CN113549600B - 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CAR‑iNKT(又称CAR‑INKT)细胞及其组成的组合物，以及提供了CAR‑iNKT细胞或其组成的组合物在制备治疗CD19相关疾病的药物中的应用。

Description

一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞。

背景技术

目前，鉴于CAR-T细胞疗法的成功，将CAR工程技术沿袭用于其他类型免疫细胞的工程化改造引起了研究者们极大的兴趣，由此衍生了CAR-NK、CAR-iNKT、CAR-巨噬细胞(CAR-M)、CAR-Treg、CAR-γδT等一系列以CAR技术为核心的新型细胞疗法。恒定自然杀伤T细胞(Invariant natural killer T cells，iNKT cells)因其表达独特的invariant TCR而得名，其主要识别由CD1d分子呈递的糖脂抗原，通过分泌大量的细胞因子来行使功能。由于CD1d分子仅在少数细胞表达，且基因呈单型性，因此iNKT细胞异体输注不产生急性移植物抗宿主反应(aGVHD)，可以开发成通用型细胞产品。iNKT另一优势在于，肿瘤微环境中的免疫抑制细胞TAM、MDSC高表达CD1d，因此iNKT可以对其杀伤，改善肿瘤微环境，增强抗肿瘤免疫效应。但是iNKT含量非常低，仅占淋巴细胞的0.01～1％，现有的iNKT细胞获取多采用大量采集外周血后进行纯化、富集的方式，外周血需求量大，且制备成功率不高。因此，体外诱导扩增高纯度iNKT细胞是制备CAR-iNKT必须解决的技术问题。

CD19作为B细胞肿瘤的标志性靶点，最早出现于晚期祖B细胞和早期前B细胞，在B细胞成熟并最终分化为浆细胞的整个过程都表达，但不表达于造血干细胞及其他组织细胞。因此该蛋白可被用于诊断B细胞恶性增殖相关的血液肿瘤，B细胞恶性增殖相关的血液肿瘤包括：B细胞急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia，B-CLL)以及B细胞淋巴瘤(Blymphoma)。B细胞急性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤是恶性程度很高的癌症，其特征为外周血、骨髓伴随高程度的B细胞恶性增殖以及全身性B细胞实体瘤的形成，严重干扰患者的血液循环系统。现今，对于B细胞肿瘤的治疗主要包括小分子靶向药物比如伊马替尼(BCR-Abl kinase inhibitor)以及依鲁替尼(bruton kinase inhibitor)、抗体药物比如利妥昔单抗(CD20 antibody)以及骨髓移植(bone marrow transplantation)；在临床应用中，小分子药物以及抗体药物可以显著延长病人的生存期，为骨髓移植争取时间，但是部分病人会出现耐药性复发，至今临床上的药物对于耐药性复发的病人很难取得疗效。

发明内容

本发明提供了一种CAR-iNKT(又称CAR-INKT)细胞及其组成的组合物，以及提供了CAR-iNKT细胞及其组成的组合物在制备药物中的应用。

第一方面本发明提供了一种CAR-iNKT细胞，所述CAR-iNKT细胞的CAR包含抗CD19的特异性抗体。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体的构成是X-Y或X-linker-Y。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体的构成是Y-X或Y-linker-X。

优选地，所述X的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR；

优选地，所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR分别是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第26-33位，51-57位，96-109位；

优选地，所述X的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述Y的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR；

优选地，所述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR分别是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的的第27-32位，第50-51位，第89-97位；

优选地，所述Y的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述linker(又称融合蛋白接头、接头)包括(GGGGS)n、(GGGS)n、(SSSSG)n、(GSGSA)n和(GGSGG)n。

具体地，“GGGGS”是指氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，“GGGS”是指氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser，“SSSSG”是指氨基酸序列Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，“GSGSA”是指氨基酸序列Gly-Ser-Gly-Ser-Ala，“GGSGG”是指氨基酸序列Gly-Gly-Ser-Gly-Gly。

优选地，所述n是大于等于1的整数。

优选地，所述linker是(GGGGS)n。

优选地，n＝4。

具体地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述linker还可以包括其他氨基酸。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体是与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的多肽。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述CAR-iNKT细胞的CAR还包含铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。

优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、ICOS铰链区和CD4铰链区。

优选地，所述铰链区选用CD8α铰链区。

优选地，所述跨膜结构域可选自CD28跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域、CD134跨膜结构域、CD137跨膜结构域、ICOS跨膜结构域和DAP10跨膜结构域。

