WO2006085583A1 - 細胞透過性ペプチド - Google Patents

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WO2006085583A1
WO2006085583A1 PCT/JP2006/302255 JP2006302255W WO2006085583A1 WO 2006085583 A1 WO2006085583 A1 WO 2006085583A1 JP 2006302255 W JP2006302255 W JP 2006302255W WO 2006085583 A1 WO2006085583 A1 WO 2006085583A1
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cell
cells
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phage
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PCT/JP2006/302255
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Shinsaku Nakagawa
Tadanori Mayumi
Kiichi Fukui
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Osaka University
Nitto Denko Corporation
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    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having permeability into cells, and a peptide conjugate formed by linking the peptide and a physiologically active substance.
  • the present invention also relates to a vaccine comprising the peptide or peptide conjugate, a preparation for transdermal absorption, particularly a tape preparation for transdermal absorption.
  • PTD Protein Transduction Domains
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-33186
  • one object of the present invention is to form a peptide that penetrates into cells more efficiently than the TAT peptide (Tat 48-60), and the peptide and a poorly cell-permeable U ⁇ bioactive substance. It is to provide a peptide conjugate.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing a vaccine containing the peptide or a conjugate thereof and a preparation for transdermal absorption.
  • an object of the present invention is to introduce a physiologically active substance into a cell using the peptide. That is.
  • the present inventor first created a gene library encoding peptides having more than 100 million types of diversity, and incorporated each into a phage medium vector. , phage coat protein g 3p tip to present each peptide which is a, ability to enter this manner a peptide surface display phage obtained by the addition to the cells, the Z or the cells binding to the cells Peptides having a concentration were selectively concentrated by panning. Next, a fusion of these selectively enriched peptides and a protein synthesis inhibitor (PSIF) that cannot enter the cell alone is added to the cells, and cytoplasmic migration (cell membrane) using protein synthesis inhibition as an index is added. Through the evaluation of permeability, it was found that peptides having the ability to enter cells more efficiently than TAT peptides (Tat 48-60) can be created comprehensively and quickly, and the present invention was completed. .
  • PSIF protein synthesis inhibitor
  • the present invention relates to the invention shown in the following items:
  • Item 1 At least one peptide selected from group power consisting of SEQ ID NOs: 1 to 16.
  • Item 2 The peptide according to Item 1, wherein the peptide is at least one selected from the group force consisting of SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 15, and 16.
  • Item 3 The peptide according to Item 1 or 2, wherein at least one Cys residue is added to the N-terminus and the Z- or C-terminus of the amino acid sequence.
  • Item 4 A peptide conjugate comprising the peptide according to any one of Items 1 to 3 and a physiologically active substance linked directly or indirectly via a cross-linking agent.
  • a vaccine comprising the peptide according to any one of Items 1 to 3 or the peptide conjugate according to Item 4.
  • a percutaneous absorption preparation comprising the peptide according to any one of Items 1 to 3 or the peptide conjugate according to Item 4.
  • Item 7 Use of the peptide according to any one of Items 1 to 3 for introducing a physiologically active substance into a cell.
  • a physiologically active substance such as a polypeptide, nucleic acid, or sugar that is introduced into the cell and exhibits biological activity, it can be expected to be effective in preventing or treating various diseases or as a vaccine.
  • FIG. 1A shows the principle of the phage surface display method.
  • FIG. 1B shows the principle of the phage surface display method.
  • Figure 2 shows the principle of cell panning.
  • FIG. 3 shows an outline of the experiment of Example 1.
  • FIG. 4 shows the principle of preparation of a random 18a.a. peptide library.
  • FIG. 5 shows the principle of preparation of a random Tat peptide library.
  • FIG. 6 shows the structure of Pseudomonas aeruginosa bacterial exotoxin (fragmented by PCR) and its effect on cells.
  • a TAT peptide derived from HIV, a PTD (Protein Transduction Domain) and protein complex 'fusion has recently passed through the BBB barrier (blood-brain barrier), and enters the brain from the blood.
  • BBB barrier blood-brain barrier
  • Attempts to apply PTD as a peptidic DDS carrier have been attracting attention, as it has been found that it can migrate, and can penetrate into the cell, and treats cranial nerve diseases such as Aruno, Imah's disease and Parkinson's disease.
  • cranial nerve diseases such as Aruno, Imah's disease and Parkinson's disease.
  • cranial nerve diseases such as Aruno, Imah's disease and Parkinson's disease.
  • the peptide of the present invention can cross the BBB barrier (blood-brain barrier) and cell membrane, It is expected to exert a great effect on improving the expression and absorbability.
  • a “TAT peptide library” (FIG. 5) was prepared in which three amino acids (ie, the first G, the seventh Q, and the first P) were fixed and the other amino acids were substituted. PCR was performed using a primer into which an NNS sequence capable of encoding 20 kinds of amino acids was introduced, and the PCR fragment was incorporated into a phagemid vector.
  • a phage library that expresses various kinds of peptides at the tip of the phage minor outer shell protein g3p was prepared.
  • the phage surface display method is known to those skilled in the art (see FIG. 1).
  • Panning In order to screen for peptides having the ability to move into fine cells, panning of A431 cells (human epidermal cells) was performed on each of the prepared phage libraries. As panning was repeated, it was confirmed that clones having the ability to bind to cells or to enter cells were selected and enriched.
  • PTD has a characteristic that it contains a lot of basic amino acids, but it is clear that each clone concentrated by Panjung has a lot of tributophane (W) along with the basic amino acids. (See Table 1).
  • the Pan-Jung method is a method known to those skilled in the art (see FIG. 2; Nature Biotechnology Vol. 21, 546-552, 2003).
  • the phagemid vector into which the library gene is inserted is not particularly limited, and examples thereof include PCANTAB5E (manufactured by Amersham Biosciences). Methods for producing phage displaying peptides on the surface are known (Applied and Environmental Microbiology Vol.63, 263-269, 1997).
  • the obtained peptide surface-displayed phage is purified and used for Cell panning.
  • the cell that can be used for cell panning is not particularly limited as long as it is a cell that allows a physiologically active substance to invade with the cell-penetrating peptide of the present invention.
  • Examples thereof include A431 cells (human epidermal cells).
  • human epidermal cells such as A431 cells
  • cells for example, organs or tissues other than skin
  • a polypeptide excellent in absorbability or permeability to other organs or tissues can be selected.
  • the number of non-ungs is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times, more preferably 3 to 5 times. If panning has already been done sufficiently, the ratio of the output phage Zlnput phage will be almost constant.
  • PSIF protein synthesis inhibitor
  • PSIF bacterial protein-derived protein synthesis inhibitor
  • PSIF protein synthesis inhibitor
  • diphtheria toxin GenBank; A04646
  • Pseudomonas exotoxin GenBank; K01397
  • a peptide having higher cell permeability than TAT peptide (Tat48-60) is provided.
  • the peptide of the present invention has an amino acid sequence of 3 to 30, preferably 3 to 20, more preferably 3 to 18 as a portion exhibiting cell permeability. As the number of amino acids in a peptide increases, the immunogenicity of the peptide tends to increase. Therefore, if the function of a physiologically active substance that does not easily penetrate the cell membrane is expressed in the cell, the peptide is short. U, which prefers the array.
  • any peptide involved in immunity induction may be linked. For example, when a peptide presented on the surface of immune cells is bound and administered as a vaccine in order to induce cellular immunity, the peptide may be longer.
  • the peptide of the present invention is not cell-permeable or poor! /, And is linked to physiologically active substances (eg, peptides, proteins, polynucleotides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids) When introduced into a peptide, shorter peptides may not be appropriate.
  • physiologically active substances eg, peptides, proteins, polynucleotides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids
  • the "physiologically active substance” may be any substance that can affect the function or state of the cell when introduced into the cell, for example, a nucleic acid, a peptide, Examples include, but are not limited to, polypeptides, proteins, polysaccharides, and glycoproteins.
  • a target combination of a physiologically active substance and a specific substance for example, a polycation to which a peptide of the present invention is bound, a peptide of the present invention to which avidin is bound, or a physiologically active substance to which a peptide is bound Quality, antibody-antigen to which the peptide of the present invention is bound, etc.
  • a specific substance for example, a polycation to which a peptide of the present invention is bound, a peptide of the present invention to which avidin is bound, or a physiologically active substance to which a peptide is bound Quality, antibody-antigen to which the peptide of the present invention is bound, etc.
  • the peptide of the present invention can permeate the cell membrane of the skin or digestive tract, or injected tissue (muscle, subcutaneous, vascular endothelium, etc.).
  • cell permeability means a property capable of penetrating a cell membrane and entering a cell. Therefore, when a physiologically active substance is linked to or complexed with the peptide of the present invention, the peptide can penetrate the cell membrane together with the physiologically active substance and enter the cell.
  • binding to a cell simply means binding to the surface of a cell
  • invading into a cell simply means binding to the surface of a cell. It refers to permeating the cell membrane and entering the cell.
