CN113416701A - 一种nk细胞培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养基及培养方法，所述的方法包括：(1)使用激活培养基调整含NK细胞细胞群的细胞密度，然后将含NK细胞细胞群加到抗体包被的细胞培养器中，加入白蛋白、IL‑2、IL‑7和/或IL‑15，置于培养箱培养；(2)培养过程中补加扩增培养基，按培养基总量补加IL‑2、IL‑7、IL‑15和/或白蛋白。通过本发明所述的方法培养NK细胞，NK细胞可以增殖150倍，且具有较高的比例。

Description

一种NK细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种NK细胞培养基及培养方法。
背景技术
近年来，恶性肿瘤的发病率逐年增高，严重危害人类健康，如何寻找到有效的治疗方法来控制肿瘤的进展、提高患者生存率及生活质量，成为众多学者关注的热点。具有细胞毒杀伤性细胞为基础的免疫细胞治疗成为手术、放化疗后的另一种治疗模式，引发越来越多学者的关注。过继免疫细胞疗法(ACI)属于细胞生物治疗方法中的其中一种，是指向病人体内输注具有抗肿瘤能力的免疫细胞，直接消灭恶变细胞或触发身体免疫反应来消灭恶变细胞，获得抗肿瘤的目的。目前临床级别的过继免疫细胞主要包括DC细胞，CIK细胞，DC-CIK细胞，TIL细胞和NK细胞。
NK细胞(natural killer cell)的表型特征为CD3-CD56+，是天然免疫系统中的一种效应细胞，不需要抗原提前致敏及MHC限制就可以识别并对恶变细胞产生杀伤作用，是临床利用细胞免疫治疗恶性血液系统疾病和实体肿瘤的基础。NK细胞主要来源于骨髓的CD34+淋巴细胞，人体许多组织，包括脾脏、肝脏、淋巴结、骨髓和外周血中都存在有NK细胞。人类外周血中淋巴细胞的NK细胞占比大约为10-15％，其中90％左右的NK细胞为CD56dim，大多数为CD16+，可通过IFN-γ、颗粒酶、穿孔素、FasL、或TRAIL途径对感染细胞或肿瘤细胞做出早期免疫应答反应或产生ADCC效应(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)；大约10％的外周血NK细胞为CD56bright，它们通过分泌IFN-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF和IL-3参与晚期(＞16小时)抗炎免疫反应。DC细胞和NK细胞的相互作用可引发适应性免疫应答非常重要，NK细胞也能够通过CD40配体直接与T细胞和B细胞相互作用。NK细胞还可以通过分泌多种细胞因子和趋化因子来调节适应性免疫应答，因此它也是连接固有性免疫和适应性免疫的一座桥梁，在肿瘤免疫和清除非自体细胞等方面产生着举足轻重的作用。
NK细胞的培养方法多种多样，细胞来源也多种多样，但因其培养过程繁琐、成本较高、细胞比例较低等因素限制了NK细胞的临床应用。如何培养具有高密度、高活性、低凋亡比例等特征的NK细胞是目前的一个研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效扩增NK细胞的培养基及培养方法。
为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种培养NK细胞的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)使用激活培养基调整含NK细胞细胞群的细胞密度，然后将含NK细胞细胞群加到抗体包被的细胞培养器中，加入白蛋白、IL-2、IL-7和/或IL-15，置于培养箱培养，优选加入白蛋白、IL-2、IL-7和IL-15；
(2)培养过程中补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白；
所述的抗体包括CD16抗体和CD52抗体。
进一步，所述的抗体还包括CD3抗体。
本文中所述的“培养”，包括提供NK细胞维持所需的化学、物理条件(例如，温度，气体)和生长因子。
NK细胞是参与免疫反应的淋巴样细胞。这些细胞具有各种功能，尤其是杀死活体内肿瘤细胞、发生致癌转化和其它异常细胞的功能，是先天免疫监视机制的重要组分。NK细胞展示出抗病毒性感染和肿瘤细胞的自发非MHC受限的细胞毒活性，并介导体内对病毒性感染和癌进展的抵抗力。
在NK细胞的培养中使用的细胞培养器只要是可培养NK细胞的，就不特别限定，但可举出瓶、组织培养用瓶、皿、平皿、组织培养用皿、多联皿、微平板、微孔板、多联盘、多孔板、显微镜载玻片、室玻片、培养皿、管、托盘、培养袋、及滚瓶。
细胞培养器可为细胞粘接性，也可为细胞非粘接性，根据目的适宜选择。细胞粘接性的培养器可为以使培养器的表面的与细胞的粘接性升高的目的，用细胞外基质(ECM)等的任意的细胞支持用基质包被的。细胞支持用基质可为以NK细胞的粘接作为目的的任意的物质。
其他培养条件可适宜设定。例如，培养温度无特别限定，可为约30～40℃、优选为约37℃。CO2浓度可为约1～10％、优选为约2～5％。氧分压可为1～10％。
进一步，所述步骤(2)包括：所述步骤(1)后的第4天，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白。
进一步，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠。
进一步，在补加扩增培养基前，将细胞转移至G-Rex10培养瓶。
进一步，所述步骤(2)还包括：所述步骤(1)后的第7天，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白。
进一步，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠。
进一步，在补加扩增培养基前，将细胞转移至G-Rex100培养瓶中。
进一步，所述步骤(2)还包括：所述步骤(1)后的第10天，弃掉部分上层培养基，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白。
进一步，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠。
进一步，所述的方法还包括：所述步骤(1)后的第14天，收获细胞。
进一步，所述的激活培养基包括GT-T551培养基、RPMI1640培养基、VIVO-15培养基.
