JP2017516496A - ヒツジｂ細胞を用いて抗体を産生するための方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書において、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、ヒツジＢ細胞プールまたは単一寄託ヒツジＢ細胞を培養するための培養系を報告する。

Description

本特許出願は、Ｂ細胞培養分野にある。本明細書において、抗体分泌細胞、例えば活性化Ｂ細胞、形質芽細胞、およびホルボールミリステートアセテートの存在下での、免疫されたヒツジから単離されたＢ細胞の刺激および拡大のための培養系を報告する。

異なる種由来の単離されたＢ細胞、形質芽細胞および形質細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が困難であることが報告されてきている。実際、これは通常、初代Ｂ細胞をハイブリドーマパートナーと融合させることによる不死Ｂ細胞株の生成または不死化によって克服されている。ウサギに関してはまた、形質細胞腫融合パートナーも開発された（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ， Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２ （１９９５） ９３４８−９３５２）が、ハイブリドーマ技術は、ウサギにおいてはうまく働かない。ヒツジに関して、ハイブリドーマ技術もまた記載されてきている（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ， Ｊ．ら， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８ （１９９９） １８３−１９１）が、やはりこれらのハイブリドーマは不安定であり、そして生産性が劣る傾向がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞の生存持続のためには、本質的な活性化刺激および生存因子を提供することが必要である。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０等の多様な化合物が記載されてきている（例えば、Ｚｕｂｌｅｒ， Ｒ．ら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４ （１９８４） ３５７−３６３およびＪ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０ （１９８４） １１７０−１１８３）。

生理学的に、Ｂ細胞は、特定の抗原との遭遇に際して、例えばＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路を通じた（Ｎｅｒｏｎ， Ｓ．ら， Ａｒｃｈ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｅｘｐ． ５９ （２０１１） ２５−４０に概説される）、そして／または例えば樹状細胞による天然背景からまたはＴ細胞の補助に際して得られるサイトカインおよび／または増殖因子を通じたさらなる活性化を加えて、活性化される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用は、ＥＬ４−Ｂ５胸腺腫細胞との共培養、あるいは可溶性または固定化抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０Ｌの添加によって模倣されうる。単一の系は十分な強度を欠き、そして異なるフィーダー混合物（例えばＺｕｂｌｅｒ混合物； ＩＬ−４、ＩＬ−１０等）（Ｚｕｂｌｅｒ， Ｒ．、上記）または胸腺細胞上清（ＴＳＮ）いずれかを用いたさらなる必要な刺激と組み合わせてしか記載されていない。

Ｗｅｉｔｋａｍｐ， Ｊ−Ｈ．ら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２７５ （２００３） ２２３−２３７）は、蛍光ウイルス様粒子で選択した単一抗原特異的Ｂ細胞からの、ロタウイルスに対する組換えヒトモノクローナル抗体の生成を報告する。複数の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に対する複数の単離された抗体を産生する方法は、ＵＳ ２００６／００５１３４８に報告される。抗原特異的Ｂ細胞のクローン集団を得るための培養法は、ＵＳ ２００７／０２６９８６８に報告される。免疫グロブリンライブラリーを調製するための方法は、ＷＯ ２００７／０３１５５０に報告される。

Ｇｒｉｅｂｅｌ， Ｐ．Ｊ．らは、非形質転換ヒツジＢ細胞のクローニングを報告する（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２３７ （２０００） １９−２８）。ＣＤ４０シグナル伝達は、ガンマ鎖共通サイトカインファミリーの複数のメンバーに対するＢ細胞反応性を誘導し、これは、Ｇｒｉｅｂｅｌ， Ｐ．ら（Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１ （１９９９） １１３９−１１４７）により報告される。Ｍｉｙａｓａｋａ， Ｍ．およびＤｕｄｌｅｒ， Ｌ．は、ホルボールミリステートアセテートに対する曝露に際してのヒツジ未成熟Ｂ細胞の分化を報告する（Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７４ （１９８４） ２８１−２８３）．「ヒツジにおけるＢリンパ球分化：Ｉ．回腸パイエル板細胞の表現型分析および回腸パイエル板におけるｓＩｇ＋細胞に関する前駆体集団の立証」が、Ｍｉｙａｓａｋａ， Ｍ．ら（Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５３ （１９８４） ５１５−５２３）によって報告される。Ｓｅｄｇｍｅｎ， Ｂ．Ｊ．らは、末梢血白血球における抗原特異的免疫グロブリン産生の検出のためのヒツジ抗体分泌細胞アッセイの最適化を報告する（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８１ （２００３） ３０５−３１０）。

発明の概要
本明細書において、ヒツジＢ細胞から出発した、ヒツジ抗体の迅速で効率的なそして再現性がある生成のための新規方法であって、少なくとも１つの培養工程を含む前記方法を報告する。

本明細書において、非常に効率的なヒツジＢ細胞刺激および培養系を提供するため、ヒツジＢ細胞の培養に関する添加剤としてホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用をさらに報告する。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ヒツジＴＳＮおよびフィーダー細胞の存在下で／これらとともに、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、ヒツジＢ細胞およびフィーダー細胞を共培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌ヒツジＢ細胞を培養し、そして培養上清から抗体を回収し、それによってヒツジ抗体を産生する工程を含む、ヒツジ抗体を産生するための方法である。

１つの態様において、ヒツジＢ細胞は、未刺激（ｎａｉｖｅ）または未成熟ヒツジＢ細胞である。
１つの態様において、Ｂ細胞はＩｇＧ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋）である。ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーＩｇＧを提示する。

１つの態様において、Ｂ細胞はＩｇＧ陽性およびＣＤ４５Ｒ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋）である。ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーＩｇＧを提示する。

１つの態様において、Ｂ細胞はＩｇＧ陽性およびＣＤ２１陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋）である。ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は、検出および標識可能な細胞表面マーカーＩｇＧを提示する。

本明細書に報告するような１つの側面は、以下の工程：
ａ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌ヒツジＢ細胞のプールまたは単一寄託（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）物を培養し、
ｂ）抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
ｃ）１またはそれより多い発現カセット内に、ｂ）において単離された核酸あるいは軽鎖および／または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
ｄ）細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。

１つの態様において、方法は、以下の工程：
ａ）抗体分泌（成熟）Ｂ細胞の集団（ヒツジ血液から得られるもの）を提供し、
ｂ）少なくとも１つの蛍光色素（１つの態様において、１〜３、または２〜３の蛍光色素）で、Ｂ細胞集団の細胞を染色し、
ｃ）Ｂ細胞染色集団の単一細胞またはＢ細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に寄託し（１つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである）、
ｄ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、寄託された個々のＢ細胞を培養し、
ｅ）個々のＢ細胞またはＢ細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
ｆ）逆転写酵素ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
ｇ）抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
ｈ）細胞において核酸を導入し、
ｉ）細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。

１つの態様において、方法は、以下の工程：
ａ）抗体分泌（成熟）ヒツジＢ細胞集団を提供し、
ｂ）少なくとも１つの蛍光色素（１つの態様において、１〜３、または２〜３の蛍光色素）で、ヒツジＢ細胞集団の細胞を染色し、
ｃ）ヒツジＢ細胞染色集団の単一細胞またはヒツジＢ細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に寄託し（１つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである）、
ｄ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、寄託されたヒツジＢ細胞を培養し、
ｅ）ヒツジＢ細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
ｆ）逆転写酵素ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
ｇ）抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
ｈ）細胞において核酸を導入し、
ｉ）細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む。

１つの態様において、細胞プールは、約１０のＢ細胞から約１，０００，０００のＢ細胞で構成される。１つの態様において、プールは、約５００のＢ細胞から約１００，０００のＢ細胞で構成される。１つの態様において、プールは約５００のＢ細胞を含む。

