CN106188298B - 一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用，属于生物制药技术领域。还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的表达载体和宿主细胞，同时还公开了该纳米抗体和鼠源Vsig4和人源Vsig4结合的抗原表位。通过本发明所公开的纳米抗体基因序列表达载体和及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达并优化获得亲和力高且稳定均一的Vsig4纳米抗体蛋白，应用于Vsig4分子检测试剂的研发并作为阻断Vsig4蛋白分子和补体C3b结合的拮抗剂。

Description

一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种Vsig4纳米抗体，该抗体与Vsig4的氨基酸结合位点以及该抗体在制备抗癌症药物、靶向结合Vsig4阳性巨噬细胞和竞争抑制Vsig4和补体C3b分子结合中的用途。
背景技术
Vsig4蛋白全称为V-set and immunoglobulin domain containing 4，是一种单次跨膜蛋白，人体中有两种存在形式，包括C2结构域和V结构域的长蛋白和只包括V结构域的短Vsig4蛋白，小鼠中只有一种含有V结构域的Vsig4蛋白。文献表明，虽然Vsig4的mRNA在不同的组织中如肝脏，肺，胎盘，滑膜和可能在中心神经系统组织等器官中表达，但其蛋白质在正常组织中，仅集中在肝脏巨噬细胞，滑膜等组织中有微量表达，在其他免疫器官几乎没有表达，因此，Vsig4具有高度巨噬细胞表达特异性。
Vsig4蛋白促进巨噬细胞的吞噬微生物的作用。Vsig4与补体系统中的C3b或C3c结合，参与C3b介导的调理作用并抑制补体激活通路的活化，研究表明，在早期感染阶段可以清除体内的致病菌，表达Vsig4的柯弗氏细胞(Kupffer cell)是一种肝脏固有巨噬细胞，这种细胞可以通过Vsig4直接或间接的在肝脏的肝脏血窦部位捕捉通过的致病菌如李斯特菌(listeria monocytogens)和金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。因此，Vsig4在人体清除细菌的感染过程中发挥了重要作用。
肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是近年来肿瘤发生和免疫逃逸机制的热点关注的细胞，是指单核吞噬细胞浸润至肿瘤间质内且数量众多，在肿瘤微环境的“再教育”下，参与肿瘤的发生、生长、侵犯、转移、肿瘤新生血管和淋巴管生成，并能通过抑制特异性T细胞免疫、协助肿瘤逃逸的巨噬细胞。一方面，TAM的数量和密度与肿瘤预后结果成反比，如肿瘤过表达的巨噬细胞分化和趋化因子M-CSF及CCL-2，其治疗效果显著较差；与此同时，TAMs的数量与肿瘤的生长成正比，最高可以达到肿瘤总细胞数的60％，故而将TAMs表面分子作为靶标影像设计探针，为肿瘤的早期诊断提供了新的可行性。另一方面有研究表明，TAMs通过分泌免疫抑制细胞因子IL-10、TGF-β和高表达B7家族免疫调节分子，抑制T细胞活性，协助肿瘤的免疫逃逸，因此针对减弱TAMs免疫逃逸作用所设计的药物，将有良好的肿瘤治疗前景。最近研究者用免疫组织化学方法在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中，检测到大量的Vsig4阳性TAMs细胞。并且在Vsig4基因敲除的小鼠中，肿瘤的成瘤率明显下降，肿瘤组织体积明显减小。此外一系列研究表明Vsig4在肿瘤组织中异常升高，在乳腺癌患者基因表达芯片研究中发现Vsig4的表达量高出对照组织的5倍。Vsig4在神经胶质瘤患者的基因表达也高于正常组。这些说明，Vsig4在肿瘤中的表达随着TAMs的逐渐增多而大量增加，因此Vsig4有作为肿瘤发展过程中TAMs标志性蛋白质的潜力。
Vsig4是B7免疫调节受体家族的成员，B7家族蛋白在抑制T细胞增殖和免疫应答中起关键作用。B7家族受体在T细胞的增殖和活化过程中起到协同刺激分子的作用，如B7-CD28家族在调节T细胞的免疫应答中起到了关键作用，而近年来抗肿瘤免疫治疗的免疫检测点的程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)和细胞程式死亡-配体1(Programmedcell death 1ligand 1，PD-L1)是目前B7家族蛋白的研究热点。据报道Vsig4具有免疫抑制的作用，在体外试验中，Vsig4的可溶性重组蛋白能直接抑制CD4+、CD8+T细胞和NKT细胞增殖和活性，并抑制IL-2细胞因子的表达。因此，Vsig4可能像其它B7家族的分子一样，在肿瘤的免疫逃逸过程中发挥至关重要的作用。研究表明，Vsig4分子作为一种负性调节分子可以显著抑制T细胞增殖和T细胞相关细胞因子的释放，Vsig4的可溶性重组蛋白能直接抑制CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤T细胞(natural killer T，NKT)细胞增殖和活性，并抑制白介素-2(Interleukin-2，IL-2)的表达。因此，Vsig4分子本身也在肿瘤的生成和发展起着重要的调节作用
