KR20220117091A - 생체내 세포에서 합성 및 분비되고 세포로 투과하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 발현카세트 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 생체내 세포에서 합성 및 분비되어 세포 또는 조직으로 투과하는 관심 폴리펩타이드(POI)의 합성 및 전달을 포함하는 발현카세트 기술로, 특히 생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 orf, 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 orf, 및 세포막 내로 효과적으로 전달하는 세포 투과성을 갖도록 하는 펩타이드를 포함하는 관심 폴리펩타이드(POI)를 코딩하는 발현카세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

생체내 세포에서 합성 및 분비되고 세포로 투과하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 발현카세트 및 이의 용도{An Expression cassette encoding a polypeptide of interest synthesized and secreted from cells in vivo and penetrating into cells, and uses thereof}
본 발명은, 생체내 세포에서 합성 및 분비되고 세포 또는 조직으로 투과하는 관심 폴리펩타이드의 합성 및 전달을 포함하는 발현카세트 기술로, 특히 생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 orf, 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 orf, 및 원형질 막 내로 효과적으로 전달하는 세포 투과성을 갖도록 하는 펩타이드 또는 세포 표면에 있는 수용체에 결합하는 펩타이드를 포함하고 체내 세포에서 합성되는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 orf를 포함하는 발현카세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
지난 40년 동안 생명공학 산업은 체외 세포 재조합 단백질 기술을 기반으로 새로운 범주의 약물을 만들었다. 이러한 약물은 항체 및 단백질 대체물을 포함한 분비 단백질을 사용하여 다양한 질병을 치료할 수 있게 하였으며 전 세계 연간 매출이 2천억 달러 이상을 달성하고 있다. 그러나 세포 내 및 막 단백질은 인간 단백질의 2/3를 차지하며, 체외 세포 재조합 단백질 기술의 영역을 크게 벗어나 있다. 체내 세포에서 모든 단백질을 직접 생산하는 mRNA를 재조합 단백질 기반 약물의 효능과 같거나 그 이상이 있는 의약품으로 개발할 수 있다.
체외 세포에서 충분한 양과 품질의 관심 단백질을 재조합적으로 발현하고 정제하는 능력은 생물학적 과학의 많은 영역에서 중요하며, 특히 치료 항체 생성을 위한 바이오 의약품 및 재조합 항원의 생산에서 중요하다. 후자의 경우 표적 항원은 천연 단백질과 가장 유사한 형태로 이용 가능해야한다. E. coli와 같은 원핵생물 발현 숙주는 재조합 단백질을 생산하기 위한 편리하고 비용 효율적인 수단을 제공하지만, 이러한 시스템을 통해 얻은 단백질은 당화되지 않으며 제대로 접히지 않을 위험이 있다. 이러한 바람직하지 않은 특성으로 인해 HEK293, NS0 및 CHO와 같은 포유류 세포가 일시적인 발현 숙주로 자주 사용한다. 그러나 특정 단백질은 포유류 숙주에서 일시적인 발현에 어려움이 있으며 다운 스트림 적용을 위한 충분한 물질을 얻으려면 상당한 최적화가 필요하다. 숙주 세포의 유전적 변형, 성장 매개 변수 변경, 배지 성분 및 형질 감염 조건, 다른 프로모터를 포함하여 이러한 단백질의 발현을 가능하게 하거나 발현 수준을 높이기 위한 몇 가지 접근법이 채택되고 있다. 유전자 서열의 코돈 최적화, 펩타이드 또는 융합 단백질 태그 (예 : GST, MBP, NusA, Fc)를 사용하고 이들의 위치를 변경하였다. 어떤 경우에는, 원하는 양의 재조합 단백질을 생성하기 위해 안정한 세포주의 생성 및/또는 확장이 필요하며. 상당한 시간과 자원에 영향을 미치는 활동이다.
본 발명에서 체외세포에서 재조합 단백질 기술의 한계성을 확인하여 체내 세포에서 분비된 재조합 단백질의 발현을 개선하기 위한 보편적인 전략을 제공하고자한다.
mRNA의 본질적인 역할을 고려할 때, mRNA는 환자의 삶을 개선할 수 있는 상당한 잠재력을 가진 새로운 의약품을 만들 수 있다. mRNA가 새로운 의약품의 기초가 될 수 있는 고유한 특성은 다음과 같다. mRNA는 모든 세포에서 모든 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있다. 체내 세포는 mRNA를 사용하여 분비, 막, 세포 내 단백질을 포함한 모든 유형의 단백질을 만든다. mRNA는 세포에서 시간이 지남에 따라 다양한 위치에서 다양한 조합으로 생산되는 단백질의 양을 변화시킬 수도 있다. 단백질 생산에서 mRNA의 보편적인 역할을 고려하면, mRNA 의약품이 인간의 질병에 광범위하게 적용될 수 있다.
재조합 단백질 제조 기술은 인간의 생물적 기전을 모방한 것이다. 체내 세포에서 단백질 치료제 또는 백신 항원을 직접 제조하는 mRNA 기술은 체외 세포를 이용한 재조합 단백질 기술보다 유리할 수 있다.
체내 세포에서 단백질을 직접 제조하는 mRNA 기술의 이점은 다음과 같은 기능이다. 여러 mRNA에 대해 다양한 조합으로 여러 단백질을 동시에 생산할 수 있다. mRNA의 염기서열의 단순한 변형으로 면역원성을 줄이거나 제거할 수 있다. 다 단백질을 생성하여 자체적으로 기능을 하는 복합체를 만들 수 있다. 국소적으로 치료 또는 백신 단백질을 생산할 수 있다. 천연 단백질 folding 및 glycosylation을 이용할 수 있다. 체외 세포는 불안정한 단백질을 만들 수 있다.
mRNA는 간단하고 유연한 화학 구조이다. 각 mRNA 분자는 화학적으로 유사한 4개의 뉴클레오티드로 구성되어 최대 20개의 화학적으로 다른 아미노산으로 구성된 단백질을 암호한다. 가능한 단백질의 완전한 다양성은 mRNA 상에서 단순한 서열 변화만으로도 가능하다. 따라서 mRNA 염기서열 또는 제조 공정의 화학 구조를 약간만 변경하여도 기존 의약품인 소분자 또는 단백질 치료제에 비해 커다란 이점을 얻을 수 있는 mRNA 치료제를 개발할 수 있다.
mRNA는 약리학적 특징에 대한 잠재력이 있다. mRNA의 고유한 특성은 다음과 같은 매력적인 약리학적 특징이 될 수 있다. 각 mRNA는 특정 단백질을 암호화하고 다른 단백질은 암호화하지 않는다. 각 mRNA 분자는 분해되기 전에 세포에서 단백질의 많은 사본을 생성할 수 있다. 세포에서 mRNA 수준이 증가하면 일반적으로 단백질 수준이 증가한다. 세포에서 mRNA의 효과는 일시적이며 세포의 DNA에 대한 비가역적 변형의 위험은 없다. 그 결과, mRNA는 재현 가능한 활성, 예측 가능한 효능 및 유효 용량 의존성을 포함하여 대부분의 현대 의약품의 매력적인 약리학적 특징들을 많이 갖고 있다. 그리고 안전성과 내약성을 보장하기 위해 복용량을 중지하거나 낮추는 것을 포함하여 개별 환자의 필요에 따라 복용량을 조정할 수 있는 능력이 있다.
mRNA 특징을 바탕으로 새로운 의약품으로서 mRNA의 가치에 대한 4가지 핵심 장점은 다음과 같다. mRNA는 다양한 의약품을 만들 수 있는 잠재력이 있다. mRNA 의약품은 환자 또는 건강한 개인에게 치료 단백질 또는 백신을 포함하여 세포 내 및 막 단백질을 제공하는 데 사용할 수 있다. 이러한 광범위한 적용 가능성은 현재 재조합 단백질 기술의 범위를 벗어난 엄청난 수의 새로운 mRNA 기반 의약품을 제조하는 가능성을 제공한다.
mRNA 의약품 개발의 발전(예, COVID 19 백신)으로 포트폴리오 전반에 걸쳐 위험을 줄였다. mRNA 의약품은 전 포트폴리오에 빠르게 적용할 수 있는 기본 기능을 공유하는데, 한 프로그램에서 신약 허가 기준의 안전성이 증명되면 유사한 mRNA 기술, 전달 기술 및 제조공정을 사용하는 관련 프로그램의 기술 및 생물학적 위험이 감소한다.
mRNA 기술은 발견과 개발을 동시에 진행할 수 있다. 소프트웨어와 유사한 mRNA의 특징은 신속한 인실리코 설계와 자동 고처리량 합성 프로세스를 사용하여 순차적이 아닌 병렬로 발견과 개발을 진행할 수 있다. 이러한 mRNA 기능이 공유된 제조공정과 인프라를 사용할 수 있어 약물 개발을 가속할 수 있다.
공유 프로세스 및 인프라를 활용하는 능력은 시간이 지남에 따라 상당한 자본 효율성이 있다. mRNA 의약품의 제조 요구 사항은 다양한 종류를 유사한 생산 파이프라인으로 할 수 있는 기존의 재조합 단백질 기반 의약품보다 훨씬 더 유사하다. 상업적 규모로 제조할 때, mRNA 의약품이 공동 자본 지출의 혜택이 있으며, 그 결과 프로그램별 자본 요구가 낮아지고 유리한 가변 비용 프로파일이 생긴다.
재조합 단백질 기반 약물은 환자 치료를 크게 발전시켰고 바이오 제약 산업을 변화시켰다. 새로운 의약품으로써 mRNA의 개발은 환자와 산업에 또 다른 돌파구를 제시하고 있다.
완전한 mRNA 의약품의 성공은 다음과 같은 약리학적 특성을 달성하는 것이다. 예측 가능한 용량 반응; 반복 투여를 포함하여 재현 가능한 약리학; 표적 조직에서 의도된 약리 활성을 달성함으로써 치료 효능; 안전 및 내약성; 및 개발을 위한 확장성 등이다.
RNA는 치료제로서 광범위한 잠재력을 가지고 있다. 현재 임상 노력은 예방 접종, 단백질 대체 요법 및 유전 질환 치료에 중점을 두고 있다. mRNA 치료제의 임상사용은 RNA 제조 및 세포내 전달 방법의 디자인의 진보를 통해 가능해졌다.
본 발명의 mRNA 치료제는 체내 세포에서 합성되고 체액으로 분비되어 세포막을 통과하여 생물학적 기능을 유지하는 POI를 코팅하는 mRNA 발현카세트를 포함한다. POI는 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드 및 융합 단백질 등이다.
본 발명의 새로운 의약품의 발견 및 개발을 위한 강력한 플랫폼 기술은, 생체내 세포에서 합성된 관심 폴리펩타이드(Polypeptide Of Interest, POI)가 체액으로 분비하고 세포 또는 조직으로 이동하는 전달기술로 인체 세포에서 합성된 폴리펩타이드가 체액으로 분비하도록 하는 신호 펩타이드를 코딩하는 orf 및 합성 관심폴리펩타이드의 세포 투과성을 제공하는 전달 펩타이드를 코딩하는 orf를 포함하는 POI mRNA 발현카세트 기술이다.
폴리펩타이드 분해 표적화 키메라 proteolysis targeting chimeras (PROTAC)라는 새로운 접근법이 2001년에 등장했으며 기존의 표적 요법에 비해 장점을 보여주었다. PROTAC 분자는 POI 결합 도메인, E3 ligase 결합 도메인 및 링커의 세 가지 성분으로 구성된 이중 기능성 키메라이다. POI 결합 도메인은 세포 내 폴리펩타이드를 표적으로 인식하는 소분자 또는 펩타이드이다. 일단 PROTAC 분자가 POI와 상호 작용하면 E3 ligase도메인은 E3 ligase에 동시에 결합하고 프로테아좀을 통해 POI 분해를 가능하게 한다.
이 기술은 단지 그 활성을 약화시키기보다는 세포 내 폴리펩타이드를 선택적으로 분해할 수 있는 수단을 제공하였다. 현재 PROTAC은 핵 수용체, 폴리펩타이드 키나제 및 효소를 포함한 다양한 폴리펩타이드를 표적으로 삼는 데 널리 사용되고 있다. PROTAC (Proteolysis TArgeting Chimera)는 세포 내 또는 관심 폴리펩타이드 (POI)의 동적 분해를 유도하는 새로운 치료 방식으로, 전체 병원성 폴리펩타이드의 분해를 통해 약물 내성을 해결하는 데 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 폴리펩타이드의 비정상적인 발현은 종양 형성을 초래할 수도 있다.
현재 대부분의 PROTAC은 POI의 결합 포켓에 크게 의존하는 POI 결합 도메인의 리간드는 소분자를 사용하고 있다. 구조 생물학의 급속한 발전으로 POI 에피토프에 대한 높은 친화성을 가진 펩타이드를 얻는 것이 더 용이할 수도 있다. 따라서 특정 펩타이드를 기반으로 하는 PROTAC(p-PROTAC)을 설계하는 것은 POI의 특이적이고 효과적인 분해를 실현하고 얕은 결합 포켓의 제한을 피하면서 "강력한" 폴리펩타이드 표적화와 관련하여 범위를 확장하는 새로운 접근 방식일 수도 있다.
POI와 펩타이드 사이의 표면에서 큰 상호 작용으로 소분자기반 PROTAC과 비교하여 p-PROTAC은 몇 가지 고유한 장점이 있다. p-PROTAC은 비 펩타이드 PROTAC보다 더 높은 작업 농도를 필요로 하지만 손쉬운 변형 및 큰 폴리펩타이드-폴리펩타이드 상호 작용 표면을 포함한다. 이는 상호 작용이 알려지지 않은 작은 분자가 있는 드래깅 불가능한 종양 폴리펩타이드에 대한 치료 전략의 개발 가능성을 제공한다. p-PROTAC, POI 및 E3 ligase의 상호작용을 위해, 사용된 펩타이드는 안전성과 친화성이 높은 내인성 펩타이드이다. 이러한 내인성 리간드는 다른 방식 (소분자 및 항체)에 비해 약물 개발을 위한 이상적인 선택일 수도 있다. 그러나, 후속 연구의 대부분은 펩타이드의 낮은 투과성과 낮은 안정성으로 인해 저분자 리간드를 선택하고 있다.
본 발명에서 이를 극복하기 위해, 관심 폴리펩타이드를 mRNA 발현 카세트로 제조하여 인체내에서 직접 합성하고 분비하여 표적세포내로 투과하여 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 하는 전략을 개발하였으며, 특히, p-PROTAC 및 E3 ligase, 둘 다 또는 각각 mRNA로 체내세포에 전달하여 p-PROTAC 및 E3 ligase, 둘 다 또는 각각을 합성하고 체액으로 분비하여 세포막을 투과하여 세포질에서 생물학적 기능을 유지하는 기술을 제안하고자한다.
체내 세포에서 직접 합성 및 분비되고; 세포막을 투과하여, 생물학적 기능을 수행하는 관심 폴리펩타이드(POI)를 코딩하는 발현카세트의 효능 극대화를 위해서, 어떠한 유형의 특성을 갖는 어떠한 유형의 펩타이드가 어떠한 염기서열 구조를 형성할 수 있는 발현카세트는 공지되지 않았다.
상기 발현카세트는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있거나 바이러스 형태 또는 비바이러스 형태 운반체일 수도 있다.
상기 발현카세트의 구성성분은 체내 세포에서 합성된 POI가 체액으로 이동하도록 하는 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP)를 코딩하는 open reading frame(orf); 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP) 또는 세포 표면에 있는 수용체에 결합하는 펩타이드를 코딩하는 orf; 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 orf;를 포함하도록 한다.
상기 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드는 E3 ligase, p-PROTAC(Peptide-proteolysis targeting chimera) 및 p-AUTOTAC(Peptide-Autophagy-targeting chimera)을 포함하는 융합단백질, p62, 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 일 수도 있다.
상기 POI에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 상기 POI 또는 이의 기능적 변이체의 C-말단에 포함(연결)될 수 있다. 예컨대, 상기 POI는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (1) POI 또는 이의 기능적 변이체 및 (2) 면역글로불린의 Fc 영역를 포함하는 것일 수 있다.
상기 POI에 포함된 면역글로불린의 Fc 영역은 POI 또는 이의 변이체의 안정성을 증진시키는 역할을 하는 것으로, 예컨대, 반감기 (eg, 체내 반감기)를 연장시키는 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 POI를 코딩하는 발현카세트는 2종류 이상의 폴리펩타이드를 코딩할 수도 있다.
상기 체내 세포로 2종류 이상의 발현카세트를 도입할 수도 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수도 있다.
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame): (b) 5' UTR; (C) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트를 제공하도록 한다.
