KR20180083383A - 렌티바이러스 제제의 안정화를 위한 완충제 - Google Patents

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아미타브하 데브
유진 네벨리트스키
블라디미르 슬레프스킨
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노파르티스 아게
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 술폰산 완충제, 예컨대 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), 및 3-모르폴리노프로판-1-술폰산 (MOPS), 시트르산나트륨 완충제, 또는 포스페이트 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제를 제공한다. 본 발명은 추가적으로 렌티바이러스 정제 방법 뿐만 아니라 인간 세포를 형질도입하는 방법을 포괄한다.

Description

렌티바이러스 제제의 안정화를 위한 완충제
본 발명은 개선된 형질도입 능력 및 저장 안정성을 나타내는 렌티바이러스 제제, 뿐만 아니라 표적 세포에서의 이종 유전자 발현 방법에 관한 것이다.
유전자 요법 기술의 진보와 함께, 치료 바이러스 벡터의 사용은 인간 질환을 치료하기 위한 점점 더 효과적인 패러다임을 제시한다. 유전자 요법 적용에 이용가능한 바이러스 벡터 중에서 렌티바이러스 벡터가 있다. 이러한 벡터는 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1)로부터 유래된 재구축된 바이러스 벡터를 포함하며, 관심의 유전자를 동물 및 인간 1차 세포 또는 세포주 내로 도입할 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 게놈은 RNA의 코딩 가닥을 포함하며, 이는 DNA 통합전 복합체를 형성하기 위해 바이러스 역전사효소에 의한 숙주 세포의 세포질에 진입 시 DNA로 역-전사된다. 이러한 복합체는 숙주 세포의 핵 내로 수송되며, 여기서 바이러스 DNA의 부분은 후속적으로 숙주 세포 게놈 내로 통합된다. 통합된 DNA는 그 후 RNA, 예컨대 단백질-코딩 mRNA로 전사되며, 이는 궁극적으로 관심의 단백질의 후속적인 발현을 위해 세포질로 내보내질 수 있다.
렌티바이러스 벡터-매개된 유전자 발현은, 관심의 유전자가 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 바 있고, 따라서, 세포의 분열 시 복제되기 때문에, 연속적이고 안정한 단백질 생산을 달성하는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포 뿐만 아니라 세포 주기를 통해 활발하게 진행하는 것들을 효과적으로 감염시킬 수 있다. 대조적으로, 다른 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 및 고전적인 레트로바이러스 벡터는 단지 분열하는 세포만을 감염시킬 수 있다. 관심의 유전자의 렌티바이러스 벡터-매개된 만성 발현이 일어날 수 있는 조직 및 세포로는 다른 것들 중에서도 뇌, 간, 근육 세포, 망막, 조혈 줄기 세포, 골수 중간엽 줄기 세포, 및 대식세포를 들 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 생산은 몇몇 도전에 의해 장해된 바 있으며, 그 중 하나는 벡터의 낮은 안정성이다. 렌티바이러스 벡터의 제조 작업은 몇몇 단계를 포함한다: 생산, 정제, 저장, 및 유전자 전달의 적용 (Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). 렌티바이러스 벡터는 이들 공정 동안의 불활성화에 감수성이며, 이는 벡터 제제의 감소된 최종 품질 및 효능에 기여할 수 있다. 이전의 연구에서, 바이러스 벡터가 불활성화되는 한 메카니즘은 역전사를 수행하는 바이러스 용량의 소실에 의한 것으로 제시된 바 있다 (문헌 [Carmo et al., Hum. Gene Ther. 20:1168-76, 2009]; 및 [Carmo et al., J. Gene Med. 10:383-391, 2008]). 더욱이, 감염력의 소실을 수반하는 비가역적 응집을 방지하기 위해 렌티바이러스 벡터 제제를 안정화시키는 방법에 대한 필요가 잔류한다. 추가적으로, 렌티바이러스 벡터의 정제 동안, 안정화 성분은 렌티바이러스 제제로부터 제거되며, 이는 벡터가 점점 더 불안정하게 되는 것을 유발할 수 있다. 따라서, 정제 공정 전반에 걸쳐 벡터 안정성을 보존하는 렌티바이러스 제형에 대한 필요가 또한 있다.
정제 및 저장 동안, 벡터는 대개 4℃에서 저장된다 (Rodrigues et al., J. Biotechnol. 127:520-541, 2007). 렌티바이러스 벡터는 안정화 성분, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 추가적인 필요를 갖는 것으로 보고된 바 있다 (Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). 이는 외인성 단백질을 간단히 첨가하여 세포 배양 상청액과 필적하는 안정성을 되가져 오는 감마-레트로바이러스와 뚜렷이 대조된다. 지단백질은 콜레스테롤, 인지질, 및 단백질을 비롯한 몇몇 지질로 구성된 복합 구조이다 (Olson, J. Nutr. 128:S439-S443, 1998). 이들은 HSA와 함께 혈액에서 지질 수송체로서 작용한다. 지단백질-HSA 구조는 렌티바이러스 벡터의 막 주위에 보호적 배열을 형성하는 것이 가능하다 (Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). 알부민은 또한 세포 표면과 긴밀하게 회합하는 것으로 공지되어 있기 때문에 (Dziarski et al., J. Biol. Chem. 269:20431-20436, 1994), 이들 지단백질/HSA 복합체는 세포막과 유사한 벡터의 막과 회합할 수 있다. 이러한 회합은 그들의 구조에 보호를 제공하고, HSA 단독보다 더 효율적으로 형태적 변화를 방지할 수 있다.
저장 동안 안정성을 보장하기 위해, 감염성 바이러스 벡터의 스톡은 그들의 복잡성으로 인해 통상적으로 저온에서 (예를 들어, -80℃에서) 저장된 바 있다. 지질-외피화된 바이러스는 -60℃ 미만의 온도에서 양호하게 생존하고, "바이러스 감염력의 보유"가 필수적이지 않은 경우 -20℃ 또는 4℃에서의 저장이 단지 사용되어야 함이 제안된 바 있다 (Gould et al., Mol. Biotechnol. 13:57-66, 1999). 다른 조사는 특정 바이러스 벡터는 감염력을 보유하기 위해 -70℃ 이하에서 저장되어야 한다고 결론내렸다 (Harper, Virology Ed. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, UK, 1993). 전형적으로, 렌티바이러스 벡터 제제는 지질 이중층 막에 포매된 외피 단백질을 비롯한 바이러스 게놈에 의해 코딩되는 단백질을 함유한다. 저온에서, 단백질은 변성에 감수성일 수 있으며, 지질 이중층은 구조적 통합성의 소실에의 경향이 있을 수 있다. 따라서, 연장된 기간 동안 저온에서 바이러스 벡터 제제의 안정성을 증가시킬 수 있는 렌티바이러스 제형에 대한 필요가 존재한다.
렌티바이러스 벡터는, 바이러스 벡터의 반복적인 동결 및 해동이 형질도입 용량의 소실을 초래할 수 있기 때문에, 대개 장기 저장을 위해 이들 저온에서 유지된다. 따라서, 다수의 동결/해동 주기를 겪은 후에 감염력을 보유하는 렌티바이러스 제제에 대한 필요가 잔류한다.
정제 및 저장 동안의 안정성 외에도, 생체외 적용, 예컨대 키메라 항원 수용체 T (CART) 세포 요법에 유용한 렌티바이러스 벡터는 바람직하게는 생리학적으로 관련된 온도, 예컨대 형질도입을 촉진시키기 위해 렌티바이러스 벡터가 숙주 세포와 함께 인큐베이션될 수 있는 온도인 37℃에서 안정성을 보유할 것이다. 따라서, 생체외에서의 유전자 전달 사건 동안 바이러스 벡터의 구조적 통합성을 유지하는 렌티바이러스 제제에 대한 필요가 또한 존재한다.
상기-언급된 생물학적 고려사항 외에도, 바이러스 벡터 안정성을 보존하는 렌티바이러스 벡터 제제는 추가적으로 상업적 관점에서 유용할 수 있다. 재조합 렌티바이러스 벡터가 과도한 기간 동안 저온에서 저장되는 경우, 또는 재조합 벡터가 실험적 사용 또는 제조 작업 동안 다수의 동결/해동 주기를 겪는 경우, 생물학적 활성은 상당히 감소한다. 이는 감염성 입자의 감소된 회수율, 나아가 상품의 비용 (COG)의 상승을 초래한다. 또한, 활성을 소실하는 벡터 입자의 보다 높은 감수성은 전임상 또는 임상 연구에서의 부정확한 결과를 초래할 수 있다. 임상 환경에서, 초저온 (예를 들어, -60℃ 이하) 저장 장치의 사용은 추가적인 비용 부담이며, 병원 및 다른 현장 시설에서 보급적 과제를 제기한다. 일반적으로, 이들 시설은 치료를 전달하기 위해 초저온 동결 장치를 가질 것으로 예상된다. 따라서, 효율적인 제조 작업 및 실행가능한 저온 저장 방법을 촉진시키기 위해 벡터 안정성을 보존하는 재조합 렌티바이러스 벡터 제제에 대한 필요가 잔류한다.
본 발명은 각각 렌티바이러스 벡터, 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES) 완충제, 및 염을 포함하는 수성 조성물을 제공한다.
다양한 실시양태에서, PIPES 완충제는 약 10 내지 약 50 mM (예를 들어, 약 20 mM)의 농도로 존재하고/거나; 수성 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0 (예를 들어, 약 6.5)이고/거나; 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 수성 조성물 중의 염의 농도는 예를 들어, 약 25 mM 내지 약 150 mM (예를 들어, 약 50 mM 또는 약 75 mM)일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 수성 조성물은 렌티바이러스 벡터, 20 mM PIPES, 및 75 mM 염화나트륨을 포함하고, 약 6.5의 pH를 갖는다.
수성 조성물은 탄수화물, 예를 들어, 비-환원 탄수화물, 예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 탄수화물은 수성 조성물의 부피당 약 1 중량% 내지 약 10 중량% (예를 들어, 약 2 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 약 2.5 중량%)의 농도로 존재한다. 특정한 실시양태에서, 수성 조성물은 렌티바이러스 벡터, 20 mM PIPES, 75 mM 염화나트륨, 및 수성 조성물의 부피당 2.5 중량% 수크로스를 포함하고, 수성 조성물은 약 6.5의 pH를 갖는다.
