MX2012013437A - Metodo de cultivo de celulas b individuales. - Google Patents

Metodo de cultivo de celulas b individuales.

Info

Publication number
MX2012013437A
MX2012013437A MX2012013437A MX2012013437A MX2012013437A MX 2012013437 A MX2012013437 A MX 2012013437A MX 2012013437 A MX2012013437 A MX 2012013437A MX 2012013437 A MX2012013437 A MX 2012013437A MX 2012013437 A MX2012013437 A MX 2012013437A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
igg
cell
culture
antibody
Prior art date
Application number
MX2012013437A
Other languages
English (en)
Inventor
Josef Endl
Sonja Offner
Natalie Schuhmacher
Josef Platzer
Basile Siewe
Irmgard Thorey
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MX2012013437A publication Critical patent/MX2012013437A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1185—Thymus cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/70—Non-animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/016—White blood cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Se reporta en este documento un método para obtener una célula B que comprende las siguientes etapas a) etiquetar células B, b) depositar las células B etiquetadas como células individuales, c) co-cultivar las células B depositadas como células individuales con células alimentadoras, d) seleccionar una célula B que prolifera y secreta IgG en la etapa c) y obtener en consecuencia una célula B. El etiquetado puede ser de células IgG+CDl9+-B, células IgG+CD38+-B, células IgG+CD268+-B, células IgG+CDl38+-B, células CD27+CDl38+-B, o células CD3+CD27+-B. El método puede comprender la etapa de incubar las células B a 37°C durante una hora en medio EL-4 B5 antes de la etapa de deposición. El método también puede comprender la etapa de centrifugar células depositadas como células individuales antes del co-cultivo. En el co-cultivo se puede usar una mezcla alimentadora que comprende interleucina-l-beta, y factor de necrosis tumoral alfa y células Cowans de cepa de Staphylococcus aureus o BAFF o interleucina-2 y/o interleucina-10 y/o interleucina-6 y/o interleucina-4.

Description

METODO DE CULTIVO DE CELULAS B INDIVIDUALES Campo de la Invención En este documento se reporta un método para obtener la secuencia de aminoácidos de por lo menos dos dominios variables de un anticuerpo monoclonal secretado por una célula B individual que se ha obtenido a partir de una población de células B de un animal experimental mediante la deposición y co-cultivo de células individuales con células alimentadoras en presencia de una mezcla alimentadora .
Antecedentes de la Invención Para obtener células que secretan anticuerpos monoclonales se usa ampliamente la tecnología de hibridoma desarrollada por Koehler y Milstein. Pero en la tecnología de hibridoma, solo una fracción de las células B obtenidas de un animal experimental inmunizado se puede fusionar y propagar. La fuente de las células B es en general un órgano de un animal experimental inmunizado tal como el bazo.
Zubler y colaboradores comenzaron a desarrollar en 1984 un procedimiento diferente para obtener células que secretan anticuerpos monoclonales (véase por ejemplo Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp . Med. 160 (1984) 1170-1183) . Ahí las células B se obtienen de la sangre del animal experimental inmunizado y co-cultivado con células alimentadoras EL-4 B5 de murino en presencia de una mezcla Ref. 235499 alimentadora que comprende citoquina. Con esta metodología hasta 50 ng/ml de anticuerpos se pueden obtener después de 10-12 días de co-cultivo.
Weitkamp, J-H., y colaboradores, (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) reportan la generación de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes para rotavirus de células B específicas de antígeno individuales seleccionadas con partículas similares a virus fluorescente. Un método para producir una pluralidad de anticuerpos aislados para una pluralidad de antígenos cognados se reporta en el documento US 2006/0051348. En los documentos O 2008/144763 y WO 2008/045140 se reportan anticuerpos a IL-6 y usos de los mismos y un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno, respectivamente. Un método de cultivo para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno se reporta en el documento US 2007/0269868. Masri y colaboradores (en Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) reportan la clonación y expresión en E. coli de un fragmento Fab funcional obtenido de un linfocito humano individual contra la toxina del ántrax. Un método para preparar bibliotecas de inmunoglobulina se reporta en el documento WO 2007/031550.
Breve Descripción de la Invención En este documento se reporta un método para el aislamiento de una célula B de una población de células B que tiene propiedades especiales. Primero ya dentro de cuatro semanas después de la primera inmunización de un animal experimental las células que producen anticuerpos inducidos se pueden aislar y la especificidad de enlace de los anticuerpos se puede determinar. Segundo es posible mejorar el número y/o la calidad (por ejemplo la producción de anticuerpos/capacidad de secreción) de las células que producen anticuerpos por cualquiera de las siguientes etapas: i) una etapa de pre- incubación, y/o ii) una etapa de centrifugación, y/o iii) una etapa de inmunoadsorción. Tercero, la mezcla alimentadora usada para el co-cultivo de células B y células alimentadoras se puede mejorar mediante la adición de IL-21, o IL-6, o SAC, o BAFF.
De esta manera, se reporta en este documento como un aspecto un método para seleccionar una célula B que comprende las siguientes etapas: a) etiquetar opcionalmente las células B de una población de células B, b) co-cultivar individualmente cada célula B de una población de células B, que se ha depositado como una sola célula, con células alimentadoras, c) seleccionar un clon de célula B que prolifera y secreta anticuerpos en la etapa B.
En este documento se reporta además como un aspecto un método para obtener un clon de célula B que comprende las siguientes etapas: a) obtener células B de un animal experimental, b) etiquetar las células B, c) depositar las células B etiquetadas como células individuales, d) co-cultivar individualmente las células B depositadas como células individuales con células alimentadoras , e) seleccionar un clon de célula B que prolifera y secreta anticuerpos en la etapa d) y obteniendo en consecuencia un clon de célula B.
En este documento se reporta como otro aspecto un método para producir un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno objetivo que comprende las siguientes etapas a) etiquetar opcionalmente las células de una población de células B con por lo menos un tinte de fluorescencia, b) cultivar cada célula B de una población de células B, que se ha depositado como una célula individual en recipientes individuales, en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora, para obtener clones de célula B individuales y sobrenadantes de cultivo, c) seleccionar un clon de célula B que produce un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno objetivo, d) cultivar una célula, que contiene un ácido nucleico que codifica el anticuerpo que se enlaza específicamente al antígeno objetivo, que se produce por el clon de célula B seleccionado en la etapa c) , o una variante humanizada del mismo, y recuperar el anticuerpo de la célula o el sobrenadante de cultivo y producir en consecuencia el anticuerpo .
En una modalidad el método comprende una o más de las siguientes etapas: después de la etapa c) : el) determinar las secuencias de ácido nucleicos que codifica el dominio de cadena ligera variable y el dominio de cadena pesada variable del anticuerpo por una PCR de transcriptasa inversa, después de la etapa el) : c2) transfectar una célula con un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleicos que codifica el dominio de cadena ligera variable del anticuerpo y el dominio de cadena pesada variable.
En este documento también se reporta como un aspecto un método para producir un anticuerpo comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una población de células B (maduras) obtenidas de la sangre de un animal experimental) , b) etiquetar las células de la población de células B con por lo menos un tinte de fluorescencia (en una modalidad con uno a tres, dos a tres tintes de fluorescencia) , c) depositar las células individuales de la población etiquetada de células B en recipientes individuales (en una modalidad es el recipiente un pocilio de una placa de múltiples pocilios) , d) cultivar las células B individuales depositadas en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora (en una modalidad las células alimentadoras son células EL-4B5, en una modalidad la mezcla alimentadora es TSN natural, en una modalidad la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética) , e) determinar la especificidad de enlace de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de las células B individuales, f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio de cadena variable y cadena pesada de anticuerpos que se enlazan específicamente por una PCR transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, y obtener en consecuencia un dominio de cadena variable y cadena pesada de anticuerpo monoclonal que codifica el ácido nucleico, g) introducir el dominio variable de cadena ligera y pesada variable de anticuerpo monoclonal que codifica el ácido nucleico en un cásete de expresión par la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo de la célula o el sobrenadante de cultivo celular y producir en consecuencia un anticuerpo.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento, el método comprende la etapa de incubar la población de células B en medio de co-cultivo antes de la deposición de células individuales. En una modalidad, la incubación es aproximadamente 37°C. En una modalidad la incubación es durante 0.5 a dos horas. En una modalidad específica, la incubación es durante aproximadamente una hora. En una modalidad la incubación es aproximadamente 37 °C a aproximadamente una hora.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el método comprende la etapa de centrifugar las células B depositadas de células individuales antes de la co-cultivo. En una modalidad la centrifugación es de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos. En una modalidad específica, la centrifugación es para aproximadamente 5 minutos. En una modalidad la centrifugación es de aproximadamente 100 x g a aproximadamente 1,000 x g. En una modalidad específica, la centrifugación es de aproximadamente 300 x g. En una modalidad la centrifugación es durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 300 x g- En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el método comprende inmediatamente antes de la etapa de etiquetado la siguiente etapa: inmunoadsorción de las células B con antígeno inmovilizado.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento, la población de células B se obtiene de la sangre de un animal por una centrifugación de gradiente de densidad.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento la población de células B se obtiene de la sangre de un animal experimental después de 4 días después de la inmunización. En otra modalidad, la población de células B se obtiene de la sangre de un animal experimental de 4 días a por lo menos 9 días después de la inmunización. En una modalidad adicional, la población de células B se obtiene de la sangre de un animal experimental de 4 días a 9 días después de la inmunización.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento la población de células B se aisla mediante centrifugación en gradiente de densidad.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento las células B son células B maduras .
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el etiquetado es con uno a tres tintes de fluorescencia. En una modalidad específica el etiquetado es con dos o tres tintes de fluorescencia.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el etiquetado de las células B da por resultado el etiquetado de 0.1% a 2.5% de las células de 5 la población de células B totales.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento las células B son células B de ratón, o células B de hámster, o células B de conejo.
En una modalidad de todos los aspectos como se ]_Q reportan en este documento la deposición de células individuales está en los pocilios de una placa de múltiples pocilios .
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento las células alimentadoras son 15 células EL-4 B5 de murino.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
En una modalidad de todos los aspectos como se 20 reportan en este documento el etiquetado es de IgG+CD19+- células B, IgG+CD38+-células B, IgG+CD268+-células B, IgG+CD138+-células B, CD27+CD138+-células B, o CD3+CD27+- células B.