进一步，所述的激活培养基为VIVO-15培养基
进一步，所述的扩增培养基为88-581-CM培养基。
进一步，采用所述的方法培养NK细胞，NK细胞可以增殖150倍以上。
本发明的NK细胞可以源自任何包含这种细胞的来源。NK细胞可以发现于许多组织，并能够获自，例如，淋巴结、脾、肝、肺、肠、蜕膜，并也能够获自iPS细胞或胚胎干细胞(ESC)。通常情况下，脐血，外周血，流通外周血和骨髓，含有异质淋巴细胞的细胞群，用于提供大量的NK细胞供研究和临床应用。因此，根据本发明一个实施方式的一个方面，所述方法包括培养源自脐血、外周血或骨髓中之一的含NK细胞细胞群。
进一步，所述的含NK细胞细胞群为白细胞。
进一步，所述的白细胞为外周血白细胞。
进一步，所述的外周血白细胞的分离方法为Ficoll密度梯度分离法。
进一步，所述的外周血白细胞的调整后的细胞密度为1*106/mL。
作为白蛋白，具体而言，可举出卵清蛋白、猪来源白蛋白、牛来源白蛋白、人来源白蛋白等的天然来源的白蛋白或牛型、猪型、或者人型等的基因重组体的白蛋白等，可适宜地例示特别血清来源的白蛋白或人型的基因重组体白蛋白(重组体人白蛋白(rHSA))。在本发明的具体实施例中，所述的白蛋白为人血白蛋白。
进一步，所述的人血白蛋白浓度为2％。
除非本文内另外规定，否则术语“抗体”广泛涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体诸如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体、以及所有前述各物的片段和衍生物，所述片段和衍生物具有抗原结合位点。抗体衍生物可包含缀合于抗体的蛋白质或化学部分。
如本文所用的术语“抗体”也包括抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)。如本文所用的术语“抗原结合部分”是指抗体的一种或多种保留特异性结合抗原(例如生物标志物多肽或其片段)的能力的片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来执行。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)经分离互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但可使用重组方法由使得它们能够成为其中VL区和VH区配对以形成单价多肽的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science242:423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；以及Osbourn等1998,NatureBiotechnology 16:778)的合成接头来使它们接合。所述单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。可使特定scFv的任何VH和VL序列连接于人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列以产生编码完整IgG多肽或其他同种型的表达载体。VH和VL也可用于使用蛋白质化学或重组DNA技术来产生Fab、Fv或其他免疫球蛋白片段。也涵盖其他形式的单链抗体，诸如微型双功能抗体。微型双功能抗体是二价双特异性抗体，其中VH结构域和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短以致不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。
抗体可为多克隆或单克隆抗体；异种异体、同种异体或同种同基因抗体；或其经修饰形式(例如人源化抗体、嵌合抗体等)。抗体也可为完全人抗体。优选地，本发明的抗体特异性或大致上特异性结合生物标志物多肽或其片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指仅含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的一个种类的抗原结合位点的抗体多肽的群体，而术语“多克隆抗体”是指含有能够与特定抗原相互作用的多个种类的抗原结合位点的抗体多肽的群体。
进一步，所述CD3抗体为CD3单克隆抗体。
进一步，所述的CD3单克隆抗体的浓度为0.095～0.15μg/mL。
进一步，所述的CD16抗体为CD16单克隆抗体。
进一步，所述的CD16单克隆抗体的浓度为2.5～3.5μg/mL。
进一步，所述的CD52抗体为CD52单克隆抗体。
进一步，所述的CD52单克隆抗体的浓度为8～12μg/mL。
进一步，所述的IL-2的浓度为450～550U/mL。
进一步，所述的IL-7的浓度为25～35ng/mL。
进一步，所述的IL-15的浓度为16～24ng/mL。
进一步，所述的转铁蛋白的浓度为0.95～1.25μg/mL。
进一步，所述的亚硒酸钠的浓度为4.5～5.5ng/mL。
