BRPI0616446A2 - composição contendo conjugados de interleucina-1, vacina, uso da vacina, composição farmacêutica, processo para a produção da composição ou da vacina, bem como medicamento - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO CONTENDO CONJUGADOS DE INTERLEUCINA-1, VACINA, USO DA VACINA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, PROCESSO PARA A PRODUçãO DA COMPOSIçãO OU DA VACINA, BEM COMO MEDICAMENTO. A presente invenção pertence aos campos de Biologia molecular, Virologia, Imunologia e Medicina. A invenção provê uma composição compreendendo uma disposição de antígeno ordenada e repetitiva, onde o antígeno é uma proteína IL-1, uma muteina de IL-1 ou um fragmento de IL-1. Mais especificamente, a invenção provê uma composição compreendendo uma partícula do tipo vírus, e pelo menos uma proteína IL-1, muteina de IL-1 ou pelo menos um fragmento de IL-1 ligado a ela. A invenção também provê um processo para produção da composição. As composições da invenção são úteis na produção de vacinas para o tratamento de doenças inflamatórias e doenças auto-imunes crónicas, doenças genéticas e doenças cardio-vasculares. A composição da invenção induz eficientemente respostas imunes, em particular respostas de anticorpo. Ainda, as composições da invenção são particularmente úteis para induzir eficientemente respostas imunes auto-específicas dentro do contexto indicado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO CONTENDO CONJUGADOS DE INTERLEUCINA-1, VACINA, USODA VACINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PROCESSO PARA APRODUÇÃO DA COMPOSIÇÃO OU DA VACINA, BEM COMO MEDICAMENTO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção pertence aos campos de Medicina, Saúdepública, Imunologia, Biologia molecular e Virologia. A invenção provê composi-ções compreendendo uma partícula do tipo vírus (VLP) ou uma partícula devírus e pelo menos um antígeno, onde o dito antígeno é uma proteína Interleu-cina-1 (IL-1), um fragmento de IL-1 ou peptídeo ou uma muteína de IL-1 cova-lentemente ligado à VLP ou à partícula do vírus. A invenção também provê umprocesso para produção das composições. As composições da presente inven-ção são úteis na produção de vacinas para o tratamento de vários distúrbioshumanos, incluindo artrite reumatóide, osteoartrite e outros. As composições dainvenção induzem então respostas imunes eficientes, em particular respostasde anticorpo.

TÉCNICA RELACIONADA

IL-1 é uma citocina pró-inflamatória potente produzida por váriostipos de célula, incluindo macrófagos, células dendríticas, células B e células T(Dinarello, C.A., 1991, Blood 77(8): 1627-1652). Ela consiste em duas espéciesmoleculares, IL-Ia e IL-1 a, que compartilham apenas identidade de seqüêncialimitada, mas exercem atividades biológicas similares através de ligação a re-ceptor de IL-1 tipo I (IL-1 RI) (Dinarello, C.A. e outros, 1997, Cytokine & GrowthFactor Rev. 8:253). Ambas moléculas de IL-1 também se ligam a um segundoreceptor de IL-1 (IL-1 Rll), que não tem o domínio de sinalização intracelular, e éacreditado desempenhar um papel regulador como um receptor de atração (Di-narello, C.A. e outros, 1997, Cytokine & Growth Factor Rev. 8:253). Ainda, umterceiro membro da família IL-1, o antagonista do receptor de IL-1 (IL-1ra), se ligaa ambos receptores sem exercer qualquer atividade agonística. IL-Ira junto comIL-1 Rll e as formas soltas (shed) de IL-1 Rl e IL-1 Rll neutralizam a atividade deIL-Ia e IL-Ia e asseguram uma regulagem firme da resposta inflamatória.

Uma desregulagem da resposta inflamatória mediada por IL-1 éobservada em muitos distúrbios humanos, incluindo artrite reumatóide, do-ença inflamatória do intestino, doenças renais, osteoporose e outros. Emcada uma dessas doenças superprodução de IL-1 e/ou subprodução de IL-1ra predispõem ao desenvolvimento de doença (Arend, W.P., 2003, Cytoki-ne & Growth Factor Reviews 13:323-340). Uma versão recombinante de IL-ra (anakinra, Kineret®) é eficaz na redução de inflamação e prevenção dedado tecido em vários distúrbios inflamatórios, mas a necessidade de con-centrações sistêmicas altas e a meia-vida curta do fármaco requerem admi-nistrações freqüentes (diárias) de doses altas (-10 mg), resultando em custoalto de produtos e problemas de obediência do paciente potenciais (Kinerefprescribing information, Amgen; Granowitz, E.V. e outros, 1992, Cytokine4:353). Ainda, uma grande proporção de pacientes desenvolve anticorposcontra Kineret®, que neutralizam potencialmente a atividade biológica dofármaco (Fleischmann, R.M. e outros, 2003, Arthritis Rheum. 46:2287).

Novas técnicas terapêuticas então focam nas estratégias de i-munização ativa, que induzem a produção de anticorpos de neutralização deIL-1 pelo sistema imune do paciente. Svenson e colaboradores (2000, J.Immunol. Methods 236:1-8) imunizaram camundongos com IL-Ia recombi-nante quimicamente ligada com cruzamento a derivado de proteína purifica-da de tuberculina (PPD), e observaram a indução de anticorpos que neutrali-zaram a atividade biológica de IL-1a. Esta estratégia se apóia na aplicaçãode ajuda de célula T para autorreativar células B através de ligação física doauto-antígeno a um antígeno estranho.

A Patente US 6.093.405 revela um método de redução do nívelde uma citocina em circulação através da imunização com uma composiçãoimunogênica contendo a própria citocina quimicamente ou fisicamente inati-vada. Enquanto neste método citocinas nativas são tornadas imunogênicasatravés de tratamento físico ou químico, a presente invenção revela um mé-todo para tornar citocinas nativas imunogênicas através da sua apresenta-ção de uma maneira altamente repetitiva sobre a superfície de VLPs. OW02003/084979 descreve ainda o uso de compostos imunogênicos conten-do peptídeos derivados de citocina de 5-40 aminoácidos de comprimentopara o tratamento de doenças associadas com uma superprodução de cito-cinas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi, agora, surpreendentemente constatado pela requerente queas composições e vacinas da invenção, respectivamente, compreendendopelo menos uma molécula de IL-1, não são apenas capazes de indução derespostas imunes contra IL-1, então em particular respostas de anticorpo,mas são, ainda, capazes de neutralização da atividade pró-inflamatória deIL-1 in vivo. Ainda, a requerente surpreendentemente verificou que moléculade IL-1, quando covalentemente ligada à VLP de acordo com a invenção,pode proteger de inflamação e de sinais clínicos de artrite em um modelo decamundongo de artrite reumatóide. Além disso, a requerente constatou queas composições da invenção protegeram os camundongos melhor do de-senvolvimento de sintomas de artrite do que o antagonista de receptor de IL-1 recombinante Kineret®, que é aprovado para o tratamento de artrite reuma-tóide humana (Exemplo 7). Ainda, foi ainda surpreendentemente constatadopela requerente que as composições da invenção eram capazes de inibir odesenvolvimento de sintomas ateroscleróticos, quando injetadas em camun-dongos geneticamente suscetíveis (Exemplo 4) e então são um tratamentoeficiente para aterosclerose. Ainda, foi demonstrado que IL-1 está envolvidana patogênese de aterosclerose.

Então, no primeiro aspecto, a presente invenção provê umacomposição que compreende (a) uma partícula tipo vírus (VLP) com pelomenos um primeiro sítio de ligação; e (b) pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de ligação, onde o dito pelo menos um antígenouma molécula de IL-1 de preferência selecionada do grupo consistindo emproteína de IL-1, fragmento maduro de IL-1, peptídeo de IL-1 e muteína deIL-1, onde (a) e (b) são ligados através do dito pelo menos um primeiro e ditopelo menos um segundo sítio de ligação, de preferência para formar umadisposição de antígeno ordenada e repetitiva. Em modalidades preferidas dainvenção, as partículas do tipo vírus adequadas para uso na presente inven-ção compreendem proteína recombinante, de preferência proteína de reves-timento recombinante ou fragmento dela, de um vírus, de preferência de umbacteriófago de RNA. Em uma modalidade preferida, a composição da in-venção compreende pelo menos um fragmento maduro de IL-1, de preferên-cia compreendendo a atividade biológica de IL-1. Então, a presente invençãousa a apresentação do auto-antígeno de uma maneira altamente repetitivaem partículas do tipo vírus para estimular células B auto-reativas.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composiçãode vacina.

Ainda, a presente invenção provê um método para administrar acomposição de vacina a um humano ou um animal, de preferência um ma-mífero. A composição de vacina da invenção é capaz de induzir respostaimune forte, em particular resposta de anticorpo, tipicamente e de preferên-cia sem a presença de pelo menos um adjuvante. Deste modo, em uma mo-dalidade preferida, a vacina é destituída de um adjuvante. Evitando o uso deadjuvante pode haver redução da possível ocorrência de respostas de célulainflamatórias indesejadas.

Em uma modalidade preferida, a VLP é uma VLP de um bacteri-ófago de RNA. Em uma modalidade preferida adicional, o dito bacteriófagode RNA é um bacteriófago de RNA selecionado do grupo consistindo em:Qβ, fr, GA e AP205. Em uma modalidade preferida adicional a dita VLP deum bacteriófago de RNA compreendida pela composição e pela composiçãode vacina, respectivamente, é recombinantemente produzida em um hospe-deiro onde a VLP de um bacteriófago de RNA é essencialmente livre de umRNA hospedeiro, de preferência ácido nucléico hospedeiro. É vantajoso re-duzir, ou de preferência eliminar, a quantidade de RNA hospedeiro para evi-tar respostas de célula T indesejadas bem como outros efeitos colateraisindesejados, tal como febre.

Em um aspecto, a presente invenção provê um método de tra-tamento de uma doença selecionada do grupo consistindo em: (a) doençasvasculares; (b) doenças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas; (c) do-enças inflamatórias autoimunes crônicas; (d) doenças degenerativas do ossoe cartilagem; (e) doenças alérgicas; e (f) doença neurológica; doenças ondeproteína IL-1 faz a mediação da, ou contribui para a, condição, onde o méto-do compreende administrar a composição da invenção ou a composição devacina da invenção, respectivamente, a um animal, de preferência humano.Doenças, onde a proteína IL-1 faz a mediação da, ou contribui para a, condi- ção, são, por exemplo, aterosclerose, febre Mediterrânea familiar, artritereumatóide, osteoartrite e alergia.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma com-posição farmacêutica compreendendo a composição da invenção e um veí-culo farmacêutico aceitável.

Novamente em um aspecto adicional, a presente invenção provêum método de produção da composição da invenção compreendendo (a)provisão de uma VLP com pelo menos um primeiro sítio de ligação; (b) pro-visão de pelo menos um antígeno, onde o dito antígeno é uma molécula deIL-1, uma proteína de IL-1, um fragmento maduro de IL-1, um peptídeo deIL-1 ou uma muteína de IL-1, com pelo menos um segundo sítio de ligação;e (c) combinação da dita VLP e dito pelo menos um antígeno para produzir adita composição, onde o dito pelo menos um antígeno e a dita VLP são liga-dos através do dito pelo menos um primeiro e dito pelo menos um segundosítios de ligação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Acoplamento de proteína mlL-1 β119.269 à proteína decapsídeo de Οβ

As proteínas foram analisadas em um gel de SDS- poliacrilamidaa 12% sob condições de redução. O gel foi tingido com Coomassie BrilliantBlue. Pesos moleculares de proteínas marcadoras são dados em kDa namargem esquerda, identidades de faixas de proteína são indicadas na mar-gem direita. Faixa 1: Marcador de proteína pré-tingida (New England Bio-labs). Faixa 2: proteína de capsídeo de Οβ derivatizada. Faixa 3: proteínamlL-1 βι 19-269 reduzida livre. Faixa 4: reação de acoplamento de Οβ-mlL-1 βΐ 19-269-

Figura 2: Acoplamento de proteína mlL-1oci 17-270 à proteína decapsídeo de ΟβAs proteínas foram analisadas em um gel de SDS- poliacrilamidaa 12% sob condições de redução. O gel foi tingido com Coomassie BrilliantBlue. Pesos moleculares de proteínas marcadoras são dados em kDa namargem esquerda, identidades de faixas de proteína são indicadas na mar-gem direita. Faixa 1: Marcador de proteína pré-tingida (New England Bio-labs). Faixa 2: proteína de capsídeo de Οβ. Faixa 3: proteína mlL-1aii7.27oreduzida livre. Faixa 4: reação de acoplamento de Op-mlL-lam^o-

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm os mesmos significados conforme geralmentecompreendido por um versado na técnica à qual a presente invenção pertence.

Adjuvante: O termo "adjuvante" conforme aqui usado refere-se aestimuladores não-específicos da resposta imune ou substâncias que permi-tem a geração de um depósito no hospedeiro que quando combinado com avacina e composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção,pode prover uma resposta imune ainda mais acentuada. Adjuvantes preferi-dos são adjuvante de Freund completo e incompleto, adjuvante contendoalumínio, de preferência hidróxido de alumínio e muramildipeptídeo modifi-cado. Adjuvantes preferidos adicionais são géis minerais tal como hidróxidode alumínio, substâncias tensoativas tal como lisolecitina, polióis pluronic,poliânions, peptídeos, emulsões em óleo, hemocianinas de límpeto keyhole,dinitrofenol e adjuvantes humanos tal como BCG (bacilo Calmette Guerirí) eCorynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bem conhecidos natécnica. Adjuvantes adicionais que podem ser administrados com as compo-sições da invenção incluem, mas não estão limitados a, imunomodulador delipídeo Monofosforil, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sais de alumí-nio (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 e tecnologia de adjuvante Vi-rossomal. Os adjuvantes podem também compreender uma mistura dessassubstâncias. VLP foi geralmente descrita como um adjuvante. No entanto, otermo "adjuvante", conforme usado dentro do contexto do presente pedido,refere-se a um adjuvante não sendo a VLP usada para as composições dainvenção, ao contrário ele refere-se a um componente distinto, adicional.

Antígeno: Conforme aqui usado, o termo "antígeno" refere-se auma molécula capaz de ser ligada por um anticorpo ou um receptor de célulaT (TCR) se apresentada por moléculas MHC. O termo "antígeno", conformeaqui usado, refere-se também a epítopos de célula T. Um antígeno é adicio-nalmente capaz de ser reconhecido pelo sistema imune e/ou ser capaz deinduzir uma resposta imune humoral e/ou resposta imune celular levando àativação de linfócitos B e/ou T. Isto pode, no entanto, requerer que, pelo me-nos em certos casos, o antígeno contenha ou esteja ligado a um epítopo decélula Th e seja dado em adjuvante. Um antígeno pode ter um ou mais epí-topos (epítopos B e Τ). A reação específica referida acima pretende indicarque o antígeno vai de preferência reagir, tipicamente de uma maneira alta-mente seletiva, com seu anticorpo correspondente ou TCR e não com umamultiplicidade de outros anticorpos ou TCRs que podem ser evocados por outros antígenos. Antígenos conforme aqui usado podem ser também mistu-ras de vários antígenos individuais.

Epítopo: O termo epítopo refere-se a porções contínuas ou des-contínuas de um antígeno, de preferência um polipeptídeo, onde as ditasporções podem ser especificamente ligadas por um anticorpo ou por um re-ceptor de célula T dentro do contexto de uma molécula MHC. Com relação aanticorpos, ligação específica exclui ligação não-específica, mas não neces-sariamente exclui reatividade cruzada. Um epítopo compreende tipicamente5-10 aminoácidos em uma conformação espacial que é única para o sítio deantígeno.

Ligação específica (anticorpo/antígeno): Dentro do presente pe-dido, anticorpos são definidos ser especificamente Iigantes se eles se liga-rem ao antígeno com uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M'1 ou mais, depreferência 107 M1 ou mais, com mais preferência 108 M1 ou mais e commais preferência 109 M'1 ou mais. A afinidade de um anticorpo pode serprontamente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica(por exemplo, através de análise Scatchard, através de ELISA ou análiseBiacore).Ligação específica (IL-1/receptor de IL-1): A interação entre umreceptor e um Iigante de receptor pode ser caracterizada por métodos biofí-sicos geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISA ouanálise Biacore. Uma molécula de IL-1 é considerada como sendo capaz dese ligar especificamente a um receptor de IL-1, quando a afinidade de liga-ção (Ka) da dita IL-1 ao dito receptor de IL-1 for pelo menos 105 M"1, de pre-ferência pelo menos 106 M"1, com mais preferência pelo menos IO7M"1, commais preferência ainda pelo menos 108 M"1 e com mais preferência pelo me-nos 109 M"1; onde de preferência o dito receptor de IL-1 é um receptor de IL-1 de camundongo ou humano, com mais preferência humano. Ainda de pre-ferência, o dito receptor de IL-1 compreende ou com mais preferência con-siste em qualquer uma das seqüências SEQ ID NO: 166 a SEQ ID NO: 169,com mais preferência o dito receptor de IL-1 compreende ou de preferênciaconsiste em qualquer uma das seqüências SEQ ID NO:166 e SEQ IDNO:167.

Associado: O termo "associado" ou "associação" conforme aquiusado refere-se a todos os modos possíveis, de preferência interações quí-micas, através dos quais duas moléculas são unidas. Interações químicasincluem interações covalentes e não-covalentes. Exemplos típicos para inte-rações não-covalentes são interações iônicas, interações hidrofóbicas ouligações hidrogênio, enquanto interações covalentes são baseadas, a títulode exemplo, em ligações covalentes tal como éster, éter, fosfoéster, amida,peptídeo, ligações carbono-fósforo, ligações carbono-enxofre tal como tioé-ter ou ligações imida.

Sítio de Ligação, Primeiro: Conforme aqui usado, a expressão"primeiro sítio de ligação" refere-se a um elemento que é de ocorrência natu-ral com a VLP ou que é artificialmente adicionado à VLP, e ao qual o segun-do sítio de ligação pode ser ligado. O primeiro sítio de ligação de preferênciaé uma proteína, um polipeptídeo, um aminoácido, um peptídeo, um açúcar,um polinucleotídeo, um polímero natural ou sintético, um metabólito ou com-posto secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, íons de metal,fluoreto de fenilmetilsulfonila) ou um grupo quimicamente reativo tal comoum grupo amino, um grupo carboxila, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila,um grupo guanidinila, um grupo hisitidinila ou uma combinação deles. Umamodalidade preferida de um grupo quimicamente reativo sendo o primeirosítio de ligação é o grupo amino de um aminoácido, de preferência de lisina.

O primeiro sítio de ligação está localizado, tipicamente sobre a superfície, ede preferência na superfície externa da VLP. Primeiros sítios de ligação múl-tiplos estão presentes na superfície, de preferência na superfície externa departícula do tipo vírus, tipicamente em uma configuração repetitiva. Em umamodalidade preferida, o primeiro sítio de ligação está associado com a VLP,através de pelo menos uma ligação covalente, de preferência através depelo menos uma ligação peptídeo. Em uma modalidade preferida adicional oprimeiro sítio de ligação é de ocorrência natural com a VLP. Alternativamen-te, em uma modalidade preferida o primeiro sítio de ligação é artificialmenteadicionado à VLP.

Sítio de Ligação, Segundo: Conforme aqui usado, a expressão"segundo sítio de ligação" refere-se a um elemento que é de ocorrência na-tural com ou que é artificialmente adicionado à molécula de IL-1 e ao qual oprimeiro sítio de ligação pode ser ligado. O segundo sítio de ligação da mo-lécula de IL-1 é de preferência uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo,um aminoácido, um açúcar, um polinucleotídeo, um polímero natural ou sin-tético, um metabólito ou composto secundário (biotina, fluoresceína, retinol,digoxigenina, íons de metal, fluoreto de fenilmetilsulfonila) ou um grupo qui-micamente reativo tal como um grupo amino, um grupo carboxila, um gruposulfidrila, um grupo hidroxila, um grupo guanidinila, um grupo histidinila ouuma combinação deles. Uma modalidade preferida de um grupo quimica-mente reativo sendo o segundo sítio de ligação é o grupo sulfidrila, de prefe-rência de um aminoácido cisteína. O termo "molécula de IL-1 com pelo me-nos um segundo sítio de ligação" refere-se, então, a um construto compre-endendo a molécula de IL-1 e pelo menos um segundo sítio de ligação. Noentanto, em particular para um segundo sítio de ligação, que não é de ocor-rência natural dentro da molécula de IL-1, tal construto tipicamente e de pre-ferência compreende ainda um "ligante". Em outra modalidade preferida osegundo sítio de ligação é associado com a molécula de IL-1 através de pelomenos uma ligação covalente, de preferência através de pelo menos umaligação peptídeo. Em uma modalidade adicional, o segundo sítio de ligaçãoé de ocorrência natural dentro da molécula de IL-1. Em outra modalidadepreferida adicional, o segundo sítio de ligação é artificialmente adicionado àmolécula de IL-1 através de um ligante, onde o dito Iigante compreende oualternativamente consiste em uma cisteína. De preferência, o ligante é fundi-do à molécula de IL-1 por uma ligação peptídeo.

Proteína de revestimento: O termo "proteína de revestimento" eo termo intercomutavelmente usado "proteína capsídeo" dentro do presentepedido referem-se a uma proteína viral, de preferência uma subunidade deum capsídeo natural de um vírus, de preferência de um fator de RNA, que écapaz de ser incorporada a um capsídeo de vírus ou uma VLP.

Molécula de IL-1: O termo "molécula de IL-1" ou de maneira su-cinta "IL-1", conforme aqui usado, refere-se a qualquer polipeptídeo tendouma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelomenos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferênciaainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de se-qüência com qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo consis-tindo em SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:116, SEQ ID N0:130 a SEQ IDNO: 140 e SEQ ID NO:163 a SEQ ID NO:165. O termo "molécula de IL-1",conforme aqui usado, refere-se de preferência a qualquer proteína IL-1,fragmento de IL-1, fragmento maduro de IL-1, peptídeo de IL-1 ou muteínade IL-1 compreendendo ou alternativamente consistindo em um polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferênciapelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais prefe-rência ainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidadede seqüência com qualquer uma das seqüências selecionadas do grupoconsistindo em SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:116, SEQ ID N0:130 a SEQ IDNO: 140 e SEQ ID NO: 163 a SEQ ID NO: 165. O termo molécula de IL-1, con-forme aqui usado, refere-se também tipicamente e de preferência a ortólo-gos de proteínas IL-1 de qualquer espécie animal. Uma molécula de IL-1 éde preferência, mas não necessariamente, capaz de ligação ao receptor deIL-1 e compreende de preferência ainda atividade biológica.

Molécula de IL-1 alfa: O termo "molécula de IL-1 alfa" ou sucin-tamente "IL-1 alfa", conforme aqui usado, refere-se a uma proteína IL-1 alfa,fragmento de IL-1 alfa, fragmento maduro de IL-1 alfa, peptídeo de IL-1 alfaou muteína de IL-1 alfa compreendendo ou alternativamente consistindo emum polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência100% de identidade de seqüência com qualquer uma das seqüências sele-cionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO:36 a 48, SEQ ID NO:63, SEQID NO:65, SEQ ID NO:67 a SEQ ID NO:88 e SEQ ID NO: 163. Uma modali-dade especificamente preferida de IL-1 alfa é IL-1 alfa humana 119-271(SEQ ID NO:63).

Molécula de IL-1 beta: O termo "molécula de IL-1 beta" ou sucin-tamente "IL-1 beta", conforme aqui usado, refere-se a uma proteína IL-1 be-ta, fragmento de IL-1 beta, fragmento maduro de IL-1 beta, peptídeo de IL-1beta ou muteína de IL-1 beta compreendendo ou alternativamente consistin-do em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo me-nos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência100% de identidade de seqüência com qualquer uma das seqüências sele-cionadas do grupo consistindo na SEQ ID NO:49 a SEQ ID NO:62, SEQ IDNO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:89 a SEQ ID NO:116, SEQ ID N0:130 aSEQ ID NO: 140, SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:165. Uma modalidade espe-cificamente preferida de IL-1 beta é IL-Ibeta humana 117-269 (SEQ ID NO:64).

Proteína IL-1: O termo "proteína IL-1", conforme aqui usado, re-fere-se a uma proteína de ocorrência natural, onde a dita proteína de ocor-rência natural tem uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, depreferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95, commais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% deidentidade de seqüência com qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ IDNO: 62; ou onde a dita proteína de ocorrência natural é capaz de ligação aoreceptor de IL-1 e de preferência compreende atividade biológica. O termo"proteína IL-1", conforme aqui usado, de preferência refere-se a uma proteí-na de ocorrência natural, onde a dita proteína de ocorrência natural tem umaseqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:62; e onde a dita prote-ína de ocorrência natural é capaz de se ligar ao receptor de IL-1 e de prefe-rência compreende atividade biológica. Tipicamente e de preferência, o ter-mo "proteína IL-1", conforme usado, refere-se a pelo menos uma proteína deocorrência natural, onde a dita proteína é capaz de ligação com o receptorde IL-1 e compreende atividade biológica, e onde ainda a dita proteína com-preende ou alternativamente consiste em um polipeptídeo tendo uma se-qüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:62. Então, o termo "pro-teína IL-1 alfa" refere-se a uma proteína IL-1 compreendendo ou alternati-vamente consistindo em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoáci-do tendo pelo menos 80%, de preferência apelo menos 90%, com mais pre-ferência pelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% ecom mais preferência 100% de identidade de seqüência com qualquer umdas SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:48, onde o termo "proteína IL-1 beta" refe-re-se a uma proteína IL-1 compreendendo ou alternativamente consistindoem um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência100% de identidade de seqüência com qualquer uma das SEQ ID NO;49 aSEQ ID NO:62.

Fragmento de IL-1: O termo "fragmento de IL-1", conforme aquiusado, refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma extensão consecu-tiva de uma proteína IL-I, onde o dito polipeptídeo é pelo menos de 50, depreferência pelo menos 100, com mais preferência pelo menos 150 aminoá-cidos de comprimento. Tipicamente e de preferência, o dito fragmento de IL-1 é no máximo de 300, com mais preferência no máximo 250 e com maispreferência no máximo 200 aminoácidos de comprimento. Tipicamente e depreferência, fragmentos de IL-1 são capazes de ligação do receptor de IL-1 eainda de preferência compreendem atividade biológica. Deste modo, os ter-mos "fragmento de IL-1 alfa" e "fragmento de "IL-1 beta" referem-se a umfragmento de IL-1 conforme definido, onde a dita proteína IL-1 é uma proteí-na IL-1 alfa ou uma proteína IL-1 beta, respectivamente.

Fragmento maduro de IL-1: O termo "fragmento maduro de IL-1",conforme aqui usado, refere-se a um fragmento de IL-1, onde o dito frag-mento de IL-1 é um produto de maturação de ocorrência natural de uma pro-teína IL-1. Deste modo, os termos "fragmento maduro de IL-1 alfa" e "frag-mento maduro de IL-1 beta", conforme aqui usado, referem-se a fragmentosmaduros de IL-1 conforme definido, onde a dita proteína IL-1 é uma proteínaIL-1 alfa ou uma proteína IL-1 beta, respectivamente. Modalidades preferidasde fragmentos maduros de IL-1 alfa são SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 eSEQ ID NO: 163. Modalidades preferidas de fragmentos maduros de IL-1beta são SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:130, SEQ ID NO:164 eSEQ ID NO:165.

Fragmentos maduros de IL-1 alfa preferidos compreendem ouconsistem de preferência em uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo em: (a) IL-1 alfa humana 119-271 (SEQ ID NO:63); (b) IL-1 alfa de camundongo 117-270 (SEQI ID NO:65); (c) IL-1 alfa de camundon-go 117-270s (SEQ ID NO:163); e (e) uma seqüência de aminoácido que épelo menos 80% ou de preferência pelo menos 90%, com mais preferência95% ou com mais preferência pelo menos 99% idêntica a uma das SEQ IDNO:63, SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:163.

Os fragmentos maduros de IL-1 beta preferidos compreendemou de preferência consistem em uma seqüência de aminoácido selecionadado grupo consistindo em: (a) IL-1 beta humana 117-269 (SEQ ID NO:64); (b)IL-1 beta humana 116-269 (SEQI ID NO:165); (c) IL-1 beta de camundongo119-269 (SEQ ID NO:66); (d) IL-1 beta de camundongo 119-269s (SEQ IDNO: 164); e (c) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80% ou depreferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95% ou commais preferência pelo menos 99% idêntica a qualquer uma das SEQ IDNO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:165.

Peptídeo de IL-1: O termo "peptídeo de IL-1", conforme aqui u-sado, refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma extensão consecuti-va de uma proteína de ocorrência natural, onde a dita proteína é capaz deligação do receptor de IL-1 e de preferência compreende atividade biológica,onde o dito polipeptídeo é de 4 a 49, de preferência 6 a 35, com mais prefe-rência 10 a 25 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo de IL-1 podeser, mas tipicamente não é, capaz de ligação com o receptor de IL-1 e tipi-camente não tem nenhuma atividade biológica. Deste modo, os termos "pep-tídeo de IL-1 alfa" e "peptídeo de IL-1 beta", conforme aqui usado, referem-se a peptídeos de IL-1 conforme definido, onde a dita proteína de ocorrêncianatural é uma proteína IL-1 alfa ou uma proteína IL-1 beta, respectivamente.Peptídeos de IL-1 preferidos são SEQ ID NO:82 até SEQ ID NO:116.

Muteína de IL-1: O termo "muteína de IL-1" conforme aqui usadocompreende ou de preferência consiste em qualquer polipeptídeo derivadode uma molécula de IL-1, de preferência de a partir de uma proteína IL-1 alfaou uma IL-1 beta, um fragmento de IL-1 alfa ou um IL-1 beta, um fragmentomaduro de IL-1 alfa ou um IL-1 beta ou um peptídeo de IL-1 alfa ou um deIL-1 beta, onde de preferência o dito polipeptídeo exibe atividade biológicareduzida conforme comparado com a molécula de IL-1 da qual ele é deriva-do. Deste modo, muteínas de IL-1 alfa e muteínas de IL-1 beta são muteínasde IL-1 conforme definido, onde o dito polipeptídeo é derivado de uma molé-cula de IL-1 alfa ou uma molécula de IL-1 beta, respectivamente.

Em muteínas de IL-1 preferidas, a dita atividade biológica é me-nos do que 80%, com mais preferência menos do que 60%, com mais prefe-rência ainda menos do que 40%, com mais preferência ainda menos do que20% da atividade biológica da molécula de IL-I da qual ela é derivada. Mute-ínas de IL-1 preferidas adicionais são derivadas de um fragmento maduro deIL-1, onde a dita atividade biológica da dita muteína de IL-1 é menos do que80%, com mais preferência menos do que 60%, com mais preferência aindamenos do que 40%, com mais preferência ainda menos do que 20% da ati-vidade biológica do fragmento maduro de IL-1 do qual a dita muteína de IL-1é derivada. Muteínas de IL-1 muito preferidas não exibem atividade biológi-ca. Ainda de preferência, mas não necessariamente, as muteínas de IL-1são capazes de especificamente se ligar a um receptor de IL-1. Muito prefe-ridas são as muteínas de IL-1 derivadas de (i) uma proteína IL-1, de prefe-rência de a partir da SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:62; ou (ii) com mais prefe-rência de um fragmento de IL-1 maduro, de preferência de qualquer um deSEQ ID NO:63 a SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:130 e SEQ ID NO:163 até SEQID NO: 165.

As muteínas de IL-1 úteis no contexto foram descritas em Ka-mogashira e outros (1988) J. Biochem. 104:837-840; Gehrke e outros (1990)The Journal of Biological Chemistry 265(11):5922-5925; Conca e outros(1991) The Journal of Biological Chemistry 266(25): 16265-16268; Ju e ou-tros (1991) PNAS 88:2658-2662; Auron e outros (1992) Biochemistry31:6632-6638; Guinet e outros (1993) Eur. J. Biochem. 211:583-590; Cama-cho (1993) Biochemistry 32:8749-8757; Baumann (1993) JournaIofReceptorResearch 13(1-4):245-262; Simon (1993) The Journal of Biological Chemis-try 268(13):9771-9779; e Simoncsits (1994) Cytokine 6(2):206-214, cujasdescrições são aqui incorporadas a título de referência.

Muteínas de IL-1 preferidas compreendem ou de preferênciaconsistem em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que di-fere da seqüência de aminoácido de uma proteína IL-1, um fragmento de IL-1, um fragmento maduro de IL-1 ou um peptídeo de IL-1 em 1 a 10, de prefe-rência 1 a 6, com mais preferência 1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4,com mais preferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e commais preferência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de prefe-rência o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletados do dito poli-peptídeo, (ii) inseridos no dito polipeptídeo, (iii) trocados por um outro resí-duo de aminoácido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Em uma moda-lidade preferida, os ditos resíduos de aminoácido estão em uma extensãoconsecutiva. Muteínas de IL-I preferidas adicionais compreendem ou depreferência consistem em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoá-cido que difere da seqüência de aminoácido de uma proteína IL-1, um frag-mento de IL-1 ou um fragmento maduro de IL-1, de preferência de um frag-mento maduro de IL1, em 1 a 10, de preferência 1 a 6, com mais preferência1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4, com mais preferência ainda 1 a 3,com mais preferência ainda 1 a 3, e com mais preferência em exatamente 1resíduo de aminoácido, onde de preferência o(s) dito(s) resíduo(s) de ami-' noácido são (i) deletado(s) do dito polipeptídeo, (ii) inserido(s) no dito poli-peptídeo, (iii) trocado(s) por um outro resíduo de aminoácido ou (iv) qualquercombinação de (i) a (iii).

