CN113046313A - 用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试剂盒以及该免疫细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试剂盒以及该免疫细胞的培养方法，该组合物包括白细胞介素‑1β、白细胞介素‑6、前列腺素E2、干扰素γ、CD3单抗、CD28单抗、白细胞介素‑2、肿瘤坏死因子‑α、粒细胞巨噬细胞刺激因子、白细胞介素‑1α、白细胞介素‑4以及PD‑1抗体或者CTLA‑4抗体。本发明提供的组合物可以有效的提高杀伤性T自体免疫细胞的增殖能力及其杀伤肿瘤细胞能力。

Description

用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试 剂盒以及该免疫细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试剂盒以及该免疫细胞的培养方法。
背景技术
免疫系统(Immune System)在机体内执行免疫应答及免疫功能，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡。
胸腺依赖淋巴细胞(Thymus dependent lymphocyte)，可简称T细胞，是一种免疫细胞，主要包括杀伤性T细胞和记忆性T细胞。成熟的T细胞经血液分布到外周免疫器官，可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。杀伤性T细胞(也称效应T细胞)是经过抗原(或抗原呈递细胞Antigen-presenting cells,APC)呈递特异性杀伤肿瘤的一种免疫细胞，其比例直接决定了肿瘤杀伤效果。抗原呈递细胞(APC)是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T、B淋巴细胞的一类免疫细胞。APC细胞主要包括单核-吞噬细胞、树突状细胞、B细胞以及内皮细胞、肿瘤细胞的病毒感染的靶细胞等，其中树突状细胞(Dendritic Cells，简称DC)的抗原呈递能力最强。DC细胞因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名，是目前发现的抗原递呈功能最强的细胞。据相关报道，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞
Figure BDA0002982430330000021
增殖的抗原呈递细胞，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在细胞免疫研究中具有非常重要的作用。
随着细胞免疫技术的日渐成熟发展，由此衍生出CIK(Cytokine-Induced KillerCells，细胞因子诱导杀伤性细胞)、NK(natural killer，自然杀伤细胞)和NKT(naturalkiller T，自然杀伤T细胞)等免疫细胞，以上免疫细胞来源于外周血的体外培养技术，且其肿瘤杀伤效果各不相同。CIK细胞是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+、CD56+细胞为主要效应杀伤细胞的细胞群，其既有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，同时兼顾NK细胞(主要以CD3-、CD56+细胞为主)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广、正常组织毒性低和体外易扩增等特点，是目前广泛科学研究及临床应用较多的免疫治疗方案。
然而，目前CIK细胞体外扩增培养稳定性、一致性及细胞表型表达率一般，同时针对实体瘤的杀伤效果不好，NK免疫细胞属于广谱型的杀伤，针对性不足。故急需一种针对性较强且肿瘤杀伤功能增强型的免疫细胞，来突破细胞免疫技术的瓶颈。研究者们采用DC-CIK细胞技术，DC-CIK即DC细胞和CIK细胞在体外共同孵育培养得到的细胞群。DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床实验和科研研究。
T淋巴细胞的激活主要依靠两个信号通路共同作用：
(1)TCR(T细胞受体)与其他抗原识别结合，而抗原主要由APCs(DC抗原递呈细胞)上的主要抗原肽复合物MHC呈递；
(2)抗原递呈细胞(APC)表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号，如正性共刺激分子CD28/B7，即CD28与CD86(B7-2)或CD80(B7-1)结合。
为避免过度活跃的免疫应答导致过度的炎症反应和自身免疫性疾病，人体进化出免疫检查点(immune checkpoint)机制来控制免疫反应的强度和持续时间，最大限度地减少免疫应答对健康组织的损害，主要有CTLA4-B7通路和PD-1/PD-L1通路。
但是肿瘤细胞入侵后，会利用这一抑制性的通路来压制T细胞激活，从而逃脱免疫系统的围剿，即免疫逃逸。即位于肿瘤细胞上的PD-L1分子与T细胞上的PD1分子识别结合，导致T细胞不能激活，参见图1的PD1抗体作用机制示意图；细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)又名CD152，与其配体B7结合后，亦能导致T细胞不能激活发挥杀伤效应，参见图2的CTLA-4抗体作用机制示意图。目前临床有使用PD1抗体治疗肿瘤细胞的先例，但效果并不理想，主要原因有人体是一个复杂的系统，PD1抗体进入人体后会与所有免疫细胞结合(包括杀伤性T细胞、免疫调节T细胞和NK细胞等)导致药品疗效降低，同时影响整个免疫系统的正常功能。
发明内容
本发明旨在解决上述存在的部分技术问题，提供一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物、试剂盒以及该免疫细胞的培养方法。
根据本发明的第一方面，提供一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物，所述组合物包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)、干扰素γ(INF-γ)、CD3单抗、CD28单抗、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-4(IL-4)以及PD-1抗体或者CTLA-4抗体。
