JPH02109976A - Ｌａｋ活性リンパ細胞の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 養子免疫療法は、免疫システムを巧みに取扱うことを目
指しており、被検者に免疫学的に活性な細胞を投与し、
種々の有害な病気の状態に対する被検者の免疫応答を高
揚させることを含んでいる。

免疫不全を引き起こす、がんやその他の病気は、この方
法に対し正の応答を示した。まず養子免疫療法は処置を
する被検者又は別の被検者から多数のリンパ細胞の採取
が必要でなる。そこからこれらの細胞をインターロイキ
ン−２（ｒＬ−２）又は組換えインターロイキン−２（
ｈＩＬ−２）のような免疫促進剤の存在下、インビトロ
で培養し、免疫活性が増大した細胞を生成する。

養子免疫療法によって成し遂げられる多くの有益な活性
に寄与している１つの免疫学的に活性な細胞集団は、ナ
チュラルキラー細胞もしくは大顆粒リンパ細胞（Ｌ　Ｇ
　Ｌ）として知られている前駆細胞群に由来するリンホ
カイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と呼ばれるある種類
のリンパ細胞である。ＬＧＬ及びＬＡＫ細胞のいずれも
、腫瘍細胞もしくはウィルス感染細胞を含むある種の標
的細胞を選択的に溶解もしくは殺生することができる。

これら免疫学的に活性な細胞を患者に投与したとき、そ
れらはその病気の状態を緩和する働きをする。例えば、
養子免疫療法は種々のかん及び腫瘍の抑制を効果的に引
き起こすことが報告されている。

成功した養子免疫療法では、困難で高価な操作を必要と
する苦しんでいる患者に、多数のこれらの細胞を投与す
る。現在行なわれているように、およそ２Ｘ１０”から
２ＸＩＯ”細胞が治療で望ましい応答を示すのに必要で
ある（その細胞が十分なＬＡＫ活性をもつことを仮定す
ると）。まず、正常なリンパ細胞集団からＬＡＫ前駆（
Ｌ　Ｇ　Ｌ）細胞を単離する問題がある。そして、第２
には、これらの細胞を膨張させ、大容量のＬＡＫ活性リ
ンパ細胞を作る問題がある。ＬＡＫ前駆ＬＧＬが治療を
受ける被検者及びしばしばすでにリンパ細胞が同温した
被検者からりューコフェレシスによって得るときは、特
にこのことは正しい。

従って、正常なリンパ細胞群からＬＡＫ前駆細胞（ＬＧ
Ｌ）を効果的に単離し、かつ、それらを膨張させて多数
のＬＡＫ活性リンパ細胞を作る方法の開発が必要である
。

（本発明の概要） 本発明は、ＬＧＬのみが粘着するプラスチックもしくは
ガラスの容器中、ｈＩＬ−２とともにリンパ細胞を培養
することを含む準精製リンパ細胞群からＬＧＬを単離す
る方法を含んでいる。

また本発明は、ｈＩＬ−２中、プラスチックもしくはガ
ラス粘着性ＬＧＬを再培養することを含む、ＬＧＬの膨
張及びＬＡＫ活性リンパ細胞への変換のための方法を含
んでいる。

また本発明は、本発明の方法に従って入手したＬＡＫ活
性リンパ細胞を被検者に投与することを含む、免疫療法
を含んでいる。

また本発明は、プラスチックもしくはガラス粘着性によ
って単離した大顆粒リンパ細胞由来のＬＡＫ活性リンパ
細胞の比較的均一な組成物同様、大顆粒リンパ細胞の比
較的均一な組成物を含んでいる。

１Ｌ−２ ｈＩＬ ＡＫ ＬＧＬ Ｋ Ｃ３ ＢＳ ＩＴＣ 定義 ヒト・インターロイキン−２ ２Ｍ１換えヒト・インターロイキン ２もしくはムティン物又は他の 修正物 リンホカイン活性化キラー 大顆粒リンパ細胞。

ナチュラルキラー細胞 ウシ胎児血清 リン酸緩衝溶液 フルオレセインーイソチオシアネ ート トリチムウ化チミジン ライシャー３４４ラツト由来の 肺臓単核白血球 ＮＫ感受性で、かつＮＫ活性の 指標として使われる、マロニーウ ’Ｈ−ＴｄＲ Ｆ３４４牌細胞 ＹＡＣ−１細胞 イルス誘導リンパ腫細胞 Ｐ８１５細胞　ＬＡＫ感受性でかつＬＡＫ活性の指標と
して使われる、ＮＫ耐性肥 満細胞腫細胞 ＬＡＫ培地　　感受性リンパ細胞中にＬＡＫ活性を誘導
するのに十分な量のｒＩＬ−２ を含む組織培養培地 ならし培地　　リンパ細胞又はその他の適当な細胞がす
てにＬＡＫ活性を増加する ため培養してあったＬＡＫ培地。

本発明は、ｒＩＬ−２による刺激後のＬＧＬの最初の応
答の１つ、あるいはいくつかの組合せとして、プラスチ
ックもしくはガラスへのそれらの付着があるという発見
を含んでいる。ｈＩＬ−２活性化プラスチツクまたはガ
ラス粘着性ＬＣＬは、特に活性化リンパ細胞由来のなら
し培地存在下、３〜４日間の培養で３０倍から１００倍
以上にまで膨張し非常に高濃度のＬＡＫ活性をもつ細胞
を生ずる。

本発明は、ＬＧＬのみが粘着するプラスチックもしくは
ガラス製の容器中、ｈＩＬ−２とともに重積製リンパ細
胞を培養することを含む重積製リンパ細胞からＬＧＬを
単離する方法を含んでいる。

