CN111518765B - 一种b淋巴细胞体外培养体系及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于原代细胞培养技术领域，尤其涉及一种B淋巴细胞体外培养体系及应用。该培养体系利用能够分泌IL‑2等白介素分子的T淋巴细胞系为滋养细胞，以提供B淋巴细胞生长发育所需的微量白介素分子；再加入体外重组表达的、具有高生物活性的三聚体CD40L分子为重要分子，来进一步刺激B淋巴细胞的生长繁殖以及发育；本申请中还对滋养层细胞进行伽玛射线照射处理，使经过预处理的滋养层细胞失去细胞繁殖的能力，但在7‑14天内，仍旧具有蛋白质合成和分泌的能力。本发明提供的新型体外培养B淋巴细胞的培养体系，能够在体外有效地培养来源于兔、羊驼的B淋巴细胞，并能够利用这个方法来开发相应的单克隆抗体。

Description

一种B淋巴细胞体外培养体系及应用
技术领域
本发明属于原代细胞培养技术领域，尤其涉及一种B淋巴细胞体外培养体系及应用。
背景技术
随着现代生物学的发展，科学家们了解到人或动物体内的抗体，是由脾脏或外周血淋巴细胞中的B淋巴细胞及由此发育而成的浆细胞所产生和分泌。因此，如果能获得单一的B淋巴细胞，则可以从中获得对特定抗原物质均一的、特异性的抗体，即单克隆抗体。
由于能产生相应抗体的B淋巴细胞在体外不能够无限繁殖，因此目前对于单克隆抗体的开发主要依赖于分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在1975年创建的杂交瘤技术。该技术的主要原理是，针对相应的动物种属开发一种体外无限繁殖但不能合成分泌抗体的骨髓瘤细胞(如鼠骨髓瘤细胞、兔骨髓瘤细胞等)，然后将该骨髓瘤细胞在体外和含有分泌抗体的B淋巴细胞的脾脏细胞进行融合，再利用选择性培养基在体外进行培养和筛选，最终获得一种可以在体外增殖而又能分泌单克隆抗体的杂交瘤方法。虽然目前该方法仍然被广泛应用于科学研究、临床诊断和药物开发等多个领域，但是其局限性是显而易见的，主要表现在：1)开发周期长，一般需要4-6个月；2)所获得杂交瘤细胞中编码抗体的基因不稳定：在长期繁殖后，容易丢失，而失去分泌抗体的功能；3)不具有普适性：骨髓瘤细胞的开发费时费力，目前只有小鼠、大鼠和兔有相应的骨髓瘤细胞，且兔的骨髓瘤细胞还处于专利保护期，除了Abcam公司，其他公司均不可得。
所以，如何能够快速、有效、经济的从任何一种经免疫之后的动物中筛选和制备单克隆抗体，并获得稳定的单克隆抗体来源，仍然是目前单克隆抗体制备领域所亟需解决的问题。
目前，随着现代免疫学、分子生物学和细胞分选技术的发展，从人体或经免疫后的动物体内筛选出单个抗体分泌细胞(B淋巴细胞或浆细胞)；然后将所获得的细胞中编码抗体的基因扩增出来，在体外表达产生单克隆抗体的方法，逐渐被广泛应用。因此，如何在体外有效地培养单个抗体分泌细胞，是这个技术路线的关键步骤。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种B淋巴细胞体外培养体系及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明提供的一种原代分离B淋巴细胞的体外培养体系，该培养体系以能够表达分泌白介素2(IL-2)的HuT78细胞株为滋养层细胞、并辅以具有高度生物活性的CD40L三聚体蛋白，能够在体外高效的培养B淋巴细胞并诱导其分泌高浓度的免疫球蛋白(IgG)分子。
本发明是这样实现的，一种B淋巴细胞体外培养体系，包括：滋养层细胞，CD40L蛋白，白介素21和基础培养基；所述滋养层细胞能够分泌白介素2。
进一步地，所述滋养层细胞需经过4500RAD的伽玛射线预处理。
进一步地，所述滋养层细胞需经过佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导，诱导时间为12-24小时，所述佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯的浓度为5-10ng/ml。
进一步地，所述滋养层细胞经佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导后，再使用4500RAD的伽玛射线处理。
进一步地，所述CD40L蛋白为CD40L三聚体蛋白或CD40L单体蛋白。所述的CD40L蛋白为人源的蛋白、且为三聚体蛋白，在体外通过哺乳动物细胞体系重组生产，并经验证其为三聚体蛋白。
