CN115558641B - 高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用。该试剂组合物包括包被液、活化培养基和扩增培养基。包被液为RetroNectin；活化培养基由无血清培养基、CD3单抗、IL‑15、IL‑21和IL‑2组成；扩增培养基由无血清培养基和IL‑2组成。细胞培养方法为：先包被RetroNectin；再将细胞接种到包被RetroNectin的细胞培养瓶中，活化培养14天，在第一天、第四天及第六天分别添加10%、5%及2%血清替代物，此后无需添加，即可获得大量高纯度效应免疫细胞。该细胞对慢性髓性白血病细胞K562具有较高的杀伤能力，可用于治疗慢性髓细胞白血病。

Description

高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种高纯度效应免疫细胞群及其培养方法、试剂组合物和应用。
背景技术
慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病，骨髓以髓系增生，外周血白细胞增多及脾脏肿大为主要特征。慢性髓细胞白血病在我国发病率较高，约占成年人白血病的15％~20％，现有治疗方法包括化学疗法、基因治疗、免疫治疗、骨髓移植、靶向药物治疗等，然而该类方法的治疗效果并不十分理想，大多存在着费用高、成功率低、副作用大等问题。
近年来，细胞治疗发展迅速。细胞作为一个独立的生命体，它具有很强的生命力、增殖分化能力和功能的可塑性能力。细胞疗法治疗疾病的机理主要分为两大类:一是细胞的直接作用，直接运用其特定的生物活性修复受损伤的组织和器官，或起到特异性/非特异性杀伤作用；二是细胞的间接作用，如分泌相关的因子或活性分子来调节患者自身细胞的增殖和功能活动。与传统恶性肿瘤治疗方法相比，细胞治疗具有疗效好、副作用小、更个体化、个性化等独特优势。已知的治疗性的细胞包括NK细胞、γδT细胞、CD3AK、CIK细胞等。CIK群体是由效应细胞CD3+CD56+细胞及CD3+CD8+细胞等组成的异质性细胞群。目前，CIK培养方法需要使用血清，并且存在增殖效率差、细胞纯度低、对肿瘤细胞的细胞毒性弱等问题，一定程度上阻碍了细胞免疫治疗的发展。
公开号为CN104357390A的发明专利公开了一种同时高效扩增CD3+CD56+CIK细胞和CD3-CD56+NK细胞的方法，具体为：用含自体血浆的无血清培养基调整分离的PBMC浓度，加入Anti-CD16抗体、IL-2、IL-15后转入T175培养瓶中培养，后再加入Anti-CD3抗体、Anti-CD137抗体，根据细胞的生长情况，每隔2天补充含自体血浆、IL-2和IL-15的无血清培养基，控制细胞浓度约1.5×106/ml，培养14～21天即可。该专利未公开本发明的培养基，并且采用该细胞培养方法培养细胞，总细胞增殖倍数较低，不超过70倍。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于培养高纯度效应免疫细胞的试剂组合物，该试剂组合物通过使用游离状态的CD3单抗激活免疫细胞，获得特定比例的目的细胞。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于培养高纯度效应免疫细胞的试剂组合物，所述试剂组合物包括包被液、活化培养基和扩增培养基；所述包被液为终浓度为10-50ug/ml的RetroNectin；所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为200-1000ng/ml的CD3单抗、终浓度为20-100ng/ml的IL-15、终浓度为20-100ng/ml的IL-21和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成；所述扩增培养基由无血清培养基和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成。
通常情况下，CD3单抗往往以包被的形式来激活免疫细胞，而本发明选择使用游离状态的CD3单抗激活免疫细胞，达到获得特定比例的目的细胞。
进一步，所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为400-800ng/ml的CD3单抗、终浓度为30-90ng/ml的IL-15、终浓度为30-90ng/ml的IL-21和终浓度为500U/ml的IL-2组成。