根据本发明的第二方面，提供一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：第一诱导因子组、第二诱导因子组、第三诱导因子组、激活培养基和诱导培养基，所述第一诱导因子组包括以下组分：500-1000U/ml IFN-γ、200-600ng/ml CD3、200-600ng/ml CD28、2000-70000U/ml IL-2和2-5ng/ml IL-1α；所述第二诱导因子组包括以下组分：400-1000U/ml GM-CSF、500-1200U/ml IL-4、1-3mM Gln、600-1000U/ml TNF-α、5-20ng/ml IL-1β、500-1200U/ml IL-6、1-4ug/ml PGE2；所述第三诱导因子组包括以下组分：1000U/ml IL-2和9-12mg PD-1抗体或CTLA-4抗体。
进一步，所述激活培养基(FUTURE O)包括VIVO15培养基；所述诱导培养基(FUTURET)包括配比为2:1的VIVO15培养基和TAKARA551培养基。
根据本发明的第三方面，提供一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1，采集人体外周血，分离外周血和自体血浆，从提取血浆后的外周血中分离单个核细胞；
S2，培养T细胞：
S21，将分离得到的外周血单个核细胞置于培养箱中进行培养，以使部分单个核细胞贴壁；
S22，收集培养箱内的悬浮细胞，用FUTURE O无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂500-1000U/ml的IFN-γ和10％浓度的自体血浆；
S23，培养24h后，加入200-600ng/ml的CD3单抗、200-600ng/ml的CD28单抗、2000-70000U/ml的IL-2和2-5ng/ml的IL-1α；
S24，培养96h后，补充FETURE O培养基，并补加含重组人IL-2500-1000U/ml的FUTURE O 250ml；
S25，再培养72h后，收获T细胞；
S3，培养DC细胞：
S31，将400-1000U/ml的GM-CSF、500-1200U/ml的IL-4、1-3mM Gln和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基FUTURE O中，得到混合培养基，向步骤S21培养箱的贴壁细胞中加入15ml所述混合培养基和1-5％的自体血浆；
S32、48h后，再次加入5ml所述混合培养基；
S33、再经过48h后，再次加入5ml所述混合培养基；
S34、再次培养48h后，从培养瓶中培养基抽出25ml混合液，离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的所述混合培养基，再加入600-1000U/ml的TNF-α、5-20ng/ml的IL-1β、500-1200U/ml的IL-6和1-4ug/ml的PGE2；
S35、培养24h后，收获DC细胞；
S4，培养杀伤性免疫细胞：
S41，将上述获得的T细胞与DC细胞共培养，添加含1000U/ml重组人IL-2的FUTURET无血清培养基；
S42，每间隔72h补液一次，并同时补加1000U/ml重组人IL-2；
S43，当细胞数量达到1*1010以上时，收集细胞；
S44，向步骤S43收集的细胞中加入9-12mg PD-1抗体或者CTLA-4抗体，并在培养箱中孵育30min，获得可降低避免肿瘤逃逸功能的杀伤性免疫细胞。
进一步，所述步骤S1采集的人体外周血单个核细胞来源于肿瘤患者的外周血。
进一步，所述步骤S1中分离外周血和自体血浆包括如下步骤：(1)将采集的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；(2)用移液管抽取离心后的上层血浆10ml，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml自体血浆。
进一步，所述步骤S1中分离单个核细胞包括如下步骤：(1)在50ml离心管内加入15ml淋巴细胞分离液，加入30ml提取血浆之后的外周血；(2)室温下，用800g离心力离心20-30min；(3)离心后，血液被分为4层，抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；(4)向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心力离心10min沉淀细胞，去除上清；(5)向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心力离心沉淀细胞，得到人体外周血单个核细胞。
进一步，所述步骤S22中所述的自体血浆经过灭活后再使用，灭活步骤如下：(1)将获得的10ml自体血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；(2)将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心力离心5min，取上清即得灭活后的自体血浆。
进一步，所述步骤S42每次补液的量为600-1000ml。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明创造性的提出一种新的T自体杀伤性免疫细胞的诱导组合物、诱导方法和培养体系，将从外周血来源的PBMC先诱导成为杀伤性强激活的T细胞，然后在体外通过PD1抗体(或者CTLA-4抗体)封闭T细胞上的PD1(或者CTLA-4)受体，从而导致肿瘤细胞不能结合T细胞的PD1(或者CTLA-4)受体位点而形成免疫逃避，最终高效杀伤肿瘤细胞。本发明还将本技术方案中所用的各类因子组合成一种可简易使用的试剂套装，方便同行和医疗机构能够更加便捷的获得本发明提出的抗肿瘤功能增强型免疫细胞，从而推动医疗技术向前发展。
本发明提供的用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物，其包含的各类因子IL-1β、IL-6、PGE2、INF-γ、CD3、CD28、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-1α、IL-4、Gln(谷氨酰胺)和PD-1抗体(或CTLA-4抗体)以一种新的组合方式可以有效的提高杀伤性T自体免疫细胞的增殖能力及其杀伤肿瘤细胞能力。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1和PD-L1结合抑制T细胞激活其杀伤效应，使肿瘤细胞获得免疫逃逸，CTLA-4与T细胞表面受体CD28具有相似的结构，但效应完全相反。CD28能够与B7配体相结合刺激T细胞成熟和分化。而CTLA-4与B7的亲和力比CD28高8-10倍，阻断CD28与B7结合，目的是限制T细胞的杀伤作用，保护正常细胞不受伤害。因此CTLA-4是一种在T细胞活化过程中起重要负调控作用的共刺激分子。而肿瘤患者的T细胞会表达过量的CTLA-4，从而高度抑制T细胞的免疫活性，阻止其对于肿瘤产生杀伤作用。本发明创造性的提出一种新的T自体杀伤性免疫细胞诱导方法和培养体系，将从外周血来源的PBMC先诱导成为杀伤性强激活的T细胞，然后在体外通过PD1抗体(或者CTLA-4抗体)封闭T细胞上的PD1(或者CTLA-4)受体，从而导致肿瘤细胞不能结合T细胞的PD1(或者CTLA-4)受体位点而形成免疫逃避，最终高效杀伤肿瘤细胞。
