CN117402261A - 一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于重组腺病毒的CAR‑NK细胞制备方法及其应用，本发明提供了一种高效的CAR‑NK细胞制备方案，可制备CAR分子高效表达的CAR‑NK细胞，解决NK细胞转导效率低的问题，提升CAR‑NK细胞的疗效。本发明添加促转导试剂(0.5‑1μM BX795)可以增强转导效率，转导效率可达到70％以上。本发明使用重组腺病毒转导不影响NK细胞的表型及扩增。基于重组腺病毒CAR‑NK细胞，具有显著的体外杀伤效率。重组腺病毒CAR‑NK细胞，具有显著的体内抗肿瘤(Raji移植瘤模型)效应。

Description

一种基于重组腺病毒的CAR-NK细胞制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于重组腺病毒的CAR-NK细胞制备方法及其应用。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的重要效应细胞，占血液和淋巴器官中单个核细胞的5％至15％。NK细胞是人体抵御病毒感染和恶性细胞的第一道防线，其既可以直接杀死癌症或感染细胞，也可以间接改善抗体和T细胞介导的反应。此外，NK细胞还具有免疫调节功能，对树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，以及抗原特异性T细胞和B细胞反应具有调节作用。
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是一种受体蛋白，可以特异性识别靶蛋白并诱导次级信号传导。CAR主要由三个结构域组成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外结构域包含单链可变片段(Single chain variable fragment，scFv)，通常来源于能够特异性识别癌细胞上表达的肿瘤抗原的抗体；跨膜结构域将CAR结构锚定在效应细胞膜上；胞内活化结构域则会激活下游信号，促进靶细胞的杀伤。
与天然NK细胞相比，表达CAR受体的CAR-NK细胞有更强的靶向性和抗肿瘤反应。将基因递送到NK细胞上的方法主要有病毒法和非病毒法，其中，病毒法以逆转录病毒和慢病毒为代表；而非病毒法则包括mRNA电转、转座子及CRISPR/Cas9介导的方法等。NK细胞对外来遗传物质的敏感性和防御机制，通常会导致低水平的转导，并诱导细胞凋亡，因此，与T细胞相比，NK细胞的转导效率相对较低。
目前CAR-NK细胞的制备主要通过逆转录病毒和慢病毒进行转导。其中，重组慢病毒在NK细胞上的转导效率偏低，在10％～30％，这是由于慢病毒的VSV-G包膜对低密度脂质受体LDL-R结合能力较低，而LDL-R是促进病毒进入的受体，但这种受体在活化的NK细胞上表达较低；而逆转录病毒可随机整合到基因组中，存在插入突变的潜在风险。此外，非病毒转导体系仍然还不稳定：核酸通过电穿孔导入NK细胞，这是一种简单且经济高效的方法，但电脉冲对细胞膜的透化很容易通过内部或外部细胞成分的不受调节的交换或产生永久性膜泄露而导致细胞死亡率较高。
发明内容
腺病毒载体具有转染效率高、致病性低、滴度高以及在体内不整合到宿主细胞染色体等特点，是基因治疗临床试验及疫苗研发中常用的载体之一。但是，应用最为广泛的5型腺病毒对NK细胞的基因转导效率低。尚未见采用改构的重组腺病毒进行CAR-NK细胞制备的相关报道，为解决现有技术中存在的问题，本发明将提供一种高效、稳定的CAR-NK细胞制备方案。
本发明第一方面提供了一种靶向CD19的CAR，所述CAR包括靶向CD19的ScFv，所述CAR还包括信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激区、或信号转导区中的一种或多种。
进一步，所述CAR包括信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区、共刺激区、信号转导区顺次相连。
进一步，所述CAR包括信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区顺次相连。
进一步，所述信号肽为CD8α，所述铰链区包括lgG4、lgG4(L)、或CD8α，所述跨膜区包括CD28或CD8α，所述共刺激区包括CD28、4-1BB、或OX40，所述信号转导域为CD3ζ。
进一步，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4铰链区、CD28跨膜区、OX40共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连。
进一步，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4铰链区、CD28跨膜区顺次相连。
进一步，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4(L)铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连。
进一步，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连。