ｈＩＬ−２はｒｈＩＬ−２である方が好ましい。

また重積製のリンパ細胞集団を、約１００〜１２００Ｕ
／’ａ＋ＩｌのｒｈＩＬ、−２を含む標準組織培養培地
中、約３２〜３８℃で２〜７２時間培養することが好ま
しい。

特に、本積製リンパ細胞集団を、約１０００Ｕ／ｌｌｌ
１のｒｈＩＬ−２を含む標準組織培養培地中、約３７℃
で約２４．４８又は７２時間培養することが好ましい。

精製したリンパ細胞集団は、処理される被検者又は別の
被検者から得られる不均一な細胞から誘導される。もし
、その細胞がｍ織に由来するなら、単細胞サスペンショ
ンは適当な培地又は希釈剤を用いて調製する。また、細
胞は末梢血液からベナパンクチアーにより引き出し、ヘ
パリン処理した容器に入れられることもある。

まず単核細胞を従来法により不均一な集団から単離する
。はの方法の１つは、ここに参考として組入れた、キャ
ンサー・リサーチ（ＣａＩＩｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）
　、４２巻、９１３〜９１８　（１９８２）；ジャーナ
ル・オフ゛・イムノロジー（Ｊ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．）
１３０巻、９５８〜９６４頁（１９８３年）中の先に示
したパーコール・ハイバク勾配遠心がある。

もし、単核細胞を血液又は肺細胞から得たときは、フィ
コール−ハイバク勾配遠心後、それらをさらに当分野で
よく知られている方法に従がい精製し、卓球、マクロフ
ァージ及びＢ細胞を除く。

例えば、単核細胞調製物を公表されている方法（ここに
参考として組入れた、ヨーロピアン　ジャーナ７Ｌ／　
φオブ自イムノロジー（↑ｈａ　ＥｕｒｏｐｅａｒａＪ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇν）、３巻、
６４５頁（１９７３年））に従がい、ナイロンウールカ
ラムに通す。

ナイロンウール非粘着性細胞は、本発明の方法に従って
、さらに精製することができる本積製リンパ細胞集団を
構成している。

その後、ＬＧＬをプラスチック又はガラス粘着現象を用
いて、この精製したリンパ細胞集団から単離する。

これらの車積製細胞を、当分野で知られている細胞培養
法を用い、ｈ　Ｉ　Ｌ−２を含む培養培地の入ったプラ
スチック又はガラス容器内で培養する。

およそｍ１当り１０３〜１（１９）個の生細胞を、ｈＩ
Ｌ−２含有組織培養培地中で培養した。この細胞を約１
００”ｌ　２００Ｕ／　ｌｌ１ｌのｈＩＬ−２を含む標
準Ｍｉ織培養培地中、約３２〜３８℃で、２〜７２時間
の間の種々の時間培養する。ｈＩＬ−２での活性化で、
ＬＧＬはプラスチック又はガラスへの粘着性を生じさせ
る表面の変化を迅速に起こす。プラスチック又はガラス
粘着性は、ｂｌＬ　−２中での培養わずか２時間後に明
確に現れるが、２時間プラスチック粘着細胞の増殖能は
制限され、その結果それらの膨張及びＬＡＫ活性リンパ
細胞への変換は減少する。約２４〜７２時間インキュベ
ートしたプラスチック又はガラス粘着性細胞は、膨張と
、ＬＡＫ活性リンパ細胞への変換のより大きい能力を示
す（第１表参照）。

必要とされるインキュベーション期間後、組織培養培地
をプラスチック又はガラス表面に付着した細胞のみをそ
こに残してデカンテーションする。

これらの細胞は、第３表で示した表面マーカーテストで
明白なように比較的均一なＬＧＬ集団を示している。プ
ラスチック又はガラス粘着細胞は、温培養培地又は他の
適当な等張溶液で数回洗浄し、無関係な非プラスチック
又はガラス粘着性細胞及び細胞破壊物を除かなければな
らない。

また、本発明は、本発明の方法に従って単離したプラス
チック又はガラス粘着性ＬＧＬをｈＩＬ−２中で再培養
することを含む、ＬＧＬの膨張及びＬＡＫ活性リンパ細
胞への変換に関する方法を含んでいる。

再培養培地は１００〜１２０００／ｍ１のｒｈＩＬ−２
を含む標準組織培養培地であることが好ましい。

プラスチック又はガラス粘着性ＬＧＬは、３２〜３８℃
、４〜８日間再培養することが好ましい。

特に、プラスチック又はガラス粘着性細胞を、約１００
０Ｕ／ｎ＋ｌのｒｈＩＬ　　２を含む標準組織培養培地
中約３７℃で、約４〜８日間再培養することが好ましい
。

ＬＡＫ活性をもつ細胞の最適な生成に用いる標準組織培
養培地をルーチンな実験で測定した。−般に１００〜１
２００Ｕ１０＋ｌのｈＩＬ−２、好ましくは約１０００
０／ｓｊ！が必要である。Ｆｅ２、添加物及び抗生物質
を通常な割合で含む、標準細胞培養培地で一般に十分で
あり、そしてヘペスバッファは培地から除かれる。ＬＡ
Ｋ細胞を生成するのに十分なｈＩＬ−２を含む標準組織
培養培地とＬＡＫ培地と呼ぶ。

またならし培地をプラスチック又はガラス粘着性ＬＧＬ
からＬＡＫ活性細胞を生成し、かつ膨張するのに用いこ
とができる。ならし培地とは、すでに細胞を培養するの
に用いたＬＡＫ培地である。

