BR112019022356A2 - Reagentes de partícula oligoméricos e métodos de uso dos mesmos - Google Patents
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Abstract
são fornecidos aqui reagentes oligoméricos, incluindo reagentes oligoméricos de estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina, e composições dos mesmos, e métodos para a fabricação de reagentes oligoméricos, incluindo métodos para a fabricação confiável de reagentes de partícula oligoméricos de um tamanho desejado. em alguns casos, os reagentes são reagentes de partícula oligoméricos contendo uma pluralidade de sítios de ligação para agentes e, portanto, um ou mais agentes são multimerizados pela ligação reversível ao reagente de partícula oligomérico, por exemplo, criando assim um reagente de partícula oligomérico multimerizado, tendo agentes estimuladores multimerizados sobre o mesmo. também são fornecidos métodos para usar os reagentes oligoméricos para incubação ou cultura, tal como induzir a estimulação de expansão, ativação e/ou sobrevivência, de uma composição de células, tal como uma população de linfócitos. em alguns aspectos, a descrição fornece métodos e reagentes para a estimulação, sobrevivência, persistência, ativação, ou outro efeito, de populações celulares que envolvem a ligação de agentes a uma molécula sobre a superfície da célula.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para REAGENTES DE PARTÍCULA OLIGOMÉRICOS E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS”.
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provisório de patente U.S. 62/491.245, intitulado OLIGOMERIC PARTICLE REAGENTS AND METHODS OF USE THEREOF apresentado em 27 de abril de 2017, cujo conteúdo é incorporado por referência na sua totalidade.
Incorporação por Referência da Listagem de Sequências
[002] O presente pedido está sendo apresentado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado 735042008540 SeqList.TXT, criado em 26 de abril de 2018, com 110.426 bites de tamanho. As informações no formato eletrônico da Listagem de sequências são incorporadas por referência em sua totalidade.
Campo
[003] A presente descrição fornece reagentes oligoméricos, incluindo reagentes oligoméricos de estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina, e composições dos mesmos e métodos para a fabricação de reagentes oligoméricos, incluindo métodos para a fabricação confiável de reagentes de partículas oligoméricos de um tamanho desejado. Em alguns casos, os reagentes são reagentes de partículas oligoméricos contendo uma pluralidade de sítios de ligação para agentes e, portanto, um ou mais agentes, por exemplo, um ou mais agentes de seleção ou reagentes estlmuladores, são multimerlzados por ligação reversível ao reagente de partículas oligomérico, por exemplo, criando assim um reagente de partícula oligomérico multimerizado, tendo agentes estimuladores ou de seleção multimerizados no mesmo. A presente descrição também fornece métodos para usar os reagentes
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2/378 olígoméricos para incubação ou cultura, como induzir estimulação de expansão (proliferação), ativação, coestimulação e/ou sobrevivência de uma composição de células, como uma população de linfócitos. Em alguns aspectos, a descrição fornece métodos e reagentes para a estimulação, por exemplo, de expansão (proliferação), sobrevivência ou persistência, ativação, coestimulação ou outro efeito (por exemplo, seleção por afinidade) de populações celulares que envolvem a ligação de agentes a uma molécula na superfície das células, fornecendo assim um ou mais sinais para as células.
Antecedente
[004] Várias estratégias estão disponíveis para estimular populações de células T in vitro, incluindo a expansão de células T específicas para antígenos in vitro para uso em imunoterapia celular adotiva ou terapia contra câncer, nas quais se demonstrou que infusões dessas células T têm reatividade antitumoral em um hospedeiro portador de tumor ou para uso no tratamento de infecções virais. Estratégias aprimoradas são necessárias para expandir as populações celulares in vitro, inclusive para fins de pesquisa, diagnóstico e propósitos terapêuticos.
Sumário
[005] São fornecidos neste documento reagentes de partículas olígoméricos compreendendo uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, em que o tamanho do reagente de partícula oligomérico compreende i) arádio, por exemplo, um raio hidrodinâmico superior a 25 nm, ii) um peso molecular de pelo menos 5 x 106 g/mol; e/ou (iii) pelo menos 100 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina por reagente de partículas oligomérico.
[006] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas olígoméricos aqui fornecidos, as moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina se ligam a ou são capazes de se
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3/378 ligar à biotina, um análogo de biotina (por exemplo, destiobiotina, iminobiotina) ou a um peptídeo de ligação à estreptavidina (por exemplo, Strep-tag II (WSHPQFEK, SEQ ID NO: 8)). Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, as moléculas de muteinmute de estreptavidina ou estreptavidina se ligam de forma reversível a ou são capazes de se ligar de forma reversível à biotina, um análogo de biotina ou a um peptídeo de ligação à estreptavidina (por exemplo, Strep-tag II (WSHPQFEK, SEQ ID NO: 8)). Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidlna, em que as moléculas de muteína de estreptavidina compreendem a sequência de aminoácidos Val44-'Thr45--Ala46--Arg47 ou sequência de l44-Gly45-Ala46-Arg47 nas posições de sequência correspondentes às posições 44 a 47 com referência às posições em estreptavidina na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
[007] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, as moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina se ligam ou são capazes de se ligar à biotina, avidina, um análogo de biotina ou muteína, um análogo de avidina ou muteína e/ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, as moléculas de muteína de estreptavidina ou estreptavidina se ligam de forma reversível a ou são capazes de se ligar de forma reversível a biotina, avidina, um análogo de biotina ou muteína, um análogo de avidina ou muteína e/ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina, em que as moléculas de mu
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4/378 teína de estreptavidina compreendem a sequência de aminoácidos Val^ThriMda^-Arg47 ou sequência de l44~Gly45~Ala46-Arg47 nas posições de sequência correspondentes às posições 44 a 47 com referência às posições na estreptavidina na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
[008] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem: a) a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61; b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61 e contêm a sequência de aminoácidos correspondente a Val44-Thr45-Aia46-Arg47 ou Ile44-Gly45 -Ala46-Arg47 e/ou se ligam reversivelmente à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou e/ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61 e contêm a sequência de aminoácidos correspondente a Val44-Thr45-Ala4'3-Arg47 ou He44- Gly45-Ala46Arg47 e/ou se liga à biotina ou a uma forma biologicamente ativa, um análogo de biotina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou um peptídeo de ligação à estreptavidina) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga à biotina ou a uma forma biologicamente ativa da mesma, um análogo de biotina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo ou um peptídeo de ligação à estreptavidina e/ou se ligam reversivelmente à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou c) um fragmento funcional
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5/378 de a) ou b) que se liga à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, em que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 ou 61. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a molécula de muteína de estreptavidina compreende ainda uma substituição ou substituições de aminoácidos em uma posição correspondente a 117, 120 e/ou 121 com referência a posições na estreptavidina na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
[009] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos: a substituição ou substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121· Tyr121 ou Phe121; ou a substituição ou substituições de aminoácidos são selecionadas de um ou mais dentre Glu117, Gly120 ou Tyr121; ou as substituições de aminoácidos são selecionadas entre Glu117, Gly120 ou Tyr121. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem: a) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 ou 28; b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 e contém a sequência de aminoácidos correspondente a Vai44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 e Tyr121 e/ou se liga à biotina ou a um fragmento biologicamente ativo, um análogo de biotina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou
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6/378 um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou c) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga à biotina ou a um fragmento biologicamente ativo, a um análogo de biotina ou a muteína ou a um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou a um peptídeo de ligação à estreptavidina.
[0010] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos: a substituição ou substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 ou Phe121; ou a substituição ou substituições de aminoácidos são selecionadas de um ou mais dentre Glu117, Gly120 ou Tyr121; ou as substituições de aminoácidos são selecionadas entre Glu117, Gly120 ou Tyr121. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem: a) a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 ou 28; b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 e contém a sequência de aminoácidos correspondente a Vai44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 e Tyr121 e/ou liga-se reversivelmente à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou c) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga reversivelmente à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
[0011] Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico é ligado ou é capaz de se ligar a um ou mais agentes através de um parceiro de ligação, em que um ou mais agentes compreendem o parceiro de ligação, tais como biotina, um análogo de biotina ou um
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7/378 peptídeo de ligação à estreptavidina. Em modalidades particulares de qualquer um dos oligoméricos reagentes de partículas aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreendem um parceiro de ligação, em que o parceiro de ligação é capaz de se ligar a um ou mais sítios de ligação no reagente de partículas oligomérico. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o parceiro de ligação compreende um peptídeo ou biotina de ligação à estreptavidina ou um análogo de biotina. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o parceiro de ligação compreende uma ligação à estreptavidina peptídeo selecionado do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-GIn-PheGlu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(GlyGlyGlySer)3-TrpSer-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), T rp-Ser~His~Pro~Gln-Phe~GIULys-(GlyGlyGlySer)2T rp~Ser~ His~Pro~ Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(GlyGlyGlySe^Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser- His-Pro~Gln~Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19). Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o um ou mais agentes se liga ou é ainda capaz de se ligar a uma molécula expressa na superfície celular de uma célula-alvo. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreendem um anticorpo, opcionalmente um Fab ou um nanocorpo®, por exemplo, um anticorpo de domínio único (sdAb).
[0012] Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso na superfície de uma célula-alvo. Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é ou compreende um
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8/378 agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula na superfície de uma célula-alvo, induzindo ou modulando um sinal na célula-alvo. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, ligase a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou liga-se especificamente ao CD3. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o reagente de partícula oligomérico compreende um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula na superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
[0013] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocinas, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão.
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[0014] Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada a partir de CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM. Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4.
[0015] Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocinas ou quimiocinas e o fator é um ligante que se liga especificamente a uma citocina ou receptor de quimiocina.
[0016] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1 R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNFalfa, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF, ou é um fragmento biologi
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10/378 camente ativo do mesmo.
[0017] Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especificamente a um receptor de quimiocina selecionado a partir de entre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é selecionado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0018] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso na superfície de uma célula-alvo. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula imune. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a célulaalvo é um linfócito ou uma célula apresentadora de antígeno. Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T, célula B, célula NK, macrófago ou célula dendrítica. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T. Em algumas modalidades de qualquer
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11/378 um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
[0019] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende um raio superior a 25 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm ou superior a 90 nm. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende um raio entre 25 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 115 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive, ou 90 nm ± 15 nm, ou 95 nm ± 2025 nm. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico tem um raio inferior a 150 nm. Em modalidades particulares, o raio é um raio hidrodinâmico.
[0020] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende um peso molecular de pelo menos 1 x 107 g/mol, pelo menos 5 x 107 g/mol ou pelo menos 1 x 108 g/mol. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas olígoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende um peso molecular entre 1x10® g/mol e 1 x 101° g/mol, entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol. Em algumas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui proporcionados, o reagente de partícula oligomérico compreende pelo menos 100 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, pelo menos 500 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, pelo menos 1.000 tetrâmeros de estrepta
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12/378 vidina ou muteína de estreptavidina ou pelo menos 1,5 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina tetrâmeros de muteína de estreptavidina ou pelo menos 2.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[0021] Em modalidades particulares de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende entre 100 e 50.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, entre 1.000 e 20.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, entre 1.000 e 10.000 estreptavidinor ou estreptavidinato, entre 2.000 e 5.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos, a pluralidade de estreptavidina ou muteína de estreptavidina compreende resíduos de Usina, em que menos de 20 %, 10 %, 5 %, 1 % dos resíduos de Usina compreendem iminotiolano N-substituído.
[0022] É aqui fornecida uma composição que compreende um ou mais reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, o um ou mais reagentes de partículas oligoméricos é uma pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreende I) um raio médio superior a 70 nm; li) um peso molecular médio de pelo menos 1 x 108 g/mol; e/ou iii) um número médio de tetrâmeros de estreptavidina ou estreptavidina por reagente de partícula oligomérico de pelo menos 2.000 e/ou iv) uma distribuição de tamanho de raio em que pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreendem um raio entre 10 nm e 150 nm. Em certas modalidades, a distribuição de tamanho de raio é uma distribuição de tamanho de raio hidrodinâmico.
[0023] Em certas modalidades de qualquer uma das composições
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13/378 aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreende um raio médio superior a 25 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm ou superior a 100 nm. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreende um raio médio entre 25 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 110 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive, ou 90 nm ± 15 nm ou 95 nm ± 20-25 nm. Em modalidades particulares de qualquer uma das composições aqui fornecidas, pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreendem um raio entre 50 e 150 nm, entre 70 nm e 140 nm, entre 80 nm e 120 nm, entre 80 nm e 115 nm, entre 80 nm e 100 nm, entre 90 nm e 110 nm e/ou entre 100 nm e 120 nm.
[0024] Em certas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos compreendem um raio entre ± 50 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 % e/ou ± 5 % do raio médio e/ou mediano da pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreendendo um raio médio entre 80 nm e 115 nm e em que pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos compreendem um raio entre ± 25 % do raio médio. Em modalidades particulares de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de partículas compreende um peso molecular médio entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive.
[0025] Em certas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreende um número médio de tetrâmeros estreptavidina ou es
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14/378 treptavidina por reagente de partícula oligomérico de peto menos 100, pelo menos 500, peto menos 1.000, pelo menos 1.500, ou pelo menos 2.000. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, a pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos compreende um número médio de tetrâmeros estreptavidina ou estreptavidina por reagente de partícula oligomérico entre 100 e 50.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 10.000, ou entre 2.000 e 5.000, cada um inclusive.
[0026] Em modalidades particulares de qualquer uma das composições aqui fornecidas, o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 25 % quando armazenado a aproximadamente ou abaixo de -80°C, a aproximadamente ou abaixo de 20°C e/ou a uma temperatura igual ou inferior a 4°C durante peto menos 1 semana. Em certas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenado a aproximadamente ou abaixo de 4°C por pelo menos uma semana. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui fornecidas, o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenado a aproximadamente ou abaixo de 4°C por peto menos 3 semanas. Em modalidades particulares de qualquer uma das composições aqui fornecidas, o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenado a aproximadamente ou abaixo de 4°C por pelo menos 9 semanas, pelo menos 27 semanas ou pelo menos 46 semanas. Em modalidades particulares, o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenado a, aproximadamente ou abaixo de -20°C, -30°C, -40°C, 50°C, -60°C, -70°C ou -80°C, por peto menos 1 semana, 3 semanas, 9 semanas, 27 semanas ou 46 semanas.
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[0027] São fornecidos neste documento métodos para a produção de um reagente de partícula oligomérico compreendendo estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina, o método compreendendo: incubar uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada ou muteína de estreptavidina compreendendo um grupo funcional reativo a tiol capaz de reagir com um grupo funcional tiol e uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol, gerando desse modo partículas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina oligoméricas; separar as partículas oligoméricas do monômero e/ou moléculas oligoméricas menores; e contatar a partícula oligomérica com um agente estabilizador, produzindo assim o reagente de partículas oligomérico.
[0028] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de estreptavidina ou estreptavidina ativada as moléculas de muteína são geradas incubando uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de ativação que é capaz de converter uma ou mais aminas em um grupo funcional reativo a tiol. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina é gerada pela incubação de uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de tlolação que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional de tiol a um ou mais resíduos de Usina.
[0029] Também é aqui fornecido um método para a produção de reagentes de partículas oligoméricos, o método compreendendo: (a) incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de ativação sob condições para converter uma ou mais aminas em um grupo reativo a tiol capaz reagir com um grupo funcional tiol, gerando assim uma pluralidade de
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16/378 moléculas estreptavidina ativada ou muteína de estreptavidina; (b) incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de tiolação que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tio! a um ou mais resíduos de lisina, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina; e (c) incubar a pluralidade de moléculas estreptavidina ativada ou muteína de estreptavidina com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidinas, gerando assim composição de partículas compreendendo os reagentes de partículas oligoméricos; em que o método é realizado sob condições em que, no momento do início da incubação em (c), incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina são tais que pelo menos 60 % das lisinas, em média, compreendem um tio! grupo funcional e/ou pelo menos 10 lisinas, em média, por estreptavidina tiolada ou tetrâmero de muteína de estreptavidina compreendem um grupo funcional tiol.
[0030] Certas modalidades compreendem ainda a separação dos reagentes de partículas oligoméricos dos monômeros e/ou moléculas menores de estreptavidina oligomérica ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada a uma relação molar entre 1 : 1 e 1 : 10 de estreptavidina ou muteína de estreptavidina para a ativação reagente. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada a uma relação molar de 1 : 2 ± 2 % de estreptavidina ou muteína de estreptavidina para o reagente de ativação. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ativação compreende um reticulador
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17/378 heterobifuncional. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ativação compreende 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo SMOG) e/ou succinimidil-6“[(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o grupo funcional reativo ao tiol é um grupo haloacetila, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acriloíla, um agente de arilaçâo, um grupo viníl-sulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfureto. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o grupo funcional reativo ao tiol é um grupo maleimida. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubadas a um pH neutro.
[0031] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubadas a um pH entre 6,8 e 7,5. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados a um pH entre 7,0 e 7,4, opcionalmente ou aproximadamente 7,2. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados a uma temperatura entre 4°C e 39°C. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, opcionalmente cerca de 23°C ou cerca de 24°C.
[0032] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos
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18/378 aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados por entre 15 minutos e 6 horas ou 30 minutos e 2 horas, cada um inclusive. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados dentre 45 minutos e 1,5 horas, inclusive, opcionalmente por aproximadamente 1 hora.
[0033] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 10 : 1 e 1 : 1, inclusive, do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 1 : 50 e 1 : 500, inclusive, de estreptavidina ou muteína de estreptavidina para o agente de tiolação. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar de aproximadamente 1 : 100 de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ao reagente de ativação. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de tiolação é ou compreende 2-iminotiolano.
[0034] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados a um pH de 7,0 ou superior, opcionalmente entre 7,0 e 8,0, Inclusive. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a
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19/378 segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados a um pH de cerca de 7,7. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação é iniciada na presença de um tampão com um pH de 8,0 ou superior, opcionalmente entre 8,0 e 9,0, inclusive. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação é iniciada na presença de um tampão com um pH de cerca de 8,5. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o tampão compreende borato. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o tampão compreende 10 mM a 200 mM de borato ou 50 mM a 100 mM de borato, cada um inclusive, opcionalmente cerca de 100 mM de borato.
[0035] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados a uma temperatura entre 4°C e 39°C. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, opcionalmente a ou aproximadamente 23°C ou a ou cerca de 24°C. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados por entre 15 minutos e 2 horas ou 15 minutos e 1,5 horas. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados por entre 15 minutos
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20/378 e 2 horas ou 25 minutos e 1 hora, cada um inclusive. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados por ou por cerca de 1 hora.
[0036] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados por ou por cerca de 25 minutos. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina durante a incubação está na relação molar de X: 1, em que X é o número de resíduos de Usina disponíveis para ser tiolado por molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a relação molar é de 1 : 1 a 8: 1 ou 2 : 1 a 6 : 1, opcionalmente ou em torno de 4: 1. Em certas modalidades, a relação molar é de 1 : 1 a 1 : 8 ou 1 : 2 a 1 : 6, opcionalmente ou aproximadamente 1 : 4.
[0037] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina são incubadas a um pH entre 6,8 e 7,5, inclusive. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina são incubadas a um pH entre 7,0 e 7,4, inclusive. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina ou estreptavida tiolada e a pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina ou estreptavidina tioladas são
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21/378 incubadas a um pH de cerca de 7,2.
[0038] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina são incubadas a uma temperatura entre 4°C e 39°C, inclusive. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina são incubadas em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, inclusive, opcionalmente a ou cerca de 23°C ou a ou cerca de 24°C. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada são incubadas por entre 15 minutos e 6 horas ou 30 minutos e 2 horas, cada uma inclusive. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada são incubadas por entre 45 minutos e 1,5 horas, inclusive, opcionalmente por ou por cerca de 1 hora. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada e as moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina termina com o contato das moléculas com N~ etilmaleimida (NEM).
[0039] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, pelo menos uma porção da incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de ativação e pelo menos uma porção da incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de tiolaçâo são realizadas separadamen
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22/378 te ao mesmo tempo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de ativação e a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com o agente de tiolação são realizadas para substancialmente as mesmas quantidade de tempo e/ou são concluídas substancialmente ao mesmo tempo. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que, antes da incubação das moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina e das moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada, o método compreende (I) remover o agente de ativação da composição compreendendo a estreptavidina ativada ou moléculas de muteína de estreptavidina; e/ou (ii) remover o agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina.
[0040] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada ou muteína de estreptavidina e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina é iniciada dentro de 15 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com o agente de tiolação é finalizado e/ou após a remoção do agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina.
[0041] São fornecidos aqui métodos que produzem reagentes de partículas oligoméricos, compreendendo: incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com succinlmidil-6-[(p-maleimidopropionamldo)hexanoato (SMPH) por ou por cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, desse modo gerando uma pluralidade de moléculas estreptavidina ativada ou mute
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23/378 ína de estreptavidina, compreendendo um grupo funcional que reage à maleimida tiol; incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com 2-iminotiolano por ou por cerca de 1 hora a um pH entre 7,5 e 8,5, inclusive, gerando desse modo uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol; e incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada ou muteína de estreptavidina com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada por ou durante cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, gerando assim uma composição compreendendo os reagentes de partículas oligoméricos; em que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ativada com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tiolada é iniciada dentro de 10 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com extremidades de 2-iminotiolano.
[0042] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o método compreende ainda o contato dos reagentes de partículas oligoméricos com um agente de estabilização. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de estabilização reduz uma quantidade de iminotiolano Nsubstituído presente nos resíduos de lisina dos reagentes de partículas oligoméricos. Em certa modalidade de qualquer dos métodos aqui fornecidos, o agente de estabilização reduz uma quantidade de iminotiolano N-substituído presente nos resíduos de lisina dos reagentes de partículas oligoméricos em pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de estabilização compreende hidroxilamina.
[0043] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, os reagentes de partículas oligoméricos têm um raio
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24/378 inferior a 150 nm. Certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos compreendem ainda a esterilização por filtro dos reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, os reagentes de partículas oligoméricos são separados das moléculas monoméricas ou estreptavidinas oligoméricas menores de estreptavidina ou muteína de estreptavidina por cromatografia de exclusão por tamanho. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o limite de exclusão por tamanho é maior ou superior a cerca de 100 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1000 kDa ou 2000 kDa. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o limite de exclusão por tamanho é de ou de cerca de 500 kDa a 1000 kDa. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o limite de exclusão por tamanho é ou é de cerca de 750 kDa.
[0044] Modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos compreendem a coleta de uma ou mais frações compreendendo o volume vazio, separando assim os reagentes de partículas oligoméricos das moléculas de monômero ou estreptavidina oligomérica menor ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, os métodos compreendem ainda armazenar os reagentes de partículas oligoméricos a uma temperatura a cerca de 4°C, a cerca de -20°C ou a -20°C ou a -80°C. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda a mistura dos reagentes de partículas oligoméricos com um ou mais agentes sob condições para ligar reversivelmente o um ou mais agentes aos reagentes de partículas oligoméricos.
[0045] Também são aqui fornecidos métodos de multimerização de um ou mais agentes para um reagente de partículas oligomérico, o método compreendendo a mistura de um reagente de partícula oligomérico produzido pelos métodos aqui fornecidos com um ou mais agentes sob condições para ligar reversivelmente um ou mais agentes
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25/378 a os reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreendem um parceiro de ligação, em que o parceiro de ligação é capaz de se ligar a um ou mais sítios de ligação no reagente de partículas oligomérico. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o parceiro de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
[0046] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o parceiro de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado do grupo que consiste em Trp-SerHis-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-PheGlu-Lys (GlyGlyGlySer) 3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser -Sua-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-SerHis-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-PheGlu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-GluLys (SEQ ID NO: 19).
[0047] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes se liga ou é capaz de se ligar a uma molécula expressa na superfície de uma célula-alvo. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreende um anticorpo, opcionalmente um Fab. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso na superfície de uma célula-alvo. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula na superfície de uma célula-alvo, induzindo ou modulando um sinal na célula-alvo.
[0048] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal
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26/378 associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, liga-se a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou liga-se especificamente ao CD3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o método compreende ainda a ligação reversível ao reagente de partícula oligomérico de um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de ligação específica a uma segunda molécula na superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
[0049] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocinas, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão.
[0050] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada a partir de CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154
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27/378 (CD40L), IGOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN -gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4.
[0051] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocina ou quimiocina e o fator é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina ou quimiocina. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNFalfa, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF, ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0052] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especlficamente a um receptor de quimiocina selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é seleci
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28/378 onado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0053] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso na superfície de uma célulaalvo. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula imune. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é um linfócito ou uma célula apresentadora de antígeno. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T, célula B, célula NK, macrófago ou célula dendrítica. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
[0054] Modalidades particulares são direcionadas a uma composição compreendendo reagentes de partículas oligoméricos produzidos pelo método de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas. Modalidades particulares são direcionadas a uma composição compreendendo uma pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos produzidos pelo método de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas. Certas modalidades são direcionadas a um artigo de fabricação, com
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29/378 preendendo o reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas ou a composição de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas.
[0055] Sâo aqui fornecidos métodos para modular células, o método compreendendo a incubação de uma composição celular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas ou na presença da composição de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas, desse modo modular as células-alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a modulação das célulasalvo compreende ativar, enriquecer e/ou expandir as células-alvo.
[0056] Métodos fornecidos para a cultura de células, o método compreendendo a incubação de uma composição celular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas ou na presença da composição de qualquer uma das modalidades aqui fornecidas. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o reagente de partícula oligomérico compreende está ligado reversívelmente a um ou mais agentes. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes se liga ou é capaz de se ligar a uma molécula expressa na superfície de uma célula-alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreendem um anticorpo, opcionalmente um Fab.
[0057] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso na superfície de uma célula-alvo. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula
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30/378 na superfície de uma célula-alvo, induzindo ou modulando um sinal na célula-alvo.
[0058] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, liga-se a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou liga-se especificamente ao CD3. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o método compreende ainda a ligação reversível ao reagente de partícula oligomérico de um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de ligação específica a uma segunda molécula na superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas céiulas-alvo.
[0059] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuiadora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocinas, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuiadora, molécula acessória, molécula de ponto de verificação imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocinas, produção de quimiocinas e/ou expressão de uma molécula de adesão.
[0060] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui
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31/378 fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada a partir de CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN -gamaR, TNF-aifaR, IL-4R, IL10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4.
[0061] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocina ou quimiocina e o fator é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina ou quimiocina. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNF-alfa, IL4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF, ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0062] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de
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32/378 ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especificamente a um receptor de quimiocina selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é selecionado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0063] Em certas modalidades de Nos métodos aqui fornecidos, o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VL.A-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
[0064] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso na superfície de uma célulaalvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula imune. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é um linfócito ou uma célula apresentadora de antígeno. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T, célula B, célula NK, macrófago ou célula dendrítica. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a célula-alvo é uma célula T. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO. Em certas modalidades, as células-alvo compreendem células sanguíneas, leucócitos, linfócitos, células B, uma população de células B, células T, uma população de células T, células NK, células dendríticas e/ou macrófagos. Em modalidades particulares de qual
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33/378 quer um dos métodos aqui fornecidos, as células-alvo expressam um receptor recombinante. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, as células-alvo expressam um receptor de célula T recombinante e/ou um receptor de antígeno quimérlco (CAR).
[0065] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, as células-alvo expressam um CAR que se liga a um antígeno associado a uma doença e/ou câncer. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o antígeno é ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um testículo cancerígeno antígeno, antígeno 1B de câncer/testículo (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante de Quimiocina de Motivo de C-C 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vlll), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor da efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc como 5 (FCRL5) ; também conhecido como receptor Fc homólogo 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor de folato alfa, receptor de acetilcolina fetal, gangliosídeo GD2, O-acetilado GD2 (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPCR5D), Her2/neu (tirosina cinase receptora erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb- B4), dímeros erbB, antígeno humano associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-AI), antígeno leuco
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34/378 citário humano A2 (HLA-A2), receptor de IL-22 alfa (IL-22Ra), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro A da família 8 Contendo Repetição Rica em Leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovirus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro D do grupo 2 exterminador natural (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NOAM), antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de célulatronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor órfão 1 tipo tirosina cinase receptora (RORI), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT1), um antígeno específico de patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[0066] Algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos compreendem ainda interromper a ligação reversível entre um ou mais agentes e o reagente de partículas oligomérico. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a referida interrupção compreende a introdução nas células-alvo de uma composição que compreende uma substância capaz de reverter a ligação entre o um ou mais agentes e o reagente de partículas oligomérico. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a substância é um parceiro de ligação livre e/ou é um agente de competição.
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[0067] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a referida interrupção termina ou diminui o sinal induzido ou modulado pelo um ou mais agentes nas células-alvo, opcionalmente células T. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a substância compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina, biotina ou um fragmento biologicamente ativo, opcionalmente uma D-biotina ou um análogo de biotina (ou fragmento biologicamente ativo)
[0068] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a substância é um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (GlyGlyGlySer)3- TrpSer-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser -Sua-Pro-GInPhe-Glu~Lys-(GlyGlyGlySer)2~Trp-Ser~His-Pro~Gln-Phe~Glu~Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2GlyGly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a interrupção é realizada dentro de 5 dias após o início da referida incubação.
Breve Descrição dos Desenhos
[0069] A FIG. 1 descreve os níveis de grupos funcionais tiol ligados aos tetrâmeros de muteína de estreptavidina durante uma incubação de tempo do exemplo de muteína de estreptavidina STREPTACTIN® M2 com 2-iminotiolano na presença de borato de 100 mM.
[0070] A FIG. 2 mostra um gráfico exibindo níveis de grupos funcionais tiol ligados a tetrâmeros de muteína de estreptavidina durante uma incubação do exemplo de muteína de estreptavidina STREPTACTIN® M2 com tampão de borato de 2-iminotiolanoína a 25 mM a um pH de 8,3 ou 8,5.
[0071] A FIG. 3 mostra o perfil de eluição de SEC da muteína de
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36/378 estreptavidina incubada com 2-iminotiolano. Os picos de eluição para os padrões de peso molecular são mostrados como uma linha sólida para pesos moleculares de 158.000 Da, 44.000Da, 17.000 Da ou 1350 Da. O perfil de eluição da muteína de estreptavidina exemplificativa não tiolada STREP-TACTIN® M2 é mostrado como uma linha pontilhada. Os perfis de eluição restantes representam perfis de eluição de várias muteínas de estreptavidina tiolada STREP-TACTIN® M2 que foram incubadas na presença de tampão de borato a 25 mM a pH de 8,3 ou pH 8,5 por 10 minutos, 50 minutos ou 390 minutos. São mostrados especificamente perfis de eluição após a incubação da muteína de estreptavidina STREP-TACTIN® M2 exemplar com 2-iminotiolano na presença de tampão de borato a 25 mM a um pH de 8,3 por 10 minutos, tampão de borato a 25 mM a um pH de 8,3 por 50 minutos, Tampão de borato a 25 mM a um pH de 8,3 por 390 minutos, ou tampão de borato a 25 mM a pH de 8,5 por 10 minutos, tampão de borato a 25 mM a pH de 8,5 por 50 minutos ou tampão de borato a 25 mM a pH de 8,5 por 390 minutos.
[0072] A FIG.4 representa a concentração de grupos funcionais tiol (conteúdo de SH) após a incubação da muteína de estreptavidina exemplar STREP-TACTIN® M2 com 2~iminotiolano por 1 hora ou 3 horas com tampão de borato a 25 mM a um pH de 8,3, 8,5, e 8.7.
[0073] A FIG. 5 representa a perda de grupos funcionais tiol (conteúdo de SH) da muteína de estreptavidina exemplificativa STREPTACTIN® M2 em diferentes momentos após a incubação com 2iminotiolano e filtraçâo em gel com colunas PD10.
[0074] A FIG. 6A e 6B mostram os resultados de um ensaio metabólico de WST de células T de três doadores diferentes incubados com anti-CD3/antl-CD28 multimerizado em diferentes bateladas de reagentes oligoméricos compostos da muteína de estreptavidina exemplificativa STREP-TACTIN® M2. FIG. 6A resume a atividade me
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37/378 tabólica do WST para todas as bateladas testadas (agrupados) em comparação com as bateladas de referência contendo anti-CD3/antiCD28 multimerizados em um cadeia principal oligomérico com um raio hidrodinâmico médio de 36 nm ou 101 nm. A atividade metabólica média do WST entre as células T dos diferentes doadores para bateladas individuais testadas e reagentes de referência é mostrada na FIG. 6B. [0075] A FIG. 7, que inclui as FIGS. 7A-7E, fornece representações esquemáticas de modalidades exemplares.
[0076] A FIG.7A mostra uma representação esquemática de um reagente (ou porção representativa do mesmo), como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, com uma pluralidade de sítios de ligação para ligação reversível a agentes. Neste caso, o reagente é mostrado como capaz de se ligar reversivelmente a dois agentes, cada um dos quais é capaz de se ligar especificamente a uma molécula em uma célula. O reagente tem uma pluralidade de sítios de ligação, incluindo uma pluralidade do sítio de ligação, Z1, cada um capaz de se ligar reversivelmente aos agentes. O primeiro e o segundo agentes, que, em alguns casos, podem ser os mesmos, na representação esquemática mostrada cada um contém pelo menos um parceiro de ligação C1. O parceiro de ligação C1 liga-se reversivelmente ao sítio de ligação Z1. O primeiro e o segundo agentes também contêm um sítio de ligação, B2, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula, que, em alguns casos, pode estar na mesma célula. Aqui, o primeiro e o segundo agentes são mostrados especificamente ligando-se a moléculas na mesma célula.
[0077] A FIG.7B mostra uma representação esquemática de um reagente, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, com uma pluralidade de sítios de ligação, capazes de ligação reversível a um primeiro e segundo agentes, cada um dos
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38/378 agentes capazes de se ligar especificamente a uma molécula em uma primeira e segunda células, respectivamente. O reagente tem uma pluralidade de sítios de ligação Z1, cada um capaz de se ligar de forma reversível a um agente. O primeiro e o segundo agentes, que, em alguns casos, podem ser os mesmos, cada um contém um parceiro de ligação 01, que se liga de forma reversível ao sítio de ligação Z1. O primeiro e o segundo agentes contêm cada um sítio de ligação B2, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula, que, em alguns casos, pode estar na mesma célula ou em uma célula diferente. Aqui, o primeiro agente está ligado a uma molécula na superfície de uma primeira célula e o segundo agente está ligado a uma molécula na superfície de uma segunda célula.
[0078] [78] A FIG.7C mostra um reagente, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, capaz de se ligar de forma reversível a um primeiro e segundo agentes, cujos agentes sâo cada um capazes de se ligar especificamente a uma molécula na primeira e na segunda célula, respectivamente. O reagente tem uma pluralidade de sítios de ligação Z1 e Z2, que podem ser iguais ou diferentes, cada um capaz de se ligar de forma reversível a um ou a ambos os agentes. O primeiro agente contém um parceiro de ligação 01, que se liga reversivelmente a Z1; o segundo agente contém um parceiro de ligação C2, que pode se ligar reversivelmente a Z2. Em alguns casos, 01 e 02 são diferentes. Em alguns casos, 01 e 02 são iguais ou substancialmente iguais. O primeiro agente contém um sítio de ligação B1, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula e o segundo agente contém pelo menos um sítio de ligação B3, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula. Os sítios de ligação B1 e B3, em alguns casos, se ligam a duas moléculas diferentes da superfície celular, ou epítopos diferentes em uma única molécula, ou as mesmas mo
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39/378 léculas ou diferentes na superfície de células diferentes. Aqui, o primeiro agente é mostrado como sendo ligado, via B1, a uma molécula na superfície de uma primeira célula, e o segundo agente é ligado a uma molécula na superfície de uma segunda célula.
[0079] A FIG. 7D mostra um reagente, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, capaz de se ligar de forma reversível a um primeiro e segundo agente, como agentes de seleção, que são capazes de se ligar especificamente a uma molécula em uma célula. O reagente tem uma pluralidade de sítios de ligação, incluindo Z1 e Z2, que podem ser iguais ou diferentes, cada um capaz de se ligar reversivelmente a um agente. O primeiro agente contém um parceiro de ligação C1 que pode se ligar especificamente ao sítio de ligação Z1 e o segundo agente contém pelo menos um parceiro de ligação C2 que pode se ligar especificamente ao sítio de ligação Z2. Em alguns casos, C1 e 02 são diferentes. Em alguns casos, C1 e 02 são iguais ou substancialmente iguais. O primeiro agente contém um sítio de ligação B1, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula e o segundo agente contém um sítio de ligação B3, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente podem ser um agente de seleção. Os sítios de ligação B1 e B3 podem ligar a mesma ou diferentes moléculas (por exemplo, receptor) na superfície de uma célula, o mesmo ou diferentes epítopos em uma molécula, ou a mesma ou diferentes moléculas na superfície de diferentes células. Aqui, o primeiro agente é ligado a uma primeira molécula na superfície de uma célula e o segundo agente é ligado a uma segunda molécula na superfície da mesma célula.
[0080] A FIG.7E mostra um reagente, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, ligado reversivelmente a um primeiro e segundo agentes, cujos agentes são capazes
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40/378 de se ligar especificamente a uma molécula em uma célula. O reagente tem uma pluralidade de sítios de ligação, incluindo Z1 e Z2, que podem ser iguais ou diferentes, cada um capaz de se ligar reversívelmente a um agente. O primeiro agente contém um parceiro de ligação C1 que pode ligar-se reversívelmente a Z1 do reagente e o segundo agente contém um parceiro de ligação C2 que pode ligar-se reversivelmente a Z2. Em alguns casos, C1 e C2 são diferentes. Em alguns casos, C1 e C2 são iguais ou substancialmente Iguais. O primeiro agente contém pelo menos um sítio de ligação B2, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula e o segundo agente contém pelo menos um sítio de ligação B4, que pode se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente podem ser agentes estimuladores. Os sítios de ligação B2 e B4 podem ligar a mesma ou diferentes moléculas na superfície de uma célula, o mesmo ou diferentes epítopos em uma molécula, ou a mesma ou diferentes moléculas na superfície de diferentes células. Aqui, o primeiro agente é ligado a uma primeira molécula na superfície de uma célula e o segundo agente é ligado a uma segunda molécula na superfície da mesma célula.
[0081] A FIG. 8, que inclui as FIGS. 8A-8E, fornecem representações esquemáticas de modalidades exemplares, como mostrado nas FIGS. 7A-7E, respectivamente, exceto que os reagentes representados um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina é mostrado como sendo imobilizado em um suporte, tal como uma fase estacionária.
[0082] A FIG. 9 fornece uma representação esquemática de modalidades exemplares nas quais reagentes olígoméricos, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, são usados para multimerizar agentes estimuladores e os complexos resul
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41/378 tantes incubados com células para liberar sinais às células, seguidos pela reversão da ligação. O painel A mostra um reagente oligomérico 1, que é mostrado como não ligado a nenhum suporte e como sendo flexível. Os agentes estimuladores 2, que são mostrados aqui como fragmentos Fab e são capazes de se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula, são combinados com o reagente. Os agentes compreendem um parceiro de ligação (por exemplo, parceiro de ligação C) que é capaz de se ligar de forma reversível a um sítio de ligação (por exemplo, sítio de ligação Z) no reagente, multimerizando os agentes. O painel B representa o parceiro de ligação que se liga reversivelmente a um sítio de ligação no reagente. As células 3 são adicionadas ao sistema. O Painel C representa os agentes multimerizados (fragmentos Fab) que se ligam especificamente às moléculas 4 na superfície de uma célula 3. No Painel C, os agentes representados são agentes de ligação ao receptor estimuladores (por exemplo, um primeiro agente de ligação ao receptor e/ou um segundo agente de ligação ao receptor), que pode induzir ou modular um sinal em uma célula após a ligação do agente, à molécula na célula. Como mostrado no painel D, uma substância 5, como um reagente competitivo (por exemplo, biotina), é adicionada à composição, que pode ser uma substância que exibe uma maior afinidade de ligação para o sítio de ligação no reagente do que para o parceiro de ligação no o agente, interrompendo assim a ligação reversível entre o reagente 1 e o agente 2. Em alguns casos, o agente, por exemplo, o fragmento Fab também pode se dissociar de sua interação com a molécula 4 na célula 3. Em alguns casos, isso pode interromper, diminuir e/ou terminar a sinalização na célula.
[0083] A FIG. 10 fornece uma representação esquemática de modalidades exemplares de um sistema reversível envolvendo reagentes oligoméricos, como um reagente oligomérico de estreptavidina ou mu
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42/378 teína de estreptavidina, anexado a um suporte, como um suporte sólido ou uma superfície, incluindo uma fase estacionária. O painel A mostra um suporte 6 contendo o reagente 1. Agentes 2, como fragmentos Fab, capazes de se ligar especificamente a uma molécula na superfície de uma célula são adicionados ao sistema. Os agentes 2, tais como fragmentos Fab, compreendem um parceiro de ligação (por exemplo, parceiro de ligação C) que é capaz de se ligar reversivelmente a um sítio de ligação (por exemplo, sítio de ligação Z) no reagente. O painel B representa o parceiro de ligação que se liga reversivelmente a um sítio de ligação no reagente. As células 3 são adicionadas ao sistema. O painel C representa os agentes 2, por exemplo, Fragmentos Fab, ligação às moléculas 4 na superfície de uma célula 3. Em algumas modalidades, os scFvs compreendem um agente de ligação ao receptor ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, os agentes, por exemplo, Os fragmentos Fab podem ser um agente de ligação ao receptor ou um agente de seleção. O painel C representa um agente ou agentes de ligação a receptores exemplares (por exemplo, um primeiro agente de ligação a receptores e/ou um segundo agente de ligação a receptores), que pode induzir ou modular um sinal em uma célula após a ligação do agente, por exemplo, fragmento Fab, para a molécula na célula. É adicionada uma substância 5, como um reagente competitivo (por exemplo, biotina), que pode ser uma substância que exibe uma afinidade de ligação mais alta para o sítio de ligação no reagente do que para o parceiro de ligação no agente, por exemplo, fragmento Fab, interrompendo assim a ligação entre o reagente e o agente. O painel D representa uma ruptura da ligação entre o agente 2, por exemplo, fragmento Fab e o reagente, resultando assim na dissociação do reagente do agente e, portanto, da célula. Em alguns casos, o agente, por exemplo, O fragmento Fab também pode se dissociar de sua interação com a molécula 4 na célula 3. Em alguns
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43/378 casos, isso pode interromper, diminuir e/ou terminar a sinalização na célula.
[0084] A FIG. 11 mostra gráficos de alterações no tamanho, medidos por dispersão dinâmica da luz de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina em vários momentos após a armazenagem a 80°C, 4°C ou 37°C.
[0085] As FIGS. 12A e B mostram gráficos das células totais (FIG. 12A) e a porcentagem de células viáveis (FIG. 12B) ao longo do tempo durante a incubação com diferentes bateladas individuais de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com anti-CD3/anti~CD28 Fab durante um exemplo processo de engenharia para gerar composições de células T contendo células T que expressam receptores de antígeno quimérico (CAR).
[0086] A FIG. 13 mostra um gráfico exibindo as porcentagens do total de células CAR+, CD4+CAR+ e CD8+CAR+, bem como a porcentagem de células T de CAR+CD4+ entre as células T CD4+ e a porcentagem de células T de CAR+ CD8+ entre as células T CD8+ de composições de células T incubadas com diferentes bateladas individuais de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugada com anti-CD3/anti~CD28 durante um processo de engenharia exemplar para gerar composições de células T de CAR.
[0087] A FIG. 14 mostra gráficos exibindo a porcentagem de células positivas para manchamento de Fab residual (painel superior) ou muteína de estreptavidina residual (painel inferior) entre composições de células que foram incubadas com diferentes bateladas individuais de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com Fab.
[0088] A FIG. 15 mostra um gráfico exibindo a atividade citolítica de composições de células T contendo células T de CAR que foram geradas por um processo de engenharia exemplar que envolveu a in
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44/378 cubação com diferentes bateladas individuais de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina oligoméricos conjugados com antiCD3/anti~CD28 Fab.
Descrição Detalhada
[0089] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outros termos ou terminologia técnica e científica usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém de experiência ordinária na técnica a que o assunto reivindicado pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica.
[0090] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e bases de dados, mencionadas neste pedido são incorporadas por referência na integra para todos os fins, na mesma extensão como se cada publicação individual fosse incorporada individualmente por referência. Se uma definição apresentada neste documento for contrária ou inconsistente com uma definição apresentada nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que são aqui incorporadas por referência, a definição aqui apresentada prevalece sobre a definição que é incorporada aqui por referência.
[0091] Os títulos das seções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.
I. VISÃO GERAL
[0092] São aqui fornecidos métodos para fabricar, produzir e/ou gerar reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são úteis para oligomerizar moléculas em reagentes de partículas oligoméricos que variam de 1 milhão de Da a
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100 milhões de Da, 1 milhão de Da a 1 bilhão de Da, 1 milhão de Da a 10 bilhões de Da e/ou 1 milhão de Da a 100 bilhões de Da. Modalidades particulares contemplam que a distribuição de tamanho dos reagentes de partículas oligoméricos produzidos pelos métodos fornecidos é afetada pela alteração das condições de reação distintas de uma ou mais das várias etapas. Assim, em algumas modalidades, condições como tempo, concentrações e proporções molares de reagentes e pH das soluções são controladas e mantidas constantes com precisão. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são úteis para derivar reagentes de partículas oligoméricos com tamanhos consistentes entre bateladas ou lotes. Em algumas modalidades, as condições de uma ou mais etapas ou estágios dos métodos aqui fornecidos podem ser ajustadas para fabricar, produzir ou gerar reagentes de partículas oligoméricos de um ou mais tamanhos desejados diferentes. [0093] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para fabricar, produzir e/ou gerar reagentes de partículas oligoméricos reticulam moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, reagindo uma pluralidade de moléculas que possuem grupos funcionais tiol (também referidos em como moléculas tioiadas, por exemplo, moléculas de muteína de estreptavidina ou estreptavidina tioladas) com uma pluralidade de moléculas que anexam um grupo funcional reativo ao tiol (por exemplo, moléculas ativadas, por exemplo, moléculas de estreptavidina ou muteína de estreptavidina), como um grupo funcional de maleimida.
[0094] Modalidades particulares consideram que os reagentes de multimerização e/ου reagentes de partículas oligoméricos de um ou mais tamanhos particulares podem ser particularmente eficazes para uso em células moduladoras. Por exemplo, em algumas modalidades, reagentes de partículas oligoméricos de um determinado tamanho, quando ligados reversivelmente a um ou mais agentes estimuladores,
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46/378 são particularmente eficazes para expandir, ativar e/ou enriquecer uma população de células. Quando aqui encontrado, reagentes de partículas oligoméricos de um tamanho maior particular, por exemplo, ter um raio médio, por exemplo, raio hidrodinâmico, superior a 32 nm, e geralmente um raio médio superior a 60 nm, como um raio médio maior ou superior a cerca de 90 nm, 95 nm ou 100 nm, que são reversivelmente ligados a estímulos agentes ativam as células em maior grau que as partículas oligoméricas de tamanho menor, por exemplo, FIG. 6. Assim, em algumas modalidades, são fornecidos aqui reagentes de partículas oligoméricos de tamanhos e distribuições de tamanhos definidos e métodos para fabricar consistentemente reagentes de partículas oligoméricos com tamanhos e distribuições de tamanhos desejados.
[0095] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para a fabricação de reagentes de partículas oligoméricos resultam em variabilidade reduzida e geração geralmente consistente de reagentes oligoméricos de tamanho maior, enquanto minimizar a distribuição de tamanho de oligômeros em uma composição. Em algumas modalidades, os grupos tlol reativos para a reação de oligomerização são adicionados às moléculas por uma ativação iminotiolana de aminas presentes nos resíduos de Usina e no terminal N das moléculas. Em algumas modalidades, o tempo da reação de tlolação e o tempo entre o final da reação de tiolação e o início da reação de oligomerização são mantidos constantes de reação a reação, em alguns casos, porque os tióis livres podem ser perdidos devido à isomerlzação, Isto é, formação de iminotiolano N-substituído. Em alguns aspectos, o tempo deve minimizar a perda de tióis e a geração da forma de iminotiolano N-substituído, que, em alguns casos, é uma fonte oculta de funções SH mediante reisomerização que pode levar ao crescimento pós-sintético de oligômeros. Em algumas modalidades, controlar a disponibilidade de
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47/378 grupos tiol para reação com moléculas contendo maleimida e minimizar o acúmulo de imlnotiolano N-substituído, é um parâmetro que pode influenciar na consistência do tamanho do oligômero.
[0096] Além disso, em algumas modalidades, a cinética da ativação do tiol e também de outras reações químicas podem, em alguns casos, ser dependentes do pH. Em algumas modalidades, o pH de um ou mais tampões para reações químicas (tampões de ativação e acoplamento) e, em particular, o pH do tampão para o agente de tiolação, está dentro de uma faixa ou nível predeterminado e geralmente é medido e ajustado com precisão. Além disso, em algumas modalidades, a estequiometria entre os agentes de tiolação e de ativação e as moléculas é ajustada com alta precisão, ajustando concentrações dentro de pequenas tolerâncias (± 2 %) para obter tamanhos médios reproduzíveis dos multímeros.
[0097] Também são fornecidos neste documento os reagentes oligoméricos descritos aqui. Em algumas modalidades, um ou mais agentes podem ser ligados reversível ou irreversivelmente aos reagentes oligoméricos, os quais, em alguns casos, são um agente de multimerização no qual o um ou mais agentes é multimerizado nos reagentes de partículas oligoméricos. Os reagentes oligoméricos que se ligam a um ou mais agentes, como os agentes de multimerização, podem ser utilizados em métodos que envolvem cultura ou incubação com células-alvo, incluindo células primárias, como células T.
[0098] Em alguns aspectos, são aqui proporcionados reagentes de partículas oligoméricos que são ligados ou reversivelmente ligados (por exemplo, multimerizados) a um ou mais agentes, como reagentes de ligação a receptores e/ou reagentes estimuladores. Em modalidades particulares, as partículas oligoméricas fornecidas são compostas de moléculas oligoméricas, por exemplo, muteína de estreptavidina reticulada e estão ligadas a agentes estimuladores e/ou de ligação ao
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48/378 receptor, que se ligam e/ou são capazes de se ligar à superfície de uma célula. Em alguns aspectos, os agentes são ou incluem anticorpo anti-CD3 e/ou anti~CD28 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno com um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, como Strep-tag II. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligomerizadas têm um raio entre 50 nm e 150 nm, 75 nm e 125 nm, 80 nm e 115 nm, ou um raio de ou de cerca de 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 % ou ± 0,1 %. Em alguns aspectos, é fornecida uma composição que contém uma pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos, como aqueles ligados ou re~ versivelmente ligados (por exemplo, multimerizados) a um ou mais agentes, nos quais o raio médio dos reagentes de partículas oligoméricos entre a pluralidade está entre 50 nm e 150 nm, 75 nm e 125 nm, 80 nm e 115 nm, ou um raio igual ou superior a 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 % ou ± 0,1 %. Em alguns aspectos, os reagentes de partículas oligomerizadas são particularmente úteis para selecionar e/ou estimular células, como via ligação do agente de seleção ou agente estimulador, respectivamente, a uma molécula de superfície celular nas células-alvo. Em alguns casos, a presença ou adição de um reagente de competição resulta em uma dissociação entre o reagente de partícula oligomérico e os agentes, por exemplo, reagentes de ligação ao receptor, que em alguns casos, podem rapidamente terminar, finalizar ou interromper a estimulação das células pelos reagentes de partículas oligoméricos.
[0099] É fornecido aqui um método para expandir a composição de células-alvo, como células T, usando os reagentes oligoméricos fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos referem-se a sistemas de reagentes reversíveis capazes de se ligar a moléculas na su
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49/378 perfície de uma célula-alvo, como uma molécula de ligação ao receptor, fornecendo assim um sinal para as células, o que, em alguns casos, pode ser uma ativação primária sinal. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos empregados nos métodos são reagentes de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos tendo ligado a um ou mais agentes, por exemplo, um primeiro agente, segundo agente, etc. que fornece um sinal para as células, como um sinal de ativação primário um sinal acessório ou coestimulador. Em algumas modalidades, o sinal de ativação primário pode, como tal, ser suficiente para ativar as células para expandir/proliferar. Este primeiro agente pode ser ligado reversivelmente ou também irreversivelmente ao reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos. O reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos podem ter ligado a eles também um segundo agente que estimula uma molécula acessória na superfície das células. O segundo agente, quando se liga à molécula acessória na superfície da superfície das células, pode assim estimular as células ativadas a se expandir. Também este segundo agente pode ser ligado reversivelmente ou também irreversivelmente ao reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. O reagente de multimerização e/ou o reagente de partículas oligomerizadas podem ser imobilizados em um suporte sólido ou solúveis. Em um aspecto, o método aqui descrito é uma expansão serial de uma população de células na qual uma população completa de linfócitos é estimulada/expandida, os reagentes necessários para a expansão são então removidos por cromatografia em uma fase estacionária adequada. Em algumas modalidades, as células expandidas/estimuladas, que são as células cultivadas, são opcionalmente transfectadas com por exemplo, um receptor de célula T ou um receptor de antígeno quiméríco (CAR) e, em alguns aspectos, pode ser submetido a uma segunda expansão de estimula
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50/378 ção com uma molécula estimuladora diferente que se liga ao receptor de célula T introduzido ou ao receptor de antígeno quimérico.
[00100] É aqui fornecido um método para expandir a composição de células-alvo, como células T. Em algumas modalidades, os métodos referem-se a sistemas de reagentes reversíveis capazes de se ligar a moléculas na superfície de uma célula-alvo, como uma molécula de ligação ao receptor, fornecendo um sinal para as células que, em alguns casos, podem ser um sinal de ativação primário. Em algumas modalidades, os métodos empregam reagentes, tais como reagentes de partículas oligoméricos, que podem ser reagentes de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos tendo ligado a um ou mais agentes, por exemplo, um primeiro agente, segundo agente, etc. que fornece um sinal para as células, como um sinal de ativação primário e/ou um sinal acessório ou coestimulador. Em algumas modalidades, o sinal de ativação primário pode, como tal, ser suficiente para ativar as células para expandir/proliferar. Este primeiro agente pode ser ligado reversivelmente ou também irreversivelmente ao reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. O reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico pode ter ligado a ele também um segundo agente que estimula uma molécula acessória na superfície das células. O segundo agente, quando se liga à molécula acessória na superfície das células, pode assim estimular as células ativadas a se expandir. Também este segundo agente pode ser ligado reversivelmente ou também irreversivelmente ao reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. O agente de multimerização pode ser imobilizado em um suporte sólido ou solúvel. Em um aspecto, o método aqui descrito é uma expansão serial de uma população de células na qual uma população completa de linfócitos é estimulada/expandida, os reagentes necessários para a expansão são então removidos por cromatografia em uma fase estacionária
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51/378 adequada. Em algumas modalidades, as células expandidas/estimuladas, que são as células cultivadas, são opcionalmente transfectadas com por exemplo, um receptor de célula T ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) e, em alguns aspectos, pode ser submetido a uma segunda expansão de estimulação com uma molécula estimuladora diferente que se liga ao receptor de célula T introduzido ou ao receptor de antígeno quimérico.
[00101] Métodos de expansão de populações de células T in vitro na ausência de fatores de crescimento exógenos ou baixas quantidades de fatores de crescimento exógenos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente US 6.352.694 B1 e Patente Européia EP 0 700 430 B1). Em geral, esses métodos empregam superfícies de fase sólida com mais de 1 pm de diâmetro, às quais são imobilizados vários agentes de ligação (por exemplo, anticorpo anti~CD3 e/ou anticorpo anti-CD28). Por exemplo, Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen) são reagentes disponíveis comercialmente para expansão de células T, uniformes, com 4,5 pm de diâmetro, contas de poliestireno superparamagnéticas, estéreis e não pirogênicas, revestidas com uma mistura de anticorpos monoclonais purificados por afinidade contra o CD3 e moléculas de superfície celular CD28 em células T humanas. No entanto, em alguns casos, tais contas magnéticas são, por exemplo, difíceis de integrar em um método para expandir células sob condições exigidas para ensaios clínicos ou fins terapêuticos, uma vez que é necessário garantir que essas contas magnéticas sejam completamente removidas antes de administrar a expansão. Células T para um paciente.
[00102] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos abordam essas preocupações. Em alguns aspectos, os reagentes fornecidos são reversíveis, de modo que os agentes estimulantes possam ser removidos da composição celular. Além disso, em alguns asPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 88/524
52/378 pectos, o reagente por exemplo, o reagente de multimerização ou um reagente de partículas oligomérico, ao qual os agentes estimulantes estão ligados não é imobilizado em um suporte, tal como não imobilizado em um suporte ou superfície sólida. Assim, em alguns aspectos, o reagente, por exemplo, reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico, é flexível e não rígido. Em algumas modalidades, o reagente pode se adaptar ou se adaptar à superfície da célula. Em algumas modalidades, é possível imobilizar o reagente em um suporte, como um suporte sólido, Incluindo uma fase estacionária. Em algumas modalidades, esses métodos podem ser usados em conjunto com métodos de seleção usando agentes de seleção semelhantes nos quais uma ou mais células-alvo podem ser selecionadas e, simultaneamente ou sequencialmente, expostas aos agentes estimuladores. Portanto, em alguns aspectos, a estimulação de células ou subconjuntos de células particulares pode ser influenciada por seleção e isolamento juntamente com a estimulação.
[00103] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem cultura, por exemplo, contactar, uma composição de células com um reagente, por exemplo, reagente de multimerização ou reagente de partículas oligomérico, ao qual está ligado um ou mais agentes de ligação ao receptor (por exemplo, agentes estimuladores) (veja, por exemplo, FIGS.10A e 10B). Em algumas modalidades, após o contato da composição celular com o reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico com um ou mais agentes de ligação ao receptor ligados e geralmente incubando a população celular com o reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico com um ou mais receptores ligados agentes de ligação, a população de células forma complexos/é ligada ao agente de multimerização via o primeiro agente. As outras populações celulares contidas na amostra inicial que não possuem a molécula específica da superfície celular
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53/378 não se ligam ao reagente de multimerização e/ou ao reagente de partícula oligomérico com um ou mais agentes de ligação ao receptor. A este respeito, note-se que a população celular geralmente possui várias cópias da molécula da superfície celular em sua superfície e a ligação dessas cópias múltiplas é normalmente necessária para estimulação ou ativação.
[00104] Assim, o agente de multimerização fornece tipicamente mais de um sítio de ligação, por exemplo, Z1, em que, em alguns casos, uma pluralidade de agentes pode ser ligada reversivelmente, tal como via ligação de um parceiro de ligação, por exemplo, C1, do um ou mais agentes para o um ou mais sítios de ligação, por exemplo, Z1. Em alguns desses aspectos, isso apresenta o primeiro agente, o segundo agente e/ou outros agentes em uma densidade suficiente para a população de células. A este respeito, note-se que um agente de multimerização pode, como tal, ter múltiplos sítios de ligação, por exemplo, Z1, por exemplo, uma muteína de estreptavidina (sendo um homotetrâmero) em seu estado nativo, possui quatro sítios de ligação, por exemplo, Z1 e pode ainda ser oligomerizado. Em alguns casos, um reagente pode ter apenas um sítio de ligação, por exemplo, Z1, para a ligação reversívei de um parceiro de ligação, por exemplo, C1. Um exemplo é a calmodulina multimérica. A calmodulina, como tal, possui apenas um sítio de ligação para peptídeos de ligação à calmodulina. No entanto, a caimodulina pode ser biotinilada e, em seguida, reagir com oligômeros de estreptavidina (veja também abaixo), fornecendo um reagente de muitimerização no qual várias moléculas de calmodulina são apresentadas em alta densidade em um suporte, fornecendo assim calmodulina multimérica.
[00105] Em algumas modalidades, após a incubação ou outro momento adequado no qual se deseja interromper a estimulação, a ligação entre o parceiro de ligação, também aqui referida como parceiro
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54/378 de ligação C, por exemplo, C1 de um agente ligado reversivelmente e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, do reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico é interrompido interrompendo a respectiva ligação reversível. Em alguns casos, a interrupção pode ser alcançada adicionando um concorrente à mistura de incubação/reação contendo a população de células que estão ligadas ao reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos. Para interrupção competitiva (que pode ser entendida como uma eluição competitiva) da ligação reversível entre o parceiro de ligação C, por exemplo, C1, de um agente ligado reversivelmente e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z1 do reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos, a mistura de incubação/população de células pode ser contatada com um primeiro parceiro de ligação livre C, por exemplo, C1, ou um análogo do referido primeiro parceiro de ligação C, que é capaz de romper a ligação entre o primeiro parceiro de ligação e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z1 No exemplo do parceiro de ligação C, por exemplo, C1, sendo um peptídeo de ligação à estreptavidina que se liga ao sítio de estreptavidina de ligação à biotina, o primeiro parceiro livre pode ser o peptídeo de ligação à estreptavidina livre correspondente ou um análogo que se liga competitivamente. Um tal análogo pode, por exemplo, ser biotina ou um derivado ou análogo de biotina, como a destiobiotina.
[00106] Em algumas modalidades, a adição do parceiro livre ou seu análogo resulta no deslocamento do parceiro de ligação C, por exemplo, C1, do reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico e, portanto, uma vez que o parceiro de ligação está compreendido no agente ligado reversivelmente, é alcançado o deslocamento desse agente do reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. Esse deslocamento do agente, por sua vez, resulta em uma dissociação do primeiro agente da molécula da superfície ce
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55/378 lular, em particular se a afinidade de ligação da ligação entre o primeiro agente e o receptor da superfície celular tiver uma constante de dissociação (Kd) na faixa de 10’2 M a 10’13 M e, portanto, também é reversível. Devido a essa dissociação, em alguns aspectos, a estimulação da população celular também é encerrada.
[00107] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação das moléculas de anticorpo ao seu antígeno, incluindo, por exemplo, uma molécula receptora da superfície celular está geralmente na faixa de afinidade do Kd de 10~7 M a 10~13 M. Assim, os anticorpos monoclonais convencionais podem ser usados como um agente (primeiro ou segundo, ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador ou agente de seleção). Em algumas modalidades, a fim de evitar efeitos de avidez indesejados que levam a uma ligação mais forte, os anticorpos monoclonais também podem ser utilizados na forma de seus fragmentos de anticorpos monovalentes, como fragmentos Fab ou fragmentos Fv de cadeia única.
[00108] Em algumas modalidades, devido à dissociação do agente ou agentes ligados reversivelmente da molécula da superfície celular, o método fornecido tem a vantagem adicional de que a população celular estimulada está livre de agentes estimuladores no final do período de estimulação. Além disso, em algumas modalidades, todos os outros reagentes utilizados no método, nomeadamente os agentes (por exemplo, primeiro ou segundo, agentes de ligação ao receptor, por exemplo, agentes estimuladores ou agentes de seleção), bem como o reagente de competição do parceiro de ligação C, por exemplo, C1, ou seu análogo, pode ser facilmente removido da população celular estimulada por meio de um cartucho de remoção (veja, por exemplo, descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474). Em alguns casos, por exemplo, nos quais o reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico está imobilizado em um suporte
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56/378 sólido, como uma superfície de biorreator ou uma conta magnética, ele está sendo retido. Assim, o uso de um cartucho de remoção para remoção do agente livre e do reagente de competição pode incluir o carregamento da amostra de eluição (por exemplo, amostra obtida após a ruptura do laço ou ligação reversível) em uma segunda coluna de cromatografia.
[00109] Em algumas modalidades, esta coluna de cromatografia tem uma fase estacionária adequada que é uma matriz de cromatografia de afinidade e, ao mesmo tempo, pode atuar como matriz de permeação em gel. Em alguns aspectos, esta matriz de cromatografia de afinidade possui um reagente de afinidade imobilizado nela. Em algumas modalidades, o reagente de afinidade pode, por exemplo, ser estreptavidina, muteína de estreptavidina, avidina, muteína de avidina ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, primeiro ou segundo, agentes de ligação ao receptor, por exemplo, agentes estimuladores ou agentes de seleção), o reagente de competição do parceiro de ligação C, C1, liga-se ao reagente de afinidade, sendo assim imobilizado na matriz de cromatografia. Como resultado, a amostra de eluição contendo a população celular isolada e expandida está sendo esgotada do agente (por exemplo, primeiro ou segundo, agentes de ligação ao receptor, por exemplo, agentes estimuladores ou agentes de seleção) e o reagente de competição. Em algumas modalidades, a composição cultivada está livre de quaisquer reagentes, o que, em alguns aspectos, é vantajoso para uso em conexão com aplicações de diagnóstico (por exemplo, posterior classificação FACS™) ou para qualquer aplicação terapêutica baseada em células.
[00110] Em algumas modalidades, a capacidade de remover o reagente e outros componentes da composição tem a vantagem adicional de poder evitar qualquer suporte sólido, como contas magnéticas. Em
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57/378 algumas modalidades, isso significa que não há risco ou risco mínimo de contaminação das células T ativadas por tais contas magnéticas. Em algumas modalidades, isso também significa que um processo que é compatível com os padrões GMP pode ser mais facilmente apresentado em comparação com outros métodos, como o uso do Dynabeads®, no qual medidas adicionais devem ser tomadas para garantir que a população final expandida de células T está livre de contas magnéticas. Além disso, em algumas modalidades, o uso de um agente de multimerização solúvel facilita muito a remoção do mesmo da população de células ativadas (células T, células B ou também células exterminadoras naturais), uma vez que as células podem ser simplificadas por centrifugação e sobrenadante, incluindo o agente de multimerizaçâo solúvel pode ser descartado. Alternativamente, o agente de multimerização solúvel pode ser removido da população celular expandida em uma matriz de permeações em gel do cartucho de remoção, como descrito acima (por exemplo, pedido de patente internacional WO 2013/124474). Em algumas modalidades, uma vez que nenhuma fase sólida (por exemplo, contas magnéticas) está presente, a presente invenção também fornece um sistema fechado automatizado para expansão das células que pode ser integrado aos sistemas de expansão celular conhecidos tais como Xuri Cell Expansion System W25 e WAVE Bioreactor 2/10 System, disponíveis na GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdon) ou no QUANTUM® Cell Expansion System, disponível na TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA).
