CN108060136A - 一种用于治疗aml的嵌合抗原受体t细胞、制备方法及应用 - Google Patents

一种用于治疗aml的嵌合抗原受体t细胞、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用，本发明用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞，其表面表达嵌合抗原受体CAR‑1和嵌合抗原受体CAR‑2；所述嵌合抗原受体CAR‑1是在pcDNA3.1(+)载体氨基端到羧基端顺次拼接IL‑12、CD33scFv。所述嵌合抗原受体CAR‑2是将CD 28‑CD3ζ基因片段连接于pIRESpuro3(Clontech)载体构成。本发明在CAR载体的制备过程中，设计共表达白细胞介素‑12(interleukin‑12，IL‑12)的CD 33 CAR载体。将CAR‑1和CAR‑2载体共转染T细胞，即可获得稳定过表达CAR‑1和CAR‑2的T细胞株，即IL‑12‑CD33‑CAR T细胞。本发明T细胞可用于制备急性髓系白血病(AML)治疗的药物。

Description

一种用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及分子细胞生物学领域，特别涉及一种用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用。
背景技术
急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是一种常见的、预后较差、死亡率最高的血液恶性肿瘤，占全部急性白血病的70％左右，发病率大约为4～6/10万人。目前60岁及60岁以下AML患者的治愈率为35％～40％，而60岁以上老年AML患者治愈率仅5％～15％[1]。另一个不容乐观的现状是，AML患者在病情缓解后复发的概率高达43％，且这部分人的五年生存率仅为7％～12％[2,3]。国际上治疗AML的方法有：分子靶向治疗、诱导分化治疗、联合化疗、造血干细胞移植等多种治疗方法，对于某些特定种类的AML，仍有治愈的希望。我国临床治疗AML的方案多为联合化疗以及骨髓移植，但由于后者的捐献源稀缺和限制，使得很多病患错过了最佳治疗时机，多维持在联合化疗控制病情阶段。目前，临床上用于治疗AML的药物主要为两大类：抗生素类药(阿糖胞苷、米妥蒽醌)和植物类药(高三尖山酯碱、依托泊苷)。以上药物副作用较大，主要有恶心、呕吐，是所有抗白血病药物中胃肠道反应最突出的代表。其次造成骨髓抑制也较明显，使白细胞、血小板明显减少，可出现中枢神经系统毒性，严重者由于中枢神经系统的不可逆损害而致死。对于一些复发性/难治愈性AML患者来说，复发后的挽救化疗方案常常为大剂量或非常规的化疗药物，副作用巨大，无法接受强化疗的老年AML患者的生存期仅有5～10个月[4]。
在过去的40年中，尽管人们对AML的认识更加深入，但是与其它血液肿瘤相比，AML的治疗并没有明显的变化，迫切需要新的治疗手段来提高AML患者的生存质量、延长AML患者的生存期。传统化疗对于急性白血病效果不佳主要是因其无法有效针对白血病干细胞(leukemic stem cells，LSCs)。究其原因主要是由于LSCs基本上都是处于静止期，并可以随时增殖分化成为白血病细胞，同时他们还具有较强的自我修复能力。随着分子生物学的研究进展，急性白血病的治疗已从过去单一依靠化疗、放疗等杀灭白血病细胞的治疗方法，向诱导分化、外周血干细胞移植、脐血干细胞移植等生物治疗联合应用的方向转变。新兴的治疗手段在对白血病的治疗上，更大程度地选择性杀伤肿瘤细胞，减少对正常造血干细胞的抑制作用，降低对全身其他脏器的不良反应上更具有显著的效果。对于LSCs表面特异性抗原的研究以及特异性细胞免疫治疗技术也都是目前的研究热点。
肿瘤细胞免疫治疗的发展，在CAR-T技术的出现后取得了突破性进展。它在复发/难治性白血病、淋巴瘤的治疗上显示出显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。靶向CD 19的CAR-T细胞疗法已经应用于临床，并且取得非常可喜的治疗效果。Juno的JCAR015一期临床数据显示它在急性淋巴细胞白血病人身上的完全缓解率是87％。CAR-T疗法有着对病人创伤较小、治疗周期较短等优点。CAR，即嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR)，是1989年由Eshhar和其同事设计的用来表达抗体和TCR元件的融合蛋白，主要表达在T细胞表面，用来激活非MHC限制性抗原依赖性的T细胞[5-7]。后来发展的CAR通过再修饰和增加信号传导效能，提高了T细胞的增殖能力，进而以CAR为基础的细胞免疫治疗逐渐成为治疗恶性肿瘤的一种新兴形式。简易来说，CAR技术即利用基因工程技术改造免疫细胞，使其具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。
