JP2016506968A - 胎盤由来のナチュラルキラー細胞 - Google Patents

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Abstract

本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞、胎盤及び臍帯血由来の組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにこれらの組合せである。また本明細書に提供されるのは、それらを含む組成物、並びに胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞、及び組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにこれらの組合せを用いて、腫瘍細胞、癌細胞などの成長又は増殖を抑制し、及び腫瘍細胞を有する個体を治療する方法である。また本明細書に提供されるのは、腫瘍又は移植片対宿主病を有する個体を、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞、並びに/又は胎盤由来、例えば、胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を含む組み合わされたナチュラルキラー細胞で治療する方法である。【選択図】図１

Description

本出願は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2013年2月5日に出願された米国仮特許出願第61/761,176号及び2013年3月13日に出願された米国仮特許出願第61/780,115号の利益を主張するものである。
(1.分野)
本明細書に提示されるのは、腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞、並びに/又は胎盤由来、例えば、胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を含む組み合わされたナチュラルキラー細胞と接触させることによって、腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する方法である。また本明細書に提供されるのは、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液、例えば、ヒト胎盤灌流液由来の固有のナチュラルキラー細胞集団を産生する方法である。さらに本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、及びそれに由来するナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。また本明細書に提供されるのは、腫瘍又は移植片対宿主病を有する個体を、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤由来、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞、並びに/又は胎盤由来、例えば、胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を含む組み合わされたナチュラルキラー細胞で治療する方法である。
(2.背景)
胎盤灌流液は、灌流溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる胎盤細胞の収集物、及び該血管系由来、胎盤の母胎面由来、又はその両方の灌流液の収集物を含む。哺乳動物の胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第7,045,146号及び米国特許第7,255,879号に記載されている。灌流によって得られる胎盤細胞の集団は不均質であり、造血(CD34+)細胞、有核細胞、例えば、顆粒球、単球、及びマクロファージ、わずかな比率(1％未満)の組織培養基材接着性胎盤幹細胞、並びにナチュラルキラー細胞を含む。これまで、腫瘍細胞増殖の抑制における、胎盤灌流液、又は灌流液由来の胎盤細胞集団の使用を記載したものはいない。
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系の主要な構成要素となる細胞傷害性リンパ球である。NK細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)も、CD3も、表面免疫グロブリン(Ig) B細胞受容体も発現していないが、通常ヒトでは、表面マーカーCD16(FcγRIII)及びCD56を発現する。NK細胞は細胞傷害性であり;その細胞質中の小顆粒は、パーフォリン、及びグランザイムとして知られるプロテアーゼなどの特殊なタンパク質を含有している。死滅させる予定の細胞のすぐ近くに放出されると、パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、そこからグランザイム及び関連分子が進入可能になり、アポトーシスが誘導される。グランザイムの1つであるグランザイムB(グランザイム2及び細胞傷害性Tリンパ球関連セリンエステラーゼ1としても知られている)は、細胞性免疫応答における標的細胞アポトーシスの迅速な誘導に重要なセリンプロテアーゼである。
NK細胞は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。活性化されたNK細胞は、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞と呼ばれることもある。NK細胞は、細胞の細胞傷害活性を制御する、「活性化受容体」及び「抑制性受容体」と名付けられた、2種類の表面受容体を保有する。
数ある活性の中でも特に、NK細胞は、宿主による腫瘍の拒絶に役割を果たしている。癌細胞では、クラスI MHC発現が低下しているか又はクラスI MHC発現がないので、癌細胞は、NK細胞の標的になることができる。蓄積しつつある臨床データは、PBMC又は骨髄から単離されたヒトNK細胞のハプロタイプ一致性移植が、検出可能な移植片対宿主病(GVHD)を保有することなく、強力な抗白血病効果を媒介することを示唆している。Ruggeriらの文献、Science 295:2097-2100(2002)を参照されたい。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質を欠如しているか又はそのレベルの低下を示している細胞によって活性化されるようになることができる。活性化及び増殖させたNK細胞及びLAK細胞は、進行癌を有する患者のエクスビボ療法とインビボ治療の両方で使用されており、白血病などの骨髄関連疾患;乳癌;ある種のリンパ腫に対してある程度の成功を収めている。LAK細胞治療では、患者にまずIL-2を投与し、次に白血球除去療法を施し、その後、回収された自己血液細胞を、IL-2の存在下で数日間、エクスビボでインキュベートし、培養する必要がある。治療を終了するためには、LAK細胞を比較的高用量のIL-2と一緒に再注入しなければならない。このパージ治療(purging treatment)は高価であり、重篤な副作用を引き起こすことがある。これらの副作用には、体液貯留、肺水腫、血圧低下、及び高熱が含まれる。
腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を死滅させる上でのNK細胞の有利な特性にもかかわらず、NK細胞は、その腫瘍標的能力及び殺腫瘍能力を培養及び増殖の間に維持するのが難しいことが主な理由で、取扱い及び免疫療法での適用が依然として難しい。したがって、当技術分野では、ナチュラルキラー細胞の素早い供給が必要とされている。
(3.概要)
一態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞増殖を抑制するための、胎盤灌流液;胎盤灌流液由来の細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞;胎盤灌流液細胞と臍帯血細胞の組合せ;及び/又は胎盤由来のナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞もしくは胎盤組織の消化により得られるナチュラルキラー細胞の使用である。
一態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団をヒト胎盤灌流液と接触させることを含む、方法である。この方法の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞(a blood cancer cell)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞(blood cancer cells)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞(a solid tumor cell)である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞(solid tumor cells)である。別の実施態様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロで行われる。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビボで行われる。より具体的な実施態様において、該インビボで接触させることは、ヒトで行われる。
別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎盤血管系に、例えば、胎盤血管系にのみ通された灌流液である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎盤血管系に通され、胎盤の母体面から回収されたものである。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、複数の赤血球を除去するように処理されたものである。
本明細書で使用されるように、「胎盤由来のナチュラルキラー細胞(複数可)」という語句は、臍帯血又は胎盤血由来のナチュラルキラー細胞を含まない。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を複数の胎盤灌流液細胞と接触させることを含む、方法である。別の具体的な実施態様において、該複数の胎盤灌流液細胞は、胎盤灌流液由来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液又は胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞は、少なくとも1種類の細胞を除去するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロで行われる。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビボで行われる。より具体的な実施態様において、該インビボで接触させることは、哺乳動物、例えば、ヒトで行われる。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、少なくとも1種類の細胞、例えば、CD56+細胞を濃縮するように処理されたものである。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、CD56+胎盤細胞である。より具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、例えば、胎盤灌流液細胞、又は胎盤組織の機械的もしくは酵素的破壊によって得られる胎盤細胞から得られる、CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー(PINK)細胞である。別の具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、CD56コンジュゲートマイクロビーズによって選択される。別の具体的な実施態様において、該CD56+細胞は、同等数のCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いNKG2D、NKp46、又はCD94の発現を示す細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該PINK細胞は、CD3-である。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞中の細胞の少なくとも50％は、該CD56+細胞である。該CD56+細胞が該胎盤灌流液細胞の少なくとも50％であるより具体的な実施態様において、腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロで接触させることである。別の実施態様において、該接触させることは、インビボで、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトで接触させることである。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を胎盤由来の複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞と接触させることを含む、方法である。具体的な実施態様において、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から得られるナチュラルキラー細胞である。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、胎盤組織の物理的破壊及び/又は酵素消化によって得られるナチュラルキラー細胞である。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞である。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、例えば、胎盤灌流液細胞又は胎盤組織の物理的破壊及び/もしくは酵素消化によって得られる細胞から、CD56コンジュゲートマイクロビーズによって選択される。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、CD3-である。具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞は、該ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団内の細胞の少なくとも80％である。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビトロで行われる。別の具体的な実施態様において、該接触させることは、インビボで行われる。より具体的な実施態様において、該インビボで接触させることは、哺乳動物、例えば、ヒトで行われる。
本方法の別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞は、同等数のCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いNKG2D、NKp46、又はCD94の発現を示す細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、及び/又はhsa-miR-99aのうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する。
別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を、該複数のナチュラルキラー細胞が免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムBを発現するのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物と接触させる。より具体的な実施態様において、該免疫調節化合物は、レナリドミド又はポマリドミドである。別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を、該ナチュラルキラー細胞が免疫調節化合物、例えば、レナリドミド又はポマリドミドと接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に大きい該腫瘍細胞に対する細胞傷害性を示すのに十分な量及び時間で、該免疫調節化合物と接触させる。別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、及びTBX21のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。
別の実施態様において、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞を、別の源、例えば、胎盤血及び/又は臍帯血由来のナチュラルキラー細胞と組み合わせて、例えば、組み合わされたナチュラルキラー細胞を形成させる。
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、混合された源、例えば、胎盤(例えば、胎盤灌流液)及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞である。例えば、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、マッチした臍帯血及びヒト胎盤灌流液、例えば、ドナーがマッチした源から得ることができ、ここで、該胎盤灌流液は、臍帯血と同じ胎盤から得られる。両方から得られるナチュラルキラー細胞を、別々に又は同時に単離し、組み合わせる。一実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、組み合わされた臍帯血及びヒト胎盤灌流液から単離される。組み合わされたナチュラルキラー細胞は、本明細書において「pNK」細胞と呼ばれる場合もある。より具体的な実施態様において、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞を、別の源由来のナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比で組み合わせる。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、胎盤由来(例えば、胎盤灌流液由来)の細胞と別の源、例えば、臍帯血由来の細胞の組合せから得られる。一実施態様において、胎盤及び別の源由来の細胞を、組み合わされたナチュラルキラー細胞の単離の前に組み合わせる。また別の実施態様において、ナチュラルキラー細胞を胎盤から単離し、それとは別に、ナチュラルキラー細胞を他の源から単離し、その後、これら2つの源由来のナチュラルキラー細胞を組み合わせて、組み合わされたナチュラルキラー細胞を形成させる。
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は培養されない。他の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は培養される。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のKIR2DL2/3+、NKp30+、2B4+、及び/又はCD94+ナチュラルキラー細胞を含む。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量のNKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は:末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+2B4+ナチュラルキラー細胞;又は末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD94+ナチュラルキラー細胞を含む。他の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は培養され:末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp44+ナチュラルキラー細胞;末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-miR-155、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量で発現する。
上記の方法のいずれかの具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。別の具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、液性腫瘍細胞、例えば、血液腫瘍細胞である。より具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、単離された胎盤CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から単離される。別の具体的な実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞は、胎盤組織の物理的破壊及び/又は酵素消化によって胎盤から単離される。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離されたCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞を含む。より具体的な実施態様において、該CD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞は、該CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該単離されたCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞は、少なくとも2人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、該PINK細胞を増殖させる。
より具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤ナチュラルキラー細胞及び別の源由来のナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、該他の源は、臍帯血(cord blood)及び/又は臍帯血(umbilical cord blood)である。別の具体的な実施態様において、該他の源は、末梢血である。より具体的な実施態様において、該胎盤由来のナチュラルキラー細胞を、別の源由来のナチュラルキラー細胞と、約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100などの比で組み合わせる。具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤細胞(例えば、胎盤灌流液)と別の源(例えば、臍帯血)由来の細胞の組合せから得られるナチュラルキラー細胞を含む。
別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の細胞の全て又は実質的に全て(例えば、90％、95％、98％、もしくは99％超)は、胎児細胞である。別の具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞及び母親細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液中の胎児細胞は、該灌流液中の細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、0.9％NaCl溶液を胎盤血管系に通すことによって得られる。別の具体的な実施態様において、該灌流液は培養培地を含む。別の具体的な実施態様において、該灌流液は、複数の赤血球を除去するように処理されたものである。
別の具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞を含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。該組成物は、単離されたPINK細胞をさらに含むことができ、ここで、該PINK細胞は、該胎盤灌流液又は該灌流液細胞とは異なる個体に由来するものである。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法であって、複数の胎盤細胞を得ること、及びナチュラルキラー細胞を該複数の胎盤細胞から単離することを含む、方法である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞を、混合された源、例えば、胎盤(例えば、胎盤灌流液)及び臍帯血から単離する方法であって、複数の胎盤細胞及び臍帯血細胞を得ること、並びにナチュラルキラー細胞を該複数の胎盤細胞及び臍帯血細胞から単離することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該胎盤細胞は、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該複数の胎盤細胞は、胎盤組織の機械的及び/もしくは酵素的消化によって得られる胎盤細胞であるか、又は該細胞を含む。別の実施態様において、該単離することは、1以上の抗体を用いて実施される。より具体的な実施態様において、該1以上の抗体は、CD3、CD16、又はCD56に対する抗体のうちの1つ又は複数を含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+細胞を該複数の胎盤細胞中のCD56-細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、CD16-胎盤細胞を、CD56-又はCD16+である胎盤細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞を、CD56-、CD16+、又はCD3+である胎盤細胞から単離することを含む。別の実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は少なくとも99％CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞である胎盤細胞の集団を生じさせる。
上記の方法のある実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、培養で増殖させたものである。ある実施態様において、該胎盤灌流液細胞及び別の源(例えば、臍帯血)由来の細胞は、培養で増殖させたものである。ある実施態様において、胎盤(例えば、胎盤灌流液)から得られた又は混合された源(例えば、胎盤及び臍帯血)から得られたナチュラルキラー細胞は、培養で増殖させたものである。様々な実施態様において、該細胞は、少なくとも、約、又はわずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30日間増殖させたものである。具体的な実施態様において、該細胞は、フィーダー層の存在下で及び/又は少なくとも1つのサイトカインの存在下で増殖させたものである。より具体的な実施態様において、該フィーダー層は、K562細胞もしくは末梢血単核細胞(PBMC)、又は両方の組合せを含む。別のより具体的な実施態様において、該少なくとも1つのサイトカインは、インターロイキン-2である。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する個体を治療する方法であって、該個体に、本明細書に記載の胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞(例えば、胎盤及び別の源、例えば、臍帯血から得られるナチュラルキラー細胞)、又はこれらの組合せの治療有効量を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、該個体は、固形腫瘍を有する。ある他の実施態様において、該個体は、血液癌を有する。具体的な実施態様において、該個体は、原発性腺管癌、白血病、急性T細胞白血病、慢性骨髄性リンパ腫(CML)、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病(CML)、肺癌、結腸腺癌、組織球性リンパ腫、多発性骨髄腫、網膜芽腫、結腸直腸癌、又は結腸直腸腺癌を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、移植片対宿主病を有する個体を治療する方法である。より具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、同種異系骨髄移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、固形臓器移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、複合組織同種移植後に発症する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、該投与することにより、少なくとも1段階グレードが低下する。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、該投与することの結果として、移植後100日以内にグレードIIを超えて進行しない。別のより具体的な実施態様において、該移植片対宿主病は、該投与することの結果として、移植後100日以内にグレードIを超えて進行しない。
(3.1.定義)
本明細書で使用されるように、「組み合わされたナチュラルキラー細胞」は、例えば、マッチした臍帯血及びヒト胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞であり、ここで、胎盤灌流液は、臍帯血と同じ胎盤から得られる。両方由来のナチュラルキラー細胞は、別々に又は同時に単離され、組み合わされる。
本明細書で使用されるように、「PINK」及び「PINK細胞」は、ヒト胎盤、例えば、ヒト胎盤灌流液又は機械的に及び/もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得られる胎盤中間ナチュラルキラー細胞を指す。該細胞は、例えば、フローサイトメトリー、例えば、CD56及びCD16に対する抗体を用いる蛍光活性化細胞選別によって決定したとき、CD56+及びCD16-である。PINK細胞は、臍帯血だけから得られるものでも、末梢血だけから得られるものでもない。
本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液」は、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部に通した、例えば、胎盤血管系に通した灌流溶液を意味し、これには、胎盤に通す間に、該灌流溶液によって回収される複数の細胞が含まれる。
本明細書で使用されるように、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離されるか又は単離可能である有核細胞、例えば、全有核細胞を意味する。
本明細書で使用されるように、「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、例えば、該腫瘍細胞の集団を、PINK細胞、PINK細胞を含む細胞の集団、組み合わされたナチュラルキラー細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団、ヒト胎盤灌流液などと接触させることによって、例えば、該腫瘍細胞の集団内の腫瘍細胞の1つ又は複数を死滅させることにより、腫瘍細胞の集団の成長を減速させることを含む。
(4.図面の簡単な説明)
抗CD3抗体及び抗CD56抗体を、CD56マイクロビーズによって選択されるヒト胎盤灌流液(HPP)由来の細胞に用いたフローサイトメトリーの結果を示す。単離された細胞の大部分は、CD56+CD3-である。
24時間の培養後のPINK細胞及び/又は腫瘍細胞によるサイトカインの産生を示す。図2Aは、単独での又はKG-1a腫瘍細胞の存在下での胎盤灌流液由来中間ナチュラルキラー細胞(PINK)細胞によるインターフェロンガンマ(IFNγ)の分泌を示す。PINK細胞及びKG-1a細胞を単独で又は1:1の比で組み合わせて培養した。Y軸:培養物によって産生されたIFNγのピコグラム。図2Bは、単独での又はKG-1a腫瘍細胞の存在下でのPINK細胞による顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の分泌を示す。PINK細胞及びKG-1a細胞を単独で又は1:1の比で組み合わせて培養した。Y軸:培養物によって産生されたGM-CSFのピコグラム。
1:1、5:1、10:1、又は20:1のPINK細胞対腫瘍細胞の比での24時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対するPINK細胞の細胞傷害性を示す。X軸: PINK細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: PINK細胞なしの腫瘍細胞と比較した死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
21日間培養された胎盤ナチュラルキラー細胞及び末梢血(PB)NK細胞のK562細胞に対する細胞傷害性を示す。エラーバーは、4ユニットの培養胎盤NK細胞又は3ユニットの培養末梢血NK細胞の標準偏差を表す。
1:1、5:1、10:1、もしくは20:1、又は100:1のHPP細胞対腫瘍細胞の比での24時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞なしの腫瘍細胞と比較した死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.56:1、又は0.78:1のHPP細胞又はUCB細胞対腫瘍細胞の段階希釈での48時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤及び臍帯血から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。X軸: HPP細胞又は臍帯血細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞又は臍帯血細胞なしの腫瘍細胞と比較した48時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.56:1、又は0.78:1のHPP細胞対腫瘍細胞の段階希釈での48時間の共培養におけるKG-1a腫瘍細胞に対する胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す。灌流液は、回収された状態で使用されたか、又は100U/mLもしくは1000U/mLのインターロイキン-2(IL-2)で24時間刺激された。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比。Y軸: HPP細胞なしの腫瘍細胞と比較した48時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
50:1の対腫瘍細胞比でHPP又はUCB細胞と培養した後の一群の腫瘍細胞株に対するヒト胎盤灌流液の細胞傷害効果を示す。図8A: 24時間の共培養。図8B: 48時間の共培養。X軸:試験した腫瘍細胞株。Y軸:腫瘍細胞の非存在下の腫瘍細胞の数と比較した共培養後の死滅した腫瘍細胞のパーセンテージ。
様々なHPP細胞対腫瘍細胞比でKG-1a腫瘍細胞と共培養したHPP細胞によるIFNγ産生を示す。X軸: HPP細胞対腫瘍細胞の比を含む実験条件。Y軸: 24時間の共培養後の1ミリリットル当たりのIFNγレベル。
一群の腫瘍細胞との共培養におけるHPP又はUCB細胞によるIFNγの産生。HPP又はUCB細胞を50:1の対腫瘍細胞株比で24時間(図10A)又は48時間(図10B)共培養した。IFNγレベルをLuminexアッセイ(HCYTO-60K-03, Millipore)により決定した。X軸:試験された腫瘍細胞株。Y軸:腫瘍細胞の非存在下で産生されたIFNγのピコグラムと比較した、HPP又はUCB細胞によって産生されたIFNγのピコグラム。
2×107個のヒト胎盤灌流液(HPP)細胞を約332mm3の体積のKG-1細胞腫瘍を有するマウスに投与したときの腫瘍サイズの低下を示す。腫瘍内−HPP細胞を皮下腫瘍部位に直接注射した。IV−HPP細胞を静脈内投与した。対照−ビヒクル投与のみ。腫瘍体積はmm3で表されている。
ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及び臍帯血(CB)ユニット由来のNK細胞の比較を示す。(A)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びCBユニット由来のNK細胞の免疫表現型特徴付け; 2標本t-検定を用いて、母平均がヒト胎盤由来幹細胞とCBで等しいかどうかを判定した。(B)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びCBユニット由来の増殖させたNK細胞のK562細胞に対する細胞傷害性。E＝NK細胞; T＝腫瘍細胞。
