ES2549155T3 - Células iPS obtenidas a partir de células NKT y células NKT obtenidas a partir de las mismas - Google Patents
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Abstract
Un método de generación de una célula NKT madura que comprende: (a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena α del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a Vα-Jα uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene: - la región de la cadena α del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a Vα-Jα uniforme de modo específico de receptor de células NKT, y - pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch; (b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a); y (c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch.
Description
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DESCRIPCIÓN
Células iPS obtenidas a partir de células NKT y células NKT obtenidas a partir de las mismas
Campo técnico
La presente invención se refiere a una célula madre pluripotente inducida obtenida a partir de una célula NKT (a la que se hace referencia de aquí en adelante como célula iPS por sus siglas en inglés), a células NKT obtenidas a partir de la célula iPS, a un método de producción de la misma y a una aplicación de uso de la misma. La presente invención se refiere también a una célula iPS obtenida a partir de una célula somática en la que se reordena la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T formando V-J uniforme de modo específico del receptor de la célula NKT, a células NKT obtenidas a patir de la célula iPS, a un método de producción de la misma y a una aplicación de uso de la misma.
Antecedentes de la técnica
Las células iPS poseen unas capacidades de diferenciación y formación de tejidos equivalentes a las de las células madre embrionarias (células ES por sus siglas en inglés). Debido a la inducibilidad a partir de células de cultivo primario humanas, las células iPS son células que poseen potencialmente la capacidad de desempeñar un papel clave en la medicina regenerativa. Yamanaka et al. establecieron una célula iPS que posee pluripotencia como las células ES mediante transferencia de cuatro factores (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) a fibroblastos embrionarios de ratón (MEF por la siglas en inglés) (documento no de patente 1). Además de MEF, tuvieron éxito en establecer células iPS de ratón a partir de otras diversas células (documentos no de patente 2 y 3), órganos (documento no de patente 4) y similares. Además, también en seres humanos se ha reseñado el establecimiento de células iPS a partir de células somáticas humanas usando la misma técnica (documentos no de patente 5-8).
Un aspecto que puede ser un impedimento importante para asegurar la eficacia y seguridad de las células iPS en el contexto de su aplicación clínica reside en la diversidad de los mismos. Se especula que el funcionamiento de las células iPS difiere entre diferentes estirpes, dependiendo del fondo genético del individuo, del tipo de células, del grado de reprogramación, de la etapa de génesis en la que se inmortalizan las células y similares. De hecho, incluso en células ES de ratón, el patrón de expresión génica difiere ampliamente dependiendo del fondo genético, y la competencia de diferenciación varía ampliamente entre diferentes estirpes. Se ha encontrado ya por Yamanaka et al. que, también en células iPS humanas, el patrón de expresión génica difiere ampliamente entre diferentes estirpes (documento no de patente 5). Por lo tanto, se prevé que la competencia de diferenciación y la tendencia a la tumorigénesis varíen considerablemente entre las diferentes células iPS. También hay espacio para una mejora adicional del protocolo de reprogramación nuclear; se han reseñado diversos protocolos mejorados (documentos no de patente 9-14).
El sistema inmunohematopoyético se ha instaurado desde hace tiempo como sujeto de la medicina regenerativa o citoterapia, desde transfusión de sangre a trasplante de médula ósea y trasplante de sangre de cordón umbilical, y se ha mostrado que estas terapias son sustancialmente eficaces. Se ha mostrado también que, en ratones y seres humanos, puede inducirse la diferenciación a partir de células ES en una variedad de células del sistema inmunohematopoyético. Esto indica que la inducción de células del sistema inmunohematopoyético a partir de células iPS sería potencialmente eficaz como terapia en el marco convencional.
Las células T citolíticas naturales (NKT por sus siglas en inglés), que son una serie de linfocitos constituyentes del sistema inmunitario, desempeñan un papel clave en la inmunidad antitumoral y las reacciones defensivas ante enfermedades infecciosas por el efecto coadyuvante de la citocina de Th1IFN-; la falta de células NKT conduce a la muerte por infección. Al mismo tiempo, debido a que las respuestas inmunitarias están controladas por IL-10, que es una citocina de Th2 producida por células NKT, los linfocitos son también responsables del control de la reacción inmunitaria ante trasplantes y la supresión del inicio de enfermedades autoinmunitarias. Como se afirma anteriormente, las células NKT ostentan una parte clave del control inmunitario; por lo tanto, la -galactosilceramida (-GalCer), que es un ligando glicolipídico de células NKT que permite el control artificial de la función celular de los mismos, no es el único regulador de la respuesta inmunitaria disponible actualmente; de hecho, las células NKT están ya en algunas aplicaciones clínicas en pacientes de cáncer de pulmón, y los resultados de estudios clínicos de fase II que se han realizado hasta la fecha muestran que el tiempo medio de supervivencia se alarga tanto como 4-5 veces en comparación con la quimioterapia.
Sin embargo, en pacientes de cáncer sujetos a inmunoterapia con células NKT, se observan reducciones del recuento de células NKT y defectos funcionales (véase, por ejemplo, el documento no de patente 15), de modo que hay algunos casos en que no puede lograrse una activación de células NKT suficiente para obtener un efecto terapéutico simplemente mediante la administración de células dendríticas con pulsos de -GalCer. En este caso, es posible recoger células NKT del paciente u otra persona del mismo tipo de HLA, propagarlas y devolverlas entonces (trasplantarlas) al paciente; sin embargo, las células NKT están habitualmente presentes en cantidades extremadamente pequeñas de no más de un 0,1 % de los linfocitos de sangre periférica, y es incómodo propagarlas masivamente. Por lo tanto, a condición de que pueda propagarse un clon de células NKT en grandes cantidades
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mediante la reprogramación de las células NKT recogidas, y dejarlas entonces diferenciar y madurar de nuevo, se espera que pueda mejorar el efecto terapéutico de la inmunoterapia de células NKT.
Sin embargo, las células diferenciadas finalmente son menos fáciles de reprogramar, en comparación con las células no diferenciadas; no se han presentado hasta la fecha informes de inducción de células iPS a partir de células T o células NKT. Para las células B, se ha reseñado que las células iPS no pueden inducirse con los denominados cuatro factores o tres factores (Oct3/4, Sox2, Klf4) solos, requiriendo a menudo su inducción el uso de otro gen como factor de reprogramación nuclear (documento no de patente 3). Sin embargo, se teme que el aumento del número de transgenes agudice los problemas de seguridad, incluyendo la tumorigénesis potencial de las células diferenciadas a partir de células iPS. Además, incluso si las células iPS se establecieran a partir de una célula NKT, seguiría siendo desconocido si podtía inducirse la diferenciación a partir de la célula iPS hasta células NKT maduras funcionales.
[Referencias de la técnica anterior] [Documentos no de patente]
Documento no de patente 1: Cell. 25 de agosto de 2006; 126(4): 663-676. Documento no de patente 2: Nature. 19 de julio de 2007; 448(7151): 313-317. Epub de 6 de junio de 2007. Documento no de patente 3: Cell. 18 de abril de 2008; 133(2): 250-264. Corrección en: Cell. 25 de julio de 2008;
134(2): 365. Documento no de patente 4: Science. 1 de agosto de 2008; 321(5889): 699-702. Epub e 14 de frebrero de 2008. Documento no de patente 5: Cell. 30 de noviembre de 2007; 131(5): 861-872. Documento no de patente 6: Science. 21 de diciembre de 2007; 318(5858): 1917-1920. Epub de 20 de noviembre de
2007. Documento no de patente 7: Nature. 10 de enero de 2008; 451(7175): 141-146. Epub de 23 de diciembre de 2007. Documento no de patente 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 26 de febrero de 2008; 105(8); 2883-2888. Epub de 15 de
febrero de 2008. Documento no de patente 9: Nat. Biotechnol. enero de 2008; 26(1): 101106. Epub de 30 de noviembre de 2007. Documento no de patente 10: Nat. Biotechnol. agosto de 2008; 26(8): 916-924. Epub de 1 de julio de 2008. Documento no de patente 11: Utikal JS, Arnold K, Jaenisch R, Hochedlinger K. “Reprogramming of neural progenitor
cells into iPS cells in the absence of exogenous Sox2 expression”. Stem Cells. Epub de 17 de julio de 2008. Documento no de patente 12: Nature. 31 de julio de 2008; 454(7204): 646-650. Epub de 29 de junio de 2008. Documento no de patente 13: Cell Stem Cell. 5 de junio de 2008; 2(6): 525-528. Documento no de patente 14: Curr. BioI. 24 de junio de 2008; 18(12): 890-894. Epub de 22 de mayo de 2008. Documento no de patente 15: J. Immunol. 2006 177: 3484-3492
Sumario de la invención Problemas a resolver por la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar una célula iPS obtenida a partir de una célula NKT, céluas NKT diferenciadas a partir de la célula iPS y métodos de creación de las mismas. Es otro objeto de la presente invención proporcionar una célula iPS obtenida a partir de una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de un modo específico del receptor de la célula NKT, células NKT diferenciadas a partir de células iPS y métodos de creación de las mismas. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un agente de inmunoterapia celular y similares preparado usando células diferenciadas a partir de células iPS.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores realizaon extensas investigaciones para resolver los problemas anteriormente descritos, y han tenido éxito inesperadamente en establecer una célula que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de células T (TCR por sus siglas en inglés) reordenada a V14-J18, y que posee propiedades características de las células iPS, tales como competencia de proliferación, pluripotencia y un patrón de expresión génica similar a células ES (a la que se hace referencia de aquí en adelante como “célula NKT-iPS”), mediante la
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introducción de solo los cuatro factores Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en una célula NKT obtenida a partir de bazo de ratón usando un retrovirus. Los presentes inventores han tenido éxito también en establecer una célula NKT-iPS mediante la introducción de los cuatro factores anteriormente mencionados en un fibroblasto embrionario de un ratón clon de células NKT obtenido transfiriendo el núcleo de una célula NKT obtenida a partir de bazo de ratón a un ovocito enucleado. Además, los presentes inventores han ensayado diversas combinaciones de células alimentadoras y citocinas, y como resultado han tenido éxito en propagar masivamente células NKT maduras a partir de la célula NKT-iPS obtenida, confirmaron que la célula NKT es funcional in vivo y desarrollaron la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a lo siguiente:
[1] Un método de generación de una célula NKT madura que comprende:
(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en la que la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:
la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, y
pluripotencia y competencia de replicación,
y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;
- (b)
- cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a); y
- (c)
- cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch.
[2] El procedimiento descrito en [1] anteriormente, en donde
la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es una célula NKT o un fibroblasto; y/o
los factores de reprogramación nuclear usados para obtener la célula iPS son Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc o ácidos nucleicos que codifican los mismos, u Oct3/4, Sox2 y Klf4 o ácidos nucleicos que codifican los mismos.
[3] El método descrito en [1] o [2] anteriormente, en donde la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es de origen humano.
