CN101267834B - 白介素-1偶联物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种包含有序且重复的抗原阵列的组合物，其中所述抗原是IL-1蛋白、IL-1突变蛋白或IL-1片段。更具体地，本发明提供一种包含病毒样颗粒和与该病毒样颗粒连接的至少一种IL-1蛋白、IL-1突变蛋白或至少一种IL-1片段的组合物。本发明还提供一种制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备治疗炎性疾病和慢性自身免疫病、遗传疾病和心血管疾病的疫苗。本发明的组合物有效地诱导免疫应答，特别是抗体应答。而且，本发明的组合物尤其可用于在所述环境内有效地诱导自身特异性免疫应答。

Description

白介素-1偶联物及其用途
发明领域
本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒和至少一种抗原的组合物，其中所述抗原是与该VLP或病毒颗粒共价连接的白介素-1(IL-1)蛋白、IL-1片段或肽或IL-1突变蛋白。本发明也提供一种制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以用于制备治疗包括类风湿性关节炎、骨关节炎等在内的多种人类疾病的疫苗。本发明的组合物由此诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。
相关技术
IL-1是由包括巨噬细胞、树突细胞、B细胞和T细胞在内的各种细胞型产生的一种强促炎细胞因子(Dinarello C.A.，1991.Blood77(8)：1627-1652)。它由两个分子类型组成，IL-1α和IL-1β，它们只有有限的序列相同性，但是通过与I型IL-1受体(IL-1RI))结合发挥类似的生物活性(Dinarello C.A.等人，1997，Cytokine & Growth Factor Rev.8：253)。两种IL-1分子也都与第二种IL-1受体(IL-1RII)结合，该受体缺少细胞内信号域，被认为作为诱饵受体起调节作用(Dinarello C.A.等人，1997，Cytokine & Growth Factor Rev.8：253)。另外，IL-1家族的第三个成员，IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)，与两种受体结合，而不发挥任何对抗活性。IL-1ra与IL-1RII和IL-1RI和IL-1RII的脱落形式一起抵消IL-1α和IL-1β的活性，并且确保炎症反应的紧密调节。
在许多人类疾病中观察到IL-1介导的炎症应答的异常调节，包括类风湿性关节炎、炎性肠病、肾病、骨质疏松症等。在每种这样的疾病中，IL-1的过量产生和/或IL-1ra的产生不足都会诱发疾病发展(Arend W.P.，2002，Cytokine & Growth Factor Reviews 13：323-340)。重组形式的IL-1ra(阿那白滞素，Kineret)在减轻炎症和防止几种炎性疾病的组织损伤方面是有效的，但是该药物需要高系统浓度，具有短半衰期，因此需要频繁地(每天)施用高剂量(约100mg)，导致药物成本高和潜在的患者依从性问题(Kineret处方信息，Amgen；Granowitz E.V.等人1992，Cytokine 4：353)。另外，一大部分患者产生抗Kineret
Figure 2006800343698_2
的抗体，该抗体潜在中和了药物的生物活性(Fleischmann R.M.，等人，2003，Arthritis Rheum 46：2287)。
因此，新的治疗技术集中于主动免疫策略，该策略诱导患者的免疫系统产生IL-1-中和抗体。Svenson和同事(2000，J.Immunol.Methods236：1-8)用与纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)化学交联的重组IL-1α免疫了小鼠，观察到中和IL-1α的生物活性的抗体的诱导。这一策略依赖于通过自身抗原与外源抗原的物理连接而向自身反应性B细胞提供T细胞帮助。
美国专利6,093,405描述了一种通过用含有化学或物理灭活的细胞因子本身的免疫原性组合物进行免疫，来降低循环细胞因子的水平的方法。在该方法中，通过物理或化学处理使天然细胞因子具有免疫原性，而本发明公开了一种通过将天然细胞因子以高度重复的方式展示在VLP表面上而使它们具有免疫原性的方法。此外，WO2003/084979描述了含有长度为5-40个氨基酸的细胞因子衍生肽的免疫原性化合物在治疗与细胞因子过量产生有关的疾病中的用途。
发明内容
现在，我们惊奇地发现，本发明的分别包含至少一种IL-1分子的组合物和疫苗不仅能够诱导针对IL-1的免疫应答，特别是抗体应答，而且能够在体内中和IL-1的促炎活性。另外，我们还惊讶地发现，IL-1分子当根据本发明与VLP共价连接时，在小鼠类风湿性关节炎模型中能够防止炎症和关节炎的临床体征。而且，我们还发现本发明的组合物比重组IL-1受体拮抗剂Kineret
Figure 2006800343698_3
(被批准用于治疗人类类风湿性关节炎)更好地保护小鼠不发展关节炎症状(实施例7)。此外，我们还惊奇地发现，本发明的组合物当注射到遗传敏感的小鼠体内时能够抑制动脉粥样硬化症状的发生(实施例4)，因此是一种有效的动脉粥样硬化治疗剂。此外，我们还证明了IL-1α与动脉粥样硬化的发病机理有关。
因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是优选选自IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽和IL-1突变蛋白的IL-1分子，其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，优选地形成有序且重复的抗原阵列。在本发明的优选实施方案中，适合在本发明中使用的病毒样颗粒包括病毒(优选RNA噬菌体)的重组蛋白，优选重组外壳蛋白、其突变体或片段。在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种IL-1成熟片段，该片段优选地具有IL-1的生物活性。因此，本发明利用在病毒样颗粒上以高度重复的方式呈现自身抗原来刺激自身反应性B细胞。
在另一方面，本发明提供一种疫苗组合物。
而且，本发明提供一种给人或动物、优选给哺乳动物施用该疫苗组合物的方法。本发明的疫苗组合物一般且优选地在不含至少一种佐剂的情况下能够诱导强免疫应答，特别是抗体应答。因此，在一个优选实施方案中，该疫苗组合物不含佐剂。避免使用佐剂可以减少不希望的炎性T细胞应答的可能的发生。
在一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。在一个进一步优选的实施方案中，所述RNA噬菌体是选自Qβ、fr、GA和AP205的RNA噬菌体。在一个进一步优选的实施方案中，分别在组合物和疫苗组合物中所含的所述RNA噬菌体的VLP在宿主中重组产生，并且所述RNA噬菌体的VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。减少(或者优选地消除)宿主RNA的量以避免不希望的T细胞应答以及其他不希望的副作用(如发热)是有利的。
在一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述疾病选自：(a)血管疾病；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病；(c)慢性自身免疫炎性疾病；(d)骨和软骨变性性疾病；(e)变态反应疾病；和(f)神经疾病；在这些疾病中，IL-1蛋白介导其病症或对其病症有贡献，其中该方法包括给动物(优选给人)分别施用本发明的组合物或本发明的疫苗组合物。其中IL-1蛋白介导或贡献于其病症的疾病例如是动脉粥样硬化、家族性地中海热、类风湿性关节炎、骨关节炎和变态反应。
在另一方面，本发明提供包含本发明的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。
再另一方面，本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包括：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
附图说明
图1：mIL-1β119-269蛋白与Qβ衣壳蛋白的偶联
在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝将该凝胶染色。在左边空白处给出了标记蛋白质的分子量，单位是kDa，右边空白处标明了蛋白质带的身份。泳道1：预染色的蛋白质标记物(New England Biolabs)。泳道2：衍生的Qβ衣壳蛋白。泳道3：游离的还原的mIL-1β119-269蛋白。泳道4：Qβ-mIL-1β119-269偶联反应物。
图2：mIL-1α117-270蛋白与Qβ衣壳蛋白的偶联
在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析蛋白质。用考马斯亮蓝将该凝胶染色。在左边空白处给出了标记蛋白质的分子量，单位是kDa，右边空白处标明了蛋白质带的身份。泳道1：预染色的蛋白质标记物(New England Biolabs)。泳道2：衍生的Qβ衣壳蛋白。泳道3：游离的还原的mIL-1α117-270蛋白。泳道4：Qβ-mIL-1α117-270偶联反应物。
发明详述
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
佐剂：本文使用的术语“佐剂”涉及免疫应答的非特异性刺激物或使宿主内产生贮库(depot)的物质，当与本发明的疫苗和药物组合物分别组合时，可以提供增强的免疫应答。优选的佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂，含铝佐剂，优选氢氧化铝，和修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂有矿物质凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔
Figure 2006800343698_4
血蓝蛋白、二硝基酚，和人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些佐剂也是本领域已知的。可以和本发明的组合物一起施用的其他佐剂包括但不限于，单磷酸类脂免疫调节剂、Adju Vax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294、和病毒颗粒佐剂技术。所述佐剂也可以包含上述物质的混合物。VLP通常被描述为佐剂。然而，在本申请上下文中使用的术语“佐剂”是指不是用于本发明组合物的VLP，而是涉及另外一种不同成分的佐剂。
抗原：本文所用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递，则能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或者连接于Th细胞表位上，并且在佐剂中提供。一个抗原可能具有一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应的意思是，抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
表位：术语表位是指抗原(优选多肽)的连续或不连续的部分，其中所述部分可以被抗体或在MHC分子环境内被T细胞受体特异性地结合。对于抗体，特异性结合排除了非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。表位在对于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。
特异性结合(抗体/抗原)：在本申请中，如果抗体与抗原以106M-1或更高、优选107M-1或更高、更优选108M-1或更高、最优选109M-1或更高的结合亲和力(Ka)结合，则被定义为特异性结合。抗体的亲和力可以由本领域技术人员容易地测定(例如，通过Scatchard分析、ELISA或Biacore分析)。
特异性结合(IL-1/IL-1受体)：受体和受体配体之间的相互作用可以用本领域公知的生物物理方法来表征，所述方法包括，例如，ELISA或Biacore分析。当IL-1与IL-1受体的结合亲和力(Ka)至少为105M-1，优选至少106M-1，更优选至少107M-1，再更优选至少108M-1，最优选至少109M-1时，认为所述IL-1分子能够特异性结合所述IL-1受体；其中优选地所述IL-1受体是来自小鼠或人、最优选地来自人的IL-1受体。进一步优选地，所述IL-1受体包含序列SEQ ID NO：166至SEQ ID NO：169中的任一种或者更优选地由该序列组成，最优选地所述IL-1受体包含序列SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167中的任一种或者更优选地由该序列组成。
联接的(associated)：本文所用的术语“联接的”或“联接”是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个分子连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。
第一附着位点：本文所用的短语“第一附着位点”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应性基团的一个优选的实施方案是氨基酸(优选赖氨酸)的氨基。第一附着位点一般位于VLP的表面上，优选位于VLP的外表面上。多个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键联接。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点自然存在于VLP中。或者，在一个优选的实施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。
第二附着位点：本文使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于或者人工添加到IL-1分子上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。IL-1分子的第二附着位点优选地是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应性基团，例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应性基团的一个优选的实施方案是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基。本文使用的术语“具有至少一个第二附着位点的IL-1分子”因此是指包含IL-1分子和至少一个第二附着位点的构建体。然而，特别是对于并非天然存在于IL-1分子内的第二附着位点，这种构建体一般且优选地进一步含有“接头”。在另一个实施方案中，第二附着位点与IL-1分子通过至少一个共价键，优选地通过至少一个肽链联接。在一个进一步的实施方案中，第二附着位点天然存在于IL-1分子内。在另外一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点被通过接头人工添加到IL-1分子上，其中所述接头包含半胱氨酸或由半胱氨酸组成。优选地，所述接头与IL-1分子通过肽键融合。
外壳蛋白：本申请中的术语“外壳蛋白”和可交换使用的术语“衣壳蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质，优选病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚单位。
IL-1分子：本文使用的术语“IL-1分子”或简写“IL-1”是指任何多肽，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：116、SEQ IDNO：130至SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：165的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。本文使用的术语“IL-1分子”优选地是指任何IL-1蛋白、IL-1片段、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：130至SEQ IDNO：140和SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：165的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。本文使用的术语IL-1分子典型且优选地还指任何动物种的IL-1蛋白的直向同源物。IL-1分子优选地但不是必须地能够与IL-1受体结合并且进一步优选地具有生物活性。
IL-1α分子：本文使用的术语“IL-1α分子”或简写“IL-1α”是指IL-1α蛋白、IL-1α片段、IL-1α成熟片段、IL-1α肽或IL-1α突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ IDNO：36至48、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67至SEQID NO：88和SEQ ID NO：163的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。IL-1α的一种特别优选的实施方案是人IL-1α119-271(SEQ IDNO：63)。
IL-1β分子：本文使用的术语“IL-1β分子”或简写“IL-1β”是指IL-1β蛋白、IL-1β片段、IL-1β成熟片段、IL-1β肽或IL-1β突变蛋白，其包含一种多肽或者由该多肽组成，该多肽的氨基酸序列与选自SEQ IDNO：49至SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：89至SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：130至SEQ ID NO：140、SEQ IDNO：164和SEQ ID NO：165的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。IL-1β的一种特别优选的实施方案是人IL-1β117-269(SEQ IDNO：64)。
IL-1蛋白：本文使用的术语“IL-1蛋白”是指一种天然存在的蛋白质，其中所述天然存在的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQID NO：62的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性；或者其中所述天然存在的蛋白质能够与IL-1受体结合，优选地具有生物活性。本文使用的术语“IL-1蛋白”优选地是指一种天然存在的蛋白质，其中所述天然存在的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：62的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性；并且其中所述天然存在的蛋白质能够与IL-1受体结合，优选地具有生物活性。典型且优选地，本文使用的术语“IL-1蛋白”是指至少一种天然存在的蛋白质，其中所述蛋白质能够与IL-1受体结合，并且具有生物活性，其中进一步地所述蛋白质包含一种多肽或由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：36至SEQ ID NO：62的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。相应地，术语“IL-1α蛋白”涉及包含一种多肽或者由该多肽组成的IL-1蛋白，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：48的任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性，而术语“IL-1β蛋白”涉及包含一种多肽或者由该多肽组成的IL-1蛋白，所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO：49至SEQ ID NO：62的任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
IL-1片段：本文使用的术语“IL-1片段”涉及含有IL-1蛋白的连续序列段的多肽，其中所述多肽的长度为至少50个、优选至少100个、最优选至少150个氨基酸。典型且优选地，所述IL-1片段的长度最多为300个、更优选最多250个、最优选最多200个氨基酸。典型且优选地，IL-1片段能够与IL-1受体结合，进一步优选地具有生物活性。相应地，术语“IL-1α片段”和“IL-1β片段”涉及如上定义的IL-1片段，其中所述IL-1蛋白分别是IL-1α蛋白或IL-1β蛋白。
IL-1成熟片段：本文使用的术语“IL-1成熟片段”涉及IL-1片段，其中所述IL-1片段是IL-1蛋白的天然存在的成熟产物。相应地，本文使用的术语“IL-1α成熟片段”和“IL-1β成熟片段”涉及如上定义的IL-1成熟片段，其中所述IL-1蛋白分别是IL-1α蛋白或IL-1β蛋白。IL-1α成熟片段的优选实施方案是SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ IDNO：163。IL-1β成熟片段的优选实施方案是SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165。
优选的IL-1α成熟片段包含选自下组的氨基酸序列或者优选地由所述氨基酸序列组成：(a)人IL-1α119-271(SEQ ID NO：63)；(b)小鼠IL-1α117-270(SEQ ID NO：65)；(c)小鼠IL-1α117-270(SEQ ID NO：163)；和(e)与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：163任一种至少80％、或优选至少90％、更优选至少95％、或最优选至少99％相同的氨基酸序列。
优选的IL-1β成熟片段包含选自下组的氨基酸序列或者优选地由所述氨基酸序列组成：(a)人IL-1β117-269(SEQ ID NO：64)；(b)人IL-1β116-269(SEQ ID NO：165)；(c)小鼠IL-1β119-269(SEQ ID NO：66)；(d)小鼠IL-1β119-269(SEQ ID NO：164)；和(e)与SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165任一种至少80％、或优选至少90％、更优选至少95％、或最优选至少99％相同的氨基酸序列。
IL-1肽：本文使用的术语“IL-1肽”涉及一种含有天然存在的蛋白质的连续序列段的多肽，其中所述蛋白质能够与IL-1受体结合，并且优选地具有生物活性，其中所述多肽的长度为4-49个，优选6至35个，最优选10至25个氨基酸。IL-1肽可以，但是一般不能够结合IL-1受体，典型地没有生物活性。相应地，本文使用的术语“IL-1α肽”和“IL-1β肽”涉及如上定义的IL-1肽，其中所述天然存在的蛋白质分别是IL-1α蛋白或IL-1β蛋白。优选的IL-1肽是SEQ ID NO：82至SEQ IDNO：116。
IL-1突变蛋白：本文使用的术语“IL-1突变蛋白”包含由IL-1分子、优选地由IL-1α或IL-1β蛋白、IL-1α或IL-1β片段、IL-1α或IL-1β成熟片段或IL-1α或IL-1β肽衍生的任何多肽，或者优选地由所述多肽组成，其中优选地所述多肽显示比衍生出它的IL-1分子降低的生物活性。相应地，IL-1α突变蛋白和IL-1β突变蛋白是以上定义的IL-1突变蛋白，其中所述多肽分别衍生自IL-1α分子或IL-1β分子。
在优选的IL-1突变蛋白中，所述生物活性低于衍生出它的IL-1分子的生物活性的80％，更优选低于60％，更优选低于40％，更优选低于20％。进一步优选的IL-1突变蛋白衍生自IL-1成熟片段，其中所述IL-1突变蛋白的生物活性低于衍生所述IL-1突变蛋白的IL-1成熟片段的生物活性的80％，更优选低于60％，更优选低于40％，更优选低于20％。非常优选的IL-1突变蛋白不显示生物活性。进一步优选地，但不是必须地，IL-1突变蛋白能够特异性结合IL-1受体。非常优选的是衍生自以下物质的IL-1突变蛋白：(i)IL-1蛋白，优选来自SEQ IDNO：36至SEQ ID NO：62；或(ii)更优选IL-1成熟片段，优选来自SEQID NO：63至SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：163至SEQID NO：165中的任一种。
在上下文中有用的IL-1突变蛋白已经在以下文献中描述：Kamogashira等人(1988)J.Biochem.104：837-840；Gehrke等人(1990)The Journal of Biological Chemistry 265(11)：5922-5925；Conca等人(1991)The Journal of Biological Chemistry 266(25)：16265-16268；Ju等人(1991)PNAS 88：2658-2662；Auron等人(1992)Biochemistry 31：6632-6638；Guinet等人(1993)Eur.J.Biochem 211：583-590；Camacho(1993)Biochemistry 32：8749-8757；Baumann(1993)Journal of Recepror Research13(1-4)：245-262；Simon(1993)The Journal of Biological Chemistry268(13)：9771-9779；和Simoncsits(1994)Cytokine 6(2)：206-214，它们的公开内容在此引用作为参考。
优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1蛋白、IL-1片段、IL-1成熟片段或IL-1肽的氨基酸序列有1至10个、优选1至6个，更优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸残基是一个连续序列段。进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1蛋白、IL-1片段、或IL-1成熟片段的氨基酸序列有1至10个、优选1至6个，更优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。
进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：62中任一种的氨基酸序列有1至10个、优选1至6个，更优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自以下序列的氨基酸序列有1至10个、优选1至6个，更优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同：(i)SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：65和SEQ ID NO：163中的任一种，最优选SEQ ID NO：63；或(ii)选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165的任一种，最优选SEQ ID NO：64，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。
进一步优选的IL-1突变蛋白是IL-1α突变蛋白，其中所述IL-1α突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：48中任一种的氨基酸序列有1至6个，优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1α突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：163中任一种，最优选SEQ ID NO：63的氨基酸序列有1至6个，优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。非常优选的IL-1α突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：63的氨基酸序列有1至10个、优选1至6个，更优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。
进一步优选的IL-1突变蛋白是IL-1β突变蛋白，其中所述IL-1α突变蛋白包含一种多肽或者更优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：62中任一种的氨基酸序列有1至6个，优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。进一步优选的IL-1β突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165，最优选SEQ ID NO：64的氨基酸序列有1至6个，优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。非常优选的IL-1β突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：64的氨基酸序列有1至10个，优选1至6个，优选1至5个，更优选1至4个，更优选1至3个，更优选1至2个，最优选正好1个氨基酸残基不同，其中优选地所述氨基酸残基(i)从所述多肽上删除，(ii)插入所述多肽内，(iii)更换为另外一种氨基酸残基，或者(iv)(i)至(iii)的任意组合。更优选的IL-1β突变蛋白包含一种多肽或者优选地由该多肽组成，所述多肽具有选自SEQ ID NO：131至SEQ ID NO：140中任一种的氨基酸序列。
IL-1的促动效应/生物活性：本文用于IL-1的术语“生物活性”或“生物活性的”是指IL-1分子在给动物全身施用后诱导IL-6产生的能力，优选地如实施例2E和实施例3E所述。IL-1分子的生物活性也指诱导胸腺细胞(Epps等人，Cytokine 9(3)：149-156(1997))、D10.G4.1T辅助细胞(Orencole和Dinarello，Cytokine 1(1)：14-22(1989))增殖的能力，或诱导MG64或HaCaT细胞(Boraschi等人，J.Immunol.155：4719-4725(1995))或成纤维细胞(Dinarello等人，Current Protocols in Immunology 6.2.1-6-2-7(2000))产生IL-6的能力，或者诱导EL-4胸腺瘤细胞产生IL-2(Simon等人，J.Immunol.Methods 84(1-2)：85-94(1985))的能力，或者抑制人骨髓瘤细胞系A375生长的能力(Nakai等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.154：1189-1196(1988))。
连接的：本文所用的术语“连接的”或“连接“是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，本文所用的术语“连接”不仅指至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个、优选一个异双功能交联剂连接。在其他优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个肽键连接，更优选只通过肽键连接。在一个非常优选的实施方案中，第一附着位点和第二附着位点只通过肽结合连接，优选通过直接基因融合或优选地通过氨基酸接头的基因融合连接。在一个进一步优选的实施方案中，第二附着位点只通过肽结合，优选地通过基因融合，与所述第一附着位点的C末端连接。
接头：本文所用的“接头”将第二附着位点与IL-1分子联接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或者由第二附着位点组成。优选地，本文所用的“接头”已经包含第二附着位点，典型且优选地—但不是必需地—为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。本文所用的“接头”也被称为“氨基酸接头”，特别是当本发明的接头含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语“接头”和“氨基酸接头”在本文中可以交换使用。然而，这并不意味着这种接头仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的接头是本发明的优选的实施方案。接头的氨基酸残基优选地由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物组成。本发明的接头的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也包括在本发明中。可用于本发明的其他接头有包含C1-C6烷基-、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选地包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基-或杂芳基-部分和另外的氨基酸的接头也可以用作本发明的接头，并且包括在本发明的范围内。接头与IL-1分子优选地通过至少一个共价键、更优选地通过至少一个肽键联接。在通过基因融合连接的情况中，接头可以不存在，或者优选地是氨基酸接头，更优选地是仅仅由氨基酸残基组成的氨基酸接头。非常优选的用于基因融合的接头是柔性氨基酸接头。在通过基因融合连接的情况中，接头优选地由1-20个、更优选2-15个、更优选2-10个、更优选2-5个、最优选3个氨基酸组成。非常优选的用于基因融合的接头包含GSG(SEQ ID NO：189)或者优选地由GSG组成。
有序且重复的抗原阵列：本文所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，或者其特征在于抗原相对于病毒样颗粒的空间排列具有典型且优选地高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是几何模式。本发明的某些实施方案，例如与RNA噬菌体的VLP偶联的抗原，是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优选的实例，而且其优选地具有严格重复的类晶体抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。
包装的：本文所用的术语“包装的”是指聚阴离子大分子或免疫刺激物相对于VLP的状态。本文所用的术语“包装”包括结合，该结合可以是共价的，例如化学偶联，也可以是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。该术语也包括聚阴离子大分子的包封或部分包封。因此，聚阴离子大分子或免疫刺激物可以被VLP包封，而不需要存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子或免疫刺激物被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式包装。在所述免疫刺激物是核酸，优选地是DNA的情况中，术语包装的含意是所述核酸对于核酸酶水解而言是不可及的，优选地对于DNAse水解(例如DNAseI或Benzonase)是不可及的，其中优选地所述可及性如WO2003/024481A2的实施例11-17所述测定。
多肽：如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如：糖基化、乙酰化、磷酸化等。
重组VLP：本文使用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。本文使用的术语“重组产生的VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的VLP。因此，术语“重组VLP”和“重组产生的VLP”在本文中可以互换使用，具有相同的含义。
病毒颗粒：本文使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具有额外的结构(例如被膜、尾等)。
本文使用的病毒样颗粒(VLP)是指非复制性或非传染性的、优选非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者是指非复制性或非传染性的、优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒、优选病毒衣壳的结构。本文使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所含的基因组。本文使用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因组已经被物理或化学灭活的病毒颗粒。典型且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体、优选RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360个和360个以上的病毒蛋白亚单位。典型且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成具有固有的重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述结构一般是球形或管状。例如，RNA噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面体对称的球形形式。本文使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白亚单位组成的大分子装配体，其类似于上述定义的衣壳形态，但是不同于典型的对称装配体，同时保持足够程度的顺序和重复性。病毒颗粒和病毒样颗粒的一个共同特征是其亚单位高度有序且重复的排列。
RNA噬菌体的病毒样颗粒：本文使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段、或者优选地基本由其组成、或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的基因，一般也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义应当也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，这样也可产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。优选的来源于RNA噬菌体的VLP表现为二十面体对称，并且由180个亚单位(单体)组成。使RNA噬菌体的病毒样颗粒成为非复制性和/或非传染性的优选方法是通过物理、化学灭活，如紫外线照射、甲醛处理，一般且优选地是通过遗传操作。
一种或一个：术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序等已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序、优选使用Bestfit来确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。
本发明提供增强动物或人体中对IL-1的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是优选选自IL-1蛋白、IL-1成熟片段、IL-1肽和IL-1突变蛋白的IL-1分子，其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，所述IL-1分子与核心颗粒连接，从而形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在本发明的优选实施方案中，至少20个，优选至少30个，更优选至少60个，更优选至少120个，进一步更优选至少180个IL-1分子与核心颗粒连接。
可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本发明的VLP或病毒颗粒。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA或RNA病毒已经在WO 2004/009124的第25页第10-21行，第26页第11-28行，和第28页第4行到第31页第4行公开。这些公开的内容在此引入作为参考。
病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中产生和纯化。获得的用于疫苗目的的病毒或病毒样颗粒优选地是非复制性或非传染性的，更优选地是非复制性且非传染性的。紫外线照射、化学处理，如甲醛或氯仿处理，是本领域公知的灭活病毒的常用方法。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是病毒颗粒，并且其中优选地所述病毒颗粒是噬菌体，其中进一步优选地所述噬菌体是RNA噬菌体，其中进一步优选地所述RNA噬菌体是选自Qβ、fr、GA或AP205的RNA噬菌体。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是VLP。在一个进一步优选的实施方案中，VLP是重组VLP。几乎所有公知的病毒都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员能够容易地确定编码外壳蛋白的基因。通过在宿主中重组表达外壳蛋白制备VLP是本领域技术人员公知的常识。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者由选自下组的病毒的重组蛋白、其突变体或片段组成：a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))或其表面蛋白(WO 92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))；e)辛德毕斯病毒；f)轮状病毒(US5,071,651和US 5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))；h)诺沃克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))；i)甲病毒；.j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO96/30523)；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白p1；l)人乳头瘤病毒(WO98/15631)；m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和o)禽兽棚病毒。
包含一种以上不同的重组蛋白的VLP在本申请中通常被称为嵌合VLP。在一个实施方案中，VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含或者由一种以上的重组蛋白、优选两种重组蛋白、最优选两种重组衣壳蛋白、其突变体或片段组成。
本文使用的术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”被定义为一种多肽，其长度分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，并且优选地保留形成VLP的能力。优选地，该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。进一步优选地，所述片段通过最多5、4、3或2个内部缺失、通过最多2个截短或通过恰好一个它们的组合获得。
术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”还包括与以上定义的“重组蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”分别具有至少80％，优选90％，更优选95％的氨基酸序列同一性并且优选能够装配为病毒样颗粒的多肽。
术语“突变外壳蛋白”是指具有分别由野生型重组蛋白或外壳蛋白衍生的氨基酸序列的多肽，其中该衍生的氨基酸序列与野生型序列至少80％、优选至少85％、90％、95％、97％或99％相同，并且优选地保留装配为VLP的能力。
在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备已经在WO 00/32227、WO01/85208和WO 02/056905中公开，所有三篇文献在此都引用以作参考。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在WO01/056905的第34-39页已经公开。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽中，来介导IL-1分子与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO：1的氨基酸1-144、或1-149、1-185组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列(SEQ ID NO：170)的肽。这个修饰将SEQ ID NO：1改变为SEQ ID NO：2。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO：2的第48和110位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1-149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含、或由与SEQID NO：21至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段，或者基本由其组成，或者由其组成。优选地，该RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。
在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：3；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的混合物(QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：5(R17衣壳蛋白)；(d)SEQ ID NO：6(fr衣壳蛋白)；(e)SEQ ID NO：7(GA衣壳蛋白)；(f)SEQ ID NO：8(SP衣壳蛋白)；(g)SEQ ID NO：8和SEQID NO：9的混合物；(h)SEQ ID NO：10(MS2衣壳蛋白)；(i)SEQ IDNO：11(M11衣壳蛋白)；(j)SEQ ID NO：12(MX1衣壳蛋白)；(k)SEQ ID NO：13(NL95衣壳蛋白)；(l)SEQ ID NO：14(f2衣壳蛋白)；(m)SEQ ID NO：15(PP7衣壳蛋白)；和(n)SEQ ID NO：21(AP205衣壳蛋白)。
在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列，或者由该氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方案中，VLP包含RNA噬菌体的两种不同的外壳蛋白，或者由所述外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有CP Qβ(SEQ ID NO：3)和CP QβA1(SEQ ID NO：4)或CP SP(SEQ ID NO：8)和CP SP A1(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的重组外壳蛋白、其突变体或片段，或者基本由其组成，或者由其组成。
在一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。Qβ的衣壳或病毒样颗粒显示为二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，这些外壳蛋白通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4：543-5554(1996))，使Qβ衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。Qβ的衣壳或VLP显示对有机溶剂和变性剂有不同寻常的耐受性。我们惊奇地发现，高至30％的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ的衣壳或VLP的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。
根据本发明进一步优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒、特别是Qβ和fr的病毒样颗粒，已经在WO02/056905中公开，其公开内容在此引用作为参考。特别地，WO 02/056905的实施例18给出了由Qβ制备VLP颗粒的详细描述。