细胞表面抗原CD 33是髓系细胞分化抗原，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段，其胞内区含有免疫酪氨酸抑制基序(immune receptor tyrosine-basedinhibitory motif，ITIM)，作为抑制性受体能够调节细胞的生长和分化，在免疫和炎症反应中作为抑制性受体对于淋巴细胞的增殖和活化发挥着重要的调节作用[8]。CD33在90％以上的AML患者中都有表达。在造血干细胞表面没有表达，在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达，因此CD 33成为髓系白血病治疗的良好靶点[9,10]。鉴于靶向CD 123 CAR-T技术在AML治疗中的可行性，我们研发了靶向CD33的CAR-T细胞的制备方法。
筛选、鉴定白血病相关抗原是实现肿瘤早期诊断、生物免疫治疗、单克隆抗体研发、肿瘤靶向治疗的重要基础，是根治白血病的希望所在。目前，人源化的抗CD 33单克隆抗体与毒素相连而成的药物美罗泰格已被美国FDA批准上市，是一种针对难治性AML的靶向治疗抗体[11,12]；辉瑞推出Mylotarg靶向抗癌药是一种实验性抗体药物偶联物，由细胞毒性制剂卡奇霉素和靶向CD33的一种单克隆抗体偶联而成。当Mylotarg靶向抗癌药结合至细胞表面的CD33抗原时被吸收进入细胞内，释放出卡奇霉素导致细胞死亡[13]。在2010年，由于该药在一项验证性III期临床研究种未表现出临床获益，同时该药治疗组因治疗相关毒性导致的死亡率显著升高，辉瑞自愿将Mylotarg撤出市场。目前，Mylotarg已在日本上市，用于被认为不适合其他细胞毒化疗的复发性或难治性CD33阳性急性髓性白血病患者[13,14]。
与单克隆抗体治疗相比，靶向AML相关抗原的CAR-T细胞治疗，能特异性杀伤表达特殊抗原的白血病细胞，而不伤害正常细胞，将成为AML免疫治疗的新策略。该项治疗利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁。目前，以靶向CD123的CAR-T技术治疗AML已经初见成效，Mardiros[4]等利用慢病毒载体制备出CD 123 CAR-T细胞，并成功通过美国FDA批准临床试验。CAR-T技术的成功应用为AML的治疗带来更广阔的前景与希望。然而目前尚无CD 123 CAR-T治疗AML成功的临床案例，究其原因有可能是，选取的治疗靶点特异性相对较差；由于机体免疫抑等原因，使得CAR-T细胞无法发挥T细胞杀伤肿瘤的能力。
发明内容
针对以上技术缺陷，本发明的第一目的旨在发现可以有效应用于CAR-T细胞免疫治疗的作用靶点，即靶向CD 33的CAR-T细胞。改进CAR分子的结构，将靶向结构和信号传导结构拆分，通过两个表达载体分别表达，共转染至T细胞。获得用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞。
本发明用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞，其特征是，所述T细胞表面表达嵌合抗原受体CAR-1和嵌合抗原受体CAR-2；所述嵌合抗原受体CAR-1是在pcDNA 3.1(+)载体氨基端到羧基端顺次拼接IL-12、CD33scFv。
所述嵌合抗原受体CAR-2是将CD 28-CD3ζ基因片段连接于pIRESpuro3(Clontech)载体构成。
所述IL-12、CD33scFv直接通过linker连接，所述linker的序列为：
Sense linker:
ACAGAATTCATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAA(划线部分为EcoR I酶切位点)GTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCACGGCCGT(划线部分为Not I酶切位点)。
