JP2003525016A - リンパ球活性化を調節するための組成物および方法 - Google Patents

リンパ球活性化を調節するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、リンパ球活性化の調節に関する。より詳細には、本発明は、リンパ球により発現される複数の細胞表現抗原に選択的に結合することにより、このリンパ球の活性化を調節するための組成物および本発明の方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （１．序論） 本発明は、リンパ球活性化の調節に関する。より詳細には、本発明は、リンパ
球により発現される複数の細胞表現抗原に選択的に結合することにより、このリ
ンパ球の活性化を調節するための組成物および本発明の方法に関する。抗原の凝
集は、リンパ球を、この標的抗原に特異的な、固定化されたリガンドまたは抗体
または抗体フラグメントとともにインキュベートすることによりインビトロで達
成され得る。さらに、単一の可溶性分子において複数の結合特異性を含む多重特
異性分子は、複数の抗原をインビボで凝集させてリンパ球の活性化をもたらす際
に特に有用である。多重特異性分子はまた、リンパ球への活性化シグナルの送達
をブロックすることによりこの細胞の活性化を阻害するために構築され得る。そ
れゆえ、本発明は、Ｔ細胞およびＢ細胞の免疫応答をインビトロおよびインビボ
で調節する際に有用である。
【０００２】 （２．発明の背景） （２．１．Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３複合体） 成熟Ｔ細胞（Ｔ細胞）は、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）複合体により抗原
を認識する。一般に、各ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、６つのサブユニットからなる
。これらのサブユニットは、クローン型の（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ）ジスルフィ
ド結合ＴＣＲα／βまたはＴＣＲγ／δヘテロダイマーおよび不変のＣＤ３複合
体を含む（Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：
４７５，Ａ．Ｃ．Ｃｈａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５
５５）。ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖は、抗体に似
た可変性領域（Ｖ）、連結領域（Ｊ）、および定常（Ｃ）領域を含む、Ｔ細胞特
異的遺伝子によりコードされる４０ｋＤａ〜５０ｋＤａの糖タンパク質である（
Ｓ．Ｍ．Ｈｅｄｒｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３０８：１４９；Ｓ．Ｍ．Ｈｅｄｒ
ｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ，３０８：１５３）。ＴＣＲヘテロダイマーは、抗原結
合サブユニットであり、そしてこれらは個々のＴ細胞の特異性を決定する。α／
βヘテロ発現細胞は、ヒトおよびマウスの両方における９０％を超える末梢Ｔ細
胞を構成し、そしてこれらは古典的ヘルパーＴ細胞応答または細胞傷害性応答を
担う（Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：４７
５，Ａ．Ｃ．Ｃｈａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５５５
）。大部分の場合、ＴＣＲα／βリガンドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨ
Ｃ）クラスＩまたは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子により
提示されるペプチド抗原である。対照的に、ＴＣＲγ／δリガンドの性質はそれ
ほど規定されておらず、そしてＭＨＣタンパク質による提示を含まないかもしれ
ない（Ｙ．−Ｈ．Ｃｈｉｅｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：
５１１）。
【０００３】 不変ＣＤ３複合体は、４つの比較的小さなポリペプチド（ＣＤ３δ（２０ｋＤ
ａ）、ＣＤ３ε（２０ｋＤａ）、ＣＤ３γ（２５ｋＤａ）およびＣＤ３ζ（１６
ｋＤａ））から構成される。ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３γ鎖は、そ
れらのアミノ酸配列において有意な程度の類似性を互いに示す。これらは、免疫
グロブリン（Ｉｇ）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、それらの各々
は、単一の細胞外Ｉｇ様ドメインを保有する。対照的に、ＣＤ３ζのみが、９ア
ミノ酸の細胞外ドメイン、およびＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３γと比較し
た場合により長い細胞質ドメインを有する。ＣＤ３鎖の細胞質ドメインは、免疫
レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｍｏｔｉｆ）（ＩＴ
ＡＭ）と称される、細胞の活性化を媒介し得る、１〜３コピーの保存されたモチ
ーフを含む。ペプチド−ＭＨＣリガンドによるＴＣＲ／ＣＤ３複合体連結の１つ
の結果は、ＣＤ３鎖のＩＴＡＭへの種々のシグナル伝達因子の補充である。これ
は、複数のシグナル伝達経路の活性化を開始し、最終的に遺伝子発現、細胞増殖
およびエフェクターＴ細胞の機能の生成をもたらす（Ａ．ＷｅｉｓｓおよびＤ．
Ｒ．Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｃｅｌｌ，７６：２６３；Ｒ．ＷａｎｇｅおよびＬ．Ｅ．
Ｓａｍｅｌｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：１９７）。
【０００４】 ＴＣＲ複合体のアセンブリーおよび発現は、複雑であり、そして強固に調節さ
れたプロセスである；どのようにして異なる鎖のレセプター複合体がこれらに寄
与するかについての正確なところは十分に解明されていない。それにもかかわら
ず、ＴＣＲ複合体の表面発現が、ＴＣＲα／βまたはＴＣＲγ／δに加えて、Ｃ
Ｄ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３γ鎖、およびＣＤ３ζ鎖の存在を必要とすること
が十分に確立されている（Ｙ．Ｍｉｎａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：２６８８；Ｂ．Ａｌａｒａｃｏｎら，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：２９５３）。任意の１つの鎖が存在しないことによ
り、この複合体は細胞質に捕獲され、そして迅速なタンパク質分解を受ける（Ｃ
．Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０７：２１４９；Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉ
ｆａｃｉｎｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９：７３）。ＴＣＲ／ＣＤ３複
合体の正確な化学量論は未知である。いくつかの系統の証拠によって、１つのＴ
ＣＲ／ＣＤ３複合体が２コピーのＴＣＲヘテロダイマー、１つのＣＤ３ε／δヘ
テロダイマー、１つのＣＤ３ε／γヘテロダイマー、および１つのＣＤ３ζζホ
モダイマーを含んで、デカマー複合体を構成し得ることが示唆されている（Ｒ．
Ｓ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．，８７：７２２０；Ｍ．Ｅｘｌｅｙら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：８
２９）。この複合体では、ＴＣＲヘテロダイマーとＣＤ３ζホモダイマーとがジ
スルフィド結合により共有結合しており、一方、ＣＤ３ε／δヘテロダイマーと
ＣＤ３ε／γヘテロダイマーとは共有結合していない。さらに、ＣＤ３ε／δ鎖
、ＣＤ３ε／γ鎖、ＣＤ３ζζ鎖と、ＴＣＲα／β鎖またはＴＣＲγ／δ鎖との
間の相互作用は、非共有結合的であることが示されている。
【０００５】 ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のアセンブリーは、小胞体（ＥＲ）における個々のＴＣ
Ｒα鎖、ＴＣＲβ鎖と、ＣＤ３鎖との間の対となるような（ｐａｉｒｗｉｓｅ）
相互作用で始まり、ＣＤ３鎖と会合した１つのＴＣＲ鎖からなる中間体の形成と
なる（Ｂ．Ａｌａｒｃｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：２９５３；Ｎ
．Ｍａｎｏｌｉｏｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：１６４３）。非リンパ系細胞に
おいて行ったトランスフェクション研究は、ＴＣＲαが、ＣＤ３δおよびＣＤ３
εと会合し得るが、ＣＤ３ζとは会合し得ず、一方、ＴＣＲβがＣＤ３δ、ＣＤ
３ε、およびＣＤ３γと会合し得るが、ＣＤ３ζとは会合し得ないことを示す（
Ｎ．Ｍａｎｏｌｉｏｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：１６４３；Ｔ．Ｗｉｌｅｍａ
ｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２２：６７）。ＣＤ３ζ鎖の取り込みは、
成熟ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の形成について律速段階であるようである。ＴＣＲα
／β、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３γ鎖は、ＣＤ３ζが部分的なＴＣＲ／
ＣＤ３複合体とアセンブルして、表面での発現のための最終的な産物を形成する
前にＥＲにおいて存在することが厳密に必要とされる（Ｙ．Ｍｉｎａｍｉら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：２６８８０）。Ｔ
ＣＲ鎖とＣＤ３鎖との間の会合は、大部分は、それらの膜貫通ドメインにおける
荷電したアミノ酸残基に依存するようである。正に荷電したアミノ酸残基は、Ｔ
ＣＲα／β鎖の膜貫通ドメインにおいて存在し、ＴＣＲαについてはアルギニン
およびリジンであり、そしてＴＣＲβについてはリジンである。負に荷電したア
ミノ酸は、ＣＤ３鎖の膜貫通ドメインに見出され、ＣＤ３γについてはグルタミ
ン酸であり、そしてＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３ζの各々についてはアスパ
ラギン酸である。これらの荷電したアミノ酸に起因する塩橋の形成は、ＴＣＲα
／β鎖とＣＤ３鎖との間で会合させる主な力であると考えられる（Ｃ．Ｈａｌｌ
ら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：３５９；Ｐ．Ｃｏｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５１：４１４）。上記のトランスフェクションおよび生化学データに適合
する成熟ＴＣＲ／ＣＤ３複合体についてのモデルが提唱されている。このモデル
では、各々１コピーのＣＤ３ε／δ、ＣＤ３ε／γ、およびＣＤ３ζ／ζは、外
側の２コピーのＴＣＲα／βとのレセプター複合体のコアを形成する。ＴＣＲα
鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３γと対合し得る。ジス
ルフィド結合したＣＤ３ζζは、ＴＣＲαの膜貫通ドメインにおけるさらなる負
に荷電したアミノ酸に起因して、ＴＣＲαと優先的に対合し得る。
【０００６】 ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のアセンブリーおよび発現は広範に研究されているが、
ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖またはＣＤ３γ鎖の細胞外ドメインの潜在的な機能につ
いては比較的わずかしか知られていない。ＴＣＲ抗ＴＣＲ複合体の結晶構造につ
いての近年の研究は、ＣＤ３εの細胞外ドメインを収容するのに十分大きな、Ｔ
ＣＲβ鎖における結合ポケットの存在についての証拠を提供してきている（Ｊ．
−Ｈ．Ｗａｎｇら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：１０；Ｙ．Ｇｈｅｎｄｌｅｒら，Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：１５２９）。他方、欠失分析を用いて、保存され
たＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフを有するＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖またはＣＤ
３γ鎖の膜貫通ドメインに近位の領域は、ＣＤ３鎖ヘテロダイマー化を媒介する
ことが関連付けられている（Ａ．Ｂｏｒｒｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２７３：１２８０７）。Ｉｇスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、接着分
子としてのそれらの機能について周知である。それゆえ、Ｉｇ様ドメインのＣＤ
３の細胞外ドメインについてのリガンドが存在し得ることは驚くべきことではな
い。従って、ＣＤ３鎖とそれらの潜在的なリガンドとの間の相互作用は、Ｔリン
パ球の活性化の調節において重要な役割を果たし得る。
【０００７】 可溶性ＣＤ３複合体をその天然のコンホメーションで生成する系が存在しない
ことは、ＣＤ３鎖の細胞外ドメインの機能についての情報のずれの１つの強調す
る理由である。多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体
に対して惹起されている；これらの多くは、ＣＤ３複合体を特異的に認識する。
さらに、大部分の抗ＣＤ３ ｍＡｂの反応性は、２つのカテゴリーに分類される
：ＣＤ３ε鎖を単独で認識し得る抗ＣＤ３ ｍＡｂ、およびＣＤ３ε鎖とＣＤ３
δ鎖またはＣＤ３γ鎖のいずれかとの間の天然の相互作用により生じると考えら
れるコンホメーションエピトープのみを認識する抗ＣＤ３ ｍＡｂ（Ａ．Ｓａｌ
ｍｅｒｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３０４７）。後者は、対応する
ｃＤＮＡクローン鎖でトランスフェクトされた非リンパ系細胞の細胞質における
天然のＣＤ３ε／δヘテロダイマーおよびＣＤ３ε／γヘテロダイマー鎖の形成
を可視化するために適用されている（Ａ．Ｓａｌｍｅｒｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１４７：３０４７）。
【０００８】 （２．２．表面レセプターを誘発することによりリンパ球活性化） リンパ球に対するｍＡｂの生成は、多数のリンパ球表面抗原の同定を導いた。
リンパ球のサブセットによるこれらの抗原の発現は、Ｔ細胞およびＢ細胞を特異
的機能的なサブ集団および異なる分化段階に分類するために用いられている。よ
り近年では、これらの特定の表面抗原が、活性化シグナルを媒介し得ると認識さ
れている。最も顕著なことには、ＣＤ３に対する抗体は、抗原の非存在下でＴ細
胞を活性化するために用いられている（Ｌｅｏら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：１３７４）。さらに、Ｔ細胞活性化
の研究は、特異的コレセプター（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するリガンドが
、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の刺激により開始される、Ｔ細胞の増殖およびサイトカ
インの生成を調節することを示した。
【０００９】 コレセプターとしての特定の表面抗原のクラスター化が、増強されたＴ細胞活
性化をもたらすことが観察された。レセプターのクラスター化を媒介するリガン
ドを用いるためのいくつかのアプローチが開発されている。例えば、リガンドは
、ビーズまたはプラスチックの表面に固定化されており、結合したレセプターが
その細胞と人工表面との間の接触部位でクラスター化することを生じる。レセプ
ターはまた、可溶性リガンドを二重特異性分子の形態で用いて、または２以上の
一重特異性リガンドがそれらのそれぞれのレセプターに結合した後に２以上の一
重特異性リガンドと反応する第２工程試薬を用いてクラスター化を媒介すること
により、一緒にクラスター化されている。これらのアプローチを用いるシグナル
伝達実験およびインビトロ細胞活性化実験は、機能的レセプター−コレセプター
相互作用についての証拠を生じた。しかし、インビボでの治療に関して受容可能
な組成物は生成されていない。
【００１０】 ＣＤ３とのＣＤ２の凝集またはＣＤ３とのＣＤ４の凝集は、ＣＤ３単独での凝
集よりも強力にＴ細胞を活性化することが示されている（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら
、１９８８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：５２５−５３２；Ｗｅｅら，
１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：２１９）。同様に、ＣＤ３との、ＣＤ
１８またはＣＤ８を含む他のレセプターの凝集は、ＣＤ３単独の凝集と比較した
場合、シグナル伝達および活性化を増強する。
【００１１】 複数の補助的刺激レセプターが同定されているが、それらの互いの関係、なら
びにＣＤ３活性化に対する補助的刺激効果に関する空間的または時間的必要要件
についての知識は限られている。１つの研究では、ＣＤ１８、ＣＤ２８、および
ＴＣＲについてのリガンドの同時固定化が研究された（Ｄａｍｌｅら，１９９２
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２５４１）。プラスチックプレート上にコーテ
ィングされた抗Ｉｇを用いるＩＣＡＭ１−Ｉｇ、Ｂ７−Ｉｇおよび抗ＴＣＲの間
接的固定化は、抗ＴＣＲ依存性増殖を、個々のＩＣＡＭ１−ＩｇまたはＢ７−Ｉ
ｇの固定化よりも増強した。しかし、ＩＣＡＭ１−Ｉｇは、Ｔ細胞を静止させる
ことに関して、より効果的であり、一方、Ｂ７−Ｉｇは、予め活性化されたＴ細
胞に関して、より効果的であった。このことは、これらのコレセプター間の相互
作用が物理的ではなく一時的であり得ることを暗示する。
【００１２】 複数のコレセプターは、ＴＣＲ複合体を介して活性化応答を改変するが、これ
らのコレセプターが凝集においてどのように一緒に作用するかに関して、制限さ
れた情報が存在する。各々が活性化シグナルおよび細胞応答全体に対して機能的
に寄与するような３以上のレセプターのクラスター化は、十分には研究されてい
ない。
【００１３】 Ｂ細胞活性化の研究はまた、Ｂ細胞抗原レセプター複合体に対する結合により
開始される活性化シグナルおよび応答を改変する、複数のコレセプターの存在を
示した。これらのレセプターの顕著な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２
１、ＣＤ２２、ＣＤ４０および表面免疫グロブリン（Ｉｇ）が挙げられる。レセ
プター−コレセプター相互作用は、細胞表面上で、第２工程試薬、可溶性二重特
異性分子（例えば、ヘテロ結合体化抗体）、または固体表面に固定化されたリガ
ンドの組合せと一緒に架橋された可溶性リガンドを用いて実証されている。複数
のコレセプターが公知であるが、Ｂ細胞上の３以上のレセプターの機能的相互作
用は、報告されていない。
【００１４】 （３．発明の要旨） 本発明は、リンパ球の活性化を調節するための組成物および方法に関する。詳
細には、本発明は、３以上の細胞表面抗原を凝集させることにより、Ｔ細胞およ
び／またはＢ細胞を活性化するための組成物および方法に関する。活性化シグナ
ルは、免疫増強または免疫抑制のいずれかをもたらし得る。
【００１５】 本発明はまた、複数の表面レセプターに同時に結合し、そして活性化シグナル
を伝達する能力をブロックもしくは阻害することによるか、ならびに／または他
の細胞上のレセプターへの結合能力および活性化能力を防止することによる、リ
ンパ球活性化の阻害に関する。
【００１６】 本発明の目的は、３以上の表面抗原を凝集させることにより、インビトロおよ
びインビボでＴ細胞および／またはＢ細胞の数を増大することである。拡大され
たＴ細胞およびＢ細胞は、癌および感染性疾患（例えば、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ））の養子免疫治療において用いられる。複数の細胞表面抗原をイン
ビトロで凝集させるための好ましい方法は、細胞表面抗原に結合するリガンドお
よび／またはこの抗原に特異的な抗体もしくはその抗原結合誘導体（例えば、可
変ドメインおよび可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ））の固体基体（例え
ば、培養ディッシュまたは懸濁可能なビーズ）への吸着による。
【００１７】 リガンド、抗体、またはその抗原結合誘導体は、インビボでの投与のために生
体分解性基体に吸着され得るが、これらの分子は合わされて、化学的結合体化ま
たは組換え発現方法によって単一の可溶性多価分子を形成することが好ましい。
それゆえ、複数の細胞表面抗原に同時に結合する多重特異性分子を構築すること
もまた本発明の目的である。このような多重特異性分子は、インビトロでのリン
パ球活性化のために固定化され得るか、またはインビボでリンパ球活性化の調節
のために被験体に薬学的組成物として投与され得る。多重特異性分子は、複数の
表面レセプターを凝集させることによってリンパ球を活性化し得るか、またはＴ
細胞とＢ細胞との間、もしくはリンパ球と抗原提示細胞との間のリガンド／レセ
プター相互作用を妨害することによってリンパ球活性化を阻害し得る。広範な種
々の用途は、本発明のこの局面によって包含される。この用途としては、免疫不
全、感染性疾患および癌の処置、ならびに自己免疫、過敏症、脈管性疾患、およ
び移植拒絶の抑制が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】 本発明は、３つのＴ細胞表面抗原に特異的な、固定化した抗体でのヒトＴ細胞
の刺激が、２つの固定化された抗体による刺激と比較した場合に増強された増殖
をもたらしたという出願人の発見に一部基づく。それゆえ、３つのＴ細胞表面抗
原の凝集は、Ｔ細胞増殖を増強した。本発明はまた、ヒトＴ細胞表面抗原で免疫
したラマが、このような抗原に結合した軽鎖が全くない抗体を生成したという出
願人の発見に一部基づく。これらの重鎖のみの抗体は、ラマにおいて、ヒト細胞
表面抗原に対して生成され得、これらの抗体およびそれらの抗原結合誘導体は、
多重特異性分子の構築において好ましい。なぜなら、抗原結合に参加する軽鎖が
存在しないことは、軽鎖または軽鎖可変領域を含む必要を排除するからである。
従って、多重特異性分子の構築における重鎖のみの抗体の使用は、それらの結合
部位の形成の複雑性をより少なくする。さらに、このような抗体は、重鎖および
軽鎖から構成される抗体よりも長いＣＤＲ、特にＣＤＲ３を含む。このことは、
重鎖のみの抗体に由来するＣＤＲペプチドが、多重特異性分子の構築において使
用するために非常に親和性が高く、かつ安定であることを示す。
【００１９】 本発明の目的は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科（ラクダ科）から得た重鎖のみの抗体