  • the "target cell” is not particularly limited as long as it is a cell to which a physiologically active substance is intended to enter.
  • vascular endothelial cells mucosal epithelial cells, skin cells (keratinocytes) , Muscle cells, cells of various organs, blood cells (lymphocytes, macrophages, T cells, rod cells, B cells, etc.).
  • any force of SEQ ID NOs: 1 to 16 preferably a polypeptide force represented by any force of SEQ ID NOs: 1, 5 ⁇ 6, 7, 9, 10, 11, 15, and 16 is cited. It is done.
  • sequences include polypeptides in which one or several amino acids are substituted, deleted or added as long as they retain cell permeability.
  • cell permeability means that a physiologically active substance bound to the peptide of the present invention permeates the cell membrane and is introduced into the cell.
  • DNA can be chemically synthesized by the phosphoramidite method or triester method, or can be synthesized on a commercially available automated oligonucleotide synthesizer.
  • This strand fragment is chemically synthesized by synthesizing complementary strands and annealing the strands together under appropriate conditions, or by adding a complementary strand using a DNA polymerase with an appropriate primer sequence.
  • the chain product strength can also be obtained.
  • the peptide of the present invention can also be synthesized by a solid phase synthesis method using a peptide synthesizer, and substitution 'addition' deletion can be easily performed by changing the type of protected amino acid when using a peptide synthesizer. Can be done. It is also possible to introduce a special amino acid such as D amino acid or sarcosine (N-methylglycine).
  • Cis-inducible proteins proteins such as adenosine deaminase that induce metabolic disorders due to deficiency (including enzymes) and enzyme inhibitors (eg calpain inhibitors), genetic information expression regulators (eg I ⁇ B, NF ⁇ B), force S exemplified by peptide hormones (insulin, calcitonin, etc.), but not limited thereto.
  • the polypeptide linked to the peptide of the present invention and introduced into the cell is not particularly limited, and includes any polypeptide.
  • Examples of the molecular weight of the polypeptide include about 500 to 1,000,000, preferably about 1,000 to 500,000, regardless of the type of secreted protein, membrane-bound protein, peptide hormone, and the like.
  • the polypeptide to be introduced into cells and the peptide of the present invention have at least one cysteine residue when the peptide of the present invention has a cysteine residue or inside the peptide of the present invention or at the N-terminus or C-terminus.
  • it may be linked to the cysteine residue of the polypeptide via an —SS— bond or an appropriate crosslinking agent.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention and the polynucleotide (gene) encoding the introduced polypeptide are preferably directly linked, introduced into a vector, and expressed in a host cell such as E. coli.
  • the cross-linking agent is at least a bivalent cross-linking agent that can bind the cell-penetrating peptide of the present invention and the protein or polypeptide to be introduced, nucleic acid, sugar, or cell-permeability and a physiologically active substance.
  • Non-limiting examples include N- (6-maleimidocaprooxy) succinimide ester (EMCS).
  • a Cys residue is formed in a manner such as Cys or Gly-Cys, and on the N-terminal side, a Cys residue is formed in a manner such as Cys or Cys-Gly. It is preferred to further attach the group.
  • the SH group of the Cys residue is not added to the maleimide group of EMCS, or is introduced into the protein or polypeptide that is introduced by SS-bonding when the polypeptide has a free SH group. Can be linked. When linked via an SS bond, the SS bond is reduced in the cell and is preferably unmodified protein and polypeptide released.
  • the peptide library to be displayed on the phage surface may be one in which all amino acids are random, or a part of the TAT peptide may be constant while other amino acids are random. Good.
  • the TAT peptide library has three amino acids (i.e., first G, seventh Q, and eleventh P) that are the origin of the ⁇ helix in the sequence GRKKRRQR RRPPQ (SEQ ID NO: 17). Can be prepared by randomly substituting other amino acids.
  • the physiologically active substance to be bound to the peptide of the present invention is not particularly limited, and for example, a group force selected from nucleic acid, peptide, polypeptide, protein, polysaccharide and glycoprotein strength is selected.
  • the physiologically active substance may be bound to any part of the peptide of the present invention. However, binding to the C terminus or N terminus, particularly the C terminus, is preferable because the preparation of the recombinant is easy.
  • topical administration agents such as ointments, plasters, lotions, creams, inhalants, nasal drops and the like are particularly preferred. It is preferably used for a tape preparation for skin absorption.
  • the present invention also relates to a vaccine comprising the peptide or peptide conjugate of the present invention.
  • Conventional vaccine methods stimulate humoral immunity, i.e. production of antigen-specific antibodies. Although it is effective in removing virus particles and the like released to the outside of cells, it is ineffective in removing infected cells and cancer cells that are the main components of virus infection.
  • Cellular immunity needs to be enhanced for the treatment of viral infections. It is known that cellular immunity is enhanced by antigens entering cells. Therefore, a conjugate obtained by linking the peptide of the present invention and an antigen can put an antigen into a cell and can be very useful as a vaccine.
  • the protective antigen which is a physiologically active substance introduced into cells, refers to the microorganism-derived protein that serves as an infection protective antigen of pathogenic microorganisms (bacteria, fungi, viruses, etc.), cancer cell specific
  • pathogenic microorganisms bacteria, fungi, viruses, etc.
  • mutant proteins expressed in the above, or their peptide fragments that retain immunogenicity all of the live attenuated microorganisms that have been used as conventional live vaccines or inactive vaccines or their dead bacteria are included.
  • microorganism-derived proteins include HIV-derived proteins, surface antigens of B and C hepatitis viruses, surface antigens of influenza viruses, and cancer cell-specific mutant proteins such as cancerous cell differentiation antigen proteins. It is done.
  • These protective antigens may be used alone or in combination with a plurality of protective antigens.
  • the pharmaceutical composition containing the antigen-specific peptide conjugate of the present invention may be either an oral preparation or a parenteral preparation, for example, in the form of an external preparation.
  • the protective antigen is present in the form of an ointment prepared by mixing with an appropriate ointment base, or the protective antigen is seeded on the adhesive layer using the adhesive layer as a base.
  • adhesive tape preparations that are designed to be capable of sustained release by being present in the form embedded in a hook or the adhesive layer.
  • an ointment base such as petrolatum, paraffin, plastic base, silicone, plant oil, wax, etc.
  • an emulsified base such as hydrophilic ointment, hydrophilic petrolatum, purified lanolin, euserin, macro
  • water-soluble bases such as goals.
  • preservatives such as noraoxybenzoic acid ester, as needed.
  • Transcutaneous inoculation of the protective antigen can be performed by applying the ointment to the skin epidermis.
  • the protective antigen content in the ointment is adjusted so that the dose when a normal amount of the ointment is applied is in the range of 0.1 / ⁇ ⁇ « ⁇ 2 to 1 ⁇ 2 for one antigen. Is preferred.
  • a particularly preferred embodiment of the transdermal inoculation of the protective antigen is the adhesive tape preparation of the present invention (also referred to as "transdermal absorption tape preparation”), which is applied to the skin epidermis.
  • the pressure-sensitive adhesive tape preparation of the present invention is designed so that the protective antigen is moderately and slowly released, and at the same time, the protective antigen implanted at the surface of the adhesive layer or embedded in the adhesive layer is at least It is desirable to exist stably to the extent that it retains its original function as a protective antigen. It is also desirable that the adhesive strength of this adhesive tape formulation is designed to be strong enough to adhere to the epidermis.
  • the pressure-sensitive adhesive used is preferably a pressure-sensitive adhesive that satisfies the above conditions, preferably not reducing or changing the antigenicity of the protective antigen, even if it is an acrylic polymer pressure-sensitive adhesive. An agent may be used.
  • the pressure-sensitive adhesive preferably used includes a pressure-sensitive adhesive having a hydrophilic polymer strength.
  • hydrophilic polymer examples include water-soluble natural polymers such as gum arabic and carboxymethyl cellulose, but also pyrrolidone, butyl alcohol, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-methoxyethyl acrylate, acrylic acid, etc.
  • examples include polybulurpyrrolidone obtained by polymerizing these water-soluble monomers, polybulualcohol, polymethoxyethyl acrylate, polyacrylic acid, and the like, and further copolymers of two or more of these water-soluble monomers.
  • it may be an adhesive polymer obtained by polymerizing hydrophobic monomers such as butyl acrylate and 2-exoxyhexyl acrylate within the range without impairing the hydrophilicity required in the present invention.
  • a hydrophilic or water-soluble low molecular weight substance may be added to the pressure-sensitive adhesive layer in order to impart more appropriate pressure-sensitive adhesiveness.
  • hydrophilic or water-soluble low molecular weight substances include high-boiling liquid compounds having a boiling point of 100 to 400 ° C. Specific examples thereof include polyhydric alcohols and sugar alcohols. At this time, reducing sugars are preferably used without causing browning reaction (Maillard reaction) by reacting with proteins.