상기 자가 증폭 mRNA 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 나노입자, Polyectrolyte complex(PEC), 에멀젠, 미셀, 나노구조체 및 젤 등일 수도 있다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 주사제, 크림 및 구강 점막 투여, 연고, 젤, 흡수제, 먹든 약을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 방법 이상일 수도 있다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 포함한 추가적인 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 관신 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트 전략으로 질병 예방 및 악화 방지 효과, 특히 종양 조직에서의 항암물질의 이동 촉진을 통한 높은 항암 치료 성적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
체내 세포에서 직접 합성 및 분비되고; 세포막을 투과하여, 생물학적 기능을 하는 관심 폴리펩타이드(POI)를 코딩하는 발현카세트의 효능 극대화를 위해서, 어떠한 유형의 특성을 갖는 어떠한 유형의 펩타이드가 어떠한 염기서열 구조를 형성할 수 있는 발현카세트는 공지되지 않았다.
상기 발현카세트는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있거나 바이러스 형태 또는 비바이러스 형태 운반체일 수도 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트의 구성성분은 (일반식 1)과 같다. 상기 POI mRNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수 있다.
5'CAP-5‘UTR-POI ORF-3'UTR-PolyA (일반식 1)
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame): (b) 5' UTR; (C) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수 있다.
상기 자가 증폭 mRNA 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트가 체내세포에 도입되어 합성되는 POI는 (일반식 2)와 같으며, 상기 POI는 체액으로 이동하도록 하는 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP); 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP) 또는 세포 표면에 있는 receptor에 결합하는 펩타이드; 및 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드;를 포함하도록 한다. SSP는 POI의 N 말단에 있으며 나머지는 순서에 무관할 수도 있다.
분비 신호 펩타이드 - 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드 - 세포 투과성 펩타이드(또는 세포 표면에 있는 receptor에 결합하는 펩타이드) (일반식 2)
상기 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP)는 POI를 체액으로 이송하며, 하기 특징을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드로, N-말단의 양성 전하 부위; 중앙의 소수성 코아(hydrophobic core) 부위; 및 C-말단의 절단 부위로 구성되어 신호 펩티다제 (signal peptidase)에 의해 인지되는 부위;를 포함할 수도 있다.
상기 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)는 POI를 원형질 막 내로 전달하며, 하기 특성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)이며, a. 아미노산 길이: 9 - 13; b. 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P); c. 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60; d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220; e. 소수성 지수(Hydropathy): 소수성 지수의 전체 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY): 2.1 - 2.6; 및 f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임;을 포함할 수도 있다.
상기 아미노산 서열이 12개 아미노산 서열로 구성된 하기 일반식을 갖는 것인 CPP:
(일반식 3)
Figure pat00001
상기 (일반식 3)에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있으며; 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성되고, 12'에 있는 P는 프롤린임을 포함할 수도 있다.
펩타이드 리간드에 의해 활성화되는 세포 수용체는 POI 표적 운반에 주요 관심사이다. 이들 수용체는 두 가지 주요 기준을 충족해야 한다. 첫째, 수용체는 정상 세포와 비교하여 표적세포에서 독특하거나 고도로 과발현되어야 한다. 일반적으로 3 : 1 이상의 표적 대 정상 세포 발현 비율이 바람직하다. 둘째, 표적세포에 대한 표적 수용체의 총 발현 수준은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 적절한 양의 POI의 세포 전달을 보장할 수 있을 만큼 충분히 높아야 한다. 많은 펩타이드 결합 수용체는 이러한 특징을 가지고 있으며, 따라서 이들의 활성화 펩타이드 리간드는 POI 접합체에 사용하기 위한 유망한 선택 리간드이다. 또한, 펩타이드 결합 수용체의 표적화는 화학적으로 설계된 소분자 결합제 또는 항체로도 달성 할 수 있다. 그런 다음 수용체 결합 분자에 공유 결합된 POI로 구성된 모듈형 접합체 시스템을 엔지니어링하여 직접 약물 전달이 가능하다. 최적으로 후자는 약물의 선택적 세포 내 전달을 위해 표적세포의 침투를 보장해야 한다. 많은 경우에 스마트 링커가 POI와 표적 단위 사이에 추가로 적용되어 표적 세포 내부에서 POI의 제어 방출을 촉진한다.
상기 POI에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 상기 POI 또는 이의 기능적 변이체의 C-말단에 포함(연결)될 수 있다. 예컨대, 상기 POI는 N-말단에서 C-말단 방향으로 (1) POI 또는 이의 기능적 변이체 및 (2)면역글로불린의 Fc 영역를 포함하는 것일 수 있다.
상기 POI에 포함된 면역글로불린의 Fc 영역은 POI 또는 이의 변이체의 안정성을 증진시키는 역할을 하는 것으로, 예컨대, 반감기 (eg, 체내 반감기)를 연장시키는 효과를 갖는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1의 Fc 영역 및 IgG4의 Fc 영역으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 IgG1의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG1의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다. IgG4의 Fc 영역은 IgG4의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG4의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 POI는 면역글로불린의 Fc 영역과 POI 또는 이의 기능적 변이체 사이에 펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 양 쪽에 융합된 Fc 영역과 POI가 각각 자유롭게 기능을 발휘하도록 하기 위하여 유연성 링커(flexible linker)인 것이 좋다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 강직성 링커(rigid linker)가 아닐 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 하나 이상의 Gly(G)와 하나 이상의 Ser(S)을 반복적으로 포함하는 GS 링커일 수 있으며, 예컨대, (GGGGS)n (n은 GGGGS)의 반복 회수로 서 1 내지 10의 정수 또는 1 내지 5의 정수 (1, 2, 3, 4, 또는 5)임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 POI에서, 면역글로불린의 Fc 영역과 융합된 POI 또는 이의 기능적 변이체는, 면역글로불린의 Fc 영역이 융합되지 않은 POI 또는 이의 기능적 변이체와 비교하여, 체내 (또는 혈중) 안정성(지속기간)이 증가된 것을 특징으로 한다 (예컨대, 체내 또는 혈중 반감기 증가) 또한, 상기 면역글로불린의 Fc 영역과 융합된 POI 또는 이의 기능적 변이체는, 면역글로불린의 Fc 영역이 융합되지 않은 POI 또는 이의 기능적 변이체와 비교하여, 약리 효과 (예컨대, 체중 감소 효과)가 개선된 것을 특징으로 한다.
상기 생물학적 기능을 하는는 폴리펩타이드는 E3 ligase, p-PROTAC(Peptide-Proteolysis targeting chimera) 및 p-AUTOTAC(Peptide-Autophagy-targeting chimera)을 포함하는 융합단백질, p62, 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수도 있다.
상기 POI를 코딩하는 mRNA 발현카세트는 2종류 이상의 폴리펩타이드를 코딩할 수도 있다.
상기 체내세포로 2종류 이상의 mRNA 발현카세트를 도입할 수도 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수도 있다.
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame): (b) 5' UTR; (C) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 자가 증폭 mRNA 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 RNA 발현카세트는 당 변형, 염기 변형, 백본 변형 및 지질 변형을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 화학적 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체, 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체를 포함한다. 각각 구조체는 5‘ 캡 구조, 5‘UTR 및 3’UTR를 포함하여 RNA의 안정성 및 발현의 증가할 수 있도록 구조체에서 독특한 2차 구조를 가역적으로 유지하도록 해야 한다.
치료제 목적을 위한 최적의 시험관 내 전사를 위해서 본 발명의 RNA 발현 키세트는 T7, T3 또는 Sp6 파지(phage) RNA 중합 효소(polymerase)를 사용하여 선형 DNA 주형(linear DNA template)으로부터 제조할 수 있다. 이렇게 만들어진 RNA 발현카세트는 카세트의 안정성 및 발현의 효율성이 향상되도록 표적 단백질을 암호화하고 있는 Open reading frame, UTR, 5'Cap과 다중 아데노신 꼬리 서열(poly (A) tail)을 갖고 있는 개선된 형태일 수 있다.
5‘ 및 3’UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 하고 있다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성할 수 있도록 한다. 5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5’-terminal oligo-pyrimidine, 5’TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 표적 단백질 네트워크의 표적 제어를 가능하게 해야 한다.
상기 RNA 발현카세트는 G/C 함량, 코돈 최적화(optimization), UTR 변형, 30개 초과의 아데노신 뉴클레오타이드를 갖는 폴리(A) 꼬리, 폴리(C) 서열, 5'캡(CAP) 구조 및 히스톤-스템-루프 서열을 포함하는 염기서열 변형으로부터 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 RNA 발현카세트는 콜레스테롤(Cholesterol)과 비공유결합 또는 공유결합을 하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 나노입자 Polyectrolyte complex(PEC) 및 젤 등일 수도 있다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 주사제, 크림 및 구강 점막 투여, 연고, 젤, 흡수제, 먹든 약을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 방법 이상일 수도 있다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 포함한 추가적인 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 관신 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA 발현카세트 전략으로 질병 예방 및 악화 방지 효과, 특히 종양 조직에서의 항암물질의 이동 촉진을 통한 높은 항암 치료 성적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 체내에서 합성될 수 있는, 분비 신호 펩타이드, CPP 및 생물학적 기능 폴리펩타이드를 코딩하는 orf를 포함하는 염기서열로부터 인공적으로 제작된 발현카세트를 제공하며, 이는 체외 재조합 단백질 기술로 합성되어 시험 전에 제한된 다양성 및 예측 불가능한 세포 투과성과 같은 선행 기술의 한계를 극복할 수 있다. 상기 펩타이드 및 폴리펩타이드 설계에 대한 무한한 가능한 디자인으로 세포내 활성을 보장하는 POI에 기초하여, 본 발명은 생물학적 활성 POI를 살아있는 세포 내로 전달하기 위해 이의 선행 기술과 비교하여 향상된 능력을 갖는 전략을 제시하였다. 따라서, 이것은 분자 전달, 약물 전달, 폴리펩타이드 요법, 세포내 폴리펩타이드 요법, 폴리펩타이드 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등에서 이들의 실제적 효과적인 적용을 가능하게 할 것이다.
도 1은 본 발명의 mRNA 발현카세트의 구성이고,
도 2는 상기 제조된 mRNA 발현 카세트의 DNA 주형을 증폭한 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소으로 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 재조합하였으며 상기 반응용액을 대장균에 형질전환한 후, 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 3은 캡된 POI mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 <T7 promoter - 5'UTR - POI ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>을 가지는 DNA가 삽인된 pUC19 벡터에서 EcoRI/BamHI으로 절단된 DNA 절편을 주형으로 증폭한 PCR 산물을 주형으로 체외전사한 결과이고,
도 4는 제조한 캡된 RNA 발현카세트, 캡된 변형 RNA 발현카세트 및 3’말단에 cholesterol이 부가된 캡된 변형 RNA 발현카세트를 세포 배양액에 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인한 결과이고,
도 5는 공동 배양 시간에 따라 형질주입된 Neuro-2a 세포에서 tau 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과이다.
여기서 산물, 조성물 및 방법을 정의할 때 사용하는 바, "구성된 (comprising)"이라는 용어는 산물 (product), 조성물 (composition) 및 방법 (method)이 언급된 구성성분 (component) 또는 단계를 포함하지만 다른 것도 배제하지 않는다는 것을 말하고자 한다. "필수적으로 구성된 (consisting essentially of)"이라는 용어는 기타 필수적으로 중요한 구성성분 또는 단계를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 인용된 구성성분으로 필수적으로 구성된 조성물은 소량 오염물 (trace contaminant) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 배제하지 않는다. 예를 들어, 펩타이드가 어떠한 아미노산도 포함하지 않지만 인용된 아미노산 서열을 포함하고 있으면 상기 펩타이드는 아미노산 서열로 "구성되는" 것이다. 펩타이드는 이러한 아미노산 서열이 단지 몇 개의 부가적 아미노산 잔기, 구체적으로 약 1개부터 약 10개까지 또는 그러한 부가적 잔기와 함께 존재하는 경우, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 것이 된다. 펩타이드는 아미노산 서열이 펩타이드의 최종 아미노산 서열의 적어도 일부인 경우 상기 아미노산 서열로 이루어진 (comprise) 것이다. 이러한 펩타이드는 몇 개부터 수백 개까지 부가적 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 부가적 아미노산 잔기는 펩타이드 전달 (peptide trafficking)에서 중요한 역할을 하고, 폴리펩타이드 생산 또는 순수 분리를 용이하게 하며 다른 서열과 비교하여 반감기 (half-life)를 연장시킬 수 있다. 동일한 내용이 뉴클레오타이드 서열에도 적용될 수 있다.
여기서 사용되는 "아미노산"이라는 용어는 자연적으로 존재하는 L-아미노산, 예를 들어 20개의 유전자 인코딩된 아마노산인 알라닌 (Ala 또는 A), 발린 (Val 또는 V), 루이신 (Leu 또는 L), 이소루이신 (Ile 또는 I), 프롤린(Pro 또는 P), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 트립토판 (Trp 또는 W), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 타이로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라진(Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아스파탐산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 라이신 (Lys 또는 K), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H) 또는 G) 그리고 베타-알라닌, 오르니틴, 또는 메티오닌 설폭사이드 또는 하나 이상의 알파-아미노 (α-amino), 알파-카르복실 (α-carboxyㅣ) 또는 가지 사슬 (sidechain)이 변형된 메틸, 포르밀, 아세틸, 글루코실 및 포스포릴 등이 결합한 아미노산과 같은 자연적으로 존재하는 이들의 유도체를 말한다.
여기서 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"이라는 용어는 상호 교환하여 사용되고 9개 이상의 아미노산이 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산 잔기들의 폴리머를 일컫는다. 상기 폴리머는 직선상 (linear), 가지상(branched) 또는 환상 (cyclic)의 형태를 가질 수 있다. 일반적으로 표시하는 바, 아미노산 폴리머가 긴 경우에는 (예로, 80개 이상의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드라고 칭하는 것이 바람직하다. 결과적으로, "펩타이드"는 약 9개 내지 약 80개 아미노산, 바람직하게는 약 10개 내지 약 75개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 20개 내지 약 70개 아미노산, 또한 가장 바람직하게는 약 23개 내지 약 66개 길이의 아미노산 단편을 말한다. 펩타이드는 폴리펩타이드 정착 (localisation)에 관여하는 부위 (예로, 특정 세포 기관 또는 막으로 폴리펩타이드를 유도하는)와 같은 자연적으로 존재하는 [예로, 자연 그대로 (native)] 폴리펩타이드의 선택된 부위로 이루어질 수 있다. "폴리펩타이드/펩타이드"라는 용어의 정의는 변형된 형태뿐만 아니라 자연 그대로의 폴리펩타이드/펩타이드를 포함한다.
여기서 사용하는 "자연 그대로 (native)"라는 용어는 연구실에서 사람이 인공적으로 변형하거나 변화시킨 물질과 구별하여 자연 상태의 원료로부터 얻은 (예로, 분리된, 순수 분리된) 물질을 말한다. 예를 들어, 자연 그대로의 폴리펩타이드/펩타이드는 야생형 생물체 또는 세포의 게놈에 존재하는 유전자에 의해 인코딩된다. 대조적으로, 변형된 폴리펩타이드/펩타이드는 연구실에서 변형되어 왔던 핵산 분자에 의해 인코딩되고 하나 이상의 아미노산(들)의 삽입, 결실 또는 치환 또는 이들 가능성의 조합에 의해 자연 그대로의 폴리펩타이드/펩타이드와는 달라진다. 몇 가지 변형을 조사해보면, 이들은 연속적인 (consecutive) 잔기 및/또는 비연속적인 (nonconsecutuve) 잔기와 관련이 있을 수 있다.
"신호전달 펩타이드 (signaling peptide)"는 주어진 숙주세포 또는 생물체에서 해당 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드의 특이적인 정착 (specific localisation)을 가능하게 하는 펩타이드이다. 신호전달 펩타이드의 예로는 신호 펩타이드 및 막 고정 펩타이드를 들 수 있다.
여기서 사용하는 "신호 펩타이드 (signal peptide)" 또는 "신호 서열 (signal sequence)"은 내형질 망상(ER) 내로 연결되어 작동하는 (operably linked) 폴리펩타이드의 이동 (passage)을 촉발할 수 있는 아미노산 서열을 말한다. 신호 펩타이드는 일반적으로 엔도펩티다제 (endopeptidase; 특이 ER-지정하는 신호 펩티다제)에 의해 절단되고 (성숙한) 폴리펩타이드가 방출된다. 전형적인 신호 펩타이드의 길이는 약 10개부터 약 40개까지의 아미노산, 바람직하게는 약 15개부터 약 30개까지의 아미노산, 또한 더욱 바람직하게는 약 18개부터 25개까지의 아미노산 또한 가장 바람직하게는 메티오닌 개시 잔기 (Met initiator residue)를 포함하여 약 23개의 아미노산 범위에 속한다.
여기서 사용하는 "막-고정 (membrane-anchoring) 펩타이드"는 세포막 및 특히 세포질 막에 연결되어 작동하는 폴리펩타이드를 고정할 수 있는 성질 상 소수성 (hydrophobic)인 아미노산 서열을 말한다. 전형적인 막-고정 펩타이드는 약 20개부터 약 85개까지의 아미노산, 바람직하게는 약 25개부터 약 75개까지의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 30개부터 약 70개까지의 아미노산, 또한 가장 바람직하게는 약 66개의 아미노산 길이 범위를 가진다. 이것은 중앙에 매우 소수성을 띠고 한 번 이상 세포막의 지질 이중층 (lipid bilayer)을 거쳐서 막의 외부 표면 (outer surface)과 상호 작용할 수 있는 도메인을 포함하는 것이 바람직하다.