本明細書に報告するような１つの側面は、抗体分泌ヒツジＢ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、単一寄託ヒツジＢ細胞またはヒツジＢ細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、細胞増殖を改善するためのヒツジＢ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、単一寄託ヒツジＢ細胞またはヒツジＢ細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジＢ細胞の細胞増殖を改善するための方法である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ｓＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋ Ｂ細胞によるＩｇＧ分泌。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ｓＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋ Ｂ細胞によるＩｇＧ分泌。 単一寄託ｓＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋ Ｂ細胞のソーティングおよび培養；最も左の列：全体のＩｇＧ陽性ウェル；中央の列および右の列：全体の割合のうち、特定の生産性を持つものの相対的割合。

本明細書に報告する主題は、ヒツジＢ細胞から出発する、ヒツジ、キメラ（すなわちヒツジ−非ヒツジ種キメラ）、またはヒト化抗体の、迅速で効率的なそして再現性がある生成のためであり、そして少なくとも１つの培養工程を含む、一般的に適用可能な方法を提供する。培地にホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を添加すると、ヒツジＢ細胞の増殖特性が改善可能であり、すなわち、単一寄託細胞または細胞プールとしてのいずれかのヒツジＢ細胞を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の非存在下よりもより迅速に高い細胞密度まで増殖させることも可能である。したがって、短期間に、高いヒツジＢ細胞密度およびそれに対応する培養上清中の高いＩｇＧ濃度を得ることが可能である。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ヒツジＴＳＮおよびフィーダー細胞の存在下で／これらとともに、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、ヒツジＢ細胞およびフィーダー細胞を共培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌ヒツジＢ細胞を培養し、そして培養上清から抗体を回収し、それによってヒツジ抗体を産生する工程を含む、ヒツジ抗体を産生するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、以下の工程：
ａ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌ヒツジＢ細胞のプールまたは単一寄託物を培養し、
ｂ）抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
ｃ）１またはそれより多い発現カセット内に、ｂ）において単離された核酸あるいは軽鎖および／または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
ｄ）細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、抗体分泌ヒツジＢ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、単一寄託ヒツジＢ細胞またはヒツジＢ細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジＢ細胞を培養するための方法である。

本明細書に報告するような１つの側面は、細胞増殖を改善するためのヒツジＢ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用である。
本明細書に報告するような１つの側面は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、単一寄託ヒツジＢ細胞またはヒツジＢ細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジＢ細胞の細胞増殖を改善するための方法である。

本発明を実行するために有用な、当業者に知られる方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．監修， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第Ｉ巻〜ＩＩＩ巻（１９９７）， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載される。

定義
本明細書の目的のための「アクセプター・ヒト・フレームワーク」は、以下に定義するような、ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリン・フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク「由来の」アクセプター・ヒト・フレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことも可能であるし、またはアミノ酸配列変化を含有することも可能である。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は、１０またはそれ未満、９またはそれ未満、８またはそれ未満、７またはそれ未満、６またはそれ未満、５またはそれ未満、４またはそれ未満、３またはそれ未満、あるいは２またはそれ未満である。いくつかの態様において、ＶＬアクセプター・ヒト・フレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリン・フレームワーク配列またはヒト・コンセンサス・フレームワーク配列に配列が同一である。

「アフィニティ成熟」抗体は、こうした改変を所持しない親抗体に比較して、１またはそれより多い超可変領域（ＨＶＲ）における１またはそれより多い改変を含む抗体を指し、こうした改変は、抗原に対する抗体のアフィニティの改善を生じる。

用語「アミノ酸」は、本出願において、カルボキシα−アミノ酸群を示し、直接または前駆体の形で、核酸にコードされることも可能である。個々のアミノ酸は、３つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは３つ組塩基からなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は、少なくとも１つのコドンによってコードされる。異なるコドンによる同じアミノ酸のコードは、「遺伝暗号の縮重」として知られる。用語「アミノ酸」は、本出願において、天然存在カルボキシα−アミノ酸を示し、そしてアラニン（３文字暗号：ａｌａ、１文字暗号：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。

用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、そして限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および望ましい抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む、多様な抗体構造を含む。

「抗体断片」は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体以外の分子を指し、損なわれていない抗体が結合する抗原に結合する、損なわれていない抗体の一部を含む。抗体断片の例には、限定されるわけではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ディアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。

用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

用語「ヒツジ−非ヒツジ種キメラ抗体」は、親ヒツジ抗体の可変ドメイン、および異なる種の抗体由来、例えばヒト抗体、ネズミ抗体、またはウサギ抗体由来の定常領域を含む抗体を示す。用語「ヒツジ−非ヒツジ種キメラ抗体」は、親ヒツジ抗体の可変領域および異なる種の定常領域を含む抗体を示す。

抗体の「クラス」は、重鎖によって所持される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２に分けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

用語「クローン」は、単一Ｂ細胞から生じる／由来する、分裂し、そして抗体を分泌しているＢ細胞の集団を示す。したがって、Ｂ細胞クローンは、モノクローナル抗体を産生する。

用語「発現」は、本明細書において、細胞内で起こる転写および／または翻訳プロセスを指す。細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて、細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルを決定することも可能である。例えば、関心対象の配列から転写されるｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照されたい）。多様な方法によって、例えばＥＬＩＳＡによって、ポリペプチドの生物学的活性に関してアッセイすることによって、あるいはこうした活性とは独立のアッセイ、例えば、ポリペプチドを認識し、そして結合する免疫グロブリンを用いたウェスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイを使用することによって、関心対象の核酸にコードされるポリペプチドを定量化してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照されたい）。

「発現カセット」は、細胞において、少なくとも含有される核酸の発現のため、必要な制御要素、例えばプロモーターおよびポリアデニル化部位を含有する構築物を指す。
遺伝子の発現を一過性または永続的発現のいずれかとして行う。関心対象のポリペプチド（単数または複数）は、一般に、分泌ポリペプチドであり、そしてしたがって、細胞壁を通じた、細胞外培地へのポリペプチドの輸送／分泌に必要である、Ｎ末端伸張（シグナル配列としてもまた知られる）を含有する。一般的に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来してもよい。異種シグナル配列を用いる場合、好ましくは、宿主細胞によって認識され、そしてプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。例えば、酵母における分泌のため、発現させようとする異種遺伝子の天然シグナル配列を、分泌される遺伝子に由来する同種酵母シグナル配列、例えば酵母インベルターゼ・シグナル配列、アルファ因子リーダー（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）α因子リーダーを含む、二番目に記載されるものはＵＳ ５，０１０，１８２に記載される）、酸性ホスファターゼ・シグナル配列、またはＣ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼ・シグナル配列（ＥＰ ０ ３６２ １７９）によって置換してもよい。哺乳動物細胞発現において、関心対象のタンパク質の天然シグナル配列は、満足がいくものであるが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、例えばヒトまたはネズミ起源の免疫グロブリン、ならびにウイルス分泌シグナル配列、例えば単純疱疹糖タンパク質Ｄシグナル配列が適切でありうる。こうしたプレセグメントをコードするＤＮＡ断片を、インフレームで、すなわち機能可能であるように、関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片に連結する。

用語「実験動物」は、非ヒト動物を示す。１つの態様において、実験動物は、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ラマ、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、サメおよび爬虫類より選択される。１つの態様において、実験動物はヒツジである。

用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するよう用いられる。該用語には、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域が含まれる。１つの態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸張する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもまたはしなくてもよい。本明細書に別に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）， ＮＩＨ公報９１−３２４２、第１〜３巻に記載されるような、ＥＵインデックスとも称される、ＥＵ番号付け系にしたがう。