进一步地，所述滋养层细胞为商业化的T淋巴细胞系HuT78细胞，所述基础培养基为含15％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基。
进一步地，所述滋养层细胞的浓度为2.5X 105cells/ml，所述CD40L三聚体蛋白的终浓度为0.25-0.5ug/ml，所述IL-21的终浓度为40-80ng/ml。
所述IL-21为人源的白细胞介素，在体外通过哺乳动物细胞体系重组生产，并利用人NK-92细胞系经刺激后分泌干扰素能力的实验测定其生物活性不低于2ng/ml，具体参照文章Coquet JM,et al.(2007)IL-21is produced by NKT cells and modulates NKTcell activation and cytokine production.J Immunol.178(5):2827-34。
如上述的一种B淋巴细胞体外培养体系在B淋巴细胞体外培养中的应用，所述B淋巴细胞从兔子脾脏细胞或外周血淋巴细胞或骨髓细胞中分离的B淋巴细胞，或从羊驼外周血淋巴细胞中分离的B淋巴细胞。
进一步地，所述应用还包括诱导所述B淋巴细胞分泌兔IgG分子或羊驼IgG分子。
如上述的一种B淋巴细胞体外培养体系在制备兔单克隆抗体或羊驼单克隆抗体中的应用。所述羊驼单克隆抗体包括VHH纳米抗体。
进一步地，所述兔单克隆抗体的制备方法包括：使用抗原免疫新西兰大白兔后，获得兔子脾脏细胞、外周血淋巴细胞以及骨髓细胞，按照本公司专利《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，专利号ZL20191012091.4所述步骤，分离到表达抗原特异性抗体的兔B淋巴细胞，并通过流式筛选技术将其分选到含有滋养层细胞、IL-21、CD40L三聚体蛋白和基础培养基的U型底96孔细胞培养板中，进行体外培养，培养时间为7-14天。
进一步地，羊驼单克隆抗体的制备方法，使用抗原免疫美洲羊驼后，获得羊驼外周血淋巴细胞，按照本公司专利《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》，专利号ZL20191012091.4所述步骤，分离到表达抗原特异性抗体的羊驼B淋巴细胞，并通过流式筛选技术将其分选到含有滋养层细胞、IL-21、CD40L三聚体蛋白和基础培养基的U型底96孔细胞培养板中，进行体外培养，培养时间为7-14天。
如上述的一种B淋巴细胞体外培养体系在制备单克隆抗体药物中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
在原代分离的B淋巴细胞的体外培养体系中，单个或数量很少的细胞不易生存和繁殖，必须加入其他细胞和相应的细胞因子才能促使其生长和繁殖，其中所加入的其他细胞称之为滋养层细胞(Feeder Cells)。在B淋巴细胞的体外培养中，目前所见的专利，都以能分泌CD40L分子的细胞株为滋养细胞，并在培养基中加入体外重组表达的白介素分子(如IL-2等)来促进B淋巴细胞的生长繁殖以及发育。但是，发明人发现，在B淋巴细胞的生长繁殖以及发育过程中，所需要白介素分子的浓度非常低，而需要较高浓度和高活性的CD40L分子，所以利用分泌CD40L分子的细胞株为滋养细胞，所分泌的CD40L分子并不能达到促使B淋巴细胞生长繁殖以及发育的有效浓度，因此所培养的B淋巴细胞分泌IgG分子的比例和浓度均不高。
本发明提供了一种新型的B淋巴细胞体外培养体系，即利用能够分泌IL-2等白介素分子的T淋巴细胞系(在本专利中是HuT78细胞系)为滋养细胞，以提供B淋巴细胞生长发育所需的微量白介素分子；再加入体外重组表达的、具有高生物活性的三聚体CD40L分子为重要分子，来进一步刺激B淋巴细胞的生长繁殖以及发育。
在对原代分离的B淋巴细胞的体外培养过程中，必须对所使用的滋养层细胞进行预处理。使用活的滋养层细胞，其在培养过程也会生长而消耗培养基中的一些营养成分，从而不利于所需要的B淋巴细胞的生长和繁殖。对滋养层细胞的预处理以使用伽玛射线照射为佳，即通过对伽玛射线剂量的摸索，可以使经过预处理的滋养层细胞失去细胞繁殖的能力，但在7–14天内，仍旧具有蛋白质合成和分泌的能力。在本专利中，用于预处理滋养层细胞的伽玛射线剂量为4500RAD。
本发明主要提出了一种新型的体外培养B淋巴细胞的培养体系，能够在体外有效的培养来源于兔、羊驼的B淋巴细胞，并能够利用这个方法来开发相应的单克隆抗体。