本发明还将本技术方案中所用的各类因子组合成一种可简易使用的试剂套装，方便同行和医疗机构能够更加便捷的获得本方案提出的抗肿瘤功能增强型免疫细胞，从而推动医疗技术向前发展。本发明还提出了一种新型的用于扩增T自体免疫细胞的培养基，所述培养基为激活培养基(FUTURE O)和诱导培养基(FUTURE T)，该培养基可以有效的供给细胞增殖的营养所需，维持T外周血免疫细胞的蛋白表达和基因表达谱，培养基是细胞培养过程中的关键因素，往往细胞的增殖其诱导分化效果不佳都与培养基相关。
本发明采用高通量筛选以获得高效诱导扩增外周血杀伤性免疫细胞的组合物，发现IL-1β、IL-6、PGE2、INF-γ、CD3、CD28、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-1α、IL-4、FUTURE O和FUTURE T这些化合物之间能够相互配合，并且起到协同增效的作用，可以高效扩增诱导扩增外周血杀伤性免疫细胞并提高其杀伤细胞表达率，同时通过PD1和CTLA-4分子作用机制，进一步抑制肿瘤免疫逃避效应，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为PD1抗体治疗肿瘤细胞的作用机制示意图。
图2为CTLA-4抗体治疗肿瘤细胞的作用机制示意图。
图3为本发明实施例和对比例制备的免疫细胞的抗体表达检测结果。
图4为本发明实施例和对比例制备的免疫细胞对肿瘤细胞株RKO的杀伤效果对比图。
图5为本发明实施例和对比例制备的免疫细胞对肿瘤细胞株MGC-803的杀伤效果对比图。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
实施例1-3采取的是不同肿瘤患者(例如，肺癌、结直肠癌和鼻咽癌等)的外周血，以验证本发明提供的技术方案的有效性。实施例4采用的是肺癌患者的外周血。
实施例1
本发明提供的PDCT细胞(T细胞+DC细胞)的培养步骤如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血80ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml血浆；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆之后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)下，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，可将离心时间延长，例如离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成；
3.4、用移液管取出上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；
3.5、向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清；
3.6、向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。(单采机建议30min左右)
4、T细胞的培养
4.1、取步骤3.6获得的外周血单个核细胞(PBMC)用无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于75cm2培养瓶内；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，以使部分单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用FUTURE O无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂500U/ml的IFN-γ和10％浓度的2.4步骤保存自体血浆上清(此时为第一天)；
4.4、24h后加入200ng/ml的CD3单抗、200ng/ml的CD28单抗、2000U/ml的IL-2和2ng/ml的IL-1α，刺激T细胞的生长和增殖；
4.5、培养96h后(即，第五天)补液150ml的FETURE O培养基，并补加含重组人IL-2500U/ml的FUTURE O 250ml；先加一部分不含IL-2的培养基是为了稀释原来添加因子浓度，避免对后期培养的影响；然后再添加含IL-2的培养基是为了保证细胞增殖的速度；
4.6、在培养的第八天，收获T细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、将400U/ml的GM-CSF、500U/ml的IL-4、1mM Gln(谷氨酰胺)和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基FUTURE O中，得到H培养基，向步骤4.3剩下的贴壁细胞中加入15ml H培养基和1-5％的自体血浆(此时为第一天)；
5.2、第三天加入5ml H培养基；
5.3、第五天再次加入5ml H培养基；
5.4、第七天从培养瓶中培养基抽出25ml离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的新鲜培养基，加入600U/ml的TNF-α、5ng/ml的IL-1β、500U/ml的IL-6、1ug/ml的PGE2；
5.5、第八天收获DC细胞。
6、PDCT细胞的制备
6.1、收集步骤4.6和步骤5.5所得的细胞进行共培养，添加含重组人IL-21000U/ml的FUTURE T无血清培养基；
6.2、每三天补液一次，并补加重组人IL-2(1000U/ml)，补液量为600ml；
6.3、第十四天或十五天收集细胞，细胞数量应达到1*1010以上；
6.4、向步骤6.3收集的细胞中加入9mg PD-1抗体，37℃培养箱中孵育30min；得到PDCT细胞。
对比例1