末梢血(PB)NK細胞と比較した胎盤由来NK細胞(pNK)細胞の表現型特徴付けを示す。(A)ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCB(本明細書では「コンボユニット」と呼ばれる)由来のNK細胞(pNK)並びにPB由来のNK細胞(PB NK)のフローサイトメトリーによる同定。CD56+CD3-でゲートがかけられたNK細胞は、CD16、KIR3DL1、NKG2D、KIR2DL2/L3、NKp46、CD94、CD226、NKp44、NKp30、及び2B4を含む: NK細胞活性を調節するために重要な受容体のレパートリーを発現していた。(B) NK細胞単離前のコンボユニット由来のCD56+CD3- pNK細胞のパーセンテージ。(C)コンボユニット由来の90％のCD56+CD3- NK細胞をNK細胞単離後に獲得した。
増殖させたpNK細胞の細胞周期解析を示す。(A)表示された様々な時点のエクスビボ増殖させたpNKの代表的なAPC-BrdU/7-AAD細胞周期解析。(B)表示された様々な時点のエクスビボ増殖させたpNKの様々な段階での細胞周期解析(n＝5)。
エクスビボ増殖させたpNK細胞の増殖倍数、表現型、及び機能的特徴付けを示す。(A)21日目の増殖させたpNK細胞の増殖倍数及び細胞生存率。(B) 21日目の増殖させたpNK細胞の表現型特徴付け。(C) 21日目の増殖させたPB NK細胞と比較した表示された様々な時点の増殖させたpNK細胞のK562に対する細胞傷害性。
広範囲の腫瘍細胞株に対する21日目のエクスビボ増殖させたpNK細胞の細胞傷害性を示す。表示された10:1、5:1、2:1、及び1:1のE:T比での広範囲の腫瘍細胞株に対するエクスビボ増殖させたpNK細胞の細胞傷害性。
(5.詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制するための、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はそのために得られるナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤灌流液由来中間ナチュラルキラー(「PINK」)細胞もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞の使用である。特に、本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、例えば、ヒト胎盤灌流液から単離されるか、又は別の源、例えば、臍帯血(UCB)由来の細胞と組み合わされた胎盤灌流液から単離されるか、又は機械的に及び/もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から単離される、ナチュラルキラー(NK)細胞及びNK細胞の集団、該NK細胞を得る方法、並びに該細胞を使用する方法である。本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞を含む、細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団でもある。胎盤灌流液を得る方法、及び胎盤灌流液由来の細胞を得る方法は、下の第5.1節に記載されている。胎盤組織由来の細胞を得る方法は、下の第5.2節に記載されている。胎盤灌流液由来ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー(PINK)細胞、及び該細胞を得る方法は、下の第5.3節に記載されている。胎盤灌流液細胞由来のナチュラルキラー細胞及び別の源、例えば、臍帯血由来の細胞、並びに組み合わされたナチュラルキラー細胞を得る方法は、下の第5.4節に記載されている。胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤灌流液由来ナチュラルキラー細胞、例えば、中間ナチュラルキラー細胞、及び組み合わされたナチュラルキラー細胞を含む組成物、並びに該細胞を保存する方法及び該細胞を用いて腫瘍細胞の増殖を抑制する方法は、下の第5.5〜5.7節に記載されている。
(5.1.胎盤灌流液)
(5.1.1.細胞回収組成物)
本明細書に提供される胎盤灌流液、灌流液細胞、及び胎盤灌流液由来ナチュラルキラー細胞は、胎盤細胞回収組成物を用いた、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤の灌流によって回収することができる。灌流液は、任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液、培養培地、又はより複雑な細胞回収組成物による胎盤の灌流によって、胎盤から回収することができる。胎盤の灌流に、並びに灌流液細胞、例えば、全有核胎盤灌流液細胞又はPINK細胞の回収及び保存に好適な細胞回収組成物は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる関連米国特許出願公開第2007/0190042号に詳細に記載されている。
細胞回収組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に好適な任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などを含むことができる。
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、胎盤細胞を保存する、すなわち、胎盤細胞の死を防止するか、又は胎盤細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞の集団内の胎盤細胞の数を低下させるなどの傾向がある1以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはJNK阻害剤);血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン、もしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など);壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、もしくはクロナゼパム); TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化ペルフルオロデシルなど)であることができる。
細胞回収組成物は、1以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞回収組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。ある非制限的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシム、もしくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム(+)及び/又はグラム(-)細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性がある。
細胞回収組成物は、以下の化合物のうち1つ又は複数を含むこともできる:アデノシン(約1mM〜約50mM); D-グルコース(約20mM〜約100mM);マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM);一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の巨大分子(例えば、約25g/l〜約100g/l、もしくは約40g/l〜約60g/lで存在する、合成もしくは天然のコロイド、デキストランなどの多糖類、もしくはポリエチレングリコール);酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、もしくはビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン);細胞内へのカルシウム進入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L);一実施態様において、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン);又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、もしくはイソブチルアミロライド)。
(5.1.2.胎盤の回収及び取扱い)
通常、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施態様において、インフォームドコンセントの後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、胎盤又はそれから回収された細胞のその後の使用を調整することができる。例えば、ヒト胎盤細胞を、病歴を考慮して、該胎盤と関連する乳児、又は該乳児の両親、兄弟、もしくはその他の親族の個別化医療のために使用することができる。
灌流液の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。ある実施態様において、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。通常、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号: Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照されたい)。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank Inc.、Cedar Knolls, N.J.、ViaCord、Cord Blood Registry、及びCryoCellにより行われてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
通常、臍帯血の回収及び灌流液の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。ある実施態様において、臍帯血の回収前に、近位臍帯を、好ましくは、胎盤への挿入部から4〜5cm(センチメートル)以内のところでクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
胎盤を、灌流液の回収前に、滅菌条件下、かつ室温又は5〜25℃の温度(摂氏)のどちらかで保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤を、48時間よりも長い時間、好ましくは4〜24時間、保存してもよい。胎盤は、5〜25℃の温度(摂氏)で、抗凝血剤溶液に入れて保存することが好ましい。好適な抗凝血剤溶液は当技術分野で周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウム溶液を用いることができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中に1％w/w)を含む。放血された胎盤は、胎盤灌流液を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。
(5.1.3.胎盤灌流)
哺乳動物の胎盤を灌流する方法は、例えば、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Haririの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号、並びに「臓器を回収及び保存するための改良された組成物(Improved Composition for Collecting and Preserving Organs」という表題の米国出願公開第2007/0190042号に開示されている。
灌流液は、灌流溶液、例えば、生理食塩水溶液、培養培地、又は上記の細胞回収組成物を、胎盤血管系に通すことによって得ることができる。一実施態様において、哺乳動物の胎盤を、灌流溶液を臍帯動脈と臍帯静脈のどちらか又は両方に通すことによって灌流する。胎盤を通る灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を用いて達成することができる。好ましくは、灌流溶液を、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて、胎盤に強制的に通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されている、カニューレ、例えば、TEFLON(登録商標)又はプラスチックカニューレを挿入することができる。この滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。
灌流に備えて、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い地点に位置するような形で、胎盤を配置することが好ましい。灌流溶液を胎盤血管系に通すか、又は胎盤血管系及び周辺組織に通すことによって、胎盤を灌流することができる。一実施態様において、臍帯動脈及び臍帯静脈を、可撓性コネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続する。灌流溶液を臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、及び/又は血管壁を通って胎盤の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。別の実施態様において、灌流溶液を、臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する、すなわち、胎盤血管系(胎児組織)のみに通す。
一実施態様において、例えば、臍帯動脈及び臍帯静脈を、例えば、可撓性コネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されているピペットに同時に接続する。灌流溶液を臍帯静脈及び臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、及び/又は血管壁を通って胎盤の周辺組織に入り、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液を、臍帯開口部を介して導入し、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出又は浸出させることもできる。「受け皿(pan)」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、通常、胎児細胞と母親細胞の混合物である。
別の実施態様において、灌流溶液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、通常、ほとんど胎児のものしかない。
閉回路灌流法は、一実施態様において、次のように実施することができる。分娩後胎盤を、出産後、約48時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯は、廃棄することができるか、又は例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び/もしくは生体材料の産生用に臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜を灌流の間保持することができるか、又は例えば、指を用いる鈍的剥離を用いて、絨毛膜から分離することができる。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば、廃棄するか、又は例えば、酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば、羊膜生体材料、例えば、米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている生体材料を産生するために、処理することができる。例えば、滅菌ガーゼを用いて、全ての目に見える血の塊及び残留血液を胎盤から除去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させることにより、臍帯血管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲータークランプを各々の血管の切断端に通して前進させることによって広げる。その後、装置、例えば、灌流装置又は蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプは、この目的に好適な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであることができる。その後、滅菌された回収リザーバ、例えば、250mL回収バッグなどの血液バッグに接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈に挿入する。或いは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、回収リザーバ(複数可)に接続されたチューブを胎盤動脈の一方又は両方に挿入する。その後、胎盤を、一定の体積の灌流溶液、例えば、約750mlの灌流溶液で灌流する。その後、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収する。
一実施態様において、灌流の間、近位臍帯をクランプし、より好ましくは、胎盤への臍帯挿入部から4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。
放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流液の最初の回収物は、通常、臍帯血及び/又は胎盤血の残留赤血球のために色が付いている。該灌流液は、灌流が進み、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になっていく。通常、最初に胎盤から血液を洗い流すためには、30〜100mLの灌流液で十分であるが、観察された結果次第で、より多くの又はより少ない灌流液を用いることができる。
胎盤を灌流するために使用される灌流液の体積は、回収しようとする胎盤細胞の数、胎盤の大きさ、単一の胎盤から行われる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施態様において、灌流液の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであることができる。通常、放血後、胎盤を700〜800mLの灌流液で灌流する。
胎盤を、数時間又は数日間かけて、複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌流しようとする場合、それを、容器(container)又は他の好適な容器(vessel)中、無菌条件下で維持又は培養し、細胞回収組成物、或いは標準的な灌流溶液(例えば、抗凝血剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)を含むかもしくは含まない、及び/又は抗微生物剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM):ストレプトマイシン(例えば、40〜100μg/ml)、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンフォテリシンB(例えば、0.5μg/ml)などの抗生物質を含むかもしくは含まない通常の生理食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」))で灌流することができる。一実施態様において、単離された胎盤を、灌流及び灌流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は2もしくは3日間、又はそれより長い間、維持又は培養するように、該胎盤を、灌流液を回収しないで、しばらくの間、維持又は培養する。灌流された胎盤を、さらにもう1回以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、又はそれより長い時間、維持し、例えば、700〜800mLの灌流液で再び灌流することができる。胎盤を、1、2、3、4、5回、又はそれより多く、例えば、1、2、3、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様において、回収された有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで、胎盤の灌流、及び灌流溶液、例えば、胎盤細胞回収組成物の回収を繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、細胞、例えば、全有核細胞の時間依存的な集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプールすることもできる。
(5.1.4.胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞)
胎盤灌流液は、不均質な細胞の集まりを含む。通常、使用前に、胎盤灌流液から赤血球を除去する。そのような除去は、赤血球を有核血液細胞から分離する公知の方法によって実施することができる。ある実施態様において、該灌流液又は灌流液細胞は、凍結保存される。ある実施態様において、胎盤灌流液由来の細胞は、凍結保存前に増殖させられることも、培養されることもない。ある実施態様において、該胎盤灌流液は、胎児細胞のみもしくは胎児細胞と母親細胞の組合せを含み、又は該灌流液細胞は、胎児細胞のみもしくは胎児細胞と母親細胞の組合せを含む。
通常、単回の胎盤灌流由来の胎盤灌流液は、約1億〜約5億個の有核細胞を含む。ある実施態様において、該胎盤灌流液又は灌流液細胞は、幹細胞を含む。ある実施態様において、該胎盤灌流液又は灌流液細胞は、CD34+細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞を含む。そのような細胞は、より具体的な実施態様において、CD34+CD45-幹細胞もしくは前駆細胞、CD34+CD45+幹細胞もしくは前駆細胞、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞、及び/又は赤血球前駆細胞を含むことができる。他の実施態様において、胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は、接着性胎盤幹細胞、例えば、CD34-幹細胞を含む。他の実施態様において、該胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨前駆細胞、及びナチュラルキラー細胞を含む。ある実施態様において、胎盤から回収され、赤血球が除去された胎盤灌流液、又はそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、例えば、フローサイトメトリー、例えば、FACS解析によって測定したとき、約6〜7％のナチュラルキラー細胞(CD3-、CD56+);約21〜22％のT細胞(CD3+);約6〜7％のB細胞(CD19+);約1〜2％の内皮前駆細胞(CD34+、CD31+);約2〜3％の神経前駆細胞(ネスチン+);約1〜5％(例えば、2〜5％)の造血前駆細胞(CD34+);及び約0.5〜1.5％の接着性胎盤幹細胞(例えば、CD34-、CD117-、CD105+、及びCD44+)を含む。
(5.2.PINK細胞を得るための胎盤組織の破壊及び消化)
胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、機械的に及び/又は酵素的に破壊された胎盤組織から得ることができる。
胎盤組織は、1以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを用いて破壊することができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチクム由来のコラゲナーゼなど);ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。通常、消化後、消化された組織をストレイナー又はフィルターに通して、部分消化された細胞塊を除去し、実質的に単一細胞の細胞懸濁液にする。
胎盤細胞の懸濁液を得た後、ナチュラルキラー細胞を、例えば、CD3及びCD56に対する抗体を用いて単離することができる。具体的な実施態様において、胎盤ナチュラルキラー細胞は、CD56+である細胞を選択して、第一の細胞集団を産生すること;該第一の細胞集団をCD3及び/又はCD16に特異的な抗体と接触させること;並びにCD3+又はCD56+である細胞を該第一の細胞集団から除去し、それにより、実質的にCD56+及びCD3-、CD56+及びCD16-、又はCD56+、CD3-、及びCD16-である第二の細胞集団を産生することによって単離される。
一実施態様において、磁気ビーズを用いて、胎盤ナチュラルキラー細胞を胎盤細胞の懸濁液から単離する。該細胞は、例えば、1以上の特異的抗体、例えば、抗CD56抗体を含む磁気ビーズ(例えば、約0.5〜100μmの直径)に結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて単離することができる。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を、磁気マイクロスフェアに対して行うことができる。その後、該ビーズを該細胞と混合して、結合させる。その後、細胞を磁場に通して、特異的な細胞表面マーカーを有する細胞を完全に分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体に結合した磁気ビーズと再び混合する。該細胞を再び磁場に通し、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、個別のディッシュ、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。
(5.3.胎盤ナチュラルキラー細胞)
一態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤から、例えば、胎盤灌流液から及び/又は機械的に及び/もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得ることができるナチュラルキラー細胞、並びにそのようなナチュラルキラー細胞を含む組成物の単離、特徴付け、及び使用である。具体的な実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞は、「胎盤中間ナチュラルキラー細胞」又は「PINK」細胞であり、CD56+CD16-である、すなわち、例えば、フローサイトメトリー、例えば、上記のような、CD16及びCD56に対する抗体を用いる蛍光活性化細胞選別によって測定したとき、CD56細胞マーカーを示し、かつCD16細胞マーカーを欠如していると特徴付けられる。したがって、本明細書に提供されるのは、単離されたPINK細胞及び単離された複数のPINK細胞である。また本明細書に提供されるのは、CD56+CD16- PINK細胞をCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞との組合せで含む単離された複数の細胞である。より具体的な実施態様において、該CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞は、胎盤から、又は別の源、例えば、末梢血、臍帯血、骨髄などから単離することができる。したがって、様々な他の実施態様において、PINK細胞を、CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞と、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、又は約9:1の比で組み合わせることができる。この文脈で使用される場合、「単離された」とは、細胞がその通常の環境、例えば、胎盤から取り出されていることを意味する。
ある実施態様において、PINK細胞は、CD3-である。
他の実施態様において、PINK細胞は、完全に成熟したナチュラルキラー細胞によって示される1以上の細胞マーカー(例えば、CD16)を示さないか、又はそのような1以上のマーカーを完全に成熟したナチュラルキラー細胞と比較して検出可能な程度に低下したレベルで示すか、又はナチュラルキラー細胞前駆細胞と関連するが、完全に成熟したナチュラルキラー細胞と関連しない1以上の細胞マーカーを示す。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるPINK細胞は、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、完全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される複数のPINK細胞は、全体で、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、同等数の完全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。
ある実施態様において、PINK細胞は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、及び/又はhsa-miR-99aのうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する。
ある実施態様において、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、培養で増殖させたものである。ある他の実施態様において、胎盤灌流液細胞は、培養で増殖させたものである。具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、フィーダー層の存在下で及び/又は少なくとも1つのサイトカインの存在下で増殖させたものである。より具体的な実施態様において、該フィーダー層は、K562細胞又は末梢血単核細胞を含む。別のより具体的な実施態様において、該少なくとも1つのサイトカインは、インターロイキン-2である。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、単離された複数のPINK細胞(例えば、PINK細胞集団)である。別の具体的な実施態様において、該単離された細胞集団は、胎盤灌流液由来の細胞のCD56マイクロビーズ単離によって産生される。様々な具体的な実施態様において、該集団は、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は少なくとも約99％のPINK細胞を含む。別の実施態様において、該複数のPINK細胞は、増殖させていない;例えば、胎盤灌流液から回収された状態のPINK細胞を含むか、又は該PINK細胞からなる。別の実施態様において、該複数のPINK細胞は、増殖PINK細胞を含むか、又は該PINK細胞からなる。ナチュラルキラー細胞を増殖させる方法は、例えば、Ohnoらの文献、米国特許出願公開第2003/0157713号に記載されている; Ysselらの文献、J. Immunol. Methods 72(1):219-227(1984)及びLitwinらの文献、J. Exp. Med. 178(4):1321-1326(1993)、並びに下の実施例1のナチュラルキラー細胞の増殖に関する記載も参照されたい。
他の実施態様において、該単離された複数のPINK細胞は、完全に成熟したナチュラルキラー細胞によって示される1以上の細胞マーカー(例えば、CD16)を示さないか、又はそのような1以上のマーカーを完全に成熟したナチュラルキラー細胞と比較して検出可能な程度に低下したレベルで示すか、又はナチュラルキラー細胞前駆細胞と関連するが、完全に成熟したナチュラルキラー細胞と関連しない1以上の細胞マーカーを示す。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるPINK細胞は、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、完全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される複数のPINK細胞は、全体で、NKG2D、CD94、及び/又はNKp46を、同等数の完全に成熟したNK細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。
ある具体的な実施態様において、該PINK細胞集団は、マイクロRNAのhsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、及び/又はhsa-miR-99aのうちの1つ又は複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、該PINK細胞集団は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のグランザイムBを発現する。
他の実施態様において、本明細書に提供されるPINK細胞は、培養で増殖させたものである。具体的な実施態様において、該PINK細胞は、少なくとも、約、又は多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、又は28日間培養したもの、例えば、培養で増殖させたものである。具体的な実施態様において、該PINK細胞は、約21日間培養される。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、PINK細胞を含む、単離された細胞、例えば、胎盤細胞の集団である。具体的な実施態様において、該単離された細胞の集団は、自己の単離されたPINK細胞を含む、胎盤灌流液由来の全有核細胞、例えば、胎盤灌流液細胞である。別の具体的な実施態様において、該細胞の集団は、胎盤灌流液由来の細胞のCD56マイクロビーズ単離によって産生される単離された細胞の集団である。様々な具体的な実施態様において、該集団は、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は少なくとも約99％のPINK細胞を含む。
分娩後胎盤は、胎児由来及び母親由来の組織及び細胞を含むので、胎盤灌流液は、回収方法に応じて、胎児細胞のみ、又は胎児細胞の実質的大部分(例えば、約90％、95％、98％、もしくは99％超)を含むことができるか、或いは胎児細胞と母親細胞の混合物(例えば、該胎児細胞は、該灌流液の全有核細胞の約90％、80％、70％、60％、又は50％未満を含む)を含むことができる。一実施態様において、PINK細胞は、胎児胎盤細胞、例えば、胎盤の閉回路灌流(上記参照)から得られる細胞のみに由来しており、ここで、該灌流は、胎児胎盤細胞の実質的大部分、又は胎児胎盤細胞のみを含む灌流液を生じさせる。別の実施態様において、PINK細胞は、胎児細胞及び母親細胞、例えば、受け皿法(上記参照)による灌流によって得られる細胞に由来しており、ここで、該灌流は、胎児細胞と母親胎盤細胞の混合物を含む灌流液を生じさせた。したがって、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、その実質的大部分が胎児の遺伝子型を有する胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎児の遺伝子型を有するナチュラルキラー細胞及び母親の表現型を有するナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。
また本明細書に提供されるのは、非胎盤源由来のナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団である。例えば、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、臍帯血、末梢血、骨髄、又は前述のもののうちの2以上の組合せ由来のナチュラルキラー細胞も含むPINK細胞の集団である。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、臍帯血由来のナチュラルキラー細胞も含むPINK細胞の集団である。PINK細胞及び非胎盤源由来のナチュラルキラー細胞を含むナチュラルキラー細胞の集団は、該細胞を、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、又は約1:100などの比で含むことができる。
さらに本明細書に提供されるのは、臍帯血と単離されたPINK細胞の組合せである。様々な実施態様において、臍帯血を、PINK細胞と、臍帯血1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、もしくは5×108個、又はそれより多くのPINK細胞で組み合わせる。
また本明細書に提供されるのは、PINK細胞を単離する方法である。一実施態様において、PINK細胞は、胎盤灌流液を得、その後、該胎盤灌流液を、CD56+細胞に特異的に結合する組成物、例えば、CD56に対する抗体と接触させ、その後、該結合に基づいてCD56+細胞を単離して、CD56+細胞の集団を形成させることにより回収される。該CD56+細胞の集団は、単離されたナチュラルキラー細胞の集団を含む。具体的な実施態様において、CD56+細胞を、CD16+細胞に特異的に結合する組成物、例えば、CD16に対する抗体と接触させ、CD16+細胞をCD56+細胞の集団から排除する。別の具体的な実施態様において、CD3+細胞もCD56+細胞の集団から排除する。
一実施態様において、PINK細胞は、次のように、胎盤灌流液から得られる。分娩後ヒト胎盤を放血させ、例えば、約200〜800mLの灌流溶液を胎盤血管系のみに通して灌流する。具体的な実施態様において、胎盤から臍帯血を抜き、例えば、灌流溶液を胎盤血管系に流して、該灌流の前に残留血液を除去する。灌流液を回収し、処理して、残留赤血球を除去する。該灌流液中の全有核細胞中のナチュラルキラー細胞は、CD56及びCD16の発現に基づいて単離することができる。ある実施態様において、PINK細胞の単離は、CD56に対する抗体を用いる単離を含み、ここで、単離される細胞はCD56+である。別の実施態様において、PINK細胞の単離は、CD16に対する抗体を用いる単離を含み、ここで、単離される細胞はCD16-である。別の実施態様において、PINK細胞の単離は、CD56に対する抗体を用いる単離、及びCD16に対する抗体を用いる複数の非PINK細胞の排除を含み、ここで、単離される細胞は、CD56+、CD16-細胞を含む。
