WO2006126682A1

WO2006126682A1 - アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン

Info

Publication number: WO2006126682A1
Application number: PCT/JP2006/310573
Authority: WO
Inventors: Chikateru Nozaki; Shin Sakuma; Tetsuhiro Harakawa; Moon-Hee Sung; Tomomitsu Sewaki; Seung-Pyo Hong; Jong-Soo Lee
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute; Genolac Bl Corporation
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2006-11-30
Also published as: JPWO2006126682A1

Abstract

　副作用が少なく安全で且つ簡便使用が可能なアルツハイマー病予防・治療用ワクチン及びその作製方法を提供する。アルツハイマー病の原因となる老人班の構成成分であるＡβ分子種を、乳酸菌で例示される細菌の表層に発現させることにより、当該生成物の投与により惹起される抗体の作用による従来にはない安全かつ安価な経口タイプのアルツハイマー病予防・治療用ワクチンを可能とする。

Description

明細書

アルツハイマー病の予防'治療用ワクチン

技術分野

[0001] 本願発明は、医療用医薬品に関する。詳細には、高齢ィヒに伴い増加する老人性痴呆症の約半分を占めるアルッノ、イマ一病の予防 ·治療用ワクチン、当該ワクチンの製造方法、及び当該製造方法に使用されるワクチン抗原発現用ベクターに関する。背景技術

[0002] 我が国の 65歳以上の老人の約 10%が老年期痴呆であると報告されている。その老年期痴呆のニ大原因の一つがアルツハイマー病であり、割合でも約 50%を占めている。更に 85歳以上では 2人に 1人がアルツハイマー病あるいはその前段階である軽度認知障害に罹患するといわれ、我国はもとより欧米に於いても大きな社会的問題となっている。その患者数は世界で約 1500万人、我が国では 150万人以上と報告されている。

[0003] 現在、アルツハイマー病治療薬として世界で市販されているのは、エーザィ株式会社が開発したドネぺジルとメルツ社が開発したメマンチンの 2つである力両薬剤は病気の進行を遅らせる作用しかなく病気を根治させることは出来ない。

[0004] そのアルッノヽイマ一病の病態仮説として、アミロイド 13 (以下、 A と略すことがある) の凝集'沈着による老人斑の形成が原因であるとするアミロイドカスケード仮説が有力である。この仮説をもとにアルツハイマー病の新 U、治療法としてワクチン (免疫）療法が注目されている。本ワクチン療法の目的は Α βをワクチンとして投与し、それに対する抗体を体内で産生させ、抗体が老人斑を除去し、さらに分泌された Α |8の凝集 ·沈着を抑制することにより神経細胞の脱落を防止しょうとするものである。

[0005] エラン（Elan)社のシェンク（Schenk)らはアルツハイマー病の動物モデルマウスに A

をワクチンとしてアジュバントと共に皮下投与したところ、老人斑の形成が減少したことを最初に報告した (非特許文献 1参照)。このデータをもとにエラン'ワイス (ElanW yeth)社によるアルツハイマー病患者への臨床治験 (AN— 1792)が開始された。し力臨床試験第 Π相で 6% (298名中 18名）の患者に髄膜脳炎の副作用が報告され中断された。

[0006] 一方、国立長寿医療センター研究所の田平らは、経口ワクチンにより腸管免疫系を利用すれば抗体産生は誘導されるが、細胞性免疫は誘導され難いことに着目し、ァデノ随伴ウィルス (AAV)ベクターに分泌型 A β cDNAを組み込み、アルツハイマーマウスに経口投与して効果を調べた結果、 A |8に対する抗体が誘導され、血清中の A j8に対する抗体は、 4週後をピークとして、 6ヶ月間持続した (特許文献 1参照)。 13 ヶ月齢のアミロイド前駆体タンパク質 (以下、 APPと略すことがある）トランスジヱニックマウス脳組織を免疫染色で詳細に検索した結果、治療したマウス脳において明らかにアミロイド沈着.老人斑形成がコントロールに比べ減少していた。この研究によってアルツハイマー病が経口投与と、う患者にとって負担の少な、方法で治療できる可能性が示されたと言える。し力しながら、経口投与とはいえ、アデノ随伴ウィルスはヒトへの感染性が高いウィルスであり、病原性を備えている。しカゝも、アデノ随伴ウィルスを培養してワクチンとして精製するには多くの費用と時間を要する。つまり、ウィルスベクターを利用したワクチンは、安全 ¾やコストの面で理想的とはいえない。

[0007] 特許文献 1 :特開 2005— 021149号

非特許文献 l : Schenk D.ら、 1999 Jul 8, Nature; 400(6740): p.173-7, "Immunization with amyloid— beta attenuates Alzheimer— disease— like pathology in the PDAPP mous e"

