JP5312028B2 - インターロイキン−１コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は、医学野、公衆衛生、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分におけるものである。本発明は、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)又はウイルス粒子と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、該抗原がＶＬＰ又はウイルス粒子に共有結合したインターロイキン-１(ＩＬ-１)タンパク質、ＩＬ-１断片ないしはペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質である、組成物を提供する。また、本発明は組成物を産生するための方法を提供する。本発明の組成物は、関節リウマチ、骨関節炎などを含む様々なヒトの疾患の治療のためのワクチンの産生に有用である。本発明の組成物によって有効な免疫応答、特に抗体応答が誘導される。
（関連技術）
ＩＬ-１は、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞を含む様々な種類の細胞によって産生される強力な炎症誘発性サイトカインである(Dinarello C.A., 1991. Blood 77(8): 1627-1652)。限定した配列の同一性しか有しないが、ＩＬ-１レセプタータイプI(ＩＬ-１ＲI)への結合により類似の生物学的な活性を及ぼす２種の分子、ＩＬ-１α及びＩＬ-１βからなる(Dinarello C.A.等, 1997, Cytokine & Growth Factor Rev. 8: 253)。また、両ＩＬ-１分子は細胞内シグナル伝達ドメインを欠く第二ＩＬ-１レセプター(ＩＬ-１ＲII)にも結合し、デコイレセプターとして調節的な役割を果たすと考えられる(Dinarello C.A.等, 1997, Cytokine & Growth Factor Rev. 8: 253)。さらに、ＩＬ-１ファミリーの第三のメンバーであるＩＬ-１レセプターアンタゴニスト(ＩＬ-１ｒａ)は、アゴニスト活性を全く及ぼすことなく両レセプターに結合する。ＩＬ-１ＲII及びＩＬ-１ＲI及びＩＬ-１ＲIIのシェド(shed)型とＩＬ-１ｒａは、ＩＬ-１α及びＩＬ-１βのを中和し、炎症応答を厳密に調節する。
ＩＬ-１媒介性炎症応答の調節不全は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、腎症、骨粗鬆症などを含む多くのヒトの疾患において観察される。これらの疾患それぞれにおいて、ＩＬ-１の過剰産生及び／又はＩＬ-１ｒａの過少産生は疾患の発症の素因となる(Arend W.P., 2002, Cytokine & Growth Factor Reviews 13:323-340)。ＩＬ-１ｒａの組み換えバージョン(アナキンラ、Ｋｉｎｅｒｅｔ(登録商標))は、炎症の低減及びいくつかの炎症性疾患の組織損傷の予防に効果的であるが、高い全身濃度と薬剤の短い半減期が必要であるため高用量(〜１００ｍｇ)の頻回(毎日)投与を要する。この結果、費用が高く、患者のコンプライアンスの問題が生じうる(Ｋｉｎｅｒｅｔ(登録商標)処方情報、Amgen; Granowitz E.V.等 1992, Cytokine 4:353)。さらに、大多数の患者はＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)に対する抗体を産生し、薬剤の生物学的活性を中和しうる(Fleischmann R.M.,等, 2003, Arthritis Rheum 46:2287)。
ゆえに、新規の治療技術は、患者の免疫系によるＩＬ-１-中和抗体の産生を誘導する活性な免疫方策に注目したものである。Svenson及び共同研究者等(2000, J. Immunol. Methods 236:1-8)は、ツベルクリン(ＰＰＤ)の精製したタンパク質誘導体に化学的に架橋させた組み換えＩＬ-１αによりマウスを免疫化し、ＩＬ-１αの生物学的活性を中和した抗体の誘導を観察した。この方策は、外来性の抗原への自己抗原の物理的な結合により、自己応答性Ｂ細胞へＴ細胞ヘルプが運搬されることによるものである。
米国特許第６０９３４０５号は、化学的又は物理的に不活性化されたサイトカイン自体を含有する免疫原性組成物による免疫化によって循環サイトカインのレベルを減少する方法を開示する。この方法では、天然のサイトカインが物理的又は化学的な処置によって免疫原性になるのに対して、本発明は、ＶＬＰの表面上に高度に反復した様式で天然のサイトカインを提示することによって天然のサイトカインを免疫原性にするための方法を開示する。さらに、国際公開第２００３／０８４９７９号は、サイトカインの過剰産生に関係する疾患の治療のための５−４０のアミノ酸長のサイトカイン由来ペプチドを含有する免疫原性化合物の使用を記述する。
（発明の概要）
驚くべきことに近年、発明者等は、少なくとも１のＩＬ-１分子を含有する本発明の組成物及びワクチンのそれぞれがＩＬ-１に対する免疫応答、これによる特に抗体応答を誘導するだけでなく、さらにインビボでのＩＬ-１の炎症誘発性の活性を中和することができることを明らかにした。さらに驚くべきことに、発明者等は、本発明に従ってＶＬＰに共有結合させたＩＬ-１分子が、関節リウマチのマウスモデルの関節炎の臨床徴候及び炎症から防御しうることを明らかにした。さらに、発明者等は、本発明の組成物が、ヒトの関節リウマチの治療が承認されている組み換えＩＬ-１レセプターアンタゴニストであるＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)より良好に関節炎症状の発達からマウスを防御したことを明らかにした(実施例７)。さらに驚くべきことに、発明者等は、本発明の組成物を遺伝的に罹患しやすいマウスに注射した場合に、アテローム硬化性症状の発達を阻害することが可能であり(実施例４)、ゆえにアテローム性動脈硬化の有効な治療であることを明らかにした。さらに、発明者等は、ＩＬ-１αがアテローム性動脈硬化の発症に関与することを示した。
したがって、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原とを含んでなり、このとき、該少なくとも１の抗原が好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド及びＩＬ-１変異タンパク質からなる群から選択されるＩＬ-１分子であり、(a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位を介して結合して好ましくは規則正しく反復した抗原アレイを形成する、組成物を提供する。本発明の好適な実施態様では、本発明の使用に好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異タンパク質ないしはその断片を含んでなる。好適な実施態様では、本発明の組成物は、好ましくはＩＬ-１の生物学的活性を含む少なくとも１のＩＬ-１成熟断片を含んでなる。ゆえに、本発明は、ウイルス様粒子に非常に反復した様式の自己抗原を提示させて自己応答性Ｂ細胞を刺激するために使用する。
他の態様では、本発明はワクチン組成物を提供する。
さらに、本発明は、ヒト又は動物、好ましくは哺乳類へワクチン組成物を投与する方法を提供する。本発明のワクチン組成物は、典型的及び好ましくは少なくとも１のアジュバントの非存在下で、強力な免疫応答、特に抗体応答を誘導することができる。ゆえに、ある好適な実施態様では、ワクチンはアジュバントを欠いている。アジュバントの使用を避けると、望ましくない炎症性Ｔ細胞応答が生じる可能性が減少しうる。
ある好適な実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰである。 更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ及びＡＰ２０５からなる群から選択されるＲＮＡバクテリオファージである。更なる好適な実施態様では、組成物及びワクチン組成物のそれぞれに含まれるＲＮＡバクテリオファージの前記ＶＬＰは宿主内で組み換えて産生され、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰは宿主のＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を本質的に欠いている。望ましくないＴ細胞応答並びに熱などの他の望ましくない副作用を避けるために、宿主のＲＮＡの量を減らす、好ましくは取り除くことは有用である。
一態様では、本発明は、ＩＬ-１タンパク質が症状を媒介している又は症状に関与している(a) 血管系疾患；(b) 遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患；(c) 慢性自己免疫性炎症性疾患；(d) 骨及び軟骨変性疾患；(e) アレルギー性疾患；及び、(f) 神経学的疾患；からなる群から選択される疾患の治療方法であって、動物、好ましくはヒトに本発明の組成物又は本発明のワクチン組成物のそれぞれを投与することを含んでなる方法を提供する。ＩＬ-１タンパク質が症状を媒介している又は症状に関与している疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化、家族性地中海熱、関節リウマチ、骨関節炎及びアレルギーである。
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な製薬的担体とを含有してなる製薬的組成物を提供する。
また更なる態様では、本発明は、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを供給すること、(b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原を供給すること、このとき該抗原がＩＬ-１分子、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質であること、そして、(c) 組成物を生産するために該ＶＬＰと該少なくとも１の抗原を結合させること、このとき該少なくとも１の抗原と該ＶＬＰが該少なくとも１の第一付着部位と該少なくとも１の第二付着部位を介して結合するものであること、を含んでなる本発明の組成物の産生方法を提供する。
(発明の詳細な説明)
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。
アジュバント：本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチン及び薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。様々なアジュバントが用いられうる。例として、完全及び不完全なフロイントアジュバント、アルミニウム水酸化物及び修飾ムラミルジペプチドなどがある。更なるアジュバントは、ミネラルゲル、例えば酸化アルミニウム三水和物、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)及びコリネバクテリウムパルバムである。このようなアジュバントも当分野で公知である。本発明の組成物とともに投与されうる更なるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類(ミョウバン)、ＭＦ-５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４及びＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれるが、これらに限定するものではない。また、アジュバントは、これらの物質の混合物を含んでもよい。ＶＬＰは一般的にアジュバントとして記載されている。しかしながら、本明細書中の文脈で用いる「アジュバント」なる用語は、本発明の組成物に用いたＶＬＰでないアジュバントであり、むしろ更なる遠位の成分に関する。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(Ｂ及びＴエピトープ)を有しうる。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
エピトープ：エピトープなる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって特異的に結合される抗原、好ましくはポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。抗体に関して、特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応が除外されない。典型的に、エピトープは、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含有する。
特異的な結合(抗体／抗原)：本出願において、抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上及び最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性(Ｋａ)で抗原に結合する場合、特異的に結合していると定義される。抗体の親和性は当業者によって容易に測定されうる(例えばスキャッチャード分析、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ分析によって)。
特異的な結合(ＩＬ-１／ＩＬ-１レセプター)：レセプターとレセプターリガンドとの相互作用は、一般に当分野で公知の生物物理学的な方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ分析によって特徴付けされうる。ＩＬ-１レセプターへのＩＬ-１の結合親和性(Ｋａ)が少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０６Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、さらにより好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、及び最も好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１であり、好ましくは該ＩＬ-１レセプターがマウス又はヒト、最も好ましくはヒトのＩＬ-１レセプターである場合に、ＩＬ-１分子はＩＬ-１レセプターを特異的に結合することができるとみなす。さらに好ましくは、前記ＩＬ-１レセプターは、配列番号：１６６から配列番号：１６９のいずれか一の配列を含むか、より好ましくはこれからなり、最も好ましくは前記ＩＬ-１レセプターは配列番号：１６６及び配列番号：１６７のいずれかの配列を含むか、好ましくはこれからなる。
付随(結合)(associated)：本明細書中で用いられる「付随された(associated)」又は「付随(association)」なる用語は、２つの分子がともに結合するすべての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有的相互作用及び非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有的相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであるのが好ましい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、アミノ酸、好ましくはリジンのアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＶＬＰと付随(結合)する。更なる好適な実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに天然に生じる。あるいは、好適な実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに人工的に付加される。
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、ＩＬ-１分子に天然に生じる又はＩＬ-１分子に人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。ＩＬ-１分子の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであるのが好ましい。第二付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１分子」なる用語は、ＩＬ-１分子と少なくとも一の第二付着部位を含むコンストラクトを指す。しかしながら、特に、ＩＬ-１分子内に天然に生じない第二付着部位の場合、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＩＬ-１分子と付随(結合)する。更なる実施態様では、第二付着部位はＩＬ-１分子に天然に生じる。さらに他の好適な実施態様では、第二付着部位はリンカーを介してＩＬ-１分子に人工的に付加され、このリンカーはシステインを含むか、あるいはシステインからなるものである。好ましくは、リンカーはペプチド結合によりＩＬ-１分子に融合される。
コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはＲＮＡファージの天然のキャプシドのサブユニットを指す。
ＩＬ-１分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１分子」又は単に「ＩＬ-１」なる用語は、配列番号：３６から配列番号：１１６、配列番号：１３０から配列番号：１４０及び配列番号：１６３から配列番号：１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す。本明細書中で用いる「ＩＬ-１-分子」は好ましくは、配列番号：３６から配列番号：１１６、配列番号：１３０から配列番号：１４０及び配列番号：１６３から配列番号：１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなる任意のＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質を指す。また典型的及び好ましくは、本明細書中で用いるＩＬ-１分子なる用語は、任意の動物種のＩＬ-１タンパク質のオルソログを指す。必須ではないが好ましくは、ＩＬ-１分子はＩＬ-１レセプターに結合可能であり、さらに好ましくは生物学的な活性を含む。
ＩＬ-１α分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１α分子」又は単に「ＩＬ-１α」なる用語は、配列番号：３６から４８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７から配列番号：８８及び配列番号：１６３からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１αタンパク質、ＩＬ-１α断片、ＩＬ-１α成熟断片、ＩＬ-１αペプチド又はＩＬ-１α変異タンパク質を指す。ＩＬ-１αの特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１α１１９−２７１(配列番号：６３)である。
ＩＬ-１β分子：本明細書中で用いる「ＩＬ-１β分子」又は単に「ＩＬ-１β」なる用語は、配列番号：４９から６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：８９から配列番号：１１６、配列番号：１３０から配列番号：１４０、配列番号：１６４及び配列番号：１６５からなる群から選択されるいずれか一の配列に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１β断片、ＩＬ-１β成熟断片、ＩＬ-１βペプチド又はＩＬ-１β変異タンパク質を指す。ＩＬ-１βの特に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１β１１７−２６９(配列番号：６４)である。
ＩＬ-１タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は天然に生じるタンパク質を指し、該天然に生じるタンパク質は配列番号：３６から配列番号：６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有すか、又は該天然に生じるタンパク質がＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含むものである。本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は天然に生じるタンパク質を指し、該天然に生じるタンパク質は配列番号：３６から配列番号：６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ該天然に生じるタンパク質がＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含むものである。典型的及び好ましくは、本明細書中で用いる「ＩＬ-１タンパク質」なる用語は少なくとも１の天然に生じるタンパク質を指し、該タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができ、生物学的な活性を含むものであり、さらに該タンパク質は配列番号：３６から配列番号：６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなる。したがって、「ＩＬ-１αタンパク質」は、配列番号：３６から配列番号：４８のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１タンパク質を指し、一方、「ＩＬ-１βタンパク質」は、配列番号：４９から配列番号：６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％及び最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこれからなるＩＬ-１タンパク質を指す。
ＩＬ-１断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１断片」なる用語は、ＩＬ-１タンパク質の連続的な範囲を含むポリペプチドを指し、該ポリペプチドは少なくとも５０、好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸の長さである。典型的及び好ましくは、前記ＩＬ-１断片は、多くても３００、より好ましくは多くても２５０、最も好ましくは多くても２００のアミノ酸の長さである。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１断片は、ＩＬ-１レセプターを結合することが可能で、さらに好ましくは生物学的な活性を含む。したがって、「ＩＬ-１α断片」及び「ＩＬ-１β断片」なる用語は、定義されるＩＬ-１断片を指し、該ＩＬ-１タンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。
ＩＬ-１成熟断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１成熟断片」なる用語はＩＬ-１断片を指し、該ＩＬ-１断片はＩＬ-１タンパク質の天然に生じる成熟生成物である。したがって、本明細書中で用いる「ＩＬ-１α成熟断片」及び「ＩＬ-１β成熟断片」なる用語は定義されるＩＬ-１成熟断片を指し、該ＩＬ-１タンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。ＩＬ-１α成熟断片の好適な実施態様は、配列番号：６３、配列番号：６５及び配列番号：１６３である。ＩＬ-１β成熟断片の好適な実施態様は、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：１３０、配列番号：１６４及び配列番号：１６５である。
好適なＩＬ-１α成熟断片は、(a) ヒトＩＬ-１α１１９−２７１(配列番号：６３)；(b) マウスＩＬ-１α１１７−２７０(配列番号：６５)；(c) マウスＩＬ−１α１１７-２７０ｓ(配列番号：１６３)；及び、(e) 配列番号：６３、配列番号：６５及び配列番号：１６３のいずれか一に、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の同一性があるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれからなる。
好適なＩＬ-１β成熟断片は、(a) ヒトＩＬ-１β１１７−２６９(配列番号：６４)；(b) ヒトＩＬ-１β１１６−２６９(配列番号：１６５)；(c) マウスＩＬ-１β１１９−２６９(配列番号：６６)；(d) マウスＩＬ-１β１１９−２６９ｓ(配列番号：１６４)；及び、(e) 配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：１６４及び配列番号：１６５のいずれか一に、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９９％の同一性があるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、好ましくはこれからなる。