  • Polyhydric alcohols include ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, liquid polyethylene glycol
  • Propylene glycol, dipropylene glycol, 1,1,1 trihydroxypropane, glycerin and the like, and reducing sugars include sorbitol, sorbitan, erythritol, xylitol, trehalose and the like.
  • an ether-type casing of glycerin and ethylene glycol or propylene glycol Some polyoxyethylene glyceryl ethers or polyoxypropylene sorbitol ethers may be polyoxyethylene sorbitan ethers.
  • the amount of these hydrophilic or water-soluble low-molecular substances used is added in the range of 5 to 90% by weight of the adhesive forming the adhesive layer.
  • the flexible sheet-like support used in the tape preparation of the present invention is handled
  • the material is not particularly limited as long as it does not break down and has sufficient strength, but for example, polyethylene, polypropylene, polyester, polyamide, polycarbonate, polysulfone, polyvinyl chloride, polyether, polyurethane, ethylene butyl acetate copolymer, A plastic film made of cellulose acetate, nitrocellulose, or the like is preferably used.
  • the pressure-sensitive adhesive tape preparation of the present invention was prepared, for example, so as to contain a protective antigen at a necessary concentration in an aqueous solution or a water-Z alcohol mixed solution containing the above-mentioned adhesive hydrophilic polymer and a hydrophilic low molecular weight substance.
  • a protective antigen at a necessary concentration in an aqueous solution or a water-Z alcohol mixed solution containing the above-mentioned adhesive hydrophilic polymer and a hydrophilic low molecular weight substance.
  • the drying temperature is preferably as low as possible in order to prevent deterioration of the contents in the applied viscous dispersion, and a temperature range of usually 30 to LOO ° C is used.
  • the pressure-sensitive adhesive layer of the pressure-sensitive adhesive tape preparation produced by this method contains the protective antigen uniformly at a necessary concentration. Further, the protective antigen exists in the form of being embedded in the entire or part of the adhesive layer formed by force, and as a result, the protective antigen is designed to be released moderately.
  • an aqueous solution containing the above-mentioned adhesive hydrophilic polymer and a hydrophilic low-molecular substance or a water-Z alcohol mixed solution is used as it is as a flexible sheet-like support. It is coated with a certain thickness and dried at an appropriate temperature in the range of 10 to 200 ° C.
  • an aqueous dispersion or water Z alcohol mixed dispersion adjusted to contain the necessary amount of protective antigen is added to the surface of the adhesive layer of the adhesive tape to the required protective antigen seeding amount.
  • a method of applying and evaporating water or alcohol is mentioned.
  • An adhesive tape preparation of a dosage form having an adhesive layer region containing a protective antigen and an adhesive layer region not containing a protective antigen is obtained by appropriately combining the above two production methods. Can be manufactured.
  • the pressure-sensitive adhesive tape preparation of the present invention is usually designed and adjusted so that the amount of protective antigen is included in the range of 0.1 ⁇ mol / cm 2 to 1 mmol / cm 2 for one antigen.
  • the amount of protective antigen is included in the range of 0.1 ⁇ mol / cm 2 to 1 mmol / cm 2 for one antigen.
  • the present invention further relates to the use of the cell-permeable peptide for introducing a physiologically active substance into cells.
  • the physiologically active substance include at least one selected from the group force of nucleic acid, peptide, polypeptide, protein, polysaccharide, and glycoprotein strength.
  • Fig. 3 shows an outline of the experiment.
  • Random 18a.a. Peptide Library in which all 20 types of amino acids are randomly arranged, and a part of Tat peptide (13mer; Tat48-60) derived from HIV Tat protein were replaced with random amino acids
  • a gene library in which 18 amino acids were arranged and a gene library in which a part of the base codon of the Tat peptide was replaced with an NNS sequence were prepared.
  • oligo-1 (5,-GATTACGCCAAGCTT 18) and oligo-3 (5'-CGGCGCACCTGCGGCCGCSNNSNNCGGSNNSNNSNNCT
  • PCR products were purified with a PCR purification kit (Qiagen companies).
  • the obtained PCR product was treated with Hindlll and Notl (Toyobo Co., Ltd.), and ligation reaction was performed at 16 ° C for 16 hours using phagemid vectors pY03, FLAG and T4 ligase (Roche Diagnostics) previously treated with Hindlll and Notl. It was.
  • 2YT medium Invitrogen TM life technologies
  • Phage displaying the peptide on the surface was prepared by supplementing 2YT medium containing 50 g / ml L ampicillin and 100 / zg / mL kanamycin (Sigma-Aldrich, Inc.) and culturing for 6 hours.
  • the TG1 culture solution containing the phage particles was centrifuged at 2,000 rpm at 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was collected. Centrifuge at 10,000 rpm for 15 minutes, and collect 1/5 volume of ice-cooled 20% PEG-8,000 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2.5M NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) on ice. Mix and leave on ice for 2-3 hours. Next, suspend the phage pellet obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes in NTE Buffer (lOOmM NaCl, 10 mM Tris, ImM EDTA), and add 0.45 ⁇ m Mil lex (registered trademark)-HV (MILLIPORE). Filtered to obtain a purified phage solution.
  • A431 cells human epidermal cells
  • the A431 cells 6 Anapu rate (NUNC TM) were seeded at 5.0xl0 5 cells / well, 37 ° C, saturated vapor pressure, and cultured for 24 hours under 5% carbon dioxide gas vapor. After washing 3 times with PBS, the cells were blocked at 37 ° C. for 2 hours with 2% ushi serum albumin (BSA) diluted with Opti-MEM (Invitrogen TM life technologies).
  • BSA 2% ushi serum albumin
  • Opti-MEM Invitrogen TM life technologies
  • the purified phage was also blocked for 1 hour at 4 ° C using an equal amount of 2% BSA.
  • the blocked phages were added to A431 cells and cultured at 37 ° C for 2 hours at 15 ° C with shaking force every 15 minutes.
  • a random 18a.a. peptide library in which 18 amino acids are randomly arranged and a part of the Tat peptide (Tat 48-60)
  • a TAT peptide library with amino acid substitutions was prepared.
  • PCR was performed using a primer into which an NNS sequence capable of encoding 20 kinds of amino acids was introduced, and the PCR fragment was incorporated into a phagemid vector.
  • a phage library that expresses various kinds of peptides at the tip of g3p, a phage minor outer protein was prepared.
  • a result of analyzing the DNA Sequence of picked-up clone from the library was sure that is configured by Ru in independent clones 0
  • each prepared phage library was panned against A431 cells (human epidermal cells). As panning was repeated, it was confirmed that clones having the ability to bind to cells or enter cells were selected and enriched.
  • A431 cells human epidermal cells
  • clones having the ability to bind to cells or enter cells were selected and enriched.
  • PTD contains a lot of basic amino acids, it has a characteristic, but it is clear that each clone concentrated by Panjung has a lot of tributophane (W) along with the basic amino acids. It was.
  • Plasmids recovered from the prepared library (input) and the libraries after 2nd, 3rd, and 4th panning were treated with Ncol (Toyobo Co., Ltd.) and Notl.
  • Ncol Toyobo Co., Ltd.
  • Notl By using Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) into PSIF expression vector pY7 (with PSIF expression codon incorporated into pCantab5e) treated with Ncol and Notl in advance, the peptide and PSIF A plasmid expressing the fusion was constructed.
  • PSIF protein synthesis inhibitor
  • GenBank protein synthesis inhibitor
  • Pseudomonas aeruginosa bacterial exotoxin GenBank; K01397)
  • a plasmid expressing a fusion of peptide and PSIF was transferred to TG1 by electoral positioning.
  • the obtained colonies were randomly picked up in a 96-well plate (NUNC TM) and cultured at first.
  • NUNC TM 96-well plate
  • the supernatant was removed, 200 ⁇ L of ImM IPTG (Sigma-Aldrich, In), 2 ⁇ m medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 12 hours.
  • the mixture was centrifuged again at 3,0 OOrpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was subjected to subsequent screening.
  • each library gene was recombined into a PSIF expression vector, which is a protein synthesis inhibitor, and a peptide-PSIF fusion was used, and the intracellular transfer of peptides using PSIF cytotoxicity as an indicator. Activity was evaluated. Since PSIF itself does not have the ability to move into cells, it does not show cytotoxicity unless the peptide has intracellular transfer activity. As a result of screening using an E. coli culture supernatant that produced a fusion of peptide and PSIF, it was found that clones having the ability to enter cells were selected and concentrated as panning was repeated. Sarako, succeeded in obtaining a large number of clones with higher introduction efficiency than the TAT peptide, which is said to have the highest introduction efficiency.