进一步，所述CAR包括与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述CAR包括与SEQ ID NO:8至少90％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述CAR包括与SEQ ID NO:10至少90％序列同一性的氨基酸序列。
进一步，所述CAR包括与SEQ ID NO:12至少90％序列同一性的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸分子或包含其的载体，所述多核苷酸分子包括编码前面所述的CAR的核苷酸序列。
进一步，所述载体为腺病毒载体。
进一步，所述腺病毒载体是pAd.NK腺病毒载体。
在本发明中，所述pKAd.NK腺病毒载体是指来源于申请号202110677612.4的发明专利，其原理为HAdV-5fiber基因改造为人工改造的f11p228R基因的人5型腺病毒，其中f11p228R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示(即，MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVDDTNGFLKENISATTPLVKTGHSIGLPLGAGLGTNENKLCIKLGQGLTFNSNNICIDDNINTLWTGVNPTEANCQIMNSSESNDCKLILTLVKTGALVTAFVYVIGVSNNFNMLTTHRNINFTAELFFDSTGNLLTRLSSLKTPLNHKSGQNMATGCDCRGDCFCAITNAKGFMPSTTAYPFNDNSREKENYIYGTCYYTASDRTAFPIDISVMLNRRAINDETSYCIRITWSWNTGDAPEVQTSATTLVTSPFTFYYIREDD)。
如本文所用，术语“载体”是指可以转导、转染、转化或感染细胞的试剂，从而使细胞表达除了细胞天然的那些以外的核酸和/或蛋白质，或以细胞非天然的方式表达。核酸从细胞外环境易位到细胞中时，细胞被核酸“转导”。可以使用将核酸转移到细胞中的任何方法；除非另有说明，否则该术语不暗示将核酸递送到细胞中的任何特定方法。核酸转导到细胞中并稳定复制时，细胞被核酸“转化”。载体包括待由细胞表达的核酸(通常是RNA或DNA)。在本发明具体的实施方案中，所述载体的具体类型为腺病毒载体，具体的为改造的pAd.NK腺病毒载体。
进一步，所述多核苷酸分子包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列至少90％序列同一性的核苷酸序列。
术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应的分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共享的匹配位置数除以比较的位置数再乘以100。通常，当将两个序列比对以获得最大同一性时进行比较。可以通过使用例如GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,第7版,Madison,Wisconsin)堆积程序或任何序列比较算法(如BLAST、FASTA或CLUSTALW)进行比对来计算同一性。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可通过标准比对算法确定。基本上，同源或同一的序列通常预期在中等或高度严格的条件下与全部或至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多的序列全长杂交。还考虑了在杂交多核苷酸中含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
进一步，所述多核苷酸分子还包括编码sIL-15分子的核苷酸序列，所述sIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
进一步，所述编码sIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
进一步，所述多核苷酸分子还包括编码EF1α的如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸分子还包括编码BGHpa的如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸分子还包括编码hPGKp的如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸分子还包括编码SV40 PA的如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
进一步，所述多核苷酸分子中编码EF1α、前面所述的CAR、BGHpa、hPGKp、sIL-15、SV40 PA的核苷酸序列顺次相连。
进一步，所述多核苷酸分子中编码EF1α、前面所述的CAR、BGHpa、hPGKp、sIL-15、SV40 PA的核苷酸序列由P2A、T2A或E2A连接。
术语“连接”是指核酸表达调节序列和编码靶蛋白的核酸序列之间的功能性连接，以便执行总体功能。可使用本领域众所周知的基因重组技术制备与重组载体的有效连接，并使用本领域众所周知的酶进行位点特异性DNA切割和连接。
本发明第三方面提供了一种细胞，所述细胞包括前面所述的CAR、或前面所述的多核苷酸分子或包含其的载体。
进一步，所述细胞包括真核细胞或原核细胞。