ＩＬ-１ペプチド：本明細書中で用いる「ＩＬ-１ペプチド」なる用語は、天然に生じるタンパク質の連続的な範囲を含むポリペプチドを指し、該タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができ、好ましくは生物学的な活性を含み、該ポリペプチドは４〜４９、好ましくは６〜３５、最も好ましくは１０〜２５のアミノ酸の長さである。ＩＬ-１ペプチドはＩＬ-１レセプターを結合するかもしれないが典型的にはすることができず、典型的には生物学的な活性を持たない。したがって、本明細書中で用いる「ＩＬ-１αペプチド」及び「ＩＬ-１βペプチド」なる用語は、定義されるＩＬ-１ペプチドを指し、該天然に生じるタンパク質はそれぞれＩＬ-１αタンパク質又はＩＬ-１βタンパク質である。好適なＩＬ-１ペプチドは、配列番号：８２から配列番号：１１６である。
ＩＬ-１変異タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１変異タンパク質」なる用語は、ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１αないしはＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１αないしはＩＬ-１β断片、ＩＬ-１αないしはＩＬ-１β成熟断片、又はＩＬ-１αないしはＩＬ-１βペプチド由来の任意のポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、好ましくは該ポリペプチドは由来するＩＬ-１分子と比較して、生物学的な活性が低減している。したがって、ＩＬ-１α変異タンパク質及びＩＬ-１β変異タンパク質は定義されるＩＬ-１変異タンパク質であり、該ポリペプチドはそれぞれＩＬ-１α分子又はＩＬ-１β分子由来のものである。
好適なＩＬ-１変異タンパク質では、前記生物学的な活性は、由来するＩＬ-１分子の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満である。さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１成熟断片に由来し、該ＩＬ-１変異タンパク質の生物学的な活性は、該ＩＬ-１変異タンパク質が由来するＩＬ-１成熟断片の生物学的な活性の８０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは４０％未満、さらにより好ましくは２０％未満である。非常に好適なＩＬ-１変異タンパク質は生物学的な活性を示さない。さらに好ましくは必須ではないが、ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１レセプターを特異的に結合することができる。(i) ＩＬ-１タンパク質、好ましくは配列番号：３６から配列番号：６２；又は、(ii) より好ましくはＩＬ-１成熟断片、好ましくは配列番号：６３から配列番号：６６、配列番号：１３０、及び配列番号：１６３から配列番号：１６５のいずれかに由来するＩＬ-１変異タンパク質が非常に好ましい。
本明細書中で有用なＩＬ-１変異タンパク質は、Kamogashira等 (1988) J. Biochem. 104:837-840；Gehrke等 (1990) The Journal of Biological Chemistry 265(11): 5922-5925；Conca等 (1991) The Journal of Biological Chemistry 266(25): 16265-16268；Ju等 (1991) PNAS 88:2658-2662；Auron等 (1992) Biochemistry 31:6632-6638；Guinet等 (1993) Eur. J. Biochem 211:583-590；Camacho (1993) Biochemistry 32:8749-8757；Baumann (1993) Journal of Recepror Research 13(1-4): 245-262；Simon (1993) The Journal of Biological Chemistry 268(13): 9771-9779；及び、Simoncsits (1994) Cytokine 6(2): 206-214に記載されており、これらの開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)がＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片又はＩＬ-１ペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。好適な実施態様では、前記アミノ酸残基は１つの連続的な範囲にあるものである。さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)がＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、又はＩＬ-１成熟断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号：３６から配列番号：４８及び配列番号：４９から配列番号：６２のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、(i) 配列番号：６３、配列番号：６５及び配列番号：１６３のいずれか一、最も好ましくは配列番号：６３；又は(ii) 配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：１３０、配列番号：１６４、及び配列番号：１６５からなる群から選択されるいずれか一、最も好ましくは配列番号：６４からなる群から選択されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１α変異タンパク質であり、該ＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号：３６から配列番号：４８のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、(i) 配列番号：６３、配列番号：６５及び配列番号：１６３のいずれか一、最も好ましくは配列番号：６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。非常に好適なＩＬ-１α変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号：６３のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。
さらに好適なＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１β変異タンパク質であり、該ＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が配列番号：４９から配列番号：６２のいずれか一のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、より好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらに好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜６、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：１３０、配列番号：１６４及び配列番号：１６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号：６４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。非常に好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５、さらにより好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、及び最も好ましくはちょうど１つのアミノ酸残基(一又は複数)が、配列番号：６４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、このとき好ましくは該アミノ酸残基(一又は複数)は、(i) 該ポリペプチドから欠失している、(ii) 該ポリペプチドに挿入されている、(iii) 他のアミノ酸残基と置き換わっている、又は(iv) (i)から(iii)のいずれかの組み合わせである。さらにより好適なＩＬ-１β変異タンパク質は、配列番号：１３１から配列番号：１４０からなる群のいずれか一から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなる。
ＩＬ-１のアゴニスト効果／生物学的な活性：ＩＬ-１に関して本明細書中で用いる「生物学的な活性」又は「生物学的に活性な」なる用語は、好ましくは実施例２Ｅ及び実施例３Ｅに概説するように、動物に全身投与された後にＩＬ-６の産生を誘導するＩＬ-１分子の能力を指す。また、ＩＬ-１分子の生物学的な活性は、胸腺細胞の増殖誘導能(Epps等, Cytokine 9(3): 149-156 (1997)、Ｄ１０.Ｇ４.１ Ｔヘルパー細胞の増殖誘導能(Orencole and Dinarello, Cytokine 1(1): 14-22 (1989)、又はＭＧ６４細胞又はＨａＣａＴ細胞(Boraschi等, J. Immunol. 155:4719-4725 (1995)又は線維芽細胞(Dinarello等, Current Protocols in Immunology 6.2.1-6-2-7 (2000))からのＩＬ-６産生誘導能、ＥＬ-４胸腺腫細胞からのＩＬ-２産生誘導能(Simon等, J. Immunol. Methods 84(1-2): 85-94 (1985))、又はヒトのメラノーマ細胞株Ａ３７５の増殖抑制能(Nakai等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 154:1189-1196 (1988))を指す。
結合(linked)：ここで用いられる場合、「結合した(連結)」又は「結合」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位の直接結合を指すだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接的な結合も指す。他の好適な実施態様では、第一付着部位及び第二付着部位は、少なくとも１の共有結合により、好ましくは少なくとも１のペプチド結合により、さらにより好ましくはペプチド結合(一又は複数)のみにより結合する。非常に好適な実施態様では、第一付着部位及び第二付着部位は、ペプチド結合のみによって、好ましくは遺伝子融合によって、直接あるいは好ましくはペプチドリンカーによって結合する。更なる好適な実施態様では、第二付着部位は、ペプチド結合によってのみ、好ましくは遺伝的融合によって前記第一付着部位のＣ末端に結合する。
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位とＩＬ-１分子を付随(結合)させるか、第二付着部位を既に含むか、基本的に第二付着部位からなるか第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも一のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含有する分子は本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含有する分子である。さらに好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。ＩＬ-１分子とリンカーの間の付随(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。遺伝的融合による結合において、リンカーは無くてもよいか又は、好ましくはアミノ酸リンカー、より好ましくはアミノ酸残基のみからなるアミノ酸リンカーである。遺伝子融合のために非常に好適なリンカーは、順応性があるアミノ酸リンカーである。遺伝子融合による結合において、好適なリンカーは、１〜２０、より好ましくは２〜１５、さらにより好ましくは２〜１０、さらにより好ましくは２〜５、最も好ましくは３のアミノ酸からなる。遺伝子融合に非常に好適なリンカーはGSG(配列番号：１８９)を含むか、好ましくはこれからなる。
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある、抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰにカップリングした抗原などの本発明の特定の実施態様では、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ、好適に規則的で反復性の抗原の典型的かつ好ましい例である。
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子又は免疫賦活性物質の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。また、この用語にはポリ陰イオン性高分子の封入ないしは部分的な封入が含まれる。したがって、ポリ陰イオン性高分子又は免疫賦活性物質を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子又は免疫賦活性物質はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。前記免疫賦活性物質が核酸、好ましくはＤＮＡである場合、パッケージ化なる用語は、前記核酸がヌクレアーゼ加水分解に接触することができない、好ましくはＤＮアーゼ加水分解(例えばＤＮアーゼI又はベンゾナーゼ(Benzonase))に接触することができないことを意味し、好ましくはこの接触可能性は国際公報第２００３／０２４４８１Ａ２号の実施例１１〜１７に記載されるようにアッセイされる。
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
組み換えＶＬＰ：本明細書中で用いる「組み換えＶＬＰ」なる用語は、少なくとも１工程の組み換えＤＮＡ技術を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。本明細書中で用いる「組み換えて産生されたＶＬＰ」なる用語は、少なくとも１工程の組み換えＤＮＡ技術を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。ゆえに、「組み換えＶＬＰ」及び「組み換えて産生されたＶＬＰ」なる用語は本明細書中で交換可能に用い、同一の意味を有しなければならない。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
ここで用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指し、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに類似する非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入できないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは物理的又は科学的に不活性化されている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の相等物のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシド又はＨＢｃＡｇは、正二十面体の対称の球状形である。本明細書中で用いる「キャプシド様構造」なる用語は、上記に定義された文脈においてキャプシドの形態に似ているが典型的な対称の集合体(アセンブリ)から逸脱しており、なおかつ十分な程度の規則性及び反復性を維持しているウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子集合体を意味する。ウイルス粒子とウイルス様粒子のある共通の特徴は、そのサブユニットの非常に規則的な反復した配位である。
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が包含される。ＲＮＡバクテリオファージ由来の好適なＶＬＰは、正二十面体の対称性を表し、１８０のサブユニット(単量体)からなる。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を非複製及び／又は非感染性にするための好適な方法は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理的、化学的な不活性化による、典型的及び好ましくは遺伝子操作によるものである。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性があるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
この発明は、動物又はヒトにおいてＩＬ-１に対する免疫応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するコア粒子(このときのコア粒子はウイルス様粒子(ＶＬＰ)又はウイルス粒子である)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を含んでなり、該少なくとも一の抗原が、好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド及びＩＬ-１変異タンパク質から選択されるＩＬ-１分子であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して共有結合しているものである。好ましくは、前記ＩＬ-１分子はコア粒子に結合しており、規則的で反復性の抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好適な実施態様では、本発明の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも１２０及びさらにより好ましくは少なくとも１８０のＩＬ-１分子がコア粒子に結合する。
規則的で反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰ又はウイルス粒子として選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はキャプシドタンパク質は、国際公開第２００４／００９１２４号の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に援用される。
ウイルス又はウイルス様粒子は、ウイルス感染した細胞培養物から産生され精製されうる。ワクチンの目的のために結果として生じたウイルス又はウイルス様粒子は、好ましくは非複製性又は非感染性、より好ましくは非複製性かつ非感染性であるべきである。ＵＶ照射、ホルムアルデヒドやクロロホルムなどによる化学的処理は、当業者に公知の、ウイルスを不活性化させるための一般的な方法である。
好適な実施態様では、コア粒子はウイルス粒子であり、好ましくは該ウイルス粒子はバクテリオファージであり、さらに好ましくは該バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージであり、よりさらに好ましくは該ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５から選択されるＲＮＡバクテリオファージである。
好適な実施態様では、コア粒子はＶＬＰである。更なる好適な一実施態様では、ＶＬＰは組み換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般的に公知のウイルスは配列決定されており、容易に入手可能である。コートタンパク質をコードする遺伝子は当業者に容易に同定されうる。宿主内でコートタンパク質を組み換え発現させることによるＶＬＰの調整は、当業者の共通の知識内である。
好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、a) ＲＮＡバクテリオファージ；b) バクテリオファージ；c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのキャプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開公報92/11291)；d) はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))；e) シンドビスウイルス；f) ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)；g) 口蹄疫ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))；h) ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；i) アルファウイルス属；j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；m) ポリオーマウイルス；n) タバコモザイク病ウイルス；及びo) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、あるいはこれからなる。
１より多くの異なる組み換えタンパク質を含むＶＬＰを本出願では概してモザイクＶＬＰとする。一実施態様では、ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、該モザイクＶＬＰは、１より多くの組み換えタンパク質、好ましくは２の組み換えタンパク質、最も好ましくは２の組み換えキャプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はこれからなる。
ここで使用される「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一の内部欠失、少なくとも一の切断、又はそれらの少なくとも一の組合せから得られる。さらに好ましくは、最大５、４、３又は２の内部欠失、最大２の切断又はそれらのただ１つの組合せにより得られる。
さらに、「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドを指す。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持している。
好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開第００／３２２２７号、同第０１／８５２０８号及び同第０１／０５６９０５号に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報０１／０５６９０５の３４−３９頁に開示されている。
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、ＩＬ-１分子のＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号１のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整される。このアミノ酸は修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号：１７０)のアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号１から配列番号２に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。
本発明のある実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは、ａ)バクテリオファージＱβ；ｂ)バクテリオファージＲ１７；ｃ)バクテリオファージｆｒ；ｄ)バクテリオファージＧＡ；ｅ)バクテリオファージＳＰ；ｆ)バクテリオファージＭＳ２；ｇ)バクテリオファージＭ１１；ｈ)バクテリオファージＭＸ１；ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；ｋ)バクテリオファージｆ２；ｌ)バクテリオファージＰＰ７、及びｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明のある好適な実施態様では、組成物はＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含み、該コートタンパク質は(a) Ｑβ ＣＰと称する配列番号：３；(b) 配列番号：３及び配列番号：４(Ｑβ Ａ１タンパク質)の混合物；(c) 配列番号：５(Ｒ１７キャプシドタンパク質)；(d) 配列番号：６(ｆｒキャプシドタンパク質)；(e) 配列番号：７(ＧＡキャプシドタンパク質)；(f) 配列番号：８(ＳＰキャプシドタンパク質)；(g) 配列番号：８及び配列番号：９の混合物；(h) 配列番号：１０(ＭＳ２キャプシドタンパク質)；(i) 配列番号：１１(Ｍ１１キャプシドタンパク質)；(j) 配列番号：１２(ＭＸ１キャプシドタンパク質)；(k) 配列番号：１３(ＮＬ９５キャプシドタンパク質)；(l) 配列番号：１４(ｆ２キャプシドタンパク質)；(m) 配列番号：１５(ＰＰ７キャプシドタンパク質)；及び(n) 配列番号：２１(ＡＰ２０５キャプシドタンパク質)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