[00111] Em alguns aspectos, os métodos aqui fornecidos podem incluir uma população de células que carregam pelo menos duas moléculas específicas da superfície celular. Em algumas modalidades, uma primeira molécula de superfície celular está envolvida em um sinal de ativação primário para a população celular, enquanto a segunda
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58/378 molécula de superfície celular é uma molécula acessória na superfície celular que está envolvida em fornecer um estímulo para as células. Em modalidades particulares, a população de células é contatada com um reagente de multimerizaçâo e/ou reagentes de partículas oligoméricos, que é ligado de forma reversível ou não reversível a um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células e a um segundo agente que induz ou modula um sinal adicional, como estimula uma molécula acessória na superfície das células. Em algumas modalidades, a população de células é contatada com um reagente de multimerizaçâo e/ou reagente de partícula oligomérico no qual está ligado reversivelmente um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células e um segundo agente que induz ou modula um sinal adicional, como estimula uma molécula acessória na superfície das células. A população de células pode, por exemplo, ser uma população de células T na qual a molécula de superfície celular é um complexo TCR/CD3 e a molécula de superfície celular é a molécula acessória CD28. Em alguns aspectos, a estimulação por meio de outras moléculas acessórias pode resultar em um aumento de células T de população menos diferenciada e, em alguns casos, de longa duração, como células T de memória de longa duração, em comparação à estimulação convencional por CD28. Em algumas modalidades, a ligação do complexo TCR/CD3 como sinal de ativação primário e a ligação da molécula acessória (por exemplo, CD28 ou outra molécula acessória) pode ser necessária para a expansão/proliferação de células T.
[00112] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos também podem ser ainda combinados para incluir pelo menos um agente de seleção ligado reversivelmente ao mesmo reagente, por exemplo, mesmo reagente de multimerizaçâo e/ou reagentes de partículas oligoméricos, como um ou ambos do primeiro ou segundo agen
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59/378 te de ligação ao receptor (por exemplo, agente estimulador). Em alguns casos, é possível aprimorar ou aumentar um ou mais recursos resultantes da incubação ou cultura, como estimulação da expansão (proliferação), ativação, coestimulação e/ou sobrevivência, em um subconjunto de células T que pode ser reversível selecionado na presença de pelo menos um ou mais agentes de seleção em uma incubação ou cultura que ocorre também na presença de um ou mais agentes estimuladores. Por exemplo, como mostrado nos exemplos deste documento, o grau de expansão em uma composição de células T foi aumentado seletivamente nas células CD8+ quando essas células foram incubadas com um agente multimerizado ao qual foi ligado reversivelmente um anticorpo anti-CD8, além do anticorpo anti-CD3 e agentes estimuladores de anticorpos anti-CD28. Em algumas modalidades, um ou mais recursos resultantes da incubação ou cultura, como estimulação da expansão (proliferação), ativação, coestimulação e/ou sobrevivência, podem ser aumentados pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 10 vezes ou mais em um subconjunto de célula T na composição cultivada que é positiva para um marcador de seleção quando incubada na presença de um ou mais agentes estimuladores e o agente de seleção que se liga especificamente ao marcador de seleção em comparação com a incubação apenas na presença de um dos mais agentes estimuladores, mas não o agente de seleção. Essa polarização ou seletividade da célula, como a célula T, permite controlar os recursos dos pontos finais de subconjuntos ou populações específicos de células T. Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser qualquer marcador de seleção como descrito aqui. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é selecionado dentre CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127,
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CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
[00113] Em algumas modalidades, o reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico compreende pelo menos um sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, para a ligação reversível do primeiro agente e o primeiro agente também compreende pelo menos um parceiro de ligação C, por exemplo, C1, em que o parceiro de ligação C, por exemplo, C1, é capaz de se ligar de maneira reversível ou não reversível ao sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, do reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. Assim, o primeiro agente, quando contactado ou incubado com o agente de multimerização, pode ser ligado reversivelmente ao reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico através da ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C, por exemplo, C1 e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z1 Além disso, o segundo agente pode compreende um parceiro de ligação C, por exemplo, 02, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ser ligado reversivelmente a um sítio de ligação Z, por exemplo, Z2, respectivamente, do reagente de multimerização e/ou reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, o segundo agente, quando é contatado ou incubado com o agente de multimerização, é reversivelmente ligado ao reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas oligoméricos através da ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C, por exemplo, C1 e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z2. Em alguns casos, C1 e 02 podem ser iguais ou substancialmente iguais e/ou compreender a mesma ou substancialmente a mesma porção. Em alguns casos, Z1 e Z2 podem ser iguais ou substancialmente iguais e/ou compreender a mesma ou substancialmente a mesma porção.
[00114] Em algumas modalidades, usando como parceiros de ligação C1 e C2, as porções que se ligam ao mesmo sítio de ligação do agente de multimerização têm a vantagem de que o mesmo reagente
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61/378 de competição (do primeiro parceiro de ligação 01 e também do segundo parceiro de ligação C2) ou seu análogo pode ser usado para interromper e, em alguns casos, encerrar a expansão da população de células-alvo (por exemplo, células T) e para liberar essa população de células-alvo (por exemplo, células T) do agente de multimerização.
[00115] Em alguns casos, para a produção dos agentes de ligação (por exemplo, primeiro ou segundo, agentes de ligação ao receptor, por exemplo, agentes estimuladores ou agentes de seleção) para compreender um parceiro de ligação C, o parceiro de ligação 0, por exemplo, 01 ou 02, pode ser fornecido pelo respectivo vetor de expressão usado para a produção recombinante do agente (por exemplo, fragmento de anticorpo), de modo que o parceiro de ligação C, por exemplo, C1 ou C2, faz parte de um peptídeo de fusão com o agente no terminal N ou no terminal C. Em algumas modalidades, no contexto de um agente que é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, o parceiro de ligação C, por exemplo, 01 ou 02, podem estar presentes no terminal 0 da cadeia leve ou pesada. Também esta metodologia de clonagem de uma proteína recombinante, como os domínios variáveis de uma molécula de anticorpo, e a produção recombinante de uma proteína respectiva, por exemplo, fragmento de anticorpo, é bem conhecido do perito na técnica, veja, por exemplo, Skerra, A. (1994). Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo pode ser gerada de moléculas de ligação artificiais com propriedades semelhantes a anticorpos contra um determinado alvo, como CD3 ou CD28 ou outras moléculas de acessório ou agente estimulador, conforme descrito, como por métodos evolutivos bem conhecidos, como exibição de fagos (revisado, por exemplo, em Kay, BK et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1a Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, HB (1997) Annu. Rev. Blophys. Biomol Struct. 26, 401-424, ou Rodi, DJ e Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Bio
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62/378 technok 10, 87-93), exibição de ribossomos (revisado em Amstutz, P. eta/. (2001) Curr. Opin. Biotechno!A2, 400-405) ou exibição de mRNA como relatado em Wilson, DS et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Set. USA 98, 3750-3755.
Il· SISTEMAS DE REAGENTES REVERSÍVEIS E USOS RELACIONADOS
[00116] Em algumas modalidades, os métodos empregam sistemas reversíveis nos quais pelo menos um agente (por exemplo, um agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) capaz de se ligar a uma molécula na superfície de uma célula (molécula de superfície celular) está associado, por exemplo, reversivelmente associado a um reagente. Em alguns casos, o reagente contém uma pluralidade de sítios de ligação capazes de ligação, por exemplo, ligação reversível ao agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção). Em alguns casos, o reagente é um reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico que se liga a pelo menos um agente. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) contém pelo menos um sítio de ligação B que pode se ligar especificamente a um epítopo ou região da molécula e também contém um parceiro de ligação, também aqui referido como um parceiro de ligação C, que se liga especificamente a pelo menos um sítio de ligação Z do reagente. Em alguns casos, a interação de ligação entre o parceiro de ligação C e o pelo menos um sítio de ligação Z é uma interação nâo covalente. Em alguns casos, a interação de ligação entre o parceiro de ligação C e o pelo menos um sítio de ligação Z é uma interação covalente. Em algumas modalidades, a interação de ligação, como interação não covalente, entre o parceiro de ligação Ceo pelo menos um sítio de ligação Z é reversível.
[00117] Em algumas modalidades, a associação reversível pode ser
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63/378 mediada na presença de uma substância, como um reagente de competição (também chamado de reagente eluente), que é ou contém um sítio de ligação que também é capaz de se ligar ao pelo menos um sítio de ligação Z. Geralmente, a substância (por exemplo, reagente de competição) pode atuar como concorrente. Por exemplo, em algumas modalidades, o parceiro de ligação C se dissocia do pelo menos um sítio de ligação Z como consequência de sua taxa baixa. Em certos aspectos, após o parceiro de ligação de dissociação C (i) pode-se ligar novamente a pelo menos um o sítio de ligação Z, ou, em alguns aspectos, (ii) será impedido de se ligar novamente ao pelo menos um sítio de ligação Z se a substância, por exemplo, o reagente de competição, se ligar primeiro a um ou mais sítios de ligação Z. Em alguns aspectos, a substância pode ter uma afinidade de ligação mais alta e/ou estar presente em uma concentração alta e/ou suficiente para o sítio de ligação Z presente no reagente e/ou devido a estar presente em concentrações mais altas do que o parceiro de ligação C, reduzindo o quantidade de parceiro de ligação C ligado e/ou associado a partir de um ou mais parceiros de ligação C. Em algumas modalidades, a afinidade da substância (por exemplo, reagente de competição) para pelo menos um sítio de ligação Z é superior a a afinidade do parceiro de ligação C do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) para pelo menos um sítio de ligação Z. Em certas modalidades, as ligações entre o sítio de ligação Z do reagente e o parceiro de ligação C do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ser reduzido ou diminuído pela adição da substância (por exemplo, reagente de competição), assim, em alguns aspectos, tornando a associação do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e reagente efetivamente reversível.
[00118] Os reagentes que podem ser utilizados em tais sistemas
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64/378 reversíveis são descritos e conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.168.049; 5.506.121; 6.103.493; 7.776.562; 7.981.632; 8.298.782; 8.735.540; 9.023.604; e Ped. PCT International publicado WO2013/124474 e WO2014/076277. Exemplos não limitantes de reagentes e parceiros de ligação capazes de formar uma interação reversível, bem como substâncias (por exemplo, reagentes de competição) capazes de reverter essa ligação, são descritos abaixo.
A. Reagente
[00119] Em algumas modalidades, o reagente contém um ou vários sítios de ligação Z que são capazes de se ligar de forma reversível a um parceiro de ligação C compreendido pelo agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção). Em algumas modalidades, o reagente contém uma pluralidade de sítios de ligação Z, cada um deles capaz de se ligar especificamente ao parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção), de modo que o reagente seja capaz de ligação reversível a uma pluralidade de agentes (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção), por exemplo, é um reagente de multimerização e/ou reagente de partícula oligomérico com um ou mais reagentes ligados. Em algumas modalidades, o reagente é um oligômero ou polímero de moléculas individuais (por exemplo, monômeros) ou complexos que compõem uma molécula individual (por exemplo, tetrâmero), cada um contendo pelo menos um sítio de ligação Z. Em algumas modalidades, o reagente contém pelo menos dois sítios de ligação Z, pelo menos três sítios de ligação Z, pelo menos quatro sítios de ligação Z, como pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72 ou mais sítios de ligação Z. Os sítios de ligação podem ser todos iguais ou a pluralidade de sítios de ligação pode contêm um ou mais sítios de ligação diferentes (por exemplo, Z1, Z2, Z3, etc.).
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Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de partícula oligomérico e contém pelo menos 72, 120, 140, 200, 240, 280, 320, 360, 400, 440, 480, 520, 560, 600, 640, 680, 720, 760, 800, 900, 1.000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000 ou pelo menos 100.000 sítios de ligação Z.
[00120] Em algumas modalidades, um ou mais agentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) associamse a, como estão reversivelmente ligados ao reagente, como por meio de um ou vários sítios de ligação Z presentes no reagente. Em alguns casos, isso faz com que os agentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) sejam organizados estreitamente entre si, de modo que um efeito de avidez possa ocorrer se uma célula-alvo possuir (pelo menos duas cópias) uma molécula de superfície celular é colocado em contato com o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) que possui um ou mais sítios de ligação B capazes de se ligar à molécula específica.
[00121] Em algumas modalidades, dois ou mais agentes diferentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) que são os mesmos, isto é, contendo o mesmo sítio de ligação B, podem ser ligados reversivelmente ao reagente. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes diferentes contendo o mesmo sítio de ligação B são reversivelmente ligados ao reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, é possível usar pelo menos dois (tipos de) agentes diferentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) e, em alguns casos, três ou quatro (tipos de) agentes diferentes, por exemplo, dois ou mais diferentes agentes de ligação ao receptor e/ou agente de seleção. Por exemplo, em algumas modalidades, o reagente pode ser ligado reversivelmente a um primeiro agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) contendo um sítio de ligação B1, B2, B3 ou B4,
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66/378 etc. e um segundo agente (por exemplo, receptor ou agente de seleção) contendo outro sítio de ligação, por exemplo, outro de um sítio de ligação B1, B2, B3 ou B4. Em algum caso o sítio de ligação do primeiro agente e do segundo agente pode ser o mesmo. Por exemplo, em alguns aspectos, cada um dos pelo menos dois agentes (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode se ligar à mesma molécula. Em alguns casos, o site de ligação do primeiro agente e do segundo agente pode ser diferente. Em alguns aspectos, cada um dos pelo menos dois agentes (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode se ligar a uma molécula diferente, como uma primeira molécula, uma segunda molécula e assim por diante. Em alguns casos, as diferentes moléculas, como as moléculas da superfície celular, podem estar presentes na mesma célula-alvo. Em outros casos, as diferentes moléculas, como as moléculas da superfície celular, podem estar presentes em diferentes célulasalvo que estão presentes na mesma população de células. Em alguns casos, um terceiro, quarto e assim por diante (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ser associado ao mesmo reagente, cada um contendo um outro sítio de ligação diferente.
[00122] Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes diferentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) contêm o mesmo parceiro de ligação C. Em algumas modalidades, os dois ou mais agentes diferentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) contêm diferentes parceiros de ligação. Em alguns aspectos, um primeiro agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ter um parceiro de ligação C1 que pode se ligar especificamente a um sítio de ligação Z1 presente no reagente e a um segundo agente (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ter um
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67/378 parceiro de ligação 02 que pode se ligar especificamente ao sítio de ligação Z1 ou a um sítio de ligação Z2 presente no reagente. Assim, em alguns casos, a pluralidade de sítios de ligação Z compreendidos pelo reagente inclui os sítios de ligação Z1 e Z2, que são capazes de se ligar de forma reversível aos parceiros de ligação C1 e C2, respectivamente, compreendidos pelo agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção). Em algumas modalidades, C1 e 02 são os mesmos e/ou Z1 e Z2 são os mesmos. Em outros aspectos, um ou mais da pluralidade de sítios de ligação Z podem ser diferentes. Em outros casos, um ou mais dentre a pluralidade de parceiros de ligação C pode ser diferente. Está dentro de um nível de um técnico versado escolher qualquer combinação de diferentes parceiros de ligação C que sejam compatíveis com um reagente contendo os sítios de ligação Z, desde que como cada um dos parceiros de ligação C é capaz de interagir, como especificamente ligar, com um dos sítios de ligação Z.
[00123] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina, uma muteína de avidina ou análogo (como neutravidina) ou uma mistura dos mesmos, na qual esse reagente contém um ou mais sítios de ligação Z para associação reversível com um parceiro de ligação C. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C pode ser uma biotlna, um derivado ou análogo de biotlna ou um peptídeo de ligação à estreptavidina ou outra molécula que seja capaz de se ligar especificamente à estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina ou um avidin mutein ou analógico. Em algumas modalidades, o reagente é ou contém estreptavidina, avidina, um análogo ou muteína de estreptavidina, ou um análogo ou muteína ou avidina que se liga reversivelmente à biotína, um análogo de biotina ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Em algumas modalidades, o reagente é ou contém um análo
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68/378 go ou muteína da estreptavidina ou um análogo ou muteína da avidina que se liga de forma reversível a um peptídeo de ligação à estreptavidina. Em algumas modalidades, a substância (por exemplo, reagente competitivo) pode ser uma biotina, um derivado da biotina ou análogo ou um peptídeo de ligação à estreptavidina capaz de competir pela ligação com o parceiro de ligação C pelos um ou mais sítios de ligação Z. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação Cea substância (por exemplo, reagente competitivo) são diferentes e a substância (por exemplo, reagente competitivo) exibe uma afinidade de ligação mais alta para um ou mais sítios de ligação Z em comparação com a afinidade do parceiro de ligação.
[00124] Em algumas modalidades, a estreptavidina pode ser estreptavidina tipo selvagem, muteína de estreptavidina ou análogos, como polipeptídeos semelhantes à estreptavidina. Da mesma forma, a avidina, em alguns aspectos, inclui avidina ou muteína tipo selvagem ou análogos da avidina, como a neutravidina, uma avidina desglicosilada com argininas modificadas que normalmente exibe um pi mais neutro e está disponível como uma alternativa à avidina nativa. Geralmente, as formas neutras desglicosiladas de avidina incluem as formas comercialmente disponíveis, como Extravidina, disponível através da Sigma Aldrich, ou NeutrAvidin” disponível na Thermo Scientific ou Invitrogen, por exemplo.
[00125] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina ou análogo. Em algumas modalidades, a estreptavidina tipo selvagem (estreptavidina ts) possui a sequência de aminoácidos descrita por Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 (SEQ ID NO: 1). Em geral, a estreptavidina ocorre naturalmente como um tetrâmero de quatro subunidades idênticas, isto é, é um homotetrâmero, onde cada subunidade contém um único sítio de ligação para a biotina, um derivado ou análogo de biotina
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69/378 ou um mímico de bíotina. Uma sequência exemplar de uma subunidade estreptavidina é a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, mas essa sequência também pode incluir uma sequência presente em seus homólogos de outras espécies de Streptomyces. Em particular, cada subunidade da estreptavidina pode exibir uma forte afinidade de ligação à bíotina com uma constante de dissociação (Kd) da ordem de 10-14 M. Em alguns casos, a estreptavidina pode existir como um tetrâmero monovalente, no qual apenas um dos quatro sítios de ligação é funcional (Howarth et a/. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang eta/. (2015) Biochem. Biophys. Res. Common., 463: 1059-63)), um tetrâmero divalente em cujos dois dos quatro sítios de ligação são funcionais (Fairhead et a!. (2013) J. Mol. Biol., 426 : 199214) ou podem estar presentes na forma monomérica ou dimérica (Wu et a/. (2005) J. Biol. Chem., 280 : 23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50: 8682-91).
[00126] Em algumas modalidades, a estreptavidina pode estar em qualquer forma, como estreptavidina tipo selvagem ou não modificado, como uma estreptavidina de uma espécie de Streptomyces ou um fragmento funcionalmente ativo que inclua pelo menos uma subunidade funcional contendo um sítio de ligação para bíotina, um derivado ou análogo de bíotina ou um mímico de bíotina, tal como geralmente contém pelo menos uma subunidade funcional de uma estreptavidina tipo selvagem de Streptomyces avidinii apresentada na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo. Por exemplo, em algumas modalidades, a estreptavidina pode incluir um fragmento de estreptavidina tipo selvagem, que é reduzido no terminal N e/ou C. Tais estreptavidinas mínimas incluem aquelas que começam no terminal N na região das posições de aminoácidos 10 a 16 da SEQ ID NO: 1 e terminam no terminal C na região das posições de aminoácidos 133 a 142 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um fragmento
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70/378 funcionalmente ativo de estreptavidina contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a estreptavidina, como a apresentada na SEQ ID NO: 2, pode ainda conter uma metionina de terminal N em uma posição correspondente a Ala13 com a numeração apresentada na SEQ ID NO: 1. A referência à posição dos resíduos na estreptavidina ou na muteína de estreptavidina refere-se à numeração de resíduos na SEQ ID NO: 1.
[00127] Em alguns aspectos, as muteínas de estreptavidina incluem polipeptídeos que se distinguem da sequência de uma estreptavidina nâo modificada ou tipo selvagem por uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos, mas que incluem pelo menos uma subunidade funcional que contém um sítio de ligação para biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina. Em alguns aspectos, polipeptídeos do tipo estreptavidina e muteínas da estreptavidina podem ser polipeptídeos que são essencialmente imunologicamente equivalentes à estreptavidina tipo selvagem e são particularmente capazes de se ligar à biotina, derivados de biotina ou análogos de biotina com a mesma ou diferente afinidade como a estreptavidina ts. Em alguns casos, polipeptídeos do tipo estreptavidina ou muteínas da estreptavidina podem conter aminoácidos que não fazem parte da estreptavidina tipo selvagem ou podem incluir apenas uma parte da estreptavidina tipo selvagem. Em algumas modalidades, os polipeptídeos do tipo estreptavidina são polipeptídeos que não são idênticos aos da estreptavidina tipo selvagem, uma vez que o hospedeiro não possui as enzimas necessárias para transformar o polipeptídeo produzido pelo hospedeiro na estrutura da estreptavidina tipo selvagem. Em algumas modalidades, a estreptavidina também pode estar presente como tetrâmeros de estreptavidina e dímeros de estreptavidina, em particular homotetrômetros de estreptavidina, homodímeros de estreptavidina, heterotetrâmeros de estreptavidina e heterodímeros
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71/378 de estreptavidina. Geralmente, cada subunidade normalmente possui um sítio de ligação para biotina ou análogos de biotina ou para peptídeos de ligação à estreptavidina. Exemplos de estreptavidinas ou muteínas de estreptavidina são mencionados, por exemplo, nos documentos WO 86/02077, DE 19641876 Al, US 6.022.951, WO 98/40396 ou WO 96/24606.
[00128] Em alguns emobdimentos, a biotina é geralmente empregada em sua forma d-esterioisoménca natural, isto é, D-biotina. Em algumas modalidades, a biotina é D-biotina. Em modalidades particulares, exemplos de análogos e/ou derivados de biotina incluem, entre outros, D-biotina, análogo de biotina de N~cetona, um análogo de biotina de cetona, um análogo de biotina de N-azida, um análogo de biotina de azida, um análogo de biotina de N-acil azida, um análogo de biotina NBD-GABA, um análogo de biotina de 1,2-diamina, um análogo de biotina de N-alcina, um análogo de biotina de tetratiol, análogo de N-hidroxissuccinimida-iminobiotina, iminobiotina, N-hidroxissuccinimida-iminobiotina de amidobiotina, amidobiotinas, amidobiotinas, destiobiotina, biotina sulfona, caproilamidobiotina e biocitina. Em alguns aspectos, os análogos da biotina são ou incluem biotina sulfona, 2!tiobiotina, 2'-iminobiotina, d-destiobiotina, dl-destiobiotina, éster metílico da dl-destiobiotina e outros derivados da imidazolidona e os descritos em Green, N.M, (1975) em Advances in Protein Chemistry (Anson, ML e Edsell, JT, Eds), vol. 29, pp. 85-133, Academic Press, New York. Em certas modalidades, o anólogo ou derivado de biotina é D-biotina, destiobiotina e/ou iminobiotina.
[00129] Em algumas modalidades, uma muteína de estreptavidina pode conter aminoácidos que não fazem parte de uma estreptavidina não modificada ou tipo selvagem ou pode incluir apenas uma parte de uma estreptavidina tipo selvagem ou não modificada. Em algumas modalidades, uma muteína de estreptavidina contém pelo menos uma
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72/378 subunidade que pode ter mais uma substituição de aminoácidos (substituições) em comparação com uma subunidade de uma estreptavidina não modificada ou tipo selvagem, como comparada à subunidade de estreptavidina tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 1 ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, por exemplo, apresentado na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, pelo menos uma subunidade de uma muteína de estreptavidina pode ter pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 diferenças de aminoácidos em comparação com uma estreptavidina tipo selvagem ou não modificada e/ou contém pelo menos uma subunidade que compreende uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 59, em que essa muteína de estreptavidina exibe atividade funcional para ligar a biotina, um derivado da biotina ou um análogo ou um mimético da biotina. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos (substituições) são mutações conservadoras ou não conservadoras. Exemplos de muteína de estreptavidina são conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Pat. No. 5.168.049; 5.506.121; 6.022.951; 6.156.493; 6.165.750; 6.103.493; ou 6.368.813; ou Pedido PCT International publicado WO2014/076277.
[00130] Em algumas modalidades, a estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina inclui proteínas contendo uma ou mais de uma subunidade funcional contendo um ou mais sítios de ligação Z para biotina, um derivado ou análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina, como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais e, em alguns casos, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais subunidades funcionais. Em algumas modalidades, estreptavidina ou muteína de estreptavidina podem incluir um monômero; um dímero, incluindo um heterodímero
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73/378 ou um homodímero; um tetrâmero, incluindo um homotetrâmero, um heterotetrâmero, um tetrâmero monovalente ou um tetrâmero divalente; ou pode induir multimeros ou oligômeros de ordem superior.
[00131] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação, como constante de dissociação (Kd), da estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina para um parceiro de ligação ao ligante peptídico é inferior a 1 x 10-4 M, 5x 10-4 M, 1 x 10'5 M, 5x 10“s M, 1 x 10’6 M , 5 x 10~6 M ou 1 x IO 7 M, mas geralmente superior a 1 x 1013 M, 1 x 1012 M ou 1 x 10’11 M. Por exemplo, sequências peptídicas (Strep-tags), tais como descritas na Pat No. 5.506.121, pode atuar como mímico de biotina e demonstrar uma afinidade de ligação à estreptavidina, por exemplo, com uma Kd de aproximadamente entre 10'4 e 10 5 M. Em alguns casos, a afinidade de ligação pode ser melhorada ainda mais, fazendo uma mutação dentro da molécula de estreptavidina, veja, por exemplo, Pat. No. 6.103.493 ou Pedido PCT International publicado WO2014/ 076277. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, como qualquer um aqui descrito.
[00132] Em algumas modalidades, o reagente, como uma estreptavidina ou muteína de estreptavidina, exibe afinidade de ligação para um parceiro de ligação ao ligante peptídico, cujo parceiro de ligação ao ligante peptídico pode ser o parceiro de ligação C presente no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção). Em algumas modalidades, a sequência peptídica contém uma sequência com a fórmula geral apresentada na SEQ ID NO: 9, como contém a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a sequência peptídica tem a fórmula geral apresentada na SEQ ID NO: 11, como apresentado na SEQ ID NO: 12. Em um exemplo, a sequência peptídica é Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (também chamado Strep-tag®, apresentada na SEQ ID NO: 7). Em um
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74/378 exemplo, a sequência peptídica é Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (também chamada Strep-tag® II, apresentada na SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o ligante peptídico contém um arranjo sequencial de pelo menos dois módulos de ligação à estreptavidina, em que a distância entre os dois módulos é de pelo menos 0 e não superior a 50 aminoácidos, em que um módulo de ligação tem de 3 a 8 aminoácidos e contém pelo menos a sequência His-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 9), em que Xaa é glutamina, asparagina ou metionina, e em que o outro módulo de ligação possui o mesmo ou diferente ligante peptídico de estreptavidina, como apresentado na SEQ ID NO: 11 (veja, por exemplo, o Pedido PCT Internacional Publicado No. W002/077018; Patente US No. 7.981.632). Em algumas modalidades, o ligante peptídico contém uma sequência com a fórmula apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 13 ou 14. Em algumas modalidades, o ligante peptídico possui a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 15- 19. Na maioria dos casos, todos esses peptídeos de ligação à estreptavidina se ligam ao mesmo sítio de ligação, a saber, o sítio de ligação à biotina da estreptavidina. Se um ou mais desses peptídeos de ligação à estreptavidina for usado como parceiros de ligação C, por exemplo, C1 e C2, o reagente de multimerização e/ou reagentes de partículas olígoméricos ligados a um ou mais agentes através do parceiro de ligação C são tipicamente compostos por uma ou mais muteínas de estreptavidina.
[00133] Em algumas modalidades, o reagente é ou contém uma muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, as muteínas de estreptavidina contêm uma ou mais mutações (por exemplo, substituições de aminoácidos) em comparação com a estreptavidina tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 1 ou uma porção biologicamente ativa da mesma. Por exemplo, porções biologicamente ativas de estreptavidina podem incluir variantes de estreptavidina que são encur
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75/378 tadas no terminal N e/ou C, que em alguns casos é chamado estreptavidina mínima. Em algumas modalidades, uma estreptavidina mínima reduzida no terminal N, para a qual qualquer uma das mutações pode ser feita, começa no terminal N na região das posições de aminoácidos 10 a 16 e termina no terminal C na região das posições de aminoácidos 133 a 142 em comparação com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma estreptavidina encurtada no terminal N, na qual qualquer uma das mutações pode ser feita, contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 59. Em algumas modalidades, a estreptavidina mínima contém uma sequência de aminoácidos da posição Ala13 a Ser139 e opcionalmente tem um resíduo de metionina de terminal N em vez de Ala13. Para os propósitos aqui apresentados, a numeração das posições de aminoácidos refere-se ao longo da numeração de estreptavidina ts apresentada na SEQ ID NO: 1 (por exemplo, Argarana et aí, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871 -1882, cf. também a Figura 9).
[00134] Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina é um mutante como descrito na Patente U.S. No. 6.103.493. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém pelo menos uma mutação na região das posições de aminoácidos 44 a 53, com base na sequência de aminoácidos da estreptavidina tipo selvagem, como apresentado na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém uma mutação em um ou mais resíduos 44, 45, 46 e/ou 47. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém uma substituição de Glu na posição 44 da estreptavidina tipo selvagem por um aminoácido alifático hidrofóbico, por exemplo, Vai, Ala, He ou Leu, qualquer aminoácido na posição 45, um aminoácido alifático, tal como um aminoácido alifático hidrofóbico na posição 46 e/ou uma substituição de Vai na posição 47 com um aminoácido básico, por exemplo, Arg ou Lys, como geralmente Arg. Em algumas mo
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76/378 dalidades, Ala está na posição 46 e/ou Arg está na posição 47 e/ou Vai ou He está na posição 44. Em algumas modalidades, o mutante estreptavidina contém os resíduos Val44-Thr45-Ala46-Arg47, como apresentado em muteínas de estreptavidina exemplares contendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou 60 (também conhecido como mutante de estreptavidina 1, SAM1). Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém os resíduos lle44-Gly45-Ala46-Arg47, como os apresentados em exemplo de muteína de estreptavidina que contêm a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5, 6 ou 61 (também conhecida como SAM2). Em alguns casos, essa muteína de estreptavidina é descrita, por exemplo, na patente US 6.103.493 e está comercialmente disponível sob a marca comercial Strep-Tactin®.
[00135] Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina é um mutante como descrito em Pedido PCT Internacional Publicado WO 2014/076277. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém pelo menos dois resíduos de cisteína na região das posições de aminoácidos 44 a 53 com referência às posições de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, os resíduos de cisteína estão presentes nas posições 45 e 52 para criar uma ponte de dissulfeto conectando esses aminoácidos. Em tal modalidade, o aminoácldo 44 é tipicamente gliclna ou alanina e o aminoácido 46 é tipicamente alanina ou glicina e o aminoácido 47 é tipicamente arginina. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém pelo menos uma diferença de mutação ou aminoácido na região dos resíduos de aminoácidos 115 a 121 com referência às posições de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém em pelo menos uma mutação na posição de aminoácido 117, 120 e 121 e/ou uma exclusão dos aminoácidos 118 e 119 e substituição de pelo menos a posição de aminoPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 113/524
77/378 ácido 121.
[00136] Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém uma mutação na posição correspondente à posição 117, cuja mutação pode ser para um grande resíduo hidrofóbico como Trp, Tyr ou Phe ou um resíduo carregado como Glu, Asp ou Arg ou um resíduo hidrofílico como Asn ou Gin, ou, em alguns casos, os resíduos hidrofóbicos Leu, Met ou Ala, ou os resíduos polares Thr, Ser ou His. Em algumas modalidades, a mutação na posição 117 é combinada com uma mutação em uma posição correspondente à posição 120, que pode ser um pequeno resíduo como Ser ou Ala ou Gly e uma mutação em uma posição correspondente à posição 121, cuja mutação pode ser um resíduo hidrofóbico, como um resíduo hidrofóbico volumoso como Trp, Tyr ou Phe. Em algumas modalidades, a mutação na posição 117 é combinada com uma mutação na posição 120 da estreptavidina tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, cuja mutação pode ser um resíduo hidrofóbico como Leu, He, Met ou Vai ou, geralmente, Tyr ou Phe, e uma mutação em uma posição correspondente à posição 121 em comparação com as posições de estreptavidina tipo selvagem apresentadas na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, cuja mutação pode ser um pequeno resíduo como Gly, Ala ou Ser, ou com Gin, ou com um resíduo hidrofóbico como Leu, Vai, He, Trp, Tyr, Phe ou Met. Em algumas modalidades, essas muteínas também podem conter resíduos Val44-Thrs-Ala'’6-Arg47 ou resíduos lle44Gly45-Ala46-Arg47. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina contém os resíduos Vai44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 e Tyr121. Em algumas modalidades, a muteína estreptavidina contém a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96
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78/378 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28, contém os resíduos Vai44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 e Tyr121 e exibe atividade funcional para se ligar à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
[00137] Em algumas modalidades, a molécula, por exemplo, a estreptavidina ou a muteína de estreptavidina têm cerca de 5 a 30 aminas primárias, as quais, em alguns casos, podem Incluir uma amina de terminal N e/ou um ou mais resíduos de lisina. Em modalidades particulares, a molécula é um tetrâmero de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, incluindo qualquer uma das muteínas de estreptavidina descritas, que, como um tetrâmero, contém mais de 5 aminas primárias, como geralmente 5 a 40 ou 15 a 35, como geralmente cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 14, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou mais aminas primárias. Em algumas modalidades, a molécula é estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina ou um fragmento truncado, como qualquer uma dessas moléculas descritas. Em modalidades particulares, a molécula é um tetrâmero de estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina compreendendo uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 27, 59, 60 ou 61, que, como tetrâmero, é uma molécula que contém 20 aminas primárias, incluindo 1 amina de terminal N e 4 lisinas por monômero.
[00138] Em algumas modalidades, uma muteína de estreptavidina pode conter qualquer uma das mutações acima em qualquer combinação, e a muteína de estreptavidina resultante pode exibir uma afinidade de ligação caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) que é ou é menor que 3,7 x 10~5 M para o ligante peptídico (Trp-Arg-HisPro-Gln-Phe-Gly-Gly; também chamado Strep-tag®, apresentado na SEQ ID NO: 7) e/ou que é ou é menor que 7,1 x 10'5 M para o ligante peptídico (Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys; também chamado Strep
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79/378 tag® II, apresentado na SEQ ID NO: 8) e/ou que é ou é menor que 7,0 x 10'5 M, 6,0 x 10'5 M, 5,0 x 10'5 M, 4,0 x 10'5 M, 3,0 x 10'5 M, 2,0 x 10“5 M, 1,0 x 105 M, 9,0 x 10 6 M, 8,0 x 10 6 M, 7,0 x 10 6 M, 6,0 x 10 6 M, 5,0 x IO'6 M, 4,0 x IO'6 M, 3,0 x 10’6 M, 2,0 x 10’6 M, 1,0 x 10’6 M, 9,0 x 10-7 M, 8,0 x 10’7 M, 7,0 x 10~7 M, 6,0 x 107 M, 5,0 x 107 M, 4,0 x 10 7 M, 3,0 x 10’7 M, 2,0 x 10'7 M ou 1,0 x 10’7 M, mas geralmente superior a 1 x 10~13 M, 1 x 10‘12 M ou 1 x 10'11 M para qualquer um dos ligantes peptídicos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-19.
[00139] Em algumas modalidades, uma muteína de estreptavidina pode conter qualquer uma das mutações acima em qualquer combinação, e a muteína de estreptavidina resultante pode exibir uma afinidade de ligação caracterizada por uma constante de associação (Ka) que é ou é superior a 2,7 x 104 IVT1 para o ligante peptídico (Trp-Arg-HisPro-Gln-Phe-Gly-Gly; também chamado Strep-tag®, apresentado na SEQ ID NO: 7) e/ou que é ou é superior a 1,4 x 104 M’1 para o ligante peptídico (Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys; também chamado Streptag® II, apresentado na SEQ ID NO: 8) e/ou que é ou é superior a 1,43 x 104 M'1, 1,67 x 104 IVI1, 2 x 104 M'1, 3,33 x 104 M'1, 5 x 104 M’1, 1 x
105 IVl·1, 1,11 x 105 M'1, 1,25 x 105 M’1, 1,43 x 105 M'1, 1,67 x 105 M1, 2 x 105 M’1, 3,33 x 105 M1,5x105 M'1, 1 x 106 M’1, 1,11 x 106 M’1, 1,25 x
106 M'1, 1,43 x 106 M'1, 1,67 x 106 M'1, 2 x 106 M’1, 3,33 x 10s M’1, 5 x 106 M'1, 1 x 107 M'1, mas geralmente menor que 1 x 1013 M’1, 1 x 1012 M’1 ou 1 x 1011 M’1 para qualquer um dos ligantes peptídicos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-19.
[00140] Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina exibe a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 3-6, 27, 28, 60 ou 61 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 3-6,
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27, 28, 60 ou 61 e exibe uma afinidade de iigação caracterizada por uma constante de dissociação (Kd) que é ou é menor que 3,7 x 10 5 M para o ligante peptídico (Trp-Arg-His-Pro-GIn-Phe-Gly-Gly; também chamado STREP-TAG ®, apresentado na SEQ ID NO: 7) e/ou que é ou é menor que 7,1 x 10 5 M para o ligante peptídico (Trp-Ser-His-ProGln-Phe-Glu-Lys; também chamado STREP-TAG® II, apresentado na SEQ ID NO: 8) e/ou que é ou é menor que 7,0 x 10'5 M, 6,0 x 10'5 M, 5,0 x IO 5 M, 4,0 x 10'5 M, 3,0 x 105 M, 2,0 x 105 M, 1,0 x 10'5 M, 9,0 x 10“6 M, 8,0 x 10-6 M, 7,0 x 10“6 M, 6,0 x 10‘6 M, 5,0 x 106 M, 4,0 x 10‘6 M, 3,0 x IO’6 M, 2,0 x 10'6 M, 1,0 x 10’6 M, 9,0 x 10’7 M, 8,0 x 10'7 M, 7,0 x 10 7 M, 6,0 x 10 7 M, 5,0 x 10 7 M, 4,0 x 10 7 M, 3,0 x 107 M, 2,0 x 107 M ou 1,0 x 107 M, mas geralmente superiora 1 x 10~13 M, 1 x 10'12 M ou 1 x 10’11 M para qualquer um dos ligantes peptídicos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-19.
[00141] Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina também exibe ligação a outros ligantes de estreptavidina, como mas não se limitando a biotina, iminobiotina, ácido lipoico, destiobiotina, dlaminobiotina, HABA (ácido hidroxazobenzeno-benzoico) e/ou dimetilHABA. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina exibe uma afinidade de ligação por outro ligante de estreptavidina, como biotina ou destiobiotina, que é superior a a afinidade de ligação da muteína de estreptavidina por um ligante peptídico mímico de biotina, como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-19. Em algumas modalidades, a muteína de estreptavidina exibe uma afinidade de ligação por outro ligante de estreptavidina, como biotina ou destiobiotina, que é a mesma, aproximadamente a mesma, ou menor que a afinidade de ligação da muteína de estreptavidina por um ligante peptídico de mímico de biotina, tal como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 7-19. Em algumas modalidades, a biotina ou um análogo ou derivado de biotina (por exemplo, destiobiotina) pode ser empregada
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81/378 como reagente de competição nos métodos fornecidos. Por exemplo, como exemplo, a interação de uma muteína estreptavidina designada Strep-tactin® (por exemplo, contendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 60) com o ligante peptídico designado STREP-TAG® II (por exemplo, apresentado na SEQ ID NO: 8) é caracterizada por uma afinidade de ligação com uma Kd de aproximadamente 10’6 M em comparação com aproximadamente 10‘13 M para a interação biotinaestreptavidina. Em alguns casos, a biotina, que pode se ligar com alta afinidade ao Strep-Tactin® com uma Kd dentre 10-10 e 1013 M, pode competir com o STREP-TAG® II pelo sítio de ligação.
[00142] Em alguns casos, o reagente contém pelo menos dois grupos quelantes K que podem ser capazes de se ligar a um íon de metal de transição. Em algumas modalidades, o reagente pode ser capaz de se ligar a um marcador de afinidade de oligo-histidina, uma glutationaS-transferase, calmodulina ou um análogo do mesmo, peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), um peptídeo de FLAG, um marcador de HA, uma proteína de ligação à maltose (MBP), um epítopo de HSV, um epítopo de myc e/ou uma proteína veículo biotinilada.
[00143] Em algumas modalidades, o reagente é um oligômero ou polímero. Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero pode ser gerado pela ligação direta ou indireta de moléculas individuais da proteína como existe naturalmente, seja pela ligação direta ou indireta de moléculas individuais de um monômero ou de um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual (por exemplo, ligação direta ou indireta de dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc. de uma proteína como existe naturalmente). Por exemplo, em algumas modalidades, estreptavidina ou avidina tetramérica pode ser referida como uma molécula individual ou o menor bloco de construção de um respectivo oligômero ou polímero. Em modalidades particulares, um homodímero ou heterodímero tetramérico de estreptavidina ou avidina pode ser re
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82/378 ferido como uma molécula individual ou o menor bloco de construção de um respectivo oligômero ou polímero. Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero pode conter ligação de pelo menos 2 moléculas individuais da proteína (por exemplo, é um 2-mer), ou pode ser pelo menos um 3-mer, 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11~mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16~mer, 17-mer, 18~mer, 19mer, 20-mer, 25-mer, 30-mer, 35-mer, 40-mer, 45-mer ou 50-mer de moléculas individuais da proteína (por exemplo, monômeros, tetrâmeros). Em certas modalidades, o oligômero pode ser pelo menos 100mer, 200-mer, 300-mer, 400-mer, 500-mer, 1.000-mer, 1.500-mer, 2.000~mer, 2.500-mer, 3.000~mer ou pelo menos 3.500-mer de moléculas individuais da proteína. Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de partícula oligomérico descrito na Seção II (A) (1) ou (2), ou é um reagente de partícula oligomérico fabricado pelos métodos descritos na seção II (B) (3).
[00144] Os oligômeros podem ser gerados usando quaisquer métodos conhecidos na técnica, como os descritos no pedido de patente US publicado US2004/0082012. Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero contém duas ou mais moléculas individuais que podem ser reticuladas, como por um polissacarídeo ou um ligante bifuncional. [00145] Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero é obtido reticulando moléculas individuais ou um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual na presença de um polissacarídeo. Em algumas modalidades, oligômeros ou polímeros podem ser preparados pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo, dextrano. Em alguns aspectos, moléculas individuais do reagente (por exemplo, monômeros, tetrâmeros) podem ser acopladas via grupos amino primários de resíduos de lisina internos e/ou o terminal N livre aos grupos carboxila na cadeia principal de dextrano usando a química convencional da carbodiimida. Em algumas modalidades,
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83/378 a reação de acoplamento é realizada a uma relação molar de cerca de 60 moles de moléculas individuais do reagente (por exemplo, monômeros, tetrâmeros) por mole de dextrano.
[00146] Em algumas modalidades, o reagente é um oligômero ou um polímero de uma ou mais estreptavidina ou avidina ou de qualquer análogo ou muteína de estreptavidina ou um análogo de avidina ou muteína (por exemplo, neutravidina). Em algumas modalidades, o sítio de ligação Z é um sítio de ligação à biotina natural da avidina ou estreptavidina, para o qual pode haver até quatro sítios de ligação em uma molécula individual (por exemplo, um tetrâmero contém quatro sítios de ligação Z), pelo qual um homotetrâmero pode conter até 4 sítios de ligação iguais, ou seja, Z1, enquanto um heterotetrâmero pode conter até 4 sítios de ligação que podem ser diferentes, por exemplo, contendo Z1 e Z2. Em algumas modalidades, o oligômero é gerado ou produzido a partir de uma pluralidade de moléculas individuais (por exemplo, uma pluralidade de homotetrâmeros) da mesma estreptavidina, muteína de estreptavidina, avidina ou muteína de avidina, caso em que cada sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, do oligômero é o mesmo. Por exemplo, em alguns casos, um oligômero pode conter uma pluralidade de sítios de ligação Z1, como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 ou mais sítios de ligação Z1. Em algumas modalidades, o oligômero é gerado ou produzido a partir de uma pluralidade de moléculas individuais que podem ser heterotetrâmeros de uma estreptavidina, muteína de estreptavidina, avidina ou muteína de avidina e/ou de uma pluralidade de duas ou mais moléculas individuais diferentes (por exemplo, homo diferentes tetrâmeros) de estreptavidina, muteína de estreptavidina, avidina ou muteína de avidina que diferem nos seus sítios de ligação Z, por exemplo, Z1 e Z2, caso em que uma pluralidade de diferentes sítios de
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84/378 ligação Z, por exemplo, Z1 e Z2 podem estar presentes no oligômero. Por exemplo, em alguns casos, um oligômero pode conter uma pluralidade de sítios de ligação Z1 e uma pluralidade de sítios de ligação Z, que, em combinação, podem incluir pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40,45, 50 ou mais sítios de ligação combinados Z1 e Z2.
[00147] Em alguns casos, o respectivo oligômero ou polímero pode ser reticulado por um polissacarídeo. Em uma modalidade, oligômeros ou polímeros de estreptavidina ou de avidina ou de análogos de estreptavidina ou de avidina (por exemplo, neutravidina) podem ser preparados pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo, g. dextrano, essencialmente como descrito em Noguchi, A, et al., Bioconjugate Chemistry (1992) 3 132-137 em um primeira etapa. Em alguns desses aspectos, a estreptavidina ou a avidina ou seus análogos podem então ser ligados via grupos amino primários do resíduo de lisina interna e/ou o terminal N livre aos grupos carboxil na cadeia principal de dextrano usando a química convencional de carbodiimida em uma segunda etapa. Em alguns casos, oligômeros ou polímeros reticulados de estreptavidina ou avidina ou de qualquer análogo de estreptavidina ou avidina também podem ser obtidos por reticulação via moléculas bifuncionais, servindo como ligante, como glutardialdeído ou por outros métodos descritos na técnica.
[00148] Em algumas modalidades, o oligômero ou polímero é obtido pela retlculação de moléculas individuais ou de um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual utilizando um ligante bifuncional ou outro ligante químico, como o glutardialdeído ou por outros métodos conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, oligômeros ou polímeros reticulados de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína ou análogo de estreptavidina ou avidina podem ser obtidos
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85/378 reticulando moléculas individuais de estreptavidina ou avidina por moléculas bifuncionais, servindo como ligante, como glutardialdeído ou por outros métodos descritos na técnica. Por exemplo, é possível gerar oligômeros de muteína de estreptavidina introduzindo grupos tiol na muteína de estreptavidina (isso pode, por exemplo, ser feito reagindo a muteína de estreptavidina com 2~iminotiolano (reagente de Trauts) e ativando, por exemplo, uma reação separada, grupos amino disponíveis na muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, essa ativação de grupos amino pode ser alcançada pela reação da muteína de estreptavidina com um reticulador heterobifuncional disponível comercialmente, como 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano~1~carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo SMCC) ou succinimidil-6-[(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH). Em algumas dessas modalidades, os dois produtos de reação assim obtidos são misturados, levando tipicamente à reação dos grupos tiol contidos em um batelada de muteína de estreptavidina modificada com os aminoácidos ativados (como por funções da maleimida) da outra batelada de muteína de estreptavidina modificada. Em alguns casos, por essa reação, formam-se multímeros/oligômeros da muteína de estreptavidina. Esses oligômeros podem ter qualquer número adequado de moléculas individuais, como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000 ou mais, e o grau de oligomerização pode variar de acordo com a condição da reação.
[00149] Em algumas modalidades, o reagente oligomérico ou polimérico pode ser isolado via cromatografia de exclusão por tamanho e qualquer fração desejada pode ser usada como reagente. Por exemplo, em algumas modalidades, após a reação da muteína de estreptavidina modificada, na presença de 2-iminotiolano e um reticulador he
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86/378 terobifuncional, como sulfo SMCC, o reagente oligomérico ou polimérico pode ser isolado via cromatografla de exclusão por tamanho e qualquer fração desejada pode ser usada como o reagente. Em algumas modalidades, os oligômeros não têm (e não precisam ter) um único peso molecular, mas podem observar uma distribuição estatística de peso, como a distribuição Gaussiana. Em alguns casos, qualquer oligômero com mais de três tetrâmeros estreptavidina ou muteína, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros, pode ser usado como reagente, como geralmente de 3 a 50 tetrâmeros, por exemplo, homotetrômetros ou heterotetrâmeros, 10 a 40 tetrâmeros, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros, ou 25 a 35 tetrâmeros, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros. Os oligômeros podem ter, por exemplo, de 3 a 25 tetrâmeros de muteína de estreptavidina, por exemplo, homotetrâmeros ou heterotetrâmeros. Em alguns aspectos, com um peso molecular de cerca de 50 kDa para muteínas de estreptavidina, os oligômeros podem ter um peso molecular de cerca de 150 kDa a cerca de 2000 kDa, cerca de 150 kDa a cerca de 1500 kDa, cerca de 150 kDa a cerca de 1250 kDa, cerca de 150 kDa a 1000 kDa, cerca de 150 kDa a cerca de 500 kDa ou cerca de 150 kDa a cerca de 300 kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 2000 kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 2000 kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 500 kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 500 kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 300 kDa kDa, cerca de 300 kDa a cerca de 500 kDa, cerca de 500 kDa a cerca de 2000 kDa, cerca de 500 kDa a cerca de 1500 kDa, cerca de 500 kDa a cerca de 1250 kDa, cerca de 500 kDa a 1000 kDa, cerca de 500 kDa a cerca de 2000 kDa, cerca de 1000 kDa a cerca de 1500 kDa, cerca de 1000 kDa a cerca de 1250 kDa, cerca de 1250 kDa a cerca de 2000 kDa ou cerca de 1500 kDa a cerca de 2000 kDa. Em algumas modalidades, os oligômeros têm um peso molecular de mais de 2.000 kDa. Geralmente, porque cada molécula de estreptavidina/muteína
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87/378 tem quatro sítios de ligação à biotina, esse reagente pode fornecer 12 a 160 sítios de ligação Z, como 12 a 160 ou mais sítios de ligação Z. Em algumas modalidades, os oligômeros são reagentes solúveis.
1. Reagentes de partículas oligoméricos
[00150] São aqui fornecidos reagentes de partículas oligoméricos que são compostos e/ou contêm uma pluralidade de moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são reagentes solúveis. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos contêm pelo menos um sítio de ligação que se liga de forma reversível ou é capaz de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente estimulador e/ou um agente de seleção. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos contêm uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar reversivelmente a um ou mais agentes, por exemplo, em um sítio em um parceiro de ligação, por exemplo, um parceiro de ligação C, que está ligado a o um ou mais agentes. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos estão ligados reversivelmente a um ou mais agentes. Em modalidades particulares, o reagente de partícula de oligômero é uma partícula oligomérica que é fabricada, produzida ou gerada por qualquer um dos métodos descritos na Seção II (B).
[00151] Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos são compostos e/ou contêm moléculas oligomerizadas que são proteínas, polipeptídeos, peptídeos e/ou moléculas que contêm ou incluem um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos contêm e/ou são compostos de moléculas oligomerlzadas que contêm uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um ou mais agentes, por exemplo, agente de ligação ao receptor. Em algu
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88/378 mas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um agente descrito na Seção II (B) (4) e/ou na Seção II (B) (5). Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos aqui fornecidos contêm uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam ou são capazes de se ligar a um ou mais agentes em um sítio dentro do parceiro de ligação, por exemplo, um parceiro de ligação C, que está ligado a um ou mais agentes. Em modalidades particulares, a molécula que é oligomerizada contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um parceiro de ligação C descrito na Seção II (A). Em algumas modalidades, a molécula que é oligomerizada é ou inclui uma estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina, uma muteína de avidina ou análogo (como neutravidina). Em certas modalidades, a estreptavidina é um tetrâmero no estado nativo. Assim, em certas modalidades, a molécula é um tetrâmero de uma estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina, uma muteína de avidina ou análogo (como neutravidina). Em modalidades particulares, o reagente de partícula oligomérico contém uma pluralidade de um ou mais dos reagentes descritos na Seção II (A).
[00152] Em modalidades particulares, o tamanho dos reagentes de partículas oligoméricos é determinado por qualquer meio adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a massa e/ou o peso molecular dos reagentes de partículas oligoméricos são determinados por qualquer meio adequado na técnica, incluindo, mas não se limitando a, eletroforese, por exemplo, SDS-PAGE, cromatografia, por exemplo, cromatografia de filtração em gel ou SEC, ou espectrometria de massa. Em algumas modalidades, o tamanho, por exemplo, o raio, do reagente de partícula oligomérico é determinado por técnicas dinâmicas de dispersão de luz (DLS). Em algumas modalidades, o tamanho,
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89/378 por exemplo, o ralo, é determinado por técnicas de fracionamento de fluxo de campo de fluxo (F4). Em certas modalidades, F4 pode ser usado para separar e medir partículas com base no tamanho independente da densidade das partículas. Em certas modalidades, o tamanho de partícula é medido por fracionamento de fluxo de campo de fluxo assimétrico (AF4). Em algumas modalidades, o tamanho da partícula pode ser determinado medindo o diâmetro ou raio da partícula. Em certas modalidades, o tamanho da partícula pode ser determinado medindo o raio hidrodinâmico ou o raio de rotação da partícula. Em certas modalidades, o raio é determinado com técnicas dinâmicas de dispersão de luz. Em certas modalidades, o raio, por exemplo, o raio hidrodinâmico e/ou o raio de Stokes, pode ser determinado a partir de técnicas de cromatografia, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho SEC).
[00153] Em modalidades particulares, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido tem um raio, por exemplo, um raio médio de pelo menos 5 nm, pelo menos 10 nm, pelo menos 15 nm, pelo menos 20 nm, pelo menos 25 nm, em pelo menos 30 nm, pelo menos 35 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 45 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 55 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 65 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 75 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 85 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 95 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 105 nm, pelo menos 110 nm, pelo menos 115 nm, pelo menos 120 nm, pelo menos 125 nm, pelo menos 130 nm, pelo menos 135 nm, pelo menos ou pelo menos pelo menos 140 nm. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico tem um raio entre 5 nm e 150 nm, entre 25 nm e
150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e
125 nm, entre 80 nm e 140 nm, entre 85 nm e 135 nm, entre 80 nm e
120 nm, entre 80 nm e 115 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive.
Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui for
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90/378 necido tem um raio de cerca de 85 nm, cerca de 86 nm, cerca de 87 nm, cerca de 88 nm, cerca de 89 nm, cerca de 90 nm, cerca de 91 nm, cerca de 92 nm, cerca de 93 nm, cerca de 94 nm, cerca de 95 nm, cerca de 96 nm, sobre 97 nm, sobre 98 nm, sobre 99 nm, sobre 100 nm, sobre 101 nm, sobre 102 nm, sobre 103 nm, sobre 104 nm, sobre 105 nm, sobre 106 nm, sobre 107 nm, sobre 108 nm, sobre 109 nm, sobre 110 nm, sobre 111 nm, sobre 112 nm, sobre 113 nm, cerca de 114 nm ou cerca de 115 nm. Em certas modalidades, as partículas têm um raio entre 80 nm e 115 nm, inclusive.
[00154] Em algumas modalidades, o raio é o raio hidrodinâmico, raio de rotação, raio de Stokes, raio de Stokes~E in stein e/ou o raio hidratado efetivo em solução. Em certas modalidades, o ralo é o raio hidrodinâmico. Em algumas modalidades, o raio é o raio de Stokes. Em modalidades particulares, o raio hidrodinâmico é o raio de Stokes. Em algumas modalidades, o raio é um raio médio(mean), mediano e/ou médio(average) de uma pluralidade de partículas.
[00155] Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido tem um peso molecular de pelo menos 2x10® g/mol, 3 x 10® g/mol, 5x10® g/mol, 1 x 107 g/mol, pelo menos 5 x 107 g/mol, pelo menos 1 x 108 g/mol, pelo menos 1,25 x 108 g/mol, pelo menos 1,5 x 108 g/mol, pelo menos 2 x 108 g/mol ou pelo menos 5 x 108 g/mol. Em algumas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido tem um peso molecular entre 1 x 106 g/mol e 1 x 101° g/mol, 2 x 106 g/mol e 1 x 101° g/mol, entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 7,5 x 107 g/mol e 2,5 x 108 g/mol, entre 2,5 x 107 g/mol e 2,75 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 7,5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive. Em modalidades particulares, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido tem um peso molecular de cerca de 7,5 x 107 g/mol, cerca de 8,0 x 107 g/mol, cerca de 9,0 x
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107 g/mol, cerca de 9,0 x 107 g/mol, cerca de 1,0 x 108 g/mol, cerca de 1,1 x 108 g/mol, cerca de 1,1 x 108 g/mol, cerca de 1,2 x 108 g/mol, cerca de 1,3 x 108 g/mol, cerca de 1,4x 108 g/mol, cerca de 1,5x 108 g/mol, cerca de 1,6 x 108 g/mol, cerca de 1,7 x 108 g/mol, cerca de 1,7 x 108 g/mol, cerca de 1,8 x 108 g/mol, cerca de 1,8 x 108 g/mol, cerca de 1,9 x 108 g/mol, cerca de 2,0 x 108 g/mol, cerca de 2,1 x 108 g/mol, cerca de 2,2 x 108 g/mol, cerca de 2,3 x 108 g/mol, cerca de 2,4 x 108 g/mol ou cerca de 2,5 x 108 g/mol. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido tem um peso molecular entre 5 x 107 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive.
[00156] Em algumas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido é composto e/ou contém uma pluralidade de tetrâmeros estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido é composto por e/ou contém pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos pelo menos 900, pelo menos 1.000, pelo menos 1.100, pelo menos 1.200, pelo menos 1.300, pelo menos 1.400, pelo menos 1.500, pelo menos 1.600, pelo menos 1.700, pelo menos 1.800, pelo menos 1.900, pelo menos 2.200, pelo menos 2.300, pelo menos 2.400, pelo menos 2.500, pelo menos 2.600, pelo menos 2.700, pelo menos 2.800, pelo menos 2.900, pelo menos 3.000, pelo menos 4.000, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000 ou pelo menos 20.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas olígoméricos aqui fornecidos contêm e/ou são compostos entre 100 e 50.000, entre 500 e 10.000, entre 1.000 e 20.000, entre 500 e 5.000, entre 500 e 5.000, entre 300 e 7.500, entre 1.500 e 7.500, entre 500 e 3.500, entre 1.000 e 5.000, entre 1.500 e 2.500, entre 1.500 e 2.500, entre 2.000 e 3.000, entre 2.500 e 3.500, entre 2.000 e 4.000, ou entre
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2.000 e 5.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido é composto e/ou contém entre cerca de 2.000 e 3.500 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[00157] Em algumas modalidades, é aqui proporcionado um reagente de partícula oligomérico que é composto e/ou contém uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido contém uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversivelmente ou são capazes de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente estimulador e/ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, a partícula oligomérica tem um raio entre 25 nm e 150 nm, inclusive; um peso molecular entre 2 x 106 g/mol e 1 x 101° g/mol; e/ou entre 500 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[00158] Em modalidades particulares, é aqui fornecido um reagente de partícula oligomérico que é composto e/ou contém uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido contém uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversívelmente ou são capazes de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente estimulador e/ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, a partícula oligomérica tem um raio, por exemplo, um raio médio, entre 70 nm e 125 nm, inclusive; um peso molecular entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, inclusive; e/ou entre 1.000 e 5.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, inclusive. Em algumas modalidades, o reagente de partícula oligomérico está ligado, por exemplo, ligado reversivelmente, a um ou mais agentes, como um agente que se liga a uma molécula, por exemplo, receptora, na superfície de uma célula. Em certas modalida
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93/378 des, o um ou mais agentes são agentes aqui descritos, por exemplo, na Seção ll-C-3. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-CD3 e/ou um anticorpo anti~CD28 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo ou seu fragmento de antígeno que contém um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, por exemplo, Strep-tag® II. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes é um Fab anti-CD3 e/ou anti-CD28 contendo um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, por exemplo, Strep-tag® II.
[00159] Em algumas modalidades, é aqui fornecido um reagente de partícula oligomérico que é composto e/ou contém uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, o reagente de partícula oligomérico aqui fornecido contém uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversivelmente ou são capazes de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente estimulador e/ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, a partícula oligomérica tem um raio, por exemplo, um raio médio, entre 80 nm e 120 nm, inclusive; um peso molecular, por exemplo, um peso molecular médio entre 7,5 x 106 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive; e/ou uma quantidade, por exemplo, uma quantidade média, entre 500 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, inclusive. Em algumas modalidades, o reagente de partícula oligomérico está ligado, por exemplo, ligado reversivelmente, a um ou mais agentes, como um agente que se liga a uma molécula, por exemplo, receptora, na superfície de uma célula. Em certas modalidades, o um ou mais agentes são agentes aqui descritos, por exemplo, na Seção ll-C-3. Em algumas modalidades, o agente é um Fab anti-CD3 e/ou anti-CD28, como um Fab que contém um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, por exemplo, Strep-tag® II. Em modalidades particulares, o um ou mais
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94/378 agentes é um Fab anti-CD3 e/ou anti-CD28 contendo um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, por exemplo, Strep-tag® II.
2. Composições de reagentes de partículas oligoméncos
[00160] São aqui fornecidas composições que contêm reagentes de partículas oligoméricos, por exemplo, uma pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos, que são compostos e/ou contêm uma pluralidade de moléculas, por exemplo, tetrâmeros estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, a composição aqui fornecida contém uma pluralidade de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos aqui descritos. Em modalidades particulares, a composição contém uma pluralidade de qualquer um dos reagentes de partículas oligoméricos descritos na Seção II (A) (1). Em algumas modalidades, a composição contém uma pluralidade de reagentes de partículas oligoméricos que são fabricados, produzidos e/ou gerados por qualquer um dos métodos descritos na Seção II (B).
[00161] Em modalidades particulares, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com tamanho médio(average), médio(mean) e/ou mediano. Em certas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com uma média(average), média(mean) ou raio médio de pelo menos 25 nm, pelo menos 30 nm, pelo menos 35 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 45 nm, pelo menos 50 nm, em pelo menos 55 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 65 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 75 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 85 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 95 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 105 nm, pelo menos 110 nm, pelo menos 115 nm, pelo menos 120 nm, pelo menos 125 nm, pelo menos 130 nm, pelo menos 135 nm, pelo menos ou pelo menos 140 nm. Em certas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com um raio médio(average), médio(mean) ou mediano entre 5 nm e 150 nm,
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95/378 entre 25 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 50 nme 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 140 nm, entre 85 nm e 135 nm, entre 80 nm e 120 nm, entre 80 nm e 115 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive.
[00162] Em algumas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com um raio médio(average), médio(mean) ou mediano de 90 nm ± 25 nm, 90 nm ± 20 nm, 90 nm ± 15 nm, 90 nm ± 10 nm, 90 nm ± 5 nm, 95 nm ± 25 nm, 95 nm ± 20 nm, 95 nm ± 15 nm, 95 nm ± 10 nm, 95 nm ± 5 nm, 97 nm ± 20 nm, 97 nm ± 15 nm, 97 nm ± 10 nm 97 nm ± 5 nm.
[00163] Em certas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com um raio médio(average), médio(mean) ou mediano de cerca de 85 nm, cerca de 86 nm, cerca de 87 nm, cerca de 88 nm, cerca de 89 nm, cerca de 90 nm, cerca de 91 nm, cerca de 92 nm, cerca de 93 nm, sobre 94 nm, sobre 95 nm, sobre 96 nm, sobre 97 nm, sobre 98 nm, sobre 99 nm, sobre 100 nm, sobre 101 nm, sobre 102 nm, sobre 103 nm, sobre 104 nm, sobre 105 nm, sobre 106 nm, sobre 107 nm, sobre 108 nm, sobre 109 nm, sobre 110 nm, cerca de 111 nm, cerca de 112 nm, cerca de 113 nm, cerca de 114 nm ou cerca de 115 nm. Em certas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com um raio médio(average), médlo(mean) ou mediano entre 80 nm e 115 nm, inclusive.
[00164] Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular médio(average), médlo(mean) ou mediano de pelo menos 2 x 106 g/mol, 3 x 106 g/mol, 5 x 10® g/mol, 1 x 107 g/mol, pelo menos 5 x 107 g/mol, pelo menos 1 x 108 g/mol, pelo menos 1,25 x 108 g/mol, pelo menos 1,5 x 108 g/mol, pelo menos 2 x 108 g/mol ou pelo menos 5 x 108 g/mol. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano entre 1
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96/378 x 106 g/mol e 1 x 101° g/mol, 2 x 106 g/mol e 1 x 1010 g/mol, entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 7,5 x 107 g/mol e 2,5 x 108 g/mol, entre 2,5 x 107 g/mol e 2,75 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 7,5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive. Em modalidades particulares, o reagente de partícula oligomérico da composição tem um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano de cerca de 7,5 x 107 g/mol, cerca de 8,0 x 107 g/mol, cerca de 9,0 x 107 g/mol, cerca de 9,0 x 107 g/mol, cerca de 1,0 x 108 g/mol, cerca de 1,1 x 108 g/mol, cerca de 1,2 x 108 g/mol, cerca de 1,3 x 108 g/mol, cerca de 1,4x 108 g/mol, cerca de 1,5x 108 g/mol, cerca de 1,5x 108 g/mol, cerca de 1,6x 108 g/mol, cerca de 1,6x 108 g/mol, cerca de 1,7x 108 g/mol, aproximadamente 1,8x 108 g/mol, cerca de 1,9x 108 g/mol, cerca de 2,0x 108 g/mol, cerca de 2,1x 108 g/mol, cerca de 2,2 x 108 g/mol, cerca de 2,2 x 108 g/mol, cerca de 2,3 x 108 g/mol, cerca de 2,4x 108 g/mol ou aproximadamente 2,5x 108 g/mol. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano entre 5 x 107 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive.