다양한 실시양태에서, 수성 조성물의 오스몰랄농도는 약 270 mOsm/kg 내지 약 330 mOsm/kg (예를 들어, 약 275 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 또는 약 285 mOsm/kg)이고/거나, 렌티바이러스 벡터는 약 2 x 108 밀리리터당 형질도입 단위 (TU/mL) 내지 약 1 x 109 TU/mL (예를 들어, 약 3 x 108 TU/mL 내지 약 5 x 108 TU/mL)의 농도로 존재한다.
렌티바이러스 벡터는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV-1)일 수 있고, 임의로, 수포성 구내염 바이러스 G (VSV-G) 단백질 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 존재하는)을 포함할 수 있다. 더욱이, 렌티바이러스 벡터는 단백질 (예를 들어, 1종 이상의 키메라 항원 수용체 (CAR))을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 1종 이상의 트랜스진을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, CAR은 각각 N-말단에서 C-말단 방향으로 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1종 이상의 신호전달 도메인을 포함한다. 신호전달 도메인은 1종 이상의 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3-제타 자극성 도메인) 및/또는 1종 이상의 공동자극성 신호전달 도메인 (예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극성 단백질로부터 선택되는 세포내 도메인)을 포함할 수 있다.
CAR의 항원 결합 도메인은 임의로 scFv이거나 이를 포함할 수 있다. 더욱이, 항원 결합 도메인은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; C-유형 렉틴-유사 분자-1, CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 강글리오시드 G2 (GD2); 강글리오시드 GD3; TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-연관된 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암배아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2; 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21; 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 회합된 뮤신 1 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 안히드라제 IX (CAIX); 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 절단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질 (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3; 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종-연관된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 군 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라마이드 (글로보H)의 헥사사카라이드 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 로커스 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-연관된 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1; 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 시클린 B1; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사, T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2 (SSX2); 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체 (RAGE-1); 신장 편재성 1 (RU1); 신장 편재성 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관된 이뮤노글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 이뮤노글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 임의로 결합할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 CD19, 메소텔린, 또는 CD123에 결합한다. 추가의 특정한 실시양태에서, CAR은 항-CD19 항체 또는 그의 단편, 4-1BB (CD137) 막횡단 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 수성 조성물은 1종 이상의 (예를 들어, 모든) 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA), 소 혈청 알부민 (BSA), 및 지단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중 1종 이상 (예를 들어, 모두)을 함유하지 않고/거나; 렌티바이러스 벡터는 혈청의 부재 하에서 배양된 세포에서 생산된다.
특정 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 동적 광 산란 (DLS)에 의해 측정 시 100 ± 25 nm의 유체역학적 반경을 특징으로 한다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 25℃ 내지 55℃의 온도 범위 내에서 100 ± 25 nm의 유체역학적 반경을 유지할 수 있다.
특정 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 10% 내지 25%의 다분산도를 특징으로 한다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 25℃ 내지 55℃의 온도 범위 내에서 10% 내지 25%의 다분산도를 유지할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 동결/해동 주기 전의 수성 조성물 중의 렌티바이러스 벡터의 농도에 비해 약 70% 내지 약 100%의 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후의 농도를 유지하고, 각각의 동결/해동 주기는 수성 조성물을 동결시키고, 후속적으로 수성 조성물을 실온에서 해동시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 각각 렌티바이러스 벡터, 포스페이트 완충제, 시트르산나트륨 완충제, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충제, 3-모르폴리노프로판-1-술폰산 (MOPS) 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제, 및 염 (예를 들어, 염화나트륨, 염화마그네슘, 또는 염화칼슘)을 포함하는 수성 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 탄수화물, 예를 들어, 비-환원 탄수화물 (예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 수성 조성물을 건조시키거나 동결건조시킴으로써 제조된 건조되거나 동결건조된 조성물, 뿐만 아니라 이러한 건조되거나 동결건조된 조성물을 본원에 기재된 완충제 (또는 또 다른 투여용 표준 비히클) 중에 재구성함으로써 제조된 수성 조성물을 추가로 포함한다.
또한, 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법이 본 발명에 포함된다. 이들 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 필터를 통해 통과시켜, 그에 의해 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 수성 조성물을 제조한다. 다양한 실시양태에서, 필터는 복수의 세공, 예를 들어, 약 0.2 μm의 직경을 갖는 세공을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 수성 조성물은 렌티바이러스 벡터를 접촉 전의 수성 조성물 중의 렌티바이러스 벡터의 농도에 비해 약 80%의 농도로 포함한다.
본 발명은 또한 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법이며, (a) 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 복수의 입자를 포함하는 재료와 접촉시키고; (b) 재료를 통해 유동하는 물질을 재료 내에 잔류하는 물질로부터 분리하여, 그에 의해 렌티바이러스 벡터로 풍부화된 수성 조성물을 제조하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 뉴클레아제와 접촉시켜, 그에 의해 오염성 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 함유하지 않는 수성 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 세포를 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 1종 이상의 트랜스진을 발현하는 방법이 본 발명에 제공된다. 다양한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, T 세포, 예컨대 인간 T 세포)이다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 293T 세포, Jurkat T 세포, 또는 1차 인간 T 세포이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물 및 임의로 패키지 삽입물, 예를 들어, 키트의 사용자에게 본원에 기재된 바와 같은 방법에 따라 세포에서 트랜스진을 발현하는 것을 지시하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 포함한다. 키트는 임의로 본원에 기재된 바와 같은 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 1종 이상의 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 수성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스진을 임의로 포함하는 바이러스 벡터를 대상체의 세포 내로 전달하는 방법에 있어서의 상기 조성물의 용도를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하는, 및/또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진 (예를 들어, CARS를 코딩하는 유전자)을 전달하는 방법이 또한 본 발명에 포함되며, 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 기재되어 있는 값의 10% 초과 또는 미만 내에 있는 값을 지칭한다. 예를 들어, "약 50 mM"의 값은 45 mM 내지 55 mM의 농도를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "완충제"는 약산 및 그의 접합체 염기 또는 약염기 및 그의 접합체 산의 혼합물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 "1,4-피페라진디에탄술폰산 완충제"는 1,4-피페라진디에탄술폰산 및 1,4-피페라진디에탄술포네이트 음이온 (예를 들어, 나트륨 1,4-피페라진디에탄술포네이트)을 포함하는 혼합물을 지칭한다. 마찬가지로, 본원에 사용된 바와 같은 "시트르산나트륨 완충제"는 시트르산나트륨, 뿐만 아니라 그의 접합체 산인 시트르산을 포함하는 혼합물을 지칭한다. 약산 및 그의 접합체 염기 사이에 확립된 화학적 평형으로 인해, 완충제를 함유하는 용액은 용액에의 소량의 산 또는 염기의 첨가 시 pH의 갑작스런 변화를 저항한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "오염성 폴리뉴클레오티드"는 렌티바이러스 벡터로부터 유래되지 않은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 오염성 폴리뉴클레오티드로는 예를 들어, 렌티바이러스 벡터가 생산된 세포로부터 유래된 비-렌티바이러스 폴리뉴클레오티드, 예컨대 렌티바이러스 벡터의 트랜스진 또는 다른 성분 내에 포함되지 않는 염색체 포유동물 DNA (예를 들어, 인간 DNA)를 들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동결/해동 주기"는 액체 혼합물, 예컨대 수성 액 또는 현탁액을 혼합물이 동결될 때까지 그의 동결점 이하의 온도에 노출시킨 후, 혼합물을 그의 동결점 초과의 온도에서 해동시키는 것을 지칭한다. 동결 단계는 예를 들어, 혼합물을 온도가 약 -80℃ 내지 약 -20℃인 환경에 정치시킴으로써 수행될 수 있다. 혼합물은 해동 전에 예를 들어, 하나 이상의 일, 주, 개월, 또는 년의 기간 동안 동결된 채 잔류할 수 있다. 해동 단계는 혼합물을 온도가 약 2℃ 내지 약 8℃인 조건에 노출시킴으로써, 또는 혼합물을 실온 (예를 들어, 실험실의 주위 온도, 또는 약 25℃)에서 저장함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 해동은 수조 (예를 들어, 37℃에서)의 사용에 의해 일어날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유체역학적 반경"은 입자의 확산 특징으로부터 추론된 바와 같은 용액 중의 입자의 겉보기 반경 (Rh, nm로)을 지칭한다. 바이러스 입자의 유체역학적 반경은 수성 용액 중에서의 바이러스 입자의 확산의 속도, 뿐만 아니라 거대분자의 겔에서 이동하는 입자의 능력을 지시하는 한 인자이다. 바이러스 입자의 유체역학적 반경은 부분적으로 입자의 성분 각각의 질량 및 분자 구조, 뿐만 아니라 그의 수화 상태에 의해 결정된다. 바이러스 입자의 유체역학적 반경을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 동적 광 산란 및 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-환원 탄수화물"은 알데히드와의 화학적 평형의 상태로 존재하지 않으며, 따라서, 전이 금속 양이온, 예컨대 은 (Ag+) 및 구리 (Cu2+)에 의해 카르복실산으로 산화되는 능력이 결여된 탄수화물을 지칭한다. 예시적인 비-환원 탄수화물로는 제한 없이, 이당류, 예컨대 수크로스, 트레할로스, 및 팔라티니톨, 삼당류, 예컨대 라피노스 및 멜레지토스, 뿐만 아니라 사당류, 예컨대 스타키오스를 들 수 있다. 