CN103097520A - 产生自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用两步扩增和分化方法产生自然杀伤细胞的方法。本文还提供了抑制肿瘤细胞增殖、治疗患有癌或病毒感染的个体的方法，包括将通过所述方法产生的NK细胞施用给患有癌或病毒感染的个体。

Description

产生自然杀伤细胞的方法
1.相关申请
本发明申请主张2010年7月13日提交的美国临时专利申请序号No.61/363981和2011年6月16日提交的美国临时专利申请序号No.61/497897的权益，以上专利申请的公开内容以它们的全部内容作为参考并入本文。
2.技术领域
本文提供了产生自然杀伤细胞群体的方法，例如，来源于胎盘的自然杀伤细胞，例如，来源于胎盘灌洗液（例如，人胎盘灌洗液），如胎盘源中间体自然杀伤细胞，或者来源于其他组织，例如，脐带血或外周血。本文还提供了通过本文所提供的方法产生的扩增的自然杀伤细胞群体。本文还提供了使用胎盘灌洗液以及来自所述胎盘灌洗液的自然杀伤细胞抑制肿瘤细胞增殖的方法。在某些实施方式中，将所述自然杀伤细胞与一种或多种免疫调节化合物（例如，称为IMiDTM的免疫调节化合物）组合使用或用所述一种或多种免疫调节化合物处理。
3.背景技术
自然杀伤（NK）细胞是构成天然免疫系统的主要部分的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞不表达T细胞抗原受体（TCR）、CD3或表面免疫球蛋白（Ig）B细胞受体。NK细胞通常在人中表达表面标志物CD16（FcyRIII）和CD56，但人NK细胞的亚类为CD16。NK细胞是细胞毒性的；它们细胞质中的微粒含有特殊的蛋白质，如穿孔素和被称为颗粒酶的蛋白酶。一旦在要杀伤的靶细胞附近释放，则穿孔素在所述靶细胞的细胞膜中形成孔，通过该孔颗粒酶和结合分子可以进入，从而引起细胞凋亡。一种颗粒酶，颗粒酶B（也称为颗粒酶2和细胞毒性T-淋巴细胞相关丝氨酸酯酶1），是对于在细胞介导免疫反应中快速引起靶细胞细胞凋亡来说至关重要的丝氨酸蛋白酶。
NK细胞对干扰素或者巨噬细胞源细胞因子响应而被激活。激活的NK细胞称为淋巴因子活化的杀伤（LAK）细胞。NK细胞具有控制细胞的细胞毒活性的两种表面受体类型（标记为“激活受体”和“抑制受体”）。
除了活性，NK细胞在宿主肿瘤排斥中起作用。由于癌细胞的I类MHC表达降低或无表达，因此它们可以成为NK细胞的靶标。积累的临床数据表明分离自外周血单核细胞（PBMC）或骨髓的人NK细胞的单倍同一性移植介导了有效力的抗白血病作用而不会导致可检测的移植物抗宿主病（GVHD）。参见Ruggeri等人,Science295:2097-2100(2002)。自然杀伤细胞可以通过细胞缺少或显示出降低水平的主要组织相容性复合体（MHC）蛋白而被激活。另外，已知NK细胞上表达的激活受体介导了具有激活受体表达配体的“应激”或转化细胞的检测，并因此引起了NK细胞的激活。例如，NCR1（NKp46）结合病毒血球凝集素。NKG2D配体包含CMV UL16结合蛋白1（ULB1）、ULB2，ULB3和MHC I类多肽相关序列A（MICA）和MICB蛋白。NK蛋白2B4结合CD48，并且DNAM-1结合脊髓灰质炎病毒受体（PVR）和连接素2（Nectin-2），两者均在急性骨髓性白血病（AML）中持续检测到。参见Penda等人,Blood105:2066-2073(2004)。参见Marrobio等，此外，已说明AML的溶胞主要是自然细胞毒性受体（NCR）依赖性的。参见Fauriat等人,Blood109:323-330(2007)。激活并扩增的来源于外周血的NK细胞和LAK细胞已在晚期癌患者的离体疗法和体内治疗中使用，并且对骨髓相关疾病，如白血病；乳腺癌；和某些类型的淋巴瘤取得了一定的成功。LAK细胞治疗需要患者首先接受IL-2，随后进行白细胞去除术，然后将收获的自体同源性血细胞在存在IL-2的情况下培育和培养几天。必须将LAK细胞与相对高剂量的IL-2一起再输注以完成所述疗法。这种净化治疗（purging treatment）是昂贵的并可以导致严重的副作用。这些包括体液潴留、肺水肿、血压降低和高烧。
虽然NK细胞在杀死肿瘤细胞和病毒感染细胞中具有有利性能，但是它们仍难以与免疫疗法一起使用和在免疫疗法中应用，这主要是由于在培养和扩增期间难以维持它们的肿瘤靶向和杀肿瘤能力。因此，在本领域中需要发展产生和扩增保留杀肿瘤功能的自然杀伤细胞的有效方法。
4.发明内容
本文提供了将细胞，例如，造血细胞，如造血干细胞，例如，CD34+造血干细胞，扩增和分化为自然杀伤细胞的方法。在一个方面，本文提供了产生自然杀伤（NK）细胞的方法，包括在第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+干细胞或祖细胞以产生扩增和分化的细胞，并随后在其中所述细胞进一步扩增并分化成自然杀伤细胞的第二培养基中培养所述扩增的细胞。该第一步骤和第二步骤包括在具有细胞因子独特组合的培养基中培养细胞。在某些实施方式中，所述细胞因子（例如，细胞因子）不包含在培养基不明确的组分（例如，血清）中，例如，细胞因子（例如，细胞因子）对于培养基不明确的组分（例如，血清）来说是外源的。在某些实施方式中，所述方法是两步法。在某些实施方式中，该方法不包括其中接触细胞的任何第三步骤或中间步骤。在具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的方法，其包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自第一步骤的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。通过本文所提供的方法（例如，两步法）产生的自然杀伤细胞在本文中被称为TSNK细胞。
在某些实施方式中，所述第一培养基包括含有人血清（例如，人血清AB)、胎牛血清（FBS）或胎牛血清（FCS），例如，5%至20%（v/v）；干细胞因子（SCF），例如，1ng/mL至50ng/mL；FMS样酪氨酸激酶-3配体（Flt-3配体），例如，1ng/mL至20ng/mL；白细胞介素-7（IL-7），例如，1ng/mL至50ng/mL；促血小板生成素（TPO），例如，1ng/mL与50ng/mL；白细胞介素-2（IL-2），例如，50IU/mL至500IU/mL；白细胞介素-15（IL-15），例如，1ng/mL至50ng/mL；和/或肝素，例如，0.1IU/mL至10IU/mL中一种或多种的培养基。在具体的实施方式中，所述第一培养基包含干细胞因子（SCF）、白细胞介素-7（IL-7）和白细胞介素-15（IL-15）。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、人血清（例如，人血清AB)、FBS、FCS、SCF、IL-7和IL-15。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基还包含Flt-3配体（Flt3-L）、TPO、IL-2和/或肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、10%的人血清或者胎牛血清、20ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt3-L、20ng/mL的IL-7、20ng/mL的TPO、200IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-15和1.5IU/mL的肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基不包含IL-2。在另一种具体的实施方式中，在所述第一培养基中的所述培养包括使用饲养细胞，例如，K562细胞，例如，丝裂霉素C处理的K562细胞；外周血单核细胞（PBMC），例如，丝裂霉素C处理的PBMC或者组织培养贴壁干细胞，例如，丝裂霉素C处理的组织培养贴壁干细胞的培养。
在某些实施方式中，所述第一培养基为或者包含
Figure BDA00002911163500041
Figure BDA00002911163500042
X-VIVOTM10、X-VIVOTM15、OPTMIZER、
Figure BDA00002911163500043
H3000、CELLGRO、COMPLETETM和/或DMEM:F12。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰卡尼汀（还称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或OAC)，例如，约0.5mM-10mM。在一种实施方式中，所述培养基包括H3000和/或DMEM:F12和OAC，例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。在具体的实施方式中，所述培养基包含
Figure BDA00002911163500045
在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM:F12和约5mM的OAC。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含
Figure BDA00002911163500046
H3000和约5mM的OAC。
在某些实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含人血清（例如，人血清AB)、胎牛血清（FBS）或者胎牛血清（FCS），例如，5%-15%的FCS（v/v）；IL-2，例如，10IU/mL至1000IU/mL；转铁蛋白，例如，10μg/mL与50μg/mL；胰岛素，例如，5μg/mL至20μg/mL；乙醇胺，例如，5×104至5×105M；油酸，例如，0.1μg/mL至5μg/mL；亚油酸，例如，0.1μg/mL至5μg/mL；棕榈酸，例如，0.05μg/mL至2μg/mL；牛血清白蛋白（BSA），例如，1μg/mL至5μg/mL；和/或植物凝集素，例如，0.01μg/mL至1μg/mL中的一种或多种。在具体的实施方式中，所述第二培养基包含IL-2。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含人血清、FBS或FCS（例如，10%（v/v））、IL-2、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白（BSA）和/或植物凝集素。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含伊思考夫改良杜尔贝可培养基（IMDM）、10%的人血清、FBS或者FCS、400IU的IL-2、35μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的胰岛素、2×10-5M的乙醇胺、1μg/mL的油酸、1μg/mL的亚油酸、0.2μg/mL的棕榈酸、2.5μg/mL的BSA和0.1μg/mL的植物凝集素。在另一种具体的实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养包括（例如）当细胞在所述第二培养基中起始时，此后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天时，使用饲养细胞，例如，K562细胞（例如，丝裂霉素C处理的K562细胞）或PBMC（例如，丝裂霉素C处理的PBMC）的培养。在某些实施方式中，所述培养基包含 X-VIVOTM10、X-VIVOTM、OPTMIZER、H3000、CELLGRO COMPLETETM和/或DMEM:F12。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰卡尼汀（也称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或OAC）或影响线粒体中乙酰辅酶A循环的化合物、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺（thiazovivin）、Y-27632、pyintegrin、ρ激酶（ROCK）抑制剂、半胱天冬氨酸酶抑制剂或其他抗凋亡化合物/肽、NOVA-RS（Sheffield Bio-Science）或其他小分子生长增强因子中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含烟酰胺。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mM-10mM OAC。在一种实施方式中，所述培养基包括
Figure BDA00002911163500051
H3000和/或DMEM:F12和OAC，例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。在具体的实施方式中，所述培养基包含在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM:F12和约5mM的OAC。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含
Figure BDA00002911163500053
H3000和约5mM的OAC。
在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的方法，包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的两步法，其中所述方法的第一步包括在包含SCF、IL-7和IL-15中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分（例如，血清）中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中该方法的第二步包括在包含IL-2的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞，以产生激活的NK细胞。在另一种具体的实施方式中，该第一培养基还包含Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3-L）、促血小板生成素（Tpo）、白细胞介素-2（IL-2）和/或肝素中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，该第一培养基还包含约5%-20%的胎牛血清或人血清。在另一种具体的实施方式中，所述SCF在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述Flt3-L在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-2在所述第一培养基中以约50至约1500IU/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-7在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-15在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述Tpo在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述肝素在所述第一培养基中以约0.1至约30U/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述第二步中的所述IL-2在所述第二培养基中以50至约1500IU/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述第二培养基另外包含胎牛血清（FCS）、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白（BSA）和植物凝集素中的一种或多种。
在某些具体的实施方式中，在所述第二培养基中进行所述培养前将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在某些其他的具体实施方式中，将所述细胞在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在更具体的实施方式中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养21天，然后在所述第二培养基中培养21天。
本文还提供了通过如上所述的两步法产生的自然杀伤细胞群体，其在本文中称为TSNK细胞。在具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD3-CD56+。在具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD3-CD56+CD16-。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是CD94-CD117+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是CD161-。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是NKG2D+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是NKp46+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是CD226+。
在某些实施方式中，大于90%、92%、94%、96%或98%的所述TSNK细胞为CD56+和CD16-。在一些实施方式中，至少80%、82%、84%、86%、88%或90%的所述TSNK细胞为CD3-和CD56+。在其他实施方式中，大于90%、92%、94%、96%或98%的所述TSNK细胞是CD56+、CD16-和CD3-。在其他实施方式中，至少50%、52%、54%、56%、58%或60%的所述TSNK细胞是NKG2D+。在其他实施方式中，少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%的所述TSNK细胞是NKB1+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是NKAT2+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16+。在更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%或70%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为NKp46+。在其他更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD117+。在其他更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%、40%或45%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD94+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD161-。在其他更具体的实施方式中，至少10%、12%、14%、16%、18%或20%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD226+。在更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%或40%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD7+。在更具体的实施方式中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD5+。
在另一个方面，本文提供了TSNK细胞抑制肿瘤细胞增殖，治疗病毒感染或治疗癌（例如，血癌和实体瘤）的使用。在某些实施方式中，TSNK细胞与免疫调节化合物接触或与免疫调节化合物组合使用，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺。
在具体的实施方式中，所述癌是实体瘤。在另一种实施方式中，所述癌是血癌。在具体的实施方式中，所述癌是成胶质细胞瘤、原发性导管癌、白血病、急性T细胞白血病、慢性脊髓淋巴瘤（CML）、急性髓性白血病（AML）、慢性粒细胞性白血病（CML）、肺癌、结肠腺癌、组织细胞淋巴瘤、结直肠癌、结直肠腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤或视网膜母细胞瘤。
在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞来自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，是来自胎盘灌洗液和脐带血（例如，来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血）的混合细胞。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，可以通过混合或合并脐带血和胎盘灌洗液来获得混合的细胞。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或者3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。在更具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5（85%:15%）的比例混合。
在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的总有核细胞（TNC）含量的比值混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5或者3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。
因此，在一种实施方式中，本文提供了治疗患有癌或病毒感染的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的分离的TSNK细胞。
在具体的实施方式中，在所述施用之前，已用免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺处理了所述分离的TSNK细胞。在另一种具体的实施方式中，所述方法包括向所述个体施用（1）有效量的分离的TSNK细胞；和（2）有效量的免疫调节化合物或者沙利度胺。在本文中，“有效量”是指与患有所述癌或所述感染但未施用所述TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的个体相比导致所述癌或所述感染的一种或多种症状的可检测的改善的TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是来那度胺或玻马利度胺（pomalidomide）。在另一种实施方式中，所述方法还包括向所述个体施用抗癌化合物，例如，以下6.8.3节中所述的抗癌化合物的一种或多种。
在另一种实施方式中，本文提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括用治疗有效量的TSNK细胞接触肿瘤细胞。
在具体的实施方式中，在所述接触之前，已用免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺处理了所述分离的TSNK细胞。在另一种具体的实施方式中，另外用有效量的免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺接触所述肿瘤细胞。在本文中，“有效量”是指与未与所述TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺接触的相等个数的肿瘤细胞相比，导致所述肿瘤细胞可检测的抑制的TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在另一种具体的实施方式中，所述方法还包括用有效量的抗癌化合物，例如，下文中6.8.3节中所述的抗癌化合物接触所述肿瘤细胞。
在本方法的具体实施方式中，所述肿瘤细胞是血癌细胞。在另一种具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是实体瘤细胞。在另一种实施方式中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性脊髓淋巴瘤（CML）细胞、急性髓性白血病细胞、慢性粒细胞性白血病（CML）细胞、成胶质细胞瘤细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、结直肠癌细胞、前列腺癌细胞或结直肠腺癌细胞。在另一种具体的实施方式中，所述接触是在体外进行的。在另一种具体的实施方式中，所述接触是在体内进行的。在更具体的实施方式中，所述体内接触是在人中进行的。
在另一个方面，本文提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括向所述个体施用（1）来那度胺；（2）美法仑；和（3）扩增的NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的多发性骨髓瘤来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血细胞产生的NK细胞，例如，造血干细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞（例如，用于产生TSNK细胞）的任何方法产生了所述NK细胞。在另一种实施方式中，在所述施用之前已扩增了所述NK细胞。在另一种实施方式中，所述来那度胺、美法仑和/或NK细胞是彼此单独施用的。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施方式中，所述NK细胞是通过产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的两步法产生的，其中所述方法的第一步包括在包含干细胞因子（SCF）、白细胞介素-7（IL-7）和白细胞介素-15（IL-15）中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中所述方法的第二步包括在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞以产生激活的NK细胞。
在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的其他的具体实施方式中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增以产生激活的NK细胞群体。
在另一个方面，本文提供了治疗患有慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的（1）来那度胺；（2）美法仑；（3）氟达拉滨；和（4）扩增的NK细胞（例如，TSNK细胞），其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的所述CLL来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血细胞产生的NK细胞，例如，造血干细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞（例如，用于产生TSNK细胞）的任何方法产生了所述NK细胞。在任何上述方法的具体实施方式中，在所述施用之前已将所述NK细胞扩增了至少10天。在任何上述方法的具体实施方式中，将所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和扩增的NK细胞单独施用给所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施方式中，所述NK细胞是通过产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的两步法产生的，其中所述方法的第一步包括在包含干细胞因子（SCF）、白细胞介素-7（IL-7）和白细胞介素-15（IL-15）中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中所述方法的第二步包括在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞以产生激活的NK细胞。