En una modalidad de todos los aspectos como se 5 reportan en este documento las células B son de origen de ratón y el etiquetado es de IgG+CD19+-células B, y/o IgG+CD138+-células B.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento las células B son de origen de hámster y el etiquetado es de IgG+IgM+-células B.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento las células B son de origen de conejo y el etiquetado es de IgG+-células B y/o CD138+-células B, o CD138+IgG+-células B y/o IgG+IgM+-células B.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el co-cultivo está en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de FCS, 1% (p/v) de una solución de glutamina 200 mM que comprende penicilina y estreptomicina, 2% (v/v) de una solución de piruvato de sodio 100 mM, y 1% (v/v) de una solución amortiguadora de ácido 2-(4- (2-hidroxietil) -1-piperazina) -etano-sulfónico (HEPES) 1 M. en otra modalidad, el medio de co-cultivo comprende además beta-mercaptoetanol 0.05 mM.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en este documento el co-cultivo de las células B es con células alimentadoras y una mezcla alimentadora. En una modalidad la mezcla alimentadora es un sobrenadante de cultivo de timocitos natural (TSN, por sus siglas en inglés) o una mezcla alimentadora sintética.
En una modalidad específica, la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética. En una modalidad, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina. En una modalidad específica, la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética. En una modalidad, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa. En una modalidad, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-10 (IL-10) . En una modalidad la mezcla alimentadora sintética comprende además células Cowans de la cepa (SA) Staphylococcus aureus (SAC) . En una modalidad la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-21 (IL-21) . En una modalidad la mezcla alimentadora sintética comprende factor de activación de células B de la familia del factor de necrosis tumoral (BAFF, por sus siglas en inglés) . En una modalidad la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina- 6 (IL-6) . En una modalidad la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-4 (IL-4) .
En una modalidad el co-cultivo está en presencia de un sobrenadante de cultivo de timocitos como mezcla alimentadora. En una modalidad específica el sobrenadante de cultivo de timocitos se obtiene de timocitos de la glándula del timo de un animal joven.
En una modalidad el método para obtener un clon de célula B comprende además la etapa de f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera y pesada variable del anticuerpo producido por el clon de célula B seleccionado de la etapa e) mediante una PCR de transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, y obtener en consecuencia una secuencia de dominio variable de aminoácidos de anticuerpo monoclonal.
En una modalidad el animal experimental se selecciona de ratón, hámster, y conejo.
Descripción Detallada de la Invención El método reportado en este documento permite una rápida caracterización de la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales obtenida de clones de célula B individual, es decir dentro de cuatro semanas después de la primera inmunización del animal experimental, las células productoras de anticuerpos inducidos se pueden aislar y la especificidad de enlace de los anticuerpos producidos de las mismas se pueden determinar, mediante lo cual por lo menos cuatro experimentos diferentes se pueden llevar a cabo debido a la cantidad/concentración de anticuerpos en sobrenadante de co-cultivo de células T.
Inmunización: Frecuentemente animales no humanos, tales como ratones, conejos, hámster y ratas, se usan como modelo animal para evaluar las terapias basadas en anticuerpos. Por lo tanto, se requiere frecuentemente proporcionar anticuerpos de reacción cruzada que se enlazan al antígeno animal no humano así como también al antígeno humano. El método como se reporta en este documento se puede usar para proporcionar anticuerpos de reacción cruzada. En el método como se reporta en este documento las células B obtenida de por ejemplo ratón, hámster y conejo se pueden usar. En una modalidad el ratón es un ratón NMRI o un ratón balb/c. En otra modalidad, el hámster se selecciona de hámster Armenio (Cricetulus migratorius) , hámster Chino [Cricetulus griseus) , y hámster Sirio (Mesocricetulus auratus) . En una modalidad específica el hámster es el hámster Armenio. En una modalidad el conejo se selecciona de conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW, por sus siglas en inglés) , conejos de Zimmermann (ZIKA, por sus siglas en inglés) , conejos de la cepa mutante Alicia, conejos de la cepa mutante basilea, conejos transgénicos con un sitio de inmunoglobulina humana, conejos genéticamente deficientes de rblgM y reproducción cruzada de los mismos.
En una modalidad los animales experimentales, por ejemplo ratones, hámster y conejos, seleccionados para inmunización no son más de 12 semanas de edad.
Fuente y aislamiento de células B: La sangre de un animal experimental proporciona una alta diversidad de células B productoras de anticuerpos. Las células B obtenidas de las mismas secretan anticuerpos que no tienen casi secuencias de aminoácidos idénticas o solapantes dentro del CDRs, de esta manera, muestran una alta diversidad .
En una modalidad las células B de un animal experimental, por ejemplo de la sangre, se obtienen de 4 días después de la inmunización hasta por lo menos 9 días después de la inmunización o el refuerzo más reciente. Ester intervalo de tiempo permite una alta flexibilidad en el método como se reporta en este documento. En este intervalo de tiempo es probable que las células B proporcionan los anticuerpos más afines migren del bazo a la sangre (véase por ejemplo Paus, D., y colaboradores, JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S., y colaboradores, The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J. , y colaboradores, Nature 453 (2008) 667-672) .
Las células B de la sangre de un animal experimental se pueden obtener con cualquier método conocido por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la centrifugación en gradiente de densidad (DGC, por sus siglas en inglés) o lisis de glóbulos rojos (lisis) . La centrifugación en gradiente de densidad comparada con la lisis hipotónica proporciona un rendimiento general más alto, es decir número de clones de células B. adicionalmente , de las células B obtenidas por la centrifugación en gradiente de densidad un gran número de células se divide y se desarrolla en la etapa de co-cultivo. También la concentración del anticuerpo secretado es mayor comparada con las células obtenida con un método diferente. Por lo tanto, en una modalidad la provisión de una población de células B es mediante centrifugación en gradiente de densidad.
Tabla 1: Número de clones pocilios/células productores de IgG cuando las células se obtienen mediante centrifugación en gradiente de densidad (DGC) o lisis hipotónica de eritrocitos .
Etapas de selección antes del co-cultivo: Las células B que producen anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno se pueden enriquecer de células mononucleares en sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) . De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la población de células B se enriquece de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) .
El término "que se enlaza específicamente" y equivalentes gramaticales del mismo indican que el anticuerpo se enlaza a su objetivo con una constante de disociación (Kd) de 10"7 M o menor, en una modalidad de 10"8 M a 10~13 M, en una modalidad adicional de 10"9 M a 10"13 M. El término se usa además para indicar que el anticuerpo no se enlaza específicamente a otras biomoléculas presentes, se enlaza a otras biomoléculas con una constante de disociación (Kd) de 10"6 M o más, en una modalidad de 10"e M a 1 M.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las PBMC se agotan de macrofagos. Esto es ventajoso como se describe a continuación, por ejemplo como en una modalidad para las células B de origen de conejo, para la etapa de co-cultivo.
Los macrofagos se pueden agotar de PBMC por la adhesión a la superficie de la placa de cultivo celular (véase la etapa de pre- incubación) .
En una modalidad de los métodos como se reporta en este documento, las células son de un animal inmunizado con proteínas y se agota de macrofagos antes del etiquetado.
Se ha descubierto que la incubación de la población de células B en el medio de co-cultivo antes de la deposición de células individuales incrementa el número total de células secretoras de anticuerpos obtenidas después de la deposición de células individuales comparada con una deposición de células individuales directamente después del aislamiento y enriquecimiento opcional de la población de células B de la sangre de un animal experimental (por ejemplo conejo, véase las Tablas 2a y 2b) . Específicamente la incubación es a aproximadamente 37°C durante aproximadamente una hora en el medio EL-4 B5, por ejemplo usando una incubadora de cultivo celular.
Tabla 2a: Pocilios de IgG positiva/clones de célula con y sin incubación de una hora en medio EL-4 B5 antes de la deposición de células individuales de todas las células (rb=conejo) . * agotada de macrófagos y monocitos Tabla 2b: Pocilios de IgG positiva/clones de célula y sin incubación de una hora en medio EL-4 B5 antes de deposición de células individuales de células B.
En una modalidad de los métodos como se reporta en este documento las células se obtienen de un animal pero inmunizado con proteínas y agotado de macrófagos.
Las células que no producen un anticuerpo que se enlazan al antígeno o, del mismo modo, células que producen un anticuerpo que se enlazan al antígeno se pueden reducir o enriquecer, respectivamente, al usar un procedimiento de inmunoadsorción. En el mismo se presenta un socio de enlace unido a una superficie y células que se enlacen a la misma se enriquecen selectivamente en la población de células en caso de que las células enlazadas se procesen adicionalmente, o se reduzcan en la población de células en caso de que las células que permanecen en solución se procesen adicionalmente .
Tabla 3 : Enriquecimiento de células B que secretan un anticuerpo específico de antígeno mediante inmunoadsorción con el antígeno respectivo.
El método como se reporta en este documento comprende en una modalidad antes de la deposición de células individuales una etapa de selección en la cual las células B que producen anticuerpos específicos y no de reacción cruzada se selecciona con base en los marcadores de superficie celular y clasificación/selección de células activadas con fluorescencia. En una modalidad, las células B maduras se clasifican/enriquecen/selecciona. Para la selección de las células B de diferentes especies animales experimentales se pueden usar diferentes marcadores de superficie celular. Se ha descubierto que muchos de los marcadores de superficie celular disponibles, ya sea individualmente o en combinación, no proporcionan un etiquetado adecuado.
Con el etiquetado de poblaciones de células no objetivo y linfocitos que no se enlazan específicamente es posible agotar selectivamente estas células. En esta etapa de agotamiento solo se puede lograr un agotamiento no total . Aunque el agotamiento no es cuantitativo proporciona una ventaja en el etiquetado de fluorescencia sucesivo de las células restantes ya que el número de células interferentes se puede reducir o aún minimizar. Por una deposición de células individuales de células B maduras (células B de memoria, plasmablastos madurados por afinidad, y células plasmáticas) por la clasificación de células activadas con fluorescencia usando el etiquetado como se describe a continuación un mayor número de pocilios de IgG+-/clones de célula se pueden obtener en la etapa de co-cultivo.
El término "etiquetado" indica la presencia o ausencia de un marcador superficial que se puede determinar por la adición de un anticuerpo marcador que se enlaza específicamente y anti-superficial etiquetado. De esta manera, la presencia de un marcador superficial se determina por ejemplo en el caso de una etiqueta de fluorescencia por la ocurrencia de una fluorescencia mientras que la ausencia de un marcador superficial se determina por la ausencia de una fluorescencia después de la incubación con el anticuerpo marcador que se enlaza específicamente y anti-superficial etiquetado respectivo.
Se pueden etiquetar poblaciones de células diferentes al usar marcadores superficiales diferentes tales como CD3+-células (células T) , CD19+-células (células B) , Ig +-células (células B no activadas maduras) , IgG+-células (células B maduras) , CD38+-células (por ejemplo plasmablastos) , y IgG+CD38+-células (células pre-plasmáticas ) .