비-환원 탄수화물로는 추가적으로 단당류 유도체, 예컨대 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 및 크실리톨, 이당류 유도체, 예컨대 락티톨 및 말티톨, 알돈산 및 그의 락톤, 예컨대 글루콘산, 글루콘산 γ-락톤, 알다르산 및 그의 락톤, 예컨대 리바라산, 아라비나르산, 및 갈락타르산, 우론산, 예컨대 글루쿠론산, 갈락쿠론산, 및 이티안누론산, 에스테르 유도체, 예컨대 트레할로스 옥타아세테이트, 수크로스 옥타아세테이트, 및 셀로비오스 옥타아세테이트, 및 히드록실 기가 O-알킬화된 에테르 유도체를 들 수 있다. 비-환원 탄수화물은 D 또는 L 입체화학 배향을 갖는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "오스몰랄농도"는 수성 용액 중의 용해된 용질 입자의 삽투압의 척도를 지칭한다. 용질 입자는 이온 뿐만 아니라 비-이온화된 분자 둘 다를 포함한다. 오스몰랄농도는 용매 (즉, 물) 1 kg에 용해된 삼투압적 활성 입자 (즉, 오스몰)의 농도로서 표현된다. 오스몰랄농도는 본원에서 물 1 kg당 밀리오스몰 (mOsm/kg)의 단위로 표현된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "부피당 중량 퍼센트" 또는 "% w/v"는 성분을 함유하는 혼합물의 총 부피 대비 단일 성분의 백분율 중량 (그램으로)을 나타낸다. 예를 들어, 8 ml의 총 부피 중의 500 mg의 성분은 6.25% w/v이고, 5 ml의 총 부피 중의 500 mg의 성분은 10% w/v이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다분산도"는 샘플 내의 입자, 예컨대 렌티바이러스 입자의 크기의 균질성의 정도를 지칭한다. 보다 높은 다분산도는 보다 적은 균질성을 지시하고, 보다 낮은 다분산도는 보다 높은 수준의 균질성을 지시한다. 예를 들어, 균질성의 수준이 높은 경우, 렌티바이러스 입자는 동일한 크기에 접근하고 있는 것으로 간주될 수 있으며, 따라서, 단분산이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 다분산도가 감소함에 따라, 균질성의 수준은 증가한다. 따라서, 보다 낮은 다분산도는 보다 높은 수준의 균질성을 지시한다. 예를 들어, 15% 다분산도를 갖는 제형은 10% 다분산도를 갖는 제형보다 더 적은 균질성을 갖는다. 균질성의 수준이 낮은 경우, 입자 집단은 유의하게 상이한 크기를 함유하며, 따라서, 다분산인 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "scFv"는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 결합하여 하나의 쇄를 형성한 단일 쇄 Fv 항체를 지칭한다. scFv 단편은 링커에 의해 분리된 항체 경쇄의 가변 영역 (VL) (예를 들어, CDR-L1, CDR-L2, 및/또는 CDR-L3) 및 항체 중쇄의 가변 영역 (VH) (예를 들어, CDR-H1, CDR-H2, 및/또는 CDR-H3)을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 함유한다. scFv 단편의 VL 및 VH 영역을 결합시키는 링커는 단백질생성 아미노산으로 구성된 펩티드 링커일 수 있다. 대안적인 링커는 단백질분해성 열화에 대한 scFv 단편의 내성을 증가시키기 위해 (예를 들어, D-아미노산을 함유하는 링커), scFv 단편의 용해도를 향상시키기 위해 (예를 들어, 친수성 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜-함유 링커 또는 반복하는 글리신 및 세린 잔기를 함유하는 폴리펩티드), 분자의 생물물리적 안정성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 분자내 또는 분자간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 함유하는 링커), 또는 scFv 단편의 면역원성을 약독화시키기 위해 (예를 들어, 글리코실화 부위를 함유하는 링커) 사용될 수 있다. ScFv 분자는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호; 문헌 [Flo et al. (Gene 77:51, 1989)]; [Bird et al. (Science 242:423, 1988)]; [Pantoliano et al. (Biochemistry 30:10117, 1991)]; [Milenic et al. (Cancer Research 51:6363, 1991)]; 및 [Takkinen et al. (Protein Engineering 4:837, 1991)]에 기재되어 있다. scFv 분자의 VL 및 VH 도메인은 1종 이상의 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 scFv 분자의 가변 영역은 그들이, 그들이 유래된 항체 분자로부터 아미노산 서열에 있어서 다양하도록 변형될 수 있음은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 아미노산 잔기에서 보존적 치환 또는 변화를 초래하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다 (예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에서). 대안적으로 또는 추가로, 관련 기술분야에 인식된 기술을 사용하여 항원-결합을 최적화하기 위해 CDR 아미노산 잔기에 돌연변이가 생성될 수 있다. ScFv 단편은 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/084714에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "특이적으로 결합한다" 및 "결합한다"는 예를 들어, 특정성을 갖는 리간드에 의해 인식되는 단백질 및 다른 생물학적 분자의 이종 집단에서의 특정 단백질의 존재에 결정적인 결합 반응을 지칭한다. 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드 (예를 들어, 단백질, 프로테오글리칸, 또는 글리코스아미노글리칸)은 500 nM 미만의 KD로 단백질에 결합할 것이다. 예를 들어, 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드는 500 nM 이하 (예를 들어, 1 pM 내지 500 nM)의 KD로 단백질에 결합할 것이다. 단백질 또는 그의 도메인에의 특이적 결합을 나타내지 않는 리간드는 그 특정 단백질 또는 그의 도메인에 대해 500 nM 초과 (예를 들어, 600 nm, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μM, 100 μM, 500 μM, 또는 1 mM 초과)의 KD를 나타낼 것이다. 다양한 검정 형식이 특이적 단백질에 대한 리간드의 친화도를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 검정은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 확인하는데 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 특이적 단백질 결합을 결정하는데 사용될 수 있는 검정 형식 및 조건의 설명에 대해, 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988)] 및 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스진"은 트랜스진이 도입되어야 하는 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 단백질 또는 기능적 RNA 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 트랜스진은 트랜스진이 도입되어야 하는 세포의 내인성 유전자와 상동일 수 있지만, 그것이 삽입되는 세포의 게놈을 변경시키기 위해 표적 세포의 게놈 내로 삽입되도록 설계된다. 예를 들어, 트랜스진은 표적 세포의 내인성 유전자와 상동일 수 있지만, 천연 발생 유전자의 위치와는 상이한 표적 세포의 게놈 내의 위치에 삽입되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "수포성 구내염 바이러스 G 단백질" 또는 "VSV-G 단백질"은 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질과 실질적 상동성을 갖는 단리된 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 예를 들어, 그것이 야생형 VSV-G 단백질의 막-융합 특성을 나타내는 경우, VSV-G 단백질과 실질적 상동성을 갖는다. VSV-G 단백질은 폴리펩티드가 핵산-지질 입자와 회합하고, 형질감염을 용이하게 하는 능력을 보유하는 한, 예를 들어, 전장 VSV-G 단백질 또는 그의 단편을 함유하는 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 역가"는 표적 세포에서 트랜스진 생성물의 생산을 초래하는 감염성 벡터 입자의 수, 또는 "형질도입 단위"를 지칭한다. 바이러스 역가는 기능적 검정, 예컨대 문헌 [Xiao et al., Exp. Neurobiol. 144:113-124, 1997], 또는 [Fisher et al., J. Virol. 70:520-532, 1996] (이들 둘 다의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 검정에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 역가는 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 숙주 게놈 세포 내로 통합된 바이러스 DNA의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 벡터"는 핵산 분자를 숙주 내로 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"는 HIV-1로부터 유래된 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 외인성 유전자(들)를 운반하는 렌티바이러스 벡터는 특이적 세포주를 사용한 패키징 플라스미드의 도움으로 바이러스 패키징을 통해 감염성 바이러스 입자 내로 패키징된다. 감염성 바이러스 입자는 세포를 감염시켜 외인성 유전자의 발현을 달성한다. "재조합" 바이러스 벡터는 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 바이러스 벡터를 지칭한다. 재조합 바이러스 벡터는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 패키징 세포주를 바이러스 게놈을 코딩하는 핵산으로 형질도입하고, 후속적으로 새롭게 패키징된 바이러스 입자를 단리함으로써 구축될 수 있다.
도 1은 렌티바이러스 제제를 안정화시킬 수 있는 완충제의 확인을 위한 전략을 예시하는 흐름도이다. 완충제 확인에 대한 계층별 접근법 (좌측)은 샘플 폭넓은 범위의 완충제, 염, 및 pH 조건을 샘플링하고, 저장 안정성 및 형질도입 용량을 최적으로 촉진시키는 조건에 대해 점차적으로 선택하기 위해, 안정성 검정, 예컨대 동적 광 산란 (DLS)을 수행하고, 임의로 하나 이상의 동결/해동 (F/T) 주기 후에 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포에서 렌티바이러스 역가 (형질도입 단위, TU로)를 결정하는 것을 포함한다. 병렬 접근법 (우측)에서, 다양한 렌티바이러스 제조 조건을 동시에 샘플링하고, 후속적으로 가장 효과적으로 렌티바이러스 응집을 방지하고, 감염력을 보존하는 조건을 예를 들어, 키메라 항원 수용체 T-세포 (CART) 적용을 위해 선택한다.
도 2는 다양한 완충제 및 염을 함유하고, 6.0 내지 8.0의 pH 값 범위를 나타내는 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가 (TU/mL로)를 제시하는 그래프이다.
도 3은 상이한 유체역학적 반경 분포를 예시하는 일련의 그래프이다. 단일모드 단분산 분포 (상부)는 렌티바이러스 단량체일 가능성이 있는 단일 종을 특징으로 한다. 단일모드 다분산 분포 (중간)는 전형적으로 대개 동적 광 산란에 의해 분해될 수 없는 다중 종을 지시하며, 단일모드 단분산 분포에 비해 응집하는 렌티바이러스 입자의 증가된 존재의 표명일 수 있다. 다중모드 다분산 분포 (하부)는 동적 광 산란에 의해 분해될 수 있는 렌티바이러스 입자의 다중 응집된 종을 지시한다.
도 4는 히스티딘 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 5는 PIPES 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 6은 시트르산나트륨 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 7은 HEPES 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 8은 MOPS 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 9는 MES 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 10은 포스페이트 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 11은 3-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]프로판-1-술폰산 (HEPPS) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 12는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (Tris) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경 및 다분산도에 대한 온도의 증가의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 13은 히스티딘 (상부, 좌측), 시트레이트 (상부, 중간), MOPS (상부, 우측), PIPES (하부, 좌측), HEPES (하부, 중간), 또는 MES (하부, 우측) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 별표로 강조된 조건은 상승된 온도에서 수행된 형질도입 실험에서의 최고 렌티바이러스 역가를 초래하는 pH 값 및 염 농도를 지정한다 (예를 들어, 도 15 및 16 참조).
도 14는 포스페이트 (좌측), HEPPS (중간), 및 Tris (우측) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 유체역학적 반경에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 별표로 강조된 조건은 상승된 온도에서 수행된 형질도입 실험에서의 최고 렌티바이러스 역가를 초래하는 pH 값 및 염 농도를 지정한다 (예를 들어, 도 17 및 18 참조).
