CN109789164A - 具有gitr胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其包含从N末端到C末端：(i)单链可变片段(scFv)，包含VH和VL，其中scFv结合肿瘤抗原，(ii)跨膜结构域，(iii)GITR胞内结构域的共刺激结构域，和(iv)激活结构域。在一个实施方式中，肿瘤抗原是人表皮生长因子受体(EGFR)、人间皮素或人CD19。具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的CAR具有优于其他传统CAR共刺激结构域的某些优势。

Description

具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体
参考序列表、表格或计算机程序
序列表通过EFS-Web与说明书同时提交作为ASCII格式的文本文件，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2017年8月30日，大小为38.7千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并且其全部内容通过引用的形式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体(CAR)，它有效地攻击过表达肿瘤抗原，如EGFR，间皮素或CD19的肿瘤细胞，而不攻击不表达这种肿瘤抗原的癌细胞。
发明背景
免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞，作为我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原，并区分异常(癌症或感染细胞)与正常细胞。用CAR遗传修饰T细胞是设计肿瘤特异性T细胞的最常用方法。靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞可以输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，CAR-T技术的优势在于重编程的工程化T细胞可以增殖并持续存在于患者体内(“活药物”)[3]，[4]。
CAR
CAR(嵌合抗原受体)通常由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)组成，其通过铰链和跨膜结构域连接至数量可变的细胞内信号传导结构域：(i)单个细胞激活的CD3-ζ结构域；或(ii)CD28或CD137(4-1BB)作为共刺激结构域，与CD3-ζ结构域串联。(图1)。CD27信号传导结构域也被用于代替CD28或CD137结构域[1,2]。CAR从第一代(没有共刺激结构域)演变到第二代(具有一个共刺激结构域)、到第三代CAR(具有几个共刺激结构域)。生成具有多个共刺激结构域的CAR(所谓的第3代CAR)已导致细胞溶解活性增加，并且显著改善了表现出抗肿瘤活性增强的CAR-T细胞的持久性。CAR结构如图1所示。
CAR-T细胞有效地用于针对血液癌症靶标的临床试验[6]。最近，CAR-T细胞用于针对间皮素、EGFR、Her-2或其他靶标的实体瘤[5,7]。亲和调节的Her-2和EGFR对癌细胞的特异性比正常细胞高，为CAR-T治疗提供了更高的安全性[5]。
EGFR
EGFR是一种表皮生长因子受体，其在许多类型的癌症中过表达[3]。EGFR是Erb家族的四种受体酪氨酸激酶之一，如ErbB2/HER-2，ErbB3/HER3和ErbB4/HER4[3]。EGFR在增殖、生长调节、血管生成、存活和转移中起重要作用。
EFGR含有4个细胞外结构域、跨膜结构域和含有酪氨酸激酶结构域和羧基末尾的细胞内结构域(图2)。许多类型的癌症，如胶质母细胞瘤和其他癌症都缺失5-273的氨基酸，从而导致EGFRvIII形式的表达[4]。两种形式的EGFR野生型和EGFRvIII对于肿瘤存活信号传导都是至关重要的。
EGFR参与MAP激酶、PI3K、AKT、STAT信号通路的调节。开发了许多酪氨酸激酶抑制剂，并且最近开发了靶向EGFR信号传导的免疫治疗方法[5]。
间皮素
间皮素是一种肿瘤表面抗原，其在许多类型的肿瘤中高度过表达[8]，包括卵巢肿瘤[9]。间皮素-CD28-CD3ζCAR-T细胞已被证明可杀死卵巢肿瘤[10]。
CD19
分化簇19(CD19)是由CD19基因编码的蛋白质，并且是在B细胞表面上发现的B淋巴细胞抗原。CD19在许多类型的血液癌症中高度表达[2,6,11,12]。CD19-CD28-CD3ζ和CD19-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞已被证明可以杀死血液癌症[13]。许多CD19-CAR-T细胞临床试验在这种类型的治疗中显示出有希望的临床结果[14]。
附图的简要说明
图1.CAR的结构。在左图，显示了第一代(无共刺激结构域)的结构。在中间图中，显示了第二代(一个共刺激结构域CD28)。在右图中，显示了第三代(CD28和4-1BB的两个共刺激结构域)[7]。
图2.EGFR和EGFRvIII蛋白的结构。
图3.EGFR-CAR、间皮素-CAR和CD19-CAR构建体的结构。本发明使用GITR作为共刺激结构域。
图4.体外扩增EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞。
图5A-5D.FAB染色证明EGFR scFv在转导的T细胞中表达。
图6A-6E.EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞对EGFR阳性癌细胞具有高度细胞毒性，但不针对EGFR阴性的癌细胞。图6A-6D显示具有不同共刺激结构域的EGFR-CAR在EGFR高表达的不同癌细胞系中的细胞毒活性。图6E显示EGFR-CAR在EGFR-1阴性的MCF-7细胞中没有细胞毒活性。E：T，效应物与靶细胞的比例。
图7.间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞杀伤间皮素阳性的卵巢癌和胰腺癌细胞。
图8.在BxPC3细胞中，间皮素-GITR CAR-T细胞比间皮素-28-CD3ζ产生的IFN-γ细胞因子至少低2倍。
图9.CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞杀伤CD19阳性的Hela-CD19细胞。CAR-T与靶细胞的比例为10：1。CD19-GITR-z表示CD19-GITR-CD3ζ。(1)和(2)显示了TM结构域不同的不同CD19构建体。CD19-GITR-z(1)具有CD8跨膜结构域，CD19-GITR-z(2)具有CD28TM结构域。两种构建体对Cd19阳性癌细胞具有大致相同的细胞溶解活性。
图10.CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞在Raji-荧光素酶+异种移植NSG小鼠模型中降低肿瘤生长。用CAR-T细胞处理3只小鼠，用1×PBS处理3只小鼠，用T细胞处理1只小鼠。
具体实施方式
定义
如本文所用，“过继细胞疗法”(ACT)是使用癌症患者自身的抗肿瘤活性T淋巴细胞的治疗，这些T淋巴细胞在体外扩增并重新注入患有癌症的患者中。
如本文所用，“亲和力”是单个分子与其配体结合的强度。通常通过平衡解离常数(KD或Kd)测定和报告亲和力，其被用于评估和分级双分子相互作用的顺序强度(orderstrength)。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指融合蛋白，其包含能够结合抗原的细胞外结构域，衍生自某多肽的跨膜结构域(该多肽不同于衍生细胞外结构域的多肽)，并且至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T-体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的细胞外结构域”是指可以结合某种抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知能够起到传递信号以引起胞内生物过程的激活或抑制的结构域作用的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区域，其独立于其他区域折叠成特定结构。
GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)是一种表面受体分子，已知可诱导T淋巴细胞存活并抑制调节性T细胞的抑制活性[15]。GITR是TNF家族受体的成员。GITR也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)，活化诱导型TNFR家族受体(AITR)，并且是由人类中的TNFRSF18基因编码的蛋白质。GITR具有241个氨基酸，其NCBI参考序列号为NP_004186.1。本发明使用GITR的细胞内结构域(SEQ ID NO：12)，其为NCBI参考序列号NP_004186.1的氨基酸残基184-241。
如本文所用，“单链可变片段(scFv)”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区通过间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
描述
发明人已经发现GITR胞内结构域可以替代CAR中的其他传统的共刺激结构域，例如CD28和4-1BB，并且在临床中提供优势。发明人已经证明，具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的CAR激活CAR-T细胞以表达EGFR、间皮素或CD19的ScFv，并杀伤EGFR-，间皮素-或CD19-阳性细胞。作为共刺激结构域的GITR胞内结构域提供优于CD28或4-1BB的优势，因为GITR可以提供以下双重功能：(i)诱导T细胞效应子功能和激活T细胞，和(ii)抑制阻断免疫应答的抑制性T调节细胞。含GITR胞内结构域的CAR T细胞可以减少细胞因子的产生，这导致较少的细胞因子释放综合征(CRS)。
本发明提供靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞，所述肿瘤抗原在许多类型的癌症中高度过表达，例如乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌和血液癌症(白血病、淋巴瘤，多发性骨髓瘤)。本发明人使用(i)特异性识别表达肿瘤抗原的癌细胞的抗体以制备scFv，和(ii)GITR胞内结构域作为共刺激结构域，以产生GITR-CAR-T细胞。本发明人已经证明，本发明的几种GITR-CD3ζ-CAR-T细胞对具有高肿瘤抗原表达的几种癌细胞具有高细胞毒活性，并且在肿瘤抗原阴性细胞中没有活性。