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本願発明は、社会的問題となっているアルツハイマー病の予防 ·治療に供与されうる副作用の少ない安全で且つ簡便な投与形態が可能なアルツハイマー病の予防 · 治療用ワクチンを提供することを目的とする。

[0009] また、本願発明の他の目的は、アルツハイマー病の予防'治療用ワクチンの作製の際に用いられる、微生物表面にワクチン抗原たる A |8分子種を発現させるための発現ベクターの提供であり、且つ当該発現ベクターで形質転換された宿主微生物の提供である。また、 A 分子種を発現する微生物を個体に投与することによる、抗 Α |8 抗体を誘導する方法、及び前記抗 Α |8抗体を誘導する方法に基づくアルツハイマー病の予防及び/または治療方法の提供である。なお、本願明細書において、 A |8分子種とは、 A 完全長分子及び当該分子に基づく A の液性免疫惹起部位を内包する部分ポリペプチド群の総称である。

課題を解決するための手段

[0010] 上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、本願発明者らは、アルツハイマー病の主たる病因と考えられて、る A βに対する抗体惹起を目的とし、 Α βの液性免疫惹起部位を含む断片をコードする DNAをもとに、これより該ペプチドを微生物の表面に発現することができる発現ベクターを構築し、これを用いて好適な微生物を形質転換させると、所望のペプチドを表層に発現し得ることを見出し、アルツハイマー病の予防 '治療用ワクチンを提供し得る本願発明を達成するに至った。とりわけ、宿主微生物として乳酸菌を選択した場合、経口投与可能な好まし、ワクチンを提供することができる。

発明の効果

[0011] 本願発明による最適実施態様である乳酸菌を用いたアルッノ、イマ一病ワクチンを用いれば、従来の乳酸菌の食品と同様の感覚と簡便さでアルツハイマーの予防及び治療薬を摂取することが可能となる。特に本疾患が老人に多い事を考えれば、簡便に摂取できる経口投与と低コストの実現は、これ力の高齢ィ匕社会における患者の Q OLの向上と医療経済の面からも非常に大きなメリットを社会に与える発明と言える。図面の簡単な説明

[0012] [図 1]図 1は、本願発明の Α |8 42の乳酸菌細胞表層提示用組換え発現ベクター pHC EIILB-pgsA-L-A β 42の遺伝子地図である。

[0013] [図 2]図 2は、本願発明の Α β 42提示用組換え発現ベクター pHCEIILB-pgsA-L-A β 42で形質転換された乳酸菌のウェスタンブロッテイングの結果であり、 A j8 42の細胞膜画分での表層発現を示す。 M :分子量マーカー、 C : A 遺伝子を有しない乳酸菌 (コントロール)全細胞画分、 1 :形質転換体全細胞画分、 2 :形質転換体細胞質画分、 3 :形質転換体細胞膜画分。

[0014] [図 3]図 3は、本願発明の A β 42提示用組換え発現ベクター pHCEIILB-pgsA-L-A β 42で形質転換された乳酸菌の Α β 42の細胞膜画分での表層での発現を示す図であり、 Facs scanに基づいている。

[0015] [図 4]図 4は、本願発明の A β Ν- 20提示用組換え発現ベクター pHCEIILB- pgsA- L- A β N-20の遺伝子地図である。

[0016] [図 5]図 5は、本願発明の A β Ν- 20提示用組換え発現ベクター pHCEIILB- pgsA-L- A β Ν- 20で形質転換された乳酸菌のウェスタンブロッテイングの結果であり、 Α β N-20 の細胞膜画分での表層発現を示す。 M :分子量マーカー、 C : A |8遺伝子を有しない乳酸菌（コントロール)全細胞画分、 1 :形質転換体全細胞画分、 2 :形質転換体細胞質画分、 3 :形質転換体細胞膜画分。

[0017] [図 6]図 6は、本願発明の A β Ν- 20提示用組換え発現ベクター pHCEIILB- pgsA-L- A β Ν-20で形質転換された乳酸菌の Α β N-20の細胞膜画分での表層での発現を示す図であり、 Facs scanに基づいている。

[0018] [図 7]図 7は、実施例 2で得た pHCEIILB- pgsA- L- A β N-20 (Α β N- 20発現用べクタ一）で形質転換した乳酸菌をマウス C57BL6株に経口投与したときのマウス血清中の抗体価の測定を ELISA法により行った結果を示す。パネル (A)およびパネル (B)は、それぞれ A βの Ν末端側から 16アミノ酸残基および 42アミノ酸残基を固相化した場合の結果を示す。