本发明还设置对比例，对比例细胞的培养过程如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血50ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，1000g离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，补充10ml生理盐水进去；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，将离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成。
3.4、用移液管取出少量上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中。
3.5、加入生理盐水3倍体积以上稀释收集细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清。
3.6、加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。
4、CIK细胞的培养
4.1、上述步骤中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于培养瓶内(此时为第一天)；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，以使单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml；
4.4、加入1000U/ml的重组人IFN-γ培养；
4.5、24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
4.6、每三天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300U/ml；
4.7、在培养的第七天，收获CIK细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、步骤4.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单个核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单个核细胞向DC细胞分化；
5.2、每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
5.3、在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
5.4、在培养的第7d或第8d，收获DC细胞。
6、细胞共培养
6.1、收集上述中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；
6.2、每3d半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)；
6.3、在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；得到DC+TIK细胞。
实施例2
本发明提供的PDCT细胞(T细胞+DC细胞)的培养步骤如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血80ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml血浆；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆之后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)下，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，可将离心时间延长，例如离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成；
3.4、用移液管取出上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；
3.5、向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清；
3.6、向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。(单采机建议30min左右)
4、T细胞的培养
4.1、取步骤3.6获得的外周血单个核细胞(PBMC)用无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于75cm2培养瓶内；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，以使部分单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用FUTURE O无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂600U/ml的IFN-γ和10％浓度的2.4步骤保存自体血浆上清(此时为第一天)；
4.4、24h后加入500ng/ml的CD3单抗、500ng/ml的CD28单抗、4000U/ml的IL-2和3ng/ml的IL-1α，刺激T细胞的生长和增殖；
4.5、培养96h后(即，第五天)补液150ml的FETURE O培养基，并补加含重组人IL-2700U/ml的FUTURE O 250ml；
4.6、在培养的第八天，收获T细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、将600U/ml的GM-CSF、1000U/ml的IL-4、2mM Gln(谷氨酰胺)和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基FUTURE O中，得到H培养基，向步骤4.3剩下的贴壁细胞中加入15ml H培养基和1-5％的自体血浆(此时为第一天)；
5.2、第三天加入5ml H培养基；
5.3、第五天再次加入5ml H培养基；
5.4、第七天从培养瓶中培养基抽出25ml离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的新鲜培养基，加入800U/ml的TNF-α、15ng/ml的IL-1β、1000U/ml的IL-6、1.5ug/ml的PGE2；
5.5、第八天收获DC细胞。
