。用ELISA读数仪在450nm波长处定量测定反应产物。

图9：抗ζ链抗体结合所诱导的TCR/CD3复合物内化作用的流式细胞计数分析。200.000个单核细胞与1μg/ml抗ζ链抗体2-B-5一起在4℃或37℃孵育30或60分钟；用大鼠抗人CD3抗体进行一平行实验。用冷PBS洗涤两次来终止加帽过程。为了标记细胞表面结合的抗体，细胞与荧光素(FITC)偶联的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗体1∶100PBS稀释液一起孵育。阴性对照只用了第二抗体。

图10：抗ζ链/抗EpCAM双特异性单链抗体的DNA和蛋白质序列。数字表示核苷酸(nt)的位置，核苷酸序列下是所得的氨基酸序列。DNA序列从第67位起至第1605位止编码所述抗体。核苷酸10-66编码一段前导肽，它在哺乳动物细胞内介导双特异性抗体的分泌。前6个nt(第1-6位)和最后6个nt(第1632-1637位)分别含EcoRI和Sall的限制酶识别位点。

图11：因抗ζ链/抗EpCAM双特异性抗体而再抗EpCAM阳性Kato细胞的PBMC和CD8+T淋巴细胞的细胞毒性。将100μl体积的200.000个非活化PBMC或CD8+T淋巴细胞加入100μl体积的10.000个铬-51标记的Kato III细胞。加入50μl体积，浓度为40ng/ml-5μg/ml的双特异性抗体。微滴板37℃，5％CO₂孵育4小时。然后，从各格取50μl上清液，在γ计数仪中测定51Cr的释放。

图12：通过ζ链/抗EpCAM双特异性抗体将NK细胞的细胞毒性再指向EpCAM阳性细胞。将100μl体积的100.000个NK细胞加入100μl体积的10.000个铬-51标记的Kato III细胞。加入50μl体积，浓度为1μg/ml的双特异性抗体。微滴板37℃，5％CO₂孵育4小时。然后，从各格取50μl上清液，在γ计数仪中测定51Cr的释放。

本发明的实施例描述包涵了以上和其他实施方式。有关本发明所用的抗体、方法、用途或化合物的其他文献，可从公共图书馆和数据库获取，例如用电子工具。例如，可利用网上的公共数据库“Medline”，网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其他数据库及其地址例如：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http：//www.infobiogen.fr/，http：/www.fmi.ch/biology/research-tools.html，http：//www.tigr.org/，这些都是本领域技术人员所已知的，也可用http：//www.lycos.com.获得。有关生物技术专利信息的评论，以及用于检索和了解当前状况的相关专利信息来源的调查报告可参见Berk，TIBECH 12(1994)，352-364。

以上内容总体上描述了本发明。通过以下具体实施例可获得更完全的理解，这些实施例仅以说明为目的，不限定本发明的范围。实施例1：用ζ肽-KLH偶联物免疫小鼠，并用ζ肽-BSA偶联物测定血清效价

用ζ肽-KLH偶联物(Jerini Bio Tools，Berlin)免疫10周龄的balb/c×C57黑鼠交配产下的F小鼠。含有ζ链N末端氨基酸序列(QSFGLLDPKLG)的该肽与马来酰亚胺活化的KLH通过C末端半胱氨酸的巯基定向偶联。将此偶联物溶于0.9％NaCl至100μg/ml浓度。然后用完全Freund佐剂乳化，给每个小鼠腹腔内注射50μl。在4、8和12周后，除以不完全Freund佐剂替换完全Freund佐之外，以相同的方式对小鼠进行加强免疫。第一次加强免疫后10天，采集血样，ELISA测定抗ζ肽-BSA偶联物的抗体血清效价。免疫动物的血清效价比没有免疫动物高1000倍。第二次加强免疫后3天，按照“现代免疫学方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)中所述的标准方法，将脾细胞与P3X63Ag8.653细胞(ATCCCRL-1580)融合，生成杂交瘤细胞系。PEG融合后，按100.000个/格将细胞接种在微滴板的格内，培养在补充了10％胎牛血清、300单位/ml重组人白介素6和HAT-添加剂的200μl RPMI 1640培养基中进行选择。致密生长格中的培养物上清液按1∶20稀释，用ELISA分析进行测试。用以下ELISA检测杂交瘤上清液与ζ肽-BSA偶联物结合的能力：和ζ肽-KLH偶联物一样(Jerini Bio Tools，Berlin)，将100μlζ肽与牛血清白蛋白偶联，然后以5μg/ml的浓度涂到96格U形底微滴板(Nunc，maxisorb)的格内。涂覆后在4℃过夜，用洗涤缓冲液(0.1M NaCl，0.05M Na₂HPO4，pH7.3，0.05％Tween 20，0.05％NaN₃)洗涤三次，然后将脱脂奶粉加入洗涤缓冲液配成200μl 2％的溶液，用该溶液在室温下封闭1小时。下一步，纯的或数种稀释度的杂交瘤上清液在室温下孵育2小时。检测系统使用的是与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗体。5次洗涤后，最后用TMB底物溶液(四甲基二氨基联苯，Boehringer Mannheim)进行ELISA显色。15分钟后，有色沉淀用ELISA读数仪在405nm处测定。

150个克隆的上清液表现出强ELISA信号，挑选它们进行流式细胞计数分析。

为了验证杂交瘤上清液在T淋巴细胞和NK细胞上的结合活性，进行流式细胞计数分析。1×10⁶PBMC在150个不同克隆的各50μl上清液原液中，冰上孵育30分钟，与荧光素(FITC)偶联的家兔抗小鼠Ig抗体F(ab)′₂片段(Dako Hamburg，CodeNo.F0313)以PBS按1∶100稀释，用该溶液检测结合的抗体。为了避免非特异性结合，在下一步标记中，加入50μl 1∶10稀释的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen，M-5905)反应30分钟，封闭FITC偶联的抗体的游离价。为了区别两个PBMC亚组，将先前标记的细胞一分为二。一半用1∶100稀释的三色偶联的抗CD8抗体(Caltac实验室，Burlingame；USA，Code No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀释的藻红蛋白(PE)偶联的抗CD56抗体(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。阴性对照使用特异性不相关的鼠单克隆抗体而不是杂交瘤上清液。用特异性染色NK细胞或T淋巴细胞的非标记的抗CD16抗体和抗CD6抗体作为第一标记步骤的对照。

在FACS扫描仪(Becton Dickinson，Heidelberg)上用流式细胞计数分析细胞。按照“现代免疫学方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法进行FACS-染色和荧光强度测定。

进行双色荧光分析，对CD8⁺细胞施加正栅极，对CD56⁺细胞施加负栅极，这样，只分别检测到CD8⁺T淋巴细胞或NK细胞上的FITC荧光。尽管各自的阳性对照抗体明显染色CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞，150份杂交瘤上清液都未显示在CD8⁺T淋巴细胞和/或NK细胞上的结合活性。实施例2：用噬菌体展示法在鼠组合抗体文库中体外选择抗ζ抗体