細胞分離は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)、又は好ましくは、特異的抗体にコンジュゲートしたマイクロビーズを用いる磁気細胞選別によって達成することができる。磁気細胞選別は、例えば、AUTOMACS(商標) Separator(Miltenyi)を用いて実施し、自動化することができる。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法であって、複数の胎盤細胞を得ること、及びナチュラルキラー細胞を該複数の胎盤細胞から単離することを含む、方法である。具体的な実施態様において、該胎盤細胞は、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞であるか、又は該細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該複数の胎盤細胞は、胎盤組織の機械的及び/もしくは酵素的消化によって得られた胎盤細胞であるか、又は該細胞を含む。別の実施態様において、該単離することは、1以上の抗体を用いて行われる。より具体的な実施態様において、該1以上の抗体は、CD3、CD16、又はCD56に対する抗体のうちの1つ又は複数を含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+細胞を該複数の胎盤細胞中のCD56-細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、CD16-胎盤細胞、例えば、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞を、CD56-又はCD16+である胎盤細胞から単離することを含む。より具体的な実施態様において、該単離することは、CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞を、CD56-、CD16+、又はCD3+である胎盤細胞から単離することを含む。別の実施態様において、該胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は少なくとも99％CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞である胎盤細胞の集団を生じさせる。
(5.4.マッチした灌流液及び臍帯血由来の胎盤ナチュラルキラー細胞)
さらに本明細書に提供されるのは、組み合わされたナチュラルキラー細胞と本明細書で呼ばれる、マッチしたユニットの胎盤灌流液と臍帯血の組合せから得られるか、又は該組合せから得ることができるナチュラルキラー細胞である。ある実施態様において、本明細書で使用される「マッチしたユニット」は、NK細胞が胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞から得られることを示し、ここで、該臍帯血細胞は、該胎盤灌流液が得られる胎盤由来の臍帯血から得られる、すなわち、該胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞、ひいては、各々に由来するナチュラルキラー細胞は同じ個体に由来するものである。ある実施態様において、そのようなマッチしたユニットは、「ドナーがマッチした」ユニットと呼ばれる。ある実施態様において、本明細書で使用される「マッチしたユニット」は、NK細胞が胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞から得られることを示し、ここで、該臍帯血細胞は、該胎盤灌流液が得られる胎盤由来の臍帯血から得られるのではなく、免疫学的にマッチした個体の臍帯血から得られる、すなわち、該胎盤灌流液細胞及び臍帯血細胞、ひいては、各々に由来するナチュラルキラー細胞は、異なるが、免疫学的にマッチした個体に由来するものである。ある実施態様において、そのようなマッチしたユニットは、「HLAがマッチした」ユニットと呼ばれる。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞を、例えば、約1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45: 50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、又は約1:100などの比で含む。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、CD56+及びCD16-であるナチュラルキラー細胞のみを含むか、又は実質的に該細胞のみを含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は99.5％のCD56+CD16-ナチュラルキラー細胞(例えば、PINK細胞)を含む。ある他の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、CD56+及びCD16-であるNK細胞、並びにCD56+及びCD16+であるNK細胞を含む。特定の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞を含む。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、CD56+及びCD3-であるナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は99.5％のCD56+CD3-ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD56+CD3-ナチュラルキラー細胞を含む。
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+2B4+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+CD94+ナチュラルキラー細胞を含む。
具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp44+ナチュラルキラー細胞を含む。具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のKIR2DL2/3+ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより多くのKIR2DL2/3+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のNKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより多くのNKp30+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量の2B4+ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、又はそれより多くの2B4+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量のCD94+ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは99.5％、又はそれより多くのCD94+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量のNKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。ある具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、5％、10％、15％、20％、又は25％未満のNKp46+ナチュラルキラー細胞を含む。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、末梢血由来のナチュラルキラー細胞と比較して異なるマイクロRNA(miRNA)発現プロファイルを有する。具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を検出可能な程度に発現する。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618を検出可能な程度に発現する。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する。具体的な実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞と比較してhsa-miR-155の発現が増加している。
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を検出可能な程度には発現しない。別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631を検出可能な程度には発現しない。別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、miRNAのhsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量で発現する。別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、hsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない量で発現する。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、以下のmiRNA: hsa-miR-211、hsa-miR-520c、hsa-miR-125b、hsa-miR-100、hsa-miR-326、hsa-miR-519c、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-450、hsa-miR-198、hsa-miR-522、hsa-miR-518e、hsa-miR-497、hsa-miR-566、hsa-miR-519d、hsa-miR-627、hsa-miR-524、hsa-miR-520g、hsa-miR-302c、hsa-miR-512-3p、及びhsa-miR-520hのうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベル(例えば、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、90倍、100倍、250倍、500倍、もしくは1000倍、又はそれを上回る)で発現する。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、以下のmiRNA: hsa-miR-331、hsa-miR-186、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-26a、hsa-miR-133b、hsa-miR-181b、hsa-miR-222、hsa-miR-197、hsa-miR-146b、hsa-miR-342、hsa-miR-181d、hsa-miR-155、hsa-miR-484、hsa-let-7g、hsa-miR-200c、hsa-miR-181c、hsa-miR-191、hsa-miR-596、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-95、hsa-let-7a、hsa-miR-21、hsa-miR-152、hsa-miR-642、hsa-miR-24、hsa-miR-10a、hsa-miR-429、hsa-let-7b、及びhsa-miR-199bのうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いレベル(例えば、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、90倍、100倍、250倍、500倍、もしくは1000倍、又はそれを上回る)で発現する。
別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多い量のグランザイムBを発現する。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、インターフェロン(IFN)-γを、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞と比較して増大したレベルで誘導する。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞と比較して、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍細胞株に対するより大きい細胞傷害性を有する。細胞傷害性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、乳酸脱水素酵素アッセイ又は蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースのPKH26/TP-PRO-3アッセイ、及び例えば、K562、U937、WERI-RB-1、RPMI8226、HCT-116、又はU266などの腫瘍細胞株を用いて測定することができる。
一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、培養したものでも、増殖させたものでもない。別の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、例えば、7日、10日、14日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日間、又はそれより長い間増殖させたものである。特定の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を14日よりも長い間増殖させる。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を28日よりも短い間増殖させる。特定の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を21日間増殖させる。ある実施態様において、増殖は、エクスビボで行われる。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、フィーダー細胞の非存在下で行われる。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、フィーダー細胞の存在下で行われる。ある実施態様において、フィーダー細胞は、増殖の間、例えば、(フィーダー細胞あり又はフィーダー細胞なしで)培養を開始してから5日、6日、7日、8日、9日、10日後、又はそれよりも後に、組み合わされたナチュラルキラー細胞に添加される。ナチュラルキラー細胞の培養又は増殖において使用される当技術分野で公知の任意のフィーダー細胞、例えば、PBMC又はK562細胞をフィーダー細胞として使用することができる。一実施態様において、PBMCとK562細胞の組合せを、フィーダー細胞として、例えば、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、又は1:1のPBMC:K562の比で使用する。一実施態様において、フィーダー細胞は、PBMC及びK562を1:1の比で含む。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞を、例えば、エクスビボで、約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28日、又はそれより長い日数の間増殖させる。一実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞のエクスビボ増殖は、約21日間である。ある実施態様において、フィーダー細胞は、増殖の間、添加される。一実施態様において、増殖の間の培養物へのフィーダー細胞の添加は、追加のフィーダー細胞の非存在下での増殖と比較してNK細胞増殖の度合いを高める。一実施態様において、新鮮なフィーダー細胞は、当技術分野で公知の技術を用いて(例えば、BrdU及び7-アミノアクチノマイシン-D(7-AAS)染色を用いて)判定したとき、培養NK細胞の大部分がS期にある場合に添加される。一実施態様において、追加のフィーダー細胞は、培養から1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、又はそれより長い日数の後に添加される。一実施態様において、追加のフィーダー細胞は、培養7日目に添加される。
ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、CD56+CD3-である細胞の割合の増加をもたらす。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、NKG2D、NKp46、NKp44、及び/又はNKp30の発現の増加をもたらす。ある実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞の増殖は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、二方向性受容体2B4の発現の減少をもたらす。
ある実施態様において、増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞は、増殖させていないか又は21日よりも短い間増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、特定のmiRNAの発現が増加又は減少している−例えば、下の表23参照−。一実施態様において、miRNAのhsa-miR-155は、増殖させていない、21日よりも短い間増殖させた、及び/又は21日よりも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、もしくはそれより長い間)増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、21日増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞で上方調節される。
ある実施態様において、増殖させた(例えば、21日間増殖させた)組み合わされたナチュラルキラー細胞は、増殖させていない、21日よりも短い間増殖させた、及び/又は21日よりも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、もしくはそれより長い間)増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍細胞株に対するより大きい細胞傷害性を有する。
ある実施態様において、増殖させた組み合わされたナチュラルキラー細胞は、インターフェロン(IFN)-γを、増殖させていない、21日よりも短い間増殖させた、及び/又は21日よりも長い間(例えば、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、もしくはそれより長い間)増殖させた同等数の組み合わされたナチュラルキラー細胞と比較して増大したレベルで誘導する。
さらに本明細書に提供されるのは、臍帯血と組み合わされたナチュラルキラー細胞の組合せである。様々な実施態様において、臍帯血を、組み合わされたナチュラルキラー細胞と、臍帯血1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個の組み合わされたナチュラルキラー細胞の比で組み合わせる。
(5.5.灌流液/細胞組成物)
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞に加えて、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖の抑制において使用するための、該灌流液又は細胞を含む組成物である。
(5.5.1.胎盤灌流液、灌流液細胞、及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の組合せ)
さらに本明細書に提供されるのは、上の第5.1節、第5.3節、又は第5.4節に記載されている、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞の組合せを含む組成物である。一実施態様において、例えば、本明細書に提供されるのは、複数の胎盤灌流液細胞、及び/又は例えば、胎盤灌流液細胞又は機械的にもしくは酵素的に破壊された胎盤組織から得られる、複数の胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞が補充された一定の体積の胎盤灌流液である。具体的な実施態様において、例えば、胎盤灌流液の各ミリリットルに、約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、又はそれより多くの胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。別の実施態様において、複数の胎盤灌流液細胞に、胎盤灌流液、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。別の実施態様において、複数の胎盤中間ナチュラルキラー細胞に、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。ある実施態様において、灌流液を補充に使用する場合、灌流液の体積は、(溶液中の)細胞＋灌流液の全体積の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満である。ある他の実施態様において、胎盤灌流液細胞を、複数のPINK細胞及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と組み合わせる場合、該胎盤灌流液細胞は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、PINK細胞を複数の胎盤灌流液細胞及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と組み合わせる場合、該PINK細胞は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、組み合わされたナチュラルキラー細胞をPINK細胞及び/又は胎盤灌流液細胞と組み合わせる場合、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、通常、細胞の総数の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含む。ある他の実施態様において、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤灌流液細胞を用いて胎盤灌流液を補充する場合、細胞を懸濁させる溶液(例えば、生理食塩水溶液、培養培地など)の体積は、灌流液＋細胞の全体積の約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％超、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％、もしくは1％未満を含み、その場合、該PINK細胞を、補充前に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、又はそれより多くの細胞になるように懸濁させる。
他の実施態様において、上記の組合せのいずれかをさらに、臍帯血又は臍帯血由来の有核細胞と組み合わせる。
さらに本明細書に提供されるのは、2以上の源、例えば、2以上の胎盤から得られ、混合された、例えば、プールされた、プール胎盤灌流液である。そのようなプール灌流液は、各々の源に由来するほぼ等体積の灌流液を含むことができるか、又は各々の源に由来する異なる体積を含むことができる。各々の源に由来する相対的な体積は、無作為に選択することができるか、或いは例えば、1以上の細胞因子、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモンなどの濃度もしくは量;各々の源に由来する灌流液中の胎盤細胞の数;又は各々の源に由来する灌流液の他の特徴に基づくことができる。同じ胎盤の複数回の灌流に由来する灌流液を同様にプールすることができる。
同様に、本明細書に提供されるのは、2以上の源、例えば、2以上の胎盤から得られ、プールされた胎盤灌流液細胞及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞である。そのようなプール細胞は、2以上の源に由来するほぼ同等数の細胞を含むことができるか、又はプール源のうちの1つもしくは複数に由来する異なる数の細胞を含むことができる。各々の源に由来する細胞の相対的な数は、例えば、プールされるべき細胞における1以上の特定細胞型の数、例えば、CD34+細胞の数、CD56+細胞の数などに基づいて選択することができる。
プールは、例えば、胎盤灌流液細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤由来中間ナチュラルキラー(PINK)細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤灌流液細胞とPINK細胞の両方が補充された胎盤灌流液;胎盤灌流液が補充された胎盤灌流液細胞; PINK細胞が補充された胎盤灌流液細胞;胎盤灌流液とPINK細胞の両方が補充された胎盤灌流液細胞;胎盤灌流液が補充されたPINK細胞;胎盤灌流液細胞が補充されたPINK細胞;又は胎盤灌流液細胞と胎盤灌流液の両方が補充されたPINK細胞を含むことができる。
さらに本明細書に提供されるのは、例えば、所与の数の胎盤灌流液もしくはPINK細胞、又は所与の体積の灌流液から予想される腫瘍抑制の程度又は量(すなわち、効力)を決定するためにアッセイされた、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び胎盤中間ナチュラルキラー細胞、並びにそれらのプール又はそれらの組合せである。例えば、一定の分量又はサンプル数の細胞を、そうでなければ腫瘍細胞が増殖するであろう条件下で既知の数の腫瘍細胞と接触させ、胎盤灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組合せの存在下での経時的な(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10週、又はそれより長い間の)腫瘍細胞の増殖速度を、灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、又はそれらの組合せの非存在下での同等数の腫瘍細胞の増殖と比較する。胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞、又はそれらの組合せもしくはプールの効力は、例えば、腫瘍細胞成長を、例えば、約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、又は同様の程度抑制するために必要とされる細胞の数又は溶液の体積として表すことができる。
ある実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及びPINK細胞は、医薬品等級の投与可能なユニットとして提供される。そのようなユニットは、例えば、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mLなどの不連続体積で提供することができる。そのようなユニットは、指定された数の、例えば、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、又はその両方、例えば、1ミリリットル当たり1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの細胞、又は1ユニット当たり1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの細胞を含むように提供することができる。そのようなユニットは、指定された数の、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞のうちのいずれか2つ、又は3つ全てを含むように提供することができる。
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞の上記の組合せにおいて、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞のうちのいずれか1つ、いずれか2つ、又は3つ全ては、レシピエントにとって自己のもの(すなわち、レシピエントから得られたもの)であることができるか、又はレシピエントにとって相同のもの(すなわち、該レシピエント以外の少なくとも1人の他の個体から得られたもの)であることができる。
PINK細胞、胎盤灌流液細胞、及び/又は胎盤灌流液の上記の組合せ又はプールはいずれも、例えば、胎盤灌流液、末梢血、臍帯血、骨髄などに由来するCD56+CD16+ナチュラルキラー細胞を含むことができる。具体的な実施態様において、該組合せは、1ミリリットル当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106個、もしくはそれより多くのそのようなナチュラルキラー細胞、又は1ユニット当たり約、少なくとも約、もしくは多くとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの細胞を含む。該CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞は、天然源から単離された状態で使用することができるか、又は上記の組合せもしくはプールのうちの1つに含める前に増殖させることができる。該CD56+CD16+ NK細胞は、自己のもの(すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞と同じ個体から得られたもの;又はレシピエントから得られたもの)であることができるか、或いは相同のもの(すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/もしくはPINK細胞とは異なる個体に由来するもの;又はレシピエントではない個体に由来するもの)であることができる。
好ましくは、各々のユニットに表示を付けて、体積、細胞の数、細胞のタイプ、該ユニットが特定のタイプの細胞について濃縮されているかどうか、及び／又は該ユニット中の所与の細胞数もしくは該ユニットの所与のミリリットル数の効力が特定のタイプ(単数もしくは複数)の腫瘍細胞の増殖の測定可能な抑制を引き起こすかどうかを明記する。
また本明細書に提供されるのは、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を単独で又は胎盤灌流液細胞及び/もしくは胎盤灌流液との組合せで含む組成物である。したがって、別の態様において、本明細書に提供されるのは、単離されたCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞を含む組成物であり、ここで、該ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から単離されており、かつ該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも50％を含む。具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、該組成物中の細胞の少なくとも80％を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離されたCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞を含む。より具体的な実施態様において、該CD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞は、該CD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞は、単一の個体に由来するものである。より具体的な実施態様において、該単離されたナチュラルキラー細胞は、少なくとも2人の異なる個体由来のナチュラルキラー細胞を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、該ナチュラルキラー細胞とは異なる個体由来の胎盤灌流液を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤灌流液細胞を含む。より具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来するものである。別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液細胞は、該ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来するものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤灌流液及び単離された胎盤灌流液細胞をさらに含み、ここで、該単離された灌流液及び該単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来するものである。胎盤灌流液を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該胎盤灌流液は、少なくとも2人の個体由来の胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、該単離された胎盤灌流液細胞は、少なくとも2人の個体に由来するものである。
(5.5.2.接着性胎盤幹細胞を含む組成物)
他の実施態様において、胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは複数のPINK細胞、又は前述のもののいずれかの組合せもしくはプールに、接着性胎盤幹細胞を補充する。そのような幹細胞は、例えば、Haririの米国特許第7,045,148号及び第7,255,879号に記載されている。接着性胎盤幹細胞は、栄養膜細胞ではない。
胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは複数のPINK細胞、又は前述のもののいずれかの組合せもしくはプールに、例えば、1ミリリットル当たり1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの接着性胎盤細胞を補充することができる。該組合せ中の接着性胎盤幹細胞は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、もしくは40回の集団倍加の間、又はそれより長い間、培養された、例えば、接着性胎盤幹細胞であることができる。
接着性胎盤幹細胞は、初代培養で又は細胞培養で培養したとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器表面(例えば、組織培養プラスチック)に接着する。培養下の接着性胎盤幹細胞は、通常、線維芽細胞のような星状の外観をしており、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から伸びている。しかしながら、接着性胎盤幹細胞は、線維芽細胞が示すよりも多くのそのような突起を示すので、該胎盤幹細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態的に区別することができる。形態的には、胎盤幹細胞は、造血幹細胞からも区別することができ、造血幹細胞は、通常、培養下では、より丸みを帯びた、又は敷石状の形態をとる。
本明細書に提供される組成物及び方法において有用な接着性胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、該幹細胞又は該幹細胞を含む細胞の集団を同定及び/又は単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書に提供される組成物及び方法において有用な接着性胎盤幹細胞及び接着性幹細胞集団には、胎盤、又は任意のその部分(例えば、羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤葉、臍帯など)から直接的に得られる幹細胞及び幹細胞含有細胞集団が含まれる。該接着性胎盤幹細胞集団は、一実施態様において、培養下の接着性胎盤幹細胞の集団(すなわち、2個以上の接着性胎盤幹細胞)、例えば、容器、例えば、バッグ中の集団である。
接着性胎盤幹細胞は、通常、マーカーであるCD73、CD105、CD200、HLA-G、及び/又はOCT-4を発現し、かつCD34も、CD38も、CD45も発現しない。接着性胎盤幹細胞は、HLA-ABC(MHC-1)及びHLA-DRを発現することもできる。これらのマーカーを用いて、接着性胎盤幹細胞を同定し、かつ胎盤幹細胞を他の幹細胞型と区別することができる。該胎盤幹細胞は、CD73及びCD105を発現することができるので、それらは、間葉系幹細胞様の特徴を有することができる。しかしながら、接着性胎盤幹細胞は、胎児特異的マーカーであるCD200及びHLA-Gを発現することができるので、それらは、CD200もHLA-Gも発現しない間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができる。同じように、CD34、CD38、及び/又はCD45の発現の欠如により、接着性胎盤幹細胞は非造血幹細胞として同定される。
