MX2013000395A - Metodos de generar celulas asesinas naturales. - Google Patents

Metodos de generar celulas asesinas naturales.

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Xiaokui Zhang
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Lin Kang
Stephen Jasko
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Abstract

En la presente se proveen métodos de producir células asesinas naturales usando un método de expansión y diferenciación de dos pasos. En la presente también se proveen métodos de suprimir la proliferación celular de tumor, de tratar individuos que tienen cáncer o una infección viral, que comprenden administrar las células NK producidas por el método a un individuo que tiene cáncer o infección viral.

Description

MÉTODOS DE GENERAR CÉLULAS ASESINAS NATURALES 1. SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 61/363,981, presentada el 13 de julio de 2010 y solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 61/497,897, presentada el 16 de junio de 2011, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en su totalidad. 2. CAMPO DE LA INVENCIÓN En la presente se proveen métodos de producir una población de células asesinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales derivadas de placenta, por ejemplo, de perfundido de placenta (por ejemplo, perfundido de placenta humana) tales como células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta, u otros tejidos, por ejemplo, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. En la presente también se proveen poblaciones de células asesinas naturales expandidas producidas por los métodos presentados en la presente. Además en la presente se proveen métodos de usar el perfundido de placenta, y las células asesinas naturales del mismo, para suprimir la proliferación de células tumorales. En ciertas modalidades, las células asesinas naturales se usan en combinación con, o tratar con, uno o más compuestos ¡nmunomoduladores, por ejemplo, compuestos ¡nmunomoduladores referidos como IMiDs™. 3. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que constituyen un componente principal del sistema inmune innato. Las células NK no expresan receptores de antígeno de célula T (TCR), CD3 o receptor de célula B de inmunoglobulinas de superficie (Ig). Las células NK por lo general expresan los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 en humanos, pero una subclase de células NK humanas es CD16. Las células NK son citotóxicas; gránulos pequeños en su citoplasma contienen proteínas especiales tales como perforina y proteasas conocidas como granzimas. Al liberar en proximidad cercana a una célula dirigida para asesinar, perforina forma poros en la membrana celular de la célula diana a través de la cual las granzimas y moléculas asociadas pueden entrar, induciendo apoptosis. Una granzima, granzima B (también conocida como granzima 2 y serina esterasa 1 asociada con linfocito T citotóxico), es una serina proteasa crucial para inducción rápida de apoptosis de célula diana en la respuesta inmune mediada por célula.
Las células NK se activan en respuesta a interferones o citocinas derivadas de macrófago. Las células NK activadas son referidas como células asesinas activadas con linfocina (LAK). Las células NK poseen dos tipos de receptores de superficie, marcados "receptores activadores" y "receptores inhibidores" que controlan la actividad citotóxica de las células.
Entre otras actividades, las células NK juegan un papel en el rechazo de huésped de tumores. Ya que las células cancerosas tienen expresión reducida o ninguna de MHC clase I, se convierten en objetivo de células NK. Los datos clínicos acumulantes sugieren que el trasplante haploidentico de células NK humanas aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o efectos antileucemia potentes mediados de médula ósea sin injerto detectable que incurre contra enfermedad huésped (GVHD). Ver uggeri y otros, Science 295:2097-2100 (2002). Las células asesinas naturales pueden hacerse activadas por células carentes de, o exhibiendo niveles reducidos de, proteínas de complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Adicíonalmente, los receptores activadores expresados en células NK son conocidos por mediar la detección de células "estresadas" o transformadas con ligandos expresos a receptores activadores y por tanto provocan la activación de célula NK. Por ejemplo, NCR1 (NKp46) une hemaglutininas virales. Los ligandos de NKG2D incluyen proteína 1 de unión CMV UL16 (ULB1), ULB2, ULB3 y secuencia A relacionada con polipéptido MHC clase I (MICA) y proteínas MICB. La proteina NK 2B4 une CD48, y DNAM- une receptor de poliovirus (PVR) y Nectina-2, ambos están consistentemente conectados en leucemia mieloide aguda (AML). Ver Penda y otros, Blood 105:2066-2073 (2004). Además, se ha descrito la lisis de AML principalmente como receptor de citotoxicidad natural (NCR) dependiente. Ver Fauriat y otros, Blood 109:323-330 (2007). Las células NK activadas y expandidas y células LAK de sangre periférica se han usado en terapia ex vivo y tratamiento in vivo de pacientes que tienen cáncer avanzado, con algo de éxito contra enfermedades relacionadas con médula ósea, tales como leucemia; cáncer de mama; y ciertos tipos de linfoma. El tratamiento de célula LAK requiere que el paciente primero reciba IL-2, seguido por leucoferesis y después una incubación ex vivo y cultivo de los linfocitos autólogos cosechados en presencia de IL-2 durante algunos días. Las células LAK se deben para completar la terapia. Este tratamiento de purgación es costoso y puede causar efectos laterales serios. Estos incluyen retención de fluido, edema pulmonar, caída en presión sanguínea, y fiebre alta.
A pesar de las propiedades ventajosas de células NK en células tumorales asesinas y células infectadas con virus, siguen siendo difíciles de trabajar con y aplicar en inmunoterapia, primariamente debido a la dificultad de mantener sus capacidades dirigidas a tumor y tumoricidas durante el cultivo y expresión. De esta manera, se necesita en la técnica desarrollar un método eficiente para producir y expandir células asesinas naturales que retienen funciones tumoricidas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se proveen métodos de expandir y diferenciar células, por ejemplo, células hematopoyéticas, tales como células madre hematopoyéticas, por ejemplo, células madre hematopoyéticas CD34 + , a células asesinas naturales. En un aspecto, en la presente se provee un método de producir células asesinas naturales (NK) comprendiendo cultivar células madre hematopoyéticas o células progenitoras, por ejemplo, células madre o células progenitoras CD34 + , en un primer medio para producir células expandidas y diferenciadas, y posteriormente cultivar dichas células expandidas en un segundo medio en donde dichas células se expanden más y diferencian en células asesinas naturales. Los primeros y segundos pasos comprenden cultivar las células en medio con una única combinación de factores celulares. En ciertas modalidades, dichos factores celulares (por ejemplo, citocinas) no están comprendidos dentro de un componente no definido del medio (por ejemplo, suero), por ejemplo, los factores celulares (por ejemplo, citocinas) son exógenos al componente no definido del medio (por ejemplo, suero). En ciertas modalidades, dicho método es un método de dos pasos. En ciertas modalidades, dicho método no comprende ningún tercer paso o intermedio en donde se contactan las células. En una modalidad específica, en la presente se provee un método de producir una población de células asesinas naturales (NK) activadas, comprendiendo: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicho IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del primer paso en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas. Las células asesinas naturales producidas por los métodos provistos en la presente (por ejemplo, método de dos pasos) son referidos en la presente como células TSNK.
En ciertas modalidades, dicho primer medio comprende medio que comprende uno o más de suero humano (por ejemplo, suero humano AB), suero bovino fetal (FBS) o suero de becerro fetal (FCS), por ejemplo, 5% a 20% v/v, factor de célula madre (SCF), por ejemplo, 1 ng/mL a 50 ng/mL, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo FMS (ligando Flt-3), por ejemplo, 1 ng/ml a 20 ng/mL; interleucina-7 (IL-7), por ejemplo, 1 ng/mL a 50 ng/mL; trombopoyetina (TPO), por ejemplo, 1 ng/mL a 50 ng/mL; interleucina-2 (IL-2), por ejemplo, 50 lU/mL a 500 lU/mL; interleucina-15 (IL-5), por ejemplo, 1 ng/mL a 50 ng/mL; y/o heparina, por ejemplo, 0.1 lU/mL a 10 lU/mL. En una modalidad específica, dicho primer medio comprende factor de célula madre (SCF), ¡nterleucina-7 ( I L- 7 ) e interleucina-15 (IL-15). En otra modalidad específica, dicho primer medio comprende medio de crecimiento, suero humano (por ejemplo, suero humano AB), FBS FCS, SCF, IL-7 e IL-15. En otra modalidad específica, dicho primer medio comprende además ligando Flt-3 (Flt3-L), IL-2 y/o heparina. En otra modalidad específica, dicho primer medio comprende medio de crecimiento, 10% suero humano o suero bovino fetal, 20 ng/mL SCF, 10 ng/ml Flt3-L, 20 ng/mL IL-7, 20 ng/mL TPO, 200 lU/mL IL-2, 10 ng/mL IL-15, y 1.5 lU/mL heparina. En otra modalidad específica, dicho primer medio no comprende IL-2. En otra modalidad específica, dicho cultivo en dicho primer medio comprende cultivo usando células alimentadoras, por ejemplo, células K562, por ejemplo, células K562 tratadas con mitomicina C, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), por ejemplo, PBMCs tratadas con mitomicina C o células madre adherentes de cultivo de tejido, por ejemplo, células madre adherentes de cultivo de tejido tratadas con mitomicina C.
En ciertas modalidades, dicho primer medio es, o comprende GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTIMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, y/o DMEM.F12. En ciertas modalidades, dicho medio comprende O-acetil-carnitina (también referida como acetilcarnitina, O-acetil-L-carnitina u OAC), por ejemplo, aproximadamente 0.5 mM-10 mM. En una modalidad, dicho medio comprende Stemspan® H3000 y/o DMEM:F12 y OAC, por ejemplo, aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mM. En una modalidad específica, dicho medio comprende GBGM®. En otra modalidad específica, dicho medio comprende DMEM.F12 y aproximadamente 5 mM de OAC. En otra modalidad específica, dicho medio comprende Stemspan® H3000 y aproximadamente 5 mM de OAC.
En ciertas modalidades, dicho segundo medio comprende medio de crecimiento celular que comprende uno o más de: suero humano (por ejemplo, suero humano AB), suero bovino fetal (FBS) o suero de becerro fetal (FCS), por ejemplo, 5 % - 15 % FCS v/v; IL-2, por ejemplo, 10IU/mL a 1000 lU/mL; transferina, por ejemplo, 10 µ?/?t??. a 50 µg mL; insulina, por ejemplo, 5 µg/mL a 20 µg mL; etanolamina, por ejemplo, 5 x 10"4 a 5 x 10"5 M; ácido oleico, por ejemplo, 0.1 µg/mL a 5 µg/mL; ácido linoleico, por ejemplo, 0.1 µg/mL a 5 µg/mL; ácido palmítico, por ejemplo, 0.005 µg/ml_ a 2 µg/mL; albúmina de suero bovino (BSA), por ejemplo, 1 µ?/???. a 5 µg/mL; y/o fitohemaglutinina, por ejemplo, 0.01 µglmL· a 1 µg/mL. En una modalidad específica, dicho segundo medio comprende IL-2. En una modalidad más específica, dicho segundo medio comprende medio de crecimiento celular que comprende suero humano, FBS o FCS, por ejemplo, 10% v/v, IL-2, transferina, insulina, etanolamina, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, albúmina de suero bovino (BSA) y/o fitohemaglutinina. En una modalidad más específica, dicho segundo medio comprende medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 10% suero humano, FBS o FCS, 400 IU IL-2, 35 µg/mL insulina, 2 x 10"5 M etanolamina, 1 µg/mL ácido oleico, 1 µg/mL ácido linoleico, 0.2 µ?/Gp? ácido palmítico, 2.5 µglmL· BSA y 0.1 ng/mL fitohemaglutinina. En otra modalidad específica, dicho cultivo en dicho segundo medio comprende cultivar usando células alimentadoras, por ejemplo, células K562 (por ejemplo, células K562 tratadas con mitomicina C) o PBMCs (por ejemplo, PBMC tratada con mitomicina C), por ejemplo, al momento que las células son iniciadas en dicho segundo medio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días después. En ciertas modalidades, dicho medio comprende GBGM®, AIM-V®, X-VIVO™ 10, X-VIVO™ 15, OPTMIZER, STEMSPAN® H3000, CELLGRO COMPLETE™, y/o DMEM:F12. En ciertas modalidades, dicho medio comprende uno o más de O-acetil-carnitina (también referida como acetilcanitina, O-acetil-L-carnitína u OAC), o un compuesto que afecta ciclización de acetil-CoA en mitodronia, tiazovivina, Y-27632, " py i nteg ri n" , inhibidores de Rho quinasa (ROCK), inhibidores de caspasa u otros compuestos/péptidos anti-apoptóticos, NOVA-RS (Sheffield Bio-Science) u otros potenciadores de crecimiento de molécula pequeña. En ciertas modalidades, dicho medio comprende nicotinamida. En ciertas modalidades, dicho medio comprende de alrededor de 0.5 mM-10 mM OAC. En una modalidad, dicho medio comprende Stemspan® H3000, y/o DMEM: F12 y OAC, por ejemplo, aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mM. En una modalidad específica, dicho medio comprende GBGM®. En otra modalidad específica, dicho medio comprende DMEM:F12 y aproximadamente 5 mM de OAC. En otra modalidad específica, dicho medio comprende Stemspan® H3000 y aproximadamente 5 mM de OAC.
En otra modalidad específica, en la presente se provee un método de producir una población de células asesinas naturales (NK) activadas, que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más factores de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y opcionalmente SCF e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente indefinido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas.
En otra modalidad específica, en la presente se provee un método de dos pasos de producir una población de células (NK) asesinas naturales, en donde un primer paso de dicho método comprende expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de SCF, IL-7 e IL-15, y en donde dicho SCF, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio (por ejemplo, suero), y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y en donde un segundo paso de dicho método comprende expandir las células a partir del primer paso en un segundo medio que comprende IL-2, para producir células NK activadas. En otra modalidad específica, dicho primer medio comprende además uno o más de ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FU3-L), trombopoyetina (Tpo), interleucina-2 (IL-2), y/o heparina. En otra modalidad específica, dicho primer medio comprende además aproximadamente 5%-20% de suero bovino fetal o suero humano. En otra modalidad específica, el SCF está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 50 ng/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, el F 113 - L está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, la IL-2 está presente a una concentración de alrededor de 50 a aproximadamente 1500 lU/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, la IL-7 está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, la IL-15 está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, el Tpo está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, la heparina está presente a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 30 U/mL en el primer medio. En otra modalidad específica, la IL-2 en el segundo paso está presente a una concentración de alrededor de 50 a aproximadamente 1500 lU/mL en el segundo medio. En otra modalidad específica, dicho segundo medio adicionalmente comprende uno o más de suero de becerro fetal (FCS), transferina, insulina, etanolamina, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, albúmina de suero bovino (BSA) y fitohemaglutinina.
En ciertas modalidades específicas, dichas células madre o progenitoras hematopoyéticas son cultivadas en dicho primer medio durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días antes de dicho cultivo en dicho segundo medio. En ciertas otras modalidades específicas, dichas células son cultivadas en dicho segundo medio durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días. En una modalidad más específica, dichas células madre o progenitoras hematopoyéticas son cultivadas en dicho primer medio durante 21 días, y después cultivadas en dicho segundo medio durante 21 días.
Además en la presente se provee una población de células asesinas naturales producidas por el método de dos pasos descrito antes, referido en la presente como células TSNK. En una modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son CD3" CD56 + . En una modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son CD3"CD56 + CD 16". En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente CD94 + CD117 + . En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente CD161". En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente NKG2D + . En otra modalidad específica, dichas células NK son adicionalmente NKp464. En otra modalidad específica, dichas células NK son adicionalmente CD226 + .
En ciertas modalidades, más de 90%, 92%, 94%, 96% o 98% de dichas células TSNK son CD56+ y CD16". En algunas modalidades, por lo menos 80%, 82%, 84%, 86%, 88% o 90% de dichas células TSNK son CD3" y CD56 + . En otras modalidades, más de 90%, 92%, 94%, 96% o 98% de dichas células TSNK son CD56 + , CD16 y CD3\ En otras modalidades, por lo menos 50%, 52%, 54%, 56%, 58% o 60% de dichas células TSNK son NKG2D + . En otras modalidades, menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% o 3% de dichas células TSNK son NKB1 + . En ciertas otras modalidades, menos de 10%, 8%, 6%, 4% o 2% de dichas células TSNK son CD56+ y CD16+. En más modalidades específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65% o 70% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son NKp46 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o 85% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD117 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD94+. En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD161". En otras modalidades más especificas, por lo menos 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% de dichas células TSNK CD3", CD56* son CD226 + . En más modalidades específicas, por lo menos 20%, 25%,.30%, 35% o 40% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD7 + . En más modalidades específicas, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% de dichas TSNK CD3", CD56 + son CD5 + .
En otro aspecto, en la presente se provee el uso de células TSNK para suprimir proliferación de célula tumoral, tratar infección viral o tratar cáncer, por ejemplo, cánceres de sangre y tumores sólidos. En ciertas modalidades, las células TSNK hacen contacto con, o se usan en combinación con, un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1 más adelante, o talidomida.
En una modalidad específica, dicho cáncer es un tumor sólido. En otra modalidad, dicho cáncer es un cáncer de sangre. En modalidades específicas, el cáncer es glioblastoma, carcinoma ductal primario, leucemia, leucemia de célula T aguda, linfoma mieloide crónico (CML), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon, linfoma histíocítico, carcinoma colorectal, adenocarcinoma colorectal, cáncer de próstata, mieloma múltiple o retinoblastoma.
En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas, de las cuales las células TSNK son producidas, son obtenidas de perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas, de las cuales las células TSNK son producidas, son células combinadas de perfundido de placenta y sangre de cordón, por ejemplo, sangre de cordón de la misma placenta como el perfundido. En otra modalidad específica, dicha sangre de cordón umbilical se aisla de una placenta diferente de la placenta de la cual se obtiene dicho perfundido de placenta. En ciertas modalidades, las células combinadas se pueden obtener al agrupar o combinar la sangre de cordón y perfundido de placenta. En ciertas modalidades, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares por volumen para obtener las células combinadas. En una modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1 a 1:10, de 5:1 a 1:5, o de 3:1 a 1:3. En otras modalidades específicas, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 o 1:10. En una modalidad más específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 8.5:1.5 (85%: 15%).
En ciertas modalidades, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20. 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares por contenido de células nucleadas totales (TNC) para obtener las células combinadas. En una modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1 a 10:1, de 5:1 a 1:5, o de 3:1 a 1:3. En otra modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 o 1:10.
En una modalidad, por tanto, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene cáncer o una infección viral, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de células TSNK aisladas.
En una modalidad específica, las células TSNK aisladas han sido tratadas con un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1 más adelante, o talidomida, antes de dicha administración. En otra modalidad específica, el método comprende administrar al individuo (1) una cantidad efectiva de células TSNK aisladas; y (2) una cantidad efectiva de un compuesto inmunomodulador o talidomida. Una "cantidad efectiva" en este contexto significa una cantidad de células TSNK, y opcionalmente compuesto inmunomodulador o talidomida, que resulta en una mejora detectable en uno o más síntomas de dicho cáncer o dicha infección, en comparación con un individuo que tiene dicho cáncer o dicha infección que no ha sido administrado dichas células TSNK y, opcionalmente, un compuesto inmunomodulador o talidomida. En una modalidad específica, dicho compuesto inmunomodulador es lenalidomida o pomalidomida. En otra modalidad, el método comprende adicionalmente administrar un compuesto anti-cáncer al individuo, por ejemplo, uno o más de los compuestos anti-cáncer descritos en la sección 6.8.3, más adelante.
En otra modalidad, en la presente se provee un método de suprimir la proliferación de células tumorales que comprende contactar las células tumorales con una cantidad terapéuticamente efectiva de células TSNK.
En una modalidad específica, las células TSNK aisladas han sido tratadas con un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1 más adelante, o talidomida, antes de dicho contacto. En otra modalidad específica, las células tumorales adicionalmente son contactadas con una cantidad efectiva de un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1 más adelante, o talidomida. Una "cantidad efectiva" en este contexto significa una cantidad de células TSNK, y opcionalmente un compuesto inmunomodulador o talidomida, que resulta en una supresión detectable de dichas células tumorales comparada con un número equivalente de células tumorales no contactadas con dichas células TSNK, y opcionalmente un compuesto inmunomodulador o talidomida. En otra modalidad específica, el método comprende además contactar las células tumorales con una cantidad efectiva de un compuesto anti-cáncer, por ejemplo, un compuesto anti-cáncer descrito en la sección 6.8.3 más adelante.
En una modalidad específica de este método, las células tumorales son linfocitos de cáncer. En otra modalidad específica, las células tumorales son células tumorales sólidas. En otra modalidad, las células tumorales son células de carcinoma ductal primario, células de leucemia, células de leucemia de célula T aguda, células de linfoma mieloide crónico (CML), células de leucemia mielógena aguda, células de leucemia mielógena crónica (CML), células de glioblastoma, células de carcinoma de pulmón, células de adenocarcinoma de colon, células de linfoma histioc ítico , células de mieloma múltiple, célula de retinoblastoma, células de carcinoma colorectal, células de cáncer de próstata, o células de adenocarcinoma colorectal. En otra modalidad específica, dicho contacto ocurre in vitro. En otra modalidad específica, dicho contacto ocurre in vivo. En una modalidad más específica, dicho contacto in vivo ocurre en un humano.
En otro aspecto, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo (1) lenalidomida; (2) melfalan; y (3) células NK expandidas, en donde dichas células NK son efectivas para tratar mieloma múltiple en dicho individuo. En una modalidad específica, dichas células NK son células NK de sangre de cordón, o células NK producidas de células hematopoyéticas de sangre de cordón, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. En otra modalidad, dichas células NK han sido producidas por cualquiera de los métodos descritos en la presente para producir células NK, por ejemplo, para producir células TSNK. En otra modalidad, dichas células NK han sido expandidas antes de dicha administración. En otra modalidad, dicha lenalidomida, melfalan, y/o células NK se administran por separado entre sí. En ciertas modalidades específicas del método de tratar un individuo con mieloma múltiple, dichas células NK son producidas por un método de dos pasos de producir una población de células asesinas naturales (NK) activadas, en donde un primer paso de dicho método comprende expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), ¡nterleucina-7 ( I L- 7 ) e interleucina-15 (IL-15), y en donde dicho SCF, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y en donde un segundo paso de dicho método comprende expandir las células a partir del primer paso en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir células NK activadas.
En otras modalidades específicas del método de tratar un individuo con mieloma múltiple, dichas células NK son producidas por un método que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitores hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicho IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población expande, y una pluralidad de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas.
En otro aspecto, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene leucemia linfocítica crónica (CLL), que comprende administrar al individuo una dosis terapéuticamente efectiva de (1) lenalidomida; (2) melfalan; (3) fludarabina; y (4) células NK expandidas, por ejemplo, células TSNK, en donde dichas células NK son efectivas para tratar dicha CLL en dicho individuo. En una modalidad específica, dichas células NK son células NK de sangre de cordón, o células NK producidas de células hematopoyéticas de sangre de cordón, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. En otra modalidad, dichas células NK se han producido por cualquiera de los métodos descritos en la presente para producir células NK, por ejemplo, para producir células TSNK. En una modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, dichas células NK se han expandido por al menos 10 días antes de dicha administración. En una modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, dicha lenalidomida, melfalan, fludarabina y células NK expandidas se administran a dicho individuo por separado. En ciertas modalidades específicas del método de tratar un individuo con CLL, dichas células NK son producidas por un método de dos pasos de producir una población de células asesinas naturales (NK) activadas, en donde un primer paso de dicho método comprende expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), interleucina-7 (IL-7) e ¡nterleucina-15 (IL-15), y en donde dicho SCF, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y en donde un segundo paso de dicho método comprende expandir las células el primer paso en un segundo medio que comprende interleucina2 (IL-2), para producir células NK activadas.
En otras modalidades específicas del método de tratar un individuo con CLL, dichas células NK son producidas por un método que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas.
En un aspecto, en la presente se provee un método de crioconservar una población de células NK, por ejemplo, células TSNK. En una modalidad, dicho método comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-IL (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas, y (c) crioconservar las células NK del paso (b) en un medio de crioconservación. En una modalidad específica, dicho paso (c) comprende además (1) preparar una solución de suspensión celular; (2) agregar medio de crioconservación a la solución de suspensión celular del paso (1) para obtener suspensión celular crioconservada; (3) enfriar la suspensión celular crioconservada del paso (3) para obtener una muestra crioconservada; y (4) clasificar la muestra crioconservada debajo de -80°C. En ciertas modalidades, el método incluye ningún paso intermediario entre el paso (a) y (b), y entre el paso (b) y (c).
En otra modalidad, dicho método de crioconservar una población de células NK, por ejemplo, células TSNK comprenden: (a) expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), IL-2, interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) y heparina, y en donde dicho SCF, IL-2, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir células NK activadas; y (c) crioconservar las células NK del paso (b) en un medio de crioconservación. En una modalidad específica, dicho paso (c) comprende además (1) preparar una solución de suspensión celular; (2) agregar medio de crioconservación a la solución de suspensión celular del paso (1) para obtener suspensión celular crioconservada; (3) enfriar la suspensión celular crioconservada del paso (3) para obtener una muestra crioconservada; y (4) almacenar la muestra crioconservada debajo de -80°C. En ciertas modalidades, el método incluye ningún paso intermediario entre el paso (a) y (b), y entre el paso (b) y (c), y/o ningún paso de cultivo adicional antes del paso (a).
En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas de las cuales las células TSNK son producidas expreso uno o más de microARNs hsa-m¡R-380, hsa-miR-512, hsa-miR-517, hsa-miR-518c, hsa-miR-519b, y hsa-miR-520a a un nivel detectablemente más alto que las células asesinas naturales de sangre periférica, como se determina, por ejemplo, por PCR en tiempo real cuantitativo (qRT-PCR).
En otra modalidad específica de los métodos anteriores, dichas células TSNK son contactadas con un compuesto inmunomodulador o talidomida en una cantidad y durante un tiempo suficiente para que dichas células asesinas naturales expresen detectablemente más granzima B o perforina que un número equivalente de células asesinas naturales, por ejemplo, células TSNK, no contactadas con dicho compuesto inmunomodulador o talidomida. En otra modalidad específica, dichas células TSNK son contactadas con un compuesto inmunomodulador o talidomida en una cantidad y durante un tiempo suficiente para que dichas células expresen detectablemente más citotoxicídad hacia dichas células tumorales que una cantidad equivalente de células asesinas naturales, por ejemplo, células TSNK, no contactadas con dicho compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida o pomalidomida, o con talidomida. En otra modalidad específica, dichas células TSN expresan uno o más de BAX, CCL5, CCR5, CSF2, FAS, GUSB, IL2RA o TNFRSF18 a un nivel más alto que un número equivalente de células asesinas naturales, por ejemplo, células TSNK, no contactadas con dicho compuesto inmunomodulador o talidomida. En otra modalidad específica, dichas células TSNK expresan uno o más de ACTB, BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CCR5, CS F 1 , CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL10, LTA, PRF1 , PTGS2, SK1 y/o TBX21 a un nivel más alto que un número equivalente de células asesinas naturales, por ejemplo, células TSNK, no contactadas con dicho compuesto inmunomodulador o talidomida.
