JP2015211690A - 単一b細胞培養法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の段階を含むB細胞を得るための方法。a)B細胞を標識する段階、b)標識されたB細胞を単一細胞として沈着させる段階、c)単一細胞沈着したB細胞をフィーダー細胞と共培養する段階、d)段階c)における、増殖しかつIgGを分泌するB細胞を選択し、それによってB細胞を得る段階。沈着段階の前に、EL-4B5培地中で該B細胞を37°Cで1時間インキュベートする段階を含み得る。また共培養の前に、単一細胞沈着した該B細胞を遠心分離する段階を含み得る。共培養において、IL1βおよびTNFα、並びに黄色ブドウ球菌株Cowans細胞又はBAFF又はIL2および/又はIL10および/又はIL6および/又はIL4を含むフィーダー混合物が使用され得る。
【選択図】なし
Description
モノクローナル抗体を分泌する細胞を得るためには、KoehlerおよびMilsteinによって開発されたハイブリドーマ技術が広く用いられている。しかし、ハイブリドーマ技術では、免疫化実験動物から得られたB細胞のごく一部のみが融合され、増殖され得るにすぎない。B細胞の供給源は一般的に、免疫化実験動物の脾臓などの臓器である。
a) B細胞集団のB細胞を任意に標識する段階、
b) 単一細胞として置かれた、B細胞集団の各B細胞をフィーダー細胞と個々に共培養する段階、
c) 段階b)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階。
a) 実験動物からB細胞を採取する段階、
b) B細胞を標識する段階、
c) 標識されたB細胞を単一細胞として置く段階、
d) 単一細胞として置かれたB細胞をフィーダー細胞と個々に共培養する段階、
e) 段階d)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択し、それによってB細胞クローンを得る段階。
a) B細胞集団の細胞を少なくとも1つの蛍光色素で任意に標識する段階、
b) 個々の容器に単一細胞として置かれた、B細胞集団の各B細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下で培養して、個々のB細胞クローンおよび培養上清を得る段階、
c) 標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞クローンを選択する段階、
d) 段階c)において選択されたB細胞クローンによって産生される、標的抗原に特異的に結合する抗体をコードする核酸、またはそのヒト化変種を含む細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
段階c)の後の:c1) 逆転写PCRにより、抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸配列を決定する段階、
段階c1)の後の:c2) 抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸配列を含む核酸を細胞にトランスフェクトする段階。
a) (実験動物の血液から採取された)(成熟)B細胞集団を提供する段階、
b) B細胞集団の細胞を少なくとも1つの蛍光色素で(1つの態様においては、1つ〜3つまたは2つ〜3つの蛍光色素で)標識する段階、
c) 個々の容器(1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に、標識されたB細胞集団の単一細胞を置く段階、
d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物(1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は天然TSNであり、1つの態様においてフィーダー混合物は合成フィーダー混合物である)の存在下で培養する段階、
e) 個々のB細胞の培養液中に分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
g) モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
h) 該核酸を細胞に導入する段階、
i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、段階e)の選択されたB細胞クローンによって産生される抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体アミノ酸可変ドメイン配列を得る段階
をさらに含む。
[本発明1001]
以下の段階を含む、B細胞を選択するための方法:
a) 単一細胞として置かれた、B細胞集団の各B細胞をフィーダー細胞と共培養する段階、
b) 段階a)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階。
[本発明1002]
以下の段階を含む、標的抗原に結合する抗体を生成するための方法:
a) 個々の容器に単一細胞として置かれたB細胞集団の各B細胞を、フィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下で共培養する段階、
b) 標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞クローンを選択する段階、
c) 段階b)において選択されたB細胞クローンによって産生される抗体をコードする核酸またはそのヒト化変種を含む細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
[本発明1003]