Muteínas de IL-1 preferidas adicionais compreendem ou de pre-ferência consistem em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidoque difere da seqüência de aminoácido de qualquer uma da SEQ ID NO:36a SEQ ID NO:48 ou SEQ ID NO:49 a SEQ ID NO:62 em 1 a 10, de preferên-cia 1 a 6, com mais preferência 1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4, commais preferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e com maispreferência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de preferênciao(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do dito polipeptí-deo, (ii) inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduo deaminoácido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Muteínas de IL-1 prefe- ridas adicionais compreendem ou de preferência consistem em um polipep-tídeo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da seqüência de ami-noácido selecionada do grupo consistindo em (i) qualquer uma das SEQ IDNO:63, SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:163, com mais preferência SEQ IDNO:63; ou (ii) qualquer uma das selecionadas do grupo consistindo na SEQID NO: 64, SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:130, SEQ ID NO:164 e SEQ IDNO: 165, com mais preferência SEQ ID NO:64 em 1 a 10, de preferência 1 a6, com mais preferência 1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4, com maispreferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e com mais prefe-rência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de preferência o(s)dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do dito polipeptídeo, (ii)inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduo de aminoá-cido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).

Muteínas de IL-1 preferidas adicionais são muteínas IL-I alfa,onde as ditas muteínas IL-1 alfa compreendem ou de preferência consistemem um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da se-qüência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ IDNO:48 em 1 a 6, de preferência 1 a 5, com mais preferência 1 a 4, com maispreferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e com mais prefe-rência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de preferência o(s)dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do dito polipeptídeo, (ii)inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduo de aminoá-cido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Muteínas de IL-1 alfa preferi-das adicionais compreendem ou de preferência consistem em um polipeptí-deo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da seqüência de amino-ácido selecionada do grupo consistindo em (i) qualquer uma das SEQ IDNO:63, SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:163, com mais preferência SEQ IDNO:63; ou 1 a 6, de preferência 1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4,com mais preferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e commais preferência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de prefe-rência o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do dito poli-peptídeo, (ii) inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduode aminoácido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Muteínas de IL-1alfa muito preferidas compreendem ou consistem de preferência em um po-lipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da seqüência deaminoácido da SEQ ID NO:63 em 1 a 10, de preferência 1 a 6, com maispreferência 1 a 5, com mais preferência ainda 1 a 4, com mais preferênciaainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e com mais preferência emexatamente 1 resíduo de aminoácido, onde de preferência o(s) dito(s) resí-duo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do dito polipeptídeo, (ii) inseri-do(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduo de aminoácido ou(iv) qualquer combinação de (i) a (iii).

Muteínas de IL-I preferidas adicionais são muteínas de IL-1 be-ta, onde as ditas muteínas de IL-1 beta compreendem ou com mais prefe-rência consistem em um polipeptídeo tendo uma seqüência de amino ácidoque difere da seqüência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO:49a SEQ ID NO:62 em 1 a 10, de preferência 1 a 5, com mais preferência 1 a4, com mais preferência 1 a 3, com mais preferência ainda de preferência 1a 2 e com mais preferência exatamente 1 resíduo de aminoácido, onde depreferência o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) do ditopolipeptídeo, (ii) inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro re-síduo de aminoácido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Muteínas deIL-1 beta preferidas adicionais compreendem ou de preferência consistemem um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da se-qüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66, SEQ ID:130, SEQ ID NO:164 e SEQ ID NO:165, com maispreferência SEQ ID NO:64, em 1 a 6, de preferência 1 a 5, com mais prefe-rência 1 a 4, com mais preferência ainda 1 a 3, com mais preferência ainda 1a 2 e com mais preferência em exatamente 1 resíduo de aminoácido, ondede preferência o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são (i) deletado(s) dodito polipeptídeo, (ii) inserido(s) no dito polipeptídeo, (iii) trocado(s) por outroresíduo de aminoácido ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii). Muteínas deIL-1 beta muito preferidas compreendem ou de preferência consistem em umpolipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que difere da seqüênciade aminoácido da SEQ ID NO:64 em 1 a 10, de preferência 1 a 6, com maispreferência 1 a 5, com mais preferência 1 a 4, com mais preferência ainda 1s 3, com mais preferência ainda 1 a 2 e com mais preferência em exatamen-te 1 resíduo de aminoácido, onde de preferência o(s) dito(s) resíduo(s) deaminoácido é/são (i) deletado(s) do dito polipeptídeo, (ii) inserido(s) no ditopolipeptídeo, (iii) trocado(s) por outro resíduo de aminoácido ou (iv) qualquercombinação de (i) a (iii). Muteínas de IL-1 beta mais preferidas compreen-dem ou de preferência consistem em um polipeptídeo tendo uma seqüênciade aminoácido selecionada de qualquer um do grupo consistindo em SEQ IDNO:131 a SEQ ID N0:140.

Efeito agonístico/atividade biológica da IL-I: O termo "atividadebiológicá" ou "biologicamente ativo" conforme aqui usado com relação à IL-1refere-se à habilidade da molécula de IL-1 em induzir a produção de IL-6após administração sistêmica a animais, de preferência conforme mostradono Exemplo 2E e no Exemplo 3E. Por atividade biológica da molécula de IL-1 se quer dizer também a habilidade em induzir a proliferação de timócitos(Epps e outros, Cytokine 9(3):149-1'56 (1997), células T auxiliares D10.G4.1T (Orencole e Dinarello, Cytokine 1(1): 14-22 (1989), ou a habilidade em in-duzir a produção de IL-6 a partir de células MG64 ou HaCaT (Boraschi e ou-tros, J. Immunol. 155:4719-4725 (1995) ou fibroblastos (Dinarello e outros,Current Protocols in Immunology 6.2.1 -6-2-7 (2000)), ou a produção de IL-2a partir de células de timoma EL-4 (Simon e outros, J. Immunol. Methods84(1-2):85-94 (1985)), ou a habilidade em inibir o crescimento da linhagemde célula de melanoma humano A375 (Nakai e outros, Biochem. Biophys.Res. Commun. 154:1189-1196 (1988)).

Ligado: O termo "ligado" ou "ligação" conforme aqui usado refe-re-se a todos os modos possíveis, de preferência interações químicas, atra-vés dos quais pelo menos um primeiro sítio de ligação e o pelo menos umsegundo sítio de ligação são unidos. Interações químicas incluem interaçõescovalentes e não-covalentes. Exemplos típicos de interações não-covalentessão interações iônicas, interações hidrofóbicas ou ligações hidrogênio, en-quanto interações covalentes são baseadas, por meio de exemplo, em Iiga-ções covalentes tal como éster, éter, fosfoéter, amida, peptídeo, ligações decarbono-fósforo, ligações de carbono-enxofre tal como ligações tioéter ouimida. Em certas modalidades preferidas, o primeiro sítio de ligação e o se-gundo sítio de ligação são ligados através de pelo menos uma ligação cova-lente, de preferência através de pelo menos uma ligação não-peptídeo, ecom mais preferência ainda através de ligações exclusivamente não-peptídeo. O termo "ligado" conforme aqui usado, no entanto, não deve sereferir apenas a uma ligação direta do pelo menos um primeiro sítio de liga-ção e o pelo menos um segundo sítio de ligação, mas também, alternativa-mente e de preferência, uma ligação indireta do pelo menos um primeiro sí-tio de ligação e do pelo menos um segundo sítio de ligação através de molé-cula(s) intermediária(s) e então tipicamente e de preferência usando pelomenos um, de preferência um, Iigante com cruzamento hetero-bifuncional.

Em outras modalidades preferidas o primeiro sítio de ligação e o segundosítio de ligação são ligados através de pelo menos uma ligação covalente,de preferência através de pelo menos uma ligação peptídeo, e com maispreferência ainda através de ligação(ões) exclusivamente peptídeo. Em umamodalidade muito preferida o primeiro sítio de ligação e o segundo sítio eligação são ligados exclusivamente por ligações peptídeo, de preferênciaatravés de fusão genética, ou diretamente ou, de preferência, através deuma ligação de aminoácido. Em uma modalidade preferida adicional o se-gundo sítio de ligação é ligado ao terminal C do dito primeiro sítio de ligaçãoexclusivamente por ligações peptídeo, de preferência através de fusão gené-tica.

Ligante: Um "ligante", conforme aqui usado, ou associa o se-gundo sítio de ligação com a molécula de IL-1 ou já compreende, essencial-mente consiste em ou consiste no segundo sítio de ligação. De preferência,um "ligante", conforme aqui usado, já compreende o segundo sítio de liga-ção, tipicamente e de preferência - mas não necessariamente - como umresíduo de aminoácido, de preferência um resíduo de cisteína. Um "ligante"conforme aqui usado é também chamado "ligante de aminoácido", em parti-cular quando um ligante de acordo com a invenção contém pelo menos umresíduo de aminoácido. Deste modo, os termos "ligante" e "ligante de ami-noácido" são intercomutavelmente usados aqui. No entanto, isto não implicaque tal ligante consista exclusivamente em resíduos de aminoácido, mesmose um ligante consistindo em resíduos de aminoácido for uma modalidadepreferida da presente invenção. Os resíduos de aminoácido do ligante são,de preferência, compostos de aminoácidos de ocorrência natural ou aminoá-cidos não-naturais conhecidos na técnica, todos L ou todos D ou misturasdeles. Modalidades preferidas adicionais de um ligante de acordo com apresente invenção são moléculas compreendendo um grupo sulfidrila ou umresíduo cisteína e tais moléculas são, então, também compreendidas napresente invenção. Ligantes adicionais úteis para a presente invenção sãomoléculas compreendendo uma porção C1-C6 alquila, uma cicloalquila talcomo uma ciclopentila ou cicloexila, uma cicloalquenila, arila ou heteroarila.

Além disso, Iigantes compreendendo de preferência uma porção C1-C6 al-quila, cicloalquila (C5, C6), arila ou heteroarila e aminoácido(s) adicional(ais)podem ser também usados como Iigantes para a presente invenção e devemser compreendidos dentro do escopo da invenção. Associação do Iigantecom a molécula de IL-1 é de preferência por meio de pelo menos uma liga-ção covalente, com mais preferência por meio de pelo menos uma ligaçãopeptídeo. No contexto de ligação por fusão genética, um Iigante pode estarausente ou de preferência é um Iigante de aminoácido, com mais preferênciaum Iigante de aminoácido consistindo exclusivamente em resíduos de ami-noácido. Ligantes muito preferidos para fusão genética são Iigantes de ami-noácido flexíveis. No contexto de ligação por fusão genética, Iigantes prefe-ridos consistem em 1 a 20, com mais preferência 2 a 15, com mais preferên-cia ainda de 2 a 10, com mais preferência ainda de 2 a 5 e com mais prefe-rência de 3 aminoácidos. Ligantes muito preferidos para fusão genéticacompreendem ou de preferência consistem em GSG (SEQ ID NO: 189).

Disposição de antígeno ordenada e repetitiva: Conforme aquiusado, o termo "disposição de antígeno ordenada e repetitiva" refere-se emgeral a um padrão de repetição de antígeno ou, caracterizado por uma or-dem típica e de preferência maior de uniformidade em disposição espacialdos antígenos com relação à partícula do tipo vírus, respectivamente. Emuma modalidade da invenção, o padrão de repetição pode ser um padrãogeométrico. Certas modalidades da invenção, tal como antígenos acopladosà VLP de bacteriófagos de RNA, são típicas e exemplos preferidos de dispo-sições de antígeno ordenadas e repetitivas adequadas que, além disso, pos-suem ordens paracristalinas estritamente repetitivas de antígenos, de prefe-rência com espaçamento de 1 a 30 nanometros, de preferência 2 a 15 na-nometros, com mais preferência ainda 2 a 10 nanometros, novamente commais preferência 2 a 8 nanometros, e com mais preferência ainda 1,6 a 7nanometros.

Embalado: O termo "embalado" conforme aqui usado refere-seao estado de uma macromolécula polianiônica ou substâncias imuno-estimuladoras em relação à VLP. O termo "embalado" conforme aqui usadoinclui ligação que pode ser covalente, por exemplo, através de acoplamentoquímico, ou não-covalente, por exemplo, interações tônicas, interações hi-drofóbicas, ligações hidrogênio, etc. O termo também inclui o confinamento,ou confinamento parcial, de uma macromolécula polianiônica. Deste modo, amacromolécula polianiônica ou substâncias imunoestimuladoras podem serconfinadas pela VLP sem a existência de uma ligação real, em particular deuma ligação covalente. Em modalidades preferidas, a pelo menos uma ma-cromolécula polianiônica ou substâncias imuonestimuladoras são embaladasdentro da VLP, com mais preferência de uma maneira não-covalente. Nocaso das ditas substâncias imunoestimuladoras serem ácido nucléico, depreferência um DNA, o termo embalado implica que o dito ácido nucléiconão é acessível à hidrólise de nucleases, de preferência não acessível a hi-drólise de DNAse (por exemplo, DNaseI ou Benzonase), onde de preferênciaa dita acessibilidade é ensaiada conforme descrito nos Exemplos 11-17 doW02003/024481A2.

Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo" conforme aqui usado refe-re-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmenteligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídeo).Ele indica uma cadeia molecular de aminoácidos e não refere-se a um com-primento específico do produto. Deste modo, peptídeos, dipeptídeos, tripep-tídeos, oligopeptíceos e proteínas são incluídos na definição de polipeptídeo.Modificações pós-traducionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações,acetilações, fosforilações e similar são também compreendidas.

VLP recombinante: O termo "VLP recombinante", conforme aquiusado, refere-se a uma VLP que é obtida através de um processo que com-preende pelo menos uma etapa de tecnologia de DNA recombinante. O ter-mo "VLP recombinantemente produzida", conforme aqui usado, refere-se auma VLP que é obtida através de um processo que compreende pelo menosuma etapa de tecnologia de DNA recombinante. Então, os termos "VLP re-combinante" e "VLP recombinantemente produzida" são intercomutavelmen-te usados aqui e devem ter significado idêntico.

Partícula de vírus: O termo "partícula de vírus" conforme aquiusado refere-se à forma morfológica de um vírus. Em alguns tipos de vírusela compreende um genoma circundado por uma proteína capsídeo; outrastêm estruturas adicionais (por exemplo, envelopes, filamentos, etc.).

Partícula do tipo vírus (VLP), conforme aqui usado, refere-se auma partícula de vírus não-replicativa ou não-infecciosa, de preferência umanão-replicativa e não-infecciosa, ou refere-se a uma estrutura não-replicativaou não-infecciosa, de preferência uma não-replicativa e não-infecciosa lem-brando uma partícula de vírus, de preferência um capsídeo de um vírus. Otermo "não-replicativo", conforme aqui usado, refere-se a ser incapaz de re-plicação do genoma compreendido pela VLP. O termo "não-infeccioso", con-forme aqui usado, refere-se a ser incapaz de entrar na célula hospedeiro. Depreferência, uma partícula do tipo vírus de acordo com a invenção é não-replicativa e/ou não-infecciosa uma vez que ela não tem todo ou parte dogenoma viral ou função de genoma. Em uma modalidade, uma partícula dotipo vírus é uma partícula de vírus, onde o genoma viral foi fisicamente ouquimicamente inativado. Tipicamente e com mais preferência uma partículado tipo vírus não tem todos ou parte dos componentes replicativos e infec-ciosos do genoma viral. Uma partícula do tipo vírus de acordo com a inven-ção pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma. Uma modalidadetípica e preferida de uma partícula do tipo vírus de acordo com a presenteinvenção é um capsídeo viral tal como o capsídeo viral do vírus correspon-dente, bacteriófago, de preferência bacteriófago de RNA. O termo "capsídeoviral" ou "capsídeo" refere-se a uma montagem molecular composta de su-bunidades de proteína viral. Tipicamente, existem 60, 120, 180, 240, 300 e360 e mais de 360 subunidades de proteína viral. Tipicamente e de prefe-rência, as interações dessas subunidades levam à formação de capsídeoviral ou estrutura do tipo capsídeo viral com uma organização repetitiva ine-rente, onde a dita estrutura é, tipicamente, esférica ou tubular. Por exemplo,os capsídeos de bacteriófagos de RNA ou HBcAgs têm uma forma esféricade simetria icosaedral. O termo "estrutura do tipo capsídeo", conforme aquiusado, refere-se a uma montagem macromolecular composta de subunida-des de proteína viral lembrando a morfologia do capsídeo no sentido acimadefinido, mas desviando da montagem simétrica típica enquanto mantendoum grau suficiente de ordem e repetitividade. Uma característica comum departículas de vírus e partículas do tipo vírus é a disposição altamente orde-nada e repetitiva de sua subunidade.

Partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA: Conformeaqui usado, o termo "partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA" re-fere-se a uma partícula do tipo vírus compreendendo, ou de preferência con-sistindo essencialmente em ou consistindo em proteínas de revestimento,mutantes ou fragmentos deles, de um bacteriófago de RNA. Em adição, par-tícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA lembrando a estrutura de umbacteriófago de RNA, sendo não-replicativa e/ou não-infecciosa, e sem pelomenos o gene ou genes codificando o mecanismo de replicação do bacterió-fago de RNA, e tipicamente também sem o gene ou genes codificando a pro-teína ou proteínas responsáveis por ligação viral a ou entrada no hospedei-ro. Esta definição deve, no entanto, também compreender partículas do tipovírus de bacteriófagos de RNA, onde o gene ou genes acima mencionadosestão ainda presentes, mas inativos e, então, também levando a partículasdo tipo vírus não-replicativas e/ou não-infecciosas de um bacteriófago deRNA. VLPs preferidas derivadas de bacteriófagos de RNA exibem simetriaicosaedral e consistem em 180 subunidades (monômeros). Métodos preferi-dos para tornar uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA não-replicativa e/ou não-infecciosa é através de inativação física, química, talcomo irradiação por UV, tratamento com formaldeído, tipicamente e de pre-ferência através de manipulação genética.

Um, um ou uma: Quando o termo "um", um ou "uma" é usado napresente descrição, ele significa "pelo menos um" ou "um ou mais" a menosque de outro modo indicado.A identidade de seqüência de aminoácido de polipeptídeos podeser determinada convencionalmente usando programas de computador talcomo o programa Bestfit. Quando usando Bestfit ou qualquer outro progra-ma de alinhamento de seqüência, de preferência usando Bestfit, para deter-minar se uma seqüência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma se-qüência de aminoácido de referência, os parâmetros são ajustados de modoque a porcentagem de identidade é calculada sobre o comprimento completoda seqüência de aminoácido de referência e que lacunas em homologia deaté 5% do número total de resíduos de aminoácido na seqüência de referên-cia são permitidas. Este método acima mencionado na determinação da por-centagem de identidade entre polipeptídeos é aplicável a todas as proteínas,polipeptídeos ou um fragmento deles revelados na presente invenção.

A presente invenção provê composições e métodos para aumen-to das respostas imunes contra IL-1 em um animal ou em humano. As com-posições da invenção compreendem: (a) uma partícula de núcleo com pelomenos um primeiro sítio de ligação, onde a dita partícula de núcleo é umapartícula do tipo vírus (VLP) ou uma partícula de vírus; e (b) pelo menos umantígeno com pelo menos um segundo sítio de ligação, onde o pelo menosum antígeno é uma molécula de IL-1, de preferência selecionada do grupoconsistindo em proteína IL-1, fragmento de IL-1 maduro, peptídeo de IL-1 emuteína de IL-1, onde (a) e (b) são covalentemente ligados através do pelomenos um primeiro e o pelo menos um segundo sítio de ligação. De prefe-rência, a dita molécula de IL-1 é ligada à partícula de núcleo, de modo aformar uma disposição de antígeno-VLP ordenada e repetitiva. Em modali-dades preferidas da invenção, pelo menos 20, de preferência pelo menos30, com mais preferência pelo menos 60, novamente com mais preferênciapelo menos 120 e ainda com mais preferência pelo menos 180 moléculas deIL-1 são ligadas à partícula de núcleo.

Qualquer vírus conhecido na técnica tendo uma estrutura orde-nada e repetitiva pode ser selecionado como uma VLP ou uma partícula devírus da invenção. Vírus de DNA ou RNA ilustrativos, o revestimento ou pro-teína capsídeo dos quais pode ser usado para a preparação de VLPs, foramrevelados no W02004/009124 na página 25, linhas 10-21, na página 26,linhas 11-28 e na página 28, linha 4 até a página 31, linha 4. Essas descri-ções são aqui incorporadas a título de referência.

Vírus ou partícula do tipo vírus pode ser produzido e purificado apartir de culturas celulares infectadas por vírus. O vírus ou partícula do tipovírus resultante para propósito de vacina deve ser de preferência não-replicativo ou não-infeccioso, com mais preferência não-replicativo e não-infeccioso. Irradiação por UV, tratamento químico, tal como com formaldeídoou clorofórmio, são os métodos gerais conhecidos da pessoa versada natécnica para inativar vírus.

Em uma modalidade preferida, a partícula de núcleo é uma par-tícula de vírus, e onde de preferência a dita partícula de vírus é um bacterió-fago, e onde ainda de preferência o dito bacteriófago é um bacteriófago deRNA, e onde com mais preferência ainda o dito bacteriófago de RNA é umbacteriófago de RNA selecionado de Qp, fr, GA ou AP205.

Em uma modalidade preferida, a partícula de núcleo é uma VLP.Em uma modalidade preferida adicional, a VLP é uma VLP recombinante.Quase todos os vírus geralmente conhecidos foram seqüenciados e estãoprontamente disponíveis para o público. O gene codificando a proteína derevestimento pode ser facilmente identificado por um versado na técnica. Apreparação de VLPs ao recombinantemente expressar a proteína de reves-timento em um hospedeiro está dentro do conhecimento comum de um ver-sado na técnica.

Em uma modalidade preferida, a partícula do tipo vírus compre-ende, ou alternativamente consiste em, proteínas recombinantes, mutantesou fragmentos deles, de um vírus selecionado do grupo consistindo em: a)bacteriófagos de RNA; b) bacteriófagos; c) vírus da Hepatite B, de preferên-cia sua proteína capsídeo (Ulrich e outros, Virus Res. 50:141-182 (1998)) ousua proteína de superfície (WO 92/11291); d) vírus do sarampo (Warnes eoutros, Gene 160:173-178 (1995)); e) vírus sindbis-, f) rotavírus (US5.071.651 e US 5.374.426); g) vírus da doença do pé-e-da-boca (Twomey eoutros, Vaccine 13:1603-1610 (1995)); h) vírus Norwalk (Jiang, X. e outros,Science 250:1580-1583 (1990); Matsui, S.M. e outros, J. Clin. Invest.87:1456-1461 (1991)); i) Alfavírus; j) retrovírus, de preferência sua proteínaGAG (WO 96/30523); k) retrotransposon Ty, de preferência a proteína p1; I)vírus Papilloma humano (WO 91/15631); m) vírus Polyoma; n) vírus do mo-saico do tabaco; e o) vírus Flock House.

VLP compreendendo mais de uma proteína recombinante dife-rente é geralmente referida, neste pedido, como VLP de mosaico. Em umamodalidade, a VLP é uma VLP de mosaico, onde a dita VLP de mosaicocompreende, ou consiste em, mais de uma proteína recombinante, de prefe-rência de duas proteínas recombinantes, com mais preferência de duas pro-teínas capsídeo recombinantes, mutantes ou fragmentos deles.

O termo "fragmento de uma proteína recombinante" ou o termo"fragmento de uma proteína de revestimento", conforme aqui usado, é defi-nido como um polipeptídeo que é de pelo menos 70%, de preferência pelomenos 80%, com mais preferência pelo menos 90%, com mais preferênciaainda pelo menos 95% de comprimento da proteína recombinante do tiposelvagem, ou da proteína de revestimento, respectivamente e que de prefe-rência retém a capacidade de formação de VLP. De preferência, o fragmentoé obtido através de pelo menos uma deleção interna, pelo menos um trun-camento ou pelo menos uma combinação deles. Ainda de preferência, ofragmento é obtido através de no máximo 5, 4, 3 ou 2 deleções internas, porno máximo 2 truncamentos ou por exatamente uma combinação deles.

O termo "fragmento de uma proteína recombinante" ou "frag-mento de uma proteína de revestimento" deve se referir ainda a um polipep- tídeo, que tem pelo menos 80%, de preferência 90%, com mais preferênciaainda 95% de identidade de seqüência de aminoácido com o "fragmento deuma proteína recombinante" ou "fragmento de uma proteína de revestimen-to", respectivamente, conforme acima definido e que é de preferência capazde montagem em uma partícula do tipo vírus.

O termo "proteína de revestimento mutante" refere-se a um poli-peptídeo tendo uma seqüência de aminoácido derivada da proteína recom-binante do tipo selvagem, ou proteína de revestimento, respectivamente,onde a seqüência de aminoácido é pelo menos 80%, de preferência pelomenos 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica à seqüência do tipo selvageme de preferência retém a habilidade de montagem em uma VLP.

Em uma modalidade preferida, a partícula do tipo vírus da inven-ção é do vírus da Hepatite Β. A preparação de partículas do tipo vírus daHepatite B foi revelada, inter alia, no WO 00/32227, no WO 01/85208 e noWO 01/056905. Todos os três documentos são explicitamente aqui incorpo-rados a título de referência. Outras variantes de HBcAg adequadas para usona prática da presente invenção foram reveladas nas páginas 34-39 do WO01/056905.

Em uma modalidade preferida adicional da invenção, um resíduode Iisina é introduzido no polipeptídeo de HBcAg, para mediar a ligação demolécula de IL-I à VLP de HBcAg. Em modalidades preferidas, VLPs ecomposições da invenção são preparadas usando um HBcAg compreen-dendo, ou alternativamente consistindo em, aminoácidos 1-144 ou 1-149, 1-185 da SEQ ID NO:1, que é modificado de modo que os aminoácidos nasposições 79 e 80 são substituídos com um peptídeo tendo uma seqüênciade aminoácido de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID N0:170). Esta modificaçãomuda a SEQ ID NO:1 para SEQ ID NO:2. Em modalidades preferidas adi-cionais, o resíduo de cisteína nas posições 48 e 110 da SEQ ID NO:2, ouseus fragmentos correspondentes, de preferência 1-144 ou 1-149, são mu-tados para serina. A invenção inclui ainda composições compreendendo mu-tantes de proteína de núcleo de Hepatite B tendo acima anotadas alteraçõesde aminoácido correspondentes. A invenção inclui ainda composições e va-cinas, respectivamente, compreendendo polipeptídeos de HBcAg que com-preendem, ou alternativamente consistem em, seqüências de aminoácidoque são pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% idênticas à SEQ ID NO:2.

Em uma modalidade preferida da invenção, a partícula do tipovírus da invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consistealternativamente em, proteínas de revestimento recombinantes, mutantes oufragmentos deles, de um bacteriófago de RNA. De preferência, o bacteriófa-go de RNA é selecionado do grupo consistindo em a) bacteriófago Qp; b)bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP;f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófa-go NL95; k) bacteriófago f2; I) bacteriófago PP7 e m) bacteriófago AP205.

Em uma modalidade preferida da invenção, a composição com-preende proteína de revestimento, mutantes ou fragmentos deles, de bacte-riófagos de RNA, onde a proteína de revestimento tem seqüência de amino-ácido selecionada d o grupo consistindo em: (a) SEQ ID NO:3, referindo aΟβ CP; (b) uma mistura de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 (proteína de ΟβA1); (c) SEQ ID NO:5 (proteína capsídeo R17); (d) SEQ ID NO:6 (proteínacapsídeo fr); (e) SEQ ID NO:7 (proteína capsídeo GA); (f) SEQ ID NO:8 (pro-teína capsídeo SP); (g) uma mistura de SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9; (h)SEQ ID N0:10 (proteína capsídeo MS2); (i) SEQ ID NO:11 (proteína capsí-deo M1.1); (j) SEQ ID NO:12 (proteína capsídeo MX1); (k) SEQ ID NO:13(proteína capsídeo NL95); (I) SEQ ID NO: 14 (proteína capsídeo f2); (m) SEQID NO: 15 (proteína capsídeo PP7); e (n) SEQ ID NO:21 (proteína capsídeoAP205).

Em uma modalidade preferida da invenção, a VLP é uma VLPde mosaico compreendendo ou alternativamente consistindo em mais deuma seqüência de aminoácido, de preferência duas seqüências de aminoá-cido, mutantes ou fragmentos deles, de um bacteriófago de RNA.

Em uma modalidade muito preferida, a VLP compreende ouconsiste alternativamente em duas proteínas de revestimento diferentes deum bacteriófago de RNA, as ditas duas proteínas têm uma seqüência deaminoácido de CP de Οβ (SEQ ID NO:3) e CP de Οβ (SEQ ID NO:4) ou CPSP (SEQ ID NO:8) e CP SP A1 (SEQ ID NO:9).

Em modalidades preferidas da presente invenção, a partícula dotipo vírus da invenção compreende, ou alternativamente consiste essencial-mente em, ou alternativamente consistem em, proteínas de revestimentorecombinantes, mutantes ou fragmentos deles, do bacteriófago de RNA Οβ,fr, AP205 ou GA.

Em uma modalidade preferida, a VLP da invenção é uma VLPde bacteriófago de RNA Οβ. O capsídeo ou partícula do tipo vírus Οβ mos-trou uma estrutura de capsídeo tipo fago icosaedral com um diâmetro de 25nm e quasi simetria T=3. O capsídeo contém 180 cópias da proteína de re-vestimento, que são ligadas em pentâmeros e hexâmeros covalentes porpontes dissulfeto (Golmohammadi, R. e outros, Structure 4:543-5554(1996)), levando a uma estabilidade notável do capsídeo de Οβ. Capsídeosou VLPs feitos de proteína de revestimento de Οβ recombinante podem con-ter, no entanto, subunidades não ligadas por ligações dissulfeto a outras su-bunidades dentro do capsídeo, ou incompletamente ligadas. O capsídeo ouVLP de Οβ mostra resistência incomum a solventes orgânicos e agentes dedesnaturação. Surpreendentemente, foi observado pela requerente que con-centrações de DMSO e acetonitrila tão altas quanto 30% e concentrações deguanidina tão altas quanto 1 M não afetam a estabilidade do capsídeo. Aestabilidade alta do capsídeo ou VLP de Οβ é uma característica vantajosa,em particular, para seu uso em imunização e vacinação de mamíferos e hu-manos de acordo com a presente invenção.

Partículas do tipo vírus preferidas adicionais de bacteriófagos deRNA, em particular de Οβ e fr de acordo com a presente invenção são reve-ladas no WO 02/056905, cuja descrição é aqui incorporada a título de refe-rência em sua totalidade. O exemplo particular 18 do WO 02/056905 davadescrição detalhada de preparação de partículas de VLP a partir de Οβ.

Em outra modalidade preferida, uma VLP da invenção é umaVLP de bacteriófago de RNA AP205. Formas mutantes competentes emmontagem de VLPs de AP205, incluindo proteína de revestimento de AP205com a substituição de prolina no aminoácido 5 em treonina, podem ser tam-bém usadas na prática da invenção e leva a outras modalidades preferidasda invenção. O WO 2004/007538 descreve, em particular no Exemplo 1 e noExemplo 2, como se obter VLP compreendendo proteínas de revestimentode AP205, e então em particular a expressão e purificação para elas. O WO2004/007538 é aqui incorporado a título de referência. VLPs de AP205 sãoaltamente imunogênicas e podem ser ligadas com molécula de IL-1 paratipicamente e de preferência gerar construtos de vacina mostrando a molé-cula de IL-1 orientada de uma maneira repetitiva.Em uma modalidade preferida, a VLP da invenção compreendeou consiste em uma proteína de revestimento mutante de um vírus, de prefe-rência um bacteriófago de RNA, onde a proteína de revestimento mutante foimodificada através da remoção de pelo menos um resíduo de Iisina por meiode substituição e/ou por meio de deleção. Em outra modalidade preferida, aVLP da invenção compreende ou consiste em uma proteína de revestimentomutante de um vírus, de preferência um bacteriófago de RNA, onde a prote-ína de revestimento mutante foi modificada através da adição de pelo menosum resíduo de Iisina por meio de substituição e/ou por meio de inserção. Adeleção, substituição ou adição de pelo menos um resíduo de Iisina permitevariação do grau de acoplamento, isto é, da quantidade de molécula de IL-1por subunidades da VLP de um vírus, de preferência de um bacteriófago deRNA, em particular para estar compatível e adaptar as necessidades da va-cina.

Em uma modalidade preferida, as composições e vacinas dainvenção têm uma densidade de antígeno sendo de a partir de 0,5 a 4,0. Otermo "densidade de antígeno", conforme aqui usado, refere-se a um núme-ro médio de moléculas de IL-1 que é ligado por subunidade, de preferênciapor proteína de revestimento, da VLP, e então de preferência da VLP de um bacteriófago de RNA. Deste modo, este valor é calculado como uma médiasobre todas as subunidades da VLP, de preferência da VLP do bacteriófagode RNA, na composição ou vacinas da invenção.

