ES2434256T3 - Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos - Google Patents

Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos Download PDF

Info

Publication number
ES2434256T3
ES2434256T3 ES10005602T ES10005602T ES2434256T3 ES 2434256 T3 ES2434256 T3 ES 2434256T3 ES 10005602 T ES10005602 T ES 10005602T ES 10005602 T ES10005602 T ES 10005602T ES 2434256 T3 ES2434256 T3 ES 2434256T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
igg
cell
antibody
individual
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10005602T
Other languages
English (en)
Inventor
Josef Endl
Natalie Herr
Sonja Offner
Josef Platzer
Basile Siewe
Irmgard Thorey
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2434256T3 publication Critical patent/ES2434256T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1185—Thymus cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/70—Non-animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/016—White blood cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Método para obtener una célula B, que comprende las etapas siguientes: a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo, b) marcar células B IgG+ y/o células B CD138+, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales, d) cocultivar las células depositadas como células individuales con una célula nodriza en un medio de cocultivo, e) seleccionar un clon de células B proliferante en la etapa d) y obtener de esta manera una célula B.

Description

Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos.
En la presente memoria se informa de un método para obtener la secuencia de aminoácidos de por lo menos los dominios variables de un anticuerpo monoclonal secretado por una única célula B que ha sido obtenida de una población de células B de un animal experimental mediante deposición de células individuales y cocultivo con células nodriza en presencia de una mezcla nutriente.
Antecedentes de la invención
Para obtener células que secretan anticuerpos monoclonales, se utiliza ampliamente la tecnología de hibridoma desarrollada por Koehler y Milstein. Sin embargo, en la tecnología de hibridoma sólo puede fusionarse y propagarse una fracción de las células B obtenidas de un animal experimental inmunizado. De esta manera, se pierde una gran fracción de la diversidad de anticuerpos. La fuente de las células B generalmente es un órgano de un animal experimental inmunizado, tal como el bazo.
Zubler et al. en 1984 empezaron a desarrollar un enfoque diferente a la obtención de células que secretan anticuerpos monoclonales. En este enfoque, las células B se obtienen de la sangre del animal experimental inmunizado y se cocultivan con células nodriza EL-4 B5 murinas en presencia de una mezcla nutriente que comprende citoquinas. Con esta metodología pueden obtener hasta 50 ng/ml de anticuerpo tras 10 a 12 días de cocultivo.
Weitkamp J-H. et al. (J. Immunol. Meth. 275:223-237, 2003) informan de la generación de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes contra rotavirus a partir de células B específicas de antígeno seleccionadas con partículas fluorescentes similares a virus. En el documento US nº 2006/0051348 se informa de un método para producir una pluralidad de anticuerpos aislados contra una pluralidad de antígenos afines. En los documentos WO nº 2008/144763 y nº 2008/045140 se informa de anticuerpos contra IL-6 y usos de los mismos y de un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno, respectivamente.
En el documento US nº 2007/269868 se informa de un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno. La clonación y expresión en E. coli de un fragmento Fab funcional obtenido de linfocitos humanos individuales contra la toxina del ántrax se informa en Masri S.A. et al. (Mol. Immunol. 44:21012106, 2007). En el documento WO nº 2007/031550 se informa de un método para preparar bibliotecas de inmunoglobulinas. Tung J.W. et al. informan de que las rutas de desarrollo de células B fenotípicamente diferentes se corresponen con los tres linajes de células B en el ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:6293-6298, 2006).
Descripción resumida de la invención
En la presente memoria se informa de un método para el aislamiento de una célula B a partir de una población de células B, en la que, en las cuatro semanas posteriores a la primera inmunización del animal experimental, pueden aislarse las células productoras de anticuerpos inducidas y puede determinarse la especificidad de unión de los anticuerpos.
Un aspecto informado en la presente memoria es un método para obtener un clon de células B, que comprende las etapas siguientes: a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo, b) marcar células B-IgG+ y/o células B CD138+, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales, d) cocultivar individualmente las células B depositadas como células individuales con células nodriza, e) seleccionar un clon de células B que prolifera y secreta anticuerpos en la etapa d) y obtener de esta manera un clon de células B.
En una realización adicional, el método comprende la etapa de centrifugar las células B depositadas como células individualmente antes del cocultivo. En todavía otra realización, el método comprende, tras la etapa a) y antes de la etapa b), la etapa siguiente: ab) inmunoadsorción ("panning") de las células B con antígeno inmovilizado. Asimismo, en una realización la obtención se realiza mediante centrifugación en gradiente de densidad.
En una realización, el medio de cocultivo es un medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10% (v/v), 1% (p/v) de una solución de glutamina 200 mM que comprende penicilina y estreptomicina, piruvato sódico 100 mM al 2% (p/v), tampón de ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazín)-etanosulfónico 1 M al 1% (v/v) (HEPES).
En una realización, el marcaje es de células B IgG+CD19+, células B IgG+CD38+, células B IgG+CD268+, células B IgG-CD18+, células B CD27+CD138+ ó células B CD3-CD27+. En otra realización, las células B se obtienen de un ratón y el marcaje es de células B IgG+CD19+ y/o de células B IgG-CD138+. En una realización adicional, las células B se obtienen de hámster y el marcaje es de células B IgG+IgM-. En todavía otra realización, las células B se obtienen de un conejo y el marcaje es de células B IgG+CD138+ y/o de células B IgG+IgM-.
En una realización, la célula nodriza es una célula B5 EL-4 murina.
En una realización, el cocultivo es en presencia de una mezcla nutriente. En una realización adicional, la mezcla nutriente es un sobrenadante de cultivo de timocitos. En otra realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-beta y factor alfa de necrosis tumoral. También en una realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-2 y/o interleuquina-10. En una realización, la mezcla nodriza comprende células de Staphylococcus aureus cepa Cowans. También una realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-21. En otra realización, la mezcla nutriente comprende factor de activación de células B de la familia del factor de necrosis tumoral (BAFF). En una realización adicional, la mezcla nutriente comprende interleuquina-6. En todavía otra realización, la mezcla nutriente comprende interleuquina-4.
En una realización, el método comprende la etapa adicional de: f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo producido por el clon de células B seleccionado de la etapa e) mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera una secuencia de aminoácidos de dominio variable de anticuerpo monoclonal.
En otra realización, la obtención de las células B es de un animal experimental entre 4 y 9 días después de la inmunización. También en una realización, el marcaje de las células B resulta en el marcaje de 0,1% a 2,5% de las células de la población total de células B.
También es un aspecto informado en la presente memoria un método para producir un anticuerpo, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una población de células B maduras obtenidas a partir de la sangre de un conejo, b) marcar las células B IgG+ y/o las células B CD18+ de la población de células B con por lo menos un pigmento fluorescente (en una realización con uno a tres, o dos a tres pigmentos fluorescentes), c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar células individuales de la población marcada de células B en recipientes individuales (en una realización el recipiente es un pocillo de una placa multipocillo), d) cultivar las células B individuales depositadas en presencia de células nodriza y una mezcla nutriente (en una realización, las células nodriza son células B5 EL-4; en una realización la mezcla nutriente es SCT natural; en una realización, la mezcla nutriente es una mezcla nutriente sintética), e) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individuales, f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos de unión específica mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera un ácido nucleico codificante de dominio variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal, g) introducir el ácido nucleico codificante de dominio variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y de esta manera producir un anticuerpo.
Descripción detallada de la invención
El método informado en la presente memoria permite una rápida caracterización de la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales individuales secretados por una población de células B, es decir, en las cuatro semanas posteriores a la primera inmunización del animal experimental, pueden aislarse las células productoras de anticuerpos inducidas y puede determinarse la especificidad de unión de los anticuerpos producidos a partir de las mismas, es decir, pueden llevarse a cabo por lo menos 4 experimentos diferentes por la cantidad/concentración de anticuerpos en el sobrenadante de las células B.
Inmunización:
Con frecuencia se utilizan ratones como modelo animal para evaluar las terapias basadas en anticuerpos. Por lo tanto, con frecuencia se requiere proporcionar anticuerpos con reactividad cruzada ligantes del antígeno murino, así como del antígeno humano. El método informado en la presente memoria puede utilizarse para proporcionar
anticuerpos con reactividad cruzada. En el método informado en la presente memoria, pueden obtenerse células B obtenidas de ratón, hámster y conejo. En una realización, el conejo se selecciona de entre conejos New Zealand White (NZW), conejos Zimmermann (ZIKA), cepa mutante Alicia, cepa mutante Basilea, conejos transgénicos con un locus de inmunoglobulina humana, conejos con desactivación génica de rbIgM y mezclas de los mismos.
En una realización, los conejos seleccionados para la inmunización no presentan más de 12 semanas.
Fuente y aislamiento de células B:
La sangre de un animal experimental proporciona una elevada diversidad de células B productoras de anticuerpos. Los anticuerpos obtenidos de ellas no presentan prácticamente ninguna secuencia de aminoácidos idéntica o solapante; de esta manera, muestran una elevada diversidad.
En una realización, las células B de la sangre de un animal experimental se obtienen entre 4 días después de la inmunización y 9 días después de la inmunización. Este intervalo de tiempo permite una elevada flexibilidad en el método informado en la presente memoria y en este intervalo de tiempo las células B que proporcionan los anticuerpos más afines migran del bazo a la sangre.
Las células B de la sangre de un animal experimental pueden obtenerse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse la centrifugación en gradiente de densidad y la lisis celular de glóbulos rojos. La centrifugación en gradiente de densidad en comparación con la lisis hipotónica proporciona un rendimiento global más alto, es decir, un mayor número de células. Además de las células obtenidas mediante la centrifugación en gradiente de densidad, un gran número de células se divide y crece en la etapa de cocultivo y la concentración de anticuerpo secretado también es más alta que en las células obtenidas mediante un método diferente. Por lo tanto, en una realización, una población de células B se proporciona mediante centrifugación en gradiente de densidad.