在治疗患有CLL的个体的方法的其他的具体实施方式中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
在一个方面，本文提供了冷冻保存NK细胞（例如，TSNK细胞）群体的方法。在一种实施方式中，所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体，和（c）将来自步骤（b）的NK细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在具体的实施方式中，所述步骤（c）还包括（1）制备细胞悬液；（2）将冷冻保存培养基加入到来自步骤（1）的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；（3）将来自步骤（3）的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和（4）在-80℃以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤（a）和（b）以及步骤（b）和（c）之间不包括中间步骤。
在另一种实施方式中，冷冻保存NK细胞（例如，TSNK细胞）群体的所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子（SCF）、IL-2、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；（b）在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增来自步骤（a）的细胞以产生激活的NK细胞，和（c）在冷冻保存培养基中冷冻保存得自步骤（b）的NK细胞。在具体的实施方式中，所述步骤（c）还包括（1）制备细胞悬液；（2）将冷冻保存培养基加入到来自步骤（1）的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；（3）将来自步骤（3）的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和（4）在-80℃以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤（a）和（b）以及步骤（b）和（c）之间不包含中间步骤，和/或在步骤（a）之前不包含其他培养步骤。
在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞（例如，从中产生TSNK细胞的造血干细胞或祖细胞）以比外周血自然杀伤细胞可检测更高的水平表达微小RNA hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517，hsa-miR-518c，hsa-miR-519b和hsa-miR-520a中的一种或多种，如（例如）通过定量实时PCR（qRT-PCR）所确定的。
在上述方法的另一种具体实施方式中，所述TSNK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述自然杀伤细胞比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）表达可检测更多的颗粒酶B或穿孔素的量和时间接触。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述细胞比未接触所述免疫调节化合物（例如，来那度胺或者玻马利度胺（pomalidomide））或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）对所述肿瘤细胞表现出可检测更强的细胞毒性的量和时间接触。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞以比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）更高的水平表达BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA或TNFRSF18中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞以比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）更高的水平表达ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSFl、CSF2、ECEl、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI和/或TBX21中的一种或多种。
在上述治疗法或肿瘤抑制法的某些实施方式中，TSNK细胞与其他自然杀伤细胞混合，例如，分离自胎盘灌洗液、脐带血或外周血的自然杀伤细胞或者通过不同的方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞。在具体的实施方式中，所述TSNK细胞与来自另一种来源或通过不同的方法制备的自然杀伤细胞以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比值混合。
在另一个方面，本文提供了包含分离的TSNK细胞的组合物。在具体的实施方式中，所述TSNK细胞是由造血细胞产生的，例如，分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞占所述组合物中至少50%的细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞占所述组合物中至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的细胞。在某些实施方式中，所述组合物中大于90%、92%、94%、96%或98%的TSNK细胞是CD56+和CD16-。在其他实施方式中，所述组合物中至少80%、82%、84%、86%、88%或90%的TSNK细胞是CD3-和CD56+。在其他实施方式中，至少50%、52%、54%、56%、58%或60%的所述细胞是NKG2D+。在其他实施方式中，少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%的所述细胞是NKB1+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述细胞是NKAT2+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16+。在更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%或70%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为NKp46+。在其他更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD117+。在其他更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%、40%或45%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD94+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、12%、14%、16%、18%或20%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD226+。在更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%或40%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD7+。在更具体的实施方式中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD5+。
在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD56+、CD16-TSNK细胞来自单一个体。在更具体的实施方式中，所述分离的CD56+、CD16-自然杀伤细胞包括来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述TSNK细胞比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞（即，TSNK细胞）表达可检测更多的颗粒酶B或穿孔素的量和时间接触。在另一种个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或者沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是下文中6.2.1节中所述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。
在更具体的实施方式中，所述组合物包含来自另一种来源或通过另一种方法制备的TSNK细胞和自然杀伤细胞。在具体的实施方式中，所述其他来源是胎盘血和/或脐带血。在另一种具体的实施方式中，所述其他来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述TSNK细胞与来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比值混合。
在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含TSNK细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞中的任一种。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液来源于和所述TSNK细胞相同的个体。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来源于和所述TSNK细胞不同的个体的胎盘灌洗液。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或基本上所有（例如，大于90%、95%、98%或者99%）的细胞是胎儿细胞。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母细胞。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90%、80%，70%、60%或者50%的细胞。在另一种具体的实施方式中，通过将0.9%NaCl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一种具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一种具体的实施方式中，已处理了所述灌洗液以除去红血球。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如，下文中5.2.1.1节中所述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。
在另一种个具体的实施方式中，所述组合物包含TSNK细胞和胎盘灌洗液细胞。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞来源于和所述TSNK细胞相同的个体。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞来源于和所述TSNK细胞不同的个体。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞来源于不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一种更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞来源于至少两个个体。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。
4.1.定义
如本文所使用的，术语“免疫调节化合物”和“IMiDTM”不包含沙利度胺。
如本文所使用的，“来那度胺”表示3-(4'-氨基异吲哚-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮（化学文摘社命名）或者2,6-哌啶二酮,3-(4-氨基-l,3-二氢-1-氧-2H-异吲哚-2-基)-（国际纯粹化学与应用化学联合会（IUPAC）命名）。如本文所使用的，“玻马利度胺（pomalidomide）”表示4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。
如本文所使用的，当表示细胞时，“多能”表示细胞具有分化成另一种细胞类型的细胞的能力。在某些实施方式中，“多能细胞”是具有生长为哺乳动物体约260种细胞类型的任何亚类的能力的细胞。与多潜能细胞不同，多能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
如本文所使用的，“饲养细胞”是指与第二类型细胞共培养以提供其中第二类型细胞可以维持并且可能增殖的环境的一种类型的细胞。不受任何理论的束缚，饲养细胞可以为靶标细胞提供（例如）肽、多肽、电信号、有机分子（例如，类固醇）、核酸分子、生长因子（例如，bFGF）、其他因子（例如，细胞因子）和代谢营养物。在某些实施方式中，饲养细胞单层生长。
如本文所使用的，未进一步修饰的“自然杀伤细胞”或者“NK细胞”包括来自任何组织来源的自然杀伤细胞。
如本文所使用的，“TSNK”和“TSNK细胞”表示通过本文所公开的培养/扩增方法（例如，两步法）产生的自然杀伤细胞。
如本文所使用的，“胎盘灌洗液”是指已通过至少一部分胎盘（例如，人胎盘），例如通过胎盘脉管系统的灌洗溶液，其包含在从所述胎盘中通过期间由灌洗溶液所收集的多个细胞。
如本文所使用的，“胎盘灌洗液细胞”表示分离自或可分离自胎盘灌洗液的有核细胞，例如，总有核细胞。
如本文所使用的，“肿瘤细胞抑制”、“肿瘤细胞增殖的抑制”等包括（例如）通过杀死所述肿瘤细胞群体中一个或多个肿瘤细胞（例如，通过用（例如）TSNK细胞或者包含TSNK细胞的细胞群体接触肿瘤细胞群体）来减缓肿瘤细胞群体的生长。
如本文所使用的，术语“造血细胞”包括造血干细胞和造血祖细胞。
如本文所使用的，所述“不明确的组分”是培养基领域中的技术术语，其表示成分通常未提供或定量的组分。“不明确的组分”的实例无限制地包括人血清（例如，人血清AB）和胎儿血清（例如，胎牛血清（fetal bovine serum）或者胎牛血清（fetal calf serum））。
如本文所使用的，当用于表示特定细胞标志物的存在时，“+”表示在对同种型对照的荧光激活细胞分选中可检测地存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量RT-PCR中是在背景之上可检测的。
如本文所使用的，当用于表示特定细胞标志物的存在时，“-”表示在对同种型对照的荧光激活细胞分选中可检测地不存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量RT-PCR中是在背景之上不可检测的。
5.附图说明
图1：使用多种培养基制剂从造血干细胞（HSC）分化的NK细胞的成倍扩增。误差线代表来自三个供体的标准偏差。X轴：培养天数（D）。Y轴：与第0天（培养开始）相比的成倍扩增。
图2：用NK2A培养基培养的NK细胞的表型鉴定。用PE-抗CD56、FITC-抗CD3、PerCP-抗CD16三重标记的细胞。水平线、垂直线：荧光标记水平显著高于背景。
图3：用NK2A（FF）、NK2A（胎盘干细胞作为饲养细胞）、NK2A（MSC作为饲养细胞）或两阶段NK培养基培养的NK细胞的成倍扩增。X轴：培养天数（D）。Y轴：与第0天（培养开始）相比的成倍扩增。
图4：在培养开始后第45天，用NK2A（无饲养细胞）、两阶段NK培养基；用CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞（PSC）作为饲养细胞的NK2A、用骨髓源间质干细胞（MSC）作为饲养细胞的NK2A培养的NK细胞的细胞毒性。图4中显示了来源于三个供体的代表性数据。
图5：在培养第41天（D41）时NK细胞的表型鉴定。
显示了来源于3个单独供体的代表性数据。X轴：通过两阶段法产生的NK细胞的百分比，所述细胞是CD3-CD56+、CD16-CD56+或CD16+CD56+；或者所述细胞表达NKB1、NKG2D、NKp46、CD94、CD117、CD226、CD7或CD5。在培养开始后的第41天，在NK2A（无饲养细胞）、两阶段NK培养基；用CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞（PSC）作为饲养细胞的NK2A、用骨髓源间质干细胞（MSC）作为饲养细胞的NK2A中培养细胞。
图6：NK在NK2A培养基中培养期间，CD56+CD3-NK细胞群体中CD94和CD117的表达。从在NK2A培养基中培养的NK细胞中鉴别了主要的CD56+CD94+CD117+细胞群体，其与胚胎干细胞（ESC）来源的NK细胞（CD56+CD94+CD117low/-）可区分。图6中显示了来自3个供体的代表性数据。X轴：来自藻红蛋白（PE）标记的抗CD94的荧光。Y轴：来自APC标记的抗CD117的萤光。水平、垂直线：显著高于背景的荧光标记水平。D13、D20、D28、D35：CD34+细胞培养开始后的第13、20、28和35天。
图7：与仅有MSC和NK2A培养基相比，胎盘干细胞对培养的NK细胞的影响。X轴：在无饲养层的NK2A培养基（FF）中培养的NK细胞；在用骨髓源间质干细胞（MCS）作为饲养层的NK2A培养基中培养的NK细胞；或用CD10+、CD34-、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞（PDAC）作为饲养层的NK2A培养基中培养的NK细胞。Y轴（左）：细胞毒性，表示为残余的肿瘤细胞的百分比（1.0=100%）；用空心正方形表示细胞毒性。Y轴（右）：使用两步法的NK细胞成倍扩增；用星号表示成倍扩增。
图8A-8B：脐带血（UCB）和人胎盘灌洗液（HPP）的相对比值对融化后CD34+细胞纯度的影响。图8A：HPP体积含量（体积%）对CD34+Lin-纯度的影响。X轴：混合的UCB和HPP（组合）中HPP的体积份数。Y轴：CD34+Lin-细胞的百分比。图8B.HPP TNC含量（TNC%）对CD34+Lin-纯度的影响。Y轴：CD34+Lin-细胞的百分比。
6.具体实施方式
本文提供了从造血细胞（例如，造血干细胞或祖细胞）产生并扩增NK细胞的新型方法。用于产生所述NK细胞的造血细胞可以分离自任何来源，例如，无限制地，胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝。在某些实施方式中，所述NK细胞是从扩增的造血细胞（例如，造血干细胞和/或造血祖细胞）产生的。在一种实施方式中，造血细胞收集自该类细胞的来源，例如，胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝和/或骨髓。在具体的实施方式中，所述造血细胞是在不使用饲养细胞的第一培养基中连续扩增和分化的。然后，将所述细胞在存在饲养细胞的第二培养基中培养。这种分离、扩展和分化可以在集中处理站中进行，其提供扩增的造血细胞以用于运输到使用地点（例如，医院、军事基地、部队前线等）进行分散扩增和分化。
6.1.造血细胞
在本文所公开的方法中有用的造血细胞可以是能够分化为NK细胞的任何造血细胞，例如，前体细胞、造血祖细胞、造血干细胞等。造血细胞可以得自组织来源，如（例如）骨髓、脐带血、胎盘血、外周血、肝等或它们的组合。造血细胞可以得自胎盘。在具体的实施方式中，所述造血细胞得自胎盘灌洗液。来自胎盘灌洗液的造血细胞可以包含胎儿和母体造血细胞的混合物，例如，其中母细胞占造血细胞总数的5%以上的混合物。优选地，来自胎盘灌洗液的造血细胞包含至少约90%、95%、98%、99%或者99.5%的胎儿细胞。
在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，来自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，是来自胎盘灌洗液和脐带血（例如，得自与灌洗液相同的胎盘的脐带血）的混合细胞。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，可以通过混合或合并脐带血和胎盘灌洗液来获得混合的细胞。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或者3:1至1的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。在更具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5（85%:15%）的比值混合。
在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的总有核细胞（TNC）含量的比值混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5或3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。
在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞（例如，从中产生所述TSNK细胞的造血干细胞或祖细胞）来源于脐带血和胎盘灌洗液，但是其中所述脐带血分离自获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。
在某些实施方式中，所述造血细胞是CD34+细胞。在具体的实施方式中，在本文所公开的方法中有用的造血细胞是CD34+CD38+或CD34+CD38-。在更具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+CD38-Lin-。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是CD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-和/或血型糖蛋白A-中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是CD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-和血型糖蛋白A-中的一种或多种。在另一种更具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+CD38-CD33-CD117-。在另一种更具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+CD38-CD33-CD117-CD235-CD36-。
在另一种实施方式中，所述造血细胞是CD45+。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+CD45+。在另一种实施方式中，所述造血细胞是Thy-1+。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+Thy-1+。在另一种实施方式中，所述造血细胞是CD113+。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+D133+或者CD133+Thy-1+。在另一种具体的实施方式中，所述CD34+造血细胞是CXCR4+。在另一种具体的实施方式中，所述CD34+造血细胞是CXCR4-。在另一种实施方式中，所述造血细胞对于KDR（血管生长因子受体2）是阳性的。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+KDR+、CD133+KDR+或Thy-1+KDR+。在某些其他实施方式中，所述造血细胞对于醛脱氢酶（ALDH+）是阳性的，例如，所述细胞是CD34+ALDH+。
在某些其他实施方式中，所述CD34+细胞是CD45-。在具体的实施方式中，所述CD34+细胞（例如，CD34+、CD45-细胞）表达微小RNA hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b和/或hsa-miR-520a中的一种或多种或全部。
在某些实施方式中，所述造血细胞是CD34-。
所述造血细胞还可以缺少指示谱系提交的某些标志物或缺少发育纯真性（developmental naivete）。例如，在另一种实施方式中，所述造血细胞是HLA-DR-。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+HLA-DR-、CD133+HLA-DR-、Thy-1+HLA-DR-或ALDH+HLA-DR-。在另一种实施方式中，所述造血细胞对于谱系标志物CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A中的一种或多种，优选地全部是阴性的。
因此，根据表明未分化状态的标志物的存在性或者根据表明至少一些谱系分化发生的谱系标志物的缺少，可以选择造血细胞用于在本文所公开的方法中使用。在（例如）下文6.1.2节中详细讨论了根据特定标志物的存在或缺失的分离细胞（包括造血细胞）的方法。
在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以是基本上均质的种群，例如，包含至少约95%、至少约98%或至少约99%的来源于单一组织来源的造血细胞的群体，或包含表现出相同造血细胞相关细胞标志物的造血细胞的群体。例如，在多种实施方式中，所述造血细胞可以包含至少约95%、98%或99%的来源于骨髓、脐带血、胎盘血、外周血或胎盘（例如，胎盘灌洗液）的造血细胞。
在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以得自单一个体，例如得自单一胎盘；或得自多个个体，例如，可以是混合的。当所述造血细胞得自多个个体并且是混合的时，所述造血细胞可以得自相同组织来源。因此，在多种实施方式中，所述混合的造血细胞全部来自胎盘，例如，胎盘灌洗液；全部来自胎盘血；全部来自脐带血；全部来自外周血等。
在某些实施方式中，在本文所公开的方法中使用的造血细胞包含来自两种或更多种组织来源的造血细胞。例如，在某些实施方式中，当将来自两种或更多种来源的造血细胞混合以用于在本文所述方法中使用时，用于产生TSNK细胞的多种造血细胞包含来自胎盘（例如，胎盘灌洗液）的造血细胞。在多种实施方式中，用于产生TSNK细胞的造血细胞包括来自胎盘和来自脐带血的造血细胞；来自胎盘和外周血的造血细胞；来自胎盘和胎盘血的造血细胞，或来自胎盘和骨髓的造血细胞。在优选的实施方式中，所述造血细胞包含来自胎盘灌洗液的造血细胞结合来自脐带血的造血细胞，其中所述脐带血和胎盘来自于相同个体，即，其中所述灌洗液和脐带血是相配的。在其中所述造血细胞包含来自两种组织来源的造血细胞的实施方式中，可以将来自所述来源的造血细胞以下列比值混合物，例如，1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
6.1.1.胎盘造血干细胞
在某些实施方式中，在本文所提供的方法中使用的造血细胞是胎盘造血细胞。如本文所使用的，“胎盘造血细胞”表示得自胎盘本身的造血细胞，而不是得自胎盘血或脐带血的造血细胞。在一种实施方式中，胎盘造血细胞是CD34+。在具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞主要是（例如，至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%）CD34+CD38-细胞。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞主要是（例如，至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%）CD34+CD38+细胞。胎盘造血细胞可以通过本领域技术人员所知的任何方式（例如，通过灌洗）得自分娩后的哺乳动物（例如，人）胎盘。
在另一种实施方式中，所述胎盘造血细胞是CD45-。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞是CD34+CD45+。