进一步，所述细胞包括淋巴细胞。
进一步，所述细胞包括T细胞、B细胞、或NK细胞。
如本文所用的术语“淋巴细胞”是指免疫系统的细胞，其是一种白细胞。淋巴细胞包括但不限于T细胞(细胞毒性和辅助T细胞)、B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。
如本文所用，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的，并且旨在包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。术语“T细胞”在其范围内包括天然T细胞(例如，从生物体分离的，所述生物体例如为哺乳动物，例如，人，例如，受试者)、离体生长的T细胞和遗传工程化的T细胞。术语T细胞还包括包含T细胞受体(例如，天然TCR，或重组TCR)的T细胞和包含人工T细胞受体的T细胞(例如，CAR-T细胞)。
如本文所用的术语“NK细胞”是指自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。
本发明第四方面提供了一种制备靶向CD19的CAR细胞的方法，所述方法包括将前面所述的CAR、或前面所述的多核苷酸分子或包含其的载体通过腺病毒转导进入细胞。
术语“转导”用于生产重组抗原受体细胞或嵌合抗原受体细胞时，是指将外源核苷酸序列引入细胞的过程。在一些实施方案中，该转导通过载体进行。
进一步，所述方法具体包括步骤：
1)通过分子生物学技术合成前面所述的信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区、共刺激区、信号转导区和前面所述的BGHpa、hPGKp、sIL15、SV40pa的核苷酸片段；
2)将步骤1)中所述分子以本发明第二方面中的核苷酸序列的顺序进行连接，并将完整核苷酸序列克隆到腺病毒载体；
3)选取健康淋巴系统中的单个核细胞，接种到NK细胞激活培养基和NK细胞扩增培养基培养10-15天；
4)将培养出的细胞接种到NK细胞基础培养基，腺病毒载体感染细胞，添加BX795促转导剂，转导4h，补充等体积含双倍因子的NK细胞完全培养基，转导24h，离心换液，用NK细胞扩增培养基继续培养，转导3天，得到CAR细胞。
进一步，所述NK细胞激活培养基为含5％的自体血浆、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS。其商用来源为Miltenyi。
进一步，所述NK细胞扩增培养基为含5％的血清替代物、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS。其商用来源为Miltenyi。
进一步，所述NK细胞基础培养基为NK MACS。其商用来源为Miltenyi。
进一步，所述NK细胞完全培养基为含2000IU/mL的IL-2、1000IU/mL的IL-15的NKMACS。其商用来源为Miltenyi。
进一步，所述分子生物学技术包括PCR、限制性酶切、同源重组。
进一步，所述腺病毒载体为pAd.NK腺病毒载体。
进一步，所述步骤2)中连接的方式为正向插入，连接的位点为PmeI。
进一步，所述步骤3)中的细胞为NK细胞。
进一步，所述步骤4)中腺病毒载体感染细胞的MOI＝2500VPs/cell。
本发明第五方面提供了一种用于治疗或预防癌症的细胞治疗组合物，所述细胞治疗组合物包括本发明第三方面所述的细胞，或前面所述的方法制备的细胞作为活性成分。
如本文所用，术语“癌症”、“过度增殖的”和“肿瘤的”是指具有自发生长能力的细胞，即以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。过度增殖和肿瘤疾病状态可归类为病理性的，即表征或构成疾病状态，或可归类为非病理性的，即偏离正常但与疾病状态无关。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不管组织病理学类型或侵袭阶段。
如本文所用，术语“治疗”是指设计用于在临床病理学过程中改变待治疗个体或细胞的自然过程的临床干预。期望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。例如，减轻或消除本发明涉及的疾病相关一种或多种病症，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖，减少病原体感染，减少由疾病引起的症状，提高患有疾病的那些的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的存活，则个体被成功地“治疗”。
本发明第六方面提供了前面所述的CAR、前面所述的多核苷酸分子或包含其的载体、或前面所述的细胞在制备治疗CD19阳性癌症的药物组合物中的应用。
进一步，所述CD19阳性癌症包括骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、白血病前期、血癌、急性白血病、B细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、小淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺癌、胆道癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、骨髓癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、胃癌、胶质瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、头颈癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、或成神经管细胞瘤。