在另一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205 VLP的能够装配的突变形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，这产生本发明的其他优选的实施方案。WO 2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。WO 2004/007538在此引入作为参考。AP205 VLP具有高度免疫原性，能够与本发明的IL-1分子连接，典型且优选地产生以重复方式展示定向的IL-1分子的疫苗构建体。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的VLP包含病毒(优选RNA噬菌体)的突变外壳蛋白，或者由所述突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP包含病毒(优选RNA噬菌体)的突变外壳蛋白，或者由所述突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。至少一个赖氨酸残基的删除、置换或添加可以改变偶联程度，即病毒(优选RNA噬菌体)的VLP的每个亚单位上IL-1分子的量，特别是，用来匹配和适应疫苗的要求。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。本文使用的术语“抗原密度”是指VLP(优选RNA噬菌体)的VLP的每个亚单位上(优选每个外壳蛋白上)连接的IL-1分子的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP(优选RNA噬菌体的VLP)的所有亚单位上的平均数。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的拓扑学，3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部。优选地，至少一个第一附着位点是赖氨酸残基，指向或位于VLP的外部。
其暴露的赖氨酸残基被精氨酸取代的Qβ突变体可以用于本发明。这样，在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含下列物质，基本上由下列物质组成，或由下列物质组成：突变Qβ外壳蛋白。优选的突变外壳蛋白包含选自以下序列的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成；a)Qβ-240(SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：3的Lys13-Arg)，b)Qβ-243(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：3的Asn 10-Lys)，c)Qβ-250(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：3的Lys2-Arg)d)Qβ-251(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：3的Lys16-Arg)；和e)Qβ-259(SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：3的Lys2-Arg、Lys 16-Arg)。上述Qβ突变外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化在WO 02/056905中有描述。特别参考上述申请的实施例18。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含Qβ的突变外壳蛋白、或其突变体或片段和相应的A1蛋白，或者基本由其组成，或者由其组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：16、17、18、19或20的突变外壳蛋白和相应的A1蛋白，或者基本由其组成，或者由其组成。
其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后也显示自装配(Kastelein，RA.等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271：759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244：279-290，(1994))的生物学和生化性质。几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个反应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种抗原，优选1至4种，更优选1至3种，更优选1-2种，最优选正好1种抗原，其中所述至少一种抗原是IL-1分子，优选IL-1蛋白、IL-1片段、IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，其中所述IL-1分子优选地含有一种多肽或更优选地由该多肽组成，所述多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：130至SEQ IDNO：140和SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：165中任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述抗原是来源于选自下组的生物的IL-1分子：(a)人；(b)灵长类动物；(c)啮齿类动物；(d)马；(e)羊；(f)猫；(g)牛；(h)猪；(i)兔；(j)狗；(k)小鼠；和(g)大鼠。最优选地，所述IL-1分子来源于人类，优选地包含一种多肽，或者更优选由该多肽组成，所述多肽与选自SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64的任一种序列、SEQ IDNO：67-110的任一种序列、SEQ ID NO：130-140的任一种序列和SEQID NO：165具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子来源于大鼠或小鼠，优选小鼠，其中所述IL-1分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由该多肽组成，所述多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66的任一种序列、SEQ ID NO：111-116的任一种序列、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，IL-1分子是IL-1α分子，优选IL-1α蛋白、IL-1α片段、IL-1α成熟片段、IL-1α肽或IL-1α突变蛋白，其中所述IL-1α分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：36至48、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67至88和SEQ ID NO：165的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。IL-1α分子的特别优选的实施方案是人IL-1α分子，优选人IL-1α蛋白、人IL-1α片段或人IL-1α成熟片段，其中所述IL-1α分子优选地包含一种多肽或者更优选由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：63和SEQID NO：163中的任一种、最优选与SEQ ID NO：63具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1β分子，优选IL-1β蛋白、IL-1β片段、IL-1β成熟片段、IL-1β肽或IL-1β突变蛋白，其中所述IL-1β分子优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：49至62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：89至116、SEQ ID NO：130至SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165中的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。IL-1β分子的特别优选的实施方案是人IL-1β分子，优选人IL-1β蛋白、人IL-1β片段或人IL-1β成熟片段，其中所述IL-1β分子优选地包含一种多肽，或者更优选由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：130至SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：165中的任一种，最优选地与SEQ IDNO：64具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1蛋白、IL-1片段或优选IL-1成熟片段，其中所述IL-1蛋白、IL-1片段或IL-1成熟片段优选地能够与IL-1受体结合，更优选地另外也具有生物活性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1蛋白，其中所述IL-1蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：62中的任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1蛋白是IL-1α蛋白，其中所述IL-1α蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：48的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。最优选地，所述IL-1α蛋白是人IL-1α蛋白，其中所述人IL-1α蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：36具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述所述IL-1蛋白是IL-1β蛋白，其中所述IL-1β蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：49至SEQ IDNO：62的任一种序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。最优选地，所述IL-1β蛋白是人IL-1β蛋白，其中所述人IL-1β蛋白优选地包含一种多肽，或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：49具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述所述IL-1分子是IL-1片段，优选IL-1成熟片段，其中所述IL-1片段或所述IL-1成熟片段优选地来源于小鼠或人类，最优选地来源于人类。优选地，所述IL-1片段或所述IL-1成熟片段含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：130和SEQ ID NO：163至SEQ ID NO：165中的任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1成熟片段是IL-1α成熟片段，其中所述IL-1α成熟片段优选地具有生物活性，并且其中进一步，所述IL-1α成熟片段优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：65任一种，最优选地与SEQ ID NO：63具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1成熟片段是IL-1β成熟片段，其中所述IL-1β成熟片段优选地具有生物活性，并且其中进一步所述IL-1β成熟片段优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：130中的任一种，最优选地与SEQ ID NO：64具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1肽，其中所述IL-1肽来源于小鼠、大鼠或人类，最优选地来源于人类。优选地，所述IL-1肽优选地含有一种多肽或者更优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：116中的任一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子是IL-1突变蛋白，其中优选地所述IL-1突变蛋白包含降低的生物活性或更优选地没有生物活性，并且其中进一步所述IL-1突变蛋白能够结合IL-1受体。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1突变蛋白包含一种多肽或优选地由一种多肽组成，所述多肽的氨基酸序列与IL-1成熟片段的氨基酸序列有1至3个，更优选1-2个，最优选正好1个氨基酸残基不同。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1突变蛋白是IL-1β突变蛋白，优选人IL-1β突变蛋白，最优选选自SEQ ID NO：131至SEQ IDNO：140的人IL-1β突变蛋白。
本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包括：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1片段，优选IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白；和(c)将所述VLP与所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在一个优选实施方案中，提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，即IL-1分子、IL-1蛋白、IL-1片段、优选IL-1成熟片段、IL-1肽或IL-1突变蛋白，是通过表达，优选地通过在细菌系统中，优选地在大肠杆菌中表达而实现的。为了有利于纯化过程，通常添加纯化标签，如His标签、Myc标签、Fc标签或HA标签。在另一方法中，特别可以化学合成具有不长于50个氨基酸的IL-1肽或IL-1突变蛋白。
在本发明的一个优选实施方案中，具有至少一个第一附着位点的VLP与具有至少一个第二附着位点的IL-1分子通过至少一个肽键连接。编码IL-1分子(优选IL-1成熟片段)的基因符合读框地连接到编码VLP外壳蛋白的基因的内部或优选连接到其N末端或C末端。也可以通过将IL-1的序列插入部分外壳蛋白序列已经缺失的突变外壳蛋白(其进一步称为截短突变体)中实现融合。截短突变体可以具有外壳蛋白的部分序列的N末端或C末端或者内部缺失。例如，对于特异性VLP HBcAg，氨基酸79-80被替换为外源表位。该融合蛋白优选保留了在表达后装配为VLP的能力，这可以通过电镜检查。
可加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和外源表位之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列提供额外的柔性，可减少外源序列融合进入VLP亚单位序列时可能的去稳定效应，并且可减少外源表位的存在对装配的干扰。
在另外一些实施方案中，至少一种IL-1分子，优选IL-1成熟片段，能够与大量其它病毒外壳蛋白融合，例如，与Qβ的A1蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology 39：9-15(1996))，或者插入CP延伸的位点72和73之间。作为另一个实例，IL-1可以插入fr CP的氨基酸2和3之间，产生IL-1-fr CP融合蛋白(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。此外，IL-1也可以与RNA噬菌体MS-2的外壳蛋白的N末端突出β-发夹融合(WO 92/13081)。此外，IL-1也可以与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合，优选与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。将BPV-1 L1的氨基酸130-136置换为IL-1也是本发明的实施方案。将IL-1分子与病毒的外壳蛋白、其突变体或片段融合的实施方案已经在WO 2004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，在此引入作为参考。
US 5,698,424描述了一种能够形成衣壳的修饰的噬菌体MS-2外壳蛋白，其中通过向N端发夹区中插入半胱氨酸残基，以及通过将位于N端发夹区外部的每一个半胱氨酸残基置换为非半胱氨酸氨基酸残基，修饰了该外壳蛋白。插入的半胱氨酸然后可以直接连接到欲呈递的期望的分子种类如表位或抗原性蛋白质上。
然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可导致衣壳通过形成二硫键而寡聚化。而且，衣壳和抗原性蛋白质之间通过二硫键的连接是不稳定的，特别是对于含有巯基部分的分子不稳定，而且，在血清中例如比硫醚连接的稳定性差(Martin FJ.和Papahadjopoulos D.(1982)Irreversible Coupling of Immunoglobulinfragments to Preformed Vesicles.J.Biol.Chem.257：286-288)。
因此，在本发明的另一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种抗原即IL-1分子的联接或连接不包括二硫键。进一步优选的，所述至少一个第二附着位点包含，或优选地是巯基。而且，在本发明一个非常优选的实施方案中，VLP与至少一种IL-1分子的联接或连接不包括硫-硫键。进一步优选地，至少一个第二附着位点包含或者优选地是巯基。在另一个非常优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或不包含巯基。在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点不是或者不包含半胱氨酸的巯基。
在一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个第一附着位点包含氨基，并且所述第二附着位点包含巯基。
在一个进一步优选的实施方案中，只有一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键连接，形成单一且均匀类型的所述IL-1分子与所述核心颗粒的结合，其中与所述第一附着位点连接的所述只有一个第二附着位点是巯基，并且其中所述IL-1分子和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。
在另一个优选实施方案中，IL-1分子，优选IL-1蛋白，更优选IL-1成熟片段，更优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：66、最优选SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64、或者由上述序列组成的IL-1成熟片段，与RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N-或C-末端、优选与C-末端融合。含有RNA噬菌体AP205的外壳蛋白与抗原的融合蛋白的VLP在WO2006/032674A1中总体公开，在此引用作为参考。在一个进一步优选的实施方案中，融合蛋白进一步包含接头，其中所述接头与AP205的外壳蛋白、其突变体或片段和IL-1分子融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子与AP205的所述外壳蛋白、其突变体或片段通过所述接头融合。
已经发现，IL-1分子，特别是包含至少100个、最多300个氨基酸、典型且优选地大约140-160个氨基酸、最优选大约155个氨基酸的IL-1蛋白和IL-1片段，可以与噬菌体的外壳蛋白融合，优选地与AP205的外壳蛋白融合，同时保持该外壳蛋白自装配为VLP的能力。
鉴于IL-1蛋白、IL-1片段和IL-1成熟片段的大尺寸，以及由于空间原因，构建了产生包含与IL-1分子融合的AP205外壳蛋白以及野生型外壳蛋白亚单位的嵌合VLP的表达系统。在该系统中，终止密码子的抑制产生了AP205-IL-1外壳蛋白融合，而正确终止产生野生型AP205外壳蛋白。两种蛋白质在细胞中同时产生，并装配为嵌合VLP。这种系统的优点是可以展示大蛋白质，而不干扰VLP的装配。由于AP205-IL-1融合蛋白引入嵌合VLP中的水平依赖于阻抑水平，AP205-IL-1在已经包含过量表达抑制t-RNA的质粒的大肠杆菌细胞中表达。对于乳白阻抑，使用质粒pISM3001(Smiley，B.K.，Minion，F.C.(1993)Enhanced readthrough of opal(UGA)stop codons and production ofMycoplasma pneumoniae P1 epitopes in Escherichia coli.Gene 134，33-40)，其编码识别乳白终止密码子的阻抑型t-RNA并引入Trp。应用质粒pISM579可以增加琥珀终止的阻抑，pISM579过量表达识别琥珀终止密码子并引入Trp的阻抑型t-RNA。质粒pISM579如下产生：用限制性内切核酸酶EcoRI从pISM3001上切下trpT176基因，并将其替换为含有琥珀t-RNA阻抑基因的来自质粒pMY579(Michael Yarus惠赠)的EcoRI片段。该t-RNA阻抑基因是trpT175的突变体(Raftery LA.等人(1984)J.Bacteriol.158：849-859)，与trpT在三个位点上不同：G33，A24和T35。在具有琥珀阻抑(supE或glnV)的大肠杆菌株如大肠杆菌JM109中表达AP205-白介素-1α融合蛋白，除了在琥珀终止密码子处引入Trp的AP205-IL-1融合蛋白以外，还可以产生一定比例的在琥珀终止密码子处引入Gln而不是Trp的AP205-IL-1融合蛋白。在终止密码子处翻译的氨基酸身份因此可依赖于过量表达的阻抑型t-RNA和菌株表型的组合。如Miller JH等人((1983)J.Mol.Biol.164：59-71)所述和本领域中公知的，阻抑效率是依赖于环境的。特别是，位于终止密码子3’的密码子和位于终止密码子3’的第一个碱基特别重要。例如，后接嘌呤碱的终止密码子通常被很好地阻抑。
因此，在一个优选的实施方案中，所述VLP是嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一个、优选一个第一多肽和至少一个、优选一个第二多肽，或优选地由上述多肽组成，其中所述第一多肽是重组衣壳蛋白、其突变体或片段；并且其中所述第二多肽是优选所述第一多肽的重组衣壳蛋白、其突变体或片段与IL-1分子的基因融合产物。在一个进一步优选的实施方案中，所述第一多肽是噬菌体AP205的重组衣壳蛋白或其突变体或片段。在一个进一步优选的实施方案中，所述第一多肽选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23。在一个非常优选的实施方案中，所述第一多肽是SEQ ID NO：21。包含抗原的噬菌体AP205的嵌合VLP在WO2006/032674A1中总体公开，特别是在所述公开文本的第107段。在一个进一步优选的实施方案中，所述第二多肽是优选所述第一多肽的重组衣壳蛋白、其突变体或片段与IL-1分子的基因融合产物，其中所述IL-1分子与所述重组衣壳蛋白、其突变体或片段的C-末端融合，优选地通过氨基酸接头融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述IL-1分子包含100-300个氨基酸、典型且优选地大约140-160个氨基酸、最优选地大约155个氨基酸，或者优选地由上述氨基酸组成。在一个非常优选的实施方案中，所述嵌合VLP中所述第一多肽与所述第二多肽的摩尔比为10∶1至5∶1，优选8∶1至6∶1，最优选大约7∶1。
在本发明一个优选的实施方案中，所述组合物含有或者基本由具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒组成，该病毒样颗粒与具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原(即IL-1分子)通过至少一个共价键连接，优选地该共价键是非肽键。在本发明的一个优选的实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含，或者优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。
在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将IL-1分子与VLP连接。在优选的实施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位点(优选氨基，更优选赖氨酸残基的氨基)反应的官能团，和能够与IL-1分子固有的或人工添加的优选的第二附着位点(即巯基，优选半胱氨酸残基的巯基)反应的另一个官能团，任选地该另一个官能团也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它例如可从Pierce Chemical Company获得的、具有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的交联剂。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在IL-1分子与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含接头。根据本发明的公开内容，通过连接优选包含适合作为第二附着位点的至少一个氨基酸的接头，实现向IL-1分子上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，接头通过至少一个共价键、优选通过至少一个、通常一个肽键与IL-1分子连接。优选地，接头包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，接头包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸接头是半胱氨酸残基。
接头的选择取决于IL-1分子的性质，取决于其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接头通常是有利的。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，接头由氨基酸组成，其中进一步优选地，接头由最多25个，优选最多20个，更优选最多15个氨基酸组成。在本发明的另一优选实施方案中，氨基酸接头含有1-10个氨基酸。接头的优选实施方案选自：(a)CGG(SEQ ID NO：171)；(b)N-端γ1接头，优选CGDKTHTSPP(SEQ ID NO：172)；(c)N-端γ3接头，优选CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO：173)；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头，优选GCGGGG(SEQ ID NO：174)；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5(SEQ ID NO：175)；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头，优选(GGGGS)n，n＝1-3(SEQ ID NO：176)，具有另外一个半胱氨酸；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO：177)；(i)GGC(SEQ ID NO：178)；(k)GGC-NH2(SEQ ID NO：179)；(l)C端γ1接头，优选DKTHTSPPCG(SEQ ID NO：180)；(m)C-端γ3接头，优选PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO：181)；(n)C-端甘氨酸接头，优选GGGGCG(SEQ ID NO：182)；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5(SEQ ID NO：183)；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头，优选(SGGGG)n，n＝1-3(SEQ ID NO：184)，具有另外一个半胱氨酸；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO：185)。在一个进一步优选的实施方案中，接头添加到IL-1分子的N末端。在本发明的另一个优选实施方案中，接连体添加到IL-1分子的C末端。
本发明优选的接头是进一步含有半胱氨酸残基作为第二附着位点的甘氨酸接头(G)n，如N-末端甘氨酸接头(GCGGGG，SEQ IDNO：174)和C-末端甘氨酸接头(GGGGCG，SEQ ID NO：182)。进一步优选的实施方案是C-末端甘氨酸-赖氨酸接头(GGKKGC，SEQ ID NO：186)和N-末端甘氨酸-赖氨酸接头(CGKKGG，SEQ ID NO：187)，位于肽的C-末端的GGCG(SEQ ID NO：188)和GGC(SEQ ID NO：179，″NH2″代表酰胺化)接头，或位于其N-末端的CGG(SEQ ID NO：171)。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在的空间位阻。
根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接IL-1分子与VLP，使得本发明的抗原以定向方式与VLP偶联。连接IL-1分子和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联IL-1分子和VLP的方法。IL-1分子也可以首先通过例如与SATA、SATP或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在脱保护之后，IL-1分子可以和VLP如下所述偶联。在分离过量的硫醇化试剂之后，IL-1分子与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的IL-1分子能够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)或含有对VLP的胺基或羧基有反应性的官能团的其它已知同型双功能交联剂，将IL-1分子与VLP连接。
在本发明的其他实施方案中，组合物包含或者基本由通过化学相互作用与IL-1分子连接的病毒样颗粒组成，其中这些相互作用的至少一种不是共价键。
VLP与IL-1分子的连接可以通过将VLP生物素化并且将IL-1分子表达为链霉抗生物素-融合蛋白而实现。
一个或几个抗原分子，即IL-1分子，可以附着到优选RNA噬菌体外壳蛋白的VLP的一个亚单位上，优选通过RNA噬菌体外壳蛋白VLP的暴露的赖氨酸残基附着，如果空间上允许的话。RNA噬菌体的VLP(特别是Qβ外壳蛋白VLP)的特定特征因此是每个亚单位能够偶联几个抗原。这允许产生密集的抗原阵列。
在本发明的非常优选的实施方案中，IL-1分子通过添加到IL-1分子N末端或C末端上的半胱氨酸或IL-1分子内的天然半胱氨酸残基与RNA噬菌体的VLP的外壳蛋白(特别是Qβ的外壳蛋白)的赖氨酸残基连接。
如上所述，4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP的表面。典型地，这些残基通过与交联剂分子反应而衍生化。当不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联时，在衍生化步骤后，已与交联剂反应的赖氨酸残基就留下来，交联剂分子附着到ε-氨基上。这就使对VLP的溶解性和稳定性可能不利的一种或几种正电荷消失。通过例如在下文所述的Qβ外壳蛋白突变体中那样用精氨酸取代某些赖氨酸残基，我们避免了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基并不能与优选的交联剂反应。此外，用精氨酸取代赖氨酸残基会产生更确定的抗原阵列，因为只有较少的位点可与抗原反应。
因此，在下列的Qβ外壳蛋白突变体中，用精氨酸取代暴露的赖氨酸残基：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO：16)，Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg，SEQ ID NO：18)，Qβ-259(Lys2-Arg、Lys16-Arg；SEQID NO：20)，和Qβ-251(Lys16-Arg；SEQ ID NO：19)。在一个进一步的实施方案中，我们公开了具有另外一个赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：17)，它适合获得较高密度的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，RNA噬菌体的VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的聚阴离子大分子。在一个进一步优选的实施方案中，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
在另一个优选实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的免疫刺激物。在进一步优选的实施方案中，所述免疫刺激物是核酸，优选DNA，最优选含非甲基化CpG的寡核苷酸。
基本不含宿主RNA、优选宿主核酸：本文所用的术语“基本不含宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、优选宿主核酸的量，该量典型且优选地为每mg VLP不到30μg，优选不到20μg，更优选不到10μg，甚至更优选不到8μg，甚至更优选不到6μg，甚至更优选不到4μg，最优选不到2μg。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主。测定RNA(优选核酸)的量的常规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA(优选核酸)的量的典型且优选的方法在WO2006/037787A2的实施例17中描述。对于含有Qβ以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA(优选核酸)的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。确定的量的数值应当典型且优选地被理解为包括指定数值±10％、优选±5％偏差的数值。
聚阴离子大分子：本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。聚阴离子大分子的分子量应当为至少2000道尔顿，更优选至少3000道尔顿，甚至更优选至少5000道尔顿。本文所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优选地不包括Toll-样受体配体，甚至更优选地不包括免疫刺激物，如Toll-样受体配体、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更优选地，本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。甚至更优选地，术语“聚阴离子大分子”不包括免疫刺激物。本文所用的术语“免疫刺激物”是指能够诱导和/或增强特别针对本发明中包括的抗原的免疫应答的分子。
宿主RNA、优选宿主核酸：本文使用的术语“宿主RNA、优选宿主核酸”或术语“具有二级结构的宿主RNA、优选宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA或优选核酸。然而，RNA、优选核酸在典型且优选地通过本发明的方法减少或去除RNA、优选核酸的量的过程中可能经受化学和/或物理学改变，例如，RNA、优选核酸的大小可能被缩短，或者其二级结构可能改变。但是，甚至这种得到的RNA或核酸仍然被认为是宿主RNA，或宿主核酸。
2004年10月5日同一申请人提交的美国临时申请中公开了确定VLP包含的RNA的量以及减少VLP包含的RNA的量的方法，因此整个申请引入本文作为参考。减少或消除宿主RNA、优选宿主核酸的量，最小化或者减少了不希望的T细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答，和其他不希望的副作用，如发热，而同时保持特异性针对IL-1的强抗体应答。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种制备本发明的组合物和本发明的RNA-噬菌体的VLP的方法，其中所述VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸，该方法包括以下步骤：a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段；b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA-噬菌体的所述外壳蛋白、其变体或片段；c)纯化所述外壳蛋白、其变体或片段；d)将所述纯化的所述RNA-噬菌体的外壳蛋白、其变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸；和(e)连接具有至少一个第二附着位点的至少一种本发明的抗原与步骤d)获得的所述VLP。在一个进一步优选的实施方案中，重装配所述纯化的外壳蛋白、其变体或片段的步骤在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明的组合物的疫苗。在一个优选实施方案中，在疫苗组合物中与VLP连接的IL-1分子可以是来源于动物，优选来源于哺乳动物或人类。在优选实施方案中，本发明的IL-1来源于人、牛、狗、猫、小鼠、大鼠、猪或马。
在一个优选实施方案中，该疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或允许在宿主中产生储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物结合时能够产生更强的免疫应答。
在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。
本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如此。而且，不含佐剂使得不希望的炎性T细胞应答的发生减至最少，炎性T细胞应答是针对自身抗原接种中的一个安全性问题。因此，优选地给患者施用本发明的疫苗而不需在施用该疫苗之前、同时或之后给同一患者施用至少一种佐剂。
本发明进一步公开了一种免疫方法，包括给动物或人施用本发明的疫苗。所述动物优选地是哺乳动物，如猫、绵羊、猪、马、牛、狗、大鼠、小鼠，特别是人。疫苗可以用本领域所知的各种方法给动物或人施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。
如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为本发明的疫苗是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发明的疫苗可以诱导可与IL-1结合的抗体，从而降低了它的浓度和/或干扰它的生理学或病理学功能。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明教导的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。当给个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资料中提供，包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed，MackPublishing Co，(1990))。
本发明教导了一种制备本发明的组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的IL-1分子；和(c)将所述VLP和所述IL-1分子组合，产生组合物，其中所述IL-1分子和所述VLP通过所述第一附着位点和第二附着位点连接。
在一个进一步优选的实施方案中，提供具有至少一个第一附着位点的VLP的步骤包括以下另外的步骤：(a)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA噬菌体的所述外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)将所述纯化的所述RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
本发明提供一种使用本发明的组合物治疗和/或减轻其中IL-1发挥重要病理作用的动物或人类的疾病或病症的方法。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病优选地选自：(a)血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF)；(c)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(d)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(e)变态反应病，优选接触过敏、1型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(f)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病是血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是本发明的IL-1α分子，优选IL-1α成熟片段，最优选SEQ ID NO：63或其突变蛋白。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物疾病的药物中的用途，所述动物优选狗、猫、马或人，最优选人，其中所述疾病选自：(a)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF)；(b)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(c)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(d)变态反应病，优选接触过敏、1型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(e)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1β分子，优选IL-1β成熟片段，最优选SEQ ID NO：64或其突变蛋白。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是血管疾病，优选动脉粥样硬化。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是骨和软骨变性性疾病，优选骨关节炎。
本发明进一步提供本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物在制备治疗动物、优选人的疾病的药物中的用途，其中所述疾病是神经疾病，优选多发性硬化。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地选自：(a)血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化；(b)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF)；(c)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(d)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(e)变态反应病，优选接触过敏、1型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(f)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地是血管疾病，优选冠状动脉疾病、动脉粥样硬化和脉管炎，最优选动脉粥样硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1α分子，优选IL-1α成熟片段，最优选SEQ ID NO：63或其突变蛋白。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病优选地选自：(a)遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)、家族性冷自身炎性综合征(FCAS)、新生儿发作多系统炎性疾病(NOMID)和Muckle Wells综合征，最优选家族性地中海热(FMF)；(b)慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎、全身发作青少年特发性关节炎、成人发作Still病、银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，最优选类风湿性关节炎；(c)骨和软骨变性性疾病，优选痛风、骨质疏松症和骨关节炎，最优选骨关节炎；(d)变态反应病，优选接触过敏、1型超敏反应和变态反应，最优选变态反应；和(e)神经疾病，优选阿尔茨海默病、癫痫症、帕金森氏病和多发性硬化，最优选多发性硬化，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1β分子，优选IL-1β成熟片段，最优选SEQ ID NO：64或其突变蛋白。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给狗、猫、马或人，最优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)，并且其中所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物中包含的所述至少一种抗原是IL-1β分子，优选IL-1β成熟片段，最优选SEQ ID NO：64或其突变蛋白。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是血管疾病，优选动脉粥样硬化。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是遗传性IL-1-依赖的炎性疾病，优选家族性地中海热(FMF)。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病是慢性自身免疫炎性疾病，优选类风湿性关节炎。
本发明进一步提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给动物，优选给人施用本发明的组合物或本发明的疫苗或本发明的药物组合物，其中所述疾病疾病是骨和软骨变性性疾病，优选骨关节炎。
本文引用的所有参考文献都全文引入作为参考。
实施例
                    实施例1
    鼠IL1α117-270和IL-1β119-269的克隆、表达和纯化
使用寡核苷酸IL1α1(5’-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3’；SEQ ID NO：24)和IL1α2(5’-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATA GAG-3’；SEQ ID NO：25)，通过PCR从TNFα-活化的鼠巨噬细胞cDNA文库中扩增编码鼠IL-1α的氨基酸117-270的核苷酸序列。使用相同的cDNA文库，用寡核苷酸IL1β1(5’-ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3’；SEQ ID NO：26)和IL1β2(5’-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3’；SEQ ID NO：27)扩增编码鼠IL-1β前体的氨基酸119-269的核苷酸序列。两条DNA片段用NheI和XhoI消化，并且克隆到表达载体pModEC1(SEQ ID NO：29)内。
载体pModEC1(SEQ ID NO：29)是pET22b(+)(Novagen Inc.)的衍生物，分两步构建。第一步，将pET22b(+)的NdeI和XhoI位点之间的原始序列替换为退火的oligos引物MCS-1F(5’-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3’；SEQ ID NO：30)和引物MCS-1R(5’-TCGAATGCGGCCGCCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3’；SEQ ID NO：31)(在15mM TrisHCl pH 8缓冲液中退火)，由此改变pET22b(+)的多克隆位点。得到的质粒被命名为pMod00，在其多克隆位点中具有NdeI，BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制酶切位点。退火oligos对Bamhis6-EK-Nhe-F(5’-GATCCACACCACCACCACCACCACGGTTCTGGTGA CGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3’；SEQ ID NO：32)和Bamhis6-EKNhe-R(5’-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGT GGTGGTGGTGGTGTG-3’；SEQ IDNO：33)和退火oligo对1F-C-甘氨酸-接头(5’-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3’；SEQ ID NO：34)和oligo1R-C-甘氨酸-接头(5’-GGCCGCGTTTAAACTTATTA ACCGCAACCACCACCACCACCC-3’；SEQ ID NO：35)一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00质粒内，获得pModEC1，其编码N-末端六组氨酸标签，肠激酶酶切位点和含有一个半胱氨酸残基的C-末端甘氨酸接头。