用語「フィーダー混合物」は、異なる添加物、例えばＢ細胞の活性化および／または生存および／または抗体分泌を促進する、増殖因子、サイトカインおよび／またはさらなるタンパク質の組み合わせを示す。フィーダー混合物は、天然フィーダー混合物、例えば胸腺細胞（ＴＳＮ）の培養上清から得られるものであってもよく、これはサイトカインの定義されない組み合わせであるか、あるいは、フィーダー混合物は、例えばＩＬ−２１および／またはＩＬ−２および／またはＩＬ−６の混合物を含む、合成フィーダー混合物であってもよい。

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中、以下の順序で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

用語「細胞」または「宿主細胞」は、核酸、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸がトランスフェクション可能であるかまたはトランスフェクションされている細胞を指す。用語「細胞」には、プラスミドの増殖用に用いられる原核細胞、ならびに核酸発現およびコードされるポリペプチドの産生のために用いられる真核細胞の両方が含まれる。１つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。１つの態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞である。１つの態様において、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１またはＤＳＭ ＡＣＣ １１０）、またはＣＨＯ ＤＧ４４細胞（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ［−］、ＤＳＭ ＡＣＣ １２６としてもまた知られる）、またはＣＨＯ ＸＬ９９細胞、ＣＨＯ−Ｔ細胞（例えば、Ｍｏｒｇａｎ， Ｄ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６ （１９８７） ２９５９−２９６３を参照されたい）、またはＣＨＯ−Ｓ細胞、またはＳｕｐｅｒ−ＣＨＯ細胞（Ｐａｋ， Ｓ．Ｃ．Ｏ．ら． Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２ （１９９６） １３９−１４６）である。１つの態様において、ＨＥＫ細胞はＨＥＫ２９３細胞である。これらの細胞が、血清不含培地または懸濁中での増殖に適応していない場合、本方法で使用する前に適応が実行されるものとする。本明細書において、表現「細胞」には、対象細胞およびその子孫が含まれる。したがって、該単語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、初代対象細胞、およびトランスファーまたは継代培養の数にかかわらず、そこから得られる培養が含まれる。また、縮重または偶発性の突然変異のため、すべての子孫が、ＤＮＡ内容物において正確に同一でない可能性もあることも理解される。元来の形質転換細胞においてスクリーニングされるものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生されるか、あるいはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源から得られる抗体のものに対応する、アミノ酸配列を所持するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。

「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群由来である。一般的に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）， ＮＩＨ公報９１−３２４２、第１〜３巻におけるような下位群である。１つの態様において、ＶＬに関して、下位群は、Ｋａｂａｔら、上記におけるような下位群カッパＩである。１つの態様において、ＶＨに関して、下位群は、Ｋａｂａｔら、上記におけるような下位群ＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろうし、ここで、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト抗体のものに対応し、そしてＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の抗体定常領域の部分を少なくとも含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を経ている抗体を指す。

用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、本明細書において、配列中で超可変（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、そして／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、そして／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、抗体可変ドメインの領域各々を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。

本明細書において、ＨＶＲには
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．およびＬｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６（１９８７） ９０１−９１７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， 米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）， ＮＩＨ公報９１−３２４２）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２−７４５（１９９６））；および
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組み合わせ
が含まれる。

別に示されない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書においてＫａｂａｔら、上記にしたがって番号付けされる。
用語「標識」は、特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体の添加によって決定可能な、表面マーカーの存在または非存在を示す。したがって、表面マーカーの存在は、例えば蛍光標識の場合には蛍光の発生によって決定され、一方、表面マーカーの非存在は、それぞれの特異的に結合し、そして標識されている抗表面マーカー抗体とのインキュベーション後の蛍光の非存在によって決定される。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、ありうる変異体抗体、例えば天然発生突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じるものを除いて、同一であり、そして／または同じエピトープに結合し、前述の変異体は一般的に少量でしか存在しない。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特性を示し、そして何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするとは見なされないものとする。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、多様な技術によって作製可能であり、こうした方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を本明細書に記載する。

「天然抗体」は、多様な構造を持つ天然存在免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合される２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２つのタイプの一方に割り当て可能である。

本出願内で交換可能に用いられる用語である「核酸」または「核酸配列」は、個々のヌクレオチド（塩基とも称される）、ａ、ｃ、ｇ、およびｔ（またはＲＮＡではｕ）からなるポリマー分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその修飾物を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然存在ポリヌクレオチド分子または合成ポリヌクレオチド分子、あるいは１またはそれより多い合成ポリヌクレオチド分子を含む１またはそれより多い天然存在ポリヌクレオチド分子の組み合わせであることも可能である。この定義にやはり含まれるのは、１またはそれより多いヌクレオチドが変化している（例えば突然変異誘発によって）か、欠失しているか、または付加されている、天然存在ポリヌクレオチド分子である。核酸は、別の核酸において、例えば発現カセット、プラスミド、または宿主細胞の染色体において、単離されているかまたは組み込まれているかいずれかであってもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって特徴付けられる。

当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換する手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなる核酸配列によって、そして同様にこれにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によって、特徴付けられる。

用語「特異的に結合する」およびその文法的同等物は、抗体が１０^−７Ｍまたはそれ未満、１つの態様において１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、さらなる態様において１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）で、ターゲットに結合することを示す。該用語は、さらに、抗体が、存在する他の生体分子に特異的に結合しない、すなわち１０^−６Ｍまたはそれより高い、１つの態様において１０^−６Ｍ〜１Ｍの解離定数（Ｋｄ）で他の生体分子に結合することを示すために用いられる。

「トランスフェクションベクター」は、宿主細胞において、コード核酸／構造遺伝子（単数または複数）で構成されるトランスフェクションベクター中の発現のための必要な要素をすべて提供する核酸（核酸分子ともまた称される）である。トランスフェクションベクターは、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）に関する原核プラスミド増殖単位を含み、次に、原核複製起点、および原核選択剤に対する耐性を与える核酸を含み、さらに真核選択剤に対する耐性を与える１またはそれより多い核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする１またはそれより多い核酸を含む。好ましくは、選択剤に耐性を与える核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸（単数または複数）は、各々、発現カセット内に配置され、これによって、各発現カセットは、プロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの調節下に置かれ、そしてこうした構造遺伝子は、プロモーターに「機能可能であるように連結される」と言われる。同様に、制御要素およびコアプロモーターは、制御要素がコアプロモーターの活性を調節するならば、機能可能であるように連結されている。

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されるフレームワーク配列（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ， Ｔ．Ｊ．ら， Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第６版， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ． （２００７）， ９１ページ）。単一のＶＨまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を与えるために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを用いて、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、該抗原に結合する抗体を単離することも可能である。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ， Ｓ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０ （１９９３） ８８０−８８７； Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３５２ （１９９１） ６２４−６２８を参照されたい。

用語「ベクター」は、本明細書において、連結している別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。該用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞ゲノム内に取り込まれるベクターが含まれる。特定のベクターは、機能可能であるように連結された核酸の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。

用語「若い動物」は、性的成熟が起こる前の動物を示す。若いハムスターは、例えば、６週齢未満、特に４週齢未満のものである。若いマウスは、例えば、８週齢未満、特に５週齢未満のものである。

免疫
本明細書に報告するような方法において、ヒツジから得たＢ細胞を用いる／プロセシングする。

１つの態様において、Ｂ細胞はヒツジＢ細胞である。１つの態様において、ヒツジＢ細胞は、免疫したヒツジから、または特定の抗原に対してワクチン接種した後のヒツジから得られる。