一実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD200+、HLA-G+であり、ここで、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、及びCD105+である。別の実施態様において、該接着性幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を産生する。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+であり、ここで、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。該集団の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、及びCD45-である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、該接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を産生する。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD200+、OCT-4+であり、ここで、該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、HLA-G+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+、及びHLA-G+である。別の具体的な実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を産生する。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+、及びHLA-G+であり、ここで、該接着性幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。上記複数の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD200+である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+、及びCD200+である。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD73+、CD105+幹細胞であり、ここで、該幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で、1以上の胚様体を産生し、かつ該接着性幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+である。より具体的な実施態様において、該接着性幹細胞はまた、OCT-4+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、OCT-4+幹細胞であり、ここで、該接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、1以上の胚様体を産生し、かつ該幹細胞は、癌細胞増殖又は腫瘍成長を検出可能な程度に抑制するももとして同定されている。
様々な実施態様において、該単離された胎盤細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％は、OCT4+幹細胞である。上記の集団の具体的な実施態様において、該幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の具体的な実施態様において、該幹細胞は、CD34-、CD38-、又はCD45-である。別の具体的な実施態様において、該幹細胞は、CD200+である。より具体的な実施態様において、該幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別の具体的な実施態様において、該集団は、増殖させたものであり、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回継代したものである。
上記の実施態様のいずれかのより具体的な実施態様において、接着性胎盤細胞は、ABC-p(胎盤特異的ABC輸送体タンパク質;例えば、Allikmetsらの文献、Cancer Res. 58(23):5337-9(1998)参照)を発現する。
別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞は、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-、及びCD133-である。別の実施態様において、接着性胎盤幹細胞、胎盤幹細胞は、IL-6、IL-8、及び単球走化性タンパク質(MCP-1)を構成的に分泌する。
上で参照されている胎盤幹細胞の各々は、哺乳動物胎盤から直接得られ、単離された胎盤幹細胞、又は培養され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30回、もしくはそれより多くの回数継代された胎盤幹細胞、又はそれらの組合せを含むことができる。腫瘍細胞抑制性の複数の上記の接着性胎盤幹細胞は、約、少なくとも、又は高々1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれより多くの接着性胎盤幹細胞を含むことができる。
(5.5.3.胎盤幹細胞馴化培地を含む組成物)
また本明細書に提供されるのは、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤灌流液、さらには馴化培地を含む、腫瘍抑制性組成物の使用である。接着性胎盤幹細胞、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞抑制性である馴化培地、すなわち、複数の1以上のタイプの免疫細胞に対する検出可能な腫瘍細胞抑制効果を有する幹細胞によって分泌又は排出される1以上の生体分子を含む培地を産生することができる。様々な実施態様において、該馴化培地は、胎盤細胞(例えば、幹細胞、胎盤灌流液細胞、PINK細胞)又は組み合わされたナチュラルキラー細胞が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24日、又はそれより長い間、その中で成長した培地を含む。他の実施態様において、該馴化培地は、該細胞が、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は100％コンフルエンスにまでその中で成長した培地を含む。そのような馴化培地を用いて、胎盤細胞又は別の種類の細胞の個別の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、本明細書に提供される馴化培地は、接着性胎盤幹細胞及び非胎盤幹細胞が培養された培地を含む。
そのような馴化培地を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは胎盤中間ナチュラルキラー細胞のいずれか、又はこれらの任意の組合せと組み合わせて、腫瘍細胞抑制性組成物を形成させることができる。ある実施態様において、該組成物は、体積で半分未満の、例えば、体積で約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％、又は約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％未満の馴化培地を含む。
したがって、一実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤幹細胞の培養物由来の培養培地を含む組成物であり、ここで、該胎盤幹細胞は、(a)基材に接着し;(b)CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105、及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105、及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、該集団内の1以上の胚様体の形成を促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養したときに、該集団内の1以上の胚様体の形成を促進し;かつ(c)腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の成長又は増殖を検出可能な程度に抑制する。具体的な実施態様において、該組成物は、複数の該胎盤幹細胞をさらに含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的な実施態様において、該非胎盤細胞はCD34+細胞、例えば、造血前駆細胞、例えば、末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞、又は胎盤血造血前駆細胞を含む。該非胎盤細胞は、他の幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞を含むこともできる。該非胎盤細胞は、1以上のタイプの成体細胞又は細胞株であることもできる。別の具体的な実施態様において、該組成物は、抗増殖剤、例えば、抗MIP-1α又は抗MIP-1β抗体を含む。
具体的な実施態様において、胎盤細胞馴化培養培地又は上清は、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、又は約5:1の胎盤幹細胞対腫瘍細胞の比で複数の腫瘍細胞と共培養した複数の胎盤幹細胞から得られる。例えば、馴化培養培地又は上清は、約1×105個の胎盤幹細胞、約1×106個の胎盤幹細胞、約1×107個の胎盤幹細胞、もしくは約1×108個の胎盤幹細胞、又はそれより多くの胎盤幹細胞を含む培養物から得ることができる。別の具体的な実施態様において、馴化培養培地又は上清は、約1×105〜約5×105個の胎盤幹細胞及び約1×105個の腫瘍細胞;約1×106〜約5×106個の胎盤幹細胞及び約1×106個の腫瘍細胞;約1×107〜約5×107個の胎盤幹細胞及び約1×107個の腫瘍細胞;又は約1×108〜約5×108個の胎盤幹細胞及び約1×108個の腫瘍細胞を含む共培養物から得られる。
具体的な実施態様において、70kgの個体への投与に好適な馴化培地は、約200mLの培養培地中の約7,000万個の胎盤幹細胞によって馴化された上清を含む。
馴化培地を濃縮して、投与可能な医薬品等級の製品を製造することができる 。例えば、馴化培地を、例えば、蒸発、凍結乾燥などによる水の除去により、約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、又はそれを超えて濃縮することができる。具体的な実施態様において、例えば、約7,000万個の胎盤幹細胞由来の200mLの馴化培地を、約180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL、又はそれ未満の体積にまで濃縮することができる。該馴化培地を、例えば、蒸発、凍結乾燥などによって、例えば、粉末にまで、実質的に乾燥させることもできる。
(5.6.灌流液及び胎盤細胞の保存)
胎盤灌流液、胎盤細胞、例えば、灌流液細胞又はPINK細胞、及び組み合わされたナチュラルキラー細胞を保存する、すなわち、長期保存を可能にする条件下に、又は例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
胎盤灌流液は、胎盤細胞組成物を、胎盤の少なくとも一部に、例えば、胎盤血管系に通すことによって産生することができる。胎盤細胞回収組成物は、灌流液内に含まれる細胞を保存するように作用する1以上の化合物を含む。そのような胎盤細胞回収組成物は、上の第5.1節に記載されており、これには、例えば、2007年8月16日に公開された関連米国出願公開US 2007-0190042号に記載されているような、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物がある。一実施態様において、胎盤又は胎盤組織に通した胎盤細胞回収組成物は、下の第5.4節に記載の方法において有用な胎盤灌流液である。
一実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞は、該細胞を、アポトーシスの阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む胎盤細胞回収組成物と接触させることにより、哺乳動物、例えば、ヒトの分娩後胎盤から回収され、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触させていない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシスを低下させ又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。例えば、該胎盤を該胎盤細胞回収組成物で灌流することができ、胎盤細胞、例えば、全有核胎盤細胞をそれから単離する。具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、該JNK阻害剤は、該幹細胞の分化も増殖も調節しない。別の実施態様において、該胎盤細胞回収組成物は、分離相中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該胎盤細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該胎盤細胞回収組成物は、乳化剤、例えば、レシチンをさらに含む。別の実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該胎盤細胞を接触させるときに、約0℃〜約25℃である。別のより具体的な実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該胎盤細胞を接触させるときに、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別のより具体的な実施態様において、該接触させることは、該幹細胞の集団の輸送の間に行われる。別のより具体的な実施態様において、該接触させることは、該幹細胞の集団の凍結及び解凍の間に行われる。
別の実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞は、該灌流液及び/又は細胞をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることによって回収及び保存することができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触させていない灌流液又は胎盤細胞と比較したとき、該細胞のアポトーシスを低下させ又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。
具体的な実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されており; VIASPAN(商標)としても知られているもの; Southardらの文献、Transplantation 49(2):251-257(1990)も参照のこと)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液である。別の実施態様において、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組合せである。別の実施態様において、胎盤細胞回収組成物は、2相中にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの、酸素運搬ペルフルオロカーボンをさらに含む。
本方法の別の実施態様において、胎盤灌流液及び/又は胎盤細胞を、灌流の間、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はこれらの組合せを含む胎盤細胞回収組成物と接触させる。別の実施態様において、胎盤細胞を、灌流による回収の後に、該幹細胞回収化合物と接触させる。
通常、胎盤細胞の回収、濃縮、及び単離の間、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態様において、それゆえ、胎盤灌流液、胎盤細胞、又は胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離の間、該保存の間、6時間未満、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、正常な血中酸素濃度を下回る酸素濃度である。より具体的な実施態様において、該胎盤細胞の集団は、該保存の間、2時間未満、該低酸素状態に曝される。別のより具体的な実施態様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離の間、1時間未満、もしくは30分未満、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的な実施態様において、該胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離の間、剪断ストレスに曝されない。
本明細書に提供される胎盤細胞、胎盤由来のナチュラルキラー細胞、又は組み合わされたナチュラルキラー細胞は、例えば、小型の容器、例えば、アンプル中の凍結保存培地に入れて凍結保存することができる。好適な凍結保存培地としては、例えば、成長培地を含む培養培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695、C2639、もしくはC6039(Sigma)が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存培地は、好ましくは、例えば、約10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)を含む。凍結保存培地は、追加の薬剤、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含んでいてもよい。細胞は、凍結保存時に、約1℃/分で冷却されることが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存した細胞を液体窒素に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様において、例えば、アンプルが約-90℃に達したら、それを液体窒素保存区域に移す。凍結保存した細胞を、好ましくは約25℃〜約40℃の温度で、好ましくは約37℃の温度で解凍する。
(5.7.腫瘍細胞成長を抑制するための胎盤灌流液、PINK細胞、及び組み合わされたナチュラルキラー細胞の使用)
また本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、胎盤灌流液から単離された細胞、単離された組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は単離された胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を用いて、腫瘍細胞の成長、例えば、増殖を抑制する方法である。
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖が、胎盤灌流液、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させていない同じタイプの腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞と比較して検出可能な程度に低下するように、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させることを含む、方法である。
本明細書で使用されるように、「接触させること」は、一実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と;腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞との直接的で物理的な、例えば、細胞間の接触を包含する。別の実施態様において、「接触させること」は、同じ物理的空間内での存在を包含し、例えば、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞と同じ容器、例えば、培養ディッシュ、マルチウェルプレース中に入れられる。別の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞とを「接触させること」は、例えば、該胎盤灌流液又は細胞、例えば、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、個体、例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含むヒト、例えば、癌患者に注射又は注入することによって達成される。
ある実施態様において、胎盤灌流液は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含む個体、例えば、癌患者に検出可能な治療的利益をもたらす任意の量で使用される。ある他の実施態様において、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含む個体に検出可能な治療的利益をもたらす任意の量で使用される。したがって、別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞もしくは複数のPINK細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と個体内で接触させることを含み、その結果、該接触させることが、該個体にとって検出可能な程度に又は実証可能な程度に治療的に利益があるものとなる、方法である。
本明細書で使用されるように、「治療的利益」には、例えば、腫瘍のサイズの低下;腫瘍の増殖の軽減又は停止;単位体積当たりの、組織試料、例えば、血液試料中の癌細胞の数の低下;該個体が有する特定の癌の任意の症状の臨床的改善、該個体が有する特定の癌の任意の症状の悪化の軽減又は停止などが含まれるが、これらに限定されない。そのような治療的利益のいずれか1つ又は複数を達成する胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又はPINK細胞との接触は、治療的に利益があると言われる。
ある実施態様において、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の有核細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞を含む個体、例えば、癌患者に検出可能な治療的利益をもたらす任意の量又は数で使用される。胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、そのような個体に、細胞の数を単位として投与することができ、例えば、該個体に、約、少なくとも約、又は多くとも約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、又は5×1010個の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を投与することができる。他の実施態様において、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を、そのような個体に、細胞の数を単位として投与することができ、例えば、該個体に、該個体1キログラム当たり、約、少なくとも約、又は多くとも約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、又は5×1010個の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を投与することができる。胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞を、そのような個体に、該個体における胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞とのおおよその比に従って投与することができる。例えば、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、該個体に、該個体における腫瘍細胞の数に対して約、少なくとも約、又は多くとも約1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、又は100:1の比で投与することができる。そのような個体における腫瘍細胞の数は、例えば、該個体由来の組織の試料、例えば、血液試料、生検などにおける腫瘍細胞の数を計数することによって推定することができる。具体的な実施態様において、例えば、固形腫瘍について、該計数することは、おおよその腫瘍体積を得るために、腫瘍(単数又は複数)のイメージングと組み合わせて行われる。
さらに本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の組合せを用いて、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法である。様々な実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞(単数又は複数)を、複数の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はPINK細胞が補充された胎盤灌流液;胎盤灌流液又は複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞もしくはPINK細胞が補充された胎盤灌流液細胞;胎盤灌流液及び胎盤灌流液細胞が補充されたPINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞、複数のPINK細胞及び/又は複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞;複数の組み合わされたナチュラルキラー細胞及び複数の胎盤灌流液細胞;組み合わされたナチュラルキラー細胞が補充された胎盤灌流液;或いは胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及びPINK細胞の全ての組合せと接触させることを含む、方法である。
具体的な一実施態様において、例えば、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、複数の胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は複数の胎盤中間ナチュラルキラー細胞が補充された胎盤灌流液によって抑制される。具体的な実施態様において、例えば、胎盤灌流液の各ミリリットルに、約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106個、又はそれより多くの胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞を補充する。他の具体的な実施態様において、胎盤灌流液、例えば、1ユニット(すなわち、単一の胎盤からの回収物)、又は約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの灌流液に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くのPINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは胎盤灌流液細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くのPINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくは胎盤灌流液細胞を補充する。
別の具体的な実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又は胎盤中間ナチュラルキラー細胞が補充された複数の胎盤灌流液細胞によって抑制される。より具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞に、1ミリリットル当たり約もしくは少なくとも約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くのPINK細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くのPINK細胞もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。他のより具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞、PINK細胞、及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞に、約もしくは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの灌流液、又は約1ユニットの灌流液を補充する。
別の具体的な実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞が補充された複数の胎盤中間ナチュラルキラー細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞によって抑制される。より具体的な実施態様において、約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤中間ナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くのPINK細胞に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞を補充する。他のより具体的な実施態様において、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの胎盤灌流液細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの胎盤中間ナチュラルキラー細胞及び/もしくは組み合わされたナチュラルキラー細胞に、約もしくは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000mLの灌流液、又は約1ユニットの灌流液を補充する。
別の実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、該腫瘍細胞(単数又は複数)を、接着性胎盤幹細胞が補充された胎盤灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、及び/又は組み合わされたナチュラルキラー細胞と接触させることによって抑制される。具体的な実施態様において、該胎盤灌流液、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はPINK細胞に、1ミリリットル当たり約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個、もしくはそれより多くの接着性胎盤幹細胞、又は1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、もしくはそれより多くの接着性胎盤幹細胞を補充する。
別の実施態様において、腫瘍細胞又は複数の腫瘍細胞の増殖は、該腫瘍細胞(単数又は複数)を、接着性胎盤幹細胞馴化培地、例えば、1ユニットの灌流液、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/もしくはPINK細胞当たり、又は104、105、106、107、108、109、もしくは1010個の細胞当たり、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mLの幹細胞馴化培養培地が補充された胎盤灌流液、灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、及び/又はPINK細胞と接触させることによって抑制される。
他の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにそれらを含む組合せ及びプールは、最初に得られた状態で、すなわち、灌流液は、灌流の間に得られた状態で、胎盤灌流液細胞は、そのような灌流液から単離された状態で、組み合わされたナチュラルキラー細胞は、そのような灌流液及びマッチした臍帯血から単離された状態で、又はPINK細胞は、そのような灌流液もしくはそのような胎盤灌流液細胞から単離された状態で使用される。他の実施態様において、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにそれらの組合せ及びプールは、使用前に処理される。例えば、胎盤灌流液を、胎盤から回収された状態の、その未加工、未処理の形態で使用することができる。胎盤灌流液を、例えば、1以上のタイプの細胞のネガティブ選択、脱水による体積の減少;凍結乾燥及び再水和などによって、使用前に処理することもできる。同様に、灌流液細胞の集団を、胎盤灌流液から最初に単離された状態、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞として使用することができ、又は例えば、1以上の細胞型(例えば、赤血球)を除去するために処理することができる。PINK細胞を、例えば、CD56マイクロビーズを用いて胎盤灌流液から最初に単離された状態で使用することができ、又は例えば、1以上の非キラー細胞型を除去するために処理することができる。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞(単数又は複数)の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞(単数又は複数)を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せと接触させることを含む、方法であり、ここで、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せは、該接触させることの前に一定期間、インターロイキン-2(IL-2)と接触させたものである。ある実施態様において、該一定期間は、該接触させることの前の約、少なくとも、又は多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、又は48である。
灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらのプール及び/もしくは組合せは、癌を有する個体又は腫瘍細胞を有する個体に対して、抗癌療法の期間中に1回投与することができるか、或いは治療期間中、複数回、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23時間毎に1回、又は1、2、3、4、5、6、もしくは7日毎に1回、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週、もしくはそれより長い週毎に1回投与することができる。灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、並びにそれらのプール及び/又は組合せは、該灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらのプール及び/又は組合せが、癌を有する人又は腫瘍細胞を有する人に対して過去に投与されたかどうかとは無関係に投与することができる。したがって、本明細書に提供される方法は、癌を有する人又は腫瘍細胞を有する人への、胎盤灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらを含むプール及び/又は組合せのいずれかの組合せの投与を包含する。
具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、血液癌細胞である。様々な具体的な実施態様において、該腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽腫細胞、結腸直腸癌細胞、又は結腸直腸腺癌細胞である。
