CN112029721A - 一种活性增强型nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将外周血单个核细胞与饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有细胞因子组合物的培养基培养，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞进行第二次共培养，得到活性增强型NK细胞。本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，按照特定顺序添加饲养细胞或细胞因子组合物，制备得到高纯度、高数量、具有显著提高的细胞杀伤能力的NK细胞，在细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。

Description

一种活性增强型NK细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种活性增强型NK细胞的制备方法。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)又称大颗粒性淋巴细胞，与γδT细胞和NKT细胞共同发挥固有免疫和获得性免疫功能。一方面，当机体发生感染或创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的方式快速、广泛、特异识别抗原，及时清除病原微生物和变异细胞，发挥固有免疫作用；另一方面，NK细胞参与适应性免疫应答，影响αβT细胞和B细胞的效应功能。
近年来细胞免疫疗法在癌症治疗中展现出了巨大的潜力，被认为是最有希望攻克癌症的方法，其中，基于NK细胞的免疫治疗技术受到了越来越多的关注。目前，制约NK细胞临床应用的主要障碍在于难以获得数量充足的NK细胞，在体外实现NK细胞的大规模扩增是NK细胞治疗要解决的关键问题。外周血中NK细胞数量少，而肿瘤病人的外周血中NK细胞的数量和活性明显下降，不同人的NK细胞的性质有很大差别。将基于NK细胞的免疫治疗技术应用于临床，对NK细胞的数量要求高。
现有技术存在着扩增后的NK细胞寿命短、活性不足等问题。因此，寻找更高效的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法采用饲养细胞和细胞因子相结合的方式培养NK细胞，提高了体外扩增后NK细胞的数量和活性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞与饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；
(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有细胞因子组合物的培养基培养，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；
(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞进行第二次共培养，得到活性增强型NK细胞。
本发明中，采用饲养细胞和细胞因子相结合的方式培养NK细胞，短期内提高了NK细胞的扩增倍数，增强了NK细胞的扩增能力、纯度和扩增后细胞状态，有利于应用于细胞免疫治疗领域。
优选地，步骤(1)所述饲养细胞包括Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞。
优选地，步骤(1)所述饲养细胞经γ射线处理。
优选地，所述γ射线的强度为100～200Gy，例如可以是100Gy、110Gy、120Gy、130Gy、140Gy、150Gy、160Gy、170Gy、180Gy、190Gy或200Gy。
优选地，步骤(1)所述外周血单个核细胞与饲养细胞的细胞数比例为1:(1～10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
本发明中，外周血单个核细胞与饲养细胞的细胞数比例在1:(1～10)的范围内，可以最大程度促进NK细胞的增长，有利于短期内获得大量的NK细胞，高于1:(1～10)的范围饲养细胞不能充分刺激NK细胞扩增，低于1:(1～10)的范围饲养细胞则会抑制NK细胞的扩增。
优选地，所述外周血单个核细胞与Daudi细胞的细胞数比例为1:(6～8)，例如可以是1:6、1:7或1:8。
优选地，所述外周血单个核细胞与B淋巴母细胞样细胞的细胞数比例为1:(3～5)，例如可以是1:3、1:4或1:5。
优选地，步骤(1)所述第一次共培养的时间为3～5天，例如可以是3天、4天或5天。
优选地，步骤(2)所述细胞因子组合物包括IL-12、IL-15和IL-18。
优选地，所述IL-12的终浓度为5～20ng/mL，例如可以是5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL。
优选地，所述IL-15的终浓度为5～20ng/mL，例如可以是5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL。
优选地，所述IL-18的终浓度为5～20ng/mL，例如可以是5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL。
优选地，步骤(2)所述培养的时间为12～24h，例如可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h。
本发明中，采用细胞因子组合物激活经第一次共培养的细胞群体12～24h，12～24h立即去除细胞因子组合物并采用饲养细胞与NK细胞进行第二次共培养，不仅实现了对经第一次共培养的细胞群体的充分活化，而且避免了NK细胞被细胞因子持续刺激、过度激活。
优选地，步骤(3)所述饲养细胞包括K562细胞、Daudi细胞或B淋巴母细胞样细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞的细胞数比例为1:(0.1～5)，例如可以是1:0.1、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与K562细胞的细胞数比例为1:(3～5)，例如可以是1:3、1:4或1:5。
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与Daudi细胞的细胞数比例为1:(0.1～3)，例如可以是1:0.1、1:0.5、1:1、1:2或1:3。
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与B淋巴母细胞样细胞的细胞数比例为1:(0.1～3)，例如可以是1:0.1、1:0.5、1:1、1:2或1:3。
优选地，步骤(3)所述第二次共培养的时间为1～2天。
作为优选技术方案，本发明提供了一种活性增强型NK细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞与Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞按照1:(1～10)的比例进行第一次共培养3～5天，所述Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞预先经100～200Gyγ射线处理，得到经第一次共培养的细胞群体；
(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有终浓度为5～20ng/mLIL-12、5～20ng/mL IL-15和5～20ng/mL IL-18的培养基培养12～24h，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；
(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与K562细胞、Daudi细胞或B淋巴母细胞样细胞按照1:(0.1～5)的比例进行第二次共培养1～2天，得到活性增强型NK细胞。
本发明中，采用饲养细胞、细胞因子和饲养细胞相结合的方式培养NK细胞，并优化饲养细胞、细胞因子的添加类型和添加顺序，不仅增强了NK细胞的扩增能力，而且避免了对NK细胞的过度激活，有利于获得高纯度、高数量、高活力的NK细胞，达到了最优的NK细胞的扩增效果。
第二方面，本发明提供了一种NK细胞，所述NK细胞采用第一方面所述的方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，按照特定顺序添加饲养细胞或细胞因子组合物，显著提高了NK细胞的体外扩增能力、扩增的NK细胞纯度、扩增后细胞的状态；
(2)本发明在两次饲养细胞法之间短时间利用细胞因子刺激法激活NK细胞，不仅实现了对经第一次共培养的细胞群体的充分活化，而且避免了NK细胞被细胞因子持续刺激、过度激活；
(3)本发明的方法工艺简单、成本低廉、效率较高，制备得到高纯度、高数量、具有显著提高的细胞杀伤能力的NK细胞，在细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。