Ｂ細胞の供給源および単離
免疫した実験動物の血液は、非常に多様な抗体産生Ｂ細胞を提供する。ここから得られるＢ細胞は、一般的に、ＣＤＲ内に、ほぼ同一でないかまたは重複しないアミノ酸配列をを有し、そしてしたがって高い多様性を示す抗体を分泌する。

１つの態様において、例えば実験動物の血液から得られる、実験動物のＢ細胞は、免疫４日後から、免疫または最も最近の追加免疫の１５日後までに得られる。
１つの態様において、Ｂ細胞は、免疫または最も最近の追加免疫の４日後から最長９日後までに得られる。

この時間枠は、本明細書に報告するような方法において、高い柔軟性を可能にする。この時間枠において、最もアフィニティが高い（ａｆｆｉｎｅ）抗体を提供するＢ細胞は、脾臓から血液に遊走するようである（例えばＰａｕｓ， Ｄ．ら， ＪＥＭ ２０３ （２００６） １０８１−１０９１； Ｓｍｉｔｈ， Ｋ．Ｇ．Ｓ．ら， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． １６ （１９９７） ２９９６−３００６； Ｗｒａｍｍｅｒｔ， Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ４５３ （２００８） ６６７−６７２を参照されたい）。

共培養前の選択工程
抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から濃縮することも可能である。したがって、本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、Ｂ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得るかまたはＢ細胞プールを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から濃縮する。

パニング・アプローチを用いることによって、それぞれ、関心対象の抗原に結合する抗体を産生しない細胞、または同様に、関心対象の抗原に結合する抗体を産生する細胞を、減少させるかまたは濃縮することも可能である。その際、結合パートナーは、表面に付着して提示され、そして結合した細胞をさらにプロセシングする場合、これに結合する細胞が細胞集団において選択的に濃縮され、または溶液中に残る細胞をさらにプロセシングする場合、結合する細胞は細胞集団において減少させられる。

本明細書に報告するような方法は、１つの態様において、選択工程を含み、ここで、特異的抗体を産生するＢ細胞は、細胞表面マーカーおよび蛍光活性化細胞ソーティング／ゲーティングに基づいて選択される。１つの態様において、成熟Ｂ細胞がソーティング／濃縮／選択される。異なる実験動物種からＢ細胞を選択するため、異なる細胞表面マーカーを用いることも可能である。

非ターゲット細胞集団および非特異的結合リンパ球の標識を用いて、これらの細胞を選択的に枯渇させることが可能である。この枯渇工程において、一般的に、非総枯渇を達成してもよい。枯渇は定量的ではないが、干渉細胞数を減少させるか、またはさらに最小限にすることも可能であるため、残りの細胞の続く蛍光標識において利点を提供する。

異なる表面マーカー、例えば、ＣＤ３^＋細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ１９^＋細胞（Ｂ細胞一般）、ＩｇＭ^＋細胞（成熟未刺激Ｂ細胞）、ＩｇＧ^＋細胞（成熟Ｂ細胞）、ＣＤ３８^＋細胞（例えば形質芽細胞）、およびＩｇＧ^＋ＣＤ３８^＋細胞（プレ形質細胞）を用いることによって、異なる細胞集団を標識してもよい。

１つの態様において、ＩｇＧ陽性およびＣＤ４５Ｒ陽性（ＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋）であるヒツジＢ細胞（単数または複数）を標識／選択する。
１つの態様において、ＩｇＧ陽性およびＣＤ２１陽性（ＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋）であるヒツジＢ細胞（単数または複数）を標識／選択する。

成熟ＩｇＧ^＋−Ｂ細胞、例えばメモリーＢ細胞、形質芽細胞、および形質細胞の選択のための免疫蛍光標識を、本明細書に報告するような方法で用いてもよい。
Ｂ細胞の選択または濃縮のため、細胞を単一標識、または二重標識、または三重標識のいずれかで標識する。

単一細胞寄託
本明細書に報告するような方法は、１つの態様において、Ｂ細胞集団のＢ細胞を単一細胞として寄託する工程を含む。

１つの態様において、単一細胞としての寄託は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）による。
１つの態様において、特異的に標識されたＢ細胞を単一細胞として寄託する。１つの態様において、標識は、蛍光標識抗体での細胞表面マーカーの標識である。

１つの態様において、本明細書に報告するような方法は、モノクローナル抗体を提供する。
本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、Ｂ細胞は成熟Ｂ細胞であり、そして成熟Ｂ細胞は単一細胞として寄託される。

実験動物の血液から得られるＢ細胞に関して用いられる免疫蛍光標識はまた、実験動物の脾臓および他の免疫学的臓器から得られるＢ細胞の標識のためにも使用可能である。
多細胞寄託
１つの態様において、本明細書に報告するような方法は、Ｂ細胞プールを寄託する工程を含む。Ｂ細胞のこのプールにおいて、末梢血からの磁気アフィニティビーズまたはＦＡＣＳ単離後、すべてのＢ細胞をウェルごとに寄託する。

１つの態様において、約５０のＢ細胞を寄託する。
１つの態様において、約５００のＢ細胞を寄託する。
１つの態様において、約２，５００のＢ細胞を寄託する。

寄託Ｂ細胞総数は、例えばヒツジＢ細胞に関して、単一の実験において、最大９０，０００のＢ細胞またはそれより多くまで増加させることも可能である。
培養
本明細書に報告するのは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下での、Ｂ細胞を産生する抗体の培養である。

したがって、本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、Ｂ細胞プールとしてまたは単一寄託Ｂ細胞としてのＢ細胞いずれかを、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびフィーダー細胞とともに／これらの存在下で培養する。

すでに、約３、４、５、６、７、８、１０、１５、または２１日培養後、十分な量／数の抗体分子が上清中に得られる。例えば結合特異性に関して、より詳細に抗体を性質決定するため、これとともに提供される抗体の量を用いて、異なる分析を実行することも可能である。抗体の特性が改善されていれば、スクリーニング／選択プロセスにおけるこの初期段階で、実行しなければならない、必要な核酸単離数および配列決定反応数を減少させることも可能である。

１つの態様において、培養期間は約５〜１０日間である。１つの特定の態様において、培養期間は約７日間である。
本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下での、抗体産生Ｂ細胞の培養がある。

フィーダー混合物は、天然フィーダー混合物または合成フィーダー混合物であることも可能である。
天然フィーダー混合物は、例えば胸腺細胞上清（ＴＳＮ）である。これは、適切な可溶因子を含有するが、この試薬は不均質であり、成分は適切には記載されず、そして動物間で異なる。

本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、フィーダー混合物は、ヒツジ胸腺細胞培養上清である。１つの態様において、Ｂ細胞はヒツジＢ細胞である。
１つの態様において、胸腺細胞培養上清は、それぞれの若い動物の胸腺の胸腺細胞の培養から得られる。特に、成体動物血液由来の胸腺細胞の単離と比較して、若い動物の胸腺を使用することが適している。

一般的に、本明細書に報告するような方法における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下でのヒツジＢ細胞の培養工程は、いくつかのさらなる工程に先行してもよいし、そしてまたこうした工程に続いてもよい。

本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、抗体産生Ｂ細胞およびフィーダー細胞の共培養は、ヒツジ胸腺上清（ヒツジＴＳＮ）、および／またはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、および／またはホルマリン固定ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）Ａ株Ｃｏｗａｎ １粒子（ＳＡＣ）の存在下である。１つの態様において、Ｂ細胞はヒツジＢ細胞であり、そしてフィーダー細胞はネズミＥＬ４Ｂ５細胞である。１つの態様において、ＰＭＡおよびＳＡＣを培地とともに、培養の出発時に添加する。