[0019] [図 8]図 8は、実施例 1で得た pHCEIILB- pgsA- L- Α β 42 (Α β 42発現用ベクター）で形質転換した乳酸菌をマウス C57BL6株に経口投与したときのマウス血清中の抗体価の測定を ELISA法により行った結果を示す。パネル (Α)およびパネル (Β)は、それぞれ Α βの Ν末端側から 16アミノ酸残基および 42アミノ酸残基を固相化した場合の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 本願発明による、とりわけ好適な態様として乳酸菌で例示される微生物の表面に A β分子種を産生するための発現ベクターは、 Α βの液性免疫惹起部位を含む断片をコードする DNAを、機能しうる形態で含んでなり、これより該ペプチドを微生物の表面に発現することができる。ここで、「機能しうる形態で含んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、ェンハンサー、転写ターミネータ一など）の制御下に、導入遺伝子 (DNA)の発現を可能にする様式で、そのベクター中に該導入遺伝子が挿入されてヽることを意味する。

[0021] A βの液性免疫惹起部位ェピトープは複数存在すると考えられるが、そのェピトープを含む断片を調製するには、例えば、該ェピトープが Α |8の第 4〜 10アミノ酸の領域 (Α |8 4— 10)に存在すれば、それらを微生物表面に産生させる発現ベクターには Α β 4— 10をコードする遺伝子を含むことになる。

[0022] このアミノ酸配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号 4で表されるヌクレオチド配列中の第 12〜30ヌクレオチドが挙げられる。また、アミノ酸配列は同じでも塩基配列は異なるコドンを使用することによって、使用する乳酸菌などの微生物の好むコドンを用いることによって発現量を上げることも可能である。

[0023] 本願発明の好適な実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、 Α βペプチドの第 1から 42アミノ酸 (A |8 1—42)を含んでなるものである。 A |8 1—42のアミノ酸配列としては、配列番号 5で表されるアミノ酸配列が例示され、従って、前記抗原ペプチド断片は、配列番号 5で表されるアミノ酸配列を含むことになる。このアミノ酸配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号 4で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。また、アミノ酸配列は同じでも塩基配列は異なるコドンを使用することによって、使用する乳酸菌などの微生物の好むコドンを用いることも出来る。

[0024] 本願発明の他の好まヽ実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、 A βぺプチドの第 1〜20アミノ酸 (A j8 1 - 20)を含んでなるものである。 A j8 1— 20のアミノ酸配列としては、配列番号 5で表されるアミノ酸配列中の第 1〜 20アミノ酸を含むものが挙げられる。このアミノ酸配列をコードする DNAのヌクレオチド配列は特に制限されうるものではないが、例えば、配列番号 4で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。また、アミノ酸配列は同じでも塩基配列は異なるコドンを使用することによって、使用する乳酸菌などの微生物の好むコドンを用いることも出来る。

[0025] 前記八|8 4—10、八|8 1—42及び八|8 1— 20のアミノ酸配列には、ェピトープが存在すると考えられるが、本願発明による A |8分子種が発現された微生物によって経口投与された場合には、主に抗体産生が誘導される。 [0026] 本願発明によるベクターは、目的の DNAを効率よく発現させるための調節エレメント、例えば、プロモーター、ェンハンサー、転写ターミネータ一などを含んでいてもよく、発現ユニットを複数連結してもよい。

[0027] 本願発明によるベクターは、当該技術分野で周知となっている標準的方法により調製することができる。例えば、特表 2005— 500054号及びそこに引用される参考文献には、適切な種々のベクター、並びにそれらのベクターの作製方法が記されている。

[0028] 本願発明者らは、アルツハイマー病の予防 ·治療を目的とする経口免疫法を更に簡便で安全に実施するために、とりわけ乳酸菌で例示される微生物の表層発現系を応用した。乳酸菌の表層発現系とは、乳酸菌の表層に目的タンパクを発現させるものである。この系を利用すればワクチン抗原となるタンパクを乳酸菌表層に発現させ、その乳酸菌を経口投与することによって、腸管免疫担当細胞へ認識させることが可能となる。乳酸菌そのものが、古くから安全な食品として広く食されており、最近ではプロバイオテイクスとして積極的に健康食品や医薬品として利用されつつある。そのように安全で健康にも有用な乳酸菌は遺伝子発現の宿主として利用されている。成らは乳酸菌の表層にワクチン抗原を発現させたものを経口投与すること〖こよりヮクチンとしての有用性を証明している（特表 2005— 500054号参照)。今回、本願発明者らはこの方法を応用することにより、安全で経済的な経ロワクチンの開発に先鞭をつけた。

[0029] 細菌の細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を細胞表層へ発現させるためには細胞外膜タンパク質と外来タンパク質を遺伝子のレベルで連結して融合タンパク質が生合成されるようにし、これを安定的に細胞内膜を通過して細胞外膜に付着させ、維持するようにしなければならない。このためには細胞外膜タンパク質を選定して表層発現のモチーフとして使用しなければならない（S. Y. Lee, J. H. Choi, Z. Xu, Tr ends BiotechnoL, 21, 45(2003)参照）。グラム陽性菌である乳酸菌の表層へのタンパク質の提示については、種々の検討が行なわれているが（S. Y. Lee, J. H. Choi, Z. Xu, Trends BiotechnoL, 21, 45 (2003) ; P. Samuelson, E. Gunneriusson, P. A. Nygre n, S. Stahl, J. BiotechnoL, 96, 129 (2002) ; K. Leenhouts, G. Buist, J. Kok, Antonie Van Leeuwenhoek, 76, 367 (1999) ; E. Gunneriusson, P. Samuelson, M. Uhlen, P. A.