[00165] Em algumas modalidades os reagentes de partículas oligoméricos da composição são compostos e/ou contêm uma pluralidade de tetrâmeros estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição são compostos e/ou contêm uma quantidade média(average), média(mean) ou mediana de pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1.000, pelo menos 1.100, pelo menos 1.200, pelo menos 1.300, pelo menos 1.400, pelo menos 1.500, pelo menos 1.600, pelo menos 1.700, pelo menos 1.800, pelo menos 1.900, pelo menos 2.200, pelo
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97/378 menos 2.300, pelo menos 2.400, pelo menos 2.500, pelo menos 2.600, pelo menos 2.700, pelo menos 2.800, pelo menos 2.900, pelo menos 3.000, pelo menos 4.000, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, ou pelo menos 20.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oil· goméricos da composição contêm e/ou são compostos de uma quantidade média(average), média(mean) ou mediana entre 100 e 50.000, entre 500 e 10.000, entre 1.000 e 20.000, entre 500 e 5.000, entre 300 e 7.500, entre 1.500 e 7.500, entre 500 e 3.500, entre 1.000 e 5.000, entre 1.500 e 2.500, entre 1.500 e 2.500, entre 2.000 e 3.000, entre 2.500 e 3.500, entre 2.500 e 3.500, entre 2.000 e 4.000 ou entre 2.000 e 5.000 estreptavidina ou muteína de estreptavidina tetrâmeros. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição são compostos e/ou contêm uma quantidade mé~ dia(average), média(mean) ou mediana entre cerca de 2.000 e 3.500 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[00166] Em algumas modalidades, a composição contém reagentes de partículas oligoméricos com uma distribuição de tamanho. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição têm uma distribuição de tamanho em que pelo menos 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um tamanho que está dentro de ± 100 %, ± 90 %, ± 80 %, ± 70 %, ± 60 %, ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,01 %, de ± 0,001 % da mediana ou tamanho médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição. Em certas modalidades, o tamanho é medido por raio, peso molecular ou número de moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, do reagente de partículas oligomérico.
[00167] Em algumas modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes
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98/378 de partículas oligoméricos da composição têm um raio dentro de ± 100 %, ± 90 %, ± 80 %, ± 70 %, ± 60 %, ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,01 %, de ± 0,001 % do raio mediano ou médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição. Em modalidades particulares, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um raio que está entre 10 nm e 250 nm, entre 25 nm e 200 nm, entre 50 e 150 nm, entre 50 e 150 nm, entre 70 nm e 140 nm, entre 70 e 130 nm, entre 70 e 100 nm, entre 80 nm e 110 nm, entre 80 nm e 120 nm, entre 80 nm e 115 nm, entre 80 nm e 100 nm, entre 90 e 120 nm, entre 90 e 120 nm, entre 90 nm e 110 nm, entre 100 nm e 120 nm, ou entre 85 e/ou 115 nm, inclusive. Em modalidades particulares, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um raio dentro de ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 % ou ± 1 % do raio médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.
[00168] Em modalidades particulares, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular que está dentro de ± 100 %, ± 90 %, ± 80 %, ± 70 %, ± 60 %, ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,01 %, de ± 0,001 % do peso molecular mediano ou médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.Em algumas modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular entre 2 x 106 g/mol e 1 x 1010 g/mol, entre 1 x 106 g/mol e 1 x 108 g/mol, entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 1 x 10w g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 1 x 109 g/mol e 1 x 1010 g/mol, entre 1 x 107 g/mol e x 108 g/mol, entre 7,5 x 107 g/mol e 2,5 x 108 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 2,5 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 3 x 108 g/mol, entre 7,0 x 107 g/mol e 3,0 x 108 g/mol ou entre pt 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive.Em algumas
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99/378 modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um peso molecular dentro de ± 25 %, ± 20 %, ±15 %, ± 10 %, ± 5 % ou ± 1 % do peso molecular médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.
[00169] Em certas modalidades, as partículas oligoméricas da composição são compostas por uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos são compostos por uma quantidade de tetrâmeros dentro de ± 100 %, ± 90 %, ± 80 %, ± 70 %, ± 60 %, ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,01 %, de ± 0,001 % da mediana ou valor médio de tetrâmeros por reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, as partículas oligoméricas da composição pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos são compostas entre 100 e 50.000, entre 500 e 10.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 5.000, entre 5.000 e 10.000, entre 10.000 e 15.000, entre 1.500 e 4.000, entre 2.000 e 4.500, entre 2.500 e 5.000, entre 3.000 e 5.000, entre 3.500 e 5.500, entre 4.000 e 6.000, ou entre 1.500 e 3.500 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição são compostos por uma quantidade de tetrâmeros dentro de ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 % ou ± 1 % do peso molecular médio dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.
[00170] Em algumas modalidades, a composição de reagentes de partículas oligoméricos é armazenada por um período de tempo, por exemplo, após a fabricação dos reagentes de partículas oligoméricos produzidos e/ou gerados e antes da adição de um agente, por exemplo, um agente de ligação ao receptor. Em certas modalidades, a composição de reagentes de partículas oligoméricos é armazenada
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100/378 em um tampão com um pH neutro. Em algumas modalidades, a composição é armazenada em alíquotas separadas. Em algumas modalidades, a composição de reagentes de partículas oligoméricos é armazenada em temperatura ambiente ou abaixo, a ou abaixo de 4°C, a ou abaixo de -20°C, ou a ou abaixo de -80°C. Em certas modalidades, a composição é armazenada por um período de tempo de, aproximadamente, ou pelo menos 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 18 semanas, 20 semanas,22 semanas, 24 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas,30 semanas, 32 semanas, 34 semanas, 36 semanas, 38 semanas,40 semanas, 42 semanas, 44 semanas, 46 semanas, 46 semanas, 48 semanas, 50 semanas, 52 semanas, 60 semanas, 70 semanas, 80 semanas, 90 semanas, 12 meses, 16 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses, 36 meses ou mais de 36 meses. Em modalidades particulares, a composição de reagentes de partículas oligoméricos é armazenada a ou abaixo de 4°C por, durante aproximadamente ou pelo menos 1 semana 9 semanas, 27 semanas ou 46 semanas. Em certas modalidades, a composição de reagentes de partículas oligoméricos é armazenada a ou abaixo de -80°C por, durante aproximadamente ou pelo menos 1 semana, 9 semanas, 27 semanas ou 46 semanas. Em modalidades particulares, o tamanho das partículas oligoméricas é estável durante o armazenamento, por exemplo, o tamanho não muda ou aumenta em mais de 25 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 %.
[00171] Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos da composição não sofrem um aumento na média, por exemplo, tamanho médio das partículas durante o armazenamento. Em certas modalidades, a composição é armazenada por um período
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101/378 de tempo e os reagentes de partículas oligoméricos não experimentam um aumento no tamanho médio, superior a 1 %, superior a 5 %, superior a 10 %, superior a 20 %, superior a 25 %, superior a 30 %, superior a 40 % ou superior a 50 %. Em modalidades particulares, a composição é armazenada a aproximadamente ou abaixo de 4°C, a aproximadamente ou abaixo de ~20°C, ou a aproximadamente ou abaixo de 80°C por pelo menos 9, 27 ou 46 semanas e não experimenta um aumento em tamanho médio superior a 1 %, 5 % ou 10 %. Em certas modalidades, a composição é armazenada a cerca de -80°C.
[00172] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma composição de reagentes de partículas oligoméricos que são compostos e/ou contêm uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos da composição contêm, cada um, uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversivelmente ou são capazes de se ligar de forma reversível a um ou mais agentes, por exemplo, um agente estimulador e/ou um agente de seleção. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos têm um raio médio(average), médio(mean) ou mediano entre 25 nm e 150 nm; um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano entre 2 x 106 g/mol e 1 x 1010 g/mol; e/ou uma quantidade média(average), média(mean) ou mediana entre 500 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, pelo menos 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um ralo, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros que está dentro de ± 100 %, ± 90 %, ± 80 %, ± 70 %, ± 60 %, ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 % da média, raio médio ou mediano, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.
[00173] Em modalidades particulares, é aqui fornecida uma compo
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102/378 sição de reagentes de partículas oligoméricos que são compostos e/ou contêm uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e que contêm uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversivelmente a um ou mais agagentes, agentes por exemplo, agentes de ligação ao receptor, tais como Fabs anti-CD3 e/ou anti-CD28 com um streptag. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos têm um raio médio(average), médio(mean) ou mediano entre 50 nm e 150 nm; um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol; e/ou uma quantidade média(average), média(mean) ou mediana entre 1.000 e 5.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um raio, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros que está dentro de ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 % ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 % da média, raio médio ou mediano, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros dos reagentes de partículas oligoméricos da composição.
[00174] Em algumas modalidades, é aqui fornecida uma composição de reagentes de partículas oligoméricos que são compostos e/ou contêm uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e que contêm uma pluralidade de sítios de ligação que se ligam reversivelmente a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos têm um raio mé~ dio(average), médio(mean) ou mediano entre 50 nm e 150 nm; um peso molecular médio(average), médio(mean) ou mediano entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol; e/ou uma quantidade média(average), média(mean) ou mediana entre 2.000 e 4.000 tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, pelo menos 95 % dos reagentes de partículas oligoméricos da composição têm um raio, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros que está dentro
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103/378 de ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 % ± 1 % do raio médio(average), médio(mean) ou mediano, peso molecular ou uma quantidade de tetrâmeros dos reagentes de partículas oligoméricos da composição. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos não sofrem um aumento no tamanho superior a 10 % quando armazenados a -80°C por pelo menos 9, 27 semanas ou 46 semanas.
[00175] Em algumas modalidades, qualquer um dos reagentes oligoméricos fornecidos é produzido pelo método para fabricar ou gerar reagentes oligoméricos descritos na Seção II.B abaixo.
6. Fabricação de reagentes de partículas oligoméricos
[00176] São aqui fornecidos métodos para gerar, produzir e/ou fabricar reagentes que são compostos de reagentes oligomerizados, isto é, reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos contêm vários sítios de ligação que são capazes de se ligar reversivelmente a um agente, por exemplo, um agente estimulador. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos contêm vários sítios de ligação que são capazes de se ligar reversivelmente a agentes, por exemplo, agentes estimuladores e/ou agentes de seleção, que reconhecem e/ou se ligam a uma ou mais moléculas expressas em uma célula. Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos são úteis para gerar, produzir e/ou fabricar reagentes de partículas oligoméricos de tamanho desejado ou alvo.
[00177] São aqui fornecidos métodos para fabricar, gerar e/ou produzir regentes que são reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são úteis para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos que contêm e/ou são compostos de uma pluralidade de moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em
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104/378 algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos que são reagentes solúveis. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem ou contêm uma etapa para incubar, tratar e/ou entrar em contato com moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, sob condições adequadas para oligomerlzar as moléculas. Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir os reagentes de partículas oligoméricos contêm uma etapa para separar os reagentes de partículas oligoméricos das moléculas que não oligomerizaram. Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos contêm uma etapa para estabilizar uma ou mais propriedades dos reagentes de partículas oligoméricos, por exemplo, tamanho de partícula.
[00178] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos contêm uma etapa para oligomerlzar as moléculas, uma etapa para remover moléculas oligomerizadas de moléculas que não olígomerizam e/ou uma etapa para estabilizar uma propriedade dos reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos contêm e/ou incluem uma ou mais etapas para adicionar um grupo funcional à molécula, por exemplo, um grupo funcional que é adequado para uma reticulação ou oligomerização reação. Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos contêm e/ou incluem uma ou mais etapas para adicionar um grupo funcional à molécula e uma ou mais etapas para oligomerlzar a molécula. Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos contêm e/ou inclu
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105/378 em etapas para adicionar um ou mais grupos funcionais às moléculas, uma etapa para oligomerizar as moléculas e uma etapa para separar os oligomerizados moléculas, por exemplo, partículas oligoméricas, de moléculas que não oligomerizaram.
[00179] Em certas modalidades, as moléculas que são oligomerizadas são proteínas, polipeptídeos, peptídeos e/ou moléculas que contêm ou incluem um ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, a molécula que é oligomerizada contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um agente, por exemplo, um agente de ligação ao receptor. Em algumas modalidades, a molécula que é oligomerizada contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um agente descrito na Seção II (C) (3). Em certas modalidades, a molécula que é oligomerizada contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de se ligar a um parceiro de ligação, por exemplo, um parceiro de ligação C. Em modalidades específicas, a molécula que é oligomerizada contém uma pluralidade de sítios de ligação que são capazes de ligação a um parceiro de ligação C descrito na Seção II (A). Em algumas modalidades, a molécula que é oligomerizada é ou inclui uma estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina, uma muteína de avidina ou análogo (como neutravidina). Em certas modalidades, a estreptavidina é um tetrâmero no estado nativo. Assim, em certas modalidades, a molécula é um tetrâmero de uma estreptavidina, uma muteína de estreptavidina ou análogo, avidina, uma muteína de avidina ou análogo (como neutravidina). Em modalidades particulares, a molécula é qualquer um dos reagentes descritos na Seção II (A). Em certas modalidades, a molécula é um tetrâmero dos reagentes descritos na Seção II (A).
[00180] Modalidades particulares consideram que as características, por exemplo, tamanho, dos reagentes de partículas oligoméricos que sâo fabricados, produzidos e/ou gerados pelos métodos aqui for
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106/378 necidos dependem do tempo das várias etapas, procedimentos e incubações, bem como em condições como pH e temperatura e as concentrações de regentes nas diferentes etapas ou estágios do procedimento. Assim, em modalidades particulares, uma ou mais etapas ou estágios dos métodos aqui fornecidos são executadas e/ou registradas com tempo e medições precisas, por exemplo, para garantir que quando os métodos aqui fornecidos forem repetidos, os reagentes de partículas oligoméricos fabricados resultantes terão tamanho e características iguais ou semelhantes a outras bateladas ou lotes produzidos pelos métodos aqui fornecidos. Por exemplo, em algumas modalidades, os tampões e reagentes são medidos para estar dentro de ± 10 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % do alvo ou da quantidade ou concentração desejada. Em certas modalidades, as reações, por exemplo, uma incubação, tratamento ou contato são realizadas a um pH desejado ou alvo com um pH de ± 1, ± 0,5, ± 0,1, ± 0,05, ± 0,04, ± 0,03, ± 0,02, ± 0,01, ± 0,001 ou ± 0,0001. Em modalidades particulares, uma incubação, tratamento ou contato é realizada por 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 90 segundos, 60 segundos, 45 segundos, 30 segundos, 15 segundos, 10 segundos, 5 segundos ou dentro de 1 segundo de um destino ou quantidade de tempo desejada. Em modalidades particulares, o tempo entre etapas, estágios e/ou reações, por exemplo, incubações ou tratamento, é de 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 90 segundos, 60 segundos, 45 segundos, 30 segundos, 15 segundos, 10 segundos, 5 segundos ou dentro de 1 segundo de um destino definido ou do tempo desejado.
[00181] Em algumas modalidades, características particulares dos métodos aqui fornecidos para a fabricação, produção ou geração de reagentes de partículas oligoméricos são críticas para a produção consistente de reagentes de partículas oligoméricos. Por exemplo, em
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107/378 algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos incluem uma etapa para tiolar as moléculas, por exemplo, incubando moléculas com um agente de tiolação, e o tempo, o pH e/ou as concentrações e quantidades de reagentes da incubação caem todas dentro de ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % do valor alvo ou desejado, para obter uma produção consistente de reagentes de partículas oligoméricos. Em certas modalidades, a quantidade de tempo entre o final da etapa para tiolar as moléculas e a etapa para oligomerizar as moléculas, por exemplo, incubando moléculas ativadas e tioladas, cai dentro de ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % de um período de tempo desejado ou desejado. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos incluem uma etapa para ativar as moléculas, por exemplo, incubando moléculas com um agente de ativação que adiciona grupos funcionais às moléculas e o tempo, o pH e/ou as concentrações e quantidades de reagentes da incubação caem dentro de ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % do alvo ou dos valores desejados para obter uma produção consistente de reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares, o tempo, o pH e/ou as concentrações e quantidades de reagentes para a etapa de oligomerização das moléculas caem dentro de ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % dos valores alvo ou desejados para obter uma produção consistente de reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares, a produção consistente de reagentes de partículas oligoméricos resulta ou inclui a produção de bateladas ou lotes consistentes. Assim, em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos resultam em bateladas ou lotes consistentes de reagentes de partículas oligoméricos. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos resultam em bateladas ou lotes de reagentes de partículas oligoméricos com tamanhos médios, por exemplo, médios de partículas que caem dentro de ± 50 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %,
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108/378 ± 4 %, ± 3 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,01 % ou ± 0,001 % da média, por exemplo, média, tamanho de partícula do bateladas ou lotes fabricados, produzidos ou gerados pelos métodos aqui descritos.
[00182] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos incluem uma etapa de ativação de moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, incubando, tratando e/ou entrando em contato com as moléculas com um agente de ativação. Em certas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar a uma molécula um grupo funcional que reage ou é capaz de reagir em uma reação de reticulação. Em algumas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar o grupo funcional a uma ou mais aminas da molécula. Em algumas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar a uma molécula um grupo reativo a amina, um grupo reativo à sulfidrila ou reativo a tiol, um grupo reativo a aldeído, um grupo fotorreativo e/ou um grupo reativo à hidroxila. Em algumas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar a uma molécula um grupo reativo à sulfidrila ou reativo a tiol. Em certas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar a uma molécula um grupo haloacetila, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acriloíla, um agente de arilação, um grupo vinililsulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfureto. Em certas modalidades, o agente de ativação adiciona ou é capaz de adicionar a um grupo maleimida à molécula. Em certas modalidades, o agente de ativação é ou contém 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo SMCC) e/ou Succinimidil-6-[(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH).
[00183] Em modalidades particulares, as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, são incu
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109/378 badas, tratadas e/ou contatadas com um agente de ativação sob condições adequadas para ativar as moléculas, ou seja, adicionar um ou mais grupos funcionais às moléculas. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada a um pH neutro. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada a um pH entre 5,0 e 9,0, entre 6,0 e 8,0, entre 6,5 e 7,5 ou entre 7,0 e 7,5. Em certas modalidades, a incubação, o tratamento ou o contato do agente de ativação com as moléculas é realizada a um pH de cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4 ou cerca de 7,5. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 7,2. Em modalidades particulares, o pH é 7,2 ± 0,1, ± 0,05, ± 0,02, ± 0,01, ± 0,005 ou ± 0,0001.
[00184] Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, é realizada a uma temperatura constante. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) a uma temperatura de pelo menos 4°C, pelo menos 8°C, pelo menos 12°C, pelo menos 12°C, pelo menos 16°C, pelo menos 20°C, pelo menos 24°C, pelo menos 28°C, pelo menos 32°C, pelo menos 37°C, pelo menos 39°C, pelo menos 50°C, pelo menos 60°C, pelo menos 70°C, pelo menos 80°C, pelo menos 90°C ou pelo menos 100°C. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 37°C, entre 10°C e 25°C, entre 20°C e 30°C, entre 24°C e 39°C, ou entre 40°C e 100°C. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para
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110/378 oligomerizar as moléculas é realizada a ou a cerca de 24°C. n modalidades, a incubação e/ou tratamento para ativar as moléculas é realizada a 24°C ± 2°C, ± 1 °C, ± 0,5°C, ± 0,2°C, ± 0,1 °C, ± 0,05°C ou ± 0,01 °C.
[00185] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, é realizada por um período de tempo. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) por entre 5 minutos e 1 hora, entre 15 minutos e 2 horas, entre 30 minutos e 90 minutos, entre 1 hora e 6 horas, entre 6 horas e 24 horas ou mais de 24 horas. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) por cerca de 5 minutos, 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 18 horas, cerca de 20 horas ou cerca de 24 horas. Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) por ou por cerca de 1 hora. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada por 1 hora ± 5 minutos, ± 2 minutos, ± 1 minuto, ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo.
[00186] Em modalidades particulares, o agente de ativação é incubado, tratado e/ou contatado com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, a uma relação molar do agente de ativação para as moléculas. Em certas modalidades, a relação molar da molécula para o agente de ativação é ou é de cerca de 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9 ou 1 : 10. Em modalidades particulares, a proporção molar da molécula para o agen
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111/378 te de ativação é 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9 ou 1 : 10, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %. Em certas modalidades, a relação molar é de 1 : 2, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %. Em algumas modalidades, o a relação molar é de 1 : 2 ± 5 %. Em modalidades particulares, a relação molar 1 : 2 ± 2 %.
[00187] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato com o agente de ativação e as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, terminam removendo o agente de ativação das moléculas. Em algumas modalidades, o agente de ativação é removido das moléculas por cromatografia. Em certas modalidades, o agente de ativação é removido das moléculas por cromatografia de filtração em gel, por exemplo, com uma coluna de dessalinização.
[00188] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem uma etapa de moléculas de tiolação, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, incubando, tratando e/ou entrando em contato com as moléculas com um agente de tiolação. Em certas modalidades, o agente de tiolação é um agente que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tiol a uma molécula. Em algumas modalidades, o agente de tiolação é um agente que adiciona ou é capaz de adicionar o grupo funcional tiol a uma ou mais aminas livres. Em algumas modalidades, o grupo funcional tiol é adicionado ao grupo amina de terminal N e/ou a aminas livres presentes nos resíduos de lisina da molécula. Em certas modalidades, o agente de tiolação é ou contém um composto tioimidato cíclico. Em modalidades particulares, o agente de tiolação é ou contém 2iminotiolano (reagente de Traut). Em algumas modalidades, o agente de tiolação é ou contém 2-iminotiolano e adiciona um grupo funcional
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112/378 tiol a uma amina livre em uma reação, como ilustrado abaixo:
\____/
2-iminothlano
R-nh2
Amina
NHj cF ................................>- R- - wx. ,SH
H
Modificação produzindo grupo tiol terminai
[00189] Em modalidades particulares, o agente de tiolação, por exemplo, 2-iminotiolano, é adquirido, armazenado e/ou obtido como um cloridrato, por exemplo, um sal de 2-iminotiolano-HCI. Assim, em algumas modalidades, a adição do 2-iminotiolano a uma solução induz uma queda significativa no pH da solução. Em certas modalidades, a solução pode ser tamponada para impedir ou reduzir a queda no pH. Modalidades particulares consideram que as reações de tiolação realizadas a um pH ácido e/ou a um pH abaixo de 7,0 limitam a disponibilidade de resíduos de Usina, por exemplo, limitam a disponibilidade de aminas livres nos resíduos de lisina e, portanto, limitam a quantidade de grupos funcionais tiol adicionados a a molécula pelo reagente de tiolação. Em certas modalidades, os grupos amina nos resíduos de lisina podem tornar-se protonados a um grau que reduz ou impede a capacidade de tiolação e/ou a adição de funções tiol aos grupos amina em valores de pH ácidos e/ou em valores de pH inferiores a 7,0. Assim, em certas modalidades, a acidez da solução contendo o agente de tiolação é ajustada e/ou neutralizada para aumentar a eficiência da reação de tiolação.
[00190] Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas Inclui adicionar o agente de tiolação a um tampão com um pH básico ou um pH acima de 7,0 antes ou no início da incubação, tratamento, do contato do agente de tiolação com as moléculas. Em modalidades particulares, o agente de tiolação é adicionado a um tampão que possuí um pH de pelo menos 7,0, pelo menos 7,2, pelo menos 7,4, pelo menos 7,6, pelo
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113/378 menos 7,8, pelo menos 7,8, pelo menos 8,0, pelo menos 8,1, pelo menos 8,1, pelo menos 8,2, pelo menos pelo menos 8,3, pelo menos 8,4, pelo menos 8,5, pelo menos 8,6, pelo menos 8,7, pelo menos 8,8, pelo menos 8,9, pelo menos 9,0, pelo menos 9,5 ou pelo menos 10,0 antes ou no inicio da incubação, tratamento, do contato do agente de tiolação com as moléculas. Em certas modalidades, o agente de tiolação é adicionado a um tampão com um pH de cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de8,1, cerca de 8,1, cerca de 8,3, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, cerca de9,0, cerca de 9,1, cerca de 9,2, cerca de 9,3, cerca de 9,4 ou cerca de 9,5 antes ou no início da incubação, tratamento ou contato do agente de tiolação com as moléculas. Em algumas modalidades, o pH do tampão é de cerca de 8,5. Em modalidades particulares, o pH do tampão é 8,5 ± 0,1, ± 0,05, ± 0,02, ± 0,01, ± 0,005 ou ± 0,0001. Em algumas modalidades, o tampão contém um agente tampão com um pKa em temperatura ambiente superior a 7,0, superior a 7,5, superior a 8,0, superior a 8,5 ou superior a 9,0. Em modalidades particulares, o agente de tamponamento é ou inclui TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, trlcino, Gly-gly, bicino, HERBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS e/ou bo rato. Em certas modalidades, o tampão é ou contém um tampão de borato. Em modalidades particulares, o tampão borato contém pelo menos 25 mM de borato, pelo menos 50 mM de borato, pelo menos 75 mM de borato ou cerca de ou pelo menos 100 mM de borato. Em modalidades particulares, o tampão é ou inclui 100 mM ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 % de borato.
[00191] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada a um pH básico ou a um pH acima de 7,0. Por exemplo, em algumas modalida
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114/378 des, o pH da solução quando o agente de tiolação e as moléculas são adicionados é um pH básico ou um pH acima de 7,0. Em algumas modalidades, o pH durante a incubação, tratamento ou contato do agente de tiolação com as moléculas entre 7,0 e 11,0, entre 7,0 e 9,0, entre 7,5 e 8,5, ou entre 7,5 e 8,0. Em certas modalidades, a incubação, o tratamento ou o contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada a um pH de cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,3, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9 ou cerca de 8,0. Em algumas modalidades, o pH é ou é de cerca de 7,7 durante a incubação, tratamento ou contato do agente de tiolação com as moléculas. Em modalidades particulares, o pH é 7,7 ±0,1, ± 0,05, ± 0,02, ± 0,01, ± 0,005 ou ± 0,0001 durante a incubação, tratamento ou contato do agente de tiolação com as moléculas.
[00192] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, é realizada por um período de tempo. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realízado(s) por entre 5 minutos e 1 hora, entre 15 minutos e 2 horas, entre 30 minutos e 90 minutos, entre 1 hora e 6 horas, entre 6 horas e 24 horas ou mais de 24 horas. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(sâo) realizado(s) por cerca de 5 minutos, 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 6 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, aproximadamente 16 horas, cerca de 18 horas, cerca de 20 horas ou cerca de 24 horas. Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) por ou por cerca de 1 ho
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115/378 ra. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada por 1 hora ± 5 minutos, ± 2 minutos, ± 1 minuto, ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é(são) realizado(s) por ou por cerca de 25 minutos. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada por 25 minutos ± 5 minutos, ± 2 minutos, ± 1 minuto, ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo.
[00193] Modalidades particulares consideram que a incubação, tratamento e/ou contato de uma molécula, por exemplo, uma molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, resulta em uma primeira reação que adiciona o grupo funcional tiol desejado. No entanto, em algumas modalidades, o grupo funcional tiol desejado pode reisomerizar em uma forma N-substituída mais estável, mas inativa. Assim, em algumas modalidades, a tiolação de uma molécula por 2-iminotiolano adiciona um grupo funcional tiol à molécula que pode reisomerizar a uma forma N-substituída mais estável sem a mesma reatividade que o grupo funcional tiol (Singh et al. Anal Biochem 236 (1): 114-1125 (1996)). Uma representação dessa reação é mostrada abaixo:
u ..x ü _ Λ + R' Y ) ----♦ R· Y SH 1 o .1 tenta .
Amina 2-iminotk>l3no L J fápída | í1 ír^Y''‘wYsh wtí
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[00194] Portanto, em algumas modalidades, a tiolação de uma molécula com 2-iminotiolano não deve resultar em uma curva de saturação padrão e, em vez disso, resultará em uma curva em que o nível ou a quantidade de grupos funcionais tiol que estão presentes nas moléculas, por exemplo, estreptavidina ou tetrâmeros de muteína de estreptavidina, atingirão um nível de pico ou máximo e deverão cair novamente após atingirem o máximo. Em certas modalidades, a meiavida de um grupo funcional tiol é de 139 minutos.
[00195] Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol ligados às moléculas que é alcançado durante uma reação de tiolação é influenciado pelo pH das soluções em que a reação ocorre. Em certas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é maior quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão com um pH mais básico do que quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão que é menos básico. Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é alcançado em um período menor de tempo quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão com um pH mais básico do que quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão que é menos básico. Em certas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é maior quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão com um pH de ou de cerca de 8,5 do que quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão que é menos básico, por exemplo, um tampão com um pH de 8,3. Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é alcançado em um período menor de tempo quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão com um pH de ou de cerca de 8,5 do que quando o agente de tiolação é adicionado a um tampão que é menos básico, por exemplo, um tampão com um pH de 8,3. Em certas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é maior quando o pH da solução
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117/378 na qual a incubação, o tratamento e/ou o contato com o agente de tiolação e a molécula estão em ou a um pH de 7,7 durante a reação do que quando a incubação, tratamento e/ou contato ocorrem em uma solução com um pH inferior a 7,7 durante a reação, por exemplo, um pH de cerca de 6,9. Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é alcançado em um período menor de tempo quando o pH da solução em que a incubação, o tratamento e/ou o contato com o agente de tiolação e a molécula está em ou aproximadamente um pH de 7,7 durante a reação do que quando a incubação, tratamento e/ou contato ocorre em uma solução com um pH menor que 7,7 durante a reação, por exemplo, um pH de cerca de 6,9.
[00196] Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol que são adicionados à molécula é uma média (por exemplo, média) que é expressa como uma quantidade de grupos funcionais tiol que são adicionados à molécula. Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40 ou pelo menos 50 grupos funcionais tiol. Em algumas modalidades, o nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol que são adicionados a cada molécula é a porcentagem média (por exemplo, média) de resíduos de lisina por molécula com um grupo funcionai de tiol conectado ou adicionado. Em certas modalidades, o nível máximo ou de pico é de pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 99 % dos resíduos de lisina com um grupo funcional tiol ligado ou adicionado. Em modalidades particulares, a molécula é um tetrâmero de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e o nívei
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118/378 de pico ou máximo de grupos funcionais tiol é de pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15 ou pelo menos 16 grupos funcionais tiol por tetrâmero.
[00197] Em algumas modalidades, a molécula é incubada, tratada e/ou contatada com um agente de tiolação por um período de tempo suficiente para atingir um nível de pico ou máximo de grupos funcionais tiol que são adicionados à molécula. Em modalidades particulares, o nível máximo ou de pico é alcançado em 1 minuto, em 2 minutos, em 5 minutos, em 10 minutos, em 15 minutos, em 20 minutos, em 25 minutos, em 25 minutos, em 30 minutos, em 45 minutos, em 60 minutos, dentro de 90 minutos ou dentro de 120 minutos após a incubação, tratamento ou contato do agente de tiolação com a molécula.
[00198] Em modalidades particulares, o agente de tiolação é incubado, tratado e/ou contatado com a molécula, e a quantidade de grupos funcionais tiol que são adicionados ou anexados às moléculas atinge um nível de pico ou máximo e então começa a declinar uma vez o máximo ou pico foi atingido. Em algumas modalidades, a incubação, contato e/ou tratamento termina após o nível de pico ou máximo foi atingido. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento ou contato é finalizada antes ou a quantidade de grupos funcionais tiol ligados às moléculas é 50 % menor, 40 % menor, 30 % menor, 25 % menor, 20 % menor, 15 % menor, 10 % a menos, 5 % a menos ou 1 % a menos que o nível de pico ou máximo. Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato é encerrada em um ponto no tempo em que a quantidade média (por exemplo, média) de grupos funcionais tiol é de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos
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30, peto menos 40 ou peto menos 50 grupos funcionais tiol. Em algumas modalidades, a incubação, contato e/ou tratamento termina em um momento no qual pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, a 65 %, peto menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % dos resíduos de lisina têm um grupo funcional tiol ligado ou adicionado. Em modalidades particulares, a molécula é um estreptavidina ou um tetrâmero de muteína de estreptavidina e a incubação, contato e/ou tratamento termina em um momento no qual a quantidade de grupos funcionais tiol é de pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, peto menos 14, peto menos 15 ou pelo menos 16 grupos funcionais tiol por tetrâmero. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e da molécula é finalizada após 1 hora. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e da molécula é finalizada após 25 minutos.
[00199] Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, é realizada a uma temperatura constante. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada a uma temperatura de pelo menos 4°C, peto menos 8°C, pelo menos 12°C, pelo menos 16°C, pelo menos 20°C, pelo menos 24°C, pelo menos 28°C, pelo menos 32°C, pelo menos 37°C, pelo menos 39°C, peto menos 50°C, pelo menos 60°C, pelo menos 70°C, peto menos 80°C, pelo menos 90°C ou pelo menos 100°C. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 37°C, entre 10°C e 25°C, entre 20°C e 30°C, entre
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24°C e 39°C, ou entre 40°C e 100°C. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a ou a cerca de 24°C. Em certas modalidades, a incubação e/ou tratamento para a tiolação das moléculas é realizada a 24°C ± 2°C, ± 1°C, ±0,5°C, ±0,2°C, ±0,1°C, ±0,05°C ou ±0,01 °C.
[00200] Em modalidades particulares, o agente de tiolação é incubado, tratado e/ou contatado com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, em uma relação molar do agente de tiolação para as moléculas. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e das moléculas é realizada a uma relação molar entre 1 : 1 a 10 : 1 do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e das moléculas é realizada em uma relação molar de 5: 1 do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula. Em certas modalidades, a relação molar do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula é ou é de cerca de 10 : 1,9: 1,8: 1,7: 1, 6 : 1, 5: 1, 4: 1, 3 : 1, 2 : 1 ou 1 : 1. Em modalidades particulares, a proporção molar do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula é 10 : 1, 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6 : 1, 5: 1, 4: 1, 3 : 1, 2 : 1 ou 1 : 1, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %. Em certas modalidades, a relação molar é de 1 : 5, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %. Em certas modalidades, o a proporção molar do agente de tiolação para a molécula é de 1 : 1 e 1.000 : 1, entre 1 : 1 e 500 : 1, entre 10 : 1 e 200 : 1 ou entre 100 : 1 e 1.000 : 1. Em modalidades particulares, a relação molar do agente de ativação para a molécula é de cerca de 100 : 1. Em certas modalidades, a relação molar é de 100 : 1, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1
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121/378 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %.
[00201] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, termina removendo ou separando o agente de tiolação das moléculas. Métodos para remover ou separar moléculas, por exemplo, moléculas de proteína ou polipeptídeo, como estreptavidina, são rotineiros na e incluem métodos como cromatografia e/ou filtração em gel. Em algumas modalidades, o agente de tiolação é removido das moléculas por cromatografia. Em certas modalidades, o agente de ativação é removido das moléculas por cromatografia de filtração em gel, por exemplo, com uma coluna de dessalinização.
[00202] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos contêm e/ou incluem uma etapa de moléculas de oligomerização. Em certas modalidades, as moléculas são oligomerizadas pela reticulação de moléculas individuais ou de um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos incluem uma ou mais etapas de tratamento, incubação e/ou contato de moléculas com um agente que promove a oligomerização. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas são oligomerizadas por Incubação, tratamento e/ou contato das moléculas com um agente, por exemplo, um agente de ativação, que é um ligante ou reticulador, por exemplo, um ligante bifuncional ou reticulador ou outro ligante químico. Em algumas modalidades, o ligante ou reticulador é ou inclui um ligante bifuncional. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante homobifuncional, por exemplo, um ligante com pelo menos dois grupos funcionais e/ou reativos iguais. Em modalidades particulares, o ligante é um ligante heterobifuncional, por exemplo, um ligante com pelo menos dois grupos funcionais e/ou rea
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122/378 tivos que são diferentes. Em certas modalidades, as moléculas são incubadas com um ligante para oligomerizar ou tornar-se capaz de ollgomerizar. Os Hgantes adequados para moléculas de oligomerização são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, glutaraldeído, dl· metil adipimidato (DMA), dimetil suberimidato (DMS), dimetil pimelimidato (DMP), dimetil pimelimidato (DMP), N~ hidroxissuccinimida (NHS), ditiobis (succinimidilpropionato) (DSP), ditiobis (sulfossuccinimidilpropionato) (DTSSP), etileno glicol bis [succininimidilsucclnato], éster de NHS, ácido Ν-ε-maleimidocaproico, ácido N-[e-maleimidocaproico] hidrazida, N-succinimidil S-acetiltioacetato, N-succinimidil S-acetiltiopropionato, 2~iminotiolano (reagente de Traut), 4-Succinimidiloxicarbo~ ηΙΙ^βίίΗ2-ρί^ί^ί1Ιο)~ΤοΙυβηο53υΙίθ53θοαηίιτ^ίΐ3, 4-[N-maleimidometil]-ciclo-hexano-1-carboxilato, éster de N-[gama-Maleimidobutirilóxi] sulfo-succinimida, éster de N~(K~maleimidoundecanoilóxi)Sulfossucci~ nimida, éster de N-Hidroxissuccinimida de ácido maleimidoacético, Ácido N-(Épsilon-IVIaleimidocaproico) Hidrazida, Ácido N-(K-Maleiml· doundecanoico) Hidrazida, Ácido N-(Beta-Maleimidoundecanoico) Hi~ drazida, Ácido N-(Beta-Maleimidopropiônico) e 3-(2-Piridilditiol)Propionil Hidrazida.
[00203] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos contêm e/ou incluem moléculas de oligomerização que foram modificadas, por exemplo, quimicamente modificadas. Em modalidades particulares, uma ou mais moléculas modificadas são oligomerizadas. Em modalidades particulares, a uma ou mais moléculas são ativadas. Em certas modalidades, a molécula modificada é uma molécula ativada que foi ativada pela adição e/ou ligação de um grupo funcional que reage ou é capaz de reagir em uma reação de reticulação e/ou oligomerização. Em algumas modalidades, o grupo funcional é adicionado ou anexado a uma amina, por exemplo, uma amina primária, da molécula, por exemplo, uma amina disponível e/ou livre. Em algumas modalida
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123/378 des, a amina, por exemplo, a amina primária é uma amina de terminal N. Em modalidades particulares, a amina, por exemplo, a amina primária em um resíduo de lisina. Em algumas modalidades, a molécula ativada foi modificada pela adição e/ou ligação de um grupo funcional que é ou inclui um grupo reativo a amina (por exemplo, um éster de Nhidroxissuccinimida, imidoéster, éster pentafluorofílico ou hidroximetil fosfina), um grupo reativo à sulfidrila ou reativo a tiol (por exemplo, uma maleimida, um haloacetila, um piridildissulfeto, um tiossulfonato ou um vinilsulfona), um grupo reativo a aldeído (por exemplo, uma hidrazida ou alcoxiamina), um grupo fotorreativo (por exemplo, uma diazirina ou uma aril azida) e/ou um grupo reativo à hidroxila (por exemplo, ísocíanato). Em algumas modalidades, a molécula ativada foi ativada pela adição e/ou ligação de um grupo reativo à sulfidrila ou reativo a tiol. Em certas modalidades, a molécula ativada foi ativada pela adição e/ou ligação de um grupo haloacetila, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acriloíla, um agente de arilação, um grupo vinililsulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfeto. Em certas modalidades, a molécula ativada foi ativada pela adição e/ou ligação de um grupo maleimida.
[00204] Em certas modalidades, uma molécula que foi modificada é uma molécula tiolada. Em modalidades particulares, a molécula modificada foi modificada por tiolação, por exemplo, a adição de um tiol (isto é, um grupo tiol, função de tiol ou um grupo funcional tiol). Em modalidades particulares, a molécula tiolada foi tiolada pelo anexo/ou adição de um grupo funcional tiol a um ou mais resíduos de lisina.
[00205] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos contêm e/ou incluem uma etapa de incubação, tratamento ou contato de moléculas ativadas com moléculas tioladas. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato oligomeriza e/ou
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124/378 resulta em uma reação de oligomerização entre as moléculas tioladas e as moléculas ativadas. Em modalidades particulares, os oligômeros da molécula são formados por incubação, tratamento e/ou contato de moléculas tioladas com moléculas ativadas. Em certas modalidades, a molécula ativada possui um ou mais grupos maleimida ligados. Em modalidades particulares, a molécula ativada é ou inclui uma molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada. Em certas modalidades, a molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativada é ou inclui molécula de astreptavidina ou muteína de estreptavidina com um ou mais grupos de maleimida ligados. Em modalidades particulares, a molécula tiolada é uma molécula de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina. Em algumas modalidades, a molécula de estreptavidina tiolada ou muteína de estreptavidina é uma molécula de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um ou mais grupos funcionais tiol. Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos incluem uma etapa de incubar, entrar em contato e/ou tratar os tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina tiolados com os tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina ativados, por exemplo, para oligomerizar os tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[00206] Em modalidades particulares, as moléculas são oligomerizadas por uma reação de reticulação. Em algumas modalidades, uma porção das moléculas foi tiolada pela adição de um ou mais grupos funcionais tiol à molécula. Em certas modalidades, os grupos tiol são adicionados a grupos amina livres da molécula, por exemplo, em amina, por exemplo, amina primária, grupos de resíduos de lisina e/ou uma amina de terminal N, por exemplo, uma amina primária de terminal N. Em algumas modalidades, uma porção das moléculas que são separadas das moléculas tioladas é ativada pela adição ou ligação de grupos maleimida. Em algumas modalidades, as moléculas ativadas
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125/378 não contêm resíduos de cisteína e/ou grupos funcionais tiol. Portanto, em algumas modalidades, as moléculas ativadas não são reativas com outras moléculas ativadas. Em algumas modalidades, as moléculas ativadas e tioladas são incubadas e ocorre uma reação de reticulação entre os grupos funcionais maleimida das moléculas ativadas e o grupo funcional tiol das moléculas tioladas. Por exemplo, uma reação de reticulação entre um grupo funcional maleimida na molécula R e um grupo funcional tiol (SH) na molécula P é ilustrada abaixo:
.-/'Ή í’1-'8·”·5 ’'CríTT) í R Μ Ώ ·!· Í P ) --------ÍrW SÒ a—X
[00207] Em algumas modalidades, a reação entre o grupo funcional tiol e o grupo funcional maleimida é adequada de moléculas de reticulação para formar oligômeros. Em certas modalidades, as moléculas são tetrâmeros estreptavidina ou muteína de estreptavidina.
[00208] Em modalidades particulares, as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina são incubadas e/ou tratadas sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas. Em modalidades particulares, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a um pH neutro. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a um pH entre 5,0 e 9,0, entre 6,0 e 8,0, entre 6,5 e 7,5 ou entre 7,0 e 7,5. Em certas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a um pH de cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 7,2. Em modalidades particulares, o pH é 7,2 ± 0,1, ± 0,05, ± 0,02, ± 0,01, ± 0,005 ou ± 0,0001.
[00209] Em algumas modalidades, as moléculas, por exemplo, molécula de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina,
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126/378 são incubadas e/ou tratadas sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas, e as condições adequadas incluem temperatura. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a uma temperatura de pelo menos 4°C, pelo menos 8°C, pelo menos 12°C, pelo menos 16°C, pelo menos 20°C, pelo menos 24°C, pelo menos 28°C, pelo menos 32°C, pelo menos 37°C, pelo menos 39°C, pelo menos 50°C, pelo menos 60°C, pelo menos 70°C, pelo menos 80°C, pelo menos 90°C ou pelo menos 100°C. Em modalidades particulares, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 37°C, entre 10°C e 25°C, entre 20°C e 30°C, entre 24°C e 39°C, ou entre 40°C e 100°C. Em modalidades particulares, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a ou a cerca de 24°C. Em certas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada a 24°C ± 2°C, ± 1°C, ± 0,5°C, ± 0,2°C, ± 0,1°C, ± 0,05°C, ou ± 0,01°C.
[00210] Em certas modalidades, as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina, são incubadas e/ou tratadas sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas por um período de tempo. Em algumas modalidades, as moléculas são incubadas e/ou tratadas sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas por entre 5 minutos e 1 hora, entre 15 minutos e 2 horas, entre 30 minutos e 90 minutos, entre 1 hora e 6 horas, entre 6 horas e 24 horas ou mais de 24 horas. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada por cerca de 5 minutos, 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 6 horas,
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127/378 cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 18 horas, cerca de 20 horas ou cerca de 24 horas. Em certas modalidades, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada por ou por cerca de 1 hora. Em modalidades particulares, a incubação e/ou tratamento para oligomerizar as moléculas é realizada por 1 hora ± 5 minutos, ± 2 minutos, ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo.
[00211] Em modalidades particulares, moléculas ativadas e tioladas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina, são incubadas e/ou tratadas oligomerizam as moléculas na proporção molar de moléculas ativadas para moléculas tioladas. Em modalidades particulares, a relação molar de moléculas ativadas para moléculas tioladas 1 : X. Em algumas modalidades, X é o número, isto é, a soma, de lisinas e aminas do terminal N na molécula tiolada. Em algumas modalidades, X é o número de grupos amina livres ou disponíveis na molécula. Em algumas modalidades, X é o número de lisinas na molécula tiolada antes da adição de grupos funcionais tiol. Em modalidades particulares, a proporção molar de moléculas ativadas para moléculas tioladas é ou é de cerca de 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9 ou 1 : 10. Em modalidades particulares, a proporção molar de moléculas ativadas para moléculas tioladas é 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7, 1 : 8, 1 : 9, ou 1 : 10, ± %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %.
Em certas modalidades, a relação molar é de 1 : 4, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ± 0,05 % ou ± 0,001 %.
[00212] Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato sob condições para oligomerizar as moléculas, por exemplo, estreptavidina ou os tetrâmeros de muteína de estreptavidina terminam adicionando um ou mais reagentes, por exemplo, um agente químico,
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128/378 que termina e/ou é capaz de terminar a reação de oligomerização. Em algumas modalidades, o agente é um agente que modifica ou impede que um ou mais grupos funcionais, por exemplo, grupos funcionais maleimida ou tiol, reajam em uma reação de reticulação ou oligomerização. Em algumas modalidades, as moléculas são ativadas e moléculas tioladas e o um ou mais agentes é ou inclui um agente que satura os grupos de maleimida disponíveis, como adicionando e/ou anexando um grupo de tiol ou que cliva e/ou desanexa grupos de maleimida de as moléculas. Em algumas modalidades, grupos de maleimida que não reagiram podem ser removidos por um agente que eleva o pH. Em certas modalidades, o pH elevado resultaria na remoção e/ou desprendimento de grupos de maleimida que não reagiram, enquanto grupos de maleimida reticulados seriam estáveis. Em certas modalidades, o um ou mais agentes incluem agente que catalisa uma hidrólise do sistema de anel de maleimida, por exemplo, por uma reação de abertura do anel. Em algumas modalidades, as moléculas são ativadas e moléculas tioladas e o um ou mais agentes é ou inclui um agente modifica e/ou satura grupos funcionais tiol. Em algumas modalidades, a saturação e/ou modificação dos grupos funcionais tiol impede a oligomerização e/ou reações de reticulação com grupos maleimida. Em algumas modalidades, moléculas ativadas e tioladas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina, são incubadas, tratadas e/ou contatadas com N-etilmaleimida (NEM) para terminar a oligomerização e/ou reações de reticulação.
[00213] Em algumas modalidades, as moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina, são incubadas, tratadas e/ou contatadas com um agente que termina e/ou é capaz de terminar a oligomerização e/ou a reação de reticulação. Em algumas modalidades, o agente que termina e/ou é capaz de terminar a oligomerização e/ou reações de reticulação é in
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129/378 cubado, tratado e/ou contatado com as moléculas a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 4°C e 25°C, entre 4°C e 10°C, ou entre 20°C e 30°C. Em modalidades particulares, a incubação, o tratamento e/ou o contato são realizados inicialmente em temperatura ambiente e depois realizados a cerca de 4°C. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato é inicialmente realizada a ou a cerca de 24°C e é então realizada a cerca de 4°C. Em certas modalidades, a incubação, tratamento ou contato é realizada inicialmente por cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 90 minutos ou cerca de 120 minutos em temperatura ambiente e/ou a cerca de 24°C e, em seguida, é incubada, contatada e/ou tratada por cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas, cerca de 24 horas ou mais de 24 horas a cerca de 4°C. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento ou contato é realizada inicialmente por cerca de 15 minutos em temperatura ambiente e/ou a cerca de 24°C e, em seguida, realizada por cerca de 16 horas a cerca de 4°C. Em certas modalidades, a incubação, tratamento ou contato com o NEM é inicialmente realizada por cerca de 15 minutos em temperatura ambiente e/ou a cerca de 24°C e, em seguida, é incubada, contatada e/ou tratada por cerca de 16 horas em cerca de 4°C.
[00214] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem etapas para moléculas de tiolação e para ativar moléculas. Em certas modalidades, diferentes populações ou pluralidades das moléculas são tioladas a partir das populações ou pluralidades das moléculas que são ativadas. Em algumas modalidades, as etapas de ativação e tiolação são realizadas quase ao mesmo tempo, por exemplo, para que as moléculas tioladas e ativadas estejam dis
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130/378 poníveis para uma reação de incubação sem a necessidade de armazenar as moléculas tioladas ou ativadas enquanto o outro processo está ocorrendo. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas e a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas são realizadas ao mesmo tempo.
[00215] Em certas modalidades, pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % da incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizada enquanto a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizada. Em certas modalidades, pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos pelo menos 80 %, pelo menos, 90 % ou pelo menos 95 % da incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizado enquanto é realizada a incubação, o tratamento e/ou o contato do agente de tiolação com as moléculas.
[00216] Em algumas modalidades, pelo menos 1 minuto, pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 120 minutos, pelo menos 4 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas ou pelo menos 24 horas da incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas é realizado, enquanto é realizada a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas. Em modalidades particulares, pelo menos 1 minuto, pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos
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131/378 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 120 minutos, pelo menos 4 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas ou pelo menos 24 horas da incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação com as moléculas é realizado enquanto a incubação, tratamento e/ou o contato do agente de ativação com as moléculas é realizado.
[00217] Em algumas modalidades, a Incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas são iniciadas aproximadamente ao mesmo tempo. Em certas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas são iniciadas dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos, dentro de 10 minutos, dentro de 5 minutos, dentro de 1 minuto, dentro de 30 segundos, dentro de 15 segundos, dentro de 10 segundos, dentro de 5 segundos, dentro de 1 segundo um do outro. Em algumas modalidades, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas terminam aproximadamente ao mesmo tempo. Em modalidades particulares, a incubação, tratamento e/ou contato do agente de tiolação e a incubação, tratamento e/ou contato do agente de ativação com as moléculas terminam em 30 minutos, em 15 minutos, em 10 minutos, em 10 minutos, em 5 minutos, dentro de 1 minuto, dentro de 30 segundos, dentro de 15 segundos, dentro de 10 segundos, dentro de 5 segundos, dentro de 1 segundo um do outro.
[00218] Modalidades particulares consideram que, quando um grupo funcional tiol é anexado ou adicionado a uma molécula, o grupo funcional tiol pode isomerizar em uma forma N-substituída mais estável, mas inativa. Em alguns aspectos, o grupo funcional tiol é adicio
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132/378 nado ou anexado na presença de 2-iminotiolano (reagente de Trauts). Certas modalidades consideram que quando um grupo funcional tiol é anexado ou adicionado a uma molécula na presença de 2-iminotiolano (reagente de Trauts), o grupo funcional tiol pode isomerizar em uma forma N-substituída mais estável, mas inativa. Em certas modalidades, os grupos funcionais tiol se isomerizam com uma meia-vida de ou cerca de 139 minutos após a remoção do agente de tiolação. Assim, em algumas modalidades, a quantidade de grupos funcionais tiol nas moléculas após a incubação, tratamento e/ou contato com o agente de tiolação é reduzida ao longo do tempo.
[00219] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem etapas de moléculas de tiolação, moléculas ativadoras e oligomerização da molécula, por exemplo, incubação das moléculas ativadas e tioladas sob condições adequadas para oligomerização. Em modalidades particulares, a etapa de oligomerizar a molécula é programada para começar dentro ou em uma quantidade precisa de tempo após o término ou conclusão da etapa de tiolação. Em algumas modalidades, a etapa de oligomerizar a molécula é programada para começar dentro ou em um período preciso de tempo após a etapa de tiolação e a etapa de ativação ter sido concluída ou concluída.
[00220] Em modalidades particulares, a etapa de oligomerizar a molécula, por exemplo, incubar as moléculas ativadas e tioladas sob condições adequadas para oligomerização, é iniciada dentro de um período de tempo após o final da etapa de tiolação, por exemplo, a incubação da molécula com o agente de tiolação, terminou. Em certas modalidades, a etapa de oligomerizar a molécula é iniciada ou iniciada antes de uma perda, redução ou desintegração de 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % ou
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0,0001 % dos grupos funcionais tiol que estão ligados à molécula no final da etapa de tiolação. Em modalidades particulares, a etapa de oligomerizar a molécula é iniciada ou iniciada antes de uma perda, redução ou desintegração de 10 % dos grupos funcionais tiol que estão ligados à molécula no final da etapa de tiolação. Em algumas modalidades, a etapa o ng a molécula é iniciada ou iniciada dentro de 24 horas, dentro de 16 horas, dentro de 12 horas, dentro de 8 horas, dentro de 6 horas, dentro de 4 horas, dentro de 2 horas, dentro de 90 minutos, dentro de 60 minutos, dentro de 60 minutos, dentro de 45 minutos, dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos, dentro de 10 minutos, dentro de 5 minutos ou dentro de 1 minuto após o final da etapa de tiolação. Em certas modalidades, a etapa de oligomerizar a molécula é iniciada ou iniciada 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 90 minutos, 60 minutos, 45 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos, 5 minutos, ou 1 minuto ± 5 minutos, ± 2 minutos, ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo. Em certas modalidades, a etapa de oligomerização da molécula é iniciada ou iniciada dentro de 15 minutos após o final da etapa de tiolação. Em modalidades particulares, a etapa de oligomerizar a molécula é começado ou iniciado 10 minutos ± 1 minuto, ± 30 segundos, ± 15 segundos, ± 10 segundos, ± 5 segundos ou ± 1 segundo após o final da etapa de tiolação.
[00221] Em modalidades particulares, o fim da etapa de tiolação, por exemplo, a incubação da molécula com o agente de tiolação, é ou ocorre quando o agente de tiolação é removido das moléculas ou quando o processo de remoção do agente de tiolação é começado ou iniciado. Em algumas modalidades, o final da etapa de tiolação é ou ocorre quando o processo de remoção do agente de tiolação é começado ou iniciado. Em modalidades particulares, o processo de remoção do agente de tiolação é ou inclui cromatografia, por exemplo, cro
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134/378 matografia de filtração em gel. Em algumas modalidades, o final da etapa de tiolação é ou ocorre quando ou no instante em que a amostra ou solução contendo o agente de tiolação e as moléculas são vertidas em uma coluna de cromatografla, por exemplo, uma coluna de cromatografia de filtração em gel, para remover ou separar o agente de tiolação das moléculas. Em modalidades particulares, o inicio da etapa de oligomerização da molécula começa e/ou é iniciado quando as moléculas ativadas são contatadas, adicionadas e/ou misturadas com moléculas tioladas.
[00222] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem uma etapa de remoção e/ou separação de reagentes de partículas oligoméricos e/ou moléculas oligomerizadas de moléculas que não oligomerizaram. Em certas modalidades, a etapa de remover e/ou separar os reagentes de partículas oligoméricos e/ou moléculas oligomerizadas de moléculas que não oligomerizaram ocorre após a etapa de oligomerização das moléculas ter sido concluída ou finalizada.
[00223] Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligomerizadas e/ou os oligômeros das moléculas são removidos e/ou separados das moléculas que não oligomerizaram e das partículas de oligômeros que são inferiores ou inferiores a um tamanho limite. Em algumas modalidades, o limite de tamanho é ou inclui um raio de pelo menos 5 nm, pelo menos 10 nm, pelo menos 15 nm, pelo menos 20 nm, pelo menos 25 nm, pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, em pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 75 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 85 nm ou pelo menos 90 nm. Em certas modalidades, o limite de tamanho é ou inclui um peso molecular de pelo menos 100 kDa, pelo menos 500 kDa, pelo menos 1.000 kDa, pelo menos 2.000 kDa, pelo menos 5.000 kDa, pelo menos
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10.000 kDa, pelo menos 50.000 kDa, ou pelo menos 100.000 kDa. Em certas modalidades, o tamanho do limiar não afeta o tamanho médio (por exemplo, médio) e/ou a distribuição de tamanho dos reagentes de partículas oligoméricos produzidos pelos métodos aqui fornecidos.
[00224] Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos, por exemplo, oligômeros de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, são removidos e/ou separados de partículas que não foram oligomerizadas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Em algumas modalidades, SEC é uma técnica que permite a separação de moléculas por tamanho sem danificar ou destruir as moléculas, em que moléculas menores que um limite de exclusão são capturadas em uma coluna e moléculas maiores que o limite de exclusão passam pela coluna, por exemplo, sem retardo. Em certas modalidades, o limite de exclusão é um tamanho que fica entre 1 kDa e 100.000 kDa, entre 100 kDa e 10.000 kDa, entre 500 kDa e 1.000 kDa, entre 500 kDa e 5.000 kDa, entre 500 kDa e 5.000 kDa, entre 5.000 kDa e 20.000 kDa, entre 10.000 kDa e 50.000 kDa, ou entre 50.000 e 100.000 kDa. Em certas modalidades, o limite de exclusão é superior a o peso molecular de um monômero e/ou um tetrâmero da molécula. Em algumas modalidades, o limite de exclusão é superior a o peso molecular de um tetrâmero de estreptavidina ou muteína de estreptavidina. Em modalidades particulares, todas as partículas, por exemplo, partículas oligoméricas que passam através da coluna SEC, como no volume vazio, por exemplo, sem retardo, são coletadas.
[00225] Em modalidades particulares, quando a SEC é executada, a ordem na qual as moléculas sair da coluna está em relação ao tamanho das moléculas, assim, em algumas modalidades, o eluato da coluna pode ser coletado em diferentes frações. Em algumas modalidades, as frações podem ser combinadas ou descartadas para remover partículas de certos tamanhos. Por exemplo, em algumas modali
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136/378 dades, frações podem ser descartadas para remover partículas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, com tamanho menor que 100 kDa, menor que 500 kDa, menor que 1.000 kDa, menor que 2.000 kDa, menor que 5.000 kDa, menos de 10.000 kDa, menos de 50.000 kDa ou menos de 100.000 kDa. Em certas modalidades, a SEC remove reagentes de partículas oligoméricos de moléculas que não oligomerizaram, mas não afetam o tamanho médio (por exemplo, médio) e/ou a distribuição de tamanho dos reagentes de partículas oligoméricos produzidos pelos métodos aqui fornecidos.
[00226] Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos, por exemplo, tetrâmeros oligomerizados de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, podem continuar a reticular e/ou oligomerizar após a incubação, tratamento e/ou contato das moléculas para oligomerização ter sido concluída ou terminada. Assim, em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem uma etapa para estabilizar, por exemplo, estabilizar o tamanho dos oligômeros. Em algumas modalidades, a etapa para estabilizar os oligômeros é ou inclui incubação, contato e/ou tratamento de moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, com um agente de estabilização.
[00227] Em algumas modalidades, o agente de estabilização é qualquer agente que impede ou é capaz de impedir uma alteração na partícula, por exemplo, tamanho do reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, o agente de estabilização é qualquer agente que modifica um grupo funcional na molécula ou partícula oligomérica que faz ou é capaz de reagir em uma reação de oligomerização e/ou reticulação. Em certas modalidades, agente de estabilização é qualquer agente que impede a formação, isomerização e/ou conversão para produzir um grupo funcional na molécula ou partícula oligo
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137/378 mérica que faz ou é capaz de reagir em uma reação de oligomerização e/ou retículação. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização é qualquer agente que modifica ou é capaz de modificar um grupo haloacetila, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acriloíIa, um agente arilante, um grupo vinililsulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfeto que está ligado à molécula ou partícula oligomérica. Em modalidades particulares, o reagente de estabilização é qualquer agente que impede a formação, isomerização e/ou conversão para produzir um grupo haloacetila, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acrilil, um agente de arilação, um grupo vinililsulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfeto que está ligado à molécula ou partícula oligomérica.
[00228] Em algumas modalidades, o agente de estabilização é incubado, tratado e/ou contatado com uma partícula oligomérica. Em algumas modalidades, a partícula oligomérica é um reagente de partícula oligomérico que contém uma pluralidade de moléculas tioladas e moléculas ativadas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ativada e tiolada ou muteína de estreptavidina. Em certas modalidades, a partícula oligomérica contém mais moléculas tioladas que contêm um iminotiolano N-substituído em anexo. Em algumas modalidades, a incubação e/ou tratamento com NEM satura e/ou modifica todos os grupos funcionais tiol disponíveis, interrompendo desse modo a reação de re~ ticulação e/ou oligomerização. No entanto, em algumas modalidades, o iminotiolano N-substituído não é reativo com NEM e esses isômeros permanecem em moléculas e partículas oligoméricas após a incubação com NEM. Em algumas modalidades, a reisomerização do iminotiolano N-substituído no Isômero tiol pode, portanto, levar ao crescimento pós-síntético do reagente de partículas oligomérico, por exemplo, por retículação adicional e/ou reações de oligomerização, como os
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138/378 grupos de maleimida restantes disponíveis em outras partículas oligoméricas.
[00229] Em algumas modalidades, o agente de estabilização é um agente que é ou é capaz de modificar, remover e/ou impedir que o iminotiolano N-substituído reisomerize em um grupo funcional tiol. Em algumas modalidades, o agente de estabilização é ou inclui hidroxilamina. Em certas modalidades, uma partícula oligomérica e/ou molécula que contém um iminotiolano N-substituído anexado é incubada, tratada e/ou contatada com um agente de estabilização que é ou é capaz de modificar, remover e/ou prevenir um iminotiolano N-substituído de reisomerizar em um grupo funcional tiol. Em modalidades particulares, uma partícula oligomérica e/ou molécula que contém um iminotiolano N-substituído anexado é incubada, tratada e/ou contatada com hidroxilamina.
[00230] Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, de modo a realizar uma reação de estabilização. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é adicionado às moléculas oligomerizadas após a reação de reticulação entre grupos funcionais tiol e grupos funcionais maleimida é realizada e/ou concluída. Em modalidades particulares, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, depois que a reação de reticulação é finalizada, completada e/ou terminada pela adição de NEM às moléculas oligomerizadas. Em certas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, após o término da reação de reticulação, conclusão e/ou
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139/378 terminação pela adição de NEM às moléculas oligomerizadas. Em certas modalidades, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas antes do armazenamento a longo prazo, por exemplo, armazenamento a, aproximadamente ou abaixo da temperatura ambiente, 4°C, -20°C ou -80°C por pelo menos 1 dia, 1 semana, 3 semanas, 9 semanas, 27 semanas, 46 semanas ou 1 ou mais anos. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, depois que as moléculas oligomerizadas são carregadas, passadas e/ou eluídas de uma coluna, uma coluna de cromatografia e/ou uma coluna SEC. Em modalidades particulares, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas após as moléculas oligomerizadas serem carregadas, passadas e/ou eluídas de uma coluna SEC. Em certas modalidades, o reagente de estabilização é contatado, tratado, e/ou incubados com as moléculas oligomerizadas antes de qualquer etapa em que as moléculas oligomerizadas são carregadas, passadas e/ou eluídas de uma coluna SEC.
[00231] Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, por, durante aproximadamente ou pelo menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas ou 24 horas. Em certas modalidades, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas por entre 1 minuto e 12 horas, entre 1 minuto e 1 hora, entre 1 minuto e 1 hora, entre 1 minuto e 30 minutos, entre 5 minutos e 30 minutos, entre 10 minutos e 60 minutos, entre 10 minutos e 20 minutos, entre 1
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140/378 hora e 3 horas, entre 1 hora e 2 horas ou entre 6 horas e 12 horas. Em modalidades particulares, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas por entre 5 minutos e 30 minutos, ou por ou por cerca de 15 minutos. Em certas modalidades, o tratamento, contato e/ou incubação são realizados com mistura e/ou balanço, por exemplo, balanço gentil e/ou mistura.
[00232] Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, a uma temperatura de, aproximadamente, ou de 4°C, 8°C, 12°C, 16°C, 20°C, 24°C, 28°C, 32°C, 37°C, 39°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C ou 100°C. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 37°C, entre 10°C e 25°C, entre 20°C e 30°C, entre 24°C e 39°C, ou entre 40°C e 100°C. Em modalidades particulares, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas em temperatura ambiente. Em certas modalidades, o reagente de estabilização é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas a ou a cerca de 23°C, 24°C, 25°C ou 26°C ± 2°C, ± 1°C, ± 0,5°C, ± 0,2°C, ± 0,1°C, ± 0,05°C ou ± 0,01°C.
[00233] Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é removido e/ou separado das moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares, a reação de estabilização é finalizada e/ou finalizada pela separação e/ou remoção do reagente de estabilização das partículas oligomerizadas. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização é removido e/ou separado das partículas oligomerizadas com uma etapa de cromatografia. Em modalidades particulares, a etapa de cromatografia é ou inclui SEC. Em algumas modalidades, o
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141/378 reagente de estabilização é removido e/ou separado das moléculas oligomerizadas com uma coluna e/ou um filtro. Em algumas modalidades, a coluna ou filtro é uma coluna de dessalinização. Em certas modalidades, a coluna de dessalinização contém uma resina, por exemplo, uma resina que é ou contém sephadex, dextrano e/ou epicloridrina.
[00234] Em modalidades particulares, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, por entre 1 minuto e 1 hora a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 25°C, ou entre 20°C e 30°C. Em algumas modalidades, o reagente de estabilização, por exemplo, hidroxilamina, é contatado, tratado e/ou incubado com as moléculas oligomerizadas, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos, entre 5 minutos e 30 minutos a uma temperatura entre 10°C e 25°C .
[00235] Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos, por exemplo, reagentes de partículas oligoméricos que contêm uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina que são incubados, tratados ou contatados com um agente de estabilização são estáveis em relação ao tamanho. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos que são incubados, tratados ou contatados com um agente de estabilização não sofrem uma alteração no tamanho ao longo do tempo superior a 1 %, superior a 5 %, superior a 10 %, superior a 20 %, superior a 25 %, superior a 30 %, superior a 40 % ou superior a 50 %, alteração no tamanho, por exemplo, alteração no raio ou no peso molecular, ao longo de um período de tempo, por exemplo, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14
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142/378 semanas, 15 semanas, 16 semanas ou mais de 16 semanas quando as partículas são armazenadas em temperatura ambiente, a ou a cerca de 4°C ou menos, a ou a cerca de -20°C ou abaixo, ou a cerca de 80°C. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos que são incubados, tratados ou contatados com um agente de estabilização não experimentam um aumento no tamanho ao longo do tempo superior a 1 %, maior superior a 5 %, superior a 10 %, superior a 20 %, superior a 25 %, superior a 30 %, superior a 40 % ou superior a 50 % de aumento de tamanho em 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas ou mais de 16 semanas.