Abstract

　本発明は、１億種以上もの多様性を有するランダムペプチドライブラリの中から、ファージ表面提示法を使用して、細胞に結合する／あるいは細胞内へ侵入する能力を有するペプチドを選択濃縮して数を絞込み、次いで、これら選択濃縮したペプチドと単独では細胞内に侵入することが出来ないタンパク質合成阻害因子（PSIF）との融合体を細胞に添加して、蛋白質合成阻害を指標とした細胞質移行性の評価を行う。

Description

明 細 書
細胞透過性ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、細胞内への透過性を有するペプチド、および該ペプチドと生理活性物 質を連結してなるペプチドコンジュゲートに関する。また、本発明は、前記ペプチド又 はペプチドコンジュゲートを含むワクチン、経皮吸収用製剤、特に経皮吸収用テープ 製剤に関する。
背景技術
[0002] 近年、細胞質内への侵入能を有する機能性ペプチド（PTD； Protein Transduction Domain)がいくつか同定され、核酸や蛋白質等の経皮'経粘膜吸収や脳デリバリー に有効な DDSキャリアとして PTDを展開しょうとする試みが注目されている。例えば、 特許文献 1において、 HIV-1 Tatタンパク質由来のペプチドを用いてペプチド '蛋白 質を導入する試みがなされている。しかし、これら PTDは細胞特異性に乏しぐ蛋白 質等の細胞内導入効率も不十分であるため、既存 PTDの改良や新規 PTDの同定が 必須となって！/ヽる。本観点から世界的に PTDの立体構造解析に基づ 、たアナログ作 製や細胞への吸着性向上を目的としたカチオン性アミノ酸導入体の作製が、ぺプチ ド合成によりトライ 'アンド'エラーで進められている。しかし、合成できるペプチドの種 類 (多様性）にも限界があり、 TATペプチドに勝る PTDは未だ見いだされていない。 特許文献 1：特開平 10— 33186号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 従って、本発明の 1つの目的は、 TATペプチド（Tat 48-60)よりも効率よく細胞内に 透過するペプチド、該ペプチドと細胞透過性の乏 Uヽ生理活性物質を連結してなる ペプチドコンジュゲートを提供することである。
[0004] また、本発明の他の目的は、該ペプチド又はそのコンジュゲートを含むワクチンを 含む薬学的組成物および経皮吸収用製剤を提供することである。
[0005] 更に、本発明の目的は、該ペプチドを使用して生理活性物質を細胞内に導入する ことである。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、まず、 1億種以上も の多様性を有するペプチドをコードする遺伝子ライブラリを作製して各々をファージミ ドベクターに組み込み、ファージ外殻蛋白質である g3pの先端に各ペプチドを提示さ せ、このようにして得られたペプチド表面提示ファージを細胞に添加して、細胞に結 合する Zあるいは細胞内へ侵入する能力を有するペプチドをパンユングにより選択 濃縮した。次いで、これら選択濃縮したペプチドと単独では細胞内に侵入することが 出来ないタンパク質合成阻害因子 (PSIF)との融合体を細胞に添加して、蛋白質合 成阻害を指標とした細胞質移行性 (細胞膜透過性)の評価を行うことで、 TATぺプチ ド (Tat 48-60)よりも効率よく細胞内へ侵入する能力をもつペプチドを網羅的かつ迅 速に創製できることを見出し、本発明を完成した。
[0007] 即ち、本発明は、以下の各項に示す発明に関する：
項 1. 配列番号 1〜16からなる群力も選ばれる少なくとも 1種のペプチド。
項 2. 配列番号 1、 5、 6、 7、 9、 10、 11、 15および 16からなる群力 選ばれる少なく とも 1種である、上記項 1に記載のペプチド。
項 3. 少なくとも 1つの Cys残基を前記アミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に付 加してなる上記項 1又は 2に記載のペプチド。
項 4. 上記項 1〜3のいずれかに記載のペプチドと生理活性物質とを直接的にまた は架橋剤を介して間接的に連結してなるペプチドコンジュゲート。
項 5. 上記項 1〜3のいずれかに記載のペプチド又は上記項 4に記載のペプチドコ ンジュゲートを含むワクチン。
項 6. 上記項 1〜3のいずれかに記載のペプチド又は上記項 4に記載のペプチドコ ンジュゲートを含む経皮吸収用製剤。
項 7. 生理活性物質を細胞内に導入するための上記項 1〜3のいずれかに記載の ペプチドの使用。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、単独で投与した場合に細胞内に移行し難 、ポリペプチド、核酸、 糖を高効率で細胞内に導入することができる。
[0009] 細胞内に導入されて生物活性を示すポリペプチド、核酸、糖などの生理活性物質 を細胞内に導入することにより、各種の疾患の予防ないし治療、あるいはワクチンとし て効果が期待できる。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1A]図 1Aは、ファージ表面提示法の原理を示す。
[図 1B]図 1Bは、ファージ表面提示法の原理を示す。
[図 2]図 2は、セルパンニングの原理を示す。
[図 3]図 3は、実施例 1の実験の概略を示す。
[図 4]図 4は、ランダム 18a.a.ペプチドライブラリの作製の原理を示す。
[図 5]図 5は、ランダム Tatペプチドライブラリの作製の原理を示す。
[図 6]図 6は、緑膿菌菌体外毒素 (PCRで Fragment作製)の構造と細胞への作用を示 す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 一般に、ペプチドないし蛋白質、核酸、糖などの生体関連物質は親水性が高ぐ細 胞膜を通過することは困難である。このような物質の生理活性を利用する場合、細胞 内に生理活性を保持したまま送達する必要がある。生体関連物質がエンドサイトーシ ス経路で細胞内に送達された場合、細胞内で代謝'分解されてしまい、その生理活 性が失われてしまう可能性が高い。従って、エンドサイト一シス経路以外の経路で生 体関連物質を送達することが好まし ヽ。
[0012] 一方で最近、 HIV由来の TATペプチドと 、つた PTD (Protein Transduction Domain) と蛋白質との複合体'融合体が、 BBBバリア (血液-脳関門）を通過し、血中から脳内 へ移行できること、細胞外力 細胞内へ侵入できることなどが判明し、 PTDをペプチド 性 DDSキャリアとして適用しょうとする試みが注目されて、例えばアルッノ、イマ一病や パーキンソン病と 、つた脳神経疾患に対して治療効果を発揮し得る「イントラボディ」 や「シャペロン」と 、つた蛋白質を有効な医薬品として適用しょうとする試みに大きな 期待が寄せられている。
[0013] 本発明のペプチドは、 BBBバリア (血液-脳関門）及び細胞膜を通過し得、生物活 性の発現と吸収性の改善にも大きな効果を発揮するものと期待される。
[0014] 上記したように、本発明によれば、 TATペプチド (Tat 48-60)よりも高!、細胞透過性 を有する細胞透過性ペプチドを得ることができる。本発明の細胞透過性ペプチドを得 るために、本発明者は、より具体的には実施例に示すように、次のような実験を行つ た：
ファージ表 rif提示：
18個のアミノ酸をランダムに並べた「ランダム 18a.a.ペプチドライブラリ」（図 4)と、配列 GRKKRRQRRRPPQ (配列番号 17)を有する TATペプチド（Tat 48-60)のうち、 oc ヘリックスの基点である 3つのアミノ酸 (即ち、第 1番目の G、第 7番目の Q、および第 1 1番目の P)を固定してその他のアミノ酸を置換した「TATペプチドライブラリ」（図 5)を 作製した。 20種類のアミノ酸をコードし得る NNS配列を導入したプライマーを用いて P CRを行い、 PCR断片をファージミドベクターに組み込んだ。このベクターを大腸菌 TG 1に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、多様な種類のペプチドを、ファー ジマイナー外殻蛋白質である g3pの先端に発現するファージライブラリを作製した。ラ イブラリから任意にピックアップしたクローンの DNAシークェンスを解析した結果、独 立したクローンで構成されていることを確認した。ファージ表面提示法は当業者に公 知の方法である（図 1参照)。
[0015] パンニング:細朐内移行能を有するペプチドをスクリーニングするため、作製した各 ファージライブラリについて、 A431細胞（ヒト表皮細胞）に対するパンユング (panning) を行った。パンユングを繰り返すにつれ、細胞に結合する Zあるいは細胞内へ侵入 する能力をもつクローンが選択'濃縮されていることを確認した。また、一般的に PTD は塩基性アミノ酸を多く含むと 、う特徴を有して 、るが、パンユングによって濃縮され た各クローンは塩基性アミノ酸とともに、トリブトファン (W)を多く含むことが明ら力とな つた（表 1参照）。パンユング法は当業者に公知の方法である（図 2参照； Nature Biote chnology Vol.21, 546-552, 2003)。