优选地，所述跨膜结构域选用CD8α跨膜结构域。

优选地，所述共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CD244(2B4)、DAP10、DAP12的胞内结构域或其组合。

优选地，所述共刺激结构域选用CD137的胞内结构域。

优选地，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ(CD3 zeta)、CD3δ、CD3ε、FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的胞内信号传导结构域。

优选地，所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ的胞内信号传导结构域。

优选地，所述铰链区、跨膜结构域、胞内信号传导结构域和共刺激结构域是人为合成的或天然存在的。

优选地，所述包含抗CD19的特异性抗体的CAR的完整结构是：抗CD19的特异性抗体-CD8α铰链区-CD8α跨膜结构域-CD137胞内结构域-CD3ζ胞内信号传导结构域。

优选地，所述包含抗CD19的特异性抗体的CAR的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述抗CD19的特异性抗体或包含抗CD19的特异性抗体、胞外识别区、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域的CAR还可以是在多肽主链或侧链末端的氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基、胍基、吲哚基、甲硫基等位点进行化学修饰后的产物。

优选地，所述的化学修饰包括乙酰化、酰胺化、糖基化、聚乙二醇(PEG)修饰、脂肪酸修饰及本领域已知的其它多肽修饰技术。

优选地，所述乙酰化和酰胺化包括多肽主链N端乙酰化，多肽主链C端酰胺化。

优选地，所述糖基化修饰包括N-糖基化、O-糖基化、S-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇修饰。

优选地，所述N-糖基化是通过天冬酰胺使侧链的酰胺氮进行连接。

优选地，所述O-糖基化是与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧相连。

优选地，所述糖基化的糖结构包括各种单糖、寡糖和多糖。

优选地，所述PEG修饰类型包括直链PEG、支链PEG、同双官能团PEG衍生物、异官能团双取代PEG衍生物和多臂官能团PEG衍生物。

优选地，所述脂肪酸修饰可分为不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸修饰。

优选地，所述饱和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕榈酸。

优选地，所述不饱和脂肪酸修饰包括油酸、亚油酸。

优选地，所述CAR与信号肽相连接。

优选地，所述信号肽是膜蛋白信号肽。

优选地，所述膜蛋白信号肽包括lgG6信号肽、CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。

优选地，所述膜蛋白信号肽是lgG6信号肽。

优选地，所述连接可以是信号肽位于CAR之前、之后或CAR中间任一部位。

优选地，所述连接顺序是lgG6信号肽-CAR。

优选地，所述CAR-iNKT细胞还可以表达免疫调节剂。

优选地，所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂和/或免疫活化剂。

优选地，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、BLTA、TIM-3或LAG-3的抑制剂。

优选地，所述免疫活化剂包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、CCR4、EGFR、CCR2b、类肝素酶、CD137L、LEM或Bcl-2。

优选地，所述免疫调节剂是IL-15。

优选地，所述表达免疫调节剂是将免疫调节剂的氨基酸序列连接在前述CAR上。

优选地，所述连接在CAR上可以是CAR之前(N端，氨基端)、之后(C端，羟基端)或CAR中间任一部位。

优选地，所述免疫调节剂的氨基酸序列连接在CAR之后。

优选地，所述免疫调节剂的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述免疫调节剂的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述CAR和免疫调节剂的氨基酸序列之间还有自我剪切序列。具体地，所述连接的顺序是：CAR-自我剪切序列-免疫调节剂。

优选地，所述自我剪切序列是2A肽(又称2A自剪切肽，2A self-cleavingpeptides)。

优选地，所述2A肽包括P2A，E2A，F2A和T2A。

优选地，所述2A肽选用T2A。

优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

优选地，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述CAR还可以与信号肽连接。

优选地，所述信号肽-CAR-自我剪切序列-免疫调节剂的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

优选地，所述CAR可以包含一个或多个合成的氨基酸，所述合成的氨基酸在本领域是已知的，并且包括但不限于氨基环己羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苯甲基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔丁基甘氨酸。

第二方面本发明还提供了一种经改造的iNKT细胞，所述细胞中有编码前述包含抗CD19的特异性抗体-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-胞内信号传导结构域的CAR的核酸分子或其所在的载体。

优选地，前述编码包含抗CD19的特异性抗体-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-胞内信号传导结构域的CAR的核酸分子与SEQ ID NO:8所示的序列有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