本发明所提供的B淋巴细胞体外培养体系，利用HuT78细胞株为滋养细胞系；HuT78细胞株在经PMA刺激之后，可以分泌白介素-2(IL-2)分子，为诱导B淋巴细胞增殖分化的重要分子，并且通过刺激HuT78所产生的IL-2分子具有天然构象、生物活性高。
CD40L是B淋巴细胞体外存活和进行抗体类型转换(Class switch)的重要分子，主要是通过和B淋巴细胞表面的CD40受体分钟结合发挥作用；天然状态下的CD40L以三聚体形式的存在，因此和一般市售的单聚体CD40L分子相比，三聚体CD40L分子具有比较高的生物活性，有助于进一步促进B细胞在体外的存活和分泌IgG分子的能力。
和其他B淋巴细胞体外培养技术相比，利用本发明中的培养体系对B淋巴细胞进行培养之后，无论是B淋巴细胞的体外存活能力(反映在IgG分子分泌的阳性率)和分泌IgG分子的浓度上面，具有显著提高。
本发明中所提供的B淋巴细胞体外培养方法还具有一定的普适性，即既可以用于兔B淋巴细胞的体外培养，也可以用于羊驼B淋巴细胞的体外培养。
附图说明
图1是实施例1中的实验结果；
图2是兔B淋巴细胞培养实验结果；
图3是羊驼B淋巴细胞培养实验结果；
图4是实施例4中的实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种B淋巴细胞体外培养体系及应用。
本发明涉及的新型B淋巴细胞体外培养体系，包括滋养层细胞、IL-21、三聚体CD40L蛋白和基础培养基；其中，滋养细胞优选为HuT78细胞系，包括现有保藏号为
Figure BDA0002488447980000041
TIB-152TM的细胞株。
具体技术方案如下各实施例所示。
实施例1伽玛射线处理后滋养细胞分泌白介素水平检测
在第一天，将作为滋养细胞的HuT78细胞按照0.3X 106的密度在RPMI-1640+10％胎牛血清的基础培养基中，并置于37℃5％CO2浓度的培养箱中进行培养。
第二天，加入佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(Phorbol Myristate Acetate，PMA)至终浓度为10ng/ml，继续培养24小时。
第三天，将HuT78细胞用4500RAD的伽玛射线照射。处理后，按照滋养细胞所需要的浓度(2.5X 105cells/ml)对HuT78细胞进行调整，并继续培养。
培养24小时、48小时、7天和10天后，分别收集培养上清，用针对IL-2分子的夹心法ELISA检测试剂盒(购自爱博泰克生物科技，目录号：RK00002)对上清中的IL-2水平进行检测；
检测结果见图1，其中，1：HuT78细胞未经PMA处理(按照第一天的条件处理后，后续既不PMA处理，也不射线照射，而是延续第一天的条件培养)；2：HuT78细胞经10ng/ml PMA处理24小时、再培养24小时；3：HuT78细胞经10ng/ml PMA处理24小时后用4500RAD伽玛射线辐照后，再培养24小时；4：HuT78细胞经10ng/ml PMA处理24小时后用4500RAD伽玛射线辐照后，再培养48小时；5：HuT78细胞经10ng/ml PMA处理24小时后用4500RAD伽玛射线辐照后，再培养7天；6：HuT78细胞经10ng/ml PMA处理24小时后用4500RAD伽玛射线辐照后，再培养12天。
结果显示：HuT78细胞在经10ng/ml PMA处理48小时之后，在培养基上清中可以检测到约3.5ng/ml的人IL-2蛋白；而HuT78细胞在经10ng/ml PMA处理并经过4500RAD伽玛射线辐照后培养24小时，在培养基上清中可以检测到人IL-2蛋白分子，浓度和未经伽玛射线辐照的HuT78细胞基本一致；HuT78细胞在经10ng/ml PMA处理并经过4500RAD伽玛射线辐照后分别培养48小时、7天、10天后取样，在培养基上清中可以检测到人IL-2蛋白分子，与培养24小时的样品相比，浓度略有下降，但在第10天的样品中，仍旧可以检测到约为1.4ng/ml的人IL-2蛋白分子。
实施例2兔B淋巴细胞培养体系