如实施例1所述免疫10周龄的balb/c×C57黑鼠交配产下的F小鼠。第一次加强免疫后10天，采集血样，ELISA测定抗ζ肽-BSA偶联物抗体的血清效价(参见实施例1)。免疫动物的血清效价比未免疫动物高1000倍。第三次注射后3天，收获小鼠的脾细胞。用Chomczynski(分析生物化学(Analytical Biochemistry)162(1987)156-159)的方法分离总RNA。通过小鼠脾细胞RNA的RT-PCR构建一个鼠免疫球蛋白(Ig)κ轻链和Ig重链Fd片段(＝VH+CH1)的DNA文库。用标准方法合成cDNA(Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第二版)。

选择引物组(见表1)，使得重链含有5′-XhoI和3′-SpeI识别位点，轻链片段含5′-SacI和3′-XbaI识别位点。为了PCR扩增HC DNA片段，8种不同的5′-VH家族特异性引物各自与4种与不同IgG亚型HC-CH1结构域3′区杂交的3′引物组合；为了PCR扩增κ轻链片段，7种不同的5′-VK家族特异性引物各自与1种与κ恒区(CK)3′末端杂交的3′引物组合。

用以下PCR程序进行扩增：94℃初变性2分钟；扩增40轮：94℃变性20秒，52℃引物退火50秒，72℃引物延伸60秒；然后72℃延长10分钟。

将450ngκ轻链片段(Sacl-XbaI消化)与1400ng噬菌粒pComb3H(Sacl-XbaI消化；大片段)连接(Barbas等，美国科学院院报88，7978-82(1991))。然后将得到的轻链文库通过电穿孔(2.5kV，0.2cm宽的比色杯，25FD，200Ω，Biorad基因脉冲仪)转化到300μl电感受态的大肠杆菌XL1Blue中，得到大小为6×10⁸个独立克隆的文库。1小时的表型表达后，在100ml液态SB培养物中过夜，选出载体编码羧苄青霉素抗性的阳性转化子。然后离心收集细胞，用市售的质粒制备试剂盒(Qiagen)制备质粒。

将2800ng含κ轻链文库的该质粒DNA(Xhol-SpeI消化；大片段)与900ng HC-Fd-DNA片段(Xhol-SpeI消化)连接，并仍通过电穿孔(2.5kV，0.2cm宽的比色杯，25FD，200Ω)转化到两份300μl电感受态的大肠杆菌XL1Blue中，得到4×10⁸个独立克隆的抗体Fab片段组合文库。

1小时的表型表达后，根据羧苄青霉素抗性选出阳性转化子。经过如此适应后，用感染剂量1×10¹²个辅助噬菌体VCSM13颗粒感染这些克隆，于是产生并分泌出丝状M13噬菌体，各噬菌体颗粒含编码单个鼠抗体Fab片段的噬菌粒载体的单链拷贝，并在噬菌体表面展示相应的Fab蛋白。通过翻译将HC-Fd片段与噬菌体包被蛋白III融合，Ig轻链自发地与HC片段结合，这样将Fab片段锚着在噬菌体表面上。

用PEG8000/NaCl沉淀和离心，从培养物上清液收获带有克隆Fab集的噬菌体文库，重溶于补充了10％FCS的RPMI1640培养基，隔日轮换地与固定化ζ肽-BSA偶联物或分离的CD8⁺淋巴细胞或NK细胞一起培养。预先用免疫磁力分离法分离两个人PBMC亚群。用Ficoll密度梯度离心从外周血获得单核细胞，它们先与抗人CD8和CD56的鼠源特异性第一抗体一起孵育，然后用偶联了绵羊抗小鼠IgG抗体的顺磁性微珠(Dynal，Oslo，Norway)进行花结实验。用一块磁铁贴在含细胞悬液试管的壁上，分离出CD8⁺T淋巴细胞和CD56⁺NK细胞。噬菌体文库分别与纯化的CD8⁺T淋巴细胞或NK细胞在4℃连续搅拌孵育2小时，然后，因为顺磁性微珠仍然结合着细胞，所以可从非结合噬菌体颗粒中拯救出结合噬菌体颗粒的细胞。

所以，与磁场作用可用来取消每轮从筛选时为减弱噬菌体背景而多次使用洗涤溶液重悬细胞。最后，用HCl-甘油，pH2.2洗脱特异性结合的噬菌体颗粒，用2M Tris，pH12中和后，用洗脱物感染新的未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物。同样，用羧苄青霉素抗性选出编码鼠Fab片段的pComb3H噬菌粒拷贝成功转导的细胞，然后用VCMS13辅助噬菌体感染，开始另一轮抗体展示和体外选择。

完整的体外选择包括：前两轮固定化ζ肽-BSA偶联物上的筛选，然后一轮分别在CD8⁺T淋巴细胞和CD56⁺NK细胞上的筛选。然后，又是两轮固定化ζ肽-BSA偶联物上的筛选，接一轮CD8⁺T淋巴细胞上的筛选，最后在CD56⁺NK细胞上筛选。为了保持对ζ链特异性Fab片段的选择压力，按(Barbas等，美国科学院院报88，7978-82(1991))所述进行固定化抗原上的筛选，否则，这些Fab片段可能因非特异性噬菌体洗脱而从含有除ζ链之外大量其他抗原的细胞表面丢失。每轮筛选后，从得到的大肠杆菌培养物制备质粒DNA。

为了生产可溶性Fab蛋白，从制备的质粒DNA中切下基因III DNA片段(SpeI/NheI)，从而破坏了Fab片段与基因III蛋白的翻译融合。连接后，将该质粒集合转化到100μl热休克感受态大肠杆菌XL1Blue中，并在羧苄青霉素LB-琼脂板上培养。将单克隆培养在10ml LB-Carb-培养物/20mM MgCl₂中，6小时后，加入最终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)诱导Fab表达。

20小时后，离心收获细胞，经4次-70℃冷冻和37℃融解循环后，细菌的外膜被温度冲击所破坏，包括Fab抗体片段在内的可溶性周质蛋白于是释放进入液体。离心去除完整细胞和细胞碎片，用ELIDA测定上清液中Fab抗体片段与ζ肽-BSA偶联物的结合。

用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG+IgM抗体的F(ab′)₂片段(0.16μg/ml)检测与固定化ζ肽-BSA偶联物结合的Fab抗体片段(Pierce，Rockford，USA，Prod.No.311448)。加入底物溶液(含2，2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)和过硼酸钠，进行信号显色，并在405nm处检测。