[4] El método descrito en una cualquiera de [1] a [3] anteriormente, en donde el cocultivo de la etapa (c) se efectúa en presencia de dos o más citocinas seleccionadas de interleucina 2, interleucina 7, interleucina 15 y ligando de Flt3.
[5] El método descrito en una cualquiera de [1] a [4] anteriormente, en donde el cocultivo de la etapa (c) se efectúa en presencia de interleucina 15.
[6] Un método de generación de una célula NKT activada que comprende:
(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:
la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT y
pluripotencia y competencia de replicación,
y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;
(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);
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- (c)
- cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y
- (d)
- poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro.
5 [7] Un método para producir un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT, que comprende:
(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en la que la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células
10 NKT, en donde la célula iPS tiene:
la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT y
pluripotencia y competencia de replicación,
y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;
15 (b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);
(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenido en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y
(d) poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de 20 -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro; y
(e) combinar la célula NKT activada obtenido en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable.
[8] Un método para producir un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT en combinación con una -galactosilceramida, que comprende:
(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula
25 NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene:
la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J 30 uniforme de modo específico de receptor de células NKT y
pluripotencia y competencia de replicación,
y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;
(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);
35 (c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenido en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y
- (d)
- combinar la célula obtenida en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable; y
- (e)
- combinar -galactosilceramida con un portador farmacéuticamente aceptable.
Efecto de la invención
40 Según la presente invención, es posible inducir células NKT funcionalmente maduras que son equivalentes a células NKT periféricas en términos de expresión de antígenos de superficie celular, y que poseen sensibilidad a ligando glicolipídico, a través de células iPS in vitro.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama esquemático de los loci del gen TCR de células de tipo silvestre y NKT. 45 La Fig. 2 es un dibujo que muestra la reordenación de V-J en células NKT-iPS.
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La Fig. 3 es un dibujo que muestra la expresión de genes específicos de células ES en células NKT-iPS.
La Fig. 4 es un dibujo que muestra las correlaciones de los perfiles de expresión génica entre células NKT-iPS y células NKT-ES o células ES, y entre células NKT-iPS y células NKT de bazo de tipo silvestre. La Fig. 5 es un dibujo que muestra la similitud de las células NKT-iPS con células iPS obtenidas a partir de MEF o
células ES en morfología y la expresión de los genes SSEA1 y Oct3/4. La Fig. 6 es un dibujo que muestra cómo se expresa TCR/ en cada célula obtenida a partir de ratón en
esplenocitos de un ratón quimérico de células NKT-iPS generado a partir de los clones 2a de células NKT-iPS obtenidas a partir de ratón C57BL/6 y una célula obtenida a partir de ratón Balb/C. La Fig. 7 es un dibujo que muestra la inducción de la diferenciación in vitro de células NKT-DP a partir de células
NKT-iPS. La Fig. 8 es un dibujo que muestra los resultados de un análisis fenotípico de células NKT-DP. La Fig. 9 es un dibujo que muestra la inducción de la diferenciación in vitro de células NKT que exhiben el mismo
fenotipo que células NKT periféricas, a partir de células NKT-iPS.
La Fig. 10 es un dibujo que muestra la propagación masiva de células NKT a partir de células NKT-DP usando diversas combinaciones de citocinas. La Fig. 11 es un dibujo que muestra la expresión de TCR invariante, la expresión de CD4/CD8 y la expresión de
NK1.1 en células obtenidas cocultivando NKT DP con células estromales que (A) no expresan/(B) expresan un
ligando de Notch usando diversas combinaciones de citocinas. La Fig. 12 es un dibujo que muestra la sensibilidad a -GalCer de la diferenciación de células NKT inducida a partir de una célula NKT-iPS.
La Fig. 13 es un dibujo que muestra el efecto coadyuvante in vivo de la diferenciación de células NKT inducida a
partir de una célula NKT-iPS. La Fig. 14 es un dibujo que muestra el establecimiento de una célula iPS a partir de esplenocitos de ratón silvestre C57BL/6.
La Fig. 15 es un dibujo que muestra la generación de un ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6.
La Fig. 16 es un dibujo que muestra la secuencia de bases de la región del receptor de linfocitos T de un ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6. La Fig. 17 es un dibujo que muestra un análisis de reordenación génica de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g. La Fig. 18 es un dibujo que muestra un análisis de expresión génica de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g. La Fig. 19 es un dibujo que muestra un análisis de micromatriz de ADN y análisis de correlación de los clones de
células NKT-iPS 7a y 7g.
La Fig. 20 es un dibujo que muestra el examen morfológico de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g y la expresión de marcadores de células ES. La Fig. 21 es un dibujo que muestra un análisis de metilación de ADN de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g. La Fig. 22 es un dibujo que muestra la transmisión de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g a la descendencia. La Fig. 23 es un dibujo que muestra un método de inducción de la diferenciación in vitro de células NKT a partir de
los clones de células NKT-iPS 7a y 7g.
La Fig. 24 es un dibujo que muestra la expresión de marcadores de superficie celular en células de diferenciación inducida a partir de los clones de células NKT-iPS 7a y 7g in vitro. La Fig. 25 es un dibujo que muestra un análisis de correlación de la expresión génica integral de células 7a dif. y 7g
dif. de diferenciación inducida in vitro.
La Fig. 26 es un dibujo que muestra un análisis funcional in vitro de las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro. La Fig. 27 es un dibujo que confirma la presencia de genes transferidos al cabo de 1 semana (1 sem) y 2 semanas
(2 sem) después de la transferencia de las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro a un ratón deficiente en células NKT. 6
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La Fig. 28 es un dibujo que muestra el protocolo de una evaluación in vivo de las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.
La Fig. 29 es un dibujo que muestra la inducción de linfocitos T positivos en CD8 específicos de antígeno por células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.
La Fig. 30 es un dibujo que muestra el rechazo de tumor maligno por las células 7a dif. y 7g dif. de diferenciación inducida in vitro.
La Fig. 31 es un dibujo que muestra un método para establecer eficazmente una célula iPS a partir de una célula NKT de tipo silvestre.
La Fig. 32 es un dibujo que muestra las propiedades del clon 14k de células NKT-iPS.
La Fig. 33 es un dibujo que muestra una evaluación funcional in vitro de células de diferenciación inducida a partir del clon 14k de células NKT-iPS.
[Modos para representar la invención]
Se da a conocer en la presente memoria una célula que tiene la región de la cadena del gen TCR (TCR) reordenada a V-J uniforme y que posee propiedades características de las células iPS, tales como competencia de replicación, pluripotencia y un patrón de expresión génica similar a células ES (células NKT-iPS). Como se usa en la presente memoria, “una célula iPS” hace referencia a una célula que tiene pluripotencia y competencia de replicación adquiridas conferidas artificialmente por la puesta en contacto de factores de reprogramación nuclear con una célula somática, y que es similar a células ES en términos del perfil de expresión génica. Aquí, “pluripotencia” significa la capacidad de diferenciarse en una pluralidad de series de células inmunohepatopoyéticas tales como células NKT, linfocitos T, linfocitos B, eritrocitos, macrófagos y células progenitoras de los mismos, así como en una
o más series celulares distintas del sistema inmunohematopoyético, y se distingue de la multipotencia en células madre hematopoyéticas y células progenitoras multipotentes. “Competencia de replicación” significa la capacidad de que una célula continúe propagándose en un entorno particular (por ejemplo, condiciones adecuadas para cultivar células ES) mientras que retiene la “pluripotencia” anteriormente descrita. Además, “similar a células ES en términos del perfil de expresión génica” significa que el coeficiente de correlación r entre el conjunto de datos de expresión génica en las células en cuestión y el conjunto de datos de expresión génica en células ES es de 0,9 o más. Las células ES para la comparación incluyen células ES generadas a partir de un óvulo fertilizado derivado de la misma especie, preferiblemente de la misma cepa, células ES generadas a partir de un embrión trasplantado con el núcleo de una célula NKT y similares.
La célula NKT-iPS generada mediante el método de la presente invención puede ser una célula que tiene la región de la cadena del gen TCR (TCR) reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT y que posee propiedades características de células iPS, tales como competencia de replicación, pluripotencia y un patrón de expresión génica similar a células ES. El término “de modo específico de receptor de células NKT” se describirá a continuación.
La célula NKT-iPS generada mediante el método de la presente invención puede establecerse poniendo en contacto una célula somática que tiene la región de la cadena del gen TCR (TCR) reordenada a V-J uniforme de modo específico del receptor de células NKT, tal como las células NKT, con factores de reprogramación nuclear. En la presente memoria, “NKT” no está particularmente limitado, siempre que cada región de TCR se reordene a V-J uniforme, y se usa con un significado que engloba no solo las células NKT maduras (caracterizados, por ejemplo, por NK1.1+/CD3+), sino también las células progenitoras de los mismos (células caracterizadas, por ejemplo, por CD4+/CD8+ y similares). Las células NKT pueden aislarse de bazo, nódulo linfático, sangre periférica, sangre del cordón umbilical y similares mediante un método conocido por sí mismo, por ejemplo, citometría de flujo usando un anticuerpo contra los marcadores de superficie celular descritos anteriormente y un clasificador celular. En el caso de ratones, es preferible recoger las células NKT del bazo o nódulo linfático, en los que el cociente de abundancia de células NKT es alto; sin embargo, en el caso de seres humanos, es deseable desde el punto de vista de la baja invasividad y facilidad de preparación que las células NKT se preparen a partir de sangre periférica, sangre de cordón umbilical y similares.
El NKT usado en la presente invención puede derivar de cualquier especie animal que permita el establecimiento de células NKT-iPS mediante la puesta en contacto de factores de reprogramación nuclear con la célula NKT; específicamente pueden mencionarse aquellos de origen humano o de ratón, y se prefieren células NKT obtenidas a partir de seres humanos. El ser humano o ratón que sirve como fuente de las células NKT recogidas no está particularmente limitado, sin embargo, cuando las células NKT-iPS obtenidas se van a usar para inmunoterapia celular en seres humanos, es particularmente preferible desde el punto de vista de la prevención del rechazo de injertos que las células NKT se recojan del paciente o de otra persona que tenga el mismo tipo de HLA que el del paciente. Cuando las células NKT-iPS obtenidas no se van a administrar (trasplantar) a un ser humano, sino que se usan, por ejemplo, como fuente de células para cribado de evaluación de la sensibilidad a fármacos de un paciente o
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la presencia o ausencia de reacciones adversas, es necesario recoger las células NKT del paciente o de otra persona con el mismo polimorfismo genético correlacionado con la sensibilidad a fármacos o reacciones adversas.
Las células NKT preparadas a partir de bazo, nódulo linfático, sangre periférica, sangre de cordón umbilical y similares mediante el método anteriormente descrito pueden ponerse en contacto inmediatamente con factores de reprogramación nuclear para inducir células NKT-iPS, o pueden conservarse también con congelación mediante un método convencional, descongelarse justo antes del uso, cultivarse, y ponerse entonces en contacto con factores de reprogramación nuclear para inducir células NKT-iPS. Por lo tanto, es posible, por ejemplo, conservar células NKT preparadas a partir de bazo, nódulo linfático, sangre periférica, sangre de cordón umbilical y similares del propio receptor con congelación durante largo tiempo mientras está sano, para inducir células NKT-iPS a partir de las células NKT y células, tejidos y similares de autotrasplante obtenidas mediante inducción de la diferenciación de los mismos cuando se hace necesario el trasplante de células en fecha posterior.