本实施例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，包括：经gamma射线辐照处理后的滋养层细胞、IL-21、人CD40L三聚体蛋白(购自恺佧生物科技，目录号：CDL-HM140)和基础培养基。其中，表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞，从兔子的脾脏细胞中分离所得(方法同专利号ZL20191012091.4中的技术方案)。经gamma射线辐照处理后的滋养层细胞(同实施例1中的3条件下的处理条件)，浓度为2.5X 105cells/ml。IL-21的终浓度为50ng/ml，IL-21为人白介素21蛋白。人CD40L三聚体蛋白浓度为0.75ug/ml。基础培养基为含15％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基；培养条件为37度，5％CO2浓度。
对比例1
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中不含有滋养细胞。
对比例2
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中所加的滋养层细胞未经PMA预处理，但用相同剂量的gamma射线处理。
对比例3
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中所加的滋养层细胞为经PMA预处理，但未经gamma射线处理。
对比例4
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中未加IL-21蛋白。
对比例5
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中未加人CD40L三聚体蛋白。
对比例6
本对比案例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达兔IgG分子的兔B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中未加人CD40L三聚体蛋白，但加终浓度为0.75ug/ml的人CD40L单体蛋白(购自恺佧生物科技，目录号：CD4-HM140)。
按实施例2的条件和对比例1至6条件培养的单个兔B淋巴细胞，在培养7天后取上清，利用ELISA方法测试上清中IgG浓度。
ELISA检测方法如下：
用1ug/ml的羊抗兔IgG Fc特异性多克隆抗体铺384孔ELISA板，每孔25ul，4℃过夜。
次日，洗板后，用含5％脱脂奶粉、0.5％tween-20的1X PBS缓冲液封闭ELISA板，在常温孵育一小时。
洗板后，在384孔ELISA板的每个孔中加入15ul单个B细胞的培养上清和15ulELISA稀释液(1％BSA,0.5％tween-20,1X PBS)，室温孵育一小时。
洗板后，加入按产品说明书推荐比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG二抗分子，室温孵育一小时。
洗板后，加入新鲜配置的TMB显色液，加入25ul每孔，室温显色；待阳性孔显出蓝色后，加硫酸终止液进行终止显色反应。
用酶标仪记录450nm和630nm处的读数，最终每孔OD值为OD450–OD630。
IgG阳性细胞的比例和上清中所含的IgG浓度结果如图2所示，其中，1：实施例2；2：对比例1；3：对比例2；4：对比例3；5：对比例4；6：对比例5；7：对比例6。由图2可以看出，实施例2所提供的单个兔B淋巴细胞培养条件为最优，在培养7天之后，在IgG阳性细胞的比例或上清中所含IgG浓度，均优于其他对比例条件。具体来看：由实施例2和对比例1、2的比较可以看出，滋养层细胞、以及对滋养层细胞的预刺激和gamma射线照射的预处理对于单个兔B淋巴细胞的培养十分关键，没有滋养层细胞和对滋养层细胞进行预刺激，在培养上清中将不含有相应的白介素分子，使单个兔B淋巴细胞经培养后IgG阳性细胞的比例急剧下降，证明白介素分子对B淋巴细胞的存活率存在着重大影响。由实施例2和对比例3可以看出，未对滋养层细胞进行gamma射线照射的预处理，滋养层细胞仍旧具有增殖的能力，需要消耗培养基中的大量养分，使单个兔B淋巴细胞的存活率也大大下降。由实施例2和对比例4的比较可以看出，IL-21主要的作用是促进B淋巴细胞产生抗体，在培养基中不加IL-21，对IgG阳性细胞比例和对培养上清中所含的IgG浓度均存在着一定的影响，含高浓度IgG分子(IgG浓度大于100ng/ml)培养孔的比例减少约50％左右。由实施例2和对比例5的比较可以看出，由于人的CD40L和兔CD40L蛋白存在着同源性，用人的CD40L蛋白能够对单个兔B淋巴细胞的增殖和存活具有重要的作用，但在不含人CD40L蛋白的培养基中，单个兔B淋巴细胞经培养后IgG阳性细胞的比例下降50％；由实施例2和对比例6的比较可以看出，单体的人CD40L分子对单个兔B淋巴细胞的增殖和存活同样具有刺激作用，但和三聚体人CD40L蛋白分子相比，其刺激作用相对较弱，具体表现在分泌高浓度IgG分子(IgG浓度大于1000ng/ml)培养孔的比例明显减少。