与体外选择前取自文库的克隆相反，不同轮次筛选后的被测克隆在ζ肽-ELISA中证明呈阳性，频率全面提高，直至用纯化CD8⁺T细胞进行的第7轮筛选(图2)。但从第7轮到用纯化NK细胞进行的第8轮筛选，阳性克隆数显著下降。这显示，凭借其在T细胞上结合活性而富集的克隆大多数不结合NK细胞，只有克隆90例外，它在最后的NK细胞筛选后仍然存在。

为了验证ζ肽反应性Fab片段在CD8+T细胞和NK细胞上的结合活性，进行流式细胞计数分析。1×10⁶个PBMC在50μl周质制剂原液中冰上孵育30分钟，然后与荧光素(FITC)偶联的山羊抗小鼠IgG+IgM抗体的F(ab′)₂片段(JacksonImmunoresearch Laboratories，West Grove，USA，Code No.115-096-068)的1∶100 PBS稀释液一起孵育。为了避免非特异性结合，在以后的标记步骤中，加入50μl 1∶10稀释的小鼠血清(Sigma immunochemicals，Deisenhofen)反应30分钟，封闭FITC-抗体的游离价。为了区分两PBMC亚组，将先前标记的细胞一分为二。一半用1∶100稀释的三色偶联的抗CD8抗体(Caltac Laboratories，USA，Code.No.MHCD0306)染色；另一半用1∶25稀释的藻红蛋白(PE)偶联的抗CD56抗体(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)染色。阴性对照使用特异性不相关的Fab抗体周质制剂。分别用非标记的抗CD16抗体和抗CD6抗体作为NK细胞和CD8⁺T淋巴细胞的阳性对照。

在FACS扫描仪(Becton Dickinson)上进行双色荧光分析，对CD8⁺细胞和CD56⁺施加正栅极，这样，只分别检测到CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞上的FITC荧光。按照“现代免疫学方法”(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述的方法进行细胞标记和荧光强度测定。

用以上方法，在PBMC上分析了60个不同克隆，它们都在ELISA分析中被证明与ζ肽-BSA偶联物反应。虽然阳性对照表现出明显的阳性FACS信号，但抗ζ链Fab片段周质制剂都不能与CD8⁺细胞和NK细胞的表面结合。这可以解释为，用T细胞表面筛选得到的Fab片段的亲和反应性低，这对于体外选择过程中的富集可能已足够，但却低于流式细胞计数分析的灵敏度。然而，最后在NK细胞上选择时，ζ肽反应性克隆消失，这明确显示，这些潜在的T细胞反应性克隆完全不与NK细胞表面结合。另一方面，克隆90，根据其可变区序列与体外筛选过程中早期出现的其他ζ肽反应性克隆的可变区序列的比较，在最后的NK细胞表面选择时才首次出现，很可能具有结合NK细胞表面的低亲和力，但与T细胞不反应。所以，直到第二轮NK细胞选择，克隆90才出现，用相应的Fab片段进行的流式细胞计数分析在T细胞或NK细胞上都没有检测到结合信号。实施例3：用ζ肽-KLH偶联物免疫大鼠，并用杂交瘤技术产生抗ζ肽抗体

3月龄时，用人T细胞系Jurkat(ATCC TIB-152)通过腹腔内注射1×10⁷细胞免疫Spargue Dawley大鼠。3个月后，用ζ肽-KLH偶联物免疫大鼠。将该偶联物溶于0.9％NaCl中达200μg/ml的浓度。用Freund完全佐剂将该溶液按1∶2乳化，取100μl进行腹腔内注射和皮下注射。4周后，以相同方式但不加佐剂，对大鼠进行加强免疫。加强免疫后3天，杀死动物取出脾细胞，按标准方法，将其与P3X63Ag8.653细胞(ATCC CRL-1580)融合，生成杂交瘤细胞系。PEG融合后，按100.000/格将细胞接种在微滴板上，培养在200μl补充了10％胎牛血清和HAT添加剂的RPMI 1640培养基中进行选择。8天后，完全除去培养上清液，换以新鲜的培养基。又4天后，各格的培养上清液按1∶1稀释，并进行ELISA测试(参见实施例1)。挑选与固定化ζ肽-BSA偶联物反应最强烈的45格的上清液，如实施例1就鼠单克隆抗体筛选所述，在CD⁸⁺T淋巴细胞和NK细胞上进行FACS分析，但使用的是FITC标记的抗大鼠免疫球蛋白抗体(IgG+IgM)(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)而不是FITC偶联的大鼠抗小鼠Ig抗体的F(ab′)₂片段。在被测的45种不同大鼠单克隆抗体中，只有克隆2-B-5在CD⁸⁺T淋巴细胞和NK细胞上都结合。所以，在实施例4-7中，对该克隆进行更详细的分析。实施例4：在CD⁸⁺T淋巴细胞和NK细胞上进行的抗ζ链抗体2-B-5的流式细胞计数分析

为了测试抗体2-B-5在CD⁸⁺T淋巴细胞和NK细胞上的结合活性，取两名健康供者的外周血，通过Ficoll密度梯度离心分离出单核细胞。将细胞按100.000/格接种在微滴板上，分别与2-B-5杂交瘤培养上清液原液及其几个浓度的稀释液一起孵育。阴性对照用的是同型但特异性不相关的抗体(大鼠IgM)的培养上清液。冰上孵育30分钟后，细胞用PBS洗涤两次，然后用两种不同的抗体标记混合物染色。同时，CD⁸⁺T淋巴细胞与荧光素(FITC)偶联的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗体((Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)的1∶100 PBS稀释液，藻红蛋白(PE)偶联的CD56抗体(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347747)的1∶25PBS稀释液，和三色偶联的CD3抗体(Caltac Laboratories，Burlingame，USA，Cod.No.MHCD0306)的1∶50PBS稀释液一起在冰上孵育30分钟。为了避免抗大鼠抗体与小鼠抗体的非特异性结合，在该标记混合物中加入1∶10稀释的小鼠血清(Sigma Aldrich，St.Louis，USA，Cat.No.054H-8958)。

NK-细胞与相同的山羊抗大鼠抗体1∶100 PBS稀释液，三色偶联的CD8抗体((Caltac Laboratories，Cod.No.MHCD0806)的1∶100 PBS稀释液，和藻红蛋白(PE)偶联的CD16抗体(Becton Dickinson，Heidelberg，Cat.No.347617)的1∶25PBS稀释液一起孵育。也在该混合物中加入小鼠血清。标记后的细胞用PBS洗涤两次，然后用PBS/1％聚甲醛固定。

在FACS扫描仪(Becton Dickinson，Heidelberg)上对细胞进行流式细胞计数分析。按现代免疫学方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)所述，进行FACS染色和荧光强度测定。