Como se reporta en este documento, un etiquetado de inmunofluorescencia para selección de IgG+-células B, tales como células B de memoria, plasmablastos, y células plasmáticas, se han desarrollado. Para una selección o enriquecimiento de células B las células ya sea se etiquetan individualmente o se etiquetan dobles o se etiquetan triples. También se requiere un etiquetado que de por resultado aproximadamente 0.1% a 2.5% de células etiquetadas de la población de células total. En una modalidad las células B se depositan como células individuales seleccionadas por el etiquetado de moléculas superficiales presentes en 0.1% a 2.5% de las células B en la población, en otra modalidad de 0.3% a 1.5% de las células B de la población, en una modalidad adicional en 0.5% a 1% de las células B de la población.
Las IgG+-células B dentro de la población PBMC 0.5% - 1% se pueden etiquetar doblemente como células IgG+CD19+, células IgG+CD38+, y células IgG+CD268+. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células IgG CD19+-B, células IgG CD38+-B, o células IgG+CD268+-B se depositan como células individuales.
De las células IgG~-B dentro de la población PBMC 0.5% - 1% se pueden etiquetar doblemente como células IgG" CD+138+. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG"CD138+-B se depositan como células individuales.
El etiquetado de células CD27+CD138+- o células CD3" CD27+- da por resultado aproximadamente 1.5% de las células de la población celular que se etiqueta, respectivamente. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células CD27+CD138+-B o células CD3" CD27+-B se depositan como células individuales.
De células IgG+-B de hámster dentro de la población PBMC 0.6% + 0.1% se pueden etiquetar doblemente como células IgG+IgM-B de hámster. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG+IgM~-B de hámster se depositan como células individuales.
En una modalidad células IgG"CD138+-B se depositan como células individuales de las células B obtenidas de un animal inmunizado. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG+CD19+-B se depositan como células individuales de las células B obtenidas de un animal no inmunizado. En otra modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG+IgM"-B se depositan como células individuales de las células B obtenidas de un animal no inmunizado o inmunizado. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG+CD19+-B de murino se depositan como células individuales. Esta etapa de selección da por resultado un rendimiento mejorado o aún más alto de pocilios de IgG+- en la etapa de co-cultivo sucesiva. En otra modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG"CD138+-B de murino se depositan como células individuales. Con las mismas se seleccionan células que producen la cantidad más alta de clones de célula B en primer lugar y en segundo lugar la concentración más alta de IgG (véase la Tabla 5) . En otra modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento células IgG+CD19+-B de murino y células IgG"CD138+-B de murino se depositan como células individuales. En una modalidad específica el método es con la condición de que si las células son de origen de conejo el etiquetado no es de células IgG+-B y/o células CD138+-B.
Las células IgG+-B de murino se pueden etiquetar con el anticuerpo IgG-anti-ratón 227 (Ab 227) , las células IgG+-B de hámster se pueden etiquetar con el anticuerpo IgG-anti-hámster 213 (AB 213) y/o anticuerpo IgG-anti-hámster 225 (AB 225) , y células B de conejo se pueden etiquetar con el anticuerpo anti-IgG- 184 (véase la Tabla 4) .
Tabla 4: Etiquetado de inmunofluorescencia de células B la tabla presente la fracción etiquetada promedio de la población de células B de murino (A-E) , células B de hámster (F-H) y células B de conejo (I-J) .
AB 120 - anticuerpo IgG antiSouthern 4030-09 conejo de cabra Biotech AB 184 - anticuerpo IgG Fe antiAbDSerotech STAR121F conejo de cabra AB 185 - anticuerpo IgG antiCaltag M35004-3 ratón de cabra AB 200 - anticuerpo IgG antiInvitrogen M31504 ratón de cabra AB 212 - anticuerpo IgG antiAbDSerotech STAR79F hámster de cabra AB 213 - anticuerpo IgG anti- Becton 554010 hámster de ratón Dickinson AB 215 - anticuerpo IgG antiSigma B 0529 ratón de cabra AB 217 - anticuerpo IgG anti- AbDSerotech STAR120F ratón de cabra AB 218 - anticuerpo CD19 antiAbcara ab22480 ratón de rata AB 219 - anticuerpo IgM anti- Rockland 710-1607 ratón de cabra AB 222 - anticuerpo IgG anti- Abcam ab7064 ratón de cabra AB 223 - anticuerpo IgM anti- Becton 554035 hámster de ratón Dickinson AB 224 - anticuerpo IgM anti- Becton 554033 hámster de ratón Dickinson AB 225 - anticuerpo IgM anti- Becton 554056 hámster de ratón Dickinson AB 227 - anticuerpo IgG anti- Sigma F 8264 ratón de cabra PE: Ficoeritrina APC: Aloficocianina FITC: Isotiocianato de fluoresceína Se ha señalado que no todos los anticuerpos comercialmente disponibles se pueden usar para el etiquetado debido a su baja o no existente especificidad.
Las células B de murino se pueden etiquetar con el anticuerpo anti-IgG- 227, las células B de hámster se pueden etiquetar con el anticuerpo anti-IgG- 213.
Las IgG+CD19+-células B de murino se pueden etiqueta con el anticuerpo 227 y el anticuerpo 218, las IgG+IgM~-células B de murino se pueden etiquetar con el anticuerpo 227 y el anticuerpo 219, las IgG+IgM~-células B de hámster se pueden etiquetas con el anticuerpo 213 y el anticuerpo 224, IgG+-células B de conejo se pueden etiquetar con el anticuerpo 184, las IgG+IgM" -células B de conejo se pueden etiquetar con el anticuerpo 184 y el anticuerpo 254 y SA 263, las IgG+CD138+-células B de conejo se pueden etiquetar con el anticuerpo 259 y el anticuerpo 256.
Las células B de murino se pueden etiquetar con el anticuerpo anti-CD27 235 o 236 (AB 235, AB 236) , el anticuerpo anti- CD3 8 192 (AB 192 ) , el anticuerpo anti- CD13 8 233 (AB 233) y el anticuerpo anti-CD268 246 (AB 246) .
Tabla 5: Etiquetado de inmunofluorescencia para la determinación de células B de ratón (A-J) , de hámster (K) y de conejo (L-N) maduras.
AB 184 - anticuerpo IgG Fe anti- AbDSerotec STAR121F conejo de cabra AB 189 - anticuerpo CD3 anti-ratón Becton 553062 de hámster Dickinson AB 192 - anticuerpo CD38 anti-ratón Becton 553764 de rata Dickinson AB 213 - anticuerpo IgG anti- Becton 554010 hámster de ratón Dickinson AB 218 - anticuerpo CD19 anti-ratón Abcam ab22480 de rata AB 224 - anticuerpo IgM anti- Becton 554033 hámster de ratón Dickinson AB 227 - anticuerpo IgG anti-ratón Sigma F 8264 de cabra AB 233 - anticuerpo CD138 anti- Becton 553714 ratón de rata Dickinson AB 235 - anticuerpo CD27 anti-ratón Becton 558754 de hámster Dickinson AB 236 - anticuerpo CD27 anti-ratón Becton 558753 de hámster Dickinson AB 241 - anticuerpo CD3 anti-ratón Becton 553060 de hámster Dickinson AB 246 - anticuerpo BAFF-R antieBiosciene 51-5943 ratón de rata anticuerpo IgM anti-conejo Becton hecho a la de ratón Dickinson mediad AB 256 - anticuerpo IgG anti-rata Southern 3030-09 de cabra Biotech AB 259 - anticuerpo CD138 anti- Roche conejo de rata Glycart AG SA 263 - Estreptavidina IInnvviittrroogqeenn S866 A647: Alexa Fluor 647 FITC: Isotiocianato de fluoresceína En una modalidad los métodos comprenden la etapa de agotar la población de células B de macrófagos y enriquecimiento de las células B de la población de células B que secretan anticuerpos que se enlazan específicamente a un antígeno objetivo .
Deposición de células individuales : El método como se reporta en este documento comprende la etapa de depositar las células B de una población de células B como células individuales . En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la deposición como células individuales es por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) . El etiquetado requerido para la deposición de células individuales FACS se puede llevar a cabo como se reporta en la sección previa .
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células B específicamente etiquetadas se depositan como células individuales. En una modalidad adicional de todos los métodos como se reporta en este documento el etiquetado es un etiquetado de marcadores de superficie celular con anticuerpos etiquetados con fluorescencia. En otra modalidad, los métodos como se reporta en este documento proporcionan anticuerpos monoclonales . En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células B maduras se depositan como células individuales.
También se ha descubierto que una etapa de centrifugación adicional después de la deposición de células individuales y antes del co-cultivo proporciona un número incrementado de células secretoras de anticuerpos e incrementa la cantidad de la IgG secretada (animal experimental ejemplar con sitio de inmunoglobulina humana, véase la Tabla 6) .
Tabla 6: pocilios de IgG positiva/clones de célula con y si etapa de centrifugación después de la deposición de células individuales.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento el método comprende la etapa de centrifugación de las células depositadas individuales antes del co-cultivo. En una modalidad específica la centrifugación es durante 5 minutos a 300 x g.
Co-cultivo : La etapa de co-cultivo con células alimentadoras puede ser precedida y también seguida por una variedad de etapas adicionales.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células B depositadas individuales se co-cultivan con células alimentadoras en presencia de una mezcla alimentadora . En una modalidad específica las células B se co-cultivan con células alimentadoras EL-4 B5 de murino. Mediante etiquetado de inmunofluorescencia adecuado como se describe en lo anterior se puede lograr un incremento en el rendimiento en la etapa de co-cultivo (número de clones de pocilio de IgG+- /célula así como también concentración de igG) y también un enriquecimiento o aislamiento de IgG+-célula B madura de PBMC.
Con la deposición de células individuales de células IgG+CD19+- y/o IgG+CD38+-B de PBMC recientemente aisladas el número más alto de clones pocilios de IgG-/células se puede obtener. Con la deposición de células individuales de células IgG+CD19+-, IgG+CD38+- y/o IgG"CD138+-B después del agotamiento de macrófagos o células especificas de KLH (hemocianina de lapa californiana) se pueden obtener buenos resultados. Con la deposición de células individuales de células IgG+CD19+-, IgG+CD38+- y/o IgG"CD138+-B después del agotamiento de células B específicas de antígeno se pueden obtener resultado mejorados. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reportan en este documento células IgG+CD19+ -, IgG+CD38+ - y/o IgG~CD138+-B se depositan como células individuales.