Tabla 1: número de pocillos productores de IgG al obtener las células mediante centrifugación en gradiente de densidad (CGD) o mediante lisis hipotónica de eritrocitos.
Ratón, CGD
ratón, lisis hámster, CGD hámster, lisis
Número de células aisladas [x106]
1,7±0,2 (n= 2) 1,6±0,1 (n= 2) 2,1 ± 0,2 (n= 2) 0,9 ± 0,1 (n= 2)
pocillos IgG+ [%]
22 12 7 6
Etapas de selección previas al cocultivo:
Las células B productoras de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno pueden enriquecerse a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). En una realización, las CMSP son pobres en macrófagos. Lo anterior resulta ventajoso tal como se indica de manera general posteriormente, por ejemplo en una realización de células B obtenidas de conejos, para la etapa de cocultivo.
Puede reducirse la proporción de macrófagos en las CMSP mediante adhesión a la superficie de la placa de cultivo celular (ver la etapa de preincubación).
Se ha encontrado que la incubación de la población de células B a 37ºC durante una hora en medio de B5 EL-4 antes del depósito de células individuales incrementa el número total de células secretoras de anticuerpos tras el depósito de células individuales en comparación con un depósito de células individuales directamente después del aislamiento y enriquecimiento opcional de la población de células B a partir de la sangre de un animal experimental (por ejemplo un conejo, ver las Tablas 2a y 2b).
Tabla 2a: Pocillos positivos para IgG con y sin incubación de una hora en medio de B5 EL-4 antes del depósito de células individuales de todas las células.
ELISA de rbIgG
20 células) 100-׎CMSP frescas (( LSP tras la incubación *׎( 50-10 células)
pocillos rbIgG+ [n]
40 108
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
28 75
* empobrecido en macrófagos y monocitos
Tabla 2b: Pocillos positivos para IgG con y sin incubación de una hora en medio de B5 EL-4 antes del depósito de células individuales de las células B.
ELISA de rbIgG
Célulasindividuales sangre extraída B de recién células B individuales de sangre, incubada durante 1 h células B individuales de bazo recién obtenido células B individuales de bazo, incubadas durante 1 h
pocillos rbIgG+ [n]
2 55 6 52
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
2 33 7 31
En una realización del método informado en la presente memoria, las células se obtienen de un animal inmunizado con proteínas y empobrecido en macrófagos.
Las células no productoras de un anticuerpo ligante del antígeno o, análogamente, las células productoras de un
10 anticuerpo ligante de antígeno, pueden reducirse o enriquecerse, respectivamente, mediante la utilización de un enfoque de inmunoadsorción. En el enfoque se presenta una pareja de unión adherida a una superficie y las células unidas a la misma se enriquecen selectivamente en la población celular en el caso de que las células adheridas se procesen adicionalmente o se reduzcan en la población celular en el caso de que las células remanentes en la solución se procesen adicionalmente.
15 Tabla 3: Enriquecimiento en células B secretoras de un anticuerpo específico de antígeno mediante inmunoadsorción con el antígeno respectivo.
Proteína antígeno
sin inmunoadsorción con inmunoadsorción utilizando el antígeno
número total de pocillos [n]
4284 2113
pocillos IgG+ específicos de antígeno [n]
235 419
pocillos IgG+ específicos de antígeno [% del total de pocillos]
5 20
antígeno de molécula pequeña
sin inmunoadsorción con inmunoadsorción utilizando la molécula pequeña
número total de pocillos [n]
336 336
pocillos IgG+ de molécula pequeña [n]
2 115
pocillos IgG+ de molécula pequeña [% del total de pocillos]
1 34
20 El método informado en la presente memoria comprende en una realización previamente al depósito de células individuales, una etapa de selección en la que las células B productoras de anticuerpos específicos y/o sin reactividad cruzada se seleccionan basándose en marcadores de superficie celular y separación/selección celular activada por fluorescencia. En una realización, las células B maduras se separan/enriquecen/seleccionan. Para la selección de las células B de diferentes especies de animal experimental, pueden utilizarse diferentes marcadores
25 de superficie celular. Se ha encontrado que muchos de los marcadores de superficie celular disponibles, individualmente o en combinación, no proporcionan un marcaje adecuado.
Con el marcaje de poblaciones celulares no diana y linfocitos de unión no específica, resulta posible reducir selectivamente el número de estas células. En esta etapa de reducción, sólo puede conseguirse una reducción no 30 total. Aunque la reducción no es cuantitativa, proporciona una ventaja en el posterior marcaje fluorescente de las células remanentes, ya que puede reducirse o incluso minimizarse el número de células interfirientes. Mediante el
depósito de células individuales de células B maduras (células B de memoria, plasmablastos de afinidad madurada y células plasmáticas) mediante separación celular activada por fluorescencia utilizando el marcaje tal como se indica de manera general posteriormente, puede obtenerse un número más alto de pocillos IgG+ en la etapa de cocultivo.
El término "marcaje" se refiere a la presencia o ausencia de un marcador de superficie que puede determinarse mediante la adición de un anticuerpo de unión y marcaje específicos anti-marcador de superficie. De esta manera, la presencia de un marcador de superficie se determina a partir de, por ejemplo, la presencia de fluorescencia, mientras que la ausencia de un marcador de superficie se determina a partir de la ausencia de fluorescencia en cada incubación con el anticuerpo respectivo de unión y marcaje específicos anti-marcador de superficie.
Pueden marcarse diferentes poblaciones celulares mediante la utilización de diferentes marcadores de superficie, tales como células CD3+ (células T), células CD19+ (células B), células IgM+ (céluals B no expuestas maduras), células IgG+ (células B maduras), células CD38+ (por ejemplo plasmablastos) y células IgG+CD38+ (células preplasmáticas).
Tal como se informa en la presente memoria, se ha desarrollado un marcaje de inmunofluorescencia para la selección de células B IgG+ maduras, tales como células B de memoria, plasmablastos y células plasmáticas. Para una selección o enriquecimiento de células B, las células presentan un único marcaje o un doble marcaje. También se requiere un marcaje que resulte en aproximadamente 0,1% a 2,5% de células marcadas en la población celular total. En una realización, se depositan células B como células individuales seleccionadas mediante el marcaje de moléculas de superficie presentes en 0,1% a 2,5% de todas las células B; en otra realización en 0,3% a 1,5% de todas las células B; en una realización adicional en 0,5% a 1% de todas las células B.
De las células B IgG+ en la población de CMSP, 0,5% a 1% pueden encontrarse doblemente marcadas como células IgG+CD19+, células IgG+CD38+ y células IgG+CD268+. De esta manera, en una realización, se depositan como células individuales células B IgG+CD19+, células B IgG+CD38+ o células B IgG+CD268+.
De las células B IgG-en la población de CMSP, 0,5% a 1% pueden encontrarse doblemente marcadas como células IgG-CD268+. De esta manera, en una realización, se depositan células B IgG-CD138+ como células individuales.
El marcaje de las células CD27+CD138+ o de las células CD3-CD27+ resulta en el marcaje de aproximadamente 1,5% de las células de la población celular, respectivamente. De esta manera, en una realización, se depositan como células individuales células B CD27+CD138+ o células B CD3-CD27+.
De las células B IgG+ de hámster en la población de CMSP, 0,6 % ± 0,1% pueden encontrarse doblemente marcadas como células B IgG+IgM- de hámster. De esta manera, se depositan como células individuales células B IgG+IgM- de hámster.
En una realización se depositan como células individuales células B IgG-CD138+ de entre las células B obtenidas de un animal inmunizado. En una realización se depositan como células individuales células B IgG+CD19+ de entre las células B obtenidas de un animal no inmunizado. En otra realización se depositan como células individuales células B IgG+IgM- de entre las células B obtenidas de un animal no inmunizado o de un animal inmunizado. Se depositan como células individuales células B IgG+CD19+ murinas. Esta etapa de selección resulta en el rendimiento más alto de pocillos IgG+ en la posterior etapa de cocultivo. Se depositan como células individuales células B IgG-CD138+ murinas. En ellos, en primer lugar se seleccionan las células que producen la cantidad más alta de clones de células B y en segundo lugar la concentración más alta de IgG (ver la Tabla 5). Se depositan como células individuales células B IgG+CD19+ e IgG-CD138+ murinas.
Pueden marcarse células B IgG+ murinas con el anticuerpo 227 anti-IgG de ratón (Ab 227); las células B IgG+ de hámster pueden marcarse con el anticuerpo 213 anti-IgG de hámster (Ab 213) y/o el anticuerpo 225 anti-IgG de hámster (Ab 225) y las células B de conejo pueden marcarse con el anticuerpo 184 anti-anticuerpo IgG (ver la Tabla 4).
Tabla 4: Marcaje de inmunofluorescencia de células B -la tabla presenta la fracción marcada media de la población de células B murinas (A-E), células B de hámster (F-H) y las células B de conejo (I-J).