本发明提供了嵌合抗原受体融合蛋白，其从N末端到C末端包含：(i)单链可变片段(scFv)，其具有抗肿瘤抗原活性，(ii)跨膜结构域，(iii)作为共刺激结构域的GITR胞内结构域，和(iv)激活结构域。
在一个实施方式中，人肿瘤抗原选自下组：EGFR、间皮素、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD38、CD138、VEGFR-2、CD4、CD5、CD30、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD47、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD133、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2,10a、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、NGFR、MCAM、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、ROR-2、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9，PTCH1、WT-1、Robol、跨膜受体(Frizzled)、OX40、CD79b和Notch-1-4。优选的肿瘤抗原是人EGFR、人间皮素和人CD19。
本发明的CAR包含与感兴趣的肿瘤抗原特异性结合的单链可变片段(scFv)。抗体的重链(H链)和轻链(L链)片段通过接头序列连接。例如，接头可以是5-20个氨基酸。scFv结构从N-末端到C-末端可以是VL-接头-VH或VH-接头-VL。
本发明的CAR包含跨膜的跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然多肽，或可以人工设计。衍生自天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合或跨膜蛋白获得。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD28、CD3-ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选在合成跨膜结构域的每个末端有苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在优选的实施方式中，跨膜结构域衍生自CD28或CD8，其提供良好的受体稳定性。
本发明的CAR包含GITR胞内结构域作为共刺激结构域。
胞内结构域(激活结构域)是CAR的信号传输部分。在抗原识别后，受体聚集并将信号传递给细胞。最常用的胞内结构域组分是CD3ζ(CD3Z或CD3ζ)，其含有3个ITAM。其在抗原结合后将激活信号传递给T细胞
CAR融合蛋白可包含位于scFv的N末端，或scFv的C末端或VH和VL之间的FLAG标签。FLAG标签需要在胞外结构域，而不在胞内结构域。除了FLAG标签之外，可以在构建体中使用其他标签。FLAG标签是优选的标签，因为它不会引起免疫原性并且细胞因子分泌水平降低。
本发明的CAR可以在scFv的N-末端包含信号肽，使得当CAR在细胞，例如T细胞内表达时，新生蛋白被导向内质网并随后导向细胞表面并表达。信号肽的核心可含有长的疏水性氨基酸延伸段，其倾向于形成单个α-螺旋。信号肽可以始于短的带正电荷的氨基酸段，这有助于在易位期间实施多肽的适当拓扑。在信号肽的末端，通常存在一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位完成期间或之后切割以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后通过特异性蛋白酶消化游离信号肽。例如，信号肽可以衍生自人CD8或GM-CSF，或其具有1或2个氨基酸突变的变体，条件是信号肽仍然起作用以引起CAR的细胞表面的表达。
本发明的CAR可包含间隔序列作为铰链，以连接scFv与跨膜结构域，并在空间上分离抗原结合结构域和胞内结构域。柔性间隔物使得结合结构域在不同方向上定向以使其能够与肿瘤抗原结合。间隔序列可以例如包含IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎环、或其组合。优选人CD28或CD8茎环。
图3显示EGFR、间皮素或CD19CAR构建体的结构。使用第二代CAR-T构建体。共刺激结构域是CD28(对比)、4-1BB(对比)或GITR胞内结构域(本发明)。CD19-GITR-CD3ζ设计有CD8和CD28跨膜结构域。
本发明提供了编码上述CAR的核酸。编码CAR的核酸可以通过常规方法由特定CAR的氨基酸序列制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从各结构域的氨基酸序列的上述NCBI参考序列号(RefSeq ID)或GenBenk的登录号获得，并且使用标准分子生物学和/或化学步骤制备本发明的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且通过组合采用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA文库获得的DNA片段来制备本发明的核酸。
可以将编码本发明的CAR的核酸插入载体中，并将所述载体导入细胞中。例如，可以使用病毒载体，如逆转录病毒载体(包括慢病毒载体，致癌反转录病毒载体和假型载体)，腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，猿类病毒载体，痘苗病毒载体或仙台病毒载体，爱泼斯坦－巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺乏复制能力使得不在感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以通过基于LTR序列和载体所具有的包装信号序列选择合适的包装细胞，并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒来实施本发明的方法。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)，PA317(ATCC CRL-9078)，GP+E-86和GP+envAm-12，以及Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒产生的多种逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞可从许多公司广泛商业获得。
本发明提供了修饰的T细胞，用来表达如上所述的嵌合抗原受体融合蛋白。本发明的CAR-T细胞通过CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞中，结果，细胞被激活。表达CAR的细胞的活化根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放，细胞增殖率的改善，细胞表面分子的变化等作为指标来确认。
经修饰以表达CAR的T细胞可用作疾病的治疗剂。治疗剂包含表达CAR的T细胞作为活性成分，并且还可以包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，用于本发明的EGFR scFv对人EFGR具有低亲和力，即其具有>50nM，或>80nM，或>100nM，或>150nM，和优选≥200nM或250nM的解离常数(KD)。在一个实施方式中，scFv衍生自C10或P3-5(参见参考文献5和8)或具有至少90％的序列同一性，如C10或P3-5的序列同一性。优选地，scFv具有至少92％，95％，98％或99％的序列同一性，如C10或P3-5的序列同一性。具有对EGFR低亲和力的scFv的CAR-T细胞表现出与高亲和力抗体细胞类似的强抗肿瘤效应，但对表达生理EGFR水平的正常细胞没有作用，因此它们增加了治疗指数。
在一个实施方式中，用于本发明的间皮素scFv衍生自Lanitis等[17]报道的抗间皮素抗体。
在一个实施方式中，用于本发明的CD19scFv衍生自Kochenderfer等报道的抗CD19抗体[18]。
GITR胞内结构域属于TNFR超家族(TNFRSF)蛋白家族，并且是激活T细胞的共刺激结构域。发明人发现了使用GITR进行CAR-T治疗的以下优点。GITR-GITRL相互作用通过促进效应T细胞群的扩增和活化，并通过抑制抑制免疫活性的T调节细胞来介导有效的抗肿瘤免疫应答。GITR激活效应细胞和对抑制性调节细胞的抑制功能(inhibit the repressingfunctions of T regulatory cells)的双重功能使其对CAR-T免疫疗法有效。
本发明证明了含有慢病毒EGFR-GITR-CD3ζ的载体和EGFR-GITR-CAR-T细胞；含有慢病毒间皮素-GITR-CD3ζ的载体和间皮素-GITR-CAR-T细胞；含有慢病毒CD19-GITR-CD3ζ的载体和CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的构建。
本发明提供了具有SEQ ID NO：2、25或27所示氨基酸序列，或具有与其至少95％、或97％或99％序列同一性的序列的CAR融合蛋白。
本发明提供了编码CAR融合蛋白的核酸，该核酸具有SEQ ID NO：1、24或26所示序列，或具有与其至少95％、或97％或99％序列同一性的序列。
本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括将EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞施用于患有癌症的个体的步骤。
本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括向患有癌症的个体施用间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞的步骤。
本发明提供了用于治疗癌症的过继细胞疗法，包括将CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞施用于患有癌症的个体的步骤。