本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、抗体産生ヒツジＢ細胞およびフィーダー細胞の培養は、ＰＭＡおよびＳＡＣの存在下であり、これによって、ＰＭＡおよびＳＡＣを培地とともに培養出発時に添加する。

Ｂ細胞およびＰＭＡを含む培養系の使用は、Ｂ細胞の増殖改善を生じる、すなわちＰＭＡを含まない系に比較して、Ｂ細胞が、より迅速に分裂し、そして培養上清中で、より短い期間で、それぞれより高い細胞密度および抗体力価が得られうることが見出されてきている。

ヒツジＢ細胞に関して、ＰＭＡ、ヒツジＴＳＮおよびＳＡＣを含む共培養系が特に適していることがさらに見出されてきている。
ＩｇＧ産生による共培養細胞の性質決定
共培養後に分泌されるＩｇＧの（定性的および定量的）決定のため、一般的に、当業者に知られるすべての方法、例えばＥＬＩＳＡが使用可能である。本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、ＥＬＩＳＡを用いる。

性質決定結果に応じて、Ｂ細胞クローンを得る、すなわち選択することも可能である。
拡大および増殖による共培養細胞の性質決定
細胞拡大の（定性的および定量的）決定のため、異なる読み取り系（商業的細胞活性試験「ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＣＦＳＥ希釈法、^３Ｈチミジン取り込み、または細胞培養画像）を用いて、共培養Ｂ細胞の増殖または生存度を評価することも可能である。

ｍＲＮＡの単離、クローニングおよび配列決定
高い抗体力価を産生するＢ細胞クローンは、縮重ＰＣＲプライマーの使用を可能にする（同族）モノクローナル軽鎖および重鎖可変領域をコードするｍＲＮＡのある量を提供し、そして非常に特異的なＰＣＲプライマーの必要性を除去する。ＰＣＲ周期の必要な数もまた減少する。したがって、１つの態様において、逆転写酵素ＰＣＲは、軽鎖および重鎖可変ドメインに関する縮重ＰＣＲプライマーを用いる。

Ｂ細胞から総ｍＲＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡに転写してもよい。それぞれのプライマーに関して、同族ＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸を増幅することも可能である。
本明細書に報告するようなすべての方法の１つの態様において、アミノ酸配列は、増幅された可変ドメインコード核酸に由来する。可変ドメインコード核酸の正確な出発点および終点は、アミノ酸配列を位置決定することによって同定され、例えばＱＶＱＬ／ＱＶＲＬからＶＳＳ／ＶＳＫ（ＶＨ領域）、例えばＱＡＶＬＴからＶＬＧＱＰ（ＶＬラムダ領域）、および例えばＤＶＶＬ／ＤＩＱＶからＶＥＩＫＲＳＤ（ＶＬカッパ領域）である。

プール分析
本発明を例示するため、ＫＬＨコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、ＰＢＭＣを単離し、そして抗原特異的Ｂ細胞を濃縮するため、ビオチン化ハプテンおよび磁気ストレプトアビジンビーズを用いた陽性パニングを経た。続いて、Ｂ細胞を表面ＩｇＧ（ｓＩｇＧ）およびＢ細胞マーカーＣＤ４５ＲまたはＣＤ２１の両方に関して染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞ソーターを用いて、５０細胞プール（ｓＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋またはｓＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋）を９６ウェルプレート内にソーティングした。Ｂ細胞増殖ならびにＩｇＧ分泌細胞（すなわち形質細胞）への分化を促進する培地組成を同定するため、異なる因子を補充した培地中で細胞を培養した。

すべての実験において、基本培地に１０％ＦＣＳ、ＳＡＣ、およびヒツジＴＳＮを補充した。ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ｓＩｇＧ ^＋ ＣＤ４５Ｒ ^＋ Ｂ細胞によるＩｇＧ分泌
抗原濃縮ｓＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋ Ｂ細胞の５０細胞／ウェルのプールを、ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞の存在下、９６ウェルプレート中の異なる培地中で培養した。培養１週間後、ヒツジＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて、上清のヒツジＩｇＧ濃度を分析した。基本培地としてのＩＭＤＭに関する結果を図１に提示し、そして基本培地としてのＤＭＥＭおよびＩＭＤＭに関する結果を、以下の表に提示する。

表

ＩＭＤＭ＝イスコーブの修飾ダルベッコ培地
ＩＬ−６＝ヒトインターロイキン６
ＩＬ−４＝ヒトインターロイキン４
ＬＰＳ＝リポ多糖
ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの修飾イーグル培地
ヒツジＩｇＧの有意な濃度（＞５０ｎｇ／ｍｌ）を含有したウェルは、それぞれわずか５％または１８％であったため、基本培地自体（１０％ＦＣＳ、ＳＡＣおよびヒツジＴＮＳを補充したＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ）は、ヒツジＢ細胞の増殖／分化を効率的に促進しないことがわかる。ＩｇＧ含有ウェルの数の増加は、基本培地にＩＬ−４および／またはＩＬ−６またはＬＰＳを補った際に顕著であった。驚くべきことに、ＰＭＡを基本培地に添加すると、それぞれ、６４％または１００％のウェルが、十分な濃度のＩｇＧ（＞５０ｎｇ／ｍｌ）を含有することが見出された。

より詳細な分析のため、ウェルの４つのカテゴリーを定義した：ＩｇＧ産生細胞を含まないウェル（ＩｇＧ濃度が検出限界未満、すなわち＜１０ｎｇ／ｍｌ）、低いＩｇＧ濃度を含むウェル（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、平均的なＩｇＧ濃度を含むウェル（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、そして高いＩｇＧ濃度を含むウェル（２００〜４００ｎｇ／ｍｌ）。結果を以下の表に提示する。

表

表

ＩＭＤＭ＝イスコーブの修飾ダルベッコ培地
ＩＬ−６＝ヒトインターロイキン６
ＩＬ−４＝ヒトインターロイキン４
ＬＰＳ＝リポ多糖
ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのＩＭＤＭに関して、ＩＬ−６および／またはＩＬ−４での培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なＩｇＧ濃度を含むおよそ６０〜７０％のウェルおよび高いＩｇＧ濃度を含む少数のウェル（ウェルのおよそ５〜９％）を生じた。細胞のＬＰＳ刺激に関して同様の結果を得た。ＰＭＡでの刺激は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲の平均的なＩｇＧ濃度を含む１００％のウェルを生じる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ｓＩｇＧ ^＋ ＣＤ２１ ^＋ Ｂ細胞によるＩｇＧ分泌
抗原濃縮ｓＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋ Ｂ細胞の５０細胞／ウェルのプールを、ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞の存在下、９６ウェルプレート中、示す培地中で培養した。培養１週間後、ヒツジＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて、上清のヒツジＩｇＧ濃度を分析した。基本培地としてのＩＭＤＭに関する結果を図２に提示し、そして基本培地としてのＤＭＥＭおよびＩＭＤＭに関する結果を、以下の表に提示する。

表

ＩＭＤＭ＝イスコーブの修飾ダルベッコ培地
ＩＬ−６＝ヒトインターロイキン６
ＩＬ−４＝ヒトインターロイキン４
ＬＰＳ＝リポ多糖
ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの修飾イーグル培地
基本培地（１０％ＦＣＳ、ＳＡＣおよびヒツジＴＮＳを補充したＤＭＥＭまたはＩＭＤＭ）は、ｓＩｇＧ＋ＣＤ２１＋ヒツジＢ細胞の増殖／分化を促進することがわかる。基本培地としてのＩＭＤＭに関しては、ウェルのおよそ６０％が、ヒツジＩｇＧの有意な濃度（＞５０ｎｇ／ｍｌ）を含有した。基本培地にＩＬ−４またはＬＰＳを補充すると、ＩｇＧ含有ウェル数の増加が認められた。同様に、基本培地にＰＭＡを添加すると、有意なレベルのＩｇＧを含有するウェル数が増加した（およそ９０％）
より詳細な分析のため、ウェルの４つのカテゴリーを定義した：ＩｇＧ産生細胞を含まないウェル（ＩｇＧ濃度が検出限界未満、すなわち＜１０ｎｇ／ｍｌ）、低いＩｇＧ濃度を含むウェル（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、平均的なＩｇＧ濃度を含むウェル（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、そして高いＩｇＧ濃度を含むウェル（２００〜４００ｎｇ／ｍｌ）。結果を以下の表に提示する。