进行三色荧光分析，对CD8⁺细胞(三色)加以正栅极，对CD16⁺细胞(PE)加以副栅极，这样，检测到的只是CD8⁺T淋巴细胞(表型：CD8⁺，CD16⁺)上的FITC荧光，而没有来自CD8⁺NK细胞的干扰。同样，进行三色荧光分析，对CD56⁺细胞(PE)加以正栅极，对CD3⁺细胞(三色)加以副栅极，这样，检测到的只是NK细胞(表型：CD56⁺，CD3⁺)上的FITC荧光，而没有来自CD56⁺T淋巴细胞的干扰。

如图3所示，2-B-5杂交瘤抗体与不同供者的T淋巴细胞和NK细胞都特异性地结合。实施例5：用夹心ELISA验证2-B-5抗体的ζ链特异性

为了验证2-B-5抗体的ζ链特异性，进行夹心ELISA。

为此，纯化已知表达ζ链的CD8⁺T淋巴细胞的裂解液，与固定化的识别胞外ζ链结构域的抗体一起孵育。细胞裂解液的ζ链分子于是被该抗体捕捉，继而被抗ζ链胞外部分的2-B-5抗体检测到。如实施例1所述，用顺磁性微珠分离CD8⁺T淋巴细胞。具体步骤按照生产商(Dynal，Oslo，Norway)的说明书进行。用除垢剂NP-40(Sigma，deisenhofen)，在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(Merk，Darmstadt)存在下，裂解纯化的CD8⁺T淋巴细胞。有关详细的缓冲液配方，参见Sambrook，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Habor Laboratory Press，Cold Spring Hobart，NY(1989)。

如下进行夹心-ELISA：

一种ζ链特异性抗体(Santa Cruz Biotechnology，Cat-No1124)识别ζ链羧基末端的144-163位氨基酸，叫将它以5μg/ml的浓度涂在96格U形底微滴板(Nunc，Maxisorb)上。涂层在4℃保持过夜，用BSA的3％PBS溶液室温下封闭1小时。然后，加入CD8⁺T淋巴细胞裂解液原液和几个浓度的稀释液，培养1小时。阴性对照是与PBS而不是细胞裂解液一起孵育的孔。在以下步骤中，加入1μg/ml的纯化单克隆抗体2-B-5，孵育1小时。先加生物素化小鼠抗大鼠IgM抗体(Zymed，San Francisco，CA.USA；Cat-No.03-9840；工作浓度为400ng/ml)，然后加亲合素-过氧化物酶偶联物(Dako，Hamburg；Code-No.P03347；工作浓度位1μg/ml)，检测结合的2-B-5抗体。最后加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)进行ELISA的显色。用ELISA读数仪在405nm测定有色沉淀。

按照生产商的说明使用Bakerbond Abx柱(J.T.Baker，Greisheim，Germany)，用离子交换层析法，从杂交瘤培养上清液中纯化大鼠IgM抗体2-B-5。

如图4所示，单克隆抗体2-B-5与T细胞裂解液中的ζ链分子结合，被识别胞外ζ链结构域的固定化抗体所捕捉，ζ特异性的ELISA信号依赖于裂解液的稀释度，而且明显高于阴性对照。实施例6：ζ抗体2-B-5可变区的克隆，和其相应Fab片段在大肠杆菌内的表达

按照Chomczynski等的方法(生物化学年报，Vol.162，p.156-9，1989)，从5×10⁶个大鼠杂交瘤细胞系2-B-5细胞中分离RNA。按照标准方法(Sambrook，Cold SpringHarbour Laboratory Press 1989，第二版)，用MMLV逆转录酶Superscritpt II(Gibco BRL，Eggenstein)逆转录总RNA。大鼠cμRT(GTGCAGGGCCAGAGAAGGCATC)与大鼠μ链恒区的一段短序列匹配，大鼠ckRT(GTAGGTCGCTTGTGGGGAAGTCTC)与轻链(κ链)3′非翻译区的一部分互补，用这两段寡核苷酸特异性合成cDNA，两引物分别位于转录产物IgM-CH1-重链或κ轻链恒区的核苷酸序列末端下游70碱基对(bp)处。两种情况中的核苷酸信息都来自Genebank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)，κ链：登录号J02574，μ链：登录号X68312。然后，按照标准方法，用末端转移酶(Pharmacia，Freiburg)给cDNA第一链加上聚G尾。根据Gilliland，L.K.等公开(Tissue Antigens 47，1-20，1996)的锚引物5′-Anc尾(CGTCGATGAGCTCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCD)，用一段含聚C延伸的有义引物对加尾cDNA进行PCR扩增。将该锚引物与分别对编码κ轻链恒区C末端或IgM-CH1重链C末端的核苷酸序列具有特异性的反义引物混合。将该两引物称为3′大鼠ck(GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA)和3′大鼠cμ(ATTGGGACTAGTCTCAACGACAGCTGGAAT)。如下进行PCR：初变性：94℃ 4分钟；30轮扩增：93℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；最后延长：72℃3分钟。这些引物都含有一个限制酶剪切位点(5′-Anc尾：EcoRI；3′大鼠ck：XbaI；3′大鼠cμ：SpeI)，从而可将相应PCR片段插入分别用EcoRI/XbaI消化或EcoRI/SpeI消化的质粒载体；为此，使用bluescript KS+质粒载体(Genebank Accession No X52327)，因为它允许用一般测序引物方便地对所得插入片段进行序列分析。因为重链(VH)可变区内有一个SpeI剪切位点，必须先部分消化，然后克隆全长片段，才能获得VH链的全序列信息。部分消化按照标准方法进行(Sambrook，Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989，第二版)。重链和轻链的几个克隆分别被证明具有相同的序列，可认为编码功能性VL或VH区(参见图6和7)。

通过与Genebank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/)中序列比较，鉴定两可变区的成熟N末端，然后设计第二组PCR引物，以便根据亚克隆到细菌表达载体中的要求，引入一个与2-B-5Fab抗体片段编码序列同框的合适的限制酶剪切位点。这两个引物是5′RVHZXhoI(CAGGTACAGCTGCTCGAGTCTGGGGC-TGAGCTAG)和5′RVKZSacI(GTAAATGTGAGCTCCAGATGACACAGTCTCCTG)，分别与3′大鼠cμ和3′大鼠ck引物联用。PCR扩增，并用合适的限制酶组合(XhoI/SpeI用于重链片段，SacI/XbaI用于κ轻链)消化后，将所得的DNA片段分别克隆到相应制备的bluestript质粒载体中，然后进行序列验证(测序结果，参见图6和7)。