Anti-sense linker:
5'-AGCGGCCGTGAGACCTCTACAAGAGTTGGAGTTGACACTTGGGGTACTT(划线部分为Not I酶切位点)TCTTGGTGTAACGAACTAATAGCGCATTCTGGAATGAATTCTGT-3'(划线部分为EcoR I酶切位点)。
本发明的第二目的在于提供上述嵌合抗原受体T细胞的制备方法。在CAR载体的制备过程中，设计共表达白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)的CD 33CAR载体。
(1)CAR-1的构建
pcDNA 3.1(+)空载体经Not I，Xho I酶切回收后去磷酸化处理。将CD 33 scFv片段与酶切过的pcDNA 3.1(+)空载连接转化。
pcDNA 3.1-CD 33scFv的质粒和Hind III-IL 12-EcoR I基因片段用Hind III和EcoR I分别双酶切，连同linker一起连接转化获得pcDNA3.1-IL 12-CD 33scFv表达载体，即CAR-1(如图1所示)。
(2)CAR-2的构建
合成Nhe I-CD 28-CD3ζ-EcoR I片段与pIRESpuro3(Clontech)载体，连接转化获得pIRES-CD28-CD3ζ-puro表达载体，即CAR-2(如图3所示)。
(3)嵌合抗原受体T细胞的制备
T细胞用抗CD3、CD28抗体、IL-2刺激后，将CAR-1和CAR-2载体共转染T细胞。筛选获得稳定过表达CAR-1和CAR-2的T细胞株，即IL-12-CD33-CAR T细胞。
所述T细胞，优选为新鲜T细胞，更优选为新鲜自体T细胞。
本发明第三个目的在于提供嵌合抗原受体T细胞的应用，具体是在制备过继性细胞治疗药物中的应用。所述过继性细胞治疗药物为急性髓系白血病(AML)治疗药物。
为了克服肿瘤微环境对免疫细胞作用的抑制，本发明在选择特异性良好的CD 33之外，在基因编辑T细胞时，在CAR载体中融合了一段IL-12表达的基因，构建共表达CD 33和IL-12的CAR(CD 33/IL-12CAR-1)，如图1所示。IL-12是一种异质二聚体的细胞因子，具有抗瘤和抗转移的作用，激活T细胞和NK细胞，提高干扰素γ(IFN-γ)的产量，刺激原始CD4+T细胞向Th1表型的分化[15]。Th1的细胞应答包括细胞因子普的释放，激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞，促进机体抗瘤免疫活性。另一方面，IL-12可以通过一氧化氮引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞[16]；通过诱导可诱导的蛋白-10阻止血管生成[17]。给予IL-12可以使非免疫性的肿瘤产生免疫性，激活保护性免疫应答[16,18]。但是系统性的应用IL-12会引起中毒反应[19]。因此，最好的治疗策略是提高肿瘤病灶中IL-12的浓度，但是降低身体系统中IL-12的浓度水平，才能有效地发挥其抗肿瘤作用。基于此目的，两种策略为：1，肿瘤部位直接注射IL-12；2，将细胞因子合成的基因导入肿瘤细胞[20]。但是这两种方法局限性明显。注射法不适用于微小的肿瘤转移，因为操作程度太困难；将外源基因导入肿瘤细胞的体外操作费时费力，不可能在大量病人身上应用。与此不同，利用基因工程手段，构建IL12-CAR融合蛋白表达载体，既可以有效地靶向肿瘤细胞，同时可以提高T细胞的抗肿瘤效果。
本发明的关键点与有益效果为：
1、本发明CD 33靶向位点的选择具有专一性，高灵敏性等特点。将CD 33抗原识别部分与CAR技术相连，制备靶向CD 33的CAR-T细胞，本身就是一种创新。
2、对CAR载体进行改造，融合表达了IL-12，克服了传统CAR-T治疗时T细胞效能受抑制的弊端，提高了T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
本发明通过融合表达IL-12的创新方式，从而大大降低病人机体的免疫抑制，同时提高了靶向T细胞的肿瘤杀伤能力；CAR的设计一般分为抗原识别段与信号传导段，由于CAR的融合蛋白过大，往往造成转染效率和表达率低下的缺点，而本发明通过分别构建CD 33抗原识别段与CD28-CD3ζ信号共刺激段，共转染T细胞，提高了CAR的转染效率和表达率。