、ＶHHとして公知のそれらの可変ドメイン、またはそれらに由来する抗原結合Ｃ
ＤＲを用いて多重特異性分子を構築することである。このような多重特異性分子
は、リンパ球の活性化の刺激または阻害に基づく、免疫調節のために有用である
。このクラスのＶHH含有抗体を生成するＢ細胞を富化するための取り組みにおい
て、出願人はまた、ラマのＢ細胞が、抗ヒトＣＤ４０抗体と交叉反応性のヒトＣ
Ｄ４０エピトープを発現し、そしてＣＤ４０+ラマ細胞のサブ集団は、重鎖のみ
の抗体を発現することを発見した。さらに、このＣＤ４０+細胞は、抗ＣＤ４０
抗体によって活性化されて増殖し得る。それゆえ、本発明の目的は、ラマＢ細胞
によるＣＤ４０および軽鎖を含まない免疫グロブリンの同時発現を基礎として、
重鎖のみの抗体を発現するラマＢ細胞を富化すること、ならびにＣＤ４０刺激に
よってそれらの数を増大することである。増大された細胞は、ＶHHドメインのラ
イブラリーの構築のためにｍＲＮＡの供給源として、および抗原結合特異性の選
択のために、特に有用である。Ｌ．ｌｌａｍａからのこのようなＶHHの新規なサ
ブクラスを、ＣＨ１ドメインを欠くものとして実施例に示し、そしてそれらのＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はジスルフィド結合によっては連結されない
。
【００２０】 本発明の目的はまた、マウス抗体のような従来の抗体を、ラマ化（ｌｌａｍａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれるプロセスにおいて重鎖のみの抗体へと変換するこ
とである。ラマ化抗体は、軽鎖と対合せずに、その本来の抗体結合特異性を保持
する。
【００２１】 本発明の別の目的は、抗体可変領域またはヒト抗原と、ラマ定常領域との間で
の融合タンパク質を構築することである。このような融合タンパク質は、非ラマ
エピトープに対するＶHHを生成するラマ免疫において特に有用である。
【００２２】 本発明のなお別の目的は、可溶性ヒトＣＤ３ヘテロダイマーを生成することで
ある。
【００２３】 （５．発明の詳細な説明） リンパ球によって発現される複数の抗原（またはレセプター）は、細胞活性化
を調節するために共に作用する。多くの場合において、レセプターは、緊密に近
接することによって共に作用するか、または互いに接触して活性化シグナルを集
合的に媒介する。生理学的条件下において、このプロセスは、細胞−細胞接触に
よって制御され得、ここで、１つの細胞によって発現されるリガンドは、第２の
細胞によって発現されるレセプターに接触し、そしてこのレセプターは、架橋し
、そして細胞−細胞接触の部位でクラスター形成される。正確なアレイおよびこ
のレセプター接触の順序は、このリガンドの空間的配向によって、および特定の
部位で、および特定の順序で互いに接触するレセプターの固有の能力によって制
御され得る。クラスター形成されたレセプターによって媒介される活性化シグナ
ルは、各レセプターと直接的もしくは間接的（リンカー分子を介して）に結合す
るレセプターまたは分子の、本来の酵素活性に依存する。このクラスター形成さ
れたレセプターは、細胞膜においてシグナル伝達複合体の形成を可能にし、これ
はこのクラスター形成されたレセプターの正確な組立ておよび配向に依存して複
合シグナルを生じる。レセプタークラスター化のパターンにおける変化は、内在
する細胞の活性化状態の変更を生じる。
【００２４】 以下の節は、活性化シグナルを生成するためにリンパ球抗原を凝集することに
よる、レセプタークラスター化を模倣する組成物および方法を記載する。本明細
書中に記載される特定の手順および方法は、３つのＴ細胞抗原に特異的な固定化
抗体を使用して例証されるが、これらは、単に本発明の実施のための例示に過ぎ
ない。類似の手順および技術、ならびに本明細書中で提供される詳細な開示に基
づいて当業者に明らかであるように、機能的に等価な組成物もまた、本発明に含
まれる。
【００２５】 （５．１．リンパ球表面抗原） Ｔ細胞およびＢ細胞活性化の研究は、直接的または間接的に活性化シグナルを
媒介する多くの細胞表面抗原を同定してきた。本明細書中で使用される場合、「
活性化シグナル」とは、増殖、分化、細胞傷害性、およびアポトーシス、ならび
にサイトカインの分泌、サイトカインプロフィールの変化、細胞表面レセプター
の発現レベルまたは分布の変化、抗体産生、および抗体クラスの転換のような、
測定可能な細胞活性に現れる分子事象をいう。さらに、「活性化シグナル」は、
細胞内カルシウム移動およびレセプターのチロシンリン酸化を検出することによ
ってアッセイされ得る（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９９１、Ｂｌｏｏｄ ７７：
１２７１）。
【００２６】 ＴＣＲ／ＣＤ３に加えて、活性化シグナルを媒介するＴ細胞によって発現され
る他の分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、Ｃ
Ｄ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、Ｃ
Ｄ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤｗ１５０、Ｃ
Ｄ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５４、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、
ＣＤｗ１３７（４−１ＢＢ）（Ｔｈｅ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ
Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、１９９３、Ｂａｒｃｌａｙら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ；Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ、１９８４、Ｂｅｒｎａｒｄら（編
）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｉ
Ｉ、１９８６、Ｒｅｉｎｈｅｒｚら（編）、Ｓｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ、１９８７、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（編
）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ
Ｔｙｐｉｎｇ ＩＶ、１９８９、Ｋｎａｐｐら（編）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；ＣＤ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１９９６、ＶＩ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｕｍ
ａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ
ｓ。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｗ）、
ＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３〜２６
６）、サイトカインレセプターなど。ＴＣＲ／ＣＤ３と共に作用する細胞表面抗
原は、しばしば当該分野でコレセプターと呼ばれる。
【００２７】 特定の抗体は、上述のＴ細胞表面抗原の全てに対して生成され、そしてこれら
は市販されている。上述のＴ表面抗原に結合する他の分子としては、可変ドメイ
ン、ペプチド、超抗原、およびこれらの天然のリガンド、またはリガンド融合タ
ンパク質（例えば、ＣＤ２についてＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ４についてＨ
ＩＶ ｇｐ１２０、ＣＤ２７についてＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８またはＣＤ１５２に
ついてＣＤ８０またはＣＤ８６、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８についてＩＣＡＭ１、Ｉ
ＣＡＭ２およびＩＣＡＭ３、ＣＤｗ１３７について４−１ＢＢＬ）が挙げられる
。本明細書中で表面抗原の「結合パートナー」と集合的に呼ばれるこのような分
子を使用して、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを送達または阻害し得る。特定の
抗原の活性化について、複数のリガンドを使用して同じ結果を達成し得る。例え
ば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、およびＢ７．３を使用して
ＣＤ２８を活性化し得る。Ｂ７．３は、最近同定されたＣＤ８０／ＣＤ８６ファ
ミリーのメンバーである（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ登録番号Ｙ０７８
２７）。Ｂ７．３のアミノ酸配列の、他のファミリーメンバーのアミノ酸配列と
の順序は、Ｂ７．１がＢ７．２に類似するように、Ｂ７．３がＢ７．１およびＢ
７．２に類似することを示す。
【００２８】 Ｂ細胞によって発現される活性化分子は、以下を含むがこれらに限定されない
：表面Ｉｇ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、
ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＡＭ１。同様に、これら
の分子の天然のリガンド、これらに対する抗体、ならびに抗体の誘導体を使用し
て、Ｂ細胞の活性化シグナルを送達または阻害し得る。
【００２９】 後述の第６節の実施例によって例示される特定の実施態様において、本発明は
、ＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣＤ２８、またはＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣ
Ｄ４、またはＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣＤ５の凝集がＴ細胞の増殖を増大し
たことを実証する。本発明のこの局面に従って、３以上１０までの任意の上述の
Ｔ細胞抗原およびＢ細胞抗原が、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞活性化を誘導するた
めに結合および凝集される。Ｔ細胞活性化について、好ましい抗原の組合せとし
ては、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ
４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５、ＣＤｗ１３７、ＣＤｗ１５０、ＣＤ１５２
、またはＣＤ１５４を含む可変である第３の抗原を伴う、ＣＤ２およびＣＤ３が
挙げられる。さらに、ＣＤ２およびＣＤ３が、任意の組合せにおいてこれらの表
面抗原の２または３つと共に凝集することがまた好ましい。これらの組合せの例
としては、ＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣＤ４およびＣＤ５、またはＣＤ２およ
びＣＤ３ならびにＣＤ４およびＣＤ２８、またはＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣ
Ｄ５およびＣＤ２８、またはＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣＤ８およびＣＤ２８
、または、ＣＤ２およびＣＤ３ならびにＣＤｗ１３７およびＣＤ２８，またはＣ
Ｄ２およびＣＤ３ならびにＣＤ４およびＣＤ５およびＣＤ２８が挙げられる。Ｂ
細胞活性化について、この好ましい組合せとしては、ＣＤ４０またはＣＤ５６を
含む可変である第３の抗原を伴う、ＣＤ８０およびＣＤ８６が挙げられる。さら
に、ＣＤ４０は、ＣＤ４５およびＣＤ８６と共に、またはＣＤ１９およびＣＤ２
０と共に凝集され得る。別の好ましい実施態様において、この抗原の組合せは、
ＣＤ３またはＴＣＲおよびＣＤ２８ならびに上記の第３の抗原を含む。
【００３０】 （５．２．複数のリンパ球表面抗原を凝集する方法） 本発明の１つの局面は、リンパ球活性化を誘導する３つ以上の抗原の組合せの
特定のセットを凝集する方法に関する。複数の細胞表面抗原を凝集する簡便な方
法は、共有結合もしくは非共有結合によって、培養皿上、ビーズ上、または生分
解性マトリクス上の吸着のような固体基体上の抗原の「結合パートナー」の固定
化による。好ましい実施態様において、この結合パートナーはビーズ上に被覆さ
れ、これは、サイズ濾過または磁場によって細胞から容易に分離され得る。この
ような「結合パートナー」は、天然のリガンド、リガンドの結合ドメイン、およ
びリガンド融合タンパク質を含むが、本発明のこの局面の実施に関する好ましい
実施態様は、抗体およびこれらの抗原結合誘導体（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’
）2、Ｆv、単鎖抗体、重鎖のみの抗体、ＶHH、およびＣＤＲである（Ｈａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；ＷＯ９４／０４６７８）。これらの分子は、組換
え方法によって、化学的合成方法によって、または天然供給源からの精製によっ
て産生され得る。固定化のための代替方法は、一般に共有されるエピトープを結
合する２次抗体を有する３つ以上の抗体またはこれらの抗原結合性誘導体の架橋
である。この分子がビオチン化される場合において、アビジンおよびストレプト
アビジンが、第２工程の架橋試薬として使用され得る。
【００３１】 固体基体上の適切な抗体またはこれらの抗原結合性誘導体を吸着するために、
この分子は、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）中に
懸濁される。この濃度は、１０μｇ／ｍｌまでに調節されることが好ましい。固
体表面上で４〜３７℃にて１〜２４時間のインキュベーションの後、広範な洗浄
を実施して、細胞を添加する前に遊離分子を除去することが好ましい。あるいは
、抗体は、ビーズに共有結合により結合され得る。
【００３２】 最近、Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅら（１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７７９
）は、種々の基体上のパターンタンパク質への微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ
ｉｃ）ネットワークの使用を記載した。このようなネットワークを使用して、基
体の特定の領域に抗体を拘束し得、その結果、基体上に添加される細胞は、この
基体を通じて移動するとき規則的様式で異なる抗体に曝される。結果として、細
胞表面抗原は、一連の順序で抗体によって凝集されて、最適な活性化を達成する
。例えば、Ｔ細胞は、抗体に曝されてＣＤ２→ＣＤ３→ＣＤ４の順序で表面抗原
の凝集を達成し得る。ＣＤ２およびＣＤ４はＣＤ３の次に配置されるので、この
凝集の順序が、最適なＴ細胞活性化を生じる。対照的に、ＣＤ２→ＣＤ４→ＣＤ
３またはＣＤ４→ＣＤ２→ＣＤ３の順序は、これらの順序では、ＣＤ２のＣＤ４
との凝集が、それらをＣＤ３との相互作用を阻止し得るので、最適ではないこと
が予測される。結合パートナーの比率、順序、および空間的配向は、所望される
結果に従って調節され得る。
【００３３】 本発明のこの局面は、培養物中のリンパ球の増殖に特に有用である。リンパ球
の調製のために、末梢血の単核細胞を標準的な手順に従って単離し、そして固定
化抗体を含む培養皿に添加する。さらに、Ｔ細胞調製物またはＢ細胞調製物を、
セルソーティングおよびパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）、補体細胞傷害性、ならび
にプラスチック固着のようなアフィニティー方法を含むがこれらに限定されない
、当該分野で周知の方法を使用して刺激の前に富化し得る。同様に、別個のＴ細
胞サブセットおよびＢ細胞サブセットを、これらの手順を使用して精製し得る。
一般的に、これらの細胞は、数日から一週間の間刺激され、次いで短い休止期間
の後、再刺激される。あるいは、増殖細胞は、３〜１４日毎に再刺激され得る。
細胞数の増加を容易にするために、ＩＬ−２およびＩＬ−４のような成長因子を
、この培養物に添加し得る。ｍＡｂが固体表面またはビーズに付着される場合、
刺激性のサイトカインがまた、同じ固体支持体に同様に付着され得る。
【００３４】 インビボで複数のリンパ球抗原を凝集するために、これらの抗体およびこれら
の抗原結合性誘導体を、天然材料（例えば、ネコ腸縫合糸）、または合成材料（
例えば、ポリグリコール酸）から作成される生分解性基体上に吸着させ得る。し
かし、複数の抗原結合性特異性を有する単一の可溶性分子がインビボ投与に使用
されることが、好ましい。実際、このような可溶性の多重特異性分子はまた、こ
れらが固定化される場合に、インビトロでのリンパ球活性化のために好ましい。
以下の節は、このような分子の構築を記載する。
【００３５】 （５．３．複数のリンパ球表面抗原を凝集する多重特異性分子） 複数の細胞標的抗原に結合する可溶性分子は、免疫系のインビボでの調節のた
めに粒子マトリクス上に固定化される分子を超える利点を有する。これらの利点
としては、免疫系を通じて迅速に拡散する可溶性分子の能力、および固定化マト
リクスを有さない薬学的組成物の処方物が挙げられる。可溶性の多重特異性分子
は、特異性およびアビディティにおいて単一特異性分子の組合せを超える利点を
有し、効力および有効性の増加を生じる。多重特異性分子はまた、たとえ個々の
成分が特定の細胞型に対する特異性を欠失しているとしても、増加した標的細胞
の特異性を有する。別個の標的抗原に特異的な、いくつかの低親和性（５０ｎｍ
未満）の結合部位は、全ての標的抗原を発現する細胞に対する結合アビディティ
が増加した多重特異性タンパク質を形成するために、タンデムに融合され得る。
例えば、たとえ、ＣＤ１８が全てのリンパ球で発現される場合でさえ、ＣＤ１８
結合パートナーから構成される多重特異性分子は、リンパ球サブセットの特異性
をなお示し得る。なぜなら、ＣＤ１８を発現し、そして多重特異性分子の他の標
的抗原でないリンパ球サブセットは、高いアビディティでこの分子を結合しない
からである。
【００３６】 免疫系の調節は、リンパ球の活性化、十分な活性化を生じない不完全な刺激シ
グナル、リンパ球のアポトーシスまたはアネルギーを引き起こすこと、および複
数のレセプター−リガンド相互作用の同時の遮断を含む。さらに、阻害サイトカ
インを分泌する細胞の活性化は、特定の応答の能動的抑制を生じ得る。この点に
ついて、Ｔ細胞は、「ＴＨ2」様細胞になるように活性化され、そして誘導され
てＩＬ−４産生およびＴＣＲ−ＣＤ３に対するシグナルによって免疫応答を抑制
するＴＧＦβおよびＩＬ−１０を分泌し得る。ＩＬ−４のようなサイトカインは
、固体支持体に共有結合により結合し得るか、またはそうでなければ、ＴＨ2Ｔ
細胞分化を誘導する抗体もしくはリガンドと固定化し得る。その目的のために、
多重特異性分子が、低親和性（１００ｎｍ未満）のＣＤ３結合部位と、ＣＤ２お
よびＣＤ４に対する結合部位との間で構築され得る。Ｔ細胞の活性化のために、
好ましい多重特異性分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ２８を凝集する結合パ
ートナーから構成される。他のＴ細胞活性化多重特異性分子は、前述の第５．１
節で記載されるような第３の可変抗原を伴う、ＣＤ２およびＣＤ３、またはＣＤ
３およびＣＤ２８を凝集する結合パートナーから構成される。
【００３７】 本発明の範囲内にはまた、Ｔ細胞活性化またはＢ細胞活性化を阻害する可溶性
の多重特異性分子がある。このような阻害性分子は、同じ表面上に同時に２、３
および１０までの抗原を結合し得、そしてこれらの抗原を通じて活性化シグナル
の送達を阻害し得る。このような多重特異性分子の１つの例は、抗原提示細胞お
よびＢ細胞上でＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０に結合し、そしてＣＤ２８
経路およびＣＤ４０経路の活性化を同時に妨げる。ＣＤ２８およびＣＤ４０経路
の二重特異性インヒビターは、Ｔ細胞上でＣＤ２８およびＣＤ１５４（ＣＤ４０
リガンド）に結合し、ＣＤ２８の活性化をブロックし、そしてＣＤ１５４がＣＤ
４０を活性化することを妨げる。他のＴ細胞阻害性の二重特異性分子は、ＣＤ２
０およびＣＤ４０、またはＣＤ２およびＣＤ４、またはＣＤ２８およびＣＤ４５
、またはＣＤ２およびＣＤ１５４を標的する。三重特異性な阻害性分子は、ＣＤ
２およびＣＤ２８およびＣＤ４５、またはＣＤ２およびＣＤ４およびＣＤ４５、
またはＣＤ２およびＣＤ４およびＣＤ２８、またはＣＤ２およびＣＤ２７および
ＣＤ２８を標的する。
【００３８】 複数のＢ細胞レセプターに結合し、そして活性化シグナルを増大する可溶性多
重特異性分子は、悪性Ｂ細胞のアポトーシスの誘導について特に有利である。こ
のような多重特異性分子はまた、特異的標的において利点を有する。なぜなら、
これらが、全てのレセプターを発現する細胞により強力に結合し、そしてこの多
重特異性分子によって認識されるレセプターの１つまたはサブセットのみを発現
する任意の細胞それほど良好に結合しないと予想されるからである。好ましい多
重特異性分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ４０レセプターに同時に結合
し、そしてこれらのレセプターを通じて活性化シグナルを生成し、悪性のＢ細胞
のアポトーシスを生じる。二重特異性Ｂ細胞阻害分子および多重特異性Ｂ細胞阻
害分子は、Ｂ細胞あるいは抗原提示細胞上の、ＣＤ８０およびＣＤ４０、または
ＣＤ８６およびＣＤ４０、またはＣＤ８０およびＣＤ８６、またはＣＤ８０およ
びＣＤ８６およびＢ７−３を標的し得る。
【００３９】 多重特異性分子は、細胞表面抗原を結合する複数の結合パートナーの化学的結
合体によって、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組
換え発現によって生成され得る。抗体中に見られるような、複数のポリペプチド
鎖またはこれらのコード配列の連結の複雑さを減少する試みにおいて、低分子量
の単鎖ポリペプチドが、多重特異性分子を構築するための結合パートナーとして
使用されることが好ましい。この点について、ラクダは軽鎖の無い抗体を分泌す
ることがＷＯ９４／０４６７８において報告されている。ＶHHとして言及される
このような重鎖のみの抗体の可変ドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメ
インに連結されるヒンジ領域に直接融合される。重鎖においてＣＨ１ドメインの
非存在は、軽鎖とのジスルフィド結合の形成を妨げる。
【００４０】 重鎖のみの抗体は、多重特異性分子の構築における使用に特に適している。な
ぜならば、軽鎖による抗原結合における関与がないからである。これらの抗体の
ＶHHドメインは、これらの定常ドメインの除去がＦｃレセプターに対する非特異
的結合を減少するために、さらにより適切である。後述の第８節は、Ｌ．ｌｌａ
ｍａのＶHHドメインが従来の抗体におけるＣＤＲよりも長いＣＤＲ３を含み、そ
してこれらのＶHH配列の特定のサブクラス（ハイブリッドサブクラス）のＣＤＲ
が、同じ可変領域中に他のＣＤＲとジスルフィド結合を形成しないことを実証す
る。従って、これらのＣＤＲはより安定で、かつ抗原結合に非依存性であり得、
そして適切な折り畳みを生じるために迅速に発現され得る。このＣＤＲのクラス
に特有の特徴は、これらを、多重特異性分子の構築における使用に特に適切にす
る。これらの抗体におけるＣＤＲを、当該分野で周知の方法（米国特許第５，６
３７，６７７号）によって決定し得、そして多重特異性分子の産生に使用し得る