为了在大肠杆菌的周质中表达2-B-5-Fab片段，用限制酶SacI/XbaI从BluescriptKS+中切取相应的κ轻链，亚克隆入相同酶消化的载体pComb3HHis。然后，用限制酶XhoI/NheI消化所得的质粒，以其为载体亚克隆2-B-5重链Fd片段(VH+CH1)；该DNA片段用XhoI/SpeI切自相应的Bluescript KS+克隆。

pComb3HHis是pComb3H和pComb3(Barbas等，美国科学院院报88，7978-82(1991))经以下修饰而得：用NheI剪切pComb3H载体，通过连接插入一段带有合适末端的双链寡核苷酸。该双链寡核苷酸是5′磷酸化引物His6s(CTAGCCATCACCATCACCATCACA)和His6as(CTAGTGTGATGGTGATGGTGATGG)退火(94℃10分钟；65℃30分钟；52℃30分钟；30℃10分钟)而成。引物末端的设计为：在与载体融合后，3′NheI限制酶位点被破坏，而5′NheI剪切位点保持完好。最后，进行插入片段的测序，验证克隆成功。

用渗透性冲击制备细胞周质，并用ELISA检测与ζ肽-KLH偶联物结合的Fab片段。为此，将以含2-B-5重链Fd片段和κ轻链的pComb3Hhis转化的大肠杆菌XL1Blue的单克隆培养在10ml补充了羧苄青霉素和20mM MgCl₂的Super肉汤培养基中，6小时后，加入最终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)，诱导Fab的表达。20小时后，收获细胞，重溶于1ml PBS中。4轮-70℃冷冻和37℃融化后，细菌的外膜被破坏，含有Fab片段的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。离心去除完整细胞和细胞碎片，收集含ζ-Fab抗体片段的上清液，用于以后的检测。

用以下ELISA检测周质表达的单克隆抗体2-B-5 Fab片段与ζ肽-KLH偶联物的结合：将抗原固定在96U格ELISA板(Nunc maxisorb)上，浓度为每格50μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的200μg/ml。涂层在4℃保持12小时，然后用PBS/0.05％Tween洗涤一次。然后用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封闭ELISA板一小时，再洗涤一次。然后，加入含Fab的周质制剂原液和几个浓度的稀释液，培养2小时。先加1∶200稀释的小鼠抗His-尾抗体(Dianova，Hamburg，cat.no.DIA900)，然后加1∶5000稀释的过氧化物酶偶联的多克隆山羊抗小鼠IgG(Fcγ特异性)抗体(Dianova/Jackson，Hamburg，cat.no.115-035-071)，检测与ζ肽-KLH偶联物结合的Fab片段。最后，加入ABTS底物溶液(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat-No.1682008)进行ELISA显色。用ELISA读数仪在405nm测定有色底物的转变率，结果见图5。阴性对照是与PBS而不是周质制剂一起培养的细胞。

可检测到几个克隆与ζ肽-KLH偶联物的特异性结合，克隆8和9的结果见图5。信号强度明显高于阴性对照，可用样品稀释液进行滴定。因此，克隆的2-B-5Fab片段的ζ链特异性得到了证实。实施例7：用抗ζ链抗体2-B-5激发T淋巴细胞和NK细胞。

本实验的目的是分析受抗体2-B-5诱导的T细胞，NK细胞和PBMC的激发和增殖。为此，采用基于测定DNA合成时掺入的5-溴脱氧脲苷(BrdU)的比色免疫试验(Boehringer Mannheim，Mannheim，Cat.No.1647229)。

第一步，用纯化的2-B-5抗体的几个浓度的稀释液覆盖96格平底微滴板(有关2-B-5的纯化，参见实施例5)。涂层在4℃保持过夜。用PBS洗涤3次后，在微滴板的格内加入100.000 CD8⁺T淋巴细胞、NK细胞和非分离的PBMC，一式三份，按照实施例2的说明，用磁性微珠和第一抗体抗CD8⁺(MT-811)和抗CD16(3G8，小鼠IgG1，Dianova，Hamburg，Cat.No.0813)，分离CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞。

作为2-B-5介导激发的特异性的对照，使用同浓度，特异性不相关的同型抗体(大鼠IgM)。抗体OKT3(同型IgG2a，Ortho.，Prod.Code 710320，Johnson+Johnson，NewYork，USA)识别人CD3复合物，用它作为阳性对照，以1μg/ml覆盖浓度分别用于T细胞和NK非分离PBMC的激发。用特异性不相关的IgG2a抗体作为OKT3的同型对照。还包括一个空白对照(无细胞的格)和一个背景对照(没有BrdU)格。培养3天后，加入BrdU标记溶液反应24小时。在此标记期间，嘧啶类似物BrdU取代胸腺嘧啶掺入增殖细胞的DNA。去除培养基后，固定细胞，加入变性性溶液变性DNA。DNA的变性是必需的，这是为了提高用与过氧化物酶偶联的抗BrdU抗体检测掺入BrdU的可接近性。该抗体与新合成的细胞DNA内掺入的BrdU结合。然后用底物反应检测结合的抗BrdU抗体。用ELISA读数仪进行反应产物的定量。以405nm处的吸光度作为有色底物的转化率，它与DNA合成水平即增殖细胞数直接相关。所有步骤都按照试剂盒生产商的说明进行。

图8中，该试验的结果清楚地显示，抗体2-B-5不仅与T淋巴细胞和NK细胞上的ζ链短胞外域结合，而且还通过这一相互作用强烈诱导以上两种细胞的激发。实施例8：抗ζ链抗体结合诱导的TCR/CD3复合物内化的流式细胞计数分析

对许多受体来说，配体结合的激活作用后紧跟着受体的内化。所以，在抗CD3抗体结合后，典型地观察到了T细胞上TCR复合物的内化。因此，2-B-5抗体通过胞外ζ链表位结合TCR复合物后的内化验证了本发明抗体的独特特异性。(Boyer，C.，Auphan，N.，Luton，F.，Malburet，J.M.，Barad，M.Bizozzero，J.P.，Reggio，H.和Schmitt-Verhulst，A.M.(1991)。溶胞性T细胞克隆活化后T细胞受体/CD3复合物的内化：非蛋白激酶C依赖性星形孢菌素敏感性步骤的证据。欧洲免疫学杂志21，1623-34)。

为了测定2-B-5抗体与T细胞表面结合后的受体内化作用，在不同温度进行流式细胞计数试验，观察表面结合抗ζ链抗体的消失。

为此，用Ficoll密度梯度离心法分离来自健康供者外周血的单核细胞。在微滴板的各格中，200.000个细胞与1μg/ml抗ζ链抗体2-B-5在4℃或37℃培养30或60分钟，从而为加帽反应提供足够的时间。用大鼠抗人CD3抗体(大鼠IgG2B)(克隆26-II 6-5)进行平行实验作为阳性对照。通过两次冷PBS洗涤终止加帽反应。为了标记细胞表面结合的抗体，将细胞与PBS1∶100稀释的荧光素(FITC)偶联的山羊抗大鼠Ig(IgG+IgM)抗体(Dianova/Jackson，Hamburg，Cat.No.112-016-044)一起培养。单纯用第二抗体作为阴性对照。标记后细胞用PBS洗涤两次，然后用PBS/0.1％聚甲醛固定。