优选地，前述编码包含抗CD19的特异性抗体-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-胞内信号传导结构域的CAR的核酸分子序列如SEQ ID NO:8所示。

优选地，所述载体上还可以包括以下任一一种组成的编码核酸：信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列。

优选地，所述免疫调节剂的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

优选地，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选地，所述载体上还包括信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列的编码核酸。

优选地，所述载体上的CAR、信号肽、免疫调节剂、自我剪切序列的连接顺序是信号肽-CAR-自我剪切序列-免疫调节剂。

优选地，所述载体上包含如SEQ ID NO:12所示的核酸序列的部分序列。

优选地，所述载体上包含如SEQ ID NO:12所示的核酸序列。

优选地，所述载体包含慢病毒表达载体(慢病毒载体)、逆转录病毒表达载体(逆转录病毒载体)、腺病毒表达载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、腺伴随病毒DNA载体、DNA载体或RNA载体。

优选地，所述载体是成熟的商品化载体或根据需求自行构建的载体。

优选地，所述载体是逆转录病毒表达载体。

优选地，所述逆转录病毒载体包括但不限于以下成熟商品化载体：MSCV、MSCV-NWU ER、MSCV-N SM、MSCV.IRES.hCD4、mscv2.2、pMSCVpuroATT、pMSCV_puro_41584、pMSCV_puro_41585、pMSCVII-LO、pMSCV_puro_41589、pMSCVII、pMSCVII-AM、HOXA10-MSCV、HOXB4-NA-MSCV、HOXB6-NA-MSCV、HOXB6-WG-MSCV、HOXD4-WV-MSCV、PRRX2-MSCV、MEIS1B-MSCV、MSCVJMJD3、MSCV FLIP FF、MSCV、P2Gm FF、pMSCV-FlagBcl10、MSCV-N GFP和MSCV-C GFP。

优选地，所述逆转录病毒载体是MSCV。

优选地，所述载体上还包括调节元件。

优选地，所述调节元件包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

优选地，所述增强子包括WPRE增强子、CMV增强子、在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段、SV40增强子。

优选地，所述启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。

优选地，所述启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸生长因子-1α(EF-1α)启动子、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子、肌酸激酶启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

第三方面本发明还提供了一种制备前述经改造的iNKT细胞的方法，所述方法包括将编码前述包含抗CD19的特异性抗体-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-胞内信号传导结构域的CAR的核酸分子所在的载体引入iNKT细胞。

优选地，所述引入是将载体通过物理、化学或生物学手段转移入iNKT细胞。

优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔。

优选地，所述化学手段包括胶体分散系统(包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠)和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。