本发明第七方面提供了前面所述的CAR、前面所述的多核苷酸分子或包含其的载体在制备高靶向CD19的CAR表达同时sIL-15低表达的NK细胞中的应用。
本发明第八方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的细胞。
进一步，所述药物组合物包括药学上可接受的辅料。
进一步，所述药物组合物通过药学上可接受的载体进行药物递送。
术语“药物组合物”是指这样的制剂，其形式允许活性成分的生物活性有效，并且不含对施用组合物或制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”辅料(介质、添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、聚山梨酯、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在具体实施方案中，在数值前时，术语“约”或“大约”表示该值加上或减去15％、10％、5％或1％的范围。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种高效的CAR-NK细胞制备方案，可制备CAR分子高效表达的CAR-NK细胞，解决NK细胞转导效率低的问题，提升CAR-NK细胞的疗效。
附图说明
图1是CAR结构示意图；
图2是重组腺病毒结构示意图；
图3是不同MOI转导后，流式检测CAR表达效率的结果图；
图4是不同浓度促转导试剂对CAR转导效率的影响图；
图5是重组腺病毒与重组慢病毒转导NK细胞效率对比图；
图6是重组腺病毒与重组慢病毒转导NK细胞后的杀伤效率统计图；
图7是CAR19-NK细胞对CD19+肿瘤细胞系Raji、Daudi、Nalm-6及H929的杀伤效率图；
图8是CAR19-NK细胞治疗Raji移植瘤后，不同时间点活体成像结果图；
图9是CAR19-NK细胞治疗Raji移植瘤后，不同时间点活体成像统计结果图；
图10是CAR19-NK细胞治疗Raji移植瘤后，小鼠体重的检测结果图；
图11是CAR19-NK细胞治疗Raji移植瘤后，小鼠的生存曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。
除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1不同CAR结构的设计及重组腺病毒的制备
1、实验方法
1)本发明设计了如图1所示的CAR结构，其具体核苷酸和氨基酸序列见表1。
2)重组腺病毒的制备步骤
合成CD8α信号肽、FMC63(靶向CD19的ScFv)、IgG4铰链区、CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD8α跨膜区、OX40共刺激信号区、4-1BB共刺激信号区、CD28共刺激信号区和CD3ζ信号转导区、BGHpa、hPGKp、sIL15、SV40pa等DNA片段，通过PCR、限制性酶切、同源重组等分子生物学技术，合成以上CAR分子。将获得的上述CAR分子通过同源重组方式正向插入到重组腺病毒载体pAd.NK的PmeI位点，获得带有靶向CD19 CAR基因的重组腺病毒质粒JD-A-CAR1、JD-A-CAR2、JD-A-CAR8、JD-A-CAR13、JD-A-CAR14及JD-A-CAR16，其基本结构如图2所示，其中CARs代表不同的CAR分子，Ad5基因组为E1和E3区缺失的5型腺病毒基因组(其中，纤维顶球进行了F11p228RGD的改造)。
2、实验结果
经过分子测序，成功构建EF1α核苷酸序列、BGHpa核苷酸序列、hPGKp核苷酸序列、SV40 PA核苷酸序列，其序列见表2；且本发明构建的重组腺病毒质粒构建成功，其CARs分子与表1中的序列一致，sIL-15核苷酸序列构建成功，其氨基酸与核苷酸序列参见表1。
表1
表2
实施例2不同CAR结构对病毒产量和活性的影响
A、实验方法
1.重组腺病毒的包装：
1.1管1添加400μl Opti-MEM、10μl P3000及10μg质粒，管2添加400μl Opti-MEM及15μl Lip3000，管1与管2均匀混合后，室温静置20min。
1.2将上述混合质粒添加到细胞融合度为80％的HEK293细胞中，之后每3-4天补液1次，观察细胞病变情况，直至出现80％病变时，收集细胞及上清至离心管中。
2.重组腺病毒的扩增：
2.1第一轮扩增：将上述收集的细胞及上清，反复冻融3次，500g离心10min，取5mL上清感染2个15cm皿，观察细胞病变情况，约3天出现80％病变时，收集细胞及上清至离心管中。
2.2第二轮扩增：将上述收集的细胞及上清，反复冻融3次，500g离心10min，取5mL上清感染10个15cm皿，观察细胞病变情况，约3天出现80％病变时，收集细胞及上清至离心管中。
2.3第三轮扩增：将上述收集的细胞及上清，反复冻融3次，500g离心10min，取5mL上清感染20个15cm皿，观察细胞病变情况，约3天出现80％病变时，收集细胞及上清至离心管中。
3.重组腺病毒的纯化：