Las células NKT son presuntamente células inmunocompetentes uniformemente funcionales caracterizadas por la reordenación de cada región de TCR aV-J uniforme (V24-J18 en seres humanos, V14-J18 en ratones). En las células NKT-iPS generadas mediante el método de la presente invención, se conserva la reordenación a NKT-TCR.
Las células NKT-iPS generadas mediante el método de la presente invención pueden establecerse poniendo en contacto una célula somática con factores de reprogramación nuclear, incluso si la célula somática es distinta de una célula NKT, siempre que la célula somática tenga la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocitos T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT. Un receptor de células NKT es un receptor de linfocitos T que se expresa específicamente en células NKT, y que reconoce específicamente una galactosilceramida (-GalCer) presentada en CD1d. La cadena de un receptor de células NKT se reordena normalmente a V24-J18 en seres humanos, y a V14-J18 en ratones. Por lo tanto, la reordenación de modo específico de receptor de células NKT significa la reordenación génica en la región de la cadena de tal modo que la combinación V-J en la región de la cadena del receptor de antígeno de linfocitos T sea V24-J18 en seres humanos y V14-J18 en ratones, y que el TCR obtenido pueda constituir el receptor de células NKT. Dicha célula somática puede prepararse mediante un método conocido por sí mismo. Por ejemplo, dicha célula somática puede ser una célula somática recogida de un animal clon de células NKT preparada trasplantando el núcleo de una célula NKT a una célula enucleada (p.ej., ovocito) y sometiendo la célula a una operación especificada. Se describe la generación de un animal clon, por ejemplo, en los documentos WO2006/018998 y similares. La célula somática puede ser, por ejemplo, un fibroblasto y similares, y es preferiblemente un fibroblasto (particularmente un fibroblasto embrionario).
La célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT puede ser una célula obtenida a partir de una especie de mamífero elegida opcionalmente. Los ejemplos de dicha especie de mamífero incluyen primates tales como seres humanos y monos, ratones, ratas, hámsteres, conejillos de Indias y otros roedores, conejos, gatos, perros, caballos, bovinos, ovejas, cabras y cerdos. Cuando la célula somática es una establecida por trasplante nuclear, la célula somática establecida por trasplante nuclear puede ser también una célula establecida trasplantando el núcleo de una célula NKT a una célula enucleada obtenida a partir de la misma especie de mamífero que el núcleo, o una célula establecida trasplantando el núcleo a una célula enucleada obtenida a partir de una especie de mamífero diferente del donante del núcleo.
En la presente invención, “un factor de reprogramación nuclear” puede estar compuesto por cualquier sustancia tal como un factor o factores proteicos o un ácido nucleico que codifica los mismos (incluyendo formas incorporadas a un vector) o un compuesto de bajo peso molecular, siempre que sea una sustancia (o un grupo de sustancias) capaz de inducir células que poseen pluripotencia y competencia de replicación a partir de una célula somática tal como una célula NKT. Cuando el factor de reprogramación nuclear es un factor proteico o un ácido nucleico que codifica el mismo, son preferibles las siguientes combinaciones, por ejemplo (de aquí en adelante, solo se muestran los nombres de los factores proteicos).
- (1)
- Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (Sox2 es reemplazable por Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 o Sox18; Klf4 es reemplazable por Klf1, Klf2 o Klf5; c-Myc es reemplazable por T58A (mutante activo), N-Myc o L-Myc)
- (2)
- Oct3/4, Klf4, Sox2
- (3)
- Oct3/4, Klf4, c-Myc
- (4)
- Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
- (5)
- Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
- (6)
- Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
- (7)
- Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
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- (8)
- Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
- (9)
- Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
Cuando se tiene en mente el uso de las células NKT-iPS obtenidas con fines terapéuticos, es preferible la combinación de los tres factores Oct3/4, Sox2 y Klf4 de estas combinaciones. Al mismo tiempo, cuando no se tiene en mente el uso de las células NKT-iPS con fines terapéuticos (por ejemplo, el uso como herramienta de investigación para cribado de descubrimiento de fármacos y similares), se prefieren los cuatro factores Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc o los cinco factores consistentes en los mismos cuatro factores y Lin28 o Nanog. De forma particularmente preferible, los factores de reprogramación nuclear de la presente invención son los cuatro factores Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc.
En la presente invención, las células NKT-iPS pueden adquirirse solo con los factores de reprogramación nuclear anteriormente descritos de uso común para reprogramar fibroblastos y similares, obviando así el uso de otros factores como se reseñan en el caso de linfocitos B. Esto hace posible reducir la tumorigénesis potencial en las células y tejidos de diferenciación inducida a partir de una célula NKT-iPS.
La información de las secuencias de ADNc de ratón y humano de los factores proteicos anteriormente mencionados está disponible con referencia a los números de acceso a NCBI mencionados en el documento WO 2007/069666 (en la publicación, Nanog se describe como ECAT4; la información de secuencia de ADNc de ratón y humano sobre Lin28 puede adquirirse con referencia a los siguientes números de acceso a NCBI NM_145833 y NM_024674, respectivamente). Los especialistas en la materia son capaces de aislar fácilmente estos ADNc. Puede prepararse un factor proteico para uso como factor de reprogramación nuclear insertando el ADNc obtenido en un vector de expresión apropiado, transfiriendo el vector a una célula hospedadora, cultivando la célula y recuperando el factor proteico recombinante del cultivo obtenido. Al mismo tiempo, cuando el factor de reprogramación nuclear usado es un ácido nucleico que codifica un factor proteico, el ADNc obtenido se inserta en un vector vírico o plasmídico para construir un vector de expresión, y se somete el vector a la etapa de reprogramación nuclear.
La puesta en contacto de un factor de reprogramación nuclear con una célula somática tal como células NKT puede conseguirse usando un método conocido por sí mismo para la transferencia de proteína a células cuando la sustancia es un factor proteico. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, el método que usa un reactivo de transferencia de proteína, el método que usa una proteína de fusión de dominio de transferencia de proteína (PTD por sus siglas en inglés), el método de microinyección y similares. Los reactivos de transferencia de proteína están comercialmente disponibles, incluyendo aquellos basados en un lípido catiónico tal como el reactivo de suministro de proteína BioPOTER (Gene Therapy Systems), el reactivo de transferencia de proteína Pro-Ject™ (PIERCE) y ProVectin (IMGENEX); aquellos basados en un lípido tal como Profect-1 (Targeting Systems); aquellos basados en un péptido permeable por membrana tal como Penetrain Peptide (Q biogene), el kit Chariot (Active Motif) y similares. La transferencia puede conseguirse mediante los protocolos adjuntos a estos reactivos, siendo un procedimiento común como se describe a continuación. Se diluye un factor de reprogramación nuclear en un disolvente apropiado (p.ej., una disolución tampón tal como PBS o HEPES), se añade un reactivo de transferencia, se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 a 15 minutos formando un complejo, se añade este complejo a células después de intercambiar el medio por un medio exento de suero y se incuban las células a 37 ºC durante una a varias horas. Después de ello, se retira el medio y se reemplaza por un medio que contiene suero.
Los PTD desarrollados incluyen aquellos que usan dominios transcelulares de proteínas tales como AntP obtenida a partir de Drosophila, TAT obtenida a partir de VIH y VP22 obtenida a partir de HSV. Se prepara un vector de expresión de proteína de fusión que incorpora un ADNc de un factor de reprogramación nuclear y una secuencia de PTD para permitir la expresión recombinante de la proteína de fusión, y se recupera la proteína de fusión para uso en la transferencia. Esta transferencia puede conseguirse como se describe anteriormente, excepto porque no se añade reactivo de transferencia de proteína.
La microinyección, un método de disposición de una disolución de proteína en una aguja de vidrio que tiene un diámetro de punta de aproximadamente 1 µm e inyección de la disolución en una célula, asegura la transferencia de la proteína a la célula.
Sin embargo, teniendo en cuenta la facilidad de transferencia a una célula somática tal como una célula NKT, se usa preferiblemente un factor de reprogramación nuclear en forma de un ácido nucleico que codifica un factor proteico, en lugar del factor como tal. El ácido nucleico puede ser un ADN o ARN o una quimera ADN/ARN y puede ser bicatenario o monocatenario. Preferiblemente, el ácido nucleico es un ADN bicatenario, particularmente un ADNc.
Se inserta un ADNc de un factor de reprogramación nuclear en un vector de expresión apropiado que comprende un promotor capaz de funcionar en una célula somática hospedadora tal como una célula NKT. Los vectores de expresión útiles incluyen, por ejemplo, vectores víricos tales como retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus, plásmidos para expresión en células animales (p.ej., pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) y similares.
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La clase de vectores usados puede elegirse según sea apropiado según el uso pretendido de las células NKT-iPS obtenidas. Por ejemplo, pueden usarse un vector adenovírico, vector plasmídico, vector vírico adenoasociado, vector retrovírico, rector lentivírico y similares.
Los ejemplos de promotores usados en los vectores de expresión incluyen el promotor SR, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV (citomegalovirus), el promotor RSV (virus de sarcoma de Rous), la LTR de MoMuLV (virus de leucemia Moloney de ratón), el promotor HSV-TK (timidina cinasa de herpesvirus simple) y similares, dando preferencia a LTR de MoMuLV, el promotor de CMV, el promotor SR y similares.
El vector de expresión puede contener, según se desee, además de un promotor, un potenciador, una señal de adición de poliA, un gen marcador de selección, un origen de replicación de SV40 y similares. Los ejemplos de genes marcadores de selección útiles incluyen el gen de dihidrofolato reductasa y el gen de resistencia a neomicina. Puede transferirse a una célula un vector de expresión que alberga un ácido nucleico como factor de reprogramación nuclear mediante una técnica conocida por sí misma según la elección del vector. En el caso de un vector vírico, por ejemplo, se introduce un plásmido que contiene el ácido nucleico en una célula de empaquetamiento apropiada (p.ej. células Plat-E) o una estirpe celular complementaria (p.ej. células 293), se recupera el vector vírico producido en el sobrenadante de cultivo y se infecta el vector en la célula mediante un método adecuado para el vector vírico. Al mismo tiempo, puede transferirse un vector plasmídico a una célula usando el método de lipofección, método de liposoma, método de electroporación, método de coprecipitación con fosfato de calcio, método de DEAE-dextrano, método de microinyección, método de pistola génica y similares.