上述片段向pModEC1内的克隆分别产生质粒pModEC1-His-EK-mIL1α117-270和pModEC1-His-EK-mIL1β119-269。这些质粒分别编码由N-末端His-标签、肠激酶酶切位点、成熟鼠IL-1α或IL-1β和含C-末端半胱氨酸的接头(GGGGGCG，SEQ ID NO：28)组成的融合蛋白。对于表达，含有质粒的大肠杆菌BL21细胞在37℃生长至600nm处的OD为1.0，然后加入1mM浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导。细菌在37℃下生长4小时，离心收获，重悬浮在80ml裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，pH 7.0)中。然后超声处理破碎细胞，在室温下与64μl 2M MgCl2和10μl Benzonase孵育30分钟消化细胞DNA和RNA。离心除去细胞碎片(SS34转头，20000rpm，4℃，60min)，将澄清的裂解液加到Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Hilden，Germany)上。用洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM Imidazol，pH 8.0)充分洗涤后，用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，200mMImidazol，pH 8.0)洗脱蛋白质。纯化的蛋白质用PBS pH 7.2透析，在液氮中骤冻，并且贮存在-80℃直到进一步使用。
                        实施例2
        A.小鼠IL-1β119-269与Qβ病毒样颗粒的偶联
在PBS pH 7.2中含有1.3mg/ml实施例1获得的纯化的鼠IL-1β119-269蛋白(SEQ ID NO：66)的溶液在室温下与等摩尔量的TCEP孵育60分钟，以还原C-末端半胱氨酸残基。
然后6ml 2mg/ml Qβ衣壳蛋白在PBS pH 7.2中的溶液在室温下与131μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)反应60分钟。反应溶液在4℃下用3升20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2透析24小时，其中更换三次透析液。75μl衍生化并透析的Qβ溶液与117μl H2O和308μl纯化并预还原的小鼠IL-1β119-269蛋白混合，并且在15℃下孵育过夜，用于化学交联。使用分子量截断值为300,000Da的纤维素酯膜，通过相对于PBS正切流动过滤除去未偶联的蛋白质。
偶联的产物在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。图1中显示考马斯染色的凝胶。可见几条相对于Qβ衣壳单体分子量升高的带，清楚地证明了小鼠IL-1β119-269蛋白与Qβ衣壳的成功交联。
B.使用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1β119-269蛋白(Qβ-mIL-1β119-269)免
                     疫小鼠
对5只balb/c雌性小鼠用Qβ-mIL-1β119-269(SEQ ID No：66)进行免疫。将50μg总蛋白质用PBS稀释到200μl，并在第0天、第21天皮下注射(100μl在腹部两侧)。在第0天、第21天和第35天，对小鼠眶后取血，使用小鼠IL-1β119-269特异性的ELISA分析血清。
                        C.ELISA
使用浓度为1μg/ml的小鼠IL-1β119-269蛋白包被ELISA板。封闭该板，然后与第0天、第21天、第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm处产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价。抗小鼠IL-1β119-269的平均效价是第21天1:22262，第35天1:309276。这表明使用与小鼠IL-1β119-269蛋白偶联的Qβ免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1β119-269的高效价抗体。
                    D.IL-1β的体外中和
然后测试Qβ-mIL-1β119-269(SEQ ID No：66)免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1β蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为1μg/ml的重组mIL-1受体I-hFc融合蛋白包被ELISA板，并与免疫小鼠的血清的连续稀释液共孵育，所述小鼠已用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1β119-269免疫或者用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1α117-270与100ng/ml的小鼠IL-1β119-269免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-1β抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素蛋白来检测IL-1β119-269与固定化的mIL-1受体I-hFc融合蛋白的结合。所有的针对鼠IL-1β119-269免疫的小鼠的血清在浓度为≥0.4％时完全抑制小鼠IL-1β119-269与其受体的结合，而针对小鼠IL-1α117-270免疫的小鼠的血清甚至在最高使用浓度(3.3％)时都没有显示任何抑制效果。这些数据表明用偶联到Qβ衣壳上的小鼠IL-1β119-269免疫能够产生能够特异性地中和小鼠IL-1β119-269与其受体相互作用的抗体。
                E.IL-1β的体内中和
然后研究了通过用Qβ-mIL-1β119-269免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天用Qβ-mIL-1β119-269对4只balb/c雌性小鼠免疫两次，同时单独用Qβ衣壳对4只小鼠免疫。在第21天对所有小鼠静脉注射1μg游离IL-1β119-269。作为注射的IL-1β119-269的炎症活性的读数，在注射3小时后分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。Qβ免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加1.01±0.61ng/ml，而用Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠则显示出平均增加只有0.11±0.30ng/ml(p＝0.004)。作为对照，在第28天对所有小鼠注射1μg mIL-1α。注射3小时后，仅用Qβ载体免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加40.24±8.06ng/ml，而用Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠则显示出增加57.98±29.92ng/ml(p＝0.30)。这些数据表明用Qβ-mIL-1β119-269免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1α的促炎症反应活性。
  F.Qβ-mIL-1β119-269对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性
在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试Qβ-mIL-1β119-269免疫的有效性。这个模型反映出人类类风湿性关节炎的免疫学和组织学的大部分方面，因而常规地用来测试抗炎剂的有效性。对DBA/1雄性小鼠通过皮下单独注射50μg Qβ-mIL-1β119-269(n＝8)或者Qβ(n＝8)来免疫三次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。
根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢给予范围从0-3的临床评分。连续3周按照以下定义给予每个肢临床评分：0正常，1轻度红斑和/或趾/爪肿胀，2红斑和扩展到全爪/关节的肿胀，3严重的肿胀，爪/关节变形，僵硬。计算单个小鼠的累积临床评分，作为所有四肢的临床评分总和，得到每只小鼠可能的最大累积评分为12。
第二次胶原注射2周后，Qβ免疫的小鼠显示出4.44的平均累积临床评分，而Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠显示出仅为1.06的平均累积临床评分。而且，Qβ免疫的小鼠的后肢踝关节厚度平均增长18％，而已经用Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠平均增长仅为1％。在第二次胶原注射1周后，测量血清IL-6水平，作为炎症反应的另外的读数。Qβ免疫的小鼠的平均IL-6血清浓度为1.92±0.36，而Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠的平均IL-6血清浓度仅为0.79±0.16(p＝0.01)。综合考虑，这些数据显示Qβ-mIL-1β119-269免疫强有力地保护CIA模型小鼠不出现炎症和关节炎的临床体征。
                          实施例3
         A.小鼠IL-1α117-270与Qβ病毒样颗粒的偶联
在PBS pH 7.2中含有1.8mg/ml实施例1获得的纯化的鼠IL-1α117-270蛋白(SEQ ID NO：65)的溶液在室温下与等摩尔量的TCEP孵育60分钟，以还原C-末端半胱氨酸残基。
然后6ml 2mg/ml Qβ衣壳蛋白在PBS pH 7.2中的溶液在室温下与131μl SMPH溶液(65mM，在DMSO中)反应60分钟。反应溶液在4℃下用3升20mM HEPES，150mM NaCl pH 7.2透析24小时，其中更换三次透析液。75μl衍生化并透析的Qβ溶液与192μl H2O和233μl纯化并预还原的小鼠IL-1α117-270蛋白混合，并且在15℃下孵育过夜，用于化学交联。使用分子量截断值为300,000Da的纤维素酯膜，通过相对于PBS正切流动过滤除去未偶联的蛋白质。
偶联的产物在还原条件下的12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。图2中显示考马斯染色的凝胶。可见几条相对于Qβ衣壳单体分子量升高的带，清楚地证明了小鼠IL-1α117-270蛋白与Qβ衣壳的成功交联。
B.使用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1α117-270蛋白(Qβ-mIL-1α117-270)
                      免疫小鼠
对5只balb/c雌性小鼠用Qβ-mIL-1α117-270进行免疫。将50μg总蛋白质用PBS稀释到200μl，并在第0天、第21天对小鼠皮下注射(100μl在腹部两侧)。在第0天、第21天和第35天，对小鼠眶后取血，使用小鼠IL-1α117-270特异性的ELISA分析血清。
                        C.ELISA
使用浓度为1μg/ml的小鼠IL-1α117-270蛋白包被ELISA板。封闭该板，然后与第0天、第21天、第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价。抗小鼠IL-1α117-270的平均效价是第21天1:9252，第35天1:736912。这表明使用与小鼠IL-1α117-270蛋白偶联的Qβ免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1α117-270的高效价抗体。
                    D.IL-1α的体外中和
然后测试Qβ-mIL-1α117-270免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1α117-270蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为1μg/ml的重组mIL-1受体I-hFc融合蛋白包被ELISA板，并与免疫小鼠的血清的连续稀释液共孵育，所述小鼠已用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1α117-270免疫或者用与Qβ衣壳偶联的小鼠IL-1β119-269与5ng/ml的小鼠IL-1α117-270免疫。使用生物素化的抗小鼠IL-1α抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素蛋白来检测IL-1α117-270与固定化的mIL-1受体I-hFc融合蛋白的结合。所有的针对鼠IL-1α117-270免疫的小鼠的血清在浓度为≥0.4％时完全抑制小鼠IL-1α117-270与其受体的结合，而针对小鼠IL-1β119-269免疫的小鼠的血清甚至在最高使用浓度(3.3％)时都没有显示明显的抑制效果。这些数据表明用偶联到Qβ衣壳上的小鼠IL-1α117-270免疫能够产生能够特异性地中和小鼠IL-1α117-270与其受体相互作用的抗体。
                E.IL-1α的体内中和
然后研究了通过用Qβ-mIL-1α117-270免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天用Qβ-mIL-1α117-270对4只balb/c雌性小鼠免疫两次，同时单独用Qβ衣壳对4只小鼠免疫。在第21天对所有小鼠静脉注射1μg游离IL-1α117-270。作为注射的IL-1α117-270的炎症活性的读数，在注射3小时后分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。Qβ免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加8.16±2.33ng/ml，而用Qβ-mIL-1α117-270免疫的小鼠则显示出平均增加只有0.15±0.27ng/ml(p＝0.0005)。作为对照，在第28天对所有小鼠注射1μgmIL-1β。注射3小时后，仅用Qβ载体免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加9.52±7.33ng/ml，而用Qβ-mIL-1α117-270免疫的小鼠则显示出增加21.46±27.36ng/ml(p＝0.43)。这些数据表明用Qβ-mIL-1α117-270免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1α的促炎活性。
  F.Qβ-mIL-1α117-270对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性
在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试Qβ-mIL-1α117-270免疫的有效性。这个模型反映出人类类风湿性关节炎的免疫学和组织学的大部分方面，因而常规地用来测试抗炎剂的有效性。对DBA/1雄性小鼠通过皮下单独注射50μgQβ-mIL-1α117-270(n＝8)或者Qβ(n＝8)来免疫三次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢进行实施例2F定义的临床评分。第二次胶原注射2周后，Qβ免疫小鼠显示出4.44的平均累积临床评分，而Qβ-mIL-1α117-270免疫小鼠显示出仅为2.31的平均累积临床评分。而且，Qβ免疫小鼠的后肢踝关节厚度平均增长18％，而已经用Qβ-mIL-1α117-270免疫的小鼠平均增长仅为7％。在第二次胶原注射1周后，测量血清IL-6水平，作为炎症反应的补充读数。Qβ免疫小鼠的平均IL-6血清浓度为1.92±0.36，而Qβ-mIL-1α117-270免疫小鼠的平均IL-6血清浓度仅为0.94±0.48。综合考虑，这些数据显示Qβ-mIL-1α117-270免疫保护CIA模型小鼠不出现炎症与关节炎的临床体征。
                         实施例4
     Qβ-mIL-1α117-270对动脉粥样硬化小鼠模型的有效性
在第O、第14、第28、第56、第105和第133天，对7到8周龄的Apoe-/-雄性小鼠(Jackson实验室，Bar Harbor ME)皮下注射50μgQβ-mIL-1α117-270疫苗(n＝13)或者50μg Qβ(n＝12)(5只动物，Qβ-mIL-1α117-270组中的3只和Qβ组中的2只在第33天接受第二次加强注射)。最初对小鼠用正常饮食喂养，在第21天时用西式饮食代替(20％脂肪，0.15％胆固醇，Provimi Kliba AG，瑞士)。在实验中，对小鼠定期取血，测量血清中对IL-1α的抗体应答。在第159天处死小鼠，基本上按照Tangirala R.K.等人(1995)J.Lipid.Res.36：2320-2328所述分离和准备主动脉。另外，基本上按照Paigen B.等人(Atherosclerosis1987；68：231-24)和Zhou X.等人(Arterioscler Thromb Vasc Biol2001；21：108-114)所述，取出心脏并在液氮中快速冷冻以备后续的组织学制备。通过心脏穿刺对动物取血，并灌注冷PBS。然后暴露主动脉，尽可能地原位去除外膜，最后从距心脏2mm处切断主动脉。将心脏从中切开，将上半部分在液氮中塑料管中的Hank平衡盐溶液中立即冷冻。用恒冷切片机穿过主动脉的起点进行连续切片(7μm厚度)，在至少出现两个瓣叶收集，直到最后一个瓣叶消失。在福尔马林中固定切片，用油红O染色，使用定量图像分析评价每只小鼠的4-7个切片的斑块负荷(Qβ组中每只动物3个切片)。根据用于评价的每个切片的斑块面积来计算每只动物的平均斑块面积。分别计算Qβ-mIL-1α117-270和Qβ组的组平均斑块面积。通过Student t检验来进行统计分析。认为P＜0.05在统计上有意义。
为了评价整个主动脉的动脉粥样硬化，在充满冷PBS的玻璃培养皿中进一步清除残留的外膜，并从左锁骨下动脉向下5mm切成拱形。纵切主动脉，别在黑蜡表面上，固定在4％的福尔马林中过夜。然后在油红O中过夜染色。用数码照相的成像软件(Motic Image Plus 2.0)对斑块定量。将取自直到髂骨分叉的主动脉的所有斑块的表面总和除以测得的直到髂骨分叉的主动脉的总表面，以百分数形式来表述斑块负荷。以斑块负荷的平均值或者中间值来分析Qβ-mIL-1α117-270和Qβ组之间的差别。
使用重组IL-1α包被的ELISA板，以经典ELISA测量抗体应答。使用山羊抗小鼠HRP偶联物来检测特异性抗体的结合。以在测试中获得半数最大结合的血清稀释度的倒数来计算抗IL-1α效价。通过测量免疫前血清来评价应答的特异性。免疫前效价低于测试所用的最低血清稀释度，并指定它为最低血清稀释度值。Qβ-mIL-1α117-270免疫动物的抗体应答的测量结果如表1所示，清楚地显示出用与Qβ偶联的鼠IL-1α免疫产生了对IL-1α的强烈而持续的特异性抗体应答，因为在免疫前(d0)血清中几乎没有检测到效价。而且，IL-1α特异性抗体应答的诱导导致Qβ-mIL-1α117-270组在主动脉起点的斑块面积比Qβ组减少了37％(292803±21272μm2对464694±36545μm2，p＝0.0005)。另外，在整个制备的主动脉“正面”观察到斑块负荷中间值减少31％(5.7对8.3，p＝0.06)。
这些数据表明，Qβ-mIL-1α117-270疫苗对抗IL-1α抗体的诱导抑制了动脉粥样硬化的发展，因而Qβ-mIL-1α117-270疫苗是对动脉粥样硬化的一种有效的治疗。而且，这些数据表明IL-1α与动脉粥样硬化的发病机理有关。
表1：Qb-IL1α免疫的Apoe-/-小鼠中的抗IL1α抗体效价的几何平均值(几何平均效价±平均标准差)
  d0   d21   d28*   d56   d84   d105   d159
  几何平均值±SEM ＜10000   225400±93385   167867±121345   522864±106887   712061±144922   621687±184389   805370±155764
*对于5只动物，第33天获得的数值。
                            实施例5
        使用Qβ-mIL-1α117-270和/或Qβ-mIL-1β119-269免疫
                    预防TNBS诱导的炎性肠病
对8周龄的SJL雄性小鼠(每组5只)，以2周的间隔3次皮下注射50μg Qβ-mIL-1α117-270或者50μg Qβ-mIL-1β119-269或者各50μg Qβ-mIL-1α117-270与Qβ-mIL-1β119-269的混合物。以同样方案单独注射QβVLP的5只小鼠作为对照。最后一次免疫2周后，将所有的小鼠用异氟烷轻度麻醉，在距离肛门4cm处通过聚乙烯导管直肠内施用溶于100μl 50％乙醇的1mg三硝基苯磺酸(TNBS)。每日记录体重作为疾病进程的读数，在施用TNBS 7天后处死所有小鼠。取出每只小鼠的结肠，将位于临近肛门2cm处的结肠标本固定于PBS缓冲的福尔马林中，依照Neurath M.F.等人(JEM(1995)，182：1281-1290)所述，根据苏木精-和伊红-染色的结肠横切片对炎症程度半定量评价。
与Qβ免疫小鼠相比，单独用Qβ-mIL-1α117-270或者Qβ-mIL-1β119-269或者用Qβ-mIL-1α117-270与Qβ-mIL-1β119-269的组合免疫，降低了TNBS诱导的体重减轻。而且，结肠横切片的组织学检查表明，与Qβ免疫小鼠相比，Qβ-mIL-1α117-270和/或Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠显示出炎症细胞向结肠组织的浸润显著减少。
                        实施例6
Qβ-mIL-1β119-269免疫对于携带截短型MEFV基因的小鼠中
                内毒素-超敏反应的改善
家族性地中海热是一种隐性遗传炎性疾病，特征为阵发性回归热以及腹膜炎、浆膜炎、关节炎和皮疹。患者携带的MEFV基因发生错义突变，导致截短型热蛋白(pyrin)的表达。MEFV基因具有类似突变的小鼠，显示出增强的半胱天冬酶-1活性，导致成熟IL-1β过量产生、体温过低以及施用LPS后致死率的增加。对8周龄的纯合热蛋白-截短型小鼠(每组5只)以2周的间隔每次单独使用50μg Qβ-mIL-1β119-269或者50μg QβVLP进行3次免疫。最后一次免疫2周后，对所有小鼠腹膜内注射20mg D-半乳糖胺与0.01μg/g LPS的混合物。与Qβ免疫对照组相比，Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠显示出明显减少的体温过低和降低的LPS施用引起的致死率。
                        实施例7Qβ-mIL-1α117-270、Qβ-mIL-1β119-269免疫与Kineret
Figure 2006800343698_5
治疗
                在类风湿性关节炎小鼠模型中的比较
Kineret
Figure 2006800343698_6
(Anakinra，Amgen)是一种重组的人IL-1受体拮抗剂，被批准用来治疗人类类风湿性关节炎。为了达到临床效果，必须每天通过皮下注射使用相对高的剂量(100mg)。用胶原诱导的关节炎模型来比较Qβ-mIL-1α117-270、Qβ-mIL-1β119-269免疫与每日应用不同剂量Kineret
Figure 2006800343698_7
的有效性。对DBA/1雄性小鼠用50μg Qβ-mIL-1α117-270(n＝8)、Qβ-mIL-1β119-269(n＝8)或者单独Qβ(n＝32)3次(第0天、第14天和第28天)皮下免疫，然后在第42天皮内注射200μg与完全弗氏佐剂混合的牛II型胶原。从第42天起，用Qβ-mIL-1α117-270与Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠与一组Qβ免疫的小鼠(n＝8)每日接受腹膜内注射200μl PBS，而另外三组Qβ免疫的小鼠每日接受腹膜内注射37.5μg(n＝8)、375μg(n＝8)或者3.75mg(n＝8)Kineret。每只小鼠每日注射37.5μg Kineret大致相当于1.5mg/kg的剂量，这在推荐的对于人类有效的剂量范围内(100mg)。所有的小鼠在第63天加强注射200μg与不完全弗氏佐剂混合的牛II型胶原，并每日检查关节炎症状的发展。
第二次胶原注射4周后，Qβ免疫的对照小鼠显示出3.75的平均累积临床评分(如实施例2F定义的)，而Qβ-mIL-1α117-270和Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠分别显示出仅为0.81和1.44的平均评分(见表2)。用37.5μg或者375μg Kineret
Figure 2006800343698_10
台疗的小鼠分别达到了2.44和2.63的平均评分，而用3.75mg Kineret
Figure 2006800343698_11
治疗的小鼠基本保持无症状，达到了仅为0.19的最高评分。
定期测量所有动物的后踝关节厚度，作为炎症反应的附加读数。第二次胶原注射4周后，Qβ免疫的对照小鼠显示出后踝关节厚度平均增加16％，而Qβ-mIL-1α117-270免疫的小鼠显示出增加2％，Qβ-mIL-1β119-269免疫的小鼠显示出增加6％。用37.5μg或者375μg Kineret
Figure 2006800343698_12
治疗的小鼠分别显示出13％和10％的平均增加，而用3.75mg Kineret
Figure 2006800343698_13
治疗的小鼠则显示出后踝关节厚度完全没有增加。
总之，我们惊奇地发现三次注射Qβ-mIL-1α117-270或者Qβ-mIL-1β119-269要比每日以与人类相当的剂量或者甚至十倍于人类的剂量注射Kineret更好地保护小鼠免于关节炎症状的发展。只有应用100倍于人类的剂量的Kineret
Figure 2006800343698_15
时才显示出对应于Qβ-mIL-1α117-270或者Qβ-mIL-1β119-269免疫接种的增强的有益效应。
表2：胶原诱导的关节炎模型中的临床疾病症状
  治疗   第91天的平均临床评分   第63-91天的后踝关节厚度平均增加(％)
  3x Qβ皮下+PBS腹膜内(200μl/天)   3.75   16
  3x Qβ-mIL-1α117-270皮下+PBS腹膜内(200μl/天)   0.81   2
  3x Qβ-mIL-1β119-269皮下+PBS腹膜内(200μl/天)   1.44   6
  3x Qβ皮下+Kineret
Figure 2006800343698_16
腹膜内(37.5μg/天)		   2.44   13
  3x Qβ皮下+Kineret
Figure 2006800343698_17
腹膜内(375μg/天)		   2.63   10
  3x Qβ皮下+Kineret
Figure 2006800343698_18
腹膜内(3.75mg/天)		   0.19   0
                          实施例8
A.与小鼠IL-1α117-270基因融合的AP205外壳蛋白(AP205_mIL-1α117-270)所组成的病毒样颗粒的克隆、表达和纯化
考虑到IL-1α的大体积与空间原因，构建产生所谓的嵌合颗粒的表达体系，该嵌合颗粒包含与IL-1α融合的AP205衣蛋白和野生型外壳蛋白亚单元。在这一体系中，终止密码子的阻抑产生AP205-IL-1α外壳蛋白融合物，而正确的终止产生野生型AP205外壳蛋白。两种蛋白质在细胞中同时产生，并装配为嵌合病毒样颗粒。制备两个编码被阻抑型密码子TAG(琥珀，pAP590)或者TGA(乳白，pAP592)终止的AP205外壳蛋白基因的中间质粒pAP590和pAP592。将一个编码三肽Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：189)的接头序列添加到外壳蛋白基因的下游和阅读框中。在Gly-Ser-Gly氨基酸接头的C末端和AP205外壳蛋白的C末端添加Kpn2I和HindIII位点，用于克隆编码外源氨基酸序列的序列。产生的构建体是：AP590(SEQ ID NO：117)：AP205外壳蛋白基因-琥珀密码子-GSG(Kpn2I-HindIII)；AP592(SEQ ID NO：118)：AP205外壳蛋白基因-乳白密码子-GSG(Kpn2I-HindIII)。为了构建质粒pAP590，用NcoI和HindIII消化由寡核苷酸p1.44(5’-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3’；SEQ ID NO：119)和pINC-36(5’-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCCTAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3’；SEQ ID NO：120)获得的PCR片段，并将其克隆到已经用相同的限制性内切酶消化的pQb185载体中。pQb185是一个由pGEM载体衍生的载体。此载体中克隆基因的表达受trp启动子的控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene137：133-37(1993))。同样地，通过克隆NcoI/HindIII消化的由寡核苷酸p1.44和pINC-40(5’-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCAGTAGTA TCAGACGATACG-3’；SEQ ID NO：121)获得的PCR片段到同样的载体内，构建质粒pAP592。
使用将Kpn2I和HindIII限制性位点分别添加到5’和3’末端的引物pINC-34(5’-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3’；SEQ ID NO：122)和pINC-35(5’-GTAAGCTTATGCATTATGATATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3’；SEQ ID NO：123)，从质粒pModEC1-His-EK-mIL1α117-270(见实施例1)中PCR扩增编码鼠IL-1α的氨基酸117-270的序列。获得的DNA片段用Kpn2I和HindIII消化，并分别克隆到pAP590载体和pAP592载体中，分别产生出质粒pAP594(琥珀阻抑)和pAP596(乳白阻抑)质粒。
为了表达在其表面上展示鼠IL-1α的嵌合AP205VLP，分别用pAP594质粒或者pAP596质粒转化包含pISM 579质粒或者pISM 3001质粒的大肠杆菌JM109细胞。通过使用限制性核酸内切酶EcoRI从pISM3001上切除trpT176基因，并用来自pMY579质粒(MichaelYarus赠予)的包含琥珀t-RNA抑制基因的EcoRI片段置换它，产生质粒pISM579。此t-RNA阻抑基因是trpT175的突变体(Raftery LA.等人(1984)J.Bacteriol.158：849-859)，在G33、A24和T35这3个位点不同于trpT175。在包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的5毫升LB液体培养基中接种单一菌落，并在37℃下静置培养16-24小时。制备的接种物用包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的M9培养基稀释50倍，并在37℃下在摇床中过夜培养。通过离心分离收获细胞。
在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA、150mM NaCl、pH7.8、0.1％吐温20)中通过超声处理来裂解细胞(1g，用质粒pAP594转化，包含pISM579)。通过离心分离来清除裂解液，用裂解缓冲液来清洗细胞碎片。将合并的上清液加样到琼脂糖凝胶CL-4B柱上，用TEN缓冲液(20mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，pH 7.8)洗脱。通过琼脂糖凝胶电泳(1％TAE，溴化乙啶染色凝胶和UV检测)证实在清除的裂解液和清洗的上清液中存在衣壳。通过SDS-PAGE或者310nm处的光散射UV光谱分析来检测从柱上洗脱的两个峰。将包含衣壳的第二个峰的级分集中并加样到琼脂糖凝胶CL-6B柱上。集中CL-6B柱的峰级分，并用离心过滤单元(Amicon Ultra 15 MWCO 30000，Millipore)来浓缩。通过新一轮的CL-4B柱的凝胶过滤来进一步纯化蛋白质，并集中产生的峰级分，如上所述用离心过滤单元来浓缩。将缓冲液交换为10mM Hepes，pH 7.5，并添加甘油到50％的最终浓度。
基本上按照以上描述的纯化pAP594的步骤，从质粒pAP596中纯化AP205_mIL-1α117-270，在经过最后的CL-4B柱后，增加另外一个蔗糖梯度纯化步骤。蛋白质在用以下蔗糖溶液制备的梯度上分层：9ml36％，3ml 30％，6ml 25％，8ml 20％，6ml 15％，6ml 10％和3ml 5％蔗糖。通过紫外光谱鉴定级分，集中的含有衣壳的级分如上所述用离心过滤单元来浓缩，缓冲液交换为10mM Hepes，pH 7.5。最后添加甘油到50％的最终浓度。
           B.使用AP205_mIL-1α117-270免疫小鼠
4只balb/c雌性小鼠用AP205_mIL-1α117-270免疫。将25μg总蛋白用PBS稀释到200μl，并在第0天、第14天和第28天对小鼠皮下注射(100μl在腹部两侧)。在第0天、第14天、第28天和第35天对小鼠眶后取血，使用鼠IL-1α117-270-特异性ELISA来分析血清。
                      C.ELISA
使用浓度为1μg/ml的小鼠IL-1α117-270蛋白包被ELISA板。封闭板，然后与第14天、第28天和第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm处产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价。抗小鼠IL-1α117-270的平均效价是第14天1:4412，第28天1:27955，第35天1:34824。这表明使用AP205_mIL-1α117-270免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1α117-270的高效价抗体。
                 D.IL-1α的体外中和
检测AP205_mIL-1α117-270免疫小鼠的血清抑制鼠IL-1α蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为1μg/ml的重组mIL-1受体I-hFc融合蛋白包被ELISA板，并与来自单独用AP205_mIL-1α117-270或者单独用AP205与100ng/ml的小鼠IL-1α117-270一起免疫的小鼠的血清的连续稀释液共孵育。使用生物素化的抗小鼠IL-1α抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素来检测IL-1α117-270与固定化的mIL-1受体I-hFc融合蛋白的结合。所有的AP205_mIL-1α117-270免疫的小鼠的血清在浓度为≥3.3％时完全抑制小鼠IL-1α117-270与其受体结合，而AP205免疫的小鼠血清在任何浓度都没显示明显的抑制效果。这些数据表明用AP205_mIL-1α117-270免疫能够产生能够特异性地中和小鼠IL-1α117-270与其受体相互作用的抗体。
                 E.IL-1α的体内中和
然后研究通过AP205_mIL-1α117-270免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天和第28天用AP205_mIL-1α117-270对4只balb/c雌性小鼠免疫3次，同时有4只小鼠单独用AP205免疫。在第42天对所有小鼠静脉注射1μg游离的鼠IL-1α117-270。作为注射的IL-1α117-270的炎症活性的读数，在注射前和注射3小时后取样，并分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。AP205免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度平均增加12.92±3.95ng/ml，而用AP205_mIL-1α117-270免疫的小鼠则显示出平均增加只有0.06±0.05ng/ml(p＜0.01)。这些数据表明用AP205_mIL-1α117-270免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1α的促炎活性。
F.AP205_mIL-1α117-270对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性
在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试AP205_mIL-1α117-270免疫的有效性。对DBA/1雄性小鼠皮下单独注射50μg AP205_mIL-1α117-270(n＝8)或者AP205(n＝8)免疫3次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200μg牛型II胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢给出0-3的临床评分。第二次胶原注射4周后，Qβ免疫小鼠显示出5.81的平均累积临床评分，而AP205_mIL-1α117-270免疫小鼠显示出仅为2.06的平均累积临床评分。而且，AP205免疫小鼠的后肢踝关节厚度平均增长为19％，而已经用AP205_mIL-1α117-270免疫的小鼠仅为9％。综合考虑，这些数据显示AP205_mIL-1α117-270免疫强有力地保护CIA模型小鼠不出现炎症和关节炎的临床体征。
                        实施例9
A.与小鼠IL-1β119-269基因融合的AP205外壳蛋白(AP205_mIL-1β119-269)所组成的病毒样颗粒的克隆和表达
基本上按照实施例8中所述的对AP205_mIL-1α117-270的操作来对与小鼠IL-1β119-269基因融合的AP205外壳蛋白所组成的病毒样颗粒进行克隆、表达和纯化。使用引物pINC-75(5’GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3’，SEQ ID NO：192)和pINC-77(5’-GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3’，SEQ ID NO：193)，从编码鼠IL-1β的质粒pModEC1-His-EK-mIL1β119-269中扩增鼠IL-1β序列。这对引物扩增带有5’Kpn2I和3’Hind III位点的鼠IL-1β基因，并且另外编码在鼠IL-1β的N端的Gly-Gly氨基酸序列。将获得的鼠IL-1β片段用Kpn2I和HindIII消化，并克隆到载体pAP590(琥珀阻抑)的相同限制性位点，产生质粒pAP630。用质粒pAP630转化包含质粒pISM579并提供琥珀阻抑的大肠杆菌JM109。在包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中接种单一菌落，并在37℃下静置培养16-24小时。制备的接种物用包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的M9培养基稀释50倍，并在37℃下在摇床中过夜培养。通过离心分离收获细胞。
B.与人IL-1β119-269基因融合的AP205外壳蛋白(AP205_hIL-1β119-269)所组成的病毒样颗粒的克隆和表达
使用引物pINC-74(5’-GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTACGA TCA CTG AAC TG-3’，SEQ ID NO：194)和pINC-76(5’-GTATGCATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTC-3，SEQ IDNO：195)，从编码人IL-1β的质粒pET42T-hIL-1β116-269上扩增人IL-1β序列，分别引入5’Kpn2I和3’Mph1103I位点。将获得的人IL-1β片段用Kpn2I和Mph1103I消化，并克隆到载体pAP590(琥珀阻抑)的相同限制性位点，产生质粒pAP649。用质粒pAP649转化包含有质粒pISM 579(提供琥珀阻抑)的大肠杆菌JM109。在包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中接种单一菌落，并在37℃下静置培养16-24小时。制备的接种物用包含20μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的M9培养基稀释50倍，并在37℃下在摇床中过夜培养。通过离心分离收获细胞。
          C.使用AP205_mIL-1β119-269免疫小鼠
4只balb/c雌性小鼠用AP205_mIL-1β119-269进行免疫。将25μg总蛋白用PBS稀释到200μl，并在第0天、第14天和第28天对小鼠皮下注射(100μl在腹部两侧)。在第0天、第14天、第28天和第35天对小鼠眶后取血，使用小鼠IL-1β119-269特异性ELISA来分析血清。
                   D.ELISA
使用浓度为1μg/ml的小鼠IL-1β119-269蛋白包被ELISA板。封闭该板，然后与第0天、第14天、第28天和第35天的小鼠血清的连续稀释液一起孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm处产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算鼠血清的抗体效价。用AP205_mIL-1β119-269免疫产生特异性的高的抗鼠IL-1β119-269效价。这表明使用AP205_mIL-1β119-269免疫能够克服免疫耐受，并产生特异性识别IL-1β119-269的高效价抗体。
                  E.IL-1β的体外中和
然后测试AP205_mIL-1β119-269免疫小鼠的血清抑制小鼠IL-1β蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为1μg/ml的重组mIL-1受体I-hFc融合蛋白包被ELISA板，与来自单独用AP205_mIL-1β119-269或者单独用AP205与100ng/ml小鼠IL-1β119-269一起免疫的小鼠的血清的连续稀释液共孵育。使用生物素化的抗小鼠IL-1β抗体与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素来检测IL-1β119-269与固定化的mIL-1受体I-hFc融合蛋白的结合。所有的来自用AP205_mIL-1β119-269免疫的小鼠的血清强烈抑制小鼠IL-1β119-269与其受体的结合，而来自单独用AP205免疫的小鼠的血清则没有显示任何抑制效果。这些数据表明用AP205_mIL-1β119-269免疫能够产生能够是和小鼠IL-1β119-269与其受体相互作用的抗体。
                 F.IL-1β的体内中和
然后研究通过AP205_mIL-1β119-269免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而在第0天、第14天和第28天用AP205_mIL-1β119-269对4只balb/c雌性小鼠免疫三次，同时有4只小鼠单独用AP205免疫。在第35天对所有小鼠静脉注射1μg游离的鼠IL-1β119-269。作为注射的IL-1β119-269的炎症活性的读数，在注射前和注射3小时后取样，并分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。AP205免疫的小鼠显示出血清IL-6浓度显著增加，而用AP205_mIL-1β119-269免疫的小鼠则只显示出很轻微的增加。这些数据表明用AP205_mIL-1β119-269免疫产生的抗体能够特异性地、有效地中和IL-1β的促炎活性。
G.AP205_mIL-1β119-269对类风湿性关节炎小鼠模型的有效性
在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中测试AP205_mIL-1β119-269免疫的有效性。对DBA/1雄性小鼠单独用50μg AP205_mIL-1β119-269(n＝8)或者AP205(n＝8)皮下注射免疫3次(第0天、第14天和第28天)，然后在第42天皮内注射混合有完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原。在第63天，加强注射混合有不完全弗氏佐剂的200μg牛II型胶原后，每天检查小鼠关节炎症状的发展。根据观察到的红肿程度和测得的所有后肢的踝关节厚度，对每个肢给出0-3的临床评分。第二次胶原注射4周后，与AP205免疫的小鼠相比，AP205_mIL-1β119-269免疫小鼠显示出显著减少的平均临床评分。而且，AP205_mIL-1β119-269免疫小鼠的后肢踝关节厚度只表现出较少增加，而AP205免疫小鼠的后肢踝关节厚度则表现出显著增加。综合考虑，这些数据显示AP205_mIL-1β119-269免疫强有力地保护CIA模型小鼠不出现炎症与关节炎的临床体征。
                      实施例10
          A.人IL-1β116-269的克隆、表达和纯化
以人类肝组织的cDNA文库为模板，使用寡核苷酸HIL-1(5’-ATATATGATATCCCTGTACGATCACTGAACTGCACG-3’；SEQ IDNO：124)和HIL-2(5’-ATATATCTCGAGGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAG-3’；SEQ ID NO：125)，通过PCR扩增编码人IL-1β(hIL-1β116-269)的氨基酸116-269的核苷酸序列，将扩增的核苷酸序列用XhoI和EcoRV消化，并克隆到表达载体pET42T(+)中。
通过用新的接头序列置换pET-42a(+)(Novagen)的T7启动子和T7终止子之间的整个区域分两个步骤来构建质粒pET-42T(+)，这促进将目标蛋白质表达为与包含His-标签的C末端标签(SEQ ID NO：190)和含有半胱氨酸的接头的融合蛋白。第一步，用限制性内切酶NdeI和AvrII消化质粒pET-42a(+)，释放一个位于T7启动子和T7终止子之间的958bp的由1个GST标签、S标签、2个His标签和多克隆位点组成的片段。分离包含pET-42a(+)载体主链的4792bp的残留片段，并将其连接到退火的互补寡核苷酸42-1(5′-TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAATTGATTAC-3′；SEQ ID NO：126)和42-2(5′-CTAGGTAATCAATTACTCGA GCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3′；SEQ ID NO：127)上，产生质粒pET-42S(+)。第二步，将质粒pET-42S(+)通过用限制性内切酶XhoI和AvrII消化而线性化，并连接到互补的退火寡核苷酸42T-1(5′-TCGAGCACCACCACCACCACCACGGTGGTTGCTAATAATAATTGATTAATAC-3′；SEQ ID NO：128)和42T-2(5′-CTAGGTATTAATCAATTATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3′；SEQ ID NO：129)上，产生质粒pET-42T(+)。
将上面提到的hIL-1β116-269片段克隆到pET-42T(+)中，产生了质粒pET42T-hIL-1β116-269。此质粒编码相当于成熟的人IL-1β、1个His标签和1个C-末端包含半胱氨酸的接头(GGC，SEQ ID NO：178)的融合蛋白。因此，该融合蛋白由在C-末端融合到SEQ ID NO：165上的SEQ ID NO：190组成。位于人IL-1β的117位点的原始丙氨酸残基在此融合蛋白中转变为异亮氨酸。基本上按照实施例1所述的对于鼠mIL-1β119-269蛋白的操作进行人IL-1β116-269蛋白的表达与纯化。
      B.人IL-1β116-269突变蛋白的克隆、表达和纯化
通过对质粒pET42T-hIL-1β116-269的定向诱变，构建10个不同的突变型人IL-1β116-269融合蛋白表达载体。为实现此目标，按照使用说明来使用Quik-Change
Figure 2006800343698_19