胎盤灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらを含むプール及び/又は組合せは、1以上の他の抗癌剤を含む抗癌療法レジメンの一部であることができる。そのような抗癌剤は、当技術分野で周知である。灌流液、灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、それらのプール及び/又は組合せに加えて、癌を有する個体に投与することができる具体的な抗癌剤としては、限定されないが:アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン;酢酸アメタントロン;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ;アゾトマイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ジメシル酸ビスナフィド;ビゼレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;セレコキシブ(COX-2阻害剤);クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;メシル酸クリスナトール;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;メシル酸デザグアニン;ジアジコン;ドセタキセル;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;クエン酸ドロロキシフェン;プロピオン酸ドロモスタノロン;デュアゾマイシン;エダトレキセート;塩酸エフロミチン;エルサミトルシン;エンロプラチン;エンプロメート;エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール;塩酸エソルビシン;エストラムスチン;リン酸エストラムスチンナトリウム;エタニダゾール;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン;塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;フルロシタビン;ホスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;ヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシン;イプロプラチン;イリノテカン;塩酸イリノテカン;酢酸ランレオチド;レトロゾール;酢酸ロイプロリド;塩酸リアロゾール;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;メイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;酢酸メレンゲストロール;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;マイトカルシン;マイトクロミン;マイトギリン;マイトマルシン;マイトマイシン;マイトスペル;ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン;ペンタムスチン;硫酸ペプロマイシン;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リボプリン;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルホセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム;タキソテール;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン;リン酸トリシリビン;トリメトレキセート;グルクロン酸トリメトレキセート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;硫酸ビンブラスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン;硫酸ビングリシネート;硫酸ビンロイロシン;酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;及び塩酸ゾルビシンが挙げられる。
他の抗癌薬としては、限定されないが: 20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3; 5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン; ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス;アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラフォリド;血管形成阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリクス;抗背方化形態形成タンパク質-1;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィジコリングリシネート;アポトーシス遺伝子調節物質;アポトーシス調節因子;アプリン酸; ara-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット; BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体;β-アレチン;βクラマイシンB;ベツリン酸; bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテンA;ビゼレシン;ブレフレート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール; CaRest M3; CARN700;軟骨由来阻害剤;カルゼレシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン;クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クラムベスシジン816;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;クラシンA;シクロペンタントラキノン;シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホスフェート;細胞溶解因子;サイトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデンミンB;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド;デクスラゾキサン;デクスベラパミル;ジアジコン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール、9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドキソルビシン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフル;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;リン酸エトポシド;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン;フォルフェニメックス;フォルメスタン;フォストリエシン;フォテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イマチニブ(例えば、GLEEVEC(登録商標))、イミキモド;免疫刺激性ペプチド;インスリン様成長因子-1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール、4-;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;ラメラリン-Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトルスタチン;レトロゾール;白血病阻害因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン;リュープロレリン;レバミソール;リアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;脂溶性二糖ペプチド;脂溶性白金化合物;リッソクリナミド7;ロバプラチン;ロンブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロキソリビン;ルルトテカン;ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン;溶解性ペプチド;マイタンシン;マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド; MIF阻害剤;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;マイトグアゾン;マイトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド;マイトトキシン線維芽細胞成長因子-サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム; Erbitux;ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン;モノホスホリル脂質A＋ミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモール;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン; N-アセチルジナリン; N-置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチップ;ナロキソン＋ペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素調節物質;窒素酸化物酸化防止剤;ニトルリン;オブリメルセン(GENASENSE(登録商標)); O6-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導因子;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサンポリ硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;酢酸フェニル;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲン活性化因子阻害剤;白金錯体;白金化合物;白金トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;プロテインAに基づく免疫調節物質;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク質キナーゼC阻害剤、微細藻類性;タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン抱合体; rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン; rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤; ras阻害剤; ras-GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン;レニウムRe 186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム; RIIレチナミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメックス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン; SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム; Sdi 1模倣剤;セムスチン;老化誘導阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シゾフィラン;ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテイト;酢酸フェニルナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフィノシン;超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポイエチン;トロンボポイエチン模倣剤;チマルファシン;チモポイエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チルホスチン; UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベラレソール;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、移植片対宿主病(GVHD)を有するか、又は該疾患の症状を経験しているか、又は該疾患を発症するリスクのある個体、例えば、移植レシピエント又は移植を受けることになる個体を治療する方法であって、該個体に、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せの治療有効量を投与することを含む、方法であり、ここで、該胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、PINK細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、又はそれらを含むプールもしくは組合せは、該接触させることの前に一定期間、インターロイキン-2(IL-2)と接触させたものであり、該治療有効量は、GVHDの1以上の症状の検出可能な改善をもたらすのに十分な、又はGVHDの1以上の症状の発症を検出可能な程度に低下させるのに十分な量である。ある実施態様において、該一定期間は、該接触させることの前の約、少なくとも、又は多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、又は48である。
(5.8.免疫調節化合物によるナチュラルキラー細胞の処理)
本明細書中の別所に記載されている、単離されたナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞を、免疫調節化合物で処理して、例えば、免疫調節化合物と接触させて、該細胞の抗腫瘍活性を増強することができる。したがって、本明細書に提供されるのは、腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増大させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞が、免疫調節化合物と接触させていないナチュラルキラー細胞と比較して、腫瘍細胞に対する増大した細胞傷害性を示すのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞におけるグランザイムBの発現を増加させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞が、免疫調節化合物と接触させていないナチュラルキラー細胞と比較して、増加したグランザイムBの発現を示すのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。免疫調節化合物は、下記の任意の化合物、例えば、レナリドミド又はポマリドミドであることができる。
また本明細書に提供されるのは、複数の腫瘍細胞に対する、ナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞の集団の細胞傷害性を増大させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞の集団が、免疫調節化合物と接触させていない同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、該複数の腫瘍細胞に対する検出可能な程度に増大した細胞傷害性を示すのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、ナチュラルキラー細胞の集団におけるグランザイムBの発現を増加させる方法であって、該ナチュラルキラー細胞の集団が、免疫調節化合物と接触させていない同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、検出可能な程度に増大した量のグランザイムBを発現するのに十分な時間及び濃度で、該ナチュラルキラー細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。具体的な実施態様において、該ナチュラルキラー細胞の集団は、胎盤灌流液細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞に含まれる。
上記の実施態様の具体的な実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、CD56+、CD16-胎盤中間ナチュラルキラー細胞(PINK細胞)である。上記の実施態様の別の具体的な実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、組み合わされたナチュラルキラー細胞、すなわち、マッチした胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞である。
別の具体的な実施態様において、該免疫調節化合物と接触させた、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞又は組み合わされたナチュラルキラー細胞は、BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA、又はTNFRSF18のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。別の具体的な実施態様において、該免疫調節化合物と接触させた、該複数のナチュラルキラー細胞、例えば、PINK細胞は、ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、及びTBX21のうちの1つ又は複数を、該免疫調節化合物と接触させていない同等数の該ナチュラルキラー細胞よりも高いレベルで発現する。
また本明細書に提供されるのは、複数の腫瘍細胞に対する、ヒト胎盤灌流液細胞の集団、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞の細胞傷害性を増大させる方法であって、該胎盤灌流液細胞が、免疫調節化合物と接触させていない同等数の胎盤灌流液細胞と比較して、該複数の腫瘍細胞に対する検出可能な程度に増大した細胞傷害性を示すのに十分な時間及び濃度で、胎盤灌流液細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、胎盤灌流液細胞の集団におけるグランザイムBの発現を増加させる方法であって、該胎盤灌流液細胞の集団が、免疫調節化合物と接触させていない同等数の胎盤灌流液細胞と比較して、検出可能な程度に増大した量のグランザイムBを発現するのに十分な時間及び濃度で、該胎盤灌流液細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む、方法である。
免疫調節化合物は、市販で購入することができるか、又はその全てが引用により組み込まれる本明細書に言及される特許もしくは特許公開に記載の方法に従って調製することができる。さらに、光学的に純粋な組成物は、不斉合成するか、又は既知の分割剤もしくはキラルカラム及び他の標準的な合成有機化学技術を用いて分割することができる。免疫調節化合物は、ラセミ化合物、ステレオマー的に濃縮されたもの、又はステレオマー的に純粋なものであることができ、かつその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及びプロドラッグを包含することができる。
本明細書で使用されるように、及び別途示されない限り、「免疫調節化合物」という用語は、TNF-α、LPS誘導性単球IL-1β及びIL-12を顕著に阻害し、IL-6産生を部分的に阻害する小有機分子を包含する。具体的な例において、免疫調節化合物は、レナリドミド、ポマリドミド、又はサリドマイドである。
免疫調節化合物の具体的な例としては、限定されないが、置換スチレンのシアノ及びカルボキシ誘導体、例えば、米国特許第5,929,117号に開示されているもの; 1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えば、米国特許第5,874,448号及び第5,955,476号に記載されているもの;米国特許第5,798,368号に記載されているテトラ置換2-(2,6-ジオキソピペルジン(dioxopiperdin)-3-イル)-1-オキソイソインドリン; 1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリン(例えば、サリドマイドの4-メチル誘導体)、これには、限定されないが、米国特許第5,635,517号、第6,476,052号、第6,555,554号、及び第6,403,613号に開示されているものが含まれる;米国特許第6,380,239号に記載されている、インドリン環の4-位又は5-位で置換された1-オキソ及び1,3-ジオキソイソインドリン(例えば、4-(4-アミノ-1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)-4-カルバモイルブタン酸);米国特許第6,458,810号に記載されている、2-位で2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルと置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-1,3-ジオン(例えば、2-(2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシ-5-フルオロピペリジン-5-イル)-4-アミノイソインドリン-1-オン);米国特許第5,698,579号及び第5,877,200号に開示されているあるクラスの非ポリペプチド環状アミド;アミノサリドマイド、並びにアミノサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝体、誘導体、及び前駆体、並びに置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドール、例えば、米国特許第6,281,230号及び第6,316,471号に記載されているもの;並びにイソインドール-イミド化合物、例えば、米国特許公報第2003/0045552 A1号、米国特許第7,091,353号、及びWO 02/059106号に記載されているものが挙げられる。本明細書で特定されている特許及び特許出願の各々の全体が引用により本明細書中に組み込まれている。免疫調節化合物に、サリドマイドは含まれない。
ある実施態様において、免疫調節化合物は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許第5,635,517号に記載されているような、ベンゾ環中でアミノと置換された1-オキソ-及び1,3 ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンである。これらの化合物は、構造I:
Figure 2016506968
 を有し、ここで、X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり、R2は、水素又は低級アルキル、特にメチルである。具体的な免疫調節化合物としては:
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-6-アミノイソインドリン;
1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-7-アミノイソインドリン;
1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-アミノイソインドリン;及び
1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-5-アミノイソインドリン
が挙げられるが、これらに限定されない。
他の具体的な免疫調節化合物は、置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)フタルイミド及び置換2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-1-オキソイソインドール、例えば、その各々が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,281,230号;第6,316,471号;第6,335,349号;及び第6,476,052号、並びにWO 98/03502号に記載されているものの1つのクラスに属する。代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のうちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、又は炭素原子1〜8個のアルキルであり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンジル、又はハロであり;
但し、X及びYがC=Oである場合、R6は水素以外のものであり、かつ(i)R1、R2、R3、及びR4の各々はフルオロであるか、又は(ii)R1、R2、R3、もしくはR4のうちの1つはアミノである。このクラスの代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、R1は、水素又はメチルである。独立した実施態様において、包含されるのは、これらの化合物のエナンチオマー的に純粋な形態(例えば、光学的に純粋な(R)又は(S)エナンチオマー)の使用である。
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、その各々が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開US 2003/0096841号及びUS 2003/0045552号、並びにWO 02/059106号に開示されているイソインドール-イミドの1つのクラスに属する。代表的な化合物は、式IIのもの、並びにその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、及び立体異性体の混合物であり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、もう一方は、CH2又はC=Oであり;
R1は、H、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3 、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'、又は(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり;
R2は、H、F、ベンジル、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、又は(C2-C8)アルキニルであり;
R3及びR3'は、独立に、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり;
R4は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、(C1-C4)アルキル-OR5、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、又は(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリールであり;
R5は、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、又は(C2-C5)ヘテロアリールであり;
各々の出現するR6は、独立に、H、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C2-C5)ヘテロアリール、もしくは(C0-C8)アルキル-C(O)O-R5であるか、又は該R6基は結合して、ヘテロシクロアルキル基を形成し;
nは、0又は1であり;かつ
*は、キラル炭素中心を表す。
式IIの具体的な化合物において、nが0であるとき、R1は、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、C(O)R3、C(O)OR4、(C1-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、C(S)NHR3、又は(C1-C8)アルキル-O(CO)R5であり;
R2は、H又は(C1-C8)アルキルであり;かつ
R3は、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C5-C8)アルキル-N(R6)2;(C0-C8)アルキル-NH-C(O)O-R5;(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、又はC(O)OR5であり;かつ他の変数は、同じ定義を有する。
式IIの他の具体的な化合物において、R2は、H又は(C1-C4)アルキルである。
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、(C1-C8)アルキル又はベンジルである。
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、H、(C1-C8)アルキル、ベンジル、CH2OCH3、CH2CH2OCH3、又は
Figure 2016506968
 である。
式IIの化合物の別の実施態様において、R1は、
Figure 2016506968
 であり、ここで、Qは、O又はSであり、かつ各々の出現するR7は、独立に、H、(C1-C8)アルキル、(C3-C7)シクロアルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、ベンジル、アリール、ハロゲン、(C0-C4)アルキル-(C1-C6)ヘテロシクロアルキル、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C0-C8)アルキル-N(R6)2、(C1-C8)アルキル-OR5、(C1-C8)アルキル-C(O)OR5、(C1-C8)アルキル-O(CO)R5、もしくはC(O)OR5であるか、又は隣接して出現するR7は一緒になって、二環式アルキルもしくはアリール環を形成することができる。
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、C(O)R3である。
式IIの他の具体的な化合物において、R3は、(C0-C4)アルキル-(C2-C5)ヘテロアリール、(C1-C8)アルキル、アリール、又は(C0-C4)アルキル-OR5である。
式IIの他の具体的な化合物において、ヘテロアリールは、ピリジル、フリル、又はチエニルである。
式IIの他の具体的な化合物において、R1は、C(O)OR4である。
式IIの他の具体的な化合物において、C(O)NHC(O)のHは、(C1-C4)アルキル、アリール、又はベンジルと置換することができる。
このクラスの化合物のさらなる例としては、限定されないが:[2-(2,6-ジオキソ-ピペリジン-3-イル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イルメチル]-アミド;(2-(2,6-ジオキソ-ピペリジン-3-イル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イルメチル)-カルバミン酸 tert-ブチルエステル; 4-(アミノメチル)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン; N-(2-(2,6-ジオキソ-ピペリジン-3-イル)-1,3-ジオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-4-イルメチル)-アセトアミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル)-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}シクロプロピル-カルボキサミド; 2-クロロ-N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}アセトアミド; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)-3-ピリジルカルボキサミド; 3-{1-オキソ-4-(ベンジルアミノ)イソインドリン-2-イル}ピペリジン-2,6-ジオン; 2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-4-(ベンジルアミノ)イソインドリン-1,3-ジオン; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}プロパンアミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}-3-ピリジルカルボキサミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}ヘプタンアミド; N-{(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)メチル}-2-フリルカルボキサミド;{N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)カルバモイル}メチルアセタート; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)ペンタンアミド; N-(2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル)-2-チエニルカルボキサミド; N-{[2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル]メチル}(ブチルアミノ)カルボキサミド; N-{[2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル]メチル}(オクチルアミノ)カルボキサミド;及びN-{[2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-1,3-ジオキソイソインドリン-4-イル]メチル}(ベンジルアミノ)カルボキサミドが挙げられる。
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、その各々が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許出願公開第2002/0045643号、国際公開WO 98/54170号、及び米国特許第6,395,754号に開示されているイソインドール-イミドの1つのクラスに属する。代表的な化合物は、式IIIのもの、並びにその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、包摂化合物、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、及び立体異性体の混合物であり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、もう一方は、CH2又はC=Oであり;
Rは、H又はCH2OCOR'であり;
(i)R1、R2、R3、もしくはR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、もしくはR4のうちの1つは、ニトロもしくは-NHR5であり、R1、R2、R3、もしくはR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであり、
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R'は、R7-CHR10-N(R8R9)であり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値を有する)であり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、もしくは-NH-である)であり;
R10は、水素、炭素原子8個のアルキル、又はフェニルであり;かつ
*は、キラル炭素中心を表す。
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、もしくはR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のうちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、又は炭素原子1〜8個のアルキルであり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン又はp-フェニレン又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値を有する)であり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、もしくは-NH-である)であり;
R10は、水素、炭素原子8個のアルキル、又はフェニルである。
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のうちの1つは、ニトロもしくは保護アミノであり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;かつ
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである。
他の代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
(i)R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、もしくは炭素原子1〜4個のアルコキシであるか、又は(ii)R1、R2、R3、及びR4のうちの1つは-NHR5であり、R1、R2、R3、及びR4のうちの残りは水素であり;