在一个实施方式中，使用低亲和力EGFR抗体和作为共刺激结构域的GITR胞内结构域来制备EFGR-GITR CAR-T细胞构建体。将EGFR scFv(例如，来自低亲和力抗体C10或P3-5[16])克隆到慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点。CAR构建体含有CD8信号肽、来自低亲和力EGFR抗体的EGFR scFv：VH-(可变重链)－连接肽3－VL(可变轻链)、CD8铰链、CD28跨膜结构域、GITR胞内结构域和CD3ζ激活结构域。
本发明人已经产生针对EGFR阳性癌细胞系，例如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，脑癌等的EGFR-scFv-GITR-CD3ζ-CAR-T细胞。本发明人已经提供数据证明EGFR-GITR CAR-T细胞在培养中有效扩增。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T可靶向EGFR阳性和EGFR-vIII阳性癌细胞。
本发明人已经产生针对间皮素阳性癌细胞系，如卵巢和胰腺细胞的间皮素-scFv-GITR-CD3zeta-CAR-T细胞。发明人已证明间皮素-GITR CAR-T细胞在培养中的有效扩增。间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞对间皮素阳性CAR-T细胞呈阳性。
本发明人已经产生针对CD19阳性癌细胞系(例如宫颈癌细胞和血液癌)的CD19-ScFv-GITR-CD3ζ-CAR-T细胞。发明人已证明CD19-GITR CAR-T细胞在培养中的有效扩增。CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞对CD19阳性的CAR-T细胞呈阳性。
EGFR-GITR-CD3ζCAR-T，间皮素-GITR-CD3ζCAR-T和CD19-GITR-CD3ζCAR-T可与化疗，如检查点抑制剂、靶向治疗、小分子抑制剂和抗体联合使用。
第三代CAR或其他共刺激信号结构域可与EGFR-GITR-CD3ζCAR、间皮素-GITR-CD3ζCAR和CD19-GITR-CD3ζCAR一起使用。
EGFR-GITR-CD3ζCAR-T，间皮素-GITR-CD3ζCAR-T或CD19-GITR-CD3ζCAR-T与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境(VEGFR-1-3)的CAR-T的组合可用于增强单一疗法的活性。
Bi-scFv-GITR CAR可用于增强单一抗体scFv-GITR CAR，scFv-间皮素CAR或scFv-CD19CAR的活性。
以下实施例进一步说明了本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，不应解释为限制。
实施例
将本发明人在慢病毒载体内产生的EGFR、间皮素(Meso)、CD19CAR构建体克隆到慢病毒载体的Xba I和EcoR I位点。包含CD8信号肽-EGFRscFv(或Meso scFv，或CD19scFv)-CD8铰链-CD28跨膜胞内结构域-GITR结构域-CD3ζ的pCD510-FMC63-28z慢病毒CAR构建体插入在Xba I和EcoRI克隆位点之间。
在293T细胞中产生慢病毒，通过RT-PCR建立滴度。然后如实施例部分所述，使用等剂量的慢病毒转导T细胞。我们使用CAR慢病毒转导T细胞，并使用对照非转导T细胞测试CAR-T细胞对EGFR、间皮素或CD19阳性细胞系的细胞毒活性。
实施例1.细胞系
在含有10％FBS(AmCell，山景城，加利福尼亚州)的DMEM(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺斯州)中培养A1847、SKOV-3、卵巢细胞和BxPC3胰腺癌细胞。利用Ficoll-Paque(GEHealthcare)作密度沉降分离人外周血单核细胞(PBMC)。HEK293FT细胞来自AlStem(Richmond，加利福尼亚州)的馈赠，并在含有10％FBS的DMEM中培养。在我们的实验室中，通过流式细胞术，使用细胞特异性的表面标记验证所有细胞系。
实施例2.EGFR、间皮素、CD19CAR构建体
将间皮素P4人抗体(Lanitis，等人(2012)，Mol Ther 20,633-643)，EGFR C10人抗体((Liu等(2015)Cancer Res 75,3596-3607)或小鼠CD19FMC063(Kochenderfer等，2009，JImmunother 32,689-702.[13])的ScFv插入到第二代CAR盒中，侧接人CD8的信号肽和来自人CD8α的铰链区之间的Nhe I和Xho I限制性位点，接着是(i)CD28，或(ii)GITR结构域的跨膜结构域和共刺激结构域，和CD3zeta激活结构域，如图3中所示。合成编码CAR的DNA，并将其亚克隆到第三代的慢病毒载体，Syno Biological(中国北京)的Lenti CMV-MCS-EF1a-puro中。所有CAR慢病毒构建体均在两个方向进行测序以确认CAR序列并用于慢病毒生产。
实施例3.编码CAR的慢病毒的产生
将1000万个生长停滞的HEK293FT细胞(Thermo Fisher)接种到T75烧瓶中并培养过夜，然后使用CalPhos转染试剂盒(Takara，山景城，加利福尼亚州)转染pPACKH1慢病毒载体包装混合物(System Biosciences，帕罗奥图，加利福尼亚州)和10μg的各慢病毒载体。第二天，用新鲜培养基替换培养基，48小时后收集含有慢病毒的培养基。通过在2100g离心30分钟清除培养基中的细胞碎片。通过在112,000g离心100分钟收集病毒颗粒，悬浮于AIM V培养基中，等分试样并在-80℃下冷冻。根据制造商的方案使用Lenti-X qRT-PCR试剂盒(Takara)和7900HT热循环仪(Thermo Fisher)，通过定量RT-PCR测定病毒的滴度(以pfu/ml表示)。
实施例4.CAR-T细胞的产生和扩增
将PBMC以1×106个细胞/ml悬浮于含有10％FBS和300U/ml IL-2(Thermo Fisher)的AIM V-AlbuMAX培养基(Thermo Fisher)中，与相同数量(1：1比例)的CD3/CD28免疫磁珠(Thermo Fisher)混合，并在未处理的24孔板(每孔0.5ml)中培养。在24和48小时，慢病毒以5的感染复数(MOI)加入培养物中，同时加入1μl的TransPlus转导增强子(AlStem)。随着T细胞在接下来的两周内增殖，每2-3天对细胞进行计数，向培养物中加入含有300U/ml IL-2的新鲜培养基，使细胞密度保持在1-3×106个细胞/ml。
实施例5.流式细胞术
为了测量CAR表达，将50万个细胞悬浮在100μl的缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中，并在冰上与1μl的人血清(Jackson Immunoresearch，西格罗夫，宾夕法尼亚州)一起温育10分钟。然后利用检测EGFR scFv，Meso scFv或CD19scFv的1μl的别藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD3(eBioscience，San Diego，CA)、2μl的7-氨基放线菌素D(7-AAD，BioLegend，San Diego，CA)和2μl的生物素标记的多克隆的山羊抗人-F(ab)2抗体(Life Technologies)或生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体(Life Technologies)检测CAR表达。用3ml缓冲液冲洗细胞，然后悬浮在缓冲液中并在FACS Calibur(BD Biosciences)上获得。首先分析细胞的光散射与7-AAD染色，然后将7-AAD-活门控细胞的CD3染色对F(as)2染色或同种型对照染色作图。
实施例6.实时细胞毒性测定(RTCA)
将贴壁靶细胞以每孔1×104个细胞接种到96孔E板(Acea Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚州)中，并使用基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)iCELLigence系统(Acea)在培养物中监测过夜(Acea Biosciences)。第二天，除去培养基并用含有10％FBS±1×105效应细胞(CAR-T细胞或未转导的T细胞)的AIM V-AlbuMAX培养基替换，进行三次独立重复实验。用RTCA系统再监测E板中的细胞2天，并且将阻抗对时间作图。细胞溶解计算为：(没有效应细胞的靶细胞的阻抗-具有效应细胞的靶细胞的阻抗)×100/没有效应细胞的靶细胞的阻抗。
实施例7.细胞因子分泌测定
将靶细胞与效应细胞(CAR-T细胞或未转导的T细胞)以1：1的比例(每个1×104个细胞)在U形底96孔板中用200μl的含有10％FBS的AIM V-AlbuMAX培养基一起培养，进行三次独立重复实验。16小时后，将上层的150μl培养基转移至V底96孔板，并以300g离心5分钟以沉淀任何残留的细胞。将上层的120μl上清液转移至新的96孔板，并使用来自ThermoFisher的试剂盒根据制造商的方案用ELISA分析人IFN-γ和IL-2的水平。
实施例8.EGFR-GITR-CD3ζCAR序列。
该实施例的CAR构建体：人CD8信号肽，衍生自C10低亲和力EGFR抗体的人EGFRscFv[5,8](VH-连接肽-VL)，CD8铰链，CD28跨膜，共刺激结构域(GITR)，CD3ζ激活结构域(见图3)。C10EGFR抗体对A431细胞的解离常数KD为265nM。
在EcoR1和XhoI位点内具有EGFR-GITR-CD3ζCAR(图3)的慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。EGFR scFv的侧翼为NheI和XhoI位点，并且可以被其他scFv替代，例如MESO scFv或CD19scFv。
SEQ ID NO:1:
tctagagccgccaccATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagc
gaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtg
agctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcg
ccgggccagggcctggaatggatgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactat
gcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtat
atggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaa
ggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcacc
ctggtgaccgtgagcagc
GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT
cagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaatt
acctgccagggcgatagcctgcgcagctattttgcgagctggtatcagcagaaaccgggc
caggcgccgaccctggtgatgtatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgc
tttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaa
gatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggc
gcgggcaccaaactgaccgtgctg
ctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg
CAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGA
GAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTC
CCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGG
GTG
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAtaggaattc
下面的SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P A S E V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q A P G Q G L E W M G G I I P I F G T A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R E E G P Y C S S T S C Y G A F D I W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S Q S V L T Q D P A V S V A L G Q T V K I T C Q G D S L R S Y F A S W Y Q Q K P G Q A P T L V M Y A R N D R P A G V P D R F S G S K S G T S A S L A I S G L Q S E D E A D Y Y C A A W D D S L N G Y L F G A G T K L T V L L E K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A S R P A A GG A V H T R G L D F A S D K P F W V L V V V G G V L A C Y S L L V T V A F I IF W V Q L G L H I W Q L R S Q C M W P R E T Q L L L E V P P S T E D A R S C QF P E E E R G E R S A E E K G R L G D L W V R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R
EGFR-GITR CAR构建体的方案如下所示，其分别显示了SEQ ID NO：1和2所示的亚结构域核苷酸序列和氨基酸序列。
<huCD8信号肽>
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO:3)
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P(SEQ ID NO:4)
<NheI限制性位点>
GCTAGC
氨基酸：AS
<EGFR scFV>
核苷酸序列：SEQ ID NO:5
gaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtg
agctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcg
ccgggccagggcctggaatggatgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactat
gcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgcggatgaaagcaccagcaccgcgtat
atggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaa
ggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcacc
ctggtgaccgtgagcagc
GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT GGTGGCGGTGGTTCT
cagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaatt
acctgccagggcgatagcctgcgcagctattttgcgagctggtatcagcagaaaccgggc
caggcgccgaccctggtgatgtatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgc
tttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaa
gatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggc
gcgggcaccaaactgaccgtgctg
氨基酸序列：SEQ ID NO:6,其是SEQ ID NO：2中带下划线的序列
E V Q L V Q S G A E V K K P G S S V K V S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q A P G Q G L E W M G G I I P I F G T A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S T S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C A R E E G P Y C S S T S C Y G A F D I W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S Q S V L T Q D P A V S V A L G Q T V K I T C Q G D S L R S Y F A S W Y Q Q K P G Q A P T L V M Y A R N D R P A G V P D R F S G S K S G T S A S L A I S G L Q S E D E A D Y Y C A A W D D S L N G Y L F G A G T K L T V L
<XhoI限制性位点>
CTCGAG
氨基酸：LE
<CD8铰链>
AAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagccc(SEQ ID NO:7)
氨基酸序列：SEQ ID NO:8，其是SEQ ID NO：2中较大的字体，粗体序列。
<CD28跨膜结构域(CD28TM)>
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(SEQ ID NO:9)
氨基酸序列：
F W V L V V V G G V L A C Y S L L V T V A F II F W V(SEQ ID NO:10)
<GITR胞内结构域，gitr>
CAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTG(SEQ ID NO:11)
氨基酸序列：SEQ ID NO:12,其是SEQ ID NO:2中的粗体序列。
<CD3ζ激活结构域>
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAG(SEQ ID NO:13)
氨基酸序列：SEQ ID NO:14，其为SEQ ID NO：2中斜体，较大的字体，加下划线的。
实施例9.EGFR-GITR-CD3ζ-CAR的序列
该构建体包括人CD8信号肽，衍生自P3-5[5,8]的人EGFR scFv(VH-连接肽-VL)，CD8铰链，CD28跨膜，GITR共刺激结构域，CD3ζ激活结构域(图3)。对于431个细胞，P3-5的KD＝88nM。连接肽是3×(GGGGS，SEQ ID NO：15)。
序列类似于实施例8中描述的序列，不同之处在于，人EGFR scFv衍生自P3-5。
VH P3-5
带下划线和粗体的氨基酸不同于C10氨基酸序列。
使用www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html反向翻译为最可能的密码子的375碱基序列。
gaagtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaaagctgcaaagcgagcggcggcacctttagcagctatgcgattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatgggtgggcggcattattccgatttttggcaccgcgaactatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaaaattaccgcggatgaaagcgcgagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgaagaaggcccgtattgcagcagcaccagctgctatggcgcgtttgatatttggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:17)