表

表

ＩＭＤＭ＝イスコーブの修飾ダルベッコ培地
ＩＬ−６＝ヒトインターロイキン６
ＩＬ−４＝ヒトインターロイキン４
ＬＰＳ＝リポ多糖
ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの修飾イーグル培地
例えば基本培地としてのＩＭＤＭに関して、ＩＬ−４またはＬＰＳでの培地の補充は、匹敵する効果を有し、平均的なＩｇＧ濃度を含むおよそ７０〜９０％のウェルおよび高いＩｇＧ濃度を含む少数のウェル（ウェルのおよそ５〜１０％）を生じる。対照的に、ＰＭＡでの刺激は、高いＩｇＧ濃度を含むおよそ５０％のウェルおよび平均的なＩｇＧ濃度を含むおよそ４０％のウェルを導く。

単一細胞分析
単一ｓＩｇＧ ^＋ ＣＤ２１ ^＋ Ｂ細胞のソーティングおよび培養
ＫＬＨコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、ＰＢＭＣを単離し、抗原特異的Ｂ細胞を濃縮するため、陽性パニングを経て、そしてヒツジｓＩｇＧおよびＣＤ２１の両方に関して染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞ソーターを用いて、単一細胞を９６ウェルプレート内にソーティングした。１０％ＦＣＳ、ＳＡＣ、ヒツジＴＳＮおよびＰＭＡを補充したＩＭＤＭ中で細胞を培養した。ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。培養１週後、細胞上清のＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。結果を図３に示す。

培養１週後、総ウェルの３３％がＩｇＧ分泌Ｂ細胞クローンを含有した（図３の左の列）。順に、ＩｇＧ分泌クローンを含むこれらのウェルのうち６２％が低いＩｇＧ濃度（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、図３の左から２番目の列）を含有し、２４％が平均的なＩｇＧ濃度（５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、図３の右から２番目の列）を含有し、そして１４％が高いＩｇＧ濃度（２００〜４００ｎｇ／ｍｌ、図３の右列）を含有した。

抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて、分泌抗体の特異性を分析した（データ未提示）。これらのＥＬＩＳＡは、総ＩｇＧ分泌クローンの３８％が、抗原特異的である抗体を産生したことを示す。

この実験を再び行った。別のＫＬＨコンジュゲート化ハプテンで免疫されたヒツジから、ＰＢＭＣを単離し、抗原特異的Ｂ細胞を濃縮するため、陽性パニングを経て、そしてヒツジｓＩｇＧおよびＣＤ２１の両方に関して染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ細胞ソーターを用いて、二重陽性単一細胞を９６ウェルプレート内にソーティングした。１０％ＦＣＳ、ＳＡＣ、ヒツジＴＳＮおよびＰＭＡを補充したＩＭＤＭ中、ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞の存在下で細胞を培養した。対照実験において、ＰＭＡの非存在下で、同じ培養条件を用いて、単一細胞を培養した。培養１週後、細胞上清のＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。培養１週後、ＰＭＡの存在下で、総ウェルのおよそ１６％がＩｇＧ分泌Ｂ細胞クローンを含有した。順に、ＩｇＧ分泌クローンを含むウェルの３５％が低いＩｇＧ濃度を含有し、３５％が平均的なＩｇＧ濃度を含有し、そして３０％が高いＩｇＧ濃度を含有した。ＰＭＡの非存在下で、ＩｇＧ分泌Ｂ細胞クローンを含有するウェルはまったくなかった。

さらに、抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて、分泌抗体の特異性を分析した（データ未提示）。これらのＥＬＩＳＡは、ＩｇＧ分泌クローンの２９％が、抗原特異的である抗体を産生したことを示す。

実験結果を以下の表に要約する。
表

特異的態様
１． 以下の工程：
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、Ｂ細胞を培養する
を含むことを特徴とする、Ｂ細胞を培養するための方法。

２． 以下の工程：
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌Ｂ細胞を培養し、そして
培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を産生する
を含むことを特徴とする、ヒツジ抗体を産生するための方法。

３． 抗体分泌Ｂ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用。
４． 以下の工程：
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、Ｂ細胞を培養する
を含むことを特徴とする、Ｂ細胞の細胞増殖を改善するための方法。

５． Ｂ細胞がヒツジＢ細胞であることを特徴とする、態様１〜４のいずれか一項記載の方法。
６． Ｂ細胞が単一寄託Ｂ細胞または寄託Ｂ細胞プールであることを特徴とする、態様１〜５のいずれか一項記載の方法。

７． 寄託Ｂ細胞プールが、約１０のＢ細胞〜約１，０００，０００のＢ細胞を含むことを特徴とする、態様６記載の方法。
８． 寄託Ｂ細胞プールが、約２５のＢ細胞〜約１００，０００のＢ細胞を含むことを特徴とする、態様６〜７のいずれか一項記載の方法。

９． 寄託Ｂ細胞プールが約５０のＢ細胞を含むことを特徴とする、態様６〜８のいずれか一項記載の方法。
１０． 培養がさらに、フィーダー細胞の存在下で／これとともに行われることを特徴とする、態様１〜９のいずれか一項記載の方法。

１１． フィーダー細胞がＥＬ４Ｂ５細胞であることを特徴とする、態様１０記載の方法。
１２． 培養がさらに、胸腺細胞上清（ＴＳＮ）の存在下で／これとともに行われることを特徴とする、態様１〜１１のいずれか一項記載の方法。

１３． ＴＳＮがヒツジＴＳＮであることを特徴とする、態様１２記載の方法。
１４． 培養がさらに、ホルマリン固定ブドウ球菌属Ａ株Ｃｏｗａｎ １粒子（ＳＡＣ）の存在下で行われることを特徴とする、態様１〜１３のいずれか一項記載の方法。

１５． 培養が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ヒツジＴＳＮ、ＳＡＣおよびフィーダー細胞の存在下で／これとともに行われることを特徴とする、態様１〜１４のいずれか一項記載の方法。

１６． Ｂ細胞がＩｇＧ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋）であることを特徴とする、態様１〜１５のいずれか一項記載の方法。
１７． Ｂ細胞が未刺激または未成熟Ｂ細胞であることを特徴とする、態様１〜１６のいずれか一項記載の方法。

１８． Ｂ細胞がＩｇＧ陽性およびＣＤ４５Ｒ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋）であることを特徴とする、態様１〜１７のいずれか一項記載の方法。
１９． Ｂ細胞が成熟Ｂ細胞であることを特徴とする、態様１〜１６のいずれか一項記載の方法。

２０． Ｂ細胞がＩｇＧ陽性およびＣＤ２１陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋）であることを特徴とする、態様１〜１６および１９のいずれか一項記載の方法。
２１． 抗原に特異的に結合する抗体を産生するためのものであることを特徴とする、態様１〜２０のいずれか一項記載の方法。

２２． 以下の工程：
ａ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、寄託された抗体分泌Ｂ細胞を培養し、
ｂ）抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
ｃ）１またはそれより多い発現カセット内に、ｂ）において単離された核酸あるいは軽鎖および／または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
ｄ）細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様１〜２１のいずれか一項記載の方法。