Nygren, S. Stahl, J. BacterioL, 178, 1341 (1996) ; S. Stahl, A. Robert, E. Gunnerius son, H. Wernerus, F. Cano, S. Liljeqvist, M. Hansson, T. N. Nguyen, P. Samuelson,

Int. J. Med. Microbiol, 290, 571 (2000) ; L. Steidler, J. Viaene, W. Fiers, E. Remau t, Appl. Environ. Microbiol, 64, 342 (1998) ; J. C. Piard, I. Hautefort, V. A. Fischet ti, S. D. Ehrlich, M. Fons, A. Gruss, J. BacterioL, 179, 3068 (1997) ; K. Savijoki, M.

Kahala, A. Palva, Gene, 186, 255 (1997) ; A. Strauss, F. Gotz, Mol. Microbiol, 21, 491 (1996) ;及び S. Avall-Jaaskelainen, A. Lindholm, A. Palva, Appl. Environ. Micro biol, 69, 2230 (2003)参照）、現在のところ表層に提示可能なタンパク質のサイズやモチーフの安定性などに問題があることが指摘されている。

[0030] 一方、成らは、新規なモチーフとして、細菌の細胞表層への目的タンパクの発現に、バチルス属菌株由来のポリ γ グルタミン酸生合成酵素の遺伝子を含む発現プラスミドを用いて検討した結果、グラム陽性菌である乳酸菌やグラム陰性菌である大腸菌などの表層へ種々のタンパク質を提示できることを示して、る（特表 2005 - 50 0054号）。

[0031] 本願発明において、発明者らは Α |8分子種の発現に特表 2005— 500054号記載のシステムを応用することとした。本願発明において、発明者らが採用した微生物の表層発現系にお、ては、微生物の表面へ外来タンパク質を大量に発現させる新し、表面発現キャリアとしてバチルス属菌株由来のポリ γ グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択して、これを用いて外来タンパク質またはペプチド（本願発明にお!、ては Α β分子種)を微生物表面へ発現させる表面発現用のベクターを作製し、当該ベクターにより形質転換された多様な形質転換体から外来タンパク質が効率的に形質転換体の表面へ発現されることを特徴とする。

[0032] 前記の目的を達成するために、本願発明は、ポリ γ グルタミン酸生合成酵素（ pgs)複合体を構成している遺伝子である、 pgsA、 pgsB及び pgsC中のどれか一つまたは二つ以上を含む表面発現ベクターを提供する。詳細には、本願発明は、微生物表面において A |8分子種を発現するための表面発現ベクターを提供し、例えば、一つの実施態様である pgsA遺伝子は、配列番号 1に記載のヌクレオチド配列と相同性あるヌクレオチド配列を含んでいる。加えて、表面発現ベクターはまた、微生物表面に

A β分子種タンパク質を発現するために提供され、それは Α β分子種をコードする遺伝子のみならず、 3 '末端に転写終止コドンを含んでいる。さらに、最適態様として例示される乳酸菌をはじめとする細胞形質転換体は、上記発現ベクターを用い形質転換されるように提供される。

[0033] 本願発明による Α β分子種を表層に発現させた、とりわけ乳酸菌を最適実施態様とする微生物を本態とするアルツハイマー病ワクチンは、哺乳動物のアルツハイマー病の治療及び/または予防に用いることができる。従って、本願発明によれば、治療 '予防上有効量の本願発明によるアルツハイマー病ワクチンを被験者に投与することを含んでなる、アルツハイマー病の治療'予防方法、並びにアルッノ、イマ一病治療'予防剤の製造における、本願発明によるアルツハイマー病ワクチンの使用が提供される。投与対象は、哺乳動物、例えば、ィヌ、霊長類などであり、好ましくはヒトである。

[0034] 本願発明によってもたらされるアルッノヽイマ一病ワクチンの投与方法は、特段の制約はなく一般的な方法が適用され得るが、本願発明のワクチンの宿主たる乳酸菌が経口投与できると、う利点を有することから、経口投与が被験者が自ら投与できるという点で特に好適な態様である。これ以外にも、例えば、腹腔内注入、気管内注入、気管支内注入および直接的な気管支内滴注、皮下注入、経皮輸送、動脈内注入、静脈内注入、経鼻投与等が例示される。