实施例3羊驼B淋巴细胞培养体系
本实施例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达羊驼IgG分子的羊驼B淋巴细胞的培养体系，包括：经gamma射线辐照处理后的滋养层细胞(同实施例1中3的处理条件)、IL-21、人CD40L三聚体蛋白和基础培养基。其中，表面表达羊驼IgG分子的羊驼B淋巴细胞，从羊驼的外周血淋巴细胞中分离所得(方法同专利号ZL20191012091.4中的技术方案)，经gamma射线辐照处理后的滋养层细胞，浓度为2.5X 105cells/ml。IL-21的终浓度为50ng/ml。IL-21为人白介素21蛋白。人CD40L三聚体蛋白浓度为0.75ug/ml。基础培养基为含15％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基；培养条件为37℃，5％CO2浓度。
对比例7
本对比例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达羊驼IgG分子的羊驼B淋巴细胞的培养体系，与实施例3的区别在于本对比例提供的培养体系中不含有滋养细胞。
对比例8
本对比例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达羊驼IgG分子的羊驼B淋巴细胞的培养体系，与实施例3的区别在于本对比例提供的培养体系中未加IL-21蛋白。
对比例9
本对比例提供了一种在96孔U型底细胞培养板中、单个培养表面表达羊驼IgG分子的羊驼B淋巴细胞的培养体系，与实施例2的区别在于本对比例提供的培养体系中未加人CD40L三聚体蛋白。
按实施例3条件和对比例7至9条件培养的单个羊驼B淋巴细胞，在培养7天后取上清，利用ELISA方法测试上清中IgG浓度。
ELISA检测方法如下：
用1ug/ml的驴抗羊驼IgG多克隆抗体铺384孔ELISA板，每孔25ul，4℃过夜。
次日，洗板后，用含5％脱脂奶粉、0.5％tween-20的1X PBS缓冲液封闭ELISA板，在常温孵育一小时。
洗板后，在384孔ELISA板的每个孔中加入15ul单个B细胞的培养上清和15ulELISA稀释液(1％BSA，0.5％tween-20，1X PBS)，室温孵育一小时。
洗板后，加入按产品说明书推荐比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)偶联的兔抗羊驼IgG二抗分子，室温孵育一小时。
洗板后，加入新鲜配置的TMB显色液，加入25ul每孔，室温显色；待阳性孔显出蓝色后，加硫酸终止液进行终止显色反应。
用酶标仪记录450nm和630nm处的读数，最终每孔OD值为OD450–OD630。
IgG阳性细胞的比例和上清中所含的IgG浓度检测结果如图3所示，其中，1：实施例3；2：对比例7；3：对比例8；4：对比例9。由图3可以看出，实施例3所提供的单个羊驼B淋巴细胞培养条件为最优，在培养7天之后，在IgG阳性细胞的比例或上清中所含IgG浓度，均优于对比例条件7至9。具体来看：由实施例3和对比例7的比较可以看出，与单个兔B淋巴细胞的培养类似，预处理的滋养层细胞对于单个羊驼B淋巴细胞的培养十分关键，在没有滋养层细胞存在的情况下，单个羊驼B淋巴细胞经培养后IgG阳性细胞的比例急剧下降，证明有滋养层细胞所分泌的人白介素分子同样可以支持羊驼B淋巴细胞的存活，且十分关键。由实施例3和对比例8的比较可以看出，人IL-21同样能够促进B淋巴细胞分泌IgG分子，在培养基中不加人IL-21，对IgG阳性细胞比例的影响不大，但对培养上清中所含的IgG浓度存在着一定的影响，含高浓度IgG分子培养孔的比例降低。由实施例3和对比例9的比较可以看出，用人CD40L三聚体蛋白同样能够对单个羊驼B淋巴细胞的增殖和存活具有重要的作用，不在含人CD40L三聚体蛋白的培养基中，单个羊驼B淋巴细胞经培养后IgG阳性细胞的比例下降为50％。