6、PDCT细胞的制备
6.1、收集步骤4.6和步骤5.5所得的细胞进行共培养，添加含重组人IL-2 1000U/ml的FUTURE T无血清培养基；
6.2、每三天补液一次，并补加重组人IL-2(1000U/ml)，补液量为900ml；
6.3、第十四天或十五天收集细胞，细胞数量应达到1*1010以上；
6.4、向步骤6.3收集的细胞中加入10mg PD-1抗体，37℃培养箱中孵育30min；得到PDCT细胞。
对比例2
本发明还设置对比例，对比例细胞的培养过程如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血50ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，1000g离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，补充10ml生理盐水进去；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出，2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，将离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成。
3.4、用移液管取出少量上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中。
3.5、加入生理盐水3倍体积以上稀释收集细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清。
3.6、加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。
4、CIK细胞的培养
4.1、上述步骤中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于培养瓶内(此时为第一天)；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，以使单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml；
4.4、加入1000U/ml的重组人IFN-γ培养；
4.5、24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
4.6、每三天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300U/ml；
4.7、在培养的第七天，收获CIK细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、步骤4.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单个核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单个核细胞向DC细胞分化；
5.2、每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
5.3、在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
5.4、在培养的第7d或第8d，收获DC细胞。
6、细胞共培养
6.1、收集上述中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；
6.2、每3d半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)；
6.3、在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；得到DC+TIK细胞。
实施例3
本发明提供的PDCT细胞(T细胞+DC细胞)的培养步骤如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血80ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml血浆；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆之后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)下，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，可将离心时间延长，例如离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成；
3.4、用移液管取出上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；
3.5、向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清；
3.6、向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。(单采机建议30min左右)
4、T细胞的培养
4.1、取步骤3.6获得的外周血单个核细胞(PBMC)用无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于75cm2培养瓶内；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，以使部分单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用FUTURE O无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂1000U/ml的IFN-γ和10％浓度的2.4步骤保存自体血浆上清(此时为第一天)；
4.4、24h后加入600ng/ml的CD3单抗、600ng/ml的CD28单抗、7000U/ml的IL-2和5ng/ml的IL-1α，刺激T细胞的生长和增殖；
4.5、培养96h后(即，第五天)补液150ml的FETURE O培养基，并补加含重组人IL-21000U/ml的FUTURE O 250ml；
4.6、在培养的第八天，收获T细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、将1000U/ml的GM-CSF、1200U/ml的IL-4、3mM Gln(谷氨酰胺)和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基FUTURE O中，得到H培养基，向步骤4.3剩下的贴壁细胞中加入15ml H培养基和1-5％的自体血浆(此时为第一天)；