本发明第二方面提供了一种高效扩增NK细胞的培养基，所述的培养基包括基础培养基和添加因子，所述的添加因子包括白蛋白、IL-2、IL-7和/或IL-15，优选白蛋白、IL-2、IL-7和IL-15。
进一步，所述的基础培养基包括扩增培养基。
进一步，所述的扩增培养基为88-581-CM培养基。
进一步，所述的基础细胞培养基还包括激活培养基。
进一步，所述的激活培养基包括GT-T551培养基、RPMI1640培养基、VIVO-15培养基。
进一步，所述的激活培养基为VIVO-15培养基。
进一步，所述的白蛋白为人血白蛋白。
进一步，所述的人血白蛋白浓度为2％。
进一步，所述的IL-2的浓度为450～550U/mL。
进一步，所述的IL-7的浓度为25～35ng/mL。
进一步，所述的IL-15的浓度为16～24ng/mL。
进一步，所述的添加因子还包括CD52抗体和/或CD16抗体，优选包括CD52抗体和CD16抗体。
进一步，所述的CD52抗体为CD52单克隆抗体。
进一步，所述的CD52单克隆抗体的浓度为8～12μg/mL。
进一步，所述的添加因子还包括CD16抗体。
进一步，所述的CD16抗体为CD16单克隆抗体。
进一步，所述的CD16单克隆抗体的浓度为2.5～3.5μg/mL。
进一步，所述的添加因子还包括CD3抗体。
进一步，所述的CD3抗体为CD3单克隆抗体。
进一步，所述的CD3单克隆抗体的浓度为0.095～0.15μg/mL。
进一步，所述的添加因子还包括转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选包括转铁蛋白和亚硒酸钠。
进一步，所述的转铁蛋白的浓度为0.95～1.25μg/mL。
进一步，所述的亚硒酸钠的浓度为4.5～5.5ng/mL。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述的高效扩增NK细胞的培养基在培养NK细胞中的应用。
如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
在本发明中，所有数字指称，例如浓度、量等，包括范围，都是近似值，这些值在适当的情况下以0.1或1.0的增量变化，即(+)或(-)。应当理解，尽管并非总是明确地陈述，但是所有数字指称前均可以有术语“约”。
在本发明中，如果没有额外说明，所有添加因子的浓度均应理解为该添加因子在培养基中的终浓度。
目前涉及NK细胞移植患者的许多临床试验正在进行，对于这些病症，包括而不排他地，例如，白血病(NCT 00799799和NCT 00303667)，恶性血液病(NCT 00697671，NCT00354172和00640796)，后-ASCT(NCT 00586703)，成神经细胞瘤(NCT 00698009)，恶性黑[色]素瘤(NCT 00846833)，采用化疗的组合疗法(NCT 00625729)，实体肿瘤(NCT00640796)和鼻咽癌(NCT00717184)以及对于各种恶性肿瘤(NCT01105650)。对于NK细胞疗法，目前临床试验和详细方案的完整而详细的现有清单在美国国立健康临床试验研究所网站能够找到。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种培养NK细胞的方法，解决了NK细胞培养中成本高，操作繁琐、培养困难、NK细胞纯度和活性不高的问题。
本发明还提供了一种可用于NK细胞培养的细胞培养基。
附图说明
图1是流式细胞术检测CD3-细胞实验结果图；
图2是流式细胞术检测CD3-CD56+细胞实验结果图；
图3是流式细胞术检测AnnexinV FITC+/PI+细胞实验结果图；
图4是流式细胞术检测NK细胞表面NKG2D表达量实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1 NK细胞培养方法
一、实验试剂和耗材：
1)包被液，内含10mLPBS缓冲液，0.095～0.15μg/mL CD3单抗(OKT3克隆)，2.5～3.5μg/mL CD16单抗，8～12μg/mL CD52单抗，-20℃保存。使用前4℃隔夜融化，分装为1mL每支，-20℃保存，临用前取出融化。
2)添加物：IL-2、IL-7、IL-15、转铁蛋白、亚硒酸钠。
3)人血白蛋白。
4)激活培养基：VIVO-15培养基，30mL。
5)扩增培养基：88-581-CM培养基，1L。
6)高密度培养瓶：G-Rex10、100培养瓶各1个。
二、实验方法
1、NK细胞培养方法
1)取1mL包被液，加入T75培养瓶，再加入2mLPBS混匀，4℃平放静置过夜。
2)第0天，用Ficoll密度梯度分离外周血白细胞。
3)吸走PBS，加入10mL激活培养基，调整细胞密度为约1*106/mL，接种到T75培养瓶中，加入450～550U/mL IL-2、25～35ng/mL IL-7、16～24ng/mL IL-15、2％人血白蛋白。
4)第4天，将T75培养瓶中细胞转移至G-Rex10培养瓶，依据细胞密度，补充约30mL扩增培养基，使培养基总量为40mL，加入450～550U/mL IL-2，25～35ng/mL IL-7，16～24ng/mL IL-15，0.95～1.25μg/mL转铁蛋白、4.5～5.5ng/mL亚硒酸钠，2％人血白蛋白。