それは、非粘着性の細胞を遠心及び濾過で取除いて作る
。ならし培地は１００％濃度もしくは、新鮮なＬＡＫ培
地でｔｉｔに希釈して用いられる。

それから、プラスチック又はガラス粘着性細胞を約３２
〜３８℃で約４〜８日間、最も好ましくは、約３７℃で
５〜７日間再培養する。非プラスチック又はガラス粘着
性ＬＧＬは培養培地をデカンテーションすることにより
取除き、ついで粘着性ＬＧＬを数ミリリットルのＥＤＴ
Ａを含むＰＢＳのような適当な希釈剤を加えて、プラス
チック又はガラスからひき離す。

この方法は、高度に精製したＬＡＫ前駆細胞の高レベル
の膨張（１００倍まで）を提供し、従って治療又は、イ
ンビトロの実験に用いるのに十分な数の比較的均一な膨
張したＬＡＫ活性細胞の培養を可能にしている。

本発明は、ＬＧＬがプラスチック又はガラスへの粘着を
可能にする表面の変化を迅速に行うという発見を含んで
いる。プラスチック又はガラス粘着性細胞がＬＧＬ／Ｎ
Ｋ細胞であるという証拠には次に示すものが含まれる。

１）その細胞はＮＫ細胞に特徴的な表面マーカーを発現
している（第３表）。

２）最初にその細胞は高レベルのＹＡＣ−１（ＰＨ１０
ではない）細胞溶解活性を含んでいる。

３）その細胞はｒＩＬ−２に応答してＬＡＫ細胞溶解活
性を発現する。

４）その細胞は大顆粒リンパ細胞である。

この観察は、大部分のＬＡＫ前駆体活性がリンパ細胞の
ＬＧＬ／ＮＫ群に含まれることを示したラット、ヒト及
びマウスについての従来の結果と一致している。

ＬＧＬはＤＮＡを合成することができ、かつｈ［Ｌ−２
に応答して非常に迅速に増殖するということは当分野で
はよく知られていることである。

粘着性ＬＧＬの増殖は、培養後２４時間後には確認する
ことができ、４８〜７２時間でプラトーレベルに到達す
る（第４図）。

この方法を用いたＬＧＬ／ＮＫ細胞の膨張は標準のＬＡ
Ｋ培養法よりも秀れているように思われる。これらの培
養は、培養当り全細胞溶解活性を有意により高く発生し
、いくつかのＮＫ耐性新鮮腫瘍標的に対するより高いレ
ベルのＬＡＫ活性を生ずる。未分画リンパ細胞集団中、
粘着性ＬＧＬは、はんのわずかな割合しか示さず（バル
ク培養）（約１〜３％）、またこれらの細胞は、バルク
培養でみられるものより、より高い細胞分解活性を生ず
る急速な膨張が可能なことから、このことが起こるらし
い。

また本発明は本発明に従って得たＬＡＫ活性リンパ細胞
を被検者に投与することを含む、免疫療法を含んでいる
。

この細胞は単独もしくは、ｈＩＬ−２もしくは他のサイ
トカイン類又はリンホカイン類のような１つ以上の免疫
促進剤と組合せて投与される。もし免疫療法に用いるＬ
ＡＫｌ［胞が処置を受ける患者から、リューコフェレシ
スにより入手されるなら、患者はりューコフェレシス前
に、ｈＩＬ−２そして、または他の免疫促進剤で処理さ
れる。

単独もしくは、他の既知免疫促進剤と組合せでＬＡＫ細
胞を使用する養子免疫療法は、当分野ではよく知られて
いるものである。ジャーナル・オプ・イムノロジー（Ｔ
ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
、１３５巻、１号、６４６〜６５２頁（１９８５年、７
月）　；ニューイングランド・ジャーナル・オプ・メデ
ィシン（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）　３１６巻１５号、８８
９〜８９７頁（１９８７年４月９日）；ニュー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）
、３１３巻、２３号、１４８５〜１４９２頁（１９８５
年、１２月５日）参照。

本発明の方法に従って得たＬＡＫ活性リンパ細胞は、上
述のものも含む従来の方法に従って投与することができ
る。

本発明は、説明のみを目的として次にあげた例でより詳
細に説明される。

（実施例１） 大顆粒リンパ細胞の単離と、ＬＡＫ活性細胞毒性リンパ
細胞への膨張を説明している。

（材料と方法） 動物、オスのフィッシャー３４４ラツト（７５〜１００
グラム）をタコニック・ファームス（Ｔａｃｏｎｉｃ　
Ｆａｒｎ＋５）（ＮＹ、ジャーマンタウン）から購入し
た。

腫瘍細胞；ルーチンに、ＮＫ耐性マストサイトーマ、Ｐ
８１５の溶解を、ＬＡＫ活性の指標として用いた。その
他の標的細胞には、２種のＮＫ耐性の同系ラット腫瘍細
胞、ＭＡＤＢ　１０６（Ｆ３４４ホ乳類アゾンカルシノ
ーマ）（８）、及びＣＲＮＫ−１６（Ｆ３４４ＬＧＬ白
血球）、これらの細胞系列の全てを１０％ＦＣ３及び抗
生物質を含むＲＰＭＩ培地中で生育させた。いくつかの
場合において、新鮮な腫瘍外植体を、ＣＲＮＫ−１６白
血球の新鮮な肺臓腫瘍及びＭＡＤＢ　１０６アデノカル
シノーマの固体ｌ１Ｉｌ瘍外植体を含む標的として用い
た。