도 15는 42℃ ("TU42"에 의해 지시된 바와 같음) 및 50℃ ("TU50"에 의해 지시된 바와 같음)의 상승된 온도에서의 히스티딘 (상부) 또는 PIPES (하부) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 형질도입 능력에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제시된 TU42 및 TU50 값은 37℃에서 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가의 백분율로서 표현되는, 지시된 온도에서의 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 16은 42℃ ("TU42"에 의해 지시된 바와 같음) 및 50℃ ("TU50"에 의해 지시된 바와 같음)의 상승된 온도에서의 시트레이트 (상부) 또는 HEPES (하부) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 형질도입 능력에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제시된 TU42 및 TU50 값은 37℃에서 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가의 백분율로서 표현되는, 지시된 온도에서의 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 17은 42℃ ("TU42"에 의해 지시된 바와 같음) 및 50℃ ("TU50"에 의해 지시된 바와 같음)의 상승된 온도에서의 MOPS (상부) 또는 MES (하부) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 형질도입 능력에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제시된 TU42 및 TU50 값은 37℃에서 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가의 백분율로서 표현되는, 지시된 온도에서의 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 18은 42℃ ("TU42"에 의해 지시된 바와 같음) 및 50℃ ("TU50"에 의해 지시된 바와 같음)의 상승된 온도에서의 포스페이트 (상부) 또는 HEPPS (하부) 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 형질도입 능력에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제시된 TU42 및 TU50 값은 37℃에서 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가의 백분율로서 표현되는, 지시된 온도에서의 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 19는 42℃ ("TU42"에 의해 지시된 바와 같음) 및 50℃ ("TU50"에 의해 지시된 바와 같음)의 상승된 온도에서의 Tris 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제의 형질도입 능력에 대한 pH 및 염화나트륨 농도의 변화의 효과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제시된 TU42 및 TU50 값은 37℃에서 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가의 백분율로서 표현되는, 지시된 온도에서의 지시된 렌티바이러스 제제로 형질도입된 세포의 렌티바이러스 역가를 나타낸다.
도 20은 3 (좌측), 6 (중간), 또는 9 (우측) 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 부재 하에서 감염력을 유지하는 다양한 렌티바이러스 벡터 제제의 능력을 제시하는 그래프이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 21은 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 부재 하에서 스크리닝된 렌티바이러스 벡터 제제의 상대적 감염력을 제시하는 그래프이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 22는 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 부재 하에서 스크리닝된 렌티바이러스 벡터 제제의 상대적 감염력을 제시하는 표이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 23은 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 부재 하에서 선택 렌티바이러스 벡터 제제의 상대적 감염력을 제시하는 표이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 24는 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 존재 하에서 감염력을 유지하는 스크리닝된 렌티바이러스 벡터 제제의 능력을 제시하는 그래프이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 25는 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 존재 하에서 스크리닝된 렌티바이러스 벡터 제제의 상대적 감염력을 제시하는 표이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 26은 3, 6, 또는 9 동결/해동 주기 후에 탄수화물의 존재 하에서 선택 렌티바이러스 벡터 제제의 상대적 감염력을 제시하는 표이다. 감염력은 제1 동결/해동 공정 전에 렌티바이러스 벡터 제제에 존재하는 형질도입 단위의 양의 백분율로서 상응하는 수의 동결/해동 주기 후에 각각의 제제에 존재하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 단위의 양으로서 측정된다.
도 27은 1차 T 세포에서의 선택 렌티바이러스 제제의 상대적 감염력을 제시하는 표이다. 렌티바이러스 역가의 측정에 관한 상세사항은 하기 실시예 7에 제공된다.
도 28은 응집의 정도, 고온에서의 활성, 동결-해동 안정성, 및 1차 T 림프구의 형질도입에 의해 평가된 바와 같은 PIPES, HEPES, 및 히스티딘 완충제 중의 렌티바이러스 벡터의 안정성을 비교하는 표이다.
도 29는 PIPES, 히스티딘, 또는 HEPES 완충제를 사용하여 지시된 조건 하에서 정제 후에 유지된 렌티바이러스 역가의 수준 (%TU)을 제시하는 표이다.
도 30은 PIPES-기재 완충제에서 정제된 2가지 상이한 렌티바이러스 벡터 (1 및 2)의 역가의 유지를 제시하는 표이다.
도 31은 렌티바이러스 벡터 (벡터 1)의 응집 상태의 동적 광 산란 (DLS) 분석을 제시한다.
도 32는 렌티바이러스 벡터 (벡터 2)의 응집 상태의 동적 광 산란 (DLS) 분석을 제시한다.
도 33은 4℃에서 0, 7, 14, 및 21일 후의 렌티바이러스 벡터 (벡터 2)의 안정성을 제시하는 그래프이다.
도 34는 1, 3, 6, 및 9 동결-해동 주기 후의 렌티바이러스 벡터 (벡터 2)의 안정성을 제시하는 그래프이다.
본 발명은 PIPES 완충제를 함유하는 렌티바이러스 제제가 통상적인 렌티바이러스 제형 완충제, 예컨대 HEPES를 함유하는 렌티바이러스 제제에 비해 개선된 생물학적 특성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 이들 개선된 생물학적 특징은 다양한 온도 및 염 농도에 걸친 응집에 대한 상승된 내성, 생리학적 및 상승된 온도 (예컨대 42℃ 및 50℃)에서의 개선된 형질도입 용량, 및 다수의 동결/해동 주기 동안 감염력의 소실에 대한 보다 큰 내성을 포함한다. 본 발명의 렌티바이러스 제제와 함께 유용한 다른 완충제로는 포스페이트 완충제, 시트르산나트륨 완충제, MES 완충제, 및 MOPS 완충제를 들 수 있다. 본 발명의 렌티바이러스 제제는 임의로 염, 예컨대 염화나트륨을 포함할 수 있고, 임의로 탄수화물, 예컨대 비-환원 탄수화물 (하기 참조)을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터는 트랜스진, 예를 들어, 숙주 세포의 염색체 DNA 내로의 통합을 위해 설계된 단백질-코딩 유전자를 포함할 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 렌티바이러스 제제는 렌티바이러스 벡터를 개선된 회수율로 정제하기 위해, 정제 기술, 예컨대 여과 및 크로마토그래피 절차와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 T 세포)의 형질도입을 위한 공정을 포괄한다.
렌티바이러스 제제 성분
본 발명의 렌티바이러스 벡터 제제는 다양한 성분, 예컨대 1종 이상의 염 및/또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터 제제는 바이러스 안정성을 촉진시키기 위해 추가되는 단백질 성분을 요구하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 조성물은 각각 임의로 첨가되는 단백질 성분의 결여로서 특징화될 수 있다. 다수의 상이한 유형의 알부민이 렌티바이러스 벡터의 안정성을 촉진시키는 그들의 능력에 대해 시험된 바 있다 (예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 인간 혈청 알부민 (HAS), 및 재조합 HSA (rHSA)). 예를 들어, rHSA는 종종 렌티바이러스 제제 내로 혼입된 바 있는데, 이는 그것이 유전적으로 변형된 효모에서 생산되고, 따라서, 그것이 동물 기원의 것이 아니기 때문에 보다 높은 수준의 안전성을 제공하기 때문이다 (Chuang et al., Pharm. Res. 19:569-577, 2002). 본 발명의 사용을 통해, HSA 및 유사한 단백질 성분은 렌티바이러스 벡터 제제에서 회피될 수 있는데, 이는 이들이 벡터의 분석적 특징화를 방해할 수 있기 때문이다. 본 발명은 부분적으로 첨가되는 단백질 성분의 부재 하에서 렌티바이러스 벡터에 안정성을 부여하는 본원에 기재된 완충제의 능력 때문에 고유하다. 예를 들어, 도 2-19에서 입증된 바와 같이, 본원에 기재된 완충제는 바이러스 응집을 방지하고, 향상된 형질도입 용량을 촉진시키고, 다수의 동결/해동 주기 후에 감염력을 보존할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 또한 임의로 첨가되는 탄수화물 성분의 포함 또는 결여로서 특징화될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터 제제는 수성 혼합물, 예컨대 수성 용액 또는 현탁액일 수 있다. 렌티바이러스 벡터 제제는 임의로 염, 예컨대 염화나트륨, 염화마그네슘, 또는 염화칼슘을 포함할 수 있다. 염은 예를 들어, 약 1 mM 내지 약 1 M의 농도로 수성 렌티바이러스 제제에 존재할 수 있다 (예를 들어, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 450 mM, 475 mM, 500 mM, 525 mM, 575 mM, 600 mM, 625 mM, 650 mM, 675 mM, 700 mM, 725 mM, 750 mM, 775 mM, 800 mM, 825 mM, 850 mM, 875 mM, 900 mM, 925 mM, 950 mM, 957 mM, 또는 1 M). 일부 실시양태에서, 염의 농도는 약 25 mM 내지 약 250 mM, 약 50 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 150 mM (예를 들어, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 100 mM, 125 mM, 또는 150 mM)이다. 일부 실시양태에서, 염의 농도는 바람직한 경우 50 mM 또는 75 mM일 수 있다.
본원에 기재된 렌티바이러스 벡터 제제는 예를 들어, 약 5.0 내지 약 8.0, 예를 들어, 6.0 내지 약 7.0 (예를 들어, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0)의 pH를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터 제제의 pH는 6.5이다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터 제제는 임의로 탄수화물, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 비-환원 탄수화물을 함유할 수 있다. 예시적인 비-환원 탄수화물로는 다른 것들 중에서도 수크로스 및 트레할로스를 들 수 있다. 렌티바이러스 벡터 제제에 포함되는 경우, 탄수화물은 예를 들어, 수성 렌티바이러스 제제의 부피당 약 1 중량% (w/v) 내지 약 10 중량%, 약 2.5 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 2.5 중량% 내지 약 5 중량%의 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 본원에 기재된 비-환원 탄수화물은 수성 렌티바이러스 제제 내에 1% w/v, 1.5% w/v, 2% w/v, 2.5% w/v, 3% w/v, 3.5% w/v, 4% w/v, 4.5% w/v, 5% w/v, 5.5% w/v, 6% w/v, 6.5% w/v, 7% w/v, 7.5% w/v, 8% w/v, 8.5% w/v, 9% w/v, 9.5% w/v, 또는 10% w/v의 농도로 존재할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 본 발명의 렌티바이러스 제제 내에 다양한 농도 내에서 존재할 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 제제 내에 예를 들어, 약 2 x 108 밀리리터당 형질도입 단위 (TU/mL) 내지 약 1 x 109 TU/mL (예를 들어, 2 x 108 TU/mL, 2.5 x 108 TU/mL, 3 x 108 TU/mL, 3.5 x 108 TU/mL, 4 x 108 TU/mL, 4.5 x 108 TU/mL, 5 x 108 TU/mL, 5.5 x 108 TU/mL, 6 x 108 TU/mL, 6.5 x 108 TU/mL, 7 x 108 TU/mL, 7.5 x 108 TU/mL, 8 x 108 TU/mL, 8.5 x 108 TU/mL, 9 x 108 TU/mL, 9.5 x 108 TU/mL, 또는 1 x 109 TU/mL)의 농도로 존재할 수 있다. 바람직한 경우, 렌티바이러스 제제는 렌티바이러스 벡터를 약 3 x 108 TU/mL 내지 약 5 x 108 TU/mL (예를 들어, 3 x 108 TU/mL, 3.5 x 108 TU/mL, 4 x 108 TU/mL, 4.5 x 108 TU/mL, 또는 5 x 108 TU/mL)의 농도로 함유할 수 있다.