。
【００４１】 Ｌ．ｌｌａｍａからの可変領域配列は、ヒトＶＨ3ファミリーの可変ドメイン
中の配列に類似する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、１９８９、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：４１〜５０）。ヒトレシピエントにおける使用のためにＶHH分子の免疫
原性を減少するため、非ＣＤＲまたは曝露されたフレームワーク部位中のアミノ
酸を、これらの相違に基づいてヒトＶＨ3残基から変更し得る。ラクダＶHHの結
晶構造を指針として使用して、曝露の程度に基づいて残基の変化の優先順位をつ
け得る（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３
：８０３〜８１１）。残基の免疫原性を予測する他の方法もまた使用して（すな
わち、親水性またはＭＨＣ結合モチーフ）、残基置換の選択を案内し得る。抗原
結合に重要なＣＤＲ内の残基またはＣＤＲに隣接する残基は、結合アビディティ
の減少を避けるために維持されるべきである。同様に、疎水性ＶL−ＶH界面の排
除において重要であるとして同定されるフレームワーク残基は、ＶHH分子の最適
な折り畳みおよび発現のために維持されるべきである。
【００４２】 後述の第７節の実施例によって例示される特定の実施態様において、ヒトＴ細
胞で免疫されたラマから精製された重鎖のみの抗体は、Ｔ細胞表面抗原に結合し
た。図１は、迅速なスクリーニングおよび細胞表面抗原−結合特異性を有するＶ HH ドメインを選択する概略を提供する。ＶHHドメインの生成について、Ｃａｍｅ
ｌｉｄａｅファミリーに属する動物は、精製された抗原、ヒト細胞表面抗原とラ
マ抗体定常領域との間の融合タンパク質、または目的の抗原を発現する細胞を用
いる免疫化のための宿主として使用される。これらの宿主としては、旧世界のラ
クダ科の動物（ｃａｍｅｌｉｄｓ）（例えば、Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａ
ｎｕｓおよびＣ．ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ）、および新世界のラクダ科の動物（
例えば、Ｌｌａｍａ ｐａｃｃｏｓ、Ｌ．ｇｌａｍａ、Ｌ．ｖｉｃｕｇｎａ、お
よびＬ．ｌｌａｍａ）を含むがこれらに限定されない。免疫化の後、他のリンパ
組織（例えば、リンパ節および脾臓）からの末梢血リンパ球または単核細胞を、
密度勾配遠心分離によって単離し、そしてこれらのｃＤＮＡを、後述の第８．１
．２節に記載されるような逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応によって得た。ファー
ジディスプレイ技術を使用して、抗原特異的に結合するＶHHの選択のために、こ
の単離されたＶHHフラグメントを発現し得る（米国特許第５，２２３，４０９号
；同第５，４０３，４８４号および同第５，５７１，６９８号）。Ｌ．ｌｌａｍ
ａからの多くの単離されたＶHH配列の例を、後述の第８節に示す。
【００４３】 重鎖のみの抗体はまた、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、
Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７に当初に記載される、従来のハイブリド
ーマ技術によって産生し得る。重鎖のみのモノクローナル抗体は、ＶHHドメイン
を産生するためにタンパク質分解的に切断され得る。
【００４４】 単離されたＶHHドメインまたはＶHHドメインから構成される多重特異性分子は
、生物学的なエフェクター機能を有する第２の分子と融合され得る。例えば、こ
れらは、癌細胞または自己反応性Ｔ細胞のような不必要な細胞を殺傷するための
特異的な送達のために、シュードモナス属の体外毒素４０（ＰＥ４０）のような
毒素と融合され得る。これらはまた、特定の細胞型にシグナルを送達するサイト
カインと、あるいはレセプターの細胞外ドメインまたはレセプター特異性とＶHH の特異性とを組み合わせるためのレセプター結合ドメインと融合され得る。さら
に、これらは、Ｉｇ Ｆｃドメイン、特異的変異を含むＩｇ Ｆｃドメイン（米
国特許第５，６２４，８２１号）、またはキメラ抗体誘導体を構築するためのＦ
ｃドメインの部分と融合され得る。これらは、細胞内標的シグナルと融合して、
細胞内部に配置される抗原に対して特異的な結合を可能にする。これらは、酵素
として作用するタンパク質と、または酵素反応を触媒するタンパク質と融合され
得る。さらに、多重特異性分子は、遺伝子治療ベクターを改良および／または単
純化するための遺伝子として発現され得る。
【００４５】 （５．３．１．多重特異性分子の構築） 可溶性の多重特異性分子を作成する好ましい方法は、選択される細胞性標的抗
原に対して各々特異的な、複数のラクダＶHH可変領域の融合である。ラマは、こ
のような可変領域の供給源として好ましいラクダ科の種である。なぜならば、ラ
マは、容易に入手可能であるからである。多重特異性分子の機能的活性は、組成
、間隔、および可変領域の結合部位の順序に依存する。結合部位の組成は、使用
される個々のＶHHの特異性および分子中の各ＶHHの数に依存し得る。ＶHH標的特
異性は、第２の、または第３のレセプターに標的化される他のＶHHドメインに融
合した単一のレセプターに対して１つ以上のＶHH結合ドメインを含み得る。唯一
のレセプター上の２つ以上のエピトープを標的する分子は、本発明の範囲内にあ
る。これらの分子は、この標的に対する増加した結合アビディティを有し、そし
て複数のエピトープに対する結合によって細胞表面上の単一のレセプターを架橋
する。ＶHHドメインおよびレセプターエピトープの順序は、レセプター内の結合
パターン、またはレセプター間の結合パターンを駆動するために重要であり得る
。結合部位の間隔は、ＶHHドメイン間で使用されるリンカーの選択に依存する。
リンカーの長さおよび可撓性は、両方とも、結合ドメイン間の間隔を制御し得る
因子である。結合部位の順序付けは、融合タンパク質構築物内のＶHHドメインの
順序付けによって制御される。
【００４６】 リンパ球抗原またはこれら由来のＣＤＲに対する結合特異性を有するラクダＶ HH ドメインは、遺伝学的かまたは化学的にかいずれかのタンデムアレイで、共に
連結され得る。このアレイが遺伝学的に連結される場合、融合タンパク質は、単
一の分子において複数の抗原結合特異性を伴って作成される。好ましい多重特異
性構造において、この連結された分子は、ブロッキング分子、阻害性分子がより
強力な免疫抑制薬剤を作成するように、同じスペクトルの活性を生じるべきであ
る。同様に、この結合されたレセプターを凝集および刺激するアゴニストは、可
溶性または固定化分子を用いる潜在的なエキソビボ細胞治療適用のために、これ
らのレセプターを通じて結合されるリンパ球の、より強力な活性化を達成するた
めに連結され得る。
【００４７】 抑制性分子またはアクチベーター分子のいずれかで使用されるリンカーは、い
くつかの形態の１つを取り、グリシンおよびセリンのアミノ酸の繰り返しアレイ
を含む好ましいリンカーを有し得る。例として、（ｇｌｙ4ｓｅｒ）3、または（
ｇｌｙ3ｓｅｒ2）3が、抗原結合ドメイン間のリンカーの２つの好ましい選択で
ある。このリンカーは、細胞表面上の標的抗原のサイズおよび間隔に依存して、
隣接するＶHHドメインの最適な結合を達成するために長くされる必要が有り得る
。
【００４８】 ＶHHドメインの立体配置は、最適な生物学的効果を与える構造を決定するため
に逐次的実施態様において改変され得る。三重特異性分子において、この分子の
中心にあるＶHHドメインは最も束縛され得、従って、２つの隣接ドメインに対す
るこの標的に対するアビディティの明らかな減少を有し得る。同様に、いくつか
のＶHHドメインは、アミノ末端融合対カルボキシ末端融合に対して、より感受的
であり得る。従って、ＣＤ８０−ＣＤ８６−ＣＤ４０構造の抑制効果は、ＣＤ８
０−ＣＤ４０−ＣＤ８６、ＣＤ４０−ＣＤ８０−ＣＤ８６、ＣＤ４０−ＣＤ８６
−ＣＤ８０、またはＣＤ８６−ＣＤ４０−ＣＤ８０型の分子とは異なり得る。
【００４９】 （５．３．２．化学的結合体化法による多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ）分子の生成） 多重特異性分子を、３つ以上の個別の分子の化学的結合体化により構築し得る
。ＧｌｅｎｎｉｅおよびＴｒｕｔｔ（１９９０、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃｉｔｙ、１８５頁、Ｒｏｍｅｔ−Ｌｅｍｏｎｎｅ（編））が、化学的方法
を使用する三重特異性抗体を構築する方法を記載している。手短には、三重特異
性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆ（ａｂ’）3を、最初に、２つのＦ（ａｂ’）
アームを有する二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆ（ａｂ’）2誘導体を調
製し、そしてそれを第３のＦａｂ’アームに連結することにより構築し得る。２
つの抗体由来のＦ（ａｂ’）2を最初に還元してＦａｂ’（ＳＨ）を生じる。そ
して１つの抗体Ｆａｂ’（ＳＨ）上の全ての利用可能なスルフヒドリル基を、二
官能性架橋剤のｏ―フェニレンジマレイミド（ｏ―ＰＤＭ）でマレイミド化する
。その後、ＳＨ基とマレイミド基との間の反応に有利である一方でＳＨ基の再酸
化を最小にする条件下で、Ｆａｂ’（ｍａｌ）をＦａｂ’（ＳＨ）と反応させる
。カラムクロマトグラフィーにより二重特異性Ｆ（ａｂ）2を単離した後、二重
特異性Ｆ（ａｂ）2を還元し、そして第３の抗体由来のＦａｂ’（ｍａｌ）に連
結する。全ての誘導体を還元し、そしてアルキル化して、一晩のインキュベーシ
ョンの間にＳＨ基のジスルフィド交換または酸化により形成し得る任意の副次的
な都合の悪い産物に対して保護する。全ての多重特異性Ｆａｂ’誘導体を、高度
に特異的な抗マウスＦｃγ免疫吸収剤（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）に通して
、この消化混合物の分画後に、親Ｆ（ａｂ’）2フラグメントとともに免れ得た
微量のいかなる親モノクローナルＩｇＧも除去する。
【００５０】 上述のプロトコルは、もともと、架橋剤ｏ―ＰＤＭを使用して、ヒンジ領域の
スルフヒドリル基の直列のチオエーテル結合を介して三重特異性（Ｆａｂ’）3
を形成するように、マウスＩｇＧ由来のＦａｂフラグメントを結合することを設
計された。しかし、本方法は、多重特異性分子（リガンド、リガンドの結合ドメ
イン、抗体、Ｆｖ、ＶHHおよびＣＤＲを含むが、これらに限定されない）の構築
のために、３つ以上の分子いずれの連結についても調節され得る。
【００５１】 （５．３．３．組換え的方法による多重特異性分子の生成） ＶHHドメインを含む多重特異性分子は、多くの細胞系（細菌発現系、酵母発現
系、昆虫発現系、および哺乳動物発現系を含む）において、発現レベルの改善を
示す。ＶHHドメインでの特徴的変化は、強力な疎水性相互作用を介しての軽鎖可
変領域との対合を必要しない発現を可能とする。従来の可変領域は、疎水性可変
領域の界面をマスクするための第２の可変領域との対合なしでは、細胞表面上で
分泌または発現されない。従って、可変領域の発現は、第２の可変領域との対合
を要求する疎水性界面と連結される。ＶHHドメインは、個別に発現され、そして
発現を制限する疎水性残基の変更が原因で、非常により高いレベルで発現される
はずである。
【００５２】 ＶHHドメインを含む多重特異性分子もまた、より良好に発現される。なぜなら
、ＶHHドメインを含む多重特異性分子は、その活性な立体配座へと、より容易に
折り畳まれ得るからである。これは、活性な分子が、変性されたタンパク質の発
現後に、インビトロでの折り畳み手順を必要とせずに発現され得るような細菌性
発現において、有意な利点である。折り畳みの改善は、哺乳動物細胞における発
現の改善もまた補助し得る。
【００５３】 発現レベルの改善は、抗体ベースの治療剤の生成のために重要な必要性を満た
す。分子が、インビボで活性であるが、治療的効力のために高レベルのタンパク
質を必要とし得る（時には、患者１人につき１グラムを超える）場合、商品のコ
ストの高さが、抗体結合部位に基づく製品の商業化についての大きな制限であっ
た。事実、発現に関連するコストの高さは、現在、抗体ベースの製品での成功に
対する最も大きな障壁を表しているようである。
【００５４】 組換え的生成のために、複数の結合パートナーのコード配列を含む、連続する
ポリヌクレオチド配列が、適切な発現ビヒクル（すなわち、挿入されたコード配
列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター、または、ＲＮＡウイル
スベクターの場合には、複製および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）中
に挿入される。次いで、発現ビヒクルが、コードされた産物を発現する適切な標
的細胞中にトランスフェクトされる。次に、使用される発現系に依存して、発現
される産物が、当該分野で十分確立された手順により単離される。組換えタンパ
ク質またはペプチドの産生のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ
ｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００５５】 ラクダ（ｃａｍｅｌｉｄ）ＶHH分子の公開された結晶構造（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ
ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８０３〜８１１）は、Ｖ HH 分子のアミノ末端およびカルボキシ末端が、この分子の異なる側面で溶媒に曝
される（多重特異性融合タンパク質を構築するための所望の立体配座）ことを示
す。多重特異性ＶHH分子は、アミノ酸リンカー分子をコードするスペーサーｃＤ
ＮＡを介して、１つのＶHHをコードするｃＤＮＡを第２のＶHHをコードするｃＤ
ＮＡに連結することにより、構築される。この二重特異性分子に別のＶHHおよび
リンカーを付加し、そしてこのプロセスを継続して、徐々に結合部位のアレイを
構築し、多重特異性分子を生じる。適切な唯一の制限部位を、ＶHHおよびリンカ
ーのカセットの各末端に有することにより、この分子は、このような一連の挿入
のための適切な制限部位ポリリンカーを有する任意のプラスミドベクター中に組
み合わされ得る。あるいは、新しいポリリンカーが、ＶHH分子間の少なくとも２
つの結合体化のためのアミノ酸リンカーをコードするＤＮＡが散在するいくつか
の制限部位をコードする既存のプラスミド中に構築され得る。このリンカーのい
くつかには、以下が含まれる：（ｇｌｙ4ｓｅｒ）3、（ｇｌｙ3ｓｅｒ2）3、グ
リシンおよびセリンの他の型の組合せ（ｇｌｙxｓｅｒy）z、ラマＶHHドメイン
に結合するリンカーと類似のヒンジ様リンカー（アミノ酸１４６〜１７０の間の
領域のいくつかの部分、または全ての部分を含む）（リンカーの一部として、種
々の長さの、交互に表れるＰＱモチーフ（通常４〜６）をコードする配列を含む
）、多重特異性分子の疎水性を改善するためにより荷電した残基を有するリンカ
ー、あるいは、分子の検出、同定、および精製のための分子タグのような小さい
エピトープをコードするリンカー。
【００５６】 本発明の好ましい実施態様は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０(各々が
、このｃＤＮＡの末端に唯一の、稀な制限部位を備える）に対して標的化された
ＶHH分子のＰＣＲ増幅を含む。発現プラスミドは、その中に、上記で概略した２
つ以上のアミノ酸リンカーをコードする相補的オリゴヌクレオチドが挿入され、
そしてアニールされている、ポリリンカーを用いて作製される。挿入されたオリ
ゴヌクレオチドの各末端において、制限部位は、ＶHHカセットの１つのアミノ末
端またはカルボキシ末端（５’末端または３’末端）上に見出される制限部位と
一致する。次いで、多重特異性分子が、オリゴヌクレオチド―ポリリンカープラ
スミドの連続消化および個別のＶHHカセットとのライゲーションにより組み立て
られ得る。
【００５７】 種々の宿主発現ベクター系が、多重特異性分子を発現するために利用され得る
。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：適切なコード配列
を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクターもしくは組換えプラスミ
ドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；適切なコード配列
を含む、組換え酵母発現ベクターもしくは組換え真菌発現ベクターで形質転換さ
れた、酵母または糸状菌類；適切なコード配列を含む、組換えウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発
現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスもしくはタバコモザイクウ
イルス）で感染された植物細胞系、または適切なコード配列を含む、組換えプラ
スミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；
あるいは動物細胞系。
【００５８】 発現系の発現エレメントは、それらの長さおよび特異性が変化する。利用され
る宿主／ベクター系に依存して、任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エ
レメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が、発現ベク
ターにおいて使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘
導性プロモーター（例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ
、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃ ハイブリッドプロモーター）など）が使用され
得る；昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルスポリへドロ
ンプロモーターのようなプロモーターが使用され得る；植物細胞系においてクロ
ーニングされる場合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショッ
クプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに関するプロモーター；クロ
ロフィルａ／ｂ結合タンパク質に関するプロモーター）、または植物ウイルス由
来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶの
コートタンパク質プロモーター）が使用され得る；哺乳動物細胞系においてクロ
ーニングする場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロ
チオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例え
ば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ
ー；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）が使用され得る；発現産物
の複数のコピーを含む細胞株を生成する場合、ＳＶ−４０ベースのベクター、Ｂ
ＰＶベースのベクター、およびＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカー
を用いて使用され得る。
【００５９】 植物発現ベクターが使用される場合において、多重特異性分子をコードする配
列の発現は、任意の数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプ
ロモーター（ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ ＲＮＡプロ
モーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１〜５１
４）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、
１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７〜３１１）が使用され得る；あるいは、植
物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットプロモーター（Ｃｏ
ｒｕｚｚｉら、１９８４、ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌ
ｉｅら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８〜８４３）、または熱ショ
ックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ １７．５−Ｅもしくはｈｓｐ １７
．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５
９〜５６５）が使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラス
ミド、植物ウイルスベクター、直接のＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクショ
ン、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞中に導入され得る。この
ような技術の概説として、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃ
ｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１〜
４６３頁；ならびにＧｒｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、１９８８、Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ、第７〜９章を参照のこと。
【００６０】 本発明の分子を生成するために使用され得る１つの昆虫発現系において、Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）
が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。コード配列は
、このウイルスの必須でない領域（例えば、ポリへドロン遺伝子）中にクローニ
ングされ、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドロンプロモーター
）の制御下に配置され得る。コード配列の挿入が成功すると、このポリへドロン
遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリへドロン遺伝子
によりコードされるタンパク質様コートを欠くウイルス）の生成を生じる。次い
で、これらの組換えウイルスが、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために使用される（例えば、Ｓ
ｍｉｔｈら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ、米国特許
第４，２１５，０５１号を参照のこと）。この発現系のさらなる例は、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆
Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに見出され得る。