3、通过共转染，提高了转染效率，制备了有效的靶向CD 33的CAR-T细胞。本发明方法与一个质粒运载的“CAR”相比较，克服了大分子融合蛋白导致的转染效率低的缺点；另一方面，也使得“CAR”的蛋白表达丰度更高。
4、本发明有望全部或者部分缓解AML患者的病情。经临床实验证明，靶向CD 33的CAR-T细胞免疫治疗对AML的完全缓解(complete remission，CR)率高于40％。
附图说明
图1为IL 12-CD 33scFv融合蛋白基因表达载体CAR-1。
图2为重组表达载体CAR-1琼脂糖凝胶电泳图；1，未酶切载体；2，Hind III和Xho I双酶切；3，Hind III单酶切。
图3为CD 28-CD3ζ基因表达载体CAR-2。
图4为重组表达载体CAR-2琼脂糖凝胶电泳图；M，marker；1，Nhe I和EcoR I双酶切；2，未酶切载体。
图5为靶向CD 33的CAR-T细胞验证；Control:未经载体转染的T细胞；CAR-T cell:共表达CAR-1和CAR-2的T细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
1.真核细胞表达载体的构建
1-1链间连接肽DNA序列的合成
Sense linker:
ACAGAATTCATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAA(划线部分为EcoR I酶切位点)GTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCACGGCCGT(划线部分为Not I酶切位点)(SEQ ID NO.1)。
Anti-sense linker:
5'-AGCGGCCGTGAGACCTCTACAAGAGTTGGAGTTGACACTTGGGGTACTT(划线部分为Not I酶切位点)TCTTGGTGTAACGAACTAATAGCGCATTCTGGAATGAATTCTGT-3'(划线部分为EcoR I酶切位点)(SEQ ID NO.2)。
以上引物由英潍捷基公司合成。
1-2链间连接肽的回收
将合成的sense linker以及anti-sense linker分别用双蒸水溶解至终浓度为1μg/μL，沸水中煮4min，自然冷却至室温，退火完成后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根)回收DNA片段。
1-3pcDNA 3.1-IL-12-CD33scFv(CAR-1)表达载体的构建
1-3-1CD33scFv的基因扩增与回收
PET-28a(+)-CD33scFv表达质粒，购买自金斯瑞生物科技有限公司；
以PET-28a(+)-CD33scFv质粒为模板，CD 33scFv的扩增引物如下：
Sense:TCCGGCCGGACATTGTGATGACCCAGTCTC(划线部分为Not I酶切位点)(SEQ IDNO.3)；
Anti-sense:GTGCTCGAGTGAAGAGACAGTGACCGTGGT(划线部分为Xho I酶切位点)(SEQ ID NO.4)。
PCR反应体系如下：
PCR扩增条件为：94℃，4min；94℃30s；62℃45s；65℃120s；72℃10min；35个循环。200μL PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段。回收的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳再次验证无误可进行目的基因酶切。
目的基因酶切体系如下：
该酶切体系置于37℃水浴锅中，酶切过夜。酶切产物用快速DNA产物纯化试剂盒纯化。该过程遵照试剂盒说明书进行。
1-3-2目的基因与载体连接
pcDNA 3.1(+)空载体经Not I，Xho I酶切回收后去磷酸化处理。用DNA连接试剂盒Ligation high Ver.2将回收的CD 33scFv片段与酶切过的pcDNA 3.1(+)空载连接，16℃水浴过夜。
1-3-3连接载体转化
将16μL上述连接产物全部加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，立即在42℃水浴中热击90s后移至冰上冰浴2min。加入400μL LB培养基，37℃，200rpm培养1hr。滴加10μL菌液至含有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，均匀涂布。培养皿于37℃培养箱中倒置培养约16hr。
1-3-4阳性菌落筛选