Se ha descubierto que una deposición de células individuales con base en un etiquetado como se describe en lo anterior da por resultado la fracción más alta de clones pocilio de IgG+-/célula y en los clones pocilios/célula con la concentración de IgG más alta en el sobrenadante. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células IgG+CD19+- y/o IgG"CD138+-B de murino se depositan como células individuales. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células IgG+IgM+-B de hámster se depositan como células individuales. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento las células IgG+-, y/o IgG+CD138+-, y/o CD138+- y/o IgG+IgM~-B de conejo se depositan como células individuales.
Tabla 7: rendimiento en el co-cultivo dependiendo del etiquetado de inraunofluorescencia. células individuales de IgG+CDl9-células después de cada etapa de enriquecimiento (enr.) y/o agotamiento (agot.) el número más alto de clones de pocilios de IgG+-/célula después del co-cultivo se puede obtener. AlteARNtivamente, con la deposición de células individuales de pocilios de IgG~CD138+-células/clones de célula con la mejor concentración de IgG en el sobrenadante se puede obtener. La deposición de células individuales de células IgG"CD138+ se puede usar para células B de animales inmunizados.
La deposición de células individuales de células IgG+CD19+ se puede usar para las células B de animales no inmunizados . La deposición de células individuales de células IgG+IgM+ se puede usar para células B de hámster de animales inmunizados y no inmunizados. La deposición de células individuales de células IgG+-, y/o IgG+CD138+-, y/o CD138+- y/o IgG+IgM"-B se puede usa para células B de conejo.
El etiquetado de inmunofluorescencia usado para las células B obtenidas de la sangre de un animal experimental también se puede usar para el etiquetado de células B obtenidas del bazo y otros órganos inmunológicos de un animal experimental, tal como ratón, hámster y conejo. Para células B de ratón la fracción de células IgG+-B del bazo fue de aproximadamente 0.8% comparada con 0.4% para células IgG+CD19. Para las células B de hámster los números respectivos son 1.9% y 0.5% células IgG+IgM. Las células B derivadas de sangre de conejo se descubrió 0.2% de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos. Las placas Peyer'sche de conejo mostraron 0.4% de células IgG+ y el bazo mostró 0.3% de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos .
Con los métodos como se reportan en este documento después de aproximadamente siete (7) días, es decir después de 5, 6, 7, u 8 días, especialmente después de 7 y 8 días, del co- cultivo se pueden obtener concentraciones de anticuerpos de aproximadamente 30 ng/ml hasta 15 g/ml o más (valor promedio de aproximadamente 500 ng/ml) . Con la cantidad de esta manera proporcionada de anticuerpo se puede llevar a cabo un alto número de análisis diferentes a fin de caracterizar el anticuerpo, por ejemplo con respecto a la especificidad de enlace, con más detalle. Con la caracterización mejorada del anticuerpo en su etapa temprana en el proceso de clasificación/selección es posible reducir el número de aislamientos de ácidos nucleicos requeridos y reacciones de secuenciacion que van a ser llevadas a cabo. Adicionalmente el clon de célula B proporciona una cantidad de ARNm que codifica la región variable de cadena ligera y pesada monoclonal permitiendo el uso de un cebador de PCR degenerada y evita el requerimiento del cebador altamente específico. También se reduce el número requerido de ciclos de PCR. De esta manera, en una modalidad la PCR transcriptasa inversa es con el cebador de PCR degenerado para el dominio variable de cadena ligera pesada.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora es un sobrenadante de cultivo de timocitos. En una modalidad específica el sobrenadante de cultivo de timocitos se obtiene de los timocitos de la glándula del timo del animal joven respectivo. Es especialmente adecuado usar la glándula del timo de animales jóvenes comprada con el aislamiento de timocitos de animales de la sangre de animales adultos. El término "animal joven" indica un animal antes de que se presente la madurez sexual. Un hámster joven, por ejemplo, es de una edad de menor que 6 semanas, especialmente menor que cuatro semanas. Un ratón joven, por ejemplo, es de una edad de menor que 8 semanas, especialmente menor que 5 semanas.
Debido al origen de la mezcla alimentadora, que se deriva del sobrenadante de timocitos cultivados (sobrenadante de cultivo de timocitos - TSN) , se presentan variaciones de lote a lote considerables. A fin de superar esta variabilidad se ha desarrollado una mezcla alimentadora sintéticas que consiste de componentes sintéticos. Una mezcla alimentadora que consiste de IL-?ß (interleucina-l-beta) , T F (factor de necrosis tumoral alfa) , IL-2 (interleucina-2) e IL-10 (interleucina-10) se conoce de Tucci, A., y colaboradores, J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784.
Se reporta en este documento una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B depositadas individuales y células alimentadoras. También se reportan en este documento aditivos específicos de especie de células B para la mezcla alimentadora sintética para incrementar la cantidad de anticuerpos secretados por el clon de célula B respectivo. Las células altamente productoras concomitantes contienen más de ARNm que a su vez facilita la transcripción inversa y secuenciación del ácido nucleico codificante, por ejemplo, con un conjunto de cebadores no específicos, redundante.
Mediante la adición de SAC (células Cowans de cepa de Staphylococcus aureus, se usó un lote de SAC individual) el número de células B secretadas de anticuerpos y la concentración de IgG promedio en el sobrenadante después del co-cultivo se puede incrementar. Se ha descubierto que para la adición de SAC en el co-cultivo un intervalo de concentración se puede definir como reducida así como también concentraciones incrementadas de SAC reducen la cantidad de anticuerpos secretados .
Tabla 8a: Resultado de un ELISA huCk (huCk = C kappa humano) o ELISA rblgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B obtenidas de un animal experimental con sitio IgG humana o un conejo de tipo silvestre (NZW) co-cultivado con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN como mezcla alimentadora con o sin SAC agregado.
Se puede observar que una relación de SAC de 1:20000 a 1:150000 proporciona un número incrementado de pocilios de IgG+- /clones de célula, mediante lo cual la relación de 1:50000 a 1:100000 muestra los números más altos. En una modalidad la cantidad de SAC agregado al medio de cultivo se determina al proporcionar una serie de dilución y al determinar la dilución en la cual el SAC agregado proporciona el número más alto de pocilios de IgG positiva/clones de célula.
Se ha observado que mediante la adición de SAC a la mezcla alimentadora el co-cultivo de células B se cambió sorprendentemente de tal manera que solo las células B depositadas individuales tienen un beneficio en el crecimiento, mientras que el crecimiento de células B se inhibió cuando se usa un mezcla de PBL (por ejemplo células B y células T endógenas) para el co-cultivo.
Tabla 8b: Resultado de un ELISA huCk o ELISA rblgG de sobrenadantes de cultivo celular de PBLs y células B depositadas individuales con co-cultivadas con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN como mezcla alimentadora con SAC agregado .
Datos adicionales obtenidos con diferentes mezclas alimentadoras se presentan en las siguientes Tablas 9 y 10.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B comprende IL-?ß, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-21 (interleucina-21) . En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora sintética la mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B comprende IL-?ß, TNFa, IL-2, IL-10 y SAC. En una modalidad específica IL-?ß, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-21 son IL-?ß de murino recombinante, TNFa de murino, IL-2 de murino, IL-10 de murino e IL-21 de murino.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de murino comprende IL-?ß, IL-2, IL-10, TNF-a y BAFF. En una modalidad específica BAFF se agrega en una concentración de 5 ng/ml.
En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de hámster comprende IL-?ß, IL-2, IL-10, TNF- , IL-6 y SAC. En una modalidad específica IL-6 se agrega en una concentración de 10 ng/ml. En una modalidad específica SAC se agrega en una relación de 1:75,000.
Tabla 9: Resultados de un ELISA rblgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B de conejo co-cultivadas con células alimentadoras EL-4 B5 y diferentes mezclas alimentadoras sintéticas que comprenden sustancias de murino recombinantes en diferentes combinaciones .
Tabla 10: pocilios de IgG+ de sobrenadantes de cultivo células de células B de conejo co-cultivadas con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN o una mezcla alimentadora que comprende sustancias de murino recombinantes y SAC (rb = conejo, m = ratón) .
Un co-cultivo de células alimentadoras y células B de murino sin IL-2, sin IL-10, así como también sin IL- 15 2 e IL-10 da por resultado un incremento en el rendimiento de pocilios de IgG+ aunque la concentración de IgG se reduce. Sin TNFa la concentración de IgG también se reduce. Sin IL-IB nada de IgG se puede encontrar en el sobrenadante. 20 Un co-cultivo de células B de hámster sin IL-2 o sin IL-10, respectivamente, da por resultado pocilios de IgG con concentración de IgG detectable. En contraste con lo mismo en un co-cultivo sin IL-2 y IL-10 casi no se P c puede detectar el crecimiento de células B. En ausencia de TNF- oí o IL-?ß no se puede determinar la secreción de IgG.
En presencia de células alimentadoras EL-4 B5 por lo menos IL-?ß y TNFa son requeridos para el co-cultivo de células B de ratón, hámster y conejo. IL-2 e IL-10 se pueden omitir para el co-cultivo de células de murino. Las células B de hámster se pueden cultivar en ausencia de ya sea IL-2 o IL-10. Las células B de conejo se pueden cultivar en ausencia de ya sea IL-2 o IL-10 o IL-6.
Para las células B de murino y de hámster la adición de IL-4 a la mezcla alimentadora incrementa el número de pocilios IgG+- /clones de célula así como también la concentración de IgG en el sobrenadante. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la mezcla alimentadora para el co-cultivo de células B de murino o de hámster comprende IL-4.
La adición de IL-6 a la mezcla alimentadora para el co-cultivo de células B de murino o de células B de hámster da por resultado un número incrementado de pocilio de IgG+/clones de célula o una concentración de IgG incrementada, respectivamente. De esta manera, en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento, la mezcla alimentadora para el co-cultivo de células B de murino o de células B de hámster comprende IL-6. En una modalidad específica la IL-6 se agrega en una concentración de 50 ng/ral. En una modalidad específica IL-6 se agrega en una concentración de 10 ng/ml, si se requiere alta concentración de IgG. En una modalidad específica la adición de IL-6 es después de tres días de co-cultivo de las células B seleccionadas y las células EL-4 B5 células.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B y células alimentadoras que comprenden IL-?ß, TNFOÍ, IL-10, y una o más seleccionadas de IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4, e IL-6.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B y células alimentadoras que comprenden IL-?ß, TNFa, IL-2, IL-10 y SAC.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de murino y células alimentadoras que consiste de IL-?ß, TNFa, y comprende opcionalmente de IL-21, y/o SAC, y/o BAFF, y/o IL-6.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de murino y células alimentadoras que comprenden IL-IB, IL-2, IL-10, TNF-oí y BAFF.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo células B de murino de hámster y células alimentadoras que comprenden IL-?ß, TNFOÍ , IL-2, IL-10 e IL-6 Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de hámster y células alimentadoras que consiste de IL-?ß, TNFOÍ, e IL-2 o IL-10, y comprende opcionalmente de IL-21, y/o SAC, y/o BAFF.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de hámster y células alimentadoras que comprende IL-?ß, IL-2, IL-10, TNF-OÍ, IL-6 y SAC.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de conejo y células alimentadoras que comprenden IL-?ß, TNFOÍ, IL-10, e IL-6.