[0035] 投与されるアルッノヽイマ一病ワクチンの量は治療上有効量であればよぐこのような量は当該技術分野における当業者であれば容易に決定することができる。また、投与量は被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重等によって調整されることが好ましいが、このような投与量の調整は、医師または獣医師によって適宜実施され得る。

[0036] 本願発明によるアルッノヽイマ一病ワクチンは、ー且被験者に投与されると、比較的長期間に渡ってアルツハイマー病の治療作用が持続することが期待される。特に、経口投与した場合には、腸管上皮細胞において抗原が長期間提示され、これに対する抗体産生が誘導されることが確認されている。この点に鑑み、当業者であれば適切な投薬計画を作成することができる。

[0037] 本願発明によるアルツハイマー病ワクチンは、最適実施態様として乳酸菌を含む医薬組成物として被験者に投与することができる。従って、本願発明によれば、本願発明による乳酸菌を含んでなるアルッノ、イマ一病を治療 ·予防するための医薬組成物が提供される。本願発明の好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は経口投与のためのものとされる。

[0038] 本願発明による医薬組成物は、その投与経路および剤型に応じて、当技術分野において公知の方法により調製することができる。例えば、経口投与のための医薬組成物としては、カプセル剤、溶液剤等の剤型が使用可能である。従って、本願発明による医薬組成物は、それぞれの剤型に応じて、医薬上許容される担体、希釈剤、保存剤等を含んでもよい。

[0039] 以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、本願発明はこの例示に限定されるものではな、。

実施例 1

[0040] (A β 1—42からなる完全長の Α β (Α β 42と略す)を細胞表層に提示する乳酸菌の作製）

(1)乳酸菌細胞表層への Α β 42提示用ベクターの構築

先ず、ポリ γ グルタミン酸生合成酵素の一つである pgsAの遺伝子 (配列番号 1 )を含むプラスミド pHCEILB- pgsBCA (BioLeaders Corporationより入手）を铸型とし、配列番号 2および配列番号 3記載の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを各プライマ一として用いた PCR反応（MJ Research PTC- 200, Peltier Thermal Cycler,以下の PC R反応は同機を利用）、 94°C 5分/ (94°C ' l分/ 55°C ' l分/ 72°C ' l分 20秒: 30_Cycle) /7 2°〇' 10分/15°〇保持を行なぃ、反応終了後は NucleoSpin Extract kit (MACHEREY- NAGEL社)を用い pgsA遺伝子を精製した。

[0041] 次【こ、 Homo sapiens Amyloid beta (A4) precursor protein (APP : Accession No. 4丄 406056)の A βをコードする塩基配列（配列番号 4)を参考に、乳酸菌での発現効率を高めるような使用頻度の高いコドンへの最適化を行うための配列番号 6及び配列番号 7記載の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた PCR反応、 94°C ' 5分/ (94°C - 1分/ 50°C ' 1分/ 72°C ' 10秒: 15cycle)/15°C保持にて行い、新たな A j8 42の遺伝子を合成した（配列番号 8)。反応終了後、 NucleoSpin Extract kit (MAC HEREY- NAGEL社)を用い精製した。さらに、合成した A 42遺伝子を铸型として用 V、、配列番号 9及び配列番号 10記載の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた PCR反応、 94°C 5分/ (94°C ' l分/ 55°C ' l分/ 72°C ' l分： 30cycle) /7 2°C · 10分/ 15°C保持を行って制限酵素配列を付加した Α β 42の遺伝子を増幅した ( 配列番号 11)。先の PCRと同様に反応終了後は NucleoSpin Extract kit (MACHERE Y-NAGEL社)を用い目的とする A β 42遺伝子を精製した。この増幅した Α β 42の遺伝子は目的とする配列番号 11に示す 145bpの増幅された遺伝子となっている。合成した A |8 42遺伝子の両端は、上記配列番号 9及び配列番号 10のプライマーにて制限酵素 BamHIと Xbalの認識部位が存在するように構成されて、る。上記増幅された A β 42の遺伝子を制限酵素 BamHIと Xbalで切断し、乳酸菌表層発現用のベクター p HCEIILB-pgsA-Lの構成遺伝子で、細胞表層へのアンカータンパク質となる pgsAに続くリンカ一配列の 3'-末端部位に翻訳コドンを合わせて挿入し、 TAKARA Ligation Kit Version 2.1 (Takara Bio社）によって連結することにより、 pgsA- L- A j8 42をこの順で有する、目的の A j8 42提示用ベクター pHCEIILB- pgsA- L- A j8 42を得た（図 1)。

[0042] このベクターを制限酵素 BamHIと Xbalで消化し、 A β 42の遺伝子導入を確認し、 A BI PRISM (登録商標） 3100- Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）を用い、その塩基配列を確認した。