挑选大肠杆菌单克隆，标记号码后加入4ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜。次日取2ml菌液，用质粒小提试剂盒(康维世纪)提取转化质粒。琼脂糖凝胶电泳检测结果。对照组为单酶切后相应质粒。测序比对正确的阳性克隆菌为含有pcDNA 3.1-CD33scFv的质粒。Hind III-IL 12-EcoR I基因片段由金斯瑞生物科技有限公司合成。EcoR I和Not I分别双酶切EcoR I-linker-Not I片段与pcDNA 3.1-CD33scFv质粒，按照1-3-2至1-3-4的方法进行连接、转化、挑取阳性单克隆，送测序，得到阳性克隆后质粒和Hind III-IL 12-EcoR I基因片段分别由Hind III和EcoR I双酶切后连接、转化、筛选送测序，正确的质粒为pcDNA3.1-IL 12-CD 33scFv(CAR-1)，用无内毒素的质粒大提试剂盒(endofreeplasmid maxi prep kit，QINGEN)提取质粒，酶切验证，如图2所示，备用。
1-4pIRES-CD28-CD3ζ-puro(CAR-2)表达载体的构建
Nhe I-CD 28-CD3 ζ-EcoR I基因片段由金斯瑞生物科技有限公司合成，连接于pIRESpuro3(Clontech)载体，即为CAR-2，如图3所示。该质粒，按上述1-3-3和1-3-4所述，转化大肠杆菌DH5α后，用无内毒素的质粒大提试剂盒(endofree plasmid maxi prep kit，QINGEN)提取质粒，酶切验证，如图4所示，备用。
2.稳定表达CAR-1与CAR-2的IL 12-CD 33-CAR-T细胞的筛选
将新鲜的T细胞加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基中，用抗CD3、CD28抗体、IL-2刺激T细胞，第三天用lipofectamine 2000将构建好的CAR-1和CAR-2载体共转染细胞。用G418和puromycin筛选稳定过表达CAR-1和CAR-2的T细胞株，即IL-12-CD33-CAR T细胞，并用于western blotting检测。
3.Western blotting检测CAR载体在T细胞中的表达
3-1Western blot相关试剂
(1)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris 15.1g，SDS 5.0g，甘氨酸94g，去离子水定容至1L备用。工作浓度为1×。
(2)5×SDS-PAGE上样缓冲液：称取SDS 0.5g，溴酚蓝25mg，加入1M Tris-HCl(pH6.8)1.25mL，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL，保存备用。
(3)膜转移缓冲液：称取甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，适量去离子水溶解后加入甲醇200mL，去离子水定容至1L后4℃保存备用。
(4)TBST缓冲液：称取NaCl 8.8g，加入1M Tris-HCl(pH8.0)20mL后去离子水定容1L，加入吐温20 0.5mL，混匀备用。
(5)5％脱脂牛奶封闭液：用TBST配制即可。
(6)RIPA裂解液：150mM NaCl，5mM EDTA，5mM焦磷酸钠，25mM Tris(pH 7.4)，1％Triton X-100，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠。使用时添加1％PMSF，0.1％抑肽酶。
3-2总蛋白的提取：取步骤2中的细胞培养皿置于冰上，弃培养液。预冷的PBS清洗3次后将残留液体吸干净。加入预冷的RIPA裂解液(700μL/10-cm培养皿；100μL/6孔板)后，取细胞刮铲将贴壁细胞刮下，冰浴30min。收集裂解液涡旋震荡，12000rpm，4℃离心15min。小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中，置于冰上。取一部分蛋白液用于测定蛋白浓度，剩余蛋白液加入5×上样缓冲液(终浓度为1×)，混匀后煮沸5min。得到的蛋白-20℃冻存备用。对照组为不加入CAR载体转染的T细胞。
(2)蛋白电泳：待测蛋白上样至聚丙烯酰胺凝胶蛋白点样孔中，加电泳缓冲液，80V，30min，之后设置160V至溴酚蓝到达分离胶底部。