实施例4
通常，可以就特异性抗原结合来表征由单个来自于经抗原免疫后的实验动物中所分离的B淋巴细胞产生的抗体。在本实施例中，按照本公司专利号ZL20191012091.4中的技术方案，从经免疫后的新西兰大白兔中富集获得特异性抗原结合的B淋巴细胞，并单个分选至96孔U型底细胞培养板中，按照实施例2中的条件进行培养。培养7天之后，取出上清，按照下列流程检测上清中抗原特异性兔单克隆抗体的存在：
用1ug/ml的相应抗原蛋白铺384孔ELISA板，每孔25ul，4℃过夜。
次日，洗板后，用含5％脱脂奶粉、0.5％tween-20的1X PBS缓冲液封闭ELISA板，在常温孵育一小时。
洗板后，在384孔ELISA板的每个孔中加入15ul单个B细胞的培养上清和15ulELISA稀释液(1％BSA,0.5％tween-20,1X PBS)，室温孵育一小时。
洗板后，加入按产品说明书推荐比例稀释的辣根过氧化酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG二抗分子，室温孵育一小时。
洗板后，加入新鲜配置的TMB显色液，加入25ul每孔，室温显色；待阳性孔显出蓝色后，加硫酸终止液进行终止显色反应。
用酶标仪记录450nm和630nm处的读数，最终每孔OD值为OD450–OD630。
用实施例2中所列方法检测上清中兔IgG的存在。抗原ELISA检测和IgG水平ELISA检测的结果如图4所示。抗原ELISA阳性的B淋巴细胞收集后可以存储在100ulRNAlaterTMStabilization Solution(ThermoFisher,Cat.No.:AM7021)缓冲液中，于-80冷冻可以用于兔IgG重链和轻链基因的克隆。
由图4可以得出，按照实施例2中的条件，在体外培养经抗原筛选的单个B淋巴细胞，可以促进B淋巴细胞的存活并分泌抗原特异性的兔单克隆抗体(兔IgG分子)；而且阳性比例在30％左右，远远高于传统的杂交瘤融合方法(约5-10％)。因此，本专利中的兔单B淋巴细胞体外培养的方法，结合分子生物学方法，能够快速的从抗原特异性的B淋巴细胞中克隆出编码兔IgG的重链和轻链基因，最终在体外表达获得兔单克隆抗体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种B淋巴细胞体外培养体系，其特征在于，所述培养体系由滋养层细胞，CD40L蛋白，白介素21和基础培养基组成；所述滋养层细胞为商业化的T淋巴细胞系HuT78细胞，能够分泌白介素2；所述滋养层细胞需经过佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导，诱导时间为24小时，所述佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯的浓度为10 ng/ml；所述滋养层细胞经佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导后，再使用4500 RAD的伽玛射线处理；所述CD40L蛋白为CD40L三聚体蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种B淋巴细胞体外培养体系，其特征在于：所述基础培养基为含15%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基。
3.根据权利要求1所述的一种B淋巴细胞体外培养体系，其特征在于：所述滋养层细胞的浓度为2.5 × 105 cells/ml，所述CD40L三聚体蛋白的终浓度为0.75µg/ml，所述IL-21的终浓度为50ng/ml。
4.如权利要求1-3任一所述的一种B淋巴细胞体外培养体系在B淋巴细胞体外培养中的应用，所述B淋巴细胞为从兔子脾脏细胞或外周血淋巴细胞或骨髓细胞中分离的B淋巴细胞，或从羊驼外周血淋巴细胞中分离的B淋巴细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用还包括诱导所述B淋巴细胞分泌兔IgG分子或羊驼IgG分子。
6.如权利要求1-3任一所述的一种B淋巴细胞体外培养体系在制备兔单克隆抗体或羊驼单克隆抗体的任一种中的应用。
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