非常に好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質はＣＰ Ｑβ(配列番号：３)とＣＰ Ｑβ Ａ１(配列番号：４)、又はＣＰ ＳＰ(配列番号：８)とＣＰ ＳＰ Ａ１(配列番号：９)のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβである。Ｑβのキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβキャプシドとなる、コートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に対し、普通ではない耐性を示す。驚くべきことに、我々は、１Ｍの高さの濃度のグアニジウム、３０％の高さの濃度のアセトニトリル及びＤＭＳＯがキャプシドの安定性に影響しないことを発見した。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰの高い安定性は、本発明の哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種における使用に特に有用な性質である。
さらに好適な本発明のＲＮＡバクテリオファージ、特にＱβ及びｆｒのウイルス様粒子は国際公開第０２／０５６９０５号に開示されており、この開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。特に、国際公開第０２／０５６９０５号の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調整について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体コンピテント変異体型を本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開第２００４／００７５３８号の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰの入手方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開第２００４／００７５３８号は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高い免疫原性があり、ＩＬ-１分子と結合して、典型的かつ好ましくは、反復様式で配位するＩＬ-１分子をディスプレイするワクチンコンストラクトを生成することができる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は欠失によって少なくとも一のリジン残基が除去されて修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は挿入によって少なくとも一のリジン残基が付加されて修飾されている。特にワクチンの必要性に合わせて調整するために、少なくとも一のリジン残基の欠失、置換又は付加によって、カップリングの程度、すなわち、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのサブユニット当たりのＩＬ-１分子の量を変えることができる。
好適な一実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．５〜４．０の抗原密度を有する。ここで使用される「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、好ましくはＶＬＰのコートタンパク質当たり、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合するＩＬ-１分子の平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのサブユニット全体の平均として算出される。
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰ又はキャプシドは、キャプシドの内部に向かって位置しＲＮＡと相互作用する３つのリジン残基と、キャプシドの外部に露出したさらに４つのリジン残基を有する一定のトポロジーで、その表面上に一定の数のリジン残基を提示する。好ましくは、少なくとも１の第一付着部位は、ＶＬＰの外部上に位置する又は外部にあるリジン残基である。
露出したリジン残基がアルギニンに置換されているＱβ変異体を本発明のために用いることができる。ゆえに、本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβコートタンパク質を含むか、本質的にこれからなるか、あるいはこれからなる。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、a) Ｑβ-２４０(配列番号：１６、配列番号：３のＬｙｓ１３-Ａｒｇ)、b) Ｑβ-２４３(配列番号：１７、配列番号：３のＡｓｎ１０-Ｌｙｓ)；c) Ｑβ-２５０(配列番号：１８、配列番号：３のＬｙｓ２-Ａｒｇ)、d) Ｑβ-２５１(配列番号：１９、配列番号：３のＬｙｓ１６-Ａｒｇ)；及び、e) Ｑβ-２５９(配列番号：２０、配列番号：３のＬｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなる。上記のＱβ変異体コートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びキャプシドの構築、発現及び精製はそれぞれ、国際公報第０２／０５６９０５号に記述される。したがって、特に上記出願の実施例１８を参照のこと。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの変異体コートタンパク質、又はその変異体ないしはその断片、及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列 配列番号：１６、１７、１８、１９又は２０を有する変異体コートタンパク質及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
さらにまた、ＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質は、細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K 等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及び、ｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L 等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。そのような情報を用いて、表面に曝された残基を同定して、ＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質を修飾して、一又は複数の反応性のアミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができる。ＲＮＡバクテリオファージ由来のＶＬＰの他の利点は、安価で大量の物質を産生することが可能となる細菌での発現回収率が高いことである。
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は、少なくとも１の抗原、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、さらにより好ましくは１〜２、最も好ましくはちょうど１の抗原を含み、該抗原はＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、ＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質であり、該ＩＬ-１分子は配列番号：３６から配列番号：１１６、配列番号：１３０から配列番号：１４０及び配列番号：１６３から配列番号：１６５のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記抗原は、(a) ヒト；(b) 霊長類；(c) 齧歯動物；(d) ウマ；(e) ヒツジ；(f) ネコ；(g) ウシ；(h) ブタ；(i) ウサギ；(j) イヌ；(k) マウス；及び、(l) ラットからなる群から選択される生物由来のＩＬ-１分子である。最も好ましくは、前記ＩＬ-１分子はヒト由来であり、配列番号：３６、配列番号：４９、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６７から１１０のいずれか一、及び配列番号：１３０から１４０のいずれか一及び配列番号：１６５からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はラット又はマウス、好ましくはマウス由来であり、該ＩＬ-１分子は、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：１１１から１１６のいずれか一、配列番号：１６３、及び配列番号：１６４のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１α分子、好ましくはＩＬ-１αタンパク質、ＩＬ-１α断片、ＩＬ-１α成熟断片、ＩＬ-１αペプチド又はＩＬ-１α変異タンパク質であり、該ＩＬ-１α分子は、配列番号：３６から４８、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７から８８、及び配列番号：１６５からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。ＩＬ-１α分子の具体的に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１α分子、好ましくはヒトＩＬ-１αタンパク質、ヒトＩＬ-１α断片又はヒトＩＬ-１α成熟断片であり、該ＩＬ-１α分子は、配列番号：３６、配列番号：６３、及び配列番号：１６３のいずれか一、最も好ましくは配列番号：６３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１βタンパク質、ＩＬ-１β断片、ＩＬ-１β成熟断片、ＩＬ-１βペプチド又はＩＬ-１β変異タンパク質であり、該ＩＬ-１β分子は、配列番号：４９から６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：８９から１１６、配列番号：１３０から配列番号：１４０、配列番号：１６４、及び配列番号：１６５からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。ＩＬ-１β分子の具体的に好適な実施態様は、ヒトＩＬ-１β分子、好ましくはヒトＩＬ-１βタンパク質、ヒトＩＬ-１β断片又はヒトＩＬ-１β成熟断片であり、該ＩＬ-１β分子は、配列番号：４９、配列番号：６４、配列番号：１３０から配列番号：１４０及び配列番号：１６５のいずれか一、最も好ましくは配列番号：６４に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片又は、好ましくはＩＬ-１成熟断片であり、該ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片又はＩＬ-１成熟断片は好ましくはＩＬ-１レセプターに結合可能であり、またさらにより好ましくは、加えて生物学的な活性を含む。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１タンパク質であり、該ＩＬ-１タンパク質は、配列番号：３６から６２のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１タンパク質はＩＬ-１αタンパク質であり、該ＩＬ-１αタンパク質は、配列番号：３６から４８からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。最も好ましくは、前記ＩＬ-１αタンパク質はヒトＩＬ-１αタンパク質であり、該ヒトＩＬ-１αタンパク質は、配列番号：３６に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１タンパク質はＩＬ-１βタンパク質であり、該ＩＬ-１βタンパク質は、配列番号：４９から６２からなる群から選択される配列のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。最も好ましくは、前記ＩＬ-１βタンパク質はヒトＩＬ-１βタンパク質であり、該ヒトＩＬ-１βタンパク質は、配列番号：４９に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片であり、該ＩＬ-１断片又は該ＩＬ-１成熟断片は好ましくはマウス又はヒト、最も好ましくはヒト由来である。好ましくは前記ＩＬ-１断片又は前記ＩＬ-１成熟断片は、配列番号：６３から配列番号：６６、配列番号：１３０、及び配列番号：１６３から配列番号：１６５のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１成熟断片はＩＬ-１α成熟断片であり、該ＩＬ-１α成熟断片は好ましくは生物学的な活性を含み、さらに該ＩＬ-１α成熟断片は、配列番号：６３又は配列番号：６５、最も好ましくは配列番号：６３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１成熟断片はＩＬ-１β成熟断片であり、該ＩＬ-１β成熟断片は好ましくは生物学的な活性を含み、さらに該ＩＬ-１β成熟断片は、配列番号：６４、配列番号：６６及び配列番号：１３０のいずれか一、最も好ましくは配列番号：６４に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１ペプチドであり、該ＩＬ-１ペプチドはマウス、ラット又はヒト、最も好ましくはヒト由来である。好ましくは前記ＩＬ-１ペプチドは、配列番号：６７から配列番号：１１６のいずれか一に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを好ましくは含むか、さらにより好ましくはこれからなる。
更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子はＩＬ-１変異タンパク質であり、好ましくは該ＩＬ-１変異タンパク質は生物学的な活性を低減しているか、より好ましくは生物学的な活性を持たず、さらに該ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１レセプターを結合することができる。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１変異タンパク質は、１〜３、より好ましくは１〜２、最も好ましくはちょうど１のアミノ酸残基がＩＬ-１成熟断片のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなる。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１変異タンパク質はＩＬ-１β変異タンパク質、好ましくはヒトＩＬ-１β変異タンパク質、最も好ましくは配列番号：１３１から配列番号：１４０から選択されるヒトＩＬ-１β変異タンパク質である。
本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する、(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１分子、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質である、少なくとも一の抗原を供給する、そして(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する、ことを含む本発明の組成物の産生方法を提供する。好適な実施態様では、少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、すなわちＩＬ-１分子、ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片、好ましくはＩＬ-１成熟断片、ＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質の供給は、発現による、好ましくは細菌系、好ましくは大腸菌内での発現によるものである。通常、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｃタグ又はＨＡタグなどの精製タグは精製工程を容易にするために加えられる。他の方法では、特に５０以下のアミノ酸を有するＩＬ-１ペプチド又はＩＬ-１変異タンパク質は化学的に合成できる。
本発明の好適な一実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも一のペプチド結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１分子に結合する。ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１成熟断片をコードする遺伝子が、ＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子の内部に又は好ましくはＮないしＣ末端の何れかにインフレームに結合する。また、融合は、一部が欠損しているコートタンパク質の変異体内へＩＬ-１の配列を挿入することに影響を受けうる、これはさらに切断変異体と称される。切断変異体は、コートタンパク質の配列のＮ末端ないしＣ末端、又はその一部の内部が欠損していてもよい。例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇについて、アミノ酸７９−８０外来のエピトープに置換される。好ましくは、融合タンパク質は発現の際にＶＬＰ内に集合体化する能力を保持しており、その集合体化は電子顕微鏡で調べることができる。
隣接するアミノ酸残基を付加して、コートタンパク質と外来性のエピトープの間の間隙を増やしてもよい。隣接配列に用いるためにはグリシン残基及びセリン残基が特に好ましい。このような隣接配列によってフレキシビリティが付加される。このフレキシビリティの付加により、ＶＬＰサブユニットの配列内へ外来性の配列を融合する際に生じうる不安定性作用が軽減され、外来性のエピトープの存在による集合体化の阻害が軽減される。
他の実施態様では、少なくとも一のＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１成熟断片は、多くの他のウイルスコートタンパク質、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合するか (Kozlovska, T. M., 等, Intervirology 39:9-15 (1996))又は、ＣＰ伸展の位置７２と７３の間に挿入されてもよい。その他の例として、ＩＬ-１がｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３の間に挿入され、ＩＬ-１-ｆｒ ＣＰ融合タンパク質となってもよい(Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらに、ＩＬ-１は、ＲＮＡバクテリオファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ末端突出β-ヘアピンに融合してもよい(国際公開第９２／１３０８１号)。あるいは、ＩＬ-１は、パピローマウイルスのキャプシドタンパク質、好ましくはウシパピローマウイルス１型(ＢＰＶ-１)の主要キャプシドタンパク質Ｌ１に融合しうる (Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公開第００／２３９５５号)。また、ＩＬ-１へのＢＰＶ-１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。さらに、ウイルスのコートタンパク質へのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片にＩＬ-１分子を融合させる実施態様は、国際公開第２００４／００９１２４号の６２頁の第２０行目から６８頁の第１７行目に開示されており、出典明記によって、本明細書中に援用される。
米国特許第５６９８４２４号には、キャプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。ついで、挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原性タンパク質等として提示される。
しかしながら、キャプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、キャプシドのオリゴマー化に至りうることを我々は記す。さらに、ジスルフィド結合によるキャプシドと抗原性タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好適な実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原、すなわちＩＬ-１分子との付随又は結合は、ジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一の第二の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらにまた本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一のＩＬ-１分子との付随又は結合は、硫黄-硫黄結合を含まない。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第二付着部位は、スルフヒドリル基を含むか、好ましくは該基である。さらに非常に好適な実施態様では、前記少なくとも一の第一付着部位はスルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、システインのスルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
更なる好適な実施態様では、前記少なくとも１の第一付着部位はアミノ基を含み、前記第二付着部位はスルフヒドリル基を含む。
更なる好適な実施態様では、前記第二付着部位のただ１つは、前記ＩＬ-１分子の前記コア粒子への単一及び均一な種類の結合を生じさせる少なくとも１の非ペプチド共有結合を介して、前記第一付着部位に付随し、このとき該第一付着部位に付随する該ただ１つの第二付着部位がスルフヒドリル基であり、該ＩＬ-１分子と該コア粒子が該付随を介して相互作用して、規則正しく反復した抗原アレイを形成する。
他の好適な実施態様では、ＩＬ-１分子、好ましくはＩＬ-１タンパク質、より好ましくはＩＬ-１成熟断片、さらにより好ましくは配列番号：６３から配列番号：６６、最も好ましくは配列番号：６３又は配列番号：６４のアミノ酸配列を含むかこれからなるＩＬ-１成熟断片は、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片のＮ-末端又はＣ-末端のいずれか、好ましくはＣ-末端に融合する。抗原とのバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質の融合タンパク質を含むＶＬＰは、通常、出典明記によって本明細書に援用される国際公報第２００６／０３２６７４Ａ１号に開示される。ある更なる好適な実施態様では、融合タンパク質はさらにリンカーを含み、該リンカーはＡＰ２０５及びＩＬ-１分子のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体に融合する。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、前記リンカーを介してＡＰ２０５の前記コートタンパク質、その断片ないしはその変異体のＣ末端に融合する。
ＩＬ-１分子、特に少なくとも１００から３００までのアミノ酸、典型的及び好ましくはおよそ１４０〜１６０のアミノ酸、最も好ましくはおよそ１５５のアミノ酸を含むＩＬ-１タンパク質及びＩＬ-１断片は、バクテリオファージのコートタンパク質、好ましくはＡＰ２０５のコートタンパク質に融合しながら、コートタンパク質のＶＬＰへの自己集合体化(self assemble)能を維持することができる。