트랜스진 발현
본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터는 트랜스진, 예컨대 표적 세포의 염색체 DNA 내로의 통합을 위해 설계된 단백질-코딩 트랜스진을 포함할 수 있다. 예시적인 트랜스진으로는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 것들을 들 수 있다. CAR은 몇몇 도메인, 예컨대 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1종 이상의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 이들 경우에, 신호전달 도메인은 1종 이상의 1차 신호전달 도메인 (예컨대 CD3-제타 자극성 도메인) 및/또는 1종 이상의 공동자극성 신호전달 도메인 (예컨대 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드)를 함유할 수 있다.
특정 경우에, 트랜스진은 특정 표적 단백질 또는 탄수화물에 결합하는 항원-결합 도메인 (예컨대 scFv)을 포함할 수 있다. 예시적인 항원으로는 CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, C-유형 렉틴-유사 분자-1, CD33, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII), 강글리오시드 G2 (GD2), 강글리오시드 GD3, TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA), Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1), Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3), 종양-연관된 당단백질 72 (TAG72), CD38, CD44v6, 암배아성 항원 (CEA), 상피 세포 부착 분자 (EPCAM), B7H3 (CD276), KIT (CD117), 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2, 메소텔린, 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 프로테아제 세린 21, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 루이스(Y) 항원, CD24, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타), 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4), CD20, 폴레이트 수용체 알파, 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu), 세포 표면 회합된 뮤신 1 (MUC1), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 신경 세포 부착 분자 (NCAM), 프로스타제, 전립선 산 포스파타제 (PAP), 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M), 에프린 B2, 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP), 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 안히드라제 IX (CAIX), 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2), 당단백질 100 (gp100), 절단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질 (bcr-abl), 티로시나제, 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2), 푸코실 GM1, 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe), 강글리오시드 GM3, 트랜스글루타미나제 5 (TGS5), 고분자량-흑색종-연관된 항원 (HMWMAA), o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2), 폴레이트 수용체 베타, 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248), 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R), 클라우딘 6 (CLDN6), 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR), G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 군 5, 구성원 D (GPRC5D), 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61), CD97, CD179a, 역형성 림프종 키나제 (ALK), 폴리시알산, 태반-특이적 1 (PLAC1), 글로보H 글리코세라마이드 (글로보H)의 헥사사카라이드 부분, 유선 분화 항원 (NY-BR-1), 우로플라킨 2 (UPK2), A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1), 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3), 파넥신 3 (PANX3), G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20), 림프구 항원 6 복합체, 로커스 K 9 (LY6K), 후각 수용체 51E2 (OR51E2), TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP), 윌름스 종양 단백질 (WT1), 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1), 암/고환 항원 2 (LAGE-1a), 흑색종-연관된 항원 1 (MAGE-A1), 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6 (ETV6-AML), 정자 단백질 17 (SPA17), X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1), 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2), 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1), 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2), Fos-관련된 항원 1, 종양 단백질 p53 (p53), p53 돌연변이체, 프로스테인, 생존, 텔로머라제, 전립선 암종 종양 항원-1, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1, 래트 육종 (Ras) 돌연변이체, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 육종 전위 절단점, 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP), ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자), N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V (NA17), 쌍형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3), 안드로겐 수용체, 시클린 B1, v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래된 동족체 (MYCN), Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC), 티로시나제-관련된 단백질 2 (TRP-2), 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1), CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사, T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3 (SART3), 쌍형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5), 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1), 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK), A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4), 활막 육종, X 절단점 2 (SSX2), 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체 (RAGE-1), 신장 편재성 1 (RU1), 신장 편재성 2 (RU2), 레구마인, 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6), 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7), 장 카르복실 에스테라제, 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2), CD79a, CD79b, CD72, 백혈구-연관된 이뮤노글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1), IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2), CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF), C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A), 골수 기질 세포 항원 2 (BST2), EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2), 림프구 항원 75 (LY75), 글리피칸-3 (GPC3), Fc 수용체-유사 5 (FCRL5), 및 이뮤노글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1)을 들 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법
본 발명의 방법은 예를 들어, 통상적인 완충제 (예를 들어, HEPES)를 함유하는 렌티바이러스 제제의 정제에 비해 보다 많은 양의 렌티바이러스 벡터가 회수되도록, 렌티바이러스 벡터를 개선된 효율로 정제하는 공정을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터 제제는 여과 (예를 들어, 미세여과 또는 한외여과)에 의해 및/또는 크로마토그래피 (예를 들어, 크기-배제 크로마토그래피)에 의해 높은 렌티바이러스 회수율로 정제될 수 있다. 여과 기술, 예컨대 상기 기재된 및 관련 기술분야에 공지된 것들은 렌티바이러스 벡터가 제조되는 미생물 및 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)를 실질적으로 함유하지 않는 렌티바이러스 제제를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 렌티바이러스 벡터 제제는 오염성 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터가 생산된 세포로부터 유래된 비-렌티바이러스 폴리뉴클레오티드, 예컨대 염색체 포유동물 DNA, 인간 DNA, RNA, 또는 렌티바이러스 트랜스진 내에 포함되지 않는 다른 폴리뉴클레오티드)를 실질적으로 함유하지 않는 제제를 생성하기 위해 뉴클레아제로 처리될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본원에 기재된 조성물 및 방법을 어떻게 사용하고, 제조하고, 평가할 수 있는 지의 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 순수하게 예시적인 것으로 의도되고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. 혈청-무함유 세포 배양에서의 렌티바이러스 벡터의 생산
GFP 유전자 전달 벡터, 패키징 벡터, rev 발현 벡터, 및 VSV-G 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 전달 벡터는 cPPT 및 WPRE 요소 둘 다를 함유한다. 보다 상세하게는, 본 연구에 사용된 렌티바이러스 벡터는 자기-불활성화 전달 구축물 pELPS-EGFP였으며, 이는 pRRL 전달 구축물에 기재한다 (Dull et al., J. Virol. 72(11):8463-8471, 1998). pELPS-EGFP를 pELPS-19-BBz (Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464, 2009)를 사용하여, CAR 트랜스진을 EGFP로 대체함으로써 구축하였다. 렌티바이러스를 pMDLgpRRE, pRSV-Rev 및 pMD.G 플라스미드로 이루어진 제3 세대 패키징 시스템을 사용하여 제조하였으며 (Dull et al., 상기 문헌), 여기서, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II로 치환하였다.
바이러스 생산은 10 리터 규모로 수행된다. 10 리터의 상청액을 생성하는데 필요한 시약은 하기 기재된다. 혈청 무함유 프리스타일 (Freestyle) 배지 (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies))를 함유하는 Expi293F (라이프 테크놀로지즈) 세포를 5-6x106 세포/ml의 세포 밀도로 96% 생존력으로 시딩하였다. 12.5 ml PEIpro (폴리플러스 (Polyplus))를 0.25 리터의 배지에 첨가하고, 플라스미드 믹스 (0.25 리터 중 12.8 mg의 플라스미드)에 서서히 첨가하였다. 15분의 인큐베이션 후, 0.5 리터 형질감염 믹스를 2 x 5 리터 플라스크 사이에 플라스크당 또 다른 2.25 리터의 프리스타일 배지의 첨가와 함께 분할하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포를 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 그 후, 8 mM의 나트륨-부티레이트 (시그마 (Sigma))를 갖는 pH 6 배지 (프리스타일 배지, pH 조정됨)를 첨가한다. 48시간의 형질감염에서, 세포를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 정제를 위해 저장하였다 (수확물 1). 또 다른 2.5 리터의 pH 6.0 배지를 회전 진탕기 (인포스 (Infors) HT 인큐베이터, 진탕 속도 100 RPM, 8% CO2, 37℃)에서의 인큐베이션을 위해 진탕 플라스크 각각에 첨가하였다. 제2 수확물 (수확물 2)을 72시간에서 수집한 후, 저속 원심분리한다. 48 및 72시간 수확물을 풀링하고, 추가의 정제를 위해 프로세싱하였다. 부분적으로 풀링된 물질을 필요할 경우 4℃에서 저장한다.
하나의 2 x 2.5 리터 배지에 대해, 6 μg의 GFP 유전자 전달 벡터, 3 μg의 패키징 벡터, 3 μg의 rev 발현 벡터, 및 0.75 μg의 VSVG 발현 벡터를 사용하였다. 일단 형질감염 혼합물이 세포에 첨가되면, 균일한 혼합을 달성하기 위해 진탕 플라스크를 주의깊게 진탕하였다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이 세포를 인큐베이션한다.
실시예 2. 혈청-무함유 세포 배양에서 생산된 렌티바이러스 벡터의 정제
48 및 72시간 부분적으로 원심분리된 수확물을 3가지 차등적 등급화된 필터, 즉, 5 마이크로미터 유리 필터 (GE 헬스케어 (GE Healthcare)), 1.2 마이크로미터 폴리프로필렌 필터 (사르토리우스 (Sartorius)), 및 0.6/0.2 마이크로미터 폴리에테르술폰 필터 (GE 헬스케어)를 통해 통과시킨다. 여과 트레인은 생산자 세포, 세포 데브리스 및 세포소기관을 제거한다. 그 후, 500 MWCO 중공 섬유 막 (GE 헬스케어)을 사용하여 100배 농도의 바이러스 함유 상청액에 대해 접선 유동 여과한다. 벤조나제 (EMD-밀리포어 (EMD-Millipore)) 처리를 실온에서 30분 동안 50 단위/ml로 수행한 후, 3000 RPM에서 20분 동안 원심분리하였다. 백색 펠릿을 볼 수 있지만, 상청액에서는 바이러스 입자의 최소 소실 (< 5%)이 있다. 크기-배제 크로마토그래피를 PIPES 및 다른 완충제 (본 발명에 기재된 벡터의 높은 안정성을 제시함)를 사용하여 수행한 후, 0.2 마이크로미터 필터 (EMD 밀리포어)를 사용하여 멸균 여과한다.