定向诱变试剂盒(Stratagene)。这些突变型IL-1β119-269蛋白的表达载体连同用于其构建的寡核苷酸对列于表3中。按照实施例1所述进行不同的人IL-1β116-269突变蛋白的表达与纯化。
表3：IL-1突变蛋白、表达载体和用于其构建的寡核苷酸的概括
  表达载体   突变蛋白序列(无纯化标签)   寡核苷酸对
  pET42T-hIL-1β116-   hIL-1β116-269   R4D-1(5’-CATATGGATA TCCCTGTAGA
  269(R4D)   (R4D)(SEQ-IDNO：131)   CTCACTGAAC TGCACGCTC-3’；SEQ-IDNO：143)；R4D-2(5’-GAGCGTGCAG TTCAGTGAGTCTACAGGGAT ATCCATATG-3’；SEQ-IDNO：144)
  pET42T-hIL-1β116-269(L6A)   hIL-1β116-269(L6A)(SEQ-IDNO：132)   L6A-1(5’-GATATCCCTG TACGATCAGCTAACTGCACG CTCCGGGAC-3’；SEQ-IDNO：145)；L6A-2(5’-GTCCCGGAGC GTGCAGTTAGCTGATCGTAC AGGGATATC-3’；SEQ-IDNO：146)
  pET42T-hIL-1β116-269(T9G)   hIL-1β116-269(T9G)(SEQ-IDNO：133)   T9G-1(5’-GTACGATCAC TGAACTGCGGTCTCCGGGAC TCACAGC-3’；SEQ-ID NO：147)T9G-2(5’-GCTGTGAGTC CCGGAGACCGCAGTTCAGTG ATCGTAC-3’；SEQ-ID NO：148)
  pET42T-hIL-1β116-269(R11G)   hIL-1β116-269(R11G)(SEQ-IDNO：134)   R11G-1(5’-GAACTGCACG CTCGGGGACTCACAGC-3’；SEQ-ID NO：149)R11G-2(5’-GCTGTGAGTC CCCGAGCGTGCAGTTC-3’；SEQ-ID NO：150)
  pET42T-hIL-1β116-269(D54R)   hIL-1β116-269(D54R)(SEQ-IDNO：135)   D54R-1(5’-CAAGGAGAAGAAAGTAATCGCAAAATACCTGTGGCCTTG-3’；SEQ-ID NO：151D54R-2(5’-CAAGGCCACAGGTATTTTGCGATTACTTTCTTCTCCTTG-3’；SEQ-ID NO：152)
  pET42T-hIL-1β116-269(D145K)   hIL-1β116-269(D145K)(SEQ-IDNO：136)   D145K-1(5’-GCGGCCAGGATATAACTAAATTCACCATGCAATTTGTGTC-3’；SEQ-ID NO：161)D145K-2(5’-GACACAAATTGCATGGTGAATTTAGTTATATCCTGGCCGC-3’；SEQ-ID NO：162)
  pET42T-hIL-1β116-269(ΔEE50，51)   hIL-1β116-269(ΔEE50，51)   EE-1(5’-CATGTCCTTTGTACAAGGAAGTAATGACAAAATACCTGTG-3’；SEQ-ID NO：153)
  (SEQ-IDNO：137)   EE-2(5’-CACAGGTATTTTGTCATTACTTCCTTGTACAAAGGACATG-3’；SEQ-ID NO：154)
  pET42T-hIL-1β116-269(ΔSND52-54)   hIL-1β116-269(ΔSND52-54)(SEQ-IDNO：138)   SND-1(5’-CTTTGTACAAGGAGAAGAAAAAATACCTGTGGCCTTG-3’；SEQ-ID NO：155)SND-2(5’-CAAGGCCACAGGTATTTTTTCTTCTCCTTGTACAAAG-3’；SEQ-ID NO：156)
  pET42T-hIL-1β116-269(K63S/K65S)   hIL-1β116-269(K63S/K65S)(SEQ-IDNO：139)   K6365S-1(5’-GTGGCCTTGGGCCTCAGCGAAAGCAATCTGTACCTGTCCTG-3’；SEQ-ID NO：157)K6365S-2(5’-CAGGACAGGTACAGATTGCTTTCGCTGAGGCCCAAGGCCAC-3’；SEQ-ID NO：158)
  pET42T-hIL-1β116-269(Q126A/E128A)   hIL-1β116-269(Q126A/E128A)(SEQ-IDNO：140)   QE-1(5’-GTACATCAGCACCTCTGCAGCAGCAAACATGCCCGTCTTC-3’；SEQ-ID NO：159)QE-2(5’-GAAGACGGGCATGTTTGCTGCTGCAGAGGTGCTGATGTAC-3’；SEQ-ID NO：160)
                          实施例11
   人IL-1β116-269与人IL-1β116-269突变蛋白的生物活性
3只C3H/HeJ雌性小鼠为一组，对它们静脉注射10μg野生型人IL-1β119-269蛋白或者实施例10中人IL-1β119-269突变蛋白中的一种。在注射前和注射3小时后取样，并分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。注射野生型人IL-1β119-269蛋白的小鼠显示出血清IL-6浓度显著增长，而注射两种人IL-1β119-269突变蛋白中的一种的小鼠却仅仅显示出轻微的增长或根本没有增长。
                        实施例12
A.人IL-1β116-269及人IL-1β116-269突变蛋白与Qβ病毒样颗粒的偶联
实施例10中的野生型人IL-1β119-269蛋白及人IL-1β119-269突变蛋白与Qβ病毒样颗粒的化学交联基本上如实施例2A所述进行。
B.使用与Qβ衣壳偶联的人IL-1β116-269及人IL-1β116-269突变蛋白免疫小鼠
4只balb/c雌性小鼠为一组，用与Qβ偶联的野生型hIL-1β116-269蛋白或者hIL-1β116-269突变蛋白中的一种对它们进行免疫。将50μg总蛋白用PBS稀释至200μl，并在第0天、第14天和第28天进行皮下注射(100μl在腹部两侧)。在第35天对小鼠眶后取血，用对于用作免疫原的相应人IL-1β116-269突变蛋白或者野生型人IL-1β116-269蛋白特异性的ELISA分析血清。
                         C.ELISA
使用浓度为1μg/ml的野生型hIL-1β116-269蛋白或者相应的hIL-1β116-269突变蛋白包被ELISA板。封闭该板，然后与第35天的鼠血清的连续稀释液孵育。使用酶标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。以在450nm处产生半数最大光密度的那些稀释度的平均值来计算小鼠血清的抗体效价，并示于表4中。
表4：用Qβ-hIL-1β116-269或者Qβ-hIL-1β116-269突变蛋白疫苗免疫而产生的抗hIL-1β116-269(野生型和突变型)特异性IgG的效价
疫苗   抗hIL-1β116-269野生型IgG的平均效价(±SD)   抗hIL-1β116-269突变蛋白IgG的平均效价(±SD)
  Qβ-hIL-1β116-269   253325±184813   -/-
  Qβ-hIL-1β116-269(R4D)   231879±115475   160666±79478
  Qβ-hIL-1β116-269(L6A)   120224±7658   89377±17965
  Qβ-hIL-1β116-269(T9G)   261249±153716   224809±131823
  Qβ-hIL-1β116-269(R11G)   278342±50296   279290±47232
  Qβ-hIL-1β116-269(D54R)   269807±122351   206516±90998
  Qβ-hIL-1β116-269(D145K)   78365±26983   93241±28856
  Qβ-hIL-1β116-269(ΔEE50，51)   287625±143835   229862±140169
  Qβ-hIL-1β116-269(ΔSND52-54)   68895±14267   106116±25295
  Qβ-hIL-1β116-269(K63S/K65S)   403712±402594   244552±173597
  Qβ-hIL-1β116-269(Q126A/E128A)   195165±71436   170434±86831
Qβ-hIL-1β116-269免疫诱导产生针对hIL-1β116-269的高效价的IgG抗体。而且，用两种Qβ-hIL-1β116-269突变蛋白疫苗中的任一种免疫接种都能诱导产生针对用作免疫原的各自Qβ-hIL-1β116-269突变蛋白或者野生型hIL-1β116-269蛋白的高IgG效价。
                    D.人IL-1β的体外中和
测试用与Qβ偶联的野生型hIL-1β116-269蛋白或者hIL-1β116-269突变蛋白中的一种免疫的小鼠血清抑制人IL-1β蛋白与其受体结合的能力。因而使用浓度为1μg/ml的重组人IL-1受体I-hFc融合蛋白包被ELISA板，与上面提到的血清的连续稀释液和100ng/ml hIL-1β116-269蛋白共孵育。使用生物素化的抗人IL-1β抗体和与辣根过氧化酶偶联的链霉抗生物素来检测hIL-1β116-269与固定化的人IL-1受体I-hFc融合蛋白的结合。在血清浓度≥3.3％时，针对Qβ-hIL-1β116-269突变蛋白疫苗产生所有的血清完全抑制100ng/ml野生型hIL-1β116-269与hIL-1RI的结合。
                    E.IL-1β的体内中和
研究通过用与Qβ偶联的野生型hIL-1β116-269蛋白或者hIL-1β116-269突变蛋白中的一种免疫而产生的抗体的体内中和能力。因而，在第0天、第14天和第28天用50μg的任一种疫苗对每组3只C3H/HeJ雌性小鼠免疫3次。在第35天，对所有的免疫过的小鼠静脉注射1μg的游离野生型hIL-1β116-269。三只初次接受试验的小鼠同时注射相同量的野生型hIL-1β116-269作为对照。作为注射的hIL-1β116-269的炎症活性的读数，在注射前立即和注射3小时后取样，并分析血清样本中促炎细胞因子IL-6浓度的相对增加。初次接受试验的小鼠在注射hIL-1β116-2693小时后显示血清IL-6浓度显著增加，而所有用与Qβ偶联的野生型hIL-1β116-269蛋白或者hIL-1β116-269突变蛋白中的一种免疫的小鼠则显示血清IL-6没有任何增加，表明注射的hIL-1β116-269被疫苗诱导产生的抗体有效地中和了。
                     实施例13
     Qβ-mIL-1β119-269免疫对于MSU诱导的炎症的改善
痛风是一种由于尿酸单钠(MSU)晶体在关节及关节周围组织沉淀所导致的痛苦的炎性疾病。已经认为MSU晶体激活所谓的NALP3inflammasome，导致产生活性的IL-1β，IL-1β主要负责开始并促进疾病的炎症应答特征。对C57BL/6小鼠(每组5只)以2周为间隔用50μgQβ-mIL-1β119-269或者单独用50μg QβVLP进行3次皮下免疫。最后一次免疫1周后对所有小鼠进行1.5mg MSU晶体的腹膜内刺激。刺激6小时后，处死小鼠，测定腹膜渗出物中的中性粒细胞数目和中性粒细胞化学引诱物KC和MIP-2的浓度。与Qβ免疫对照组相比，Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠表现出明显的白细胞及MIP-2和KC浓度减少。
                     实施例14
Qβ-mIL-1β119-269免疫对于实验性自身免疫性脑炎的改善
对多发性硬化症小鼠模型的C57BL/6小鼠(每组8只)以2周为间隔用50μg Qβ-mIL-1β119-269或者单独用50μg QβVLP进行3次皮下免疫。最后一次免疫1周后对所有小鼠皮下注射混合有完全弗氏佐剂的100μg的MOG肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，SEQ ID NO：191)。当天和两天后，对所有小鼠腹膜内注射400ng的百日咳毒素。基于神经症状的发展依据以下方案每天对小鼠评分：0，没有临床疾病；0.5，尾巴末端无力；1，尾巴完全无力；1.5，尾巴无力和后肢虚弱(步态不稳，后足抓握无力)；2，单侧后肢部分瘫痪；2.5，两侧后肢部分瘫痪；3，两侧后肢完全瘫痪；3.5，两侧后肢完全瘫痪，单侧前肢完全瘫痪；4，四肢完全瘫痪。与Qβ-免疫小鼠相比，Qβ-mIL-1β119-269免疫小鼠的临床症状明显减轻。
序列表
<110>赛托斯生物技术公司
     M.巴克曼
     G.斯庞
<120>IL-1偶联物及其用途
<130>P1051PC00
<150>60/721,106
<151>2005-09-28
<160>195
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Leu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>2
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Ash Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr ValLeu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>3
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>3
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>4
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>4
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
                5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>5
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>5
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>6
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>6
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>7
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>7
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
                5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>8
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>8
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>9
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>9
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>10
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>10
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Glu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>11
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>11
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>12
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>12
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>13
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>13
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>14
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>14
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
ThrAsn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
           100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>15
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>15
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>16
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>16
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>17
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>18
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>19
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
                5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Qbeta
<400>20
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>21
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>21
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>22
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>22
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>23
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>23
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>24
atatatgcta gccccttaca cctaccagag tgatttg                    37
<210>25
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>25
tatatctcg agtgatatct ggaagtctgt catagag                     37
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>26
atatatgcta gcccccatta gacagctgca ctacagg                    37
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>27
atatatctcg agggaagaca cagattccat ggtgaag                    37
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>28
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1               5
<210>29
<211>5473
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆载体
<400>29
acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc    60
aatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc    120
tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac    180
cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc cggccacggg    240
gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc    300
ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat    360
gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat cgagatctcg atcccgcgaa attaatacga    420
ctcactatag gggaattgtg agcggataac aattcccctc tagaaataat tttgtttaac    480
tttaagaagg agatatacat atggatccac accaccacca ccaccacggt tctggtgacg    540
acgatgacaa agcgctagcc ctcgagggtg gtggtggtgg ttgcggttaa taagtttaaa    600
cgcggccgca tgcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag    660
gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct    720
aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg    780
cgcgccctg  tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg    840
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca    900
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta    960
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc    1020
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg    1080
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat    1140
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta    1200
acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcagg tggcactttt cggggaaatg    1260
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga    1320
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac    1380
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc    1440
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca    1500
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc    1560
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg    1620
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac    1680
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca    1740
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg    1800
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac    1860
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg    1920
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat    1980
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg    2040
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg    2100
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc    2160
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc    2220
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt    2280
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt    2340
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt    2400
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag    2460
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca    2520
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca    2580
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg    2640
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg    2700
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct    2760
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga    2820
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc    2880
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg    2940
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg    3000
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt    3060
tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc    3120
gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc    3180
ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatatggt gcactctcag    3240
tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac    3300
tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt    3360
ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag    3420
aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg    3480
tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc    3540
agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt    3600
ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca tgggggtaat gataccgatg    3660
aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa    3720
cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag    3780
ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat    3840
cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt  3900
tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag  3960
cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa  4020
ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggggcc  4080
gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg  4140
aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc  4200
gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct  4260
acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc  4320
caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc  4380
taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga  4440
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt  4500
attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt  4560
caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg  4620
aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc  4680
gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat  4740
tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt  4800
cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc  4860
tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc  4920
cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag  4980
atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt  5040
ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat  5100
ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag  5160
attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac  5220
gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg  5280
cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg  5340
gccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt   5400
tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc  5460
ggcatactct gcg                                                     5473
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>30
tatggatccg gctagcgctc gagggtttaa acggcggccg cat                    43
<210>31
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>31
tcgaatgcgg ccgccgttta aaccctcgag cgctagccgg atcca                  45
<210>32
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCT引物
<400>32
gatccacacc accaccacca ccacggttct ggtgacgacg atgacaaagc gctagccc    58
<210>33
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>33
tcgagggcta gcgctttgtc atcgtcgtca ccagaaccgt ggtggtggtg gtggtgtg    58
<210>34
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>34
tcgagggtgg tggtggtggt tgcggttaat aagtttaaac gc                     42
<210>35
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>35
agccgcgttt aaacttatta accgcaacca ccaccaccac cc                     42
<210>36
<211>271
<212>PRT
<213>人
<400>36
Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met
        35                  40                  45
Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg
        115                 120                 125
Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile
    130                 135                 140
Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu
145                 150                 155                 160
Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr
            180                 185                 190
Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe
    210                 215                 220
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro
225                 230                 235                 240
Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala
            260                 265                 270
<210>37
<211>271
<212>PRT
<213>猕猴(Macaca mulatta)
<400>37
Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met
        35                  40                  45
Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Ile Ser Lys Thr Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Phe Lys Gln Ser Met Val Val Val Ser Thr Asn Gly Lys Val
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asn Asn
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Met Thr Tyr His Phe Ile Arg
        115                 120                 125
Ile Ile Lys His Glu Phe Ile Leu Asn Asp Thr Leu Asn Gln Thr Ile
    130                 135                 140
Ile Arg Ala Asn Asp Gln His Leu Thr Ala Ala Ala Ile His Asn Leu
145                 150                 155                 160
Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Asp Thr Lys Val Pro Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Glu Ile Asn Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Phe Leu Phe Phe
    210                 215                 220
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Ile Ser Val Ala His Pro
225                 230                 235                 240
Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys His Asp Asn Trp Val Cys Leu Ala Lys
                245                 250                 255
Gly Leu Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala
            260                 265                 270
<210>38
<211>270
<212>PRT
<213>马(Equus caballus)
<400>38
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Thr Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Asp Pro Leu Pro Glu Asp Cys Met
        35                  40                  45
Asp Thr Phe Met Ser Leu Ser Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Asn Phe Lys Glu Ser Val Val Leu Val Ala Ala Asn Gly Lys Thr
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asn Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Pro Glu Glu Gly Ile Ile Arg Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Val His Tyr Asn Phe Gln Ser Asn Thr Lys Tyr Asn Phe Met Arg
        115                 120                 125
Ile Val Asn His Gln Cys Thr Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Val
    130                 135                 140
Ile Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Asp Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Glu Glu
                165                 170                 175
Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Asp Thr Pro Lys Thr Ile Lys Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp
    210                 215                 220
Glu Arg His Gly Ser Lys Asn Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Gly Lys Leu Val His Met Ala Arg Gly
                245                 250                 255
Gln Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Asp Asn Gln Phe
            260                 265                 270
<210>39
<211>268
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>39
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Arg Glu Asp His Met
        35                  40                  45
Asn Lys Phe Met Ser Leu Asp Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Arg
    50                  55                  60
Leu Ser Phe Lys Glu Asn Val Val Met Met Thr Ala Asn Gly Lys Ile
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Ala His Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg
        115                 120                 125
Val Ile His Gln Glu Cys Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile
    130                 135                 140
Ile Arg Asp Met Ser Gly Pro Tyr Leu Thr Ala Ala Thr Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Glu Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Val Ala Tyr Val Ser Glu Glu
                165                 170                 175
Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Phe
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Glu Thr Pro Lys Ile Ile Lys Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp
    210                 215                 220
Glu Lys His Gly Ser Met Asp Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Ser Gly
                245                 250                 255
Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Lys
            260                 265
<210>40
<211>270
<212>PRT
<213>猫(Felis catus)
<400>40
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Glu I1e Asp His Leu Thr Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Asp Pro Leu His Glu Asp Cys Thr
        35                  40                  45
Asp Lys Phe Met Ser Pro Ser Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Pro Gln
    50                  55                  60
Leu Thr Leu Lys Lys Ser Val Val Met Val Ala Ala Asn Gly Lys Ile
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Leu Thr Ala Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Glu Val Glu Glu Glu Ile Met Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Val Ala Pro Asn Phe Tyr Ser Ser Glu Lys Tyr Asn Tyr Gln Lys
        115                 120                 125
Ile Ile Lys Ser Gln Phe Ile Leu Asn Asp Asn Leu Ser Gln Ser Val
    130                 135                 140
Ile Arg Lys Ala Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Ala Ala Ala Leu Gln Asn