En ciertas modalidades de los métodos de tratamiento o supresión tumoral anterior, las células TSNK se combinan con otras células asesinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales aisladas de perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical o sangre periférica, o producidas de células hematopoyétícas por un método diferente. En modalidades específicas, las células TSNK se combinan con células asesinas naturales de otra fuente, o hechas por un método diferente, en una relación de aproximadamente 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares.
En otro aspecto, en la presente se provee una comparación que comprende aislar células TSNK. En una modalidad específica, dichas TSNK son producidas de células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas aisladas de perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical, y/o sangre periférica. En otra modalidad específica, dichas células TSNK comprende al menos 50% de células en la composición. En otra modalidad específica, dichas células TSNK comprenden por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de células en la composición. En ciertas modalidades, más de 90%, 92%, 94%, 96% o 98% de células TSNK en dicha composición son CD56+ y CD16". En otras modalidades, por lo menos 80%, 82%, 84%, 86%, 88% o 90% de células TSNK en dicha composición son CD3" y CD56 + . En otras modalidades, por lo menos 50%, 52%, 54%, 56%, 58% o 60% de dichas células son NKG2D*. En otras modalidades, menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% o 3% de dichas células son NKB 1 +. En ciertas otras modalidades, menos de 10%, 8%, 6%, 4% o 2% de dichas células TSNK son NKAT2 + . En ciertas otras modalidades, menos de 10%, 8%, 6%, 4% o 2% de dichas células TSNK son CD56 + y CD16 + . En más modalidades específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65% o 70% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son NKp46 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o 85% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD117 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD94+. En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% de dichas células TSNK CD3 , CD56+ son CD226\ En más modalidades específicas, por lo menos 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD7". En más modalidades específicas, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% de dichas células TSNK CD3 , CD56+ son CD5 + .
En otra modalidad específica, dichas células TSNK CD56+, CD16" son de un único individuo. En una modalidad más específica, dichas células asesinas naturales CD56 + , CD16" comprenden células asesinas naturales de por lo menos dos individuos diferentes. En otra modalidad específica, dichas células TSNK han sido contactadas con un compuesto inmunomodulador o talidomida en una cantidad y durante un tiempo suficiente para que dichas células TSNK expresen detectablemente más granzima B o perforina que un número equivalente de células asesinas naturales, es decir, células TSNK, no contactadas con dicho compuesto inmunomodulador o talidomida. En otra modalidad específica, dicha composición comprende adicionalmente un compuesto inmunomodulador o talidomida. En ciertas modalidades, el compuesto inmunomodulador es un compuesto descrito en la sección 6.2.1 más adelante, por ejemplo, un compuesto de isoindolina sustituida con amino.
En otra modalidad específica, la composición comprende adicionalmente uno o más compuestos anti-cáncer, por ejemplo, uno o más de los compuestos anti-cáncer descritos en la sección 6.8.2 más adelante.
En una modalidad más específica, la composición comprende células TSNK y células asesinas naturales de otra fuente, o hecha por otro método. En una modalidad específica, dicha otra fuente es sangre de placenta y/o sangre de cordón umbilical. En otra modalidad específica, dicha otra fuente es sangre periférica. En modalidades más específicas, las células TSNK se combinan con células asesinas naturales de otra fuente, o hechas por otro método en una relación de aproximadamente 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares.
En otra modalidad específica, la composición comprende células TSNK y perfundido de placenta aislado o células de perfundido de placenta aislado. En una modalidad más específica, dicho perfundido de placenta es del mismo individuo como dichas células TSNK. En otra modalidad más específica, dicho perfundido de placenta comprende perfundido de placenta de un individuo diferente de dichas células TSNK. En otra modalidad específica, todas, o sustancialmente todas (por ejemplo, más de 90%, 95%, 98% o 99%) de las células en dicho perfundido de placenta son células fetales. En otra modalidad específica, el perfundido de placenta o células de perfundido de placenta, comprenden células fetales y maternas. En una modalidad más especifica, las células fetales en dicho perfundido de placenta comprenden menos de aproximadamente 90%, 80%, 70%, 60% o 50% de las células en dicho perfundido. En otra modalidad específica, dicho perfundido se obtiene por paso de una solución de NaCI 0.9% a través de la vasculatura de placenta. En otra modalidad específica, dicho perfundido comprende un medio de cultivo. En otra modalidad específica, dicho perfundido ha sido tratado para eliminar eritrocitos. En otra modalidad específica, dicha composición comprende un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 5.2.1.1 más adelante, por ejemplo, un compuesto de isoindolina amino-sustituido. En otra modalidad específica, la composición comprende adicionalmente uno o más compuestos anti-cáncer, por ejemplo, uno o más de los compuestos anti-cáncer descritos en la sección 6.8.2 más adelante.
En otra modalidad específica, la composición comprende células TSNK y células de perfundido de placenta. En una modalidad más específica, dichas células de perfundido de placenta son del mismo individuo como dichas células TSNK. En otra modalidad más específica, dichas células de perfundido de placenta son de un individuo diferente que dichas células TSNK. En otra modalidad específica, la composición comprende perfundido de placenta aislado y células de perfundido de placenta aislado, en donde dicho perfundido de placenta y dichas células de perfundido de placenta aislado son de diferentes individuos. En otra modalidad más específica de cualquiera de las modalidades anteriores comprendiendo perfundido de placenta, dicho perfundido de placenta comprende perfundido de placenta de por lo menos dos individuos. En otra modalidad más específica de cualquiera de las modalidades anteriores comprendiendo células de perfundido de placenta, dichas células de perfundido de placenta aislado son de por lo menos dos individuos. En otra modalidad específica, dicha composición comprende un compuesto inmunomodulador. En otra modalidad específica, la composición comprende adicionalmente uno o más compuestos anti-cáncer, por ejemplo, uno o más de los compuestos anti-cáncer descritos en la sección 6.8.2, más adelante. 4.1 Definiciones Como se usa en la presente, los términos "compuesto inmunomodulador" e " I i D™ " no abarcan talidomida.
Como se usa en la presente, "lenalidomida" significa 3-(4'-aminoisoindolina-1 -ona)-1-piperidina-2,6-diona (nombre del Servicio de Resúmenes Químicos) o 2,6-piperidinadiona, 3-(4-am ino- 1 , 3-dihidro-1 -oxo-2H-isoindol-2-il)- (nombre de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC)). Como se usa en la presente, "pomalidomida" significa 4-amino-2-(2,6-dioxop¡peridin-3-¡l)isoindol-1 , 3-diona .
Como se usa en la presente, "multipotente", al referirse a una célula, significa que la célula tiene la capacidad de diferenciar en una célula de otro tipo celular. En ciertas modalidades, "una célula multipotente" es una célula que tiene la capacidad de crecer en cualquier subserie del cuerpo del mamífero aproximadamente 260 tipos celulares. A diferencia de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos celulares.
Como se usa en la presente, "células alimentadoras" se refiere a células de un tipo que se co-cultivan con células de un segundo tipo, para proveer un medio ambiente en donde las células del segundo tipo se pueden mantener, y quizás proliferar. Sin limitarse por ninguna teoría, las células alimentadoras pueden proveer, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, señales eléctricas, moléculas orgánicas (por ejemplo, esteroides), moléculas de ácido nucleico, factores de crecimiento (por ejemplo, bFGF), otros factores (por ejemplo, citocinas), y nutrientes metabólicos a células diana. En ciertas modalidades, las células alimentadoras crecen en una mono-capa.
Como se usa en la presente, "célula asesina natural" o "células NK" sin más modificación, incluye células asesinas naturales de cualquier fuente de tejido.
Como se usa en la presente, "TSNK" y "células TSNK" se refieren a células asesinas naturales producidas por los métodos de cultivo/expansión (por ejemplo, método de dos pasos) descritos en la presente.
Como se usa en la presente, "perfundido de placenta" significa solución de perfusión que ha sido pasado a través de por lo menos parte de una placenta, por ejemplo, una placenta humana, por ejemplo, a través de la vasculatura de placenta, incluyendo una pluralidad de células recolectadas por la solución de perfusión durante el paso a través de la placenta.
Como se usa en la presente, "células de perfundido de placenta" significa células nucleadas, por ejemplo, células nucleadas totales, aisladas de, o que se pueden aislar de, perfundido de placenta.
Como se usa en la presente, "supresión de célula tumoral", "supresión de proliferación de célula tumoral", y similares, incluye reducir el crecimiento de una población de células tumorales, por ejemplo, al asesinar una o más de las células tumorales en dicha población de células tumorales, por ejemplo, al contactar la población de células tumorales con, por ejemplo, células TSNK o una población de células que comprenden células TSNK.
Como se usa en la presente, el término "células hematopoyéticas" incluye células madre hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas.
Como se usa en la presente, el "componente no definido" es un término de la técnica en el campo de medio de cultivo que se refiere a componentes cuyos constituyentes por lo general no son provistos o cuantificados. Ejemplos de un "componente no definido" incluyen, sin limitación, suero humano (por ejemplo, suero humano AB) y suero fetal (por ejemplo, suero bovino fetal o suero de becerro fetal).
Como se usa en la presente, " + ", cuando se usa para indicar la presencia de un marcador celular particular, significa que el marcador celular está detectablemente presente en clasificación de célula activada con fluorescencia sobre un control de isotipo; o es detectable de fondo en RT-PCR cuantitativo o semi-cuantitativo.
Como se usa en la presente, cuando se usa para indicar la presencia de un marcador celular particular, significa que el marcador celular no está detectablemente presente en clasificación de célula activada con fluorescencia sobre un control de isotipo; o no es detectable de fondo en RT-PCR cuantitativo o semi-cuantitativo. 5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Expansión de pliegue de células NK diferenciadas de células madre hematopoyéticas (HSCs) con varias formulaciones de medio. Las barras de error representan derivación estándar de tres donantes. Eje X: día (D) de cultivo. Eje Y: expansión de pliegue comparada con día 0 (inicio de cultivo).
Figura 2: Caracterización fenotípica de células NK cultivadas con medio NK2A. Las células fueron marcadas en triple con PE-antiCD56, FITC anti-CD3, PerCP-antiCD16. Líneas horizontales, verticales: nivel de marcha fluorescente significativamente de fondo.
Figura 3: Expansión de pliegue de células NK cultivadas con NK2A (FF), NK2A (células madre de placenta como células alimentadoras), NK2A (MSC como células alimentadoras) o medio de NK de dos etapas. Eje X: día (D) de cultivo. Eje Y: expansión de pliegue comparada con día 0 (inicio de cultivo).
Figura 4: Citotoxicidad de células NK cultivadas con NK2A (sin células alimentadoras). Medio de NK de dos etapas; NK2A con células madre de placenta (PSC) adherentes a plástico de cultivo de tejido CD34", CD10\ CD105\ CD200+ como células alimentadoras, NK2A con células madre mesenquimatosas (MSC) como células alimentadoras, en la iniciación post-cultivo de día 45. Los datos representativos de tres donantes se muestran en la figura 4.
Figura 5: Caracterización fenotípica de células NK en día 41 (D41) de cultivo. Los datos representativos de 3 donantes individuales son mostrados. Eje X: porcentaje de células NK, producidas por el método de dos etapas, que son CD3"CD56 + , CD16" CD56+ o CD16"CD56 + ; o que expresan NKB1, NKG2D, NKp46, CD94, CD117, CD226, CD7 o CD5. Se cultivaron células en NK2A (sin células alimentadoras), medio de NK de dos etapas; NK2A con células madre de placenta (PSC) adherentes a plástico de cultivo de tejido CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ como células alimentadoras, NK2A con células madre mesenquimatosas (MSC) derivadas de médula ósea como células alimentadoras, en la iniciación postcultivo de día 41.
Figura 6: Expresión de CD94 y CD117 en la población de célula NK CD56 + CD3- durante cultivo de NK en medio de NK2A. La población dominante de células CD56 + CD94 + CD 117 + fue identificada de células NK cultivadas en medio de NK2A, que se puede distinguir de células NK derivadas de célula madre embriónica (ESC) (CD56 + CD94 + CD117bai0 "). Los datos representativos de tres donantes se muestran en la figura 6. Eje X: fluorescencia de anti-CD94 marcado con ficoeritrina (PE). Eje Y: fluorescencia de antiCD117 marcado con APC. Líneas horizontales, verticales: nivel de marca fluorescente significativamente de fondo. D13, D20, D28, D35: iniciación de cultivo celular post CD34+ días 13, 20, 28 y 35.
Figura 7: Efectos de células madre de placenta en células NK cultivadas en comparación con medio de MSC y NK2A solo. Eje X: células NK cultivadas en medio de NK2A sin una capa alimentadora (FF); células NK cultivadas en medio de NK2A con células madre mesenquimatosas (MCS) derivadas de médula ósea como una capa alimentadora; o medio de NK2A con células madre de placenta (PDACs) adherentes a plástico de cultivo de tejido CD10 + , CD34", CD105 + , CD200+ como una capa alimentadora. Eje Y (izquierda): citotoxicidad , expresada como un porcentaje de células tumorales restantes (1.0 = 100%); citotoxicidad indicada por cuadros abiertos. Eje Y (derecha): expansión de pliegue de células NK usando el método de dos pasos; expansión de pliegue expresada como asteriscos.
Figuras 8A-8B: Efectos de relaciones relativas de sangre de cordón umbilical (UCB) y perfundido de placenta humano (HPP) en la pureza de células CD34+ post-descongelación. Figura 8A: Efectos de contenido volumétrico de HPP (vol%) en pureza de CD34 + Lin". Eje X: fracción volumétrica de HPP en el UCB y HPP agrupados (combinación). Eje Y: el porcentaje de células CD34+Lin". Figura 8B: Efectos de contenido de HPP TNC (TNC%) en pureza de CD34+Lin". Eje Y: el porcentaje de células CD34+Lin". 6. DESCRIPCIÓN DETALLADA En la presente se provee un método novedoso de producir y expandir células NK de células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras hematopoyéticas. Las células hematopoyéticas usadas para producir las células NK se pueden aislar de cualquier fuente, por ejemplo, sin limitación, placenta, sangre de cordón umbilical, sangre de placenta, sangre periférica, bazo o hígado. En cierta modalidad, las células NK son producidas de células hematopoyéticas expandidas, por ejemplo, células madre hematopoyéticas y/o células progenitoras hematopoyéticas. En una modalidad, se recolectan células hematopoyéticas de una fuente de dichas células, por ejemplo, perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, bazo, hígado y/o médula ósea. En una modalidad específica, las células hematopoyéticas son expandidas y diferenciadas, continuamente, en un primer medio sin el uso de células alimentadoras. Las células entonces se cultivan en un segundo medio en presencia de células alimentadoras. Dicho aislamiento, expansión y diferenciación se puede realizar en una instalación central, la cual provee células hematopoyéticas expandidas para envío para expansión y diferenciación descentralizadas en puntos de uso, por ejemplo, hospital, base militar, frente militar, o similar. 6.1. Células Hematopoyéticas Las células hematopoyéticas útiles en los métodos descritos en la presente pueden ser cualquier célula hematopoyética capaz de diferenciar en célula NK, por ejemplo, células precursoras, células progenitoras hematopoyéticas, células madre hematopoyéticas, o similares. Se pueden obtener células hematopoyéticas de fuentes de tejido tales como, por ejemplo, médula ósea, sangre de cordón, sangre de placenta, sangre periférica, hígado o similares, o combinaciones de los mismos. Se pueden obtener células hematopoyéticas de placenta. En una modalidad específica, las células hematopoyéticas se obtienen de perfundido de placenta. Las células hematopoyéticas de perfundido de placenta pueden comprender una mezcla de células hematopoyéticas fetales y maternales, por ejemplo, una mezcla en donde células maternales comprenden más de 5% del número total de células hematopoyéticas. Preferiblemente, las células hematopoyéticas de perfundido de placenta comprenden por lo menos aproximadamente 90%, 95%, 98%, 99% o 99.5% células fetales.
En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras hematopoyéticas, de las cuales se producen las células TSNK, se obtienen de perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras hematopoyéticas, de las cuales se producen células TSNK, son células combinadas de perfundido de placenta y sangre de cordón, por ejemplo, sangre de cordón de la misma placenta como el perfundido. En otra modalidad específica, dicha sangre de cordón umbilical se aisla de una placenta diferente de la placenta de la cual se obtiene dicho perfundido de placenta. En ciertas modalidades, las células combinadas se pueden obtener al agrupar o combinar la sangre de cordón y perfundido de placenta. En ciertas modalidades, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares por volumen para obtener las células combinadas. En una modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1 a 1:10, de 5:1 a 1:5, o de 3:1 a 1:3.
En otra modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 o 1:10. En una modalidad más específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 8.5:1.5 (85%: 15%).
En ciertas modalidades, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, o similares por contenido de células nucleadas totales (TNC) para obtener las células combinadas. En una modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1 a 10:1, de 5:1 a 1:5, o de 3:1 a 1:3. En otra modalidad específica, la sangre de cordón y perfundido de placenta se combinan a una relación de 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5 o 1:10.
En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras hematopoyéticas de las cuales se producen dichas células TSNK son de sangre de cordón umbilical y perfundido de placenta, pero en donde dicha sangre de cordón umbilical se aisla de una placenta diferente de la placenta de la cual se obtiene dicho perfundido de placenta.
En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas son células CD34 + . En modalidades específicas, las células hematopoyéticas útiles en los métodos descritos en la presente son CD34+CD38+ o CD34 + CD38". En una modalidad más específica, las células hematopoyéticas son CD34 + CD38~Lin~. En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas son uno o más de CD2", CD3 , CD11b~, CD 11c", CD14", CD16", CD19", CD24", CD56-, CD66b" y/o glicoforina A". En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas son CD2', CD3", CD11b", CD11c", CD14", CD16", CD19", CD24", CD56", CD66b" y glicoforina A". En otra modalidad más específica, las células hematopoyéticas son CD34 + CD38"CD33" CD117". En otra modalidad más específica, las células hematopoyéticas son CD34 + CD38"CD33"CD 117 CD25 CD36".
En otra modalidad, las células hematopoyéticas son CD45+. En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas son CD34 + CD45 + . En otra modalidad, la célula hematopoyética es Thy-1+. En una modalidad específica, la célula hematopoyética es CD34+Thy-1+. En otra modalidad, las células hematopoyéticas son CD133 + . En modalidades específicas, las células hematopoyéticas son CD34 + CD133+ o CD133 + Thy-1\ En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas CD34+ son CXCR4 + . En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas CD34+ son CXCR4". En otra modalidad, las células hematopoyéticas son positivas para KDR (receptor 2 de factor de crecimiento vascular). En modalidades específicas, las células hematopoyéticas son CD34 + KDR + , CD133 + KDR o Thy-1 +KDR+. En ciertas otras modalidades, las células hematopoyéticas son positivas para deshidrogenase de aldehido (ALDH + ), por ejemplo, las células son CD34+ALDH\ En ciertas otras modalidades, las células CD34+ son CD45". En modalidades específicas, las células CD34+, por ejemplo, CD34 + , las células CD45" expresan uno o más, o todos, de los miARNs hsa-miR-380, hsa-miR-512, hsa-miR-517, hsa-miR-518c, hsa-m ¡R-519b, y/o hsa-miR-520a.
En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas son CD34. Las células hematopoyéticas también pueden carecer de ciertos marcadores que indican compromiso de linaje, o una falta de ingenuidad de desarrollo. Por ejemplo, en otra modalidad, las células hematopoyéticas son HLA-DR". En modalidades específicas, las células hematopoyéticas son CD34 + HLA-DR", CD133 + HLA-DR", Thy-1 + HLA-DR" o ALDH + HLA-DR". En otra modalidad, las células hematopoyéticas son negativas para uno o más, preferiblemente todos, de los marcadores de linaje CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b y glicoforina A.
De esta manera, se pueden seleccionar células hematopoyéticas para usarse en los métodos descritos en la presente sobre la base de la presencia de marcadores que indican un estado no diferenciado, o sobre la base de la ausencia de marcadores de linaje indicando que ha ocurrido al menos algo de diferenciación de linaje. Métodos de aislar células, incluyendo células hematopoyéticas, sobre la base de la presencia o ausencia de marcadores específicos se discute en detalle, por ejemplo, en la sección 6.1.2, más adelante.
Las células hematopoyéticas usadas en los métodos provistos en la presente pueden ser una población sustancialmente homogénea, por ejemplo, una población que comprende al menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de células hematopoyéticas de una única fuente de tejido, o una población que comprende células hematopoyéticas que exhiben los mismos marcadores celulares asociados con célula hematopoyética. Por ejemplo, en varias modalidades, las células hematopoyéticas pueden comprender por lo menos aproximadamente 95%, 98% o 99% de células hematopoyéticas de médula ósea, sangre de cordón, sangre de placenta, sangre periférica, o placenta, por ejemplo, perfundido de placenta.
Las células hematopoyéticas usadas en los métodos provistos en la presente se pueden obtener de un único individuo, por ejemplo, de una sola placenta, o de una pluralidad de individuos, por ejemplo, se pueden agrupar. En donde se obtienen las células hematopoyéticas a partir de una pluralidad de individuos y agrupadas, las células hematopoyéticas se pueden obtener de la misma fuente de tejido. De esta manera, en varias modalidades, las células hematopoyéticas agrupadas son todas de placenta, por ejemplo, perfundido de placenta, todas de sangre periférica, todas de sangre de cordón umbilical, todas de sangre periférica, y similares.
Las células hematopoyéticas usadas en los métodos descritos en la presente, en ciertas modalidades, pueden comprender células hematopoyéticas de dos o más fuentes de tejido. Por ejemplo, en ciertas modalidades, cuando células hematopoyéticas de dos o más fuentes se combinan para usarse en los métodos en la presente, una pluralidad de las células hematopoyéticas usadas para producir células TSNK comprenden células hematopoyéticas de placenta, por ejemplo, perfundido de placenta. En varias modalidades, las células hematopoyéticas usadas para producir células TSNK comprenden células hematopoyéticas de placenta y de sangre de cordón; de placenta y sangre periférica; de placenta y sangre periférica; o placenta y médula ósea. En una modalidad preferida, las células hematopoyéticas comprenden células hematopoyéticas de perfundido de placenta en combinación con células hematopoyéticas de sangre de cordón, en donde la sangre de cordón y placenta son del mismo individuo, es decir, en donde se igualan el perfundido y sangre de cordón. En modalidades en donde las células hematopoyéticas comprenden células hematopoyéticas de dos fuentes de tejido, las células hematopoyéticas de las fuentes se pueden combinar en una relación de, por ejemplo, 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 ó 9:1. 6.1.1 Células Madre Hematopoyéticas de Placenta En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas usadas en los métodos provistos en la presente son células hematopoyéticas de placenta. Como se usa en la presente, "células hematopoyéticas de placenta" significa células hematopoyéticas obtenidas de la placenta en sí, y no de sangre de placenta o de sangre de cordón umbilical. En una modalidad, las células hematopoyéticas de placenta son CD34 + . En una modalidad específica, las células hematopoyéticas de placenta son predominantemente (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) células CD34 + CD38". En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas de placenta son predominantemente (por ejemplo, al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) células CD34+CD38 + . Se pueden obtener células hematopoyéticas de placenta de una placenta de mamífero post-parto (por ejemplo, humana) por cualquier medio conocido a aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, por perfusión .
En otra modalidad, la célula hematopoyética de placenta es CD45". En una modalidad específica, la célula hematopoyética es CD34 + CD45". En otra modalidad específica, las células hematopoyéticas de placenta son CD34 + CD45 + . 6.2. Producción de Células Asesinas Naturales La producción de células NK por el presente método comprende expandir una población de células hematopoyéticas. Durante la expansión celular, una pluralidad de células hematopoyéticas dentro de la población de célula hematopoyética se diferencian en células NK.
En una modalidad, en la presente se provee un método de producir una población de células asesinas naturales (NK) activadas, que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 ( I L - 15 ) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicho IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas.
En otra modalidad, las células NK provistas en la presente son producidas por un proceso de dos pasos de expansión/diferenciación y maduración de células NK. Los primeros y segundos pasos comprenden cultivar las células en medio con una combinación única de factores celulares. En ciertas modalidades, el proceso involucra (a) cultivar y expandir una población de células hematopoyéticas en un primer medio, en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de la población de células hematopoyéticas se diferencian en células NK; y (b) expandir las células NK del paso (a) en un segundo medio, en donde las células NK se expanden más y diferencian, y en donde las células NK son maduradas (por ejemplo, activadas o de lo contrario poseyendo actividad citotóxica). En ciertas modalidades, el método incluye ningún paso intermediario entre el paso (a) y paso (b), ningún paso de cultivo adicional antes del paso (a), y/o ningún paso adicional (por ejemplo, paso de maduración) después del paso (b). 6.2.1. Primer Paso de Cultivo En ciertas modalidades, los métodos provistos en la presente comprenden un primer paso de cultivar y expandir una población de células hematopoyéticas en un primer medio, en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de la población de células hematopoyéticas se diferencian en células NK.
Sin limitarse por ningún parámetro, mecanismo o teoría, cultivo de las células hematopoyéticas como se provee en la presente resulta en expansión continua de las células hematopoyéticas y diferenciación de células NK de dichas células. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras, usadas en los métodos provistos en la presente se expanden y diferencian en el primer paso usando una capa alimentadora. En otras modalidades, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras, se expanden y diferencian en el primer paso sin el uso de una capa alimentadora.
La expansión y diferenciación independiente de célula alimentadora de células hematopoyéticas puede ocurrir en cualquier contenedor compatible con cultivo y expansión celular, por ejemplo, frasco, tubo, vaso de precipitados, plato, placa de multipozo, bolso o similar. En una modalidad específica, la expansión independiente de célula alimentadora de células hematopoyéticas ocurre en una bolsa, por ejemplo, una bolsa de cultivo de fluorocarburo flexible, permeable a gas (por ejemplo, de American Fluoroseal). En una modalidad específica, el contenedor en donde las células hematopoyéticas se expanden es adecuado para envío, por ejemplo, a un sitio tal como un hospital o zona militar en donde las células NK expandidas se expanden y diferencian más.