ＮＫ感受性モロニーウィルス誘導ＹＡＣ−１リンパ腫を
、ＮＫ活性の指標として用いた。

インターロイキン−２；ヒト組換えインターロイキン−
’ｌ　（ｒｈＩＬ−２）は、セタス・コーポレーション
（ＣＡ州、エメリービル）から人手し、それは、タンパ
ク質■当り１．２５ＸＩＯ６ユニノトのｒｈＩＬ　　２
を含んでいた。

リンパ細胞の調製；肺臓を無菌的に取り出し、単細胞サ
スペンションを、１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４
０で調製した。肺臓単核細胞は、フィコール・ハイバク
勾配（密度１，０７７）で３００Ｘｇ、２０分間の遠心
することにより得た。

末梢血液を心臓からヘパリン処理した注射器で取り出し
た。その後単核細胞は、フィコール・ハイバク勾配で３
００Ｘｇ、３０分間の遠心により得られる（密度１，０
７７）。肺臓又は末梢血液単核白血球はルーチンにナイ
ロンウールカラムに通し、単球／マクロファージ及びＢ
細胞を除いた。１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０２ａ
ａｌ中の１０”個の肺臓細胞を滅菌したナイロンウール
（ＮＹ州、へソファロー、セルラー・プロダクツ社）６
ｇを入れた１０ｍｊ？シリンジに入れた。この細胞を３
７℃で１時間インキュベートしてからそのナイロンウー
ルを、１０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ−１６４０（３７℃）
２０＋＋１！でおだやかに（無理に押し出さずに）洗浄
する。非粘着性の細胞を集め、洗浄して使用した。この
操作により、牌Ｒ３ＰＩ製物中のＢ細胞の割合は、−貫
して２％以下となり（抗１ｇ抗体を用いたフローサイト
メトリー分析による）、また、単球／マクロファージの
割合は、０．３％以下に減少した（ギムザ染色細胞遠心
調製物の形態分析による）。いくつかの実験では、ＬＧ
Ｌを、非粘着性血液又は牌ｌ１ｉＩｔａ胞から、レイノ
ルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）等によって報告されているよ
うに、パーコール密度遠心により精製したくジャーナル
・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、）　、１
２７巻、２８２頁）、簡便的に、ナイロンウール非粘着
性白血球を、４８．５２．５６及び６０％パーコールの
密度を有する４ステツプのパーコール勾配にのせた。そ
の勾配を、４００ｘｇ、３０分間遠心し、ＬＧＬを４８
１５８％の境界面から得た。

（ＬＡＫ活性をもつ細胞の生成） Ａ、標準的培養、ＬＡＫ活性をもつ細胞を、ｒＩＬ−２
中での培養から生成する。ＬＡＫ活性を生成するための
培地条件は、予備実験から決定しくそれは次のようなも
のである。ＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ製）に１０
％加熱失活化ＦＣ３（ギブコ製）、２ｍＭグルタミン、
５Ｘ１０−’Ｍ２メルカプトエタノール、１０”Ｕ／ｖ
ａｌのｒＩＬを含む抗生物質（ストレプトマイシン／ペ
ニシリン）を補った（以後ＬＡＫ培地と呼ぶ）。ヘペス
バソファは通常、培地から省いた。リンパ細胞を、３７
℃、５％ｃｏ、／９５％空気の雰囲気下、ＬＡＫ培地中
で２Ｘ１０ｂ生細胞／’ｓ＋ｊ！の光学密度になるまで
培養した。

Ｂ、粘着培養、Ｔ−７５フラスコ中（ＮＹ州、コーニン
グ、コーニング社）５０Ｘ１０３ナイロンウ一ル非粘着
性単核白血球を２５ｍＩＬＡＫ培地で（１００ＯＵ／　
ｍＪｒｈＩＬ−２含有）培養した。この細胞を３７℃で
種々の時間（２〜７２時間）培養し、その後、非粘着細
胞をデカンテーションし、粘着細胞を、２％ＦＣ３を含
む温ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０（約３７℃）２０ｍ＋７！
で３回洗浄した。

それから、この粘着細胞を新鮮なｒｈＩＬ　　２を含む
新鮮なＬＡＫ培地もしくは最初にそれらを培養したなら
し培地に２０＋＋ｊ！に取り出した。このならし培地は
、非粘着性細胞を遠心で除き、０．４５ミクロンのミリ
ポアフィルタ−に培地を通すことにより調製した。通常
ならし培地は１００％濃度の新鮮なものもしくは、新鮮
なＬＡＫ培培でｌ：ｌに希釈したものを使用した。この
培地も、成長促進活性を失うことなしに、−２０℃で保
存することができた。それからこの培養を計５〜７日間
続行した。粘着性ＬＧＬを取るため、その培地をデカン
テーションし、５　ｖａｌの５ｍＭ　　ＥＤＴＡＰＢＳ
溶液を加えて、そのフラスコをゴム製ポリスマンでこす
った。例２で述べられる表面マーカー分析で示されるよ
うに、比較的均一なＬＡＫ活性リンパ細胞が得られた。

実施例２ 表面マーカー分析のため、例１で得られた２ＸＩＯ’個
のリンパ細胞を、Ｏ，１ｍｌの染色バッファ　（ＰＢＳ
　ｐｆｌ　７．３．０．１％アジ化ナトリウム、２％Ｆ
Ｃ５）を含む１２Ｘ７５鰭ガラスチユーブに入れた。種
々の抗血清又は正常な血清（最終ｌ：２０〜Ｉｇｌｏｏ
希釈）を加えて、４℃、３０分間インキュベーションし
た。この細胞を２度洗浄し、第１次抗体の抗１ｇＧのＦ
ＩＴＣラヘルしたＦ（ａｂ’）ｚ断片溶液（カペル製）
に再懸濁した。４°Ｃで３０分後、この細胞を２度洗浄
し、１％パラホルムアルデヒド溶液中に再懸濁し、Ｆ　
Ａ　Ｃ５ｓｔａｒフローサイトメーター（カリホルニア
、マウンテンビュー、ベクトン、ディッキンソン製）で
蛍光分析した。