附图说明
图1为不同NK细胞与SKOV3共培养后分泌IFN-γ的能力。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和2×106个Daudi细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加5ng/mL hrIL-12、5ng/mL hrIL-15和5ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和2×105个K562细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
实施例2
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和5×106个B淋巴母细胞样细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加5ng/mL hrIL-12、10ng/mL hrIL-15和10ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和2×106个B淋巴母细胞样细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
实施例3
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和5×106个Daudi细胞(经200Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养5天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加10ng/mL hrIL-12、10ng/mL hrIL-15和20ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和1×107个Daudi细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
实施例4
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC、2×106个Daudi细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)和2×106个B淋巴母细胞样细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养5天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加20ng/mL hrIL-12、20ng/mL hrIL-15和20ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和1×107个K562细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
实施例5
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC、2×106个Daudi细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)和2×106个B淋巴母细胞样细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养5天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加20ng/mL hrIL-12和20ng/mL hrIL-15，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和1×107个K562细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
对比例1
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和2×106个Daudi细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3天；
将细胞悬液于300×g离心10min，弃上清，用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加5ng/mL hrIL-12、5ng/mL hrIL-15和5ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
对比例2
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和5×106个B淋巴母细胞样细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3天，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和2×106个B淋巴母细胞样细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
对比例3
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加10ng/mL hrIL-12、10ng/mL hrIL-15和20ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
计数完毕后，取出收集细胞中的2×106个细胞和1×107个Daudi细胞均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
对比例4
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC和2×106个Daudi细胞(经100Gy的γ射线辐射半小时)均匀混合于10mL NK细胞培养液中，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
对比例5
将2×106个来源于健康捐献者外周血的PBMC用10mL新鲜的NK细胞培养液重悬，按液体总体积计，添加10ng/mL hrIL-12、10ng/mL hrIL-15和20ng/mL hrIL-18，接种于细胞培养瓶内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，收集细胞计数；
取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
NK细胞的纯度分析
实施例1～5和对比例1～5制备的NK细胞的纯度如表1所示，可以看出，实施例1～5制备的NK细胞的纯度显著优于对比例1～5制备的NK细胞的纯度，对比例1～3分别缺少第二次与饲养细胞共培养、细胞因子刺激或第一次与饲养细胞共培养的步骤，使得NK细胞的扩增能力未能充分激发，降低了NK细胞的纯度，对比例4和5仅采用饲养细胞法或细胞因子刺激法培养NK细胞，NK细胞的纯度显著低于实施例。
表1
编号 NK细胞的纯度
实施例1 83.2％
实施例2 85.8％
实施例3 92.1％
实施例4 88.5％
实施例5 78.6％
对比例1 66.2％
对比例2 34.4％
对比例3 56.1％
对比例4 31.5％
对比例5 33.6％
NK细胞的扩增倍数分析
实施例1～5制备的NK细胞的扩增倍数如表2所示，细胞总数扩增倍数得到显著提高，提高幅度最高可达约830倍。
表2
编号 NK细胞的扩增倍数
实施例1 约450倍
实施例2 约620倍
实施例3 约790倍
实施例4 约830倍
实施例5 约390倍
NK细胞的杀伤作用
将实施例1～5和对比例1～5的NK细胞分别与5×103个卵巢癌细胞系SKOV3共培养于U型96孔板中，效应细胞与靶标细胞的比例(E:T)为4:1，每组实验重复3次；
经过18小时的共培养后，采用IFN-γELISA检测试剂盒对效应细胞与靶标细胞的共培养上清进行检测。
结果如图1所示，实施例1～5制备的NK细胞与SKOV3共培养后，分泌大量的IFN-γ，明显高于对比例1～5。
综上所述，本发明将饲养细胞法和细胞因子刺激法相结合，按照特定顺序添加饲养细胞或细胞因子组合物，显著提高了NK细胞的体外扩增能力、扩增的NK细胞纯度、扩增后细胞的状态，制备得到高纯度、高数量、具有显著提高的细胞杀伤能力的NK细胞，在细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种活性增强型NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞与饲养细胞进行第一次共培养，得到经第一次共培养的细胞群体；
(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有细胞因子组合物的培养基培养，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；