Cuando el factor de reprogramación nuclear es un compuesto de bajo peso molecular, la puesta en contacto de la sustancia con células somáticas tales como células NKT puede conseguirse disolviendo la sustancia a una concentración apropiada en un disolvente acuoso o no acuoso, añadiendo la disolución de sustancia a un medio adecuado para el cultivo de células somáticas tales como células NKT aisladas de un ser humano o ratón (por ejemplo, medio mínimo esencial (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199 y medio F-12 que contienen citocinas tales como IL-2, IL-7, SCF y ligandos de Flt3, y aproximadamente de 5 a 20 % de suero fetal bovino y similares) de modo que la concentración del factor de reprogramación nuclear entre dentro de un intervalo que sea suficiente para causar la reprogramación nuclear en células somáticas tales como células NKT y no cause citotoxicidad, y cultivando las células durante un periodo dado. La concentración del factor de reprogramación nuclear varía dependiendo de la clase de factor de reprogramación nuclear usada, y se elige como sea apropiado en el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM. La duración de la puesta en contacto no está particularmente limitada, siempre que sea suficiente para conseguir la reprogramación nuclear de las células; habitualmente puede dejarse que el factor de reprogramación nuclear este copresente en el medio hasta que surge una colonia positiva.
Cuando se genera la célula NKT-iPS con el método de la presente invención poniendo el contacto factores de reprogramación nuclear con una célula NKT, la célula NKT para poner en contacto con los factores de reprogramación nuclear puede haberse estimulado con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 en presencia de IL-2 y IL-12. La estimulación de la célula NKT puede conseguirse, por ejemplo, añadiendo IL-2 e IL-12 a un medio adecuado para cultivar NKT como se describe anteriormente y cultivando la célula NKT en un disco de cultivo con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 unidos a la superficie del mismo durante un tiempo dado. El anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28 pueden usarse en modo disuelto en el medio, siempre que sean capaces de estimular la célula NKT. La concentración de cada anticuerpo unido a la placa es de 0,1-100 µg/ml; la concentración de cada anticuerpo usado en modo disuelto en el medio es de 0,1-100 µg/ml. La concentración de cada una de IL-2 e IL-12 añadidas puede elegirse como sea apropiado en el intervalo de, por ejemplo, 0,1-100 ng/ml. La duración del cultivo no está particularmente limitada, siempre que sea un tiempo suficiente para asegurar la proliferación de la célula NKT y la estimulación con el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28; la duración es normalmente de aproximadamente 3 días a 1 mes, por ejemplo 1 semana. la célula NKT estimulada mediante esta etapa se pone en contacto con los factores de reprogramación nuclear.
Como se afirma en el ejemplo siguiente, incluir esta etapa posibilita establecer células NKT-iPS más eficazmente.
En los últimos años, se han propuesto una tras otra diversas sustancias que mejoran la eficacia del establecimiento de células iPS, que ha sido tradicionalmente baja. Cuando se ponen en contacto con células somáticas tales como células NKT junto con los factores de reprogramación nuclear anteriormente mencionados, se espera que estos mejoradores de la eficacia de establecimiento eleven adicionalmente la eficacia del establecimiento de células NKTiPS.
Los ejemplos de mejoradores de la eficacia del establecimiento de células iPS incluyen, pero sin limitación, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular tales como ácido valproico (VPA) (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008), tricostatina A, butirato de sodio, MC 1293 y M344; agentes inhibidores de la expresión basados en ácido nucleico tales como ARNip y ARNhc contra HDAC (p.ej., ARNip de HDAC1 Smartpool º. (marca registrada) (Millipore), constructos de ARNhc de 29 unidades HuSH contra HDAC1 (OriGene) y similares) y similares], inhibidores de histona G9a metiltransferasa [p.ej., inhibidores de bajo peso molecular tales como BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008); inhibidores de la expresión basados en ácido nucleico tales como ARNip y ARNhc contra G9a (por ejemplo, ARNip de G9a (humano) (Santa Cruz
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Biotechnology) y similares; y similares], y similares. Los inhibidores de la expresión basados en ácido nucleico pueden estar en forma de vectores de expresión que albergan un ADN que codifica un ARNip o ARNhc.
La puesta en contacto de un mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS con células somáticas tales como células NKT puede conseguirse como se describe anteriormente para cada uno de los tres casos: (a) el mejorador es un factor proteico, (b) el mejorador es un ácido nucleico que codifica el factor proteico y (c) el mejorador es un compuesto de bajo peso molecular.
Puede ponerse en contacto un mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS con células somáticas tales como células NKT simultáneamente con un factor de reprogramación nuclear, o puede ponerse en contacto cualquiera por adelantado, siempre que la eficacia del establecimiento de células NKT-iPS a partir de células somáticas tales como células NKT mejore significativamente en comparación con la ausencia del mejorador. En una realización, por ejemplo, cuando la sustancia de reprogramación nuclear es un ácido nucleico que codifica un factor proteico y el mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS es un inhibidor químico, el mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS puede añadirse al medio después de cultivar la célula durante un periodo de tiempo dado después del tratamiento de transferencia génica, porque la sustancia de reprogramación nuclear implica un retraso de un periodo de tiempo dado desde el tratamiento de transferencia génica a la expresión masiva del factor proteico, mientras que el mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS es capaz de actuar rápidamente sobre la célula. En otra realización, cuando el factor de reprogramación nuclear y el mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS se usan ambos en forma de un vector vírico o vector plasmídico, por ejemplo, ambos pueden transferirse simultáneamente a la célula.
Las células somáticas tales como células NKT separados de un ser humano o ratón pueden precultivarse también usando un medio conocido por sí mismo que es adecuado para su cultivo (por ejemplo, medio mínimo esencial (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199 y medio F12 que contienen citocinas tales como IL-2, IL-7, IL-15, SCF y ligandos de Flt3, y de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % de suero fetal bovino, y similares).
Cuando se usa un reactivo de transfección tal como un liposoma catiónico, por ejemplo, en la puesta en contacto con factores de reprogramación nuclear (y un mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS), a veces es preferible que el medio se reemplace anteriormente por un medio exento de suero para prevenir una reducción de la eficacia de transferencia. Después de poner en contacto con los factores de reprogramación nuclear (y el mejorador de la eficacia de establecimiento de células iPS), las células pueden cultivarse en condiciones adecuadas para el cultivo, por ejemplo, de células ES. En el caso de células humanas, es preferible que el cultivo se lleve a cabo con la adición de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como supresor de la diferenciación a un medio ordinario. Al mismo tiempo, en el caso de células de ratón, es deseable añadir factor inhibidor de leucemia (LIF) en lugar de bFGF. Habitualmente las células se cultivan en copresencia de fibroblastos derivados de ratón fetal (MEF) tratados con radiación o un antibiótico para terminar la división celular de los mismos, como células alimentadoras. Habitualmente, se usan comúnmente células STO y similares como MEF, pero para inducir iPS, se usan comúnmente células SNL [McMahon, A.P. y Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)] y similares.
Puede seleccionarse una colonia candidata a NKT-iPS mediante un método con resistencia a fármaco y actividad indicadora como indicadores, y también mediante un método basado en el examen visual de la morfología. Como ejemplo del primero, se selecciona una colonia positiva de resistencia a fármaco y/o actividad indicadora usando una célula somática recombinante tal como una célula NKT recombinante en donde se orienta un gen de resistencia a fármaco y/o un gen indicador al locus de un gen altamente expresado específicamente en células pluripotentes (p.ej., Fbx15, Nanog, Oct3/4 y similares, preferiblemente Nanog u Oct3/4). Al mismo tiempo, los ejemplos del segundo método basados en el examen visual de la morfología incluyen el método descrito por Takahashi et al. en Cell, 131, 861-872 (2007). Aunque el método que usa células indicadoras es conveniente y eficaz, se deseable, desde el punto de vista de la seguridad, que las colonias se seleccionen por examen visual cuando se preparan NKT-iPS con el fin de aplicar a tratamiento humano; incluso por examen morfológico visual puede seleccionarse bien eficazmente una colonia candidata a NKT-iPS.
Puede conseguirse la confirmación de la identidad de las células de la colonia seleccionada como células NKT-iPS mediante diversos métodos de ensayo conocidos por sí mismos, por ejemplo, midiendo la expresión de un grupo de genes que incluyen un gen especifico de células ES (por ejemplo, Oct3/4, Sox2, Nanog, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4, Esg1, Rex1, Zfp296 y similares) usando PCR-TI (véase la Fig. 3) o una micromatriz de ADN (véase la Fig. 4) y similares, y comparando el perfil de expresión de los mismos con el perfil de expresión génica en células ES (por ejemplo, ES derivados de óvulo fertilizado, ES derivados de un embrión clon obtenido por trasplante nuclear de célula somática a partir de una célula NKT y similares). Para asegurar la máxima eficacia, es posible trasplantar las células seleccionadas a un ratón y confirmar la formación de teratomas.
La confirmación del hecho de que las células NKT-iPS derivan de una célula somática, tal como células NKT, que tiene una región de la cadena del gen TCR (TCR) reordenada a V-J uniforme de modo específico del receptor de células NKT puede conseguirse examinando la presencia o ausencia de reordenación génica a NKT-TCR (véase la Fig. 1) por PCR genómica, como se describe en el Ejemplo 2 a continuación (véase la Fig. 2).
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Las células NKT-iPS así establecidas pueden usarse con diversos fines. Por ejemplo, utilizando un método de inducción de la diferenciación que se reseña que se ha aplicado a células ES, células madre hematopoyéticas y similares, puede inducirse la diferenciación en diversas células (p.ej. células del sistema inmunohematopoyetico tales como linfocitos B, células plasmáticas, linfocitos T, NK, NKT, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y macrófagos, células de músculo cardiaco, células retinianas, células nerviosas, células endoteliales vasculares, células secretoras de insulina y similares), tejidos y órganos a partir de células NKT-iPS. Por ejemplo, cultivando las células NKT-iPS en presencia de citocinas tales como IL-7 y ligando de Flt3 con células estromales que expresan un ligando de Notch como células alimentadoras, basándose en un informe sobre ES, las células NKT-iPS puede diferenciarse en células NKT doblemente positivas en CD4/CD8. Además, las células NKT-iPS pueden diferenciarse en células NKT maduras funcionales usando el método descrito a continuación.
En una realización preferida, las células NKT-iPS se diferencian en células NKT maduras funcionales o inmaduras, que se activan por estimulación con -GalCer ex vivo para utilización, por ejemplo, como fuente de un agente de inmunoterapia de células NKT. Por lo tanto, la presente invención proporciona también un método de generación de células NKT por cultivo de una célula NKT-iPS en las condiciones dadas, y una célula NKT madura o inmadura aislada que puede obtenerse mediante el método.