进一步，所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为400ng/ml的CD3单抗、终浓度为30ng/ml的IL-15、终浓度为30ng/ml的IL-21和终浓度为500U/ml的IL-2组成。
进一步，所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为800ng/ml的CD3单抗、终浓度为90ng/ml的IL-15、终浓度为90ng/ml的IL-21和终浓度为500U/ml的IL-2组成。
进一步，所述扩增培养基由无血清培养基和终浓度为500U/ml的IL-2组成。
进一步，所述包被液为终浓度为50ug/ml的RetroNectin。
本发明的目的之二在于提供一种用目的一所述的试剂组合物培养免疫细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用所述试剂组合物培养免疫细胞的方法，包括以下步骤：
S1：细胞培养瓶包被RetroNectin；
S2：使用淋巴细胞分离液分离血液样本，获得单个核细胞；
S3：将S2所得细胞接种到包被RetroNectin的细胞培养瓶中，进行活化培养；
第一天，添加含有体积百分含量为10%的血清替代物的活化培养基培养细胞；
第四天，补加含有体积百分含量为5%的血清替代物的活化培养基继续培养；
第六天，补加含有体积百分含量为2%的血清替代物的扩增培养基继续培养；
S4：培养至14天，收集对数生长的免疫细胞。
本培养方法只需要在第一天、第四天及第六天分别添加体积百分含量为10%、5%及2%血清替代物，此后无需添加，可以很好地节约成本。
进一步，所述血液样本为脐带血和/或外周血。
进一步，S3中，细胞活化培养第六天后，每两天检测细胞密度，并补加不含有血清替代物的扩增培养基继续培养细胞，保持细胞密度不低于1.0×106个/mL。
进一步，S3中，所述含有体积百分含量为5%的血清替代物的活化培养基的添加量为所述细胞培养瓶中原培养基的三倍体积；所述含有体积百分含量为2%的血清替代物的扩增培养基的添加量为所述细胞培养瓶中原培养基的二倍体积。
进一步，S3中细胞活化培养第一天，活化培养基添加体积百分含量为10%的血清替代物后，先按照0.5-1.5×106个/ml密度重悬细胞，再转入包被瓶中进行活化培养。
进一步，S1中包被方式有2种：①细胞培养前一天4℃包被过夜；②细胞培养当天37℃包被2小时。
本发明的目的之三在于提供一种采用目的二所述的方法培养得到的免疫细胞群。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
采用所述方法培养得到的免疫细胞群。
进一步，所述免疫细胞群中，效应细胞为CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞；所述CD3+CD56+细胞比例不低于总细胞的70%；所述CD3+CD8+细胞比例不低于CD3+细胞的85%。
本发明的目的之四在于提供一种所述免疫细胞群在制备杀伤慢性髓性白血病细胞K562的试剂中的应用。
本发明的目的之五在于提供一种所述免疫细胞群在制备用于治疗慢性髓性白血病的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.与传统培养方法相比，本专利提供的培养基和培养方法可以培养获得的较高比例的CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞，该细胞对慢性髓性白血病细胞K562具有较高的杀伤能力。
2.本专利提供的培养方法只需要在第一天、第四天及第六天分别添加体积百分含量为10%、5%及2%的血清替代物，此后无需添加，可以很好地节约成本。
3.现有技术中，CD3单抗通常以包被至培养瓶的形式来激活免疫细胞，而本发明选择使用游离状态的CD3单抗激活免疫细胞，以获得特定比例的目的细胞。
附图说明
图1为扩增培养14天CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞的总细胞扩增倍数的图，其中，对照组和实验组-2之间无显著性差异p>0.05。