여기서 사용하는 "조합 (chimeric)" 폴리펩타이드는 자연 상태에 존재하는 서열 상 다른 위치에서 폴리펩타이드/펩타이드를 이루는 단일 폴리펩타이드 사슬을 말한다. 조합 폴리펩타이드를 구성하는 다양한 폴리펩타이드/펩타이드는 서로 분리된 폴리펩타이드히고 정상적으로도 자연 상태에서 존재하면서 조합 폴리펩타이드에 함께 연결되거나; 또는 자연 상태에서 동일한 폴리펩타이드에 존재할 수 있지만, 조합 폴리펩타이드가 아닌 다른 배열(arrangement)로 존재한다. 예를 들어, 조합 폴리펩타이드는 서로 다른 출처로부터 얻은 단일 펩타이드 및 관심 폴리펩타이드로 구성될 수 있다. 또 다른 조합 폴리펩타이드는 단일 펩타이드, 관심 폴리펩타이드 및 막-고정 펩타이드로 구성될 수 있다. 여기서 관심 폴리펩타이드는 단일 펩타이드 및/또는 막-고정 펩타이드가 아닌 다른 출처로부터 얻은 것이다.
여기서 "연결되어 작동하는 (operably linked)" 이라는 용어는 적어도 2개의 구성성분이 나란히 위치(juxtaposition)하는 것을 말한다. 여기서 구성성분은 이미 기술한 바와 같이, 필요한 기능을 기대하게 하는 관련성을 가진다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 숙주세포 또는 생물체에서 발현이 가능한 전사를 촉발시길 경우 뉴클레오타이드 서열에 연결되어 작동한다. 신호 펩타이드는 이것이 ER 을 통하여 전위 (translocation)를 촉발하고, 다시 절단되어 폴리펩타이드를 방출할 때 폴리펩타이드에 연결되어 작동한다. 막-고정 펩타이드는 이것이 세포막, 특히 세포질 막에 고정하는 작용을 할 때 폴리펩타이드에 연결되어 작동한다.
여기서 사용하는 바, "벡터 (vector)"는 숙주세포 또는 생물체에서 핵산 분자(들)를 운반하고 발현할 수 있는 매개체 (agent)라면 어느 것도 될 수 있다. 벡터는 염색체에 부가되고 [예로, 에피좀 (episome)] 또는 삽입되고 (integrating) (숙주 염색체에 도입되기 위해), 자발적으로 복제할 수도 있고 높거나 또는 낮은 복사본 수를 가지며, 이중 가닥 또는 단일 가닥이고 맨 가닥 (naked) 또는 다른 분자와 복합되어 (complexed) 존재한다 [예로, 지질 또는 폴리머와 복합되어 리포좀, 리포플렉스 (lipoplex) 또는 나노입자 (nanoparticle), 바이러스 캡시드에 포장된 벡터 및 고체상 입자 상에 고정된 벡터 등과 같이 입자화 구조 (particulate structure)를 형성하는 벡터].
여기서 사용하는 "핵산 (nucleic acid)", "핵산 분자 (nucleic acid molecule)", "폴리 뉴클레오타이드(polynucleotide)" 및 "뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"이라는 용어는 상호 교환하여 사용될 수 있고, 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 또는 폴리리보뉴클레오타이드 (RNA) 분자 또는 이들의 조합의 길이의 가지는 폴리머라고 정의한다. 이 정의는 단일 또는 이중 가닥, 직선상 또는 환상, 자연적으로 존재하거나 합성된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 더욱이, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 핵산의 생체 내 (in vivo) 안정성을 증가시키거나 그들의 전달을 증진시키거나 숙주 개체로부터 소멸율 (clearance rate)을 감소시키기 위한 화학적 변형 (예로, WO 92/03568; US 5,118,672 참조)뿐만 아니라 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오타이드 (예로, US 5,525,711, US 4,711,955 또는 EPA 302 175에 기재된 바와 같은 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체)로 이루어질 수 있다. 변형이 존재하는 경우, 이것은 중합 (polymerization) 이전 또는 이후에 주어질 수 있다.
여기서 사용되는 바, "서열 상동성 (sequence homology)" [또는 서열 일치성 (sequence identity)]이라는 용어는 일반적으로 퍼센트 (percentage)로 표현되고 주어진 정도의 일치성을 서로 보유하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열들 간 퍼센트 상동성은 최적의 배열을 도입하는데 필요한 간격의 수 및 각 간격의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 일치되는 위치 수의 함수이다. GCG 위스콘신 패키지 및 국가 생물공학정보센터 [National Center for Biotechnology Information (NCBI)]에서 공개적으로 사용 가능하고 인쇄물로도 기재되어 있는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램과 같은 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘이 뉴클레오타이드 서열들 간 퍼센트 상동성을 결정하기 위해 당업계에서 사용 가능하다.
여기서 사용하는 "숙주세포 (host cell)"라는 용어는 본 발명의 벡터 수여자가 될 수 있거나 수여자가 되었던 세포 및 이러한 세포의 자손을 모두 말한다. 이 용어는 넓은 범위로 해석되어야 하고, 조직 및 기관과 같이 세포의 특정 조직뿐만 아니라 분리된 세포, 세포 그룹을 포함한다. 이러한 세포는 일차 (primary), 형질전환된 또는 배양된 세포를 포함할 수 있다.
여기서 사용하는 생물체라는 용어는 척추동물, 상세하게는 많은 수의 포유동물 종, 또한 특별히 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 인간을 포함한 영장류를 말한다.
본 발명에서, 체내 세포에서 직접 합성되어; 체액으로 분비되고; 세포막을 투과하여 세포질로 이동하며, 생물학적 기능을 수행하는 관심 폴리펩타이드(POI)의 효능 극대화를 위해, POI를 코팅하는 발현카세트를 제공하고자한다.
상기 발현카세트는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있거나 바이러스 형태 또는 비바이러스 형태 운반체일 수도 있다.
소분자의 공통적인 문제는 오프타겟(off-target) 약물 상호작용 가능성이다. 또한, 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA는 염기서열로 구성되고 코딩하는 폴리펩타이드가 특정되어 있어 그 특이성이 절대적이다는 사실이다. 따라서, 본 발명은 관심 폴리펩타이드가 생체내 세포에서 합성되고 분비되어 세포를 투과하도록 하는 mRNA 발현카세트 및 이들의 용도를 제공하고자한다.
상기 POI mRNA 발현카세트의 구성은 (일반식 1)과 같다. 상기 POI mRNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수도 있다.
5'CAP-5‘UTR-POI ORF-3'UTR (일반식 1)
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame): (b) 5' UTR; (C) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 자가 증폭 mRNA 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트가 체내세포에 도입되어 직접 합성된 POI의 구성은 (일반식 2)와 같으며, 상기 직접 합성된 POI는 체액으로 이동하도록 하는 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP)를 코딩하는 open reading frame(orf); 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP)를 코딩하는 orf; 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 orf;를 포함하도록 한다. SSP는 POI의 N 말단에 있으며 나머지는 순서에 무관할 수도 있다.
분비 신호 펩타이드 - 생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드 - 세포 투과성 펩타이드 (세포표면의 수용체에 결합하는 결합펩타이드, 항체의 절편 또는 항체) (일반식 2)
1. Signal peptide
신호 펩타이드 서열은 1975년에 세포에서 제거할 단백질을 표시하는 짧은 제거 가능한 N- 말단 서열로 처음 설명되었다. 그 결과, 이들 펩타이드 서열은 길이와 아미노산 구성이 매우 다양하고 원핵 생물과 진핵 생물 모두에서 발견되지만 보존된 3차 구조를 공유한다는 사실이 밝혀졌다.
각 신호 펩타이드 (20~30 개의 잔기 길이)는 기본 "N 도메인", 7~13 잔기 소수성 "H 도메인" 및 약간 극성 "C 도메인"으로 구성된다. 이러한 일반적인 구조에 추가하여, 포유류 신호 펩타이드 서열의 특정 위치에 있는 잔기의 보존이 나타난다. 예를 들어, 작은 중성 아미노산은 위치 -1 (신호 펩타이드의 마지막 아미노산)과 -3에 널리 퍼져있는 반면 부피가 큰 방향족 아미노산은 종종 -2 위치에 있다. 흥미롭게도 프롤린 잔기는 -3에서 +1 (성숙 펩타이드의 첫 번째 아미노산)의 모든 위치에 사실상 없다. 그러나 이러한 신호 펩타이드의 매우 다양한 1차 서열은 내인성 신호 펩타이드가 세포에서 특정 단백질의 생리학적 분비 수준을 조절하는 역할을 하고, 신호 펩타이드를 대체하여 단백질을 수정할 수 있다. 실제로 이것은 많은 연구에서 나타나는 사례로, 천연 신호 펩타이드를 높은 수준에서 분비하는 것으로 알려진 단백질 (예 : 루시페라제, 조직 플라스미노겐 활성화제)에서 얻은 것으로 대체하면 분비 수준이 크게 향상될 수 있다.
일반적인 분비되는 폴리펩타이드는 N-말단 (N-terminus)에 신호 펩타이드로 구성되는 전구체로서 발현된다. 신호 펩타이드는 보통 3개의 구별되는 부위: N-말단의 양성 전하 부위, 중앙의 소수성 코아(hydrophobic core) 부위 및 C-말단의 절단 부위로 구성되어 신호 펩티다제(signal peptidase)에 의해 인지된다. 신호 펩타이드는 폴리펩타이드 전구체가 내형질 망사(endoplasmic reticulum; ER) 막을 통과하여 효과적으로 이동할 수 있게 한다. 이 신호 펩타이드는 다시 이동 과정 중에 신호 펩티다제(signal peptidae)에 의해 절단되어 성숙한 폴리펩타이드(신호 펩타이드가 없는 폴리펩타이드)가 된다. 폴리펩타이드는 일단 ER내로 들어가면, 골지체(Golgi apparatus)로 이동한 다음 폴리펩타이드 특성과 신호 펩타이드의 존재 여부에 따라 분비 경로의 다양한 과정 중에서 하나를 거치게 된다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 외부 배지로 분비되거나 엔도좀 및 리소좀 기관(compartment)과 같은 세포 기관으로 향하거나 세포막에 고정될 수 있다. 폴리펩타이드의 당화(glycosylation), 디설파이드 결합 형성 및 단백분해 절단와 같은 많은 번역후 수식 과정이 ER 및 골지체에서 일어날 수 있다는 사실은 당업계에 잘 알려져 있다. 올바르지 못한 번역후 수식은 불활성 (inactive) 폴리펩타이드를 만들어 외래 (heterogenous) 폴리펩타이드 산물을 생산하는 과정에서 효과적이지 못한 신호 펩티다제 절단을 야기하므로, 특별히 인간에게는 사용될 수 없다.
신호 펩타이드는 분비 폴리펩타이드나 막폴리펩타이드의 N말단에 위치하여 분비성 폴리펩타이드 또는 막 폴리펩타이드의 표적화(targeting) 신호로 기능하는 아미노산 서열로, 현재까지 알려진 신호 펩타이드의 종류만 6천여 가지로 매우 다양하다. 관심 폴리펩타이드를 생산함에 있어서, 어떠한 신호 펩타이드를 적용하느냐에 따라 관심 폴리펩타이드의 세포외 분비율이 달라질 수 있으며, 이와 관련하여 관심 폴리펩타이드에 맞는 신호 펩타이드를 선정하여 목적 폴리펩타이드 세포외 분비를 최적화하는 연구가 많이 보고된 바 있다.
본 발명의 mRNA 발현카세트에 의해 인체 세포에서 합성되어 체액으로 분비된 폴리펩타이드에 대해 원형질 막은 세포 내재화(cellular internalization)를 제한하는 불투과성 장벽(impermeable barrier)으로서 작용한다. 이에 따라 생체 세포에서 합성된 폴리펩타이드는 세포 및/또는 조직 내로의 투과 불량; 특정 세포 및/또는 조직을 표적화하는 특이성 부족으로 인해 전신 전달될 때의 독성; 제한된 양이 표적화된 영역으로 전달되어 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수 있는 분해; 및 특정 표적 세포 및/또는 조직에서 충분한 국소 농도를 달성하기 위해 고농도로 전달될 때의 부작용과 같은 많은 어려움이 이러한 고분자를 원하는 표적으로 전달하는 것을 제한할 것이다. 포유류 재조합 단백질의 발현 및 후속 정제는 많은 생물학 분야에서 매우 중요하다. 이러한 단백질의 적절한 3차 구조와 번역 후 변형을 유지하기 위해 일시적인 포유류 발현 시스템이 종종 채택할 수 있다. 그러나 이러한 시스템의 성공적인 활용은 항상 있는 것은 아니며 일부 재조합 단백질은 포유류 숙주에서 발현에 불응성이 있다. 현탁액 HEK293 세포에서 얻은 분비된 재조합 단백질의 수준에 영향을 미치는 다른 N-말단 신호 펩타이드 및 인접 하류 잔기의 역할이 중요하다.
분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 모델 단백질로 사용하여, 이종 신호 펩타이드 측면에 있는 +1/+2 다운 스트림 잔기가 분비 수준에 상당한 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 다른 신호 펩타이드 서열의 비교를 수행하고 계산적으로 설계된 서열인 secrecon으로 가장 생산적이라고 보고하였다. 중요한 것은, secrecon 신호 펩타이드와 SEAP의 맥락에서, 또한 +1 위치 (예 : 알라닌)에서 특정 아미노산 잔기에 대한 명확한 선호도와 다른 것 (시스테인, 프롤린, 티로신 및 글루타민)의 해로운 영향이 있다. +1 위치에 이러한 "바람직하지 않은" 잔기를 자연적으로 포함하는 단백질이 고유 신호 펩타이드, 이종성 secrecon 신호 펩타이드 또는 +1 또는 +1 및 +2 위치에 추가 알라닌이 있는 secrecon으로 발현되면 표현이 크게 다르고 예측할 수 없었다.
그러나 각 단백질에 대해 신호 펩타이드/인접 아미노산 조합 패널 중 하나 이상이 성공적인 재조합 발현을 가능하게 하였다. 단백질 발현을 가능하게 하는 신호 펩타이드와 인접한 아미노산 사이의 중요한 상호 작용을 강조하고, 지금까지 HEK293 세포에서 발현에 불응성이 입증된 재조합 단백질을 충분히 생산할 수 있는 전략을 제공한다.
단백질 수율을 개선하기 위해 고도로 분비된 단백질의 이종 신호 펩타이드를 활용함으로써 제기되는 잠재력은 매력적인 것이며 모든 재조합 단백질에 대해 단일 신호 펩타이드를 사용하는 것을 포함하는 보편적으로 적용 가능한 전략의 확인은 이상적인 시나리오를 구성할 것이다. 이 잠재력을 더 조사하기 위해, 널리 사용되는 모델 분비 단백질, 분비 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SEAP)의 발현을 연구하기로 선택했지만 비 네이티브 신호 펩타이드의 맥락에서. SEAP의 분비를 위한 최적의 신호 펩타이드를 식별하지만, 중요한 것은 성숙 단백질 (위치 +1 및 +2)에서 아미노산의 중요한 역할도 있다. +1 위치에 삽입될 때 SEAP의 발현에 부정적인 영향을 미치는 아미노산을 확인하고 불리한 네이티브 +1 아미노산을 가진 단백질의 발현을 조사하여 신호 펩타이드를 교체하거나 작은 위치에 배치하여 불응성 발현을 복원할 수 있음을 입증하였다. +1/+2 위치의 중성 아미노산. 이러한 발견은 생물 의약 산업뿐만 아니라 생물학적 연구의 많은 분야에서 매우 중요한 단백질의 생산을 개선하기 위해 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 예상하였다.
결론적으로, 재조합 단백질 발현을 달성하기 위해 신호 펩타이드와 결합된 성숙한 단백질 서열의 중요성을 강화하였다. 데이터는 분비된 단백질의 작은 패널을 사용하여 단백질이 +1 아미노산만을 고려하여 포유류 세포 배양에서 재조합적으로 발현되는지 여부를 예측하고 신호 펩타이드를 "보편적인" 신호 펩타이드는 모든 경우에 발현 문제를 극복하지 못할 것이다. 그럼에도 불구하고, secrecon 신호 펩타이드를 사용하고 제한된 수의 대체 발현 플라스미드를 생성함으로써 천연 서열로는 얻을 수 없었던 포유류 세포로부터 4 가지 다른 재조합 단백질의 성공적인 발현을 달성하였다. 이 접근법은 중요한 생물학적 및 임상적 가치를 지닌 단백질을 성공적으로 생성하는 데 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
2. 세포 투과성 펩타이드(CPP)
본 발명의 세포 침투 펩타이드는 심각한 치명적인 막 손상을 일으키지 않으면서 세포막을 통과 할 수 있는 특정 펩타이드 그룹이다. 세포 진입의 정확한 메커니즘은 여전히 논란의 여지가 있지만 엔도사이토시스와 직접 침투 메커니즘이 관여한다.