ＩＬ-１タンパク質、ＩＬ-１断片及びＩＬ-１成熟断片の大きさが大きく、また立体的な理由から、ＩＬ-１分子に融合したＡＰ２０５コートタンパク質並びにｗｔコートタンパク質サブユニットを含むモザイクＶＬＰを産生する発現システムを構築した。このシステムにおいて、停止コドンを抑制するとＡＰ２０５-ＩＬ-１コートタンパク質融合が生じる一方で、適切な終止によりｗｔ ＡＰ２０５コートタンパク質が生じる。両タンパク質は細胞内で同時に生産されて、モザイクＶＬＰ内に集合化する。このようなシステムの利点は、巨大タンパク質がＶＬＰの集合体化を干渉することなくディスプレイされるということである。モザイクＶＬＰへのＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質の取込みのレベルは抑制のレベルに依存するので、ＡＰ２０５-ＩＬ-１は、サプレッサーｔＲＮＡを過剰発現するプラスミドを既に含有している大腸菌細胞において発現される。オパール抑制に関して、オパール停止コドンを認識してＴｒｐを導入するサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドｐＩＳＭ３００１(Smiley, B.K., Minion, F.C. (1993) Enhanced readthrough of opal (UGA) stop codons and production of Mycoplasma pneumoniae P1 epitopes in Escherichia coli. Gene 134, 33-40)が用いられる。アンバー終結の抑制はプラスミドｐＩＳＭ５７９を用いて増加してもよく、アンバー停止コドンを認識して、同様にＴｒｐを導入するサプレッサーｔＲＮＡを過剰発現させる。プラスミドｐＩＳＭ５７９は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIによりｔｒｐＴ１７６遺伝子をｐＩＳＭ３００１から切り出し、アンバーｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含むプラスミドｐＭＹ５７９(Michael Yarusから贈与)のＥｃｏＲI断片によって置換することによって生成された。このｔＲＮＡサプレッサー遺伝子は、ｔｒｐＴ１７５の変異体であり(Raftery LA. Et al. (1984) J. Bacteriol. 158:849-859)、Ｇ３３、Ａ２４及びＴ３５の３つの位置がｔｒｐＴと異なる。大腸菌ＪＭ１０９などのアンバー抑制(ｓｕｐＥ又はｇｌｎＶ)による大腸菌株におけるＡＰ２０５-インターロイキン-１α融合タンパク質の発現は、アンバー停止コドンに導入されたＴｒｐによるＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質に加えて、アンバー停止コドンに導入されたＴｒｐでなくＧｌｎによるＡＰ２０５-ＩＬ-１融合タンパク質を一部生成しうる。したがって、停止コドンで翻訳されるアミノ酸の同定は、過剰発現するサプレッサーｔＲＮＡと株の表現型の組合せに依存しうる。Miller JH等 ((1983) J. Mol. Biol. 164: 59-71)によって記載され、当分野で周知であるように、抑制の効率は状況に依存する。特に、停止コドンのコドン３'と停止コドンから初めの塩基３'が特に重要である。例えば、停止コドンの後のプリン塩基は、通常は十分に抑制される。
ゆえに、好適な実施態様では、前記ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、該モザイクＶＬＰは少なくとも１、好ましくは１の第一ポリペプチドと、少なくとも１、好ましくは１の第二ポリペプチドを含むか、好ましくはこれからなり、該第一ポリペプチドは組み換えキャプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片であり、該第二ポリペプチドは、好ましくは該第一ポリペプチドの組み換えキャプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片とＩＬ-１分子の遺伝的融合生成物である。更なる好適な実施態様では、前記第一ポリペプチドは、バクテリオファージＡＰ２０５の組み換えキャプシドタンパク質又はその変異体ないしはその断片である。更なる好適な実施態様では、前記第一ポリペプチドは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３から選択される。非常に好適な実施態様では、前記第一ポリペプチドは配列番号：２１である。抗原を含むバクテリオファージＡＰ２０５のモザイクＶＬＰは、通常、国際公報第２００６／０３２６７４Ａ１号の、特に１０７段落に開示される。更なる好適な実施態様では、前記第二ポリペプチドは、好ましくは前記第一ポリペプチドの組み換えキャプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片とＩＬ-１分子の遺伝的融合生成物であり、前記ＩＬ-１分子は好ましくはアミノ酸リンカーにより該組み換えキャプシドタンパク質、その変異体ないしはその断片のＣ末端に融合する。更なる好適な実施態様では、前記ＩＬ-１分子は、１００から３００のアミノ酸、典型的及び好ましくはおよそ１４０〜１６０のアミノ酸、最も好ましくはおよそ１５５のアミノ酸を含むか、好ましくはこれからなる。非常に好適な実施態様では、前記モザイクＶＬＰ中の前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドのモル比は、１０:１から５：１、好ましくは８:１から６:１、最も好ましくはおよそ７:１である。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも一の共有結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、すなわちＩＬ-１分子に結合した少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、好ましくは該共有結合は非ペプチド結合である。本発明の好適な実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
本発明の非常に好適な実施態様では、少なくとも一の第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも一の第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基である。
本発明のある好適な実施態様では、ＩＬ-１分子は、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基(一又は複数)のアミノ基を有する好ましい第一付着部位と反応可能な官能基と、好ましい第二付着部位、すなわちＩＬ-１分子に元もとある、ないしは人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくはシステイン(一又は複数)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時にＩＬ-１分子とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。
好ましい実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。ＩＬ-１分子における第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、好ましくは第二の付着部位として適切な少なくとも一のアミノ酸を含むリンカーとの結合により達成される。よって、本発明の好ましい実施態様では、リンカーは少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一のペプチド結合により、ＩＬ-１分子に付随している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含む又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、リンカーは好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
リンカーの選択は、ＩＬ-１分子の性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。本発明のさらに好適な実施態様では、アミノ酸リンカーは１〜１０のアミノ酸を含有する。リンカーの好適な実施態様は、(a) CGG(配列番号：１７１)；(b) Ｎ末端γ１-リンカー、好ましくはCGDKTHTSPP(配列番号：１７２)；(c) Ｎ末端γ３-リンカー、好ましくはCGGPKPSTPPGSSGGAP(配列番号：１７３)；(d) Ｉｇヒンジ領域；(e) Ｎ末端グリシンリンカー、好ましくはGCGGGG(配列番号：１７４)；(f) ｎ＝０〜１２及びｋ＝０〜５の(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｎ(配列番号：１７５)；(g) １つの更なるシステインを有するＮ末端グリシン-セリンリンカー、好ましくは(GGGGS)ｎ、ｎ＝１〜３(配列番号：１７６)；(h) ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２の(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｍ(Ｓ)ｌ(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号：１７７)；(i) GGC(配列番号：１７８)；(k) GGC-NH2(配列番号：１７９)；(l) Ｃ末端γ１-リンカー、好ましくはDKTHTSPPCG(配列番号：１８０)；(m) Ｃ末端γ３-リンカー、好ましくはPKPSTPPGSSGGAPGGCG(配列番号：１８１)；(n) Ｃ末端グリシンリンカー、好ましくはGGGGCG(配列番号：１８２)；(o) ｎ＝０〜１２及びｋ＝０〜５の(Ｇ)ｎＣ(Ｇ)ｋ(配列番号：１８３)；(p) １つの更なるシステインを有するＣ末端グリシン-セリンリンカー、好ましくは(SGGGG)ｎ、ｎ＝１〜３(配列番号：１８４)；(q) ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２及びｏ＝０〜８の(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k(配列番号：１８５)からなる群から選択される。さらに好適な実施態様では、リンカーはＩＬ-１分子のＮ-末端に融合している。本発明の他の好適な実施態様では、リンカーはＩＬ-１分子のＣ-末端に融合している。
本発明に係る好ましいリンカーは、第二付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ、配列番号：１７４)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ、配列番号：１８２)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号：１８６)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号：１８７)、ペプチドのＣ-末端のＧＧＣＧ(配列番号：１８８)、ＧＧＣ(配列番号：１７８)又はＧＧＣ-ＮＨ２(配列番号：１７９、「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端のＣＧＧ(配列番号：１７１)のリンカーである。一般的に、グリシン残基は、第二付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。
上記の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いることによるＶＬＰへのＩＬ-１分子の結合により、正方向の様式でＶＬＰにＩＬ-１分子をカップリングさせることができる。ＶＬＰにＩＬ-１分子を連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、ＩＬ-１分子をＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。ＩＬ-１分子は、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。次いで、必要であれば脱保護化した後にＩＬ-１分子を以下のようにＶＬＰにカップリングしてもよい。過剰なチオラート化剤を分離した後、ＩＬ-１分子を、システイン反応基を含有し、システイン残基に対して反応可能な少なくとも一又はいくつかの官能基を表出するヘテロ二官能性架橋剤にて予め活性化させた、ＶＬＰと反応させる。このときチオラート化ＩＬ-１分子は上記に記載のように反応することができる。場合によっては、少量の還元剤が反応混合物中に含まれる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(Pierce)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、ＩＬ-１分子をＶＬＰに結合させる。
本発明の他の実施態様では、組成物は、化学的な相互作用を介してＩＬ-１分子に結合したウイルス様粒子を含むか、ないしは本質的にそれからなるものであり、この相互作用の少なくとも一は共有結合ではない。
ＩＬ-１分子へのＶＬＰの結合は、ＶＬＰをビオチン化して、ストレプトアビジン-融合タンパク質としてＩＬ-１分子を発現させることによって達成することができる。
一又はいくつかの抗原分子、すなわちＩＬ-１分子は、立体的に可能であれば、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＶＬＰのコートタンパク質の露出したリジン残基を介して、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質のサブユニットに付着しうる。したがって、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの特定の特徴は、サブユニットにつきいくつかの抗原をカップリングさせることができることである。これにより密度の高い抗原アレイが生成される。
本発明の非常に好適な実施態様では、ＩＬ-１分子は、ＩＬ-１分子のＮ-末端ないしはＣ-末端のいずれかに負荷されているシステイン残基、又はＩＬ-１分子内の天然のシステイン残基により、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質のリジン残基に、特にＱβのコートタンパク質に結合する。
上述の通り、４つのリジン残基はＱβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。典型的及び好ましくは、これらの残基は架橋剤(クロスリンカー)分子との反応の際に誘導体化される。露出したリジン残基のすべてが抗原にカップリングしていない場合、架橋剤と反応したリジン残基は、誘導体化工程の後にもε-アミノ基に付着した架橋剤分子を有したままとなる。これによって１又はいくつかの正電荷が消失し、ＶＬＰの溶解性及び安定性に有害となりうる。本発明者等は、アルギニン残基は好適な架橋剤と反応しないので、開示したＱβコートタンパク質変異体にあるように、いくつかのリジン残基をアルギニンに置換することによって、正電荷の過剰な消失を防ぐ。さらに、リジン残基のアルギニン残基への置換により、抗原への反応に有用な部位が少なくなればなるほど、より多くの定義した抗原アレイが生じうる。
したがって、以下のＱβコートタンパク質変異体：Ｑβ-２４０(Ｌｙｓ１３-Ａｒｇ；配列番号：１６)、Ｑβ-２５０(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３-Ａｒｇ；配列番号：１８)、Ｑβ-２５９(Ｌｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ；配列番号：２０)、及びＱβ-２５１；(Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ、配列番号：１９)において露出したリジン残基はアルギニンに置換した。さらに好適な実施態様では、本発明者等は、さらに高い密度の抗原アレイを得るために好適な、１つの更なるリジン残基を有するＱβ変異体コートタンパク質であるＱβ-２４３(Ａｓｎ１０-Ｌｙｓ；配列番号：１７)を開示する。
本発明の好適な一実施態様では、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。好適な一実施態様では、さらに組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含有する。更なる好適な実施態様では、ポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。
好適な一実施態様では、さらに組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも一の免疫賦活性物質を含有する。よりさらに好適な実施態様では、免疫賦活性物質は核酸、好ましくはＤＮＡ、最も好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的に好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味する。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的で好適な方法は、国際公報第２００６／０３７７８７号Ａ２の実施例１７に記載される。典型的に好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。測定された量の数値は、典型的及び好ましくは、示す数値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する比較値として理解すべきである。
ポリ陰イオン性高分子：本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性電荷の反復性基を含んでなる相対的に高い質量の分子を指すものであり、その構造は、実際のところ又は概念的には、相対的に低い質量の分子から得られるユニットの複数の繰り返しを基本的に含んでなる。ポリ陰イオン性高分子は、少なくとも２０００ダルトン、好ましくは少なくとも３０００ダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０００ダルトンの分子量を有するものである。本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくは、ｔｏｌｌ様レセプターを活性化することができない分子を指す。ゆえに、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくはＴｏｌｌ様レセプターリガンドを除く、さらにより好ましくはさらに、免疫賦活性物質、例えばＴｏｌｌ様レセプターリガンド、免疫賦活性核酸およびリポポリサッカリド(ＬＰＳ)を除くものである。より好ましくは、本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。さらにより好ましくは、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は免疫賦活性物質を除くものである。本明細書中で用いる「免疫賦活性物質」なる用語は、本発明中に含有される抗原に対して特異的な免疫応答を誘導及び／又は亢進することができる分子を指す。
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸：本明細書中で用いる「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸」なる用語、又は「二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸」なる用語は、宿主が本来合成するＲＮＡ又は好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、典型的かつ好ましくは、本発明の方法による、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするかないしは除去する工程の間に、化学的及び／又は物理的な変化が起こりうる。例えばＲＮＡ、好ましくは核酸の大きさが短くなったり、その二次構造が変化しうる。しかしながら、この結果として生じるＲＮＡ又は核酸でも、宿主ＲＮＡ又は宿主核酸とみなす。
ＲＮＡの量を決定するための方法及びＶＬＰによって包含されるＲＮＡの量を減少する方法は、同出願人により２００５年１０月５日に出願した米国仮出願に開示されており、その出願全体は出典明記によって本明細書中に援用される。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするかないしは除去することにより、ＩＬ-１に特異的な抗体応答が強いままで、炎症性Ｔ細胞応答及び障害性Ｔ細胞応答などの望ましくないＴ細胞応答や、発熱などの他の望ましくない副作用を最小限にするか、又は低減する。
ある好適な実施態様では、本発明は、本発明の組成物と本発明のＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰの調製方法であって、該ＶＬＰが宿主によって組み換えて産生され、該ＶＬＰが本質的に宿主のＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠いているものであり、(a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を宿主によって組み換えて産生させる工程、このときの該ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むものである；(b) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片へのウイルス様粒子を分解させる工程；(c) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製する工程；(d) 精製した該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再構築させる工程、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである；そして(e) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の本発明の抗原を工程(d)より得た該ＶＬＰに結合させる工程、を含む方法を提供する。更なる好適な実施態様では、前記精製されたコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の再構築は、少なくとも１のポリ陰イオン性高分子の存在下において生じる。
一態様では、本発明は、本発明の組成物を含有するワクチンを提供する。好適な一実施態様では、ワクチン組成物内のＶＬＰに結合したＩＬ-１分子は、動物、好ましくは哺乳動物ないしはヒト起源のものでよい。好適な実施態様では、ＩＬ-１はヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマ起源である。
好適な一実施態様では、ワクチン組成物はさらに少なくとも一のアジュバントを含有する。少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチン及び薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。
他の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを欠く。
本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。さらにアジュバントを含んでいないので、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する所望されない炎症性Ｔ細胞反応の発生が最小となる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物、特にヒトである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって動物又はヒトに投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶液及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。
投与される個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「製薬的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。以下のメカニズムの説明によって本発明が限定されるものではなく、本発明のワクチンは、ＩＬ-１に結合する抗体であり、その濃度を抑え、及び／又は生理学的又は病理学的な働きを阻害する抗体を誘導しうる。