VLPs ou capsídeos da proteína de revestimento de Qp mostramum número definido de resíduos de Iisina em sua superfície, com uma topo- logia definida com três resíduos de Iisina apontando em direção ao interiordo capsídeo e interagindo com o RNA, e quatro outros resíduos de Iisinaexpostos para o exterior do capsídeo. De preferência, o pelo menos um pri-meiro sítio de ligação é um resíduo de lisina, apontando ou estando no exte-rior da VLP.

Mutantes de Οβ, dos quais resíduos de lisina expostos são subs-tituídos por argininas, podem ser usados para a presente invenção. Destemodo, em outra modalidade preferida da presente invenção, a partícula dotipo vírus compreende, consiste essencialmente em ou consiste alternativa-mente em proteínas de revestimento de Οβ mutantes. De preferência essasproteínas de revestimento mutantes compreendem ou consistem alternati-vamente em uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de a) Οβ-240 (SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:16, Lys13-Arg da SEQ ID NO:3); b) Οβ-243(SEQ ID NO:17, AsnIO-Lys da SEQ ID NO:3); c) 0β-250 (SEQ ID NO:18,Lys2-Arg da SEQ ID NO:3); d) αβ-251 (SEQ ID NO:19, Lys16-Arg da SEQID NO:3); e Οβ-259 (SEQ ID N0:30, Lys2-Arg, Lys16-Arg da SEQ ID NO:3).A construção, expressão e purificação das proteínas de revestimento mutan-tes de Οβ, VLPs e capsídeos de proteína de revestimento de Οβ mutanteacima indicados, respectivamente, são descritos no WO 02/056905. Em par-ticular é então referido ao Exemplo 18 do pedido acima mencionado.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, a partículado tipo vírus compreende, ou consiste alternativamente essencialmente em,ou consiste alternativamente em proteína de revestimento mutante de Οβ,ou mutantes ou fragmentos deles, e a proteína A1 correspondente. Em umamodalidade preferida adicional, a partícula do tipo vírus compreende, ouconsiste alternativamente essencialmente em, ou alternativamente consisteem proteína de revestimento mutante com seqüência de aminoácido SEQ IDNO: 16,17, 18, 19 ou 20, e a proteína A1 correspondente.

Proteínas de revestimento de bacteriófago de RNA adicionaisforam também mostradas se automontar quando da expressão em hospe-deiro bacteriano (Kastepein, R.A. e outros, Gene 23:245-254 (1983), Ko-zlovskaya, T.M. e outros, Dokl. Akad. Nauk. SSSR 287:452-455 (1986), A-dhin, M.R. e outros, Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. e outros, J. Mol.Blol. 249:283-297 (1995)). Em particular as propriedades biológicas e bio-químicas de GA (Ni, C.Z. e outros, Protein Sei. 5:2485-2493 (1996), Tars, K.e outros, J. Mol. Biol. 271:759-773 (1997)) e de fr (Pushko, P. e outros, Prot.Eng. 6:883-891 (1993), Liljas e outros, J. Mol. Biol. 244:279-290 (1994)) fo-ram reveladas. A estrutura de cristal de vários bacteriófagos de RNA foi de-terminada (Golmohammadi, R. e outros, Structure 4:543-554 (1996)). Usan-do tal informação, resíduos expostos de superfície podem ser identificadose, então, proteínas de revestimento de bacteriófago de RNA podem ser mo-dificadas de modo que um ou mais resíduos de aminoácido reativos podemser inseridos por meio de inserção ou substituição. Outra vantagem dasVLPs derivadas de bacteriófagos de RNA é seu rendimento de expressãoalto em bactérias que permite produção de grandes quantidades de materiala custo acessível.

Em uma modalidade preferida, a composição da invenção com-preende pelo menos um antígeno, de preferência um a quatro, de preferên-cia um a três, com mais preferência ainda um a dois e com mais preferênciaexatamente um antígeno, onde o dito antígeno é uma molécula de IL-1, depreferência uma proteína de IL-1, um fragmento de IL-1, um fragmento ma-duro de IL-1, um peptídeo de IL-1 ou uma muteína de IL-1, onde a dita molé-cula de IL-1 compreende de preferência ou com mais preferência ainda con-siste em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelomenos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais prefe-rência 100% de identidade de seqüência com qualquer uma das SEQ IDNO:36 a SEQ ID NO:116, SEQ ID N0:130 a SEQ ID N0l:140 e SEQ IDNO: 163 a SEQ ID NO:165.

Em uma modalidade preferida adicional o dito antígeno é umamolécula de IL-1 derivada de um organismo selecionado do grupo consistin-do em: (a) humanos; (b) primatas; (c) roedores; (d) cavalos; (e) ovelha; (f)gato; (g) gado; (h) porco; (i) coelho; (j) cachorro; (k) camundongo; e (I) rato.Com mais preferência a dita molécula de IL-1 é derivada de seres humanos,de preferência compreendendo ou consistindo com mais preferência em umpolipeptídeo tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, commais preferência pelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüência com qual-quer uma das seqüências selecionadas do grupo consistindo sem SEQ IDNO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:64, qualquer uma dasSEQ ID NO:67 a 110 e uma das SEQ ID Nos:130-140 e SEQ ID NO:165.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1derivada de rato ou camundongo, de preferência camundongo, onde a ditamolécula de IL-1 de preferência compreende ou consiste com mais prefe-rência ainda em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferênciapelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com maispreferência 100% de identidade de seqüência com qualquer uma SEQ IDNO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:65, SEQID NO:66, qualquer uma da SEQ ID NO:111 a SEQ ID NO:116, SEQ IDNO:163 e SEQ ID NO:164.

Em uma modalidade preferida adicional, a molécula de IL-1 éuma molécula de IL-1 alfa, de preferência uma proteína IL-1 alfa, um frag-mento de IL-1 alfa, um fragmento maduro de IL-1 alfa, um peptídeo de IL-1alfa ou uma muteína de IL-1 alfa, onde a dita molécula de IL-1 alfa compre-ende ou com mais preferência ainda consiste em um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo consistindo semSEQ ID NOs:36 a 48, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65; SEQ ID NOs:67 a 88 eSEQ ID NO:165. Modalidades especificamente preferidas das moléculas deIL-1 alfa são moléculas de IL-1 alfa humana, de preferência proteínas IL-1alfa humanas, fragmentos de IL-1 alfa humana ou fragmentos maduros deIL-1 alfa humana, onde as ditas moléculas de IL-1 alfa compreendem de pre-ferência ou com mais preferência consistem em um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:163,com mais preferência SEQ ID NO:63.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1 éuma molécula de IL-1 beta, de preferência uma proteína IL-1 beta, um frag-mento de IL-1 beta, um fragmento maduro de IL-1 beta, um peptídeo de IL-1beta ou uma muteína de IL-1 beta, onde a dita molécula de IL-1 beta com-preende de preferência ou com mais preferência ainda consiste em um poli-peptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, depreferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, commais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% deidentidade de seqüência com qualquer uma das seqüências selecionadas dogrupo consistindo em SEQ ID NOs:49 a 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66,SEQ ID NOs:89 a 116, SEQ ID N0:130 a SEQ ID N0:140, SEQ IE NO:164 eSEQ ID NO:165. As modalidades especificamente preferidas de moléculasde IL-1 beta são moléculas de IL-1 beta humanas, de preferência proteínasIL-1 beta humanas, fragmentos de IL-1 beta humana ou fragmentos madurosde IL-1 beta humana, onde as ditas moléculas de IL-1 beta compreendem depreferência ou com consistem com mais preferência ainda em um polipeptí-deo tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais pre-ferência pelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% ecom mais preferência 100% de identidade de seqüência com qualquer umadas SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:64, SEQ ID N0:130 a SEQ ID N0:140 eSEQ ID NO:165, com mais preferência SEQ ID NO:64.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1 é uma proteína IL-1, um fragmento de IL-1 ou, de preferência, um fragmentomaduro de IL-1, onde a dita proteína IL-1, fragmento de IL-1 ou fragmentomaduro de IL-1 de preferência é capaz de se ligar ao receptor de IL-1 e, ain-da com mais preferência, adicionalmente também compreender atividadebiológica.

Em uma modalidade preferida adicional, a dita molécula de IL-1é uma proteína IL-1, onde a dita proteína IL-1 compreende de preferência oucom mais preferência ainda consiste em um polipeptídeo tendo uma se-qüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:62.

Em uma modalidade preferida adicional, a dita proteína IL-1 éuma proteína IL-1 alfa, onde a dita proteína IL-1 alfa compreende de prefe-rência ou com mais preferência ainda consiste em um polipeptídeo tendouma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelomenos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferênciaainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de se-qüência com qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo consis-tindo em SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO:48. Com mais preferência, dita proteí-na IL-1 alfa é uma proteína IL-1 alfa, onde a dita proteína IL-1 alfa humanacompreende de preferência ou com mais preferência ainda consiste em umpolipeptídeo tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, commais preferência pelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüência com a SEQID NO:36.

Em uma modalidade preferida adicional a dita proteína IL-1 éuma proteína IL-1 beta, onde a dita proteína IL-1 beta compreende de prefe-rência ou com mais preferência consiste em um polipeptídeo tendo uma se-qüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência aindapelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüênciacom qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo consistindo emSEQ ID NO:49 a SEQ ID NO:62. Com mais preferência a dita proteína IL-1beta é uma proteína IL-1 beta humana, onde a dita proteína IL-1 beta huma-na compreende de preferência ou com mais preferência ainda consiste emum polipeptídeo tendo pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%,com mais preferência pelo menos 95%, com mais preferência ainda pelomenos 99% e com mais preferência 100% de identidade de seqüência coma SEQ ID NO:49.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1 éum fragmento de IL-1, de preferência um fragmento maduro de IL-1, e ondeo dito fragmento de IL-1 ou dito fragmento maduro de IL-1 de preferência éderivado de camundongo ou ser humano, com mais preferência ser humano.De preferência, o dito fragmento de IL-1 ou dito fragmento maduro de IL-1compreende ou consiste com mais preferência ainda em um polipeptídeotendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80%, de preferênciapelo menos 90%, com mais preferência pelo menos 95%, com mais prefe-rência ainda pelo menos 99% e com mais preferência 100% de identidadede seqüência com qualquer uma das SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO:66, SEQID N0:130 e SEQ ID NO:163 a SEQ ID NO:165.

Em uma modalidade preferida o dito fragmento maduro de IL-1 éum fragmento maduro de IL-1 alfa, onde o dito fragmento maduro de IL-1alfa compreende de preferência atividade biológica e onde ainda o dito frag-mento maduro de IL-1 alfa compreende ou consiste com mais preferênciaainda em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelomenos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelomenos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais prefe-rência 100% de identidade de seqüência com qualquer uma das SEQ ID NO:63 ou SEQ ID NO:65, com mais preferência SEQ ID NO:63.

Em uma modalidade preferida o dito fragmento maduro de IL-1 éum fragmento maduro de IL-1 beta, onde o dito fragmento maduro de IL-1beta compreende de preferência atividade biológica e onde ainda o ditofragmento maduro de IL-1 beta compreende ou consiste com mais preferên-cia ainda em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendopelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferênciapelo menos 95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com maispreferência 100% de identidade de seqüência com qualquer uma das SEQID NO:64, SEQ ID NO:66 e SEQ ID N0:130, com mais preferência SEQ IDNO:64.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1 éum peptídeo de IL-1, onde o dito peptídeo de IL-1 é derivado de camundon-go, rato ou humano, com mais preferência humano. De preferência, o ditopeptídeo de IL-1 compreende ou consiste com mais preferência ainda em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos80%, de preferência pelo menos 90%, com mais preferência pelo menos95%, com mais preferência ainda pelo menos 99% e com mais preferência100% de identidade de seqüência com qualquer uma das SEQ ID NO:67 aSEQ ID N0:116.

Em uma modalidade preferida adicional a dita molécula de IL-1 éuma muteína de IL-1, onde de preferência a dita muteína de IL-1 compreen-de atividade biológica reduzida ou com mais preferência nenhuma, e ondeainda a dita muteína de IL-1 é capaz de se ligar ao receptor de IL-1. Em umamodalidade preferida adicional, a dita muteína de IL compreende ou de pre-ferência consiste em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidoque difere da seqüência de aminoácido de um fragmento maduro de IL-1 em1 a 3, com mais preferência em 1 a 2, e com mais preferência em exatamen-te 1 resíduo de aminoácido. Em uma modalidade preferida adicional a ditamuteína de IL-1 é uma muteína de IL-1 beta, de preferência uma muteína deIL-1 beta, com mais preferência uma muteína de IL-1 beta humana selecio-nada de SEQ ID NO:131 a SEQ ID N0:140.

A presente invenção provê um método de produção da composi-ção da invenção compreendendo (a) provisão de uma VLP com pelo menosuma primeira ligação; (b) provisão de pelo menos um antígeno, onde o ditoantígeno é uma molécula de IL-1, uma proteína de IL-1, um fragmento de IL-1, de preferência um fragmento maduro de IL-1, um peptídeo de IL-1 ou umamuteína de IL-1, com pelo menos um segundo sítio de ligação; e (c) combi-nação da dita VLP com o dito pelo menos um antígeno para produzir a ditacomposição, onde o dito pelo menos um antígeno e a dita VLP são ligadosatravés dos primeiro e segundo sítios de ligação. Em uma modalidade prefe-rida, a provisão do pelo menos um antígeno, isto é, molécula de IL-1, umaproteína de IL-1, um fragmento de IL-1, de preferência um fragmento madurode IL-1, um peptídeo de IL-1 ou uma muteína de IL-1, com o pelo menos umsegundo sítio de ligação é por meio de expressão, de preferência por meiode expressão em um sistema bacteriano, de preferência em E. coli. Geral-mente um tag de purificação, tal como tag His, tag Myc1 tag Fc ou tag HA éadicionado para facilitar o processo de purificação. Em outra abordagem par-ticularmente os peptídeos de IL-1 ou muteínas de IL-1 com não mais do que50 aminoácidos são quimicamente sintetizados.Em uma modalidade preferida da invenção, a VLP com pelo me-nos um primeiro sítio de ligação é ligada à molécula de IL-1 com pelo menosum segundo sítio de ligação através de pelo menos uma ligação peptídeo.Um gene codificando uma molécula de IL-1, de preferência um fragmentomaduro de IL-1, é ligado em estrutura, ou internamente ou de preferência aoterminal N ou C ao gene codificando a proteína de revestimento da VLP. Fu-são pode ser também realizada inserindo seqüências de IL-1 em uma prote-ína de revestimento mutante onde parte da seqüência de proteína de reves-timento foi deletada, que são referidos mais como mutantes de truncamento.Mutantes de truncamento podem ter terminal N ou C, ou deleções internasde parte da seqüência da proteína de revestimento. Por exemplo, para oHBcAg de VLP específica, os aminoácidos 79-80 são substituídos com epí-topo estranho. A proteína de fusão deve de preferência reter a habilidade demontagem em uma VLP quando da expressão que pode ser examinada a-través de eletromicroscopia.

Resíduos de aminoácido de flanqueamento podem ser adiciona-dos para aumentar a distância entre a proteína de revestimento e o epítopoestranho. Resíduos de glicina e serina são aminoácidos particularmente fa-vorecidos para serem usados nas seqüências de flanqueamento. Tal se-qüência de flanqueamento confere flexibilidade adicional, que pode diminuiro efeito de desestabilização potencial de fusão de uma seqüência estranha àseqüência de uma subunidade de VLP e diminuir a interferência com a mon-tagem através da presença do epítopo estranho.

Em outras modalidades, a pelo menos uma molécula de IL-1, de preferência o fragmento maduro de IL-1, pode ser fundida a várias outrasproteínas de revestimento virais, como exemplo, ao terminal C de uma formatruncada da proteína A1 de Οβ (Kozlovska, T.M. e outros, Intervirology 39:9-15 (1996)), ou ser inserida entre as posições 72 e 73 da extensão CP. Comooutro exemplo, a IL-1 pode ser inserida entre os aminoácidos 2 e 3 da fr CP,levando a uma proteína de fusão de IL-1-fr CP (Pushko, P. e outros, ProtEng. 6:883-891 (1993)). Ainda, IL-1 pode ser fundida ao hairpin β protube-rante N-terminal da proteína de revestimento de bacteriófago de RNA MS-2(WO 92/13081). Alternativamente, a IL-1 pode ser fundida a uma proteínacapsídeo de papilomavírus, de preferência à proteína capsídeo principal L1de papilomavírus bovino tipo 1 (BPV-1) (Chackerian, B. e outros, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955. Substituição de amino-ácidos 130-136 de BPV-1 L1 com uma IL-I é também uma modalidade dainvenção. Modalidades adicionais de fusão de uma molécula de IL-1 à prote-ína de revestimento, mutantes ou fragmentos deles, a uma proteína de re-vestimento de um vírus foram reveladas no WO 2004/009124, página 62,linha 20 até página 68, linha 17 e aqui são incorporadas a título de referência.

A US 5.698.424 descreve uma proteína de revestimento modifi-cada de bacteriófago MS-2 capaz de formação de um capsídeo, onde a pro-teína de revestimento é modificada por uma inserção de um resíduo de cis-terna na região hairpin N-terminal, e através de substituição de cada o dosresíduos cisteína localizados externo à região do hairpin N-terminal por umresíduo de aminoácido de não-cisteína. A cisteína inserida pode então serligada diretamente a uma espécie molecular desejada ser apresentada talcomo um epítopo ou uma proteína antigênica.

É notado pela requerente, no entanto, que a presença de umresíduo de cisteína livre exposto no capsídeo pode levar à oligomerização decapsídeo por meio de formação de ponte dissulfeto. Além disso, ligação en-tre capsídeos e proteínas antigênicas por meio de ligações dissulfeto é lábil,em particular, para moléculas contendo porção sulfidrila, e são, ainda, me-nos estáveis em soro do que, por exemplo, ligações tioéter (Martin, F.J. ePhapahadjopouos D. (1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Frag-mente to Preformed Vesicles, J. Biol. Chem. 257:286-288).

Deste modo, em uma modalidade muito preferida adicional dapresente invenção, a associação ou ligação da VLP e pelo menos um antí-geno, isto é, molécula de IL-1, não compreende uma ligação dissulfeto. Ain-da preferido então, a pelo menos uma segunda ligação compreende, ou depreferência é, um grupo sulfidrila. Além disso, novamente em uma modali-dade muito preferida da presente invenção, a associação ou ligação da VLPe da pelo menos uma molécula de IL-1 não compreende uma ligação enxo-fre-enxofre. Preferida mais então, a pelo menos uma segunda ligação com-preende, ou de preferência é, um grupo sulfidrila. Em uma modalidade muitopreferida adicional, o dito pelo menos um primeiro sítio de ligação não é ounão compreende um grupo sulfidrila. Em novamente uma modalidade muitopreferida adicional, o dito pelo menos um sítio de ligação não é ou não com-preende um grupo sulfidrila de uma cisteína.

Em uma modalidade preferida adicional a dita pelo menos umaprimeira ligação compreende um grupo amino e a dita primeira ligação com-preende um grupo sulfidrila.

Em uma modalidade preferida adicional apenas um dos ditossegundos sítios de ligação se associa com o dito primeiro sítio de ligaçãoatravés de pelo menos uma ligação covalente não-peptídeo levando a umtipo único e uniforme de ligação da dita molécula de IL-1 à dita partícula denúcleo, onde o dito apenas um segundo sítio de ligação que se associa como dito primeiro sítio de ligação é um grupo sulfidrila, e onde a dita moléculade IL-1 e a dita partícula de núcleo interagem através da dita associaçãopara formar uma disposição de antígeno ordenada e repetitiva.

Em outra modalidade preferida, uma molécula de IL-1, de prefe-rência uma proteína IL-1, com mais preferência um fragmento maduro de IL-1, com mais preferência ainda um fragmento maduro de IL-1 compreenden-do ou consistindo nas seqüências de aminoácido SEQ ID NO:63 a SEQ IDNO:66, com mais preferência SEQ ID NOI:63 ou SEQ ID NO:64, é fundidaou ao terminal N ou C, de preferência ao terminal C, de uma proteína de re-vestimento, mutantes ou fragmentos deles, de bacteriófago de RNA Ap205.VLPs compreendendo proteínas de fusão de proteína de revestimento debacteriófago AP205 com um antígeno são geralmente reveladas noW02006/032674A1 que é aqui incorporado a título de referência. Em umamodalidade preferida adicional, a proteína de fusão compreende ainda umligante, onde o dito Iigante é fundido à proteína de revestimento, fragmentosou mutantes deles, de Ap205 e à molécula de IL-1. Em uma modalidade pre-ferida adicional a dita molécula de IL-1 é fundida ao terminal C da dita prote-ína de revestimento, fragmentos ou mutantes deles, de AP205 através dodito ligante.

Foi constatado que moléculas de IL-1, em particular proteínas IL-1 e fragmentos de IL-1 compreendendo pelo menos 100 e até 300 aminoáci-dos, tipicamente e de preferência cerca de 140 a 160 aminoácidos e commais preferência cerca de 155 aminoácidos, podem ser fundidas à proteínade revestimento de bacteriófagos, de preferência à proteína de revestimentode AP205, enquanto mantendo a habilidade da proteína de revestimento emse automontar em uma VLP.

Dado o tamanho grande das proteínas IL-1, fragmentos de IL-1 efragmentos maduros de IL-1 e também por razões estéricas, um sistema deexpressão produzindo VLPs de mosaico compreendendo proteínas de re-vestimento AP205 fundidas a uma molécula de IL-1 bem como com subuni-dades de proteína de revestimento wt foi construído. Neste sistema, supres-são do códon de parada dá a fusão da proteína de revestimento AP205-IL1,enquanto terminação apropriada dá a proteína de revestimento AP205 wt.Ambas proteínas são produzidas simultaneamente na célula e montam emuma VLP de mosaico. A vantagem de tal sistema é que proteínas grandespodem ser mostradas sem interferência com a montagem da VLP. Como onível de incorporação de proteína de fusão AP205-IL-1 na VLP de mosaico édependente do nível de supressão, AP205-IL-1 é expressa em células de E.coli\á contendo um plasmídeo superexpressando um t-RNA supressor. Parasupressão de opal, plasmídeo plSM3001 (Smiley, B.K., Minion, F.C. (1993)Enhanced reathrough of opal (UGA) stop codons and production of Myco-plasma pneumonia P1 epitopes in Escherichia coli. Gene 134, 33-40), quecodifica um t-RNA supressor reconhecendo o códon de parada opal e intro-duzindo Trp, é usado. Supressão de terminação amber pode ser aumentadaatravés do uso de plasmídeo plSM579, que superexpressa um t-RNA su-pressor reconhecendo o códon de parada amber e introduzindo Trp também.O plasmídeo plSM579 foi gerado através de excisão do gene trp176 deplSM3001 com ehdonuclease de restrição EcoRI e substituindo-o por umfragmento de EeoRIdo plasmídeo pMY579 (presente de Michael Yarus) con-tendo um gene supressor de t-RNA de amber. Este gene supressores de t-RNA é um mutante de trpT175 (Raftery, L.A. e outros (1984) J. Bacteriol.158:849-859) e difere de trpT em três posições: G33, A24 e T35. Expressãoda proteína de fusão AP205-interleucina-1 alfa em uma linhagem de E. colicom supressão de amber supE ou glnV) tal como JM109 de E. coli pode ge-rar uma proporção de proteínas de fusão AP205-IL-1 com um Gln ao invésde Trp induzido no códon de parada amber, em adição a proteínas de fusãoAp205-IL-1com um Trp introduzido no códon de parada amber. A identidadedo aminoácido traduzido no códon de parada pode então depender da com-binação de t-RNA supressor superexpresso, e fenótipo da linhagem. Con-forme descrito por Miller, J.H. e outros ((1983) J. MoL Biol. 164:59-71) e ébem conhecido na técnica, a eficiência de supressão é dependente do con-texto. Em particular, o códon 3' do códon de parada e a primeira base 3' docódon de parada são particularmente importantes. Por exemplo, o códon deparada seguido por uma base purina são em geral bem suprimidos.

Então, em uma modalidade preferida a dita VLP é uma VLP demosaico, onde a dita VLP de mosaico compreende ou consiste de preferên-cia em pelo menos um, de preferência um, primeiro polipeptídeo e em pelomenos um, de preferência um, segundo polipeptídeo, onde o dito primeiropolipeptídeo é uma proteína capsídeo recombinante, mutante ou fragmentosdele, e onde o dito segundo polipeptídeo é um produto de fusão genética deuma proteína capsídeo recombinante, mutante ou fragmentos dele, de prefe-rência do dito polipeptídeo, com uma molécula de IL-1. Em uma modalidadeadicional o dito primeiro polipeptídeo é uma proteína capsídeo recombinantede bacteriófago AP205 ou um mutante ou fragmento dele. Em uma modali-dade preferida adicional o dito primeiro polipeptídeo é selecionado de SEQID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23. Em uma modalidade muito prefe-rida o dito primeiro polipeptídeo é SEQ ID NO:21. VLPs de mosaico do bac-teriófago AP205 compreendendo um antígeno são geralmente reveladas no W02006/032674A1, em particular no parágrafo 7 da dita publicação. Emuma modalidade preferida adicional o dito segundo polipeptídeo é um produ-to de fusão genética de uma proteína capsídeo recombinante, mutante oufragmento dele, de preferência do dito polipeptídeo, com uma molécula deIL-1, onde a dita molécula de IL-1 é fundida ao terminal C da dita proteínacapsídeo recombinante, mutante ou fragmento dele, de preferência atravésde um ligante de aminoácido. Em uma modalidade preferida adicional a ditamolécula de IL-1 compreende ou de preferência consiste em 100 a 300 ami-noácidos, tipicamente e de preferência cerca de 140 a 160 aminoácidos, ecom mais preferência cerca de 155 aminoácidos. Em uma modalidade muitopreferida, a razão molar do dito primeiro polipeptídeo e dito segundo polipep-tídeo na dita VLP de mosaico é 10:1 a 5:1, de preferência 8:1 a 6:1, commais preferência cerca de 7:1.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a composi-ção compreende ou alternativamente consiste essencialmente em uma par-tícula do tipo vírus com pelo menos um primeiro sítio de ligação ligado a pelomenos um antígeno, isto é, uma molécula de IL-1, com pelo menos um se-gundo sítio de ligação através de pelo menos uma ligação covalente, ondede preferência a ligação covalente é uma ligação não-peptídeo. Em umamodalidade preferida da presente invenção, o sítio de ligação compreende,ou de preferência é, um grupo amino, de preferência o grupo amino de umresíduo lisina. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o se-gundo sítio de ligação compreende ou de preferência é um grupo sulfidrila,de preferência um grupo sulfidrila de uma cisteína.

Em uma modalidade muito preferida da invenção, pelo menosum primeiro sítio de ligação é um grupo amino, de preferência um grupo a-mino de um resíduo lisina e pelo menos um segundo sítio e ligação é umgrupo sulfidrila, de preferência um grupo sulfidrila de uma cisteína.

Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de IL-1 éligada à VPL através de ligação com cruzamento química, tipicamente e depreferência usando um ligante com cruzamento hetero-bifuncional. Em mo-dalidades preferidas, o Iigante com cruzamento hetero-bifuncional contémum grupo funcional que pode reagir com os primeiros sítios de ligação, depreferência com o grupo amino, com mais preferência com os grupos aminode resíduo(s) de lisina da VLP e um grupo funcional adicional que pode rea-gir com o segundo sítio de ligação preferido, isto é, um grupo sulfidrila, depreferência de resíduo de cisteína(s) inerente de, ou artificialmente adiciona-do à molécula de IL-1, e opcionalmente também tornado disponível para re-ação através de redução. Vários Iigantes com cruzamento hetero-bifuncio-nais são conhecidos na técnica. Esses incluem os Iigantes com cruzamentoSMPH (Pierce), Sulfo-MBS, SUlfo-EMCs, Sulfo-GMBS, sulfo-SIAB, SUIfo-SMPB1 Sulfo SMCC, SVSB, SAI e outros Iigantes com cruzamento disponí-veis por exemplo da Pierce Chemical Company e tendo um grupo funcionalreativo com relação a grupos amino e um grupo funcional reativo com rela-ção a grupos sulfidrila. Os Iigantes com cruzamento acima mencionados le-vam todos à formação de uma ligação amida após reação com o grupo ami-no e uma ligação tioéter com os grupos sulfidrila. Outra classe de Iigantescom cruzamento adequados na prática da invenção é caracterizada pelaintrodução de uma ligação dissulfeto entre a molécula de IL-1 e a VPL quan-do do acoplamento. Ligantes com cruzamento preferidos pertencentes a es-ta classe incluem, por exemplo, SPD e SuIfo-LC-SPDP (Pierce).

Em uma modalidade preferida, a composição da invenção com-preende ainda um ligante. Engenharia de um segundo sítio de ligação namolécula de IL-1 é conseguida através da associação de um ligante, de pre-ferência contendo pelo menos um aminoácido adequado como segundo sítiode ligação de acordo com as descrições da presente invenção. Deste modo,em uma modalidade preferida da presente invenção, um ligante é associadoà molécula de IL-1 por meio de pelo menos uma ligação covalente, de prefe-rência, pelo menos uma, de preferência uma ligação peptídeo. De preferên- cia, o ligante compreende o, ou alternativamente consiste no, segundo sítiode ligação. Em uma modalidade preferida adicional, o ligante compreendeum grupo sulfidrila, de preferência de um resíduo cisteína. Em outra modali-dade preferida, o ligante de aminoácido é um resíduo de cisteína.

A seleção de um ligante será dependente da natureza da molé-cuia de IL-1, de suas propriedades bioquímicas, tal como PI, distribuição decarga e glicosilação. Em geral, Iigantes de aminoácido flexíveis são favoreci-dos. Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, o liganteconsiste em aminoácidos, onde ainda de preferência o Iigante consiste empelo menos um e no máximo 25, de preferência no máximo 20, com maispreferência no máximo 15 aminoácidos. Em uma modalidade preferida no-vamente da invenção, o Iigante de aminoácido contém 1 a 10 aminoácidos.

Modalidades preferidas do Iigante são selecionadas do grupo consistindoem: (a) CGC (SEQ IS NO: 171); (b) Iigante gama 1 N-terminal, de preferênciaCGDKTHTSPP (SEQ ID NO: 172); (c) Iigante gama 3 N-terminal, de prefe-rência CGGPKPSTPPGSSGGAP (SEQ ID NO: 173); (d) regiões de impedi-mento lg; (e) Iigantes de glicina N-terminais, de preferência GCGGGG (SEQID NO:174); (f) (G)kC(G)n com n=0-12 e k=0,5 (SEQ ID NO:175); (g) Iigantesde glicina-serina N-terminais, de preferência (GGGGS)n, n=1-3 (SEQ ID' NO:176) com uma cisteína adicional; (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n com n=0-3, k=0,5, m=0-10, 1=0-2 (SEQ ID NO:177); (i) GGC (SEQ ID ΝΟ.Ί78); (k)GGC-NH2 (SEQ ID NO: 179); (I) Iigante gama-1 C-terminal, de preferênciaDKTHTSPPCG (SEQ ID NO: 180); (m) Iigante gama-3 C-terminal, de prefe-rência PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEQ ID NO:181); (n) Iigantes de glicinaC-terminais, de preferência GGGGCG (SEQ ID NO:182); (o) (G)nC(G)k comn=0-12 e k=0-5 (SEQ ID NO:183); (p) Iigantes de glicina-serina C-terminais,de preferência (SGGGG)n n=1-3 (SEQ ID NO:184 com uma cisteína adicio-nal; (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(k) com n=0-3, k=0-5, m=0-10,1=0,2 e o=0-8 (SEQ ID NO:185). Em uma modalidade preferida adicional o Iigante é adi-cionado ao N-terminal da molécula de IL-1. Em outra modalidade preferidainvenção, o Iigante é adicionado ao terminal C da molécula de IL-1.

Ligantes preferidos de acordo com a presente invenção são Ii-gantes de glicina (G)n contendo ainda um resíduo de cisteína como segundosítio de ligação, tal como Iigante de glicina N-terminal (GCGGGG, SEQ IDNO: 174) e Iigante de glicina N-terminal (GGGGCG, SEQ I=D NO:182). Mo-dalidades preferidas adicionais são Iigante de glicina-lisina C-terminais(GGKKGC, SEQ ID NO: 186) e Iigante de glicina-lisina N-terminal (CGKKGG, SEQ ID NO:187), GGCG (SEQ ID NO:188) e Iigantes GGC (SEQ IDNOI:178) ou GGC-NH2 (SEQ ID NO:179, "NH2" significa amidação) ou ter-minal C do peptídeo ou CGG (SEQ ID NO:171) em seu terminal. Em geral,resíduos de Iisina serão inseridos dentre os aminoácidos volumosos e a cis-terna a serem usados como segundo sítio de ligação, para evitar impedimen-to estérico potencial do aminoácido mais volumoso na reação de acoplamento.