실시예 3. 렌티바이러스 제제의 안정성의 고-처리량 스크리닝을 위한 샘플 제조
제바 (ZEBA)™ 스핀 탈염 플레이트 (7K MWCO, 라이프 테크놀로지즈)를 250 μl의 특이적 완충제 및 염으로 4회 완충제 교환하였다. 100 μl의 바이러스 스톡 용액을 각각의 웰에서 로딩한 후, 1000x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 완충제 교환 후 부피의 소실이 관찰되지 않는다. 20-100 μl를 분석 (DLS, 감염력 및 동결/해동 연구) 각각에 대해 사용하였다. 벡터의 감염력에 대한 온도의 효과를 연구하기 위해, 온도 충격을 96 웰 얇은-벽 PCR 플레이트에서 C-1000 터치 써멀 사이클러 (Touch Thermal Cycler) (1시간 동안 25 내지 55℃ 범위)에서 수행하였다.
실시예 4. 고-처리량 스크린에서의 동적 광 산란에 의한 렌티바이러스 응집의 분석
20 μl의 정제된 재조합 렌티바이러스 벡터 (106 내지 107 TU/ml)를 384 웰 플레이트 (흑색 폴리스티렌 베이스, 친수성 플레이트, 그라이너 바이오 (Greiner Bio))에 피펫팅하였다. 포획된 공기 버블을 제거하기 위해 플레이트를 2000 RPM에서 3분 동안 실온에서 원심분리한 후, 마이크로실 (Microseal) 'B' 실 (바이오-래드 (Bio-Rad))로 실링한다. 이를 830 nm 레이저 및 온도 제어 모듈을 구비한 다이나프로 (DynaPro) 플레이트 판독기 (와이어트 테크놀로지 코포레이션 (Wyatt Technology Corporation), 미국 캘리포니아주)에 정치시킨다. 다이나믹스 (Dynamics)® 소프트웨어 (버전 7.1.8.93, 와이어트 테크놀로지 코포레이션)를 스케줄링된 데이터 획득 및 분석에 사용하였다. 5회의 5-초 측정을 각각의 웰에 대해 취하였다. 단일, 실링된 384 웰 플레이트를 25℃에서 측정한 후, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 기재된 바와 같이 측정한다. 동일한 절차를 42℃, 50℃, 및 55℃에 대해 반복한다. 규칙화 분석을 다이나믹스R 소프트웨어와 함께 딸린 알고리듬을 사용하여 수행하였다. 상부 및 하부 상관 함수 컷 오프는 각각 0.5 및 1 x 106 μs였다. 렌티바이러스 피크의 유체역학적 반경은 50-200 nm로서 할당된다.
실시예 5. 고-처리량 스크린에서의 렌티바이러스 역가의 결정
렌티바이러스 벡터의 역가는 운반되는 유전자에 의해 코딩되는 GFP 단백질을 발현하는 세포의 수에 의해 계산된 기능적 역가 (TU/ml)를 포함한다. HEK293T 세포를 특정 밀도 (2x104/웰)로 96 웰 플레이트 (코닝 (Corning), 평저)에 10% 소 태아 혈청 (라이프 테크놀로지즈) 및 8 μg/ml 폴리브렌 (Polybrene) (EMD 밀리포어)을 함유하는 50 μl의 D-MEM 배지 (라이프 테크놀로지즈)의 부피로 시딩하였다. 희석된 GFP 표준 바이러스 및 샘플은 완전 DMEM에서 제조되고, 세포에 첨가된다 (50 μl).
10배 연속 희석의 바이러스 용액을 희석액으로서 DMEM을 갖는 희석 계열로 제조하였다. 96 웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 트립신으로 처리한 후, 200 μl의 완전 DMEM을 첨가하였다. 플레이트를 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리하였으며, 배지를 200 μl의 유동-완충제 오토맥스 (autoMACS) 실행 완충제 (밀테나이 바이오텍 (Miltenyi Biotec))로 교환한다. 그 후, 구아바 비아카운트 (Guava Viacount) (EMD 밀리포어)에서 GFP 분석을 수행한다. 세포 카운팅 및 비형질도입된 세포의 건강을 수확 시에 모니터링하였다.
실시예 6. 반복적 동결/해동 주기 후의 렌티바이러스 안정성의 분석
반복된 동결/해동 주기로의 감염력의 소실을 다루기 위해, 렌티바이러스 벡터의 작은 분취액 (~100 μl)을 -80℃에서 20분 동안 동결시킨 후, 실온에서 20분 동안 서서히 해동시켰다 (최악의 경우의 시나리오를 나타냄). 동결/해동 주기를 3, 6, 9 주기에 대해 수행하였으며, 벡터 활성을 대조군과 비교한다. 경향 분석을 스폿파이어 (Spotfire)를 사용하여 수행하며, 여기서, 높은 값은 렌티바이러스 벡터의 활성의 보존을 의미한다.
실시예 7. 1차 T-세포에서의 렌티바이러스 역가의 결정
3명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 함유하는 바이알을 해동시키고, 원심분리하고, 2% 인간 AB 혈청 (악세스 (Access)) 및 IL-2 (프로메테우스 테르. (Prometheus Ther.))로 보충된 X-비보 (X-Vivo) 배지 (론자 (Lonza))에 재현탁시켰다. 세포를 카운팅하고, 100 μL 중 1.6 x 106 세포/ml의 밀도로 각각의 공여자에 대해 중복으로 시딩하였다. 항-CD3/CD28 비드 (라이프 테크놀로지즈)를 X-비보 단순 배지 (X-vivo Simple Medium)에서 세척하고, 4.8 x105 비드/웰의 최종 비드 밀도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이터에 정치하였다.
렌티바이러스 벡터 분취액을 실온에서 해동시키고, 연속 희석액을 X-비보 배지에서 1:3 희석 방식으로 제조하였다. 사용된 벡터 분취액은 GFP (스톡 26Sept14, JDG, 250 μL), 렌티겐 (Lentigen) (렌티겐 코포레이션 (Lentigen Corp), hCART019, LN0127-0214-064), 및 하기와 같은 GFP 벡터의 4가지 상이한 제형: AD1 (20 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 2.5% 수크로스 pH 6.5), AD2 (20 mM 시트레이트, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스 pH 6.5), AD3 (20 mM HEPES, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스, pH 7), 및 AD4 (20 mM PIPES, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스, pH 6.5)였다.
세포를 재현탁시키고, 60 μL의 세포 현탁액을 새로운 플레이트의 상응하는 웰 중의 120 μL의 X-비보 단순 배지 내로 첨가함으로써, 세포를 제3일에 1:3 분할하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다. 세포를 제5일에 1:2로 새로운 플레이트 내로 다시 분할하고 (110 μL의 X-비보 단순 배지 내로 90 μL의 세포), 인큐베이터로 복귀시켰다.
각각의 플레이트로부터의 세포를 풀링하고; 세포 현탁액을 자석 상에 정치시키고, 상청액을 취하고, 구아바 비아카운트 용액 상에서 1:10 희석에서 카운팅함으로써 분취액을 탈비드화시켰다. 그 후, 200 μL의 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 20℃에서 스핀 다운시키고, 200 μL의 오토맥스 완충제 (밀테나이)에 재현탁시키고, 새로운 U-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, GFP 형광을 구아바 (Guava) 기기 (밀리포어)를 사용하여 측정하였다. GFP 형질도입된 세포의 퍼센트를 계산하였다. 렌티겐 벡터로 형질도입된 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 20℃에서 스핀 다운시키고, 오토맥스 완충제 및 PE-표지된 항-이디오타입 항체의 혼합물을 사용하여 1:160 희석에서 염색하였다 (하나의 웰은 비염색된 채 남음). 제제를 암흑에서 실온에서 방치하고, 200 μL의 오토맥스 완충제로 2회 세척하였다. 세포를 200 μL의 오토맥스 완충제에 재현탁시키고, 구아바 기기를 사용하여 모니터링하였다. GFP 및 렌티겐 둘 다에 대한 TU/mL로서의 역가를 식: D0*에서의 세포 (%형질도입된 세포/100)/바이러스 부피 (mL)에 기초하여 계산하였다.
실시예 8. 실험 결과의 요약 - 안정성 연구
렌티바이러스 벡터를 안정화시키는데 사용될 수 있는 조건을 확인하기 위한 스크리닝 연구를 병렬 접근법 (도 1)을 사용하여 수행하였다. 시판되는 렌티바이러스 벡터 (렌티겐)의 안정성을 도 2에 지시된 바와 같이 완충제, pH, 및 염 조건을 다양화한 스크린에서 평가하였다. 렌티바이러스 벡터를 밤새 (약 18시간) 실온에서 (약 25℃) 인큐베이션하였다. 안정성을 상기 실시예 5에 기재된 방법을 사용하여 역가 (TU/ml)의 평가에 의해 결정하였다. NaCl을 갖는 PIPES 완충제는 벡터를 완충제 및 염 성분 외에도 부형제를 포함할 수 있는 대조군 제형 (렌티겐 제형)와 거의 동일한 정도로 안정화시켰다. 본 실험에 사용된 렌티바이러스 벡터는 렌티겐으로부터의 CAR19 LV였다. 본 실시예에 기재된 모든 다른 연구는 상기 실시예 1에 기재된 GFP-LV를 이용하였다.
상기 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 다양한 제형의 유체역학적 반경 분포를 결정하여 렌티바이러스 벡터 응집의 수준을 평가하였다 (도 3).