En primer lugar, pueden generarse células NKT doblemente positivas en CD4/CD8 (a los que se hace referencia de aquí en adelante también como "células NKT DP") cocultivando una célula NKT-iPS con células estromales que expresan un ligando de Notch. Las células estromales incluyen, pero sin limitación, células OP9, células S17 y similares en las que se ha expresado forzadamente un ligando de Notch (p.ej. similar a delta 1; al que se hace referencia de aquí en adelante también como "Dll-1"). Los ejemplos de medio para inducción de la diferenciación incluyen, pero sin limitación, medio mínimo esencial (MEM), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio RPMI1640, medio 199 y medio F12 que contienen citocinas tales como interleucina 2 (IL-2), IL-7, IL-15, factor citoblástico (SCF) y un ligando de Flt3 (FL) (0,1-10 ng/ml cada uno, preferiblemente 1-5 ng/ml) y aproximadamente 5 a 20 % de suero fetal bovino, y similares. Se siembran NKT-iPS para obtener una densidad celular de, por ejemplo, aproximadamente 1,0x106 a aproximadamente 1,0x107 células/ml, se cultivan en un recipiente de cultivo conocido por sí mismo en atmósfera de 5 % de CO2/95 % de aire aproximadamente a 30 a aproximadamente 40 ºC, preferiblemente aproximadamente a 37 ºC, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas, preferiblemente durante aproximadamente 2 a aproximadamente 3 semanas. Puede conseguirse la confirmación de su diferenciación en células NKT DP, por ejemplo, analizando el fenotipo de un antígeno de superficie celular usando anticuerpos contra CD4 y CD8 y un clasificador (véase la Fig. 7). Según se requiera, es también posible examinar la expresión de aún otros diversos antígenos de superficie celular y comparar el fenotipo de los mismos con, por ejemplo, el de células CD4+/CD8+ que están presente en el timo (véase la Fig. 8).
Al cocultivar células NKT DP obtenidas como se describe anteriormente con células estromales en presencia de tres
o más citocinas seleccionadas de entre IL-2, IL-7, IL-15 y FL, las células NKT pueden propagarse en grandes cantidades (véase la Fig. 10). Aunque las células estromales usadas en esta operación incluyen, por ejemplo, las mismas que antes tales como células OP9 y células S17, las células pueden expresar o no un ligando de Notch. Los medios preferidos son los mismos que los mostrados anteriormente excepto por las combinaciones de citocinas. Las combinaciones específicas de citocinas incluyen IL-2/IL7/lL-15, IL-2/IL-7/FL, lL-2/lL-15/FL, IL-7/IL-15/FL e IL-2/IL-7/IL-15/FL; las combinaciones IL-2/IL-15/FL e IL-2/IL-10/IL-15/FL son particularmente preferibles. La concentración de cada citocina puede elegirse según sea apropiado en el intervalo de 0,1-10 ng/ml, preferiblemente 1-5 ng/ml. Puede añadirse al medio aún otra citocina (p.ej., SCF y similares). Se efectúa el cultivo en atmósfera de 5 % de CO2/95 % de aire a aproximadamente 30 a aproximadamente 40 ºC, preferiblemente a aproximadamente 37 ºC, durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 4 semanas, preferiblemente durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 semanas. Este cultivo permite aumentar la cantidad de células de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 veces o más en 5 días.
Al mismo tiempo, al cocultivar las células NKT-DP obtenidas como se describe anteriormente con células estromales que no expresan un ligando de Notch, pueden generarse células NKT que son muy similares a las células NKT periféricas. Estas células NKT se caracterizan por positividad de NK1.1 y adicionalmente por fenotipos tales como CD3+, Sca1+, CD44+, CD69+, CD34-y Flt3-(véase la Fig. 9), con la expresión de V14 (V24 en seres humanos) reducida en comparación con células NKT-DP, y mostrando niveles de expresión equivalentes a aquellos en células NKT periféricas (Fig. 11). En otras palabras, al cambiar las células alimentadoras de células estromales que expresan un ligando de Notch por células estromales que no expresan el ligando a mitad del cultivo para inducción de la diferenciación de células NKT-iPS en células NKT DP, las células NKT-iPS pueden diferenciarse y madurar hasta NKT que son equivalentes a células NKT periféricas. Los ejemplos de células estromales que no expresan un ligando de Notch incluyen, pero sin limitación, células OP9, células S17 y similares. Aunque puede usarse igualmente un medio para uso en la inducción de la diferenciación de células NKT-iPS en células NKT DP, es preferible que el medio contenga dos o más citocinas seleccionadas de entre IL-2, IL-7, IL-15 y FL, más preferiblemente que contenga IL-15 (véase la Fig. 11). El momento del cambio de las células alimentadoras de células estromales que expresan un ligando de Notch a células estromales que no expresan el ligando no está particularmente limitado, siempre que se obtengan finalmente NKT equivalentes a células NKT periféricas (p.ej., células positivas de NK1.1); por ejemplo, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 días, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 18 días, después de iniciar el cocultivo de células NKT-iPS y células
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estromales que expresan un ligando de Notch, se cambian las células alimentadoras a células estromales que no expresan el ligando. La duración del cocultivo con las células estromales que no expresan un ligando de Notch no está tampoco particularmente limitada, por ejemplo, la duración es de aproximadamente 3 días a aproximadamente 4 semanas, preferiblemente de aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 semanas. Al efectuar este cultivo usando un medio que contiene tres o más citocinas seleccionadas de entre IL-2, IL-7, IL-15 y FL (preferiblemente una de ellas es IL-15), pueden adquirirse en grandes cantidades células NKT que se han diferenciado y madurado en el mismo grado que con células NKT periféricas.
Debido a que las células NKT obtenidas a partir de células NKT-iPS obtenidas como se describe anteriormente (a los que se hace referencia de aquí en adelante también como "iPS-NKT”) están restringidas a CD1d, las células iPS-NKT pueden activarse poniendo en contacto estas células con una célula dendrítica (DC por sus siglas en inglés) presentadoras de -GaICer. La DC deriva preferiblemente de la misma especie que las células iPS-NKT, puede usarse una DC heteróloga siempre que las células iPS-NKT puedan activarse (por ejemplo, poniendo en contacto DC humanas y iPS-NKT de ratón). La DC no está particularmente limitada, siempre que sea capaz de activar las células iPS-NKT a través de -GaICer; aunque la DC puede ser una célula dendrítica de linaje mieloide (DC1) o una célula dendrítica linfoide (DC2), se prefiere DC1. La DC puede generarse mediante cualquier método conocido por sí mismo y puede separarse de la médula ósea, tejido no linfático periférico, la región de linfocitos T de tejido linfático, linfa aferente, epidermis, dermis y similar; preferiblemente la DC puede generarse separando monocitos, mielocitos y similares de células de médula ósea, sangre periférica y similares, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad y similares, y cultivando las células en presencia de GM-CSF (e IL-4) durante aproximadamente 7 a aproximadamente 10 días.
En la presente invención, se entiende que la -GalCer usada para someter a pulsos la DC engloba no solo galactosilceramida o sales de la misma o ésteres de la misma y similares, sino también un derivado opcionalmente elegido de la misma capaz de unirse a CD1d para activar DC y presentarse como antígeno a NKT (por ejemplo, lípidos sintéticos con una cadena grasa acortada, tal como OCH y similares). Estos pueden sintetizarse mediante un método conocido por sí mismo. Cuando las células iPS-NKT activadas con DC se pretenden para administrar a seres humanos, la -GalCer usada para someter a pulsos la DC es deseablemente de pureza GMP. La pulsación de DC con -GalCer puede efectuarse mediante una técnica de uso común; por ejemplo, la pulsación puede efectuarse cultivando la DC en medio que contiene suero (por ejemplo, medio RPMI-1640 que contiene 10 % de FCS y similares) que contiene -GalCer a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 ng/ml durante aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. La pulsación con -GalCer puede efectuarse añadiendo -GalCer al medio en el proceso de cultivo y madurando la DC inmadura en presencia de GM-CSF (e IL-4). Como alternativa, la pulsación puede efectuarse añadiendo -GalCer al medio en la etapa de cocultivo de DC madurada como se describe a continuación con iPS-NKT.
La puesta en contacto de DC e iPS-NKT puede conseguirse, por ejemplo, cocultivando ambos en el medio anteriormente descrito en inducción de la diferenciación de células NKT-iPS en iPS-NKT que exhiben fenotipos equivalentes a los de células NKT periféricas.
En la presente memoria, “una célula NKT activada” significa una célula iPS-NKT que produce al menos una citocina de Th1 tal como IFN- en respuesta a una DC presentadora de -GalCer. La célula puede poseer adicionalmente productividad de una citocina de Th2 tal como IL-4, y puede poseer potencial de proliferación. Para que las células iPS-NKT adquieran potencial de proliferación y productividad de citocinas de Th2 también tras estimulación con una DC presentadora de -GaICer, las células tienen que seguir cocultivándose con células estromales que expresan un ligando de Notch en el proceso de inducción de la diferenciación de células NKT-iPS en células iPS-NKT; en este caso, la productividad de IFN- aumenta también en comparación con las células iPS-NKT obtenidos cambiando a células estromales que no expresan un ligando de Notch (véase la Fig. 12). Al elegir la combinación IL-2/IL-15/FL como citocinas en la etapa de cultivo para propagación masiva de células iPS-NKT a partir de células NKT-DP, el equilibrio de producción de citocinas Th1/Th2 en células NKT activadas, en particular, exhibe dominancia de Th1 (véase la Fig. 12).
Se da a conocer también en la presente memoria un agente de citoterapia de células NKT que comprende células NKT activadas obtenidas como se describe anteriormente. Las células NKT activadas proporcionadas por la presente invención poseen potencial de proliferación y una productividad de citocinas dominante de Th1, y son por lo tanto útiles, por ejemplo, en la prevención/el tratamiento de diversas enfermedades tales como cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades alérgicas. Como cánceres, pueden mencionarse todas las clases de cánceres primarios, y pueden mencionarse todas las condiciones de los cánceres, incluyendo cánceres incipientes y cánceres avanzados con potencial metastásico/infiltrante.
Las células NKT activadas se producen en forma de una preparación oral/parenteral, preferiblemente en forma de una inyección, suspensión o infusión de goteo, combinándose con un portador farmacéuticamente aceptable mediante un medio convencional o de otro modo. Los portadores farmacéuticamente aceptables que pueden estar contenidos en la preparación parenteral incluyen, por ejemplo, disoluciones acuosas para inyección tales como disolución salina fisiológica y disoluciones isotónicas que contienen glucosa u otro fármaco auxiliar (p.ej., D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares). El agente de la presente invención puede formularse, por ejemplo, con un
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agente de tamponación (p.ej., disolución tampón de fosfato, disolución tampón de acetato de sodio), un agente calmante (p.ej., cloruro de benzalconio, hidrocloruro de procaína y similares), un estabilizante (p.ej., seroalbúmina bovina, polietilenglicol y similares), un conservante, un antioxidante y similares.
Cuando el agente dado a conocer en la presente memoria se prepara como una suspensión acuosa, se suspenden las células NKT activadas en el líquido acuoso anteriormente descrito a aproximadamente 1,0x106 a 1,0x107 células/mI.