Un aspecto como se reporta en este documento es una mezcla alimentadora sintética para el co-cultivo de células B de conejo y células alimentadoras que comprenden IL-?ß, TNFa, IL-10, IL-6 o IL-2, y SAC.
En una modalidad específica IL-?ß, TNFa, IL-2, IL- 10 e IL-21 son IL-?ß de murino, TNFa de murino, IL-2 de murino, IL-10 de murino, y IL-21 de murino recombinante .
En una modalidad específica BAFF se agrega en una concentración de 5 ng/ml .
En una modalidad específica IL-6 se agregan en una concentración de 10 ng/ml.
En una modalidad específica SAC se agrega en una relación de 1:75,000.
En una modalidad específica y células alimentadoras son células EL-4 B5 de murino.
La adición de un inhibidor de un cierto canal de potasio (= PAP-1 5- (4 -fenoxi-butoxi) soraleno) incrementa sorprendentemente la secreción de rblgG de células B en una manera dependiente de concentración sin disminuir el número de clones de célula B. Usualmente una citoquina que indujo la productividad de rblgG se puede correlacionar con una disminución del número total de clones de célula B. Esto no fue el caso con PAP-1.
Tabla 11: Resultados de un ELISA rblgG de sobrenadantes de cultivo celular de células B co-cultivadas con células alimentadoras EL-4 B5 en presencia de TSN y SAC ( =sin) y diferentes concentraciones de PAP-1. DMSO: solvente para PAP-1 (1 µ?) .
Con una concentración de TSN de 7.5% se puede obtener la concentración de IgG más alta en el sobrenadante.
Tabla 12: Influencia de TSN en el co-cultivo. Una concentración de TSN de 7.5% da por resultado crecimiento y productividad de células B mejorados.
Con un número de 30,000 células alimentadoras por pocilio de una placa de 96 pocilios se puede obtener el número más alto de pocilios de IgG+- en combinación con una concentración de IgG en el sobrenadante. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento el número de células alimentadoras por célula B depositada individual es de aproximadamente 30,000.
Tabla 13: Influencia de la cantidad de células alimentadoras de EL-4 B5 en el co-cultivo.
El co-cultivo está en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento en placas de múltiples pocilios de poliestireno con pocilios con un fondo redondo. El volumen de trabajo de los pocilios es en una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento de 50 µ? a 250 µ?. En una modalidad específica los pocilios se recubren por lo menos parcialmente con un substrato no fibroso preparado a partir de una mezcla de resina plástica de polímero y moléculas antipáticas, en donde la molécula anfipática comprende una porción hidrofílica y una región hidrofóbica, en donde las regiones hidrofóbicas se anclan dentro del substrato y las porciones hidrofílicas se exponen sobre el substrato. En una modalidad específica, las moléculas anfipáticas se seleccionan de alquilamina etoxiladas, poli (etilenimina) , octildecamina o mezclas de las mismas (véase por ejemplo EP 1 860 181) .
Caracterización de células co-cultivadas : Para la determinación (cualitativa y cuantitativa) de la IgG secretada después del co-cultivo se pueden usar en general todos los métodos conocidos por una persona de experiencia en la técnica tal como una ELISA. En una modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento se usa un ELISA. En una modalidad específica para la determinación de IgG secretada por células B de murino se usa un ELISA con los anticuerpos anti-IgG AB 216 (anticuerpo de captura) y AB 215 (anticuerpo trazador) . En una modalidad específica para la determinación de la IgG secretada por células B de hámster se usa una ELISA con los anticuerpos monoclonales AB 220 (anticuerpo de captura) y AB 213 (anticuerpo trazador) .
Dependiendo de los resultados de caracterización se puede obtener un clon de célula B, es decir seleccionado el término "clon" indica una población de células B de división y secretoras de anticuerpos que surgen de/se origina de una célula B individual. De esta manera, un clon de célula B produce un anticuerpo monoclonal .
Aislamiento de ARNm, clonación y secuenciación: De las células B el ARNm total se puede aislar y transcribir en ADNc . Con cebadores específicos la región VH-y VL-cognada que codifica el ácido nucleico se puede amplificar. Con la secuenciación del ácido nucleico obtenido con la misma se confirmó que los anticuerpos obtenidos son anticuerpos monoclonales en la mayoría de casos (71-95%) . También se observa a partir de la secuenciación de las células B individuales que casi no se obtienen secuencias idénticas. De esta manera, el método proporciona anticuerpos altamente diversos que se enlazan al mismo antígeno.
Los cebadores usados para la amplificación de la VH que codifica el ácido nucleico se puede usar para el ADNc obtenido de células de ratón N RI, el Hámster Armenio, el ratón Balb/c así como también el hámster Sirio y el conejo.
En una- modalidad de todos los métodos como se reporta en este documento la secuencia de aminoácidos se deriva de la VH amplificada que codifica el ácido nucleico y el punto de inicio y final exacto se identifica por la ubicación de las secuencias de aminoácidos de EVQL/QVQL a VSS (región VH) y DIVM/DIQM a KLEIK (región VL) .
El término "anticuerpo" indica una proteína que consiste de una o más cadenas de polipéptido codificada sustancialmente por genes de inmunoglobulina . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los diferentes genes de región constante así como también la miríada, de genes de región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab)2 así como también como cadenas individuales (scFv) , diacuerpos, formas monovalentes, bivalentes, trivalentes o tetravalentes, y también como forma biespecífica, triespecífica o tetraespecífica (por ejemplo Huston, J.S., y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., y, colaboradores, Science 242 (1988) 423-426; en general, Hood y colaboradores, Immunology, Benjamín N.Y., 2da edición (1984); y Hunkapiller, T. y Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).
También se reporta en este documento un método para producir un anticuerpo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una población de células B (madura) (obtenidas de la sangre de un animal experimental), b) teñir las células de la población de células B con por lo menos un tinte de fluorescencia (en una modalidad con uno a tres, o dos a tres tintes de fluorescencia) , c) depositar células individuales de la población teñida de células B en recipientes individuales (en una modalidad es el recipiente un pocilio de una placa de múltiples pocilios) , d) cultivar las células B individuales depositadas en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora (en una modalidad las células alimentadoras son células EL-4 B5, en una modalidad la mezcla alimentadora es TSN natural, en una modalidad la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética) , e) determinar la especificidad de enlace de los anticuerpos secretados en el cultivo de las células B individuales , f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera y pesada variable de los anticuerpos de enlaces específico por una PCR transcriptasa inversa y secuenciación de nucleótidos, y obtener en consecuencia un anticuerpo monoclonal de dominio de cadena ligera y pesada variable que codifica el ácido nucleico, g) introducir el dominio variable de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal que codifica el ácido nucleico en un cásete de expresión para la expresión de un anticuerpo, h) introducir el ácido nucleico en una célula, i) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo de la célula o el sobrenadante de cultivo celular y producir en consecuencia un anticuerpo.
Un "cásete de expresión" se refiere a un constructo que contiene los elementos reguladores necesarios, tal como promotor y sitio de poliadenilación, para la expresión de por lo menos el ácido nucleico contenido en una célula.
El término "animal experimental" indica un mamífero no humano. En una modalidad el animal experimental se selecciona de rata, ratón, hámster, conejo, primate no humanos, oveja, perro, vaca, pollo, anfibios y reptiles.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, el alcance real de la cual se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que las modificaciones se pueden hacer en los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la invención .
EJEMPLOS Ejemplo 1 Medios y soluciones amortiguadoras : La solución amortiguadora de bloqueo para el ELISA comprende IX PBS y 1% de BSA.
La solución amortiguadora de recubrimiento para el ELISA comprende 4.29g de Na2C03* 10 H20 y 2.93g de NaHC03 añadir agua a un volumen final de 1 litro, pH 9.6 ajustado con HC1 2 N.
Solución de etanol para el aislamiento de ARN 5 comprende 70% de Etanol u 80% de Etanol.
La solución amortiguadora de FACS para la tinción de inmunofluorescencia comprende IX PBS y 0.1% de BSA.
La solución amortiguadora de IMDM para el ELISA comprende IX PBS, 5% de IMDM y 0.5% de BSA.
-J_Q La solución amortiguadora de incubación 1 para el ELISA comprende IX PBS, 0.5%de CroteinC.
La solución incubadora de incubación 2 para el ELISA comprende IX PBS, 0.5% de CroteinC y 0.02% de Tween 20.
La solución amortiguador de incubación 3 para el 15 ELISA comprende IX PBS, 0.1% de BSA.
La solución amortiguadora de incubación para el 4 para el ELISA comprende IX PBS, 0.5% de BSA, 0.05% de Tween, PBS (10X), H2P04 0.01 M, Na2HP04 0.1 M, NaCl 1.37 M, KCl 0.027 M, pH 7.0. 20 La solución amortiguadora de PCR comprende KCl 500 mM, MgC12 15 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 9.0.
La solución amortiguadora de lavado 1 para el ELISA comprende IX PBS, 0.05% de Tween 20.
La solución amortiguadora de lavado 2 para el ELISA 25 comprende IX PBS, 0.1% de Tween 20.
La solución amortiguadora de lavado 3 para el ELISA comprende agua, 0.9% de NaCl, 0.05% de Tween 20.
El medio EL-4 B5 comprende RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de mezcla de glutamina/penicilina/estreptomicina, 2% de piruvato de sodio 100 mM, 1% de solución amortiguadora HEPES 1M.
Ejemplo 2 Cuidado e inmunización del animal Los animales experimentales se mantuvieron de acuerdo con la ley de protección animal alemana (TierSCHG) así como también de acuerdo con las directivas europeas respectivas .
Ratones y hámster se recibieron en una edad de 6 a 8 semanas y se inmunizaron ante de una edad de 12 semanas. El antígeno primero se aplicó junto con el adyuvante de Freud completo (CFA, por sus siglas en inglés) . Aplicaciones adicionales fueron con adyuvante de Freud completo (IFA, por sus siglas en inglés) . La emulsión que contiene antígeno se aplicó subcutáneamente mediante lo cual la emulsión comprendió una cantidad de 50 a 100 de antígeno dependiendo del peso del animal experimental receptor.