通过靶标的天然识别分子(多肽、抗体、核酸适配体等)所介导的方法是实现主动靶向研究细胞表面受体的主要手段，特异性抗体不但可以用于基础实验研究和临床标本检测而且可作为在体示踪剂。比利时布鲁塞尔自由大学首次在世界上发现骆驼属动物体内存在天然的缺失轻链的重链抗体(HCAbs)，只包含一个重链可变区VHH和两个常规的CH2与CH3区。用单克隆表达获得VHH单域抗体，也称为纳米抗体(Camelid single-domain antibody-fragment,Nanobody)。纳米抗体是目前己知的可结合目标抗原的最小抗体单位，纳米抗体不但具有高稳定性和高亲和力，容易标记的特点，且仅是普通IgG抗体大小的十分之一。纳米抗体能够与多肽、蛋白质和膜受体结合，并可以大批量、自动化生产。纳米抗体具有良好的生物工程潜力，可以人工表达针对同一靶标或不同靶标的双分子或多分子纳米抗体，或者基于不用的用途，在纳米抗体上做不同的标记，如生物素、荧光集团和同位素等。通过二十几年的研究，纳米抗体已经应用于多个研究领域，作为检验，治疗手段等等，相关文献200多篇。而且具有可大规模发酵生产、价格低廉、免疫源性低、易于普及应用等优势，在生物医药领域有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种抗Vsig4鼠源和人源纳米抗体，该纳米抗体能够同时抗鼠源Vsig4和人源Vsig4，包括框架区和互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
该Vsig4纳米抗体的VHH链，包括四个框架区域(framework region，FR)和三个抗原互补决定区域(complementarity-determining region，CDR)。该Vsig4纳米抗体的VHH链，具有SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列。
其中，所述框架区FR1-FR4的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO.：2，SEQ IDNO.：4，SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：8。三个抗原互补决定区域(CDR1-CDR3)的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：7。
本发明公开了编码Vsig4纳米抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO.:9所示。
本发明提供一种原核表达载体，它含有所示Vsig4纳米抗体VHH。本发明提供一种原核宿主细胞，它含有所述Vsig4纳米抗体VHH的表达载体。
本发明公开的一种Vsig4纳米抗体与鼠源Vsig4结合的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。
本发明公开的一种Vsig4纳米抗体与人源Vsig4结合的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示。
本发明还公开了一种鉴定抗Vsig4纳米抗体抗原表位的方法，包括以下步骤：
1)重组Vsig4蛋白和抗Vsig4纳米抗体的共纯化，在分别表达重组Vsig4蛋白和纳米抗体后，将Vsig4和纳米抗体按1：1的摩尔体积比例混合，然后使用体积排阻色谱对抗原抗体复合物进行进一步的纯化。
2)抗原抗体复合物的结晶和X射线衍射数据的收集，将获得的抗原抗体复合物使用不同的结晶条件进行结晶实验，将获得的晶体使用X射线同步辐射光源进行衍射数据的收集。
3)抗原抗体复合物的结构解析，Vsig4纳米抗体抗原表位的确定，将获得的衍射数据，经过傅里叶转化和一系列处理，获得蛋白质复合物的电子云密度，最后将Vsig4和其纳米抗体的氨基酸排列到相应的电子云密度中，最后获得Vsig4和纳米抗体相互作用的抗原表位信息。
本发明还公开了上述Vsig4纳米抗体在制备用于治疗抗肿瘤药物中的用途。其中，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、淋巴癌，前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、肝细胞癌、成血管细胞瘤、脑胶质瘤等。