一連の抗体を本研究で使用したが、これらには、マウス
・モノクローナル抗体Ｑｘ１３　（ＣＤ８、ｒｌ）、０
ｘ１９　（ＣＤ５、ｒ　１）　、０Ｘ６（Ｉａ　。

ｒ　１）　、０Ｘ３９　　（ＣＤ２５、（ＩＬ−２レセ
プター、ｒｌ））（これら全て、ＮＹ、ウェストバリー
；アキュレート、サイエンティフィック社から購入）が
ある。これら抗体を各々、予備的投与一応答滴定に基づ
き１　：　１００希釈で使用した。

モノクローナルＲ１−３８３（ｒ２ｂ）（ＣＤ５）はワ
コーケミカル（テキサス・ダラス）から購入し、１：２
００希釈で使用した。ＮＫ細胞との反応性を示す、ウサ
ギ抗ラミニン抗血清（Ｒ６（１９））及びモノクローナ
ル抗うミニンＢ２鎖（Ｌａｎ＋　　　１）（ｒ２ｂ）が
得られた。

表面マーカー分析を行ない、プラスチック粘着性ＬＧＬ
群に対するリンパ細胞の相対的投与を測定した。第２表
に示したデータは、ｒＩＬ−２誘導プラスチック粘着性
肺臓細胞ＬＧＬ（２４時間粘着細胞、９６％ＬＧＬ）は
、ラットＮＫ細胞に特徴的な表面マーカーを発現するこ
とを示している。これらの細胞はＯＸ　８　　（ＣＤ　
８）　”　、ａｓａｌｉ。

ＣＭ”、、及びＩａｎ＋１ｍ１ｎ　”であるが、０×１
９（ＣＤ５）−、Ｒ１−３８３（ＣＤ５）−、Ｗｅ／２
５　（ＣＤ４）−１Ｏｘ３９　（ＣＤ２５）■ａ＝及び
Ｉｇ−である。同様なマーカー特性が、４８時間粘着牌
細胞ＬＧＬにも観察された（第２表）。Ｏｘ６　（ｌａ
）マーカーは２４時間低いパーセンテージで粘着性細胞
上に存在するにもかかわらず、これら細胞の５０％近く
が４８時間でこのマーカーを発現した。２４時間及び４
８時間粘着ＬＧＬに関するＯｘ５　（Ｉａ）抗原の発現
増加は、これらの細胞が活性化しており、かつ単球／マ
クロファージの混入がないことを示すことに注目すべき
である。これら粘着性細胞に食作用はなかった（ラテッ
クスビーズに対し゛）。

第２表のデータは、プラスチック粘着性肺細胞の発現型
は基本的に、パーコール勾配遠心で精製した血液細胞の
ものと同一であった。プラスチック粘着法を用いる利点
は、粘着性肺細胞ＬＧＬの発現型をパーコール精製した
肺細胞ＬＧＬと比較すれば明白である。この場合、パー
コール精製した肺細胞の５５％だけがＬＧＬであり、実
験的なレベルのＴ細胞の混入（約１０％）があった。

プラスチック粘着性ＬＧＬ由来のＬＡＫエフェクター細
胞の発現型も測定した。このデータは第３表に示した。

４８時間粘着牌細胞をさらに３日間培養し、膨張させて
、ＬＡＫエフェクター細胞を作った０表面マーカー分析
で、ＯＸ　８　、ａｒａｉｌ。

Ｇ　Ｍ　１．１ａａ＋１ｍ１ｎ及びＩａ表面マーカーを
高レベルでこれらの細胞が発現していることが分った。

ｐａｎＴｍ胞マーカー（ＯＸ１９、Ｒ１−３８３）、ヘ
ルパーＴ細胞マーカー（Ｗ３／２５）又はＢ細胞マーカ
ー（Ｉｇ）を発現する細胞はほとんどなかった（０〜５
％）。さらに、０×３９マーカー（ＩＬ−２レセプター
）を発現するのは、応答する粘着性細胞のわずか９％で
ありその強度も比較的低かった。この発現型はｒＩＬ−
２中で５日間生育させた後の、パーコール精製した末梢
血液ＬＧＬから得たものと同一であった。標準的バルク
培養物中に存在する細胞の発現型も比較のため示した。

実施例３ 本発明のＬＡＫ活性リンパ細胞の細胞毒性テストは次の
ように行った。

細胞毒性は９６穴の丸底マイクロプレート（ＭＡ州、ケ
ンブリッジ、コスタ−社）を用いた標準４時間５１Ｃ，
放出マイクロサイトドキシティー検定法で測定した。標
的細胞を２Ｘ１０’個当り１００、ｃｒｃｔのＮａ、　
”Ｃｒｙ、を用いてラベル化し、洗浄７ｆｉ５０μｌ中
、ウェル当り５Ｘ１０’個細胞の割合で、９６穴培養プ
レートに植種した。それからエフェクター細胞のサスペ
ンションを、最終容積２００μｌとなるよう種々のエフ
エクター：ターゲソｌ−（・Ｅ：Ｔ）比で三つのウェル
に添加した。さらに３７℃で４時間インキュベーション
した後、上清１００μｌを各ウェルから採取し、ガンマ
カウンターで計数して実験的放出量（Ｅ　Ｒ）を測定し
た。