优选地，所述生物学方法包括使用病毒载体转染。

优选地，所述生物学方法是使用逆病毒载体转染。

优选地，所述生物学方法是使用MSCV逆病毒载体转染。

优选地，所述方法还包括诱导iNKT细胞的步骤和扩增iNKT细胞的步骤。

优选地，所述诱导iNKT细胞的步骤包括使用优化的淋巴细胞培养基培养样品的步骤。

优选地，所述优化的淋巴细胞培养基是向基础淋巴细胞培养基中添加细胞激动剂和细胞因子配制而成。

优选地，所述细胞激动剂是α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)。

优选地，所述细胞因子包括以下一种或多种的组合：IL-2或其功能片段、IL-21或其功能片段、IL-4或其功能片段、GM-CSF或其功能片段。

优选地，所述细胞因子是商品化的IL-2、IL-21、IL-4和GM-CSF的组合。

优选地，所述α-Galcer的终浓度(工作浓度)是50～1000ng/mL。

优选地，所述α-Galcer的终浓度是50-500ng/mL。

优选地，所述α-Galcer的终浓度是100ng/mL。

优选地，所述IL-2的终浓度为10～200U/mL。

优选地，所述IL-2的终浓度为10～100U/mL。

优选地，所述IL-2的终浓度是50U/mL。

优选地，所述IL-21终浓度为5～100ng/mL。

优选地，所述IL-21终浓度为5～50ng/mL。

优选地，所述IL-21的终浓度是10ng/mL。

优选地，所述GM-CSF终浓度为100～1000U/mL。

优选地，所述GM-CSF终浓度为300～700U/mL。

优选地，所述GM-CSF的浓度是500U/mL。

优选地，所述IL-4终浓度为100～1000U/mL。

优选地，所述IL-4终浓度为300～700U/mL。

优选地，所述IL-4的终浓度是500U/mL。

优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有FCS的X-VIVO 15培养基。

优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有5％FCS的X-VIVO 15培养基。

优选地，所述培养时细胞的初始浓度为1×10⁶/mL～50×10⁶/mL。

优选地，所述培养时细胞的初始浓度为1×10⁶/mL～10×10⁶/mL。

优选地，所述培养时细胞的初始浓度为2×10⁶/mL。

优选地，所述培养的培养条件是37℃、5％CO₂。

优选地，所述培养隔天换液。

优选地，所述换液是半量换液。

优选地，所述样品含有或不含有iNKT细胞。

优选地，所述样品是自体的或异体的。

优选地，所述样品的来源包括骨髓、脐带血和胎盘血、外周血。

优选地，所述样品来源于外周血。

优选地，所述样品是外周血中分离得到的外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)。

优选地，所述外周血中分离得到的外周血单个核细胞是本领域熟知的，包括但不限于Ficoll分层液法(Ficoll密度梯度离心法)或Percoll分层液法。

优选地，所述外周血中分离得到PBMC使用的是Ficoll密度梯度离心法。

优选地，所述扩增iNKT细胞的步骤包括使用含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基培养包含iNKT细胞的细胞液，然后将细胞接种到抗体液包被的孔板上培养；

优选地，所述含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基，其是向基础淋巴细胞培养基中添加IL-7和IL-15配制而成。

优选地，所述IL-7的工作浓度是5～50ng/mL。

优选地，所述IL-7的工作浓度是10ng/mL。

优选地，所述IL-15的工作浓度是1～50ng/mL。

优选地，所述IL-15的工作浓度是5ng/mL。

优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有FCS的X-VIVO 15培养基。

优选地，所述基础淋巴细胞培养基是含有5％FCS的X-VIVO 15培养基。

优选地，所述包含iNKT细胞的细胞液是磁珠分选得到的。

优选地，所述包含iNKT细胞的细胞液是磁珠分选前述诱导iNKT细胞的方法制备得到的细胞得到的。

优选地，所述磁珠分选中磁珠选用的是Anti-iNKT MicroBeads。

优选地，所述磁珠分选中重悬、冲洗、洗脱任一使用的buffer是MACS buffer。

优选地，所述磁珠分选中使用LS分选柱。

优选地，所述培养的培养条件是37℃、5％CO₂。

优选地，所述培养时细胞的浓度维持在1×10⁶/mL左右。

优选地，所述培养隔天换液。

优选地，所述换液是半量换液。

优选地，所述抗体液含有CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体。

优选地，所述CD3单克隆抗体的工作浓度是1～10μg/mL。

优选地，所述CD3单克隆抗体的工作浓度是1μg/mL。

优选地，所述CD28单克隆抗体的工作浓度是1～10μg/mL。

优选地，所述CD28单克隆抗体的工作浓度是1μg/mL。

优选地，所述抗体包被孔板后可用于活化iNKT细胞。

优选地，所述孔板是24孔板。

优选地，所述方法还包括对细胞进行质检的步骤。

优选地，所述方法还包括病毒包装的步骤。

第四方面本发明还提供了一种制备前述CAR-iNKT细胞的方法，所述方法包括将经改造的iNKT细胞继续在能使细胞表达蛋白的环境中培养。

第五方面本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含前述CAR-iNKT细胞和/或经改造的iNKT细胞。

优选地，所述组合物还可以包含另外的药学活性剂。

优选地，所述另外的药学活性剂包括化学治疗剂、放射性药品、与免疫调节作用相关的药物、与自身免疫性疾病相关的药物、酪氨酸激酶抑制剂。

优选地，所述化学治疗剂包括抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂。

优选地，所述化学治疗剂包括但不限于：如5-氟尿嘧啶，放线菌素-D，柔红霉素，丝裂霉素，长春新碱或其任意组合。

优选地，所述放射性药品包括但不限于：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131等。

优选地，所述免疫调节作用相关的抗体指的是有预防、抑制、和/或治疗肿瘤作用的抗体，如抗CTLA-4抗体、抗HER2抗体、抗EGFR抗体、抗LAG-3抗体或TIM-3抗体。

