CN109468282A - 一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用 - Google Patents

一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，具体步骤包括CD19‑CAR慢病毒载体的构建，慢病毒的制备，T细胞的分离和培养与T细胞的感染和扩增。该方法对转染体系，以及细胞培养过程中所用的培养基等进行了优化。一方面提高了T细胞的转导效率，克服了转染效率不足的问题；另一方面，CAR‑T细胞对CD19阳性细胞的杀伤能力显著提高，达到了98％以上，在治疗肿瘤中显示出巨大的潜力。

Description

一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用。
背景技术
B细胞恶性肿瘤是血液系统一组恶性异质性疾病，包括急性和慢性B淋巴细胞白血病以及一些淋巴瘤亚型，因其复发率高、预后差，是临床较难治愈的血液系统恶性肿瘤。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原，不仅表达于正常前B细胞和成熟B细胞表面，也广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达，血液中也未曾检测到CD19可溶性蛋白的存在。此外，CD19分子在膜上的分布比较暴露，易与单克隆抗体结合，且结合后无显著内化、脱落以及抗原调变的发生，因此它被认为是治疗B细胞肿瘤的一个理想靶点。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)，是人工合成的T细胞受体，结构上是由胞外靶向连接区以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。嵌合抗原受体T细胞是最具前景的肿瘤细胞免疫治疗方式之一。通过将患者的T细胞“重编码”，使其可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至细胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。通过这种靶向治疗可以有效治疗肿瘤甚至达到治愈的效果。相比于传统的治疗方法，CAR-T治疗展现出巨大的优势，如对肿瘤的特异性杀伤，只要表达它所针对的靶点就能杀伤，杀瘤范围广，并且对转移性和复发性肿瘤都有效。
虽然CAR-T治疗在临床上取得了很好的疗效，尤其是靶向CD19的CAR-T治疗更是使CD19阳性的淋巴细胞白血病患者达到90％的缓解率，但是CAR-T细胞的制备过程中所涉及到的步骤和细节很多，如T细胞的活化，转染以及扩增等等，任何环节的不足都是限制CAR-T细胞广泛开展和应用的主要因素，目前尚未在体内比较第二代和第三代CAR的报道，两代CAR之间的差异可能不止来自于信号传导域，胞外的抗原结合域(scFv)、重组T细胞的转染方法、重组T细胞的回输方式等均可能影响CAR-T细胞的最终抗肿瘤效果。CN106754725A公开了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用，制备方法并没有优化，靶细胞的杀伤率仅在75％左右，CAR-T细胞的活化能力不强。因此，本领域亟需开发和优化CAR-T的制备方法，促使细胞扩增，提高肿瘤细胞杀伤效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用，提高CAR-T细胞治疗中T细胞活化能力，克服转染效率不足的问题，对CD19的杀伤能力强。
本发明一方面提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建
在靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、提取质粒，经过酶切电泳和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；
所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)慢病毒的制备
提取慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以6-8:5:3的质量比混合，测定质粒浓度，与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，收获培养上清并离心得慢病毒浓缩液；
所述无血清培养基包括：无血清DMEM、硫酸葡聚糖、丙酮酸钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
具体步骤如下：
取细胞状态良好的HEK293T/17细胞，接种于培养皿中，细胞数量是24h后细胞融合度为80％，用含10％FBS的DMEM高糖培养液培养；
24h后，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv和辅助质粒psPAX2和pMD2.G以8:5:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，孵育15min后共转染HEK293T/17细胞，12h更换新鲜培养液；
分别在转染换液后24h，48h时收集病毒上清，4℃，3000rpm离心15min。病毒上清用4.5μm滤器过滤，过滤后的病毒上清液转入到超速离心管中，4℃，20000rpm离心2h；弃掉上清，沉淀用无血清培养液按1:50的比例重悬，得慢病毒浓缩液。
(3)T细胞的分离和培养
取健康外周血，分离淋巴细胞，用培养液1重悬，接种于CD3和CD28抗体包被的培养板中刺激培养24-48h；
所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了PHA和自体血浆；
具体步骤如下：
用肝素抗凝管取健康供者外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，400g离心30min，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水清洗，100g离心10min，得分离的淋巴细胞；