145                 150                 155                 160
Leu Asp Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Lys Glu
                165                 170                 175
Asp Ser Lys Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Glu Thr Pro Lys Thr Ile Arg Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp
    210                 215                 220
Glu Arg His Gly Ser Lys Asn Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ile Ala Thr Gln Glu Glu Gln Leu Val His Met Ala Arg Gly
                245                 250                 255
Leu Pro Ser Val Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Thr Gln Ser
            260                 265                 270
<210>41
<211>268
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>41
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Arg Glu Asp Gln Met
        35                  40                  45
Asn Lys Phe Met Ser Leu Asp Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Ser Phe Lys Glu Asn Val Val Met Val Ala Ala Ser Gly Lys Ile
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asn Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Ala His Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg
        115                 120                 125
Val Ile His Gln Glu Cys Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile
    130                 135                 140
Ile Arg Asp Met Ser Gly Pro Tyr Leu Thr Ala Thr Thr Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Glu Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Val Ala Tyr Val Ser Glu Glu
                165                 170                 175
Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Phe
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro
        195                 200                 205
Glu Thr Pro Lys Ile Ile Lys Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp
    210                 215                 220
Glu Lys His Gly Ser Met Asp Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Ser Gly
                245                 250                 255
Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Lys
            260                 265
<210>42
<211>270
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<400>42
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Asp Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Pro Gly Asp Gly Met
        35                  40                  45
Asp Lys Phe Met Pro Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ser Lys Thr Ser Arg
    50                  55                  60
Leu Asn Phe Lys Asp Ser Val Val Met Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ile
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Ala Thr Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Met Lys Tyr Asn Phe Met Arg
        115                 120                 125
Val Ile Asn His Gln Cys Ile Leu Asn Asp Ala Arg Asn Gln Ser Ile
    130                 135                 140
Ile Arg Asp Pro Ser Gly Gln Tyr Leu Met Ala Ala Val Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Ala Ala Tyr Thr Ser Asn Asp
                165                 170                 175
Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Glu Thr Arg Leu Phe
            180                 185                 190
Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Leu Pro
        195                 200                 205
Glu Thr Pro Lys Thr Ile Lys Asp Glu Thr Ser Leu Leu Phe Phe Trp
    210                 215                 220
Glu Lys His Gly Asn Met Asp Tyr Phe Lys Ser Ala Ala His Pro Lys
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ile Ala Thr Arg Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Pro Gly
                245                 250                 255
Leu Pro Ser Val Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ser
            260                 265                 270
<210>43
<211>268
<212>PRT
<213>兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>43
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Phe Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu His Glu Asp Cys Met
        35                  40                  45
Asn Lys Val Val Ser Leu Ser Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser Pro Asn
    50                  55                  60
Leu Thr Phe Gln Glu Asn Val Val Ala Val Thr Ala Ser Gly Lys Ile
65                  70                  75                  80
Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Pro Ile Thr Asp Val Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Thr Asn Val Ser Asp Pro Glu Glu Gly Ile Ile Lys Pro Arg
            100                 105                 110
Ser Val Pro Tyr Thr Phe Gln Arg Asn Met Arg Tyr Lys Tyr Leu Arg
        115                 120                 125
Ile Ile Lys Gln Glu Phe Thr Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Leu
    130                 135                 140
Val Arg Asp Thr Ser Asp Gln Tyr Leu Arg Ala Ala Pro Leu Gln Asn
145                 150                 155                 160
Leu Gly Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Val Tyr Met Thr Ser Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Ser Ile Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Gln Thr Pro Leu
            180                 185                 190
Phe Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met
        195                 200                 205
Pro Glu Thr Pro Arg Ile Ile Thr Asp Ser Glu Ser Asp Ile Leu Phe
    210                 215                 220
Phe Trp Glu Thr Gln Gly Asn Lys Asn Tyr Phe Lys Ser Ala Ala Asn
225                 230                 235                 240
Pro Gln Leu Phe Ile Ala Thr Lys Pro Glu His Leu Val His Met Ala
                245                 250                 255
Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser
            260                 265
<210>44
<211>265
<212>PRT
<213>犬(Canis familiaris)
<400>44
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Met Ser Cys Asp Pro Leu His Glu Asp Cys Met
        35                  40                  45
Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ile Ser Lys Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys
    50                  55                  60
Glu Asn Val Val Val Val Ala Ala Asn Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg
65                  70                  75                  80
Arg Leu Ser Leu Ser Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp Leu Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Ala Asn Asp Thr Glu Glu Val Ile Met Lys Pro Arg Ser Val Ala Tyr
            100                 105                 110
Asn Phe His Asn Asn Glu Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg Ile Ile Lys Ser
        115                 120                 125
Gln Phe Ile Leu Asn Asp Asn Leu Asn Gln Ser Ile Val Arg Gln Thr
    130                 135                 140
Gly Gly Asn Tyr Leu Met Thr Ala Ala Leu Gln Asn Leu Asp Asp Ala
145                 150                 155                 160
Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Glu Asp Ser Lys Leu Pro
                165                 170                 175
Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe Val Ser Ala Gln Asn
            180                 185                 190
Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Thr Pro Lys Thr
        195                 200                 205
Ile Arg Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Arg His Gly Ser
    210                 215                 220
Lys His Tyr Phe Lys Ser Val Ala Gln Pro Lys Leu Phe Ile Ala Thr
225                 230                 235                 240
Gln Glu Arg Lys Leu Val His Met Ala Arg Gly Gln Pro Ser Ile Thr
                245                 250                 255
Asp Phe Arg Leu Leu Glu Thr Gln Pro
            260                 265
<210>45
<211>270
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>45
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
1               5                   10                  15
Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Gly Ser Leu His Glu Thr Cys Thr
        35                  40                  45
Asp Gln Phe Val Ser Leu Arg Thr Ser Glu Thr Ser Lys Met Ser Asn
    50                  55                  60
Phe Thr Phe Lys Glu Ser Arg Val Thr Val Ser Ala Thr Ser Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Phe Ser Glu Thr Phe Thr
                85                  90                  95
Glu Asp Asp Leu Gln Ser Ile Thr His Asp Leu Glu Glu Thr Ile Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Ser Ala Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Leu
        115                 120                 125
Met Lys Leu Val Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln
    130                 135                 140
Thr Ile Tyr Gln Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr Trp Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp Leu Gln Gln Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Asp Ser
            180                 185                 190
Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys
        195                 200                 205
Glu Leu Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu
    210                 215                 220
Ile Phe Phe Trp Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Pro Glu Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg Val His
               245                 250                 255
LeuAla Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser
           260                 265                 270
<210>46
<211>270
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>46
Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser
                5                   10                  15
Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Gly Ser Leu His Glu Asn Cys Thr
        35                  40                  45
Asp Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Ser Glu Thr Ser Lys Met Ser Thr
    50                  55                  60
Phe Thr Phe Lys Glu Ser Arg Val Val Val Ser Ala Thr Ser Asn Lys
65                  70                  75                  80
Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Phe Asn Gln Pro Phe Thr
                85                  90                  95
Glu Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ala His Asp Leu Glu Glu Thr Ile Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Ser Ala Pro His Ser Phe Gln Asn Asn Leu Arg Tyr Lys Leu
        115                 120                 125
Ile Arg Ile Val Lys Gln Glu Phe Ile Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln
    130                 135                 140
Asn Ile Tyr Val Asp Met Asp Arg Ile His Leu Lys Ala Ala Ser Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp Leu Gln Leu Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Val Ser Asn Thr
            180                 185                 190
Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Lys Pro Val Leu Leu Lys
        195                 200                 205
Glu Ile Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu
    210                 215                 220
Ile Phe Phe Trp Glu Lys Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala
225                 230                 235                 240
Ala Phe Pro Glu Leu Leu Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Gln Val His
                245                 250                 255
Leu Ala Arg Gly Leu Pro Ser Met Ile Asp Phe Gln Ile Ser
            260                 265                 270
<210>47
<211>152
<212>PRT
<213>大猩猩(Gorilla gorilla)
<400>47
Lys Asn Cys Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His
                5                   10                  15
Leu Ser Leu Asn Gln Lys Ser Phe Tyr His Val Thr Tyr Gly Pro Leu
            20                  25                  30
His Glu Gly Cys Met Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr
        35                  40                  45
Ser Lys Thr Ser Lys Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala
    50                  55                  60
Thr Asn Gly Lys Val Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser
65                  70                  75                  80
Ile Thr Asp Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu
                85                  90                  95
Ile Ile Lys Pro Arg Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys
            100                 105                 110
Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Asn Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala
        115                 120                 125
Leu Asn G1n Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala
145                 150
<210>48
<211>204
<212>PRT
<213>豚鼠(Cavia porcellus)
<400>48
Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Tyr Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln Lys Ser Phe Tyr Asp Thr Asn
            20                  25                  30
Tyr Asp Pro Leu His Glu Asn Arg Val Asp Glu Pro Val Ser Pro Asn
        35                  40                  45
Pro Tyr Glu Asn Ser Glu Glu Ser Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ser Ser
    50                  55                  60
Asp Ser Ser Ala Val Val Leu Thr Ser Ala His Gly Glu Val Leu Lys
65                  70                  75                  80
Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Thr Met Ser Asn Glu Asp Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Glu Pro Trp Ser Val
            100                 105                 110
Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Leu Lys Phe Lys Tyr Gln Arg Ser Ile
        115                 120                 125
Lys Lys Gly Ala Val Ile Thr Asp Ala Met His Gln Ser Leu Ile Arg
    130                 135                 140
Glu Ser Asn Gly Gln His Leu Lys Ala Met His Val Val Asp Arg Lys
145                 150                 155                 160
His Glu Val Lys Phe Asp Ile Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ala Thr Arg
                165                 170                 175
Ile Arg Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Cys
            180                 185                 190
Ala Gln Glu Glu Gly Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu
        195                 200
<210>49
<211>269
<212>PRT
<213>人
<400>49
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met
            20                  25                  30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala
    50                  55                  60
Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65                  70                  75                  80
Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala
            100                 105                 110
Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
        115                 120                 125
Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
    130                 135                 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145                 150                 155                 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
                165                 170                 175
Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
            180                 185                 190
Cys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
        195                 200                 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
    210                 215                 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly
                245                 250                 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
            260                 265
<210>50
<211>193
<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>50
Met Leu Val Pro Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser rhr
1               5                   10                  15
Phe Phe Pro Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp
            20                  25                  30
Glu Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys
        35                  40                  45
Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr
    50                  55                  60
Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile
                85                  90                  95
Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys
        115                 120                 125
Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile
    130                 135                 140
Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly
                165                 170                 175
Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser
            180                 185                 190
Ser
<210>51
<211>269
<212>PRT
<213>猕猴
<400>51
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Asp Val Asp Gly Pro Lys Gln Met
            20                  25                  30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Gly Gly Gly Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Ile Ser His Glu His Tyr Asn Glu Gly Phe Arg Gln Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Val Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65                  70                  75                  80
Cys Pro Gln Ile Phe Gln Asp Asn Asp Leu Ser Thr Leu Ile Pro Phe
                85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Val Phe Leu Asp Thr Arg Asn Asn Asp Ala
            100                 105                 110
Cys Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu His Cys Thr Leu Arg Asp
        115                 120                 125
Ala Gln Leu Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
    130                 135                 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Leu Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145                 150                 155                 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
                165                 170                 175
Gly Leu Lys Ala Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
            180                 185                 190
Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
        195                 200                 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
    210                 215                 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Arg Gly Gly
                245                 250                 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
            260                 265
<210>52
<211>268
<212>PRT
<213>兔(0ryctolagus cunicullus)
<400>52
Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Thr Ser Glu Met Met Ala Tyr His Ser
1               5                   10                  15
Gly Asn Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Asn Tyr Met
            20                  25                  30
Lys Ser Cys Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Cys Pro Asp Glu Gly Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Arg Ile Ser Cys Gln Pro Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val
    50                  55                  60
Leu Ser Val Val Val Ala Leu Glu Lys Leu Arg Gln Lys Ala Val Pro
65                  70                  75                  80
Cys Pro Gln Ala Phe Gln Asp Asp Gly Leu Arg Thr Phe Phe Ser Leu
                85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Val Leu Cys Asn Thr Trp Asp Asp Tyr Ser
            100                 105                 110
Leu Glu Cys Asp Ala Val Arg Ser Leu His Cys Arg Leu Gln Asp Ala
        115                 120                 125
Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Thr Tyr Glu Leu Lys Ala Leu
    130                 135                 140
His Leu Asn Ala Glu Asn Leu Asn Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser
145                 150                 155                 160
Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly
                165                 170                 175
Leu Arg Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Asp Lys
            180                 185                 190
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Lys Lys
        195                 200                 205
Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Lys Asp Lys
    210                 215                 220
Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Gln Thr Glu Tyr Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gly Gln
                245                 250                 255
Asp Leu Ile Asp Phe Ser Met Glu Phe Val Ser Ser
            260                 265
<210>53
<211>269
<212>PRT
<213>小鼠
<400>53
Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Met Pro Pro Phe Asp Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Gln Lys Met Lys
            20                  25                  30
Gly Cys Phe Gln Thr Phe Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu Ser Ile Gln
        35                  40                  45
Leu Gln Ile Ser Gln Gln His Ile Asn Lys Ser Phe Arg Gln Ala Val
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro Val Ser Phe
65                  70                  75                  80
Pro Trp Thr Phe Gln Asp Glu Asp Met Ser Thr Phe Phe Ser Phe Ile
                85                  90                  95
Phe Glu Glu Glu Pro Ile Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp Asp Asp Asn
            100                 105                 110
Leu Leu Val Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg
        115                 120                125
Asp Glu Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys
    130                 135                 140
Ala Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser
145                 150                 155                 160
Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala
                165                 170                 175
Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp
            180                 185                 190