【００６１】 哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が利用され得る。
アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、コード配列は、
アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３分節
系リーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子が、インビトロま
たはインビボでの組換えにより、アデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイ
ルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染
された宿主において、生存可能でありかつペプチドを発現し得る組換えウイルス
を生じる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：３６５５〜３６５９を参照のこと）。
あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが使用され得る（例えば、Ｍａｃｋ
ｅｔｔら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９
：７４１５〜７４１９；Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：
８５７〜８６４；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．７９：４９２７〜４９３１を参照のこと）。
【００６２】 多重特異性分子は、当該分野で周知の技術（例えば、高速液体クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマト
グラフィーなど）により、精製され得る。特定の分子を精製するために使用され
る実際の条件は、部分的に、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、
そして当業者に明らかである。
【００６３】 アフィニティークロマトグラフィー精製のために、この分子に特異的に結合す
る任意の抗体が使用され得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない）が、多重特異性分子また
はその一部を注射することにより免疫され得る。この分子またはそのペプチドは
、適切なキャリア（例えば、ＢＳＡ）に、側鎖の官能基または側鎖の官能基に結
合されたリンカーによって、結合され得る。種々のアジュバントが使用され、宿
主の種に依存して、その免疫学的応答を増強し得る。このアジュバントには、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイント（完全および不完全）、
無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチ
ン）、プロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、
油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在
的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およ
びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）。
【００６４】 （５．４．複数の表面抗原凝集に続く、活性化リンパ球の使用） リンパ球は、本発明の方法に従って、複数の表面抗原の凝集により、培養物中
で活性化される。活性化細胞は、感染性疾患、特にＡＩＤＳのようなウイルス感
染、ならびに癌の養子治療において使用され得る。活性化細胞は、サイトカイン
を分泌し得るか、または自己抗原もしくは移植片に対する応答を抑制する他のエ
フェクター機構を有し得る。従って、活性化細胞は、自己免疫疾患および移植拒
絶の処置のために有用であり得る。さらに、複数の抗原を凝集する多重特異性分
子は、感染性物質（例えば、ウイルス）に対する免疫応答または腫瘍細胞に対す
る免疫応答を増大させるために、被験体に直接投与され得る。さらに、このよう
な分子は、直接的に腫瘍破壊を誘導するために、Ｔ細胞腫瘍およびＢ細胞腫瘍に
アポトーシスシグナルを送達し得る。あるいは、多重特異性分子は、抗原提示ま
たはＴ細胞／Ｂ細胞相互作用を妨害することにより、免疫応答のインヒビターと
して使用され得る。これらの分子は、自己免疫および過敏症の処置、ならびに移
植拒絶の予防に有用である。
【００６５】 （５．４．１．処方および投与経路） 本発明の多重特異性分子は、それ自体で、または薬学的組成物の形態で、被験
体に投与され得る。本発明の多重特異性分子を含む薬学的組成物は、従来の混合
プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖剤作製プロセス、微粒子化プロセ
ス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）プロセ
スまたは凍結乾燥プロセスにより製造され得る。薬学的組成物は、薬学的に使用
され得る調製物中への活性成分の処理を容易にする、１つ以上の生理学的に受容
可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、または補助剤を使用して、従来の様式で処方
され得る。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
【００６６】 局所投与のために、本発明の多重特異性分子は、当該分野で周知のように、溶
液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁物などとして処方され得る。
【００６７】 全身性の処方物は、注射（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下内、髄腔
内注射）による投与のため設計された処方物、ならびに経皮、経粘膜、経口、肺
投与（例えば、エアロゾル、吸入器、および噴霧器）のために設計された処方物
を含む。
【００６８】 注射のために、本発明の多重特異性分子は、水性溶液、好ましくは、生理学的
に適合可能な緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水
緩衝液）中に処方され得る。この溶液は、懸濁剤、安定化剤、および／または分
散剤のような処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含み得る。
【００６９】 あるいは、多重特異性分子は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌した
発熱物質を有さない水）と構成するための粉末形態であり得る。
【００７０】 経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に対して適切な浸透剤が、この処方物に
おいて使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知である。
【００７１】 経口投与のために、多重特異性分子が、当業者に周知の薬学的に受容可能なキ
ャリアと組み合わせることにより、容易に処方され得る。このようなキャリアは
、本発明の多重特異性分子が、処置されるべき患者による経口摂取のための、錠
剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとし
て処方されることを可能にする。経口固体処方物（例えば、粉末、カプセル、お
よび錠剤）のために、適切な賦形剤としては、以下が挙げられる：糖（例えば、
ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール）のような充填剤
；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデ
ンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；顆粒化剤；ならびに結合剤
。所望される場合、崩壊剤（例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、ま
たはアルギン酸、あるいはアルギン酸ナトリウムのようなその塩）が添加され得
る。
【００７２】 所望される場合、固体投薬形態は、標準的技術を使用して、糖でコートされ得
るか、または腸溶性であり得る。
【００７３】 経口液体調製物（例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液）については、
適切なキャリア、賦形剤、または希釈剤には、水、グリセロール、油、アルコー
ルなどが含まれる。さらに、香味料、保存剤、着色剤などが、添加され得る。
【００７４】 口腔内投与のために、多重特異性分子は、従来の様式で処方された錠剤、ロゼ
ンジなどの形態を採り得る。
【００７５】 吸入による投与のために、本発明に従う使用のための多重特異性分子は、加圧
パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で、適切な推進剤（例えば
、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフル
オロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用して、都合良く送達さ
れる。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、計量された量を送達するための
弁を備えることにより決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例
えば、ゼラチンのカプセルおよび薬包（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）は、その化合物と
適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を包含する
ことにより処方され得る。
【００７６】 多重特異性分子はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターまた
は他のグリセリド）を含む、坐剤または停留浣腸のような直腸用組成物あるいは
膣用組成物に処方され得る。
【００７７】 以前に記載された処方物に加えて、多重特異性分子もまた、貯蔵調製物として
処方され得る。このような長期作用性処方物は、移植（例えば、皮下に、または
筋肉内に）によるか、あるいは筋肉内注射により投与され得る。従って、例えば
、多重特異性分子は、適切なポリマー性物質もしくは疎水性物質（例えば、受容
可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂で、あるいはそれほど
可溶性でない誘導体（例えば、それほど可溶性でない塩）として、処方され得る
。
【００７８】 あるいは、他の薬学的送達系が、使用され得る。リポソームおよびエマルジョ
ンは、本発明の多重特異性分子を送達するために使用され得る送達ビヒクルの周
知の例である。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）もまた、通常
はより大きな毒性という犠牲を払うが、使用され得る。さらに、多重特異性分子
は、持続放出性系（例えば、その治療用薬剤を含む固体ポリマーの半透性マトリ
ックス）を使用して送達され得る。種々の持続放出性物質が確立されており、そ
して当業者に周知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に依存して、
２、３週間から１００日を超えるまで、多重特異性分子を放出する。その治療用
薬剤の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のための
さらなるストラテジーが使用され得る。
【００７９】 本発明の多重特異性分子は、荷電した側鎖または末端を有するので、これらは
、遊離の酸または塩基、あるいは薬学的に受容可能な塩として、上記の処方物の
いずれかに含まれ得る。薬学的に受容可能な塩は、遊離の塩基の生物学的活性を
実質的に保持する塩、および無機酸との反応により調製される塩である。薬学的
な塩は、対応する遊離の塩基形態よりも、水性溶媒および他のプロトン性溶媒に
おいてより可溶性である傾向がある。
【００８０】 （５．４．２．有効投薬量） 本発明の多重特異性分子は、一般に、意図される目的を達成するために有効な
量で使用される。免疫応答媒介性Ｔ細胞および／またはＢ細胞を、活性化あるい
は抑制するための使用のために、本発明の多重特異性分子、またはその薬学的組
成物は、治療的に有効な量で投与あるいは適用される。治療的に有効な量により
、症状を緩和または予防するため、あるいは処置される患者の生存を延長するた
めに有効な量が意味される。治療的に有効な量の決定は、十分に当業者の能力の
範囲内であり、特に、本明細書中に提供される詳細な開示の権利の範囲内である
。
【００８１】 全身性投与のために、治療的に有効な用量が、最初にインビトロアッセイから
評価され得る。例えば、細胞培養物中で決定されるＩＣ50を含む循環する濃度の
範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて処方され得る。このような情
報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【００８２】 最初の投薬量はまた、当該分野で周知の技術を使用して、インビボのデータ（
例えば、動物モデル）から評価され得る。当業者は、動物のデータに基づいて、
ヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【００８３】 投薬の量および間隔は、治療効果を維持するに十分である多重特異性分子の血
漿レベルを提供するように、個々に調整され得る。注射による投与についての通
常の患者投薬量は、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、好ましくは約０
．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療上有効な血清レベルは、毎日複数用
量の投与によって達成され得る。
【００８４】 局所投与または選択的取り込みの場合、多重特異的分子の有効な局所濃度は血
漿濃度に関連しないかもしれない。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療
上有効な局所投薬量を最適化し得る。
【００８５】 投与される分子の量は、当然、処置する被験体、その被験体の体重、その苦痛
の重篤度、投与様式、および処方医の判断に依存する。
【００８６】 治療は、症状が検出され得る間、または症状が検出され得ない場合でさえ、断
続的に繰り返され得る。治療は、単独で、または他の薬物との併用で提供され得
る。
【００８７】 （５．４．３．毒性） 好ましくは、治療上有効な投与量の、本明細書に記載される多重特異性分子は
、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供する。
【００８８】 本明細書に記載される多重特異性分子の毒性は、標準的な薬学的手順により、
細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ50（その集団の５０％に対し
て致死的な投与量）またはＬＤ100（その集団の１００％に対して致死的な投与
量）を決定することによって、決定され得る。毒性効果と治療効果との間の投与
比が、治療指数である。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養
アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用して、ヒトにおける使用のた
めに、毒性でない投薬範囲を設定（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）し得る。本明細書に記
載の多重特異的分子の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全く
ない有効な用量を含む所定の範囲の循環濃度にある。投薬量は、用いる剤形およ
び利用する投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経
路および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（
例えば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章 第１頁、Ｆｉｎｇｌら、１９７５を参照）。
【００８９】 （５．５．ラマＶHHを発現するトランスジェニック動物） 本明細書において開示された方法によって単離されたＶHH遺伝子配列は、ラマ
ＶHHを発現する創始動物を作製するために、トランスジェニック技術によって動
物において発現させ得る（米国特許第５，５４５，８０６号；ＷＯ９８／２４８
９３）。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ（ｍｉｃｒ
ｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、チン
パンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物が、ラマＶHHを発現す
るトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。本明細書において使
用される用語「トランスジェニック」とは、異なる種に由来するコード配列を発
現する動物（例えば、ラマの遺伝子配列を発現するマウス）をいう。
【００９０】 トランスジェニック動物の創始系統を作製するために、当該分野において公知
の任意の技術を使用して、ＶHH導入遺伝子を動物に導入し得る。このような技術
には、前核マイクロインジェクション（ＨｏｐｐｅおよびＷａｇｎｅｒ，１９８
９，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺
伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２）；胚性幹細胞におけ
る遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３
２１）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．３：１８０３−１８１４）；および精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒ
ａｎｏら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３）が含まれるが、これら
に限定されない（Ｇｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａ
ｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５，１７１−２２９を参照）。当該
分野において公知の任意の技術を使用して、ＶHH導入遺伝子を含むトランスジェ
ニック動物クローンを作製し得る（例えば、静止まで誘導した、培養した胚、胎
児、または成体の細胞由来の核を摘出した卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｂｅｌ
ｌら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６；Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８５：８１０−８１３））。
【００９１】 本発明は、そのすべての細胞にＶHH導入遺伝子を有するトランスジェニック動
物、およびその全てではないがいくつかの細胞にこの導入遺伝子を有する動物（
すなわち、モザイク動物）を提供する。ＶHHは個々の遺伝子セグメントとしてか
またはコンカテマー（例えば、頭部−頭部縦列（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ ｔ
ａｎｄｅｍ）または頭部−尾部縦列（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ｔａｎｄｅｍ
））に組み込まれ得る。ＶHH導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（１９９
２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３
６）の教示に従って、特定の細胞型（例えば、リンパ球）に選択的に導入され得
る。このような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に
依存し、そして当業者に明らかである。導入遺伝子が内因性の可変領域遺伝子の
染色体部位に組み込むまれることを望む場合、遺伝子標的化が好ましい。簡潔に
述べると、そのような技術が利用される場合、染色体の配列との相同組換えを介
して、内因性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込み、そしてその内因性遺伝子の
ヌクレオチド配列の機能を破壊するという目的のために、この内因性遺伝子に相
同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが設計される。導入遺伝子はま
た、例えば、Ｇｕら（１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６）に
従って、特定の細胞型に選択的に導入され、したがってその細胞型のみでその内
因性遺伝子が不活化され得る。このような細胞型特異的不活化に必要な調節配列
は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。
【００９２】 一旦、トランスジェニック動物が作製されると、ラマＶHHの発現は、標準的な
技術を利用してアッセイされ得る。初期スクリーニングは、動物組織を分析して
、ＶHHの組み込みが起きたかどうかをアッセイするために、サザンブロット分析
またはＰＣＲ技術により達成され得る。抗原を免疫した後のトランスジェニック
動物の組織におけるＶHHのｍＲＮＡ発現レベルはまた、その動物から得られる組
織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析
、およびＲＴ−ＰＣＲを含むが、それらに限定されない技術を使用して、評価さ
れ得る。ＶHH発現組織のサンプルはまた、ラマ可変領域エピトープに特異的な抗
体を使用して免疫細胞化学的に評価され得る。
【００９３】 当該分野において公知の種々の手順が、抗原でトランスジェニック動物を免疫
することによる任意の抗原に対するＶHHの作製に使用され得る。取扱いの容易さ
および試薬の入手可能性のために、マウスが好ましい。このような抗体には、ポ
リクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、
抗イディオタイプ抗体、抗原結合性の抗体フラグメント、および可変領域発現ラ
イブラリにより作製されたフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。
【００９４】 免疫学的応答を増大させるために、宿主の種に依存して、種々のアジュバント
が使用され得る。これには、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水
酸化アンモニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌ
ｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これ
らに限定されない。