Marcaje de IgG único
marcaje IgG+CD19 marcaje IgG+IgM
A
IgG+ AB 185 PE 17 % ± 3 % n=4 - IgG+IgM+ AB 185 PE, AB 219 APC 12 % n= 1
B
IgG+ AB 215 APC 12 % ± 3 % n=5 IgG+CD19+ AB 215 APC, AB 218 PE 11 % n=1 IgG+IgM+ AB 215 APC, AB 200 PE 14 % n= 1
C
IgG+ AB 217 FITC 17 % ± 4 % n=7 IgG+CD19+ AB 217 FITC, AB 218 PE 10 % n=1 IgG+IgM+ AB 217 FITC, AB 200 PE 19 % n= 1
D
IgG+ AB 222 FITC 18 % ± 2 % n=3 IgG+CD19+ AB 222 FITC, AB 218 PE 15 % n=1 IgG+IgM+ AB 222 FITC, AB 200 PE 14 % n= 1
E
IgG+ AB 227 FITC 0,8 % ± 0,3 % n= 13 IgG+CD19+ AB 227 FITC, AB 218 PE 0.5 % n=1 IgG+IgM+ AB 227 FITC, AB 200 PE 0,2 % n= 1
F
IgG+ AB 212 FITC 43 % ± 6 % n=7 ningún marcador conocido de células B IgG+IgM+ AB 212 FITC, AB 223 APC 43 % n= 1
G
IgG+ AB 213 APC 0,9 % ± 0,4 % n=27 ningún marcador conocido de células B IgG+IgM+ AB 213 APC, AB 224 FITC 0,07 % n= 1
H
IgG+ AB 225 PE 17 % ± 3 % n=5 ningún marcador conocido de células B IgG+IgM+ AB 225 PE, AB 224 FITC 0,7 % n= 1
I
IgG+ AB 120 PE > 10 % - -
J
IgG+ AB 184 FITC - -
0,3 -2 %
AB 120 -anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Southern Biotech 4030-09 AB 184 -anticuerpo Fc de cabra anti-IgG de conejo AbDSerotech STAR121F AB 185 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Caltag M35004-3 AB 200 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Invitrogen M31504 AB 212 -anticuerpo de cabra anti-IgG de hámster AbDSerotech STAR79F AB 213 -anticuerpo de ratón anti-IgG de hámster Becton Dickinson 554010 AB 215 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma B 0529 AB 217 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón AbDSerotech STAR120F AB 218 -anticuerpo de rata anti-CD19 de ratón Abcam ab22480 AB 219 -anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Rockland 710-1607 AB 222 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Abcam ab7064 AB 223 -anticuerpo de ratón anti-IgM de hámster Becton Dickinson 554035 AB 224 -anticuerpo de ratón anti-IgM de hámster Becton Dickinson 554033 AB 225 -anticuerpo de ratón anti-IgG de hámster Becton Dickinson 554056 AB 227 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma F 8264 FE: Ficoeritrina AFC: Aloficocianina ITF: Isotiocianato de fluoresceína
Debe indicarse que no pudieron utilizarse todos los anticuerpos para el marcaje debido a su baja o nula
especificidad.
Las células B murinas pueden marcarse con el anticuerpo 227 anti-IgG; las células B de hámster pueden marcarse con el anticuerpo 213 anti-IgG.
Las células B IgG+CD19+ murinas pueden marcarse con los anticuerpos 227 y 218, las células B IgG+IgM- murinas pueden marcarse con los anticuerpos 227 y 219, las células B IgG+IgM- de hámster pueden marcarse con los anticuerpos 213 y 224, las células B IgG+ de conejo pueden marcarse con el anticuerpo 184,
10 las células B IgG+IgM- de conejo pueden marcarse con los anticuerpos 184 y 254 y SA 263, las células B IgG+CD138+ de conejo pueden marcarse con los anticuerpos 259 y 256.
Las células B murinas pueden marcarse con los anticuerpos 235 ó 236 anti-CD27 (AB 235, AB 236), el anticuerpo 192 anti-CD38 (AB 192), el anticuerpo 233 anti-CD138 (AB 233) y el anticuerpo 246 anti-CD268 (AB 246).
15 Tabla 5: Marcaje de inmunofluorescencia para la determinación de células B maduras de ratón (A-J), de hámster (K) y de conejo (L-N).
marcaje
marcaje de inmunofluorescencia para la separación de células B porcentaje del total de células viables (%)
A
IgG+CD19+ AB 227 FITC, AB 218 PE 0,5 ± 0,2 n=14
B
IgG+CD38+ AB 227 FITC, AB 192 PE 0,8 ± 0,5 n= 9
C
IgG+CD138+ -AB 227 FITC, AB 233 PE 0,06 ± 0,07 n= 6
D
IgGCD138+ -AB 227 FITC, AB 233 PE 0,6 ± 0,5 n=6
E
IgG+CD27+ AB 227 FITC, AB 235 PE 0,1 ± 0,1 n= 8
F
CD27+CD138+ -AB 236 A647, AB 233 PE 1,5 ± 0,5 n= 2
G
CD27+IgG+CD3--AB 235 PE, AB 227 FITC, AB 241 A647 0,10 ± 0,04 n= 3
H
CD3-CD27+ -AB 189 FITC, AB 235 PE 1,33 n= 1
I
IgG+CD268+ -AB 227 FITC, AB 246 A647 0,8 n= 1
J
CD38+CD3--AB 192 PE, AB 189 FITC 12 ± 7 n= 2
K
IgG+IgM--AB 213 A647, AB 224 FITC 0,6 ± 0,1 n= 15
L
IgG+ -AB 184 FITC 0,6 ± 0,2, n= 5
M
IgG+IgM--AB 184 FITC, AB 254 Biotina, SA 263 PE 0,4 ± 0,2, n=2
N
IgG+CD138+ -AB 259, AB 256 PE 0,3 ± 0,1, n= 5
AB 184 -anticuerpo Fc de cabra anti-IgG de conejo AbD Serotech STAR121F AB 189 -anticuerpo de hámster anti-CD3 de ratón Becton Dickinson 553062 AB 192 -anticuerpo de rata anti-CD38 de ratón Becton Dickinson 553764 AB 213 -anticuerpo de ratón anti-IgG de hámster Becton Dickinson 554010 AB 218 -anticuerpo de rata anti-CD19 de ratón Abcam ab22480 AB 224 -anticuerpo de ratón anti-IgM de hámster Becton Dickinson 554033 AB 227 -anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma F 8264 AB 233 -anticuerpo de rata anti-CD38 de ratón Becton Dickinson 553714
AB 235 -anticuerpo de hámster anti-CD27 de ratón Becton Dickinson 558754 AB 236 -anticuerpo de hámster anti-CD27 de ratón Becton Dickinson 558753 AB 241 -anticuerpo de hámster anti-CD3 de ratón Becton Dickinson 553060 AB 246 -anticuerpo de rata anti-CD38 de ratón eBioscience 51-5943 AB 254 -anticuerpo de ratón anti-IgM de conejo Becton Dickinson preparado a medida AB 256 -anticuerpo de cabra anti-IgG de rata Southern Biotech 3030-09 AB 259 -anticuerpo de rata anti-CD38 de conejo Roche Glycart AG SA 263 -Estreptavidina Invitrogen S866 A647: Alexa Fluor® 647 ITF: Isotiocianato de fluoresceína
En una realización, el método comprende la etapa de reducir el número de macrófagos y enriquecer en células B secretoras de anticuerpos específicamente ligantes de un antígeno diana.
Depósito de células individuales:
El método informado en la presente memoria comprende la etapa de depositar las células B como células individuales. En una realización, el depósito como células individuales se lleva a cabo mediante separación celular 10 activada por fluorescencia (FACS). El marcaje requerido para el depósito de células individuales por FACS puede llevarse a cabo tal como se ha indicado en la sección anterior.
En una realización, se depositan como células individuales células B marcadas específicamente. En una realización adicional, el marcaje es un marcaje de marcadores de superficie celular con anticuerpos marcados 15 fluorescentemente. En otra realización, el método informado en la presente memoria proporciona anticuerpos monoclonales. En una realización, se depositan como células individuales células B maduras.
Se ha encontrado que una etapa adicional de centrifugación tras el depósito como células individuales y antes del cocultivo proporciona un número incrementado de células secretoras de anticuerpos (animal experimental ejemplar 20 con locus de inmunoglobulina humana, ver la Tabla 6).
Tabla 6: Pocillos positivos para IgG con y sin la etapa de centrifugación después del depósito de células individuales
ELISA de huCk
con etapa de centrifugación sin etapa de centrifugación
Pocillos huCk+ [n]
9 1
pocillos huCk+ [% del total de pocillos]
13 1
conc. de huCk de todos los pocillos huCk+ [promedio de ng/ml]
76,4 9,7
25 De esta manera, en una realización el método informado en la presente memoria comprende la etapa de incubar las células B en medio B5 EL-4 durante aproximadamente una hora antes del depósito de células individuales. En otra realización, el método comprende la etapa de centrifugar las células depositadas individuales antes del cocultivo. En una realización, la centrifugación es durante 5 minutos a 300xg.
30 Cocultivo:
La etapa de cocultivo con células nodriza puede estar precedida o seguida de varias etapas adicionales.
En otra realización, las células B depósitadas individuales se cocultivan con células nodriza en presencia de una
35 mezcla nutriente. En otra realización, las células B se cocultivan con células nodriza B5 EL-4 murinas. Mediante el marcaje de inmunofluorescencia adecuado, tal como se ha descrito de manera general anteriormente, puede conseguirse un incremento del rendimiento en la etapa de cocultivo (número de pocillos IgG+, así como de la concentración de IgG) y también un enriquecimiento o un aislamiento de las células B IgG+ maduras a partir de CMSP.
40 Con el depósito de células B IgG+CD19+ y/o IgG+CD38+ individuales a partir de CMSP recién aisladas, puede obtenerse el número máximo de pocillos IgG+. Con el depósito de células B IgG+CD19+ y/o IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ individuales tras el empobrecimiento en macrófagos o en células específicas de KHL, pueden obtenerse buenos resultados. Con el depósito de células B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ individuales tras el
45 empobrecimiento en células B específicas de antígeno, pueden obtenerse los mejores resultados. De esta manera, en una realización, se depositan como células individuales células B IgG+CD19+, células B IgG+CD38+ y/o células B IgG-CD138+.
Se ha encontrado que el depósito de células individuales basado en el marcaje indicado de manera general
5 anteriormente, resulta en la fracción máxima de pocillos IgG+ y en pocillos con la concentración de IgG más alta. De esta manera, las células B IgG+CD19+ y/o IgG-CD138+ murinas se depositan como células individuales. Las células B IgG+IgM- de hámster se depositan como células individuales. En una realización, se depositan como células individuales células B de conejo IgG+ y/o IgG+CD138+ y/o CD138+ y/o IgG+IgM-.