[0043] (2)細胞表層に A β 42を提示する乳酸菌の作製

上記（1)で得た Α β 42表層発現用のベクター pHCEIILB-pgsA-L-A β 42を、大腸菌（E. coli DH5 a )コンビテントセルにヒートショック法によって形質転換し、 500 μ g/m 1のエリスロマイシンを含む Luria-Bertain (以下、 LB)寒天培地（トリプトン lw/v%、酵母エキス 0.5w/v%、塩化ナトリウム lw/v%、および寒天末 1.5w/v%)で形質転換体を選択した。次いで、得られた形質転換体を LB液体培地で培養し、菌体を回収した後、 Wiz eard (登録商標） Plus SV Miniprepsp (Promega社）にて pHCEIILB- pgsA- L- A β 42を精製した。次いで、得られた表層発現ベクター pHCEIILB- pgsA- L- A j8 42を Lactobac illus casei BLS525株にエレクト口ポレーシヨン法を用いて形質転換し、 20 g/mlのェリスロマイシンを含む MRS寒天培地（Oxoid社)上に塗布し、 37°Cで 48時間培養後、形質転換体を得た。得られた形質転換体を MRS液体培地で 37°Cで 24時間培養し、 700 0r.p.m.、 10分間の遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体は PBS緩衝液 (pH7. 4)にて洗浄後、同緩衝液に再懸濁した後、氷上に保持し、超音波破砕機（出力 4、 2 分間 X 2回/トミー精工社）にて破砕した。その破砕液を 3,000r.p.m.、 5分間 X 3回にて遠心分離して不純物を除去し、 16,500r.p.m.、 20分間の遠心分離にて分画した。全細胞、細胞質および細胞膜画分をそれぞれサンプルバッファーに懸濁後、 100°Cで 1 0分間熱変性させ、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後、 PVDFメンブラン (Millipore社）に転写した。 PVDFメンブランをブロッキング緩衝溶液（PBS、 5 %スキムミルク、 pH8.0)で 1時間振とうし、ブロッキングさせた後、 pgsAのポリクローナル抗体（BioLeaders Corporationより入手）を一次抗体としてブロッキング緩衝液で 10 00倍希釈して 37°C、 12時間反応させた。反応終了後、メンブランを TBST緩衝液（1L 中に NaCl 8.8g/lM Tris- HC1 pH8.0/0.5ml Tween20)にて洗浄し、ビォチン標識された抗ゥサギ IgG抗体 (Vector社)を二次抗体とし、ブロッキング緩衝液で 2000倍希釈して 3時間反応させた。反応終了後、メンブランを洗浄し、 vectastain ABC kit standard (Vector社）にてアビジンィ匕し、さらに peroxidase substrate kits DAB/Ni substrate (Ve ctor社）にて発色させ、細胞膜画分に pgsAと融合した Α β 42の発現を確認した（図 2) 。同様に Α β 42に対するモノクローナル抗体（Chemicon international社）とビォチン標識された抗マウス IgG抗体 (Vector社)を二次抗体として用いたウェスタンブロッティングを行って細胞膜画分に A β 42の乳酸菌細胞表層への発現を確認した。

[0044] 次ヽで、 Fluorescence-activating cell sorting (Facs) flow cytometryによる A βの表層発現を観察した。発現菌体を PBS緩衝液 (ρΗ7.4)で 3回洗浄した後、ブロッキング用 PBS緩衝液 (ρΗ7.4)に再懸濁した。一次抗体として Α |8に対するモノクローナル抗体を用い、 4°Cで 12時間反応させ、反応終了後、 PBS緩衝液にて洗浄し、ピオチン標識された二次抗体を 4°Cで 3時間反応させた。反応終了後、ピオチン特異的なストレプトアビジン- R-ピコトリェンにて発色させ、菌体を PBS緩衝液で 2回洗浄後、 Facs sea nにて測定した。その結果、コントロールと比較して、 A |8 42が細胞表層に発現していることを確認した（図 3)。

実施例 2

[0045] (Α β ΐ - 20からなる Α β分子種 (Α β Ν-20と略す)を表層提示する乳酸菌の作製） (1)乳酸菌細胞表層への A β Ν-20提示用ベクターの構築

前述の Α β 42の表層発現用ベクターと同様の乳酸菌表層発現ベクター pHCEIILB- pgsA-Lに A βの Ν末端力も 20アミノ酸までのェピトープを示す部位を導入するために、 pHCEIILB-pgA-L-A j8 42に導入されている pgsA、リンカ一配列及び A j8 42の遺伝子までを铸型として用いて、配列番号 12及び配列番号 13記載の塩基配列を持つォリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた PCR反応、 94°C 5分/ (94°C ' l分/ 55°C ' l分 /72°C · 1分： 30cycle) /72°C · 10分/ 15°C保持を行って、 pgsA遺伝子の 364bp目の塩基配列から、リンカ一配列及び A |8 42の N末端力 20アミノ酸までの遺伝子を増幅した。前述の実施例 1の PCRと同様に、反応終了後は NucleoSpin Extract kit (MACHERE Y-NAGEL社)を用い目的とする A β Ν-20遺伝子を精製した。このとき増幅された遺伝子部位は 888bpの大きさであった。上記配列番号 12及び配列番号 13のプライマ一は制限酵素 Pstlと Xbalの認識部位が存在するように構成されて！、る。