En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas se expanden y diferencian, por ejemplo, en un modo continuo, en un primer medio de cultivo. En una modalidad, el primer medio de cultivo es un medio libre de componente de animal. Los medios libres de componente animal ejemplares útiles en los métodos provistos en la presente incluyen, pero no se limitan a, medio basal Eagle (BME), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Glasgow (GMEM), medio de Eagle modificado de Dulbecco/mezcla de nutriente F-12 Ham (DMEM/F-12), medio esencial mínimo ( E ), medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), mezcla de nutriente F-10 Ham (F-10 de Ham), mezcla de nutriente F-12 Ham (F-12 de Ham), medio RPMI-1640, medio E de Wílliam, STEMSPAN® (No. Cat. Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá), medio de crecimiento basal Glycostem Basal Growth Médium (GBGM®), medio AIM-V® (Invitrogen), X-VIVO™ 10 (Lonza), X-VIVO™ 15 (Lonza), OPTIMIZER (Invitrogen), STEMSPAN® H3000 (STEMCELL Technologies), CELLGRO COMPLETE™ (Mediatech), o cualquier variante modificado o combinaciones del mismo.
En modalidades preferidas, el primer medio de cultivo comprende uno o más suplementos de medio (por ejemplo, nutrientes, citocinas y/o factores). Los suplementos de medio adecuados para usarse en los métodos provistos en la presente incluyen, por ejemplo sin limitación, suero tal como suero humano AB, suero bovino fetal (FBS) o suero de becerro fetal (FCS), vitaminas, albúmina de suero bovino (BSA), aminoácidos (por ejemplo, L-glutamina), ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico, ácido linoleico o ácido palmítico), insulina (por ejemplo, insulina humana recombinante), transferina (transferina humana saturada de hierro), ß-mercaptoetanol, factor de célula madre (SCF), ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FU3-L), citocinas tales como ¡nterleucina-2 ( I L - 2 ) , i nterle uci na-7 ( I L - 7 ) , interleucina-15 (IL-15), trombopoyetina (Tpo), heparina, u O-acetil-carnitina (también referida como acetilcarnitina, O-acetil-L-carnitina u OAC). En una modalidad específica, el medio usado comprende suero humano AB. En otra modalidad específica, el medio usado en la presente comprende FBS. En otra modalidad específica, el medio usado en la presente comprende OAC.
En ciertas modalidades, el primer medio no comprende uno o más de, factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor estimulante de colonia de granulocito/macrófago (GM-CSF), interleucina-6 (IL-6), proteína 1 a inflamatoria de macrófago (MIP1a), o factor inhibidor de leucemia (LIF).
De esta manera, en un aspecto, en la presente se provee un método de dos pasos de producir células NK, en donde dicho primer paso comprende expandir y diferenciar una población de células hematopoyéticas en un primer medio de cultivo en ausencia de células alimentadoras, en donde una pluralidad de células hematopoyéticas dentro de dicha población de células hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión, y en donde el medio comprende SCF a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL, IL-2 a una concentración de alrededor de 50 a aproximadamente 1500 lU/mL, IL-7 a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL, IL-15 a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL y heparina a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 30 lU/mL, y en donde dicho SCF, IL-2, IL-7, IL-15 y heparina no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio (por ejemplo, suero). En ciertas modalidades, dicho medio comprende uno o más de O-acetil-carnitina (también referida como acetilcarnitina, O-acetil-L-carnitina u OAC), o un compuesto que afecta el ciclo de acetil-CoA en mitodronia, tiazovivina, Y-27632, piintegrina, inhibidores de Rho quinasa (ROCK), inhibidores de caspasa u otros compuestos /péptidos anti-apoptóticos, NOVA-RS (Sheffield Bio-Science) u otros potenciadores de crecimiento de molécula pequeña. En ciertas modalidades, dicho medio comprende nicotinamida. En ciertas modalidades, dicho medio comprende aproximadamente 0.5 mM-10 mM OAC. En una modalidad, dicho medio comprende Stemspan® H3000, y/o DM EM : F 12 y aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mM OAC. En una modalidad específica del método, dicho medio es GBGM®. En otra modalidad específica, dicho medio comprende Stemspan® H3000 y aproximadamente 5 mM de OAC. En otra modalidad específica, dicho medio comprende DMEM:F12 y aproximadamente 5 nM de OAC. El OAC se puede agregar en cualquier momento durante los métodos de cultivo provistos en la presente. En ciertas modalidades, dicho OAC se agrega al primer medio en el día 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 del cultivo. En una modalidad específica, dicho OAC se agrega al primer medio en el día 7 del primer paso de cultivo. En una modalidad más específica, dicho OAC se agrega al primer medio en el día 7 del cultivo y está presente en los primeros y segundos pasos de cultivo. En ciertas modalidades, dicho OAC se agrega al segundo medio y/o durante el segundo paso de cultivo. En algunas modalidades, dicho OAC se agrega al segundo medio en el día 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 del cultivo.
En otra modalidad específica, dicho medio es IMDM suplementado con aproximadamente 5-20% BSA, aproximadamente 1-10 µg/mL insulina humana recombinante, aproximadamente 10-50 µg/mL transferina humana saturada de hierro y aproximadamente 10-50 µ? ß-mercaptoetanol. En otra modalidad específica, dicho medio no comprende uno o más, o ninguno, de IL-11, IL-3, homeobox-B4 (HoxB4), y/o metilcelulosa.
En otras modalidades específicas, dicho medio comprende SCF a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 500 ng/mL; de alrededor de 5 a aproximadamente 100 ng/mL; o aproximadamente 20 ng/mL. En otras modalidades específicas, dicho medio comprende IL-2 a una concentración de alrededor de 10 a aproximadamente 2000 lU/mL; o de alrededor de 100 a aproximadamente 500 lU/mL; o aproximadamente 200 lU/mL. En otras modalidades específicas, dicho medio comprende IL-7 a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 500 ng/mL; de alrededor de 5 a aproximadamente 100 ng/mL; o aproximadamente 20 ng/mL. En otras modalidades específicas, dicho medio comprende IL-15 a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 500 ng/mL; de alrededor de 5 a aproximadamente 100 ng/mL; o aproximadamente 10 ng/mL. En otras modalidades específicas, dicho medio comprende heparina a una concentración de alrededor de 0.05 a aproximadamente 100 lU/mL; o de alrededor de 0.5 a aproximadamente 20 U/ml; o aproximadamente 1.5 U/mL.
Todavía en otra modalidad específica del método, dicho medio comprende además ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (Flt-3L) a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL, trombopoyetina (Tpo) a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL, o una combinación de alrededor de 0.1 a aproximadamente 500 ng/mL; de alrededor de 5 a aproximadamente 100 ng/mL; o aproximadamente 20 ng/mL. En otras modalidades específicas, dicho medio comprende Tpo a una concentración de alrededor de 0.1 a aproximadamente 500 ng/mL; de alrededor de 5 a aproximadamente 100 ng/mL; o aproximadamente 20 ng/mL.
En una modalidad más específica del método, el primer medio de cultivo es GBGM®, que comprende aproximadamente 20 ng/mL SCF, aproximadamente 20 ng/mL IL-7, aproximadamente 10 ng/mL IL-15. En otra modalidad más específica del método, el primer medio de cultivo es GBGM®, que comprende aproximadamente 20 ng/mL SCF, aproximadamente 20 ng/mL FH3-L, aproximadamente 200 lU/mL IL-2, aproximadamente 20 ng/mL IL-7, aproximadamente 10 ng/mL IL-15, aproximadamente 20 ng/mL Tpo, y aproximadamente 1.5 U/mL heparina. En otra modalidad específica, dicho primer medio de cultivo comprende además 10% suero humano (por ejemplo, suero humano AB) o suero fetal (por ejemplo, FBS).
En otra modalidad, las células hematopoyéticas se expanden al cultivar dichas células, por ejemplo, en dicho primer medio, en contacto con un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inhibidor de TNF-a, durante un tiempo y en una cantidad suficientes para causar un aumento detectable en la proliferación de las células hematopoyéticas sobre un tiempo dado, en comparación con un número equivalente de células hematopoyéticas no contactadas con el compuesto inmunomodulador. Ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2003/0235909, la descripción de la cual se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, el compuesto inmunomodulador es una isoindolina amino-sustituida. En una modalidad preferida, el compuesto inmunomodulador es 3-(4-amino-1 -oxo-1 ,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina-2,6-diona; 3-(4'-aminoisoindolina-1'-ona)-1-piperidina-2,6-diona; 4-(amino)-2-(2,6-dioxi(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona; o 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1 ,3-diona. En otra modalidad preferida, el compuesto inmunomodulador es pomalidomida o lenalidomida. En otra modalidad, dicho compuesto inmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura en donde uno de X e Y es C = 0, el otro de X e Y es C = 0 o CH2, y R2 es hidrógeno o alquilo menor, o una sal, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diaestereómero, racemato farmacéuticamente aceptable o mezcla de estereoisómeros de los mismos. En otra modalidad, dicho compuesto inmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura en donde uno de X e Y es C=0 y el otro es CH2 o C = 0; R es H, alquilo (d-C8), cicloalquilo (C3-C7), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquilo (C0-C4)-heterocicloalquilo (d-Ce), alquilo (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5), C(0)R3, C(S)R3, C(0)OR4, alquilo (d -C8)-N(R6)2, alquilo (d-C8)-OR5, alquilo (Ci-C8)-C(0)OR5, C(0)NHR3, C(S)NHR3, C(0)NR3R3', C(S)NR3R3' o alquilo (d-C8)-0(CO)R5; R2 es H, F, bencilo, alquilo (d-C8), alquenilo (C2-C8), o alquinilo (C2-C8); R3 y R3 son independientemente alquilo (d-C8), cicloalquilo ( C3-C7 ), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, alquilo (C0-d)-heterocicloalquilo (C^-d), alquilo (C0-C )-heteroarilo (C2-C5), alquilo (C0-C8)-N(R6)2, alquilo (d-C8)-OR5, alquilo (d-C8)-C(0)OR5, alquilo (d-C8)-0(CO)R5 o C(0)OR5; R4 es alquilo (C^-C^), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), alquilo (C -C4)-OR5, bencilo, arilo, alquilo (C0-C4)-heterocicloalquilo (Ci-Ce) o alquilo (C0-C4)-heteroarilo (C2-C5); R5 es alquilo (Ci-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo o heteroarilo (C2-C5); cada ocurrencia de R6 es independientemente H, alquilo (Ci-C8), alquenilo (C2-C8), alquinilo (C2-C8), bencilo, arilo, heteroarilo (C2-C5) o alquilo (C0-C8)-C(O)O-R5 o los grupos R6 pueden juntarse para formar un grupo heterocicloalquilo; n es 0 ó 1 ; y * representa un centro quiral de carbón; o una sal, hidrato, solvato, clatrato, ena ntiómero, diaestereómero, racemato, o mezcla de estereoisómeros de los mismos. En otra modalidad, dicho compuesto ¡nmunomodulador es un compuesto que tiene la estructura en donde: uno de X e Y es C = 0 y el otro es CH2 o C = 0; R es H o CH2OCOR'; (i) cada uno de R1, R2, R3 o R4, independientemente de los demás, es halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono o (ii) uno de R1, R2, R3 o R4 es nitro o -NHR5 y el resto de R\ R2, R3 o R4 son hidrógeno; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, benzo, cloro o flúor; R' es R7-CHR10-N(R8R9); R7 es m-fenileno o p-fenileno o -(CnH2n)- en donde n tiene un valor de 0 a 4; cada uno de R8 y R9 tomado independientemente del otro es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, o R8 y R9 tomados juntos son tetrametileno, pentametileno, hexametileno, o -CH2CH2X1CH2CH2- en donde X1 es -O-, -S- o -NH-; R10 es hidrógeno, alquilo de 8 átomos de carbono, o fenilo; y * representa un centro quiral de carbón; o una sal, hidrato, solvato, clatrato, enantiómero, diaestereómero, racemato, o mezcla de estereoisómeros de los mismos.
En una modalidad específica, la expansión de las células hematopoyéticas se realiza en IMDM suplementado con 20% BITS (albúmina de suero bovino, insulina humana recombinante y transferina), SCF, ligando Flt-3, IL-3 y 4-(amino)-2-(2,5-dioxo(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona (10 µ?? en 0.05% DMSO). En una modalidad más específica, aproximadamente 5 x 107 células hematopoyéticas, por ejemplo, células CD34 + , se expanden en el medio de alrededor de 5 x 1010 células a aproximadamente 5 x 1012 células, que se resuspenden en 100 ml_ de IMDM para producir una población de células hematopoyéticas expandidas. La población de células hematopoyéticas expandidas preferiblemente se crioconserva para facilitar el envío.
En varias modalidades específicas, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de las células hematopoyéticas se diferencian a células NK.
En ciertas modalidades, el método de expansión y diferenciación de las células hematopoyéticas, como se describe en la presente, comprende mantener la población celular que comprende dichas células hematopoyéticas a entre de alrededor de 2 x 104 y aproximadamente 2 x 105 células por mililitro durante la expansión y diferenciación. En ciertas otras modalidades, el método de expansión y diferenciación de las células hematopoyéticas, como se describe en la presente, comprende mantener la población celular que comprende dichas células hematopoyéticas a no más de aproximadamente 1 x 105 células por mililitro.
El tiempo para expansión y diferenciación de células hematopoyéticas en células NK puede ser, por ejemplo, de alrededor de 3 días a aproximadamente 120 días. En una modalidad, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 7 días a aproximadamente 75 días. En otra modalidad, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 14 días a aproximadamente 50 días. En una modalidad específica, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 21 días a aproximadamente 28 días. 6.2.2. Segundo Paso En el método provisto en la presente, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o células progenitoras, y células asesinas naturales, que resultan del primer paso, se expanden más y diferencian en un segundo paso, por ejemplo, sin el uso de capa alimentadora o en presencia de células alimentadoras. El cultivo de las células como se provee en la presente resulta en expansión continua, diferenciación así como maduración de las células NK del primer paso. En el segundo paso, las células NK son expandidas, diferenciadas y maduradas, en un modo continuo, en un segundo medio de cultivo, por ejemplo, comprendiendo diferentes citocinas y/o moléculas bioactivas que dicho primer medio. En ciertas modalidades, el segundo medio de cultivo es un medio libre de componente animal. Se describen medios de cultivo celular libres de componente animal ejemplares en la sección 6.2.1, anterior.
De esta manera, en un aspecto, en la presente se provee un método de producir células NK, comprendiendo expandir las células NK del primer paso, descrito antes, en un segundo medio en presencia de células alimentadoras y en contacto con interleucina-2 (IL-2). En modalidades específicas, dicho segundo medio comprende medio de crecimiento celular que comprende IL-2, por ejemplo, 10 lU/mL a 1000 lU/mL, y uno o más de: suero humano (por ejemplo, suero humano AB), suero bovino fetal (FBS) o suero de becerro fetal (FCS), por ejemplo, 5 % - 15 % FCS v/v; transferina, por ejemplo, 10 µ?/mL a 50 µ?/mL; insulina, por ejemplo, 5 µg|{? L· a 20 µ?/?t??-; etanolamina, por ejemplo, 5 x 10" a 5 x 10"5 M; ácido oleico, por ejemplo, 0.1 µ?/?t??. a 5 µ?/?t??-; ácido linoleico, por ejemplo, 0.1 µ9/???_ a 5 µQlmL·: ácido palmítico, por ejemplo, 0.05 µ?/G??. a 2 µ?/???-.; albúmina de suero bovino (BSA), por ejemplo, 1 µ9/????_ a 5 µ9/???_; y/o fitohemaglutinina, por ejemplo, 0.01 µ9/?"??_ a 1 µ9/???-. En una modalidad más específica, dicho segundo medio comprende medio de crecimiento celular que comprende FBS o FCS, por ejemplo, 10% FCS v/v, IL-2, transferina, insulina, etanolamina, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, albúmina de suero bovino (BSA) y fitohemaglutinina. En una modalidad más específica, dicho segundo medio comprende medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 10% FBS o FCS, 400 IU IL-2, 35 µg/mL transferina, 5 µg/mL insulina, 2 x 10~5 M etanolamina, 1 µ?/???- ácido oleico, 1 µ?/mL ácido linoleico (Sigma-Aldrich), 0.2 µglmL· ácido palmítico (Sigma-Aldrich), 2.5 µg/mL BSA (Sigma-Aldrich) y 0.1 µ9/(??_ fitohemaglutinina.
En ciertas modalidades, el segundo medio no comprende uno o más de, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonia de granulocito/macrófago (GM-CSF), interleucina-6 (IL-6), proteína 1 a inflamatoria de macrófago(MIP1 a), o factor inhibidor de leucemia (LIF).
Además del método, en la presente se provee cualquiera de los medios descritos antes como composiciones.
Se pueden establecer células alimentadoras, cuando se usan, de varios tipos celulares. Ejemplos de estos tipos celulares incluyen, sin limitación, fibroblastos, células madre (por ejemplo, células madre de placenta adherentes a cultivo de tejido), fibroblastos (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC)), y células cancerosas (por ejemplo, células de leucemia mielógena crónica (CML) tal como K562). En una modalidad específica, dicho cultivo en dicho segundo medio comprende cultivar usando células alimentadoras, por ejemplo, células K562 y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), por ejemplo, al momento en que las células inician en dicho segundo medio, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días después. En ciertas modalidades, las células alimentadoras opcionalmente son de una especie diferente como las células que apoyan. Por ejemplo, las células NK humanas pueden ser soportadas por fibroblastos embriónicos de ratón (de cultivo primario o una línea telomerizada).
En ciertas modalidades, las células alimentadoras son opcionalmente inactivadas por irradiación (por ejemplo, irradiación ?) o tratamiento con un agente anti-mitótico tal como mitomicina C, para prevenir que sobrepasen a las células que están apoyando, pero permiten la síntesis de factores importantes que soportan las células NK. Por ejemplo, se pueden irradiar células a una dosis para inhibir proliferación pero permiten síntesis de factores importantes que apoyan las células madre embriónicas humanas (hES) (aproximadamente 4000 rads irradiación gama).
El cultivo de células NK para el segundo paso puede ocurrir en cualquier contenedor compatible con cultivo y expansión celular, por ejemplo, frasco, tubo, vaso de precipitados, plato, placa multipozo, bolsa o similar. En una modalidad específica, el cultivo dependiente de célula alimentadora de células NK ocurre en una bolsa, por ejemplo, bolsa de cultivo flexible de fluorocarburo permeable a gas (por ejemplo, de American Fluoroseal). En una modalidad especifica, el contenedor en donde las células NK son cultivadas es adecuado para envío, por ejemplo, a un sitio tal como un hospital o zona militar en donde las células NK expandidas se expanden más, diferencian y maduran.
La diferenciación de las células del paso 1 en células TSNK puede ser evaluada al detectar marcadores específicos de célula NK, por ejemplo, por citometría de flujo. Los marcadores específicos de célula NK incluyen, pero no se limitan a, CD56, CD94, CD117 y NKp46. También se puede evaluar la diferenciación por las características morfológicas de células NK, por ejemplo, tamaño grande, actividad de síntesis de proteína alta en el retículo endoplásmico abundante (ER) y/o gránulos preformados.
El tiempo para expansión y diferenciación de células del paso 1 en células TSNK puede ser, por ejemplo, de alrededor de 3 días a aproximadamente 120 días. En una modalidad, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 7 días a aproximadamente 75 días.
En otra modalidad, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 14 días a aproximadamente 50 días. En una modalidad específica, el tiempo de diferenciación es de alrededor de 10 días a aproximadamente 21 días.
La diferenciación de células hematopoyéticas en células NK se puede evaluar al detectar marcadores, por ejemplo, CD56, CD94, CD117, NKG2D, DNAM-1 y NKp46, por ejemplo, por citometría de flujo. También se puede evaluar la diferenciación por las características morfológicas de células NK, por ejemplo, tamaño grande, actividad de síntesis de proteína alta en el retículo endoplásmico (ER) abundante y/o gránulos preformados. La maduración de células NK (por ejemplo, células TSNK) se puede evaluar al detectar uno o más marcadores funcionalmente relevantes, por ejemplo, CD94, CD161, NKp44, DNAM-1, 2B4, NKp46, CD94, KIR, y la familia NKG2 de receptores activadores (por ejemplo, NKG2D). La maduración de células NK (por ejemplo, células TSNK) también se puede evaluar al detectar marcadores específicos durante diferentes etapas de desarrollo. Por ejemplo, en una modalidad, las células pro-NK son CD34 + , CD45RA\ CD10 + , CD117+ y/o CD161". En otra modalidad, las células inmaduras son CD34 + , CD45RA\ CD10", CD117+ y/o CD161". En otra modalidad, las células NK inmaduras son CD34-, CD117\ CD161\ NKp46" y/o CD94/N KG2A . En otra modalidad, las células CD56brNlante NK son CD117 + , NKp46 + , CD94/NKG2A+, CD16" y/o KIR+'\ En otra modalidad, las células CD56,enue NK son CD117", NKp46 + , CD94/N KG2 A+/", CD16+ y/o KIR + .
En una modalidad específica, la maduración de células NK (por ejemplo, células TSNK) se determina por el porcentaje de células NK (por ejemplo, células TSNK) que son CD161", CD94+ y/o NKp46\ En una modalidad más específica, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65% o 70% de células NK maduras (por ejemplo, células TSNK) son NKp46 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células NK maduras (por ejemplo, células TSNK) son CD94 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células NK maduras (por ejemplo, células TSNK) son CD161".
En ciertas modalidades, la diferenciación de células hematopoyéticas en células NK son evaluadas al detectar el nivel de expresión de, por ejemplo, CD3, CD7 o CD127, CD10, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD56, CD94, CD117, CD161, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM-1, 2B4 o TO-PRO-3, usando, por ejemplo, anticuerpos a uno o más de estos marcadores celulares. Dichos anticuerpos pueden ser conjugados a una marca detectable, por ejemplo, como marca fluorescente, por ejemplo, FITC, R-PE, PerCP, PerCP-Cy5.5, APC, APC-Cy7 o APC-H7. 6.3. Aislamiento de Células TSNK Los métodos de aislar células asesinas naturales son conocidos en la técnica y se pueden usar para aislar las células TSNK. Se pueden aislar células asesinas naturales o enriquecer al manchar células de una fuente de tejido, por ejemplo, sangre periférica, con anticuerpos a CD56 y CD3, y seleccionando para células CD56 + CD3". Las células TSNK se pueden aislar usando un equipo comercialmente disponible, por ejemplo, el equipo de aislamiento de célula NK (Miltenyi Biotec). Las células TSNK también se pueden aislar o enriquecer por eliminación de células diferentes de las células NK en una población de células que comprenden las células TSNK. Por ejemplo, las células TSNK se pueden aislar o enriquecer por omisión de células que exhiben marcadores de célula no NK, por ejemplo, anticuerpos a uno o más de CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, H LA DR y/o CD235a (glicoforina A). Se puede llevar aislamiento negativo usando un equipo comercialmente disponible, por ejemplo, el equipo de aislamiento negativo de célula NK (Dynal Biotech). Las células aisladas por estos métodos se pueden clasificar adicionalmente, por ejemplo, para separar células CD16+ y CD16".
Se puede lograr separación celular, por ejemplo, por citometría de flujo, clasificación celular activada con fluorescencia (FACS), o, preferiblemente, clasificación celular magnética usando microesferas conjugadas con anticuerpos específicos. Las células se pueden aislar, por ejemplo, usando una técnica de clasificación activada magnética (MACS), un método para separar partículas con base en su habilidad de unir esferas magnéticas (por ejemplo, aproximadamente 0.5-100 µ?t? diámetro) que comprenden uno o más anticuerpos específicos, por ejemplo, anticuerpos anti-CD56. Se puede realizar separación celular magnética y automatizar usando, por ejemplo, un separador AUTOMACS™ (Miltenyi). Se puede realizar una variedad de modificaciones útiles en las microesferas magnéticas, incluyendo adición covalente de anticuerpo que reconoce específicamente una molécula de superficie celular particular o hapteno. Las esferas entonces se mezclan con las células para permitir unión. Las células entonces pasan a través de un campo magnético para separar células que tienen el marcador de superficie celular específico. En una modalidad, estas células entonces se pueden aislar y re-mezclar con esferas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie celular adicionales. Las células entonces pasan una vez más a través de un campo magnético, aislando células que unen ambos anticuerpos. Dichas células entonces se pueden diluir en platos separados, tales como platos de microtítulo para aislamiento clonal. 6.4. Perfundido de Placenta Se pueden producir células TSNK de células hematopoyéticas, por ejemplo, madre o progenitores hematopoyéticas de cualquier fuente, por ejemplo, tejido de placenta, perfundido de placenta, sangre de cordón umbilical, sangre de placenta, sangre periférica, bazo, hígado, o similar. En ciertas modalidades, las células madre hematopoyéticas son células madre hematopoyéticas combinadas de perfundido de placenta y de sangre de cordón de la misma placenta usada para general el perfundido de placenta. El perfundido de placenta que comprende células de perfundido de placenta que se pueden obtener, por ejemplo, por los métodos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 7,045,148 y 7,468,276, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades. 6.4.1. Composición de Recolección Celular Las células de perfundido de placenta y de perfundido, de las cuales se pueden aislar células madre o progenitores hematopoyéticas, o útiles en supresión de tumor o el tratamiento de un individuo teniendo células tumorales, cáncer o una infección viral, por ejemplo, en combinación con las células TSNK, como se provee en la presente, se pueden recolectar por perfusión de un mamífero, por ejemplo, placenta post-parto humana usando una composición de recolección celular de placenta. Se puede recolectar perfundido de la placenta por perfusión de la placenta con cualquier solución fisiológicamente aceptable, por ejemplo, una solución salina, medio de cultivo, o una composición de recolección celular más compleja. Una composición de recolección celular adecuada para perfundir una placenta, y para la recolección y conservación de células de perfundido se describe en detalle en la publicación de solicitud de E.U.A. No. 2007/0190042, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.
La composición de recolección celular puede comprender cualquier solución fisiológicamente aceptable adecuada para la recolección y/o cultivo de células madre, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, solución salina regulada con fosfato, solución de Kreb, solución de Kreb modificada, solución de Eagle, 0.9% NaCI, etc.), un medio de cultivo (por ejemplo, DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.