图2为细胞亚群比例的图，CD3+CD8+细胞中，对照组和实验组-2之间存在显著性差异p<0.01；CD3+CD56+细胞中，对照组和实验组-2之间存在显著性差异p<0.01。
图3A和图3B为流式细胞术检测细胞亚群的结果图；图3A为CD3+CD56+细胞比例的图，横坐标CD3 PC7-A表示被检细胞的白细胞分化抗原3的表达密度，纵坐标CD56 PE-A表示被检细胞的白细胞分化抗原56的表达密度，Q2-UL表示表达白细胞分化抗原56而不表达白细胞分化抗原3的细胞，Q2-UR表示表达白细胞分化抗原56和白细胞分化抗原3的细胞，Q2-LL表示不表达白细胞分化抗原56和白细胞分化抗原3的细胞，Q2-LR表示不表达白细胞分化抗原56而表达白细胞分化抗原3的细胞；图3B为CD3+CD8+细胞比例的图，横坐标CD4 PC5.5-A表示被检细胞的白细胞分化抗原4的表达密度，纵坐标CD8 FITC-A表示被检细胞的白细胞分化抗原8的表达密度，Q1-UL表示表达白细胞分化抗原8而不表达白细胞分化抗原4的细胞，Q1-UR表示表达白细胞分化抗原8和白细胞分化抗原4的细胞，Q1-LL表示不表达白细胞分化抗原8和白细胞分化抗原4的细胞，Q1-LR表示不表达白细胞分化抗原8而表达白细胞分化抗原4的细胞；PE-A、PC7-A、FITC-A、PC5.5-A表示不同的荧光通道。
图4A和图4B为免疫细胞杀伤能力检测的结果图，对照组和实验组-2之间存在显著性差异p<0.001；图4A为三次杀伤实验的统计对比图；图4B为具有代表性的杀伤检测的结果图，横坐标7AAD PC5.5-A表示被检细胞是否存活，即被P5圈定的范围内为死亡细胞，P5左侧为活细胞，纵坐标SSC-A表示被检细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，P5表示检测过程中为选定检测细胞所设定的第5个“门”。
图5为细胞因子分泌细胞比例检测的结果图，其中，a1、a2表示Perforin+细胞的检测结果，对照组和实验组-2之间存在显著性差异p<0.01；b1、b2表示Granzyme B+细胞的检测结果，对照组和实验组-2之间存在显著性差异p<0.05；c1、c2表示IFN-γ+细胞的检测结果，对照组和实验组-2之间无显著性差异p>0.05。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
以下实施例中：
活化培养基：用于激活静息的免疫细胞；
扩增培养基：使激活的免疫细胞增殖分化；
CD3+CD56+细胞：具有类似于NK细胞及T细胞的细胞毒性活性的免疫细胞；
CD3+CD8+细胞：细胞毒性T淋巴细胞；
无血清培养基可以是本领域常用的任何一种免疫细胞培养基；
RetroNectin为人纤维连接蛋白片段，购自Takara公司；
CD3单抗为白细胞分化抗原3单克隆抗体，购自ThermoFisher公司；
IL-15为白细胞介素-15，购自美国PeproTech公司；
IL-21为白细胞介素-21，购自美国PeproTech公司；
IL-2为白细胞介素-2，购自美国PeproTech公司；
Perforin+细胞为穿孔素阳性的细胞；
Granzyme B+细胞为颗粒酶B阳性的细胞；
IFN-γ+细胞为γ干扰素阳性的细胞。
实施例1
1. 试剂
（1）包被液：RetroNectin；
（2）活化培养基：无血清培养基、CD3单抗、IL-15、IL-21、IL-2；
（3）扩增培养基：无血清培养基、IL-2。
采用上述试剂培养CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞（简称实验组），实验组包含实验组-1和实验组-2，两者区别在于部分培养试剂的浓度不同，具体详见表1。
表1。
2. CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
（1）培养前一天（4℃过夜包被）或培养当天（37℃包被2h）使用包被液包被细胞培养瓶；
（2）使用淋巴细胞分离液分离脐带血样本，获得单个核细胞；
（3）活化培养基添加10%血清替代物后按照0.5-1.5x106个/ml密度重悬细胞，并转入包被瓶中进行活化培养；
（4）第四天，补加三倍体积含有5%血清替代物的活化培养基继续培养；
（5）第六天，补加二倍体积含有2%血清替代物扩增培养基继续培养；
