JP7026634B2 - B細胞培養法 - Google Patents
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Description
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るためには、KoehlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、免疫化実験動物から採取されたB細胞のごく一部のみが融合および増殖され得るにすぎない。B細胞の供給源は一般的に、免疫化実験動物の脾臓などの臓器である。
(i) 単離されたB細胞またはB細胞クローンが、標的に特異的に結合する抗体を産生する、B細胞の集団からのB細胞またはB細胞クローンの単離、
(ii) 単一の置かれたB細胞の共培養、および
(iii) 抗体の生成
のための方法である。
- 1個または複数個のB細胞をEL4-B5細胞と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、EL4-B5細胞が、細胞600,000個/mlから細胞1,500,000個/mlまでの(最終)細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られている/該EL4-B5細胞の培養物に由来する、方法である。
- 細胞約600,000個/ml~細胞約1,500,000個/mlの細胞密度までEL4-B5細胞を培養する段階、および
- 1個または複数個のB細胞を、前段階のEL4-B5細胞の培養物の/前段階のEL4-B5細胞の培養物からの、すなわち細胞約600,000個/ml~細胞約1,500,000個/mlの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物からのEL4-B5細胞の一定分量と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法である。
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む。
- (単一の置かれた各)B細胞またはB細胞(のプール)を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と共に(個々に)共培養/インキュベートする段階
を含む。
- 1~3種類または1~4種類の蛍光色素/フルオロフォアで標識されたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階。
- 異なるB細胞表面抗原にそれぞれが特異的に結合する1~4種類の抗体と接触させたB細胞の集団のB細胞を、単一細胞として置く段階であって、各抗体が、異なる蛍光色素にコンジュゲートされているが、1~4種類の蛍光色素でのみ標識されている、段階。
(a) (任意で、B細胞集団を、2~4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2~4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を1~4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1~4種類の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 段階(e)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階。
(a) (任意で、B細胞集団を、2~4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2~4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を1~4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1~4種類の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 抗体を分泌する段階(e)のB細胞クローンを選択する段階、
(g) (i) 段階(f)において選択されたB細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る段階、
(ii) B細胞クローンがヒトB細胞クローンではない場合、可変ドメインをヒト化し、各コード核酸を提供する段階、および
(iii) 1つまたは複数の核酸を1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(h) 段階(g)の1つまたは複数の発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
(a) (任意で、B細胞集団を、2~4種類の異なる所定のB細胞表面マーカーに特異的に結合する2~4種類の蛍光標識抗体と共にインキュベートすることにより)B細胞の集団のB細胞を1~4種類の蛍光色素で標識する段階、
(b) 任意で、細胞を共培養培地中でインキュベートする段階、
(c) 1~4種類の蛍光色素で標識された(および任意で、他の蛍光色素で標識されていない)B細胞の集団のB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞上に単一細胞として置く段階、
(d) 任意で、単一の置かれたB細胞を、予め負荷されたフィーダー細胞と共に遠心分離する段階、
(e) 単一の置かれた各B細胞を、フィーダー混合物が補充された共培養培地中でフィーダー細胞と(個々に)共培養する段階、
(f) 個々のB細胞の培養液中に分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(g) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、B細胞クローンから、分泌された抗体の可変ドメインをコードする1つまたは複数の核酸を得る(およびそれによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る)段階、