20년 전에 발견된 이래로 수백 개의 CPP가 이미 설명되었으며 대략 양이온 성, 양친매성 및 소수성 CPP의 세 가지 화학 그룹으로 분류될 수 있다. 양이온성 CPP는 아르기닌과 라이신 잔기에서 파생된 양전하를 포함하는 반면, 양친 매성 펩타이드는 대부분 나선 구조를 채택하여 친수성 및 소수성 부분을 특징으로 한다. 소수성 CPP는 무극성 아미노산이 풍부하고 순 전하가 낮다. 그러나 이러한 화학 그룹 간에는 명확한 중복이 존재하며 CPP가 화학적으로 다양한 펩타이드 그룹을 나타낸다.
상기 CPP의 세포투과성을 개선하기 위해, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 화합물 등을 포함하는 생물학적 활성 고분자가 세포 내 원형질 막을 횡단하는 것을 용이하게 하는, 의생물 과학, 전임상 및 임상 연구에 적용가능한 세포 투과성을 갖는, 제한되지 않은 수의 디자인으로 확장될 수 있는 기본 플랫폼인 신규 개선된 고분자 전달 펩타이드 서열들이 많이 제안되고 있다.
상기 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)는 관심 폴리펩타이드를 원형질 막 내로 전달하며, 하기 특성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)이며, a. 아미노산 길이: 9 - 13; b. 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P); c. 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60; d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220; e. 소수성 지수(Hydropathy): 소수성 지수의 전체 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY): 2.1 - 2.6; 및 f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임;을 포함하여 제공하도록 한다.
상기 아미노산 서열이 12개 아미노산 서열로 구성된 하기 일반식을 갖는 것인 CPP:
(일반식 3)
Figure pat00002
상기 일반식 3에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있으며; 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성되고, 12'에 있는 P는 프롤린임을 포함하여 제공하도록 한다.
240개의 개선된 CPP 서열이 결정 인자에 기초하여 디자인되고 개발되었다. 240개의 개선된 CPP(소수성, 유연한, 굽힘, 지방족 및 12 a/a 길이 펩타이드)의 정량적 및 시각적 세포 투과성은 모두 실질적으로 결정된다.
개선된 CPP의 세포 투과성을 결정하기 위해, r펩타이드를 또한 디자인하고 시험하였다. 펩타이드의 세포 투과성 및 결정 인자는 분명한 연관성이 있다. 이들 결정 인자 중에서, 가장 효과적인 세포 투과성 개선된 CPP가 12개의 아미노산 길이; A, V, L, I 및 P의 조성; 7' 또는 8' 중 어느 하나 및 말단(12')에 위치한 다수의 프롤린; 41.3 - 57.3 범위의 불안정성 지수; 187.5 - 220.0 범위의 지방족 지수; 및 2.2-2.6 범위의 소수성 지수(GRAVY)를 갖는 것으로 설정할 수 있다.
이러한 조사된 결정 인자는 결정 인자에 대해 설정한 범위에 속하며; 따라서, 이러한 결정 인자를 만족하는 개선된 CPP가 지난 20년 동안 보고된 레퍼런스 소수성 CPP와 비교하여 상대적으로 높은 세포 투과성 및 훨씬 더 높은 세포내 전달 잠재성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
많은 인간 질환이 기능 획득 또는 기능 손실과 같은 돌연변이를 유발하는 결핍 또는 과발현을 가진 폴리펩타이드에 의해 유발된다는 것이 명확해졌다. 만약 생물학적 활성 폴리펩타이드가 정량적 방식으로 비정상적인 폴리펩타이드를 짧은 시간내에, 아마도 1 또는 2시간 내에 대체하기 위해 전달될 수 있다면, 폴리펩타이드가 필요한 때와 방법에 따라 복용량이 조절될 수 있다. 신규 개선된 CPP의 용해도 및 수율을 현저히 향상시킴으로써, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 및 다른 화학적 화합물과 같은 치료 고분자를 살아있는 세포 뿐만 아니라 인간을 포함하는 살아있는 포유동물 내로 효과적으로 전달하는 제제로서 그의 실제적인 잠재성을 기대할 수 있다. 따라서, 신규 개선된 CPP의 집단을 이용하는 새롭게 개발된 세포투과 기술은 최적의 카고-개선된 CPP 관계를 결정한 후 세포내 폴리펩타이드를 이해하기 위해 폴리펩타이드 기반의 바이오치료제의 발견 및 개발을 위한 플랫폼 기술로서 사용될 수 있다.
2.1. BBB 투과체로써의 CPP
CPP가 세포막을 통과할 수 있어 이것이 뇌를 보호하는 혈액-뇌 장벽 (BBB)도 통과할 수 있는지 여부에 대한 관심이 많다. BBB는 혈액에서 뇌로 화합물이 유입되는 것을 방지하는 선택적 장벽이다. 그러나 신경계 질환의 치료에 있어서는 BBB 뒤에 있는 표적에 치료제를 수송하는 것이 필요하다. 뇌에 치료제를 전달하는 것은 CNS 약물 개발에 있어 중요한 과제이다. BBB를 우회하기 위한 많은 전략이 제안되었다.
혈액-뇌 장벽(BBB)은 뇌 약물 개발의 병목 현상을 나타내며 신경 치료제의 향후 성장을 제한하는 가장 중요한 요소이다. BBB는 대뇌 미세 혈관을 형성하고 뇌에서 혈액을 분리하는 내피 세포에 의해 형성된 선택적 반투과성 장벽이다. 약물을 중추 신경계 (CNS)로 전달하는 치료 전략은 BBB의 내피 세포 사이의 제한적인 긴밀한 접합에 의해 제한한다.
이상적인 약물 후보는 BBB를 쉽게 통과 할 수 있는 작고 친유성이며 소수성이며 조밀한 분자이다. 예를 들어, 펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 단일 클론 항체, RNA 간섭 (RNAi) 기반 약물 및> 98 %의 소분자 약물과 같은 큰 분자는 BBB를 통과하지 못한다. 일반적으로, 펩타이드는 수용체 매개 트랜스사이토시스 receptor-mediated transcytosis(RMT) 및/또는 흡착 매개 트랜스사이토시스 adsorptive-mediated transcytosis(AMT)를 포함하는 내 세포 메커니즘을 통해 BBB를 가로 지르며, 이 둘 모두는 활성 수송 메커니즘에 속한다. transcytosis 과정에서 형성된 소포는 분해 경로를 우회하여 세포를 순환합니다. 결국, 그들은 자신의 내용물을 parenchyma로 방출 (exocytosis)할 수 있습니다. 흡착 매개 트랜스사이토시스는 비특이적으로 간주되며 폴리펩타이드 수용체를 포함하지 않는 모든 소포 수송 메커니즘을 포함한다.
AMT에서 세포 내이 입은 종종 양전하를 띤 분자와 막 인지질의 상호 작용에 의해 촉진한다. 흡착 매개 transcytosis는 첫 번째가 불포화로 간주되고 AMT의 포화 농도가 RMT보다 높기 때문에 가장 높은 수송을 제공한다.
BBB를 우회하고 치료제를 뇌에 전달하기 위해 여러 CNS 전달 전략이 개발되었다. 그중 가장 유망한 접근 방식은 수용체 매개 수송 (RMT)이다. 수용체 매개 수송은 BBB를 통해 폴리펩타이드나 항체와 같은 큰 분자의 수송에 사용될 수 있다. 이 전략은 천연 리간드 또는 펩타이드의 일부이고 뇌 내피 세포의 수용체에 의해 명시적으로 인식되는 "벡터"와 바이오 치료제의 접합체에 기초한다. 수용체와 상호 작용한 후 접합체는 세포 내 이입을 통해 BBB를 통해 운반된다. 이러한 방식으로 바이오 치료제는 장벽 특성을 파괴하지 않고 내피를 통과하여 뇌로 들어갈 수 있다. 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, 저밀도-지질 폴리펩타이드 수용체 관련 폴리펩타이드, 저밀도 지질 폴리펩타이드 수용체 관련 폴리펩타이드, 디프테리아 독소 수용체와 같은 여러 RMT 수송 시스템이 있다.
BBB 전달을 위한 표적화 벡터로서 수용체를 필요로 하지 않는 BBB 셔틀 펩타이드를 설명하는 보고는 거의 없다. 세포 침투 펩타이드(CPP)와 BBB를 통한 수동 확산을 겪는 펩타이드는 뇌 선택성을 제공하지 않는다. 그러나 내재화 능력은 BBB 셔틀과 함께 미세 조정되거나 활용되어 화물을 뇌로 전달하는 능력을 향상시킬 수 있다. 여러 연구에서 빠른 대량 뇌 축적이 문서화되었지만 그중 일부만이 개선된 치료 효과를 보여 주었다. 세포를 관통하는 펩타이드는 화물 운반선 역할을 하며 의학 연구에서 현재 핫스팟을 구성하였다. 그들은 비침습적 방식으로 조직에 들어갈 수 있으며 에너지 의존적 세포 내 이입 및 에너지 독립적인 직접 침투와 같은 생리학적 메커니즘을 통해 거대 분자의 흡수를 가속화할 수 있다. 세포 침투 펩타이드는 합성 나노 구조로 다시 접히고 조립할 수 있어 비선택적이고 낮은 전달 효율 및 분해에 대한 감수성 감소로 인한 단점을 개선할 수 있다. 세포 침투 펩타이드를 화물 운반 플랫폼에 통합하여 코팅된 약물 흡수를 개선하고 자극 반응 메커니즘을 통해 방출 제어를 보장하는 새로운 약물 전달 시스템을 만들 수도 있다. 약물 전달에 CPP를 사용하면 약물이 BBB, 코 점막, 위장 점막 또는 피부와 같은 생리적 장벽을 통과할 가능성을 높여 폴리펩타이드 또는 핵산 기반 제제의 효능을 향상시킬 수 있다.
서로 다른 CPP가 BBB를 동일한 정도로 교차하는지 평가하기 위해 세포 침투 능력이 다른 5 가지 화학적으로 다양한 CPP의 BBB 수송에 대해, 생체 내 마우스 모델을 사용하여 BBB 유입 수송 속도, 모세 혈관 및 뇌 흡수 후 뇌내 지역 분포, 유출 특성을 조사하였다. SynB3, Tat 47-57 및 pVEC는 상대적으로 높은 (초기) 뇌 유입률을 보였고 TP10 및 TP10-2의 유입은 낮았다. CPP는 비 포화 유입 메커니즘을 사용하며 pVEC에 대해 입증된 바와 같이 BBB 투과성의 (일시적인) 증가를 일으키지 않는다. pVEC를 제외하고 모든 펩타이드는 뇌에서 상당한 유출을 보였으며, 부분적으로 SynB3 및 Tat 47-57의 2상 행동이 있었다. 그러나, BBB 수송 결과는 CPP가 BBB를 선택적으로 교차하므로 펩타이드의 세포 침투 특성이 BBB 침투 능력을 의미하지 않는다.
또한, 화학적으로 다양한 5 가지 CPP, 즉 pVEC, SynB3, Tat 47-57, transportan 10 (TP10) 및 TP10-2의 생체 내 BBB 수송 특성이 결정되었다. MTR (Multiple Time Regression) 분석 결과, CPP는 다양한 BBB 유입 특성을 보여주었다. Tat 47-57, SynB3, 특히 pVEC는 4.73 μl / (g × min), 5.63 μl / (g × min) 및 6.02 μl / (g × min)의 매우 높은 단방향 유입 속도를 나타냈다, 반면 transportan 유사체는 무시할 수 있는 낮은 뇌 유입을 보여 주었다. 유입된 펩타이드의 80%가 효과적으로 뇌 실질(Ventricular system)에 도달한 것으로 나타났다.
소분자 (<300 Da)의 전달을 위해 diketopiperazines, methylphenylalanines 및 phenylproline과 같은 짧은 2-4 아미노산 펩타이드가 개발되었다. TAT 펩타이드 (GRKKRRQRRRPQ)는 폴리펩타이드와 나노 입자의 뇌 전달을 위해 가장 잘 연구된 CPP이다. TAT 펩타이드 코팅된 나노 입자는 흡착 매개된 세포 내 이입에 의해 뇌 모세 혈관 내피 세포에 효율적으로 내재화된다는 것이 입증되었다. BBB 수송을 위한 가장 임상적으로 발전된 CPP 기술은 Angiochem Inc. (캐나다 몬트리올 소재)에서 개발한 Angiopep-2 펩타이드를 사용하는 것이다. 이 회사는 ANG1005 (Angiopep-2에 결합 된 파클리탁셀)로 임상을 진행하고 있다. ANG1005를 사용한 두 가지 임상 1상 연구가 이미 완료되었다(악성 신경 교종 환자를 대상으로 한 첫 번째 연구, 진행성 고형 종양 및 전이성 뇌암 환자를 대상으로 한 두 번째 연구). COG133으로 지정된
또 다른 전달 펩타이드는 ApoE의 아미노산 133-149에서 파생된 apoE 모방 펩타이드이다. 그것은 생체 외 및 생체 내에서 생물학적 활성을 유지하며, ApoE의이 영역은 저밀도 지폴리펩타이드 (LDL) 수용체와의 상호 작용에 중요하였다. TGN으로 지정된 펩타이드도 효율적으로 뇌로 운반되었다. 형광 cumarine 6이 장착된 TGN 펩타이드 장식 나노 입자는 뇌에 축적된 것으로 나타났으며, 이로 인해 나노 입자에 결합된 더 많은 수의 펩타이드로 축적이 증가하였다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여 BBB를 통해 효과적으로 이동할 수 있는 펩타이드를 개발하였다. 펩타이드 스크리닝을 위해 1 차 쥐 내피 세포를 사용하였다. 그 결과 가장 높은 발생 빈도를 가진 두 가지가 발견되었다 : VAARTGEIYVPW 및 GLHTSATNLYLH. 이들 펩타이드 서열의 BLAST 분석은 생리적 폴리펩타이드와 다양한 정도의 유사성을 나타냈다. 인테그린 알파-1 (VAARTGEIYVPW에 대한 72% 상동성) 및 유기 양이온 수송체 1 (GLHTSATNLYLH에 대한 60% 상동성)에 대한 서열 상동성을 확인하였다.
상기 체외 BBB 모델을 사용하여 펩타이드 투과성을 평가하였다. VAARTGEIYVPW 펩타이드의 경우 시간이 지남에 따라 증가하는 펩타이드의 양이 1.5 × 10-6 cm/s이고 GLHTSATNLYLH 펩타이드의 경우 각각 3.3 × 10-7 cm/s임을 확인하였다. 펩타이드는 대조군 펩타이드보다 2 배 더 효율적으로 시험 관내 BBB 모델을 통해 수송되었다. 투과성 실험 및 질량 분석 분석 결과 Pe 계수에 따라 VAARTGEIYVPW 펩타이드가 GLHTSATNLYLH보다 높은 효율로 BBB를 교차하는 것을 확인하였다.
VAARTGEIYVPW 펩타이드에 대해 얻은 투과성은 MiniAp4와 같은 다른 알려진 BBB 셔틀과 같은 크기로 6.7 × 10-6 cm/s (인간 일차 세포) 및 1.49 × 10-6 cm/s (소 일차 세포), 6.88 × 10-6 cm/s 값의 PhPro4 및 6.8 × 10-6 cm/s 값의 NMePhe4-병렬 인공막 투과성 분석 (PAMPA) 값이다. 그러나 이러한 연구에 사용된 다양한 1 차 세포 배양 모델 또는 무 세포 시스템으로 인해 펩타이드와 이러한 셔틀의 정확한 비교는 아직 결정되지 않았다.
확인된 펩타이드가 BBB를 통해 운반되는 메커니즘을 밝히기 위해, 일차 쥐 내피 세포와 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포주를 사용하여 내재화 분석을 수행하였는데, 결과는 두 펩타이드가 모두 일차 내피 세포에 의해 효과적으로 내재화되었으며 내피가 아닌 세포에 대한 내재화 또는 결합이 없음을 보여주었다. 이 분석을 위해 37℃와 4℃에서 펩타이드의 수송을 비교하였다. 저온은 세포 대사를 감소시켜 세포 내 이입을 늦추었다. 결과는 두 펩타이드 모두 세포 간 메커니즘에 의해 BBB를 통해 운반되었음을 나타냈었다.
또한, 실험실 쥐를 사용하여 순환 7-mer 파지 디스플레이 라이브러리 C7C에서 clone7 펩타이드의 생체 내 식별을 위해 생체 내 파지 디스플레이 접근 방식이 사용되었는데, 파지 제시 클론 7 펩타이드는 무작위 파지에 비해 랫트 뇌로의 전좌 효능이 약 50 배 더 높았다. 랫트에 비강으로 적용된 클론 7의 표시된 서열에서 파생된 11 개 아미노산 합성 펩타이드는 BBB를 우회하여 직접 뇌로 들어갔다.