5)第7天，G-Rex10中细胞转移到G-Rex100培养瓶中，补加扩增培养基360mL，使终体积为400mL，加入450～550U/mL IL-2，25～35ng/mL IL-7，16～24ng/mL IL-15，0.95～1.25μg/mL转铁蛋白、4.5～5.5ng/mL亚硒酸钠，2％人血白蛋白。
6)第10天，将G-Rex100瓶中上层培养基吸去300mL，补加扩增培养基300mL，使终体积为400mL，加入450～550U/mL IL-2，25～35ng/mL IL-7，16～24ng/mL IL-15，0.95～1.25μg/mL转铁蛋白、4.5～5.5ng/mL亚硒酸钠，2％人血白蛋白。
7)第14天，收获细胞，进行相应检测。
2、细胞培养效果检测
1)PBS离心清洗细胞，1000rpm，5min，重复洗2次。
2)重悬细胞，终浓度1×105/mL。
3)分别取1mL细胞悬液于流式细胞管中，1000rpm，5min，弃去大部分上清，仅保留80-100μL液体。
4)按照下表加入抗体，FITC标记每管加入抗体20μL，PE标记每管加入抗体20μL，APC标记每管加抗体10μL，漩涡混合后，4℃避光孵育30min。
表1流式细胞管中添加的抗体种类
Figure BDA0003184466140000091
Figure BDA0003184466140000101
5)待检测样品分别用1mLPBS缓冲液悬浮，1000rpm离心5min。
6)弃去上清液，待检测样品用500μLPBS重悬，上机进行检测。
三、实验结果
1)通过本方法培养的NK细胞，初始细胞总量为1*107，最终收获细胞1.5*109，细胞增殖150倍。
2)如图2，流式检测结果显示，通过本方法培养NK细胞，CD3-细胞比例为90.46％，CD3-CD56+NK细胞比例为87.36％。
3)如图3，流式检测结果显示，凋亡细胞的比例为9.79％，证明通过本方法培养的NK细胞具有较低的凋亡水平。
4)如图4，流式检测结果显示，NKG2D表达水平高(91.37％)，证明通过本方法培养的NK细胞，细胞活性高。
实施例2不同培养方法的效果对比
对比组1：
对比组1中，除未添加人血白蛋白、激活剂和扩增剂中不包含IL-7、包被液中不包含CD3和CD52，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。对比组2：
对比组2中，除包被液中不包含CD3和CD52，包被液额外添加了10μg/mL CD56，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组3：
对比组3中，除未添加人血白蛋白、激活剂和扩增剂中不包含IL-7、包被液中不包含CD3，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组4：
对比组4中，除包被液中不包含CD16和CD3，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组5：
对比组5中，除激活剂和扩增剂不包含IL-2和IL-5，包被液中不包含CD3，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组6：
对比组6中，除包被液中不包含CD3，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组7：
对比组7中，除包被液中不包含CD3，包被液中额外添加了CD56，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组8：
对比组8中，除包被液中不包含CD16、CD52，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
对比组9中，除包被液中不包含CD52、CD3，其余实验材料和实验步骤均与实施例1中的实验组一致。
实验结果：如表2所示，采用实验组培养方法培养NK细胞的效果优于对照组。
表2不同培养方法的对比实验结果
Figure BDA0003184466140000111
Figure BDA0003184466140000121
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种培养NK细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)使用激活培养基调整含NK细胞细胞群的细胞密度，然后将含NK细胞细胞群加到抗体包被的细胞培养器中，加入白蛋白、IL-2、IL-7和/或IL-15，置于培养箱培养，优选加入白蛋白、IL-2、IL-7和IL-15；
(2)培养过程中补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白；