将上述收集的细胞用PBS重悬，反复冻融3次，用氯化铯密度梯度离心纯化病毒，之后转入透析袋，4℃透析过夜后分装，获得不同CAR结构的重组腺病毒AD.CAR1、AD.CAR2、AD.CAR8、AD.CAR13、AD.CAR14和AD.CAR16。
4.重组腺病毒病毒滴度测定：
4.1感染滴度测定：将K562细胞按2×105cells/孔接种在24孔板中，取纯化后的病毒0.00001μl、0.0001μl、0.001μl、0.01μl、0.1μl及1μl添加到K562细胞中，感染48h后，收集细胞，进行流式检测，根据流式检测阳性率，计算感染滴度。
4.2颗粒滴度测定：将纯化后的病毒分别稀释5倍、10倍、20倍后，添加1％ SDS，55℃孵育10min，离心取上清，使用Nanodrop 2000测定OD260值，计算颗粒滴度。
B、实验结果
结果如表3所示，不同CAR结构的病毒产量之间无太大差异，但AD.CAR1、AD.CAR2的病毒活性较差，比活性低于1/1000，表明CAR结构对病毒的产量有较大的影响。其他病毒，包括AD.CAR8、AD.CAR13、AD.CAR14和AD.CAR16，感染滴度均大于1.0×1010/ml，比活性均大于1/100IU，符合的重组腺病毒质量标准。
表3重组腺病毒体积及滴度统计
实施例3重组腺病毒转导体系的优化
1、重组腺病毒不同MOI对转导效率的影响。
A、实验方法
1.1NK细胞铺板：取培养至第14天的NK细胞KA062的悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞基础培养基重悬后，以1×106cells/0.5mL/孔的体系接种在24孔板中，保持2×106/mL的铺板密度即可。
1.2添加重组腺病毒：将重组腺病毒从-80℃冰箱取出放在冰盒上融化，混匀后，按照MOI＝2500、MOI＝5000及MOI＝10000(VPs/cell)添加相应的病毒体积。
1.3补液：转导4h后，每孔补0.5mL等体积的含双倍因子的NK细胞完全培养基。
1.4离心换液：转导24h后，取转导后细胞悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞扩增培养基重悬细胞，按照接种密度为1×106/mL接种至24孔培养板中。
B、实验结果
转导72h后，取适量细胞计数及流式检测CAR19表达量，如表4及图3所示，随着MOI的增加，转导效率也随之提高，在MOI＝10000时，转导效率为77％，且细胞活率无显著变化。但是，5000VPs/细胞组和10000VPs/细胞组的细胞生长速度显著慢于2500VPs/细胞组，因此，考虑选择2500VPs/细胞作为病毒感染强度，同时，通过添加促转导试剂来提高转导效率。
表4不同MOI转导后细胞扩增倍数、细胞活率及转导效率统计
组别 细胞扩增倍数 活率(％) 转导效率(％)
对照 2.43 94.59 0.07
2500VPs/细胞 2.06 92.35 49.09
5000VPs/细胞 1.78 93.89 64.95
10000VPs/细胞 1.35 93.75 77.34
2、添加促转导试剂对转导效率的影响
A、实验方法
2.1NK细胞铺板：取培养至第14天的NK细胞WM005的悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞基础培养基重悬后，以1×106cells/0.5mL/孔的体系接种在24孔板中，保持2×106/mL的铺板密度即可。
2.2添加重组腺病毒：将重组腺病毒从-80℃冰箱取出放在冰盒上融化，混匀后，按照MOI＝2500添加相应的病毒体积。
2.3添加不同浓度的促转导试剂：10mM BX795稀释100倍后添加2.5μl，即终浓度为0.5μM；10mM BX795稀释100倍后添加5μl，即终浓度为1μM。
2.4离心换液：转导24h后，取转导后细胞悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞扩增培养基重悬细胞，按照接种密度为1×106/mL接种至24孔培养板中。
B、实验结果
转导72h后，取适量细胞计数及流式检测CD19 scFv表达量，如表5及图4所示，相同MOI条件下，添加促转导试剂可大大提高转导效率，转导效率提升1倍以上，但对NK细胞的生长影响较小，因此选择0.5-1μM作为添加浓度。
表5不同浓度促转导试剂转导后细胞浓度、细胞活率及转导效率统计
名称 细胞扩增倍数 活率(％) 转导效率(％)
对照 3.71 89.83 0.09
0μM BX795 3.54 88.25 33.64
0.5μM BX795 3.55 88.31 70.42
1μM BX795 3.33 87.47 79.17
实施例4基于重组慢病毒的CAR-NK细胞与基于重组腺病毒的CAR-NK细胞功能比较
A、实验方法
1.基于重组腺病毒的CAR19-NK细胞制备：
1.1NK细胞铺板：取培养至第14天的NK细胞WM005的悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞基础培养基重悬后，以1×106cells/0.5mL/孔的体系接种在24孔板中，保持2×106/mL的铺板密度即可。
1.2添加重组腺病毒：将重组腺病毒从-80℃冰箱取出放在冰盒上融化，混匀后，按照MOI＝2500添加相应的病毒体积。
1.3添加不同浓度的促转导试剂：10mM BX795稀释100倍后添加2.5μl，即终浓度为0.5μM；10mM BX795稀释100倍后添加5μl，即终浓度为1μM。