이상과 같이 파지 디스플레이 기술을 사용하여 새로운 BBB 셔틀 펩타이드를 개발할 수 있다. 일차 내피 세포에 특이적으로 결합하고 BBB를 통과 할 수 있는 펩타이드를 확인하였다.
결론적으로, 체외 파지 디스플레이 접근법에 의해 두 개의 BBB 투과성 펩타이드를 확인하였다. 확인된 펩타이드는 내피 세포에 의해 내재화되고 BBB를 통과해서 이동하였다. 이러한 펩타이드가 치료제가 뇌에 침투하는 것을 개선하는 데 사용될 수 있다.
2.2. 고분자 약물 운반체로써의 CPP
세포내 운반 폴리펩타이드 투과를 위해 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)를 접합시키는 방안이 있으나, E3 ligase 세레블론은 폴리펩타이드 수준의 접합체가 추가될 경우, 그 접합위치에 따라 구조적 입체장애로 인해 세포 내에서 E3 ligase 복합체 형성에 실패할 수 있고, 원래 결합하던 약물이 결합되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 세포 투과성 펩타이드를 세레블론에 단순히 접합시킨다고 하여 온전히 세레블론의 기능을 발휘할 것인지 예상하기는 대단히 어렵다.
세포 투과성 펩타이드의 경우, 가장 많은 연구가 이루어진 세포 투과성 펩타이드는 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV1)에서 유래된 TAT 폴리펩타이드이다. 86개의 아미노산으로 구성된 TAT 폴리펩타이드 중 47-57번 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 세포 투과 기능이 있다는 사실이 알려져 있다. 비슷한 예로 HSV-1의 VP22 폴리펩타이드의 267번에서 300번째까지 아미노산과 초파리의 Antennapedia(Antp)의 339번 내지 355번째 아미노산, 인위적으로 합성한 양전하를 띄는 펩타이드 등이 세포 투과성 펩타이드로 기능한다는 사실이 알려져 있다. 이같은 사실을 바탕으로 세포 투과성 펩타이드에 폴리펩타이드 또는 핵산과 같은 카고 물질을 결합시켜 이들을 세포 내로 전달하는 연구들이 수행하고 있다.
한편, 30Kc19 폴리펩타이드는 누에(Bombyx mori)의 혈림프에서 유래한 약 28kDa 크기의 폴리펩타이드로서, 항-아폽토시스 활성, 폴리펩타이드 안정화 또는 용해도 향상 기능 등을 갖고 있어 여러 연구에 적용되어 왔다. 대한민국 공개특허 10-2011-0003889는 세포 투과성 펩타이드로서 30Kc19 폴리펩타이드의 세포 투과성 펩타이드 기능을 개시한다. 대한민국 등록 특허 제10-1626343호는 30Kc19 폴리펩타이드의 α-나선 도메인(30Kc19α)의 세포 투과성 기능을 개시한다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 몇 가지 캐리어(carrier) 매개 전달 시스템이 개발되었다. 소수성 CPP의 사용은 다양한 펩타이드 서열 변형을 포함하는 몇 가지 이점이 있다. 이것은 상이한 세포서브도메인에 들어갈 수 있고/있거나 다양한 유형의 카고(cargo) 분자를 이동시킬 수 있는 캐리어의 조작을 가능하게 한다. 원칙적으로, 폴리펩타이드 기반의 치료제는 불안정 상태(non-steady state) 조건하에 살아있는 세포에서 생화학적 과정을 제어하고 종래 소분자 치료제보다 적은 오프타겟 효과를 갖는 방법을 제공한다.
동물에서 전신 폴리펩타이드 전달은 불량한 조직 투과 및 빠른 제거(clearance)로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 세포내 고분자 전달은 포유동물 세포에 의한 폴리펩타이드 및 다른 고분자의 투과를 향상시키는 특정 염기성, 양친매성, 및 소수성 펩타이드 서열과 같은 다양한 CPP의 능력을 이용한다. 세포내 고분자 전달이 널리 사용되어 왔음에도 불구하고, 동물에서 폴리펩타이드의 전신 전달은 내재화된 폴리펩타이드의 비효율적인 세포질 전달 및 불량한 조직 투과로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 이 문제는 양이온성 폴리펩타이드 전달 도메인(PTD, 예컨대 HIV Tat, Hph-1, 안테나피디아(antennapedia), 폴리아르기닌, 등)의 경우 특히 사실이고, 폴리펩타이드 흡수의 주요 기전인 흡착성 세포내 함입(absorptive endocytosis) 및 고분자음세포 작용(macropinocytosis)이 상당량의 폴리펩타이드를 막 결합된 구획 및 엔도솜 구획 내로 격리시켜 폴리펩타이드 생체이용률을 제한한다. 친수성, 염기성 및 소수성 아미노산과 같은 혼합된 유형의 서열들을 함유하는 키메라 CPP는 독성이 있는 것으로 밝혀졌고, 따라서, 이러한 유형의 CPP는 그 사용이 제한되었다.
종래에, 소수성 CPP(MTS/MTM) 또는 고분자 전달 도메인이 보고되었다. 그러나, 이러한 레퍼런스 소수성 CPP 서열을 이용하여 세포 투과성 치료용 폴리펩타이드를 개발하기 위한 많은 노력들은 생리학적 버퍼 조건에서 재조합 폴리펩타이드의 불량한 용해도 및 추가 임상 개발 및 적용을 위한 상대적으로 낮은 세포 투과성에 의해 좌절되었다. 폴리펩타이드 카고의 소수성 CPP 의존적 흡수가 폴리펩타이드 기반의 바이오치료제를 개발하기 위한 강력한 방법이라는 합의가 있었음에도 불구하고, 재조합 CPP 융합된 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 응집, 낮은 용해도/수율, 및 불량한 세포/조직 투과성과 같은 비카고(non-cargo) 특이적 인자에 의해 영향을 받는 중요한 문제들을 해결하기 위해 추가적인 향상이 요구된다. 이들 CPP는 비공통 서열 및 서열의 비상동 구조를 갖는다.
섬유아세포 성장인자 4(FGF4)의 소수성 신호 펩타이드로부터 유래된 막 전좌 서열(MTS) 또는 막 전좌 모티프(MTM)와 같은 서열이 더 성공적인 것으로 보고되었다. MTS/MTM은 동물에서 전신(특히 간, 폐, 췌장 및 림프양 조직)으로 생물학적 활성 펩타이드 및 폴리펩타이드를 전달하는데 사용되어 왔으며, 치명적인 염증 질환 및 폐 전이를 극적으로 예방한다.
개선된 CPP 서열의 세포 투과 능력을 촉진하는 이들 결정 인자를 분석, 확인, 및 결정할 수 있다. 이들 개선된 CPP 서열은 종래 공개된 소수성 CPP의 심층 분석으로부터 결정된 결정 인자에 기초하여 인공적으로 조립할 수 있다.
개선된 CPP 서열을 생물학적 활성 카고 분자에 융합함으로써 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작할 수 있다.
또한 개선된 CPP가 생물학적 활성 카고 분자에 부착된 세포 투과성 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 분자를 세포에 전달하기 위한 그의 치료 적용할 수 있다.
생물학적 활성 고분자에 융합된 개선된 CPP 서열로 구성된 세포 투과성 재조합 폴리펩타이드의 작제물로서 생물학적 활성 고분자가 살아있는 세포 내로 들어갈 수 있다.
분자 전달, 약물 전달, 폴리펩타이드 요법, 세포내 폴리펩타이드 요법, 폴리펩타이드 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등을 위한 개선된 CPP 서열의 효율적 사용할 수도 있다.
개선된 CPP 서열은 세포의 원형질 막을 통한 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 도메인, 또는 전장 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 활성 고분자의 전달을 매개할 수 있는 최초의 인공적으로 개발된 세포 투과성 폴리펩타이드이다.
3. 펩타이드 리간드
펩타이드 리간드에 의해 활성화되는 세포 수용체(표 1)는 POI 표적 운반에 주요 관심사이다. 이들 수용체는 두 가지 주요 기준을 충족해야 한다. 첫째, 수용체는 정상 세포와 비교하여 표적세포에서 독특하거나 고도로 과발현되어야 한다. 일반적으로 3:1 이상의 표적 대 정상 세포 발현 비율이 바람직하다. 둘째, 표적세포에 대한 표적 수용체의 총 발현 수준은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 적절한 양의 POI의 세포 전달을 보장할 수 있을 만큼 충분히 높아야 한다. 많은 펩타이드 결합 수용체는 이러한 특징을 가지고 있으며, 따라서 이들의 활성화 펩타이드 리간드는 POI 접합체에 사용하기 위한 유망한 선택 리간드이다.
또한, 펩타이드 결합 수용체의 표적화는 화학적으로 설계된 소분자 결합제, 항체의 절편 또는 항체로도 달성 할 수 있다. 그런 다음 수용체 결합 분자에 공유 결합된 POI로 구성된 모듈형 접합체 시스템을 엔지니어링하여 직접 약물 전달이 가능하다. 최적으로 후자는 약물의 선택적 세포 내 전달을 위해 표적세포의 침투를 보장해야 한다. 많은 경우에 스마트 링커가 POI와 표적 단위 사이에 추가로 적용되어 표적 세포 내부에서 POI의 제어 방출을 촉진한다.
펩타이드 결합 수용체의 예시
Targeted receptors Peptide ligand Tumor expression
Integrin αvβ3 c(RGDfK) Glioblastoma, melanoma, breast, prostate cancer
EGFR GE11
YHWYGYTPQNVI		 Glioblastoma, lung, head and neck cancer
SSTR2 Octreotide
fc[CFwKTC]T(ol)		 NETs, breast, ovarian, cervical cancer
GnRHR [dLys]GnRHI
pGluHWSYkLRPGNH2 		Ovarian, breast, endometrial, prostate, lung cancer
Bn receptors [dTyr6, βAla11, Phe13, Nle14]Bn(614)yQWAVβAlaHFNleNH2 Prostate, breast, small cell lung, pancreatic cancer
VIP receptors VIP
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNNH2 		Endocrine tumors, colon, breast cancer
NTSR1 NT(813)
RRPYIL		 Breast, colon, pancreatic, lung, prostate cancer
CCK2R Minigastrin 11
eAYGWMDFNH2 		Gastrointestinal, thyroid, lung, pancreas, liver cancer
MC1R NAPamide
AcNleDHfRWGKNH2 		Melanoma
hY1R [F7,P34]NPY
YPSKPDFPGEDAPAEDLARYYSALRHYINLITRPRYNH2 		Breast cancer, Ewing sarcoma
4. 면역글로불린의 Fc
POI 또는 이의 기능적 변이체와 융합되는 면역글로불린의 Fc는 상기 POI 또는 이의 기능적 변이체의 안정성을 증진시키는 역할을 하는 것으로, 예컨대, 반감기 (eg, 체내 반감기)를 연장, 및/또는 renal filtration 감소 등의 효과를 갖는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1의 Fc 및 IgG4의 Fc 중에
서 선택된 것일 수 있다. 상기 IgG1의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG1의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다. IgG4의 Fc 영역은 IgG4의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG4의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는것일 수 있다.
IgG1는 인간 등의 영장류 또는 마우스, 래트 등의 설치류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 IgG1(UniProtKB P01857) 일 수 있다. IgG4는 인간 등의 영장류 또는 마우스, 래트 등의 설치류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 IgG4 (UniprotKB P01861) 일 수 있다.
상기 IgG1의 Fc 영역은 IgG1의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG1의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다. IgG4의 Fc 영역은 IgG4의 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2+CH3 도메인을 포함하고, N-말단에 IgG4의 힌지 영역을 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 구체예에서, IgG1의 Fc는 인간 IgG1의 CH2 도메인과 CH3도메인을 포함하는 폴리펩타이드 (서열번호 3), 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단에 인간 IgG1의 힌지 영역 (서열번호 4)을 추가로 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바로서, IgG1의 Fc 영역은 IgG1의 Fc의 고유 활성 및 구조를 유지하는 범위에서 'IgG1의 Fc 영역'의 아미노산 서열과 80% 이상, 85%
이상, 90 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
IgG4의 Fc 는 인간 IgG4의 CH2 도메인과 CH3도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 아미노산 서열의 N-말단에 인간 IgG4의 힌지 영역을 추가로 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바로서, IgG4의 Fc 영역은 IgG4의 Fc의 고유 활성 및 구조를 유지하는 범위에서 상기 아미노산 서열 (또는 하기 설명되는 IgG4의 변이형 Fc의 아미노산 서열)과 80% 이상, 85% 이상, 90 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
면역글로불린의 Fc 영역이 이의 N-말단 또는C-말단에 연결된 단백질의 (체내) 반감기를 연장시킬 목적으로 사용되는 경우, 면역글로불린 Fc 영역에 의한 부작용을 줄이기 위하여, Fc가 갖는 임의의 효과기(effector) 기능을 최소화시키는 것이 중요하다. 이러한 측면에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 다른 IgG 서브-타입과 비교하여 FcγR과 보체 인자와의 결합력이 낮아서 유리하다. 이에 추가하여, 인간 IgG4 Fc 영역은 아미노산 치환을 포함함으로써 효과기 기능이 보다 감소된 것일 수 있다. 상기 효과기 기능을 감소시키기 위한 인간 IgG4 Fc 영역의 아미노산 치환은 인간 IgG4(UniprotKB P01861)의 234번째 잔기인 페닐알라닌의 알라닌으로의 치환 및 235번째 잔기 류신의 알라닌으로의 치환 (IgG4 Fc의 CH2-CH3 도메인 부위에 포함됨; 상기 아미노산 잔기 번호는 EU 번호매김에 따름 [Kabat, EA 등(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, US Dept of Health
and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication no 91-3242]) 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 추가로, 상기 IgG4의 Fc 영역은 중쇄 이합체 형성을 안정화하고 반(half)-IgG4 Fc 쇄의 형성을 방지하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 인간IgG4(UniprotKB P01861)의 Fc 영역의 228번째 아미노산 잔기
세린 (EU 번호 매김에 따름; 힌지 영역에 포함됨)의 프롤린으로의 치환을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 면역원성(Immunogenicity)을 감소시키기 위하여, Fc 영역은 상기한 변이 이외의 변이를 포함하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc의 CH2-CH3 도메인;야생형, 또는 변이형을 포함하거나, 상기 CH2-CH3 도메인의 N 말단에 인간 IgG4의 힌지 영역; 야생형, 또는 변이형을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
5. 관심 단백질(POI) 및 p-PROTAC
본 발명은 관심 폴리펩타이드(POI)을 체내 세포에서 합성되고, 체액으로 분비되고 세포막을 투과하여 생물학적 기능을 유지하도록 하는 전략으로 분비 신호 펩타이드, 세포 투과 펩타이드 및 생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 체내 세포에서 합성되도록 하는 mRNA 발현 카세트 및 이의 용도를 제공하고자한다.
본 발명에서 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드는 E3 ligase, peptide-PROTAC(proteolysis targeting chimera) 및 p-AUTOTAC(Peptide-Autophagy-targeting chimera)을 포함하는 융합단백질, p62, 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 제공하도록 한다.
일 실시례로, 본 발명에서 표적 폴리펩타이드(Target Polypeptide, Tp)를 녹다운시키는 전략을 제시하고자하는데, 이에 따라 POI는 표적 폴리펩타이드를 분해하여 녹다운시키는 E3 ligase, p-AUTOTAC 또는 p-PROTAC이며, 구체적으로 이를 체내에서 합성하는 전략으로 E3 ligase, p-AUTOTAC 또는 p-PROTAC mRNA 발현카세트를 제시한다.
생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드는 E3 ligase 또는 표적 폴리펩타이드 결합 모티프와 프로테아좀 결합 모티프를 포함하는 p-PROTAC 또는 표적 폴리펩타이드 결합 모티프와 p62 결합 모티프를 포함하는 p-AUTOTAC이고, 세포 투과성 펩타이드(CPP) 또는 세포표면 수용체의 결합 펩타이드, 분비 신호펩타이드를 N-말단에 배치하여 키메라 폴리펩타이드를 설계하였다. 이어서, 이를 역번역(reverse-translation)하여 이를 코딩하는 RNA를 설계하였다. 설계된 RNA를 mRNA 발현카세트에 재조합하여 E3 ligase p-AUTOTAC 또는 pPROTAC mRNA 발현카세트를 완성한다.
본 발명의 pPROTAC mRNA 발현카세트는 POI의 체내 세포에서 발현할 수 있도록 하는 염기서열 및 변형을 포함하고 있으며, pPROTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 분비 신호 펩타이드는 체액으로 분비, CPP는 POI의 세포투과를 용이하게 하여 pPROTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 p-PROTAC이 표적 폴리펩타이드에 결합하도록 하며, 마지막으로, proteasome-targeting 모티프는 표적 폴리펩타이드의 분해를 하도록 하여 궁극으로 표적 폴리펩타이드를 효율적으로 분해하는 전략이다.