２３． 以下の工程：
ａ）抗体分泌Ｂ細胞集団を提供し、
ｂ）少なくとも１つの蛍光色素（１つの態様において、１〜３、または２〜３の蛍光色素）で、Ｂ細胞集団の細胞を染色し、
ｃ）Ｂ細胞染色集団の単一細胞またはＢ細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に寄託し（１つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである）、
ｄ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、寄託された個々のＢ細胞を培養し、
ｅ）個々のＢ細胞またはＢ細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
ｆ）逆転写酵素ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
ｇ）抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
ｈ）細胞において核酸を導入し、
ｉ）細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様１〜２２のいずれか一項記載の方法。

２４． 以下の工程：
ａ）抗体分泌Ｂ細胞集団を提供し、
ｂ）少なくとも１つの蛍光色素（１つの態様において、１〜３、または２〜３の蛍光色素）で、Ｂ細胞集団の細胞を染色し、
ｃ）Ｂ細胞染色集団の単一細胞またはＢ細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に寄託し（１つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである）、
ｄ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、寄託されたヒツジＢ細胞を培養し、
ｅ）ヒツジＢ細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
ｆ）逆転写酵素ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
ｇ）抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
ｈ）細胞において核酸を導入し、
ｉ）細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗原に特異的に結合する抗体を産生する
を含むことを特徴とする、態様１〜２３のいずれか一項記載の方法。

２５． 抗体がヒト化抗体であることを特徴とする、態様２および５〜２４のいずれか一項記載の方法。
２６． 抗体がキメラ抗体であることを特徴とする、態様２および５〜２４のいずれか一項記載の方法。

２７． キメラ抗体が、ヒツジ−ネズミ・キメラ抗体またはヒツジ−ウサギ・キメラ抗体またはヒツジ−ヒト・キメラ抗体であることを特徴とする、態様２６記載の方法。
２８． 態様１〜２７のいずれか一項記載の方法で得られる抗体。

本発明の理解を補助するために、以下の実施例、図および配列を提供するが、本発明の真の範囲は付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される方法において修飾を行いうることが理解される。

材料および方法
ヒツジＴＳＮ（胸腺細胞上清）の調製
ヒツジ胸腺細胞の調製：
サフォーク−メリノ種ヒツジから胸腺を除去し、片に切り分け、そして細胞ストレーナーを通じてすりつぶした。胸腺の細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国ユタ州ローガン）、Ｌ−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）および５５μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、英国ペーズリー）に収集した。細胞を８００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして培地中に再懸濁した。生存細胞を計数した後、細胞懸濁物を再び遠心分離し、そして細胞ペレットを凍結培地（２０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ培地）中に１ｘ１０^８細胞／ｍｌで再懸濁した。−８０℃でイソプロピルアルコールを充填した細胞凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、細胞アリコットを凍結し、そして続いて液体窒素中に保存した。

ヒツジ・マクロファージの調製：
およそ５０ｍｌのＥＤＴＡ−血液をサフォーク−メリノ種ヒツジから採取し、そして等体積のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と混合した。希釈した血液１５ｍｌのアリコットを、１２．５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）−哺乳動物（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カナダ・オンタリオ州）に重層し、そして８００ｘｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を収集し、ＰＢＳで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌ−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）および５５μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、１ｘ１０^６細胞／ｍｌで、Ｔ１７５細胞培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ・フリッケンハウゼン）内に細胞を植え付けた。細胞を加湿大気中、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベーションした。続いて、細胞を培地で穏やかに洗浄することによって非接着細胞を除去し、一方、接着細胞（マクロファージ濃縮集団）を以下に記載するように胸腺細胞と共培養することによって、ＴＳＮ調製のために用いた。

ヒツジ胸腺細胞およびマクロファージの共培養
凍結胸腺細胞を融解し、そして１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌ−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）および５５μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、５ｘ１０^５細胞／ｍｌで、Ｔ１７５細胞培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）内に植え付けた。胸腺細胞を加湿大気中、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベーションした。続いて細胞を採取し、遠心分離によって収集し、そして新鮮な培地中に再懸濁した。胸腺細胞を計数し、そして５μｇ／ｍｌ植物性血球凝集素Ｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）および１０ｎｇ／ｍｌホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって刺激した。

刺激胸腺細胞をおよそ２：１（胸腺細胞：マクロファージ）の比でマクロファージに添加した。共培養３６時間後、細胞上清（ＴＳＮ）を採取し、０．２μＭフィルターを通じて濾過し、そして−８０℃でアリコットで保存した。

抗原特異的ヒツジＢ細胞プールの単離および培養
免疫原としてＫＬＨ共役ハプテン（アジュバント中に配合した５００μｇ用量）を用いて、サフォーク−メリノ種ヒツジを数回免疫した。Ｂ細胞単離の５日前、免疫原（アジュバント中に配合した動物あたり５００μｇの用量）の皮下適用によってヒツジに追加免疫した。Ｂ細胞を単離するため、動物からおよそ１５０ｍｌのＥＤＴＡ−血液を採取し、そして等体積のＰＢＳと混合した。希釈血液をＬｅｕｃｏｓｅｐ^ＴＭ試験管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ・フリッケンハウゼン）に装填し（試験管あたり２０ｍｌ）、そして室温、８００ｘｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を収集し、ＰＢＳで洗浄し、そして計数チャンバーを用いて計数した。

ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＭＣを５ｘ１０^７細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中に再懸濁した。抗原特異的Ｂ細胞の陽性パニングのため、細胞を穏やかに回転させながら、ビオチン化ハプテン（５００ｎｇ／ｍｌ）と４℃で３０分間インキュベーションすることによって、標識した。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして９０μｌあたり１ｘ１０^７細胞で標識緩衝液（ＰＢＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。細胞を穏やかに回転させながら、磁気ストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ・ベルギッシュグラートバハ）と４℃で３０分間、インキュベーションした（細胞懸濁物９０μｌあたりビーズ１０μｌを用いる）。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を２ｘ１０^８細胞／ｍｌでＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、そしてＭＡＣＳ緩衝液で平衡化したＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上に装填した。ＭＡＣＳ緩衝液での洗浄後、磁石をカラムから除去し、そして標識された抗原特異的細胞をＭＡＣＳ緩衝液中で溶出させた。

Ｂ細胞染色のため、溶出した細胞分画をＰＢＳで洗浄し、そして２ｘ１０^７細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。１：５０希釈ＦＩＴＣ標識抗ヒツジＩｇＧモノクローナル抗体（クローンＧＴ−３４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を１：１０希釈ＲＰＥ標識抗ヒツジＣＤ４５Ｒ ｍＡｂ（クローン２０．９６、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ドイツ・デュッセルドルフ）またはＲＰＥ標識抗ヒツジＣＤ２１ ｍＡｂ（クローンＣＣ２１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）と組み合わせて用いて、細胞を染色した。細胞を穏やかに回転させながら、ｍＡｂと４℃で４５分間インキュベーションした。対照実験において、細胞アリコットを個々のｍＡｂ単独で染色した（単一染色）。未染色細胞は陰性対照として供した。

ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｉ細胞ソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ・ハイデルベルグ）を用いた細胞ソーティングに供した。表面ＩｇＧ（ｓＩｇＧ）^＋ＣＤ２１^＋またはｓＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋二重陽性Ｂ細胞を同定し、そして２８０μｌ培地およびγ照射ネズミ胸腺腫ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞を含有する９６ウェルプレート（およそ５ｘ１０^４フィーダー細胞／ウェルをプレート内への細胞ソーティング２４時間前に植え付ける）内にソーティングした（５０細胞／ウェル）。