[0016] ライブラリ遺伝子を^ aみ込むファージミドベクターとしては、特に限定されないが、例 えば PCANTAB5E (アマシャムバイオサイエンス社製）が挙げられる。ペプチドを表面 提示したファージの作製方法は公知である（Applied and Environmental Microbiology Vol.63, 263-269, 1997)。
[0017] 得られたペプチド表面提示ファージを精製後、セルパンユング (Cell panning)に使 用する。セルパンニングに使用できる細胞としては、本発明の細胞透過性ペプチドで 生理活性物質を侵入させる細胞であれば特に限定されな!ゝが、例えば A431細胞 (ヒ ト表皮細胞）が挙げられる。 A431細胞のようなヒト表皮細胞を使用すると、経皮吸収性 (表皮細胞への透過性)に優れたポリペプチドを選別することができ、ヒト表皮細胞に 代えてヒトを含む哺乳動物の他の細胞 (例えば皮膚以外の臓器、組織)を使用すれば 、他の臓器、組織への吸収性または透過性に優れたポリペプチドを選別することがで きる。
[0018] ノ ンユングの回数は、特に限定されず、例えば 1〜10回、好ましくは 2〜8回、より 好ましくは 3〜5回である。既にパンユングが十分に行われていれば、 Outputファー ジ Zlnputファージの比はほぼ一定となる。
[0019] ペプチド、の糸田 移行 の ¾平 (PSTFによる糸田 集 験）：次に、各ライブラリ 遺伝子を蛋白質合成阻害因子である PSIF発現ベクターに組換え、ペプチドと PSIFと の融合体を用い、 PSIFによる細胞傷害性を指標にペプチドの細胞内移行活性を評 価した。 PSIF自体は細胞内への移行能をもたないため、ペプチドが細胞内移行活性 をもたな 、限り細胞傷害性を示さな 、。ペプチドと PSIFとの融合体を産生した大腸菌 培養上清を用いてスクリーニングを行った結果、パンユングを繰り返すにつれ、細胞 内へ侵入する能力をもつクローンが選択'濃縮されていることを確認できる。さらに、 現在最も導入効率に優れて 、ると言われる TATペプチドよりも導入効率の高 、クロー ンを多数得ることに成功した。
[0020] 本発明者は、タンパク質合成阻害因子 (PSIF)を高濃度で細胞に添加しても細胞は 死滅しな 、が、 PSIFと TATとの融合体を細胞に添加すると細胞が死滅するという事実 を発見し、この事実力もこの PSIFそのものは単独で細胞内に侵入できないが、 TATと 融合させると PSIFは細胞内に侵入できることを見出した。
[0021] 即ち、菌体由来の蛋白質合成阻害因子 (PSIF)そのものは、単独で細胞内に侵入 できないため、蛋白合成阻害作用を全く示さない。一方で TAT (最小 llmerのぺプチ ド）のような PTDと融合 *結合させることで、細胞質への移行能を PSIFに付与すると、 蛋白合成阻害活性を初めて発揮するようになる。
[0022] PSIF (蛋白質合成阻害因子）としては、ジフテリアトキシン（GenBank; A04646)もしく は緑膿菌菌体外毒素（Pseudomonas exotoxin) (GenBank; K01397)の蛋白質合成阻 害活性領域などが挙げられ、いずれも利用可能である。
[0023] 本発明のペプチド
本発明によれば、 TATペプチド (Tat48-60)よりも高 、細胞透過性を有するペプチド が提供される。
[0024] 本発明のペプチドは細胞透過性を発揮する部分として、 3〜30、好ましくは 3〜20 、より好ましくは 3〜18のアミノ酸配列を有する。ペプチドのアミノ酸数が多くなるにつ れ、ペプチドの免疫原性が高くなる傾向にあるので、細胞膜を透過し難い生理活性 物質の機能を細胞内にぉ 、て発現させる場合には、短 、ペプチド配列が好ま U、。 また、本発明のペプチドを免疫を誘導するためのワクチンとして投与する場合には、 免疫誘導に関与する任意のペプチドを連結したものであってもよ 、。例えば細胞性 免疫を誘導するために免疫細胞表面に提示されるペプチドを結合してワクチンとして 投与する場合、ペプチドはより長 、ものであってもよ 、。
[0025] 一方、本発明のペプチドを細胞透過性がな!、か乏し!/、生理活性物質 (例えばぺプ チド、蛋白質、ポリヌクレオチド、多糖、糖蛋白、糖脂質)と連結して細胞内に導入す る場合には、ペプチドはより短いものが適当である力もしれない。
[0026] 本明細書中で、「生理活性物質」とは、細胞内に導入された場合に該細胞の機能 又は状態に影響を与えることができる物質であればよぐ例えば、核酸、ペプチド、ポ リペプチド、蛋白質、多糖および糖蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。
[0027] このような場合、例えば細胞内の酵素（ぺプチダーゼ、エステラーゼなどの加水分 解酵素）により切断されるようにアミド結合 (ペプチド結合)、エステル結合、チォエス テル結合などを介して結合してもよい。或いは、細胞内は通常還元性であるので、ジ スルフイド（一 SS ）結合を介して細胞内に導入した ヽ生理活性物質を結合しておけ ば、細胞内で切断されて生理活性物質を遊離させることができる。或いは目的とする 生理活性物質と特定物質の組み合わせ (例えば核酸一本発明ペプチドが結合した ポリカチオン、アビジンが結合した本発明ペプチド ピオチンが結合した生理活性物 質、抗体—本発明ペプチドが結合した抗原など)を使用することもできる。
[0028] 本発明のペプチドは、皮膚ないし消化管、あるいは注射した組織 (筋肉、皮下、血 管内皮など)の細胞膜を透過することができる。
[0029] 本明細書中で、「細胞透過性」とは、細胞膜を透過し、細胞内に侵入することができ る性質を意味する。従って、本発明のペプチドに生理活性物質を連結あるいは複合 体とした場合、該ペプチドは、生理活性物質と共に、細胞膜を透過し、細胞内に侵入 することができる。
[0030] 本明細書中で、「細胞に結合する」とは、単に細胞の表面に結合することをいい、一 方、「細胞内へ侵入する」とは、細胞の表面に結合するだけでなぐ細胞膜を透過し、 更に細胞内に侵入することをいう。
[0031] 本明細書中において、「標的細胞」とは、生理活性物質を侵入させようとする細胞で あれば特に限定されないが、例えば血管内皮細胞や粘膜上皮細胞、皮膚細胞 (角 化細胞）、筋肉細胞、各種臓器の細胞、血液細胞（リンパ球、マクロファージ、 T細胞 、榭状細胞、 B細胞など）が挙げられる。
[0032] 本発明のペプチドとしては、配列番号 1〜16のいずれ力 好ましくは配列番号 1、 5 ゝ 6、 7、 9、 10、 11、 15および 16のいずれ力で表されるポリペプチド力挙げられる。こ れらの配列は、細胞透過性を保持する限りにおいて 1又は数個のアミノ酸が置換、欠 失又は付加したポリペプチドを含む。
[0033] 改変されたペプチドが細胞透過性を有する限り、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」 の程度及びそれらの位置などは、特に制限されない。本発明において「細胞透過性」 とは、本発明のペプチドと結合した生理活性物質が、細胞膜を透過し、細胞内に導 入されることを意味する。
[0034] アミノ酸の置換 '付加'欠失の手段としては、該ペプチドをコードする DNAを経由し て行う場合には、例えばサイトスぺシフィック 'ミュータゲネシス [Methods in Enzymolo gy, 154, 350, 367-382 (1987)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン 酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. So ， 89, 4801(1967)〕などが例示 できる。 DNAは、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成することも でき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で合成することもできる。二 本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、ま たは適当なプライマー配列と共に DNAポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによ つて、化学合成した一本鎖生成物力も得ることもできる。さらに、本発明のペプチドは 、ペプチド合成機を用いて固相合成法により合成することもでき、置換 '付加'欠失は 、ペプチド合成機を用いる場合には保護アミノ酸の種類を変えることにより容易に行う ことができる。又、 D アミノ酸やサルコシン (N-メチルグリシン)等の特殊なアミノ酸を 導人することちでさる。
[0035] 細胞内に導入されるポリペプチド (生理活性物質)の具体例としては、カルボニック アンヒドラーゼ、ミオグロビン、西洋わさびペルォキシダーゼ、 β ガラクトシダーゼ、 ロイシンジッパーや亜鉛フィンガーモチーフを有する転写因子、 Fas p53などのアポト 一シス誘導タンパク質、欠損により代謝異常の疾病を誘発するアデノシンデァミナ一 ゼなどのタンパク質 (酵素を含む)及び酵素阻害剤（例えばカルパインインヒビター）、 遺伝情報発現調節因子 (例えば I κ B、 NF κ B)、ペプチドホルモン (インスリン、カル シトニン等)などが例示される力 S、これらに限定されない。