【００９５】 ＭＡｂは、培養の連続細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技術を使
用することによって調製され得る。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５−４９７）により最初に記載
されたハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限定されない。このような抗体
は、重鎖のみの抗体であり得、そしてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ
およびそれらの任意のサブクラスを含むがこれらに限定されない任意の免疫グロ
ブリンクラスであり得る。
【００９６】 これまで本発明が記載されてきたが、以下の実施例は例示のために提供され、
限定のためではない。
【００９７】 （６．実施例：３つのＴ細胞表面抗原に特異的な固定化抗体は、ヒトＴ細胞の
増殖を増強した） （６．１．材料および方法） （６．１．１．ヒトＴ細胞増殖の刺激） 単核細胞を、ヒト末梢血から、「ＦＩＣＯＬＬ」での遠心分離により単離した
。２回のプラスチックへの接着により単球を枯渇させた。次いで、単核細胞を、
固定化した抗体を含む１ウェルあたり５０，０００細胞にて、９６ウェルＣｏｓ
ｔａｒ平底マイクロタイタープレート中で刺激した。そのウェルにおいて、リン
酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で精製した抗体混合物を、１００μｌ／ウェル
で３時間３７℃にてインキュベートし、続いて、細胞の添加の前に、未結合の抗
体をウェルから洗い流すことにより、抗体を固定化する。抗体濃度は、１０μｇ
／ｍｌの抗ＣＤ３、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２、および種々の濃度の示される第
３の抗体であった。増殖を、４日間培養の最後の１８時間の3Ｈ−チミジンの取
り込みにより、４連のウェルで測定した。平均を示す。標準誤差は、各点で平均
の１５％未満である。
【００９８】 （６．１．２．抗Ｔ細胞抗体） ＭＡｂ抗ＣＤ３であるＯＫＴ３をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８００１）か
ら得た。ＭＡｂ抗ＣＤ２８であるＢ−Ｔ３をＤｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎｃｏ
ｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ＭＡｂ抗ＣＤ２である９．６および抗ＣＤ２
８抗体である９．３は、Ｊｏｈｎ Ｈａｎｓｅｎ（ＦＨＣＲＣ，Ｓｅａｔｔｌｅ
，ＷＡ）より提供された。抗ＣＤ４であるＯＫＴ４をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−８００２）から得た。ＭＡｂ抗ＣＤ５である１０．２は、Ｊｏｈｎ Ｈａｎ
ｓｅｎ（ＦＨＣＲＣ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）より提供された。コントロールｍ
ＡｂはＬ６であった。抗ＣＤ４０ｍＡｂは、ＣｌａｒｋおよびＬｅｄｂｅｔｔｅ
ｒ（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：４
４９４−４４９８）により記載されている。抗ＣＤ１８ｍＡｂは、Ｂｅａｔｌｙ
ら（１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２９１３−２９１８）によって記
載されている。
【００９９】 （６．１．３．Ｔ細胞サブセットの分離） Ｔ細胞を末梢血から、「ＦＩＣＯＬＬ」での遠心分離、続いて単球、Ｂ細胞、
ＮＫ細胞、およびＣＤ４もしくはＣＤ８細胞のいずれかの枯渇によるＣＤ４+ま
たはＣＤ８+サブセットへの分離によって単離した。ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ
１１ｂ、およびＣＤ８もしくはＣＤ４に対するｍＡｂを使用し、続いて抗マウス
ＩｇＧでコートした磁気ビーズを使用する抗体結合細胞の除去することによって
、細胞枯渇を実施した。ＣＤ４+もしくはＣＤ８+Ｔ細胞は、枯渇工程後、フロー
サイトメトリーにより分析すると９５％を超えて純粋であった。細胞を、抗体を
コートしたマイクロタイタープレートにおいて、５×１０4にて４日間培養し、
そして増殖を、培養の最後の１２時間の3Ｈ−チミジンの取り込みによって、測
定した。マイクロタイタープレートは、示されるような固定化された抗体を含み
、固定化について総タンパク質濃度を等しくするために、コントロールである非
結合Ｌ２０抗体をいくつかのウェルに含ませた。抗体を、各１０μｇ／ｍｌで１
８時間、３７℃にてのインキュベーション、続く十分過ぎるほどの洗浄による未
結合タンパク質の除去により、固定化した。
【０１００】 （６．１．４．抗ＴＣＲ可変領域抗体） ＴＣＲ Ｖβ８、Ｖβ９、Ｖβ１４、およびＶβ２０に特異的なＭＡｂ（それ
ぞれ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ３３１３ １Ａ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ３３１３
１Ｂ；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍ．１５５７；およびＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｍ．１５６
１）を、２工程手順を使用して培養プレートに固定化した。精製ヤギ抗マウス（
Ｃａｐｅｌ）抗体をまず固定化し、続いて抗ＶβｍＡｂおよび抗ＣＤ２８の添加
の前に、洗浄し、そしてブロッキングした。細胞増殖を観察し、そして９日後、
増殖している細胞を、５Ｕ／ｍＬのインターロイキン−２（Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．，
Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む新しい培養プレートに移した。５日後、
すなわち１４日目に、二次のフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ試薬（Ｂｉｏｓ
ｏｕｒｃｅ）を使用して、ＴＣＲ Ｖβ特異性の発現について、フローサイトメ
トリーにより、細胞を分析した。
【０１０１】 （６．１．５．細胞刺激のためのビーズへの抗体カップリング） Ｍ−４５０トシルで活性化した、４×１０8ビーズ／ｍｌの２．８ｍｌの「Ｄ
ＹＮＡＬ」ビーズ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）の懸濁液を３回洗浄した。それぞ
れ４ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）を用い、緩衝液の除去に磁
石を使用した。次いで、このビーズを１．５ｍｌのホウ酸緩衝液に懸濁した。２
００μｌ（１．８×１０8ビーズ）のビーズ懸濁液に、１４０μｌのホウ酸緩衝
液、３０μｇのカップリングすべき所定の抗体、およびＰＢＳの混合液を加えた
。添加するＰＢＳの容量を、反応混合液の最終容量が４００μｌであるように、
調整した。ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２に対する抗体（それぞれ、ＯＫＴ−
３，９．３、および９．６）の全ての可能な組合せをカップリングした。これら
の抗体を、約２０時間３７℃にて回転板上で、ビーズと反応させた。この後、未
反応の抗体を磁石で除去した。次いで、このビーズ調製物を、０．１％（重量：
容量）アジ化ナトリウムを含む１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、そして３％（容量
：容量）ヒト血清、５ｍＭ ＥＤＴＡ，および０．１％（重量：容量）アジ化ナ
トリウムを含むＰＢＳ（保存緩衝液）で３回洗浄した。保存緩衝液中での３回の
洗浄の最後を、約３０分間周囲温度にて回転板上で行った。次いで、すべてのビ
ーズ調製物を、約３１時間４℃にて回転板上で、保存緩衝液とともにインキュベ
ートした。この後、調製物のそれぞれを１．０ｍｌの保存緩衝液に再懸濁した。
【０１０２】 末梢血リンパ球を密度遠心分離により単離した。リンパ球を、２％ＦＣＳを含
むＲＰＭＩにおいてプラスチックに付着させた。細胞をペレット化し、９６ウェ
ル平底プレートに２．５×１０5／ｍｌの密度にてプレートした。次いで、ｍＡ
ｂと結合させたＤｙｎａｌビーズを、３ビーズ：１細胞の比にて細胞とともにプ
レートした。細胞を、３７℃および５％ＣＯ2にて５日間インキュベートした。
次いで、１μＣｉ／ウェルの3Ｈ−チミジンをウェルに添加し、そして一晩イン
キュベートした。培養物をガラスフィルターマット上に回収し、そしてｃｐｍを
測定した。
【０１０３】 （６．２．結果） ヒトＴ細胞を、正常なドナーの末梢血から単離し、そして固定化した、３種の
Ｔ細胞表面抗原に対するｍＡｂでインビトロにて刺激した。ＣＤ２およびＣＤ３
に特異的な抗体ならびに第３の抗体（例えば、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４または抗Ｃ
Ｄ５）を、培養プレートの表面に吸着により同時固定化し、続いて培養培地中で
Ｔ細胞とともにインキュベートした。Ｔ細胞増殖を、Ｔ細胞の活性化の尺度とし
てアッセイした。３つの固定化抗体の組合せは、固定化した抗ＣＤ２抗体、抗Ｃ
Ｄ３抗体および第３の抗体Ｌ６（Ｔ細胞が発現しない抗原に特異的である）の組
合せの使用と比較して場合、Ｔ細胞増殖を増強した（図２）。特に、抗ＣＤ２、
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の組合せは、試験したすべての濃度で、最高レベルの
Ｔ細胞増殖を生じた。３つの固定化抗体は、溶液で提示された同じ３つの抗体、
または２つの固定化抗体および溶液での第３の抗体より大きな細胞増殖を誘導し
た。同時に固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ならびに抗ＣＤ１８ｍＡｂも
また、これら３つの抗体のうちの２つの組合せより大きなＴ細胞増殖を誘導した
。さらに、同時に固定化された抗ＣＤ３ｍＡｂ、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよび抗ＣＤ
４０ｍＡｂは、精製Ｔ細胞の増殖を増強した（図３）。ＣＤ４０は、活性化した
Ｔ細胞および抗原提示細胞により発現されることを特筆する。したがって、同時
に固定化された抗体による３つのＴ細胞表面抗原の凝集は、Ｔ細胞活性化を増強
する。固定化された抗体は、培養物中のＴ細胞およびＢ細胞の数を増大するため
および細胞分化を誘導するために使用され得る。活性化された細胞は、溶液中に
加えられた抗体からより容易に固定化された抗体から分離され得る。このため、
細胞が養子療法における使用のために採取される場合、その細胞に結合した抗体
のレシピエントへの注入は、最少化され得る。
【０１０４】 精製ＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細胞を、固定化抗ＣＤ３抗体とインキュベートし
た場合、その抗体が単独で３０μｇ／ｍｌにて固定化されているか、またはコン
トロール抗体Ｌ２０と共に、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３＋２０μｇ／ｍｌのＬ２
０の濃度にて固定化されているかに拘わらず、細胞増殖は最少であった（図４）
。しかし、抗ＣＤ２８ｍＡｂを抗ＣＤ３と共に固定した場合、ＣＤ４+およびＣ
Ｄ８+の両Ｔ細胞の増殖の増大が観察され、そしてそのような効果は、より多く
の抗ＣＤ２８ｍＡｂの添加によって、さらには増強しなかった（図４）。同様に
、同時固定化した抗ＣＤ２ｍＡｂおよび抗ＣＤ３ｍＡｂは、ＣＤ４+およびＣＤ
８+Ｔ細胞の増殖を、抗ＣＤ３単独により誘導されるレベルを超えて増大させた
。抗ＣＤ２および抗ＣＤ２８の両方を、抗体固定化工程の間に抗ＣＤ３に添加し
た場合、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖にさらなる劇的な増大が存在したが、他方、ＣＤ
８+細胞の増殖は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２により誘導
される増殖を超えて増強しなかった（図４）。これらの結果は、同時固定化した
抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ２抗体の組合せが、同時固定化した抗ＣＤ３
および抗ＣＤ２８の組合せ、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２の組合せを超えて、
ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を増強したことを示す。総合的なＴ細胞刺激において、抗
ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ２の組合せが、ＣＤ４+Ｔ細胞による、より多
い量のリンホカイン産生（これは、次いでより多いＣＤ８+Ｔ細胞の活性化を刺
激する）を誘導すると予測される。それに関して、同時固定化された抗体は、活
性化されたＴ細胞による異なるサイトカインプロフィールを刺激する。これに依
存して、３またはそれ以上の抗体の特定の組合せが使用される。このような活性
化されたＴ細胞は、インビトロで他の細胞型（例えば、単球または樹状細胞）と
共に同時培養され、外因性サイトカインの非存在下で、それらの増殖または分化
を促進し得る。
【０１０５】 さらに、図５Ａおよび５Ｂは、Ｔ細胞増殖の3Ｈ−チミジン組込み測定が、固
定化抗体での刺激後の細胞増殖と相関したことを示す。精製ＣＤ４+Ｔ細胞の増
殖を、７日目に、3Ｈ−チミジンの１２時間パルスで測定した。他方、細胞数を
、８日目に、血球計での直接細胞計数により測定した。このような知見は、3Ｈ
−チミジン取り込みによるＴ細胞増殖の測定は、同時固定化した抗ＣＤ２、抗Ｃ
Ｄ３および抗ＣＤ２８抗体の、培養物におけるＴ細胞数を増大する能力を直接的
に反映することを示す。
【０１０６】 Ｔ細胞活性化における、別の形態の固体支持体に固定化された抗体の能力を試
験するために、ｍＡｂを「ＤＹＮＡＬ」ビーズに同時固定化し、そしてヒトＴ細
胞と共にインキュベートした。図６は、ビーズ上に同時に固定化された抗ＣＤ３
、抗ＣＤ２および抗ＣＤ２８抗体の組合せが、一貫して、抗ＣＤ３単独、または
２抗体の組合せと比較して、試験した全ての患者からの最高レベルのＴ細胞増殖
を誘導することを示す。したがって、ビーズへの抗体の同時固定化は、Ｔ細胞の
より優れた活性化を生じる。さらに、図７Ａおよび７Ｂは、同じビーズ上への抗
体の同時固定化が、ビーズと別に固定化した抗体との混合物より高いレベルのＴ
細胞増殖を生じることを示す。このことは、Ｔ細胞上の複数の表面分子の凝集が
、抗体を互いにすぐ近くに配置することにより最適に達成されることを示す。そ
れに関して、図８は、別のビーズに固定化されるかまたは溶液で添加された抗Ｃ
Ｄ２が、同じビーズに同時固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により刺激さ
れたＴ細胞増殖を阻害したことを示す。
【０１０７】 別の実験において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８と共に培養プレートに同時固定化さ
れた抗ＴＣＲ可変領域抗体より選択的に刺激し、続いてこの培養細胞のＶβ特異
性を分析した。同時固定化した抗ＴＣＲ Ｖβ８および抗ＣＤ２８で刺激された
細胞は、Ｖβ８の発現について７２％が陽性であったが、Ｖβ９も、Ｖβ１４も
、Ｖβ２０も、コントロールの抗マウスＩｇＧ第２工程試薬単独により検出され
るレベルを超えて発現しなかった（図９Ｂ、９Ｄおよび９Ｆ）。対照的に、同時
固定化された、同じドナーサンプル由来の抗ＴＣＲ Ｖβ９および抗ＣＤ２８で
刺激された細胞は、抗Ｖβ８抗体とも、抗Ｖβ１４抗体とも、抗Ｖβ２０抗体と
も反応しなかったが、抗Ｖβ９ｍＡｂとは顕著に反応した（６５％が陽性；図９
Ａ、９Ｃおよび９Ｅ）。抗体刺激前に分析した、このドナー由来の細胞は、これ
らＶβ特異性のそれぞれの発現が５％未満であることを示した。
【０１０８】 これらのデータは、Ｔ細胞の非常に小さな亜集団が、固体表面に同時に固定化
された、個々のＴＣＲ Ｖβエピトープに特異的なｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡ
ｂを使用して、選択的に拡大され得ることを示す。ＴＣＲ Ｖβの使用が、Ｔ細
胞の抗原特異的反応性と有意な相関を示し、そしてＴＣＲ Ｖβの使用が、自己
免疫疾患およびガンを有する患者において高度に偏り得るので、抗原特異的Ｔ細
胞または特定の抗原認識について高度に富化されたＴ細胞は、抗ＣＤ２８ｍＡｂ
と共に固定化された適切なＶβｍＡｂを使用して、選択的に増大され得る可能性
が高い。さらに、さらなるＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ１５０、ＣＤ５、
またはＩＣＯＳ）に対する第３のｍＡｂの固定化は、特定のＶβを発現するＴ細
胞の選択的増大をさらに増強する。２以上のＶβ鎖に対する抗体もまた、抗ＣＤ
２８およびさらなるｍＡｂと共に使用されて、所望のＶβポリペプチド鎖を発現
するＴ細胞を、その他のＴ細胞サブセットを拡大することなく、増大し得る。さ
らに、γδＴＣＲを発現するＴ細胞もまた、他の抗体と同時固定化された、γδ
ヘテロダイマーに対するｍＡｂによって、選択的に増大され得る。ＴＣＲ／ＣＤ
３複合体の成分（任意のＣＤ３ポリペプチド鎖またはＣＤＲのようなＴＣＲα／
βもしくはγ／δダイマーを含む）と反応性である任意の抗体が、本発明の実施
のために使用され得る。
【０１０９】 （７．実施例：ラマＢ細胞はＣＤ４０を発現し、そしてヒト細胞表面抗原に結
合した重鎖のみの抗体を産生した） （７．１．材料および方法） （７．１．１．ラマの免疫） Ｌｌａｍａ ｌｌａｍａを、ＪＪＪファーム（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）から入
手し、そしてＰＢＳ中のヒト細胞およびフロイント完全アジュバントで腹腔内免
疫し、続いてフロイント不完全アジュバント中の同じ細胞で少なくとも３回追加
免疫した。免疫に使用した細胞型には、正常で刺激されていないか、もしくは活
性化されたヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、ＪｕｒｋａｔおよびＨＰＢ−ＡＬＬ
のようなＴ細胞株、ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓのようなＢ細胞株、またはＥＢ
Ｖ形質転換株ＣＥＳＳが含まれた。ラマをまた、その細胞について上記したよう
に、アジュバントと混合したＰＢＳ中の１００〜５００μｇの精製融合タンパク
質で免疫した。各追加免疫の４〜７日後、動物から採血し、血清が標的細胞と反
応性である抗体を含んでいるかどうかを決定した。動物の抗体応答に依存して、
３回目の追加免疫後もしくはより後の追加免疫後に、大量の採血（２００ｍｌ）
を行った。頸静脈の静脈穿刺により動物から採血し、全血をクエン酸抗凝固剤で
処理した。
【０１１０】 （７．１．２．ラマ末梢血の調製） ラマ（Ｌｌａｍａ）の全血（２００ｍｌ）を、９００ｒｐｍで２０分間遠心分
離し、そして末梢血単核細胞を含む細胞の上層を第２のチューブに吸引した。次
いでこの画分を、ＰＢＳ中に１：１希釈し、そして３０ｍｌを、Ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（ＬＳＭ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋ
ｎｉｋａ）の１５ｍｌクッション上に充填した。バフィーコートを、Ｓｏｒｖａ
ｌｌ卓上型遠心分離機中２０分間２０００ｒｐｍで遠心分離することにより分画
し、そして血清／ＬＳＭ界面から吸引により単離した。細胞をＰＢＳまたは無血
清のＲＰＭＩ中で３回洗浄し、１２００〜１４００ｒｐｍで１０分間スピンし、
そして最後のスピンの後計数した。適切な数の細胞を、最後のスピンのため、新
たな遠心分離チューブにアリコートに分けた。最後の細胞ペレットを、ドライア
イス−エタノール浴中、１０8細胞／チューブで液体なしに急速凍結し、そして
ｍＲＮＡ単離まで−７０#Ｃに置いた。あるいは、細胞を、インビトロの結合ア
ッセイまたは機能的研究における使用のためにＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清中
に１０6細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁し、そして一晩培養した。細胞はまた、
将来の機能的アッセイにおける使用のために血清／１０％ＤＭＳＯ中２×１０7
細胞のアリコートで凍結した。
【０１１１】 （７．１．３．細胞染色およびフローサイトメトリー） Ｌ．ｌｌａｍａからのＰＢＬを、ＬＳＭ上の遠心分離により単離し、そして細
胞を、抗ＣＤ４０ｍＡｂであるＧ２８−５、（米国特許第５，１８２，３６８号
）、抗ラマ免疫グロブリン（Ｉｇ）、および抗軽鎖抗体で染色した。この抗ＣＤ
４０抗体（Ｇ２８−５）をビオチンで標識し、そしてその結合を、フィコエリト
リン結合体化ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）で検出した。抗ラ
マＩｇを、フルオレセインで直接標識した。抗軽鎖染色は、フルオレセイン結合
体化抗ヒトκに加えて、Ｃａｌｔａｇ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）からの抗
ヒトλ試薬を用いて実施した。細胞染色を、ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメータ
ーにより分析した。
【０１１２】 （７．１．４．ラマリンパ球の増殖） Ｌ．ｌｌａｍａからのＰＢＬを、ＬＳＭ上の遠心分離により単離した。このリ
ンパ球を、ホルボール−１２−ミリスチン酸（ＰＭＡ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗
ＣＤ４０ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌのＧ２８−５）、ＣＤ８６発現チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、コントロールＣＨＯ細胞または上記の試薬の組み
合わせで刺激した。ＣＨＯ細胞を、アッセイの前に放射線照射してＣＨＯ細胞の
増殖を防いだ。リンパ球増殖を、各々５０，０００のリンパ球を含むマイクロタ
イタープレートの四連ウェル中で、３日間の培養期間の最後の１２時間の間の3
Ｈチミジンの取り込みにより測定した。平均は、２つの異なるラマからのリンパ
球増殖結果から示される。
【０１１３】 （７．１．５．ラマ抗体の精製） ＪｕｒｋａｔＴ細胞の複数注入で免疫したラマからの血清を、複数工程手順に
より、従来のＩｇＧアイソタイプおよび重鎖のみのＩｇＧアイソタイプ中に分画
した。血清を、最初、プロテインＡに結合させ、溶出し、次いでＤＥＡＥイオン
交換クロマトグラフィーにより分離した。このプロテインＡ溶出液を、プロテイ
ンＧへの結合、次いでｐＨ２．７またはｐＨ３．５における溶出により別々に分
画した。画分を、還元後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１４】 （７．２．結果） 単離されたラマＰＢＬを、抗ＣＤ４０抗体および抗Ｉｇまたは抗軽鎖抗体と反
応させ、そしてフローサイトメトリーにより分析した。図１０Ａおよび１０Ｂは
、ラマ末梢血細胞の集団が、抗ヒトＣＤ４０抗体と反応したことを示す。２色染
色は、すべてのＣＤ４０+細胞が、表面Ｉｇを発現したことをさらに示し、これ
らの細胞が、抗体産生Ｂ細胞であったことを示す（図１０Ｅおよび１０Ｆ）。し
かし、ＣＤ４０+細胞の一部分のみが、検出可能な軽鎖を発現した（図１０Ｃお