도 4는 히스티딘 완충제 (20 mM 히스티딘, 50-150 mM NaCl, pH 6.0, 6.5, 및 7.0)가 온도의 증가에 따라 렌티바이러스 벡터 응집에 대한 매우 낮은 경향성을 가짐을 제시한다 (Rh의 변화에 의해 모니터링됨). 도 5는 50-150 mM 범위의 NaCl 농도를 갖는 20 mM PIPES, pH 6.5 중의 렌티바이러스 벡터가 모든 온도에서 응집에 대한 경향성을 제시하지 않았음을 제시한다 (55℃에서 100 mM NaCl은 제외). 또한, 50-150 mM 범위의 NaCl을 갖는 20 mM PIPES, pH 7.0 중의 렌티바이러스 벡터는 온도 42-55℃에서 응집 경향성을 제시하였다. 도 6은 시트레이트 완충제 (20 mM 시트레이트, 50-150 mM NaCl, pH 6.0, 6.5)가 온도의 증가에 따라 렌티바이러스 벡터 응집에 대한 매우 낮은 경향성을 가짐을 제시한다 (Rh의 변화에 의해 모니터링됨). 도 7은 HEPES 완충제 (20 mM HEPES, 50-150 mM NaCl, pH 7.0, 7.5 및 8.0)가 pH 7.5 및 8.0에서 큰 응집 성향을 갖는 반면, pH 7.0은 상이한 온도에서 단량체성 바이러스를 보존함을 제시한다. 도 8은 MOPS 완충제 (20 mM MOPS, 50-150 mM NaCl, pH 6.5, 7.0 및 7.5)가 pH 6.5 및 7.0에서 50 mM NaCl에서 및 pH 7.5에서의 모든 조건에서 높은 응집 성향을 가짐을 제시한다. 단지 20 mM MOPS, 75 mM NaCl, pH 6.5는 고온 (55℃, 이는 바이러스가 결코 실제 경우 상황에서 이러한 온도에 노출되지 않을 것이기 때문에 유의하게 높음)에서 응집을 제시한다. 도 9는 MES 완충제 (20 mM MES, 50-150 mM NaCl, pH 6.0 및 6.5)가 이들 조건 하에서 렌티바이러스 벡터의 낮은 응집 성향을 가짐을 제시한다. 도 10은 포스페이트 완충제 (20 mM 포스페이트, 50-150 mM NaCl, pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0)는 pH 6.5에서 렌티바이러스 벡터의 낮은 응집 성향을 가지며; 모든 다른 pH 조건은 보다 높은 응집 성향을 가짐을 제시한다. 도 11은 HEPPS 완충제 (20 mM HEPPS, 50-150 mM NaCl, pH 7.5 및 8.0)에 대해, 모든 조건이 LV의 응집을 촉진시킴을 제시한다 (25℃에서는 제외). 도 12는 Tris 완충제 (20 mM Tris, 50-150 mM NaCl, pH 7.5 및 8.0)에 대해, 모든 조건이 LV의 응집을 촉진시킴을 제시한다 (25℃에서는 제외).
이들 결과는 렌티바이러스 벡터의 개선된 안정성이 히스티딘, 시트레이트, MOPS, PIPES, 및 MES 완충제에서 얻어질 수 있음을 제시한다. DLS는 렌티바이러스 입자의 유체역학적 반경을 측정하는데 사용되었다. DLS는 반-정량적 검정이기 때문에, 본 발명자들은 상이한 온도 (저 내지 고)에서의 응집에 대한 경향 분석에 의존하였다.
상이한 완충제 조건에서의 Rh의 강건성을 결정하기 위한 추가적인 분석을 수행하였다 (도 13-19). 분석은 DLS (예를 들어, 상기 실시예 4 참조) 및 역가의 결정 (상기 실시예 5 참조)을 포함하였다. 도 13은 히스티딘, 시트레이트, MOPS, PIPES, HEPES, 및 MES 완충제가 단지 DLS에 의해 평가된 바와 같이 단량체를 안정화시키는데 있어서 렌티바이러스 벡터에 대한 안정성을 선택적으로 촉진시킴을 제시한다. 도 14는 포스페이트, HEPPS, 및 Tris 기재 완충제가 단지 DLS에 의해 평가된 바와 같이 고온에서의 응집으로부터 임의의 보호 작용을 제공하지 않음을 제시한다.
도 15-19는 2가지 범주 (응집으로부터의 보호 및 고온에서의 감염력의 소실로부터의 보호)를 함께 분석한 연구의 결과를 제시한다. 도 15는 히스티딘 및 PIPES 완충제가 감염력을 보존하는데 있어서 심지어 고온에서도 안정성을 제공함을 제시한다 (고유한 pH 및 염 조합으로). 도 16은 시트레이트 완충제가 고온에서 HEPES에 비해 감염력의 소실로부터의 보호를 제공함을 나타내는 반면, 도 17은 MOPS 및 MES 완충제가 고온에서의 감염력의 소실로부터의 보호를 제공함을 제시한다. 도 18은 포스페이트 완충제가 고온에서 HEPPS에 비해 감염력의 소실로부터의 보호를 제공함을 제시하는 반면, 도 19는 Tris 완충제가 고온에서의 감염력의 소실로부터의 보호를 제공하지 않음을 제시한다. 이들 결과는 선택된 완충제 (예를 들어, 히스티딘, PIPES, 시트레이트 등)가 2가지의 직교 분석 기술에 의해 결정된 바와 같이 감염력 및 단량체를 보존하는데 있어서 유의한 안정화 효과를 가짐을 제시한다.
안정성을 추가로 평가하기 위한 동결-해동 연구를 수행하였다. 사용된 방법은 상기 실시예 6에 기재되어 있다. 도 20은 렌티바이러스 벡터가 3, 6, 및 9 동결-해동 주기에서 역가의 65% 초과의 보유로 생존한 조건의 수를 제시한다. 도 21은 3, 6, 및 9 동결-해동 주기로부터의 렌티바이러스 벡터의 불활성화 동역학이 벡터에 대해 고 또는 저 안정성을 제공하는 완충제를 구별하였음을 제시한다. 데이터의 분석 (예를 들어, 도 22 참조)은 렌티바이러스 벡터가 9 동결-해동 주기에서 역가의 65% 초과의 보유로 생존한 5가지 조건을 확인하였다. 이들 조건의 상세사항은 도 23에 제시된다.
다수의 동결-해동 주기 후의 안정성의 유지에 대한 탄수화물, 수크로스를 포함하는 것의 효과를 평가하기 위한 추가적인 연구를 수행하였다. 상기 실시예 6의 방법을 이들 실험을 위해 채용하였다. 시트레이트, HEPES, 및 PIPES-기재 완충제에 대해, 9 동결-해동 주기 후에 활성의 약 20% 소실을 제시하는 히스티딘 완충제에 비해, 렌티바이러스 벡터의 활성의 소실은 없다 (도 24 및 25 참조). 탄수화물을 갖는 선택된 안정화 완충제 조건의 예는 도 26에 제시되어 있다.
바이러스 역가를 1차 T 세포에서 상기 실시예 7에 기재된 방법을 사용하여 평가하였다. 결과는 도 27에 제시된다. PIPES 및 시트레이트 완충제는 1차 세포에서 매우 높은 역가를 제공하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 세포에서의 효율적인 형질도입을 제시한다. HEPES 및 히스티딘 완충제는 또한 높은 역가를 제공하였다. 상업적 벡터를 능가한 확인된 조건 모두는 렌티겐 코포레이션 (상업적 제형, 공지되지 않음)으로부터 구입하였다.
PIPES, HEPES, 및 히스티딘 완충제를 사용한 안정성 연구의 특정 결과의 비교는 도 28에 제시된다. 응집 결과는 DLS에 의해 측정 시 온도의 함수로서 렌티바이러스 벡터 유체역학적 반경의 증가를 제시한다. 특정 pH를 갖는 평균 값이 제시되어 있다 (50-150 mM NaCl을 가짐). 고온에서의 렌티바이러스 벡터의 활성을 293T 세포에서 평가하였다. 50℃에서의 값을 25℃에서의 값과 비교하였다. 특정 pH를 갖는 평균 값이 제시되어 있다 (50-150 mM NaCl을 가짐). 9 동결-해동 주기 후의 293T 세포에서의 렌티바이러스 벡터의 활성이 렌티바이러스 벡터 안정성을 지시하기 위한 예로서 제시되어 있다 (>100% 활성은 활성의 소실이 없음을 의미하고; 검정은 생체내 검정에서와 같이 가변적임). 1차 T 세포에서의 렌티바이러스 벡터의 활성이 형질도입 능력에 대한 추가적인 시험으로서 제시되어 있다. PIPES 완충제 중의 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 히스티딘 완충제 중의 렌티바이러스 벡터에 비해 각각 ~ 25% 및 ~ 35% 더 많은 1차 T 세포를 형질감염시킬 수 있었다. 따라서, PIPES 완충제는, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터가 PIPES 완충제에서 보다 안정하기 때문에, 표준 HEPES-기재 제형에 대한 대안을 제공한다. 더욱이, PIPES 완충제 중의 렌티바이러스 벡터는 HEPES 및 히스티딘 완충제에 비해 ~ 20-25% 더 많은 1차 T 세포를 형질감염시킬 수 있었다.
실시예 9. PIPES, 히스티딘, 및 HEPES 완충제 중의 렌티바이러스 벡터의 정제
렌티바이러스 벡터를 제조하고, 상기 실시예 1 및 2에 기재된 방법을 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피 정제 단계 후, 0.2 마이크로미터 필터를 통한 통과의 포함을 수행하여 멸균성을 유지한다. 낮은 회수율은 응집으로 인해 정제로부터 초래될 수 있기 때문에, 상이한 완충제를 시험하여 최적 회수율을 초래하는 조건을 확인하였다. 도 29에 제시된 바와 같이, PIPES 완충제는 HEPES 및 히스티딘 완충제에 비해 보다 양호한 회수율을 제시하였다.
실시예 10. 추가적인 렌티바이러스 벡터의 안정화
상기 언급된 바와 같이, 상기 수행된 연구를 GFP 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행하였다 (상기 언급된 바와 같은 도 2에 예시된 안정성 연구는 제외). 본 발명자들은 추가적인 실험을 수행하였으며, 이는 PIPES-기재 완충제 (20 mM PIPES, pH 6.5, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스)가 상이한 트랜스진을 발현하는 2가지 추가적인 렌티바이러스 벡터 (벡터 1 및 2)를 안정화시키는데 유효함을 제시한다.
PIPES-기재 완충제 (20 mM PIPES, pH 6.5, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스)에 존재하는 2가지 렌티바이러스 벡터를 미세여과, 접선 유동 여과 (TFF), 벤조나제 처리, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 및 멸균 여과의 단계를 포함하는 방법을 사용하여 정제하였다. 샘플을 TFF 보유물로부터 얻고, -80℃ 또는 +4℃에서 4일 동안 유지하였다. 또한, 샘플을 SEC 용출물로부터 얻고, -80℃ 또는 +4℃에서 3일 동안 유지하였다. 바이러스 역가를 유지 기간 전후에 샘플로부터 얻었다. 둘 다의 벡터는 정제 동안 PIPES 완충제에서 안정하였다. 도 30에 제시된 바와 같이, 역가 결정에 의해 측정 시 활성의 유의한 변화는 -80℃ 또는 +4℃에서의 TFF 및 SEC 샘플의 단기 저장 동안 없는 것으로 밝혀졌다.