Gly Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro
        195                 200                 205
Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys
    210                 215                 220
Ser Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser
225                 230                 235                 240
Thr Ser Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly
                245                 250                 255
Gln Asp Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser
            260                 265
<210>54
<211>268
<212>PRT
<213>大鼠
<400>54
Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Ile Ala Ala Phe Asp Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Arg Pro Gln Lys Ile Lys
            20                  25                  30
Asp Cys Phe Gln Ala Leu Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu Ser Ile Gln
        35                  40                  45
Leu Gln Ile Ser Gln Gln His Leu Asp Lys Ser Phe Arg Lys Ala Val
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro Met Ser Cys
65                  70                  75                  80
Pro Trp Ser Phe Gln Asp Glu Asp Pro Ser Thr Phe Phe Ser Phe Ile
                85                  90                  95
Phe Glu Glu Glu Pro Val Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp Asp Asp Leu
            100                 105                 110
Leu Val Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Cys Arg Leu Arg Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Gln Lys Cys Leu Val Leu Ser Asp Pro Cys Glu Leu Lys Ala
    130                 135                 140
Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Ser Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145                 150                 155                 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Thr Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
                165                 170                 175
Gly Leu Lys Gly Leu Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly
            180                 185                 190
Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys
        195                 200                 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys Thr
    210                 215                 220
Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Ala Glu His Arg Pro Val Phe Leu Gly Asn Ser Asn Gly Arg
               245                 250                 255
AspIle Val Asp Phe Thr Met Glu Pro Val Ser Ser
           260                 265
<210>55
<211>268
<212>PRT
<213>马(Equus caballus)
<400>55
Met Ala Ala Val Pro Asp Thr Ser Asp Met Met Thr Tyr Cys Ser Gly
1               5                   10                  15
Asn Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Glu Asp Gly Pro Lys Gln Met Lys
            20                  25                  30
Gly Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Ser Ser Met Gly Asn Gly Gly Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Phe Ser His Gln Leu Tyr Asn Lys Thr Phe Lys His Val
    50                  55                  60
Val Ser Ile Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Lys Lys Ile Pro Val Pro
65                  70                  75                  80
Cys Ser Gln Ala Phe Gln Asp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Phe Ser Val
                85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Asp Asn Trp Asp Asp Asp Tyr
            100                 105                 110
Val Cys Asp Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg Asp Ile
        115                 120                 125
Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln Ala Val
    130                 135                 140
His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys Met Ser
145                 150                 155                 160
Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly
                165                 170                 175
Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Met Lys Asp Gly Lys
            180                 185                 190
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro Lys Arg
        195                 200                 205
Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys Gly Asn
    210                 215                 220
Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly Gly Arg
                245                 250                 255
Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala
            260                 265
<210>56
<211>267
<212>PRT
<213>猫(Felis catus)
<400>56
Met Ala Pro Val Pro Glu Leu Thr Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Glu Lys Met Lys
            20                  25                  30
Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ser His Ser Phe Leu Gly Asp Glu Gly Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Pro Asp Asn Lys Ser Leu Arg His Ala
    50                  55                  60
Val Ser Val Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Lys Lys Ile Ser Phe Ala
65                  70                  75                  80
Cys Ser Gln Pro Leu Gln Asp Glu Asp Leu Lys Ser Leu Phe Cys Cys
                85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Asp Thr Trp Asp Asp Gly Phe
            100                 105                 110
Val Cys Asp Ala Ala Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Thr Phe Arg Asp Ile
        115                 120                 125
Ser Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu
    130                 135                 140
His Leu Asn Gly Gln Asn Met Asn Gln Gln Val Val Phe Arg Met Ser
145                 150                 155                 160
Phe Val His Gly Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ile Pro Val Val Leu Cys
                165                 170                 175
Ile Lys Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys
            180                 185                 190
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Met Leu Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Lys
        195                 200                 205
Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Thr Glu Ile Lys Gly Asn
    210                 215                 220
Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Gln Ala Glu Glu Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Lys Gly Gly Gln
                245                 250                 255
Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ser Ala Ser
            260                 265
<210>57
<211>267
<212>PRT
<213>猪
<400>57
Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ala Lys Glu Val Met Ala Asn Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Asn Asn Asn Asp Leu Leu Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Glu Met
            20                  25                  30
Lys Cys Arg Thr Gln Asn Leu Asp Leu Ser Pro Leu Gly Asp Gly Ser
        35                  40                  45
Ile Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Leu Cys Asn Glu Ser Ser Arg Pro
    50                  55                  60
Met Val Ser Val Ile Val Ala Lys Glu Glu Pro Met Asn Pro Ser Ser
65                  70                  75                  80
Gln Val Val Cys Asp Asp Asp Pro Lys Ser Ile Phe Ser Ser Val Phe
                85                  90                  95
Glu Glu Glu Pro Ile Val Leu Glu Lys His Ala Asn Gly Phe Leu Cys
            100                 105                 110
Asp Ala Thr Pro Val Gln Ser Val Asp Cys Lys Leu Gln Asp Lys Asp
        115                 120                 125
Glu Lys Ala Leu Val Leu Ala Gly Pro His Glu Leu Lys Ala Leu His
    130                 135                 140
Leu Leu Lys Gly Asp Leu Lys Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe
145                 150                 155                 160
Val Gln Gly Asp Asp Ser Asp Asp Lys Ile Pro Val Thr Leu Gly Ile
                165                 170                 175
Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Asp Thr Pro
            180                 185                 190
Thr Leu Gln Leu Glu Asp Val Asp Pro Lys Ser Tyr Pro Lys Arg Asp
        195                 200                 205
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Arg Val
    210                 215                 220
Glu Phe Glu Ser Ala Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
225                 230                 235                 240
Ala Glu Gln Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Ser Lys Gly Arg Gln Asp
                245                 250                 255
Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Val Leu Ser Pro
            260                 265
<210>58
<211>266
<212>PRT
<213>豚鼠
<400>58
Met Ala Ala Val Pro Glu Leu Ser Ser Glu Val Thr Ala Tyr His Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Asn Glu Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Asn Lys Met Gln
            20                  25                  30
Tyr Cys Phe Gln Asp Arg Asp Leu Cys Ser Leu Asp Glu Gly Ile Lys
        35                  40                  45
Leu Gln Ile Ser His Gln His Phe Asn Lys Ser Phe Arg Gln Thr Val
    50                  55                  60
Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Arg Lys Lys Leu Ala Pro Cys
65                  70                  75                  80
Thr Trp Ala Phe Gln Asp Asp Asp Leu Arg Pro Leu Leu Pro Phe Ile
                85                  90                  95
Phe Glu Glu Glu Pro Ile Val Cys Asp Thr Trp Asp Glu Glu Tyr Glu
            100                 105                 110
Ser Asp Thr Pro Val Pro Ser Arg Asn Cys Thr Leu His Asp Ile Gln
        115                 120                 125
His Lys Arg Leu Val Leu Ser Asp Pro Cys Glu Leu Lys Ala Leu His
    130                 135                 140
Leu Asn Gly Asp Asn Leu Asn Arg Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
145                 150                 155                 160
Val Gln Gly Glu Arg Ser Asp Asn Lys Met Pro Val Ala Leu Gly Leu
                165                 170                 175
Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro
           180                 185                 190
Val Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Gly Lys Gln Tyr Pro Lys Lys Lys
        195                 200                 205
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Thr Ser Lys Ser Thr Val
    210                 215                 220
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
225                 230                 235                 240
Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Asn Gly Gln Asp Ile
                245                 250                 255
Ile Asp Phe Lys Leu Glu Leu Val Ser Ser
            260                 265
<210>59
<211>266
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>59
Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ile Asn Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Asn Glu Leu Leu Phe Glu Ala Asp Asp Pro Lys Gln Met Lys
            20                  25                  30
Ser Cys Ile Gln His Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Asp Gly Asn Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Phe Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val
    50                  55                  60
Val Ser Val Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Asn Ser Ala Tyr Ala
65                  70                  75                  80
His Val Phe His Asp Asp Asp Leu Arg Ser Ile Leu Ser Phe Ile Phe
                85                  90                  95
Glu Glu Glu Pro Val Ile Phe Glu Thr Ser Ser Asp Glu Phe Leu Cys
            100                 105                 110
Asp Ala Pro Val Gln Ser Ile Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln
        115                 120                 125
Lys Ser Leu Val Leu Ala Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Gln Glu Met Asn Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val
145                 150                 155                 160
Gln Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Lys
                165                 170                 175
Asp Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr
            180                 185                 190
Glu Gln Leu Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met
        195                 200                 205
Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu
    210                 215                 220
Phe Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile
225                 230                 235                 240
Glu Glu Arg Pro Val Phe Leu Gly His Phe Arg Gly Gly Gln Asp Ile
                245                 250                 255
Thr Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro
            260                 265
<210>60
<211>266
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis aries)
<400>60
Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ile Asn Glu Val Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Asn Glu Leu Leu Phe Glu Val Asp Gly Pro Lys Gln Met Lys
            20                  25                  30
Ser Cys Thr Gln His Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Asp Gly Asn Ile
        35                  40                  45
Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Leu Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val
    50                  55                  60
Val Ser Val Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Ser Arg Ala Tyr Glu
65                  70                  75                  80
His Val Phe Arg Asp Asp Asp Leu Arg Ser Ile Leu Ser Phe Ile Phe
                85                  90                  95
Glu Glu Glu Pro Val Ile Phe Glu Thr Ser Ser Asp Glu Leu Leu Cys
            100                 105                 110
Asp Ala Ala Val Gln Ser Val Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln
        115                 120                 125
Lys Ser Leu Val Leu Asp Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu
    130                 135                 140
Pro Ser Gln Glu Met Ser Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val
145                 150                 155                 160
Gln Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Arg
                165                 170                 175
Asp Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr
            180                 185                 190
Leu Gln Leu Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met
        195                 200                 205
Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu
    210                 215                 220
Phe Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile
225                 230                 235                 240
Glu Glu Lys Pro Val Phe Leu Gly Arg Phe Arg Gly Gly Gln Asp Ile
                245                 250                 255
Thr Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro
            260                 265
<210>61
<211>267
<212>PRT
<213>鸡(Gallus gallus)
<400>61
Met Ala Phe Val Pro Asp Leu Asp Val Leu Glu Ser Ser Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Glu Thr Phe Tyr Gly Pro Ser Cys Leu Cys Leu Gln Lys Lys Pro
            20                  25                  30
Arg Leu Asp Ser Glu His Thr Thr Val Asp Val Gln Val Thr Val Arg
        35                  40                  45
Lys Gly Arg Gly Ala Arg Ser Phe Arg Arg Ala Ala Val Leu Val Val
    50                  55                  60
Ala Met Thr Lys Leu Leu Arg Arg Pro Arg Ser Arg Asp Phe Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Leu Ser Ala Leu Leu Glu Glu Val Phe Glu Pro Val Thr Phe
                85                  90                  95
Gln Arg Leu Glu Ser Ser Tyr Ala Gly Ala Pro Ala Phe Arg Tyr Thr
            100                 105                 110
Arg Ser Gln Ser Phe Asp Ile Phe Asp Ile Asn Gln Lys Cys Phe Val
        115                 120                 125
Leu Glu Ser Pro Thr Gln Leu Val Ala Leu His Leu Gln Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Ser Ser Gln Lys Val Arg Leu Asn Ile Ala Leu Tyr Arg Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Pro Arg Gly Ser Ala Gly Thr Gly Gln Met Pro Val Ala Leu Gly Ile
                165                 170                 175
Lys G1y Tyr Lys Leu Tyr Met Ser Cys Val Met Ser Gly Thr Glu Pro
            180                 185                 190
Thr Leu Gln Leu Glu Glu Ala Asp Val Met Arg Asp Ile Asp Ser Val
        195                 200                 205
Glu Leu Thr Arg Phe Ile Phe Tyr Arg Leu Asp Ser Pro Thr Glu Gly
    210                 215                 220
Thr Thr Arg Phe Glu Ser Ala Ala Phe Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr
225                 230                 235                 240
Ser Leu Gln Pro Arg Gln Pro Val Gly Ile Thr Asn Gln Pro Asp Gln
                245                 250                 255
Val Asn Ile Ala Thr Tyr Lys Leu Ser Gly Arg
            260                 265
<210>62
<211>127
<212>PRT
<213>犬(Canis familiaris)
<400>62
Gly Pro Gly Gly Ser Asn Val Lys Cys Cys Cys Gln Asp Leu Asn His
                5                   10                  15
Ser Ser Leu Val Asp Glu Gly Ile Gln Leu Gln Val Ser His Gln Leu
            20                  25                  30
Cys Asn Lys Ser Leu Arg His Phe Val Ser Val Ile Val Ala Leu Glu
        35                  40                  45
Lys Leu Lys Lys Pro Cys Pro Gln Val Leu Gln Glu Asp Asp Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Ile Phe Cys Tyr Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Lys Thr
65                  70                  75                  80
Asp Ala Asp Asn Phe Met Ser Asp Ala Ala Met Gln Ser Val Asp Cys
                85                  90                  95
Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser Tyr
            100                 105                  110
Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Ala
        115                  120                  125
<210>63
<211>153
<212>PRT
<213>人
<400>63
Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe
1               5                   10                  15
Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln
            20                  25                  30
Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe
        35                  40                  45
Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val
    50                  55                  60
Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu
65                  70                  75                  80
Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile
                85                  90                  95
Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Thr His Gly Thr
            100                 105                 110
Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr
        115                 120                 125
Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr
    130                 135                 140
Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala
145                 150
<210>64
<211>153
<212>PRT
<213>人
<400>64
Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln
            20                  25                  30
Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln
        35                  40                  45
Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
    50                  55                  60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
                85                  90                  95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe
            100                 105                 110
Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
        115                 120                 125
Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
    130                 135                 140
Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150
<210>65
<211>183
<212>PRT
<213>小鼠
<400>65
Met Asp Pro His His His His His His Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Ala Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Leu
            20                  25                  30
Met Lys Leu Val Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln
        35                  40                  45
Thr Ile Tyr Gln Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr Trp Leu
    50                  55                  60
Asn Asp Leu Gln Gln Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser
65                  70                  75                  80
Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Asp Ser
                85                  90                  95
Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys
            100                 105                 110
Glu Leu Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu
        115                 120                 125
Ile Phe Phe Trp Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala
    130                 135                 140
Ala Tyr Pro Glu Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg Val His
145                 150                 155                 160
Leu Ala Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser Leu Glu
                165                 170                 175
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly
            180
<210>66
<211>180
<212>PRT
<213>小鼠
<400>66
Met Asp Pro His His His His His His Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Ala Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg Asp Glu
            20                  25                  30
Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu
        35                  40                  45
His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser Met Ser
    50                  55                  60
Phe Val Gln Gly Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly
65                  70                  75                  80
Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys Lys
            100                 105                 110
Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys Ser Lys