Debido a que la preparación así obtenida es estable y de baja toxicidad, puede administrarse con seguridad a mamíferos tales como seres humanos. Aunque el receptor de administración es preferiblemente el paciente del que derivan las células NKT usadas como material de partida para generar las células NKT-iPS (es decir, trasplante autólogo), sin embargo, esto no ha de considerarse como limitante, siempre que la fuente sea otro individuo de la misma especie que se estima que es compatible con las células NKT activadas administrados (es decir, comparte el mismo tipo de HLA). Aunque el método de administración no está particularmente limitado, la preparación puede administrarse por vía parenteral, preferiblemente por inyección o infusión de goteo; los ejemplos incluyen administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración directa al sitio afectado y similares. La dosis de agente de citoterapia de células NKT varía dependiendo del receptor de la administración, órgano diana, síntomas, método de administración y similares; en el caso de administración parenteral, por ejemplo, normalmente es conveniente administrar de aproximadamente 1,0x106 a aproximadamente 1,0x107 células, basándose en la cantidad de células NKT activadas por dosis, a intervalos de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, para un paciente adulto (suponiendo un peso corporal de 60 kg).
Se da a conocer también en la presente memoria un agente de citoterapia de células NKT que comprende células iPS-NKT obtenidas como se describe anteriormente y -GalCer en combinación. Las células iPS-NKT proporcionadas por la presente invención funcionan como células NKT endógenas, exhibiendo un efecto coadyuvante cuando se administran a un mamífero tal como un ser humano, y son por lo tanto útiles, por ejemplo, en la prevención/el tratamiento de diversas enfermedades tales como cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades alérgicas. Como cánceres, pueden mencionarse todas las clases de cánceres primarios, y pueden mencionarse todas las condiciones de cánceres, incluyendo cánceres incipientes y cánceres avanzados con potencial metastásico/infiltrante.
Las células iPS-NKT pueden producirse en forma de una preparación oral/parenteral, preferiblemente en forma de una preparación parenteral tal como una inyección, suspensión o infusión de goteo, al combinarse con un portador farmacéuticamente aceptable de la misma manera que en el caso anteriormente descrito de células NKT activadas, y pueden administrarse con las mismas dosis y vías de administración.
Como -GalCer para uso en combinación con las células iPS-NKT, pueden usarse las mismas que las anteriormente descritas con respecto a la generación de células NKT activadas, sin embargo, cuando el receptor de la administración es un ser humano, se usa una -GalCer de pureza GMP. En pacientes que padecen una enfermedad que requiere citoterapia de células NKT, tal como un cáncer, que a veces tienen un número reducido o falta de función de DC endógenas, pueden usarse DC sometidas a pulsos de -GalCer en lugar de -GalCer para mejorar la activación de las células iPS-NKT in vivo. En este caso, la fuente de DC recogidas es preferiblemente el paciente que es el receptor de la administración (es decir, trasplante autólogo); sin embargo, esto no ha de considerarse como limitante, siempre que la fuente sea otro individuo de la misma especie que se estime que es compatible con el paciente (es decir, comparte el mismo tipo de HLA).
La -GalCer se produce normalmente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, en forma de una preparación parenteral tal como una inyección, suspensión o infusión de goteo. Los portadores farmacéuticamente aceptables que pueden estar contenidos en la preparación parenteral incluyen, por ejemplo, disoluciones acuosas para inyección tales como disolución salina fisiológica y disoluciones isotónicas que contienen glucosa u otro fármaco auxiliar (p.ej., D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares). El agente de la presente invención puede formularse, por ejemplo, con un agente de tamponación (p.ej., disolución tampón de fosfato, disolución tampón de acetato de sodio), un agente calmante (p.ej., cloruro de benzalconio, hidrocloruro de procaína y similares), un estabilizante (p.ej., seroalbúmina bovina, polietilenglicol y similares), un conservante, un antioxidante y similares. Cuando se prepara la -GalCer en forma de suspensión acuosa, se disuelve la -GalCer en un disolvente orgánico apropiado (p.ej., DMSO y similares) y se disuelve en el líquido acuoso anteriormente descrito, obteniendo una densidad celular de aproximadamente 100 µg a aproximadamente 1 mg/ml.
Al mismo tiempo, cuando se usa una DC sometida a pulsos de -GaICer en lugar de -GalCer, puede suspenderse una DC sometida a pulsos de -GaICer, preparada mediante la técnica descrita anteriormente con respecto a la generación de células NKT activadas, en el líquido acuoso anteriormente descrito a aproximadamente 1,0x106 a aproximadamente 1,0x107 células/ml.
La -GalCer preparada en forma de una preparación como se describe anteriormente puede administrarse por vía oral o parenteral, preferiblemente por inyección o infusión de goteo; los ejemplos incluyen administración intravenosa, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración
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intraperitoneal, administración directa al sitio afectado y similares. La dosis de -GalCer varía dependiendo del receptor de la administración, órgano diana, síntomas, método de administración y similares; en el caso de administración parenteral, por ejemplo, la dosis es normalmente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 6,0 mg, basada en una sola dosis para un paciente adulto (suponiendo un peso corporal de 60 kg). Al mismo tiempo, cuando se usa una DC sometida a pulsos de -GaICer en lugar de -GalCer, la dosis de la misma es normalmente de aproximadamente 1,0x106 a aproximadamente 1,0x107 células por dosis. Estas cantidades pueden administrarse según el protocolo de administración para la preparación que contiene iPS-NKT. La preparación que contiene iPS-NKT y la preparación que contiene -GaICer pueden administrase simultánea, separadamente o combinadas justo antes del uso, y pueden administrarse secuencialmente en el orden de preparación que contiene iPS-NKT y entonces preparación que contiene -GaICer.
La presente invención se describe de aquí en adelante con más detalle mediante los siguientes ejemplos a los que, sin embargo, la invención no está limitada en modo alguno.
Ejemplos
Ejemplo 1: Establecimiento de células iPS a partir de células NKT obtenidas a partir de esplenocito de ratón
Se prepararon NKT a partir de esplenocitos de ratón C57BL/6 que tienen la región de la cadena de receptor de antígeno de linfocito T (TCR) ya reordenada a TCR usado en células NKT (NKT-TCR). Puesto que las células NKT se caracterizan por reconocer antígenos glicolipídicos presentados en moléculas CD1d similares a MHC de clase I, se concentraron las células seleccionando positivamente las células reactivas con un anticuerpo de IgG1 anti-ratón preparado por marcaje con APC de una IgG1 de ratón recombinante de CDd1 solubilizada que tiene el antígeno glicolipídico -GalCer insertado en la misma (producido por BD Bioscience Company), usando un método MACS que utiliza perlas magnéticas anti-APC (producidas por Miltenyi Biotech Company). Esta operación volvía las células NKT como se definen como células cargadas con -GalCer positivas de dímero de CD1d/positivas de TCR que tienen una pureza del 90 % o más. Se cultivaron las células NKT concentrados en presencia de IL-2 (10 ng/ml) a una densidad celular de 106 células/ml, usado un medio RPMI que contenía 10 % de FCS durante 24 horas, después de lo cual se infectaron las células con un retrovirus que contenía cuatro factores derivados de ratón (ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) (106 ufp/ml) según el método descrito en Cell, 126: 663676 (2006) durante 24 horas. De 3 a 7 días después de la infección vírica, se recuperaron las células, se resembraron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y se cocultivaron en presencia de LIF usando un medio de cultivo de células ES. Se evaluaron morfológicamente las colonias emergentes, se recogieron las colonias que adoptaban una morfología similar a células ES y se cultivaron adicionalmente en presencia de LIF en MEF, con lo que se establecieron 4 clones de células iPS derivadAs de células NKT (NKT-iPS) (nombres de código de clon: 2a, 5b, 5d, 5g).
Ejemplo 2: Caracterización de células NKT-iPS
Para demostrar que los cuatro clones de células NKT-iPS establecidos en el ejemplo 1 derivaban de células NKT, se determinó si había tenido lugar la reordenación a NKT-TCR por PCR genómica. En las células que tienen células NKT-TCR, cada región de TCR se había reordenado ya a V14-J18 (Fig. 1); así que se comprobó la presencia o ausencia de reordenación efectuando una PCR usando los cebadores mostrados a continuación con el genoma de cada clon de células NKT-iPS como molde.
SEQ 1D NO:1: cebador 1: 5'-gacccaagtggagcagagtcct-3'
SEQ 10 NO:2: cebador 2: 5'-tcacctatgtctcctggaagcctc-3'
SEQ 10 NO:3: cebador 3: 5'-cagctccaaaatgcagcctccctaa-3'
[En caso de que no hubiera tenido lugar la reordenación a V14-J18 (silvestre), se amplifica una banda de 349 pb por PCR usando el cebador 1 y el cebador 2; al mismo tiempo, en el caso de que hubiera tenido lugar la reordenación a V14-J18 (NKT-TCR), se amplifica una banda de 317 pb por PCR usando el cebador 1 y el cebador 3].
Como resultado, se encontró que los cuatro clones establecidos tenían el genoma reordenado a NKT-TCR (Fig. 2), confirmando que las células iPS establecidos derivaban de células NKT.
Ejemplo 3: Análisis de la expresión genética de células NKT-iPS
Para determinar si las células NKT-iPS identificadas en el ejemplo 2 se habían reprogramado a células similares a iPS, se efectuó el análisis del perfil de expresión génica. Se preparó el ARN total a partir de cada uno de las células NKT-iPS, células ES derivadas de embrión con trasplante nuclear de células NKT (NKT-ES) y células NKT periféricas mediante el método de fenol-cloroformo, y se analizó la expresión de una serie de grupos génicos cuya expresión en células ES es conocida mediante el método de PCR-TI de una etapa (producida por Invitrogen Company). Los genes analizados y las secuencias de los cebadores usados se muestran a continuación.
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- Oct3/4 endógeno:
- 5'-tctttccaccaggcccccggctc-3' (SEQ 10 NO:4)
- 5'-tgcgggcggacatggggagatcc-3' (SEQ 10 NO:5)
- Sox2 endógeno:
- 5'-tagagctagactccgggcgatga-3' (SEQ 10 NO:6)
- 5'-ttgccttaaacaagaccacgaaa-3' (SEQ 10 NO:7)
- Klf4 endógeno:
- 5'-gcgaactcacacaggcgagaaacc-3' (SEQ 10 NO:8)
- 5'-tcgcttcctcttcctccgacaca-3'(SEQ ID NO:9)
- c-myc endógeno:
- 5'-tgacctaactcgaggaggagctggaatc-3' (SEQ 10 NO:10)
- 5'-aagtttgaggcagttaaaattatggctgaagc-3' (SEQ ID NO: 11)
- Ecat1:
- 5'-tgtggggecetgaaaggcgagctgagat-3' (SEQ 1D NO:12)
- 5'-atgggccgccatacgacgaegctcaact-3' (SEQ 1D NO:13)
- Nanog:
- 5'-caggtgtttgagggtagctc-3' (SEQ ID NO:14)
- 5'-cggttcatcatggtacagtc-3' (SEQ ID NO:15)
- Gdf3:
- 5’-gttccaacctgtgcctcgcgtctt-3' (SEQ ID NO:16)
- 5'-agcgaggcatggagagagcggagcag-3' (SEQ IO NO:17)
- Rex1:
- 5'-acgagtggcagtttcttcttggga-3' (SEQ ID NO:18)
- 5'-tatgactcacttccagggggcact-3' (SEQ ID NO:19)
- Zfp296:
- 5'-ccattaggggccatcatcgctttc-3' (SEQ IO NO:20)
- 5'-cactgctcactggagggggcttgc-3' (SEQ ID NO:21)
- HPRT:
- 5'-ctgtgtgctcaaggggggct-3' (SEQ ID NO:22)
- 5'-ggactcctcgtatttgcagattcaacttg-3' (SEQ ID NO:23)
Como resultado, se confirmó la expresión de todos los genes analizados en células NKT-iPS y células NKT-ES, pero no se confirmó la expresión en células NKT periféricas (Fig. 3). Este resultado sugiere que las células NKT-iPS pueden poseer una función similar a las células iPS. Además, usando una micromatriz de ADN (producida por Affimetrix Company), se comprobaron las correlaciones del perfil de expresión génica entre células NKT-iPS, células NKT-ES, células ES y células NKT periféricas; se encontró que las células NKT-iPS tenían un patrón de expresión génica muy similar al de células NKT-ES o células ES, siendo distinto de las células NKT periféricas (Fig. 4).