所述的抗体包括CD16抗体和CD52抗体，优选的，所述的抗体还包括CD3抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：所述步骤(1)后的第4天，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白，优选的，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠，优选的，在补加扩增培养基前，将细胞转移至G-Rex10培养瓶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括：所述步骤(1)后的第7天，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白，优选的，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠，优选的，在补加扩增培养基前，将细胞转移至G-Rex100培养瓶中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括：所述步骤(1)后的第10天，弃掉部分上层培养基，补加扩增培养基，按培养基总量补加IL-2、IL-7、IL-15和/或白蛋白，优选补加IL-2、IL-7、IL-15和白蛋白，优选的，还补加转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选补加转铁蛋白和亚硒酸钠，优选的，所述的方法还包括在所述步骤(1)后的第14天，收获细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活培养基包括GT-T551培养基、RPMI1640培养基、VIVO-15培养基，优选的，所述的激活培养基为VIVO-15培养基，优选的，所述的扩增培养基为88-581-CM培养基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，采用所述的方法培养NK细胞，NK细胞可以增殖150倍以上。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的含NK细胞细胞群为白细胞，优选的，所述的白细胞为外周血白细胞，优选的，所述的外周血白细胞的分离方法为Ficoll密度梯度分离法，优选的，所述的外周血白细胞的调整后的细胞密度为1*106/mL，优选的，所述的白蛋白为人血白蛋白，优选的，所述的人血白蛋白浓度为2％，优选的，所述CD3抗体为CD3单克隆抗体，优选的，所述的CD3单克隆抗体的浓度为0.095～0.15μg/mL，优选的，所述的CD16抗体为CD16单克隆抗体，优选的，所述的CD16单克隆抗体的浓度为2.5～3.5μg/mL，优选的，所述的CD52抗体为CD52单克隆抗体，优选的，所述的CD52单克隆抗体的浓度为8～12μg/mL，优选的，所述的IL-2的浓度为450～550U/mL，优选的，所述的IL-7的浓度为25～35ng/mL，优选的，所述的IL-15的浓度为16～24ng/mL。
8.根据权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，所述的转铁蛋白的浓度为0.95～1.25μg/mL，优选的，所述的亚硒酸钠的浓度为4.5～5.5ng/mL。
9.一种高效扩增NK细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括基础培养基和添加因子，所述的添加因子包括白蛋白、IL-2、IL-7和/或IL-15，优选白蛋白、IL-2、IL-7和IL-15，优选的，所述的基础培养基包括扩增培养基，优选的，所述的扩增培养基为88-581-CM培养基，优选的，所述的基础细胞培养基还包括激活培养基，优选的，所述的激活培养基包括GT-T551培养基、RPMI1640培养基、VIVO-15培养基，优选的，所述的激活培养基为VIVO-15培养基，优选的，所述的白蛋白为人血白蛋白，优选的，所述的人血白蛋白浓度为2％，优选的，所述的IL-2的浓度为450～550U/mL，优选的，所述的IL-7的浓度为25～35ng/mL，优选的，所述的IL-15的浓度为16～24ng/mL，优选的，所述的添加因子还包括CD52抗体和/或CD16抗体，优选包括CD52抗体和CD16抗体，优选的，所述的CD52抗体为CD52单克隆抗体，优选的，所述的CD52单克隆抗体的浓度为8～12μg/mL，优选的，所述的CD16抗体为CD16单克隆抗体，优选的，所述的CD16单克隆抗体的浓度为2.5～3.5μg/mL，优选的，所述的添加因子还包括CD3抗体，优选的，所述的CD3抗体为CD3单克隆抗体，优选的，所述的CD3单克隆抗体的浓度为0.095～0.15μg/mL，优选的，所述的添加因子还包括转铁蛋白和/或亚硒酸钠，优选包括转铁蛋白和亚硒酸钠，优选的，所述的转铁蛋白的浓度为0.95～1.25μg/mL，优选的，所述的亚硒酸钠的浓度为4.5～5.5ng/mL。
10.权利要求9所述的高效扩增NK细胞的培养基在培养NK细胞中的应用。
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