（6）此后每两天检测细胞密度，补加不含有血清替代物的扩增培养基使细胞密度不低于1.0x106个/mL；
（7）培养至14天，收集对数生长的免疫细胞。
对比例1. 对照组
1. 试剂
（1）包被液：RetroNectin（50ug/ml）、CD3单抗（50ug/ml）
（2）活化培养基：无血清培养基、IFN-γ（500U/ml）、IL-2（500U/ml）
（3）扩增培养基：无血清培养基、IL-2（500U/ml）
采用上述试剂培养CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞（简称对照组）。
2. 细胞培养方法：与实施例1相同。
实施例2
将实施例1和对比例1种培养获得的细胞，分别进行如下检测：
（1）检测总细胞扩增倍数；
（2）采用流式细胞术检测细胞亚群；
（3）以免疫细胞与CFSE标记的K562比例为10：1（效靶比）共孵育4小时后，检测培养获得的免疫细胞杀伤能力；
（4）使用常规实验方法对免疫细胞进行细胞内染色后，利用流式细胞术检测分泌细胞因子的细胞比例。
检测结果如下。以下结果中，对照组和实验组-2使用3个不同健康志愿者的脐带血样本，实验组-1只采用了3个志愿者中的1个健康志愿者的脐带血样本，以此开展对比实验。
（1）细胞扩增倍数检测结果如表2和图1所示。结果显示，对照组中使用样本-1~样本-3检测的总细胞扩增倍数依次为285.0倍，349.9倍，411.5倍；实验组-1中使用样本-1检测的总细胞扩增倍数为198.9倍；实验组-2中使用样本-1~样本-3检测的总细胞扩增倍数依次为281.2倍，409.2倍，268.9倍。可以看出，对照组平均扩增倍数最高，实验组-2略低于对照组，实验组-1最低。由于首次实验中，实验组-1扩增倍数略低对照组和实验组-2，因此未开展后续第二次和第三次对比实验。
表2. 细胞扩增倍数。
（2）流式细胞术检测细胞亚群结果如表3和图2~图3A和图3B所示。结果显示，对照组中，使用样本-1~样本-3检测的CD3+CD56+细胞亚群比例依次为26.24%，41.25%和16.43%，使用样本-1~样本-3检测的CD3+CD8+细胞亚群比例依次为29.12%，52.97%和21.52%；实验组-1中，使用样本-1检测的CD3+CD56+细胞亚群比例为55.47%，使用样本-1检测的CD3+CD8+细胞亚群比例为61.90%；实验组-2中，使用样本-1~样本-3检测的CD3+CD56+细胞亚群比例依次为66.55%，70.34%和63.93%，使用样本-1~样本-3检测的CD3+CD8+细胞亚群比例依次为76.30%，86.23%和86.08%。图3A和图3B为具有代表性的流式细胞术检测结果图。图3A显示，Q2-UR范围内表示的CD3+CD56+细胞比例可以达到70.34%，Q2-LR范围内表示的CD3+细胞比例为20.08%。进一步的，图3B显示，在CD3+细胞中，Q1-UL范围内表示的CD3+CD8+细胞比例高达86.23%，而Q1-LR范围内表示的CD3+CD4+细胞比例为8.05%。可以看出，对照组的两种细胞群平均比例均低于实验组-2，实验组-1处于两者之间。说明在相同的细胞收获量条件下，实验组-2可以获得更多数量的效应细胞用于临床治疗，达到更好的治疗效果。
表3. 细胞亚群比例。
（3）实验组和对照组培养获得的免疫细胞杀伤能力结果如表4和图4A和图4B所示。结果显示，对照组中，使用样本-1~样本-3检测的溶解细胞比例依次为8.8%，14.5%和9.5%；实验组-1使用样本-1检测的溶解细胞比例为33.8%；实验组-2使用样本-1~样本-3检测的溶解细胞比例依次为53.4%，55.1%和63.6%。图4B为具有代表性的利用流式细胞术检测培养获得的免疫细胞对肿瘤细胞K562杀伤能力的结果图。图中P5门范围内表示的被免疫细胞杀伤的K562细胞比例占总K562细胞的65.38%。可以看出，对照组的平均溶解细胞比例低于实验组-2，实验组-1处于两者之间。说明实验组-2培养获得的免疫细胞能够杀伤更多的肿瘤细胞，具有更高的抗肿瘤能力。
表4. 免疫细胞杀伤能力。