R5は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はCO-R7-CH(R10)NR8R9(ここで、R7、R8、R9、及びR10の各々は、本明細書に定義されている通りである)であり;かつ
R6は、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロである。
該化合物の具体的な例は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中:
X及びYのうちの一方はC=Oであり、X及びYのうちのもう一方は、C=O又はCH2であり;
R6は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、ベンジル、クロロ、又はフルオロであり;
R7は、m-フェニレン、p-フェニレン、又は-(CnH2n)-(ここで、nは、0〜4の値である)であり;
R8及びR9の各々は、もう一方とは独立に、水素又は炭素原子1〜8個のアルキルであるか、或いは一緒になったR8及びR9は、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又は-CH2CH2X1CH2CH2-(ここで、X1は、-O-、-S-、又は-NH-である)であり;かつ
R10は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はフェニルである。
最も好ましい免疫調節化合物は、4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオン及び3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンである。該化合物は、標準的な合成法によって得ることができる(例えば、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,635,517号を参照されたい)。該化合物は、Celgene Corporation, Warren, NJから入手可能である。4-(アミノ)-2-(2,6-ジオキソ(3-ピペリジル))-イソインドリン-1,3-ジオンは、以下の化学構造を有する:
Figure 2016506968
 。
化合物3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンは、以下の化学構造を有する:
Figure 2016506968
 。
別の実施態様において、具体的な免疫調節化合物は、引用により本明細書中に組み込まれる米国公開US 2005/0096351 A1号に開示されている、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの多形形態、例えば、形態A、B、C、D、E、F、G、及びHを包含する。例えば、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Aは、非水性溶媒系から得ることができる非溶媒和結晶物質である。形態Aは、約8、14.5、16、17.5、20.5、24、及び26度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約270℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Aは、弱吸湿性又は非吸湿性であり、これまでに発見された3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリジン-2,6-ジオンのうちの最も熱力学的に安定な無水多形であるように思われる。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Bは、限定されないが、ヘキサン、トルエン、及び水を含む、様々な溶媒系から得ることができる半水和結晶物質である。形態Bは、約16、18、22、及び27度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、DSC曲線から約146及び268℃の吸熱を有し、これは、ホットステージ顕微鏡実験により、脱水及び融解と同定される。相互変換研究は、形態Bが水性溶媒系で形態Eに変換し、アセトン及び他の無水系で他の形態に変換することを示している。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Cは、限定されないが、アセトンなどの溶媒から得ることができる半溶媒和結晶物質である。形態Cは、約15.5及び25度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Cは、約85％未満のRHでは吸湿性ではないが、より高い相対湿度で形態Bに変換することができる。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Dは、アセトニトリルと水の混合物から調製される結晶性溶媒和多形である。形態Dは、約27及び28度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約270℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Dは、弱吸湿性又は非吸湿性のどちらかであるが、通常、より高い相対湿度で圧力を加えたときに形態Bに変換する。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Eは、3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンを水中でスラリー化することによって、及びアセトン:水の比が約9:1の溶媒系における3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの低速蒸発によって得ることができる二水和結晶物質である。形態Eは、約20、24.5、及び29度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。形態Eは、アセトン溶媒系で形態Cに、及びTHF溶媒系で形態Gに変換することができる。水性溶媒系において、形態Eは、最も安定な形態であるように思われる。形態Eに対して行われた脱溶媒和実験は、約125℃で約5分間加熱したとき、形態Eが形態Bに変換することができることを示している。175℃で約5分間加熱したとき、形態Bは、形態Fに変換することができる。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Fは、形態Eの脱水によって得ることができる非溶媒和結晶物質である。形態Fは、約19、19.5、及び25度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Gは、形態B及びEを、限定されないが、テトラヒドロフラン(THF)などの溶媒中でスラリー化することによって得ることができる非溶媒和結晶物質である。形態Gは、約21、23、及び24.5度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約267℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。
3-(4-アミノ-1-オキソ-1,3ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-ピペリデン-2,6-ジオンの形態Hは、形態Eを0％相対湿度に暴露させることによって得ることができる部分水和(約0.25モル)結晶物質である。形態Hは、約15、26、及び31度の2θに顕著なピークを含むX線粉末回折パターンを有し、約269℃の示差走査熱量測定融点最大値を有する。
本明細書に提供される方法において使用可能な他の具体的な免疫調節化合物としては、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3イル)イソインドリン及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソ-3-フルオロピペリジン-3-イル)イソインドリン、例えば、その各々が引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,874,448号及び第5,955,476号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、Yは、酸素又はH2であり、かつ
R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、又はアミノである。
本明細書に提供される方法において使用可能な他の具体的な免疫調節化合物としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,798,368号に記載されているテトラ置換2-(2,6-ジオキソピペルジン(dioxopiperdin)-3-イル)-1-オキソイソインドリンが挙げられるが、これに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、R1、R2、R3、及びR4の各々は、他のものとは独立に、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、又は炭素原子1〜4個のアルコキシである。
本明細書に提供される方法において使用することができる他の具体的な免疫調節化合物としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第6,403,613号に開示されている1-オキソ及び1,3-ジオキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)イソインドリンが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、
Yは、酸素又はH2であり、
R1及びR2の第一のものは、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり、R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独立に、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、アルキル、又はベンジルである。
該化合物の具体的な例は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、R1及びR2の第一のものは、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シアノ、又はカルバモイルであり、
R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、アルキルアミノ(ここで、アルキルは、炭素原子が1〜4個である)、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シアノ、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、炭素原子1〜4個のアルキル、又はベンジルである。具体的な例としては、1-オキソ-2-(2,6-ジオキソピペリジン-3-イル)-4-メチルイソインドリンが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書に提供される方法において使用することができる他の化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、R1及びR2の第一のものは、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シアノ、又はカルバモイルであり、
R1及びR2の第二のものは、第一のものとは独立に、水素、ハロ、炭素原子1〜4個のアルキル、炭素原子1〜4個のアルコキシ、アルキルアミノ(ここで、アルキルは、炭素原子が1〜4個である)、ジアルキルアミノ(ここで、各々のアルキルは、炭素原子が1〜4個である)、シアノ、又はカルバモイルであり、かつ
R3は、水素、炭素原子1〜4個のアルキル、又はベンジルである。
本明細書に提供される方法において使用することができる他の具体的な免疫調節化合物としては、引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,380,239号及び米国出願公開第2006/0084815号に記載されている、インドリン環の4-位又は5-位で置換された1-オキソ及び1,3-ジオキソイソインドリンが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な化合物は、次式のもの;及びその塩であり:
Figure 2016506968
 式中、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成し(nが0ではなく、R1がR2と同じではない場合); X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル、又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、水素、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又はハロアルキルであり; Zは、水素、アリール、炭素1〜6個のアルキル、ホルミル、又は炭素1〜6個のアシルであり;かつnは、0、1、又は2の値を有し;但し、X1がアミノであり、nが1又は2である場合、R1とR2の両方がヒドロキシであることはない。
本明細書に提供される方法において使用することができるさらなる化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、C*と表記された炭素原子は、nが0ではなく、R1がR2ではない場合、キラリティの中心を構成し; X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル、又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり; Zは、水素、アリール、又は炭素1〜6個のアルキルもしくはアシルであり;かつnは、0、1、又は2の値を有する。
本明細書に提供される方法において使用することができる化合物の具体的な例としては、それぞれ、以下の構造を有する、2-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-4-カルバモイル-酪酸及び4-(4-アミノ-1-オキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-4-カバモイル(cabamoyl)-酪酸、並びにそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグ、及び立体異性体が挙げられるが、これらに限定されない:
Figure 2016506968
 。
他の代表的な化合物は、次式のもの;及びその塩であり:
Figure 2016506968
 式中、C*と表記された炭素原子は、nが0ではなく、R1がR2ではない場合、キラリティの中心を構成し; X1及びX2のうちの一方は、アミノ、ニトロ、炭素1〜6個のアルキル、又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり; R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり; R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり; Zは、水素、アリール、又は炭素1〜6個のアルキルもしくはアシルであり;かつnは、0、1、又は2の値を有する。
具体的な例としては、それぞれ、以下の構造を有する、4-カルバモイル-4-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-酪酸、4-カルバモイル-2-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-酪酸、2-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-4-フェニルカルバモイル-酪酸、及び2-{4-[(フラン-2-イル-メチル)-アミノ]-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル}-ペンタン二酸、並びにそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、プロドラッグ、及び立体異性体が挙げられるが、これらに限定されない:
Figure 2016506968
 。
該化合物の他の具体的な例は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、X1及びX2のうちの一方は、ニトロ又はNH-Zであり、X1又はX2のうちのもう一方は、水素であり;
R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、炭素1〜6個のアシル、又は炭素1〜6個のアルキルであり;かつ
nは、0、1、又は2の値を有し;
但し、X1及びX2のうちの一方がニトロであり、nが、1又は2である場合、R1及びR2は、ヒドロキシ以外のものであり;かつ
-COR2及び-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成する。他の代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中、X1及びX2のうちの一方は、炭素1〜6個のアルキルであり;
R1及びR2の各々は、もう一方とは独立に、ヒドロキシ又はNH-Zであり;
R3は、炭素1〜6個のアルキル、ハロ、又は水素であり;
Zは、水素、フェニル、炭素1〜6個のアシル、又は炭素1〜6個のアルキルであり;かつ
nは、0、1、又は2の値を有し;かつ
-COR2及び-(CH2)nCOR1が異なる場合、C*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成する。
さらに他の具体的な免疫調節化合物としては、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第6,458,810号に記載されている、2-位で2,6-ジオキソ-3-ヒドロキシピペリジン-5-イルにより置換されたイソインドリン-1-オン及びイソインドリン-1,3-ジオンが挙げられるが、これに限定されない。代表的な化合物は、次式のものであり:
Figure 2016506968
 式中:
*と表記された炭素原子は、キラリティの中心を構成し;
Xは、-C(O)-又は-CH2-であり;
R1は、炭素原子1〜8個のアルキル又は-NHR3であり;
R2は、水素、炭素原子1〜8個のアルキル、又はハロゲンであり;かつ
R3は、水素、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、炭素原子1〜8個のアルキル、
炭素原子3〜18個のシクロアルキル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、フェニル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、ベンジル、或いは-COR4
であり、ここで、
R4は、水素、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、炭素原子1〜8個のアルキル、
炭素原子3〜18個のシクロアルキル、
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、フェニル、或いは
置換されていない、又は炭素原子1〜8個のアルキル、炭素原子1〜8個のアルコキシ、ハロ、アミノ、もしくは炭素原子1〜4個のアルキルアミノで置換されている、ベンジル
である。
本明細書に提供される化合物は、市販で購入することができるか、又は本明細書に開示される特許もしくは特許公開に記載の方法に従って調製することができる。さらに、光学的に純粋な化合物は、不斉合成するか、又は既知の分割剤もしくはキラルカラム及び他の標準的な合成有機化学技術を用いて分割することができる。
様々な免疫調節化合物は1以上のキラル中心を含有し、エナンチオマーのラセミ混合物又はジアステレオマーの混合物として存在することができる。包含されるのは、そのような化合物のステレオマー的に純粋な形態の使用及びそれらの形態の混合物の使用である。例えば、特定の免疫調節化合物の等量又は不等量のエナンチオマーを含む混合物を、本明細書に提供される方法及び組成物において使用することができる。これらの異性体は、不斉合成するか、又はキラルカラムもしくはキラル分割剤などの標準的な技術を用いて分割することができる。例えば、Jacques, J.らの文献、エナンチオマー、ラセミ化合物、及び分割(Enantiomers, Racemates and Resolutions)(Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H.らの文献、Tetrahedron 33:2725(1977); Eliel, E. L.の文献、炭素化合物の立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds)(McGraw-Hill, NY, 1962);及びWilen, S. H.の文献、分割剤及び光学分割の表(Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions)、268頁(E.L. Eliel編、Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, 1972年)を参照されたい。
図示された構造とその構造に与えられている名称に矛盾がある場合、図示された構造により重きが置かれるということに留意すべきである。さらに、構造又は構造の一部の立体化学が、例えば、太線又は破線で示されていない場合、該構造又は該構造の一部は、その全ての立体異性体を包含するものと解釈すべきである。
(5.9. PINK細胞、ヒト胎盤灌流液、又は組み合わされたナチュラルキラー細胞の投与)
PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、そのような細胞を含む細胞集団、又はこれらの組合せは、生細胞の投与に好適な当技術分野で公知の任意の医学的に許容し得る経路によって、個体、例えば、腫瘍細胞を有する個体、例えば、癌患者に投与することができる。様々な実施態様において、本明細書に提供される細胞は、例えば、カテーテルもしくはシリンジによって、外科的に移植し、注射し、注入するか、又は別の方法で、修復もしくは強化を必要とする部位に、直接的もしくは間接的に投与することができる。一実施態様において、該細胞は、静脈内から個体に投与される。別の実施態様において、該細胞は、腫瘍、例えば、固形腫瘍の部位で、個体に投与される。個体が複数の部位に腫瘍を有する具体的な実施態様において、該細胞は、少なくとも2つ又は全ての腫瘍部位に投与される。ある他の実施態様において、本明細書に提供される細胞、又は該細胞を含む組成物は、経口、経鼻、動脈内、非経口、眼内(ophthalmically)、筋肉内、皮下、腹腔内、大脳内、脳室内(intraventricularly)、脳室内(intracerebroventricularly)、髄腔内、嚢内、脊髄内、及び/又は脊髄近傍に投与される。ある具体的な実施態様において、該細胞は、ポンプ装置を用いて又はポンプ装置なしで、頭蓋内又は脊椎内(intravertebral)用の針及び/又はカテーテルによって送達される。
PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、もしくはこれらの組合せ、又はそのような細胞を含む細胞集団は、該細胞を含む組成物、例えば、マトリックス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどに入れて、個体に投与することができる。
一実施態様において、本明細書に提供される細胞は、天然のマトリックス、例えば、胎盤生体材料、例えば、羊膜材料の上に播種される。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接切断された羊膜;固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわち、H2Oが20％未満の)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜などであることができる。胎盤幹細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示が引用により完全に本明細書中に組み込まれるHaririの米国出願公開第2004/0048796号に記載されている。
別の実施態様において、PINK細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、組み合わされたナチュラルキラー細胞、もしくはこれらの組合せ、又はそのような細胞を含む細胞集団を、例えば、注射に好適なヒドロゲル溶液に懸濁させる。そのような組成物のための好適なヒドロゲルとしては、RAD16などの自己集合性ペプチドが挙げられる。一実施態様において、該細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、細胞がその中に分散している移植用のマトリックスを形成させることができる。そのようなマトリックス中の細胞は、該細胞が移植の前に有糸分裂で増殖するように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合により架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成させる3次元開格子構造を生成させる有機ポリマー(天然又は合成)であることができる。ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、多糖、例えば、アルギネート及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はブロックポリマー、例えば、それぞれ、温度もしくはpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。いくつかの実施態様において、本発明のヒドロゲル又はマトリックスは生体分解性である。
本発明のいくつかの実施態様において、製剤は、インサイチュ重合可能なゲルを含む(例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号; Ansethらの文献、J. Control Release, 78(1-3):199-209(2002); Wangらの文献、Biomaterials, 24(22):3969-80(2003)を参照されたい)。
いくつかの実施態様において、ポリマーは、荷電側基又はその一価イオン性塩を有する水性溶液、例えば、水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液に少なくとも部分的に可溶性である。陽イオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン酸化ポリマー、例えば、スルホン酸化ポリスチレンである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ化)アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
本発明の胎盤幹細胞又はその共培養物を3次元フレームワーク又はスキャフォールドの上に播種し、インビボに移植することができる。そのようなフレームワークは、任意の1以上の成長因子、細胞、薬物、或いは組織形成を刺激し、又は本発明の実施を別の形で強化もしくは改善する他の成分と組み合わせて移植することができる。
本発明において使用することができるスキャフォールドの例としては、不織布マット、多孔質フォーム、又は自己集合性ペプチドが挙げられる。不織布マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性コポリマー(例えば、PGA/PLA)(VICRYL, Ethicon社, Somerville, N.J.)から構成される繊維を用いて形成させることができる。例えば、フリーズドライ又は凍結乾燥などの処理によって形成されるポリ(ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)コポリマーから構成されるフォーム(例えば、米国特許第6,355,699号参照)をスキャフォールドとして使用することもできる。
本発明の胎盤幹細胞は、限定されないが、モノ-、ジ-、トリ-、α-トリ-、β-トリ-、及びテトラ-リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムリン酸カルシウム、生体活性ガラス、例えば、BIOGLASS(登録商標)、並びにこれらの混合物を含む、生理的に許容し得るセラミック材料の上に播種するか、又は該セラミック材料と接触させることもできる。現在市販されている多孔性生体適合性セラミック材料としては、SURGIBONE(登録商標)(CanMedica社, Canada)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France, France)、CEROS(登録商標)(Mathys, AG, Bettlach, Switzerland)、並びに石灰化コラーゲン骨移植用製品、例えば、HEALOS(商標)(DePuy社, Raynham, MA)、及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登録商標)(Orthovita, Malvern, Pa.)が挙げられる。フレームワークは、天然材料及び/又は合成材料の混合物、ブレンド、又は複合物であることができる。
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマーもしくはブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料でできたマルチフィラメント糸から構成されることができるフェルトの上に播種するか、又は該フェルトと接触させることができる。
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施態様において、複合構造であり得るフォームスキャフォールドの上に播種することができる。そのようなフォームスキャフォールドは、有用な形状、例えば、修復、置換、又は補強されるべき体内の特定の構造の部分の形状に成形することができる。いくつかの実施態様において、細胞の付着を増強するために、該フレームワークを、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後、ポリリジン、PBS、及び/又はコラーゲン中でインキュベートした後、本発明の細胞を接種する。マトリックスの外部表面を、例えば、マトリクスのプラズマコーティング、又は1以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など)、細胞マトリックス、及び/又は例えば、限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどの他の材料の付加によって修飾して、細胞の付着又は成長及び組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施態様において、該スキャフォールドは、それを非血液凝固性にする材料を含むか、又は該材料で処理される。これら処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリックス沈着を促進及び維持することもできる。これらの材料及び処理の例としては、天然材料、例えば、基底膜タンパク質、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲン、合成材料、例えば、EPTFE及びセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社, Berkeley, Calif.)が挙げられるが、これらに限定されない。該スキャフォールドは、抗血栓剤、例えば、ヘパリンを含むこともでき;該スキャフォールドを、表面の電荷を変化させる(例えば、プラズマをコーティングする)ように処理した後、胎盤幹細胞を播種することもできる。
(6.実施例)
(6.1.実施例1)
本実施例は、ヒト胎盤灌流液及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の単離、培養、及び特徴付けを示す。
(ナチュラルキラー細胞の単離)
ナチュラルキラー細胞を、CD56コンジュゲートマイクロビーズを用いて、8ユニットのヒト胎盤灌流液(HPP)から、及び4ユニットの臍帯血(UCB、本明細書では「CB」とも呼ばれる)から単離した。単離は、磁気ビーズ選択(Miltenyi Biotec)によって行った。分娩後胎盤を放血させ、約200〜約750mLの灌流溶液(0.9％NaCl注射溶液USP等級(Cat No. 68200-804, VWR)で灌流した。未処理の灌流液を回収し、赤血球を除去するように処理した。HPP又はUCB由来の単核細胞を蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファー(5％FBSを含む、フェノールレッド非含有RPMI 1640)で1回洗浄し、その後、1500rpmで6分間遠心分離した。細胞数を計数し、細胞ペレットを、20μLのCD3マイクロビーズ(カタログNo. 130-050-101, Miltenyi)とともに、107個の全細胞当たり80μLのバッファーに再懸濁させた。この系をよく混合し、4〜8℃で15分間インキュベートした。107個の全細胞当たり1〜2mLのバッファーを添加し、その後、該混合物を300gで10分間遠心分離した。上清をピペッティングして完全に除去した。細胞ペレットを最大108個の細胞になるよう500μLのバッファーに再懸濁させ、磁気分離用に調製した。LSカラム(Miltenyi Biotec)をMIDIMACS(商標)細胞分離装置(Miltenyi Biotec)の磁場に置き、3mLのバッファーを適用して、カラムをすすぎ、細胞/マイクロビーズ懸濁液をカラムに適用した。カラムを通過し、かつナチュラルキラー細胞を含む未標識のCD3-細胞を2×3mLの洗浄バッファーと一緒に回収した。CD3-細胞を計数し、1回洗浄し、その後、CD56マイクロビーズ(Cat#: 130-050-401, Miltenyi)で染色し、上記のCD3マイクロビーズ分離と同じプロトコルを用いて分離/単離した。CD56+CD3-集団をこのように回収し、さらなる解析の準備ができた。ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、HPPで3.52〜11.6(中央値6.04、平均値5.22)、UCBで1.06〜8.44(中央値: 3.42、平均値: 4.2)であった。HPP由来のナチュラルキラー細胞のCD56マイクロビーズ選択によって、約80％純粋な集団が生じた。図1を参照されたい。全CD56+、CD3-ナチュラルキラー細胞集団の中で、HPP由来のCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞(すなわち、PINK細胞)のパーセンテージ範囲は、56.6〜87.2(中央値74.2、平均値65.5)であり、UCB由来のCD56+、CD16-ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、53.7〜96.6(中央値72.8)であった。HPP由来のCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、12.8〜43.3(中央値25.8、平均値34.5)であり、UCB由来のCD56+、CD16+ナチュラルキラー細胞のパーセンテージ範囲は、3.4〜46.3(中央値27.3、平均値33.4)であった。
他の実験において、ナチュラルキラー細胞を、ヒト血液細胞上の細胞表面抗原(CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA-DR、グリコフォリンA)を標的とする磁気ネガティブ選択キットを用いて単離した。HPP及びUCB凍結保存ユニットを解凍し、解凍培地(RPMI培地1640(カタログ#22400, Gibco)＋20％熱非働化胎仔ウシ血清(カタログ#SH30070.03, Hyclone))で、1:1で希釈し、1500rpmで8分間遠心分離した。上清を除去し、塩化アンモニウム処理を適用して、赤血球をさらに除去し;各ユニットを約30mLの氷冷FACSバッファー(5％FBSを含むフェノールレッド非含有RPMI 1640)に再懸濁させ、その後、60mLの氷冷塩化アンモニウム(カタログ#07850, Stem Cell)を添加し、該溶液をボルテックス処理し、その後、氷上で5分間インキュベートした。その後、単核細胞をFACSバッファーで3回洗浄し、その後、1500rpmで8分間遠心分離した。細胞数を計数し、細胞ペレットを、5×107個の生細胞/mlで、RoboSepバッファー(カタログ#20104, Stem Cell)に再懸濁させ、さらに、0.1mg/mL DNAアーゼI溶液(カタログ#07900, Stem Cell)を該細胞懸濁液に添加し、ピペットで穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートした後、単離した。40μmメッシュナイロンストレイナー(カタログ#352340, BD Falcon)で濾過することによって、塊を該細胞懸濁液から除去した後、単離を進めた。単離は、EasySepネガティブ選択ヒトNK細胞濃縮カクテル及びEasySep磁気微粒子を含むヒトNK細胞濃縮キット(カタログ#19055, Stem Cell)を用いて、RoboSep(カタログ#20000, Stem Cell)装置及び「ヒトNKネガティブ選択19055及び高回収」プログラム(50μL/mLカクテル添加、100μL/mL微粒子添加、10分及び5分のインキュベーション、1×2.5分間の分離)により自動化される。CD56+CD3-集団をこのように回収し、さらなる解析の準備ができた。