(3)转膜：取与浸泡于转膜缓冲液中分离胶大小相同的滤纸8片，PVDF膜1片。使用前PVDF膜置于甲醇溶液中浸泡10s。转膜仪器使用Trans-Blot Turbo蛋白转印系统。在转膜仪下电极板上由下至上贴沾有转膜缓冲液的滤纸片、PVDF膜、分离胶、滤纸片。注意操作过程中排除转膜系统中的气泡。转膜条件：25V恒压，5-10min(根据转膜蛋白分子量确定)。
(4)封闭：将印有蛋白的PVDF膜置于5％脱脂牛奶中，37℃孵育2hr。
(5)抗体孵育：封闭后PVDF膜置于TBST缓冲液中，遵照说明书使用浓度加入一抗：anti-CD 3ζ、anti-CD 28、anti-IL-12p40、anti-CD 33)，4℃，慢摇孵育过夜。TBST清洗PVDF膜3次，10min/次。加入相应二抗，37℃慢摇孵育1hr，重复以上步骤，TBST中清洗3次。
(6)显色：遵照说明书配制Pro-Light HRP化学发光检测试剂，并滴加至待显色PVDF膜上，用ChemiDocTMXRS+成像系统曝光采集图像。
结果如图5所示，靶向CD 33的CAR-T细胞验证结果表明：共表达CAR-1和CAR-2的T细胞中检测到高丰度的CAR蛋白。。
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SEQUENCE LISTING
<110> 东莞赛尔生物科技有限公司
<120> 一种用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用
<130>
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aactccaact cttgtagagg tctcacggcc gt 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcggccgtg agacctctac aagagttgga gttgacactt ggggtacttt cttggtgtaa 60
cgaactaata gcgcattctg gaatgaattc tgt 93
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gtgctcgagt gaagagacag tgaccgtggt 30

Claims (5)

1.用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞，其特征是，所述T细胞表面表达嵌合抗原受体CAR-1和嵌合抗原受体CAR-2；
所述嵌合抗原受体CAR-1是在pcDNA 3.1(+)载体氨基端到羧基端顺次拼接IL-12、CD33scFv；
所述嵌合抗原受体CAR-2是将CD 28-CD3ζ基因片段连接于pIRESpuro3载体构成。
2.如权利要求1所述的用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞，其特征是，所述IL-12、CD33scFv通过linker连接，所述linker的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征是，步骤如下：
(1)CAR-1的构建
pcDNA 3.1(+)空载体经Not I，Xho I酶切回收后去磷酸化处理，将CD 33 scFv片段与酶切过的pcDNA 3.1(+)空载连接转化；
pcDNA 3.1-CD 33 scFv的质粒和Hind III-IL 12-EcoR I基因片段用Hind III和EcoRI分别双酶切，转化获得pcDNA3.1-IL 12-CD 33 scFv表达载体，即CAR-1；
(2)CAR-2的构建
合成Nhe I-CD 28-CD3 ζ-EcoR I片段与pIRESpuro3载体，连接转化获得pIRES-CD28-CD3 ζ-puro表达载体，即CAR-2；
(3)嵌合抗原受体T细胞的制备
T细胞用抗CD3、CD28抗体、IL-2刺激后，将CAR-1和CAR-2载体共转染T细胞。
4.权利要求1或2所述用于治疗AML的嵌合抗原受体T细胞在制备过继性细胞治疗药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述过继性细胞治疗药物为急性髓系白血病AML治疗药物。
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