        115                 120                 125
Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser
    130                 135                 140
Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly
                165                 170                 175
Gly Gly Cys Gly
            180
<210>67
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>67
Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp
1               5                   10
<210>68
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>68
Arg IleIle Lys Tyr Glu
1              5
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>69
Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn
1               5                   10
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>70
Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn
1               5                   10
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>71
Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu
1               5                   10
<210>72
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>72
Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val
1               5                   10
<210>73
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>73
Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys
1               5                   10
<210>74
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>74
Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile
1               5                   10
<210>75
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>75
Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu
            20                  25                  30
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>76
Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr
1               5                   10
<210>77
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>77
Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp
1               5                   10                  15
Glu Asp Gln Pro Val Leu
            20
<210>78
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>78
Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Lys Glu Met Pro
            20
<210>79
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>79
Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly
1               5                   10                  15
Ser Glu Thr Asn Leu
            20
<210>80
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>80
Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr
1               5                   10
<210>81
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>81
Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe
1               5                   10
<210>82
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>82
Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu
1               5                   10                  15
Thr His Gly Thr Lys
            20
<210>83
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>83
Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp
1               5                   10
<210>84
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>84
Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys
1               5                   10
<210>85
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>85
Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala
1               5                   10
<210>86
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>86
Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro
1               5                   10                  15
Ser Ile
<210>87
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>87
Lys Gln Asp Tyr Trp
1               5
<210>88
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>88
Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala
1               5
<210>89
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>89
Ala Pro Val Arg Ser Leu
1               5
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>90
Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
1               5                   10
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>91
Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln
1               5                   10
<210>92
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>92
Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly
1               5                   10
<210>93
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>93
Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln
1               5                   10
<210>94
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>94
Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val
1               5                   10
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>95
Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln
1               5                   10
<210>96
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>96
Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile
1               5                   10
<210>97
<211>32
<212>PRT
<213>人
<400>97
Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
1               5                   10                  15
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
            20                  25                  30
<210>98
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>98
Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210>99
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>99
Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu
1               5                   10                  15
Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
            20
<210>100
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>100
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
1               5                   10                  15
Gln Leu Glu Ser Val
            20
<210>101
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>101
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Met Glu Lys
            20
<210>102
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>102
Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met
1               5                   10
<210>103
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>103
Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe
1               5                   10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>104
Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe
1               5                   10
<210>105
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>105
Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn
1               5                   10                  15
Asn Lys
<210>106
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>106
Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe
1               5                   10
<210>107
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>107
Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly
1               5                   10                  15
<210>108
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>108
Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly Gly Gln Asp Ile
            20
<210>109
<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>109
Gln Ala Glu Asn Met Pro
1               5
<210>110
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>110
Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
1               5
<210>111
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>111
Val Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg Asp
1               5                   10
<210>112
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>112
Lys Ala Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val
1               5                   10
<210>113
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>113
Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly
1               5                   10                  15
<210>114
<211>20
<212>PRT
<213>大鼠
<400>114
Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Thr Pro Thr Leu Gln
1               5                   10                  15
Glu Glu Ser Val
            20
<210>115
<211>20
<212>PRT
<213>大鼠
<400>115
Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Met Glu Lys
            20
<210>116
<211>22
<212>PRT
<213>大鼠
<400>116
Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu His Arg Pro Val Phe Leu Gly Asn Ser
1               5                   10                  15
Asn Gly Arg Asp Ile Val
            20
<210>117
<211>421
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>117
atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat    60
ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt    120
atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct    180
aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc    240
acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac    300
aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct    360
actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttagggat ccggataatg catctaagct    420
t                                                                    421
<210>118
<211>421
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>118
atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat    60
ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt    120
atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct    180
aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc    240
acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac    300
aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct    360
actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttgaggat ccggataatg catctaagct    420
t                                                                    421
<210>119
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>n为a，c，g或t
<400>119
aaccatggca aataagccaa tgcaaccg                                       28
<210>120
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>120
gtaagcttag atgcattatc cggatcccta agcagtagta tcagacgata cg            52
<210>121
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>121
gtaagcttag atgcattatc cggatcctca agcagtagta tcagacgata cg    52
<210>122
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>122
ggtccggagc gctagcccct tacac                                  25
<210>123
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>123
gtaagcttat gcattatgat atctggaagt ctgtcataga                  40
<2l0>124
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>124
atatatgata tccctgtacg atcactgaac tgcacg                      36
<210>125
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>125
atatatctcg agggaagaca caaattgcat ggtgaag                     37
<210>126
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>126
tatggatatc gaattcaagc ttctgcagct gctcgagtaa ttgattac         48
<210>127
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>127
ctaggtaatc aattactcga gcagctgcag aagcttgaat tcgatatcca       50
<210>128
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>128
tcgagcacca ccaccaccac cacggtggtt gctaataata attgattaat ac    52
<210>129
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>129
ctaggtatta atcaattatt attagcaacc accgtggtgg tggtggtggt gc    52
<210>130
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>130
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser Leu Glu His His His
145                 150                 155                 160
His His His Gly Gly Cys
                165
<210>131
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>131
Met Asp Ile Pro Val Asp Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>132
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>132
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Ala Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>133
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>133
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Gly Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lyg Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>134
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>134
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Gly Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
   130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>135
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>135
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Arg Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>136
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>136
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>137
<211>153
<212>PRT
<213>人
<400>137
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
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Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
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Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe
            100                 105                 110
Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
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Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
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Asp Phe ThrMet Gln Phe Val Ser Ser
145                 150
<210>138
<211>152
<212>PRT
<213>人
<400>138
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys
    50                  55                  60
Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys
                85                  90                  95
Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu
            100                 105                 110
Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn
        115                 120                 125
Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp
    130                 135                 140
Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150
<210>139
<211>155
<212>PRT
<213>人
<4O0>139
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
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Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Ser Glu Ser Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
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Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>140
<211>155
<212>PRT
<213>人
<400>140
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
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Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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<213>人工序列
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<223>合成序列
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<213>人工序列
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<220>
<223>合成序列
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gacacaaatt gcatggtgaa tttagttata tcctggccgc    40
<210>163
<211>154
<212>PRT
<213>小鼠
<400>163
Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Leu Met Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln Thr Ile Tyr Gln
            20                  25                  30
Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr Trp Leu Asn Asp Leu Gln
        35                  40                  45
Gln G1u Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser Gly Gly Asp Asp
    50                  55                  60
Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Phe Val
65                  70                  75                  80
Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Leu Pro Glu
                85                  90                  95
Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu Ile Phe Phe Trp
            100                 105                 110
Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala Ala Tyr Pro Glu
        115                 120                 125
Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg Val His Leu Ala Arg Gly
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser
145                 150
<210>164
<211>151
<212>PRT
<213>小鼠
<400>164
Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg Asp Glu Gln Gln Lys Ser
                5                   10                  15
Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Asn Gly
            20                  25                  30
Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly
        35                  40                  45
Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Gly Lys
    50                  55                  60
Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Thr Pro Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys
                85                  90                  95
Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys Ser Lys Val Glu Phe Glu
            100                 105                 110
Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu His
        115                 120                 125
Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asp Phe
    130                 135                 140
Thr Met Glu Ser Val Ser Ser
145                 150
<210>165
<211>155
<212>PRT
<213>小鼠
<400>165
Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His
            20                  25                  30
Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe
        35                  40                  45
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu
            100                 105                 110
Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
145                 150                 155
<210>166
<211>569
<212>PRT
<213>人
<400>166
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser
1               5                   10                  15
Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu
            20                  25                  30
Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro
        35                  40                  45
Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr
    50                  55                  60
Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys
65                  70                  75                  80
Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys
            100                 105                 110
Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe
        115                 120                 125
Lys Gln Asn Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr
    130                 135                 140
Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly
                165                 170                 175
Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly
            180                 185                 190
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro
        195                 200                 205
Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr
    210                 215                 220
Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro
            260                 265                 270
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg
        275                 280                 285
Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg
    290                 295                 300
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile
305                 310                 315                 320
Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys
                325                 330                 335
Lys Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser
            340                 345                 350
Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg
        355                 360                 365
Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr
    370                 375                 380
Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr
385                 390                 395                 400
Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu
                405                 410                 415
Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val
            420                 425                 430
Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg
        435                 440                 445
Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Ser Phe Ser Trp Leu
    450                 455                 460
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln
465                 470                 475                 480
Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr
                485                 490                 495
Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala
            500                 505                 510
Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr
        515                 520                 525
Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser
    530                 535                 540
Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu
545                 550                 555                 560
Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly
                565
<210>167
<211>398
<212>PRT
<213>人
<400>167
Met Leu Arg Leu Tyr Val Leu Val Met Gly Val Ser Ala Phe Thr Leu
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ala His Thr Gly Ala Ala Arg Ser Cys Arg Phe Arg Gly
            20                  25                  30
Arg His Tyr Lys Arg Glu Phe Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Ala Leu
        35                  40                  45
Arg Cys Pro Gln Val Pro Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Val Ser Pro Arg
    50                  55                  60
Ile Asn Leu Thr Trp His Lys Asn Asp Ser Ala Arg Thr Val Pro Gly
65                  70                  75                  80
Glu Glu Glu Thr Arg Met Trp Ala Gln Asp Gly Ala Leu Trp Leu Leu
                85                  90                  95
Pro Ala Leu Gln Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Thr Thr Arg Asn
            100                 105                 110
Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Met Ser Ile Glu Leu Arg Val Phe Glu Asn
        115                 120                 125
Thr Asp Ala Phe Leu Pro Phe Ile Ser Tyr Pro Gln Ile Leu Thr Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Ser Gly Val Leu Val Cys Pro Asp Leu Ser Glu Phe Thr Arg
145                 150                 155                 160