他の態様では、本発明は、本発明で述べられる組成物と受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファー又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。
本発明は、本発明の組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給し；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１分子を供給し；そして(c) 該ＶＬＰと該ＩＬ-１分子を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して該ＩＬ-１分子と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する工程を含む産生方法を教示する。
更なる好適な実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを提供する工程は、(a) 該ウイルス様粒子を該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に分解して；(b) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製して；(c) 該精製された該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再集合体化させる工程をさらに含むものであり、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである。より更なる好適な実施態様では、前記の精製したコートタンパク質の再集合体化は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下にてなされる。
本発明は、ＩＬ-１が動物又はヒトの重要な病理学的機能を及ぼす疾患又は症状を治療及び／又は軽減するための本発明の組成物の使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が好ましくは、(a) 血管系疾患、好ましくは冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化及び血管炎、最も好ましくはアテローム性動脈硬化；(b) 遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)、家族性感冒自己炎症性症候群(ＦＣＡＳ)、新生児期発症多臓器性炎症性疾患(ＮＯＭＩＤ)及びマックル・ウェルズ症候群、最も好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)；(c) 慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、成人発症性スティル病、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎、最も好ましくは関節リウマチ；(d) 骨及び軟骨変性疾患、好ましくは痛風、骨粗鬆症及び骨関節炎、最も好ましくは骨関節炎；(e) アレルギー性疾患、好ましくは接触過敏症、１型過敏症及びアレルギー、最も好ましくはアレルギー；及び、(f) 神経学的疾患、好ましくはアルツハイマー病、癲癇、パーキンソン病及び多発性硬化症、最も好ましくは多発性硬化症からなる群から選択される、使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が血管系疾患、好ましくは冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化及び血管炎、最も好ましくはアテローム性動脈硬化であり、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、本発明のＩＬ-１α分子、好ましくはＩＬ-１α成熟断片、最も好ましくは配列番号：６３又はこれらの変異タンパク質である、使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が、(a) 遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)、家族性感冒自己炎症性症候群(ＦＣＡＳ)、新生児期発症多臓器性炎症性疾患(ＮＯＭＩＤ)及びマックル・ウェルズ症候群、最も好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)；(b) 慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、成人発症性スティル病、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎、最も好ましくは関節リウマチ；(c) 骨及び軟骨変性疾患、好ましくは痛風、骨粗鬆症及び骨関節炎、最も好ましくは骨関節炎；(d) アレルギー性疾患、好ましくは接触過敏症、１型過敏症及びアレルギー、最も好ましくはアレルギー；及び、(e) 神経学的疾患、好ましくはアルツハイマー病、癲癇、パーキンソン病及び多発性硬化症、最も好ましくは多発性硬化症からなる群から選択され、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１β成熟断片、最も好ましくは配列番号：６４又はこれらの変異タンパク質である、使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)であって、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１β成熟断片、最も好ましくは配列番号：６４又はこれらの変異タンパク質である、使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が血管系疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化である使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)である使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチである使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が骨及び軟骨変性疾患、好ましくは骨関節炎である使用を提供する。
さらに、本発明は、動物、好ましくはヒトの疾患の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物の使用であって、該疾患が神経学的疾患、好ましくは多発性硬化症である使用を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトに本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が好ましくは、(a) 血管系疾患、好ましくは冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化及び血管炎、最も好ましくはアテローム性動脈硬化；(b) 遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)、家族性感冒自己炎症性症候群(ＦＣＡＳ)、新生児期発症多臓器性炎症性疾患(ＮＯＭＩＤ)及びマックル・ウェルズ症候群、最も好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)；(c) 慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、成人発症性スティル病、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎、最も好ましくは関節リウマチ(d) 骨及び軟骨変性疾患、好ましくは痛風、骨粗鬆症及び骨関節炎、最も好ましくは骨関節炎；(e) アレルギー性疾患、好ましくは接触過敏症、１型過敏症及びアレルギー、最も好ましくはアレルギー；及び、(f) 神経学的疾患、好ましくはアルツハイマー病、癲癇、パーキンソン病及び多発性硬化症、最も好ましくは多発性硬化症からなる群から選択される、方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトに本発明の組成物又は本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が血管系疾患、好ましくは冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化及び血管炎、最も好ましくはアテローム性動脈硬化であり、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、本発明のＩＬ-１α分子、好ましくはＩＬ-１α成熟断片、最も好ましくは配列番号：６３又はこれらの変異タンパク質である、方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が好ましくは、(a) 遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)、家族性感冒自己炎症性症候群(ＦＣＡＳ)、新生児期発症多臓器性炎症性疾患(ＮＯＭＩＤ)及びマックル・ウェルズ症候群、最も好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)；(b) 慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチ、全身発症性若年性特発性関節炎、成人発症性スティル病、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎、最も好ましくは関節リウマチ；(c) 骨及び軟骨変性疾患、好ましくは痛風、骨粗鬆症及び骨関節炎、最も好ましくは骨関節炎；(d) アレルギー性疾患、好ましくは接触過敏症、１型過敏症及びアレルギー、最も好ましくはアレルギー；及び、(e) 神経学的疾患、好ましくはアルツハイマー病、癲癇、パーキンソン病及び多発性硬化症、最も好ましくは多発性硬化症からなる群から選択され、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１β成熟断片、最も好ましくは配列番号：６４又はこれらの変異タンパク質である、方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはイヌ、ネコ、ウマ又はヒト、最も好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)であって、該組成物、該ワクチン又は該製薬的組成物に含まれる前記少なくとも１の抗原は、ＩＬ-１β分子、好ましくはＩＬ-１β成熟断片、最も好ましくは配列番号：６４又はこれらの変異タンパク質である、方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が血管系疾患、好ましくはアテローム性動脈硬化である方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が遺伝性ＩＬ-１依存性炎症性疾患、好ましくは家族性地中海熱(ＦＭＦ)である方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が慢性自己免疫性炎症性疾患、好ましくは関節リウマチである方法を提供する。
さらに、本発明は、疾患の治療方法であって、動物、好ましくはヒトに本発明の組成物、本発明のワクチン又は本発明の製薬的組成物を投与することを含み、該疾患が骨及び軟骨変性疾患、好ましくは骨関節炎である方法を提供する。
本明細書において引用される文献は出典明記によって全体が援用される。
実施例１
マウスＩＬ１α１１７−２７０及びＩＬ-１β１１９−２６９のクローニング、発現及び精製
オリゴヌクレオチドＩＬ１α１(5'-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3'；配列番号：２４)及びＩＬ１α２(5'-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATA GAG-3'；配列番号：２５)を用いて、ＴＮＦα活性化マウスのマクロファージのｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲによってマウスＩＬ-１αのアミノ酸１１７−２７０をコードするヌクレオチド配列を増幅した。同じｃＤＮＡライブラリーを用いて、オリゴヌクレオチドＩＬ-１β１(5'-ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3'；配列番号：２６)及びＩＬ-１β２(5'-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3'；配列番号：２７)によりマウスＩＬ-１β前駆体のアミノ酸１１９−２６９をコードするヌクレオチド配列を増幅した。両ＤＮＡ断片を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩにて消化し、発現ベクターｐＭｏｄＥＣ１(配列番号：２９)にクローニングした。
ベクターｐＭｏｄＥＣ１(配列番号：２９)は、ｐＥＴ２２ｂ(＋) (Novagen Inc.)の誘導体であって、２つの工程で構築した。第一の工程では、ＮｈｅＩとＸｈｏＩ部位の間の元の配列をアニールしたオリゴプライマーＭＣＳ-１Ｆ(5'-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3'；配列番号：３０)及びプライマーＭＣＳ-１Ｒ(5'-TCGAATGCGGCCG CCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'；配列番号：３１)(１５ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８バッファ中でアニール)に置き換えることによって、ｐＥＴ２２ｂ(＋)のマルチプルクローニングサイトを変えた。結果として生じるプラスミドをｐＭｏｄ００と称し、そのマルチクローニングサイトにＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有した。オリゴＢａｍｈｉｓ６-ＥＫ-Ｎｈｅ-Ｆ(5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGG TTCTGGTGACGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3'；配列番号：３２)とＢａｍｈｉｓ６-ＥＫＮｈｅ-Ｒ(5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGT GGTGGTGGTGGTGTG-3'；配列番号：３３)とのアニールした対と、オリゴ１Ｆ-Ｃ-グリシン-リンカー(5'-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'；配列番号：３４)とオリゴ１Ｒ-Ｃ-グリシン-リンカー(5'-GGCCGCGTTTAAACTTATTA ACCGCAACCACCACCACCACCC-3'；配列番号：３５)とのアニールした対を、ＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩ消化のｐＭｏｄ００プラスミドに共にライゲーションして、ｐＭｏｄＥＣ１を得た。このｐＭｏｄＥＣ１はＮ末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位及び１つのシステイン残基を含有するＣ末端グリシンリンカーをコードしている。
ｐＭｏｄＥＣ１への上述の断片のクローニングによりそれぞれ、プラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１α１１７−２７０及びｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１β１１９−２６９が生じた。これらのプラスミドは、Ｎ末端Ｈｉｓ-タグ、エンテロキナーゼ切断部位、成熟したマウスのＩＬ-１α又はＩＬ-１βのそれぞれ、及びＣ末端システイン含有リンカー(GGGGGCG、配列番号：２８)からなる融合タンパク質をコードする。発現のために、いずれかのプラスミドを有する大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１を３７℃で１．０の６００ｎｍＯＤまで生育し、次いで、１ｍＭの濃度のイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを加えて誘導した。細菌を３７℃でさらに４時間生育させ、遠心によって回収し、８０ｍｌの溶解バッファ(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０)に再懸濁した。次いで、細胞を超音波処理し、６４μｌの２Ｍ ＭｇＣｌ２及び１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅと共に室温で３０分間インキュベートして細胞のＤＮＡ及びＲＮＡを消化した。細胞のデブリを遠心によって除去し(ＳＳ３４ローター、２００００ｒｐｍ、４℃、６０分)、クリアになった可溶化液をＮｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen, Hilden, Germany)にアプライした。洗浄バッファ(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０)にてカラムを十分に洗浄した後、タンパク質を、溶出バッファ(５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０)にて溶出した。精製したタンパク質をＰＢＳ ｐＨ７．２にて透析し、液体窒素中で瞬時に凍結し、後の使用まで−８０℃で保存した。
実施例２
Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのマウスＩＬ-１β１１９−２６９のカップリング
実施例１の精製されたマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質(配列番号：６６)を１．３ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ ｐＨ７．２の溶液を、等モル量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートして、Ｃ末端システイン残基の還元を行った。
次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．２に２ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む６ｍｌの溶液を、１３１μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯに６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を、２４時間にわたって３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌｐＨ７．２にて３回交換して、４℃で透析した。誘導体化して透析した７５μｌのＱβ溶液を、１１７μｌのＨ２Ｏと３０８μｌの精製して予め還元したマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質と混合し、１５℃で終夜インキュベートして化学的な架橋を行った。３０００００Ｄａの分子量カットオフを有するセルロースエステル膜を用いて、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過によって非カップリングタンパク質を除去した。
カップリングした生成物を、還元条件下の１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色したゲルを図１に示す。Ｑβキャプシド単量体に関していくつかのバンドの増加した分子量が観察され、これによって、マウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質のＱβキャプシドへの架橋結合の成功が明らかに示された。
Ｂ．ＱβキャプシドにカップリングされたマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質(Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９)によるマウスの免疫化
５匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９(配列番号：６６)にて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０及び第２１日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第２１及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１β１１９−２６９特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第０、第２１及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１β１１９−２６９力価は、第２１日目に１:２２２６２、第３５日目に１:３０９２７６であった。これにより、マウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質にカップリングしたＱβによる免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１β１１９−２６９を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｄ．ＩＬ-１βのインビトロ中和
Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９(配列番号：６６)にて免疫化したマウスの血清を、それぞれのレセプターへのマウスＩＬ-１βタンパク質の結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β１１９−２６９又はＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α１１７−２７０のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１β１１９−２６９とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１β１１９−２６９の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。マウスＩＬ-１β１１９−２６９に対して免疫化したマウスのすべての血清が０．４％以上の濃度でマウスＩＬ-１β１１９−２６９のそのレセプターに対する結合を完全に阻害したのに対して、マウスＩＬ-１α１１７−２７０に対して免疫化したマウスの血清は高濃度に用いても阻害効果を示さなかった(３．３％)。これらのデータから、ＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によりマウスＩＬ-１β１１９−２６９とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１βのインビボ中和
次に、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて第０日目及び第１４日目に２度免疫化し、４匹のマウスをＱβキャプシド単独で同時に免疫化した。第２１日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１β１１９−２６９を注射した。注射したＩＬ-１β１１９−２６９の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の３時間後に分析して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加として求めた。Ｑβ-免疫化マウスは１．０１±０．６１ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度において平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウスはたった０．１１±０．３０ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した。第２８日目のコントロールとして、すべてのマウスに１μｇのｍＩＬ-１αを注射した。注射の３時間後、Ｑβキャリア単独にて免疫化したマウスは４０．２４±８．０６ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度において平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウスは５７．９８±２９．９２ｎｇ／ｍｌの増加を示した(ｐ＝０．３０)。これらのデータから、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１βの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示された。