(h) B細胞が非ヒトB細胞である場合、可変軽鎖および重鎖ドメインをヒト化し、ヒト化可変ドメインをコードする核酸を提供する段階、
(i) モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、(ヒトまたはヒト化)抗体の発現用の1つまたは複数の発現ベクターに導入する段階、
(j) 発現ベクターを細胞に導入する段階、
(k) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
- 抗体産生B細胞クローンからの全RNAの抽出、
- 抽出されたポリA+ mRNAの一本鎖cDNA合成/逆転写の実施、
- 1組の種特異的プライマーを用いてPCRの実施、
- 任意で、PCRプライマーの除去/PCR産物の精製、
- 任意で、PCR産物の配列決定。
- 可変軽鎖および重鎖可変ドメインのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 発現ベクターの線状化および増幅、
- 増幅された発現ベクターのT4ポリメラーゼインキュベーション、
- 増幅された発現ベクター中への、可変ドメインをコードする核酸の配列およびライゲーション非依存的クローニング、ならびに
- ベクターで形質転換された大腸菌細胞のプールからのベクターの調製。
- B細胞の集団を、固体表面上に固定化されている(標的)抗原と共にインキュベートし、固定化抗原に結合しているB細胞(のみ)を回収する段階。
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびに/または
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/もしくはインターロイキン-10 (IL-10) 、ならびに/または
(iii) 黄色ブドウ球菌株Cowan細胞 (SAC)、ならびに/または
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、ならびに/または
(v) 腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、ならびに/または
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、ならびに/または
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)
を含む。
[本発明1001]
- 細胞600,000個/ml~細胞1,500,000個/mlの細胞密度までEL4-B5細胞を培養する段階、および
- 1個または複数個のB細胞を、前段階で得られた該EL4-B5細胞の一定分量と共にインキュベートする段階
を含む、該1個または複数個のB細胞を共培養するための方法。
[本発明1002]
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞650,000個/ml~細胞1,450,000個/mlの細胞密度までである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞1,000,000個超/ml~細胞1,500,000個/mlの細胞密度までである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記EL4-B5の培養が、細胞650,000個/ml~細胞825,000個/mlの細胞密度までである、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
前記EL4-B5細胞の培養が、細胞1,400,000個/ml~細胞1,500,000個/mlの細胞密度までである、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記インキュベートする段階がさらに、フィーダー混合物の存在下である、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記フィーダー混合物が、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 該腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記フィーダー混合物が、IL-1βと、TNF-αと、IL-10と、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4、およびIL-6より選択される1つまたは複数とを含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記培養する段階の後かつ前記インキュベーションする段階の前に、前記EL4-B5細胞にγ線を照射する、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
1個のB細胞の共培養のためである、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記1個のB細胞が単一の置かれたB細胞である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記インキュベートする段階が5~14日間である、本発明1001~1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
本発明1001~1012のいずれかの方法を含み、それによって抗体を生成する、該抗体を生成するための方法。
「親和性」とは、分子(例えば、抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で用いられる場合の「結合親和性」とは、結合対(例えば、抗体および抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は一般的に、解離定数 (kd) によって表すことができる。親和性は、本明細書において記載されるものを含めた、当技術分野で公知の通常の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的および例示的態様を以下に記載する。