単一細胞を置く前に、B細胞集団を共培養培地中でインキュベートする段階をさらに含む、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1004]
インキュベーションする段階が約37℃で約1時間であることを特徴とする、本発明1003記載の方法。
[本発明1005]
共培養の前に、単一細胞として置かれたB細胞を遠心分離する段階をさらに含む、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1006]
遠心分離が約300×gで約5分間行われることを特徴とする、本発明1005記載の方法。
[本発明1007]
B細胞集団が密度勾配遠心分離によって単離されることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1008]
B細胞が成熟B細胞であることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1009]
標識化が2つまたは3つの蛍光色素を用いて行われることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1010]
全B細胞集団の細胞の0.1%〜2.5%が標識されることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1011]
B細胞がマウスB細胞またはハムスターB細胞またはウサギB細胞であることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1012]
フィーダー細胞がマウスEL-4 B5細胞であることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1013]
共培養する段階が、10%(v/v) FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む1%(w/v)の200 mMグルタミン溶液、2%(v/v)の100 mMピルビン酸ナトリウム溶液、ならびに1%(v/v)の1 M 2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン)-エタンスルホンサン(HEPES)緩衝液を補充したRPMI 1640培地中で行われることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1014]
B細胞がマウス起源のものであり、かつ標識化がIgG+CD19+ B細胞および/またはIgG-CD138+ B細胞のものであることを特徴とする、本発明1001〜1010および1012〜1013のいずれか一項記載の方法。
[本発明1015]
B細胞がハムスター起源のものであり、かつ標識化がIgG+IgM- B細胞のものであることを特徴とする、本発明1001〜1010および1012〜1013のいずれか一項記載の方法。
[本発明1016]
B細胞がウサギ起源のものであり、かつ標識化がIgG+ B細胞および/もしくはCD138+ B細胞、またはCD138+IgG+ B細胞および/もしくはIgG+IgM- B細胞のものであることを特徴とする、本発明1001〜1010および1012〜1013のいずれか一項記載の方法。
[本発明1017]
共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10および黄色ブドウ球菌(Staphylocuccus aureus)株Cowans細胞を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、前記本発明のいずれか一項記載の方法。
[本発明1018]
共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10およびインターロイキン21を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、本発明1001〜1016のいずれか一項記載の方法。
[本発明1019]
共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10および腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子(BAFF)を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、本発明1001〜1016のいずれか一項記載の方法。
[本発明1020]
共培養する段階が、フィーダー混合物としての胸腺細胞培養上清の存在下で行われることを特徴とする、本発明1001〜1016のいずれか一項記載の方法。
[本発明1021]
胸腺細胞培養上清が若年動物の胸腺の胸腺細胞から得られる、本発明1020記載の方法。
本明細書において報告される方法により、個々のB細胞クローンから得られたモノクローナル抗体の結合特異性の迅速な特徴づけが可能になる、すなわち実験動物の最初の免疫化後の4週間以内に、誘導された抗体産生細胞を単離することができ、それらから産生された抗体の結合特異性を決定することができ、そのためにはB細胞共培養上清中の抗体量/濃度のために少なくとも4回の異なる実験が行われ得る。