6.2.自然杀伤细胞的产生
通过本发明所述方法的NK细胞的产生包括扩增造血细胞群体。在细胞扩增期间，造血细胞群体内的多个造血细胞分化为NK细胞。
在一种实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的方法，包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
在另一种实施方式中，通过NK细胞的扩增/分化和成熟的两步方法产生了本文提供的NK细胞。所述第一和第二步骤包括在具有细胞因子独特组合的培养基中培养细胞。在某些实施方式中，该方法包括（a）在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体，其中所述造血细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞分化为NK细胞；和（b）在第二培养基中扩增得自步骤（a）的NK细胞，其中所述NK细胞进一步扩增和分化，并且其中所述NK细胞成熟（例如，激活或否则具有细胞毒素活性）。在某些实施方式中，所述方法在步骤（a）和（b）之间不包含中间步骤，在步骤（a）之前不包含其他培养步骤，和/或在步骤（b）之后不包含其他步骤（例如，成熟步骤）。
6.2.1.第一培养步骤
在某些实施方式中，本文所提供的方法包括在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体的第一步骤，其中造血细胞种群内的多个造血干细胞或祖细胞分化为NK细胞。
不希望受任何参数、机制或理论的束缚，如本文所提供的造血细胞的培养导致所述造血细胞的连续扩增和从所述细胞向NK细胞的分化。在某些实施方式中，使用饲养层将在本文所提供的方法中使用的造血细胞（例如，干细胞或祖细胞）在第一步骤中扩增和分化。在其他实施方式中，不使用饲养层将造血细胞（例如，干细胞或祖细胞）在第一步骤中扩增和分化。
造血细胞不依赖于饲养细胞的扩增和分化可以在与细胞培养和扩增相容的任何容器中发生，例如，三角瓶、管、烧杯、培养皿、多孔板、袋等。在具体的实施方式中，造血细胞不依赖于饲养细胞的扩增在袋中进行，例如，柔韧的透气性碳氟化合物培养袋（例如，获自American Fluoroseal）。在具体的实施方式中，在其中扩增所述造血细胞的容器适合于运输（例如）至其中将所述扩增的NK细胞进一步扩增并分化的地点，如医院或部队区。
在某些实施方式中，在第一培养基中以（例如）连续方式扩增和分化造血细胞。在一种实施方式中，所述第一培养基是不含动物成分的培养基。在本文所提供的方法中有用的示例性不含动物成分的培养基包括（但不限于）伊格尔基础培养基（BME）、达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、格拉斯哥极限必须培养基（GMEM）、达尔伯克改良的伊格尔培养基/营养混合物F-12Ham（DMEM/F-12）、极限必须培养基（MEM）、伊思考夫改良达尔伯克培养基（IMDM）、汉姆氏营养混合物F-10（汉姆氏F-10）、汉姆氏营养混合物F-12（汉姆氏F-12）、RPMI-1640培养基、威廉姆斯培养基E、
Figure BDA00002911163500221
（产品目录号No.Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada）、Glycostem基础生长培养基（）、
Figure BDA00002911163500223
培养基（Invitrogen）、X-VIVOTM10（Lonza）、X-VIVOTM15（Lonza）、OPTMIZER（Invitrogen）、
Figure BDA00002911163500224
H3000（STEMCELL Technologies)、CELLGROCOMPLETETM（Mediatech）或它们的任何改良变化形式或组合。
在优选实施方式中，所述第一培养基包含一种或多种培养基补充剂（例如，营养物、细胞因子和/或因子）。适合于在本文所提供的方法中使用的培养基补充剂（例如）无限制地包括血清（如人血清AB、胎牛血清（FBS）或者胎牛血清（FCS））、维生素、牛血清白蛋白（BSA）、氨基酸（例如，L-谷氨酰胺）、脂肪酸（例如，油酸、亚油酸或棕榈酸）、胰岛素（例如，重组人胰岛素）、转铁蛋白（铁饱和人转铁蛋白）、β-巯基乙醇、干细胞因子（SCF）、Fms样酪氨酸激酶3配体（FK3-L）、细胞因子（如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）、促血小板生成素（Tpo）、肝素或O-乙酰-卡尼汀（也称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或者OAC）。在具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含人血清AB。在另一种具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含FBS。在另一种具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含OAC。
在某些实施方式中，所述第一培养基不包含粒性白细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）或白血病抑制因子（LIF）中的一种或多种。
因此，在一个方面，本文提供了产生NK细胞的两步法，其中所述第一步包括在不存在饲养细胞的情况下在第一培养基中扩增和分化造血细胞群体，其中所述造血细胞群体内的多个造血细胞在所述扩增期间分化为NK细胞，并且其中所述培养基包含浓度为约1至约150ng/mL的SCF、浓度为约50至约1500IU/mL的IL-2、浓度为约1至约150ng/mL的IL-7、浓度为1至约150ng/mL的IL-15和浓度为约0.1至约30IU/mL的肝素，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7、IL-15和肝素不包含在所述培养基的不明确的组分内（例如，血清）。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰-卡尼汀（还称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或OAC）或影响线粒体中乙酰辅酶A循环的化合物、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺（thiazovivin）、Y-27632、pyintegrin、ρ激酶（ROCK）抑制剂、半胱天冬氨酸酶抑制剂或其他抗凋亡化合物/肽、NOVA-RS（Sheffield Bio-Science）或其他小分子生长增强因子中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含烟酰胺。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mM-10mMOAC。在一种实施方式中，所述培养基包括
Figure BDA00002911163500231
H3000和/或DMEM:F12和约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM的OAC。在所述方法的具体实施方式中，所述培养基是
Figure BDA00002911163500232
。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含H3000和约5mM的OAC。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM:F12和约5mM的OAC。可以在本文所提供的培养法期间的任何时候加入OAC。在某些实施方式中，将所述OAC加入到第一培养基中和/或在第一培养步骤期间加入。在一些实施方式中，在培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天将所述OAC加入到第一培养基中。在具体的实施方式中，在第一培养步骤的第7天将所述OAC加入到第一培养基中。在更具体的实施方式中，在培养的第7天将所述OAC加入到第一培养基中并且在整个第一和第二培养步骤期间存在。在某些实施方式中，将所述OAC加入到第二培养基中和/或在第二培养步骤期间加入。在一些实施方式中，在培养的第22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35天将所述OAC加入到第二培养基中。
在另一种具体的实施方式中，所述培养基是添加了约5-20%BSA、约1-10μg/mL重组人胰岛素、约10-50μg/mL铁饱和人转铁蛋白和约10-50μΜβ-巯基乙醇的IMDM。在另一种具体的实施方式中，所述培养基不包含IL-11、IL-3、同源框-B4（HoxB4）和/或甲基纤维素中的一种或多种或任一种。
在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL；约5至约100ng/mL；或者约20ng/mL的SCF。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约10至约2000IU/mL；或者约100至约500IU/mL；或者约200IU/mL的IL-2。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL；约5至约100ng/mL；或者约20ng/mL的IL-7。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL；约5至约100ng/mL；或者约10ng/mL的IL-15。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.05至约100U/mL；或者约0.5至约20U/ml；或者约1.5U/mL的肝素。
在所述方法的其他具体实施方式中，所述培养基还包含浓度约1至约150ng/mL的Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）、浓度约1至约150ng/mL的促血小板生成素（Tpo）或两者的组合。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL；约5至约100ng/mL；或者约20ng/mL的Flt-3L。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL；约5至约100ng/mL；或者约20ng/mL的Tpo。
在所述方法的更具体的实施方式中，所述第一培养基是
Figure BDA00002911163500241
其包含约20ng/mL的SCF、约20ng/mL的IL-7、约10ng/mL的IL-15。在所述方法的另一种更具体的实施方式中，所述第一培养基是
Figure BDA00002911163500242
其包含约20ng/mL的SCF、约20ng/mL的Flt3-L、约200IU/mL的IL-2、约20ng/mL的IL-7、约10ng/mL的IL-15、约20ng/mL的Tpo和约1.5U/mL的肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基还包含10%的人血清（例如，人血清AB)或胎儿血清（例如，FBS）。
在另一种实施方式中，通过将造血细胞在（例如）所述第一培养基中以与未接触所述免疫调节化合物的相等个数的造血细胞相比在给定时间内足以导致所述造血细胞增殖的可检测增加的时间和量与免疫调节化合物（例如，TNF-α抑制化合物）接触来扩增所述细胞。参见（例如）美国专利申请公开No.2003/0235909，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是氨基取代的异吲哚啉。在优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是3-(4-氨基-l-氧代-l,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-l-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮或4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。在另一种优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是玻马利度胺（pomalidomide）或来那度胺。在另一种实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物
Figure BDA00002911163500251
其中X和Y之一是C=O，X和Y中的另一个是C=O或CH2，并且R2是氢或低级烷基，或者它们的可药用盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一种实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物
Figure BDA00002911163500252
其中X和Y之一是C=O，而另一个是CH2或C=O；
R1是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；
R2是H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基;
R3和R3'独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或C(O)OR5;
R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基;
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂芳基；
R6的每次出现独立地是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5或者R6基团可以连接以形成杂环烷基；
n是0或1；和
*表示手性碳中心；
或者它们的可药用盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。在另一种实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物
Figure BDA00002911163500261
其中：
X和Y之一是C=O，而另一个是CH2或C=O；
R是H或CH2OCOR'；
（i）R1、R2、R3或R4中的每一个彼此独立地为卤素、1至4个碳原子的烷基或1至4个碳原子的烷氧基或者（ii）R1、R2、R3或R4之一是硝基或-NHR5并且R1、R2、R3或R4中其余的是氢；
R5是氢或1至8个碳的烷基
R6是氢、1至8个碳原子的烷基、苯并、氯代或氟代；
R'是R7-CHR10-N(R8R9)；
R7是m-亚苯基或p-亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0至4；
R8和R9中的每一个彼此独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9组合在一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-O-、-S-或-NH-；
R10是氢、1至8个碳原子的烷基或苯基；和
*表示手性碳中心；
或者它们的可药用盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映体、外消旋物或立体异构体的混合物。
在具体的实施方式中，造血细胞的扩增是在添加了20%BITS（牛血清白蛋白、重组人胰岛素和转铁蛋白）、SCF、Flt-3配体、IL-3和4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-l,3-二酮（10μΜ，在0.05%DMSO中的溶液）的IMDM中进行的。在更具体的实施方式中，将约5×107个造血细胞（例如，CD34+细胞）在培养基中扩增以形成约5×1010个细胞至约5×1012个细胞，其再悬浮于100mL IMDM中以产生扩增的造血细胞群体。优选地，将扩增的造血细胞群体冷冻保存以有利于运输。
在多个具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的造血细胞分化为NK细胞。
在某些实施方式中，如本文所述的造血细胞的扩增和分化的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体在扩增和分化期间维持在约2×104和约2×105个细胞/毫升之间。在某些其他实施方式中，如本文所述的造血细胞的扩增和分化的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在不超过约1×105个细胞/毫升。
造血细胞向NK细胞的扩增和分化的时间可以是（例如）约3天至约120天。在一种实施方式中，所述分化时间为约7天至约75天。在另一种实施方式中，所述分化时间为约14天至约50天。在具体的实施方式中，所述分化时间为约21天至约28天。
6.2.2.第二步
在本文所提供的方法中，所述造血细胞（例如，干细胞或祖细胞）和由第一步产生的自然杀伤细胞（例如）在不使用饲养层或者在存在饲养细胞的情况下在第二步中进一步扩增和分化。如本文所提供的细胞培养导致来自第一步的NK细胞持续扩增、分化和成熟。在第二步中，所述NK细胞以连续方式在第二培养基（例如，包含与所述第一培养基不同的细胞因子和/或生物活性分子）中扩增、分化和成熟。在某些实施方式中，所述第二培养基是不含动物成分的培养基。在以上6.2.1节中描述了示例性不含动物组分的细胞培养基。
因此，在一个方面，本文提供了产生NK细胞的方法，其包括在存在饲养细胞并且与白细胞介素-2（IL-2）接触的情况下在第二培养基中扩增如上所述来自第一步的NK细胞。在具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含IL-2（例如，10IU/mL至1000IU/mL）和以下中的一种或多种：人血清（例如，人血清AB)、胎牛血清（FBS）或者胎牛血清（FCS），例如，5%-15%FCS（v/v）；转铁蛋白，例如，10μg/mL至50μg/mL；胰岛素，例如，5μg/mL至20μg/mL；乙醇胺，例如，5×10-4至5×10-5M；油酸，例如，0.1μg/mL至5μg/mL；亚油酸，例如，0.1μg/mL至5μg/mL；棕榈酸，例如，0.05μg/mL至2μg/mL；牛血清白蛋白（BSA），例如，1μg/mL至5μg/mL；和/或植物凝集素，例如，0.01μg/mL至1μg/mL。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含FBS或FCS（例如，10%FCS（v/v））、IL-2、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白（BSA）和植物凝集素。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含伊思考夫改良达尔伯克培养基（IMDM）、10%FBS或FCS、400IU的IL-2、35μg/mL的转铁蛋白、5μg/mL的胰岛素、2×10-5M的乙醇胺、1μg/mL的油酸、1μg/mL的亚油酸（Sigma-Aldrich）、0.2μg/mL的棕榈酸（Sigma-Aldrich）、2.5μg/mL的BSA（Sigma-Aldrich）和0.1μg/mL的植物凝集素。
在某些实施方式中，所述第二培养基不包含粒性白细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）或白血病抑制因子（LIF）中的一种或多种。
除了所述方法以外，本文提供了作为组分的任何如上所述的培养基。
当使用时，可以从多种细胞类型建立饲养细胞。这些细胞类型的实例无限制地包括成纤维细胞、干细胞（例如，组织培养贴壁胎盘干细胞）、血细胞（例如，外周血单核细胞（PBMC））和癌细胞（例如，慢性粒细胞性白血病（CML）细胞，如K562）。在具体的实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养包括（例如）当细胞在所述第二培养基中起始时，此后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天时，使用饲养细胞，例如，K562细胞和/或外周血单核细胞（PBMC）的培养。在某些实施方式中，饲养细胞可选地来自于与它们所支持的细胞不同的种。例如，小鼠胚胎成纤维细胞（得自原代培养或端粒酶化的细胞系）可以支持人NK细胞。
在某些实施方式中，可选地通过辐射（例如，γ-辐射）或使用抗有丝分裂剂（如丝裂霉素C）处理使饲养细胞失活以防止它们比它们所支持的细胞长得更快，但允许支持NK细胞的重要因子的合成。例如，可以以抑制增殖但允许支持人胚胎干（hES）细胞的重要因子合成的剂量辐射细胞（约4000rad的γ照射）
用于第二步的NK细胞的培养可以在与细胞培养和扩增相容的任何容器中发生，例如，三角瓶、管、烧杯、培养皿、多孔板、袋等。在具体的实施方式中，NK细胞的饲养细胞依赖性培养在袋中进行，例如，柔韧的透气性碳氟化合物培养袋（例如，获自American Fluoroseal）。在具体的实施方式中，在其中培养NK细胞的容器适合于运输（例如）至其中将所述扩增的NK细胞进一步扩增、分化和成熟的地点，如医院或部队区。
可以通过（例如）使用流式细胞术检测NK细胞特异性标志物来评价得自步骤1的细胞向TSNK细胞的分化。NK细胞特异性标志物包括（但不限于）CD56、CD94、CD117和NKp46。还可以通过NK细胞的形态特征评价分化，例如，大尺寸、在大量内质网（ER）中的高蛋白合成活性和/或预先形成的微粒。
得自步骤1的细胞向TSNK细胞扩增和分化的时间可以（例如）从约3天至约120天。在一种实施方式中，分化时间为约7天至约75天。在另一种实施方式中，分化时间为约14天至约50天。在具体的实施方式中，分化时间为约10天至约21天。
可以通过（例如）使用流式细胞术检测标志物（例如，CD56、CD94、CD117、NKG2D、DNAM-1和NKp46）评价造血细胞向NK细胞的分化。还可以通过NK细胞的形态特征评价分化，例如，大尺寸、在大量内质网（ER）中的高蛋白合成活性和/或预先形成的微粒。可以通过检测一种或多种功能上相关的标志物（例如，CD94、CD161、NKp44、DNAM-1、2B4、NKp46、CD94、KIR和激活受体的NKG2家族（例如，NKG2D））来评价NK细胞（例如，TSNK细胞）的成熟。还可以通过检测不同发育阶段的特异性标志物来评价NK细胞（例如，TSNK细胞）的成熟。例如，在一种实施方式中，NK祖细胞是CD34+、CD45RA+、CD10+、CD117-和/或CD161-。在另一种实施方式中，前NK细胞是CD34+、CD45RA+、CD10-、CD117+和/或CD161-。在另一种实施方式中，未成熟的NK细胞是CD34-、CD117+、CD161+、NKp46-和/或CD94/NKG2A-。在另一种实施方式中，CD56bright NK细胞是CD117+、NKp46+、CD94/NKG2A+、CD16-和/或KIR+/-。在另一种实施方式中，CD56dim NK细胞是CD117-、NKp46+、CD94/NKG2A+/-、CD16+和/或KIR+。在具体的实施方式中，通过CD161-、CD94+和/或NKp46+的NK细胞（例如，TSNK细胞)的百分比确定NK细胞（例如，TSNK细胞）的成熟。在更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%或者70%的成熟NK细胞（例如，TSNK细胞）是NKp46+。在另一种更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的成熟NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD94+。在另一种更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的成熟NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD161-。
在某些实施方式中，通过使用（例如）抗这些细胞标志物中的一种或多种的抗体检测（例如）CD3、CD7或CD127、CD10、CD14、CD15、CD16、CD33、CD34、CD56、CD94、CD117、CD161、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM-1、2B4或TO-PRO-3的表达水平来评价造血细胞向NK细胞的分化。这些抗体可以结合至可检测标记物，例如，作为荧光标记物，例如，FITC、R-PE、PerCP、PerCP-Cy5.5、APC、APC-Cy7或者APC-H7。
6.3.TSNK细胞的分离
分离自然杀伤细胞的方法是在本领域中已知的并且可用于分离TSNK细胞。可以通过用抗CD56和CD3的抗体对来自组织来源（例如，外周血）的细胞染色并对CD56+CD3-细胞筛选来分离或富集自然杀伤细胞。可以使用可商购试剂盒（例如，NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec））分离TSNK细胞。还可以通过除去包含TSNK细胞的细胞群体中除NK细胞以外的细胞来分离或富集TSNK细胞。例如，可以通过使用（例如）抗CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR和/或CD235a（血型糖蛋白A）中的一种或多种的抗体排出表现出非NK细胞标志物的细胞来分离或富集TSNK细胞。可以使用可商购试剂盒（例如，NK细胞阴性分离试剂盒（Dynal Biotech））进行阴性分离。可以对通过这些方法分离的细胞另外进行分选（例如）以分离CD16+和CD16-细胞。
可以通过（例如）流式细胞术、荧光激活细胞分类术（FACS），或者优选地，使用结合了特异性抗体的微珠的磁细胞分选术完成细胞分离。可以（例如）使用分类磁激活细胞分选（MACS）技术分离细胞，磁激活细胞分选技术是基于它们结合包含一种或多种特异性抗体（例如，抗CD15抗体）的磁珠（例如，约0.5-100μm直径）的能力来分离颗粒的方法。可以使用（例如）AUTOMACSTM分离器（Miltenyi）实施并自动化进行磁细胞分离。可以在磁性微球上进行多种有用的修饰，其包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后，将珠与细胞混合以使其结合。然后，将细胞通过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一种实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与和抗其他细胞表面标志物的抗体结合的磁珠再混合。
将这些细胞再次通过磁场，从而分离出与两种抗体结合的细胞。然后，可以将这些细胞稀释至单独的盘中，如用于无性系分离的微量滴定盘。
6.4.胎盘灌洗液
可以从造血细胞产生TSNK细胞，例如，来自任何来源的造血干细胞或祖细胞，例如，胎盘组织、胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝等。在某些实施方式中，造血干细胞是从胎盘灌洗液获得和从来自用于产生胎盘灌洗液的相同胎盘的脐带血获得的混合造血干细胞。胎盘灌洗液包含可以（例如）通过美国专利No.7045148和7468276中所公开的方法获得的胎盘灌洗液细胞，以上专利的公开内容以其全部内容并入本文。
6.4.1.细胞收集组合物
可以通过使用胎盘细胞收集组合物的哺乳动物（例如，人分娩后的胎盘）的灌洗收集从中可以分离造血干细胞或祖细胞或者在肿瘤抑制或具有肿瘤细胞、癌或病毒感染的个体的治疗中有用（例如，与如本文所提供的TSNK细胞结合）的胎盘灌洗液和灌洗液细胞。可以通过用任何生理学可用的溶液（例如，盐溶液、培养基或更复杂的细胞收集组合物）灌洗胎盘来从胎盘收集灌洗液。在相关美国专利申请公开No.2007/0190042中详细描述了适合于灌洗胎盘并且适合于灌洗液细胞的收集和保存的细胞收集组合物，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
细胞收集组合物可以包括适合于干细胞的收集和/或培养的任何生理学可用的溶液，例如，盐溶液（例如，磷酸盐缓冲盐水、克氏液、改良的克氏液、伊格尔氏溶液、0.9%NaCl等）、培养基（例如，DMEM、H.DMEM等）等。