[00236] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos incluem uma ou mais etapas de esterilização por filtro das moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina e/ou os reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são esterilizados por filtro. Em algumas modalidades, as moléculas ou reagentes de partículas oligoméricos são esterilizados por filtro antes ou após a incubação com um agente de ativação ou um agente de tiolação, antes ou depois das moléculas ativadas e tioladas serem reticuladas e/ou oligomerizadas, antes ou após a SEC ser realizada para remover partículas oilgoméricas reagentes de moléculas não oligomerizadas, por exemplo, tetrâmeros e/ou antes ou depois dos reagentes de partículas oligoméricos são incubados com um agente de estabilização. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são ou são capazes de serem esterilizados por filtro. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos não agregam, obstruem ou impedem ou impedem um processo de esterilização do filtro. Em algumas
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143/378 modalidades, a esterilização do filtro inclui a passagem de uma solução contendo as moléculas ou os reagentes de partículas oligoméricos através de um filtro ou membrana porosa. Em algumas modalidades, o filtro ou membrana porosa contém poros que são ou são pelo menos cerca de 0,02 pm, cerca de 0,05 pm, cerca de 0,1 pm, cerca de 0,15 pm, cerca de 0,2 pm, cerca de 0,22 pm, cerca de 0,3 pm, cerca de 0,4 pm, cerca de 0,45 pm ou cerca de 0,5 pm de diâmetro. Em algumas modalidades, os poros têm um tamanho que está entre 0,01 pm e 1,0 pm, entre 0,1 pm e 0,05 pm, entre 0,2 pm e 0,25 pm, 0,4 e 0,45 pm ou entre 0,2 pm e 0,45 pm. Em algumas modalidades, as partículas oligoméricas têm um raio e/ou um raio médio que é igual ou inferior a 150 nm. Em modalidades particulares, as partículas oligoméricas têm um raio e/ou um raio médio que é de cerca de, a ou abaixo de 125 nm, 110 nm ou 100 nm.
[00237] Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são fabricados, gerados e/ou produzidos pelos métodos aqui fornecidos e são então armazenados. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados por um período de tempo antes de quaisquer tratamentos ou incubações para ligar agentes, por exemplo, agentes de ligação a receptores, aos reagentes de partículas oligoméricos. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados por um período de tempo após um ou mais tratamentos ou incubações para ligar reversivelmente agentes, por exemplo, agentes de ligação ao receptor, aos reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados em duas ou mais alíquotas. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados em um tampão. Em algumas modalidades, o tampão tem um pH neutro e/ou um pH entre 6,5 e 7,5, entre 6,8 e 7,4, ou cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,0,
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144/378 cerca de 7,1, cerca de 7,2 ou cerca de 7,3. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados em um tampão com um pH de cerca de 7,2. Em certas modalidades, o tampão é um tampão de fosfato, por exemplo, um tampão de fosfato de sódio. Em certas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados em temperatura ambiente, a ou a cerca de 4°C ou menos, a ou a cerca de -20°C ou menos, ou a cerca de -80°C. Em modalidades particulares, os reagentes de partículas oligoméricos são armazenados 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas ou mais de 16 semanas. Em algumas modalidades, os reagentes de partículas oligoméricos colocados em um tampão com um pH neutro e são armazenados a uma temperatura de aproximadamente 80°C.
[00238] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem ou contêm uma etapa para incubar, tratar e/ou entrar em contato com moléculas, por exemplo, tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina, sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas, uma etapa para separar os reagentes de partículas oligoméricos das moléculas que não oligomerizaram pela SEC e uma etapa para incubar as partículas com um agente de estabilização. Em algumas modalidades, a etapa de incubar, tratar e/ou entrar em contato com moléculas sob condições adequadas para oligomerizar as moléculas é ou inclui incubar moléculas tioladas com um ou mais grupos funcionais tiol ligados com moléculas ativadas com um ou mais grupos funcionais de maleimida.
[00239] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para
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145/378 a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas ohgoméricos incluem: uma etapa para incubar uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de tiolação em um tampão com um pH básico para um quantidade de tempo entre 15 a 90 minutos para tiolar os tetrâmeros, uma etapa para incubar uma pluralidade separada de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com um agente de ativação por um período de tempo entre 30 minutos e 90 minutos para adicionar um ou mais grupos funcionais de maleimida a os tetrâmeros, terminando as incubações de 2-iminotiolano e SMPH aproximadamente ou ao mesmo tempo, uma etapa para incubar os tetrâmeros tiolados e ativados dentro de um período de tempo entre cinco e quinze minutos após o término das incubações de ativação e tiolação, uma etapa para separando os reagentes de partículas oligoméricos das moléculas que não oligomerizaram pela SEC e uma etapa de incubar as partículas com uma estabilização para estabilizar o tamanho dos reagentes de partículas oligoméricos. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma etapa de armazenamento dos reagentes de partículas oligoméricos em solução tampão com um pH neutro a aproximadamente ou abaixo de 80°C, -20°C ou 4°C.
[00240] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos para a fabricação, geração e/ou produção de reagentes de partículas oligoméricos incluem: uma etapa para incubar uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com 2iminotiolano em um tampão com um pH básico entre 7,7 e 8,5 a uma temperatura de cerca de 24°C por 60 minutos para tiolar os tetrâmeros, uma etapa para incubar uma pluralidade separada de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com SMPH a um pH neutro de 7,2 a uma temperatura de cerca de 24°C por 1 hora para adicionar um ou mais grupos funcionais de maleimida aos tetrâmeros,
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146/378 uma etapa para terminar as incubações de 2-iminotiolano e SMPH ao mesmo tempo, separando as incubações de 2-iminotiolano e SMPH dos tetrâmeros com cromatografia, por exemplo, SEC, uma etapa para incubação os tetrâmeros tiolados e ativados dez minutos após o término das incubações com 2-iminotiolano e SMPH, uma etapa para terminar a reação de oligomização entre os tetrâmeros tiolados e ativados após 60 minutos incubando os tetrâmeros com NEM, uma etapa para separar os reagentes de partículas oligoméricos das moléculas que não oligomerizaram pela SEC e uma etapa de incubar as partículas com hidroxilamina para estabilizar o tamanho dos reagentes das partículas oligoméricas. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma etapa de armazenamento dos reagentes de partículas oligoméricos em solução tampão com um pH neutro a -80°C. Em algumas modalidades, o 2~iminotiolano é adicionado a um tampão com um pH básico de 8,5. Em certas modalidades, o tampão é ou contém tampão de borato 100 mM. Em algumas modalidades, as partículas são estáveis, por exemplo, não sofrem uma alteração no tamanho superior a 10 %, por pelo menos 46 semanas.
[00241] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos para fabricar, gerar e/ou produzir reagentes de partículas oligoméricos incluem: uma etapa para incubar uma pluralidade de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com 2-iminotiolano em um tampão com um pH básico entre 7,7 e 8,5 a uma temperatura de cerca de 24°C durante 60 minutos para tiolar os tetrâmeros; uma etapa para incubar uma pluralidade separada de tetrâmeros de estreptavidina ou muteína de estreptavidina com SMPH a um pH neutro de 7,2 a uma temperatura de cerca de 24°C por 1 hora para adicionar um ou mais grupos funcionais de maleimida aos tetrâmeros; uma etapa para terminar as incubações de 2-iminotiolano e SMPH ao mesmo tempo, separando as incubações de 2-iminotiolano e SMPH dos tetrâmeros com
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147/378 cromatografia, por exemplo, SEC; uma etapa para incubar os tetrâmeros tiolados e ativados, opcionalmente dentro de 10 minutos, após o término das incubações de 2-iminotiolano e SMPH; uma etapa de terminar a reação de oligomizaçâo entre os tetrâmeros tiolados e ativados após ou após cerca de 60 minutos incubando os tetrâmeros com NEM, uma etapa de incubar as partículas com hidroxilamina; uma etapa SEC e, opcionalmente, uma etapa de filtrar as partículas, por exemplo, através de uma membrana e/ou filtro com ou com tamanho de poro de cerca de 0,45 pm e/ou 0,2 pm de diâmetro. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma etapa de armazenamento dos reagentes de partículas oligoméricos em solução tampão com um pH neutro a -80°C. Em algumas modalidades, as partículas são estáveis, por exemplo, sofrem uma alteração no tamanho superior a 10 %, por pelo menos 46 semanas.
A. Formato do Reagente
1. Suporte
[00242] Em algumas modalidades, o reagente é constituído por um suporte, como um suporte ou superfície sólida, por exemplo, conta, ou uma fase sólida ou uma fase estacionária (matriz de cromatografia). Em algumas dessas modalidades, o reagente é reversivelmente imobilizado no suporte. Em alguns casos, o reagente é imobilizado no suporte por meio de ligações covalentes. Em alguns aspectos, o reagente é imobilizado reversivelmente no suporte de forma não covalente.
[00243] Em algumas modalidades, o suporte é um suporte sólido. Qualquer suporte sólido (superfície) pode ser utilizado para a imobilização reversível do reagente. Exemplos ilustrativos de suportes sólidos nos quais o reagente pode ser imobilizado incluem uma conta magnética, uma conta polimérica, uma placa de cultura de células, uma placa de microtitulação, uma membrana, uma conta de agarose,
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148/378 uma conta de poliestireno ou uma fibra oca. Em alguns aspectos, as fibras ocas podem ser usadas como um biorreator no sistema de expansão celular Quantum®, disponível na TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA). Em algumas modalidades, o reagente é covalentemente ligado ao suporte sólido. Em outras modalidades, interações não covalentes também podem ser usadas para imobilização, por exemplo, em substratos plásticos. Em algumas modalidades, o reagente pode, por exemplo, ser uma estreptavidina ou muteína de avidina que se liga reversivelmente a um peptídeo de ligação à estreptavidina. Tais muteínas de estreptavidina podem ser ligadas covalentemente a qualquer superfície, por exemplo, resina (contas) usada para purificação por cromatografia e estão disponíveis comercialmente na IBA GmbH, Gottingen, por exemplo, como Strep-Tactin® Sepharose, Strep-Tactin® Superflow ®, Strep-Tactin® Superflow® de alta capacidade ou StrepTactin® MacroPrep®. Outros exemplos ilustrativos disponíveis comercialmente são as resinas de cromatografia de afinidade imobilizada por metais (IMAC), como as resinas TALON® (Westburg, Leusden, Holanda) que podem ser usadas para a imobilização reversível de proteínas marcadas com oligo-histidina (marcadas com his), como para a ligação reversível de um agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) que contém como parceiro de ligação C um marcador de olígo-histidina, como um marcador de penta ou hexahistidina. Outros exemplos incluem calmodulina sefarose disponível na GE Life Sciences que pode ser usada em conjunto com um agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) que contém um peptídeo de ligação à calmodulina como parceiro de ligação C ou sefarose, ao qual a glutationa está acoplada. Em alguns desses casos, o parceiro de ligação C é a glutationa-S-transferase.
[00244] Em algumas modalidades, o suporte contém uma fase sólida ou uma fase estacionária. Assim, em algumas modalidades, o rea
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149/378 gente é constituído por uma fase sólida ou uma fase estacionária (também chamada de matriz de cromatografia). Em algumas dessas modalidades, o reagente é imobilizado reversivelmente na fase sólida ou fase estacionária. Em alguns casos, o reagente é reversivelmente imobilizado na fase estacionária por meio de ligações covalentes. Em alguns aspectos, o reagente é reversivelmente imobilizado na fase estacionária de forma não covalente.
[00245] Qualquer material pode ser empregado como uma matriz de cromatografia. Em geral, um material de cromatografia adequado é essencialmente inócuo, isto é, não prejudicial à viabilidade celular, tal como quando usado em uma coluna de cromatografia compactada sob condições desejadas. Em algumas modalidades, a fase estacionária permanece em um local predefinido, como uma posição predefinida, enquanto o local da amostra está sendo alterado. Assim, em algumas modalidades, a fase estacionária é a parte de um sistema cromatográfico através do qual a fase móvel flui (por fluxo através ou em um modo batelada) e onde ocorre a distribuição dos componentes contidos na fase líquida (dissolvida ou dispersa) entre as fases.
[00246] Em algumas modalidades, a matriz de cromatografia tem a forma de uma fase sólida ou semissólida, enquanto a amostra que contém a célula-alvo a ser isolada/separada é uma fase fluida. A matriz de cromatografia pode ser um material particulado (de qualquer tamanho e forma adequados) ou um material de cromatografia monolítica, incluindo um substrato ou membrana de papel. Assim, em alguns aspectos, a cromatografia pode ser tanto cromatografia de coluna quanto cromatografia planar. Em algumas modalidades, além das colunas de cromatografia padrão, as colunas que permitem um fluxo bidirectional, como as colunas PhyTip® disponíveis na PhyNexus, Inc. San Jose, CA, USA ou pontas de pipeta, podem ser usadas para métodos baseados em coluna/fluxo por modo. Assim, em alguns casos, as pon
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150/378 tas ou colunas da pipeta que permitem um fluxo bidirecional também sâo compostas por colunas de cromatografia úteis nos presentes métodos. Em alguns casos, como onde um material de matriz particulada é usado, o material da matriz particulada pode, por exemplo, ter um tamanho médio de partícula de cerca de 5 pm a cerca de 200 pm, ou de cerca de 5 pm a cerca de 400 pm, ou de aproximadamente 5 pm a cerca de 600 pm. Em alguns aspectos, a matriz de cromatografia pode, por exemplo, ser ou incluir uma resina polimérica ou um óxido de metal ou um óxido metaloide. Em alguns aspectos, como onde a cromatografia planar é usada, o material da matriz pode ser qualquer material adequado para cromatografia planar, como membranas convencionais à base de celulose ou à base de polímeros orgânicos (por exemplo, uma membrana de papel, uma membrana de nitrocelulose ou um difluoreto de polivinilideno (PVDF)) ou placas de vidro revestidas com silica. Em uma modalidade, a matriz de cromatografia/fase estacionária é um material não magnético ou material nâo magnetizável.
[00247] Em algumas modalidades, as fases estacionárias ou sólidas de cromatografia nâo magnética ou não magnetlzável que são adequadas nos presentes métodos incluem silica derivada ou um gel reticulado. Em alguns aspectos, um gel reticulado pode ser baseado em um polímero natural, como em uma classe de polímero que ocorre na natureza. Por exemplo, um polímero natural no qual uma fase estacionária de cromatografia pode ser baseada é um polissacarídeo. Em algumas modalidades, a fase sólida ou fase estacionária é uma conta de poliestireno. Em alguns casos, um polissacarídeo respectivo é geralmente reticulado. Um exemplo de matriz de polissacarídeo inclui, mas não está limitado a, um gel de agarose (por exemplo, Superflow™ agarose ou um material Sepharose®, como Superflow™ Sepharose®, que estão comercialmente disponíveis em diferentes tamanhos de
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151/378 contas e poros) ou um gel de dextrano (s) reticulado (s). Um exemplo ilustrativo adicional é uma matriz de agarose reticulada particulada, à qual o dextrano é covalentemente ligado, que está disponível comercialmente (em vários tamanhos de grânulos e com vários tamanhos de poros) como Sephadex® ou Superdex®, ambos disponíveis na GE Healthcare. Outro exemplo ilustrativo desse material de cromatografia é o Sephacryl®, que também está disponível em diferentes tamanhos de contas e poros da GE Healthcare. Outro exemplo ilustrativo desse material de cromatografia são as contas de poliestireno CytoSorb.
[00248] Em algumas modalidades, um gel reticulado também pode ser baseado em um polímero sintético, como em uma classe de polímero que não ocorre na natureza. Em alguns aspectos, um polímero sintético no qual se baseia uma fase estacionária ou sólida de cromatografia é um polímero que possui unidades de monômeros polares e, portanto, é por si só polar. Assim, em alguns casos, esse polímero polar é hidrofílico. Moléculas hidrofílicas, também denominadas lipofóbicas, em alguns aspectos contêm porções que podem formar interações dipolo-dipolo com moléculas de água. Em geral, moléculas hidrofóbicas, também denominadas lipofílicas, tendem a se separar da água.
[00249] Exemplos ilustrativos de polímeros sintéticos adequados são poliacrílamida (s), um gel de estireno-divinilbenzeno e um copolímero de um acrilato e um diol ou de uma acrilamida e um diol. Um exemplo ilustrativo é um gel de polimetacrilato, disponível comercialmente como um Fractogel®. Um outro exemplo é um copolímero de etileno glicol e metacrilato, disponível comercialmente como um Toyopearl®. Em algumas modalidades, uma fase estacionária de cromatografia pode também incluir componentes poliméricos naturais e sintéticos, como uma matriz compósita ou um composite ou um copolímero de um polissacarídeo e agarose, por exemplo, um composite de po
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152/378 liacrilamida/agarose, ou de um polissacarídeo e Ν,Ν'-metilenobisacrilamida. Um exemplo ilustrativo de um copolímero de um dextrano e N,N!-metilenobisacrilamida é a série de materiais Sephacryl® acima mencionada. Em algumas modalidades, uma síiica derivada pode incluir partículas de silica que são acopladas a um polímero sintético ou natural. Exemplos de tais modalidades incluem, mas não estão limitados a, silica enxertada com poiissacarídeo, silica enxertada com polivinilpirrolidona, silica enxertada com óxido de polietlleno, silica enxertada com poli(2-hidroxietilaspartamida) e silica enxertada com poli(Nisopropilacrilamida).
[00250] Em algumas modalidades, a matriz de cromatografia é uma matriz de filtração em gel, por exemplo, quando usada em um cartucho de remoção, conforme descrito aqui. Geralmente, uma filtração em gel pode ser caracterizada pela propriedade que foi projetada para sofrer. Portanto, em alguns aspectos, uma matriz de filtração em gel permite a separação de células ou outras entidades biológicas em grande parte com base em seu tamanho. Em alguns desses aspectos, a respectiva matriz de cromatografia é tipicamente um material poroso particulado, como mencionado acima. A matriz de cromatografia pode ter um certo limite de exclusão, que é tipicamente definido em termos de um peso molecular acima do qual as moléculas são totalmente excluídas da entrada nos poros. Em algumas modalidades, o respectivo peso molecular que define o limite de exclusão por tamanho pode ser selecionado para estar abaixo do peso correspondente ao peso de uma célula-alvo. Em tal modalidade, a célula-alvo é impedida de entrar nos poros da matriz de cromatografia de exclusão por tamanho. Da mesma forma, uma fase estacionária pode ter poros de tamanho menor que o tamanho de uma célula-alvo escolhida. Em modalidades ilustrativas, a matriz de cromatografia tem um tamanho médio de poro de 0 a cerca de 500 nm.
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[00251] Em algumas modalidades, os componentes presentes em uma amostra como agentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) ou um reagente de competição podem ter um tamanho que está abaixo do limite de exclusão dos poros e, portanto, podem entrar nos poros de a matriz de cromatografia. Em alguns aspectos, dos componentes que são capazes de entrar parcial ou totalmente no volume do poro, moléculas maiores, com menos acesso ao volume do poro, podem eluir primeiro, enquanto as moléculas menores tipicamente eluem por último. Em algumas modalidades, o limite de exclusão da matriz de cromatografia é selecionado para estar abaixo da largura máxima da célula-alvo. Portanto, em alguns aspectos, os componentes que têm acesso ao volume de poros podem permanecer mais tempo em/na matriz de cromatografia do que na célula-alvo. Assim, em alguns casos, as células-alvo podem ser coletadas no eluato de uma coluna de cromatografia separadamente de outras matérias/componentes de uma amostra. Portanto, em alguns aspectos, componentes como um agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) ou, quando aplicável, um reagente de competição, podem eluir em um ponto posterior do tempo a partir de uma matriz de filtração em gel que a célula-alvo. Em algumas modalidades, esse efeito pode ser aumentado ainda mais, como se a matriz de permeação de gel contiver um reagente (como covalentemente ligado a ela) que contém os sítios de ligação Z que são capazes de se ligar a agentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) e/ou um reagente de competição presente em uma amostra. Em alguns casos, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e/ou o reagente de competição pode ser ligado pelos sítios de ligação Z do reagente e, assim, imobilizado na matriz. Em alguns aspectos, esse método é realizado em um cartucho de remoção.
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[00252] Em algumas modalidades, uma matriz de cromatografia empregada nos presentes métodos também pode incluir matéria magneticamente atraível, como uma ou mais partículas magneticamente atraíveis ou um ferrofluido. Uma respectiva partícula magneticamente atraente pode compreender um reagente com um sítio de ligação que é capaz de se ligar a uma célula-alvo. Em alguns casos, partículas magneticamente atraentes podem conter material díamagnético, ferromagnético, paramagnético ou superparamagnético. Em geral, o material superparamagnético responde a um campo magnético com um campo magnético induzido sem uma magnetizaçâo permanente resultante. Partículas magnéticas à base de oxido de ferro estão, por exemplo, disponíveis comercialmente como Dynabeads® da Dynal Biotech, como MicroBeads magnéticas da Miltenyi Biotec, como contas de vidro magnético poroso da CPG Inc., bem como de várias outras fontes, como Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBiON, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences ou Novagen Inc., para citar apenas algumas. Nanopartículas magnéticas baseadas em Co e FeCo superparamagnéticos, bem como nanocristais de ferro ferromagnético foram descritas, por exemplo, por Hutten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63). Em outras modalidades, uma matriz de cromatografia empregada nos presentes métodos é isenta de qualquer matéria magneticamente atraente.
[00253] Em algumas modalidades, é fornecido um aparelho que contém pelo menos um arranjo de uma primeira e uma segunda fase estacionária, como coluna de cromatografia para seleção de células (um cartucho de seleção) e uma segunda coluna de cromatografia (um cartucho de remoção) para remoção de reagentes. O aparelho pode compreender uma pluralidade de arranjos de primeira e segunda fases estacionárias (colunas de cromatografia) sendo conectadas fluidamente em série. O aparelho pode compreender uma entrada de amostra
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155/378 sendo conectada fluidamente à primeira fase estacionária do primeiro arranjo das primeira e segunda fases estacionárias. Em algumas modalidades, o aparelho também pode compreendem uma saída de amostra para células, a saída de amostra sendo conectada fluidamente à segunda fase estacionária da última do pelo menos um arranjo de uma primeira e segunda fases estacionárias para cromatografia. Em alguns aspectos, o aparelho também pode compreender um recipiente de reagente de competição que é conectado fluidamente a pelo menos uma das primeiras fases estacionárias dos arranjos das primeira e segunda fases estacionárias.
2. Reagentes solúveis
[00254] Em algumas modalidades, o reagente não está ligado a um suporte sólido, isto é, está presente na forma solúvel ou é solúvel. Em princípio, o mesmo reagente pode ser usado como no caso de um reagente imobilizado em um suporte, como um suporte sólido ou fase estacionária. Por exemplo, qualquer um dos exemplos de reagentes descritos acima pode ser usado sem imobilizar ou anexar esse reagente a um suporte, por exemplo, não anexar suporte sólido ou fase estacionária. Em algumas modalidades, o reagente contém uma pluralidade de sítios de ligação, Z, para ligação reversível a um agente de ligação via interação com um parceiro de ligação, C. Em alguns casos, o reagente é um oligômero ou polímero de moléculas individuais ou um oligômero ou polímero de um complexo de subunidades que compõem a molécula individual (por exemplo, oligômeros ou polímeros de uma proteína dimérica, trimérica ou tetramérica). Em algumas modalidades, o reagente pode, por exemplo, ser um oligômero de muteína de estreptavidina, um oligômero de calmodulina, um composto (oligômero) que fornece pelo menos dois grupos quelantes K, em que os pelo menos dois grupos quelantes são capazes de se ligar a um íon de metal de transição, tornando assim o reagente capaz de se ligar a um
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156/378 marcador de afinidade de oligo-histidína, glutationa-S-transferase multimérica ou uma proteína veículo biotinilada.
[00255] Em algumas modalidades, o reagente é caracterizado pela ausência de um suporte sólido (superfície) anexado ao reagente. Por exemplo, em algumas modalidades, o reagente não compreende ou não está ligado (direta ou indiretamente) a uma partícula, cordão, nanopartícula, microesfera ou outro suporte sólido. Em algumas modalidades, o reagente não é rígido, inflexível ou rígido ou não compreende ou não está ligado a uma superfície rígida, inflexível ou rígida. Em algumas modalidades, o reagente é flexível ou substancialmente flexível. Em alguns casos, o reagente é capaz de ajustar ou adaptar-se à forma da superfície das células. Em algumas modalidades, o reagente nâo compreende ou não compreende uma forma que é esférica ou substancialmente esférica.
[00256] Em algumas modalidades, substancialmente todas, ou seja, mais de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais do reagente é, é composto ou contém material orgânico. Por exemplo, em algumas modalidades, mais de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais do reagente é, é composto ou contém lipídios, carboidratos, proteínas, peptídeos ou suas misturas. Em algumas modalidades, o reagente é composto de ou contém uma ausência essencial de material inorgânico, um núcleo inorgânico, por exemplo, metal, por exemplo, ferro, polímeros sintéticos ou inorgânicos, tais como polímeros de estireno, por exemplo, poliestireno, látex, silica ou núcleos magnéticos. Por exemplo, em algumas modalidades, a porcentagem relativa de material inorgânico do reagente ou que é composta como parte do reagente é inferior a 20 %, 15 %, 10 %, 5 % ou menos.
[00257] Em algumas modalidades, a maioria (ou seja, mais de 50 %), como mais de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou mais do
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157/378 volume total do reagente em solução aquosa consiste nas moléculas de proteína individuals que compreendem o reagente, como oligômeros ou polímeros de moléculas individuais ou um complexo de subunidades que compõem uma molécula individual (por exemplo, molécula tetramérica). Em algumas modalidades, a densidade total do reagente solúvel é inferior a 1,2 g/cm3, 1,1 g/cm3, 1,0 g/cm3 ou menos.
[00258] Em algumas modalidades, o reagente solúvel, por exemplo, não estar preso a um suporte ou suporte sólido (por exemplo, não está preso a um cordão), possui um tamanho relativamente pequeno, como geralmente menor ou menor que 20 nM de tamanho, como menor ou menor que 15 nM, menor ou menor que 10 nM, menor ou menor que 5 nM ou menor.
[00259] Em algumas modalidades, o reagente solúvel, por exemplo, não estando ligado a um suporte ou suporte sólido (por exemplo, não está ligado a uma conta), é biologicamente inerte, isto é, não é tóxico para as células vivas. Em algumas modalidades, o reagente pode ser biodegradável, por exemplo, pode ser degradado pela atividade enzimática ou eliminado pelas células fagocíticas.
[00260] Em algumas modalidades, é possível reagir o reagente (por exemplo, uma estreptavidina ou muteína, tal como muteína de estreptavidina tetraméricas) a um veículo, como um veículo orgânico. Em alguns aspectos, além de uma reação com um polissacarídeo, também é possível usar proteínas fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitáveis, como albumina sérica (por exemplo, albumina sérica humana (HSA) ou albumina sérica bovina (BSA)) como proteína veículo. Nesse caso, o reagente, como estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina (como tetrâmero individual ou também na forma de oligômeros), pode ser acoplado à proteína veículo por meio de interação não covalente. Em algumas dessas modalidades, a BSA biotinilada (que está comercialmente disponível em vários fornecedores, como
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ThermoFisher Scientific, Sigma Aldrich ou Vectoriabs, para citar apenas alguns) pode ser reagida com o reagente (por exemplo, muteína de estreptavidina). Em alguns aspectos, alguns dos oligômeros reagentes (por exemplo, oligômeros de estreptavidina) podem se ligar de forma não covalente por meio de um ou mais sítios de ligação Z à proteína veículo biotinilada, deixando a maioria dos sítios de ligação Z do oligômero disponíveis para a ligação ao agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e qualquer outro agente como aqui descrito. Assim, por essa abordagem, um reagente solúvel com uma infinidade de sítios de ligação Z pode ser preparado.
[00261] Em algumas modalidades, um reagente, como uma muteína de estreptavidina (como um tetrâmero Individual ou também na forma de um oligômero), pode ser covalentemente acoplado a um veículo sintético, como uma molécula de polietileno glicol (PEG). Qualquer molécula de PEG adequada pode ser utilizada para este fim, por exemplo, e a molécula de PEG e o respectivo reagente podem ser solúveis. Tipicamente, moléculas de PEG até um peso molecular de 1000 Da são solúveis em água ou meio de cultura que podem ser utilizados nos presentes métodos. Em alguns casos, esse reagente à base de PEG pode ser preparado usando moléculas de PEG ativadas disponíveis comercialmente (por exemplo, derivados de PEG-NHS disponíveis na NOF North America Corporation, Irvine, California, USA ou derivados de PEG ativado disponíveis na Creative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USA) com grupos amino da muteína de estreptavidina.
3. Agentes
[00262] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) tem um ou sítios de ligação, B, para ligação à molécula na superfície da célula, por exemplo, molécula de superfície celular. Assim, em alguns casos, o agente (por
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159/378 exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) contém um sítio de ligação B ou uma pluralidade de sítios de ligação B, em que a ligação específica entre o agente (agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e a molécula na superfície das células-alvo contém interação entre B e a molécula. Em algumas modalidades, o agente contém apenas um único sítio de ligação, ou seja, é monovalente. Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) possui pelo menos dois, como uma pluralidade de sítios de ligação B, incluindo três, quatro ou cinco sítios de ligação B capazes de se ligar à molécula da superfície celular. Em alguns desses aspectos, os pelo menos dois ou vários sítios de ligação B podem ser idênticos. Em algumas modalidades, um ou mais dos pelo menos dois ou vários sítios de ligação B podem ser diferentes (por exemplo, B1 e B2).
[00263] Em algumas modalidades, um ou mais agentes diferentes (por exemplo, um ou mais agentes de ligação a receptores, agentes de seleção ou outros agentes que se ligam a uma molécula em uma célula) são ligados reversivelmente ao reagente. Em algumas modalidades, o reagente é um reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, pelo menos 2, 3, 4 ou mais agentes diferentes são reversivelmente ligados ao mesmo reagente. Em algumas modalidades, pelo menos dois agentes diferentes são ligados reversivelmente ao mesmo reagente, em que cada reagente compreende um sítio de ligação B ou uma pluralidade de sítios de ligação B para ligação específica entre o agente e a molécula. Em algumas modalidades, os pelo menos dois ou mais agentes contêm o mesmo sítio de ligação B, por exemplo, para a ligação da mesma ou substancialmente a mesma molécula. Em algumas modalidades, os pelo menos dois ou mais agentes contêm diferentes sítios de ligação B, por exemplo, para a ligação a diferentes moléculas. Em algumas modalidades, um primeiro agente
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160/378 (por exemplo, um primeiro agente de ligação ao receptor ou um primeiro agente de seleção) contém um sítio de ligação B1, B2, B3, B4, etc. e um segundo agente (por exemplo, um segundo agente de ligação ao receptor ou segunda agente de seleção) contém outro sítio de ligação B1, B2, B3, B4, etc. Em algumas modalidades, um primeiro agente (por exemplo, um primeiro agente de seleção) contém um sítio de ligação B1 e um segundo agente (por exemplo, segundo agente de seleção) contém um sítio de ligação B3. Em algumas modalidades, um primeiro agente (por exemplo, um primeiro agente de ligação ao receptor) contém um sítio de ligação B2 e um segundo agente (por exemplo, um segundo agente de ligação ao receptor) contém um sítio de ligação B4. Em qualquer uma dessas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente podem conter um parceiro de ligação, C1 ou C2. Em algumas modalidades, C1 e 02 podem ser os mesmos. Em algumas modalidades, C1 e 02 são diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente contêm o mesmo parceiro de ligação, C1.
[00264] Em alguns casos, a constante de dissociação (Kd) da ligação entre o agente (por exemplo, através do sítio de ligação B) e o sítio de ligação Z do reagente pode ter um valor na faixa de cerca de 10’ 2 M a cerca de 10'13 M ou de cerca de 10 3 M a cerca de 10'12 IVI ou de cerca de 10“4 M a cerca de 1011 M ou de cerca de 10 5 M a cerca de 10’1° M. Em algumas modalidades, a constante de dissociação (Kd) para a ligação entre o agente de ligação e a molécula é de baixa afinidade, por exemplo, na faixa de uma Kd de cerca de IO’3 a cerca de 10 7 M. Em algumas modalidades, a A constante de dissociação (Kd) para a ligação entre o agente de ligação e a molécula é de alta afinidade, por exemplo, na faixa de uma Kd de cerca de 107 a cerca de 1 x 1010 M.
[00265] Em algumas modalidades, a dissociação da ligação do agente através do sítio de ligação B e da molécula ocorre suficiente
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161/378 mente rápido, por exemplo, para permitir que a célula-alvo seja apenas transitoriamente manchada ou associada ao agente após a interrupção do reversível ligação entre o reagente e o agente. Em alguns casos, quando expressa em termos da taxa de koff (também chamada de taxa de dissociação constante para a ligação entre o agente (através do sítio de ligação B) e a molécula, a taxa de kOff é de cerca de 0,5 χ 10’4 seg ~1 ou superior, cerca de 1 χ 10'4 seg '1 ou superior, cerca de 2 x 10’ 4 seg 1 ou superior, cerca de 3 χ 10~4 seg 1 ou superior, cerca de 4 χ 10 4 seg 1 ou superior, cerca de 5 χ 10“4 seg 1 ou superior, cerca de 1 χ 10'3 seg ~1 ou superior, cerca de 1,5 χ 10~3 seg ~1 ou superior, cerca de 2 χ 10'3 seg1 ou superior, cerca de 3 χ 10’3 seg1 ou superior, cerca de 4 χ 10‘3 seg1, cerca de 5 χ 10 3 seg1 ou superior, cerca de 1 χ 10 2 segundos ou superior ou cerca de 5 χ 10Ί segundos 1. Está dentro do nível de um técnico versado determinar empiricamente a faixa da taxa de korr adequada para uma interação específica de agente e molécula celular (veja, por exemplo, o pedido publicado U.S. No. US2014/0295458). Por exemplo, um agente com uma alta taxa de k0« de, por exemplo, superior a 4,0 χ 10‘4 seg 1 pode ser usado para que, após a Interrupção dos complexos de ligação, a maior parte do agente possa ser removida ou dissociada dentro de uma hora. Em outros casos, um agente com uma taxa de kOfr mais baixa de, por exemplo, 1,0 χ 10‘4 seg1, pode ser usado, para que, após a interrupção dos complexos de ligação, a maior parte do agente possa ser removida ou dissociada do célula dentro de cerca de 3 horas e meia.
[00266] Em algumas modalidades, a Kd dessa ligação, bem como a taxa de Kd, koff e kon da ligação formada entre o sítio de ligação B do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e a molécula da superfície celular pode ser determinada por qualquer meio adequado, por exemplo, por titulação de fluorescência, diálise de equilíbrio ou ressonância de plasmônio superficial.
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[00267] Em alguns aspectos, a molécula de superfície celular é uma molécula contra a qual um agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ser direcionado. Em algumas modalidades, a molécula da superfície celular é um peptídeo ou uma proteína, como um receptor, por exemplo, uma proteína receptora de membrana. Em algumas modalidades, o receptor é um lipídeo, um polissacarídeo ou um ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula de superfície da célula que é uma proteína pode ser uma proteína de membrana periférica ou uma proteína de membrana integral. A molécula da superfície celular pode, em algumas modalidades, ter um ou mais domínios que abrangem a membrana. Como alguns exemplos ilustrativos, uma proteína de membrana com um domínio transmembranar pode ser um receptor acoplado à proteína G, como receptores odorantes, receptor de rodopsina, receptor de feromônio rodopsina, receptor de hormônio peptídico, receptor de paladar, receptor de GABA, um receptor de opiáceos, um receptor de serotonina, um receptor de Ca2+, melanopsina, um receptor de neurotransmissor, como um ligante bloqueado, um bloqueador de voltagem ou um receptor bloqueado mecanicamente, incluindo a acetilcolina, o nicotínico, o adrenérgico, a norepinefrina, as catecolaminas, o L-DOPA-, um receptor de neuropeptídeo dopamina e serotonina (amina biogênica, endorfina/encefalina), um receptor cinase como serina/treonina cinase, uma tirosina cinase, uma porina/canal como um canal de cloreto, um canal de potássio, um canal de sódio, uma proteína OMP, um transportador ABC (transportador de cassetes de ligação ATP), como veículo de aminoácidos, transportador de Na-glicose, transportador de Na/iodeto, transportador de íons, como o Light Harvesting Complex, citocromo c oxidase, ATPase Na/K, H/K, Ca, um receptor de adesão celular, como metaloprotease, integrina ou caterina.
[00268] Em algumas modalidades, a molécula de superfície celular
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163/378 pode ser um antígeno que define uma população ou subpopulação celular desejada, por exemplo, uma população ou subpopulação de células sanguíneas, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células T, células T auxiliares, por exemplo, células T auxiliares CD4+, células B ou células exterminadoras naturais), monócltos ou células-tronco, por exemplo, células-tronco periféricas CD34 positivas ou células-tronco que expressam Nanog ou Oct-4. Exemplos de células T incluem células como linfócitos T CD8+ específicos de CMV, células T cltotóxicas, células T de memória e células T reguladoras (Treg). Um exemplo ilustrativo de Treg são as células Treg CD4 CD25 CD45RA e um exemplo ilustrativo de células T de memória são as células T de memória central específica CD62L CD8+. A molécula da superfície celular também pode ser um marcador para uma célula tumoral.
[00269] Como descrito acima, em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) possui, além do sítio de ligação B que é capaz de se ligar à molécula da superfície celular, um parceiro de ligação C. Em alguns aspectos, esse parceiro de ligação C é capaz de se ligar a um sítio de ligação Z do reagente, em que o reagente tem um ou mais sítios de ligação para o parceiro de ligação C. Em algumas modalidades, a ligação não covalente que pode ser formada entre o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e o (s) sítio (s) de ligação Z do reagente pode ser de qualquer força e afinidade desejadas e pode ser perturbável ou reversível sob condições nas quais o método é realizado. O agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode incluir pelo menos um, incluindo dois, três ou mais, parceiros de ligação adicionais Ceo reagente pode incluir pelo menos dois, como três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais sítios de ligação Z para o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de
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164/378 ligação ao receptor ou agente de seleção). Como descrito na patente US 7.776.562, na patente US 8.298.782 ou no pedido de patente internacional WO 2002/054065, qualquer combinação de um parceiro de ligação C e um reagente com um ou mais sítios de ligação Z correspondentes pode ser escolhida, por exemplo, de modo que o parceiro de ligação Ceo sítio de ligação Z é capaz de se ligar reversivelmente em um complexo, de modo a causar um efeito de avidez.
[00270] O parceiro de ligação C incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode, por exemplo, ser à base de hidrocarbonetos (inclusive polimérico) e incluir nitrogênio, fósforo, enxofre, carbeno, halogênio ou grupos pseudo-halogênio. Em alguns aspectos, pode ser um álcool, um ácido orgânico, um ácido inorgânico, uma amina, uma fosfina, um tiol, um dissulfeto, um alcano, um aminoácido, um peptídeo, um oligopeptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucleico, um lipídeo, um sacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Como exemplos adicionais, também pode ser um cátion, um ânion, um policátion, um poliânion, um policátion, um eletrólito, um polieletrólito, um nanotubo de carbono ou nanofibra de carbono. Geralmente, esse parceiro de ligação C tem uma maior afinidade com o sítio de ligação do reagente do que com outra substância. Exemplos de um respectivo parceiro de ligação C incluem, mas não estão limitados a, um éter coroa, uma imunoglobulina, um fragmento da mesma e uma molécula de ligação proteica com funções semelhantes a anticorpos.
[00271] Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui biotina e o reagente inclui um análogo de estreptavidina ou um análogo de avidina que se liga de forma reversível à biotina. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou
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165/378 agente de seleção) inclui um análogo de biotina que se liga de forma reversível à estreptavidina ou avidina, e o reagente inclui estreptavidina, avidina, um análogo de estreptavidina ou um análogo de avidina que se liga reversivelmente ao respectivo análogo de biotina. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui um peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina e o reagente inclui estreptavidina, avidina, um análogo de estreptavidina ou um análogo de avidina que se liga reversivelmente ao respectivo peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina.
[00272] Em algumas modalidades, o reagente é uma estreptavidina, como uma muteína de estreptavidina, incluindo qualquer um descrito acima (por exemplo, apresentado na SEQ ID NOS: 3-6 ou 60-61) e o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode incluir um peptídeo de ligação à estreptavidina. Em algumas modalidades, o peptídeo de ligação à estreptavidina pode incluir uma sequência com a fórmula geral apresentada na SEQ ID NO: 9, tal como contém a sequência apresentada na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a sequência peptídica tem a fórmula geral apresentada na SEQ ID NO: 11, tal como apresentada na SEQ ID NO: 12. Em um exemplo, a sequência peptídica é Trp-Arg-His-Pro-GIn-Phe-Gly-Gly (também chamada Streptag ®, apresentado na SEQ ID NO: 7). Em um exemplo, a sequência peptídica é Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (também chamada Streptag® II, apresentada na SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o ligante peptídico contém um arranjo sequencial de pelo menos dois módulos de ligação à estreptavidina, em que a distância entre os dois módulos é de pelo menos 0 e nâo superior a 50 aminoácidos, em que um módulo de ligação tem de 3 a 8 aminoácidos e contém pelo menos a sequência His-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 9), em que Xaa é glutamina,
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166/378 asparagina ou metionina, e em que o outro módulo de ligação possui ο mesmo ou diferente ligante peptídico de estreptavidina, como apresentado na SEQ ID NO: 11 (veja, por exemplo, o Pedido PCT Internacional Publicado No. W002/077018; Patente US No. 7.981.632). Em algumas modalidades, o ligante peptídico contém uma sequência com a fórmula apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 13 ou 14. Em algumas modalidades, o ligante peptídico possui a sequência de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 15-19 [00273] Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C do agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui uma fração conhecida pelo técnico versado como um marcador de afinidade. Em tal modalidade, o reagente pode incluir um parceiro de ligação correspondente, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, conhecido por se ligar ao marcador de afinidade. Como alguns exemplos ilustrativos de marcadores de afinidade conhecidas, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode incluir d ink trofenol ou digoxigenina, oligohistidina, polhistidina, um domínio de imunoglobulina, proteína de ligação à maltose, glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação à quitina (CBP) ou tioredoxina, peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), peptídeo FLAG o marcador de HA (sequência: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp -Tyr-Ala) (SEQ ID NO: 20), o marcador de VSV-G (sequência: Tyr-Thr-Asp-lle-Glu-Met-AsnArg-Leu-Gly-Lys) (SEQ ID NO: 21), o marcador de HSV (sequência: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp) (SEQ ID NO: 22), o epítopo de T7 (Ala-Ser-Met-Thr -Gly-Gly-GIn-GIn-Met-Gly) (SEQ ID NO: 22), proteína de ligação à maltose (MBP), o epítopo de HSV da sequência Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp- O Pro-Glu-Asp (SEQ ID NO: 24) da glicoproteína D do vírus do herpes simples, o epítopo myc do fator de transcrição c-myc da sequência Glu-GIn-Lys-Leu-lle
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Ser-Glu-Glu Asp-L eu (SEQ ID NO: 25), o marcador de V5 (sequência: Gly-Lys-Pro-lle-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr) (SEQ ID NO: 26) ou glutationa-S-transferase (GST). Em tais modalidades, o complexo formado entre o um ou mais sítios de ligação Z do reagente, que pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo, e o antígeno pode ser rompido competitivamente adicionando o antígeno livre, ou seja, o peptídeo livre (marcador do epítopo) ou a proteína livre (como MBP ou CBP). Em algumas modalidades, o marcador de afinidade também pode ser um marcador de oligonucleotídeo. Em alguns casos, esse marcador de oligonucleotídeo pode, por exemplo, ser usado para hibridar com um oligonucleotídeo com uma sequência complementar, ligada ou incluída no reagente.
[00274] Outros exemplos de um parceiro de ligação C adequado incluem, entre outros, uma lectina, proteína A, proteína G, um metal, um íon metálico, derivados do ácido nitrilo triacético (NTA), motivos RGD, dextrano, polietilenoimina (PEI), um polímero redox, glicoproteínas, aptâmeros, corante, amilose, maltose, celulose, quitina, glutationa, calmodulina, gelatina, polimixina, heparina, NAD, NADP, lisina, arglnina, benzamidina, poli U ou oligo-dT. Sabe-se que lectinas como Concavalina A se ligam a polissacarídeos e proteínas glicosiladas. Um exemplo ilustrativo de um corante é um corante de triazina, como o azul Cibacron F3G-A (CB) ou o vermelho HE-3B, que se ligam especificamente a enzimas dependentes de NADH. Normalmente, o verde A se liga a proteínas Co A, albumina sérica humana e desidrogenases. Em alguns casos, os corantes 7-aminoactinomicina D e 4i,6-diamidino2-fenilindol se ligam ao DNA. Geralmente, cátions de metais como Ni, Cd, Zn, Co ou Cu são normalmente usados para ligar marcadores de afinidade, como uma sequência contendo oligo-histidina, incluindo a hexahistidina ou o marcador His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Giy-Gly-GlyCys (marcador MAT) (SEQ ID NO: 35) e éster metílico de N-metaPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 204/524
168/378 criloil-(L)-cisteína.
[00275] Em algumas modalidades, a ligação entre o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e o um ou mais sítios de ligação Z do reagente ocorre na presença de um divalente, um cátion trivalente ou tetravalente. A este respeito, em algumas modalidades, o reagente inclui um cátion divalente, trivalente ou tetravalente, tipicamente retido, por exemplo, complexado, por meio de um quelante adequado. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode incluir uma fração que inclui, por exemplo, complexos, um cátion divalente, trivalente ou tetravalente. Exemplos de um respectivo quelante de metal incluem, entre outros, etilenodiamina, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido etileno glicol tetraacético (EGTA), ácido dietilenotri-aminapentaacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil) glicina (também chamado ácido nitrilotriacético, NTA), ácido 1,2-bis(oaminofenóxi)etano-N,N,N',N'~tetraacético (BAPTA), 2,3-dímero-capto1-propanol (dimercaprol), porfina e heme. Como exemplo, o EDTA forma um complexo com a maioria dos íons metálicos monovalentes, divalentes, trivalentes e tetravalentes, como por exemplo, prata (Ag+), cálcio (Ca2+), manganês (Mn2+), cobre (Cu2+), ferro (Fe2+), cobalto (Co+) e zircônlo (Zr4+), enquanto BAPTA é específico para Ca2+. Como exemplo ilustrativo, um método padrão usado na técnica é a formação de um complexo entre um marcador de oligo-histidina e os íons cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+) ou zinco (Zn2+), que são apresentados por meio de do ácido nitrilotriacético quelante (NTA).
[00276] Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui um peptídeo de ligação à calmodulina e o reagente inclui calmodulina multimérica como descrito na Patente US
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5.985.658, por exemplo. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui um peptídeo FLAG e o reagente inclui um anticorpo que se liga ao peptídeo FLAG, por exemplo, o peptídeo FLAG, que se liga ao anticorpo monoclonal 4E11, como descrito na Patente US 4.851.341. Em uma modalidade, o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) inclui um marcador de oligo-histidina e o reagente inclui um anticorpo ou um íon de metal de transição que liga o marcador de oligo-histidina. Em alguns casos, a ruptura de todos esses complexos de ligação pode ser realizada por quelação de íons metálicos, por exemplo, quelação de cálcio, por exemplo, adicionando EDTA ou EGTA. Em algumas modalidades, calmodulina, anticorpos como 4E11 ou íons metálicos quelados ou quelantes livres podem ser multimerizados por métodos convencionais, por exemplo, por biotinilação e complexação com estreptavidina ou avidina ou seus oligômeros ou pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo, dextrano, essencialmente como descrito em Noguchi, A, et aL Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137 em um primeira etapa e ligação de calmodulina ou anticorpos ou íons metálicos quelatados ou quelantes livres através de grupos amino primários aos grupos carboxilo no polissacarídeo, por exemplo, dextrano, cadeia principal usando a química convencional da carbodiimida em uma segunda etapa. Em algumas dessas modalidades, a ligação entre o parceiro de ligação C que está incluído no agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) e o um ou mais sítios de ligação Z do reagente podem ser interrompidos por quelação de íons metálicos. A quelação de metal pode, por exemplo, ser realizada por adição de EGTA ou EDTA.
[00277] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente
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170/378 de ligação ao receptor ou agente de seleção), que se liga especificamente à molécula da superfície celular, pode, por exemplo, ser composto por um anticorpo, um fragmento do mesmo ou uma molécula de ligação proteica com anticorpo Em algumas modalidades, o sítio de ligação B do agente é um sítio de combinação de anticorpos, tal como é ou contém uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo (recombinante) incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia única (scFv), um fragmento de anticorpo divalente, como um fragmento (Fab)2', diabetes, triacorpos (lliades), P„ et a/., FEB S Lett (1997) 409, 437-441), decacorpos (Stone, E., et ai, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) e outros anticorpos de domínio (Holt, LJ, et a!., Trends Blotechnol. (2003), 21, 11, 484-490), anticorpos de domínio único (nanobodies®). Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode compreender uma molécula de ligação artificial proteica bivalente, como uma lipocalina muteína dimérica que também é conhecida como duocalina.
[00278] Em algumas modalidades, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) pode ter um único sítio de ligação B, isto é, pode ser monovalente. Exemplos de agentes monovalentes (por exemplo, agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) incluem, mas não estão limitados a, um fragmento de anticorpo monovalente, uma molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes a anticorpos ou uma molécula de MHC. Exemplos de fragmentos de anticorpo monovalente incluem, mas não estão limitados a, um fragmento Fab, um fragmento Fv, anticorpos de domínio único, por exemplo, nanobodies® derivados de camelídeos e um fragmento Fv de cadeia única (scFv), incluindo um fragmento Fv de cadeia única divalente.
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[00279] Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno, como fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia única (scFv), anticorpos de domínio único, por exemplo, nanobodies® derivados de camelídeos, um fragmento de anticorpo divalente, tal como um fragmento (Fab)2!. Em algumas modalidades, o agente é ou é derivado de um anticorpo parental que é conhecido por se ligar a uma molécula celular de interesse. Várias moléculas de anticorpo ou seus fragmentos contra moléculas da superfície celular são bem conhecidas na técnica e qualquer uma de uma variedade delas pode ser usada como agentes nos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo ou seu fragmento que contém uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia pesada variável de um anticorpo parental ou de referência, por exemplo, para gerar um anticorpo com uma afinidade alterada ou que exibe uma taxa de dissociação suficientemente rápida como descrito acima. Por exemplo, exemplos de tais mutações são conhecidos no contexto de mutantes do anticorpo anti-CD4 13B8.2 (veja, por exemplo, as patentes U.S.s n° 7.482.000, pedido de patente U.S. n° US2014/0295458 ou pedido de patente internacional n° WO2013/124474) e qualquer uma dessas mutações pode ser gerada em outro anticorpo parental ou de referência.
[00280] Em alguns aspectos, o agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) que pode ser monovalente, por exemplo, compreende um fragmento de anticorpo monovalente ou uma molécula de ligação artificiai monovalente (proteico ou outro), como uma muteína à base de um polipeptídeo da família lipocalina (também conhecido como Anticalin®), ou uma molécula bivalente, como um anticorpo ou um fragmento, no qual os dois sítios de ligação são retidos, como um fragmento F(ab')2.
[00281] Um exemplo de uma molécula de ligação proteica com funções semelhantes a anticorpos inclui uma muteína baseada em um
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172/378 polipeptídeo da família das lipocalinas (veja, por exemplo, WO 03/029462, Beste et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96, 18981903). Geralmente, as lipocalinas, como a proteína de ligação à bilina, a lipocalina associada à gelatinase humana neutrófila, a lipoproteína D Apo humana ou a lipocalina lacrimal humana possuem sítios de ligação ao ligante naturais que podem ser modificados para que eles liguem um determinado alvo. Outros exemplos de uma molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes a anticorpos que podem ser usados como agente (por exemplo, agente de ligação ao receptor ou agente de seleção) que se liga especificamente à molécula da superfície celular incluem, mas não estão limitados a, os chamados glucorpos (veja, por exemplo, pedido de patente internacional WO 96/23879), proteínas à base de estrutura anquirina (Mosavi, LK, et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) ou estrutura cristalina (por exemplo, pedido de patente Internacional WO 01/04144) as proteínas descritas em Skerra, J. Mol. Reconhecer. (2000) 13, 167187, AdNectinas, tetranectinas e avímeros. Geralmente, avímeros, incluindo proteínas avlméricas multivalentes desenvolvidas pelo embaralhamento de éxons de uma família de domínios de receptores humanos, contêm os chamados domínios A que ocorrem como cadeias de múltiplos domínios em vários receptores da superfície celular (Silverman, J. et ai., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). As adnectinas, geralmente derivadas de um domínio da fibronectina humana, contêm tipicamente três alças que podem ser manipuladas para a ligação do tipo imunoglobulina a alvos (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). As tetranectinas, geralmente derivadas da respectiva proteína homotrimérica humana, também contêm tipicamente regiões de alça em um domínio de lectina do tipo C que pode ser manipulado para a ligação desejada. Os peptídeos, que podem, em alguns casos, atuar como ligantes proteicos, são
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173/378 tipicamente oliginas (N-alquil)glicina que diferem dos peptídeos, pois a cadeia lateral está conectada ao nitrogênio da amida e não ao átomo de carbono. Os peptídeos são tipicamente resistentes a proteases e outras enzimas modificadoras e podem ter uma permeabilidade celular muito superior aos peptídeos (veja, por exemplo, Kwon, Y.-U. e Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509).
[00282] Outros exemplos de moléculas de ligação proteica adequadas incluem, mas não estão limitados a, um domínio semelhante ao EGF, um domínio Kringle, um domínio da fibronectina tipo I, um domínio da fibronectina tipo II, um domínio da fibronectina III, um domínio PAN, um domínio Gla, um domínio SRCR, um domínio Inibidor da tripsina pancreática Kovitz/Bovino, tendamistat, um domínio inibidor da serina protease do tipo Kazal, um domínio Trefoil (tipo P), um domínio do tipo C do fator von Willebrand, um domínio do tipo Anafilatoxina, domínio CUB, repetição de tireoglobulina tipo I, domínio classe A do receptor de LDL, domínio Sushi, domínio Link, domínio Trombospondina I, domínio imunoglobulina ou domínio semelhante à imunoglobulina (por exemplo, anticorpos de domínio ou anticorpos de cadeia pesada de camelo), um domínio lectina do tipo C, um domínio MAM, um domínio do fator A de von Willebrand, um domínio Somatomedina B, um domínio com quatro dissulfetos do tipo WAP, um domínio do tipo C F5/8, um domínio da hemopexina, um domínio SH2, um domínio SH3, um domínio tipo EGF do tipo Laminina, um domínio C2, Kappabodies (III eta/. Protein Eng (1997) 10, 949-57, um chamado minicorpo (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), urn diacorpo (Holliger et al., PNAS USA (1993) 90, 6444- 6448), o chamado Janusis (Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659, ou Traunecker et a/., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52)), urn nanocorpo, um microcorpo, uma afilina, um aficorpo, um knottin, ubiquitina, uma proteína de ligador de zinco, uma proteína autofluorescente, DARPinas ou uma proteína de re
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174/378 petição rica em leucina. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico com funções semelhantes a anticorpos pode ser um aptâmero. Geralmente, um aptâmero se dobra em um motivo tridimensional definido e mostra alta afinidade para uma dada estrutura alvo.
[00283] Em certas modalidades, um ou mais agentes, por exemplo, agentes contendo um parceiro de ligação, como um parceiro de ligação C, sâo anexados, conectados e/ou ligados a um reagente de partículas oligomérico. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes são reversivelmente ligados, conectados e/ou ligados ao reagente de partículas oligomérico. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes são ligados, conectados e/ou ligados, por exemplo, de forma reversível, aos reagentes de partículas oligoméricos ao entrar em contato, tratar e/ou incubar o um ou mais agentes com os reagentes de partículas oligoméricos. Em certas modalidades, o tratamento, contato e/ou incubação são realizados com mistura e/ou agitação, por exemplo, agitação gentil e/ou mistura.
[00284] Em certas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou em contato com os reagentes de partículas oligoméricos por, aproximadamente, ou por pelo menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas ou 24 horas. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos por entre 1 minuto e 12 horas, entre 1 minuto e 1 hora, entre 1 minuto e 1 hora, entre 1 minuto e 30 minutos, entre 10 minutos e 60 minutos, entre 10 minutos e 20 minutos, entre 1 hora e 3 horas, entre 1 hora e 2 horas ou entre 6 horas e 12 horas. Em certas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos por entre 5 minutos e 30 minutos, ou por ou por cerca de 15 minutos.
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[00285] Em modalidades particulares, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos a uma temperatura de, aproximadamente, ou pelo menos 4°C, 8°C, 12°C, 16°C, 20°C, 24°C, 28°C, 32°C, 37°C, 39°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C ou 100°C. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 37°C, entre 10°C e 25°C, entre 20°C e 30°C, entre 24°C e 39°C, ou entre 40°C e 100°C. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes sâo incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos em temperatura ambiente. Em certas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos a ou a cerca de 23°C, 24°C, 25°C ou 26°C ± 2°C, ± 1°C, ± 0,5°C, ± 0,2°C, ± 0,1 °C, ± 0,05°C ou ±0,01 °C.
[00286] Em certas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos em uma quantidade de, de cerca de, ou de pelo menos 0,1 pg, 0,2 pg, 0,3 pg, 0,4 pg, 0,5 pg, 0,6 pg, 0,7 pg, 0,8 pg, 0,9 pg, 1,0 pg, 1,2 pg, 1,4 pg, 1,6 pg, 1,8 pg, 2,0 pg, 2,2 pg, 2,4 pg, 2,4 pg, 2,6 pg, 2,8 pg ou 3,0 pg por 0,5 pg, 1,0 pg, 1,5 pg, 2,0 pg, 2,5 pg, 3,0 pg, 4,0 pg, 5,0 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg ou 10 pg de reagente de partículas oligomérico. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos em uma quantidade de ou de cerca de 1,0 pg, agentes por 2 pg, 3 pg, 4 pg ou 5 pg de partículas oligoméricas reagente.
[00287] Em algumas modalidades, um ou mais agentes, por exemplo, agentes contendo um parceiro de ligação, como um parceiro de ligação C, são anexados, conectados e/ou ligados a um reagente de partícula oligomérico incubando, tratando e/ou contatando o oligoméri
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176/378 co reagentes de partículas com um ou mais agentes. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos em uma quantidade de ou de aproximadamente 1,0 pg de agentes por 2 pg, 3 pg, 4 pg ou 5 pg de reagente de partícula oligomérico entre 1 minuto e 1 hora a uma temperatura entre 4°C e 39°C, entre 10°C e 25°C ou entre 20°C e 30°C. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes são incubados, tratados e/ou contatados com os reagentes de partículas oligoméricos em uma quantidade de ou de cerca de 1,0 pg de agentes por 3 pg de reagente de partícula oligomérico por entre 5 minutos e 30 minutos a uma temperatura entre 10°C e 25°C. Em certas modalidades, o um ou mais agentes são agentes aqui descritos, por exemplo, na Seção ll-C-3. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti~CD3 e/ou um anticorpo anti-CD28 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo ou seu fragmento de antígeno que contém um parceiro de ligação, por exemplo, um streptag. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes é um Fab anti-CD3 e/ou an~ ti-CD28 contendo um parceiro de ligação, por exemplo, um peptídeo de ligação à estreptavidina, como Strep-tag II.
a. Agentes de ligação ao receptor
[00288] Em algumas modalidades, o agente é um agente de ligação ao receptor. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor se liga a uma molécula (por exemplo, receptor) na superfície de uma célula, cuja ligação entre o agente e a molécula é capaz de induzir ou modular um sinal nas células. Em alguns casos, a molécula de superfície celular (por exemplo, receptor) é uma molécula de sinalização. Em alguns desses casos, o agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especiflcamente a uma molécula de sinalização expressa por uma ou mais das células. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor é um agente estimulador, que pode ser qualquer
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177/378 agente capaz de induzir um sinal em uma célula (por exemplo, uma célula T) após a ligação a uma molécula da superfície celular, como um receptor. Em algumas modalidades, o sinal pode ser imunoestimulador, caso em que o agente de ligação ao receptor ou agente estimulador é capaz de induzir ou modular um sinal que está envolvido ou que estimula uma resposta imune pela célula (por exemplo, célula T), por exemplo, aumentar a proliferação ou expansão de células imunes, ativação de células imunes, diferenciação de células imunes, secreção de citocinas, atividade citotóxica ou uma ou mais outras atividades funcionais de uma célula imune. Em alguma modalidade, o sinal pode ser inibitório, caso em que o agente de ligação ao receptor ou agente estimulador é capaz de induzir ou modular um sinal na célula (por exemplo, célula T) que está envolvida ou que inibe uma resposta imune, por exemplo, inibe ou diminui a proliferação ou expansão de células imunes, ativação de células imunes, diferenciação de células imunes, secreção de citocinas, atividade citotóxica ou uma ou mais outras atividades funcionais de uma célula imune.
[00289] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, primeiro agente estimulador. Em alguns aspectos, o primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, se liga a uma molécula receptora na superfície das células. Assim, em alguns casos, o primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, induz ou modula um sinal. Em alguns aspectos, a indução ou modulação de um sinal pelo primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, primeiro agente estimulador, afeta a ativação, estimulação e/ou expansão (proliferação) das células. Assim, em alguns casos, o primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, fornece um sinal de ativação primário para as células, ativando assim as
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178/378 células.
[00290] Em algumas modalidades, a população de células pode ser uma população de linfócitos, incluindo, entre outros, uma população de células B, uma população de células T ou uma população de células exterminadoras naturais. Exemplos ilustrativos de populações de células são células B que transportam CD40 ou CD137 (ambas as populações de células podem ser proliferadas mediante a ligação de apenas um primeiro agente que fornece um sinal de ativação, por exemplo, ligante 4-1 BB; ou uma molécula de anticorpo aCD40 ou uma molécula de anticorpo aCD137 (veja, por exemplo, Zhang et aL, 2010, J Immunol, 184: 787-795)). Outros exemplos ilustrativos de agentes (primeiro ou segundo) que podem ser utilizados para a expansão de células B são agentes que se ligam a IgG, CD19, CD28 ou CD14, por exemplo, moléculas de anticorpo aCD19, algG, aCD28 ou aCD14. Também está previsto que o primeiro ou o segundo agente para a expansão da célula B possa compreender ligantes para receptores do tipo pedágio ou interleucinas, como IL-21 (veja, por exemplo, Dienz O, et al. 2009. J. Exp. Med. 206 : 69) Note-se que a ativação de células B dependente de lipopolissacarídeo também é abrangida na presente invenção, pois um lipopolissacarídeo também pode ser usado como primeiro agente e pode ser equipado com um parceiro de ligação C1, quando aqui utilizado.
[00291] Outros exemplos ilustrativos de populações de células adequadas incluem a população de células T que se expandem após serem ativadas pela ligação de um primeiro agente ao TCR/CD3 e a ligação de um segundo agente a uma molécula acessória na célula T, como CD28. Neste caso, o primeiro agente estimula um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T e o segundo agente fornece um estímulo secundário ligando o CD28 como molécula acessória. Os agentes que podem ser usados para a expansão de células T também
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179/378 podem incluir interleucinas, como IL-2, IL-7, IL-15 ou IL-21 (veja, por exemplo, Cornish et al. 2006, Blood. 108 (2) : 600-8, Bazdar e Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81 (22): 12670-12674, Battalia et al., 2013, Immunology, 139 (1): 109-120). Outros exemplos ilustrativos para agentes que podem ser utilizados para a expansão de células T são agentes que se ligam a CD8, CD45 ou CD90, como anticorpos aCD8, aCD45 ou aCD90. Exemplos ilustrativos de população de células T, incluindo células T específicas para antígeno, células T auxiliares, células T citotóxicas, célula T de memória (um exemplo ilustrativo de células T de memória são células T de memória central específica para CD62L + CD8+) ou células T reguladoras (um exemplo ilustrativo de Treg são células Treg CD4+CD25+CD45RA+).
[00292] Outro exemplo ilustrativo de uma população celular adequada inclui células exterminadoras naturais (células NK), que podem, por exemplo, ser expandidas com agentes que se ligam a CD16 ou CD56, como, por exemplo, anticorpos aCD16 ou oCD56. No exemplo ilustrativo para esse anticorpo oCD16 está o anticorpo 3G8 com uma sequência VH apresentada na SEQ ID NO: 52 e uma sequência VL apresentada na SEQ ID NO: 53 (veja, por exemplo, Hoshino et al., Blood. 1991 Dec 15; 78 (12): 3232-40.). Outro agente que pode ser utilizado para expansão das células NK pode ser a IL-15 (veja, por exemplo, Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266 : 87-92). Ainda outro exemplo ilustrativo de uma população celular adequada inclui monócitos, que podem, por exemplo, ser expandidos usando um agente que se liga ao CD14, como uma molécula de anticorpo oCD14.
[00293] Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, tem como alvo especifico uma molécula expressa na superfície das células-alvo na qual a molécula é um TCR ou um receptor de antígeno quimérico. Por exemplo, a molécula expressa na superfície da célula-alvo é selecionada a partir de um comPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 216/524
180/378 plexo receptor de célula T ou célula B, uma cadeia CD3, uma CD3 zeta, uma porção de ligação ao antígeno de um receptor de células T ou um receptor de células B ou um receptor de antígeno quimérico. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor direciona complexos de peptídeo:MHC classe I. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estlmulador, liga-se especificamente à porção de anticorpo do receptor recombinante, por exemplo, CAR. Em alguns casos, a porção de anticorpo do receptor recombinante inclui pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como uma região de articulação, por exemplo, uma região de articulação de lgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como lgG4 ou lgG1. Em alguns casos, o reagente é carregado com algG que reconhece o espaçador lgG4.
[00294] Em algumas modalidades, o primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, pode estimular um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células, por exemplo, células T. Em alguns aspectos, o primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, pode ser um agente de ligação que se liga especificamente ao CD3. Em alguns casos, um primeiro agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro agente estimulador, que se liga especificamente ao CD3 selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti~CD3, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD3 e uma molécula de ligação proteica CD3 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpos, o fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento (Fab)2' ou um fragmento Fv divalente de cadeia única, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv, um nanocorpo (sdAnticor
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181/378 po) e um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Em alguns casos, uma molécula de ligação proteica a CD3 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpos pode ser um aptâmero, uma muteína com base em um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína à base da estrutura anquirina, uma proteína baseada na estrutura cristalina, uma adnectina, DARPin ou um avímero.
[00295] Em algumas modalidades, um fragmento Fab anti-CD3 pode ser derivado do anticorpo monoclonal de ligação a CD3 produzido pela linhagem celular de hibridoma OKT3 (ATCC® CRL-8001™: veja também a Patente U.S. No. 4.361.549). O domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD3 OKT3 são descritos em Arakawa et a/. Biochem. 120, 657-662 (1996) e compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 31 e 32, respectivamente.