よび１０Ｄ）。これらの結果は、ラマＢ細胞が、重鎖および軽鎖から構成される
従来の抗体、および軽鎖のない重鎖のみの抗体を発現することを示す。従って、
重鎖のみの抗体を発現するラマＢ細胞を、その他のＢ細胞から、抗ＣＤ４０との
それらの反応性および抗軽鎖試薬との反応性の欠如により分離し得る。
【０１１５】 ２つのラマからのＰＢＬを単離し、そして異なる試薬で刺激し、次いで細胞増
殖を測定した。抗ＣＤ４０抗体は、ラマＢ細胞増殖を刺激し、それはＰＭＡによ
りさらに増強された（図１１）。ＣＤ８６（またはＢ７．２）発現ＣＨＯ細胞単
独では、Ｌ．ｌｌａｍａ Ｂ細胞増殖を誘導しなかったが、そのＰＭＡとの組み
合わせた使用は、有意な増殖を誘導した（図１１）。ＣＤ４０刺激はまた、培養
中のラマＢ細胞分化およびＩｇ親和性成熟を誘導し得る。従って、ＣＤ４０刺激
を用いて、重鎖のみの抗体を産生するラマＢ細胞を選択的に増殖させ得、これら
の抗体およびそれらの特異的ＶHH領域の単離を容易にし得る。さらに、ＶHHを産
生するＢ細胞の数を増大させるために、抗ＣＤ４０抗体を、ラマに注入し、Ｂ細
胞をインビボで刺激し得る。特異的可変領域を発現する細胞は、赤血球に結合し
た特異的抗原を用いたロゼット形成を含む、種々の方法により単離され得る。
【０１１６】 ラマを、ヒトＴ細胞で免疫し、そしてその血清を分画して、重鎖および軽鎖か
ら構成される従来の抗体から重鎖のみの抗体を分離した。精製された抗体画分を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１２は、ＩｇＧ１ Ｄ（レーン１中のＤ
ＥＡＥフロースルー）、ＩｇＧ１ Ｇ（プロテインＧ、レーン２中のｐＨ２．７
溶出）ＩｇＧ２＋ＩｇＧ３（プロテインＧ、レーン３中のｐＨ３．５溶出）、お
よびＩｇＧ３（レーン４中のプロテインＧフロースルー）を含む、精製されたＩ
ｇアイソタイプを示す。このＩｇＧ２アイソタイプおよびＩｇＧ３アイソタイプ
（レーン３および４）は、検出可能な軽鎖なしの重鎖バンドを含んでいた。
【０１１７】 重鎖のみの抗体（ＩｇＧ２＋ＩｇＧ３、およびＩｇＧ３画分）を、細胞表面抗
原への抗体結合の検出のためにＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともにインキュベートし
た。特異的結合を、フルオレセイン結合体化抗ラマＩｇまたは抗軽鎖第２工程試
薬を用い、次いでフローサイトメーターを用いた分析により検出した（図１３Ａ
〜１３Ｈ）。ネガティブコントロールは、非免疫ラマからの同じ濃度の精製され
たＩｇＧアイソタイプであった。抗軽鎖試薬は、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＩｇＧ１
画分の結合を検出したが（図１３Ｂおよび１３Ｄ）、軽鎖を含まなかったＩｇＧ
２画分およびＩｇＧ３画分は、抗軽鎖試薬では検出されなかった（図１３Ｆおよ
び１３Ｈ）。しかし、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、重鎖のみの画分で染色し、そして抗
Ｉｇ第２工程試薬により検出したとき、Ｊｕｒｋａｔ細胞表面抗原への抗体結合
が観察された（図１３Ｅおよび１３Ｇ）。軽鎖のないラマ抗体がヒト細胞表面抗
原に対して生成されたと結論される。
【０１１８】 （８．実施例：Ｌ．ｌｌａｍａＶHHライブラリーの構築およびラマＶHH配列の
特徴付け） （８．１. 材料および方法） （８．１．１．ラマｍＲＮＡの単離） ラマＰＢＬ ｍＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉのグア
ニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−チオシアネート酸−フェノール手順（１
９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９）の変法により調
製した。１０8細胞には、５〜１０ｍｌの変性／溶解溶液を添加し、ＲＮＡを調
製した。ポリＡ ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースを用いて単離し、７５％エタ
ノール／ＤＥＰＣ処理水中で洗浄し、再遠心分離し、そしてＤＥＰＣ処理水中に
再懸濁した。
【０１１９】 （８．１．２．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）） ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
を用いるランダムヘキサマーでプライムされる逆転写反応により生成した。ＰＣ
Ｒ反応を、以下のプライマーセットを用いて実施した：正方向プライマーは、Ｖ HH タンパク質のアミノ末端配列決定から設計された２０マーの群の１つである配
列５’ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＡＲ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧ３’（配列番号
４７）を持つＬＶＨ５’−１であり、その一方用いた逆方向プライマーは、先に
決定された、既存のラクダおよびヒトＶH配列から設計された４４マーであるＬ
ＶＨ３ＲＳであった。配列５’ＣＧＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＴＣ
Ｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＹＴＧ ＧＧ
３’（配列番号４８）は、ＶHドメインの３’末端にアニールした。ＰＣＲ産物
を、６％アクリルアミド／０．５×ＴＢＥゲル上で電気泳動し、そしてバンドを
臭化エチジウム染色後可視化した。ＤＮＡバンドを、２％ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴ
Ｇゲル（ＦＭＣ）から単離し、そしてＱｉａｅｘビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）から製
造業者の指示書に従って精製した。ＰＣＲ後に精製したＤＮＡを、ｐＴ−Ａｄｖ
プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中に連結
し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に形質転換し
た。一旦ＶHおよびＶHH配列の代表的サンプルが決定されたなら、新たなプライ
マーが設計され、ＶHHフラグメント中のＣＨ１ドメインがないことを基にＶH含
有フラグメントとは異なるフラグメント長を有するＶHH含有フラグメントを増幅
するために選択された。次いでこれらのフラグメントを精製し、ファージディス
プレイベクターＸＰＤＮＴ中にクローン化し、そしてほとんどのＶHH配列を含む
ラマ可変領域のライブラリーを生成することにおいてテンプレートとして用いた
。
【０１２０】 ラマＶHH領域配列のクローニングのためのさらなる方法は以下のようである。
ラマＩｇＧ2特異的ＶHH領域を、ラマＰＢＬから調製されたｃＤＮＡからクロー
ン化し、そしてヒトＶｈ１ファミリー特異的５’プライマーおよび３’ラマＩｇ
Ｇ2ヒンジ領域プライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。これらのプライマー
の配列は、それぞれ、ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ（配列番
号４９）およびＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧ（配列番号５０）
であった。
【０１２１】 さらに、ラマＩｇＧ2特異的ＶHH領域を、ラマＰＢＬから調製したｃＤＮＡか
らクローン化し、そしてヒトＶｈ２ファミリー特異的５’プライマーを、３’ラ
マＩｇＧ2ヒンジ領域プライマーとともに用いるＰＣＲにより増幅した。これら
のプライマーの配列は、それぞれ、ＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＧＴ
ＣＴＧＧ（配列番号５１）およびＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧ
（配列番号５０）であった。
【０１２２】 ラマＩｇＧ2特異的ＶHH領域をまた、ラマＰＢＬから調製したｃＤＮＡからク
ローン化し、そしてヒトＶｈ４ファミリー特異的５’プライマーを３’ラマＩｇ
Ｇ2ヒンジ領域プライマーとともに用いるＰＣＲにより増幅した。これらのプラ
イマーの配列は、それぞれ、ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧ（配
列番号５２）およびＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧ（配列番号５
０）であった。
【０１２３】 増幅物からのラマＶHH配列をプールし、そしてＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消
化し、次いで改変ファージディスプレイベクターＸＰＤＮＴ中に挿入し、遺伝子
ＩＩＩ融合カセットを生成した。このＶHHライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１
ＢＬＵＥ細菌中にエレクトロポレーションにより形質転換し、そしてＳＢ／ａｍ
ｐ／ｔｅｔ培地を含む大ＮＵＮＣバイオアッセイデッシュにプレートした。この
工程で、系列希釈したサンプルのプレーティングもまた実施し、形質転換効率を
推定した。ライブラリーを、２０％グリセロールを含むＳＢ／ａｍｐ／ｔｅｔ中
にかきとり、そして１〜２ｍｌアリコート中−７０#Ｃで凍結した。ライブラリ
ーを、液体２×ＹＴ／ａｍｐ／ｔｅｔ＋グルコース中、３７#Ｃで数時間増幅し
、次いでヘルパーファージに感染させ、プレートしてファージ力価を測定し、そ
してグルコースを欠く培地中選択条件下で３０#Ｃ一晩増殖させた。増幅したフ
ァージを、これらの培養物から、細菌をペレット化するための遠心分離により、
次いで培養上清のＰＥＧ沈殿、そしてファージ沈殿物を回収するための第２の遠
心分離により単離した。沈殿しなかった培養上清の小アリコートもまた、ＰＥＧ
／ＮａＣｌの添加前に回収した。沈殿物を、１／１００容量のＰＢＳ／１％ＢＳ
Ａ中に再懸濁し、そして数分間、２０００〜５０００ＲＣＦでスピンし、不溶性
材料をペレットにした。ファージストックまたは上清を、プレブロックされたヒ
ト抗原または細胞に対してパニングする前に、氷上で１時間、１０％脱脂乳／Ｐ
ＢＳ中のインキュベーションによりプレブロックした。多くの回のパニングは、
非トランスフェクトまたは正常ヒト細胞を用いてか、または無関係の−Ｉｇ融合
タンパク質を用いて非特異的結合剤の頻度を減少させ、事前に安全を保証した。
この保証およびパニングを、ブロックされたファージを抗原または細胞と氷上で
１時間同時インキュベートし、そして結合したファージをペレット化するための
遠心分離により実施した。−Ｉｇ融合タンパク質抗原を用いたパニングには、プ
ロテインＡセファロースを用いて遠心分離前にファージ−抗原複合体を捕獲した
。結合細胞またはプロテインＡセファロースを、溶出前、１０％乳／ＰＢＳ、Ｐ
ＢＳ／１％ＢＳＡまたはＰＢＳ／ブロッカー／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中、少なく
とも６回、そして１２回程度も洗浄した。結合したファージの溶出を、いくつか
の異なる緩衝液のうちの１つにおけるインキュベーション、および室温で１０分
間のインキュベーションにより実施した。溶出緩衝液は、ＰＢＳ中０．１Ｎ Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ２．５、０．１Ｍクエン酸ｐＨ２．８、ＰＢＳ中０．５％ ＮＰ−４
０、または１００ＭＭトリエチルアミンを含んでいた。細胞／セファロースをペ
レット化し、そして溶出したファージを含む上清液を、新たなチューブ中にアリ
コートとして分けた。溶出液を、対数増殖期ＸＬ１ＢＬＵＥ細胞の感染前に、１
Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５中で中和した。感染後、アリコートを採取し、溶出し
たファージの力価を測定した。次いでこれらのプレーティングからランダムクロ
ーンを増幅し、パニングの各回における挿入頻度およびＤＮＡ配列を決定した。
ラマＶHH配列は、初めのライブラリーから、およびランダムクローンからのパニ
ングの各回の後に決定した。
【０１２４】 （８．１．３．ファージディスプレイベクター） ファージディスプレイベクターを構築し、それは、バクテリオファージＭ１３
コートタンパク質ＩＩＩの短縮型バージョンに結合したヒト抗原に特異的なラマ
免疫グロブリンＶHHドメインをコードするハイブリッド融合タンパク質を生成し
た（図１４）。このファージミドベクターは、ｐＵＣベクター骨格、および遺伝
子ＩＩＩ融合タンパク質の発現およびヘルパーファージとの同時感染後のファー
ジミドのパッケージングのためのいくつかのＭ１３ファージ由来配列を含んでい
た。このベクターを、２つの形態で構築し、それらは、２つのタンパク質ドメイ
ン間の融合が達成された様式が異なった。第１の形態は、２つのドメインの間に
、機能的融合タンパク質の精製および検出のための可能なツールとしてｈｉｓ６
タグを含んでいた。第２の形態は、このタグを欠き、そして２つのカセット間に
１つの（ｇｌｙ4ｓｅｒ）サブユニットのみを含んでいた。このベクターの両方
のバージョンを、ＶHHが、リーダーペプチドドメインと遺伝子ＩＩＩドメインと
の間に挿入されなければ、フレームの外および非機能的な遺伝子ＩＩＩ融合を用
いて構築した。すべてのＶHH分子を、ｏｍｐＡリーダーペプチド（ＥｃｏＲＩ−
ＳａｃＩ）とＳｐｅｌで始まる遺伝子ＩＩＩ融合物との間での挿入のためにＳａ
ｃＩ−ＢａｍＨＩ末端でＰＣＲ増幅した。一旦ヒト抗原または細胞に対して結合
活性を有するＶHHカセットが検出および単離されたなら、このＳａｃＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントは、適合性部位を有する哺乳動物発現ベクターに直接移入され
得る。この哺乳動物ベクターは、ヒト、ラマ、またはマウスのＩｇ融合タンパク
質を発現するために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩリーダーペプチドおよびＢａｍ
ＨＩ−ＸｂａＩ免疫グロブリンドメインを含んでいた。この改変ベクターは、機
能的分析をよりし易い系中への、推定の抗原に結合するＶHHの迅速な往復を可能
にした。
【０１２５】 個々のファージクローンを、標的抗原との３〜５回のパニングの後単離した。
パニングの各回からの溶出液を、宿主細菌中に感染させ、そしてアリコートを、
単離されたコロニーのために、ＬＢ／ａｍｐ／ｔｅｔプレートにプレートした。
個々のクローンを、２×ＹＴ／ａｍｐ／ｔｅｔ液体培地中に数時間接種し、ヘル
パーファージを感染させ、そして選択的条件下一晩３０#Ｃで増殖させた。次い
でファージ上清液を、遠心分離により細胞をペレット化することにより調製し、
そして培養上清液を新たなチューブにアリコートとして分けた。沈殿した、濃縮
ファージ（１００×）を、培養上清液のＰＥＧ沈殿およびＰＢＳ／１％ＢＳＡ中
の再懸濁により調製した。
【０１２６】 実験に用いたファージ上清液、沈殿物、またはヘルパーファージを、氷上で３
０分間、１０％脱脂乳／ＰＢＳを用いて１：１でプレブロックした。ヒトＰＢＬ
または単球を計数し、そして５％脱脂乳／ＰＢＳ中に再懸濁し、そして氷上で３
０分間プレブロックした。その後、細胞をペレット化し、そして５％脱脂乳／Ｐ
ＢＳ中に再懸濁し、サンプルあたり２５μｌ中のプレブロックしたファージに添
加し、そして氷上で１時間インキュベートした。結合の後、細胞を、５％乳／Ｐ
ＢＳおよび１％ＢＳＡ／ＰＢＳで交互に３回洗浄した。染色培地（２％ＦＢＳ／
ＲＰＭＩ＋０．１％アジ化ナトリウム）中１０μｇ／ｍｌのマウス抗Ｍ１３抗体
を、サンプルあたり１００μｌづつ細胞に添加し、そして氷上で１時間インキュ
ベートした。細胞を上記のように３回洗浄した。染色培地中のＦＩＴＣ結合体化
ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ（γおよび軽、ＡＭＩ４４０８ ＢｉｏＳｏｕ
ｒｃｅ Ｉｎｔ．）１：１００を、サンプルあたり１００μｌづつ細胞に添加し
、そして氷上で３０分間インキュベートした。次いで、染色したサンプルを洗浄
し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１２７】 （８．１．４．ＤＮＡフラグメントの配列決定） サブクローン化したＤＮＡフラグメントを、９６#Ｃ１０秒間の変性プロフィ
ール、５０#Ｃで３０秒間のアニーリング、および７２#Ｃで４分間の伸長を用い
るプログラムの２５サイクルを用いてＰＥ２４００サーモサイクラー上のサイク
ル配列決定にかけた。用いた配列決定プライマーは、Ｔ７プロモータープライマ
ー５’ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡ３’（
配列番号５３）およびＭ１３逆方向配列決定プライマー５’ＡＡＣ ＡＧＣ Ｔ
ＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ Ｇ３’（配列番号５４）（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ）であった。
反応を、製造業者の指示書に従って、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｒｅａｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｉｘ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて実施した。サンプルを
エタノール沈殿し、変性し、そしてＡＢＩ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でキャピラリー電
気泳動により分析した。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ３．０（Ｇｅｎｅｃｏｄｅ
ｓ）を用いて編集および翻訳した。
【０１２８】 （８．２．結果） ラマを、上記の第７．１．１．節に記載のように、リンパ球表面抗原に対する
抗体応答の生成のためにヒトリンパ球または融合タンパク質で免疫した。免疫後
、ラマＰＢＬを調製し、そしてＶHH含有ＤＮＡフラグメントを、ＶHHライブラリ
ーの構築のためにＲＴ／ＰＣＲにより得た。
【０１２９】 ファージディスプレイベクターを、ヒトリンパ球で免疫したラマから細胞結合
性ＶHH配列のクローニングのために構築した（図１４および以下の第８．１．３
．節）。表Ｉは、いくつかの単離されたファージクローンを示し、それらの各々
は、異なるヒト細胞型への特徴的な結合のパターンを示した。次の配列分析は、
各クローンが特有のＶHHをコードしていたことを確認した。さらに、２つのＶHH クローン、Ｌ１０およびＬ１１を単離し、それらは、ＣＨＯ細胞上で発現された
１５０〜２００ＫＤａの高分子量糖タンパク質抗原と反応した（図１５）。これ
らのクローンの標的抗原への結合は、ＣＨＯ細胞をトリプシンで前処理したとき
、完全になくなった。ＶHH結合は、ノイラミニダーゼまたはその他のエンドグリ
コシダーゼを用いた細胞の処理後は部分的に減少したに過ぎなかった。従って、
このＶHHクローンは、ＣＨＯ細胞の表面上に発現した糖タンパク質と反応した。
【０１３０】
【表１】 多くのラマＶHHＤＮＡクローンを単離し、配列決定し、そして翻訳した。ファ
ージクローンが、抗原または抗原発現細胞を含むデッシュ上の数回のパニングに
より選択されたとき、クローンの配列多様性は、５回のパニング後に減少した。
ＶHHの得られるタンパク質配列を、Ｌ．ｌｌａｍａからのこのファミリーの抗体
可変領域中に存在する配列モチーフを同定するためにアラインした。配列アライ
ンメントは、Ｌ．ｌｌａｍａ中のＶHH配列の２つのサブクラスを示し、これらは
、本明細書ではハイブリッドＶHH配列（配列番号１〜９）および完全ＶHH配列（
配列番号１０〜１５）と呼ぶ。いずれのサブクラスも従来の重鎖のＣＨ１ドメイ
ンを含まず、従って両者は、抗体のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに直接融合
したＶHHドメインとして発現される。大部分の抗体可変領域中に存在する超可変
ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、両方の型のＶHH分子に見られる
（図１６Ａおよび１６Ｂ）。Ｌ．ｌｌａｍａ ＶHHドメイン中のＣＤＲ３配列は
、重鎖および軽鎖から構成される従来の抗体の大部分のＣＤＲ３ドメインよりも
平均的に長く、図１６Ｂ中に示される最長のＣＤＲ３は、２６アミノ酸残基を含
む。ラクダにおけるＣＤＲ３ドメインおよびＣＤＲ２ドメイン（またはたまにＣ
ＤＲ１ドメイン）は、通常、２つのＣＤＲドメイン間のジスルフィド結合の形成
に関与すると仮定されたシステイン残基を含んでいることが以前に報告されてい
た（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．７：１１２
９−１１３５）。この残基は、完全ＶHHとして分類された分子のＣＤＲ中に存在
するが（図１６Ｂ）、ハイブリッドサブクラスの配列は、ＣＤＲ１ドイメン、Ｃ
ＤＲ２ドメイン、またはＣＤＲ３ドメイン中にもシステインを含まない（図１６
Ａ）。従って、Ｌ．ｌｌａｍａからのこのクラスのＶHH分子は特有であり、そし
てヒトコブラクダ種から区別される。このサブクラスに由来するＣＤＲは、安定
性に優れ得る。なぜなら、それらは、それらの間にジスルフィド結合なしで独立
に機能するからである。
【０１３１】 先に述べた配列情報に基づき、残基１１、３７、４４、４５、および４７を含
む、可変領域中のいくつかのアミノ酸残基を、ＶL−ＶH界面の形成において重要
であるとして同定した（表ＩＩ）。４つの位置におけるアミノ酸残基は、ラクダ
抗体において親水性残基であると報告された。これらの残基における変化はまた
、ラマＶHHドメイン中に見出され，そしてそれらは不対ポリペプチドの溶解度を
変更し得る。しかし、残基１１におけるロイシンは、通常、ラクダにおいてセリ
ンで置換されているが、Ｌ．ｌｌａｍａ配列の大部分は、この位置にロイシンを
含む。引き続くクローンは、ラマ配列がたまに、この位置にリジン、セリン、バ
リン、スレオニンまたはグルタミン酸を含んでいたことを示した。
【０１３２】 ラクダの抗体の４４位、４５位および４７位でのアミノ酸は、従来のＶHドメ
イン（それぞれ、４４−Ｇｌｙ、４５−Ｌｅｕおよび４７−Ｔｒｐ）において観
察される通常の疎水性残基に関して、親水性アミノ酸置換を含むことが報告され
ている。ＶHHドメインのハイブリッドサブクラスにおける親水性置換のこの一般
的観察にはいくつかの例外が存在する。ラクダ種およびラマ種のすべてについて
残基４５は、従来のＶHドメインにおいて見出されるＬｅｕ残基に置き換わった
不変的な親水性のＡｒｇ残基を含む唯一の位置である。この位置においてイソロ
イシンを含む特定の稀な配列が観察されている。残基４７（Ｔｒｐ）は、より可
変性であり、Ｌ．ｌｌａｍａの完全ＶHH配列においてＧｌｙまたはＡｒｇをコー
ドするが、ハイブリッドＶHH配列において疎水性の残基ＬｅｕまたはＰｈｅをコ
ードする。後続のクローンがトリプトファン、イソロイシン、セリンまたはアラ
ニンを含むこともまた、見出されている。残基４４（Ｇｌｙ）もまた、より可変
性であり、完全ＶHHサブクラスにおけるＧｌｙがＧｌｕまたはＡｓｐに置換され
ているが、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＧｌｎがハイブリッドグループにおけるこの位
置で生ずる。４４位においてスレオニンを含有するクローンもまた単離されてい
る。
【０１３３】 まとめると、ＶHH配列のハイブリッドサブクラスファミリーは、以下の特徴を
有する： １．これらの可変領域ポリペプチドは、軽鎖のない抗体に由来し、これは、Ｃ
Ｈ１ドメインを含まない。