10 Tabla 7: Rendimiento en el cocultivo dependiente del marcaje de inmunofluorescencia.
marcaje
nges pocillos IgG+ de nges (%) concentración (ng/ml) de IgG
Aisl.
Abr. Anr. Isol. Abr. Anr.
ratón
IgG+CD19+ 356/ 356/324 45 50 37 68 46 42
IgG+
-/144/144 - 32 7 - 34 31
IgG+CD38+
72/190/190 36 41 43 37 26 27
IgG+ CD138+
72/72/72 3 13 12 22 59 43
marcaje
nges pocillos IgG+ de nges (%) concentración (ng/ml) de IgG
IgG-CD138+
36/108/48 19 52 37 55 31 51
IgG+CD27+
64/64/64 4 28 20 102 54 32
CD27+CD1 38+
-/32/- - 6 - - 135 -
CD27+IgG+ CD3
72/72/72 14 0 14 4 0 0
CD3CD27+
-/32/- - 13 - - 29 -
hámster
IgG+ CD268+ -/72/- - 35 - - 93 -
IgG+IgM-
-/216/216 - 17 22 - 78 93
IgG+
-/216/216 - 10 35 1 71 64
conejo
IgG+ -/1512/1307 - 33 28 - 59 60
IgG+IgM-
-/76/- - 29 - - 5 -
CD138+
-/2016/- - 14 - - 16 -
IgG+CD138+
-/168/- - 37 - - 64 -
Para las células B murinas con el depósito de células IgG+CD19+ individuales tras cada etapa de enriquecimiento y/o empobrecimiento, puede obtenerse el número máximo de pocillos IgG+ tras el cocultivo. Alternativamente, con el 15 depósito de células IgG-CD138+ individuales, pueden obtenerse pocillos con la máxima concentración de IgG en el sobrenadante. El depósito de células IgG-CD138+ individuales puede utilizarse para las células B procedentes de animales inmunizados. El depósito de células IgG+CD19+ individuales puede utilizarse para las células B procedentes de animales no inmunizados. El depósito de células IgG+IgM- individuales puede utilizarse para las células B de hámster de animales inmunizados y no inmunizados. El depósito como células individuales de células B
20 IgG+ y/o IgG+CD138+ y/o CD138+ y/o IgG+IgM- puede utilizarse para las células B de conejo.
El marcaje de inmunofluorescencia utilizado para las células B obtenidas de sangre de un animal experimental también puede utilizarse para el marcaje de células B obtenidas del bazo y de otros órganos inmunológicos de un animal experimental, tal como el ratón, el hámster y el conejo. Para las células B de ratón, la fracción de células B
25 IgG+ de bazo era de aproximadamente 0,8%, en comparación con 0,4% de células IgG+CD19+. Para las células B de hámster, estos números eran 1,9% y 0,5% de células IgG+IgM-, respectivamente. En la sangre de conejo se encontraron 0,2% de células IgG+ tras el empobrecimiento en macrófagos. Las placas de Peyer de conejo mostraron 0,4% de células IgG+ y el bazo mostró 0,3% de células IgG+ tras el empobrecimiento en macrófagos.
Con el método informado en la presente memoria, tras aproximadamente siete (7) días, es decir, 5, 6, 7 ó 8 días, especialmente 7 ó 8 días, de cocultivo, pueden obtenerse concentraciones de anticuerpos de entre aproximadamente 30 ng/ml y 15 mg/ml ó más (valor promedio de aproximadamente 500 ng/ml). Con cantidad de anticuerpos proporcionada de esta maenra, puede llevarse a cabo un número mayor de análisis diferentes para 5 caracterizar el anticuerpo, por ejemplo con respecto a la especificidad de unión, en mayor detalle. Con la caracterización mejorada de los anticuerpos en esta etapa temprana del procedimiento de cribado/selección, resulta posible reducir el número de aislamientos de ácidos nucleicos y las reacciones de secuenciación que resulta necesario realizar. Además, el clon de células B proporciona una cantidad de ARNm codificante de región variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal que permite la utilización de cebadores de PCR degenerados
10 y evita la necesidad de un cebador altamente específico. Además, se reduce el número requerido de ciclos de PCR.
En una realización, la mezcla nutriente es un sobrenadante de cultivo de timocitos.
Debido al origen de la mezcla nutriente, que se derivad el sobrenadante de timocitos en cultivo (sobrenadante del
15 cultivo de timocitos -SCT), se producen considerables variaciones entre lotes. Para superar esta desventaja, se ha desarrollado una mezcla nutriente sintética que consiste de componentes sintéticos. Se conoce de Zubler et al. una mezcla nutriente que consiste de IL-1β (interleuquina1-beta), TNFα (factor alfa de necrosis tumoral), IL-2 (interleuquina-2) e IL-10 (interleuquina-10).
20 En la presente memoria se informa de una mezcla nutriente sintética para el cocultivo de células B depositadas como células individuales y células nodriza. También se informa en la presente memoria de aditivos específicos de células B para la mezcla nutriente sintética para incrementar la cantidad de anticuerpos secretados por las células B respectivas. Concomitantemente, las células de alta producción contienen más ARNm, lo que a su vez facilita la transcripción inversa y secuenciación del ácido nucleico codificante, por ejemplo con un conjunto de cebadores no
25 específicos redundantes.
Mediante la adición de SAC (células de Staphylococcus aureus cepa Cowans), puede incrementarse el número de células B secretoras de anticuerpos y la concentración promedio de IgG en el sobrenadante tras el cocultivo. Se ha encontrado que para la adición de SAC en el cocultivo, puede definirse un intervalo de concentraciones, ya que
30 concentraciones tanto más pequeñas como más grandes de SAC reducen la cantidad de anticuerpo secretado.
Tabla 8a: Resultados de un ELISA de huCk o de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B obtenidas de un animal experimental con locus de IgG humana o de un conejo de tipo salvaje (NZW) cocultivadas con células nodriza B5 EL-4 y SCT como mezcla nutriente con o sin SAC añadido
SCT
SCT+ SAC
Pocillos huCk+ [n]
7 45
pocillos huCk+ [% del total de pocillos] conc. de huCk de todos los pocillos huCk+ [Ø ng/ml]
5 89,1 31 41,0
SAC 1:5000
SAC 1:10000 SAC 1:20000 SAC 1:40000
pocillos rbIgG+ [n]
13 15 27 30
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
15 18 32 36
conc. de rblgG de todos los pocillos rbIgG+ [Ø ng/ml]
149,0 159,1 233,7 197,2
con
SAC 1:20000 SAC 1:50000 SAC 1:100000 SAC 1: 150000
pocillos rbIgG+ [n]
1 2 75 93 92 72
con
SAC 1:20000 SAC 1:50000 SAC 1:100000 SAC 1: 150000
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
5 30 37 37 29
conc. de rbIgG de todos los pocillos rbIgG+ [Ø ng/ml]
199 665 742 774 668
Puede observarse que una proporción SAC de entre 1:20.000 y 1:150.000 proporciona un número incrementado de pocillos IgG+, en el que una proporción de entre 1:50.000 y 1:100.000 muestra los números más altos.
5 Se ha observado que mediante la adición de SAC a la mezcla nutriente, se modificaba inesperadamente el cocultivo de las células B de manera que sólo las células B depositadas como células individuales resultaban beneficiadas en su crecimiento, mientras que el crecimiento de las células B resultaba inhibido al utilizar una mezcla de PBL (por ejemplo células B y células T endógenas) para el cocultivo.
10 Tabla 8b: Resultados de un ELISA de huCk o de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de PBL y de células B depositadas como células individuales cocultivadas con células nodriza B5 EL-4 y SCT como mezcla nutriente con SAC añadido
ELISA de rbIgG
PBL* (30 celdas) células B rbIgG+ depositadas individualmente
pocillos rbIgG+ [n]
8 104
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
6 58
conc. de rbIgG de todos los pocillos huCk+ [promedio de ng/ml]
55,0 129,2
* empobrecido en macrófagos
15 En las Tablas 9 y 10 se proporcionan datos adicionales obtenidos con diferentes mezclas nutrientes.
En una realización, la mezcla nutriente para el cocultivo de células B comprende IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e IL21 (interleuquina-21). En una realización, la mezcla nutriente para el cocultivo de células B comprende IL-1β, TNFα, IL2, IL-10 y SAC. En otra realización, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 y IL-21 son IL-1β, TNFα, IL-2, IL10 y IL-21 murinos
20 recombinantes.
La mezcla nutriente para el cocultivo de células B murinas comprende IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α y BAFF. Se añadió BAF a una concentración de 5 ng/ml.
25 La mezcla nutriente para el cocultivo de células B de hámster comprende IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α, IL-6 y SAC. Se añadió IL-6 a una concentración de 10 ng/ml. Se añadió SAC en una proporción de 1:75.000.