[00296] Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, é um segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador. Em alguns casos, o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador, se liga a uma molécula na superfície das células, como uma molécula de superfície celular, por exemplo, molécula do receptor. Em algumas modalidades, o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, o segundo agente estimulador, é capaz de realçar, amortecer ou modificar um sinal liberado através da primeira molécula. Em algumas modalidades, o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador, induz ou modula um sinal, por exemplo, um segundo ou um sinal adicional. Em alguns aspectos, o segundo agente de ligação a receptores, por exemplo, segundo agente estimulador, pode melhorar ou potencializar um sinal induzido pelo primeiro agente de ligação a receptores, por exemplo, primeiro agente estimulador. Em algumas modalidades, o segundo agente de
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182/378 ligação a receptores, por exemplo, o segundo agente estimulador, ligase a uma molécula acessória e/ou pode estimular ou induzir um sinal acessório ou secundário na célula. Em alguns aspectos, o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, o segundo agente estimulador, se liga a uma molécula coestimuladora e/ou fornece um sinal coestimulador.
[00297] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador, liga-se, por exemplo, liga-se especificamente a uma segunda molécula que pode ser uma molécula coestimuladora, uma molécula acessória, um receptor de citocina, um receptor de quimiocina, uma molécula de ponto de verificação imune ou um membro da família TNF ou da família de receptores de TNF.
[00298] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD28 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador,) liga-se especificamente ao CD28. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente a CD28, pode ser selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD28 e uma molécula de ligação proteica CD28 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpos. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento (Fab)2' ou um fragmento Fv divalente de cadeia única, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um
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Fv de cadeia única fragmento (scFv). Um a molécula de ligação aquosa da proteína CD28 com propriedades de ligação do tipo anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína à base de um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína à base da estrutura anquirina, uma proteína à base da estrutura cristalina, uma adnectina e um avímero. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, o agente estimulador que se liga especificamente ao receptor é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, um fragmento Fab.
[00299] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um ligante que se liga, por exemplo, se liga especificamente ao receptor, por exemplo, uma molécula de superfície celular que estimula ou ativa um sinal de ativação de células T 2, por exemplo, sinal coestimulador, após ligação do agente. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou adicional agente de ligação ao receptor, é um ligante endógeno, um ligante cognato, um ligante sintético e/ou uma porção, uma variante ou formas modificadas dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato.
[00300] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador é capaz de se ligar à qualquer um ou mais dentre CD28, CD5, CD4, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, 0X40, CD27L (CD70), 4-1 BBL, CD30L e LIGHT. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um anticorpo, anticorpo divalente (por exemplo, um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente), anticorpo monovalente (por exemplo, um fragmento Fab,
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184/378 um fragmento Fv ou um fragmento Fv de cadeia única (scFv)) ou ligante a qualquer um ou mais dentre CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, 0X40, CD27L (CD70), 4-1 BBL, CD30L e LIGHT, em qual tal agente é capaz de induzir ou modelar um sinal nas células na ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador à molécula.
[00301] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um ligante para qualquer um ou mais dentre CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, 0X40, CD27L (CD70), 4-1 BBL, CD30L e LIGHT, em que tal agente é capaz de induzir ou modelar um sinal nas células na ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador à molécula. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é ou contém o domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ICOS-L, PD-L1, OX40L, CD27, 4-1 BB (CD137) e/ou CD30.
[00302] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, é capaz de se ligar especificamente a uma molécula sobre a superfície das células-alvo que não sejam CD28, CD3, CD137 ou CD40. Em alguns casos, a ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, à molécula sobre a superfície das células-alvo que não sejam CD28, CD3, CD137 ou CD40 induz ou modula um sinal nas células-alvo e/ou altera uma função das células-alvo, gerando assim células-alvo cultivadas.
[00303] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador é capaz de se ligar à qualquer um ou mais de um membro da família TNF ou da família do receptor TNF, por
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185/378 exemplo, um membro da superfamília do receptor TNF, e/ou um receptor ou correceptor de Wnt, por exemplo, a família Frizzled (Fz) de receptores.
[00304] Em algumas modalidades, a molécula na célula é um membro da superfamília do receptor de TNF, tal como Receptor 1 do fator de necrose de tumor (CD120a), Receptor 2 do fator de necrose de tumor 2 (CD120b), Receptor beta de linfotoxina (CD18), 0X40 (CD134), CD40 (Bp50), receptor Fas (Apo-1, CD95), Receptor isca 3 (TR6, M68), CD27 (S152, Tp55), CD30 (Ki-1), 4-1 BB (CD137), Receptor de morte 4 (TRAILR1, Apo-2, CD261), Receptor de morte 5 (TRAILR2, CD262), Receptor isca 1 (TRAILR3, LIT, TRID, CD263), Receptor isca 2 (TRAILR4, TRUNDD, CD264), RANK (CD265), Osteoprotegerina (OCIF, TR1), receptor TWEAK (Fn14, CD266), TACI (IGAD2, CD267), receptor BAFF (CD268), Mediador de entrada do herpesvirus (ATAR, TR2, CD270), Receptor do fator de crescimento de nervo (p75NTR, CD271), antígeno de maturação de célula B (TNFRSF13A, CD269), Relacionado ao TNFR induzido por glicocorticoide (AITR, CD357), TROY (TAJ, TRADE), Receptor de morte 6 (CD358), Receptor de morte 3 (Apo-3, TRAMP, LARD, WS-1) ou Receptor de ectodisplasina A2 (XEDAR).
[00305] Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente à proteína da superfamília do receptor de TNF é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente à proteína da superfamília do receptor de TNF pode ser um ligante que se liga, por exemplo, especificamente se liga ao receptor e/ou a um domínio extracelular ou a uma porção do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante é ou inclui TNFa, Linfotoxina beta (TNF-C), OX40L, CD154, FasL, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, ligante 4-1 BB, TRAIL, RANKL,
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TWEAK, ABRIL, BAFF, CAMLG, BAFF, LIGHT, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, BAFF, ligante GITR, TL1A ou EDA-A2, ou um domínio extracelular ou uma porção do mesmo de qualquer uma das proteínas de transmembrana.
[00306] [329] Em algumas modalidades, a molécula na célula é um receptor ou correceptor de Wnt, como um receptor da família Frizzled (Fz), uma proteína relacionada ao receptor da lipoproteína (LRP) -5/6, tirosina cinase do receptor ( RTK) e receptor órfão 2 relacionado ao receptor (ROR2). Em algumas modalidades, a molécula na célula é, por exemplo, Frlzzled-1 (FZD1), Frlzzled-2 (FZD2), Frizzled-3 (FZD3), Frizzled-4 (FZD4), Frizzled-5 (FZD5), Frizzled- 6 (FZD6), Frizzled-7 (FZD7), Frizzled-8 (FZD8), Frizzled-9 (FZD9) ou Frizzled-10 (FZD10).
[00307] Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente ao receptor ou correceptor Wnt é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente ao receptor ou correceptor Wnt pode ser um lígante que se liga, por exemplo, especificamente se liga ao receptor. Em algumas modalidades, o ligante é ou inclui, por exemplo, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9A, WNT9A, WNT9A
[00308] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o agente estimulador é capaz de se ligar à qualquer um ou mais dentre CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (41BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 e HVEM. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um anticorpo, anticorpo divalente (por exemplo, um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente), anticorpo monovalente (por exemplo, um fragmento Fab,
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187/378 um fragmento Fv ou um fragmento Fv de cadeia única (scFv)) ou ligante a qualquer um ou mais de CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 e HVEM, em que tal agente é capaz de induzir ou modelar um sinal nas células na ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador à molécula.
[00309] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um ligante para qualquer um ou mais dentre CD28, 4-1 BB (CD137), CD40, CD40L, Ligador para ativação de células T (LAT), CD27, 0X40 (CD134) e mediador de entrada de herpesvirus (HVEM), em que tal agente é capaz de induzir ou modelar um sinal nas células na ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador à molécula. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é ou contém o domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1 BBL, CD40, CD40L, CD27L (CD70) e/ou OX40L.
[00310] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD28 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) liga-se especificamente ao CD28.
[00311] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD28 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) liga-se especificamente ao CD28. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo,
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188/378 que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD28, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo antiCD28, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo antiCD28 e uma molécula de ligação ao CD28 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv, um nanocorpo e um fragmento Fv de cadeia única (scFv).
[00312] Em algumas modalidades, um fragmento Fab anti-CD28 pode ser derivado do anticorpo CD28.3 (depositado como uma construção de Fv de cadeia única sintética sob o N° de Acesso GenBank AF451974.1; veja também Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, páginas 564-570) cujas cadeias pesada e leve compreendem a SEQ ID NO: 33 e 34, respectivamente.
[00313] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD90 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador,) liga-se especificamente ao CD90. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD90, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD90, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo antiCD90, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo antiCD90 e uma molécula de ligação ao CD90 proteica com propriedades
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189/378 de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer conhecido na técnica. Veja, por exemplo, anticorpo anti~CD90 G7 (Biolegend, cat. no 105201).
[00314] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD95 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador,) liga-se especificamente ao CD95. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD95, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti~CD95, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo antiCD95, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo antiCD95 e uma molécula de ligação ao CD95 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer conhecido na técnica. Por exemplo, em alguns aspectos, o anticorpo anti-CD90 pode ser CD95 CH11 anti-humano de camundongo monoclonal (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) ou pode ser mAb 7C11 anti-CD95 ou anti-APO-1, tal como descrito em Paulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631.
[00315] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T ou célula B, pode ser CD137 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo estimulador), llga-se especiflcamente ao CD137. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por
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190/378 exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD137, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD137 e uma molécula de ligação ao CD137 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer conhecido na técnica. Por exemplo, o anticorpo anti-CD137 pode ser LOB12, lgG2a ou LOB12.3, lgG1 como descrito em Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec; 32(12):3617-27. Veja também, por exemplo, US6569997, US6303121, Mittler et al. Immunol Res. 2004; 29(13):197-208.
[00316] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula B pode ser CD40 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador), liga-se especificamente ao CD40. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor (que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD40 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD40, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD40, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti~CD40 e uma molécula de ligação ao CD40 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer um conhecido na técnica. Por exemplo, o anticorpo anti-CD40 pode ser o anticorpo monoclonal quimérico anti-CD40 humano Teneliximabe e CD40 anti-humano (Affymetrix cat. N° 14-0409-80) ou qualquer um descrito em, por exemplo, US 2002/0142358, US 2007/0077242, WO 2001/083755, Zhang et al., 2010, J Immunol, 184: 787-795.
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[00317] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD40L (CD154) e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) se liga especificamente ao CD40L Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao CD40L, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD40L, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD40L, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD40L e uma molécula de ligação ao CD40L proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer conhecido na técnica. Por exemplo, o anticorpo anti-CD40L pode, em alguns aspectos, ser Hu5C8, como descrito em Blair et al. JEM vol. 191 no. 4 651-660. Veja também, por exemplo, WO1999061065, US20010026932, US7547438, WO2001056603. Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser um estimulador de célula T induzível (ICOS), Ligante para Ativação de células T (LAT), CD27, 0X40 (CD134), mediador de entrada do herpesvirus (HVEM), CD90 e/ou CD95 e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, segundo agente estimulador), liga-se especificamente ao ICOS, LAT, CD27, CD134, HVEM, CD90 e/ou CD95, respectivamente. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser o segundo agente de ligação ao receptor, por exemplo, o segundo agente estimulador) que se liga especificamente ao ICOS, LAT, CD27, CD134, HVEM, CD90 e/ou CD95 pode ser selecionado a
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192/378 partir do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo divalente do mesmo, um fragmento de anticorpo monovalente do mesmo e uma molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser derivado de qualquer conhecido na técnica.
[00318] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, à qual o agente de ligação ao receptor, que pode ser um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, se liga a uma molécula de superfície celular que estimula ou ativa um sinal de citocina, sinal de quimiocina, sinal de adesão celular, sinal de ativação de célula T ou sinais adicionais, por exemplo, sinais ambientais, na ligação do agente. Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, à qual o agente de ligação ao receptor, que pode ser um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, especificamente se liga, é um receptor de citocina ou um receptor de quimiocina. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um agente de ligação ao receptor adicional, é ou contém uma molécula de adesão, é um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina, expressão de uma molécula de adesão e/ou está envolvido na estimulação e/ou modulação de um sinal acessório e/ou um sinal adicional, por exemplo, um sinal ambiental.
[00319] Em qualquer uma das modalidades aqui fornecidas, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, o segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador, pode ser um agente de ligação que se liga especificamente a um receptor, por exemplo, um receptor expresso sobre a superfície da célula.
[00320] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um anticorpo ou frag
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193/378 mento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma molécula de superfície celular que estimula ou ativa um sinal de citocina, sinal de quimiocina, sinal de adesão celular, sinal de ativação de célula T ou sinais adicionais, por exemplo, sinais ambientais, na ligação do agente. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador, que se liga especificamente ao receptor, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-receptor, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-receptor, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-receptor e uma molécula de ligação ao receptor proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Em alguns casos, uma molécula de ligação ao receptor proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína baseada na estrutura anquirina, uma proteína baseada na estrutura cristalina, uma adnectina, um DARPIn ou um avímero. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, o agente estimulador que se liga especifícamente ao receptor é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab.
[00321] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um ligante que se liga, por exemplo, especificamente se liga ao receptor, por exemplo, uma molécula de superfície celular que estimula ou ativa um sinal de citocina,
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194/378 sinal de quimiocina, sinal de adesão celular, sinal de ativação de célula T ou sinais adicionais, por exemplo, sinais ambientais, na ligação do agente. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, é um ligante endógeno, um ligante cognato, um ligante sintético e/ou uma porção, uma variante ou formas modificadas dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato.
[00322] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, é ou contém um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, é ou compreende um ligante do receptor de citocina, por exemplo, uma citocina ou uma porção do mesmo. Os receptores de citocina exemplares incluem, porém, não estão limitados a, IL-2R, IL7R, IL-21R, CD132 (cadeia gama comum do receptor de IL), IL-1 R, IL15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR Tipo I, IL-12R, IL17R, TNFR1 e TNFR2. Ligantes exemplares, por exemplo, citocinas, incluem, porém, não estão limitados a, IL-2, IL-7, IL-21, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, IL-10, interferons tipo I (por exemplo, IFNa e/ou IFNp), IL-12, IL-17, IL-9 e TNF e seus fragmentos biologicamente ativos.
[00323] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um receptor de citocina. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agen
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195/378 te de ligação adicional ao receptor, que se liga especificamente ao receptor de citocina, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti~(receptor de citocina), um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-(receptor de citocina), um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-(receptor de citocina) e uma molécula de ligação ao receptor de citocina proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv).
[00324] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente de ligação ao receptor adicional, é ou contém um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, é ou compreende um ligante do receptor de quimiocina, por exemplo, uma quimiocina ou uma porção da mesma. Exemplos de receptores de quimiocina incluem, porém, não estão limitados a, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4. Ligantes exemplares, por exemplo, quimiocinas, incluem, porém, não estão limitados a, CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou seus fragmentos biologicamente ativos.
[00325] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação ao receptor adicional, é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um receptor de quimiocina. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, um segundo ou um agente de ligação adicional ao receptor, que se liga especificamente ao receptor de quimiocina, pode ser selecionado a partir do grupo que con
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196/378 siste em um anticorpo anti-(receptor de quimiocina), um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-(receptor de quimiocina), um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-(receptor de quimiocina) e uma molécula de ligação ao receptor de quimiocina proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv).
[00326] Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente à molécula de adesão ou aos fatores que induzem a citocina é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor que se liga especificamente à molécula de adesão ou fatores que induzem a citocina podem ser um ligante que se liga, por exemplo, especificamente se liga ao receptor. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é um ligante endógeno, um ligante cognato, um ligante sintético e/ou uma porção, uma variante ou forma modificada dos mesmos, da molécula de adesão e/ou do receptor. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato que é ele próprio uma proteína de transmembrane e de superfície celular.
[00327] Em alguns casos, a molécula na célula, por exemplo, molécula de adesão, é CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1; sequência de cadeia alfa e beta de tamanho natural definida na SEQ ID NOS: 36 e 37, respectivamente), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina; sequência de tamanho natural mencionada em SEQ ID NO: 38),
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CD29/CD49d (VLA-4; sequência de tamanho natural mencionada em SEQ ID NO: 40), CD106 (VCAM-1; sequência de tamanho natural mencionada em SEQ ID NO: 39) ou é um fragmento biologicamente ativo dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno que se liga, por exemplo, especificamente se liga a uma molécula de adesão, por exemplo, CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 ( ICAM-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM1) ou é um fragmento biologicamente ativo dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é um ligante ou uma porção dele, que se liga, por exemplo, especificamente se liga a uma molécula de adesão, por exemplo, CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA1), CD29, CD54 (ICAM- 1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA4), CD106 (VCAM-1). Tais agentes de ligação ao receptor incluem um agente que é ou compreende um domínio extracelular (ECD) ou uma porção do mesmo, de um ligante endógeno e/ou um ligante cognato de uma molécula de adesão. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor é um domínio extracelular ou uma porção do mesmo, de uma molécula de adesão e pode ligar uma ou mais moléculas de adesão na superfície de uma célula. Exemplos de tais agentes de ligação ao receptor incluem o domínio extracelular de LFA-1 α (ECD mencionado em SEQ ID NO: 54); LFA-1 β (ECD mencionado em SEQ ID NO: 55); L-selectina (ECD mencionado em SEQ ID NO: 57); VCAM-1 (ECD mencionado em SEQ ID NO: 56); e VLA-4 (ECD mencionado em SEQ ID NO: 58), ou qualquer porção dos mesmos.
[00328] Em algumas modalidades, o fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão é ou contém um fator nuclear, tal como um receptor órfão gama relacionado ao receptor de ácido retinoico (RORgama) ou RORalfa.
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[00329] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser IL-2R, IL-7R (CD127), IL-21 R (CD360), cadeia gama comum do receptor de IL (yc; ou CD132), IL-1R (CD121), tal como IL-1R1 ou IL-1R2, IL-15R (CD215), receptor de interferon gama (IFNyR; CD119), receptor alfa do fator de necrose de tumor (TNFaR), incluindo TNFR1 (CD120a) e TNFR2 (CD120b), IL-4R, IL-10R, receptor de Interferon tipo I, por exemplo, receptor de IFNa (IFNAR), incluindo IFNAR1 e IFNAR2, IL-17R (CD217) e/ou IL-12R e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador liga-se especificamente à molécula. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente adicional de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador adicional) que se liga especificamente à molécula na célula, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo divalente, um fragmento de anticorpo monovalente e uma molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo.
[00330] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador adicional) pode incluir um ligante de um receptor estimulador ou outro receptor capaz de induzir um sinal na célula, tal como um ligante de IL2, um ligante de IL-7, um ligante de IL-21, um ligante de IL-1, um ligante de IL-15, um ligante de IL-9, um ligante de IFNy, um ligante de TNFa, um ligante de IL-4, um ligante de IL-10, um ligante de IL-12, um ligante de IL-17 ou uma porção ou variante biologicamente ativa do mesmo. Em algumas modalidades, a porção ou variante biologicamente ativa mantém a atividade para se ligar ao receptor e/ou uma atividade funcional para modular um ou mais sinais para o receptor.
[00331] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor,
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199/378 por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador adicional) pode incluir um ligante de um receptor estimulador ou outro receptor capaz de induzir um sinal na célula, tal como um Interferon tipo I, por exemplo, IFNa, ΙΕΝβ, IFNk, IFNõ, IFNe, IFNt, IFNü) e ΙΕΝζ (também conhecido como limitina) ou uma porção biologicamente ativa dos mesmos.
[00332] Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CXCR3, CCR7, CXCR1 ou CXCR4, e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador adicional) liga-se especificamente a CXCR3, CCR7, CXCR1 ou CXCR4. Em alguns aspectos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente adicional de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador adicional) que especificamente liga o CXCR3, CCR7, CXCR1 ou CXCR4, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo divalente, um fragmento de anticorpo monovalente e uma molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo.
[00333] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador adicional) pode incluir um ligante de um receptor estimulador ou outro receptor capaz de induzir um sinal na célula, tal como um ligante CXCL9, ligante CXCL10, um ligante CCL19, um ligante CCL21, ligante CCL25 ou uma porção biologicamente ativa dos mesmos que mantém atividade para se ligar ao receptor e/ou uma atividade funcional para modular um ou mais sinais para o receptor.
[00334] Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por
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200/378 exemplo, agente de ligação ao receptor adicional, é ou contém uma molécula de adesão ou é um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina, expressão de uma molécula de adesão e/ou está envolvido na estimulação e/ou modulação de um sinal acessório e/ou um sinal adicional. Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser CD62L e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador), liga especificamente o CD62L. Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser RORyt e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador adicional) se liga especificamente RORyt. Em algumas modalidades, a molécula na célula, por exemplo, célula T, pode ser RORa e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador (por exemplo, que pode ser um agente adicional de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador adicional) liga especificamente o RORa.
[00335] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador é capaz de se ligar à qualquer um ou mais dentre CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD1, 0X40, CD27L (CD70), 4-1 BBL, CD30L e LIGHT e o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, pode ser um anticorpo, anticorpo divalente (por exemplo, um fragmento (Fab)2' ou um fragmento Fv de cadeia única divalente), anticorpo monovalente (por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fv ou um fragmento Fv de cadeia única ( scFv)) ou ligante a qualquer um ou mais dentre CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, 0X40, CD27L (CD70), 4-1 BBL, CD30L e LIGHT, em que tal agente é capaz de induzir ou modelar um sinal nas células na ligação do agente de ligação ao
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201/378 receptor, por exemplo, agente estimulador à molécula.
[00336] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, é capaz de se ligar especificamente a uma molécula sobre a superfície das células-alvo que não sejam CD28, CD3, CD137 ou CD40. Em alguns casos, a ligação do agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, à molécula sobre a superfície das células-alvo que não sejam CD28, CD3, CD137 ou CD40 Induz ou modula um sinal nas células-alvo e/ou altera uma função das células-alvo, gerando assim células-alvo cultivadas.
[00337] Em qualquer um dos exemplos acima, o fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento (Fab)2! ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Em qualquer um dos exemplos acima, a molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína baseada na estrutura de anquirina, uma proteína baseada na estrutura cristalina, uma adnectina, um nanocorpo, um DARPin e um avímero.
b. Agentes de Seleção
[00338] Em algumas modalidades, o agente é um agente de seleção. Em algumas modalidades, o agente de seleção liga-se a uma molécula sobre a superfície de uma célula, tal como uma molécula de superfície celular. Em alguns casos, a molécula da superfície celular é um marcador de seleção. Em alguns desses casos, o agente de seleção é capaz de se ligar especificamente a um marcador de seleção expresso por uma ou mais das células. Em algumas modalidades, um agente ou agentes de seleção que são reversivelmente ligados a um reagente podem ser usados para facilitar a seleção ou o isolamento de
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202/378 células.
[00339] Em qualquer uma das modalidades fornecidas aqui, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador, pode ser um agente de ligação que se liga especificamente a um receptor, por exemplo, um receptor expresso sobre a superfície da célula. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, agente estimulador, que se liga especificamente ao receptor, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-receptor, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-receptor, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-receptor e uma molécula de ligação ao receptor proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento F(ab’)2 ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Em alguns casos, uma molécula de ligação ao receptor proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína baseada no andaime de anquirina, uma proteína baseada na estrutura cristalina, uma adnectina, um nanocorpo, um DARPin ou um avímero. Em alguns casos, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, o primeiro, segundo e/ou agente de ligação ao receptor adicional, por exemplo, o agente estimulador que se liga especificamente ao receptor é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab.
[00340] Em alguns aspectos, a molécula da superfície celular, por exemplo, marcador de seleção, pode ser um antígeno que define uma
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203/378 população ou subpopulação celular desejada, por exemplo, uma população ou subpopulação de células sanguíneas, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células T, células T auxiliares, por exemplo, células T auxiliares CD4+, células B ou células exterminadoras naturais), monócitos ou células-tronco, por exemplo, células-tronco periféricas CD34 positivas ou células-tronco que expressam Nanog ou Oct-4. Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser um marcador expresso sobre a superfície das células T ou um subconjunto de células T, tais como CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO. Exemplos de células T incluem células tais como linfócitos T CD8+ específicos para CMV, células T citotóxicas, células T de memória e células T reguladoras (Treg). Um exemplo ilustrativo de Treg inclui células Treg CD4 CD25 CD45RA e um exemplo ilustrativo de células T de memória inclui células T de memória central específicas de CD62L CD8+. A molécula de superfície celular, por exemplo, marcador de seleção, também pode ser um marcador para uma célula de tumor.
[00341 ] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD4 e o agente de seleção especificamente liga-se ao CD4. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD4 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo antl-CD4, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti~CD4, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD4 e uma molécula de ligação ao CD4 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo (por exemplo, uma anticalina ou um nanocorpo). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD4, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovalente (por exemplo, fragmento Fab de CD4) pode ser derivado do anticorpo 13B8.2 ou de um mutante funcionalmente ativo de 13B8.2 que mantém a ligação específica ao CD4. Por exemplo, mutantes exempla
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204/378 res do anticorpo 13B8.2 ou m13B8.2 são descritos na Patente U.S. Nos. 7.482.000, Pedido de Patente U.S. US2014/0295458 ou Pedido de Patente Internacional No. WO2013/124474; e Bes, C, et al. J. Biol Chem 278, 14265-14273 (2003). O fragmento Fab mutante denominado m!3B8.2 carrega o domínio variável do anticorpo de murino de ligação ao CD4 13B8.2 e um domínio constante contendo o domínio CH1 humano constante do tipo gama para a cadeia pesada e o domínio da cadeia leve humana constante do tipo capa, como descrito na Patente US 7.482.000. Em algumas modalidades, o anticorpo antiCD4, por exemplo, um mutante do anticorpo 13B8.2, contém a substituição de aminoácido H91A na cadeia leve variável, a substituição de aminoácido Y92A na cadeia leve variável, a substituição de aminoácido H35A na cadeia pesada variável e/ou a substituição de aminoácido R53A na cadeia pesada variável, cada uma pela numeração Kabat. Em alguns aspectos, em comparação com domínios variáveis do fragmento Fab 13B8.2 em m!3B8.2, o resíduo His na posição 91 da cadeia leve (posição 93 na SEQ ID NO: 30) sofre mutação para Ala e o resíduo Arg na posição 53 da cadeia pesada (posição 55 na SEQ ID NO: 29) sofre mutação para Ala. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti~CD4 ou um fragmento do mesmo está comercialmente disponível ou derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 68000-206 ou 6-8000-205 ou 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00342] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD8 e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD8. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD8 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD8, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD8, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo
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205/378 anti-CD8 e uma molécula de ligação de CD8 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD8, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovalente (por exemplo, fragmento Fab de CD8) pode ser derivado do anticorpo OKT8 (por exemplo, ATCC CRL-8014) ou de um mutante funcionalmente ativo que mantém ligação específica para CD8. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti-CD8 ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 68003 ou 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00343] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD3 e o agente de seleção liga especificamente ao CD3. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD3 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo antiCD3, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo antiCD3 e uma molécula de ligação de CD3 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD3, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovalente (por exemplo, fragmento Fab de CD3) pode ser derivado do anticorpo OKT3 (por exemplo, ATCC CRL8001; veja, por exemplo, Stemberger et al. PLoS One 2012; 7 (4): e35798) ou um mutante funcionalmente ativo do mesmo que mantém a ligação específica para CD3. Em algumas modalidades, o reagente que é reversivelmente ligado ao anti-CD3 ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00344] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser
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206/378
CD25 e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD25. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD25 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD25, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD25, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD25 e uma molécula de ligação de CD25 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD25, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovalente (por exemplo, fragmento Fab de CD25) pode ser derivado do anticorpo FRT5 (Veja, por exemplo, Stemberger et al. 2012) ou um mutante funcionalmente ativo que mantém ligação específica para CD25. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti-CD4 ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está disponível comercialmente (por exemplo, catálogo No. 6-8000-205 ou 6-8000-207 ou 6-8004-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00345] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD62L e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD62L. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD62L pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD62L, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD62L, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD62L e uma molécula de ligação de CD62L proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD62L, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovalente (por exemplo, fragmento Fab de CD62L) pode ser derivado do anticorpo DREG56 (por exemplo, ATCC HB300; veja, por exemplo, Stemberger et al. 2012) ou um mutante funcionalmente ativo do mesmo que man
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207/378 tém a ligação específica para CD62L. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti-CD62L ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está disponível comercialmente (por exemplo, catálogo No. 6-8000-204 ou 6-8005-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00346] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD45RA e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD45RA. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especlficamente ao CD45RA pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD45RA, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD45RA, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD45RA e um molécula de ligação de CD45RA proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD45RA, tal como um fragmento de anticorpo divalente ou um fragmento de anticorpo monovaiente (por exemplo, fragmento Fab de CD45RA) pode ser derivado do anticorpo MEM56 (por exemplo, Millipore 05-1413; veja, por exemplo, Stemberger et al. 2012) ou um mutante funcionalmente ativo do mesmo que mantém a ligação específica para CD45RA. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti-CD45RA ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 6-8000-208 ou 6-8007-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00347] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD45RO e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD45RO. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD45RO pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD45RO, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD45RO, um fragmento de anticorpo monovalente
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208/378 de um anticorpo anti-CD45RO e uma molécula de ligação ao CD45RO proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, o reagente que é reversivelmente ligado ao anti-CD45RO ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 6-8000-209 ou 6-8012-020; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00348] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD154 e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD154. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD154 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD154, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD154, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD154 e uma molécula de ligação ao CD154 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao antiCD154 ou um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de um reagente que está comercialmente disponível (por exemplo, catálogo No. 6-8000-202 ou 6-5510-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
[00349] Em algumas modalidades, o marcador de seleção pode ser CD16 e o agente de seleção liga-se especificamente ao CD16. Em alguns aspectos, o agente de seleção que se liga especificamente ao CD16 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD16, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD16, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD16 e uma molécula de ligação ao CD16 proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo. Em algumas modalidades, o reagente que está reversivelmente ligado ao anti-CD16 ou a um fragmento do mesmo está disponível comercialmente ou é derivado de
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209/378 um reagente que está comercialmente disponível. Em alguns aspectos, a molécula de ligação a CD16 compreende as sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve mencionadas em SEQ ID NO: 52 e 53, respectivamente.
[00350] Em qualquer um dos exemplos acima, o fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento (Fab)z’ ou um fragmento Fv de cadeia única divalente, enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Em qualquer um dos exemplos acima, a molécula de ligação proteica com propriedades de ligação semelhantes ao anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína baseada em um polipeptídeo da família lipocalina, um glucorpo, uma proteína baseada na estrutura de anquirina, uma proteína baseada na estrutura cristalina, uma adnectina, um nanocorpo, DARPin e um avímero.
Ill, MÉTODOS DE CULTIVAR CÉLULAS
[00351] São fornecidos aqui métodos de cultivar células que incluem a incubação de uma composição contendo células-alvo (por exemplo, células T) na presença de um agente (por exemplo, primeiro ou segundo, agentes de ligação ao receptor, por exemplo, agentes estimuladores ou agentes de seleção) que é capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície das células-alvo (por exemplo, células T) na composição e que está reversivelmente ligada a um reagente contendo uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar reversivelmente ao agente. Em certas modalidades, o reagente é um reagente de partícula oligomérico, tal como qualquer um como descrito. Em algumas modalidades, a incubação é realizada sob condições nas quais o agente se liga, tal como se liga especificamente, à molécula na célula. Em alguns casos, para certos agentes de ligação ao receptor (por exemplo, agentes estimuladores), tal ligação pode induzir ou mo
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210/378 dular um sinal nas células-alvo (por exemplo, células T) nas composições, tal como um sinal primário ou sinal acessório, como descrito. Em algumas modalidades, a ligação do agente à molécula resulta em uma ou mais da estimulação, ativação, expansão (proliferação) e/ou diferenciação das células-alvo na composição.
[00352] Em algumas modalidades, o método fornecido pode ser usado para induzir seletivamente a expansão ex vivo de uma população de células, tais como células B, células T ou células exterminadoras naturais. Em alguns casos, a estimulação pode ocorrer na ausência de fatores de crescimento exógenos, tais como linfocinas e células acessórias. Em algumas modalidades, a proliferação dessas células, tais como células B ou células T, pode ser induzida sem a necessidade de antígeno, fornecendo assim uma população de célula expandida, tal como uma população de células T, que é policlonal em relação à reatividade ao antígeno. Os métodos descritos aqui podem fornecer a proliferação sustentada de uma população selecionada de células T, tais como células T CD4+ ou CD8+, durante um período prolongado de tempo para produzir um aumento múltiplo no número de tais células em relação à população original de células T. Em geral, no caso de uma expansão (clonal) de uma população de iinfócitos como aqui descrito, toda a progênie pode compartilhar a mesma especificidade de antígeno que a população de células que foi selecionada para expansão.
[00353] Em algumas modalidades, os métodos referem-se à expansão de uma população de células T específicas do antígeno. Em algumas modalidades, para produzir uma população de células T específicas do antígeno, as células T são contactadas com um antígeno em uma forma adequada para acionar um sinal de ativação primário na célula T, isto é, o antígeno é apresentado à célula T tal que um sinal é acionado na célula T através do complexo TCR/CD3. Por exemplo, o
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211/378 antígeno pode ser apresentado à célula T por uma célula de apresentação de antígeno em conjunto com uma molécula de MHC. Uma célula de apresentação de antígeno, tal como uma célula B, macrófago, monócito, célula dendrítica, célula de Langerhans ou outra célula que pode apresentar o antígeno em uma célula T, pode ser incubada com a célula T na presença do antígeno (por exemplo, um antígeno solúvel), de modo que a célula de apresentação de antígeno apresente o antígeno à célula T. Alternativamente, uma célula que expressa um antígeno de interesse pode ser incubada com a célula T. Por exemplo, uma célula de tumor que expressa antígenos associados ao tumor pode ser incubada com uma célula T juntas para induzir uma resposta específica do tumor. Da mesma forma, uma célula infectada com um patógeno, por exemplo, um vírus, que apresenta antígenos do patógeno, pode ser incubada com uma célula T. Após a ativação específica do antígeno de uma população de células T, as células podem ser expandidas de acordo com os métodos fornecidos. Por exemplo, após a especificidade do antígeno ter sido estabelecida, as células T podem ser expandidas por cultura com um anticorpo anti-CD3 (usado como primeiro agente) e um anticorpo anti-CD28 (usado como segundo agente) de acordo com os métodos aqui descritos. Em outra modalidade, o primeiro agente pode ser um complexo MHC Lpeptídeo, que se liga a uma população de células T específicas ao antígeno. Em uma tal modalidade, qualquer peptídeo específico de antígeno que é conhecido e que pode ser complexado com a respectiva molécula de MHC I pode ser usado. Alternativamente, também é possível usar como primeiro agente o ligante natural de um receptor que aciona a expansão celular. Por exemplo, o domínio extracelular de CD19 pode ser usado para causar a ativação de cascatas de sinalização intracelular de células transduzidas para expressar o receptor de antígeno de ligação a CD19 quimérico (CAR). Aspectos exemplares do acima são
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212/378 mostrados nos Exemplos.
[00354] Em algumas modalidades, é fornecido um método in vitro para cultivar uma população de células, compreendendo o contato com uma amostra compreendendo uma composição compreendendo uma pluralidade de células com um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, o reagente de mulimerização é um reagente de partícula oligomérico. O reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes imobilizou reversivelmente nele (ligado a ele) um agente (primeiro ou segundo, ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador ou agente de seleção), que pode ser usado para a seleção, estimulação, expansão e/ou diferenciação de células. Em algumas modalidades, um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário para as células, em que o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico se ligou a um ou mais agentes compreendendo pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível do primeiro agente. O primeiro agente compreende pelo menos um par de ligação C1, em que o par de ligação C1 é capaz de se ligar reversivelmente ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, em que o primeiro agente está ligado ao reagente de multimerização através da ligação reversível formada entre o par de ligação C1 e o sítio de ligação Z1. O primeiro agente se liga a uma molécula receptora sobre a superfície das células, fornecendo assim um sinal de ativação primário para as células e, assim, ativando as células.
[00355] Em algumas modalidades, o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes estão imobilizados em um suporte, tal como uma superfície sólida. Em algumas modalidades, o reagente de multimerização e/ou um rea
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213/378 gente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes não está ligado a um suporte, tal como não ligado a uma superfície sólida ou fase estacionária.
[00356] Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um método in vitro para expandir uma população de células, compreendendo o contato de uma amostra compreendendo uma população de células com um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, em que o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes não está imobilizado em um suporte sólido, ou seja, está em uma forma solúvel, e se ligou a um agente (primeiro ou segundo, ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador, ou agente de seleção), que pode ser usado para a seleção, estimulação, expansão e/ou diferenciação de células. Em algumas modalidades, um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário para as células é reversivelmente ligado ao reagente de multimerização e/ou a um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. O reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes compreendem pelo menos um sítio de ligação, por exemplo, Z1 para a ligação do primeiro agente, em que o primeiro agente compreende pelo menos um par de ligação, por exemplo, C1, em que o par de ligação C1 é capaz de se ligar ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, o primeiro agente está ligado ao reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes através da ligação formada entre o par de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora sobre a superfície das células, fornecendo assim um sinal de ativação primário para as células e, assim, ativando as células. Em algumas
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214/378 modalidades, quando um agente de multlmerização solúvel é usado, a ligação entre a parte de ligação C, por exemplo, C1 e o sítio de ligação Z, por exemplo, Z1 não precisa ser reversível.
[00357] Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos fornecidos também incluem o uso de um reagente de multlmerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que se ligam a um segundo agente, tais como moléculas acessórias ou coestimuladoras que estimulam uma molécula acessória sobre a superfície das células. Em alguns casos, o agente de multlmerização é imobilizado em um suporte, por exemplo, um suporte sólido, fase sólida ou fase estacionária. Em algumas modalidades, o agente de multimerização não é imobilizado em um suporte, isto é, na forma solúvel. Em algumas modalidades, o segundo agente compreende um par de ligação, por exemplo, C2, em que o par de ligação, por exemplo, C2 é capaz de ser ligado reversivelmente a um sítio de ligação, por exemplo, Z2 do reagente de multlmerização e/ou um reagente de partícula oligomérico, em que o segundo agente está ligado ao reagente de multlmerização e/ou um reagente de partícula oligomérico através da ligação reversível formada entre o par de ligação C2 e o sítio de ligação Z2. Em algumas modalidades, a ligação formada entre o par de ligação C1 e o sítio de ligação Z1 pode ser reversível e a ligação formada entre o par de ligação C2 e o sítio de ligação Z2 pode ser reversível. Neste caso, a constante de dissociação (Kd) para a ligação reversível entre o referido sítio de ligação Z1 e o referido par de ligação C1 e/ou para a ligação reversível entre o referido sítio de ligação Z2 e o referido par de ligação C2 pode estar na faixa de 10 2 M a 1013 M. Em alguns aspectos, tal como quando o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes não está ligado a um suporte (por exemplo, não ligado a um suporte sólido ou fase estacionária), a ligação formada entre o par de liga
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215/378 ção C1 e o sítio de ligação Z1 pode ser irreversível e/ou também a ligação formada entre o par de ligação C2 e o sítio de ligação Z2 pode ser irreversível.
[00358] Em alguns casos, o segundo agente liga-se à molécula acessória sobre a superfície das células, estimulando assim as células ativadas. Nesta modalidade, o primeiro agente pode estimular um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T e pode ser um agente de ligação que especificamente liga-se ao CD3. Nesta modalidade, a molécula acessória sobre a célula T pode ser CD28 e o segundo agente que se liga à molécula acessória é um reagente de ligação que se liga especificamente ao CD28. Alternativamente, em algumas modalidades, verificou-se que o direcionamento de outras moléculas acessórias também pode ser empregado, o que pode, em alguns casos, alterar, como melhorar, uma ou mais características, propriedades ou características das células cultivadas. Em algumas modalidades, a molécula acessória pode ser uma ou mais de IL-12R, IFNyR, IL-4R, IL-17R, RORyt, RORa, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 ou CXCR4 (por exemplo, um anticorpo antl-IL-12R, um anticorpo anti-IFNyR, um anticorpo anti-IL-4R e um anticorpo anti-IL-17R, anticorpo anti-RORyt, anticorpo anti-RORa, anticorpo anti~CXCR3, anticorpo anti-CCR7, anticorpo antiCD62L, anti- Anticorpo CXCR1 ou anticorpo anti-CXCR4, respectivamente. Agentes exemplares, como agentes de ligação ao receptor (por exemplo, agentes estimuladores), são descritos abaixo.
[00359] Em algumas modalidades, o método fornecido pode ser realizado a qualquer temperatura em que a viabilidade da população de células seja pelo menos essencialmente descomprometida. Em algumas modalidades, a condição na qual a incubação ou a cultura é realizada inclui quaisquer condições que são pelo menos essencialmente não prejudiciais, não danosas ou pelo menos essenclalmente não comprometendo a viabilidade, por exemplo, sob as quais a porcenta
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216/378 gem da população de células a ser expandida com total viabilidade, é de pelo menos 70 %, incluindo pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou pelo menos 99,5 %. Em algumas modalidades, o método fornecido é realizado a uma temperatura de cerca de 20°C ou superior. Dependendo da população de células a ser expandida, uma faixa de temperatura adequada pode, por exemplo, ser de cerca de 20°C a cerca de 45°C, incluindo cerca de 25°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 32°C a 37°C. Em algumas modalidades, um método de acordo com a invenção é realizado a um valor de temperatura constante ou a um valor de temperatura selecionado ± cerca de 5°C, ± cerca de 4°C, ± cerca de 3°C, ± cerca de 2°C, ± cerca de 1°C ou ± cerca de 0,5°C. O especialista na técnica é capaz de determinar empiricamente uma temperatura adequada, levando em consideração a natureza das células e as condições de expansão. Normalmente, as células humanas são expandidas a uma temperatura tal como 37°C.
[00360] De acordo com a descrição aqui, também são fornecidos agentes multimerizados, ou composição compreendendo reagentes de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que se importam com capacidade de expandir uma população de células. Um tal agente multimerizado e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que são capazes de expandir uma população de células é um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que não estão ligados a um suporte (por exemplo, na forma solúvel) e compreende pelo menos um sítio de ligação Z, por exemplo, Z1, para a ligação reversível de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário para as células, em que o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou
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217/378 mais agentes ligam-se reversivelmente ao referido primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário para as células; em que o primeiro agente compreende pelo menos um par de ligação C, por exemplo, C1, em que o par de ligação C1 é capaz de se ligar reversivelmente a pelo menos um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, em que o primeiro agente está ligado ao reagente de multimerização e/ou a um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes através da ligação reversível formada entre o par de ligação C1 e o sítio de ligação Z1. Deve-se notar aqui que este agente de multimerização pode ter imobilizado sobre ele qualquer um dos primeiros agentes aqui descritos.
[00361] Em algumas modalidades, um reagente multimerizado aqui fornecido pode ainda compreender pelo menos um sítio de ligação, por exemplo, Z2 para a ligação reversível de um segundo agente que estimula uma molécula acessória na superfície das células, em que o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes ligou-se reversivelmente ao segundo agente que estimula uma molécula acessória sobre a superfície das células, em que o segundo agente compreende um par de ligação, por exemplo, C2, em que o par de ligação C2 é capaz de se ligar ao pelo menos um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização e/ou a um reagente de partícula oligomérico. Nesta modalidade, o segundo agente está ligado ao reagente de multimerização e/ou a um reagente de partícula oligomérico através da ligação formada entre o par de ligação C2 e o sítio de ligação Z2. Em algumas modalidades, o segundo agente é qualquer um que pode se ligar à IL-12R, IFNyR, IL-4R, IL17R, RORyt, RORa, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 ou CXCR4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL-12R, um anticorpo anti-IFNyR, um anticorpo anti-IL-4R e um anticorpo anti-IL-17R, anticorpo anti-RORyt, an
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218/378 ticorpo anti-RORa, anticorpo anti-CXCR3, anticorpo anti-CCR7, anticorpo anthCD62L, anti -CXCR1 ou anticorpo anti-CXCR4, respectivamente).
[00362] Em algumas modalidades, a cultura da composição contendo células-alvo (por exemplo, células T) com o agente multimerizado (por exemplo, estreptavidina de muteína anti-CD3/anti-CD28 ou oligômero da mesma) pode ser realizada em um biorreator, como um biorreator de fibra oco (por exemplo, biorreator de fibra oco do sistema de expansão celular Quantum®) ou um biorreator de saco plástico (por exemplo, Cellbag® usado no Sistema de Expansão de Células Xuri W25 de GE Healthcare).
[00363] Em algumas modalidades, o método inclui ainda o contato das células-alvo cultivadas (por exemplo, células T) na mistura de reação (por exemplo, contendo as células-alvo, por exemplo, células T, ligadas ao reagente de multimerização e/ou a um reagente de partícula oligomérico através de, por por exemplo, o primeiro agente e o segundo agente) com (I) um reagente de competição (por exemplo, o primeiro par de ligação livre C, por exemplo, C1) ou um análogo do mesmo capaz de interromper a ligação entre o primeiro par de ligação, por exemplo, C1 e o sítio de ligação, por exemplo, Z1 e/ou (como se necessário) (ii) um segundo reagente de competição, por exemplo, segundo par de ligação livre, por exemplo, C2, ou um análogo do mesmo, capaz de interromper a ligação entre o segundo par de ligação C2 e o sítio de ligação Z2. Ao fazer isso, a ligação reversível entre o referido par de ligação C1 do primeiro agente e os referidos sítios de ligação Z1, bem como a ligação reversível entre o referido par de ligação C2 do segundo agente e o referido sítio de ligação Z2 do referido reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico é interrompido, liberando desse modo as células T ligadas ao reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico através
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219/378 do primeiro agente e o segundo agente e interrompendo a estimulação e/ou expansão das células T.
[00364] Em algumas modalidades, o reagente de competição (por exemplo, o primeiro e/ou o segundo reagente de competição) é adicionado dentro de 14, dias, 10 dias, 7 dias ou 5 dias após o início da incubação, como dentro de 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia após o início da incubação. Em modalidades particulares, o reagente de competição é adicionado dentro de 5 dias após o início da incubação, como dentro de 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia após o inicio da incubação. Em certas modalidades, o reagente de competição é adicionado dentro de 1 dia após o início da incubação, como dentro de 18 horas, 16 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 90 minutos, 60 minutos ou 30 minutos após o início da incubação. Portanto, controlando o tempo em que a estimulação é interrompida, uma ou mais características particulares das células T cultivadas eluídas do agente multimerizado podem ser alteradas como descrito aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, a adição do reagente de competição dentro de 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia após o início da incubação aumentará a estimulação, ativação, enriquecimento, expansão, seleção e/ou proliferação de uma ou mais células cultivadas.
[00365] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a separação ou remoção de um ou mais dentre componentes restantes após a dissociação reversível dos componentes. Em algumas modalidades, qualquer biotina não ligada ou residual nas células-alvo cultivadas (por exemplo, células T) pode ser separada ou removida. Em algumas modalidades, o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico é removido ou separado das células na composição celular cultivada. Por exemplo, em algumas modalidades, a separação/remoção pode ser realizada usando uma segunda fase estacioná
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220/378 ria. Para esse fim, uma mistura que compreende as células-alvo (por exemplo, células T) e o reagente de multimerização solúvel e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes é exposta, antes ou depois de ser aplicada na primeira fase estacionária descrita acima, à cromatografia em uma segunda fase estacionária adequada. Esta fase estacionária secundária pode ser uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia por afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia por afinidade compreende um reagente de afinidade. O reagente de afinidade compreendido na resina de cromatografia Inclui um par de ligação D que (especificamente) se liga ao sítio de ligação Z1 e/ou ao sítio de ligação Z2, se presente, do reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, imobilizando desse modo o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes na fase estacionária. Se um reagente de multimerização à base de estreptavidina e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes for utilizado e ambos os primeiro e segundo agentes tiverem um peptídeo de ligação à estreptavidina como par de ligação C1 ou C2, o par de ligação D que está compreendido no reagente de afinidade desta segunda fase estacionária pode ser biotina. O oligômero solúvel de estreptavidina ou de uma muteína de estreptavidina que é usado como reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico em seguida se liga à biotina que geralmente é acoplada covalentemente a uma matriz de cromatografia, tal como biotin-sepharose™, que está disponível comercialmente. Em algumas de tais modalidades, as células cultivadas (por exemplo, células T cultivadas) podem ser recuperadas para longe do reagente de multimerização e/ou de um reagente de partícula oligomérico.
A. Células
[00366] As células contidas na composição que contêm células-alvo
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221/378 geralmente são células eucarióticas, como células de mamíferos, e tipicamente são células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, ou são células do sistema imune, como células da imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T e/ou células NK. Outras células exemplares incluem células-tronco, como células-tronco multipotentes e pluripotentes, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As células são tipicamente células primárias, como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. [00367] Em algumas modalidades, os agentes reversivelmente ligados, como agentes multimerizados, aqui fornecidos são capazes de expandir uma população de linfócitos ou uma subpopulação contida na população de linfócitos. A população de linfócitos a ser expandida pode ser qualquer população adequada, por exemplo, uma população de células B, uma população de células T ou uma população de célula exterminadora natural. A população de células T pode ser uma população de células T específica de antígeno, uma população de células T auxiliares, uma célula T citotóxica, uma célula T de memória, uma célula T reguladora ou uma população de células T exterminadoras naturais. Por conseguinte, em tais modalidades do reagente multimerizado, o primeiro agente é capaz de estimular um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T. O primeiro agente presente no agente multimerizado pode, portanto, ser um reagente de ligação que se liga especificamente ao CD3, enquanto o segundo agente que se liga à molécula acessória, como pode ser um agente de ligação que se liga especificamente ao CD28, CD137, IL-12R, IFNyR, IL- 4R, IL-17R, RORyt, RORa, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 ou CXCR4.
[00368] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, como populações
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222/378 inteiras de células T, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, como as definidas por função, estado de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, expansão, recirculação, localização e/ou capacidades de persistência, especificidade de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento particular, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferenciação. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou autólogas. Entre os métodos incluem métodos prontos para uso. Em alguns aspectos, como para tecnologias prontas para uso, as células são pluripotentes e/ou multipotentes, como células-tronco, como células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou projetá-las, como descrito aqui, e reintroduzí-las no mesmo paciente, antes ou depois da criopreservação.
[00369] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou CD4+ e/ou CD8*, estão células T não tratadas (Tn) não tratadas, células T efetoras (Teff), células T de memória e seus subtipos, como T de memória de células-tronco (Tscm), T de memória central (Tcm), T de memória efetora (Tem) ou células T de memória efetoras terminalmente diferenciadas, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxlcas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas e de ocorrência natural (Treg), células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta e células T delta/gama.
[00370] Em algumas modalidades, as células são células exterminadoras naturais (NK). Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos,
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223/378 neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófllos.
1. Preparação de células
[00371] Em algumas modalidades, a preparação das células inclui uma ou mais etapas de cultura e/ou preparação. As células podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra biológica, por exemplo, uma obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual as células são isoladas é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou à qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano que necessita de uma intervenção terapêutica específica, como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou modificadas.
[00372] Por conseguinte, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras colhidas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, como separação, centrifugação, engenharia genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou de uma amostra que é processada. As amostras biológicas incluem, porém, não estão limitadas a, fluidos corporais, como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, fluido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amostras processadas delas derivadas.
[00373] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são derivadas ou isoladas é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaférese. Exemplos de amostras Incluem sangue total, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intesti
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224/378 no, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outro órgão e/ou células deles derivadas. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogênicas.
[00374] Em algumas modalidades, as células são derivadas de linhagens celulares, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas a partir de uma fonte xenogênica, por exemplo, de camundongo, rato, primata não humano ou porco.
[00375] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou de separação de células baseadas sem afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes específicos.
[00376] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaférese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas e, em alguns aspectos, contêm outras células que não glóbulos vermelhos e plaquetas.
[00377] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração plasmática e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modalidades,
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225/378 as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por uma centrífuga semiautomatizada de fluxo contínuo (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter), de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangenclal (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após a lavagem, como, por exemplo, PBS livre de Ca+Wlg++. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de células sanguíneas são removidos e as células ressuspensas diretamente nos meios de cultura.
[00378] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, como a preparação de glóbulos brancos a partir de sangue periférico através da iise dos glóbulos vermelhos e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.
[00379] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento incluem a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marcadores pode ser usado. Os métodos de separação podem incluir qualquer um dos aqui divulgados, incluindo métodos que utilizam sistemas de reagentes reversíveis, por exemplo, agentes (como agentes de ligação ao receptor ou agentes de seleção) e reagentes, como aqui descrito.
[00380] Em algumas modalidades, a separação é uma separação
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226/378 baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de células com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou par de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticorpo ou par de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou par de ligação.
[00381] Tais etapas de separação podem ser com base na seleção positiva, na qual as células que ligaram os reagentes são retidas para uso posterior e/ou seleção negativa, na qual as células que não se ligaram ao anticorpo ou par de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não há anticorpo disponível que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a separação seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células que não a população desejada.
[00382] A separação não precisa resultar em 100 % de enriquecimento ou remoção de uma população celular específica ou de células que expressam um marcador específico. Por exemplo, seleção positiva de ou enriquecimento para células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do número ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção ou depleçâo de células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem de tais células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas estas células.
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[00383] Em alguns exemplos, várias rodadas de etapas de separação são realizadas, onde a fração selecionada positiva ou negativamente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode esgotar as células que expressam vários marcadores simultaneamente, como incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou pares de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente através da incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou pares de ligação expressos nos vários tipos de células.
[00384] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, como células positivas ou expressando altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou células T CD45RO*, são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. [00385] Por exemplo, as células T CD3+, CD28+ podem ser selecionadas positívamente usando contas magnéticas conjugadas CD3/CD28 (por exemplo, Expansor de Células T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).
[00386] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma população celular específica por seleção positiva, ou depleção de uma população celular particular, por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada incubando células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador4) em um nível relativamente mais alto (marcadoraito) nas células positiva ou negativamente selecionadas, respectivamente.
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[00387] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expressos em células não~T, como células B, monócitos ou outros glóbulos brancos, como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4+ ou CDS' é usada para separar as células T cltotóxicas auxiliares CD4+ e CD8+. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T não tratadas, de memória e/ou efetoras.
[00388] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enriquecidas ou esgotadas de células-tronco não tratadas, de memória central, de memória efetiva e/ou de memória central, como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (Tcm) é realizado para aumentar a eficácia, como para melhorar a sobrevivência a longo prazo, a expansão e/ou o enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto em tais subpopulações. Veja Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72~82; Wang et al. (2012) J smmunother. 35(9): 689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD8+ enriquecidas com Tcm e células T CD4+ realça ainda mais a eficácia.
[00389] Em modalidades, as células T de memória estão presentes em ambos subconjuntos de CD62L? e CD62L· dos linfócitos do sangue periférico de CD8+. A PBMC pode ser enriquecida ou esgotada das frações de CD62LCD8* e/ou CD62L+CD8+, como o uso de anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.
[00390] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (Tom) é baseado na expressão superficial positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD 127; em al
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229/378 guns aspectos, é baseado na seleção negativa para células que expressam ou expressam altamente o CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população de CD8+ enriquecida para células Tcwi é realizado pela depleção de células que expressam CD4, CD14, CD45RA, e seleção ou enriquecimento positivo para células que expressam CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento para células T de memória central (Tcm) é realizado começando com uma fração negativa das células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA e a uma seleção positiva com base em CD62L Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada em expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+, também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, de modo que as frações positivas e negativas da separação baseada em CD4 são retidas e usadas nas etapas subsequentes dos métodos, seguindo opcionalmente uma ou mais etapas de seleção positivas ou negativas.
[00391] As células T auxiliares CD4+ são classificadas em células não tratadas, de memória central e efetoras, identificando populações de células que possuem antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ não tratados são células CD45RO', CD45RA+, CD62L+, CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ de memória central são CD62L? e CD45RO*. Em algumas modalidades, as células CD4+ efetoras são CD62L e CD45RO’.
[00392] Em um exemplo, para enriquecer as células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8.
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Em algumas modalidades, o anticorpo ou par de ligação está ligado a um suporte ou matriz sólida, como uma conta magnética ou conta paramagnética, para permitir a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou afinidade magnética) (revisadas em Methods In Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p. 17-25 Editado por: S. A. Brooks and U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[00393] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou responsivo magneticamente, como partículas ou micropartículas responsivas magneticamente, como contas paramagnéticas (por exemplo, como contas Dynalbeads ou MACS). O material responsivo magneticamente, por exemplo, partícula, geralmente é diretamente ou indiretamente ligado a um par de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que é desejado separar, por exemplo, que é desejado selecionar negativa ou positivamente.
[00394] Em algumas modalidades, a partícula ou conta magnética contém um material responsivo magneticamente ligado a um membro de ligação específico, como um anticorpo ou outro par de ligação. Existem muitos materiais responsivos magneticamente bem conhecidos usados nos métodos de separação magnética. Partículas magnéticas adequadas incluem as descritas em Molday, Pat. U.S. No. 4.452.773, e na Especificação de Patente Européia EP 452342 B, que são aqui incorporadas por referência. Partículas de tamanho coloidal, como as descritas em Owen Pat. U.S. No. 4.795.698, e Libert! et al., Pat. U.S. No. 5.200.084 são outros exemplos.
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[00395] A incubação geralmente é realizada sob condições pelas quais os anticorpos ou pares de ligação, ou moléculas, como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a esses anticorpos ou pares de ligação, que estão ligados à partícula ou conta magnética, especificamente ligam-se às moléculas da superfície celular, se presentes nas células da amostra.
[00396] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células que possuem partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveís ligadas a ele serão atraídas ao ímã e separadas das células nâo marcadas. Para seleção positiva, as células que são atraídas pelo ímã são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, em que as frações positiva e negativa são retidas e posteriormente processadas ou submetidas a etapas de separação adicionais.
[00397] Em certas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são revestidas em anticorpos primários ou outros pares de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são ligadas às células através de um revestimento de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez das esferas, são marcadas com um anticorpo primário ou par de ligação e, em seguida, partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro par de ligação (por exemplo, estreptavidina), são adicionadas. Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotinilados.
[00398] Em algumas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são deixadas ligadas às células que devem ser subse
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232/378 quentemente incubadas, cultivadas e/ou modificadas; em alguns aspectos, as partículas são deixadas ligadas às células para administração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Os métodos para remover partículas magnetizáveis das células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados competentes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados com ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradáveis.
[00399] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade é através da classificação celular ativada magnética (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Os sistemas de Classificação Celular Ativada Magnética (MACS) são capazes de seleção de alta pureza de células tendo partículas magnetizadas ligadas a eles. Em certas modalidades, a MACS opera em um modo em que as espécies não alvo e alvo são sequencialmente eluídas após a aplicação do campo magnético externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não ligadas são eluídas. Então, após a conclusão desta primeira etapa de eluição, as espécies que foram capturadas no campo magnético e impedidas de serem eluídas são liberadas de alguma maneira, de forma que possam ser eluídas e recuperadas. Em certas modalidades, as células sem alvo são marcadas e esgotadas da população heterogênea de células.
[00400] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação celular, separação, processamento, incubação, cultura e/ou formulação dos métodos. Em alguns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimizar erros, manipulação do usuário e/ou contaminação. Em um exem
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233/378 pio, o sistema é um sistema conforme descrito no Pedido de Patente Internacional, Número da Publicação W02009/072003 ou US 20110003380A1.
[00401] Em algumas modalidades, o sistema ou aparelho executa uma ou mais, por exemplo, todas as etapas de isolamento, processamento, engenharia e formulação em um sistema integrado ou independente, e/ou de maneira automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparelho inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, que permite ao usuário programar, controlar, avaliar o resultado e/ou ajustar vários aspectos de etapas de processamento, isolamento, engenharia e formulação.
[00402] Em alguns aspectos, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS (Miltenyi Biotic), por exemplo, para separação automática de células em nível de escala clínica em um sistema fechado e estéril. Os componentes podem incluir um microcomputador integrado, unidade de separação magnética, bomba perlstáltica e várias válvulas de aperto. O computador integrado em alguns aspectos controla todos os componentes do instrumento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética em alguns aspectos inclui um ímã permanente móvel e um suporte para a coluna de seleção. A bomba perlstáltica controla a taxa de fluxo em todo o conjunto de tubulação e, juntamente com as válvulas de aperto, garante o fluxo controlado de tampão através do sistema e a suspensão contínua das células.
[00403] O sistema CliniMACS, em alguns aspectos, usa partículas magnetizáveis acopladas a anticorpos que são fornecidas em uma solução estéril, não pirogênica. Em algumas modalidades, após a marcação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas
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234/378 para remover o excesso de partículas. Uma bolsa de preparação de células é então conectada ao conjunto de tubos, que por sua vez é conectado a uma bolsa contendo tampão e uma bolsa de coleta de células. O conjunto de tubos consiste em tubos estéreis pré-montados, incluindo uma pré-coluna e uma coluna de separação, e são apenas para uso único. Após o início do programa de separação, o sistema aplica automaticamente a amostra de células na coluna de separação. As células marcadas são retidas na coluna, enquanto as células não marcadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos não são marcadas e não são retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são marcadas e retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são eluídas da coluna após a remoção do campo magnético e são coletadas dentro da bolsa de coleta de células.
[00404] Em certas modalidades, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). O sistema CliniMACS Prodigy, em alguns aspectos, é equipado com uma unidade de processamento celular que permite a lavagem e o fracionamento automatizados de células por centrifugação. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmera integrada e software de reconhecimento de imagem que determina o ponto final ideal de fracionamento de células, discernindo as camadas macroscópicas do produto celular da fonte. Por exemplo, o sangue periférico pode ser automaticamente separado em eritrócitos, glóbulos brancos e camadas plasmáticas. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultura de células como, por exemplo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antígeno e cultura celular a longo prazo. As portas de
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235/378 entrada podem permitir a remoção estéril e a reposição de mídia e as células podem ser monitoradas usando um microscópio integrado. Veja, por exemplo, Klebanoff et al. (2012) J ímmunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82, e Wang et al. (2012) J Irrimunother. 35(9): 689-701.
[00405] Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) por citometria de fluxo, na qual as células coradas por vários marcadores de superfície celular são transportadas em uma corrente fluídica. Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou esgotada) pelo uso de chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (veja, por exemplo, WO 2010/033140, Cho et al. ( 2010) Lab Chip 10, 1567-1573; e Godin et al. (2008) J. Biophoton. 1(5): 355-376. Nos dois casos, as células podem ser marcadas com vários marcadores, permitindo o isolamento de subconjuntos de células T bem definidos em alta pureza.
[00406] Em algumas modalidades, os anticorpos ou pares de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células com base na ligação de anticorpos ou outros pares de ligação específicos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em uma corrente fluídica, como por classificação celular ativada por fluorescência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e/ou chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção citométrica de fluxo. Tais métodos permitem a
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236/378 seleção positiva e negativa com base em vários marcadores simultaneamente.
[00407] Em algumas modalidades, os métodos de preparação incluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservaçâo, das células, antes ou depois do isolamento, incubação e/ou criação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população celular. Em algumas modalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20 % de DIVISO e 8 % de albumina sérica humana (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Este é, então, diluído 1:1 com meios, de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10 % e 4 %, respectivamente. As células são, então, congeladas a ~80°C a uma taxa de 1o por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.
[00408] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou em conexão com a engenharia genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas projetadas para induzir proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno e/ou preparar as células para engenharia genética, como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.
[00409] As condições podem incluir um ou mais meios específicos,
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237/378 temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, pares de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.
[00410] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimulantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para um componente de TCR e/ou receptor coestimulador, por exemplo, anti-CD3, anti-CD28, por exemplo, ligados a suporte sólido, como uma conta, e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, o método de expansão pode ainda compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e/ou anti CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, os agentes estimulantes incluem IL-2 e/ou IL-15, por exemplo, uma concentração de IL-2 de pelo menos cerca de 10 unidades/mL.
[00411] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com a técnica como as descritas na Patente US No. 6.040.177 de Riddell et ai., Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82, e/ou Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701.
[00412] Em algumas modalidades, as células T são expandidas adicionando à composição, células alimentadoras, como células mononucleares de sangue periférico (PBMC) não divididas (por exemplo, de modo que a população resultante de células contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubando a
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238/378 cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir o número de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras que não se dividem podem compreender células alimentadoras de PBMC irradiadas com gama. Em algumas modalidades, a PBMC é irradiada com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T
[00413] Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem temperatura adequada para o crescimento de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos 30 graus e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode ainda compreender a adição de células linfoblastoides transformadas por EBV não divididas (LCL) como células alimentadoras. A LCL pode ser irradiada com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células alimentadoras LCL em alguns aspectos são fornecidas em qualquer quantidade adequada, como uma relação de células alimentadoras LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.
[00414] Em modalidades, células T específicas de antígeno, como células T CD4+ e/ou CD8+ específicas de antígeno, são obtidas estimulando linfócitos T não tratados ou específicos de antígeno com antígeno. Por exemplo, clones ou linhagens de células T específicas de antígeno podem ser gerados para antígenos do citomegalovírus, isolando as células T de indivíduos infectados e estimulando as células in vitro com o mesmo antígeno.
B. Aparelhos e Artigos de Fabricação
[00415] Em algumas modalidades, também é fornecido um aparelho ou artigo de fabricação. Em algumas modalidades, é fornecido um arranjo de um biorreator e uma primeira fase estacionária para croma
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239/378 tografia. O biorreator é adequado para a expansão das células e a fase estacionária é adequada para a separação celular e a remoção dos reagentes. A primeira fase estacionária é uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia por afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia por afinidade compreendem um reagente de afinidade, em que o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z1 que se liga especificamente a um par de ligação 01 compreendido em um primeiro agente e/ou o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z2 que se liga especificamente a um par de ligação C2 compreendido em um segundo agente. A primeira fase estacionária é assim adequada para imobilizar nela o primeiro agente e/ou o segundo agente, o primeiro par de ligação C1 e/ou o segundo par de ligação livre C2. Além disso, o biorreator e a fase estacionária são conectados de forma fluida. Esse arranjo pode ser usado na expansão serial, conforme explicado acima, e pode ser integrado em sistemas de expansão celular conhecidos, como o sistema de expansão celular Quantum®) ou ao Sistema de Expansão Celular Xuri W25.
[00416] Neste arranjo, a primeira fase estacionária é compreendida em uma coluna de cromatografia ou é uma fase estacionária plana. O arranjo pode ainda compreender uma segunda fase estacionária que está conectada fluidamente à primeira fase estacionária. A fase estacionária secundária pode ser uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia por afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia por afinidade compreende um reagente de afinidade. Este reagente de afinidade pode compreender um par de ligação D que (especificamente) se liga ao sítio de ligação Z1 do reagente de multlmerização e/ou um reagente de partícula oligomérico, sendo assim adequado para imobilizar o reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico na fase estacionária.