Ligação da molécula de IL-1 à VLP usando um ligante com cru-zamento hetero-bifuncional de acordo com os métodos preferidos descritosacima permite acoplamento da molécula de IL-1 à VLP de uma maneira ori-entada. Outros métodos de ligação da molécula de IL-1 à VLP incluem mé-todos onde a molécula de IL-1 é ligada com cruzamento à VPL, usando acarbodiimida EDC, e NHS. A molécula de IIL-I pode ser também primeirotiolada através de reação, por exemplo, com SATA, SATP ou iminotiolano. Amolécula de IL-1, após desproteção se requerido, pode então ser acoplada àVPL como segue. Após separação de reagente de tiolação em excesso, amolécula de IL-1 é reagida com a VLP, previamente ativada com um ligantecom cruzamento hetero-bifuncional compreendendo uma porção reativa decisteína, e então mostrando pelo menos um ou vários grupo funcionais reati-vos com relação a resíduos de cisteína, para os quais a molécula de IL-1tiolada pode reagir, tal como acima descrito. Opcionalmente, quantidadesbaixas de um agente de redução são incluídas na mistura de reação. Emmétodos adicionais, a molécula de IL-1 é ligada à VLP, usando um Iigantecom cruzamento homo-bifuncional tal como glutaraldeído, DSG, BM[PEO]4,BS3, (Pierce) ou outros Iigantes com cruzamento homobifuncionais conheci-dos com grupos funcionais com relação a grupos amina ou grupos carboxilada VLP.

Em outras modalidades da presente invenção, a composiçãocompreende ou alternativamente consiste essencialmente em uma partículado tipo vírus ligada à molécula de IL-1 através de interações químicas, ondepelo menos uma dessas interações não é uma ligação covalente.

Ligação da VLP à molécula de IL-1 pode ser realizada atravésde biotinilação da VLP e expressando a molécula de IL-1 como uma proteínade fusão de estreptavidina.

Uma ou várias moléculas de antígeno, isto é, moléculas de IL-1,podem ser ligadas a uma subunidade da VLP1 de preferência de proteínasde revestimento de bacteriófago de RNA1 de preferência através da exposi-ção de resíduos de Iisina das proteínas de revestimento de VLP de bacterió-fago de RNA, se estericamente permissível. Uma característica específicadas VLPs de bacteriófago de RNA e em particular da proteína de revesti-mento de VLP de Οβ é então a possibilidade de acoplar vários antígenos porsubunidade. Isto permite a geração de uma disposição de antígeno densa.

Em modalidades muito preferidas da invenção, a molécula de IL-1 é ligada através de um resíduo de cisteína, tendo sido adicionado ou aoterminal N ou ao terminal C de, ou um resíduo de cisteína natural dentro deuma molécula de IL-1, a resíduos de Iisina de proteínas de revestimento das1 VLPs de bacteriófago de RNA, e em particular à proteína de revestimento de Οβ.

Conforme acima descrito, quatro resíduos de Iisina são expostossobre a superfície da VLP da proteína de revestimento de Οβ. Tipicamente ede preferência esses resíduos são derivatizados quando da reação com umamolécula Iigante de cruzamento. No caso onde nem todos os resíduos deIisina expostos podem ser acoplados a um antígeno, os resíduos de Iisinaque foram reagidos com o Iigante de cruzamento são deixados com umamolécula de ligação com cruzamento ligada ao grupo ε-amino após a etapade derivatização. Isto leva ao desaparecimento de uma ou várias cargas po-sitivas, que pode ser prejudicial para a solubilidade e estabilidade da VLP.

Ao substituir alguns dos resíduos de Iisina com arginina, como nos mutantesde proteína de revestimento de Οβ revelados, é prevenido o desaparecimen-to excessivo de cargas positivas uma vez que os resíduos de arginina nãoreagem com os Iigantes com cruzamento preferidos. Além disso, substitui-ção dos resíduos de Iisina por resíduos arginina pode levar a disposições deantígeno mais definidas, uma vez que menos sítios estão disponíveis parareação com o antígeno.

Deste modo, resíduos de Iisina expostos foram substituídos porargininas nos mutantes de proteína de revestimento de Οβ que seguem: Οβ-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 16), 0β-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ IDNO: 18), Οβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID N0:20) e Οβ-251 (Lys16-Arg, SEQ ID NO:19). Em uma modalidade adicional, foi revelada uma prote-ína de revestimento mutante de Οβ com um resíduo de Iisina adicional deΟβ-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO:17), adequada para obtenção de disposi-ções de antígenos de densidade ainda maior.

Em uma modalidade preferida da invenção, a VLP de um bacte-riófago de RNA é recombinantemente produzida por um hospedeiro e onde adita VLP é essencialmente livre de RNA hospedeiro, de preferência ácidosnucléicos. Em uma modalidade preferida adicional, a composição compre-ende ainda pelo menos uma macromolécula polianiônica ligada a, de prefe-rência embalada na ou encerrada na, VLP. Em ainda uma modalidade prefe-rida, a macromolécula polianiônica é ácido poliglutâmico e/ou ácido poliaspártico.

Em outra modalidade preferida, a composição compreende ain-da pelo menos uma substância imunoestimuladora ligada a, de preferênciaembalada na ou encerrada na, VLP. Em uma modalidade ainda adicionalpreferida, a substância imunoestimuladora é um ácido nucléico, de preferên-cia DNA, com mais preferência um oligonucleotídeo contendo CpG não-metilado.

Essencialmente livre de RNA hospedeiro, de preferência ácidosnucléicos hospedeiro: O termo "essencialmente livre de RNA de hospedeiro,de preferência ácidos nucléicos hospedeiro" conforme aqui usado, refere-seà quantidade de RNA de hospedeiro, de preferência ácidos nucléicos hos-pedeiro, compreendidas pela VLP, quantidade que tipicamente e de prefe-rência é menos do que 30 μg, de preferência menos do que 20 μ, com maispreferência menos do que 10 μg, com mais preferência ainda menos do que8 μg, com mais preferência ainda menos do que 6 μg, com mais preferênciaainda menos do que 4 μg, com mais preferência menos do que 2 μg, por mgda VLP. Hospedeiro, conforme usado dentro do contexto acima mencionado,refere-se ao hospedeiro onde a VLP é recombinantemente produzida. Méto-dos convencionais de determinação da quantidade de RNA, de preferênciaácidos nucléicos, são conhecidos da pessoa versada na técnica. O métodotípico e preferido para determinar a quantidade de RNA1 de preferência áci-dos nucléicos, de acordo com a presente invenção é descrito no Exemplo 17do W02006/037787A2. Condições idênticas, similares ou análogas são, tipi-camente e de preferência, usadas para a determinação da quantidade deRNA, de preferência ácidos nucléicos, para composições da invenção com-preendendo VLP outra que não de Qp. As modificações das condições even-tualmente necessárias estão dentro do conhecimento da pessoa versada natécnica. O valor numérico das quantidades determinadas deve tipicamente ede preferência ser entendido como compreendendo valores tendo um desviode ±10%, de preferência tendo um desvio de ±5%, do valor numérico indicado.

Macromolécula polianiônica. O termo "macromolécula polianiôni-ca", conforme aqui usado, refere-se a uma molécula de massa molecularrelativa alta que compreende grupos repetitivos de carga negativa, cuja es-trutura compreende essencialmente a repetição múltipla de unidades deriva-das, atualmente ou conceitualmente, de moléculas de massa molecular rela-tiva baixa. Uma macromolécula polianiônica deve ter um peso molecular depelo menos 200 Dáltons, com mais preferência pelo menos 3000 Dáltons ecom mais preferência ainda de pelo menos 5000 Dáltons. O termo "macro-molécula polianiônica" conforme aqui usado, tipicamente e de preferênciarefere-se a uma molécula que não é capaz de ativação de receptores tipoto//. Deste modo, o termo "macromolécula polianiônica" tipicamente e de pre-ferência exclui Iigantes de receptores tipo to//, e com mais preferência aindade preferência exclui ainda substâncias imunoestimuladoras tal como Iigan-tes de receptores tipo to//, ácidos nucléicos imunoestimuladores e Iipopolis-sacarídeos (LPS). Com mais preferência, o termo "macromolécula polianiô-nica" conforme aqui usado refere-se a uma molécula que não é capaz deindução de produção de citocina. Com mais preferência ainda, o termo "ma-cromolécula polianiônica" exclui substâncias imunoestimuladoras. O termo"substância imunoestimuladora", conforme aqui usado, refere-se a uma mo-lécula que é capaz de indução e/ou aumento da resposta imune especifica-mente contra o antígeno compreendido na presente invenção.RNA de hospedeiro, de preferência ácidos nucléicos hospedeiro:

O termo "RNA hospedeiro, de preferência ácidos nucléicos hospedeiro" ou otermo "RNA hospedeiro, de preferência ácidos nucléicos hospedeiro, comestrutura secundária", conforme aqui usado, refere-se ao RNA, ou de prefe-rência ácidos nucléicos, que são originalmente sintetizados pelo hospedeiro.

O RNA, de preferência ácidos nucléicos, pode, no entanto, sofrer mudançasquímicas e/ou físicas durante o procedimento de redução ou eliminação daquantidade de RNA, de preferência ácidos nucléicos, tipicamente e de prefe-rência por meio dos métodos da invenção, por exemplo, o tamanho do RNA,de preferência ácidos nucléicos, pode ser encurtado ou a sua estrutura se-cundária pode ser alterada. No entanto, mesmo tal RNA ou ácidos nucléicosresultantes são ainda considerados como RNA hospedeiro, ou ácidos nu-cléicos hospedeiro.

Métodos para determinar a quantidade de RNA e reduzir a quan-tidade de RNA compreendida pela VLP foram revelados no pedido de paten-te provisório US depositado pelo mesmo cessionário em 5 de outubro de2004 e então o pedido em sua totalidade é aqui incorporado a título de refe-rência. Redução ou eliminação da quantidade de RNA hospedeiro, de prefe-rência nucléico hospedeiro, minimiza ou reduz as respostas de célula T in-desejadas, tal com resposta de célula T inflamatória e resposta de célula Tcitotóxica, e outros efeitos colaterais indesejados, tal como febre, enquantomantendo resposta de anticorpo forte especificamente contra IL-1.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê ummétodo de preparação das composições da invenção e VLP de um bacterió-fago de RNA da invenção, onde a dita VLP é recombinantemente produzidapor um hospedeiro e onde a dita VLP é essencialmente livre de RNA hospe-deiro, de preferência ácidos nucléicos, compreendendo as etapas de: a)produção recombinantemente de uma partícula do tipo vírus (VLP) com pelomenos um primeiro sítio de ligação por um hospedeiro, onde a dita VLPcompreende proteínas de revestimento, variantes ou fragmentos delas, deum bacteriófago de RNA; b) desmontagem da dita partícula do tipo vírus pa-ra as ditas proteínas revestidas, variantes ou fragmentos dela, do dito bacte-riófago de RNA; c) purificação das ditas proteínas de revestimento, variantesou fragmentos delas; d) remontagem das ditas proteínas de revestimentopurificadas, variantes ou fragmentos delas, do dito bacteriófago de RNA parauma partícula do tipo vírus, onde a dita partícula do dito vírus é essencial-mente livre de RNA hospedeiro, de preferência ácidos nucléico hospedeiro;e e) ligação de pelo menos um antígeno da invenção com pelo menos umsegundo sítio de ligação à dita VLP obtida a partir da etapa d). Em uma mo-dalidade preferida adicional, a remontagem das ditas proteínas de revesti-mento purificadas, variantes ou fragmentos delas, é realizada na presençade pelo menos uma macromolécula polianiônica.

Em um aspecto, a invenção provê uma vacina compreendendo acomposição da invenção. Em uma modalidade preferida, a molécula de IL-Ique é ligada à VLP na composição de vacina pode ser de animal, de prefe-rência de origem de mamífero ou humana. Em modalidades preferidas, aIL-1 da invenção é de origem humana, bovina, de cachorro, gato, camun-dongo, rato, porco ou cavalo.

Em outra modalidade preferida, a composição de vacina com-preende ainda pelo menos um adjuvante. A administração do pelo menosum adjuvante pode por isso acontecer antes, contemporaneamente ou apósa administração da composição da invenção. O termo "adjuvante" conformeaqui usado refere-se a estimuladores não-específicos da resposta imune ousubstâncias que permitem a geração de um depósito no hospedeiro quequando combinado com a vacina e composição farmacêutica, respectiva-mente, da presente invenção pode prover uma resposta imune ainda maisaumentada.

Em outra modalidade preferida, a composição de vacina é desti-tuída de adjuvante.

Uma característica vantajosa da presente invenção é a imuno-genicidade alta da composição, mesmo na ausência de adjuvantes. A au-sência de um adjuvante, ainda, minimiza a ocorrência de respostas de célulaT inflamatórias indesejadas, representando uma preocupação com seguran-ça na vacinação contra auto-antígenos. Então, a administração da vacina dainvenção a um paciente vai de preferência acontecer sem administração depelo menos um adjuvante ao mesmo paciente antes da, contemporanea-mente a ou após a administração da vacina.

A invenção revela ainda um método de imunização compreen-dendo administrar a vacina da presente invenção a um animal ou um huma-no. O animal é de preferência um mamífero, tal como gato, ovelha, porco,cavalo, bovino, cachorro, rato, camundongo e particularmente humano. Avacina pode ser administrada a um animal ou um humano através de váriosmétodos conhecidos na técnica, mas será normalmente administrada atra-vés de injeção, infusão, inalação, administração oral ou outros métodos físi-cos adequados. Os conjugados podem ser alternativamente administradosintramuscularmente, intravenosamente, transmucosalmente, transdermal-mente, intranasalmente, intraperitonealmente ou subcutaneamente. Compo-nentes de conjugados para administração incluem soluções e suspensõesaquosas estéreis (por exemplo, salina fisiológica) ou não-aquosas. Exemplosde solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vege-tais tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato deetila. Veículos ou curativos oclusivos podem ser usados para aumentar apermeabilidade da pele e aumentar a absorção de antígeno.

As vacinas da invenção são ditas ser "farmacologicamente acei-táveis" se sua administração puder ser tolerada por um indivíduo recipiente.Ainda, as vacinas da invenção serão administradas em uma "quantidadeterapeuticamente eficaz" (isto é, uma quantidade que produz um efeito fisio-lógico desejado). A natureza ou tipo de resposta imune não é um fator Iimi-tante da descrição. Sem a intenção de limitar a presente invenção pelo me-canismo de explicação que segue, a vacina da invenção pode induzir anti-corpos que se ligam à IL-1 e então reduzindo sua concentração e/ou interfe-rindo com sua função fisiológica ou patológica.

Em um aspecto, a invenção provê uma composição farmacêuti-ca compreendendo a composição conforme ensinado na presente invençãoe um veículo farmacêutico aceitável. Quando a vacina da invenção é admi-nistrada a um indivíduo, ela pode estar na forma que contém sais, tampões,adjuvantes ou outras substâncias que são desejáveis para melhorar a eficá-cia do conjugado. Exemplos de materiais adequados para uso em prepara-ção de composições farmacêuticas são providos em várias fontes incluindoRemington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., Ed., Mack PUbIishing Co.,(1990)).

A invenção ensina um processo para produção da composiçãoda invenção compreendendo as etapas de: (a) provisão de uma VLP compelo menos um primeiro sítio de ligação; (b) provisão de uma molécula de IL-1 com pelo menos um segundo sítio de ligação; e (c) combinação da ditaVLP e da dita molécula de IL-1 para produzir uma composição, onde a ditamolécula de IL-1 e a dita VLP são ligadas através dos primeiro e segundosítios de ligação.

Em uma modalidade preferida adicional, a etapa de provisão deuma VLP com pelo menos um primeiro sítio de ligação compreende as eta-pas adicionais: (a) desmontagem da dita partícula do tipo vírus para as pro-teínas de revestimento, mutantes ou fragmentos deles, do dito bacteriófagode RNA; (b) purificação das ditas proteínas de revestimento, mutantes oufragmentos deles; (c) remontagem das ditas proteínas de revestimento puri-ficadas, mutantes ou fragmentos deles, do dito bacteriófago de RNA parauma partícula do tipo vírus, onde a dita partícula do tipo vírus é essencial-mente livre de RNA hospedeiro, de preferência ácidos nucléicos hospedeiro.Em ainda uma modalidade preferida adicional, a remontagem das ditas pro-teínas de revestimento purificadas é realizada na presença de pelo menosuma macromolécula polianiônica.

A invenção provê um método de uso das composições da inven-ção para tratamento e/ou atenuação de doenças ou condições onde IL-1exerce uma função patológica importante em um animal ou em ser humano.

A invenção provê ainda o uso das composições da invenção ouda vacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para afabricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais prefe-rência ser humano, onde a dita doença é de preferência selecionada do gru-po consistindo em: (a) doenças vasculares, de preferência da artéria coroná-ria, aterosclerose e vasculite, com mais preferência aterosclerose; (b) doen-ças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas, de preferência Febre Medi-terrânea Familiar (FMF), Síndrome Auto-inflamatória ao Frio Familiar(FCAS), Doença Inflamatória Multissistêmica de Início Neonatal (NOMID) eSíndrome Mucke Wells, com mais preferência Febre Mediterrânea Familiar(FMF); (c) doenças inflamatórias autoimunes crônicas, de preferência artritereumatóide, artrite idiopática de início juvenil sistêmica, doença de Still deinício adulto, psoríase, doença de Crohn e colite ulcerativa, de preferênciaartrite reumatóide; (d) doenças regenerativas do osso e cartilagem, de prefe-rência gota, osteoporose e osteoartrite, com mais preferência osteoartrite;(e) doenças alérgicas, de preferência hipersensibilidade por contato, hiper-sensibilidade do tipo 1 e alergia, com mais preferência alergia; e (f) doençasneurológicas, de preferência doença de Alzheimer, epilepsia, doença deParkinson e esclerose múltipla, com mais preferência esclerose múltipla.

A invenção provê ainda uso das composições da invenção ou davacina da invenção ou da composição da invenção para a fabricação de ummedicamento para tratamento de uma doença em um animal, de preferênciacachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais preferência ser humano,onde a dita doença é uma doença vascular, de preferência doença da artériacoronária, aterosclerose e vasculite, com mais preferência aterosclerose, eonde o dito pelo menos um antígeno compreendido pela dita composição,dita vacina ou dia composição farmacêutica é uma molécula de IL-1 alfa dainvenção, de preferência um fragmento maduro de IL-1 alfa, com mais prefe-rência SEQ ID NO:63 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda o uso das composições da invenção ouda vacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para afabricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais prefe-rência ser humano, onde a dita doença é selecionada do grupo consistindoem: (a) doenças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas, de preferênciaFebre Mediterrânea Familiar (FMF), Síndrome Auto-inflamatória ao Frio Fa-miliar (FCAS), Doença Inflamatória Multissistêmica de Início Neonatal (NO-MID) e Síndrome Mucke Wells, com mais preferência Febre MediterrâneaFamiliar (FMF); (b) doenças inflamatórias autoimunes crônicas, de preferên-cia artrite reumatóide, artrite idiopática de início juvenil sistêmica, doença deStill de início adulto, psoríase, doença de Crohn e colite ulcerativa, de prefe-rência artrite reumatóide; (c) doenças regenerativas do osso e cartilagem, depreferência gota, osteoporose e osteoartrite, com mais preferência osteoar-trite; (d) doenças alérgicas, de preferência hipersensibilidade por contato,hipersensibilidade do tipo 1 e alergia, com mais preferência alergia; e (e)doenças neurológicas, de preferência doença de Alzheimer, epilepsia, doen-ça de Parkinson e esclerose múltipla, com mais preferência esclerose múlti-pia, e onde o dito pelo menos um antígeno compreendido pela dita composi-ção, dita vacina ou dita composição farmacêutica é uma molécula de IL-1beta, de preferência um fragmento maduro de IL-1 beta, com mais preferên-cia SEQ ID NO:64 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda o uso das composições da invenção ouda vacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para afabricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais prefe-rência ser humano, onde a dita doença é uma doença inflamatória depen-dente de IL-1 herdada, de preferência Febre Mediterrânea Familiar (FMF); eonde o dito pelo menos um antígeno compreendido pela dita composição,dita vacina ou dita composição farmacêutica é uma molécula de IL-1 beta,de preferência um fragmento maduro de IL-1 beta, com mais preferênciaSEQ ID NO:64 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda o uso das composições da invenção ouda vacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para afabricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença vascular,de preferência aterosclerose.

A invenção provê ainda uso das composições da invenção ou davacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para a fa-bricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença inflama-tória dependente de IL-I, de preferência febre mediterrânea familiar (FMF).

A invenção provê ainda uso das composições da invenção ou davacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para a fa-bricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença inflama-tória auto-imune crônica, de preferência artrite reumatóide.

A invenção provê ainda uso das composições da invenção ou davacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para a fa-bricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença degene-rativa do osso e cartilagem, de preferência osteoartrite.

A invenção provê ainda o uso das composições da invenção ouda vacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção para afabricação de um medicamento para tratamento de uma doença em um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença neuroló-gica, de preferência esclerose múltipla.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais preferênciaser humano, onde a dita doença é de preferência selecionada do grupo con-sistindo em: (a) doenças vasculares, de preferência doença da artéria coro-nária, aterosclerose e vasculite, com mais preferência aterosclerose; (b) do-enças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas, de preferência FebreMediterrânea Familiar (FMF), Síndrome Auto-inflamatória ao Frio Familiar(FCAS), Doença Inflamatória Multissistêmica de Início Neonatal (NOMID) eSíndrome Mucke Wells, com mais preferência Febre Mediterrânea Familiar(FMF); (c) doenças inflamatórias auto-imunes crônicas, de preferência artritereumatóide, artrite idiopática de início juvenil sistêmica, doença de Still deinício adulto, psoríase, doença de Crohn e colite ulcerativa, com mais prefe-rência artrite reumatóide; (d) doenças regenerativas do osso e cartilagem, depreferência gota, osteoporose e osteoartrite, com mais preferência osteoar-trite; (e) doenças alérgicas, de preferência hipersensibilidade por contato,hipersensibilidade do tipo 1 e alergia, com mais preferência alergia; e (f) do-enças neurológicas, de preferência doença de Alzheimer, epilepsia, doençade Parkinson e esclerose múltipla, com mais preferência esclerose múltipla.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais preferênciaser humano, onde a dita doença é uma doença vascular, de preferência do-ença da artéria coronária, aterosclerose e vasculite, com mais preferênciaaterosclerose e onde o dito pelo menos um antígeno compreendido pela ditacomposição, dita vacina ou dia composição farmacêutica é uma molécula deIL-1 alfa, de preferência um fragmento maduro de IL-1 alfa, com mais prefe-rência SEQ ID NO:63 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais preferênciaser humano, onde a dita doença é de preferência selecionada do grupo con-sistindo em: (a) doenças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas, depreferência Febre Mediterrânea Familiar (FMF), Síndrome Auto-inflamatóriaao Frio Familiar (FCAS), Doença Inflamatória Multissistêmica de Início Neo-natal (NOMID) e Síndrome Mucke Wells, com mais preferência Febre Medi-terrânea Familiar (FMF); (b) doenças inflamatórias auto-imunes crônicas, depreferência artrite reumatóide, artrite idiopática de início juvenil sistêmica,doença de Still de início adulto, psoríase, doença de Crohn e colite ulcerati-va, com mais preferência artrite reumatóide; (c) doenças regenerativas doosso e cartilagem, de preferência gota, osteoporose e osteoartrite, com maispreferência osteoartrite; (d) doenças alérgicas, de preferência hipersensibili-dade por contato, hipersensibilidade do tipo 1 e alergia, com mais preferên-cia alergia; e (e) doenças neurológicas, de preferência doença de Alzheimer,epilepsia, doença de Parkinson e esclerose múltipla, com mais preferênciaesclerose múltipla, e onde o dito pelo menos um antígeno compreendidopela dita composição, dita vacina ou dita composição farmacêutica é uma molécula de IL-1 beta, de preferência um fragmento maduro de IL-1 beta,com mais preferência SEQ ID NO:64 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência cachorro, gato, cavalo ou ser humano, com mais preferênciaser humano, onde a dita doença é uma doença inflamatória dependente deIL-1 herdada, de preferência Febre Mediterrânea Familiar (FMF); e onde odito pelo menos um antígeno compreendido pela dita composição, dita vaci-na ou dita composição farmacêutica é uma molécula de IL-1 beta, de prefe-rência um fragmento maduro de IL-1 beta, com mais preferência SEQ IDNO:64 ou uma muteína dela.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administração da composição da invenção, davacina da invenção ou da composição farmacêutica da invenção a um ani-mal, de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença vascular,de preferência aterosclerose.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença inflamatóriadependente de IL-1, de preferência febre mediterrânea familiar (FMF).

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença inflamatóriaauto-imune crônica, de preferência artrite reumatóide.

A invenção provê ainda um método de tratamento de uma doen-ça, o método compreendendo administrar a composição da invenção, a va-cina da invenção ou a composição farmacêutica da invenção a um animal,de preferência ser humano, onde a dita doença é uma doença degenerativado osso e cartilagem, de preferência osteoartrite.

Todas as referências citadas aqui são incorporadas em sua tota-lidade a título de referência.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Clonagem, expressão e purificação de IL1an7.27oe Ιί-1β119.269de murino

A seqüência de nucleotídeo codificando os aminoácidos 117-270de IL-Ia de murino foi amplificada através de PCR a partir de uma bibliotecade cDNA de macrófagos de murino ativados por TNFa usando oligonucleotí-deos IL1a1 (5'-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3';SEQ ID NO:24) e IL-1a2 (5'-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATAGAG-3'; SEQ ID NO:25). Usando a mesma biblioteca de cDNA, a se-qüência de nucleotídeo codificando os aminoácidos 119-269 do precursor deIL-1 β de murino foi amplificada com oligonucleotídeos IL-1 β1 (5'-ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3'; SEQ ID NOI:26) eIL-1 β2 (5'-ATATATCTGGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3'; SEQID NO:27). Ambos fragmentos de DNA foram digeridos com Nhel e Xhol eclonados no vetor de expressão pModECI (SEQ ID NO:29).

O vetor pModECI (SEQ ID NO:29) é derivado de pET22b(+)(Novagen Inc.) e foi construído em duas etapas. Em uma primeira etapa osítio de clonagem múltiplo de pET22b(+) foi mudado pondo a seqüência ori-ginal entre os sítios Ndel e Xhol com os iniciadorMCS-1 F (5'-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCAT-3'; SEQ ID NO:30) e oligos iniciadorMCS-1 R (5'-TCGAATGCGGCCGCCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'; SEQ ID NO:31) anelados (anelamento emtampão de TrisHCI pH 8 a 15 mM). O plasmídeo resultante foi chamadopModOO, e tinha sítios de restrição Ndel1 BamHI, Nhel, Xhol, Pmel e Notl emseu sítio de clonagem múltiplo. O par anelado de oligos Bamhis6-EK-Nhe-F(5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGGTTCGGTGACGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3'; SEQ ID NO:32) e Bamhis6-EKNhe-R (5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTG-3'; SEQ ID NO:33) e o par anelado de oligo1F-C-glicina-ligante (5'-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGVGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'; SEQ ID NO:34) e oligol R-C-glicina-ligante (5'-GGCCGCGTTATAAACTTATTAACCGCAACCACCACCACCACCC-3'; SEQ ID NO:35) foram ligados juntos no plasmí-deo pModOO digerido com BamHI-NotI para se obter pModECI, que codificaum tag de hexa-histidina N-terminal, um sítio de clivagem de enterocidase eum Iigante glicina C-terminal contendo um resíduo cisteína.

A clonagem dos fragmentos mencionados acima em pModECIdeu origem a plasmídeos pModECI-His-EK-mlLloci-17-270 © pModECI-His-ΕΚ-ηΊΐΙ_1βι19.269, respectivamente. Esses plasmídeos codificam proteínas defusão consistindo em tag His N-terminal, um sítio de clivagem de enterocina-se, a IL-Ia ou IL-Ip de murino madura, respectivamente, e um Iigante con-tendo cisteína C-terminal (GGGGGCG, SEQ ID NO:28). Para expressão,células de Escherichia coli BL21 abrigando também plasmídeo foram culti-vadas a 37°C para um OD a 600 nm de 1,0 e então induzidas através daadição de isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo em uma concentração de 1 mM.As bactérias foram cultivadas por mais 4 horas a 37°C, coletadas através decentrifugação e ressuspensas em 80 ml de tampão de Iise (Na2HPO4 a 10mM, NaCI a 30 mM, pH 7,0). As células foram então rompidas através desonificação e DNA e RNA celular foram digeridos por 30 minutos de incuba-ção em temperatura ambiente com 64 μΙ de MgCI2 a 2M e 10 μΙ de Benzona-se. Restos celulares foram removidos através de centrifugação (rotor SS34,20000 rpm, 4°C, 60 min) e o Iisato limpo foi aplicado a uma coluna de agaro-se de Ni2+-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). Após lavagem extensiva da co-luna com tampão de lavagem (NaH2PO4 a 50 mM, NaCI a 300 mM, Imidazola 20 mM, pH 8,0) as proteínas foram eluídas com tampão de eluição

(NaH2PO4 a 50 mM, NaCI a 300 mM, Imidazol a 200 mM, pH 8,0). Proteínaspurificadas foram dialisadas contra PBS pH 7,2, congeladas rapidamente emnitrogênio líquido e armazenadas a -80°C até uso adicional.EXEMPLO 2

A. Acoplamento de Ιί-1β119.269 de camundongo a partícu-las do tipo vírus de Οβ

Uma solução contendo 1,3 mg/ml da proteína IL-1 βι 19-269 de mu-rino purificada do EXEMPLO 1 (SEQ ID NO:66) em PBS pH 7,2 foi incubadapor 60 min em temperatura ambiente com uma quantidade equimolar deTCEP para redução do resíduo cisteína C-terminal.

Uma solução de 6 ml de 2 mg/ml de proteína capsídeo em PBSpH 7,2 foi então reagida por 60 min em temperatura ambiente com 131 μΙ deuma solução SMPH (65 mM em DMSO). A solução de reação foi dialisada a4°C contra três mudanças de 3 I de HEPES a 20 mM, NaCI a 150 mM pH 7,2' durante 24 horas. Setenta e cinco μΙ da solução de Οβ derivatizada e diali-sada foram misturados com 117 μΙ de H2O e 308 μΙ de proteína IL-1 βιι9-269de camundongo purificada e pré-reduzida e incubados durante a noite a15°C para ligação com cruzamento química. Proteína não-acoplada foi re-movida através de filtragem de fluxo tangencial contra PBS usando mem-branas de éster de celulose com um corte de peso molecular de 300.000 Da.

Produtos acoplados foram analisados em um gel de SDS- polia-crilamida a 12% sob condições de redução. O gel tingido com Coomassie émostrado na Figura 1. Várias faixas de peso molecular aumentado com rela-ção ao monômero de capsídeo de Οβ são visíveis, demonstrando claramen-te a ligação com cruzamento bem sucedida da proteína IL-1 βιι9-269 de ca-mundongo ao capsídeo de Οβ.

Β. Imunização de camundongo com proteína ΙΙ_-1β119.269 decamundongo acoplada a capsídeo de Οβ (Οβ-ηιΙί-1βι 19-269)

Cinco camundongos fêmea balb/c foram imunizados com Οβ-ΠΊΐί-1βιΐ9-269 (SEQ ID NO:66). Cinqüenta μg de proteína total foram diluídosem PBS para 200 μΙ e injetados subcutaneamente (100 μΙ em dois ladosventrais) no dia 0 e no dia 21. Os camundongos foram sangrados retroorbi-talmente nos dias 0, 21 e 35 e soros foram analisados usando ELISA especí-fico de IL-1 βι 19-269de camundongo.

C. ELISAPlacas de ELISA foram revestidas com proteína IL-1 β119-260 decamundongo em uma concentração de 1 μςι/ml. As placas foram bloqueadase então incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos dos dias0, 21 e 35. Anticorpos ligados foram detectados com anticorpo IgG antica-mundongo enzimaticamente marcado. Títulos de anticorpo de soros de ca-mundongo foram calculados como a média daquelas diluições que levaram àdensidade óptica médio máxima a 450 nm. O título de ΙΙ_-1B119-269 19-269 antica-mundongo médio foi 1:22262 no dia 21 e 1:309276 no dia 35. Isto demonstraque imunização com Οβ acoplado à proteína ΙΙ_-1β119.269 de camundongopoderia superar a tolerância imunológica e produzir anticorpos de titulo altoque reconhecem IL-ii9.269 especificamente.

D. Neutralização de IL-I β in vitro

Soros de camundongos imunizados com Qp-mlL-1 β119-269 (SEQID NO:66) foram então testados quanto à sua habilidade em inibir a ligaçãode proteína IL-1 β de camundongo a seu receptor. Placas de ELISA foramentão revestidas com uma proteína de fusão mll-1receptorl-hFc recombinan-te em uma concentração de 1 μg/ml e co-incubadas com diluições seriais desoros de camundongos que tinham sido imunizados ou com ΙL-1β119.269 decamundongo acoplada a capsídeo de Οβ ou com IL-lan7-270 de camundon-go acoplada a capsídeo de Οβ e 100 ng/ml de IL-1 β119.269 de camundongo.Ligação de IL-1 Png-269 à proteína de fusão mlL-1receptorl-hFc imobilizada foidetectada com um anticorpo de L-1β anticamundongo biotinilado e estrepta-vidina conjugada à peroxidase do rábano de cavalo. Todos os soros de ca-mundongos imunizados contra IL-B119.269de murino inibiram completamentea ligação de Ιί-1β119.269 de camundongo a seu receptor em concentraçõesde >0,4%, enquanto soros de camundongos imunizados contra IL-Ian7.270de camundongo não mostraram nenhum efeito inibidor mesmo na concen-tração mais alta usada (3,3%). Esses dados demonstram que imunizaçãocom IL-B119.269de camundongo acoplado ao capsídeo de Οβ pode dar anti-corpos que são capazes de neutralizar a interação de IL-1B119-269de camun-dongo e seu receptor.