细胞收集组合物可以包含趋于保存胎盘细胞的一种或多种成分，即在从收集到培养期间防止胎盘细胞死亡或延缓胎盘细胞死亡、减少细胞群体中死亡的胎盘细胞的数目等。这些成分可以是（例如）细胞凋亡抑制剂（例如，半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂或JNK抑制剂）；血管扩张剂（例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽（ANP）、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂（例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮）；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳（例如，全氟辛基溴化物、全氟癸基溴化物等）。
细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、玻璃酸酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括（但不限于）胶原酶（例如，胶原酶I、II、III或IV、得自溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）的胶原酶等）；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性酶、胰蛋白酶、释放酶、玻璃酸酶等。
细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，所述抗生素是大环内酯（例如，妥布霉素）、头孢菌素（例如，头孢氨苄、环己烯胺头孢菌素、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄）、克拉霉素、红霉素、青霉素（例如、青霉素V）或喹诺酮（例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星）、四环素、链霉素等。在具体的实施方式中，所述抗生素对革兰氏（+）和/或革兰氏（-）细菌是有活性的，例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。
细胞收集组合物还可以包含一种或多种下列化合物：腺苷（约1mM至约50mM）；D-葡萄糖（约20mM至约100mM）；镁离子（约1mM至约50mM）；分子量大于20000道尔顿的大分子，在一种实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞存活力的量存在（例如，合成或天然存在的胶体，如葡聚糖的多糖或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或者约40g/l至约60g/l存在）；抗氧化剂（例如，丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，其以约25μM至约100μM存在）；还原剂（例如，以约0.1mM至约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸）；防止钙进入细胞的试剂（例如，以约2μM至约25μM存在的维拉帕米）；硝酸甘油（例如，约0.05g/L至约0.2g/L）；抗凝剂，在一种实施方式中，其以足以帮助防止残余血液凝结的量存在（例如，以约1000单位/升至约100000单位/升的浓度存在的肝素或水蛭素）；或含有阿米洛利的化合物（例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1.0μM至约5μM存在）。
6.4.2.胎盘的收集和处理
一般地，在分娩后胎盘去除后不久回收人胎盘。在优选的实施方式中，在知情同意后并且在获得患者的完整病历并且该病历与胎盘有关后从患者回收胎盘。优选地，病历在产后继续。
在回收灌洗液之前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，产后回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常，借助于重力使用针或插管对胎盘抽血（参见，例如，Anderson，美国专利No.5372581；Hessel等人，美国专利No.5415665）。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。可以通过商业进行这种脐带血回收，例如，LifeBank Inc.,Cedar Knolls,N.J,ViaCord,Cord Blood Registry和CryoCell。优选地，将胎盘重力放血而无需其他操作从而使脐带血回收期间的组织破环程度最小。
通常，将胎盘从分娩或生产房间输送到另一个位置（例如，实验室）以用于脐带血回收和灌洗液收集。优选地，将胎盘在无菌、隔热的输送装置（将胎盘温度维持在20-28℃之间）中输送，例如，通过将近端脐带夹紧的胎盘置于无菌自封塑料袋中，然后置于保温容器中。在另一种实施方式中，在基本如美国专利No.7147626中所述的脐带血收集试剂盒中输送胎盘。优选地，在分娩后的4至24小时将胎盘输送到实验室。在某些实施方式中，在脐带血回收之前将近端脐带夹紧，优选地，在胎盘中插入的4-5cm（厘米）内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在胎盘的其他处理前将近端脐带夹紧。
在灌洗液收集前，可以将胎盘储存在无菌条件下和室温或5℃至25℃（摄氏度）的温度下。在灌洗胎盘以除去任何残留脐带血之前，可以将胎盘储存大于48小时的一段时间，并且优选地储存4至24小时的一段时间。优选地，将胎盘在5℃至25℃（摄氏度）的温度下储存在抗凝剂溶液中。适合的抗凝剂溶液在本领域中是熟知的。例如，可以使用肝素或华法令钠溶液。在优选的实施方式中，所述抗凝剂溶液包括肝素溶液（例如，1:1000溶液中的1%（w/w））。优选地，在收集胎盘灌洗液之前将放血的胎盘储存不超过36小时。
6.4.3.胎盘灌洗
例如，在Hariri的美国专利No.7045148和7255879，以及在美国专利申请公开No.2007/0190042和20070275362中公开了灌洗哺乳动物胎盘和获得胎盘灌洗液的方法，以上每篇专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
可以通过将灌洗溶液（例如，盐溶液、培养基或者细胞收集组合物）通过胎盘脉管系统来获得灌洗液。在一种实施方式中，通过将灌洗溶液通过脐动脉和脐静脉之一或两者来灌洗哺乳动物胎盘。可以使用（例如）重力流动至胎盘来完成灌洗溶液通过胎盘的流动。优选地，使用泵（例如，蠕动泵）迫使灌洗溶液通过胎盘。可以（例如）用连接到无菌连接装置（如，无菌管）的插管（例如，或塑料插管）插入脐静脉。将无菌连接装置连接到灌洗歧管。
在为灌洗做准备时，优选地以使脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式定向胎盘。可以通过将灌洗溶液通过胎盘脉管系统或通过胎盘脉管系统和周围组织来灌洗胎盘。在一种实施方式中，同时将脐动脉和脐静脉连接至通过挠性连接器连接至灌洗溶液储罐的吸移管。将灌洗溶液通过至脐静脉和动脉。灌洗溶液从血管壁流出和/或穿过血管壁至胎盘的周围组织，并且从连接至妊娠期间母体子宫的胎盘表面收集至适合的开放容器中。还可以将灌洗溶液引入通过脐带开口并允许从与母体子宫壁连接的胎盘壁中的开口中流出或渗出。在另一种实施方式中，将灌洗溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集，也就是说，仅通过胎盘脉管系统（胎儿组织）。
在一种实施方式中，例如，同时将脐动脉和脐静脉连接至（例如）通过挠性连接器连接至灌洗溶液储罐的吸移管。将灌洗溶液通过至脐静脉和动脉。灌洗溶液从血管壁流出和/或穿过血管壁至胎盘的周围组织，并且从连接至妊娠期间母体子宫的胎盘表面收集至适合的开放容器中。还可以将灌洗溶液引入通过脐带开口并允许从与母体子宫壁连接的胎盘壁中的开口中流出或渗出。通过这种方法（该方法可以称为“盘”法（pan method））收集的胎盘细胞通常是胎儿和母体细胞的混合物。
在另一种实施方式中，将灌洗溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集。通过这种方法（该方法可以称为“封闭回路”法（closed circuit method））收集的胎盘细胞通常几乎只是胎儿细胞。
在一种实施方式中，可以如下所示进行封闭回路灌洗法。在分娩后约48小时内获得分娩后胎盘。夹紧脐带并在夹子上方切割。可以将脐带丢弃，或者可以加工以回收（例如）脐带干细胞和/或以加工脐带膜用于生产生物材料。可以在灌洗期间保留羊膜，或者可以（例如）用手指使用钝器切开将其与绒毛膜分离。如果在灌洗之前将羊膜与绒毛膜分离，则可以将其（例如）丢弃或通过酶促消化加工以（例如）获得干细胞或以产生（例如）羊膜生物材料，例如，美国专利申请公开No.2004/0048796中所述的生物材料。在（例如）使用消毒纱布清洗胎盘的所有可见血块和残余血液后，通过（例如）部分切割脐带膜以暴露脐带横截面来暴露脐带血管。鉴别血管并通过（例如）将闭合的鳄鱼夹向前通过每根血管的切头来打开血管。然后，将所述装置（例如，连接到灌洗装置或蠕动泵的塑料管）插入每根胎盘动脉。所述泵可以是适合于该目的的任何泵，例如，蠕动泵。然后，将连接到无菌收集储罐（例如，血液袋，如250mL收集袋）的塑料管插入胎盘静脉。作为另外一种选择，将连接到泵的管插入胎盘静脉，并将连接到收集储罐的管插入胎盘动脉之一或两者。然后，用大量灌洗溶液（例如，约750ml灌洗溶液）灌洗胎盘。然后，通过（例如）离心作用收集灌洗液中的细胞。
在一种实施方式中，在灌洗期间将近端脐带夹紧，并且更优选地，在胎盘中脐带插入的4-5cm（厘米）内夹紧近端脐带。
一般地，放血过程中来自哺乳动物胎盘的第一次收集的灌洗液被脐带血和/或胎盘血的残留红细胞染色。随着灌洗的进行，灌洗液变得更无色并且残留的脐带血细胞被清洗出胎盘。一般地，30至100mL灌洗液足以一开始对来自胎盘的血液进行冲洗，但是根据观察结果可以使用更多或更少的灌洗液。
可以根据要收集的胎盘细胞数目、胎盘尺寸、对单个胎盘进行收集的次数等改变用于灌洗胎盘的灌洗液的体积。在多个实施方式中，灌洗液的体积可以为50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL或者750mL到2000mL。通常，在放血后用700-800mL的灌洗液灌洗胎盘。
可以在几小时或几天的过程中对胎盘灌洗多次。当将胎盘灌洗多次时，可以将其在无菌条件下在容器或其他适合的器皿中维持或培养，并用细胞收集组合物或标准灌洗溶液（例如，生理盐溶液，如加入或未加入抗凝剂（例如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素）和/或加入或未加入抗微生物剂（例如，β-巯基乙醇（0.1mM）；抗生素，如链霉素（例如，40-100μg/ml）、青霉素（例如，40U/ml）、两性霉素B（例如，0.5μg/ml））的磷酸盐缓冲盐水（“PBS”））灌洗。在一种实施方式中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌洗液，从而在灌洗液的灌洗和收集之前将该胎盘维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者2或3或更多天。可以将灌洗的胎盘维持额外的一次或多次，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用（例如）700-800mL灌洗液灌洗第二次。可以将胎盘灌洗1、2、3、4、5或更多次，例如，每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方式中，重复胎盘的灌洗和灌洗溶液（例如，胎盘细胞收集组合物）的收集直至回收的有核细胞的数目低于100个细胞/毫升。可以在不同的时间点分别进一步处理灌洗液以回收时间依赖性细胞（例如，总有核细胞）群体。还可以将来自不同时间点的灌洗液混合。
6.4.4.胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞
通常，来自单次胎盘灌洗的胎盘灌洗液包含约1亿至约5亿个有核细胞，其包括从中可以通过本文所公开的方法产生TSNK细胞的造血细胞。在某些实施方式中，所述胎盘灌洗液或灌洗液细胞包含CD34+细胞，例如，造血干细胞或祖细胞。在更具体的实施方式中，这些细胞可以包含CD34+CD45-干细胞或祖细胞、CD34+CD45+干细胞或祖细胞等。在某些实施方式中，在从中分离造血细胞之前，将所述灌洗液或灌洗液细胞冷冻保存。在某些其他实施方式中，所述胎盘灌洗液包含或者所述灌洗液细胞包含仅胎儿细胞，或者胎儿细胞和母细胞的组合。
6.5.TSNK细胞
在一个方面，本文提供了TSNK细胞，通过本文所述的方法产生的NK细胞（例如，两步法）。本文还提供了包含通过本文所述的方法（例如，两步法）产生的TSNK细胞的细胞群体。在具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD3-CD56+。在具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）是CD3-CD56+CD16-。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是CD94+CD117+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是CD161-。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞（例如，TSNK细胞）另外是NKG2D+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是NKp46+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是CD226+。
在某些实施方式中，大于50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16-。在其他实施方式中，至少50%、60%、70%、80%、82%、84%、86%、88%或90%的所述TSNK细胞是CD3-和CD56+。在其他实施方式中，至少50%、52%、54%、56%、58%或60%的所述TSNK细胞是NKG2D+。在其他实施方式中，少于30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%的所述细胞是NKB1+。在某些其他实施方式中，少于30%、20%、10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是NKAT2+。在某些其他实施方式中，少于30%、20%、10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16+。在更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%或70%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞是NKp46+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞是CD117+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD94+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD161-。在其他更具体的实施方式中，至少10%、12%、14%、16%、18%或20%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD226+。在更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%或40%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD7+。在更具体的实施方式中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%的所述CD3-、CD56+TSNK细胞为CD5+。
在多种其他实施方式中，可以将TSNK细胞以（例如）约1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或约9:1的比值与（例如）NK细胞混合，其中所述NK细胞已从组织来源中分离并且尚未扩增；NK细胞分离自组织来源并扩增或NK细胞通过不同的方法产生（例如，CD56+CD16+自然杀伤细胞）。如上下文中所使用的，“分离的”表示细胞已从它们正常的组织环境中除去。
TSNK细胞可以具有胎儿基因型或母体基因型。例如，由于作为适合于产生TSNK细胞的造血细胞来源的分娩后胎盘包含来自胎儿和来自母体的组织和细胞，因此胎盘灌洗液可以包含仅胎儿细胞或大多数的胎儿细胞（例如，大于约90%、95%、98%或99%），或者可以包含胎儿和母体细胞的混合物（例如，胎儿细胞占灌洗液总有核细胞的小于约90%、80%、70%、60%或50%）。在一种实施方式中，所述TSNK细胞仅来源于胎儿胎盘造血细胞，例如，得自胎盘的封闭回路灌洗的细胞，其中所述灌洗产生包含大多数或仅有胎儿胎盘造血细胞的灌洗液。在另一种实施方式中，所述TSNK细胞来源于胎儿和母体细胞，例如，通过盘法（参见上文）灌洗获得的细胞，其中所述灌洗产生了包含胎儿和母体胎盘细胞混合物的灌洗液。因此，在一种实施方式中，本文提供了胎盘来源的中间体自然杀伤细胞群体，其中大多数具有胎儿基因型。在另一种实施方式中，本文提供了包含具有胎儿基因型的自然杀伤细胞和具有母体表型的自然杀伤细胞的胎盘来源的中间体自然杀伤细胞群体。
本文还提供了包含未通过本文所述的方法产生的自然杀伤细胞的TSNK细胞群体。例如，在一种实施方式中，本文提供了还包含分离自（例如）脐带血、外周血、骨髓或上述两种或更多种的组合的自然杀伤细胞，或者通过本文所述的方法以外的方法扩增的NK细胞的TSNK细胞群体。这些TSNK细胞群体可以包含TSNK细胞及其他NK细胞，例如，以约1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或约1:100等的比值。
在某些实施方式中，可以通过检测一种或多种功能性相关标志物（例如，CD94、CD161、NKp44、DNAM-1、2B4、NKp46、CD94、KIR和激活受体的NKG2家族（例如，NKG2D））来评价分离的自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）或富含自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）的群体。在一些实施方式中，可以通过检测CD56、CD3和CD16中的一种或多种来确认分离的或富集的自然杀伤细胞的纯度。
可选地，可以在（例如）使用肿瘤细胞（例如，培养的K562、LN-18、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1或U266肿瘤细胞等）作为靶细胞的细胞毒性测定中评价分离的或富集的自然杀伤细胞的细胞毒素活性。
6.6.TSNK细胞与胎盘灌洗液结合
本文还提供了包含TSNK细胞与胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞和/或贴壁胎盘细胞结合的组合物以（例如）用于在抑制肿瘤细胞或多个肿瘤细胞的增殖中使用。
6.6.1.TSNK细胞和灌洗液或灌洗液细胞的组合
本文还提供了包含TSNK细胞和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞组合的组合物。在一种实施方式中，例如，本文提供了添加TSNK细胞的大量胎盘灌洗液。在具体的实施方式中，例如，每毫升胎盘灌洗液添加约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个或更多个TSNK细胞。在另一种实施方式中，胎盘灌洗液细胞添加了TSNK细胞。在某些其他实施方式中，当胎盘灌洗液细胞与TSNK细胞结合时，所述胎盘灌洗液细胞通常占细胞总数的约、大于约或小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%。在某些其他实施方式中，当TSNK细胞与多个胎盘灌洗液细胞和/或混合的自然杀伤细胞结合时，所述NK细胞通常占细胞总数的约、大于约或小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%。在某些其他实施方式中，当TSNK细胞用于添加胎盘灌洗液时，其中悬浮细胞的溶液（例如，盐溶液、培养基等）的体积占灌洗液加细胞总体积的约、大于约或小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%，其中在添加前将所述TSNK细胞悬浮至约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个或更多个细胞/毫升。
在其他实施方式中，反过来，任何上述细胞组合与脐带血或得自脐带血的有核细胞混合。
本文还提供了得自两种或更多种来源（例如，两种或更多种胎盘）并且合并（例如，混合）的混合胎盘灌洗液。这些混合的灌洗液可以包含得自每一种来源的近似相等体积的灌洗液或者可以包含得自每一种来源的不同体积的灌洗液。可以随机选择得自每一种来源的相对体积，或者可以基于（例如）一种或多种细胞因子（例如，细胞因子、生长因子、激素等）的浓度或量；得自每一种来源的灌洗液中胎盘细胞的数目；或得自每一种来源的灌洗液的其他特征进行选择。
可以类似地将得自相同胎盘的多次灌洗的灌洗液混合。
类似地，本文提供了得自两种或更多种来源（例如，两种或更多种胎盘）并且混合的胎盘灌洗液细胞和胎盘来源的中间体自然杀伤细胞。这些混合的细胞可以包含得自两种或更多种来源近似相等数目的细胞或者得自一种或多种混合来源的不同数目的细胞。可以根据（例如）要混合的细胞中一种或多种特异性细胞类型的数目（例如，CD34+细胞数目）等来选择得自每种来源的细胞的相对数目。
本文还提供了TSNK细胞和TSNK细胞与胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞的组合，已对其进行测试以确定根据（例如）给定数目的TSNK细胞或给定体积的灌洗液所预期的肿瘤抑制程度或量（即效力）。例如，将细胞等份或样品数在肿瘤细胞将增殖的条件下与已知数目的肿瘤细胞接触，并且将在存在胎盘灌洗液、灌洗液细胞、胎盘自然杀伤细胞或它们的组合的情况下肿瘤细胞随时间（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更长的时间）的增殖速率与在不存在灌洗液、灌洗液细胞、胎盘自然杀伤细胞或它们的组合的情况下相等个数的肿瘤细胞的增殖进行比较。细胞的效力可以表示为（例如）将肿瘤细胞的生长抑制（例如）约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等所需的细胞个数或溶液体积。
在某些实施方式中，作为药物级可施用单位提供TSNK细胞。可以以单独的体积提供这些单位，例如，15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等。可以提供这些单位以包含指定个数的细胞，例如，仅TSNK细胞或TSNK细胞与其他NK细胞或灌洗液细胞结合，例如，1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个或更多个细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多个细胞/单位。在具体的实施方式中，所述单位可以包含约、至少约或至多约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106个或更多个TSNK细胞毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多个细胞/单位。可以提供这些单位以包含指定个数的TSNK细胞和/或任何其他细胞。
在上述实施方式中，TSNK细胞或TSNK细胞与其他NK细胞、灌洗液细胞或灌洗液的组合可以是与受体自体同源的（即得自所述受体），或者与受体是异源的（即得自与所述受体相比至少一个其他个体）。
在某些实施方式中，标记每个细胞单元以指明体积、细胞个数、细胞类型、该单元是否已富集了特定类型的细胞和/或该单元中给定个数的细胞或给定毫升数的单元的效力（即该单元中的细胞是否造成特定类型的肿瘤细胞增殖的可测量的抑制）中的一种或多种。
6.6.2.TSNK细胞和贴壁胎盘干细胞的组合
在其他实施方式中，对单独的TSNK细胞或与胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞结合的TSNK细胞添加分离的贴壁胎盘细胞，例如，胎盘干细胞和胎盘多能细胞，如（例如）在Hariri的美国专利No.7045148和7255879以及在美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的，以上专利的公开内容以它们全部内容作为参考并入本文。“贴壁胎盘细胞”是指贴附在组织培养表面（例如，组织培养塑料制品）上的细胞。在本文所公开的组合物和方法中有用的贴壁胎盘细胞不是滋养层细胞、胚胎生殖细胞或者胚胎干细胞。在某些实施方式中，在如上所述的方法（例如，两步法）期间将贴壁胎盘干细胞用作饲养细胞。
可以对单独的TSNK细胞或与胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞结合的TSNK细胞添加（例如）1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个或更多个贴壁胎盘细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多个贴壁胎盘细胞。组合中的贴壁胎盘细胞可以是（例如）已培养了（例如）1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增或更多次群体倍增的贴壁胎盘细胞。
当在原代培养中培养或在细胞培养中扩增时，分离的贴壁胎盘细胞贴附至组织培养基底，例如，组织培养容器表面（例如，组织培养塑料制品）。培养中的贴壁胎盘细胞呈现出一般成纤维样星形外观，其中多个胞质突从中央细胞体中伸出。然而，由于贴壁胎盘细胞显示出比成纤维细胞数目更多的这些过程，因此所述贴壁胎盘细胞在形态上是与相同条件下培养的成纤维细胞可区分的。在形态上，贴壁胎盘细胞还与造血干细胞是可区分的，造血干细胞在培养时一般呈现出更圆的或卵石形态。
在本文所提供的组合物和方法中有用的分离的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群体表达可以用于鉴别和/或分离包含所述贴壁胎盘细胞的细胞群体的多种标志物。在本文所提供的组合物和方法中有用的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群体包括直接得自胎盘或其任何部分（例如，羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜板、胎盘绒毛叶、脐带等）的贴壁胎盘细胞和含有贴壁胎盘细胞的细胞群体。在一种实施方式中，贴壁胎盘干细胞群体是培养中的贴壁胎盘干细胞群体（即两种或更多种），例如，容器（例如，袋）中的群体。
贴壁胎盘细胞通常表达标志物CD73、CD105和CD200和/或OCT-4，并且不表达CD34、CD38或CD45。贴壁胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC（MHC-1）和HLA-DR。这些标志物可用于鉴别贴壁胎盘细胞和将贴壁胎盘细胞与其他细胞类型相区别。由于所述贴壁胎盘细胞可以表达CD73和CD105，因此它们可以具有间质干细胞样特征。CD34、CD38和/或CD45表达的缺少将贴壁胎盘干细胞鉴别为非造血干细胞。
在某些实施方式中，本文所述的分离的贴壁胎盘细胞可检测地抑制了癌细胞增殖或肿瘤生长。