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[00417] A invenção é ainda direcionada a um aparelho para purificação (por exemplo, seleção) e cultura, como estimulação ou expansão, de uma composição de células, o aparelho compreendendo pelo menos um arranjo de um biorreator e uma primeira fase estacionária e/ou uma segunda fase estacionária para cromatografia como definido acima.
[00418] O aparelho pode ainda compreender uma pluralidade de arranjos de um biorreator e uma fase estacionária sendo conectada fluidamente em série.
[00419] O aparelho pode compreender uma entrada de amostra sendo conectada fluidamente ao biorreator da disposição de um biorreator e a fase estacionária para cromatografia. O aparelho também pode compreender uma saída de amostra para células-alvo purificadas e expandidas, sendo a saída de amostra conectada de maneira fluida à fase estacionária do último dos pelo menos um arranjo de um biorreator e à fase estacionária para cromatografia.
[00420] Em certas modalidades, o aparelho pode ser projetado como um sistema funcionalmente fechado.
C. Características Exemplares de Células Cultivadas
[00421] Em algumas modalidades, as células-alvo cultivadas (por exemplo, células T cultivadas), que podem incluir células cultivadas geradas ou produzidas de acordo com os métodos aqui fornecidos, exibem uma ou mais características fenotípicas e/ou funcionais especificadas, com base em ou relacionadas à capacidade de proliferação, expressão do marcador de superfície, estado de diferenciação, estado de ativação e/ou perfil metabólico. Em algumas modalidades, a cultura das células-alvo (por exemplo, cultivo de células T) de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos resulta em uma alteração em um parâmetro associado à função (por exemplo, aumento ou diminuição de uma atividade funcional) ou fenótipo (por exemplo, expressão maior
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241/378 ou menor de um marcador ou marcadores) de células em comparação com a função ou fenótipo correspondente ou respectivo das células na composição antes da incubação de acordo com os métodos aqui fornecidos. Em algumas modalidades, as células T cultivadas exibem a alteração em relação a um parâmetro dentre capacidade de expansão e/ou proliferação, distribuição ou relação de células T CD4*/CD8+, expressão do marcador de superfície, atividade funcional ou perfil metabélico.
[00422] Em algumas modalidades, a alteração no parâmetro conforme medido nas células T cultivadas é comparada ou com referência ao mesmo parâmetro ou similar ao medido em uma composição ou preparação de célula T de referência. Tipicamente, as células T na composição ou preparação de células T de referência incluem ou são derivadas da mesma ou substancialmente da mesma composição de células T antes da incubação com o agente de ligação reversível (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), exceto que essas células não foram submetidas à incubação ou foram submetidas a uma incubação diferente. Em algumas modalidades, a preparação de células T de referência é submetida à incubação usando substancialmente o mesmo protocolo ou condições (por exemplo, tipo de agentes ou agentes estimuladores, formato de agentes ou agentes estimuladores, substancialmente os mesmos números de células iniciais, lavagens, presença ou ausência de reagentes adicionais, tempo de incubação, temperatura de incubação), exceto pelo menos um aspecto e, em alguns casos, apenas um aspecto desta incubação em uma preparação de células T de referência é diferente do que na incubação que produz as células T cultivadas.
[00423] Em algumas modalidades, a composição ou preparação de células T de referência é a composição que contém células T antes da
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242/378 incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, como incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica).
[00424] Em algumas modalidades, as células T cultivadas são geradas por incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, como incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica) por menos de 28 dias, 21 dias, 14 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia e/ou onde a associação de tal agente com uma ou mais moléculas na célula é interrompida (por exemplo, na presença de um reagente de competição, por exemplo, biotina ou um análogo de biotina), tal como interrompida com 28 dias, 21 dias, 14 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia do início da incubação com tal agente. Por exemplo, em aiguns aspectos, as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica) como descrito aqui, em que a incubação é encerrada e/ou interrompido dentro de 28 dias, 21 dias, 14 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias após o início de tal incubação (tal como dentro ou cerca de 4, 3, 2 ou 1 dia ou menos) e/ou onde um agente de competição (por exemplo, biotina) que dissocia o agente ligado reversivelmente das células é adicionado às células incubadas dentro de 28 dias, 21 dias, 14 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias após o início de tal incubação (tal como dentro de ou cerca de 4, 3, 2 ou 1 dia ou menos). Em algumas modalidades, a preparação de células T de referência é gerada ou produzida após a incubação com o mesmo ou substanciaimente o mesmo agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, tal como a incubação
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243/378 com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligoméríca), mas onde a incubação é realizada por mais de 5 dias, não é terminada e/ou interrompida para diminuir ou terminar o sinal induzido ou modulado na célula e/ou onde a preparação de células T é produzida sem a adição de um agente de competição (por exemplo, biotina ou análogo da biotina) que dissocia o reagente das células.
[00425] Em algumas modalidades, as células T cultivadas são geradas por incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, tal como a incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica) na qual o agente de ligação ao receptor (por exemplo, agente estimulador) é aquele que não se liga ao CD28 e/ou induz a sinalização, isto é, não é um anticorpo anti-CD28 ou um fragmento do mesmo. Por exemplo, em algumas modalidades, as células T cultivadas são produzidas ou geradas após a incubação com um reagente ligado reversivelmente, no qual um ou mais agentes estimuladores são reversivelmente ligados a uma estreptavidina de muteína na qual pelo menos um agente estimulador é específico para CD3 (por exemplo, anticorpo anti~CD3 ou fragmento do mesmo) e um segundo agente estimulador pode ser específico para um ou mais dentre CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM (por exemplo, um anticorpo anti-CD90, um anti~CD95 anticorpo, um anticorpo antiCD137 e um anticorpo anti-CD154, anticorpo anti-ICOS, anticorpo antiLAT, anticorpo anti-CD27, anticorpo anti-OX40 ou anticorpo antiHVEM, respectivamente, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno). Em algumas modalidades, a preparação de células T de referência é uma cultura de células T gerada ou produzida após a incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, como incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a
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244/378 uma estreptavidina de muteína oligomérica), mas onde o reagente compreende um agente que se liga especificamente ao CD28 e/ou induz ou modula a sinalização de CD28. Por exemplo, em algumas modalidades, a preparação de células T de referência é gerada ou produzida após a incubação de uma composição de células T com contas οη1ί-ΟΟ3/3η1Ι~ΟΟ28 Dynabeads®, 3η1Ι-003/3ηίί-0028 ExPact® ou outro agente estimulador anti-CD3/anti-CD28. Em algumas modalidades, tal outro agente estimulador anti-CD3/anti-CD28 é aquele em que os reagentes de anticorpo estão ligados a um suporte (por exemplo, suporte sólido), por exemplo, uma conta, partícula, partícula ou conta magnética, nanopartícula ou microesfera. Em algumas modalidades, as células T cultivadas são preparadas por incubação com um agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica) que é solúvel, ou seja, não está ligado a um suporte (por exemplo, suporte sólido).
[00426] Por exemplo, em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui ( por exemplo, agente multimerizado, tal como incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), em que as células T cultivadas são caracterizadas por uma capacidade de expansão e/ou proliferação realçada em comparação a uma composição ou preparação de célula T de referência. Em algumas modalidades, a capacidade realçada de expansão e/ou proliferação compreende um aumento no número ou porcentagem de células T CD3+, células T CD4+ e/ou células T CD8+ nas células T cultivadas em pelo menos cerca de duas vezes (como em pelo menos cerca de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes,
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245/378 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem de células T CD3+ T, células T CD4+ e/ou células T CD8+, respectivamente, na composição ou preparação de células T de referência.
[00427] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), em que as células T cultivadas são caracterizadas por uma maior capacidade de expansão e/ou proliferação de células T CD3+ em comparação a uma cultura de células T de referência. Em algumas modalidades, a capacidade realçada de expansão e/ou proliferação compreende um aumento no número ou porcentagem de células T CD3 + nas células T cultivadas em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como por pelo menos cerca de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou à porcentagem de células T CD3+ na composição ou preparação de células T de referência.
[00428] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), em que as células T cultivadas são caracterizadas por uma capacidade realçada de expansão e/ou proliferação de células T CD4+ em comparação a uma composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, a capacidade real
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246/378 çada de expansão e/ou proliferação compreende um aumento no número ou porcentagem de células T CD4+ nas células T cultivadas em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como por pelo menos cerca de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem de células T CD4+ na composição ou preparação de células T de referência.
[00429] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), em que as células T cultivadas são caracterizadas por uma capacidade realçada de expansão e/ou proliferação de células T CD8+ em comparação a uma composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, a capacidade realçada de expansão e/ou proliferação compreende um aumento no número ou porcentagem de células T CD8+ nas células T cultivadas em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como por pelo menos cerca de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou a porcentagem de células T CD8+ na composição ou preparação de células T de referência.
[00430] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui (por exemplo, agente multimerizado, como a incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica), em que as células T cultivadas são caracterizadas por uma distribuição alterada de células T CD8+/CD4+ ou distri
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247/378 buição normalizada de células T, como uma relação alterada de CD8+/CD4+ ou relação ce célula T CD8+/CD4+ normalizada, em comparação a uma composição ou preparação de células T de referência. A relação de CD8+/CD4+ ou relação normalizada pode ser aumentada ou diminuída. Em algumas modalidades, a relação alterada de células T CD8+/CD4+ resulta de um aumento no número ou porcentagem ou número normalizado ou porcentagem de células T CD8+ nas células T cultivadas em relação ou em comparação ao número ou porcentagem ou número normalizado ou porcentagem em uma composição ou preparação de referência. Em algumas modalidades, o número de células T CD8+ nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, pelo menos, cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem de células T CD8+ ou o número normalizado ou porcentagem de células T CD8+ na composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, a proporção de células T CD8+/CD4 + ou a proporção normalizada de CD8+/CD4 + é aumentada em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, vezes ou mais) em comparação à proporção de células T CD8+/CD4 + ou a relação normalizada de CD8+/CD4+ na composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, o número, porcentagem ou relação nas células T cultivadas ou em uma composição ou preparação é normalizado para o número, porcentagem ou relação na composição inicial que contém as células T antes da incubação.
[00431] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após
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248/378 a incubação com um agente ligado reversivelmente, como descrito aqui (por exemplo, agente multimerizado, como incubação com um agente estimulador ligado reversivelmente a uma estreptavidina de muteína oligomérica) e em que as células T cultivadas são caracterizadas por um perfil de expressão de marcador de superfície alterado em comparação a uma composição ou preparação de célula T de referência. Em algumas modalidades, o perfil de expressão do marcador de superfície alterado é devido a uma alteração no número ou porcentagem de um ou mais subconjuntos de células T que são positivos, negativos ou baixos para um ou mais marcadores de superfície selecionados dentre CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CCR7, CD27, CD28, CD122, t-bet, IL-7Ra, CD95, IL-2Rp, CXCR3, LFA-1, KLRG1. Em algumas modalidades, o número ou porcentagem do subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como em pelo menos cerca de 3), 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou preparação de referência.
[00432] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T nas células T cultivadas (por exemplo, um subconjunto de células T que é aumentado nas células T cultivadas em comparação à composição ou preparação de referência) exibe um estado de diferenciação ou ativação diminuído ou reduzido em comparação à composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T não é ou não inclui um fenótipo de célula T efetora (Te) ou célula T de memória efetora (Tem). Em algumas modalidades, o subconjunto de células T contém um fenótipo de superfície que é um ou mais dentre CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+ ou KLRG1baix0/. Em algumas modalidades, tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como por,
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249/378 pelo menos, cerca de qualquer uma de 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00433] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T nas células T cultivadas (por exemplo, um subconjunto de células T que é aumentado nas células T cultivadas em comparação à composição ou preparação de referência) é positivo para CD62L e/ou IL-7Ra (CD127) e/ou negativo ou baixo para t-bet. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é positivo para CD45RA e/ou negativo ou baixo para CD45RO. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é positivo para um ou mais de CCR7, CD45RA, CD62L, CD27, CD28, IL-7Ra (CD127), CD95, IL-2Rp, CXCR3 e LFA-1 e/ou negativo para CD45RO. Em algumas modalidades, tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos, cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00434] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T nas células T cultivadas (por exemplo, um subconjunto de células T que é aumentado nas células T cultivadas em comparação à composição ou preparação de referência) é ou inclui células que são positivas para CD62L (CD62L+). Em algumas modalidades, um tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00435] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T nas
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250/378 células T cultivadas (por exemplo, um subconjunto de células T que é aumentado nas células T cultivadas em comparação à composição ou preparação de referência) é ou inclui células que são CD62L+ e a) qualquer um ou mais dentre CD45RAbaiXO/+, CD45RObaixo/+, CCR7+ e CD27+ e b) qualquer um ou mais dentre t-betbaixo, IL-7Ra+ (CD127+), CD95+, IL~2Rp-F, CXCR3* e LFA-1+. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T também pode ser CD3+, CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, um tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00436] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T, como um subconjunto de células T CD62L+, nas células T cultivadas é ou inclui ou compartilha características fenotípicas com células T de memória ou subconjuntos particulares das mesmas, como células T de memória de longa duração. Em algumas modalidades, tais células T de memória são células T de memória central (Tem) ou células-tronco de memória T (Tscm). Em algumas modalidades, as células T de memória são células Tscm. As células Tscm podem ser descritas como tendo uma ou mais diferenças fenotípicas ou características funcionais em comparação a outros subconjuntos de células T de memória ou em comparação a células T não tratadas, tal como sendo menos diferenciadas ou mais não tratadas (veja, por exemplo, Ahlers and Belyakov (2010) Blood, 115:1678); Cieri et al. (2015) Blood, 125:2865; Flynn et al. (2014) Clinical & Translational Immunology, 3, e20; Gattinoni et al. (2012) Nat. Med. 17:1290-1297; Gattinoni et al. (2012) Nat. Reviews, 12:671; Li et al. (2013) PLOS ONE, 8:e67401; e Publicação PCT publicada No. WO2014/039044). Em alguns casos, acredita-se que as célu
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251/378 las Tscm sejam as únicas células T de memória capazes de gerar células T efetoras e todos os três subconjuntos de células T de memória (Tscm, Tem e Tem). Em alguns aspectos, as células Tscm têm a maior resposta de sobrevivência e proliferação a estímulos antigênicos ou homeostáticos de todos os subconjuntos de células T de memória e o menor antígeno cognato ausente de menos atrito. Em algumas modalidades, as células Tscm menos diferenciadas podem exibir maior expansão, viabilidade a longo prazo e destruição de células-alvo após a transferência adotiva do que outras células T de memória e, portanto, podem mediar um tratamento mais eficaz com menos células transferidas do que seria possível para células Tem ou Tem.
[00437] Em alguns aspectos, exemplos de características fenotípicas ou funcionais que foram relatadas ou conhecidas para células Tscm incluem, por exemplo, estas tais células a) são CD45RO’, CCR7+, CD45RA*, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Ro+, CD95+, IL-2Rp+, CXCR3* e LFA-1+; b) são CD45RA+, CCR7+, CD62L+ e CD95+; c) são CD45RA+, CD45RCF, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ e IL2Rp+; d) são CD45RO; CD45RA+, CCR7+, CD62L?, CD27+, CD28+, CD127+ e CD95+; e) são CD45RA*, CD44+A, CD62U, CD127+, IL2Rp+, CD28+, CD43’, KLRGT, Peforin e GranzymeB-; f) expressam altos níveis de CCR7, CD62L, CD27 e CD28, níveis intermediários de CD95 e IL-2Rp, baixos níveis de CD45RA e não expressam CD45RO ou KLRG-1; ou g) expressam altos níveis de CD62L, baixos níveis de CD44 e t-bet e são Sca-1+; e/ou têm capacidade intermediária de produção de IL-2, baixa capacidade de produção de IFNy, baixa citotoxicidade e alta capacidade de autorrenovação.
[00438] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T nas células T cultivadas (por exemplo, um subconjunto de células T que é aumentado nas células T cultivadas em comparação à composição ou preparação de referência) é ou inclui células T de memória, tais como
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252/378 células T de memória de longa duração. Em algumas modalidades, as células T da memória são células T de memória central (Tem). Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RA-, CD45RObaixo/+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ CD122+ e/ou KLGR1bab®. Em algumas modalidades, um tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00439] Em algumas modalidades, as células T da memória são células T da memória central de tronco (Tscm). Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RAbaix0/+, CD45RObaixo/+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ e/ou KLGR1-. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RAbaix0/+, CD45RO-, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ e/ou KLGR1-. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RO’, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rp+, CXCR3* e/ou LFA-Γ. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RAT CCR7+, CD62L+ e/ou CD95T Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RA+, CD45RO*, CCR7+, CD62L+, CD27*, CD28+, CD95+ e/ou IL-2Rp+. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RO', CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+ e/ou CD951·. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rp+, CD28+, CD43; KLRG1’,
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Peforirr e/ou GranzymeBi Em algumas modalidades, o subconjunto de células T expressa altos níveis de CCR7, CD62L, CD27 e/ou CD28, níveis intermediários de CD95 e/ou IL-2Rp, baixos níveis de CD45RA e/ou não expressa CD45RO e/ou KLRG-1. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T expressa altos níveis de CD62L, baixos níveis de CD44 e t-bet e/ou é Sca-1+. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T tem uma característica fenotípica intermediária IL-2 - capacidade de produção, baixa capacidade de produção de IFNy, baixa citotoxicidade e/ou alta capacidade de autorrenovação. Em algumas modalidades, um tal subconjunto de células T nas células T cultivadas é aumentado em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais) em comparação ao número ou porcentagem do subconjunto de células T na composição ou cultura de células T de referência.
[00440] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T, tal como qualquer subconjunto de células T descrito acima, está presente em uma porcentagem maior do total de células T nas células T cultivadas ou em um número maior de células T totais nas células T cultivadas em comparação a uma composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto de células T nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou de células totais na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto de células T nas células cultivadas, tal como qualquer subconjunto de células T descrito acima, é maior, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes maior, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, superior à porcentagem correspondente do subconjunto de células em uma célula T em uma composição de
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254/378 célula T isolada ou enriquecida diretamente de um indivíduo humano com base na expressão de superfície de um ou marcadores compreendendo o fenótipo, porém, sem a incubação ou cultura. Em algumas modalidades, o número total, número relativo ou número normalizado do subconjunto de células T nas células cultivadas, tal como qualquer subconjunto de células T descrito acima, é maior, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes maior, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, superior ao número, número relativo ou número normalizado do subconjunto de células T em um composição ou preparação de células T de referência, como qualquer composição ou preparação de células T de referência descrita acima, por exemplo, a composição de células T antes da Incubação com o agente ligado reversivelmente (por exemplo, agente multimerizado, tal como incubação com um agente estimulador reversivelmente ligado a uma estreptavidina de muteína oligomérica) de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos. Em algumas modalidades, o número de células T correspondentes ao subconjunto de células T presente na cultura de células T é pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 106 células, 2 x 106 células, 3 x 106 células, 4 x 106 células, 5 x 106 células ou mais.
[00441] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é CD62L+ e/ou IL-7Ra+ (CD127*) e a porcentagem do subconjunto de CD62L+ e/ou IL-7Ra+ (CD127+) nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou total de células na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é CD45RA-, CD45RObaixo/+ e/ou KLRG1baiX0 e a porcentagem do subconjunto de CD45RA; CD45RObaixQ,'+ e/ou KLRG1baix0 nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou o total de células na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60
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255/378 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é CD45RA baixo/+, CD45RObaixo/+ e/ou KLRGT e a porcentagem do subconjunto de CD45RAbaiX0/+, CD45RObaixo/+ e/ou KLRGT nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou total de células na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais.
[00442] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é ou inclui células Tem. Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto de Tem nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou total de células na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais.
[00443] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T é ou inclui células Tscm. Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto de Tscm nas células T cultivadas como uma porcentagem do total de células T ou total de células na cultura é de pelo menos 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais.
[00444] Em algumas modalidades, o subconjunto de células T, como células T CD62L+, tem ou exibe a) um baixo nível de círculos de excisão de rearranjo do TCR (TREC); e/ou b) expressa um marcador de proliferação (por exemplo, Ki~67); e/ou c) exibe a capacidade de proliferar na presença de um agente estimulador; e/ou d) exibe uma capacidade de produzir uma citocina selecionada dentre IFN-gama, TNF e IL-2 na presença de um agente estimulador; e/ou e) é refratário ao atrito na ausência de um agente estimulador; e/ou f) é capaz de gerar células Tscm, Tem, Tem e Teff; e/ou g) tem baixa citotoxicidade; e/ou h) pode produzir a mesma ou maior resposta após a transferência adotiva de menos células do que as células Tem ou Tem. Em algumas
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256/378 modalidades, o agente estimulador é um antígeno, uma citocina homeostática (por exemplo, IL-15 ou IL-17) ou é um agente que é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T. Em algumas modalidades, a capacidade de produzir uma citocina compreende uma baixa capacidade de produzir IFNy e/ou uma capacidade intermediária de produzir 11.-2.
[00445] Em algumas modalidades, são fornecidas células T cultivadas, como preparadas de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que as células T cultivadas são geradas ou produzidas após a incubação, como descrito aqui, e em que as células T cultivadas são caracterizadas por um perfil de atividade funcional modificado em comparação a uma composição ou preparação de células T de referência. Em algumas modalidades, as células T cultivadas ou um subconjunto específico de células T presentes na cultura exibem um perfil de atividade funcional alterado em comparação a uma composição ou preparação de referência ou em comparação ao subconjunto de células T na composição ou preparação de referência, como uma atividade funcional que é alterada (por exemplo, aumentada ou diminuída) pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes. Em algumas modalidades, a atividade funcional é selecionada dentre um ou mais de a) um baixo nível de círculos de excisões de rearranjo de TCR (TREC); e/ou b) expressão de um marcador de proliferação (por exemplo, Ki-67); e/ou c) a capacidade de proliferar na presença de um agente estimulador; e/ou d) a capacidade de produzir uma citocina selecionada dentre IFNgama, TNF e IL-2 na presença de um agente estimulador; e/ou e) são refratários ao atrito na ausência de um agente estimulador; e/ou f) são capazes de gerar células Tscm, Tem, Tem e Teff; e/ou g) apresentam baixa citotoxicidade. Em algumas modalidades, o agente estimulador é um antígeno, uma citocina homeostátlca (por exemplo, IL-15 ou IL-17)
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257/378 ou é um agente que é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T. Em algumas modalidades, a capacidade de produzir uma citocina compreende uma baixa capacidade para produzir IFNy e/ou uma capacidade intermediária para produzir IL-2. Em algumas modalidades, o subconjunto de células T compreende células T de memória, como células T de memória de longa duração, nas células T cultivadas. Em algumas modalidades, as células T de memória são células Tscm.
[00446] Em algumas modalidades, as células T cultivadas ou um subconjunto específico de células T presentes na cultura podem produzir a mesma ou maior resposta após a transferência adotiva de menos células do que pode ser alcançado por uma composição ou preparação de referência ou pelo subconjunto de células T na composição ou preparação de referência. Em algumas modalidades, tal resposta é alcançada com pelo menos cerca de 2 vezes (tal como por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9- vezes, 10 vezes ou mais) menos células. Em algumas modalidades, a resposta é aumentada ou é maior em pelo menos cerca de 2 vezes (tal como, por pelo menos cerca de qualquer dentre 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais).
[00447] Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto de células T nas células cultivadas, tal como qualquer subconjunto de células T descrito acima, é maior, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes maior, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, superior ao subconjunto correspondente de células em uma preparação de células T que foram incubadas na presença de um inibidor de GSK-P. Em algumas modalidades, a composição de células T cultivadas não contém um inibidor de GSK-P.
[00448] Em algumas modalidades, a porcentagem do subconjunto
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258/378 de células T nas células cultivadas, tal como qualquer subconjunto de células T descrito acima, é maior, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes maior, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, superior ao subconjunto correspondente de células que foram incubadas na presença de uma citocina homeostática recombinante, opcionalmente IL-7 ou IL-15. Em algumas modalidades, a composição de células T cultivadas não contém uma citocina IL-7 recombinante (por exemplo, exógena) ou uma citocina IL-15 recombinante (por exemplo, exógena).
[00449] Em algumas modalidades, a composição de células T cultivadas foi produzida ou gerada de acordo com qualquer um dos métodos aqui fornecidos, em que uma substância, tal como um agente de competição, foi adicionada às células T para interromper, tal como diminuir e/ou terminar, a sinalização do agente ou agentes estimulador(es). Em algumas modalidades, a composição de células T cultivadas contém a presença de uma substância, tal como um agente de competição, por exemplo, biotina ou um análogo de biotina, por exemplo, D-biotina. Em algumas modalidades, a substância, tai como um agente de competição, por exemplo, biotina ou um análogo de biotina, por exemplo, D-biotina, está presente em uma quantidade que é pelo menos 1,5 vezes maior, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais do que a quantidade da substância em uma composição de referência ou preparação de células T cultivadas em que a substância não foi adicionada exogenamente durante a incubação. Em algumas modalidades, a quantidade da substância, tal como um agente de competição, por exemplo, biotina ou um análogo de biotina, por exemplo, D-biotina, na composição de células T cultivadas é de ou de cerca de 10 μΜ a 100 μΜ, 100 μΜ a 1 mM, 100 μΜ a 500 μΜ ou 10 μΜ a 100 μΜ.
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IV, MÉTODOS DE CÉLULAS CULTIVADAS GENETICAMENTE MODIFICADAS, RECEPTORES DE ANTÍGENO E CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
[00450] Em algumas modalidades, as células cultivadas contêm ou são modificadas para conter um receptor modificado, por exemplo, um receptor de antígeno modificado, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T (TCR). Também são fornecidas populações de tais células, composições que contêm tais células e/ou enriquecidas para tais células, tais como nas quais as células de um determinado tipo, tais como células T ou células CD8+ ou CD4+, são enriquecidas ou selecionadas. Entre as composições estão composições farmacêuticas e formulações para administração, como para terapia celular adotiva. Também são fornecidos métodos terapêuticos para administrar as células e composições a indivíduos, por exemplo, pacientes.
[00451] Assim, em algumas modalidades, as células cultivadas incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por engenharia genética e, assim, expressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a transferência de genes é realizada estimulando primeiro as células cultivadas, tal como combinando-as com um estímulo que induz uma resposta como proliferação, sobrevivência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela expressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguido por transdução das células ativadas e expansão em cultura para números suficientes para aplicações clínicas.
[00452] Em alguns contextos, a superexpressão de um fator estimulador (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) pode ser tóxica para um indivíduo. Assim, em alguns contextos, as células modificadas incluem segmentos de genes que fazem com que as células sejam suscetíveis à seleção negativa in vivo, tal como na administração em
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260/378 imunoterapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, as células cultivadas são modificadas para que possam ser eliminadas como resultado de uma alteração na condição in vivo do paciente ao qual são administradas. O fenótipo seiecionável negativo pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Genes selecionáveis negativos incluem o gene da timidina cinase do vírus do Herpes simples tipo I (HSV-I TK) (Wigler et ai., Cell II: 223, 1977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene da hipoxantina fosfribosiltransferase celular (HPRT), o gene da adenina fosforibosiltransferase (APRT) celular, citosina desaminase bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA: 89:33 (1992)). Em alguns aspectos, as células cultivadas são também modificadas para promover a expressão de citocinas ou outros fatores.
A. Ácidos nucleicos codificando Receptores de Antígeno, por exemplo, receptores de antígeno quiméricos
[00453] São fornecidos métodos, ácidos nucleicos, composições e kits para a produção de células geneticamente modificadas. A engenharia genética geralmente envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica o componente recombinante ou modificado em uma composição contendo as células cultivadas, tal como por transdução, transfecção ou transformação retroviral.
[00454] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, como uma obtida de outro organismo ou célula, que por exemplo, normalmente não é encontrado na célula que está sendo modificada e/ou um organismo do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de ácidos nucleicos que codificam vários domínios de vários tipos celulares diferenPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 297/524
261/378 tes.
1. Receptores de Antígeno Quiméricos (CARs)
[00455] As células geralmente expressam receptores recombinantes, como receptores de antígeno, incluindo receptores funcionais de antígeno nâo-TCR, por exemplo, receptores de antígeno quiméricos (CARs) e outros receptores de ligação ao antígeno, como receptores de células T transgênicos (TCRs). Também entre os receptores estão outros receptores quiméricos.
[00456] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs, e métodos para engenharia e introdução de tais receptores nas células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedido de patente internacional W0200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 números de publicação do pedido de patente U.S. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes U.S. Nos.: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, e 8.479.118 e Pedido de Patente Européia número EP2537416 e/ou os descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 Abril; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígeno incluem um CAR, como descrito na Patente U.S. 7.446.190, e aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional: WO/2014055668 A1. Exemplos de CARs Incluem CARs, conforme divulgado em qualquer uma das publicações mencionadas, tais como WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente U.S. No. 7.446.190, Patente U.S. No. 8.389.282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinicai Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; e Brentjens et al., Sei Transi
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Med. 2013 5(177). Veja, também WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente U.S. No. 7.446.190 e Patente US N.° 8.389.282. Os receptores quiméricos, como CARs, geralmente incluem um domínio de ligação ao antígeno extracelular, como uma porção de uma molécula de anticorpo, geralmente uma região variável de cadeia pesada (Vh) e/ou região variável de cadeia leve (Vl) do anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo scFv.
[00457] Em algumas modalidades, o antígeno direcionado pelo receptor é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação a células ou tecidos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células modificadas.
[00458] Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem o receptor de tirosina cinase órfão RORI, tEGFR, Her2, LI-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 ou 4, FBP, receptor de acetilcolina fetal e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22Ralfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadeia leve de capa, Lewis Y, molécula de adesão de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, Li~ gantes de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno específico da próstata, PS MA, Her2/neu, receptor de estrogên io, receptor de progesterona, efrinaB2, CD123, c-Met, GD-2 e MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, tal como cicllna A1 (CCNA1), e/ou moléculas biotiniladas, e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
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[00459] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, as células-alvo expressam um CAR que se liga a um antigen© associado a uma doença e/ou câncer. Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o antígeno é ανβδ integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um agente testicular cancerígeno, agente cancerígeno/testicular, antígeno cancerígeno/testicular 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante de Quimiocina de Motivo de CC 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vlll), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo do receptor Fc 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, receptor de acetilcolina fetal, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor Acoplado à Proteína G 5D (GPCR5D), Her2/neu (tirosina cinase receptora erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno humano associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, Antígeno leucocitário humano A1 (HLA-AI), Antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Repetição Rica em
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Leucina Contendo 8 Membros da Família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c~Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes naturais de membro D de grupo 2 exterminador (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específico de próstata, antígeno prostátlco de células-tronco (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), tirosina cinase receptora como receptor órfão 1 (RORI), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.
[00460] Em algumas modalidades, o CAR se liga a um antígeno específico de patógeno. Em algumas modalidades, o CAR é específico para antígenos virais (como HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.
[00461] Em algumas modalidades, a porção de anticorpo do receptor recombinante, por exemplo, CAR, inclui ainda pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como uma região de articulação, por exemplo, uma região de articulação de lgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como lgG4 ou lgG1. Em alguns aspectos, a porção da região constante serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv e domínio de transmembrana. O espaçador pode ter
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265/378 um comprimento que forneça maior responsividade da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador. Espaçadores exemplares, por exemplo, regiões de articulação, incluem aqueles descritos na publicação de pedido de patente internacional número WO2014031687. Em alguns exemplos, o espaçador tem ou tem cerca de 12 aminoácidos de comprimento ou não tem mais que 12 aminoácidos no comprimento. Espaçadores exemplares incluem aqueles que têm pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoácidos, cerca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a 20 aminoácidos ou cerca de 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer um dos intervalos listados. Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 aminoácidos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos. Espaçadores exemplares incluem articulação de lgG4 sozinha, articulação de lgG4 ligada aos domínios CH2 e CH3 ou articulação de lgG4 ligada ao domínio CH3.
[00462] Esse domínio de reconhecimento de antígeno geralmente está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, como componentes de sinalização que imitam a ativação por meio de um complexo de receptor de antígeno, como um complexo de TCR, no caso de um CAR, e/ou sinal por outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) está ligado a um ou mais domínios de sinalização de transmembrana e intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é fundido ao domínio extracelular. Em uma modalidade, um domínio de transmembrana que naturalmente
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266/378 está associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR, é usado. Em alguns casos, o domínio de transmembrana é selecionado ou modificado por substituição de aminoácido para evitar a ligação de tais domínios aos domínios de transmembrana da mesma ou de diferentes proteínas da membrana de superfície diferentes para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.
[00463] O domínio de transmembrana em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou sintética. Onde a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões de transmembrana incluem aquelas derivadas de (isto é, compreendem pelo menos a(s) regiões de transmembrana(s) de) cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Alternativamente, o domínio de transmembrana em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana sintético compreende resíduos predominantemente hidrofóbicos, tais como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana sintético. Em algumas modalidades, a ligação é por ligantes, espaçadores e/ou domínio(s) de transmembrana(s).
[00464] Entre os domínios de sinalização intracelular estão aqueles que imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através de um tal receptor em combinação com um receptor coestimulador e/ou um sinal através de um receptor coestimulador sozinho. Em algumas modalidades, um ligante ollgo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligante dentre 2 a 10 aminoácidos no comprimento, como aquele contendo glicinas e serinas, por exemplo, dubleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio de transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático
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267/378 do CAR.
[00465] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelular de um complexo de TCR, como uma cadeia de CD3 CDR que media a ativação de células T e citotoxicidade, por exemplo, cadeia CD3 zeta. Assim, em alguns aspectos, a porção de ligação ao antígeno está ligada a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização celular incluem o domínio de transmembrana de CD3, domínios de sinalização intracelular de CD3 e/ou outros domínios de transmembrana de CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, tal como o receptor de Fc y, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR ou outro receptor quimérico inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CDS-ζ) ou receptor de Fc y e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[00466] Em algumas modalidades, na ligação do CAR ou outro receptor quimérico, o domínio citoplasmático ou o domínio de sinalização intracelular do receptor ativa pelo menos uma das funções ou respostas efetoras normais da célula imune, por exemplo, célula T modificada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T, como atividade citolítica ou atividade de T auxiliar, como secreção de citocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de um domínio de sinalização intracelular de um componente receptor de antígeno ou molécula coestimuladora é usada no lugar de uma cadeia imunoestimuladora intacta, por exemplo, se ela transduz o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, o domínio ou domínios de sinalização intracelular incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também os de correceptores que
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268/378 no contexto natural agem em conjunto com tais receptores para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno.
[00467] No contexto de um TCR natural, a ativação completa geralmente requer nâo apenas sinalização através do TCR, mas também um sinal coestimulador. Assim, em algumas modalidades, para promover a ativação completa, um componente para gerar sinal secundário ou coestimulador também é incluído no CAR. Em outras modalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimulador. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulador.
[00468] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como sendo mediada por duas classes de sequências de sinalização citoplasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências primárias de sinalização citoplasmática) e aquelas que agem de maneira independente de antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador (sequências de sinalização citoplasmáticas secundárias). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos os componentes de sinalização.
[00469] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinalização citoplasmática primária que regula a ativação primária do complexo de TCR. As sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que atuam de maneira estimuladora podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas primárias incluem aquelas derivadas de TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de sinalização citoplasmática(s) no CAR contém um domínio de sinalização citoplasmático, uma porção do mesmo ou
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269/378 uma sequência derivada de CD3 zeta.
[00470] Em algumas modalidades, o CAR inclui um domínio de sinalização e/ou porção de transmembrana de um receptor coestimulador, como CD28, 4-1 BB, 0X40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui ambos os componentes ativadores e coestimuladores.
[00471] Em algumas modalidades, o domínio de ativação é incluído dentro de um CAR, enquanto o componente coestimulador é fornecido por outro CAR reconhecendo outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores, CARs coestimuladores, ambos expressos na mesma célula (veja, WO2014/055668). Em alguns aspectos, as células incluem um ou mais CARs estimuladores ou ativadores e/ou um CAR estimulador. Em algumas modalidades, as células incluem ainda CARs inibitórios (ICARs, veja, Fedorov et al., Sei. Transi. Medicine, 5 (215) (Dezembro, 2013), como um CAR que reconhece um antígeno diferente daquele associado a e/ou específico para a doença ou condição pela qual um sinal de ativação liberado através do CAR de direcionamento à doença é diminuído ou inibido pela ligação do CAR inibidor ao seu ligante, por exemplo, para reduzir os efeitos fora do alvo.
[00472] Em certas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de transmembrana e de sinalização de CD28 ligado a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3zeta). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio coestimulador quimérico CD28 e CD137 (41 BB, TNFRSF9), ligado a um domínio intracelular de CD3 zeta.
[00473] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais domínios coestimuladors e um domínio de ativação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção cltoplasmática. Exemplos de CARs incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4-1 BB.
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[00474] Em algumas modalidades, o CAR ou outro receptor de antígeno inclui ainda um marcador, tal como um marcador de superfície celular, que pode ser usado para confirmar a transdução ou engenharia da célula para expressar o receptor, tal como uma versão truncada de um receptor de superfície celular, tal como EGFR truncado (tEGFR). Em alguns aspectos, o marcador inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR ou receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica para uma sequência de ligante, tal como uma sequência de ligante clivável, por exemplo, T2A. Veja, WO2014031687.
[00475] Em algumas modalidades, o marcador é uma molécula, por exemplo, proteína da superfície celular, não encontrada naturalmente nas células T ou não encontrada naturalmente na superfície das células T ou em uma porção das mesmas.
[00476] Em algumas modalidades, a molécula é uma molécula nonself, por exemplo, proteína non-self, isto é, uma que não é reconhecida como self pelo sistema imune do hospedeiro no qual as células serão transferidas adotivamente.
[00477] Em algumas modalidades, o marcador não serve a função terapêutica e/ou produz outro efeito além de ser usado como um marcador para engenharia genética, por exemplo, para selecionar células modificadas com sucesso. Em outras modalidades, o marcador pode ser uma molécula ou molécula terapêutica que exerce de outra maneira algum efeito desejado, tal como um ligante para uma célula a ser encontrada in vivo, como uma molécula do ponto de checagem coestimulador ou imune para realçar e/ou diminuir as respostas das células na transferência adotiva e encontrar com ligante.
[00478] Em alguns casos, os CARs são referidos como CARs de
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271/378 primeira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que apenas fornece um sinal induzido pela cadeia CD3 na ligação ao antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele que fornece um tal sinal e sinal coestimulador, como aquele que inclui um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador tal como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração é aquele que inclui múltiplos domínios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.
[00479] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv e o domínio intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular Inclui um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3zeta (Οϋ3ζ). Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui um domínio de transmembrana ligando o domínio extracelular e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana contém uma porção de transmembrana de CD28. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de células T é CD28 ou 41 BB.
[00480] Os termos polipeptídeo e proteína são usados alternadamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido, e não estão limitados a um comprimento mínimo. Polipeptídeos, incluindo os receptores fornecidos e outros polipeptídeos, por exemplo, ligantes ou peptídeos, podem incluir resíduos de aminoácido, incluindo resíduos de aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os termos também inclu
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272/378 em modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação e fosforilação. Em alguns aspectos, os polipeptídeos podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcionada ao sítio, ou podem ser acidentais, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[00481 ] Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, o CAR, expresso pelas células na dose consecutiva contém pelo menos um epítopo imunorreativo como o receptor, por exemplo, o CAR, expresso pelas células da primeira dose. Em alguns aspectos, o receptor, por exemplo, o CAR, expresso pelas células administradas na dose consecutiva, é idêntico ao receptor, por exemplo, o CAR, expresso pela primeira dose ou é substancialmente idêntico ao receptor, por exemplo, o CAR, expresso pelas células administradas na primeira dose.
[00482] Os receptores recombinantes, como CARs, expressos pelas células administradas ao indivíduo nas várias doses geralmente reconhecem ou se ligam especificamente a uma molécula que é expressa em, associada a e/ou específica para a doença ou condição ou células da mesma a ser tradas. Na ligação específica à molécula, por exemplo, antígeno, o receptor geralmente libera um sinal imunoestimulador, como um sinal transduzido por ITAM, na célula, promovendo assim uma resposta imune direcionada à doença ou condição. Por exemplo, em algumas modalidades, as células na primeira dose expressam um CAR que se liga especificamente a um antígeno expresso por uma célula ou tecido da doença ou condição ou associado à doença ou condição.
2. TCRs
[00483] Em algumas modalidades, os receptores de antígeno gene
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273/378 ticamente modificados incluem receptores de células T recombinantes (TCRs) e/ou TCRs clonados de células T de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um clone de células T de alta afinidade para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de câncer) é identificado, isolado de um paciente e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o clone de TCR para um antígeno alvo foi gerado em camundongos transgênicos modificados com genes do sistema imune humano (por exemplo, o sistema de antígeno leucocitário humano, ou HLA). Veja, por exemplo, antígenos de tumor (veja, por exemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15: 169-180 e Cohen et al. (2005) J. Immunol. 175:5799-5808. Em algumas modalidades, a exibição de fa~ go é usado para isolar TCRs contra um antígeno alvo (veja, por exemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 e Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354.
[00484] Em algumas modalidades, após a obtenção do clone de células T, as cadeias alfa e beta do TCR são Isoladas e clonadas em um vetor de expressão gênica. Em algumas modalidades, os genes alfa e beta do TCR são ligados por meio de um peptídeo de salto ribossômico de picornavírus 2A, de modo que ambas as cadeias sejam coexpressão. Em algumas modalidades, a transferência genética do TCR é realizada por vetores retrovirais ou lentivirais ou por transposons (veja, por exemplo, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; um Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683.
3. Multhdireclonamento
[00485] Em algumas modalidades, as células e métodos incluem estratégias de multl-direcionamento, como expressão de dois ou mais
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274/378 receptores geneticamente modificados na céiula, cada um reconhecendo o mesmo de um antígeno diferente e tipicamente cada um incluindo um componente de sinalização intracelular diferente. Tais estratégias de multi-direcionamento são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação No.: WO 2014055668 A1 (descrevendo combinações de CARs ativadores e coestimuladores, por exemplo, direcionando dois antígenos diferentes presentes individualmente em células fora do alvo, por exemplo, normais, mas presentes juntos apenas nas células da doença ou condição a ser tratada) e Fedorov et ah, Sei. Transi. Medicine, 5(215) (December, 2013) (descrevendo células que expressam um CAR ativador e um inibidor, como aquelas nas quais o CAR ativador se liga a um antígeno expresso em ambas células normais ou não doentes e células da doença ou condição a ser tratada, e o CAR inibitório se liga a outro antígeno expresso apenas nas células normais ou células que não se deseja tratar).
[00486] Por exemplo, em algumas modalidades, as células incluem um receptor que expressa um primeiro receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR) que é capaz de induzir um sinal de ativação na célula, geralmente na ligação específica ao antígeno reconhecido pelo primeiro receptor, por exemplo, o primeiro antígeno. Em algumas modalidades, a célula inclui ainda um segundo receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR), por exemplo, um receptor coestimulador quimérico, que é capaz de induzir um sinal coestimulador para a célula imune, geralmente na ligação específica a um segundo antígeno reconhecido pelo segundo receptor. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são diferentes.
[00487] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou
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TOR) é capaz de induzir um sinal de ativação para a célula. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente de sinalização intracelular contendo motivos ITAM ou tipo ITAM. Em algumas modalidades, a ativação induzida pelo primeiro receptor envolve uma transdução de sinal ou alteração na expressão de proteína na célula, resultando no início de uma resposta imune, como a fosforilação de ITAM e/ou o início da cascata de transdução de sinal mediada por ITAM, a formação de uma sinapse imunológica e/ou agrupamento de moléculas próximas ao receptor ligado (por exemplo, CD4 ou CD8, etc.), ativação de um ou mais fatores de transcrição, como NF-κΒ e/ou AP-1, e/ou indução da expressão gênica de fatores como citocinas, proliferação e/ou sobrevivência.
[00488] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor incluem domínios de sinalização intracelular de receptores co~ estimuladores, como CD28, CD137 (4-1 BB), 0X40 e/ou ICOS. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo receptores incluem domínios de sinalização intracelular de receptores coestimuladors diferentes. Em uma modalidade, o primeiro receptor contém uma região de sinalização coestimuladora de CD28 e o segundo receptor contém uma região de sinalização coestimuladora de 4-1 BB ou vice-versa.
[00489] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor incluem um domínio de sinalização intracelular contendo motivos ITAM ou tipo ITAM e um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador.
[00490] Em algumas modalidades, o primeiro receptor contém um domínio de sinalização intracelular contendo motivos ITAM ou tipo ITAM e o segundo receptor contém um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulador. O sinal coestimulador em combinação com o sinal de ativação induzido na mesma célula é aquele que resulta em uma resposta imune, como uma resposta imune forte e
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276/378 sustentada, como aumento da expressão gênica, secreção de citocinas e outros fatores e funções efetoras mediadas por células T como morte celular.
[00491] Em algumas modalidades, nem a ligação do primeiro receptor isoladamente nem a ligação do segundo receptor isoladamente induz uma resposta imune forte. Em alguns aspectos, se apenas um receptor é ligado, a célula torna-se tolerada ou não responsiva ao antígeno ou inibida e/ou não é induzida a proliferar ou secretar fatores ou realizar funções efetoras. Em algumas de tais modalidades, no entanto, quando a pluralidade de receptores é ligada, como no encontro de uma célula que expressa o primeiro e o segundo antígenos, uma resposta desejada é alcançada, como ativação ou estimulação imune completa, por exemplo, conforme indicado pela secreção de uma ou mais citocinas, proliferação, persistência e/ou realização de uma função efetora imune, tal como a morte citotóxica de uma célula-alvo.
[00492] Em algumas modalidades, os dois receptores induzem, respectivamente, um sinal de ativação e inibitório à célula, de modo que a ligação de um dos receptores ao seu antígeno ativa a célula ou induz uma resposta, mas a ligação pelo segundo receptor inibidor ao seu antígeno induz um sinal que suprime ou amortece esta resposta. Exemplos são combinações de CARs ativadores e CARs inibidores ou ICARs. Uma tal estratégia pode ser usada, por exemplo, em que o CAR ativador liga um antígeno expresso em uma doença ou condição, mas que também é expresso em células normais, e o receptor iníbítório se liga a um antígeno separado que é expresso nas células normais, mas não células da doença ou condição.
[00493] Em algumas modalidades, a estratégia de multi-direcionamento é empregada em um caso onde um antígeno associado a uma doença ou condição particular é expresso em uma célula não doente e/ou é expresso na própria célula modificada, seja de forma transitória
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277/378 (por exemplo, na estimulação em associação à engenharia genética) ou permanentemente. Em tais casos, ao exigir a ligação de dois receptores de antígeno separados e individualmente específicos, a especificidade, a seletividade e/ou a eficácia podem ser melhoradas.
[00494] Em algumas modalidades, a pluralidade de antígenos, por exemplo, o primeiro e o segundo antígenos, são expressos na célula, tecido ou doença ou condição direcionada, tal como na célula cancerígena. Em alguns aspectos, a célula, tecido, doença ou condição é mieloma múltiplo ou uma célula de mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, uma ou mais da pluralidade de antígenos geralmente também é expresso em uma célula que não se deseja direcionar com a terapia celular, tal como uma célula ou tecido normal ou não doente, e/ou as próprias células modificadas. Em tais modalidades, ao exigir a ligação de múltiplos receptores para obter uma resposta da célula, a especificidade e/ou eficácia é alcançada.
B. Vetores e métodos para engenharia genética
[00495] Vários métodos para a introdução de componentes geneticamente modificados, por exemplo, receptores de antígeno, por exemplo, CARs ou TCRs, são bem conhecidos e podem ser usados com os métodos e composições fornecidos. Métodos exemplares incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos que codificam os receptores, incluindo via viral, por exemplo, retroviral ou lentivíral, transdução, transposons e eletroporação.
[00496] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células cultivadas usando partículas de vírus infecciosos recombinantes, tal como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovirus, vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T usando vetores lentivirais recombinantes ou vetores retrovirais, tais como vetores gama-retrovirais (veja, por exemplo,
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Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 abr 3. doi: 10.1038/gt. 2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11)): 550-557.
[00497] Em algumas modalidades, o vetor retroviral tem uma sequência de repetição terminal longa (LTR), por exemplo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia de murino Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula tronco embrionária de murino (MESV), vírus da célula tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV). A maioria dos vetores retrovirais são derivados de retrovirus de murino. Em algumas modalidades, os retrovirus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células aviária ou de mamífero. Os retrovirus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espécies, incluindo seres humanos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequências retrovirais de gag, pol e/ou env. Um número de sistemas retrovirais ilustrativos foi descrito (por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller e Rosman (1989) BioTechniques 7: 980990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14 Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
[00498] Métodos de transdução lentiviral são conhecidos. Métodos exemplares são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. !m~ munother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506:97-114; e Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
[00499] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos em células T através de eletroporação (veja, por
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279/378 exemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 e Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos em células T através de transposição (veja, por exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Moiec Ther Nud Acids 2, e74; e Huang et al. (2009) Methods Moi Biol 506: 115-126). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes incluem a transfecção de fosfato de cálcio (por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.), fusão de protoplasto, transfecção mediada por lipossoma catiônico; bombardeamento de microparticuias facilitado por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e coprecipitação de DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[00500] Outras abordagens e vetores para transferência dos ácidos nucleicos que codificam os produtos recombinantes são os descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação No.: WO2014055668 e Patente U.S. No. 7.446.190.
[00501] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, podem ser transfectadas durante ou após a expansão, por exemplo, com um receptor de células T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfecção para a introdução do gene do receptor desejado pode ser realizada com qualquer vetor retroviral adequado, por exemplo. A população de células geneticamente modificadas pode, então, ser liberada do estímulo inicial (o estímulo CD3/CD28, por exemplo) e subsequentemente ser estimulada com um segundo tipo de estímulo, por exemplo, através de um receptor introduzido de novo). Esse segundo tipo de estímulo pode Incluir um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticulação) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo, ligante na
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280/378 tural de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anticorpo) que ligase diretamente à estrutura do novo receptor (por exemplo, ao reconhecer regiões constantes no receptor). Veja, por exemplo, Cheadle et al, Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).
[00502] Entre ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, genes para introdução são aqueles para melhoram a eficácia da terapia, tal como por exemplo, promovendo a viabilidade e/ou a função das células transferidas; genes para fornecer um marcador genético para seleção e/ou avaliação das células, tal como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo, genes para melhorar a segurança, por exemplo, tomando a célula suscetível à seleção negativa in vivo, como descrito por Lupton S. D. et al., Moi. and Ceii BioL, 11:6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); veja também as publicações de PCT/US91 /08442 e PCT/US94/05601 por Lupton et al. descrevendo o uso de genes de fusão selecionáveis bifunclonais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Veja, por exemplo, Riddell et al., Patente US No. 6.040.177, nas colunas 14-17.
[00503] Em alguns casos, um vetor pode ser usado que não requer que as células, por exemplo, células T, sejam ativadas. Em alguns tais casos, as células podem ser selecionadas e/ou transduzidas antes da ativação. Assim, as células podem ser modificadas antes ou após a cultura das células, como descrito aqui, e em alguns casos ao mesmo tempo que ou durante pelo menos uma porção da cultura. Em algumas modalidades, as células a serem modificadas são as células cultivadas ou, em alguns casos, as células podem ser transduzidas antes da realização da cultura, como descrito aqui.
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C. Métodos de Transdução de Células
[00504] Em algumas modalidades, os métodos de transferência viral na célula são realizados usando qualquer um dos reagentes de proteína oligoméricos fornecidos (por exemplo, estreptavidina ou muteína de estreptavidina). Em algumas modalidades, o reagente de proteína oligomérico usado de acordo com os métodos de transdução fornecidos é um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, as células são para uso em terapia celular, tais como células primárias preparadas para transferência autóloga ou alogênica, por exemplo, em terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, o reagente também pode ser explorado nos métodos para facilitar uma ou mais outras etapas de processamento associadas à preparação de uma composição celular modificada, tal como uma ou mais de seleção ou modulação, ativação e/ou estimulação de células. Os métodos podem incluir etapas de processamento celular adicionais, tal como lavagem, isolamento, separação, formulação celular ou outras etapas relacionadas à produção de uma composição celular.
[00505] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usados para introduzir partículas de vetor viral, tais como partículas de vetor retroviral, em células, tais células imunes, incluindo células T. Em algumas modalidades, as partículas de vetor viral têm um genoma que contém um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou receptor de célula T transgênlco (TCR). Portanto, em algumas modalidades, os métodos fornecidos podem ser utilizados para a expressão em células imunes, taos como células T, um receptor de antígeno geneticamente modificado, tal como um TCR transgênico ou um CAR. Também são fornecidas células transduzidas por tais partículas e métodos e composições que contêm tais células, e métodos para usá-los.
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[00506] Em algumas modalidades, as partículas e métodos de vetor retroviral incluem características que resultam em uma maior transdução de células imunes e/ou certas populações e/ou subpopulações das mesmas, desejáveis para uso em imunoterapia adotiva. Em algumas modalidades dos métodos de transdução fornecidos e partículas de vetor viral, as células, por exemplo, células T, nas populações sendo transduzidas não são ou não precisam ser estimuladas e/ou ativadas antes e/ou em conjunto com o contato ou incubação das células com a partícula de vetor retroviral fornecida.
a. Incubação das Células com Partículas de Vetor Viral
[00507] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem os métodos de transdução de células entrando em contato, por exemplo, incubando, uma composição celular que compreende uma pluralidade de células (a seguir também denominada composição de entrada) com um (1) um reagente de proteína oligomérico (por exemplo, muteína de estreptavidina), tal como um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes e (2) uma partícula viral. Em algumas modalidades, o método envolve misturar as células com o reagente e com as partículas virais simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, o método envolve a pré-mistura das partículas virais e o reagente juntamente e em seguida contactando a composição celular com a mistura de partículas virais associadas ao reagente. Em algumas modalidades, o contato é de 30 minutos a 72 horas, tais como 30 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas ou 1 hora a 24 horas, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas ou mais.
[00508] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, (i) a incubação inclui misturar as células-alvo com o reagente e/ou misturar as células-alvo com a partícula viral, sequenci
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283/378 almente, em qualquer ordem, opcionalmente, em que a mistura em (a) e a mistura em (b) são realizadas dentro de um período não superior a 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas ou 72 horas e/ou a mistura em (a) é realizada a não mais de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 48 horas de intervalo à parte da mistura em (b); (ii) a Incubação inclui a mistura das células-alvo, o reagente e a partícula viral, a referida mistura realizada simultaneamente ou substancialmente simultaneamente; (iii) a incubação inclui misturar uma composição que contém as células-alvo e as partículas virais, e não inclui o reagente, opcionalmente em que: não mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou 40 % das célulasalvo na composição, incluindo as células-alvo e o reagente, são células ativadas, expressam um marcador de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40, CD40L e 4-1 BB; inclui expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFNgama, TNF-alfa e/ou é capaz de proliferar; e/ou a mistura é realizada no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 48 horas após uma mistura das células-alvo e das partículas virais na composição; (iv) a incubação inclui misturar uma composição que contém as células-alvo e o reagente, e não inclui a partícula viral, com a partícula viral, opcionalmente em que: não mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou 40 % das células-alvo na composição, incluindo as células-alvo e as células ativadas por reagente, expressam um marcador de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-DR, CD25, CD25, CD69, CD71, CD40L e 4-1 BB; incluindo expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFNgama,
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TNF-alfa e/ou é capaz de proliferar; e/ou a mistura é realizada no máximo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 48 horas após uma mistura das células-alvo e das partículas virais na composição; e/ou (v) a incubação inclui misturar uma composição incluindo as partículas virais e o reagente com uma composição que contém as células-alvo e não a partícula viral e/ou não o reagente, opcionalmente em que: não mais que 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou 40 % das células-alvo na composição, incluindo as células-alvo e o reagente, são células ativadas que expressam um marcador de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L e 4 -1BB; inclui expressão intracelular de uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IFNgama, TNFalfa e/ou é capaz de proliferar.
[00509] Em algumas modalidades, a incubação inclui a mistura da célula com o reagente e com a partícula viral, simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, durante pelo menos uma porção da incubação, o reagente e a partícula viral estão na presença de ou em contato com a célula simultaneamente.
[00510] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem (a) contactar de uma partícula viral com um reagente de proteína oligomérico, gerando assim uma composição incluindo partículas virais e o reagente, em que as partículas virais estão opcionalmente associadas ao reagente; e (b) incubar a composição em (a) com uma pluralidade de células incluindo células-alvo, em que o método produz uma composição de saída incluindo uma ou mais células transduzidas com a partícula viral.
[00511] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a mistura de uma composição contendo partículas virais e um reagente de proteína oligomérico com uma pluralidade de células incluin
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285/378 do células-alvo, em que o método produz uma composição de saída incluindo uma ou mais células transduzidas com a partícula viral.
[00512] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem (a) contactar uma partícula viral com um reagente de proteína oligomérico, incluindo uma estreptavidina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo de qualquer um dos anteriores, e/ou várias subunidades de qualquer um dos anteriores, gerando assim uma composição incluindo partículas virais e o reagente, em que as partículas virais estão opcionalmente associadas ao reagente; e (b) incubar a composição em (a) com uma pluralidade de células, em que o método produz uma composição de saída incluindo uma ou mais células transduzidas com a partícula viral.
[00513] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a mistura de uma composição contendo partículas virais e um reagente de proteína com uma pluralidade de células, incluindo célulasalvo, em que: o reagente de proteína inclui uma estreptavidina, uma avidina, um análogo de estreptavidina ou muteína, um análogo de avidina, uma muteína ou um fragmento biologicamente ativo de qualquer um dos anteriores, e/ou várias subunidades de qualquer um dos anteriores; e o método produz uma composição de saída incluindo uma ou mais células transduzidas com a partícula viral. Em algumas modalidades, o reagente e/ou cada uma das unidades monoméricas e/ou cada uma das unidades multiméricas, tem uma carga positiva líquida ou uma carga positiva geral.
[00514] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem incubar uma pluralidade de células, incluindo células-alvo com: 1) um reagente de proteína oligomérico, incluindo uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar reversivelmente a um agente de ligação, em que um ou mais sítios de ligação são reversivelmente ligados ao agente de ligação; e 2) uma partícula viral, em que pelo menos uma
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286/378 porção da incubação em (1) ocorre simultaneamente com (2) e em que o método produz uma composição de saída incluindo uma ou mais células transduzidas com a partícula viral.
[00515] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem (1) entrar em contato (a) com uma composição que inclui uma ou mais partículas virais e (b) um agente de ligação que é um agente de ligação viral que (i) é capaz de se ligar especificamente a uma molécula sobre a superfície da partícula viral e ii) é reversivelmente ligado a um reagente incluindo uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar reversivelmente ao agente de ligação viral; e (2) incubar pelo menos uma pluralidade de células, incluindo células-alvo na presença de uma ou mais partículas virais, em que o contato em (1) e a incubação em (2) são realizados simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem, em que o método gera uma composição de saída incluindo uma pluralidade de células transduzidas com a partícula viral.
[00516] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o contato em (1) e a incubação em (2) são realizados dentro de um período não superior a 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas ou 72 horas e/ou a mistura em (a) é realizada a não mais de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 48 horas à parte da incubação em (b). Em algumas modalidades, a partícula de vetor viral compreende um genoma que codifica um receptor de antígeno recombinante, opcionalmente um receptor de antígeno quimérico.
[00517] A composição que contém as partículas e células de vetor viral durante a etapa de transdução pode incluir ainda um ou mais agentes adicionais, tais como os que promovem a eficiência da transdução, tais como policátions incluindo protamina (por exemplo, sulfato
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287/378 de protamina), brometo de hexadimetrina (POLYBRENE®, Abbott Laboratories Corp) e CH-296 (RETRONECTIN®, Clontech). Em algumas modalidades, o policátion pode estar presente na composição de entrada em uma concentração final de 1 pg/mL a 100 pg/mL, tais como 5 pg/mL a 50 pg/mL. A composição também pode incluir meios, incluindo o meio de cultura de células, incluindo o meio projetado para a cultura do tipo de célula a ser processado, tal como o meio de célulastronco hematopoiéticas, por exemplo, meio livre de soro.
[00518] Em algumas modalidades, a concentração de células da composição de entrada é de cerca de 1,0 x 105 células/mL a 1,0 x 108 células/mL, tal como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 1,0 x 105 células/mL, 5 x 105 células/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL ou 1 x 108 células/mL.
[00519] Em algumas modalidades, as partículas virais são fornecidas em uma certa relação de cópias das partículas de vetor viral ou unidades infecciosas (UI) das mesmas, por número total de células (Ul/célula) na composição de entrada ou número total de células a ser transduzidas. Por exemplo, em algumas modalidades, as partículas virais estão presentes durante o contato em ou sobre ou pelo menos em ou a cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 UI das partículas do vetor viral por uma das células.
[00520] Em algumas modalidades, o título de partículas de vetor viral está entre ou entre cerca de 1 x 106 UI/mL e 1 x 108 UI/mL, tal como entre ou entre cerca de 5 x 106 UI/mL e 5 x 107 UI/mL, tal como pelo menos 6x10® UI/mL, 7 x10s UI/mL, 8 x 106 UI/mL, 9 x 106 UI/mL, 1 x 107 UI/mL, 2 x 107 UI/mL, 3 x 107 UI/mL, 4 x 107 UI/mL ou 5 x 107 UI/mL.
[00521] Em algumas modalidades, a transdução pode ser alcançada em uma multiplicidade de infecção (MOI) inferior a 100, tal como
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288/378 geralmente inferior a 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou menos.
[00522] Em algumas modalidades, o contato é realizado em solução, tal como o uso de um reagente de proteína oligomérico solúvel (por exemplo, muteína de estreptavidina) ou reagente de multimerizaçâo e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, as células, reagente oligomérico e partículas virais são contactadas em um volume de ou de cerca de 0,5 mL a 500 mL, tal como de ou de cerca de 0,5 mL a 200 mL, 0,5 mL a 100 mL, 0,5 mL a 50 mL, 0,5 mL a 10 mL, 0,5 mL a 5 mL, 5 mL a 500 mL, 5 mL a 200 mL, 5 mL a 100 mL, 5 mL a 50 mL, 5 mL a 10 mL, 10 mL a 500 mL, 10 mL a 200 mL, 10 mL a 100 mL, 10 mL a 50 mL, 50 mL a 500 mL, 50 mL a 200 mL, 50 mL a 100 mL, 100 mL a 500 mL, 100 mL a 200 mL ou 200 mL a 500 mL.
[00523] Em algumas modalidades, quando o contato é realizado em solução, por exemplo, utilizando um reagente de proteína oligomérico solúvel (por exemplo, muteína de estreptavidina), o contato pode ser realizado no qual pelo menos uma porção do contato é com centrifugação, tal como espinoculação (por exemplo, inoculação centrífuga). Em algumas modalidades, a composição contendo células, partículas virais e reagente pode ser girada, geralmente em força ou velocidade relativamente baixa, tal como velocidade menor que a usada para peletizar as células, tal como de ou de cerca de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas modalidades, a rotação é realizada a uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de ou de cerca de 100 g a 3200 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos em ou cerca de 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), medidos por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade. O termo força centrífuga relativa ou RCF é geralmente entendida como a força efetiva transmiti
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289/378 da a um objeto ou substância (tal como uma célula, amostra ou pélete e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente sendo girado), em relação à força gravitacional da terra, em um ponto particular do espaço em comparação com o eixo de rotação. O valor pode ser determinado usando fórmulas conhecidas, levando em consideração a força gravitacional, a velocidade de rotação e o raio de rotação (distância do eixo de rotação e o objeto, substância ou partícula na qual a RCF está sendo medida).
[00524] Em algumas modalidades, o reagente oligomérico, tal como reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, não está ligado a um suporte, tal como não ligado a uma superfície sólida ou fase estacionária.
[00525] Em algumas modalidades, o reagente oligomérico, tal como reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, é imobilizado em um suporte, tal como uma superfície sólida ou fase estacionária. Em algumas modalidades, o contato é realizado em uma fase estacionária, tal como o uso de uma matriz de cromatografia na qual é imobilizada na proteína (muteína de estreptavidina), tal como um reagente de proteína oligomérico (por exemplo, muteína de estreptavidina). Exemplos de tais formatos para uso em conexão com os métodos fornecidos são descritos aqui. Assim, em algumas modalidades, uma transdução na coluna pode ser realizada de acordo com os métodos fornecidos.
[00526] Em algumas modalidades, a composição de entrada que é contactada com as células compreende células ativadas. Em algumas modalidades, pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais das células, por exemplo, células T, na composição de entrada são ativadas, tal como, em alguns casos, são positivas para a superfície para um ou mais HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L e/ou 4-1 BB. Em algumas modalidades, as células são ativadas com um agente ati
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290/378 vador, tal como na presença de antí-CD3/anti-CD28, antes do início do contato, por exemplo, antes do início da transdução. Os métodos de expandir populações de células T in vitro na ausência de fatores de crescimento exógenos ou baixas quantidades de fatores de crescimento exógenos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente US 6.352.694 BI e Patente Européia EP 0 700 430 B1). Em geral, tais métodos empregam superfícies de fase sólida superiores a 1 μΜ nas quais vários agentes de ligação (por exemplo, anticorpo anti-CD3 e/ou anticorpo anti-CD28) são imobilizados. Por exemplo, Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen) são reagentes comercialmente disponíveis para expansão de células T, que são contas de poliestireno não pirogênicas, estéreis, superparamagnéticas de 4,5 pm, uniformes revestidas com uma mistura de anticorpos monoclonais purificados por afinidade contra as moléculas de superfíciede células CD3 e CD28 em células T humanas. Em algumas modalidades, o agente ativador, por exemplo, anti-CD3 e/ou anti-CD28, pode ser imobilizado em esferas, tais como contas magnéticas.
[00527] Em algumas modalidades, a ativação celular também é realizada na presença de IL-2 (por exemplo, de ou de cerca de 50 UI/mL a 200 UI/mL, tal como ou cerca de 100 UI/mL). Em algumas modalidades, a ativação é realizada entre ou entre cerca de 1 hora e 96 horas, 1 hora e 72 horas, 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, tal como pelo menos ou cerca de 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em algumas modalidades, a ativação é realizada a uma temperatura superior ou superior a cerca de 25°C, tal como geralmente superior ou superior a cerca de 32°C, 35°C ou 37°C, por exemplo, em ou cerca de 37°C ± 2°C, tal como a uma temperatura igual ou superior a 37°C.