本発明は、少なくとも一部は、B細胞との共培養において使用されるEL4-B5フィーダー細胞が採取される際の培養物の細胞密度が、B細胞およびEL-4-B5フィーダー細胞の共培養において得られる、抗原特異的抗体を分泌するB細胞クローンの頻度(すなわち、相対数)に影響を及ぼすという知見に基づく。当技術分野では、単独EL-4 B5培養物における細胞1,000,000個/mlというEL4-B5細胞の最大細胞密度を超えてはならないといと教示しているため、この知見は驚くべきことである。これが事実とは異なること、およびさらにより高い細胞密度を使用することができ、それによってEL4-B5細胞のより効率的な生成が可能になること、すなわち、共培養において用いられるEL4-B5細胞の数を変更することなく、より高い細胞密度が使用され得るという理由で、培養物の数が減少することが見出された。
治療用抗体の作製については、非ヒト動物を治療標的で免疫化して(単独で、または免疫原性刺激と組み合わせて)免疫応答を誘発するか、またはファージディスプレイライブラリーなどの合成アプローチを使用するかのいずれかである。トランスジェニック動物(すなわち、ヒト免疫系を有する)またはヒトファージディプレイライブラリーが用いられる場合には、ヒト抗体が得られる。そうでなければ、非ヒト動物抗体が得られ、これはその後ヒト化される。潜在的な治療用抗体を得るための稀な可能性は、疾患から回収されたヒトの血液によるものである。
血液は、高度な多様性の抗体産生B細胞を提供する。そこから採取されたB細胞クローンは、CDR内にほとんど同一ではないまたは重複しないアミノ酸配列を有する抗体を分泌し、よって高度な多様性を示す。
抗原と特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮することができる。したがって、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、B細胞集団は末梢血単核細胞 (PBMC) から濃縮される。
本明細書において報告される方法は、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く段階を含む。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、単一細胞として置く段階は蛍光活性化細胞選別 (FACS) による。FACSで単一細胞を置く段階に必要な標識化のために用いられる表面マーカーは、本明細書において概説されるような特異的マーカー組み合わせであってよい。
単一の置かれたB細胞を、フィーダー混合物の存在下でマウスEL-4-B5フィーダー細胞と共培養する。
共培養後の分泌されたIgGの(定性的および定量的)測定には、一般的に、ELISAなどの当業者に公知のすべての方法を用いることができる。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、ELISAが用いられる。
B細胞から全mRNAを単離し、cDNAに転写することができる。特異的プライマーを用いて、同族のVH領域およびVL領域コード核酸を増幅することができる。同一の配列はほとんど得られない。前記方法は、同一抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
(a) (実験用非ヒト動物の血液から採取された)(成熟)B細胞の集団を提供する段階、
(b) B細胞の集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素で(1つの態様においては、1~4種類または2~4種類の蛍光色素で)染色する段階、
(c) 個々の容器(1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に、染色されたB細胞の集団の単一細胞を置く段階、
(d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物(1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は天然TSNであり、1つの態様においてフィーダー混合物は合成フィーダー混合物である)の存在下で培養する段階、
(e) 個々のB細胞の培養において分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
(f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
(g) モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
(h) 該核酸を細胞に導入する段階、
(i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
本発明は、少なくとも一部は、細胞500,000個超/ml、特に細胞600,000個/mlから細胞1,500,000個/mlまでの範囲の(最終)細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られたEL4-B5フィーダー細胞を、B細胞との共培養において使用することが有利であるという知見に基づく。
- 1個または複数個のB細胞をEL4-B5細胞と共にインキュベートする段階
を含む、1個または複数個のB細胞を共培養するための方法であって、EL4-B5細胞が、細胞600,000個/mlから細胞1,500,000個/mlまでの細胞密度を有するEL4-B5細胞の培養物から得られている/該EL4-B5細胞の培養物に由来する、方法である。
組換えDNA法
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) に記載されているような標準方法を用いて、DNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。