将分离出的淋巴细胞用T淋巴细胞培养液1重悬，以2×106/ml的密度接种于培养板中，按照细胞：磁珠＝1：1的比例加入预洗的抗CD3/CD28磁珠，并加入500U/ml的IL-2刺激培养。
(4)T细胞的感染和扩增
将步骤(3)刺激培养的T细胞接种到RetroNectin包被培养板中，每孔2×106个的细胞数，加入步骤(2)的慢病毒浓缩液和polybrene，37℃，饱和湿度为5％的CO2孵箱中感染8-12h后，更换新鲜培养液2，培养7-10天，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；
所述的培养液2是在X-VIVO15培养基中加入了自体血浆。
具体步骤如下：
将刺激培养后的细胞按每孔2×106个的细胞数接种到RetroNectin包被的12孔培养板中，所用包被液浓度为20μg/ml，每个孔500μl,4℃过夜或37℃，2h包被。每个孔加入200μl步骤(2)的病毒浓缩液，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene；
32℃，1800rpm离心12孔板1.5h；后置于37℃，饱和湿度为5％的CO2孵箱中感染8-12h后更换新鲜培养液2，并补足自体血浆；每隔两天更换新鲜培养液，从而获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。
优选地，步骤(1)中所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点BamH1和Sal1,与慢病毒表达载体Plv-EF1a用限制性内切酶BamH1和Sal1进行双酶切。
优选地，步骤(2)中所述的慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G的质量比为8:5:3。
优选地，步骤(2)所述的无血清培养基包括：无血清DMEM、15mg/L的硫酸葡聚糖、1.0mM的丙酮酸钠和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
优选地，步骤(3)中所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了1ng/ml的PHA和2％体积的自体血浆。
优选地，步骤(4)中所述的培养液2包是在X-VIVO15培养基中加入了2％体积的自体血浆。
优选地，在步骤(4)所述的培养板中补充终浓度为500U/ml的重组人白介素2，30ng/ml的重组人白介素7和30ng/ml的重组人白介素15。
本发明另一方面提供了靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法在制备抗B细胞恶性肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1、本发明的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备方法经过步骤的优化，使得T细胞的转导效率提高，达到了55.7％，CAR-T细胞对CD19阳性细胞的杀伤能力显著提高，达到了98％以上，在治疗肿瘤中显示出巨大的潜力，相比于现有技术中的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的肿瘤细胞杀伤效率显著提高。
2、本发明的制备方法能更有效的刺激T细胞增殖，提高所得T细胞的数量和质量，T细胞的纯度达到了99.4％，保证足够数量的CAR-T细胞发挥好的杀伤效果。
附图说明
图1为实施例1中含有靶向CD19的嵌合抗原受体基因的慢病毒质粒结构示意图；
图2为实施例2中慢病毒表达载体Plv-EF1a-CD19ScFv的限制性内切酶BamH1/Sal1双酶切片段的电泳鉴定图；
图3为实施例4中流式细胞仪检测培养前后CD3阳性T细胞的比例图；
图4为实施例4中流式细胞仪检测感染后T细胞表面Fab即CAR的表达水平图；
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1
靶向CD19的嵌合抗原受体的制备
靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其结构示意图见图1，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示，长度为1584bp。
其中，CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，长度为726bp。
实施例2
CD19-CAR慢病毒载体的构建
靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端分别加上BamH1和Sal1酶切位点，全序列合成。合成后的序列和慢病毒表达载体Plv-EF1a用限制性内切酶BamH1和Sal1进行双酶切。
酶切体系如下：
含合成序列的质粒
或Plv-EF1a空载体质粒4μg
BamH1 2μl
Sal1 2μl
10XBμffer 5μl
ddH2O补充至50μl
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将大小正确的片段切下来，利用胶回收试剂盒(购自Takara公司)回收DNA片段。
将回收后的CAR基因片段与载体片段利用连接试剂盒(购自Takara公司)进行连接，16℃连接过夜。
将连接产物10μl转入到DH5a感受态中，放置细菌培养箱中培养过夜。
取单克隆菌落，在含氨苄青霉素的LB培养液中扩大培养。
通过PCR初步筛选连接正确的克隆，小量质粒提取试剂盒提取质粒，经过BamH1和Sal1双酶切电泳和测序鉴定，酶切电泳图如图2所示,其中，M1为15000bp的Marker，M2为2000bp的Marker，1泳道为酶切的Plv-EF1a-CD19ScFv,正确的质粒命名为Plv-EF1a-CD19ScFv。取部分鉴定正确的菌液冻存于-80℃，保种。