自然放出量（Ｓ　Ｒ）は標的細胞及び培地のみを入れた
ウェルで測定し、総放出１　（ＴＲ）は１％トリトンＸ
−１００を入れたウェルからデータを得た。ＳＲは決し
てＴＲの２０％を越えることはなく、またほとんどの実
験でＴＨの５と１５％の間の範囲にあった。細胞毒性率
は次の式 で計算した。

細胞毒性活性の溶解ユニットは種々のＥ：Ｔ比での値を
、プロットした線型回帰曲線から決定した。全ての場合
において、１溶解ユニツトは、５Ｘ１０”個の標的細胞
から２０％の特異的ゝ’Ｃｒ放出を引き起こすのに必要
なエフェクター細胞数と定義した。培養物当りの総溶解
ユニットは、溶解ユニット（２０）値を培養物中の全細
胞数倍することにより計算した。結果を第１表及び第４
表にまとめた。

第１表の代表的データは、ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ　−２中での
２時間培養内に、高レベルのＹＡＣ−１細胞溶解活性（
Ｐ８１５細胞溶解活性ではない）を発現するリンパ細胞
集団は、プラスチック表面に付着した。肺細胞を用いる
と、プラスチックに粘着する細胞の割合は２時間の時点
では低かった（約１〜２％）が、４８時間では、投入細
胞の約４．５％に増加した（第１表）。

ＮＫ感受性の標的ＹＡＣ−１に対する細胞溶解活性は、
２時間粘着細胞をテストしたとき高く、またその粘着細
胞を集め、２４時間または４８時間目にテストしたとき
、増加しつづけていた。４８時間粘着細胞由来の、ＹＡ
（、−１に対する細胞溶解活性は、非粘着性集団に見ら
れるものより約４０倍高く、また新鮮な未活性化、ナイ
ロンウール非粘着性肺細胞における細胞毒性活性よりも
約１８０倍高かった。Ｐ８１５標的細胞に対する細胞溶
解活性は２時間粘着細胞には検出されず、２４時間粘着
細胞では高く、４８時間粘着細胞でピークを示した。第
１表に示すデータも粘着ＬＧＬの増殖活性は、２時間粘
着細胞では低いが２４．４８及び７２時間粘着細胞では
著しくなってきた。

実施例４ 膨張及びＬＡＫ活性の生成に対する粘着ＬＧＬを選択す
るための至適時間を決定するため、速度論理的実験を行
った。これらのデータを第２図に示した。２．２４．４
８又は７２時間に粘着性肺臓細胞ＬＧＬを採取し、自分
自身のならし培地巾計５日間培養した。粘着性細胞を集
めた時間とは無関係に、同レベルの細胞毒性が単位細胞
当りに生成しているにもかかわらず（１０３細胞当りＬ
Ｕ２０）、培養物当りの全溶解ユニットは、明らかに、
４８時間目に採取した粘性細胞由来のものが最も高かっ
た。２時間粘着細胞から得られた、培養物当りの全溶解
ユニットのレベルが低いことは、次の５日間での膨張レ
ベルが低いことと同時に、２時間目に得られた粘着細胞
数が少ないことを示している。４８時間培養を選択した
。

実施例５ プラスチック粘着性ＬＧＬの至適生育のためのインター
ロイキン−２投与・応答関係を測定した。

投与・応答実験は、粘着性肺細胞の生成及び膨張に必要
な至適ｒｈＩＬ−２レベルを測定するよう計画された。

従って、２０ｘ１０”個のナイロンウール非粘着性肺細
胞を、別々のＴ−２５フラスコに入れ、別々の濃度のｒ
ＩＬ−２中で培養した。４８時間後、粘着性細胞を集め
、自分自身のならし培地を再び与え、さらに３日間（計
５日間）生育させた。これらの実験の結果を第３図に示
した。粘着性細胞はせいぜい４ユニット／ｍ７！（Ｄｒ
ＩＬ−２で生成する一方、膨張の至適レベル及び培養当
りの全細胞溶解活性の生成は、少なくとも１０Ｇユニツ
ト／１ａｌｌのｒｈＩＬ−２を含む培養で得られる。ラ
ットに対しても、これが、標準バルク培養中のＬＡＫ活
性を生成するための至適ｒｈＩＬ−２投与範囲である。

実施例６ インビトロにおけるｒｈＩＬ−２活性化プラスチック粘
着ＬＧＬの膨張も研究した。第４図に示したデータは、
４８時間粘着細胞をさらに３〜４日間、ｒｈＩＬ−２中
で膨張させたとき（すなわち計５〜６日間の培養）、膨
張指標は、しばしば９０倍にまで到達したことを示して
いる。これを測定するため、４８時間粘着細胞（９７６
％ＬＧＬ）を集め、さらに、５Ｘ１０３細胞／ｌｌｌ１
の密度で再びブレーティングし、さらに３〜４日間生育
させた。これらの細胞はこの３〜４日間にわたり、その
密度は１．８ＸＩＯ’から３．０Ｘ１０３細胞／ｍｌに
到達した（第１図Ｂ、Ｄ及び第４Ａ図）。

いくつかの実験で（６回のうちの２回）、密度は４．５
Ｘ１０”細胞／ｒａｌまでにも到達した（もしくは、９
０倍の膨張）。さらに、粘着細胞を元々それらを生育さ
せたならし培地で培養したとき、指標は、粘着細胞を、
新鮮なｒｈＩＬ−２を含む新鮮なＬＡＫ培地で培養した
ときよりも２〜３倍高かったことが注目される（第４Ａ
図）。迅速な膨張は、培養当りの高レベルな全細胞溶解
活性の蓄積を伴う（第４Ｂ図）。