优选地，所述与免疫调节作用相关的药物指的是有预防、抑制和/或治疗炎症、感染、或具有免疫调节作用的药物，如抗IL-1抗体、抗IL-6抗体、抗TNF-α抗体等。

优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于：伊马替尼、索拉非尼、舒尼替尼、拉帕替尼、达沙替尼。

优选地，所述组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)，气雾剂，膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)，注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)，静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)，小药丸，鼻制剂，肺制剂(吸入剂)，眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。

第六方面本发明还提供了前述CAR-iNKT细胞和组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病是高表达CD19的血液系统恶性肿瘤。

优选地，所述血液系统恶性肿瘤包括B细胞淋巴瘤、B型急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤。

优选地，所述血液系统恶性肿瘤是白血病。

附图说明

图1为人源化CD19-CAR-iNKT细胞CAR阳性率检测结果；左侧是未转染的iNKT细胞，右侧是转染连接有IL-15的CAR的iNKT细胞。

图2为人源化CD19-CAR-iNKT细胞CAR转染效率统计图；左侧是未转染的iNKT细胞，右侧是转染连接有IL-15的CAR的iNKT细胞。

图3为人源化iNKT、CD19.CAR-iNKT、CD19.CAR/IL15-iNKT细胞对白血病细胞Nalm-6的杀伤效率统计图。

图4为NCG小鼠白血病模型治疗模式图。

图5为NCG小鼠活体成像图，左侧是未转染的NCG小鼠(对照组Ctrl)，中间是转染CAR的iNKT细胞(CD19.CAR-iNKT)，右侧是转染连接有IL-15的CAR的iNKT细胞(CD19.CAR/IL15-iNKT)。

图6为流式检测NCG小鼠外周血中CAR-iNKT细胞存活情况

具体实施方式

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1人源化CD19-CAR-iNKT细胞的制备

1.实验方法

(1)iNKT的制备

分离PBMCs：采集供者外周血，用等量生理盐水稀释全血，将淋巴细胞分离液与稀释血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得外周血单个核细胞PBMCs。

诱导iNKT细胞：用淋巴细胞培养基重悬PBMCs，调整浓度为2×10⁶/mL，加入α-Galcer、IL-2、IL-21、IL-4和GM-CSF，将细胞接种于24孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱。每日观察细胞状态，隔天半量换液。

磁珠分选iNKT细胞：第10天收集诱导后细胞，用500μL MACS buffer重悬，按照说明书用量加入Anti-iNKT MicroBeads，混匀置于4℃孵育30分钟，加入5mL MACS buffer清洗，400×g离心5分钟，弃上清；用500μL MACS buffer重悬，上样LS分选柱，MACS buffer清洗3次，每次3mL；最后将分选柱置于收集管，加500μLMACS buffer洗脱获得iNKT阳性细胞。

活化扩增iNKT细胞：第10天用含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基重悬上一步纯化所得细胞，接种于CD3Ab和CD28Ab预包被板，置于37℃、5％CO2培养箱进行大量扩增。

(2)CAR表达载体的构建

合成靶向人CD19的scFv编码序列，所述scFv包括轻链VL和重链VH，二者之间由G4S短肽连接；将逆转录毒载体MSCV和合成的靶向人CD19的scFv分别经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为hCD19.CAR。

上述构建方法中，所述靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:8所示

所述靶向CD19的嵌合抗原受体的编码序列还可以与T2A和IL-15的编码序列相连接，连接后的序列如SEQ ID NO:12的第58-2040位所示。

(3)逆转录病毒包装

将含有CAR结构的穿梭质粒MSCV-CD19.CAR 6μg、辅助质粒pCL-Ampho 4μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入30μlGenejuice转染试剂，轻弹混匀，室温静置5分钟，将含有转染试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将转染试剂与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48-72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。

(4)病毒感染iNKT细胞

将CD19.CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，用该病毒液重悬活化的iNKT细胞，然后加入RetroNectin预包被的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基，继续扩增培养，即可得到CD19-CAR-iNKT细胞。

(5)CAR表达效率的检测

待病毒感染后72小时，取2×10⁵细胞进行染色，首先加入1μg/mL Biotin-ProteinL4℃孵育30分钟，清洗细胞再加入PE Strepavidin 4℃避光孵育30分钟，清洗细胞最后加入PerCP/Cy5.5 CD3、APC invariant TCR、抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。