5.2、第三天加入5ml H培养基；
5.3、第五天再次加入5ml H培养基；
5.4、第七天从培养瓶中培养基抽出25ml离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的新鲜培养基，加入1000U/ml的TNF-α、20ng/ml的IL-1β、1200U/ml的IL-6、4ug/ml的PGE2；
5.5、第八天收获DC细胞。
6、PDCT细胞的制备
6.1、收集步骤4.6和步骤5.5所得的细胞进行共培养，添加含重组人IL-2 1000U/ml的FUTURE T无血清培养基；
6.2、每三天补液一次，并补加重组人IL-2(1000U/ml)，补液量为1000ml；
6.3、第十四天或十五天收集细胞，细胞数量应达到1*1010以上；
6.4、向步骤6.3收集的细胞中加入12mg PD-1抗体，37℃培养箱中孵育30min；得到PDCT细胞。
对比例3
本发明还设置对比例，对比例细胞的培养过程如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血50ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，1000g离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，补充10ml生理盐水进去；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，将离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成。
3.4、用移液管取出少量上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中。
3.5、加入生理盐水3倍体积以上稀释收集细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清。
3.6、加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。
4、CIK细胞的培养
4.1、上述步骤中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于培养瓶内(此时为第一天)；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，以使单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml；
4.4、加入1000U/ml的重组人IFN-γ培养；
4.5、24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
4.6、每三天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300U/ml；
4.7、在培养的第七天，收获CIK细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、步骤4.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单个核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单个核细胞向DC细胞分化；
5.2、每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
5.3、在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
5.4、在培养的第7d或第8d，收获DC细胞。
6、细胞共培养
6.1、收集上述中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；
6.2、每3d半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)；
6.3、在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；得到DC+TIK细胞。
实施例4
本发明提供的PDCT细胞(T细胞+DC细胞)的培养步骤如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血80ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml血浆；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆之后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)下，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，可将离心时间延长，例如离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成；
3.4、用移液管取出上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；
3.5、向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清；
3.6、向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。(单采机建议30min左右)
4、T细胞的培养
4.1、取步骤3.6获得的外周血单个核细胞(PBMC)用无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于75cm2培养瓶内；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，以使部分单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用FUTURE O无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂700U/ml的IFN-γ和10％浓度的2.4步骤保存自体血浆上清(此时为第一天)；
4.4、24h后加入400ng/ml的CD3单抗、400ng/ml的CD28单抗50000U/ml的IL-2和4ng/ml的IL-1α，刺激T细胞的生长和增殖；