5.1. p-PROTAC의 설계 및 합성
PROTAC은 일반적으로 표적 폴리펩타이드의 후속 분해를 유도하기 위해 표적 폴리펩타이드와 E3 리가아제 사이의 다리 역할을 하는 이중 기능성 분자로 간주된다. p-PROTAC은 펩타이드 기반 표적 폴리펩타이드 결합 성분, 화학적 링커 및 E3 유비퀴틴 리가아제에 대한 결합 성분으로 구성된다. 이 부분에서 주로 p-PROTAC의 합성 전략, 후속 펩타이드의 최적화, 그리고 p-PROTAC의 후속 사용을 위한 이론적 기반을 제공하는 세 가지 구성 요소에 대한 설계 원칙을 요약하였다.
임의의 구현예에서, 키메라 펩타이드는 다음의 일반적인 구조를 갖는다.
TpBM-L-UBM
특정 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 다음의 일반적인 구조 (A)를 갖는다.
TpBM-L-VBM (A)
특정 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 다음의 일반적인 구조 (B)를 갖는다.
TpBM-L-CBM (B)
여기에서, TpBM은 표적 폴리펩타이드 결합 모티프(Target Polypeptide binding motif, TpBM)를 나타내고, UBM(Ubiquitin ligase binding motif)은 VBM(VHL 리가아제-결합 모티프) 및 CBM(세레블론 리가아제-결합 모티프)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 E3 유비퀴틴 리가아제 결합 모티프를 나타내고, 모티프는 연결기, 예를 들어, 결합부 또는 펩타이드 연결 모티프를 나타낸다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 폴리펩타이드는 각각의 기능적 펩타이드의 수 및 위치가 목적하는 대로 변경될 수 있도록 합성될 수 있다.
특정 실시예에서, 구조체 (A)의 TpBM은 타우뿐만 아니라 VHL E3 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 리간드이다.
특정 실시예에서, 구조체 (B)의 TpBM은 타우뿐만 아니라 CLM E3 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 리간드이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 기술된 키메라 폴리펩타이드은 다수의 UBM, 다수의 TpBM, 다수의 펩타이드 연결기 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명에 기술된 바와 같은 유효량의 mRNA 발현카세트 또는 이의 염 형태, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
p-PROTAC의 설계
Tp 및 E3 리가제를 표적으로 하는 결합 펩타이드 설계
Tp 및 E3 리가제를 표적으로 하는 펩타이드의 적절한 선택은 유비퀴틴화 효율에 영향을 미치는 Tp 및 E3 리가제의 결합 친화도 및 공간 방향에 상당한 영향을 미친다. 결합 펩타이드의 획득은 데이터베이스 및 가상 스크리닝에 의존하는 소분자와 같은 지루한 시행착오 과정이 아니다.
일반적으로 Tp와 결합 펩타이드의 핵심 폴리펩타이드-폴리펩타이드 상호 작용 (PPI) 모티프를 나타내는 내인성 복합체의 결정 구조를 기반으로, Tp에 선택적으로 결합하는 모티프를 설계할 수 있다. 그런 다음 얻은 폴리펩타이드 에피토프 모방체 서열을 Tp 결합 모티프의 주요 후보로 사용할 수 있다. 폴리펩타이드 에피토프 모방체의 효능을 극대화하기 위해 중요하지 않은 상호 작용 잔기의 점 돌연변이를 추가로 사용하여 Tp를 표적으로 하는 펩타이드를 특정 Tp에 대한 높은 친화력으로 최적화할 수 있다.
예를 들어, 화학적 에피토프 타겟팅 전략을 사용하여 ERα와 함께 coactivator 도메인의 결합 나선을 모방하는 펩타이드 서열이 ER 길항제 역할을 할 수 있다고 제안하였다. 짧은 펩타이드에서 Tp 에피토프 모방체의 α- 나선 구조와 특이성을 유지하기 위해, 그들은 펜타 펩타이드 모티프를 제안하고, ER- 공동 활성화제 상호 작용을 조절하여 ER에 단단하고 선택적으로 결합하는 선택적 억제제로 일련의 나선 안정화 고리형 펩타이드를 개발하였다. 이러한 펩티도미 메틱 에스트로겐 수용체 조절제 (PERM)를 기초한 N- 말단 아스파르트산 가교 전략 (말단 아스파르트 산, TD)을 사용하여 우수한 세포 투과성을 갖는 보다 안정화된 펩타이드 조절제 (TD-PERM)를 설계하였다. 그런 다음 TD-PERM을 VHL (Von Hippel-Lindau) E3 리가아제의 모집 펩타이드와 접합하여 TD-PERM에 비해 생물학적 활성이 향상된 p-PROTAC 분자를 제조하였다.
또한, 파지 디스플레이 및 효모 디스플레이 기술을 사용하여 Tp에 대한 높은 친화성을 갖는 결합 펩타이드를 개발할 수 있다. 이러한 기술은 여러 라운드의 바이오 패닝 후 가장 높은 빈도의 클론을 가진 결합 펩타이드를 얻기 위한 대체 도구를 제공한다. 더 중요한 것은 이러한 기술이 폴리펩타이드 결정 복합체와 무관하며 D-구성 결합 펩타이드는 생체 내 폴리펩타이드 분해 효소에 의한 L-결합 펩타이드의 쉬운 분해를 피할 수 있는 미러 이미지 파지 디스플레이를 통해 얻을 수 있다. 펩타이드 파지 디스플레이 기술이 p-PROTAC에 대한 결합 펩타이드를 설계하는 미래의 트렌드가 될 수 있을 것으로 기대한다.
E3 ubiquitin ligase-recruiting 리간드
유비퀴틴화 태그는 Tp의 분해를 촉진하기 위해 p-PROTAC에 의해 모집된 프로테아좀에 의한 분해를 유도하므로, 복합체 성분을 합리적으로 선택하고 설계하는 것이 매우 중요하다. PROTAC 약물 개발에 엄청난 이론적 가능성을 제공하는 특정 degron 인식 모티프를 가진 인체에는 많은 E3 *?**?*유비퀴틴 리가제가 있다. 그러나 Von Hippel-Lindau (VHL), Cereblon (CRBN), IAP, Keap1, RNF4, RNF114 및 MDM2를 포함한 E3 리가아제의 1 % 미만만이 생체 내에서 PROTAC에 의해 사용될 수 있다. 지금까지 보고된 대부분의 PROTAC는 특이적 및 고친화성 리간드의 존재로 인해 VHL 또는 CRBN을 E3 리가아제로 선택하였다.
처음 보고된 PROTAC 전략에서 E3 유비퀴틴 리가제 복합체에서 Skp1-Cullin-F boxβ-TRCP (SCFβ-TRCP)의 모집을 조절하는 IκBα 내의 포스포 펩타이드 (DRHDSGLDSM)가 유비퀴틴화를 유도하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 알았다. 종양 부위에서 저산소증 유발인자-1α (HIF-1α)는 VHL 매개 유비퀴틴화를 통해 분해 될 수 있다. 따라서 HIF-1α의 최소 인식 서열 (ALAPYIP)은 생체 내에서 HIF-1α의 분해를 유도하기 위한 E3 유비퀴틴 리가제 복합체 리간드로 선택되었다. 그 후, HIF-1α octapeptide 및 기타 5개 아미노산 (LAP(OH)YI)을 포함한 일련의 펩타이드가 VHL 모집을 위해 더욱 최적화되었다. 지금까지 VHL에 대한 E3 유비퀴틴 리가아제 모집 리간드는 p-PROTAC 설계에 널리 적용하고 있다.
편리하고 쉬운 합성으로 인해 E3 ubiquitin ligase-recruiting 기능을 가진 일련의 작은 분자를 표적 탄두와 결합하여 p-PROTAC을 형성 할 수도 있다. 예를 들어, 세 가지 아민 약물 (탈리도마이드, 레날리도 마이드 및 포말리도 마이드)이 CRBN 리간드로 확인되었다.
연결 모이어티 선택
연결 모이어티는 3차원 복합체의 안정성 및 후속 기능에 중요한 영향을 미친다. 친화도와 공간 효과 사이의 섬세한 균형을 유지하려면 연결 모이어티가 적절한 입체 화학적 구조를 가져야 하며 결합 펩타이드를 E3 유비퀴틴 리가제 모집 리간드와 연결하는 데 적합한 용매 노출 위치를 제공해야한다. 지금까지 아미노산은 아미노 헥사노산 (Ahx), 글리신 및 세린을 포함하여 p-PROTAC에서 일반적으로 사용되는 연결 모이어티이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 p-PROTAC의 친수성을 개선하기 위해 정기적으로 사용되는 또 다른 연결 모이어티이다. 예를 들어, ER을 표적으로 하는 VHL 모집 PROTAC은 E3 인식 모이어티와 탄두 사이의 원자 사슬 길이로 최적의 효율성을 보여주었다. 흥미롭게도 이 PROTAC은 별도의 연구에서 링커 및 연결 모드의 변경으로 인해 ER에 대한 향상된 효율성과 친화성을 나타냈었다. 유사하게, FAK를 표적으로 하는 일련의 VHL-모집 PROTAC은 연결 모이어티의 상이한 길이 및 구성으로 인해 상이한 POI 분해 가능성을 나타내었다.
본 발명은 유비퀴틴화 및 후속적인 분해를 위해 E3 유비퀴틴 리가아제에 내인성 폴리펩타이드를 도입시키는 기능을 갖는 키메라 펩타이드, 이를 포함하는 조성물을 포함하는 키메라 펩타이드, 및 이를 사용하는 방법을 기술한다.
본 발명에서 설계된 키메라 폴리펩타이드는 역번역(reverse-translation)하여 이들은 코딩하는 RNA로 설계할 수 있다. 본 발명의 키메라 폴리펩타이드를 체내 합성을 하는 대상 개체에 있는 코돈의 선호도(codon usage) 및 G/C 변형 등을 고려하여 디자인해야 한다.
특히, 본 발명은 키메라 또는 폴리펩타이드 분해 표적화 키메라(PROTAC) 펩타이드를 제공하며, 타우 폴리펩타이드 응집체의 표적화된 유비퀴틴화 및 분해의 조절제로서의 유용성을 발견한다. 또한, 본 발명은 타우병증과 같은 타우 폴리펩타이드의 축적이나 응집으로 인한 질환 상태의 치료 또는 완화를 위해 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 질환 또는 장애는 신경계 또는 신경 퇴행성 장애를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 유비퀴틴화 및 분해를 위한 내인성 폴리펩타이드, 예를 들어, 타우를 E3 유비퀴틴 리가아제에 도입시키는 기능을 하는 펩타이드를 제공한다.
치료 조성물은 환자 또는 대상물, 예를 들어 인간과 같은 동물의 폴리펩타이드 분해를 조절하고, 분해된 폴리펩타이드를 통해 조절되는 질환 또는 질환 상태를 치료 또는 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명에 기술된 치료 조성물은 질환, 예를 들어, 신경 세포 질환의 치료 또는 완화를 위한 목적 폴리펩타이드의 분해를 유도하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포 내 표적 폴리펩타이드를 유비퀴틴화/분해하는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 방법은 연결 잔기를 통해 연결될 수 있는 ULM 및 PTM을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트를 제조하고 투여하는 단계를 포함하고, ULM은 PTM에 결합되되, ULM은 유비퀴틴 경로 폴리펩타이드, 예컨대, E3 유비퀴틴 리가아제, 보다 바람직하게는 VLM 및 CLM과 같은 유비퀴틴 리가아제를 인식하고, PTM은 표적 폴리펩타이드(TBM)을 인식하여, 표적 폴리펩타이드(예를 들어, 타우)이 유비퀴틴 리가아제의 인근에 위치할 경우 표적 폴리펩타이드의 분해가 일어나 표적 폴리펩타이드의 분해, 그 효과의 억제 및 폴리펩타이드 레벨의 조절을 야기한다.
다른 양태에서, 표적 폴리펩타이드는 타우이다. 본 발명은 폴리펩타이드 레벨의 조절을 통해, 즉, 환자의 세포 내에서 폴리펩타이드 레벨(예를 들어, 타우 폴리펩타이드)을 분해를 통해 낮춤으로써, 질병 또는 질병 상태의 치료를 제공한다.
특히, PTM은 타우 폴리펩타이드(TBM)에 결합하는 분자이고, ULM은 VHL E3 유비퀴틴 리가아제 및/또는 CLM E3 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 분자로서, 다음과 같은 일반적인 구조를 갖는다:
5.2. 약물로써의 p-PROTAC
대부분의 소분자 약물은 밀착되고 윤곽이 분명한 포켓 내에서 효소 또는 수용체를 결합시킨다. 반면, 폴리펩타이드-폴리펩타이드 상호작용은 큰 접촉면 및 얕은 홈 또는 이와 관련된 평면형 계면으로 인해 소분자를 사용하여 표적화하기에는 매우 어렵다. E3 유비퀴틴 리가제(수백 개가 인체에 알려져 있음)는 유비퀴틴화에 대한 기질 특이성을 부여하며, 특정 폴리펩타이드 기질에 대한 특이성으로 인해 일반적인 프로테아좀 억제제보다 더 각광받는 치료 표적이다. E3 리가제의 리간드의 개발은, 부분적으로 폴리펩타이드-폴리펩타이드 상호작용을 파괴해야 한다는 사실 때문에, 어려운 것으로 입증되었다. 그러나, 최근의 개발은 이들 리간드에 결합하는 특정 리간드를 제공하였다. 예를 들어, 최초의 소분자 E3 리가제 억제제인 뉴트린(nutlin)의 발견 이후, E3 리가제를 표적으로 하는 추가적인 화합물이 보고되었지만, 그 분야는 아직 미개발 상태로 남아있다.
흥미로운 치료 잠재력을 갖는 하나의 E3 리가제는 E3 리가제 복합체 VCB의 기질 인식 서브유닛인 폰 히펠린도우(VHL, von Hippel-Lindau) 종양 억제제이며, 이는 또한 엘론긴(eleongin) B 및 C, Cul2 및 Rbx1으로 구성된다. VHL의 주요 기질은, 전구 혈관 형성 성장 인자(VEGF) 및 적혈구와 같은 유전자를 상향 조절하여, 저산소 레벨에 반응하여 이토카인 에리스로포이에틴(cytokine erythropoietin)을 유도하는 전사 인자인, 저산소증 유도성 인자 1a(HIF-1α) 이다. E3 리가아제의 기질 인식 서브유닛에 대한 폰 히펠 라도우(VHL)의 제1 소분자 리간드가 생성되었고, 그 화합물이 VHL의 주요 기질인 전사 인자 HIF-1α의 결합 모드를 모방한다는 것을 확인하는 결정 구조를 얻었다.
세레블론은 인체 내에서 CRBN 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드이다. CRBN 오르소로그는 주로 식물로부터 인체내로 보존되며, 이는 CRBN 오르소로그의 생리학적 중요성을 강조한다. 세레블론은 손상된 DNA 결합 폴리펩타이드1(DDB1), 쿨린(cullin)-4A(CUL4A), 및 쿨린 1의 조절체(ROC1)와 함께 E3 유비퀴틴 리가제 복합체를 형성한다. 이 복합체는 다수의 다른 폴리펩타이드를 유비퀴틴화한다. 완전히 규명되지 않은 기구를 통해, 표적 폴리펩타이드의 세레블론 유비퀴틴화는 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 및 섬유아세포 성장 인자 10(FGF10)의 레벨을 증가시킨다. FGF8은 결국 사지 및 청각적 소포 형성과 같은 다수의 발달 과정을 조절한다. 최종적인 결과는 이 유비퀴틴 리가아제 복합체가 배아에서의 사지 성장에 중요하다는 것이다. 세레블론의 부재 시, DDB1은 DNA 손상 결합 폴리펩타이드로서 기능하는 DDB2와 복합체를 형성한다.
오늘날 전 세계적으로 고령화 인구가 계속 증가함에 따라 신경 장애가 지속적으로 증가하여 전 세계 사망의 12%를 차지하고 있습니다. 이러한 질환 중 알츠하이머 병은 6번째 주요 사망 원인으로 전 세계 거의 4천 4백만 명의 사람들에게 영향을 미친다. 그러나 과학계의 엄청난 노력에도 불구하고 현재 이용 가능한 치료법은 병리학적 증상의 완화에 불과하며 이러한 질병의 실제 원인에 대한 치료는 아니다.
타우는 중추 신경계의 다른 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되지만, 타우 폴리펩타이드는 중추 세포에서 주로 발견되는 중추 신경계에서 풍부한 폴리펩타이드이다. 건강한 신경 세포에서, 타우는 미세소관(microtubules)에 결합하고 미세소관 안정성을 조절하며, 이는 축삭 성장 및 신경 가소성에 중요하다. 병리학적으로 변형될 경우, 타우 분자는 미세소관을 안정화할 수 없으며, 불용성 응집체를 형성하기 쉽다. 타우 폴리펩타이드가 세포 내에서 불용성 응집체를 형성하면, 세포 기능 부전이 발생하며, 축삭수송이 이루어지고, 신경세포 손실이 일어난다. 신경 세포에서의 비정상적인 타우 응집체의 축적은 알츠하이머병을 포함하는 다발성 신경 퇴행성 장애에서 중요한 병리학적 특징이다. 특정 병리학적 조건에서, 타우 응집은 쌍나선형 필라멘트(paired-helical filament, PHF), 직선형 필라멘트(straight filament, SF) 및/또는 신경섬유성 접선(neurofibrillary tangles, NFT)을 초래한다. 신경 세포에서의 PHF 및 NFT의 축적은 미세소관 기능 장애 및 신경부 퇴화와 직접적으로 상관관계가 있다. 타우 PHF, SF 및/또는 NFT를 함유하는 신경 세포는 비정상적인 폴리펩타이드 응집체의 세포를 시도하고 제거하기 위한 다양한 세포 기구를 활성화시킨다.