在FACS扫描仪(Becton Dickinson，Heidelberg)上，对细胞进行流式细胞计数分析。按现代免疫学方法中所述的方法(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，1992)进行FACS染色和荧光强度的测定。

结果清楚地显示，在抗ζ链抗体2-B-5结合后，可观察到37℃培养和4℃培养的细胞样品间发生明显的荧光强度漂移。抗CD3抗体结合后，也可看到类似的内化方式。与在37℃的受体内化相反，在加帽反应无法进行的4℃培养的样品，其荧光方式不变。实施例9：根据本发明的抗ζ链特异性构建双特异性抗体

为了获得抗ζscFv片段，以克隆在各自质粒载体内的VL和VH区作为模板，分别用寡核苷酸引物对5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VL2B5GS15和5′VH2B5GS15/3′VH2B5BspEI，进行VL和VH特异性PCR。由此，将重叠的互补序列引入PCR产物，在融合PCR过程中，组合成一段15氨基酸(Gly4Ser1)3接头的编码序列。用引物对5′VL2B5BsrGI-EcoRV/3′VH2B5BspEI进行该扩增步骤，用限制酶EcoRV和BspEI剪切得到的融合产物(或抗ζ链scFv片段)，克隆到质粒(参见PCT/EP98/07313)中，该质粒经相同的限制酶消化，含有特异性结合EpCAM抗原的scFv片段，和用于纯化和分析的组氨酸尾C末端。接着，将编码抗ζ链/抗EpCAM的双特异性单链抗体(其结构域排列为：VL_抗ζ-VH_抗ζ-VH_抗EpGAM-VL_抗EpCAM)的DNA片段通过EcoRI/SalI亚克隆入哺乳动物表达载体PEF-DHFR(Mack，M.，Riethmuller，G.，和Kufer，P.(1995)。“一种以功能性单链分子形式表达的高肿瘤细胞毒性双特异性抗体小构建物”。美国科学院院报92，7021-5)。经序列验证(图10)后，所得的质粒DNA通过电穿孔转染到DHFR缺陷型CHO细胞中；如Mack等所述，选择稳定的转化子，进行基因扩增和蛋白质生产。如Mack等所述，在Ni-NTA-柱上，用亲合性层析，通过C末端的组氨酸尾纯化该双特异性抗体。

引物表：5′VL2B5BsrGI/EcoRV  5′-AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GAT GAC ACA GTC TCC-3′3′VL 2B5 GS15       5′-GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT CAG

                   CTC CAG CTT GGT CCC-3′5′VH 2B5 GS15       5′-GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG GTA

                   CAG CTG CAG CAA TCT GG-3′3′VH 2B5 BspEI      5′AAT CCG GAA GAG ACA GTG ACC AGA GTG-3′实施例10：因双特异性抗ζ链/抗EpCAM抗体而再抗EpCAM阳性靶细胞的PBMC和CD8+T淋巴细胞的细胞毒性

在本试验中，靶细胞用⁵¹Cr标记，洗涤，与效应细胞按效靶比20∶1的比例混合，然后与不同浓度的双特异性抗ζ链/抗EpCAM抗体一起培养。定量测定因靶细胞被杀伤而释放到上清液中的⁵¹Cr，并计算各抗体浓度的比裂解率。

从健康供者血液的新鲜黄色白细胞层中分离人外周血单核细胞(PBMC)或细胞毒T淋巴细胞作为效应细胞用于本试验。先ficoll密度梯度离心，然后离心(100g)去除血小板，分离PBMC。用CD8⁺亚组柱试剂盒(R&D System，Wiesbaden，Cat-No.HCD8C-1000)，按照生产商的方案，分离细胞毒T淋巴细胞。100μl补充了10％FCS的RPMI1640培养基中加200000个未激发的PBMC或CD8+T淋巴细胞，将其分别加入圆底微滴板的各孔。靶细胞是Kato III细胞(ATCC HTB-103)，一个EpCAM阳性的胃癌细胞系，已用铬-51(NEN-Life Science，Koln；Cat-No.NEZ030S)(约100μCi)标记12小时；在微滴板的各格内加入100μl体积内的10.000个靶细胞。加入50μl浓度为40ng/ml至5μg/ml的双特异性抗体。微滴板于37℃，5％CO₂培养16小时，结束时，从各格取50μl上清液，在γ计数仪(Wallac，1480Wizard 3″，Freiburg)中分析释放出的⁵¹Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)缓冲液裂解靶细胞，测定最大⁵¹Cr释放。将靶细胞在无效应细胞和双特异性抗体存在下培养，测定自发性⁵¹Cr释放。靶细胞与双特异性抗体一起孵育没有引起可测的裂解。如下计算比裂解：比裂解(％)＝[(cpm，实验释放)-(cpm，自发释放)]/[(cpm，最大释放)-(cpm，自发释放)]×100。所有测试都平行进行3份。所有实验的3份平行实验的SD都低于6％。

用流式细胞计数分析分离的CD8⁺效应细胞的纯度，用PE偶联的抗人CD56抗体染色排除NK细胞污染。如实施例1所述进行FACS分析。使用了以下抗体偶联物：FITC抗人CD3抗体(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS结果验证了CD8⁺细胞群的高纯度(＞99％)。

铬释放试验的结果(图11)清楚地显示双特异性抗ζ链/抗EpCAM抗体能够令未激发的PBMC或CD8⁺细胞毒淋巴细胞再抗EpCAM阳性KATO III细胞。非分离PBMC介导和分离的细胞毒T淋巴细胞介导的比裂解率之间的差异是因为NK细胞的细胞毒性。实施例11：因双特异性抗ζ链/抗EpCAM抗体而再抗EpCAM阳性靶细胞的PBMC和NK细胞的细胞毒性

该实验是为了证明双特异性抗ζ链/抗EpCAM抗体能够令NK细胞再抗EpCAM阳性靶细胞。为了进行该试验，用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，BergischGladbach；Order No.465-02)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离NK细胞。该分离方法是基于磁性去除非NK细胞。先加半抗原偶联的CD3、CD14、CD19、CD36和抗IgE抗体的混合物，接着加顺磁性微珠结合的抗半抗原单克隆抗体，间接标记T细胞、B细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、树状细胞和血小板。与磁性微珠结合的细胞因磁场而滞留。未标记的NK细胞从柱上洗脱，并保持完好。将3名不同健康供者的100000个NK细胞加入100μl补充了10％FCS的RPIM1640培养基中，将此加入圆底微滴板的各格中。在各格内加入靶细胞即⁵¹Cr标记的Kato细胞(每格100μl，内含10000个靶细胞)。加入50μl 1μg/ml双特异性抗体。微滴板在37℃，5％CO₂中培养4小时。结束时，取50μl上清液，在γ计数仪(Wallac，1480Wizard 3″，freiburg)中分析释放的⁵¹Cr。用含Triton-X100(1.0％的PBS溶液)缓冲液裂解靶细胞，测定最大⁵¹Cr释放。将靶细胞在无效应细胞和双特异性抗体存在下培养，测定自发性⁵¹Cr释放。靶细胞与双特异性抗体一起孵育没有引起可测的裂解。如下计算比裂解：比裂解(％)＝[(cpm，实验释放)-(cpm，自发释放)]/[(cpm，最大释放)-(cpm，自发释放)]×100。所有测试都平行进行3份。所有实验3份平行实验的SD都低于6％。