在某些实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其他实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，分离的贴壁胎盘细胞是CD34-、CD10+和CD105+。在更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一种更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞是多能贴壁胎盘细胞。在另一种具体的实施方式中，分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化为神经表型细胞、成骨表型细胞或软骨形成表型细胞的潜能。在更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD200+。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外是CD90+和CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-贴壁胎盘细胞另外是CD80-和CD86-。
在一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD200+、HLA-G+。在具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD73+和CD105+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一种实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞产生一个或多个胚状体样体。
在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD73+、CD105+和CD200+。在所述群体的具体实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是HLA-G+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一种具体的实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞产生一个或多个胚状体样体。
在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD200+、OCT-4+。在具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD73+和CD105+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是HLA-G+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一种具体的实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞还产生一个或多个胚状体样体。
在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+。在具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是OCT-4+。在另一种具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是CD200+。在更具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。
在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD73+、CD105+干细胞，其中所述细胞在允许胚状体样体形成的条件下产生了一个或多个胚状体样体。在具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一种具体的实施方式中，分离的贴壁胎盘细胞还是OCT-4+。在更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。
在另一种实施方式中，所述贴壁胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，其中所述贴壁胎盘干细胞在允许胚状体样体形成的条件下培养时产生一个或多个胚状体样体，并且其中已将所述干细胞鉴别为可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。
在多种实施方式中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述分离的贴壁胎盘细胞是OCT-4+。在上述群体的具体实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD73+和CD105+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述干细胞是CD200+。在更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一种具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞已扩增，例如，传代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在任何上述实施方式的更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞表达ABC-p（胎盘特异性ABC转运蛋白；参见，例如Allikmets等人,CancerRes.58(23):5337-9(1998)）。
在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-和CD133-。在另一种实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞组成性地分泌IL-6、IL-8和单核细胞化学引诱蛋白（MCP-1)。
每一个以上提及的分离的贴壁胎盘细胞可以包含直接从哺乳动物胎盘获得和分离的细胞，或已培养并传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多次的细胞，或者它们的组合。如上所述的多种分离的肿瘤细胞抑制性贴壁胎盘细胞可以包含约、至少或不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多个分离的贴壁胎盘细胞。
6.6.3.包含贴壁胎盘细胞条件培养基的组合物
本文还提供了包含TSNK细胞和另外的条件培养基的组合物的使用，其中所述组合物是肿瘤抑制性的，或者在癌或病毒感染的治疗中有效。如以上6.6.2节中所述的贴壁胎盘细胞可以用于产生肿瘤细胞抑制性、抗癌或抗病毒的条件培养基，即包含所述细胞所分泌或排出的具有可检测的肿瘤细胞抑制效果、抗癌效果或抗病毒效果的一种或多种生物分子的培养基。在多种实施方式中，所述条件培养基包含其中所述细胞已增殖（即，已培养）至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天的培养基。在其他实施方式中，所述条件培养基包含其中这些细胞已生长至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或多至100%汇合的培养基。这种条件培养基可以用于支持单独的细胞（例如，胎盘细胞）群体，或另一类细胞群体的培养。在另一种实施方式中，本文所提供的条件培养基包含其中已培养了分离的贴壁胎盘细胞（例如，分离的贴壁胎盘干细胞或分离的贴壁胎盘多能细胞）和除分离的贴壁胎盘细胞（例如，非胎盘干细胞或多能细胞）的培养基。
这种条件培养基可以与TSNK细胞、胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞中的任何或任意组合混合以形成肿瘤细胞抑制性、抗癌或抗病毒组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含按体积小于一半的条件培养基，例如，按体积约或小于约50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。
因此，在一种实施方式中，本文提供了包含TSNK细胞和来自分离的贴壁胎盘细胞的培养的培养基的组合物，其中所述分离的贴壁胎盘细胞（a）贴壁至基底；和（b）是CD34-、CD10+和CD105+；其中所述组合物可检测地抑制肿瘤细胞的生长或增殖，或是抗癌或抗病毒的。在具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述分离的贴壁胎盘细胞是CD34-、CD10+和CD105+。在更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一种更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞是多能贴壁胎盘细胞。在另一种具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化为神经表型细胞、成骨表型细胞或软骨形成表型细胞的潜能。在更具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD200+。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外是CD90+或CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外是CD90+和CD45-。在另一种更具体的实施方式中，如通过流式细胞术所检测的，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-贴壁胎盘细胞另外是CD80-和CD86-。
在另一种实施方式中，本文提供了包含TSNK细胞和来自分离的贴壁胎盘细胞的培养的培养基的组合物，其中所述分离的贴壁胎盘细胞（a）贴壁至基底；和（b）表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时有利于在包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群体中一种或多种胚状体样体的形成，或表达OCT-4并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时有利于在包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群体中一种或多种胚状体样体的形成；其中所述组合物可检测地抑制肿瘤细胞的生长或增殖，或是抗癌或抗病毒的。在具体的实施方式中，所述组合物还包含多种所述分离的胎盘贴壁细胞。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含多种非胎盘细胞。在更具体的实施方式中，所述非胎盘细胞包含CD34+细胞，例如，造血祖细胞，如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。所述非胎盘细胞还可以包含干细胞，如间质干细胞，例如，骨髓源间质干细胞。所述非胎盘细胞还可以是一种或更多种类型的成熟细胞或细胞系。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含抗增殖剂，例如，抗MIP-lα或抗ΜΙΡ-1β抗体。
在具体的实施方式中，通过如上所述的细胞或细胞组合之一调节的培养基得自与多个肿瘤细胞共培养的多个分离的贴壁胎盘细胞，所述分离的贴壁胎盘细胞与所述肿瘤细胞的比值为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1。例如，所述调节的培养基或上清液可以得自包含约1×105个分离的贴壁胎盘细胞、约1×106个分离的贴壁胎盘细胞、约1×107个分离的贴壁胎盘细胞或约1×108个分离的贴壁胎盘细胞或更多个的培养。在另一种具体的实施方式中，所述调节的培养基或上清液得自包含约1×105至约5×105个分离的贴壁胎盘细胞和约1×105个肿瘤细胞；约1×106至约5×106个分离的贴壁胎盘细胞和约1×106个肿瘤细胞；约1×107至约5×107个分离的贴壁胎盘细胞和约1×107个肿瘤细胞；或者约1×108至约5×108个分离的贴壁胎盘细胞和约1×108个肿瘤细胞的共培养。
6.7.细胞的保存
可以放置在允许长期储存的条件下或者放置在抑制通过（例如）细胞凋亡或坏死的细胞死亡的条件下来保存细胞，例如，TSNK细胞或包含造血干细胞或祖细胞的胎盘灌洗液细胞。
可以通过将细胞收集组合物通过至少一部分胎盘（例如，通过胎盘脉管系统）来产生胎盘灌洗液。所述细胞收集组合物包含起作用以保存包含在灌洗液内的细胞的一种或多种化合物。这种胎盘细胞收集组合物可以包含细胞凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳，如相关美国专利申请公开No.20070190042中所述，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
在一种实施方式中，通过将灌洗液或细胞群体与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物接触来从哺乳动物（例如，人）分娩后胎盘收集灌洗液或胎盘细胞群体，其中与未与细胞凋亡抑制剂接触的细胞群体相比，所述细胞凋亡抑制剂以足以降低或防止胎盘细胞（例如，贴壁胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞）群体中细胞凋亡的量和时间存在。例如，可以用细胞收集组合物灌洗所述胎盘，并且从中分离胎盘细胞，例如，总有核胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂。在另一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节贴壁胎盘细胞（例如，贴壁胎盘干细胞或贴壁胎盘多能细胞）的分化或增殖。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于分离的相的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于乳浊液中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物另外包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一种实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与所述胎盘细胞接触时处于约0℃至约25℃之间。在另一种更具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与所述胎盘细胞接触时处于约2℃至10℃之间，或者约2℃至约5℃之间。在另一种更具体的实施方式中，在所述细胞群体的输送期间进行所述接触。在另一种更具体的实施方式中，在所述细胞群体的冻融期间进行所述接触。
在另一种实施方式中，可以收集胎盘灌洗液和/或胎盘细胞并且通过将所述灌洗液和/或细胞与细胞凋亡抑制剂和器官保存化合物接触进行保存，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触所述细胞凋亡抑制剂的灌洗液或胎盘细胞相比足以降低或防止细胞凋亡的量和时间存在。在具体的实施方式中，所述器官保存化合物是UW溶液（美国专利No.4798824中所述；也称为VIASPANTM；另外参见Southard等人,Transplantation49(2):251-257(1990)）或在Stern等人的美国专利No.5552267中所述的溶液，以上专利文献的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在另一种实施方式中，所述器官保存组合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或它们的组合。在另一种实施方式中，所述胎盘细胞收集组合物另外包含处于两相或作为乳浊液的携氧全氟化碳。
在所述方法的另一种实施方式中，在灌洗期间将胎盘细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或它们的组合的细胞收集组合物接触。在另一种实施方式中，在通过灌洗收集后将胎盘细胞与所述细胞收集化合物接触。
通常，在胎盘细胞的收集、富集和分离期间，优选地减少或消除由于缺氧和机械应力所造成的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一种实施方式中，在收集、富集或分离期间将胎盘灌洗液或胎盘细胞群体在所述保存期间在缺氧条件下暴露小于6小时，其中缺氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在更具体的实施方式中，在所述保存期间将所述灌洗液或胎盘细胞群体在所述缺氧条件下暴露小于两小时。在另一种更具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间将所述胎盘细胞群体在所述缺氧条件下暴露小于1小时或小于30分钟，或不暴露于缺氧条件。在另一种具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间未将所述胎盘细胞群体暴露于切应力。
可以在（例如）小容器（例如，安瓿瓶或隔膜瓶）中在冷冻保存培养基中冷冻保存细胞，例如，胎盘灌洗液细胞、造血细胞，例如，CD34+造血干细胞；NK细胞，例如，TSNK细胞；本文所提供的分离的贴壁胎盘细胞。在某些实施方式中，本文提供的细胞以约l×l04-5×108个细胞/mL的浓度冷冻保存。在具体的实施方式中，本文提供的细胞以约1×106-1.5×107个细胞/mL的浓度冷冻保存。在更具体的实施方式中，本文提供的细胞以约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、1.5×107个细胞/mL的浓度冷冻保存。
适合的冷冻保存培养基包括（但不限于）生理盐水、培养基，其包括（例如）生长培养基或细胞冷冻培养基，例如，可商购的细胞冷冻培养基，例如，C2695、C2639或C6039（Sigma）；CS2、
Figure BDA00002911163500482
CS5或
Figure BDA00002911163500483
CS10（BioLife Solutions）。冷冻保存培养基优选地包含处于（例如）约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%（v/v）浓度的DMSO（二甲亚砜）。冷冻保存培养基可以包含其他试剂，例如，甲基纤维素、葡聚糖、白蛋白（例如，人血清白蛋白）、海藻糖和/或甘油。在某些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含约1%-10%的DMSO、约25%-75%的葡聚糖和/或约20-60%的人血清白蛋白（HSA）。在某些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含约1%-10%的DMSO、约25%-75%的海藻糖和/或约20-60%的人HSA。在具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5%的DMSO、55%的葡聚糖和40%的HSA。在更具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5%的DMSO、55%的葡聚糖（10% w/v，在生理盐水中的溶液）和40%的HSA。在另一种具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5%的DMSO、55%的海藻糖和40%的HSA。在更具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5%的DMSO、55%的海藻糖（10% w/v，在生理盐水中的溶液）和40%的HSA。在另一种具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含CS5。在另一种具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含CS10。
可以通过任何多种方法并且在细胞培养、扩增或分化的任何阶段冷冻保存本文所提供的细胞。例如，可以在从来源组织或器官（例如，胎盘灌洗液或脐带血）分离后马上或者在上述方法的第一或第二步期间或之后冷冻保存本文所提供的细胞。在某些实施方式中，在从来源组织或器官分离后约1、5、10、15、20、30、45分钟内或者约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内冷冻保存所述造血细胞（例如，造血干细胞或祖细胞）。在某些实施方式中，在从来源组织或器官分离后的1、2或3天内冷冻保存所述细胞。在某些实施方式中，在如上述6.2.1节中所述的第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后冷冻保存所述细胞。在一些实施方式中，在如上述6.2.1节中所述的第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天并且如上述6.2.1节中所述在第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后冷冻保存所述细胞。
在一个方面，本文提供了冷冻保存NK细胞（例如，TSNK细胞）群体的方法。在一种实施方式中，所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）和可选地一种或多种干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和（b）将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增以产生激活的NK细胞群体，和（c）将来自步骤（b）的NK细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在具体的实施方式中，所述步骤（c）还包括（1）制备细胞悬液；（2）将冷冻保存培养基加入到来自步骤（1）的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；（3）将来自步骤（3）的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和（4）在-80℃以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤（a）和（b）以及步骤（b）和（c）之间不包含中间步骤，和/或在步骤（a）之前不包含其他培养步骤。
在另一种实施方式中，冷冻保存NK细胞（例如，TSNK细胞）群体的所述方法包括：（a）将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子（SCF）、IL-2、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；（b）在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增来自步骤（a）的细胞以产生激活的NK细胞；和（c）在冷冻保存培养基中冷冻保存得自步骤（b）的NK细胞。在具体的实施方式中，所述步骤（c）还包括（1）制备细胞悬液；（2）将冷冻保存培养基加入到来自步骤（1）的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；（3）将来自步骤（3）的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和（4）在-80℃以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤（a）和（b）以及步骤（b）和（c）之间不包含中间步骤。
本文所提供的细胞优选地在控制速率的致冷器中冷却，例如，在冷冻保存期间以约0.1、0.3、0.5或1℃/min的速率。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，优选地约-125℃至约-140℃。在融化使用前，可以将冷冻保存的细胞转移至液氮。在一些实施方式中，例如，一旦安瓿瓶达到约-90℃，则将它们转移至液氮储存区。优选地，在约25℃至约40℃的温度下，优选地至约37℃的温度下融化冷冻保存的细胞。在某些实施方式中，在冷冻保存约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后融化所述冷冻保存的细胞。在某些实施方式中，在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个月后融化所述冷冻保存的细胞。在某些实施方式中，在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年后融化所述冷冻保存的细胞。
适合的融化培养基包括（但不限于）生理盐水、plasmalyte培养基，其包括（例如）生长培养基，例如，RPMI培养基。在优选的实施方式中，融化培养基包括一种或多种培养基补充剂（例如，营养物、细胞因子和/或因子）。适合用于融化本文所提供的细胞的培养基包含，例如无限制地包括，血清（如人血清AB、胎牛血清（FBS）或者胎牛血清（FCS））、维生素、人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、氨基酸（例如，L-谷氨酰胺）、脂肪酸（例如，油酸、亚油酸或棕榈酸）、胰岛素（例如，重组人胰岛素）、转铁蛋白（铁饱和人转铁蛋白）、β-巯基乙醇、干细胞因子（SCF）、Fms样酪氨酸激酶3配体（FK3-L）、细胞因子（如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）、促血小板生成素（Tpo）或肝素）。在具体的实施方式中，在本文所提供的方法中有用的所述融化培养基包括RPMI。在另一种具体的实施方式中，所述融化培养基包括plasmalyte。在另一种具体的实施方式中，所述融化培养基包括约0.5-20%的FBS。在另一种具体的实施方式中，所述融化培养基包括约1、2、5、10、15或20%的FBS。在另一种具体的实施方式中，所述融化培养基包括约0.5%-20%的HSA。在另一种具体的实施方式中，所述融化培养基包括约1、2.5、5、10、15或20%的HSA。在更具体的实施方式中，所述融化培养基包括RPMI和约10%的FBS。在另一种更具体的实施方式中，所述融化培养基包括plasmalyte和约5%的HSA。
可以优化本文所提供的冷冻保存方法以允许长期储存或处于抑制通过（例如）细胞凋亡或坏死的细胞死亡的情况下。在一种实施方式中，融化后的细胞包含大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的活细胞，如通过（例如）自动细胞计数器或台盼蓝法所确定的。在另一种实施方式中，所述融化后的细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或25%的死细胞。在另一种实施方式中，所述融化后的细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或25%的早期凋亡细胞。在另一种实施方式中，约0.5、1、5、10、15或20%的融化后细胞在融化后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后经历细胞凋亡，例如，如通过细胞凋亡测定（例如，TO-PRO3或AnnV/PI细胞凋亡测定试剂盒）所确定的。在某些实施方式中，在使用本文所提供的方法培养、扩增或分化后将融化后的细胞再冷冻保存。
6.8.TSNK细胞的使用
本文所提供的TSNK细胞可以在治疗患有癌的个体（例如，具有实体瘤细胞和/或血液癌细胞的个体）或患有病毒感染的人的方法中使用。本文所提供的TSNK细胞还可以在抑制肿瘤细胞增殖的方法中使用。
6.8.1.患有癌的个体的治疗
在一种实施方式中，本文提供了治疗患有癌（例如，血液癌或实体瘤）的个体的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的TSNK细胞。在某些实施方式中，所述个体缺少自然杀伤细胞，例如，缺少对个体癌的NK细胞活性。在具体的实施方式中，所述方法还包括向所述个体施用分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞，例如，治疗有效量的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在另一种具体的实施方式中，所述方法另外包括向所述个体施用有效量的免疫调节化合物，例如，上文6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺。如本文所使用的，“有效量”是（例如）导致所述个体所患癌的一种或多种症状的可检测改善、发展的减轻或消除的量。