[0046] 上記増幅された pgsAの遺伝子 363bp目から、リンカ一配列及び A β Ν-20遺伝子を制限酵素 p_stI、 Xbalで切断し、乳酸菌表層発現用のベクター pHCEIILB-pgsA-Lの構成遺伝子で、細胞表層へのアンカータンパク質となる pgsAに続くリンカ一配列の 3' -末端部位に翻訳コドンを合わせて挿入し、 TAKARA Ligation Kit Version 2.1 (Taka ra社）によって連結することにより、 pgsA-L-A β Ν-20をこの順で有する、目的の Α β Ν - 20提示用ベクター pHCEIILB- pgsA- L- Α β N- 20を得た（図 4)。このベクターを制限酵素 Pstlと Xbalで消化し、 A j8 N- 20の遺伝子導入を確認し、 ABI PRISM (登録商標） 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製）を用い、その塩基配列を確した ₀

[0047] (2)細胞表層に A β Ν-20を提示する乳酸菌の作製

(1)で得た表層発現用のベクター pHCEIILB- pgsA- L- Α β Ν- 20を用、て実施例 1と同様な方法で Α β Ν-20の発現を確認した。

[0048] 図 5に示すように、細胞膜画分に pgsA抗体においてアンカータンパク質である pgsA との融合タンパク質として A β Ν-20の発現が確認できた。同様に Α βのモノクローナル抗体にぉ、ても細胞膜画分に pgsAとの融合タンパク質として Α β Ν-20の発現が確認できた。さらに Facs scanにおいても A j8 N- 20の表層発現が確認された（図 6)。実施例 3

[0049] (A |8発現乳酸菌の経口投与による免疫実験）

実施例 1および 2で構築した Α βを表層に発現する乳酸菌の経口投与による免疫原性を調べた。

[0050] (1)乳酸菌投与方法

接種動物として 1群 6匹のマウス C57BL6株を用い、実施例 1で得た pHCEIILB-pgs A-L-A β (Α β 42発現用ベクター）で形質転換した乳酸菌または実施例 2で得た ρ HCEIILB-pgsA-L-A β Ν-20 (Α β N-20発現用ベクター）で形質転換した同乳酸菌を経口投与した。投与量は、 Α |8 42発現用ベクターについては l X 10⁹cfo/ml (3-l)、 1 X 10¹⁰clu/ml (3-2)または 5 X 10¹⁰clu/ml (3-3)、 Α β Ν- 20発現用ベクターにつ!/、ては 1 X 10⁹cfo/ml (2- 1)または 1 X li^cfo/ml ^- 2)であった。対照として、 pHCEIILB- pgs A-L (Α βを発現しな、コントロールベクター）で形質転換した同乳酸菌を 1 X 10¹⁰clu/ ml (1-1)の投与量にて同マウスに経口投与した。

[0051] 具体的には以下の手順を行った。上記乳酸菌の各種形質転換体を 37°Cで前培養した後、 1 X 10⁹〜5 X 10^1Qcfo/mほで培養した。遠心分離にて菌体を回収し、 PBSで洗浄した後、死菌化した。ついで、死菌化した菌体を凍結乾燥工程を経て粉末ィ匕した。粉末化した菌体を 1 X 10⁹〜5 X lO^fo/mlの濃度になるように PBSに再懸濁した。この懸濁液の 100 1を上記に示した各投与量にてマウスに経口投与した。投与期間としては、 1週間の内 6日間連続投与で行い、 4週間継続した。血液中の A |8に対する抗体生産を確認するために、採血を、実験開始前、投与開始から 3週間後、 5週間後、 6週間後、 7週間後の計 5回の採血スケジュールで行い、血清サンプルを得た。得られた血清サンプルは測定時まで 20°Cで保存した。