基本培地は、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国ユタ州ローガン）、Ｌ−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、ヒツジＴＳＮ（１：２０希釈）および熱殺菌ホルマリン固定黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細胞（ＳＡＣ；１:１０，０００希釈）（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ（登録商標）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ・ダルムシュタット）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、英国ペーズリー）またはＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）のいずれかであった。基本ＩＭＤＭは、上述のように補充したものに加えて、０．０２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を含有した。

ヒツジＢ細胞の増殖および分化に対する異なる刺激の影響を評価するため、図に示すように、以下の化合物を単独でまたは組み合わせて、基本培地に添加した：１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ドイツ・ハンブルグ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）、１μｇ／ｍｌ大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または１μｇ／ｍｌホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。

加湿大気中、３７℃／５％ＣＯ_２で、培地中、７〜１０日間、Ｂ細胞をインキュベーションした。続いて、細胞上清を採取し、そして以下に示すように、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度を決定した。

単一抗原特異的Ｂ細胞の単離および培養
免疫動物由来のヒツジＰＢＭＣを上述のように単離した。上述のように、ビオチン化抗原および磁気ストレプトアビジン・マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陽性パニングによって、抗原特異的Ｂ細胞を濃縮した。１：５０希釈ＦＩＴＣ標識抗ヒツジＩｇＧモノクローナル抗体（クローンＧＴ−３４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１０希釈ＲＰＥ標識抗ヒツジＣＤ２１ ｍＡｂ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）と組み合わせて用いて、細胞を染色した。細胞を穏やかに回転させながら、ｍＡｂと４℃で４５分間インキュベーションした。対照実験において、細胞アリコットを個々のｍＡｂ単独で染色した（単一染色）。未染色細胞は陰性対照として働いた。

ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｉ細胞ソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた細胞ソーティングに供した。単一ｓＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋二重陽性Ｂ細胞を同定し、そして２８０μｌ培地およびγ照射ネズミＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞を含有する９６ウェルプレート（およそ５ｘ１０^４フィーダー細胞／ウェルをプレート内への細胞ソーティング２４時間前に植え付ける）内にソーティングした（１細胞／ウェル）。

単一ヒツジＢ細胞の培養用の培地は、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌ−ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、０．０２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ）、ヒツジＴＳＮ（１：２０希釈）、ＳＡＣ（１：１０，０００希釈）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および１μｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）であった。

加湿大気中、３７℃／５％ＣＯ_２で、培地中、７〜１０日間、Ｂ細胞をインキュベーションした。続いて、細胞上清を採取し、そして以下に記載するように、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度を決定した。

ＥＬＩＳＡによるヒツジＩｇＧ濃度の決定
ビオチン・コンジュゲート化モノクローナル抗ヒツジＩｇＧ抗体（カタログ番号２１３−０６２−１７７、Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ・ハンブルグ）を、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ドイツ・ベルンリート）上に固定した。ＰＢＳ／１％ＲＰＬＡ４（ウシ血漿アルブミン）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）中、３００ｎｇ／ｍｌの濃度でｍＡｂ（１００μｌ／ウェル）を用い、そしてウェルを室温（ＲＴ）で１時間、希釈ｍＡｂとインキュベーションした。洗浄緩衝液（０．９％ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養Ｂ細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ）の連続希釈をプレートに添加し、そしてＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号７１３−０３５−１４７）で標識したロバ（ｄｏｎｋｅｙ）抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＰＢＳ／１％ＲＰＬＡ４中、１：１５，０００希釈）と、ウェルをインキュベーションした。ＲＴで１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてＡＢＴＳ溶液（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、シグナルを検出した。プレートを４０５ｎｍで（参照波長４９２ｎｍ）マイクロプレート読み取り装置中で読み取った。精製ヒツジＩｇＧ（０〜２００ｎｇ／ｍｌ）の連続希釈は標準として働き、そしてこれをＢ細胞上清のＩｇＧ濃度の計算に用いた。

ＥＬＩＳＡによるヒツジＩｇＧの抗原特異性の決定
ビオチン・コンジュゲート化抗原を、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ドイツ・ベルンリート）上に固定した。ＰＢＳ／１％ＲＰＬＡ４（ウシ血漿アルブミン）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）中、１００〜３００ｎｇ／ｍｌの濃度でビオチン化抗原（１００μｌ／ウェル）を用い、そしてウェルを室温（ＲＴ）で１時間、希釈抗原とインキュベーションした。洗浄緩衝液（０．９％ＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養Ｂ細胞の上清または精製ポリクローナル・ヒツジＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ）の連続希釈をプレートに添加し、そしてＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号７１３−０３５−１４７）で標識したロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＰＢＳ／１％ＲＰＬＡ４中、１：１５，０００希釈）と、ウェルをインキュベーションした。ＲＴで１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質としてＡＢＴＳ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）を用いて、シグナルを検出した。

Claims (11)

1. 以下の工程：
   ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、ヒツジＢ細胞を培養する
   を含むことを特徴とする、ヒツジＢ細胞を培養するための方法。
2. 培養が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ヒツジＴＳＮおよびフィーダー細胞の存在下であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 以下の工程：
   ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で抗体分泌ヒツジＢ細胞を培養し、そして
   培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を産生する
   を含む、抗体を産生するための方法。
4. ヒツジＢ細胞が未刺激（ｎａｉｖｅ）または未成熟ヒツジＢ細胞であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. Ｂ細胞がＩｇＧ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋）であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
6. Ｂ細胞がＩｇＧ陽性およびＣＤ４５Ｒ陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ４５Ｒ^＋）であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. Ｂ細胞がＩｇＧ陽性およびＣＤ２１陽性Ｂ細胞（ＩｇＧ^＋ＣＤ２１^＋）であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
8. 以下の工程：
   ａ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で／これとともに、抗体分泌ヒツジＢ細胞のプールまたは単一寄託（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）物を培養し、
   ｂ）抗原に特異的に結合する、抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、そして可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離し、
   ｃ）１またはそれより多い発現カセット内に、ｂ）において単離された核酸あるいは軽鎖および／または重鎖可変ドメインのヒト化型をコードするその変異体を含む細胞を培養し、
   ｄ）細胞または培地から抗体を回収し、そしてそれによって抗体を産生する
   を含むことを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項記載の方法。
9. 以下の工程：
   ａ）抗体分泌（成熟）Ｂ細胞の集団（ヒツジ血液から得られるもの）を提供し、
   ｂ）少なくとも１つの蛍光色素（１つの態様において、１〜３、または２〜３の蛍光色素）で、Ｂ細胞集団の細胞を染色し、
   ｃ）Ｂ細胞染色集団の単一細胞またはＢ細胞染色集団由来の細胞プールを、個々の容器に寄託し（１つの態様において、容器はマルチウェルプレートのウェルである）、
   ｄ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下で、寄託された個々のＢ細胞を培養し、
   ｅ）個々のＢ細胞またはＢ細胞プールの培養において分泌された抗体の結合特異性を決定し、
   ｆ）逆転写酵素ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、そしてそれによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得て、
   ｇ）抗体の発現のため、発現カセット中に、モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を導入し、
   ｈ）細胞において核酸を導入し、
   ｉ）細胞を培養し、そして細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、そしてそれによって抗体を産生する
   を含むことを特徴とする、請求項８記載の方法。
10. 抗体分泌ヒツジＢ細胞の培養における、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の使用。
11. ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに／その存在下で、単一寄託ヒツジＢ細胞またはヒツジＢ細胞プールを培養する工程を含む、ヒツジＢ細胞の細胞増殖を改善するための方法。