[0036] 本発明のペプチドに連結されて細胞内に導入されるポリペプチドは特に限定され ず、任意のポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチドの分子量は 500〜 100万程度 、好ましくは 1000〜50万程度が例示され、分泌タンパク、膜結合タンパク、ペプチド ホルモンなどの種類も問わな 、。
[0037] 細胞内に導入されるポリペプチドと本発明のペプチドは、本発明ペプチドがシステ イン残基を有する場合あるいは本発明のペプチドの内部または N末端もしくは C末端 にシスティン残基を少なくとも 1個導入 (挿入、付加又は置換)した場合には、ポリぺプ チドのシスティン残基と—SS—結合を介して連結してもよぐ適当な架橋剤を介して 連結してもよい。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと導入されるポ リペプチドをコードするポリヌクレオチド (遺伝子）を、好ましくは直接に結合し、ベクタ 一に導入し、大腸菌等の宿主細胞内で発現させるなどの常法により、本発明のぺプ チドの N末端または C末端 (好ましくは C末端側）に導入されるタンパク質な!/ヽしポリべ プチドが直接連結されたペプチドコンジュゲートを得ることができる。同様に、核酸や 糖についても、適当な架橋剤を介して連結することができる。 [0038] 架橋剤としては、本発明の細胞透過性ペプチドと導入されるタンパク質ないしポリ ペプチド、核酸または糖もしくは細胞透過性の低 、生理活性物質を結合できる少なく とも 2価の架橋剤であれば特に限定されな ヽが、例えば N-(6-マレイミドカプロィルォ キシ)コハク酸イミドエステル (EMCS)などが挙げられる。
[0039] 本発明の細胞透過性ペプチドの C末端側には、例えば Cys、 Gly-Cysなどの様式で Cys残基を、 N末端側には、例えば Cys、 Cys- Glyなどの様式で Cys残基をさらに結合 するのが好ましい。該 Cys残基の SH基は、 EMCSのマレイミド基に付加反応させたり、 導入されるタンパク質な 、しポリペプチドがフリーの SH基を有する場合には SS— 結合により導入されるタンパク質ないしポリペプチドに、連結することができる。 SS 結合を介して連結した場合には、細胞内で該ー SS 結合が還元され、非修飾の タンパク質な 、しポリペプチドが遊離されるので好まし 、。
[0040] ファージ表面に提示させるためのペプチドライブラリは、全てのアミノ酸がランダムで あるものであってもよぐ TATペプチドの一部は一定のままその他のアミノ酸がランダ ムであるものであってもよい。例えば、 TATペプチドライブラリは、配列 GRKKRRQR RRPPQ (配列番号 17)のうち、 αヘリックスの基点である 3つのアミノ酸 (即ち、第 1番 目の G、第 7番目の Q、および第 11番目の P)を固定してその他のアミノ酸をランダム に置換して作製することができる。
[0041] ペプチドコンジユゲート
本発明のペプチドに結合させる生理活性物質は、特に限定されないが、例えば、 核酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、多糖および糖蛋白質力 なる群力 選択さ れる。生理活性物質は、本発明ペプチドのどの部分に結合させても構わないが、 C 末端または N末端、特に C末端に結合させるとリコンビナントの作製が容易であるの で好ましい。
[0042] 本発明のペプチドは、経皮吸収性、粘膜吸収性とも良好であるので、局所投与剤、 例えば軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、クリーム剤、吸入剤、点鼻剤など、特に経皮吸 収用テープ製剤に好ましく使用される。
[0043] 本発明はまた、本発明のペプチド又はペプチドコンジュゲートを含むワクチンに関 する。従来のワクチン法は体液性免疫を賦活する、すなわち抗原特異的な抗体の産 生を高めるものであり、細胞外に放出されたウィルス粒子等の除去には有効であるが 、ウィルス感染の主体となる感染細胞や癌細胞の除去に対しては効力が無い。ウイ ルス感染等の治療には、細胞性免疫を高める必要がある。細胞内に抗原が入ること によって細胞性免疫が高められることは公知である。従って、本発明のペプチドと抗 原とを連結させたコンジュゲートであれば、細胞内に抗原を入れることができ、ヮクチ ンとして非常に有用であり得る。
[0044] 本発明において、細胞内に導入される生理活性物質である防御抗原とは、病原微 生物 (細菌、真菌、ウィルス等)の感染防御抗原となる該微生物由来蛋白、癌細胞特 異的に発現する変異蛋白、あるいは免疫原性を保持したそれらのペプチド断片等の 他、従来生ワクチンまたは不活ィ匕ワクチンとして使用される生弱毒性微生物またはそ の死菌などもすベて包含する。微生物由来蛋白としては、例えば HIV由来蛋白、 B 型および C型肝炎ウィルスの表面抗原、インフルエンザウイルスの表面抗原等力 ま た、癌細胞特異的変異蛋白としては、癌化細胞分化抗原蛋白等が挙げられる。該防 御抗原は 1種のみでも、複数の防御抗原を混合して使用してもよい。
[0045] 本発明の抗原特異的なペプチドコンジュゲートを含む薬学的組成物は、経口剤、 非経口剤のいずれでもよぐ例えば外用剤の形態であってもよい。具体的には、例え ば、防御抗原を、適当な軟膏基剤と混和して調製される軟膏剤や、あるいは粘着層 を基剤として、防御抗原を該粘着層に植種する形に存在させるカゝもしくは該粘着層 に埋め込む形で存在させて徐放放出が可能となるように設計された粘着テープ製剤 が挙げられる。
[0046] 軟膏剤の場合、軟膏基剤としてワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコン、植 物油、ロウ等の油脂系基剤、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、ォイセリン等の 乳剤性基剤、マクロゴール類等の水溶性基剤などが例示される。また、必要に応じて ノラオキシ安息香酸エステル類等の保存剤を添加してもよい。
[0047] 防御抗原の経皮接種は、該軟膏剤を皮膚表皮に塗布することにより行うことができ る。軟膏剤中の防御抗原含有量は、該軟膏剤を通常量塗布した際の投与量が、 1種 の抗原について 0. 1 /ζ πιοΐΖ«η2〜1πιπιοΐΖοπι2の範囲となるように調整されるの が好ましい。 [0048] 防御抗原の経皮接種の特に好ま ヽ態様は、本発明の粘着テープ製剤 (「経皮吸 収型テープ製剤」ともいう）であり、これは皮膚表皮に貼付するものである。本発明の 粘着テープ製剤は、防御抗原が適度に徐放されるように設計されていると同時に、粘 着層表面に植種されるかもしくは粘着層中に埋め込まれた該防御抗原が、少なくとも 本来の防御抗原としての機能を保持する程度に安定に存在することが望ましい。ま た、この粘着テープ製剤の粘着力は、表皮に十分接着するほどに強く設計されてい ることも望ましい。使用される粘着剤は、防御抗原の抗原性を低下または変化させな いことが好ましぐ上記の条件を充足する粘着剤であれば、アクリル系ポリマー粘着 剤であっても、ゴム系ポリマー粘着剤であってもよい。特に、好適に用いられる粘着 剤としては親水性ポリマー力もなる粘着剤が挙げられる。
[0049] 親水性ポリマーとしては、アラビアゴム，カルボキシメチルセルロースなどの水溶性 天然高分子など、またビュルピロリドン、ビュルアルコール、 2—ヒドロキシェチルァク リレート、 2—メトキシェチルアタリレート、アクリル酸などの水溶性モノマーを重合して なるポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリメトキシェチルアタリレート、ポリ アクリル酸など、さらにこれら水溶性モノマーの 2種以上の共重合体が例示される。ま た本発明で求められる親水性を損なわな 、範囲内で、アクリル酸ブチルやアクリル酸 2—エキシへキシルなどの疎水性モノマーが重合された粘着性高分子であっても よい。
[0050] 粘着層には、さらに適度な粘着性を付与するために、親水性または水溶性の低分 子物質を添加してもよい。親水性または水溶性の低分子物質としては、沸点が 100 〜400°Cの高沸点液状ィ匕合物が挙げられる。その具体例として多価アルコール、糖 アルコールなどが挙げられる力 この時タンパク質と反応して褐変反応 (メイラード反 応）など起こさな 、還元糖が好ましく用 、られる。多価アルコールとしてはエチレング リコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、液状ポリエチレングリコール
、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、 1, 1, 1 トリヒドロキシプロパン、グ リセリンなどが挙げられ、還元糖としては、ソルビトール、ソルビタン、エリスリトール、キ シリトール、トレハロースなどが挙げられる。
[0051] またグリセリンとエチレングリコールやプロピレングリコールとのエーテル型付カ卩体で あるポリオキシエチレングリセルエーテルやポリオキシプロピレンソルビトールエーテ ルゃポリオキシエチレンソルビタンエーテルでもよ 、。これらの親水性又は水溶性低 分子物質の使用量は、粘着層を形成する粘着剤の 5〜90重量％範囲で添加される 本発明のテープ製剤で用いる柔軟なシート状の支持体は、取扱時破壊しな 、程度 に十分な強度があれば特に材質は限定されないが、例えばポリエチレン、ポリプロピ レン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリ エーテル、ポリウレタン、エチレン 酢酸ビュル共重合体、酢酸セルロース、ニトロセ ルロースなどからなるプラスチックフィルムが好適に用いられる。