Tabla 9: Resultados de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B cocultivadas con células nodriza B5 EL-4 y diferentes mezclas nutrientes sintéticas que comprendían sustancias murinas recombinantes en 30 diferentes combinaciones
SCT de conejo, SAC
IL-6, IL-1β, TNFα, IL2, IL-10 IL-6, TNFα, IL-2, IL-10 IL-6, IL-1β, IL-2, IL-10 IL-6, IL-1β, TNFα, IL-2 IL-6, IL-1β, TNFα, IL-10 IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10
pocillos rbIgG+ [n]
37 24 12 16 18 23 24
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
51 33 17 22 25 32 33

Table 10: Pocillos IgG+ de sobrenadantes de cultivo celular de células B cocultivadas con células nodriza B5 EL-4 y SCT o una mezcla nutriente que comprende sustancias murinas recombinantes y SAC (rb=conejo, m=ratón). pocillos rbIgG+ [n]
SCT+ SAC
IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 + SAC
puro
64 55
+ mIL21
22 25
+ mIL10
78 61
+ mIL21 + mIL10
57 93
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
puro
25 22
+ mIL21
9 10
+ mIL10
31 24
+ mIL21 + mIL10
23 37
conc. de rbIgG de todos los pocillos rbIgG+ [Ø ng/ml]
puro
312,3 662,3
+ mIL21
263,7 541,1
+ mIL10
553,0 522,3
+ mIL21 + mIL10
422,6 307,5
Un cocultivo de células nodriza y células B murinas sin IL-2, sin IL-10, así como sin IL-2 ni IL-10, resulta en un incremento del rendimiento de pocillos IgG+, a pesar de que se reduce la concentración de IgG. Sin TNFα también se reduce la concentración de IgG. Sin IL-1β no puede encontrarse IgG en el sobrenadante.
10 Un cocultivo de células B de hámster sin IL-2 y sin IL-10, respectivamente, resulta en pocillos IgG+ sin concentraciones detectables de IgG. En contraste con lo anterior, en un cocultivo sin IL-1 ni IL-10, prácticamente no puede detectarse crecimiento de células B. En ausencia de TNF-α o de IL-1β, no puede determinarse secreción de IgG.
15 En presencia de células nodriza B5 EL-4, resultan necesarios por lo menos IL-1β y TNF-α para el cocultivo de células B de ratón, de hámster y de conejo. Pueden omitirse IL-2 e IL-10 en el cocultivo de las células murinas. Las células B de hámster pueden cultivarse en ausencia de IL-2 ó IL-10. Las células B de conejo pueden cultivarse en ausencia de IL-2 ó IL-10 ó IL-6.
20 Para las células B murinas y de hámster, la adición de IL-4 a la mezcla nutriente incrementa el número de pocillos IgG+, así como la concentración de IgG en el sobrenadante. De esta manera, la mezcla nutriente para el cocultivo de células B murinas o de hámster comprende IL-4.
25 La adición de IL-6 a la mezcla nutriente para el cocultivo de células B murinas o células B de hámster resulta en un número incrementado de pocillos IgG+ o en una concentración incrementada de IgG, respectivamente. De esta manera, la mezcla nutriente para el cocultivo de células B murinas o células B de hámster comprende IL-6. En una realización, se añade IL-6 a una concentración de 50 ng/ml. En una realización, se añade IL-6 a una concentración de 10 ng/ml, en caso de requerirse una concentración elevada de IgG. En una realización, la adición de IL-6 se
5 realiza tras tres días de cocultivo de las células B seleccionadas y células B5 EL-4. La adición de un inhibidor de un determinado canal del potasio (=PAP-1, 5-(4-fenoxibutoxi)psoraleno) inesperadamente incrementa la secreción de rbIgG de las células B de una manera dependiente de la concentración sin reducir el número de células B. Habitualmente, una citoquina que induce productividad de rbIgG puede correlacionarse con una reducción del número total de clones de células B. Éste no fue el caso con PAP-1.
10 Tabla 11: Resultados de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B cocultivadas con células nodriza B5 EL-4 en presencia de SCT y SAC (=con) y diferentes concentraciones de PAP-1. DMSO: solvente para PAP-1 (1 mM).
con
0,01 mM 0,1 mM 1 mM 10 mM DMSO
pocillos rbIgG+ [n]
53 72 69 93 80 76
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
21 29 27 37 32 30
conc. de rbIgG de todos los pocillos huCk+ [promedio de ng/ml]
195,8 289,0 452,9 579,5 890,7 225,3
Con una concentración de SCT de 7,5%, puede obtenerse la concentración más alta de IgG en el sobrenadante.
Tabla 12: Influencia de SCT sobre el cocultivo. Una concentración de SCT de 7,5% resulta ventajosa en términos de crecimiento y productividad de células B
5% SCT
7,5% SCT 10% SCT
pocillos rbIgG+ [n]
71 71 81
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
28 28 32
conc. de rbIgG de todos los pocillos rbIgG+ [Ø ng/ml]
246 512 372
Con 30.000 células nodriza en cada pocillo de una placa de 96 pocillos puede obtenerse el número más alto de pocillos IgG+ en combinación con una concentración elevada de IgG en el sobrenadante.
25 Tabla 13: Influencia de la cantidad de células nodriza B5 EL-4 sobre el cocultivo.
20000
22000 24000 30000 35000 40000
pocillos rbIgG+ [n]
71 73 78 78 73 38
pocillos rbIgG+ [% del total de pocillos]
28 29 31 31 29 15
conc. de rbIgG de todos los pocillos rbIgG+ [Ø ng/ml]
246 319 346 418 457 656
En una realización, el cocultivo es en placas multipocillo de poliestireno con pocillos con fondo redondo. El volumen de trabajo de los pocillos es, en una realización, de entre 50 y 250 ml. En una realización, los pocillos se recubren 30 por lo menos parcialmente con un sustrato no fibroso preparado a partir de una mezcla de resina plástica polimérica y moléculas anfipáticas, en la que la molécula anfipática comprende una fracción hidrofílica y una región hidrofóbica, en el que las regiones hidrofóbicas se encuentran ancladas dentro del sustrato y las fracciones hidrofílicas se encuentran expuestas sobre el sustrato. En una realización, las moléculas anfipáticas se seleccionan de entre
alquilamina etoxilada, poli(etilenimina), octildecamina o mezclas de las mismas (ver, por ejemplo, la patente EP nº 1 860 181).
Caracterización de las células cocultivadas:
Para la determinación (cualitativa y cuantitativa) de las IgG secretadas tras el cocultivo, generalmente pueden utilizarse todos los métodos conocidos por el experto en la materia, tales como un ELISA. En una realización se utiliza un ELISA. Para la determinación de la IgG secretada por células B murinas, se utiliza un ELISA con los anticuerpos anti-IgG AB 216 (anticuerpo de captura) y AB 215 (anticuerpo trazador). Para la determinación de la IgG secretada por las células B de hámster, se utilizó un ELISA con los anticuerpos monoclonales AB 220 (anticuerpo de captura) y AB 213 (anticuerpo trazador).
Dependiendo de los resultados de caracterización, puede obtenerse un clon de células B, es decir, células B seleccionadas. El término "clon" se refiere a una población de células B en división y secretoras de anticuerpos que proceden/se originan de un única célula B. De esta manera, un clon de células B produce un anticuerpo monoclonal.
Aislamiento de ARNm, clonación y secuenciación:
A partir de las células B, puede aislarse el ARNm total y transcribirse en ADNc. Con cebadores específicos, puede amplificarse el ácido nucleico codificante de las regiones VH y VL afines. Mediante la secuenciación del ácido nucleico obtenido de esta manera puede confirmarse que los anticuerpos obtenidos son anticuerpos monoclonales en la mayoría de casos (71% a 95%). Además, puede conocerse a partir de la secuenciación de las células B individuales que no se obtiene prácticamente ninguna secuencia idéntica. De esta manera, el método proporciona anticuerpos altamente diversos que se unen al mismo antígeno.
Los cebadores utilizados para la amplificación del ácido nucleico codificante de VH pueden utilizarse para el ADNc obtenido a partir de células del ratón NMRI, del hámster armenio, del ratón Balb/c, así como del hámster sirio y el conejo.
En una realización, la secuencia de aminoácidos se deriva del ácido nucleico codificante de VH amplificado y los puntos de inicio y final exactos se identifican mediante la localización de las secuencias de aminoácidos EVQL/QVQL a VSS (región de VH) y DIVM/DIQM a KLEIK (región de VL).
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste de una o más cadenas polipeptídicas codificadas sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los diferentes genes de región constante, así como la multitud de genes de región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden encontrarse en una diversidad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como cadenas sencillas (scFv), diacuerpos, formas monovalentes, bivalentes, trivalentes o tetravalentes, y también en forma biespecífica, triespecífica o tetraespecífica (por ejemplo Huston J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; Bird R.E. et al., Science 242:423-426, 1988; en general Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2a edición, 1984, y Hunkapiller T. y Hood L., Nature 323:15-16, 1986).
En la presente memoria también se informa de un método para producir un anticuerpo, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una población de células B maduras obtenidas a partir de la sangre de un conejo, b) teñir las células B IgG+ y/o las células B CD138+ de la población de células B con por lo menos un pigmento fluorescente (en una realización con uno a tres, o dos a tres pigmentos fluorescentes), c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar células individuales de la población teñida de células B en recipientes individuales (en una realización, el recipiente es un pocillo de una placa multipocillo), d) cultivar las células B individuales depositadas en presencia de células nodriza y una mezcla nutriente (en una realización, las células nodriza son células B5 EL-4; en una realización la mezcla nutriente es TSN natural; en una realización, la mezcla nutriente es una mezcla nutriente sintética), e) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individuales, f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos de unión específica mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera un ácido nucleico codificante de dominio variable de cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal, g) introducir el ácido nucleico codificante del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y de esta manera producir un anticuerpo.
Un "casete de expresión" se refiere a un constructo que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como un promotor y un sitio de poliadenilación, para la expresión de por lo menos el ácido nucleico contenido en una célula.
La expresión "animal experimental" se refiere a un mamífero no humano. En una realización, el animal experimental se selecciona de entre la rata, el ratón, el hámster, el conejo, primates no humanos, la oveja, el perro, la vaca, el pollo, los anfibios y los reptiles.
Los ejemplos y listado de secuencias siguientes se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Ejemplos Ejemplo 1 Medios y tampones:
Tampón de bloqueo para ELISA que comprende 1X PBS y BSA al 1%. Tampón de recubrimiento para ELISA que comprende 4,29 g de Na2CO3*10 H2O y 2,93g de NaHCO3; adición de agua hasta un volumen final de 1 litro, pH 9,6 ajustado con HCl 2 N.