최근 연구는, 큰 불용성 필라멘트들 대신에, 가용성 타우 올리고머가 PHF- 또는 NHT-유도 신경 독성의 발생 이전에 질환의 발병 및 진행에 대해 보다 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한다. 타우의 올리고머 종은 천연 타우의 응집을 위한 시드로서 작용하여, 신경 독성 타우 응집을 촉진한다. 축적된 증거는 타우 응집체가 프리온형 방식으로 전파됨으로써 하나의 세포에서 다른 세포로 전달될 수 있음을 제안하고 있다.
타우의 변형과 기능 장애 및 광범위한 신경 세포 손실은 현재 총괄적으로 타우병증(tauopathy)으로 지칭되는 여러 신경 퇴행성 질환과 연관되어 왔다.
"타우병증"이라는 용어는, 본원에서 인간 뇌의 신경 섬유성 또는 글리오 섬유성 접목에서 타우 폴리펩타이드의 병리학적 응집과 연관된 신경 퇴행성 질환의 부류를 지칭한다. 타우병증의 예로는 AD, 다운증후군, 전두엽 소엽성 치매(FTLD), 피질 기저 퇴행(CBD) 및 진행성 핵상 마비(PSP)가 포함되나 이에 국한되지 않는다.
다수의 신경 퇴행성 질환에서의 병리학적 중요성으로 인해, 타우는 중요한 치료 목표이다. 타우 응집을 예방하는 것은 타우와 관련된 신경 퇴행성 장애를 치료하기 위한 잠재적인 방법이 된다. 지금까지, 타우 응집의 분자 기구를 식별하고 신경 퇴행의 진행을 중단시키는 치료제를 찾기 위한 많은 노력이 이루어졌다.
유망한 임상 전 데이터를 나타내는 타우 응집 억제제는 다양한 타우병증의 치료를 위한 최근의 임상 시험에서 비효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 타우병증과 같은 신경 퇴행성 장애에서 타우의 응집과 관련된 질환 및 상태의 효과적인 치료에 대한 필요성이 당 업계에 존재한다.
6. 코-뇌 (Nose-to-Brain) 약물 전달
과학계의 엄청난 노력에도 불구하고 현재 이용 가능한 알츠하이머 병 치료법은 병리학적 증상의 완화에 불과하며 이러한 질병의 실제 원인에 대한 치료는 아니다. 파괴적인 대안으로서, RNA 간섭 (RNAi) 기반 치료제의 사용은 이러한 쇠약 장애의 치료에 혁명을 일으킬 가능성이 크다. 그러나 치료용 RNA 분자를 뇌에 전달하는 것은 불안정성, 표적을 벗어난 효과의 위험, 면역원성 및 생물학적 막을 통한 투과성 불량으로 인해 특히 어려운 것으로 입증되었다. 또한 중추 신경계 (CNS)는 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 단단히 보호되며, 이는 CNS 로의 RNA 전달에 주요 장애가 됩니다. 이 전달 문제는 시장 또는 신경학적 적응증에 대한 고급 임상 단계에서 제한된 수의 RNA 기반 제형을 설명하였다 (예 : nusinersen (Spinraza), ATL1102, IONIS-SOD1Rx, IONIS-HTTRx).
대안으로, 직접 코-뇌 (N-to-B) 약물 전달에 대한 관심이 증가하여 후각 상피를 통해 BBB로 우회할 수 있게 되었다. 그러나 이 장벽을 극복하는 것은 또한 소화 효소, 보호 점액 및 깔끔하게 조직된 상피의 존재를 포함하여 중요한 장애물을 제기한다. 초기 개발 단계에 있지만, RNA 분자가 코를 통해 뇌로 전달되는 것을 촉진하기 위한 전략으로 나노 구조 전달 시스템이 제안되었다. 지금까지 생성된 지식은 나노 캐리어의 크기가 후각 경로에 의해 흡수되기 위해서는 이상적으로 ≤ 100nm 여야 한다는 결론에 이르렀고, 운반체의 약물 로딩 효능은 비강 내 투여되는 제한된 부피와 같은 이유로 매우 높아야 한다.
지금까지 탐색된 주요 코-뇌 전달 전략은 침투 강화제의 사용에 의존해 왔다. 그 중에서 소위 세포 투과 펩타이드 (CPP)가 주목을 받고 있다. 최근 연구에서는 트랜스 활성화 전사 (TAT) 펩타이드 또는 광견병 바이러스 당 폴리펩타이드 (RVG)에서 파생된 29 개 아미노산 펩타이드인 RVG-9R과 같은 아르기닌 (R)이 풍부한 펩타이드의 잠재력을 강조하였다.
신경 퇴행성 질환의 치료를 위해 후각 신경 경로를 통해 설치류의 뇌로의 siRNA 전달을 촉진한다. 다른 한편으로, 미리스토일, 스테아릴 또는 라우릴 지질 꼬리 myristoyl, stearyl or lauryl lipid tails를 사용하는 CPP의 소수성 변형은 친유성을 증가시키고 그에 따라 안정성과 막 침투 능력을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한 최근 연구에서 Kanazawa et al. 쥐에게 N-to-B 투여 후 CPP의 소수성 변형이 뇌 생체 분포에 미치는 영향을 연구하고 소수성 변형된 CPP가 후각 경로를 통해 전뇌로의 관련 약물의 표적 수송을 나타냄을 보여주었다.
이러한 전제를 기반으로 효율적인 N-to-B RNA 전달을 위해 극복해야 할 생물학적 장벽을 고려하여 특별히 선택된 주요 구성 요소의 조합을 포함하는 새로운 전달 전략을 제안한다. 보다 정확하게, 접근 방식의 참신함은 라우르산 lauric acid (C12)과 화학적으로 결합된 옥타아르기닌 octaarginine (r8)의 소수성 유도체와 관심있는 RNA 사이에 정전기적으로 구동되는 나노 복합체의 형성과 다른 보호 바이오 폴리머로의 후속 봉입에 의존한다. 후각 영역에 존재하는 효소, 폴리에틸렌글리콜과 폴리글루탐산 (PEG-PGA) 및 히알루론산(HA)의 블록 공중 합체에 대해 향상된 안정성과 보호 기능을 제공하는 CPPRNA 나노 복합체를 제공하는 능력에 대해 두 가지 다른 외피 중합체를 연구하였다.
이러한 보호 폴리머는 또한 후각 상피를 덮는 점액층을 가로 질러 복합 RNA의 확산을 촉진할 것으로 예상되었다. 벌크 형식으로 ENCP (enveloped nanocomplexes)라고 하는 이러한 나노 구조의 개발에 따라 미세 유체 혼합 시스템을 사용하여 이 시스템의 공식화 프로세스를 최적화하였다. 생산된 NP의 특성에 대한 다양한 매개 변수의 효과를 조사하였다. 또한 생성된 나노 구조의 특성화에는 RNA를 분해로부터 보호하는 능력, 알츠하이머 병의 마우스 모델에 투여에서 생물학적 관련 배지와 배양시 콜로이드 안정성 및 RNA 방출, 시험관 내 흡수 능력, 마지막으로 비강 내 후뇌 생체 분포 및 생체 내 효능 연구가 포함되었다.
여기서 알츠하이머 병의 잠재적인 치료적 접근 방식으로 코에서 뇌로 직접 miRNA를 전달할 수 있는 새로운 나노 기술을 제안하였다. 이 시스템은 옥타 아르기닌 (C12-r8)의 소수성 유도체와 관심있는 RNA 사이에 정전기적으로 구동되는 나노 복합체의 형성과 보호 바이오 폴리머로의 후속 포위를 기반으로 한다. 결과는 (1) BBB를 뇌로 우회하고, (2) 학습과 기억에 중요한 뇌 영역인 해마에 도달하고, (3) miR-132 수준을 상향 조절하는 것과 같은 중요한 문제를 극복 할 수 있는 나노 캐리어의 능력을 보여준다. 그 기능의 후속 개선과 함께. 이러한 발견은 코-뇌 RNAi 전달이 신경 퇴행성 질환에 대해 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여준다. 그러나 이 관리 경로는 아직 비교적 새롭고 완전히 탐구되지 않았다. 관련 경로를 깊이 이해하면 특정 뇌 영역으로의 선택적 전달을 향상시킬 수 있는 운반자를 설계하고 다양한 신경 장애에 대한 맞춤형 약물 치료법을 개발할 수 있다.
7. mRNA 발현 카세트
mRNA는 단백질 정보를 암호화하는 DNA의 전사와 세포질의 리보솜에 의한 단백질 생산과정 사이를 연결하는 중간 매개체이다. 현재까지 RNA 백신의 두 가지 주요 유형은 비복제형 mRNA (non-replicating mRNA)와 바이러스에서 유래된 자가 증폭형 RNA (self-amplifying RNA)가 있다. 전통적인 mRNA 기반 백신은 5' 와 3' 말단에 비번역구간(untranslational region, UTR)을 포함하는 반면에, 자가 증폭형 RNA는 항원뿐만 아니라 세포 내 RNA 증폭 및 풍부한 단백질 발현을 가능하게 하는 바이러스 복제 기작을 갖고 있다.
치료제 목적을 위한 최적의 시험관 내 전사를 위해서 본 발명의 RNA 발현 키세트는 T7, T3 또는 Sp6 파지(phage) RNA 중합 효소(polymerase)를 사용하여 선형 DNA 주형(linear DNA template)으로부터 제조할 수 있다. 이렇게 만들어진 RNA 발현카세트는 카세트의 안정성 및 발현의 효율성이 향상되도록 표적 단백질을 암호화하고 있는 Open reading frame, UTR, 5*?**?*Cap과 다중 아데노신 꼬리 서열(poly (A) tail)을 갖고 있는 개선된 형태를 선호한다. 따라서 이렇게 제작된 RNA 발현카세트는 완전히 성숙한 자연적인 mRNA 분자와 유사하며 진핵세포의 세포질에 자연적으로 존재할 수도 있다.
5' 및 3'UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 하고 있다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성할 수 있도록 한다. 5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5’-terminal oligo-pyrimidine, 5'TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 유전자 네트워크의 표적 제어를 가능하게 한다.
생체 내 전달(In vivo delivery)을 위한 mRNA의 복합체에 대해서도 최근에 많이 개발되었다. naked mRNA(단백질과 같은 물질로 둘러싸여 있지 않는 RNA 분자 자체)는 세포 외 RNA 분해효소(RNases)에 의해 빨리 분해되고 효과적으로 세포 안으로 들어가지 않는다.
따라서, mRNA의 세포 흡수를 촉진하고 분해로부터 mRNA를 보호하는 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 형질주입(transfection) 기술이 개발되었다. 일단 mRNA가 세포질로 이동하면 번역 후 변형 (post-translational modification)을 거친 단백질을 생성하여 최적으로 접히고(3차 구조를 형성하고) 완전히 기능하는 단백질을 생성한다. 시험관 내 전사 mRNA는 정상적인 생리적 과정에 의해 최종적으로 분해되어 대사산물 독성의 위험이 적다.
바이러스에서 유래한 UTR을 원하는 타켓 유전자를 발현하는데 사용하는 대신에 사람 세포 유래 mRNA의 UTR 부분을 활용하여 RNA 백신 플랫폼을 개발하는 시도도 있다. 독일 CureVac 회사에서는 다양한 리보소옴(ribosome) 단백질 UTR을 활용한 플랫폼을 개발하고 있다. 예를 들면 5' 말단 oligopyrimidine tract이 없는 human ribosomal large protein의 5'UTR, human ribosomal protein의 3'-UTR, 64개의 poly A, 30개의 cytidylates를 가진 poly C 및 histone stem-loop 서열을 이용한 RNA 플랫폼을 개발하였다.
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체, 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함한다.
7.1. 비증폭 mRNA 구조체
비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체는 mRNA의 기본 구조를 포함하며, 원하는 항원을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 있다.
비증폭 mRNA 구조체의 주요 특성은 (1) 자가 증폭 mRNA와 비교하여 비교적 작은 크기의 mRNA (~ 2-3 대 ~ 10 kb); (2) 추가 단백질의 부재 (바이러스와 관련) 숙주와의 원치않는 면역 원성 상호 작용을 유발할 가능성을 최소화하는 시스템; (3) 확장 및 제조가 비교적 용이하여, 확산이 발생할 경우 신속한 사용이 가능하다. 그리고 (4) 백신 성능을 향상시키고 표적외 효과를 최소화하기 위한 용이한 유전공학 기술 등이다.
mRNA 치료제 유용성에 대한 가장 큰 장벽은 세포 내 전달의 필요성이다. 화학적 변형 및 서열 공학은 합성 mRNA 백신의 번역 및 저장 수명 둘 다를 향상시켰다.
향상된 치료 성적을 달성하기 위해, mRNA는 생체외에서 형질전환에 사용되는 수지상 세포로 전기 천공되었다. 이 전략은 여러 임상 시험에 적용되었다. 그러나, 형질전환은 힘들고, 확장하기 어렵고, 불리한 면역원성을 유발할 수 있다. 따라서, 본 분야는 지질 또는 중합 체계 물질을 사용하여보다 효율적이고 잠재적으로 덜 독성인 mRNA 담체를 개발하는 쪽으로 이동하였다.
RNA 치료제의 가장 단순한 형태의 구조인 naked RNA 치료제는 양 끝에 짧은 5'-UTR 부위와 3'-UTR 부위가 있고 그 사이에 발현하고자 하는 단백질(표적단백질)의 유전 정보(ORF/GOI)가 있다.
이 구조의 장점은 단순성에 있다. 즉 비증폭 mRNA 플랫폼은 단백질 발현 조절에만 관여하는 양 말단의 UTR만 가지고 있고, 이 부분은 단백질 발현이 일어나지 않아 기본적으로는 숙주와 상호 작용하거나 면역 반응에 영향을 미칠 수 없다는 점이다.
따라서 발현을 원하는 가운데의 ORF (GOI) 부분에서만 단백질을 발현한다. 그러나 mRNA의 지속적인 발현을 제한하려는 세포의 특성 때문에, 상대적으로 고농도의 RNA 투여가 필요하며, 만일 아무런 변형을 가하지 않은 naked RNA를 면역하면 생체 내에서 일시적이거나 낮은 수준의 발현만 가능할 수도 있다.
본 발명의 RNA 발현카세트는 표적단백질의 발현을 증가시키기 위한 세포내 번역이 가능한 구조를 갖춘 mRNA는 5'UTR, 상기 표적단백질을 코딩하는 RNA; 및 3'UTR;를 포함한다.
1) 세포 번역이 가능한 구조
표적단백질을 발현시키기 위한 표적단백질 mRNA는 5'캡 또는 IRES를 포함하는 5'UTR를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적단백질 RNA 발현카세트 및 mRNA 분자는 소위 "5' 캡(CAP)" 구조의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
5'캡(cap)은 독립체, 일반적으로 성숙한 mRNA의 5'말단을 "덮는(caps)" 일반적으로 변형 독립체이다. 5'캡(cap)은 일반적으로 변형, 특히 구아닌 뉴클레오타이드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 5'캡(cap)은 5'5'트리포스페이트 결합을 통해 5'말단에 연결된다. 5'캡(cap)은 메틸화될 수 있으며, 예를 들어, m7GpppN, 여기서 N은 5'캡(cap), 일반적으로 RNA의 5'말단을 운반하는 핵산의 말단 5' 뉴클레오타이드이다. m7GpppN은 폴리머라아제 II에 의해 전사된 mRNA에서 자연적으로 발생하는 5'캡(CAP) 구조이고, 따라서, 본 발명에 따른 mRNA에 포함된 으로서 간주되지 않는다.
본 발명에 따른 mRNA는 5'캡(CAP)으로서 m7GpppN을 포함할 수 있는 것을 의미하지만, 추가적으로 mRNA는 본 원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 변형을 포함한다.
표적단백질의 번역이 표적단백질 mRNA 상의 5'캡에 의해 유도된다. 표적단백질 mRNA 상의 5'캡이 표적단백질의 발현뿐만 아니라 시스템 전체의 성능에 매우 긍정적인 영향을 미친다. 트랜스로 코딩된 목적 RNA의 효율적인 생산을 달성할 수 있다.