在具体的实施方式中，所述癌是血癌，例如，白血病或淋巴瘤。在更具体的实施方式中，所述癌是急性白血病，例如，急性T细胞白血病、急性髓性白血病（AML）、急性前髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、前体B急性淋巴母细胞性白血病、前体T急性淋巴母细胞性白血病、伯基特氏白血病（伯基特氏淋巴瘤）或急性双表型白血病；慢性白血病，例如，慢性脊髓淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）/小淋巴细胞性淋巴瘤或B细胞幼淋巴细胞白血病；毛细胞淋巴瘤；T细胞幼淋巴细胞白血病；或者淋巴瘤，例如，组织细胞淋巴瘤、淋巴质浆细胞淋巴瘤（例如，瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症）、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞赘生物（例如，浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病）、结外边缘区B细胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）、节边缘区B细胞淋巴瘤（NMZL）、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔（胸腺）大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、大颗粒T淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成熟T细胞白血病/淋巴瘤、鼻型节外NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、阿利贝尔氏病（赛谢综合征）、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病（例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病）、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤（未指明）、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在另一种具体的实施方式中，所述癌是多发性骨髓瘤或脊髓发育不良综合征。
在某些其他具体的实施方式中，所述癌是实体瘤，例如，癌，如腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤（例如，恶性黑色素瘤）、非黑素瘤皮肤癌或未指明的癌；硬纤维瘤肿瘤；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；内分泌肿瘤；尤因肉瘤；生殖细胞肿瘤（例如，睾丸癌、卵巢癌、恶性合胞体瘤、内胚窦瘤、胚组织瘤等）；肝胚细胞瘤；肝细胞癌；成神经细胞瘤；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤；骨肉瘤；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；或肾母细胞瘤。在另一种实施方式中，所述实体瘤是胰癌或乳腺癌。在其他实施方式中，所述实体瘤是听神经瘤；星形细胞瘤（例如，I级纤维性星形细胞瘤、II级低级星形细胞瘤；III级间变性星形细胞瘤；或者IV级多形性胶质母细胞瘤）；脊索瘤；颅咽管瘤；神经胶质瘤（例如，脑干神经胶质瘤；室管膜瘤；混合性胶质细胞瘤；视神经神经胶质瘤；或者亚室管膜瘤）；成胶质细胞瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；转移性脑肿瘤；寡枝神经胶质细胞瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；原始神经外胚层瘤；或者许旺氏细胞瘤。在另一种实施方式中，所述癌是前列腺癌。
在某些实施方式中，患有癌（例如，血癌或实体瘤）的个体（例如，缺少自然杀伤细胞的个体）是在所述施用之前已接受骨髓移植的个体。在某些实施方式中，骨髓移植处于所述癌的治疗中。在某些其他实施方式中，骨髓移植处于所述癌以外的病况的治疗中。在某些实施方式中，所述个体除所述骨髓移植外接受了免疫抑制剂。在某些实施方式中，已进行骨髓移植的个体在所述施用时表现出移植物抗宿主病（GVHD）的一种或多种症状。在某些其他实施方式中，在表现出移植物抗宿主病（GVHD）症状前向已进行骨髓移植的个体施用所述细胞。
在某些具体的实施方式中，在所述施用前，患有癌（例如，血癌）的个体已接受了至少一剂量的TNFα抑制剂，例如，
Figure BDA00002911163500531
（Enbrel）。在具体的实施方式中，所述个体在所述癌诊断的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内接受所述剂量的TNFα抑制剂。在具体的实施方式中，已接受一剂量TNFα抑制剂的个体表现出急性骨髓性白血病。在更具体的实施方式中，已接受一剂量TNFα抑制剂并且表现出急性骨髓性白血病的个体还表现出血细胞中5号染色体长臂的缺失。在另一种实施方式中，患有癌（例如，血癌）的个体表现出费城染色体。
在某些其他实施方式中，在所述个体中癌（例如，血癌或实体瘤）对一种或多种抗癌药来说是难治的。在具体的实施方式中，所述癌对
Figure BDA00002911163500532
（伊马替尼甲磺酸盐）来说是难治的。
在某些实施方式中，在所述个体中所述癌（例如，血癌）对至少一种抗癌药起反应；在该实施方式中，将胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞（例如，胎盘自然杀伤细胞，例如，胎盘源中间体自然杀伤细胞）、分离的混合自然杀伤细胞和/或它们的组合以及可选的免疫调节化合物作为辅助治疗或作为与所述抗癌药的组合疗法加入。在某些其他实施方式中，在所述施用前，已用至少一种抗癌药治疗了患有癌（例如，血癌）的个体并且已复发。
在一个方面，本文提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括向所述个体施用（1）来那度胺；（2）美法仑；和（3）扩增的NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的多发性骨髓瘤来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血细胞产生的NK细胞，例如，造血干细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞（例如，用于产生TSNK细胞）的任何方法产生了所述NK细胞。在另一种实施方式中，在所述施用之前已扩增了所述NK细胞。在另一种实施方式中，所述来那度胺、美法仑和/或NK细胞是彼此单独施用的。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施方式中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括：将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子（SCF）、IL-2、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中在所述造血干细胞或祖细胞群体内多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增。
在另一个方面，本文提供了治疗患有慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的个体的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的（1）来那度胺；（2）美法仑；（3）氟达拉滨；和（4）扩增的NK细胞（例如，TSNK细胞），其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的所述CLL来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血干细胞产生的NK细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞（例如，用于产生TSNK细胞）的任何方法产生了所述NK细胞。在任何上述方法的具体实施方式中，在所述施用之前已将所述NK细胞扩增了至少10天。在任何上述方法的具体实施方式中，将所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和扩增的NK细胞单独施用给所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施方式中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括：将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子（SCF）、IL-2、白细胞介素-7（IL-7）、白细胞介素-15（IL-15）和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中在所述造血干细胞或祖细胞群体内多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和将来自步骤（a）的细胞在包含白细胞介素-2（IL-2）的第二培养基中扩增以产生激活的NK细胞。
6.8.2.肿瘤细胞增殖的抑制
本文还提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括用TSNK细胞接触肿瘤细胞。可选地，所述肿瘤细胞和/或TSNK细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞接触。在另一种具体的实施方式中，将所述肿瘤细胞和/或TSNK细胞另外与免疫调节化合物（例如，以上6.2.1节中所述的免疫调节化合物）或沙利度胺接触，从而与未与TSNK细胞接触的相同类型的肿瘤细胞相比可检测地降低肿瘤细胞的增殖。可选地，将与免疫调节化合物接触的所述肿瘤细胞和/或TSNK细胞与分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞接触。
如本文所使用的，在一种实施方式中，相对于细胞来说“接触”涵盖了胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞（例如，TSNK细胞）和/或分离的混合自然杀伤细胞与肿瘤细胞之间的直接物理（例如，细胞-细胞）接触。在另一种实施方式中，“接触”涵盖了在相同物理空间中的存在，例如，将胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞（例如，胎盘中间体自然杀伤细胞）和/或分离的混合自然杀伤细胞放置在与肿瘤细胞相同的容器（例如，培养皿、多孔板）中。在另一种实施方式中，通过（例如）将胎盘灌洗液或细胞（例如，胎盘灌洗液细胞、混合自然杀伤细胞或自然杀伤细胞（例如，胎盘中间体自然杀伤细胞））注射或输注到个体（例如，包含肿瘤细胞的人，例如，癌患者）中来实现胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、混合自然杀伤细胞或胎盘中间体自然杀伤细胞与肿瘤细胞的接触。在免疫调节化合物和/或沙利度胺的背景中，“接触”表示（例如）所述细胞与所述免疫调节化合物和/或沙利度胺直接彼此物理接触或放置在相同物理体积（例如，细胞培养容器或个体）内。
在具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是血癌细胞，例如，白血病细胞或淋巴瘤细胞。在更具体的实施方式中，所述癌是急性白血病，例如，急性T细胞白血病细胞、急性髓性白血病（AML）细胞、急性前髓细胞白血病细胞、急性成髓细胞白血病细胞、急性巨核细胞白血病细胞、前体B急性淋巴母细胞性白血病细胞、前体T急性淋巴母细胞性白血病细胞、伯基特氏白血病（伯基特氏淋巴瘤）细胞或急性双表型白血病细胞；慢性白血病细胞，例如，慢性脊髓淋巴瘤细胞、慢性粒细胞性白血病（CML）细胞、慢性单核细胞性白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）/小淋巴细胞性淋巴瘤细胞或B细胞幼淋巴细胞白血病细胞；毛细胞淋巴瘤细胞；T细胞幼淋巴细胞白血病细胞；或者淋巴瘤细胞，例如，组织细胞淋巴瘤细胞、淋巴质浆细胞淋巴瘤细胞（例如，瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症细胞）、脾边缘区淋巴瘤细胞、浆细胞赘生物细胞（例如，浆细胞骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病）、结外边缘区B细胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）细胞、节边缘区B细胞淋巴瘤（NMZL）细胞、滤泡性淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞、纵隔（胸腺）大B细胞淋巴瘤细胞、血管内大B细胞淋巴瘤细胞、原发性渗出性淋巴瘤细胞、大颗粒T淋巴细胞白血病细胞、侵袭性NK细胞白血病细胞、成熟T细胞白血病/淋巴瘤细胞、鼻型节外NK/T细胞淋巴瘤细胞、肠病型T细胞淋巴瘤细胞、肝脾T细胞淋巴瘤细胞、母细胞性NK细胞淋巴瘤细胞、阿利贝尔氏病（赛谢综合征）、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病（例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病）细胞、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤细胞、外周T细胞淋巴瘤（未指明）细胞、间变性大细胞淋巴瘤细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤细胞。在另一种具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞或者脊髓发育不良综合征细胞。
在具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是实体瘤细胞，例如，癌细胞，例如，腺癌细胞、肾上腺皮质癌细胞、结肠腺癌细胞、结直肠腺癌细胞、结直肠癌细胞、导管细胞癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、鼻咽癌细胞、黑素瘤细胞（例如，恶性黑色素瘤细胞）、非黑素瘤皮肤癌细胞或未指明的癌细胞；硬纤维瘤肿瘤细胞；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤细胞；内分泌肿瘤细胞；尤因肉瘤细胞；生殖细胞肿瘤细胞（例如，睾丸癌细胞、卵巢癌细胞、恶性合胞体瘤细胞、内胚窦瘤细胞、胚组织瘤细胞等）；肝胚细胞瘤细胞；肝细胞癌细胞；成神经细胞瘤细胞；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤细胞；骨肉瘤细胞；视网膜母细胞瘤细胞；横纹肌肉瘤细胞；或肾母细胞瘤细胞。在另一种实施方式中，所述肿瘤细胞是胰癌细胞或乳腺癌细胞。在其他实施方式中，所述实体瘤细胞是听神经瘤细胞；星形细胞瘤细胞（例如，I级纤维性星形细胞瘤细胞、II级低级星形细胞瘤细胞；III级间变性星形细胞瘤细胞；或者IV级多形性胶质母细胞瘤细胞）；脊索瘤细胞；颅咽管瘤细胞；神经胶质瘤细胞（例如，脑干神经胶质瘤细胞；室管膜瘤细胞；混合性胶质细胞瘤细胞；视神经神经胶质瘤细胞；或者亚室管膜瘤细胞）；成胶质细胞瘤细胞；成神经管细胞瘤细胞；脑膜瘤细胞；转移性脑肿瘤细胞；寡枝神经胶质细胞瘤细胞；成松果体细胞瘤细胞；垂体瘤细胞；原始神经外胚层瘤细胞；或者许旺氏细胞瘤细胞。在另一种实施方式中，所述肿瘤细胞是前列腺癌细胞。
如本文所使用的，“治疗有益的”和“治疗益处”包括（但不限于），例如，肿瘤尺寸的减小；肿瘤扩大的减轻或停止；单位体积组织样品（例如，血样）中癌细胞数目的减少；所述个体所患的特定癌或肿瘤的任何症状的临床改善、所述个体所患的特定癌的任何症状的减轻或停止恶化等。
6.8.3.使用TSNK细胞及其他抗癌剂的癌的治疗
使用本文所述的TSNK细胞的患癌个体的治疗可以是包含一种或多种其他抗癌剂的抗癌疗法方案的一部分。这些抗癌剂在本领域中是熟知的。除TSNK细胞和可选地灌洗液、灌洗液细胞、除TSNK细胞以外的自然杀伤细胞之外，可以施用给患癌个体（例如，具有肿瘤细胞的个体）的具体的抗癌剂包括（但不限于）：阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑盐酸盐；阿克罗宁；阿多来新；氟尿嘧啶；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌乙酸盐；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；安维汀（贝伐单抗）；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；比生群盐酸盐；双奈法德二甲磺酸盐；比折来新；博来霉素硫酸盐；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；卡柔比星盐酸盐；卡折来新；西地芬戈；塞来考昔（COX-2抑制剂）；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克立那托甲磺酸盐；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；柔红霉素盐酸盐；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地扎胍宁甲磺酸盐；地吖醌；多西他赛；多柔比星；多柔比星盐酸盐；屈洛昔芬；屈洛昔芬柠檬酸盐；屈他雄酮丙酸盐；达佐霉素；依达曲沙；依氟鸟氨酸盐酸盐；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；表柔比星盐酸盐；厄布洛唑；依索比星盐酸盐；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；氯苯乙嘧胺；法倔唑盐酸盐；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；吉西他滨盐酸盐；羟基脲；伊达比星盐酸盐；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；伊立替康盐酸盐；兰瑞肽乙酸盐；来曲唑；亮脯利特乙酸盐；利阿唑盐酸盐；洛美曲索钠；洛莫司汀；洛索蒽醌盐酸盐；马索罗酚；美登素；氮芥盐酸盐；甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；草绿霉素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；培洛霉素硫酸盐；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡罗蒽醌盐酸盐；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸甲基下肼；嘌罗霉素；嘌罗霉素盐酸盐；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；沙芬戈盐酸盐；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；锗螺胺盐酸盐；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰索帝；替加氟；替洛蒽醌盐酸盐；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；托瑞米芬柠檬酸盐；曲托龙乙酸盐；曲西立滨磷酸盐；三甲曲沙；三甲曲沙葡萄糖醛酸盐；曲普瑞林；妥布氯唑盐酸盐；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸醛基长春碱；长春地辛；长春地辛硫酸盐；长春匹定硫酸盐；长春甘酯硫酸盐；长春罗新硫酸盐；长春瑞滨酒石酸盐；长春罗定硫酸盐；长春利定硫酸盐；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；和佐柔比星盐酸盐。
其他抗癌药包括（但不限于）：20-表-1,25-二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；3,4-二羟基苄胺肟（amidox）；氨磷汀；氨基-γ-酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯（antarelix）；抗背侧形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素物质；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸盐；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；无嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司琼；阿扎毒素；氮杂酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰星孢菌素；β内酰胺衍生物；β-alethine；β-clamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫堇；卡泊三醇；卡弗他丁C；camptosar（也称作Campto；伊立替康）；喜树碱衍生物；卡培他滨；氨甲酰基氨基三唑；羧酰氨三唑；CaRest M3；CARN700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂（ICOS）；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；绿素类（chlorlns）；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他丁A4；考布他丁类似物；conagenin；crambescidin816；克立那托；cryptophycin8；cryptophycin A衍生物；curacin A；环戊烯蒽醌（cyclopentanthraquinone）；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱水代代宁B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；3,4-二羟荃苯并氧肟酸（didox）；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌毒素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡醇（flavopiridol）；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin盐酸盐；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德克萨卟啉钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼（例如，
Figure BDA00002911163500591
）；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三醋酯盐；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮脯利特+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；德克萨卟啉镥；利索茶碱；裂解肽；美坦新；制甘糖酶素A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素（mitotoxin）成纤维细胞生长因子-肥皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；爱必妥（西妥昔单抗），人绒毛膜促性腺激素；单磷酰酯A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；芥末抗癌剂；印度洋海绵B（mycaperoxide B）；分支杆菌细胞壁萃取；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；奥利默森（）；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口腔细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂（例如，Floxatin）；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；副球菌素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；帕斯婷A；帕斯婷B；纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯化血红蛋白聚氧乙烯结合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化的瑞替普汀；羟乙二磷酸铼Re186；根霉素；核糖酶；RII视黄酰胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老源抑制剂1（senescence derived inhibitor1）；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；脾脏五肽；海绵抑制素1；角鲨胺；stipiamide；基质降解酶抑制剂；sulfinosine；超强血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆碱；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；未端酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；菌体胚素；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；topsentin；托瑞米芬；转化抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿甙（triacetyluridine）；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸蛋白激酶抑制剂（tyrphostins）；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；Vectibix（帕木单抗）维拉雷琐；维拉雷琐；藜芦明；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；整合素拮抗剂（Vitaxin）；伏氯唑；Welcovorin（亚叶酸）；希罗达（卡培他滨）；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；和净司他丁斯酯。
6.8.4.病毒感染的治疗