Solución de etanol para el aislamiento del ARN que comprende etanol al 70% o etanol al 80%. Tampón FACS para la tinción inmunofluorescente que comprende 1X PBS y BSA al 0,1%. Tampón IMDM para ELISA que comprende 1X PBS, IMDM al 5% y BSA al 0,5%. Tampón de incubación 1 para ELISA que comprende 1X PBS y CroteinC al 0,5%. Tampón de incubación 2 para ELISA que comprende 1X PBS, CroteinC al 0,5% y Tween-20 al 0,02%. Tampón de incubación 3 para ELISA que comprende 1X PBS y BSA al 0,1%. Tampón de incubación 4 para ELISA que comprende 1X PBS, BSA al 0,5%, Tween al 0,05%, PBS (10X), KH2PO4
0,01 M, Na2HPO4 0,1 M, NaCl 1,37 M, KCl 0,027 M, pH 7,0. El tampón de PCR comprende KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 9,0. Tampón de lavado 1 para ELISA que comprende 1X PBS y Tween-20 al 0,05%. Tampón de lavado 2 para ELISA que comprende 1X PBS y Tween-20 al 0,1%. Tampón de lavado 3 para ELISA que comprende NaCl al 0,9% y Tween-20 al 0,05%. Medio de B5 EL-4 que comprende RPMI 1640, FCS al 10%, mezcla de glutamina/penicilina/estreptomicina al 1%, piruvato sódico 100 mM al 2% y tampón HEPES 1 M al 1%. Ejemplo 2 Cuidados e inmunización de los animales Los animales experimentales se cuidaron siguiendo la legislación de protección animal alemana (TierSCHG), así
como las directrices europeas correspondientes. Los ratones y hámsters se recibieron con edades de entre 6 y 8 semanas y se inmunizaron antes de cumplir las 12 semanas. Inicialmente el antígeno se aplicó con adyuvante completo de Freund (ACF). Las aplicaciones posteriormente se realizaron con adyuvante incompleto de Freund (AIF). La emulsión que contenía antígenos se aplicó por vía subcutánea, comprendiendo la emulsión entre 50 y 100 mg de antígeno, según el peso del animal experimental receptor.
Durante la inmunización, se determinó el título sérico de anticuerpos utilizando un ensayo específico de antígeno. A un título de anticuerpo con una IC50 de 1:10.000, se extrajo sangre o el bazo del animal inmunizado. Para la reactivación de las células B específicas de antígeno se aplicaron por vía intravenosa 30 a 50 mg del antígeno en los animales experimentales tres días antes de extraer sangre o el bazo.
Ejemplo 3
Extracción de órganos, sangre y macrófagos
Se obtuvo sangre de los animales experimentales mediante punción de la vena retrobulbar.
Se aislaron macrófagos a partir de la sangre obtenida. De los ratones y los hámsters se obtuvieron aproximadamente 3x105 macrófagos de cada animal.
En caso de requerir una mayor cantidad de macrófagos, se extraían las células necesarias de la cavidad intraperitoneal de los animales experimentales. Para ello, los animales debían ser de por lo menos 3 meses de edad. Para la extracción, se introdujeron en la cavidad intraperitoneal 5 ml de medio de B5 EL-4 a una temperatura de 37ºC. Tras atar la cavidad durante 5 minutos, se extraía la solución que contenía las células.
Ejemplo 4
Cultivo de células B5 KL-4
Las células B5 EL-4 congeladas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37ºC y se diluyeron con 10 ml de medio de B5 EL-4. Tras centrifugar a 300xg durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en medio. Tras una etapa adicional de centrifugación, se descartó nuevamente el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 1 ml de medio.
Las células B5 EL-4 se inocularon a una densidad celular de 3x104 células/ml en matraces de cultivo de 175 ml. Se determinó la densidad celular cada dos días y se ajustó a 3x104 células/ml. Las células presentan un tiempo de duplicación de aproximadamente 12 horas y deben cultivarse a una densidad celular inferior a 5x105 células/ml debido a que a una densidad celular más alta se pierden las propiedades estimulantes de las células.
Tras alcanzar el número total de células aproximadamente 1,5x109, se extrajo el medio mediante centrifugación. A continuación, las células se irradiaron con 50 gray (5.000 rad). Tras determinar el número de células viables mediante tinción con azul tripán, se dividieron las células en alícuotas de entre 5x106 y 1x107 células y se congelaron a -80ºC.
Para el cocultivo, las células se descongelaron y se lavaron dos veces con medio de B5 EL-4. Para la determinación del número de células viables, la suspensión celular se diluyó 1:10 con solución de azul tripán al 0,4% (p/v) y se transfirieron 10 ml de la mezcla a una cámara de recuento de Neubauer y se realizó un recuento del número de células.
Centrifugación en gradiente de densidad
Se llevó a cabo el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante separación en gradiente de densidad con Lympholyte® siguiendo las instrucciones del fabricante (Lympholyte® para mamífero, Cedarlane).
La sangre extraída se diluyó 2:1 con solución salina tamponada con fosfato (SSTF). En un vial para centrífuga se proporcionó el mismo volumen de medio de separación de densidad y la sangre diluida se añadió cuidadosamente a través de la pared del vial. Se centrifugó el vial durante 20 minutos a 800xg sin freno. Los linfocitos se obtuvieron de la capa intermedia blanca. Las células extraídas se suplementaron con 10 ml de PBS y se centrifugaron a 800xg durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió, se lavó y se centrifugó. El pellet final se resuspendió en PBS.
Ejemplo 6
Lisis hipotónica de glóbulos rojos
Para la rotura de los glóbulos rojos mediante lisis hipotónica, una solución de cloruro amónico (BD LyseTM) se diluyó
1: 10 con agua y se añadió a una proporción de 1:16 a sangre completa. Para la lisis de los glóbulos rojos, la mezcla se incubó durante 15 minutos en la oscuridad. Para la separación de los residuos celulares respecto de las células intactas, la solución se centrifugó durante 10 minutos a 800xg. Se descartó el sobrenadante, se resuspendió el pellet en PBS, se lavó nuevamente, se centrifugó y se resuspendió el pellet en PBS.
Ejemplo 7
Preparación de células a partir de los órganos internos de un animal experimental
Para la preparación de células de bazo y de timo, se disecció el órgano respectivo en una placa de Petri y se introdujeron las células en PBS. Para la extracción del tejido restante, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz de 100 µm. Para obtener linfocitos a partir de las células de bazo, se utilizó la centrifugación en gradiente de densidad. Para las células de timo no resultó necesaria ninguna etapa adicional de enriquecimiento.
Ejemplo 8
Empobrecimiento en macrófagos
La suspensión celular se ajustó a una densidad celular de 2x106 células/ml y se añadieron tres milímetros a cada pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos. La placa se incubó durante 60 a 90 minutos a 37ºC. A continuación, el sobrenadante que contenía linfocitos se transfirió a un vial para centrifugación y se centrifugó a 800xg durante 10 minutos. El pellet se resuspendió en PBS.
Ejemplo 9
Empobrecimiento en células B específicas de KHL
Se incubaron cuatro mililitros de una solución que contenía hemocianina de lapa americana (HLA) con tampón de recubrimiento a una concentración de 2 mg/ml en los pocillos de una placa multipocillo durante la noche a temperatura ambiente. Antes de la etapa de empobrecimiento, se extrajo el sobrenadante y los pocillos se lavaron dos veces con PBS. A continuación, se ajustó la densidad de células sanguíneas a 2x106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa multipocillo. Después, la placa multipocillo se incubó durante 60 a 90 minutos a 37ºC. Se transfirió el sobrenadante a un vial para centrifugación y los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se agruparon los sobrenadantes en el vial para centrifugación. Las células se peletizaron mediante centrifugación a 800xg durante 10 minutos y el pellet se resuspendió en PBS.
Ejemplo 10
Enriquecimiento en células B específicas de antígeno
Se diluyó el antígeno respectivo con tampón de recubrimiento hasta una concentración final de 2 mg/ml. Se añadieron 3 ml de esta solución al pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Antes de la utilización, se extrajo el sobrenadante y los pocillos se lavaron dos veces con PBS. La solución de células B se ajustó a una densidad de 2x106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos. La placa se incubó durante 60 a 90 minutos a 37ºC. Se extrajo el sobrenadante y los pocillos se lavaron dos a cuatro veces con PBS. Para la recuperación de las células B específicas de antígeno, se añadió 1 ml de una solución de tripsina-EDTA a los pocillos de la placa multipocillo y se incubó durante 10 a 15 minutos a 37ºC. Se detuvo la incubación mediante la adición de medio y el sobrenadante se transfirió a un vial para centrifugación. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS y se agruparon los sobrenadantes con los demás sobrenadantes. Las células se peletizaron mediante centrifugación durante 10 minutos a 800xg. El pellet se resuspendió en PBS.
Ejemplo 11
Cocultivo de células B y células B5 EL-4
El cocultivo se llevó a cabo en placas multipocillo de 96 pocillos con fondo redondo. Se preparó una solución base que comprendía células B5 EL-4 (1,6x106 células/15,2 ml) y citoquinas en el medio de B5 EL-4. Se añadieron 200 ml de la solución base a cada pocillo de la placa multipocillo. A cada pocillo se añadió una única célula B mediante separación celular activada por fluorescencia. Tras la adición de las células B, la placa se centrifugó durante 5 minutos a 300xg. La placa se incubó durante siete días a 37ºC.
Ejemplo 12
Cultivo de células T
Las células T se aislaron del timo de ratones y hámsters de 3-4 semanas de edad, respectivamente. Las células se centrifugaron y se cultivaron o congelaron inmediatamente en alícuotas de 3x107 células. Se sembraron los timocitos con una densidad celular mínima de 5x105 células/ml de medio de B5 EL-4 en matraces de cultivo de 175 ml y se incubaron durante 48 horas a 37ºC.