동적 광 산란을 사용하여 PIPES 완충제 (20 mM PIPES, pH 6.5, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스)에 저장된 벡터의 응집 상태를 평가하였다. 도 31 및 32에 제시된 바와 같이, 둘 다의 벡터는 25℃에서 PIPES 제형에서 단량체성이며, 결정된 d,nm는 대략 140 nm인 것으로 밝혀졌다. 사용된 방법은 상기 실시예 4에 기재된 바와 같다.
정제된 벡터 2의 안정성을 4℃에서 3주 동안 PIPES 완충제 (20 mM PIPES, pH 6.5, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스)에서의 저장 후에 평가하였다. 도 33에 제시된 바와 같이, 이러한 벡터는 293T 세포에서의 역가의 결정에 의해 측정 시 이들 조건 하에서 높은 안정성, 뿐만 아니라 대조군 (4℃, 제0일; 도 33에서 첫번째 막대, 대조군의 활성을 100%로서 취함)에 비해 잔류하는 활성의 백분율을 유지한다. x-축 막대는 각각 제14일 및 제21일에서의 활성을 제시한다 (대조군에 대한 퍼센트로서 표현됨).
추가의 연구에서, PIPES 완충제 (20 mM PIPES, pH 6.5, 75 mM NaCl, 2.5% 수크로스)에서의 벡터 2의 동결-해동 안정성을 평가하였다 (방법에 대해서는 상기 실시예 6 참조). 도 34에 제시된 바와 같이, 이러한 벡터는 293T 세포에서의 역가의 결정에 의해 측정 시 다수의 주기의 동결-해동 (9 주기 이하를 수행하였음) 후에 높은 안정성, 뿐만 아니라 대조군 (1 동결-해동 주기 후의 역가, 정제된 렌티바이러스 샘플을 정제 직후 -80℃에서 저장할 때)에 비해 잔류하는 활성의 백분율을 유지한다. 도 34에서의 첫번째 막대에 나타낸 대조군 샘플의 활성을 100%로서 취한다. x-축 막대는 3, 6, 및 9 동결-해동 주기 후의 잔류 활성 (퍼센트로)을 제시한다 (대조군에 대한 퍼센트로서 표현됨).
다른 실시양태
이 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명을 그의 구체적인 실시양태와 관련하여 기재하였지만, 추가의 변형이 가능하고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술분야 내의 공지되거나 통상적인 관행 내에 있으며 상기 제시된 본질적 특색에 적용될 수 있는 본 발명으로부터의 이러한 일탈을 포함한 본 발명의 임의의 변형, 용도, 또는 개조를 포괄하는 것으로 의도되며, 청구항의 범위를 따르는 것으로 이해될 것이다.

Claims (67)

  1. 렌티바이러스 벡터, 1,4-피페라진디에탄술폰산 (PIPES) 완충제, 및 염을 포함하는 수성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PIPES 완충제가 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 PIPES 완충제가 약 20 mM의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 약 6.0 내지 약 7.0인 수성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 수성 조성물의 pH가 약 6.5인 수성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 수성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨인 수성 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물 중의 상기 염의 농도가 약 25 mM 내지 약 150 mM인 수성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수성 조성물 중의 상기 염의 농도가 약 50 mM인 수성 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 수성 조성물 중의 상기 염의 농도가 약 75 mM인 수성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 20 mM PIPES 및 75 mM 염화나트륨을 포함하고, 상기 수성 조성물이 약 6.5의 pH를 갖는 것인 수성 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 탄수화물을 추가로 포함하는 것인 수성 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 탄수화물이 비-환원 탄수화물인 수성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 비-환원 탄수화물이 수크로스 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 수성 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물이 상기 수성 조성물의 부피당 약 1 중량% 내지 약 10 중량%의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 탄수화물이 상기 수성 조성물의 부피당 약 2 중량% 내지 약 5 중량%의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 탄수화물이 상기 수성 조성물의 부피당 약 2.5 중량%의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 20 mM PIPES, 75 mM 염화나트륨, 및 상기 수성 조성물의 부피당 2.5 중량% 수크로스를 포함하고, 상기 수성 조성물이 약 6.5의 pH를 갖는 것인 수성 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물의 오스몰랄농도가 약 270 mOsm/kg 내지 약 330 mOsm/kg인 수성 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 수성 조성물의 오스몰랄농도가 약 275 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg인 수성 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 수성 조성물의 오스몰랄농도가 약 285 mOsm/kg인 수성 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 약 2 x 108 밀리리터당 형질도입 단위 (TU/mL) 내지 약 1 x 109 TU/mL의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 약 3 x 108 TU/mL 내지 약 5 x 108 TU/mL의 농도로 존재하는 것인 수성 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 재조합 인간 면역결핍 바이러스인 수성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 수포성 구내염 바이러스 G (VSV-G) 단백질을 포함하는 것인 수성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 VSV-G 단백질이 상기 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 존재하는 것인 수성 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 트랜스진을 포함하는 것인 수성 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 트랜스진이 단백질을 코딩하는 것인 수성 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 단백질이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 것인 수성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 CAR이 N-말단에서 C-말단 방향으로 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1종 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 신호전달 도메인이 1종 이상의 1차 신호전달 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 신호전달 도메인이 1종 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 1종 이상의 1차 신호전달 도메인 중 하나가 CD3-제타 자극성 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인 중 1종 이상이 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극성 단백질로부터 선택되는 세포내 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인 중 상기 1종 이상이 4-1BB (CD137) 공동자극성 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 공동자극성 도메인 중 상기 1종 이상이 CD28 공동자극성 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 scFv인 수성 조성물.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; C-유형 렉틴-유사 분자-1, CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 강글리오시드 G2 (GD2); 강글리오시드 GD3; TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-연관된 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암배아성 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2; 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21; 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 회합된 뮤신 1 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 안히드라제 IX (CAIX); 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 절단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질 (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3; 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종-연관된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 군 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라마이드 (글로보H)의 헥사사카라이드 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3 (ADRB3); 파넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 로커스 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-연관된 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1, T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1; 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 시클린 B1; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사, T 세포에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2 (SSX2); 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체 (RAGE-1); 신장 편재성 1 (RU1); 신장 편재성 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 돌연변이된 열 충격 단백질 70-2 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관된 이뮤노글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 이뮤노글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는 것인 수성 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 CD19, 메소텔린, 또는 CD123에 결합하는 것인 수성 조성물.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 항-CD19 항체 또는 그의 단편, 4-1BB (CD137) 막횡단 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 수성 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 조성물이 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA), 소 혈청 알부민 (BSA), 및 지단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질을 함유하지 않는 것인 수성 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 수성 조성물이 HSA, rHSA, BSA, 및 지단백질을 함유하지 않는 것인 수성 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 혈청의 부재 하에서 배양된 세포에서 생산되는 것인 수성 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 동적 광 산란 (DLS)에 의해 측정 시 100 ± 25 nm의 유체역학적 반경을 특징으로 하는 것인 수성 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 25℃ 내지 55℃의 온도 범위 내에서 100 ± 25 nm의 상기 유체역학적 반경을 유지하는 것인 수성 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 10% 내지 25%의 다분산도를 특징으로 하는 것인 수성 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 25℃ 내지 55℃의 온도 범위 내에서 10% 내지 25%의 상기 다분산도를 유지하는 것인 수성 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 동결/해동 주기 전의 상기 수성 조성물 중의 상기 렌티바이러스 벡터의 농도에 비해 약 70% 내지 약 100%의 3 동결/해동 주기 후의 농도를 유지하며, 여기서 각각의 상기 동결/해동 주기가 상기 수성 조성물을 동결시키고, 후속적으로 상기 수성 조성물을 실온에서 해동시키는 것을 포함하는 것인 수성 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 6의 상기 동결/해동 주기 후에 약 70% 내지 약 100%의 상기 농도를 유지하는 것인 수성 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 9의 상기 동결/해동 주기 후에 약 70% 내지 약 100%의 상기 농도를 유지하는 것인 수성 조성물.
  51. 렌티바이러스 벡터, 포스페이트 완충제, 시트르산나트륨 완충제, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충제, 3-모르폴리노프로판-1-술폰산 (MOPS) 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제, 및 염을 포함하는 수성 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 수성 조성물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 수성 조성물이 수크로스 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-환원 탄수화물을 추가로 포함하는 것인 수성 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물을 필터를 통해 통과시켜, 그에 의해 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 수성 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 필터가 복수의 세공을 포함하고, 상기 세공이 약 0.2 μm의 직경을 갖는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 상기 수성 조성물이 상기 렌티바이러스 벡터를 상기 접촉 전의 상기 수성 조성물 중의 상기 렌티바이러스 벡터의 농도에 비해 약 80%의 농도로 포함하는 것인 방법.
  57. 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법이며,
    a. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물을 복수의 입자를 포함하는 재료와 접촉시키고;
    b. 상기 재료를 통해 유동하는 물질을 상기 재료 내에 잔류하는 물질로부터 분리하여, 그에 의해 상기 렌티바이러스 벡터로 풍부화된 수성 조성물을 제조하는 것
    을 포함하는 방법.
  58. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물을 뉴클레아제와 접촉시켜, 그에 의해 오염성 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 함유하지 않는 수성 조성물을 제조하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 정제하는 방법.
  59. 세포를 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 트랜스진을 발현하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 T 세포인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 T 세포가 인간 T 세포인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 인간 T 세포가 293T 세포, Jurkat T 세포, 또는 1차 인간 T 세포인 방법.
  64. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물 및 패키지 삽입물을 포함하는 키트.
  65. 제64항에 있어서, 상기 패키지 삽입물이 상기 키트의 사용자에게 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항의 방법에 따라 세포에서 트랜스진을 발현하는 것을 지시하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 키트가 제65항의 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 시약을 추가로 포함하는 것인 키트.
  67. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 수성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스진을 임의로 포함하는 바이러스 벡터를 대상체의 세포 내로 전달하는 방법에 있어서의 상기 조성물의 용도.
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