La composición de recolección celular puede comprender uno o más componentes que tienden a conservar células de placenta, es decir, prevenir las células de placenta de secado, o retrasar la muerte de las células de placenta, reducen el número de células de placenta en una población de células que mueren, o similares, desde el momento de la recolección al momento de cultivar. Dichos componentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de apoptosis (por ejemplo, un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK); un vasodilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un fármaco anti-hipertenso, péptido natriurético atrial (ANP), adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprussida de sodio, hidralazina, trifosfato de adenosina, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfod iesterasa , etc.); un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2-(1 H-indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, o clonazepam); un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarburo portador de oxígeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).
La composición de recolección celular puede comprender una o más enzimas degradantes de tejido, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutral, una hialuronidasa, una ARNasa, o una ADNasa, o similar. Dichas enzimas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas (por ejemplo, colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum , etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa, y similares.
La composición de recolección celular puede comprender una cantidad bacteriocídicamente o bacterioestáticamente efectiva de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitantes, el antibiótico es una macrolida (por ejemplo, tobramicina), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxil), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, ciprofloxacina o norf loxacina ), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad particular, el antibiótico es activo contra bacteria Gram( + ) y/o Gram(-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares.
La composición de recolección celular también puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (de alrededor de 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (de alrededor de 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones de magnesio (de alrededor de 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolécula de peso molecular mayor de 20,000 daltons, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener integridad endotelial y viabilidad celular (por ejemplo, un coloide que ocurre de manera sintética o natural, un polisacárido tal como dextran o un polietilenglicol presente de alrededor de 25 g/l a aproximadamente 100 g/l, o de alrededor de 40 g/l a aproximadamente 60 g/l); un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C o vitamina E presente de alrededor de 0.1 M a aproximadamente 5 mM); un agente que previene entrada de calcio en células (por ejemplo, verapamil presente de alrededor de 2 µ? a aproximadamente 25 µ?); nitroglicerina (por ejemplo, de alrededor de 0.05 g/L a aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir coagulación de sangre residual (por ejemplo, heparina o hirudina presente a una concentración de alrededor de 1000 unidades/I a aproximadamente 100,000 unidades/l); o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, amilorida de etilo isopropilo, amilorida de hexametileno, amilorida de dimetilo o amilorida de isobutilo presente de alrededor de 1.0 µ? a aproximadamente 5 µ?). 6.4.2. Recolección y Manejo de Placenta En general, una placenta humana es recuperada en breve después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad preferida, la placenta es recuperada de un paciente después de consentimiento informado y después de tomar un historial médico completo del paciente y se asocia con la placenta. Preferiblemente, el historial médico continúa después del alumbramiento.
Antes de recuperar el perfundido, la sangre de cordón umbilical y sangre de placenta son eliminados. En ciertas modalidades, después del alumbramiento, la sangre de cordón en la placenta es recuperada. La placenta se puede someter a un proceso de recuperación convencional de sangre de cordón. Típicamente se usa una aguja o cánula, con la ayuda de gravedad, para exsanguinar la placenta (ver, por ejemplo, Anderson, patente de E.U.A. No. 5,372,581; Hessel y otros, patente de E.U.A. No. 5,415,665). La aguja o cánula usualmente se coloca en la vena umbilical y la placenta se pueda masajear con cuidado para ayudar a drenar sangre de cordón desde la placenta. Dicha recuperación de sangre de cordón se puede realizar comercialmente, por ejemplo, LifeBank, Inc., Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry y CryoCell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin más manipulación para así minimizar interrupción de tejido durante la recuperación de sangre de cordón.
Típicamente, una placenta es transportada desde la sala de parto o alumbramiento a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio, para recuperación de sangre de cordón y recolección de perfundido. La placenta preferiblemente es transportada en un dispositivo de transporte estéril térmicamente aislado (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C), por ejemplo, al colocar la placenta, con cordón umbilical próximo sujeto, en una bolsa de plástico zip-lock estéril, que después se coloca en un contenedor aislado. En otra modalidad, la placenta es transportada en un equipo de recolección de sangre de cordón sustancialmente como se describe en la patente de E.U.A. No. 7,147,626. Preferiblemente, la placenta es entregada al laboratorio cuatro a veinticuatro horas después del alumbramiento. En ciertas modalidades, el cordón umbilical próximo se sujeta, preferiblemente dentro de 4-5 cm (centímetro) de la inserción en el disco de placenta antes de la recuperación de sangre de cordón. En otras modalidades, el cordón umbilical próximo se sujeta después de la recuperación de sangre de cordón pero antes de procesar más la placenta.
La placenta, antes de la recolección del perfundido, se puede almacenar bajo condiciones estériles y a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados). La placenta se puede almacenar durante un periodo más largo de cuarenta y ocho horas, y preferiblemente durante un periodo de cuatro a veinticuatro horas antes de perfundir la placenta para eliminar cualquier sangre de cordón residual. La placenta preferiblemente se almacena en una solución anticoagulante a una temperatura de 5°C a 25°C (Centígrados). Soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede usar una solución de heparina o warfarina de sodio. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (por ejemplo, 1% p/p en 1:1000 solución). La placenta exsanguinada preferiblemente se almacena por no más de 36 horas antes de recolectar perfundido de placenta. 6.4.3. Perfusión de Placenta Se describen métodos de perfundir placentas de mamífero y obtener perfundido de placenta, por ejemplo, en Hariri, patentes de E.U.A. Nos. 7,045,148 y 7,255,879, y en las publicaciones de solicitud de E.U.A. Nos. 2007/0190042 y 20070275362, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades.
Se puede obtener perfundido por paso de solución de perfundido, por ejemplo, solución salina, medio de cultivo o composiciones de recolección celular descritas antes, a través de vasculatura de placenta. En una modalidad, una placenta de mamífero es perfundida por paso de solución de perfusión a través de una o ambas de la arteria umbilical y vena umbilical. El flujo de solución de perfusión a través de la placenta se puede lograr usando, por ejemplo, flujo de gravedad en la placenta.
Preferiblemente, la solución de perfusión es forzada a través de la placenta usando una bomba, por ejemplo, una bomba peristáltica. La vena umbilical, por ejemplo, se puede canular con una cánula, por ejemplo, un TEFLON® o cánula de plástico, que se conecta a un aparato de conexión estéril, tal como tubo estéril. El aparato de conexión estéril se conecta a un colector de perfusión.
En preparación para perfusión, la placenta se orienta preferiblemente en tal manera que la arteria umbilical y vena umbilical están ubicadas en el punto más alto de la placenta. La placenta se puede perfundir por p aso de una solución de perfusión a través de la vasculatura de placenta, o a través de la vasculatura de placenta y tejido circundante. En una modalidad, la arteria umbilical y la vena umbilical están conectadas simultáneamente a una pipeta que se conecta vía un conector flexible a un depósito de la solución de perfusión. La solución de perfusión pasa en la vena y arteria umbilical. La solución de perfusión exuda desde y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos desde la superficie de la placenta que se fijó al útero de la madre durante la gestación. La solución de perfusión también se puede introducir a través de la abertura del cordón umbilical y se deja fluir o percolar fuera de las aberturas en la pared de la placenta que están en ¡nterface con la pared uterina maternal. En otra modalidad, la solución de perfusión se pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta desde la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta desde las venas umbilicales, es decir, se pasa a través sólo de la vasculatura de placenta (tejido fetal).
En una modalidad, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan simultáneamente, por ejemplo, a una pipeta que se conecta vía un conector flexible a un depósito de la solución de perfusión. La solución de perfusión se pasa en la vena umbilical y arteria. La solución de perfusión exuda desde y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en los tejidos circundantes de la placenta, y se recolecta en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que se fijó al útero de la madre durante la gestación. La solución de perfusión también se puede introducir a través de la abertura de cordón umbilical y se deja fluir o percolar fuera de las aberturas en la pared de la placenta que están en ¡nterface con la pared uterina maternal. Las células de placenta que se recolectan por este método, se pueden ser referidas como un método de "cacerola", están típicamente en una mezcla de células fetales y maternales.
En otra modalidad, la solución de perfusión se pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta desde la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta desde las venas umbilicales. Las células de placenta recolectadas por este método, que pueden ser referidas como un método de "circuito cerrado", son típicamente casi en exclusivo fetales.
El método de perfusión de circuito cerrado, en una modalidad, se puede realizar de la siguiente manera. Se obtiene una placenta post-parto dentro de aproximadamente 48 horas después del nacimiento. El cordón umbilical se sujeta y corta arriba de las pinzas. El cordón umbilical puede ser desechado, o se puede procesar para recuperar, por ejemplo, células madre de cordón umbilical, y/o para procesar la membrana de cordón umbilical para la producción de un biomaterial. La membrana amniótica puede ser retenida durante la perfusión, o se puede separar del corion, por ejemplo, usando disección directa con los dedos. Si la membrana amniótica se separa del corion antes de la perfusión, se puede, por ejemplo, descartar o procesar, por ejemplo, para obtener células madre por digestión enzimática, o para producir, por ejemplo, un biomaterial de membrana amniótica, por ejemplo, el biomaterial descrito en la publicación de solicitud de E.U.A. No. 2004/0048796. Después de limpiar la placenta de todos los coágulos sanguíneos visibles y sangre residual, por ejemplo, usando gasa estéril, los vasos de cordón umbilical son expuestos, por ejemplo, al cortar parcialmente la membrana de cordón umbilical para exponer una sección transversal del cordón. Los vasos son identificados, y abiertos, por ejemplo, al avanzar una pinza de cocodrilo cerrada a través del extremo cortado de cada vaso. El aparato, por ejemplo, tubo de plástico conectado a un dispositivo de perfusión o bomba periestá Itica , después se inserta en cada una de las arterias de placenta. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para el propósito, por ejemplo, una bomba periestáltica. El tubo de plástico, conectado a un depósito de recolección estéril, por ejemplo, una bolsa de sangre tal como una bolsa de recolección de 250 mi, después se inserta en la vena de placenta. Alternativamente, el tubo conectado a la bomba se inserta en la vena de placenta, y tubos a un depósito(s) de recolección se insertan en una o ambas de las arterias de placenta. La placenta entonces es perfundida con un volumen de solución de perfusión, por ejemplo, aproximadamente 750 mi de solución de perfusión. Después se recolectan células en el perfundido, por ejemplo, por centrifugación.
En una modalidad, el cordón umbilical próximo se sujeta durante la perfusión, y más preferible, se sujeta dentro de 4-5 cm (centímetros) de la inserción del cordón en el disco de placenta.
La primera recolección de fluido de perfusión de una placenta de mamífero durante el proceso de exsanguinación por lo general es coloreado con glóbulos rojos residuales de la sangre de cordón y/o sangre de placenta. El fluido de perfusión se hace más incoloro conforme la perfusión procede y los glóbulos de cordón residuales son lavados fuera de la placenta. Por lo general, de 30 a 100 mL de fluido de perfusión es adecuado para lavar al inicio sangre desde la placenta, pero se puede usar más o menos fluido de perfusión dependiendo de los resultados observados.
El volumen de líquido de perfusión usado para perfundir la placenta puede variar dependiendo del número de células de placenta a recolectarse, el tamaño de la placenta, el número de recolecciones a hacerse desde una única placenta, etc. En varias modalidades, el volumen de líquido de perfusión puede ser de 50 mL a 5000 ml_, 50 ml_ a 4000 mL, 50 ml_ a 3000 mL, 100 ml_ a 2000 mL, 250 mL a 2000 mL, 500 mL a 2000 mL, o 750 mL a 2000 mL. Típicamente, la placenta se perfunde con 700-800 mL de líquido de perfusión después de la exsanguinación.
La placenta se puede perfundir una pluralidad de veces sobre el curso de varias horas o varios días. Cuando la placenta se va a perfundir una pluralidad de veces, se puede mantener o cultivar bajo condiciones asépticas en un contenedor u otro recipiente adecuado, y perfundir con una composición de recolección celular, o una solución de perfusión estándar (por ejemplo, una solución salina normal tal como solución salina regulada con fosfato ("PBS") con o sin un anticoagulante (por ejemplo, heparina, warfarina de sodio, coumarina, bíshidroxicoumarina) y/o con o sin un agente antimicrobial (por ejemplo, ß-mercaptoetanol (0.1 mM); antibióticos tales como estreptomicina (por ejemplo, 40-100 µg ml), penicilina (por ejemplo, a 40U/ml), anfotericina B (por ejemplo, a 0.5 µ?/???). En una modalidad, una placenta aislada se mantiene o cultiva durante un periodo de tiempo sin recolectar el perfundido, de modo que la placenta se mantiene o cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 horas, o 2 ó 3 0 más días antes de la perfusión y recolección de perfundido. La placenta perfundida se puede mantener por una o más vez(es) adicional, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más horas, y perfundido una segunda vez con, por ejemplo, 700-800 mL fluido de perfusión. La placenta se puede perfundir 1, 2, 3, 4, 5 o más veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas. En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y recolección de solución de perfusión, por ejemplo, composición de recolección celular de placenta, es repetida hasta que el número de células nucleadas recuperadas caiga debajo de 100 células/ml. Los perfundidos en puntos de tiempo diferentes se pueden procesar más individualmente para recuperar poblaciones dependientes de tiempo de células, por ejemplo, células nucleadas totales. También se pueden agrupar perfundidos de puntos de tiempo diferentes. 6.4.4. Perfundido de Placenta y Células de Perfundido de Placenta Típicamente, el perfundido de placenta de una sola perfusión de placenta comprende de alrededor de 100 millones a aproximadamente 500 millones de células nucleadas, incluyendo células hematopoyéticas de las cuales se pueden producir células TSNK por el método descrito en la presente. En ciertas modalidades, las células de placenta o células de perfundido comprenden células CD34 + , por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas. Dichas células pueden, en una modalidad más específica, comprender células madre o progenitoras CD34 + CD45", células madre o progenitoras CD34 + CD45 + , o similares. En ciertas modalidades, el perfundido o células de perfundido son crioconservadas antes del aislamiento de células hematopoyéticas. En ciertas otras modalidades, el perfundido de placenta comprende, o las células de perfundido comprenden, sólo células fetales, o una combinación de células fetales y células maternales. 6.5. Células TSNK En un aspecto, en la presente se proveen células TSNK, las células NK producidas por los métodos descritos en la presente (por ejemplo, método de dos pasos). Además en la presente se provee una población de células que comprende las células TSNK producidas por los métodos descritos en la presente (por ejemplo, método de dos pasos). En una modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son CD3"CD56 + CD16". En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente CD94+CD117 + . En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente CD161". En otra modalidad específica, dichas células NK (por ejemplo, células TSNK) son adicionalmente NKG2D + . En otra modalidad específica, dichas células NK son adicionalmente NKp46 + . En otra modalidad específica, dichas células NK son adicionalmente CD226 + .
En ciertas modalidades, más de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% de dichas células TSNK son CD56+ y CD16\ En otras modalidades, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88% o 90% de dichas células TSNK son CD3" y CD56 + . En otras modalidades, por lo menos 50%, 52%,.54%, 56%, 58% o 60% de dichas células TSNK son NKG2D + . En otras modalidades, menos de 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% o 3% de dichas células son NKB1 +. En ciertas otras modalidades, menos de 30%, 20%, 10%, 8%, 6%, 4% o 2% de dichas células TSNK son NKAT2 + . En ciertas otras modalidades, menos de 30%, 20%, 10%, 8%, 6%, 4% o 2% de dichas células TSNK son CD56" y CD16 + . En más modalidades específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65% o 70% de dichas células TSNK CD3\ CD56+ son NKp46 + . En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o 85% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD117\ En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD94+. En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de dichas células TSNK CD3", CD56* son CD161". En otras modalidades más específicas, por lo menos 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD226+. En más modalidades específicas, por lo menos 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de dichas células TSNK CD3\ CD56+ son CD7+. En más modalidades específicas, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% de dichas células TSNK CD3", CD56+ son CD5 + .
En varias otras modalidades, las células TSNK se pueden combinar con, por ejemplo, células NK, en donde dichas células NK se han aislado de una fuente de tejido y no se han expandido; las células NK aisladas desde una fuente de tejido y expandidas, o células NK producidas por un método diferente, por ejemplo, células asesinas naturales CD56+CD16 + , por ejemplo, en relaciones de, por ejemplo, aproximadamente 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 o aproximadamente 9:1. Como se usa en este contexto, "aislado" significa que las células han sido eliminadas de su medio ambiente de tejido normal.
Las células TSNK pueden tener un genotipo fetal o un genotipo maternal. Por ejemplo, ya que la placenta post-parto, como una fuente de células hematopoyéticas adecuadas para producir células TSNK, comprenden tejido y células del feto y de la madre, el perfundido de placenta puede comprender células fetales solamente, o una mayoría sustancial de células fetales (por ejemplo, más de aproximadamente 90%, 95%, 98% o 99%) o puede comprender una mezcla de células fetales y maternales (por ejemplo, las células fetales comprenden menos de aproximadamente 90%, 80%, 70%, 60% o 50% de las células nucleadas totales del perfundido). En una modalidad, las células TSNK se derivan sólo de células hematopoyéticas de placenta fetal, por ejemplo, células obtenidas de perfusión de circuito cerrado de la placenta en donde la perfusión produce perfundido que comprende una mayoría sustancial, o solamente, células hematopoyéticas de placenta fetal. En otra modalidad, las células TSNK se derivan de células fetales y maternales, por ejemplo, células obtenidas por perfusión por el método de cacerola (ver antes), en donde la perfusión produjo perfundido que comprende una mezcla de células de placenta fetales y maternales. De esta manera, en una modalidad, en la presente se provee una población de células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta, la mayoría sustancial de las cuales tienen el genotipo fetal. En otra modalidad, en la presente se provee una población de células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta que comprenden células asesinas naturales que tienen el genotipo fetal y células asesinas naturales que tienen el fenotipo maternal.
También se provee en la presente poblaciones de células TSNK que comprenden células asesinas naturales no producidas por los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, en una modalidad, en la presente se provee una población de células TSNK que también comprende células asesinas naturales aisladas de, por ejemplo, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea, o una combinación de dos o más de los anteriores, o células NK expandidas por un método diferente de los métodos descritos en la presente. Dichas poblaciones de células TSNK pueden comprender las células TSNK y otras células NK en, por ejemplo, una relación de aproximadamente 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 10:1, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 o aproximadamente 1:100 o similares.
En ciertas modalidades, las células asesinas naturales aisladas (por ejemplo, células TSNK) o poblaciones enriquecidas para células asesinas naturales (por ejemplo, células TSNK) se pueden evaluar al detectar uno o más marcadores f uncionalmente relevantes, por ejemplo, CD94, CD161, NKp44, DNAM-1 , 2B4, NKp46, CD94, KIR y la familia NKG2 de receptores activadores (por ejemplo, NKG2D). En algunas modalidades, la pureza de las células asesinas naturales aisladas o enriquecidas se puede confirmar al detectar uno o más de CD56, CD3 y CD16.
Opcionalmente, se puede evaluar la actividad citotóxica de células asesinas naturales aisladas o enriquecidas, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidad usando células tumorales, por ejemplo, células tumorales cultivadas K562, LN-18, U937, WER1-RB-1, U-118MG, HT-29, HCC2218, KG-1 o U266, o similares como células diana. 6.6. Células TSNK en Combinación con Perfundido de Placenta Además en la presente se proveen composiciones que comprenden células TSNK en combinación con perfundido de placenta, células de perfundido de placenta y/o células de placenta adherentes, por ejemplo, para usarse en suprimir la proliferación de una célula tumoral o pluralidad de células tumorales. 6.6.1. Combinaciones de Células TSNK y Perfundido o Células de Perfundido Además en la presente se proveen composiciones que comprenden combinaciones de las células TSNK y perfundido de placenta y/o células de perfundido de placenta. En una modalidad, por ejemplo, en la presente se provee un volumen de perfundido de placenta suplementado con células TSNK. En modalidades específicas, por ejemplo, cada mililitro de perfundido de placenta es suplementado con aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células TSNK. En otra modalidad, se suplementan células de perfundido de placenta con células TSNK. En ciertas otras modalidades, cuando células de perfundido de placenta se combinan con células TSNK, las células de perfundido de placenta en general comprenden aproximadamente, más de aproximadamente, o menos de aproximadamente, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del número total de células. En ciertas otras modalidades, cuando células TSNK se combinan con una pluralidad de células de perfundido de placenta y/o células asesinas naturales combinadas, las células NK en general comprenden aproximadamente, más de aproximadamente, o menos de aproximadamente, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del número total de células. En ciertas otras modalidades, cuando se usan células TSNK para suplementar perfundido de placenta, el volumen de solución (por ejemplo, solución salina, medio de cultivo o similar) en donde las células se suspenden comprende aproximadamente, más de aproximadamente, o menos de aproximadamente, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del volumen total de perfundido más células, en donde las células TSNK se suspenden a aproximadamente 1 x 104, 5 x 10\ 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro antes de suplementación.
En otras modalidades, cualquiera de las combinaciones anteriores de células, a su vez, se combina con sangre de cordón umbilical o células nucleadas de sangre de cordón umbilical.
Además en la presente se agrupa perfundido de placenta que se obtiene de dos o más fuentes, por ejemplo, dos o más placentas, y se combinan, por ejemplo, agrupadas. Dicho perfundido agrupado puede comprender aproximadamente volúmenes iguales de perfundido de cada fuente, o puede comprender volúmenes diferentes de cada fuente. Los volúmenes relativos de cada fuente se pueden seleccionar aleatoriamente, o con base en, por ejemplo, una concentración o cantidad de uno o más factores celulares, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o similares; el número de células de placenta en perfundido de cada fuente; u otras características de perfundido de cada fuente. El perfundido de múltiples perfusiones de la misma placenta se puede agrupar de manera similar.
De manera similar, en la presente se proveen células de perfundido de placenta, y células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta, que se obtienen de dos o más fuentes, por ejemplo, dos o más placentas, o se agrupan. Dichas células agrupadas pueden comprender aproximadamente números iguales de células de dos o más fuentes, o números diferentes de células de una o más de las fuentes agrupadas. Los números relativos de células de cada fuente se pueden seleccionar con base en, por ejemplo, el número de uno o más tipos celulares específicos en las células a agruparse, por ejemplo, el número de células CD34 + , etc.
Además en la presente se proveen células TSNK, y combos de células TSNK con perfundido de placenta y/o células de perfundido de placenta, que han sido probados para determinar el grado o cantidad de supresión de tumor (es decir, la potencia) a ser esperada de, por ejemplo, un número dado de células TSNK, o un volumen dado de perfundido. Por ejemplo, una alícuota o número de muestra de células se contacta con un número conocido de células tumorales bajo condiciones en donde las células tumorales de lo contrario prolif eraría , y la velocidad de proliferación de las células tumorales en presencia de perfundido de placenta, células de perfundido, y la velocidad de proliferación de las células tumorales en presencia de perfundido de placenta, células de perfundido, células asesinas naturales de placenta, o combinaciones de los mismos, con el tiempo (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas, o más) se compara con la proliferación de un número equivalente de las células tumorales en ausencia de perfundido, células de perfundido, células asesinas naturales de placenta, o combinaciones de los mismos. La potencia de las células se puede expresar, por ejemplo, como el número de células o volumen de solución requerido para suprimir crecimiento celular tumoral, por ejemplo, por aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o similar.
En ciertas modalidades, se proveen células TSNK como unidades administrables de grado farmacéutico. Dichas unidades se pueden proveer en volúmenes discretos, por ejemplo, 15 ml_, 20 ml_, 25 mL, 30 mL, 35 ml_, 40 mL, 45 ml_, 50 ml_, 55 ml_, 60 ml_, 65 ml_, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL, 90 mL, 95 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, o similares. Dichas unidades se pueden proveer para así contener un número especificado de células, por ejemplo, células TSNK solas, o células TSNK en combinación con otras células NK o células de perfundido, por ejemplo, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro, o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células por unidad. En modalidades específicas, las unidades pueden comprender aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o a lo mucho aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro, o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células por unidad. Dichas unidades se pueden proveer para contener números especificados de células TSNK, y/o cualquier otra célula.
En las modalidades anteriores, las células TSNK o combinaciones de células TSNK con otras células NK, células de perfundido o perfundido pueden ser autólogas a un recipiente (es decir, obtenidas del recipiente), o alogénicas a un recipiente (es decir, obtenidas de por lo menos otro individuo de dicho recipiente).
En ciertas modalidades, cada unidad de células es marcada para especificar uno o más de volumen, número de células, tipo de células, ya se que la unidad haya sido enriquecida por un tipo particular de célula, y/o potencia de un número dado de células en una unidad, o un número dado de mililitros de la unidad, es decir, si las células en la unidad causan una supresión medible de proliferación de un tipo particular o tipos de célula tumoral. 6.6.2. Combinaciones de Células TSNK y Células Madre de Placenta Adherentes En otras modalidades, las células TSNK, ya sea solas o en combinación con perfundido de placenta o células de perfundido de placenta, se suplementa con células de placenta adherentes aisladas, por ejemplo, células madre de placenta y células multipotentes de placenta como se describe, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. De Hariri 7,045,148 y 7,255,879, y en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. No 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades. "Células de placenta adherentes" significa que las células son adherentes a una superficie de cultivo de tejido, por ejemplo, plástico de cultivo de tejido. Las células de placenta adherentes útiles en las composiciones y métodos descritos en la presente no son trofoblastos, células de germen embrionico o células madre embriónicas. En ciertas modalidades, se usan células madre de placenta adherentes como células alimentadoras durante los procesos (por ejemplo, método de dos pasos) como se describió antes.
Las células TSNK, ya sea solas o en combinación con perfundido de placenta o células de perfundido de placenta se pueden suplementar con, por ejemplo, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro, o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 , 5 ? 108, o más células de placenta adherentes por mililitro, o 1 x 10\ 5 x 1 O4, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 1 O6, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro, o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células de placenta adherentes. Las células de placenta adherentes en las combinaciones pueden ser, por ejemplo, células de placenta adherentes que se han cultivado para, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ó 40 duplicaciones de población, o más.
Las células de placenta adherentes aisladas, cuando se cultivan en cultivos primarios o expandidas en cultivo celular, se adhieren al sustrato de cultivo de tejido, por ejemplo, superficie de contenedor de cultivo de tejido (por ejemplo, plástico de cultivo de tejido). Las células de placenta adherentes en cultivo asumen una apariencia estrellada por lo general fibroblastoide, con un número de procesos citoplásmicos que se extienden desde el cuerpo celular central. Sin embargo, las células de placenta adherentes distinguibles morfológicamente de fibroblastos cultivados bajo las mismas condiciones, como las células de placenta adherentes exhiben un número mayor de dichos procesos que los fibroblastos. Morfológicamente, las células de placenta adherentes también son distinguibles de células madre hematopoyéticas, que por lo general asumen una morfología más redonda, o adoquinada, en cultivo.