Conejos NZW (Charles River Laboratories InteARNtional , Inc.) se usaron para inmunización. El antígeno se disolvió en solución amortiguadora de K3P04 a pH 7.0 en una concentración de 1 mg/ml y se mezcló (1:1) con adyuvante de Freud completo (CFA) hasta la generación de una emulsión estable. Los conejos recibieron una inyección intradérmica (i.d.) de 2 mi de emulsión seguido por una segunda inyección intramuscular (i.m.) y una tercera inyección subcutánea (s.c.) cada una con 1 mi en un intervalo de una semana. La cuarta inyección i.m. de 1 mi se realizó dos semanas después seguido por dos inyecciones s.c. adicionales de 1 mi en un intervalo de cuatro semanas .
Durante la inmunización se determinó el título del anticuerpo en suero con un ensayo específico de antígeno. En un título de anticuerpo con una IC50 de 1:10000 se removió la sangre o el bazo del animal inmunizado. Para reactivación de células B específicas de antígeno se aplicaron intravenosamente 30 µ? a 50 pg de antígeno al animal experimental tres días antes de la remoción de la sangre o el hígado .
Ejemplo 3 Remoción de órganos, sangre y macrófagos Sangre de ratones y hámster se obtuvo por punción de la vena retrobulbérica . La sangre de los conejos se obtuvo por punción de la vena de la oreja o, para grandes volúmenes, de la arteria de la oreja. Se recolectó sangre entera (10 mi) de conejos 4-6 días después de la tercera, cuarta, quinta y sexta inmunización y se usó para clasificación de células individuales mediante FACS.
Los macrofagos se aislaron de la sangre obtenida por la unión al plástico del cultivo celular. De ratones y hámster, se obtuvieron aproximadamente 3* 105 macrofagos de cada animal mediante este método.
Si se requirió una gran cantidad de macrofagos de ratón o hámster, se aislaron macrofagos peritoneales . Para esto los animales tienen que ser de por lo menos 3 meses de edad. Para la remoción de los macrofagos peritoneales, los animales se sacrificaron y 5 mi de medio EL-4 B5 con una temperatura de 37°C se inyectó inmediatamente en la cavidad peritoneal . Después de masajear el vientre del animal durante 5 minutos, se removió la solución que contiene las células. Ejemplo 4 Cultivo de las células EL-4 B5 Las células EL-4 B5 congeladas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C y se diluyeron con 10 mi de medio EL-4 B5. Después de la centrifugación a 300 x g durante 10 minutos el sobrenadante se eliminó y el peletizado se volvió a suspender en el medio. Después de una etapa de centrifugación adicional el sobrenadante se eliminó nuevamente y el peletizado se volvió a suspender en 1 mi de medio.
Las células EL-4 B5 se inocularon en una densidad celular de 3 x 104 células/ml en matraces de cultivo de 175 m2. La densidad celular se determinó cada segundo día y se ajustó a 3 x 104 célula/ml. Las células tuvieron un tiempo de duplicación de aproximadamente 12 horas y tiene que ser cultivadas en una densidad celular abajo de 5 x 105 célula/ml debido a que con mayor densidad celular las propiedades estimuladoras de las células se pierden.
Cuando el número de células total fue de aproximadamente 1.5 x 109 células el medio se removió mediante centrifugación. Después las célula se irradiaron con gris 50 (5000 rad) . Después de la determinación del número de células viables mediante la tinción con azul tripan entre 5 x 106 y 1 x 107 células se formaron en alícuotas y se congelaron a -80°C.
Para el co- cultivo las células se descongelaron y se lavaron dos veces con medio EL-4 B5. Para la determinación del número de células viables la suspensión de células se diluyó 1:10 con 0.4% (p/v) de solución de azul tripan 10 µ? de la mezcla se transfirió a una cámara de conteo Neubauer y se contó el número de células .
Ejemplo 5 Centrifugación en gradiente de densidad El aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) se efectuó por la separación en gradiente de densidad con LympholyteMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante A (LympholyteMR de mamífero, cedarlano) .
La sangre extraída se diluyó 2 : 1 con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) . En un vial de centrifuga se proporcionó el mismo volumen de medio de separación de densidad y la sangre diluida se agregó cuidadosamente a través de la pared del vial. El vial se centrifugó durante 20 minutos a 800 x g sin descanso. Los linfocitos se obtuvieron de la capa intermedia blanca. Las células removidas se suplementaron con 10 mi de PBS y se centrifugaron a 800 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y el peletizado se volvió a suspender, se lavó, se centrifugó. El peletizado final se volvió a suspender en PBS.
Ejemplo 6 Lisis hipotonica de glóbulos rojos Para la alteración de los glóbulos rojos por lisis hipotonica se diluyó una solución de cloruro de amonio (BD LyseMR) 1:10 con agua y se agregó en una relación de 1:16 a sangre entera. Para la lisis de los glóbulos rojos la mezcla se incubó durante 15 minutos en la oscuridad. Para la separación de los restos celulares de las células intactas la solución se centrifugó durante 10 minutos a 800 x g. El sobrenadante se eliminó, el peletizado se volvió a suspender en PBS, se lavó nuevamente, se centrifugó y el peletizado se volvió a suspender en PBS.
Ejemplo 7 Preparación de células de órganos internos de un animal experimental Para la preparación de células del bazo y timo el órgano respectivo se diseccionó en una caja de Petri y las células se recogieron en PBS. Para la remoción del tejido restante la suspensión celular se filtró a través de un tamiz de 100 µp?. Para obtener linfocitos de las células del bazo se amplió la centrifugación en gradiente de densidad. Para las células del timo no se requirió etapas de enriquecimiento adicional .
Ejemplo 8 Agotamiento de macrófagos Placas de 6 pocilios estériles (grado de cultivo celular) se usaron para agotar macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica . Los pocilios se recubrieron ya sea con hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés) o con estreptavidina y los péptidos de control. Cada pocilio se llenó con 3 mi a un máximo de 4 mi ee medio y hasta 6xl06 de células mononucleares de sangre periférica del conejo inmunizado y se dejó enlazar durante 60 a 90 minutos a 37°C en la incubadora. Después el sobrenadante que contiene linfocitos se transfirió a un vial de centrifugación y se centrifugó a 800 x g durante 10 minutos. El peletizado se volvió a suspender en PBS. 50% de las células en el sobrenadante se usaron para la etapa de inmunoadsorción los 50% restantes de las células se sometieron directamente a tinción de inmunofluorescencia y clasificación de células individuales. Ejemplo 9 Agotamiento de las células B especificas de KLH Cuatro mililitros de una solución que contiene hemocianina de lapa californiana (KLH) se incubó con solución amortiguador de recubrimiento en una concentración de 2 g/ml en los pocilios de una placa de múltiples pocilios durante toda la noche a temperatura ambiente . Antes de la etapa de agotamiento de sobrenadante se removió y los pocilios se lavaron dos veces con PBS . Después las células de sangre se ajustaron a una densidad celular de 2 x 106 células/ml y 3 mi se agregaron a cada pocilio de una placa de múltiples pocilios. Después la placa de múltiples pocilios se incubó durante 60 a 90 minutos a 37°C. El sobrenadante se transfirió a un vial de centrifugación y los pocilios se lavaron dos veces con PBS y los sobrenadantes se combinaron en el vial de centrifugación. Las células se formaron en pelotillas mediante centrifugación a 800 x g durante 10 minutos y el peletizado se volvió a suspender en PBS.
Ejemplo 10 Enriquecimiento de células B específicas de antígeno El antígeno respectivo se diluyó con solución amortiguadora de recubrimiento a una concentración final de 2 pg/ml . 3 mi de esta solución se agregaron al pocilio de una placa de múltiples pocilios de 6 pocilios y se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. Antes del uso 5 el sobrenadante se removió y los pocilios se lavaron dos veces con PBS . La solución de células B se ajustó a una concentración de 2 x 10s células/ml y se agregaron 3 mi a cada pocilio de una placa de múltiples pocilios de 6 pocilios. La placa se incubó durante 60 a 90 minutos a 37°C. ]_ø El sobrenadante se removió y los pocilios se lavaron de dos a cuatro veces con PBS. Para la recuperación de las células B específicas de antígeno se agregó 1 mi de una solución de tripsina/EDTA a los pocilios de la placa de múltiples pocilio y se incubó durante 10 a 15 minutos 37 °C. La incubación se 15 detuvo mediante la adición del medio y el sobrenadante se transfirió a un vial de centrifugación. Los pocilios se lavaron dos veces con PBS y los sobrenadantes se recombinaron con los otros sobrenadantes. Las células se formaron en pelotillas mediante centrifugación durante 10 minutos a 800 x 20 g. El peletizado se volvió a suspender en PBS.
Ejemplo 11 Co-cultivo de células B y células EL-4 B5 a) EL co-cultivo se llevó a cabo en placas de múltiples pocilios de 96 pocilios con fondo redondo. Se 5 preparó una solución base que comprende células EL-4 B5 (1.6 x 106 células / 15.2 mi) y citoquinas en medio EL-4 B5. 200 µ? de la solución base se agregaron a cada pocilio de la placa de múltiples pocilios. A cada pocilio se agregó una célula B individual por clasificación de células activadas con fluorescencia. Después de la adición de las células B la placa se centrifugó durante 5 minutos a 300 x g. La placa se incubó durante siete días durante 37 °C. b) Células B clasificadas individuales se cultivaron en placas de 96 pocilios con 210 µ?/pocillo de medio EL-4 B5 con Células Pansorbin (1:20000) (Calbiochem (Merck) , Darmstadt, Alemania) , 5% de sobrenadante de timocitos de conejo y células de timoma de murino EL-4-B5 irradiadas con rayos gamma (2 x 10 /pocillo) durante 7 días a 37°C en una atmósfera de 5% de C02 en la incubadora. Los sobrenadantes de cultivo de células B se removió para clasificación y las células se recolectaron inmediatamente para la clonación de genes de región variable o se congelaron a - 80 °C en 100 µ? de solución amortiguadora RLT (Qiagen, Hilden, Alemania) .