用流式细胞计数分析分离的NK效应细胞的纯度，用三色偶联的小鼠抗人CD8抗体染色排除CD8⁺细胞污染。如实施例1所述进行FACS分析。使用了以下抗体偶联物：FITC抗人CD3抗体(Pharmingen Cat-No.30140X)1∶50；PE抗人CD56(BectonDickinson Cat-No.347747)1∶20；三色小鼠抗人CD8(Caltac Lab Code No.MHCD0806)1∶100(Becton Dickinson)。FACS结果验证了NK细胞群的高纯度(＞98％)。

铬释放试验的结果显示了3种情况下，能够具有重复性地，令NK细胞再抗EpCAM阳性靶细胞。

序列表<110>Connex GmbH<120>与人ζ链胞外域特异性相互作用的免疫试剂<130>C1368PCT<140><141><150>EP 98 11 2867.1<151>1998-07-10<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(33)<400>1cag gca agc cag gac att ggt aat tgg tta gca    33Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1              5                  10<210>2<211>11<212>PRT<213>褐鼠<400>2Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala1              5                   10<210>3<211>21<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(21)<400>3agt gca acc agc ttg gca gac                               21Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1              5<210>4<211>7<212>PRT<213>褐鼠<400>4Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp1              5<210>5<211>27<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(27)<400>5cta cag cgt tat agt aat ccc aac acg                       27Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1               5<210>6<211>9<212>PRT<213>褐鼠<400>6Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn Thr1               5<210>7<211>30<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(30)<400>7ggc tac aca ttc acc agt tac gat atg cac                   30Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1              5               10<210>8<211>10<212>PRT<213>褐鼠<400>8Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His1              5               10<210>9<211>51<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(51)<400>9tgg att tat cct gga aat ggt aat act aag tac aat caa aag ttc aat    48Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Asn1                     5               10              15ggg                                                    51Gly<210>10<211>17<212>PRT<213>褐鼠<400>10Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Asn1              5                  10                  15Gly<210>11<211>42<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(42)<400>11gat tgg cat tac tat agc agc tat atc cgt ccc ttt gct tac    42Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr1              5                  10<210>12<211>14<212>PRT<213>褐鼠<400>12Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr1              5                  10<210>13<211>369<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(369)<400>13cag gta cag ctg cag caa tct ggg gct gaa cta gtg aag cct ggg tcc    48Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser1                  5              10                  15tca gtg aaa att tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttc acc agt tac    96Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

        20                   25                 30gat atg cac tgg ata aaa cag cag cct gga aat ggc ctt gag tgg att   144Asp Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

    35                  40                  45ggg tgg att tat cct gga aat ggt aat act aag tac aat caa aag ttc   192Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50                  55                  60aat ggg aag gca aca ctc act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tat   240Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65                 70                   75                  80atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt   288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

             85                  90                  95gca aga gat tgg cat tac tat agc agc tat atc cgt ccc ttt gct tac   336Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr

        100             105                     110tgg ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca                       369Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    115                 120<210>14<211>123<212>PRT<213>褐鼠<400>14Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser1              5                  10                  15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

        20                   25                 30Asp Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

    35                  40                  45Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50                  55                  60Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

            85                  90                  95Ala Arg Asp Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr

        100                 105                 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    115                 120<210>15<211>321<212>DNA<213>褐鼠<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>15gac atc cag atg aca cag tct cct gct tcc ctg tct gcg tct ccg gaa    48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Glu1              5                  10                  15gaa att gtc acg atc aca tgc cag gca agc cag gac att ggt aat tgg    96Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

        20                  25                  30tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct caa ctc ctg atc   144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

    35                  40                  45tat agt gca acc agc ttg gca gac ggg atc cca tca agg ttc agc ggc   192Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50                   55                  60agt aga tct ggt aca cag tat tct ctt aag atc agc aga cta cag gtt   240Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val65                  70                  75                  80gaa gat act gga atc tat tac tgt cta cag cgt tat agt aat ccc aac   288Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn

             85                 90                  95acg ttt gga gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa                     321Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

        100                 105<210>16<211>107<212>PRT<213>褐鼠<400>16Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Glu1              5                  10                  15Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

         20                 25                  30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

    35                  40                  45Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50                  55                  60Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val65                 70                  75                  80Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser Asn Pro Asn

            85                  90                  95Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

        100                 105<210>17<211>1637<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：人造序列<400>17gaattcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgta  60cactccgata tccagatgac acagtctcct gcttccctgt ctgcgtcccc ggaagaaatt  120gtcacgatca catgccaggc aagccaggac attggtaatt ggttagcatg gtatcagcag  180aaaccaggga aatctcctca actcctgatc tatagtgcaa ccagcttggc agacgggatc  240ccatcaaggt tcagcggcag tagatctggt acacagtatt ctcttaagat cagcagacta  300caggttgaag atactggaat ctattactgt ctacagcgtt atagtaatcc caacacgttt  360ggagctggga ccaagctgga gctgaaaggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt  420ggtggtggtt ctcaggtaca gctgcagcaa tctggagctg agctagtgaa gcctgggtcc  480tcagtgaaaa tttcctgcaa ggcttctggc tacacattca ccagttacga tatgcactgg  540ataaaacagc agcctggaaa tggccttgag tggattgggt ggatttatcc tggaaatggt  600aatactaagt acaatcaaaa gttcaatggg aaggcaacac tcactgcaga caaatcctcc  660agcacagcct atatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcagt ctatttctgt  720gcaagagatt ggcattacta tagcagctat atccgtccct ttgcttactg gggccaaggc  780actctggtca ctgtctcttc cggaggtggt ggttctgagg tgcagctgct cgagcagtct  840ggagctgagc tggcgaggcc tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac  900accttcacaa actatggttt aagctgggtg aagcagaggc ctggacaggt ccttgagtgg  960attggagagg tttatcctag aattggtaat gcttactaca atgagaagtt caagggcaag  1020gccacactga ctgcagacaa atcctccagc acagcgtcca tggagctccg cagcctgacc  1080tctgaggact ctgcggtcta tttctgtgca agacggggat cctacgatac taactacgac  1140tggtacttcg atgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt  1200tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgagctcg tgatgaccca gactccactc  1260tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc tccatctctt gcagatctag tcagagcctt  1320gtacacagta atggaaacac ctatttacat tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca  1380aagctcctga tctacaaagt ttccaaccga ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc  1440agtggatcag ggacagattt cacactcaag atcagcagag tggaggctga ggatctggga  1500gtttatttct gctctcaaag tacacatgtt ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctt  1560gagatcaaac gtacgactag ccatcaccat caccatcaca ctagctaatt aatttaagcg  1620gccgctctag agtcgac                                     1637<210>18<211>532<212>PRT<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：人造序列<400>18Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1              5                  10                  15Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala

         20                  25                  30Ser Pro Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile

     35                  40                  45Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln

 50                  55                  60Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg65                  70                  75                  80Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg

             85                  90                  95Leu Gln Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Tyr Ser

        100                 105                 110Asn Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly

    115                 120                 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

130                 135                 140Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys145                 150                 155                 160Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Met His

            165                 170                 175Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile

        180                 185                 190Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Asn Gly Lys

    195                 200                 205Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu

210                 215                 220Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp225                 230                 235                 240Trp His Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

            245                 250                 255Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

        260                 265                 270Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

    275                 280                 285Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu

290                 295                 300Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu305                 310                 315                 320Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

            325                 330                 335Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu

        340                 345                 350Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

    355                 360                 365Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val  Trp Gly

370                 375                 380Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly385                 390                 395                 400Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro

            405                 410                 415Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg

        420                 425                 430Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp

    435                 440                 445Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val

450                 455                 460Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser465                 470                 475                 480Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu

            485                 490                 495Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val  Pro Tyr Thr Phe Gly

       500                 505                  510Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Ser His His His His

    515                 520                 525His His Thr Ser

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Claims (29)

1.一种核酸分子，含有编码一种抗体的可变区的至少一个互补决定区(CDR)的核酸序列，该抗体特异性地与人ζ链的胞外域相互作用，该抗体可以通过先用Jurkat细胞，接着用载体分子与含有大鼠ζ链N末端11个氨基酸的肽构成的偶联物免疫大鼠来制取。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，它含有编码所述可变区至少两个CDR的核酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，它含有编码所述可变区三个CDR的核酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，所述的核酸序列编码V_H链。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，所述的核酸序列编码V_L链。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸分子，它是DNA分子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸分子，所述CDR具有以下核苷酸序列之一：

(a)SEQ ID No.1；

(b)SEQ ID No.3；

(c)SEQ ID No.5；

(d)SEQ ID No.7；

(e)SEQ ID No.9；

(f)SEQ ID No.11。

8.根据权利要求4所述的核酸分子，所述的V_H链具有核苷酸序列SEQ ID No.13或编码氨基酸序列SEQ ID No.14。

9.根据权利要求5所述的核酸分子，所述的V_L链具有核苷酸序列SEQ ID No.15或编码氨基酸序列SEQ ID No.16。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸分子，所述CDR编码以下氨基酸序列之一：

(a)SEQ ID No.2；

(b)SEQ ID No.4；

(c)SEQ ID No.6；

(d)SEQ ID No.8；

(e)SEQ ID No.10；

(f)SEQ ID No.12。

11.一种载体，它含有权利要求1-10中任一项所述的核酸分子。

12.一种宿主，它是用权利要求11所述载体转化或转染的。

13.一种产生由权利要求1-10中任一项所述核酸分子编码的肽或多肽的方法，包括在合适的条件下培养权利要求12所述的宿主，和从培养物中分离所述肽或多肽。

14.一种肽或多肽，它是由权利要求1-10中任一项所述核酸分子所编码的，或是用权利要求13所述方法产生的。

15.一种抗体或其片段或衍生物，它包含至少一种权利要求14所述的肽或多肽。

16.根据权利要求15所述的抗体，它是单克隆抗体。

17.根据权利要求15所述的抗体，它是双特异性抗体。

18.根据权利要求17所述的抗体，它的第一特异性针对完整细胞表面上人ζ链的胞外域，第二特异性针对T淋巴细胞、自然杀伤细胞或它们前体细胞表面上可能的另一种分子。

19.根据权利要求17所述的抗体，它的第一特异性针对完整细胞表面上人ζ链的胞外域，第二特异性针对另一种细胞表面上另一种分子，该另一种细胞不是T细胞、NK细胞或它们的前体细胞，该另一种分子是病毒编码的抗原、肿瘤相关抗原或抗原呈递细胞(APC)或非APC上的表面抗原，所述APC以树状细胞为佳。

20.权利要求15所述抗体的衍生物，它是scFv链。

21.根据权利要求16所述的抗体，它是IgM。

22.一种双特异性受体，它含有权利要求14所述的肽或多肽和一种天然受体、天然配体或它们的衍生物，后者与同一或另一细胞上的一种表面分子相互作用，所述的受体或配体优选CD4、CTLA-4、B7-1、B7-2、LFA-3、ICAM-1、-2、-3或MIP-1α、MIP-1β、RANTES或SDF-1等趋化因子。

23.一种药物组合物，它含有权利要求1-10中任一项所述的核酸分子，权利要求11所述的载体，权利要求12所述的宿主，权利要求14所述的肽或多肽，权利要求15-21中任一项所述的抗体或其片段或衍生物和/或权利要求22所述的双特异性受体。

24.权利要求18所述抗体用于制备药物组合物的用途，所述的药物组合物用于治疗或预防自身免疫病，免疫缺陷，T细胞性恶性肿瘤，感染性疾病，或用于抑制免疫反应以避免例如器官移植后移植物排斥。

25.根据权利要求19所述抗体用于制备药物组合物的用途，所述的药物组合物用于治疗或预防恶性肿瘤、病毒感染或其他感染性疾病。

26.权利要求14所述肽或多肽，或权利要求15-21中任一项所述的抗体或其片段或衍生物，或权利要求22所述的双特异性受体用于制备药物组合物的用途，所述的药物组合物用于增强或抑制NK细胞依赖性免疫，或用于治疗NK细胞衍生的恶性肿瘤。

27.一种测定NK细胞、T淋巴细胞或它们的前体细胞上ζ链或η链表达的方法，包括：

(a)权利要求14所述的肽或多肽，或权利要求15-21中任一项所述的抗体或其片段或衍生物与所述NK细胞、T淋巴细胞或它们的前体细胞接触；

(b)测定被结合的肽或多肽、抗体或衍生物的量。

28.一种试剂盒，它包含权利要求1-10中任一项所述的核酸分子，权利要求11所述的载体，权利要求12所述的宿主，权利要求14所述的肽或多肽，权利要求15-21中任一项所述的抗体或其片段或衍生物和/或权利要求22所述的双特异性受体。

29.一种转基因动物，它的种系内含有权利要求1-10中任一项所述核酸分子或权利要求11所述载体的至少一份拷贝。

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