’Ｈ−ＴｄＲ取込み同様、高レベルの細胞膨張が注目さ
れるが、実験は、活発なりＮＡを合成する細胞の割合を
測定するように計画した。第４図に示した積重ねたデー
タは、４８時間培養により、粘着性細胞の８５％が”Ｈ
−ＴｄＲの２時間パルスで検出され多ようＤＮＡを合成
していた。このことは、細胞のわずか１８％しかＤＮＡ
を合成していない非粘着性細胞と著しい対比を示した。

実施例７ プラスチック粘着性ＬＧＬの膨張がより効果的で巾広い
細胞毒性（ＬＡＫ）キラー細胞を生成することが示され
た。

ナイロンウール非粘着性Ｆ３４４牌細胞を４８時間培養
し、プラスチック粘着性ＬＧＬを採集し、さらに３日間
、ならし培地中で培養した。それから、これらの細胞に
ついて、２つの異なる同系のＮＫ耐性標的細胞（ＭＡＤ
Ｂ　１０６及びＣＲＮＫ１６）の新鮮な外植体を含む、
いくつかの腫瘍細胞に対する細胞溶解活性をテストした
。膨張した粘着ＬＧＬの細胞溶解活性を標準条件下で生
成したＬＡＫ細胞のバルク培養物及び培養初期に５５％
のＬＧＬ及び少なくとも１０％の成熟Ｔ細胞を含むパー
コール精製した肺細胞ＬＧＬと比較した。

第４表のデータは、培養した精製粘着性ＬＧＬにおける
細胞溶解（ＬＡＫ）活性が、標準ＬＡＫ培養物もしくは
部分的に精製した肺細胞と比較して実質的により高いレ
ベルであることを示している。

次に上述した第１表から第５表をまとめて示す。

第　　５　　表 種々のプラスチック及びガラスビン上での粘着性ＬＡＫ
　（＾−し八Ｋ）の生成ドナー：Ｆ３４４ナイロンウー
ル通過牌細飽培４％：　２ＸｌＧ’細胞ｈα　　　ファ
ルコンＴ７５フラスコ１０００ＪＪ／Ｉｎｊ！　ｒＩＬ
−２ギブコ　Ｔ７５コーニングＴ７５ ２４　ロ２　沈殿瓶 ファルコン 未分離細胞 −ＬＡＫ ギブコ 未分離細胞 −ＬＡＫ コーニング 未分離細胞 −ＬＡＫ ボトル 未分離細胞 −ＬＡＫ ２９Ｘ１０＠ １８　Ｘ　１０３ ３１　Ｘ　１０３ １４Ｘ１０’ ３０Ｘ１０”　　　　　　３９　　　１５１６゜６ｘ１
０’　　　　７９　　　６６２６Ｘ１０＠３３　　　１
５ １４．９ＸＩＯ’　　　、　８１　　　６５本発明は好
ましい態様とともに説明されているが、これは本発明の
範囲を先の特殊なものへの制限を意味するものではなく
、逆に、特許請求の範囲で定義される本発明の精神及び
範囲内に含まれるような代替物、修正物及び同等物のカ
バーを意図するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図；ｒｈＩＬ−２の添加後、種々の時間に収集され
た粘着性ＬＧＬ由来のＬＡＫ活性の生成。 ナイロンウール非粘着性Ｆ３４４牌細胞を、２．２４．
４８及び７２時間、ＬＡＫ培地で培養した。 各時点で、非粘着性細胞を取り出し、粘着性細胞になら
し培地を与えた。それから全培養を計５日間続行した。 ５日間に、３Ｈ−ＴｄＲ取込み量と同様、ＹＡＣ−１及
びＰ８１５標的細胞の細胞溶解活性を測定した。 上部パネル；溶解ユニッ）／ｌ　Ｑ’個細胞。 下部パネル；全溶解ユニット／培養及びＤＮＡへの３Ｈ
−ＴｄＲの取込み。 第２図；プラスチック粘着性Ｆ３４４牌細胞由来のＬＡ
Ｋ活性発生に対するインターロイキン２投与・応答関係
。２０Ｘ１０ｂ個のナイロンウール非粘着性肺細胞をＴ
−２５フラスコ中、種々の濃度のｒｈＩＬ−２を含むＬ
ＡＫ培地で培養した。４８時間後、非粘着性細胞を取り
出し、粘着性細胞にならし培地を与え、さらに３日間、
培養を続けた。培養当たの全細胞溶解ユニットをＹＡＣ
−１及びＰ８１５標的細胞について測定した。 第３図；５日間にわたるプラスチック粘着性ＬＧＬの膨
張。ナイロンウール非粘着性Ｆ３４４牌細胞をＬＡＫ培
地中４８時間培養した。プラスチック粘着性細胞を採集
し、ｒｈＩＬ−２の存在下又は非存在下の、４８時間な
らし培地もしくは新鮮な培地に５Ｘ１０３細胞／ｍ１で
ブレーティングした。それから細胞の生育を５日間にわ
たってモニターした（左パネル）。各曲線上の数字は再
供給なしての膨張ピーク位置でのＬＧＬの膨張倍率を示
している。右パネルは、同時間における培養当りの全熔
解ユニットで表現された、ＹＡＣ−１及びＰ８１５標的
細胞に対する細胞毒性活性の増加を示している。 第４図；種々の培養時間におる粘着及び非粘着肺細胞に
おけるＤＮＡ合成の速度論比較。第５図で述べたものと
同じ操作を用いて、オートラジオグラフィーによる強い
核粒子発達を示す細胞はポジティブと印した。各データ
ポイントについて５００個の細胞を計数した。黒棒は粘
着性細胞、９棒は、非粘着性細胞を表わしている。棒の
上の数字は、Ｐ８１５標的細胞に関する。１０３個の各
細胞集団当りの細胞細胞活性溶解ユニット（２０）を示
している。 ｒＩＬ−２ユニツト数／ｄ 第２図 手 続 補 正 書（方式） ％式％ ［１ １、事件の表示 昭和６３年特許願第３２０３１４号 ２、発明の名称 ＬＡＫ活性リンパ細胞の調整法 ３、補正をする者 事件との関係 出 願人 名 称 ユニヴアーシティ オヴ ピッツバーグ ４、代 理 人 ５、補正命令の日付 平成１年３月２８日 培 養 時 間 第 図