(ナチュラルキラー細胞の増殖)
一般に、ナチュラルキラー細胞を次のように増殖させた。ナチュラルキラー細胞培養用の出発培地を、Ysselらの文献、J. Immunol. Methods 72(1):219-227(1984)及びLitwinらの文献、J. Exp. Med. 178(4):1321-1326(1993)に記載されているプロトコルの改変に基づいて調製した。簡潔に述べると、出発培地は、10％FCS(Hyclone)を含むIMDM(Invitrogen)を含み、これは、以下の最終濃度の試薬、35μg/mLのトランスフェリン(Sigma-Aldrich)、5μg/mLのインスリン(Sigma-Aldrich)、2×10-5Mのエタノールアミン(Sigma-Aldrich)、1μg/mLのオレイン酸(Sigma-Aldrich)、1μg/mLのリノール酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg/mLのパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mLのBSA(Sigma-Aldrich)、及び0.1μg/mLのフィトヘマグルチニン(PHA-P、Sigma-Aldrich)を含む。CD56+CD3- NK細胞を、細胞培養液で処理した24ウェルプレートもしくはT字フラスコ中、1mLの出発培地＋200U/mL IL-2(R&D Systems)当たり2.5×105個の生細胞で再懸濁させた。マイトマイシンC処理した同種異系PBMCとK562細胞(慢性骨髄性白血病細胞株)の両方を、フィーダー細胞として、1mL当たり1×106個の最終濃度になるよう出発培地に添加した。NK細胞を、37℃、5％CO2で、5〜6日間培養した。5〜6日後、及びその後は3〜4日毎に、等体積の維持培地(10％FCS、2％ヒトAB血清、抗生物質、L-グルタミン、及び1mL当たり400ユニットのIL-2を含むIMDM)を該培養物に添加した。NK細胞を21日目に回収した。
(胎盤及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の特徴付け)
ドナーがマッチしたHPP及びCBを解凍し、該細胞をFACSバッファー(5％FBSを含むRPMI-1640)で洗浄した。その後、ナチュラルキラー細胞を、製造業者によって指示される通りにROBOSEP(登録商標)磁気分離システム(StemCell Technologies)を用いて、CD56マイクロビーズで濃縮した。CD56濃縮ナチュラルキラー細胞集団を、免疫表現型特徴付け用の以下の抗体(別途示されない限り、BD Bioscience): PE-Cy-7にコンジュゲートした抗CD56、抗CD3 APC Cy7、抗CD16 FITC、抗NKG2D APC、抗NKp46 APC、抗CD94 PE(R&D)、抗NKB1 PE、及び抗KIR-NKAT2 PEで染色した。CD94、NKG2D、及びNKp46は、NK細胞前駆細胞で存在しない又は発現の低下を示すが、完全に分化したNK細胞上には存在するマーカーである。Freudらの文献、「インビボにおけるヒトナチュラルキラー細胞分化の不連続状態の証拠(Evidence for Discrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo)、 J. Exp. Med. 203(4):1033-1043(2006); Eagle及びTrowsdaleの文献、「非特異性及び単一受容体: NKG2D (Promiscuity and the Single Receptor: NKG2D)」、Nature Reviews Immunology 7, 737-744(2007); Walzerらの文献、「ナチュラルキラー細胞: CD3-NKp46+からポストゲノミクスメタアナリシスへ(Natural Killer Cells: From CD3-NKp46+ to Post-Genomics Meta-Analyses)」 Curr. Opinion Immunol. 19:365-372(2007)を参照されたい。表1に示すように、KIR3DL1、KIR2DL2/L3、NKG2D、並びにCD94(及びNKp46;データは示さない)の発現は、HPP由来の濃縮されたCD56+細胞集団と臍帯血(CB)由来のHLAがマッチしたCD56+細胞集団の間で有意差がなかった。
表1.特定のマーカー組合せを有するNK細胞のパーセンテージ。3つの試料の平均。
Figure 2016506968
(6.2.実施例2)
臍帯血及び胎盤灌流液(コンボ)のドナーがマッチした単核細胞を混合し、FACSバッファー(5％FBSを含むRPMI-1640)で1回洗浄し、表2に記載されている抗体を用いて、BD FACSCanto(BD Biosciences)で免疫表現型について特徴付けた。データをFlowJoソフトウェア(Tree Star)により解析した。
表2:免疫表現型特徴付けで使用された抗体のリスト。
Figure 2016506968
(胎盤NK細胞及び末梢血(PB)NK細胞の免疫表現型特徴付け)
NK細胞は、2つの主要な群: CD56+CD16+ NK細胞及びCD56+CD16-細胞に分けることができる。CD56+CD16+ NK細胞は、豊富な細胞溶解性顆粒を有し、CD16を高発現し、したがって、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発することができる。CD56+CD16- NK細胞は、逆に、細胞溶解性顆粒がほとんどなく、CD16発現が低下しているか又はCD16発現が見られないが、活性化されたときにサイトカイン及びケモカインを産生することができる。個々のNK細胞は、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR、例えば、KIR3DL1及びKIR2DL2/3)、天然の細胞傷害性受容体NCR(例えば、NKp30、NKp44、及びNKp46)、キラー細胞レクチン様受容体(KLR;例えば、CD94、NKG2D)、2B4、並びにCD226を含む、活性化及び抑制性受容体の多様なレパートリーを示す。
特定のNK受容体に対する蛍光コンジュゲートmAbを用いて、胎盤(コンボ)NK及び末梢血NK細胞に対してFACS解析を行った。特徴付けられた11のNKサブセットの中で、11のNKサブセットのうちの7つ(CD3-CD56+CD16-、CD3-CD56+CD16+、CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+NKp46+、CD3-CD56+NKp30+、CD3-CD56+2B4+、及びCD3-CD56+CD94+)の細胞の数が、胎盤NKと末梢血NK細胞の間で有意差(p＜0.05)を示した(64％の差を占める)(表3A;表3B及び3Cも参照)。
表3A. 16ユニットのドナーがマッチした組み合わされた臍帯血及びヒト胎盤灌流液(コンボ)並びに13ユニットの末梢血(PB)におけるCD3-CD56+ NK細胞の表現型特徴付け。2標本t-検定を用いて、母平均が胎盤ユニットと末梢血ユニットで等しいかどうかを判定する。
Figure 2016506968
 表3B及び3Cは、独立した実験における16ユニットのドナーがマッチした組み合わされた臍帯血及びヒト胎盤灌流液(コンボ)並びに13ユニットの末梢血(PB)中のCD3-CD56+CD16-及びCD3-CD56+CD16+ NK細胞の表現型特徴付けを示す。
表3B
Figure 2016506968
 表3C
Figure 2016506968
胎盤NK細胞の60.9％がCD56+CD16-(胎盤由来中間ナチュラルキラー(PINK)細胞)である一方、末梢血NK細胞のわずか21.4％がCD56+CD16-である。21日間培養した後、11のNKサブセットのうちの4つ(CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+NKp46+、CD3-CD56+NKp44+、及びCD3-CD56+NKp30+)のパーセンテージは、胎盤NK細胞と末梢血NK細胞の間で有意差(p＜0.05)を示した。
さらに、独立した実験において、21日間培養した後、胎盤NK細胞及び末梢血NK細胞は、Luminexアッセイで決定したとき、特に、IL-8について、固有のサイトカインプロファイルを示すことが明らかにされた(表4)。
表4
Figure 2016506968
(胎盤NK細胞及び末梢血NK細胞のマイクロRNAプロファイリング)
単離し又は増殖させたNK細胞を、MIRVANA(商標) miRNA単離キット(Ambion, Cat # 1560)を用いるマイクロRNA(miRNA)調製に供した。NK細胞(0.5〜1.5×106細胞)を変性溶解バッファー中で破壊した。次に、試料を酸-フェノール＋クロロホルム抽出に供して、低分子RNA種が高度に濃縮されたRNAを単離した。100％エタノールを添加して、該試料を25％エタノールにした。この溶解物/エタノール混合物をガラス繊維フィルターに通すと、高分子RNAは固相化され、低分子RNA種は濾液中に回収された。その後、該濾液のエタノール濃度を55％に増大させ、該混合物を、第二のガラス繊維フィルターに通し、その中で、低分子RNAが固相化されるようになった。このRNAを数回洗浄し、低イオン強度溶液中で溶出させた。回収された低分子RNAの濃度及び純度を、260nm及び280nmでのその吸光度を測定することにより決定した。
PINK細胞に固有であることが分かったmiRNAを表5に示す。hsa-miR-199bと表記された1つのmiRNAは、末梢血NK細胞に固有であることが分かった
表5. qRT-PCRによるpiNK細胞及びPB NK細胞についてのmiRNAプロファイリング。
Figure 2016506968
(培養胎盤NK細胞及び非培養NK細胞の免疫表現型特徴付け)
培養PINK細胞の全体的特性を広範な免疫表現型研究及び細胞傷害性アッセイにより評価した。増殖させたNK細胞の表現型を決定するために、NK受容体(NKR)、例えば、KIR、NKG2D、NKp46、NKp44、及び2B4の発現を解析した。細胞傷害性アッセイは、腫瘍細胞(K562細胞)をPKH26で標識し、その後、PINK細胞と4時間共培養することにより実施した。0日目から21日目まで、NKG2Dの発現は、60.9％±4.8％から86％±17.4％に増大し(0.024のp値); NKp46は、10.5％±5.4％から82.8％±9.0％に増大し(0.00002のp値); NKp44は、9.6％±6.5％から51.6％±27.5％に増大し(0.022のp値); 2B4は、13.0％±7.1％から0.65％±0.5％に減少した(0.009％のp値)(表6)。これらの培養条件下で、KIR3DL1(キラー細胞免疫グロブリン様受容体、3つのドメイン、長い細胞質テール1、抑制性受容体)並びにKIR2DL2/L3(キラー細胞免疫グロブリン様受容体、2つのドメイン、長い細胞質テール2及び長い細胞質テール3;抑制性受容体)を含む抑制性KIRは、21日間の増殖の間、影響を受けないままであった。NKRの発現の変化は、14日と比べた21日でのK562細胞に対する細胞溶解活性の顕著な増加とさらに相関した(63％±15％対45％±4％、0.0004のp値)。これらの知見から、NK細胞の細胞傷害活性とよく相関する推定上のNK細胞マーカーが同定された。
表6. 21日間の培養の前及び後のpiNK細胞の表現型特徴付け。5人のドナーの母平均について、標準偏差(Stdev)を計算した。
Figure 2016506968
(脂質に基づくタンパク質固相化技術及び線形イオントラップLC/MSによる培養胎盤NK細胞及び培養末梢血NK細胞の膜プロテオミクスプロファイリング)
(膜タンパク質精製:)
21日間培養された、組み合わされた胎盤灌流液及び臍帯血細胞由来の胎盤ナチュラルキラー細胞、並びにPB NK細胞を、細胞溶解前に、プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液(P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO; 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、ペプスタチンA、E-64、ベスタチン、ロイペプチン、及びアプロチニンを含み、金属キレート剤を含まない)とともに15分間インキュベートした。その後、該細胞を、界面活性剤を含まない10mM HCl溶液を添加して溶解させ、400gで10分間遠心分離して、核をペレット化し、除去した。核を除去した後の上清(post-nuclear supernatant)を超遠心分離チューブに移し、T-1270ローター(Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC)を備えたWX80超遠心分離機で、100,000gで150分間遠心分離して、膜タンパク質ペレットを生成させた。
(プロテオリポソームの生成、固相化、及び消化:)
膜タンパク質ペレットを、NANOXIS(登録商標)バッファー(10mM Tris、300mM NaCl、pH 8)を用いて数回洗浄した。該膜タンパク質ペレットを1.5mLのNANOXIS(登録商標)バッファーに懸濁させ、その後、VIBRA-CELL(商標) VC505超音波プロセッサー(Sonics & Materials社, Newtown, CT)を用いて、氷上で20分間、チップ式超音波処理した(tip-sonicated)。プロテオリポソームのサイズを、FM1-43色素(Invitrogen, Carlsbad, CA)による染色及び蛍光顕微鏡法による可視化により決定した。該プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度をBCAアッセイ(Thermo Scientific)により決定した。その後、該プロテオリポソームを、標準的なピペットチップを用いてLPI(商標)フローセル(Nanoxis AB, Gothenburg, Sweden)に注入し、1時間固相化させておいた。固相化させた後、一連の洗浄工程を実行し、5μg/mLのトリプシン(Princeton Separations, Adelphi, NJ)をLPI(商標)フローセルに直接注入した。チップを37℃で一晩インキュベートした。その後、トリプシン消化ペプチドを該チップから溶出させ、その後、Sep-Pakカートリッジ(Waters Corporation, Milford, MA)を用いて脱塩した。
(強陽イオン交換(SCX)分画:)
トリプシン消化ペプチドを0.1％ギ酸/水溶液中で再構成させ、30μmのポリスルホエチルアスパルトアミドSCX充填材が充填されたピペットチップである、強陽イオン交換(SCX) TOP-TIP(商標)カラム(PolyLC, Columbia, MD)にかけた。ギ酸アンモニウムバッファー、pH 2.8のステップ勾配(10mM〜500mM)を用いて、ペプチドをSCX TOP-TIP(商標)から溶出させた。各々のSCX画分をスピード-バックシステムを用いて乾燥させ、下流のLC/MS分析に備えて5％アセトニトリル、0.1％ギ酸で再構成させた。
(LTQ線形イオントラップLC/MS/MS分析:)
各々のSCX画分を、180分勾配(バッファーA:水、0.1％ギ酸;バッファーB:アセトニトリル、0.1％ギ酸)を用いて、軸方向脱溶媒和真空補助ナノキャピラリーエレクトロスプレーイオン化(ADVANCE)源(Michrom Bioresources社)に直接接続された0.2mm×150mm 3μm 200Å MAGIC C18カラム(Michrom Bioresources社, Auburn, CA)で分離した。ADVANCE源は、3μL/分というかなり速い流速で動作しながらも従来のnanoESIに匹敵する感度を達成する。溶出したペプチドは、各々のフルスキャン質量スペクトルの後に10回のデータ依存性MS/MSスキャンを利用するLTQ線形イオントラップ質量分析計(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)で分析した。
(バイオインフォマティクス:)
各々の腫瘍細胞株(AML、CML)について回収された6つの塩画分に対応する6つのRAWファイルを、SORCERER(商標) SOLO(商標)ワークステーション(Sage-N Research, San Jose, CA)でのSEQUESTアルゴリズムの実行を用いて、IPIヒトデータベースに対する1回の検索として検索した。1.2amuのペプチド質量許容値を指定し、メチオニンの酸化を示差修飾として指定し、カルバミドメチル化を静的修飾として指定した。Trans-Proteomic Pipeline(TPP)のScaffoldソフトウェアの実行を用いて、膜プロテオームデータを選別し、解析した。タンパク質が95％のペプチド確率、95％のタンパク質確率、及び1つの固有のペプチドを有すると特定された場合、それを解析にかけることを検討した。自前で開発したカスタム版のPerlスクリプトを用いて、膜プロテオームデータセット間の比較を行った。
この解析は、末梢血NK細胞から同定された膜タンパク質に対して固有である培養胎盤NK細胞由来の8つの膜タンパク質の同定を明らかにした。表7を参照されたい。さらに、培養胎盤NK細胞に対して固有である8つの膜タンパク質を末梢血NK細胞から同定した。表7を参照されたい。同定された10の膜タンパク質のみが、培養胎盤NK細胞と末梢血NK細胞の両方で共有されていることが分かった。
表7
Figure 2016506968
(6.3.実施例3)
この実施例は、胎盤中間ナチュラルキラー細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害性であることを示している。HPP由来のPINK細胞は、細胞傷害性アッセイで及びNK細胞サイトカイン分泌のLuminex解析により示されるように、急性骨髄性白血病細胞に対して細胞傷害性である。
サイトカイン分泌アッセイにおいて、HPP由来のCD56マイクロビーズ濃縮NK細胞をKG-1a急性骨髄性白血病細胞と1:1の比で混合した。24時間インキュベートした後、上清を回収し、IFN-γ及びGM-CSF分泌のLuminex解析に供した。図2に示すように、CD56濃縮HPP細胞をKG-1a細胞とともに24時間インキュベートした後、IFN-γ及びGM-CSFのレベルの増加が観察された。
(PINK細胞の細胞傷害性)
PINK細胞を利用する細胞傷害性アッセイにおいて、標的腫瘍細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識した。CFSEは、細胞に対して毒性がなく、かつ細胞分裂時に娘細胞間で分配される生体染料である。その後、該細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充されたRPMI 1640中、20:1、10:1、5:1、及び1:1のエフェクター-標的(E:T)比で、新たに単離されたCD56+CD16- PINK細胞とともにインキュベートした。4時間のインキュベーション時間の後、細胞を回収し、CFSEの存在についてフローサイトメトリーにより調べた。NK細胞を含まない培養物から回収された標的細胞の数を参照として使用した。細胞傷害性は:(1-CFSE試料/CFSE対照)*100％として定義される。顕著な腫瘍細胞の細胞傷害性は、20:1の比で観察された。図3を参照されたい。
(培養PINK細胞に対する腫瘍細胞の感受性)
(乳酸脱水素酵素(LDH)-放出アッセイ)
LDH-放出アッセイを、CYTOTOX 96(登録商標)比色細胞傷害性アッセイキット(Promega, Cat# G1780)を用いて実施した。このアッセイにおいて、マッチしたHPP/UCBに由来するCD56+CD16-細胞とCD56+CD16+細胞の組合せを含む培養NK細胞をエフェクター細胞とし、腫瘍細胞を標的細胞とした。エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、2％ヒトAB血清(Gemini, Cat# 100-512)が補充された100μlのフェノールレッド非含有RPMI 1640(Invitrogen, Cat# 11835-030)中、様々なエフェクター-標的(E:T)比でインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO2で、4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの上清を酵素アッセイプレートに移し、LDH活性を、製造業者によって提供されているように検出し、吸収を、ELISAリーダー(Synergy HT, Biotek)中、490nmで測定した。細胞傷害性の度合いを以下の方程式に従って計算した:％細胞傷害性＝(試料-エフェクター自然−標的自然)/(標的最大−標的自然)*100。
特定の腫瘍型は、他のものよりもNK細胞に応答性であり得る。培養PINK細胞に対するの腫瘍細胞の感受性を解析するために、PINK細胞と共培養した12種の異なる腫瘍細胞株をLDH放出アッセイで解析した。該12種の腫瘍細胞株には、ヒト慢性骨髄性白血病(CML)、リンパ腫、網膜芽腫(RB)、及び多発性骨髄腫(MM)が含まれた(表8)。4時間の共培養の後、NK細胞の細胞傷害性をLDH放出アッセイにより測定した。
表8. ATCC腫瘍細胞株
Figure 2016506968
10:1のエフェクター対標的(E:T)比で、培養PINK細胞の顕著な細胞傷害性は、K562細胞(CML)に対しては88.6％±5.6％で、U937細胞(リンパ腫)に対しては89.2％±9.8％で、WERI-RB-1細胞(RB)に対しては73.3％±11.8％で、RPMI8226細胞(MM)に対しては61.3％±1.3％で、及びU266細胞(MM)に対しては57.4％±4.7％で見られた(表9)。
表9.培養piNK細胞に対する腫瘍細胞の示差感受性。3人のドナーの平均細胞傷害性について、平均値の標準誤差(S.E.M.)を計算した。
Figure 2016506968
(レナリドミド及びポマリドミドでの処理によるPINK細胞の細胞傷害性の増強)
(RNA単離及び精製)
単離し又は増殖させたNK細胞を、RNAQUEOUS(登録商標)-4PCRキット(Ambion, Cat #AM1914)を用いるRNA調製に供した。簡潔に述べると、NK細胞(0.5〜1.5×106細胞)をグアニジウム溶解溶液中で溶解させた。その後、試料溶解物をエタノール溶液と混合し、mRNA及びより大きいリボソームRNAに選択的かつ定量的に結合し; tRNA及び5SリボソームRNAなどの非常に小さいRNAは定量的には結合されないシリカ系フィルターに適用した。その後、該フィルターを洗浄して、残存するDNA、タンパク質、及び他の夾雑物質を除去し、RNAを、重金属をキレートするための微量のEDTAを含むヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。該シリカフィルターを、キットに供給されるRNアーゼ非含有微量遠心チューブに適合する小型のカートリッジに収容した。該試料溶解物、洗浄溶液、及び溶出溶液は、遠心分離又は真空圧により、該フィルターの中を移動させた。該フィルターからの溶出の後、RNAを、キットに提供される超高純度DNアーゼ1で処理して、微量のDNAを除去した。最後に、該DNアーゼ及び二価陽イオンを、同じくキットに提供される試薬により除去した。回収されたRNAの濃度及び純度を、260及び280nmでのその吸光度を測定することにより決定した。
(定量的リアルタイム(qRT-PCR)解析)
その後、単離されたRNAを、TAQMAN(登録商標)逆転写試薬(Applied Biosystems, Cat #N8080234)を用いるcDNA合成、次いで、ヒト免疫アレイ(Applied Biosystems, Cat# 4370573)及びヒトマイクロRNAアレイ(Applied Biosystems, Cat# 4384792)を用いる7900HT高速リアルタイムPCRシステムによるリアルタイムPCR解析に使用した。
レナリドミド及びポマリドミドは、増強された抗癌活性及び抗炎症活性を有するサリドマイドの化学類似体である。レナリドミド及びポマリドミドがPINK細胞の細胞傷害性を増強し得るかどうかを検討するために、エクスビボ培養した(19日)PINK細胞をレナリドミド又はポマリドミドで24時間前処理し、その後、標的結腸直腸癌細胞株のHCT-116と共培養した。レナリドミド処理したNK細胞は、42.1％の細胞傷害性を示し、ポマリドミド処理したNK細胞は、47.4％の細胞傷害性を示したが、対照の未処理PINK細胞は、24.3％の細胞傷害性しか示さなかった。
定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)及びフローサイトメトリー解析は、ポマリドミドによって誘発されるNK細胞の細胞傷害性の増強がグランザイムB(GZMB)遺伝子発現の増加(60％±1.7％増加)(表10)及びGZMB陽性NK細胞のパーセンテージの増加(25％増加)と相関することを示した。さらに、GM-CSFの発現は、レナリドミド(232％±1.6％増加)及びポマリドミド(396％±0.3％増加)処理したPINK細胞で増加した(表10A、10B)。
表10A、10B。未処理の細胞と比較したレナリドミド及びポマリドミド処理した培養PINK細胞のqRT-PCT解析。10A:記載された遺伝子についてのレナリドミド処理試料とレナリドミド未処理試料の間の遺伝子発現の変化倍数。対応のあるt-検定を用いて、変化倍数がレナリドミド処理試料とレナリドミド未処理試料で等しいかどうかを判定する。10B:記載されている25遺伝子についてのポマリドミド処理試料とポマリドミド未処理試料の間での遺伝子発現の変化倍数。対応のあるt-検定を用いて、変化倍数が処理試料と未処理試料で等しいかどうかを判定する。
表10A
Figure 2016506968
 BAX−BCL2関連Xタンパク質
CCL5−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5−ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF2−コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
FAS−TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GUSB−βグルクロニダーゼβ
IL2RA−αインターロイキン2受容体
TNFRSF18−腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー18
表10B
Figure 2016506968
 ACTB−β-アクチン
BAX−BCL2関連Xタンパク質
CCL2−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2
CCL3−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3
CCL5−ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5−ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF1−コロニー刺激因子1(マクロファージ)
CSF2−コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
ECE1−エンドセリン変換酵素1
FAS−TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GNLY−グラニュライシン
GUSB−グルクロニダーゼ-β
GZMB−グランザイムB(グランザイム2、細胞傷害性Tリンパ球関連セリンエステラーゼ1)
IL1A−αインターロイキン1
IL2RA−インターロイキン2受容体-α
IL8−インターロイキン8
IL10−インターロイキン10
LTA−リンホトキシンα(TNF スーパーファミリー、メンバー1)
PRF1−パーフォリン1(孔形成タンパク質)
PTGS2−プロスタグランジン-エンドペルオキシドシンターゼ2(プロスタグランジンG/Hシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ)
SKI-v−ski肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ)
TBX21−Tボックス21
(組み合わされたナチュラルキラー細胞の細胞傷害性)
独立した細胞傷害性アッセイにおいて、ドナーがマッチした臍帯血及び胎盤灌流液に由来する培養NK細胞をエフェクター細胞とし、一方、腫瘍細胞を標的細胞とした。腫瘍細胞を、その親油性脂肪族残基により細胞の形質膜に挿入するPKH26(Sigma-Aldrichカタログ# PKH26-GL)(例えば、Lee-MacAryらの文献、J. Immunol. Meth. 252(1-2):83-92(2001)参照)で標識し、その後、96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充された200μlのRPMI1640中、様々なエフェクター:標的(E:T)比で培養NK細胞とともにインキュベートした。培養物を、37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、膜不透過性DNA染料のTO-PRO-3(Invitrogenカタログ# T3605)を1μMの最終濃度まで培養物に添加し、その後、BD FACSCantoを用いてFACS解析を行った。細胞傷害性は、全PKH26+標的腫瘍細胞内の死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)のパーセンテージとして表した。
この細胞傷害性アッセイでは、ヒト慢性骨髄性リンパ腫(CML)K562細胞を、細胞の形質膜に挿入するPKH26で標識し、96ウェルのU底組織培養プレートに入れた。21日間培養された胎盤(コンボ)又は末梢血NK細胞を、10％v/vのFBSが補充されたRPMI1640中、10:1、5:1、2.5:1、及び1.25:1のエフェクター対標的(E:T)比でK562細胞と混合した。4時間のインキュベーション時間の後、細胞を回収し、TO-PRO-3を細胞培養物に添加し、その後、PKH26及びTO-PRO-3の存在についてフローサイトメトリーを行った。細胞傷害性は、全PKH26+腫瘍標的細胞内のPKH26+TO-PRO-3+死細胞のパーセンテージとして表した。胎盤NK細胞と末梢血NK細胞はどちらも、試験された全てのE:T比でK562細胞に対する相当な毒性を示した(図4)。K562細胞に対する末梢血NK細胞よりも有意に高い胎盤NK細胞の毒性は、10:1と5:1の2つのE:T比で観察された(図4)。
(6.4.実施例4)
この実施例は、ヒト胎盤灌流液細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害性であること、及びHPP由来の全有核細胞(TNC-HPP)のKG-1aに対する細胞傷害性が、マッチしたUCB由来のTNCの細胞傷害性よりも高かったことを示している。HPP又は臍帯血(UCB)由来の全有核細胞を、1:1、5:1、10:1、20:1、又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。24時間又は48時間のインキュベーションの後、細胞を回収し、CFSEの存在についてFACS解析(BD FACSCanto, BD Bioscience)により調べた。単独で培養された腫瘍細胞を対照として使用した。細胞傷害性は、(1-CFSE試料/CFSE対照)*100％として定義された。顕著な細胞傷害性は、100:1の比で示された。図5を参照されたい。
独立した実験において、HPP由来の全有核細胞の細胞傷害性を臍帯血由来の全有核細胞の細胞傷害性と比較した。マッチしたTNC-HPP又はUCBを、0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25:1、12.5:1、25:1、50:1、又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。TNC-HPPは、UCBの細胞傷害性と比較して、全ての比で一貫してより高い細胞傷害性を示した。図6を参照されたい。
別の実験において、KG-1a細胞とインキュベーションする24時間前に、TNC-HPPを100U/mL又は1000U/mLのIL-2で刺激し、一方、RPMI培地で培養されたHPPを対照として使用した。KG-1a細胞当たり6.25個のNK細胞及びそれを上回る比で、IL-2は、TNC-HPPの細胞傷害性を増大させるように見える。図7を参照されたい。
5×105個のHPP細胞及び1×104個の腫瘍細胞を用いて、表11に示されるような、より広範囲の腫瘍細胞型を用いて実験を繰り返した。
表11:胎盤灌流液の細胞傷害効果について試験された腫瘍細胞型
Figure 2016506968
HPP細胞及び腫瘍細胞を、24時間又は48時間、50:1の比で共培養したとき、HPP細胞は、腫瘍細胞に対する相当な毒性を示した。両方の時間について、共培養は、50％を超える腫瘍細胞の死滅をもたらした。図8A及び8Bを参照されたい。
(6.5.実施例5)
HPP細胞の強力な抗腫瘍効果の媒介に関与する任意の特定の作用機序に束縛されることを望むものではないが、腫瘍細胞株と共培養されたHPP細胞のIFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFサイトカイン放出プロファイルを解析し、多重化Luminexアッセイにより、様々な時点で、腫瘍細胞株と共培養されたUCB細胞の該プロファイルと比較した。上清中のIFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの源を検討するために、共培養された細胞のフローサイトメトリーに基づく細胞内特徴付けを実施し、結果として、これらのサイトカインが腫瘍細胞では産生されないことが示された。
インキュベーション後に回収された上清を、IFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの濃度を決定するためのLuminexアッセイ(Cat# HCYTO-60K-03, Millipore)に供した。これら3つのサイトカインはNK細胞傷害性と関連している。(例えば、Imaiらの文献、Blood 2005. 106(1):376-83を参照されたい)。また、Applied Biosystems FAST 7900HT機器及びプライマーを用いて、定量的RT-PCRを実施して、IFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの発現を調べた。培養条件は、上記の共培養細胞傷害性アッセイの場合と同じであった。サイトカインの濃度は、Luminexアッセイを用いて決定した。
腫瘍細胞と共培養されたHPP細胞からのIFN-γ、TNF-α、及びGM-CSFの分泌は、UCB細胞からの該分泌よりも有意に多いことが分かった。ある実験において、HPP細胞を、100U/mlのIL-2の存在下又は非存在下、0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25:1、12.5:1、25:1、50:1、又は100:1の比でKG-1a細胞と混合した。TNC-HPPは、IL-2の非存在下と比較して、IL-2の存在下で、IFN-γの産生が一貫して増加していることが示された。24時間でのIFN-γレベルは、約5〜26倍(中央値:16倍)増加し; 48時間では約3〜65倍(中央値:27倍)増加することが分かり、これは、細胞傷害性研究の結果と一致していた。図9を参照されたい。
別の実験において、KG-1a細胞とのインキュベーションの24時間前に、TNC-HPPを、100U/mL又は1000U/mLのIL-2で刺激し、一方、RPMI培地で培養されたHPPを対照として使用した。HPP又はマッチしたUCB細胞を、KG-1a細胞と共培養する前に、IL-2とともに又はIL-2なしで24時間インキュベートした。IFN-γの分泌は、K562及びKG-1aと共培養されたHPP細胞において、48時間で最も増加した。HPP細胞を100U/mLのIL-2で処理したとき、24時間及び48時間でのKG-1aに対するHPP細胞の細胞傷害性が増大した。HPP細胞におけるIFN-γの分泌レベルは、IL-2処理したときのマッチしたUCB細胞の分泌レベルよりも高かった。より高いIFN-γ発現は、マッチしたHPP及びUCB由来の細胞のRT-PCR解析によって確認された。これらの結果は、HPP細胞がUCB細胞と比較してより高い抗白血病活性を示し、このより高い活性がIFN-γ産生の顕著な増加と関連することを示している。
一群の腫瘍細胞株との共培養時のHPP細胞における及び臍帯血細胞におけるIFN-γ産生を、上の表1に記載の腫瘍細胞株を用いて解析した。HPP細胞及び腫瘍細胞を、104個の腫瘍細胞及び5×105個のHPP細胞を用いて、50:1の比で24時間又は48時間共培養した。CCRF-CEM、J.RT3-T3.5、K562、KG1、KG-1a、KU812、NC1-H1417、U-937、及びWER1-RB-1細胞株については、24時間の共培養でのHPP細胞におけるIFN-γ産生の増加は、これらの細胞株と同じ時間共培養された臍帯血細胞におけるIFN-γ産生の増加を超えていた。図10Aを参照されたい。48時間の共培養では、HPP細胞におけるIFN-γ産生の増加は、全ての腫瘍細胞株について臍帯血におけるIFN-γ産生の増加を超えていた。図10Bを参照されたい。腫瘍細胞株のうち、K562細胞は、24時間と48時間の両方でHPP細胞におけるIFN-γ産生の最大増加を誘導した。同様の結果が、TNF-α及びGM-CSFについて観察された。