本发明还公开了上述Vsig4纳米抗体在炎症检测中的作用，具体为Vsig4纳米抗体体外和体内检测结合巨噬细胞表面结合Vsig4受体，从而监测炎症的发生和发展。所述炎症包括类风湿性关节炎、骨关节炎、红斑狼疮、心血管动脉硬化、糖尿病等。
本发明还公开了上述的抗Vsig4人源纳米抗体在制备用于Vsig4受体拮抗剂的用途。
本发明还涉及Vsig4纳米抗体在非疾病诊断治疗目的的免疫学检查分析中的应用，可以通过将Vsig4纳米抗体在制备吸附Vsig4蛋白的试剂中的使用，例如可以将本发明Vsig4纳米抗体制作成Vsig4免疫亲和柱，吸取或者富集Vsig4并或进而富集能与Vsig4结合的受体或者细胞，以供进一步研究。
本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，进行随机，点突变或者人源化改造，获得亲和力，特异性或者稳定性更高，免疫原性低的突变体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过深入研究B7家族新成员Vsig4补体受体家族配体识别和受体活化的机制，采用噬菌体展示技术对Vsig4纳米抗体进行表达；通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体；得到了具有针对肿瘤巨噬细胞的高亲和力并可以中和Vsig4和C3b结合作用的抗鼠源、人源Vsig4纳米抗体，也称为Nb119。本发明表达并优化获得亲和力高且稳定均一的Vsig4纳米抗体蛋白，开辟了靶向Vsig4的纳米抗体的分子影像学，抗肿瘤药物和Vsig4拮抗剂的新领域，具有深远的社会意义和广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为Vsig4纳米抗体噬菌体文库的DNA电泳图；
图2为Vsig4纳米抗体通过分子筛Superdex75纯化图；
图3为Vsig4纳米抗体Nb119和Vsig4蛋白稳定转染细胞系结合图；
图4为用等温滴定量热仪分析Vsig4蛋白和Vsig4纳米抗体Nb119的反应动力学结果图；其中，A为Vsig4纳米抗体Nb119和鼠源Vsig4蛋白的亲和力鉴定图；B为Vsig4纳米抗体Nb119和人源Vsig4蛋白的亲和力鉴定图；
图5为鼠源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119的蛋白质晶体结构图以及抗原表位；其中，A为鼠源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119复合物晶体结构表面显示图示。B为鼠源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119复合物晶体结构二级结构显示图示，其中抗原识别的CDR1,CDR2,CDR3标记。C为鼠源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119相互作用的特异氨基酸显示为棍状。
图6为人源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119的蛋白质晶体结构图以及抗原表位；其中，A为人源与鼠源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119相互作用的比对；B为人源Vsig4和Vsig4纳米抗体Nb119相互作用的特异氨基酸；C为人源和鼠源抗原识别表位氨基酸序列的差异比对。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明利用噬菌体展示技术，从羊驼免疫的单域重链抗体中筛选能与靶重组蛋白Vsig4特异性结合的纳米抗体克隆，以作为巨噬细胞的特异性探针，用于肿瘤的治疗和中和Vsig4蛋白和C3b结合的拮抗剂。
通用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫，分离血液中的白细胞，利用噬菌体展示技术，构建噬菌体展示文库，经过3次连续生物淘筛法获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体，经测序后和生物比对后，用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体，并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。
1、以Vsig4为抗原的纳米抗体文库的构建
1)首先，获得羊驼免疫血清中抗VHH基因
用100μg Vsig4重组蛋白免疫羊驼五次，每次间隔3周，获得抗血清50mL，利用淋巴分离液分离从全血中分离出淋巴细胞。用Trazol法提取淋巴细胞RNA，经过反转录试剂盒获得cDNA。
