JP2006504653A - グレリン−担体複合体 - Google Patents

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Abstract

本発明は分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医薬品に関する。本発明は規則的な繰り返し抗原又は抗原決定基アレイを有する組成物、具体的にはグレリン又はグレリン由来のペプチドアレイを提供する。より詳しくは、本発明はウイルス様粒子と、それに結合した少なくとも一つのグレイン又はグレリン由来ペプチドを有する組成物を提供する。本発明はまた、複合体と規則的な繰り返しアレイそれぞれの製造プロセスを提供する。本発明の組成物は、摂食増加又は体重増加に関連する肥満及び他の疾患治療用であり、免疫反応、特に抗体反応を効率的に誘発するワクチン製造に有用である。さらに、本発明の組成物は本明細書に記した様に自己特異的免疫反応を効率的に誘発するのに特に有用である。

Description

本発明は分子生物学、ウイルス学、免疫学及び薬学の分野に関する。本発明は規則的に繰り返された抗原又は抗体決定アレイを有する組成物、具体的にはグレリン又はグレリン由来のペプチドアレイを提供する。さらに詳しくは、本発明はウイルス様粒子と、それに結合した少なくとも一つのグレリン又はグレリン由来のペプチドを有する組成物を提供する。
本発明はまた、複合体及び規則的に繰り返すアレイをそれぞれ製造する方法を提供する。本発明の組成物は、肥満及び食物摂食の増加、又は体重の増加に関連した他の病気の治療用のワクチンの生産、及び免疫反応、特に抗体反応を効率的に誘発するのに有用である。さらに、本発明の組成物は本明細書で説明する様にに効率的に自己特異的免疫反応を誘発するのに特に有用である。
肥満は世界中で何百万もの人が罹る病気である。肥満の元になる原因は様々であるが、ほとんど全ての肥満に共通の理由は食物摂食の増加である。レプチン、成長ホルモン（ＧＨ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、アグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）その他を含む多くの因子が空腹と摂食行動を制御している。摂食行動の鍵となる調節因子は、胃及び脳のある部分（視床下部）で製造されるアシル化ペプチドであるでグレリンである（コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０２：６５６−６６０（１９９９））。グレリンは１１７アミノ酸を含むプレプロ型からの酵素開裂に由来し、セリン３でｎ−オクタノイル化された２８アミノ酸長のペプチドとなる。生物活性グレリンはこの位置でｎ−オクタノイル化される必要がある。位置１４でグルタミン（Ｑ）を欠いた第２のグレリンの２７アミノ酸イソ型（グレリン−ｄｅｓＱ１４）が同定されたが、このイソ型は循環グレリンの少数成分である。全長グレリンと同様に、グレリン−ｄｅｓ−Ｑ１４の生物活性はセリン３のｎ−オクタノイル基に依存している。しかしながら、ほとんどの機能活性は２８アミノ酸のグレリン−イソ型から生じる（ホソダ（Ｈｏｓｏｄａ）ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２７９（３）；９０９−９１３（２０００））。ヒト及びラットグレリン（ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３１）とＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３２））は２個のアミノ酸が異なるのみであり、グレリンは高度に保存されている（コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），４０２：６５６−６６０（１９９９））。
グレリンの受容体（ＧＨＳ−Ｒ）は、視床下部の弓状核（Ａｒｃ）及び腹内核、及び下垂体内を含む脳の様々な領域で発現し（ハワード（Ｈｏｗａｒｄ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３７：９７４−９７７（１９９６）；マッキー（ＭｃＫｅｅ）ら、モレキュラー・エンドクリン（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｋｒｉｎ．）、１１：４１５−４２３（１９９７）：グアン（Ｇｕａｎ）ら、モレキュラー・ブレイン・リサーチ（Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、４８：２３−２９（１９９７））、グレリンがまず脳で作用することを示している。下垂体からＧＨの刺激放出（コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０２：６５６−６６０（１９９９））に加えて、最近グレリンが摂食の鍵となる中心制御因子であることが同定されている（ナカザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０９：１９４−１９８（２００１））。特に、脳室内投与により、グレリンが摂食を刺激することが示された。さらに、抗グレリン抗体を脳室内に投与すると摂食が阻害された。グレリンの注射はＮＰＹ及び抗ＮＰＹ抗体の上方制御放出を誘発すると共に拮抗物質がグレリン誘発摂食を妨害し、グレリンが発現昂進を通じて摂食を調節することを示している（ナカザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０９：１９４−１９８（２００１））。さらに、グレリンを毎日末梢血に投与すると、マウス及びラットで体重増加を誘発し、絶食ラットでは血清グレリン濃度が増加し、摂食により減少した。これはグレリンが摂食を制御する鍵となる役割を果たしていることを示唆している（チョップ（Ｔｓｃｈｏｐ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０７：９０８−９１２）。弓状核でアンチセンスＧＨＳ−Ｒ ＲＮＡを発現するラットは体重がより低く、脂肪組織が少なかったが、これもグレリンが体重を調節するという見解を支持している（シュート（Ｓｈｕｔｏら）、ＪＣＩ、１０９：１４２９１４３６（２００２））。ヒトの摂食挙動でグレリンが鍵となる役割を果たすと言う事実もある。ヒトにグレリンを末梢投与すると、食欲を増進し、摂食量が増加する（ウレン（Ｗｒｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・クエイニカル・エンドクリノロジーカル・メタボリズム（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．）、８６：５９９２−５９９８（２００１））。ヒト肥満症の最も普通の形であるプラーダー・ウィリー（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ）症候群を有するヒトではグレリンレベルが増加した（カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ）ら、ナショナル・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、８：６４３−６４４（２００２））。さらに、ヒトの血漿グレリンレベルは食事療法による体重減少後に大きく増加し、食事療法を中止した場合の急速な体重回復と相関している。対照的に、胃バイパス手術用を受けた患者では、食事療法中及び後もグレリンレベルは低いままであり、この様な条件下では患者は通常体重を回復しない（カミングス（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ）ら、ニュー・イングランド・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、２１：１６２３−１６３０（２００２））。従って、グレリンはヒトにおける鍵となる摂食と体重の調節因子である様に思われる。
グレリンの末梢血投与で摂食が増加し体重が増えるので（ショップ（Ｔｓｃｈｏｐ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０７：９０８−９１２）、胃で生成したグレリンが血流を通って脳に達し、摂食を引き起こすと思われる。従って、血流から脳へのグレリンの移動を阻止することで、動物及びヒトの摂食を止めることが可能であると考えられる。特定の抗体が脳におけるグレリンの作用を阻止することが示されているので（ナカザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０９：１９４−１９８（２００１））、末梢血中の抗体もグレリンの作用を阻止すると考えられる。さらに、抗体は血液脳障壁を通過する効率が悪いので、グレリン特異的抗体はグレリンを脳から隔離することが可能と思われるが、脳内のグレリンには作用しない。グレリンは脳でも生成し、そこで摂食調節とは異なった機能を果たしていると考えられるので（ナカザト（Ｎａｋａｚａｔｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０９：１９４−１９８（２００１））、上記の事実は特に魅力的な可能性である。従って、肥満に対する可能な治療法により、宿主中でグレリン特異的抗体を誘発してグレリンの長期阻止妨害に導き、胃バイパス患者中で観察されたのと同様に摂食を減少させることができると考えられる。
国際公開ＷＯ９８／４２８４０はグレリンとグレリン由来フラグメントの消化管への影響と、特にそれによる胃の運動と空腹に対する効果を開示している。さらに米国特許第６、４２０、５２１号は空腹、胃の収縮性及びグルコース吸収に影響する短鎖グレリンペプチドの使用を開示している。
しかしながら、ペプチド、特に自己ペプチドに対する抗体を誘導することは通常困難である。ワクチン投与の効率を改善する一つの方法は、抗原投与の繰り返し回数を増加することである。単離されたタンパク質と異なり、ウイルスはＴ細胞の助けを借りても借りなくても、アジュバントを使用せず迅速で効率的な免疫反応を誘起する（バッハマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）及びジンカーナーゲル（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ）、アニューアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：２３５−２７０（１９９１））。ウイルスは数個のタンパク質によって構成されることが多いが、それらは単離された成分よりもより強い免疫反応の引き金を引くことができる。Ｂ細胞反応では、ウイルスの免疫源性の重要な因子の一つは反復性と表面エピトープの並列であることが知られている。多くのウイルスは、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンを効率的に架橋する、エピトープの規則的なアレイを表示する偽結晶性表面を示す（バッハマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）及びジンカーナーゲル（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ）、イミュノロジー・トゥデイ（Ｉｎｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ）、１７：５５３−５５８、（１９９６））。このＢ細胞上の表面免疫グロブリンの架橋は、細胞周期の進行とＩｇＭ抗体の生産を直接誘発する強い活性化信号である。さらに、これらの誘起されたＢ細胞はヘルパーＴ細胞を活性化することができ、このＴ細胞がＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体へのスイッチを押し、ワクチン投与の目的である長寿命のＢ細胞記憶を生じさせる（バッハマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）及びジンカーナーゲル（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ）、アニューアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５：２３５−２７０（１９９７））。ウイルスの構造は、自己免疫疾患における、及び病原体に対する自然免疫反応の一部としての抗体生成にも結びついている（フェール（Ｆｅｈｒ、Ｔ．）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１８５：１７８５−１７９２（１９９７）参照）。従って、高度に組織されたウイルス表面に提示される抗体は、強い抗抗体返納を誘発することが可能である。
しかしながら、上記の様に免疫系は通常、自己起源の構造に対して抗体を生成しない。低濃度で存在する可溶性抗原では、これはＴｈ細胞レベルの寛容性のためである。この様な条件下では、Ｔ細胞の配送を助長することができる自己抗原と担体の結合が寛容性を打破し得ると思われる。高濃度で存在する可溶性タンパク質、又は低濃度の膜タンパク質では、Ｂ及びＴｈ細胞が寛容されると思われる。しかしながら、Ｂ細胞の寛容性は可逆性（アネルギー）であり、外来担体と結合した高度に組織された抗原の投与により打破し得る（バッハマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）及びジンカーナーゲル（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ）、アニューアル・レビュー・オブ・イミュノロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５：２３５−２７０（１９９７））。
固有の繰り返し組織を有する構造のコア粒子に結合したグレリン又はグレリンペプチドを我々は発見したが、それは具体的には特定に抗体を誘導するための強力な免疫源であるウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びＶＬＰのサブユニットである。規則的で繰り返し構造のグレリン又はグレリン由来のペプチドコア粒子、特にＶＬＰ−グレリン／グレリンペプチド複合体及びアレイに基づく、肥満及びそれに関連する疾患の予防及び治療法を本発明は提供する。この予防及び治療用組成物は、ワクチン投与動物又はヒトに高力価の抗グレリン抗体を誘発することができる。従って、本発明の目的はグレリン及びその脳に関連する性質である。さらに、本発明の目的はグレリンの脳における中心的な効果、より重要なことは食欲、成長ホルモン分泌及びエネルギー恒常性である。従って、我々のワクチン戦略で誘発された抗体は、グレリンのオクタノイル化型に結合することができる。上記の様に、コア粒子に結合した、もしくは好ましくはアジュバント中で投与されたグレリン、又はより短いグレリンペプチドフラグメントを使用し、ヒト及び動物中にグレリン特異的抗体を誘発することができる。
従ってグレリンの短いペプチドフラグメント、特にコア粒子にＣ末端又はＮ−末端で結合した２４〜３３、４２〜５１、３１〜４１及び２８から３７の短いペプチド残基は、特異性の高い抗グレリン抗体を誘発し、末梢血中を循環するグレリンをＣＮＳに入る前に中和し、成長ホルモン、従って摂食に影響を及ぼすことができる。
従って、本発明の好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は、配列番号：１４４〜１４６に示される任意の配列の２４〜３３、４２〜５１、３１〜４１及び２８〜３７に対応するグレリンペプチドの群から選ばれ、その好ましいグレリンペプチドフラグメントは（ａ）ヒトグレリン、（ｂ）ウシグレリン、（ｃ）ヒツジグレリン、（ｄ）イヌグレリン、（ｅ）ネコグレリン、（ｆ）マウスグレリン、（ｇ）ブタグレリン及び（ｈ）ウマグレリンでなる群より選ばれる。
具体的には、本発明で我々は本明細書、特に実施例１７に示されるグレリンのｎ−オクタノイル化型を認識する高レベルの抗体を誘発することができる。さらに、生成した抗体は別なイソ型であるグレリン−ｄｅｓＱ１４も認識する。その結果、コア粒子、好ましくはＶＬＰへＣ−又はＮ−末端で結合したグレリン及びグレリンペプチドそれぞれによるワクチン投与から生成した抗体は、ｎ−オクタノイル化グレリンの脳への侵入を阻止し、マウスで摂食を調製することができる。従って、本発明の目的は、肥満及び他の関連する疾患の治療用の活性グレリンに対するワクチン投与戦略である。
本明細書、特に実施例１８に示す様に、コア粒子、好ましくはＶＬＰにＣ−又はＮ−末端で結合したグレリン又はグレリンペプチドは、マウスで摂食を低下させるため、グレリン及びグレリンペプチドそれぞれが摂食の鍵となる調節因子であり、グレリン及びグレリンペプチドそれぞれを標的とする抗体が肥満及び関連する疾患の治療法となる可能性があると推測される。
従って、本発明は（ａ）少なくとも１個所の第１付着部位を有するコア粒子、及び（ｂ）少なくとも１個所の第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を含む組成物を提供し、その抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリン由来のペプチドであり、その第２付着部位は（ｉ）その抗原又は抗原決定基で天然に生成しない付着部位、及び（ｉｉ）その抗原又は抗原決定基で天然に生成する付着部位でなる群より選ばれ、その第２付着部位は第１付着部位と会合可能であり、抗原又は抗原決定基とコア粒子が相互作用により会合し、規則的な繰り返し抗原アレイを生成する。使用に適したコア粒子の好ましい実施態様はウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、細菌線毛又は鞭毛、又は本発明による規則的な繰り返し構造の抗原アレイを形成可能な固有の繰り返し構造を有する任意の他の粒子である。
具体的には、本発明は規則的な繰り返し抗原又は抗原決定基アレイ、具体的にはグレリン又はグレリン由来のペプチド−ＶＬＰ複合体を有する組成物を提供する。具体的には、本発明はウイルス様粒子、及びそれに結合した少なくとも一つのグレリン又はグレリン由来のペプチドを有する組成物を提供する。本発明はまた、複合体及び規則的な繰り返しアレイをそれぞれ製造するプロセスを提供する。本発明の組成物は肥満及び関連する疾患の治療に有用なワクチンの生産、及び肥満及び関連する疾患の治療のための薬剤として、免疫反応、特に抗体反応を効率的に誘発するために有用である。さらに、本発明の組成物は示された記載された内容の範囲で、自己特異的免疫反応を効率的に誘発するのに特に有用である。
本発明で、グレリン又はグレリン由来のペプチドはコア粒子及びＶＬＰそれぞれに、典型的には配向下様式で結合し、規則的な繰り返しグレリン又はグレリン由来ペプチド抗原アレイを生成する。さらに、コア粒子及びＶＬＰそれぞれの高度な繰り返し組織構造は、高度に規則的な繰り返し様式のグレリン又はグレリン由来のペプチドの表示を仲介し、高度に組織された繰り返し抗原アレイを生成する。さらに、コア粒子及びＶＬＰはコア粒子−グレリン又はグレリン由来のペプチドアレイ、及びＶＬＰ−グレリン又はグレリン由来のペプチドアレイそれぞれで免疫された宿主に対して異物であるので、グレリン又はグレリン由来のペプチドのコア粒子及びＶＬＰそれぞれへの結合によりヘルパーＴ細胞エピトープが提供される。これらのアレイは特に、高度の規則構造、寸法及びアレイ表面の抗原の繰り返しで従来技術の複合体と異なる。
本発明のある態様では、グレリン又はグレリン由来のペプチドは適当な発現宿主中で発現又は合成され、コア粒子及びＶＬＰそれぞれは、コア粒子及びＶＬＰそれぞれを保持し組み立てるに適した発現宿主で発現し生成される。グレリン又はグレリン由来のペプチは化学的に合成できると思われる。生物活性グレリンは位置３にｎ−オクタノイル化セリンを含むので、グレリンの生物活性型を含むワクチン調合用グレリンの製造に化学合成が好ましい方法である。次にグレリン又はグレリン由来のペプチドをコア粒子及びＶＬＰにそれぞれ結合して、グレリン又はグレリン由来のペプチドアレイが組み立てられる。
他の態様では、本発明は（ａ）ウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を含む組成物を提供するが、その抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリン由来のペプチドであり、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基がウイルス様粒子と結合している。
さらに別な態様では、本発明は（ａ）本発明の組成物、及び（ｂ）許容し得る医薬品担体を含む医薬組成物を提供する。
さらに別な態様では、本発明は（ａ）少なくとも一つの第１付着部位を有するコア粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を含むワクチン組成物を提供するが、その抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリン由来のペプチドであり、第２付着部位は（ｉ）抗原又は抗原決定基で天然に生じない付着部位及び（ｉｉ）抗原又は抗原決定基で天然に生る付着部位でなる群から選ばれ、第２付着部位は第１付着部位と会合可能であり、抗原又は抗原決定基、及びコア粒子は前記相互作用により会合し、規則的な繰り返しアレイを生成する。
さらに別な態様では、本発明は組成物を含むワクチン組成物を提供し、その組成物は（ａ）ウイルス様粒子、及び（ｂ）少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を含み、抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリン由来のペプチドであり、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基がウイルス様粒子に結合している。
さらに別な態様では、本発明は（ａ）ウイルス様粒子を提供する工程、及び（ｂ）抗原又は抗原決定基がグレリン又はグレリン由来のペプチドである、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を提供する工程、及び（ｃ）ウイルス様粒子と少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を組み合わせ、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基がウイルス様粒子と結合する工程を有する請求項１の組成物の製造プロセスを提供する。
同様に、本発明は（ａ）少なくとも一つの第１付着部位を有するコア粒子を提供する工程、（ｂ）抗原又は抗原決定基がグレリン又はグレリン由来のペプチドであり、第２付着部位が（ｉ）抗原決定基又は抗原決定基で天然に生じない付着部位、及び（ｉｉ）抗原決定基又は抗原決定基で天然に生る付着部位でなる群から選ばれ、第２付着部位が第１付着部位と会合可能である、少なくとも一つの第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を提供する工程、及び（ｃ）抗原又は抗原決定基とコア粒子が相互作用により会合し、規則的な繰り返し抗原アレイを生成する、コア粒子と少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を組み合わせる工程を有する本発明の組成物を製造するプロセスを提供する。
他の態様では、本発明は請求項１の組成物を動物又はヒトに投与する工程を有する免疫法を提供する。
また別な態様では、本発明は肥満又は関連する疾患の治療用の医薬品を製造するための請求項１の組成物の使用を提供する。
さらに別な態様では、本発明は肥満又は関連する疾患の治療用の医薬品を調合するための請求項１の組成物の使用を提供する。さらに、また別な態様では、本発明は単独又は他の薬剤と組み合わせた、肥満又は関連する疾患の治療用、及び／又は哺乳動物免疫系刺激様の組成物、ワクチン、薬剤、又は医薬品を製造するための請求項１の組成物の使用を提供する。
従って、本発明は特に肥満又は肥満に関連する状態を予防及び／又は軽減又は治療する、ワクチン組成物を提供する。本発明はさらに、動物、特にネコ及び／又はイヌの他、ヒトにおける肥満又は肥満に関連する状態を予防及び／又は軽減又は治療するための、免疫化及び／又はワクチン投与法をそれぞれ提供する。本発明の組成物は予防又は治療に使用し得る。
特定の実施態様では、本発明は「自己」遺伝子産生物、すなわち本明細書出用いる「自己抗体」で発症又は悪化する、肥満又は肥満に関連する病態を予防、治療及び／又は軽減又はする方法を提供する。関連する実施態様で、本発明は「自己」遺伝子生産物で発症又は悪化する、肥満又は肥満に関連する状態を予防及び／又は軽減する、動物及び個人それぞれで免疫反応を誘発する方法を提供する。
当業者が理解し得る様に、本発明の組成物を動物又はヒトに投与する場合、その組成物は塩、緩衝液、アジュバント又は組成物の効力を改善するために望ましい他の物質を踏む無組成物中に添加することができる。医薬組成物を調合するために用いる、適当な組成物はレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、オゾール（Ｏｓｏｌ、Ａ．）編集、マック・パブリシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））を含むを含む様々な文献に提供される。
その投与が個々の受容者で寛容である場合、本発明の組成物は「薬学的に許容し得る」と言われる。さらに、本発明の組成物は「薬学的に有効な量」（所望の生理効果を与える量）で投与される。
本発明の組成物は公知の様々な方法で投与し得るが、通常は注射、輸液、吸入、経口投与又は他の適当な物理的方法で投与されると考えられる。又は、組成物は筋肉内、静脈内又は腹腔内に投与し得る。投与のための組成物の成分には滅菌水溶液（例えば生理食塩水）又は非水溶液及びエマルジョンが含まれる。非水溶剤の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。担体又は包摂ドレッシングを皮膚透過性を増大し抗原の吸収を促進するために使用することができる。
本発明の他の実施態様は、本発明の記述及びクレームに従い、公知の事実と照らし合わせて当業者に明らかであると思われる。
特に断らない限り、本明細書で用いる全ての科学技術用語は、本発明が所属する分野の当業者が共通に理解し得る意味を有する。本明細書に記載された、又はそれと類似又は同等の方法と材料を本発明の試験に使用できるが、好ましい方法と材料を以下に説明する。
１．定義
アジュバント：本明細書で用いる用語「アジュバント」とは、免疫反応の非特異的刺激物質、又は本発明のワクチン及び医薬組成物それぞれと組み合わせた場合、より免疫反応を増進させる堆積物を宿主中に生成する物質を指す。例えば完全及び不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウム及び修飾ムラミルジペプチドを含む、様々なアジュバントを使用し得る。その他のアジュバントは水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）及びコリネバクテリウム・パルブムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等の有用であると考えられるヒトアジュバントである。このようなアジュバントもまた、寿癩技術においてよく知られれている。本発明の組成物と共に投与し得るまた別なアジュバントにはモノホスフォリルリピド免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５，アルミニウム塩（明礬）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４及びビロソームアジュバント技術が含まれるが、それらに限定されない。アジュバントはこれらの物質の混合物であってもよい。
南アメリカ産樹木バラ科キアラ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮由来の、アジュバント活性を有する免疫活性サポニン分画が従来技術に置いて１公知である。例えば、ＱＡ２１としても知られるバラ科キアラ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木からＨＰＬＣで精製した分画であり、その（ＱＡ２１としての）製造法は米国特許第５、０５７、５４０号に開示されている。キアラ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）サポニンもアジュバントとしてスコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．、１９８５、７７、４０９）に開示されている。モノスフォリルリピドＡ及びその誘導体が従来技術で公知である。好ましい誘導体は３脱−ｏ−アシル化モノフォスフォリルリピドＡであり、英国特許第２２２０２１１号に開示されている。さらに好ましいアジュバントは国際公開ＷＯ００／００４６２に記載され、その全文を本明細書に引用して援用する。
しかしながら、本発明の有利な特徴は、本発明の組成物の高い免疫原性である。本明細書で既に概説した様に、又は以後の本明細書で明らかになる様に、アジュバントが副作用を生じることがあるため、後述の罰態様又は好ましい態様では、安全性に優れたアジュバントなしのＡＤ用のワクチン及び医薬組成物が得られるアジュバントを欠くワクチン及び医薬組成物が提供される。ＡＤ処置用のワクチン及び医薬組成物に関して本明細書で用いる用語「欠いている」とは、アジュバントなしで使用されるワクチン及び医薬組成物を指す。
アミノ酸リンカー：本明細書で用いる単に「リンカー」とも呼ばれる「アミノ酸リンカー」は、具体的には抗原又は抗原決定基を第２付着部位と会合させるか、より好ましくは第２付着部位を、１個のアミノ酸残基、好ましくはシステイン残基として既に有するか含むが、それに限定されない。しかしながら、本明細書で用いる用語「アミノ酸リンカー」とは、アミノ酸残基によって構成されるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様であるとしても、この様なアミノ酸残基がアミノ酸残基のみによって構成されることを意味するものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、すべてＬ−型、全てＤ−型又はその混合物である、好ましくは公知の天然起源アミノ酸又は非天然アミノ酸によって構成される。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明の範囲に含まれる。この様な分子にはＣ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又はヘテロアリール成分が含まれることが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル−（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又はヘテロアリール成分を有し、アミノ酸類がないリンカーも本発明の範囲に含まれる必要がある。抗原又は抗原決定基、随意には第２付着部位とアミノ酸得リンカーとの会合は、好ましくは少なくとも一つの共有結合、より好ましくは少なくとも一つのペプチド結合で行われる。
動物：本明細書で用いる用語「動物」とは、例えばヒト、ヒツジ、ヘラジカ、シカ、ミュールシカ、ミンク、哺乳動物、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫及びクモを含む。
抗体：本明細書で用いる用語「抗体」とは、エピトープ又は抗原決定基と結合し得る分子を指す。この用語には全抗体と一本鎖抗体を含むその抗原結合フラグメントを含むことを意味する。抗体がヒト抗原結合抗体フラグメントであることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）及びＶＬ又はＶＨドメインを有するフラグメントが含まれるが、それらに限定されない。抗体は鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源であが、抗体がヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリ抗体であることが好ましい。本明細書で用いる用語「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリー、又は例えばクッヘルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）らによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載の少なくとも一つのヒト免疫グロブリンが遺伝子導入され、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
抗原：本明細書で用いる用語「抗原」とは、抗体が結合し得る分子、又はＭＨＣ分子によって提示された場合にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合し得る分子を指す。本明細書で用いる用語「抗体」はＴ細胞エピトープも含む。さらに、抗原は免疫系で認識可能、及び／又は体液性免疫反応及び／又はＢリンパ球及び／又はＴリンパ球を活性化する細胞性免疫反応を誘発可能である。しかしながら、これには抗原がＴｈ細胞を含んでいるか、それと結合しており、抗原をアジュバントに溶解して与えなければならない場合が少なくともある。抗原は少なくとも一つのエピトープ（Ｂリンパ球及びＴ細胞）を持つことができる。上記に言う特異的反応とは、好ましくは抗原が対応する抗体又はＴＣＲと通常極めて選択的に反応し、他の抗原で誘導される複数の他の抗体又はＴＣＲと反応しないことを意味する。本明細書で用いる抗原は、いくつかの個別の抗原の混合物類であってもよい。
抗原決定基：本明細書で用いる用語「抗原決定基」とは、Ｂリンパ球又はＴリンパ球で認識される抗原の部分を意味する。抗原決定基に対応するＢリンパ球リンパ球は抗体を生産し、Ｔリンパ球は増殖、細胞性及び／又は体液性免疫の媒介に重要であるエフェクター機能の確立により、抗原決定基に反応する。
会合：本明細書で第１及び第２付着部位に対して用いられる用語「会合」とは、好ましくは少なくとも一つの非ペプチド結合による第１及び第２付着部位への結合を指す。会合の性質は共有結合、イオン結合、疎水性結合、極性結合又はその任意の組み合わせであり、会合の性質が共有結合であることが好ましい。
付着部位、その１：本明細書で用いる用語“第１付着部位"とは、抗原又は抗原決定基に存在する第２付着部位が会合し得る非天然又は天然起源の要素を指す。第１付着部位はタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオライド）又はそれらの組み合わせ、又はそれらの化学反応性基であってもよい。具体的には、第１付着部位は好ましくはウイルス様粒子等のコア粒子の表面上に位置することが好ましい。コア及びウイルス様粒子それぞれの表面上には、具体的には複数の第１付着部位が繰り返される形態で存在する。
付着部位、その２：本明細書で用いる用語「第２付着部位」とは、コア粒子又はウイルス様粒子それぞれの表面上の第１付着部位が会合し得る、抗原又は抗原決定基と会合する要素を指す。抗原又は抗原決定基の第２付着部位はタンパク質、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオライド）又はそれらの組み合わせ、又はそれらの化学反応性基である。少なくとも一つの第２付着部位が抗原又は抗原決定基上に存在する。従って、用語「少なくとも一つの第２付着部位を有する抗原又は抗原決定基」とは、少なくとも抗原又は抗原決定基と第２付着部位を有する抗原又は抗原決定基を指す。しかしながら、特に非天然起源、すなわち抗原又は抗原決定基内に天然では生じない第２付着部位では、これらの抗原又は抗原決定基は「アミノ酸リンカー」を有する。
結合：本明細書で用いる用語「結合」とは、共有結合又は付着、例えば化学的カップリング、又はイオン性会合、疎水性会合、水素結合等の非共有結合又は付着を指す。共有結合は例えばエステル、エー照る、燐酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素―燐結合等とすることができる。用語「結合」は用語「カップル」、「融合」及び「付着」より広いく、それらの用語を含む。
コートタンパク質類：本明細書で用いる用語“コートタンパク質"とは、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのカプシドアセンブリ内に含まれ得るバクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質類を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子生産物を指す場合、用語「ＣＰ」が使用される。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子生産物は「Ｑβ ＣＰ」と呼ばれ、一方、バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は「Ｑβ ＣＰ」と共にＡ１タンパク質も有する。バクテリオファージＱβカプシドは主としてＡ１タンパク質の含有量が少ないＱβ ＣＰによって構成される。同様に、ＶＬＰ Ｑβコートタンパク質は主としてＱβ ＣＰを含み、Ａ１タンパク質の含有量が少ない。
コア粒子：本明細書で用いる用語「コア粒子」とは、固有の繰り返し組織を有する剛性構造を指す。本明細書で用いるコア粒子は合成プロセスの生成物、又は生物学的プロセスの生成物であってもよい。
カップル：本明細書で用いる用語「カップルした」とは、共有結合又は非共有的会合による付着を指し、通常好ましくは共有結合による付着を指す。生物活性材のカップリングに当業者が通常用いる任意の方法を本発明で用いることができる。
有効量：本明細書で用いる用語“有効量"は、所望の生物学的効果を実現するに必要な、又は十分な量を指す。組成物の有効量とは、この選択された結果を達成する量であり、この様な量は当業者にとって常例に従って決定することができる。例えば、免疫系不全を治療するのに有効な量とは、免疫系を活性化し、抗原に晒されると抗原特異的免疫反応を発生させるのに必要な寮とすることができる。この用語は「十分な量」と同義語である。
任意の用途に対する有効量は、いずれも治療される疾患又は状態、投与される特定の組成物、対象者の大きさ、及び／又は疾患又は病状の感受性等の因子によって変化する。当業者は余計な実験を必要とせず、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
エピトープ：本明細書で用いる用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトで抗原性又は免疫原性活性を有するポリペプチドの連続又は不連続部分である。エピトープはＭＨＣ分子に関連するＴ細胞受容体を仲介して、抗体又はＴ細胞によって認識される。本明細書で用いる“「免疫原性エピトープ」は公知の方法で測定され、動物で抗体反応を誘発するか、又はＴ細胞反応を誘起するポリペプチドの部分であると定義される（例えばゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミーア・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８１：３９８８−４００２（１９８３）参照）。本明細書で用いる用語“抗原性エピトープ"とは、公知の任意の方法で測定され、抗体が免疫特異的にその抗原に結合するタンパク質の一部であると定義される。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性を必ずしも除外しない。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性ではない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープでも有り得るが、その場合は抗原性エピトープはＭＨＣ分子に関連するＴ細胞受容体により免疫特異的に結合し得る。
エピトープはエピトープに固有の立体配座中に３個のアミノ酸を有する。一般的に、エピトープは少なくとも約５個のアミノ酸で構成され、より一般的には少なくとも８〜１０個のアミノ酸によって構成される。エピトープが有機分子であるとすれば、ニトロフェニル程度の大きさである。
融合：本明細書で用いる用語“融合"とは、それらをコードする異なった起源を持つ複数のアミノ酸が、ヌクレオチド配列のフレーム内の組み合わせによって、一つのポリペプチド鎖中に組み合わさること指す。用語「融合」とはその末端の一つに対して融合するだけでなく、内部融合、すなわち異なった起源の配列をポリペプチド鎖内に挿入することが含まれるのは明らかである。
グレリン：本明細書で用いる用語「グレリン」とは、グレリン遺伝子でコードされるタンパク質由来のペプチドを指す。本明細書で用いる「グレリン」にはヒト、ネコ、イヌ及び全ての家畜その他の動物の公知のあらゆる形のグレリンが含まれる。本明細書で用いる「グレリン」にはｎ−オクタノイルで修飾された、又は修飾されないグレリンが含まれる。さらに、グレリンにはグレリンの実在するスプライス変異体も含まれる。さらに、異なった種のグレリン間の配列相同性が高いのため（ラット及びヒトグレリンはで僅か２個のアミノ酸が交換されている（コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０２：６５６−６６０（１９９９）））、ヒトグレリンのと８０％以上同一、好ましくは９０％以上同一、さらに好ましくは９５％以上同一、さらに好ましくは９９％以上同一であるグレリンの天然変異体の全ては本明細書で「グレリン」と呼ばれる。
本明細書で用いる用語「グレリン由来ペプチド」又は「グレリンペプチド」とは、グレリンの一部であり、元のグレリンペプチドの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個又は６個、さらに好ましくは少なくとも８個又は９個、さらに好ましくは少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む任意のペプチドであると広く定義される。具体的には、「グレリンペプチド」及び「グレリンフラグメント」は互換的に用いられる。さらに、本明細書で用いる用語「グレリンペプチド」及び「そのフラグメント」はグレリンペプチドの他にそのグレリンペプチドの任意の部分を当然に含み、その部分はＮ末端及び／又はＣ末端の少なくとも一つのアミノ酸の欠失によって得られるものとしてもよい。グレリンペプチド単独として、又は例えばグレリンペプチドの折り畳み、発現又は溶解度を改善する、又はグレリンペプチドの精製を容易にするために、他のアミノ酸又はタンパク質と融合させた融合体として、真核又は原核細胞の発現系の組み換え発現によりグレリンペプチドを得ることができる。グレリンペプチドとＶＬＰ又はカプシドのサブユニットタンパク質との間で融合タンパク質の正しい折り畳みを助長又は可能にするため、グレリンペプチドのＮ末端又はＣ末端に少なくとも一つのアミノ酸を付加し得る。グレリンペプチドのＶＰＬ又はカプシドのサブユニットタンパク質又はコア粒子とのカップリングを可能にするため、少なくとも一つの第２付着部位をグレリンペプチドに付加してもよい。あるいはグレリンペプチドを公知の方法を用いて合成してもよい。さらにこの様なペプチドは、対応するグレリンタンパク質中に存在しないアミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドをｎ−オクタノイル化で修飾することもできる。
残基：本明細書で用いる用語「残基」とは、ポリペプチド主鎖又は側鎖中の特定のアミノ酸を意味する。
免疫反応：本明細書で用いる用語「免疫反応」とは、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化又は増殖を招く体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応を指す。しかしながらある場合は、免疫反応の強度が低く、本明細書による少なくとも一つの物質を用いてのみ検出可能であることがある。「免疫原性」とは、生物の免疫系を刺激するのに用いられる因子であって、これにより免疫系の１種以上の機能が上昇し、その因子を標的にする。「免疫原性ポリペプチド」は細胞性及び／又は体液性免疫反応を誘発し、アジュバントの有無を問わない単独又は担体に結合したポリペプチドである。抗原提示細胞が活性化されることが好ましい。
免疫反応を「増大」する物質とは、その物質を添加せずに測定した同じ免疫反応と比較して、より大きい、又は強化された、又は変化した免疫反応がその物質の添加により観察される物質である。例えば、免疫化中にその物質を使用し、又は使用せずに得られた試料中細胞障害性Ｔ細胞の溶解活性を、で例えば５１Ｃｒ放出分析で測定することができる。該物質を用いないＣＴＬ溶解活性と比較してＣＴＬ溶解活性が増加するときの該物質の量を、抗原にする動物の免疫反応を増大するのに十分な量で言う。好ましい実施態様では、免疫反応は少なくとも２倍、より好ましくは約３倍以上増大する。サイトカインの量又はタイプを変更してもよい。又は、誘発される抗体の量、又はそのサブクラスを変更してもよい。
免疫化：本明細書で用いる用語「免疫化する」又は「免疫化」又は関連する用語は、標的抗原又はエピトープに対する実質的な免疫反応付与能（抗体及び／又はエフェクターＣＴＬ等の細胞性免疫を含む）を指す。これらの用語では、完全な免疫性が現れることよりも、むしろベースラインより実質的に大きい免疫反応が現れることが必要である。例えば、本発明の方法を用いた後に標的抗原に対する細胞性及び／又は体液性免疫反応が現れれば、その哺乳動物はその標的抗原に対して免疫化されたと考えることができる。
天然起源：本明細書で用いる用語「天然起源」とは、それ全体又は一部が合成でなく、天然に存在又は生産されることを意味する。
非天然：本明細書で用いる用語「非天然」とは天然由来でない、具体的には人の手によるものであることを意味する。
非天然起源：本明細書で用いる用語「非天然起源」とは、一般的に合成であるか天然由来でないことを意味し、具体的にはその用語は人の手によることを意味する。
規則的な繰り返し構造の抗原又は抗原決定基アレイ：本明細書で用いる用語「規則的な繰り返し構造の抗原又は抗原決定基アレイ」とは、一般的に抗原又は抗原決定基の繰り返しパターンを指し、具体的には、及び好ましくはコア粒子及びウイルス様粒子それぞれに対して抗原又は抗原決定基が均一に空間配置されることが特徴である。本発明の一実施態様では、繰り返しパターンは幾何学的なパターンでもあり得る。好適な規則的、繰り返し抗原又は抗原決定基アレイの具体的な好ましい例は、好ましくは１〜３０ナノメーター又は５〜１５ナノメーターの間隔を有する、抗原又は抗原決定基の厳密な繰り返し純結晶列を有するアレイである。
線毛：本明細書で用いる「線毛（ｐｉｌｉ、単数はｐｉｌｕｓ）」とは、規則的な繰り返しパターン組織を有するタンパク質モノマー（例えばピリンモノマー）によって構成される細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに、線毛は細菌細胞の宿主細胞表面レセプターへの付着、細胞間遺伝子交換、及び細胞間認識等の過程に関与する構造体である。線毛の例には１型線毛、Ｐ−線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ−線毛及び９８７Ｐ−線毛が含まれる。線毛の他の例は以下に示される。
線毛様構造：本明細書で用いる用語「線毛様構造」とは、線毛に類似の特性を有し、タンパク質モノマーによって構成される構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然線毛の構造と同じ規則的な繰り返しアレイを形成しない修飾線毛タンパク質を発現する細菌細胞で生成する。
ポリペプチド：本明細書で用いる用語「リペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合として知られる）で線状に繋がったモノマー（アミノ酸）によって構成される分子を指す。それはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物ではない。従って、ペプチド、ジペプチド類、オリゴペプチド類及びタンパク質類がこのポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等も意味するものとする。組み換え又は誘導化ポリペプチドは必ずしも特定の核酸配列から翻訳される必要はない。ポリペプチドは化学合成を含む任意の方法で生成してもよい。
自己抗原：本明細書で用いる用語「自己抗原」とは、宿主のＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び宿主のＤＮＡでコードされるタンパク質又はＲＮＡにより生成する産生物を意味し、自己であると定義される。さらに、２個又は数個の自己分子の組み合わせから得られるか、又は自己分子の一部を持つタンパク質、及び上記に定義した様に２個の自己分子間の相同性が高い（＞９５％、好ましくは＞９％、より好ましくは＞９９％）タンパク質も自己であると考えられる。
処置：本明細書で用いる用語「処置」、「処置する」、「処置した」又は「処置している」とは、予防及び／又は治療を意味する。例えば感染症に関して用いられる場合、この用語は対象の病原体への感染に対する抵抗性を増加させる予防処置、言い換えれば、対象が病原体に感染する可能性、又は感染が原因の病気の兆候を示す可能性を減少させる予防処置の他、対象が感染した後に感染と戦う、すなわち感染を駆逐するか、又は感染が悪化するのを防ぐための処置を意味する。肥満又は関連する疾患に関して用いた場合、用語「処置」は対象の肥満に対する抵抗性を増加する、及び／又は肥満を元に戻す予防又は治療処置を意味する。
ワクチン：本明細書で用いる用語「ワクチン」とは、本発明の組成物を含み動物に投与し得る形の製剤を指す。具体的には、ワクチンは通常の生食液又は緩衝水溶液溶媒を含み、この中に本発明の組成物が懸濁又は溶解している様な形態で本発明の組成物を用いれば、病状を好適に予防したり、寛解したり、又はその他の処置を実施することができる。宿主中へ導入すると、このワクチンは抗体及び／又はサイトカインの生産、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化及び／又はその他の細胞性反応を含むが、それらに限定されない免疫反応を誘起することができる。
随意には、本発明のワクチンはさらに本発明の化合物に対して少数又は多数の割合で存在し得るアジュバントを含む。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で用いる用語「ウイルス様粒子」とは、ウイルス粒子に類似した構造を指す。さらに、本発明によるウイルス様粒子はウイルスゲノムの全て又は一部、特にウイルスゲノムの複製及び感染成分を欠くので、複製せず非感染性である。本発明によるウイルス様粒子はそのゲノムとは異なった核酸を含んでもよい。本発明によるウイルス様粒子の典型的で好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのウイルスカプシド等のウイルスカプシドである。互換的に本明細書で用いられる用語「ウイルスカプシド」又は「カプシド」はウイルスタンパク質サブユニットによって構成される高分子アセンブリのことである。典型的かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットはそれぞれ本来の繰り返し組織を有するウイルスカプシド及びカプシドに組み立てられ、その構造は典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇｓのカプシドは正二十面体対称の球状の形を有する。本明細書で用いる用語「カプシド様構造」とは、上記に定義した意味でカプシドの形態に類似しているが、十分な規則性と反復性を維持する一方、典型的な対称構造からはずれているウイルスタンパク質サブユニットによって構成される高分子アセンブリを指す。
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で用いる用語“バクテリオファージのウイルス様粒子"とは、複製せず非感染性で、バクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子（単数又は複数）を少なくとも欠いており、さらに典型的には宿主にウイルスが付着又は侵入するために必要なタンパク質（単数又は複数）をコードする遺伝子（単数又は複数）を欠如しており、バクテリオファージの構造に類似しているウイルス様粒子を指す。しかしながら、この定義には上記の遺伝子（単数又は複数）が存在するが不活性であり、このため複製をせず非感染性であるバクテリオファージのウイルス様粒子も当然含まれる。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージのコートタンパク質の１８０個のサブユニットの自己組織化から形成され、宿主ＲＮＡを随意に含むカプシド構造は「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。具体例はＱβコートタンパク質のＶＬＰである。この具体例では、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰはＱβ ＣＰサブユニット（例えば抑制により、より長いＡ１タンパク質の発現を何れも妨害するＴＡＡ終止コドンを含むＱβ ＣＰ遺伝子の発現で形成される；コズロフスカヤ（（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ、Ｔ．Ｍ．）ら、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６）参照）のみから組み立てられるか、又はカプシドアセンブリ中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含む。
ウイルス粒子：本明細書で用いる用語“ウイルス粒子"とは、ウイルスの形態学的な形を指す。あるウイルスのタイプでは、タンパク質カプシドで囲まれたゲノムを含み、他のタイプでは異なった構造（例えば外被、尾部等）を有する。
一つ（ｏｎｅ、ａ又はａｎ）：本明細書で“一つ"という用語を使用する場合、特に断らない限り“少なくとも一つ"又は“一つ以上"を意味する。
当業者に明らかである様に、本発明のある実施態様にはクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡ及びＲＮＡの精製、原核細胞及び真核細胞中の組み換えタンパク質の発現等の組み換え核酸技術の便利な使用が含まれる。この様な方法は当業者に公知であり、公開された実験室手法マニュアル中に見出される（例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）ら編集、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ、Ｆ．）ら編集；「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・Ｈ・ウィリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞株を用いる基礎実験技術（セリス（Ｃｅｉｌｓ、Ｊ．）ら、セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、第２版（１９９８））及び抗体系技術（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．）及びレーン（Ｌａｎｅ、Ｄ．）、アンタイボディス：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；ドィッシャー（Ｄｅｕｔｓｈｅｒ、Ｍ．Ｐ．）、「タンパク質ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、メソッドオブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１２８、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）（１９９０）；スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．Ｋ．）、「タンパク質の精製、原理と実際（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、第３版、スプリンガー−フェルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））も文献に記載され、その全文を本明細書に引用して援用する。
２．免疫反応を増大するための組成物と方法
開示された本発明は、動物中のグレリン又はグレリンペプチドに対する免疫反応を増大する組成物と方法を提供する。本発明の組成物は（ａ）少なくとも一つの第１付着部位、及び（ｂ）少なくとも一つの第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を有するか、又はそれらで構成され、抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリンペプチドであり、第２付着部位は（ｉ）抗原又は抗原決定基との非天然起源付着部位、及び（ｉｉ）抗原又は抗原決定基との天然起源付着部位でなる群から選ばれ、第２付着部位は第１付着部位と会合可能であり、抗原又は抗原決定基とコア粒子が上記相互作用で会合し、規則的な繰り返しアレイを形成する。具体的には、本発明の組成物はウイルス様粒子及び少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を有するか、又はそれらで構成され、抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリンペプチドであり、抗原又は抗原決定基の少なくとも一つがウイルス様粒子と結合し、規則的な繰り返し抗原−ＶＬＰアレイを形成する。さらに本発明は、肥満の処置又は予防ためのこの様な組成物を術者が構築するのにとりわけ便利である。
ある実施態様では、コア粒子はウイルス、細菌線毛、細菌線毛から形成される構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子又はその遺伝子組み換え型を含むか、それらによって構成される。規則的な繰り返し被覆及び／又はコアタンパク質構造を有する公知の任意のウイルスを、本発明のコア粒子として選択し得る。適当なウイルスの例にはシンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス及び他のアルファウイルス、ラブド（ｒｈａｂｄｏ）ウイルス（例えば小胞口内炎ウイルス）、ピコルナ（ｐｉｃｏｒｎａ）ウイルス（例えばヒトリノ（ｒｈｉｏ）ウイルス、アイチ（Ａｉｃｈｉ）ウイルス）、トガ（ｔｏｇａ）ウイルス（例えば風疹ウイルス）、オルソミキソウイルス（例えばトゴト（Ｔｈｏｇｏｔｏ）ウイルス、バトケン（Ｂａｔｋｅｎ）ウイルス、ニワトリ黒死病ウイルス）、ポリオーマウイルス（例えばポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、トリポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、口蹄病ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイク病ウイルス、フロックハウス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ）ウイルス及びヒトパピロマウイルス、及び好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７が含まれる（例えばバッハマン（Ｂａｃｋｍａｎｎ、Ｍ．Ｆ．）及びジンカーナーゲル（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｒ．Ｍ．）、イミュノロジー・トゥディ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ）、１７：５５３−５５８（１９９６）中の表１参照）。
さらに別な実施態様では、本発明はウイルスの遺伝子工学を利用して、規則的な繰り返しウイルス外被タンパク質と、好ましくは異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基又は選ばれた反応性アミノ酸又は残基を有する第１付着部位とを融合させる。当業者に公知の他の遺伝子操作も本発明の組成物の構成に含むことができるが、例えば遺伝子突然変異により組み換えウイルスの複製能を制限することが望ましい。さらに、本発明に用いられるウイルスは、化学的又は物理的不活性化のために、又は上記の様に複製適応ゲノムがないために複製に適さない。第１付着部位への融合のために選ばれたウイルスタンパク質は、組織化された繰り返し構造を持つ必要がある。この様な組織化された繰り返し構造には、ウイルス表面上の５〜３０ｎｍ、好ましくは５〜１５ｎｍの間隔を有するパラ結晶組織が含まれる。この型の融合タンパク質の生成の結果、複数の規則的な繰り返し第１付着部位がウイルスの表面上に得られ、それは天然のウイルスタンパク質の正常な組織を反映する。当業者が理解し得る様に、第１付着部位は抗原又は抗原決定基を特異的に付着する役割を有し、規則的な繰り返し抗原アレイとなる、任意の適当なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然又は合成ポリマー、二次代謝産生物又はそれらの組み合わせであってもよい。
本発明の他の実施態様では、コア粒子は組み換えアルファウイルスであり、具体的には組み換えシンビスウイルスである。アルファウイルスはＤＮＡの仲介なしでその全ゲノムＲＮＡを感染細胞の細胞質中で複製する、正方向鎖ＲＮＡウイルスである（ストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ、Ｊ．）及びストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ、Ｅ．）、マイクロバイオロジー・レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）、５８：４９１−５６２（１９９４））。アルファウイルス属のいくつかの構成員、すなわちシンドビス（キョン（Ｘｉｏｎｇ、Ｃ）．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３：１１８８−１１９１（１９８９）；シュレジンガー（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．）、トレンド・オブ・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１１：１８−２２（１９９３））、セムリキ（セムリキ）森林ウイルス（ＳＦＶ；リルジェストローム（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｐ．）及びカロフ（Ｃａｒｏｆｆ、Ｈ．）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、９：１３５６−１３６１（１９９１））、及びその他（デービス（Ｄａｖｉｓ、Ｎ．Ｌ．）ら、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１７１：１８９−２０４（１９８９）が、様々な異なったタンパク質に対するウイルス系発現ベクターとして（ルンドストローム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｋ．）、カレント・オピニオン・オブ・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、８：５７８−５８２（１９９７）；リルジェストローム（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｐ．）、カレント・オピニオン・オブ・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、５：４９５−５００（１９９４））、及びワクチン開発の候補として我々はかなり注目した。最近、異種タンパク質の発現及びワクチンの開発のためのアルファウイルスの使用を目的とするいくつかの特許が出願されている（米国特許第５、７６６、６０２号、第５、７９２、４６２号、第５、７３９、０２６号、第５、７８９、２４５号及び第５、８１４、４８２号）。本発明のアルファウイルスコア粒子が上記文献に記載の様に組み換えＤＮＡ技術の公知の方法により構築され、その全文を本明細書に引用して援用する。
様々な組み換え宿主細胞を利用して、抗原又は抗原決定基用のウイルス系コア粒子を作成することができる。例えば、アルファウイルスは広い宿主範囲を有することが知られ、シンドビスウイルスは培養哺乳動物、爬虫類及び両生類細胞の他、ある昆虫細胞に感染する（クラーク（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．）、ジャーナル・オブ・ナショナル・カンサー・インスティチュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．）、５１：６４５（１９７３）；リーケ（Ｌｅａｋｅ、Ｃ．）、ジャーナル・オブ・ジェネティック・バイロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、３５：３３５（１９７７）；ストーラー（Ｓｔｏｌｌａｒ、Ｖ．）、ザ・トガウイルス（ＴＨＥ ＴＯＧＡ ＶＩＲＵＳＥＳ）、シュレジンガー（Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）編集、アカデミック・プレス（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、（１９８０）、ｐｐ５８３−６２１）。従って、多数の組み換え宿主細胞を本発明の実施に使用することができる。ヒト細胞中と同様な方法で異種タンパク質をグリコシル化する能力を有する可能性があるので、ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ及び／又はＣＨＯ細胞が異種タンパク質の製造に実用的に適しており（アトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、４：２７７（１９９４））、選択（ツァン（Ｚａｎｇ、Ｍ．）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１３；３８９（１９９５））又は遺伝子操作（レナー（Ｒｅｎｎｅｒ、Ｗ．）ら、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、４：４７６（１９９５）；リー（Ｌｅｅ、Ｋ．）ら、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ）、５０：３３６（１９９６））により無血清培地の他、懸濁培養で生育することができる。
ポリヌクレオチドベクターを標準実験室マニュアルに記載の方法で宿主細胞中へ導入することができる（例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）ら編集、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、Ｎ．Ｙ．、（１９８９、第９章；アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ、Ｆ．）ら編集、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・Ｈ・ウィリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｈ． Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９７）、第１６章）参照）が、それらの方法にはエレクトロポーレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、ミクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、トランスダクション、スクレープ・ローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入及び感染が含まれる。宿主細胞中への外来ＤＮＡ配列の導入法はフェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｐ．）らの米国特許第５、５８０、８５９号中に議論されている。
ＲＮＡ配列パッケージを感染ホスト細胞中に使用することができる。これらのＲＮＡ配列パッケージを培養培地に加えて宿主細胞中に導入することができる。例えば、非感染性アルファウイルス粒子が“シンドビス発現系"バージョンＣ（イントロゲン（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号Ｋ７５０−１）を含む様々な文献中に記載されている。
哺乳動物細胞をウイルス系コア粒子の作成に用いる場合、これらの細胞は一般的に組織培養中で生育する。培地中で細胞を生育する方法は公知である（例えばセリス（Ｃｅｌｉｓ、Ｊ．）編集、セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、第２版（１９８８）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）ら編集、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．）ら編集、分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・Ｈ・ウィリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９７））；フレシュネイ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．）、動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ）、アラン・Ｒ・リス社（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８３）））。
本発明のコア粒子として使用するに適したＲＮＡウイルスの別な例には以下が含まれるが、それに限定されない：オルソレオウイルス属（哺乳動物及びトリレトロウイルスの複数の抗原型）、オルビウイルス属（ブルータング（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ）ウイルス、オイゲナンギ（Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボ（Ｋｅｍｅｒｏｖｏ）ウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、及びコロラドチック熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子牛下痢ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシ又は綿羊ロタウイルス、トリロタウイルス）を含むレオウイルス科；エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コザッキーウイルスＡ及びＢ、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、腸細胞変性オルファン（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型肝炎ウイルス、トリエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルスムリス、ウシ腸ウイルス、ブタ腸ウイルス）、心臓ウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、リノウイルス属（少なくとも１１３のサブタイプを含むヒトリノウイルス、その他のリノウイルス）、アプトウイルス属（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ））を含むピコマ（Ｐｉｃｏｍａ）ウイルス科；ブタ小胞発疹ウイルス、サンミグエル（Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ）アシカウイルス、ネコピコナウイルス及びノーウォークウイルスを含むカルシビリ（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉ）ウイルス科；アルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングンヤ（Ｃｊｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オンヨン−ヨンウイルス、ロス川（Ｒｏｓｓ Ｌｉｖｅｒ）ウイルス、ベネゼラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラウイルス属（蚊黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニウイルス、キアサナ（Ｋｙａｓａｎａ）森林ウイルス、ローピングＩＩＩウイルス、ポワサンウイルス、オムスク（Ｏｍｓｋ）出血性熱ウイルス）、ルビ（Ｒｕｂｉ）ウイルス属（ルベラ（Ｒｕｂｅｌｌａ）ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜疾患ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含むトガウイルス科；バンャ（Ｂｕｎｙａ）ウイルス属（バンヤムウェラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、静脈ウイルス属（サンドフライ熱シシリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ溶血性熱ウイルス、ナイロビ羊疫ウイルス）、及びウウク（Ｕｕｋｕ）ウイルス（ウウクニエミ（Ｕｋｕｎｉｅｍｉ）及び関連ウイルス）を含むバンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（Ａ型インフルエンザウイルス、その他多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミキソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス及びウマインフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス（多くのヒトサブタイプ）、及びＣ型インフルエンザウイルス（可能な別な属）；パラミキソウイルス属（Ｉ型パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、ヘム吸着ウイルス、２型〜５型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マンプスウイルス）、はしかウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器合胞ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞ウイルス及びマウス肺炎ウイルス）を含むパラミキソウイルス属；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングンヤウイルス、オンヨン−ヨンウイルス、ロス川ウイルス、ベネゼラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、フラウイルス属（蚊黄熱ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニウイルス、キアサナウ森林ウイルス、ルーピングＩＩＩウイルス、ポワサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（ルベラウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；バンヤウイルス属（バンヤムウエラ及び関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、静脈ウイルス（サンドフライ熱シシリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ溶血性熱ウイルス、ナイロビ羊疫ウイルス）、及びウククウイルス（ウククニエミ及び関連ウイルス）を含むバンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（Ａ型インフルエンザウイルス、多くのヒトサブタイプ）、ブタインフルエンザウイルス、及びトリ及びウマインフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス（多くのヒトサブタイプ）及びＣ型インフルエンザウイルス（可能な別な属）を含むオルソミキソウイルス科；パラミキソウイルス属（Ｉ型パラミキソウイルス、センダイウイルス、ヘム吸着ウイルス、２〜５型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マンプスウイルス）、はしかウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス科（呼吸器合胞ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞ウイルス及びマウス肺炎ウイルス）を含むパラミキソウイルス科；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）、チャンディプラウイルスフランダースハートパークウイルス、リサウイルス属（ラビーウイルス）、魚ラブドウイルス及びフラボウイルス（マールブルグウイルス及びエボラウイルス）を含むラブドウイルス科；リンパ球コリオ髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、及びラサウイルスを含むアレナウイルス科；感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸内コロナウイルス、及びネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネココロナウイルス）を含むコロノアウイルス科。
コア粒子として用い得るＤＮＡウイルスの例にはオルソポックスウイルス属（大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、モンキーポックスワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、ウサギポックスウイルス、欠肢症ウイルス）、レポリポックスウイルス属（ミクソマウイルス、繊維腫ウイルス）、アビポックスウイルス属（ニワトリポックスウイルス、その他のトリポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊ポックスウイルス、ヤギポックスウイルス）、スイポックスウイルス属（ブタポックスウイルス）、パラポックスウイルス属（接触伝染性起立性皮膚炎ウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含むポックスウイルス科；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス２及び３、魚リンパ種ウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純性疱疹ウイルス１及び２、水痘−帯状疱疹ウイルス、ウマ流産ウイルス、ウマ疱疹ウイルス２及び３、偽狂犬病ウイルス、感染性ウシ角結膜炎ウイルス、感染性ウシ鼻腔気管炎ウイルス、ネコ鼻腔気管炎ウイルス、感染性咽頭気管炎ウイルス）；ベータ疱疹ウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、及びブタ、サル、齧歯類サイトメガロウイルス）；ガンマ疱疹ウイルス（エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、リスザル疱疹ウイルス、クモザル疱疹ウイルス、ワタオウサギ疱疹ウイルス、モルモット疱疹ウイルス、ルック腫瘍ウイルス）；乳腺腫ウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び未グループ化ウイルス、類人猿アデノウイルス（少なくとも一つの２３の抗原決定基型）、感染性イヌ肝炎ウイルス、及びウシ、ブタ、ヒツジ、カエルその他多くの種のアデノウイルス）及び非培養性アデノウイルスを含むアデノウイルス科；パピローマウイルス属（ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープラビットパピローマウイルス及び他の種の様々な病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス科（ポリオーマウイルス、類人猿液胞化ウイルス（ＳＶ−４０）、ウサギ液胞化ウイルス（ＲＫＶ）ウイルス、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、及び好リンパ球パピロマウイルス等の他の霊長類ポリオーマウイルス）を含むパポウイルス科；アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血病ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルス等）を含むパルボウイルス科が含まれるがそれに限定されない。最後に、ＤＮＡウイルスには慢性感染性神経症ウイルス（ＣＨＩＮＡウイルス）等のウイルスが含まれる。
他の実施態様では、細菌線毛、細菌線毛のサブ部位、又は細菌線毛又はそのサブ部位を含む融合タンパク質が、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれを調合するために用いられる。線毛タンパク質の例にはエスチェリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ナイセリア・メニンギティジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノローエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、カヌロバクター・クレッセンタス（Ｃａｎｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、シュードモナス・スチュツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、及びシュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が含まれる。本発明における使用に適した線毛タンパク質のアミノ酸配列には、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）報告ＡＪ０００６３６、ＡＪ１３２３６４、ＡＦ２２９６４６、ＡＦ０５１８１４、ＡＦ０５１８１５及びＸ００９８１に記載のものが含まれ、その全文を本明細書に引用して援用する。
通常は、細菌線毛タンパク質を処理して、タンパク質を細菌周辺質中へ移送する前にＮ−末端リーダー配列を除去する。さらに、当業者が理解し得る様に、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれを調節するために使用される細菌線毛は通常、天然に存在するリーダー配列を持たない。
本発明で使用するに適した線毛タンパク質の具体例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰ−繊毛（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）報告ＡＦ２３７４８２（配列番号：１））である。本発明で使用するに適した１型線毛タンパク質の具体例は、ジーンバンク（ＧａｎＢａｎｋ）報告Ｍ２７６０３（配列番号：３）に記載の核酸でコードされる、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）報告Ｐ０４１２８（配列番号：２）に記載のアミノ酸配列を有する線毛である。これらのジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）報告に開示される全てを、その全文を本明細書に引用して援用する。再言すると、上記に引用したタンパク質の成熟型を本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれの調製に一般的に使用される。
本発明の実施に用いるに適した細菌線毛及び線毛サブ部位をまとめて、規則的な反復抗原アレイを形成することができる。
試験管内で線毛及び線毛状構造を調製する方法は公知である。例えばバリット（Ｂｕｌｌｉｔｔ）ら（プロシーディング・オブ・サショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９３：１２８９０−１２８９５（１９９６））はＥ．ｃｏｌｉＰ−線毛サブユニットの試験管内構築を報告している。さらに、エスダット（Ｅｓｈｄａｔ）ら（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１４８：３０８−３１４（１９８１））は大腸菌の１型線毛を解離し、線毛を再構築する方法を報告している。簡単に言えばその方法は以下の通りである：線毛を飽和グアニン塩酸塩中で３７℃でインキュベーションする。次に線毛タンパク質をクロマトグラフィーで精製し、その後５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン臭素酸塩（ｐＨ８．０）に対して透析して線毛二量体を生成する。Ｅｓｈｄａｔらは、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン臭素酸塩（ｐＨ８．０）に対して透析すると、線毛二量体が再組織化することも見出した。
さらに、例えば通常の遺伝子工学及びタンパク質修飾法を用いて線毛タンパク質を修飾し、第２付着部位により抗原又は抗原決定基を結合させることもできる。又は、第二結合部位により、これらのタンパク質内に自然に存在するアミノ酸残基に抗原又は抗原決定基を直接結合させることもできる。次にこれらの修飾線毛タンパク質を本発明のワクチン組成物に使用する。
ＨＢｃＡｇに対して本明細書に記載された方法と類似の方法で、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれに用いられた細菌線毛を修飾する。例えば、システイン及びリジン残基を除去するか、又は他のアミノ酸残基で置換し、これらのタンパク質に第１付着部位を付加することができる。さらに、線毛タンパク質を修飾型で発現するか、発現後に化学的に修飾することもできる。同様に、無傷の線毛を細菌から収穫し、化学的に修飾することもできる。
他の実施態様では、繊毛又は繊毛様構造を細菌（例えば大腸菌）から収穫し、本明細書の組成物及びワクチン組成物を生成する。組成物及びワクチン組成物を調製するに適した線毛の一例は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有する線毛モノマーから形成される大腸菌の１型線毛である。
細菌線毛を収穫するいくつかの方法が公知である。例えばブリット（Ｂｕｌｌｉｔｔ）及びマコウスキ（Ｍａｋｏｗｓｋｉ）（バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．）、７４：６２３−６３２（１９９８））は大腸菌からＰ−繊毛を収穫するための線毛の精製法を報告している。この方法によれば、線毛をＰ−繊毛プラスミドを含む線毛過剰大腸菌から切り出し、可溶化及びＭｇＣｌ２（１．０Ｍ）沈殿を繰り返して精製する。
繊毛を収穫後、線毛又は線毛様構造を様々な方法で修飾する。例えば、抗原又は抗原決定基が第２付着部位によって付着する線毛に、第１付着部位を付け加えることができる。言い換えれば、細菌線毛又は繊毛様構造を収穫し、修飾して規則的な繰り返し抗原アレイとすることができる。
抗原又は抗原決定基を、線毛又は線毛様構造中に存在する天然起源システイン残基又はリジン残基と結合することができる。この様な場合、天然起源アミノ酸残基の高度に規則的で繰り返し構造に導かれて、抗原又は抗原決定基と線毛又は線毛様構造が結合する。例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、線毛又は線毛様構造を抗原又は抗原決定基の第２付着部位へ結合することができる。
生物が天然で合成する構造（例えば線毛）を使用して本発明の組成物及びワクチン組成物を調製する場合、所望の特性を有する様にこれらの生物を遺伝子操作することが有利である場合が多い。例えば、大腸菌の１型線毛を使用する場合、これらの線毛が収穫される大腸菌を、特定の特性を有する構造を生産する様に修飾し得る。線毛タンパク質の可能な修飾の例には、少なくとも一つのリジン残基の挿入、少なくとも一つの天然に存在するリジン残基の欠失又は置換、及び少なくとも一つの天然に存在するシステイン残基（例えば配列番号：２の４４及び８４位のシステイン残基）の欠失又は置換が含まれる。
リジン残基以外の第１付着部位（例えばＦＯＳ又はＪＵＮドメイン）を含む発現生成物が得られる線毛遺伝子を、さらに修飾することもできる。当然、適当な第１付着部位は一般に、線毛タンパク質が本発明のワクチン組成物に使用するに適した線毛又は線毛様構造を形成することを妨害しないものに限られる。
細菌細胞中に天然で存在する線毛遺伝子を試験管内で（例えば相同組み換えで）修飾するか、特定の特性を有する線毛遺伝子をこれらの細胞中へ導入することができる。例えば、複製可能なクローニングベクター又は細菌染色体中へ挿入するベクター何れかの成分として、線毛遺伝子を細菌細胞中へ導入することができる。導入された線毛遺伝子を、発現調節制御配列（例えばｌａｃオペレーター）と結合する。
ほとんどの場合、本発明の組成物又はワクチン組成物それぞれに用いられた線毛又は線毛様構造は、線毛サブユニット単独型によって構成される。高度に規則的な繰り返し抗原アレイを有する構造を形成すると期待されるので、同一のサブユニットによって構成される線毛又は線毛様構造を使用すること使用される。
しかしながら、本発明の組成物には、不均一線毛構造から形成された線毛又は線毛様構造を有する組成物又はワクチン組成物も含まれる。これらの線毛又は線毛様構造を形成する線毛サブユニットを、細菌細胞中に天然で存在する遺伝子から発現するか、細胞中へ導入することができる。天然に存在する線毛遺伝子及び導入された遺伝子の双方が線毛又は線毛様構造を生成する細胞内で発現された場合、その結果は一般にこれらの線毛タンパク質で形成される構造となる。さらに、２種以上の線毛遺伝子が細菌細胞中で発現した場合、各線毛遺伝子の相対的な発現は、具体的には線毛又は線毛様構造中で異なった線毛サブユニットの比率を決定する因子となる。
混合線毛サブユニットの特定の組成を有する線毛又は線毛様構造が必要な場合、少なくとも一つの線毛遺伝子の発現を、異種誘導可能プロモーターで制御することができる。この様なプロモーターの他、他の遺伝子要素を用いて細菌細胞中で生産される異なった線毛サブユニットの量、従って線毛又は線毛様構造の組成を制御することができる。
さらにペプチド結合でない結合で抗原及び抗原決定基を細菌線毛又は線毛様構造と結合し、本発明の組成物に使用される線毛又は線毛様構造を生産する細菌細胞を遺伝子操作して、抗原又は抗原決定基と融合した線毛タンパク質を生成することができる。線毛又は線毛様構造を生成するこのような融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物に使用するのに適している。
本発明出願に記されたウイルス様粒子とは、ウイルス粒子に類似しているが病原性でない構造を指す。一般に、ウイルス様粒子にはウイルスゲノムがなく、従って非感染性である。また、ウイルス様粒子を異種発現で大量に製造し、容易に精製することができる。
好ましい実施態様では、コア粒子はウイルス様粒子であり、そのウイルス様粒子は組み換えウイルス様粒子である。当業者は組み換えＤＮＡ技術と、一般に容易に入手できるウイルスコード配列を用いてＶＬＰを製造することができる。例えば、市販バキュロウイルスベクターを用い、ウイルスプロモーターの調節制御下にウイルス外被又はコアタンパク質のコード配列をバキュロウイルスベクター中に遺伝子操作して発現させ、配列を適当に修飾してコード配列を調節配列に結合して機能的させることができる。例えば、ウイルス外被又はコアタンパク質のコード配列を遺伝子操作し、細菌発現ベクター中で発現することもできる。
ＶＬＰの例にはＢ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（ウルリッヒ（Ｕｌｒｉｃｈ）ら、ウイルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．）、５０：１４１−１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（ワーネス（Ｗａｒｎｅｓ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１６０：１７３−１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５、０７１、６５１号及び第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（ツオメイ（Ｔｗｏｍｅｙ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、１３：１６０３−１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（ジャン（Ｊｉａｎｇ、Ｘ．）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５０：１５８０−１５８３（１９９０）；マツイ（Ｍａｔｓｕｉ、Ｓ．Ｍ．）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスチゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、８７：１４５６−１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（国際公開ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（国際公開ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（国際公開ＷＯ９８／１５６３１）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ及びＱβファージが含まれるがそれに限定されない。
当業者に自明である様に、本発明のＶＬＰはどのような特定の形式にも限定されない。その粒子は化学的又は生物学的プロセスで合成することが可能で、天然型又は非天然型いずれでもよい。例えば、このタイプの実施態様にはウイルス様粒子又はその組み換え型が含まれる。
具体的な実施態様では、ＶＬＰはロタウイルスの組み換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組み換えポリペプチド、アルファウイルスの組み換えポリペプチド、口蹄疫ウイルスの組み換えポリペプチド、麻疹ウイルスの組み換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組み換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組み換えポリペプチド、レトロウイルスの組み換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えポリペプチド（例えばＨＢｃＡｇ）、タバコモザイク病ウイルスの組み換えポリペプチド、フロックハウスウイルスの組み換えポリペプチド、ヒトパピローマウイルスの組み換えポリペプチド、バクテリオファージの組み換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組み換えポリペプチド、Ｔｙの組み換えポリペプチド、ｆｒファージの組み換えポリペプチド、ＧＡ−ファージの組み換えポリペプチド、及びＱβファージの組み換えポリペプチドから選ばれた組み換えポリペプチド又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。さらに、ウイルス様粒子はポリペプチドの少なくとも一つのフラグメントの他、このようなポリペプチドの突然変異体を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。例えばポリペプチドの突然変異体はその野生型ポリペプチドとアミノ酸レベルで少なくとも８０％、８５％，９０％、９５％、９７％又は９９％同一である。
好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。ＲＮＡファージはａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、ｌ）バクテリオファージＰＰ７，及びｍ）バクテリオファージＡＰ２０５でなる群から選ばれることが好ましい。
他の好ましい実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージＱβ、ＲＮＡバクテリオファージｆｒ又はＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
本発明のさらに好ましい実施態様では、組み換えタンパク質はＲＮＡファージのコートタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
従って、カプシド又はＶＬＰを形成するＲＮＡファージコートタンパク質、又はカプシド又はＶＬＰ中に自己組織化可能なバクテリオファージのフラグメントは、本発明のさらに好ましい実施態様である。例えば、バクテリオファージＱβコートタンパク質は組み換えにより大腸菌中で発現し得る。さらに、この様に発現するとこれらのタンパク質は自発的にカプシドを形成する。さらに、これらのカプシドは固有の繰り返し組織を有する構造を形成する。
本発明の組成物を調製するために使用し得るバクテリオファージコートタンパク質の具体な好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号：４；ＰＩＲデータベース、Ｑβ ＣＰに対応する寄託番号ＶＣＢＰＱβ、及び配列番号：５；ＱβＡ１タンパク質に対応する寄託番号ＡＡＡ１６６６３）、バクテリオファージＲ１７（配列番号：６；ＰＩＲ寄託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号：７；ＰＩＲ寄託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号：８；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号：９；ＳＰＣＰに対応するジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＣＡＡ３０３７４、及び配列暗号１０；ＳＰＡ１タンパク質に対応する寄託番号ＮＰ６０５０２６）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号：１１；ＰＩＲ寄託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号：１２；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号：１３；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号：１４；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号：１５；ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号：１６）、及びバクテリオファージＡＰ２０５（配列番号：２８）等のＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。さらに、バクテリオファージＱβ（配列番号：５）のＡ１タンパク質、及びそのＣ末端から１００、１５０又は１８０個のアミノ酸を失ったＣ末端切断型も、Ｑβコートタンパク質のカプシドアセンブリに含まれ得る。一般的に、カプシド形成を保証するためにはカプシドアセンブリ中のＱβＣＰに対するＱβＡ１の割合は限られる。
大腸菌中で発現した場合、Ｑβコートタンパク質がカプシド中へ自己組織化することも見出されている（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ、Ｔ．Ｍ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３７：１３３−１３７（１９９３））。得られたカプシド又はカプシド様粒子は直径２５ｎｍ、Ｔ３偽対称を有する正二十面体ファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造が解析された。カプシドはコートタンパク質の１８０のコピーを含み、そのタンパク質はジスルフィド結合で共有結合５量体又は６量体で結合し（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ、Ｒ．）ら、ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、４：５４３−５５５４（１９９６））、Ｑβコートタンパク質のカプシドが著しく安定になっている。しかしながら、組み換えコートタンパク質から作られるカプシド又はＶＬＰはジスルフィドでカプシド内の他のタンパク質と結合しない、又は不完全に結合するサブユニットを含んでもよい。しかしながら、具体的には約８０％以上のサブユニットが、ＶＬＰ内でジスルフィド結合で相互に結合している。従って、組み換えＱβを非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、モノマーＱβコートタンパク質に対応するバンドと共に、Ｑβコートタンパク質の６量体又は５量体に対応するバンドが見られる。不完全にジスルフィド結合したサブユニットは非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２量体、３量体又は４量体バンドとして現れる。Ｑβカプシドタンパク質は有機溶剤及び変性剤に異常に耐性である。驚くべきことに、我々は３０％の高濃度のＤＭＳＯ及びアセトニトリル、及び１Ｍの高濃度のグアニジウムがカプシドの安定性に影響しなことを観察した。Ｑβコートタンパク質のカプシドの高い安定性は、本発明による哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン投与に特に有利な特徴である。
大腸菌中で発現すると、ストール（Ｓｔｏｌｌ、Ｅ．）ら（ジャーナル・オブ。バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５２：９９０−９９３（１９７７））によるＮ−末端エドマン配列決定で我々が観察した様に、通常はＱβコートタンパク質のＮ−末端メチオニンが除去される。Ｎ−末端メチオニンが除去されていないＱβタンパク質によって構成されるＶＬＰ、又はＮ−末端メチオニンが切除されているか存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＰＬも、本発明の範囲内である。
本発明によるさらに好ましいＲＮＡファージ、特にＱβのウイルス様粒子が国際公開ＷＯ０２／０５６９０５に開示され、その全文を本明細書に引用して援用する。
他のＲＮＡファージコートタンパク質も細菌宿主で発現すると自己組織化することが示されている（カステライン（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ、ＲＡ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２３：２４５−２５４（１９８３）；コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ、ＴＭ．）ら、ドクダディ・アダデミー・ナウク（Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲ）、２８７：４５２−４５５（１９８６）；アドヒン（Ａｄｈｉｎ、Ｍ．Ｒ．）ら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１７０：２３８−２４２（１９８９）；ニ（Ｎｉ、Ｃ．Ｚ．）、プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．）、５：２４８５−２４９３（１９６９）；プリアン（Ｐｒｉａｎｏ、Ｃ．）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、２４９：２８３−２９７（１９９５））。コートタンパク質に加えて、Ｑβファージカプシドはいわゆる読み通しタンパク質Ａ１及び成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１はＵＧＡ終止コドンにおける抑制で生成し、３２９アミノ酸の長さを有する。本発明で用いられるファージＱβコートタンパク質のカプシドはＡ２溶解タンパク質が欠落し、宿主由来のＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコートタンパク質はＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクル中に翻訳レプレッサーとして作用するレプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位の幹ループと会合する。配列と会合の構造要素は既知である（ウイザレル（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ、Ｇ．Ｗ．）及びウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｏ．Ｃ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２８：７１−７６（１９８９）；リム（Ｌｉｍ、Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７１：３１８３９−３１８４５（１９９６））。幹ループ及びＲＮＡは一般にウイルスアセンブリに含まれることが知られている（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ、Ｒ．）ら、ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、４：５４３−５５５４（１９９６））。
さらに別な好ましい本発明の実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、組み換えタンパク質はＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質、好ましくは上記のＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。他の好ましい実施態様では、ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が少なくとも一つの、又は少なくとも二つのリジン残基の置換による除去、又は少なくとも一つのリジン残基の置換による付加により修飾されているか、もしくはＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が少なくとも一つの、又は少なくとも二つのリジン残基の欠失、又は少なくとも一つのリジン残基の挿入による付加で修飾されている。少なくとも一つのリジン残基の欠失、置換又は付加により、カップリング度、即ちＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット当たりのＡβ１〜６の量が変化し、特にワクチンの要請に適合する様に合わせることができる。
他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、組み換えタンパク質はアミノ酸配列４を有するコートタンパク質、又はアミノ酸配列４及びアミノ酸配列５を有するコートタンパク質又は配列番号：５の突然変異体の混合物を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、Ｎ−末端メチオニンが切り離されていることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＱβの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、組み換えタンパク質は突然変異Ｑβコートタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。他の好ましい実施態様では、これらの突然変異コートタンパク質は置換による少なくとも一つのリジン残基の除去で修飾されるか、置換による少なくとも一つのリジン残基の付加で修飾されている。又は、これらの突然変異コートタンパク質は少なくとも一つのリジン残基の欠失により修飾されるか、又は挿入による少なくとも一つのリジン残基の付加により修飾される。
４個のリジン残基がＱβコートタンパク質のカプシドの表面に露出される。露出したリジン残基がアルギニンで置換されたＱβ突然変異体を、本発明のために使用することができる。従って、本発明の実施に以下のＱβコートタンパク質及びＱβＶＬＰの突然変異体を用いることができる：“Ｑβ−２４０"（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号：１７）、“Ｑβ−２４３（配列番号：１８）"（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ）、“Ｑβ−２５０"（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号：１９）、“Ｑβ−２５１"（配列番号：２０）及び“Ｑβ−２４０"（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号：２１）。従って、本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は突然変異Ｑβコートタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、そのコートタンパク質はａ）配列番号：１７のアミノ酸配列、ｂ）外列番号１８のアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１９のアミノ酸配列、ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列、及びｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列の群から選ばれたアミノ酸配列を有するタンパク質を有する。上記Ｑβコートタンパク質、突然変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びカプシドそれぞれの発現と精製は国際公開ＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。上記出願の実施例１８が特に本明細書で参照される。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＱβの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、組み換えタンパク質は上記Ｑβ突然変異体及び対応するＡ１タンパク質の何れか一つの混合物を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
ＡＰ２０５ゲノムは成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼ及び関連するファージに存在しない二つの開放読み取り枠で構成され、溶解遺伝子と開放読み取り枠が成熟遺伝子の翻訳に働いている（Ｋｌｏｖｉｎｓ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｌ．、８３：１５２３−３３（２００２））。ＡＰ２０５タンパク質をプラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号：２７）から発現できるが、そのタンパク質はｐＱｂ１０の誘導体であり（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ、Ｔ．Ｍ．ら）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３７：１３３−３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む。又は、ＡＰ２０５コートタンパク質を、ベクター中に存在するリボソーム結合部位の下流のｐＱｂ１８５中にクローニングし得る。その全文を本明細書に引用して援用する、“分子抗原決定基アレイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｒｒａｙ）"の表題を有する同時係属仮米国特許出願に記載され、本発明の承継人により２００２年７月１７日に出願された通り、双方のアプローチにより、タンパク質が発現しカプシドが生成する。ベクターｐＱｂ１０及びｐＱｂ１８５はｐＧＥＭベクター由来のベクターであり、これらのベクター中にクローニングされた遺伝子の発現はｔｒｐプロモーターで制御される（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３７：１３３−３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号：２７）は、ＸｂａＩ部位の下流であり、ＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開始コドンに隣接した上流である以下の配列中に推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を有する：（tctagaＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡ−ＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡatg配列番号：５７）。ベクターｐＱｂ１８５はＸｂＩ部位の下流、開始コドン（tctagaＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣatg配列番号：５８）の上流にシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を有する（シャイン−ダルガルノ配列に下線）。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
従って本発明のこの好ましい実施態様はカプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を有する。このようなタンパク質は組み換えで発現するか、又は天然起源から調製される。電子顕微鏡（ＥＭ）及び免疫核酸で確認される様に、細菌中で生成するＡｐ２０５コートタンパク質は自発的にカプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号：２８）で形成されるカプシド、及びＡＰ２０５ＲＮＡファージで形成されるカプシドの構造的特性は、ＥＭで見るとほとんど区別できない。ＡＰ２０５ＶＬＰは高度に免疫原性であり、抗原又は抗原決定基と結合して繰り返し構造で配向した抗原及び／又は抗原決定基を表示するワクチン構成物を生成する。この様に表示された抗原に対し高い力価が誘導され、結合した抗原及び／又は抗原決定基に接近して抗体分子と会合し、免疫原性となる。
さらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え突然変異コートタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
アミノ酸５〜トレオニン（配列番号：２９）の置換を有するＡＰ２０５コートタンパク質ＡＰ２０５ＶＰＬのアセンブリ可能突然変異型を本発明の実施に使用し、これが本発明のさらに好ましい実施態様となる。天然起源のＶＬＰ、ＡＰ２０５ＶＬＰ、又はＡＰ２０５ウイルス粒子が抗原に結合し、本発明による抗原の規則的な繰り返しアレイを形成する。
ＡＰ２０５Ｐ ５−Ｔ突然変異コートタンパク質をプラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号：３０）から発現することができるが、そのプラスミドはｐＱｂ１８５から直接誘導され、Ｑβコートタンパク質遺伝子の代わりに突然変異ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子を含む。ＡＰ２０５コートタンパク質用のベクターは大腸菌中に移動し、ＡＰ２０５コートタンパク質を発現する。
ＶＬＰへ自己組織化するコートタンパク質及び突然変異コートタンパク質それぞれの発現法を実施例２０及び２１に説明する。適当な大腸菌株は大腸菌Ｋ８０２、ＪＭ１０９及びＰＲ１であるが、それらに限定されない。適当なベクター及び株、及びそれらの組み合わせを、コートタンパク質及び突然変異コートタンパク質それぞれの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験して、及び随意には最初にカプシドをゲル濾過で精製し、次に免疫拡散分析又は電子顕微鏡で試験する（オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）試験）カプシド形成と組織化により同定することができる（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３７：１３３−３７（１９９３））。
ベクターｐＡＰ２８３−５８及びｐＡＰ２８１−３２から発現したＡＰ２０５コートタンパク質は、大腸菌の細胞質中で処理されるために最初のメチオニンアミノ酸が欠落している。ＡＰ２０５ＶＬＰの開裂又は非開裂型、又はその混合物は、本発明のさらに好ましい実施態様である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質又はそのフラグメント、及びＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え突然変異コートタンパク質又はそのフラグメントの混合物を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコートタンパク質又は組み換え突然変異コートタンパク質のフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される。
ＶＬＰ及びカプシドそれぞれにアセンブリ可能な組み換えＡＰ２０５コートタンパク質のフラグメントも、本発明の実施に有用である。これらのフラグメントはコートタンパク質及び突然変異コートタンパク質それぞれの内部又は末端における欠失で形成されることもある。コートタンパク質及び突然変異コートタンパク質配列中への挿入、又は抗原配列のコートタンパク質及び突然変異コートタンパク質への融合、及びＶＬＰ中への適合性が本発明の別な実施態様であり、その結果キメラＡＰ２０５コートタンパク質及び粒子がそれぞれ得られる。コートタンパク質への挿入、欠失及び融合の結果、及びその結果がＶＬＰ中への組織化に適合するかどうかは、電子顕微鏡で確認できる。
ＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質フラグメント及び上記キメラコートタンパク質で形成される粒子を、沈殿による分画工程、及び例えばセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラム及びそれらの組み合わせを用いるゲル濾過工程の組み合わせで純粋な形で単離することができる。ウイルス様粒子の単離法は公知であり、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の単離に使用してもよい。例えば、酵母レトロトランスポゾンＴｙを単離するための超遠心の使用は、米国特許第４、９１８、１６６号に記載され、その全文を本明細書に引用して援用する。
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（ゴルモハマディ（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ、Ｒ．）ら、ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、４：５４３−５５４（１９９６））。この様な情報を用い、表面に露出した残基を同定し、ＲＮＡファージコートタンパク質を修飾して少なくとも一つの反応性アミノ酸残基を挿入又は置換により挿入することができる。その結果、これらのバクテリオファージコートタンパク質の修飾型も本発明で使用し得る。従って、カプシド又はカプシド様構造を形成するタンパク質突然変異体（例えばバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＡＰ２０５及びバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）を本発明の組成物を調製するために使用できる。
上記突然変異タンパク質の配列はその対応する野生型の配列とは異なるが、これらの突然変異タンパク質は、通常はカプシド又はカプシド様構造を形成する能力を維持している。従って、カプシド又はカプシド様構造を形成する組成物及びワクチン組成物それぞれが本発明にさらに含まれると同時に、この様な組成物及びワクチン組成物それぞれの調製法、この様な組成物を調製するために用いられる個々のタンパク質サブユニット、及びこれらのタンパク質サブニットをコードする核酸分子が含まれる。従って、カプシド又はカプシド様構造を形成し、会合能を維持し、カプシド又はカプシド様構造を形成する野生型タンパク質の突然変異体が本発明の範囲に含まれる。
その結果、規則的なアレイを形成し、固有の繰り返し構造を有する、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される組成物及びワクチン組成物それぞれが本発明に含まれる。
本発明の組成物を調製するために用いられるタンパク質をコードする核酸分子も、本発明の範囲にさらに含まれる。
他の実施態様では、配列番号：４〜２１で示される任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるタンパク質を含む組成物が本発明にさらに含まれる。
カプシド又はカプシド様構造、又はＶＬＰを形成するタンパク質のＣ末端切断型突然変異体も、本発明で使用するのに適当なタンパク質に含まれる。このような切断型突然変異体の具体例には、配列番号：４〜２１の任意の配列で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている。特に、これらのＣ末端切断型突然変異体はカプシド又はカプシド様構造を維持する能力を維持している。
本発明で使用するのに適当な別なタンパク質には、カプシド又はカプシド様構造を形成するＮ−末端切断型突然変異体もさらに含まれる。この様な切断型突然変異体の具体例には配列番号：４〜２１の任意の配列で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＮ−末端から除去されている。特に、これらのＣ末端切断型突然変異体はカプシド又はカプシド様構造を維持する能力を維持している。
本発明で使用するのに適当な別なタンパク質には、カプシド又はカプシド様構造を形成するＮ−末端及びＣ末端切断型突然変異体が含まれる。適当な切断型突然変異体の具体例には配列番号：４〜２１の任意の配列で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＮ−末端から除去され、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている。特に、これらのＣ末端切断型突然変異体はカプシド又はカプシド様構造を維持する能力を維持している。
本発明には上記切断型突然変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるタンパク質を有する組成物がさらに含まれる。
従って、本発明にはカプシド又はＶＬＰのカプシドを形成するタンパク質から調製した組成物及びワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニット及びＶＬＰ又はカプシドからこれらの組成物の調製法、これら個々のタンパク質サブユニット、及びこれらのサブユニットをコードする核酸分子の調製法、及び本発明のこれらの組成物を用いるワクチン投与法及び／又は免疫反応誘発法が含まれる。
ある実施態様では、本発明はアジュバントをさらに含む本発明のワクチン組成物を提供する。他の実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを含まない。本発明のさらに別な実施態様では、ワクチン組成物は本発明のコア粒子を含み、コア粒子はウイルス様粒子を含むか、ウイルス様粒子であることが好ましく、このウイルス様粒子は組み換えウイルス様粒子であることが好ましい。ウイルス様粒子はＲＮＡファージ、好ましくはＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるタンパク質を有する組成物がさらに含まれることが好ましい。好ましい実施態様では、ＲＮＡファージのコートタンパク質は（ａ）配列番号：４、（ｂ）配列番号：４及び配列番号：５の混合物、（ｃ）配列番号：６、（ｄ）配列番号：７、（ｅ）配列番号：８、（ｆ）配列番号：９、（ｇ）配列番号：９と配列番号：１０との混合物、（ｈ）配列番号：１１、（ｉ）配列番号：１２、（ｋ）配列番号：１３、（ｌ）配列番号：１４、（ｍ）配列番号：１５、（ｎ）配列番号：１６、及び（ｏ）配列番号：２８でなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する。又は本発明のワクチン組成物のウイルス様粒子の組み換えタンパク質はＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらで構成され、ＲＮＡ−ファージは（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージＲ１７、（ｃ）バクテリオファージｆｒ、（ｄ）バクテリオファージＧＡ、（ｅ）バクテリオファージＳＰ、（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、（ｇ）バクテリオファージＭ１１、（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｋ）バクテリオファージｆ２、（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及びバクテリオファージＡＰ２０５でなる群より選ばれる。
好ましい実施態様では、上記ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、少なくとも一つのリジン残基の置換による除去又は付加で修飾されている。他の好ましい実施態様では、上記ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、少なくとも一つのリジン残基の挿入による欠失で修飾されている。好ましい実施態様では、ウイルス様粒子はＲＮＡファージＱβ、又はＲＮＡファージｆｒ、又はＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有する。
上記の様に、本発明にはウイルス様粒子又はその組み換え型が含まれる。さらに好ましい実施態様では、本発明の組成物に用いられる粒子はＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）又はＨＢｃＡｇのフラグメントによって構成される。さらに別な実施態様では、本発明の組成物に使用される粒子は修飾されて遊離システイン残基が除去されたか、その数が減少したＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）又はＨＢｃＡｇのフラグメントによって構成される。Ｚｈｏｕら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：５３９３−５３９８（１９９２））は、修飾により天然に存在するシステイン残基が除去されたＨＢｃＡｇが会合しカプシドを形成する能力を維持していることを示した。従って、本発明の組成物に使用するのに適当なＶＬＰには修飾されたＨＢａＡｇ又はそのフラグメントが含まれ、その中で少なくとも一つの天然に存在するシステイン残基が欠失しているか、又は他のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換されている。
ＨＢｃＡｇはＢ型肝炎ウイルスコア抗原前駆体タンパク質の加工で生成するタンパク質である。ＨＢｃＡｇのいくつかのイソタイプが同定され、そのアミノ酸配列は当業者が容易に入手し得る。ほとんどの場合、本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれをＨＢｃＡｇの加工型（例えばＢ型肝炎ウイルスコア抗原前駆体タンパク質が除去されたＨＢｃＡｇ）を用いて調製される。
さらに、加工が行われない条件下にＨＢｃＡｇが生成する場合、ＨＢｃＡｇは「加工型」で発現する。例えば、タンパク質の発現が細胞質内である大腸菌発現系を本発明のＨＢｃＡｇの製造に使用する場合、これらのタンパク質は一般にＢ型肝炎ウイルスコア抗原前駆体タンパク質のＮ−末端リーダー配列が存在しない様に発現する。
本発明に使用し得るＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えば国際公開ＷＯ００／３２２２７、具体的には実施例１７〜１９及び２１〜２４の他、国際公開ＷＯ０１／８５２０８に開示され、また国際公開ＷＯ０２／０５６９０５、具体的には実施例１７〜１９及び２１〜２４及び４１に開示されている。後者の出願では、特に実施例２３、２４、３１及び５１に開示されている。２種の資料のその全文を明確に本明細書に引用して援用する。
本発明には、修飾されてさらに少なくとも一つのシステイン残基が欠失するか置換されたＨＢｃＡｇも含まれる。遊離システイン残基がいくつかの化学的副反応に関与し得ることは公知である。副反応にはジスルフィド交換、組み合わせ治療で注入又は生成した化学物質又は代謝産物と他の物質との反応、ＵＶ照射による直接酸化又はヌクレオチドとの反応が含まれる。ＨＢｃＡｇが核酸と結合する強い傾向を有するという事実を考慮すると、毒性抱合体も生成し得る。毒性抱合体は複数の種間に分布し、それらは個々には低濃度で存在するが、集まると毒性レベルに達し得る。
上記の観点から、修飾されて天然で存在するシステイン残基が除去されたＨＢｃＡｇをワクチン組成物に使用する利点の一つは、抗原又は抗原決定基が付着した場合に毒性種が結合し得る部位の数が減少するか、共に除去されると言うことである。
本発明の実施で使用するに適したいくつかの天然起源ＨＢｃＡＧが同定されている。例えば、ユアン（Ｙｕａｎ）ら（ジャーナル・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、７３：１０１２２−１０１２８（１９９９））は配列番号：２２の９７位に対応する位置のイソロイシン残基がロイシン残基又はフェニルアラニン残基で置換された突然変異体を報告している。いくつかのＨＢｃＡｇ突然変異体、及びいくつかのＢ型肝炎ウイルスコア抗原決定基前駆体突然変異体のアミノ酸配列がジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）報告ＡＡＦ１２１２４０、ＡＦ１２１２３９、Ｘ８５２９７、Ｘ０２４９６、Ｘ８５３０５、Ｘ８５３０３、ＡＦ１５１７３５、Ｘ８５２５９、Ｘ８５２８６、Ｘ８５２６０、Ｘ８５３１７、Ｘ８５２９８、ＡＦ０４３５９３、Ｍ２０７０６、Ｘ８５２９５、Ｘ８０９２５、Ｘ８５２８４、Ｘ８５２７５、Ｘ７２７０２、Ｘ８５２９１、Ｘ６５２５８、Ｘ８５３０２、Ｘ８５２９３、Ｍ３２１３８、Ｘ８５３１５、Ｕ９５５５１、Ｘ８５２５６、Ｘ８５３１６、Ｘ８５２９６、ＡＢ０３３５５９、Ｘ５９７９５、Ｘ８５２９９、Ｘ８５３０７、Ｘ６５２５７、Ｘ８５３１１、Ｘ８５３０１（配列番号：２３）、Ｘ８５３１４、Ｘ８５２８７、Ｘ８５２７２、Ｘ８５３１９、ＡＢ０１０２８９、Ｘ８５２８５、ＡＢ０１０２８９、ＡＦ１２１２４２、Ｍ９０５２０（配列番号：２４）、Ｐ０３１５３、ＡＦ１１０９９９及びＭ９５５８９に開示され、その各開示を本明細書に引用して援用する。上記Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原決定基前駆体突然変異体の配列は、国際公開ＷＯ０１／８５２０８の配列番号：８９〜１３８にさらに開示されている。これらのＨＢｃＡｇ突然変異体のアミノ酸配列はいくつかの位置で異なり、それらには配列番号：２５中の１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、０３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２及び１８３位に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が含まれる。本発明の組成物中で使用するのに適当な、本明細書の開示によりさらに修飾され得る別なＨＢｃＡｇ突然変異体は国際公開ＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８及びＷＯ００／２１４４７８に記載されている。
上記の様に、処理されたＨｂｃＡｇ（例えばリーダー配列がないもの）を本発明の組成物及びワクチン組成物それぞれに使用する。本発明にはワクチン組成物の他、上記突然変異ＨＢｃＡｇを用いるこれらの組成物の使用法も含まれる。
ポリペプチドのアミノ酸配列が上記野生型アミノ酸配列又はそのサブ部分に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するかどうかは通常、ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラム等の公知のコンピュータープログラムを用いて決定し得る。ベストフィット又は他の配列整列プログラムを用いて、例えばある特定の配列が参照アミノ酸配列に対し例えば９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一割合を参照アミノ酸配列の全長にわたり計算し、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同ギャップが許される様にパラメーターを設定する。
上記ＨＢｃＡｇ突然変異体及び前駆体のアミノ酸配列は相対的に相互に類似している。従って、配列番号：２５中の特定の位置に対応する位置に位置するＨＢｃＡｇ突然変異体のアミノ酸残基を参照することは、配列番号：２５中に示されるアミノ酸配列中のその位置に存在するアミノ酸残基を指す。ＨＢｃＡｇ突然変異体間の相同性は、ほとんどの部分で哺乳動物に感染するＢ型肝炎ウイルス間で十分に高く、従って配列番号：２５に示されるアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ突然変異体の双方を検査し、「対応する」アミノ酸残基を同定することは、当業者にとって困難ではない。さらに、マーモットに感染するウイルス由来のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す配列番号：２４に示されるＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列番号：２５のアミノ酸残基１５５と１５６との間で配列番号：２３中に３個のアミノ酸残基が挿入されている、配列番号：２５に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇに対し十分な相同性を有する。
本発明には鳥類に感染するＢ型肝炎ウイルスのＨＢｃＡｇ突然変異体を有するワクチン組成物と共に、これらのＨＢｃＡｇ突然変異体のフラグメントを有するワクチン組成物が含まれる。これらのＨＢｃＡｇ突然変異体では、本発明のワクチン組成物中に添加される前に、これらのポリペプチド中で天然に存在する１個、２個、３個又はそれ以上のシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されているか、又は欠失している。
上記の様に、遊離システイン残基を除去すると、毒性成分がＨｂＣＡｇに結合し得る部位の数を減らし、同時に同じ又は隣接するＨＢｃＡｇ分子のリジンとシステイン残基との架橋が生じ得る部位を除去する。従って、本発明の他の実施態様では、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の少なくとも一つのシステイン残基が欠失しているか、又は他のアミノ酸残基で置換されている。
他の実施態様では、本発明の組成物及びワクチン組成物のそれぞれは、Ｃ末端領域（例えば配列番号：２５のアミノ酸残基１４５〜１８５又は１５０〜１８５）が除去されたＨＢｃＡｇを含む。従って、本発明の実施に用いられる、さらに修飾されたＨＢｃＡｇにはＣ末端切断型突然変異体が含まれる。適当な切断型突然変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４又は３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇが含まれる。
本発明の実施に用いるのに適当なＨＢｃＡｇには、Ｎ−末端切断型突然変異体も含まれる。適当な切断型突然変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＮ−末端から除去されたＨＢｃＡｇが含まれる。
本発明の実施に用いるのに適当なＨＢｃＡｇには、Ｎ−末端及びＣ末端切断型突然変異体もさらに含まれる。適当な切断型突然変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５又は１７個のアミノ酸がＮ−末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４又は３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇが含まれる。
本発明には、上記切断型突然変異体に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される、ＨＢｃＡｇポリペプチドを有する組成物及びワクチン組成物がさらに含まれる。
本発明のある実施態様では、リジン残基がＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、グレリン又はグレリンペプチドのＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を仲介する。好ましい実施態様では、本発明の組成物は配列番号：２５のアミノ酸１〜１４４又は１〜１４９を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるＨＢｃＡｇを用いて調製されるが、ＨＢｃＡｇは７９位及び８０位に対応するアミノ酸がアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：３３）を有するペプチドで置換され、配列番号：２６に示される配列を有するＨＢｃＡｇポリペプチドとなる様に修飾されている。さらに好ましい実施態様では、配列番号：２５の４８位及び１０７位のシステイン残基がセリンに突然変異している。上記のアミノ酸の変化を有する、上記のＢ型肝炎ウイルスコア抗原決定基前駆体突然変異体の任意の一つに示されるアミノ酸配列を有する、対応するポリペプチドを含む組成物が本発明にはさらに含まれる。会合してＶＬＰのカプシドを形成し得る、上記のアミノ酸の変化を有する別なＨＢｃＡｇ突然変異体も、本発明の範囲に含まれる。従って、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるＨＢｃＡｇポリペプチド、及び適当であれば処理されてＮ−末端リーダー配列が除去され、上記アミノ酸の変化で修飾されたこれらのタンパク質の形を有する組成物及びワクチン組成物それぞれが、本発明にはさらに含まれる。
本発明の組成物又はワクチン組成物は異なったＨＢｃＡｇの混合物を含んでいてもよい。従って、ワクチン組成物をアミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇによって構成されることもある。例えば、少なくとも一つのアミノ酸残基が変化した（例えば欠失した、挿入された、又は置換された）「野生型」ＨＢｃＡｇ及び修飾ＨＢｃＡｇを含むワクチン組成物を調製することができる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、高度に規則的な繰り返し抗原決定基アレイを示す組成物であり、抗原はグレリン又はグレリンペプチドである。
本発明のさらに好ましい実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドの少なくとも一つは上記コア粒子及びウイルス様粒子に、好ましくは少なくとも一つの共有結合で結合している。グレリン又はグレリンペプチドの少なくとも一つはコア粒子及びウイルス様粒子それぞれに少なくとも一つの共有結合で結合することが好ましく、その共有結合は非ペプチド結合であり、コア粒子−グレリンの規則的な繰り返しアレイ、及びグレリン−ＶＬＰアレイ又は複合体となる。少なくとも一つ、通常は一つ以上のグレリン又はグレリンペプチドがＶＬＰ及びコア粒子に配向してそれぞれ結合しているので、具体的にはこのグレリン−ＶＬＰアレイ及び複合体それぞれは、繰り返し規則構造を有することが好ましくい。１２０以上、１８０以上、好ましくは２７０以上、さらに好ましくは３６０以上のグレリン又はグレリンペプチドがＶＬＰに結合することが好ましい。繰り返し規則性グレリン−ＶＬＰ及びコア粒子アレイ及び複合体の生成は、以下で明らかとなる様に、少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドのＶＬＰ及びコア粒子への、配向し一方向を向き、かつ一定の結合で確認される。さらに、ＶＬＰ及びコア粒子それぞれの典型的な固有の高度の繰り返し組織構造は、高度に規則的な繰り返し様式のグレリン又はグレリンペプチドの表示に有利に寄与し、高度に組織された繰り返しグレリン−ＶＬＰ／コアアレイ及び複合体を形成する。
従って、好ましい本発明の複合体及びアレイそれぞれは、その高度に組織された構造、寸法、及びアレイ表面の抗原の反復性で従来の複合体と異なる。さらに、本発明の好ましい実施態様により、抗原、すなわちグレリン又はグレリンペプチドの少なくとも一つの折り畳み前に発現宿主中の粒子及び抗原双方の発現、及びＶＬＰの正しい折り畳みと組織化が保証される。
本発明はグレリン又はグレリンペプチドのコア粒子及びＶＬＰそれぞれへの結合法を開示する。上記の様に、本発明のある態様では、グレリン又はグレリンペプチドがコア粒子及びＶＬＰそれぞれに化学的架橋で結合し、具体的にはヘテロ二官能性架橋剤で結合することが好ましい。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が公知である。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は第１付着部位、すなわちリジン残基及びＶＬＰ又は少なくともＶＬＰサブユニットの側鎖アミノ基と優先的に反応し得る官能基と、第２付着部位、すなわち天然に存在し、還元により利用可能になるか、グレリン又はグレリンペプチド上に遺伝子工学で形成され、随意には還元反応で利用できる第２付着部位と優先的に反応し得る別な官能基を含む。具体的には誘導化と呼ばれる手順の第１工程は、コア粒子又はＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は活性化担体と呼ばれる活性化コア粒子又は活性化ＶＬＰである。この第二工程では、ゲル濾過又は透析等の通常の方法を用いて未反応の架橋剤が除去される。第三工程では、グレリン又はグレリンペプチドが活性化担体と反応し、この工程は具体的にはカップリング工程と呼ばれる。未反応のグレリン又はグレリンペプチドは、随意には例えば透析で第四工程で除去される。いくつかの二官能架橋剤が公知である。これらには例えばピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ロックフォード、イリノイ州、アメリカ合衆国（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ））から市販され、アミノ基と反応する一つの官能基とシステイン残基反応するもう一つの官能基を有する好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（ピアス社）、スルフォＭＢＳ、スルフォＥＭＣＳ、スルフォＧＭＢＳ、スルフォＳＩＡＢ、スルフォＳＭＰＢ、スルフォＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ及び他の架橋剤が含まれる。上記架橋剤は全て、アミノ基と反応後にアミド結合を形成し、システインと反応後にチオエーテル結合を形成する。本発明の実施に適した他の架橋剤は、カップリング時にグレリン又はグレリンペプチドとコア粒子又はＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することが特徴である。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルフォＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。コア粒子とＶＬＰそれぞれの架橋剤による誘導化の程度は、各反応パートナーの濃度、一つの試薬の他の試薬に対する過剰度、ｐＨ、温度及びイオン強度等の実験条件の変化に影響される。カップリングの程度、すなわちコア粒子及びＶＬＰそれぞれ当たりのグレリン又はグレリンペプチドの量を、上記の実験条件を変えて調節し、ワクチンの要請に合わせることができる。グレリン又はグレリンペプチドの溶解度が、各サブユニット上に結合し得るグレリン又はグレリンペプチドの量を規制し、得られたワクチンが不溶性である場合は、グレリン又はグレリンペプチドを減らすことが有利である。
グレリン又はグレリンペプチドをコア粒子及びＶＬＰそれぞれと結合するための特に好ましい方法は、コア粒子及びＶＬＰそれぞれの表面上のリジン残基と、グレリン又はグレリンペプチド上のシステイン残基との結合である。従って、本発明の好ましい実施態様では、第１付着部はリジン残基であり、第２付着部位はシステイン残基である。ある実験では、第２付着部位又はその一部としてのシステイン残基を含むアミノ酸リンカーのコア粒子の、ＶＬＰそれぞれへのカップリングのためのグレリン又はグレリンペプチドに対する遺伝子操作が必要である。又は、グレリン又はグレリンペプチド内への挿入又は突然変異によりシステインを導入し得る。又は、システイン残基を化学的カップリングで導入してもよい。
アミノ酸リンカーの選択は抗原及び自己抗原それぞれの性質、すなわちグレリン又はグレリンペプチドの性質、及びｐＩ、電荷分布及びグリコシル化等の生化学的性質に依存する。一般に、柔軟なアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの好ましい実施態様は（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ−末端ガンマ１リンカー、（ｃ）Ｎ−末端ガンマ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ−末端グリシンリンカー、（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５（配列番号：３４）、（ｇ）Ｎ−末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２（配列番号：３５）、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）Ｃ末端ガンマ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端ガンマ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜１２、ｋ＝０〜５（配列番号：３６）、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）（Ｇ）ｍＣ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、ｏ＝０〜８（配列番号：３７）でなる群から選ばれる。
アミノ酸リンカーのさらに好ましい例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：３８）、及びグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、すべて第２付着部位としてシステイン残基と、随意にはさらにグリシン残基を含む。このアミノ酸リンカーの特に好ましい例はＮ−末端ガンマ１：（配列番号：３９）；Ｃ末端ガンマ１：（配列番号：３９）；Ｃ末端ガンマ１：（配列番号：４０）；Ｎ−末端ガンマ３：（配列番号：４１）；Ｃ末端ガンマ３：（配列番号：４２）；Ｎ−末端グリシンリンカー：（配列番号：４３）；Ｃ末端グリシンリンカー：（配列番号：４４）；Ｃ末端グリシン−リジンリンカー：（配列番号：４５）；Ｎ−末端グリシン−リジンリンカー：（配列番号：４６）である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、特に抗原がグレリンペプチドである場合は、ペプチドのＣ末端又はＮ−末端のＧＧＣＧの（配列番号：４７）、ＣＧＣ又はＧＧＣ−ＮＨ２（ＮＨ２はアミド化を表す）がアミノ酸リンカーとして好ましい。一般に、カップリング反応における嵩高いアミノ酸の立体障害を避けるため、グリシン残基が嵩高いアミノ酸とシステインの間に挿入される。
活性化ＶＬＰ上のヘテロ二官能性架橋剤と反応するためには、すなわち有利のスルフヒドリル基を有する有利のシステイン又はシステイン基が利用できるためには、グレリン又はグレリンペプチド上のシステイン残基は還元状態である必要がある。システイン残基がその酸化状態で結合部位として作用する場合、例えばジスルフィド結合を形成している場合、このジスルフィド架橋剤を例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβ−メルカプトエタノール等で還元する必要がある。
上記の好ましい方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いるコア粒子及びＶＬＰそれぞれへの結合により、グレリン又はグレリンペプチドがコア粒子及びＶＬＰそれぞれに配向して結合することができる。グレリン又はグレリンペプチドをコア粒子及びＶＬＰそれぞれに結合する他の方法には、カルボジイミド、ＥＣＤ及びＮＨＳを用いてをコア粒子及びＶＬＰそれぞれに架橋する方法が含まれる。グレリン又はグレリンペプチドを例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオレートとの反応で、最初にチオール化することもできる。必要に応じ脱保護後、グレリン又はグレリンペプチドを以下の様にコア粒子及びＶＬＰそれぞれと結合することができる。過剰のチオール化試薬を分離後、グレリン又はグレリンペプチドを、システインと反応する部分を有し、少なくとも一つ又は数個のシステイン残基と反応する基を表示し、そこへチオール化グレリン又はグレリンペプチドが上記の様に反応し得るヘテロ二官能性架橋剤で予め活性化したコア粒子及びＶＬＰそれぞれと反応させる。随意には、反応混合物中に少量の還元剤が含まれる。別な方法では、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ合衆国（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ））等のホモ二官能性架橋剤、又はコア粒子及びＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基それぞれと反応し得る官能基を有する他の公知の架橋剤を用いて、グレリン又はグレリンペプチドをコア粒子及びＶＬＰそれぞれに付着させる。
ＶＬＰをグレリン又はグレリンペプチドに結合する他の方法には、コア粒子及びＶＬＰそれぞれをビオチン化し、グレリン又はグレリンペプチドをストレプタビン融合タンパク質として発現する方法、又はグレリン又はグレリンペプチドとコア粒子及びＶＬＰそれぞれの双方を、例えば国際公開００／２３９５５に記載の様にビオチン化する方法が含まれる。この場合、次の工程で添加されるコア粒子及びＶＬＰそれぞれの結合に遊離結合部位が利用できる様に、グレリン又はグレリンペプチドのストレプタビンに対する比率を調節して、グレリン又はグレリンペプチドが最初にストレプタビンに結合する。或いは、全ての成分を「ワンポット」反応で混合する。可溶性レセプター及びリガンドが利用可能で、コア粒子及びＶＬＰそれぞれと、又はグレリン又はグレリンペプチドと架橋可能である場合、グレリン又はグレリンペプチドをコア粒子及びＶＬＰそれぞれに結合するための結合剤として他のリガンド−レセプター対を使用し得る。或いは、リガンド又はレセプターの何れかをグレリン又はグレリンペプチドと融合し、コア粒子及びＶＬＰそれぞれへの結合を仲介するか、レセプター又はリガンド何れかへ化学結合するか融合する。挿入又は置換により融合させることもできる。
既に述べた様に、本発明の好ましい実施態様ではＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。
立体的に可能ならば、ＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基により、一つ又は数個の抗原分子、すなわちグレリン又はグレリンペプチドをカプシドの１個のサブユニット、又はＲＮＡコートタンパク質のＶＬＰに付着することができる。ＲＮＡファージ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰのコートタンパク質のＶＬＰの具体的な特徴は、サブユニットあたり数個の抗原を結合し得ることである。これにより密な抗原アレイを作成することができる。
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドのコア粒子及びウイルス様粒子それぞれへの結合及び付着は、ウイルス様粒子の少なくとも一つの付着部位と、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基の第２付着部位との間の相互作用又は会合によって行われる。
ＶＬＰ又はＱβのカプシドは一定数のリジン残基を表面に表示するが、３個のリジン残基がカプシド内部を指しＲＮＡと会合し、他の４個のリジン残基がカプシドの外部に露出した一定のトポロジーを有している。これらの一定の性質は、抗原がリジン残基がＲＮＡと会合する粒子の内部でなく、粒子の外部に付着するのに都合が良い。ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面に一定量のリジン残基と、これらのリジン残基の一定のトポロジーを有する。
本発明のさらに好ましい実施態様では、第１付着部位はリジン残基であり、及び／又は第２付着部位はスルフヒドリル又はシステイン残基を有する。本発明の極めて好ましい実施態様では、第１付着部位はリジン残基であり、第２付着部位はシステイン残基である。
本発明の極めて好ましい実施態様では、グレリン又はグレリンペプチド上に天然で存在するか、又は遺伝子操作によるシステイン残基を経由して、グレリン又はグレリンペプチドがＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰのリジン残基と結合する。
ＲＮＡファージ由来のＶＬＰの他の利点は細菌中での高い発現収率であり、妥当なコストで大量の材料を生産することができる。
上記の様に、本発明の複合体とアレイそれぞれはその高度に組織された構造、寸法、及びアレイ表面上の抗原の反復度の点で従来技術の複合体と異なる。さらに、ＶＬＰを担体として用いることにより、様々な抗原密度の頑丈な抗原アレイと複合体それぞれを生成できる。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰの使用により、極めて高いエピトープ密度を達成し得る。高いエピトープ密度を有するＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ組成物の調製を、本出願の教示を用いて行うことができる。本発明の好ましい実施態様では、グレリンペプチドが好ましくはＱβコートタンパク質のＶＬＰと結合する場合、サブユニットあたりの平均グレリンペプチド数は０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０，１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１，７、１．８、１．９、２．０、２．１、２，２、２，３、２，４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又はそれ以上であることが好ましい。
本明細書で定義する第２付着部位には抗原又は抗原決定基が天然で、或いは非天然で存在する。抗原又は抗原決定基上に適当な天然起源第二付着部がない場合、抗原に非天然第２付着部位を遺伝子操作で作成しなければならない。
上記の様に、４個のリジン残基がＱβコートタンパク質のＶＬＰの表面上に露出している。具体的にはこれらの残基は架橋剤分子と反応して誘導化されている。露出したリジン残基の全てが抗原に結合できない場合、架橋剤と反応したリジン残基は誘導化工程後にε−アミノ基に付着した架橋剤分子と共に残留する。これにより、ＶＬＰの溶解正と安定性に不利な１個又は数個の正電荷が消失する。アルギニン残基は架橋剤と反応しないので、以下に述べる開示されたＱβコートタンパク質の場合の様に、リジン残基のいくつかをアルギニンで置換することにより、我々は正電荷が過剰に消失することを阻止した。さらに、リジン残基をアルギニンで置換することにより、抗原との反応に使用できる部位が減少するので、抗原アレイがより明確になる。
従って、本出願で開示された以下のＱβコートタンパク質及び／又は突然変異ＱβＶＬＰでは露出したリジン残基がアルギニンで置換された：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号：１７）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号：１９）及びＱβ−２５９（Ｋｙｓ２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号：２１）。コンストラクトをクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製し、ペプチド及びタンパク質抗原との結合に使用した。Ｑβ２５１（配列番号：２０）も構築したが、発現、精製及びＱβ−２５１のＶＬＰの結合法の手引きは本出願内に見出すことができる。
別な実施態様では、より高い密度の抗原アレイを得るのに適当なリジン残基を１個追加したＱβ突然変異コートタンパク質を我々は開示した。この突然変異Ｑβコートタンパク質であるＱβ−２４３（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号：１８）をクローニングし、ＶＬＰのカプシドを単離精製して、リジン残基をさらに追加することがサブユニットのカプシド又はＶＬＰへの自己組織化に適合し得ることを示した。従って、グレリン又はグレリンペプチドアレイ、及び複合体のそれぞれを、Ｑβコートタンパク質突然変異体のＶＬＰを用いて調製し得る。抗原をＶＬＰへ、特にＲＮＡファージタンパク質のＶＬＰへ付着する特に好ましい方法は、ＲＮＡファージタンパク質のＶＬＰの表面上に存在するリジン残基と抗原、すなわちグレリン又はグレリンペプチド上に天然で存在するか、又は遺伝子操作で生成したシステイン残基との結合である。システイン残基が第２付着部位として有効であるためには、スルフヒドリル基が結合に利用できなければならない。従って、システイン残基が還元状態である必要がある、すなわち遊離のスルフヒドリル基を有する遊離システイン又はシステイン残基が利用できる必要がある。第２付着部位として機能するシステイン残基が酸化型である場合、例えばジスルフィド架橋を形成している場合、このジスルフィド結合の例えばＤＴＴ，ＴＣＥＰ又はβ−メルカプトエタノールによる還元が必要である。還元剤の濃度及び抗原に対する還元剤の過剰のモル数を各抗原につき調節しなければならない。１０ｍＭ以下の低い濃度から出発して、必要あれば１０〜２０ｍＭ以上の還元剤の滴定範囲を試験し、抗原の担体への結合を評価する。国際公開ＷＯ０２／０５６９０５に記載の様に、低濃度の還元剤がカップリング反応に適応するが、公知の様に高濃度はカップリング反応を阻害し、この場合は還元剤を透析又はゲル濾過で除去する必要がある。透析又は平行緩衝液のｐＨが７以下、好ましくは６であることが有利である。低ｐＨ緩衝液の抗原活性又は安定性との適合性を試験する必要がある。
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度を、架橋剤及び他の反応条件の選択で調節することができる。例えば、具体的には架橋剤スルフォ−ＢＭＢＳ及びＳＭＰＨにより、高いエピトープ密度を達成し得る。誘導化は高濃度の還元剤で正の影響を受け、ＲＮＡファージタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに結合した抗原数を制御するために反応条件の操作を用いることができる。
非天然第２付着部位を設計する前に、融合、挿入又は遺伝子操作を行う位置を選ばなければならない。従って、第２付着部位又はそれを含む任意のアミノ酸リンカーに由来する立体障害を避ける様に、第２付着部位の位置が選ばれる。別な実施態様では、自己抗原とその天然リガンドとの会合位置とは異なる部位を指向する抗体反応が望ましい。このような実施態様では、自己抗原とその天然リガンドとの会合部位に対する抗体の生成を避けるように、第２付着部位が選ばれる。
最も好ましい実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドはコア粒子、及びＶＰＬ（単数又は複数）それぞれの上の第１付着部位と会合し得る単一の第２付着部位又は単一の反応性付着部位を有する。これにより、少なくとも１個、具体的には１個以上、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３６０、４００、４５０個以上の抗原のコア粒子及びＶＬＰそれぞれへの明確で均一な結合及び会合が保証される。従って、単一の第２付着部位又は単一の反応性付着部位を備えることは、単一で均一な型の結合と会合をそれぞれ保証し、極めて高度の繰り返しアレイが得られる。例えば、結合と会合それぞれがリジン（第１付着部位として）及びシステイン（第２付着部位として）の会合により行われ、この本発明の好ましい実施態様によれば、抗原上に存在するシステイン残基が天然型であるか非天然型であるかに拘わらず、抗原１個に付きただ１個のシステインがコア粒子のＶＬＰ及び第１付着部位それぞれと結合又は会合することができる。
ある実施態様では、本発明の開示による第２付着部位に適したアミノ酸を含むアミノ酸リンカーの抗原上への第二付着部の遺伝子操作には、アミノ酸リンカーの融合が必要である。従って、本発明の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーが少なくとも一つの共有結合で抗原又は抗原決定基に結合している。アミノ酸リンカーが第２付着部位を有するか、それによって構成されることが好ましい。さらに好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーはスルフヒドリル基又はシステイン残基を有する。他の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーの選択基準、及び本発明によるアミノ酸リンカーのさらに好ましい実施態様は既に上記で説明されている。
本発明のさらに好ましい実施態様では、少なくとも一つの抗原又は抗原決定基、即ちグレリン又はグレリンペプチドがコア粒子及びウイルス様粒子と融合する。上記に概説した様に、ＶＬＰは具体的にはＶＬＰ中への少なくとも一つのサブユニットの組織化によって構成される。従って、本発明の好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基、好ましくは少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドがＶＬＰ中に取り込まれ得るウイルス様粒子又はタンパク質の少なくとも一つのサブユニットに融合し、キメラＶＬＰ−サブユニット−グレリン又はグレリンペプチド融合体を生成する。
グレリン又はグレリンペプチドの融合はＶＬＰサブユニット配列中への挿入、又はＶＬＰ中に取り込むことが可能なＶＬＰサブユニット又はタンパク質のＮ−末端又はＣ末端への融合で行うことができる。以後ペプチドのＶＬＰサブユニットへの融合と言う場合、サブユニット配列の何れかの末端への融合、又はサブユニット内のペプチドの内部挿入が含まれる。
グレリン又はグレリンペプチド配列をサブユニット配列の一部が欠失し、以後切断型突然変異体と呼ばれるＶＬＰサブユニットの突然変異体中へ挿入して、融合を行ってもよい。切断型突然変異体はＮ−末端又はＣ末端の欠失、又はＶＬＰサブユニットの内部欠失を有することもある。例えば、７９〜８１個のアミノ酸残基を有する特異的ＶＬＰ ＨＢｃＡｇは内部欠失を有する切断型突然変異体である。グレリン又はグレリンペプチドの切断型突然変異ＶＬＰサブユニットへの融合も、本発明の実施態様となる。同様に、エピトープのＶＬＰサブユニット中への融合も置換により行われ、例えば特異的ＶＬＰ ＨＢｃＡｇでは７９から８１個のアミノ酸が外来エピトープで置換されている。従って、以後に言う融合はグレリン又はグレリンペプチド配列のＶＬＰサブユニット中への挿入、ＶＬＰサブユニットの一部のグレリン又はグレリンペプチド配列による置換、又は欠失、置換又は挿入の組み合わせにより行ってもよい。
キメラグレリン又はグレリンペプチドＶＬＰサブユニットは、一般にＶＬＰ中へ自己組織化が可能である。サブユニット中へ融合したエピトープを表示するＶＬＰも、本明細書中で以後キメラと呼ぶ。上記の様に、ウイルス様粒子は少なくとも一つのＶＬＰサブユニットを有するか、そのサブユニットによって構成される。本発明の別な実施態様では、ウイルス様粒子はキメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわちそれらに融合した抗原を持たないＶＬＰサブユニットを有するか、それによって構成される。このことは、ＶＬＰの形成及び組織化を保証するのに有利である。これらの実施態様では、キメラＶＬＰサブユニットの割合は１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又はそれ以上である。
側面アミノ酸残基を、ＶＬＰのサブユニットの何れかの末端に融合するペプチド又はエピトープの何れかの末端に付け加えるか、又はこの様なペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列内へ挿入することができる。グリシン及びセリン残基が、融合するグレリン又はグレリンペプチドに付加する側面配列に用いられる特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基はさらに柔軟性を与え、外来配列をＶＬＰサブユニットを配列中へ融合することによる不安定化効果の可能性を低減し得る。
本発明の具体的な実施態様では、ＶＬＰはＢ型肝炎ウイルスコア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇの何れかのＮ−末端への融合タンパク質（ネイリンク（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ、Ｓ．）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．）、５：１１５７−１１６３（１９９９））、又はいわゆる主要免疫主体領域（ＭＩＲ）中への挿入体が報告され（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１））、本発明の好ましい実施態様である。ＭＩＲ欠失を有するＨＢｃＡｇの天然起源突然変異体も報告され（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１）、その全文を明確に本明細書に引用して援用する）、Ｎ−末端又はＣ末端への融合体、及びｗｔＨＢｃＡｇと比較して欠失部位に対応するＭＩＲ部位への挿入体も本発明の別な実施態様である。Ｃ末端への融合も報告されている（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１））。当業者は古典的分子生物学技術を用いる融合タンパク質の構築法の手引きを容易に見出し得ると考えられる（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）ら編集、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））；ホー（Ｈｏ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、７７：５１（１９８９））。ＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用なベクターが報告され（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ、Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１４４（２００１）；ネイリンク（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ、Ｓ．）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．）、５：１１５７−１１６３（１９９９）、本発明の実施態様に使用できる。我々は例（実施例６）としてキメラ自己組織化ＨＢｃＡｇが得られる、ＨＢｃＡｇのＭＩＲ中へのエピトープの挿入を説明する。自己アセンブリの効率の最適化と、ＨＢｃＡｇ中へ挿入されるエピトープの表示の重要な因子は、挿入部位の選択の他、挿入によりＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸数（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ、Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１））であり、言い換えるとＨＢｃＡｇ由来のどのアミノ酸を新しいエピトープで置換するかということである。例えば、７６〜８０、７９〜８１、７５〜８５又は８０〜８１個のアミノ酸を外来エピトープで置換することが報告されている（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ、Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１）；欧州特許第０４２１６３５；米国特許第６、２３１、８６４号）。ＨＢｃＡｇは長いアルギニンの尾部を含むが（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ、Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１））、それはカプシドアセンブリにはそれほど必要ではなく、核酸を結合し得る（パンペンス（Ｐｕｍｐｅｎｓ、Ｐ．）及びグレンス（Ｇｒｅｎｓ、Ｅ．）、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４４：９８−１１４（２００１））。このアルギニンの尾部を有するか、持たないＨＢｃＡｇは共に本発明の実施態様である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要コートタンパク質は細菌、特に大腸菌中で発現すると自発的に組織化してＶＬＰとなりる。本発明の組成物を調製するために使用し得るバクテリオファージコートタンパク質の具体例には、バクテリオファージＱβ等のＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる（ＰＩＲデータベース、配列番号：４；Ｑβ ＣＰに対応する寄託番号ＶＣＢＰＱβ；Ｑβ Ａ１に対応する寄託番号ＡＡＡ１６６６３、）及びバクテリオファージｆｒ（配列番号：７；寄託番号ＶＣＢＰＦＲ）が含まれる。
より好ましい実施態様では、少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドをＱβコートタンパク質に融合する。エピトープがＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合した、又はＡ１タンパク質内に挿入された融合タンパク質コンストラクトが報告されている（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））。Ａ１タンパク質はＵＧＡ終止コドンの抑制で生成し、Ｎ−末端メチオニンを入れて数えると３２９アミノ酸又は３２８アミノ酸長を有する。アラニン（ＱβＣＰ遺伝子でコードされる２番目のアミノ酸）の前のＮ−末端メチオニンの開裂は、通常大腸菌中で行われ、これはＱβコートタンパク質ＣＰのＮ−末端の場合である。Ａ１遺伝子の一部。すなわちＵＧＡアンバーコドンの３’はＣＰの伸長部をコードし、１９５アミノ酸長を有する。ＣＰ伸長部の７２位と７３位の間に少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドを挿入することは、本発明の別な実施態様である（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ、Ｔ．Ｍ．）ら、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））。Ｃ末端切断型ＱβＡ１タンパク質のＣ末端にグレリン又はグレリンペプチドを融合することは、本発明のさらに別な実施態様である。例えば、コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）ら（インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９−１５（１９９６））は、エピトープが１９位で切断されたＱβＣＰのＣ末端に融合した、ＱβＡ１タンパク質の融合を報告している。
コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）ら（インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））が報告する様に、融合エピトープを表示する粒子組織は、具体的にはＡ１タンパク質−グレリン又はグレリンペプチドと、ｗｔＣＰ双方の存在でモザイク粒子を形成することが必要である。しかしながら、ウイルス様粒子を含む実施態様、及び具体的に少なくとも一つのグレリン又はグレリンペプチドを有するＶＬＰサブユニット飲みによって構成されるＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰも、本発明の範囲内である。
モザイク粒子の製造はいくつかの方法で行い得る。コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）ら（インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））は二つの方法を報告しているが、その二つを本発明の実施に用いることができる。最初のアプローチでは、ＶＬＰ上の癒合エピトープの効率的な表示が、クローン化されたＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドを内蔵する大腸菌株中のＣＰ及びＣＰ延長部の間にＵＧＡ終止コドンを有する、ＱβＡ１タンパク質融合をコードするプラスミドの発現で仲介され、ＵＧＡコドンがＴｒｐ（ｐＩＳＭ３００１プラスミド、スミレイ（Ｓｍｉｌｅｙ、Ｂ．Ｋ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３４：３３−４０（１９９３））中へ翻訳される。他のアプローチでは、ＣＰ遺伝子終止コドンがＵＡＡに修飾され、Ａ１タンパク質−グレリン又はグレリンペプチド融合体が共形質転換される。第二プラスミドは異なった抗生物質耐性をコードし、複製開始点は第１プラスミドと互換性である（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））。第三のアプローチでは、ＣＰ及びＡ１タンパク質−グレリン又はグレリンペプチド融合体が二遺伝子的にコードされ、コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら（インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：９−１５（１９９６））に記載される様にＴｒｐプロモーター等のプロモーターと結合して作用する。
さらに別な実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドがｆｒＣＰのアミノ酸２及び３（Ｎ−末端が開裂した開裂ＣＰの番号付け）の間に挿入され、グレリン又はグレリンペプチド−ｆｒＣＰ融合タンパク質となる。ＶＬＰへ自己組織化し、本発明の実施態様に有用なｆｒＣＰ融合タンパク質の構築と発現のためのベクターと発現システムが報告されている（プシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ、Ｐ．）ら、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．）、６：８８３−８９１（１９９３））。特定の実施態様では、グレリン又はグレリンペプチド配列が、ｆｒＣＰの残基３及び４が欠失したｆｒＣＰの欠失突然変異体中のアミノ酸２の後に挿入される（プシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ、Ｐ．）ら、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．）、６：８８３−８９１（１９９３））。
エピトープのＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ−末端隆起β−ヘアピン中への融合、及びその後のＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上への表示も報告され（国際公開９２／１３０８１）、ＭＳ−２ＲＮＡファージのコートタンパク質中への挿入又は置換によるグレリン又はグレリンペプチドの融合も、本発明の範囲内である。
本発明の他の実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドをパピロマウイルスのカプシドタンパク質中へ融合する。具体的な実施態様では、グレリン又は１型グレリンペプチドをウシパピロマウイルス（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１中へ融合する。バキュロウイルス／昆虫細胞系中でのＢＶＰ−１融合タンパク質の構築及び発現のためのベクター及び発現系が報告されている（チャッケリアン（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ、Ｂ．）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９６：２３７３−２３７８（１９９９）；国際公開ＷＯ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６のグレリン又はグレリンペプチドによる置換により、ＢＰＶ−１ Ｌ１−グレリン又はグレリンペプチド融合タンパク質が得られ、これは本発明の好ましい実施態様である。バキュロウイルスベクター中へのクローニング、及びバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞中の発現が報告され、本発明の実施に使用することができる（チャッケリアン（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ、Ｂ．）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９６：２３７３−２３７８（１９９９）；国際公開００／２３９５５）。融合グレリン又はグレリンペプチドを表示する組織化粒子の精製を、例えばゲル濾過又はスクロース勾配超遠心等の多くの方法で行うことができる（チャッケリアン（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ、Ｂ．）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９６：２３７３−２３７８（１９９９）；国際公開ＷＯ００／２３９５５）。
さらに別な実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドをＴｙＶＬＰ中へ取り込まれ得るＴｙタンパク質と融合する。具体的な実施態様では、グレリン又はグレリンペプチドをＴＹＡ遺伝子でコードされるｐｌ又はカプシドタンパク質と融合する（ロス（Ｒｏｔｈ、Ｊ．Ｆ．）、イースト（Ｙｅａｓｔ）、１６：７８５−７９５（２０００））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３及び４がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離され、レトロトランスポゾンＴｆ１がシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂａｅ）から単離されている（ベーケ（Ｂｏｅｋｅ、Ｊ．Ｄ．）及びサンドマイヤー（Ｓａｎｄｍｙｅｒ、Ｓ．Ｂ．）「酵母トランスポゾン要素（Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ）、酵母サッカロミセスの分子及び細胞生物学：ゲノム動力学、タンパク質合成及びエネルギー過程（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）」、ｐ１９３、コールド・スプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１及び２は植物及び動物要素のコピアクラスに関連し、ＴＹ３は植物及び／又は動物レトロウイルスに関連するレトロトランスポゾンのｇｙｐｓｙファミリーに属する、Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｃａｇ又はカプシドタンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質は４４０アミノ酸長を有する。Ｐ１はＶＬＰの成熟中に４０８位で開裂し、ＶＬＰの必須成分であるｐ２タンパク質となる。
ｐ１への融合タンパク質、及びその融合タンパク質を酵母中で発現するためのベクターが報告されている（アダムス（Ａｄａｍｓ、Ｓ．Ｅ．）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２９：６８−７０（１９８７））。従って、例えばグレリン又はグレリンペプチドをコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位へ挿入することにより、グレリン又はグレリンペプチドをｐ１中へ融合し得る（アダムス（Ａｄａｍｓ、Ｓ．Ｅ．）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２９：６８−７０（１９８７））。外来エピトープをコードする配列をｐＭＡ５６２０ベクター中へクローニングすることにより、Ｃ末端が外来エピトープのＮ−末端に融合した、Ｔｙ１〜１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質が発現する。同様に、グレリン又はグレリンペプチドのＮ−末端融合、又はｐ１配列中への内部挿入、又はｐ１配列の一部の置換も、本発明の範囲内である。具体的には、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０−３１、６７−６８、１１３−１１４及び１３２−１３３の間のＴｙ配列中へのグレリン又はグレリンペプチドの挿入（欧州特許第０６７７１１１号）は、本発明の好ましい実施態様である。
グレリン又はグレリンペプチドの融合に適当な別なＶＬＰは例えばレトロウイルス様粒子（国際公開ＷＯ９６３０５２３）、ＨＩＶ２ Ｇａｇ（カン（Ｋａｎｇ、Ｙ．Ｃ．）ら、バイオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、３８０：３５３−３６４（１９９９））、ササゲモザイクウイルス（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ、Ｋ．Ｍ．）ら、バイオロジカル・ケミストリー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、３８０：３８７−３９２（１９９９））、パルボウイルスＶＰ２ ＶＬＰ（レウダ（Ｒｕｅｄａ、Ｐ．）ら、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２６３：８９−９９（１９９９））及びＨＢｓＡｇ（米国特許第４、７２２、８４０号、欧州特許第００２０４１６（Ｂ１）号）である。
本発明の実施態様に適したキメラＶＬＰの例は、インターヴィロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３９：１（１９９６）に記載のものである。本発明で使用し得ると思われるＶＬＰのその他の例にはＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ ＧＡＧ、タバコモザイク病ウイルス、ＳＶ−４０のウイルス様粒子、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ロタウイルス及びノーウォークウイルスであり、これらＶＬＰのキメラＶＬＰも本発明の範囲内である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基はグレリン又はグレリンペプチドである。
本発明のさらに極めて好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は（ａ）ヒトグレリン、（ｂ）ネコグレリン、（ｃ）イヌグレリン、（ｄ）ウシグレリン、（ｅ）ヒツジグレリン、（ｆ）ウマグレリン、（ｇ）ブタグレリン、（ｈ）任意のグレリン（ａ）〜（ｇ）のペプチド又はそのフラグメントでなる群から選ばれる。
さらに好ましい本発明の実施態様では、抗原又は抗原決定基は以下でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される：
（ａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ （配列番号：４８）
（ｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３１）
（ｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：４９）
（ｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５０）
（ｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３２）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５１）
ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）
ＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５３）
ＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５４）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ（配列番号：５５）
ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）
ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１１）
ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１１２）
ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１３）
ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥ（配列番号：１１４）
ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１５）
ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１１６）
ＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１１７）
（ｓ）ＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱ（配列番号：１１８）
本発明のさらに極めて好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基はそれぞれヒト、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、モルモット、イヌ又はマウスグレリン及びグレリンペプチドである。グレリン及びグレリンペプチドそれぞれは、強いプロモータの制御下にグレリン及びグレリンペプチドそれぞれをコードするＤＮＡの発現で製造される。ＤＮＡがプレプログレリンをコードせず、活性ｎ−オクタノイル修飾ペプチドのペプチド主鎖のみをコードすることが好ましい。従来の様々な実施例が文献に記載され、場合によっては修飾後に任意の所望の種のグレリンを発現するために用いることができる。
本発明のさらに好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基はグレリン由来のペプチド又はそのフラグメントである。グレリンペプチドは（ａ）ヒトグレリンペプチド、（ｂ）ウシグレリンペプチド、（ｃ）ネコグレリンペプチド、（ｄ）イヌグレリンペプチド、（ｅ）ブタグレリンペプチド、（ｆ）ニワトリグレリンペプチド、（ｇ）マウスグレリンペプチド、（ｈ）ウマグレリンペプチド、（ｉ）ヒツジグレリンペプチド、及び（ｊ）任意のグレリンペプチド（ａ）〜（ｉ）のフラグメントでなる群から選ばれることが好ましい。
この様なグレリンペプチド又はそのフラグメントを標準の分子生物学技術を用いて製造することができるが、関心のあるフラグメントをコードするヌクレオチド配列がＰＣＲで増幅され、融合タンパク質としてヒスチジンタグ、フラグタグ、ｍｙｃタグ等のポリペプチドタグ又は抗体の不変領域（Ｆｃ領域）にクローニングされる。グレリンフラグメントとタグ間にエンテロキナーゼ開裂部位を導入することにより、エンテロキナーゼで消化後にグレリンフラグメントをタグから分離することができる。他のアプローチでは、当業者に公知の標準ペプチド合成反応を用いて、ｎ−オクタノイルで修飾、又は修飾せずにグレリンフラグメントを試験管内で合成できる。別なアプローチでは、グレリンフラグメントを全長グレリンのプロテアーゼ消化又は化学開裂で製造することができるが、二つの方法は当業者に公知である。
本発明のさらに好ましい実施態様では、グレリンペプチドは少なくとも一つのグレリンの抗原部位を有する。対応するペプチド及びアミノ酸配それぞれ列は当業者に公知である。好ましいフラグメントにはグレリンのＮ−末端又はＣ末端を含み得る。非修飾型に特異的な抗体の結合を妨害し得るｎ−オクタノイル修飾はＮ−末端に近接しているので、Ｃ末端が特に有用である。
好ましいヒトグレリンペプチドは以下を含む：
ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）
ＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５３）
ＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５４）
ＫＬＱＰＲ（配列番号：５９）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ（配列番号：５５）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（配列番号：６０）；
ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６１）；
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱ（配列番号：６２）；
ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６３）；
ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１１）；
ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１１２）；
ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１３）；
ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥ（配列番号：１１４）；
ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１５）；
ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１１６）；
ＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１１７）；
ＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱ（配列番号：１１８）；
ＧＳＳＦＬＳＰ（配列番号：１１９）、
しかしながら、グレリンの内部部位由来のペプチドもワクチンの魅力的な候補である。様々な種のグレリンが高度に相同性であるので、交差反応性抗体反応を誘導し得ると思われる。従って、イヌ又はマウスグレリンに対する抗体反応もヒトグレリンを認識し得るし、その逆も可能である。従って、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、９７％、さらには９９％のアミノ酸同一性を有する全てのグレリン分子及びそれから誘導されるペプチドをワクチン投与に使用し得る。
ヒトグレリン又はグレリンペプチドの修飾法、特にウイルス様粒子へ結合するための修飾法の手引きは、本出願全体に示される。好ましくはコア粒子及びＶＬＰそれぞれに結合したヒトグレリン又はグレリンペプチドを含む本発明の組成物を用いる、グレリンに対する免疫化は、肥満を処置する方法を提供し得る。
本発明のさらに極めて好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は以下でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されるグレリン又はグレリンペプチドである：

（ａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：
４８）
（ｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：３１）
（ｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（ヒト）（配列番号：６０）
（ｄ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：６１）
（ｅ）ＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：５３）
（ｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（イヌ）（配列番号：４９）
（ｇ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（イヌ）（配列番号：５０）
（ｈ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱ（イヌ）（配列番号：６２）
（ｉ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（イヌ）（配列番号：６３）
（ｋ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（ヒト）（配列番号：５６）
（１）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（マウス）（配列番号：３２）
（ｎ）配列番号：（ａ）〜（ｌ）の任意のフラグメントのアミノ酸配列。
さらに好ましい実施態様では、抗原又は抗原決定基は（ｉ）上記抗原又は抗原決定基を有する天然起源でない付着部位、及び（ｉｉ）上記抗原又は抗原決定基を有する天然起源の付着部位でなる群より選ばれる少なくとも一つの第２付着部位をさらに有する。好ましい実施態様では、上記付着部位は本発明のアミノ酸リンカー、好ましくはＣ、ＣＧ又はＣＧＧのリンカー配列を有する。少なくとも上記付着部位を有する抗原又は抗原決定基は、以下でなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成されることが好ましい：
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：６４）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号： ６５）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（ヒト）（配列番号：６６）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（ヒト）（配列番号： １２０）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（ヒト）（配列番号： ６７）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（ヒト）（配列番号：１２１）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＣ（ヒト）（配列番号：６８）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＧＣ（ヒト）（配列番号：１２２）
ＣＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：６９）
ＣＰＰＡＫＬＱＰＲ（ヒト）（配列番号：７０）
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（イヌ）（配列番号： ７１）
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（イヌ）（配列番号：７２）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（イヌ）（配列番号： ７３）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（イヌ）（配列番号：１２３）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（イヌ）（配列番号：７４）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（イヌ）（配列番号： １２４）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＣ（配列番号：７５）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＧＣ（配列番号：１２５）
ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：７６）
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（マウス）（配列番号：７７）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（マウス）（配列番号： １２６）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（マウス）（配列番号：１２７）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（マウス）（配列番号：１２８）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（マウス）（配列番号：１２９）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＣ（マウス）（配列番号：１３０）
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＧＣ（マウス）（配列番号：１３１）
ＧＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＧＣ（配列番号：１３２）
ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１３３）
ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１３４）
ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３５）
ＣＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１３６）
ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３７）
ＣＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１３８）
任意の配列番号：（ａ）〜（ｅｅ）の任意のフラグメントのアミノ酸配列
極めて好ましいグレリンペプチドのいくつかを実施例１３に記載し、特に対応するマウスペプチドが提供される。これらのペプチドはＶＬＰ及び／又は線毛に結合するための第２付着部位として、Ｎ−末端又はＣ末端システイン残基を有する。これらの極めて好ましい短いペプチドフラグメントは、ＶＬＰ及びコア粒子それぞれと結合した場合、非常に高い免疫原性を持つことができる。従って、好ましいグレリンフラグメントは、より短い標的フラグメントとしての自己タンパク質がＴ細胞エピトープを含む可能性が高い場合、安全性基準を満たすことができる。具体的には、ペプチドが短いほどＴ細胞活性化に関してより安全である。しかしながら、ペプチドが短すぎると、溶液中でグレリンと強く結合し得る親和性の高い抗体を誘発することができない。
主としてグレリンのＮ−末端が知られている全ての種間で同一であるので、残基１〜１０（配列番号：５５）のマウスグレリンフラグメントに対応する極めて好ましいグレリンペプチドフラグメントが選ばれた。さらに、グレリンが同定され得る種間でも、同一である可能性がある。従って、Ｃ末端残基であるグルタミンが溶解性を高め、ＶＬＰ及びコア粒子それぞれに結合した場合、可溶性ワクチン生成物の生産を促進する。事実、ペプチドの溶解度がカップリング効率とワクチンの安定性の制限因子となることが多い。その他の理由には、可能性のあるＴ細胞エピトープを避けることが含まれる。より小さなペプチドフラグメントを選択することにより、Ｔ細胞エピトープが損残知る確率を減少する。マウスグレリン残基１〜１０をＣ末端でＶＬＰに結合することは、活性グレリンを結合し得るマウス中に免疫した場合、Ｎ−末端特異的抗体を誘発すると思われ、従ってそれが血液脳障壁を通過することが防止され、摂食が低下することになる。
残基４２〜５１（配列番号：５２）のマウスグレリンペプチドフラグメントに対応するさらに極めて好ましいグレリンペプチドフラグメントが、上記と同じ理由で選ばれた。唯一の違いは、マウス中に免疫した場合、Ｎ−末端で結合したこのペプチドフラグメントはグレリンのＣ末端部に特異的な抗体を含み得ることである。さらに、セリン３上のｎ−オクタノイル基が避けられ、その妨害を減少させる可能性があるので、抗体認識を竹メルコとができる。マウスグレリン残基４２〜５２をＮ−末端でＶＬＰに結合することは、活性グレリンを中和し得る抗体を誘発し、それが血液脳障壁を通過することを防止し、摂食が低下する。
さらに、残基３１〜４１（配列番号：１１３）及び残基２８〜３７（配列番号：１１７）のマウスグレリンペプチドフラグメントに対応するさらに極めて好ましいグレリンペプチドフラグメントが選ばれ、グレリンの中心セグメントとなる。同様に、これらのグレリンフラグメントはＴ細胞エピトープを回避する可能性があり、同時にセリン３上のｎ−オクタノイル基も避けると考えられる。これらのペプチドをＮ−末端又はＣ末端でＶＬＰに結合することにより、活性グレリンを中和し得る抗体が誘発され、それが血液脳障壁を通過することを防止し、摂食が低下する。
本発明に使用するに適したさらに好ましいグレリンペプチドを、既存の、又は今後調製されるモノクローン又はポリクローン抗体を用いて同定できる。
さらに好ましいグレリン分子、及びその分子由来のペプチドが、配列情報が現在入手できない種で将来発見されると考えられる。
本明細書に記載の他の適当な変更、及びこの方法及び応用への適用は自明であり、本発明の範囲及びその任意の実施態様から逸脱せず実施し得ることは、当業者が理解し得ると考えられる。本発明を詳細に説明したが、同様のことは本明細書に説明のためのみに含まれ、本発明を制限するものでない以下の実施例を参照してより明確に理解し得ると考えられる。
実施例１ 突然変異Ｑβコートタンパク質の構築と発現、及び突然変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ又はカプシドの精製
プラスミド構築と突然変異コートタンパク質のクローニング
ｐＱβ−２４０の構築：
プラスミドｐＱβ１０（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ）、Ｔ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ、１３７：１３３−１３７）をｐＱβ−２４０の構築のための最初のプラスミドとして使用した。Ｌｙｓ１３→Ａｒｇの突然変異体を逆ＰＣＲで作成した。逆プライマーは反転した尾部から尾部方向で設計した：
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3'（配列番号：７８）、及び
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3'（配列番号：７９）
最初のＰＣＲ生成物を、次のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。使用したプライマーは：
上流プライマー：5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'（配列番号：８０）；及び
下流プライマー：5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGC-TGGGTTCAG-3'
（配列番号：８１）
であった。二回目のＰＣＲ生成物をＸｂａｌＩ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクター中へクローニングし、同じ制限酵素で開裂した。ＰＣＲ反応をＰＣＲキット試薬を用い製造業者のプロトコールに従って行った（ＭＢＩフェルメンタス、ビルニウス、リトアニア（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ））。
直接標識組み込み法を用いる配列決定は、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２４０を含む大腸菌により、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動する１４ｋＤタンパク質の効率的な合成が支持された。
得られたアミノ酸配列（配列番号：１７）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰ ＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱ ＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２４３の構築：
プラスミドｐＱβ１０をｐＱβ−２４３の構築のための最初のプラスミドとして使用した。Ａｓｎ１０→Ｌｙｓの突然変異体を逆ＰＣＲで作成した。逆プライマーは反転した尾部から尾部方向で設計した：
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG -3' （配列番号：８２）、及び
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC -3'（配列番号：８３）
最初のＰＣＲ生成物を、次のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。使用したプライマーは：
上流プライマー：5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'（配列番号：８０）；及び
下流プライマー：5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
（配列番号：８１）
であった。二回目のＰＣＲ生成物をＸｂａｌＩ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクター中へクローニングし、同じ制限酵素で開裂した。ＰＣＲ反応をＰＣＲキット試薬を用い製造業者のプロトコールに従って行った（ＭＢＩフェルメンタス、ビルニウス、リトアニア（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ））。
直接標識組み込み法を用いる配列決定は、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２４３を含む大腸菌により、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動する１４ｋＤタンパク質の効率的な合成が支持された。
得られたアミノ酸配列（配列番号：１８）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＫＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰ ＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱ ＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２５０の構築：
プラスミドｐＱβ−２４０をｐＱβ−２５０の構築のための最初のプラスミドとして使用した。Ｌｙｓ２→Ａｒｇの突然変異体を部位指向突然変異誘発で作成した。上流プライマー
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' （配列番号：８４）、及び
及び下流プライマー
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' (配列番号：８５)
を突然変異ＰＣＲフラグメントの合成のために使用し、このフラグメントをユニーク制限部位ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのｐＱβ−１８５発現ベクター中へ導入した。ＰＣＲ反応をＰＣＲキット試薬を用い製造業者のプロトコールに従って行った（ＭＢＩフェルメンタス、ビルニウス、リトアニア（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ））。
直接標識組み込み法を用いる配列決定は、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５０を含む大腸菌により、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質と共にＰＡＧＥ上で泳動する１４ｋＤタンパク質の効率的な合成が支持された。
得られたアミノ酸配列（配列番号：１９）：
ＡＲＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰ
ＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱ
ＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ｐＱβ−２５１の構築：
プラスミドｐＱβ−１０をｐＱβ−２５１の構築のための最初のプラスミドとして使用した。Ｌｙｓ１６→Ａｒｇの突然変異体を逆ＰＣＲで作成した。反転プライマーを反転した尾部から尾部の方向に設計した。
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3'（配列番号：８６）、及び
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC -3'（配列番号：８７）
最初のＰＣＲ生成物をＰＣＲ反応の鋳型として使用した。使用したプライマーは
上流プライマー：5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3'（配列番号：８０）、及び
下流プライマー：5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
（配列番号：８１）
であった。二番目のＰＣＲ生成物をＸｂａＩ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクター中へクローニングし、同じ制限酵素で開裂した。ＰＣＲ反応をＰＣＲキット試薬を用い製造業者のプロトコールに従って行った（ＭＢＩフェルメンタス、ビルニウス、リトアニア（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ））。
直接標識組み込み法を用いる配列決定は、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５１を含む大腸菌により、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動する１４ｋＤタンパク質の効率的な合成が支持された。
得られたアミノ酸配列（配列番号：２０）：
ｐＱβ−２５９の構築：
プラスミドｐＱβ−２５１をｐＱβ−２５９の構築のための最初のプラスミドとして使用した。Ｌｙｓ２→Ａｒｇの突然変異体を部位指向性突然変異誘発で作成した。突然変異ＰＣＲフラグメントの合成のために
上流プライマー：5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3'
（配列番号：８４）、及び
下流プライマー：5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' （配列番号：８５）
を使用し、これらのプライマーをユニーク制限部位ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５倍に導入した。ＰＣＲ反応をＰＣＲキット試薬を用い製造業者のプロトコールに従って行った（ＭＢＩフェルメンタス、ビルニウス、リトアニア（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ））。
直接標識組み込み法を用いる配列決定は、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５９を含む大腸菌により、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動する１４ｋＤタンパク質の効率的な合成が支持された。
得られたアミノ酸配列（配列番号：２１）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰ
ＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱ
ＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
Ｑβ及びＱβ突然変異体の一般的発現及び精製法
発現
大腸菌 ＪＭ１０９をＱβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地にＱβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換したクローンを接種した。接種した培地を振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベーションした。次に調製した接種培地を２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００〜３００ｍｌの新鮮なＬＢ培地で１：１００に希釈し、振盪せずに３７℃で終夜インキュベーションした。得られた二番目の接種培地をフラスコ中で１％カザミノ酸及び０．２％グルコースを含むＭ９培地中で１：５０に希釈し、振盪しながら３７℃で終夜インキュベーションした。
精製
精製工程様用の溶液及び緩衝液
１．溶解緩衝液ＬＢ
５０ｍＭトリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ０．１％
トリトンＸ１００及び新たに調製したＰＭＳＦ濃度／ｍｌ
リゾチーム及びＤＮＡｓｅなし
２．ＳＡＳ
硫酸アンモニウム飽和水溶液
３．緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５ｍＭＥＤＴＡ及び１５０ｍＭＮａＣｌ
４．ＰＥＧ
ＮＥＴ中４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
破壊と溶解
凍結細胞を２ｍｌ／ｇ細胞でＬＢ中に懸濁した。溶液を氷上で冷却するため、１分間の間隔をあけて混合物を２２ｋＨで５回、１５秒間超音波処理した。次にＪａｎｅｋｉＫ６０ローターを用い、溶解液を１４、０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。特に断らない限り、以下に述べる遠心工程を同じローターを用いて行った。上澄液を４℃で保存し、細胞破片をＬＢで２回洗浄した。遠心分離後、溶解液の上澄及び洗浄分画を貯蔵した。
分画
上記貯蔵溶解液を攪拌しながら、飽和硫酸アンモニウム溶液を滴下した。ＳＡＳの容積を全容積の１／５に調節し、２０％飽和とした。溶液を終夜放置し、次の日に１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムで洗浄し、再度遠心分離した。得られた上澄液を貯蔵し、ＳＡＳを滴下して４０％飽和とした。溶液を終夜放置し、次の日に１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液中に溶解した。
クロマトグラフィー
ＮＥＴ緩衝液中に溶解したＶＬＰタンパク質のカプシドをセファロースＣＬ−４Ｂカラムに負荷した。３本のピークがクロマトグラフィー中に溶出した。最初のピークは主として膜と膜フラグメントを含んでおり、採集しなかった。カプシドは二番目のピークに含まれ、三番目のピークはその他の大腸菌タンパク質を含んでいた。
ピーク分画を貯蔵し、ＮａＣｌ濃度を最終濃度０．６５Ｍに調節した。貯蔵したピーク分画の半分に対応する容積のＰＥＧ溶液を攪拌しながら滴下した。溶液を攪拌せずに終夜放置した。１４、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してカプシドタンパク質を沈殿させた。沈殿を最小容積のＮＥＴに溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに再度負荷した。ピーク分画を貯蔵し、６０％飽和（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離とＮＥＴ緩衝液中への再溶解後、再クロマトグラフィーのためにカプシドタンパク質をセファローズＣＬ−６Ｂカラムに負荷した。
透析と乾燥
上記で得たピーク分画を貯蔵し、滅菌水に対して十分に透析し、保存するために凍結乾燥した。
Ｑβ−２４０の発現と精製
細胞（プラスミドｐＱβ−２４０で形質転換した大腸菌 ＪＭ１０９）をＬＢ中に再懸濁し、１５分間、５回超音波処理し（水／氷ジャケット）、１３、０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上澄液をさらに処理するまで４℃ｄで保存し、細胞破片を９ｍｌのＬＢで２回洗浄、最後に９ｍｌの０．７Ｍ尿素／ＬＢで洗浄した。上澄をすべて貯蔵し、セファローズＣＬ−４Ｂカラムに負荷した。貯蔵したピーク分画を硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離した。次に溶解したタンパク質をセファロース２Ｂカラムでさらに精製し、最後にセファロース６Ｂカラムで精製した。カプシドピークを水に対して最後に十分に透析し、上記の様に凍結乾燥した。コートタンパク質のカプシド中への組み込みを電子顕微鏡で確認した。
Ｑβ−２４３の発現と精製
細胞（大腸菌ＲＲ１）をＬＢ中に懸濁し、一般的な手順に記載通りに処理した。タンパク質をセファロースＣＬ−４Ｂによる２回の連続ゲル濾過工程、及び最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製した。ピーク分画を貯蔵し、上記の様に凍結乾燥した。コートタンパク質のカプシド中への組み込みを電子顕微鏡で確認した。
Ｑβ−２５０の発現と精製
細胞（ｐＱβ−２５０で形質転換した大腸菌 ＪＭ１０９）をＬＢ中に懸濁し、上記の様に処理した。タンパク質をセファロースＣＬ−４Ｂカラム、及び最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製し、上記の様に凍結乾燥した。コートタンパク質のカプシド中への組み込みを電子顕微鏡で確認した。
Ｑβ−２５９の発現と精製
細胞（ｐＱβ−２５９で形質転換した大腸菌 ＪＭ１０９）をＬＢ中に懸濁し、超音波処理した。細胞破片を１０ｍｌのＬＢで１回洗浄し、２回目は１０ｍｌの０．７Ｍ尿素／ＬＢで洗浄した。タンパク質をセファロースＣＬ−４Ｂカラムで２回のゲル濾過クロマトグラフィー工程、で精製した。タンパク質を上記の様に透析し凍結乾燥した。コートタンパク質のカプシド中への組み込みを電子顕微鏡で確認した。
実施例２ リジン残基を含むペプチドのＨＢｃＡｇ（１−１４９）のｃ／ｅｌエピトープ中への挿入
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅｌエピトープ（残基７２〜８８）はＢ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面上の先端領域に位置している。この領域の一部（プロリン７９及びアラニン８０）をペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号：３３）で遺伝的に置換し、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓコンストラクト（配列番号：２６）を得た。導入されたリジン残基は、ＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含む任意の抗原との分子間化学架橋に使用できる反応性アミノ基をその側鎖に含む。
配列番号：７８に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ−ＬｙｓをＰＣＲで作成したが、ＨＢｃＡｇフラグメント（アミノ酸残基１〜７８及び８１〜１４９）をコードする二つのフラグメントをＰＣＲで別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用したプライマーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙペプチド（配列番号：３３）をコードするＤＮＡ配列も導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）フラグメントをプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）及びＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を用いてｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）をプライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ及びＨＢｃＡｇ（１〜４９）Ｈｉｎｄを用いてｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）及びＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は相補ＤＮＡ配列を二つのＰＣＲ生成物の末端に導入し、二つのＰＣＲ生成物を次のアセンブリＰＣＲで融合させた。組み込まれたフラグメントを、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）及びＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いてＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲでは、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭのｄＮＴＰ及び２ｍＭのＭｇＳＯ４と共に１００ｐｍｏｌの各オリゴＤＮＡ及び５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した。双方の反応で、温度サイクルは以下の様であった：９４℃２分；９４℃（１分）３０サイクル；５０℃（１分）、７２℃（２分）。
プライマー配列：
ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3'）（配列番号：８８）；
Ｋｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）：
（5'CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3'）
（配列番号：８９）
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）：
(5' GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT GTC -3')
（配列番号：９０）
ＨＢｃＡｇ（１〜４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）：
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3')
（配列番号：９１）
二つのＰＣＲ生成物をＰＣＲで融合するため、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭのｄＮＴＰ及び２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む５０ｍｌの反応混合物中の１００ｎｇの二つの精製得ＰＣＲフラグメントと共に、１００ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）とＨＢｃＡｇ（１〜１４９）を使用した。ＰＣＲサイクル条件：９４℃、２分；９４℃（１分）３０サイクル；５０℃（１分）；７２℃（２分）。組み込んだＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分析、精製しＲｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素により適当な緩衝液中で１９時間消化した。消化したＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨＩＮＤＩＩＩ消化ｐＫＫベクターとライゲートし、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを作成した。ＰＣＲ生成物のベクター中への挿入をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限解析及び挿入物のＤＮＡ配列決定で分析した。
実施例３ ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現と精製
大腸菌株Ｋ８０２及びＪＭ１０９をｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地の接種に、１ｍｌの終夜培養細菌を用いた。６００ｎｍのＯＤが０．８に達するまで、この培養細胞を３７℃で４時間生育した。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ合成の誘導を、最終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを添加して行った。誘導後、細菌を３７℃で４時間さらに振盪した。細菌を５、０００×ｇ、１５分の遠心で収穫した。ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを溶解し、２００ｍＭのリゾチーム及び１０μｌのバンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した細菌溶解緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ツイーン２０、１０ｍＭのＥＤＴＡ）中へ再懸濁した。細胞を３０分間インキュベーションし、超音波処理で破壊した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミド又は制御プラスミドを内蔵する大腸菌細胞をＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現の誘導に用いた。ＩＰＴＧ添加前に、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを含む培養細菌、及び制御プラスミドを含む培養細胞から試料を採取した。ＩＰＴＧの添加から４時間後、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを含む培養細菌、及び制御プラスミドを含む培養細胞から試料を再び採取した。タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシー染色でモニターした。
不溶性の細胞破片を除くため、次に溶解液を１２、０００×ｇで３０分間遠心分離した。抗ＨｂＢｃＡｇモノクローン抗体（ＹＶＳ１８１４、アキュアレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）、ウエストブーリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入）を用い、上澄液とペレットをウエスターンブロッティングで分析し、相当量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることを示した。簡単に言えば、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現する大腸菌細胞由来、及び対照細胞由来の溶解液を１４、０００×ｇで３０分間遠心分離した。上澄液（可溶性分画）とペレット（不溶性分画）を分離し、ＳＤＳ試料緩衝液で等容積に希釈した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ＨＢｃＡｇモノクローン抗体ＹＶＳ１８４１を用いウエスターンブロッティングで分析した。
４ｍｌの６５％スクロース溶液に３ｍｌの１５％スクロース溶液、次いで４ｍｌの細菌溶解液を重層したスクロース段階濃度勾配を用いる段階勾配遠心分離に透明な細胞溶解液を使用した。試料を１００、０００×ｇ、４℃で３時間遠心分離した。遠心後、傾斜の上から１ｍｌの分画を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色で分析した。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質をクーマシー染色で検出した。
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が１５及び６５％スクロース間の界面に濃縮され、カプシド粒子を形成したことを示した。ほとんどの細菌タンパク質は勾配のスクロースのない上層に残り、従ってＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の段階勾配遠心により粒子が濃縮され、部分的に精製された。
ＨＢｃａｇ−Ｌｙｓの大量発現及び精製を以下のように行った。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ中に単一コロニーを接種して終夜培養液を調製し、培養細胞を３７℃で終夜生育させた。翌日、２５ｍｌの前培養液を８００ｍｌのＬＢアンピシリン培地で希釈し、細胞を光学密度（ＯＤ６００）０．６〜０．８に生育させた。次いで培養細胞を１ｍＭＩＰＴＧで誘導し、さらに４時間放置して生育させた。細胞を収穫し、基本的に上記の様に溶解した。
最初にタンパク質を硫酸アンモニウム（３０％飽和）で透明な細胞溶解液から沈殿し、次いで再溶解ペレットをゲル濾過カラム（セファリルＳ−４００、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｉａ））に負荷してＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを精製した。貯蔵した分画を硫酸アンモニウムで再沈殿し、ペレットを再溶解して同じゲル濾過カラムに再度負荷した。分画を最終的に貯蔵し濃縮、ブラフォード試験（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて濃度を分析した。
実施例４ 遊離システイン残基がなく、挿入されたリジン残基を含むＨＢｃＡｇの構築
本明細書でＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔと呼ばれる、配列番号：２５の４８及び１０７に対応する位置にシステインがなく、挿入されたリジン残基を含む肝炎ウイルスコア抗原を、以下の方法を用いて構築した。
以下のＰＣＲプライマーの組み合わせで、上記の実施例２の様に調製した三つのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ遺伝子のフラグメントを最初に別々に増幅して、二つの突然変異を導入した。ＰＣＲ法及び通常のクローニング技術を用いてＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ遺伝子を調製した。
簡単に言えば、以下のプライマーを使用してフラグメント１を調製した：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）、
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG（配列番号：８８）
プライマー２：４８ａｓ、
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC（配列番号：９２）
以下のプライマーを用いてフラグメント２を調製した：
プライマー３：４８ｓ、
GAGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC（配列番号：９３）
プライマー４：１０７ａｓ、
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC（配列番号：９４）
以下のプライマーを用いてフラグメント３を調製した：
プライマー５：ＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓ、
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG（配列番号：９５）
プライマー６：１０７ｓ、
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG （配列番号：９６）
次にプラスミド１及び２をＰＣＲプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）及び１０７ｓと組み合わせてフラグメント４とした。次にフラグメント４及びフラグメント３をＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）及びＨＢｃＡｇ１４９−ｈｉｎｄ−ａｓと組み合わせて全長遺伝子を精製した。次に全長遺伝子をＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化し、同じ制限部位で切断したｐＫＫベクター（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））中へクローニングした。ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの発現と精製を実施例３に示した様に行った。
実施例５ ＨＢｃＡｇ１−１８５−ｌｙｓの構築
肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）１−１８５を実施例２に記載の通りに修飾した。ｃ／ｅｌエピトープの一部（残基７２〜８８）領域（プロリン７９及びアラニン８０）をペプチドＧｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：３３）で遺伝子操作により置換し、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓコンストラクト（配列番号：２６）を得た。導入されたリジン残基は、ＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含む任意の抗原との分子間化学架橋剤のために使用し得る、反応性アミノ基をその側鎖に含む。ＰＣＲ法と通常のクローニング技術を用いてＨＢｃＡｇ１−１８５−ｌｙｓ遺伝子を調製した。
上記実施例２に記載の様に、ＨＢｃＡｇ遺伝子の二つの別々なフラグメントをｐＷｃｏ６３から増幅し、次いで二つのフラグメントをＰＣＲで融合してＧｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列（配列番号：３３）を挿入し、全長遺伝子を組み立てた。以下のＰＣＲプライマーの組み合わせを使用した：
フラグメント１：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号：８８、実施例２参照）
プライマー２：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）（配列番号：８９、実施例２参照）
フラグメント２：
プライマー３：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号：９０、実施例２参照）
プライマー４：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩ
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG （配列番号：９７）
組織体：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号：８８、実施例２参照）
プライマー２：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号：９７）
組み立てられた全長遺伝子をＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化し、同じ制限部位で切断したｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中へクローニングした。
実施例６ ペプチドエピトープのＨＢｃＡｇのＭＩＲ領域中への融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９及び８０を配列ＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧ（配列番号：９８）のエピトープＣεＨ３で置換した。ＣεＨ３配列はヒトＩｇＥの重鎖の第三の不変領域配列に由来する。アセンブリＰＣＲ法を用いてこのエピトープをＨＢｃＡｇ１−１８５配列中へ挿入した。最初のＰＣＲ工程では、ＡＴＣＣクローンｐＥｃｏ６３由来で、プライマーＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ及びＨＢｃＡｇ−ｗｔＨＩＮＤＩＩＩｒｅｖで増幅したＨＢｃＡｇ１−１８５遺伝子を二つの別々な反応の鋳型として使用し、ＣεＨ３配列をコードする配列要素を含む二つのフラグメントを増幅した。これらの二つのフラグメントをアセンブリＰＣＲ反応の二番目のＰＣＲ工程で組み込んだ。
ＰＣＲ第１工程のプライマーの組み合わせ：ＣεＨ３ｆｗｄとＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ、及びＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ及びＣεＨ３ｒｅｖ。アセンブリＰＣＲ反応では、第１ＰＣＲ工程で単離された二つのフラグメントを最初に外部プライマーを使用せず３回のＰＣＲサイクル中に組み込み、外部プライマーを次の２５サイクルのために反応混合物中へその後添加した。外部プライマー：ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ及びＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ。
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてＰＣＲ生成物をｐＫＫ２２３．３中へクローニングし、大腸菌中で発現させた（実施例２参照）。キメラＶＬＰを実施例２に記載の様に大腸菌中で発現させ、精製した。ゲル濾過からＨＢｃＡｇ１−１８５−ＣεＨ３が溶出した溶出容積は、融合タンパク質のキメラＶＬＰ中への組み込みを示した。
プライマー配列：
ＣεＨ３ｆｗｄ：
5' GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3' （配列番号：９９）
V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86（配列番号：１００）
ＣεＨ３ｒｅｖ：
5' ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3' （配列番号：１０１）
配列番号：１０２
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ：
5' CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG（配列番号：１０３）
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ：
5' CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG （配列番号：１０４）
実施例７ グレリンペプチドエピトープのＨＢｃＡｇのＭＩＲ領域中への融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９及び８０を、配列ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）のグレリンペプチドエピトープで置換した。実施例６に記載の戦略を用いて、二つの重複するプライマーを設計し、融合タンパク質をアセンブリＰＣＲで構築した。ＰＣＲ生成物をｐＫＫ２２３．３中にクローニングし、大腸菌 Ｋ８０２中で発現した。キメラＶＬＰを実施例３に記載の様に発現させ、精製した。
実施例８ ＣＰ伸長部の１９位で切断したＱβＡ１タンパク質のＣ末端へのグレリンペプチドエピトープの融合
ＱβＡ１の５’末端にアニーリングするプライマー、及びＡ１遺伝子の３’末端にアニーリングし、配列ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）のグレリンフラグメントをコードする配列要素をさらに有するプライマーを、ｐＱβ１０を鋳型とするＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ生成物をｐＱβ１０へクローニングし（コズロフスカヤ（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，Ｔ．Ｍ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３７：１３３−３７（１９９３））、実施例１に記載の様にキメラＶＬＰを発現させ、精製した。
実施例９ グレリンペプチドエピトープのｆｒコートタンパク質の２位及び３位間への挿入
配列ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）のグレリンペプチドをコードし、Ｂｓｐ１１９Ｉ適合末端とフレーム内挿入を可能にするヌクレオチドを含む相補プライマーをｐＦｒｄ８ベクター中のＢＳＰ１１９Ｉ部位（プシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ、Ｐ．）ら、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．）、６：８８３−９１（１９９３））へ標準の分子生物学技術により挿入した。また、ｐＦｒｄ８ベクターのオーバーハングをＢｓｐ１１９Ｉで消化後にＫｌｅｎｏｗで充填し、マウスグレリンペプチドをコードするオリゴヌクレオチド、及びフレーム内クローニング用の別なヌクレオチドをクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理後にｐＦｒｄ８中にライゲートした。正しい配向で挿入されたクローンを配列決定で分析した。大腸菌 ＪＭ１０９又は大腸菌Ｋ８０２中のキメラ融合タンパク質の発現と精製をプシュコ（Ｐｕｓｈｋｏ、Ｐ．）ら（プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．）、６：８８３−９１（１９９３））の記載通りに行ったが、クロマトグラフィー工程はセファロースＣＬ−４Ｂ又はセファリルＳ−４００（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用した。溶解液を硫酸アンモニウムで沈殿させ、実施例１のＱβで記載と同様に２回の連続ゲル濾過精製工程で精製した。
実施例１０ ベクターｐＯＧＳ８１１１中のＴｙ１タンパク質ｐ１の６７位及び６８位間へのグレリンペプチドエピトープの挿入
ｐＯＧＳ８１１１のＮｈｅＩ部位に適合する末端を有し、ヒトグレリンペプチド配列ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）をコードする相補オリゴヌクレオチドを合成した。欧州特許第０６７７１１１号に従い、別なヌクレオチドを負荷してマウスグレリンエピトープをコードする配列を挿入した。挿入したエピトープを側面するアミノ酸ＡＳ及びＳＳを、ｐＯＧＳ８１１１のＴｙＡ（ｄ）遺伝子中のオリゴヌクレオチドの挿入に由来する修飾ＭｈｅＩ部位でコードする。
ＥＰ０６７７１１１及びその中の参考文献に記載の通り、キメラＴｙ ＶＬＰを発現のため、ＰＯＧＳ８１１１をＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）株ＭＣ２中に形質転換する。欧州特許第０６７７１１１号に記載の様に、キメラＴｙ ＶＬＰをスクロース勾配超遠心で精製する。
実施例１１ グレリンペプチドエピトープの１型パピロマウイルス（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１中への挿入
文献（チャッケリアン（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ、Ｂ．）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ）、９６：２３７３−２３７８（１９９９））に記載の通り、配列ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）を有するグレリンエピトープをコードする配列を、ｐＦａｓｔＢａｃ１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）ベクター中にクローニングされたＢＰＶ−１Ｌ１遺伝子のアミノ酸１３０〜１３６をコードする配列に置換する。コンストラクトの配列をヌクレオチド配列解析で検証する。ＢＩＢＣＯ／ＢＲＬバキュロウイルス系を製造業者の説明通りに使用し、組み換えバキュロウイルスを作成する。キルンバウアー（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ、Ｒ）ら（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ）、８９：１２１８０−８４（１９９２））及びグリーンストーン（Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅ、Ｈ．Ｌ．よら（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ）、９５：１８００−０５（１９９８））の記載通り、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からキメラＶＰＬを精製する。
実施例１２ ＶＬＰに融合したグレリンペプチドによるマウスの免疫化
実施例７、９、１０及び１１で作成した配列ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）のマウスグレリンエピトープを表示するキメラＶＬＰを、実施例１５に記載の通りにマウスの免疫化のために使用する。実施例１４に記載通り、免疫化マウスから得られた血清をグレリン特異的ＥＬＩＳＡで分析する。
ワクチンの効果をマウスの体重増加の追跡と、摂食の測定で調べる。
実施例１３ マウスグレリン及びマウスグレリンペプチドのＱβカプシドタンパク質への結合：グレリンペプチドワクチン
ＶＬＰ及び線毛へ結合するための付加Ｎ−末端及びＣ末端システイン残基を有し、以下に記載の様にＱβへの化学結合のために使用する以下のグレリンペプチドを化学合成する：
ｃＧｒｅｌ：
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７７）
ＣＧｒｅｌ：
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（配列番号：１０５）
ｃＧｈｒＱ１４：
ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰR（配列番号：１０６）
ＧｈｒＱ１４Ｃ：
ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ（配列番号：１０７）
Ｇｈｒｅｌ２４−３３Ｃ：
ＧＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＧＣ（配列番号：１３２）
ｃＧｈｒｅｌ４２−５１：
ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１３３）
ｃＧｈｒｅｌ３１−４０：
ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１３４）
ｃＧｈｒｅｌ３１−４１：
ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１４５）
ｃＧｈｒｅｌ２８−３７：
ＣＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１３６）
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の５ｍｌの１４０μＭ Ｑβカプシドタンパク質溶液を、Ｈ２Ｏ中のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）の６５ｍＭ溶液１８０ｍｌと振動シェーカー上で３０分間反応させる。次に反応溶液を２回、５Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間透析した。次に１００μｌの透析反応混合物を、グレリンペプチドの２８．６μｌの１０ｍＭ保存溶液（ＤＭＳＯ中；ペプチド／Ｑβカプシドタンパク質比１：１０）と反応させる。カップリング反応を水浴中、１５℃で２時間行う。次に反応混合物を５Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対し２回、４℃で２４時間透析する。
結合した生成物を遠心分離し、上澄液とペレットを還元条件下に１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色する。
グレリンペプチドのｆｒカプシドへの結合
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の１２０ｍＭのｆｒカプシドタンパク質溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃で３０分間、振動シェーカー上で反応させる。次に反応溶液を１Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間、２回透析する。次に透析したｆｒ反応混合物を等モル濃度のグレリンペプチドと、又は１：２のグレリンペプチド／ｆｒ比で終夜、１６℃で振動シェーカー上で反応させる。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
グレリンプチドのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔへの結合
２０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液を希釈した１０倍モル過剰のＡＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と２５℃で振動シェーカー上で反応する。次に反応溶液を１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間、２回透析する。透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−ｃｙｓ−Ｍｕｔの反応混合物を等モル濃度のグレリンペプチドと、又はグレリンペプチド／ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−ｃｙｓ−Ｍｕｔ比１：２、１６℃で振動シェーカー上で終夜反応する。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
グレリンペプチドの線毛への結合
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２中の１２５μＭの大腸菌 １型線毛溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル過剰の架橋剤ＡＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で振動シェーカー上で反応する。反応混合物をＰＤ−１０カラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））上で脱塩する。絡むから溶出するタンパク質含有分画を貯蔵し、脱塩した線毛タンパク質誘導体を等モルのグレリンペプチドと、又はペプチド／線毛比１：２で振動シェーカー上、１６℃で終夜反応する。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
実施例１４ マウスのＶＬＰ−グレリンペプチド複合体による免疫化
Ｑβに結合したグレリンペプチドによるマウスの免疫化
実施例１３に列記した、Ｑβに結合し、明礬と混合し、ＩＦＡ中に乳化した、又はアジュバントを含まないマウスグレリンペプチドで雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化する。第０日、１４日及び２９日に５０μｇを皮下注射する。免疫化後、第１４、２１、２８、４２日に、その後毎月、眼窩後部から採血する。血清をグレリンタンパク質特異的ＥＬＩＳＡで分析する。
明確に理解するために図面と実施例により本発明をある程度詳細に説明したが、条件、処方及びその他のパラメーターを修正又は変更して、本発明の範囲又はその任意の特定の実施態様に影響せず同じことを行うことが可能で、この様な修正も付属するクレームの範囲内であることは、当業者に自明であると考えられる。
本明細書に述べた全ての出版物及び特許出願は、本発明が関連する当業者の技術レベルを示すものであり、各個別の出版物、特許及び特許出願が具体的かつ個々に本明細書に引用して援用すると同様に、その全文を本明細書に引用して援用する。
実施例１５ Ｃ−グレリン及びグレリン−ＧＣのＱβカプシドタンパク質への結合
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の２．０ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質溶液を１１４。４μｌのＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液（ＤＭＳＯ中に溶解した５０ｍＭの保存溶液から調製）と２５℃で反応した。次に反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間、２回透析した。
次に透析し誘導化したＱβ ＶＬＰをマウスＣ−グレリン（配列番号：７７）又はマウスグレリン−ＧＣペプチド（配列番号：１０５）と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中で１５℃で２時間反応させた。カップリング反応を複数回行ったが、その場合、１ｍｌの誘導化Ｑβ ＶＬＰ（濃度２ｍｇ／ｍｌ）を２８６μｌの１０ｍＭペプチド溶液と反応させた。カップリング反応に１０％アセトニトリルを加えた。反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間、１回透析した。
カップリング生成物を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図１に示す。カップリング生成物がクーマシー染色ゲル上で検出され、Ｇグレリン又はグレリン−ＧＣとＱβカプシドとの共有結合を明らかに示した。サブユニット当たり１個、２個、３個又は４個のペプチドに対応するカップリングバンドが矢印で示される。
図１はＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣとＱβカプシドとのカップリング生成物を示す。レーン２及び４はそれぞれ、Ｑβ−Ｃ−グレリン及びグレリン−ＧＣ−Ｑβの可溶性分画中のカップリング生成物を示す。不溶性分画中の生成物は極めて少ない。
実施例１６ カプシドタンパク質に結合したＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣによるマウスの免疫化
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ当たり５匹）をＱβカプシドタンパク質に結合したＣ−グレリン（配列番号：７７）又はグレリン−ＧＣ（配列番号：１０５）で免疫化した。各試料由来の透析ワクチン５０μｇのをＰＢＳ中で２００ｍｌの容積に希釈し、第０、１４及び４２日に皮下注射（腹部２個所に１００μｌ）した。アジュバントなしでワクチンを投与した。対照として、マウスの１グループをＰＢＳで免疫化した。第０、１４、２１及び４２日目にマウスの眼窩後部から採血し、血清をグレリン特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析した（実施例１７に概説）。さらに、実験期間中、マウスの体重と食物消費を一定間隔でモニターした（実施例１８に概説）。
実施例１７ ＥＬＩＳＡ中のグレリン特異的抗体の検出
ＥＬＩＳＡプレートを濃度２０μｇ／ｍｌのセリン−オクタニル化グレリン（Ｂａｃｈｅｍ、製品番号Ｈ−４８６２）で被覆したプレートを保護し、第１４、２１及び４２日の逐次希釈マウス血清と共にインキュベーションした。結合した抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、同じマウスの免疫前血清も試験した（図２）。
Ｑβ−Ｃ−グレリン又はグレリン−ＣＧ−Ｑβで免疫化したマウスで、第２１日の平均力価はそれぞれ１３、０００及び８、０００に達した（図２）。免疫前血清及びＰＢＳで免疫化したマウスの血清はグレリンと反応しなかった。このことは、グレリン−ＶＬＰ複合体が、たとえそれが自己タンパク質であっても、グレリンに対して高い力価を誘導し得ることを明らかに示している。
実施例１８ Ｑβカプシドタンパク質と結合したＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣによる効力実験
実施例１６に記載の様に、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ当たり５匹）をＱβカプシドタンパク質と結合したマウスＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣで免疫化した。対照として、マウスをＰＢＳで免疫化した。第０〜１４日の間、全てのマウスに通常の食餌を与えた。次に、食餌誘発肥満の発症を促すため、全てのマウスに高脂質食（４５％）を与えた。食物と水を随意に与えた。免疫化後に一定間隔（第５、１１、１４、２１、２８、３５、４０、４９及び５５日）で、各マウスの体重変化、及び食物及び水の消費量を各ケージ毎にモニターした（図３参照）。
マウスＱβ−Ｃ−グレリン又はマウスグレリン−ＣＧ−Ｑβで免疫化したマウスでは、ＰＢＳで免疫化した対照マウスと比較して、平均約３０〜４０％の摂食の減少が見られた。このことは、グレリン−ＶＬＰ複合体が食欲を抑え食物消費を減少することを明らかに示している。
実施例１９ 肥満の動物モデルにおけるＱβカプシドタンパク質と結合したＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣによる効力実験
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ当たり５匹）をＱβカプシドタンパク質と結合したマウスＣ−グレリン又はグレリン−ＧＣで免疫化する。対照マウスをＰＢＳ又はＱβ ＶＬＰ単独で免疫化する。５０μｇの透析ワクチン又は対照タンパク質を２００ｍｌ容積のＰＢＳ中に希釈し、第０日に明礬を使用、又は使用せずに皮下注射する（腹部２個所に１００μｌ）。マウスを第１４、２８及び４２日に対応する製剤で追加免疫化する。
第０、１４、２１、４２、５６およい７０日に、その後毎月、マウスの眼窩後部から採血する。実施例１７に記載の様に、血清のグレリン特異的抗体をグレリン特異的ＥＬＩＳＡで分析する。事件期間中にグレリン特異的抗体力価がかなり減少した場合、マウスを追加免疫化する。実施例１８に記載の通り、随意の条件、及び体重増加を追跡して、食物消費を測定してワクチンの効果を調べる。
実施例２０ ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子のクローニング
逆転写ＰＣＲ技術と、配列決定用の市販プラスミドｐＣＲ ４−ＴＯＰＯを用いて、ＡＰ２０５コートタンパク質（ＣＰ）のｃＤＮＡをファージＡＰ２０５ ＲＮＡから作成した二つのｃＤＮＡから組立てた。逆転写技術は公知である。プラスミドｐ２０５−２４６に含まれる第１フラグメントはＣＰ配列の上流に２６９個のヌクレオチド、及びＣＰの最初の２４個のＮ−末端アミノ酸をコードする７４個のヌクレオチドを含んでいた。プラスミドｐ２０５−２６２に含まれる第二フラグメントは、ＣＰのアミノ酸１２〜１３１をコードする３６４個のヌクレオチド、及びＣＰ配列の下流にさらに１６２個のヌクレオチドを含んでいた。ｐ２０５−２４６及びｐ２０５−２６１は共にＪ．Ｋｌｏｖｉｎｓから提供された。
二つのＣＰフラグメントｐ２０５−２４６及びｐ２０５−２６２を一つの全長ＣＰ配列に融合するため、プラスミド２８３．−５８を２工程ＰＣＲで消化した。
プラスミドｐＱｂ１８５中へクローニングするためのＮｃｏＩ部位を含む上流プライマーｐ１．４４、又はプラスミドｐＱｂ１０中へクローニングするためのＸｂａＩ部位を含む−１．４５、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む下流プライマーｐ１．４６を使用した（制限酵素の認識部位に下線）。
ｐ１．４４：5'-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3'（配列番号：１３９）
ｐ１．４５：5'-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3'（配列番号：１４０）
ｐ１．４６：5'-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3' （配列番号：１４１）
ｐ２０５−２６２に含まれるフラグメントの５’末端にアニールするｐ１．４７、及びｐ２０５−２４６に含まれるフラグメントの３’末端にアニールするｐ１．４８の二つのプラスミドを最初のＰＣＲでフラグメントを増幅するために用いた。プライマーｐ１．４７とｐ１．４８は相互に相補性である。
ｐ１．４７：5'-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTG-3' （配列番号：１４２）
ｐ１．４８：5'-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGAGTTGGATCACTC-3'（配列番号：１４３）
最初の二つのＰＣＲ反応では、二つのフラグメントが生成した。最初のフラグメントはプライマーｐ１．４５及びｐ１．４８、及び鋳型ｐ２０５−２４６で生成した。二番目のフラグメントはプライマーｐ１．４７及びｐ１．４６、及び鋳型ｐ２０５−２６２で生成した。二つのフラグメントをプライマーの組み合わせｐ１．４５とｐ１．４６、及びｐ１．４４とｐ１．４６による第二ＰＣＲ反応であるスプライス重複伸長の鋳型として使用した。二つの第二工程ＰＣＲ反応の生成物をＸｂａＩ又はＮｃｏＩそれぞれ、及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限部位でｐＱｂ１０又はｐＱｂ１８５中にそれぞれクローニングし、大腸菌トリプトファンオペロンプロモーターの制御下にある二つのｐＧＥＭ由来発現ベクターとした。
ｐＱｂ１０中のＡＰ２０５ＣＰ（配列番号：２８）を含むｐＡＰ２８３−５８（配列番号：２７）、及びｐＱｂ１８５中の突然変異Ｐｒｏ５→Ｔｈｒ（配列番号：２９）を有するｐＡＰ２８１−３２（配列番号：３０）の二つのプラスミドが得られた。コートタンパク質の配列をＤＮＡ配列決定で検証した。ｐＡＰ２８３−５８はＣＰのＡＴＧコドンの上流、ＸｂａＩ部位の下流に４９個のヌクレオチドを含み、コートタンパク質ｍＲＮＡに対する推定初期結合部位を含む。
実施例２１ 組み換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現と精製
Ａ． 組み換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現
大腸菌 ＪＭ１０９をプラスミドｐＡＰ２８３−５８で形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に単一コロニーを接種し、振盪せずに３７℃で１６〜２４時間インキュベーションした。
調製した接種培地を２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００〜３００ｍｌのＬＢ培地中に１：１００で希釈し、振盪せずに３７℃で終夜インキュベーションした。得られた二番目の接種倍溶液を０．２％グルコースと緩衝のための燐酸塩を含む２ＴＹ培地中で１：５０に希釈し、シェーカー上で３７℃で終夜インキュベーションした。細胞を遠心分離で収穫し、−８０℃で凍結した。
Ｂ． 組み換えＡＰ２０５ ＶＬＰの精製
溶液及び緩衝液：
溶解緩衝液
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ１００、及びｍｌあたり５μｇのＰＭＳＦ
ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水
ＮＥＴ緩衝液
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５ｍＭＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ
ＰＥＧ
ＮＥＴ中４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
溶解：
凍結細胞を２ｍｇ／細胞で溶解緩衝液中に再懸濁した。混合物を５回、１５秒間、溶液を冷却するために氷上で１分間の間隔を置き２ｋＨで超音波処理した。Ｆ３４−６−３８ローター（Ｅｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて溶解液を１２、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。特に断らない限り、以下に記す遠心工程は全て同じローターを用いて行った。上澄液を４℃で保存し、細胞破片を溶解緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、溶解液の上澄液と洗浄分画を貯蔵した。
ＡＰ２０５ ＶＬＰを精製するため、硫酸アンモニウム沈殿をさらに用る。最初の工程で、ＡＰ２０５ ＶＬＰが沈殿しない硫酸アンモニウム濃度を選ぶ。次の工程で、ＡＰ２０５ ＶＬＰが選択的に沈殿する濃度を選び、この沈殿工程からのペレットからＡＰ２０５ ＶＬＰ遠心分離（１４、０００ｒｐｍ、３０分）で単離する。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液中に溶解する。
クロマトグラフィー：
貯蔵した上澄液からのカプシドタンパク質をセファロース４Ｂカラム（２．８×７０ｃｍ）に負荷し、４ｍｌ／時間／分画でＮＥＴ緩衝液で溶出した。分画２８〜４０を集め、６０％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿した。沈殿前に分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡＰ２０５特異的抗血清によるウエスターンブロットで分析した。遠心で単離したペレットをＮＥＴ緩衝液に再溶解し、セファロース２Ｂカラム（２．３×６５ｃｍ）に付加、３ｍｌ／時間／分画で溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、分画５５〜５０を集め、貯蔵し、６０％法亜硫酸アンモニウムで沈殿した。遠心分離で単離したペレットをＮＥＴ緩衝液中に再溶解し、セファロース６Ｂカラム（２．５×４７ｃｍ）で精製、３ｍｌ／時間／分画で溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。分画２３〜３７を集め、塩濃度を０．５Ｍに調節し、４０％貯蔵液から最終濃度１３．３％にしたＰＥＧ６０００を加えて沈殿した。遠心分離で単離したペレットをＮＥＴ緩衝液に再溶解し、上記と同じセファロース２Ｂカラムに負荷し、同様に溶出した。分画４３〜５３を集め、６０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿した。遠心分離で単離したペレットを水に再溶解し、得られたタンパク質溶液を水に対し十分に透析した。細胞グラム当たり約１０ｍｇの精製タンパク質を単離することができた。
ウイルス様粒子の電子顕微鏡検査により、それらの粒子がファージ粒子と同じであることが分かった。
明確に理解するための図面と実施例により本発明をある程度詳細に説明してきたが、本発明の範囲又はその特定の実施態様に影響せず、条件、製剤及びその他のパラメーターの広く等価の範囲内で本発明を修正又は変更して同じ事を行い得ること、及びこのような修正又は変更が付属のクレームの範囲内に含まれることを意図することは、当業者に自明であると考えられる。
本明細書に述べた全ての出版物及び特許出願は、本発明が関連する当業者の技術レベルを示すものであり、各個別の出版物、特許及び特許出願が具体的かつ個々に本明細書に引用して援用すると同様に、その全文を本明細書に引用して援用する。
図１はマウスＣ−グレリン（配列番号：７７）又はグレリン−ＧＣ（配列番号：１０５）とＱβカプシドタンパク質との反応由来のカップリング生成物を示す。レーンＭはマーカーであり、レーン１はＱβ ＶＬＰ誘導体を示し、レーン２は可溶性分画中のＱβ−Ｃ−グレリン、レーン３は可溶性分画中のＱβ−Ｃ−グレリンを示し、レーン４は可溶性分画中のグレリン−ＧＣ−Ｑβを示し、レーン５は不溶性分画中のグレリン−ＧＣ−Ｑβを示す。不溶性分画中の生成物はほとんどない。 図２はマウスＱβ−Ｃ−グレリン（Ｑｂ−ｃＧｈｒ）、マウスグレリン−ＧＣ−Ｑβ（Ｑｂ−ＧｈｒＣ）又はＰＢＳで第０、１４、２１及び４２日に免疫された、マウス由来のプールされた血清中で検出されたグレリン特異的ＩｇＧの平均力価を示す。ＥＬＩＳＡ力価はＥＬＩＳＡ分析で最大値の半分のＯＤを示す血清希釈液で表される。ＥＬＩＳＡプレートを２０μｇ／ｍｌの濃度のセリンオクタノイル化マウスグレリン（Ｂａｃｈｅｍ、製品番号Ｈ−４８６２）で被覆した。プレートをブロックし、第１４、２１及び４２日の段階希釈マウス血清と共にインキュベーションした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、同じマウスの予備免疫血清も試験した。 図３はマウスＱβ−Ｃ−グレリン（Ｑｂ−ｃＧｈｒ）、マウスグレリン−ＧＣ−Ｑβ（Ｑｂ−ＧｈｒＣ）又はＰＢＳで免疫したマウスの累積食物消費量を示す。対照としてマウスをＰＢＳで免疫した。第０日〜第１４日の間、全てのマウスに通常の餌を与えた。食事誘発肥満の発症を促進するため、全てのマウスに高脂肪（４５％）食を与えた。食べ物と水を随意に投与した。各マウスの体重変化と食物及び水の消費も、免疫後の一定間隔（免疫後第５、１１、１４、２１、２８、３５、４０、４９及び／又は５５日）にケージ（即ち群）毎に追跡した。

Claims (50)

  1. （ａ）少なくとも一つの第１付着部位を有するコア粒子と；
    （ｂ）少なくとも一つの第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原または抗原決定基とを有する組成物であって、
    前記抗原または抗原決定基がグレリンまたはグレリンペプチドであり、前記第２付着部位が
    （ｉ）前記抗原または抗原決定基を有し天然には生じない付着部位、及び
    （ｉｉ）前記抗原または抗原決定基を有し天然に生じる付着部位と
    でなる群より選ばれ：
    前記第２付着部位が前記第１付着部と会合可能であり；前記グレリンまたはグレリンペプチドと前記コア粒子とが前記相互作用により会合し、規則的な繰り返し抗原アレイを生成する組成物。
  2. 前記コア粒子が
    （ｉ）ウイルス、
    （ｉｉ）ウイルス様粒子、
    （ｉｉｉ）バクテリオファージ、
    （ｉｖ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子、
    （ｖ）細菌線毛、
    （ｖｉ）ウイルスカプシド粒子、及び
    （ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉ）の組み換え体
    からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記コア粒子がウイルス様粒子を含むか、好ましくはウイルス様粒子であり、前記ウイルス様粒子が好ましくは組み換えウイルス様粒子である請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ウイルス様粒子が：
    （ａ）Ｂ型肝炎ウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｂ）麻疹ウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｃ）シンドビスウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｄ）ロタウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｅ）口蹄疫ウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｆ）レトロウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｇ）ノーウォークウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｈ）アルファウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｉ）ヒトパピローマウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｊ）ポリオーマウイルスの組み換えタンパク質、
    （ｋ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
    （ｌ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
    （ｍ）Ｔｙの組み換えタンパク質、
    （ｎ）Ｑβファージの組み換えタンパク質、
    （ｏ）ＧＡファージの組み換えタンパク質、
    （ｐ）ｆｒファージの組み換えタンパク質、
    （ｑ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、及び
    （ｑ）（ａ）〜（ｑ）の任意の組み換えタンパク質のフラグメントと、
    でなる群から選ばれた組み換えタンパク質またはそのフラグメントを有する請求項２又は３の何れか１項に記載の組成物。
  5. 前記ウイルス様粒子がＢ型肝炎ウイルスコア抗原である請求項２又は３の何れか１項に記載の組成物。
  6. 前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有するか、それらによって構成される請求項２又は３の何れか１項に記載の組成物。
  7. 前記ＲＮＡファージが：
    （ａ）バクテリオファージＱβ、
    （ｂ）バクテリオファージＲ１７、
    （ｃ）バクテリオファージｆｒ、
    （ｄ）バクテリオファージＧＡ、
    （ｅ）バクテリオファージＳＰ、
    （ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
    （ｇ）バクテリオファージＭ１１、
    （ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
    （ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
    （ｋ）バクテリオファージｆ２、
    （ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び
    （ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
    でなる群から選ばれる請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有するか、それらによって構成される請求項２及び３の何れか１項に記載の組成物。
  9. 前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージｆｒの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有するか、それらによって構成される請求項２及び３の何れか１項に記載の組成物。
  10. 前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有するか、それらによって構成される請求項２及び３の何れか１項に記載の組成物。
  11. 組み換えタンパク質がＲＮＡファージコートタンパク質を有するか、基本的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される請求項３〜１０の何れか１項に記載の組成物。
  12. ＲＮＡファージの前記コートタンパク質が：
    （ａ）配列番号：４と；
    （ｂ）配列番号：４と配列番号：５との混合物と；
    （ｃ）配列番号：６と；
    （ｄ）配列番号：７と；
    （ｅ）配列番号：８と；
    （ｆ）配列番号：９と；
    （ｇ）配列番号：９と配列番号：１０の混合物と；
    （ｈ）配列番号：１１と；
    （ｉ）配列番号：１２と；
    （ｋ）配列番号：１３と；
    （ｌ）配列番号：１４と；
    （ｍ）配列番号：１５と；
    （ｎ）配列番号：１６と；
    （ｏ）配列番号：２８と、
    でなる群から選ばれる請求項１１に記載の組成物。
  13. 組み換えタンパク質がＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質を有するか、基本的にそれらによって構成されるか、又はそれらによって構成される請求項３〜１０の任意の１項に記載の組成物。
  14. 前記ＲＮＡファージが：
    （ａ）バクテリオファージＱβと；
    （ｂ）バクテリオファージＲ１７と；
    （ｃ）バクテリオファージｆｒと；
    （ｄ）バクテリオファージＧＡと；
    （ｅ）バクテリオファージＳＰと；
    （ｆ）バクテリオファージＭＳ２と；
    （ｇ）バクテリオファージＭ１１と；
    （ｈ）バクテリオファージＭＸ１と；
    （ｉ）バクテリオファージＮＬ９５と；
    （ｋ）バクテリオファージｆ２と；
    （ｌ）バクテリオファージＰＰ７と；
    （ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５と、
    でなる群から選ばれる請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記ＲＮＡファージの前記突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも一つのリジン残基の除去により修飾されている、請求項１３及び１４に記載の組成物。
  16. 前記ＲＮＡファージの前記突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも一つのリジン残基の付加により修飾されている、請求項１３及び１４に記載の組成物。
  17. 前記ＲＮＡファージの前記突然変異コートタンパク質が、少なくとも一つのリジン残基の欠失により修飾されている、請求項１３及び１４に記載の組成物。
  18. 前記ＲＮＡファージの前記突然変異コートタンパク質が、挿入による少なくとも一つのリジン残基の付加により修飾されている、請求項１３及び１４に記載の組成物。
  19. 前記第２付着部位が少なくとも一つの共有結合により前記第１付着部と会合し得る、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  20. 前記第２付着部位が少なくとも一つの非ペプチド結合により前記第１付着部と会合し得る、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  21. 前記グレリン又はグレリンペプチドが前記コア粒子に融合される、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  22. 前記抗原又は抗原決定基が：
    （ａ）ヒトグレリンと；
    （ｂ）ウシグレリンと；
    （ｃ）ヒツジグレリンと；
    （ｄ）イヌグレリンと；
    （ｅ）ネコグレリンと；
    （ｆ）マウスグレリンと；
    （ｇ）ブタグレリンと；
    （ｈ）ウマグレリンと；
    （ｋ）（ａ）〜（ｈ）の任意のグレリンのペプチド又はそのフラグメント、
    でなる群より選ばれるグレリンである、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  23. 前記抗原又は抗原決定基が：
    （ａ）ヒトグレリンペプチドと；
    （ｂ）ウシグレリンペプチドと；
    （ｃ）ヒツジグレリンペプチドと；
    （ｄ）イヌグレリンペプチドと；
    （ｅ）ネコグレリンペプチドと；
    （ｆ）マウスグレリンペプチドと；
    （ｇ）ブタグレリンペプチドと；
    （ｈ）ウマグレリンペプチドと；
    （ｋ）（ａ）〜（ｈ）の任意のグレリンのペプチド又はそのフラグメント、
    でなる群より選ばれるグレリンペプチドである、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  24. 前記抗原又は抗原決定基がグレリンペプチド、好ましくはヒトグレリンペプチド又はイヌグレリンペプチドである、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  25. 前記グレリン又はグレリンペプチドが；
    （ａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：４８）；
    （ｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：３１）；
    （ｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：４９）；
    （ｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：５０）；
    （ｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：３２）；
    （ｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：５１）；
    （ｇ）ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）；
    （ｈ）ＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５３）；
    （ｉ）ＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５４）；
    （ｊ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ（配列番号：５５）；
    （ｋ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）；
    （ｌ）ＫＬＱＰＲ（配列番号：５９）；
    （ｍ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（配列番号：６０）；
    （ｎ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６１）；
    （ｏ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱ（配列番号：６２）；
    （ｐ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６３）；
    （ｑ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１１）；
    （ｒ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１１２）；
    （ｓ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１３）；
    （ｔ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥ（配列番号：１１４）；
    （ｕ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１５）；
    （ｖ）ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１１６）；
    （ｗ）ＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１１７）；
    （ｘ）ＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱ（配列番号１１８）；
    （ｙ）ＧＳＳＦＬＳＰ（配列番号：１１９）、
    でなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、好ましくは有する組成物。
  26. 抗原又は抗原決定基がグレリンの抗原決定基部位を少なくとも一つ有する、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  27. 前記組成物はアミノ酸リンカーをさらに有し、該アミノ酸リンカーは該第２付着部位を有するか、該付着部位によって構成される、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  28. 前記第２付着部位又は前記第２付着部位を有するアミノ酸リンカーはそのＣ末端、又はＮ末端で前記グレリン又はグレリンペプチドと結合する、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  29. 前記第２付着部位又は第２付着部位を有する前記アミン酸リンカーは：
    （ａ）ＧＧＣと；
    （ｂ）ＧＧＣ−ＣＯＮＨ２と；
    （ｃ）ＧＣと；
    （ｄ）ＧＣ−ＣＯＮＨ２と；
    （ｅ）Ｃと；
    （ｆ）Ｃ−ＣＯＮＨ２と、
    でなる群より選ばれる、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  30. 前記少なくとも一つの第２付着部位を有する前記グレリン又はグレリンペプチドは：
    （ａ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：６４）；
    （ｂ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：６５）；
    （ｃ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：７１）；
    （ｄ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：７２）；
    （ｅ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：７７）；
    （ｆ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：１０６）；
    （ｇ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：６６）；
    （ｈ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２０）；
    （ｉ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：６７）；
    （ｊ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２１）；
    （ｋ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：７３）；
    （ｌ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２３）；
    （ｍ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：７４）；
    （ｎ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２４）；
    （ｏ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１０５）；
    （ｐ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１０７）；
    （ｑ）ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１０８）；
    （ｒ）ＣＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７０）；
    （ｓ）ＣＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１０９）；
    （ｔ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＣ（配列番号：１１０）；
    （ｕ）ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：７６）；
    （ｖ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＣ（配列番号：６８）；
    （ｗ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＧＣ（配列番号：１２２）；
    （ｘ）ＣＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６９）；
    （ｙ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＣ（配列番号：７５）；
    （ｚ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＧＣ（配列番号：１２５）；
    （ａａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１２６）；
    （ｂｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２７）；
    （ｃｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１２８）；
    （ｄｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２９）；
    （ｅｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＣ（配列番号：１３０）；
    （ｆｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＧＣ（配列番号：１３１）；
    （ｇｇ）ＧＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＧＣ（配列番号：１３２）；
    （ｈｈ）ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１３３）；
    （ｉｉ）ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１３４）；
    （ｊｊ）ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３５）；
    （ｋｋ）ＣＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１３６）；
    （ｌｌ）ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３７）；
    （ｍｍ）ＣＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１３８）；
    でなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するか、好ましくはそのアミノ酸配列によって構成される、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  31. 前記抗原又は抗原決定基が、ｎ−オクタノイル修飾を含まないグレリン、又は好ましくはグレリンぺプチドの生物不活性型である、先行する任意の請求項に記載の組成物。
  32. （ａ）請求項１記載の組成物と；
    （ｂ）許容し得る医薬担体と、
    を有することを特徴とする医薬組成物。
  33. アジュバントをさらに含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. ワクチン組成物がアジュバントを欠いている、請求項３２又は３３に記載の医薬組成物。
  35. 先行する任意の請求項に記載の組成物を有する、請求項３５に記載のワクチン組成物。
  36. アジュバントをさらに含む、請求項３５に記載のワクチン組成物。
  37. 前記ワクチン組成物がアジュバントを含まない、請求項３５又は３６の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  38. 前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質又はそのフラグメントを有する、請求項３５〜３７の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  39. 前記グレリン又はグレリンペプチドが：
    （ａ）ヒトグレリンと；
    （ｂ）ウシグレリンと；
    （ｃ）ヒツジグレリンと；
    （ｄ）イヌグレリンと；
    （ｅ）ネコグレリンと；
    （ｆ）マウスグレリンと；
    （ｇ）ブタグレリンと；
    （ｈ）ウマグレリンと；
    （ｋ）任意のグレリン（ａ）〜（ｈ）のペプチド又はそのフラグメントと、
    でなる群より選ばれる、請求項３５〜３８の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  40. 前記グレリン又はグレリンペプチドが：
    （ａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：４８）；
    （ｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：３１）；
    （ｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：４９）；
    （ｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：５０）；
    （ｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：３２）；及び
    （ｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
    （配列番号：５１）；
    （ｇ）ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）；
    （ｈ）ＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５３）；
    （ｉ）ＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５４）；
    （ｊ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ（配列番号：５５）；
    （ｋ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）；
    （ｌ）ＫＬＱＰＲ（配列番号：５９）；
    （ｍ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（配列番号：６０）；
    （ｎ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６１）；
    （ｏ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（配列番号：６２）；
    （ｐ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６３）；
    （ｑ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１１）；
    （ｒ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１１２）；
    （ｓ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１３）；
    （ｔ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥ（配列番号：１１４）；
    （ｕ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１５）；
    （ｖ）ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１１６）；
    （ｗ）ＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１１７）；
    （ｘ）ＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱ （配列番号：１１８）；及び
    （ｙ）ＧＳＳＦＬＳＰ（配列番号：１１９）
    でなる群より選ばれたアミノ酸配列を含む、好ましくは有する、請求項３５〜３９の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  41. 前記抗原又は抗原決定基が：
    （ａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ （配列番号：４８）
    （ｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３１）
    （ｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：４９）
    （ｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５０）
    （ｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：３２）
    （ｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５１）
    （ｇ）ＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５２）
    （ｈ）ＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５３）
    （ｉ）ＡＫＬＱＰＲ（配列番号：５４）
    （ｊ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱ（配列番号：５５）
    （ｋ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：５６）
    （１）ＫＬＱＰＲ（配列番号：５９）
    （ｍ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱ（配列番号：６０）
    （ｎ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６１）
    （ｏ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱ（配列番号：６２）
    （Ｐ）ＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６３）
    （ｑ）ＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１１）
    （ｒ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１１２）
    （ｓ）ＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１３）
    （ｔ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥ（配列番号：１１４）
    （ｕ）ＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１１５）
    （ｖ）ＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１１６）
    （ｗ）ＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１１７）
    （ｘ）ＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱ（配列番号：１１８）， 及び
    （ｙ）ＧＳＳＦＬＳＰ（配列番号：１１９）。
    でなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する、好ましくはそのアミノ酸配列によって構成される、請求項３５〜３９の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  42. 前記第２付着部位を少なくとも有する前記抗原又は抗原決定基が：
    （ａ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６４）
    （ｂ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６５）
    （ｃ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７１）
    （ｄ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７２）
    （ｅ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７７）
    （ｆ）ＣＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１０６）
    （ｇ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（配列番号： ６６）
    （ｈ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２０）
    （ｉ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（配列番号：６７）
    （ｊ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号： １２１）
    （ｋ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（配列番号：７３）（１）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号： １２３）（ｍ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ（配列番号：７４）（ｎ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２４）
    （ｏ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１０５）
    （ｐ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１０７）
    （ｑ）ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１０８）
    （ｒ）ＣＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：７０）
    （ｓ）ＣＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１０９）
    （ｔ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＣ（配列番号：１１０）
    （ｕ）ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥ（配列番号：７６）
    （ｖ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＣ（配列番号：６８）
    （ｗ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＧＣ（配列番号：１２２）
    （ｘ）ＣＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：６９）
    （ｙ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＣ（配列番号：７５）
    （ｚ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＬＱＧＣ（配列番号：１２５）
    （ａａ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１２６）
    （ｂｂ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２７）
    （ｃｃ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
    （配列番号：１２８）
    （ｄｄ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＧＣ
    （配列番号：１２９）
    （ｅｅ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＣ（配列番号：１３０）
    （ｆｆ）ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＧＣ（配列番号：１３１）
    （ｇｇ）ＧＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＧＣ（配列番号：１３２）
    （ｈｈ）ＣＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１３３）
    （ｉｉ）ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥ（配列番号：１３４）
    （ｊｊ）ＣＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３５）
    （ｋｋ）ＣＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱ（配列番号：１３６）、及び
    （１１）ＣＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳ（配列番号：１３７）
    （ｍｍ）ＣＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱ（配列番号：１３８。
    でなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項３５〜４１の任意の１項に記載のワクチン組成物。
  43. （ａ）少なくとも一つの第１付着部位を有するコア粒子を提供する工程と；
    （ｂ）少なくとも一つの第２付着部位を有する少なくとも一つの抗原又は抗原決定基を提供する工程であって、
    前記抗原又は抗原決定基がグレリン又はグレリンペプチドであり、前記第２付着部位が：
    （ｉ）前記抗原決定基又は抗原決定基で天然に生じない付着部位と；
    （ｉｉ）前記抗原決定基又は抗原決定基で天然に生る付着部位と、
    でなる群より選ばれ：
    前記第２付着部位が前記第１付着部位と会合し得る前記工程と；
    （ｃ）前記コア粒子と前記少なくとも一つの抗原又は抗原決定基とを組み合わせる工程であって、前記抗原又は抗原決定基及び前記コア粒子が前記会合によって相互作用し、規則的な繰り返し抗原アレイを形成する工程と、
    を有する先行する任意の請求項に記載の組成物を製造するプロセス。
  44. 先行する任意の請求項に記載の組成物を動物又はヒトに投与する工程を有する免疫化法。
  45. 前記抗原又は抗原決定基が自己抗原であることを特徴とする請求項４４に記載の免疫化法。
  46. 前記動物がヒトであり、前記抗原又は抗原決定基がヒトグレリン又はヒトグレリンペプチドである、請求項４４及び４５項の任意の１項に記載の免疫化法。
  47. 前記動物がネコ科であり、前記抗原又は抗原決定基がグレリン又はグレリンペプチドであることを特徴とする請求項４４〜４６の任意の１項に記載の免疫化法。
  48. 前記動物がイヌ科であり、前記抗原又は抗原決定基がネコグレリン又はグレリンペプチドである、請求項４４〜４７の任意の１項に記載の免疫化法。
  49. 医薬品として使用する、請求項１〜４２の任意の１項に記載の組成物。
  50. 肥満処置用医薬品の製造用である、請求項１〜４２の任意の１項に記載の組成物の使用。
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