Ejemplo 4: Examen morfológico de células NKT-iPS
Se examinó la morfología de las células NKT-iPS establecidas en el ejemplo 2 bajo el microscopio. Como resultado, se demostró que la expresión localizada de SSEA1 y Oct3/4 y la morfología de las células NKT-iPS eran muy similares a las de células ES (Fig. 5).
Ejemplo 5: Establecimiento y análisis de ratón quimérico de células NKT-iPS
Se generó un ratón quimérico a partir de una célula NKT-iPS obtenida a partir del clon de células NKT de ratón C57BL/6 establecido en el ejemplo 2 y una célula obtenida a partir de Balb/c mediante el método de agregación. Se analizaron en los esplenocitos del ratón quimérico obtenido los antígenos de superficie celular. Se clasificaron las células derivadas de C57BL/6 y las células derivadas de Balb/C mediante distinción por la clase de MHC I (I-Ab y I-Ad, respectivamente) y se analizaron los cocientes de contenido de células NKT. Como resultado, casi todas las células derivadas de C57BL/6 tenían un antígeno de superficie celular como el de células NKT cargadas con -GaICer positivos de dímero de CD1d/positivos de TCR, mientras que las células derivadas de Balb/c contenían linfocitos T/NKT a la frecuencia ordinaria (Fig. 6).
Ejemplo 6: Inducción de la diferenciación in vitro a partir de células NKT-iPS
Las células ES pueden inducirse a la diferenciación en linfocitos T doblemente positivas en CD4/CD8 (DP) cocultivando con células estromales OP9 que expresan forzadamente el ligando de Notch similar a Delta 1 (DII-1) (OP9/DII-1) en presencia de IL-7 y un ligando de Flt3 (FL) (Schmitt TM, de Pooter RF, Gronski MA, Cho SK, Ohashi PS, Zuniga-Pflucker JC. “Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic
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stem cells differentiated in vitro”. Nat. Immunol. abril de 2004; 5(4): 410-417). Basándose en este hallazgo, se cocultivaron NKT-iPS con células OP9/DII-1 en presencia de IL-7 (1 ng/ml) y FL (5 ng/ml) durante 20 días; se demostró que se inducirían células similares a NKT DP de CD4/CD8 cargadas con -GaICer positivas de dímero de CD1d/positivas de TCR (NKT DP derivados de células NKT-iPS) (Fig. 7). Se efectuó un análisis de la expresión de antígeno de superficie celular con más detalle, demostrando que el fenotipo de las células NKT-DP es muy similar al de las células DP de CD4/CD8 en el timo (Fig. 8). Este resultado sugiere que las células NKT-iPS, bajo la influencia de una reordenación génica de la región de TCR, pueden experimentar probablemente inducción de la diferenciación en células similares a NKT y muestra también que, introduciendo el nuevo concepto de hacer el mejor uso de la reordenación génica en células inmunitarias, es posible garantizar una tecnología para generar las células inmunitarias deseadas (particularmente células NKT, linfocitos T, linfocitos B) en grandes cantidades.
Ejemplo 7: Inducción de la diferenciación in vitro de células NKT maduras a partir de células NKT-iPS
Se efectuó un análisis para determinar si se inducirían células NKT mediante cocultivo de células NKT-iPS con OP9/DII-1 hasta el día 14 de cultivo, y entonces con OP9 del día 14 al día 20 de cultivo. Como resultado, se encontró que podían surgir NKT incluso en una etapa de diferenciación temprana en la que solo habían surgido los denominados DN1, que son negativos de Lin/positivos en CD44/negativos de CD25 (Fig. 9), y que los marcadores de superficie de las células NKT de diferenciación inducida eran muy similares a los de células NKT periféricas (Fig. 9). Este resultado muestra que las células NKT son capaces de diferenciarse en células NKT maduras incluso si falta la señal Notch en una etapa de diferenciación temprana.
Ejemplo 8: Inducción de la diferenciación in vitro de células NKT maduras a partir de células NKT-DP derivadas de células NKT-iPS
Para propagar adicionalmente y madurar NKT DP derivadas de células NKT-iPS cuya inducción se confirmó en el ejemplo 6 in vitro, se cultivaron las células usando diversas combinaciones de citocinas con o sin células alimentadoras durante 5 días. Como resultado, se demostró que mediante el cocultivo con OP9 u OP9/DII-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-2/IL-15/FL o IL-2/IL-7/IL-15/FL, las células podían propagarse adicionalmente más de 10 veces (Fig. 10). Además, se estimó que las células cultivadas en estas condiciones habían experimentado una inducción de la diferenciación adicional, con la expresión de NK1.1 inducida en las mismas (Fig. 11). Así que las células NKT obtenidos mediante inducción por cocultivo con OP9 u OP9/DII-1 en presencia de la combinación de citocinas IL-2/IL-15/FL o IL-2/IL-7/IL-15/FL se cocultivaron con células dendríticas derivadas de células de médula ósea (inducidas con GM-CSF) en presencia de -GaICer, con lo que se comprobó el potencial de proliferación y la productividad de citocinas de las mismas. Como resultado, se confirmó que se observaba potencial de proliferación cuando las células se cultivaban adicionalmente con OP9/DII-1 (Fig. 12), y que existía un sesgo hacia Th1 particularmente cuando se cultivaban con IL-2/IL-15/FL (Fig. 12).
Ejemplo 9: Efecto coadyuvante de células NKT maduras derivadas de células NKT-iPS in vivo
Se efectuó una evaluación para determinar si las células NKT maduras derivadas de células NKT-iPS inducidas en el Ejemplo 8 (cocultivadas con OP9/DII-1 en presencia de IL-7/FL durante 20 días, y entonces con OP9/DII-1 en presencia de IL-2/IL-15/FL durante 5 días) eran funcionales in vivo. Se cultivaron esplenocitos derivados de ratón con desactivación génica de TAP con ovoalbúmina (OVA) 10 mg/ml en una disolución hipertónica, después de lo cual se indujo la apoptosis y se transfirieron 2x107 células apoptóticas, junto con 2 µg de -GaICer, a un ratón con desactivación génica de J18 (ratón deficiente en células NKT) que tenía 105 o 106 NKT maduras derivados de células NKT-iPS transferidos por adelantado 1 hora antes. 7 días después, se recogieron esplenocitos del ratón, se estimularon con péptido OVA (257-264) in vitro y se analizó la producción de IFN- mediante tinción intracelular. Como resultado, se confirmó que se habían inducido linfocitos T específicos de antígeno OVA positivos en CD8 que poseen productividad de IFN- dependientemente del número de células transferidas, demostrando que las células NKT maduras derivados de células NKT-iPS funcionan in vivo y tienen un potente efecto coadyuvante (Fig. 13).
Ejemplo 10: Establecimiento de células iPS a partir de células NKT obtenidas a partir de esplenocito de ratón silvestre
En los Ejemplos 1-8, se demostraron el establecimiento de células NKT-iPS a partir de una población de células NKT de ratón purificads, la inducción de la diferenciación a partir de células NKT-iPS en células NKT, la posesión por las células de una función como células NKT y similares. Así que, mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, se prepararon NKT a partir de esplenocitos de un ratón C57BL/6 sin operación de concentración, con lo que se obtuvo una población de células NKT de aproximadamente 30-50 % de pureza. Se cultivaron estas células en presencia de IL-2 (10 ng/rnl) a una densidad celular de 106 células/ml durante 24 horas de la misma manera que en el Ejemplo 1, después de lo cual se infectaron las células con un retrovirus que contenía cuatro factores derivados de ratón (ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) (106 ufp/ml) durante 24 horas. De 3 a 7 días después de la infección vírica, se recuperaron las células, se resembraron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y se cocultivaron en presencia de LIF usando un medio de cultivo de células ES. Se evaluaron morfológicamente las colonias emergentes, se recogieron las colonias que adoptan una morfología similar a células ES y se cultivaron adicionalmente en presencia de LIF en MEF, con lo que se establecieron exitosamente 5 clones de células NKT-iPS (nombre de código de clon: i12c, i12d, i13g, i13h, i13i) (Fig. 14).
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Ejemplo de generación 1: Generación de ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6
Como se muestra en la Fig. 15, con fines de efectuar un experimento de transferencia celular, se generó un ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6. Es decir, se transfirió el núcleo de una célula NKT obtenida a partir de bazo de ratón C57BL/6 a un ovocito enucleado de un ratón BDF1. Se fusionó esta célula con un ES de BDF1xICR, se transfirió al útero de una madre adoptiva y se obtuvo una descendencia de ratones quiméricos. Se cruzó el ratón quimérico (macho) obtenido con un ratón C57BL/6 (hembra), y se usó la descendencia obtenida como ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6.
En el ratón clon de células NKT establecidO usando este método, el núcleo de partida derivaba 100 % de una célula NKT obtenida a partir del bazo del ratón C57BL/6; por lo tanto, el ratón clon es un C57BL/6 completo y no experimenta una reacción alogénica o semialogénica con el ratón C57BL/6. La única diferencia genómica entre el ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6 y el ratón C57BL/6 parece ser la diferencia en secuencia debida a la reordenación de la región de receptor de linfocitos T como resultado de la diferenciación en células NKT. Se muestra en la Fig. 16 la secuencia básica de la región de receptor de linfocitos T de un ratón clon de células NKT con fondo de C57BL/6 en la que se ha completado la reordenación.