[00528] Em algumas modalidades, as células não são ativadas com um agente ativador, tal como na presença de anti-CD3/anti-CD28, an
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291/378 tes do início do contato, por exemplo, antes do início da transdução. Em algumas modalidades, a composição de entrada que é contatada com as células compreende uma pluralidade de células em repouso. Em algumas modalidades, pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais das células T na população são células T em repouso, tais como células T que não possuem um marcador de ativação de células T, tal como um marcador de superfície ou citocina intracelular ou outro marcador e/ou células T que estão no estágio Go ou GoGia do ciclo celular.
[00529] Em aspectos particulares, os métodos fornecidos permitem que a transdução ocorra em células T sem a necessidade de ativação antes do contato e/ou incubação com o reagente de proteína oligomérico, tal como reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes. Em algumas modalidades, os métodos incluem a transdução de uma população de células T que contêm células T em repouso ou não tratadas com um vetor viral na presença de um reagente de proteína oligomérico (por exemplo, estreptavidina) de acordo com os métodos fornecidos, sem antes, ou seja, antes da transdução, ativação e/ou estimulação as células T. Em algumas tais modalidades, os métodos fornecidos podem ser usados para preparar células imunes, tais como células T, para terapia adotiva, que não incluem uma etapa de ativação e/ou estimulação de células T.
[00530] Em algumas modalidades, a proteína oligomérica (por exemplo, muteína de estreptavidina) está nua.
[00531] Em algumas modalidades, a proteína oligomérica (por exemplo, muteína de estreptavidina) é um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que se ligaram a um ou mais agentes de ligação capazes de se ligar a uma molécula sobre a superfície das células-alvo (por exemplo,
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292/378 células T) ou, em alguns casos, na superfície das partículas virais na composição. Em algumas modalidades, o agente de ligação é ligado reversivelmente a um reagente contendo uma pluralidade de sítios de ligação capazes de se ligar reversivelmente ao agente. Em algumas modalidades, a incubação é realizada sob condições nas quais o agente se liga, tal como se liga especificamente, à molécula na célula ou partícula viral. Em algumas modalidades como descrito, o reagente oligomérico imobilizou reversivelmente sobre ele (ligado a ele) um agente ou agentes (por exemplo, primeiro ou segundo ou terceiro, etc.), que podem incluir a ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador ou agentes acessórios, agente de seleção ou agentes de ligação viral, que podem ser utilizados para a seleção, estimulação, expansão e/ou diferenciação de células ou modulação da transdução de células.
[00532] Em alguns casos, para certos agentes de ligação ao receptor (por exemplo, agentes estimuladores ou agentes acessórios), tal ligação pode induzir ou modular um sinal nas células-alvo (por exemplo, células T) nas composições, tal como um sinal primário ou sinal acessório como descrito. Em algumas modalidades, a ligação do agente à molécula resulta em uma ou mais da estimulação, ativação, expansão (proliferação) e/ou diferenciação de células-alvo na composição. Em algumas modalidades, o reagente compreende um agente estimulador que fornece um sinal de ativação primário às células, em que o agente estimulador compreende pelo menos um par de ligação C (por exemplo, C1, C2 ou 03, etc), em que o par de ligação C é capaz de se ligar reversivelmente ao sítio de ligação Z1 do reagente oligomérico para ligação reversível do agente. Em algumas modalidades, o reagente compreende um agente acessório que fornece um sinal acessório às células, em que o agente acessório compreende pelo menos um par de ligação C (por exemplo, 01, C2 ou C3, etc), em que
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293/378 o par de ligação C é capaz de se ligar reversivelmente ao sítio de ligação Z1 do reagente oligomérico para ligação reversível do agente. Em algumas modalidades, o reagente compreende um agente de seleção que direciona especificamente a ligação a uma molécula ou marcador de superfície celular específico, em que o agente de seleção compreende pelo menos um par de ligação C (por exemplo, C1, C2 ou C3, etc), em que o par de ligação C é capaz de se ligar reversivelmente ao sítio de ligação Z1 do reagente oligomérico, para se ligar reversivelmente ao agente.
[00533] Em algumas modalidades, a ativação das células na composição de entrada é iniciada durante o contato das células da composição de entrada com o reagente de proteína oligomérico e/ou partícula viral. Em tais casos, o reagente de proteína oligomérico pode ter imobilizado nele um agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador e/ou agente acessório, capaz de induzir ou modular um sinal nas células, tais como as células T. Em algumas modalidades, o agente estimulador compreende um complexo MHC Lpeptídeo ou porção funcional do mesmo, um complexo MHCILpeptídeo ou porção funcional do mesmo e/ou é capaz de fornecer um sinal estimulador através de um complexo TCR/CD3 em uma célula T, um complexo contendo CD3 em uma célula T e/ou uma molécula contendo ITAM em uma célula T. Em algumas modalidades, o reagente oligomérico pode ter imobilizado sobre ele um agente acessório capaz de fornecer um sinal acessório para as células, tais como as células T. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao receptor, por exemplo, agente estimulador e/ou agente acessório, é qualquer agente como aqui descrito, tal como anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28 (por exemplo, Fabs). Alternativamente, também é possível usar como agente estimulador um ligante, tal como um ligante natural, de um receptor que aciona a expansão celular. Por exemplo, o domínio extracelular de CD19 pode
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294/378 ser usado para causar a ativação de cascatas de sinalização intracelular de células transduzidas para expressar o receptor de antígeno de ligação a CD19 quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o reagente de proteína oligomérico (por exemplo, estreptavidina) é capaz de modular a transdução celular e ativar, tal como estimular células, durante o contato e, opcionalmente, a outra incubação. Em algumas modalidades, a ligação do reagente oligomérico compreendendo o agente estimulador é reversível, tal como na presença de um agente de competição, por exemplo, biotina.
[00534] Em algumas modalidades, o método fornecido pode ser usado para induzir seletivamente a transdução e/ou expansão ex vivo de uma população específica de células, tais como células B, células T ou células exterminadoras naturais. Em algumas modalidades, o reagente de proteína oligomérico (por exemplo, muteína de estreptavidina) é um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que podem incluir pelo menos um agente de seleção ligado reversivelmente ao mesmo reagente usado para modular a transdução. Em algumas modalidades, o reagente oligomérico (por exemplo, muteína de estreptavidina) é um reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes que podem conter o agente de seleção e um ou ambos os primeiro ou segundo agentes de ligação ao receptor (por exemplo, agente estimulador ou agente acessório) no mesmo reagente. Em algumas modalidades, o reagente de proteína oligomérico (por exemplo, estreptavidina), tal como reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, é capaz de modular a transdução celular e preferivelmente direcionar a transdução para uma subpopulação específica de células-alvo. Em algumas modalidades, o reagente de proteína oligomérico (por exemplo, estreptavidina), tal como reagente de multimerização e/ou
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295/378 um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes, é capaz de modular a transdução celular, tal como preferivelmente direcionar a transdução para uma subpopulação particular de células direcionadas ou selecionadas, e ativar, tal como estimular células, durante o contato e, opcionalmente, a incubação adicional.
[00535] Em algumas modalidades, a ligação do reagente oligomérico compreendendo os agentes de ligação, por exemplo, agente de seleção e/ou agente estimulador, é reversível, como na presença de um agente de competição, por exemplo, biotina. Como descrito abaixo, em alguns aspectos, o método inclui adicionar ou incubar a composição contendo células, partículas virais e reagente oligomérico (por exemplo, reagente de multimerização e/ou um reagente de partícula oligomérico ligado a um ou mais agentes de ligação) com uma substância de competição para reverter, dissociar ou interromper a ligação de um ou mais agentes de ligação à célula ou às partículas virais. Em algumas modalidades, após a reversão, dissociação ou interrupção, um ou mais componentes da composição podem ser removidos, tal como o reagente oligomérico dissociado, um ou mais agentes de ligação e/ou a substância de competição.
[00536] Em algumas modalidades, as células produzidas a partir do método fornecido (em seguida também chamado de composição de saída ou composição incubada) incluem aquelas transduzidas com o vetor viral, como um vetor viral contendo nucleotídeos que codificam uma proteína heteróloga, como um receptor recombinante, por exemplo, um CAR. Por heterólogo, neste contexto, refere-se a uma proteína que normalmente não é expressa a partir de um vírus e/ou não é codificada por um genoma viral. Em algumas modalidades, a integração de um vetor viral em um genoma hospedeiro pode ser avaliada medindo o nível de expressão de uma proteína recombinante, tal como uma proteína heteróloga, codificada por um ácido nucleico contido no genoma
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296/378 da partícula de vetor viral após a incubação. Um número de métodos bem conhecidos para avaliar o nível de expressão de moléculas recombinantes pode ser utilizado, como detecção por métodos baseados em afinidade, por exemplo, métodos baseados em imunoafinidade, por exemplo, no contexto de proteínas da superfície celular, como por citometria de fluxo. Em alguns exemplos, a expressão é medida pela detecção de um marcador de transdução e/ou construção repórter. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma proteína de superfície truncada é incluído no vetor e usado como um marcador de expressão e/ou realce do mesmo.
V, COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
[00537] Também são fornecidas composições contendo o receptor modificado (por exemplo, receptor de antígeno modificado), como CAR ou TCR, e composições contendo as células modificadas, incluindo composições e formulações farmacêuticas. Também são fornecidos métodos de uso e usos das composições, como no tratamento de doenças, condições e distúrbios nos quais o antígeno é expresso, ou nos métodos de detecção, diagnóstico e prognóstico.
A. Composições/Formulações
[00538] O termo formulação farmacêutica refere-se a uma preparação que é de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo nele contido seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual o formulação seria administrada.
[00539] Um veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingrediente ativo, que não seja tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, porém, não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.
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[00540] Em alguns aspectos, a escolha do veículo é determinada em parte pela célula particular e/ou pelo método de administração. Por conseguinte, existe uma variedade de formulações adequadas. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propllparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais conservantes. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001 % a cerca de 2 % em peso da composição total. Os veículos são descritos, por exemplo, pela Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, porém, não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como pollvinilplrrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tal como polietilenoglicol (PEG).
[00541] Agentes de tamponamento em alguns aspectos estão inclu
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298/378 idos nas composições. Os agentes de tamponamento adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento é usada. O agente de tamponamento ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001 % a cerca de 4 % em peso da composição total. Métodos para preparar composições farmacêuticas administráveis são conhecidos. Métodos exemplares são descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
[00542] A formulação ou composição também pode conter mais de um ingrediente ativo útil para a indicação particular, doença ou condição a ser tratada com as células, preferivelmente aquelas com atividades complementares à célula, onde as atividades respectivas não se afetam adversamente. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda outros agentes ou fármacos farmaceuticamente ativos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximabe, vinitubebe, vincristina, etc. Em algumas modalidades, as células ou anticorpos são administrados na forma de um sal, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem aqueles derivados de ácidos minerais, como ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúrico e ácidos orgânicos, tais como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, lático, fumárico, benzoico, glicólico, glicônico, succínico e arilsulfônico, por exemplo, ácido p-toiuePetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 335/524
299/378 nossulfônico.
[00543] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsulas, em sistemas de administração de fármacos coloidais (por exemplo, Hpossomas, microesferas de aibumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é formulada como um complexo de inclusão, como um complexo de inclusão de ciclodextrina ou como um llpossoma. Os Hpossomas podem servir para direcionar as células hospedeiras (por exemplo, células T ou células NK) para um tecido específico. Muitos métodos estão disponíveis para a preparação de lipossomos, tais como os descritos em, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), e Patentes U.S. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 5.019.369.
[00544] A composição farmacêutica em alguns aspectos pode empregar sistemas de distribuição liberada no tempo, de liberação retardada e de liberação prolongada de modo que a distribuição da composição ocorra antes e com tempo suficiente para causar a sensibilização do sítio a ser tratado. Muitos tipos de sistemas de distribuição de liberação estão disponíveis e conhecidos. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas da composição, aumentando assim a conveniência ao indivíduo e ao médico.
[00545] A composição farmacêutica em algumas modalidades contém células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, tal como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada por avaliação periódica dos indivíduos tratados. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis e podem ser determinados. A dosa
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300/378 gem desejada pode ser distribuída por uma administração em bolo única da composição, por múltiplas administrações em bolo da composição ou por administração de infusão contínua da composição.
[00546] As células podem ser administradas usando técnicas de administração padrão, formulações e/ou dispositivos. São fornecidas formulações e dispositivos, tais como seringas e frasconetes, para armazenamento e administração das composições. A administração das células pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, as células ou progenitores imunorresponsivos podem ser obtidos de um indivíduo e administrados ao mesmo indivíduo ou a um indivíduo compatível diferente. As células imunorresponsivas derivadas de sangue periférico ou sua progênie (por exemplo, derivada in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser administradas por injeção localizada, incluindo a administração de cateter, injeção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa ou administração parentérica. Ao administrar uma composição terapêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma célula imunorresponsiva geneticamente modificada), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão).
[00547] As formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório. Em algumas modalidades, as populações celulares são administradas parentericamente. O termo parenteral, quando aqui usado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as populações de células são administradas a um indivíduo usando distribuição sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.
[00548] As composições em algumas modalidades são fornecidas como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas
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301/378 isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões ou composições viscosas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas para um pH selecionado. As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de preparar do que os géis, outras composições viscosas e composições sólidas. Além disso, as composições líquidas são um pouco mais convenientes para administrar, especialmente por injeção. As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de viscosidade apropriada para fornecer períodos de contato mais longos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender veículos, que podem ser um solvente ou meio dispersante contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e suas misturas adequadas.
[00549] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando as células em um solvente, tal como em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado, tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições também podem ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares, como agentes umectantes, dispersantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes de tamponamento de pH, aditivos de realce de gelificação ou viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, cores e similares, dependendo da rotina de administração e da preparação desejada. Em alguns aspectos, os textos padrão podem ser consultados para preparar as preparações adequadas.
[00550] Vários aditivos que realçam a estabilidade e esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelaçâo e tampões, podem ser adicionados. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo
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302/378 robutanol, fenol, ácido sórbico e similares. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00551] Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[00552] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. B. Métodos de Administração
[00553] São fornecidos métodos de administração de células, populações e composições, e usos de tais células, populações e composições para tratar ou prevenir doenças, condições e distúrbios, incluindo cânceres. Em algumas modalidades, as células, populações e composições são administradas a um indivíduo ou paciente com a doença ou condição particular a ser tratada, por exemplo, através de terapia celular adotiva, como terapia de célula T adotiva. Em algumas modalidades, células e composições preparadas pelos métodos fornecidos, como composições modificadas e composições de final de produção após a incubação e/ou outras etapas de processamento, são administradas a um indivíduo, como um indivíduo com ou em risco de doença ou condição. Em alguns aspectos, os métodos, desse modo, tratam, por exemplo, melhoram um ou mais sintomas da doença ou condição, tal como diminuindo a carga do tumor em um câncer que expressa um antígeno reconhecido por uma célula T modificada.
[00554] Os métodos para administração de células para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser utilizados em conexão com
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303/378 os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, os métodos de terapia de células T adotiva são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US No. 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente US No. 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Veja, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnoi. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
[00555] Quando aqui usado, um indivíduo é um mamífero, como um humano ou outro animal, e tipicamente é humano. Em algumas modalidades, o indivíduo, por exemplo, paciente, ao qual as células, populações de células ou composições são administradas é um mamífero, tipicamente um primata, como um humano. Em algumas modalidades, o primata é um macaco ou um símio. O indivíduo pode ser homem ou mulher e pode ter qualquer idade adequada, incluindo indivíduos infantis, juvenis, adolescentes, adultos e geriátricos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não primata, como um roedor.
[00556] Quando aqui usado, tratamento (e variações gramaticais do mesmo tal como tratar ou tratando) refere-se à melhoria ou redução completa ou parcial de uma doença ou condição ou distúrbio, ou um sintoma, efeito adverso ou resultado, ou fenótipo associado a ele. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, porém, não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metastases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico melhorado. Os termos não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação completa de qualquer sintoma ou efeito(s) em todos os sintomas ou resultados.
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[00557] Quando aqui usado, atrasar o desenvolvimento de uma doença significa adiar, impedir, reduzir, retardar, estabilizar, suprimir e/ou adiar o desenvolvimento da doença (tal como o câncer). Esse atraso pode durar vários períodos de tempo, dependendo da história da doença e/ou indivíduo a ser tratado.Como é evidente para um especialista na técnica, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medida em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, como o desenvolvimento de metastases, pode demorar.
[00558] Prevenção, quando aqui usado, inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, as células e composições fornecidas são usadas para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.
[00559] Quando aqui usado, suprimir uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade em comparação com as mesmas condições, exceto por uma condição ou parâmetro de interesse, ou altemativamente, em comparação com outra condição. Por exemplo, as células que suprimem o crescimento do tumor reduzem a taxa de crescimento do tumor em comparação com a taxa de crescimento do tumor na ausência das células.
[00560] Uma quantidade eficaz de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, células ou composição, no contexto da administração, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens/quantidades e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado desejado, tal como um resultado terapêutico ou profilático.
[00561] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica ou células, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo neces
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305/378 sários, para alcançar um resultado terapêutico desejado, como para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio e/ou efeito farmacocinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e as populações de células administradas. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a administração de células e/ou composições em quantidades efetivas, por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes.
[00562] Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[00563] A doença ou condição que é tratada pode ser qualquer uma na qual a expressão de um antígeno está associada e/ou envolvida na etiologia de uma condição ou distúrbio de doença, por exemplo, causa, exacerba ou de outra forma está envolvida em tal doença, condição ou distúrbio. Doenças e condições exemplares podem incluir doenças ou condições associadas a malignidade ou transformação de células (por exemplo, câncer), doença autoimune ou inflamatória ou uma doença infecciosa, por exemplo, causada por um patógeno bacteriano, viral ou outro. Antígenos exemplares, que incluem antígenos associados a várias doenças e condições que podem ser tratadas, são descritos acima. Em modalidades particulares, o receptor de antígeno quimérico ou TCR transgênico se liga especificamente a um antígeno associado à doença ou condição.
[00564] Assim, os métodos e usos fornecidos incluem métodos e usos para terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, os méto
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306/378 dos incluem a administração das células ou uma composição que contém as células a um indivíduo, tecido ou célula, como uma pessoa com risco ou suspeita de ter a doença, condição ou distúrbio. Em algumas modalidades, as células, populações e composições são administradas a um indivíduo com a doença ou condição específica a ser tratada, por exemplo, através de terapia celular adotiva, como terapia de célula T adotiva. Em algumas modalidades, as células ou composições são administradas ao indivíduo, como um indivíduo com ou em risco para a doença ou condição, para melhorar um ou mais sintomas da doença ou condição.
[00565] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia de célula T adotiva, é realizada por transferência autóloga, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir do indivíduo que deve receber a terapia celular ou de um amostra derivada de tal indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células são derivadas de um indivíduo, por exemplo, paciente, necessitando de um tratamento e as células, após isolamento e processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.
[00566] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia de célula T adotiva, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir de um indivíduo que não seja um indivíduo que deve receber ou que finalmente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são, então, administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo, da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo Indivíduos são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe ou supertipo HLA que o primeiro indivíduo. As células podem ser administradas por
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307/378 qualquer meio adequado. Dosagem e administração podem depender em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluem, porém, não estão limitados a, administrações únicas ou múltiplas em vários momentos, administração por bolo e infusão de pulsos.
[00567] Em certas modalidades, as células, ou populações individuais de subtipos de células, são administradas ao indivíduo a uma faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células e/ou essa quantidade de células por quilograma de peso corporal, como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou uma faixa definida por dois dos valores anteriores), como cerca de 10 a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células ou uma faixa definida por dois dos valores anteriores) e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer vaior entre estas faixas e/ou por quilograma de peso corporal. Novamente, as dosagens podem variar dependendo dos atributos
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308/378 particulares da doença ou distúrbio e/ou paciente e/ou outros tratamentos. Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento combinado, como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção terapêutica, como um anticorpo ou célula ou receptor ou agente modificado, como um agente citotóxico ou terapêutico. As células em algumas modalidades são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou em conexão com outra intervenção terapêutica, simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia suficientemente próxima no tempo, de modo que as populações celulares aumentam o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes adicionais inclui uma citocina, como IL-2, por exemplo, para realçar a persistência. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de um agente quimioterapêutico.
[00568] Após a administração das células, a atividade biológica das populações de células modificadas em algumas modalidades é medida, por exemplo, por qualquer um de vários métodos conhecidos. Os parâmetros para avaliar incluem a ligação especifica de uma célula T modificada ou natural ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imagem ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células modificadas para destruir as células-alvo pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica, como ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) e Herman et al. J. Immunological Methods,
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285(1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células é medida testando a expressão e/ou secreção de uma ou mais citocinas, como CD 107a, IFNy, IL-2 e TNF. Em alguns aspectos, a atividade biológica é medida pela avaliação do resultado clínico, como redução na carga(burden) ou carga(load) do tumor.
[00569] Em certas modalidades, as células modificadas são ainda modificadas de várias maneiras, de modo que sua eficácia terapêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR ou TCR modificado expresso pela população pode ser conjugado direta ou indiretamente através de um ligante a uma fração de direcionamento. A prática de conjugar compostos, por exemplo, o CAR ou TCR, para direcionar as porções é conhecida na técnica. Veja, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3:1 1 1 (1995) e Patente U.S. 5.087.616.
VI. DEFINIÇÕES
[00570] Quando aqui usado, as formas singulares um, uma e a/o incluem referentes plurais, a menos que o contexto Indique claramente o contrário. Por exemplo, um ou uma significa pelo menos um ou um ou mais. Entende-se que aspectos e variações aqui descritos Incluem consistindo e/ou consistindo essencialmente em aspectos e variações.
[00571] Ao longo desta descrição, vários aspectos do assunto reivindicado são apresentados em um formato de faixa. Deve-se entender que a descrição no formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da matéria objeto reivindicada. Por conseguinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especiflcamente todas as subfalxas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro desta faixa. Por exemplo, onde uma faixa de de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite superior e inferior deste intervalo e qualquer outro valor decla
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310/378 rado ou interveniente neste intervalo declarado, é abrangido pela matéria objeto reivindicada. Os limites superior e inferior destes intervalos menores podem ser incluídos independentemente nos intervalos menores e também estão incluídos na matéria objeto reivindicada, indivíduos a qualquer limite excluído especificamente na faixa indicada. Onde a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídas na matéria objeto reivindicada. Isso se aplica índependentemente da amplitude da faixa.
[00572] O termo cerca de, quando aqui usado, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo especialista nesta campo técnico. A referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a cerca de X inclui a descrição de X. Em modalidades particulares, cerca de é ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, ±0,01 % ou ±0,001 %.
[00573] Quando aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mesmos.
[00574] Quando aqui usado, enriquecer ao se referir a um ou mais tipos de células ou populações de células em particular, refere-se ao aumento do número ou porcentagem do tipo ou população de células, por exemplo, em comparação ao número total de células ou volume de células da composição, ou em relação a outros tipos de células, como por seleção positiva com base em marcadores expressos pela população ou célula, ou por seleção negativa com base em um marcador não presente na população de células ou célula a ser esgotada. O termo não requer remoção completa de outras células, tipo de célula ou po
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311/378 pulações da composição e não requer que as células tão enriquecidas estejam presentes em ou mesmo próximo a 100 % na composição enriquecida.
[00575] Quando aqui usado, uma declaração de que uma célula ou população de células é positiva para um marcador particular referese à presença detectável em ou na célula de um marcador particular, normalmente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à presença de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e peia detecção do referido anticorpo, em que a coloração é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada realizando o mesmo procedimento com um controle pareado por isótipo sob condições de outra maneira idênticas e/ou em um nível substancialmente similar ao da célula conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais alto do que para uma célula conhecida como negativa para o marcador.
[00576] Quando aqui usado, uma declaração de que uma célula ou população de células é negativa para um marcador específico referese à ausência de presença detectável substancial sobre ou na célula de um marcador específico, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à ausência de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a coloração não é detectada pela citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada realizando o mesmo procedimento com um controle pareado por Isótipo sob condições de outra maneira idênticas, e/ou em um nível substancialmente mais baixo do que o da célula conhecida como positiva para o marcador e/ou
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312/378 em um nível substancialmente similar ao de uma célula conhecida como negativa para o marcador.
[00577] O termo expressão, quando aqui usado, refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de codificação de uma molécula de ácido nucleico, tal como um gene. O processo pode incluir transcrição, controle pós-transcricional, modificação pós-transcricional, translação, controle pós-translação, modificação pós-translação ou qualquer combinação dos mesmos.
[00578] Quando aqui usado, um indivíduo inclui qualquer organismo vivo, tais como seres humanos e outros mamíferos. Os mamíferos incluem, porém, não estão limitados a, seres humanos e animais não humanos, incluindo animais de fazenda, animais esportivos, roedores e animais de estimação.
[00579] Quando aqui usado, um controle refere-se a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, exceto que não é tratada com um parâmetro de teste ou, se for uma amostra de plasma, pode ser de um voluntário normal, não afetado com a condição de interesse. Um controle também pode ser um controle interno.
VII. MODALIDADES EXEMPLARES
[00580] Entre as modalidades fornecidas, estão:
1. Um reagente de partícula oligomérico compreendendo uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, em que o tamanho do reagente de partícula oligomérico compreende i) um raio superior a 25 nm; ii) um peso molecular de pelo menos 5 x 106 g/mol; e/ou (iii) pelo menos 100 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico.
2. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 1, em que as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina se ligam ou são capazes de se ligar à biotina, avidina, um análogo de bio
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313/378 tina ou muteína, um análogo de avidina ou muteína e/ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos, ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
3. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 2, em que as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina se ligam reversivelmente a ou são capazes de se ligar reversivelmente à biotina, avidina, um análogo de biotina ou muteína, um análogo de avidina ou muteína e/ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos, ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
4. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-3, em que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina, em que as moléculas de muteína de estreptavidina compreendem a sequência de aminoácido Val44-Thr45~Ala45~Arg47 ou lle44-Gly45-Ala46-Arg47 em posições de sequência correspondentes às posições 44 a 47 com referência às posições em estreptavidina na sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 1.
5. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-4, em que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem:
a) a sequência de aminoácidos mencionada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61;
b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61 e contém a sequência de aminoácido correspondente a Val44-Thr45-Ala46Arg47 ou lle44-Gly45 -Ala46-Arg47 e/ou se ligam reversivelmente à biotina ou a uma forma biologicamente ativa dos mesmos, um análogo de bio
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314/378 tina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou
c) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga reversivelmente à biotina ou a uma forma biologicamente ativa do mesmo, um análogo de biotina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
6. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-5, em que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 6 ou 61.
7. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 4-6, em que a molécula de muteína de estreptavidina compreende ainda uma substituição ou substituições de aminoácido em uma posição correspondente a 117, 120 e/ou 121 com referência a posições na estreptavidina na sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 1.
8. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 7, em que:
a substituição ou substituições de aminoácido são selecionadas dentre Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 ou Phe121; ou a substituição ou substituições de aminoácido são selecionadas dentre um ou mais dentre Glu117, Gly120 ou Tyr121; ou as substituições de aminoácido são selecionadas dentre Glu117, Gly120 ou Tyr121.
9. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-8, em que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem:
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a) a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 27 ou 28;
b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28 e contém a sequência de aminoácido correspondente a Vai44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 e Tyr121 e/ou liga-se reversivelmente à bíotina ou a um fragmento biologicamente ativo, um análogo de bíotina ou muteína ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou
c) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga reversivelmente à bíotina ou a um fragmento biologicamente ativo, a um anáiogo de bíotina ou a muteína ou a um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou a um peptídeo de ligação à estreptavidina.
10. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-9, em que o reagente de partícula oligomérico é ligado a ou é capaz de se ligar a um ou mais agentes.
11.0 reagente de partícula oligomérico da modalidade 10, em que o um ou mais agentes compreende um par de ligação, em que o par de ligação é capaz de se ligar, opcionalmente de se ligar reversivelmente a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico.
12. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 11, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
13. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 11 ou 12, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-SerHis-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-PheGlu-Lys (GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-Hls-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID
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NO: 17), Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GiyGlyGlySer)2-Trp-SerHis-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-Hls-Pro-GInPhe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly~Ser-Ala~Trp-Ser~His~Pro~GlnPhe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19).
14. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-13, em que o um ou mais agentes se liga ou é capaz de se ligar a uma molécula expressa sobre a superfície de uma célula-alvo.
15. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-14, em que o um ou mais agentes é ou compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos.
16. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 15, em que o um ou mais reagentes é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
17. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 15 ou modalidade 16, em que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
18. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-17, em que o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
19. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-18, em que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície de uma célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
20. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 18 ou reivindicação 19, em que a célula-alvo é uma célula imune.
21. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma
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317/378 das modalidades 18-20, em que a célula-alvo é uma célula T.
22. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, em que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, se liga a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou se liga especificamente ao CD3.
23. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 22, em que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o reagente de partícula oligomérico compreende um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas célulasalvo.
24. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 23, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
25. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 22 ou modalidade 23, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especlficamente a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
26. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-25, em que o um ou mais agentes é um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, opcionalmente um Fab anti-CD3 e um Fab anti-CD28.
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27. 0 reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, em que o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
28. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, 23 ou 24, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada dentre CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM.
29. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, 23 ou 24, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-1 OR, IFNR Tipo I, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2.
30. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, 23 ou 24, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4.
31. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, 23 ou 24, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocina ou quimiocina e o fator é um ligante que se liga
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319/378 especificamente a um receptor de citocina ou quimiocina.
32. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 31, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-1 OR, IFNR Tipo I, IL-12R, IL-15R, IL17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
33. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 30, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especificamente a um receptor de quimiocina selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CRC9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é selecionado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
34. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 18-21, 23 ou 24, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
35. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 10-34, em que o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é ca
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320/378 paz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
36. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 35, em que a célula-alvo é uma célula imune.
37. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 35 ou modalidade 36, em que a célula-alvo é um linfócito ou uma célula de apresentação de antígeno.
38. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 35-37, em que a célula-alvo é uma célula T, célula B, célula NK, macrófago ou célula dendrítica.
39. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 35-38, em que a célula-alvo é uma célula T.
40. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 35-39, em que o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
41. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-40, em que o reagente de partícula oligomérico compreende um raio superior a 25 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm ou superior de 90 nm.
42. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-41, em que o reagente de partícula oligomérico compreende um raio entre 25 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 115 nm ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive, ou 90 nm ± 15 nm ou 95 nm ± 20-25nm.
43. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-42, em que o reagente de partícula oligomérico tem um raio inferior a 150 nm.
44. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 41-43, em que o raio é um raio hidrodinâmico.
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45. 0 reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-44, em que o reagente de partícula oligomérico compreende um peso molecular de pelo menos 1 x 107 g/mol, pelo menos 5 x 107 g/mol ou pelo menos 1 x 108 g/mol.
46. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-45, em que o reagente de partícula oligomérico compreende um peso molecular entre 1 x 106 g/mol e 1 x 1O10 g/mol, entre 1 x 107 g/mol e 1 x 109 g/mol, entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol.
47. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-46, em que o reagente de partícula oligomérico compreende pelo menos 100 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, pelo menos 500 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, pelo menos 1.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, pelo menos 1.500 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, ou pelo menos 2.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
48. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-47, em que o reagente de partícula oligomérico compreende entre 100 e 50.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, entre 1.000 e 20.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, entre 1.000 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, ou entre 2.000 e 5.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
49. O reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-48, em que a pluralidade de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina compreende resíduos de lisina, em que menos de 20 %, 10 %, 5 %, 1 % dos resíduos de lisina compreendem
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322/378 iminotioiano N-substituído.
50. Uma composição compreendendo um ou mais reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1~49.
51. A composição da modalidade 50, em que o um ou mais reagente de partícula oligomérico é uma pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos.
52. A composição da modalidade 51, em que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende i) um raio médio superior a 70 nm; ii) um peso molecular médio de pelo menos 1 x 108 g/mol; e/ou iii) um número médio de estreptavidina ou tetrâmeros de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico de pelo menos 2.000 e/ou iv) uma distribuição de tamanho de raio em que pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre 10 nm e 150 nm.
53. A composição da modalidade 51 ou 52, em que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio superior a 25 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm ou superior a 100 nm.
54. A composição de qualquer uma das modalidades 51-53, em que:
a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio entre 25 nm e 150 nm, entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 110 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive; ou a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio de 90 nm ± 15 nm, 95 nm ± 20-25 nm ou 97 ± 10 nm.
55. A composição de qualquer uma das modalidades 51-54, em que pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partícula oli
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323/378 goméricos compreendem um raio entre 50 e 150 nm, entre 70 nm e 140 nm, entre 80 nm e 120 nm, entre 80 nm e 115 nm, entre 80 nm e 100 nm, entre 90 nm e 110 nm e/ou entre 100 nm e 120 nm.
56. A composição de qualquer uma das modalidades 51-55, em que pelo menos 95 % dos reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre ± 50 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 % e/ou ± 5 % do raio médio e/ou mediano da pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos.
57. A composição de qualquer uma das modalidades 51-56, em que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreendendo um raio médio dentre 80 nm e 115 nm e em que pelo menos 95 % dos reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre ± 25 % do raio médio.
58. A composição de qualquer uma das modalidades 51-57, em que a pluralidade de partículas compreende um peso molecular médio dentre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou dentre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive.
59. A composição de qualquer uma das modalidades 51-58, em que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um número médio de estreptavidina ou tetrâmeros de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico de pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 1.500 ou pelo menos 2.000.
60. A composição de qualquer uma das modalidades 51-59, em que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um número médio de estreptavidina ou tetrâmeros de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico entre 100 e 50.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 10.000, ou entre 2.000 e 5.000, cada qual inclusive.
61. A composição de qualquer uma das modalidades 51-60,
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324/378 em que o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 25 % ou 10 % quando armazenadas a cerca de ou abaixo de ~80°C, a cerca de ou abaixo de -20°C e/ou a cerca de ou abaixo de 4°C por pelo menos 1,3,9, 27 ou 46 semanas.
62. A composição de qualquer uma das modalidades 51-61, em que o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenadas a cerca de ou abaixo de 4°C por pelo menos uma semana.
63. A composição de qualquer uma das modalidades 61-62, em que o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenadas a cerca de ou abaixo de 4°C por pelo menos 3 semanas.
64. A composição de qualquer uma das reivindicações 5163, em que o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 10 % quando armazenadas a cerca de ou abaixo de 4°C por pelo menos 9 semanas.
65. Método para produzir um reagente de partícula oligomérico compreendendo estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina, o método compreendendo:
incubar uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas ou de muteína de estreptavidina compreendendo um grupo funcional reativo ao tiol capaz de reagir com um grupo funcional tiol e uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas ou de muteína de estreptavidina compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol, gerando assim uma composição de partícula compreendendo as partículas de estreptavidina oligoméricas ou de muteína de estreptavidina:
separar as partículas oligoméricas do monômero e/ou moléculas oligoméricas menores; e entrar em contato com a partícula oligomérica com um agente estabilizador, produzindo assim o reagente de partícula oligoPetição 870190108127, de 24/10/2019, pág. 361/524
325/378 mérico.
66. O método da modalidade 65, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas é gerada incubando uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de ativação que é capaz de converter uma ou mais aminas em um grupo funcional reativo ao tiol.
67. O método da modalidade 65 ou modalidade 66, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas é gerada pela incubação de uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de tiolação que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tiol para um ou mais resíduos de lisina.
68. Um método para produzir reagentes de partícula oligoméricos, o método compreendendo:
(a) incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de ativação sob condições para converter uma ou mais aminas em um grupo reativo ao tiol capaz de reagir com um grupo funcional tiol, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativada;
(b) incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de tiolação que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tiol a um ou mais resíduos de Usina, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas ou de muteína de estreptavidina; e (c) incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas, gerando assim a composição de partícula compreendendo os reagentes de par-
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326/378 tícula oligoméricos;
em que o método é realizado sob condições em que, no momento do início da incubação em (c), a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são tal que pelo menos 60 % das lisinas, em média, compreendem um grupo funcional tiol e/ou pelo menos 10 lisinas, em média, por tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tiolado compreendem um grupo funcional tiol.
69. O método da modalidade 68, compreendendo ainda a separação dos reagentes de partícula oligoméricos do monômero e/ou moléculas de estreptavidina oligomérica ou de muteína de estreptavidina menores.
70. O método de qualquer uma das modalidades 65-69, em que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada a uma relação molar entre 1 : 1 e 1 : 10 de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina para o reagente de ativação.
71. O método de qualquer uma das modalidades 66-70, em que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada a uma relação molar de 1 : 2 ± 2 % de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ao reagente de ativação.
72. O método de qualquer uma das modalidades 66-71, em que o agente de ativação compreende um reticulador heterobifuncional.
73. O método de qualquer uma das modalidades 66-72, em que o agente de ativação compreende 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo SMCC) e/ou Succinimidil-6-[(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH)
74. O método de qualquer uma das modalidades 65-73, em
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327/378 que o grupo funcional reativo ao tiol é um grupo haloacetiia, um grupo maleimida, um grupo aziridina, um grupo acriloíla, um agente de arilação, um grupo vinil-sulfona, um dissulfeto de piridila, um TNB-tiol ou um agente redutor de dissulfeto.
75. O método de qualquer uma das modalidades 65-74, em que o grupo funcional reativo ao tiol é um grupo maleimida.
76. O método de qualquer uma das modalidades 65-75, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados a um pH neutro.
77. O método de qualquer uma das modalidades 65-76, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação sâo incubados a um pH entre 6,8 e 7,5.
78. O método de qualquer uma das modalidades 65-77, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados a um pH entre 7,0 e 7,4, opcionalmente ou cerca de 7,2.
79. O método de qualquer uma das modalidades 65-78, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados a uma temperatura entre 4°C e 39°C.
80. O método de qualquer uma das modalidades 65-79, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, opcionalmente cerca de 23°C ou cerca de 24°C.
81. O método de qualquer uma das modalidades 65-80, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados por entre
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328/378 minutos e 6 horas ou 30 minutos e 2 horas, cada qual inclusive.
82. O método de qualquer uma das modalidades 65-81, em que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados por entre 45 minutos e 1,5 horas, inclusive, opcionalmente por ou durante cerca de 1 hora.
83. O método de qualquer uma das modalidades 66-82, em que a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 10 : 1 e 1 : 1, inclusive, do reagente de tiolação a cada amina primária por molécula de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
84. O método de qualquer uma das modalidades 66-83, em que a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 1 : 50 e 1 : 500, inclusive, de tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ao agente de tiolação.
85. O método de qualquer uma das modalidades 66-84, em que a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar de ou cerca de 1 : 100 de tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina para o reagente de ativação.
86. O método de qualquer uma das modalidades 66-85, em que o agente de tiolação é ou compreende 2-iminotiolano.
87. O método de qualquer uma das modalidades 66-86, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada a um pH de 7,0 ou superior, opcionalmente entre 7,0 e 8,0, Inclusive.
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88. O método de qualquer uma das modalidades 66-87, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada a um pH de cerca de 7,7.
89. O método de qualquer uma das modalidades 66-88, em que a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é iniciada na presença de um tampão com um pH de 8,0 ou superior, opcionalmente entre 8,0 e 9,0, inclusive.
90. O método de qualquer uma das modalidades 66-89, em que a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é iniciada na presença de um tampão com um pH de cerca de 8,5.
91. O método da modalidade 89 ou 90, em que o tampão compreende borato.
92. O método de qualquer uma das modalidades 89-91, em que o tampão compreende 10 mM a 200 mM de borato ou 50 mM a 100 mM de borato, cada qual inclusive, opcionalmente cerca de 100 mM de borato.
93. O método de qualquer uma das modalidades 65-92, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada a uma temperatura entre 4°C e 39°C.
94. O método de qualquer uma das modalidades 65-93, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, opcionalmente a ou cerca de 23°C ou a ou cerca de 24°C.
95. O método de qualquer uma das modalidades 66-94, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de mute
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330/378 ína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada por entre 15 minutos e 2 horas ou 15 minutos e 1,5 horas.
96. O método de qualquer uma das modalidades 66-95, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada por entre 15 minutos e 2 horas ou 25 minutos e 1 hora, cada qual inclusive.
97. O método de qualquer uma das modalidades 66-96, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada por ou durante cerca de 1 hora.
98. O método de qualquer uma das modalidades 66-97, em que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada por ou durante cerca de 25 minutos.
99. O método de qualquer uma das modalidades 65-98, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas à pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas durante a incubação está, em uma relação molar de 1 : X, em que X é o número de resíduos de Usina disponíveis para serem tiolados por molécula de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
100. O método de qualquer uma das modalidades 65-99, em que a relação molar é de 1 : 1 a 1 : 8 ou 1 : 2 a 1 : 6, opcionalmente ou cerca de 1 : 4.
101.0 método de qualquer uma das modalidades 65 a 100, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas a um pH entre 6,8 e 7,5, inclusive.
102. O método de qualquer uma das modalidades 65-101, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de
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331/378 estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas a um pH entre 7,0 e 7,4, inclusive.
103. O método de qualquer uma das modalidades 65-102, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas a um pH de cerca de 7,2.
104. O método de qualquer uma das modalidades 65-103, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas a uma temperatura entre 4°C e 39°C, inclusive.
105. O método de qualquer uma das modalidades 65-104, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, inclusive, opcionalmente em ou cerca de 23°C ou a cerca de 24°C.
106. O método de qualquer uma das modalidades 65-105, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas são incubadas por entre 15 minutos e 6 horas ou 30 minutos e 2 horas, cada qual inclusive.
107. O método de qualquer uma das modalidades 65-106, em que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas são incubadas por entre 45 minutos e 1,5 horas, inclusive, opcionalmente por ou durante cerca de 1 hora.
108. O método de qualquer uma das modalidades 65-107,
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332/378 em que a incubação de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas é terminada com o contato das moléculas com N-etilmaleimida (NEM).
109. O método de qualquer uma das modalidades 68-108, em que pelo menos uma porção da incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação e pelo menos uma porção da incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação são realizadas separadamente ao mesmo tempo.
110. O método da modalidade 109, em que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação e a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação são realizadas por substancialmente a mesma quantidade de tempo e/ou são concluídas substancialmente ao mesmo tempo.
111.0 método de qualquer uma das modalidades 68-110, em que, antes de incubar as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas e as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas, o método compreende:
(I) remover o agente de ativação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas; e/ou (ií) remover o agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas.
112. O método de qualquer uma das modalidades68-111, em que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ou
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333/378 de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas é iniciada dentro de 15 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com o agente de tiolação ser finalizado e/ou após a remoção do agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas.
113. Um método para a produção de reagentes de partícula oligoméricos, compreendendo:
incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com Succinimidil-6-[(p~ maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH) por ou durante cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas compreendendo um grupo funcional de reação a maleimida tiol:
incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com 2~iminotiolano por ou durante cerca de 1 hora a um pH entre 7,5 e 8,5, inclusive, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol; e incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas por ou durante cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, gerando assim uma composição de partículas compreendendo os reagentes de partícula oligoméricos;
em que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas é iniciada dentro de 10 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com extremidades de 2iminotiolano.
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114. O método de qualquer uma das modalidades 68-113, em que o método compreende ainda o contato dos reagentes de partícula oligoméricos com um agente estabilizador.
115. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 ou 114, em que o agente estabilizador reduz uma quantidade de iminotiolano N-substituído presente nos resíduos de lisina dos reagentes de partícula oligoméricos.
116. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 ou 114-115, em que o agente estabilizador reduz uma quantidade de iminotiolano N-substituído presente nos resíduos de lisina dos reagentes de partícula oligoméricos em pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %.
117. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 e 114-116, em que o agente estabilizador compreende hídroxilamina.
118. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 e 114-117, em que o agente estabilizador é removido dos reagentes de partícula oligoméricos por uma cromatografia, opcionalmente por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).
119. O método de qualquer uma das modalidades 65-118, em que os reagentes de partícula oligoméricos têm um raio inferior a 150 nm.
120. O método de qualquer uma das modalidades 65-119, compreendendo ainda a esterilização por filtro dos reagentes de partícula oligoméricos.
121. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 e 69-120, em que os reagentes de partícula oligoméricos são separados do monômero ou moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina oligoméricas menores por cromatografia de exclusão por tamanho.
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122. O método da modalidade 113, em que o limite de exclusão por tamanho é superior ou superior a cerca de 100 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1000 kDa ou 2000 kDa.
123. O método da modalidade 121 ou modalidade 122, em que o limite de exclusão por tamanho é de ou de cerca de 500 kDa a 1000 kDa.
124. O método de qualquer uma das modalidades 121-123, em que o limite de exclusão por tamanho é ou é de cerca de 75 kDa.
125. O método de qualquer uma das modalidades 65-67 e 69-124, compreendendo a coleta de uma ou mais frações compreendendo o volume vazio, separando assim os reagentes de partícula oilgoméricos do monômero ou moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina oligoméricas menores.
126. O método de qualquer uma das modalidades 65-125, compreendendo ainda o armazenamento dos reagentes de partícula oligoméricos a uma temperatura a cerca de 4°C, a cerca de ou abaixo de -20°C, ou a cerca de -80°C.
127. O método de qualquer uma das modalidades 65-12, compreendendo ainda misturar os reagentes de partícula oligoméricos com um ou mais agentes sob condições para ligar reversivelmente o um ou mais agentes aos reagentes de partícula oligoméricos.
128. Um reagente de partícula oligomérico produzido pelo método de qualquer uma das modalidades 65-127.
129. Método de multimerização de um ou mais agentes para um reagente de partícula oligomérico, o método compreendendo a mistura de um reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das reivindicações 1 a 49, uma composição compreendendo um reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das reivindicações 50-64, ou um reagente de partícula oligomérico produzido pelo método de qualquer uma das modalidades 65-128 com um ou mais agentes sob con
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336/378 dições para ligar reversivelmente o um ou mais agentes aos reagentes de partícula oligoméricos.
130. O método da modalidade 127 ou modalidade 129, em que o um ou mais agentes compreende um par de ligação, em que o par de ligação é capaz de se ligar a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico.
131. O método da modalidade 130, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
132. O método da modalidade 130 ou modalidade 131, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-His-ProGln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (GlyGlyGlySer)3-TrpSer-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), T rp-Ser~His -Pro~Gln~Phe~Glu~Lys-(GlyGlyGlySer)2~T rp-Ser~His~Pro~
Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Giu-Lys (SEQ ID NO: 19).
133. O método de qualquer uma das modalidades 130-132, em que o um ou mais agentes se liga ou é capaz de se ligar a uma molécula expressa sobre a superfície de uma célula-alvo.
134. O método de qualquer uma das modalidades 130-133, em que o um ou mais agentes compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
135. O método da modalidade 134, em que o um ou mais agentes é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
136. O método da modalidade 134 ou modalidade 135, em que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
137. O método de qualquer uma das modalidades 130-136, em que o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso sobre a superfí-
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337/378 cie de uma célula-alvo.
138. O método da modalidade 137, em que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície de uma célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
139. O método da modalidade 137 ou modalidade 138, em que a célula-alvo é uma célula imune.
140. O método de qualquer uma das modalidades 137-139, em que a célula-alvo é uma célula T.
141. O método de qualquer uma das modalidades 137-140, em que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, se liga a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou se liga especificamente ao CD3.
142. O método da modalidade 141, em que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o método compreende ainda a ligação reversível ao reagente de partícula oligomérico um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
143. O método da modalidade 142, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
144. O método da modalidade 142 ou modalidade 143, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente
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338/378 a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
145. O método de qualquer uma das modalidades 127 e 129-144, em que o um ou mais agentes é um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, opcionalmente um Fab anti-CD3 e um Fab antiCD28.
146. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 137 ou modalidade 138, em que o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
147. O método de qualquer uma das modalidades 137, 138, 143 ou 144, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada dentre CD28, CD90 (Thy -1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM.
148. O método de qualquer uma das modalidades 137, 138, 143 ou 144, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL-2R, IL- 1R, IL15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR Tipo I, IL-12R, IL15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2.
149. O método de qualquer uma das modalidades 137, 138, 143 ou 144, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e
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CXCR4.
150. O método de qualquer uma das modalidades 137, 138, 143 ou 144, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocina ou quimiocina e o fator é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina ou quimiocina.
151. O método da modalidade 150, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR Tipo I, IL-12R, IL-15R, IL17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
152. O reagente de partícula oligomérico da modalidade 151, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especificamente a um receptor de quimiocina selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é selecionado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
153. O método de qualquer uma das modalidades 137, 138, 143 ou 144, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
154. O método de qualquer uma das modalidades 127-153,
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340/378 em que o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se iigar a um marcador de seleção que é expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
155. O método da modalidade 154, em que a célula-alvo é uma célula imune.
157. O método da modalidade 154 ou modalidade 155, em que a célula-alvo é um linfócito ou uma célula de apresentação de antígeno.
158. O método de qualquer uma das modalidades 154-156, em que a célula-aivo é uma céluia T, céluia B, céiula NK, macrófago ou célula dendrítica.
159. O método de qualquer uma das modalidades 154-158, em que a célula-alvo é uma célula T.
160. O método de qualquer uma das modalidades 154-159, em que o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
161. Uma composição compreendendo reagentes de partícula oligoméricos produzidos pelo método de qualquer uma das modalidades 65-160.
162. Uma composição compreendendo uma pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos produzidos pelo método de qualquer uma das modalidades 65-161.
163. Um artigo de fabricação, compreendendo o reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-49 ou a composição de qualquer uma das modalidades 50-64 ou 161-162.
164. Um método para modular células, o método compreendendo a incubação de uma composição ceiular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-49 ou na presença da composição de qualquer uma das modalidades 50-64 ou 161-163, modulando assim
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341/378 as células-alvo.
165. O método da modalidade 164, em que a modulação das células-alvo compreende ativar, enriquecer e/ou expandir as células-alvo.
166. Um método para cultura de células, o método compreendendo a incubação de uma composição celular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico de qualquer uma das modalidades 1-49 ou na presença da composição de qualquer uma das modalidades 50-64 ou 161-163.
167. O método de qualquer uma das modalidades 164-166, em que o reagente de partícula oligomérico compreende estar ligado reversivelmente a um ou mais agentes.
168. O método da modalidade 167, em que o um ou mais agentes compreende um par de ligação, em que o par de ligação é capaz de se ligar a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico, desse modo ligando reversivelmente o um ou mais agentes ao reagente de partícula oligomérico.
169. O método da modalidade 168, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
170. O método da modalidade 168 ou 169, em que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-GluLys (SEQ ID NO: 8), Trp -Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser-His- Pro-G ln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2“Trp-Ser-His-ProGln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-GluLys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19).
171. O método de qualquer uma das modalidades 167-170, em que o um ou mais agentes se liga ou é capaz de se ligar a uma
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342/378 molécula expressa sobre a superfície de uma célula-alvo.
172. O método de qualquer uma das modalidades 167-171, em que o um ou mais agentes compreende um anticorpo, opcionalmente um Fab.
173. O método de qualquer uma das modalidades 167-172, em que o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
174. O método da modalidade 173, em que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície de uma célula-alvo, induzindo ou modulando assim um sinal na célula-alvo.
175. O método da modalidade 173 ou modalidade 174, em que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, liga-se a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou liga-se especificamente a CD3.
176. O método da modalidade 175, em que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o método compreende ainda a ligação reversível ao reagente de partícula ollgoméríco um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
177. O método da modalidade 176, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina,
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343/378 produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
178. O método da modalidade 176 ou 177, em que o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
179. O método de qualquer uma das modalidades 174, 175, 177 ou 178, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga a uma molécula coestimuladora ou acessória e a molécula coestimuladora ou acessória é selecionada dentre CD28, CD90 (Thy -1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1 BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, 0X40 ou HVEM.
180. O método de qualquer uma das modalidades 174, 175, 177 ou 178, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de citocina e o receptor de citocina é selecionado dentre IL-2R, IL- 1R, IL15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR Tipo I, IL-12R, IL15R, IL-17R, TNFR1 e TNFR2.
181.0 método de qualquer uma das modalidades 174, 175, 177 ou 178, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) se liga especificamente a um receptor de quimiocina e o receptor de quimiocina é selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4.
182. O método de qualquer uma das modalidades 174, 175, 177 ou 178, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um fator que induz a produção de citocina ou quimiocina e o fator é um ligante que se liga especiflcamente a uma
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344/378 citocina ou receptor de quimiocina.
183. O método da modalidade 182, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de citocina, em que o ligante se liga especificamente a IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, IFNR Tipo I, IL-12R, IL-15R, IL17R, TNFR1 e TNFR2; e/ou o ligante é selecionado dentre IL-2, IL-1, IL-15, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, ÍL-10, IL-12, IL-15, IL-17 e TNF ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
184. O método da modalidade 183, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é um ligante que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, em que o ligante se liga especificamente a um receptor de quimiocina selecionado dentre CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CRC9, CXCR1, CXCR3 e CXCR4; ou o ligante é selecionado dentre CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 e CCL25 ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
185. O método de qualquer uma das modalidades 174, 175, 177 ou 178, em que o agente de ligação ao receptor (segundo agente de ligação ao receptor) é uma molécula de adesão e a molécula de adesão é selecionada dentre CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) e CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) ou é um fragmento biologicamente ativo do mesmo.
186. O método de qualquer uma das modalidades 164-185, em que o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
187. O método da modalidade 186, em que a célula-alvo é uma célula imune.
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188. O método da modalidade 186 ou modalidade 187, em que a célula-alvo é um linfócito ou uma célula de apresentação de antígeno.
189. O método de qualquer uma das modalidades 186-188, em que a célula-alvo é uma célula T, célula B, célula NK, macrófago ou célula dendrítica.
190. O método de qualquer uma das modalidades 186-189, em que a célula-alvo é uma célula T.
191. O método de qualquer uma das modalidades 186-190, em que o marcador de seleção é CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
192. O método de qualquer uma das modalidades 186-191, em que as células-alvo compreendem células sanguíneas, leucócitos, linfócitos, células B, uma população de células B, células T, uma população de células T, células NK, células dendríticas e/ou macrófagos.
193. O método de qualquer uma das modalidades 186-192, em que as células-alvo expressam um receptor recombinante.
194. O método de qualquer uma das modalidades 186-193, em que as células-alvo expressam um receptor de célula T recombinante e/ou um receptor de antígeno quimérico (CAR).
195. O método de qualquer uma das modalidades 186-194, em que as células-alvo expressam um CAR que se liga a um antígeno associado a uma doença e/ou câncer.
196. O método da modalidade 195, em que o antígeno é ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de célula B (BCMA), B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de testículo de câncer, antígeno 1B de câncer/testículo (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante de Quimiocina de Motivo de C-C 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22,
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CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo ill (EGFR vlII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc como 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo do receptor Fc 5 ou FCRH5), receptor de acetllcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, receptor de acetilcolina fetal, gangliosídeo GD2, GD2 acetilado O (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Her2/neu (tirosina cinase receptora erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano associado ao melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, Antígeno leucocitário humano A1 (HLA-AI), Antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa de IL-13 2 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Repetição Rica em Leucina Contendo 8 Membros da Família A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE- A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MLJC1), MUC16, ligantes naturais de membro D de grupo 2 exterminador (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferivelmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterone, um antígeno específico de próstata, antígeno prostático de células-tronco (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), tirosina cinase receptora como receptor órfão 1 (RORI), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular
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347/378 (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), ou um antígeno específico de patógeno.
197. O método de qualquer uma das modalidades 186-196, compreendendo ainda interromper a ligação reversível entre um ou mais agentes e o reagente de partícula oligomérico.
198. O método da modalidade 197, em que a referida Interrupção compreende a introdução nas células-alvo de uma composição que compreende uma substância capaz de reverter a ligação entre um ou mais agentes e o reagente de partícula oligomérico.
199. O método da modalidade 198, em que a substância é um par de ligação livre e/ou é um agente de competição.
200. O método de qualquer uma das modalidades 197-199, em que a referida interrupção termina ou diminui o sinal induzido ou modulado pelo um ou mais agentes nas células-alvo, opcionalmente células T.
201. O método de qualquer uma das modalidades 197-200, em que a substância compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina, biotina ou um fragmento biologicamente ativo, opcionalmente uma D-biotina, ou um análogo de biotina ou fragmento biologicamente ativo.
202. O método da modalidade 201, em que a substância é um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-Hls-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), T rp-Ser -His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-T rp-Ser-His-ProGln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser-His-Pro- Gln-Phe-Glu-Lys(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-Hls-Pro-Gln-Phe-Glu-Ly s (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-TrpSer-His-Pro-GIn-Phe-Glu Lys (SEQ ID NO: 19).
203. O método de qualquer uma das modalidades 197-202,
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348/378 em que a interrupção é realizada dentro de 5 dias após o início da referida incubação.
204. O método de qualquer uma das modalidades 164-203, em que o um ou mais agentes de ligação ao receptor é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
205. O método da modalidade 204, em que o um ou mais agentes de ligação ao receptor é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
206. O método da modalidade 204 ou modalidade 205, em que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
207. O método de qualquer modalidade 164-206, em que a célula-alvo é uma célula imune.
208. O método de qualquer uma das modalidades 164-207, em que a célula-alvo é uma célula T.
209. O método de qualquer uma das modalidades 176-208, em que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície da célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
210. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 176-209, em que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, ligase a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou liga-se especificamente ao CD3.
211. O método, de acordo com a reivindicação 209 ou reivindicação 210, em que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o reagente de partícula oligomérico compreende um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, em que a ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um
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349/378 sinal nas células-alvo.
212. O método, de acordo com a reivindicação 211, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
213. O método, de acordo com a reivindicação 211 ou reivindicação 212, em que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
214. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 176-213, em que um ou mais agentes são um anticorpo antiCD3 e um anticorpo anti-CD28, opcionalmente um Fab anti-CD3 e um Fab anti-CD28.
VIII. EXEMPLOS
[00581] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1: Métodos para a preparação de um reagente oligomérico compreendendo uma muteína de estreptavidina.
[00582] Um reagente oligomérico foi preparado polimerizando uma muteína de estreptavidina exemplar designada STREP-TACTIN® M2 (um homo-tetrâmero de estreptavidina contendo a sequência de muteína de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 61, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.103.493 e Voss e Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982). Para preparar muteínas de estreptavidina para oligomerização, muteínas de estreptavidina contendo um ou mais grupos tiol reativos foram incubados com muteínas de estreptavidina ativadas por
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350/378 maleimida. Para preparar a muteína de estreptavidina tiolada, cerca de 100 mg de tetrâmero de muteína de estreptavidina foram tiolados por incubação com cloridrato de 2-iminotiolano em uma relação molar de 1:100 a um pH de cerca de 8,5 a 24°C por 1 hora em tampão de Borato 100 mM em um volume total de 2,6 mL. Para a reação de ativação que introduziu maleimidas, cerca de 400 mg de tetrâmero de muteína de estreptavidina foram incubados com succinimidil-e-^p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH) em uma relação molar de 1:2 a um pH de cerca de 7,2 a 24°C por 1 hora em um volume total de cerca de 10,4 mL em um tampão de fosfato de sódio. As reações de tiolação e ativação da maleimida foram coordenadas para começar aproximadamente ao mesmo tempo, e a duração das reações foi controlada.
[00583] Após as reações, o cloridrato de 2-iminotiolano e o SMPH que não reagiram com o STREP-TACTIN® M2, juntamente com os subprodutos da reação de baixo peso molecular (predominantemente NHS), foram removidos das amostras por meio de filtragem individual em gel das amostras com colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare). Para cada volume de 2,5 mL de amostra, uma coluna PD-10 (8,3 mL de volume do leito) foi equilibrada e carregada com muteína estreptavidina tiolada ou muteína estreptavidina de maleimida e a eluição foi realizada adicionando 3,5 mL de tampão de acoplamento (NaH2P4 100 mM, NaCI 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,2). A filtragem em gel da muteína estreptavidina de maleimida foi realizada em 4 colunas para dar conta do volume > 10 mL e os eluatos foram reunidos. O tempo das reações de ativação e tiolação e o tempo entre o final das reações de ativação e tiolação e o início das reações de oligomerização foram cuidadosamente controlados. Geralmente, era permitido que aproximadamente dez minutos passassem do início das fUtrações em gel, isto é, o fim das reações de ativação e tiolação, quando a reação de oligomerizaçâo foi iniciada.
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351/378
[00584] Para oligomerização, as amostras de muteína de estreptavidina de maleimida e estreptavidina tiolada foram combinadas em um volume total de cerca de 17,5 mL e incubadas por 1 hora a um pH de 7,2 a 24°C sob condições de agitação a cerca de 600 rpm. Como quatro vezes mais muteína de estreptavidina foi incubada com SMPH do que com cloridrato de 2-iminotiolano, a relação molar de muteína de estreptavidina e muteína de estreptavidina de maleimida foi de 1 : 4 durante a reação de oligomerização. Após a reação, os grupos SH restantes do reagente de muteína de estreptavidina oligomerizada foram saturados por incubação com N-etilmaleimida (NEM) por 15 minutos a 24°C com agitação (cerca de 600 rpm) seguida de incubação por mais 16-20 horas a 4°C.
[00585] Após a incubação com NEM, a amostra contendo muteína Strep-Tactina oligomerizada foi centrifugada e o sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de 0,45 pm (Millex-HP 0,45 pm da Merck Millipore). A solução filtrada foi então carregada em uma coluna (Sephacryl S-300 HR HiPrep 26/60, GE Healthcare) para cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) com um sistema de cromatografia AKTA Explorer (GE Healthcare). As frações que tinham no final das unidades de mill absorção de coleção (mAU) superiores ou iguais a 1500 mAU foram reunidas.
[00586] A amostra combinada contendo muteína de estreptavidina oligomérica foi tratada com hidroxilamina 100 mM pela adição de 890 mM pH 6,35 por 15 minutos em temperatura ambiente. Para remover a hidroxilamina após o tratamento, a amostra foi carregada em uma coluna PD10 (2,5 mL por coluna) equilibrada com NaH2PO4 100 mM, NaCI 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2 e eluída com 3,5 mL do mesmo tampão (NaH2PO4 100 mM, NaCI 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2). Os eluatos PD10 foram reunidos e filtrados estéreis com um filtro de 0,45 pm, seguido por um filtro de 0,22 pm e, em seguida, as amostras fo
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352/378 ram congeladas e armazenadas a -80°C. Antes do congelamento, a concentração final do reagente oligomérico de muteína de estreptavldina foi medida e o tamanho do reagente oligomérico de muteína de estreptavidina foi determinado por dispersão da luz dinâmica (DLS).
[00587] Para avaliar a consistência do processo de oligomerização, 10 reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina foram preparados usando os métodos descritos acima em cinco bateladas diferentes de muteína de estreptavidina (SAM). O tamanho médio, o percentual de rendimento (determinado pela medição da absorvência a 280 nm sem correção da linha de base) e a atividade (ligação à biotina) dos oligômeros foram avaliados e os resultados são mostrados na Tabela E1. Os resultados indicaram que os reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina resultantes eram consistentes nestes parâmetros com um raio médio de 97 nm ± 10 nm e ligação à biotina de 40 nmol/mg ± 3 nmol/mg.
Tabela E1: Comparação de STREP-TACTINA oligomerizada de diferentes bateladas.
| SAM lot | Raio (nm) | Rendimento Ι·|||||||||||| | Ligação de Biotina (nmol/mg) | |
| Batelada 1 | 1 | 92 | 74 | 41 |
| Batelada 2 | 2 | 100 | 68 | 40 |
| Batelada 3 | 2 | 106 | 82 | 37 |
| Batelada 4 | 2 | 94 | 73 | 39 |
| Batelada 5 | 3 | 87 | 79 | 41 |
| Batelada 6 | 3 | 90 | 81 | 39 |
| Batelada 7 | 4 | 97 | 84 | 43 |
| Batelada 8 | 4 | 97 | 76 | 43 |
| Batelada 9 | 5 | 102 | 85 | 42 |
| Batelada 10 | 5 | 87 | 63 | 42 |
[00588] O peso molecular médio (MW) de três reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina gerados conforme descrito acima foi
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353/378 medido por fracionamento de campo de fluxo-fluxo assimétrico (AF4) realizado com um sistema HPLC (AGILENT 1100 e Wyatt ECLIPSE DUALTEC) com detecção UV (Agilent Detector de UV acoplado ao MALLS DAWN HELEOS (Wyatt)). As medições por AF4 permitiram o cálculo do número médio de tetrâmeros de muteína de estreptavidina em cada reagente oligomérico, assumindo o peso molecular médio de um tetrâmero de muteína de estreptavidina de 52.500 g/mol (52,5 kDa) (Tabela E2).
Tabela E2 : Tamanho e Peso Molecular de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina
| Raio (nm) | MW (g/mol) | Número de Tetrâmeros |
| 102 | 1,65x10® | 3150 |
| 82 | 1,08x10® | 2050 |
| 92 | 1,26x10® | 2280 |
Exemplo 2: Avaliação de parâmetros que afetam a oligomerização de um reagente de muteína de estreptavidina.
[00589] Vários parâmetros no método descrito no Exemplo 1 foram avaliados para avaliar impactos em diferentes aspectos do procedimento para gerar um reagente oligomérico de muteína de estreptavidina.
A. Nível de pH
[00590] O efeito de realizar a reação de tiolação em diferentes pHs no tamanho do oligômero e no rendimento do produto foi avaliado. O iminotiolano foi adquirido como cloridrato e sua dissolução em tampão de borato 100 mM a pH 8,5 para uma concentração de 100 mg/mL induziu uma queda no pH de ± 0,7 unidades para pH 7,8. Quando o tampão borato foi utilizado com menor resistência, isto é, 25 mM, a adição do cloridrato de iminotiolano a uma concentração de 100 mg/mL induziu uma queda maior de pH de 1,6 unidades para pH 6,9. As reações de tiolação foram realizadas em pH diferente por incuba
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354/378 ção de 100 mg de muteína de estreptavidina com cloridrato de 2iminotiolano na proporção molar de 1 : 100 em tampão de borato a 25 mM a pH 7,5, pH 8,5 e pH 9,5. A muteína de estreptavidina tiolada foi combinada com muteína de estreptavidina ativada por maleimida e o processo de oligomerização foi realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1. Como mostrado na Tabela E3, a redução do pH do tampão de borato usado com a reação de tiolação levou a uma redução do tamanho do oligômero e o rendimento ao aumentar o pH levou ao aumento do tamanho e rendimento. Ocorreu uma perda inadvertida de material durante o experimento com a condição de pH 9,5, o que resultou em um rendimento reduzido. O valor entre parênteses na Tabela E3 reflete o rendimento calculado caso a perda não tivesse ocorrido.