E. Neutralização in vivo de IL-1 βA capacidade de neutralização in vivo dos anticorpos criadospela imunização com Οβ-ηΊΐΙ_-1β119.269 foi investigada em seguida. Quatrocamundongos balb/c fêmea foram então imunizados duas vezes nos dias 0 e14 com Οβ-mIL-Ip119.269 e quatro camundongos foram imunizados ao mes-mo tempo com capsídeo de Οβ sozinho. No dia 21 todos os camundongosforam injetados intravenosamente com 1 μg de ΙΙ_-1β119.269 livre. Como leiturada atividade inflamatória da ΙΙ_-1β119.269 injetada, amostras de soro foramanalisadas 3 h após injeção para o aumento relativo na concentração da ci-tocina pró-inflamatória IL-6. Camundongos imunizados com Οβ mostraramum aumento médio na concentração de IL-6 no soro de 1,01 ± 0,61 ng/ml,enquanto camundongos imunizados com Οβ^Ιί-Ιβ^^ mostraram umaumento médio de apenas 0,11 ± 0,30 ng/ml (p=0,04). Como um controle nodia 28 todos os camundongos foram injetados com 1 μg de mll_-1a. Trêshoras após injeção camundongos imunizados com veículo de Οβ sozinho mostraram um aumento médio em concentrações de IL-6 o soro de 40,24 ±8,06 ng/ml, enquanto camundongos imunizados com Οβ-ηΊΐΙ_-1β119.269 mos-traram um aumento de 57,98 ± 29,92 ng/ml (p=0,30). Esses dados indicamque os anticorpos produzidos pela imunização com Οβ-ι·ηΙΙ_-1β119.269 eramcapazes de neutralizar especificamente e eficientemente a atividade pro-inflamatória de IL-1 β.

F. Eficácia de Οβ-πιΙΙ_-1β119.269 em um modelo de camun-dongo de artrite reumatóide

A eficácia de imunização de Οβ-ΓηΙΙ_-1β119.269 foi testada em ummodelo de artrite induzida por colágeno de murino (CIA). Este modelo refletea maioria dos aspectos imunológicos e histológicos de artrite reumatóidehumana e é então rotineiramente usado para avaliar a eficácia de agentesantiinflamatórios. Camundongos DBA/1 machos foram imunizados subcuta-neamente três vezes (dias 0, 14 e 28) com 50 μg ou de Οβ-ΓηΙΙ_-1β119.269(n=8) ou Οβ sozinho (n=8), e então injetados intradermalmente no dia 42com 200 μg de colágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante de Freundcompleto. Após uma injeção de reforço de 200 μg de colágeno bovino tipo Ilmisturado com adjuvante de Freund incompleto no dia 63 os camundongosforam examinados em uma base diária quanto ao desenvolvimento de sin-tomas de artrite.

Um score clínico variando de 0 a 3 foi designado para cadamembro de acordo com o grau de vermelhidão e inchaço observados, e aespessura do tornozelo de todos os membros traseiros foi medida. O scoreclínico foi designado durante 3 semanas consecutivas a cada membro deacordo com as definições que seguem: 0 normal, 1 eritema leve e/ou incha-ço de dedos/pata, 2 eritema e inchaço se estendendo em toda a pata/junta,3 inchaço forte, deformação da pata/junta, rigidez. Scores clínicos cumulati-vos de camundongos individuais foram calculados como a soma de scoresclínicos de todos os quatro membros, resultando em um score cumulativomáximo possível por camundongo de 12.

Duas semanas após a segunda injeção de colágeno camundon-gos imunizados com Οβ mostraram um score clínico cumulativo médio de4,44, enquanto camundongos imunizados com Qp-mlL-iPn9.269 mostraramum score médio de apenas 1,06. Além disso, o aumento médio na espessu-ra do tornozelo traseiro foi 18% para camundongos imunizados com Οβ eapenas 1% para camundongos que tinham sido imunizados com Οβ-mlL-1 βι 19-269- Como uma leitura adicional da reação inflamatória, níveis no sorode IL-6 foram determinados 1 semanas após a segunda injeção de coláge-no. Camundongos imunizados com Οβ tinham uma concentração de IL-6 nosoro média de 1,92 ± 0,36 enquanto camundongos imunizados com Οβ-mlL-1 βι 19-269 tinham uma concentração de IL-6 média de apenas 0,79 ± 0,16(p=0,01). Tomados juntos, esses dados mostram que imunização com Οβ-mll_-1 βι 19-269 protege fortemente camundongos de inflamação e sinais clíni-cos de artrite em modelo de CIA.EXEMPLO 3

A. Acoplamento de IL-Ian7-270 de camundongo a partícu-las do tipo vírus Οβ

Uma solução contendo 1,8 mg/ml da proteína IL-1aii7.27o purifi-cada do EXEMPLO 1 (SEQ ID NO:65) em PBS pH 7,2 foi incubada por 60min em temperatura ambiente com uma quantidade equimolar de TCEP pararedução do resíduo de cisteína C-terminal.

Uma solução de 6 ml de 2 mg/ml de proteína capsídeo de Οβem PBS pH 7,2 foi então reagida por 60 minutos em temperatura ambientecom 131 μΙ de uma solução de SMPH (65 mM em DMSO). A solução de re-ação foi dializada a 4°C contra três mudanças de 3 I de HPES a 20 mM, Na-Cl a 150 mM pH 7,2 durante 24 horas. Setenta e cinco μΙ da solução de Qpderivatizada e dializada foram misturados com 192 μΙ de H2O e 233 μΙ daproteína de camundongo IL-1oci 17-270 purificada e pré-reduzida e incubadosda noite para o dia a 15°C para ligação com cruzamento química. Proteínanão-acoplada foi removida através de filtragem em fluxo tangencial contraPBS usando membranas de éster de celulose com um corte de peso mole-cular de 300.000 Da.

Produtos acoplados foram analisados em um gel de SDS- polia-crilamida a 12% sob condições de redução. O gel tingido com Coomassie émostrado na Figura 2. Várias faixas de peso molecular alto com relação aomonômero de capsídeo de Οβ são visíveis, demonstrando claramente a li-gação com cruzamento bem sucedida da proteína IL-Ian7-270de camundon-go ao capsídeo de Οβ.

Β. Imunização de camundongos com proteína IL-I0C117-270acoplada ao capsídeo de Οβ (Οβ-mIL-Ian7-270)

Cinco camundongos balb/c fêmeas foram imunizadas com Οβ-mlL-1aii7-27o· Cinqüenta μg de proteína total foram diluídos em PBS para200 μΙ e injetados subcutaneamente (100 μΙ nos dois lados ventrais) no dia 0e no dia 21. Os camundongos foram sangrados retroorbitalmente nos dias 0,21 e 35, e soros foram analisados usando ELISA específico de IL-1an7-27ode camundongo.

C. ELISA

Placas de ELISA foram revestidas com proteína IL-1aii7-27o decamundongo em uma concentração de 1 μg/ml. As placas foram bloqueadase então incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos dos dias0, 21 e 35. Anticorpos ligados foram detectados com anticorpo IgG antica-mundongo enzimaticamente marcado. Títulos de anticorpo de soros de ca-mundongo foram calculados como a média daquelas diluições que levaram àdensidade óptica média máxima a 450 nm. O título de IL-1aii7.27o antica-mundongo médio foi 1:9252 no dia 21 e 1:736912 no dia 35. Isto demonstraque imunização com Οβ acoplado à proteína ΙΙ_-1αιι7.27ο de camundongopoderia superar a tolerância imunológica e produzir anticorpos de título altoque reconhecem especificamente IL-101117.270·

D. Neutralização de IL-1 a in vitro

Soros de camundongos imunizados com Οβ-mIL- 1oci 17-270 foramentão testados quanto à sua habilidade em inibir a ligação de proteína IL-Iade camundongo a seu receptor. Placas de ELISA foram então revestidascom uma proteína de fusão mlL-1receptorl-hFc recombinante em uma con-centração de 1 μg/ml e co-incubadas com diluições seriais de soros de ca-mundongos que tinham sido imunizados ou com IL-1 αιι7.27ο de camundongoacoplada a capsídeo de Οβ ou com IL-^n9.269de camundongo acoplada aocapsídeo de Οβ e 5 ng/ml de IL-1an7-27o de camundongo. Ligação de IL-I0C117-270 à proteína de fusão mlL-1 receptorl-hFc imobilizada foi detectadacom um anticorpo de L-1a anticamundongo biotinilado e estreptavidina con-jugada à peroxidase do rábano de cavalo. Todos os soros de camundongosimunizados contra IL-ICX117-270 de murino inibiram completamente a ligaçãode IL-I0C117-270 de camundongo a seu receptor em concentrações de >0,4%,enquanto soros de camundongos imunizados contra IL-1 Pn9-269 de camun-dongo não mostraram nenhum efeito inibidor significante mesmo na concen-tração mais alta usada (3,3%). Esses dados demonstram que imunizaçãocom IL-1 ai 17-270 de camundongo acoplado ao capsídeo de Οβ pode dar anti-corpos que são capazes de neutralizar a interação de IL-Ian7^ode camun-dongo e seu receptor.

E. Neutralização de IL-Ia in vivo

A capacidade de neutralização in vivo dos anticorpos criadospela imunização com Οβ-m I L-Ian 7-270 foi investigada em seguida. Quatrocamundongos balb/c fêmeas foram então imunizados duas vezes nos dias 0e 14 com Οβ-mlL-lαιΐ7_27ο e quatro camundongos foram imunizados aomesmo tempo com capsídeo de Οβ sozinho. No dia 21 todos os camundon-gos foram injetados intravenosamente com 1 μς de IL-1aii7.27o livre. Comoleitura da atividade inflamatória da ΙΙ_-1αιι7-27ο injetada, amostras de soroforam analisadas 3 h após injeção para o aumento relativo na concentraçãoda citocina pró-inflamatória IL-6. Camundongos imunizados com Οβ mostra- ram um aumento médio na concentração de IL-6 no soro de 8,16 ± 2,33ng/ml, enquanto camundongos imunizados com Οβ-m I L-Ian 7-270 mostraramum aumento médio de apenas 0,15 ± 0,27 ng/ml (p=0,0005). Como um con-trole no dia 28 todos os camundongos foram injetados com 1 μg de mlL-Ιβ.Três horas após injeção camundongos imunizados com veículo de Οβ sozi- nho mostraram um aumento médio em concentrações de IL-6 o soro de9,52 ± 7,33 ng/ml, enquanto camundongos imunizados com G$-mlL-1aii7-27o' mostraram um aumento de 21,46 ± 27,36 ng/ml (p=0,43). Esses dados indi-cam que os anticorpos produzidos pela imunização com Οβ-mlL-lai 17-270eram capazes de neutralizar especificamente e eficientemente a atividade pró-inflamatória de IL-1 a.

F. Eficácia de Οβ-ιηΙί-101117-270 em um modelo de camun-dongo de artrite reumatóide

A eficácia de imunização de C$-mlL-1aii7-27o foi testada em ummodelo de artrite induzida por colágeno de murino (CIA). Este modelo reflete a maioria dos aspectos imunológicos e histológicos de artrite reumatóidehumana e é então rotineiramente usado para avaliar a eficácia de agentesantiinflamatórios. Camundongos DBA/1 machos foram imunizados subcuta-neamente três vezes (dias 0, 14 e 28) com 50 μg ou de Οβ-m IL-1cci 17-270(n=8) ou Οβ sozinho (n=8), e então injetados intradermalmente no dia 42 com 200 μg de colágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante de Freundcompleto. Após uma injeção de reforço de 200 μg de colágeno bovino tipo Ilmisturado com adjuvante de Freund incompleto no dia 63 os camundongosforam examinados em uma base diária quanto ao desenvolvimento de sin-tomas de artrite. Um score clínico conforme definido no EXEMPLO 2F foi designado para cada membro de acordo com o grau de vermelhidão e in-chaço observados, e a espessura do tornozelo de todos os membros trasei-ros foi medida. Duas semanas após a segunda injeção de colágeno camun-dongos imunizados com Οβ mostraram um score cumulativo clínico médiode 4,44, enquanto camundongos imunizados com Qp-mlL-1an7.27o mostra-ram um score médio de apenas 2,31. Além disso, o aumento médio na es-pessura do tornozelo traseiro foi 18% para camundongos imunizados comQpe apenas 7% para camundongos que tinham sido imunizados com Οβ-mIL-1 αιΐ7-27ο· Como uma leitura adicional da reação inflamatória, níveis nosoro de IL-6 foram determinados 1 semana após a segunda injeção de colá-geno. Camundongos imunizados com Οβ tinham uma concentração de IL-6no soro média de 1,92 ± 0,36 enquanto camundongos imunizados com Οβ-mlL-1ai 17-270 tinham uma concentração de IL-6 média de apenas 0,94 ± 0,48.Tomados juntos, esses dados mostram que imunização com Οβ-ΓηΙί-1αιι7.270 protege fortemente camundongos de inflamação e sinais clínicos de artri-te em modelo de CIA.

EXEMPLO 4

Eficácia de Qp-mlL-1cci 17-270 em um modelo de camundongode aterosclerose

Camundongos Apoe1' machos de sete a oito semanas de vida(The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME) foram injetados subcutaneamenteou com 50 μιτι de vacina Οβ-ηιΙί-1αιΐ7-27ο(η=13) ou com 50 μΒ de Οβ (n=12)nos dias 0, 14, 28, 56, 105 e 133 (5 animais, nos grupos de Οβ-ηηΙί-101117-270e 2 nos grupo Οβ receberam sua segunda dose de reforço no dia 33). Oscamundongos foram alimentados inicialmente com uma dieta de comidanormal, que foi substituída no dia 21 por uma dieta ocidental (20% de gordu-ra, 0,15% de colesterol, Provimi Kliba AG, Suíça). Os camundongos foramsangrados em intervalos regulares por todo o experimento e a resposta deanticorpo contra IL-IaIfa foi medida nos soros. O sacrifício foi no dia 159, e aaorta foi isolada e preparada essencialmente conforme descrito (Tangirala,R.K. e outros (1995) J. Lipid. fíes. 36:2320-2328). Ainda, os corações foramremovidos e congelados rapidamente em nitrogênio líquido para prepara-ções histológica subsequente essencialmente conforme descrito por PaigenB. e outros (Atherosclerosis 1987;68:231-240) e Zhou X. e outros (Arterios-der. Thromb. Vasc. Bioi 2001,21:108-114). Os animais foram sangradosatravés de punção cardíaca e perfundidos com PBS. A aorta foi então ex-posta, o máximo possível do revestimento externo removido in situ e a aortafinalmente seccionada 2 mm a partir do coração. O coração foi seccionadono meio, e a parte superior foi imediatamente congelada em solução salinaequilibrada de Hank em um tubo plástico em nitrogênio líquido. Seções seri-ais (7 μηη de espessura) foram cortadas em um criostat através da origem daaorta e coletadas quando do aparecimento de pelo menos duas cúspides deválvula, até desaparecimento das últimas cúspides de válvula. As seçõesforam fixadas em formalina, tingidas com oil red Oe a carga de placa foiavaliada em 4-7 seções (3 seções em um animal do grupo Οβ) por camun-dongo através de análise de imagem quantitativa. Uma área de placa médiafoi computada para cada animal a partir da área de placa de cada seção u-sada para a avaliação. Uma área de placa de grupo média foi computadapara os grupos Οβ-mlL-lai 17-270 e Οβ respectivamente. Análise estatística foirealizada com um teste t de Student. P<0,05 foi considerado estatisticamen-te significante.

Para avaliação de aterosclerose na aorta inteira, essas foramlimpas mais de revestimento externo adicional em uma placa de petri de vi-dro cheia com PBS frio, e o arco foi seccionado 5 mm para baixo a partir daartéria subclaviana esquerda. A aorta foi cortada longitudinalmente, achata-da em uma superfície de cera preta e fixada da noite para o dia em 4% deformalina. Elas foram então tingidas da noite para o dia em oil red O. As pla-cas foram quantificadas com um software de imagem (Motic Image Plus 2.0)em fotografias digitais. A carga da placa foi expressa como a soma da super-fície de todas as placas da aorta tomada para a bifurcação ilíaca, divididapela superfície total da aorta medida até a bifurcação ilíaca, em porcenta-gem. A diferença em média ou mediana da carga de placa entre os gruposΟβ-ηιΙΙ_-1αιΐ7-27οβ Οβ foi analisada.

A resposta de anticorpo foi medida em um ELISA clássico, comIL-IaIfa recombinante revestida na placa de ELISA. Ligação de anticorposespecíficos foi detectada usando um conjugado de HRP anticamundongo decabra. Os títulos contra IL-IaIfa foram calculados como a recíproca da dilui-ção do soro dando ligação médio máxima no ensaio. A especificidade daresposta foi avaliada medindo soro pré-imune. O título pré-imune estava a-baixo da diluição de soro menor usada no ensaio, e foi dado este valor dediluição de soro mais baixo. Os resultados da medição da resposta de anti-corpo nos animais imunizados com Οβ-mlL-l an 7-270 são mostrados na Ta-bela 1, e demonstram claramente que imunização contra IL-IaIfa de murinoacoplada a Οβ leva a uma resposta de anticorpo específica forte e sustenta-da contra IL-1 alfa, uma vez que quase nenhum título era detectável no soropré-imune (dO). Ainda, indução de uma resposta de anticorpo específica pa-ra IL-IaIfa levou a uma redução de 37% em área de placa na origem aórticano grupo de Οβ-mIL-Ian7-270 comparado com o grupo Οβ (292803 ± 21272μ2 vs. 464694 ± 36545 μηη2, p=0,0005). Ainda, uma redução de 31% na car-ga de placa média em aortas inteiras preparadas "en face" (5,7 vs. 8,3,p=0,06) foi observada.

Esses dados demonstram que indução de anticorpos anti-IL-lalfa pela vacina de Οβ-m IL-Ian7-270 inibiu o desenvolvimento de ateroscle-rose e então que a vacina de Οβ-m I L-Ian 7-270 é um tratamento eficaz paraaterosclerose. Ainda, esses dados demonstram que IL-IaIfa está envolvidona patogênese de aterosclerose.

Tabela 1: Média geométrica de título de anticorpo anti-IL1 -alfa

em camundongos Apoe1' imunizados com ΟβΙίΙβΙίβ (título de média geo-métrica ± erro de desvio padrão da média)

<table>table see original document page 72</column></row><table>

*Para 5 animais, os valores são do dia 33.

EXEMPLO 5

Proteção de doença do intestino inflamatória induzida porTNBS através de imunização com Οβ-mlL-lai 17-270e/ou Οβ-mlL-lβηθ-269

Camundongos SJL machos de oito semanas de vida (5 por gru-po) são injetados subcutaneamente três vezes em intervalos de duas sema-nas ou com 50 μg de Οβ-mlL-l ai 17-270 ou 50 μg de Οβ-mlL-l βι 19-269. ou uma mistura de 50 μg de cada um de Οβ-mlL-lan7-270 e Οβ-mlL-l βη9-269· Comoum controle 5 camundongos são injetados no mesmo regime com VLPs deΟβ sozinho. Duas semanas após a última imunização, todos os camundon-gos são levemente anestesiados com Isoflurano e 1 mg de ácido trinitroben-zenossulfônico (TNBS) em 100 μΙ de etanol a 50% é administrado intrate-calmente através de um cateter de polietileno em uma distância de 4 cm doânus. O peso do corpo é registrado diariamente como leitura de progressãode doença, e 7 dias após administração de TNBS todos os camundongossão sacrificados. O colo de cada camundongo é removido, um espécime decolo localizado 2 cm proximal ao ânus é fixado em formalina tamponada comPBS e o grau de inflamação é classificado semiquantitativamente em seçõestransversais colônicas tingidas com hematoxilina e eosina de acordo com1 Neurath M.F. e outros (JEM(1995), 182:1281-1290).

Imunização ou com Οβ-mlL-loci 17-270 ou Οβ-ηΊΐΙ_-1β119.269 sozi-nha, ou com uma combinação de G$-mlL-1an7-27oOu Οβ-ΐ7ΐΙΙ_-1βιι9.269 reduza perda de peso induzida por TNBS, conforme comparado com camundon-gos imunizados com Οβ. Ainda, exame histológico de seções trasnversaiscolônicas revela que os camundongos imunizados com Οβ-mlL-lai 17.270 e/ouΟβ-ιτιΙΙ.-Ιβπθ^βΘ mostram uma infiltração de células inflamatórias acentua-damente reduzida no tecido colônico quando comparado com camundongosimunizados com Οβ.

EXEMPLO 6

Melhora de hipersensibilidade à Endotoxina em camundon-gos carregando uma versão truncada do gene MEFV através de imuni-zação COm Οβ-ΙϊΐΙί-1 βΐ 19-269

Febre Mediterrânea Familiar é um distúrbio inflamatório recessi-vamente herdado caracterizado por febre recorrente bem como peritonite,serosite, artrite e rachaduras na pele. Indivíduos afetados carregam umamutação missense no gene MEFV, levando à expressão de uma proteínapirina truncada. Camundongos carregando uma mutação similar no geneMEFV mostram uma atividade de caspase-1 aumentada, levando à super-produção de IL-1 β madura e hipotermia e Ietalidade aumentadas após admi-nistração de LPS. Camundongos com truncamento de pirina homozigotos deoito semanas de vida (5 por grupo) são imunizados três vezes em intervalosde duas semanas com 50 μ9 de Οβ-mlL-l 0C117-270 ou 50 μρ de VLPs de Οβsozinho. Duas semanas após a última imunização todos os camundongossão injetados intraperitonealmente com uma mistura de 20 mg de D-Galac-tosamina e 0,01 μg/g de LPS. Camundongos imunizados com Qp-mlL-1p119.269 mostram uma hipotermia acentuadamente reduzida e uma Ietalidade re-duzida em resposta à administração de LPS, quando comparados com con-troles imunizados com Οβ.

EXEMPLO 7

Comparação de imunização com Οβ-mlL-l 0C117.270 ou Qp-mlL-1 βι 19-269 a tratamento com Kineret® em um modelo de camundongo deartrite reumatóide

Kineret® é (Anakinra, Amgen) é uma versão recombinante doantagonista de receptor de IL-1 humano, que é aprovado para o tratamentode artrite reumatóide humana. A fim de se obter um benefício clínico, quanti-dades relativamente altas (100 mg) têm que ser aplicadas através de viasubcutânea em uma base diária. O modelo de artrite induzida por colágenofoi usado para comparar a eficácia de imunização com Οβ-mlL-lai 17-270 ouΟβ-mlL-l β! 19-269 com aplicações diárias de doses diferentes de Kineret®.Camundongos DBA/1 machos foram imunizados subcutaneamente três ve-zes (dias 0, 14 e 28) com 50 μg ou de Οβ-mlL-l oti 17-270 (n=e), Οβ-mlL-l βιι9.269(n=8) ou Οβ sozinho (n=32), e então injetados intradermalmente no dia 42com 200 μ9 de colágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante de Freundcompleto. A partir do dia 42, camundongos imunizados com Οβ-mlL-l oi 17-270ou Οβ-mlL-lβιι9-269 e um grupo de camundongos imunizados com Οβ (n=8)receberam injeções intraperitoneais diárias de 200 μΙ de PBS, enquanto trêsgrupos imunizados com Οβ adicionais receberam injeções intraperitoneaisdiárias ou de 37,5 μg (n=8), 375 μg (n=8) ou 3,75 mg (n=8) de Kineret®. Umainjeção diária de 37,5 μg de Kineret® pró-camundongo corresponde aproxi-madamente a uma dose de 1,5 mg/kg, que está na faixa da quantidade efi-caz recomendada para seres humanos (100 mg). Todos os camundongosforam reforçados no dia 63 através de injeção intradermal de 200 μ9 de co-lágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante de Freund, e examinados emuma base diária quanto ao desenvolvimento de sintomas de artrite.

Quatro semanas após a segunda injeção de colágeno, camun-dongos controle imunizados com Οβ mostraram um score clínico cumulativomédio (conforme definido no EXEMPLO 2F) de 3,75, enquanto camundon-gos imunizados com Qp-mlL-1oci 17-270 ou Qp-mlL-lpng^ mostraram scoresmédios de apenas 0,81 e 1,44, respectivamente (vide Tabela 2). Camun-dongos tratados com 37,5 μg ou 375 μg de Kineret® atingiram um score mé-dio de 2,44 e 2,63, respectivamente, enquanto camundongos tratados com3,75 mg de Kineret® permaneceram bastante assintomáticos, atingindo umascore máximo de apenas 0,19.

Como uma leitura adicional da reação inflamatória, a espessurado tornozelo traseiro de todos os animais foi medida em uma base regular.Quatro semanas após a segunda injeção de colágeno camundongos contro-le imunizados com Οβ mostraram um aumento médio em espessura de tor-nozelo traseiro de 16%, enquanto camundongos imunizados com Οβ-mlL1 oti 17-270 mostraram um aumento de 2% e camundongos imunizados comΟβ-mIL-1ß119-269 mostraram um aumento de 6%. Camundongos tratados oucom 37,5 μg ou 375 μg de Kineret® mostraram um aumento médio de 13% e10%, respectivamente, enquanto camundongos tratados com 3,75 mg deKineret® não mostraram nenhum aumento em espessura de tornozelo demodo algum.

Em conclusão foi surpreendentemente verificado que três inje-ções ou de Οβ-mlL-1α117-27ο ou Οβ-mlL-1β119.269 protegeram melhor do de-senvolvimento de sintomas de artrite do que injeções diárias de Kineret® emquantidades correspondendo à dose humana ou até mesmo a dose humanadez vezes. Apenas aplicação da dose humana de 100 vezes de Kineret®mostrou um benefício aumentado com relação à vacinação de Οβ-mlL-1α117.

270 OU Οβ-mIL-1ß119-269.Tabela 2: Sintomas de doença clínicos em modelo de artrite in-duzida por colágeno

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EXEMPLO 8

A. Clonagem, expressão e purificação de partículas dotipo vírus consistindo em proteína de revestimento AP205 genetica-mente fundida à Qp-mlL-101117-270 (AP205_ Οβ-ιηΙΙ_-1αιΐ7-27ο)

Dado o tamanho grande de interleucina-1alfa e por razões esté-ricas, um sistema de expressão produzindo as chamadas partículas de mo-saico, compreendendo proteínas de revestimento AP205 fundidas à interleu-cina-lalfa bem como subunidades de proteína de revestimento wt foi cons-truído. Neste sistema, supressão do códon de parada dá a fusão de proteínade revestimento AP-205-interleucina-1alfa, enquanto terminação apropriadadá a proteína de revestimento AP205 wt. Ambas proteínas são produzidassimultaneamente na célula e montadas em uma partícula do tipo vírus domosaico. Dois plasmídeos intermediários, pAP590 e pAP592, codificando ogene da proteína de revestimento AP205 terminado pelos códons supresso-res TAG (amber, pAP590) ou TGA (opal, pAP592) foram feitos. Uma se-qüência Iigante codificando o tripeptídeo Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO:189) foiadicionada a jusante e em estrutura do gene de proteína de revestimento.Sítios Kpn2l e Hindlll foram adicionados para clonagem de seqüências codi-ficando seqüências de aminoácido estranhas no terminal C do Iigante deaminoácido Gly-Ser-Gly, C-terminais para a proteína de revestimentoAP205. Os construtos resultantes eram: AP590 (SEQ ID NO:117): gene daproteína de revestimento AP205 - códon amber - GSG(Kpn21 - Hindlll); eAP592 (SEQ ID NO:118): gene de proteína de revestimento AP205 - códonopal - GSG(Kpn2l - Hindlll). Para construção de plasmídeo pAP590, umfragmento de PCR obtido com oligonucleotídeos p1.44 (5'-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3'; SEQ ID NO:19) e Pinc-36 (5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3'; SEQID N0:120) foi digerido com Ncol e Hindlll, e clonado no vetor pQb185, quetinha sido digerido com as mesmas enzimas de restrição. pQb185 é um ve-tor derivado de vetor pGEM. Expressão dos genes clonados neste vetor écontrolada pelo promotor trp (Kozlovska, T.M. e outros, Gene 137:133-37(1993)). Similarmente, o plasmídeo pAP592 foi construído através de clona-gem de um fragmento de PCR digerido com Ncol/Hindlll obtido com oligonu-cleotídeo p1.44 e plNC-40 (5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCGTAGTATCAGACGATACG-3'; SEQ ID NO: 121) no mesmo vetor.

A seqüência codificando os aminoácidos 117-270 de IL-Ia demurino foi amplificada através de PCR a partir do plasmídeo pModECI-His-EK-mlL-1ai 17-270 (vide EXEMPLO 1), usando iniciadores plNC-34 (5'-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3'; SEQ ID NO:122) e plNC-35 (5'-GTAAGCTTATGCATTATGATATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3'; SEQ ID NO:123),que adicionou sítios de restrição Kpn2l e Hindlll às extremidades 5' e 3',respectivamente. O fragmento de DNA obtido foi digerido com Kpn2l e Hindl-Il e clonado em ambos vetor pAP590, criando o plasmídeo pAP594 (supres-são de amber), e vetor pPA592, criando o plasmídeo pAP596 (supressão deopal), respectivamente.

Para expressão de VLPs de AP205 de mosaico mostrando IL-Iade murino em sua superfície, células JM109 de E. coli contendo plasmídeopISM 579 ou pISM 3001 foram transformadas com plasmídeo pAP594 oupAP596, respectivamente. O plasmídeo plSM579 foi gerado através de exci-são do gene trpT176 de plSM3001 com endonuclease de restrição EcoRI esubstituindo-o por fragmento de EcoRI do plasmídeo pMY579 (presente deMichael Yarus) contendo um gene supressor de t-RNA amber. Este genesupressores de t-RNA é um mutante de rpT175 (Raftery, L.A. e outros,(1984) J. Bacteriol 158:849-859) e difere de trpT em três posições: G33, A24e T35. Cinco mililitros de meio líquido LB contendo 20 μg/ml de ampicilina e10 μg/ml de canamicina foram inoculados com uma colônia única e incuba-dos a 37°C por 16-24 h sem agitação. O inócuo preparado foi diluído 50 χcom meio M9 contendo 20 μg/ml de ampicilina e 10 μg/ml de Canamicina eincubado a 37°C da noite para o dia em um agitador. As células foram cole-tadas através de centrifugação.

Células (1 g, transformadas com plasmídeo pAP594 e contendoplSM579) foram Iisadas através de ultrassonificação em tampão de Iise(Tris-HCI a 20 mM, EDTA a 5 mm, NaCI a 150 mM, pH 7,8, Tween 20 a0,1%). O lisato foi limpo através de centrifugação, e os restos celulares fo-ram lavados com tampão de lise. Sobrenadante agrupado foi carregado emuma coluna Sepharose CL-4B eluída em tampão TEM (Tric-HCl a 20 mM,EDTA a 5 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,8). A presença de capsídeos no Iisatolimpo e sobrenadante de lavagem foi confirmada através de eletroforese degel de agarose (TAE a 1%, gel tingido com brometo de etídio e detecçãoUV). Dois picos eluíram da coluna conforme determinado através de análiseSDS-PAGE ou UV-espectrométrica do espalhamento de luz a 310 nm. Fra-ções do segundo pico, contendo os capsídeos, foram agrupadas e carrega-das em uma coluna Sepharose CL-6B. Frações de pico da coluna CL-6Bforam agrupadas e concentradas usando uma unidade de filtro centrífugo(Amicon Ultra 15 MWCO 30000, Millipore). A proteína foi purificada mais a-través de uma rodada adicional de filtragem em gel em uma coluna CL-4B eas frações de pico resultantes foram agrupadas e concentradas em uma u-nidade de filtro centrífugo como acima. O tampão foi trocado para Hepes a10 mM, pH 7,5, e glicerol foi adicionado para uma concentração final de 50%.

Purificação de AP205_ mlL-1an7-27o do plasmídeo pAP596 foirealizada essencialmente conforme descrito para pAP594 acima, com a in-clusão de uma etapa de purificação de gradiente de sacarose adicional apósa última coluna CL-4B. A proteína foi posta em camada em um gradientepreparado com as soluções de sacarose que seguem: 9 ml 36%, 3 ml 30%,6ml 25%, 8 ml 20%, 6 ml 15%, 6 ml 10% e 3 ml 5% de sacarose. As fraçõesforam identificadas através de espectroscopia UV e frações agrupadas con-tendo os capsídeos foram concentradas em uma unidade de filtro centrífugocomo acima, e o tampão trocado para Hepes a 10 mM, pH 7,5. Glicerol foifinalmente adicionado para uma concentração final de 50%.

B. Imunização de camundongos com AP205_mIL-Ian7-270

Quatro camundongos balb/c fêmeas foram imunizados comAP205_- mlL-1ai 17-270· Vinte e cinco μg de proteína total foram diluídos emPBS para 200 μΙ e injetados subcutaneamente (100 μΙ em dois lados ven-trais) no dias 0, dia 4 e dia 28. Os camundongos foram sangrados retroorbi-talmente nos dias 0, 14, 28 e 35 e soros foram analisados usando ELISAespecífico de IL-1an7-27ode camundongo.

C. ELISA

Placas de ELISA foram revestidas com proteína IL-1ai17.27o decamundongo em uma concentração de 1 μg/ml. As placas foram bloqueadase então incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos dos dias14, 28 e 35. Anticorpos ligados foram detectados com anticorpo IgG antica-mundongo enzimaticamente marcado. Títulos de anticorpo de soros de ca-mundongo foram calculados como a média daquelas diluições que levaram àdensidade óptica média máxima a 450 nm. O título de IL-I0C117.270 antica-mundongo médio foi 1:4412 no dia 14, 1:27955 no dia 28 e 1:34824 no dia35. Isto demonstra que imunização com AP205_mIL-Ian7-270 poderia supe-rar a tolerância imunológica e produzir anticorpos de título alto que reconhe-cem especificamente I L-Ian 7-270·

D. Neutralização de IL-Ia in vitro

Soros de camundongos imunizados com AP205_mIL-Ian7-270foram testados quanto à sua habilidade em inibir a ligação de proteína IL-Iade camundongo a seu receptor. Placas de ELISA foram então revestidascom uma proteína de fusão mlL-1receptorl-hFc recombinante em uma con-centração de 1 μg/ml e co-incubadas com diluições seriais de soros de ca-mundongos que tinham sido imunizados ou com AP205_mlL-1ai 17-270 OUcom AP205 sozinho e 100 ng/ml de IL-Ian7-270 de camundongo. Ligação deIL-1an7-27oà proteína de fusão mlL-1receptorl-hFc imobilizada foi detectadacom um anticorpo de L-1a anticamundongo biotinilado e estreptavidina con-jugada à peroxidase do rábano de cavalo. Todos os soros de camundongosimunizados com AP205_mlL-1ai 17-270 inibiram completamente a ligação deIL-I0C117-270 de camundongo a seu receptor em concentrações de >3,3%, en-quanto soros de camundongos imunizados com AP205 não mostraram ne-nhum efeito inibidor significante em nenhuma concentração usada. Essesdados demonstram que imunização com AP205_mlL-1aii7.27o pode dar anti-corpos que são capazes de neutralizar a interação de IL-Ian7-270de camun-dongo com seu receptor.

E. Neutralização de IL-1 α in vivo

A capacidade de neutralização in vivo dos anticorpos criadospela imunização com AP205_mlL-1ai 17-270 foi investigada em seguida. Qua-tro camundongos balb/c fêmeas foram então imunizados três vezes nos dias0, 14 e 28 com AP205_mlL-1 ocn7-270 e quatro camundongos foram imuniza-dos ao mesmo tempo com AP205 sozinho. No dia 42 todos os camundongosforam injetados intravenosamente com 1 μg de IL-I0C117-270 de murino livre.

Como leitura da atividade inflamatória da ΙΙ_-1αιι7.27ο injetada, amostras desoro foram retiradas antes e 3 h após injeção e analisadas quanto ao au-mento relativo na concentração de citocina pró-inflamatória IL-6. Camundon-gos imunizados com AP205 mostraram um aumento médio na concentraçãode IL-6 no soro de 12,92 ± 3,95 ng/ml, enquanto camundongos imunizadoscom AP205_mlL-1ocii7-27o mostraram um aumento médio de apenas 0,06 ±0,05 ng/ml (p=0,01). Esses dados indicam que os anticorpos produzidos pelaimunização com AP205_mlL-1 Oc117-270 eram capazes de neutralizar especifi-camente e eficientemente a atividade pró-inflamatória de IL-1a.

F. Eficácia de AP205_mlL-1ai 17-270 em um modelo de ca-mundongo de artrite reumatóide

A eficácia de imunização de AP205_mlL-1ai17-27ofoi testada emum modelo de artrite induzida por colágeno de murino (CIA). CamundongosDBA/1 machos foram imunizados subcutaneamente três vezes (dias 0, 14 e28) com 50 μg ou de AP205_mlL-1ai 17-270 (n=8) ou AP205 sozinho (n=8), eentão injetados intradermalmente no dia 42 com 200 μg de colágeno bovinotipo Il misturado com adjuvante de Freund completo. Após uma injeção dereforço de 200 μς de colágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante deFreund incompleto no dia 63 os camundongos foram examinados em umabase diária quanto ao desenvolvimento de sintomas de artrite. Um score clí-nico variando de 0 a 3 foi designado para cada membro de acordo com ograu de vermelhidão e inchaço observados, e a espessura do tornozelo detodos os membros traseiros foi medida. Duas semanas após a segunda inje-ção de colágeno camundongos imunizados com Οβ mostraram um scorecumulativo clínico médio de 5,81, enquanto camundongos imunizados comQp AP205_mlL-1ocii7-27o mostraram um score médio de apenas 2,06. Alémdisso, o aumento médio na espessura do tornozelo traseiro foi 19% paracamundongos imunizados com AP205 e apenas 9% para camundongos quetinham sido imunizados com AP205_mlL-1an7-27o Tomados juntos, essesdados mostram que imunização com AP205_mlL-1an7-27o protege fortemen-te camundongos de inflamação e sinais clínicos de artrite em modelo de CIA.

EXEMPLO 9

A. Clonagem e expressão de partículas do tipo vírus con-sistindo em proteína de revestimento AP205 geneticamente fundida àIL-1 βι19-269 de camundongo (AP205_mlL-1 βιι9.269)

Clonagem, expressão e purificação de partículas do tipo vírusconsistindo em proteína de revestimento AP205 geneticamente fundida à IL-1 β 119-269 são realizadas essencialmente conforme descrito para AP205_mlL-1 CXi17-270 no EXEMPLO 8. A seqüência de interleucina 1 beta de murino foiamplificada a partir do plasmídeo pModEC1-His-EK-mlL^119.269 para inter-leucina 1 beta de murino usando iniciadores plNC-75 (5'-GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3', SEQ ID NO:192) e plNC-77 (5'-GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3', SEQ ID NO:193). Esses iniciadores amplifi-cam um gene interleucina-1 beta de murino com sítios 5' Kpn2l e 3' Hind III,e codificando adicionalmente a seqüência de aminoácido Gly-Gly no terminalN de interleucina 1 beta de murino. O fragmento mur-IL-1 β obtido foi digeridocom Kpn2l e Hiridlll e clonado nos mesmos sítios de restrição no vetorpAP590 (supressão de amber) criando o plasmídeo pAP630. JM109 de E.coli contendo plasmídeo plSM579, provendo supressão de amber, foi trans-formado com o plasmídeo pAP630. 5 ml de meio líquido LB com 20 μg/ml deampicilina e 10 μg/ml de canamicina foram inoculados com uma colônia úni-ca, e incubados a 37°C por 16-24 h sem agitação. O inócuo preparado foidiluído 50x com meio M9 contendo 20 μg/ml de ampicilina e 10 μg/ml de ca-namicina e incubados a 37°C da noite para o dia em um agitador. As célulasforam coletadas através de centrifugação.

B. Clonagem e expressão de partículas do tipo vírus con-sistindo em proteína de revestimento AP205 geneticamente fundida aIL-1β116-269 humana (AP205_hlL-B116.269)

A seqüência de interleucina 1 beta humana foi amplificada doplasmídeo pET42T-hlL-ipi 16-269 codificando interleucina 1 beta humanausando iniciadores plNC-74 (5'-GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTACGA TCA CTG AAC TG-G', SEQID NO:194) e plNC-76 (5'-GTATGCATTAGGAA GACA-CAAATTGCATGGTGAAGTC-3, SEQ ID NO:195), introduzindo um sítio 5'Kpn2l e 3' Mph11031, respectivamente. O fragmento de IL-1 β humana obti-do foi digerido com Kpn2l e Mphl 1031 e clonado nos mesmos sítios de res-trição no vetor pAP590 (supressão de amber) criando o plasmídeo pAP649.JM109 de E. coli contendo plasmídeo pISM 579 (provendo supressão deamber), foi transformado com plasmídeo pAP649. 5 mL de meio líquido LBcom 20 μg/ml de ampicilina e 10^g/ml de canamicina foram inoculados comuma colônia única, e incubados a 37°C por 16-24 h sem agitação. O inócuopreparado foi diluído 50x com meio M9 contendo 20 μg/ml de ampicilina e 10μ/ml de canamicina e incubados a 37°C da noite para o dia em um agitador.Células foram coletadas através de centrifugação.

C. Imunização de camundongos com AP205_mlL-ip119-269

Quatro camundongos balb/c fêmeas são imunizados comAP205_mlL-1B119.269. Vinte e cinco μg de proteína total são diluídos em PBSpara 200 μl e injetados subcutaneamente (100 μl em dois lados ventrais) nosdia 0, dia 14 e dia 28. Os camundongos são sangrados retroorbitalmente nos30 dias 0, 14, 28 e 36 e soros são analisados usando ELISA específico deAP205_mIL-1B119-269.

D. ELISAPlacas de ELISA foram revestidas com proteína ΙΙ_-1β119.269 decamundongo em uma concentração de 1 jig/ml. As placas são bloqueadas eentão incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos dos dias 0,14, 28 e 35. Anticorpos ligados são detectados com anticorpo IgG antica-mundongo enzimaticamente marcado. Títulos de anticorpo de soros de ca-mundongo são calculados como a média daquelas diluições que levaram àdensidade óptica média máxima a 450 nm. Imunização com AP205_mlL-1β119-269 dá um título de Ιί-1βι19.269 anti-camundongo específico alto. Istodemonstra que imunização com AP205_mlL-1aii9-269 poderia superar a tole-rância imunológica e produzir anticorpos de título alto que reconhecem es-pecificamente IL- 1βι 197-269·

Ε. Neutralização de IL-1 β in vitro

Soros de camundongos imunizados com ΑΡ205_ιτιΙί-1β1ι9.269foram testados quanto à sua habilidade em inibir a ligação de proteína IL-Ιβde camundongo a seu receptor. Placas de ELISA foram então revestidascom uma proteína de fusão mlL-1receptorl-hFc recombinante em uma con-centração de 1 μg/ml e co-incubadas com diluições seriais de soros de ca-mundongos imunizados ou com AP205_mlL-1aii9-269 ou com AP205 sozinhoe 100 ng/ml de IL-1 βι 19.269 de camundongo. Ligação de IL-1 βη 19-269 à proteí-na de fusão mlL-1 receptorl-hFc imobilizada é detectada com um anticorpode L-1 β anticamundongo biotinilado e estreptavidina conjugada à peroxidasedo rábano de cavalo. Todos os soros de camundongos imunizados comΑΡ205_ηηΙί-1βιΐ9.269 inibiram fortemente a ligação de Ιί-1β119.269 de camun-dongo a seu receptor, enquanto soros de camundongos imunizados comAP205 sozinho não mostraram nenhum efeito inibidor. Esses dados demons-tram que imunização com ΑΡ205_ηΊΐί-1β119.269 pode dar anticorpos que sãocapazes de neutralizar a interação de IL-1 Png-269 de camundongo e seu re-ceptor.

F. Neutralização de IL-1 β in vivo

A capacidade de neutralização in vivo dos anticorpos criadospela imunização com ΑΡ205_ΓπΙί-1βι19.269 foi investigada em seguida. Qua-tro camundongos balb/c fêmeas são então imunizados três vezes nos dias 0,14 e 28 com AP205_mlL-ip119.269 e quatro camundongos são imunizados aomesmo tempo com AP205 sozinho. No dia 35 todos os camundongos sãoinjetados intravenosamente com 1 μg de mlL-^119.269 livre. Como leitura daatividade inflamatória da ητιΙΙ_-1β119.269 injetada, amostras de soro são retira-das antes e 3 h após injeção e analisadas quanto ao aumento relativo naconcentração de citocina pró-inflamatória IL-6. Camundongos imunizadoscom AP205 mostraram um aumento médio na concentração de citocina pró-inflamatória IL-6. Camundongos imunizados com AP205 mostram um au-mento forte em concentrações de IL-6 no soro, enquanto camundongos imu-nizados com AP205_mlL-ip119.269 mostram apenas um aumente muito pe-queno. Esses dados indicam que os anticorpos produzidos pela imunizaçãocom AP205_mlL-ip119.269 são capazes de neutralizar especificamente e efi-cientemente a atividade pró-inflamatória de IL-1B.

G. Eficácia de ΑΡ205_πιΙΙ_-1β1 19-269 erri um modelo de ca-mundongo de artrite reumatóide

A eficácia de imunização de AP205_mlL-1 P119^foi testada emum modelo de artrite induzida por colágeno de murino (CIA). CamundongosDBA/1 machos foram imunizados subcutaneamente três vezes (dias O, 14 e28) com 50 μg ou de AP205_mlL-1pi19.269 (n=8) ou AP205 sozinho (n=8), eentão injetados intradermalmente no dia 42 com 200 μg de colágeno bovinotipo Il misturado com adjuvante de Freund completo. Após uma injeção dereforço de 200 μg de colágeno bovino tipo Il misturado com adjuvante deFreund incompleto no dia 63 os camundongos foram examinados em umabase diária quanto ao desenvolvimento de sintomas de artrite. Um score clí-nico variando de 0 a 3 é designado para cada membro de acordo com o graude vermelhidão e inchaço observados, e a espessura do tornozelo de todosos membros traseiros foi medida. Duas semanas após a segunda injeção decolágeno camundongos imunizados com AP205_mlL-ip119.269 mostram umscore clínico médio fortemente reduzido quando comparados com camun-dongos imunizados com AP205. Além disso, camundongos imunizados comΑΡ205_ΐΎΐΙΙ_-1β119.269 mostram apenas uma pequeno aumento em espessurade tornozelo traseiro, enquanto camundongos imunizados com AP-205 mos-tram um aumento forte em espessura de tornozelo traseiro. Tomados juntos,esses dados mostram que imunização com AP205_mll_-1 P119.269 protege for-temente camundongos de inflamação e sinais clínicos de artrite em modelode CIA.

EXEMPLO 10

A. Clonagem, expressão e purificação de IL-1 βιιβ-269 humana

A seqüência de nucleotídeo codificando os aminoácidos 116-269de IL-1 β humana (hlL-1 pn6-269> foi amplificada através de PCR a partir deuma biblioteca de cDNA de tecido de fígado humano usando oligonucleotí-deos HIL-1 (5'-ATATATGATATCCCTGTACGATCACTGAACTGCACG-3';

SEQ ID NO: 124) e HIL-2 (5'-ATATATCTCGAGGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAG-3'; SEQ ID NO: 125), digerida com Xhol e EcoRV e clonadano vetor de expressão pET42T(+).

Plasmídeo pET-42T(+) foi construído substituindo a região inte-gral entre o promotor T7 e o ternninador T7 de pET-42a(+) (Novagen) emduas etapas por novas seqüências ligantes, que facilita a expressão de umaproteína de interesse como uma fusão com um tag C-terminal (SEQ IDNO: 190) compreendendo um H\s-tag e um Iigante contendo cisteína. Emuma primeira etapa o plasmídeo pET-42a(+) foi digerido com as enzimas derestrição Ndel e AvrlI, liberando um fragmento de 958 pb entre o promotorT7 e o terminador T7 composto de GST-tag, S-tag, dois His-tag e o sítio declonagem múltiplo. O fragmento de 4972 pb residual contendo a estruturaprincipal do vetor de pET-42a(+) foi isolado e ligado aos oligonucleotídeoscomplementares anelados 42-1 (5'-TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAATTGATTAC-3'; SEQ ID NO:126) e 42-2 (5'-CTAGGTAATCAATTACTCGAGCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3'-SEQ ID NO:127), dando origem ao plasmídeo pET-42S(+). Na segunda eta-pa o plasmídeo pET-42S(+) foi Iinearizado através de digestão com enzimasde restrição Xhol e AvrlI, e ligado aos oligonucleotídeos anelados comple-mentares 42T-1 (5'-TCGAGCACCACCACCACCACCACGGTGGTTGCTAATAATAATTGATTAATAC-3'; SEQ ID NO:128) e 42T-2 (5'-CTAGGTATTAATCAATTATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3'; SEQ IDNO:129), resultando em plasmídeo pET-42T(+).

A clonagem do fragmento de IiIL-IB116-269 acima mencionado empET-42T(+) deu origem ao plasmídeo ρΕΤ42Τ-1β116-269· Este plasmídeo co-difica uma proteína de fusão correspondendo à IL-1β humana madura e umHis-íagr e um ligante contendo cisteína C-terminal (GGC, SEQ ID NO:178).Deste modo, a proteína de fusão consiste em SEQ ID N0:190 C-terminal-mente fundida à SEQ ID NO:165. O resíduo alanina original na posição 117de IL-1β humana foi mudado para isoleucina nesta proteína de fusão. Ex-pressão e purificação de proteína IL-1 P116-269 foram realizadas essencialmen-te conforme descrito para a proteína mlL-1 P119-269 de murino no EXEMPLO 1.

B. Clonagem, expressão e purificação de muteínas de IL-1β116-269 humana

Através de mutagênese direcionada ao sítio do plasmídeoPET42T-hlL-ip116-269. vetores de expressão para dez proteínas de fusão IL-1 β116-269 humanas mutantes diferentes foram construídos. Para este objetivo,o Quik-Change® Site directed mutagenesis kit (Stratagene) foi usado de a-cordo com as instruções do fabricante. Os vetores de expressão para essasproteínas IL-ip119.269 mutantes são listados na Tabela 3 junto com os paresde oligonucleotídeo usados para sua construção. Expressão e purificaçãodas muteínas de IL-1 β119-269 humana diferentes foram realizadas conformedescrito no EXEMPLO 1.Tabela 3: Visão geral de muteínas de IL-1, vetores de expressão e oligonu-cleotídeos usados para sua construção

<table>table see original document page 87</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 88</column></row><table>

EXEMPLO 11

Atividade biológica de IL-1pn6-269 humana e muteínas de IL-1116-269 humana

Três camundongos fêmea C3H/HeJ por grupo são injetados in-travenosamente com 10 μg ou de proteína Ιί-1β119.269 humana do tipo selva-gem ou uma das muteínas de proteína IL-iPng-269 humana do EXEMPLO 10.Amostras de soro são retiradas antes e 3 h após injeção e analisadas quantoao aumento relativo na concentração de citocina pró-inflamatória IL-6. Ca-mundongos injetados com a proteína ΙL-1β119.269 humana do tipo selvagemmostram um aumento forte em concentrações de IL-6 no soro, enquantocamundongos injetados com qualquer uma das proteínas de muteína de IL-1β119-269 humana mostram apenas um aumento leve ou nenhum aumento demodo algum.

EXEMPLO 12

A. Acoplamento de IL-iPn6-269 humana e muteínas de IL-1 βι 16-269 humana a partículas do tipo vírus

Ligação com cruzamento química da proteína Ιί-1β119.269 huma-na do tipo selvagem e as muteínas de IL-1p119.269 humana do EXEMPLO 10a partículas do tipo vírus Οβ foi realizada essencialmente conforme descritono EXEMPLO 2A.

B. Imunização de camundongos com Ιί-1βι16-269 e muteí-nas de IL-1 βι 16-269 acopladas a capsídeo Οβ

Quatro camundongos balb/c fêmeas por grupo foram imunizadoscom Οβ acoplada ou à proteína Μί-1β116.269 do tipo selvagem ou uma dasproteínas de muteína de Νί-1β116-269· Cinqüenta μg de proteína total foramdiluídos em PBS para 200 μΙ e injetados subcutaneamente (100 μΙ em dois1 lados ventrais) nos dias 0, 14 e 28. Os camundongos foram sangrados re-troorbitalmente no dia 35, e soros foram analisados usando ELISAs específi-cos ou para a respectiva muteína de IL-1 βιιβ-269 humana usada como imu-nógeno ou a proteína IL-1 βιιβ-269 humana do tipo selvagem.

C. ELISA

Placas de ELISA foram revestidas ou com a proteína hlL-1 βιιβ-269 do tipo selvagem ou a respectiva muteína de Νί-1βιι6-269 em uma con-centração de 1 μg/ml. As placas foram bloqueadas e então incubadas comsoros de camundongo serialmente diluídos do dia 35. Anticorpos ligados fo-ram detectados com anticorpo IgG anticamundongo enzimaticamente mar-cados. Títulos de anticorpo de soros de camundongo foram calculados comoa média daquelas diluições que levaram à densidade óptica médio máxima a450 nm, e são mostrados na Tabela 4.Tabela 4: Títulos de IgG específico anti-hlL-1 βι16.269 (tipo selva-gem e muteína) criado pela imunização com vacinas de Qp-hlL-1 β116-269 oumuteína de Qp-ML-Ip1 16-269.

<table>table see original document page 90</column></row><table>

Imunização com Qp-hlL-1p116.269 induziu títulos altos de anticor-pos IgG contra hll_-iPii6-269· Além disso, vacinação com qualquer uma dasvacinas de muteína de Qp-hlL-1p116-269 induziu títulos de IgG altos contraambas a muteína de hlL-ip116-269 usada como imunógeno e a proteína hlL-1pi 16-269 do tipo selvagem.

D. Neutralização de IL-Ip humana in vivo

Soros de camundongos imunizados com Qp acoplado ou à pro-teína hll_-1 βι 16-269 do tipo selvagem ou a uma das muteínas de hlL-iPn6-269foram testados quanto à sua habilidade em inibir a ligação de proteína IL-1 βhumana a seu receptor. Placas de ELISA foram então revestidas com umaproteína de fusão IL-1receptorl-hFc humana em uma concentração de 1μg/ml e co-incubadas com diluições seriais dos soros acima mencionados e100 ng/ml de proteína hlL-1p116-269· Ligação de hlL-ip116.269 à proteína defusão IL-1receptorl-hFc humana imobilizada foi detectada com um anticorpoIL-ip anti-humano biotinilado e estreptavidina conjugada à peroxidase dorábano de cavalo. Todos os soros criados contra vacinas de muteína de Qp-hlL-1 βιΐ6-269 inibiram completamente a ligação de 100 ng/ml de hlL-1pn6-269do tipo selvagem a hlL-1 R1 em concentrações no soro £3,3%.Ε. Neutralização de IL-Ιβ in vivo

A capacidade de neutralização in vivo dos anticorpos criadospela imunização com Οβ acoplada o ou proteína hlL-ip116-269 do tipo selva-gem ou a uma das muteínas de hlL-1pn6-269 é investigada. Três camundon-gos C3H/HeJ fêmeas por grupo são então imunizados três vezes nos dias 0,14 e 28 com 50 μg de qualquer vacina. No dia 35 todos os camundongosimunizados são injetados intravenosamente com 1 |j,g de hlL-Ιβι 16-269 do tiposelvagem livre. Como um controle três camundongos puros (naíve) são inje-tados ao mesmo tempo com a mesma quantidade de hll_-ip116-269 do tiposelvagem. Como leitura da atividade inflamatória da Οβ-ΜΙ_-1βι 16-269 injetada,amostras de soro são retiradas imediatamente antes e 3 horas após injeçãoe analisadas quanto ao aumento relativo na concentração da citocina pró-inflamatória IL-6. Enquanto camundongos puros mostram um aumento forteem concentrações no soro 3 h após injeção de hlL-1 βιΐ6-269, todos os ca-mundongos imunizados com Οβ acoplado à proteína hlL-^n6-269do tipo sel-vagem ou a uma das muteínas de -ΜΙ_-1β116-269 não mostram nenhum au-mento de IL-6 no soro, indicando que a hlL-Ιβι 16-269 injetada é eficientemen-te neutralizada pelos anticorpos induzidos pelas vacinas.

EXEMPLO 13

Melhora de inflamação induzida por MSU através da imuni-zação com Οβ-ηιΙΙ_-1βιΐ9.269

Gota é um distúrbio inflamatório doloroso causado pela precipi-tação de cristais de urato monossódico (MSU) em juntas e tecidos periartri-culares. Cristais de MSU foram mostrados ativar a então chamada inflam-masome NALP3, resultando na produção de IL-^a ativa, que é principal-mente responsável pela iniciação e promoção da resposta inflamatória ca-racterística da doença. Camundongos C57BL/6 (5 por grupo) são imuniza-dos subcutaneamente três vezes em intervalos de duas semanas com 50 μgde Οβ-ΝΙ_-1βιΐ9-269θυ 50 μg de VLPs de Οβ sozinho. Uma semana após aúltima imunização todos os camundongos foram provocados intraperitone-almente com 1,5 mg de cristais de MSU. Seis horas após a provocação oscamundongos são sacrificados e números de neutrófilos bem como as con-centrações dos quimioatraentes de neutrófilo KC e MIP-2 são medidos emexudatos peritoneais. Camundongos imunizados com Οβ-ηηΙΙ_-1βιΐ9-269 mos-tram neutrofilia e concentrações de MIP-2 e KC acentuadamente reduzidas,quando comparados com controles imunizados com Οβ.

EXEMPLO 14

Melhora de encefalite auto-imune experimental através daimunização com Οβ-mlL-l β119.269

Em um modelo de camundongo para esclerose múltipla, camun-dongos C57BL/6 (8 por grupo) são imunizados subcutaneamente três vezesem intervalos de duas semanas com 50 μg de Οβ-hlL-l Pn9-269 ou 50 μg deVLPs de Οβ sozinho. Uma semana após a última imunização, todos os ca-mundongos são injetados subcutaneamente com 100 μg de peptídeo MOG(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK, SEQ ID NO:191) misturado com adjuvan-te de Freund completo. No mesmo dia e dois dias depois todos os camun-dongos são injetados intraperitonealmente com 400 ng de toxina pertussis.

Os camundongos são classificados em uma base diária quanto ao desenvol-vimento de sintomas neurológicos de acordo com o esquema que segue: 0,nenhuma doença clínica; 0,5, final da cauda fraco; 1, cauda completamentefraca; 1,5, cauda fraca e fraqueza do membro traseiro (caminhar instável eapoio pobre das patas traseiras); 2, paralisia do membro traseiro parcial uni-lateral; 2,5, paralisia do membro traseiro parcial bilateral; 3, paralisia domembro traseiro bilateral completa; 3,5, paralisia do membro traseiro bilate-ral completa e paralisia do membro frontal unilateral; 4, paralisia total dosmembros traseiros e frontais. Camundongos imunizados com Οβ-hlL-l β119.269 mostram sintomas clínicos claramente reduzidos quando comparado comcamundongos imunizados com Οβ.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Cytos Biotechnology AGBachmann, MartinSpohn, Gunther

<120> COMPOSIÇÃO CONTENDO CONJUGADOS DE INTERLEUCINA-1, SEUS USOS, PROCESSO

DE PRODUÇÃO, VACINA E MÉTODO DE IMUNIZAÇÃO<130> P1051PC00<150> 60/721,106<151> 2005-09-28<160> 195

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 185<212> PRT

<213> Vírus da Hepatite B<400> 1

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175

Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185

<210> 2<211> 188<212> PRT

<213> Vírus da Hepatite B<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80

Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95

Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110

Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125

Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140

Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser145 150 155 160

Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185

<210> 3<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 3

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 4

<211> 329

<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta

<400> 4Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15

Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30

Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45

Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60

Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro65 70

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln85

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu100

Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro115 120

Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu130 135

Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser75 80

Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser90 95

Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu105 .110

Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln125

Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly140

Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160

Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175

Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190

Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205

Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220

Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255

Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270

Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285

Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300

Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320

Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325

<210> 5

<211> 129

<212> PRT

<213> Bacteriófago R17<400> 5

Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15

Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60

Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125

Tyr

<210> 6<211> 130<212> PRT

<213> Bacteriófago fr<400> 6

Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr15 10 15

Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn85

Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu100

Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala115 120

Ile Tyr130

Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe90 95

Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr105 110

Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly125

<210> 7<211> 130<212> PRT

<213> Bacteriófago GA<400> 7

Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly15 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30

Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45

Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60

Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80

Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95

Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110

Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125

Tyr Ala130

<210> 8

<211> 132

<212> PRT

<213> Bacteriófago SP

<400> 8

Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15

Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30

Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45

Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60

Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 .120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 9<211> 329<212> PRT

<213> Bacteriófago SP<400> 9

Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp15 10 15

Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vál Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val50 55 60

Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp65 70 75 80

Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr85 90 95

Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala100 105 110

Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn115 120 125

Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp130 135 140

Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro145 150 155 160

Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly165 170 175

Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg180 185 19Ò

Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205

Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp210 215 220

Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp225 230 235 240

Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly245 250 255

Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu260 265 270

Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala275 280 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300

Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro305 310 315 320

Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser325

<210> 10<211> 130<212> PRT

<213> Bacteriófago MS2<400> 10

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr15 10 15

Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu100 105 110

Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125

Ile Tyr130

<210> 11

<211> 133

<212> PRT

<213> Bacteriófago Mll

<400> 11

Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 15

Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30

Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45

Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60

Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg -Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110

Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr130

<210> 12<211> 133<212> PRT

<213> Bacteriófago MXl<400> 12

Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly15 10 15

Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30

Val Ala Ala35

Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60

Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110

Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr130

<210> 13<211> 330<212> PRT

<213> Bacteriófago NL95<400> 13

Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly15 10 15

Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30

Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45

Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60

Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140

Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro145 150 155 160

Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly165 170 175

Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190

Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205

Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220

Ile225

Glu Thr His

Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp230 235 240Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255

Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270

Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300

Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320

Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330

<210> 14<211> 129<212> PRT

<213> Bacteriófago f2<400> 14

Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly15 10 15

Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60

Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125

Tyr

<210> 15<211> 128<212> PRT

<213> Bacteriófago PP7<400> 15

Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu15 10 15

Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30

Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45

Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80

Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95

Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110

Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125

<210> 16<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 16

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys15 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr --■·

130

<210> 17<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 17

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys15 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 18<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 18

Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys15 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 19<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 19

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg15 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr65 70

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys85

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu100

Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys75 80

Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe90 95

Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 20<211> 132<212> PRT

<213> Bacteriófago Qbeta<400> 20

Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg15 10 15

Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60

Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 21<211> 131<212> PRT

<213> Bacteriófago· AP205<400> 21

Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile15 10 15

Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30

Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45

Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80

Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 ' 120 125Thr Thr Ala130

<210> 22<211> 131<212> PRT

<213> Bacteriófago AP205<400> 22

Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15

Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30

Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45

Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80

Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125

Thr Thr Ala130

<210> 23

<211> 131

<212> PRT

<213> Bacteriófago AP205

<400> 23

Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile-1 - 5 10 15

Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30

Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45

Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80

Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125

Thr Thr Ala130<210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> Iniciador de PCR<400> 24

atatatgcta gccccttaca cctaccagag tgatttg

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 25

atatatctcg agtgatatct ggaagtctgt catagag

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 26

atatatgcta gcccccatta gacagctgca ctacagg

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 27

atatatctcg agggaagaca cagattceat ggtgaag

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5

<210> 29<211> 5473<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Vetor de clonagem<400> 29

acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgctatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctctcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcaccgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc cggccacggggcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatcttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgatgccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat cgagatctcg atcccgcgaa attaatacgactcactatag gggaattgtg agcggataac aattcccctc tagaaataat tttgtttaactttaagaagg agatatacat atggatccac accaccacca ccaccacggt tctggtgacgacgatgacaa agcgctagcc ctcgagggtg gtggtggtgg ttgcggttaa taagtttaaacgcggccgca tgcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaaggaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctctaaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatt ggcgaatgggacgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccgctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 900

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 960

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1020

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1080

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1140

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1200

acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcagg tggcactttt cggggaaatg 1260

tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 132 0

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 1380

atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 1440

cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 1500

tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 1560

caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 1620

ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 1680

cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 1740

taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 1800

agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 1860

cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg 1920

caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 1980

taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 2040

ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 2100

cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 2160

aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 222 0

attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 22 80

tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 2340

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagãtcaaa ggatcttctt 2400

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 2460

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 2520

gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 2580

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 2640

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 2700

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 2760

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 2820

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 2880

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 2940

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 3000

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 3060

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 3120

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc 3180

ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatatggt gcactctcag 3240

tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac 3300

tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3360

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3420

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg 3480

tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc 3540

agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt 3600

ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca tgggggtaat gataccgatg 3660

aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa 3720

cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag 3780

ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat 3840

cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt 3900

tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag 3960

cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa 4020

ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggggcc 4080

gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg 4140

aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc 4200

gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct 42 60

acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc 4320

caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc 4380

taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 4440

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 4500

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 4560

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 4620

aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc 4680

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 4740

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 4800

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 4860tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 4920

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 4980

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 5040

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 5100

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 5160

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 5220

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 5280

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 5340

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 5400

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 5460

ggcatactct gcg 5473

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 30

tatggatccg gctagcgctc gagggtttaa acggcggccg cat 43

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 31

tcgaatgcgg ccgccgttta aaccctcgag cgctagccgg atcca 45

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCT

<400> 32

gatccacacc accaccacca ccacggttct ggtgacgacg atgacaaagc gctagccc 58

<210> 33

<211> 58

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 33

tcgagggcta gcgctttgtc atcgtcgtca ccagaaccgt ggtggtggtg gtggtgtg 58

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 34

tcgagggtgg tggtggtggt tgcggttaat aagtttaaac gc 42

<210> 35

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador de PCR

<400> 35

ggccgcgttt aaacttatta accgcaacca ccaccaccac cc 42

<210> 36<211> 271<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 36

Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser15 10 15

Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met35 40 45

Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60

Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125

Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile130 135 140

Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu145 150 155 160

Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp165 170 175

Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr180 185 190

Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 -'· 200 205

Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe210 215 220

Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro225 230 235 240

Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly245 250 255

Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala260 265 270

<210> 37<211> 271<212> PRT

<213> Macaca mulatta<400> 37

Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser15 10 15

Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30Lys Ser Phe Tyr Asp Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met35 40 45

Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Ile Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60

Leu Thr Phe Lys Gln Ser Met Val Val Val Ser Thr Asn Gly Lys Val65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asn Asn85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Met Thr Tyr His Phe Ile Arg115 120 125

Ile Ile Lys His Glu Phe Ile Leu Asn Asp Thr Leu Asn Gln Thr Ile130 135. 140

Ile Arg Ala Asn Asp Gln His Leu Thr Ala Ala Ala Ile His Asn Leu145 150 155 160

Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Ser Lys Asp165 170 175

Asp Thr Lys Val Pro Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr180 185 190

Val Ser Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205

Glu Ile Asn Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Phe Leu Phe Phe210 215 220

Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Ile Ser Val Ala His Pro225 230 235 240

Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys His Asp Asn Trp Val Cys Leu Ala Lys245 250 255

Gly Leu Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala260 265 270

<210> 38<211> 270<212> PRT

<213> Equus caballus<400> 38

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Thr Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Asp Pro Leu Pro Glu Asp Cys Met35 40 45

Asp Thr Phe Met Ser Leu Ser Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60

Leu Asn Phe Lys Glu Ser Val Val Leu Val Ala Ala Asn Gly Lys Thr65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asn Asp Asp85 90 95Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Pro Glu Glu Gly Ile Ile Arg Pro Arg100 105 110

Ser Val His Tyr Asn Phe Gln Ser Asn Thr Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125

Ile Val Asn His Gln Cys Thr Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Val130 135 140

Ile Arg Asp Thr Ser Gly Gln Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Leu Asn Asn145 150 155 160

Leu Asp Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Glu Glu165 170 175

Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe180 185 190

Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205

Asp Thr Pro Lys Thr Ile Lys Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp210 215 220

Glu Arg His Gly Ser Lys Asn Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys225 230 235 240

Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Gly Lys Leu Val His Met Ala Arg Gly245 250 255

Gln Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Asp Asn Gln Phe260 265 270

<210> 39<211> 268<212> PRT<213> Ovis aries<400> 39

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Arg Glu Asp His Met35 40 45

Asn Lys Phe Met Ser Leu Asp Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Arg50 55 60

Leu Ser Phe Lys Glu Asn Val Val Met Met Thr Ala Asn Gly Lys Ile65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Ala His Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125

Val Ile His Gln Glu Cys Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile130 135 140

Ile Arg Asp Met Ser Gly Pro Tyr Leu Thr Ala Ala Thr Leu Asn Asn145 150 155 160Leu Glu Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Val Ala Tyr Val Ser Glu Glu165 170 175

Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Phe180 185 190

Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205

Glu Thr Pro Lys Ile Ile Lys Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp210 215 220

Glu Lys His Gly Ser Met Asp Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys225 230 235 240

Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Ser Gly245 250 255

Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Lys260 265

<210> 40<211> 270<212> PRT<213> Felis catus<400> 40

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser15 10 15

Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Thr Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Asp Pro Leu His Glu Asp Cys Thr35 40 45

Asp Lys Phe Met Ser Pro Ser Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Pro Gln50 55 60

Leu Thr Leu Lys Lys Ser Val Val Met Val Ala Ala Asn Gly Lys Ile65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln- Phe Leu Thr Ala Asp Asp85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Glu Val Glu Glu Glu Ile Met Lys Pro Arg100 105 110

Ser Val Ala Pro Asn Phe Tyr Ser Ser Glu Lys Tyr Asn Tyr Gln Lys115 120 125

Ile Ile Lys Ser Gln Phe Ile Leu Asn Asp Asn Leu Ser Gln Ser Val130 135 140

Ile Arg Lys Ala Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Ala Ala Ala Leu Gln Asn145 150 155 160

Leu Asp Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Lys Glu165 170 175

Asp Ser Lys Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe180 185 190

Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro195 200 205

Glu Thr Pro Lys Thr Ile Arg Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp210 215 220Glu Arg His Gly Ser Lys Asn Tyr225 230

Leu Phe Ile Ala Thr Gln Glu Glu245

Leu Pro Ser Val Thr Asp Phe Gln260

Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys235 240

Gln Leu Val His Met Ala Arg Gly250 255

Ile Leu Glu Thr Gln Ser265 270

<210> 41<211> 268<212> PRT<213> Bos taurus<400> 41

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Glu Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Arg Glu Asp Gln Met35 40 45

Asn Lys Phe Met Ser Leu Asp Thr Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys50 55 60

Leu Ser Phe Lys Glu Asn Val Val Met Val Ala Ala Ser Gly Lys Ile65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asn Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Ala His Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125

Val Ile His Gln Glu Cys Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile130 135 140

Ile Arg Asp Met Ser Gly-Pro Tyr Leu Thr Ala Thr Thr Leu Asn Asn145 150 155 160

Leu Glu Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Val Ala Tyr Val Ser Glu Glu165 170 175

Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu180

Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu

195 .200

Glu Thr Pro Lys Ile Ile Lys Asp210 215

Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Phe185 190

Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro205

Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp220

Glu Lys His Gly Ser Met Asp Tyr Phe Lys Ser Val Ala His Pro Lys

225 230 235 240

Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Ser Gly

245 250 255

Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Lys260 265

<210> 42<211> 270<212> PRT<213> Sus scrofa<400> 42

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Asp Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu Pro Gly Asp Gly Met35 40 45

Asp Lys Phe Met Pro Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ser Lys Thr Ser Arg50 55 60

Leu Asn Phe Lys Asp Ser Val Val Met Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ile65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Phe Ile Thr Asp Asp Asp85 90 95

Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Ala Thr Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Met Lys Tyr Asn Phe Met Arg115 120 125

Val Ile Asn His Gln Cys Ile Leu Asn Asp Ala Arg Asn Gln Ser Ile130 135 140

Ile Arg Asp Pro Ser Gly Gln Tyr Leu Met Ala Ala Val Leu Asn Asn145 150 155 - 160

Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Ala Ala Tyr Thr Ser Asn Asp165 170 175

Asp Ser Gln Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Glu Thr Arg Leu Phe180 185 190

Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Leu Pro195 200 205

Glu Thr Pro Lys Thr Ile Lys Asp Glu Thr Ser Leu Leu Phe Phe Trp210 215 220

Glu Lys His Gly Asn Met Asp Tyr Phe Lys Ser Ala Ala His Pro Lys225 230 235 240

Leu Phe Ile Ala Thr Arg Gln Glu Lys Leu Val His Met Ala Pro Gly245 250 255

Leu Pro Ser Val Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ser260 265 270

<210> 43<211> 268<212> PRT

<213> Oryctolagus cuniculus<400> 43

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Phe Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Glu Pro Leu His Glu Asp Cys Met35 40 45Asn Lys Val Val Ser Leu Ser Thr Ser Glu Thr Ser Val Ser Pro Asn50 55 60

Leu Thr Phe Gln Glu Asn Val Val Ala Val Thr Ala Ser Gly Lys Ile65 70 75 80

Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Pro Ile Thr Asp Val Asp85 90 95

Leu Glu Thr Asn Val Ser Asp Pro Glu Glu Gly Ile Ile Lys Pro Arg100 105 110

Ser Val Pro Tyr Thr Phe Gln Arg Asn Met Arg Tyr Lys Tyr Leu Arg115 120 125

Ile Ile Lys Gln Glu Phe Thr Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Leu130 135 140

Val Arg Asp Thr Ser Asp Gln Tyr Leu Arg Ala Ala Pro Leu Gln Asn145 150 155 160

Leu Gly Asp Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Val Tyr Met Thr Ser Lys165 170 175

Glu Asp Ser Ile Leu Pro Val Thr Leu Arg Ile Ser Gln Thr Pro Leu180 185 190

Phe Val Ser Ala Gln Asn Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met195 200 205

Pro Glu Thr Pro Arg Ile Ile Thr Asp Ser Glu Ser Asp Ile Leu Phe210 215 220

Phe Trp Glu Thr Gln Gly Asn Lys Asn Tyr Phe Lys Ser Ala Ala Asn225 230 235 240

Pro Gln Leu Phe Ile Ala Thr Lys Pro Glu His Leu Val His Met Ala245 250 255

Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser260 265

<210> 44<211> 265<212> PRT

<213> Canis familiaris<400> 44

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser15 10 15

Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Glu20

Lys Ser Phe Tyr Asp Met Ser Cys35 40

Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ile Ser50 55

Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln25 30

Asp Pro Leu His Glu Asp Cys Met45

Lys Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys60

Glu Asn Val Val Val Val Ala Ala65 70

Arg Leu Ser Leu Ser Gln Phe Ile85

Ala Asn Asp Thr Glu Glu Val Ile100

Asn Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg75 80

Thr Asp Asp Asp Leu Glu Gly Ile90 95

Met Lys Pro Arg Ser Val Ala Tyr105 110Asn Phe His Asn Asn Glu Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg Ile Ile Lys Ser115 120 125

Gln Phe Ile Leu Asn Asp Asn Leu Asn Gln Ser Ile Val Arg Gln Thr130 135 140

Gly Gly Asn Tyr Leu Met Thr Ala Ala Leu Gln Asn Leu Asp Asp Ala145 150 155 160

Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Thr Ser Glu Asp Ser Lys Leu Pro165 170 175

Val Thr Leu Arg Ile Ser Lys Thr Arg Leu Phe Val Ser Ala Gln Asn180 185 190

Glu Asp Glu Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Thr Pro Lys Thr195 200 205

Ile Arg Asp Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu Arg His Gly Ser210 215 220

Lys His Tyr Phe Lys Ser Val Ala Gln Pro Lys Leu Phe Ile Ala Thr225 230 235 240

Gln Glu Arg Lys Leu Val His Met Ala Arg Gly Gln Pro Ser Ile Thr245 250 255

Asp Phe Arg Leu Leu Glu Thr Gln Pro260 265

<210> 45

<211> 270

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 45

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser1 5 10 15

Glu Asn Glu Asp Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Gly Ser Leu His "Glu Thr Cys Thr35 40 45

Asp Gln Phe Val Ser Leu Arg Thr Ser Glu Thr Ser Lys Met Ser Asn50 55 60

Phe Thr Phe Lys Glu Ser Arg Val Thr Val Ser Ala Thr Ser Ser Asn65 70 75 80

Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Phe Ser Glu Thr Phe Thr85 90 95

Glu Asp Asp Leu Gln Ser Ile Thr His Asp Leu Glu Glu Thr Ile Gln100 105 110

Pro Arg Ser Ala Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Leu115 120 125

Met Lys Leu Val Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln130 135 140

Thr Ile Tyr Gln Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr Trp Leu145 150 155 160

Asn

Asp Leu

Gln

Gln Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser165 170 175Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Asp Ser180 185 190

Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys195 200 205

Glu Leu Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu210 215 220

Ile Phe Phe Trp Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala225 230 235 ' 240

Ala Tyr Pro Glu Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg Val His245 250 255

Leu Ala Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser260 265 270

<210> 46<211> 270<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<400> 46

Met Ala Lys Val Pro Asp Leu Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser15 10 15

Glu Asn Glu Glu Tyr Ser Ser Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln20 25 30

Lys Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Tyr Gly Ser Leu His Glu Asn Cys Thr35 40 45

Asp Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Ser Glu Thr Ser Lys Met Ser Thr50 55 60

Phe Thr Phe Lys Glu Ser Arg Val Val Val Ser Ala Thr Ser Asn Lys65 70 75 80

Gly Lys Ile Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Phe Asn Gln Pro Phe Thr85 90 95

Glu Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ala Tiis Asp Leu Glu Glu Thr Ile Gln100 105 110

Pro Arg Ser Ala Pro His Ser Phe Gln Asn Asn Leu Arg Tyr Lys Leu115 120 125

Ile Arg Ile Val Lys Gln Glu Phe Ile Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln130 135 140

Asn Ile Tyr Val Asp Met Asp Arg Ile His Leu Lys Ala Ala Ser Leu145 150 155 160

Asn Asp Leu Gln Leu Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser165 170 175

Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Val Ser Asn Thr180 185 190

Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Lys Pro Val Leu Leu Lys195 200 205

Glu Ile Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu210 215 220

Ile Phe Phe225

Trp Glu

Lys Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala230 235 240Ala Phe Pro Glu Leu Leu Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Gln Val His245 250 255

Leu Ala Arg Gly Leu Pro Ser Met Ile Asp Phe Gln Ile Ser260 265 270

<210> 47<211> 152<212> PRT

<213> Gorilla gorilla<400> 47

Lys Asn Cys Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His1 5 10 15

Leu Ser Leu Asn Gln Lys Ser Phe Tyr His Val Thr Tyr Gly Pro Leu20 25 30

His Glu Gly Cys Met Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr35 40 45

Ser Lys Thr Ser Lys Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala50 55 60

Thr Asn Gly Lys Val Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser65 70 75 80

Ile Thr Asp Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu85 90 95

Ile Ile Lys Pro Arg Ser Ala Pro Phe Ser Phè Leu Ser Asn Val Lys100 105 110

Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Asn Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala115 120 125

Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala130 135 140

Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala145 150

<210> 48<211> 204<212> PRT

<213> Cavia porcellus<400> 48

Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser Glu Asn Glu Glu Tyr Ala Ser15 10 15

Ala Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln Lys Ser Phe Tyr Asp Thr Asn20 25 30

Tyr Asp Pro Leu His Glu Asn Arg Val Asp Glu Pro Val Ser Pro Asn35 40 45

Pro Tyr Glu Asn Ser Glu Glu Ser Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ser Ser50 55 60

Asp Ser Ser Ala Val Val Leu Thr Ser Ala His Gly Glu Val Leu Lys65 70 75 80

Lys Arg Arg Leu Ser Leu Asn Gln Thr Met Ser Asn Glu Asp Leu Glu85 90 95

Ala

Ile Ala

Asn Asp100

Ser Glu Glu Glu Ile Ile Glu Pro Trp Ser Val105 110Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asn Leu Lys Phe Lys Tyr Gln Arg Ser Ile115 120 125

Lys Lys Gly Ala Val Ile Thr Asp Ala Met His Gln Ser Leu Ile Arg130 135 140

Glu Ser Asn Gly Gln His Leu Lys Ala Met His Val Val Asp Arg Lys145 150 155 160

His Glu Val Lys Phe Asp Ile Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ala Thr Arg165 170 175

Ile Arg Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Cys180 185 190

Ala Gln Glu Glu Gly Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu195 200

<210> 49

<211> 269

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser15 10 15

Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met20 25 30

Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile35 40 45

Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala50 55 60

Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro65 70 75 80

Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala100 105 110

Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp115 120 125

Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala130 135 140

Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met145 150 155 160

Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu165 170 175

Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp180 185 190

Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys195 200 205

Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn210 215 220

Lys Leu Glu225

Phe

Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr230 235 240Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly245 250 255

Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser260 265

<210> 50<211> 193<212> PRT

<213> Pan troglodytes<400> 50

Met Leu Val Pro Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr1 5 10 15

Phe Phe Pro Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp20 25 30

Glu Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys35 40 45

Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr50 55 60

Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val65 70 75 80

Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile85 90 95

Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn LeU Tyr Leu Ser Cys Val100 105 110

Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys115 120 125

Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile130 135 140

Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp145 150 155 160

Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly-Gly165 170 175

Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser180 185 190

Ser

<210> 51<211> 269<212> PRT

<213> Macaca mulatta<400> 51

Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser15 10 15

Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Asp Val Asp Gly Pro Lys Gln Met20 25 30

Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Gly Gly Gly Ile35 40 45

Gln Leu Gln Ile Ser His Glu His Tyr Asn Glu Gly Phe Arg Gln Ala50 55 60Val Ser Val Val Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro65 70 75 80

Cys Pro Gln Ile Phe Gln Asp Asn Asp Leu Ser Thr Leu Ile Pro Phe85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Val Phe Leu Asp Thr Arg Asn Asn Asp Ala100 105 110

Cys Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu His Cys Thr Leu Arg Asp115 120 125

Ala Gln Leu Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala130 135 140

Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Leu Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met145 150 155 160

Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu165 170 175

Gly Leu Lys Ala Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp180 185 190

Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys195 200 205

Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn210 215 220

Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr225 230 235 240

Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Arg Gly Gly245 250 255

Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser260 265

<210> 52<211> 268

<212> PRT -·--"-

<213> Oryctolagus cunicullus<400> 52

Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Thr Ser Glu Met Met Ala Tyr His Ser15 10 15

Gly Asn Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Asn Tyr Met20 25 30

Lys Ser Cys Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Cys Pro Asp Glu Gly Ile35 40 45

Gln Leu Arg Ile Ser Cys Gln Pro Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val50 55 60

Leu Ser Val Val Val Ala Leu Glu Lys Leu Arg Gln Lys Ala Val Pro65 70 75 80

Cys Pro Gln Ala Phe Gln Asp Asp Gly Leu Arg Thr Phe Phe Ser Leu85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Val Leu Cys Asn Thr Trp Asp Asp Tyr Ser100 105 110

Leu Glu Cys Asp Ala Val Arg Ser Leu His Cys Arg Leu Gln Asp Ala115 120 125Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser130 135

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Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn165

Leu Arg Gly Lys Asn Leu Tyr Leu180

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val195 200

Gly Thr Tyr Glu Leu Lys Ala Leu140

Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser

155 160

Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly170 175

Ser Cys Val Met Lys Asp Asp Lys185 190

Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Lys Lys205

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Lys Asp Lys

210 215 220

Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser

225 230 235 240

Gln Thr Glu Tyr Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gly Gln245 250 255

Asp Leu Ile Asp Phe Ser Met Glu Phe Val Ser Ser260 265

<210> 53

<211> 269

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 53

Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Met Pro Pro Phe Asp Ser15 10 15

Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Gln Lys Met Lys20 25 30

Gly Cys Phe Gln Thr Phe Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu Ser Ile Gln35 40 45

Leu Gln Ile Ser Gln Gln 'His Ile Asn Lys Ser Phe Arg Gln Ala Val50 55 60

Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro Val Ser Phe65 70 75 80

Pro Trp Thr Phe Gln Asp Glu Asp Met Ser Thr Phe Phe Ser Phe Ile85 90 95

Phe Glu Glu Glu Pro Ile Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp Asp Asp Asn100 105 110

Leu Leu Val Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg115 120 125

Asp Glu Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys130 135 140

Ala Leu His Leu Asn Gly Gln Asn145 150

Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Pro165

Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu180

Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser155 160

Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala170 175

Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp185 190Gly Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro195 200 205

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys210 215 220

Ser Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser225 230 235 240

Thr Ser Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly245 250 255

Gln Asp Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser260 265

<210> 54<211> 268<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<400> 54 .

Met Ala Thr Val Pro Glu Leu Asn Cys Glu Ile Ala Ala Phe Asp Ser15 10 15

Glu Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Arg Pro Gln Lys Ile Lys20 25 30

Asp Cys Phe Gln Ala Leu Asp Leu Gly Cys Pro Asp Glu Ser Ile Gln35 40 45

Leu Gln Ile Ser Gln Gln His Leu Asp Lys Ser Phe Arg Lys Ala Val50 55 60

Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Trp Gln Leu Pro Met Ser Cys65 70 75 80

Pro Trp Ser Phe Gln Asp Glu Asp Pro Ser Thr Phe Phe Ser Phe Ile85 90 95

Phe Glu Glu Glu Pro Val Leu Cys Asp Ser Trp Asp Asp Asp Asp Leu100 105 110

Leu Va:ls'Cys Asp Val Pro Ile Arg Gln Leu His Cys Arg Leu Arg Asp115 120 125

Glu Gln Gln Lys Cys Leu Val Leu Ser Asp Pro Cys Glu Leu Lys Ala130 135 140

Leu His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Ser Gln Gln Val Val Phe Ser Met145 150 155 160

Ser Phe Val Gln Gly Glu Thr Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu165 170 175

Gly Leu Lys Gly Leu Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly180 185 190

Thr Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys195 200 205

Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys Thr210 215 220

Lys Val Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr225 230 235 240

Ser Gln Ala

Glu

His Arg Pro Val Phe Leu Gly Asn Ser Asn Gly Arg245 250 255Asp Ile Val Asp Phe Thr Met Glu Pro Val Ser Ser260 265

<210> 55<211> 268<212> PRT

<213> Equus caballus<400> 55

Met Ala Ala Val Pro Asp Thr Ser Asp Met Met Thr Tyr Cys Ser Gly1 5 10 15

Asn Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Glu Asp Gly Pro Lys Gln Met Lys20 25 30

Gly Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Ser Ser Met Gly Asn Gly Gly Ile35 40 45

Gln Leu Gln Phe Ser His Gln Leu Tyr Asn Lys Thr Phe Lys His Val50 55 60

Val Ser Ile Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Lys Lys Ile Pro Val Pro65 70 75 80

Cys Ser Gln Ala Phe Gln Asp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Phe Ser Val85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Asp Asn Trp Asp Asp Asp Tyr100 105 110

Val Cys Asp Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg Asp Ile115 120 125

Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln Ala Val130 135 140

His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys Met Ser145 150 155 160

Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly165 170 175

Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Met Lys Asp Gly Lys180 185 190

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro Lys Arg195 200 205

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys Gly Asn210 215 220

Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser225 230 235 240

Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly Gly Arg245 250 255

Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala260 265

<210> 56<211> 267<212> PRT<213> Felis catus<400> 56

Met Ala Pro Val Pro Glu Leu Thr Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser15 10 15Asp Glu Asn Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Glu Lys Met Lys20 25 30

Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ser His Ser Phe Leu Gly Asp Glu Gly Ile35 40 45

Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Pro Asp Asn Lys Ser Leu Arg His Ala50 55 60

Val Ser Val Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Lys Lys Ile Ser Phe Ala65 70 75 80

Cys Ser Gln Pro Leu Gln Asp Glu Asp Leu Lys Ser Leu Phe Cys Cys85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Asp Thr Trp Asp Asp Gly Phe100 105 110

Val Cys Asp Ala Ala Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Thr Phe Arg Asp Ile115 120 125

Ser Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu130 135 140

His Leu Asn Gly Gln Asn Met Asn Gln Gln Val Val Phe Arg Met Ser145 150 155 160

Phe Val His Gly Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ile Pro Val Val Leu Cys165 170 175

Ile Lys Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys180 185 190

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Met Leu Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Lys195 200 205

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Thr Glu Ile Lys Gly Asn210 215 220

Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser225 230 235 240

Gln Ala Glu Glu Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Lys Gly Gly Gln245 250 255

Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ser Ala Ser260 265

<210> 57<211> 267<212> PRT<213> Sus scrofa<400> 57

Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ala Lys Glu Val Met Ala Asn Asn Gly15 10 15

Asp Asn Asn Asn Asp Leu Leu Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Glu Met20 25 30

Lys Cys Arg Thr Gln Asn Leu Asp Leu Ser Pro Leu Gly Asp Gly Ser35 40 45

Ile Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Leu Cys Asn Glu Ser Ser Arg Pro50 55 60

Met Val65

Ser Val

Ile Val Ala Lys Glu Glu Pro Met Asn Pro Ser Ser70 75 80Gln Val Val Cys Asp Asp Asp Pro Lys Ser Ile Phe Ser Ser Val Phe85 90 95

Glu Glu Glu Pro Ile Val Leu Glu Lys His Ala Asn Gly Phe Leu Cys100 105 110

Asp Ala Thr Piro Va1 Gln Seir Va1 Asp Cys Lys Leu Gln Asp Lys Asp115 120 125

Glu Lys Ala Leu Val Leu Ala Gly Pro His Glu Leu Lys Ala Leu His130 135 140

Leu Leu Lys Gly Asp Leu Lys Arg145 150

Val Gln Gly Asp Asp Ser Asp Asp165

Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser180

Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe155 160

Lys Ile Pro Val Thr Leu Gly Ile170 175

Cys Val Met Lys Asp Asp Thr Pro185 190

Thr Leu Gln Leu Glu Asp Val Asp Pro Lys Ser Tyr Pro Lys Arg Asp195 200 205

I.:

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Arg Val210 215 220

Glu Phe Glu Ser Ala Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln225 230 235 240

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Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Val Leu Ser Pro260 265

<210> 58<211> 266<212> PRT

<213> Cavia porcellus<400> 58

Met Ala Ala Val Pro Glu Leu Ser Serv-Glu Val Thr Ala Tyr His Ser15 10 15

Asp Glu Asn Glu Leu Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Asn Lys Met Gln20 25 30

Tyr Cys Phe Gln Asp Arg Asp Leu Cys Ser Leu Asp Glu Gly Ile Lys35 40 45

Leu Gln Ile Ser His Gln His Phe Asn Lys Ser Phe Arg Gln Thr Val50 55 60

Ser Leu Ile Val Ala Val Glu Lys Leu Arg Lys Lys Leu Ala Pro Cys65 70 75 80

Thr Trp Ala Phe Gln Asp Asp Asp Leu Arg Pro Leu Leu Pro Phe Ile85 90 95

Phe Glu Glu Glu Pro Ile Val Cys Asp Thr Trp Asp Glu Glu Tyr Glu100 105 110

Ser Asp Thr Pro Val Pro Ser Arg Asn Cys Thr Leu His Asp Ile Gln115 120 125

His Lys Arg Leu Val Leu Ser Asp Pro Cys Glu Leu Lys Ala Leu His130 135 140Leu Asn Gly Asp Asn Leu Asn Arg Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe145 150 155 160

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Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro180 185 190

Val Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Gly Lys Gln Tyr Pro Lys Lys Lys195 200 205

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Thr Ser Lys Ser Thr Val210 215 220

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln225 230 235 240

Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Asn Gly Gln Asp Ile245 250 255

Ile Asp Phe Lys Leu Glu Leu Val Ser Ser260 265

<210> 59<211> 266<212> PRT<213> Bos taurus<400> 59

Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ile Asn Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser15 10 15

Asp Glu Asn Glu Leu Leu Phe Glu Ala Asp Asp Pro Lys Gln Met Lys20 25 30

Ser Cys Ile Gln His Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Asp Gly Asn Ile35 40 45

Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Phe Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val50 55 60

Val Ser Val Ilê'Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Asn Ser Ala Tyr Ala65 70 75 80

His Val Phe His Asp Asp Asp Leu Arg Ser Ile Leu Ser Phe Ile Phe85 90 95

Glu Glu Glu Pro Val Ile Phe Glu Thr Ser Ser Asp Glu Phe Leu Cys100 105 110

Asp Ala Pro Val Gln Ser Ile Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln115 120 125

Lys Ser Leu Val Leu Ala Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu130 135 140

Leu Ser Gln Glu Met Asn Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val145 150 155 160

Gln Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Lys165 170 175

Asp Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr180 185 190

Leu Gln Leü195

Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met200 205Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu210 215 220

Phe Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile225 230 235 240

Glu Glu Arg Pro Val Phe Leu Gly His Phe Arg Gly Gly Gln Asp Ile245 250 255

Thr Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro260 265

<210> 60<211> 266<212> PRT<213> Ovis aries<400> 60

Met Ala Thr Val Pro Glu Pro Ile Asn Glu Val Met Ala Tyr Tyr Ser15 10 15

Asp Glu Asn Glu Leu Leu Phe Glu Val Asp Gly Pro Lys Gln Met Lys20 25 30

ι, Ser Cys Thr Gln His Leu Asp Leu Gly Ser Met Gly Asp Gly Asn Ile35 40 45

Gln Leu Gln Ile Ser His Gln Leu Tyr Asn Lys Ser Phe Arg Gln Val50 55 60

Val Ser Val Ile Val Ala Met Glu Lys Leu Arg Ser Arg Ala Tyr Glu65 70 75 80

His Val Phe Arg Asp Asp Asp Leu Arg Ser Ile Leu Ser Phe Ile Phe85 90 95

Glu Glu Glu Pro Val Ile Phe Glu Thr Ser Ser Asp Glu Leu Leu Cys100 105 110

Asp Ala Ala Val Gln Ser Val Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln115 120 125

'·-. -"-"Lys Ser Leu Val Leu Asp Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu130 135 140

Pro Ser Gln Glu Met Ser Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val145 150 155 160

Gln Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Arg165 170 175

Asp Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr180 185 190

Leu Gln Leu Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met195 200 205

Glu Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu210 215 220

Phe Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile225 230 235 240

Glu Glu Lys Pro Val Phe Leu Gly Arg Phe Arg Gly Gly Gln Asp Ile245 250 255

Thr Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro260 265<210> 61<211> 267<212> PRT<213> Gallus gallus<400> 61Met Ala Phe Val Pro

1 5 10 15

Glu Glu Thr Phe Tyr Gly Pro Ser Cys Leu Cys Leu Gln Lys Lys Pro20 25 30

Arg Leu Asp Ser Glu His Thr Thr Val Asp Val Gln Val Thr Val Arg35 40 45

Lys Gly50

Ala Met65

Ser Asp

Gln Arg

Arg Ser

Leu Glu130

Ser Ser145

Pro ArgLys Gly

Thr Leu

Glu Leu210

Arg Gly

Thr Lys

Leu Ser

Leu Glu100

Gln Ser115

Ser Pro

Gln Lys

Gly Ser

Tyr Lys180

Gln Leu195

Thr Arg

Ala Arg

Leu Leu70

Ala Leu85

Ser Ser

Phe Asp

Thr Gln

Val Arg150

Ala Gly165

Leu TyrGlu GluPhe Ile

Ser Phe55

Arg Arg

Leu Glu

Tyr Ala

Ile Phe120

Leu Val135

Leu Asn

Thr Gly

Met Ser

Ala Asp200

Phe Tyr215

Arg Arg

Pro Arg

Glu Val90

Gly Ala105

Asp Ile

Ala Leu

Ile Ala

Gln Met170

Cys Val185

Val MetArg Leu

Ala Ala60

Ser Arg75

Phe Glu

Pro Ala

Asn Gln

His Leu140

Leu Tyr155

Pro Val

Met Ser

Arg Asp

Asp Ser220

Val Leu

Asp Phe

Pro Val

Phe Arg110

Lys Cys125

Gln Gly

Arg Pro

Ala Leu

Gly Thr190

Ile Asp205

Pro Thr

Val Val

Ala Asp80

Thr Phe95

Tyr Thr

Phe Val

Pro Ser

Arg Gly160

Gly Ile175

Glu ProSer Val-Glu Gly

Thr Thr Arg Phe Glu Ser Ala Ala Phe Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr225 230 235 240

Ser Leu Gln Pro Arg Gln Pro Val Gly Ile Thr Asn Gln Pro Asp Gln245 250 255

Val Asn Ile Ala Thr Tyr Lys Leu Ser Gly Arg260 265

<210> 62

<211> 127

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 62

Gly Pro Gly Gly Ser Asn Val Lys Cys Cys Cys Gln Asp Leu Asn His1 5 10 15

Ser Ser Leu Val Asp Glu Gly Ile Gln Leu Gln Val Ser His Gln Leu20 25 30Cys Asn Lys Ser Leu Arg His Phe Val Ser Val Ile Val Ala Leu Glu35 40 45

Lys Leu Lys Lys Pro Cys Pro Gln Val Leu Gln Glu Asp Asp Leu Lys50 55 60

Ser Ile Phe Cys Tyr Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Ile Cys Lys Thr65 70 75 80

Asp Ala Asp Asn Phe Met Ser Asp Ala Ala Met Gln Ser Val Asp Cys85 90 95

Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser Tyr100 105 110

Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Ala115 120 125

<210> 63

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe1 5 10 15

Ile Leu Asn Asp Alci Leu Asn Gln Ser Σ1θ 11θ Arg Ais. Asn Asp Gln20 25 30

Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe35 40 45

Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val50 55 60

Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu65 70 75 80

Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile85 90 95

Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp-Glu Thr His Gly Thr100 105 110

Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu Phe Ile Ala Thr115 120 125

Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr130 135 140

Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala145 150

<210> 64

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys1 5 10 15

Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln20 25 30

Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln35 40 45Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu50 55 60

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu65 70 75 80

Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu85 90 95

Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe100 105 110

Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu115 120 125

Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr130 135 140

Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150

<210> 65

<211> 183

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 65

Met Asp Pro His His His His His His Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp15 10 15

Lys Ala Leu Ala Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Leu20 25 30

Met Lys Leu Val Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu Asn Gln35 40 45

Thr Ile Tyr Gln Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr Trp Leu50 55 60

Asn Asp Leu Gln Gln Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr Ser Ser65 70 75 80

Gly Gly Asp Asp Ser Lys Tyr-=Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser Asp Ser85 90 95

Gln Leu Phe Val Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys100 105 110

Glu Leu Pro Glu Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asp Leu115 120 125

Ile Phe Phe Trp Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Ala130 135 . 140

Ala Tyr Pro Glu Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg Val His145 150 155 160

Leu Ala Arg Gly Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser Leu Glu165 170 175

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly180

<210> 66

<211> 180

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 66Met Asp Pro His His His His His His Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg Asp Glu20 25 30

Gln Gln Lys Ser Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu35 40 45

His Leu Asn Gly Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser Met Ser50 55 60

Phe Val Gln Gly Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly65 70 75 80

Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Thr85 90 95

Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro Lys Lys100 105 110

Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys Ser Lys115 120 125

Val Glu Phe Glu Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser130 135 140

Gln Ala Glu His Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gln Asp145 150 155 160

Ile Ile Asp Phe Thr Met Glu Ser Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly165 170 175

Gly Gly Cys Gly180

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Met Arg-iIie Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp1 5 10

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Arg Ile Ile Lys Tyr Glu1 5

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn1 5 10

<210> 70<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 70

Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ile Arg Ala Asn1 5 10<210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 71 Thr Ala Ala Ala Leu1 5<210> 72 <211> 12 <212> PRT

<213><400>

Homo72

sapiens

Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Val1 5 10

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys1 5 10

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile1 5 10

<210><211><212><213><400>

75

31

PRT

Homo

75

sapiens

Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys1 5 10 15

Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu20 25 30

<210> 76

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr1 5 10

<210> 77

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp15 10 15

Glu Asp Gln Pro Val Leu20

<210> 78

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 78

Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu1 5 10 15

Lys Glu Met Pro20

<210> 79

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly1 5 10 15

Ser Glu Thr Asn Leu20

<210> 80

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Glu Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr1 5 10

<210> 81<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 81

Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe1 5 10

<210> 82

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp Glu1 5 10 15

Thr His Gly Thr Lys20

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp1 5 10

<210> 84

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys1 5 10

<210> 85

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala1 5 10

<210> 86

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro1 5 10 15

Ser Ile

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Lys Gln Asp Tyr Trp1 5

<210> 88

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala1 5

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo

<400> 89Ala Pro Val1

sapiens

Arg Ser Leu5

<210> 90<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 90

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp15 10

<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

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<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly15 10

<210> 93

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln1 5 10

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<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile15 10

<210><211><212><213><400>

97

32

PRT

Homo

97

sapiens

Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu15 10 15

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu20 25 30

<210><211><212><213><400>

98

13

PRT

Homo

98

sapiens

Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser15 10

<210> 99

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu15 10 15

Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu20

<210> 100

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu1 5 10 15

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Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys1 5 10 15

Lys Met Glu Lys20

<210> 102

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met1 5 10

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<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe1 5 10

<210> 104

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe1 5 10

<210> 105

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn1 5 10 15

Asn Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

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<210> 107

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

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<210> 108

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 108Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr1 5 10 15

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<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

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<210> 110

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 110

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<210> 111

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 111

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<210> 112

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 112

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<210> 113

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

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Leu Glu Ser Val20

<210> 115<211> 20<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<400> 115

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<213> Rattus norvegicus<400> 116

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Asn Gly Arg Asp Ile Val20

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atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat 60

ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt 120atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct 180aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc 240acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac 300aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct 360actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttagggat ccggataatg catctaagct 420421

<210> 118<211> 421<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<400> 118

atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat 60

ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt 120atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct 180aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc 240acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac 300aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct 360actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttgaggat ccggataatg catctaagct 420421

<210> 119

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> η is a, c, g, ou t

<400> 119

nnccatggca aataagccaa tgcaaccg 28

<210> 120

<211> 52

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 120

gtaagcttag atgcattatc cggatcccta agcagtagta tcagacgata cg 52

<210> 121<211> 52

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 121

gtaagcttag atgcattatc cggatcctca agcagtagta tcagacgata

<210> 122

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 122

ggtccggagc gctagcccct tacac

<210> 123

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 123

gtaagcttat gcattatgat atctggaagt ctgtcataga

<210> 124

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 124

atatatgata tccctgtacg atcactgaac tgcacg

<210> 125

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 125

atatatctcg agggaagaca caaattgcat ggtgaag

<210> 126

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<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 126

tatggatatc gaattcaagc ttctgcagct gctcgagtaa ttgattac

<210> 127

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 127

ctaggtaatc aattactcga gcagctgcag aagcttgaat tcgatatcca

<210> 128

<211> 52

<212> DNA

<213> Seqüência<220>

artificial<223> Seqüência sintetizada<400> 128

tcgagcacca ccaccaccac cacggtggtt gctaataata attgattaat ac 52

<210> 129<211> 52<212> DNA<213> Seqüência<220> <223> Seqüência<400> 129

ctaggtatta atcaattatt attagcaacc accgtggtgg tggtggtggt gc 52

<210> 130

<211> 166

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 130

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln15 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys85 90 95

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu100 105 110

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125

Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp130 135 140

Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser Leu Glu His His His145 150 155 160

His His His Gly Gly Cys165

<210> 131

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 131

Met Asp Ile Pro Val Asp Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln15 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser65 70

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp85

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn100

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro115 120

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Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu105 110

Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln125

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Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 155 <210> 132 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Ala Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His 20 25 30 Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe 35 40 45 - Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60 Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys 85 90 95Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu 100 105 110 Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln 115 120 125 Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp 130 135 140 Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 155

<210> 133

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 133

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Gly Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys 85 90 95 Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu 100 105 110 Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125 Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp 130 135 140 Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 155 <210> 134 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Gly Asp Ser Gln1 5 10 15 Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His 20 25 30 Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45 Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60 Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys 85 90 95 Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu 100 105 110 Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125 Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp 130 135 140

Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150 155<210> 135 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr

10 15

Gln Lys Ser

Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Arg Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys85 90 95

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu 100 105 110 Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125 Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp 130 135 140 Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 155 <210> 136 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His 20 25 30 Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45 Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60 Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val -Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys 85 90 95Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu 100 105 110 Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125 Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp 130 135 140 Ile Thr Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 155

<210> 137

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu50 55 60

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu65 70 75 80

Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu85 90 95

Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe100 105 110

Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu115 120 125

Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr130 135 140

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<210> 138

<211> 152

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu GlurLys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn115 120 125

Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp130 135 140

Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150

<210> 139

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 139Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Ser Glu Ser Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys85 90 95

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu100 105 110

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125

Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp130 135 140

Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150 155

<210> 140

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln15 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu--Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys85 90 95

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu100 105 110

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Ala115 120 125

Ala Ala Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp130 135 140

Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150 155

<210> 141<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 141

atatatcata tgctgagcaa tgtgaaatac aactttatg

<210> 142

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 142

atatatctcg agcgcctggt tttccagtat ctgaaag

<210> 143

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 143

catatggata tccctgtaga ctcactgaac tgcacgctc

<210> 144

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 144

gagcgtgcag ttcagtgagt ctacagggat atccatatg

<210> 145

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 145

gatatccctg tacgatcagc taactgcacg ctccgggac

<210> 146

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 146

gtcccggagc gtgcagttag ctgatcgtac agggatatc

<210> 147

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 147

gtacgatcac tgaactgcgg tctccgggac tcacagc

<210> 148

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<400> 148

gctgtgagtc ccggagaccg cagttcagtg atcgtac

<210> 149

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 149

gaactgcacg ctcggggact cacagc

<210> 150

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 150

gctgtgagtc cccgagcgtg cagttc

<210> 151

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 151

caaggagaag aaagtaatcg caaaatacct gtggccttg

<210> 152

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 152

caaggccaca ggtattttgc gattactttc ttctccttg

<210> 153

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 153

catgtccttt gtacaaggaa gtaatgacaa aatacctgtg

<210> 154

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 154

cacaggtatt ttgtcattac ttccttgtac aaaggacatg

<210> 155

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 155

ctttgtacaa ggagaagaaa aaatacctgt ggccttg

<210> 156<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 156

caaggccaca ggtatttttt cttctccttg tacaaag

<210> 157

<211> 41

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 157

gtggccttgg gcctcagcga aagcaatctg tacctgtcct g

<210> 158

<211> 41

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 158

caggacaggt acagattgct ttcgctgagg cccaaggcca c

<210> 159

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 159

gtacatcagc acctctgcag cagcaaacat gcccgtcttc

<210> 160

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 160

gaagacgggc atgtttgctg ctgcagaggt gctgatgtac

<210> 161

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 161

gcggccagga tataactaaa ttcaccatgc aatttgtgtc

<210> 162

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 162

gacacaaatt gcatggtgaa tttagttata tcctggccgc

<210> 163

<211> 154

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 163Pro Tyr Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Arg Tyr1 5 10Arg Gln Lys Phe Val Met Asn Asp Ser Leu 20 25 Asp Val Asp Lys His Tyr Leu Ser Thr Thr 35 40 Gln Glu Val Lys Phe Asp Met Tyr Ala Tyr 50 55 Ser Lys Tyr Pro Val Thr Leu Lys Ile Ser65 70 Ser Ala Gln Gly Glu Asp Gln Pro Val Leu 85 90Thr Pro Lys Leu Ile Thr Gly Ser Glu Thr 100 105 Lys Ser Ile Asn Ser Lys Asn Tyr Phe Thr 115 120 Leu Phe Ile Ala Thr Lys Glu Gln Ser Arg 130 135 Leu Pro Ser Met Thr Asp Phe Gln Ile Ser145 150 <210> 164 <211> 151 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 164 Pro Ile Arg Gln Leu His Tyr Arg Leu Arg1 5 10Leu Val Leu Ser Asp Pro Tyr Glu Leu Lys 20 25 Gln Asn Ile Asn Gln Gln Val Ile Phe Ser 35 40 Glu Pro Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala 50 55 Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp65 70 Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Gln Tyr Pro 85 90Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Val Lys

15

30

45

60

75 80

95

110

125

140

15

30

45

60

75 80

95

100 105 110

Ser Ala Glu Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu His115 120 125

Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Asn Ser Gly Gln Asp Ile Ile Asp Phe130 135 140

Thr Met Glu Ser Val Ser Ser145 150

<210><211>

165155<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 165

Met Asp Ile Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln1 5 10 15

Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His20 25 30

Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe35 40 45

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu50 55 60

Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro65 70 75 80

Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys85 90 95

Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu100 105 110

Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln115 120 125

Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp130 135 140

Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser145 150 155

<210> 166

<211> 569

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 166

Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser1 5 10 15

Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu20 25 30

Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro35 40 45

Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr50 55 60

Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys65 70 75 80

Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys85 90 95

Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys100 105 110

Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe115 120 125

Lys Gln Asn Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr130 135 140

Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp145 150 155 160Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly165 170 175

Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly180 185 190

Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro195 200 205

Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr210 215 220

Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu225 230 235 240

Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp245 250 255

Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro260 265 270

Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg275 280 285

Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg290 295 300

Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile305 310 315 320

Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys325 330 335

His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser340 345 350

Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg355 360 365

Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr370 375 380

Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr385 390 395 400

Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu405 410 415

Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val420 425 430

Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg435 440 445

Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Ser Phe Ser Trp Leu450 455 460

Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln465 470 475 480

Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr485 490 495

Glu

Lys Met

Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala500 505 510Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr515 520 525

Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser530 535 540

Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu545 550 555 560

Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly565

<210> 167

<211> 398

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

Met Leu Arg Leu Tyr Val Leu Val Met Gly Val Ser Ala Phe Thr Leu1 5 10 15

Gln Pro Ala Ala His Thr Gly Ala Ala Arg Ser Cys Arg Phe Arg Gly20 25 30

Arg His Tyr Lys Arg Glu Phe Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Ala Leu35 40 45

Arg Cys Pro Gln Val Pro Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Val Ser Pro Arg50 55 60

Ile Asn Leu Thr Trp His Lys Asn65 70

Glu Glu Glu Thr Arg Met Trp Ala85

Pro Ala Leu Gln Glu Asp Ser Gly100

Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Met Ser115 120

Thr Asp Ala Phe Leu Pro Phe Ile130 135

Asp Ser Ala Arg Thr Val Pro Gly75 80

Gln Asp Gly Ala Leu Trp Leu Leu90 95

Thr Tyr Val Cys Thr Thr Arg Asn105 110

Ile Glu Leu Arg Val Phe Glu Asn125

Ser Tyr 'Pro' Gln Ile Leu Thr Leu140

Ser Thr Ser Gly Val Leu Val Cys145 150

Asp Lys Thr Asp Val Lys Ile Gln165

Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe Leu180

Leu Val His Asp Val Ala Leu Glu195 200

Leu Thr Phe Ala His Glu Gly Gln210 215

Pro Asp Leu Ser Glu Phe Thr Arg155 160

Trp Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Leu170 175

Ser Val Arg Gly Thr Thr His Leu185 190

Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val205

Gln Tyr Asn Ile Thr Arg Ser Ile220

Glu Leu Arg Ile Lys Lys Lys Lys225 230

Ser Pro Leu Lys Thr Ile Ser Ala245

Pro Cys Lys Val Phe Leu Gly Thr260

Glu Glu Thr Ile Pro Val Ile Ile235 240

Ser Leu Gly Ser Arg Leu Thr Ile250 255

Gly Thr Pro Leu Thr Thr Met Leu265 270Trp Trp Thr Ala Asn Asp Thr His Ile Glu Ser Ala Tyr Pro Gly Gly275 280 285

Arg Val Thr Glu Gly Pro Arg Gln Glu Tyr Ser Glu Asn Asn Glu Asn290 295 300

Tyr Ile Glu Val Pro Leu Ile Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu305 310 315 320

His Met Asp Phe Lys Cys Val Val His Asn Thr Leu Ser Phe Gln Thr325 330 335

Leu Arg Thr Thr Val Lys Glu Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Gly Ile340 345 350

Val Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Gly Gly Ile Trp355 360 365

Met His Arg Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys Ala Asp Gly Leu Thr370 375 380

Val Leu Trp Pro His His Gln Asp Phe Gln Ser Tyr Pro Lys385 390 395

<210> 168

<211> 576

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 168

Met Glu Asn Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ile Cys Leu Met Val Pro1 5 10 - 15

Leu Leu Ser Leu Glu Ile Asp Val Cys Thr Glu Tyr Pro Asn Gln Ile20 25 30

Val Leu Phe Leu Ser Val Asn Glu Ile Asp Ile Arg Lys Cys Pro Leu35 40 45

Thr Pro Asn Lys Met His Gly Asp Thr Ile Ile Trp Tyr Lys Asn Asp50 55 60

Ser Lys Thr Pro Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ser Arg Ile His Gln Gln

65 70 75 80

Asn Glu His Leu Trp Phe Val Pro85

Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Asn Ser100

Thr Val Thr Val Leu Glu Asn Asp115 120

Ala Thr Phe Pro Gln Arg Leu His130 135

Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly Tyr90 95

Thr Tyr Cys Leu Lys Thr Lys Val105 110

Pro Gly Leu Cys Tyr Ser Thr Gln125

Ile Ala Gly Asp Gly Ser Leu Val140

Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Phe Lys145 150

Val Gln Trp Tyr Lys Asn Cys Lys165

Phe Phe Gly Val Lys Asp Lys Leu180

His Arg Gly Asp Tyr Ile Cys Arg

Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Glu155 160

Pro Leu Leu Leu Asp Asn Val Ser170 175

Leu Val Arg Asn Val Ala Glu Glu185 190

Met Ser Tyr Thr Phe Arg Gly LysGln Tyr210

Lys Arg225

Ala Asp

Phe Ser

Asn Asp

Thr Lys290

Lys Ser305

Asn Ile

Phe Lys

Val Cys

Trp Tyr370

Gly Lys385

Gly Ser

Val-Leu

Asp Tyr

Lys Ser450

Ser Trp465

Leu Ile

Gln Asp

His Gly

Ala Lys530

195

Pro Val

Asp Arg

Pro Gly

Asp Leu260

Pro Phe275

Arg Lys

Gln Phe

Phe Glu

Asn Tyr340

Cys Val355

Arg Asp

Thr Tyr

Phe Ser

Glu Gly420

Val Gly435

Arg Arg

Leu Gly

Gln Glu

Tyr Glu500

Val Ile515

Thr Arg

Thr Arg

Pro Val230

Ser Met245

Val Tyr

Leu Ala

Tyr Thr

Tyr Arg310

Ser Ala325

Leu Ile

Cys Ile

Ser Cys

Asp Ala390

Asp Leu405

Gln Phe

Glu Asp

Leu Ile

Gln Ser470

Gly Ile485

Lys MetCys TrpPhe Trp

200

Val Ile215

Ile Leu

Ile Gln

Trp Lys

Glu Asp280

Leu Ile295

Tyr Pro

His Val

Gly Gly

Tyr Lys360

Ser Gly375

Tyr Ile

Asp Thr

Gly Tyr

Thr Ile440

Ile Ile455

Ser Glu

Lys Ile

Pro Asp

Ser Gly520

Lys Asn535

Gln Phe

Ser Pro

Leu Ile250

Trp Asn265

Tyr Gln

Thr Thr

Phe Ile

Gln Leu330

Phe Ile345

Val Phe

Phe Leu

Leu Tyr

Phe Val410

Lys Leu425

Glu Val

Leu Val

Glu Gln

Val Leu490

Ser Ile505

Asp PheLeu Arg

Ile Thr220

Arg Asn235

Cys Asn

Gly Ser

Phe Val

Leu Asn300

Cys Val315

Ile Tyr

Ile Leu

Lys Val

Pro Ser380

Pro Lys395

Phe Lys

Phe Ile

Thr Asn

Arg Asp460

Ile Ala475

Leu Glu

Gln Phe

Gln Glu

Tyr Gln540

205

Ile Asp

Glu Thr

Val Thr

Glu Ile270

Glu His285

Ile Ser

Val Lys

Pro Val

Thr Ala350

Asp Ile365

Lys Ala

Thr Leu

Leu Leu

Tyr Gly430

Glu Asn445

Met Gly

Ile Tyr

Leu Glu

Ile Lys510

Arg Pro525

Met Pro

Glu Asn

Ile Glu240

Gly Gln255

Glu Trp

Pro Ser

Glu Val

Asn Thr320

Pro Asp335

Thr Ile

Val Leu

Ser Asp

Gly Glu400

Pro Glu415

Arg Asp

Val Lys

Gly Phe

Asn Ala480

Lys Ile495

Gln LysGln SerAla Gln

Arg Arg Ser Pro Leu Ser Lys His Arg Leu Leu Thr Leu Asp Pro Val545 550 555 560Arg Asp Thr Lys Glu Lys Leu Pro Ala Ala Thr His Leu Pro Leu Gly565 570 575

<210> 169

<211> 410

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 169

Met Phe Ile Leu Leu Val Leu Val Thr Gly Val Ser Ala Phe Thr Thr15 10 15

Pro Thr Val Val His Thr Gly Lys Val Ser Glu Ser Pro Ile Thr Ser20 25 30

Glu Lys Pro Thr Val His Gly Asp Asn Cys Gln Phe Arg Gly Arg Glu35 40 45

Phe Lys Ser Glu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Val Leu Arg Cys50 . 55 60

Pro Leu Ala Pro His Ser Asp Ile Ser Ser Ser Ser His Ser Phe Leu65 70 75 80

Thr Trp Ser Lys Leu Asp Ser Ser Gln Leu Ile Pro Arg Asp Glu Pro85 90 95

Arg Met Trp Val Lys Gly Asn Ile Leu Trp Ile Leu Pro Ala Val Gln100 105 110

Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ile Cys Thr Phe Arg Asn Ala Ser His Cys115 120 125

Glu Gln Met Ser Val Glu Leu Lys Val Phe Lys Asn Thr Glu Ala Ser130 135 140

Leu Pro His Val Ser Tyr Leu Gln Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Gly145 150 155 160

Leu Leu Val Cys Pro Asp Leu Lys Glu Phe Ile Ser Ser Asn Ala Asp165 170 175

Gly Lys Ile Gln Trp Tyr Lys Gly Ala Ile Leu Leu Asp Lys Gly Asn180 185 190

Lys Glu Phe Leu Ser Ala Gly Asp Pro Thr Arg Leu Leu Ile Ser Asn195 200 205

Thr Ser Met Asp Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val Met Thr Phe Thr210 215 220

Tyr Asn Gly Gln Glu Tyr Asn Ile Thr Arg Asn Ile Glu Leu Arg Val225 230 235 240

Lys Gly Thr Thr Thr Glu Pro Ile Pro Val Ile Ile Ser Pro Leu Glu245 250 255

Thr Ile Pro Ala Ser Leu Gly Ser Arg Leu Ile Val Pro Cys Lys Val260 265 270

Phe Leu Gly Thr Gly Thr Ser Ser Asn Thr Ile Val Trp Trp Leu Ala275 280 285

Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ala Ala Tyr Pro Arg Gly Arg Val Thr Glu290 295 300

Gly

Leu His

His Gln Tyr Ser Glu Asn Asp Glu Asn Tyr Val Glu Val305 310 315 320

Ser Leu Ile Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu His Thr Asp Phe325 330 335

Lys Cys Val Ala Ser Asn Pro Arg Ser Ser Gln Ser Leu His Thr Thr340 345 350

Val Lys Glu Val Ser Ser Thr Phe Ser Trp Ser Ile Ala Leu Ala Pro355 360 365

Leu Ser Leu Ile Ile Leu Val Val Gly Ala Ile Trp Met Arg Arg Arg370 375 380

Cys Lys Arg Arg Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Thr Lys Leu Arg Thr385 390 395 400

Asp Asn Gln Asp Phe Pro Ser Ser Pro Asn405 410

<210> 170<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<400> 170Gly Gly Lys Gly Gly1 5

<210> 171

<211> 3

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 171Cys Gly Gly1

<210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 172

Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro15 10

<210> 173 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 173

Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala15 10 15

Pro

<210> 174

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<400> 174

Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5

<210> 175

<211> 3

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<220>

<221> REPETIÇÃO

<222> (1)..(1)

<223> ocorre de 0 a 5 vezes

<220>

<221> REPETIÇÃO

<222> (3).. (3)

<223> ocorre de 0 a 12 vezes

<400> 175

Gly Cys Gly

<210> 176

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<220>

<221> REPETIÇÃO

<222> (1).. (5)

<223> ocorre 1 a 3 vezes

<400> 176

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 177

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>

REPETIÇÃO(1)-.(1)ocorre de 0

REPETIÇÃO

(3)..(3)ocorre de 0

REPETIÇÃO

(4)..(4)ocorre de 0

REPETIÇÃO(5) . . (9)ocorre de177

a 5 vezes

a 10 vezes

a 2 vezes

0 a 3 vezes

Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210> 178

<211> 3

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 178Gly Gly Cys1

<210> 179<211> 3<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<220> <221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> -NH2 (amidado)<400> 179Gly Gly Cys 1 <210> 180<211> 10<212> PRT<213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 180

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly15 10

<210> 181<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada<400> 181

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly15 10 15

Cys Gly

<210> 182

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 182

Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5

<210> 183 <211> 3 <212> PRT <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada

<220><221>

REPETIÇÃO<222> (1)..(1)

<223> ocorre de 0 a 12 vezes<220>

<221> REPETIÇÃO

<222> (3) .. (3)

<223> ocorre de 0 a 5 vezes

<400> 183Gly Cys Gly1

<210> 184

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<220>

<221> REPETIÇÃO

<222> (1)..(5)

<223> ocurrs 1 a 3 vezes

<400> 184

Ser Gly Gly Gly Gly

<210> 185

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<220> <221> REPETIÇÃO <222> (1)·.(1) <223> ocorre de 0 a 10 vezes<220> <221> REPETIÇÃO <222> (2)..(2) <223> ocorre de 0 a 2 vezes<220> <221> REPETIÇÃO <222> (3)..(7) <223> ocorre de 0 a 3 vezes<220> <221> REPETIÇÃO <222> (8) . . (8) <223> ocorre de 0 a 8 vezes<220> <221> REPETIÇÃO <222> (10)..(10) <223> ocorre de 0 a 5 vezes<400> 185

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly15 10

<210> 186

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 186

Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5

<210> 187<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 187

Cys Gly Lys Lys Gly Gly

1 5

<210> 188

<211> 4

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 188Gly Gly Cys Gly1

<210> 189

<211> 3

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 189Gly Ser Gly1

<210> 190 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 190

Leu Glu His His His His His His Gly Gly Cys1 5 10

<210> 191 <211> 21 <212> PRT <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 191

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu1 5 10 15Tyr Arg Asn Gly Lys

<210> 192 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência artificial<220> <223> Seqüência sintetizada<400> 192

gatccggagg tggtgtcccc attagacagc t

<210> 193

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 193

gtaagcttag gaagacacag attccat

<210> 194

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 194

gatccggagg tggtgcccct gtacgatcac tgaactg

<210> 195

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência sintetizada

<400> 195

gtatgcatta ggaagacaca aattgcatgg tgaagtc

161

31

27

37

Claims (48)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:(a) uma partícula semelhante a vírus (VLP) com pelo menosum primeiro sítio de ligação; e(b) pelo menos um antígeno com pelo menos um segundosítio de ligação;em que o dito pelo menos um antígeno é uma molécula de IL-1 eem que (a) e (b) são ligados através do dito pelo menos um primeiro e ditopelo menos um segundo sítio de ligação.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a dita molécula de IL-1 é selecionada do grupo consistindo em:(a) proteína IL-1;(b) fragmento maduro de IL-1;(c) fragmento de IL-1;(d) peptídeo de IL-1; e(e) muteína de IL-1.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que a dita molécula de IL-1 é derivada de um humano.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é uma moléculade IL-1 beta.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é uma moléculade IL-1 alfa.

6. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizadapelo fato de que a dita molécula de IL-1 beta é selecionada do grupo consis-tindo em:(a) proteína IL-1 beta;(b) fragmento maduro de IL-1 beta;(c) fragmento de IL-1 beta;(d) peptídeo de IL-1 beta; e(e) muteína de IL-1 beta.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a dita molécula de IL-1 alfa é selecionada do grupo consis-tindo em:(a) proteína IL-1 alfa;(b) fragmento maduro de IL-1 alfa;(c) fragmento de IL-1 alfa;(d) peptídeo de IL-1 alfa; e(e) muteína de IL-1 alfa.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é uma proteínaIL-1 beta compreendendo ou preferivelmente consistindo em uma seqüênciade aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) IL-1 beta humana (SEQ ID NO:49);(b) qualquer uma de SEQ ID N0:50 a SEQ ID NO:62; e(c) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:49 a SEQ IDNO:62.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é um fragmentomaduro de IL-1 beta compreendendo ou preferivelmente consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) IL-1 beta humana 117-269 (SEQ ID NO:64);(b) IL-1 beta humana 116-269 (SEQ ID NO:165);(c) IL-1 beta de camundongo 119-269s (SEQ ID NO:164); e(d) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:64, SEQ ID NO: 165 e SEQ ID NO:164.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é um pep-tídeo de IL-1 beta compreendendo ou preferivelmente consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) qualquer uma das SEQ ID NO:89 a SEQ ID NO:116; e(b) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:89 a SEQ ID NO:-116.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é uma mu-teína de IL-1 beta.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracteriza-da pelo fato de que a dita muteína de IL-1 beta compreende ou preferivel-mente consiste em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido,em que a dita seqüência de aminoácido difere de qualquer uma de SEQ IDNO:64 e SEQ ID NO: 165 em 1 a 6, preferivelmente 1 a 5, mais preferivel-mente 1 a 4, mais preferivelmente ainda 1 a 3, mais preferivelmente ainda 1a 2 e mais preferivelmente em exatamente 1 resíduo(s) de aminoácido, emque preferivelmente o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácido é/são trocados porum outro resíduo de aminoácido.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracteriza-da pelo fato de que a dita muteína de IL-1 beta compreende ou preferivel-mente consiste em um polipeptídeo de SEQ ID NO:131 a SEQ ID NO: 140.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza-da pelo fato de que a dita IL-1 beta muteína é htL-1 βι 16-269 (D145K) (SEQ IDNO:136).

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3 e 5, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é umaproteína IL-1 alfa compreendendo ou preferivelmente consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) IL-1 alfa humana (SEQ ID NO:36);(b) qualquer uma de SEQ ID NO:37 a SEQ ID NO:48; e(c) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:36 a SEQ IDNO:48.

16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3 e 5, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é umfragmento maduro de IL-1 alfa compreendendo ou preferivelmente consistin-do em uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) IL-1 alfa humana 119-271 (SEQ ID NO:63);(b) IL-1 alfa de camundongo 117-270s (SEQ ID NO: 163); e(c) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-Lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:63 a SEQ IDNO:163.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3 e 5, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é umpeptídeo de IL-1 alfa compreendendo ou preferivelmente consistindo emuma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em:(a) qualquer uma das SEQ ID NO:67 a SEQ ID NO:88; e(b) uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, oupreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pe-Lo menos 95% ou mais preferivelmente pelo menos 99%idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO:67 a SEQ IDNO:88.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3 e 5, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é umamuteína IL-1 alfa.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-da pelo fato de que a dita muteína de IL-1 alfa compreende ou preferível-mente consiste em um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido,em que a dita seqüência de aminoácido difere de qualquer uma de SEQ IDNO:63, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 163 em 1 a 6, preferivelmente 1 a 5,mais preferivelmente 1 a 4, mais preferivelmente ainda 1 a 3, mais preferi-velmente ainda 1 a 2 e mais preferivelmente em exatamente 1 resíduo(s) deaminoácido, em que preferivelmente o(s) dito(s) resíduo(s) de aminoácidoé/são trocados por um outro resíduo de aminoácido.

20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a dita VLP é uma VLP de umRNA de bacteriófago.

21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a dita VLP compreende, ou al-ternativamente consiste em, proteínas de revestimento recombinantes, mu-tantes ou fragmentos deles, de um RNA de bacteriófago.

22. Composição de acordo com a reivindicação 20 ou 21, carac-terizada pelo fato de que o dito RNA de bacteriófago é um RNA de bacterió-fago selecionado dentre QD e AP205.

23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a dita VLP compreende proteí-nas de revestimento recombinantes de QD de RNA de bacteriófago.

24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a dita VLP compreende a proteí-na de revestimento de SEQ ID NO:3.

25. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 24, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro sítio de ligação éligado ao dito segundo sítio de ligação através de pelo menos uma ligaçãocovalente, em que preferivelmente a dita ligação covalente é uma ligaçãonão-peptídeo.

26. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 25, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro sítio de ligaçãocompreende, ou preferivelmente é, um grupo amino, preferivelmente umgrupo amino de uma lisina.

27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 26, caracterizada pelo fato de que o dito segundo sítio de ligaçãocompreende, ou preferivelmente é, um grupo sulfidrila, preferivelmente umgrupo sulfidrila de uma cisteína.

28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro sítio de ligação é,um grupo amino de uma Iisina1 e em que o dito segundo sítio de ligação éum grupo sulfidrila de uma cisteína.

29. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro sítio de ligaçãonão é um grupo sulfidrila.

30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 29, caracterizada pelo fato de que a dita ligação da dita VLP e odito pelo menos um antígeno não compreende uma ligação dissulfeto.

31. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 30, caracterizada pelo fato de que apenas um dos ditos segundossítios de ligação se associa com o dito primeiro sítio de ligação através depelo menos uma ligação covalente não-peptídeo levando a um tipo único euniforme de ligação da dita molécula de IL-1 à dita partícula semelhante avírus, em que o dito apenas um segundo sítio de ligação que se associa como dito primeiro sítio de ligação é um grupo sulfidrila, e em que a dita molécu-la de IL-1 e dita partícula semelhante a vírus interagem através da dita asso-ciação para formarem uma disposição de antígeno ordenada e repetitiva.

32. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-25 ções 1 a 22, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno é fundido ao ter-minal N ou C da proteína de revestimento, mutantes ou fragmentos deles, deAP205.

33. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 32, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ligante,em que o dito ligante é associado à molécula de IL-1 por meio de pelo me-nos uma ligação covalente, e em que o dito ligante compreende, ou alterna-tivamente consiste no dito segundo sítio de ligação.

34. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 33, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é SEQ IDNO:64 ou uma muteína derivada dela.

35. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 33, caracterizada pelo fato de que a dita molécula de IL-1 é SEQ IDNO:63 ou uma muteína derivada dela.

36. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende, ou al-ternativamente consiste na, composição como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 35.

37. Vacina de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelofato de que a dita vacina é destituída de um adjuvante.

38. Uso da vacina, como definida na reivindicação 36 ou 37, emum método de imunização, caracterizado pelo fato de que compreende ad-ministrar a dita vacina a um animal ou humano.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelofato de que uma quantidade terapeuticamente eficaz da dita vacina é admi-nistrada ao dito animal ou dito humano.

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:(a) a composição, como definida em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 35, ou a vacina, como definida na reivindica-ção 36 ou 37; e(b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

41. Processo de produção da composição, como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou da vacina, como definida na rei-vindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) provisão de uma VLP com pelo menos um primeiro sítio deligação;(b) provisão de pelo menos um antígeno, em que o dito antí-geno é uma molécula de IL-1, uma proteína IL-1, um frag-mento maduro de IL-1, um peptídeo de IL-1 ou uma muteí-na de IL-1, com pelo menos um segundo sítio de ligação; e(c) ligação da dita VLP e dito pelo menos um antígeno paraproduzir a dita composição ou dita vacina, em que o ditopelo menos um antígeno e dita VLP são ligados através dodito pelo menos um primeiro e dito pelo menos um segun-do sítio de ligação.

42. Medicamento, caracterizado pelo fato de que contém a com-posição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, a vaci-na, como definida na reivindicação 36 ou 37, e/ou a composição farmacêuti-ca como definida na reivindicação 40.

43. Medicamento útil no tratamento de uma doença, caracteriza-do pelo fato de que contém a composição, como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 35, a vacina, como definida na reivindicação 36 ou 37, e/ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 40, emque a dita doença é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em:(a) doenças vasculares;(b) doenças inflamatórias dependentes de IL-1 herdadas;(c) doenças inflamatórias auto-imunes crônicas;(d) doenças degenerativas do osso e cartilagem;(e) doenças alérgicas; e(f) doença neurológica;em um animal, preferivelmente em um ser humano.

44. Medicamento de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença vascular, em que a dita do-ença vascular é aterosclerose.

45. Medicamento de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença inflamatória dependente deIL-1 herdada, em que a dita doença inflamatória dependente de IL-1 herdadaé febre mediterrânea familiar (FMF).

46. Medicamento de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença inflamatória auto-imunecrônica, em que a dita doença inflamatória auto-imune crônica é artrite idio-pática de início juvenil sistêmica ou artrite reumatóide.

47. Medicamento de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença degenerativa do osso e car-tilagem, em que a dita doença degenerativa do osso ou cartilagem é gota ouosteoartrite.

48. Medicamento de acordo com a reivindicação 43, caracteriza-do pelo fato de que a dita doença é uma doença neurológica, em que a ditadoença neurológica é esclerose múltipla.