(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞进行第二次共培养，得到活性增强型NK细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述饲养细胞包括Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞；
优选地，步骤(1)所述饲养细胞经γ射线处理；
优选地，所述γ射线的强度为100～200Gy。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述外周血单个核细胞与饲养细胞的细胞数比例为1:(1～10)；
优选地，所述外周血单个核细胞与Daudi细胞的细胞数比例为1:(6～8)；
优选地，所述外周血单个核细胞与B淋巴母细胞样细胞的细胞数比例为1:(3～5)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次共培养的时间为3～5天。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞因子组合物包括IL-12、IL-15和IL-18；
优选地，所述IL-12的终浓度为5～20ng/mL；
优选地，所述IL-15的终浓度为5～20ng/mL；
优选地，所述IL-18的终浓度为5～20ng/mL；
优选地，步骤(2)所述培养的时间为12～24h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述饲养细胞包括K562细胞、Daudi细胞或B淋巴母细胞样细胞中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述活化的经第一次共培养的细胞群体与饲养细胞的细胞数比例为1:(0.1～5)；
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与K562细胞的细胞数比例为1:(3～5)；
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与Daudi细胞的细胞数比例为1:(0.1～3)；
优选地，所述活化的经第一次共培养的细胞群体与B淋巴母细胞样细胞的细胞数比例为1:(0.1～3)。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述第二次共培养的时间为1～2天。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞与Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞按照1:(1～10)的比例进行第一次共培养3～5天，所述Daudi细胞和/或B淋巴母细胞样细胞预先经100～200Gyγ射线处理，得到经第一次共培养的细胞群体；
(2)将所述经第一次共培养的细胞群体采用含有终浓度为5～20ng/mLIL-12、5～20ng/mL IL-15和5～20ng/mL IL-18的培养基培养12～24h，得到活化的经第一次共培养的细胞群体；
(3)将所述活化的经第一次共培养的细胞群体与K562细胞、Daudi细胞或B淋巴母细胞样细胞按照1:(0.1～5)的比例进行第二次共培养1～2天，得到活性增强型NK细胞。
10.一种NK细胞，其特征在于，所述NK细胞采用权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501127A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种重编程nk细胞的培养方法
CN112626029A (zh) * 2020-12-22 2021-04-09 深圳市赛欧细胞生物科技有限公司 一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用
CN115232789A (zh) * 2022-09-13 2022-10-25 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014028453A2 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells and uses thereof
US20150366910A1 (en) * 2013-02-05 2015-12-24 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells from placenta
CN105624107A (zh) * 2015-09-21 2016-06-01 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
CN105838677A (zh) * 2016-05-20 2016-08-10 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种高效扩增冷冻保存nk细胞的方法及其应用
CN109666639A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 浙江大学 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法
WO2019089955A1 (en) * 2016-07-25 2019-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014028453A2 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells and uses thereof
US20150366910A1 (en) * 2013-02-05 2015-12-24 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells from placenta
CN105624107A (zh) * 2015-09-21 2016-06-01 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种多种淋巴细胞亚群的扩增方法及其应用
CN105838677A (zh) * 2016-05-20 2016-08-10 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种高效扩增冷冻保存nk细胞的方法及其应用
WO2019089955A1 (en) * 2016-07-25 2019-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use
CN109666639A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 浙江大学 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAN YANG等: "Superior Expansion and Cytotoxicity of Human Primary NK and CAR-NK Cells from Various Sources via Enriched Metabolic Pathways", 《MOLECULAR THERAPY: METHODS & CLINICAL DEVELOPMENT》 *
来元亮: "NK细胞体外大规模扩增试验研究", 《新乡学院学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501127A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种重编程nk细胞的培养方法
CN112501127B (zh) * 2020-12-21 2023-10-10 广东昭泰细胞生物科技有限公司 一种重编程nk细胞的培养方法
CN112626029A (zh) * 2020-12-22 2021-04-09 深圳市赛欧细胞生物科技有限公司 一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用
CN112626029B (zh) * 2020-12-22 2022-12-20 深圳市赛欧细胞技术有限公司 一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用
CN115232789A (zh) * 2022-09-13 2022-10-25 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法
CN115232789B (zh) * 2022-09-13 2024-03-01 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

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