ELISA用のブロッキング緩衝液は、1×PBSおよび1% BSAを含む。
実験動物は、ドイツ動物保護法 (TierSCHG) に従って、および各欧州指針に従って維持した。
マウス由来およびハムスター由来の血液は、眼球後静脈の穿刺によって採取した。ウサギ由来の血液は、耳静脈、またはより大量の場合には耳動脈の穿刺によって採取した。3度目、4度目、5度目、および6度目の免疫化の4~6日後にウサギから全血 (10 ml) を回収し、FACSによる単一細胞選別に使用した。
末梢血単核細胞 (PBMC) の単離は、製造業者の説明書A(Lympholyte(登録商標)-mammal、Cedarlane)に従ってLympholyte(登録商標)を用いて密度勾配分離により行った。
低張溶解による赤血球の破壊のため、塩化アンモニウム溶液(BD Lyse(商標))を水で1:10に希釈し、全血に対して1:16の比で添加した。赤血球を溶解するため、この混合物を暗所で15分間インキュベートした。無傷細胞から細胞残屑を分離するため、溶液を800×10で10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをPBSに再懸濁し、再度洗浄し、遠心分離し、かつペレットをPBSに再懸濁した。実施例8。
滅菌した6ウェルプレート(細胞培養等級)を使用して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させた。ウェルをKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、またはストレプトアビジンおよび対照ペプチドのいずれかでコーティングした。各ウェルを3 ml~(最大)4 mlの培地、および免疫化ウサギ由来の最大で6×106個までの末梢血単核細胞で満たし、インキュベーター内で37℃で60~90分間結合させた。その後、リンパ球含有上清を遠心分離バイアルに移し、かつ800×gで10分間遠心分離した。ペレットをPBSに再懸濁した。
各抗原を、最終濃度2μg/mlまでコーティング緩衝液で希釈した。この溶液3 mlを6ウェルマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用する前に上清を除去し、ウェルをPBSで2回洗浄した。B細胞溶液を細胞2×106個/mlの細胞密度に調整し、3 mlを6ウェルマルチウェルプレートの各ウェルに添加した(培地3~4 ml当たり最大で細胞6×106個まで)。プレートを37℃で60~90分間インキュベートした。上清を除去し、ウェルを1×PBSで1~4回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。付着性の抗原特異的B細胞を回収するため、1 mlのトリプシン/EDTA溶液をマルチウェルプレートのウェルに添加し、37℃で10~15分インキュベートした。培地を添加することによりインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルをPBSで2回洗浄し、この上清を他の上清と混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。任意で、ペレットをPBSに再懸濁した。
(a) 共培養は、丸底を有する96ウェルマルチウェルプレート中で行った。EL-4 B5培地中にEL-4 B5細胞(細胞1.6×106個/15.2 ml)およびサイトカインを含む基礎溶液を調製した。200μlの基礎溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに添加した。各ウェルに対して、蛍光活性化細胞選別により単一B細胞を添加した。B細胞の添加後、プレートを300×gで5分間遠心分離した。プレートを37℃で7日間インキュベートした。
それぞれ3~4週齢のマウスおよびハムスターまたは4~5週齢のウサギの胸腺からT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または細胞3×107個の一定分量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、細胞5×105個/EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で48時間インキュベートした。
それぞれ少なくとも3ヵ月齢のマウスおよびハムスターの腹腔からマクロファージを単離した。マウスもしくはハムスター由来の腹腔マクロファージ、またはウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中細胞少なくとも1×105個/mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を取り出し、温めたEL-4 B5培地で洗浄することにより付着したマクロファージから付着しなかった細胞を取り出し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で48時間培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。上清を破棄し、細胞ペレットを培地10 mlに再懸濁した。T細胞を細胞5×105個/mlの最小細胞密度に調整し、培地1 ml当たり10 pgホルボール-12-ミリステート-13-アセテート (PMA) および5 ngまたは50 ngフィトヘマグルチニンM (PHA-M) を添加した。マクロファージから培養液を取り出し、マクロファージを含むフラスコにT細胞懸濁液を添加した。36時間の共培養後に培養液を取り出し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を取り出すため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を4 mlの一定分量で-80℃で凍結した。
プロトコール1:
染色しようとする細胞の数に応じて、細胞をそれぞれ100μl培地(細胞106個未満)または200μl培地(細胞106個超)中に提供した。蛍光標識抗体を実験動物の5%血清およびFACS緩衝液で、それぞれ100μlまたは200μlの最終量に希釈した。反応混合物をローラーラック上で、暗所で4℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を300×gで5分間、2回洗浄した。ペレットをPBS 400μlに再懸濁し、70μmふるいを通して濾過した。濾過した溶液をFACSバイアルに移し、FACS実験の直前に、死細胞をヨウ化プロピジウム (6.25μg/ml) の添加により染色した。標識抗体がビオチンで標識されている場合には、該抗体はストレプトアビジン標識Alexa Fluor(登録商標)647(抗体197)を用いて第2段階で検出した。
単一細胞選別のために使用した抗ウサギ IgG FITCは、AbD Serotec(STAR121F、Dusseldorf, Germany)から入手した。
(a) Cell Titer Glo (CTG) 生存アッセイ
CTG生存アッセイ(Promega;#G7571)は、製造業者の説明書に従って使用した。
6日間インキュベートした後、3H-チミジンを添加し(0.5μCi/ウェル)、さらに16時間インキュベートした。細胞増殖中の3H-チミジンの取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウンター (Wallac) を用いて決定した。
顕微鏡画像を取得するために、高解像度カメラ (Leica DFC290 HD) と組み合わせたLeicaの位相差顕微鏡 (Leica DM IL) を使用した。
単離されたB細胞を、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄した。1×107個までの細胞をタンパク質不含PBS 1mlに再懸濁し、最終濃度2.5μMのCFSE(#C34554、Invitrogen/Molecular Probes)と共に37℃で3~10分間インキュベートした。過剰量のFCS補充培地を添加することにより、CFSE負荷を停止した。FCS含有培地で大規模に洗浄した後、B細胞を共培養実験において使用した。CFSE希釈の結果としてのCD19+ゲート化 (B)細胞の増殖を、表示の時点後にフローサイトメトリー解析(FL-1チャネル)によって確認した。
7日間の共培養後に、共培養を行った96ウェルマルチウェルプレートを300×gで5分間遠心分離した。上清150μlを取り出し、2枚目の96ウェルマルチウェルプレート中でPBSで2:1の比に希釈した。
単一で置かれかつ共培養されたB細胞により産生された抗体、または免疫化実験動物から採取されたB細胞から産生された抗体を、特異的抗原結合に関して特徴決定することができる。ELISAを室温で行い、個々の段階の間にELISA溶液を20×gの振盪機上でインキュベートした。第1段階では、抗原を96ウェルマルチウェルプレートのウェルに結合させた。抗原がタンパク質である場合には、それをコーティング緩衝液で希釈し、プレートに直接適用した。ペプチド抗原は、特異的結合対であるビオチン/ストレプトアビジンを介して結合させた。マルチウェルプレートのウェルは、製造業者によって可溶性CroteinC (CrC) で既にコーティングされていてよい。そうでない場合には、抗原の固定化後に、ウェルをブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした。それぞれウェル1個当たり100μlの抗原溶液(予めコーティングされたマルチウェルプレート)またはブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした後、非結合の抗原またはブロッキング緩衝液を洗浄緩衝液での洗浄により除去した。希釈したB細胞上清をウェル1個当たり100μlの量で添加し、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄した。その後、検出抗体をウェル1個当たり100μlの量で添加した。該抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合していてもよいし、またはビオチンで標識されていてもよい。検出抗体は、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートにより決定した。インキュベーション後、マルチウェルプレートを洗浄し、その後3,3',5,5'テトラメチルベンジジン (TMB) を含む基質溶液をウェル1個当たり50μl添加し、表Xに示される期間インキュベートした。硫酸50μlの添加により酵素反応を停止し、光度計(Rainbow Thermo ELISAリーダー)およびXread plusソフトウェアにより450 nmおよび680 nmの吸光度を測定した。
最初に、RNAを単離すべき細胞を遠心分離によってペレット化した。10μl/ml β-メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液100μlの添加により、細胞ペレットを溶解した。ピペットで複数回混合することにより、細胞を再懸濁した。溶液をマルチウェルプレートのウェルに移した。プレートに200×gで手短にショックを与え、これを-20℃で凍結した。
プロトコール1:
逆転写は20μlの量で行った。各反応について、逆転写酵素を用いておよび用いずに対照を実施した。1反応当たり1μl dNTP(それぞれ10 mM)、0.4μlオリゴ(dT)12-18 (0.2μg)、および0.6μlランダムヘキサマー (0.03μg) を予め混合し、H2O中のRNA 8.5μlに添加した。反応混合物を65℃で5分間インキュベートし、その後直接氷に移した。その後、2μl RT緩衝液 (10×)、4μl MgCl2 (25 mM)、2μl DTT (0.1 M)、および1μl RNAse Out(商標)(40単位)を予め混合し、氷冷反応混合物に添加した。室温での2分間のインキュベーション時間の後、0.5μl Superscript(商標)II逆転写酵素(25単位)を添加した。反応混合物を室温で10分間インキュベートした。翻訳は42℃で50分間行った。翻訳後、70℃で15分間のインキュベーションにより、逆転写酵素を不活化した。cDNAを-20℃で保存した。