1.4离心换液：转导24h后，取转导后细胞悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞扩增培养基重悬细胞，按照接种密度为1×106/mL接种至24孔培养板中继续培养2天。
1.5收集细胞，检测转导效率和杀伤活性。
2.基于重组慢病毒的CAR19-NK细胞制备：
2.1培养至第9天，室温，1800rpm离心10min收集活化的NK细胞，采用完全培养基重悬细胞，加入促转导试剂BX795(0.1μM)。按照2.0ml/孔接种至6孔板，加入表达CAR19的重组慢病毒，CAR结构与CAR16相同。
2.2将其混匀后，放入培养箱中培养4h。然后补加2ml的新鲜完全培养基继续培养。
2.3培养24h后；取出，室温1800rpm离心10min收集细胞，离心收获沉淀；使用扩增培养基重悬细胞，按照1×106细胞/ml的密度进行扩增。
2.4培养至转导后第7天，收集细胞，检测转导效率和杀伤作用。
B、实验结果
如图5所示，重组腺病毒的基因转导效率显著高于重组慢病毒；此外，在相同效靶比的情况下，基于重组腺病毒的NK细胞，其杀伤活性显著高于基于重组慢病毒的CAR-NK细胞(如图6所示)。因此，重组腺病毒在制备CAR-NK细胞中具有巨大的优势。
实施例5基于重组腺病毒的CAR-NK细胞的功能评价
1、表达CAR19-NK细胞的制备
1.1NK细胞铺板：取培养至第12天的NK细胞悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞基础培养基重悬后，以4×108cells/200mL/瓶的体系接种在T225培养瓶中，保持2×106/mL的铺板密度即可。
1.2添加促转导试剂：添加20μl 10mM BX795，即终浓度为1μM。
1.3添加重组腺病毒：将重组腺病毒从-80℃冰箱取出放在冰盒上融化，混匀后，按照MOI＝2500(VPs/cell)添加相应的病毒体积。
1.4补液：转导4h后，每瓶补200mL等体积的含双倍因子的NK细胞完全培养基。
1.5离心换液：转导24h后，取转导后细胞悬液放置于离心管中，1500rpm离心8min后，弃上清，用NK细胞扩增培养基重悬细胞，按照接种密度为1×106/mL接种至T225培养瓶中。
2、CAR19-NK细胞的体外杀伤功能评价
A、实验方法
2.1将靶细胞Raji、Daudi、Nalm-6及H929用Calcein-AM染色后，以20000cells/100μl铺板在96孔板中；
2.2分别以效靶比为0.5:1、1:1及2:1加入转导72h的CAR19-NK细胞，避光孵育4h后；
2.3用多功能酶标仪检测OD值，计算出各组杀伤效率。
B、实验结果
如图7所示，转导后的CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率远远大于NK细胞组，且各组CAR-NK之间没有太大差异。
3、CAR19-NK细胞的体内抗肿瘤效应评价
A、实验方法
3.1将处于对数生长期的人Burkkit淋巴瘤细胞系Raji细胞制备成单细胞悬液，尾静脉注射到小鼠中；
3.2随机分为6组：对照组(Vehicle组及NK细胞组)和实验组CAR-NK(CAR13及CAR16组)，每组6只荷瘤鼠，分别注射1.0×107cell/100μl，每5天给药1次，共给药4次，方案如表6所示；
3.3每周活体成像检测各鼠肿瘤负荷2次，每周称量各鼠体重2次。
B、实验结果
与对照组(Vehicle组)、NK细胞组以及CAR13-NK细胞组(非完整功能CAR-NK细胞，无胞内信号区)相比，CAR16-NK细胞治疗可以显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，同时，CAR16-NK治疗对小鼠的体重无显著影响，提示，无显著毒副作用。(如图8-11所示)
表6给药方案
组号 组名 动物数 剂量及频次 给药途径
1 Vehicle组 6 - i.v.
2 NK组 6 1*10^7，Q5D*4 i.v.
3 CAR13组 6 1*10^7，Q5D*4 i.v.
4 CAR16组 6 1*10^7，Q5D*4 i.v.
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向CD19的CAR，其特征在于，所述CAR包括靶向CD19的ScFv，所述CAR还包括信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激区、或信号转导区中的一种或多种；
优选地，所述CAR包括信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区、共刺激区、信号转导区顺次相连；
优选地，所述CAR包括信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区顺次相连；
优选地，所述信号肽为CD8α，所述铰链区包括lgG4、lgG4(L)、或CD8α，所述跨膜区包括CD28或CD8α，所述共刺激区包括CD28、4-1BB、或OX40，所述信号转导域为CD3ζ；
优选地，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4铰链区、CD28跨膜区、OX40共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连；