Ｆ．関節リウマチのマウスモデルにおけるＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の有効性
Ｑβ-ｍ ＩＬ-１β１１９−２６９免疫化の有効性を、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデル(ＣＩＡ)において試験した。このモデルは、ヒト関節リウマチの免疫学的及び組織学的態様の多くを反映しているので、通常抗炎症剤の有効性のアッセイに用いられる。雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９(ｎ＝８)又はＱβ単独(ｎ＝８)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)、皮下に免疫化し、次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを第４２日目に皮内に接種した。第６３日目に不完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを追加投与した後、マウスの関節炎症状の発症について毎日試験した。
赤くなる程度及び観察される腫脹に基づいて、各々の肢に０から３までの範囲の臨床スコアを付け、すべての後肢の厚さを測定した。以下の定義：０ 正常、１ 指／肢の軽度の紅斑及び／又は腫脹、２ 指／肢の全体にわたる紅斑及び腫脹、３ 強度の腫脹、指／肢の変形、硬直に従って、連続する３週間にわたって各肢に臨床スコアを付けた。各マウスの累積的な臨床スコアを四肢すべての臨床スコアの合計として算出したところ、１２匹のマウスにつき、可能な限り最大の累積スコアとなった。
２回目のコラーゲン注射の２週間後、Ｑβ免疫化マウスは４．４４の平均累積臨床スコアを示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスはたった１．０６の平均スコアを示した。さらに、後ろ肢厚の平均増加は、Ｑβ免疫化マウスでは１８％であり、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウスでは１％であった。炎症反応の更なる読み取り値として、ＩＬ-６の血清レベルを２回目のコラーゲン注射の１週間後に決定した。Ｑβ免疫化マウスは１．９２±０．３６の平均ＩＬ-６血清濃度であったのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスはたった０．７９±０．１６の平均ＩＬ-６濃度であった(ｐ＝０．０１)。総して、これらのデータは、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化が、ＣＩＡモデルマウスの炎症と関節炎の臨床徴候を防ぐことを示す。
実施例３
Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのマウスＩＬ-１α１１７−２７０のカップリング
実施例１の精製されたマウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質(配列番号：６５)を１．８ｍｇ／ｍｌ含むＰＢＳ ｐＨ７．２の溶液を、等モル量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートして、Ｃ末端システイン残基の還元を行った。
次いで、ＰＢＳ ｐＨ７．２に２ｍｇ／ｍｌのＱβキャプシドタンパク質を含む６ｍｌの溶液を、１３１μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯに６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を、２４時間にわたって３ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌｐＨ７．２にて３回交換して、４℃で透析した。誘導体化して透析した７５μｌのＱβ溶液を、１９２μｌのＨ２Ｏと２３３μｌの精製して予め還元したマウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質と混合し、１５℃で終夜インキュベートして化学的な架橋を行った。３０００００Ｄａの分子量カットオフを有するセルロースエステル膜を用いて、ＰＢＳに対するタンジェンシャルフロー濾過によって非カップリングタンパク質を除去した。
カップリングした生成物を、還元条件下の１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。クーマシー染色したゲルを図２に示す。Ｑβキャプシド単量体に関していくつかのバンドの増加した分子量が観察され、これによって、マウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質のＱβキャプシドへの架橋結合の成功が明らかに示された。
Ｂ．ＱβキャプシドにカップリングされたマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質(Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９)によるマウスの免疫化
５匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０及び第２１日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第２１及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１α１１７−２７０特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第０、第２１及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１α１１７−２７０力価は、第２１日目に１:９２５２、第３５日目に１:７３６９１２であった。これにより、マウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質にカップリングしたＱβによる免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１α１１７−２７０を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうる。
Ｄ．ＩＬ-１αのインビトロ中和
Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１αタンパク質のそれぞれのレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α１１７−２７０又はＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１β１１９−２６９のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１α１１７−２７０とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１α１１７−２７０の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１α抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。マウスＩＬ-１α１１７−２７０に対して免疫化したマウスのすべての血清が０．４％以上の濃度でマウスＩＬ-１α１１７−２７０のそのレセプターに対する結合を完全に阻害したのに対して、マウスＩＬ-１β１１９−２６９に対して免疫化したマウスの血清は高濃度に用いても阻害効果を示さなかった(３．３％)。これらのデータから、ＱβキャプシドにカップリングしたマウスＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化によりマウスＩＬ-１α１１７−２７０とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１αのインビボ中和
次に、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて第０日目及び第１４日目に２回免疫化し、４匹のマウスをＱβキャプシド単独で同時に免疫化した。第２１日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１α１１７−２７０を注射した。注射したＩＬ-１α１１７−２７０の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の３時間後に分析して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加として求めた。Ｑβ-免疫化マウスは８．１６±２．３３ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度において平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスはたった０．１５±０．２７ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した(ｐ＝０．０００５)。第２８日目のコントロールとして、すべてのマウスに１μｇのｍＩＬ-１βを注射した。注射の３時間後、Ｑβキャリア単独にて免疫化したマウスは９．５２±７．３３ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度の平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスは２１．４６±２７．３６ｎｇ／ｍｌの増加を示した(ｐ＝０．４３)。これらのデータから、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１αの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示された。
Ｆ．関節リウマチのマウスモデルにおけるＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０の有効性
Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化の有効性を、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデル(ＣＩＡ)において試験した。このモデルは、ヒト関節リウマチの免疫学的及び組織学的態様の多くを反映しているので、通常抗炎症剤の有効性のアッセイに用いられる。雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０(ｎ＝８)又はＱβ単独(ｎ＝８)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)、皮下に免疫化し、次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを第４２日目に皮内に接種した。第６３日目に不完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを追加投与した後、マウスの関節炎症状の発症について毎日試験した。赤くなる程度及び観察される腫脹に基づいて、各々の肢に実施例２Ｆに定義したように臨床スコアを付け、すべての後肢の厚さを測定した。２回目のコラーゲン注射の２週間後、Ｑβ免疫化マウスは４．４４の平均累積臨床スコアを示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化マウスはたった２．３１の平均スコアを示した。さらに、後ろ肢厚の平均増加は、Ｑβ免疫化マウスでは１８％であり、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスではたった７％であった。炎症反応の更なる読み取り値として、ＩＬ-６の血清レベルを２回目のコラーゲン注射の１週間後に決定した。Ｑβ免疫化マウスは１．９２±０．３６の平均ＩＬ-６血清濃度であったのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化マウスはたった０．９４±０．４８の平均ＩＬ-６濃度であった。総して、これらのデータは、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化が、ＣＩＡモデルマウスの炎症と関節炎の臨床徴候を防ぐことを示す。
実施例４
アテローム性動脈硬化のマウスモデルにおけるＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０の有効性
第０、１４、２８、５６、１０５及び１３３日目に、７〜８週齢の雄Ａｐｏｅ−／−マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME)の皮下に５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０ワクチン(ｎ＝１３)又は５０μｇのＱβ(ｎ＝１２)のいずれかを注射した(５匹のうちＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０群の３匹に、Ｑβ群の２匹に、第３３日目に２回目の追加免疫を与えた)。始めに通常の固形食餌をマウスに与え、第２１日目に西洋型食餌(２０％脂質、０．１５％コレステロール、Provimi Kliba AG, Switzerland)に換えた。実験を通じて一定の間隔でマウスから採血し、血清中のＩＬ-１αに対する抗体応答を測定した。第１５９日目に屠殺し、基本的には既に記載のあるように(Tangirala R.K.等 (1995) J. Lipid. Res. 36: 2320-2328)、大動脈を単離して、調製した。さらに、心臓を取り出し、基本的にはPaigen B.等 (Atherosclerosis 1987;68:231-240)及びZhou X.等 (Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:108-114)に記載のあるように、後の組織学的な調製のために液体窒素にて急激に凍結した。動物から心臓穿刺にて採血し、氷温ＰＢＳを注いだ。次いで、大動脈を曝し、できるだけインサイツに外膜を取り出し、最後に心臓から２ｍｍの大動脈を切り出した。心臓を中央で切開し、上部をプラスチックチューブのハンク平衡塩類溶液中で液体窒素にてすぐに凍結した。連続切片(７μｍ厚)を、大動脈の元からクリオスタットにて切断し、少なくとも２つの弁尖端の出現から最後の弁尖端の消失まで収集した。切片をホルマリンで固定し、オイルレッドＯにて染色し、量的画像分析によって１マウスにつき４〜７切片(Ｑβ群の１匹では３切片)にてプラーク負荷を評価した。平均的プラーク領域は、評価に用いた各切片のプラーク領域から、各々の動物について計算した。平均的群プラーク領域は、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０群及びＱβ群のそれぞれについて計算した。スチューデントｔ検定にて統計学的な分析を行った。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとする。
大動脈全体のアテローム性動脈硬化の評価のために、氷温ＰＢＳで満たしたガラスシャーレに残留する外膜から取り除き、左の鎖骨下動脈から５ｍｍ下方のアーチを切り出した。大動脈を縦に切開し、黒色のワックス表面上に外に向けてピンで留め、４％ホルマリンに終夜をかけて固定した。次いで、オイルレッドＯにて終夜をかけて染色した。画像ソフトウェア(Motic Image Plus 2.0)にてプラークをデジタル写真上で定量化した。プラーク負荷は、腸骨の分岐点に至る大動脈のすべてのプラークの表面の合計を、腸骨の分岐点に至る測定した大動脈の総表面で除してパーセンテージで表す。Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０群とＱβ群とのプラーク負荷の平均又は中央値の違いを分析した。
ＥＬＩＳＡプレート上にコートした組み換えＩＬ-１αを用いた典型的なＥＬＩＳＡにて抗体応答を測定した。ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを用いて特異的抗体の結合を検出した。ＩＬ-１αに対する力価は、アッセイの最大半量の結合を示す血清希釈物の逆数として算出した。応答の特異性は免疫前血清を測定することによって評価した。免疫前力価は、アッセイに用いた最も低い血清希釈物より低く、この最も低い血清希釈値を割り当てた。Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化動物における抗体応答の測定の結果を表１に示す。これは、免疫前(０日目)血清ではほとんど力価が検出されなかったので、ＱβにカップリングさせたマウスＩＬ-１αに対する免疫化により、ＩＬ-１αに対して強力で持続性の特異的な抗体応答が生じたことを示す。さらに、ＩＬ-１αに特異的な抗体応答の誘導により、Ｑβ群と比較して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０群では大動脈元でのプラーク領域が３７％減少した(４６４６９４±３６５４５μｍ２に対して２９２８０３±２１２７２μｍ２、ｐ＝０．０００５)。加えて、「エヌフェイス」に調製した大動脈全体では中央プラーク負荷の３１％の減少(８．３に対して５．７、ｐ＝０．０６)が観察された。
これらのデータから、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０ワクチンによる抗ＩＬ１α抗体の誘導によりアテローム性動脈硬化の発達が阻害されたので、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０ワクチンはアテローム性動脈硬化の有効な治療であることが示された。さらに、これらのデータは、ＩＬ-１αがアテローム性動脈硬化の病因に関与することを示す。
表１：Ｑβ-ＩＬ１αにより免疫化したＡｐｏｅ−／−マウスにおける相乗平均抗ＩＬ１α抗体力価(相乗平均力価±平均値の標準誤差)
* ５匹の動物について、３３日目の値。
実施例５
Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及び／又はＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によるＴＮＢＳ-誘発性炎症性腸疾患の防止
５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０又は５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９、又はそれぞれ５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０とＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の混合物を８週齢の雄ＳＪＬマウス(１群当たり５匹)の皮下に２週間の間隔で３回投与する。コントロールとして、５匹のマウスにＱβ ＶＬＰ単独を同じ投薬計画で投与する。最後の免疫化の２週後に、すべてのマウスをイソフルランにて僅かに麻酔をかけ、１ｍｇのトリニトロベンゼンスルホン酸塩(ＴＮＢＳ)を含む１００μｌの５０％エタノールを肛門から４ｃｍ離れた直腸にポリエチレンカテーテルにより投与する。疾患進行の読み取り値として体重を毎日記録し、ＴＮＢＳ投与の７日後にすべてのマウスを屠殺する。各マウスの大腸を摘出し、肛門に対して２ｃｍの近位に位置する大腸の試料をＰＢＳ緩衝ホルマリンにて固定し、炎症の程度をNeurath M.F.等 (JEM (1995), 182:1281-1290)に従ってヘマトキシリン-及びエオシン-染色結腸横断切片上で半定量的に等級分けする。
Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０単独又はＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９単独のいずれか、又はＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及びＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の組合せのいずれかによる免疫化により、Ｑβ-免疫化マウスと比較すると、ＴＮＢＳ誘発性の体重損失が減少する。さらに、結腸横断切片の組織学的試験から、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及び／又はＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９-免疫化マウスは、Ｑβ-免疫化マウスと比較して結腸組織への炎症細胞の浸潤が顕著に減少していたことが明らかとなった。
実施例６
ＭＥＦＶ遺伝子の切断型を有するマウスにおける、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によるエンドトキシン-過敏症の改善
家族性地中海熱は、回帰熱並びに腹膜炎、漿膜炎、関節炎、及び皮膚発疹に特徴を示す劣性遺伝性炎症性疾患である。罹患個体はＭＥＦＶ遺伝子のミスセンス突然変異を有し、切断型のｐｙｒｉｎタンパク質を発現する。ＭＥＦＶ遺伝子に同種の突然変異を有するマウスはカスパーゼ-１活性の増加を示し、成熟したＩＬ-１βの過剰発現及び低体温の増大及びＬＰＳ投与の後に致死となる。８週齢のホモ接合体ｐｙｒｉｎ切断マウス(１群当たり５匹)を、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９単独又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ単独にて２週間の間隔で３回免疫化する。最後の免疫化の２週後に、すべてのマウスの腹膜内に２０ｍｇのＤ-ガラクトサミンと０．０１μｇ／ｇのＬＰＳの混合を投与する。Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９-免疫化マウスは、Ｑβ-免疫化コントロールと比較して、低体温の減少とＬＰＳ投与に対する致死率の減少を顕著に示す。
実施例７
関節リウマチのマウスモデルにおけるＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)処置に対するＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０とＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の免疫化の比較
Ｋｉｎｅｒｅｔ(登録商標)(Anakinra, Amgen)は、ヒトの関節リウマチの治療の承認を得ているヒトＩＬ-１レセプターアンタゴニストの組み換え型である。臨床的な有用性を満たすために、比較的高い用量(１００ｍｇ)を皮下投与により毎日投与する。コラーゲン誘発性関節炎モデルを用いて、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及びＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の免疫化の有効性を異なる用量のＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の毎日適用と比較した。雄のＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０(ｎ＝８)、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９(ｎ＝８)又はＱβ単独(ｎ＝３２)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)皮下投与して免疫化し、次いで第４２日目に完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを皮内に注射した。第４２日目から、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及びＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウス、及び１群のＱβ-免疫化マウス(ｎ＝８)に２００μｌのＰＢＳを毎日腹腔内投与したのに対して、更なる３つのＱβ-免疫化群に３７．５μｇ(ｎ＝８)、３７５μｇ(ｎ＝８)又は３．７５ｍｇ(ｎ＝８)のいずれかのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)を毎日腹腔内投与した。１マウスにつき３７．５μｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の連日投与はおよそ１．５ｍｇ／ｋｇの用量に相当し、これはヒトに推奨される効果的な量の範囲内である(１００ｍｇ)。すべてのマウスに、不完全フロイントアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを６３日目に皮内投与して追加免役し、関節炎症状の発達について毎日調べた。