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. （１）大顆粒リンパ細胞のみが粘着するプラスチックは
   ガラス製の容器内でｈＩＬ−２を有するリンパ細胞の準
   精製物を培養することを含む、精製リンパ細胞集団から
   大顆粒リンパ細胞を単離する方法。
2. （２）ｈＩＬ−２がｒｈＩＬ−２である、請求項（１）
   記載の方法。
3. （３）リンパ細胞の準精製物を、プラスチック容器内で
   培養する、請求項（２）記載の方法。
4. （４）約１００〜１２００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含
   む組織培養培地中、リンパ細胞を、約３２〜３８℃で２
   〜７２時間培養する、請求項（３）記載の方法。
5. （５）リンパ細胞を約２４〜７２時間培養する、請求項
   （４）記載の方法。
6. （６）リンパ細胞を、約１０００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２
   を含む組織培養培地中、約３７℃で培養する、請求項（
   ５）記載の方法。
7. （７）培養培地が、ウシ胎児血清、抗生物質、グルタミ
   ン及びメルカプトエタノールを含む、請求項（６）記載
   の方法。
8. （８）培養した精製リンパ細胞濃度が１０＾３〜１０＾
   ７生細胞／ｍｌの範囲にある、請求項（７）記載の方法
   。
9. （９）培養した精製リンパ細胞濃度が約２×１０＾６生
   細胞／ｍｌである、請求項（８）記載の方法。
10. （１０）プラスチック容器がペトリ皿もしくはファルコ
    ンフラスコである、請求項（９）記載の方法。
11. （１１）培養後、培養培地をデカンテーションし、そし
    てプラスチック粘着性の大顆粒リンパ細胞のみが残留す
    る、請求項（１０）記載の方法。
12. （１２）プラスチックもしくはガラス粘着性により単離
    されたｈＩＬ−２大顆粒リンパ細胞を再培養することを
    含む、大顆粒リンパ細胞の膨張法及びＬＡＫ活性リンパ
    細胞への変換法。
13. （１３）大顆粒リンパ細胞をプラスチック粘着性により
    単離する、請求項（１２）記載の方法。
14. （１４）培養培地が、１００〜１２００Ｕ／ｍｌのｒｈ
    ＩＬ−２を含む、請求項（１３）記載の方法。
15. （１５）プラスチック粘着性リンパ細胞を、３２〜３８
    ℃で約４〜８日間再培養する、請求項（１４）記載の方
    法。
16. （１６）約１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を含む培養
    培地中、プラスチック粘着性リンパ細胞を、約３７℃で
    、約５〜７日間再培養する、請求項（１５）記載の方法
    。
17. （１７）培養培地が新鮮なＬＡＫ培地である、請求項（
    １６）記載の方法。
18. （１８）培地がならし培地である、請求項（１７）記載
    の方法。
19. （１９）過剰の培養培地をデカンテーションし、ＬＡＫ
    活性細胞を得るためにプラスチック表面をこすり取るこ
    とにより、膨張したＬＡＫ活性リンパ細胞を収穫する、
    請求項（１８）記載の方法。
20. （２０）こすり取り操作前に適当なバッファを添加する
    、請求項（１９）記載の方法。
21. （２１）バッファが、ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝溶液で
    ある、請求項（２０）記載の方法。
22. （２２）プラスチックもしくはガラス粘着性によって単
    離した大顆粒リンパ細胞由来の、効果的量の膨張したＬ
    ＡＫ活性リンパ細胞を被検者に投与することを含む、免
    疫療法。
23. （２３）大顆粒リンパ細胞を、プラスチック粘着性によ
    り単離する、請求項（２２）記載の方法。
24. （２４）ＬＡＫ活性リンパ細胞を、効果的量の、他の免
    疫促進剤と組合せて投与する、請求項（２３）記載の方
    法。
25. （２５）他の免疫促進剤がｒｈＩＬ−２である、請求項
    （２４）記載の方法。
26. （２６）他の免疫促進剤がインターフェロンである、請
    求項（２５）記載の方法。
27. （２７）他の免疫促進剤が、その他のサイトカインもし
    くはリンホカインである、請求項（２６）記載の方法。
28. （２８）ＬＡＫ活性化する細胞が、処置を受ける被検者
    以外の者に由来する、請求項（２７）記載の方法。
29. （２９）ＬＡＫ活性化する細胞が処置を受ける被検者に
    由来する、請求項（２８）記載の方法。
30. （３０）リューコフェレシス前、最初に被検者を従来の
    免疫促進剤で処理する、請求項（２９）記載の方法。
31. （３１）大顆粒リンパ細胞の相対的に均一な組成物。
32. （３２）プラスチック粘着性大顆粒リンパ細胞由来のＬ
    ＡＫ活性リンパ細胞の相対的に均一な組成物。