优选地，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4铰链区、CD28跨膜区顺次相连；
优选地，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、lgG4(L)铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连；
优选地，所述CAR包括CD8α信号肽、靶向CD19的ScFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ信号转导区顺次相连。
2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述CAR包括与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的氨基酸序列；
优选地，所述CAR包括与SEQ ID NO:8至少90％序列同一性的氨基酸序列；
优选地，所述CAR包括与SEQ ID NO:10至少90％序列同一性的氨基酸序列；
优选地，所述CAR包括与SEQ ID NO:12至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.一种多核苷酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述多核苷酸分子包括编码权利要求1或2所述的CAR的核苷酸序列；
优选地，所述载体为腺病毒载体；
优选地，所述腺病毒载体是pAd.NK腺病毒载体；
优选地，所述多核苷酸分子包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、或SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列至少90％序列同一性的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸分子还包括编码sIL-15分子的核苷酸序列，所述sIL-15分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
优选地，所述编码sIL-15分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
优选地，所述多核苷酸分子还包括编码EF1α的如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸分子还包括编码BGHpa的如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸分子还包括编码hPGKp的如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸分子还包括编码SV40 PA的如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸分子中编码EF1α、权利要求1或2所述的CAR、BGHpa、hPGKp、sIL-15、SV40 PA的核苷酸序列顺次相连；
优选地，所述多核苷酸分子中编码EF1α、权利要求1或2所述的CAR、BGHpa、hPGKp、sIL-15、SV40 PA的核苷酸序列由P2A、T2A或E2A连接。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求1或2所述的CAR、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体；
优选地，所述细胞包括真核细胞或原核细胞；
优选地，所述细胞包括T细胞、B细胞、或NK细胞。
5.一种制备靶向CD19的CAR细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的CAR、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体通过腺病毒转导进入细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括步骤：
1)通过分子生物学技术合成权利要求1中所述的信号肽、ScFv、铰链区、跨膜区、共刺激区、信号转导区和权利要求3中所述的BGHpa、hPGKp、sIL15、SV40pa的核苷酸片段；
2)将步骤1)中所述分子以权利要求3中的核苷酸序列的顺序进行连接，并将完整核苷酸序列克隆到腺病毒载体；
3)选取健康淋巴系统中的单个核细胞，接种到NK细胞激活培养基和NK细胞扩增培养基培养10-15天；
4)将培养出的细胞接种到NK细胞基础培养基，腺病毒载体感染细胞，添加BX795促转导剂，转导4h，补充等体积含双倍因子的NK细胞完全培养基，转导24h，离心换液，用NK细胞扩增培养基继续培养，转导3天，得到CAR细胞；
优选地，所述NK细胞激活培养基为含5％的自体血浆、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS；
优选地，所述NK细胞扩增培养基为含5％的血清替代物、1000IU/mL的IL-2、500IU/mL的IL-15的NK MACS；
优选地，所述NK细胞基础培养基为NK MACS；
优选地，所述NK细胞完全培养基为含2000IU/mL的IL-2、1000IU/mL的IL-15的NK MACS；