２回目のコラーゲン投与の４週間後、Ｑβ-免疫化コントロールマウスは３．７５の平均的累積臨床スコア(実施例２Ｆに定義する)を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０及びＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９-免疫化マウスはそれぞれたった０．８１及び１．４４の平均スコアを示した(表２を参照)。３７．５μｇ又は３７５μｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスはそれぞれ２．４４及び２．６３の平均スコアに達したのに対して、３．７５ｍｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスは大部分が無症候性のままであり、たった０．１９の最大スコアに達した。
更なる炎症反応の読み取り値として、すべての動物の後肢厚を定期的に測定した。２回目のコラーゲン投与の４週間後、Ｑβ-免疫化コントロールマウスは１６％の後肢厚の平均増加を示したのに対して、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０-免疫化マウスは２％の増加、Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９-免疫化マウスは６％の増加を示した。３７．５μｇ又は３７５μｇのいずれかのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスはそれぞれ１３％及び１０％の平均増加を示したのに対して、３．７５ｍｇのＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)にて処置したマウスは後肢厚の増加を全く示さなかった。
結論として、発明者等は、驚くべきことに、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０又はＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９の３つの投与は、ヒトの用量又はヒトの用量の１０倍に相当する量のＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)の連日投与よりもマウスの関節炎症状の発達を防いだことを明らかとした。ヒト用量の１００倍のＫｉｎｅｒｅｔ(登録商標)量の投与のみ、Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０又はＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９のワクチンに関して有益性が増加した。
表２：コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける臨床疾患症状
実施例８
Ａ．マウスＩＬ-１α１１７−２７０に遺伝的に融合したＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０)からなるウイルス様粒子のクローニング、発現及び精製
インターロイキン-１αのサイズが大きく、立体の問題から、インターロイキン-１αに融合したＡＰ２０５コートタンパク質並びにｗｔコートタンパク質サブユニットを含む、いわゆるモザイク粒子を産生する発現系を構築した。このシステムでは、停止コドンの抑制によりＡＰ２０５-インターロイキン-１αコートタンパク質融合体が生じるのに対して、適当な終止によりｗｔ ＡＰ２０５コートタンパク質が生じる。両タンパク質は細胞内で同時に生産され、モザイクウイルス様粒子内に集合する。サプレッサーコドンＴＡＧ(アンバー、ｐＡＰ５９０)又はＴＧＡ(オパール、ｐＡＰ５９２)により終止するＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子をコードする２つの中間プラスミドｐＡＰ５９０及びｐＡＰ５９２を作製した。トリペプチドＧｌｙ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙ(配列番号：１８９)をコードするリンカー配列をコートタンパク質遺伝子の下流とインフレームに付加した。Ｋｐｎ２I及びＨｉｎｄIII部位を、ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端であるＧｌｙ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙアミノ酸リンカーのＣ末端に外来性のアミノ酸配列をコードする配列をクローニングするために付加した。結果として生じるコンストラクトは以下の通りであった。ＡＰ５９０(配列番号：１１７)：ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子−アンバーコドン−ＧＳＧ(Ｋｐｎ２I − ＨｉｎｄIII)；及び、ＡＰ５９２(配列番号：１１８)：ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子−オパールコドン−ＧＳＧ(Ｋｐｎ２I−ＨｉｎｄIII)プラスミドｐＡＰ５９０の構築のために、オリゴヌクレオチドｐ１．４４(5'-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3'；配列番号：１１９)及びｐＩＮＣ-３６(5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGA TCCCTAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3'；配列番号：１２０)にて得たＰＣＲ断片をＮｃｏIとＨｉｎｄIIIにて消化して、同じ制限酵素にて消化したベクターｐＱｂ１８５にクローニングした。ｐＱｂ１８５はｐＧＥＭベクター由来のベクターである。このベクター内でのクローニングした遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターにて制御する(Kozlovska, T. M.等, Gene 137:133-37 (1993))。同様に、プラスミドｐＡＰ５９２は、オリゴヌクレオチドｐ１．４４及びｐＩＮＣ-４０(5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCAGTAGTA TCAGACGATACG-3'；配列番号：１２１)にて得たＮｃｏI／ＨｉｎｄIII消化ＰＣＲ断片をクローニングすることによって構築した。
マウスＩＬ-１αのアミノ酸１１７−２７０をコードする配列は、５'及び３'末端のそれぞれにＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIII制限酵素部位を付加した、プライマーｐＩＮＣ-３４(5'-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3'；配列番号：１２２)及びｐＩＮＣ-３５(5'-GTAAGCTTATGCATTATGATATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3'；配列番号：１２３)を用いて、プラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１α１１７−２７０(実施例１を参照)からＰＣＲによって増加した。得たＤＮＡ断片をＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIIIにて消化し、プラスミドｐＡＰ５９４(アンバー終止)を作製するベクターｐＡＰ５９０と、プラスミドｐＡＰ５９６(オパール終止)を作製するベクターｐＡＰ５９２のそれぞれにクローニングした。
表面上にマウスＩＬ-１αをディスプレイするモザイクＡＰ２０５ ＶＬＰを発現させるために、プラスミドｐＩＳＭ５７９又はｐＩＳＭ３００１を含む大腸菌ＪＭ１０９細胞をそれぞれプラスミドｐＡＰ５９４又はｐＡＰ５９６にて形質転換させた。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲIにてｐＩＳＭ３００１からｔｒｐＴ１７６遺伝子を切り出し、アンバーｔＲＮＡサプレッサー遺伝子を含むプラスミドｐＭＹ５７９(Michael Yarusから贈与)のＥｃｏＲI断片に置換することによってプラスミドｐＩＳＭ５７９を生成した。このｔＲＮＡサプレッサー遺伝子はｔｒｐＴ１７５の変異体であり(Raftery LA.等 (1984) J. Bacteriol. 158:849-859)、３つの位置：Ｇ３３、Ａ２４及びＴ３５がｔｒｐＴと異なる。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
細胞(１ｇ、プラスミドｐＡＰ５９４にて形質転換、ｐＩＳＭ５７９を含有)を、溶解バッファ(２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８、０．１％トゥイーン２０)にて超音波処理して溶解した。溶解物は遠心によってクリアにし、細胞片を溶解バッファにて洗浄した。プールした上清を、ＴＥＮバッファ(２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８)にて溶出したセファロースＣＬ-４Ｂカラムに流した。洗浄した溶解物及び洗浄上清中のキャプシドの有無は、アガロースゲル電気泳動(１％ＴＡＥ、エチジウムブロマイド染色ゲル及びＵＶ検出)によって確認した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ又は３１０ｎｍの光散乱のＵＶ分光測定分析にて測定すると、カラムから２つのピークが溶出された。キャプシドを含む２つ目のピークの分画をプールし、セファロースＣＬ-６Ｂカラムに流した。ＣＬ-６Ｂカラムのピーク分画をプールし、遠心濾過ユニット(Amiconウルトラ１５ ＭＷＣＯ３００００、Millipore)を用いて濃縮した。タンパク質は更なる１つによってさらに精製された。そして、上としての単位はＣＬ-４Ｂカラム及び生じているピークの分画上のゲル濾過の中でプールされて、遠心濾過機に濃縮された。バッファを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に交換し、グリセロールを５０％の終濃度まで加えた。
プラスミドｐＡＰ５９６からのＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０の精製は基本的に上記のｐＡＰ５９４についての記載のように行ない、最後のＣＬ-４Ｂカラムの後に更なるショ糖勾配精製工程を行った。タンパク質は以下のショ糖液によって調製した勾配の上に重ねた。９ｍｌ ３６％、３ｍｌ ３０％、６ｍｌ ２５％、８ｍｌ ２０％、６ｍｌ １５％、６ｍｌ １０％及び３ｍｌ ５％のショ糖。ＵＶ分光法によって分画を同定し、キャプシドを含むプールした分画を上記のように遠心濾過ユニットにて濃縮し、バッファを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５に交換した。最後にグリセロールを５０％の終濃度まで加えた。
Ｂ. ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０によるマウスの免疫化
４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化した。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、第１４及び第２８日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第１４、第２８及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１α１１７−２７０特異的ＥＬＩＳＡを用いて解析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質にてコートした。プレートの反応を止めて、第１４、第２８及び第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出した。平均的な抗マウスＩＬ-１α１１７−２７０力価は、第１４日目に１:４４１２、第２８日目に１：２７９５５、第３５日目に１:３４８２４であった。これにより、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１α１１７−２７０を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｄ．ＩＬ-１αのインビトロ中和
ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１αタンパク質のそれぞれのレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０又はＡＰ２０５単独のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１α１１７−２７０とともにインキュベートした。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１α１１７−２７０の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１α抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化マウスのすべての血清が３．３％以上の濃度でマウスＩＬ-１α１１７−２７０のそのレセプターへの結合を完全に阻害したのに対して、ＡＰ２０５にて免疫化したマウスの血清は用いたいずれの濃度においても有意な阻害効果を示さなかった。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化によりマウスＩＬ-１α１１７−２７０とそのレセプターとの相互作用を特異的に中和することができる抗体を得ることができることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１αのインビボ中和
次に、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べた。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて第０、１４及び２８日目に３度免疫化し、４匹のマウスをＡＰ２０５単独で同時に免疫化した。第４２日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１α１１７−２７０を注射した。注射したＩＬ-１α１１７−２７０の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。ＡＰ２０５-免疫化マウスは１２．９２±３．９５ｎｇ／ｍｌの血清ＩＬ-６濃度の平均増加を示したのに対して、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスはたった０．０６±０．０５ｎｇ／ｍｌの平均増加を示した(ｐ＜０．０１)。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１αの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であったことが示される。
Ｆ．関節リウマチのマウスモデルにおけるＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０の有効性
ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化の有効性を、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデル(ＣＩＡ)において試験した。雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０(ｎ＝８)又はＡＰ２０５単独(ｎ＝８)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)、皮下に免疫化し、次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを第４２日目に皮内に接種した。第６３日目に不完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを追加投与した後、マウスの関節炎症状の発症について毎日試験した。赤くなる程度及び観察される腫脹に基づいて、各々の肢に０から３までの範囲の臨床スコアを付け、すべての後肢の厚さを測定した。２回目のコラーゲン注射の４週間後、Ｑβ免疫化マウスは５．８１の平均累積臨床スコアを示したのに対して、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０免疫化マウスはたった２．０６の平均スコアを示した。さらに、後肢厚の平均増加は、ＡＰ２０５免疫化マウスでは１９％であり、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０にて免疫化したマウスではたった９％であった。総して、これらのデータは、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０による免疫化が、ＣＩＡモデルマウスの炎症と関節炎の臨床徴候を強く防ぐことを示す。
実施例９
Ａ．マウスＩＬ-１β１１９−２６９に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９)からなるウイルス様粒子のクローニング及び発現
基本的には実施例８のＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１α１１７−２７０について記載したように、マウスＩＬ-１β１１９−２６９に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質からなるウイルス様粒子のクローニング、発現及び精製を行った。プライマーｐＩＮＣ-７５(5'-GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3'、配列番号：１９２)及びｐＩＮＣ-７７(5'-GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3'、配列番号：１９３)を用いて、マウスインターロイキン１βをコードするプラスミドｐＭｏｄＥＣ１-Ｈｉｓ-ＥＫ-ｍＩＬ１(１１９−２６９からマウスインターロイキン１βの配列を増幅した。これらのプライマーは、５'のＫｐｎ２Iと３'のＨｉｎｄ IIIの部位を有し、マウスインターロイキン１βのN末端にアミノ酸配列Ｇｌｙ-Ｇｌｙをさらにコードするマウスインターロイキン-１β遺伝子を増幅する。得られたｍｕｒ-ＩＬ-１β断片をＫｐｎ２I及びＨｉｎｄIIIにて消化し、プラスミドｐＡＰ６３０を作製するベクターｐＡＰ５９０(アンバー終止)内の同じ制限酵素部位にクローニングした。アンバー終止を示すプラスミドｐＩＳＭ５７９を含む大腸菌ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ６３０にて形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
Ｂ．ヒトＩＬ-１β１１６−２６９に遺伝的に融合させたＡＰ２０５コートタンパク質(ＡＰ２０５＿ｈＩＬ-１β１１６−２６９)からなるウイルス様粒子のクローニング及び発現
それぞれ５'にＫｐｎ２I部位と３'にＭｐｈ１１０３I部位を導入するプライマーｐＩＮＣ-７４(5'- GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTA CGA TCA CTG AAC TG -3'、配列番号：１９４)及びｐＩＮＣ-７６(5'-GTATGCATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTC-3、配列番号：１９５)を用いて、ヒトインターロイキン１βをコードするプラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９からヒトインターロイキン１βの配列を増幅した。得られたヒト-ＩＬ-１β断片をＫｐｎ２I及びＭｐｈ１１０３Iにて消化し、プラスミドｐＡＰ６４９を作製するベクターｐＡＰ５９０(アンバー終止)内の同じ制限酵素部位にクローニングした。プラスミドｐＩＳＭ５７９(アンバー終止を示す)を含む大腸菌ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ６４９にて形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に、単一のコロニーを播いて、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された種菌は、２０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＭ９培地にて５０倍に希釈し、振とう器上で３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心して回収した。
Ｃ．ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９によるマウスの免疫化
４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化する。２５μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、第１４及び第２８日目に皮下に接種する(１００μｌを２か所の腹部に)。第０、第１４、第２８及び第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、血清をマウスＩＬ-１β１１９−２６９特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析する。
Ｄ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度のマウスＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質にてコートする。プレートの反応を止めて、第０、１４、２８及び３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートする。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出する。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出する。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化により高度に特異的な抗マウスＩＬ-１β１１９−２６９力価が生じる。これにより、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化により免疫寛容が克服され、ＩＬ-１β１１９−２６９を特異的に認識する高力価の抗体が産生されうることが示唆される。
Ｅ．ＩＬ-１βのインビトロ中和
次いで、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１βタンパク質のレセプターへの結合を阻害する能力について試験する。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９又はＡＰ２０５単独のいずれかにて免疫化したマウス血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ-１β１１９−２６９とともにインキュベートする。固定したｍＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するＩＬ-１β１１９−２６９の結合をビオチン化抗マウスＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出する。ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスのすべての血清がマウスＩＬ-１β１１９−２６９のレセプターへの結合を強く阻害するのに対して、ＡＰ２０５単独にて免疫化したマウスの血清は全く阻害効果を示さない。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によりマウスＩＬ-１β１１９−２６９とそのレセプターとの相互作用を中和することができる抗体を生じさせることができることが示唆される。