Asp Lys Thr Asp Val Lys Ile Gln Trp Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Leu
                165                 170                 175
Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe Leu Ser Val Arg Gly Thr Thr His Leu
            180                 185                 190
Leu Val His Asp Val Ala Leu Glu Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val
        195                 200                 205
Leu Thr Phe Ala His Glu Gly Gln Gln Tyr Asn Ile Thr Arg Ser Ile
    210                 215                 220
Glu Leu Arg Ile Lys Lys Lys Lys Glu Glu Thr Ile Pro Val Ile Ile
225                 230                 235                 240
Thr Pro Leu Lys Thr Ile Ser Ala Ser Leu Gly Ser Arg Leu Thr Ile
                245                 250                 255
Pro Cys Lys Val Phe Leu Gly Thr Gly Thr Pro Leu Thr Thr Met Leu
            260                 265                 270
Trp Trp Thr Ala Asn Asp Thr His Ile Glu Ser Ala Tyr Pro Gly Gly
        275                 280                 285
Arg Val Thr Glu Gly Pro Arg Gln Glu Tyr Ser Glu Asn Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Tyr Ile Glu Val Pro Leu Ile Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu
305                 310                 315                 320
His Met Asp Phe Lys Cys Val Val His Asn Thr Leu Ser Phe Gln Thr
                325                 330                 335
Leu Arg Thr Thr Val Lys Glu Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Gly Ile
            340                 345                 350
Val Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Gly Gly Ile Trp
        355                 360                 365
Met His Arg Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys Ala Asp Gly Leu Thr
    370                 375                 380
Val Leu Trp Pro His His Gln Asp Phe Gln Ser Tyr Pro Lys
385                 390                 395
<210>168
<211>576
<212>PRT
<213>小鼠
<400>168
Met Glu Asn Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ile Cys Leu Met Val Pro
1               5                   10                  15
Leu Leu Ser Leu Glu Ile Asp Val Cys Thr Glu Tyr Pro Asn Gln Ile
            20                  25                  30
Val Leu Phe Leu Ser Val Asn Glu Ile Asp Ile Arg Lys Cys Pro Leu
        35                  40                  45
Thr Pro Asn Lys Met His Gly Asp Thr Ile Ile Trp Tyr Lys Asn Asp
    50                  55                  60
Ser Lys Thr Pro Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ser Arg Ile His Gln Gln
65                  70                  75                  80
Asn Glu His Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly Tyr
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Asn Ser Thr Tyr Cys Leu Lys Thr Lys Val
            100                 105                 110
Thr Val Thr Val Leu Glu Asn Asp Pro Gly Leu Cys Tyr Ser Thr Gln
        115                 120                 125
Ala Thr Phe Pro Gln Arg Leu His Ile Ala Gly Asp Gly Ser Leu Val
    130                 135                 140
Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Glu
145                 150                 155                 160
Val Gln Trp Tyr Lys Asn Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Val Ser
                165                 170                 175
Phe Phe Gly Val Lys Asp Lys Leu Leu Val Arg Asn Val Ala Glu Glu
            180                 185                 190
His Arg Gly Asp Tyr Ile Cys Arg Met Ser Tyr Thr Phe Arg Gly Lys
        195                 200                 205
Gln Tyr Pro Val Thr Arg Val Ile Gln Phe Ile Thr Ile Asp Glu Asn
    210                 215                 220
Lys Arg Asp Arg Pro Val Ile Leu Ser Pro Arg Asn Glu Thr Ile Glu
225                 230                 235                 240
Ala Asp Pro Gly Ser Met Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln
                245                 250                 255
Phe Ser Asp Leu Val Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Glu Ile Glu Trp
            260                 265                 270
Asn Asp Pro Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Gln Phe Val Glu His Pro Ser
        275                 280                 285
Thr Lys Arg Lys Tyr Thr Leu Ile Thr Thr Leu Asn Ile Ser Glu Val
    290                 295                 300
Lys Ser Gln Phe Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys Val Val Lys Asn Thr
305                 310                 315                 320
Asn Ile Phe Glu Ser Ala His Val Gln Leu Ile Tyr Pro Val Pro Asp
                325                 330                 335
Phe Lys Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Phe Ile Ile Leu Thr Ala Thr Ile
            340                 345                 350
Val Cys Cys Val Cys Ile Tyr Lys Val Phe Lys Val Asp Ile Val Leu
        355                 360                 365
Trp Tyr Arg Asp Ser Cys Ser Gly Phe Leu Pro Ser Lys Ala Ser Asp
    370                 375                 380
Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Gly Glu
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Ser Asp Leu Asp Thr Phe Val Phe Lys Leu Leu Pro Glu
                405                 410                 415
Val Leu Glu Gly Gln Phe Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp
            420                 425                 430
Asp Tyr Val Gly Glu Asp Thr Ile Glu Val Thr Asn Glu Asn Val Lys
        435                 440                 445
Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Asp Met Gly Gly Phe
    450                 455                 460
Ser Trp Leu Gly Gln Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Ile Tyr Asn Ala
465                 470                 475                 480
Leu Ile Gln Glu Gly Ile Lys Ile Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile
                485                 490                 495
Gln Asp Tyr Glu Lys Met Pro Asp Ser Ile Gln Phe Ile Lys Gln Lys
            500                 505                 510
His Gly Val Ile Cys Trp Ser Gly Asp Phe Gln Glu Arg Pro Gln Ser
        515                 520                 525
Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Leu Arg Tyr Gln Met Pro Ala Gln
    530                 535                 540
Arg Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu Thr Leu Asp Pro Val
545                 550                 555                 560
Arg Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala Thr His Leu Pro Leu Gly
                565                 570                 575
<210>169
<211>410
<212>PRT
<213>小鼠
<400>169
Met PheIle Leu Leu Val Leu Val Thr Gly Val Ser Ala Phe Thr Thr
1              5                   10                  15
Pro Thr Val Val His Thr Gly Lys Val Ser Glu Ser Pro Ile Thr Ser
            20                  25                  30
Glu Lys Pro Thr Val His Gly Asp Asn Cys Gln Phe Arg Gly Arg Glu
        35                  40                  45
Phe Lys Ser Glu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Val Leu Arg Cys
    50                  55                  60
Pro Leu Ala Pro His Ser Asp Ile Ser Ser Ser Ser His Ser Phe Leu
65                  70                  75                  80
Thr Trp Ser Lys Leu Asp Ser Ser Gln Leu Ile Pro Arg Asp Glu Pro
                85                  90                  95
Arg Met Trp Val Lys Gly Asn Ile Leu Trp Ile Leu Pro Ala Val Gln
            100                 105                 110
Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ile Cys Thr Phe Arg Asn Ala Ser His Cys
        115                 120                 125
Glu Gln Met Ser Val Glu Leu Lys Val Phe Lys Asn Thr Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Leu Pro His Val Ser Tyr Leu Gln Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Gly
145                 150                 155                 160
Leu Leu Val Cys Pro Asp Leu Lys Glu Phe Ile Ser Ser Asn Ala Asp
                165                 170                 175
Gly Lys Ile Gln Trp Tyr Lys Gly Ala Ile Leu Leu Asp Lys Gly Asn
            180                 185                 190
Lys Glu Phe Leu Ser Ala Gly Asp Pro Thr Arg Leu Leu Ile Ser Asn
        195                 200                 205
Thr Ser Met Asp Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val Met Thr Phe Thr
    210                 215                 220
Tyr Asn Gly Gln Glu Tyr Asn Ile Thr Arg Asn Ile Glu Leu Arg Val
225                 230                 235                 240
Lys Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ile Pro Val Ile Ile Ser Pro Leu Glu
                245                 250                 255
Thr Ile Pro Ala Ser Leu Gly Ser Arg Leu Ile Val Pro Cys Lys Val
            260                 265                 270
Phe Leu Gly Thr Gly Thr Ser Ser Asn Thr Ile Val Trp Trp Leu Ala
        275                 280                 285
Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ala Ala Tyr Pro Arg Gly Arg Val Thr Glu
    290                 295                 300
Gly Leu His His Gln Tyr Ser Glu Asn Asp Glu Asn Tyr Val Glu Val
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ile Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu His Thr Asp Phe
                325                 330                 335
Lys Cys Val Ala Ser Asn Pro Arg Ser Ser Gln Ser Leu His Thr Thr
            340                 345                 350
Val Lys Glu Val Ser Ser Thr Phe Ser Trp Ser Ile Ala Leu Ala Pro
        355                 360                 365
Leu Ser Leu Ile Ile Leu Val Val Gly Ala Ile Trp Met Arg Arg Arg
    370                 375                 380
Cys Lys Arg Arg Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Thr Lys Leu Arg Thr
385                 390                 395                 400
Asp Asn Gln Asp Phe Pro Ser Ser Pro Asn
                405                 410
<210>170
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>170
Gly Gly Lys Gly Gly
1               5
<210>171
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>171
Cys Gly Gly
1
<210>172
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>172
Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
1               5                   10
<210>173
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>173
Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro
<210>174
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>174
Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>175
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>出现0-5次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>出现0-12次
<400>175
Gly Cys Gly
1
<210>176
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(5)
<223>出现1-3次
<400>176
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>177
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>出现0-5次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>出现010次
<220>
<221>REPEAT
<222>(4)..(4)
<223>出现0-2次
<220>
<221>REPEAT
<222>(5)..(9)
<223>出现0-3次
<400>177
Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>178
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>178
Gly Gly Cys
1
<210>179
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>M0D RES
<222>(3)..(3)
<223>-NH2(酰胺化)
<400>179
Gly Gly Cys
1
<210>180
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>180
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
1               5                   10
<210>181
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>181
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly
<210>182
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>182
Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1               5
<210>183
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>出现0-12次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(3)
<223>出现0-5次
<400>183
Gly Cys Gly
1
<210>184
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(5)
<223>出现1-3次
<400>184
Ser Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>REPEAT
<222>(1)..(1)
<223>出现0-10次
<220>
<221>REPEAT
<222>(2)..(2)
<223>出现0-2次
<220>
<221>REPEAT
<222>(3)..(7)
<223>出现0-3次
<220>
<221>REPEAT
<222>(8)..(8)
<223>出现0-8次
<220>
<221>REPEAT
<222>(10)..(10)
<223>出现0-5次
<400>185
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly
1               5                   10
<210>186
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>186
Gly Gly Lys Lys Gly Cys
1               5
<210>187
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>187
Cys Gly Lys Lys Gly Gly
1               5
<210>188
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>188
Gly Gly Cys Gly
1
<210>189
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>189
Gly Ser Gly
l
<210>190
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>190
Leu Glu His His His His His His Gly Gly Cys
1               5                   10
<210>191
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>191
Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu
1               5                   10                  15
Tyr Arg Asn Gly Lys
            20
<210>192
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>192
gatccggagg tggtgtcccc attagacagc t    31
<210>193
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>193
gtaagcttag gaagacacag attccat         27
<210>194
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>194
gatccggagg tggtgcccct gtacgatcac tgaactg    37
<210>195
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>195
gtatgcatta ggaagacaca aattgcatgg tgaagtc    37

Claims (28)

1.一种组合物，其包含：
(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP；和
(b)具有至少一个第二附着位点的抗原，
其中所述抗原是IL-1分子，其中所述IL-1分子是IL-1β突变蛋白，其中所述IL-1β突变蛋白是SEQ ID NO：131至SEQ ID NO：140的多肽，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
2.权利要求1的组合物，其中所述IL-1分子来源于人类。
3.权利要求1的组合物，其中所述IL-1β突变蛋白包含hIL-1β116-269(D145K)(SEQ ID NO：136)。
4.权利要求1的组合物，其中所述IL-1β突变蛋白为hIL-1β116- 269(D145K)(SEQ ID NO：136)。
5.权利要求1的组合物，其中所述VLP包含或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。
6.权利要求5的组合物，其中所述RNA噬菌体是选自Qβ和AP205的RNA噬菌体。
7.权利要求1的组合物，其中所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白。
8.权利要求1的组合物，其中所述VLP包含SEQ ID NO：3的外壳蛋白。
9.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个非肽共价键连接。
10.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸的氨基。
11.权利要求1的组合物，其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基。
12.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸的氨基，且所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基。
13.权利要求1的组合物，其中所述第一附着位点不是巯基。
14.权利要求1的组合物，其中所述VLP和所述抗原的所述连接不包含二硫键。
15.权利要求1的组合物，其中只有一个所述第二附着位点与所述第一附着位点通过至少一个非肽共价键连接，产生单一且均匀类型的所述IL-1分子与所述病毒样颗粒的结合，其中与所述第一附着位点连接的所述只有一个第二附着位点是巯基，并且其中所述IL-1分子和所述病毒样颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。
16.权利要求1的组合物，其中所述抗原与AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。
17.权利要求1的组合物，其进一步包括接头，其中所述接头通过至少一个共价键与IL-1分子连接，并且所述接头包含或者由所述第二附着位点组成。
18.一种疫苗，其包含权利要求1-17中任一项的组合物。
19.权利要求18的疫苗，其中所述疫苗不含佐剂。
20.一种药物组合物，其包含：
(a)权利要求1-17任一项的组合物或权利要求18或19的疫苗；和
(b)药物可接受的载体。
21.一种制备权利要求1-17任一项的组合物或权利要求18或19的疫苗的方法，包括：
(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP；
(b)提供具有至少一个第二附着位点的抗原，其中所述抗原是IL-1β突变蛋白，其中所述IL-1β突变蛋白是SEQ ID NO：131至SEQ IDNO：140的多肽；和
(c)将所述VLP与所述抗原相连接，产生所述组合物或所述疫苗，其中所述抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
22.权利要求1-17任一项的组合物、权利要求18或19的疫苗或权利要求20的药物组合物在制备用于治疗动物中的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自：
(a)动脉粥样硬化；
(b)家族性地中海热(FMF)；
(c)全身发作青少年特发性关节炎或类风湿性关节炎；
(d)痛风或骨关节炎；和
(e)多发性硬化。
23.权利要求22的用途，其中所述动物是人类。
24.权利要求22的用途，其中所述疾病是动脉粥样硬化。
25.权利要求22的用途，其中所述疾病是家族性地中海热(FMF)。
26.权利要求22的用途，其中所述疾病是全身发作青少年特发性关节炎或类风湿性关节炎。
27.权利要求22的用途，其中所述疾病是痛风或骨关节炎。
28.权利要求22的用途，其中所述疾病是多发性硬化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4516748B2 (ja) 2001-09-14 2010-08-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子中への免疫賦活物質のパッケージ化：調製法および使用法
AU2006274698B2 (en) 2005-08-02 2011-06-09 Xbiotech, Inc. Diagnosis, treatment, and prevention of vascular disorders using IL-1a autoantibodies
ATE551365T1 (de) * 2006-05-15 2012-04-15 Xbiotech Inc Il-1-alpha für den einsatz in einem verfahren zur behandlung von atherosklerotischen plaques.
US20110008282A1 (en) * 2006-05-15 2011-01-13 Xbiotech, Inc. IL-1alpha immunization induces autoantibodies protective against atherosclerosis
NZ573622A (en) 2006-06-12 2011-12-22 Cytos Biotechnology Ag Processes for packaging oligonucleotides into virus-like particles of rna bacteriophages
WO2008071774A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Cytos Biotechnology Ag Purification process for coat protein of rna bacteriophages
MX2010003114A (es) * 2007-09-25 2010-06-23 Intervet Int Bv Vacuna para tratamiento de osteoartritis.
BRPI0909096A2 (pt) * 2008-03-05 2015-12-01 Cytos Biotechnology Ag uso de conjugados de interleicna-1 no tratamento de diabetes
KR20150127300A (ko) 2008-05-30 2015-11-16 엑스바이오테크, 인크. 인터류킨-1 알파 항체 및 그의 사용 방법
CN102209557A (zh) 2008-09-12 2011-10-05 埃克斯生物科技公司 靶向病原性单核细胞
PL222496B1 (pl) * 2009-04-10 2016-08-31 Inst Biochemii I Biofizyki Pan Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną
US8993715B2 (en) * 2009-07-06 2015-03-31 Canon Kabushiki Kaisha Labeled protein and method for obtaining the same
EP2475397A1 (en) * 2009-09-10 2012-07-18 Cytos Biotechnology AG Use of interleukin-1 beta mutein conjugates in the treatment of diabetes
CN107596365A (zh) 2010-06-18 2018-01-19 埃克斯生物科技公司 关节炎治疗
KR20160062200A (ko) 2010-08-23 2016-06-01 엑스바이오테크, 인크. 종양성 질병들에 대한 치료
US9724409B2 (en) 2011-04-01 2017-08-08 Xbiotech, Inc. Treatment of inflammatory skin disease
RU2622021C2 (ru) 2011-09-23 2017-06-08 ИксБиотеч, Инк. Лечение кахексии
US9545441B2 (en) 2012-09-18 2017-01-17 Xbiotech, Inc. Treatment of diabetes
GB201300684D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Apitope Int Nv Peptide
US11168306B2 (en) 2014-02-25 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Phage wrapping
CA3010975A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 University Of Copenhagen Virus-like particle with efficient epitope display
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
RU2021134624A (ru) * 2015-10-22 2022-03-15 Джуно Терапьютикс Гмбх Способы, наборы, средства и устройства для трансдукции
WO2017071713A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 University Of Copenhagen Virus like particle with efficient epitope display
KR20190117579A (ko) 2017-02-16 2019-10-16 엑스바이오테크, 인크. 화농성 한선염의 치료
CA3060526A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
AU2019251421A1 (en) 2018-04-09 2020-10-29 Checkmate Pharmaceuticals Packaging oligonucleotides into virus-like particles
EP3845556A1 (fr) * 2019-12-31 2021-07-07 Peptinov SAS Conjugue immunogene destine a induire une reponse immunitaire dirigee contre l interleukine-6
CA3224376A1 (en) * 2021-07-08 2023-01-12 Nikolai Kley Interleukin-1 alpha chimeric protein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1668637A (zh) * 2002-07-17 2005-09-14 希托斯生物技术股份公司 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5374426A (en) 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
DK0460052T3 (da) * 1989-02-27 1999-03-08 New England Medical Center Inc Inhibitorer af IL-1's biologiske aktivitet
AU9052091A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
FR2677654B1 (fr) 1991-06-17 1995-11-17 Pasteur Merieux Serums Vacc Composes a effet immunogene anti-cytokine, a effet immunogene anticytostatique ou a effet vaccinal anti-infection a hiv.
GB9114003D0 (en) 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
CN1185811A (zh) 1995-03-31 1998-06-24 H·沃尔夫 依赖于逆转录病毒样颗粒的抗原呈递系统
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
DE69929232T2 (de) * 1998-10-21 2006-08-31 The United States Government As Represented By The Department Of Health And Human Services Virusähnliche partikel zur induktion von autoantikörpern
BR9915771A (pt) 1998-11-30 2001-12-26 Cytos Biotechnology Ag Apresentação molecular ordenada de antìgenos,processo de preparação e utilização
DE60040740D1 (de) 1999-12-03 2008-12-18 Celltech Chiroscience Ltd VERWENDUNG OF INTERLEUkIN-1 MUTEIN ALS IMPFSTOFFADJUVANS
DE10004232A1 (de) 2000-02-01 2001-08-02 Megamat Gmbh Buero Und Lagerte Antriebseinrichtung für eine Lagervorrichtung
US6843987B2 (en) * 2000-02-02 2005-01-18 Schering Corporation Mammalian cytokines; receptors; related reagents and methods
WO2001085208A2 (en) 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
JP4516748B2 (ja) 2001-09-14 2010-08-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子中への免疫賦活物質のパッケージ化：調製法および使用法
CA2462857C (en) * 2001-10-05 2012-01-24 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
MXPA04003901A (es) * 2001-11-07 2004-07-08 Cytos Biotechnology Ag Disposiciones de antigenos para el tratamiento de enfermedades eosinofilicas alergicas.
RU2322258C2 (ru) * 2001-11-07 2008-04-20 Цитос Байотекнолоджи Аг Антигенные матрицы для лечения заболевания костей
NZ532516A (en) * 2001-11-07 2008-05-30 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays presenting IL-5, IL-13 or eotaxin for treatment of allergic eosinophilic diseases
FR2838444B1 (fr) 2002-04-10 2016-01-01 Neovacs Nouveaux peptides et leur application en therapeutique
NZ537003A (en) * 2002-07-18 2008-03-28 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
BR0311800A (pt) 2002-07-19 2005-03-22 Cytos Biotechnology Ag Conjugados ghrelina-veìculo
CA2553594A1 (en) * 2004-01-20 2005-07-28 Cytos Biotechnology Ag Particle-induced ghrelin immune response
EP1791870A1 (en) 2004-09-21 2007-06-06 Cytos Biotechnology AG Virus-like particles comprising a fusion protein of the coat protein of ap205 and an antigenic polypeptide
AU2005291231B2 (en) 2004-10-05 2010-12-23 Cytos Biotechnology Ag VLP-antigen conjugates and their uses as vaccines

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1668637A (zh) * 2002-07-17 2005-09-14 希托斯生物技术股份公司 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dinarello CA,et al.《白介素1在疾病中的应用》.《国际骨科学杂志》.1993,第14卷(第3期),141-144. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5312028B2 (ja) 2013-10-09
JP2009510025A (ja) 2009-03-12
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IL189245A0 (en) 2008-08-07
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CA2623287A1 (en) 2007-04-12
US20130230484A1 (en) 2013-09-05
BRPI0616446A2 (pt) 2011-06-21
US8449874B2 (en) 2013-05-28
RU2441067C2 (ru) 2012-01-27
KR20080047564A (ko) 2008-05-29
AU2006298767B2 (en) 2013-01-10
EP2431468A1 (en) 2012-03-21
RU2008116323A (ru) 2009-11-10
NZ566971A (en) 2011-06-30

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