VL P3-5
加下划线的氨基酸不同于C10氨基酸序列。
QSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYLASWYQQKPGQAPTLVTYARNDRPA
GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVL(SEQ ID NO:18)
将氨基酸序列反向翻译成最可能的密码子的324碱基序列。
cagagcgtgctgacccaggatccggcggtgagcgtggcgctgggccagaccgtgaaaattacctgccagggcgatagcctgcgcagctatctggcgagctggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgaccctggtgacctatgcgcgcaacgatcgcccggcgggcgtgccggatcgctttagcggcagcaaaagcggcaccagcgcgagcctggcgattagcggcctgcagagcgaagatgaagcggattattattgcgcggcgtgggatgatagcctgaacggctatctgtttggcgcgggcaccaaactgaccgtgctg(SEQ ID NO:19)
实施例10.EGFR-CD28-CD3ζCAR的序列
该构建体包括人CD8信号肽，人EGFR scFv(VH-连接肽-VL)，CD8铰链，CD28跨膜，CD28共刺激结构域，CD3ζ激活结构域(见图3)。连接肽是3×(GGGGS，SEQ ID NO：15)。
序列与实施例8中描述的序列相似，不同之处在于将CD28用作共刺激结构域。
<CD28共刺激结构域序列>
核苷酸序列：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:20)
氨基酸序列：
R S K R S R L L H S D Y M N M T P R R P G P T R K H Y Q P Y A P P R DF A A Y R S(SEQ ID NO:21)
实施例11.EGFR-4-1BB-CD3ζCAR
该构建体包括人CD8信号肽，人EGFR scFv(VH-连接肽-VL)，CD8铰链，CD28跨膜，4-1BB共刺激结构域，CD3ζ激活结构域(见图3)。连接肽是3×(GGGGS，SEQ ID NO：15)。
序列与实施例8中描述的序列相似，不同之处在于将4-1BB用作共刺激结构域。
4-1BB共刺激结构域序列：
核苷酸序列：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:22)
氨基酸序列：
K R G R K K L L Y I F K Q P F Met R P V Q T T Q E E D G C S C R F P EE E E G G C E L(SEQ ID NO:23)
实施例12.间皮素-GITR-CD3ζCAR序列
代替如实施例8中所示的SEQ ID NO：1和2中的EGFR ScFV，将间皮素(人P4Ab)ScFv插入到SEQ ID NO：1的Xho I和Nhe I中。
间皮素-GITR CAR核苷酸序列如下的SEQ ID NO：24所示。
前两个突出显示的GCTAGC和CTCGAG分别表示间皮素插入的Xho I和Nhe I位点。第三个突出显示的CAGCTT显示的是GITR起始位置。
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGCTAGCGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCATTATTCCGATTTTTGGCACCGCGAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAAGAAGGCCCGTATTGCAGCAGCACCAGCTGCTATGGCGCGTTTGATATTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTCAGAGCGTGCTGACCCAGGATCCGGCGGTGAGCGTGGCGCTGGGCCAGACCGTGAAAATTACCTGCCAGGGCGATAGCCTGCGCAGCTATTTTGCGAGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGACCCTGGTGATGTATGCGCGCAACGATCGCCCGGCGGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTGGCGATTAGCGGCCTGCAGAGCGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCGCGGCGTGGGATGATAGCCTGAACGGCTATCTGTTTGGCGCGGGCACCAAACTGACCGTGCTGCTCGAGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
间皮素-GITR CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P A S E V Q L V Q S G A E V KK P G S S V K V S C K A S G G T F S S Y A I S W V R Q A P G Q G L E W M G G II P I F G T A N Y A Q K F Q G R V T I T A D E S T S T A Y M E L S S L R S E DT A V Y Y C A R E E G P Y C S S T S C Y G A F D I W G Q G T L V T V S S G G GG S G G G G S G G G G S Q S V L T Q D P A V S V A L G Q T V K I T C Q G D S LR S Y F A S W Y Q Q K P G Q A P T L V M Y A R N D R P A G V P D R F S G S K SG T S A S L A I S G L Q S E D E A D Y Y C A A W D D S L N G Y L F G A G T K LT V L L E K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A S R P A A GG A V H T R G L D F A S D K P F W V L V V V G G V L A C Y S L L V T V A F I IF W V Q L G L H I W Q L R S Q C M W P R E T Q L L L E V P P S T E D A R S C QF P E E E R G E R S A E E K G R L G D L W V R V K F S R S A D A P A Y Q Q G QN Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P QE G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L ST A T K D T Y D A L H M Q A L P P R
实施例13.CD19-GITR-CD3ζCAR序列
代替实施例8中所示的EGFR ScFV，序列如SEQ ID No 1和2所示，将CD19ScFv插入到SEQ ID NO：1中的Xho I和Nhe I位点。
CD19-GITR-ζCAR核苷酸序列如下SEQ ID NO：26所示。
前两个突出显示的GCTAGC和CTCGAG示出了CD19ScFv插入的Xho I和Nhe I位点。第三个突出显示的CAGCTT示出了GITR起始位置。
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagc
gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgca
ctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg
CAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGA
GAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTC
CCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGG
GTG
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
CD19-GITRζCAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。用粗体表示CD19scFv，用下划线表示GITR。
我们还使用CD19-Flag ScFv和GM-CSF信号肽代替CD8信号肽来产生CD19-Flag-GITR-CD3ζCAR，该CAR的活性与上述CD19-GITR-CD3ζ构建体相似。
我们还测试了含CD8跨膜结构域(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC，SEQ ID NO:28)，而非CD28跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζ，并且两种构建体(见图3)具有相似的活性。
具有CD8跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζ的核苷酸和氨基酸序列如下所示。
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGTTCCGGAGGCGGCGGTTCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCAGCTTGGACTGCACATCTGGCAGCTGAGGAGTCAGTGCATGTGGCCCCGAGAGACCCAGCTGCTGCTGGAGGTGCCGCCGTCGACCGAAGACGCCAGAAGCTGCCAGTTCCCCGAGGAAGAGCGGGGCGAGCGATCGGCAGAGGAGAAGGGGCGGCTGGGAGACCTGTGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:29)