实施例3
靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备
(1)慢病毒制备
用无内毒素质粒大提试剂盒(Qiangen公司)提取慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv，辅助质粒psPAX2和pMD2.G，按照操作说明书提取，获得的质粒经分光光度计测定浓度；
取细胞状态良好的HEK293T/17细胞，接种于培养皿中，数量以24h后细胞融合度为80％左右为宜，用含10％FBS的DMEM培养液培养。
24h后，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv和辅助质粒psPAX2和pMD2.G以8:5:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，孵育15min后共转染HEK293T/17细胞，12h更换新鲜培养液。所述无血清培养基包括：无血清DMEM、15mg/L的硫酸葡聚糖、1.0mM的丙酮酸钠和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
分别在转染换液后24h，48h时收集病毒上清，4℃，3000rpm离心15min。病毒上清用4.5μm滤器过滤，过滤后的病毒上清液转入到超速离心管中，4℃，20000rpm离心2h。弃掉上清，沉淀用无血清培养液按1:50的比例重悬，即可得病毒浓缩液，分装到1.5mlEP管中，每管200μl，-80℃保存备用。
(2)T细胞的分离和培养
用肝素抗凝管取健康供者外周血，离心后留自体血浆备用。剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，然后轻轻加入到淋巴细胞分离液(GE公司)的上层，400g离心30min；吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗细胞，100g离心10min。
获得的淋巴细胞经生理盐水洗两遍后，用T淋巴细胞培养液1重悬，并调整细胞密度为2×106/ml，按照细胞：磁珠＝1：1的比例加入预洗的抗CD3/CD28磁珠，并加入500U/ml的IL-2，刺激培养24h-48h后进行慢病毒感染。所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了1ng/ml的PHA和2％体积的自体血浆。
(3)T细胞的感染和扩增
将上述刺激培养后的细胞按每孔2×106个的细胞数接种到RetroNectin包被的12孔培养板中，所用包被液浓度为20μg/ml，每个孔500μl，4℃过夜或37℃，2h包被。将-80℃中冻存的病毒浓缩液经室温融化，每个孔加入200μl，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene。
32℃，1800rpm离心12孔板1.5h。后置于37℃，饱和湿度为5％的CO2孵箱中感染8-12h后更换新鲜培养液2，每隔两天更换新鲜培养液，从而获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。所述的培养液2是在X-VIVO15培养基中加入了2％体积的自体血浆；
培养板中补充终浓度为500U/ml的重组人白介素2(IL-2)，30ng/ml的重组人白介素7(IL-7)和30ng/ml的重组人白介素15(IL-15)。
实施例4
流式检测T淋巴细胞的比例以及转导效率
分别取小部分由外周血分离得到未经培养的淋巴细胞以及慢病毒感染后7天的细胞，离心后弃掉培养液，用PBS洗细胞，之后用100μl的PBS重悬细胞并加入APC anti-hμmanCD3(购于Biolegend公司)流式抗体标记细胞，标记后转移到流式管中用流式细胞仪检测，结果见图3。
图3的结果显示相比扩增前，扩增后CD3的比例显著升高，说明T淋巴细胞的纯度显著提高，达到了99.4％。
分别取感染后7天的空载体Plv-EF1a组(对照组)和实验Plv-EF1a-CD19ScFv组(实验组)的细胞，用PerCP anti-moμse IgG，F(ab’)2(购自Jackson公司)抗体标记T细胞表面CAR的表达效率，结果见图4。
图4中显示空载体对照组细胞无抗CD19嵌合抗原受体的表达，实验组细胞具有抗CD19嵌合抗原受体的表达，T淋巴细胞的转导效率为55.7％。
实施例5
CAR-T细胞对CD19阳性细胞的杀伤作用
流式检测：取两组(对照组和实验组)感染后7-10天的T淋巴细胞(效应细胞)，与CD19阳性的Nalm-6细胞(靶细胞)共培养，设置T淋巴细胞与Nalm-6细胞的数量比分别为2:1和10：1，将两组T细胞分别与肿瘤细胞共培养24h后，收集细胞，用PE anti-hμmanCD19流式抗体标记细胞，进行流式检测CD19阳性细胞的比例变化，计算CAR-T细胞对CD19阳性细胞的杀伤率，结果见表1。
LDH细胞毒性检测：收集两组T细胞，设置效应细胞和靶细胞的比值分别为2:1、5:1和10:1，种入96孔板中，每种设置三个复孔，经过24h的共培养后，离心细胞培养板，吸除上清，加入150μl的LDH释放试剂并混匀，继续培养1h，离心96孔板，取上清120μl，加入新的96孔板中，并加入60μlLDH检测工作液。避光孵育30min，在490nm处测定吸光度。测的吸光度减去背景对照孔吸光度，细胞毒性或凋亡率(％)＝(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100％。不同组细胞的凋亡率见表2。
将实验结果与现有技术进行比较，现有技术包括：中国专利公布CN107287164A(对比例1)；“李剑,田芳,姜鹏君,等.嵌合抗原受体修饰的CD19-CAR-T的体外构建、扩增及初步功能鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2018(4):389-393.”(对比例2)；中国专利公布CN106754725A(对比例3)；“高鹏,李玉霞,贾凡,等.抗CD19CAR-T对K562～(CD19+)肿瘤细胞特异性杀伤作用的研究[J].中国医药生物技术,2018(2).”(对比例4)。