第一次PCR：获得VHH基因：用淋巴细胞cDNA作为PCR模板，加入Primer call 01,Primer call 02引物，dNTP，Taq DNA聚合酶进行PCR反应，1％琼脂糖胶鉴定PCR结果，胶回收VHH基因条带(600-800bps)，按照胶回收试剂盒说明书进行DNA条带的回收并测定胶回收DNA浓度。
第二次巢式PCR，插入酶切位点：使用Primer A6E和Primer 38作为引物，引物中插入酶切位点Not I和Nco I，取少量PCR产物用1％琼脂糖胶鉴定结果，获得建库用VHH大量DNA并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。
2)VHH基因与噬菌体载体pHEN4的链接、转染和文库的表达
将第二次PCR获得的DNA产物和pHEN4噬菌体表达载体，用Not I和Nco I限制性内切酶进行双酶切，置于37℃水浴中过夜，1％琼脂糖胶鉴定酶切结果，再加入DNA连接酶之后过夜连接酶切DNA和pHEN4载体，并用DNA纯化试剂盒纯化重组质粒条带。
通过电转染将重组质粒转入过夜培养的TG1大肠杆菌感受态细胞中，之后将转染宿主菌在LB液体培养基中于37℃摇床培养1小时，在用LB培养基分别进行1/10，1/102，1/103倍稀释，分别将稀释过的细菌取500μL涂布在LB固体培养皿表面，过夜于37℃培养箱中培养TG1细胞，第二天根据平板上的菌落数计算出库容量。
随机挑选30个克隆，用RP和GIII引物进行PCR，如图1所示，经过1％琼脂糖胶鉴定确定噬菌体展示文库的插入率达到为70％以上，证明文库构建成功
2、采用噬菌体展示技术筛选Vsig4纳米抗体
1)噬菌体展示技术将纳米抗体表达于噬菌体表面，经过生物淘筛，通过3轮亲和筛选并洗脱无亲和力的噬菌体，最终留下与抗原结合的纳米抗体表达噬菌体，并使得高亲和力在每一轮筛选中得到富集。
具体操作为：
在96孔板上分别标记两个孔，B1孔是包被100μL的25μg/mL的Vsig4重组蛋白孔，标记为“+”，B12孔是阴性对照孔，标记为“-”，将96孔板室温过夜包被后，第二天将约为1011噬菌体文库分别与两个孔在室温进行的孵育，第一轮生物淘筛用PBST缓冲液洗涤后，使用TEA溶液将能与Vsig4结合的噬菌体洗脱下来，再次感染TG1细胞，TG1细胞经过37℃过夜培养，由此进入第二、第三轮淘筛。与此同时，每一轮淘筛都需要计算有亲和力噬菌体的富集率，从“+”和“-”孔中分别取出10μL噬菌体文库，对噬菌体文库进行梯度稀释，分别是5个管为1/10，1/102，1/103，1/104和1/105倍稀释，之后在每孔中分别加入90μL的TG1溶液，并将每个孔中感染的TG1细胞分别涂布于不同的LB平板中37℃培养过夜，第二天计算不同平皿上“+”和“-”孔噬菌体感染TG1的克隆数，如果有差异证明噬菌体与抗原有特异性结合。
2)ELISA法检测生物淘筛富集率，用3轮噬菌体文库分别加入脱脂奶粉封闭过的Vsig4包被的ELISA平板，加入辣根过氧化物酶anti-phage antibody-HRP抗体，室温孵育1小时后，在加入酶底物ABTS和H2O2，经过分光光度计OD405nm测定ELISA显色结果，从而计算每一轮淘筛的Vsig4特异性噬菌体富集率。
3、用酶联免疫学方法筛选和Vsig4结合的阳性单克隆
酶联免疫学方法(PE-ELISA法)鉴定抗Vsig4阳性克隆，经过连续3轮的生物淘筛，从每轮TG1细菌培养皿中随机挑选克隆，分别接种液体LB培养基，培养3小时后，加入IPTG诱导剂，于37℃摇床过夜表达蛋白。离心去除培养基上清，裂解TG1细胞，将裂解液移入脱脂奶粉封闭过的Vsig4包被的ELISA平板，加入anti-HA mouse antibody单克隆抗体,室温孵育1小时后，在加入碱性磷酸酶标记anti-mouse IgG Ab和碱性磷酸酶底物，经过分光光度计在OD405nm测定ELISA显色结果，选择吸光光度值高于阴性对照3倍以上的阳性克隆送公司测序，最后用根据测序结果按照IMGT法将纳米抗体进行比对和分组，从互补确定区CDR3相同组中选取表达量高的有代表性的纳米抗体进行后续试验。
4、纳米抗体大量表达和纯化
为了获得高产量的纳米抗体，将纳米抗体从噬菌体表达载体pHEN4，经过Nco I和Eco9II限制性内切酶进行双酶切反应，克隆至原核生物蛋白质表达载体pHEN6中，转染Escherichia coli WK6感受态大肠杆菌细胞。之后，先将WK6在1L培养基中培养至生长指数期，用IPTG诱导表达纳米抗体，过夜培养后离心收集WK6细胞，经过裂解液处理后，获得细胞裂解液。使用金属螯合亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)亲和层析法，利用镍柱结合纳米抗体上的His-tag蛋白质标记，并用咪唑竞争洗脱纳米抗体。最后，再用体积排阻层析法，利用分子筛纯化更高纯度的纳米抗体。通过OD 260测定纳米抗体浓度，如图2所示，蛋白质凝胶电泳方法和考马斯亮蓝法染色鉴定纳米抗体的纯度达到90％以上和分子量大小为15kDa左右，证明纯化获得高纯度纳米抗体