2、实验结果

利用流式检测上述制备的CD19.CAR-iNKT细胞，结果显示：CAR转染效率70-90％，图1为流式代表图，图2为统计图，实验结果证明iNKT细胞制备成功，且CAR-iNKT细胞上CAR表达效率很高，所制备的CAR-iNKT细胞可以用于下一步实验。

实施例2体外检测人源化CD19-CAR-iNKT细胞对白血病细胞的杀伤能力

构建Nalm-6-Ffluc-GFP稳定细胞系作为靶细胞，按照2×10⁴/孔接种于96孔不透明板。选取iNKT、CD19.CAR-iNKT、CD19.CAR/IL15-iNKT细胞作为效应细胞，按照10/1、5/1、2.5/1、1/1四个不同的效靶比共孵育，设单独肿瘤细胞作为对照孔。4h后每孔各加150μg/mlD-Luciferin，作用10min后酶标仪检测luciferin信号，同时将靶细胞系列稀释做标准曲线。

通过标准曲线计算各孔细胞数，杀伤效率cytotoxicity(％)＝(对照孔细胞数-实验孔细胞数)/对照孔细胞数*100

图3结果显示CD19.CAR-iNKT和CD19.CAR/IL15-iNKT细胞呈现特异性杀伤活性，在低效靶比情况下CD19.CAR/IL15-iNKT细胞杀伤活性高于CD19.CAR-iNKT细胞。

实施例3体内实验评价人源化CD19-CAR-iNKT细胞的治疗效果

购买6周龄雄性NCG小鼠，通过尾静脉注射1×106Nalm-6-Ffluc-GFP构建小鼠白血病模型，利用小动物活体成像监测成瘤情况。随机分组共3组，Ctrl组、hCD19.CAR-iNKT组、hCD19.CAR/IL15-iNKT组，每组5只。

第0天通过尾静脉输注hCD19.CAR-iNKT和hCD19.CAR/IL15-iNKT细胞进行治疗，5×10⁶/只；Ctrl组仅输注PBS。在治疗后第7、14、21、28天利用小动物活体成像观察治疗效果，并采血检测CAR-iNKT细胞存活情况。

图4为NCG小鼠白血病模型建立及治疗模式图；图5结果显示治疗后7天后治疗组小鼠肿瘤均消失，但是21天后hCD19.CAR-iNKT组小鼠复发，而

hCD19.CAR/IL15-iNKT组小鼠仍保持肿瘤完全消退。

通过颌下静脉采血检测CAR-iNKT在体内的存活情况；图6结果显示hCD19.CAR/IL15-iNKT组小鼠外周血中CAR-iNKT细胞含量是对照组的100倍，提示IL15能够促进CAR-iNKT细胞体内存活。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞

<141> 2021-07-21

<150> 2021107392954

<151> 2021-06-30

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 5

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

260 265 270

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

275 280 285

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

290 295 300

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg

305 310 315 320

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

325 330 335

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

340 345 350

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

355 360 365

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

370 375 380

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

385 390 395 400

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

405 410 415

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

420 425 430

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

435 440 445

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

450 455 460

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 6

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60

ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120

ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180

aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240

gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300

ggcaccaagc tcgagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360

ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420

tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480

cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctctga gactacttac 540

tactcttcat ccctcaagtc acgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600

tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660

tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720

tccagcacgc gtaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 780

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 840

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 900

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 960

ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcctttca tgaggcccgt gcagactacc 1020

caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 1080

agaagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1140

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1200

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1260

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1320

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1380

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1419

<210> 9

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagacctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttga 489

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatctggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cct 63