Ｆ．ＩＬ-１βのインビボ中和
次に、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べる。したがって、４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて第０、１４及び２８日目に３度免疫化し、４匹のマウスをＡＰ２０５単独で同時に免疫化する。第３５日目に、すべてのマウスの静脈内に１μｇのフリーＩＬ-１β１１９−２６９を注射する。注射したＩＬ-１β１１９−２６９の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析する。ＡＰ２０５-免疫化マウスは血清ＩＬ-６濃度の強い増加を示すのに対して、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９にて免疫化したマウスは非常にわずかな増加のみを示す。これらのデータから、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によって生産される抗体がＩＬ-１βの炎症誘発性活性を特異的かつ効果的に中和することが可能であることが示される。
Ｇ．関節リウマチのマウスモデルにおけるＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９の有効性
ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化の有効性を、マウスコラーゲン誘発性関節炎モデル(ＣＩＡ)において試験した。雄ＤＢＡ／１マウスに、５０μｇのＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９(ｎ＝８)又はＡＰ２０５単独(ｎ＝８)のいずれかを３回(第０、１４及び２８日目)、皮下に免疫化し、次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを第４２日目に皮内に接種した。第６３日目に不完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシタイプIIコラーゲンを追加投与した後、マウスの関節炎症状の発症について毎日試験した。赤くなる程度及び観察される腫脹に基づいて、各々の肢に０から３までの範囲の臨床スコアを付け、すべての後肢の厚さを測定した。２回目のコラーゲン注射の４週間後、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスはＡＰ２０５免疫化マウスと比較して非常に減少した平均臨床スコアを示す。さらに、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスは後肢厚のわずかな増加を示すのに対して、ＡＰ２０５免疫化マウスは後肢厚の強い増加を示す。総して、これらのデータは、ＡＰ２０５＿ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化が、ＣＩＡモデルマウスの炎症と関節炎の臨床徴候を強く防ぐことを示す。
実施例１０
ヒトＩＬ-１β１１６−２６９のクローニング、発現及び精製
オリゴヌクレオチドＨＩＬ-１(5'- ATATATGATATCCCTGTACGATCACTGAACTGCACG-3'、配列番号：１２４)及びＨＩＬ-２(5'-ATATATCTCGAGGGAAGACA CAAATTGCATGGTGAAG-3'、配列番号：１２５)を用いて、ヒト肝臓組織のｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにてヒトＩＬ-１βのアミノ酸１１６−２６９(ｈＩＬ-１β１１６−２６９)をコードするヌクレオチド配列を増幅し、ＸｈｏI及びＥｃｏＲVにて消化し、発現ベクターｐＥＴ４２Ｔ(＋)にクローニングした。
ｐＥＴ-４２ａ(＋) (Novagen)のＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間の全領域を新たなリンカー配列に２工程で置き換えて、プラスミドｐＥＴ-４２Ｔ(＋)を構築し、Ｈｉｓ-タグ及びシステイン含有リンカーを含むＣ末端タグ(配列番号：１９０)を有する融合体として対象のタンパク質の発現を促した。第一工程では、プラスミドｐＥＴ-４２ａ(＋)を制限酵素ＮｄｅI及びＡｖｒIIにて消化し、ＧＳＴ-タグ、Ｓ-タグの２つのＨｉｓ-タグとマルチクローニングサイトからなるＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターとの間の９５８ｂｐの断片を遊離させた。ｐＥＴ-４２ａ(＋)のベクターバックボーンを含む残りの４９７２ｂｐの断片を単離し、アニールさせた相補的なオリゴヌクレオチド４２-１(5´-TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAA TTGATTAC-3´；配列番号：１２６)及び４２-２(5´-CTAGGTAATC AATTACTCGA GCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3´；配列番号：１２７)にライゲーションしプラスミドｐＥＴ-４２Ｓ(＋)を生じさせた。第二の工程では、プラスミドｐＥＴ-４２Ｓ(＋)を制限酵素ＸｈｏI及びＡｖｒIIにて消化して線状化し、相補的なアニールさせたオリゴヌクレオチド４２Ｔ-１(5´-TCGAGCACCACCACCACCACCACGGTGGTT GCTAATAATAATTGATTAATAC-3´；配列番号：１２８)及び４２Ｔ-２(5´-CTAGGTATTAATCAATTATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3´；配列番号：１２９)にライゲーションし、プラスミドｐＥＴ-４２Ｔ(＋)を生じさせた。
上記の断片ｈＩＬ-１β１１６−２６９をｐＥＴ-４２Ｔ(＋)にクローニングしてプラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９を生じさせた。このプラスミドは、成熟ヒトＩＬ-１β及びＨｉｓ-タグ及びＣ末端システイン含有リンカー(GGC、配列番号：１７８)に相当する融合タンパク質をコードする。ゆえに、融合タンパク質は、配列番号：１６５にＣ末端で融合させた配列番号：１９０からなる。ヒトＩＬ-１βの位置１１７の元のアラニン残基をこの融合タンパク質ではイソロイシンに変更した。基本的には実施例１のマウスｍＩＬ１β１１９−２６９タンパク質についての記載のように、ヒトＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質の発現及び精製を行った。
Ｂ．ＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のクローニング、発現及び精製
プラスミドｐＥＴ４２Ｔ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９の部位特異的突然変異誘発によって、１０の異なる変異体ヒトＩＬ-１β１１６−２６９融合タンパク質のための発現ベクターを構築した。この目的のために、Quik-Change(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を製造者の指示に従って用いた。変異体ＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質の発現ベクターをその構築に用いたオリゴヌクレオチド対とともに表３に挙げる。実施例１に記載のように異なるヒトＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質の発現及び精製を行った。
表３：ＩＬ-１変異タンパク質、発現ベクター及びこれらの構築に用いたオリゴヌクレオチドについての概説
実施例１１
ヒトＩＬ-１β１１６−２６９とヒトＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質の生物学的な活性
１群につき３匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスに１０μｇの野生型ヒトＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質又は実施例１０のヒトＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質変異体の１つのいずれかを静脈内投与する。血清試料を注射の前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。野生型ヒトＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質を投与したマウスは血清ＩＬ-６濃度の強い増加を示すのに対して、ヒトＩＬ-１β１１９−２６９変異タンパク質のいずれかを投与したマウスはごくわずかな増加を示すか、全く増加を示さない。
実施例１２
Ａ．Ｑβウイルス様粒子へのヒトＩＬ-１β１１６−２６９及びヒトＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のカップリング
Ｑβウイルス様粒子への野生型ヒトＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質及び実施例１０のヒトＩＬ-１β１１９−２６９変異タンパク質の化学的な架橋は基本的に実施例２Ａに記載のように行った。
Ｂ．ＱβキャプシドにカップリングさせたヒトＩＬ-１β１１６−２６９及びヒトＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質によるマウスの免疫化
１群につき４匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質又はｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβにて免疫化した。５０μｇの総タンパク質をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０、１４及び２８日目に皮下に接種した(１００μｌを２か所の腹部に)。第３５日目にマウスの後眼窩から血液を採取し、抗原として用いたそれぞれのヒトＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質又は野生型ヒトＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質のいずれかに特異的なＥＬＩＳＡを用いて血清を分析した。
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質又はそれぞれのｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のいずれかにてコートした。プレートの反応を止めて、第３５日目のマウス血清の段階希釈液とともにインキュベートした。結合した抗体を酵素的に標識した抗マウスＩｇＧ抗体にて検出した。マウス血清の抗体力価を、４５０ｎｍで最大半量の吸光度が得られる希釈液の平均として算出し、表４に示す。
表４：Ｑβ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９又はQβ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質ワクチンによる免疫化によって生じる抗-ｈＩＬ-１β１１６−２６９(野生型及び変異タンパク質)-特異的ＩｇＧ力価
Ｑβ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９-免疫化によりｈＩＬ-１β１１６−２６９に対して高力価のＩｇＧ抗体が誘導された。さらに、いずれかのＱβ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質ワクチンによるワクチン接種により、抗原として用いたそれぞれのｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質及び野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質の両方に対して高いＩｇＧ力価が誘導された。
Ｄ．ヒトＩＬ-１βのインビトロ中和
野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質又はｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβにて免疫化したマウスの血清を、マウスＩＬ-１βタンパク質のレセプターへの結合を阻害する能力について試験した。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組み換えヒトＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質にてコートし、上記の血清の段階希釈と１００ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質とともにインキュベートした。固定したヒトＩＬ-１レセプターＩ-ｈＦｃ融合タンパク質に対するｈＩＬ-１β１１６−２６９の結合をビオチン化抗ヒトＩＬ-１β抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した。Ｑβ-ｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質ワクチンに対して生じたすべての血清が、３．３％以上の血清濃度で１００ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９のｈＩＬ-１ＲIへの結合を完全に阻害した。
Ｅ．ＩＬ-１βのインビボ中和
野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質又はｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のうちの１つのいずれかにカップリングさせたＱβによる免疫化により生じた抗体のインビボ中和能を調べる。したがって、１群につき３匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、５０μｇのいずれかのワクチンにて第０、１４及び２８日目に３度免疫化する。第３５日目に、すべての免疫化したマウスの静脈内に１μｇのフリー野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９を注射する。コントロールとして３匹のナイーブマウスに同量の野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９を同時に投与する。注射したｈＩＬ-１β１１６−２６９の炎症性活性の読み取り値として、血清試料を注射の直前と３時間後に回収して、炎症誘発性サイトカインＩＬ-６の濃度における相対的な増加について分析した。ナイーブマウスはｈＩＬ-１β１１６−２６９の投与の３時間後に血清ＩＬ-６濃度の強い増加を示すのに対して、野生型ｈＩＬ-１β１１６−２６９タンパク質又はｈＩＬ-１β１１６−２６９変異タンパク質のうちの１つにカップリングさせたＱβにて免疫化したすべてのマウスは血清ＩＬ-６の増加を全く示さない。このことから、投与したｈＩＬ-１β１１６−２６９はワクチンに誘導される抗体によって効果的に中和されることが示唆される。
実施例１３
Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化によるＭＳＵ-誘発性炎症の寛解
痛風は関節及び関節周囲組織での一ナトリウム尿酸塩(ＭＳＵ)結晶の沈殿によって生じる痛みを伴う炎症性疾患である。ＭＳＵ結晶はいわゆるＮＡＬＰ３インフラマソーム(inflammasome)を活性化してその結果、活性なＩＬ-１βを産生することが示されており、このＩＬ-１βが疾患に特徴的な炎症性応答を開始し、促す役割を主に担う。Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群につき５匹)を、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ単独を２週間の間隔で３回皮下投与して免疫化する。最後の免疫化の１週間後、１．５ｍｇのＭＳＵ結晶にてすべてのマウスを腹腔内投与により抗原刺激する。抗原刺激の６時間後にマウスを屠殺し、腹膜浸出液中の好中球数並びに好中球化学誘引物質であるＫＣ及びＭＩＰ-２の濃度を測定する。Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスは、Ｑβ免疫化コントロールと比較して、好中球及びＭＩＰ-２及びＫＣ濃度の顕著な現象を示す。
実施例１４
Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９による免疫化による実験的自己免疫性脳炎の寛解
多発性硬化症のマウスモデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１群につき８匹)を、５０μｇのＱβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９又は５０μｇのＱβ ＶＬＰ単独を２週間の間隔で３回皮下投与して免疫化する。最後の免疫化の１週間後に、完全フロイトアジュバントと混合した１００μｇのＭＯＧペプチド(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK、配列番号：１９１)をすべてのマウスの皮下に投与する。同日及び２日後に、４００ｎｇの百日咳毒素をすべてのマウスの腹腔内に投与する。以下のスキーム：０、臨床的に疾患なし；０．５、尾部端の跛行；１、尾部の完全な跛行；１．５、尾部跛行及び後肢虚弱(後肢の不安定な歩調及び弱い握力)；２、片側の部分的な後肢麻痺；２．５、左右相称の部分的な後肢麻痺；３、完全な左右相称の後肢麻痺；３．５、完全な左右相称の後肢麻痺及び片側前肢の麻痺；４、前後の四肢の総麻痺に従って、マウスの神経学的な症状の発達を毎日スコア付けする。Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９免疫化マウスは、Ｑβ免疫化マウスと比較して明らかな臨床症状の減少を示す。
Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質のカップリング。還元条件下で１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにてタンパク質を分析した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は左端にｋＤａで示し、タンパク質バンドの同定を右端に示す。レーン１：予め染色したタンパク質マーカー(New England Biolabs)。レーン２：誘導体化されたＱβキャプシドタンパク質。レーン３：フリーの還元ｍＩＬ-１β１１９−２６９タンパク質。レーン４：Ｑβ-ｍＩＬ-１β１１９−２６９カップリング反応。 Ｑβキャプシドタンパク質へのｍＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質のカップリング。還元条件下で１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにてタンパク質を分析した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。マーカータンパク質の分子量は左端にｋＤａで示し、タンパク質バンドの同定を右端に示す。レーン１：予め染色したタンパク質マーカー(New England Biolabs)。レーン２：誘導体化されたＱβキャプシドタンパク質。レーン３：フリーの還元ｍＩＬ-１α１１７−２７０タンパク質。レーン４：Ｑβ-ｍＩＬ-１α１１７−２７０カップリング反応。

Claims (17)

  1. (a) 少なくとも１の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と、
    (b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原
    とを含んでなる組成物であり、
    このとき、該ＶＬＰがＲＮＡバクテリオファージＱβ又はＡＰ２０５であるか、又は該ＲＮＡバクテリオファージＱβ又はＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質を含み、
    該少なくとも１の抗原が、配列番号：６３、６５及び１６３に示すＩＬ−１α成熟断片、配列番号：６４、６６、１６４及び１６５に示すＩＬ−１β成熟断片、及び配列番号：１３１−１４０に示すＩＬ−１β変異タンパク質からなる群から選択されるＩＬ-１分子であり、
    (a)と(b)が該少なくとも１の第一付着部位と少なくとも１の第二付着部位を介して結合しており、前記第一付着部位が少なくとも１の共有結合により前記第二付着部位に結合している、組成物。
  2. 前記ＩＬ-１β変異タンパク質がｈＩＬ-１β１１６−２６９(Ｄ１４５Ｋ)(配列番号：１３６)である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＶＬＰが、ＲＮＡバクテリオファージＱβ又はＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質からなる、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＲＮＡバクテリオファージがバクテリオファージＱβである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質が配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記第一付着部位がアミノ基を含み、前記第二付着部位がスルフヒドリル基を含む、請求項１から６のいずれか一に記載の組成物。
  8. 前記第一付着部位がリジンのアミノ基であり、前記第二付着部位がシステインのスルフヒドリル基である、請求項１から７のいずれか一に記載の組成物。
  9. 前記第二付着部位のただ１つが、前記ＩＬ-１分子の前記ウイルス様粒子への単一及び均一なタイプの結合を生じさせる少なくとも１の非ペプチド共有結合を介して、前記第一付着部位に付随し、このとき該第一付着部位に付随する該ただ１つの第二付着部位がスルフヒドリル基であり、該ＩＬ-１分子と該ウイルス様粒子が該付随を介して相互作用して、規則正しく反復した抗原アレイを形成する、請求項１から８のいずれか一に記載の組成物。
  10. 前記抗原がバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片のＮ-末端又はＣ-末端に融合している、請求項１から５のいずれか一に記載の組成物。
  11. さらにリンカーを含み、該リンカーが少なくとも１の共有結合によりＩＬ-１分子に付随し、該リンカーが前記第二付着部位を含む、請求項１から１０のいずれか一に記載の組成物。
  12. 前記ＩＬ−１分子がヘテロ二官能性架橋剤によって前記ウイルス様粒子に結合している、請求項１から９及び１１のいずれか一に記載の組成物。
  13. 前記ヘテロ二官能性架橋剤がＳＭＰＨである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 請求項１から１３のいずれか一に記載の組成物を含むワクチンであり、アジュバントを欠いているワクチン。
  15. (a) 請求項１から１３のいずれか一に記載の組成物又は請求項１４に記載のワクチン；と、
    (b) 製薬的に許容される担体
    とを含有してなる製薬的組成物。
  16. 請求項１から１３のいずれか一に記載の組成物又は請求項１４に記載のワクチンの製造方法であって、
    (a) 少なくとも１の第一付着部位を有するＶＬＰを供給すること；
    (b) 少なくとも１の第二付着部位を有する少なくとも１の抗原を供給すること、このとき該抗原が、配列番号：６３、６５及び１６３に示すＩＬ−１α成熟断片、配列番号：６４、６６、１６４及び１６５に示すＩＬ−１β成熟断片、及び配列番号：１３１−１４０に示すＩＬ−１β変異タンパク質からなる群から選択されるＩＬ-１分子であり；そして、
    (c) 該組成物又は該ワクチンを製造するために該ＶＬＰと該少なくとも１の抗原を結合させること、このとき該少なくとも１の抗原と該ＶＬＰが該少なくとも１の第一付着部位と該少なくとも１の第二付着部位を介して結合するものである、
    を含んでなる方法。
  17. 疾患の治療のための医薬であって、請求項１から１３のいずれか一に記載の組成物、請求項１４に記載のワクチン又は請求項１５に記載の製薬的組成物を含み、該疾患が、
    (a) アテローム性動脈硬化；
    (b) 家族性地中海熱(ＦＭＦ)；
    (c) 全身性若年性特発性関節炎又は関節リウマチ；
    (d) 痛風又は骨関節炎；
    (e) アレルギー性疾患；及び、
    (f) 多発性硬化症；
    からなる群から選択されるものである、医薬。
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