Ejemplo 11: Establecimiento de células iPS derivadAs de fibroblastos embrionarios derivados de ratón clon de células NKT
El método convencional de establecimiento de una célula iPS de ratón establecido por Yamanaka et al. está basado en la introducción de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en un fibroblasto embrionario (MEF). Así que se hizo un intento por establecer una célula iPS a partir de MEF de un ratón clon de células NKT creado en el ejemplo de generación 1, y se establecieron exitosamente las células NKT-iPS 7a y 7g. Se confirmó que los 7a y 7g establecidos habían experimentado reordenación de la región de receptor de linfocitos T a receptor de linfocitos T de células NKT (Fig. 17), y se confirmó también por un método de PCR-TI que eran equivalentes a células ES en términos de expresión de un grupo de genes que pueden ser marcadores de células ES (Fig. 18). También, un análisis de la expresión génica integral que usa una micromatriz de ADN y un análisis de agrupamiento de la misma procuraron resultados que muestran que los 7a y 7g establecidos estaban cercanos a las células ES y distantes de los MEF de partida del ratón clon de células NKT (Fig. 19). Además, se efectuó el examen morfológico de los mismos; se confirmó también que 7a y 7g eran morfológicamente muy similares a CE, y que se expresaban los marcadores de células ES SSEA1, Oct3/4 y Nanog (Fig. 20). Además, se analizó la tendencia a la metilación del genoma de las regiones reguladoras de la expresión génica de Oct3/4 y Nanog, demostrando suficiente reprogramación en 7a y 7g, en los que los genomas estaban no metilados en la misma medida que con ES (Fig. 21). También nacieron una pluralidad de ratones quiméricos de 7a y 7g, y toda la descendencia obtenida cruzando con un ratón C57BL/6 exhibía reordenación génica a receptor de linfocitos T de células NKT, confirmando la transmisión a la descendencia y demostrando que 7a y 7g poseen pluripotencia (Fig. 22). A partir de lo anterior, se concluyó que 7a y 7g satisfacían los criterios de células iPS.
Ejemplo 12: Inducción de la diferenciación in vitro a partir de la célula iPS del Ejemplo 11 en células NKT
A continuación, se efectuó una investigación para determinar si era posible inducir la diferenciación inducida de células NKT a partir de 7a y 7g derivados de MEF in vitro. Se cocultivaron 7a y 7g con OP9/DII-1, una estirpe celular preparada forzando a la célula estromal obtenida a partir de médula ósea OP9 a expresar el ligando de Notch DII-1 mediante el protocolo mostrado en la Fig. 23 durante 25 días. Como resultado, como se muestra en la Fig. 24, se demostró que 7a y 7g se inducían a la diferenciación en células similares a NKT positivas de -GaICer/dímero de CD1d positivas de TCR (7a dif. y 7g dif.). Además, 7a dif. y 7g dif. eran muy similares a lo que se denominan células DP, que son células positivas de CD4 y positivas de CD8 presentes en el timo, en términos de expresión de marcadores de superficie celular. También, un análisis de expresión génica integral que usa una micromatriz de ADN y un análisis de agrupamientos de la misma procuró resultados que muestran que 7a dif. y 7g dif. están distantes de 7a y 7g antes de la inducción de la diferenciación y cercanos a NKT obtenidas a partir de bazo presentes en la periferia (Fig. 25). Así que, para determinar si 7a dif. y 7g dif. son funcionalmente equivalentes a las células NKT, se estimularon con el ligando glicolipídico -GaICer mientras se cocultivaban con células dendríticas, y se examinó el potencial de proliferación y la productividad de citocinas. Como resultado, se confirmó que 7a dif. y 7g dif., como las células NKT periféricas, poseen un potencial de proliferación notable y la capacidad de producir grandes cantidades de IFN- e IL-4 (Fig. 26).
Ejemplo 13: Análisis funcional in vivo de 7a dif. y 7g dif·.
Puesto que 7a dif. y 7g dif. son funcionalmente equivalentes a células NKT periféricas, como se describe en el Ejemplo 12, se efectuó un análisis para determinar si está presente el mismo efecto in vivo usando un ratón deficiente en células NKT. Después de transferir 7a dif. y 7g dif. al ratón deficiente en células NKT, se comprobó la presencia de células transfectadas al cabo de 1 semanas y 2 semanas; se demostró que estaban presentes 7a dif. y 7g dif. positivos de -GaICer/dímero de CD1d positivos de TCR en el hígado (Fig. 27). Así que, basándose en el protocolo mostrado en la Fig. 28, se comprobó la inducción de linfocitos T positivos en CD8 específicos de antígeno y su efecto antitumoral asociado. Se cultivaron esplenocitos derivados de ratón con desactivación génica de TAP con ovoalbúmina (OVA) 10 mg/ml en disolución hipertónica, después de lo cual se indujo la apoptosis y se
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transfirieron 2x107 células apoptóticas, junto con 2 µg de -GaICer, al ratón deficiente en células NKT al que se han transferido 7a dif. y 7g dif. una semana antes (inmunización con TOG). 7 días después, se recogieron esplenocitos del ratón, se estimularon con péptido OVA (257-264) in vitro y se analizó la producción de IFN- mediante tinción intracelular. Como resultado, se confirmó que se habían inducido linfocitos T específicos de antígeno OVA positivos en CD8 que poseen productividad de IFN- equivalentemente a un ratón de tipo silvestre, demostrando que 7a dif. y 7g dif. funcionan in vivo y tienen un potente efecto coadyuvante (Fig. 29). Así que se evaluó el ratón usando un modelo de rechazo de tumor maligno que usa la estirpe celular de timoma de ratón C57BL/6 EL4 o EG7 (transfectante de EL4 OVA). Como resultado, con EG7 que es una estirpe celular que expresa forzadamente OVA, el ratón de tipo silvestre no inmunizado con TOG exhibía una progresión del tumor maligno, mientras que, en el ratón deficiente en células NKT transferido con 7a dif. y 7g dif. inmunizado con TOG, no se observaba progresión como en el ratón de tipo silvestre inmunizado con TOG. Con EL4, se observó una progresión similar en el ratón de tipo silvestre inmunizado con TOG y el ratón deficiente en células NKT; por lo tanto, se concluyó que la progresión se atribuía al efecto coadyuvante específico de antígeno de los 7a dif. y 7g dif. transferidos (Fig. 30). Los resultados anteriores muestran que cualquier célula que tenga el receptor de linfocitos T reordenado en la misma puede inducirse a diferenciación en células inmunocompetentes funcionales reordenadas al receptor de linfocitos T.
Ejemplo 14: Cómo establecer células iPS a partir de células NKT de tipo silvestre eficazmente
Aunque los presentes inventores tuvieron éxito en establecer iPS a partir de una célula NKT obtenida a partir de esplenocito de ratón de tipo silvestre, como se muestra en el Ejemplo 10, se garantizó un método más eficaz de establecimiento de células iPS. Es decir, se concentran NKT con restricción CD1d a partir de esplenocitos usando perlas MACS, después de lo cual se obtienen células NKT de 99,9 % de pureza por clasificación FACS. Las células NKT pueden forzarse a entrar en un ciclo de proliferación añadiendo IL-2 (10 ng/ml) e IL-12 (10 ng/ml) con estimulación con un anticuerpo anti-CD3 (10 µg/ml) y un anticuerpo anti-CD28 (10 µg/ml). Resultaba evidente que, al infectar las células NKT con un retrovirus que alberga ácidos nucleicos que codifican Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en estas condiciones, las células iPS podrían establecerse más de 10 veces más eficazmente que en el Ejemplo 10, con lo que los inventores tuvieron éxito en establecer el clon 14k de células NKT-iPS (Fig. 31). Como se muestra en la Fig. 32, 14k exhibe una morfología similar a células ES, la expresión de marcadores de células ES y la reordenación del receptor de linfocitos T de células NKT en la región de receptor de linfocitos T. También, como se examina mediante el método descrito en el Ejemplo 12, se observó diferenciación en células similares a NKT, que proliferaban con estimulación de glicolípido in vitro y se volvían células funcionales productoras de citocinas (Fig. 33).
Aplicabilidad industrial
Según la presente invención, es posible rediferenciar células NKT a través de células iPS que experimentan probablemente inducción de la diferenciación en células similares a células NKT, es decir, células NKT-iPS, y propagar las células NKT en grandes cantidades o inducir la diferenciación de los mismos a células NKT maduras in vitro; por lo tanto, puede proporcionarse un agente citoterapéutico de células NKT en grandes cantidades convenientemente y a bajo coste, y es extremadamente útil en inmunoterapia del cáncer, defensa de infecciones y tratamiento de enfermedades alérgicas y similares.
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1. Un método de generación de una célula NKT madura que comprende:(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto5 factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene: la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, y10 pluripotencia y competencia de replicación, y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a); y(c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal 15 que no expresa un ligando de Notch.
- 2. El método según la reivindicación 1, en donde: la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es una célula NKT o fibroblasto; y/o los factores de reprogramación nuclear usados para obtener la célula iPS son Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc o ácidos nucleicos que codifican los mismos, o Oct3/4, Sox2 y Klf4 o ácidos nucleicos que 20 codifican los mismos.
-
- 3.
- El método según la reivindicación 1 o 2, en donde la célula somática de la que se ha obtenido la célula iPS es de origen humano.
-
- 4.
- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cocultivo de la etapa (c) se
efectúa en presencia de dos o más citocinas seleccionadas de interleucina 2, interleucina 7, interleucina 15 y ligando 25 de Flt3. -
- 5.
- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cocultivo de la etapa (c) se efectúa en presencia de interleucina 15.
-
- 6.
- Un método de generación de una célula NKT activada que comprende:
(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula30 NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene: la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J 35 uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación,y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);40 (c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y(d) poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro. - 7. Un método para la producción de un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT que 45 comprende:(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto25factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene: la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J 5 uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación,y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;(b) cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);10 (c) cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y
- (d)
- poner en contacto la célula NKT madura obtenida en la etapa (c) con una célula dendrítica presentadora de -galactosilceramida, en donde la puesta en contacto se lleva a cabo in vitro; y
- (e)
- combinar la célula NKT activada obtenido en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable.
15 8. Un método para la producción de un agente para uso en un método de citoterapia de células NKT en combinación con -galactosilceramida que comprende:(a) cocultivar una célula madre pluripotente inducida (iPS) con una célula alimentadora, generando una célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8, en donde la célula iPS se ha obtenido poniendo en contacto factores de reprogramación nuclear con una célula somática que tiene la región de la cadena del gen de20 receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT, en donde la célula iPS tiene: la región de la cadena del gen de receptor de antígeno de linfocito T reordenada a V-J uniforme de modo específico de receptor de células NKT y pluripotencia y competencia de replicación,25 y la célula alimentadora es una célula estromal que expresa un ligando de Notch;- (b)
- cambiar la célula alimentadora de la célula estromal que expresa un ligando de Notch a una célula estromal que no expresa un ligando de Notch a mitad del cocultivo de la etapa (a);
- (c)
- cocultivar la célula NKT doblemente positiva en CD4/CD8 obtenida en la etapa (a) con la célula estromal que no expresa un ligando de Notch, obteniendo una célula NKT madura; y
30 (d) combinar la célula obtenida en la etapa (d) con un portador farmacéuticamente aceptable; y(e) combinar -galactosilceramida con un portador farmacéuticamente aceptable.26
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