（4）细胞因子分泌检测结果如表5和图5所示。结果显示，对照组中，使用样本-1~样本-3检测的Perforin+细胞比例依次为16.3%，25.34%和44.39%，使用样本-1~样本-3检测的Granzyme B+细胞比例依次为58.08%，66.61%和60.31%，使用样本-1~样本-3检测的IFN-γ+细胞比例依次为24.04%，37.47%和48.94%。实验组-2中，使用样本-1~样本-3检测的Perforin+细胞比例依次为58.82%，56.47%和68.34%，使用样本-1~样本-3检测的GranzymeB+细胞比例依次为73.89%，90.43%和96.14%，使用样本-1~样本-3检测的IFN-γ+细胞比例依次为28.98%，19.37%和16.34%。对照组的三种细胞因子分泌细胞平均比例均低于实验组-2。说明实验组-2中具有杀伤肿瘤细胞能力的细胞毒免疫细胞的比例更多。尤其，间接的验证了表4中的结果。由于细胞亚群比例及免疫细胞杀伤能力检测结果显示实验组-1的各结果均处于对照组与实验组-2之间，说明实验组-1中使用的试剂浓度优于对照组而逊于实验组-2，可推断实验组-1的细胞因子分泌细胞比例也会获得类似结果，因此未进行实验组-1的细胞因子分泌细胞比例检测。
表5. 细胞因子分泌细胞比例检测结果。

Claims (9)

1.利用试剂组合物培养高纯度效应免疫细胞的方法，其特征在于，所述试剂组合物包括包被液、活化培养基和扩增培养基；所述包被液为终浓度为10-50ug/ml的RetroNectin；所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为200-1000ng/ml的CD3单抗、终浓度为20-100ng/ml的IL-15、终浓度为20-100ng/ml的IL-21和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成；所述扩增培养基由无血清培养基和终浓度为200-1000U/ml的IL-2组成；所述方法包括以下步骤：
S1：细胞培养瓶包被RetroNectin；
S2：使用淋巴细胞分离液分离血液样本，获得单个核细胞；
S3：将S2所得细胞接种到包被RetroNectin的细胞培养瓶中，进行活化培养；
第一天，添加含有体积百分含量为10%血清替代物的活化培养基培养细胞；
第四天，补加含有体积百分含量为5%血清替代物的活化培养基继续培养；
第六天，补加含有体积百分含量为2%血清替代物的扩增培养基继续培养；
S4：培养至14天，收集对数生长的免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化培养基由无血清培养基、终浓度为400-800ng/ml的CD3单抗、终浓度为30-90ng/ml的IL-15、终浓度为30-90ng/ml的IL-21和终浓度为500U/ml的IL-2组成；所述扩增培养基由无血清培养基和终浓度为500U/ml的IL-2组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包被液为终浓度为50ug/ml的RetroNectin。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中，细胞活化培养第六天后，每两天检测细胞密度，并补加不含有血清替代物的扩增培养基继续培养细胞，保持细胞密度不低于1.0×106个/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中，所述含有5%血清替代物的活化培养基的添加量为所述细胞培养瓶中原培养基的三倍体积；所述含有2%血清替代物的扩增培养基的添加量为所述细胞培养瓶中原培养基的二倍体积。
6.采用权利要求1所述的方法培养得到的免疫细胞群。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞群，其特征在于，所述免疫细胞群中，效应细胞为CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞；所述CD3+CD56+细胞比例不低于总细胞的70%；所述CD3+CD8+细胞比例不低于CD3+细胞的85%。
8.权利要求6-7任一所述的免疫细胞群在制备杀伤慢性髓性白血病细胞K562的试剂中的应用。
9.权利要求6-7任一所述的免疫细胞群在制备用于治疗慢性髓性白血病的药物中的应用。
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