优选地，所述分子生物学技术包括PCR、限制性酶切、同源重组；
优选地，所述腺病毒载体为pAd.NK腺病毒载体；
优选地，所述步骤2)中连接的方式为正向插入，连接的位点为PmeI；
优选地，所述步骤3)中的细胞为NK细胞；
优选地，所述步骤4)中腺病毒载体感染细胞的MOI＝2500VPs/cell。
7.一种用于治疗或预防癌症的细胞治疗组合物，其特征在于，所述细胞治疗组合物包括权利要求4所述的细胞，或权利要求5或6所述的方法制备的细胞作为活性成分。
8.权利要求1或2所述的CAR、权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体、或权利要求4所述的细胞在制备治疗CD19阳性癌症的药物组合物中的应用；
优选地，所述CD19阳性癌症包括骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征、白血病前期、血癌、急性白血病、B细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、小淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺癌、胆道癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、骨髓癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、胃癌、胶质瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌、头颈癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、或成神经管细胞瘤。
9.权利要求1或2所述的CAR、权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体在制备高靶向CD19的CAR表达同时sIL-15低表达的NK细胞中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求4所述的细胞；
优选地，所述药物组合物包括药学上可接受的辅料。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109468282A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 青岛协和华美医学诊断技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用
CN109789164A (zh) * 2016-08-30 2019-05-21 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有gitr胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体
WO2021169977A1 (zh) * 2020-02-28 2021-09-02 南京北恒生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN113549600A (zh) * 2021-06-30 2021-10-26 徐州医科大学 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞
CN114317606A (zh) * 2021-06-18 2022-04-12 北京景达生物科技有限公司 靶向人nk细胞的腺病毒载体及其应用
CN115916224A (zh) * 2020-04-24 2023-04-04 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109789164A (zh) * 2016-08-30 2019-05-21 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有gitr胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体
CN109468282A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 青岛协和华美医学诊断技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用
WO2021169977A1 (zh) * 2020-02-28 2021-09-02 南京北恒生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN115916224A (zh) * 2020-04-24 2023-04-04 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN114317606A (zh) * 2021-06-18 2022-04-12 北京景达生物科技有限公司 靶向人nk细胞的腺病毒载体及其应用
CN113549600A (zh) * 2021-06-30 2021-10-26 徐州医科大学 一种具有CD19的特异性抗性的CAR-iNKT细胞

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