具有CD8跨膜结构域的CD19-GITR-CD3ζCAR的氨基酸序列如下所示，标有下划线的为CD8跨膜结构域，GITR结构域以粗体显示。
实施例14.EGFR-GITR-CD3ζCAR-T细胞显示培养中有效扩增
EGFR-GITR CAR-T细胞在体外有效扩增(图4)。EGFR-GITR CAR-T细胞在培养20天期间扩增超过60倍。EGFR-4-1BB-CD3z-CAR-T细胞在16天后生长减缓。CD19-CD28-CD3ζCAR-T和非CD19-CAR-T细胞和未转导的T细胞也在体外有效扩增。
如图4所示，结果显示了EGFR-GITR-CD3ζCAR细胞比EGFR 4-1BB-CD3ζ和EGFR 28-CD3ζCAR-T细胞更好地扩增。
实施例15.用EGFR-CAR慢病毒构建体转导T细胞表明EGFR ScFv的表达
为了检测转导，从C10EGFR抗体表达人scFv，CAR-T细胞用抗人FAB抗体染色。在图5A-5D中，Fab染色证明EGFR scFv在转导的T细胞中的表达。EGFR-CAR-T细胞中用抗人Fab抗体的Fab染色高于未转导的T细胞中的Fab染色。
如图5所示，结果显示了用慢病毒CAR的有效转导。EGFR scFv的表达比对照非转导细胞(9.3％)高22-32％。
实施例16.EGFR-GITR-CD3ζCAR显示针对EGFR阳性癌细胞的高细胞毒活性，并且对EGFR阴性癌细胞无细胞毒活性。
实时细胞毒性测定证明EGFR-GITR-CD3ζ-CAR细胞对EGFR阳性癌细胞具有高细胞毒活性(图6)。EGFR-CAR的细胞毒活性是癌症类型依赖性的。例如，在U87胶质母细胞瘤细胞中，EGFR-GITR-CD3z-CAR-T细胞具有比EGFR-CD28-CD3ζ-CAR-T细胞更好的细胞毒活性(图6A)。EGFR-GITR-CD3ζCAR-T活性是剂量依赖性的；与10：1的比例相比，在20:1下活性增加了。
在SKOV-3卵巢癌细胞中，EGFR-GITR-CD3ζCAR-T和EGFR-CD28-CD3ζCAR-T细胞的活性相同，但高于EGFR-4-1BB-CD3ζ和模拟－对照的CAR-T细胞的活性(图6B)。GITR和CD28共刺激结构域在SKOV-3卵巢癌细胞中具有比含有4-1BB的CAR-T细胞更高的细胞毒活性(图6B)。
在另一种卵巢癌细胞系A1847中，EGFR-GITR-CD3ζ活性在30：1E：T(效应物：靶细胞比例)下优于EGFR-CD28-CD3ζ(图6C)。
在胰腺癌细胞BxPC3中，EGFR-CD28-CD3ζ的细胞毒活性高于EGFR-GITR-CD3ζ和EGFR-41BB-CD3ζ(图6D)。在EGFR阴性细胞MCF-7细胞中没有细胞毒活性(图6E)。
实施例17.间皮素-GITR-CD3ζCAR对间皮素阳性癌细胞显示高细胞毒活性。
我们用间皮素-GITR-CD3ζCAR构建体产生间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞(图3)，并测试它们对A1847、SKOV-3卵巢癌和BxPC3胰腺癌细胞的细胞溶解活性。
具有CMV启动子的慢病毒载体用于产生间皮素-GITR-CD3ζ和间皮素-CD28-CD3ζ(第2代)CAR-T细胞。具有EF1启动子的慢病毒载体用于产生间皮素-28-41BB-CD3(第3代)CAR-T细胞。将间皮素-28-CD3ζCAR T细胞标记为Meso-28-CAR-T第二代细胞。将间皮素-GITR-CD3ζCAR T细胞标记为Meso-GITR CAR-T细胞。将间皮素-28-4-1BB-CD3ζCAR T细胞标记为Meso-28-CAR-T第三代细胞。
间皮素-GITR-CD3ζCAR和间皮素-CD28-CD3ζCAR杀伤间皮素阳性癌细胞(图7)，并且具有比间皮素-28-4-1BB-CD3ζ(第三代)CAR-T细胞更好的活性。如图7所示，下图显示了在SKOV-3细胞中，间皮素-GITR-CAR-T细胞比间皮素-CD28-CD3ζCAR T细胞和间皮素-28-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞的杀伤更快。
实施例18.间皮素-GITR CAR-T细胞对癌细胞具有相同的细胞毒活性，并且比间皮素-CD28CAR-T细胞产生更少的IFN-γ细胞因子。
我们测试了间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞和间皮素-CD28-CD3ζ；两者对BxPC3癌细胞具有相同的细胞毒活性，因为它们产生细胞因子IFN-γ。间皮素-GITR-CD3ζCAR T细胞分泌的IFN-γ比间皮素-CD28-CD3ζCAR T细胞分泌的IFN-γ少2倍(图8)，这表明间皮素-GITR-CD3ζCAR-T细胞可能由于患者细胞因子释放综合征较少，在临床上具有优势。
实施例19.CD19-GITR-CD3ζCAR对CD19阳性癌细胞显示高细胞毒活性。
我们用CD8跨膜结构域和CD28跨膜结构域CAR-T细胞产生CD19-GITR-CD3ζ，并比较它们对Hela-CD19+阳性细胞的细胞溶解活性。两种CD19-GITR CAR-T细胞均具有>50％的杀伤活性(图9)。CD19-CD28-CD3ζ具有100％的杀伤活性(未示出)。CD19-GITR CAR-T细胞较低的活性可导致临床上对正常细胞的毒性较小，并且在未来的临床试验中具有优势。
实施例20.EGFR-GITR-CD3ζCAR阻断小鼠中Raji白血病细胞的肿瘤生长。
我们比较了Raji异种移植小鼠模型中CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的体内杀伤活性。将Raji-荧光素酶+细胞皮下注射到NSG小鼠中。在第12天，当肿瘤达到>50mm3时，静脉内注射CD19-GITR-CAR-T细胞(1×107个细胞/小鼠)。与1×PBS对照处理小鼠或注射T细胞对照的小鼠相比，CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞降低生物发光强度(BLI)(图10)。结果证明了CD19-GITR-CD3ζCAR-T细胞的高体内功效。与信号增加或未改变的对照组相比，用Cd19-GITR-Cd3CAR-T细胞处理的所有三只小鼠都降低了BLI(图10)。
参考文献
1.Maus,M.V.,Haas,A.R.,Beatty,G.L.,Albelda,S.M.,Levine,B.L.,Liu,X.,Zhao,Y.,Kalos,M.,和June,C.H.(2013).表达嵌合抗原受体的T细胞可引起人类的过敏反应.Cancer Immunol Res 1,26-31.
2.Maus,M.V.,Grupp,S.A.,Porter,D.L.,和June,C.H.(2014).抗体修饰的T细胞：CAR在血液系统恶性肿瘤方面处于领先地位.血液123,2625-2635.
3.Lemmon,M.A.,Schlessinger,J.,和Ferguson,K.M.(2014).EGFR家族：不是原型受体酪氨酸激酶.Cold Spring Harb Perspect Biol 6,a020768.
4.Choi,B.D.,Archer,G.E.,Mitchell,D.A.,Heimberger,A.B.,McLendon,R.E.,Bigner,D.D.,和Sampson,J.H.(2009).EGFRvIII靶向接种治疗恶性胶质瘤.Brain Pathol19,713-723.
5.Liu,X.,Jiang,S.,Fang,C.,Yang,S.,Olalere,D.,Pequignot,E.C.,Cogdill,A.P.,Li,N.,Ramones,M.,Granda,B.等人.(2015).亲和调节的ErbB2或EGFR嵌合抗原受体T细胞在小鼠中表现出增强的抗肿瘤的治疗指数.Cancer Res 75,3596-3607.
6.Maus,M.V.,和June,C.H.(2014).在研的治疗骨髓瘤的CART.Clin Cancer Res20,3899-3901.
7.Morello,A.,Sadelain,M.,和Adusumilli,P.S.(2016).靶向间皮素的CAR：将T细胞驱动至实体肿瘤.Cancer Discov 6,133-146.
8.Lamers,C.H.,Willemsen,R.,van Elzakker,P.,van Steenbergen-Langeveld,S.,Broertjes,M.,Oosterwijk-Wakka,J.,Oosterwijk,E.,Sleijfer,S.,Debets,R.,和Gratama,J.W.(2011).用离体工程化T细胞处理的患者对转基因和逆转录病毒载体的免疫应答.血液117,72-82.
9.Beatty,G.L.,Haas,A.R.,Maus,M.V.,Torigian,D.A.,Soulen,M.C.,Plesa,G.,Chew,A.,Zhao,Y.,Levine,B.L.,Albelda,S.M.等人.(2014).间皮素特异性嵌合抗原受体mRNA工程化的T细胞在实体恶性肿瘤中诱导抗肿瘤活性.Cancer Immunol Res 2,112-120.
10.Lanitis,E.,Poussin,M.,Hagemann,I.S.,Coukos,G.,Sandaltzopoulos,R.,Scholler,N.,和Powell,D.J.,Jr.(2012).用全人抗间皮素嵌合受体转导的原代人淋巴细胞的重定向抗肿瘤活性.Mol Ther 20,633-643.
11.Maus,M.V.,和June,C.H.(2013).焦点焦点：用于治疗多发性骨髓瘤的竞争性的CAR.Clin Cancer Res 19,1917-1919.
12.Kochenderfer,J.N.,和Rosenberg,S.A.(2013).用表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞治疗B细胞癌.Nat Rev Clin Oncol 10,267-276.
13.Kochenderfer,J.N.,Feldman,S.A.,Zhao,Y.,Xu,H.,Black,M.A.,Morgan,R.A.,Wilson,W.H.,和Rosenberg,S.A.(2009).抗CD19嵌合抗原受体的构建和临床前评估.J Immunother 32,689-702.
14.Ramos,C.A.,Savoldo,B.,和Dotti,G.(2014).CD19-CAR试验.癌症J 20,112-118.
15.Knee,D.A.,Hewes,B.,和Brogdon,J.L.(2016).抗GITR癌症免疫疗法的基本原理.Eur J Cancer 67,1-10.