多くの場合、抗体に基づく治療法を評価するための動物モデルとして、マウス、ウサギ、ハムスター、およびラットなどの非ヒト動物が用いられる。したがって、非ヒト動物抗原およびヒト抗原に結合する交差反応性抗体を提供することが必要である場合が多い。本明細書において報告される方法を用いて、交差反応性抗体を提供することができる。本明細書において報告される方法では、例えばマウス、ハムスター、およびウサギから採取されたB細胞を用いることができる。1つの態様において、マウスはNMRIマウスまたはbalb/cマウスである。別の態様において、ハムスターは、アルメニアンハムスター(タビキヌゲネズミ(Cricetulus migratorius))、チャイニーズハムスター(モンゴルキヌゲネズミ(Cricetulus griseus))、およびシリアンハムスター(ゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus))より選択される。特定の態様において、ハムスターはアルメニアハムスターである。1つの態様において、ウサギは、ニュージーランドホワイト(NZW)ウサギ、ツィンマーマンウサギ(ZIKA)、Alicia変異株ウサギ、basilea変異株ウサギ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックウサギ、rbIgMノックアウトウサギ、およびそれらの交雑種より選択される。
実験動物の血液は、高度な多様性の抗体産生B細胞を提供する。そこから採取されたB細胞は、CDR内にほとんど同一ではないまたは重複しないアミノ酸配列を有する抗体を産生し、よって高度な多様性を示す。
抗原と特異的に結合する抗体を産生するB細胞を、末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮することができる。したがって、本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、B細胞集団は末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮される。
PE:フィコエリトリン
APC:アロフィコシアニン
FITC:フルオレセインイソチオシアネート
A647:Alexa Fluor(登録商標) 647
FITC:フルオレセインイソチオシアネート
本明細書において報告される方法は、B細胞集団のB細胞を単一細胞として置く段階を含む。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、単一細胞として置くことは蛍光活性化細胞選別(FACS)によって行われる。FACSで単一細胞を置くことに必要な標識化は、前項において報告されるように行うことができる。
いくつかの付加的な段階が先行しておよびまた後続して、フィーダー細胞との共培養段階を行うことができる。
*マクロファージが枯渇
共培養後の分泌されたIgGの(定性的および定量的)測定には、一般的に、ELISAなどの当業者に公知のすべての方法を用いることができる。本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様では、ELISAが用いられる。マウスB細胞によって分泌されたIgGの測定に関する1つの特定の態様では、抗IgG抗体AB 216(捕獲抗体)およびAB 215(トレーサー抗体)によるELISAが用いられる。ハムスターB細胞によって分泌されたIgGの測定に関する1つの特定の態様では、モノクローナル抗体AB 220(捕獲抗体)およびAB 213(トレーサー抗体)によるELISAが用いられる。
B細胞から全mRNAを単離し、cDNAに転写することができる。特異的プライマーを用いて、同族のVH領域およびVL領域コード核酸を増幅することができる。それと共に得られた核酸の配列決定により、ほとんどの場合に(71〜95%)、得られた抗体がモノクローナル抗体であることが確認された。個々のB細胞の配列決定から、同一の配列がほとんど得られないこともまた理解され得る。したがって、本方法は、同一抗原に結合する高度に多様な抗体を提供する。
a) (実験動物の血液から採取された)(成熟)B細胞集団を提供する段階、
b) B細胞集団の細胞を少なくとも1つの蛍光色素で(1つの態様においては、1つ〜3つまたは2つ〜3つの蛍光色素で)染色する段階、
c) 個々の容器(1つの態様においては、容器はマルチウェルプレートのウェルである)に、染色されたB細胞集団の単一細胞を置く段階、
d) 置かれた個々のB細胞をフィーダー細胞およびフィーダー混合物(1つの態様においてフィーダー細胞はEL-4 B5細胞であり、1つの態様においてフィーダー混合物は天然TSNであり、1つの態様においてフィーダー混合物は合成フィーダー混合物である)の存在下で培養する段階、
e) 個々のB細胞の培養中に分泌された抗体の結合特異性を決定する段階、
f) 逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定により、特異的結合抗体の可変軽鎖および重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによってモノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る段階、
g) モノクローナル抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、抗体発現用の発現カセットに導入する段階、
h) 該核酸を細胞に導入する段階、
i) 細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。
培地および緩衝液:
ELISA用のブロッキング緩衝液は、1×PBSおよび1% BSAを含む。
動物の管理および免疫化
実験動物は、ドイツ動物保護法(TierSCHG)に従って、および各欧州指針に従って維持した。
器官、血液、およびマクロファージの除去
マウスおよびハムスター由来の血液は、眼球後静脈の中断によって採取した。ウサギ由来の血液は、耳静脈、またはより大量の場合には耳動脈の中断によって採取した。3度目、4度目、5度目、および6度目の免疫化の4〜6日後にウサギから全血(10 ml)を回収し、FACSによる単一細胞選別に使用した。
EL-4 B5細胞の培養
凍結EL-4 B5細胞を37℃の水浴中で迅速に融解し、EL-4 B5培地10 mlで希釈した。300×gで10分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを培地に再懸濁した。さらなる遠心分離段階の後、上清を再度廃棄し、ペレットを培地1 mlに再懸濁した。