【０１３４】 ２．これらは、ＣＤＲ間のジスルフィド結合を含まない。
【０１３５】 ３．１１位でのアミノ酸残基は通常、セリンの代わりにロイシンである。
【０１３６】
【表２】 （９．実施例：ラマ免疫グロブリン定常領域コード配列のクローニング） （９．１．ラマ血清アッセイ） ラマＩｇＧ融合タンパク質として発現された抗原に対する血清反応性を試験す
るために、抗原−ラマＩｇＧ融合タンパク質を「ＤＹＮＡＬ」ビーズと結合体化
させ、そして免疫したラマからの血清サンプルとともにインキュベートした。次
いで、抗原−ビーズ複合体を、溶液から遠心沈降させ、洗浄し、そして氷上で０
．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．３でインキュベートして、血清インキュベーションの
間に結合した任意の抗原反応性タンパク質を取り出した。抗原−ビーズ複合体を
、再び、溶液から遠心沈降させ、そして上清を半容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ９．５中で中和した。等容量の２−メルカプトエタノール含有ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅサンプル緩衝液を還元剤として、中和したタンパク質に添加し、そして１００
℃で５分間加熱した。次いで、このサンプルを、１０％ Ｔｒｉｓ−グリシンポ
リアクリルアミドゲルで流し、そしてニトロセルロースフィルターに転写した。
このフィルターを、ＰＢＳ＋５％脱脂乾燥乳＋０．０１％ ＮＰ４０中でブロッ
クし、次いでブロッキング緩衝液＋１：５０００希釈のヤギ抗ラクダ科動物Ｉｇ
Ｇ−ＨＲＰ結合体中でインキュベートした。次いで、このフィルターを、ＰＢＳ
＋０．０１％ ＮＰ４０中で洗浄し、そしてＥＣＬ試薬中でインキュベートした
。タンパク質を、オートラジオグラフィーで可視化した。
【０１３７】 （９．２．結果） ラマの定常領域をコードする配列を、一連のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いてクローニングした。ラマＰＢＬ由来のＲＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡを
ランダムプライマーまたはオリゴｄＴを用いて調製した。次いで、抗体重鎖の定
常ドメインを増幅するように設計した特異的プライマーを使用して、異なるラマ
アイソタイプをＰＣＲした。
【０１３８】 ラマ重鎖遺伝子から取得した、クローニングした定常領域配列のアラインメン
トを図１７に示す。ヒンジ領域からＣＨ３ドメインまでの配列のみを比較した。
なぜなら、ＩｇＧ2およびＩｇＧ3はＣＨ１ドメインを欠くからである。ヒンジド
メインは、長さおよび配列において最も変動する。他の配列可変性は、その分子
の中に分散するいくつかの残基に限定されている。
【０１３９】 ラマの定常領域をコードする配列を、融合タンパク質の発現のために、種々の
ヒト白血球抗原をコードする配列と連結した。表ＩＩＩは、表面抗原結合活性を
保持していた、ラマ定常領域とヒトリンパ球表面抗原との間の多数の組換え融合
タンパク質を示す。ラマＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびＩｇＧ3の異なるヒンジ領域に
よって、天然に存在する分子がモノマーかダイマーかに依存して、異なる型の融
合タンパク質の設計が可能となる。ラマ定常領域を有する融合タンパク質は、ラ
マを免疫するための免疫原として特に有用である。なぜなら、このタンパク質は
、抗定常領域免疫応答を刺激せず、それによって、その分子の非免疫グロブリン
部分に対する抗体応答を最大化するからである。
【０１４０】 １つの実験において、ラマを、ＰＢＳ中２５０μｇのヒトＣＤ４０／ラマＩｇ
Ｇ1融合タンパク質で、免疫した。免疫前血清を、免疫前に収集した。最初の免
疫後２週間において、血清もまたそのラマから収集し、次いで、第二の免疫を行
った。次いで、血清を再び２週間後に収集した。異なる時点で収集したラマ血清
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合、抗ＣＤ４０ ＩｇＧ1応答は、最初の免
疫の後に観察された。この第二の免疫後に、抗ＣＤ４０活性がＩｇＧ1およびＩ
ｇＧ2の両方の画分において検出された。従って、ＣＤ４０／Ｉｇ融合タンパク
質は、ラマにおいて強力な免疫原であり；そして免疫の経過の間、その宿主の血
清反応性を検出するためのツールとして使用され得る。
【０１４１】 （１０．実施例：マウス抗体可変領域のラマ化） （１０．１．材料および方法） （１０．１．１．ラマ化のためのオリゴヌクレオチド） １対の相補的オリゴヌクレオチドを、抗体の可変領域コード配列のほぼ中点に
て設計した。これらアニールされたオリゴヌクレオチドによって形成されたＤＮ
Ａ二重鎖は、出発オリゴヌクレオチドの長さを両端で１８〜２４塩基伸ばした重
複する一本鎖プライマーを用いてＶ領域の残りを構築するための出発点であった
。このＤＮＡは、この段階では非常に短かったことから、このＰＣＲの際のサイ
クル回数を非常に短いままにし（最初の６回の反応について１０秒のアニーリン
グおよび２０秒の伸長時間、および残りの反応セットについて３０秒の伸長へと
増大させた）、そして重複するプライマーのモル量もまた、低いままに維持した
。各々のプライマー対のストック溶液を１μＭ〜３２μＭの範囲の濃度で調製し
た。次いで、これらのストックを、ＰＣＲ混合物に１：２０に希釈し、そしてこ
れを、各々連続的な１０サイクルの工程について存在する反応物に添加した。各
々の連続的な増幅工程を用いて、新たに加えたプライマーのモル濃度を増加させ
、そしてサイクル回数を、若干より長い伸長について調整した。このようにして
、所望のコード配列のデノボ構築を二方向で進行させ、そしてクローニングを容
易にするためにＤＮＡの各末端に独特な制限部位を添加した最終のＰＣＲによっ
て終結させた。
【０１４２】
【表３】 マウス抗体９．３へこの方法を適用すると、９．３ＶH分子を、ＴＥ中に最終
濃度６４μＭですべてのプライマーを希釈することによって再合成した。次いで
、プライマーセットを、出発対と等モル量で相補的プライマー対を一緒に混合す
ることによって調製した。他の全てのプライマーを、５’および３’の両方の方
向において以前のセットと重複するような対の方法でのセットで組み合わせた。
次いで、これらのプライマー対を、プライマーの最終濃度がＴＥ中で１μＭ〜３
２μＭの範囲になるように希釈した。最初のＰＣＲサイクリングのための反応物
を、以下のように調製した：１２ｎｇのプライマー対Ｈ３１−４７（配列番号２
８）およびＨＡＳ４７−３１（配列番号３１）を、最終濃度が０．６ｎｇ／μｌ
となるようにこの反応混合物に添加して、次いで、プライマーＨ２２−３６（配
列番号２７）およびＨ５４−４０（配列番号３４）を含有するプライマー対２（
最終濃度は５０ｎＭであった）の１μＭストックを１μｌ、ならびにＥｘＴａｑ
（日本国滋賀県、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）希釈緩衝液、ｄＮＴ
Ｐ、蒸留水およびＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）を含むＰＣＲ混
合物１７μｌを、製造者の指示に従って、添加した。この反応物を、９４℃での
変性を３０秒間、５５℃でのアニーリングを１０秒間、および７２℃での伸長を
２０秒間として１０サイクルにわたりインキュベートした。あるいは、ＶHのラ
マ化について、使用した第一のプライマー対は、（ＬＶ１およびＬ１ＨＡＳ）（
配列番号２９および３２）または（ＬＶ２およびＬ２ＨＡＳ）（配列番号３０お
よび３３）であり、そしてプライマー対Ｈ２２−３６（配列番号２７）およびＬ
１Ｈ５４−４０（配列番号３５）（または、Ｌ２Ｈ５４−４０；配列番号３６）
の１μｌの１μＭストックを第一の反応物に添加した。第二の１０サイクル反応
を、１９μｌ ＰＣＲ混合物ならびに１μｌのプライマー対Ｈ２２−３６（配列
番号２７）およびＨ６２−４９（配列番号３７）（２μＭストック）の添加後、
同一のサイクル条件下で進行させた。第三の１０サイクルＰＣＲを、１９μｌの
ＰＣＲ混合物ならびに１μｌのプライマー対Ｈ１３−２７（配列番号２６）およ
びＨ７０−５７（配列番号３８）（４μＭストック）を添加した後に行った。第
４回のＰＣＲを、同一の条件ならびに１μｌプライマー対Ｈ４−１８（配列番号
２５）およびＨ７８−６５（配列番号３９）（８μＭストック）を用いて行った
。第５回のＰＣＲは、１９μｌのＰＣＲ混合物ならびに１μｌのプライマー対Ｈ
ＲＳ１−１０（配列番号２４）およびＨ８４−７３（配列番号４０）（１６μＭ
ストック）を添加した後、同一の条件を利用した。２０サイクルの反応を、１μ
ｌのプライマー対ＨＲＳ１−１０およびＨ９２−８１（配列番号４１）（３２μ
Ｍストック）を添加した後に同一の条件下で行った。８μｌのこのＰＣＲを、ア
ガロースゲル電気泳動に供して、増幅についてチェックした。このＰＣＲの残り
を、ＰＣＲ ｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の指示に従って用いて
精製し、そして５０μｌ ＴＥ中に溶出した。
【０１４３】 次いで、新たなＰＣＲを設定し、プライマー濃度および伸長時間の増加につい
て一連の全体の反応セットを開始した。１８μｌのＰＣＲ混合物に、１μｌのＰ
ＣＲ産物溶出液、ならびに１μｌのプライマー対ＨＲＳ１−１０およびＨ１００
−８７（配列番号４２）（１μＭ）を添加した。反応物を、１分間９４℃で変性
し、続いて３０秒の９４℃での変性工程、１０秒間の５５℃でのアニーリング工
程、および２５秒間の７２℃での伸長工程を用いる新たな１０サイクルプログラ
ムを行った。次のＰＣＲを、１９μｌ ＰＣＲ混合物ならびに１μｌのプライマ
ー対ＨＲＳ１−１０およびＨ１０４−９５（配列番号４３）（２μＭ）を用いる
ことを除いて同一の条件下で行った。第三回のＰＣＲを、７２℃での伸長時間を
３０秒に増大させ、１９μｌのＰＣＲ混合物ならびに１μｌのプライマー対ＨＲ
Ｓ１−１０およびＨ１１１−１００（配列番号４４）（４μＭ）を添加すること
を除いて他は同一の１０サイクルプログラムを用いて行った。第４回のＰＣＲを
、１９μｌのＰＣＲ混合物ならびに１μｌプライマー対ＨＲＳ１−１０およびＨ
３ＲＳ−１０４（配列番号４６）（８μＭ）を添加した後に行った。ラマ化のた
めに使用したプライマー対は、ＨＲＳ１−１０および９３ＶＨ３’−ＢＡＭ（配
列番号４５）（８μＭ）であった。８０μｌのＰＣＲ反応物をＰＣＲ−Ｑｕｉｃ
ｋで精製し、そして３０μｌのＴＥ中に溶出した。最終のＰＣＲ反応物を、０．
５μｌのＰＣＲ溶出液、５μｌ １０×ＥｘＴａｑ緩衝液、４μｌ ２．５μＭ
ｄＮＴＰ、４０μｌ ｄＨ２Ｏ、１μｌプライマー対ＨＲＳ１−１０およびＨ
３ＲＳ−１０４（または９３ＶＨ３−ＢＡＭ）を用いて設定した。反応条件には
、６０秒間の９４℃での変性工程、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１０秒間
のアニーリング、および７２℃で４０秒間の伸長を伴う３０サイクルプログラム
、次いで７２℃で２分間の最終伸長工程、ならびに回収するまでの４℃での保持
が含まれた。リーダーペプチドを、テンプレートとしてサブクローニングした上
記のＰＣＲ産物を用いた２つのＰＣＲサイクルを反復することによって最終的に
付加した。プライマー対ＯＫＴ３／９．３ＨＹＢ（配列番号２３）および９３Ｖ
Ｈ３−ＢＡＭ（またはＨ３ＲＳ−１０４）を、７２℃での３０秒間の伸長時間を
含む最初の１０サイクルの反応に含ませた。第二の１０サイクルＰＣＲを、プラ
イマー対ＯＫＴ３ＶＨＬＰ−Ｓ（配列番号２２）および９３ＶＨ３−ＢＡＭ（ま
たはＨ３ＲＳ−１０４）を、より長い伸長時間を用いたことを除いては最初のＰ
ＣＲについて記載したものと同様な反応条件下で添加することによって実施した
。最後に、３０サイクルのＰＣＲを、ＰＣＲ−ｑｕｉｃｋ精製した産物をテンプ
レートとして、そして最後のプライマー対ＯＫＴ３ＶＨＬＰ−Ｓおよび９３ＶＨ
３−ＢＡＭ（またはＨ３ＲＳ−１０４）をプライマーとして実施して、ＯＫＴ３
ＶH由来のリーダーペプチドが付着した新しいＶHを生成した。
【０１４４】 （１０．１．２．ラマ化抗体の産生およびＦＡＣＳ分析） ラマ化９．３ＶH分子ＬＶ１およびＬＶ２を、９．３ＶHの再誘導化について記
載したように、成熟ＶHにおいて残基３７、４４、４５および４７での配列にお
いて改変を伴うオリゴ対を用いて構築した（図１８）。これらのＰＣＲ産物を、
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そしてｐＸＤ発現ベクターに
サブクローニングした。このベクターはまた、ラマＩｇＧ2定常領域をコードす
るＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ融合タンパク質カセットを含んでいた。類似の構築物も
また、ラマＩｇＧ1およびＩｇＧ3定常ドメインを用いて作製した。次いで、この
融合タンパク質発現カセットを、無血清培地中のＣＯＳ細胞に一過的にトランス
フェクトし、そしてその上清を４８時間後に採取した。培養上清を、ＡＭＩＣＯ
Ｎ濾過ユニットを用いて１０倍に濃縮し、そして１００μｌを１０6Ｊｕｒｋａ
ｔ Ｔ細胞とともに２時間氷上でインキュベートした。細胞を、１３００ｒｐｍ
で５分間スピンし、上清を吸引し、そして１：４０ ＦＩＴＣ抗ラマ（Ｋｅｎｔ
Ｌａｂｓ）またはＦＩＴＣ−抗マウス試薬（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ）を含有する１００μｌ染色緩衝液（ＰＢＳ，２％ＦＢＳ）中
に、氷上で１時間再懸濁した。細胞を、１３００ｒｐｍで５分間再びスピンし、
上清を吸引し、そして２００μｌ染色緩衝液中で洗浄した。最終の細胞ペレット
を４００μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳＣＡＮ細胞分別機を用
いて分析した。
【０１４５】 （１０．２．結果） ラマＶHHドメインの観察された特徴にもとづいて、非ラマ抗体重鎖を、本明細
書中でラマ化と呼ぶプロセスにおいて軽鎖との対合を必要としないものへと変換
させる方法を開発した。単離されたｍＡｂからのＶH配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ
ＤＮＡ配列データベースから利用可能な配列データを用いて決定または同定した
。これらの配列を使用して、ＶHドメインの短いペプチドをコードする、短い、
重複するオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの適切な
組合せを用いてＶHドメインのデノボ合成を可能にする、随伴するＰＣＲサイク
ル方法を開発した。配列変化は、ラマＶHH構造的安定性において重要であると同
定される残基（１１、３７、４４、４５および４７）にわたるオリゴヌクレオチ
ドへと取り込まれた（表ＩＩ）。このことについて、任意の抗体の１１位を、Ｓ
、Ｋ、Ｖ、ＴまたはＥへと変化させ得；３７位を、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩ
へと変化させ得；４４位を、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、ＡまたはＬへと変化させ
得；４５位を、Ｒ，ＬまたはＩへと変化させ得；そして４７位を、Ｆ、Ｇ、Ｓ、
Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｙ、ＭまたはＷへと変化させ得る。
【０１４６】 ラマ化ＶHドメインを、配列分析のために、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＸｂａＩフラグ
メントとして、ｐＵＣ１９へとサブクローニングした。一旦配列変化が確認され
ると、そのカセットを、発現研究のために、リーダーペプチドおよびＩｇ融合ド
メインをコードする哺乳動物発現ベクターへと移した。次いで、一過性トランス
フェクション実験からの培養上清を、可溶性Ｉｇ融合タンパク質の発現および抗
原結合能力についてスクリーニングした。
【０１４７】 上記の方法を、図１８に示す重複するオリゴヌクレオチドを用いて抗ＣＤ２８
抗体９．３へと適用した。相補的オリゴヌクレオチドの対を、抗体Ｖ領域コード
配列のほぼ中点にて設計した。これらアニーリングしたオリゴヌクレオチドによ
って形成されたＤＮＡ二重鎖は、出発オリゴヌクレオチドの長さを両方の末端で
２４塩基伸ばした重複する一本鎖プライマーを用いて、Ｖ領域の残りを構築する
ための出発点であった。このＤＮＡは、この段階では非常に短いことから、この
ＰＣＲの間のサイクル時間を、非常に短く保ち、そして重複するプライマーのモ
ル量もまた、低く抑えた。各連続的増幅工程を用いて、新たに添加したプライマ
ーのモル濃度を増加させ、そしてサイクル時間を若干より長い伸長へと調整した
。このようにして、所望のＤＮＡ配列のデノボ構築を二方向で進行させ、そして
クローニングを容易にするためそのＤＮＡの各末端に独特の制限部位を付加した
最後のＰＣＲによって終結させた。
【０１４８】 図１９は、第二工程のＦＩＴＣ結合体化した抗ラマ抗体単独と比較して、９．
３抗体培養上清（１０×）のラマ化バージョン２で染色したＪｕｒｋａｔ細胞に
ついてヒストグラム表示を示す。この結果は、ラマ化マウス抗ＣＤ２８抗体が、
重鎖のみの抗体として細胞上の標的抗原と結合し得たことを実証する。
【０１４９】 （１１．実施例：標的抗原に結合した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に由
来するＣＤＲペプチド） この節は、ＣＤ３δ、εまたはγサブユニットの細胞外ドメインを含む可溶性
組換え融合タンパク質の生成を記載する。ＣＤ３εと、ＣＤ３γまたはＣＤ３δ
のいずれかとの同時発現によって、ネイティブなコンホメーションエピトープに
対してのみ結合したものを含む、多数の抗ＣＤ３ ｍＡｂと高い親和性で相互作
用する融合タンパク質を生じる。従って、これは、ネイティブなＣＤ３ε／δま
たはＣＤ３ε／γヘテロダイマー形成を産生するための方法を表す。この系は、
ＣＤ３へテロダイマー形成に必要な条件を規定するのに適切であり、ＣＤ３へテ
ロダイマーについての潜在的リガンドを同定するためのツールを提供し、ＣＤ３
複合体とＴ細胞上のＴＣＲとの間の相互作用を潜在的に妨害し得る分子について
スクリーニングする。
【０１５０】 （１１．１．材料および方法） （１１．１．１．ペプチド合成） 抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２９８ ｍＡｂのＣＤＲ３領域全体に対応する
ペプチドを合成し、そしてＴｙｒ／Ｐｈｅ−システイン残基をアミノ末端および
カルボキシル末端の両方に付加した。ペプチドの改変を、ＣＤＲ３領域の１つの
アミノ酸を末端から同時に除去することによって行った。ペプチド合成を、固相
上で、Ｆｍｏｃ化学（ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびＴＦＡ切断）を用いるこ
とによって実施した。粗ペプチドを、３〜５ペプチドのバッチと合わせ、そして
ｐＨ８．５で空気酸化することによって環化した。粗環状ペプチドを、逆相ＨＰ
ＬＣで精製し、凍結乾燥し、そして分析的ＨＰＬＣおよび質量分析法によって特
徴付けた。
【０１５１】 （１１．１．２．ＢＩＡＣＯＲＥ） ＢＩＡＣＯＲＥは、金属／液体の界面で表面プラズモン波を励起する場合に生
じる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する。光を、分析物（溶液中）とリ
ガンド（固定化された）との間の二分子の相互作用に向け、そしてこれに起因し
て反射させる。ＣＤ３εδｈｕＩｇ、ＣＤ３εεｈｕＩｇおよびＣＤ２８ｈｕＩ
ｇを、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して、カルボキシメチルデキストランチップ上
に共有結合的に固定化し、次いでエタノールアミンでブロックした。ペプチドを
、ＨＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１％ＤＭＳＯを含むかまたは含まない）に溶解し
、そしてこれらの融合タンパク質固定化表面を通過させた。非特異的結合を、Ｅ
ＤＣ／ＨＮＳ単独、続いてエタノールアミンを固定化することによって調製され
たコントロールの表面にこれらのペプチドを通過させることによって差し引いた
。
【０１５２】 （１１．１．３．ＣＤ３ダイマーの構築） ＣＤ３ε−Ｉｇ融合構築物（ｐｈＣＤ３ε−Ｉｇ）を産生するために、ネイテ
ィブな開始コドンおよびリーダー配列を含むＣＤ３εの細胞外ドメインをコード
するｃＤＮＡを、以下のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにより、抗ＣＤ
３および抗ＣＤ２８活性化Ｔ細胞の総ＲＮＡから増幅した（７２時間）：正方向
プライマー、５’ＧＣＧ［ＣＴＣ ＧＡＧ］ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＧ
ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＧＧ（配列番号５５）および逆方向プライ
マー５’ＧＧＣ Ｃ［ＧＧ ＡＴＣ Ｃ］ＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＡ
Ｔ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＣＡ（配列番号５６）。括弧内のヌクレオチド
は、クローニングのために設計されたＸｈｏＩ（ＣＴＣ ＧＡＧ）部位およびＢ
ａｍＨＩ（ＧＧＡ ＴＣＣ）部位である。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＢａｍＨ
Ｉを用いて消化した。切断されたフラグメントを精製した。ヒトＩｇＧ1ヒンジ
−ＣＨ２−ＣＨ３をコードするゲノムフラグメントを保有するＣＤＭ８発現ベク
ターを、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断した。切断されたベクターおよ
びＰＣＲ産物のライゲーションは、ＩｇＧ1ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードす
るゲノムフラグメントの前およびこれとインフレームに、ＣＤ３ε細胞外ドメイ
ンをコードするｃＤＮＡを配置した。このベクターにおけるＣＭＶプロモーター
は、哺乳動物細胞におけるＣＤ３−Ｉｇ融合タンパク質の発現を制御した。
【０１５３】 ヒトＩｇＧ1ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードするｃＤＮＡフラグメントを、
ゲノムフラグメントの代わりにＣＤ３δ−（ｐｈＣＤ３δ０Ｉｇ）およびＣＤ３
γ−Ｉｇ（ｐｈＣＤ３γ−Ｉｇ）構築物に対する融合パートナーとして使用した
。このフラグメントを、ｐＤ１８発現ベクター（タンパク質発現のためにＣＭＶ
プロモーターもまた含む）のＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位にクローニング
した。ネイティブな開始コドンおよびリーダー配列を含むＣＤ３δおよびＣＤ３
γの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡのフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲによ
って上記の同じ総ＲＮＡから単離した。以下のプライマーを用いた： ＣＤ３δ正方向、５’ＧＣＧ ＡＴＡ［ＡＡＧ ＣＴＴ］ＧＣＣ ＡＣＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＡＧＣ ＡＣＧ ＴＴＴ ＣＴＣ（配列番号５７）、 ＣＤ３δ逆方向、５’ＧＣＧ［ＧＧＡ ＴＣＣ］ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ Ｃ
ＡＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＴＧ（配列番号５８）、 ＣＤ３γ正方向、５’ＧＣＧ ＡＴＡ［ＡＡＧ ＣＴＴ］ＧＣＣ ＡＣＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ（配列番号５９）、 ＣＤ３γ逆方向、５’ＧＣＧ［ＧＧＡ ＴＣＣ］ＡＴＴ ＴＡＧ ＴＴＣ Ａ
ＡＴ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＡＧＡ Ｃ（配列番号６０）。 括弧内のヌクレオチドは、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧ ＣＴ
Ｔ）部位およびＢａｍＨＩ（ＧＡＡ ＴＴＣ）部位である。ＰＣＲ産物をＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した。次いで、精製された切断ＰＣＲフラグメ
ントを、ｐＤ１８ベクターを含む、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断した
ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３にクローニングした。ＣＤ３δおよびＣＤ３γの細胞外
ドメインをコードするｃＤＮＡは、ＩｇＧ1ヒンジ−ＣＨ２−ＣＤ３をコードす
るｃＤＮＡの前およびこれとインフレームに置かれた。
【０１５４】 ジスルフィド結合を形成し得るＩｇＧ1ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメント
のヒンジ領域における２つのシステイン残基の存在のため、融合タンパク質は通
常ダイマーとして発現された。
【０１５５】 ＣＯＳ−７細胞における一過性発現を使用して、異なるＣＤ３−Ｉｇ融合タン
パク質を生成した。プラスミドｐｈＣＤ３ε−ＩｇおよびｐｈＣＤ３γ−Ｉｇを
、個々にか、またはｐｈＣＤ３ε−Ｉｇ＋ｐｈＣＤ３δ−ＩｇとｐｈＣＤ３ε−
Ｉｇ＋ｐｈＣＤ３γ−Ｉｇとの組み合わせで、ＤＥＡＥデキストラン法によって
ＣＯＳ−７にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、低濃度０
．５％のＦＢＳおよびインスリンを補充した培地において維持した。トランスフ
ェクション後３週間まで、３日間隔で、消費培地を収集した。次いで、消費培地
からプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーによって、融合タンパク質
を精製した。融合タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗ＣＤ３ｍＡ
ｂを使用するＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１５６】 （１１．２．結果） ＣＤ３−Ｉｇ融合タンパク質を、多くの抗ＣＤ３ ｍＡｂ（Ｇ１９−４、ＯＫ
Ｔ３、ＢＣ３、および６４．１を含む）を使用してＥＬＩＳＡによって、特徴付
けた。抗ＣＤ３ ｍＡｂを固定化してＣＤ３−Ｉｇを捕捉した。ヒトＩｇＧヒン
ジ−ＣＤ２−ＣＤ３に対して特異的な抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体
を使用して、ＣＤ３−Ｉｇの抗ＣＤ３ ｍＡｂへの結合を検出した。コントロー
ルＣＤ４−Ｉｇと同様に、ＣＤ３δ−ＩｇのＧ１９−４への結合は、この融合タ
ンパク質が１００μｇ／ｍｌのときでさえ、検出され得なかった（図２０）。Ｃ
Ｄ３ε−ＩｇおよびＣＤ３γ−ＩｇのＧ１９−４への結合は検出されたが、１０
０μｇ／ｍｌの高い濃度でさえ、飽和に達しなかった。一方、ＣＤ３εδ−Ｉｇ
およびＣＤ３εγ−Ｉｇのヘテロダイマーは、非常により高い親和性でＧ１９−
４と結合した（図２０）。このアッセイにおいて、ＣＤ３εδ−ＩｇおよびＣＤ
３εγ−Ｉｇは、それぞれ４μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌで飽和した。同様
に、ＯＫＴ３、ＢＣ３、および６４．１抗ＣＤ３ ｍＡｂはまた、ＣＤ３εγ−
Ｉｇよりもずっと良好にＣＤ３εδ−Ｉｇヘテロダイマーと結合することを示し
た。これらのデータは、ＣＯＳ細胞におけるＣＤ３εγ−ＩｇとＣＤ３δ−Ｉｇ
とか、またはある程度はＣＤ３εγ−ＩｇとＣＤ３γ−Ｉｇとのいずれかの同時
発現は、折り畳まれて、抗ＣＤ３ ｍＡｂによって規定されるようなそれらのネ
イティブなコンホメーションをとる、ヘテロダイマーのＣＤ３−Ｉｇ融合タンパ
ク質を生じたことを示す。さらに、異なる抗ＣＤ３抗体に対するＣＤ３−Ｉｇ融
合タンパク質の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定し、そしてその結果
を表ＩＶに示す。このように、ＣＤ３εδおよびＣＤ３εγのヘテロダイマーは
、抗体コート化プレートまたは抗体コート化ビーズにおける抗ＣＤ３抗体活性の
検出において、ならびにＣＤ３に特異的に結合する低分子またはぺプチドのスク
リーニングにおいて、使用され得る。
【０１５７】
【表４】 抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ ｍＡｂのＣＤＲ３領域を決定し、そして
この領域に対応するペプチドを合成した。システイン残基を、そのペプチドの両
末端に付加し、次に芳香族性残基のチロシンまたはトリプトファンを付加した（
Ｇｒｅｅｎｅ、ＷＯ９５／３４３１２）。大気酸化で、システイン間でのジスル
フィド架橋の形成に起因して、このぺプチドは環化された。結果として、芳香族
性残基は、環化ＣＤＲペプチドの環外部分に位置した。
【０１５８】 Ｉｇ融合タンパク質の形態の標的抗原に対する種々のペプチドの結合親和性を
ＢＩＡＣＯＲＥによって測定した。表Ｖは、多くのペプチドがＣＤ３εδ−Ｉｇ
に対して高い結合親和性を提示し、一方、いくつかのペプチドはＣＤ２８−Ｉｇ
に対して結合親和性を提示したことを示す。従って、小さなＣＤＲぺプチドは、
抗体の代わりにリンパ球の活性化において使用され得る。
【０１５９】
【表５】 本発明は、本発明の一つの局面の例証として意図される例示された実施態様に
よって範囲を限定されるべきではなく、そして機能的に等価である任意の配列が
、本発明の範囲内である。実際、本明細書中で示されそして記載される改変に加
え、本発明の種々の改変が、上記の記載および添付の図面より当業者に明白とな
る。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図さ
れる。
【０１６０】 本明細書中に引用された全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 細胞表面抗体に結合するラマＶHHポリペプチドの単離の模式的説明。
【図２】 ３つのＴ細胞表面抗原に特異的な、免疫したｍＡｂは、ヒト血液Ｔ細胞の増殖
の増強を誘導した。
【図３】 免疫した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４０は、Ｔ細胞の増殖の増強を誘
導した。
【図４】 ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化と比較した、精製されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化のＣＤ
２、ＣＤ３およびＣＤ２８間の相乗作用。
【図５】 図５Ａおよび図５Ｂ。免疫した抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８
抗体でのＴ細胞の刺激は、3Ｈチミジン取り込みの測定値（５Ａ）と直接相関し
た、細胞増殖（５Ｂ）をもたらした。
【図６】 「ＤＹＮＡＬ」ビーズ上に同時に固定化したＣＤ３、ＣＤ２およびＣＤ２８に
対するｍＡｂの相乗効果。
【図７】 図７Ａおよび図７Ｂ。Ｔ細胞増殖に関しての、同時に固定化したｍＡｂと、別
々に固定化したｍＡｂとの比較。ＣＤ３×ＣＤ２８＝同じビーズ上に同時に固定
化した抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ ｍＡｂ。ＣＤ３×ＣＤ２＝同じビー
ズ上に同時に固定化した抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ２ ｍＡｂ。ＣＤ３＋Ｃ
Ｄ２８＝抗ＣＤ３ ｍＡｂまたは抗ＣＤ２８ ｍＡｂでコーティングしたビーズ
の混合物。ＣＤ３＋ＣＤ２＝抗ＣＤ３ ｍＡｂまたは抗ＣＤ２ ｍＡｂでコーテ
ィングしたビーズの混合物。
【図８】 溶液中の抗ＣＤ２または別々のビーズにコーティングされた抗ＣＤ２は、Ｔ細
胞活性化において、同時に固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を阻害した。
【図９】 図９Ａ〜図９Ｆ。Ｖβ ＴＣＲ鎖を発現するＴ細胞の選択的増殖。
【図１０】 図１０Ａ〜図１０Ｆ。ラマＢ細胞は、ＣＤ４０および表面免疫グロブリン（Ｉ
ｇ）を発現し、そして特定のＣＤ４０+細胞は、軽鎖を含まないＩｇを発現する
。ラマの末梢血リンパ球を、染色しなかった（１０Ａ）かまたは以下の抗体で染
色した：抗ＣＤ４０（１０Ｂ）、抗ＣＤ４０および抗軽鎖（１０Ｃ）、抗軽鎖（
１０Ｄ）、抗ＣＤ４０および抗Ｉｇ（１０Ｅ）、ならびに抗Ｉｇ（１０Ｆ）。
【図１１】 ラマＢ細胞は、抗ＣＤ４０抗体およびＣＤ８６（またはＢ７．２）を発現する
、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＰＭＡに応答して増殖した。２つの
異なるラマからの結果を示す。
【図１２】 分画したラマ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１は、ＩｇＧ１ Ｄ（ＤＥ
ＡＥフロースルー）、レーン２は、ＩｇＧ１ Ｇ（ｐＨ２．７で溶出したプロテ
インＧ結合抗体）を含み、レーン３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３（ｐＨ３．５で
溶出したプロテインＧ結合抗体）を含み、そしてレーン４は、ＩｇＧ３（プロテ
インＧフロースルー）を含む。レーン３およびレーン４は、軽鎖を含まない抗体
重鎖を示す。
【図１３】 図１３Ａ〜図１３Ｈ。ラマの重鎖のみの抗体（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）は、
ヒトＴ細胞表面抗原に結合した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＩｇＧ１ Ｇ（１３
Ａ）、ＩｇＧ１ Ｄ（１３Ｃ）、ＩｇＧ２＋ＩｇＧ３（１３Ｅ）、またはＩｇＧ
３（１３Ｇ）で染色し、続いて第２工程抗Ｉｇ試薬で染色した。Ｊｕｒｋａｔ
Ｔ細胞をまた、同じ抗体画分（１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｆ、および１３Ｈ）で染色
し、続いて第２工程抗軽鎖試薬で染色した。
【図１４】 ラクダ科ＶHHファージディスプレーベクター。
【図１５】 ファージクローンＬ１０およびＬ１１は、ＣＨＯ細胞表面上に発現された高分
子量のタンパク質と反応した。
【図１６Ａ】 ＶHHポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。１６Ａは、いくつかの独特
なハイブリッド配列（配列番号１〜９）のアラインメントを示す。
【図１６Ｂ】 ＶHHポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント。１６Ｂは、以前に報告され
たラクダ可変領域に類似する、いくつかの完全配列（配列番号１０〜１５）のア
ラインメントを示す。
【図１７】 ラマ定常領域の配列（配列番号１６〜２１）。
【図１８】 抗体９．３ラマ化についてのオリゴヌクレオチド（配列番号２２〜４６）。重
複するオリゴヌクレオチドを用いて、９．３ ＶH野生型およびラマ化した、バ
ージョン１（ＬＶ１）およびバージョン２（ＬＶ２）を再度合成した。ラマ化し
たオリゴヌクレオチドについての空いたスペースは、野生型と同一であり、従っ
て、改変した残基のみを列挙する。
【図１９】 ラマ化９．３ ＶHでラマ化したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析。
【図２０】 抗ＣＤ３ｍＡｂであるＣ１９−４に対する種々のＣＤ３−Ｉｇ融合タンパク質
の結合活性。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月２２日（２０００．８．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１３Ｈ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハイデン レッドベター， マーサ アメリカ合衆国 ワシントン 98177， ショアライン， リッジフィールド ロー ド エヌ．ダブリュー． 18798 (72)発明者 ブラッディ， ウイリアム エイ． アメリカ合衆国 ワシントン 98201， ボセル， 219ティーエイチ プレイス エス．ダブリュー． 618 (72)発明者 グロスメイア， ローラ エス． アメリカ合衆国 ワシントン 98025， ホバート， ピー．オー．ボックス 252 (72)発明者 ロウ， チェ−リャン アメリカ合衆国 ワシントン 98133， ショアライン， フレモント アベニュー ノース 18834 (72)発明者 デュア， ラジ アメリカ合衆国 ワシントン 98029， イサック， エス．イー． 39ティーエイ チ プレイス 25936 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 CA04 CA11 DA06 GA14 HA11 HA17 4B065 AA26X AA90X AA90Y AA94X AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 BA01 BA02 BA08 BA23 CA17 CA53 CA56 CA59 DA01 DA58 NA05 NA13 NA14 ZB072 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA42 DA50 DA75 EA22 EA54 FA74

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リンパ球を活性化するための方法であって、該リンパ球によ
    り発現される３以上の抗原を凝集させる工程、および該リンパ球を活性化させる
    工程、を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記リンパ球が、Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４を発現する、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記３以上の抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、Ｃ
    Ｄ６、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４３
    、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤｗ１３７、ＣＤＷ１５０、ＣＤ
    １５２、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγ、お
    よびサイトカインレセプターの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記抗原が、単一の多重特異性分子により凝集される、請求
    項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記抗原が、１以上の抗体またはその抗原結合性誘導体によ
    り凝集される、請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記抗体が、重鎖またはその抗原結合性誘導体のみを含む、
    請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記抗原結合性誘導体が、ＶHHである、請求項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 前記抗原が、ペプチドにより凝集される、請求項４に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】 前記ペプチドが、抗体の相補性決定領域に由来する、請求
    項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記抗原が、それらの対応するリガンドにより凝集される
    、請求項４に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記抗体または抗原結合性誘導体が、固体表面上に固定さ
    れる、請求項６に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記抗体または抗原結合性誘導体が、粒子状基体上に結合
    体化される、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記抗体または抗原結合性誘導体が、連続する順序で配置
    される、請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記Ｔ細胞が活性化されて増殖する、請求項２に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 前記Ｔ細胞が活性化されてサイトカインを生成する、請求
    項２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記Ｔ細胞が活性化されて、細胞表面抗原のその発現を変
    更する、請求項２に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記Ｔ細胞が活性化されて、サイトカインのその発現を変
    更する、請求項２に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記Ｔ細胞が活性化されて、アポトーシスを受ける、請求
    項２に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記リンパ球が、Ｂ細胞である、請求項２に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記３以上の抗原が、表面Ｉｇ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、Ｃ
    Ｄ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ
    ８６、Ｂ７．３、およびＩＣＡＭ１の組合せから選択される、請求項２０に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 前記Ｂ細胞が活性化されて増殖する、請求項２０に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記Ｂ細胞が活性化されてアポトーシスを受ける、請求項
    ２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 多重特異性タンパク質であって、リンパ球の表面に発現さ
    れる３以上の抗原に対して特異的な結合部位を含む、多重特異性タンパク質。
  25. 【請求項２５】 Ｔ細胞を活性化する、請求項２４に記載の多重特異性タン
    パク質
  26. 【請求項２６】 Ｔ細胞の活性化を阻害する、請求項２４に記載の多重特異
    性タンパク質。
  27. 【請求項２７】 Ｂ細胞を活性化する、請求項２４に記載の多重特異性タン
    パク質。
  28. 【請求項２８】 Ｂ細胞の活性化を阻害する、請求項２４に記載の多重特異
    性タンパク質。
  29. 【請求項２９】 ＶHHドメインを含む、請求項２４に記載の多重特異性タン
    パク質。
  30. 【請求項３０】 相補性決定領域を含む、請求項２４に記載の多重特異性タ
    ンパク質。
  31. 【請求項３１】 薬学的組成物であって、請求項２４に記載の多重特異性タ
    ンパク質を含む、組成物。
  32. 【請求項３２】 二重特異性タンパク質であって、リンパ球の表面に発現さ
    れる２つの抗原に特異的な結合部位を含み、そして該リンパ球の活性化を阻害す
    る、二重特異性タンパク質。
  33. 【請求項３３】 前記リンパ球が、Ｔ細胞である、請求項３２に記載の二重
    特異性タンパク質。
  34. 【請求項３４】 前記リンパ球が、Ｂ細胞である、請求項３２に記載の二重
    特異性タンパク質。
  35. 【請求項３５】 ＶHH領域を含む、請求項３２に記載の二重特異性タンパク
    質。
  36. 【請求項３６】 相補性決定領域を含む、請求項３２に記載の二重特異性タ
    ンパク質。
  37. 【請求項３７】 薬学的組成物であって、請求項３２に記載の二重特異性タ
    ンパク質を含む、組成物。
  38. 【請求項３８】 単離された重鎖のみの抗体であって、細胞表面抗原または
    その抗原結合誘導体に結合する、抗体。
  39. 【請求項３９】 ＶHHである請求項３８に記載の抗原結合誘導体。
  40. 【請求項４０】 重鎖のみの抗体を発現するＢ細胞を単離するための方法で
    あって、Ｂ細胞を細胞混合物から単離する工程であって、該Ｂ細胞がＣＤ４０を
    発現し、かつ免疫グロブリン軽鎖を発現しない、工程、を包含する、方法。
  41. 【請求項４１】 ｃＤＮＡライブラリーであって、ラマＶHH領域をコードす
    るポリヌクレオチドを含む、ｃＤＮＡライブラリー。
  42. 【請求項４２】 前記ポリヌクレオチドが、重鎖のみの抗体をコードする、
    請求項４１に記載のｃＤＮＡライブラリー。
  43. 【請求項４３】 単離されたポリペプチドであって、配列番号１〜９からな
    る群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  44. 【請求項４４】 図８に示されるとおりの、改変されたファージディスプレ
    イベクター。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載のベクターを用いて、ヒトリンパ球の表
    面抗原に結合するラマＶHHをクローニングおよび発現する方法。
  46. 【請求項４６】 重鎖可変領域をラマ化する方法であって、 （ａ）該重鎖可変領域コード配列のほぼ中点に２つの相補的なオリゴヌクレオ
    チドをアニーリングする工程；および （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって一本鎖プライマーをオーバーラップさせ
    ることにより該アニーリングしたオリゴヌクレオチドを伸長させる工程であって
    ；ここで、該オリゴヌクレオチドが、１１位、３７位、４４位、４５位または４
    ７位に、該重鎖可変領域コード配列には存在しないアミノ酸残基をコードする、
    工程、 を包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 融合タンパク質であって、ＣＨ１のラマ定常ドメイン、ヒ
    ンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの組合せ、および異種非ラマポリペプチド
    を含む、融合タンパク質。
  48. 【請求項４８】 ペプチドであって、配列番号６１〜６３、６９〜７１、７
    ２〜７４、７５および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプ
    チド。
  49. 【請求項４９】 可溶性ヒトＣＤ３ヘテロダイマーポリペプチド。
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