Las células de placenta adherentes aisladas, y poblaciones de células de placenta adherentes, útiles en las composiciones y métodos provistos en la presente, expresan una pluralidad de marcadores que se pueden usar para identificar y/o aislar las células, o poblaciones de células que comprenden las células de placenta adherentes. Las células de placenta adherentes, y poblaciones de células de placenta adherentes útiles en las composiciones y métodos provistos en la presente incluyen células de placenta adherentes y poblaciones celulares que contienen células de placenta adherentes obtenidas directamente de la placenta, o cualquier parte de las mismas (por ejemplo, amnios, corion, placa de amnios-corion, cotiledones de placenta, cordón umbilical, y similares). La población de célula madre de placenta adherente, en una modalidad, es una población (es decir, dos o más) de células madre de placenta adherentes en cultivo, por ejemplo, una población en un contenedor, por ejemplo, una bolsa.
Las células de placenta adherentes en general expresan los marcadores CD73, CD105, y CD200, y/u OCT-4, y no expresan CD34, CD38 o CD45. Las células madre de placenta adherentes también pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) y HLA-DR. Estos marcadores se pueden usar para identificar células de placenta adherentes, y para distinguir las células de placenta adherentes de otros tipos celulares. Ya que as células de placenta adherentes pueden expresar CD73 y CD105, pueden tener características de tipo de célula madre mesenquimatosa. La falta de expresión de CD34, CD38 y/o CD45 identifica las células madre de placenta adherentes como células madre no hematopoyéticas.
En ciertas modalidades, las células de placenta adherentes aisladas descritas en la presente suprimen de manera detectable proliferación celular de cáncer o crecimiento tumoral.
En ciertas modalidades, las células de placenta adherentes aisladas son células madre de placenta aisladas. En ciertas otras modalidades, las células de placenta adherentes aisladas son células multipotentes de placenta aisladas. En una modalidad específica, las células de placenta adherentes aisladas son CD34", CD10+ y CD105 + como se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD1CT, CD105+ son células madre de placenta. En otra modalidad más específica, las células de placenta aisladas CD34", CD10+, CD105+ son células de placenta adherentes multipotentes. En otra modalidad específica, las células de placenta aisladas CD34", CD10+, CD105+ tienen el potencial de diferenciar en células de un fenotipo neutral, células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico. En una modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105* son adicionalmente CD200 + . En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células de placenta adherentes CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ son adicionalmente CD90* y CD45", como se detecta por citometría de flujo En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes CD34", CD10 + , CD105", CD200\ CD90 + , CD45" son adicionalmente CD80" y CD86", como se detecta por citometría de flujo.
En una modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son CD200+, HLA-G + . En una modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" o CD45". En una modalidad más específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105 + . En otra modalidad, dichas células de placenta adherentes aisladas producen uno o más cuerpos de tipo embrioide al cultivarse bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son CD73+, CD105+, CD200\ En una modalidad específica de dichas poblaciones, dichas células de placenta adherentes aisladas también son HLA-G + . En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38' y CD45". En una modalidad más específica, dichas células de placenta adherentes aisladas son también CD34", CD38", CD45" y HLA-G\ En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas producen uno o más cuerpos de tipo embrioide al cultivarse bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son CD200 + , OCT-4 + . En una modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD73+ y CD105 + . En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son HLA-G + . En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34', CD38" y CD45". En una modalidad más específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38", CD45", CD73\ CD105+ y HLA-G + . En otra modalidad específica, las células de placenta adherentes aisladas también producen uno o más cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.
En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son CD73 + , CD105+ y HLA-G + . En una modalidad específica, células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, dichas células madre adherentes aisladas también son OCT-4 + . En otra modalidad específica, dichas células madre adherentes también son CD200*. En una modalidad más específica, dichas células madre adherentes también son CD34", CD38", CD45\ OCT-4+ y CD200 + .
En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son células madre CD73 + , CD105+, en donde dichas células producen uno o más cuerpos de tipo embrioide bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En una modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, las células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, las células de placenta adherentes aisladas también son OCT-4 + . En una modalidad más específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son OCT-4*, CD34", CD38" y CD45 En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas son células madre OCT-4+, en donde dichas células de placenta adherentes aisladas producen uno o más cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide, y en donde dichas células madre han sido identificadas como detectablemente suprimiendo proliferación celular de cáncer o crecimiento tumoral.
En varias modalidades, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de dichas células de placenta adherentes aisladas son OCT-4 + . En una modalidad específica de las poblaciones anteriores, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD73+ y CD105 + . En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, dichas células madre son CD200 + . En una modalidad más específica, dichas células de placenta adherentes aisladas también son CD73\ CD105 + , CD200 + , CD43", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, dichas células de placenta adherentes aisladas se han expandido, por ejemplo, pasado por lo menos una vez, por lo menos tres veces, por lo menos cinco veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 15 veces o por lo menos 20 veces.
En una modalidad más específica de cualquiera de las modalidades anteriores, las células de placenta adherentes aisladas expresan ABC-p (una proteína transportadora de ABC específica de placenta; ver, por ejemplo, Allikmets y otros, Cáncer Res. 58(23):5337-9 (1998)).
En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas CD29\ CD44\ CD73\ CD90 + , CD105 + , CD200 + , CD34" y CD133\ En otra modalidad, las células de placenta adherentes aisladas secretan constitutivamente IL-6, IL-8 y proteína quimioatractiva de monocito (MCP-1 ).
Cada una de las células de placenta adherentes aisladas referenciadas antes pueden comprender células obtenidas y aisladas directamente de una placenta de mamífero, o células que se han cultivado y pasado por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 o más veces, o una combinación de los mismos. Las pluralidades supresoras de célula tumoral de las células de placenta adherentes aisladas descritas antes pueden comprender aproximadamente, por lo menos, o no más de, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o células de placenta adherentes aisladas. 6.6.3. Composiciones que Comprenden Medios Acondicionados de Células de Placenta Adherentes En la presente también se provee el uso de una composición que comprende células TSNK y adicionalmente medio acondicionado, en donde dicha composición es supresora de tumor, o es efectiva en el tratamiento de cáncer o infección viral. Las células de placenta adherentes como se describe en la sección 6.6.2, anteriores se pueden usar para producir medio acondicionado que es supresor de célula tumoral, anti-cáncer o anti-viral, es decir, medio que comprende una o más biomoléculas secretadas o excretadas por las células que tienen un efecto supresor de célula tumoral detectable, efecto anti-cáncer o efecto antiviral. En varias modalidades, el medio acondicionado comprende medio en donde las células han proliferado (es decir, se han cultivado) durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó más días. En otras modalidades, el medio acondicionado comprende medio en donde dichas células han crecido a por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluencia. Dicho medio acondicionado se puede usar para soportar el cultivo de una población separada de células, por ejemplo, células de placenta, o células de otra clase. En otra modalidad, el medio acondicionado provisto en la presente comprende medio en donde las células de placenta adherentes aisladas, por ejemplo, células madre de placenta adherentes aisladas o células multipotentes de placenta adherentes aisladas, y células diferentes de las células de placenta adherentes aisladas, por ejemplo, células madre no de placenta o células multipotentes, se han cultivado.
Dicho medio acondicionado se puede combinar con cualquiera de, o cualquier combinación de células TSNK, perfundido de placenta, células de perfundido de placenta para formar una composición que sea supresor de célula tumoral, anti-cáncer o antiviral. En ciertas modalidades, la composición comprende menos de la mitad de medio acondicionado en volumen, por ejemplo, aproximadamente, o menos de aproximadamente, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% en volumen.
De esta manera, en una modalidad, en la presente se provee una composición que comprende células TSNK y medio de cultivo a partir de un cultivo de células de placenta adherentes aisladas, en donde dichas células de placenta adherentes aisladas (a) se adhieren a un sustrato; y (b) son CD34 , CD10+ y CD105 + ; en donde dicha composición suprime detectablemente el crecimiento o proliferación de células tumorales, o es anti-cáncer o antiviral. En una modalidad específica, las células de placenta adherentes aisladas son CD34", CD10+ y CD105+, como se detecta por citometría de flujo. En una modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105+ son células madre de placenta. En otra modalidad más específica, las células de placenta aisladas CD34', CD10+, CD105+ son células de placenta adherentes multipotentes. En otra modalidad específica, las células de placenta aisladas CD34', CD10+, C105+ tienen el potencial de diferenciar en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico, o células de un fenotipo condrogénico. En una modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105+ son adicionalmente CD200+. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105+ son adicionalmente CD90+ o CD45" como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes aisladas CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ son adicionalmente CD90+ o CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ son adicionalmente CD90+ y CD45", como se detecta por citometría de flujo. En otra modalidad más específica, las células de placenta adherentes CD34", CD10\ CD105 + , CD200 + , CD90 + , CD45" son adicionalmente CD80" y CD86", como se detecta por citometría de flujo.
En otra modalidad, en la presente se provee una composición que comprende células TSNK y medio de cultivo a partir de un cultivo de células de placenta adherentes aisladas, en donde dichas células de placenta adherentes aisladas (a) se adhieren a un sustrato; y (b) expresan CD200 y HLA-G , o expresan CD73, CD105 y CD200, o expresan CD200 y OCT-4, o expresan CD73, CD105 y HLA-G, o expresan CD73 y CD105 y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células de placenta que comprenden las células madre de placenta cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide, o expresan OCT-4 y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células de placenta que comprenden las células madre de placenta cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide; en donde dicha composición suprime de manera detectable el crecimiento o proliferación de células tumorales, o es anti-cáncer o antiviral. En una modalidad específica, la composición comprende además una pluralidad de dichas células de placenta adherentes aisladas. En otra modalidad específica, la composición comprende una pluralidad de células de no placenta. En una modalidad más específica, dichas células de no placenta comprenden células CD34 + , por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas, tales como células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica, células progenitores hematopoyéticas de sangre de cordón, o células progenitoras hematopoyéticas de sangre de placenta. Las células de no placenta también pueden comprender células madre, tales como células madre mesenquimatosas, por ejemplo, células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea. Las células de no placenta también pueden ser uno o más tipos de células adultas o líneas celulares. En otra modalidad específica, la composición comprende un agente antiproliferante, por ejemplo, un a nti-M I P- 1 a o anticuerpo anti-M I P- 1 ß.
En una modalidad específica, el medio de cultivo acondicionado por una de las células o combinaciones celulares descritas antes se obtiene a partir de una pluralidad de células de placenta adherentes aisladas co-cultivadas con una pluralidad de células tumorales de alrededor de 1:1 a aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1 células de placenta adherentes aisladas a células tumorales. Por ejemplo, el medio de cultivo acondicionado o sobrenadante se puede obtener de un cultivo que comprende alrededor de 1 x 105 células de placenta adherentes aisladas, aproximadamente 1 x 106 células de placenta adherentes aisladas, aproximadamente 1 x 107 células de placenta adherentes aisladas o aproximadamente 1 x 108 células de placenta adherentes aisladas, o más. En otra modalidad específica, el medio de cultivo acondicionado o sobrenadante se obtiene de un co-cultivo que comprende de alrededor de 1 x 105 a aproximadamente 5 x 105 células de placenta adherentes aisladas y aproximadamente 1 x 105 células tumorales; de alrededor de 1 x 106 a aproximadamente 5 x 106 células de placenta adherentes aisladas y aproximadamente 1 x 106 células tumorales; de alrededor de 1 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células de placenta adherentes aisladas y aproximadamente 1 x 107 células tumorales; o de alrededor de 1 x 108 a aproximadamente 5 x 108 células de placenta adherentes aisladas y aproximadamente 1 x 108 células tumorales. 6.7. Conservación de Células Las células, por ejemplo, células TSNK o células de perfundido de placenta comprendiendo células madre o células progenitoras hematopoyéticas, se pueden conservar, es decir, colocar bajo condiciones que permiten almacenamiento a largo plazo, o bajo condiciones que inhiben muerte celular, por ejemplo, por apoptosis o necrosis.
Se puede producir perfundido de placenta por paso de una composición de recolección celular a través de por lo menos una parte de la placenta, por ejemplo, a través de la vasculatura de placenta. La composición de recolección celular comprende uno o más compuestos que actúan para conservar células contenidas dentro del perfundido. Dicha composición de recolección celular de placenta puede comprender un inhibidor de apoptosis, inhibidor de necrosis y/o un perf luorocarburo portador de oxígeno, como se describe en la publicación de solicitud de E.U.A. No. 20070190042 relacionada, la descripción de la cual se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.
En una modalidad, el perfundido o una población de células de placenta se recolectan de una placenta post-parto de mamífero, por ejemplo, humano, al contactar el perfundido o población de células con una composición de recolección celular comprendiendo un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarburo portador de oxígeno, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir apoptosis en la población de células de placenta, por ejemplo, células de placenta adherentes, por ejemplo, células madre de placenta o células multipotentes de placenta, en comparación con una población de células no contactadas con el inhibidor de apoptosis. Por ejemplo, la placenta se puede perfundir con la composición de recolección celular, y células de placenta, por ejemplo, células de placenta nucleadas totales, se aislan de ahí. En una modalidad específica, el inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad específica, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de JNK. En una modalidad más específica, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciación o proliferación de células de placenta adherentes, por ejemplo, células madre de placenta adherentes o células multipotentes de placenta adherentes. En otra modalidad, la composición de recolección celular comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarburo portador de oxígeno en fases separadas. En otra modalidad, la composición de recolección celular comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarburo portador de oxígeno en una emulsión. En otra modalidad, la composición de recolección celular adicionalmente comprende un emulsor, por ejemplo, lecitina. En otra modalidad, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarburo son entre de alrededor de 0°C y aproximadamente 25°C al momento de contactar las células de placenta. En otra modalidad más específica, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarburo son entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre alrededor de 2°C y aproximadamente 5°C, al momento de contactar las células de placenta. En otra modalidad más específica, dicho contacto se realiza durante transporte de dicha población de células. En otra modalidad más específica, dicho contacto se realiza durante la congelación y descongelación de dicha población de células.
En otra modalidad, perfundido de placenta y/o células de perfundido de placenta se puede recolectar y conservar al contactar el perfundido y/o células con un inhibidor de apoptosis y un compuesto conservador de órgano, en donde dicho inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o prevenir apoptosis de las células, en comparación con perfundido o células de placenta no contactadas con el inhibidor de apoptosis. En una modalidad específica, el compuesto conservador de oxígeno es solución UW (descrita en la patente de E.U.A. No. 4,798,824; también conocida como VIASPAN™; ver también Soouthard y otros, Transplantation 49(2):251 -257 (1990) o una solución descrita en Stern y otros, patente de E.U.A. No. 5,552,267, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades. En otra modalidad, dicha composición conservadora de órgano es almidón de hidroxietilo, ácido lactobiónico, rafinosa o una combinación de los mismos. En otra modalidad, la composición de recolección celular de placenta comprende adicionalmente un perfluorocarburo portador de oxígeno, ya sea en dos fases o como una emulsión.
En otra modalidad del método, las células de placenta son contactadas con una composición de recolección celular comprendiendo un inhibidor de apoptosis y perfluorocarburo portador de oxígeno, compuesto conservador de órgano, o combinación de los mismos, durante perfusión. En otra modalidad, las células de placenta son contactadas con dicho compuesto de recolección celular después de la recolección por perfusión.
Típicamente, durante la recolección, enriquecimiento y aislamiento celular de placenta, es preferible minimizar o eliminar estrés celular debido a hipoxia y estrés mecánico. En otra modalidad del método, por tanto, perfundido de placenta o una población de células de placenta se expone a una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento por menos de seis horas durante dicha conservación, en donde una condición hipóxica es una concentración de oxígeno que es menos de la concentración normal de oxígeno sanguíneo. En una modalidad más específica, dicho perfundido o población de células de placenta se expone a dicha condición hipóxica por menos de dos horas durante dicha conservación. En otra modalidades más específica, dicha población de células de placenta se expone a dicha condición hipóxica por menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condición hipóxica, durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento. En otra modalidad específica, dicha población de células de placenta no se expone a esfuerzo cortante durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento.
Las células, por ejemplo, células de perfundido de placenta, células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre hematopoyéticas CD34 + ; células NK, por ejemplo, células TSNK; células de placenta adherentes aisladas provistas en la presente se pueden crioconservar, por ejemplo, en medio de crioconservación en pequeños contenedores, por ejemplo, ampollas o frascos de septo. En ciertas modalidades, las células provistas en la presente se crioconservan a una concentración de aproximadamente 1 x 104 - 5 x 108 células por mL. En modalidades más específicas, las células provistas en la presente se crioconservan a una concentración de aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 células por mL.
El medio de crioconservación adecuado incluye, pero no se limita a, solución salina normal, medio de cultivo que incluye, por ejemplo, medio de crecimiento, o medio de congelación celular, por ejemplo, medio de congelación celular comercia Imente disponible, por ejemplo, C2695, C2639 o C6039 (Sigma); CryoStor® CS2, CryoStor® CS5 o CryoStor® CS10 (BioLife Solutions). El medio de crioconservación comprende preferiblemente DMSO (dimetilsulfóxido), a una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% (v/v). El medio de crioconservación puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa, dextran, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), trehalosa, y/o glicerol. En ciertas modalidades, el medio de crioconservación comprende aproximadamente 1%-10% DMSO, aproximadamente 25%-75% dextran y/o aproximadamente 20-60% albúmina de suero humano (HSA). En ciertas modalidades, el medio de crioconservación comprende aproximadamente 1 % - 10 % DMSO, aproximadamente 25%-75% trehalosa y/o aproximadamente 20-60% HSA humano. En una modalidad específica, el medio de crioconservación comprende 5% DMSO, 55% dextran y 40% HSA. En una modalidad más específica, el medio de crioconservación comprende 5% DMSO, 55% dextran (10% p/v en solución salina normal) y 40% HSA. En otra modalidad específica, el medio de crioconservación comprende 5% DMSO, 55% trehalosa y 40% HSA. En una modalidad más específica, el medio de crioconservación comprende 5% DMSO, 55% trehalosa (10% p/v en solución salina normal) y 40% HSA. En otra modalidad específica, el medio de crioconservación comprende CryoStor® CS5. En otra modalidad específica, el medio de crioconservación comprende CryoStor® CS10.
Las células provistas en la presente se pueden crioconservar por cualquiera de una variedad de métodos, y en ninguna etapa de cultivo, expansión o diferenciación celular. Por ejemplo, las células provistas en la presente se pueden crioconservar justo después del aislamiento de los tejidos u órganos de origen, por ejemplo, perfundido de placenta o sangre de cordón umbilical, o durante, o después del primer o segundo paso de los métodos delineados antes. En ciertas modalidades, las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas son crioconservadas dentro de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45 minutos o dentro de aproximadamente 1 , 2, 4, 6, 10, 12, 18, 20 ó 24 horas después del aislamiento desde los tejidos u órganos de origen. En ciertas modalidades, dichas células son crioconservadas dentro de 1 , 2 ó 3 días después del aislamiento de los tejidos u órganos de origen. En ciertas modalidades, dichas células son crioconservadas después de cultivarse en un primer medio como se describe en la sección 6.2.1 anterior, por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días. En algunas modalidades, dichas células son crioconservadas después de cultivarse en un primer medio como se describe en la sección 6.2.1 anterior, por aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 25, 27 ó 28, en un segundo medio por aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 0, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días como se describe en la sección 6.2.1 anterior.
En un aspecto, en la presente se provee un método de crioconservar una población de células NK, por ejemplo, células TSNK. En una modalidad, dicho método comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-l L (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas, y (c) crioconservar las células NK del paso (b) en un medio de crioconservación. En una modalidad específica, dicho paso (c) comprende además (1) preparar una solución de suspensión celular; (2) agregar medio de crioconservación a la solución de suspensión celular del paso (1) para obtener suspensión celular crioconservada; (3) enfriar la suspensión celular crioconservada del paso (3) para obtener una muestra crioconservada; y (4) almacenar la muestra crioconservada debajo de -80°C. En ciertas modalidades, el método incluye ningún paso intermediario entre el paso (a) y (b), y entre el paso (b) y (c), y/o ningún paso de cultivo adicional antes del paso (a).
En otra modalidad, dicho método de crioconservar una población de células NK, por ejemplo, células TSNK comprende: (a) expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), IL-2, interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) y heparina, y en donde dicho SCF, IL-2, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas, y (c) crioconservar las células NK del paso (b) en un medio de crioconservación. En una modalidad específica, dicho paso (c) comprende además (1) preparar una solución de suspensión celular; (2) agregar medio de crioconservación a la solución de suspensión celular del paso (1) para obtener suspensión celular crioconservada ; (3) enfriar la suspensión celular crioconservada del paso (3) para obtener una muestra crioconservada; y (4) clasificar la muestra crioconservada debajo de -80°C. En ciertas modalidades, el método incluye ningún paso intermediario entre el paso (a) y (b), y entre el paso (b) y (c).
Las células provistas en la presente se enfrían preferiblemente en un congelador de velocidad controlada, por ejemplo, a aproximadamente 0.1, 0.3, 0.5 ó 1°C/min durante la crioconservación . Una temperatura de crioconservación preferida es de alrededor de -80°C a aproximadamente -180°C, preferiblemente de alrededor de -125°C a aproximadamente -140°C. Las células crioconservadas se pueden transferir a nitrógeno líquido antes de descongelar para usarse. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que las ampollas alcanzan aproximadamente -90°C, son transferidas a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. Las células crioconservadas preferiblemente se descongelan a una temperatura de alrededor de 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37°C. En ciertas modalidades, las células crioconservadas se descongelan después de crioconservarse durante aproximadamente 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18, 20 ó 24 horas, o durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días. En ciertas modalidades, las células crioconservadas se descongelan después de crioconservarse durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 meses. En ciertas modalidades, las células crioconservadas se descongelan después de crioconservarse durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 años.
El medio de descongelación adecuado incluye, pero no se limita a, solución salina normal, medio de cultivo de plasmalita incluyendo, por ejemplo, medio de crecimiento, por ejemplo, medio de RPMI. En modalidades preferidas, el medio de descongelación comprende uno o más suplementos de medio (por ejemplo, nutrientes, citocinas y/o factores). Los suplementos de medio adecuados para descongelar células provistos en la presente incluyen, por ejemplo, sin limitación, suero tal como suero humano AB, suero bovino fetal (FBS) o suero de becerro fetal (FCS), vitaminas, albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero bovino (BSA), aminoácidos (por ejemplo, L-glutamina), ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico, ácido linoleico o ácido palmítico), insulina (por ejemplo, insulina humana recombinante), transferina (transferina humana saturada de hierro), ß-mercaptoetanol, factor de célula madre (SCF), ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FU3-L), citocinas tales como interleucina-2 ( I L - 2 ) , interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15), trombopoyetina (Tpo) o heparina. En una modalidad específica, el medio de descongelación útil en los métodos provistos en la presente comprende RPMI. En otra modalidad específica, dicho medio de descongelación comprende plasmalita. En otra modalidad específica, dicho medio de descongelación comprende aproximadamente 0.5-20% FBS. En otra modalidad específica, dicho medio de descongelación comprende aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15 o 20% FBS. En otra modalidad especifica, dicho medio de descongelación comprende aproximadamente 0.5-20% HSA. En otra modalidad específica, dicho medio de descongelación comprende aproximadamente 1, 2.5, 5, 10, 15 o 20% HSA. En una modalidad más específica, dicho medio de descongelación comprende RPMI y aproximadamente 10% FBS. En otra modalidad más específica, dicho medio de descongelación comprende plasmalita y aproximadamente 5% HSA.
Los métodos de crioconservacion provistos en la presente se pueden optimizar para permitir almacenamiento a largo plazo, o bajo condiciones que inhiben muerte celular, por ejemplo, por apoptosis y necrosis. En una modalidad, las células post-descongelación comprenden más de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 0 98% de células viables, como se determina, por ejemplo, por contador celular automático o método de azul triptan. En otra modalidad, las células post-descongelación comprenden aproximadamente 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 o 25% de células muertas. En otra modalidad, las células post-descongelación comprenden aproximadamente 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 o 25% de células apoptóticas tempranas. En otra modalidad, aproximadamente 0.5, 1, 5, 10, 15 ó 20% de células post-descongelación pasan por apoptosis después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 días después de descongelarse, por ejemplo, como se determina por una prueba de apoptosis (por ejemplo, TO-PR03 o equipo de ensayo AnnV/PI Apoptosis). En ciertas modalidades, las células post-descongelación son re-crioconservadas después de cultivarse, expandirse o diferenciarse usando métodos provistos en la presente. 6.8. Usos de Células TSNK Las células TSNK provistas en la presente se usan en métodos de tratar individuos que tienen cáncer, por ejemplo, individuos que tienen células tumorales sólidas y/o glóbulos con cáncer, o personas que tienen una infección viral. Las células TSNK provistas en la presente también se pueden usar en métodos de suprimir la proliferación de células tumorales. 6.8.1. Tratamiento de Individuos que Tienen Cáncer En una modalidad, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene un cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre o un tumor sólido, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células TSNK. En ciertas modalidades, el individuo tiene una deficiencia de células asesinas naturales, por ejemplo, una deficiencia de células NK activas contra el cáncer del individuo. En una modalidad específica, el método comprende adicionalmente administrar a dicho individuo perfundido de placenta aislado o células de perfundido de placenta aisladas, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de perfundido de placenta o células de perfundido de placenta aisladas. En otra modalidad específica, el método comprende adicionalmente administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1, antes, o talidomida. Como se usa en la presente, una "cantidad efectiva" es una cantidad que, por ejemplo, resulta en una mejora detectable de, reducir el progreso de, o eliminar, uno o más síntomas de un cáncer del cual el individuo sufre.