本発明の粘着テープ製剤は、例えば、上記の粘着性親水性ポリマーと親水性低分 子物質を含有する水溶液または水 Zアルコール混合溶液に、防御抗原を必要な濃 度で含むように調整された水分散液または水 zアルコール混合分散液を加えてよく 混合分散させた後、柔軟なシート状の支持体上に一定の厚さで塗布し、 10〜200°C の範囲の適当な温度で乾燥することによって製造される。この時乾燥温度は、塗布し た粘稠な分散液中の内容物の変質を防ぐためにはできるだけ低い温度が好ましく、 通常 30〜： LOO°Cの温度の範囲が用いられる。この方法で製造される粘着テープ製 剤の粘着層は必要な濃度で、且つ均一に防御抗原を含有することになる。また、防 御抗原の全体もしくは一部力 形成された粘着層に埋め込まれている形で存在して おり、結果的に該防御抗原が適度に徐放されるように設計されることになる。また、本 発明の粘着テープ製剤の別の製造方法としては、上記の粘着性親水性高分子と親 水性低分子物質を含む水溶液または水 Zアルコール混合溶液をそのまま柔軟なシ ート状の支持体上に一定の厚さで塗布し、 10〜200°Cの範囲の適当な温度で乾燥 させること〖こよって、また必要に応じて架橋処理することによって、まず防御抗原を含 有しな ヽ粘着テープを製造した後、防御抗原を必要な量で含むように調整された水 分散液または水 Zアルコール混合分散液を、該粘着テープの粘着層表面に必要な 防御抗原植種量になるように塗布し、水またはアルコールを蒸散乾燥させる方法が 挙げられる。防御抗原を含む粘着層領域と、防御抗原を含まない粘着層領域を有す る剤型の粘着テープ製剤は、上記 2通りの製造方法を適当に組み合わせることにより 製造することができる。
[0053] 本発明の粘着テープ製剤は、通常、防御抗原量が、 1種の抗原について 0. 1 μ m ol/cm2 ~lmmol/cm2の範囲で含まれるように設計調整されるのが好ま 、。
[0054] 本発明は更に、生理活性物質を細胞内に導入するための上記細胞透過性べプチ ドの使用に関する。生理活性物質としては、核酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、 多糖および糖蛋白質力 なる群力 選択される少なくとも 1つが挙げられる。
実施例
[0055] 以下、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
[0056] また、実験の概略を図 3に示す。
[0057] 実施例 1
ペプチド、ライブラリのィ乍
全 20種類のアミノ酸がランダムに並んだ「ランダム 18a.a.ペプチドライブラリ」、および HIVの Tat蛋白質に由来する Tatペプチド（13mer;Tat48-60)の一部がランダムなアミ ノ酸に置換された「TATペプチドライブラリ」を作製するため、 PCR法を用い、全 20種 類のアミノ酸をコードするランダムな塩基配列（NNS配列； N=A/T/G/C、 S=G/C)がァ ミノ酸 18個分並んだ遺伝子ライブラリと、 Tatペプチドの塩基コドンの一部が NNS配 列に置換された遺伝子ライブラリを調製した。
[0058] ランダム 18a.a.ペプチドライブラリ作製にはプライマー、 oligo- 1 (5， - GATTACGCCA
TCG
-3，；配 列番号 18)および oligo- 2 (5' - CGGCGCACCTGCGGCCGCSNNSNNSNNSNNSNN
GCCGCATAGAAAGG-3 ' ；配列番号 19)を用い、 pY03， FLAG (pUC 18プラスミドに FLAG発現コドンを組み込んだもの）をテンプレートとしてアニーリング温度を 65°Cで 1 分、伸長反応を 68°Cで 1分に設定し、 KOD-plus-DNA Polymerase (東洋紡株式会社 )を用いて PCRを 35サイクル行った。
[0059] TAT.ペプチドライブラリ作製にはプライマー、 oligo- 1 (5， - GATTACGCCAAGCTT 18)および oligo- 3 (5 ' -CGGCGCACCTGCGGCCGCSNNSNNCGGSNNSNNSNNCT
-3， ；配列番号 20)を用い、 pY03， FLAGをテンプレートとしてアニーリング温度を 65 °Cで 1分、伸長反応を 68°Cで 1分に設定し、 KOD-plus-DNA Polymeraseを用いて PC Rを 35サイクル行った。
[0060] これらの PCR産物を PCR purification kit (Qiagen companies)で精製した。得られた PCR産物を Hindlllおよび Notl (東洋紡株式会社)で処理し、あらかじめ Hindlllおよび Notlで処理したファージミドベクター pY03，FLAGと T4 ligase (Roche Diagnostics)を用 いて 16°C、 16時間ライゲーシヨン反応を行った。あらかじめ 2YT培地（Invitrogen™life technologies) 30mLで OD600=0.4まで培養し、ミリ Q水で 3回洗浄操作を行い、 10%グ リセロール溶液で 200 μ Lに懸濁し氷冷してぉ ヽた大腸菌 TGI (Stratagene (登録商標 ) )に対して、精製後の溶液 10 Lを添カ卩し、 Gene purser (登録商標） II (Bio- Rad Lab oratories,Co.,Ltd.)を用い、 2.5kV、 0.25 μ F、 200 Ωでエレクト口ポレーシヨンを行った 。その後、 2%グルコース含有 2ΥΤ培地を添カ卩し、 1時間培養した後、一部をとつて 50 g/mLアンピシリン（Sigma-Aldrich,In ）、 2%グルコース含有 2YT培地で段階希釈した 後、クロンディスク（Clontech Laboratories, Inc.)に播種し、ー晚培養した。
[0061] シークェンス解析
得られたコロニーから任意に選択した各クローンのプラスミドを QIAprep (登録商標） Miniprep kit (QIAGEN)を用いて回収し、 DNA sequencing Kit (Applied Biosystems) および 5xSequencing Buffer (Applied Biosystems)を用いてシークェンス反応を行った 。その後、 PERFORMA Gel Filtration Cartridge (Edge Bio Systems)を用いて精製し 、減圧加熱により乾燥させた。シークェンス解析は ABI PRISM 310 (Applied Biosyste ms)により行った。
[0062] ファージの作製
作製した 2つのライブラリ遺伝子をそれぞれ組み込んだファージミドベクター pCANT AB5E (アマシャムバイオサイエンス社製）を大腸菌 TG1にエレクト口ポレーシヨンし、そ の適量を 50 g/mLアンピシリン、 2%グルコース含有 LBプレートに播種し、 37°Cで一 晚培養した。 50 g/mLアンピシリン、 2%グルコース含有 2YT培地をカ卩えてコロニーを すべて回収し、 250rpm 37°Cで OD600=0.3まで培養した。 M13K07ヘルパーファー ジ（Invitrogen™ life technologies)を添カ卩し、 llOrpm 37°Cで 30分間、 250rpm 37°C で 30分間培養した後、 2,000rpmで 10分間遠心し、得られたペレットに対して 50 g/m Lアンピシリン、 100 /z g/mLカナマイシン（Sigma-Aldrich,Inc.)含有 2YT培地を添カロし て 6時間培養することで、ペプチドを表面提示したファージを調整した。
[0063] ファージの精製
ファージ粒子を含む TG1培養液を 4°C 2,000rpmで 10分間遠心し、上清を回収した 。さらに 10,000rpmで 15分間遠心し、回収した上清に氷冷した 20% PEG-8,000 (和光 純薬株式会社）、 2.5M NaCl (和光純薬株式会社)を 1/5 volumeカ卩え、激しく混和して 氷上で 2〜3時間静置した。次!、で 15,000rpmで 10分間遠心して得られたファージぺ レットを NTE Buffer (lOOmM NaCl, 10mM Tris、 ImM EDTA)に懸濁し、 0.45 μ mの Mil lex (登録商標） - HV (MILLIPORE)を用いてフィルターろ過して精製ファージ溶液とし た。
[0064] セルパン-ング
A431細胞 (ヒト表皮細胞）を用いて各ライブラリにつ 、てパンユングを行った。 6穴プ レート（NUNC™)に A431細胞を 5.0xl05cells/wellで播種し、 37°C、飽和蒸気圧、 5%炭 酸ガス気相下で 24時間培養した。 PBSで 3回洗浄した後、 Opti-MEM (Invitrogen™ lif e technologies)で希釈した 2%ゥシ血清アルブミン（BSA)を用いて 37°Cで 2時間ブロッ キングした。精製したファージにつ ヽても等量の 2%BSAを用いて 4°Cで 1時間ブロッキ ングした。ブロッキングが終了したファージを A431細胞に加え、 15分ごとに振とうしな 力 Sら 37°Cで 2時間培養した。細胞を PBSで 20回洗浄した後、 50mM HC1 lmLをカ卩えて 4°Cで 10分間培養した。このファージ溶出液を回収し、 1M Tris-HCl pH8.0 500 μ Lを 添加した後、その 50 Lを用いて下記の方法に従いタイターを測定した。残りのファ ージ溶液は 2%グルコース含有 2YT培地を 4.5mLカ卩えて再度 TG1に感染させ、増幅さ せて上記のファージ作製法に準じてファージを産出し、再度同様のパンユング操作 を行ったものを 2nd、 3rd、 4thパンニングとした。