16.Zhou,Y.,Drummond,D.C.,Zou,H.,Hayes,M.E.,Adams,G.P.,Kirpotin,D.B.,和Marks,J.D.(2007).单链Fv抗体片段亲和力对表达表皮生长因子受体的肿瘤细胞的纳米颗粒靶向的影响.J Mol Biol 371,934-947.
17.Lanitis,E.等人.(2012)用全人抗间皮素嵌合受体转导的原代人淋巴细胞的重定向抗肿瘤活性.Mol Ther 20,3,633-643.
18.Kochenderfer JN,等人.(2009)抗CD19嵌合抗原受体的构建和临床前评估.JImmunother 82/7 689-702
序列表
<110> 普曼生物技术有限公司
湖南远泰生物技术有限公司
通用医疗公司
<120> 具有GITR胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体
<130> 119995-8006.WO01
<150> US 62/381,418
<151> 2016-08-30
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1590
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tctagagccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60
ctccacgccg ccaggccggc tagcgaagtg cagctggtgc agagcggcgc ggaagtgaaa 120
aaaccgggca gcagcgtgaa agtgagctgc aaagcgagcg gcggcacctt tagcagctat 180
gcgattagct gggtgcgcca ggcgccgggc cagggcctgg aatggatggg cggcattatt 240
ccgatttttg gcaccgcgaa ctatgcgcag aaatttcagg gccgcgtgac cattaccgcg 300
gatgaaagca ccagcaccgc gtatatggaa ctgagcagcc tgcgcagcga agataccgcg 360
gtgtattatt gcgcgcgcga agaaggcccg tattgcagca gcaccagctg ctatggcgcg 420
tttgatattt ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcggtggcgg tggttctggt 480
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gtggcgctgg gccagaccgt gaaaattacc tgccagggcg atagcctgcg cagctatttt 600
gcgagctggt atcagcagaa accgggccag gcgccgaccc tggtgatgta tgcgcgcaac 660
gatcgcccgg cgggcgtgcc ggatcgcttt agcggcagca aaagcggcac cagcgcgagc 720
ctggcgatta gcggcctgca gagcgaagat gaagcggatt attattgcgc ggcgtgggat 780
gatagcctga acggctatct gtttggcgcg ggcaccaaac tgaccgtgct gctcgagaag 840
cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 900
ctgtccctgc gcccagaggc gagccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 960
ctggacttcg ccagtgataa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 1020
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgcagct tggactgcac 1080
atctggcagc tgaggagtca gtgcatgtgg ccccgagaga cccagctgct gctggaggtg 1140
ccgccgtcga ccgaagacgc cagaagctgc cagttccccg aggaagagcg gggcgagcga 1200
tcggcagagg agaaggggcg gctgggagac ctgtgggtga gagtgaagtt cagcaggagc 1260
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1320
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1380
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atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1500
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1560
caggccctgc cccctcgcta ataggaattc 1590
<210> 2
<211> 521
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr
65 70 75 80
Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
85 90 95
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Cys Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
165 170 175
Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
180 185 190
Ser Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr
195 200 205
Leu Val Met Tyr Ala Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
225 230 235 240
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Asn Gly Tyr Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260 265 270
Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
290 295 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
305 310 315 320
Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
325 330 335
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Leu
340 345 350
Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu
355 360 365
Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser
370 375 380
Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys
385 390 395 400
Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
405 410 415
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
420 425 430
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
435 440 445
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln
450 455 460
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
465 470 475 480
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
485 490 495
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
500 505 510
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 747
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60
agctgcaaag cgagcggcgg cacctttagc agctatgcga ttagctgggt gcgccaggcg 120
ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggc attattccga tttttggcac cgcgaactat 180
gcgcagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat 240
atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgaagaa 300
ggcccgtatt gcagcagcac cagctgctat ggcgcgtttg atatttgggg ccagggcacc 360
ctggtgaccg tgagcagcgg tggcggtggt tctggtggcg gtggttctgg tggcggtggt 420
tctcagagcg tgctgaccca ggatccggcg gtgagcgtgg cgctgggcca gaccgtgaaa 480
attacctgcc agggcgatag cctgcgcagc tattttgcga gctggtatca gcagaaaccg 540
ggccaggcgc cgaccctggt gatgtatgcg cgcaacgatc gcccggcggg cgtgccggat 600
cgctttagcg gcagcaaaag cggcaccagc gcgagcctgg cgattagcgg cctgcagagc 660
gaagatgaag cggattatta ttgcgcggcg tgggatgata gcctgaacgg ctatctgttt 720
ggcgcgggca ccaaactgac cgtgctg 747
<210> 6
<211> 249
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Gly Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val
130 135 140
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys
145 150 155 160
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu Val Met Tyr Ala Arg Asn
180 185 190
Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Leu Phe
225 230 235 240
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 7
<211> 147
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgagccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120
gggctggact tcgccagtga taagccc 147
<210> 8
<211> 49
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro
<210> 9
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 11
<211> 174
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
cagcttggac tgcacatctg gcagctgagg agtcagtgca tgtggccccg agagacccag 60
ctgctgctgg aggtgccgcc gtcgaccgaa gacgccagaa gctgccagtt ccccgaggaa 120
gagcggggcg agcgatcggc agaggagaag gggcggctgg gagacctgtg ggtg 174
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 13
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat ag 342
<210> 14
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Glu Thr Gly
35 40 45
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
65 70 75 80
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
100 105 110
Pro Arg
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
50 55 60
Gly Arg Val Lys Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Gly Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
gaagtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaaagc 60
tgcaaagcga gcggcggcac ctttagcagc tatgcgatta gctgggtgcg ccaggcgccg 120
ggccagggcc tggaatgggt gggcggcatt attccgattt ttggcaccgc gaactatgcg 180
cagaaatttc agggccgcgt gaaaattacc gcggatgaaa gcgcgagcac cgcgtatatg 240
gaactgagca gcctgcgcag cgaagatacc gcggtgtatt attgcgcgcg cgaagaaggc 300
ccgtattgca gcagcaccag ctgctatggc gcgtttgata tttggggcca gggcaccctg 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Leu Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu Val Thr Tyr
35 40 45
Ala Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly
85 90 95
Tyr Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 19
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
cagagcgtgc tgacccagga tccggcggtg agcgtggcgc tgggccagac cgtgaaaatt 60
acctgccagg gcgatagcct gcgcagctat ctggcgagct ggtatcagca gaaaccgggc 120
caggcgccga ccctggtgac ctatgcgcgc aacgatcgcc cggcgggcgt gccggatcgc 180
tttagcggca gcaaaagcgg caccagcgcg agcctggcga ttagcggcct gcagagcgaa 240
gatgaagcgg attattattg cgcggcgtgg gatgatagcc tgaacggcta tctgtttggc 300
gcgggcacca aactgaccgt gctg 324
<210> 20
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 21
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 22
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 23
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Glu Thr Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
20 25 30
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 24
<211> 1566
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggctagcg aagtgcagct ggtgcagagc ggcgcggaag tgaaaaaacc gggcagcagc 120
gtgaaagtga gctgcaaagc gagcggcggc acctttagca gctatgcgat tagctgggtg 180
cgccaggcgc cgggccaggg cctggaatgg atgggcggca ttattccgat ttttggcacc 240
gcgaactatg cgcagaaatt tcagggccgc gtgaccatta ccgcggatga aagcaccagc 300
accgcgtata tggaactgag cagcctgcgc agcgaagata ccgcggtgta ttattgcgcg 360
cgcgaagaag gcccgtattg cagcagcacc agctgctatg gcgcgtttga tatttggggc 420
cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcggt ggcggtggtt ctggtggcgg tggttctggt 480
ggcggtggtt ctcagagcgt gctgacccag gatccggcgg tgagcgtggc gctgggccag 540
accgtgaaaa ttacctgcca gggcgatagc ctgcgcagct attttgcgag ctggtatcag 600
cagaaaccgg gccaggcgcc gaccctggtg atgtatgcgc gcaacgatcg cccggcgggc 660
gtgccggatc gctttagcgg cagcaaaagc ggcaccagcg cgagcctggc gattagcggc 720
ctgcagagcg aagatgaagc ggattattat tgcgcggcgt gggatgatag cctgaacggc 780
tatctgtttg gcgcgggcac caaactgacc gtgctgctcg agaagcccac cacgacgcca 840
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 900
gaggcgagcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgccagt 960
gataagccct tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 1020
gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg cagcttggac tgcacatctg gcagctgagg 1080
agtcagtgca tgtggccccg agagacccag ctgctgctgg aggtgccgcc gtcgaccgaa 1140
gacgccagaa gctgccagtt ccccgaggaa gagcggggcg agcgatcggc agaggagaag 1200
gggcggctgg gagacctgtg ggtgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1260
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1320
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg 1380
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1440
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1500
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1560
cgctaa 1566
<210> 25
<211> 521
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr
65 70 75 80
Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
85 90 95
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Cys Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
165 170 175
Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
180 185 190
Ser Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr
195 200 205
Leu Val Met Tyr Ala Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
225 230 235 240
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Asn Gly Tyr Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260 265 270
Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
290 295 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
305 310 315 320
Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
325 330 335
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Leu
340 345 350
Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu
355 360 365
Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser
370 375 380
Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys
385 390 395 400
Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
405 410 415
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
420 425 430
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
435 440 445
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln
450 455 460
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
465 470 475 480
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
485 490 495
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
500 505 510
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 26
<211> 1563
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggctagcg acatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc tctgggagac 120
agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag gacattagta aatatttaaa ttggtatcag 180
cagaaaccag atggaactgt taaactcctg atctaccata catcaagatt acactcagga 240
gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagatt attctctcac cattagcaac 300
ctggagcaag aagatattgc cacttacttt tgccaacagg gtaatacgct tccgtacacg 360
ttcggagggg ggactaagtt ggaaataaca ggctccacct ctggatccgg caagcccgga 420
tctggcgagg gatccaccaa gggcgaggtg aaactgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480
gcgccctcac agagcctgtc cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540
ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600
ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac 660
aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt 720
tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggtcaa 780
ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcggcc gcactcgaga agcccaccac gacgccagcg 840
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900
gcgagccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgccagtgat 960
aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 1020
acagtggcct ttattatttt ctgggtgcag cttggactgc acatctggca gctgaggagt 1080
cagtgcatgt ggccccgaga gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac 1140
gccagaagct gccagttccc cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg 1200
cggctgggag acctgtgggt gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1260
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1320
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag 1380
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1440
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1500
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1560
taa 1563
<210> 27
<211> 520
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
50 55 60
Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
145 150 155 160
Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser
165 170 175
Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn
195 200 205
Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser
210 215 220
Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
290 295 300
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
305 310 315 320
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
325 330 335
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Leu Gly
340 345 350
Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr
355 360 365
Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys
370 375 380
Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly
385 390 395 400
Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
405 410 415
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
420 425 430
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
435 440 445
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
450 455 460
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
465 470 475 480
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
485 490 495
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
500 505 510
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 29
<211> 1509
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacaggtggc ggtggcagcg gcggtggtgg ttccggaggc 420
ggcggttctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccagc ttggactgca catctggcag 1020
ctgaggagtc agtgcatgtg gccccgagag acccagctgc tgctggaggt gccgccgtcg 1080
accgaagacg ccagaagctg ccagttcccc gaggaagagc ggggcgagcg atcggcagag 1140
gagaaggggc ggctgggaga cctgtgggtg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1200
cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1260
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tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1440
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1500
cctcgctaa 1509
<210> 30
<211> 504
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gln Leu Gly Leu
325 330 335
His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln
340 345 350
Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg
370 375 380
Leu Gly Asp Leu Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Glu Thr Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500

Claims (11)

1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，包含从N末端到C末端：
(i)单链可变片段(scFv)，包含VH和VL，其中scFv结合肿瘤抗原，
(ii)跨膜结构域，
(iii)GITR胞内结构域，作为共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人EGFR。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人EGFR是野生型或EGFRvIII。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人间皮素。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤抗原是人CD19。
6.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述激活结构域是CD3ζ。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述GITR胞内结构域包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜结构域是人CD28或人CD8。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO：2、25或27所示的氨基酸序列，或与其至少95％的序列同一性。
10.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
11.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO.1、24或26所示的序列，或与其至少95％的序列同一性。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112194726A (zh) * 2020-09-02 2021-01-08 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
CN113980130A (zh) * 2020-07-27 2022-01-28 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
CN114075287A (zh) * 2020-08-18 2022-02-22 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
CN114286691A (zh) * 2020-08-06 2022-04-05 武汉思安医疗技术有限公司 Cs1-抗体和抗cs1-car-t细胞
CN117402261A (zh) * 2023-10-17 2024-01-16 北京景达生物科技有限公司 一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110577604A (zh) * 2018-06-07 2019-12-17 亘喜生物科技（上海）有限公司 携带gitr共刺激信号靶向egfr的嵌合抗原受体t细胞
CN113710705B (zh) * 2019-03-05 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 具有人源化cd19 scfv的car-t细胞
CA3132840A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2425850A2 (en) * 2005-06-15 2012-03-07 The Regents of The University of California Bispecific single chain FV antibody molecules and methods of use thereof
US20140322275A1 (en) * 2013-02-20 2014-10-30 Jennifer Brogdon TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-EGFRvIII CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR
WO2014184143A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-20 Cellectis Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
CN105142677A (zh) * 2013-02-15 2015-12-09 加利福尼亚大学董事会 嵌合抗原受体及其使用方法
WO2016124930A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Ucl Business Plc Signalling system

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104126009B (zh) * 2011-10-07 2019-05-10 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
EP3593812A3 (en) * 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2425850A2 (en) * 2005-06-15 2012-03-07 The Regents of The University of California Bispecific single chain FV antibody molecules and methods of use thereof
CN105142677A (zh) * 2013-02-15 2015-12-09 加利福尼亚大学董事会 嵌合抗原受体及其使用方法
US20140322275A1 (en) * 2013-02-20 2014-10-30 Jennifer Brogdon TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-EGFRvIII CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR
WO2014184143A1 (en) * 2013-05-13 2014-11-20 Cellectis Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2016124930A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Ucl Business Plc Signalling system

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVRIPIDIS LANITIS 等: ""Redirected Antitumor Activity of Primary Human Lymphocytes Transduced With a Fully Human Anti-mesothelin Chimeric Receptor"", 《MOLECULAR THERAPY》 *
LINDSAY BERGAN 等: ""Development and in vitro validation of anti-mesothelin biobodies that prevent CA125/Mesothelin-dependent cell attachment"", 《CANCER LETTERS》 *
VITA GOLUBOVSKAYA 等: ""GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer"", 《FRONTIERS IN BIOSCIENCE (LANDMARK EDITION)》 *
邵荣光: ""基于单克隆抗体的肿瘤免疫治疗"", 《药学学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980130A (zh) * 2020-07-27 2022-01-28 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
CN113980130B (zh) * 2020-07-27 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
CN114286691A (zh) * 2020-08-06 2022-04-05 武汉思安医疗技术有限公司 Cs1-抗体和抗cs1-car-t细胞
CN114075287A (zh) * 2020-08-18 2022-02-22 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
CN114075287B (zh) * 2020-08-18 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
CN112194726A (zh) * 2020-09-02 2021-01-08 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用
CN117402261A (zh) * 2023-10-17 2024-01-16 北京景达生物科技有限公司 一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用

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