<210> 11

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile

35 40 45

Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

130 135 140

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser

145 150 155 160

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

165 170 175

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile

180 185 190

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val

195 200 205

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser

210 215 220

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

225 230 235 240

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Cys Gly Ser

485 490 495

Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

500 505 510

Pro Gly Pro Arg Thr Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile

515 520 525

Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr

530 535 540

Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu

545 550 555 560

Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys

565 570 575

Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr

580 585 590

Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe

595 600 605

Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile

610 615 620

His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser

625 630 635 640

Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu

645 650 655

Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val

660 665 670

Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

675

<210> 12

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgaa 60

attgtgatga cccagtcacc cgccactctt agcctttcac ccggtgagcg cgcaaccctg 120

tcttgcagag cctcccaaga catctcaaaa taccttaatt ggtatcaaca gaagcccgga 180

caggctcctc gccttctgat ctaccacacc agccggctcc attctggaat ccctgccagg 240

ttcagcggta gcggatctgg gaccgactac accctcacta tcagctcact gcagccagag 300

gacttcgctg tctatttctg tcagcaaggg aacaccctgc cctacacctt tggacagggc 360

accaagctcg agattaaagg tggaggtggc agcggaggag gtgggtccgg cggtggagga 420

agccaggtcc aactccaaga aagcggaccg ggtcttgtga agccatcaga aactctttca 480

ctgacttgta ctgtgagcgg agtgtctctc cccgattacg gggtgtcttg gatcagacag 540

ccaccgggga agggtctgga atggattgga gtgatttggg gctctgagac tacttactac 600

tcttcatccc tcaagtcacg cgtcaccatc tcaaaggaca actctaagaa tcaggtgtca 660

ctgaaactgt catctgtgac cgcagccgac accgccgtgt actattgcgc taagcattac 720

tattatggcg ggagctacgc aatggattac tggggacagg gtactctggt caccgtgtcc 780

agcacgcgta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1200

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgcgcat gcggatctgg agagggcaga 1500

ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctcgtac gatgagaatt 1560

tcgaaaccac atttgagaag tatttccatc cagtgctact tgtgtttact tctaaacagt 1620

cattttctaa ctgaagctgg cattcatgtc ttcattttgg gctgtttcag tgcagggctt 1680

cctaaaacag aagccaactg ggtgaatgta ataagtgatt tgaaaaaaat tgaagacctt 1740

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gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc tagcaaacaa cagtttgtct 1920

tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg aggaactgga ggaaaaaaat 1980

attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa tgttcatcaa cacttcttga 2040

Claims (19)

1.一种CAR-iNKT细胞，所述CAR-iNKT细胞的CAR由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成；

所述抗CD19的特异性抗体的构成是Y-linker-X，所述X的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Y的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，

所述铰链区是CD8α铰链区，所述跨膜结构域是CD8α跨膜结构域，所述共刺激结构域是CD137胞内结构域，所述胞内信号传导结构域是CD3ζ胞内信号传导结构域，

所述由抗CD19的特异性抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域组成的CAR的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.权利要求1所述的CAR-iNKT细胞，其特征在于，所述CAR上还连接有T2A和IL-15，所述IL-15的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.权利要求1所述的CAR-iNKT细胞，其特征在于，所述CAR-iNKT细胞的CAR还与lgG6信号肽相连接。

4.一种制备权利要求1所述的CAR-iNKT细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述CAR的核酸分子所在的载体引入iNKT细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引入包括将载体通过物理方法、化学方法或生物学方法转移入iNKT细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物学方法包括使用病毒载体转染。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒是MSCV逆病毒。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括诱导iNKT细胞的步骤和扩增iNKT细胞的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导iNKT细胞的步骤包括使用优化的淋巴细胞培养基培养样品的步骤，所述优化的淋巴细胞培养基是向基础淋巴细胞培养基中添加α-半乳糖基神经酰胺和细胞因子配制而成，所述细胞因子是商品化的IL-2、IL-21、IL-4和GM-CSF的组合，

所述α-半乳糖基神经酰胺的终浓度是100ng/mL，所述IL-2的终浓度是50U/mL，所述IL-21的终浓度是10ng/mL，所述GM-CSF的浓度是500U/mL，所述IL-4的终浓度是500U/mL；

所述基础淋巴细胞培养基是含有5% FCS的X-VIVO 15培养基。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述iNKT来源于外周血。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增iNKT细胞的方法包括使用含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基培养包含iNKT细胞的细胞液，然后将细胞接种到抗体液包被的孔板上培养，

所述IL-7的工作浓度是10ng/mL，所述IL-15的工作浓度是5ng/mL。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞培养基的基础淋巴细胞培养基是含有5% FCS的X-VIVO 15培养基。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述包含iNKT细胞的细胞液是磁珠分选得到的，所述抗体液含有CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述磁珠分选中磁珠选用的是Anti-iNKTMicroBeads。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述CD3单克隆抗体的工作浓度是1μg/mL。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述CD28单克隆抗体的工作浓度是1μg/mL。

17.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的CAR-iNKT细胞。

18.权利要求1所述的CAR-iNKT细胞或权利要求17所述的组合物在制备治疗高表达CD19的血液系统恶性肿瘤的药物中的应用。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述血液系统恶性肿瘤是白血病。

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