Ejemplo 12 Cultivo de células T Las células T se aislaron del timo de ratones y hámsteres de 3-4 semanas de edad, o de conejos de 4-5 semanas de edad, respectivamente. Las células se centrif garon inmediatamente o se congelaron en alícuotas de 3 x 107 células. Los timocitos se sembraron con una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml de medio EL-4 B5 en matraces de cultivo de 175 cm2 y se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Ejemplo 13 Cultivo de macrofagos Los macrofagos se aislaron de la cavidad peritoneal de ratones y hámsteres, respectivamente, de una edad de por lo menos tres meses. Los macrofagos peritoneales de ratones o hámsteres o células mononucleares de sangre de conejos se cultivaron en el medio EL-4 B5 en una densidad celular de por lo menos 1 x 105 células/ml en matraces de cultivo de 175 cm2 durante 1.5 hora a 37 °C. Después el medio se removió y las células no unidas se removieron de los macrofagos unidos al lavarlas con medio EL-4 B5 caliente, seguido por cultivo durante 48 horas en 35 mi de medio.
Ejemplo 14 Co-cultivo de células T y macrófago Las células T y macrofagos se cultivaron durante 48 horas en matraces separados . Antes de combinar ambas poblaciones celulares, las células T se centrifugaron durante 10 minutos a 800 x g. El sobrenadante se eliminó y el peletizado de células se volvió a suspender en 10 mi de medio. Las células T se ajustaron a una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml y 10 pg de forbol-12-miristato-13 -acetato (PMA) y se agregaron 5 ng o 50 ng de Fitohemaglutinina M (PHA-M) por mi de medio. El medio de cultivo se removió de los macrófagos y la suspensión de células T se agregó a los matraces que contienen macrófagos. Después de 36 horas de co-cultivo, el medio de cultivo se removió y se llamó solución TSN. Para la remoción de las células restantes la solución TSN. Para la remoción de las células restantes, la solución TSN se filtró a través de un filtró de 0.22 µp La solución TSN se congeló a - 80°C en alícuotas de 4 mi.
Ejemplo 15 Tinción de inmunofluorescencia Dependiendo del número de células que se tiñen las células se proporcionaron en 100 µ? de medio (menor que 106 células) o 200 µ? de medio (más de 106 células) , respectivamente. El anticuerpo etiquetado con fluorescencia se diluyó con suero al 5% del animal experimental y solución amortiguadora FACS a un volumen final de 100 µ? o 200 µ?, respectivamente. La mezcla de reacción se incubó en un estante de rodillo durante 40 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de la incubación a células se lavaron dos veces a 300 x g durante 5 minutos. El peletizado se volvió a suspender en 400 µ? de PBS y se filtró a través de un tamiz de 70 µt?. La solución filtrada se transfirió a un vial de FACS y directamente antes del experimento de FACS las células muertas se tiñeron por adición de yoduro de propidio (6.25 µ?/p??) . Si el anticuerpo etiquetado se etiquetó con biotina el anticuerpo se detectó en la segunda etapa con Flour(R) 647 Alexa etiquetado con estreptavidina (anticuerpo 197) .
Ejemplo 16 Cuantificación de la IgG La placa de múltiples pocilios de 96 pocilios en la cual el co-cultivo se llevó a cabo, se centrifugó después de siete días de co-cultivo a 300 x g durante 5 minutos. 150 µ? de sobrenadante se removió y se diluyó en una relación de 2:1 con PBS en una segunda placa de múltiples pocilios de 96 pocilios .
El ELISA se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 17.
El anticuerpo se usó en una concentración de 50 ng/ml. Si la OD fue o excedió 1 después de un tiempo de incubación de 5 minutos se sometió a prueba una serie de dilución de 0.8 a 108 ng/ml de IgG.
Ejemplo 17 Detección de la IgG específica de antígeno Los anticuerpos producidos por células B depositadas y co-cultivadas individuales o de células B obtenidas de un animal experimental inmunizado se pueden caracterizar con respecto al enlace de antígeno específico. El ELISA se llevó a cabo a temperatura ambiente y la solución de ELISA se incubó entre las etapas individuales en un agitador a 20 x g. En la primera etapa el antígeno se enlazó a los pocilios de una placa de múltiples pocilios de 96 pocilios. Si el antígeno fue una proteína se habría diluido en una solución amortiguadora de recubrimiento y se aplicó 5 directamente a la placa. Los antigenos de péptido se enlazaron a través del par de enlace específico de biotina/estreptavidina. Los pocilios de la placa de múltiples pocilios ya se habían recubierto con CroteinC soluble (CrC) por el fabricante. Si no, los pocilios se incubaron después ]_ø de la inmovilización del antígeno con 200 µ? de solución amortiguadora de bloqueo. Después de la incubación con 100 µ? de solución de antígeno por pocilio (placa de múltiples pocilios previamente recubiertos) o 200 µ? de solución amortiguadora de bloqueo, respectivamente, el antígeno no 15 enlazado o solución amortiguadora de bloqueo se removió mediante el lavado con una solución amortiguadora de lavado. Los sobrenadantes de células B diluidas se agregaron en un volumen de 100 µ? por pocilio y se incubaron. Después de la incubación los pocilios se lavaron. Después el anticuerpo de 20 detección se agregó en un volumen de 100 µ? por pocilio. El anticuerpo ya sea se puede conjugar con peroxidasa de rábano gigante o etiqueta con biotina. El anticuerpo de detección se determinó con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación la placa de 5 múltiples pocilios se lavó y después 50 µ? de una solución de substrato que contiene 3, 3', 5, 5' tetrametil-benzidina (TMB) se agregaron por pocilio y se incubaron durante un período como se proporciona en la Tabla X. La reacción enzimática se detuvo por la adición de 50 µ? de ácido sulfúrico y la densidad óptica se determinó a 450 nm y 680 nm con un fotómetro (Rainbow Thermo ELISA Reader) y el software Xread plus .
Ejemplo 18 Aislamiento del ácido ribonucleico (ARN) Las células de las cuales el ARN había sido aislado primero se formaron en pelotillas mediante centrifugación. El peletizado de células se lisó por la adición de 100 µ? de solución amortiguadora RLT con 10 µ?/ml de beta-mercaptoetanol . Las células se volvieron a suspender mediante mezclado múltiple con una pipeta. La solución se transfirió a un pocilio de una placa de múltiples pocilios. La placa se sacudió brevemente a 200 x g y se congeló a -20°C.
El aislamiento del ARN se llevó a cabo con el Kit RNeasy"11 (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 19 Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa La transcripción inversa se llevó a cabo en un volumen de 20 µ? . Para cada reacción se llevó a cabo un control con y sin transcriptasa inversa. Por reacción de 1 µ? de dNTP (cada uno a 10 mM) , 0.4 µ? de oligo (dT) 12-i8 (0.2 g) y 0.6 µ? de hexámero aleatorio (0.03 µg) se pre-mezclaron y se agregaron a 8.5 µ de ARN en H20. La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos 65 °C y directamente después se transfirió a hielo. Después 2 µ? de solución amortiguadora RT (10 x) , 4 µ? de MgC12 (25 mM) , 2 µ? de DTT (0.1 M) y 1 µ? de ARNsa OutMR (40 unidades) se pre-mezclaron y se agregaron a la mezcla de reacción enfriada con hielo. Después de un tiempo de incubación de 2 minutos a temperatura ambiente se agregaron 0.5 µ? de transcriptasa inversa SuperscriptMR II (25 unidades) . La mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La traducción se llevó a cabo durante 50 minutos a 42°C. Después de la traducción la transcriptasa inversa se inactivo por incubación durante 15 minutos a 70°C. El ADNc se almacenó a -20°C.
Ejemplo 20 Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo con el kit Taq PCR Core (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR se llevó a cabo en un volumen de 20 µ? . Las muestras se transfirieron al MastercylerMR a una temperatura de 95°C.
Ejemplo 21 Secuenciación Todas las secuencias se determinaron por SequiServe (Vaterstetten, Alemania) .
Ejemplo 22 Inmunoadsorción en el antígeno a) Recubrimiento de placas Biotina/Estreptavidina: Placas de 6 pocilios recubiertas con estreptavidina estéril (grado de cultivo celular) se incubaron con antígeno biotinilado en una concentración de 0.5 - 2 yg/ml en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron en PBS estéril tres veces antes del uso.
Proteina covalentemente enlazada: Placas de 6 pocilios de cultivo celular se recubrieron con 2 vq/ml de proteína en solución amortiguadora de carbonato (bicarbonato de sodio 0.1 M, carbonato de hidrógeno de disodio 34 mM, pH 9.55) durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron en PBS estéril tres veces antes del uso. b) Inmunoadsorción de células B en péptidos Placas de cultivo de tejido de 6 pocilios recubiertas con el antígeno respectivo se sembraron con hasta 6xl06 células por 4 mi de medio y se dejaron enlazar durante una hora a 37°C en la incubadora. Las células no adherentes se removieron al lavar cuidadosamente los pocilios 1-2 veces con lx de PBS . Las células unidas restantes se separaron . por tripsina durante 10 minutos a 37°C en la incubadora y posteriormente se lavaron dos veces en el medio. Las células se mantuvieron sobre hielo hasta la tinción de inmunofluorescencia .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para seleccionar una célula B, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) co-cultivar cada una de las células B de una población de células B, que se ha depositado como célula individual, con células alimentadoras , b) seleccionar un clon de célula B que prolifera y secreta anticuerpos en la etapa a) .
2. Un método para producir un anticuerpo que se enlaza a un antígeno objetivo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas a) co-cultivar cada célula B de una población de células B, que se ha depositado como célula individual en un recipiente individual, en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora, b) seleccionar un clon de célula B que produce un anticuerpo que se enlaza específicamente al antígeno objetivo, c) cultivar una célula, que contiene un ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido por el clon de célula B seleccionado en la b) o una variante humanizada del mismo, y recuperar el anticuerpo de la célula o el sobrenadante de cultivo y producir en consecuencia el anticuerpo.
3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende la etapa de incubar la población de células B en el medio de co-cultivo antes de la deposición de células individuales .
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la incubación es aproximadamente 37 °C durante aproximadamente una hora.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende la etapa de centrifugar las células B depositadas como células individuales antes de la co-cultivo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la centrifugación es durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 300 x g.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la población de células B se aisla por centrifugación en gradiente de densidad.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células B son células B maduras.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el etiquetado es con dos o tres tintes de fluorescencia.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque 0.1% a 2.5% de las células de la población de células B se etiquetan.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células B son células B de ratón, o células B hámster o células de conej o .
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que las células alimentadoras son células EL-4 B5 de murino.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado en que el co-cultivo es en un medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10% (v/v) , solución de glutamina 200 mM al 1% (p/v) que comprende penicilina y estreptomicina, solución de piruvato de sodio 100 mM al 2% (v/v), y solución amortiguadora de ácido 2- (4-(2-hidroxietil) - 1-piperazina) -etano-sulfónico (HEPES) 1 M al 1% (v/v) .
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 12 a 13, caracterizado porque las células B son de origen de ratón y el etiquetado es de células IgG+CD19+-B, y/o células IgG"CD138+-B .