密度勾配遠心分離
末梢血単核細胞(PBMC)の単離は、製造業者の説明書A(Lympholyte(登録商標)-哺乳動物、cedarlane)に従ってLympholyte(登録商標)を用いて密度勾配遠心分離により行った。
赤血球の低張溶解
低張溶解による赤血球の破壊のため、塩化アンモニウム溶液(BD Lyse(商標))を水で1:10に希釈し、全血に対して1:16の比で添加した。赤血球を溶解するため、この混合物を暗下で15分間インキュベートした。無傷細胞から細胞残屑を分離するため、溶液を800×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをPBSに再懸濁し、再度洗浄し、遠心分離し、ペレットをPBSに再懸濁した。
実験動物の内部器官からの細胞の調製
脾臓細胞および胸腺細胞を調製するため、各器官をペトリ皿内で切断し、細胞をPBS中に取り出した。残存組織を除去するため、細胞懸濁液を100μm篩を通して濾過した。脾臓細胞からリンパ球を採取するため、密度勾配遠心分離を使用した。胸腺細胞については、さらなる濃縮段階は必要ではなかった。
マクロファージの枯渇
滅菌6ウェルプレート(細胞培養等級)を使用して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させた。ウェルをKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)またはストレプトアビジンのいずれかおよび対照ペプチドでコーティングした。各ウェルを3ml〜最大4 mlの培地、および免疫化ウサギ由来の最大6×106個までの末梢血単核細胞で満たし、インキュベーター内で37℃で60〜90分間結合させた。その後、リンパ球含有上清を遠心分離バイアルに移し、800×gで10分間遠心分離した。ペレットをPBSに再懸濁した。
KLH特異的B細胞の枯渇
マルチウェルプレートのウェル中で、4 mlのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を含む溶液を、コーティング緩衝液と共に2μg/mlの濃度で室温で一晩インキュベートした。枯渇段階の前に、上清を除去し、ウェルをPBSで2回洗浄した。その後、血液細胞を2×106個細胞/mlの細胞密度に調整し、3 mlをマルチウェルプレートの各ウェルに添加した。その後、マルチウェルプレートを37℃で60〜90分間インキュベートした。上清を遠心分離バイアルに移し、ウェルをPBSで2回洗浄し、これら上清を遠心分離バイアル中で混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化し、ペレットをPBSで再懸濁した。
抗原特異的B細胞の濃縮
各抗原を、最終濃度が2μg/mlになるようにコーティング緩衝液で希釈した。この溶液3 mlを6ウェルマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用する前に上清を除去し、ウェルをPBSで2回洗浄した。B細胞溶液を2×106個細胞/mlの濃度に調整し、3 mlを6ウェルマルチウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを37℃で60〜90分間インキュベートした。上清を除去し、ウェルをPBSで2〜4回洗浄した。抗原特異的B細胞を回収するため、1 mlのトリプシン/EDTA溶液をマルチウェルプレートのウェルに添加し、37℃で10〜15分インキュベートした。培地を添加することによりインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルをPBSで2回洗浄し、この上清を他の上清と混合した。細胞を800×gで10分間遠心分離してペレット化した。ペレットをPBSで再懸濁した。
B細胞とEL-4 B5細胞の共培養
a) 共培養は、丸底を有する96ウェルマルチウェルプレート中で行った。EL-4 B5培地中にEL-4 B5細胞(1.6×106個細胞/15.2 ml)およびサイトカインを含む基礎溶液を調製した。200μlの基礎溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに添加した。各ウェルに対して、蛍光活性化細胞選別により単一B細胞を添加した。B細胞の添加後、プレートを300×gで5分間遠心分離した。プレートを37℃で7日間インキュベートした。
T細胞の培養
それぞれ3〜4週齢のマウスおよびハムスターまたは4〜5週齢のウサギの胸腺からT細胞を単離した。細胞を遠心分離し、直ちに培養するか、または3×107個細胞の分割量で凍結した。胸腺細胞は、175 cm2培養フラスコ中で、5×105個細胞/EL-4 B5培地1 mlの最小細胞密度で播種し、37℃で48時間インキュベートした。
マクロファージの培養
それぞれ少なくとも3ヵ月齢のマウスおよびハムスターの腹腔からマクロファージを単離した。マウスもしくはハムスター由来の腹腔マクロファージ、またはウサギ由来の血液単核細胞を、175 cm2培養フラスコ中少なくとも1×105個細胞/mlの細胞密度で、EL-4 B5培地中で37℃にて1.5時間培養した。その後、培地を除去し、温めたEL-4 B5培地で洗浄することにより接着したマクロファージから接着しなかった細胞を除去し、続いて35 ml培地中で48時間培養した。
T細胞とマクロファージの共培養
T細胞およびマクロファージを別々のフラスコ中で48時間培養した。両方の細胞集団を混合する前に、T細胞を800×gで10分間遠心分離した。細胞上清を破棄し、細胞ペレットを培地10 mlに再懸濁した。T細胞を5×105個細胞/mlの最小細胞密度に調整し、培地1 ml当たり10 pgホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)および5 ngまたは50 ngフィトヘマグルチニンM(PHA-M)を添加した。マクロファージから培養液を除去し、マクロファージを含むフラスコにT細胞懸濁液を添加した。36時間の共培養後に培養液を除去し、これをTSN溶液と命名した。残存細胞を除去するため、TSN溶液を0.22μmフィルターを通して濾過した。TSN溶液を4 mlの分割量で-80℃で凍結した。
免疫蛍光染色
染色しようとする細胞の数に応じて、細胞をそれぞれ100μl培地(106個未満の細胞)または200μl培地(106個超の細胞)中に提供した。蛍光標識抗体を実験動物の5%血清およびFACS緩衝液で、それぞれ100μlまたは200μlの最終量に希釈した。反応混合物をローラーラック上で、暗下で4℃にて40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を300×gで5分間、2回洗浄した。ペレットをPBS 400μlに再懸濁し、70μm篩を通して濾過した。濾過した溶液をFACSバイアルに移し、FACS実験の直前に、死細胞をヨウ化プロピジウム(6.25μg/ml)の添加により染色した。標識抗体がビオチンで標識されている場合には、抗体はストレプトアビジン標識Alexa Fluor(登録商標) 647(抗体197)により2段階で検出した。
IgGの定量
7日間の共培養後に、共培養を行った96ウェルマルチウェルプレートを300×gで5分間遠心分離した。上清150μlを除去し、第2の96ウェルマルチウェルプレート中でPBSで2:1の比に希釈した。
抗原特異的IgGの検出
単一の置かれた、共培養されたB細胞により、または免疫化実験動物から採取されたB細胞により産生された抗体を、特異的抗原結合に関して特徴づけることができる。ELISAを室温で行い、個々の段階の間にELISA溶液を20×gの振盪機上でインキュベートした。第1段階では、抗原を96ウェルマルチウェルプレートのウェルに結合させた。抗原がタンパク質である場合には、それをコーティング緩衝液で希釈し、プレートに直接適用した。ペプチド抗原は、特異的結合対であるビオチン/ストレプトアビジンを介して結合させた。マルチウェルプレートのウェルは、製造業者によって可溶性CroteinC(CrC)で既にコーティングされていてよい。そうでない場合には、抗原の固定化後に、ウェルをブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした。それぞれウェル当たり100μlの抗原溶液(予めコーティングされたマルチウェルプレート)またはブロッキング緩衝液200μlと共にインキュベートした後、非結合の抗原またはブロッキング緩衝液を洗浄緩衝液での洗浄により除去した。希釈したB細胞上清をウェル当たり100μlの量で添加し、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄した。その後、検出抗体をウェル当たり100μlの量で添加した。該抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合していてもよいし、またはビオチンで標識されていてもよい。検出抗体は、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートにより決定した。インキュベーション後、マルチウェルプレートを洗浄し、その後3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)を含む基質溶液をウェル当たり50μl添加し、表Xに示される期間インキュベートした。硫酸50μlの添加により酵素反応を停止し、光度計(Rainbow Thermo ELISAリーダー)およびXread plusソフトウェアにより450 nmおよび680 nmの吸光度を測定した。
リボ核酸(RNA)の単離
最初に、RNAを単離すべき細胞を遠心分離によってペレット化した。10μl/ml βメルカプトエタノールを含むRLT緩衝液100μlの添加により、細胞ペレットを溶解した。ピペットで複数回混合することにより、細胞を再懸濁した。溶液をマルチウェルプレートのウェルに移した。プレートに200×gで手短にショックを与え、これを-20℃で凍結した。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写は20μlの量で行った。各反応について、逆転写酵素を用いておよび用いずに対照を実施した。反応当たり1μl dNTP(それぞれ10 mM)、0.4μlオリゴ(dT)12-18 (0.2μg)、および0.6μlランダムヘキサマー(0.03μg)を予め混合し、H2O中のRNA 8.5μlに添加した。反応混合物を65℃で5分間インキュベートし、その後直接氷に移した。その後、2μl RT緩衝液(10×),4μl MgCl2(25 mM)、2μl DTT(0.1 M)、および1μl RNAse Out(商標)(40単位)を予め混合し、氷冷反応混合物に添加した。室温での2分間のインキュベーション時間の後、0.5μl Superscript(商標) II逆転写酵素(25単位)を添加した。反応混合物を室温で10分間インキュベートした。
ポリメラーゼ連鎖反応は、製造業者の説明書に従ってTaq PCR Coreキット(Qiagen、Hilden, Germany)を用いて行った。PCRは20μlの量で行った。試料を95℃のMastercyler(登録商標)に移した。
配列決定
配列はすべて、SequiServe(Vaterstetten, Germany)によって決定された。
抗原上でのパニング
a) プレートのコーティング
ビオチン/ストレプトアビジン:滅菌ストレプトアビジンコーティング6ウェルプレート(細胞培養等級)を、PBS中の0.5〜2μg/mlの濃度のビオチン化抗原と共に室温で1時間インキュベートした。プレートは、使用する前に滅菌PBSで3回洗浄した。