5、采用ELISA技术测定纳米抗体与鼠源Vsig4蛋白的亲和力
用Vsig4蛋白包被96孔平板过夜，用脱脂奶粉室温封闭平板2小时，将纳米抗体进行1/2梯度稀释后加入平板孵育1小时，再加入anti-mouse His Ab单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的anti-mouse IgG Ab-AP单克隆抗体，加入底物反应后，用微孔读板仪测OD 405nm的值。
6、纳米抗体生物活性测定如采用纳米抗体与Vsig4过表达细胞系的结合鉴定
测定纳米抗体与Vsig4稳定表达CHO细胞系的结合将Vsig4稳定表达CHO细胞系接种于96孔细胞培养板，过夜培养，第二天见细胞密度为60％-70％，移除培养基，用4％多聚甲醛固定细胞10min，轻柔地用PBS漂洗2次，用脱脂奶粉室温封闭平板2小时，将纳米抗体进行1/2梯度稀释后加入平板孵育1小时，再加入anti-mouse His单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的anti-mouse IgG-AP单克隆抗体，加入底物反应后，用微孔读板仪测OD 405的值。如图3所示，将纳米抗体Nb119和鼠源Vsig4蛋白的亲和力作图，OD 405nm的值随着纳米抗体浓度的增加而升高，直至接近达到饱和，而同型对照抗体BCII10和Vsig4蛋白没有结合，证明Nb119和鼠源Vsig4特异性结合。
7、采用等温滴定量热仪技术测定纳米抗体与鼠源Vsig4和人源Vsig4的亲和力
使用等温滴定量热仪型号ITC T200，将纳米抗体分别于鼠源和人源的Vsig4注射，纳米抗体的使用浓度为200μM分别注射到20μM的鼠源Vsig4和人源Vsig4中，第一次注射0.4μl，之后19针注射2μl，每一针之间的时间间隔为160秒。
通过拟合之后，可以获得纳米抗体和Vsig4结合的化学计量比，解离常数Kd，吉布斯自由能，熵变和焓变值。如图4所示，结果显示Vsig4纳米抗体与鼠源和人源Vsig4蛋白的解离常数分别为3nM和850nM，提示该纳米抗体有很高的亲和力，能用于抗肿瘤用途。
8、用蛋白质结晶的方法测定纳米抗体与鼠源和人源Vsig4的抗原表位
如图5和图6所示，通过结构生物信息学技术，证实纳米抗体与鼠源和人源Vsig4的相互作用表面积达到提示该纳米抗体和鼠源和人源的Vsig4能够紧密的结合，同时其相互作用的位点也就是抗体识别抗原的表位氨基酸序列被鉴定，为进一步的优化该纳米抗体使用于多种不同用途提供了可能。

Claims (6)

1.一种Vsig4纳米抗体，其特征在于，该纳米抗体能够同时抗鼠源Vsig4和人源Vsig4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的Vsig4纳米抗体，其特征在于，该Vsig4纳米抗体的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；
其中：
4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：8所示；
3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：5和SEQID NO.：7所示。
3.根据权利要求1所述的Vsig4纳米抗体，其特征在于，编码所述Vsig4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
4.权利要求1所述的Vsig4纳米抗体在制备治疗肿瘤靶向的分子影像探针中的应用。
5.权利要求1所述的Vsig4纳米抗体在制备炎症检测试剂中的应用。
6.权利要求1所述的Vsig4纳米抗体在制备免疫学检查分析试剂中的应用。
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Molecular Imaging with Macrophage CRIg-Targeting Nanobodies for Early and Preclinical Diagnosis in a Mouse Model of Rheumatoid Arthritis;Zhang Fang等;《JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE》;20140331;第55卷(第5期);摘要；补充数据中的"Nanobody Generation and Purification"、"Anti-CRIg Nanobody Generation and Characterization"、表1、图5 *

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