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 12 a 13, caracterizado porque las células B son de origen de hámster y el etiquetado es de células IgG+IgM~-B.
16. El método de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 10 y 12 a 13, caracterizado porque las células B son de origen de conejo y el etiquetado es de células lgG+-B y/o células CD138+-B, o células CD138+IgG+-B y/o células IgG+IgM"-B.
17. El método de conformidad con cualquiera de las Q reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el co- cultivo está en presencia de una mezcla alimentadora sintética que comprende interleucina-1 beta y el factor de necrosis tumoral alfa, e interleucina-2 e interleucina-10 y células Cowans de cepa de Staphylococcus aureus. 5
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el co-cultivo está en la presencia de una mezcla alimentadora sintética que comprende interleucina-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa, e interleucina-2 e interleucina-10 e interleucina-21. 0
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el co-cultivo está en presencia de una mezcla alimentadora sintética que comprende interleucina-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa, e interleucina-2 e interleucina-10 y factor de 5 activación de células B de la familia del factor de necrosis tumoral (BAFF) .
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el co-cultivo está en presencia del sobrenadante de cultivo de timocitos como mezcla alimentadora .
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sobrenadante de cultivo de timocitos se obtiene de timocitos de la glándula del timo de un animal joven.
MX2012013437A 2010-05-28 2011-05-26 Metodo de cultivo de celulas b individuales. MX2012013437A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10005602.7A EP2400298B1 (en) 2010-05-28 2010-05-28 Single B-cell cultivation method and specific antibody production
PCT/EP2011/058616 WO2011147903A1 (en) 2010-05-28 2011-05-26 Single b-cell cultivation method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2012013437A true MX2012013437A (es) 2013-01-22

Family

ID=42396427

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012013437A MX2012013437A (es) 2010-05-28 2011-05-26 Metodo de cultivo de celulas b individuales.
MX2015001467A MX345884B (es) 2010-05-28 2011-05-26 Metodo de cultivo de celulas b individuales.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2015001467A MX345884B (es) 2010-05-28 2011-05-26 Metodo de cultivo de celulas b individuales.

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20130084637A1 (es)
EP (4) EP2400298B1 (es)
JP (3) JP5779239B2 (es)
KR (1) KR101495976B1 (es)
CN (2) CN105039252B (es)
BR (1) BR112012025695B1 (es)
CA (2) CA3008822C (es)
DK (1) DK2400298T3 (es)
ES (3) ES2434256T3 (es)
HK (2) HK1181112A1 (es)
MX (2) MX2012013437A (es)
PL (2) PL2400298T3 (es)
RU (1) RU2709531C2 (es)
SI (1) SI2400298T1 (es)
WO (1) WO2011147903A1 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2854243A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Simone HOEGE Rapid method for cloning and expression of cognate antibody variable region gene segments
US10017739B2 (en) 2012-09-06 2018-07-10 Duke University Methods of expanding and assessing B cells and using expanded B cells to treat disease
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
US20150259430A1 (en) 2012-11-05 2015-09-17 Mab Discovery Gmbh Method for the production of multispecific antibodies
US10240125B2 (en) 2013-03-14 2019-03-26 Immusoft Corporation Methods for in vitro memory B cell differentiation and transduction with VSV-G pseudotyped viral vectors
CA2907570A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Protocol for identifying and isolating antigen-specific b cells and producing antibodies to desired antigens
CN104232577B (zh) * 2013-06-20 2017-12-01 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种获得自身反应性b细胞的方法
ES2927905T3 (es) * 2013-12-24 2022-11-11 Kling Biotherapeutics B V Producción de anticuerpos ex vivo
EP3313887A2 (en) 2015-06-26 2018-05-02 MAB Discovery GmbH Monoclonal anti-il-1racp antibodies
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
WO2017167714A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag B-cell cultivation method
EP3241845A1 (en) 2016-05-06 2017-11-08 MAB Discovery GmbH Humanized anti-il-1r3 antibodies
CN106222137A (zh) * 2016-08-24 2016-12-14 南昌大学 一种体外活化人记忆性b细胞成浆细胞的培养方法
CN110248668B (zh) 2016-12-15 2023-05-30 杜克大学 用于消耗调节性b10细胞的抗体和方法以及与免疫检查点抑制剂的联用
EP3562936B1 (en) 2017-01-02 2024-05-22 F. Hoffmann-La Roche AG B-cell cultivation method
EP3401332A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 MAB Discovery GmbH Anti-il-1r3 antibodies for use in inflammatory conditions
EP3625332B1 (en) * 2017-05-19 2022-02-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the production of thymocyte supernatant
JP6967080B2 (ja) * 2017-11-08 2021-11-17 シャープ株式会社 電池用負極、電池および電池の製造方法
CN111417719B (zh) 2017-11-30 2023-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 B细胞培养方法
CN108588019B (zh) * 2018-05-03 2019-04-02 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件
CN109234232A (zh) * 2018-09-30 2019-01-18 杭州华安单抗生物技术有限公司 兔外周血b细胞的培养体系及培养方法、抗体的制备方法和应用
CN113272327A (zh) * 2018-12-30 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗兔cd19抗体及其使用方法
WO2021211997A1 (en) * 2020-04-16 2021-10-21 The General Hospital Corporation B cell immunomodulatory therapy for acute respiratory distress syndrome
CN111518765B (zh) * 2020-05-12 2021-01-26 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 一种b淋巴细胞体外培养体系及应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58116678A (ja) * 1981-12-28 1983-07-11 Ajinomoto Co Inc 浮遊性動物細胞の培養法およびその装置
JPS58216125A (ja) * 1982-06-09 1983-12-15 Asahi Chem Ind Co Ltd ヒト抗体の産生方法
AU7767191A (en) * 1990-04-17 1991-11-11 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Feeder cells for monoclonal antibody production
US5387940A (en) * 1993-07-07 1995-02-07 Rca Thomson Licensing Corporation Method and apparatus for providing scaleable compressed video signal
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6541225B1 (en) * 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
WO2002014481A1 (fr) * 2000-08-16 2002-02-21 Takara Bio Inc. Procede de culture extensive de lymphocytes t cytotoxiques specifiques de l'antigene
US20060051348A1 (en) 2004-09-09 2006-03-09 Jorn Gorlach Method of producing a plurality of isolated antibodies to a plurality of cognate antigens
US20070031550A1 (en) 2005-08-15 2007-02-08 Samson Allan D Method for continuously processing meat substrates
WO2007031550A2 (en) * 2005-09-15 2007-03-22 Crucell Holland B.V. Method for preparing immunoglobulin libraries
JP2009511067A (ja) * 2005-10-14 2009-03-19 メディミューン，エルエルシー 抗体ライブラリーの細胞提示
PT2540820T (pt) * 2005-12-09 2018-03-02 Academisch Medisch Centrum Bij De Univ Van Amsterdam Meios e métodos para influenciar a establidade de células produtoras de anticorpos
PL1974020T3 (pl) * 2005-12-16 2011-11-30 Ribovax Biotechnologies Sa Sposoby uzyskiwania unieśmiertelnionych komórek wydzielających przeciwciała
DK2021463T3 (en) * 2006-05-19 2017-01-16 Alder Biopharmaceuticals Inc Culture method to obtain a cloned population of antigen-specific B cells
US8642307B2 (en) 2006-05-25 2014-02-04 Nalge Nunc International Corporation Cell culture surface chemistries
CA2688146C (en) 2007-05-21 2018-03-06 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies to il-6 and use thereof
US8404235B2 (en) * 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
WO2010011894A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vh4 codon signature for multiple sclerosis
EP2352763B2 (en) * 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
US9347043B2 (en) * 2008-10-22 2016-05-24 Institute For Research In Biomedicine Methods for producing antibodies from plasma cells
EP2233502A1 (en) * 2009-03-27 2010-09-29 Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin Sialylated antigen-specific antibodies for treatment or prophylaxis of unwanted inflammatory immune reactions and methods of producing them
US8609101B2 (en) * 2009-04-23 2013-12-17 Theraclone Sciences, Inc. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) neutralizing antibodies
WO2011046623A2 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Duke University Hiv-1 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
SI2400298T1 (sl) 2013-11-29
BR112012025695A2 (pt) 2016-07-05
US20130084637A1 (en) 2013-04-04
RU2015155197A (ru) 2019-01-16
CN102918395A (zh) 2013-02-06
EP3239708A1 (en) 2017-11-01
PL2400298T3 (pl) 2014-01-31
JP6204415B2 (ja) 2017-09-27
KR20130030758A (ko) 2013-03-27
CA2798286C (en) 2019-05-28
EP2577304B1 (en) 2017-05-10
DK2400298T3 (da) 2013-09-02
WO2011147903A1 (en) 2011-12-01
ES2632928T3 (es) 2017-09-18
CA2798286A1 (en) 2011-12-01
CA3008822A1 (en) 2011-12-01
EP2400298B1 (en) 2013-08-14
JP5779239B2 (ja) 2015-09-16
JP2013526286A (ja) 2013-06-24
RU2709531C2 (ru) 2019-12-18
CN105039252A (zh) 2015-11-11
EP3239708B1 (en) 2021-01-06
EP2577304A1 (en) 2013-04-10
HK1181112A1 (en) 2013-11-01
CA3008822C (en) 2020-08-25
EP2400298A1 (en) 2011-12-28
US20160251621A1 (en) 2016-09-01
ES2858450T3 (es) 2021-09-30
CN105039252B (zh) 2019-05-28
RU2012153785A (ru) 2014-07-10
KR101495976B1 (ko) 2015-02-25
MX345884B (es) 2017-02-22
RU2015155197A3 (es) 2019-07-17
US20210062149A1 (en) 2021-03-04
CN102918395B (zh) 2015-09-09
JP6353953B2 (ja) 2018-07-04
EP3825690A1 (en) 2021-05-26
JP2017169579A (ja) 2017-09-28
ES2434256T3 (es) 2013-12-16
HK1212731A1 (zh) 2016-06-17
JP2015211690A (ja) 2015-11-26
US20180298335A1 (en) 2018-10-18
BR112012025695B1 (pt) 2022-06-21
PL3239708T3 (pl) 2021-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2012013437A (es) Metodo de cultivo de celulas b individuales.
JP2013526286A5 (es)
US20240117308A1 (en) Method for the production of thymocyte supernatant
JP6916884B2 (ja) Ｂ細胞培養法
US11952586B2 (en) B-cell cultivation method
JP7026634B2 (ja) Ｂ細胞培養法
RU2575569C2 (ru) Способ культивирования одиночной в-клетки

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration