PL217409B1

PL217409B1 - Kompozycja, kompozycja farmaceutyczna i kompozycje szczepionki zawierające układ antygenowy amyloidu beta 1-6 oraz sposób ich wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number: PL217409B1
Application number: PL374935A
Authority: PL
Inventors: Martin F. Bachmann; Alain Tissot; Rainer Ortmann; Rainer Lüönd; Matthias Staufenbiel; Peter Frey
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag; Novartis Pharma Ag
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2014-07-31
Also published as: IL166227A0; AU2003250110A1; AU2003250110C1; CN1674934B; ZA200500151B; NO337574B1; IL166227A; CA2492930A1; PL374935A1; CA2492930C; NZ537688A; KR101070078B1; US7279165B2; JP2005539025A; NO20050894L; AU2003250110B2; DK1524994T3; US20150374807A1; US20040141984A1; CN101711865A

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek związany jest z dziedziną biologii molekularnej, wirusologii, immunologii i medycyny. Wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej uporządkowany i powtarzalny antygen lub układ determinanty antygenowej i w szczególności kompozycji VLP peptydu Αβ1-6. Bardziej konkretnie, wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej podobną do wirusa cząstkę bakteriofaga RNA i co najmniej jeden dołączony do niej peptyd Αβ1-6. Wynalazek również dostarcza odpowiednio procesu wytwarzania koniugatów i uporządkowanych i powtarzalnych układów. Kompozycje według wynalazku są użyteczne do wytwarzania szczepionek do leczenia choroby Alzheimera oraz jako szczepionka terapeutyczna do zapobiegania lub leczenia choroby Alzheimera oraz do skutecznego indukowania odpowiedzi immunologicznych, w szczególności reakcji przeciwciał. Ponadto, kompozycje według wynalazku są szczególnie użyteczne do skutecznego indukowania specyficznych dla jednostki odpowiedzi immunologicznych we wskazanym kontekście.

Choroba Alzheimera (AD) jest najbardziej powszechną przyczyną demencji wśród osób w podeszłym wieku (w wieku 65 lat i starszych) i poważnym obciążeniem dla służby zdrowia. Na przykład ogłoszono, że 4 miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych choruje na tę chorobę. Oczekuje się, że występowanie tej choroby będzie wzrastać wraz ze starzeniem się populacji.

Głównymi patologicznymi oznakami choroby Alzheimera są związane z wiekiem zmiany zachowania, odkładanie β-amyloidu w postaci nierozpuszczalnych płytek nazywanych płytkami związanymi z zapaleniem nerwów lub płytkami AD, splotami neurofibrylarnymi złożonymi z białka tau w obrębie neuronów i utrata neuronów w przodomózgowiu. W dodatku do późno występującej AD, która występuje w podeszłym wieku (65 lat i powyżej), istnieje również wcześnie występująca AD, rodzinna AD (FAD) występująca w wieku pomiędzy 35 a 60 lat. Patologiczne anomalie AD są bardziej rozpowszechnione, ciężkie i występują wcześniej w FAD niż w późno występującej lub sporadycznej AD. Mutacje genu APP, genach preseniliny 1 i preseniliny 2 były wiązane z FAD.

Jak wspomniano, jednym z kluczowych zdarzeń w chorobie Alzheimera (AD) jest odkładanie amyloidu w postaci nierozpuszczalnych włóknistych mas (amyloidogeneza) powodujących powstanie pozakomórkowych płytek związanych z zapaleniem nerwów i osadów wokół ścian mózgowych naczyń krwionośnych (dla uzyskania przeglądu patrz Selkoe, D.J. (1999) Nature. 399, A23-31). Głównym składnikiem płytek związanych z zapaleniem naczyń i kongofilną angiopatią jest amyloid β (Αβ), mimo że te osady również zawierają inne białka, takie jak glikozaminoglikany i apolipoproteiny. Αβ jest proteolitycznie odszczepiany od znacznie większej glikoproteiny znanej jako Białko Prekursorowe Amyloidu (APP), które zawiera izoformy 695-770 aminokwasów z pojedynczym hydrofobowym regionem przezbłonowym. Αβ tworzy grupę peptydów długości do 43 aminokwasów wykazując znaczącą heterogenność amino- i karboksy-końcową (skrócenie), jak również modyfikacje (Roher, A.E., Palmer, K.C., Chau, V. & Ball, M.J. (1988) J. Cell Biol. 107, 2703-2716. Roher, A.E., Palmer, K. C., Yurewicz, E.C., Ball, M.J., & Greenberg, B.D. (1993) J. Neurochem. 61, 1916-1926). Znaczącymi izoformami są Αβ1-40 i 1-42. Posiada ona dużą skłonność do tworzenia pokładów β skupiających się we włókienka, co ostatecznie prowadzi do powstania amyloidu.

Peptyd Αβ odgrywa główną rolę w neuropatologii choroby Alzheimera. Specyficznej dla regionu, pozakomórkowej akumulacji peptydu Αβ towarzyszy mikroglejoza, zmiany cytoszkieletowe, dystroficzne zapalenie nerwów i utrata synaps. Uważa się, że te patologiczne zmiany są związane z pogorszeniem funkcji poznawczych, które definiuje chorobę.

Podanie białka amyloidu beta lub, w szczególności, Αβ 1-28 w ilościach 10^-2 mg/dawkę przy braku jakiegokolwiek adiuwantu i bez połączenia białka amyloidu beta lub Αβ 1-28 z nośnikiem w celu leczenia choroby Alzheimera jest opisane w EP 526'511.

Stosowano również podawanie peptydów Αβ w kombinacji z adiuwantami w celu indukcji odpowiedzi immunologicznej, komórkowej lub humoralnej, przeciwko Αβ 1-42. W modelu choroby Alzheimera u myszy transgenicznych, zwierzęta wykazywały nadmierną ekspresję ludzkiego białka prekursora amyloidu zawierającego mutację APP(717)V-F (mysz PDAPP, Johnson-Wood, K i wsp., Proc. Natl. Acad. USA 94: 1550-1555, Games, D. i wsp., Nature 373: 523-527 (1995a), prowadzącą do nadprodukcji Αβ1-42, występowały u nich płytki, dystroficzne zapalenie nerwów, utrata zakończeń presynaptycznych, astrocytoza i mikroglejoza. W niedawnym badaniu Schenk, D. i wsp., (Natur 400:176-77 (1999) i WO 99/27944) wykazali, że podanie zagregowanego Αβ1-42 zmieszanego z silnym adiuwantem (CFA/IFA), który nie może być stosowany u ludzi, w pierwszych 4 immunizacjach i następnie podanie zagregowanego Αβ1-42 w PBS w kolejnych immunizacjach myszom PDAPP w wielu 6 tygodni zasadniczo

PL 217 409 B1 zapobiegało tworzeniu płytek i związanemu z tym dystroficznemu zapaleniu nerwów. Ci sami autorzy stwierdzili, że immunizacja starszych myszy (w wieku 11 miesięcy) przy użyciu tej samej strategii znacząco zredukowała zakres i progresję neuropatologii przypominających chorobę Alzcheimera (AD). Proliferacja splenocytów od myszy immunizowanych przy użyciu wyżej wymienionej strategii jest opisana w WO 99/27944 w Przykładzie III (klasyfikowanie skuteczności terapeutycznej wobec stwierdzonej AD) ukazując, że limfocyty T specyficzne dla Αβ1-42 były indukowane przez procedurę szczepienia. Sprzęganie fragmentów Αβ z owczym IgG przeciwko myszy i immunizacja sprzężonego fragmentu w obecności adiuwantu CFA/IFA jest opisana w WO 9927944. Użycie kompozycji zawierających fragmenty Αβ związane z polipeptydami, takimi jak toksyna błonicza w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko Αβ jest również ujawnione w WO 99/27944. Jednakże nie dostarczono danych na temat immunizacji.

Wykazano, że przeciwciało monoklonalne rozpoznające epitop w obrębie końca N (1-16) Αβ (przeciwciało 6C6) chroni komórki PC12 przed neurotoksycznością włókienkowego β-amyloidu i rozdziela β-amyloid in vitro (Solomon B. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)). Wykazano również, że przeciwciało monoklonalne wytworzone przeciwko Αβ1-28 hamuje agregację β-amyloidu in vitro (Solomon B., i wsp. Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1996)). Frenkel i wsp., (J. Neuroimmunol. 88: 85-90 (1998)) później zidentyfikowali epitop dwóch przeciwciał anty-agregacyjnych, 10D5 i 6C6 jako epitop „EFRH“, tj. Αβ3-6. W przeciwieństwie do tego, przeciwciało specyficzne dla Αβ1-7 nie było zdolne do zapobiegania agregacji β-amyloidu (Frenkel D. i wsp., J. Neuroimmunol. 95:136-142 (1999)). Αβ1-42 powoduje tworzenie się włókienek kolagenowych i rzeczywiście, kompozycja szczepionki opisana w WO 99/27944 wykorzystuje Αβ1-42 w taki sposób, że może ona tworzyć agregaty. Wykazano, że te włókienka są toksyczne dla hodowli komórek neuronalnych (Yankner i wsp., Science 245: 417-420 (1989)) i że efekt toksyczny jest również obserwowany, gdy są wstrzyknięte do mózgów zwierząt (Sigurdson i wsp., Neurobiol. Aging 17: 893-901 (1996); Sigurdson i wsp. Neurobiol. Aging 18: 591-608 (1997)). Walsh i wsp. (Nature 416: 535-539 (2002)) stwierdzili, że naturalne oligomery Αβ są tworzone w obrębie pęcherzyków wewnątrzkomórkowych. Te oligomery hamują długotrwałe wzmaganie efektu bodźca przez drugi bodziec u szczurów in vivo i zaburzają plastyczność synaptyczną w stężeniach występujących w ludzkim mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym.

W innym badaniu Bard, F. i wsp. (Nature Medicine 6: 916-19 (2000) wykazali, że obwodowe podanie przeciwciał wytworzonych przeciwko Αβ1-42 powodowało redukcję obciążenia amyloidem mimo względnie umiarkowanego poziomu w osoczu. To badanie wykorzystywało przeciwciała poliklonalne wytworzone przeciwko Αβ1-42 lub przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciwko syntetycznym fragmentom pochodzącym z różnych regionów Αβ. I tak, indukcja przeciwciała przeciwko peptydom Αβ jest obiecująca jako potencjalne postępowanie terapeutyczne w chorobie Alzheimera.

Podanie na błony śluzowe antygenu związanego z płytkami β-amyloidu, takiego jak peptyd β-amyloidu i Αβ1-40 opisano w WO 99/27949. Uważa się, że podanie na błony śluzowe hamuje pewne reakcje cytokin związane z chorobą Alzheimera i nasila pewne inne reakcje cytokin związane z hamowaniem reakcji zapalnych związanych z chorobą. Uważa się, że zahamowanie reakcji zapalnych zachodzi przez „uzyskiwanie limfocytów T charakteryzowanych przez przeciwzapalny profil cytokin”. Odpowiednie antygeny, takie jak opisane w WO 99279949, obejmują antygeny specyficzne dla AD i takie, które są rozpoznawane przez immunologiczne limfocyty T człowieka lub zwierzęcia.

Fuzja epitopów przeciwciała monoklonalnego rozpoznającego Αβ z białkami otoczki fagów włókienkowych jest opisana w WO 01/18169. Immunizacja myszy fagami włókienkowymi wykazującymi 15-merowy epitop VHEPHEFRHVALNPV (numer identyfikacyjny sekwencji: 89) na białku otoczki VIII powodowała powstanie przeciwciał rozpoznających Αβ 1-16 i Αβ1-40. Wykazano to w teście hamującym ELISA przy użyciu peptydów Αβ i stwierdzono, że IC50 wynoszące 1 μΜ hamuje wiązanie osocza do Αβ1-16 z Αβ1-40. Jednakże Solomon (WO 01/18169) nie wykazuje, że osocza uzyskane przeciwko fagom włókienkowym posiadającym epitop VHEPHEFRHVALNPV (numer identyfikacyjny sekwencji: 89) wiążą się z płytkami amyloidu lub płytkami związanymi z zapaleniem nerwów w AD.

Występuje wiele wad w stosowaniu sekwencji różniących się od antygenu, przeciwko któremu wywoływana jest odpowiedź immunologiczna w celu immunizacji. Po pierwsze, przeciwciała przeciwko części sekwencji obcej dla antygenu lub determinanty antygenowej mogą być indukowane. Po drugie, konformacja antygenu w kontekście elementu obcej sekwencji bocznej może być inna niż w kontekście antygenu pełnej długości. I tak, mimo że mogą być uzyskane przeciwciała reagujące krzyżowo z antygenem, ich wiązanie z antygenem może być suboptymalne. Wysoka specyficzność tych uzyskanych przeciwciał może również nie odpowiadać specyficzności przeciwciał wykazywanej przeciwko

PL 217 409 B1 samemu antygenowi, ponieważ dodatkowe łańcuchy boczne inne niż reszty obecne na pełnej długości Αβ są obecne w epitopie. Ostatecznie, 15-merowa sekwencja aminokwasów może zawierać epitopy limfocytów T. Występowanie epitopu YYEFRH (numer identyfikacyjny sekwencji: 90) na białku III otoczki faga włókienkowego, którego jedynie 3-5 kopii zazwyczaj występuje na każdym fagu, jest ujawnione w WO 01/18169. Występuje kilka problemów, gdy używa się infekcyjnych fagów jako nośnika do immunizacji. Po pierwsze, wytwarzanie środków infekcyjnych na dużą skalę i w wystarczającej ilości w dużych kampaniach immunizacyjnych jest problematyczne. Po drugie, obecność DNA faga zawierającego geny oporności na antybiotyki w szczepionce nie jest pozbawione problemów i jest kwestią bezpieczeństwa. Ostatecznie, łatwość i skuteczność napromieniania dużej ilości fagów, w przypadku, gdy w szczepionce stosowane są nieinfekcyjne fagi, nie jest rozwiązanym problemem.

Opisano analogi Αβ, w których Αβ jest modyfikowane tak, że zawiera epitopy pomocnicze T (WO 01/62284). Immunizacja myszy TgRND8+, transgenicznych dla ludzkiego APP, analogiem Αβ powodowała 4 do 7,5 razy większe miano przeciwciał niż immunizacja Αβ1-42 przy braku adiuwantu.

Ostatnie badania wykazały, że indukowana szczepieniem redukcja osadów amyloidu w mózgu posiada potencjał poprawy funkcji poznawczych (Schenk, D. i wsp. Nature 400: 173-177 (1999); Janus, C. i wsp. Nature 408: 979-982 (2000); Morgan, D. i wsp., Nature 408: 982-985 (2000)).

Autopsja pacjenta immunizowanego zagregowanym Αβ1-42 w Adiuwancie QS21 ujawniła obecność zapalenia opon i mózgu z limfocytami T i infiltrację istoty białej mózgu przez makrofagi (Nicoll, J.A. i wsp., Nature Med. 9: 448-452 (2003)).

Ostatnio w publikacji opisano 18 przypadków zapalenia opon i mózgu u pacjentów immunizowanych AN1792, szczepionką złożoną z zagregowanego Αβ1-42 i QS-21 jako adiuwantem (Orgogozo J.M. i wsp. Neurology 61: 46-54 (2003)).

Aktywacja limfocytów T jest uważana za potencjalny mechanizm odpowiedzialny za chorobę, podczas gdy nie ma bezpośredniego związku między chorobą a mianami anty-Aei-42 w osoczu.

Dobrze wiadomo, że podawanie samych oczyszczonych białek zazwyczaj nie jest wystarczające do wywołania silnej odpowiedzi immunologiczne; zazwyczaj musi być podany izolowany antygen razem z substancjami pomocniczymi nazywanymi adiuwantami. Wśród tych adiuwantów podawany antygen jest chroniony przed szybką degradacją i adiuwant zapewnia przedłużone uwalnianie antygenu na niskim poziomie. W niniejszym wynalazku peptydy Αβ stają się immunogenne poprzez wiązanie z VLP i nie wymagają adiuwantu.

Jedną z metod poprawy skuteczności szczepienia jest zwiększenie stopnia powtarzalności zastosowanego antygenu. W przeciwieństwie do białek, wirusy indukują szybkie i skuteczne odpowiedzi immunologiczne przy braku jakichkolwiek adiuwantów zarówno z pomocą, jak i bez pomocy limfocytów T (Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 (1991)). Mimo, że wirusy często składają się z kilku białek, są one zdolne do wywołania znacznie silniejszych odpowiedzi immunologicznych niż ich izolowane komponenty. W przypadku odpowiedzi limfocytów B wiadomo, że jednym istotnym czynnikiem immunogenności wirusów jest powtarzalność i porządek powierzchniowych epitopów. Wiele wirusów wykazuje pseudokrystaliczną powierzchnię, która przedstawia regularny układ epitopów, który skutecznie sieciuje specyficzne dla epitopów immunoglobuliny na limfocytach B (Bachmann i Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). To usieciowanie powierzchniowych immunoglobulin na limfocytach B jest silnym sygnałem aktywacyjnym, który bezpośrednio indukuje progresję cyklu komórkowego i wytwarzanie przeciwciał IgM. Dalej, takie uwolnione limfocyty B są zdolne do aktywacji pomocniczych limfocytów, które z kolei indukują przełączenie z wytwarzania IgM na wytwarzanie IgG w limfocytach B i generowanie długotrwałej pamięci limfocytów B - cel jakichkolwiek szczepień (Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Struktura wirusowa ma nawet związek z generowaniem anty-przeciwciał w chorobie autoimmunologicznej jako część naturalnej reakcji na patogeny (patrz Fehr, T. i wsp., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). I tak, przeciwciała wykazywane przez wysoko zorganizowaną powierzchnię wirusową są zdolne do indukowania silnych odpowiedzi przeciwko przeciwciałom.

Jednakże, jak wykazano, system immunologiczny zazwyczaj nie wytwarza przeciwciał przeciwko strukturom własnego organizmu. W przypadku antygenów występujących w niskich stężeniach, powodem tego jest tolerancja na poziomie komórek Th. W tych warunkach sprzęganie własnego antygenu z nośnikiem, który może dostarczać pomocnicze T może przełamać tolerancję. W przypadku rozpuszczalnych białek obecnych w wysokich stężeniach lub białek błonowych w niskich stężeniach, limfocyty B i komórki Th mogą wykazywać tolerancję. Jednakże tolerancja limfocytów B może być odwracalna (anergia) i może być przełamana przez podanie antygenu w wysoce zorganizowany spoPL 217 409 B1 sób sprzężonego z obcym nośnikiem (Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Jak pokazano w zgłoszeniu patentowym nr US2003/0175290 zgłoszonym 18 stycznia 2002 roku, silne odpowiedzi immunologiczne mogą być indukowane kompozycjami zawierającymi peptydy Αβ (Αβ1-15, Αβ1-27 i Αβ33-42, który jest antygenem własnym u myszy) związane z VLP. W szczególności, wyżej wspomniane ludzkie peptydy Αβ związane z VLP RNA faga Qe indukowały wysokie specyficzne miana Αβ u myszy transgenicznych dla ludzkiego APP (opisane w przykładzie) wykazując, że tolerancja dla własnego antygenu Αβ może być przezwyciężona przez immunizację peptydami Αβ związanymi z VLP.

I tak, istnieje zapotrzebowanie na wysoce immunogenne bezpieczne kompozycje i szczepionki, odpowiednio, do leczenia choroby Alzheimera, w szczególności przy użyciu immunogenów pozbawionych epitopów limfocytów T i adiuwantów, odpowiednio, które mogą wywoływać działania uboczne i wciąż zdolne do indukowania wysokich mian przeciwciał, które to przeciwciała, dalej, są zdolne do wiązania z płytkami amyloidu.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że peptyd Αβ1-6, który jest związany z cząstką rdzeniową posiadającą strukturę o przyrodzonej powtarzalnej organizacji i przez to w szczególności z podobnymi do wirusów cząstkami (VLPs) i podjednostkami VLPs, odpowiednio, prowadząc do powstania koniugatów, jest silnym immunogenem do indukowania przeciwciał specyficznych dla Αβ1-6. Dlatego niniejszy wynalazek dostarcza profilaktycznego i terapeutycznego środka do leczenia choroby Alzheimera, który jest oparty na uporządkowanym i powtarzalnym układzie cząstki rdzeniowej Αβ1-6 i w szczególności na koniugacie i układzie peptydu VLP^1-6, odpowiednio. Ten środek profilaktyczny i terapeutyczny jest zdolny do indukowania wysokich mian przeciwciał przeciwko peptydowi Αβ1-6, które wchodzą w reakcję krzyżową z rozpuszczalnym Αβ i są zdolne do wiązania z ludzkimi płytkami amyloidu w modelu ludzkiego APP u myszy transgenicznych i z płytkami amyloidu AD. Dalej, powstałe przeciwciała nie wiążą się z APP w wycinkach mózgu.

Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza nowych kompozycji i kompozycji szczepionek. Kompozycje i szczepionki zawierające peptydy Αβ1-6 są pozbawione epitopów limfocytów T i indukują przeciwciała wiążące płytki AD i rozpuszczalne Αβ. Peptydy Αβ1-6 kontaktują się z układem immunologicznym pacjenta w sposób wysoce powtarzalny i uporządkowany poprzez wiązanie peptydów Αβ z cząstką rdzeniową, korzystnie VLP lub nawet bardziej korzystnie z fagiem VLP lub RNA.

Kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera:

(a) cząstkę rdzeniową z co najmniej jednym pierwszym miejscem wiązania, przy czym cząsteczka rdzeniowa stanowi cząsteczkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i (b) co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania, gdzie antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie drugie miejsce wiązania jest wybrane z grupy składającej się z:

i. miejsca wiązania nie występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową i ii. miejsca wiązania naturalnie występującego z antygenem lub determinantą antygenową, gdzie drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania, przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, i gdzie peptyd Αβ1-6 i cząstka rdzeniowa wchodzą w interakcje poprzez asocjację tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy.

Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga.

Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że RNA-bakteriofag jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) bakteriofaga Qβ;

(b) bakteriofaga R17;

(c) bakteriofaga fr;

(d) bakteriofaga GA;

(e) bakteriofaga SP;

(f) bakteriofaga MS2;

(g) bakteriofaga M11;

(h) bakteriofaga MX1;

(i) bakteriofaga NL95;

(j) bakteriofaga f2;

PL 217 409 B1 (k) bakteriofaga PP7 i (l) bakteriofaga Ap205.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga Qβ.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga fr.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga AP205.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z białek otoczki RNA-bakteriofagów.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, białka otoczki RNA-bakteriofagów posiadają sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

(a) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4;

(b) mieszaniny sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5;

(c) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6;

(d) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7;

(e) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8;

(f) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9;

(g) mieszaniny sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10;

(h) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11;

(i) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12;

(j) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 13;

(k) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 14;

(l) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 15;

(m) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 16 i (n) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 28.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku, rekombinacyjne białka zawierają lub alternatywnie składają się zasadniczo, lub alternatywnie składają się ze zmutowanych białek otoczki RNA-bakteriofagów.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku RNA-bakteriofag jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) bakteriofaga Qβ;

(b) bakteriofaga R17;

(c) bakteriofaga fr;

(d) bakteriofaga GA;

(e) bakteriofaga SP;

(f) bakteriofaga MS2;

(g) bakteriofaga M11;

(h) bakteriofaga MX1;

(i) bakteriofaga NL95;

(j) bakteriofaga f2;

(k) bakteriofaga PP7 i (j) bakteriofaga AP205.

Korzystnie kompozycja charakteryzuje się tym, że białka otoczki RNA-bakteriofaga zostały zmodyfikowane przez usunięcie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze podstawienia.

Korzystnie również kompozycja zawiera zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zmodyfikowane przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze podstawienia.

Korzystnie również kompozycja zawiera zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zmodyfikowane przez delecję co najmniej jednej reszty lizyny.

Korzystnie również kompozycja zawiera zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zmodyfikowane przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze insercji.

Kompozycja korzystnie charakteryzuje się tym, że drugie miejsce wiązania antygenu lub determinanty antygenowej jest zdolne do asocjacji z pierwszym miejscem wiązania przez co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne.

PL 217 409 B1

Kompozycja korzystnie charakteryzuje się tym, że peptyd Αβ1-6 jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) ludzkiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75;

(b) mysiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 76;

(c) peptydu Αβ1-6 naczelnych posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 84;

(d) króliczego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 85;

(e) peptydu Αβ1-6 żaby szponiastej (xenopus laevis) posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 86;

(f) szczurzego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 87; i (g) peptydu Αβ1-6 świnki morskiej posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 88.

Peptyd Αβ1-6 korzystnie posiada sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75. Kompozycja korzystnie zawiera dodatkowo łącznik aminokwasowy, który zawiera, lub alternatywnie składa się z drugiego miejsca wiązania.

Korzystnie drugie miejsce wiązania lub łącznik aminokwasowy jest związany z peptydem Αβ1-6 na jego końcu C.

Korzystnie drugie miejsce wiązania lub łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) GGC;

(b) GGC-CONH2;

(c) GC;

(d) GC-CONH2;

(e) C; i (f) C-CONH2.

Korzystnie w kompozycji według wynalazku peptyd Αβ1-6 z drugim miejscem wiązania stanowi NH2-DAEFRHGGC-CONH2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77).

Korzystnie w kompozycji według wynalazku cząstka podobna do wirusa jest cząstką podobną do wirusa białka otoczki RNA-bakteriofaga Qe.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera:

(a) kompozycję określoną powyżej, i (b) farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Kompozycja farmaceutyczna korzystnie ponadto zawiera adiuwant, lub jest pozbawiona adjuwantu.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki charakteryzująca się tym, że zawiera kompozycję określoną powyżej lub kompozycję farmaceutyczną określoną powyżej.

Kompozycja szczepionki korzystnie zawiera adiuwant lub jest pozbawiona adiuwantu.

W kompozycji szczepionki korzystnie cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga lub ich fragmenty.

W kompozycji szczepionki korzystnie cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga Qe lub ich fragmenty.

W kompozycji szczepionki korzystnie cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga fr lub ich fragmenty.

W kompozycji szczepionki korzystnie cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga AP205 lub ich fragmenty.

W kompozycji szczepionki korzystnie peptyd Αβ1-6 jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) ludzkiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75 (b) mysiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 76;

PL 217 409 B1 (c) peptydu Αβ1-6 naczelnych posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 84;

(l) szczurzego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 87; i (g) peptydu Αβ1-6 świnki morskiej posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 88.

Kompozycja szczepionki korzystnie dodatkowo zawiera łącznik aminokwasowy, który zawiera lub alternatywnie stanowi drugie miejsce wiązania.

Korzystnie łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest związany z peptydem Αβ1-6 na jego końcu C.

Korzystnie w kompozycja szczepionki łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) GGC;

(b) GGC-CONH2;

(c) GC;

(d) GC-CONH2;

(e) C;

(f) C-CONH2.

W kompozycji szczepionki korzystnie antygen lub determinanta antygenowa z drugim miejscem wiązania stanowi NH2-DAEFRHGGC-CONH2 o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 77.

W kompozycji szczepionki korzystnie cząstka podobna do wirusa jest cząstką podobną do wirusa białka otoczki RNA-bakteriofaga Qβ.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji według wynalazku, kompozycji farmaceutycznej lub kompozycji szczepionki charakteryzujący się tym, że:

(a) dostarcza się cząstkę rdzeniową z co najmniej jednym pierwszym miejscem wiązania, przy czym cząsteczka rdzeniowa stanowi cząsteczkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga;

(b) dostarcza się co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania, (c) przy czym antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie drugie miejsce wiązania jest wybrane z grupy składającej się z:

(d) miejsca wiązania nie występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową; i (e) miejsca wiązania występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową; i (f) przy czym drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania, przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, i (g) łączy się cząstkę rdzeniową i co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową, a antygen lub determinanta antygenowa i cząstka rdzeniowa wchodzą w interakcje poprzez asocjację tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje określone powyżej do zastosowania jako lek.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji określonych powyżej, do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera i chorób pokrewnych.

Korzystnie kompozycja według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna albo kompozycja szczepionki, określone powyżej, charakteryzują się tym, że cząsteczka podobna do wirusa zawiera rekombinowane białko otoczki RNA-bakteriofaga Qβ o sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 4, drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, a peptyd Αβ1-6 posiada sekwencję aminokwasów jak w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 75 lub sekwencję aminokwasów otrzymaną z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 75 na drodze podstawienia, delecji i/lub insercji jednego lub kilku aminokwasu(ów) i mającą podobną do niej aktywność, oraz kompozycja zawiera ponadto łącznik aminokwasowy mający sekwencję wybraną z (a) GGC, przy czym co najmniej jedno drugie miejsce wiązania obejmuje łącznik a peptyd Αβ1-6 z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania obejmuje sekwencję DAEFRHGGC, (b) GGC-CONH2, przy czym co

PL 217 409 B1 najmniej jedno drugie miejsce wiązania obejmuje łącznik a peptyd Αβ1-6 z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania obejmuje sekwencję NH2-DAEFRHGGC-CONH2.

Korzystnie kompozycja według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna albo kompozycja szczepionki zawiera heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawierający grupę funkcyjną, która może reagować z pierwszym miejscem wiązania, i inną grupę funkcyjną, która może reagować z drugim miejscem wiązania.

Korzystnie heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawiera grupę funkcyjną, która może reagować z grupą aminową łańcucha bocznego reszt lizyny cząsteczki podobnej do wirusa lub z podjednostką takiej cząsteczki.

Także korzystnie heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawiera grupę funkcyjną, która reaguje z drugim miejscem wiązania będącym resztą cysteiny połączoną z peptydem Αβ1-6.

Heterobifunkcjonalny związek sieciujący korzystnie jest wybrany z grupy obejmującej SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA oraz inne związki sieciujące posiadające jedną grupę funkcyjną reagującą z grupami aminowymi i jedną grupę funkcyjną reagującą z resztami cysteiny.

Heterobifunkcjonalny związek korzystnie stanowi SPDP lub Sulfo-LC-SPDP.

W korzystnym wykonaniu, antygen lub determinanta antygenowa jest ludzkim peptydem beta-amyloidu Αβ1-6 (DAEFRH; numer identyfikacyjny sekwencji: 75) będącym fragmentem Αβ:

(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGMVGGVVIA (numer identyfikacyjny sekwencji: 91), gdzie ludzki peptyd beta amyloidu Αβ1-6 jest związany z cząstką rdzeniową i VLP, odpowiednio. Białko amyloidu beta jest przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 92. Białko prekursorowe amyloidu beta jest przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 93.

Fragmenty Αβ według niniejszego wynalazku są rozpuszczalne i ogólnie nie tworzą agregatów. Ponadto, są one związane, i korzystnie związane kowalencyjnie z cząstką rdzeniową i VLP, odpowiednio. Dlatego kompozycje według wynalazku nie stwarzają ryzyka wywołania toksycznych reakcji obserwowanych w przypadku osadów amyloidu.

Nieoczekiwanym stwierdzeniem tego wynalazku jest to, że wysokie miano przeciwciał Reagujących krzyżowo z rozpuszczalnym Αβ i płytkami amyloidu AD może być uzyskane w przypadku kompozycji zawierającej peptyd Αβ1-6 związany z cząstką rdzeniową i VLP, odpowiednio. W szczególności wykazano, że VLP pośredniczy w indukcji przeciwciał przeciwko własnym antygenom, przez co przełamuje własną tolerancję (WO 02/056905). Ponadto, małe rozmiary tego epitopu wykluczają obecność epitopów limfocytów T przez co zapewniają utworzenie nowych kompozycji, które nie indukują specyficznych dla Αβ odpowiedzi limfocytów T. Dodatkowo, uzyskane przeciwciała nie wiążą się z APP w wycinkach mózgu. I tak, niniejszy wynalazek dostarcza bezpiecznej kompozycji szczepionki do zapobiegania i leczenia AD.

Bardziej specyficznie, wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej uporządkowany i powtarzalny układ antygenu lub determinanty antygenowej i w szczególności koniugaty VLP peptydu Αβ1-6. Bardziej specyficznie, wynalazek dostarcza kompozycji zawierającej cząstkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i co najmniej jeden związany z nią peptyd Αβ1-6. Wynalazek również dostarcza procesu wytwarzania koniugatów i uporządkowanych i powtarzalnych układów, odpowiednio. Kompozycje według wynalazku są użyteczne do wytwarzania szczepionek do leczenia choroby Alzheimera i jako szczepionka terapeutyczna do zapobiegania lub leczenia choroby Alzheimera i do skutecznego indukowania odpowiedzi immunologicznych, w szczególności reakcji przeciwciał. Ponadto, kompozycje według wynalazku są szczególnie użyteczne do indukowania specyficznych dla osobnika odpowiedzi immunologicznych we wskazanym kontekście.

W niniejszym wynalazku peptyd Αβ1-6 jest związany z cząstką rdzeniową i VLP, odpowiednio, typowo w sposób ukierunkowany, dając uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy Αβ1-6. Ponadto, wysoce powtarzalna i zorganizowana struktura cząstek rdzeniowych i VPLs, odpowiednio, pośredniczy w przedstawianiu peptydu Αβ w sposób wysoce uporządkowany i powtarzalny prowadząc do powstania wysoce zorganizowanego i powtarzalnego układu antygenowego. Ponadto, wiązanie peptydu Αβ1-6 z cząstką rdzeniową i VLP, odpowiednio, dostarcza epitopów pomocniczych limfocytów T, ponieważ cząstka rdzeniowa i VLP jest obce dla organizmu immunizowanego układem cząstka rdzeniowa-peptyd Αβ1-6 i układem VLP-peptyd Αβ1-6, odpowiednio. Te układy różnią się od koniugatów według poprzedniego stanu techniki, w szczególności, w swojej wysoce zorganizowanej strukturze, wymiarach i powtarzalności antygenu na powierzchni układu.

PL 217 409 B1

Peptyd Αβ1-6 może być chemicznie syntetyzowany, podczas gdy cząstka rdzeniowa i VLP, odpowiednio, podlegają ekspresji i oczyszczaniu z gospodarza ekspresyjnego odpowiedniego do fałdowania i składania cząstki rdzeniowej i VLP, odpowiednio. Układ peptydu Αβ1-6 jest następnie składany przez wiązanie peptydu Αβ1-6 do cząstki rdzeniowej i VLP, odpowiednio.

Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji zawierającej (a) cząstkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i (b) co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową, gdzie wspomniany antygen lub wspomniana determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie co najmniej jeden antygen lub determinanta antygenowa jest związana z wspomnianą cząstką podobną do wirusa.

Wynalazkiem jest również kompozycja szczepionki zawierająca kompozycję, w której wspomniana kompozycja zawiera (a) cząstkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i (b) co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową, gdzie wspomniany antygen lub wspomniana determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie wspomniany co najmniej jeden antygen lub determinanta antygenowa jest związana z wspomnianą cząstką podobną do wirusa.

W niniejszym opisie ujawniono sposób immunizacji obejmujący podawanie zwierzęciu kompozycji według wynalazku, kompozycji farmaceutycznej lub kompozycji szczepionki.

W niniejszym dokumencie ujawniono proces wytwarzania kompozycji obejmujący (a) dostarczenie podobnej do wirusa cząstki i (b) dostarczenie co najmniej jednego antygenu lub determinanty antygenowej, gdzie wspomniany antygen lub wspomniana determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-5; (c) połączenie wspomnianej cząstki podobnej do wirusa i wspomnianego co najmniej jednego antygenu lub determinanty antygenowej tak, że wspomniany co najmniej jeden antygen lub determinanta antygenowa jest związana z wspomnianą cząstką podobną do wirusa.

Kompozycji według wynalazku może być stosowana sama lub w kombinacji z innymi środkami lub przy jednoznacznym braku specyficznych substancji, takich jak adiuwanty do wytwarzania kompozycji, kompozycji farmaceutycznej, szczepionki, leku lub medykamentu do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera i/lub do stymulacji układu odpornościowego ssaków.

Wynalazek dostarcza, w szczególności, kompozycji szczepionek, które są odpowiednie do zapobiegania i/lub łagodzenia choroby Alzheimera lub związanych z nią stanów. Wynalazek dalej dostarcza sposobów uodporniania i szczepienia, odpowiednio, do zapobiegania i/lub łagodzenia choroby Alzheimera lub związanych z nią stanów u ludzi. Kompozycje według wynalazku mogą być stosowane profilaktycznie lub terapeutycznie.

Kompozycja może być stosowana w sposobach zapobiegania i/lub łagodzenia choroby Alzheimera lub związanych z nią stanów, które są spowodowane lub zaostrzane przez produkty „własnych” genów, tj. „własne antygeny”, jak stosuje się tutaj. W pokrewnych aspektach wynalazek dostarcza sposobów indukowania odpowiedzi immunologicznych u zwierząt i ludzi, odpowiednio, które prowadzą do wytwarzania przeciwciał, które zapobiegają i/lub łagodzą chorobę Alzheimera lub związane z nią stany, które są spowodowane lub zaostrzane przez produkty „własnych” genów.

Jak może rozumieć osoba biegła w dziedzinie, gdy kompozycje według wynalazku są podawane zwierzęciu lub człowiekowi, mogą one być w kompozycji, która zawiera sole, bufory, adiuwanty lub inne substancje, które są pożądane w celu poprawy skuteczności kompozycji. Przykłady materiałów odpowiednich do zastosowania w sporządzaniu kompozycji farmaceutycznych są opisane w wielu źródłach włącznie z „Remington's Pharmaceutical Sciences” (Osol. A, ed., Mack Publishing Co. (1990)).

Kompozycje według wynalazku są uważane za „farmakologicznie akceptowalne”, jeżeli ich podawanie może być tolerowane przez otrzymującego je osobnika. Dalej, kompozycje według wynalazku będą podawane w „ilości skutecznej terapeutycznie” (tj. w ilości, która wywołuje pożądany efekt fizjologiczny). Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być podawane różnymi sposobami znanymi w dziedzinie, lecz normalnie będą podawane przez iniekcje, infuzje, inhalacje, podanie doustne lub innymi odpowiednimi sposobami fizycznymi. Kompozycje mogą alternatywnie być podawane domięśniowo, dożylnie lub podskórnie. Komponenty kompozycji do podawania obejmują sterylnie wodne (np. sól fizjologiczna) lub niewodne roztwory lub zawiesiny. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i iniekcyjne estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Nośniki lub opatrunki okluzyjne mogą być stosowane w celu zwiększenia przepuszczalności skóry i nasilenia absorpcji antygenu.

PL 217 409 B1

Opis figur rysunku

Fig. 1 ukazuje żel SDS-PAGE utrzymywany w warunkach redukujących uwidaczniając wynik sprzęgania peptydu Αβ1-6 (NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (Numer identyfikacyjny sekwencji: 77) z VLP białka otoczki Qe.

Fig. 2 ukazuje analizę ELISA przeciwciał specyficznych dla Αβ1-6 w osoczach myszy uodpornianych peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP białka otoczki Qe.

Fig. 3 ukazuje analizę ELISA przeciwciał specyficznych dla Αβ1-6 w osoczach myszy uodpornianych peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP białka otoczki Qe.

Fig. 4 A-B ukazuje wycinek mózgu myszy APP23 (A) i leżący w obrębie węchomózgowia wycinek kory od pacjenta z AD (B) barwiony osoczem myszy uodpornianych peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP lub białkiem otoczki Qe.

Fig. 5 A-E ukazuje wycinki mózgu myszy APP23 barwione osoczem myszy uodpornianych peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP lub białkiem otoczki Qe lub poliklonalną surowicą odpornościową królika specyficzną dla końca C człowieka lub myszy APP.

Fig. 6 ukazuje wynik uodporniania małpy rhesus ludzkim Αβ1-6 sprzężonym z Qβ VLP mierzony testem ELISA.

Fig. 7 ukazuje wynik wiązania do płytek osocza małp uodpornionych ludzkim Αβ1-6 sprzężonym z VLP w badaniu histologicznym ludzkich płytek AD lub płytek myszy transgenicznej.

Fig. 8 ukazuje analizę SDS-PAGE sprzęgania mysiego Αβ1-6 z AP205 VLP.

Fig. 9 ukazuje wynik uodporniania myszy mysim Αβ1-6 sprzężonym z AP205 mierzony testem

ELISA.

Fig. 10 ukazuje analizę ELISA mian anty-Aβ40 i anty^42 w osoczu myszy transgenicznych „Swedish/London” uodpornianych QβhΑβ1-6 pomiędzy 9,5 a 19 miesiącem życia.

Fig. 11 ukazuje barwienie immunohistochemiczne wycinków mózgu myszy transgenicznych „Swedish/London” uodpornianych QβhΑβ1-6 lub PBS.

Fig. 12 ukazuje ocenę odkładania płytek u myszy transgenicznych „Swedish/London” uodpornianych QβhΑβ1-6, Qβ lub PBS pomiędzy 9,5 a 19 miesiącem życia.

Fig. 13 ukazuje ocenę odkładania płytek u myszy transgenicznych „Swedish/London” uodpornianych QβhΑβ1-6 lub PBS pomiędzy 13,5 a 19 miesiącem życia.

Fig. 14 ukazuje analizę ELISA mian anty-Aβ40 i anty^42 w osoczach myszy transgenicznych „Swedish” uodpornianych QβΑβ1-6.

Fig. 15 ukazuje barwienie immunohistochemiczne wycinków mózgu myszy transgenicznych „Swedish” uodpornianych QβhΑβ1-6 lub PBS.

Fig. 16 ukazuje ocenę odkładania płytek u myszy transgenicznych uodpornianych QβhΑβ1-6 lub PBS.

O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie określenia techniczne i naukowe używane tutaj mają takie samo znaczenie, jakie jest rozumiane przez osobę biegłą w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Mimo, że jakiekolwiek sposoby i materiały podobne lub równoważne opisanym tutaj mogą być stosowane w praktyce lub w testach według niniejszego wynalazku, korzystne sposoby i materiały są opisane poniżej.

1. Definicje

Peptyd Αβ1-6: peptyd Αβ1-6, jak stosuje się tutaj, odnosi się do peptydów posiadających sekwencję odpowiadającą sekwencji ludzkiego Αβ1-6 lub homologiczną do sekwencji ludzkiego Αβ1-6. Sekwencje homologiczne do sekwencji ludzkiego Αβ1-6 obejmują, lecz nie są ograniczone do, sekwencji Αβ1-6 innych gatunków i przez to obejmują, lecz nie są ograniczone do, sekwencji Αβ1-6 naczelnych, królika, świnki morskiej, Xenopus Laevis, żaby, myszy i szczura. Sekwencje Αβ1-6 Xenopus Laevis lub żaby mimo, że różnią się od ludzkiego Αβ1-6 w dwóch pozycjach, posiadają konserwatywne mutacje (Ala-Ser-Phe-Tyr) i są wciąż uważane za homologiczne do Αβ1-6 zgodnie z definicją. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, peptyd Αβ1-6 jest typowo zmodyfikowany tak, że drugie miejsce wiązania jest do niego dołączone. Korzystnie, drugie miejsce wiązania jest zmodyfikowane łącznikiem lub łącznikiem aminokwasowym obejmującym drugie miejsce wiązania do wiązania cząstki rdzeniowej i VLP, odpowiednio. Przy odniesieniu do peptydów Αβ1-6 należy uwzględnić zmodyfikowany peptyd Αβ1-6, jak wskazano wyżej, tj. peptydy Αβ1-6 z drugim miejscem wiązania dołączonym do nich. Jednakże, typowo modyfikacje są wyraźnie zaznaczone w opisie. Dalsze korzystne aspekty peptydu Αβ1-6 będącego antygenem lub determinantą antygenową zgodnie z niniejszym wynalazkiem stają się oczywiste według dalszej części tego opisu.

PL 217 409 B1

Adiuwant: określenie „adiuwant”, jak stosuje się tutaj, odnosi się do niespecyficznych stymulatorów odpowiedzi immunologicznej lub substancji, które pozwalają na wytworzenie depot w organizmie, w którym, gdy jest połączony ze szczepionką i kompozycją farmaceutyczną, odpowiednio, według niniejszego wynalazku, może wywołać nawet bardziej nasiloną odpowiedź immunologiczną. Mogą być stosowane różne adiuwanty. Przykłady obejmują kompletny i niekompletny adiuwant Freund'a. wodorotlenek glinu i zmodyfikowany dipeptyd muramylowy. Inne adiuwanty to żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjaniny czareczki z rodzaju Fissurella, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne adiuwanty ludzkie, takie jak BCG (pałeczka Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Takie adiuwanty są również dobrze znane w dziedzinie. Inne adiuwanty, które mogą być podawane a kompozycjami według wynalazku obejmują, lecz nie są ograniczone do, immunomodulator monofosforylolipidowy, AdjuVax 100a, Qs-21, Qs-18, CRL1005, sole glinu (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 i otrzymywane wirosomalną technologią adiuwantową. Adiuwanty mogą również zawierać mieszaniny tych substancji.

Immunologicznie aktywne frakcje saponiny wykazujące aktywność adiuwantową pochodzące z kory drzewa południowo-amerykańskiego Qullaja Saponaria Molina są znane w dziedzinie. Na przykład QS21, również znany jako QA21, jest oczyszczoną przez HPLC frakcją z drzewa Quillaja Saponaria Molina i sposób jej wywtarzania jest ujawniony (jako QA21) w patencie U.S. Nr 5,057,540. Saponina z Quillaja została również ujawniona jako adiuwant przez Scotta i wsp., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409. Monofosforylowy lipid A i jego pochodne są znane w dziedzinie. Korzystną pochodną jest 3 de-o-acylowany monofosforylowy lipid A i jest znany z patentu brytyjskiego Nr 2220211. Dalsze korzystne adiuwanty są opisane w WO00/00462.

Jednakże korzystną cechą jest wysoka immunogenność kompozycji według wynalazku. Jak już podkreślano tutaj lub stanie się oczywiste dzięki dalszej części opisu, opisane są szczepionki i kompozycje farmaceutyczne pozbawione adiuwantów, w dalszej alternatywie lub korzystnych aspektach, prowadząc do powstania szczepionek i kompozycji farmaceutycznej do leczenia AD pozbawionych adiuwantów i przez to wykazujących lepszy profil bezpieczeństwa, gdyż adiuwanty mogą powodować działania uboczne. Określenie „pozbawionych”, jak stosuje się tutaj w kontekście szczepionek i kompozycji farmaceutycznych do leczenia AD odnosi się do szczepionek i kompozycji farmaceutycznych, które są stosowane bez adiuwantów.

Łącznik aminokwasowy: „łącznik aminokwasowy” nazywany również w opisie „łącznikiem”, albo asocjuje z antygenem lub determinantą antygenową poprzez drugie miejsce wiązania albo, korzystniej, obejmuje już lub zawiera drugie miejsce wiązania, typowo - lecz nie koniecznie - jako reszta aminokwasu, korzystnie reszta cysteiny. Jednakże określenie „łącznik aminokwasowy”, jak stosuje się tutaj, nie ma sugerować, że taki łącznik aminokwasowy składa się wyłącznie z reszt aminokwasów, nawet jeżeli łącznik aminokwasowy składający się z reszt aminokwasów jest korzystnym aspektem niniejszego wynalazku. Reszty aminokwasów łącznika aminokwasowego są, korzystnie, złożone z naturalnie występujących aminokwasów lub aminokwasów innych niż naturalne znanych w dziedzinie, wszystkich L lub D lub ich mieszanin. Jednakże łącznik aminokwasowy zawierający cząsteczkę z grupą sulfhydrylową lub resztę cysteiny znajduje się również w zakresie wynalazku. Taka cząsteczka zawiera korzystnie C1-C6-alkil, cykloalkil (C5, C6), ugrupowanie arylowe lub heteroarylowe. Jednakże, w dodatku do łącznika aminokwasowego, łącznik zawierający korzystnie C1-C6-alkil, cykloalkil (C5, C6) ugrupowanie arylowe lub heteroarylowe i pozbawiony jakichkolwiek amino-kwasów również znajduje się w zakresie wynalazku. Asocjacja pomiędzy antygenem lub determinantą antygenową lub opcjonalnie drugim miejscem wiązania i łącznikiem aminokwasowym zachodzi korzystnie poprzez co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne, korzystniej przez co najmniej jedno wiązanie peptydowe.

Zwierzę: określenie „zwierzę” oznacza na przykład człowieka, owcę, łosie, jelenie, mulaka, norki, ssaki, małpy, konie, bydło, świnie, kozy, psy, koty, szczury, myszy, ptaki, kurczęta, gady, ryby, owady i pajęczaki.

Przeciwciało: określenie „przeciwciało” odnosi się do cząsteczek, które są zdolne do wiązania epitopu lub determinanty antygenowej. Określenie obejmuje wszystkie przeciwciała i ich fragmenty wiążące antygen, włącznie z przeciwciałami o pojedynczym łańcuchu. Najkorzystniej przeciwciała są fragmentami ludzkich przeciwciał wiążących antygen i obejmują, lecz nie są ograniczone do, Fab, Fab' i F(ab'), Fd, Fvs (scFv) o pojedynczym łańcuchu, przeciwciał o pojedynczym łańcuchu, połączonymi dwusiarczkiem Fvs (sdFv) i fragmentami zawierającymi domenę VL lub VH. Przeciwciała mogą pochodzić od dowolnego zwierzęcia włącznie z ptakami i ssakami. Korzystnie, przeciwciała

PL 217 409 B1 pochodzą od człowieka, myszy, królika, kozy, świnki morskiej, wielbłąda, konia lub kurczęcia. Jak stosuje się tutaj, „ludzkie” przeciwciała obejmują przeciwciała posiadające sekwencję aminokwasów ludzkiej immunoglobuliny i obejmują przeciwciała wyizolowane z bibliotek ludzkich immunoglobulin lub od zwierząt transgenicznych pod względem jednej lub więcej ludzkich immunoglobulin i które nie wyrażają ekspresji endogennych immunoglobulin, jak opisano na przykład w patencie U.S. Nr 5,939,598 Kucherlapati'ego i wsp.

Antygen: określenie „antygen” odnosi się do cząsteczki zdolnej do bycia wiązaną przez przeciwciało lub receptor limfocytu T (TCR), jeżeli jest prezentowany przez cząsteczki MHC. Określenie „antygen”, jak stosuje się tutaj, również obejmuje epitopy limfocytów T. Antygen jest dodatkowo zdolny do bycia rozpoznanym przez układ immunologiczny i/lub jest zdolny do indukowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do aktywacji limfocytów B i/lub T. Może to jednakże wymagać tego że, co najmniej w pewnych przypadkach, antygen zawiera lub jest związany z epitopem komórki Th i jest podawany w adiuwancie. Antygen może mieć jeden lub więcej epitopów (epitopy B- i T-). Rozumie się, że specyficzna reakcja odnosząca się do powyższego wskazuje, że antygen będzie korzystnie reagował, typowo w sposób wysoce selektywny, z odpowiadającym przeciwciałem lub TCR i nie z wieloma innymi przeciwciałami lub TCR, które mogą wywołane przez inne antygeny. Antygeny, jak stosuje się tutaj, mogą również być mieszaninami kilku pojedynczych antygenów.

Determinanta antygenowa: określenie „determinanta antygenowa” odnosi się do części antygenu, który jest specyficznie rozpoznawany przez limfocyty B lub T. Limfocyty B reagujące na determinanty antygenowe wytwarzają przeciwciała, podczas gdy limfocyty T reagują na determinanty antygenowe przez proliferację i ustanowienie funkcji efektorowych istotnych dla pośredniczenia w odporności komórkowej i/lub humoralnej.

Asocjacja: określenie „asocjacja” odnoszące się do pierwszego lub drugiego miejsca wiązania, oznacza wiązanie pierwszego i drugiego miejsca wiązania, które korzystnie zachodzi poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe. Charakter asocjacji może być kowalencyjny, jonowy, hydrofobowy, polarny lub być ich dowolną kombinacją, korzystnie charakter asocjacji jest kowalencyjny.

Miejsce wiązania, pierwsze: określenie „pierwsze miejsce wiązania” odnosi się do elementu pochodzenia nienaturalnego lub naturalnego, z którym może asocjować drugie miejsce wiązania umiejscowione na antygenie lub determinancie antygenowej. Pierwsze miejsce wiązania może być białkiem, polipeptydem, aminokwasem, peptydem, cukrem, polinukleotydem, naturalnym lub syntetycznym polimerem, wtórnym metabolitem lub związkiem (biotyna, fluoresceina, retinol, digoksygenina, jony metali), fluorkiem fenylometylosulfonylowym lub ich kombinacją lub ich chemicznie reakcyjną grupą. Pierwsze miejsce wiązania jest umiejscowione, typowo i korzystnie, na powierzchni cząstki rdzeniowej, takiej jak, korzystnie, cząstka podobna do wirusa. Wiele pierwszych miejsc wiązania jest obecnych na powierzchni cząstki rdzeniowej i podobnej do wirusa, odpowiednio, typowo w powtarzalnej konfiguracji.

Miejsce wiązania, drugie: określenie „drugie miejsce wiązania” odnosi się do elementu związanego z antygenem lub determinantą antygenową, z którą może asocjować pierwsze miejsce wiązania umiejscowione na powierzchni cząstki rdzeniowej i cząstki podobnej do wirusa, odpowiednio. Drugie miejsce wiązania antygenu lub determinanty antygenowej może być białkiem, polipeptydem, peptydem, cukrem, polinukleotydem, naturalnym lub syntetycznym polimerem, wtórnym metabolitem lub związkiem (biotyna, fluoresceina, retinol, digoksygenina, jony metali, fluorek fenylometylosulfonylu) lub ich kombinacją lub ich chemicznie reaktywną grupą. Co najmniej jedno drugie miejsce wiązania jest obecne na antygenie lub determinancie antygenowej. Określenie „antygen lub determinanta antygenowa co najmniej jednym drugim miejscem wiązania” odnosi się więc do antygenu lub konstruktu antygenowego zawierającego co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową i drugie miejsce wiązania. Jednakże, w szczególności w przypadku drugiego miejsca wiązania, które nie jest pochodzenia naturalnego, tj. nie występuje naturalnie w obrębie antygenu lub determinanty antygenowej, te konstrukty antygenowe zawierają „łącznik aminokwasowy”.

Wiązanie: określenie „wiązanie” odnosi się do wiązania lub połączenia, które może być kowalencyjne, np. przez chemiczne sprzęganie lub niekowalencyjne, np. przez interakcje jonowe, interakcje hydrofobowe, wiązania wodorowe etc. Wiązania kowalencyjne mogą być na przykład wiązaniami estrowymi, eterowymi, fosfoestrowymi, amidowymi, peptydowymi, imidowymi, wiązaniami węgiel-siarka, wiązaniami węgiel-fosfor i tym podobnymi. Określenie „wiązanie” jest szersze niż i obejmuje określenia takie, jak „sprzęganie”, „stapianie” i „dołączanie”.

PL 217 409 B1

Białko (białka) otoczki: określenie „białko (białka) otoczki” odnosi się do białka (białek) RNA-bakteriofaga lub zdolnego do bycia włączonym do układu kapsydu RNA-bakteriofaga. Jednakże w odniesieniu do specyficznych produktów genowych genu białka otoczki RNA-bakteriofagów używane jest określenie „CP”. Na przykład specyficzny produkt genowy genu białka otoczki RNA-bakteriofaga Qβ jest określany jako Qβ CP”, podczas gdy „białka otoczki” bakteriofaga Qβ zawierają CP”, jak również białko A1. Kapsyd bakteriofaga Qβ jest złożony głównie z Qβ CP, a mniejszą część stanowi białko A1. Podobnie, białko otoczki VLP Qβ zawiera głównie Qβ CP, a mniejszą część stanowi białko A1.

Cząstka rdzeniowa: określenie „cząstka rdzeniowa” odnosi się do sztywnej struktury o przyrodzonej powtarzalnej organizacji. Cząstka rdzeniowa, jak stosuje się tutaj, może być produktem procesu syntetycznego lub produktem procesu naturalnego.

Sprzęganie: określenie „sprzęganie”, jak stosuje się tutaj, odnosi się do dołączenia przez wiązania kowalencyjne lub silne interakcje niekowalencyjne, typowo i korzystnie do dołączenia przez wiązania kowalencyjne. Dowolny sposób normalnie stosowany przez osobę biegłą w dziedzinie w celu sprzęgania materiałów aktywnych biologicznie może być stosowany w niniejszym wynalazku.

Skuteczna ilość: określenie „skuteczna ilość” odnosi się do ilości koniecznej lub wystarczającej do realizacji pożądanego efektu biologicznego. Skuteczna ilość kompozycji jest ilością, która wywołuje wybrany skutek i taką ilość może być uważana za rutynową przez osobę biegłą w dziedzinie. Na przykład skuteczna ilość do leczenia niewydolności układu immunologicznego jest ilością konieczną do spowodowania aktywacji układu immunologicznego, wywołując rozwój specyficznej dla antygenu odpowiedzi immunologicznej po zadziałaniu antygenu. Określenie jest również synonimem „wystarczającej ilości”.

Skuteczna ilość w dowolnym szczególnym zastosowaniu może być zróżnicowana w zależności od takich czynników, jak leczona choroba lub stan, szczególnej kompozycji, która jest podawana, wielkości osobnika i/lub nasilenia choroby lub stanu. Osoba biegła w dziedzinie może empirycznie określić skuteczną ilość szczególnej kompozycji według niniejszego wynalazku bez wykonywania niepotrzebnych eksperymentów.

Epitop: określenie „epitop” odnosi się do ciągłych lub nieciągłych części polipeptydu posiadającego aktywność antygenową lub immunogenną u zwierzęcia, korzystnie ssaka i najkorzystniej człowieka. Epitop jest rozpoznawany przez przeciwciało lub limfocyt T poprzez receptor limfocytu T w kontekście cząsteczki MHC. „epitop immunogenny”, jak stosuje się tutaj, jest zdefiniowany jako część polipeptydu, która wywołuje reakcję przeciwciał lub indukuje reakcję limfocytów T u zwierzęcia, jak określa się dowolnym sposobem znanym w dziedzinie. (Patrz, na przykład, Geysen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)). Określenie „epitop antygenowy”, jak stosuje się tutaj, jest zdefiniowany jako część białka, z którą przeciwciało może immunospecyficznie wiązać swój antygen, jak określa się dowolnym sposobem dobrze znanym w dziedzinie. Wiązanie immunospecyficzne wyklucza wiązanie niespecyficzne, lecz nie koniecznie wyklucza reakcję krzyżową z innymi anty-genami. Epitopy antygenowe nie muszą być immunogenne. Epitopy antygenowe mogą również być epitopami limfocytów T, w którym to przypadku mogą być związane immunospecyficznie z receptorem limfocytu T w kontekście cząsteczki MHC.

Epitop może zawierać 3 aminokwasy w konformacji przestrzennej, która jest wyłączna dla epitopu. Ogólnie, epitop składa się z co najmniej 5 aminokwasów i częściej składa się z co najmniej 8-10 takich aminokwasów. Jeżeli epitop jest cząsteczką organiczną, może być tak mały, jak nitrofenyl.

Fuzja: określenie „fuzja” odnosi się do kombinacji sekwencji aminokwasów o różnym pochodzeniu w jednym polipeptydzie o kombinacji wewnątrz ramki sekwencji kodujących nukleotydów. Określenie „fuzja” obejmuje fuzje wewnętrzne, tj. insercje sekwencji o różnym pochodzeniu w obrębie łańcucha polipeptydowego, w dodatku do fuzji z jednym jego końców.

Odpowiedź immunologiczna: określenie „odpowiedź immunologiczna” odnosi się do humoralnej odpowiedzi immunologicznej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do aktywacji lub proliferacji limfocytów B lub T i/lub komórek zawierających antygen. Jednakże w pewnych przypadkach odpowiedzi immunologiczne mogą być mało intensywne i stawać się wykrywalne tylko przy użyciu co najmniej jednej substancji według wynalazku. „Immunogenny” odnosi się do środka stosowanego do stymulowania układu immunologicznego żyjącego organizmu tak, że jedna lub więcej funkcji układu immunologicznego jest zwiększonych i skierowanych na środek immunogenny. „Polieptyd immunogenny” jest polipeptydem, który wywołuje komórkową i/lub humoralną odpowiedź immunoPL 217 409 B1 logiczną, sam lub w połączeniu z nośnikiem w obecności lub przy braku adiuwantu. Korzystnie, komórka zawierająca antygen może być aktywowana.

Substancja, która „nasila” odpowiedź immunologiczną, oznacza substancję, po dodaniu której obserwowana jest silniejsza lub intensywniejsza lub zmieniona w jakikolwiek sposób odpowiedź immunologiczna w porównaniu z tą samą odpowiedzią immunologiczną badaną bez dodania substancji. Na przykład, lityczną aktywność cytotoksycznych limfocytów T może być badana np. przy użyciu testu uwalniania ⁵¹Cr w próbkach uzyskanych z użyciem i bez użycia substancji w czasie uodporniania. Ilość substancji, przy której lityczna aktywność CTL jest nasilona w porównaniu z lityczną aktywnością CTL bez substancji jest określana jako ilość wystarczająca do nasilenia odpowiedzi immunologicznej zwierzęcia na antygen. W korzystnym aspekcie, odpowiedź immunologiczna jest nasilona co najmniej o czynnik 2, korzystniej o czynnik około 3 lub więcej. Ilość lub typ wydzielanych cytokin może również być zmieniona. Alternatywnie, ilość indukowanych przeciwciał lub ich podklas może być zmieniona.

Uodpornianie: określenia „uodporniać” lub „uodpornianie” lub pokrewne określenia odnoszą się do nadawania zdolności do wywoływania znaczącej odpowiedzi immunologicznej (obejmującej przeciwciała i/lub odporność komórkową, taką jak efektorowe CTL) przeciwko docelowemu antygenowi lub epitopowi. Te określenia nie wymagają wytworzenia całkowitej odporności, lecz raczej wytworzenia odpowiedzi immunologicznej, która jest zasadniczo większa niż na początku. Na przykład ssak może być uważany a uodpornionego na antygen, jeżeli komórkowa i/lub humoralna odpowiedź immunologiczna na docelowy antygen występuje po zastosowaniu sposobów według wynalazku.

Naturalne pochodzenie: określenie „naturalne pochodzenie” przedmiotu oznacza, że jego całość lub części nie są syntetyczne i występują lub są wytwarzane w naturze.

Nienaturalny: określenie ogólnie oznacza przedmiot nie pochodzący z natury, bardziej konkretnie, określenie oznacza przedmiot wytworzony przez człowieka.

Uporządkowany i powtarzalny antygen lub układ determinanty antygenowej: jak stosuje się tutaj, określenie „uporządkowany i powtarzalny antygen lub układ determinanty antygenowej” ogólnie odnosi się do powtarzalnego wzorca antygenu lub determinanty antygenowej charakteryzujący się typowym i korzystnie stałym ułożeniem przestrzennym antygenów lub determinant antygenowych względem, odpowiednio, cząstki rdzeniowej i cząstki podobnej do wirusa. W jednym wykonaniu wynalazku powtarzalny wzorzec może być wzorcem geometrycznym. Typowe i korzystne przykłady odpowiednich uporządkowanych i powtarzalnych układów antygenów lub determinant antygenowych są przykładami, które posiadają ściśle powtarzalne uporządkowania parakrystaliczne antygenów lub determinant antygenowych, korzystnie z odstępami 0,5 do 30 nanometrów, korzystniej 5 do 15 nanometrów.

Polipeptyd: określenie „polipeptyd” odnosi się do cząsteczki złożonej z monomerów (aminokwasów) połączonych liniowo wiązaniami amidowymi (również znanymi jako wiązania peptydowe). Wskazuje ono na łańcuch molekularny aminokwasów i nie odnosi się do specyficznej długości produktu. I tak, peptydy, dipeptydy, tripeptydy, oligopeptydy i białka znajdują się w obrębie definicji polipeptydu. Określenie odnosi się również do poekspresyjnych modyfikacji polipeptydu, na przykład, glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i tym podobnych. Polipeptyd rekombinacyjny lub pochodny niekoniecznie podlega translacji z określonej sekwencji kwasu nukleinowego. Może być wytworzony w dowolny sposób, włącznie z syntezą chemiczną.

Reszta: określenie „reszta” oznacza specyficzny aminokwas w łańcuchu głównym polipeptydu lub łańcuchu bocznym.

Antygen własny: określenie „antygen własny” odnosi się do białek kodowanych przez DNA gospodarza i produktów wytworzonych przez białka lub RNA kodowane przez DNA gospodarza zdefiniowane jako własne. Dodatkowo białka, które pochodzą z kombinacji dwóch lub kilku cząsteczek własnych, lub które reprezentują frakcję cząsteczki własnej i białek, które posiadają dwie cząsteczki własne o wysokiej homologii, jak zdefiniowano powyżej (>95%, korzystnie >97%, najkorzystniej >99%) mogą również być uważane za własne.

Leczenie: określenia „leczenie”, „leczyć”, „leczony” lub „lecząc” odnosi się do profilaktyki i/lub terapii. Gdy jest stosowane na przykład w odniesieniu do choroby zakaźnej, określenie dotyczy postępowania profilaktycznego, które zwiększa odporność osobnika na infekcję patogenem lub, innymi słowy, zmniejsza prawdopodobieństwo, że osobnik zakazi się patogenem lub będzie wykazywał oznaki choroby mające związek z infekcją, jak również leczenia po zainfekowaniu osobnika w celu zwalczania infekcji, np. zredukowania lub wyeliminowania infekcji lub zapobiegania pogorszeniu infekcji.

PL 217 409 B1

Szczepionka: określenie „szczepionka” odnosi się do preparatu, który zawiera kompozycję według niniejszego wynalazku i która jest w postaci zdolnej do bycia podawaną zwierzęciu. Typowo, szczepionka zawiera konwencjonalną sól lub zbuforowaną fazę wodnego roztworu, w której kompozycja według niniejszego wynalazku jest zawieszona lub rozpuszczona. W tej postaci, kompozycja według niniejszego wynalazku może być dogodnie stosowana do zapobiegania, łagodzenia lub leczenia stanu chorobowego w inny sposób. Po podaniu gospodarzowi, szczepionka jest zdolna do wywołania odpowiedzi immunologicznej włącznie, lecz bez ograniczenia do, wytwarzania przeciwciał i/lub cytokin i/lub aktywacji cytotoksycznych limfocytów T, komórek zawierających antygen, pomocniczych limfocytów T komórek dendrytycznych i/lub innych odpowiedzi komórkowych.

Opcjonalnie, szczepionka według niniejszego wynalazku dodatkowo zawiera adiuwant, który może być obecny w mniejszej lub większej proporcji względem związku według niniejszego wynalazku.

Cząstka podobna do wirusa (VLP): określenie „cząstka podobna do wirusa” odnosi się do struktury przypominającej cząstkę wirusa. Ponadto, cząstka podobna do wirusa zgodnie z wynalazkiem nie replikuje się i nie jest infekcyjna, ponieważ brakuje jej całego lub części genomu wirusowego, w szczególności komponentów replikacyjnych i infekcyjnych genomu wirusowego. Cząstka podobna do wirusa zgodnie z wynalazkiem może zawierać kwas nukleinowy różny od ich genomu. Typowe i korzystne wykonanie cząstki podobnej do wirusa zgodnie z niniejszym wynalazkiem to wirusowy kapsyd, taki jak wirusowy kapsyd odpowiedniego wirusa, RNA-bakteriofaga. Określenia „wirusowy kapsyd” lub „kapsyd”, jak wymiennie stosuje się tutaj, odnoszą się do makrocząsteczkowego zespołu złożonego z podjednostek białka wirusowego. Typowo i korzystnie, podjednostki białka wirusowego składają się odpowiednio na kapsyd wirusowy i kapsyd, posiadający strukturę z przyrodzoną powtarzalną organizacją, gdzie wspomniana struktura jest sferyczna lub rurkowata. Na przykład kapsydy RNA-bakteriofagów lub HBcAg posiadają sferyczną postać o symetrii dwudziestościanu. Określenie „struktura podobna do kapsydu”, jak stosuje się tutaj, odnosi się do makrocząsteczkowego zespołu złożonego z podjednostek białka wirusowego przypominającego morfologicznie kapsyd w wyżej zdefiniowanym sensie, lecz różniącego się od typowego symetrycznego zespołu, podczas gdy zachowuje w wystarczającym stopniu porządek i powtarzalność.

Podobna do wirusa cząstka bakteriofaga: określenie „podobna do wirusa cząstka bakteriofaga” odnosi się do podobnej do wirusa cząstki przypominającej strukturę bakteriofaga, nie replikującej się i nieinfekcyjnej i pozbawionej co najmniej genu lub genów kodujących mechanizm replikacji bakteriofaga i typowo pozbawionej genu lub genów kodujących białko lub białka odpowiedzialne za dołączanie lub wnikanie wirusa do gospodarza. Ta definicja powinna jednakże obejmować podobne do wirusa cząstki bakteriofagów, w których wyżej wymienione geny są obecne, lecz są nieaktywne i dlatego również prowadzą do powstania nie replikujących się i nieinfekcyjnych podobnych do wirusa cząstek bakteriofaga.

VLP białka otoczki RNA-bakteriofaga: kapsydowa struktura utworzona przez złożenie się 180 podjednostek białka otoczki RNA-bakteriofaga i opcjonalnie zawierająca RNA gospodarza jest określana jako „VLP białka otoczki RNA-bakteriofaga”. Konkretnym przykładem jest VLP białka otoczki Qe. W tym konkretnym przypadku, VLP białka otoczki Qβ może składać się wyłącznie z podjednostek Qβ CP (wytworzonych na skutek ekspresji genu Qβ CP zawierającego, na przykład, kodon zatrzymujący TAA wykluczający jakąkolwiek ekspresję dłuższego białka A1 poprzez supresję, patrz Kozlovska, T.M. i wsp., Intervirology 39: 9-15 (1996)) lub dodatkowo zawierać podjednostki białka A1 w układzie kapsydu.

Cząstka wirusa: określenie „cząstka wirusa”, odnosi się do morfologicznej postaci wirusa. W pewnych typach wirusów zawiera ona genom otoczony przez kapsyd białkowy; inne posiadają dodatkowe struktury (np. koperty, ogony, etc.).

Gdy określenie „jeden” jest używane w tym ujawnieniu, oznacza ono „co najmniej jeden” lub „jeden lub więcej”, o ile nie zaznaczono inaczej.

Jak stanie się jasne dla osoby biegłej w dziedzinie, pewne wykonania tego wynalazku obejmują zastosowanie technologii rekombinacji kwasu nukleinowego, jak klonowanie, reakcja łańcucha polimerazy i oczyszczania DNA lub RNA, ekspresja rekombinowanych białek w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych etc. Takie metodologie są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie i mogą być z łatwością znalezione w opublikowanych podręcznikach metod laboratoryjnych (np. Sambrook, J. i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. i wsp. eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). Podstawowe techniki laboratoryjne pracy z liniami komórkowymi hodowli

PL 217 409 B1 tkankowych (Celis, J. Ed., Cell Biology, Academic Press, 2^nd edition, (1998)) i technologie oparte na przeciwciałach (Harlow, E. i Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., „Guide to Protein Purification”, Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice, 3^rd ed., Springer_Verlag, New York (1994)) są również odpowiednio opisane w literaturze.

2. Kompozycje i sposoby nasilania odpowiedzi immunologicznej

Ujawniony wynalazek dostarcza kompozycji i sposobów indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko peptydowi Αβ1-6 u zwierzęcia, indukującej przeciwciała zdolne do wiązania płytek Αβ amyloidu i rozpuszczalnego Αβ. Kompozycje według wynalazku zawierają lub, alternatywnie, składają się z (a) cząstki rdzeniowej z co najmniej jednym pierwszym miejscem wiązania, przy czym cząsteczka rdzeniowa stanowi cząsteczkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i (b) co najmniej jednego antygenu lub determinanty antygenowej z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania, gdzie wspomniany antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie wspomniane drugie miejsce wiązania jest wybrane z grupy składającej się z (i) miejsca wiązania nie występującego naturalnie z wspomnianym antygenem lub determinantą antygenową i (ii) miejsca wiązania występującego naturalnie z wspomnianym antygenem lub determinantą antygenową, gdzie wspomniane drugie miejsce wiązania jest zdolne do asocjacji z pierwszym miejscem wiązania przez co najmniej jedno wiązanie nie-białkowe i gdzie wspomniany antygen lub determinanta antygenowa i wspomniana cząstka rdzeniowa wchodzą w interakcje poprzez wspomnianą asocjacje tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy. Bardziej konkretnie, kompozycje według wynalazku zawierają, lub alternatywnie składają się z cząstki podobnej do wirusa i co najmniej jednego antygenu lub determinanty antygenowej, gdzie antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie co najmniej jeden antygen lub determinanta antygenowa jest związana z cząstką podobną do wirusa tak, że tworzy uporządkowany i powtarzalny układ antygen-VLP. Ponadto, wynalazek dogodnie umożliwia praktykującemu stworzenie takiej kompozycji, między innymi, do leczenia i/lub zapobiegania chorobie Alzheimera. Cząstki podobne do wirusa w kontekście niniejszego zgłoszenia patentowego dotyczą struktur przypominających cząstkę wirusa, lecz nie są patogenne. Ogólnie, cząstki podobne do wirusa są pozbawione genomu wirusowego i dlatego są nieinfekcyjne. Cząstki podobne do wirusa mogą również być wytwarzane w dużych ilościach przez ekspresję heterologiczną i mogą być z łatwością oczyszczane.

W pewnym wykonaniu, cząstka rdzeniowa zawiera lub jest cząstką RNA-bakteriofaga, cząsteczką podobną do wirusa RNA-bakteriofaga, cząstką kapsydu wirusowego lub jego formy rekombinacyjnej. Dowolny RNA-bakteriofag znany w dziedzinie posiadający uporządkowaną i powtarzalną otoczkę i/lub strukturę białka rdzeniowego może być wybrany jako cząstka rdzeniowa według wynalazku; przykłady odpowiednich bakteriofagów obejmują bakteriofag Qβ, bakteriofag R17, bakteriofag M11, bakteriofag MX1, bakteriofag NL95, bakteriofag fr, bakteriofag GA, bakteriofag SP, bakteriofag MS2, bakteriofag f2, bakteriofag PP7 (na przykład patrz tabela 1 w Bachmann, M.F. i Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).

W innym wykonaniu wynalazek wykorzystuje inżynierię genetyczną wirusa do tworzenia fuzji pomiędzy uporządkowanym i powtarzalnym białkiem otoczki wirusa i pierwszym miejscem wiązania składającym się z, lub alternatywnie i korzystnie będącym heterologicznym białkiem, peptydem, determinantą antygenową lub reakcyjną resztą aminokwasową z wyboru. Inne manipulacje genetyczne znane osobom biegłym w dziedzinie mogą być wykorzystane do tworzenia kompozycji według wynalazku, na przykład może być pożądane ograniczenie zdolności replikacji rekombinacyjnego wirusa poprzez mutację genetyczną. Ponadto, wirus używany w niniejszym wynalazku jest niezdolny do replikacji w powodu inaktywacji chemicznej lub fizycznej lub, jak zaznaczono, z powodu braku zdolnego do replikacji genomu. Białko wirusowe wybrane do fuzji z pierwszym miejscem wiązania powinno mieć uporządkowaną i powtarzalną strukturę. Taka uporządkowana i powtarzalna struktura obejmuje organizacje parakrystaliczne z odstępami 5-30 nm, korzystnie 5-15 nm na powierzchni wirusa. Stworzenie białka fuzyjnego tego typu spowoduje powstanie wielokrotnych, uporządkowanych i powtarzalnych pierwszych miejsc wiązania na powierzchni wirusa i będzie odzwierciedlać normalną organizację naturalnego białka wirusowego. Jak osoby biegłe w dziedzinie zrozumieją, pierwsze miejsce wiązania może być lub jest częścią dowolnego odpowiedniego białka, polipeptydu, cukru, polinukleotydu, peptydu, (aminokwasu), naturalnego lub syntetycznego polimeru, wtónego metabolitu lub ich kombinacji, która może służyć do specyficznego dołączania antygenu lub determinanty antygenowej prowadząc do powstania uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenowego.

PL 217 409 B1

Wiele rokombinacyjnych komórek gospodarzy może być wykorzystanych w praktyce wynalazku. Komórki BHK, COS, Yero, HeLa i CHO są szczególnie odpowiednie do wytwarzania heterologicznych białek, ponieważ mają one potencjał glikozylacji heterologicznych białek w sposób podobny do komórek ludzkich (Watson, E. i wsp. Glycobiology 4: 227, (1994)) i mogą wybrane (Zang, M. i wsp., Bio/Technology 13: 389 (1995)) lub przekształcone sposobami inżynierii genetycznej (Renner W. i wsp., Biotech. Bioeng. 4: 476 (1995); Lee K. i wsp. Biotech. Bioeng. 50: 336 (1996)) w celu hodowli w pożywce wolnej od osocza, jak również w zawiesinie.

Wprowadzenie wektorów polinukleotydowych do komórek gospodarza może być wykonane sposobami opisanymi w standardowych podręcznikach laboratoryjnych (patrz np. Sambrook, J. i wsp., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Chapter 8; Ausubel, F. i wsp. Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Chapter 16) włącznie z takimi sposobami, jak Elektroporacja, transfekcja za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcja, mikroiniekcja, kationowa transfekcja za pośrednictwem lipidów, transdukcja, ładowanie przez skrobanie, wprowadzanie balistyczne i infekcję. Sposoby wprowadzania egzogennych sekwencji DNA do komórek gospodarza jest omówione przez Felgnera, P i wsp. w patencie U.S. Nr 5,580,859.

Pakowane sekwencje RNA mogą również być używane do infekowania komórek gospodarza. Te pakowane sekwencje RNA mogą być wprowadzane do komórek gospodarza przez dodawanie ich do pożywki hodowlanej.

Gdy komórki ssaków są używane jako rekombinacyjne komórki gospodarza do wytwarzania opartych na wirusach cząstek rdzeniowych, te komórki ogólnie są hodowane w hodowlach tkankowych. Sposoby hodowania komórek są dobrze znane w dziedzinie (patrz np. Celis, J. ed. Cell Biology, Academic Press, 2^nd edition, (1998); Sambrook, J. i wsp., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. i wsp., eds., Current Protocols In Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc., (1997); Freshney, R. Culture Of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. (1983)).

W korzystnym wykonaniu cząstka rdzeniowa jest cząstką podobną do wirusa, gdzie cząstka podobna do wirusa jest rekombinacyjną cząstką podobną do wirusa. Osoba biegła w dziedzinie może wytworzyć VLPs przy użyciu technologii rekombinacyjnego DNA i wirusowych sekwencji kodujących, które są łatwo dostępne. Na przykład, sekwencja kodująca otoczkę wirusową lub białko rdzeniowe może przekształcone w bakulowirusowym wektorze ekspresyjnym przy użyciu dostępnego komercyjnie wektora bakulowirusowego pod kontrolą regulacyjną promotora wirusowego z odpowiednimi modyfikacjami sekwencji w celu umożliwienia funkcjonalnego połączenia sekwencji kodującej z sekwencją regulacyjną. Sekwencja kodująca otoczki wirusowej lub białka rdzeniowego może również być przekształcana w celu ekspresji na przykład w bakteryjnym wektorze ekspresyjnym.

Przykłady VLPs obejmują fagi RNA, Ty, fr-fag, GA fag, AP205-fag i Qβ-fag.

Jak jest jasne dla osoby biegłej w dziedzinie, VLP według wynalazku nie jest ograniczone do żadnej konkretnej postaci. Cząstka może być zsyntetyzowana chemicznie lub poprzez proces biologiczny, który może być naturalny lub nienaturalny. Dla przykładu, ten aspekt obejmuje cząstkę podobną do wirusa lub jej postać rekombinacyjną.

Bardziej konkretnie, VLP może obejmować lub alternatywnie zasadniczo składać się lub alternatywnie składać się z rekombinacyjnych polipeptydów lub ich fragmentów wybranych spośród rekombinacyjnych polipeptydów RNA-bakteriofagów, rekombinacyjnych polipeptydów Ty, rekombinacyjnych polipeptydów fr-faga, rekombinacyjnych polipeptydów GA-faga i rekombinacyjnych polipeptydów Qβ-faga. Cząstka podobna do wirusa może dalej zawierać lub alternatywnie zasadniczo składać się lub alternatywnie składać się z jednego lub więcej fragmentów takich polipeptydów, jak również wariantów takich polipeptydów. Warianty polipeptydów mogą być, na przykład, w co najmniej 80%, 85%, 90%, 95% lub 99% identyczne na poziomie aminokwasowym z ich odpowiednikami typu dzikiego.

W korzystnym aspekcie cząstka podobna do wirusa zawiera, zasadniczo składa się z lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów) RNA-bakteriofagów. Korzystnie, RNA-bakteriofag jest wybrany z grupy składającej się z a) bakteriofaga Qβ; b) bakteriofaga R17; c) bakteriofaga fr; d) bakteriofaga GA e) bakteriofaga SP; f) bakteriofaga MS2; g) bakteriofaga M11; h) bakteriofaga MX1; i) bakteriofaga NL95; k) bakteriofaga f2; I) bakteriofaga PP7 i m) bakteriofaga AP205.

PL 217 409 B1

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z białek rekombinacyjnych (lub ich fragmentów) RNA-bakteriofaga Qβ lub RNA_bakteriofaga fr lub RNA-bakteriofaga AP205.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z białek fagów RNA-bakteriofaga.

Białka otoczki RNA-bakteriofaga tworzące kapsydy lub VLPs lub fragmenty białek otoczki bakteriofaga zdolne do formowania kapsydu lub VLP są dlatego dalej korzystnymi aspektami niniejszego wynalazku. Białka otoczki bakteriofaga Qβ mogą na przykład podlegać ekspresji rekombinacyjnej w E. coli. Dalej, poprzez taką ekspresję te białka spontanicznie tworzą kapsydy. Dodatkowo, te kapsydy tworzą strukturę o przyrodzonej powtarzalnej organizacji.

Konkretne korzystne przykłady białek otoczki bakteriofagów, które mogą być stosowane do sporządzania kompozycji według wynalazku obejmują białka otoczki bakteriofagów RNA, takich jak bakteriofag Qβ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4; baza danych PIR, numer dostępu VCBPQβ w odniesieniu do Qβ CP i numer identyfikacyjny sekwencji: 5; numer dostępu AAA16663 w odniesieniu do białka Qβ A1), bakteriofag R17 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6; numer dostępu PIR VCBPR7), bakteriofag fr (sekwencja o numerze identyfikacyjnymi; 7; numer dostępu PIR VCBPFR), bakteriofag GA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:; numer dostępu GenBanku NP-040754), bakteriofag SP (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9; numer dostępu GenBAnl CAA30374 w odniesieniu do SP CP i numer identyfikacyjny sekwnecji: 10; numer dostępu NP. 695026 w odniesieniu do białka SP A1), bakteriofag MS2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11; numer dostępu PIR VCBPM2) bakteriofag M11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12; numer dostępu GenBanku AAC06250), bakteriofag MX1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13; numer dostępu GenBanku AAC14699), bakteriofag NL95 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14; numer dostępu GenBanku AAC14704), bakteriofag f2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15; numer dostępu GenBanku P03611), bakteriofag PP7 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16) i bakteriofag AP205 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 28). Ponadto, białko A1 bakteriofaga Qβ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5) lub skrócone w końcu C z brakującymi 100, 150 lub 180 aminokwasami na końcu C mogą być włączone do kapsydu złożonego z białek otoczki Qβ. Ogólnie, procentowa zawartość białka Qβ A1 w stosunku do Qβ CP w kapsydzie będzie ograniczona w celu zapewnienia utworzenia kapsydu.

Stwierdzono również, że białko otoczki Qβ składa się samo tworząc kapsyd, gdy podlega ekspresji w E. coli (Kozlovska TM i wsp., GENE 137: 133-137 (1993)). Powstałe kapsydy lub cząstki podobne do wirusa posiadały dwudziestościenną podobną do faga strukturę o średnicy 25 nm i pseudosymetrii T=3. Dalej, struktura krystaliczna faga Qβ została wyjaśniona. Kapsyd zawiera 180 kopii białka otoczki, które są połączone w kowalencyjne pentamery i heksamery przez mostki dwusiarczkowe (Golmohammadi, R. i wsp., Structure 4:543-5554 (1996)), co prowadzi do znaczącej stabilności kapsydu z białka otoczki Qβ. Kapsydy lub VLPs utworzone z rekombinacyjnego białka otoczki Qβ mogą jednakże zawierać podjednostki połączone poprzez połączenia dwusiarczkowe z innymi podjednostkami w obrębie kapsydu lub niecałkowicie połączone. Jednakże, typowo więcej niż około 80% podjednostek jest połączonych przez mostki dwusiarczkowe między sobą w obrębie VLP. I tak, po umieszczeniu rekombinacyjnego kapsydu Qβ na nieredukujący SDS-PAGE, pasma odpowiadające monomerycznemu białku Qβ, jak również pasma odpowiadające heksamerowemu lub pentamerowemu białku Qβ są widoczne. Niekompletnie połączone dwusiarczkiem podjednostki mogą występować jako pasma dimeru, trimeru lub nawet tetrameru na nieredukującym SDS-PAGE. Białko kapsydu Qβ również wykazuje niezwykłą odporność na rozpuszczalniki organiczne i środki denaturujące. Zaobserwowaliśmy nieoczekiwanie, że DMSO i acetonitryl w stężeniu 30% i guanidyna w stężeniu 1 M nie wpływa na stabilność kapsydu. Duża stabilność kapsydu białka otoczki Qβ jest korzystną cechą, w szczególności w przypadku stosowania do uodporniania i szczepień ssaków i ludzi według niniejszego wynalazku.

Podczas ekspresji w E. coli, N-końcowa metionina jest białkiem otoczki Qβ i jest zazwyczaj usuwana, jak zaobserwowaliśmy przy N-końcowym sewkencjonowaniu Edmana opisanym przez Stolla, E i wsp., J. Biol. Chem. 252:990-993 (1977)). VLP złożone z białek otoczki Qβ, gdzie N-końcowa metionina nie została usunięta lub VLPs zawierające mieszaninę białek otoczki Qβ, gdzie N-końcowa metionina jest rozszczepiona lub obecna znajdują się również w zakresie niniejszego wynalazku.

PL 217 409 B1

Dalsze korzystne cząstki podobne do wirusa RNA-bakteriofagów, w szczególności Qβ, zgodnie z tym wynalazkiem są ujawnione w WO 02/056905.

Wykazane również, że dalsze białka otoczki RNA-bakteriofaga składają się same w czasie ekspresji w gospodarzu bakteryjnym (Kastelein, RA i wsp., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM i wsp., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. i wsp. Virology 170: 238-242 (1989), NI, CZ. i wsp. Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. i wsp., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). Kapsyd Qβ bakteriofaga zawiera, w dodatku do białka otoczki, tak zwane białko odczytu A1 i białko dojrzewania A2. A1 jest ogólnie tworzone przez supresję kodonu zatrzymującego UGA i posiada długość 329 aa. Kapsyd rekombinacyjnego białka otoczki Qβ bakteriofaga stosowane w wynalazku jest pozbawione białka Iizy A2 i zawiera RNA od gospodarza. Białko otoczki RNA bakteriofagów jest białkiem wiążącym RNA i wchodzi w interakcje z pętlą pnia rybosomalnego miejsca wiązania replikazy genu działając jak represor translacyjny w czasie cyklu życiowego wirusa. Sekwencja i elementy strukturalne interakcji są znane (Witherell, GW i & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. i wsp. J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). Wiadomo, że pętla pnia i RNA ogólnie są zaangażowane w składanie wirusa (Golmohammadi, R. i wsp., Structure 4: 543-5554 (1996)).

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera lub alternatywnie zasadniczo składa się z lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów) RNA bakteriofaga, gdzie rekombinacyjne białka zawierają, alternatywnie zasadniczo składają się z lub alternatywnie składają się ze zmutowanych białek otoczki RNA bakteriofaga, korzystnie zmutowanych białek otoczki RNA bakteriofagów wspomnianych wyżej. W innym korzystnym aspekcie zmutowane białka otoczki faga RNA są zmodyfikowane przez usunięcie co najmniej jednego lub alternatywnie co najmniej dwóch reszt lizyny przez podstawienie lub przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny przez podstawienie; alternatywnie, zmutowane białka otoczki faga RNA są zmodyfikowane przez delecję co najmniej jednej, lub alternatywnie co najmniej dwóch reszt lizyny lub przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny przez insercję. Delecja, podstawienie lub dodanie co najmniej reszty lizyny umożliwia zróżnicowanie stopnia sprzęgania tj. ilości peptydów Αβ1-6 na podjednostki VLP fagów RNA, w szczególności, w dopasowaniu i dostosowaniu wymagań szczepionki.

W innym korzystnym aspekcie, cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów), lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów), lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów) RNA bakteriofaga Qβ, gdzie rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z białek otoczki o sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 4, lub mieszaniny białek otoczki sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnymi: 4 i numerze identyfikacyjnym: 5 lub mutantów sekwencji o numerze identyfikacyjnymi: 5 i gdzie N-końcowa metionina jest korzystnie rozszczepiona.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku, cząstka podobna do wirusa zawiera, zasadniczo składa się z lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek Qβ lub ich fragmentów, gdzie rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się ze zmutowanych białek otoczki Qβ. W innym korzystnym aspekcie, te zmutowane białka otoczki są zmodyfikowane przez usunięcie co najmniej jednej reszty lizyny przez podstawienie lub przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny przez podstawienie. Alternatywnie, te zmutowane białka otoczki są zmodyfikowane przez delecję co najmniej jednej reszty lizyny lub przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny przez insercję.

Cztery reszty lizyny są wyeksponowane na powierzchni kapsydu białka otoczki Qβ. Mutanty Qβ, w których wyeksponowane reszty lizyny są zastąpione przez argininę mogą również być stosowane w niniejszym wynalazku. I tak, następujące mutanty białka otoczki Qβ i mutanty VLPs Qβ mogą być stosowane w praktyce wynalazku: ,Όβ-240”, (lys13-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17), ,Ώβ-243 (Asn 10-Lys; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18), ,Ώβ-250” (Iys2-Arg, Lys13-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19), ,Ώβ-251” (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20) i ,Ώβ-259” (lys 2-Arg, Lys16-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21). I tak, w innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku, cząstka podobna do wirusa zawiera, zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek zmutowanych białek otoczki Qβ, które zawierają białka o sekwencji aminokwasów wybranej z grupy a) sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 17; b) sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 18; c) sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 19; d) sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym sekwencji: 20 i e) sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym

PL 217 409 B1 sekwencji: 21. Konstrukcja, ekspresja i oczyszczanie wyżej wskazanych białek otoczki Qβ, zmutowanego białka otoczki Qβ VLPs i kapsydów, odpowiednio, są opisane w WO 02/056905. W szczególności zwraca się uwagę na przykład 18 wyżej wspomnianego zgłoszenia patentowego.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku, cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek Qβ lub ich fragmentów, gdzie rekombinacyjne białka zawierają, zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z mieszaniny któregokolwiek z powyższych mutantów Qβ i odpowiedniego białka A1.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek (lub ich fragmentów) RNA-faga AP205.

Genom AP205 składa się z białka dojrzewania, białka otoczki, replikazy i dwóch ramek otwartego czytania nieobecnych w pokrewnych fagach; gen lizyny i ramka otwartego czytania odgrywa rolę w translacji genu dojrzewania (Klovins, J. i wsp., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). Białko otoczki AP205 może podlegać ekspresji z plazmidu pAP283-58 (numer identyfikacyjny sekwencji: 27), który jest pochodną pQb10 (Kozlovska, T. M. i wsp., Gene 137:133-37 (1993)) i który składa się z rybosomalnego miejsca wiązania Ap205. Alternatywnie, białko otoczki Ap205 może być klonowane do pQb185, w dół strumienia od rybosomalnego miejsca wiązania obecnego w wektorze. Oba podejścia prowadzą do ekspresji białka i tworzenia kapsydów, jak opisano w amerykańskim tymczasowym zgłoszeniu patentowym jednocześnie oczekującym na rozpatrzenie pod tytułem „Molekularne układy antygenowe” (Atty, Wykaz Nr 1700.0310000) i zgłoszonym 17 lipca 2002 roku, które jest przytoczone tu w całości w charakterze odnośnika. Wektory pQb10 i pQb185 są wektorami pochodzącymi z wektora pGEM i ekspresja sklonowanych genów w tych wektorach jest kontrolowana przez promotor trp (Kozlovsa, T.M. i wsp., Gene 137: 133-37 (1993)). Plazmid pAP283-58 (numer identyfikacyjny sekwencji: 27) zawiera przypuszczalne rybosomalne miejsce wiązania w następującej sekwencji, która znajduje się w dół strumienia od miejsca Xbal i bezpośrednio w górę strumienia od kodonu rozpoczynającego białka otoczki Ap205: tctaagaATTTTCTGCGCACCCAT.

CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg (numer identyfikacyjny sekwencji: 57). Wektor pQb185 zawiera sekwencję Shine Delagarno w dół strumienia od miejsca Xbal w górę strumienia od kodonu rozpoczynającego (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg (numer identyfikacyjny sekwencji: 58), sekwencja Shine Delagarno podkreślona).

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku, podobna do wirusa cząstka zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek otoczki (lub ich fragmentów) RNA-faga AP205.

I tak, ten korzystny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje białka otoczki Ap205, które tworzą kapsydy. Takie białka podlegają ekspresji rekombinacyjnej lub pochodzą z naturalnych źródeł. Białka otoczki AP205 wytwarzane w bakteriach spontanicznie tworzą kapsydy, jak stwierdzono za pomocą mikroskopu elektronowego (EM) i immunodyfuzji. Właściwości strukturalne kapsydu utworzonego przez białko otoczki AP205 (numer identyfikacyjny sekwencji: 28) i kapsydów utworzonych przez białko otoczki RNA-faga Ap205 są prawie nierozróżnialne przy obserwacji w EM. VLPs AP205 są wysoce immunogenne i mogą być połączone z antygenami i/lub determinantami antygenowymi w celu wytworzenia konstruktów szczepionki wykazujących powtarzalną orientację antygenów i/lub determinant antygenowych. Wysokie miana są uzyskiwane wobec tak wykazywanych antygenów ukazując, że związane antygeny i/lub determinanty antygenowe są dostępne do interakcji z cząsteczkami przeciwciał i są immunogenne.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych zmutowanych białek otoczki (lub ich fragmentów) RNA-faga AP205.

Zdolne do złożenia zmutowane formy VLPs AP205, włącznie z białkiem otoczki AP205 z wymianą treoniny w pozycji aminokwasowej 5 na prolinę (numer identyfikacyjny sekwencji: 29) mogą również być stosowane w praktyce wynalazku i są innym korzystnym aspektem wynalazku. Te VLPs, VLPs AP205 pochodzące z naturalnych źródeł lub wirusowe cząstki AP205, mogą być związane z antygenami w celu utworzenia uporządkowanych powtarzalnych układów antygenów zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Zmutowane białko otoczki AP205 P5-T może podlegać ekspresji z plazmidu pAP281-32 (numer identyfikacyjny sekwencji: 30), który jest otrzymywany bezpośrednio z pQb185 i który zawiera zmuto22

PL 217 409 B1 wany gen białka otoczki AP205 zamiast genu białka otoczki Qβ. Wektory do ekspresji białka otoczki AP205 są transfekowane do E. coli w celu ekspresji białka otoczki Ap205.

Sposoby ekspresji, odpowiednio, białka otoczki i zmutowanego białka otoczki, prowadzące do samo-złożenia w VLPs są opisane w przykładzie 1. Odpowiednie szczepy E. coli obejmują, lecz nie są ograniczone do E. coli K802, JM 109, RR1. Odpowiednie wektory i szczepy i ich kombinacje mogą być zidentyfikowane przez testową ekspresję, odpowiednio, białka otoczki i zmutowanego białka otoczki na SDS-PAGE i tworzenie i składanie kapsydu najpierw przez, opcjonalnie, oczyszczanie kapsydów przez filtrację żelową i następnie badanie ich w teście immunodyfuzji (test Ouchterlony) lub przez mikroskop elektronowy (Kozlovska, T.M. i wsp., Gene 137: 133-37 (1993)).

Białka otoczki AP205 podlegające ekspresji z wektorów pAP283-59 i pAP281-32 mogą być pozbawione początkowego aminokwasu metioniny z powodu przetwarzania w cytoplazmie E. coli. Rozszczepione, nierozszczepione formy Ap205 i ich mieszaniny są innymi korzystnymi aspektami wynalazku.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z mieszaniny rekombinacyjnych białek otoczki (lub ich fragmentów) RNA-faga Ap205 i rekombinacyjnych zmutowanych białek otoczki (lub ich fragmentów) RNA-faga AP205.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie zasadniczo składa się z, lub alternatywnie składa się z fragmentów rekombinacyjnych białek otoczki lub rekombinacyjnych zmutowanych białek otoczki RNA-faga AP205.

Rekombinacyjne fragmenty białka otoczki AP205 zdolne do składania, odpowiednio, w VLP i kapsyd, są również użyteczne w praktyce wynalazku. Te fragmenty mogą być tworzone przez delecję, albo wewnętrznie, albo przy końcu białka otoczki i zmutowanego białka otoczki, odpowiednio. Insercje w sekwencji białka otoczki i zmutowanego białka otoczki lub fuzje sekwencji antygenowych z sekwencją białka otoczki i zmutowanego białka otoczki i kompatybilne ze składaniem w VLP są innymi aspektami wynalazku i prowadzą do powstania chimerycznych białek i cząstek otoczki AP205, odpowiednio. Wynik insercji, delecji i fuzji z sekwencją białka otoczki i możliwość składania w VLP może być określony mikroskopią elektronową.

Cząstki utworzone przez białko otoczki AP205, fragmenty białka otoczki i chimeryczne białka otoczki opisane wyżej mogą być izolowane w czystej formie przez kombinacje etapów frakcjonowania przez etapy precypitacji i oczyszczania za pomocą filtracji żelowej przy użyciu np. kolumn Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose CL-6B i ich kombinacji. Inne sposoby izolacji cząstek podobnych do wirusa są znane w dziedzinie i mogą być stosowane do izolacji cząstek podobnych do wirusa (VLPs) bakteriofaga AP205. Na przykład, zastosowanie ultrawirowania w celu izolacji VLPs retrotransposonu drożdży Ty jest opisane w patencie U.S. Nr 4,918,166.

Określona została krystaliczna struktura kilku bakteriofagów RNA (Golmohammadi, R. i wsp., Structure 4: 543-554 (1996)). Przy użyciu takich informacji można zidentyfikować wyeksponowane powierzchniowo i w ten sposób mogą być zmodyfikowane białka otoczki faga RNA w taki sposób, że jedna lub więcej reaktywnych reszt aminokwasowych może być wprowadzonych przez insercję lub podstawienie. W konsekwencji te zmodyfikowane formy białek otoczki bakteriofaga mogą być stosowane w niniejszym wynalazku. I tak, warianty białek, które tworzą kapsydy lub struktury podobne do kapsydów (np. białka otoczki bakteriofaga Qβ, bakteriofaga R17, bakteriofaga fr, bakteriofaga GA, bakteriofaga SP, bakteriofaga AP205 i bakteriofaga MS2) mogą również być stosowane do sporządzania kompozycji według niniejszego wynalazku.

Mimo, że sekwencja wariantów białek omawianych wyżej będzie się różniła od jej odpowiedników typu dzikiego, te warianty białek będą ogólnie zachowywały zdolność do tworzenia kapsydów i struktur podobnych do kapsydów. I tak, wynalazek dalej obejmuje, odpowiednio, kompozycje i kompozycje szczepionek, które dalej obejmują warianty białek, które tworzą kapsydy i struktury podobne do kapsydów, jak również sposoby sporządzania, odpowiednio, takich kompozycji i kompozycji szczepionek, poszczególne podjednostki białkowe stosowane do sporządzania takich kompozycji i cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują te podjednostki białkowe. I tak, zakres wynalazku obejmuje warianty form białek typu dzikiego, które tworzą kapsydy lub struktury podobne do kapsydów i zachowują zdolność do asocjacji i tworzenia kapsydów lub struktur podobnych do kapsydów.

W wyniku tego, wynalazek dalej obejmuje, odpowiednio, kompozycje i kompozycje szczepionek zawierające białka, które zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z sekwencji aminokwasów, które są w 80%, 85%, 90%, 95%, 97% lub 99% identyczne

PL 217 409 B1 z białkami typu dzikiego, które tworzą, odpowiednio, uporządkowane układy i posiadają przyrodzoną powtarzalną strukturę.

Dalej, zakres wynalazku obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują białka stosowane do sporządzania kompozycji według niniejszego wynalazku.

W innych aspektach wynalazek dalej obejmuje kompozycje zawierające białka, które zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z sekwencji aminokwasów, które są w 80%, 85%, 90%, 95%, 97% lub 99% identyczne z którąkolwiek sekwencją aminokwasów ukazaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 4-21.

Białka odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku również obejmują C-końcowe skrócone mutanty białek, które tworzą kapsydy lub struktury podobne do kapsydów lub VLPs. Konkretne przykłady takich skróconych mutantów obejmują białka posiadające sekwencję aminokwasów ukazaną w którejkolwiek sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4-21, gdzie 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 lub 17 aminokwasów usunięto z końca C. Typowo, te C-końcowe skrócone mutanty będą zachowywać zdolność do tworzenia kapsydów lub struktur podobnych do kapsydów.

Inne białka odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują również N-końcowe skrócone mutanty białek, które tworzą kapsydy lub struktury podobne do kapsydów. Konkretne przykłady takich skróconych mutantów obejmują białka posiadające sekwencję aminokwasów o którymkolwiek numerze identyfikacyjnym 4-21, gdzie 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 aminokwasów zostało usuniętych z końca N. Typowo, te N-końcowe skrócone mutanty będą zachowywać zdolność do tworzenia kapsydów lub sktruktur podobnych do kapsydów.

Dodatkowe białka odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują N- i C-końcowe skrócone mutanty, które tworzą kapsydy lub struktury podobne do kapsydów. Odpowiednie skrócone mutanty obejmują białka posiadające sekwencję aminokwasów ukazaną w którejkolwiek sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4-21, gdzie 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 lub 17 aminokwasów zostało usuniętych z końca N i 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 lub 17 aminokwasów zostało usuniętych z końca C. Typowo, te N-końcowe i C-końcowe skrócone mutanty będą zachowywać zdolność do tworzenia kapsydów lub struktur podobnych do kapsydów.

Wynalazek dalej obejmuje kompozycje zawierające białka, które zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z sekwencji aminokwasów, które są w co najmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 97% lub 99% identyczne z opisanymi wyżej skróconymi mutantami.

I tak, wynalazek obejmuje kompozycje i kompozycje szczepionek sporządzone z białek, które tworzą kapsydy lub VLPs, sposoby sporządzania tych kompozycji z poszczególnych podjednostek białkowych i VLPs lub kapsydów, sposoby sporządzania tych poszczególnych podjednostek białkowych, cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują te podjednostki i sposoby szczepienia i/lub wywoływania odpowiedzi immunologicznej u osobników używających tych kompozycji według niniejszego wynalazku.

Jak stwierdzono poprzednio, wynalazek obejmuje cząstki podobne do wirusa lub ich formy rekombinacyjne.

W innym korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku, co najmniej jeden peptyd Αβ1-6 jest związany, odpowiednio, z wspomnianą cząstką podobną do wirusa i cząstką rdzeniową przez co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne. Korzystnie, co najmniej jeden peptyd Αβ1-6 jest związany, odpowiednio, z cząstką podobną do wirusa i cząstką rdzeniową przez jedno wiązanie kowalencyjne, wspomniane wiązanie kowalencyjne jest wiązaniem nie-peptydowym prowadząc do powstania, odpowiednio, układu peptydu Αβ1-6 i koniugatu peptyd Αβ1-6-VLP. Układ peptydu Αβ1-6 i koniugat, odpowiednio, posiada typowo i korzystnie powtarzalną i uporządkowaną strukturę, ponieważ co najmniej jeden peptyd Αβ1-6 jest związany z VLP i cząstką rdzeniową, odpowiednio, w sposób ukierunkowany. Tworzenie powtarzalnego i uporządkowanego układu i koniugatu Αβ-W^LP, odpowiednio, jest zapewnione przez ukierunkowane i zorientowane, jak również zdefiniowane wiązanie i dołączenie, odpowiednio, co najmniej jednego peptydu Αβ1-6 do VLP i cząstki rdzeniowej, odpowiednio, jak stanie się oczywiste z następującego. Ponadto, typowa przyrodzona wysoce powtarzalna i zorganizowana struktura VLPs i cząstek rdzeniowych, odpowiednio, korzystnie przyczynia się do występowania peptydu Αβ1-6 w postaci wysoce uporządkowanej i powtarzalnej prowadząc do powstania wysoce zorganizowanego i powtarzalnego układu i koniugatu Αβ1-6, odpowiednio.

Dlatego korzystne koniugaty według wynalazku i układy, odpowiednio, różnią się od wcześniej znanych koniugatów pod względem wysoce zorganizowanej struktury, wymiarów i pod względem powtarzalności antygenu na powierzchni układu. Korzystny aspekt tego wynalazku umożliwia ponadto

PL 217 409 B1 ekspresję cząstki w gospodarzu ekspresyjnym zapewniającą właściwe fałdowanie i składanie VLP, z którym antygen, tj. peptyd Αβ1-6 jest następnie dalej sprzęgany.

Niniejszy wynalazek ujawnia sposoby wiązania peptydu Αβ1-6 z VLPs. Jak zaznaczono, w jednym aspekcie wynalazku peptyd Αβ1-6 jest związany z VLP na drodze chemicznego sieciowania, typowo i korzystnie przy użyciu hetero-bifunkcjonalnego związku sieciującego. Kilka hetero-bifunkcjonalnych związków sieciujących jest znanych w dziedzinie. W korzystnych aspektach hetero-bifunkcjonalny związek sieciujący zawiera grupę funkcyjną, która może reagować z korzystnymi pierwszymi miejscami wiązania, tj. grupą aminową łańcucha bocznego reszt lizyny VLP lub co najmniej jedną podjednostką VLP i dalej grupę funkcyjną, która może reagować z korzystnym drugim miejscem wiązania, tj. resztą cysteiny stopioną z peptydem Αβ1-6 i opcjonalnie udostępnioną do reakcji przez redukcję. Pierwszy etap procedury, typowo nazywany derywatyzacją, jest reakcją VLP ze związkiem sieciującym. Produktem tej reakcji jest aktywowana VLP, nazywana również nośnikiem. W drugim etapie nieprzereagowany związek sieciujący jest usuwany przy użyciu sposobów takich ,jak filtracja żelowa lub dializa. W trzecim etapie, peptyd Αβ1-6 jest poddawany reakcji z aktywowanym VLP i ten etap jest typowo nazwany etapem sprzęgania. Nieprzereagowany peptyd Αβ1-6 może być opcjonalnie usunięty w czwartym etapie, na przykład przez dializę. Kilka związków sieciujących jest znanych w dziedzinie. Obejmują one korzystne związki sieciujące SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA i inne związki sieciujące dostępne na przykład w Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) i posiadające jedną grupę funkcyjną reagującą z grupami aminowymi i jedną grupę funkcyjną reagującą z resztami cysteiny. Wszystkie wyżej wspomniane związki sieciujące prowadzą do utworzenia wiązania tioeterowego. Inna klasa związków sieciujących odpowiednich w praktyce wynalazku charakteryzuje się wprowadzeniem wiązania disiarczkowego pomiędzy peptydem Αβ1-6 i VLP przy sprzęganiu. Korzystne związki sieciujące należące do tej klasy obejmują na przykład SPDP i Sulfo-LC-SPDP (Pierce). Na zakres derywatyzacji VLP ze związkiem sieciującym można wpływać przez zmianę warunków eksperymentalnych takich, jak stężenie każdego z partnerów reakcji, nadmiar jednego odczynnika względem drugiego, pH, temperatura i moc jonowa. Stopień sprzęgania, tj. ilość peptydów Αβ1-6 na podjednostki VLP, może być dostosowywany przez różnicowanie warunków eksperymentalnych opisanych wyżej w celu spełnienia wymogów szczepionki.

Szczególnie korzystnym sposobem wiązania peptydów Αβ1-6 z VLP jest wiązanie reszty lizyny na powierzchni VLP z resztą cysteiny na peptydzie Αβ1-6. W pewnych aspektach może być wymagana fuzja łącznika aminokwasowego zawierającego resztę cysteiny, jak drugie miejsce wiązania lub jego część, z Αβ1-6 w celu sprzęgania z VLP.

Ogólnie, korzystne są elastyczne łączniki aminokwasowe. Przykłady łącznika aminokwsowego wybrane są z grupy składającej się z: (a) CGG; (b) N-końcowego gamma 1-łącznika; (c) N-końcowego gamma 3-łącznika; (d) regionów zawiasowych Ig; (e) N-końcowych łączników glicyny (f) (G)kC(G)n z n=0-12 i k=0-5 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 34); (g) N-końcowych łączników glicyny-seryny; (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n z n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (I) C-końcowego gamma 1-łącznika; (m) C-końcowego gamma 3-łącznika; (n) C-końcowych łączników glicyny (o) (G)nC(G)k z n=0-12 i k=0-5 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 36); (p) C-końcowych łączników glicyny-seryny; (q) (G)m(S)t(GGGGS)n-(G)oC(G)k z n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 i o=0-8 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37).

Innymi przykładami łączników aminokwasowych są regiony zawiasowe Immunoglubulin, łączniki glicyna-seryna (GGGGS)n (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38) i łączniki glicyny (G)n, z których wszystkie dalej zawierają resztę cysteiny jako drugie miejsce wiązania i opcjonalnie dalej reszty glicyny. Typowo korzystnymi przykładami wspomnianych łączników aminokwasowych są N-końcowe gammal: CGDKTHTSPP (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 39); C-końcowe gammal: DKTHTSPPCG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40); N-końcowe gamma 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41); C-końcowe gamma 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42); N-końcowy łącznik glicyny: GCGGGG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43) i C-końcowy łącznik glicyny: GGGGCG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44).

Inne łączniki aminokwasowe szczególnie odpowiednie w praktyce wynalazku, gdy hydrofobowy peptyd Αβ jest związany z VLP, to CGKKGG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46) lub CGDEGG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 31) dla łączników N-końcowych lub GGKKGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45) i GGEDGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 32) dla łączPL 217 409 B1 ników C-końcowych. Dla łączników C-końcowych, końcowa cysteina jest opcjonalnie C-końcowo amidowana.

W korzystnych aspektach niniejszego wynalazku łączniki GGCG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47), GGC lub GGC-NH2 („NH2” oznacza amidację) w końcu C peptydu lub CGG w końcu N są korzystne jako łączniki aminokwasowe. Ogólnie, reszty glicyny będą wprowadzane pomiędzy aminokwasy luzem a cysteinę używaną jako drugie miejsce wiązania w celu uniknięcia potencjalnego zakłócenia sterycznego aminokwasu luzem w reakcji sprzęgania. W najkorzystniejszym aspekcie wynalazku łącznik aminokwasowy GGC-NH2 jest stopiony z końcem C Αβ1-6.

Reszta cysteiny obecna na peptydzie Αβ1-6 musi być w stanie zredukowanym, aby reagować z hetero-bifunkcjonalnym związkiem sieciującym na aktywowanym VLP, to znaczy wolna cysteina lub reszta cysteiny z wolną grupą sulfhydrylową musi być dostępna. W przypadku, gdy reszta cysteiny działająca jako miejsce wiązania jest w postaci utlenionej, na przykład, jeżeli tworzy mostek disiarczkowy, wymagana jest redukcja tego mostku disiarczkowego np. za pomocą DTT, TCEP lub β-merkaptoetanolem. Niskie stężenia środka redukującego są kompatybilne ze sprzęganiem, jak opisano w WO 02/056905, wyższe stężenia hamują reakcję sprzęgania, jak wiadomo osobie biegłej w dziedzinie, w którym to przypadku związek redukujący musi być usunięty lub jego stężenie obniżone przed sprzęganiem, np. przez dializę, filtrację żelową lub HPLC z odwróconymi fazami.

Wiązanie peptydu aβ1-6 z VLP przy użyciu hetero-bifunkcjonalnego związku sieciującego zgodnie z korzystnymi sposobami opisanymi wyżej, umożliwia sprzęganie peptydu Αβ1-6 z VLP w sposób ukierunkowany. Inne sposoby wiązania peptydu Αβ1-6 z VLP obejmują sposoby, w których peptyd Αβ1-6 jest sieciowany z VLP przy użyciu karbodiimidu EDC i NHS. W innych sposobach peptyd Αβ1-6 jest dołączony do VLP przy użyciu homo-bifunkcjonalnego związku sieciującego takiego, jak aldehyd glutarowy, DSG, BM[PEO]4, BS³, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) lub innych znanych homo-bifunkcjonalnych związków sieciujących z grupami funkcyjnymi reagującymi z grupami aminowymi lub grupami karboksylowymi VLP.

Inne sposoby wiązania VLP z peptydem Αβ1-6 obejmują sposoby, w których VLP jest biotynylowany i peptyd Αβ1-6 podlega ekspresji jako białko fuzyjne streptawidyny lub sposoby, w których zarówno peptyd Αβ1-6, jak i VLP są biotynylowane, na przykład jak opisano w WO 00/23955. W tym przypadku peptyd Αβ1-6 może być najpierw związany ze streptawidyną lub awidyną przez dostosowanie stosunku peptydu Αβ1-6 do streptawidyny tak, że wolne miejsca wiązania są wciąż dostępne do wiązania VLP, która jest dodawana w następnym etapie. Alternatywnie, wszystkie komponenty mogą być zmieszane w reakcji w „jednym naczyniu”. Inne pary ligand-receptor, gdzie dostępne są rozpuszczalne formy receptora i ligandu i są zdolne do sieciowania z VLP lub peptydem Αβ1-6 mogą być stosowane jako środki wiążące do wiązania peptydu Αβ1-6 z VLP. Alternatywnie, ligand lub receptor może być stopiony z peptydem Αβ1-6 i w ten sposób pośredniczyć w wiązaniu VLP chemicznie związanym lub stopionym z receptorem lub ligandem. Stopienie może być również przeprowadzane przez wprowadzenie lub podstawienie.

Jak już zaznaczono, w korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku VLP jest VLP RNA bakteriofaga i korzystniejszym aspekcie VLP jest VLP białka otoczki RNA bakteriofaga Qβ.

Jedna lub kilka cząsteczek antygenu, tj. peptydu Αβ1-6, może być dołączonych do jednej podjednostki kapsydu lub VLP białek otoczki RNA bakteriofagów, korzystnie poprzez eksponowane reszty lizyny VLP RNA bakteriofagów, jeżeli to sterycznie możliwe. I tak, specyficzną cechą VLP białka otoczki RNA bakteriofagów i w szczególności VLP białka otoczki Qβ jest możliwość sprzęgania kilku antygenów na podjednostkę. Umożliwia to wytworzenie gęstego układu antygenowego.

W korzystnym aspekcie wynalazku wiązanie i dołączanie, odpowiednio, co najmniej jednego peptydu Αβ1-6 do cząstki podobnej do wirusa zachodzi na drodze interakcji i asocjacji, odpowiednio, pomiędzy co najmniej pierwszym miejscem wiązania cząstki podobnej do wirusa i co najmniej jednym drugim miejscem wiązania antygenu lub determinanty antygenowej.

VLPs lub kapsydy białka otoczki Qβ posiadają określoną liczbę reszt lizyny na swojej powierzchni, z określoną topologią z trzema resztami lizyny skierowanymi do wewnątrz kapsydu i wchodzącymi w inetrakcje z RNA i czterema innymi resztami lizyny wyeksponowanymi na zewnątrz kapsydu. Te określone właściwości sprzyjają raczej dołączaniu antygenów do zewnętrznej części cząstki niż do wnętrza cząstki, gdzie reszty lizyny wchodzą w interakcje z RNA. VLPs innych białek otoczki faga RNA również posiadają określoną liczbę reszt lizyny na swojej powierzchni i określoną topologię tych reszt lizyny.

PL 217 409 B1

W innych korzystnych aspektach niniejszego wynalazku pierwsze miejsce wiązania jest resztą lizyny i/lub drugie miejsce wiązania zawiera grupę sulfhydrylową lub resztę cysteiny. W bardzo korzystnym aspekcie niniejszego wynalazku pierwsze miejsce wiązania jest resztą lizyny i drugie miejsce wiązania jest resztą cysteiny.

W bardzo korzystnych aspektach wynalazku peptyd Αβ1-6 jest związany przez resztę cysteiny z resztami lizyny VLP lub białka otoczki faga RNA i w szczególności z VLP białka otoczki Qβ.

Inną zaletą VLPs pochodzących z fagów RNA jest ich wysoka wydajność ekspresji w bakteriach, która umożliwia wytwarzanie dużych ilości materiału w przystępnej cenie.

Jak zaznaczono, koniugaty według wynalazku i układy, odpowiednio, różnią się od znanych uprzednio koniugatów pod względem wysoce zorganizowanej struktury, wymiarów i powtarzalności antygenu na powierzchni układu. Ponadto, zastosowanie VLPs jako nośników umożliwia tworzenie silnych układów antygenowych i koniugatów, odpowiednio, o zmiennej gęstości antygenu. W szczególności, zastosowanie VLPs fagów RNA i niniejszym w szczególności zastosowanie VLP białka otoczki RNA faga Qβ umożliwia uzyskanie wysokiej gęstości epitopu. W szczególności, gęstość powyżej 1,5 epitopu na podjednostkę może być osiągnięta przez sprzęganie ludzkiego peptydu Αβ1-6 z VLP białka otoczki Qβ. Sporządzanie kompozycji VLPs białek otoczki faga RNA o wysokiej gęstości epitopu może być przeprowadzone przy użyciu opisu z tego zgłoszenia patentowego. W korzystnym aspekcie wynalazku, gdy peptyd Αβ1-6 jest sprzęgany z VLP białka otoczki Qβ, korzystna jest liczba peptydów Αβ1-6 na podjednostkę wynoszącą 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 lub więcej.

Drugie miejsce wiązania, jak zdefiniowano tutaj, może występować naturalnie lub nienaturalnie na antygenie lub determinancie antygenowej. W przypadku braku odpowiedniego naturalnie występującego drugiego miejsca wiązania na antygenie lub determinancie antygenowej, nienaturalne drugie miejsce wiązania może być wprowadzone za pomocą inżynierii do antygenu.

Jak opisano wyżej, cztery reszty lizyny są wyeksponowane na powierzchni VLP białka otoczki Qβ. Typowo te reszty są derywatyzowane w reakcji cząsteczką związku sieciującego. W przypadku, gdy nie wszystkie wyeksponowane reszty lizyny mogą być sprzężone z antygenem, reszty lizyny, które przereagowały ze związkiem sieciującym są pozostawione z cząsteczką związku sieciującego dołączoną do grupy ε-aminowej po etapie derywatyzacji. To prowadzi do zaniku jednego lub kilku dodatnich ładunków, co może być szkodliwe dla rozpuszczalności i stabilności VLP. Przez zastąpienie niektórych reszt lizyny argininą, jak w ujawnionych mutantach białka otoczki Qβ opisanych niżej, zapobiegamy nadmiernemu zanikaniu dodatnich ładunków, ponieważ reszty argininy nie reagują ze związkiem sieciującym. Ponadto, zastąpienie reszt lizyny argininą może prowadzić do powstania bardziej określonych układów antygenowych, ponieważ mniej miejsc jest dostępnych do reakcji z antygenem.

Zgodnie z tym, wyeksponowane reszty lizyny zostały zastąpione przez argininę w następujących mutantach białka otoczki Qβ i zmutowanych VLPs Qβ ujawnionych w tym zgłoszeniu patentowym: Qβ-240 (Lys13-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys 13-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19) i Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21). Konstrukty zostały sklonowane, przeprowadzono ekspresję białek, VLPs zostało oczyszczone i użyte do sprzęgania z peptydem i antygenami białkowymi. Qβ-251; (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20 została również skonstruowana i informacja, jak przeprowadzić ekspresję, oczyszczać i sprzęgać VLP białka otoczki Qβ-251 może być znaleziona w tym zgłoszeniu patentowym.

W innym aspekcie ujawniamy zmutowane białko otoczki Qβ z jedną dodatkową resztą lizyny, odpowiednie do uzyskania układów antygenów o nawet wyższej gęstości. To zmutowane białko otoczki Qβ, Qβ-243 (Asn 10-Lys; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18) zostało sklonowane, przeprowadzono ekspresję białka i wyizolowano i oczyszczono kapsyd lub VLP wykazując, że wprowadzenie dodatkowej reszty lizyny jest kompatybilne z samo-składaniem podjednostek w kapsyd lub VLP. I tak, układy i koniugaty peptydu Αβ1-6, odpowiednio, mogą być sporządzane przy użyciu VLP mutantów białka otoczki Qβ. Szczególnie korzystnym sposobem dołączania antygenów do VLPs i w szczególności do VLPs białek otoczki faga RNA jest łączenie reszty lizyny obecnej na powierzchni VLP białek otoczki faga RNA z resztą cysteiny dodaną do antygenu, tj. peptydu Αβ1-6. Aby reszta cysteiny była efektywna jako drugie miejsce wiązania, grupa sulfhydrylowa musi być dostępna do sprzęgania. I tak, reszta cysteiny musi być w stanie zredukowanym, to jest, wolna cysteina lub reszta cysteiny z wolną grupą sulfhydrylową musi być dostępna. W przypadku, gdy reszta cysteiny mająca funkcjoPL 217 409 B1 nować jako drugie miejsce wiązania jest w formie utlenionej, na przykład jeżeli tworzy mostek disiarczkowy, wymagana jest redukcja tego mostku disiarczkowego za pomocą np. DTT, TCEP lub β-merkaptoetanolu. Stężenie środka redukującego i nadmiar molowy środka redukującego nad antygenem musi być dostosowywany dla każdego antygenu. Testowany jest zakres miareczkowania zaczynając od stężenia 10 μΜ lub niższego do 10 do 20 mM lub wyższego środka redukującego i oceniane jest sprzęganie antygenu z nośnikiem. Mimo, że niskie stężenia środka redukującego są kompatybilne z reakcją sprzęgania, jak opisano w WO 02/056905, wyższe stężenia hamują reakcję sprzęgania, jak wie osoba biegła w dziedzinie, w którym to przypadku środek redukujący musi być usunięty lub jego stężenie obniżone, np. przez dializę, filtrację żelową lub HPLC z odwróconymi fazami. Korzystnie, pH buforu dializacyjnego lub równoważącego jest niższe od 7, korzystnie wynosi 6. Kompatybilność buforu o niskim pH z aktywnością lub stabilnością antygenu musi być zbadana.

Gęstość epitopu na VLP białek otoczki faga RNA może być modulowana przez wybór związku sieciującego i innych warunków reakcji. Na przykład, związki sieciujące Sulfo-GMBS i SMPH typowo umożliwiają uzyskanie wysokiej gęstości epitopu.

Na derywatyzację pozytywnie wpływa wysokie stężenie substancji reagujących i manipulacja warunkami reakcji może być stosowana w celu kontrolowania liczby antygenów sprzężonych z VLPs białek otoczki faga RNA, a w szczególności VLPs białka otoczki Qβ.

Przed zaprojektowaniem nienaturalnego drugiego miejsca wiązania powinna być wybrana pozycja, w której powinno ono być stopione, wprowadzone lub ogólnie wytworzone inżynieryjnie. Wybór pozycji drugiego miejsca wiązania może, przykładowo, być oparty na strukturze krystalicznej antygenu. Taka struktura krystaliczna antygenu może dostarczać informacji na temat dostępności końców Club N-cząsteczki (określonej na przykład z ich dostępności dla rozpuszczalnika) lub na temat ekspozycji na rozpuszczalnik reszt odpowiednich do użycia jako drugie miejsce wiązania, jak reszty cysteiny. Wyeksponowane mostki disiarczkowe, jak w przypadku fragmentów Fab, mogą również być źródłem drugiego miejsca wiązania, ponieważ mogą one ogólnie być konwertowane do pojedynczych reszt cysteiny przez łagodną redukcję, np. za pomocą 2-merkaptoetloaminy, TCEP, β-merkaptoetanolu lub DTT. Będą wybrane warunki łagodnej redukcji nie wpływające na immunogenność antygenu. Ogólnie, w przypadku, gdy immunizacja własnym antygenem ma na celu zahamowanie interakcji tego własnego antygenu z jego naturalnym ligandem, drugie miejsce wiązania będzie dodane tak, umożliwia ono wytworzenie przeciwciał przeciwko miejscu interakcji z naturalnymi ligandami. I tak, umiejscowienie drugiego miejsca wiązania będzie wybrane tak, że można uniknąć zakłócenia sterycznego z drugiego miejsca wiązania lub zawierającego go łącznika aminokwasowego. W innym aspekcie, pożądana jest reakcja przeciwciał skierowana na inne miejsce niż miejsce interakcji własnego antygenu z jego naturalnym ligandem. W takich aspektach drugie miejsce wiązania może być wybrane tak, że zapobiega tworzeniu przeciwciał przeciwko miejscu interakcji własnego antygenu z naturalnymi ligandami.

Inne kryteria wyboru pozycji drugiego miejsca wiązania obejmują stan oligomeryzacji antygenu, miejsce oligomeryzacji, obecność kofaktora i dostępność danych eksperymentalnych ujawniających miejsca w strukturze antygenu i sekwencję, gdzie modyfikacja antygenu jest kompatybilna z funkcją własnego antygenu lub z tworzeniem przeciwciał rozpoznających własny antygen.

W najkorzystniejszych aspektach peptyd Αβ1-6 zawiera pojedyncze drugie miejsce wiązania lub pojedyncze reaktywne miejsce wiązania zdolne do asocjacji z pierwszym miejscem wiązania na cząstce rdzeniowej i VLPs lub podjednostkach VLP, odpowiednio. Zapewnia to określone i jednorodne wiązanie i asocjację, odpowiednio, co najmniej jednego, lecz typowo więcej niż jednego, korzystnie więcej niż 10, 20, 40, 80, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 360, 400, 450 antygenów do cząstki rdzeniowej i VLP, odpowiednio. I tak, dostarczenie pojedynczego miejsca wiązania lub pojedynczego reaktywnego miejsca wiązania na antygenie zapewnia pojedynczy i jednorodny typ wiązania i asocjacji, prowadząc do powstania bardzo wysoce uporządkowanego i powtarzalnego układu. Na przykład, jeżeli wiązanie i asocjacja, odpowiednio, jest przeprowadzana przez interakcję lizyny- jako pierwszego miejsca wiązania) i cysteiny- (jako drugiego miejsca wiązania), zapewnione jest to, zgodnie z tym korzystnym aspektem wynalazku, że jedynie jedna reszta cysteiny na antygen, niezależnie od tego, czy ta reszta cysteiny występuje naturalnie, czy nienaturalnie na antygenie, jest zdolna do wiązania i asocjacji, odpowiednio, z VLP i pierwszym miejscem wiązania cząstki rdzeniowej, odpowiednio.

W pewnych aspektach, umiejscowienie za pomocą inżynierii drugiego miejsca wiązania na antygenie wymaga fuzji łącznika aminokwasowego zawierającego aminokwas odpowiedni jako drugie miejsce wiązania zgodnie z ujawnieniem tego wynalazku. Dlatego, w korzystnym aspekcie niniejszego

PL 217 409 B1 wynalazku, łącznik aminokwasowy jest związany z antygenem lub determinantą antygenową za pomocą co najmniej jednego wiązania kowalencyjnego. Korzystnie, łącznik aminokwasowy zawiera, lub alternatywnie składa się z drugiego miejsca wiązania. W innym korzystnym aspekcie łącznikiem aminokwasowym jest cysteina. Pewne kryteria wyboru łącznika aminokwasowego, jak również dalsze korzystne aspekty łącznika aminokwasowego zostały przedstawione wyżej.

W innym korzystnym aspekcie wynalazku co najmniej jeden antygen lub determinanta antygenowa, tj. peptyd Αβ1-6 jest stopiony z cząstką podobną do wirusa. Jak podkreślono wyżej, VLP jest typowo złożona z co najmniej jednej podjednostki składającej się na VLP. I tak, w ponownie korzystnym aspekcie wynalazku, antygen lub determinanta antygenowa, korzystnie co najmniej jeden peptyd Αβ1-6 jest stopiony z co najmniej jedną podjednostką cząstki podobnej do wirusa lub białka mogącego być włączonym do VLP tworząc fuzję białkową chimeryczne VLP-podjednostka-Αβ1-6.

Fuzja peptydów Αβ1-6 może być dokonywana przez insercję do sekwencji podjednostki VLP lub przez fuzję do końca N- lub C- podjednostki VLP lub białka zdolnego do bycia włączanym do VLP. Dalej, odniesienie do białek fuzyjnych peptydu do podjednostki VLP dotyczy fuzji któregokolwiek końca sekwencji podjednostki lub wewnętrznej insercji peptydu do sekwencji podjednostki.

Fuzja może również być dokonywana przez insercję peptydu Αβ1-6 do wariantu podjednostki VLP, gdzie część sekwencji podjednostki została usunięta, co dalej jest określane jako skrócone mutanty. Skrócone mutanty mogą posiadać koniec N- lub C- lub wewnętrznej delecje części sekwencji podjednostki VLP. Na przykład, konkretne VLP HBcAg z, na przykład, delecją reszt aminokwasowych 79 do 81 jest skróconym mutantem z wewnętrzną delecją. Fuzja peptydów Αβ1-6 z końcem N- lub Cpodjednostek VLP skróconych mutantów również jest aspektem wynalazku. Podobnie, fuzja epitopu z sekwencją podjednostki VLP może również być dokonywana przez podstawienie, gdzie na przykład w przypadku konkretnego VLP HBcAg, aminokwasy 79-81 są zastąpione obcym epitopem. I tak, fuzja, jak opisano poniżej, może być dokonywana przez insercję sekwencji peptydu Αβ1-6 do sekwencji podjednostki VLP, przez podstawienie części sekwencji podjednostki VLP peptydem Αβ1-6 lub przez kombinację delecji, podstawienia lub insercji.

Chimeryczny Αβ1-6 peptyd-podjednostka VLP będzie ogólnie zdolny do samoskładania w VLP. VLP posiadające epitopy stopione z ich podjednostkami są również określane tu jako chimeryczne VLPs. Jak wskazano, cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie jest złożona z co najmniej jednej podjednostki VLP. W innym aspekcie wynalazku cząstka podobna do wirusa zawiera, lub alternatywnie jest złożona z mieszaniny chimerycznych podjednostek VLP i niechimerycznych podjednostek VLP, tj. podjednostek VLP nie posiadających stopionego z nimi antygenu, to prowadzi do powstania tak zwanych mozaikowych cząstek. To może być korzystne do zapewnienia tworzenia i składania VLP. W tych aspektach proporcja chimerycznych podjednostek VLP może wynosić 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% lub więcej.

Boczne reszty aminokwasowe mogą być dodane do któregokolwiek końca sekwencji peptydu lub epitopu, który ma być stopiony z którymkolwiek końcem sekwencji podjednostki VLP lub do wewnętrznej insercji takiej sekwencji peptydowej do sekwencji podjednostki VLP. Reszty glicyny i seryny są szczególnie korzystnymi aminokwasami do stosowania w bocznych sekwencjach dodawanych do peptydu, który ma być stopiony. Reszty glicyny nadają dodatkową elastyczność, która może zmniejszać potencjalnie destabilizujący efekt fuzji obcej sekwencji z sekwencją podjednostki VLP.

W innym korzystnym aspekcie wynalazku, VLP jest VLP faga RNA. Główne białka otoczki RNA bakteriofagów spontanicznie składają się w VLPs podczas ekspresji w bakterii, a w szczególności w E. coli. Konkretne przykłady białek otoczki bakteriofaga, które mogą być stosowane do sporządzania kompozycji według wynalazku obejmują białka otoczki bakteriofagów RNA, takie jak bakteriofag Qβ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4, Baza Danych PIR, numer dostępu VCBP-Qβ w odniesieniu do CP Qβ i sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5, numer dostępu AAA16663 w odniesieniu do białka A1 Qβ) i bakteriofag fr (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7, numer dostępu PIR VCBPFR).

W korzystniejszym aspekcie, co najmniej jeden peptyd Αβ1-6 jest stopiony z białkiem otoczki Qβ. Zostały opisane konstrukty białka fuzyjnego, gdzie epitopy zostały stopione z końcem C skróconej formy białka A Qβ lub włączone do białka A1 (Kozlovska, T.M. i wsp., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). Białko A1 jest tworzone przez supresję kodonu zatrzymującego UGA i ma długość 329 aa lub 328 aa, jeżeli brane jest pod uwagę rozszczepienie N-końcowej metioniny. Rozszczepienie N-końcowej metioniny przed alaniną (drugi aminokwas kodowany przez gen CP Qβ) zazwyczaj zachodzi w E. coli i tak jest w przypadku końca N białek otoczki Qβ. Część genu A1, 3' kodon bursztynowy UGA koduje

PL 217 409 B1 wydłużenie CP, które ma długość 195 aminokwasów. Insercja co najmniej jednego peptydu miedzy pozycje 72 i 73 wydłużenia CP jest innym aspektem wynalazku (Kozlovska, T.M. i wsp., Intervirology 39:9-15 (1996)). Fuzja peptydu Αβ1-6 z końcem C C-końcowo skróconego białka Qβ A1 jest innym korzystnym aspektem wynalazku. Na przykład Kozlovska i wsp. (Intervirology, 39:9-15 (1996)) opisują fuzje białka A1 Qβ, gdzie epitop jest stopiony w końcu C wydłużenia CP Qβ skróconego w pozycji 19.

Jak opisuje Kozlovska i wsp. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), składanie cząstek zawierających stopione epitopy typowo wymaga obecności zarówno fuzji białka A1- peptydu Αβ1-6, jak i wt CP do utworzenia cząstki mozaikowej. Jednakże aspekty obejmujące cząstki podobne do wirusa i niniejszym w szczególności VLPs białka otoczki RNA bakteriofaga Qβ, które są wyłącznie złożone z podjednostek VLP posiadających co najmniej jeden stopiony z nimi peptyd Αβ1-6 są również w zakresie niniejszego wynalazku.

Wytwarzanie cząstek mozaikowych może być dokonywane na wiele sposobów. Kozlovska i wsp., Intervirology, 39: 9-15 (1996) opisują trzy sposoby, z których wszystkie mogą być stosowane w praktyce wynalazku. W pierwszym sposobie efektywna ekspozycja stopionego epitopu na VLPs zachodzi za pośrednictwem ekspresji plazmidu kodującego fuzję białka A1 Qβ posiadającego kodon zatrzymujący UGA pomiędzy CP i wydłużeniem CP w szczepie E. coli zawierającym plazmid kodujący sklonowany supresor UGA tRNA, co prowadzi do translacji kodonu UGA w Trp (plazmid pISM3001 (Smiley B.K. i wsp., Gene134: 33-40 (1993))). W innym sposobie kodon zatrzymujący genu CP jest zmodyfikowany do UAA i drugi plazmid, w którym zachodzi ekspresja fuzji białko A1-peptyd Αβ1-6 jest współtransformowany. Drugi plazmid koduje zróżnicowaną oporność na antybiotyki i początek replikacji jest kompatybilny z pierwszym plazmidem (Kozlovska, T.M. i wsp., Intervirology 39:9-15 (1996)). W trzecim sposobie CP i fuzja białka A1-peptydu Αβ1-6 są kodowane w sposób bicistronowy, operacyjnie powiązany z promotorem, takim jak promotor Trp, jak opisano na fig. 1 przez Kozlovską i wsp., Intervirology, 39: 9-15 (196).

W innym aspekcie peptyd Αβ1-6 jest wprowadzany pomiędzy aminokwas 2 i 3 (numerowanie rozszczepionego CP, to jest gdzie rozszczepiona jest N-końcowa metionina) fr CP, co prowadzi do powstania białka fuzyjnego peptyd Αβ1-6-Α CP. Zostały opisane wektory i systemy ekspresji do konstrukcji i ekspresji białek fuzyjnych fr CP samo-składających się w VLP i użyteczne w praktyce wynalazku (Pushko P. i wsp., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). W konkretnym aspekcie, sekwencja peptydu A31-6 jest wprowadzana do wariantu delecyjnego fr CP po aminokwasie 2, w którym usunięto reszty 3 i 4 fr CP (Pushko P. i wsp., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)).

Fuzja epitopów w N-końcowej wystającej β-szpilce białka otoczki RNA bakteriofaga MS-2 i następnie prezentacja stopionego epitopu na samo-złożonym VLP RNA bakteriofaga MS-2 została również opisana (WO 92/13081) i fuzja peptydu Αβ1-6 przez insercję lub podstawienie do białka otoczki RNA bakteriofaga MS-2 jest również w zakresie wynalazku.

W korzystnych aspektach wynalazku peptydy Αβ1-6 odpowiednie do wytwarzania szczepionek według wynalazku są zmodyfikowane łącznikiem aminokwasowym do wiązania VLP. Te peptydy Αβ1-6 obejmują, lecz nie są ograniczone do: Αβ1-6 stopionym C-końcowo z łącznikiem GGC. Łączniki aminokwasowe do fuzji z końcem N fragmentów Αβ1-6 obejmują, lecz nie są ograniczone do sekwencji CGG i CGHGNKS. Łączniki odpowiednie do fuzji z końcem C Αβ1-6 obejmują, lecz nie są ograniczone do sekwencji GGC. W korzystnym aspekcie, gdy łącznik jest stopiony z końcem C Αβ lub fragmentów Αβ, C-końcowa cysteina jest amidowana. W korzystnym aspekcie, Αβ1-6 jest stopiony z łącznikiem aminokwasowym i posiada sekwencję: „NH2-DAEFRHGGCCONH2, gdzie C-końcowa cysteina jest amidowana, na co wskazuje C-końcowe „-CONH2” i koniec N peptydu jest wolny, na co dalej wskazuje „NH-„. Łączniki aminokwasowe są korzystnie krótkie w celu uniknięcia indukcji odpowiedzi immunologicznych przeciwko aminokwasom wspomnianego łącznika, lecz powinny umożliwiać indukcję przeciwciał reagujących krzyżowo z rozpuszczalnym Αβ i płytkami AD i mogą ułatwiać interakcję przeciwciał z peptydem Αβ1-6. Inne odpowiednie właściwości łącznika aminokwasowego to elastyczność i, korzystnie, brak aminokwasów luzem, które mogłyby interferować ze sprzęganiem i/lub wywoływać odpowiedź immunologiczną przeciwko samemu łącznikowi. W korzystniejszych aspektach łącznik aminokwasowy zawierający resztę cysteiny jako drugie miejsce wiązania jest stopiony z końcem C peptydu Αβ1-6.

Dodatkowe fragmenty Αβ odpowiednie w praktyce wynalazku obejmują fragmenty Αβ odpowiadające wyżej wymienionym fragmentom, również zmodyfikowane, jak opisano wyżej, od innych gatunków zwierząt i wywołujące powstanie przeciwciał reagujących krzyżowo z ludzkimi płytkami amyloidu i rozpuszczalnym ludzkim Αβ. Przykładami takich fragmentów są: Αβ1-6 naczelnych (DAE30

PL 217 409 B1

FRH; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 84), królika (DAEFRH; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 85), świnki morskiej (DAEFRH; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 88), myszy (DAEFGH; sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76), szczura (DAEFGH sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 87) i xaenopus laevis (DSEYRH; 86).

Opisano wiele modeli zwierzęcych AD w oparciu o myszy transgeniczne, u których zachodzi nadmierna ekspresja zmutowanych ludzkich form APP (Games, D. i wsp., Nature 373: 523-527 (1995a); Stuchler-Pierrat i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 (1997); Hsiao, K. i wsp. Science 274: 99-102 (1996); Chen, G. i wsp., Nature 408: 975-979 (2000)). Te modele mysie różnią się od siebie poziomem ekspresji transgenu, mutacjami AD obecnymi na transgenie i promotorem kierującym nadmierną ekspresją transgenu. Te modele zwierzęce nie wykazują wszystkich patologicznych cech AD, które są w szczególności związanymi z wiekiem zmianami zachowania, odkładaniem β-amyloidu w postaci rozpuszczalnych płytek, splotami neurofibrylarnymi w obrębie neuronów i utratą neuronów w przodomózgowiu (Chapman, P.F. Nature 408: 915-916 (2000)). Jednakże w tych modelach mogą być określone deficyty pamięciowe i sposoby ich identyfikacji i mogą być stosowane w badaniu działania kompozycji według wynalazku w modelach zwierzęcych (Chen, G. i wsp., Nature 408: 975-979 (2000); Janus, C. i wsp., Nature 408: 979-982 (2000); Morgan, D. i wsp., Nature 408: 982-985 (2000)). Ponadto, związane z wiekiem odkładanie Αβ w postaci płytek amyloidu może być badane w tych modelach, w których również rozwija się astrocytoza i mikroglejoza.

P r z y k ł a d 1

Klonowanie i konstrukcja, ekspresja i oczyszczanie korzystnych cząstek rdzeniowych i VLP fagów RNA, odpowiednio

A. Konstrukcja i ekspresja zmutowanych białek otoczki Qβ i oczyszczanie VLPs zmutowanego białka otoczki Qβ lub kapsydów

Konstrukcja plazmidu i klonowanie zmutowanych białek otoczki

Konstrukcja pQβ-240:

Plazmid Qβ10 (Kozlovska, TM i wsp., Gene 137: 133-137) został użyty jako plazmid początkowy do konstrukcji pQe-240. Mutacja Lys 13 >Arg została wywołana przez odwrócone PCR. Odwrócone primery zostały zaprojektowane w odwróconych kierunkach koniec-do-końca:

5'-GGTAACATCGGTCGAGATGAAAACAAACTCTGTCC-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 48) i

5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 49).

Produkty pierwszego PCR zostały użyte jako szablony do drugiej reakcji PCR, w której został użyty primer w górę strumienia

5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 50) i primer w dół strumienia

5'-CGATGCATTTC ATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 51).

Produkt drugiego PCR został wytrawiony Xbal i Mph 11031 i sklonowany do wektora ekspressyjnego pQe10, który został rozszczepiony przez te same enzymy restrykcyjne. Reakcje PCR zostały przeprowadzone z odczynnikami zestawu PCR i zgodnie z protokołem producenta (MBI Fermentas, Wilno, Litwa).

Sekwencjonowanie przy użyciu sposobu bezpośredniego włączania znacznika zweryfikowało pożądane mutacje. Komórki E. coli zawierające pQe-240 wspomagały efektywną syntezę białka 14-kD współmigrującego na SDS-PAGE z kontrolnym białkiem otoczki Qe wyizolowanym z cząstek faga Qe.

Powstała sekwencja aminokwasów: (numer identyfikacyjny sekwencji: 17)

AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP

ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ

KYAVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY

Konstrukcja pQe-243

Plazmid pQe10 został użyty jako plazmid początkowy do konstrukcji pQe-243. Mutacja Asn10>Lys została wywołana przez odwrócone PCR. Odwrócone primery zostały zaprojektowane w odwróconych kierunkach koniec-do-końca:

5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 52) i

5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTCTAATTTTGCC-3'

PL 217 409 B1 (numer identyfikacyjny sekwencji: 53).

5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 51).

Produkt drugiego PCR został wytrawiony Xbal i Mph11031 i sklonowany do wektora ekspresyjnego p Qβ10, który został rozszczepiony przez te same enzymy restrykcyjne. Reakcje PCR zostały przeprowadzone za pomocą odczynników zestawu PCR i zgodnie z protokołem producenta (MBI Fermentas, Wilno, Litwa).

Sekwencjonowanie przy użyciu sposobu bezpośredniego włączania znacznika zweryfikowało pożądane mutacje. Komórki E. coli zawierające pQβ-243 wspomagały efektywną syntezę białka 14-kD współmigrującego na SDSD-PAGE z kontrolnym białkiem otoczki Qβ wyizolowanym z cząstek faga Qβ.

Powstała sekwencja: (numer identyfikacyjny sekwencji: 18)

AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP

ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ

KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY

Konstrukcja pQβ-250:

Plazmid pQβ-240 został użyty jako plazmid początkowy do konstrukcji pQβ-250. Mutacja Lys2 ——Arg została wywołana przez miejscowo-ukierunkowaną mutagenezę.

Primer w górę strumienia

5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 54) i primer w dół strumienia

5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 55) zostały użyte do syntezy zmutowanego fragmentu PCR, który został wprowadzony do wektora ekspresyjnego pQe-185 w unikalnych miejscach restrykcyjnych NcoI i HindIII

Reakcje PCR zostały przeprowadzone za pomocą odczynników zestawu PCR i zgodnie z protokołem producenta (MBI Fermentas, Wilno, Litwa).

Sekwencjonowanie przy użyciu sposobu bezpośredniego włączania znacznika zweryfikowało pożądane mutacje. Komórki E. coli zawierające pQe-250 wspomagały efektywną syntezę białka 14-kD współmigrującego na SDSD-PAGE z kontrolnym białkiem otoczki Qe wyizolowanym z cząstek faga Qe.

Powstała sekwencja: (numer identyfikacyjny sekwencji: 19)

ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP

ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ

KYADVTFSFTQYSTDEERAVFRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY

Konstrukcja pQe-251:

Plazmid pQe10 został użyty jako plazmid początkowy do konstrukcji pQe-251. Mutacja Lys16 —Arg została wywołana przez odwrócone PCR. Odwrócone primery zostały zaprojektowane w odwróconych kierunkach koniec-do-końca:

5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 56) i

5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 57).

Produkt drugiego PCR został wytrawiony Xbal i Mphl 1031 i sklonowany do wektora ekspresyjnego pQe10, który został rozszczepiony przez te same enzymy restrykcyjne. Reakcje PCR zostały przeprowadzone za pomocą odczynników zestawu PCR i zgodnie z protokołem producenta (MBI Fermentas, Wilno, Litwa).

PL 217 409 B1

Sekwencjonowanie przy użyciu sposobu bezpośredniego włączania znacznika zweryfikowało pożądane mutacje. Komórki E. coli zawierające pQe-251 wspomagały efektywną syntezę białka 14-kD współmigrującego na SDSD-PAGE z kontrolnym białkiem otoczki Qe wyizolowanym z cząstek faga Qe. Powstała sekwencja aminokwasów kodowana przez ten konstrukt jest ukazana w (sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 20).

Konstrukcja pQe-259):

Plazmid pQe-251 został użyty jako plazmid początkowy do konstrukcji pQe-259. Mutacja Lys2 ——Arg została wywołana przez miejscowo-ukierunkowaną mutagenezę.

Primer w górę strumienia

5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 55) zostały użyte do syntezy zmutowanego fragmentu PCR, który został wprowadzony do wektora ekspresyjnego pQe-185 w unikalnym miejscu restrykcyjnym Ncol i HindIII. Reakcje PCR zostały przeprowadzone za pomocą odczynników zestawu PCR i zgodnie z protokołem producenta (MBI Fermentas, Wilno, Litwa).

Sekwencjonowanie przy użyciu sposobu bezpośredniego włączania znacznika zweryfikowało pożądane mutacje. Komórki E. coli zawierające pQe-259 wspomagały efektywną syntezę białka 14-kD współmigrującego na SDS-PAGE z kontrolnym białkiem otoczki Qe wyizolowanym z cząstek faga Qp.

Powstała sekwencja aminokwasów: (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21)

AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP

ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNNPTACTANGSCDPSVTRQ

KYADVTFSTQYSTDEERAFVTRELAALLPSPLLIDAIDQLNPAY

Ogólne procedury ekspresji i oczyszczania Qp i mutantów Qp

Ekspresja

JM109 E. coli zostało transformowane za pomocą plazmidów ekspresyjnych białka otoczki Qp. 5 ml płynnego podłoża LB zawierającego 20 μg/ml ampicyliny posiano klonami transformowanymi plazmidami ekspresyjnymi białka otoczki Qe. Posiana hodowla była inkubowana w 37°C przez 16-24 godziny bez wstrząsania. Przygotowany materiał inokulacyjny został następnie rozcieńczony w stosunku 1:100 w 100-300 ml świeżej pożywki LB zawierającej 20 μg/ml ampicyliny i był inkubowany w 37°C przez noc bez wstrząsania. Powstały drugi materiał inokulacyjny został rozcieńczony w stosunku 1:50 w pożywce M9 zawierającej 1% kwasy Casamino i 0,2% glukozy w butelkach i był inkubowany w 37°C przez noc ze wstrząsaniem.

Oczyszczanie

Roztwory i bufory do procedury oczyszczania:

1. Bufor lityczny LB mM Tris-HCl pH 8,0 z 5 mM EDTA, 0,1% trytonX1000 i świeżo sporządzony PMSF w stężeniu 5 mikrogramów na ml. Bez lizozymu i DNAzy.

2. SAS

Nasycony siarczan amonu w wodzie

3. Bufor NET mM Tris-HCl, pH 7,8 z 5 mM EDTA i 150 mM NaCl.

4. PEG

40% (w/v) polietylenoglikolu 6000 w NET

Rozrywanie i Iiza

Zamrożone komórki zostały ponownie zawieszone w LB w ilości 2 ml/g komórek. Mieszanina została poddana działaniu ultradźwięków przy 22 kH pięć razy przez 15 sekund z przerwami 1 minutowymi w celu ochłodzenia roztworu na lodzie. Lizat był następnie wirowany przy 14 000 obrotów na minutę przez 1 godzinę przy użyciu wirnika Janecki K 60. Etapy wirowania opisane poniżej zostały przeprowadzone przy użyciu tego samego wirnika, o ile nie zaznaczono inaczej. Supernatant był przechowywany w 4°C, podczas gdy rozpadłe komórki zostały przemyte dwa razy przy użyciu LB. Po wirowaniu supernatanty lizatu i przemyte frakcje zostały zebrane.

Frakcjonowanie

Nasycony roztwór siarczanu amonu został dodany kroplami w czasie mieszania do wyżej opisanego zebranego lizatu. Dostosowano objętość SAS do jednej piątej całkowitej objętości w celu otrzyPL 217 409 B1 mania 20% nasycenia. Roztwór pozostawiono na noc i wirowano następnego dnia przy 14000 obrotów na minutę przez 20 minut. Grudka została przemyta małą ilością 20% siarczanu amonu i ponownie była wirowana. Uzyskane supernatanty zebrano i dodano kroplami SAS do otrzymania 40% nasycenia. Roztwór pozostawiono na noc i wirowano następnego dnia przy 14000 obrotów na minutę przez 20 minut. Uzyskana grudka została rozpuszczona w buforze NET.

Chromatografia

Kapsyd lub białko VLP rozpuszczone powtórnie w buforze NET umieszczono na kolumnie Sepharose CL-4B. W czasie chromatografii powstały trzy piki. Pierwszy pik głównie obejmował błony lub fragmenty błon i nie był brany pod uwagę. Kapsydy były zawarte w drugim piku, podczas gdy trzeci obejmował inne białka E. coli.

Frakcje pików zebrano i dostosowano stężenie NaCl ostatecznego stężenia 0,65 M. Dodano kroplami w czasie mieszania objętość roztworu PEG odpowiadającą połowie zebranej frakcji pików. Roztwór pozostawiono na noc bez mieszania. Białko kapsydu było sedymentowane przez wirowanie przy 14000 obrotów na minutę przez 20 minut. Następnie zostało rozpuszczone w minimalnej objętości NET i ponownie umieszczone na kolumnie Sepharose CL-4B. Frakcje pików zostały zebrane i były precypitowane siarczanem amonu przy 60% nasycenia (w/v). Po wirowaniu i ponownym rozpuszczeniu w buforze NET, białko kapsydu umieszczono na kolumnie Sepharose CL-6B w celu ponownej chromatografii.

Dializa i suszenie

Frakcje pików uzyskane powyżej zebrano i intensywnie dializowano wobec sterylnej wody i liofilizowano w celu przechowania.

Ekspresja i oczyszczanie Qβ-240

Komórki (E. coli JM 109, transformowane plazmidem pQβ-240) zostały ponownie zawieszone w LB, poddane działaniu ultradźwięków pięć razy przez 15 sekund (chłodzenie w wodzie z lodem) i były wirowane przy 13000 obrotów na minutę przez godzinę. Supernatant był przechowywany w 4°C w celu dalszego przetwarzania, podczas gdy rozpadłe komórki przemywano 2 razy 9 ml LB i ostatecznie 9 ml 0,7 M mocznika w LB. Wszystkie supernatanty zebrano i umieszczono na kolumnie Sepharose CL-4B. Zebrane frakcje pików precypitowano siarczanem amonu i wirowano. Powtórnie rozpuszczone białko było następnie dalej oczyszczane na kolumnie Sepharose 2B i ostatecznie na kolumnie Sepharose 6B. Pik kapsydu był następnie intensywnie dializowany wobec wody i liofilizowany, jak opisano wyżej. Składanie białka otoczki w kapsyd potwierdzono za pomocą mikroskopii elektoronowej.

Ekspresja i oczyszczanie Q3-243

Komórki (E. coli RR1) były ponownie zawieszane w LB i przetwarzane, jak opisano w ogólnej procedurze. Białko oczyszczano przez dwa kolejne etapy filtracji żelowej na kolumnie sepharose CL-4B i ostatecznie na kolumnie sepharose CL-2B. Frakcje pików zebrano i liofilizowano, jak opisano wyżej. Składanie białka otoczki w kapsyd potwierdzono za pomocą mikroskopii elektronowej.

Ekspresja i oczyszczanie Qβ-250

Komórki (E. coli JM 109, transformowane pQβ-250) zawieszano ponownie w LB i przetwarzano, jak opisano wyżej. Białko oczyszczano przez filtrację żelową na kolumnie sepharose CL-4B i ostatecznie na kolumnie sepharose CL-2B i liofilizowano, jak opisano wyżej. Składanie białka otoczki w kapsyd potwierdzono za pomocą mikroskopii elektronowej.

Ekspresja i oczyszczanie Qβ-259

Komórki (E. coli JM 109, transformowane pQβ-259) zawieszano ponownie w LB i poddawano działaniu ultradźwięków. Rozpadłe komórki przemywano raz 10 ml LB i drugi raz 10 ml 0,7 M mocznika w LB. Białko oczyszczano w dwóch etapach chromatografii z filtracją żelową na kolumnie Sepharose CL-4B. Białko dializowano i liofilizowano, jak opisano wyżej. Składanie białka otoczki w kapsyd zostało potwierdzone za pomocą mikroskopii elektronowej.

Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie rekombinacyjnego AP205 VLP

Klonowanie genu białka otoczki AP205 cDNA białka otoczki AP205 (CP) (numer identyfikacyjny sekwencji: 28) został złożony z dwóch fragmentów cDNA wytworzonych z RNA faga AP205 przy użyciu techniki odwróconej transkrypcjiPCR i klonowanie w komercyjnym plazmidzie pCR 4-TOPO w celu sekwencjonowania. Techniki odwróconej transkrypcji są dobrze znane osobom biegłym w dziedzinie. Pierwszy fragment, zawarty w plazmidzie p205-246, zawierał 269 nukleotydów w górę strumienia sekwencji CP i 74 nukleotydy kodujące pierwszych 24 N-końcowych aminokwasów CP. Drugi fragment, zawarty w plazmidzie

PL 217 409 B1 p205-262, zawierał 364 nukleotydy kodujące aminokwasy 12-131 CP i dodatkowe 162 nukleotydy w dół strumienia sekwencji CP. Zarówno p2-5-246, jak i p205-262 były darem od J. Klovinsa.

Plazmid 283-58 został zaprojektowany przez dwuetapowy PCR w celu stopienia obu fragmentów CP z plazmidów p205-246 i p205-262 w jedną sekwencję CP pełnej długości. Został użyty primer w górę strumienia p1.44 zawierający miejsce Ncol do klonowania do plazmidu pQb185 lub p1.4 zawierający miejsce Xbal do klonowania do plazmidu pQb10 i primer w dół strumienia p1.46 zawierający miejsce restrykcyjne HindIII (podkreślono sekwencję rozpoznającą enzymu restrykcyjnego):

P1.44 5'-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATGCAACCG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 79)

P1.45 5'-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 80)

P1.46 5'-AAAAGC TTA AGCAGT AGT ATC AGACGATAC G-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 81)

Dwa dodatkowe primery, p1.47, odprężające się przy końcu 5' fragmentu zawartego w p205-262 i p1.48 odprężający się przy końcu 3' fragmentu zawartego w plazmidzie p205-246 zostały użyte do amplifikacji fragmentów pierwszego PCR. Primery p1.47 i p1.48 są komplementarne w stosunku do siebie.

p1.47: 5'-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTTTCAGCAAGTCTG-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 82) p1.48: 5'-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGAGTTGGATCACTC-3' (numer identyfikacyjny sekwencji: 83)

W pierwszych dwóch reakcjach PCR wytworzono dwa fragmenty. Pierwszy fragment został wytworzony z primerów p1.45 i p1.48 i szablonu p205-246. Drugi fragment został wytworzony z primerów p1.47 i p1.46 i szablonu p205-262. Oba fragmenty zostały użyte jako szablony do drugiej reakcji PCR, rozszerzenia splatającego-zachodzącego na siebie, z kombinacją primerów p1.45 i p1.44 i p1.46. Produkt dwóch reakcji PCR drugiego etapu był wytrawiony Xbal i Ncol, odpowiednio, i HindIII i sklonowany z tymi samymi miejscami restrykcyjnymi do pQb10 lub pQb185, odpowiednio, dwoma wektorami ekspresyjnymi pochodzącymi z pGEM pod kontrolą promotora operonu tryptofanowego E. coli.

Otrzymano dwa plazmidy, pAP283-58 (numer identyfikacyjny sekwencji: 27) zawierające genu kodujący wt AP205 CP (numer identyfikacyjny sekwencji: 28) w pQb10 i pAP281-32 (numer identyfikacyjny sekwencji: 30) z mutacją Pro5»Thr (numer identyfikacyjny sekwencji: 29) w pQb185. Sekwencje białka otoczki zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie DNA. PAP283-58 zawiera 49 nukleotydów w górę strumienia kodonu ATG CP, w dół strumienia miejsca Xbal i zawiera przypuszczalne oryginalne miejsce wiązania mRNA białka otoczki.

Ekspresja i oczyszczanie rekombinacyjnego VLP AP205

A. Ekspresja rekombinacyjnego VLP AP205

E. coli JM109 zostało transformowane plazmidem pAP283-58. Na 5 ml płynnej pożywki LB z 20 μg/ml ampicyliny posiano pojedynczą kolonię i inkubowano w 37°C przez 16-24 godziny bez wstrząsania.

Przygotowany materiał inokulacyjny rozcieńczono 1:100 w 100-300 ml pożywki LB zawierającej 20 μg/ml ampicyliny i inkubowano w 37°C przez noc bez wstrząsania. Powstały drugi materiał inokulacyjny rozcieńczono 1:50 w pożywce 2TY zawierającej 0,2% glukozy i fosforan w celu zbuforowania i inkubowano w 37°C przez noc na wstrząsarce. Komórki zebrano przez wirowanie i zamrożono w -80°C.

B. Oczyszczanie rekombinacyjnego VLP AP205

Roztwory i bufory:

Bufor lityczny mM Tris-HCl pH 8,0 w 5 mM EDTA, 0,1% trytonX100 i PMSF 5 mikrograma na ml.

SAS

Nasycony siarczan amonu w wodzie

Bufor NET mM Tris-HCl, pH 7,8 z 5 mM EDTA i

150 mM NACI.

PEG

40% (w/v) polietylenoglikolu 6000 w NET

PL 217 409 B1

Liza:

Zamrożone komórki zawieszono ponownie w buforze litycznym w ilości 2 ml/g komórek. Mieszaninę poddano działaniu ultradźwięków 22 kH pięć razy przez 15 sekund w przerwami 1 minutowymi w celu ochłodzenia roztworu na lodzie. Lizat był następnie wirowany przez 20 minut przy 12000 obrotów na minutę przy użyciu wirnika F34-6-38 (Ependorf). Wszystkie etapy wirowania opisane niżej były przeprowadzane przy użyciu tego samego wirnika, o ile nie zaznaczono inaczej. Supernatant przechowywano w 4TC, podczas gdy rozpadłe komórki przemywano dwa razy buforem litycznym. Po wirowaniu zebrano supernatanty lizatu i przemyte frakcje.

Precypitacja amonowo-siarczanowa może być dalej stosowana w celu oczyszczenia VLP AP205. W pierwszym etapie wybierane jest stężenie, w którym VLP AP205 nie precypituje. Powstała grudka jest odrzucana. W następnym etapie wybierane jest stężenie siarczanu amonu, w którym VLP Ap205 precypituje ilościowo i VLP AP205 jest izolowane z grudki z tego etapu precypitacji przez wirowanie (14000 obrotów na minutę przez 20 minut). Otrzymana grudka jest rozpuszczana w buforze NET.

Chromatografia:

Białko kapsydu z zebranych supernatantów umieszczono na kolumnie Sepharose 4B (2,8 x 70 cm) i wymywano buforem NET przy 4 ml/godzinę/frakcję. Frakcje 28-40 były zbierane i precypitowane siarczanem amonu przy 60% nasycenia. Frakcje były analizowane przez SDS-PAGE i Western Blot z surowicą odpornościową specyficzną dla AP205 przed precypitacją. Grudka wyizolowana przez wirowanie była ponownie rozpuszczana w buforze NET i umieszczana na kolumnie Sepharose 2B (2,3 x 65 cm), wymywanie 3 ml/godzinę/frakcję. Frakcje były analizowane przez SDS-PAGE i zebrano frakcje 44-50 i precypitowano siarczanem amonu przy 60% nasycenia. Grudka wyizolowana przez wirowanie została ponownie rozpuszczona w buforze NET i oczyszczona na kolumnie Sepharose 6B (2,5 x 47 cm), wymywanie 3 ml/godzinę/frakcję. Frakcje były analizowane przez SDS-PAGE. Frakcje 23-27 zebrano, dostosowano stężenie soli do 0,5 M i precypitowano PEG 6000 dodanym z 40% materiału wyjściowego w wodzie i do ostatecznego stężenia 13,3%. Grudka wyizolowana przez wirowanie została ponownie rozpuszczona w buforze NET i umieszczona na tej samej kolumnie Sepharose 2B, jak wyżej, wymywanie w ten sam sposób. Frakcje 43-53 zostały zebrane i były precypitowane siarczanem amonu przy nasyceniu 60%. Grudka wyizolowana przez wirowanie została ponownie rozpuszczona w wodzie i otrzymany roztwór białkowy był intensywnie dializowany wobec wody. Około 10 mg oczyszczonego białka na gram komórek mogło być wyizolowane.

Badanie cząstek podobnych do wirusa metodą mikroskopii elektronowej wykazało, że były one identyczne z cząstkami faga.

P r z y k ł a d 2

Insercja peptydu zawierającego resztę lizyny do epitopu c/e1 HBcAg(1-149)

Epitop c/e1 (reszty 72 do 88) HBcAg jest umiejscowiony w regionie końcowym na powierzchni kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBcAg). Część tego regionu (prolina 79 i alanina 80) została genetycznie zastąpiona peptydem Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (numer identyfikacyjny sekwencji: 33), co prowadziło do powstania konstruktu HBcAg-Lys (numer identyfikacyjny sekwencji: 26). Wprowadzona reszta lizyny zawiera reaktywną grupę aminową w łańcuchu bocznym, która może być używana jako wewnątrz-cząsteczkowe chemiczne sieciowanie cząstek HBcAg z dowolnym antygenem zawierającym wolną grupę cysteinową.

HBcAg-Lys DNA posiadające sekwencję aminokwasów ukazaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 78 zostało wytworzone przez PCR: dwa fragmenty kodujące fragmenty HBcAg (reszty aminokwasowe 1 do 78 i 81 do 149) były amplifikowane oddzielnie przez PCR. Primery użyte do tych PCR wprowadzały również sekwencję DNA kodującą peptyd Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (numer identyfikacyjny sekwencji: 33). Fragment HBcAg (1 do 78) był amplifikowany z pEco63 przy użyciu primerów EcoRIHBcAg(s) i Lys-HBcAg(as). Fragment HBcAg (81 do 149) był amplifikowany z pEco63 przy użyciu primerów Lys-HBcAg(s) i HBcAg(1-149)Hind(as). Primery Lys-HBcAg(as) i Lys-HBcAg(s) wprowadzały komplementarne sekwencje DNA na końcach dwóch produktów PCR umożliwiając fuzję dwóch produktów PCR w następującym potem składającym PCR. Złożone fragmenty były amplifikowane przez PCR przy użyciu primerów EcoRIHBcAg(s) i HBcAg(1-149)Hind(as).

Do każdego PCR, 100 pmoli każdego oligo i 50 ng szablonowego DNA używano w 50 ml mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM dNTPs i mM MgSO4. Do obu reakcji stosowano cykle temperaturowe, jak następuje: 94°C przez 2 minuty, 30 cyklów w 94°C (1 minuta), 50°C (1 minuta), 72°C (2 minuty).

PL 217 409 B1

Sekwencje primerów:

EcoRIHBcAg(s):

(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (numer identyfikacyjny sekwencji: 58);

Lys-HBcAg(as):

(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3') (numer identyfikacyjny sekwencji: 59);

Lys-HBcAg(s):

(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3') (numer identyfikacyjny sekwencji: 60);

HBcAg(1-149)Hind(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3') (numer identyfikacyjny sekwencji: 61).

Do fuzji dwóch fragmentów PCR przez PCR użyto 100 pmoli primerów EcoRIHBcAg(s) i HbcAg-(1-149)Hind(as) ze 100 ng dwóch oczyszczonych fragmentów PCR w 50 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM dNTPs i mM MgSO4. Warunki cyklingu PCR: 94°C przez 2 minuty; 30 cykli w 94°C (1 minuta), 50°C (1 minuta), 72°C (2 minuty). Złożony produkt PCR był analizowany przez elektroforezę na żelu agarozowym, oczyszczany i wytrawiany przez 19 godzin w odpowiednim buforze za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoRI i HindIII. Wytrawiony fragment DNA został powiązany z wektorem pKK wytrawionym EcoRI/Hindlll w celu wytworzenia wektora ekspresyjnego pKK-HBcAg-Lys. Insercja produktu PCR do wektora była analizowana przez analizę restrykcyjną EcoRI/Hind i sekwencjonowanie DNA insertu.

P r z y k ł a d 3

Ekspresja i oczyszczanie HBcAg-Lys

Szczepy E. coli K802 i JM109 zostały transformowane pKK-HBcAg-Lys. 1 ml całonocnej hodowli bakterii zastosowano do posiania na pożywkę LB zawierającą 100 μg/ml ampicyliny. Ta hodowla była utrzymywana w 37°C przez 4 godziny do osiągnięcia OD przy 600 nm około 0,8. Indukcja syntezy HBcAg-Lys została przeprowadzona przez dodanie IPTG do ostatecznego stężenia 1 mM. Po indukcji bakterie dalej wstrząsano w 37°C przez 4 godziny. Bakterie zbierano przez wirowanie przy 5000 x g przez 15 minut. Grudkę zamrożono w 80°C. Grudkę rozmrożono i ponownie zawieszono w buforze litycznym bakterii (10 mM Na2HPO4, pH 7,0, 30 mM NaCl, 25% Tween 20, 10 mM EDTA) uzupełnionym 200 μg/ml lizozymu i 10 μl Benzonase (Merck). Komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej i rozrywano przez działanie ultradźwięków. Komórki E. coli zawierające plazmid ekspresyjny pKK-HBcAg-Lys lub plazmid kontrolny były użyte do indukcji ekspresji HBcAg-Lys za pomocą IPTG. Przed dodaniem IPTG próbka była usuwana z hodowli bakterii zawierających plazmid pKKHBcAg-Lys i z hodowli zawierającej plazmid kontrolny. Cztery godziny po dodaniu IPTG próbki ponownie usuwano z hodowli zawierającej pKK-HBcAg-Lys i z hodowli kontrolnej. Ekspresja białek była monitorowana przez SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie.

Lizat był następnie wirowany przez 30 minut przy 12000 x g w celu usunięcia nierozpuszczalnych rozpadłych komórek. Supernatant i grudka były analizowane przez Western blotting przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko HBcAg (YVS1841 zakupiony w Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA), co wskazywało, że znacząca ilość białka HBcAg-Lys była nierozpuszczalna. W skrócie, lizaty ze szczepów E. coli wykazujących ekspresję HBcAg-Lys i z komórek kontrolnych były wirowane przy 14000 x g przez 30 minut. Supernatant (= frakcja rozpuszczalna) i grudka (= frakcja nierozpuszczalna) zostały oddzielone i rozcieńczone próbką buforu SDS do równych objętości. Próbki były analizowane przez SDS-PAGE, a następnie Western blotting z przeciwciałem monoklonalnym YVS 1841 przeciwko HBcAg.

Klarowny lizat komórkowy był używany do wirowania stopniowo-gradientowej przy użyciu stopniowego gradientu sacharozy składającego się z 4 ml 65% roztworu sacharozy z nałożonymi 3 ml 15% sacharozy, a następnie 4 ml lizatu bakteryjnego. Próbka była wirowana przez 3 godziny przy 100000 x g w 4°C. Po wirowaniu 1 ml frakcji z góry gradientu pobierano i analizowano przez SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie. Białko HBcAg-Lys wykrywano przez barwienie Coomassie.

Białko HBcAg-Lys było wzbogacone na granicy między 15 i 65% sacharozą co wskazuje, że utworzyło cząstkę kapsydu. Większość białek bakteryjnych pozostawało w górnej warstwie gradientu wolnej od sacharozy, dlatego stopniowo-gradientowe wirowanie cząstek HBcAg-Lys prowadziło zarówno do wzbogacenia, jak i do częściowego oczyszczenia cząstek.

PL 217 409 B1

Ekspresja i oczyszczanie HBcAg-Lys na dużą skalę były przeprowadzane, jak następuje. Całonocna hodowla była sporządzana przez posianie pojedynczej kolonii w 100 ml LB, 100 μg/ml ampicyliny i utrzymywanie hodowli w 37°C przez noc. 24 ml wstępnej hodowli rozcieńczano w 800 ml pożywki LB Ampicillin następnego dnia i hodowla wzrastała do optycznej gęstości OD⁶⁰⁰ wynoszącej 0,6-0,8. Hodowla była następnie indukowana za pomocą 1 mM IPTG i pozostawiona na kolejne 4 godziny. Komórki były zbierane i poddawane lizie, zasadniczo jak opisano wyżej.

HBcAg-Lys było następnie oczyszczane przez pierwszą precypitację białka siarczanem amonu (30% nasycenia) z klarownego lizatu komórkowego, potem umieszczano ponownie rozpuszczoną grudkę na kolumnie do filtracji żelowej Sephacry S-400, Pharmacia). Zebrane frakcje ponownie precypitowano siarczanem amonu, grudkę ponownie rozpuszczano i po raz drugi umieszczano na tej samej kolumnie do filtracji żelowej. Frakcje były ostatecznie zbierane i zagęszczane i badano stężenie przy użyciu testu Bradforda (BioRad).

P r z y k ł a d 4

Konstrukcja HBcAg pozbawionego wolnych reszt cysteinowych i zawierającego wprowadzoną resztę lizyny.

Antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu A, określany tutaj jako HBcAg-Lys-2cys-Mut, pozbawiony reszt cysteiny w pozycjach odpowiadających 48 i 107 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 25 zawierający wprowadzoną resztę lizyny został skonstruowany przy użyciu następujących sposobów.

Dwie mutacje wywołano najpierw przez oddzielną amplifikację trzech fragmentów genu HBcAg-Lys sporządzoną, jak opisano wyżej w przykładzie 2 z następującymi kobinacjami primerów. Metody PCR i konwencjonalne techniki klonowania zostały zastosowane do sporządzenia genu HBcAg-Lys-2cys-Mut.

W skrócie, następujące primery zastosowano do sporządzania fragmentu 1:

Primer 1: EcoRIHBcAg(s)

CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG (numer identyfikacyjny sekwencji: 58)

Primer 2: 48as

GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC (numer identyfikacyjny sekwencji: 62)

Następujące primery zastosowano do sporządzania fragmentu 2:

Primer 3: 48s

GSGTCTCCTGAGC ATTCCTCACCTCACCATACTGCAC (numer identyfikacyjny sekwencji: 63)

Primer 4: 107as

CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC (numer identyfikacyjny sekwencji: 64)

Następujące primery zastosowano do sporządzania fragmentu 3:

Primer 5: HBcAg149hind-as

CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTGATAG (numer identyfikacyjny sekwencji: 65)

Primer 6: 107s

GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG (numer identyfikacyjny sekwencji: 66)

Fragmenty 1 i 2 zostały następnie połączone z primerami PCR EcoRIHBcAg0s) i 107 as dając fragment 4. Fragment 4 i fragment 3 zostały następnie połączone z primerami EcoRIHBcAg9s) i HBcAg149hind-as tworząc gen pełnej długości. Gen pełnej długości został następnie wytrawiony enzymami EcoRi (GAATTC) i HindIII (AAGCTT) i sklonowany do wektora pKK (Pharmacia) przeciętego w tych samych miejscach restrykcyjnych. Ekspresja i oczyszczanie HBcAg-lys-2cys-Mut były przeprowadzone, jak określono w przykładzie 3.

P r z y k ł a d 5

Konstrukcja HBcAg01 85-Lys

Antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby (HBcAg) 1-85 został zmodyfikowany, jak opisano w przykładzie 2. Część regionu (Prolina 79 i Alanina 80) epitopu c/e1 (reszty 72 do 88) została Genetycznie zastąpiona przez peptyd Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33), co powoduje powstanie konstruktu HBcAg-Lys (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 26). Wpro38

PL 217 409 B1 wadzona reszta lizyny zawiera reaktywną grupę aminową w łańcuchu bocznym, która może być używana w międzycząsteczkowym chemicznym sieciowaniu cząstek HBcAg w dowolnym antygenem zawierającym wolną grupę cysteiny. Metody PCR i konwencjonalne techniki klonowania były stosowane do sporządzania genu HBcAg1-185-Lys.

Sekwencja Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 33) została wprowadzona przez amplifikację dwóch oddzielnych fragmentów genu HBcAg z pEcoRI63, jak opisano powyżej w przykładzie 2 i następnie przez fuzje dwóch fragmentów przez PCR w celu złożenia genu pełnej długości. Stosowano następujące kombinacje primerów PCR:

Fragment 1:

Primer 1: EcoRIHBcAg(s) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58) (patrz przykład 2)

Primer 2: Lys-HBcAg(as) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59) (patrz przykład 2)

Fragment 2:

Primer 3: Lys-HBcAg(s) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60) (patrz przykład 2)

Primer 4: HBcAgwtHindIII

CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 67)

Składanie:

Primer 2: HBcAgwtHindIII (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 67)

Złożony gen pełnej długości został następnie wytrawiony enzymami EcoRI (GAATTC) i HindIII (AAGCTT) i sklonowany do wektora pKK (Pharmacia) przeciętego w tych samych miejscach restrykcyjnych.

P r z y k ł a d 6

Fuzja epitopu peptydu w regionie MIR HbcAg.

Reszty 79 i 80 HBcAg1-185 zostały zastąpione epitopem CeH sekwencji VNLTWSRASG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68). Sekwencja CeH3 wywodzi się z sekwencji trzeciej stałej domeny ciężkiego łańcucha ludzkiego IgE. Epitop został wprowadzony do sekwencji HBcAg1-185 przy użyciu sposobu składania PCR. W pierwszym etapie PCR gen HBcAg1-185 pochodzący z klonu ATCC pEco63 i amplifikowany primerami HBcAg-wt EcoRi fwd i HBcAg-wt Hind III rev został użyty jako szablon w dwóch oddzielnych reakcjach w celu amplifikacji dwóch fragmentów zawierających elementy sekwencji kodujące sekwencję CeH3. Te dwa fragmenty zostały następnie złożone w drugim etapie PCR, w reakcji składania PCR.

Kombinacje primerów w pierwszym etapie PCR: CeH3fwd z HBcAg-wt Hind III rev i HBcAg-wt EcoRI fwd w CeH3rev. W reakcji składnia PCR, dwa fragmenty wyizolowane w pierwszym etapie PCR były najpierw składane w czasie 3 cykli PCR bez zewnętrznych primerów, które były dodane potem do mieszaniny reakcyjnej na następne 25 cykli. Zewnętrzne primery: HBcAg-wt EcoRI fwd i HBcAg-wt Hind III rev.

Produkt PCR został sklonowany w pKK223.3 przy użyciu miejsc EcoRI i HindIII w celu ekspresji w E. coli (patrz przykład 2). Chimeryczne VLP ulegało ekspresji w E. coli i było oczyszczane, jak w przykładzie 2. Objętość wymywania, w której HBcAg1-185 CeH3 było wymywane z filtracji żelowej wykazywała złożenie białek fuzyjnych w chimeryczne VLP.

Sekwencje primera:

CeH3fwd:

5' GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69)

V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70)

CeH3rev:

5' ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71)

D78 E L N N G V72 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72)

HbcAg-wt EcoRI fwd:

5' CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73)

HbcAg-wt Hind III rev:

PL 217 409 B1

5' CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74)

P r z y k ł a d 7

Fuzja peptydu Αβ1-6 w regionie MIR HbcAg.

Reszty 79 i 80 HBcAg1-185 są postawione peptydem Αβ1-6 o sekwencji: DAEFRH (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76). Dwa zachodzące na siebie primery są zaprojektowane przy użyciu tej samej strategii opisanej w przykładzie 6 i białko fuzyjne jest skonstruowane przez złożenie PCR. Produkt PCR jest klonowany w wektorze pKK223.3 i jego ekspresja zachodzi w E. coli K802. Zachodzi ekspresja chimerycznych VLPs i są one oczyszczane, jak opisano w przykładzie 3.

P r z y k ł a d 8

Fuzja peptydu Αβ1-6 z końcem C białka Qe A1 skróconego pozycji 19 wydłużenia CP.

Primer odprężający się do końca 5' genu A1 Qe i primer odprężający się do końca 3' genu A1 i zawierający dodatkowo element sekwencji kodujący peptyd Αβ1-6 sekwencji DAEFRH (numer identyfikacyjny sekwencji: 75) lub GAEFGH ((numer identyfikacyjny sekwencji: 76) są używane w reakcji PCR z pQe10 jako szablonem. Produkt PCR jest klonowany w pQ310 (Kozlovska T. M. i wsp., Gene 137: 133-37 (1993)) i zachodzi ekspresja chimerycznej VLP i jest ona oczyszczana, jak opisano w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 9

Insercja peptydu Αβ1-6 pomiędzy pozycje 2 i 3 białka otoczki fr.

Komplementarne primery kodujące sekwencję peptydu Αβ1-6 sekwencji DAEFRH (numer identyfikacyjny sekwencji: 75) lub DAEFGH (numer identyfikacyjny sekwencji: 76) i zawierające kompatybilne końce Bsp119I i dodatkowe nukleotydy umożliwiające insercję w ramce są wprowadzane w miejscu Bsp119I wektora pFrd8 (Pushko, P i wsp., Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)) standardowymi technikami biologii molekularnej. Alternatywnie, części wystające wektora pFrd8 są wypełniane przy pomocy Klenow po wytrawianiu za pomocą Bsp119I i oligonuklotydy kodujące sekwencję peptydu Αβ1-6 i dodatkowe nukleotydy klonowanie w ramce są wiązane w pFrd8 po zadziałaniu przy pomocy Klenow. Klony z insertem w prawej orientacji są analizowane przez sekwencjonowanie. Ekspresja i oczyszczanie chimerycznego białka fuzyjnego w E. coli JM109 lub E. coli K802 są przeprowadzane, jak opisali Pushko P. i wsp., Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)), lecz w odniesieniu do etapów chromatografii, które są przeprowadzane przy użyciu kolumny Sepharose CL-4B lub Sephacryl S-400 (Pharmacia). Lizat komórkowy jest precypitowany siarczanem amonu i oczyszczany za pomocą dwóch kolejnych etapów oczyszczania przez filtrację żelową, podobnie do procedury opisanej dla Qe w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 10

Insercja peptydu Αβ1-6 pomiędzy pozycje 67 i 68 p1 białka TY1 w wektorze pOGS8111.

Syntetyzowane są dwa komplementarne oligonukleotydy kodujące peptyd Αβ1-6 sekwencji DAEFRH (numer identyfikacyjny sekwencji: 75) lub DAEFGH (numer identyfikacyjny sekwencji: 76) z końcami kompatybilnymi z miejscem NheI pOGS811. Dodatkowe nukleotydy są dodawane w celu umożliwienia insercji w ramce sekwencji kodującej peptyd Αβ1-6 zgodnie z opisem w EP 677'111. Aminokwasy AS i SS po bokach wprowadzonego epitopu są kodowane przez zmienione miejsca NheI będące wynikiem insercji oligonukleotydu w genie TyA(d) pOGS8111.

POGS8111 jest transformowany w szczepie MC2 S. cerevisiae w celu ekspresji chimerycznej VLP Ty, jak opisano w EP0677111 i jego odnośnikach. Chimeryczne VLP Ty jest oczyszczane przez ultrawirowanie z gradientem sacharozy, jak opisano w EP 677'111.

P r z y k ł a d 11

Insercja peptydu Αβ1-6 do głównego białka kapsydu L1 papillomawirusa typu 1 (BPV-1).

Sekwencja kodująca peptyd Αβ1-6 posiadająca DAEFRH (numer identyfikacyjny sekwencji: 75) lub DAEFGH (numer identyfikacyjny sekwencji: 76) jest podstawiana do sekwencji kodującej aminokwasy 130-136 genu L1 BPV-1 klonowanego w wektorze pFastBAc1 (GIBCO/BRL), jak opisano (Chackerian, B. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999)). Sekwencja konstruktu jest weryfikowana przez analizę sekwencji nukleotydów. Tworzony jest rekombinacyjny bakulowirus przy użyciu systemu bakulowirusowego GIBCO/BRL, jak opisuje wytwórca. Chimeryczne VLPs są oczyszczane z komórek zainfekowanych bakulowirusem Sf9, jak opisują Kirnbauer, R. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12180-84 (1992) i Greenstone, H. L. i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1800-05 (1998).

PL 217 409 B1

P r z y k ł a d 12

Immunizacja myszy peptydem Αβ1-6 stopionym z VLPs.

Chimeryczne VLPs zawierające peptyd Αβ1-6 o sekwencji DAEFRH (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75) lub DAEFGH (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76) wytworzone w przykładach 7-11 są używane do immunizacji myszy transgenicznych w odniesieniu do ludzkiego APP lub myszy C57/BL6, jak opisano w przykładzie 13 i 14. Osocza uzyskane od immunizowanych myszy są analizowane przez test ELISA specyficzny dla peptydu Αβ1-6 lub Αβ1-40 lub Αβ1-42, jak opisano w przykładzie 13.

Ochronne działanie szczepionki jest badane przez immunizację dużej grupy myszy APP transgenicznych w stosunku do człowieka, jak opisano w przykładzie 14.

P r z y k ł a d 13

Sprzęganie peptydu Αβ1-6 z VLP Qe (QeAe1-6) i immunizacja myszy za pomocą QeAe1-6

A. Sprzęganie peptydu Αβ1-6 VLP Qp

Peptyd Αβ1-6 (sekwencja: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77) został chemicznie zsyntetyzowany; początkowa grupa NH2 wskazuje, że peptyd posiada wolny koniec N i końcowa grupa NH2 wskazuje, że peptyd posiada amidowany koniec karboksylowy. Przeprowadzano ekspresję i oczyszczanie VLP Qp, jak opisano w przykładzie 1. VLP Qe w 20 mM Hepes, 150 ml NaCl, pH 8,2 (HBS, pH 8,2) reagował w stężeniu 2 mg/ml (określonym w teście Bradforda) z 1,43 mM SMPH (Pierce, Rockford. IL) rozcieńczonym z początkowego stężenia w DMSO przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Mieszanina reakcyjna była następnie dializowana wobec bufora HBS, pH 8,2 w 4°C i reagowała z 0,36 mM peptydu Αβ1-6 rozcieńczonym w mieszaninie reakcyjnej z początkowych 50 mM w DMSO. Reakcja sprzęgania była pozostawiona na 2 godziny w 15°C i następnie mieszaninę reakcyjną dializowano dwa razy po dwie godziny wobec 1000-krotnej objętości HBS, pH 8,2 i zamrażano w ciekłym azocie w próbkach przeznaczonych do przechowywania w - 80°C do momentu dalszego używania.

Próbkę rozmrażano i oceniano sprzęganie peptydu Αβ1-6 z podjednostkami VLP Qe za pomocą SDS-PAGE i mierzono stężenie białka w teście Bedforda. Wynik reakcji sprzęgania jest ukazany na fig. 1.

Fig. 1 ukazuje analizę SDS-PAGE reakcji sprzęgania peptydu Αβ1-6 i VLP Qe. Próbki są badane w warunkach redukujących na żelu 16% Tris-glicyna barwionym commassie brilliant blue. Pasmo 1 jest markerem białkowym z odpowiednimi masami cząsteczkowymi wskazanymi na lewej granicy żelu; pasmo 2, derywatyzowane białko VLP Qe; pasmo 3, supernatant reakcji sprzęgania białka VLP Qe z peptydem Αβ1-6; pasmo 4, grudka reakcji sprzęgania białka VLP Qe z peptydem Αβ1-6. Produkty sprzęgania odpowiadające sprzęganiu peptydów 1, 2 i 3 na monomer są wskazane strzałkami na figurze. Średnio więcej niż 1,5 peptydu na podjednostkę uległo sprzęganiu; prawie nie pozostały niesprzężone podjednostki.

B. Immunizacja myszy peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP Qp i analiza odpowiedzi immunologicznej.

VLP Qe sprzężone z peptydem Αβ1-6 (określone tu jako Qb-A3-1-6) wstrzyknięto podskórnie myszom (3 myszy) w dniu 0 i 14. Peptyd Αβ1-6 był sprzężony z białkiem VLP Qp, jak opisano wyżej. Każda mysz (C57BL/6) była immunizowana 10 μg szczepionki rozcieńczonej w PBS do 200 pl. U myszy wywoływano krwawienie zagałkowe w dniu 21 i mierzono miano przeciwciał specyficznych dla peptydu Αβ1-6 testem ELISA wobec Αβ1-6. Peptyd Αβ1-6 był sprzęgany z bydlęcą RNAzą A przy użyciu chemicznego środka sieciującego sulfo-SPDP. Płytki ELISA były pokrywane sprzężonymi preparatami RNAzy w stężeniu 10 pg/ml. Płytki były blokowane, a następnie inkubowane seryjnie rozcieńczanymi osoczami myszy. Związane przeciwciała były wykrywane znakowanymi enzymatycznie przeciwciałami przeciwko IgG myszy. Jako kontrola służyły osocza tych samych myszy sprzed immunizacji. Wyniki są ukazane na fig. 2.

Fig. 2 ukazuje analizę ELISA przeciwciała IgG specyficznych dla peptydu Αβ1-6 w osoczach myszy immunizowanych przeciwko peptydowi Αβ1-6 sprzężonemu z VLP Qp. Ukazane są wyniki dla trzech myszy immunizowanych (A1-A3), osocze sprzed immunizacji jest oznaczone jako „pre” na figurze; ukazany jest wynik dla jednego osocza sprzed immunizacji. Porównanie osocz sprzed immunizacji z osoczami myszy immunizowanych ,Φβ-Αβ1-6” wykazuje, że można uzyskać silną, specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko peptydowi Αβ1-6 przy nieobecności adiuwantu.

PL 217 409 B1

C. ELISA wobec peptydu Αβ1-40

Sporządzono zapas ludzkiego peptydu Αβ1-40 lub Αβ1-42 w DMSO i rozcieńczono w buforze powlekającym przed użyciem. Płytki ELISA powlekano 0,1 μg/studzienkę peptydu Αβ1-40. Płytki blokowano i następnie inkubowano z seryjnie rozcieńczonym osoczem myszy otrzymanym powyżej. Związane przeciwciała były wykrywane enzymatycznie znakowanym przeciwciałem przeciwko IgG myszy. Jako kontrola służyły również osocza uzyskane przed szczepieniem. Wyliczano rozcieńczenie osocza wykazujące średnio trzy odchylenia standardowe powyżej wartości początkowej i określono jako „miano ELISA”. W osoczach sprzed immunizacji nie wykryto specyficznych przeciwciał. Miano uzyskane dla trzech myszy wynosiło 1 : 100000 wykazując silną, specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko Αβ1-40. I tak, immunizacja Αβ1-6 sprzężonym z VLP Qβ wywołuje silne miana przeciwciała reagujących krzyżowo z Αβ1-40.

Fig. 3 ukazuje wynik ELISA. Sygnał ELISA jako gęstość przy 405 nm uzyskany dla osocza trzech myszy (A1-A3) immunizowanych peptydem Αβ1-6 sprzężonym z VLP Qβ jak opisano wyżej, jest przedstawiony na wykresie dla każdego rozcieńczenia, zaznaczonego na osi x. Ukazany jest wynik dla trzech myszy, u których wywołano krwawienie w dniu 21. Uwzględniono również osocze sprzed immunizacji. Miano przeciwciał w osoczach zostało określone jak opisano wyżej i wynosiło 1:100000 dla wszystkich trzech myszy.

P r z y k ł a d 14

Immunizacja myszy transgenicznych w odniesieniu do ludzkiego APP

Samice myszy APP23 w wieku 8 miesięcy, które są nosicielami ludzkiego transgenu APP (Sturchler-Pierrat i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 (1997)) są używane do szczepień. Myszom wstrzykuje się podskórnie 25 μg szczepionki rozcieńczonej w sterylnym PBS i 14 dni później podaje się dawkę przypominającą szczepionki. Myszom pobiera się krew z żyły ogonowej przed immunizacją i 7 dni po iniekcji przypominającej. Osocza są analizowane pod kątem obecności przeciwciał specyficznych dla Αβ1-6, Αβ1-40 i Ap1-42 przez ELISA, jak opisano w przykładzie 13.

P r z y k ł a d 15

Sprzęganie mysiego Αβ1-6 z VLP Qβ, wstrzykiwanie szczepionki myszom i analiza odpowiedzi immunologicznej.

Mysi peptyd Αβ1-6 (sekwencja: NH2-DAEFGHGGC-CONH2) (numer identyfikacyjny sekwencji: 78) jest chemicznie syntetyzowany i używany do sprzęgania z VLP Qβ, jak opisano w przykładzie 13. Szczepionka jest wstrzykiwana myszom C57BL/6 i określane jest miano uzyskanych przeciwciał przeciwko mysiemu Αβ1-6, mysiemu Ap1-40 i mysiemu Ap1-42. Immunizacja i test ELISA są przeprowadzane, jak opisano w przykładzie 13.

P r z y k ł a d 16

Wiązanie osocza uzyskanych przeciwko Αβ1-6 z płytkami myszy transgenicznych w odniesieniu do ludzkiego APP i płytkami AD

Immunochemia w wycinkach mózgu

Kolejne wycinki mózgu w parafinie myszy heterozygotycznych APP23 w wieku 18 miesięcy i wycinków kory węchomózgowia pacjenta z AD w stadium III Braaka (Institute of Pathology, University Basel) były używane do barwienia. Antygenowość była zwiększana przez działanie na ludzkie wycinki mózgu stężonym kwasem mrówkowym przez pięć minut i ogrzewanie mysich wycinków mózgu mikrofalami w 90°C przez 3 minuty. Osocza myszy uzyskane przeciwko ludzkiemu Αβ1-6 (otrzymane, jak opisano w przykładzie 13) rozcieńczano 1:1000 w PBS z 3% osoczem kozy i inkubowano przez noc. Po przemyciu wycinki były inkubowane przez godzinę z biotynylowanym wtórnym przeciwciałem anty-mysim rozcieńczonym 1:200 w PBS. Po przemyciu wycinki były dalej przetwarzane techniką peroksydazy awidyno-biotynowej (ABC-Elite Kit PK6100; Vector Laboratories). Ostatecznie wycinki poddano reakcji z substratem wzmocnionym metalem Diaminobenzidine (DAB) (Boehringer, Code 1718096), barwiono kontrastowo Hemalum, odwodniono, wyklarowano w ksylenie i przykryto szkiełkiem.

Wynik barwienia histologicznego jest ukazany na fig. 4 A i B. Wycinki były barwione z osoczami trzech myszy immunizowanych przeciwko ludzkiemu Αβ1-6 sprzężonemu z VLP Qβ. Każde osocze barwiło pozytywnie płytki amyloidu od myszy transgenicznych i z AD. Ukazane są wyniki jednego z trzech osoczy. Osocza uzyskane przeciwko ludzkiemu Αβ1-6 wyraźnie barwią płytki amyloidu myszy transgenicznych w odniesieniu do ludzkiego APP23, jak również płytki amyloidu od pacjentów z AD. Osocza sprzed immunizacji były negatywne. Pozakomórkowe płytki amyloidu i izolowane naczynia krwionośne są barwione przez przeciwciała.

PL 217 409 B1

P r z y k ł a d 17

Specyficzność osoczy uzyskanych przeciwko ludzkiemu Αβ1-6 oceniana przez histologię płytek mysich

Immunochemia w wycinkach mózgu

Kolejne wycinki mózgu w parafinie heterozygotycznych myszy APP23 w wieku 3 miesięcy i 18 miesięcy z nadmierną ekspresją ludzkiego APP były barwione, jak opisano w przykładzie 16 z reprezentatywnym osoczem myszy uzyskanym przeciwko ludzkiemu Αβ1-6, jak opisano w przykładzie 13 lub z przeciwciałem poliklonalnym królika specyficznym dla ostatnich 20 aminokwasów mysiego lub ludzkiego APP i które dlatego nie rozpoznaje Αβ. Wycinki inkubowane z przeciwciałem poliklonalnym królika były traktowane, jak opisano w przykładzie 16, z wyjątkiem użycia biotynylowanego wtórnego przeciwciała anty-króliczego (BA1000, Vector Laboratories).

Wynik barwienia histologicznego jest ukazany na fig. 5 A, B, B, D i E. Αβ1-6 zaznaczony u dołu po lewej stronie wycinków wskazuje, że osocza uzyskane przeciwko Αβ1-6 został użyte do barwienia, podczas gdy „Pab” wskazuje, że wycinki zostały zabarwione przeciwciałem poliklonanlnym specyficznym dla ostatnich 20 aminokwasów mysiego lub ludzkiego APP odpowiadającym pozycjom 676-695 w APP695·

Porównanie barwienia wycinków od myszy w wieku 18 miesięcy (fig. 5 A i C) wykazuje, że osocza uzyskane przeciwko Αβ1-6 nie reagują krzyżowo z APP, którego ekspresja zachodzi w mózgu, który jest jednakże barwiony przez kontrolne przeciwciało poliklonalne. Fig. 5 B ukazuje wycinek mózgu od myszy w wieku 3 miesięcy, w punkcie czasowym, w którym złogi amyloidu nie są jeszcze widoczne, barwiony przeciwciałem poliklonalnym specyficznym dla APP.

Fig. 5 D i 5 E ukazują powiększenie warstwy piramidalnej CA1 hipokampa z fig. 5A i fig. 5B, odpowiednio.

P r z y k ł a d 18

A. Sprzęganie peptydu Αβ1-6 z białkiem fr kapsydu

Roztwór 120 μΜ białka fr kapsydu w 20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7,2 jest poddawany reakcji przez 10 minut z 10-krotnym nadmiarem molowym SMPH (Pierce), rozcieńczany z roztworu zbiorczego w DMSO, w 25°C na wstrząsarce wahadłowej. Roztwór reakcyjny jest następnie Dializowany dwa razy przez 2 godziny wobec 1 l 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,2 w 4°C. Dializowana mieszanina reakcyjna fr jest następnie poddawana reakcji z 5-krotnym nadmiarem molowym peptydu Αβ1-6 (sekwencja: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (numer identyfikacyjny sekwencji: 77) przez 2 godziny w 16°C na wstrząsarce wahadłowej. Produkty sprzęgania są analizowane przez SDS-PAGE.

B. Sprzęganie peptydu Αβ1-6 z HBcAg-Lys-2cys-Mut

Roztwór 1 ml 120 μΜ HBcAg-Lys-2cys-Mut w 20 mM Hepes. 150 mM NaCl pH 7,2 jest poddawany reakcji przez 30 minut w 10-krotnym nadmiarem molowym SMPH (Pierce), rozcieńczany z roztworu zbiorczego w DMSO, w 25°C na wstrząsarce wahadłowej. Roztwór reakcyjny jest następnie dializowany dwa razy przez 2 godziny wobec 1 l 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,2 w 4°C. Dializowana mieszanina reakcyjna HBcAg-Lys-2cys-Mut jest następnie poddawana reakcji z 5-krotnym nadmiarem molowym peptydu Αβ1-6 (sekwencja: NH2-DAeFRHGGC-CONH2) (numer identyfikacyjny sekwencji: 77) przez 2 godziny w 16°C na wstrząsarce wahadłowej. Produkty sprzęgania są analizowane przez SDS-PAGE.

C. Sprzęganie peptydu Αβ1-6 z Rzęskami

Roztwór 125 μΜ rzęsek typu 1 E. coli w 20 mM Hepes, pH 7,4, jest poddawany reakcji przez 60 minut w 50-krotnym nadmiarem molowym środka sieciującego SMPH (Pierce), rozcieńczany z roztworu zbiorczego w DMSO, temperaturze pokojowej na wstrząsarce wahadłowej. Mieszanina reakcyjna jest odsalana na kolumnie PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech). Frakcje zawierające białko wymywane z kolumny są zbierane i odsolone derywatyzowane białko rzęsek jest poddawane reakcji z 5-krotnym nadmiarem molowym peptydu Αβ1-6 (sekwencja: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (numer identyfikacyjny sekwencji: 77) przez 2 godziny w 16° na wstrząsarce wahadłowej. Produkty sprzęgania są analizowane przez SDS-PAGE.

D. Immunizacja myszy peptydem Αβ1-6 sprzężonym z białkiem fr kapsydu, HBcAg-LLys-2cys-Mut lub rzęskami

Peptyd Αβ1-6 sprzężony z białkiem fr kapsydu, HBcAg-LLys-2cys-Mut lub rzęskami, jak opisano wyżej jest wstrzykiwany podskórnie myszom (3 myszy) w dniu 0 i 14. Każda mysz (C57BL/6) jest immunizowana 10 gg szczepionki rozcieńczonej w PBS do 200 μ|. U myszy jest wywoływane krwawiePL 217 409 B1 nie zagałkowe i mierzone jest miano przeciwciał specyficznych dla peptydu Αβ1-6, Αβ1-40 lub Αβ1-42 przez ELISA, jak opisano w przykładzie 13.

P r z y k ł a d 19

Immunizacja małp rhesus za pomocą QβhAβ1-6

W celu zbadania indukcji przeciwciał przeciwko ludzkiemu Αβ przy użyciu szczepionki opartej na ludzkim peptydzie Αβ1-6 w przypadku, gdy Αβ1-6 jest antygenem własnym, małpy rhesus były immunizowane za pomocą QβhAβ1-6, ponieważ sekwencja Αβ jest identyczna u ludzi i małp Rhesus. Szczepionka QβhAβ1-6 została sporządzona, jak opisano w przykładzie 13. Cztery małpy Rhesus w wieku pomiędzy 10 i 15 lat, były immunizowane w dniu 0 za pomocą 50 μg szczepionki i podano dawkę przypominającą dwa razy w dniu 28 i 56 przy użyciu 25 μg szczepionki. Małpy były immunizowane podskórnie na karku. Krew od zwierząt pobierano w dniu 0 (pobranie wstępne), 42 i 70. Pobierano 4 ml krwi z żyły głowowej przedramienia. Miano przeciwciał specyficznych dla Αβ1-40 było mierzone przez ELISA zasadniczo jak opisano w przykładzie 13 przy użyciu wtórnego przeciwciała specyficznego dla małpiego IgG.

Ponieważ ludzie i małpy rhesus mają taką samą sekwencję Αβ, wytworzenie przeciwciał o wysokim mianie u małp rhesus specyficznych dla Αβ1-6 wykazuje, że immunizacja za pomocą hΑβ1-6 sprzężonego z Qβ przełamuje tolerancję wobec własnego antygenu Αβ.

Ponadto, przeciwciała rozpoznające pełnej długości Αβ są wytwarzane ze sprzężonym fragmentem Αβ1-6 u naczelnych.

Wyniki ELISA są ukazane na fig. 6. Miana przeciwciał specyficznych dla Αβ1-40 mierzonych w osoczach 4 małp (1-4) immunizowanych za pomocą QβhAβ1-6 i średnia mian 4 małp są przedstawione na diagramie. Miana są przedstawione jako miana OD50. OD50 jest rozcieńczeniem przeciwciał, przy którym sygnał osiąga połowę maksymalnej wartości. Maksymalna wartość (OD max) została uzyskana w odniesieniu do osocza pochodzącego od małpy immunizowanej QβhAβ1-27 i rozpoznającego również Αβ1-40 i była mierzona na tej samej płytce ELISA.

Od dwóch małp (opisanych wyżej) pobierano krew w dniach 97, 110, 117, 124, 138, 143, 152, 159, 166 i otrzymały one trzecią dawkę przypominającą 25 ąg szczepionki w dniu 110. Osocza były zbierane 999 ml) i używane do oczyszczania przez powinowactwo przeciwciał specyficznych dla Αβ1-6. Te przeciwciała były używane do barwienia immunohistochemicznego w stężeniu 1,5 μg/ml i do wykrywania używano biotynylowanego wtórnego przeciwciała anty-małpiego. Wycinki mózgów w parafinie od heterozygotycznych myszy APP23 i pacjenta z AD - stadium III Braaka - były używane do barwienia. Barwienie specyficzne dla płytek było obserwowane zarówno w wycinkach mózgów myszy APP23 i w wycinku mózgu pacjenta z AD (fig. 7).

Wynik analizy histologicznej jest ukazany na fig. 7 A i B. Na fig. 7A ukazane jest barwienie płytek od myszy transgenicznych w odniesieniu do ludzkiego APP (szczep APP23) wyżej opisaną surowicą odpornościową specyficzną dla Αβ1-6 oczyszczoną przez powinowactwo. Fig. 7 B ukazuje barwienie ludzkich płytek AD z tą samą oczyszczoną surowicą odpornościową. Oczyszczona surowica odpornościowa była używana w stężeniu 1,5 μg/ml w obu wypadkach. Typowe płytki są zaznaczone strzałką na obu figurach.

P r z y k ł a d 20

Sprzęganie mysiego Αβ1-6 z VLP AP205, immunizacja myszy i analiza odpowiedzi immunologicznej

A. Sprzęganie mysiego peptydu Αβ106 z VLP AP205

Mysi peptyd Αβ1-6 (τηΑβ1-6, sekwencja: NH2-DAEFGHGGC-CONH2 (numer identyfikacyjny sekwencji: 78) został chemicznie zsyntetyzowany; początkowa grupa NH2 wskazuje, że peptyd posiada wolny koniec N i końcowa grupa NH2 wskazuje, że peptyd posiada amidowany koniec karboksylowy). VLP AP205 (którego ekspresja i oczyszczanie jest przeprowadzane, jak w przykładzie 1) w 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 8,0 (HBS, pH 8,0) poddano reakcji w stężeniu 2 mg/ml (określono w teście Bradforda) z 2,86 mM SMPH (Pierce, Rockford IL), rozcieńczono ze 100 mM w DMSO, przez 30 minut temperaturze pokojowej (RT). Mieszanina reakcyjna była następnie dializowana dwa razy wobec 1000-krotnej objętości HBS, pH 7,4 w 4°C przez 2 godziny; powstające dializowane i derywatyzowane VLP Ap205 było błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w -20°C przez noc. Derywatyzowane VLP AP205 było rozcieńczane jedną objętością 20 mM HBS, pH 7,4 i poddawane reakcji 2 godziny w 15T w czasie wstrząsania z 719 μΜ peptydu mΑβ1-6 rozcieńczonego w mieszaninie reakcyjnej z 50 mM w DMSO. Reakcja sprzęgania była dializowana dwa razy wobec 1000-krotnej objętości HBS, pH 7,4 przez 2 godziny i przez noc. Dializowana mieszanina reakcyjna

PL 217 409 B1 była błyskawicznie zamrażana w ciekłym azocie w próbkach do przechowywania w -80°C do momentu dalszego użytkowania.

Próbka była rozmrażana i sprzęganie peptydu mAei-6 z podjednostkami VLP AP205 badano przez SDS-PAGE i stężenie białka mierzono w teście Bradforda. Wynik reakcji sprzęgania jest ukazany na fig. 8.

Fig. 8 ukazuje analizę SDS-PAGE reakcji sprzęgania peptydu mAe1-6 z VLP AP205. Próbki utrzymywano w warunkach redukujących na 16% żelu Tris-glicyna i barwiono coomassie brilliant blue. Pasmo 1 jest markerem białkowym z odpowiednimi masami cząsteczkowymi zaznaczonymi na lewej granicy żelu; pasmo 2, białko VLP AP205; pasmo 3, derywatyzowana VLP Ap205; pasmo 4, supernatant reakcji sprzęgania Ap205 z peptydem mAe1-6; pasmo 5, grudka reakcji sprzęgania VLP AP205 z peptydem mAe1-6. Na żelu nie wykryto żadnych niesprzężonych podjednostek VLP AP205, podczas gdy pasma odpowiadające kilku peptydom na podjednostki były widoczne wykazując bardzo wysoką skuteczność sprzęgania. W szczególności jest wiele więcej niż jeden peptyd na podjednostkę VLP AP205.

B. Immunizacja myszy za pomocą peptydu mAe1-6 sprzężonego z VLP AP205 i analiza odpowiedzi immunologicznej.

VLP Ap205 sprzężona z mAe1-6 została wstrzyknięta podskórnie myszom (3 myszy) w dniach 0 i 14. Peptyd mAe1-6 został sprzężony z VLP AP205, jak opisano wyżej. Każda mysz (C57BL/6) była immunizowana 25 pg szczepionki rozcieńczonej w PBS do 200 pl. U myszy wywoływano krwawienie zagałkowe w dniu 21 i mierzono miano przeciwciał specyficznych dla peptydu mAe1-6 w teście ELISA wobec mAe1-6. Peptyd mAe1-6 był sprzężony z bydlęcą RNAzą A przy użyciu chemicznego środka sieciującego sulfo-SPDP. Płytki ELISA były powlekane preparatami RNAza-mAe1-6 w stężeniu 10 pg/ml. Płytki były blokowane i następnie inkubowane z seryjnie rozcieńczonymi osoczami myszy. Związane przeciwciała były wykrywane enzymatycznie znakowanymi przeciwciałami przeciwko mysiemu IgG. Jako kontrola testowane były również osocza tych samych myszy sprzed immunizacji. Wyniki są ukazane na fig. 9.

Fig. 9 ukazuje analizę ELISA przeciwciał IgG specyficznych dla peptydu mAe1-6 w osoczach myszy immunizowanych za pomocą peptydu mAe1-6 sprzężonego z VLP AP205. Wyniki ukazane są dla osocza trzech immunizowanych myszy zebranych w dniu 21 (A1 d21 -A3 d21), osocze sprzed immunizacji jest oznaczone jako „pre imm” na figurze; ukazany jest wynik dla jednego osocza sprzed immunizacji. Porównanie osocza sprzed immunizacji z osoczem myszy immunizowanych mAe1-6 sprzężonym z VLP AP205 wykazuje że silna, specyficzna odpowiedź przeciwciała przeciwko peptydowi mAe1-6, który jest antygenem własnym, może być uzyskana przy nieobecności adiuwantu. Ponadto, sprzęganie peptydu własnego z VLP Ap205 prowadzi do przełamania tolerancji wobec tego peptydu i do bardzo silnej, specyficznej odpowiedzi immunologicznej. I tak, VLP Ap205 jest odpowiednia do wytwarzania wysokich mian przeciwciała przeciwko peptydom Αβ przy nieobecności adiuwantu.

P r z y k ł a d 21

Immunizacja za pomocą QehAe1-6 redukuje liczbę płytek amyloidu u transgenicznych myszy z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London”.

Ten przykład wykazuje, że immunizacja za pomocą QehAe1-6 w modelu mysim z rozsianymi płytkami amyloidu w przebiegu choroby podobnej do choroby Alzheimera (negatywny przy barwieniu Congo-Red) powodowała znaczą redukcję gęstości płytek w regionie kory nowej i regionie podkorowym mózgu Histologiczne występowanie rozsianych płytek amyloidu jest wyróżniającą cechą patologii mózgu z AD (Selkoe, 1994, Annu. Rev. Neurosci. 17: 489-517) i, dlatego, przykład wykazuje, że immunizacja za pomocą QehAe1-6 stanowi właściwe podejście do leczenia choroby Alzheimera.

Aby ocenić skuteczność terapeutyczną immunizacji za pomocą Qe-Ae1-6 używano myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London” pod kontrolą mysiego promotora Thy-1 (APP24; K670N/M671L; V7171, patent Nr W0980-36-4423). Ten szczep myszy charakteryzuje się dużą ilością płytek amyloidu w korze nowej, hipokampie, skorupie ogoniastej i wzgórzu wzrokowym w wieku 18 miesięcy. Płytki mogą być po raz pierwszy obserwowane w wieku 9 miesięcy. Histologicznie, płytki amyloidu w myszy APP24 są głównie typu rozsianego, tj. są negatywne w barwieniu Congo-Red. W większym stopniu można również spotkać spoiste płytki (pozytywne w barwieniu Congo-Red).

Ludzki peptyd Αβ1-6 sprzężony z VLPQe (QehAe1-6) wytworzono, jak opisano w przykładzie 13. W kategoriach zastosowanej procedury eksperymentalnej, której opis nie jest potrzeby do opisania lub

PL 217 409 B1 wyjaśnienia wynalazku, myszy transgeniczne APP w wieku 9,5 miesiąca otrzymały iniekcję podskórną w dniu 0 25 μg QehAe1-6 w soli zbuforowanej fosforanem (PBS) (podawaną jako 2 x 100 μl na mysz) (n = 16) lub jako negatywna kontrola z PBS (podawana 2 x 100 μl na mysz) (n = 9) lub cząstkę Qe podobną do wirusa pozbawioną sprzężonego antygenu (n = 11). Myszom następnie podano iniekcje 25 μg szczepionki QehAe1-6, Qe lub PBS w dniach 15, 49, 76, 106, 140, 169, 200, 230, 259 i 291. Od zwierząt pobierano krew na 1-2 dni przed pierwszą immunizacją (dzień 0) i w dniach 56, 90, 118, 188, 214, 246 i 272 z żyły ogonowej. Osocze krwi było również pobierane w dniu 305, w którym pobierano również mózgi do badań histopatologicznych (wiek myszy w tym czasie: 19,5 miesiąca).

Miano przeciwciał specyficznych dla Αβ1-40 było mierzone w teście ELISA, jak opisano w przykładzie 13. Wyniki testu ELISA są ukazane na fig. 10. Miana przeciwciał specyficznych dla Αβ1-40 lub Αβ1-42 mierzone w osoczach myszy immunizowanych za pomocą QehAe1-6 są ukazane na diagramie. Miana są przedstawione jako miana OD50%. OD50% jest rozcieńczeniem przeciwciał, przy którym sygnał osiąga połowę maksymalnej wartości. Maksymalna wartość (OD max) została uzyskana z przeciwciała referencyjnego rozpoznającego Αβ1-40 i Ab42 i była mierzona na tej samej płytce ELISA. U wszystkich myszy immunizowanych QehAe1-6 występowały miana OD50% powyżej 1:8000 (miana w osoczu sprzed immunizacji były poniżej 1:100) wykazując jednolitą reakcję przeciwciał na QehAe1-6 nawet u starych myszy APP24 (fig. 10). Średnie miana OD50% w grupie immunizowanej były w zakresie 1:20000 do 1:50000 w całym okresie immunizacji.

W celu policzenia płytek amyloidu mózgi zostały ustalone przez zanurzenie w 4% formaldehydzie w 0,1 M PBS w 4°C. Po odwodnieniu etanolem mózgi były zanurzane w parafinie i krojone równolegle na mikrotomie przy odstępach 4 μm. Wycinki umieszczano na szkiełkach powierzchniowych i suszono w 37°C. Wycinki przemywano w PBS i antygenowość wzmacniano przez ogrzewanie mikrofalami w 90°C przez 3 minuty w 0,1 M w buforze kwasu cytrynowego. Surowice odpornościowe NT11 (anty Αβ1-40, Sturchler-Pierrat i wsp., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292) były rozcieńczane 1:1000 w PBS z 3% osoczem kozy i inkubowane przez noc w 4°C. Po przemyciu wycinki inkubowano przez godzinę z biotynylowanym wtórnym przeciwciałem przeciwko króliczemu IgG (BA1000, Vector Laboratories) rozcieńczonym 1:200 w PBS. Po przemyciu, wycinki były dalej przetwarzane techniką peroksydazy awidyno-biotynowej (ABC-Elite Kit PK6100; Vector Laboratories). Ostatecznie, wycinki poddawano reakcji ze wzmocnionym metalem substratem Diaminobenzidine (DAB) (Boehringer, Code 1718096), barwiono kontrastowo Hemalum, odwadniano, klarowano w ksylenie i nakrywano szkiełkiem. Systematyczne-Iosowe serie wycinków mózgów w trzech różnych płaszczyznach anatomicznych na zwierzę były używane do analizy. Płytki amyloidu były liczone przy użyciu analizatora obrazu MCID (Imaging Research, Broc University, Ontario-Canada, Program Version M5 elite). Obraz mikroskopowy był digitalizowany przy użyciu kamery CCD czarnobiałej Xillix i przechowywany przy rozdzielczości 640x480 pikseli z poziomem szarości 256. Wielkość pikseli była kalibrowana przy użyciu mikrometru wynikowego przy powiększeniu 5x (Leica Neoplan Objective). Przy użyciu mikroskopu napędzanego silnikiem w celu dokładnego umiejscowienia pól przylegających do obiektu analizowano całą korę nową i jądro węchowe każdego wycinka. Anatomiczną powierzchnię każdego pola obiektu określano manualnie. Przykładowa powierzchnia każdego indywidualnego wycinka była określana przez manualne ustalenie granicy (poziom szarości) pomiędzy immunopozytywnymi płytkami amyloidu i podłożem tkanki. Izolowane artefakty tkankowe były wykluczane przez manualny obrys. Surowe dane mierzone jako poszczególne ilości (złogi amyloidu) i proporcjonalne wartości powierzchni (immunopozytywny amyloid/kora lub jądro węchowe).

₃

Dane każdej myszy były normalizowane do liczby złogów (płytek) na mm³ i całkowitą powierzchnię płytek w % całej kory nowej. Myszy immunizowane QehAe1-6 wykazywały znaczną redukcję złogów amyloidu w korze i obszarze podkorowym w porównaniu z grupami kontrolnymi, którym wstrzyknięto PBS lub Qe (fig. 11). Zarówno średnia ilość złogów, jak i całkowita powierzchnia płytek były znacznie zredukowane o 80-98% w porównaniu z grupą PBS w korze, skorupie ogoniastej, hipokampie i wzgórzu wzrokowym (p<0,001 vs. grupa PBS, test Manna-Whitney'a; fig. 12).

W drugim badaniu myszy transgeniczne APP24 w wieku 13,5 miesiąca otrzymywały iniekcje podskórne w dniu 0 25 μg QehAe1-6 w soli zbuforowanej fosforanem (PBS) (podawanie 2x100 μl na mysz) (n = 15) lub PBS jako kontrolę negatywną (podawanie 2x100 μl na mysz) (n = 15). Myszom podawano podskórnie 25 μg szczepionki QehAe1-6 lub PBS w dniach 16, 46, 76, 109, 140 i 170. Od zwierząt pobierano krew na 1-2 dni przed pierwszą immunizacją (dzień 0) i w dniach 31, 59, 128 i 154 z żyły ogonowej. Pobierano również osocze krwi w dniu 184, w którym również pobierano mózgi do badań histopatologicznych (wiek myszy w tym czasie: 19,5 miesiąca). Miano przeciwciał specy46

PL 217 409 B1 ficznych dla Αβ1-40 było określane i wyrażane, jak opisano wyżej i ponownie stwierdzono, że wszystkie immunizowane myszy reagują na immunizację QβhAβ1-6 z mianami osocza OD50% co najmniej powyżej 1:2000 (nie ukazano). Średnie miana OD50% były w zakresie 1:10000 w całym okresie immunizacji. Liczenie złogów amyloidu wykonano, jak opisano wyżej. W porównaniu z eksperymentem, w którym immunizację rozpoczęto wcześniej (tj. w wieku 9,5 miesiąca), redukcja złogów płytek (- 55%) i powierzchni (-32%) była mniejsza w korze nowej, lecz mimo to silnie wyrażona (fig. 13) i wysoce znacząca (p>0,001 vs. PBS, test Manna-Whitney'a). W regionach podkorowych złogi płytek i powierzchnia były zredukowane o 60-90% w grupie immunizowanej QβhAβ1-6. Bardziej nasilony efekt w tych regionach w porównaniu z korą jest prawdopodobnie związany z bardziej przewlekłym czasem tworzenia się płytek w tych regionach.

Reasumując, oba eksperymenty wykazują, że immunizacja za pomocą QβhAβ1-6 myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London” znacznie redukuje występowanie złogów amyloidu u tych myszy.

Fig. 10: miana przeciwciał przeciwko Αβ40/42 w osoczu (OD50%) u myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London”. Myszy były immunizowane za pomocą QβhAβ1-6 w wieku pomiędzy 9,5 a 19 miesięcy. Ukazane są indywidualne wartości (czarne kropki) i rysunki w prostokątach, gdzie końce prostokątów określają 25 i 75 percentyl, w linią w środkowym i błędnym prostokącie (warstwy zewnętrzne ukazane jako kropki).

Figura 11: barwienie histochemiczne płytek amyloidu w równoległych wycinkach mózgu. Równoległy wycinek mózgu z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London” immunzowanych Qβ (A) lub szczepionką QβhAβ1-6 (B) jest ukazany na figurze.

Figura 12: liczenie złogów amyloidu u myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London” po immunizacji pomiędzy 9,5 a 19 miesiącem życia. (A) Gęstość płytek w korze. (B) Powierzchnia płytek w korze. (C) Gęstość płytek w skorupie ogoniastej. (D) Powierzchnia płytek w skorupie ogoniastej. (E) Gęstość płytek w hipokampie.

(F) Powierzchnia płytek w hipokampie. (G) Gęstość płytek we wzgórzu wzrokowym. (H) Powierzchnia ₂ płytek we wzgórzu wzrokowym. Gęstość płytek jest wyrażona w płytkach/mm², powierzchnia płytek w procentach powierzchni tkanki pokrytej amyloidem beta. Dane są ukazane jako poszczególne wartości (czarne kropki) i rysunki w prostokątach. Końce prostokątów określają 25 i 75 percentyl, z linią w środkowym i błędnym prostokącie określającą 10 i 90 percentyl. ** p<0,001 (test Manna-Whitney'a sumy rang). PBS, n = 9, Qβ, n = 11, QβhAβ1-6, n = 16.

P r z y k ł a d 22

Immunizacja za pomocą QβhAβ1-6 redukuje płytki amyloidu u myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish/London”.

Przykład wykazuje, że immunizacja za pomocą QβhAβ1-6 jest właściwym podejściem do leczenia choroby Alzheimera nawet, gdy immunizacja jest zapoczątkowywana w bardzo zaawansowanym stadium patologii płytek amyloidu. Proces odkładania płytek amyloidu w modelu AD u myszy używanym w tym przykładzie zaczyna się w wieku około 6 miesięcy (Sturchler-Pierrat i wsp., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292). W badaniu opisanym tutaj immunizacja za pomocą QβhAβ1-6 została zapoczątkowana w wieku 18 miesięcy, gdy wiele spoistych płytek utworzyło się już w korze. Przykład również wykazuje zdolność QβhAβ1-6 do indukowania przeciwciał Αβ40/42 u bardzo starych zwierząt (nie było niereagujących zwierząt wśród 19 myszy).

Aby ocenić działanie terapeutyczne immunizacji za pomocą QβhAβ1-6 używano myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu (APP23; K670N/M671L, Sturchler-Pierrat i wsp., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292). Patologia podobna do choroby Alzheimera u tych myszy została obszernie scharakteryzowana (Calhoun i wsp., 1998, Nature 395: 755-756; Phinney i wsp., 1999, J. Neurosci. 19: 8552-8559; Bondolfi i wsp., 2002, J. Neurosci. 22: 515-522).

Ludzki peptyd Αβ1-6 sprzężony z VLP Qβ (QβhAβ1-6) został wytworzony, jak opisano w przykładzie 13. W kategoriach zastosowanej procedury eksperymentalnej, której opis nie jest potrzebny do opisania i zrozumienia wynalazku, myszy transgeniczne APP23 w wieku 18 miesięcy otrzymywały iniekcje podskórne w dniu 0 25 μg QβhAβ1-6 rozpuszczonego w soli zbuforowanej fosforanem (podawanie 2x100 μl na mysz) (n = 19) lub sól zbuforowaną fosforanem jako negatywną kontrolę (n = 17) i dawkę przypominającą w dniach 13, 27-34, 61-63, 90-96 i 123-130 25 μg szczepionki. Od zwierząt pobierano krew na 1-2 dni przed pierwszą immunizacją (dzień 0) i w dniach 41-45 i w dniu 68

PL 217 409 B1 z żyły ogonowej. Pobierano również osocze krwi w dniach 152-154, w których również pobierano mózgi do badań histopatologicznych (wiek myszy w tym czasie: 23 miesiące).

Miano przeciwciała specyficznych dla Αβ1-40 było mierzone testem ELISA zasadniczo, jak opisano w przykładzie 13 i wyniki wyrażono, jak opisano w przykładzie 21. Wyniki testu ELISA są ukazane na fig. 14. U wszystkich myszy immunizowanych za pomocą QβhAβ1-6 stwierdzono miana OD50% powyżej 1:2000 (miana osocza sprzed immunizacji były poniżej 1:100), co wykazuje spójną reakcję przeciwciał na QβhAβ1-6 nawet u bardzo starych myszy (fig. 14). Średnie miana OD50% były w zakresie 1:9000 do 1:20000 w całym okresie immunizacji.

Liczenie płytek amyloidu wykonano, jak opisano w przykładzie 21. Dane każdej myszy były ₂ normalizowane do ilości złogów (płytek) na mm² i całkowitej powierzchni płytek w % całej kory nowej. Myszy immunizowane (QβhAβ1-6) wykazywały mniejszą liczbę złogów w korze (fig. 15, fig. 16), głównie z powodu redukcji ilości małych płytek. W porównaniu z grupą nieimmunizowaną, średnia ilość płytek była zredukowana o 33% w grupie immunizowanej QβhAβ1-6 (p< 0,001 vs. grupa PBS, test Manna-Whitney'a). Ponieważ redukcja dotyczyła głównie małych płytek, zmniejszenie całkowitej powierzchni płytek było umiarkowane i wynosiło 10% (p<0,01 vs. grupa PBS, test Manna-Whitney'a).

Figura 14: miana przeciwciał przeciwko Αβ40/42 w osoczu (OD50%) u myszy transgenicznych z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish”. Myszy były immunizowane za pomocą QβhAβ1-6 w wieku pomiędzy 18 a 23 miesięcy. Ukazane są indywidualne wartości (czarne kropki) i rysunki w prostokątach, gdzie końce prostokątów określają 25 i 75 percentyl, z linią w środkowym i błędnym prostokącie określającą 10 i 90 percentyl (Warstwy zewnętrzne są ukazane jako kropki).

Figura 15: barwienie immunohistochemiczne płytek amyloidu w równoległych wycinkach mózgu. Strzałki wskazują złogi małych rozmiarów. Na figurze ukazany jest równoległy wycinek mózgu od myszy transgenicznej z nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish” immunizowanej za pomocą PBS(A) lub QβhAβ1-6 (B).

Figura 16: Liczenie złogów płytek u myszy transgenicznych nadmierną ekspresją zmutowanego białka prekursorowego amyloidu „Swedish” po immunizacji w wieku pomiędzy 18 a 23 miesiącem.

(A) Gęstość płytek w korze. (B) Powierzchnia płytek w korze. Gęstość płytek wyrażona w płytkach ₂ na mm², powierzchnia płytek w procentach powierzchni tkanki pokrytej amyloidem beta. Dane są ukazane jako poszczególne wartości (czarne kropki) i rysunek w prostokącie. Końce prostokątów określają 25 i 75 percentyl, z linią w środkowym i błędnym prostokącie określającą 10 i 90 percentyl. ** p<0,001 test Manna Whitney'a sum rang). PBS, n = 17, QβhAβ1-6, n = 19.

Po pełnym opisaniu niniejszego wynalazku w szczegółach za pomocą zilustrowania i przykładów w celu uzyskania klarowności i zrozumiałości, dla osoby biegłej w dziedzinie stanie się oczywiste, że to samo można osiągnąć przez modyfikacje lub zmianę wynalazku w szerokim i równoważnym zakresie warunków, preparatów i innych parametrów bez wpływu na zakres wynalazku lub jakiegokolwiek jego aspektu i że takie modyfikacje lub zmiany są przewidziane w zakresie załączonych zastrzeżeń patentowych.

PL 217 409 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Cytos Biotechnology AG Novartis Pharma AG Bachmann, Martin F Tissot, Alain Ortmann, Rainer LuÓnd, Rainer Staufenbiel, Matthias Frey, Peter <120> układy antygenowe amyloidu beta 1-6 <130> PA041WO <150> US 60/396,639 <151> 2002-07-19 <150> US 60/470,432 <151> 2003-05-15 <160> 93 <17O> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1

Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gin 15 10 15

Gly Gin Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys 20 25 30

Ser Ile Ser Gin Lys Ser Ala Asp Gin Ser Ile Asp Phe Gly Gin Leu 35 40 45

Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gin Ser Lys Pro Met Asn Leu 50 55 60

Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn 65 70 75 80

Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser 85 90 95

Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile 100 105 110

PL 217 409 B1

Met Ile Gin Ala Ala Gly Lys Asn 115 120

Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly 125

Asp Pro Asn Leu Leu Lys Asp Gly ' 130 135

Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Thr 140

Val Gly Lys Lys Ser Ser Asp Gly 145 150

Asn Ala Gin Ile Thr Glu Gly Ala 155 160

Phe Ser Gly Val Ala Thr Phe Asn 165

Leu Ser Tyr Gin 170

<210> 2 <211> 182 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2
Met 1	Lys	Ile	Lys	Thr 5	Leu
Ser	Ser	Thr	Ala 20	Ala	Leu
Val	His	Phe 35	Lys	Gly	Glu
Gly	Ser 50	Val	Asp	Gin	Thr
Leu 65	Ala	Gin	Glu	Gly	Ala 70
Leu	Asn	Asp	Cys	Asp 85	Thr
Leu	Gly	Thr	Ala 100	Ile	Asp
Ser	Ser	Ala 115	Ala	Gly	Ser
Arg	Thr 130	Gly	Ala	Ala	Leu

Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu 10 15

Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr 25 30

Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala 45

Leu Gly Gin Val Arg Thr Ala Ser 60

Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gin 75 80

Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe 90 95

His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gin 105 110

Asn Val Gly Val Gin Ile Leu Asp 125

Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu 140

PL 217 409 B1

Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gin Ala Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr

165 170 175

Phe Lys Val Gin Tyr Gin 180 <210> 3 <211> 853 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3

acgtttctgt	ggctcgacgc	atcttcctca	ttcttctctc	caaaaaccac	ctcatgcaat	60
ataaacatct	ataaataaag	ataacaaata	gaatattaag	ccaacaaata	aactgaaaaa	120
gtttgtccgc	gatgctttac	ctctatgagt	caaaatggcc	ccaatgtttc	atcttttggg	180
ggaaactgtg	cagtgttggc	agtcaaactc	gttgacaaac	aaagtgtaca	gaacgactgc	240
ccatgtcgat	ttagaaatag	ttttttgaaa	ggaaagcagc	atgaaaatta	aaactctggc	300
aatcgttgtt	ctgtcggctc	tgtccctcag	ttctacgacg	gctctggccg	ctgccacgac	360
ggttaatggt	gggaccgttc	actttaaagg	ggaagttgtt	aacgccgctt	gcgcagttga	420
tgcaggctct	gttgatcaaa	ccgttcagtt	aggacaggtt	cgtaccgcat	cgctggcaca	480
ggaaggagca	accagttctg	ctgtcggttt	taacattcag	ctgaatgatt	gcgataccaa	540
tgttgcatct	aaagccgctg	ttgccttttt	aggtacggcg	attgatgcgg	gtcataccaa	600
cgttctggct	ctgcagagtt	cagctgcggg	tagcgcaaca	aacgttggtg	tgcagatcct	660
ggacagaacg	ggtgctgcgc	tgacgctgga	tggtgcgaca	tttagttcag	aaacaaccct	720
gaataacgga	accaatacca	ttccgttcca	ggcgcgttat	tttgcaaccg	gggccgcaac	780
cccgggtgct	gctaatgcgg	atgcgacctt	caaggttcag	tatcaataac	ctacctaggt	840
tcagggacgt	tca					853

<210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Bakteriofag Q-beta <400> 4

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15

Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val

PL 217 409 B1

Phe Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140

Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160

Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175

Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala 180 185 190

Val Glu Leu Gin Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220

Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Gin Ala Met Arg Asp Gin Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255

Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270

Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285

Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300

Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320

Gin Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala 325

PL 217 409 B1

Gin Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45

Thr Val Ser Val Ala Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val 50 55 60

Gin Ile Lys Leu Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp 65 70 75 80

Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr 85 90 95

Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala 100 105 110

Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn 115 120 125

Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp 130 135 140

Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro 145 150 155 160

Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175

Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg 180 185 190

Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gin Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220

Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp 225 230 235 240

Ala Thr Ala Met Gin Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255

Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu

PL 217 409 B1

Val Thr Ile Ser Val Ser Gin Pro 50 55

Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 60

Val Gin Val Lys Ile Gin Asn Pro 55 70

Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser 85

Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 90 95

Phe Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu 100

Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu 105 110

Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro 115 120

Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130

<210> <211> <212> <213> <400> Met Ala 1	14 330 PRT Bakteriofag NL95 14
Lys	Leu	Asn Lys 5
Asn Gin	Thr	Leu 20	Thr Leu
Val Ala	Ser 35	Leu	Ser Glu
Val Thr 50	Val	Ser	Val Ala
Val Gin 65	Ile	Lys	Leu Gin 70
Asp Pro	Ser	Val	Thr Arg 85
Thr Ser	Tyr	Ser 100	Thr Glu

Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly 10 15

Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 25 30

Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 45

Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 60

Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys 75 80

Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe 90 95

Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 105 110

PL 217 409 B1

Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu 115 120

Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu 125

Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu 130 135

Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly 140

Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro 145 150

Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro 155 160

Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys 165

Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly 170 175

Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp 180

Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys 185 190

Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe 195 200

Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 205

Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp 210 215

Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp 220

Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg 225 230

Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp 235 240

Ala Ser Val Met Gin Ser Asp Glu 245

Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp 250 255

Val Val Lys Met Gin Pro Pro Gly 260

Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr 265 270

Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr 275 280

Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile 290 295

Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 300

Pro Gin Leu Pro Thr Asp Phe Thr 305 310

Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro 315 320

Val Gin Thr Val Ile Val Ile Pro 325

Ser Leu 330 <210> 15 <211> 129 <212> PRT <213s Bakteriofag f2

PL 217 409 B1

Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg 65 70 75 80

Tyr Thr Gin Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr 85 90 95

Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala 100 105 110

Thr Ser Gin Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 115 120 125

<210>	17
<211>	132
e212>	PRT
<213>	Sekwencj a	sztuczna
<220>
<223>	Zmutowany	bakteriofag Qbeta 240
<400>	17
Ala Lys	i Leu Glu '	Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys

Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60

Gin Val Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

PL 217 409 B1 <210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Zmutowany bakteriofag Q-beta 243 <400> 18

Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15

Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45

Thr Val Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60

Gin Val Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 19 <211> 132 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Zmutowany bakteriofag Q-beta 250 <400> 19

Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys 15 10 15

PL 217 409 B1

Gin

Thr

Leu

Val 20

Leu Asn

Pro

Arg

Gly Val 25

Asn

Pro

Thr

Asn 30

Gly

Val

Ala

Ser

Leu

Ser

Gin

Ala

Gly

Ala

Val

Pro

Ala

Leu

Glu

Lys

Arg

Val

35

40

45

Thr

Val

Ser

Val

Ser

Gin

Pro

Ser

Arg

Asn

Arg

Lys

Asn

Tyr

Lys

Val

50

55

60

Gin

Val

Lys

Ile

Gin

Asn

Pro

Thr

Ala

Cys

Thr

Ala

Asn

Gly

Ser

Cys

65

70

75

80

Asp

Pro

Ser

Val

Thr

Arg

Gin

Lys

Tyr

Ala

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Phe

85

90

95

Thr

Gin

Tyr

Ser

Thr

Asp

Glu

Arg

Ala

Phe

Val

Arg

Thr

Glu

Leu

100

105

110

Ala

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Ile

Asp

Ala

Ile

Asp

Gin

Leu

115

120

125

Asn

Pro

Ala

Tyr

130 <21Q> 20 <211> 132 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> ;	Zmutowany bakteriofag Q-beta	251
<4oo> :	20
Ala Lys	Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly	Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1	5	10 15
Gin Thr	Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly	Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
	20 25	30
Ala Ser	Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val	Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
	35 40	45
Thr Val	Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg	Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50	55	60
Gin Val	Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala	Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65	70	75 80

PL 217 409 B1

Asp

Pro

Ser

Val

Thr 85

Arg

Gin

Lys

Tyr

Ala 90

Asp

Val

Thr

Phe

Ser 95

Phe

Thr

Gin

Tyr

Ser 100

Thr

Asp

Glu

Arg 105

Ala

Phe

Val

Arg

Thr 110

Glu

Leu

Ala

Leu 115

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu 120

Leu

Ile

Asp

Ala

Ile 125

Asp

Gin

Leu

Asn

Pro 130

Ala

Tyr

<210> <211> <212> <213>

21 132 PRT Sekwencja

i sztuczna

<220>

<223> Zmutowany bakteriofag Q-beta	259
<400> 21
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly 1 5	Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg 10 15
Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly 20 25	Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 30
Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val 35 40	Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 45
Thr Val Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg 50 55	Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 60
Gin Val Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala 65 70	Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Lys Tyr 85	Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 90 95
Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg 100 105	Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu 115 120	Ile Asp Ala Ile Asp Gin Leu 125

Asn Pro Ala Tyr 130

PL 217 409 B1 <210> 22 <211> 185 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu E <400> 22

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95

Ile Arg Gin Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175

Arg Ser Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys 180 185 c210> 23 <211> 212 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu B

PL 217 409 B1 <400> 23.