En una modalidad específica, el cáncer es cáncer de sangre, por ejemplo, una leucemia o un linfoma. En modalidades más específicas, el cáncer es una leucemia aguda, por ejemplo, leucemia aguda de célula T, leucemia mielógena aguda (A L), leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda de precursor B, leucemia linfoblástica aguda de precursor T, leucemia de Burkitt (linfoma de Burkitt), o leucemia bifenotípica aguda; una leucemia crónica, por ejemplo, linfoma mieloide crónico, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia monocítica crónica, leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítica pequeña, o leucemia prolinfocítica de célula B; linfoma de célula vellosa; leucemia prolinfocítica de célula T; o un linfoma (por ejemplo, linfoma histiocítico, linfoma linfoplasmacítico (por ejemplo, macroglobulinemia de Waldenstróm), linfoma de zona marginal esplénica, neoplasma de célula de plasma (por ejemplo, mieloma celular de plasma, plasmacitoma, una enfermedad de deposición de ¡nmunoglobulina monoclonal, o una enfermedad de cadena pesada), linfoma de célula B de zona marginal extranodal (linfoma MALT), linfoma de célula B de zona marginal nodal (NMZL), linfoma folicular, linfoma de célula de manto, linfoma de célula B grande difusa, linfoma de célula B grande mediatinal (tímica), linfoma de célula B grande intravascular, linfoma de efusión primaria, leucemia linfocítica granular grande de célula T, leucemia de célula NK agresiva, leucemia/linfoma de célula T adulta, linfoma de célula NK/T extranodal, tipo nasal, linfoma de célula T de tipo enteropatía, linfoma de célula T hepatoesplénico, linfoma de célula NK blástico, fungoides de micosis (síndrome de Sezary), un trastorno linfoproliferante de célula T CD30-positivo cutánea primaria (por ejemplo, linfoma de célula grande anaplástico cutáneo primario o papulosis linfomatoide), linfoma de célula T angioinmunoblástico, linfoma de célula T periférico, no especificado, linfoma de célula grande anaplástico, un linfoma de Hodgkin o un linfoma de Hodgkin predominante de linfocito nodular. En otra modalidad específica, el cáncer es mieloma múltiple o síndrome mielodisplástico.
En ciertas otras modalidades específicas, el cáncer es un tumor sólido, por ejemplo, un carcinoma, tal como un adenocarcinoma, un carcinoma adrenocortical, un adenocarcinoma de colon, un adenocarcinoma colorectal, un carcinoma colorectal, un carcinoma de célula ductal, un carcinoma de pulmón, un carcinoma de tiroides, un carcinoma de nasofaringe, un melanoma (por ejemplo, un melanoma maligno), un carcinoma de piel no melanoma, o un carcinoma no especificado; un tumor desmolde; un tumor de célula redonda pequeña demoplástica ; un tumor endocrino; un sarcoma de Ewing; un tumor celular de germen (por ejemplo, cáncer testicular, cáncer de ovario, coriocarcinoma , tumor de sinus endodermal, germinoma, etc.); un hepatosblastoma; un carcinoma hepatocelular; un neuroblastoma; un sarcoma de tejido blando de no rhabdomiosarcoma; un osteosarcoma; un retinoblastoma; un rhabdomiosarcoma; o un tumor de Wilms. En otra modalidad, el tumor sólido es cáncer pancreático o cáncer de mama. En otras modalidades, el tumor sólido es un neuroma acústico; un astrocitoma (por ejemplo, un astrocitoma pilocítico de grado I, un astrocitoma de grado bajo de grado II; un astrocitoma anaplástico de grado III; o un multiforme de glioblastoma de grado IV); un cordoma; un craniofaringioma; un glioma (por ejemplo, un glioma del tallo cerebral; un ependimoma; un glioma mixto; un glioma del nervio óptico; o un subependimoma); un glioblastoma; un meduloblastoma; un meningioma; un tumor cerebral metastático; un oligodendroglioma; un pineoblastoma; un tumor pituitario; un tumor neurorectodermal primitivo; o un schwannoma. En otra modalidad, el cáncer es cáncer de próstata.
En ciertas modalidades, el individuo teniendo un cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre o un tumor sólido, por ejemplo, un individuo que tiene una deficiencia de células asesinas naturales, es un individuo que ha recibido un trasplante de médula ósea antes de dicha administración. En ciertas modalidades, el trasplante de médula ósea estuvo en tratamiento de dicho cáncer. En ciertas otras modalidades, el trasplante de médula ósea estuvo en tratamiento de una condición diferente de dicho cáncer. En ciertas modalidades, el individuo recibió un inmunosupresor además de dicho trasplante de médula ósea. En ciertas modalidades, el individuo que ha tenido un trasplante de médula ósea exhibe uno p más síntomas de enfermedad de injerto-contra-huésped (GVHD) al momento de dicha administración. En ciertas otras modalidades, el individuo que ha tenido un trasplante de médula ósea se administra dichas células antes de que se manifieste un síntoma de enfermedad de injerto-contra-huésped (GVHD).
En ciertas modalidades específicas, el individuo teniendo un cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre, ha recibido por lo menos una dosis de un inhibidor de TNFa, por ejemplo, ETANERCEPT® (Enbrel), antes de dicha administración. En modalidades específicas, dicho individuo recibió dicha dosis de un inhibidor de TNFa dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses de diagnosis de dicho cáncer. En una modalidad específica, el individuo que ha recibido una dosis de un inhibidor de TNFa exhibe leucemia mieioide aguda. En una modalidad más específica, el individuo que ha recibido una dosis de un inhibidor TNFa y exhibe leucemia mieioide aguda exhibe además omisión del brazo largo de cromosoma 5 en glóbulos. En otra modalidad, el individuo que tiene un cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre, exhibe un cromosoma de Filadelfia.
En ciertas otras modalidades, el cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre o un tumor sólido, en dicho individuo es refractario a uno o más fármacos anti-cáncer. En una modalidad específica, el cáncer es refractario a GLEEVEC® (imatinib mesilato).
En ciertas modalidades, el cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre, en dicho individuo responde a por lo menos un fármaco de anti-cáncer; en esta modalidad, perfundido de placenta, células de perfundido de placenta aisladas, células asesinas naturales aisladas, por ejemplo, células asesinas naturales de placenta, por ejemplo, células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta, células asesinas naturales combinadas aisladas, y/o combinaciones de los mismos, y opcionalmente un compuesto inmunomodulador, se agregan como tratamientos adjuntos o como una terapia de combinación con dicho fármaco anti-cáncer. En ciertas otras modalidades, el individuo teniendo un cáncer, por ejemplo, un cáncer de sangre, ha sido tratado con al menos un fármaco anti-cáncer, y ha recaído, antes de dicha administración.
En un aspecto, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo (1) lenalidomida; (2) melfalan; y (3) células NK expandidas, en donde dichas células NK son efectivas para tratar mieloma múltiple en dicho individuo. En una modalidad específica, dichas células NK son células NK de sangre de cordón, o células NK producidas de células hematopoyéticas de sangre de cordón, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. En otra modalidad, dichas células NK han sido producidas por cualquiera de los métodos descritos en la presente para producir células NK, por ejemplo, para producir células TSNK. En otra modalidad, dichas células NK han sido expandidas antes de dicha administración. En otra modalidad, dicha lenalidomida, melfalan y/o células NK se administran por separado entre sí. En ciertas modalidades especificas del método de tratar un individuo con mieloma múltiple, dichas células NK son producidas por un método que comprende: expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), IL-2, interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) y heparina, y en donde dicho SCF, IL-2, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitores hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitores hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2).
En otro aspecto, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene leucemia linfocítica crónica (CLL), que comprende administrar al individuo una dosis terapéuticamente efectiva de (1) lenalidomida; (2) melfalan; (3) fludarabina; y (4) células NK expandidas, por ejemplo, células TSNK, en donde dichas células NK son células NK de sangre de cordón, o células NK producidas de células madre hematopoyéticas de sangre de cordón. En otra modalidad, dichas células NK han sido producidas por cualquiera de los métodos descritos en la presente para producir células NK, por ejemplo, para producir células TSNK. En una modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, dichas células NK han sido expandidas por al menos 10 días antes de dicha administración. En una modalidad específica de cualquiera de los métodos anteriores, dicha lenalidomida, melfalan, fludarabina y células NK expandidas son administradas a dicho individuo por separado. En ciertas modalidades específicas del método de tratar un individuo con CLL, dichas células NK son producidas por un método que comprende: expandir una población de células madre o progenitores hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), IL-2, interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15) y heparina, y en donde dicho SCF, IL-2, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitores hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitores hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende ¡nterleucina-2 (IL-2), para producir células NK activadas. 6.8.2. Supresión de Proliferación Celular Tumoral Además en la presente se provee un método de suprimir la proliferación de células tumorales, que comprende contactar las células tumorales con células TSNK. Opcionalmente, las células tumorales y/o células TSNK son contactadas con perfundido de placenta aislado o células de perfundido de placenta aisladas. En otra modalidad específica, las células tumorales y/o células TSNK adicionalmente son contactadas con un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1, antes, o talidomida, de modo que la proliferación de las células tumorales se reduce detectablemente en comparación con las células tumorales del mismo tipo no contactado con células TSNK. Opcionalmente, las células tumorales y/o células TSNK contactadas con un compuesto inmunomodulador son contactadas con perfundido de placenta aislado o células de perfundido de placenta aisladas.
Como se usa en la presente, "contactar" con respecto a células, en una modalidad abarca contacto físico directo, por ejemplo, célula-célula, entre perfundido de placenta, células de perfundido de placenta, células asesinas naturales, por ejemplo, células TSNK, y/o células asesinas naturales combinadas aisladas y las células tumorales. En otra modalidad, "contactar" abarca presencia en el mismo espacio físico, por ejemplo, perfundido de placenta, células de perfundido de placenta, células asesinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales intermedias de placenta, y/o células asesinas naturales combinadas aisladas son colocadas en el mismo contenedor, por ejemplo, plato de cultivo, placa multipozo) como células tumorales. En otra modalidad, "contactar" perfundido de placenta, células de perfundido de placenta, células asesinas naturales combinadas o células asesinas naturales intermedias de placenta, y células tumorales se logra, por ejemplo, al inyectar o infundir el perfundido de placenta o células, por ejemplo, células de perfundido de placenta, células asesinas naturales combinadas o células asesinas naturales, por ejemplo, células asesinas naturales intermedias de placenta en un individuo, por ejemplo, un humano comprendiendo células tumorales, por ejemplo, un paciente con cáncer. "Contactar" en el contexto de compuestos inmuno-moduladores y/o talidomida son físicamente contactados entre sí, o son colocados dentro del mismo volumen físico (por ejemplo, un contenedor de cultivo celular o un individuo).
En una modalidad específica, las células tumorales son células de cáncer de sangre, por ejemplo, células de leucemia o células de linfoma. En modalidades más específicas, el cáncer es una leucemia aguda, por ejemplo, células de leucemia de célula T aguda, células de leucemia mielógena aguda (AML), células de leucemia promielocítica aguda, células de leucemia m ieloblástica aguda, células de leucemia megacarioblástica aguda, células de leucemia linfoblástica aguda de precursor B, células de leucemia linfoblástica aguda de precursor T, células de leucemia de Burkitt (linfoma de Burkitt), o células de leucemia bifenotípica aguda; células de leucemia crónica, por ejemplo, células de linfoma mieloide crónico, células de leucemia mielógena crónica (CML), células de leucemia monocítica crónica, células de leucemia linfocítica crónica/de linfoma linfocítico pequeño, o células de leucemia prolinfocítica de célula B; células de linfoma de célula vellosa; células de leucemia prolinfocítica de célula T; o células de linfoma, por ejemplo, células de linfoma histiocítico, células de linfoma linfoplasmacítico (por ejemplo, células de macroglobulinemia de Waldenstróm), células de linfoma de zona marginal esplénica, células de neoplasma de célula de plasma (por ejemplo, células de mieloma de célula de plasma, células de plasmacitoma, enfermedad de deposición de inmunoglobulina monoclonal, o una enfermedad de cadena pesada), células de linfoma de célula B marginal extranodal (linfoma MALT), células de linfoma de célula B de zona marginal nodal (NMZL), células de linfoma folicular, células de linfoma de célula de manto, células de linfoma de célula B grande intravascular, células de linfoma de efusión primaria, células de leucemia linfocítica granular grande de célula T, células de leucemia de célula NK agresiva, células de leucemia/linfoma de célula T adulta, células de tipo nasal - linfoma de célula NK/T extranodal, células de linfoma de célula T de tipo de enteropatía, células de linfoma de célula T hepatoesplénica, células de linfoma de célula NK blástica, fungoides de micosis (síndrome de Sezary), células de trastorno linfoproliferante de célula T CD30-positivo cutáneo primario (por ejemplo, linfoma de célula grande anaplástico cutáneo primario o papulosis linfomatoide), células de linfoma de célula T angioinmunoblástico, células no especificadas de linfoma de célula T periférica, células de linfoma de Hodgkin predominante de linfocito nodular o células de linfoma de Hodgkin. En otra modalidad específica, las células tumorales son células de mieloma múltiple o células de síndrome mielodisplástico.
En modalidades específicas, las células tumorales son células tumorales sólidas, por ejemplo, células de carcinoma, por ejemplo, células de adenocarcinoma, células de carcinoma adenocortical , células de adenocarcinoma de colon, células de adenocarcinoma colorectal, células de carcinoma colorectal, células de carcinoma de célula ductal, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de tiroides, células de carcinoma de nasofaringe, células de melanoma (por ejemplo, células de melanoma maligno), células de carcinoma de piel de no melanoma, o células de carcinoma no especificadas; células tumorales desmoldes; células tumorales de célula redonda pequeña desmoplástica; células tumorales endocrinas; células de sarcoma de Ewing; células tumorales de célula de germen (por ejemplo, células de cáncer testicular, células de cáncer de ovario, células de coriocarcinoma, células tumorales de sinus endodermal, células de germinoma, etc.); células de hepatosblastoma; células de carcinoma hepatocelular; células de neuroblastoma ; células de sarcoma de tejido blando de no rhabdomiosarcoma; células de osteosarcoma; células de retinoblastoma; células de rhabdomiosarcoma; o células tumorales de Wilms. En otra modalidad, las células tumorales son células de cáncer pancreático o células de cáncer de mama. En otras modalidades, las células tumorales sólidas son células de neuroma acústico; células de astrocitoma (por ejemplo, células de astrocitoma policiático de grado I, células de astrocitoma de grado bajo grado II; células de astrocitoma anaplásticas de grado III; o células multiformes de glioblastoma de grado IV); células de cordoma; células d craniofaringioma; células de glioma (por ejemplo, células de glioma de tallo cerebral; células de ependimoma; células de glioma mixto; células de glioma de nervio óptico; o células de subependimoma); células de glioblastoma; células de meduloblastoma; células de meningioma; células tumorales de cerebro metastático; células de oligodendroglioma; células de pineoblastoma; células de tumor pituitario; células tumorales neuroectodermales primitivas; o células de schwannoma. En otra modalidad, las células tumorales son células de cáncer de próstata.
Como se usa en la presente, "terapéuticamente benéfico" y "beneficios terapéuticos" incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, reducción en el tamaño de un tumor; reduciendo o cesando la expansión de un tumor; reducción en el número de células cancerosas en una muestra de tejido, por ejemplo, muestra de sangre, por volumen de unidad; la mejora clínica en cualquier síntoma del cáncer particular o tumor dicho individuo tiene, la reducción o cese de empeoramiento de cualquier síntoma del cáncer particular el individuo tiene, etc. 6.8.3. Tratamiento de cánceres usando células TSNK y otros agentes anti-cáncer El tratamiento de un individuo que tiene cáncer usando las células TSNK descrito en la presente puede ser parte de un régimen de terapia anti-cáncer que incluye uno o más otros agentes anticáncer. Dichos agentes anti-cáncer son bien conocidos en la técnica. Los agentes anti-cáncer específicos que se pueden administrar a un individuo que tiene cáncer, por ejemplo, un individuo teniendo células tumorales, además de las células TSNK, y opcionalmente perfundido, células de perfundido, células asesinas naturales diferentes de células TSNK, incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; adrucil; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; avastina (bevacizumab); azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucil; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona;duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etoposida; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracil; flurocitabina ; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; iproplatina; irinotecan; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maytansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona ; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazof urina; riboprina; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; sparfosato sódico; sparsoicina; clorhidrato de spirogermanio; spiromustina; spiroplatina; streptonigrina; streptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sódico; taxotere; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona ; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de trie i ri b i na ; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina ; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracil; uredepa; vapreótido; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de ving licinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; y clorhidrato de zorubicina.
Otros fármacos anti-cáncer incluyen, pero no se limitan a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracil; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; adlesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante; antiandrógeno; carcinoma prostético; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos anti-sentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de baccatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; camptosar (también llamado Campto; irinotecan) derivados de camptotecina; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína quinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; sulfonamida de cloroquinoxalina; cícaprost; cís-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidenmina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorspermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; spiromustina de difenilo; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; doxorubicina; droloxifeno; dronabínol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; fia vopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganírelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imatinib (por ejemplo, GELLEVE®), imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor receptor de factor de crecimiento 1 como insulina; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; ¡sobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplakinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarin-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferón alfa de leucocito; leuprolida + estrógeno + progesterona ; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipofílico; compuestos de platino lipofílicos; lisoclinamida-7; lobaplatina; lombrlcina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; loxoribina; lurtotecan; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos Uticos; maitansina; manostatina A; marimastat, masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; saporina factor de crecimiento de filbroblasto de mitotoxina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; Erbitux (cetuximab), gonadotrofina coriónica humana; lípido A de monofosforilo + pared celular miobacterial sk; mopidamol; agente anti-cáncer de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared celular micobacterial; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridrónico; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; oblimersen (GENASENSE®); O6-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetron; oracina; inductor de citosina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina (por ejemplo, Floxatina); oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polusulfato sódico de pentosan; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol de perililo; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor activador de plasm inogeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; bis-acridona de propilo; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; modulador inmune basado en proteína A; inhibidor de proteína quinasa C; inhibidores de proteína quinasa C; microalgal; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de fosforilasa de nucleósido de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoixilada; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de proteína transferasa de ras farnesilo; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; Re 186 etidronato de renio; rizoxina; ribozimas; retinamida Rll; rohituquina; romurtída; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sagramostim; Sdi 1 mimética; semustina; inhibidor derivado de senescencia 1; oligonucleótidos de sentido; inhibidores de transducción de señal; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermina; ácido sparfósico; spicamicina D; spiromustina; splenopentina; spongistatina 1; squalamina; stipiamida; inhibidores de stromelsina; sulfinosina; antagonista de péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; tenipósido; tetraclorodecaóxido, tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; trombopoyetina mimética; timalfasina; agonista receptor de timopoyetina; timotrinam; hormona estimulante de tiroides; etipurpurina de etilo de estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetron; turosterida; inhibidores de tirosina quinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento derivado de sinus urogenital; antagonistas receptores de uroquinasa; vapreotida; variolina B; Vectibix (panitumumab)velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; Welcovorin (leucovorina); Xeloda (capecitabina ); zanoterona; zeniplatina; zilascorb; y estimalámero de zinostatina. 6.8.4. Tratamiento de Infección Viral En otra modalidad, en la presente se provee un método de tratar un individuo que tiene una infección viral, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de células TSNK. En ciertas modalidades, el individuo tiene una deficiencia de células asesinas naturales, por ejemplo, una deficiencia de células NK activas contra la infección viral del individuo. En ciertas modalidades específicas, dicha administración comprende adicionalmente administrar al individuo uno o más de perfundido de placenta aislado, células de perfundido de placenta aisladas, células asesinas naturales aisladas, por ejemplo, células asesinas naturales de placenta, por ejemplo, células asesinas naturales intermedias derivadas de placenta, células asesinas naturales combinadas aisladas y/o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades específicas, las células TSNK son contactadas con un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto ¡nmunomodulador descrito en 6.2.1, anterior, o talidomida, antes de dicha administración. En ciertas otras modalidades específicas, dicha administración comprende administrar un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador descrito en la sección 6.2.1, anterior, o talidomida, a dicho individuo además de dichas células TSNK, en donde dicha cantidad es una cantidad que, por ejemplo, resulta en una mejora detectable de, reducir el progreso de, o eliminación de, uno o más síntomas de dicha infección viral. En modalidades específicas, la infección viral es una infección por un virus de la familia Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papilommaviridae, Rhabdoviridae o Togaviridae. En modalidades más específicas, dicho virus es virus de inmunodeficiencia humana (VIH), coxsackievirus, virus de hepatitis A (HAV), virus de polio, virus Esptein-Barr (EBV), herpes simple tipo 1 (HSV1), herpes simple tipo 2 (HSV2), citomegalovirus humano (CMV), herpesvirus humano tipo 8 (HHV8), virus herpes zoster (virus de varicela zoster (VZV) o virus de herpes), virus de hepatitis B (HBV), virus de hepatitis C (HCV), virus de hepatitis D (HDV), virus de hepatitis E (HEV), virus de influenza (por ejemplo, virus de influenza A, virus de influenza B, virus de influenza C o togotovirus), virus de sarampión, virus de paperas, virus de parainfluenza, virus de papiloma, virus de rabia o virus de rubéola.
En otras modalidades más específicas, dicho virus es adenovirus especie A, serotipo 12, 18 ó 31; adenovirus especie B, serotipo 3, 7, 11, 14, 16, 34, 35 ó 50; adenovirus especie C, serotipo 1, 2, 5 ó 6; especie D, serotipo 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 51; especie E, serotipo 4; o especie F, serotipo 40 ó 41.
En ciertas otras modalidades más específicas, el virus es virus Apoi (APOIV), virus Aroa (AROAV), virus bagaza (BAGV), virus Banzi (BANV), virus Bouboui (BOUV), virus Cacipacore (CPCV), virus Carey Island (CIV), virus Cowbone Ridge (CRV), virus Dengue (DENV), virus Edge Hill (EHV), virus Gadgets Gully (GGYV), virus llheus (ILHV), virus de meningoencefalomielitis de pavo de Israel (ITV), virus de encefalitis japonesa (JEV), virus Jugra (JUGV), virus Jutiapa (JUTV), virus kadam (KADV), virus Kedougou (KEDV), virus Kokobera (KOKV), virus Koutango (KOUV), virus de enfermedad Kyasanur Forest (KFDV), virus Langat (LGTV), virus Meaban (MEAV), virus Modoc (MODV), virus de miotis leucoencefalitis de Montana (MMLV), virus de encefalitis Murray Valley (MVEV), virus Ntaya (NTAV), virus de fiebre hemorrágica Omsk (OHFV), virus Powassan (POWV), virus Rio Bravo (RBV), virus Royal Farmacéuticamente aceptable (RFV), virus Saboya (SABV), virus de encefalitis St. Louis (SLEV), virus Sal Veja (SVV), virus San Perlita (SPV), virus Saumarez Reef (SREV), virus Sepik (SEPV), virus Tembusu (TMUV), virus de encefalitis transmitido por garrapatas (TBEV), virus Tyuleniy (TYUV), virus Uganda S (UGSV), virus Usutu (USUV), virus Wesselsbron (WESSV), virus West Nile (WNV), virus Yaounde (YAOV), virus de fiebre amarilla ( YFV), virus Yokose (YOKV) o virus Zika (ZIKV).
En otras modalidades, las células TSNK, y opcionalmente perfundido de placenta y/o células de perfundido, son administradas a un individuo que tiene una infección viral como parte de un régimen de terapia antiviral que incluye uno o más otros agentes antivirales. Agentes antivirales específicos que se pueden administrar a un individuo que tiene una infección viral incluyen, pero no se limitan a: imiquimod podofilox, podofilina, interferón alfa (IFNa), retículos, nonox¡nol-8, Aciclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, cidofovir; amantadina, rimantadina; ribavirina; zanamavir y oseltaumavir; inhibidores de proteasa tales como indinavir, nelfinavir, ritonavir o saquinavir; inhibidores de transcriptasa invertida de nucleosido tales como didanosina, lamivudina, stavudina, zalcitabina o zidovudina; e inhibidores de transcriptasa invertida de no nucleosido tales como neviparina o efavirenz. 6.8.5. Administración La determinación del número de células, por ejemplo, células de perfundido de placenta, por ejemplo, células nucleadas de perfundido de placenta, células asesinas naturales combinadas, y/o células asesinas naturales aisladas, por ejemplo, células TSNK, y determinación de la cantidad de un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, como compuesto inmunomodulador en la sección 6.2.1, anterior, o talidomida, se pueden realizar independientemente entre sí. 6.8.5.1. Administración de Células En ciertas modalidades, se usan células TSNK, por ejemplo, administradas a un individuo, en cualquier cantidad o número que resulta en un beneficio terapéutico detectable al individuo, por ejemplo, una cantidad efectiva, en donde el individuo tiene una infección viral, cáncer o células tumorales, por ejemplo, un individuo que tiene células tumorales, un tumor sólido o un cáncer de sangre, por ejemplo, un paciente con cáncer. Dichas células se pueden administrar a dicho individuo por números absolutos de células, por ejemplo, dicho individuo se puede administrar a aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o a lo mucho aproximadamente, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 X 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 1011 células TSNK. En otras modalidades, las células TSNK se pueden administrar a dicho individuo por números relativos de células, por ejemplo, dicho individuo puede ser administrado a aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o a lo mucho aproximadamente, , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 1011 células TSNK por kilogramo del individuo. Se pueden administrar células TSNK a dicho individuo de acuerdo con una relación aproximada entre un número de células TSNK, y opcionalmente células de perfundido de placenta y/o células asesinas naturales diferentes de células TSNK, y un número de células tumorales en dicho individuo (por ejemplo, un número estimado). Por ejemplo, las células TSNK se pueden administrar a dicho individuo en una relación de aproximadamente, por lo menos aproximadamente o a lo mucho aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 o 100:1 al número de células tumorales en el individuo. El número de células tumorales en dicho individuo se puede estimar, por ejemplo, al contar el número de células tumorales en una muestra de tejido a partir del individuo, por ejemplo, muestra de sangre, biopsia, o similar. En modalidades específicas, por ejemplo, para tumores sólidos, dicho conteo se realiza en combinación con imágenes del tumor o tumores para obtener un volumen tumoral aproximado. En una modalidad específica, un compuesto ¡nmunomodulador o talídomida, por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto ¡nmunomodulador o talidomida, se administran al individuo además de las células TSNK, opcionalmente células de perfundido de placenta y/o células asesinas naturales diferentes de las células TSNK.
En ciertas modalidades, el método de suprimir la proliferación de células tumorales, por ejemplo, en un individuo; tratamiento de un individuo teniendo una deficiencia en las células asesinas naturales del individuo; o tratamiento de un individuo que tiene células tumorales, un cáncer de sangre o un tumor sólido, comprende contactar las células tumorales, o administrar a dicho individuo, una combinación de células TSNK y uno o más de perfundido de placenta y/o células de perfundido de placenta. En modalidades específicas, el método comprende adicíonalmente contactar las células tumorales, o administrar al individuo, un compuesto ¡nmunomodulador o talidomida.