製造業者の説明書に従ってSuper Script III第一鎖合成SuperMix (Invitrogen) を使用して、mRNAの逆転写によりcDNAを作製した。第一段階において、単離されたmRNA 6μlをアニーリング緩衝液1μlおよびオリゴdT 1μl (50μM) と混合し、65℃で5分間インキュベートし、その後直ちに氷上に約1分間置いた。続いて、なお氷上で、2×第一鎖反応ミックス10μlおよびSuperScript(商標)III/RNaseOUT(商標)酵素ミックスを添加した。混合後、反応物を50℃で50分間インキュベートした。85℃で5分間インキュベートすることにより、反応を停止した。停止後、反応混合物を氷上に置いた。
プロコトール1:
ポリメラーゼ連鎖反応は、製造業者の説明書に従ってTaq PCR Coreキット(Qiagen、Hilden, Germany)を用いて行った。PCRは20μlの量で行った。試料を95℃のMastercyler(登録商標)に移した。
ポリメラーゼ連鎖反応は、製造元業者の説明書に従ってAccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) を用いて行った。軽鎖および重鎖可変領域を個別の反応において増幅した。標的抗体発現ベクターに対して25 bpの重複を有するPCRプライマー(0.2μM/反応)を使用した。PCR後、PCR反応混合物8μlを48ウェルeGel (Invitrogen) での解析のために使用した。
DNA配列は、SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany) において実施された二本鎖配列決定により決定した。
配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図解のために、GCG(Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージバリアント10.2およびInfomaxのVector NTI Advanceスイートバリアント8.0を使用した。
cDNAをコードする所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH (Regensburg, Germany) によって調製された。発現構築物クローニングを容易にするために、下記のように、遺伝子セグメントには特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。
(a) プレートのコーティング
ビオチン/ストレプトアビジン: 滅菌したストレプトアビジンコーティング6ウェルプレート(細胞培養等級)を、PBS中の0.5~1 (2) μg/mlの濃度のビオチン化抗原と共に室温で1時間インキュベートした。プレートは、使用する前に滅菌したPBSで3回洗浄した。
各抗原でコーティングされた6ウェル組織培養プレートに、培地4 ml当たり6×106個までの細胞を播種し、インキュベーター内で37℃で1時間結合させた。ウェルを1×PBSで1~2回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。残存する付着細胞を、インキュベーター内で37℃で10分間にわたりトリプシンによって剥離し、次いで培地で2回洗浄した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。
抗体重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするPCR産物をクローニングするためのレシピエントとして使用されるべきプラスミドDNAを、最初に制限酵素消化によって線状化した。続いて、線状化プラスミドDNAを分取アガロース電気泳動によって精製し、ゲル (QIAquick Gel Extraction Kit / Qiagen) から抽出した。この精製プラスミドDNAを、クローニングされるべきPCR産物と(20~25 bpだけ)重複するプライマーを用いるPCRプロトコールに鋳型として加えた。PCRは、AccuPrime Pfx SuperMix (Invitrogen) を用いて行った。
Haun, R.S., et al. (BioTechniques 13 (1992) 515-518) およびLi, M.Z., et al. (Nature Methods 4 (2007) 251-256) によって記載される「部位およびライゲーション非依存的クローニング」法 (SLIC) を用いて、PCR産物を発現ベクタ中にクローニングした。精製ベクターおよびインサートの両方を、dNTPの非存在下でDNA 1μg当たりT4 DNAポリメラーゼ(Roche Applied Sciences、Mannheim, Germany)0.5 Uによって25℃で45分間処理して、適合するオーバーハングを生成した。反応容積の1/10の10 mM dCTP溶液 (Invitrogen) を添加することによって、反応を停止した。T4処理したベクターおよびインサートDNA断片を1:2 (w/w)のプラスミド:インサート比(例えば、100 ng:200 ng)で組み合わせ、RecAProtein (New England Biolabs) および10×RecA緩衝液を添加することにより37℃で30分間組換えを行った。続いて、作製された重鎖および軽鎖発現プラスミドの各5μlを使用して、標準的な化学的形質転換プロトコールを用いて、MultiShot Strip Well TOP 10 Chemically Competent E.coli cell (Invitrogen) を形質転換した。再生後(形質転換大腸菌細胞を37℃で45分間振盪する)、形質転換混合物全体を、ウェル1個当たり2 mlのアンピシリン補充LB培地を含むDWP 96(深型ウェルプレート)に移した。細胞を振盪機内で37℃で20時間インキュベートした。次の段階で、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするプラスミドDNAを、NucleoSpin 96 Plasmid Mini Kit (Macherey&Nagel) を用いて精製し、選択された制限酵素で消化し、48ウェルeGel (Invitrogen) において解析した。並行して、貯蔵のためにグリセロール保存液を調製した。