[0052] (2)血中抗体価の測定

血清中の抗体価の測定は以下の ELISA法で実施した。 A |8の 42アミノ酸残基および N末端側から 16アミノ酸残基を合成した。各合成したペプチドを 96穴プレートに 500 ng/100 1/well (重炭酸緩衝液: pH9.6)の濃度で添加し、 4°Cで 12〜14時間固相化した。各合成ペプチドで固相化したプレートを 300 1の PBSTで 5回洗浄した。 10%スキムミルクで 2時間室温状態でブロッキングした。再度プレートを 300 μ 1の PBSTで 5回洗浄した。 2%スキムミルクで希釈（1:50)した陽性スタンダード、陰性コントロールおよびマウスの血清をそれぞれ 100 1/wellで添カ卩し、 37°Cで 1時間反応させた。再度プレートを 300 μ 1の PBSTで 5回洗浄した。 2%スキムミルクで希釈した（1:1000)ペルォキシダーゼコンジユゲート抗マウス IgGを 100 μ 1/wellでプレートに添カ卩し、 37°Cで 1時間反応させた。再度プレートを 300 μ 1の PBSTで 5回洗浄した。基質である OPDを 100 μ 1/well で添加し、室温暗所で 15〜20分間反応させた。 2M H SOを 50 μ 1/wellで添カ卩し、反

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応を停止させ、 450應の波長での吸収を測定した。

[0053] その結果を図 7および図 8に示す。図 7および図 8から明らかなように、 A j8 N- 20および A β 42の各ペプチドを表層発現させた乳酸菌をマウスに経口投与し、その血清中の抗体上昇を ELISA法にて測定した結果、 Α β Ν-20および Α β 42の各ペプチドを発現させた乳酸菌投与群のマウスでコントロール群のマウスに比べ血清中の有意な抗体上昇が認められた。この結果から、本発明者らが作製した菌体表面に Α 分子種を発現する乳酸菌を経口投与することにより A βに対する抗体を誘導できることが明らかとなった。

産業上の利用可能性

[0054] 本願発明は、アルツハイマー病の予防 ·治療に供与されうる副作用の少ない安全で且つ簡便な投与形態が可能なアルツハイマー病の予防'治療用ワクチンを提供するものである。本願発明による最適実施態様である乳酸菌を用いたアルツハイマー病ワクチンを用いれば、従来の乳酸菌の食品と同様の感覚と簡便さでアルッノ、イマ一の予防及び治療薬を摂取することが可能となる。特に本疾患が老人に多い事を考えれば、簡便に摂取できる経口投与と低コストの実現は、これからの高齢ィ匕社会における患者の QOLの向上と医療経済の面からも非常に大きなメリットを社会に与える発明と言える。

Claims

請求の範囲

[I] 微生物の表面にアミロイド j8分子種を産生するための発現ベクター。

[2] ポリ y グルタミン酸生合成酵素複合体をコードする pgsA、 pgsB及び pgsCから選択される一つまたは二つ以上の遺伝子及びアミロイド j8分子種をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、請求項 1記載のアミロイド β分子種を産生するための発現ベクター。

[3] 前記 pgsA、 pgsB及び pgsC力選択される一つまたは二つ以上の遺伝子力ポリ

Ύ グルタミン酸生合成酵素複合体を産生するバチルス属菌株から由来する、請求項 2記載のアミロイド /3分子種を産生するための発現ベクター。

[4] アミロイド j8分子種が、アミロイド j8の N末端配列より 42番目までのアミノ酸配列よりなるポリペプチド及びアミロイド βの Ν末端配列より 20番目までのアミノ酸配列よりなるポリペプチドより選択される、請求項 1な!、し請求項 3の、ずれかに記載のアミロイド β分子種を産生するための発現ベクター。

[5] 微生物が乳酸菌である、請求項 1ないし請求項 4のいずれかに記載のアミロイド |8 分子種を産生するための発現ベクター。

[6] 微生物の表面にアミロイド β分子種を産生するための発現ベクターで形質転換された乳酸菌。

[7] 微生物の表面にアミロイド j8分子種を産生するための発現ベクターが請求項 1な、し請求項 5に記載の発現ベクターである、請求項 6記載の形質転換された乳酸菌。

[8] 前記乳酸菌が、 Lactobacillus属であることを特徴とする請求項 6または請求項 7のいずれかに記載の形質転換された乳酸菌。

[9] アミロイド β分子種を発現する微生物を個体に投与することによる、抗アミロイド β 抗体を誘導する方法。

[10] アミロイド β分子種を発現する微生物を個体に経口的に投与することを特徴とする、請求項 9記載の抗アミロイド抗体を誘導する方法。

[I I] アミロイド β分子種を発現する微生物が、請求項 6ないし請求項 8のいずれかに記載の乳酸菌である、請求項 9または請求項 10のいずれかに記載の方法。

[12] アミロイド j8分子種を発現する微生物を個体に投与することによって、アミロイド 13 分子種に対する免疫を個体に誘導することを特徴とするアルツハイマー病の予防及び/または治療方法。

[13] アミロイド β分子種を発現する微生物が、請求項 6ないし請求項 8のいずれかに記載の乳酸菌である、請求項 12記載のアルツハイマー病の予防及び/または治療方法。

[14] 請求項 6な、し請求項 8の、ずれかに記載の乳酸菌を主たる構成成分とするアルッハイマー病の予防'治療用ワクチン。