Ejemplo 13
Cultivo de macrófagos
Se aislaron macrófagos de la cavidad interna de los ratones y los hámsters, respectivamente, con una edad de por lo menos tres meses. Los macrófagos se cultivaron en medio de B5 EL-4 a una densidad celular de por lo menos 1x105 células/ml en matraces de cultivo de 175 ml durante 1,5 horas a 37ºC. Seguidamente se extrajo el medio y los macrófagos adheridos se lavaron con medio de B5 EL-4 caliente y se cultivaron durante 48 horas en 35 ml de medio.
Ejemplo 14
Cocultivo de células T y macrófagos
Se cultivaron células T y macrófagos durante 48 horas en matraces separados. Antes de agrupar las células, las células T se centrifugaron durante 10 minutos a 800xg. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 10 ml de medio. Se ajustaron las células T a una densidad celular mínima de 5x105 células/ml. Por cada ml de medio se añadieron 10 pg de forbol 12 miristato-13-acetato (FMA) y 5 ó 50 ng de fitohemaglutinina M (FHA-M). Antes de agrupar, se extrajo el medio de cultivo de los macrófagos y se añadieron las células a la suspensión de células T en medio fresco. Tras 36 horas de cocultivo, se extrajo el medio de cultivo y se denominó solución CST. Para la eliminación de las células remanentes, la solución CST se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. La solución CST se congeló a -80ºC en alícuotas de 4 ml.
Ejemplo 15
Tinción de inmunofluorescencia
Dependiendo del número de células que debían teñirse, se proporcionaron las células en 100 ml de medio (menos de 106 células) o en 200 ml de medio (más de 106 células), respectivamente. El anticuerpo marcado fluorescente se diluyó con suero al 5% del animal experimental y tampón de FACS hasta un volumen final de 100 ó 200 ml, respectivamente. Se incubó la mezcla de reacción en un estante de rodillos durante 40 minutos a 4ºC. Tras la incubación, se lavaron las células dos veces a 300xg durante 5 minutos. Se resuspendió el pellet en 400 ml de PBS y se filtró a través de un tamiz de 70 µm. La solución filtrada se transfirió a un vial de FACS y directamente antes del experimento de FACS se tiñeron las células muertas mediante la adición de yoduro de propidio (6,25 mg/ml). En caso de que el anticuerpo marcado lo estuviese con biotina, se detectaba en una segunda etapa con estreptavidina con marcaje Alexa.
Ejemplo 16
Cuantificación de IgG
La placa multipocillo de 96 pocillos en la que se llevó a cabo el cocultivo se centrifugó tras siete días de cocultivo a 300xg durante 5 minutos. Se extrajeron 150 ml de sobrenadante y se diluyeron en una proporción de 2:1 con PBS en una segunda placa multipocillo de 96 pocillos.
Se llevó a cabo el ELISA tal como se indica de manera general en el Ejemplo 17.
El anticuerpo se utilizó a una concentración de 50 ng/ml. En el caso de que la DO fuera igual o superior a 1 tras un tiempo de incubación de 5 minutos, se sometía a ensayo una serie de dilución entre 0,8 y 108 ng/ml de IgG.
Ejemplo 17
Detección de IgG específica de antígeno
Los anticuerpos producidos por células B depositadas como células individuales y cocultivadas o de células B obtenidas de un animal experimental inmunizado pueden caracterizarse con respecto a la unión de antígenos específicos. El ELISA se llevó a cabo a temperatura ambiente y la solución de ELISA se incubó entre etapas individuales en un agitador a 20xg. En la primera etapa, el antígeno se unió a los pocillos de una placa multipocillo de 96 pocillos. En el caso de que el antígeno fuese una proteína, se diluyó en tampón de recubrimiento y se aplicó directamente en la placa. Se unieron péptidos antígenos mediante la pareja de unión específica biotina/estreptavidina. Los pocillos de la placa multipocillo ya pueden encontrarse recubiertos con CroteinC (CrC) soluble del fabricante. En caso contrario, los pocillos se incubaron después de la inmovilización del antígeno con 200 ml de tampón de bloqueo. Tras la incubación con 100 ml de solución de antígeno en cada pocillo (placa multipocillo prerecubierta) ó 200 ml de tampón de bloqueo, respectivamente, se eliminó el antígeno no unido o el tampón de bloqueo mediante lavado con tampón de lavado. Los sobrenadantes de células B diluidos se añadieron en un volumen de 100 ml en cada pocillo y se incubaron. Tras la incubación se lavaron los pocillos. A continuación, se añadió el anticuerpo de detección en un volumen de 100 ml en cada pocillo. El anticuerpo podía encontrarse conjugado con peroxidasa de rábano picante o marcado con biotina. El anticuerpo de detección se determinó con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Tras la incubación, la placa multipocillo se lavó y después se añadieron a cada pocillo 50 ml de una solución de sustrato que contenía 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB) y se incubaron durante los periodos indicados en la Tabla X. Se detuvo la reacción enzimática mediante la adición de 50 ml de ácido sulfúrico y se determinó la densidad óptica a 450 nm y a 680 nm con un fotómetro (lector de ELISA Rainbow Thermo) y el software Xread plus.
Ejemplo 18
Aislamiento de ácido ribonucleico (ARN)
Las células a partir de las que debía aislarse el ARN en primer lugar se peletizaron mediante centrifugación. El pellet celular se lisó mediante la adición de 100 ml de tampón RLT con 10 ml/ml de beta-mercaptoetanol. Las células se resuspendieron mediante mezcla múltiple con una pipeta. La solución se transfirió a un pocillo de una placa multipocillo. La placa se agitó brevemente a 200xg y se congeló a -20ºC.
El aislamiento del ARN se llevó a cabo con el kit RNeasy® (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 19
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
La transcripción inversa se llevó a cabo en un volumen de 20 ml. Para cada reacción, se llevó a cabo un control con y sin transcriptasa inversa. En cada reacción se premezclaron 1 ml de dNTP (cada uno a 10 mM), 0,4 ml de oligo(dT)12-18 (0,2 mg) y 0,6 ml de hexámero aleatorio (0,03 mg) y se añadieron a 8,5 ml de ARN en H2O. La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos a 65ºC y directamente después se transfirió a hielo. A continuación, se premezclaron 2 ml de tampón RT (10x), 4 ml de MgCl2 (25 mM), 2 ml de DTT (0,1 M) y 1 ml de ARNasa OutTM (40 unidades) y se añadieron a la mezcla de reacción helada. Tras un tiempo de incubación de 2 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 0,5 ml de transcriptasa inversa SuperscriptTM II (25 unidades). La mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La traducción se llevó a cabo durante 50 minutos a 42ºC. Tras la traducción, la transcriptasa inversa se inactivó mediante incubación durante 15 minutos a 70ºC. El ADNc se almacenó a -20ºC.
Ejemplo 20
Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo con el kit Taq PCR Core (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR se llevó a cabo en un volumen de 20 ml. Las muestras se transfirieron al Mastercycler® a una temperatura de 95ºC.
Ejemplo 21
Secuenciación
Todas las secuencias se determinaron mediante SequiServe (Vaterstetten, Alemania).
Ejemplo 22
Adsorción ("panning") de antígenos
a) Recubrimiento de las placas
Biotina/Estreptavidina:
Se incubaron placas de 6 pocillos estériles recubiertas con estreptavidina (grado de cultivo celular) con antígeno biotinilado a una concentración de entre 0,5 y 2 mg/ml en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Las placas 5 se lavaron en PBS estéril tres veces antes de utilizarlas.
Proteína unida covalentemente:
Se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular con 2 mg/ml de proteína en tampón de carbonato (bicarbonato
10 sódico 0,1 M, hidrogenocarbonato disódico 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron en PBS estéril tres veces antes de utilizarlas.
b) Inmunoadsorción de células B sobre péptidos
15 Se sembraron con hasta 6x106 células por cada 4 ml de medio placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos recubiertas con el antígeno respectivo y se dejó que se uniese durante una hora a 37ºC en el incubador. Se extrajeron las células no adherentes mediante lavado cuidados de los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Las células adherentes restantes se desengancharon con tripsina durante 10 minutos a 37ºC en el incubador y después se lavaron dos veces en medio. Las células se mantuvieron sobre hielo hasta la realización de la tinción de inmunofluorescencia.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Método para obtener una célula B, que comprende las etapas siguientes:
    a) obtener células B a partir de la sangre de un conejo, b) marcar células B IgG+ y/o células B CD138+, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar las células B marcadas en forma de células individuales, d) cocultivar las células depositadas como células individuales con una célula nodriza en un medio de cocultivo, e) seleccionar un clon de células B proliferante en la etapa d) y obtener de esta manera una célula B.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende la etapa de centrifugar antes del cocultivo las células individuales depositadas como células individuales.
  3. 3.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el método comprende antes de la etapa de marcaje la etapa siguiente: ab) inmunoadsorción ("panning") de las células B con antígeno inmovilizado.
  4. 4.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cocultivo se lleva a cabo en una placa multipocillo de poliestireno con pocillos recubiertos con un sustrato no fibroso preparado a partir de una mezcla de resina plástica polimérica y moléculas anfipáticas.
  5. 5.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células B se obtienen mediante una centrifugación en gradiente de densidad.
  6. 6.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula nodriza es una célula B5 EL-4 murina.
  7. 7.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el medio de cocultivo comprende una mezcla nutriente.
  8. 8.
    Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha mezcla nutriente es un sobrenadante de cultivo de timocitos.
  9. 9.