4.5、培养96h后(即，第五天)补液150ml的FETURE O培养基，并补加含重组人IL-2800U/ml的FUTURE O 250ml；
4.6、在培养的第八天，收获T细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、将900U/ml的GM-CSF、900U/ml的IL-4、2mM Gln(谷氨酰胺)和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基FUTURE O中，得到H培养基，向步骤4.3剩下的贴壁细胞中加入15ml H培养基和1-5％的自体血浆(此时为第一天)；
5.2、第三天加入5ml H培养基；
5.3、第五天再次加入5ml H培养基；
5.4、第七天从培养瓶中培养基抽出25ml离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的新鲜培养基，加入800U/ml的TNF-α、15ng/ml的IL-1β、900U/ml的IL-6、1.5ug/ml的PGE2；
5.5、第八天收获DC细胞。
6、PDCT细胞的制备
6.1、收集步骤4.6和步骤5.5所得的细胞进行共培养，添加含重组人IL-2 1000U/ml的FUTURE T无血清培养基；
6.2、每三天补液一次，并补加重组人IL-2(1000U/ml)，补液量为900ml；
6.3、第十四天或十五天收集细胞，细胞数量应达到1*1010以上；
6.4、向步骤6.3收集的细胞中加入10mg CTLA-4抗体，37℃培养箱中孵育30min；得到PDCT细胞。
对比例4
本发明还设置对比例，对比例细胞的培养过程如下：
1、外周血单个核细胞的采集
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞1～2*108个(或者抽取自体外周血50ml)。
2、灭活血浆
2.1、将获得的外周血加入50ml的离心管中，1000g离心5min；
2.2、用移液管小心的抽取上层血浆10ml(不要抽到分界层面)，补充10ml生理盐水进去；
2.3、将获得的10ml血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；
2.4、将灭活的血浆取出2000g离心5min，取上清，放入4℃冰箱备用。
3、分离单个核细胞
3.1、在50ml离心管内加入15ml Ficoll-Paque density gradient media淋巴细胞分离液，小心地加入30ml提取血浆后的外周血(不要破坏分离液界面)；
3.2、室温(20℃左右)，用800g离心20min(如果血液储存超过2h，将离心时间增至30min)；
3.3、离心后，血液被分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第二层)、Ficoll-Paque分离液层(第三层)和红细胞、粒细胞层(底层)构成。
3.4、用移液管取出少量上层血浆，小心的抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中。
3.5、加入生理盐水3倍体积以上稀释收集细胞，500g离心10min沉淀细胞，去除上清。
3.6、加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心沉淀细胞，备用。
4、CIK细胞的培养
4.1、上述步骤中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml，置于培养瓶内(此时为第一天)；
4.2、在37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，以使单个核细胞贴壁；
4.3、收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1～2*106/ml；
4.4、加入1000U/ml的重组人IFN-γ培养；
4.5、24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
4.6、每三天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300U/ml；
4.7、在培养的第七天，收获CIK细胞。
5、DC细胞的培养
5.1、步骤4.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单个核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单个核细胞向DC细胞分化；
5.2、每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
5.3、在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
5.4、在培养的第7d或第8d，收获DC细胞。
6、细胞共培养
6.1、收集上述中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；
6.2、每3d半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)；
6.3、在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×10 10个以上；得到DC+TIK细胞。
对上述实施例1-4和对比例1-4培养的细胞做杀伤性细胞比例和CD3+、CD8+、CD56+纯度的流式检测，检测结果如下表1所示：
表1杀伤性细胞比例与流式检测结果
Figure BDA0002982430330000251
Figure BDA0002982430330000261
对实施例2和对比例2培养的免疫细胞的流式检测结果如图3所示，其中图3中(a)-(c)是对比例2的检测结果，(a)为对比例2自体免疫细胞CD3-CD8表达比例，(b)为对比例2自体免疫细胞CD56表达比例，(c)为对比例2自体免疫细胞CD3-CD56表达比例；图3中(d)-(f)是实施例2的检测结果，(d)为实施例2自体免疫细胞CD3-CD8表达比例，(e)为实施例2自体免疫细胞CD56表达比例，(f)为实施例2自体免疫细胞CD3-CD56表达比例。对实施例2和对比例2培养的免疫细胞对于肿瘤细胞株RKO的杀伤效果结果如图4所示，实施例2和对比例2培养的免疫细胞对于肿瘤细胞株MGC-803的杀伤效果结果如图5所示。