表1：流式细胞学检测CAR-T细胞对CD19阳性细胞的杀伤率
注：“—”表示数据不存在。
表2：不同组细胞的凋亡率
注：“—”表示数据不存在。
由表1可看出，含有CAR基因的CAR-T细胞可特异性识别CD19肿瘤抗原，对CD19阳性的Nalm-6细胞，具有更强的杀伤效率，达到98％以上。
由表2可以看出，含有CAR基因的CAR-T细胞对表达CD19的细胞具有特异性杀伤活性，与对照组相比差异显著；与上述流式检测结果吻合，说明本发明提供的制备方法与现有技术相比，对CD19阳性细胞具有更强杀伤作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛协和华美医学诊断技术有限公司
<120> 一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 1
gacatacaga tgacccagac tactagctct ctgagtgcaa gtctcgggga cagggttaca 60
atttcatgcc gggcctccca ggacatctcc aaatacctta attggtatca gcagaaacct 120
gatggaaccg tgaagctctt gatctatcac acatcccggc tgcatagcgg agttccttcc 180
aggttcagtg gtagtggcag cggaacagac tatagcctca ccatcagcaa cctggaacaa 240
gaagatatcg caacatactt ctgtcagcag gggaatacac ttccttacac ttttgggggc 300
ggcaccaaac tggagatcac cggaggcgga ggctccggag gagggggaag cgggggaggt 360
gggtctgaag taaagctgca ggagagcggg ccaggcctcg tggctccgag tcagagtttg 420
agcgttacat gtacagtgtc cggcgtaagc ttgcccgatt acggcgtctc atggattcgc 480
caacctccaa ggaagggcct ggagtggctc ggggttattt ggggctctga gactacatat 540
tataatagcg cactcaagtc taggcttact atcatcaagg ataattcaaa gagccaggtc 600
tttcttaaga tgaattcact gcagactgac gacacggcca tttactactg cgcgaaacat 660
tactattacg gtggcagcta cgcaatggac tactggggcc agggtacatc cgtcaccgtg 720
agctca 726
<210> 2
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatac agatgaccca gactactagc tctctgagtg caagtctcgg ggacagggtt 120
acaatttcat gccgggcctc ccaggacatc tccaaatacc ttaattggta tcagcagaaa 180
cctgatggaa ccgtgaagct cttgatctat cacacatccc ggctgcatag cggagttcct 240
tccaggttca gtggtagtgg cagcggaaca gactatagcc tcaccatcag caacctggaa 300
caagaagata tcgcaacata cttctgtcag caggggaata cacttcctta cacttttggg 360
ggcggcacca aactggagat caccggaggc ggaggctccg gaggaggggg aagcggggga 420
ggtgggtctg aagtaaagct gcaggagagc gggccaggcc tcgtggctcc gagtcagagt 480
ttgagcgtta catgtacagt gtccggcgta agcttgcccg attacggcgt ctcatggatt 540
cgccaacctc caaggaaggg cctggagtgg ctcggggtta tttggggctc tgagactaca 600
tattataata gcgcactcaa gtctaggctt actatcatca aggataattc aaagagccag 660
gtctttctta agatgaattc actgcagact gacgacacgg ccatttacta ctgcgcgaaa 720
cattactatt acggtggcag ctacgcaatg gactactggg gccagggtac atccgtcacc 780
gtgagctcaa caactacacc agcgccccgc ccccctaccc cggcacccac aatcgccagt 840
cagccactct ccctgagacc agaagcctgc agacccgccg ccggcggagc tgtccacacc 900
cgaggcctcg atttcgcatg cgacatctat atttgggctc ctctggcagg cacctgtggg 960
gtacttctgc tctcactggt tatcaccctt tactgccggt ccaagcgcag tcggctgctt 1020
cactccgact atatgaacat gaccccaagg aggcccggcc ccactagaaa gcactatcag 1080
ccttacgctc ccccgagaga cttcgccgcc tacagatcca aacggggcag aaagaaactc 1140
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1200