8% CO2を含む雰囲気中、HEK293細胞をF17培地 (Gibco) 中で37℃にて、120 rpmで振盪させながら増殖させた。トランスフェクションの前日に細胞を分割し、細胞0.7~0.8×106個/mlの密度で播種した。トランスフェクション当日、容積2 ml中のHEK293細胞1~1.5×106個にHCプラスミド0.5μg+LCプラスミド0.5μgをトランスフェクトし、48ウェル深型ウェルプレートにおいて293不含培地 (Novagen) 1μlおよびOptiMEM(登録商標)培地 (Gibco) 80μlに懸濁した。培養物を、37℃および8% CO2において180 rpmで7日間インキュベートした。7日後、培養上清を回収して濾過し、抗体含有量および特異性について解析した。
(a) ウサギ抗体を発現するB細胞のB細胞PCR用のプライマー
プライマーセット1:
LCプライマー
HCプライマー
プライマーセット2:
LCプライマー
HCプライマー
重鎖発現プラスミド骨格の増幅用のプライマー:
κ軽鎖発現プラスミド骨格の増幅用のプライマー:
Zublerミックス: 2 ng/mlマウスIL-1β、50 ng/mlマウスIL-2、10 ng/mlマウスIL-10、および2 ng/mlマウスTNFα(最終濃度)
規定されたサイトカインカクテルを確立するために試験したサイトカイン(特に定めのない限り最終濃度として示した):
EL-4 B5細胞の培養
凍結EL-4 B5細胞を37℃の水浴中で迅速に融解し、EL-4 B5培地10 mlで希釈した。300×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを培地1 mlに再懸濁した。
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
単一選別したB細胞を96ウェルプレート中で、Pansorbin細胞 (1:100000)(Calbiochem (Merck)、Darmstadt, Deutschland)、5%ウサギ胸腺細胞上清、およびγ照射したEL-4-B5マウス胸腺腫細胞(5×104個/ウェル)を加えた200μl/ウェルEL-4 B5培地を用いて、インキュベーター内の5% CO2の雰囲気中で37℃で7日間培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を取り出し、細胞は可変領域遺伝子クローニングのために直ちに回収するか、または100μl RLT緩衝液(Qiagen、Hilden, Germany)中で-80℃で凍結した。
Claims (10)
- - 細胞1,000,000個超/ml~細胞1,500,000個/mlの細胞密度までEL4-B5細胞を培養する段階、および
- 1個または複数個のB細胞を、前段階で得られた該EL4-B5細胞のB細胞1個当たり10 4 ~10 5 個の一定分量と共にインキュベートする段階
を含む、該1個または複数個のB細胞を共培養するための方法。 - 前記EL4-B5細胞の培養が、細胞1,400,000個/ml~細胞1,500,000個/mlの細胞密度までである、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階がさらに、フィーダー混合物の存在下である、請求項1~2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィーダー混合物が、
(i) インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子α、
(ii) インターロイキン-2 (IL-2) および/またはインターロイキン-10 (IL-10)、
(iii) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) 株Cowan細胞 (SAC)、
(iv) インターロイキン-21 (IL-21) および任意でインターロイキン-2 (IL-2)、
(v) 該腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子 (BAFF)、
(vi) インターロイキン-6 (IL-6)、
(vii) インターロイキン-4 (IL-4)、ならびに
(viii) 胸腺細胞培養上清
のうちの1つまたは複数を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記フィーダー混合物が、IL-1βと、TNF-αと、IL-10と、IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4、およびIL-6より選択される1つまたは複数とを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記培養する段階の後かつ前記インキュベーションする段階の前に、前記EL4-B5細胞にγ線を照射する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 1個のB細胞の共培養のためである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1個のB細胞が単一の置かれたB細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階が5~14日間である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の方法を含み、それによって抗体を生成する、該抗体を生成するための方法。
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