杀伤性T细胞主要表达CD3+和CD8+，结果表明，实施例制备的免疫细胞表达的CD3+和CD8+明显高于对比例制备的免疫细胞。细胞因子诱导性T细胞流式检测重要指标表达CD3+和CD56+，高表达表明细胞因子诱导作用有效，结果显示，相较于对比例，实施例均出现了高表达。此外，CD56+既表达与T细胞也表达与NK细胞，检测CD56可以发现在培养的总细胞中可发挥免疫效应的细胞比例，结果显示，实施例发挥免疫效应的细胞比例明显高于对比例的结果。
本发明培育的免疫细胞对于肿瘤细胞株的杀伤效果也显然高于对比例培育的免疫细胞的杀伤效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的组合物，其特征在于，所述组合物包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)、干扰素γ(INF-γ)、CD3单抗、CD28单抗、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-4(IL-4)以及PD-1抗体或者CTLA-4抗体。
2.一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：第一诱导因子组、第二诱导因子组、第三诱导因子组、激活培养基和诱导培养基，所述第一诱导因子组包括以下组分：500-1000U/ml IFN-γ、200-600ng/ml CD3、200-600ng/ml CD28、2000-7000U/ml IL-2和2-5ng/ml IL-1α；所述第二诱导因子组包括以下组分：400-1000U/ml GM-CSF、500-1200U/ml IL-4、1-3mM Gln、600-1000U/ml TNF-α、5-20ng/ml IL-1β、500-1200U/ml IL-6、1-4ug/ml PGE2；所述第三诱导因子组包括以下组分：1000U/ml IL-2和9-12mg PD-1抗体或CTLA-4抗体。
3.如权利要求2所述的一种用于高效诱导扩增人体外周血杀伤性免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述激活培养基包括VIVO15培养基；所述诱导培养基包括配比为2:1的VIVO15培养基和TAKARA551培养基。
4.一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，采集人体外周血，分离外周血和自体血浆，从提取血浆后的外周血中分离单个核细胞；
S2，培养T细胞：
S21，将分离得到的外周血单个核细胞置于培养箱中进行培养，以使部分单个核细胞贴壁；
S22，收集培养箱内的悬浮细胞，用激活培养基无血清培养基调整细胞浓度至1～2*106/ml，加入试剂500-1000U/ml的IFN-γ和10％浓度的自体血浆；
S23，培养24h后，加入200-600ng/ml的CD3单抗、200-600ng/ml的CD28单抗、2000-70000U/ml的IL-2和2-5ng/ml的IL-1α；
S24，培养96h后，补充FETURE O培养基，并补加含重组人IL-2500-1000U/ml的激活培养基250ml；
S25，再培养72h后，收获T细胞；
S3，培养DC细胞：
S31，将400-1000U/ml的GM-CSF、500-1200U/ml的IL-4、1-3mM Gln和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培养基激活培养基中，得到混合培养基，向步骤S21培养箱的贴壁细胞中加入15ml所述混合培养基和1-5％的自体血浆；
S32、48h后，再次加入5ml所述混合培养基；
S33、再经过48h后，再次加入5ml所述混合培养基；
S34、再次培养48h后，从培养瓶中培养基抽出25ml混合液，离心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的所述混合培养基，再加入600-1000U/ml的TNF-α、5-20ng/ml的IL-1β、500-1200U/ml的IL-6和1-4ug/ml的PGE2；
S35、培养24h后，收获DC细胞；
S4，培养杀伤性免疫细胞：
S41，将上述获得的T细胞与DC细胞共培养，添加含1000U/ml重组人IL-2的诱导培养基无血清培养基；
S42，每间隔72h补液一次，并同时补加1000U/ml重组人IL-2；
S43，当细胞数量达到1*1010以上时，收集细胞；
S44，向步骤S43收集的细胞中加入9-12mg PD-1抗体或者CTLA-4抗体，并在培养箱中孵育30min，获得所述杀伤性免疫细胞。
5.如权利要求4所述的一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1采集的人体外周血单个核细胞来源于肿瘤患者的外周血。
6.如权利要求4所述的一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中分离外周血和自体血浆通过单采机进行，或者通过如下步骤进行：(1)将采集的外周血加入50ml的离心管中，以1000g离心力离心5min；(2)用移液管抽取离心后的上层血浆10ml，向离心管中补入10ml生理盐水，得到提取血浆后的外周血和10ml自体血浆。
7.如权利要求6所述的一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中分离单个核细胞包括如下步骤：(1)在50ml离心管内加入15ml淋巴细胞分离液，加入30ml提取血浆之后的外周血；(2)室温下，用800g离心力离心20-30min；(3)离心后，血液被分为4层，抽取第二层单个核细胞至新的50ml离心管中；(4)向装有单个核细胞的离心管中加入生理盐水，生理盐水加入体积为单个核细胞体积的3倍以上，以稀释收集的单个核细胞，500g离心力离心10min沉淀细胞，去除上清；(5)向去除上清的细胞中加入适量的生理盐水重悬细胞，400g离心力离心沉淀细胞，得到人体外周血单个核细胞。
8.如权利要求6所述的一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S22中所述的自体血浆经过灭活后再使用，灭活步骤如下：(1)将获得的10ml自体血浆放入56℃的水浴锅中灭活30min；(2)将灭活的血浆取出，放入离心管，2000g离心力离心5min，取上清即得灭活后的自体血浆。
9.如权利要求4所述的一种人体外周血杀伤性免疫细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S42每次补液的量为600-1000ml。
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