Met Gin Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 15 10 15

Val Gin Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 20 25 30

Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45

Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60

Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80

His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn 85 90 95

Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp 100 105 110

Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gin 115 120 125

Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 130 135 140

Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala 145 150 155 160

Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr 165 170 175

Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 180 185 190

Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Arg 195 200 205

Glu Ser Gin Cys 210 <210> 24 <211> 188

PL 217 409 B1 <212> PRT

<213> WiruE <400> 24

i zapalenia wątroby typu

B

Met 1

Asp

Ile

Asp

Pro 5

Tyr

Lys

Glu

Phe

Gly 10

Ser

Tyr

Gin

Leu 15

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro

Leu

Asp

Phe

Pro

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Val

Asp

20

25

30

Thr

Ala

Thr

Ala

Leu

Tyr

Glu

Leu

Thr

Gly

Arg

Glu

His

cys

35

40

45

Ser

Pro

His

Thr

Ala

Ile

Arg

Gin

Ala

Leu

Val

Cys

Trp

Asp

Glu

50

55

60

Leu

Thr

Lys

Leu

ile

Ala

Trp

Met

Ser

Asn

Ile

Thr

Ser

Glu

Gin

65

70

75

80

Val

Arg

Thr

Ile

Val

Asn

His

Val

Asn

Asp

Thr

Trp

Gly

Leu

Lys

85

90

95

Val

Arg

Gin

Ser

Leu

Trp

Phe

His

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin

100

105

110

His

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

Pro

Ala

Pro

Tyr

Arg

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

Glu

His

Thr

Val

Ile

Arg

Gly

Ala

Arg

Ala

Ser

Arg

Ser

145

150

155

160

Pro

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

165

170

175

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Ser

Thr

Asn

Cys

180

185

<210>

25

<211>

185

<212>

PRT

<213>

Wirus zapalenia ¹

wątroby

typu

B

c400>

25

Met

Asp

Ile

Asp

Pro

Tyr

Lys

Glu

Phe

Gly

Ala

Thr

Val

Glu

Leu

PL 217 409 B1

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 S0

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95

Ile Arg Gin Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gin Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175

Arg Ser Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys 180 185 <210> 26 <211> 152 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu B <400> 26

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

PL 217 409 B1

Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gin Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80

Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val 85 90 95

Gly Leu Lys Phe Arg Gin Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr 100 105 110

Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 115 120 125

Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser 130 135 140

Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 145 150 <210> 27 <211> 3635 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> plazmid pAP283-S8 <400> 27 cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60 gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120 ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180 gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240 taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300 tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360 atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420 ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480 ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540 gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600

PL 217 409 B1

taacgacaat	atgtacaagc	ctaattgtgt	agcatctggc	ttactgaagc	agaccctatc	660
atctctctcg	taaactgccg	tcagagtcgg	tttggttgga	cgaaccttct	gagtttctgg	720
taacgccgtt	ccgcaccccg	gaaatggtca	ccgaaccaat	cagcagggtc	atcgctagcc	790
agatcctcta	cgccggacgc	atcgtggccg	gcatcaccgg	cgcacacagt	gcggttgctg	840
gcgcctatat	cgccgacatc	accgatgggg	aagatcgggc	tcgccacttc	gggctcatga	900
gcgcttgttt	cggcgtgggt	atggtggcag	gccccgtggc	cgggggactg	ttgggcgcca	960
tctccttgca	tgcaccattc	cttgcggcgg	cggtgcttca	acggcctcaa	cctactactg	1020
ggctgcttcc	taatgcagga	gtcgcataag	ggagagcgtc	gatatggtgc	actctcagta	1080
caatctgctc	tgatgccgca	tagttaagcc	aactccgcta	tcgctacgtg	actgggtcat	1140
ggctgcgccc	cgacacccgc	caacacccgc	tgacgcgccc	tgacgggctt	gtctgctccc	1200
ggcatccgct	tacagacaag	ctgtgaccgt	ctccgggagc	tgcatgtgtc	agaggttttc	1260
accgtcatca	ccgaaacgcg	cgaggcagct	tgaagacgaa	agggcctcgt	gatacgccta	1320
tttttatagg	ttaatgtcat	gataataatg	gtttcttaga	cgtcaggtgg	cacttttcgg	1380
ggaaatgtgc	gcggaacccc	tatttgttta	tttttctaaa	tacattcaaa	tatgtatccg	1440
ctcatgagac	aataaccctg	ataaatgctt	caataatatt	gaaaaaggaa	gagtatgagt	1500
attcaacatt	tccgtgtcgc	ccttattccc	ttttttgcgg	cattttgcct	tcctgttttt	1560
gctcacccag	aaacgctggt	gaaagtaaaa	gatgctgaag	atcagttggg	tgcacgagtg	1620
ggttacatcg	aactggatct	caacagcggt	aagatccttg	agagttttcg	ccccgaagaa	1680
cgttttccaa	tgatgagcac	ttttaaagtt	ctgctatgtg	gcgcggtatt	atcccgtatt	1740
gacgccgggc	aagagcaact	cggtcgccgc	atacactatt	ctcagaatga	cttggttgag	1800
tactcaccag	tcacagaaaa	gcatcttacg	gatggcatga	cagtaagaga	attatgcagt	1860
gctgccataa	ccatgagtga	taacactgcg	gccaacttac	ttctgacaac	gatcggagga	1920
ccgaaggagc	taaccgcttt	tttgcacaac	atgggggatc	atgtaactcg	ccttgatcgt	1980
tgggaaccgg	agctgaatga	agccatacca	aacgacgagc	gtgacaccac	gatgcctgta	2040
gcaatggcaa	caacgttgcg	caaactatta	actggcgaac	tacttactct	agcttcccgg	2100
caacaattaa	tagactggat	ggaggcggat	aaagttgcag	gaccacttct	gcgctcggcc	2160
cttccggctg	gctggtttat	tgctgataaa	tctggagccg	gtgagcgtgg	gtctcgcggt	2220
atcattgcag	cactggggcc	agatggtaag	ccctcccgta	tcgtagttat	ctacacgacg	2280
gggagtcagg	caactatgga	tgaacgaaat	agacagatcg	ctgagatagg	tgcctcactg	2340
attaagcatt	ggtaactgtc	agaccaagtt	tactcatata	tactttagat	tgatttaaaa	2400

PL 217 409 B1

Gly Gin 50

Tyr Val

Ser

Val

Tyr 55

Lys

Arg

Pro

Ala

Pro 60

Lys

Pro

Glu

Gly

Cys Ala

Asp Ala

Cys

Val

Ile

Met

Pro

Asn

Glu

Asn

Gin

Ser

Ile

Arg

65

70

75

80

Thr Val

Ile Ser

Gly

Ser

Ala

Glu

Asn

Leu

Ala

Thr

Leu

Lys

Ala

Glu

85

90

95

Trp Glu

Thr His

Lys

Arg

Asn

Val

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

100

105

110

Ala Gly

Leu Gly

Phe

Leu

Asp

Pro

Thr

Ala

Ile

Val

Ser

Asp

115

120

125

Thr Thr

Ala

130

<210? :

29

<211?

131

<212?

PRT

<213> ,

Sekwencja sztuczna

<220?

<223? :

Białko osłonowe AP205

<400?

29

Met Ala

Asn Lys

Thr

Met

Gin

Pro

Ile

Thr

Ser

Thr

Ala

Asn

Lys

Ile

1

5

10

15

Val Trp

Ser Asp

Pro

Thr

Arg

Leu

Ser

Thr

Phe

Ser

Ala

Ser

Leu

20

25

30

Leu Arg

Gin Arg

Val

Lys

Val

Gly

Ile

Ala

Glu

Leu

Asn

Val

Ser

35

40

45

Gly Gin

Tyr Val

Ser

Val

Tyr

Lys

Arg

Pro

Ala

Pro

Lys

Pro

Glu

Gly

50

55

60

Cys Ala

Asp Ala

Cys

Val

Ile

Met

Pro

Asn

Glu

Asn

Gin

Ser

Ile

Arg

65

70

75

80

Thr Val

Ile Ser

Gly

Ser

Ala

Glu

Asn

Leu

Ala

Thr

Leu

Lys

Ala

Glu

85

90

95

Trp Glu

Thr Hi s

Lys

Arg

Asn

Val

Asp

Thr

Leu

Phe

Ala

Ser

Gly

Asn

100

105

110

PL 217 409 B1

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp 115 120 125

Thr Thr Ala 130 <21Q> 30 <2ll> 3607 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> plazmid pAP281-32 <400> 30

cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga	60
gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag	120
acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta	180
tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg	240
aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc	300
agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc	360
agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac	420
actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc	480
gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat	540
acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg	600
tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt	660
cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt	720
caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc	780
ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg	840
gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca	900
ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc	960
ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa	1020
gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc	1080
caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg	1140
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg	1200
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc	1260

PL 217 409 B1

ttgaagacga	aagggcctcg	tgatacgcct	atttttatag	gttaatgtca	tgataataat	1320
ggtttcttag	acgtcaggtg	gcacttttcg	gggaaatgtg	cgcggacccc	ctattggttt	1380
atttttctaa	atacattcaa	atatgtatcc	gctcatgaga	caataaccct	gataaatgct	1440
tcaataatat	tgaaaaagga	agagtatgag	tattcaacat	ttccgtgtcg	cccttattcc	1500
cttttttgcg	gcattttgcc	ttcctgtttt	Łgctcaccca	gaaacgctgg	tgaaagtaaa	1560
agatgctgaa	gatcagttgg	gtgcacgagt	gggttacatc	gaactggatc	tcaacagcgg	1620
taagatcctt	gagagttttc	gccccgaaga	acgtttttca	atgatgagca	cttttaaagt	1680
tctgctatgt	gtcgcggtat	tatcccgtat	tgacgccggg	caagagcaac	tcggtcgccg	1740
catacactat	tctcagaatg	acttggtggt	acctaccagt	cacagaaaag	catcttacgg	1800
atggcatgac	agtaagagaa	ttatgcagtg	ctgccataac	catgagtgat	aacactgcgg	1860
ccaacttact	tctgacaacg	atcggaggac	cgaaggagct	aaccgctttt	ttgcacaaca	1920
tgggggatca	tgtaactcgc	cttgatcgtt	gggaaccgga	gctgaatgaa	gccataccaa	1980
acgacgagcg	tgacaccacg	atgcctgtac	gaacggcaac	aacgttgcgc	aaactattaa	2040
ctggcgaact	acttactcta	gcttcccggc	aacaattaat	agactggatg	gaggcggata	2100
aagttgcagg	accacttctg	cgctcggccc	ttccggctgg	ctggtttatt	gctgataaat	2160
ctggagccgg	tgagcgtggg	tctcgcggta	tcattgcagc	actggggcca	gatggtaagc	2220
cctcccgtat	cgtagttatc	tacacgacgg	ggagtcaggc	aactatggat	gaacgaaata	2280
gacagatcgc	tgagataggt	gcctcactga	ttaagcattg	gtaactgtca	gaccaagttt	2340
actcatatat	actttagatt	gatttaaaac	ttcattttta	atttaaaagg	atctaggtga	2400
agatcctttt	tgataatctc	atgaccaaaa	tcccttaacg	tgagttttcg	ttccactgag	2460
cggtcagacc	ccgtagaaag	atcaaaggat	cttcttgaga	tccttttttt	ctgcgcgtaa	2520
tctgctgctt	gcaaacaaaa	aaaccaccgc	taccagcggt	ggtttgtttg	ccggatcaag	2580
agctaccaac	tctttttccg	aaggtaactg	gcttcagcag	agcgcagata	ccaaatactg	2640
tccttctagt	gtagccgtag	ttaggccacc	acttcaagaa	ctctgtagca	ccgcctacat	2700
acctcgctct	gctaatcctg	ttaccagtgg	ctgctgccag	tggcgataag	tcgtgtctta	2760
ccgggttgga	ctcaagacga	taggtaccgg	ataaggcgca	gcggtcgggc	tgaacggggg	2820
gttcgtgcac	acagcccagc	ttggagcgaa	cgacctacac	cgaactgaga	tacctacagc	2880
gcgagcattg	agaaagcgcc	acgcttcccg	aagggagaaa	ggcggacagg	tatccggtaa	2940
gcggcagggt	cggaacaaga	gagcgcacga	gggagcttcc	agggggaaac	gcctggtatc	3000
tttatagtcc	tgtcgggttt	cgccacctct	gacttgagcg	tcgattfcttg	tgatgctcgt	3060
caggggggcg	gagcctatgg	aaaaacgcca	gcaacgcggc	ctttttacgg	ttcctggcct	3120

PL 217 409 B1

ttggctggcc	ttttgctcac	atgttctttc	ctgcgttatc	ccctgattct	gtggataacc	3180
gtattaccgc	ctttgagtga	gctgataccg	ctcgccgcag	ccgaacgacc	gacggcgcag	3240
cgagtcagtg	agcgaggaag	cggaagagcg	cccaatacgc	aaaccgcctc	tccccgcgcg	3300
ttggccgatt	cattaatgca	gctgtggtgt	catggtcggt	gatcgccagg	gtgccgacgc	3360
gcatctcgac	tgcatggtgc	accaatgctt	ctggcgtcag	gcagccatcg	gaagctgtgg	3420
tatggccgtg	caggtcgtaa	atcactgcat	aattcgtgtc	gctcaaggcg	cactcccgtt	3480
ctggataatg	ttttttgcgg	cgacatcata	acggttctgg	caaatattct	gaaatgagct	3540
ggtgacaatt	aatcatcgaa	ctagttaact	agtacgcaag	ttcacgtaaa	aagggtatcg	3600

cggaatt 3607 <210? 31 <211> 6 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?

<223? Łącznik N-końcowy <400? 31

Cys Gly Asp Glu Gly Gly 1 5 <210? 32 <211? 6 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?

<223? Łącznik C-końcowy <400? 32

Gly Gly Glu Asp Gly Cys 1 5 <210? 33 <211? 5 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220?

<223? Łącznik <400? 33

Gly Gly Lys Gly Gly 1 5

PL 217 409 B1 <210> 34 <211> 3 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> N-końcowy Łącznik glicynowy <220>

<221> Powtórzenie <222> (1) . . (1)

<223>	Dla glicyny	powtórzenie	może	być	zrealizowane	od	zera do	pięciu razy
<220> <221> <222> <223> razy	Powtórzenie (3)..(3) Dla glicyny	powtórzenie	może	być	zrealizowane	od	zera do	dwunastu
<400>	34
Gly Cys 1	i Gly

<210>	35
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	N-końcowe łączniki glicynowo-serynowe
<220>
<221>	Powtórzenie
<222>	(1) (1)
<223>	Dla glicyny powtórzenie może być	zrealizowane	od	zera do	pięciu razy
<220>
<221>	Powtórzenie
<222>	(3)..(3)
<223>	Dla glicyny powtórzenie może być	zrealizowane	od	zera do	dziesięciu

razy <220>

<221> Powtórzenie <222> (4)..(4) <223> Dla seryny powtórzenie może być zrealizowane od zera do dwóch razy <220>

<221> Powtórzenie <222> (5)..(9) <223> Dla tych reszt powtórzenie może być zrealizowane od zera do trzech razy jako grupa <400> 35

Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

PL 217 409 B1 <210> 36 <211> 3 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> C-końcowy łącznik glicynowy <220>

<221> Powtórzenie <222> (1)..(1) <223> Dla glicyny powtórzenie może być zrealizowane od zera do dwunastu razy <220>

<221> Powtórzenie <222> (3)..(3) <223> Dla glicyny powtórzenie może być zrealizowane od zera do pięciu razy <400> 36

Gly Cys Gly <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> C-końcowe łączniki glicynowo-serynowe <220>

<221> Powtórzenie <222> (1) . .(1) <223> Dla glicyny powtórzenie może być zrealizowane od zera do dziesięciu razy <220>

<221> Powtórzenie <222> (2) .. (2) <223> Dla seryny powtórzenie może być zrealizowane od zera do dwóch razy <220>

<221> Powtórzenie <222> (3) . . (7) <223> Dla tych reszt powtórzenie może być zrealizowane od zera do trzech razy jako grupa <220>

<221> Powtórzenie <222> (8)..(8) <223> Dla glicyny powtórzenie może być zrealizowane od zera do ośmiu razy <220>

PL 217 409 B1 <221? Powtórzenie <222> (10) . . (10) <223? Dla glicyny powtórzenie może być zrealizowane od zera do pięciu razy <400? 37

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly

10 <210? 38 <211? 5 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? Łącznik glicerynowe-serynowy <220>

<221? Powtórzenie <222? (1)..(5) <223> Dla tych reszt powtórzenie może być zrealizowane dowolną ilość razy jako grupa <400? 38

Gly Gly Gly Gly Ser

5 <210? 39 <211? 10 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? N-końcowy gammal <400? 39

Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 15 10 <210? 40 <211? 10 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223? C-końcowy gamma 1 <400? 40

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly 15 10 <210? 41 <211? 17

PL 217 409 B1

<210> <211> <212> <213>	45 6 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	C-końcowy łącznik glicynowo-lizynowy
<400>	45

Gly Gly Lys Lys Gly Cys 1 5

<210> <211> <212> <213>	46 6 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	N-końcowy łącznik glicynowo-lizynowy
<400>	46

Cys Gly Lys Lys Gly Gly 1 5

<210> <211> <2125» <213>	47 4 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Łącznik C-końcowy
<400>	47

Gly Gly Cys Gly 1

<210> <211> <212> <213>	48 37 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Primer oligonukleotydowy

<400> 48 ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc

<210> <211> <212> <213>	49 37 DNA Sekwencja sztuczna
<220>

PL 217 409 B1 <223> Primer oligonukleotydowy <400> 49 ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Primer oligonukleotydowy <400> 50 agctcgcccg gggatcctct ag <210> 51 <211? 40 <212? DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Primer oligonukleotydowy <400? 51 cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag <210? 52 <211? 36 <212? DNA <213> Sekwencja sztuczna <220?

<223? Primer oligonukleotydowy <400? 52 ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg <210? 53 <211? 36 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220?

<223> Primer oligonukleotydowy <400? 53 ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc

<210?	54
<211?	33
<212?	DNA
<213?	Sekwencja sztuczna
<220?
<223?	Primer oligonukleotydowy

PL 217 409 B1 <400> 54.

ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223 > Primer oligonukleotydowy <4 0 0 > 55 gatttaggtg acactatag <21Q> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Primer oligonukleotydowy <400> 56 gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Primer oligonukleotydowy <4 00> 57 ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Primer EcoRIHBcAg(s) <400> 58 ccggaattca tggacattga cccttataaa g

<210>	59
<211>	51
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Primer Lys-HBcAg(as)

PL 217 409 B1

<210?	64
<211?	33
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <2 2 3 >	Primer 107as
<400>	64

PL 217 409 B1

<210>	69
<211>	51
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Primer CeH3fwd

PL 217 409 B1

<210? 72 <211> 7 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223? Peptyd primerowy CeH3rev <400> 72

Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val 1 5 <210> 73 <211? 31

PL 217 409 B1

<212? <213>

DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223 >

Primer fwd HBcAg-wt EcoRI

<400? 73 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31

<210? <211? <212? <213?

74 38 DNA Sekwencja sztuczna

<220? <223?

Primer rev HBcAg-wt Hind III

<400? 74 cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38

<210? <211? <212? <213?	75 6 PRT Homo sapiens
<400?	75

Asp Ala Glu Phe Arg His

1	5
<210? <211? <212? <213?	76 6 PRT Mus musculus
<400?	76

Asp Ala Glu Phe Gly His

1	5
<210? <211? <212? <213?	77 9 PRT Sekwencja sztuczna

<220? <223?	Abeta 1-6 GGC
<400?	77

Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Gly Cys

1	5
<210? <211? <212?	78 9 PRT

PL 217 409 B1

<213>

Sekwencja sztuczna

<220> <223>	mysi Abeta 1-6 GGC
<400>	78

Asp Ala Glu Phe Gly His Gly Gly Cys

1	5
<210> <211> <212> <213>	79 28 DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223>

primer pl.44

<400> 79 aaccatggca aataagccaa tgcaaccg 28

<210> <211> <212> <213>

80 30 DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223>

primer pl.45

<400> 80 aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30

<210> <211> <212> <213>

81 30 DNA Sekwencja sztuczna

<22Q> <223>	primer pl.46
<400s	81

aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac 30

<210> <211> <212 > <213 >

82 43 DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223>	primer pl.47
<4 00 >	82

gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg 43 <210> 83 <211> 43

PL 217 409 B1

<212? <213?

DNA Sekwencja sztuczna

<220? <223?

primer pl.48

<400? 83 cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc 43

<210? <211? <212? <213?	84 6 PRT homo sapiens
<400?	84

Asp Ala Glu Phe Arg His

1	5
<210? <211? <212? <213?	85 6 PRT Oryctolagus cuniculus
<400?	85

Asp Ala Glu Phe Arg His

1	5
<210? <211? <212? <213?	86 6 PRT Xenopus laevis
<400?	86

Asp Ser Glu Tyr Arg His

1	5
<210? <211? <212? <213?	87 6 PRT Rattus norvegicus
<4 00?	87

Asp Ala Glu Phe Gly His

1	5
<210? <211? <212? <213?	88 6 PRT Cavia porcellus
<400?	88

PL 217 409 B1

Asp Ala Glu Phe Arg His
1	5
<210>	89
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	89
Val His	Glu Pro His	Glu	Phe Arg His Val	Ala Leu Asn Pro Val
1	5		10	15

<210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90

Tyr Tyr 1

Glu

Phe

Arg 5

His

<210>

91

<211>

42

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

91

Asp Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

His

Gin

Lys

1

5

10

15

Leu Val

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

20

25

30

Gly Leu

Met

Val

Gly

Val

Ile

Ala

35

40

<210>

92

<211>

770

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

92

Met Leu

Pro

Gly

Leu

Ala

Leu

Ala

Trp

Thr

Ala

Arg

1

5

10

15

Ala Leu

. Glu

Val

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn

Ala

Gly

Leu

Ala

Glu

Pro

20

25

30

Gin Ile

Ala

Met

Phe

Cys

Gly

Arg

Leu

Asn

Met

His

Met

Asn

Val

Gin

PL 217 409 B1

Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300

Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350

Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365

Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380

Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400

Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415

Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430

Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn 435 440 445

Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460

Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480

Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495

Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510

Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin Ile Arg Ser 515 520 525

PL 217 409 B1

Gin Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser 530 535 540

Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gin Asp 545 550 555 560

Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575

Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590

Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605

Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe 610 615 620

Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640

Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655

Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu 675 680 685

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700

Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720

Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 ' 735

Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750

Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met 755 760 765

PL 217 409 B1

Gin Asn 770

<210>	93
<211>	82
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens
<400>	93
Gly Ser	Gly	Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys

10 15

Met

Asp

Ala

Glu 20

Phe

Arg

His

Asp

Ser 25

Gly

Tyr

Glu

Val

His 30

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

40 45

Ile

Gly 50

Leu

Met

Val

Gly

Gly 55

Val

Ile

Ala

Thr 60

Val

Ile

Thr

Leu

Val

Met

Leu

Lys

Gin

Tyr

Thr

Ser

Asn

His

Gly

Val

70 75 80

Val Glu

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera:

(a) cząstkę rdzeniową z co najmniej jednym pierwszym miejscem wiązania, przy czym cząsteczka rdzeniowa stanowi cząsteczkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga i (b) co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania, gdzie antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie drugie miejsce wiązania jest wybrane z grupy składającej się z:

i. miejsca wiązania nie występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową i ii. miejsca wiązania naturalnie występującego z antygenem lub determinantą antygenową, gdzie drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania, przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, i gdzie peptyd Αβ1-6 i cząstka rdzeniowa wchodzą w interakcje poprzez asocjację tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga.
3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że RNA-bakteriofag jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) bakteriofaga Q3;

(b) bakteriofaga R17;

(c) bakteriofaga fr;

PL 217 409 B1 (d) bakteriofaga GA;

(e) bakteriofaga SP;

(f) bakteriofaga MS2;

(g) bakteriofaga M11;

(h) bakteriofaga MX1;

(i) bakteriofaga NL95;

(j) bakteriofaga f2;

(k) bakteriofaga PP7 i (I) bakteriofaga Ap205.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga Qp.
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga fr.
6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa RNA-bakteriofaga zawiera, lub alternatywnie składa się z rekombinacyjnych białek, lub ich fragmentów, RNA-bakteriofaga AP205.
7. Kompozycja według któregokolwiek z zastrz. 2, znamienna tym, że rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie zasadniczo składają się z, lub alternatywnie składają się z białek otoczki RNA-bakteriofagów.
8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że białka otoczki RNA-bakteriofagów posiadają sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

(a) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4;

(b) mieszaniny sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5;

(c) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6;

(d) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7;

(e) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8;

(f) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9;

(g) mieszaniny sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 9 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 10;

(h) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11;

(i) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12;

(j) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 13;

(k) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 14;

(l) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 15;

(m) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 16 i (n) sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 28.
9. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że rekombinacyjne białka zawierają, lub alternatywnie składają się zasadniczo, lub alternatywnie składają się ze zmutowanych białek otoczki RNA-bakteriofagów.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że RNA-bakteriofag jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) bakteriofaga Qe;

(b) bakteriofaga R17;

(c) bakteriofaga fr;

(d) bakteriofaga GA;

(e) bakteriofaga SP;

(f) bakteriofaga MS2;

(g) bakteriofaga M11;

(h) bakteriofaga MX1;

(i) bakteriofaga NL95;

(j) bakteriofaga f2;

(k) bakteriofaga PP7 i (l) bakteriofaga AP205.

PL 217 409 B1
11. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zostały zmodyfikowane przez usunięcie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze podstawienia.
12. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zostały zmodyfikowane przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze podstawienia.
13. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zostały zmodyfikowane przez delecję co najmniej jednej reszty lizyny.
14. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że zmutowane białka otoczki RNA-bakteriofaga zostały zmodyfikowane przez dodanie co najmniej jednej reszty lizyny na drodze insercji.
15. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że drugie miejsce wiązania jest zdolne do asocjacji z pierwszym miejscem wiązania przez co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne.
16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że peptyd Αβ1-6 jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) ludzkiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75;

(b) mysiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 76;

(c) peptydu Αβ1-6 naczelnych posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 84;

(d) króliczego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 85;

(e) peptydu Αβ1-6 żaby szponiastej (xenopus laevis) posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 86;

(f) szczurzego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 87; i (g) peptydu Αβ1-6 świnki morskiej posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 88.
17. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że peptyd Αβ1-6 posiada sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75.
18. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto łącznik aminokwasowy, który zawiera, lub alternatywnie składa się z drugiego miejsca wiązania.
19. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniane drugie miejsce wiązania lub łącznik aminokwasowy jest związany z peptydem Αβ1-6 na jego końcu C.
20. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że drugie miejsce wiązania lub łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) GGC;

(b) GGC-CONH2;

(c) GC;

(d) GC-CONH2;

(e) C; i (f) C-CONH2.
21. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że peptyd Αβ1-6 z drugim miejscem wiązania stanowi NH2-DAEFRHGGC-CONH2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77).
22. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa jest cząstką podobną do wirusa białka otoczki RNA-bakteriofaga Qe.
23. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera:

(a) kompozycję określoną w zastrzeżeniach od 1 do 22, i (b) farmaceutycznie akceptowalny nośnik.
24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 23, znamienna tym, że ponadto zawiera adiuwant.
25. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 23 albo 24, znamienna tym, że kompozycja jest pozbawiona adiuwantu.
26. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrzeżeniach od 1 do 25.

PL 217 409 B1
27. Kompozycja szczepionki według zastrz. 26, znamienna tym, że ponadto zawiera adiuwant.
28. Kompozycja szczepionki według zastrz. 26, znamienna tym, że jest pozbawiona adiuwantu.
29. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 28, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga lub ich fragmenty.
30. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 29, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga Qe lub ich fragmenty.
31. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 29, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga fr lub ich fragmenty.
32. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 29, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa zawiera rekombinacyjne białka RNA-bakteriofaga AP205 lub ich fragmenty.
33. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 32, znamienna tym, że peptyd Αβ1-6 jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) ludzkiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 75 (b) mysiego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 76;

(c) peptydu Αβ1-6 naczelnych posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 84;

(d) króliczego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 85;

(e) peptydu Αβ1-6 żaby szponiastej (xenopus laevis) posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 86;

(f) szczurzego peptydu Αβ1-6 posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 87; i (g) peptydu Αβ1-6 świnki morskiej posiadającego sekwencję aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 88.
34. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 33, znamienna tym, że ponadto zawiera łącznik aminokwasowy, który zawiera lub alternatywnie stanowi drugie miejsce wiązania.
35. Kompozycja szczepionki według zastrz. 34, znamienna tym, że łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest związany z peptydem Αβ1-6 na jego końcu C.
36. Kompozycja szczepionki według zastrz. 34 albo 35, znamienna tym, że łącznik aminokwasowy z drugim miejscem wiązania jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) GGC;

(b) GGC-CONH2;

(c) GC;

(d) GC-CONH2;

(e) C;

(i) C-CONH2.
37. Kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 36, znamienna tym, że antygen lub determinanta antygenowa z drugim miejscem wiązania stanowi NH2-DAEFRHGGC-CONH2 o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 77.
38. Kompozycja szczepionki według zastrz. 37, znamienna tym, że cząstka podobna do wirusa jest cząstką podobną do wirusa białka otoczki RNA-bakteriofaga Qe.
39. Sposób wytwarzania kompozycji określonych w zastrz. od 1 do 38, znamienny tym, że:

(a) dostarcza się cząstkę rdzeniową z co najmniej jednym pierwszym miejscem wiązania, przy czym cząsteczka rdzeniowa stanowi cząsteczkę podobną do wirusa RNA-bakteriofaga;

(b) dostarcza się co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania, przy czym antygen lub determinanta antygenowa jest peptydem Αβ1-6 i gdzie drugie miejsce wiązania jest wybrane z grupy składającej się z:

(i) miejsca wiązania nie występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową; i (ii) miejsca wiązania występującego naturalnie z antygenem lub determinantą antygenową; i przy czym drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania, przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, i

PL 217 409 B1 (c) łączy się cząstkę rdzeniową i co najmniej jeden antygen lub determinantę antygenową, a antygen lub determinanta antygenowa i cząstka rdzeniowa wchodzą w interakcje poprzez asocjację tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenowy.
40. Kompozycja określona w zastrz. od 1 do 38 do zastosowania jako lek.
41. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. od 1 do 38, do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera i chorób pokrewnych.
42. Kompozycja według zastrz. od 1 do 22, kompozycja farmaceutyczna według zastrz. od 23 do 25 albo kompozycja szczepionki według zastrz. od 26 do 30, znamienna tym, że cząsteczka podobna do wirusa zawiera rekombinowane białko otoczki RNA-bakteriofaga Qβ o sekwencji aminokwasów o numerze identyfikacyjnym: 4, drugie miejsce wiązania asocjuje z pierwszym miejscem wiązania przez co najmniej jedno wiązanie inne niż peptydowe, a peptyd Αβ1-6 posiada sekwencję aminokwasów jak w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 75 lub sekwencję aminokwasów otrzymaną z sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 75 na drodze podstawienia, delecji i/lub insercji jednego lub kilku aminokwasu(ów) i mającą podobną do niej aktywność, oraz kompozycja zawiera ponadto łącznik aminokwasowy mający sekwencję wybraną z (a) GGC, przy czym co najmniej jedno drugie miejsce wiązania obejmuje łącznik a peptyd Αβ1-6 z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania obejmuje sekwencję DAEFRHGGC, (b) GGC-CONH2, przy czym co najmniej jedno drugie miejsce wiązania obejmuje łącznik a peptyd Αβ1-6 z co najmniej jednym drugim miejscem wiązania obejmuje sekwencję NH2-DAEFRHGGC-CONH2.
43. Kompozycja według zastrz. 1 albo 42, znamienna tym, że zawiera heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawierający grupę funkcyjną, która może reagować z pierwszym miejscem wiązania, i inną grupę funkcyjną, która może reagować z drugim miejscem wiązania.
44. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawiera grupę funkcyjną, która może reagować z grupą aminową łańcucha bocznego reszt lizyny cząsteczki podobnej do wirusa lub z podjednostką takiej cząsteczki.
45. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że heterobifunkcjonalny związek sieciujący zawiera grupę funkcyjną, która reaguje z drugim miejscem wiązania będącym resztą cysteiny połączoną z peptydem Αβ1-6.
46. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że heterobifunkcjonalny związek sieciujący jest wybrany z grupy obejmującej SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA oraz inne związki sieciujące posiadające jedną grupę funkcyjną reagującą z grupami aminowymi i jedną grupę funkcyjną reagującą z resztami cysteiny.
47. Kompozycja według zastrz. 43, znamienna tym, że heterobifunkcjonalny związek stanowi SPDP lub Sulfo-LC-SPDP.