[0065] タイター (titer)の測定 2%グルコース含有 2YT培地で OD600=0.3まで培養した TGIに対して、 10倍希釈で 段階希釈したファージ溶液を添加し、 37°Cで 1時間培養した。培養液の一部に 50 g /mLアンピシリン、 2%グルコース含有 2YT培地を添カ卩し、クロンディスクに播種しー晚 培養した。各希釈段階でのコロニー数を計測することで、 inputファージおよび output ファージのタイターを算出した。
[0066] 上述のように、新たな細胞内移行ペプチドを創製するために、 18個のアミノ酸をラン ダムに並べたランダム 18a.a.ペプチドライブラリと Tatペプチド（Tat 48-60)の一部の アミノ酸を置換した TATペプチドライブラリを作製した。 20種類のアミノ酸をコードし得 る NNS配列を導入したプライマーを用いて PCRを行 、、 PCR断片をファージミドベクタ 一に組み込んだ。このベクターを大腸菌 TG1に導入し、ヘルパーファージを感染させ ることで、多様な種類のペプチドを、ファージマイナー外殻蛋白質である g3pの先端 に発現するファージライブラリを作製した。ライブラリから任意にピックアップしたクロー ンの DNAシークェンスを解析した結果、独立したクローンで構成されて ヽることを確 した 0
[0067] 細胞内移行能を有するペプチドをスクリーニングするため、作製した各ファージライ ブラリについて、 A431細胞 (ヒト表皮細胞）に対するパンユングを行った。パンニング を繰り返すにつれ、細胞に結合する、あるいは細胞内へ侵入する能力をもつクローン が選択'濃縮されていることを確認した。また、一般的に PTDは塩基性アミノ酸を多く 含むと 、う特徴を有して 、るが、パンユングによって濃縮された各クローンは塩基性 アミノ酸とともに、トリブトファン (W)を多く含むことが明らかとなつた。
[0068] 4thパンユング後のペプチドライブラリから任意にピックアップしたものは、下記表 1 に示すように、塩基性アミノ酸であるリシン (K)、ヒスチジン (H)、アルギニン (R)だけ でなぐ疎水性アミノ酸であるトリブトファン (W)に富んでいた。
[0069] [表 1] 表 1— 1 . 4 t hパンニング後にランダムに選択した Tat ランダムペプチド
Figure imgf000018_0001
表 1— 2 . 4 t hパンニング後にランダムに選択した 18mcr ランダムべプチド
Figure imgf000018_0002
[0070] PSIF発現ベクターへの組換え
作製したライブラリ（input)および 2nd、 3rd、 4thパンユング後のライブラリから回収し たプラスミドを Ncol (東洋紡株式会社）および Notlで処理した。あらかじめ Ncolおよび Notlで処理した PSIF発現ベクター pY7 (pCantab5eに PSIF発現コドンを組み込んだも の）にライゲーシヨンキット Ver.2 (宝酒造株式会社)を用いて組み込むことで、ぺプチ ドと PSIFとの融合体を発現するプラスミドを構築した。 PSIF (蛋白質合成阻害因子)と しては、ジフテリアトキシン（GenBank; A04646)もしくは緑膿菌菌体外毒素（GenBank; K01397) (図 6)の蛋白質合成阻害活性領域などを利用した。
[0071] ペプチド PST の融合体 含む焙着卜.清の作製
ペプチドと PSIFとの融合体を発現するプラスミドを TG1にエレクト口ポレーシヨンによ り導入し、得られたコロニーを 96穴プレート (NUNC™)ヘランダムにピックアップして一 晚培養した。 50 μ g/mLアンピシリン、 2%グルコース含有 2 YT培地 100 μ Lを新たに添 カロしたプレートに、ー晚培養した培養液 10 Lを添加し、 OD600=0.4〜0.5まで培養し た。 3,000rpmで 20分間遠心した後、上清を除き ImM IPTG (Sigma-Aldrich,In ）、 50 μ g/mLアンピシリン含有 2ΥΤ培地 200 μ Lを添加し、 37°Cで 12時間培養した。再び 3,0 OOrpm 20分間遠心し、得られた上清を以降のスクリーニングに供した。
[0072] ペプチドの細朐内移行能の評価 (PSIFによる細朐傷害性試験: MTT assay)
96穴プレートに Opti- MEM (Invitrogen™ life technologies)で 1.0xl04cells/wellに希 釈した A431細胞を播種し、終濃度 10 g/mLになるようにシクロへキシミド (和光純薬 株式会社)を添加した。次いで、上記の方法に従って作製した培養上清をそれぞれ 5 μ Lずつ加え、 37°C、飽和蒸気圧、 5%炭酸ガス気相下で 24時間培養した。その後、 5 mg/mLの MTT (和光純薬株式会社)溶液を 10 L/wellカ卩え、さらに 37°Cで 4時間培養 した。 20% SDS (和光純薬株式会社 Osaka, Japan) /0.01N HC1を 100 L/wellカ卩えて 暗所で 4時間静置し、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し (Test wave length;5 95nm/Reference wave length;655nm)、ペプチドによって細胞内に導入された PSIFに よる細胞傷害性を指標にペプチドの細胞内移行能を評価した。 Viabilityは TATぺプ チド (Tat 48-60)と PSIFとの融合体を含む培養上清を作用させた群を 100%として算出 した。
[0073] 上述のように、各ライブラリ遺伝子を蛋白質合成阻害因子である PSIF発現ベクター に組換え、ペプチドと PSIFとの融合体を用い、 PSIFによる細胞傷害性を指標にぺプ チドの細胞内移行活性を評価した。 PSIF自体は細胞内への移行能をもたな 、ため、 ペプチドが細胞内移行活性をもたない限り細胞傷害性を示さな 、。ペプチドと PSIFと の融合体を産生した大腸菌培養上清を用いてスクリーニングを行った結果、パンニン グを繰り返すにつれ、細胞内へ侵入する能力をもつクローンが選択'濃縮されている ことが判明した。さら〖こ、現在最も導入効率に優れていると言われる TATペプチドより も導入効率の高 、クローンを多数得ることに成功した。
[0074] 得られたペプチド配列および Viabilityを下記に示す。
[0075] [表 2] 表 2. ペプチド配列、 ならびにこれらペプチドと P S I Fとの融合体を 添加した場合の細胞の Viability
配列番号： 配列 生存度
1 ： GSNF FYQHRLP F S 約 45
2 ： G L F NWLQL R P P S W 約 80
3 ： G I L LRNQVL PPQ I 約 65
4 ： RRRRNRTRRNRRRVR 約 93
5 ： G I ASNGQLPTPKT 約 35
6 ： S GEHTNGP S KT S VRWVWD 約 35 /
7 ： SMTTMEFGHSM I TPYK I D 約 45
8 ： STHLQYHVNYTS RTVVSM 約 60
9 ： QDGGTWHLVAYCAKSHRY 約 45 To
1 0 ： MSDPNMNPGTLGS SH I L W 約 30 /ο
1 1 ： S PGNQSTGV I GTP S F SNH 約 45 /ο
1 2 ： STAPGS LQED I L D S V P A 約 85
1 3 ： S PTRPTHQGLL PVSNKYT 約 77
1 4 ： YS SAYEWFNRYKQPYYEL 約 65
1 5 ： S S GANYF FNA I YDFL SNF 約 35 Ζο
1 6 ： GTS RANSYDNLKS ETLTQ 約 15 /ο
1 7 ： GRKKRRQRRRPPQ 100 /ο

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1〜16からなる群力も選ばれる少なくとも 1種のペプチド。
[2] 配列番号 1、 5、 6、 7、 9、 10、 11、 15および 16からなる群から選ばれる少なくとも 1 種である、請求項 1に記載のペプチド。
[3] 少なくとも 1つの Cys残基を前記アミノ酸配列の N末端及び Z又は C末端に付加して なる請求項 1又は 2に記載のペプチド。
[4] 請求項 1〜3のいずれかに記載のペプチドと生理活性物質とを直接的にまたは架橋 剤を介して間接的に連結してなるペプチドコンジュゲート。
[5] 請求項 1〜3の 、ずれかに記載のペプチド又は請求項 4に記載のペプチドコンジュ ゲートを含むワクチン。
[6] 請求項 1〜3の 、ずれかに記載のペプチド又は請求項 4に記載のペプチドコンジュ ゲートを含む経皮吸収用製剤。
[7] 生理活性物質を細胞内に導入するための請求項 1〜3のいずれかに記載のぺプチ ドの使用。
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