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1260
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1320
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1380
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1440
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1500
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1560
atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1584

Claims (10)

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建
在靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、提取质粒，经过酶切电泳和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；
所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)慢病毒的制备
提取慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以6-8:5:3的质量比混合，测定质粒浓度，与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，收获培养上清并离心得慢病毒浓缩液；
所述无血清培养基包括：无血清DMEM、硫酸葡聚糖、丙酮酸钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸；
(3)T细胞的分离和培养
取健康外周血，分离淋巴细胞，用培养液1重悬，接种于CD3和CD28抗体包被的培养板中刺激培养24-48h；
所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了PHA和自体血浆；
(4)T细胞的感染和扩增
将步骤(3)刺激培养的T细胞接种到RetroNectin包被培养板中，每孔2×106个的细胞数，加入步骤(2)的慢病毒浓缩液和polybrene，37℃，饱和湿度为5％的CO2孵箱中感染8-12h后，更换新鲜培养液2，培养7-10天，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；
所述的培养液2是在X-VIVO15培养基中加入了自体血浆。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点BamH1和Sal1,与慢病毒表达载体Plv-EF1a用限制性内切酶BamH1和Sal1进行双酶切。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G的质量比为8:5:3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)所述的无血清培养基包括：无血清DMEM、15mg/L的硫酸葡聚糖、1.0mM的丙酮酸钠和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了1ng/ml的PHA和2％体积的自体血浆。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的培养液2是在X-VIVO15培养基中加入了2％体积的自体血浆。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
在步骤(4)所述的培养板中补充终浓度为500U/ml的重组人白介素2，30ng/ml的重组人白介素7和30ng/ml的重组人白介素15。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)的具体步骤为：
取细胞状态良好的HEK293T/17细胞，接种于培养皿中，细胞数量是24h后细胞融合度为80％，用含10％FBS的DMEM高糖培养液培养；
24h后，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv和辅助质粒psPAX2和pMD2.G以8:5:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，孵育15min后共转染HEK293T/17细胞，12h更换新鲜培养液；
分别在转染换液后24h，48h时收集病毒上清，4℃，3000rpm离心15min。病毒上清用4.5μm滤器过滤，过滤后的病毒上清液转入到超速离心管中，4℃，20000rpm离心2h，弃掉上清，沉淀用无血清培养液按1:50的比例重悬，得慢病毒浓缩液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)的具体步骤为：
用肝素抗凝管取健康供者外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，400g离心30min，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水清洗，100g离心10min，得分离的淋巴细胞；
将分离出的淋巴细胞用T淋巴细胞培养液1重悬，以2×106/ml的密度接种于培养板中，按照细胞：磁珠＝1：1的比例加入预洗的抗CD3/CD28磁珠，并加入500U/ml的IL-2刺激培养。
10.权利要求1所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法在制备抗B细胞恶性肿瘤药物中的应用。
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