在另一种实施方式中，本文提供了治疗患有病毒感染的个体的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的TSNK细胞。在某些实施方式中，所述个体缺少自然杀伤细胞，例如，缺少对个体的病毒感染的NK细胞活性。在某些具体的实施方式中，所述施用另外包括向所述个体施用一种或多种分离的胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞（例如，胎盘自然杀伤细胞，例如，胎盘源中间体自然杀伤细胞）、分离的混合自然杀伤细胞和/或它们的组合。在某些具体的实施方式中，在所述施用之前，将TSNK细胞与免疫调节化合物（例如，以上6.2.1节中所述的免疫调节化合物）或沙利度胺接触。在某些其他具体实施方式中，所述施用包括除所述TSNK细胞以外，向所述个体施用免疫调节化合物（例如，以上6.2.1节中所述的免疫调节化合物）或沙利度胺，其中所述量是（例如）导致所述病毒感染的一种或多种症状的可检测改善、发展减缓或者去除的量。在具体的实施方式中，所述病毒感染是通过腺病毒科（Adenoviridae）、微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）、疹病毒科（Herpesviridae）、肝病毒科（Hepadnaviridae）、黃病毒科（Flaviviridae）、反转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科（Orthomyxoviridae）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）、乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）或披衣病毒科（Togaviridae）病毒的感染。在更具体的实施方式中，所述病毒是人类免疫缺陷性病毒（HIV）、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒（HAV）、脊髓灰质炎病毒、埃-巴二氏病毒（EBV）、单纯性疱疹1型（HSV1）、单纯性疱疹2型（HSV2）、人巨细胞病毒（CMV）、人疱疹病毒8型（HHV8）、带状疱疹病毒（水痘带状疱疹病毒（VZV）或带状疱疹病毒（shingles virus））、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、流感病毒（例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或托高土病毒）、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、乳头状瘤病毒、狂犬病病毒或风疹病毒。
在其他更具体的实施方式中，所述病毒是腺病毒A种，12、18或31血清型；腺病毒B种，3、7、11、14、16、34、35或50血清型；腺病毒C种，1、2、5或6血清型；D种，8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49或51血清型；E种，4血清型；或者F种，40或41血清型。
在某些其他更具体的实施方式中，所述病毒是阿波衣病毒（APOIV）、aroA病毒（AROAV）、巴格扎病毒（BAGV）、斑齐病毒（BANV）、博博衣病毒（BOUV）、Cacipacore病毒（CPCV）、卡勒岛病毒（CIV）、牛骨山脊病毒（CRV）、登革热病毒（DENV）、埃杰山病毒（EHV）、Gadgets Gully病毒（GGYV）、伊列乌斯病毒（ILHV）、以色列-土耳其脑脊膜脑脊髓炎病毒（ITV）、日本脑炎病毒（JEV）、朱格拉病毒（JUGV）、朱蒂亚帕病毒（JUTV）、凯丹姆病毒（KADV）、凯多各病毒（KEDV）、科科贝拉病毒（KOKV）、科坦戈病毒（KOUV）、卡萨努森林病病毒（KFDV）、兰加特病毒（LGTV）、Meaban病毒（MEAV）、摩多克鼠病毒（MODV）、蒙大拿鼠耳蝙蝠白细胞脑炎病毒（MMLV）、澳洲墨莱溪谷脑炎病毒（MVEV）、恩塔亚病毒（NTAV）、鄂木斯克出血热病毒（OHFV）、波瓦桑病毒（POWV）、里奥布拉伏病毒（RBV）、罗亚尔农场病毒（RFV）、萨博亚病毒（SABV）、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）、Sal Vieja病毒（SVV）、San Perlita病毒（SPV）、索马里滋里夫病毒（SREV）、塞皮克病毒（SEPV）、坦布苏病毒（TMUV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、为勒尼病毒（TYUV）、乌干达S病毒（UGSV）、乌苏土病毒（USUV）、韦塞尔斯布朗病毒（WESSV）、西尼罗河病毒（WNV）、Yaounde病毒（YAOV）、黄热病毒（YFV）、Yokose病毒（YOKV）或寨卡病毒（ZIKV）。
在其他实施方式中，作为包括一种或多种其他抗病毒剂的抗病毒疗法方案的一部分，将所述TSNK细胞和可选地胎盘灌洗液和/或灌洗液细胞施用给患有病毒感染的个体。可以施用给患有病毒感染的个体的具体的抗病毒剂包括（但不限于）：咪喹莫特、普达非洛、鬼臼脂、干扰素α（IFNα）、reticolos、壬苯醇醚-9、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和奥司他韦；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦、奈非那韦、利托那韦或沙奎那韦；核苷反转录酶抑制剂，如去羟肌苷、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨或齐多夫定；和非核苷反转录酶抑制剂，如奈韦拉平或依法韦仑。
6.8.5.施用
可以彼此独立地进行细胞（例如，胎盘灌洗液细胞，例如，得自胎盘灌洗液的有核细胞、混合自然杀伤细胞和/或分离自然杀伤细胞，例如，TSNK细胞）的确定和免疫调节化合物（例如，以上6.2.1节中所述的免疫调节化合物）或沙利度胺的量的确定。
6.8.5.1.细胞的施用
在某些实施方式中，以对个体产生可检测的治疗益处的任何量或数目（例如，有效量）使用TSNK细胞（例如，将其施用给个体），其中所述个体患有病毒感染、癌或具有肿瘤细胞，例如，具有肿瘤细胞、实体瘤或血癌的个体，例如，癌患者。可以将这类细胞以绝对细胞数目施用给该个体，例如，可以对所述个体施用约、至少约或至多约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个TSNK细胞。在其他实施方式中，可以将TSNK细胞以相对细胞数目施用给该个体，例如，可以对所述个体施用约、至少约或至多约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个TSNK细胞/千克个体。可以根据TSNK细胞和可选地胎盘灌洗液细胞和/或除TSNK细胞以外的自然杀伤细胞的数目和所述个体中肿瘤细胞的数目（例如，估计的数目）之间的近似比值将TSNK细胞施用于该类个体。例如，可以将TSNK细胞以与所述个体中肿瘤细胞数目的约、至少约或至多约1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1的比值施用给所述个体。可以通过（例如）对来自个体的组织样本（例如，血样、活组织检查等）中的肿瘤细胞数目计数来估计该类个体中肿瘤细胞的数目。在具体的实施方式中，例如，对于实体瘤，所述计数是结合肿瘤成像进行的以获得近似肿瘤体积。在具体的实施方式中，除了TSNK细胞，可选地胎盘灌洗液细胞和/或除TSNK细胞外的自然杀伤细胞之外，将免疫调节化合物或沙利度胺（例如，有效量的免疫调节化合物或沙利度胺）施用给所述个体。
在某些实施方式中，抑制（例如）个体中肿瘤细胞增殖的方法；治疗在个体中缺少自然杀伤细胞的个体的方法；或治疗患有病毒感染的个体的方法；或治疗患有癌的个体（例如，具有肿瘤细胞、血癌或实体瘤的个体）的方法包括将TSNK细胞和一种或多种胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞与肿瘤细胞接触或施用给所述个体。在具体的实施方式中，所述方法另外包括将免疫调节化合物或沙利度胺与肿瘤细胞接触或施用给所述个体。
在具体的实施方式中，例如，在个体中缺少自然杀伤细胞（例如，NK细胞数目的缺少或在NK细胞中对癌、肿瘤或病毒感染细胞的反应性的缺少）的个体的治疗；或患有癌或病毒感染的个体的治疗，或肿瘤细胞增殖的抑制包括将补充有分离的胎盘灌洗液细胞或胎盘灌洗液的TSNK细胞与所述肿瘤细胞接触或施用于所述个体。在具体的实施方式中，约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多个TSNK细胞/毫升或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个TSNK细胞补充了约或至少约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多个分离的胎盘灌洗液细胞/毫升或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个分离的胎盘灌洗液细胞。在其他更具体的实施方式中，约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多个TSNK细胞/毫升或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个TSNK细胞补充了约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mL灌洗液或约1单位的灌洗液。
在另一种具体的实施方式中，在个体中缺少自然杀伤细胞的个体的治疗；患有癌的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制包括将TSNK细胞与肿瘤细胞接触或施用给所述个体，其中所述细胞补充了贴壁胎盘细胞，例如，贴壁胎盘干细胞或多能细胞，例如，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述TSNK细胞补充了约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多个贴壁胎盘干细胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多个贴壁胎盘细胞，例如，贴壁胎盘干细胞或多能细胞。
在另一种具体的实施方式中，通过免疫调节化合物或沙利度胺与TSNK细胞结合使用来实施在个体中缺少自然杀伤细胞的个体的治疗；患有癌的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制，其中所述细胞补充了条件培养基，例如，通过CD3-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘细胞调节的培养基，例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL干细胞条件培养基/单位灌洗液，或104、105、106、107、108、109、1010或1011个TSNK细胞。在某些实施方式中，所述组织培养贴壁胎盘细胞是美国专利No.7468276和美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的多能贴壁胎盘细胞，以上专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在另一种具体的实施方式中，所述方法另外包括将免疫调节化合物或沙利度胺与肿瘤细胞接触或施用给所述个体。
在另一种具体的实施方式中，在个体中缺少自然杀伤细胞的个体的治疗；患有癌的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制，其中所述TSNK细胞补充了胎盘灌洗液细胞，在所述接触之前，所述灌洗液细胞与白细胞介素-2（IL-2）接触一段时间。在某些实施方式中，所述一段时间是在所述接触之前的约、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48小时。
可以将所述TSNK细胞和可选地灌洗液或灌洗液细胞在抗癌疗法过程中一次施用给患有病毒感染的个体、患有癌的个体或具有肿瘤细胞的个体；或可以在疗法期间多次施用，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36或更多个星期一次。在其中使用细胞和免疫调节化合物或沙利度胺的实施方式中，可以将免疫调节化合物或沙利度胺和细胞或灌洗液一起施用给所述个体，例如，在相同制剂中；在大致相同的时间分别施用给所述个体，例如，在单独的制剂中；或者可以单独施用，例如，以不同的剂量时间表或在一天的不同时间。类似地，在其中使用细胞和抗病毒化合物或抗癌化合物的实施方式中，可以将抗病毒化合物或抗癌化合物和细胞或灌洗液一起施用给所述个体，例如，在相同制剂中；在大致相同的时间分别施用给所述个体，例如，在单独的制剂中；或者可以单独施用，例如，以不同的剂量时间表或在一天的不同时间。可以施用所述TSNK细胞和灌洗液或灌洗液细胞而不考虑过去是否已经将TSNK细胞、灌洗液或灌洗液细胞施用给所述个体。
7.实施例
7.1.实施例1：从人胎盘灌洗液和脐带血回收造血干细胞
通常使用聚蔗糖或氯化铵纯化人胎盘灌洗液（HPP）和脐带血（UCB）细胞以获得总有核细胞（TNC）。然后，将TNC在根据生产商（StemCellTechnologies,Inc.）的规程使用抗CD34珠和RoboSep的阳性选择程序中使用以分离CD34+细胞。在该实验中，分离了纯度大于90%的CD34+细胞。作为另外一种选择，将
Figure BDA00002911163500651
人祖细胞富集试剂盒（StemCellTechnologies,Inc.）在通过使用人祖细胞富集混合物和抗下列人细胞表面抗原：CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A的单克隆抗体的阴性选择程序中使用以排除谱系定型细胞。使用阴性选择，从原材料中回收了90%的CD34+细胞。在表1中总结了回收的HSC的细胞组成。
表1.富集的造血干细胞（HSC）的细胞组成。对于3个供体的群体平均值计算了标准偏差。
平均% STDEV
Lin-CD34+ 75.1 6.2
Lin-CD34-CD38- 9.8 2.4
Lin-CD34-CD133+ 0.9 0.2
Lin-CD34-CD117+ 7.2 0.5
7.2.实施例2：造血干细胞向自然杀伤细胞的不含饲养细胞的扩增和分化
将CD34+细胞在下列培养基制剂中培养多至48天，并且取细胞等份以进行细胞计数、细胞存活力评价、自然杀伤细胞分化的鉴定和功能性评价。
NK1培养基：GBGM（Glycostem基础生长培养基，Glycostem目录号：CCT-SCB500，Clear cell technology），其添加了pen/strep（目录号：15140，Gibco）、20ng/niL SCF（目录号：255-SC，R&D Systems）、10ng/mL Flt-3配体（目录号：308-FK，R&D system）、20ng/mL TPO（目录号：288-TP，R&D system）、20ng/mL IL-7（目录号：207-IL，R&D Systems）、200IU/mLIL-2（目录号：202-IL，R&D Systems）和10ng/mL IL-15（目录号：247-IL，R&D Systems）。
NK2培养基：DMEM（目录号：MT-10-013-CV，Fisher）：汉姆氏F12培养基（目录号：BW12-615F，Fisher）（1：2），其添加了2mM L-谷氨酰胺（目录号：25030，Invitrogen）、1%pen/strep、20%人血清AB（目录号：100-512，Gemcell）、5ng/mL亚硒酸钠（目录号：S9133，Sigma）、50μΜ乙醇胺（目录号：E0135，Sigma）、25μΜβ-巯基乙醇（目录号：21985，Invitrogen）、20mg/mL抗坏血酸（目录号：47863，Sigma）、5ng/mL IL-3（目录号：203-IL，R&D Systems）、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3配体、20ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15。
NK3培养基：X-vivo20（目录号：BW04-448Q，Fisher），其添加了pen/strep、10%人血清AB（目录号：100-512，Gemcell）和500IU/mL IL-2。
NK2A培养基：GBGM，其添加了10%人血清AB、1%pen/strep、20ng/mLSCF、10ng/mL Flt-3配体、20ng/mL TPO、20ng/mL IL-7、200IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15和1.5IU/mL肝素（目录号：H3149，Sigma）。
NK2B1培养基：DMEM：汉姆氏F12培养基（1：2），其添加了2mML-谷氨酰胺、1%pen/strep、20%人血清AB、5ng/mL亚硒酸钠、50μΜ乙醇胺、25μΜβ-巯基乙醇、20μg/mL抗坏血酸、5ng/mL IL-3、20ng/mL SCF、10ng/mL Flt-3配体、20ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15。
NK2B2培养基：DMEM：汉姆氏F12培养基（1：2），其添加了2mML-谷氨酰胺、1%pen/strep、20%人血清AB、5ng/mL亚硒酸钠、50μΜ乙醇胺、25μΜβ-巯基乙醇、20μg/mL抗坏血酸、200IU/mL IL-2、20ng/mLSCF、10ng/mL Flt-3配体、20ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15。
NK2C培养基：RPMI1640（目录号：22400105，Invitrogen），其添加了10%FBS（目录号：SH30070.03，Hyclone）、2mM L-谷氨酰胺、1%pen/strep、50ng/mL SCF、50ng/mL Flt-3配体、100IU/mL IL-2、20ng/mL IL-7和20ng/mL IL-15。
NK2D培养基：不含血清的培养基（StemSpan，目录号：09650，StemCell Technologies,Vancouver,Canada），其添加了1μΜ合成糖皮质激素地塞米松（Dex，目录号：D4902，Sigma,St Louis,MO）、40ng/mL胰岛素样生长因子1（IGF-1，目录号：291-G1-250，R&D Systems,Minneapolis,MN）、100ng/mL SCF、40μg/mL脂（富含胆固醇的脂混合物；目录号：C7305-1G，Sigma,St Louis,MO）、5ng/mL IL-3、200IU/mL IL-2、20ng/mL IL-7和20ng/mL IL-15。
用RPMI1640（不含酚）和5%FBS将在不同时间点收集的细胞清洗两次，在4℃用结合萤光物的抗体（表2和3）标记15分钟并通过流式细胞术（FACSCanto,BD）和FlowJo细胞计数软件（Tree Star）分析。
表2.用于细胞标记的抗体
HSC-NK FACS抗体
项目 供货商 目录号
FITC抗-hu CD3 BD 555332
APC-Cy7抗-hu CD3 BD 557832
APC抗-hu CD5 BD 555355
PE抗-hu CD7 BD 555361
FITC抗-hu CD16 BD 555406
PE-Cy5抗-hu CD16 BD 555408
PE抗-hu CD56 BD 555516
PE-CY5CD56（N-CAM） BD 555517
PE CD94 R&D FAB-1058P
APC抗-hu CD117 BD 550412
PE抗-hu CD226 BD 559789
同型FITC小鼠IgG1 BD 340755
同型PE小鼠IgG1 BD 340761
同型PerCP小鼠IgG1 BD 340762
同型PE-CY7小鼠IgG1 BD 348798
同型APC小鼠IgG1 BD 340754
同型APC-CY7小鼠IgG1 BD 348802
同型APC小鼠IgG2a BD 555576
PE抗-hu KIR-NKAT2（2DL3） BD 556071
PE NKB1（3DL1） BD 555967
APC NKG2D BD 558071
APC NKp46 BD 558051
Simply Cellular补偿珠 Bangs Labs 550
表3.NK表面受体流式细胞术鉴定分组
FITC PE PerCP APC APC-Cy7
空白
同型
组1 CD3 CD56 CD16
组2 CD16 NKB1 CD56 NKG2D CD3
组3 CD16 NKAT2 CD56 NKp46 CD3
组4 CD16 CD94 CD56 CD117 CD3
组5 CD16 CD226 CD56 CD3
组6 CD16 CD7 CD56 CD5 CD3
使用PKH26/TO-PRO-3标记的细胞毒性测定。将靶标肿瘤细胞用PKH26（目录号PKH26GL，Sigma-Aldrich，通过其亲脂性脂族残基插入细胞质膜的染料）标记，然后置于96孔U型底组织培养板中并在补充有10%FBS的200μl RPMI1640中以多种效应因子-靶标（E:T）比值与扩增的NK细胞一起培育。将培养物在37℃在5%CO2中培育4小时。培育后，收获细胞并将TO-PRO-3（Invitrogen目录号：T3605，不透过膜的DNA染色剂）加入到培养物（1μΜ最终浓度）中，然后进行FACS分析。将细胞毒性表示为总PKH26+靶标肿瘤细胞内死细胞（PKH26+TO-PRO-3+）的百分比。
CD34+细胞扩增和向NK细胞分化的优化。在所测试的培养基制剂（NK1、NK2和NK3）中，NK1培养基在第21天（D21）显示出500倍的扩增。NK2和NK3培养基既不维持细胞增殖也不维持分化。对NK1培养基进行进一步的培养基优化，并且后续培养基命名为NK2A、NK2B、NK2C和NK2D。使用NK2A培养基培养的CD34+细胞在第55天（D55）显示出105倍的扩增。根据得自NK1、2和3培养基的成倍扩增、分化和细胞毒性的结果，实施了第二批NK2A、NK2B、NK2C和NK2D培养基制剂，并在D55实现了105倍扩增（如图1中所示）。NK2B培养基显示出约3×104倍扩增。NK2C培养基中的培养在21天中导致3×102倍扩增，然后细胞存活力降低。在实验持续期间，NK2D培养基不维持细胞。
在第48天（D48），NK2A培养基中约90%的NK细胞是CD56+CD3-。在CD56+CD3-群体中，超过98%的细胞是CD56+CD16-群体（如图2所示），尽管58%表达激活的受体NKG2D，68%是NKp46和17%是CD226+（如表4A和4B中所示）。
表4A,4B.D48时扩增的NK细胞的表型鉴定
Figure BDA00002911163500691
Figure BDA00002911163500692
另外，在培养第21天，在NK2A培养基中培养的97.8%的细胞和在NK2B培养基中培养的93.1%的细胞是CD56+CD16-。
7.3.实施例3：CNK培养基中NK细胞的培养
提高NK细胞的扩增和细胞毒性
在第27天（D27），将在NK2A培养基中培养的CD34+细胞在下列培养基之一中进一步培养：
·两阶段培养基，其包含CNK培养基和维持培养基。CNK培养基是IMDM（Invitrogen），其添加了10%FCS（Hyclone）、200IU/mL IL-2（R&D Systems）、35μg/mL转铁蛋白（Sigma-Aldrich）、5μg/mL胰岛素（Sigma-Aldrich）、2×10-5M乙醇胺（Sigma-Aldrich）、1μg/mL油酸（Sigma-Aldrich）、1μg/mL亚油酸（Sigma-Aldrich）、0.2μg/mL棕榈酸（Sigma-Aldrich）、2.5μg/mL BSA（Sigma-Aldrich）和0.1μg/mL植物凝集素（PHA-P，Sigma-Aldrich）。将在NK2A培养基中培养的CD56+CD3-NK细胞以2.5×l05个活细胞/mL在细胞培养处理的24孔板或方瓶中的CNK培养基中再悬浮。将丝裂霉素C处理的异源PBMC和K562细胞（慢性粒细胞性白血病细胞系）均作为饲养细胞加入到CNK培养基中至1×106个/mL的最终浓度。将NK细胞在37℃在5%CO2中培养5-6天。5-6天后，每3-4天将等体积的维持培养基（具有10%FCS、2%人AB血清、抗生素、L-谷氨酰胺和400单位IL-2/mL的IMDM）加入到培养中。
·NK2A（PDAC）培养基，其具有丝裂霉素C处理的CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞作为饲养细胞；
·NK2A（MSC）培养基，其具有丝裂霉素C处理的间质干细胞（MSC）作为饲养细胞；或
·不含饲养细胞的NK2A（FF）培养基作为对照。
与NK2A（FF）、NK2A（PDAC）和NK2A（MSC）相比，两阶段培养基提高了CD34+细胞的成倍扩增，特别是在第27天（D27）和第48天（D48）之间。参见图3。
到第35天，在两阶段培养基中CD34+细胞的比例已减少至约4%，而CD56+CD3-的比例已增加至约80%。在第45天（D45），与在NK2A（FF）、NK2A（PDAC）和NK2A（MSC）中培养的NK细胞相比，在两阶段培养基中培养的细胞显示出最高的细胞毒性（如图3中所示）。第41天的表型鉴定（如图5中所示）显示出细胞中NKp46和CD226表达的升高，这显示了细胞毒性增强的可能解释。D41时，CD226+细胞的比例从NK2A培养基中的0.9%±0.8%提高至两阶段培养基中的13%±4%；NKp46+细胞的比例从NK2A培养基中的55.4%±8.7%提高至两阶段培养基中的80%±7.85%。D48时，CD226+细胞的比例从NK2A培养基中的17.3%±14.3%提高至两阶段培养基中的52.3%±11.64%；NKp46+细胞的比例从NK2A培养基中的67.9%±5.4%提高至两阶段培养基中的86%±4%。在所测试的条件中，NKG2D表达无显著差异。在下表5中显示了CD226和NKp46的表达变化。
表5.第41天（D41）和第48天（D48）时在NK2A（FF）和两阶段培养基中培养的NK细胞的CD226和NKp46的表达。对3个供体计算了标准偏差。
D41 NK2A（FF） 两阶段
CD226% 平均 0.9% 13%
STDEV 0.8% 4%
NKp46% 平均 55.4% 80%
STDEV 8.7% 7.85%
D48
CD226% 平均 17.3% 52.3%
STDEV 14.3% 11.6%
NKp46% 平均 67.9% 86%
STDEV 5.4% 4%
7.4.实施例4：两阶段培养基培养的自然杀伤细胞和来源于胚胎干细胞 （ESC）的自然杀伤细胞的比较
将在两阶段培养基中培养的NK细胞与来源于胚胎干细胞（ESC）的NK细胞相比较，后一种NK细胞通过Woll等人,Blood113(4):6094-6101(2009)的方法所产生。具体地，在两种细胞类型的培养过程中观察了CD94和CD117表达水平的差异。图6显示从第7天（D7）至第35天（D35），两阶段NK细胞中CD117的表达较高，而CD94的表达逐渐提高。在第35天（D35），约44%的CD56+CD3-（两步）细胞是CD94+CD117+细胞，37.6%的CD56+CD3-细胞是CD94-D117+，而14.7%的CD56+CD3-细胞是CD94+CD117-。照此，从培养的第14天至第35天，通过所述两步法产生的NK细胞与来源于ESC的NK细胞是可区分的，其78%仍是CD117low/-。CD117表达的这种差异是有用的，这是因为CD117+NK细胞对来自多种组织的肿瘤细胞系是具有细胞毒性的，如以下实施例6中所述。
这些结果表明TSNK细胞的分化发展不同于ESC来源的NK细胞，而且TSNK细胞与ESC来源的NK细胞是可区分的。
7.5.实施例5：PDAC提高了在NK2A培养基中培养的自然杀伤细胞的 成倍扩增
为了评价CD10+、CD34-、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞（在本实施例中称为PDAC）对造血干细胞（HSC）分化为自然杀伤细胞的影响，用丝裂霉素C处理的PDAC或骨髓源间质干细胞（MSC）以PDAC/MSC：HSC10：1的比值在第0天和第21天刺激HSC，而将不含饲养细胞的培养用作对照。将NK2A培养基用作培养基。发现与仅有培养基相比，PDAC提高了培养的NK细胞的成倍扩增。然而，发现与或不与饲养层生长的细胞之间细胞毒性无显著差异。用MSC处理的细胞显示出最高的成倍扩增，但是细胞毒性最低，如图7中所示。
7.6.实施例6：使用两阶段培养基扩增的NK细胞的细胞毒性活性
本实施例表明从使用如上所述的两阶段法扩增和分化的CD34+细胞产生的NK细胞对肿瘤细胞系是具有细胞毒性的。
乳酸脱氢酶（LDH）释放测定。使用
Figure BDA00002911163500711