細胞周期解析は、S期のKG-1aのパーセンテージが、単独で培養したKG-1a細胞と比較して、HPPと共培養した場合に30％減少したことを示した。HPPの異なる濃縮画分を用いて実施されたさらなる共培養実験は、HPPの抗白血病活性が、CD56+の高発現、CD16の発現の欠如を特徴とする高濃度の固有の未成熟ナチュラルキラー細胞に大きく起因することを示した。
(6.6.実施例6:ヒト胎盤灌流液細胞によるインビボでの腫瘍細胞増殖の抑制)
(6.6.1.材料及び方法)
ここに提示される実施例は、ヒト胎盤灌流液細胞によるインビボでの腫瘍細胞増殖の抑制を示している。特に、本実施例は、NOD/SCIDマウス異種移植片腫瘍モデルを用いた、腫瘍細胞に対するインビボでのヒト胎盤灌流液の有効性を示している。
(KG-1細胞の培養)
KG-1細胞を、20％胎仔ウシ血清が補充されたイスコフ改変ダルベッコ培地(成長培地)中、37℃、95％空気/5％CO2、及び100％湿度で維持した。培養物中の培地を1日おきに交換し、細胞を毎週継代した。KG-1細胞は懸濁物として成長する。したがって、培地交換又は細胞継代のために、細胞懸濁液を遠心分離チューブ中に回収し、Sorvall(登録商標) Heraeus(登録商標)ローター(品番75006434)中、2,000rpmで10分間遠心分離した。上清を捨て、適量の細胞ペレットを培養の継続のために成長培地に再懸濁させた。
(移植用のKG-1細胞の調製)
マウスへの細胞移植のために、細胞を上記の遠心分離により回収した。細胞ペレットを回収し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。マウスに移植されることになる細胞の数を決定するために、該細胞懸濁液のアリコートを、血球計を用いて計数した。トリパンブルー色素を用いて、該懸濁液中の非生存細胞を排除した。
(移植用のHPP細胞の調製)
HPPの保存及び解凍のために、試料を、良好な条件下、断熱容器(dry shipper container)中で凍結させた。解凍当日、HPPユニットを冷凍フリーザーから(1回につき1つ)取り出し、ジップトップ式のプラスチックバッグに入れた。その後、大部分が解凍されるまで(小さな凍結片はバッグ中に残る)、穏やかに撹拌しながらバッグを37℃の水浴に入れた。その後、水浴からバッグを取り出し、該ユニットをジップトップ式のバッグから取り出し、完全に解凍されるまで該ユニットを穏やかに反転させた。その後、該ユニットを層流フード内に入れ、70％エタノールを噴霧することにより、血液バッグの外面を滅菌した。滅菌鋏を用いて血液バッグを開封し、細胞を、滅菌ピペットにより、滅菌した50mlの円錐チューブ(各々のHPPユニットに1本のチューブ;各々のUCBユニットに2本のチューブ)に移した。次に、10mLの解凍バッファー(2.5％ヒトアルブミン、5％デキストラン40)を、穏やかに混合しながら、各々のチューブにゆっくりと(2.2〜2.9分の時間をかけて)添加した。その後、各々の血液バッグを10mLの解凍バッファーですすぎ、その後、これを、50mlの円錐チューブにゆっくりと(0.7〜1.3分の時間をかけて)添加した。
解凍後、各々のユニットを、遠心分離前に水分を含んだ氷の上で保存した。全てのチューブを10分間(440×g、10℃で)遠心分離し、上清を、滅菌ピペットを用いて吸引し、チューブを振盪させることにより、ペレットを穏やかに破壊した。ビヒクル(PBS＋1％胎仔ウシ血清)の1mlアリコートをチューブの1つに添加し、穏やかに旋回させることにより、該チューブを混合した。2mlピペットを用いて、内容物を第二のチューブに移し、次に、第三のチューブ、その後、第四のチューブに移した。空のチューブを0.2mlの希釈バッファーで洗浄した。
細胞計数のために、25μlのアリコートを、975μlのビヒクルを含む氷上の15mlの円錐チューブに移した。その後、4mlの冷塩化アンモニウム溶解試薬を添加し、氷上で10分間インキュベートすることにより、赤血球を溶解させた。インキュベーション後、5mlの冷PBSを各々のチューブに添加し、該チューブを遠心分離した(10分、400×g、10℃)。RBC溶解後、細胞を、生存率を評価するためのトリパンブルーを用いて、血球計により計数した。計数の結果を希釈に対して補正し、その後、溶解係数(0.46)で除して、RBC溶解前に存在していた細胞の数を推定した。
HPP用量調製のために、計数後、ビヒクルを添加することにより、HPP細胞を1×108細胞/mlに希釈した。その後、シリンジを装填するまで、HPP細胞を氷上で保存した。第一のユニットの解凍から用量調製の完了までの経過時間は3時間未満であった。
シリンジを充填する前に、上記のような計数による事後用量確認のために、投与材料の50μlアリコートを取っておいた。投与後、残りの投与材料を用量確認のために評価した。
(研究設計)
1日目に、24匹のNOD/SCID雄マウス(Jackson Laboratories)の側腹部に、500万個の生きたKG-1細胞を皮下(S/C)移植した。木片床敷を備えた1つのマイクロアイソレーションケージシステムで4〜5匹のマウスが飼育されるように、マウスを分離した。滅菌した齧歯類用の食餌及び水を自由に与えた。マウスを、腫瘍成長について週に2回、詳しくモニタリングした。最初の測定可能な腫瘍は25日目に観察された。その後、体重を週に1回記録し、腫瘍測定値を、キャリパーを用いて、週に2回記録した。移植後52日目に、動物を、3つの独立した群に無作為に割り付けると、腫瘍体積は平均して約300〜350mm3になった。下の表12を参照されたい。第一の群は、312mm3の平均腫瘍体積を有する4匹の対照マウスからなっていた。これらのマウスのうちの2匹に、それぞれ、200μl及び50μlのビヒクル溶液を、静脈内(IV)に、及び腫瘍内(IT)に2回、移植した。345mm3の平均腫瘍体積を有する第二の群は、マウス1匹当たり200μlのHPP細胞(2×107細胞)が静脈内に移植された4匹のマウスからなっていた。マウス1匹当たり50μlのHPP細胞をIT移植された最後の群もまた、332mm3の平均腫瘍体積を有する4匹のマウスからなっていた。
表12:インビボ腫瘍抑制実験のための実験群。
Figure 2016506968
HPP細胞を移植してから14日後の66日目に、この研究は、腫瘍体積が大きくなったために中止された。
(6.6.2.結果)
腫瘍体積(TV)は、対照群のTVが2921mm3の平均値に達した66日目(HPP細胞を移植してから14日後)まで測定された。研究の終了時のIV処置群は2076mm3の平均TVを有しており、IT群は2705mm3のTVを有していた。処置後のTVの増加％に関して、IT群がわずか20％の阻害を示したのに対し、IV群は、対照群と比較して、35％を上回る腫瘍成長阻害を示した。IT群の阻害は実証可能であった。図11を参照されたい。
(6.7.実施例7)
この実施例は、ドナーがマッチした満期ヒト胎盤灌流液細胞及び臍帯血(UCB)細胞由来の組み合わされたナチュラルキラー細胞の生成及び特徴付けを記載するものである。
(6.7.1.材料及び方法)
(ヒト胎盤由来幹細胞及びUCBの処理)
寄附された満期胎盤に生理食塩水を灌流させて、ヒト胎盤由来幹細胞を回収した。その後、ヒト胎盤由来幹細胞を処理して、赤血球、非生存細胞、及び組織破片を除去し、その後、凍結保存した。処理の間、ヒト胎盤由来幹細胞を増殖させることも、培養することもなかった。
(ヒト胎盤由来幹細胞及びUCBからのナチュラルキル細胞の単離)
凍結保存されたドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCBを最初に解凍し、組み合わせ、5％v/vの胎仔ウシ血清(FBS; Hyclone laboratories)を含むRPMI 1640(フェノールレッド非含有)(Gibco)で洗浄した。いくつかのNK細胞増殖実験では、バフィーコート(Blood Center, NJ)から得られた末梢血単核細胞(PBMC)をNK細胞の別の源として調製した。洗浄後、細胞ペレットを、5×107細胞/mlで、RoboSepバッファー(StemCell Technologies)に再懸濁させた。0.1mg/mlのDNアーゼI(StemCell Technologies)溶液を100μl/mlの最終濃度まで該細胞懸濁液に添加し、ピペットにより穏やかに混合し、EasySep(登録商標) NK細胞濃縮キット(StemCell Technologies)による単離の前に、室温で15分間インキュベートした。以下のヒト細胞表面抗原: CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA-DR、及びグリコフォリンAに対するモノクローナル抗体を含むヒトNK細胞濃縮カクテルを50μl/mlの最終濃度で該細胞懸濁液に添加し、10分間インキュベートした。その後、EasySep(登録商標)磁気微粒子を100μl/mlの最終濃度まで添加し、5分間インキュベートした。その後、製造業者(StemCell Technologies)によって提供されるプロトコルに従って全自動細胞分離装置RoboSepを用いて、NK細胞の濃縮を行った。CD56+CD3-集団をこのように回収し、さらなる解析又は培養の準備ができた。
(pNK細胞のエクスビボ増殖)
濃縮された胎盤CD56+CD3- NK細胞を、以前に記載されたプロトコル(Ysselらの文献、1984, J. Immunol. Methods. 72, 219-227)の改変に基づく出発培地中で培養した。簡潔に述べると、出発培地は、10％胎仔ウシ血清(FBS)(Hyclone)、35mg/mlのトランスフェリン(Sigma-Aldrich)、5μg/mlのインスリン(Sigma-Aldrich)、20μMのエタノールアミン(Sigma-Aldrich)、1μg/mlのオレイン酸(Sigma-Aldrich)、1μg/mlのリノール酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg/mlのパルミチン酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mlのBSA(Sigma-Aldrich)、及び0.1μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA-P、Sigma-Aldrich)が補充されたIMDM(ATCC)から構成されていた。NK細胞を、約2.5×105/mlで、出発培地＋ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen)及び200IU/ml IL-2(R&D Systems)に再懸濁させた。マイトマイシンC(Sigma-Aldrich)処理したPBMC及びK562(ATCC)細胞を、PBMC細胞については1×106/ml及びK562細胞については1×106/mlの最終濃度で、フィーダー細胞として出発培地に添加した。NK細胞増殖を開始するために、フィーダー-NK細胞懸濁液をガス透過性培養バッグ(American Fluoroseal)に移し、インキュベーター中、37℃、5％CO2で培養した。5〜7日間培養した後、増殖した細胞集団に維持培地を最大21日間供給した。維持培地は、10％FBS、2％ヒトAB血清(Gemini)、ペニシリン-ストレプトマイシン、及び200IU/ml IL-2が補充されたIMDMから構成されていた。全細胞数及び細胞生存率を、Easycount(Immunicon)及びEasycount Viasure Kit(Immunicon)を用いて調べた。次式を用いて、増殖倍数を計算した:倍数＝21日目のCD56+ CD3- NK細胞の絶対数/0日目のNK細胞の絶対数。
(BrdU/7-AAD細胞周期解析)
増殖させた細胞をBrdU(BD Bioscience)で標識し、37℃、5％CO2で24時間培養した。該細胞を回収し、固定し、製造業者によって提供されるプロトコルに従って、抗BrdU及び7-AADで染色した。FACSCalibur(BD Biosciences)で細胞周期データを収集し、FlowJo(Tree Star社)で解析を遂行した。
(免疫表現型特徴付け)
ドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCB由来の単核細胞(MNC)もしくは濃縮NK細胞、又は7日、14日、21日培養物由来の増殖細胞の表現型をマルチカラーフローサイトメトリーにより解析した。細胞をヒト血液表面抗原に対する蛍光色素コンジュゲート型モノクローナル抗体: CD56-PerCP/-PE/-PE-Cy7、CD3-FITC/-APC-Cy7、CD16-FITC/-PerCP、CD158b-PE(キラー免疫グロブリン様受容体[KIR] 2DL2/2DL3)、CD158e1-PE(KIR3DL1)、NKG2D-APC、NKp46-APC、NKp44-PE、NKp30-PE、CD226-PE、2B4-PE(全てBD Biosciences Pharmingenから購入したもの)、及びCD94-PE(R&D Systems)で染色した。全ての解析を、FACSCanto I(BD Biosciences)及びFlowJo解析ソフトウェアを用いて実施した。
(PKH26/TO-PRO-3細胞傷害性アッセイ)
NK細胞をエフェクター細胞として及び様々な腫瘍細胞株を標的細胞として用いて、NK細胞のインビトロ細胞傷害性を調べた。標的細胞をPKH26(Sigma-Aldrich)で標識し(Ferlazzoらの文献、2004; Lee-MacAryetらの文献、2001)、96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、10％FBSが補充された200μlのRPMI 1640中、様々なエフェクター対標的(E:T)比で、エフェクター細胞とともにインキュベートした。37℃、5％CO2で4時間インキュベートした後、細胞を回収し、TO-PRO-3(Invitrogen)を1μMの最終濃度で培養物に添加し、その後、BD FACSCanto Iを用いてFACS解析を行った。細胞傷害性は、全PKH26+標的腫瘍細胞内の死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)のパーセンテージとして表した。
(乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ)
或いは、NK細胞のインビトロ細胞傷害性を、CYTOTOX 96(登録商標)比色細胞傷害性アッセイキット(Promega)を用いるLDH放出アッセイにより調べた。このアッセイでは、エフェクター細胞及び標的細胞を96ウェルのU底組織培養プレートに入れ、2％ヒトAB血清が補充された100μlのフェノールレッド非含有RPMI 1640(Invitrogen)中、様々なE:T比でインキュベートし、37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの上清を、製造業者によって指示される通りに、LDH活性の検出用の酵素アッセイプレートに移した。細胞傷害性を、以下の方程式を用いて計算した:％細胞傷害性＝(実験的放出-エフェクター自然放出−標的自然放出)/(標的最大放出−標的自然放出)*100。
(miRNA調製及び定量的PCR(QPCR))
miRNAを、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってMIRVANA(商標) miRNA単離キット(Ambion)を用いて、0.5〜1.5×106個の細胞から単離した。回収された低分子RNAの濃度及び純度を、260及び280nmでのその吸光度を測定することにより決定した。精製RNA試料を、TAQMAN(登録商標)逆転写試薬(Applied Biosystems)を用いるcDNA合成、次いで、7900HT高速リアルタイムPCRシステムによるリアルタイムPCR解析に供した。ヒトマイクロRNAアレイ(Applied Biosystems)を遺伝子発現プロファイリング及びmiRNAプロファイリングに使用した。各々のmiRNAについて、リアルタイムPCRからの平均ΔCtをΔCt平均＝平均(Ct試料)−平均(Ct内部)(式中、Ct試料はmiRNAのCt値であり、Ct内部は内部対照のCt値である)として計算した。以下の基準を満たす場合、miRNAは、pNK又はPB NKに固有のものであるものとした:1)ΔCt平均＜0; 2)|ΔCt平均|≧2*Ct内部_SD(式中、|ΔCt平均|はΔCt平均の絶対値であり、Ct内部_SDはCt内部の標準偏差である);及び3)先の2つの基準を満たすmiRNAが該細胞型だけに限定されていた。前述の基準を使用する論拠は、miRNAが、内部対照と比較して、少なくとも1つのドナー試料に豊富に含まれることを確認することであった。検出可能なレベルのmiRNAを含まないドナー試料は、Ct値の平均を求めるときに、数値的に無視された。対照遺伝子からの2標準偏差を伴った負のΔCt平均は、特定の遺伝子が相対的に豊富にあることを保証するものである。さらに、参照遺伝子の標準偏差は全て0.25未満であり、これにより、対照の品質が確認された。pNKとPB NKの間で有意に発現されるmiRNA、及び0日目のpNKと21日目のpNKの間で有意に発現されるmiRNAを、ΔCt値に対する2標本t-検定(有意水準0.01のp値)により決定した。発現変化倍数を、R＝2(ΔCt1_平均−ΔCt2_平均)(式中、Rは、変化倍数であり(Livak, K.J.及びSchmittgen, T.Dの文献、2001, Methods. 4, 402-408); ΔCt1_平均は、0日目のpNKの平均ΔCtであり、ΔCt2_平均は、PB NK又は増殖させたpNKの平均ΔCtである)に従って計算した。最も豊富にあるmiRNAの1つであるRNU44を内部対照として使用した。試料1つ当たり8つの対照ウェルがあり、該対照の平均Ctを用いて、ΔCtを計算した。本明細書で利用される統計的方法は、対照と比較して豊富ではないmiRNAを排除する。
(miRNA標的予測及び経路解析)
PB NK及びpNKのどちらかに固有であるmiRNA、並びに増殖させたpNKで高発現するmiRNAの検索を、中程度から高度のストリンジェンシー検索条件を使用することにより、7つのmiRNA標的遺伝子予測データベース(Diana-microT、miRDB、miRTar、microRNA.org、MicroCosmTargets、picTar、及びTargetScan)並びに実験的に確認された3つの標的遺伝子データベース(TarBase、miRecords、及びmiRTarBase)で実施した。5以上のデータベースによって予測される遺伝子を信頼度の高い標的とみなした。その後、関連するシグナル伝達経路及び細胞機能を決定するために、そのような標的遺伝子を経路解析(Ingenuity Systems)で調べた。経路を、そのp-値に基づいてスコアリング及びランキングした。
(6.7.2.結果及び考察)
(6.7.2.1.ヒト胎盤由来幹細胞由来NK細胞の表現型プロファイル)
ヒト胎盤由来幹細胞を3つの胎盤から回収し、細胞表面マーカーについて、ドナーがマッチしたUCBと比較してフローサイトメトリーにより解析した。細胞表面マーカー発現(CD56+CD3-)によって解析されたNK細胞組成から、ヒト胎盤由来幹細胞(0.70％±0.24％)とドナーがマッチしたUCB(0.63％±0.36％)の間に実質的な違いは認められなかった(n＝3)。その後、特定のキラー細胞免疫グロブリン(Ig)様受容体(KIR)及びC-タイプレクチン受容体(KLR)(CD94、NKG2D)に対する蛍光コンジュゲート型モノクローナル抗体を用いて、CD56+CD3- NK細胞を調べた。2標本t-検定を用いて、母平均がヒト胎盤由来幹細胞とUCBで等しいかどうかを判定した。図12Aに示すように、3対のドナーがマッチしたヒト胎盤由来幹細胞及びUCBユニット由来のNK細胞は表現型の類似性を示し、CD56+CD16-、CD56+CD16+、NKG2D、CD94、KIR3DL1、及びKIR2DL2/L3などの亜集団の発現に有意な差はなかった。21日間別々にNKを増殖させた後、ヒト胎盤由来幹細胞由来のNK細胞及びUCB NK細胞は、様々なE:T比でK562細胞に対する同程度の細胞傷害性を示し、増殖後のヒト胎盤由来幹細胞由来NK細胞とUCB NK細胞の間の機能的類似性を示した(図12B)。
(6.7.2.2.凍結保存されたコンボユニット由来のpNKの単離及び特徴付け)
ヒト胎盤由来幹細胞及びドナーがマッチしたUCBユニットを組み合わせて、細胞増殖のための出発材料として使用されるべき1つの「コンボユニット」にした。
解析により、pNK細胞の約90％は、凍結保存されたコンボユニットから、70％を超えるCD56+ CD3-細胞純度でルーチンに回収されたことが示されている。
16コンボユニット由来のpNK細胞及び13ユニットのバフィーコート末梢血(PB)由来のNK細胞を免疫表現型特徴付けに供した。KIR(KIR3DL1、KIR2DL2/3)、KLRs(CD94)、NKG2D、天然の細胞傷害性受容体NCR(NKp46、NKp44、及びNKp30)、2B4、並びにCD226を含む細胞表面マーカーの発現を評価した。CD56+CD16-、CD56+CD16+、KIR2DL2/3+、NKp46+、NKp30+、2B4+、及びCD94+を含む、pNK細胞とPB NK細胞の間の有意な差が観察された(図13A及び表13)。PB NK細胞のほとんど(79％)は成熟したCD56+CD16+表現型を示したが、pNK集団の大半(60％超)は未成熟なCD56+CD16-細胞であった。PB NK細胞と比較してpNK細胞で観察されたより多くの割合のCD16-細胞は、pNK細胞がPB NK細胞よりも未熟なNK細胞集団を含むことを示している。
表13. pNK細胞表現型及びPB NK細胞表現型における亜種団の比較
Figure 2016506968
pNK細胞及びPB NK細胞の表現型を、TaqManアレイヒトマイクロRNAカードを用いるmiRNA解析によりさらに調べ、pNK細胞及びPB NK細胞における365のmiRNAの発現を比較した。これらの解析から、pNK細胞に固有の4つのmiRNA(hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618)、並びにPB NK細胞により固有に発現される8つのmiRNA(hsa-let-7b、hsa-miR-146b、hsa-miR-19b、hsa-miR-24、hsa-miR-347、hsa-miR-381、hsa-miR-517c、及びhsa-miR-631)が同定された。さらに、PB NK細胞と比較したpNK細胞において、20のmiRNAが有意により高いレベルで発現し、及び29のmiRNAが有意により低いレベルで発現していた(表14及び15)。これらの結果は、pNK細胞が、PB NK細胞と比較して固有のmiRNA発現パターンを有することを示している。
表14. pNK細胞における高発現miRNA。
Figure 2016506968
 表15. PB NK細胞における高発現miRNA。
Figure 2016506968
(6.7.2.3.miRNA標的遺伝子予測)
miRNA標的遺伝子予測解析を材料及び方法に記載の通りに実施した。pNKにおける14の高発現miRNA及びPB NKにおける24の高発現miRNAを複数の標的遺伝子とともに報告した(表16)。詳細に述べると、抗アポトーシス遺伝子のBcl-2及びBcl-2Lを標的とする、hsa-let-7a、hsa-let-7g、hsa-mir-133b、hsa-mir-181b、及びhsa-mir-181dを含む、PB NKにおけるいくつかの高発現miRNAが同定された。さらに、miRNAのhsa-mir-146bは、PB NK細胞で高発現しており、その標的TRAF6は、NF-kB活性を下方調節し、細胞増殖を抑制し、化学的感受性を増強することが報告されている(Paikらの文献、2011, Clin. Cancer Res. 17, 4761-4771)。TRAF6は、MAPK14、IL6、及びFOSなどの遺伝子とともに、自然免疫及び適応免疫において重要な役割を果たしている(Chiffoleauらの文献、2003, J. Immunol. 171, 5751-5759)。MAPK14、IL6、及びFOSは、それぞれ、hsa-mir-24、hsa-mir-7a、及びhsa-mir-222により標的とされ、全て、PB NKで高発現していることが本研究で分かった。さらに、PB NKで3倍多いhsa-mir-181群(hsa-mir-181b、hsa-mir-181c、hsa-mir-181d)が同定された。これらのmiRNAは、CD34+ HSCからのNK細胞の発生及び初代CD56+ NK細胞におけるIFN-γ産生において重要な役割を果たすNotchシグナル伝達の調節因子であるnemo様キナーゼを標的とする(Cichockiらの文献、2011, J. Immunol. 187, 6171-6175)。最近、pNKにおける高発現miRNAの群において、その大部分がPB NKにおけるmiRNAの(実験的及び確認された)標的遺伝子リストに存在しない、SOX2、BMPR1、SMO、AKT1、ATM、RAF1、及びMTORなどの、幹細胞における多能性マーカーと細胞周期調節因子とから構成されるmiRNA:mRNA標的対が同定された。
表16. PB NKと比較したpNKにおける示差調節されるmiR及びその確認された標的遺伝子
Figure 2016506968
Figure 2016506968
Figure 2016506968
Figure 2016506968
*及び**は、発現レベルが、それぞれ、PB又はpNKのみにおける内部対照よりもドナーの少なくとも1人において有意に高い(2標準偏差高い)ことを表している。括弧内の数字は、遺伝子が、(例えば、統計解析によって及び実験によって)以前に確認されたものに加えて、miRによって標的とされることを示すデータベースの数を表している。
(6.7.2.4. pNK細胞のエクスビボ増殖)
上記の単離手順の後、平均1000万個のpNK細胞から始めて、細胞傷害性T細胞及びヘルパーT細胞を増殖させるためのプロトコル(Ysselらの文献、1984)を用いて、pNK細胞の増殖を最適化した。まず、フィーダー細胞濃度を最適化するために、同種異系PBMC及びK562細胞を、PBMCの濃度を1×106/mlに固定して、1:10、1:5、及び1:1の比で試験した。表17に示すように、1:1の比(1×106/ml K562:1×106/ml PBMC)は、1:5の比の場合の31.8倍(N＝3)及び1:10の比の場合の53.1倍(N＝9)と比較して、98.4倍という最大のNK細胞増殖(N＝14)をもたらした。したがって、1:1の比をさらなるpNK培養に使用した。次に、新鮮なフィーダー細胞の補充が培養プロセスにおけるNK増殖を増強することができるかどうかを評価した。新鮮なフィーダー細胞の補充のための最良の時間帯を決定するために、7日目、14日目、21日目、及び28日目におけるpNK細胞の細胞成長動態を、BrdU及び7-アミノアクチノマイシン-D(7-AAD)二重染色と、それに続くフローサイトメトリーで評価した。図14に見られるように、7日目に、培養NK細胞の大部分はS期にあり、該細胞が増殖していることを示した。活発に増殖している/分裂している細胞のパーセンテージは、その後の培養の間に大幅に減少し、7日目が再刺激のための最適な時間帯であることが示唆された。表18に示すように、7日目における新鮮なK562及びPBMCフィーダー細胞の添加は、NK細胞の増殖の3倍増をもたらした。この最適化された21日間NK培養法を20回の増殖実験で繰り返して、ドナー当たり平均1.2×109個のCD56+CD3- NK細胞が、約80％の生存率で得られた(図15A)。
表17.フィーダー細胞としてのK562対PBMCの比の最適化
Figure 2016506968
 *増殖倍数＝21日目のCD56+ CD3- NK細胞の絶対数/0日目のNK細胞の絶対数。
表18.フィーダーを様々な時点で補充する効果
Figure 2016506968
(6.7.2.5.エクスビボ増殖させたpNK細胞の特徴付け)
免疫表現型及びmiRNAの変化を、増殖させていない細胞と比較して、12コンボユニット由来の増殖させたpNK細胞で特徴付けた。21日目のpNK細胞は、例えば、増殖させていない細胞と比較して、NKG2D、NKp46、NKp44、及びNKp30などの活性化受容体の発現の有意な増加、並びに双方向性受容体2B4の発現の有意な減少を示した。KIR3DL1及びKIR2DL2/L3を含む抑制性KIRの発現は、増殖させた細胞と増殖させていない細胞について同様であった(図15B及び表19)。
表19. 21日目の増殖させたpNK対増殖させていないpNK細胞の亜集団比較
Figure 2016506968
また、pNKについて確立されている最適化された単離及び増殖手順(上記)を用いた、9人のドナーにおけるPB NKの増殖及び免疫表現型を特徴付けた。21日目の増殖させたpNKと21日目の増殖させたPB NKの比較を表20に示す。
表20. 21日目の増殖させたpNKと21日目の増殖させたPB NKにおける亜集団比較
Figure 2016506968
さらに、エクスビボ増殖後、23のmiRNAの発現は増加していたが、他の31のmiRNAは下方調節されていた(表21)。上方調節されることが分かったmiRNAのうちの1つはhsa-miR-155である。これは、過剰発現したとき、IFN-γの誘導の増強によって、NK細胞機能を増大させることが示されている(Trottaらの文献、2012, Blood 119, 3478-3485)。
表21. pNKエクスビボ増殖の間に示差調節されるmiRNA
Figure 2016506968
Figure 2016506968
Figure 2016506968
(6.7.2.6.増殖させたpNK細胞の抗腫瘍性細胞溶解活性)
増殖させたpNK細胞を、種々の腫瘍型に対する細胞溶解活性について評価した。増殖させたpNKの細胞溶解活性を、K562細胞に対するFACSベースのPKH26/TO-PRO-3細胞傷害性アッセイで評価した。図15Cに示すように、14日目と比べて21日目に、10:1のE:T比で、K562に対するpNK細胞の有意な増強があった(63％±15％対45％±4％、p＜0.001)。比較により、より小さい細胞傷害/細胞溶解活性が21日目のPB NK細胞(対pNK細胞)から観察された(42％±7％)(図15C)。
pNK細胞を21日間増殖させた後のこの細胞溶解活性の増加は、活性化受容体及びmiRNAの発現の増加と相関している。培養を28日に延長しても、K562細胞に対する細胞溶解活性のさらなる増加は生じなかった。
11の追加の腫瘍細胞株を21日目の増殖させたpNK細胞と共培養し、10:1、5:1、2:1、及び1:1のE:T比でのNK細胞の細胞溶解活性を4時間のLDH放出アッセイで測定した。10:1のE:T比では、増殖させたpNK細胞は、U937細胞(89.2％±9.8％); WERI-RB-1細胞(73.3％±11.8％); RPMI8226細胞(61.3％±1.3％); HCT-116細胞(61％±5.1％)、及びU266細胞(57.4％±4.7％)、並びにK562細胞(88.6％±5.6％)を含む、複数の腫瘍細胞株に対する50％を超える細胞傷害性を示した(図16)。腫瘍株に対する増殖させたpNK細胞の細胞溶解活性は、E:T比の系統的漸増によって示したとき、用量依存的な様式であった。
これらの結果は、増殖させたpNKが、血液腫瘍(例えば、白血病)と固形腫瘍の両方を含む、種々の腫瘍細胞を死滅させる能力を有することを示している。
(6.7.3.結論)
この実施例は、PB NK細胞と比較して表現型及びmiRNAプロファイルが異なるpNK細胞、例えば、ヒト胎盤由来幹細胞及びUCB細胞由来の細胞を増殖させて、種々の腫瘍細胞型に対して有用な、臨床的に意義のある量の細胞傷害性の高い細胞を生み出すことができることを示している。
(6.8.実施例8)
この実施例は、HLA非同一(同種異系)幹細胞移植を受ける患者のGVHDを治療するためのpNK細胞の使用を記載している。
(血液悪性腫瘍を有する患者におけるHLA非同一ドナー造血幹細胞(HSC)＋pNK細胞の移植)
癌細胞の成長を停止させるために及び該個体の免疫系が健常ドナーの幹細胞を拒絶するのを防ぐために、血液悪性腫瘍を有する個体に化学療法及び全身放射線照射を投与する。個体に注入されるドナー由来の健常HSCは、該個体の造血再構築を助ける。その後、個体は、再発を予防すること及び生存を向上させることに加え、GVHDを予防し又はGVHDの重症度を軽減するために、pNK細胞移植を受ける。
(均等物:)
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載された変更に加えて、本発明の様々な変更が、上の説明及び添付の図面から当業者に明白となるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書で引用された全ての参考文献は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が、あらゆる目的のために、その全体として引用により具体的かつ個別に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、あらゆる目的のために、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示を目的としたものであり、本発明が先行発明を理由としてそのような刊行物に先行する資格がないという承認と解釈されるべきではない。

Claims (21)

  1. 腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、該腫瘍細胞をヒト胎盤灌流液及び臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞と接触させることを含む、前記方法。
  2. 移植片対宿主病を治療する方法であって、ヒト胎盤灌流液及び臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞を、移植片対宿主病を有するか、移植片対宿主病を有することが疑われるか、又は移植片対宿主病を発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。
  3. 前記腫瘍細胞が血液癌細胞である、請求項1記載の方法。
  4. 前記腫瘍細胞が固形腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
  5. 前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性骨髄性リンパ腫(CML)細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、又は網膜芽腫細胞である、請求項1記載の方法。
  6. 前記ヒト胎盤灌流液及び臍帯血が、複数の赤血球を除去するように処理されたものである、請求項1記載の方法。
  7. 前記接触させることがインビトロで接触させることである、請求項1記載の方法。
  8. 前記接触させることがインビボで接触させることである、請求項1記載の方法。
  9. 前記接触させることがヒトにおけるものである、請求項8記載の方法。
  10. 前記胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液由来の全有核細胞である、請求項1記載の方法。
  11. 前記ナチュラルキラー細胞が、少なくとも約50％のCD56+細胞を含む、請求項1記載の方法。
  12. 前記ナチュラルキラー細胞が、少なくとも約50％のCD56+CD16-細胞を含む、請求項1記載の方法。
  13. 前記ナチュラルキラー細胞を、免疫調節化合物と、該細胞が該免疫調節化合物と接触させていない同等数の細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムBを発現するのに十分な量及び時間で接触させる、請求項1記載の方法。
  14. 前記免疫調節化合物がレナリドミド又はポマリドミドである、請求項13記載の方法。
  15. 前記ナチュラルキラー細胞が:
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD16-ナチュラルキラー細胞;
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+CD16+ナチュラルキラー細胞;
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+KIR2DL2/L3+ナチュラルキラー細胞;
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少ない数のCD3-CD56+NKp46+ナチュラルキラー細胞;
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+NKp30+ナチュラルキラー細胞;
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+2B4+ナチュラルキラー細胞;又は
    末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの数のCD3-CD56+CD94+ナチュラルキラー細胞
    を含む、請求項1記載の方法。
  16. 前記ナチュラルキラー細胞が、hsa-miR-155、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549、及びhsa-miR-618のうちの1つ又は複数を、末梢血由来の同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多くの量で発現する、請求項1記載の方法。
  17. 前記ナチュラルキラー細胞が培養されていないものである、請求項1記載の方法。
  18. 前記ナチュラルキラー細胞が培養されたものである、請求項1記載の方法。
  19. 前記ナチュラルキラー細胞が約21日間培養されたものである、請求項18記載の方法。
  20. 前記ナチュラルキラー細胞がフィーダー細胞の存在下で培養されたものである、請求項18記載の方法。
  21. さらなるフィーダー細胞が約7日目に前記培養物に添加される、請求項20記載の方法。
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