各抗原でコーティングした6ウェル組織培養プレートに、培地4 ml当たり最大で6×106個までの細胞を播種し、インキュベーター内で37℃で1時間結合させた。ウェルを1×PBSで1〜2回注意深く洗浄することにより、非接着細胞を除去した。残存する付着細胞を、インキュベーター内で37℃で10分間にわたりトリプシンによって剥離し、次いで培地で2回洗浄した。細胞は、免疫蛍光染色まで氷上で維持した。
Claims (21)
- 以下の段階を含む、B細胞を選択するための方法:
a) 単一細胞として置かれた、B細胞集団の各B細胞をフィーダー細胞と共培養する段階、
b) 段階a)における、増殖しかつ抗体を分泌するB細胞クローンを選択する段階。 - 以下の段階を含む、標的抗原に結合する抗体を生成するための方法:
a) 個々の容器に単一細胞として置かれたB細胞集団の各B細胞を、フィーダー細胞およびフィーダー混合物の存在下で共培養する段階、
b) 標的抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞クローンを選択する段階、
c) 段階b)において選択されたB細胞クローンによって産生される抗体をコードする核酸またはそのヒト化変種を含む細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収し、それによって抗体を生成する段階。 - 単一細胞を置く前に、B細胞集団を共培養培地中でインキュベートする段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーションする段階が約37℃で約1時間であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 共培養の前に、単一細胞として置かれたB細胞を遠心分離する段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 遠心分離が約300×gで約5分間行われることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- B細胞集団が密度勾配遠心分離によって単離されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- B細胞が成熟B細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 標識化が2つまたは3つの蛍光色素を用いて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 全B細胞集団の細胞の0.1%〜2.5%が標識されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がマウスB細胞またはハムスターB細胞またはウサギB細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- フィーダー細胞がマウスEL-4 B5細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 共培養する段階が、10%(v/v) FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む1%(w/v)の200 mMグルタミン溶液、2%(v/v)の100 mMピルビン酸ナトリウム溶液、ならびに1%(v/v)の1 M 2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン)-エタンスルホンサン(HEPES)緩衝液を補充したRPMI 1640培地中で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がマウス起源のものであり、かつ標識化がIgG+CD19+ B細胞および/またはIgG-CD138+ B細胞のものであることを特徴とする、請求項1〜10および12〜13のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がハムスター起源のものであり、かつ標識化がIgG+IgM- B細胞のものであることを特徴とする、請求項1〜10および12〜13のいずれか一項記載の方法。
- B細胞がウサギ起源のものであり、かつ標識化がIgG+ B細胞および/もしくはCD138+ B細胞、またはCD138+IgG+ B細胞および/もしくはIgG+IgM- B細胞のものであることを特徴とする、請求項1〜10および12〜13のいずれか一項記載の方法。
- 共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10および黄色ブドウ球菌(Staphylocuccus aureus)株Cowans細胞を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10およびインターロイキン21を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 共培養する段階が、インターロイキン1βおよび腫瘍壊死因子α、ならびにインターロイキン2およびインターロイキン10および腫瘍壊死因子ファミリーのB細胞活性化因子(BAFF)を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 共培養する段階が、フィーダー混合物としての胸腺細胞培養上清の存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 胸腺細胞培養上清が若年動物の胸腺の胸腺細胞から得られる、請求項20記載の方法。
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