En una modalidad específica, por ejemplo, tratamiento de un individuo que tiene una deficiencia en las células asesinas naturales del individuo (por ejemplo, una deficiencia en el número de células NK o en la reactividad de las células NK a un cáncer, tumor o células infectadas viralmente); o tratamiento de un individuo que tiene un cáncer o una infección viral, o supresión de proliferación celular tumoral, comprende contactar dichas células tumorales, o administrar a dicho individuo, células TSNK suplementadas con células de perfundido de placenta aisladas o perfundido de placenta. En modalidades específicas, aproximadamente , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células TSNK por mililitro, o , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 1011 o más células TSNK, se suplementan con aproximadamente, o por lo menos aproximadamente, , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células de perfundido de placenta aisladas por mililitro, o , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 1011 0 más células de perfundido de placenta aisladas. En otras modalidades más específicas, aproximadamente , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 o más células TSNK por mililitro, o , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 X 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 ? 1010, 5 ? 1010 o 1 x 1011 o más células TSNK se suplementan con aproximadamente, o por lo menos aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1000 ml_ de perfundido, o aproximadamente 1 unidad de perfundido.
En otra modalidad específica, el tratamiento de un individuo que tiene una deficiencia en las células asesinas naturales del individuo; tratamiento de un individuo que tiene cáncer; tratamiento de un individuo teniendo una infección viral; o supresión de proliferación de célula tumoral, comprende contactar las células tumorales, o administrar al individuo, células TSNK, en donde dichas células son suplementadas con células de placenta adherentes, por ejemplo, células madre de perfundido de placenta o células multipotentes, por ejemplo, células de placenta adherentes a plástico de cultivo CD34\ CD10\ CD105 + , CD200+. En modalidades específicas, las células TSNK se suplementan con aproximadamente , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 1 O8 o más células madre de placenta adherentes por mililitro, o , 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 1011 o más células de placenta adherentes, por ejemplo, células madre de placenta adherentes o células multipotentes.
En otra modalidad específica, el tratamiento de un individuo que tiene una deficiencia en las células asesinas naturales del individuo; tratamiento de un individuo que tiene cáncer; tratamiento de un individuo que tiene una infección viral; o supresión de proliferación de célula tumoral, se realiza usando un compuesto inmunomodulador o talidomida en combinación con células TSNK, en donde dichas células se suplementan con medio acondicionado, por ejemplo, medio acondicionado por células de placenta adherentes a plástico de cultivo de tejido CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+, por ejemplo, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mL de medio de cultivo acondicionado de célula madre por unidad de perfundido, o por 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 células TSNK. En ciertas modalidades, las células de placenta adherentes a plástico de cultivo de tejido son las células de placenta adherentes multipotentes descritas en la patente de E.U.A. No. 7,468,276 y publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan a la presente por referencia en sus totalidades. En otra modalidad específica, el método comprende adicionalmente contactar las células tumorales, o administrar al individuo, un compuesto inmunomodulador o talidomida.
En otra modalidad específica, el tratamiento de un individuo teniendo una deficiencia en las células asesinas naturales del individuo; tratamiento de un individuo que tiene cáncer; tratamiento de un individuo que tiene una infección viral; o supresión de proliferación de célula tumoral, en donde dichas células TSNK se suplementan con células de perfundido de placenta, las células de perfundido son contactadas con interleucina-2 ( I L -2 ) durante un periodo de tiempo antes de dicho contacto. En ciertas modalidades, dicho periodo de tiempo es aproximadamente, por lo menos, o a lo mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ó 48 horas antes de dicho contacto.
Las células TSNK, y opcionalmente perfundido o células de perfundido, se pueden administrar una vez a un individuo que tiene una infección viral, un individuo que tiene cáncer, o un individuo que tiene células tumorales, durante un curso de terapia anti-cáncer; o se pueden administrar múltiples veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó 23 horas, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 36 o más semanas durante terapia. En modalidades, en donde se usan células y un compuesto inmunomodulador o talidomida, el compuesto inmunomodulador o talidomida, y células o perfundido, se pueden administrar al individuo juntos, por ejemplo, en la misma formulación; por separado, por ejemplo, en formulaciones separadas, a aproximadamente el mismo tiempo; o se pueden administrar por separado, por ejemplo, en diferentes horarios de dosificación o en momentos diferentes del día. De manera similar, en modalidades en donde se usan células y un compuesto antiviral o compuesto anti-cáncer, el compuesto antiviral o compuesto anti-cáncer, y células o perfundido, se pueden administrar al individuo juntos, por ejemplo, en la misma formulación; por separado, por ejemplo, en formulaciones separadas, a aproximadamente el mismo tiempo; o se pueden administrar por separado, por ejemplo, en horarios de dosificación diferentes o en momentos diferentes del día. Las células TSNK, y perfundido o células de perfundido, se pueden administrar sin importar si las células TSNK, perfundido o células de perfundido han sido administrados al individuo en el pasado. 7. EJEMPLOS 7.1. Ejemplo 1: Recuperación de Células Madre Hematopovéticas de Perfundido de Placenta Humano y Sangre de Cordón Umbilical Por lo general perfundido de placenta humano (HPP) y sangre de cordón umbilical (UCB) se purificaron usando Ficoll y cloruro de amonio para obtener células nucleadas totales (TNCs). Entonces se usaron TNCs en un procedimiento de selección positiva para aislar células CD34+ usando esferas anti-CD34 y RoboSep de acuerdo con el protocolo del fabricante (StemCell Technologies, Inc.). En este experimento, se aislaron células CD34+ con más de 90% de pureza. Alternativamente, EasySep® Human Progenitor Cell Enrichment Kit (StemCell Technologies, Inc.) se usó en un procedimiento de selección negativa para omitir las células comprometidas a linaje al usar Human Progenitor Cell Enrichment Cocktail con anticuerpos monoclonales a los siguientes antígenos de superficie celular humanos: CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b y glicoforina A. Usando la selección negativa, 90% de células CD34+ fueron recuperadas de la materia prima. La composición celular de las HSCs recuperadas se resume en la tabla 1.
Tabla 1. Composición celular de células madre hematopoyéticas (HSCs) enriquecidas. Se calculó la desviación estándar para medio de población de 3 donantes. 7.2. Ejemplo 2: Expansión y Diferenciación Libre de Célula Alimentadora de Células Madre Hematopoyéticas en Células Asesinas Naturales Se cultivaron células CD34+ en las siguientes formulaciones de medio de hasta 48 días, y se tomaron alícuotas de células para evaluación de conteo celular, viabilidad celular, caracterización de diferenciación y evaluación funcional de células asesinas naturales.
Medio de NK: GBGM (Medio de crecimiento a base de Glycostem, Glycostem Cat# CCT-SCB500, tecnología celular transparente) suplementado con pen/strep (Cat# 15140, Gibco), 20 ng/mL SCF (Cat# 255-SC, R&D Systems), 10 ng/mL ligando Flt-3 (Cat# 308-FK, R&D Systems), 20 ng/mL TPO (Cat# 288-TP, R&D Systems), 20 ng/mL IL-7 (Cat# 207-IL, R&D Systems), 200 lU/mL IL-2 (Cat# 202-IL, R&D Systems) y 10 ng/mL IL-15 (Cat# 247-IL, R&D Systems).
Medio de NK2: DMEM (Cat# MT-10-013-CV, Fisher): F12 de Ham (Cat# BW12-615F, Fisher) como 1:2 suplementado con 2 mM L-Glutamina (Cat# 25030, Invitrogen), 1% pen/strep, 20% suero humano AB (Cat# 100-512, Gemcell), 5 ng/mL selenita de sodio (Cat# S9133, Sigma), 50 µ? etanolamina (Cat# E0135, Sigma), 25 µ? ß-mercaptoetanol (Cat# 21985, Invitrogen), 20 ng/mL ácido ascórbico (Cat# 47863, Sigma), 5 ng/mL IL-3 (Cat# 203-IL, R&D Systems), 20 ng/mL SCF, 10 ng/mL ligando Flt-3, 20 ng/mL IL-7 y 10 ng/mL IL-15.
Medio de NK3: X-vivo 20 (Cat# BW04-448Q, Fisher) suplementado con pen/strep, 10% suero humano AB (Cat# 100-512, Gemcell) y 500 lU/mL IL-2.
Medio de NK2A: GBGM suplementado con 10% suero humano AB, 1% pen/strep, 20 ng/mL SCF, 10 ng/mL ligando Flt-3, 20 ng/mL TPO, 20 ng/mL IL-7, 200 lU/mL IL-2, 10 ng/mL IL-15 y 1.5 lU/mL heparina (Cat# H3149, Sigma).
Medio de NK2B1 : DMEM: F12 de Ham como 1:2 suplementado con 2 mM L-glutamina, 1% pen/strep, 20% suero humano AB, 5 ng/mL selenita de sodio, 50 µ? etanolamina, 25 µ? ß-mercaptoetanol , 20 µg/mL ácido ascórbico, 5 ng/mL IL-3, 20 ng/mL SCF, 10 ng/mL ligando Flt-3, 20 ng/mL IL-7 y 10 ng/mL IL-15.
Medio de NK2B2: DMEM: F12 de Ham como 1:2 suplementado con 2 (ÍIM L-glutamina, 1% pen/strep, 20% suero humano AB, 5 ng/mL selenita de sodio, 50 µ? etanolamina, 25 µ? ß-mercaptoetanol, 20 µg/mL ácido ascórbico, 200 lU/mL IL-2, 20 ng/mL SCF, 10 ng/mL ligando Flt-3, 20 ng/mL IL-7 y 10 ng/mL IL-15.
Medio de NK2C: RPMI 1640 (Cat# 22400105, Invitrogen) suplementado con 10% FBS (Cat# SH30070.03, Hyclone), 2 mM L-glutamina, 1% pen/strep, 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL ligando Flt-3, 100 lU/mL IL-2, 20 ng/mL IL-7 y 20 ng/mL IL-15.
Medio de NK2D: medio libre de suero (StemSpan, Cat# 09650, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) suplementado con 1 µ? dexametasona glucocorticoide sintético (Dex, Cat# D4902, Sigma, St Louis, MO), 40 ng/mL factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1, Cat# 291-G1-250, R&D Systems, Minneapolis, MN), 100 ng/mL SCF, 40 ng/mL lípidos (mezcla de lípido rica en coíesterol; Cat# C7305-1G, Sigma, St Louis, MO), 5 ng/mL IL-3, 200 lU/mL IL-2, 20 ng/mL IL-7 y 20 ng/mL IL-15.
Se lavaron las células recolectadas en puntos de tiempo diferentes dos veces con TPM11640 (libre de fenol) y 5% FBS, marcadas con anticuerpos conjugados con fluorescencia (Tablas 2 y 3) durante 15 minutos a 4°C, y analizadas por citometría de flujo (FACSCanto, BD) y software de citometría de flujo Jo (Tree Star).
Tabla 2. Anticuerpos usados para etiqueta celular Tabla 3. Panel de caracterización citométrica de flujo de receptores de superficie de NK Ensayo de citotoxicidad usando etiqueta PKH26/TO-PRO-3. Las células tumorales diana se marcaron con PKH26 (Cat#PKH26GL, Sigma-Aldrich), un colorante que inserta en membrana de plasma celular vía su residuo a lifático lipofílico, después colocado en placas de cultivo de tejido de fondo en U de 96 pozos e incubadas con células NK expandidas a varias relaciones de efector-objeti vo (E:T) en 200µ? RPM! 1640 suplementado con 10% FBS. Se incubaron cultivos durante 4 horas a 37°C en 5% C02. Después de la incubación, se cosecharon células y TO-PRO-3 (Invitrogen Cat# T3605), una mancha de ADN impermeable a membrana, se agregó a cultivos (1 µ?? concentración final) seguido por análisis FACS. Se expresó citotoxicidad como el porcentaje de células muertas (PKH26 + TO-PRO-3 + ) dentro de las células tumorales diana PKH26 + totales.
Optimización de expansión y diferenciación de células CD34* en células NK. Entre las formulaciones de medio probadas, los medios NK1, NK2, y NK3, NK1 mostraron una expansión de 500 pliegues el día 21 (D21). Ni el medio NK2 ni NK3 mantuvo proliferación o diferenciación celular. Se realizó más optimización de medio para medio NK1 y los medios posteriores se llamaron NK2A, NK2B, NK2C y NK2D, . Las células CD34+ cultivadas con medio NK2A mostraron una expansión de 10"5-pl¡egue el día 55 (D55). Con base en los resultados de expansión de pliegue, diferenciación y citotoxicidad de medio NK1, 2 y 3, la segunda tanda de formulaciones de medio NK2A, NK2B, NK2C y NK2D se realizaron y en D55, se logró una expansión de 105-pliegue (como se muestra en la figura 1). El medio NK2B mostró una expansión de aproximadamente 3 x 10 -pliegue. El cultivo en medio NK2C resultó en expansión de 3 x 102-pliegue en 21 días, seguido por viabilidad celular declinada. El medio NK2D no mantuvo células a través de la duración del experimento.
En el día 48 (D48), alrededor de 90% de las células NK en medio NK2A fueron CD56 + CD3~. Dentro de la población CD56 + CD3", más de 98% de células fueron CD56 + CD16" (como se muestra en la figura 2), mientras que 58% expresó el receptor activador NKG2D, 68% fueron NKp46+ y 17% fueron CD226+ (como se muestra en las tablas 4A y 4B).
Tabla 4A, 4B. Caracterización fenotípica de células NK expandidas en D48 Adicionalmente, 97.8% de células cultivadas en medio NK2A y 93.1% de células cultivadas en medio NK2B fueron CD56 + CD16" en el día 21 de cultivo. 7.3 Ejemplo 3: Cultivo de Células NK en Medio de CNK Potencia Expansión y Citotoxicidad de Células NK En el día 27 (D27), las células CD34+ cultivadas en el medio de NK2A se cultivaron más en uno de los siguientes medios: • Medio de dos etapas, que comprende medio de CNK y Medio de Mantenimiento. Medio de CNK es IMDM (Invitrogen) suplementado con 10% FCS (Hyclone), 200 lU/mL IL-2 (R&D Systems), 35 Mg/mL transferina (Sigma- Aldrich), 5 µg/mL insulina (Sigma-Aldrich), 2 x 10'5 M etanolamina (Sigma-Aldrich), 1 µ9/???_ ácido oleico (Sigma-Aldrich), 1 µg/mL ácido linoleico (Sigma-Aldrich), 0.2 µg/mL ácido palmítico (Sigma-Aldrich), 2.5 µ9/???_ BSA (Sigma-Aldrich) y 0.1 µg/mL fitohemaglutinina (PHA-P, Sigma-Aldrich). Las células CD56+CD3" NK cultivadas en medio de NK2A se suspendieron a 2.5 x 105 células vivas/mL en medio de CNK en placas de 24 pozos tratadas con cultivo celular o frascos T. PBMC alogénico tratado con mitomicina C y células K562 (línea celular de leucemia mielógena crónica) se agregaron al medio de CNK como células alimentadoras, a una concentración final de 1 x 106 por mL. Se cultivaron células NK durante 5-6 días a 37°C en 5% C02. Después de 5-6 días y después cada 3-4 días un volumen igual a medio de mantenimiento (IMDM con 10% FCS, 2% suero AB humano, antibióticos, L-glutamina y 400 unidades de IL-2 por ml_) se agregó a! cultivo.
• Medio de NK2A (PDAC) con células madre de placenta adherentes a plástico de cultivo de tejido CD34", CD10 + , CD105 + , CD200+ tratadas con mitomicina C como células alimentadoras; • Medio de NK2A (MSC) con célula madre mesenquimatosa (MSC) tratada con mitomicina C como células alimentadoras; o · Medio de NK2A libre de alimentadora (FF) como el control.
El medio de dos etapas potenció la expansión de pliegue de las células CD34+ en comparación con NK2A (FF), NK2A (PDAC) y NK2A (MSC), en particular entre día 27 (D27) y día 48 (D48). Ver figura 3.
Para el día 35, la proporción de células CD34+ ya había disminuido a aproximadamente 4% mientras que la proporción de CD56 + CD3" había aumentado a aproximadamente 80% en el medio de dos etapas. El día 45 (D45), las células cultivadas en medio de dos etapas mostraron citotoxicidad más alta en comparación con células NK tratadas en NK2A (FF), NK2A (PDAC) y NK2A (MSC) (como se muestra en la figura 3). La caracterización fenotípica en el día 41 (como se muestra en la figura 5) mostró expresión aumentada de NKp46 y CD226 en las células, indicando una explicación posible para la mejora de citotoxicidad. En el D41, la proporción de células CD226+ aumentó de 0.9% ± 0.8% en medio de NK2A a 13% ± 4% en medio de dos etapas; la proporción de células NKp46+ aumentó de 55.4 ± 8.7% en medio de NK2A a 80% ± 7.85% en medio de dos etapas. En el D48 la proporción de células CD226+ aumentó de 17.3 ± 14.3% en medio de NK2A a 52.3% ± 11.64% en medio de dos etapas; la proporción de células NKp46+ aumentó de 67.9% ± 5.4% en medio de NK2A a 86% ± 4% en medio de dos etapas. No hubo diferencia significativa de expresión de NKG2D entre las condiciones probadas. Los cambios en expresión de CD226 y NKp46 se muestran en la tabla 5, a continuación.
Tabla 5. Expresión de CD226 y NKp46 en células NK cultivadas en NK2A (FF) y medio de dos etapas el día 41 (D41) y día 48 (D48). Se calculó la desviación estándar para 3 donantes. 7.4 Ejemplo 4: Comparación de Células Asesinas Naturales Cultivadas en Medio de Dos Etapas y Células Asesinas Naturales Derivadas de Células Madre Embriónicas (ESCs) Las células NK en el medio de dos etapas se compararon con células NK derivadas de células madre embriónicas (ESCs), que fueron producidas por el método de Woll y otros, Blood 113(4): 6094- 6101 (2009). Específicamente, una diferencia en niveles de expresión de CD94 y CD117 se observó durante el proceso de cultivo de ambos tipos celulares. La figura 6 muestra que la expresión de CD117 fue alto en células NK de dos etapas, o " + ", del Día 7 (D7) al Día 35 (D35), mientras que la expresión de CD94 aumentó gradualmente. En el día 35 (D35), aproximadamente 44% de las células CD56 + CD3" (dos pasos)' fueron células CD94+CD117\ 37.6% de las células CD56 + CD3 fueron CD94"CD117+ y 14.7% de las células CD56 + CD3" fueron células CD94 + CD117". Como tales, las células NK producidas por el método de dos pasos son distinguibles de las células NK derivadas de ESCs, 78% de las cuales permanecieron CD117baio/" del día 14 al día 35 del cultivo. Esta diferencia en expresión de CD117 es útil ya que las células NK CD117+ son citotóxicas hacia líneas celulares tumorales de varios tejidos, como se describe en el ejemplo 6, a continuación.
Estos resultados sugieren que el progreso de diferenciación de células TSNK es diferente de células NK derivadas de ESC, y que las células TSNK son distinguibles de células NK derivadas de ESC. 7.5 Ejemplo 5: PDACs Mejoran Expansión de Pliegue de Células Asesinas Naturales Cultivadas en Medio de NK2A Para evaluar el efecto de células madre de placenta adherentes a plástico de cultivo de tejido CD10 + , CD34", CD105 + , CD200+ (referidas en este ejemplo como PDACs) en diferenciación de célula madre hematopoyética (HSC) a células asesinas naturales, HSCs fueron estimuladas con PDACs tratados con mitomicina C o células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea (MSC) a una relación de 10:1 PDACs/MSC:HSC en el día 0 y día 21, mientras que se usó un cultivo libre de alimentadora como el control. Se usó medio de NK2A como medio de cultivo. Se descubrió que PDACs mejoran la expansión de pliegue de células NK cultivadas en comparación con medio solo. Sin embargo, no se encontró diferencia significativa en citotoxicidad entre células crecidas con o sin la capa alimentadora. Las células tratadas con MSC mostraron la expansión de pliegue más alta, pero la citotoxicidad más baja, como se muestra en la figura 7. 7.6 Ejemplo 6: Actividad Citotóxica de Células NK Expandidas Usando Medio de Dos Etapas Este ejemplo demuestra que las célula NK producidas de células CD34+ expandidas y diferenciadas usando el proceso de dos etapas descrito antes son citotóxicas a líneas celulares tumorales.
Ensayo de liberación de deshidrogenase de lactado (LDH). Se realizó el ensayo de liberación de LDH usando equipo de citotoxicidad no radioactiva CYTOTOX 96® (Promega, Cat# G1780). En este ensayo, las células NK cultivadas derivadas de perfundido de placenta humano compatible con donante (HPP) y unidades de sangre de cordón (unidades Combos) se usaron como células efectoras, mientras que ciertas células de línea celular tumoral se usaron como células diana. A partir de tres unidades en este estudio, el porcentaje de células HPP fue 56.6 ± 28.3%. Se colocaron células efectoras y células diana en placas de cultivo de tejido de fondo en U de 96 pozos e incubadas a varias relaciones de efectora-diana (E:T) en 100 µ? RPMI 1640 sin fenol rojo (Invitrogen, Cat# 11835-030) suplementado con 2% suero humano AB (Gemini, Cat# 100-512). Se incubaron cultivos durante 4 horas a 37°C en 5% C02. Después de la incubación, 50 µ? de sobrenadante se transfirió a placa de ensayo enzimático, se detectó actividad de LDH como se provee por el fabricante, y se midió absorción a 490 nm en un lector de ELISA (Synergy HT, Biotek). Se calculó la citotoxicidad de acuerdo con la siguiente ecuación: % Citotoxicidad = (Muestra = Efectora Espontánea - Diana Espontánea)/(Diana máxima - Diana espontánea)*100, en donde "Efectora Espontánea" es un control para la liberación espontánea de LDH de células efectoras; "Diana Espontánea" es un control para la liberación espontánea de LDH de células diana; y "Diana Máximo" es un control para la liberación de LDH máxima cuando se lisan esencialmente 100% de las células.
Aislamiento de Células CD34+ de Perfundido de Placenta Humano (HPP) y Células CD34+ de Sangre de Cordón Umbilical (UCB). Se purificaron células HPP y UCB usando Ficoll o cloruro de amonio para obtener células nucleadas totales (TNCs). Después se usaron TNCs en un procedimiento de selección positiva para aislar células CD34+ usando esferas anti-CD34 y RoboSep siguiendo el protocolo provisto por el fabricante (StemCell Technologies, Inc.). En este experimento, se aislaron células CD34+ con más de 90% de pureza.
Estudio de susceptibilidad de célula tumoral a células NK de dos etapas cultivadas. Las líneas celulares tumorales (tabla 1), incluyendo cáncer de mama humano (HCC2218), adenocarcinoma colorectal humano (HT-29), leucemia mielógena crónica humana (CML), leucemia mieloide aguda humana (AML), glioblastoma humano (LN-18 y U-118MG), mieloma múltiple humano (U266), linfoma histiocítico humano (U937), y retinoblastoma humano (WERI-RB-1) se co-cultivaron en células NK de dos etapas. Las células NK cultivadas de dos etapas incluyeron aquellas cultivadas en medio de NK2A durante 21 días, después cultivadas en medio de CNK durante 21 días, y aquellas cultivadas en medio de NK2A durante 28 días y después medio de CNK durante 14 días. Se midió la citotoxicidad de célula NK por el ensayo de liberación de deshidrogenasa de lactado (LDH) después de co-cultivo de 4 horas. A relación de efectora a diana (E:T) de 10:1 la última por lo general mostró citotoxicidad mayor que el primero (tabla 6). De las líneas celulares tumorales, LN-18 fue la más susceptible a asesinato mediado con NK, seguido por K562, U937, WERI-RB-1, U-118MG, HT-29, HCC2218, KG-1 y U266.
Por lo tanto, las células TSNK mostraron citotoxicidad significativa hacia varias líneas celulares de cáncer. Además parece que la citotoxicidad de NK puede mejorar al prolongar el periodo de cultivo en medio de NK2A de 21 días a 28 días.
Tabla 6. Citotoxicidad de células TSNK cultivadas focalizando en líneas celulares tumorales Perfil de microARN de Células CD34+ de Perfundido de Placenta Humano (HPP) y Células CD34+ de Sangre de Cordón Umbilical (UCB). Se sometieron células HPP y UCB CD34 + compatibles con donante purificadas a preparación microARN (miARN) usando un equipo de aislamiento de miARN IRVANA™ (Ambio, Cat# 1560). Se interrumpieron células CD34+ (0.5 X 106 células) en un regulador de lisis desnaturalizante. Las muestras entonces se sometieron a extracción de ácido-fenol + cloroformo para aislar ARN altamente enriquecido para especie de ARN pequeña. Se agregó 100% de etanol para llevar las muestras a 25% de etanol. Cuando esta mezcla de lisato/etanol pasó a través de un filtro de fibra de vidrio, se inmovilizaron especies grandes de ARN, y se recolectaron las especies pequeñas de ARN en el filtrado. La concentración de etanol del filtrado después se aumentó a 55%, y la mezcla pasó a través de un segundo filtro de fibra de vidrio en donde los ARNs pequeños se inmovilizan. Este ARN se lavó pocas veces, y eluyó en una solución iónica de baja resistencia. La concentración y pureza del ARN pequeño recuperado se determinó al medir su absorbancia a 260 y 280 nm. Se descubrió que los miARNs fueron únicos para células HPP CD34+ en todos los donantes probados (n = 3) incluidos hsa-miR-380, hsa-miR-512, hsa-miR-517, hsa-m¡R-518c, hsa-miR-519b, y hsa-miR-520a. 7.7 Ejemplo 7: Aislamiento de células CD34* de UCB y HPP agrupadas Este ejemplo demuestra el aislamiento de células CD34+ de sangre de cordón umbilical (UCB) y perfundido de placenta humano (HPP) agrupados (Combo). Para evaluar la relación de agrupación de UCB:HPP, se realizaron comparaciones de lado a lado de 3 relaciones diferentes de agrupación de la siguiente manera: (1) agrupación completa: 1x UCB (volumen completo) + 1x HPP (volumen completo); (2) agrupación parcial de HPP (33%): 1x UCB (volumen completo) + 0.33x HPP (1/3 de volumen HPP); y (3) agrupación parcial de HPP (10%): 1x UCB (volumen completo) + 0.10x HPP (1/10 de volumen HPP). Se ejecutó un total de N = 3 réplicas experimentales. Se registraron TNC inicial y volúmenes. Las muestras agrupadas entonces se purificaron para células CD34+ y pureza CD34+ se determinó post-descongelación. La relación de agrupación óptima entonces fue determinada gráficamente de la pureza CD34+ post-descongelación vs. fracciones volumétricas o conteo celular (TNC) (como % de combo) gráficas. Como se muestra en la figura 8, la pureza de CD34+ de punto final se correlaciona bien con el contenido de volumen de HPP, pero no tanto con el contenido de HPP TNC. En global, UCB 85% v/v, HPP 15% v/v se encontró ser la relación de agrupación óptima para obtener células CD34+ con pureza de 80% y más. 7.8 Ejemplo 8: Comparación de Cultivo de Célula NK Usando medio basado en GBGM® Este ejemplo demuestra la comparación de procesos de cultivo de célula NK usando dos medios a base de GBGM (el proceso de tres etapas y proceso de dos etapas). Los dos procesos se resumen en la tabla 10. Ambos procesos utilizaron GBGM como el medio basal para la diferenciación de células NK y células CD34+ de placenta en origen .