    Método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha mezcla nutriente comprende interleuquina-1beta y factor alfa de necrosis tumoral y por lo menos un compuesto seleccionado de entre interleuquina-2, interleuquina-10, células de Staphylococcus aureus cepa Cowan, interleuquina-21, BAFF, interleuquina-6, interleuquina-4, 5-(4fenoxibutoxi)psoraleno y otros compuestos estimuladores que incrementan la productividad de IgG del clon de células B sin reducir el número de pocillos IgG+.
  10. 10.
    Método para producir un anticuerpo, que comprende las etapas siguientes:
    a) proporcionar una población de células B maduras obtenidas a partir de la sangre de un conejo, b) marcar las células B IgG+ y/o las células B CD138+ con por lo menos un pigmento fluorescente, c) incubar las células B a 37ºC durante una hora en medio de cocultivo antes de depositar células individuales de la población marcada de células B en recipientes individuales, d) cultivar las células B depositadas como células individuales en presencia de células nodriza y una mezcla nutriente, e) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individualesf) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo de unión específica mediante una PCR con transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, obteniendo de esta manera un ácido nucleico codificante del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal, g) introducir el ácido nucleico codificante del dominio variable de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo a partir de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y de esta manera producir un anticuerpo.
ES10005602T 2010-05-28 2010-05-28 Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos Active ES2434256T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10005602.7A EP2400298B1 (en) 2010-05-28 2010-05-28 Single B-cell cultivation method and specific antibody production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2434256T3 true ES2434256T3 (es) 2013-12-16

Family

ID=42396427

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10005602T Active ES2434256T3 (es) 2010-05-28 2010-05-28 Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos
ES17169362T Active ES2858450T3 (es) 2010-05-28 2011-05-26 Procedimiento de cultivo de linfocitos B individuales
ES11722402.2T Active ES2632928T3 (es) 2010-05-28 2011-05-26 Procedimiento de cultivo de linfocitos B simples

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17169362T Active ES2858450T3 (es) 2010-05-28 2011-05-26 Procedimiento de cultivo de linfocitos B individuales
ES11722402.2T Active ES2632928T3 (es) 2010-05-28 2011-05-26 Procedimiento de cultivo de linfocitos B simples

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20130084637A1 (es)
EP (4) EP2400298B1 (es)
JP (3) JP5779239B2 (es)
KR (1) KR101495976B1 (es)
CN (2) CN105039252B (es)
BR (1) BR112012025695B1 (es)
CA (2) CA3008822C (es)
DK (1) DK2400298T3 (es)
ES (3) ES2434256T3 (es)
HK (2) HK1181112A1 (es)
MX (2) MX2012013437A (es)
PL (2) PL2400298T3 (es)
RU (1) RU2709531C2 (es)
SI (1) SI2400298T1 (es)
WO (1) WO2011147903A1 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2854243A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Simone HOEGE Rapid method for cloning and expression of cognate antibody variable region gene segments
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
US10240125B2 (en) 2013-03-14 2019-03-26 Immusoft Corporation Methods for in vitro memory B cell differentiation and transduction with VSV-G pseudotyped viral vectors
CA2907570A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Protocol for identifying and isolating antigen-specific b cells and producing antibodies to desired antigens
CN104232577B (zh) * 2013-06-20 2017-12-01 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种获得自身反应性b细胞的方法
ES2927905T3 (es) * 2013-12-24 2022-11-11 Kling Biotherapeutics B V Producción de anticuerpos ex vivo
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
WO2017167714A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag B-cell cultivation method
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
CN106222137A (zh) * 2016-08-24 2016-12-14 南昌大学 一种体外活化人记忆性b细胞成浆细胞的培养方法
CN110248668B (zh) 2016-12-15 2023-05-30 杜克大学 用于消耗调节性b10细胞的抗体和方法以及与免疫检查点抑制剂的联用
EP3562936B1 (en) 2017-01-02 2024-05-22 F. Hoffmann-La Roche AG B-cell cultivation method
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
EP3625332B1 (en) * 2017-05-19 2022-02-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production of thymocyte supernatant
JP6967080B2 (ja) * 2017-11-08 2021-11-17 シャープ株式会社 電池用負極、電池および電池の製造方法
CN111417719B (zh) 2017-11-30 2023-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 B细胞培养方法
CN108588019B (zh) * 2018-05-03 2019-04-02 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件
CN109234232A (zh) * 2018-09-30 2019-01-18 杭州华安单抗生物技术有限公司 兔外周血b细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用
CN113272327A (zh) * 2018-12-30 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗兔cd19抗体及其使用方法
WO2021211997A1 (en) * 2020-04-16 2021-10-21 The General Hospital Corporation B cell immunomodulatory therapy for acute respiratory distress syndrome
CN111518765B (zh) * 2020-05-12 2021-01-26 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 一种b淋巴细胞体外培养体系及应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58116678A (ja) * 1981-12-28 1983-07-11 Ajinomoto Co Inc 浮遊性動物細胞の培養法およびその装置
JPS58216125A (ja) * 1982-06-09 1983-12-15 Asahi Chem Ind Co Ltd ヒト抗体の産生方法
AU7767191A (en) * 1990-04-17 1991-11-11 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Feeder cells for monoclonal antibody production
US5387940A (en) * 1993-07-07 1995-02-07 Rca Thomson Licensing Corporation Method and apparatus for providing scaleable compressed video signal
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6541225B1 (en) * 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
WO2002014481A1 (fr) * 2000-08-16 2002-02-21 Takara Bio Inc. Procede de culture extensive de lymphocytes t cytotoxiques specifiques de l'antigene
US20060051348A1 (en) 2004-09-09 2006-03-09 Jorn Gorlach Method of producing a plurality of isolated antibodies to a plurality of cognate antigens
US20070031550A1 (en) 2005-08-15 2007-02-08 Samson Allan D Method for continuously processing meat substrates
WO2007031550A2 (en) * 2005-09-15 2007-03-22 Crucell Holland B.V. Method for preparing immunoglobulin libraries
JP2009511067A (ja) * 2005-10-14 2009-03-19 メディミューン，エルエルシー 抗体ライブラリーの細胞提示
PT2540820T (pt) * 2005-12-09 2018-03-02 Academisch Medisch Centrum Bij De Univ Van Amsterdam Meios e métodos para influenciar a establidade de células produtoras de anticorpos
PL1974020T3 (pl) * 2005-12-16 2011-11-30 Ribovax Biotechnologies Sa Sposoby uzyskiwania unieśmiertelnionych komórek wydzielających przeciwciała
DK2021463T3 (en) * 2006-05-19 2017-01-16 Alder Biopharmaceuticals Inc Culture method to obtain a cloned population of antigen-specific B cells
US8642307B2 (en) 2006-05-25 2014-02-04 Nalge Nunc International Corporation Cell culture surface chemistries
CA2688146C (en) 2007-05-21 2018-03-06 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to il-6 and use thereof
US8404235B2 (en) * 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
WO2010011894A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vh4 codon signature for multiple sclerosis
EP2352763B2 (en) * 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
US9347043B2 (en) * 2008-10-22 2016-05-24 Institute For Research In Biomedicine Methods for producing antibodies from plasma cells
EP2233502A1 (en) * 2009-03-27 2010-09-29 Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin Sialylated antigen-specific antibodies for treatment or prophylaxis of unwanted inflammatory immune reactions and methods of producing them
US8609101B2 (en) * 2009-04-23 2013-12-17 Theraclone Sciences, Inc. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) neutralizing antibodies
WO2011046623A2 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Duke University Hiv-1 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
SI2400298T1 (sl) 2013-11-29
BR112012025695A2 (pt) 2016-07-05
US20130084637A1 (en) 2013-04-04
RU2015155197A (ru) 2019-01-16
CN102918395A (zh) 2013-02-06
EP3239708A1 (en) 2017-11-01
PL2400298T3 (pl) 2014-01-31
JP6204415B2 (ja) 2017-09-27
KR20130030758A (ko) 2013-03-27
CA2798286C (en) 2019-05-28
EP2577304B1 (en) 2017-05-10
DK2400298T3 (da) 2013-09-02
WO2011147903A1 (en) 2011-12-01
ES2632928T3 (es) 2017-09-18
CA2798286A1 (en) 2011-12-01
CA3008822A1 (en) 2011-12-01
EP2400298B1 (en) 2013-08-14
JP5779239B2 (ja) 2015-09-16
JP2013526286A (ja) 2013-06-24
RU2709531C2 (ru) 2019-12-18
CN105039252A (zh) 2015-11-11
EP3239708B1 (en) 2021-01-06
EP2577304A1 (en) 2013-04-10
HK1181112A1 (en) 2013-11-01
CA3008822C (en) 2020-08-25
EP2400298A1 (en) 2011-12-28
US20160251621A1 (en) 2016-09-01
ES2858450T3 (es) 2021-09-30
CN105039252B (zh) 2019-05-28
RU2012153785A (ru) 2014-07-10
KR101495976B1 (ko) 2015-02-25
MX345884B (es) 2017-02-22
RU2015155197A3 (es) 2019-07-17
US20210062149A1 (en) 2021-03-04
CN102918395B (zh) 2015-09-09
JP6353953B2 (ja) 2018-07-04
EP3825690A1 (en) 2021-05-26
JP2017169579A (ja) 2017-09-28
MX2012013437A (es) 2013-01-22
HK1212731A1 (zh) 2016-06-17
JP2015211690A (ja) 2015-11-26
US20180298335A1 (en) 2018-10-18
BR112012025695B1 (pt) 2022-06-21
PL3239708T3 (pl) 2021-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2434256T3 (es) Método de cultivo de células B individuales y producción de anticuerpos específicos
JP2013526286A5 (es)
CN110621773B (zh) 用于产生胸腺细胞上清液的方法
US11952586B2 (en) B-cell cultivation method
US20200149006A1 (en) B-cell cultivation method
JP7026634B2 (ja) Ｂ細胞培養法
RU2575569C2 (ru) Способ культивирования одиночной в-клетки