Tabela E3: Tamanho e rendimento do oligômero STREP-TACTIN após tiolização em diferentes pHs
| pH da Reação de Tiolização | Raio (nm) | Rendimento (%) |
| pH 7,5 | 14 | 6 |
| pH 8,5 | 40 | 48 |
| pH 9,5 | 52 | 14(62) |
[00591] Para avaliar se um tampão mais forte (isto é, tampão de borato 100 mM em comparação com 25 mM com aumento concomitante do pH na mistura de reação final) altera a cinética da reação, uma reação de ativação de iminotiolano foi realizada conforme descrito no Exemplo 1. O teor da função de tiol líquido foi determinado pelo reagente de Ellman em vários momentos durante a reação. A velocidade da reação no tampão de borato 100 mM está representada na FIG. 1, e foi observado ser mais rápido e introduzir mais grupos SH do que quando a reação foi realizada em tampão de borato a 25 mM. A reação de ativação do iminotiolano alcançou um pico de concentração das funções de tiol, iniciando aos 25 minutos após o início da reação
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355/378 em tampão de borato 100 mM, em comparação com entre 50 e 150 minutos quando a reação foi realizada em tampão de borato a 25 mM, o que é um resultado do pH final mais alto sob o qual a reação ocorre ao usar o tampão 100 mM em vez do tampão 25 mM.
[00592] Os efeitos do pH em outras etapas do processo de oligomerização também foram avaliados. As reações de oligomerização foram realizadas com tampões de reação (borato a 25 mM) em diferentes pH, pH 8,3 e 8,5, e com tampões de acoplamento (fosfato 100 mM) em diferentes pH, pH 7,0 e 7,2. A realização da reação de tiolação a um pH mais baixo (8,3 em vez de 8,5) teve uma influência maior no tamanho do oligômero do que a realização das reações de ativação ou acoplamento a um pH mais baixo (7,0 em vez de 7,3). No entanto, realizar a reação de ativação ou a reação de acoplamento em pH 7,0 reduziu o tamanho do oligômero em comparação com a realização das reações em pH 7,2.
B. Efeito do tempo e do pH na reação de tiolação
[00593] A análise da muteína de estreptavidina ativada por iminotiolano (tiolado) foi realizada para determinar se a deterioração das funções de tiol era devida à formação de dissulfeto (que não pode reagir com maleimida) ou à isomerização em relação ao iminotiolano N~ substituído.
[00594] Em um experimento, o teor da função de tiol líquido foi detectado em diferentes momentos com o reagente de Ellman, medindo a absorbância a 412 nm após uma reação de tiolação com iminotiolano. A reação foi realizada com tampão de borato a 25 mM que tinha pH inicial de 8,3 ou 8,5, embora o pH real durante a reação estivesse ligeiramente abaixo de 7. Como mostrado na FIG. 2, o conteúdo da função de tiol atingiu um máximo entre 50 e 150 minutos (anteriormente usando pH 8,5 e posteriormente usando pH 8,3) e a altura era dependente do pH (maior usando pH 8,5 em comparação com o pH 8,3).
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O conteúdo da função de tiol da muteína de estreptavidina durante a reação em ambos os pHs convergiu após 3 h, demonstrando que, após 3 horas, a muteína de estreptavidina gerada usando pH mais alto 8,5 incluía mais iminotiolano N-substituído. Experiências adicionais indicaram que a diminuição da função SH não foi influenciada pela adição do agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), que teria sido revertido se a formação de dissulfeto fosse a causa da diminuição da função SH.
[00595] Além disso, as muteínas de estreptavidina foram tioladas por incubação com iminotiolano por 10 minutos, 50 minutos ou 390 minutos usando tampão de borato a 25 mM a pH 8,3 e 8,5, e os produtos da reação foram analisados por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min com NaH2PO4 100 mM, NaCI 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0 e usando uma coluna Agilent Bio SEC-3 3 pm 300A. Para determinação do tamanho, foram utilizados padrões de peso molecular (indicados por picos em 158.000 Da, 44.000 Da, 17.000 da ou 1.350 Da na FIG. 3). Uma análise da SEC é mostrada na FIG. 3, em que o tetrâmero de muteína de estreptavidina não ativado é mostrado pela linha pontilhada. Observou-se que o tetrâmero de muteína não ativado tem o menor tempo de retenção, enquanto as amostras tioladas migram mais lentamente (consistente com um menor peso molecular) quanto mais tempo elas reagem com iminotiolano. Os picos observados das amostras que haviam reagido com iminotiolano eram essencialmente idênticos ao tamanho e não foram observados picos com tempos de retenção mais baixos. Assim, a partir da análise, pode-se concluir que não foram gerados dímeros ou oligômeros de ordem superior durante a reação prolongada com Iminotiolano, o que deveria ter sido o caso em caso de formação de dissulfeto.
[00596] Para avaliar o efeito do tempo na desintegração do teor de
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SH, o teor da função de tiol líquido no final de uma ativação de 1h ou 3h de iminotiolano da muteína de estreptavidina a diferentes pHs (pH 8,3, 8,5 ou 8,7) em tampão de borato a 25 mM foi avaliado. Após a reação e a filtragem em gel de PD10, o teor de SH foi determinado medindo a absorvência a 412 nM após a adição do reagente de Ellman 5,5'-ditiobis-(2~nitrobenzoato) (DTNB). A reação libera o íon de 5-tio-2nitrobenzoato TNB2; que tem uma absorção máxima em 412 nm. Medindo o aumento da absorvência em 412 nm e dividindo pelo coeficiente de extinção molar do ion de TNB2-412 nm, o teor de sulfidrila livre da molécula pode ser calculado. Como mostrado na FIG. 4, enquanto o teor da função de tiol após uma reação de 1 hora era dependente do pH, muito pouco efeito do pH no teor da função de tiol foi evidente após uma reação de 3 h. A hipótese de que uma reação de ativação mais longa pode reduzir a influência do pH no teor da função de tiol e, assim, tornar a reação mais robusta em termos de variações de tamanho dependentes do pH, mas também pode aumentar o iminotiolano N~substituído, o que pode ser uma fonte de instabilidade de tamanho de longa duração devido à reisomerização.
[00597] Para medir a desintegração da função de tiol na ausência de formação de tiol, o teor da função de tiol foi medido em vários momentos após o término da reação de tiolação, isto é, após a remoção do reagente de iminotiolano. O teor de SH da estreptavidina tiolada foi medido com o reagente de Ellman em vários momentos após a remoção do 2-iminotiolano por filtragem em gel de PD10. Como mostrado na FIG. 5, uma desintegração de 5 % das funções tiol foi detectado 10 minutos após o término da reação, uma desintegração de 26 % foi detectada 60 minutos após a reação e uma desintegração de 45 % das funções tiol foi detectada 120 minutos após a reação. A meia-vida da perda de SH foi calculada em 139 min. Isso indica o efeito do uso de diferentes prazos entre o fim do iminotiolano e a ativação do SMPH e o
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358/378 início da reação de multimerização.
C. Relações molares de muteína de estreptavidina e SMPH
[00598] Para avaliar o impacto da concentração de SMPH e muteína de estreptavidina na reação de ativação do SMPH na oligomerização da muteína de estreptavidina, foram realizados procedimentos de oligomerização com diferentes concentrações (variação de ± 10 %) de SMPH e muteína de estreptavidina. Um aumento ou diminuição de dez por cento nas concentrações de SMPH ou estreptavidina resultaram em diferenças detectáveis no tamanho do oligômero de muteína de estreptavidina. Em alguns aspectos, recomenda-se que a precisão desses parâmetros (concentração de Strep-Tactin e SMPH) seja superior a ± 2 %.
D. Estabilização de oligômeros
[00599] O iminotiolano N-substituído não reagido da tiolação pode permanecer nos resíduos de lisina e no terminal N livre da muteína de estreptavidina e contribuir para aumentos pós-sintéticos no tamanho do oligômero. Para avaliar os efeitos do tratamento com hidroxilamina no crescimento de oligômeros pós-sintéticos, os procedimentos de oligomerização foram realizados conforme descrito no Exemplo 1, com a exceção de que os procedimentos envolviam uma reação de ativação de 1 hora com iminotiolano (amostras 1 e 2) ou uma reação de ativação de 3,5 horas com iminotiolano (amostras 3 e 4). Além disso, nesses estudos, após a realização da SEC, as amostras contendo os reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina receberam tratamento com hidroxilamina (HA) 100 mM a um pH de 6,35 por 15 minutos em temperatura ambiente (amostras 1 e 3) ou não receberam hidroxilamina tratamento (amostras 2 e 4). As amostras foram divididas em frações que foram armazenadas a -80°C, 4°C ou 37°C. O tamanho do oligômero foi medido por DLS imediatamente após a síntese (dia 0) e 1 semana, 3 semanas e 9 semanas após a síntese. Os resultados
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359/378 são mostrados na Tabela E4.
Tabela E4: Efeitos da Temperatura de Armazenamento e do Crescimento Pós~sintético do Tratamento com Hidroxilamina
| Amostra | Condições de Armazona mento | Raio om d0 | RãiO apôs wl | Raio apôs | após | Raio após wi? |
| Amostra 1 | -80°C | 89 um | 94 nm | 93 nm | 91 nm | 91 nm |
| +HA | 4°C | 89 nm | 95 nm | 95 nm | 96 nm | 100 nm |
| Ativação de 1 hr | 37°C | 89 nm | 99 nm | 108 nm | 107 nm | 114 nm |
| Amostra 2 | -80°C | 88 nm | 93 nm | 96 nm | 94 nm | 94 nm |
| -HA | 4°C | 88 nm | 97 nm | 106 nm | 106 nm | 112 nm |
| Ativação de 1 hr | 37°C | 88 nm | 115 nm | 137 nm | 178 nm | 329 nm |
| Amostra 3 | -80°C | 94 nm | 100 nm | 98 nm | 94 nm | 92 nrn |
| +HA | 4°C | 94 nm | 96 nm | 98 nm | 100 nm | 102 nm |
| Ativação de 3,5 hr | 37°C | 94 nm | 108 nm | 121 nrn | 142 nm | 249 nm |
| Amostra 4 | -80°C | 91 nm | 98 nm | 98 nm | 96 nm | 100 nm |
| -HA | 4°C | 91 nm | 111 nm | 138 nm | 157 nm | 99 nrn |
| Ativação de 3,5 hr | 37°C | 91 nm | 148 nm | 177 nm | 265 nm | 409 nm |
[00600] Como mostrado na Tabela E4, o tratamento com hidroxilamina reduziu o crescimento de oligômeros durante o armazenamento a temperaturas de 4°C e 37°C. Observou-se que o tamanho era estável durante o armazenamento a -80°C, independentemente do tratamento com hidroxilamina. As amostras 3 e 4 foram ativadas por 3,5 horas e exibiram um crescimento pós-sintético mais pronunciado dos oligômeros. Sem desejar ser limitado pela teoria, em alguns aspectos, o tempo de ativação de 3,5 horas não é tão sensível às variações de pH quanto o tempo de ativação de 1 hora (veja o Exemplo 2B), mas pode resultar em um teor mais alto de iminotiolano N-substituído. Juntos, os resultados mostraram que o tratamento com hidroxilamina reduz o crescimento pós-sintético dos oligômeros de muteína de estreptavidina. Os dados também demonstraram que o armazenamento a 80°C aumenta a estabilidade dos oligômeros. Assim, em alguns aspectos, a combinação do tratamento com hidroxilamina seguido pelo
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360/378 armazenamento a uma temperatura de -80°C pode fornecer estabilidade aprimorada para manter o tamanho consistente, inclusive durante o armazenamento prolongado.
Exemplo 3: Geração de um reagente estimulador solúvel, contendo fragmentos Fab anti-CD3 e antí-CD28 oligomerizados, reversivelmente ligados a oligômeros de muteína de estreptavidina.
[00601] Os agentes estimuladores (fragmentos Fab anti-CD3 e antiCD28) foram multimerizados por ligação reversível a um reagente oligomérico de muteína de estreptavidina gerado como descrito no Exempio 1. Os fragmentos Fab anti-CD3 e anti-CD28 foram ligados reversivelmente ao oligômero de muteína de estreptavidina via parceiro de ligação ao peptídeo de estreptavidina fundido a cada fragmento Fab. O fragmento Fab anti-CD3 foi derivado do anticorpo monoclonal de ligação a CD3 produzido pela linhagem celular de hibridoma OKT3 (ATCC® CRL-8001™; veja também a Patente US No. 4.361.549) e continha o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD3 OKT3 descrito em Arakawa et at. J. Biochem. 120, 657-662 (1996). Estas sequências são apresentadas na SEQ ID NOS: 31 e 32, respectivamente. O fragmento Fab anti-CD28 foi derivado do anticorpo CD28.3 (depositado como uma construção Fv sintética de cadeia única sob o N° de Acesso GenBank AF451974.1; veja também Vanhove et a!., BLOOD, 15 de julho de 2003, Vol. 102, N°. 2, páginas 564-570) e continham os domínios variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo anti-CD28 CD28.3 apresentados na SEQ ID NOS: 33 e 34, respectivamente. Os fragmentos Fab foram fundidos individualmente no terminal carbóxi de sua cadeia pesada a uma sequência de ligação ao peptídeo de estreptavidina contendo um arranjo sequencial de dois módulos de ligação à estreptavidina com a sequência dos aminoácidos SAWSHPQFEK (GGGS) 2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 16). Os fragmentos Fab marcados com peptídeo foram
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361/378 produzidos de forma recombinante (veja Pub. de Ped. de Patente International Nos. WO 2013/011011 e WO 2013/124474).
[00602] Para realizar a ligação reversível, os fragmentos Fab antiCD3 e anti-CD28 marcados com peptídeos foram misturados com o reagente oligomérico de muteína de estreptavidina a aproximadamente temperatura ambiente, ligando-os reversivelmente ao reagente por meio de interação entre marcadores de estrep. duplos sobre os fragmentos Fab, que eram parceiros de ligação capazes de se ligar reversivelmente aos sítios de ligação no reagente. Em alguns casos, os fragmentos Fab marcados com peptídeo foram pré-misturados antes da imobilização no reagente oligomérico de muteína de estreptavidina, que, em alguns casos, pode resultar em uma distribuição mais uniforme das diferentes moléculas Fab.
Exemplo 4: Avaliação da Atividade de fragmentos Fab anti-CD3 e antiCD28 oligomerizados ligados reversivelmente a oligômeros de muteína de estreptavidina
[00603] Os fragmentos Fab anti~CD3 e anti~CD28, ligados reversivelmente a vários reagentes oligoméricos de estreptavidina de cada uma das bateladas descritas na Tabela E1 pelo processo descrito no Exemplo 1, foram avaliados quanto à capacidade de estimular células T. Estes reagentes oligoméricos de estreptavidina tinham um raio médio de cerca de 95 nm. A atividade metabólica das células como um indicador da proliferação celular foi avaliada por monitoramento colorimétrico da divagem do sal de tetrazólio estável WST-1 em um complexo de corante formazana solúvel.
[00604] As células T, de três doadores diferentes, foram incubadas com os fragmentos Fab multimerizados anti-CD3/anti-CD28, ligados reversivelmente a um reagente de estreptavidina oligomérico. As células também foram incubadas com reagentes oligoméricos de controle que tinham um raio médio de 101 (referência interna) ou 36 nm, que
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362/378 também estavam reversivelmente ligados a fragmentos Fab antiCD3/anti-CD28. Após a incubação, o reagente WST-1 foi aplicado às células e os níveis de atividade metabólica foram avaliados medindo a absorvência a 450 nm como uma leitura. Os resultados foram normalizados para o número de células na cultura sendo analisada e representadas como a razão de WST-1 por número de células.
[00605] Como mostrado na FIG. 6B, a atividade média de células T WST-1 estimulada com cada um dos reagentes testados era comparável. Além disso, o grau de estimulação foi semelhante para todos os reagentes testados e foi comparável a um reagente de referência interno de tamanho semelhante (variando geralmente dentro de ± 2 desvios padrão). A FIG. 6A mostra a atividade de WST-1 representada como um ponto de dados separado para cada reagente. As FIG. 6A e FIG. 6B indicam que a estimulação de células T, como observado pela atividade de WST-1, foi menor usando Fabs anti-CD3/anti-CD28 multimerizados em uma cadela principal menor de reagente ollgomérico de muteína de estreptavidina de 36 nm.
Exemplo 5: Método exemplar para a preparação de uma muteína de estreptavidina oligomérica.
[00606] Os reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos foram gerados por um método exemplar semelhante ao método descrito no Exemplo 1, com algumas modificações. Especificamente, após incubação com NEM, a amostra contendo muteína de estreptavidina ollgomerizada foi centrifugada e o sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de 0,45 pm. A solução filtrada foi então tratada com hidroxilamina 100 mM a um pH de 6,35 por 15 minutos em temperatura ambiente. A amostra foi então carregada em uma coluna para cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) com um sistema de cromatografia AKTA Explorer (GE Healthcare). As frações com uma unidade de mill absorvência (mAU) maior ou igual a 1500 mAU foram mistura
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363/378 das e depois filtradas estéreis com um filtro de 0,45 pm seguido por um filtro de 0,22 pm. A estreptavidina oligomerizada foi armazenada a -80°C. Assim, diferentemente do método descrito no Exemplo 1, nenhuma outra filtração em gel à base de PD-10 foi realizada.
[00607] O tamanho e a estabilidade dos reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos produzidos pelo método exemplar foram comparados aos oligômeros produzidos pelo método descrito no Exemplo 1. Os oligômeros foram divididos em frações que foram armazenadas a -80°C, 4°C ou 37°C. O tamanho do oligômero foi medido por DLS imediatamente após a síntese (dia 0) e em vários pontos de tempo após a síntese. Ambos os métodos, independentemente da hi~ droxilamina ter sido removida após a SEC ou antes da SEC, oligômeros produzidos de tamanho e estabilidade comparáveis. Como mostrado na FIG. 11, os oligômeros armazenados a -80°C ou 4°C exibiram uma alteração média no tamanho de menos de 10 % durante 46 semanas após a síntese. Os oligômeros armazenados a 37°C exibiram um aumento no tamanho de aproximadamente 50 % em 9 semanas após a síntese.
Exemplo 6: Avaliação de diferentes grupos fabricados de reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos
[00608] Diferentes grupos de reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos compostos de diferentes bateladas de matériasprimas foram avaliados como parte de um processo de engenharia de células T com um receptor de antígeno quimérlco (CAR). Três grupos de reagente de muteína de estreptavidina oligomérico discreto foram gerados a partir de grupos individuais de STREP-TACTIN® M2 substancialmente como descrito acima. Fabs anti-CD3 e antl-CD28 contendo o par de ligação ao peptídeo de estreptavidina fundido do mesmo grupo de fabricação foram ligados reversivelmente aos oligômeros de muteína de estreptavidina individuais de cada grupo substancialmente
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364/378 como descrito acima. Os três grupos de reagente de muteína de estreptavidina oligomérico discreto têm diâmetros médios entre 100 nm e 109 nm.
[00609] Os três grupos individuais de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com Fab anti-CD3/anti-CD28 foram usados para estimular as células T CD4+ e CD8* primárias. As células T CD4+ e CD8+ foram selecionadas individualmente a partir de uma amostra de anaférese de três doadores individuais antes de combinar as células selecionadas em uma relação especificada de células T CD4+ para CD8+. As células T CD4+ e CD8+ combinadas foram, então, modificadas com um receptor de antígeno quimérico (CAR) por um processo de engenharia exemplar que incluiu a incubação das células com um grupo dos reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com Fab anti-CD3/anti~CD28, transduzindo com um lentivírus, e em seguida cultivando para expansão. Antes da conclusão da expansão, as células foram tratadas com biotina para dissociar os Fabs anti-CD3/anti-CD28 dos reagentes oligoméricos da estreptavidina. As condições de incubação, transdução e cultivo foram as mesmas para todos os grupos testados dos reagentes de muteína de estreptavidina conjugados com Fab 3η1ί-003/3ηίΙ~0028, e cada grupo foi testado com até quatro replicações para cada uma das três amostras de doadores. Para monitorar a eficiência de transdução de células T modificadas, o lentivírus liberou um polinucleotídeo que codifica o CAR separado de um receptor truncado por uma sequência de salto ribossômico para uso como um marcador substituto para detectar a expressão do CAR.
[00610] O número total de células viáveis em vários estágios do processo de engenharia exemplar foi quantificado. As células foram marcadas com uma mancha de viabilidade antes da adição do reagente oligomérico de muteína de estreptavidina conjugado com Fab
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365/378 (dia 0) e em vários dias do processo. Como mostrado nas FIGS. 12A e 12B, as quantidades totais de células viáveis e a porcentagem de células viáveis medidas nos diferentes estágios do processo de engenharia foram consistentes entre células obtidas de diferentes doadores e usando grupos diferentes dos reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com Fab.
[00611] A eficiência da transdução foi medida em células coletadas a partir de processos de engenharia exemplares. As células foram marcadas com anticorpos específicos para CD4, CD8 e o marcador substituto e analisadas por fluxocitometria. A porcentagem de células CAR+, CAR+CD4+, CAR+CD8+ entre o total de células T viáveis é mostrada na FIG. 13. A eficiência da transdução foi consistente entre diferentes grupos de reagentes oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados com Fab, e a variabilidade observada foi principalmente dependente da fonte doadora.
[00612] As células T de CAR+ modificadas também foram examinadas para diferentes marcadores associados a fenótipos de memória ou exaustão. As células T foram marcadas com anticorpos específicos para CD3, CD4, CD8 e marcadores substitutos, bem como para os marcadores associados à memória CCR7, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO e CD62L ou com os marcadores associados à exaustão CCR7, LAG3, PD -1 e ΊΊΜ3 e depois analisados por citometria de fluxo. Não foram observadas variações significativas na coloração para marcadores associados à memória ou associados à exaustão. Uma análise dos componentes principais de acordo com os marcadores fenotípícos associados à memória e associados à exaustão foi realizada. Clusters derivados da comparação de dados cumulativa, separados de acordo com doadores e não com grupos individuais de reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos conjugados com Fab, estavam de acordo com a consistência dos reagentes nos fenótipos de células
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T relacionados à memória e à exaustão que podem ocorrer durante o processo de engenharia.
[00613] As células T CAR* modificadas foram analisadas quanto à presença de Fab residual ou estreptavidina de muteína em superfícies celulares por detecção de Fabs anti-CD3 e anti-CD28 residuais por coloração com StrepTactin-PE ou por detecção de estreptavidina de muteína residual com um anticorpo específico para StrepTactin. Como mostrado na FIG. 14, menos de 1 % das células T viáveis eram positivas para Fab ou estreptavidina de muteína.
[00614] A atividade do antígeno dependente do CAR foi avaliada por cocultura de células T de CAR+ modificadas com células irradiadas que expressam o antígeno alvo do CAR. As células T cultivadas na ausência das células de expressão de antígeno irradiadas serviram como um controle negativo. Após quatro horas de cocultura, as células T foram avaliadas para IL-2, IFN-gama e TNF-alfa intracelulares por coloração de citocina intracelular (ICS), coradas para o marcador substituto indicando expressão de CAR e CD3 e avaliadas por citometria de fluxo. Porcentagens semelhantes de células positivas para IL-2, IFN-gama e TNF-alfa, bem como porcentagens de células que expressam duas ou três citocinas foram observadas entre as células T CD3+ de CAR+ originárias de diferentes doadores e entre as células produzidas na presença de grupos diferentes de reagentes de muteína de estreptavidina oligoméricos conjugados com Fab.
[00615] A atividade citolítica foi avaliada em células T de CAR+ modificadas após a cocultura das células com células-alvo que expressam o antígeno alvo do CAR em uma relação de células efetoras para células-alvo de 5:1. As células-alvo aderentes foram semeadas nas cavidades de uma placa de microtitulação eletrônica e o número de células-alvo foi quantificado medindo-se a impedância da corrente elétrica entre os eletrodos ligados. Para os controles, as células-alvo fo
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367/378 ram cultivadas sozinhas ou com células T que foram incubadas durante o processo de engenharia exemplar com um reagente de contas paramagnético conjugado com anticorpo 3ηΙί~003/3ηίί-0028. Como mostrado na FIG. 15, as células T de CAR+ demonstraram morte eficaz no ensaio. A atividade citolítlca observada foi comparável entre as células T obtidas de diferentes doadores individuais e entre diferentes grupos fabricados de reagentes de muteína de estreptavidina oligomérlcos conjugados com Fab.
[00616] Juntos, estes dados estão de acordo com um alto grau de consistência dos reagentes de muteína de estreptavidina olígoméricos conjugados com Fab gerados pelos métodos fornecidos.
[00617] A presente invenção não se destina a ser limitada em escopo às modalidades particulares divulgadas, as quais são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações para as composições e métodos descritos tornar-se-ão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui contidos. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da descrição e pretendem se enquadrar no escopo da presente descrição.
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SEQUÊNCIAS
| No, | Sequência | Descrição |
| 1 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAES RYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEA RINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPL DAVQQ | Espécies de Estreptavidina: Streptomyces avidinii UniProt No. P22629 |
| 2 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPA TDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTT EANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Espécies de estreptavidina mínimas: Streptomyces avidinii |
| 3 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAES RYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEA RINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPL DAVQQ | Estreptavidina de Muteína Val44-ThH5-Ala4e-Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
| 4 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPA TDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTT EANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína Val44-Thr45-Ala46-Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
| 5 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYÍGARGNAES RYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEA RINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASiDAAKKAGVNNGNPL DAVQQ | Estreptavidina de Muteína lle44-Gly45-Ala48-Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
| 6 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPA TDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTT EANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína lle44-Gly4S-Ala-48Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
| 7 | Trp-Arg-His-Pro-GIn-Phe-Gly-Gly | Peptídeo de ligação de estreptavidina, Strep-tag® |
| 8 | WSHPQFEK | Strep-tag® II |
| 9 | His-Pro-Baa | Peptídeo de Ligação à Estreptavidina Baa é selecionado dentre glutamina, asparagina e metionina |
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| No. | Sequência | Descrição |
| 10 | His-Prc-Gin-Phe | Peptídeo de ligação à estreptavidina |
| 11 | Oaa-Xaa-His-Pro-GIn-Phe-Yaa-Zaa | Peptídeo de ligação à estreptavidina Oaa é Trp, Lys ou Arg; Xaa é qualquer aminoácido; Yaa é Giy ou Glu Zaa é Giy, Lys ou Arg |
| 12 | -Trp-Xaa-His-Pro-Gín-Phe-Yaa-Zaa- | Peptídeo de ligação à estreptavidina Xaa é qualquer aminoácido; Yaa é Giy ou Glu Zaa é Giy, Lys ou Arg |
| 13 | Trp-Ser-H!S-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Giu-Lys- | Módulos sequenciais de peptídeo de ligação à estreptavidina Xaa é qualquer aminoácido; n é 8 ou 12 |
| 14 | Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Giu-Lys-(GlyGlyGiySer)n-Trp-Ser-His-Pro-Gín-Phe- Glu-Lys | Módulos sequenciais de peptídeo de ligação à estreptavidina n é 2 ou 3 |
| 15 | SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK | Marcador de Twin-Estrep. |
| 16 | SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK | Marcador de Twin-Estrep. |
| 17 | WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK | Marcador de Twin-Estrep. |
| 18 | WSHPQFEKGGGSGGGSWSHPQFEK | Marcador de Twin-Estrep. |
| 19 | WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK | Marcador de Twin-Estrep, |
| 20 | Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala | Marcador de HA |
| 21 | Tyr-Thr-Asp-lle-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys | Marcador de VSV-G |
| 22 | Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp | Marcador de HSV |
| 23 | Aia-Ser-Met-Thr-Gly-Giy-Gln-Gln-Met-Gly | Epítopo de T7 |
| 24 | Glu-GIn-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu | Epítopo de HSV |
| 25 | Glu-GIn-Lys-Leu-lle-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu | Epítopo de Myc |
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| No. | Sequência | Descrição |
| 26 | Gly-Lys-Pro-lle-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr | Marcador de V5 |
| 27 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPA TDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTT EENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína He44-Gly45-Ala-46-Arg47 e Glu117, Gly120, Try121 (muteína m1-9) Espécies: Streptomyces avidinii |
| 28 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAES RYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEA RINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína He44-Gly45-Ala-46-Arg47 e Glu117, Gly120, Try121 (muteína m1-9) Espécies: Streptomyces avidinii |
| 29 | AMQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTFGVHWVRQSPGKGLEWLG VIWASGITD YNVPFMSRLSITKDNSKSQVFFKLNSLQPD DTAIYYCAKNDPGTGFAYWGQGTLVTVSAGSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSAWSHPQ FEKGGGSGGG SGGSAWSHPQFEK | Cadeia Pesada Variável de fragmento Fab m13B8.2 |
| 30 | AMDIQMTQSPASLSASVGETVTFTCRASEMIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVH DAKTLAEGVPSRFSGGGSGTQFSLKINTLQPEDFGTYYCQAHYGNPPTFGG GTKLEIKRGIAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGS | Cadeia Leve Variável de Fragmento Fab m13B8.2 |
| 31 | Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser | Cadeia Pesada Variável de anticorpo anti-CD3 OKT3 |
| 32 | Gin lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser | Cadeia Leve Variável de anticorpo anti-CD3 OKT3 |
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| No. | Sequência | Descrição |
| Giy Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Asn | ||
| 33 | Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala Ser Vai Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr He lie His Trp lie Lys Leu Arg Ser Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Asn Asp He Gin Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Vai Tyr Met Glu Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai | Cadeia Pesada Variável de anticorpo anti-CD28 CD28.3 |
| 34 | Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Vai Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr He Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn He Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Ala Ala Thr His Leu Vai Glu Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Thr Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg | Cadeia Leve Variável de anticorpo anti-CD28 CD28.3 |
| 35 | His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys | Marcador de MAT |
| 36 | YNLDVRGARSFSPPRAGRHFGYRVLQVGNGVIVGAPGEGNSTGSLYQCQS GTGHCLPVTLRGSNYTSKYLGMTLATDPTDGSILACDPGLSRTCDQNTYLSG LCYLFRQNLQGPMLQGRPGFQECIKGNVDLVFLFDGSMSLQPDEFQKILDFM KDVMKKLSNTSYQFAAVQFSTSYKTEFDFSDYVKRKDPDALLKHVKHMLLLT NTFGAINYVATEVFREELGARPDATKVLIIITDGEATDSGNIDAAKDIIRYIIGIGK HFQTKESQETLHKFASKPASEFVKILDTFEKLKDLFTELQKKIYVIEGTSKQDLT SFNMELSSSGISADLSRGHAWGAVGAKDWAGGFLDLKADLQDDTFIGNEPL TPEVRAGYLGYTVTWLPSRQKTSLLASGAPRYQHMGRVLLFQEPQGGGHW SQVQTIHGTQIGSYFGGELCGVDVDQDGETELLLIGAPLFYGEQRGGRVFIYQ RRQLGFEEVSELQGDPGYPLGRFGEAITALTDINGDGLVDVAVGAPLEEQGA | LFA-1a (homo sapiens) |
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| No. | Sequência | Descrição |
| VYIFNGRHGGLSPQPSQRIEGTQVLSGIQWFGRSIHGVKDLEGDGLADVAVG AESQMIVLSSRPWDMVTLMSFSPAElPVHEVECSYSTSNKMKEGVNmCFQI KSLIPQFQGRLVANLTYTLQLDGHRTRRRGLFPGGRHELRRNIAVTTSMSCT DFSFHFPVCVQDLISPINVSLNFSLWEEEGTPRDQRAQGKDIPPILRPSLHSET WEIPFEKNCGEDKKCEANLRVSFSPARSRALRLTAFASLSVELSLSNLEEDAY WVQLDLHFPPGLSFRKVEMLKPHSQIPVSCEELPEESRLLSRALSCNVSSPIF KAGHSVALQMMFNTLVNSSWGDSVELHANVTCNNEDSDLLEDNSATTIIP1LY PiNILlQDQEDSTLYVSFTPKGPK!HQVKHMYQVR!QPSiHDHN!PTLEAWGVP QPPSEGPiTHQWSVQMEPPVPCHYEDLERLPDAAEPCLPGALFRCPVVFRQ EILVQVIGTLELVGEIEASSMFSLCSSLSISFNSSKHFHLYGSNASLAQVVMKV DWYEKQMLYLYVLSGIGGLLLLLLIFIVLYKVGFFKRNLKEKMEAGRGVPNGI PAEDSEQLASGQEAGDPGCLKPLHEKDSESGGGKD | ||
| 37 | QECTKFKVSSCRECIESGPGCTWCQKLNFTGPGDPDSiRCDTRPQLLMRGC AADDIMDPTSLAETQEDHNGGQKQLSPQKVTLYLRPGQAAAFNVTFRRAKG YPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLGGDLLRALNEITESGRIGFGSFVDKTVLP FVNTHPDKLRNPCPNKEKECQPPFAFRHVLKLTNNSNQFQTEVGKQL1SGNL DAPEGGLDAMMQVAACPEEIGWRNVTRLLVFATDDGFHFAGDGKLGAILTP NDGRCHLEDNLYKRSNEFDYPSVGQLAHKLAENNiQPiFAVTSRMVKTYEKL TEIIPKSAVGELSEDSSNWQLIKNAYNKLSSRVFLDHNALPDTLKVTYDSFCS NGVTHRNQPRGDCDGVQINVPITFQVKVTATECiQEQSFVIRALGFTDIVTVQ VLPQCECRCRDQSRDRSLCHGKGFLECGICRCDTGYIGKNCECQTQGRSSQ ELEGSCRKDNNSIICSGLGDCVCGQCLCHTSDVPGKLIYGQYCECDTINCER YNGQVCGGPGRGLCFCGKCRCHPGFEGSACQCERTTEGCLNPRRVECSG RGRCRCNVCECHSGYQLPLCQECPGCPSPCGKYISCAECLKFEKGPFGKNC SAACPGLQLSNNPVKGRTCKERDSEGCWVAYTLEQQDGMDRYLIYVDESRE CVAGPNIAAIVGGTVAGIVLIGiLLLViWKALIHLSDLREYRRFEKEKLKSQWNN DNPLFKSATTTVMNPKFAES | LFA-Ιβ (homo sapiens) |
| 38 | DFLAHHGTDCWTYHYSEKPMNWQRARRFCRDNYTDLVAIQNKAEÍEYLEKTL | L-selectina |
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| No. | Sequência | Descrição |
| PFSRSYYWiGIRKIGGiWTWVGTNKSLTEEAENWGDGEPNNKKNKEDCVEiYI KRNKDAGKWNDDACHKLKAALCYTASCQPWSCSGHGECVEIINNYTCNCDV GYYGPQCQFVIQCEPLEAPELGTMDCTHPLGNFSFSSQCAFSCSEGTNLTGi EETTCGPFGNWSSPEPTCQVÍQCEPLSAPDLGIMNCSHPLASFSFTSACTFIC SEGTELiGKKKTICESSGiWSNPSPiCQKLDKSFSMIKEGDYNPLFIPVAVMVT AFSGLAFIIWLARRLKKGKKSKRSMNDPY | (homo sapiens) | |
| 39 | FKIETTPESRYLAQiGDSVSLTCSTTGCESPFFSWRTQIDSPLNGKVTNEGTT STLTMNPVSFGNEHSYLCTATCESRKLEKGIQVEIYSFPKDPEiHLSGPLEAG KPITVKCSVADVYPFDRLEIDLLKGDHLMKSQEFLEDADRKSLETKSLEVTFTP ViEDIGKVLVCRAKLHIDEMDSVPTVRQAVKELQVYISPKNTViSVNPSTKLQE GGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYV CEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESP SFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGI QVELYSFPRDPEiEMSGGLVNGSSVTVSCKVPSVYPLDRLEIELLKGETILENi EFLEDTDMKSLENKSLEMTFIPTIEDTGKALVCQAKLHIDDMEFEPKQRQSTQ TLYVNVAPRDTTVLVSPSSILEEGSSVNMTCLSQGFPAPKILWSRQLPNGELQ PLSENATLTLISTKMEDSGVYLCEGINQAGRSRKEVELIIQVTPKDIKLTAFPSE SVKEGDTVlISCTCGNVPETWilLKKKAETGDTVLKSIDGAYTIRKAQLKDAGVY ECESKNKVGSQLRSLTLDVQGRENNKDYFSPELLVLYFASSLIlPAfGMIlYFAR KANMKGSYSLVEAQKSKV | VCAM-1 (homo sapiens) |
| 40 | YNVDTESALLYQGPHNTLFGYSVVLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINP GAiYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPG ENGSIVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVK KFGENFASCQAGiSSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQ NQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEWGGAPQHEQIGKAYlFSIDEKELNfLH EMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTiREEGRVFVYiNSGS GAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGA lYfYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQlDADNNGYVDVAVGAF | VLA-4 (homo sapiens) |
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| No. | Sequência | Descrição |
| RSDSAVLLRTRPWiVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKG KEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRT HQAFMRKDVRDILTPIQlEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDiMK KTINFARFCAHENCSADLQVSAKIGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNA GDDAYETTLHVKLPVGLYFIKILELEEKQINCEVTDNSGWQLDCSIGYIYVDHL SRIDiSFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAiPLKYEVKL TVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMV PNSFSPQTDKLFNILDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFL SKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSA LKFEIRATGFPEPNPRVIELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFTIVIISSSLLLG LiVLLLlSYVMWKAGFFKRQYKSILQEENRRDSWSYlNSKSNDD | ||
| 41 | APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELK HLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYA DETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT | iL-2 |
| 42 | HKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQF YSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQ STLENFLERLKTIMREKYSKCSS | IL-4 |
| 43 | DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEG MFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALG EAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH | IL-7 |
| 44 | SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKES LLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRL RLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTM KiRN | IL-10 |
| 45 | GIHVFiLGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHiDATLYTESDVHPSCK VTAMKCFLLELQViSLESGDASIHDTVENLIlLANNSLSSNGNVTESGCKECEE LEEKNiKEFLQSFVHiVQMHNTS | IL-15 |
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| No. | Sequência | Descrição |
| 46 | GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWN LHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPP HCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA | IL-17 |
| 47 | TPWRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLN PDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT | CXCL9 |
| 48 | VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLN PESKAIKNLLKAVSKERSKRSP | CXCL10 |
| 49 | GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAWFTTLRGRQLCAPP DQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS | CCL19 |
| 50 | SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCA DPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTE RSQTPKGP | CCL21 |
| 51 | QGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVC GNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHHNTQTFQAGPHAVKKLSSGNSKLSS SKFSNPISSSKRNVSLLISANSGL | CCL25 |
| 52 | Gin Vai Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Vai Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Vai Phe Leu Lys he Ala Ser Vai Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin lie Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser | VH de anticorpo 3GS de aCD16 |
| 53 | Asp lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn He His Pro Vai Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin | VL de anticorpo 3G8 de aCD16 |
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| No. | Sequência | Descrição |
| Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys | ||
| 54 | YNLDVRGARSFSPPRAGRHFGYRVLQVGNGVIVGAPGEGNSTGSLYQCQS GTGHCLPVTLRGSNYTSKYLGMTLATDPTDGSILACDPGLSRTCDQNTYLSG LCYLFRQNLQGPMLQGRPGFQECIKGNVDLVFLFDGSMSLQPDEFQKILDFM KDVMKKLSNTSYQFAAVQFSTSYKTEFDFSDYVKRKDPDALLKHVKHMLLLT NTFGAINYVATEVFREELGARPDATKVLIIITDGEATDSGNIDAAKDIIRYIIGIGK HFQTKESQETLHKFASKPASEFVKILDTFEKLKDLFTELQKKIYVIEGTSKQDLT SFNMELSSSGISADLSRGHAVVGAVGAKDWAGGFLDLKADLQDDTFIGNEPL TPEVRAGYLGYTVTWLPSRQKTSLLASGAPRYQHMGRVLLFQEPQGGGHW SQVQTIHGTQIGSYFGGELCGVDVDQDGETELLLIGAPLFYGEQRGGRVFIYQ RRQLGFEEVSELQGDPGYPLGRFGEAITALTDINGDGLVDVAVGAPLEEQGA VYIFNGRHGGLSPQPSQRIEGTQVLSGIQWFGRSIHGVKDLEGDGLADVAVG AESQMIVLSSRPWDMVTLMSFSPAEIPVHEVECSYSTSNKMKEGVNITICFQI KSLÍPQFQGRLVANLTYTLQLDGHRTRRRGLFPGGRHELRRNIAVTTSMSCT dfsfhfpvcvqduspinvslnfslweeegtprdqraqgkdippilrpslhset WEIPFEKNCGEDKKCEANLRVSFSPARSRALRLTAFASLSVELSLSNLEEDAY WVQLDLHFPPGLSFRKVEMLKPHSQIPVSCEELPEESRLLSRALSCNVSSPIF KAGHSVALQMMFNTLVNSSWGDSVELHANVTCNNEDSDLLEDNSATTHPILY PÍNILIQDQEDSTLYVSFTPKGPKÍHQVKHMYQVRÍQPSfHDHNÍPTLEAVVGVP QPPSEGPÍTHQWSVQMEPPVPCHYEDLERLPDAAEPCLPGALFRCPWFRQ EILVQVIGTLELVGEIEASSMFSLCSSLSISFNSSKHFHLYGSNASLAQVVMKV DWYEKQML | Domínio Extracelularde LFA-la (ECD) |
| 55 | QECTKFKVSSCRECIESGPGCTWCQKLNFTGPGDPDSIRCDTRPQLLMRGC AADDIMDPTSLAETQEDHNGGQKQLSPQKVTLYLRPGQAAAFNVTFRRAKG YPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLGGDLLRALNEITESGRIGFGSFVDKTVLP FVNTHPDKLRNPCPNKEKECQPPFAFRHVLKLTNNSNQFQTEVGKQLISGNL DAPEGGLDAMMQVAACPEEIGWRNVTRLLVFATDDGFHFAGDGKLGAILTP NDGRCHLEDNLYKRSNEFDYPSVGQLAHKLAENN1QP1FAVTSRMVKTYEKL | Domínio Extracelularde LFA-Ιβ (ECD) |
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| No. | Sequência | Descrição |
| TEIIPKSAVGELSEDSSNWQLIKNAYNKLSSRVFLDHNALPDTLKVTYDSFCS NGVTHRNQPRGDCDGVQINVPITFQVKVTATECIQEQSFVIRALGFTDIVTVQ VLPQCECRCRDQSRDRSLCHGKGFLECGICRCDTGYIGKNCECQTQGRSSQ ELEGSCRKDNNSI1CSGLGDCVCGQCLCHTSDVPGKL1YGQYCECDT1NCER YNGQVCGGPGRGLCFCGKCRCHPGFEGSACQCERTTEGCLNPRRVECSG RGRCRCNVCECHSGYQLPLCQECPGCPSPCGKYISCAECLKFEKGPFGKNC SAACPGLQLSNNPVKGRTCKERDSEGCWVAYTLEQQDGMDRYL1YVDESRE CVAGPN | ||
| 56 | FKIETTPESRYLAQIGDSVSLTCSTTGCESPFFSWRTQIDSPLNGKVTNEGTT STLTMNPVSFGNEHSYLCTATCESRKLEKGIQVEIYSFPKDPEIHLSGPLEAG KPITVKCSVADVYPFDRLEIDLLKGDHLMKSQEFLEDADRKSLETKSLEVTFTP VIEDIGKVLVCRAKLHIDEMDSVPTVRQAVKELQVYISPKNTVISVNPSTKLQE GGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYV CEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESP SFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGI QVELYSFPRDPEIEMSGGLVNGSSVTVSCKVPSVYPLDRLEIELLKGETILENI EFLEDTDMKSLENKSLEMTFIPTIEDTGKALVCQAKLHIDDMEFEPKQRQSTQ TLYVNVAPRDTTVLVSPSSILEEGSSVNMTCLSQGFPAPKILWSRQLPNGELQ PLSENATLTLISTKMEDSGVYLCEGINQAGRSRKEVELIIQVTPKDIKLTAFPSE SVKEGDTVIISCTCGNVPETWIILKKKAETGDTVLKSIDGAYTIRKAQLKDAGVY ECESKNKVGSQLRSLTLDVQGRENNKDYFSPE | Domínio Extracelular de VCAM-1 (ECD) |
| 57 | WTYHYSEKPMNWQRARRFCRDNYTDLVAIQNKAEIEYLEKTLPFSRSYYWIG IRKIGGIWTWVGTNKSLTEEAENWGDGEPNNKKNKEDCVEIYIKRNKDAGKW NDDACHKLKAALCYTASCQPWSCSGHGECVEIINNYTCNCDVGYYGPQCQF ViQCEPLEAPELGTMDCTHPLGNFSFSSQCAFSCSEGTNLTGlEETTCGPFG NWSSPEPTCQVIQCEPLSAPDLGIMNCSHPLASFSFTSACTFICSEGTELIGK KKTICESSGIWSNPSPiCQKLDKSFSMIKEGDYN | Domínio Extracelular de L-selectina (ECD) |
| 58 | NVDTESALLYQGPHNTLFGYSWLHSHGANRWLLVGAPTANWLANASVINP | Domínio Extracelular de VLA-4 (ECD) |
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| No. | Sequência | Descrição |
| GAIYRCRIGKNPGQTCEQLQLGSPNGEPCGKTCLEERDNQWLGVTLSRQPG ENGSiVTCGHRWKNIFYIKNENKLPTGGCYGVPPDLRTELSKRIAPCYQDYVK KFGENFASCQAGISSFYTKDLIVMGAPGSSYWTGSLFVYNITTNKYKAFLDKQ NQVKFGSYLGYSVGAGHFRSQHTTEWGGAPQHEQIGKAYIFSIDEKELNÍLH EMKGKKLGSYFGASVCAVDLNADGFSDLLVGAPMQSTIREEGRVFVYINSGS GAVMNAMETNLVGSDKYAARFGESIVNLGDIDNDGFEDVAIGAPQEDDLQGA MYNGRADGISSTFSQRIEGLQISKSLSMFGQSISGQIDADNNGYVDVAVGAF RSDSAVLLRTRPWiVDASLSHPESVNRTKFDCVENGWPSVCIDLTLCFSYKG KEVPGYIVLFYNMSLDVNRKAESPPRFYFSSNGTSDVITGSIQVSSREANCRT HQAFMRKDVRDILTPIQIEAAYHLGPHVISKRSTEEFPPLQPILQQKKEKDIMK KTINFARFCAHENCSADLQVSAKiGFLKPHENKTYLAVGSMKTLMLNVSLFNA GDDAYETTLHVKLPVGLYFiKILELEEKQiNCEVTDNSGWQLDCSiGYiYVDHL SRIDISFLLDVSSLSRAEEDLSITVHATCENEEEMDNLKHSRVTVAiPLKYEVKL TVHGFVNPTSFVYGSNDENEPETCMVEKMNLTFHVINTGNSMAPNVSVEIMV PNSFSPQTDKLFNiLDVQTTTGECHFENYQRVCALEQQKSAMQTLKGIVRFL SKTDKRLLYCIKADPHCLNFLCNFGKMESGKEASVHIQLEGRPSILEMDETSA LKFEiRATGFPEPNPRViELNKDENVAHVLLEGLHHQRPKRYFT | ||
| 59 | MEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAP ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARÍNTQWLLTSGT TEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Espécies de estreptavidina mínimas: Síreptomyces avidinii |
| 60 | MEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAP ATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGT TEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína Val44-Thr45-Ala46-Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
| 61 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPA TDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTT EANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | Estreptavidina de Muteína ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 Espécies: Streptomyces avidinii |
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Claims (121)
1. Reagente de partícula oligomérico caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, em que o tamanho do reagente de partícula oligomérico compreende i) um raio superior a 50 nm; ii) um peso molecular de pelo menos 5x10® g/mol; e/ou (iii) pelo menos 100 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico.
2. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina se ligam reversivelmente ou são capazes de se ligar reversivelmente à biotina, um análogo de biotina ou um peptídeo de ligação à estreptavidina.
3. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com reivindicações 1 a a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina, em que as moléculas de muteína de estreptavidina compreendem a sequência de aminoácido Val44-Thr45-Ala46-Arg47 ou lle44-Gly45-Ala46- Arg47 nas posições de sequência correspondentes às posições 44 a 47 com referência às posições em estreptavidina na sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 1.
4. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem:
a) a sequência de aminoácidos mencionada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61;
b) uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93 %, 94
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2/25 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 3-6, 27, 28, 60 ou 61 e contêm a sequência de aminoácido correspondente a Val44-Thr45-Ala46Arg47 ou Ile44-Gly45 -Ala46-Arg47 e/ou se ligam reversivelmente à biotina, um análogo de biotina, um peptídeo de ligação à estreptavidina; ou
c) um fragmento funcional de a) ou b) que se liga reversivelmente à biotina, a um análogo de biotina ou a um peptídeo de ligação à estreptavidina.
5. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende uma pluralidade de moléculas de muteína de estreptavidina que compreendem a sequência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO: 6 ou 61.
6. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico está ligado ou é capaz de se Ilgar a um ou mais agentes.
7. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes compreende um par de ligação, em que o par de ligação é capaz de se ligar, opcionalmente reversivelmente ligar, a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico.
8. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
9. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (GlyGlyGlySer)3
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Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser-His -ProGln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-TrpSer-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe -Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-HIs-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19).
10. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
11. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
12. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
13. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
14. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície de uma célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
15. Partícula oligomérica, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a célula-alvo é uma célula imune.
16. Partícula oligomérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que a célula-alvo é uma célula T.
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4/25
17. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, se liga a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou se liga especificamente ao CD3.
18. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o reagente de partícula oligomérico compreende um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, em que a ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
19. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
20. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
21. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 20, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes são um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, opcionalmente um Fab anti-CD3 e um Fab anti-CD28.
22. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com
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5/25 qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou do receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimíocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimíocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
23. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 22, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
24. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula imune, opcionalmente uma célula T.
25. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é CCR7, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD28, CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L e/ou CD127.
26. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende:
um raio superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm ou superior a 90 nm.
27. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende:
um raio entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 115 nm ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive; ou
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6/25 um raio de 90 nm ± 15 nm ou 95 nm ± 20-25 nm.
28. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o raio é um raio hidrodinâmico.
29. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende um peso molecular de:
pelo menos 5 x 107 g/mol, ou pelo menos 1 x 10s g/mol; e/ou entre 5 x 107 g/mol e 5 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol.
30. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico compreende pelo menos 500 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, pelo menos 1.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, pelo menos 1.500 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, ou pelo menos 2.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina; e/ou;
entre 1.000 e 20.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, entre 1.000 e 10.000 tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina, ou entre 2.000 e 5.000 e tetrâmeros de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
31. Reagente de partícula oligomérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina compreende resíduos de lísina, em que menos de 20 %, 10 %, 5 %, 1 % dos resíduos de lisina compreendem iminotiolano N-substituído.
32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen
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7/25 de uma pluralidade de reagente de partícula oligomérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende i) um raio médio superior a 70 nm; ii) um peso molecular médio de pelo menos 1 x 108 g/mol; e/ou iii) um número médio de estreptavidina ou tetrâmeros de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico de pelo menos 2.000 e/ou iv) uma distribuição de tamanho de raio em que pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre 10 nm e 150 nm.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm ou superior a 100 nm.
35. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizada pelo fato de que:
a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio entre 50 nm e 150 nm, entre 75 nm e 125 nm, entre 80 nm e 110 nm, ou entre 90 nm e 110 nm, inclusive; ou a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio de 90 nm ± 15 nm, 95 nm ± 20-25 nm; ou 97 ± 10 nm.
36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizada pelo fato de que pelo menos 95 % da pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre 50 e 150 nm, entre 70 nm e 140 nm, entre 80 nm e 120 nm, entre 80 nm e 115 nm, entre 80 nm e 100 nm, entre 90 nm e 110 nm e/ou entre 100 nm e 120 nm.
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8/25
37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizada pelo fato de que pelo menos 95 % dos reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre ± 50 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ±10 % e/ou ± 5 % do raio médio e/ou mediano da pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos.
38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos compreende um raio médio entre 80 nm e 115 nm e em que pelo menos 95 % dos reagentes de partícula oligoméricos compreendem um raio entre ± 25 % do raio médio.
39. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de partículas compreende:
(I) um peso molecular médio entre 1 x 108 g/mol e 5 x 108 g/mol, ou entre 1 x 108 g/mol e 2 x 108 g/mol, inclusive; e/ou (ii) um número médio de estreptavidina ou tetrâmeros de estreptavidina por reagente de partícula oligomérico de pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 1.500 ou pelo menos 2.000 ou entre 1.000 e 20.000, entre 1.000 e 10.000, ou entre 2.000 e 5.000, cada qual inclusive.
40. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 39, caracterizada pelo fato de que o raio médio da pluralidade das partículas de oligômero não aumenta em mais de 25 % ou 10 % quando armazenadas a cerca de ou abaixo de -80°C, a cerca de ou abaixo de -20°C e/ou a uma temperatura igual ou inferior a 4°C durante pelo menos 1 semana.
41. Método para a produção de um reagente de partícula oligomérico compreendendo estreptavidina ou uma muteína de estreptavidina, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
Incubar uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou
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9/25 de muteína de estreptavidina ativadas compreendendo um grupo funcional reativo ao tio! capaz de reagir com um grupo funcional tiol e uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol, gerando assim uma composição de partículas compreendendo as partículas oligoméricas;
separar as partículas oligoméricas do monômero e/ou moléculas oligoméricas menores; e entrar em contato com a partícula oligomérica com um agente estabilizador, produzindo assim o reagente de partícula oligomérico.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas é gerada incubando uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de ativação que é capaz de converter uma ou mais aminas em um grupo funcional reativo ao tiol.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas é gerada por incubação de uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de tiolação que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tiol a um ou mais resíduos de Usina.
44. Método para a produção de reagentes de partícula oligoméricos, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
(a) incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de ativação sob condições para converter uma ou mais aminas em um grupo reativo ao tiol capaz de reagir com um grupo funcional tiol, gerando
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10/25 assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas;
(b) incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com um agente de tiolaçâo que adiciona ou é capaz de adicionar um grupo funcional tiol a um ou mais resíduos de lisina, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas; e (c) incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas, gerando assim uma composição de partículas compreendendo os reagentes de partícula oligoméricos;
em que o método é realizado sob condições em que, no momento do início da incubação em (c), a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são tal que pelo menos 60 % das lisinas, em média, compreendem um grupo funcional tiol e/ou pelo menos 10 lisinas, em média, por tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tiolado compreendem um grupo funcional tiol.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de compreender ainda a separação dos reagentes de partícula oligoméricos do monômero e/ou moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina oligoméricas menores.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada a uma relação molar entre 1 : 1 e 1 : 10 de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ao reagente de ativação.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica
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11/25 ções 41 a 46, caracterizado pelo fato de que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação é realizada em uma relação molar de 1 : 2 ± 2 % de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ao reagente de ativação.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que o agente de ativação compreende um reticulador heterobifuncional, opcionalmente 4-(Nmaleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo SMCC) e/ou Succinimidil-6-[(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH).
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 48, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional reativo ao tiol é um grupo maleimida.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados em pH entre 6,8 e 7,5, entre 7,0 e 7,4, cada qual inclusive, opcionalmente em ou a cerca de 7,2.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 50, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, inclusive, opcionalmente em ou a cerca de 23°C ou 24°C.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 51, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de ativação são incubados por entre 15 minutos e 6 horas, 30 minutos e 2 horas, cada qual inclusive, opcionalmente por ou durante cerca
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12/25 de 1 hora.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 52, caracterizado pelo fato de que:
a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 10 : 1 e 1 : 1, inclusive, do reagente de tiolação para cada amina primária por molécula de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina; e/ou a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação é realizada a uma relação molar entre 1 : 50 e 1 : 500, inclusive, de tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina para o agente de tiolação, opcionalmente em ou cerca de 1 : 100 de tetrâmero de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina para o reagente de ativação.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 53, caracterizado pelo fato de que o agente de tiolação é ou compreende 2-iminotiolano.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 54, caracterizado pelo fato de que:
a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de tiolação são incubados a um pH de 7,0 ou superior, opcionalmente entre 7,0 e 8,0, inclusive, opcionalmente a um pH de cerca de 7,7; e/ou a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e o agente de tiolação é iniciada na presença de um tampão com um pH de 8,0 ou superior, opcionalmente entre 8,0 e 9,0, inclusive, opcionalmente em ou a cerca de 8,5.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 55, caracterizado pelo fato de que a segunda pluralidade de
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13/25 moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, inclusive, opcionalmente em ou a cerca de 23°C ou a cerca de 24°C.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 56, caracterizado pelo fato de que a segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina e do agente de tiolação é incubada por entre 15 minutos e 2 horas, 15 minutos e 1,5 horas ou 25 minutos e 1 hora, cada qual inclusive, opcionalmente por ou durante cerca de 1 hora ou por ou durante cerca de 25 minutos.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 57, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas durante a incubação estão, em uma relação molar de X: 1, em que X é o número de resíduos de lisina disponíveis para serem tiolados por molécula de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas durante a incubação está em uma relação molar de 1 : 1 a 8: 1 ou 2 : 1 a 6 : 1, opcionalmente ou a cerca de 4: 1.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 59, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas a um pH entre 6,8 e 7,5 ou entre 7,0 e 7,4,
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14/25 cada qual inclusive, opcionalmente em um pH igual ou superior a 7,2.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 60, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas são incubadas em temperatura ambiente, opcionalmente entre 20°C e 25°C, inclusive, opcionalmente em ou cerca de 23°C ou em ou cerca de 24°C.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 61, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas são incubadas por entre 15 minutos e 6 horas ou 30 minutos e 2 horas, cada qual inclusive, opcionalmente por ou durante cerca de 1 hora.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 62, caracterizado pelo fato de que a geração da composição de partícula compreendendo as partículas oligoméricas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina compreende ainda terminar a reação das moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e das moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas entrando em contato com as moléculas com Netilmaleimida (NEM).
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 63, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação e pelo menos uma porção da incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação são realizadas separadamente ao mesmo tempo.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza
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15/25 do peto fato de que a incubação da primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de ativação e a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com o agente de tiolação são realizadas por substancialmente a mesma quantidade de tempo e/ou são concluídas substancialmente ao mesmo tempo.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 65, caracterizado pelo fato de que, antes de incubar as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tloladas e as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas, o método compreende:
(I) remover o agente de ativação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas; e/ou (li) remover o agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 66, caracterizado pelo fato de que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas e a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas é iniciada dentro de 15 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com o agente de tiolação ser finalizada e/ou após a remoção do agente de tiolação da composição compreendendo as moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina tioladas.
68. Método para a produção de reagentes de partícula oligoméricos, caracterizado pelo fato de que compreende:
incubar uma primeira pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com Succinimidil-6-[(p
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16/25 maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH) por ou durante cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas compreendendo um grupo funcional de reação a maleimida tiol;
incubar uma segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina com 2-iminotiolano por ou durante cerca de 1 hora a um pH entre 7,5 e 8,5, inclusive, gerando assim uma pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas compreendendo um ou mais grupos funcionais tiol; e incubar a pluralidade de moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas por ou durante cerca de 1 hora a um pH de ou de cerca de 7,2, gerando assim uma composição de partículas compreendendo os reagentes de partícula oligoméricos;
em que a incubação da pluralidade de moléculas de estreptavidina ativadas com a pluralidade de moléculas de estreptavidina tioladas é iniciada dentro de 10 minutos após a incubação da segunda pluralidade de moléculas de estreptavidina com extremidades de 2iminotiolano.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 68, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda o contato dos reagentes de partícula oligoméricos com um agente estabilizador.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43 e 69, caracterizado pelo fato de que o agente estabilizador reduz uma quantidade de iminotiolano N-substituído presente em resíduos de lisina dos reagentes de partícula oligoméricos.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, 69 e 70, caracterizado pelo fato de que o agente estabilizador compreende hidroxilamina.
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17/25
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43 e 69 a 71, caracterizado pelo fato de que o agente estabilizador é removido dos reagentes de partícula oligoméricos por uma cromatografia, opcionalmente por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 72, caracterizado pelo fato de compreender ainda a esterilização por filtro dos reagentes de partícula oligoméricos.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43 e 45 a 73, caracterizado pelo fato de que os reagentes de partícula oligoméricos são separados do monômero ou moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina oligoméricas menores por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC).
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a SEC compreende um limite de exclusão por tamanho e o limite de exclusão por tamanho é superior ou superior a cerca de 100 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1000 kDa ou 2000 kDa.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o limite de exclusão por tamanho é de ou de cerca de 500 kDa a 1000 kDa, opcionalmente é ou é de cerca de 75 kDa.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43 e 45 a 76, caracterizado pelo fato de que compreende a coleta de uma ou mais frações compreendendo um volume vazio, separando assim os reagentes de partícula oligoméricos do monômero ou moléculas de estreptavidina ou de muteína de estreptavidina oligoméricas menores.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 77, caracterizado pelo fato de compreender ainda a mistura dos reagentes de partícula oligoméricos com um ou mais agentes sob condições para ligar reversivelmente o um ou mais agentes aos rea
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18/25 gentes de partícula oligoméricos.
79. Reagente de partícula oligomérico, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78.
80. Método de multimerizaçâo de um ou mais agente para um reagente de partícula oligomérico, caracterizado pelo fato de que o método compreende a mistura de um reagente de partícula ollgomérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, uma composição compreendendo uma pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos como definidos em qualquer uma das reivindicações 32 a 40 ou um reagente de partícula oligomérico produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78, com um ou mais agentes sob condições para ligar reversivelmente o um ou mais agentes aos reagentes de partícula oligoméricos.
81. Método, de acordo com a reivindicação 78 ou 80, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes compreende um par de ligação, em que o par de ligação é capaz de se ligar a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
83. Método, de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp -Ser-His-ProGln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser-His- Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-ProGln-Phe- Glu-Lis-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-GlnPhe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19).
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19/25
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 83, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a 86, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é um agente de ligação ao receptor que se liga ou é capaz de se ligar a um receptor expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície de uma célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
89. Método, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula imune.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 89, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula T.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 90, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, se liga a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou se liga especificamente ao CD3.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica
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20/25 ções 87 a 91, caracterizado pelo fato de que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o método compreende ainda a ligação reversível ao reagente de partícula oligomérico a um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, cuja ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimlocina ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que Induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
94. Método, de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 e 80 a 94, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes são um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti~CD28, opcionalmente um Fab antl-CD3 e um Fab anti-CD28.
96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 90, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina, ou é ou compreende uma molécula de adesão
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21/25 ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 e 80 a 96, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes compreende um agente de seleção, em que o agente de seleção se liga a ou é capaz de se ligar a um marcador de seleção que é expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula imune, opcionalmente uma célula T.
99. Método, de acordo com a reivindicação 97 ou 98, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é CCR7, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L e/ou CD127.
100. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de reagentes de partícula oligoméricos produzidos pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78 e 80 a 99.
101. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende o reagente de partícula oligomérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, a composição compreendendo uma pluralidade de reagentes oligoméricos como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 40 e 100 ou o reagente oligomérico produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78 e 80 a 99.
102. Método para modular células, caracterizado pelo fato de que o método compreende a incubação de uma composição celular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, a composição compreendendo uma pluralidade de reagentes oligoméricos como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 40 e 100,
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22/25 ou um reagente oligomérico produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78 e 80 a 99, modulando assim as células-alvo.
103. Método para cultivo de células, caracterizado pelo fato de que o método compreende incubar uma composição celular compreendendo células-alvo na presença do reagente de partícula oligomérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, a composição compreendendo uma pluralidade de reagentes oligoméricos como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 40 e 100, ou um reagente oligomérico produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 78 e 80 a 99.
104. Método, de acordo com a reivindicação 102 ou 103, caracterizado pelo fato de que o reagente de partícula oligomérico está ligado reversivelmente a um ou mais agentes de ligação ao receptor que se ligam ou são capazes de se ligar a um receptor expresso sobre a superfície de uma célula-alvo.
105. Método, de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes de ligação ao receptor compreende um par de ligação, em que o par de ligação é reversivelmente ligado a um ou mais sítios de ligação no reagente de partícula oligomérico.
106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina.
107. Método, de acordo com a reivindicação 105 ou 106, caracterizado pelo fato de que o par de ligação compreende um peptídeo de ligação à estreptavidina selecionado a partir do grupo que consiste em Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8), Trp -SerHis-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-PheGlu-Lys ((SEQ ID NO: 17), Trp-Ser-His- Pro-Gln-Phe-Glu-Lys
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23/25 (GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18) e Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe- Glu-Lis-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-TrpSer-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19).
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 87 a 107, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes de ligação ao receptor compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
109. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes de ligação ao receptor é ou compreende um fragmento de anticorpo monovalente.
110. Método, de acordo com a reivindicação 108 ou 109, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes é ou compreende um Fab.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 110, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula imune.
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 111, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma célula T.
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 112, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é ou compreende um agente estimulador capaz de se ligar a uma molécula sobre a superfície da célula-alvo, em que a ligação induz ou modula um sinal na célula-alvo.
114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 113, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ao receptor é capaz de iniciar um sinal associado ao complexo TCR/CD3 nas células T, se liga a um membro de um complexo TCR/CD3; e/ou se liga especificamente ao CD3.
115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114,
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24/25 caracterizado pelo fato de que o agente estimulador é um primeiro agente de ligação ao receptor e o reagente de partícula oligomérico compreende um segundo agente de ligação ao receptor, em que o segundo agente de ligação ao receptor é capaz de se ligar especificamente a uma segunda molécula sobre a superfície da célula-alvo, em que a ligação à segunda molécula é opcionalmente capaz de induzir ou modular um sinal nas células-alvo.
116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora, molécula acessória, molécula do ponto de checagem imune, é um membro da família TNF ou receptor da família TNF, receptor de citocina, receptor de quimiocina ou é ou compreende uma molécula de adesão ou um fator que induz a produção de citocina, produção de quimiocina e/ou expressão de uma molécula de adesão.
117. Método, de acordo com a reivindicação 115 ou 116, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação ao receptor se liga especificamente a uma molécula coestimuladora e a molécula coestimuladora é CD28.
118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 117, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes são um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, opcionalmente um Fab anti~CD3 e um Fab anti~CD28.
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 102 a 118, caracterizado pelo fato de que as células-alvo expressam um receptor recombinante, opcionalmente um receptor de célula T recombinante e/ou um receptor de antígeno quimérico (CAR).
120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 119, caracterizado pelo fato de compreender ainda a interrupção da ligação reversível entre o um ou mais agentes e o reagente
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25/25 de partícula oligomérico, a referida interrupção compreendendo a introdução nas células-alvo de uma substância capaz de reverter ou competir com a ligação entre o agente ou mais agente e o reagente de partícula oligomérico.
121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que a substância compreende bíotina ou um análogo de bíotina, opcíonalmente uma D-bíotína.
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