Tabla 7. Resumen de los procesos de tres etapas y dos etap Los parámetros experimentales se delinean a continuación: Lotes de donantes: (1) Células CD34+ de UCB fresco: N = 6 (2) Células CD34+ de "Combo" fresco: N = 2 (3) CD34+ de "Combo" crioconservado: N = 8 Escala: Platos multipozo a T-25, hasta múltiples frascos T-75, mL en volumen de cultivo Métodos de Proceso: (1) Proceso de dos etapas (2) Proceso de tres etapas Uso de alimentadores: (1 ) Sin alimentadores (2) Con alimentadores K562 & PBMC inactivados, agregados a cultivo en el día 21 Densidad de semillero: 20000 - 50000 células / mL Células CD34+ de UCB fresco o combo fresco se generaron y crioconservaron con métodos descritos en los ejemplos 7, 10 y 11. Se mantuvieron cultivos en una incubadora a 37°C, >90% humedad y 5% C02. Se monitoreó el crecimiento celular (conteo celular) y se realizaron intercambios de medio dos veces por semana para mantener concentraciones celulares dentro del rango de 5 x 104 - 1 x 106 por ml_. Se monitoreó la diferenciación por análisis fenotípico en el día 21 y 35. Cuando se usaron alimentadores, en el día 21 de cultivo de NK, se inactivaron K562 cultivado de 3 días fresco y alo-PBMC post-descongelación con mitomicina-C (16 µg mL> 2 horas, 37°C) y se agregaron a las condiciones de proceso de dos etapas a 1 x 106 por mL. En el día 35, después de realizar conteos celulares finales, un ensayo de citotoxicidad basado en citometría de flujo usando células K562 marcadas con PKH y frescamente cultivadas (relación E:T 10:1, 4 hr, 37°C) se realizó para evaluar funcionalidad de NK.
Resultados El medio del pliegue de expansión de TNC para células CD34+ derivadas de UCB fresco usando los dos procesos fueron comparables en el día 35. El proceso de dos etapas pareció producir mayor pliegue de expansión de TNC que el proceso de tres etapas para células CD34+ derivadas de combo fresco. Los pliegues de expansión globales de TNC fueron comparables para las células CD34+ derivadas de combo post-descongelación usando ambos procesos, pero fueron significativamente menores que aquellos derivados de UCB fresco o combo fresco. En todo, ambos procesos de dos etapas y tres etapas produjeron rendimiento celular similar al final del cultivo.
En el día 21, no hubo diferencias notables de fenotipo en células originadas de UCB o Combo. El proceso de dos etapas resultó en un porcentaje mayor de células NK CD56 + CD3" (promedio 14.7%) que el proceso de tres etapas (promedio 6.1%). El grado de diferenciación (por ejemplo, nivel de CD56 + CD3~) pareció ser dependiente de donante. El porcentaje de ambas poblaciones CD3 + CD56" (células T) y CD3 + CD56 + (células tipo NKT) fueron mínimos en todos los casos.
En el día 35, se descubrió que ambos procesos son efectivos para diferenciar células NK, como se evidencia por los niveles de pureza CD56 + CD3" de punto final alto (87.2% y 90.1% para los procesos de dos etapas y tres etapas, respectivamente). La adición de alimentadores en el proceso de dos etapas pareció mejorar la pureza fenotípica de NK (75.3% sin alimentadores; 87.2% con alimentadores), aunque no se encontró beneficio observable de alimentadores sobre pureza de NK (90.1% sin alimentadores; 84.7% con alimentadores) con el proceso de tres etapas.
Las células NK cultivadas mantuvieron su producción de fenotipo CD16'. El proceso de dos etapas pareció producir ligeramente más células CD56 + CD3+ en ausencia de alimentadores (promedio 11.2%) que las otras condiciones (<2%). La presencia de alimentadores de PBMC y K562 en ambos procesos significativamente reguló de manera ascendente/activó ciertos marcadores NK funcionales (NKp46, DNAM-1, CD94) en la población de célula NK. En global, los perfiles de expresión de pureza de NK y marcador funcional se descubrió ser compatibles entre los dos procesos, cuando las condiciones alimentadoras fueron idénticas.
La funcionalidad de células NK cultivadas, como se determina por el ensayo de citotoxicidad de K562 in vitro de 4 horas, se descubrió ser comparable entre los dos procesos cuando las condiciones alimentadoras fueron idénticas. Las células NK activadas con alimentador fueron altamente efectivas en células K562 asesinas in vitro, con lisis específica promedio de 93.2% y lisis específica 93.6% para los procesos de dos etapas y tres etapas, respectivamente.
En resumen, los procesos de dos etapas y tres etapas se descubrió que producen crecimiento comparable, fenotipo (marcadores de pureza y activación), y funcionalidad in vitro para células NK cuando se usó la misma condición alimentadora. El proceso de dos etapas ofrece la facilidad y conveniencia de cultivar células NK en comparación con el proceso de tres etapas. 7.9. Ejemplo 9: Comparación de Cultivo de Célula NK Usando Varios Medios Básales Este estudio busca evaluar la diferenciación y expansión de células NK derivadas de CD34+ usando diferentes medios básales.
Las condiciones experimentales se resumen en la tabla 11. Las células se cultivaron como se describe en el ejemplo 11. Todos los experimentos fueron puestos en la escala de platos de multipozo/frascos T y se mantuvieron a 37°C, >90% humedad, y 5% C02 incubadora. Se monitoreó el crecimiento celular (conteo celular) y se realizaron intercambios de medio dos veces por semana para mantener concentraciones celulares dentro del rango de 5x104 - 1x106 por mL. Se monitoreó la diferenciación por análisis fenotípico en el día 21 y día 35. En el día 21, se inactivaron K562 cultivado en 3 días fresco y alo-PBMC post-descongelación y se agregaron a cultivo de célula NK en desarrollo a 1x106 por mL. Las células NK se normalizaron a 0.5x106 por mL. En el día 35, después se realizaron conteos celulares finales, un ensayo de citotoxicidad basado en citometría de flujo usando células K562 marcadas con PKH y frescamente cultivadas (relación E:T 10:1, 4 hr, 37°C) se llevó a cabo para evaluar la funcionalidad de NK.
Tabla 8. Resumen de condiciones experimentales para evaluación de varios medios básales Rendimiento de Crecimiento Stemspan H3000 y OpTimizer mostraron rendimiento de crecimiento comparable (pliegue de expansión de TNC) a GBGM en el día 35. Cellgro, X-VIVO 15, AIM-V, X-VIVO 10, DMEM:F12, DMEM:F12 el 5 mM OAC mostraron rendimiento de crecimiento menor que GBGM.
Análisis Fenotípico En el día 35 (punto final), GBGM produjo aproximadamente 80% pureza de células CD56 + CD3". OpTimizer y Stemspan H3000 produjeron aproximadamente 50% pureza de células CD56 + CD3\ DMEM:F12 produjo aproximadamente 35% pureza de células CD56 + CD3\ AIM-V, X-VIVO 10, X-VIVO 15 y medio Cellgro produjeron aproximadamente <30% pureza de células CD56 + CD3'. La adición de OAC a DMEM:F12 medio basal durante el cultivo se descubrió potenciar en gran manera la pureza de NK de punto final; el porcentaje de CD56 + CD3' en el día 35 del cultivo aumentó de 35% a 72%.
Cito toxicidad/Funcionalidad La adición de 5 mM OAC a DMEM:F12 medio basal durante cultivo se descubrió potenciar en gran manera el estado de activación y funcionalidad in vitro de células NK. La adición de OAC también aumentó significativamente el nivel de marcadores de activación de NK NKp46, NKG2D, DNAM-1 y CD94. La funcionalidad in vitro (citotoxicidad de K562) de células NK de día 35 aumentó sustancialmente también, de 21.4% a 97.1%.
En global, las propiedades de célula NK mejoraron significativamente de la adición de 5 mM OAC. 7.10. Ejemplo 10: Almacenamiento y Crioconservación de Células NK Este ejemplo demuestra los métodos de almacenar y crioconservar células NK. Las células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas de perfundido de placenta humano (HPP) y células de sangre de cordón umbilical fueron expandidas y diferenciadas en células NK usando los protocolos descritos en los ejemplos previos. Las células se crioconservaron justo después de aislarse de HPP y sangre de cordón umbilical (en día 0) o durante la primera fase de crecimiento de las células NK (en día 9, día 14, día 21 o día 35 postaislamiento).
Las células se crioconservaron en las siguientes formulaciones de crioconservación: Formulación 1 - medio crio de dextran: 5% DMSO (Sigma Aldrich, D2650), 55% dextran (10% p/v en solución salina normal) (10% LMD en 0.9% inyección de cloruro de sodio, Hospira), 40% HAS (Octapharma); Formulación 2 - medio crio de trehalosa: 5% DMSO, 55% trehalosa (10% p/v en solución salina normal), 40% HSA; Formulación 3 - CryoStor® CS2 (BioLife Solutions); Formulación 4 - CryoStor® CS5 (BioLife Solutions); Formulación 5 - CryoStor® CS10 (BioLife Solutions); Formulación 6 -medio de congelación libre de suero (Sigma-Aldrich, Cat# 6295); Formulación 7 - medio de congelación de glicerol (Sigma-Aldrich, Cat# C6039); o Formulación 8 - DMSO y medio de congelación libre de suero (Sigma-Aldrich, CAT# 2639).
Las células recolectadas en puntos de tiempo diferentes se lavaron varias veces con medio de cultivo o solución salina. Las células entonces se centrifugaron para obtener bolitas de célula. Los sobrenadantes fueron eliminados, y las bolitas de célula se suspendieron con medio de crioconservación a aproximadamente 1 x 106 - 1.5 x 107 o más células por mililitro. La suspensión celular se alicuotó a 1mL ó 2mL frascos de septo y se incubaron a 2-8°C durante aproximadamente 10 minutos. Posteriormente, las células se congelaron en un congelador de velocidad de control (Thermo) a 0.5°C/m¡n. Se transfirieron frascos congelados a un congelador criogénico para almacenamiento en vapor de nitrógeno líquido. Las células NK crioconservadas se descongelaron con rapidez en un baño de agua de 37°C con turbulencia cuidadosa de las muestras hasta que todo el hielo visible se derritió. Las muestras celulares se pueden diluir con medio de cultivo pre-calentado. 7.11. Ejemplo 11: Almacenamiento y Crioconservación de Células NK Este ejemplo demuestra otro método de almacenar y crioconservar células NK. Las células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas de perfundido de placenta humano (HPP) y células de sangre de cordón umbilical se expandieron y diferenciaron en células NK usando los protocolos descritos antes. Se crioconservaron células justo después de aislarse de HPP y sangre de cordón umbilical (en el día 0) o durante la primera fase de crecimiento de las células NK (en el día 9, día 14, día 21 o día 35 posterior al aislamiento).
Se preparó una solución de suspensión celular al combinar Dextran-40 y HSA en la relación de 60% Dextran-40 v/v, 40% HSA (de una solución de 25%) v/v).
Se preparó una solución de 2x descongelación con 50% Dextran-40 v/v, 40% HSA (25% solución) v/v, 10% DIVISO v/v. DMSO primero se agregó lentamente al Dextran-40 y se mezcló bien.
Posteriormente, 25% de solución de HSA se agregó a la solución lentamente con mezcla. La solución resultante se mezcló bien y se llevó a temperatura ambiente antes de usarse.
Procedimiento de Crioconservación Se estimó y normalizó el número celular como una suspensión celular a 15x106 en solución de suspensión celular. El volumen de la suspensión celular fue determinado y un volumen igual de solución de 2x congelación frescamente preparada se registró y distribuyó a un número de frascos. Se realizó prueba MycoAlert en sobrenadantes de cultivo ahorrados para detectar contaminación de micoplasma. Se realizó una prueba post-descongelación en un frasco de retención para determinar la viabilidad post-descongelación, recuperación celular y caracterización celular. 7.12. Ejemplo 12: Análisis de células NK crioconservadas/ descongeladas Ensayo de viabilidad. Las células NK crioconservadas en varias formulaciones como en el ejemplo 10 ú 11 se descongelaron. Se congelaron células a la densidad de 2 x 106 - 3 x 107 células/mL. Las células NK descongeladas fueron evaluadas para viabilidad celular usando el contador celular automatizado Countess® (Invitrogen) en el día 0, día 3 y día 18 posterior a la descongelación en comparación con células frescas o células precongeladas. Brevemente, 10 µ? de muestras celulares se mezclaron con 10 µ? de azul triptan. Las mezclas celulares se pipetearon en el portaobjetos de cámara Countess®. El portaobjetos fue insertado en el instrumento y las células fueron contadas. Las células post-congelación-descongelación mostraron viabilidad celular aproximadamente 80% a >90% de viabilidad, dependiendo de diferentes formulaciones de crioconservación.
Ensayo de apoptosis. Las células NK descongeladas también fueron evaluadas para apoptosis usando equipo de ensayo BD AnnV/PI Apoptosis en el día 0, día 3 y día 18 posterior a la descongelación. En breve, se lavaron células dos veces con 1x PBS frío y se re-suspendieron en 1x regulador de unión (equipo BD Annexin V/PI Apoptosis número de parte 556547 Composición de Unión número de parte de regulador 51-66121 E 0.1M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4M NaCI, 25 m CaCI2. Para 2x diluido 1 parte 10x regulador a 9 partes de agua destilada). 100µ? de suspensión celular conteniendo aproximadamente 100,000 células se transfirió en un tubo FACS. 100µ? de 1x regulador de unión, 5µ? de Ann V-FITC, y 5µ? de PI-PE se agregó al tubo. El tubo entonces fue mezclado en vórtice cuidadosamente e incubado en la oscuridad durante 15 minutos. Posteriormente, 400 µ? de 1x regulador de unión se agregó. Las muestras fueron analizadas en 1 hora. Los controles usados para establecer cuadrantes y rejas fueron células no manchadas, células manchadas con Ann V-FITC solamente y no Pl, células manchadas con Pl solamente y no AnnV. Se cuantif icaron las células apoptóticas como un % de la población de casos enrejados como "células" en la gráfica de dispersión de tamaño (FSC vs SSC). Las células postcongelación-descongelación mostraron aproximadamente 5-25% de células apoptóticas muertas/tardías y 10 - 25% de células apoptóticas tempranas, dependiendo de diferentes formulaciones de crioconservación. En global, la formulación 1 (5% DMSO, 55% dextran (10% p/v en solución salina normal), 40% HSA), formulación 2 (5% DMSO, 55% trehalosa (10% p/v en solución salina normal), 40% HSA), formulación 4 - CryoStor® CS5 (BioLife Solutions), y formulación 5 (CryoStor® CS10 (BioLife Solutions) mostraron mayor viabilidad celular y menores células apoptóticas en comparación con otras formulaciones. 7.13. Ejemplo 13: Evaluación de Banca Celular Crioconservada de Proceso Este ejemplo demuestra la evaluación de Banca Celular Crioconservada En-Proceso. El cultivo celular inició con células UCB CD34+ usando el método como se describe por Spanholtz y otros, PLoS One 5(2):e9221 (2010) usando HS-AB o FBS como la fuente de suero. La concentración celular fue determinada y ajustada, y el medio fue repuesto según sea necesario. En el día 7, 9, 10 ó 14, aproximadamente 106 - 3 x 106 células fueron eliminadas del cultivo celular, centrifugadas y resuspendidas en medio de crioconservación (5.5% v/v Dextran-40, 10% v/v HSA, 5% v/v DMSO). Las células se congelaron en un congelador de velocidad controlada y se transfirieron a almacenamiento de nitrógeno de fase líquida para crioconservación. Aproximadamente 1ml_ células cada frasco fueron crioconservadas a una concentración que varía de 106 - 107 por ml_. El cultivo restante fue llevado hacia el punto final (día 35), referido como "fresco (sin crioconservación en proceso)". Se realizaron análisis fenotípicos en el día 21, 28 y 35 del cultivo celular. La funcionalidad in vitro (citotoxicidad K562, E:T 10:1) fue evaluada en el día 35 (punto final) del cultivo.
El funcionamiento post-descongelación de las muestras de cultivo crioconservadas en proceso (día 9 y 14) se cultivaron de la siguiente manera. Los frascos de banco celular se descongelaron con rapidez en el baño de agua a 37°C. Las células entonces se diluyeron con medio de RPMI-FBS, se centrifugaron, resuspend ieron y sembraron en medio de cultivo. Cada una de las condiciones de cultivo se llevaron hacia delante al día 35, acumulativo desde el inicio del proceso de cultivo. Analíticos (conteo celular, viabilidad, análisis fenotípico, evaluación de funcionalidad) se hicieron en la misma manera como su contraparte "fresca".
Resultados Muestras crioconservadas en proceso de día 9, 10 y 14 todas produjeron excelente viabilidad post-descongelación, sin importar el punto de tiempo en proceso o concentración celular (96.2%-97.3% azul triptan negativo, 86.1%-93.2% Annexin-V negativo/TO-PRO 3 negativo). La banca en proceso no tuvo efectos negativos en pérdida de rendimiento de cultivo final (día 35). El rendimiento celular final entre el día 9 o día 14 post-descongelación y condiciones "frescas" son comparables, con HS-AB o HS-AB como la fuente de suero.
Los perfiles fenotípicos de células NK en maduración en puntos de tiempo de día 21/28/35 fueron bastante comparables entre el cultivo "fresco" y "post-descongelación", respectivamente. La pureza fenotípica (CD56 + CD3 ) fue comparable también. La expresión de ciertos marcadores funcionales NK (CD94, NKG2D) fueron ligeramente diferentes debido a variabilidades.
En el ensayo de citotoxicidad K562, se descubrió que las células NK cultivadas post-descongelación del día 9/14 producen -0-20% lectura de lisis de K562 específica menor comparando con células NK cultivadas crioconservadas no en proceso. Sin embargo, dados los niveles de expresión de marcadores de superficie relevantes a función citotóxica de NK (DNAM1 , NKp46, NKG2D, etc.) no se redujeron concurrentemente, la tendencia necesitaría ser confirmada con donantes adicionales y repeticiones de ensayo. En global, la crioconservación en proceso en el día 9/14 de cultivo tuvo impacto mínimo en resultado del proceso. 7.14. Ejemplo 14: Desarrollo de medio post-descongelación para dosificación de célula NK Este ejemplo demuestra el desarrollo de medio postdescongelación para dosificación de célula NK en animales. Los efectos de medio de inyección y densidad celular se probaron en la viabilidad de célula NK, citotoxicidad, recuperación celular y formación de grumo. Se evaluó la viabilidad por manchado con azul triptan; se evaluó la citotoxicidad por FACS (relación 10:1 de NK:K562) y formulación de grumo se evaluó por ensayo microscópico. Los resultados se muestran en las tablas 9-12 para los varios tipos de medio de inyección y densidad celular.
Tabla T. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 10. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 11. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 12. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Los resultados mostraron que el medio de inyección de Plasmalita + 1 % HSA mantuvo células NK con mejor viabilidad y citotoxicidad que medio de inyección de PBS+1% FBS. La citotoxicidad también disminuyó con el tiempo después de suspender las células en medio de inyección. No hay efecto de densidad celular observado en viabilidad y citotoxicidad cuando las células se suspendieron en Plasmalita + 1 % HSA. Las células NK también se establecieron en medio de PBS + 1% FBS o Plasmalita + 1 % HSA después de 1 hora; sin embargo, las células no parecieron agregarse. Finalmente, no hubo pérdida obvia de recuperación celular y viabilidad observadas desde el proceso de congelación-descongelación. 7.15. Ejemplo 16: Desarrollo de Medio Post-desconqelación para dosificación de célula NK Los efectos de varias concentraciones de HSA también fueron probados en la viabilidad e la célula NK, citotoxicidad, recuperación celular y formación de grumo. Los mismos métodos se utilizaron del ejemplo 19. Los resultados se muestran en las tablas 14-16 para los varios tipos de medio de inyección y densidad celular.
Tabla 13. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 14. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 15. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad formación de grumo de condiciones específicas probadas Tabla 16. Recuperación celular, viabilidad, citotoxicidad y formación de grumo de condiciones específicas probadas Los resultados muestran que la viabilidad se mantuvo bien sobre 4 horas de post-descongelación en los tres medios de inyección probados. También, la citotoxicidad disminuyó con el tiempo en tres medios de inyección. Sin embargo, el nivel de reducción fue menor en concentraciones más altas de HSA mientras que Plasmalita + 5% HSA mantuvo la citotoxicidad más alta. También se observó que las células NK no se agregan e los tres medios de inyección. En global, Plasmalita parece ser un mejor candidato de medio de inyección que PBS. 7.16. Ejemplo 17: Cultivo de células NK sin IL-2 Este ejemplo demuestra el cultivo de células NK en ausencia de IL-2. Se realizó cultivo celular por el proceso de dos etapas descrito en el ejemplo 11. Cinco diferentes concentraciones de IL-2 en el primer medio fueron probadas: 0, 200, 500, 1000, 2000 U/mL.
Los resultados indican que desarrollar células NK en cultivo no parecieron responder a IL-2 en crecimiento. La pureza de células NK no pareció depender de IL-2; las células NK se diferencian en fenotipo CD56 + CD3- en ausencia de IL-2. La combinación de IL-7, IL-15 y SCF pareció ser suficiente para desarrollo de célula NK in vi tro.
Equivalentes: La presente invención no se debe limitar en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción y figuras acompañantes. Dichas modificaciones deben caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente específica e individualmente fue indicada para incorporarse por referencia en su totalidad para todos los propósitos. La cita de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe ser considerada una admisión de que la presente invención no debe anteceder dicha publicación en virtud de la invención previa.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. - Un método de producir una población de células asesinas naturales (NK), que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK acti adas.
2. - Un método de dos pasos de producir una población de células asesinas naturales (NK), en donde un primer paso de dicho método comprende expandir una población de células madre o progenitoras hematopoyéticas en un primer medio que comprende uno o más de factor de célula madre (SCF), interleucina-7 (IL-7) e interleucina-15 (IL-15), y en donde dicho SCF, IL-7 e IL-15 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, y en donde una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y en donde un segundo paso de dicho método comprende expandir las células a partir del primer paso en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir células NK activadas.
3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el primer medio comprende además uno o más de ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (Flt3-L), trombopoyetina (Tpo), ¡nterleucina-2 (IL-2) o heparina.
4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el primer medio comprende además suero bovino fetal o suero humano.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el SCF está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el Flt3-L está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la IL-2 está presente a una concentración de alrededor de 50 a aproximadamente 1500 lU/mL en el primer medio.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la IL-7 está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la IL-15 está presente a una concentración de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
10. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la IL-15 está presente a una concentración de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
11. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la Tpo está presente a una concentración de alrededor de 1 a aproximadamente 150 ng/mL en el primer medio.
12 - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha IL-2 en el segundo paso está presente a una concentración de 50 a aproximadamente 1500 lU/mL en el segundo medio.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho segundo medio comprende adicionalmente uno o más de suero de becerro fetal (FCS), transferina, insulina, etanolamina, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, albúmina de suero bovino (BSA) y fitohemaglutinina.
14. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células madre o progenitoras hematopoyéticas son CD34+.
15. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células madre o progenitoras hematopoyéticas comprenden células madre o progenitoras hematopoyéticas de perfundido de placenta humano y células madre o progenitoras hematopoyéticas de cordón umbilical, en donde dicho perfundido de placenta y dicho cordón umbilical son de la misma placenta.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células alimentadoras en el paso (b) comprenden células mononucleares de sangre periférica tratadas con mitomicina C (PBMC), células K562 o células madre adherentes a cultivo de tejido.
17. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células NK son CD3"CD56 + CD16".
18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células NK son adicionalmente CD94+CD117 + .
19. - El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células NK son adicionalmente CD161".
20. - El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células NK son adicionalmente NKG2D + .
21.- El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células NK son adicionalmente NKp46 + .
22. - El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde las células NK son adicionalmente CD226 + .
23. - Una población de células NK activadas obtenidas por un método que comprende: (a) sembrar una población de células madre o progenitores hematopoyéticas en un primer medio que comprende interleucina-15 (IL-15) y, opcionalmente, uno o más de factor de célula madre (SCF) e interleucina-7 (IL-7), en donde dicha IL-15 y SCF opcional e IL-7 no están comprendidos dentro de un componente no definido de dicho medio, de modo que la población se expande, y una pluralidad de células madre o progenitoras hematopoyéticas dentro de dicha población de células madre o progenitoras hematopoyéticas se diferencian en células NK durante dicha expansión; y (b) expandir las células del paso (a) en un segundo medio que comprende interleucina-2 (IL-2), para producir una población de células NK activadas.
24. - Un método de suprimir la proliferación de células tumorales que comprende contactar las células tumorales con una pluralidad de células NK CD94 + CD117\ en donde dichas células NK han sido producidas por el método de conformidad con la reivindicación .
25. - El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde dichas células tumorales son células de carcinoma ductal primario, células de glioblastoma, células de leucemia, células de leucemia de célula T aguda, células de linfoma mieloide crónico (CML), células de leucemia mielógena aguda, células de leucemia mielógena crónica (CML), células de carcinoma pulmonar, células de adenocarcinoma de colon, células de linfoma histiocítico, células de mieloma múltiple, células de carcinoma colorectal, células de adenocarcinoma colorectal, células de cáncer de próstata o células de reti noblastoma .
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