非放射性细胞毒性测定试剂盒（Promega，目录号：G1780）进行LDH释放测定。在该测定中，将来源于供体配合的人胎盘灌洗液（HPP）和脐带血单元（组合单元（Combos unit））的培养的NK细胞用作效应细胞，而将某些肿瘤细胞系细胞用作靶细胞。根据本研究中所使用的三个单元，HPP细胞的百分比为56.6%±28.3%。将效应细胞和靶细胞置于96孔U型底组织培养板中并在补充了2%人AB血清（Gemini，目录号：100-512）的100μl无酚红RPMI1640（Invitrogen，目录号：11835-030）中以多种效应因子-靶标（E:T）比培育。将培养物在37℃在5%CO2中培育4小时。培育后，将50μl上清液转移到酶测定板中，如生产商所提供的检测LDH活性，并在ELISA读数器（SynergyHT,Biotek）中在490nm下测量吸光值。根据以下方程计算细胞毒性：%细胞毒性=（样品-效应因子自发值-靶标自发值)/(靶标最大值-靶标自发值）*100，其中“效应因子自发值”是从效应细胞中自发释放的LDH的对照；“靶标自发值”是从靶细胞中自发释放的LDH的对照；和“靶标最大值”是当基本100%的细胞溶解时最大LDH释放的对照。
人胎盘灌洗液（HPP）CD34+细胞和脐带血（UCB）CD34+细胞的分离。使用聚蔗糖或氯化铵纯化HPP和UCB细胞以获得总有核细胞（TNC）。然后，将TNC在按照生产商（StemCell Technologies,Inc.）所提供的规程使用抗CD34珠和RoboSep的阳性选择程序中使用以分离CD34+细胞。在该实验中，分离了纯度大于90%的CD34+细胞。
肿瘤细胞对所培养的两阶段NK细胞的敏感性研究。将肿瘤细胞系（表1），其包括人乳腺癌（HCC2218）、人结直肠腺癌（HT-29）、人慢性粒细胞性白血病（CML）、人急性骨髓性白血病（AML）、人成胶质细胞瘤（LN-18和U-118MG）、人多发性骨髓瘤（U266）、人组织细胞淋巴瘤（U937）和人视网膜母细胞瘤（WERI-RB-1），与两阶段NK细胞共培养。所述两阶段培养的NK细胞包括在NK2A培养基中培养21天，然后在CNK培养基中培养21天的那些，和在NK2A培养基中培养28天然后在CNK培养基中培养14天的那些。通过4小时共培养后的乳酸脱氢酶（LDH）释放测定来测量NK细胞的细胞毒性。在效应因子比靶标（E:T）为10：1的比值时，后者通常比前者显示出更高的细胞毒性（表6）。在肿瘤细胞系中，LN-18对NK介导的杀死最敏感，随后是K562、U937、WERI-RB-1、U-118MG、HT-29、HCC2218、KG-1和U266。
因此，TSNK细胞对多种癌细胞系显示出显著的细胞毒性。还显示可以通过将在NK2A培养基中的培养期从21天延长至28天来改善NK细胞毒性。
表6.培养的TSNK细胞靶向肿瘤细胞系的细胞毒性
Figure BDA00002911163500731
*n：供体数
人胎盘灌洗液（HPP）CD34+细胞和脐带血（UCB）CD34+细胞的微小RNA谱。使用MIRVANATM miRNA分离试剂盒（Ambion，目录号：1560）对纯化的供体配合的HPP和UCB CD34+细胞进行微小RNA（miRNA）制备。将CD34+细胞（0.5至1.5×106个细胞）在变性溶胞缓冲液中破碎。然后，对样品进行酸-酚+氯仿提取以分离小RNA物质高度浓缩的RNA。加入100%的乙醇使样品达到25%的乙醇。当该溶胞产物/乙醇混合物通过玻璃纤维过滤器时，大RNA物质被固定，而在滤液中收集小RNA物质。然后将滤液的乙醇浓度提高至55%，将混合物通过第二玻璃纤维过滤器，在该过滤器中小RNA被固定。将该RNA清洗几次，并在低离子强度溶液中洗脱。通过在260和280nm测量其吸光度来确定回收的小RNA的浓度和纯度。在所测试的所有供体中（n=3），认为对HPP CD34+细胞独特的微小RNA包括hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b和hsa-miR-520a。
7.7.实施例7：从混合的UCB和HPP分离CD34 + 细胞
本实施例表明了从混合的脐带血（UCB）和人胎盘灌洗液（HPP）（组合）的CD34+细胞的分离。为了评价UCB:HPP的混合比，如下进行了3种不同混合比的并行比较：（1）完全混合：1×UCB（完全体积）+1×HPP（完全体积）；（2）HPP的部分混合（33%）：1×UCB（完全体积）+0.33×HPP（1/3的HPP体积）；和（3）HPP的部分混合（10%）：1×UCB（完全体积）+0.10×HPP（1/10的HPP体积）。总计进行了N=3个实验重复。记录初始TNC和体积。然后，对混合的样品纯化CD34+细胞，并且在融化后确定CD34+的纯度。然后，根据融化后CD34+的纯度对体积或细胞计数（TNC）部份（作为组合的%）的图，通过作图确定最佳混合比。如图8所示，终点CD34+纯度与HPP的体积含量良好相关，但是与HPP TNC含量的相关性不太好。整体来说，发现85%UCB（v/v）和15%HPP（v/v）是获得纯度80%及以上的CD34+细胞的最佳混合比。
7.8.实施例8：使用
Figure BDA00002911163500741
基培养基的NK细胞培养的比较
本实施例表明了使用两种GBGM基培养基的NK细胞培养方法（三阶段法和两阶段法）的比较。在表10中总结了这两种方法。两种方法均使用GBGM作为用于胎盘来源的NK细胞和CD34+细胞分化的基础培养基。
表7.三级和两阶段法的总结
Figure BDA00002911163500742
以下列出了实验参数：
供体批次：
（1）来自新鲜UCB的CD34+细胞：N=6
（1）来自新鲜“组合”的CD34+细胞：N=2
（3）来自冷冻保存的“组合”的CD34+：N=8
规模：多孔碟至T-25，大至多个T-75三角瓶，1至80mL体积
处理方法：
（1）两阶段法
（2）三阶段法
饲养细胞的使用：
（1）无饲养细胞
（2）使用失活的K562和PBMC饲养细胞，在第21天加入到培养物中
接种密度：20000-50000个细胞/mL
产生了来自新鲜UCB或新鲜组合的CD34+细胞，并使用实施例7、10和11中所述的方法冷冻保存。将培养物维持在37℃、90%湿度和5%CO2的培育箱中。整个过程监测细胞生长（细胞计数）并且每周更换两次培养基以将细胞浓度维持在5×104-1×106个/mL的范围内。通过在第21天和35天进行表型分析来监控分化。当使用饲养细胞时，在NK培养的第21天，用丝裂霉素-C（16μg/mL，2小时，37℃）使培养3天的新鲜K562和融化后的allo-PBMC失活，并将其以1×106个/mL加入到两阶段法条件中。将分化NK归一化至0.5×l06个/mL。在第35天，在进行了最终细胞计数后，使用新鲜培养和PKH标记的K562细胞（10:1的E:T比，4小时，37℃）进行基于流式细胞术的细胞毒性测定以评价NK功能性。
结果
在第35天，使用两种方法的来源于新鲜UCB的CD34+细胞的TNC扩增倍数的中值是可比较的。两阶段法看起来获得了比用于新鲜组合来源的CD34+细胞的三阶段法更高的TNC扩增倍数。对于使用两种方法的来源于融化后的组合的CD34+细胞来说，整体TNC扩增倍数是可比较的，但是其显著低于来源于新鲜UCB或新鲜组合的那些。总之，在培养结束时三阶段法和两阶段法均获得了相似的细胞产率。
在第21天，来源于UCB或组合的细胞的表型无显著差异。与三阶段法相比（平均6.1%），两阶段法导致产生了更高的CD56+CD3-NK细胞百分比（平均14.7%）。分化程度（例如，CD56+CD3-水平）好象是供体依赖性的。在所有情况下，CD3+CD56-（T细胞）和CD3+CD56+（NKT样细胞）种群的百分比均是最小的。
在第35天，对于分化NK细胞来说，发现两种方法均是有效的，如通过高终点CD56+CD3-纯度水平所证明的（对于两阶段和三阶段法，分别为87.2%和90.1%）。在两阶段法中加入饲养细胞似乎提高了NK表型纯度（无饲养细胞为75.3%；使用饲养细胞为87.2%），而使用三阶段法未发现饲养细胞对NK纯度有可观察到的益处（无饲养细胞为90.1%；使用饲养细胞为84.7%）。
培养的NK细胞在整个过程中维持了它们的CD16-表型。在不存在饲养细胞的情况下，两阶段法似乎获得了比另一种情况（<2%）稍微更多的CD56+CD3+细胞（平均11.2%）。在两种方法中，PBMC和K562饲养细胞的存在显著上调/激活了NK细胞群体上的某些NK功能性标志物（NKp46、DNAM-1、CD94）。整体来说，当饲养细胞条件相同时，发现两种方法之间NK纯度和功能性标志物表达谱是可比较的。
如通过4小时体外K562细胞毒性测定所确定的，发现当饲养细胞条件相同时，培养的NK细胞的功能性在两种方法之间是可比较的。饲养细胞激活的NK细胞在体外杀死K562细胞中是非常有效的，其对于两阶段和三阶段法分别具有93.2%和93.6%的平均特异性溶胞。
总之，发现当使用相同的饲养细胞条件时，两阶段和三级法对于NK细胞获得了可比较的生长、表型（纯度和激活标志物）和体外功能性。与三阶段法相比，两阶段法提供了简单方便的NK细胞培养。
7.9.实施例9：使用多种基础培养基的NK细胞培养的比较
本研究旨在评价使用不同基础培养基的CD34+来源的NK细胞的分化和扩增。
表11中总结了实验条件。如实施例11所述培养细胞。所有实验均在多孔碟/T-三角瓶规模下组织并维持在37℃、90%湿度和5%CO2培育箱中。在整个过程中监测细胞生长（细胞计数）并且每周更换两次培养基以将细胞浓度维持在5×104-1×106个/mL的范围内。
通过第21天和35天的表型分析监控分化。在第21天，使培养3天的新鲜K562和融化后的allo-PBMC失活并以1×106个/mL加入到生长的NK细胞培养中。将NK细胞归一化至0.5×l06个/mL。在第35天，在进行了最终细胞计数后，使用新鲜培养和PKH标记的K562细胞（10:1的E:T比，4小时，37℃）进行基于流式细胞术的细胞毒性测定以评价NK功能性。
表8.用于多种基础培养基评价的实验条件的总结
Figure BDA00002911163500771
生长得率
在第35天，Stemspan H3000和OpTmizer对GBGM显示出相当的生长得率（TNC扩增倍数）。Cellgro、X-VIVO15、AIM-V、X-VIVO10、DMEM:F12、DMEM:F12w/5mM OAC显示出比GBGM低的生长得率。
表型分析
在第35天（终点），GBGM获得了约80%纯度的CD56+CD3-细胞。OpTmizer和Stemspan H3000获得了约50%纯度的CD56+CD3-细胞。DMEM:F12产生了约35%纯度的CD56+CD3-细胞。AIM-V、X-VIVO10、X-VIVO15和Cellgro培养基产生了约<30%纯度的CD56+CD3-细胞。发现在培养期间向DMEM:F12基础培养基中加入OAC会大大提高终点NK纯度；在培养的第35天，CD56+CD3-的百分比从35%提高到72%。
细胞毒性/功能性
发现在培养期间向DMEM:F12基础培养基中加入5mM的OAC会大大提高NK细胞的激活状态和体外功能性。OAC的加入还显著提高了NK激活标志物NKp46、NKG2D、DNAM-1和CD94的水平。第35天的NK细胞的体外功能性（K562细胞毒性）同样从21.4%显著提高至97.1%。
整体来说，由于5mM OAC的加入，NK细胞性能得到显著提高。
7.10.实施例10：NK细胞的储存和冷冻保存
本实施例表明了储存和冷冻保存NK细胞的方法。使用以上实施例中所述的规程，将分离自人胎盘灌洗液（HPP）和脐带血细胞的CD34+造血干细胞扩增并分化为NK细胞。在从HPP和脐带血分离（第0天）后马上或者在NK细胞的第一生长期（分离后第9天、第14天、第21天或第35天）将细胞冷冻保存。
在以下冷冻保存制剂中冷冻保存细胞：制剂1-葡聚糖冷冻保存培养基：5% DMSO（Sigma Aldrich, D2650）、55%葡聚糖（10% w/v在生理盐水中的溶液）（10% LMD在0.9%氯化钠注射液中的溶液，Hospira）、40% HAS（Octapharma）；制剂2-海藻糖冷冻保存培养基：5% DMSO、55%海藻糖（10% w/v在生理盐水中的溶液）、40% HAS；制剂
Figure BDA00002911163500781
CS2（BioLifeSolutions）；制剂
Figure BDA00002911163500782
CS5（BioLife Solutions）；制剂CS10（BioLife Solutions）；制剂6-不含血清的冷冻培养基（Sigma-Aldrich，目录号：6295）；制剂7-甘油冷冻培养基（Sigma-Aldrich，目录号：C6039）；或制剂8-DMSO和不含血清的冷冻培养基（Sigma-Aldrich，目录号：2639）。
将在不同时间点收集的细胞用培养基或盐溶液清洗几次。然后，将细胞离心以获得细胞颗粒。除去上清液，用冷冻保存培养基将所述细胞颗粒悬浮为约1×106-1.5×107或更多个细胞/毫升。将细胞悬液等份至1ml或2mL隔膜小瓶并在2-8℃培育约10分钟。随后，在以0.5℃/min的控制速率冷冻机（Thermo）中冷冻细胞。将冷冻小瓶转移至低温冷冻机中以用于在液氮蒸汽中储存。可以将冷冻保存的NK细胞在使样品轻轻旋转的37℃水浴中快速融化直至所有可见冰融化。可以用预热的培养基稀释细胞样品。
7.11.实施例11：NK细胞的储存和了冷冻保存
本实施例表明了储存和冷冻保存NK细胞的另一种方法。使用如上所述的规程，将分离自人胎盘灌洗液（HPP）和脐带血细胞的CD34+造血干细胞扩增并分化为NK细胞。在从HPP和脐带血分离（第0天）后马上或者在NK细胞的第一生长期（分离后第9天、第14天、第21天或第35天）将细胞冷冻保存。
通过将葡聚糖-40和HSA以60%葡聚糖-40和40% HSA（来自25%溶液，v/v）的比例混合来制备细胞悬液溶液。
用50%葡聚糖-40（v/v）、40% HSA（25%溶液，v/v）、10% DMSO（v/v）制备2×冷冻溶液。首先，将DMSO缓慢加入到葡聚糖-40中并混合良好。随后，将25%的HSA溶液缓慢加入到所述溶液中并混合。在使用之前，将所得溶液良好混合并使其恢复至室温。
冷冻保存程序
估计细胞数目并将其作为细胞悬液归一化至在细胞悬浮溶液中的15×l06个。确定细胞悬液的体积并将等体积的新鲜制备的2×冷冻溶液缓慢加入并混合。记录冷冻溶液中最终细胞悬液的体积并分配至多个小瓶。对保留的培养上清液进行MycoAlert测试以检测支原体污染。对一个保留小瓶进行融化后测试仪确定融化后存活力、细胞回收和细胞鉴定。
7.12.实施例12：冷冻保存/融化的NK细胞的分析
存活力测定。将在如实施例10或11中的多种制剂中冷冻保存的NK细胞融化。以2×106-3×107个细胞/mL的密度冷冻细胞。与新鲜细胞或预冷冻细胞相比，使用
Figure BDA00002911163500791
自动细胞计数器（Invitrogen）在融化后的第0天、第3天和第18天对融化的NK细胞评价细胞存活力。简要地，将10μl细胞样品与10μl台盼蓝混合。将细胞混合物吸移到
Figure BDA00002911163500792
室载玻片中。将该载玻片插入到仪器中并对细胞计数。基于不同的冷冻保存制剂，冻融后的细胞显示出约80%至>90%存活力的细胞存活力。
细胞凋亡测定。在融化后的第0天、第3天和第18天，还使用BDAnnV/PI细胞凋亡测定试剂盒对融化的NK细胞评价了细胞凋亡。简要地，用1×冷PBS将细胞清洗两次并在1×结合缓冲液（BD膜联蛋白V/PI细胞凋亡试剂盒，部件号：556547，结合缓冲液组合物，部件号：51-66121E，0.1M Hepes/NaOH（pH7.4）、1.4M NaCl、25mM CaCl2）中再悬浮。对于1×稀释液，将1部分10×缓冲液加入到9部分蒸馏水中。将100μL含有约100000个细胞的细胞悬液转移至FACS管中。将100μL1×结合缓冲液，5μL AnnV-FITC和5μL PI-PE加入到所述管中。然后，轻轻地将所述管涡旋并在黑暗中培育15分钟。随后，加入400μL1×结合缓冲液。在1小时内分析样品。用于建立象限与门的对照是未染色的细胞，仅用AnnV-FITC而不用PI染色的细胞，仅用PI而不用AnnV染色的细胞。将凋亡细胞定量为作为尺寸散点图（FSC vs SSC）上“细胞”的门的事件群体的%。基于不同的冷冻保存制剂，冻融后的细胞显示了约5-25%的死/晚期凋亡细胞和10-25%的早期凋亡细胞。整体来说，制剂1（5% DMSO、55%葡聚糖（10%w/v，在生理盐水中的溶液）、40% HAS）、制剂2（5% DMSO、55%海藻糖（10% w/v，在生理盐水中的溶液）、40% HSA）、制剂CS5（BioLife Solutions）和制剂5（
Figure BDA00002911163500794
CS10（BioLife Solutions））显示出较高的细胞存活力和较少的凋亡细胞。
7.13.实施例13：处理中的冷冻保存细胞库的评价
本实施例表明了处理中的冷冻保存细胞库的评价。使用如Spanholtz等人,PLoS One.5(2):e9221(2010)中所述的方法，使用HS-AB或FBS作为血清源用UCB CD34+细胞起始细胞培养。确定并调节细胞浓度，并且根据需要补充培养基。在第7、9、10或14天，从细胞培养物中除去约106-3×106个细胞，将其离心并在冷冻保存培养基（5.5%v/v葡聚糖-40、10%v/v HSA、5%v/v DMSO）中再悬浮。在控制速率的冷冻机中冷冻细胞并将其转移至液氮中用于冷冻保存。将每瓶约1mL细胞在106-107个/mL的浓度范围冷冻保存。将剩余的培养物继续至终点（第35天），其称为“新鲜（无处理中的冷冻保存）”。在细胞培养的第21、28和35天进行表型分析。在培养的第35天（终点）评价体外功能性（K562细胞毒性，10:1的E:T）。
如下评价了处理中冷冻保存的培养样品的融化后性能（第9和14天）。在37℃水浴中快速融化细胞库小瓶。然后，用RPMI-FBS培养基稀释细胞，离心，再悬浮并在培养基中接种。然后，将每个培养条件继续至从培养过程开始算起的第35天。以与它们的“新鲜”对应物相同的方式进行分析（细胞计数、存活力、表型分析、功能性评价）。
结果
在第9、10和14天，不考虑处理中的时间点或细胞浓度，处理中冷冻保存的样品均获得了优良的融化后存活力（96.2%-97.3%的台盼蓝阴性，86.1%-93.2%的膜联蛋白-V阴性/TO-PRO-3阴性）。处理中的库对培养终点（第35天）的得率损失不具有负面影响。使用HS-AB或者HS-AB作为血清源，在融化后第9天或第14天和“新鲜”条件之间，最终细胞得率是可比较的。
发现分别在“新鲜”和“融化后”培养之间，成熟NK细胞在第21/28/35天时间点的表型谱是相当可比较的。发现表型纯度（CD56+CD3-）也是可比较的。由于不同批次之间的差异度，某些NK功能性标志物（CD94、NKG2D）的表达稍有不同。
在K562细胞毒性测定中，发现融化后第9/14天培养的NK细胞获得了与非处理中冷冻保存的培养的NK细胞相比低约0-20%的特异性K562溶胞读数。然而，考虑到与NK细胞毒性功能（DNAM1、NKp46、NKG2D等）相关的表面标志物的表达水平不是同时降低的，因此需要用另外的供体和测定重复确认趋势。整体来说，在培养第9/14天时的处理中的冷冻保存对处理结果具有最小的影响。
7.14.实施例14：用于NK细胞剂量施用的融化后的培养基的开发
本实施例表明了在动物中用于NK细胞剂量施用的融化后的培养基的开发。测试了注射媒介和细胞密度对NK细胞存活力、细胞毒性、细胞回收和块形成的影响。通过台盼蓝染色评价存活力；通过FACS（10:1的NK:K562比值）评价细胞毒性，并且通过显微测定评价块形成。在表9-12中显示了多种类型的注射媒介和细胞密度的结果。
表9.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
表10.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
Figure BDA00002911163500812
表11.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
表12.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
结果显示Plasmalyte+1%HSA注射媒介维持的NK细胞具有比PBS+1%FBS注射媒介更好的存活力和细胞毒性。将细胞在注射媒介中悬浮后，细胞毒性还随时间降低。当细胞在Plasmalyte+1%HSA中悬浮时，未观察到细胞密度对存活力和细胞毒性的影响。1小时后，NK细胞还在PBS+1%FBS或Plasmalyte+1%HSA培养基中沉降；然而，细胞看起来不聚集。最后，在冻融法中未观察到细胞回收和存活力的明显损失。
7.15.实施例16：用于NK细胞剂量施用的融化后的培养基的开发
还测试了多种HSA浓度对NK细胞存活力、细胞毒性、细胞回收和块形成的影响。使用了来自实施例19的相同方法。表14-16中显示了多种类型的注射媒介和细胞密度的结果。
表13.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
Figure BDA00002911163500821
表14.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
表15.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
Figure BDA00002911163500823
表16.所测试的特定条件的细胞回收、存活力、细胞毒性和块形成
Figure BDA00002911163500831
结果显示在所测试的全部三种注射媒介中存活力在融化后4小时内维持良好。另外，在所有三种注射媒介中细胞毒性随时间降低。然而，在较高浓度的HSA中，降低水平较小，而Plasmalyte+5%HSA维持最高的细胞毒性。还观察到在所有三种注射媒介中NK细胞不聚集。整体来说，Plasmalyte似乎是比PBS更好的注射媒介候选。
7.16.实施例17：无IL-2的NK细胞培养
本实施例显示了在不存在IL-2的情况下NK细胞的培养。通过实施例11中所述的两阶段法实施细胞培养。在第一培养基中测试了五种不同的IL-2浓度：0、200、500、1000、2000U/mL。
结果表明培养中生长的NK细胞在生长过程中似乎不对IL-2响应。NK细胞的纯度似乎不取决于IL-2：在不存在IL-2的情况下，NK细胞分化为CD56+CD3-表型。IL-7、IL-15和SCF的组合似乎对体外NK细胞发育是足够的。
等同性：
本发明未受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除所述那些以外，通过上述说明和附图本发明的多种改变将对本领域技术人员是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
本文所引用的所有参考文献以它们的全部内容并且以达到似乎每个出版物、专利或专利申请均具体并单独指明出于所有目的以其全部内容作为参考并入本文的相同程度出于所有目的作为参考并入本文。任何出版物的引用是对于其在提交之日之前的公开，并且不应视为对由于在先发明而不授权本发明从而使该出版物在先的许可。

Claims (25)

1.一种产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的方法，包括：
（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和
（b）将来自步骤（a）的所述细胞在包含干扰白细胞素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
2.一种产生激活的自然杀伤（NK）细胞群体的两步法，其中，所述方法的第一步包括在包含干细胞因子（SCF）、白细胞介素-7（IL-7）和白细胞介素-15（IL-15）中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和
其中所述方法的第二步包括在包含干扰白细胞素-2（IL-2）的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞，以产生激活的NK细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一培养基还包含Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3-L）、促血小板生成素（Tpo）、白细胞介素-2（IL-2）或肝素中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一培养基还包含胎牛血清或人血清。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述SCF在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述Flt3-L在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-2在所述第一培养基中以约50至约1500IU/mL的浓度存在。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-7在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-15在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述Tpo在所述第一培养基中以约1至约150ng/mL的浓度存在。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述肝素在所述第一培养基中以约0.1至约30U/mL的浓度存在。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述第二步中所述IL-2在所述第二培养基中以50至约1500IU/mL的浓度存在。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二培养基另外包含胎牛血清（FCS）、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白（BSA）和植物凝集素中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述造血干细胞或祖细胞是CD34+。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述造血干细胞或祖细胞包括来自人胎盘灌洗液的造血干细胞或祖细胞和来自脐带的造血干细胞或祖细胞，其中所述胎盘灌洗液和所述脐带血来自于相同胎盘。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（b）中的所述饲养细胞包括丝裂霉素C处理的外周血单核细胞（PBMC）、K562细胞或组织培养贴壁干细胞。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述NK细胞是CD3-CD56+CD16-。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD94+CD117+。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD161-。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是NKG2D+。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是NKp46+。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD226+。
23.通过以下方法获得的激活的NK细胞群体，所述方法包括：
（a）将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15（IL-15）并可选地包含干细胞因子（SCF）和白细胞介素-7（IL-7）中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和
（b）将来自步骤（a）的所述细胞在包含干扰白细胞素-2（IL-2）的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
24.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述肿瘤细胞与多个CD94+CD117+NK细胞接触，其中所述NK细胞已通过根据权利要求1所述的方法产生。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性脊髓淋巴瘤（CML）细胞、急性髓性白血病细胞、慢性粒细胞性白血病（CML）细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞、前列腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
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