본 발명의 표적단백질 mRNA는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함하지 않는다. 일반적으로, 내부 리보솜 진입 부위, 약칭 IRES는 표적단백질 mRNA 서열의 5' 말단과 다른 위치, 예컨대 표적단백질 mRNA 서열의 중앙에서의 위치로부터의 메신저 RNA (mRNA)로부터의 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열로 mRNA 서열의 중간에 위치한다.
본 발명에서 5'캡으로 IRES의 치환은 표적단백질 mRNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 RNA 분자의 특정 변형이다(비-폴리펩티드-서열 개질성 변형). 예를 들어, 진핵세포 메신저 RNA의 경우, 비-폴리펩티드-서열 개질성 변형은 특정 비번역된 영역의 선택, 인트론의 도입, 예를 들어 토끼 베타-글로빈 인트론 II 서열), 또는 코딩 서열의 침묵 변형, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드 서열의 변형없이(침묵 변형) 대상세포 또는 대상 유기체에서 우선 코돈 사용법에 적응하는 것에 의한 것을 포함한다.
본 발명에 해 코딩되는 표적 단백질의 생산은 캡이 표적단백질 mRNA 상에 존재할 때 효율적이다.
진핵세포 mRNA에서 5'캡의 존재는 그 중에서도 특히 mRNA의 핵내 방출 조절과 가공, 특히 5′ 근위부 인트론 절제의 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 표적단백질 mRNA는 전형적으로 핵으로부터 배출되거나 가공될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 표적단백질 mRNA 상에 5'캡이 존재하는 것이 유리하다.
진핵세포 mRNA의 경우, 5'캡은 또한 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여한다고 일반적으로 기술되어 있다: 일반적으로 진핵세포에서 번역은 IRES가 없는 한 메신저 RNA (mRNA) 분자의 5' 말단에서만 개시된다.
진핵세포는 핵 내 전사 중에 5'캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 새로 합성된 mRNA는 통상적으로 전사체가 20 ~ 30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때 5'캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'말단 뉴클레오타이드 pppN(ppp는 트리포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5' GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용된 5'캡은 자연성 5'캡이다.
본 발명에서, 자연성 5'캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 5'캡(cap) 구조로 이들 화학적 변형된 5'캡(CAP) 구조는 본 발명에 따른 mRNA에 포함된 적어도 하나의 으로 여겨진다.
본 발명의 표적단백질 mRNA는 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 대상세포 내로 형질주입되는 경우, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 전형적으로 세포 핵, 즉 전형적인 진핵세포에서 캡핑이 일어나는 부위에 국한되지 않는 것으로 여겨진다.
종래 기술에서 IRES와 유사하게, 표적단백질 mRNA 상의 5'캡은 표적단백질의 번역 개시를 유발하는데 유용하다. 진핵세포 번역 개시 인자 elF4E는 캡핑된 mRNA를 리보솜과 결합시키는 데 관여하는 것으로 생각될 수 있다. 5'캡의 존재가 성능을 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 5'캡을 포함한다.
5'캡의 존재는 또한 본 발명의 트랜스-복제 시스템에서 예기치 않은 상승적인 효과를 제공한다. 캡핑된 표적단백질 mRNA가 RNA에 대해 트랜스로 제공될 때 캡핑된 표적단백질 mRNA가 목적 단백질의 생산을 유발하는 것이 보다 효율적이다. 따라서, 트랜스로 5'캡 및 복제의 상승 효과, 즉 시스로 복제하는 것보다 우수한 효과가 있다.
본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다.
RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제2 염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5 ~ 10으로 설정함으로써 억제된다.
5'캡은 5'캡 유사체이다. RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.
이전에 기재된 조작된 복제 시스템과 대조적으로, 본 발명의 표적단백질 mRNA는 바람직하게는 캡 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 시스템의 표적단백질의 번역은 바람직하게는 캡 유사체에 의해 유도된다.
이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다. 따라서, 본 발명은 임의의 변형을 함유하지 않고 천연 캡 [(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG라고도하며, 시판된 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnology사에 의해 첨가할 수 있음)]을 포함하는 발현 시스템을 제시하고 있다.
2) 화학적 변형
"RNA 화학적 변형"은 당 변형 또는 염기 변형뿐만 아니라 백본 변형을 포함하는 화학적 변형을 나타낼 수 있다.
본 발명의 화학적 변형 RNA 분자는 뉴클레오타이드 유사체/변형체, 예를 들어, 백본 변형체, 당 변형체 또는 염기 변형체를 함유할 수 있다. 본 발명과 관련된 백본 변형은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자에 함유된 뉴클레오타이드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자의 뉴클레오타이드의 당의 변형이다. 더욱이, 본 발명과 관련된 염기 변형은 핵산 분자의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 염기 성분의 변형이다. 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형체는 바람직하게 전사 및/또는 번역에 적용할 수 있는 뉴클레오타이드 유사체로부터 선택된다.
(1) 당 변형체(Sugar Modifications):
본 발명의 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 성분에서 화학적 변형될 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 상이한 수의 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체와 함께 되거나 치환될 수 있다. "옥시" -2'하이드록실기 화학적 변형체의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 알콕시 또는 아릴옥시(-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), -0(CH2CH2o)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들어, 메틸렌 다리(methylene bridge)에 의해 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금(locked)" 핵산(LNA); 아미노기(-O-아미노, 여기서 아미노기 예를 들어, NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노일 수 있다) 또는 아미노알콕시를 포함한다.
"데옥시" 변형체는 하이드로겐, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 또는 연결자(linker)를 통해 당에 부착될 수 있는, 여기서 상기 연결자는 원자, C, N 및 O 중 하나 이상의 원자를 포함하는 아미노기를 포함한다.
당기(sugar group)는 또한 리보오스 내 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, mRNA는 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
(2) 백본 변형체(Backbone Modifications):
포스페이트 백본은 또한, 본원에 설명된 바와 같이, 변형 RNA 내로 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드로 변형될 수 있다. 백본의 포스페이트기는 상이한 치환체를 갖는 하나 이상의 산소 원자를 치환함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 본원에 설명된 바와 같은 변형된 포스페이트를 갖는 비화학적 변형된 포스페이트 성분의 총 치환을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로티오에이트는 황(sulfur)으로 치환된 모두 비-연결된 산소를 갖는다. 포스페이트 연결자는 또한 연결된 산소가 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌-포스포네이트)의 치환에 의해 될 수 있다.
(3) 염기 변형체(base modifications):
변형 RNA 내로 포함될 수 있는 화학적 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 성분(moiety)에서 추가로 될 수 있다. RNA에서 발견되는 핵염기의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실이 포함된다. 예를 들어, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 주홈면(major groove face)에서 화학적으로 될 수 있다. 화학적 변형체는 아미노기, 티올기, 알킬기, 또는 할로기를 포함할 수 있다.
(4) 지질 변형체(Lipid modification):
본 발명의 변형 RNA는 지질 변형을 함유할 수 있다. 이와 같은 지질-변형 RNA는 일반적으로 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 포함한다. 본 발명의 지질-변형 RNA 분자는 일반적으로 RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질을 추가적으로 포함한다. 대신에, 지질-변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 RNA 분자 및 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 세 번째 대안에 따라서, 지질-화학적 변형 RNA 분자는 본원에 정의된 바와 같은 RNA 분자, RNA 분자와 공유결합된 적어도 하나의 연결자, 및 각각의 연결자와 공유결합된 적어도 하나의 지질, 및 또한 RNA 분자와 (연결자 없이) 공유결합된 적어도 하나의 (2 기능성) 지질을 포함한다. 지질 변형은 선형 RNA 서열의 말단 끝에 존재하는 것이 특히 바람직하다.
3) 염기서열의 변형
(1) 오픈 리딩 프레임의 변형: G/C 함량의 변형:
본 발명의 mRNA는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는, 코딩 영역의 G/C 함량은 변형되고, 이의 특정 야생형 코딩 영역, 즉, 비변형 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하였을 때 특히 증가된다. 코딩 역역의 아미노산 서열은 특정 야생형 코딩 영역의 코딩된 아미노산 서열과 비교하였을 때 변형되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 mRNA 코딩 영역의 G/C-함량의 변형은, 번역될 임의의 mRNA 영역의 서열이 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실을 기초로 한다. 따라서, 다양한 뉴클레오타이드의 조성 및 서열은 중요하다. 특히 G(구아노신)/C(사이토신) 함량이 증가된 mRNA 서열은, A(아데노신)/U(우라실) 함량이 증가된 mRNA 서열보다 더욱 안정하다. 본 발명에 따르면, 지속적으로 아미노산 서열로 번역되고 있는 코딩 영역의 코돈은, 이 코돈 중 G/C 뉴클레오타이드의 양이 증가되었다는 점에서 이의 야생형 코딩 영역의 코돈과는 상이하다. 몇몇 코돈은 하나의 동일한 아미노산을 코딩한다는 사실(소위 유전적 암호의 축퇴성(degeneration))에 비추어, 안정성에 가장 유리한 코돈이 결정될 수 있다(소위 대안적 코돈 선호도(alternative codon usage)).
본 발명에서 mRNA의 코딩 영역에 의해 코딩될 아미노산에 따라서, 이의 야생형 코딩 영역과 비교할 때 RNA 서열, 예를 들어, 코딩 영역의 변형에 대한 다양한 가능성이 존재한다. 오직 G 또는 C 뉴클레오타이드만을 함유하는 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 경우, 코돈의 변형은 필요하지 않다. 따라서, A 또는 U가 존재하지 않기 때문에, Pro(CCC 또는 CCG), Arg(CGC 또는 CGG), ala(GCC 또는 GCG) 그리고 Gly (GGC 또는 GGG)에 대한 코돈은 변형이 필요하지 않다.
대조적으로, A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈은, 동일한 아미노산을 코딩하지만 A 및/또는 U를 함유하지 않는 다른 코돈의 치환에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량을, 특정 야생형 코딩 영역(즉 원래의 서열)의 G/C 함량에 비해 증가시키기 위해서는, 상기 나열된 치환들은 개별적으로 적용될 수 있거나, 가능한 임의의 조합으로 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 야생형 서열에서 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈은 ACC(또는 ACG)로 변형될 수 있다.
바람직하게 본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 7% 이상, 더욱 바람직하게 15% 이상, 특히 바람직하게 20% 이상 증가된다. 병원성 항체 또는 절편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 하나 이상을 코딩하는 코딩 영역에서 치환 가능한 코돈들 중 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상 또는 심지어 100%가 치환되며, 이로써 상기 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하게 된다.
특히 바람직하게, 본 발명에서 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량은, 야생형 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여 최대값(즉, 치환 가능한 코돈의 100%)만큼 증가할 수 있다.
(2) 코돈 최적화(Codon optimization):
일반적으로 유전 암호의 축퇴는 동일한 코딩 능력을 유지하면서 다른 코돈 (염기 삼중항)에 의해 RNA 서열에 존재하는 특정 코돈(아미노산을 코딩하는 염기 삼중항)을 대체할 수 있게 한다(코돈을 대체하는 것은 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 코딩한다).
본 발명에서, RNA 분자에 포함된 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 코돈은 오픈 리딩 프레임이 유래한 종에서 각각의 오픈 리딩 프레임의 각각의 코돈과 상이하다. 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열은 "개조된" 것으로 언급된다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, 빈번하게 사용되는 코돈이 선택될 수 있다. 더욱 빈번하게 사용되는 희귀 코돈의 치환을 포함하여, 핵산 분자의 코딩 서열의 변형을 한다.
코돈 사용의 빈도는 대상세포 또는 대상 유기체에 따라 다르기 때문에, 그러한 유형의 변형은 특정 대상세포 또는 대상 유기체에서의 발현에 핵산 서열을 맞추는 것이 적합하다. 일반적으로 말하면, 보다 빈번하게 사용되는 코돈은 전형적으로 대상세포 또는 대상 유기체에서 보다 효율적으로 번역되지만, 오픈 리딩 프레임의 모든 코돈의 변형이 항상 필요한 것은 아니다.
예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, G (구아닐레이트) 잔기 및 C (시티딜레이트) 잔기의 함량은 각 아미노산에 대해 가장 풍부한 GC-함량을 갖는 코돈을 선택함으로써 변형될 수 있다. GC가 풍부한 오픈 리딩 프레임을 가진 RNA 분자는 면역 활성을 감소시키고 RNA의 번역 및 반감기를 향상시킬 가능성이 있다고 보고되어 있다.
본 발명에 따른 RNA 발현카세트는 각각 개조될 수 있다.
본 발명에서 mRNA의 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역의 추가적인 바람직한 변형은 번역 효율이 세포 내 tRNA의 출현의 상이한 빈도에 의해 또한 결정된다는 발견에 기초한다. 따라서, 만약, 소위 "희귀(rare) 코돈"이 야생형 RNA 서열의 코딩 영역에 증가된 정도로 존재하면, 상대적으로 "빈번한(frequent)" tRNA를 코딩하는 코돈이 존재하는 경우보다 현저히 낮은 정도로 번역된다.
mRNA의 코딩 영역은 바람직하게 상응하는 야생형 코딩 영역과 비교하여 변형되는 결과, 적어도 하나의 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 코돈은, 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하고 상대적으로 희귀한 tRNA로서 동일한 아미노산을 운반하는 코돈으로 치환된다. 이러한 변형에 의해, 본 발명의 mRNA의 코딩 영역은 변형되는 결과, 빈번하게 발생하는 tRNA를 이용하기 위한 코돈이 삽입된다. 다시 말해서, 본 발명에 따르면, 이러한 변형에 의해 세포 내에서 상대적으로 희귀한 tRNA를 코딩하는 야생형 코딩 영역의 모든 코돈은 각각의 경우에서 세포 내에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있고, 각각의 경우에서 상대적으로 희귀한 tRNA로서 아미노산을 운반할 수 있다.
어떤 tRNA가 세포 내에서 상대적으로 빈번하게 발생하는지, 그리고 이와는 대조적으로 어떤 tRNA가 상대적으로 희귀하게 발생하는지는 통상의 기술자에게 알려져있다. 특정 아미노산을 위해 사용하는 가장 빈번하게 발생하는 tRNA, 예를 들어, (인간) 세포내에서 가장 빈번하게 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 코돈이 특히 바람직하다.
본 발명의 mRNA의 코딩 영역 내에 특히 최대로 증가된 서열 G/C 함량을, RNA 서열의 코딩 영역에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열이 변형되지 않은 "빈번한" 코돈과 연관짓는 것이 특히 바람직하다. 특히 효율적으로 번역 및 안정화된(화학적 변형된) RNA 서열을 제공한다.
(3) UTR의 변형
UTR
Untranslated region 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. UTR은 ORF의 상류 및/또는 표적단백질를 코딩하는 ORF의 하류에 존재할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 표적단백질 mRNA에서, "3'UTR"은 표적단백질에 대한 코딩영역의 3'에 위치하는 영역에 관한 것이고, "5'UTR" 이는 표적단백질에 대한 코딩영역의 5'에 위치하는 영역에 관한 것이다.
5' 및 3'UTR은 주로 cis 조절 요소라고 통칭하는 서열 및 구조적 모티프와 RNA 결합 단백질(RBP) 또는 작은 RNA 전달 인자 간의 동적 상호 작용을 통해 기능을 한다. 그들은 함께 특정 mRNA의 대사와 번역을 조정하여 세포 단백체를 형성하도록 한다. 5'UTR에서 시스 요소의 예는 5'-말단 올리고-피리미딘 모티프(5'-terminal oligo-pyrimidine, 5'TOP) motif, 피리미딘이 풍부한 번역 요소(pyrimidine-rich translational element, PRTE) 또는 TOP- 유사 서열(TOP-like sequence), 시토신이 풍부한 번연의 조절인자(cytosine-enriched regulator of translation, CERT), G-quadruplex 구조(G-quadruplex structure), 및 진핵 개시 인자 3결합 줄기 루프 구조(eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)-binding stem-loop structure) 등이다. 이러한 각 요소는 mRNA의 하위 집합에 존재하여 선별된 유전자 네트워크의 표적 제어를 가능하게 한다.
5' 및/또는 3'UTR은 ORF와 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 ORF와 관련되어 안정성 및/또는 상기 ORF를 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
UTR은 RNA의 운반을 이용한 효과적인 운반의 전제 조건인 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3'UTR을 선택함으로써, 5'캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다.
UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'UTR이 존재하는 것이 바람직하다.
3'UTR은 존재하는 경우 ORF의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'말단에 위치하지만, "3'UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).
본 발명의 표적단백질 mRNA는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'UTR; (b) 표적단백질를 코딩하는 ORF; (c) 3'UTR; 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 UTR-함유 RNA는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이들은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자(예컨대 DNA)의 발현을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
5'UTR은 일반적으로 전령 RNA(mRNA)의 특정 부분(section)으로 이해된다. 이는 mRNA의 ORF의 5'에 위치한다. 일반적으로, 5'UTR은 전사 시작부(transcriptional start site)와 함께 시작하고 ORF의 시작 코돈의 하나의 뉴클레오타이드 전에 종료된다. 5'UTR은 조절 요소라고도 불리우는 유전자 발현을 조절하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이와 같은 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합부 또는 5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract)일 수 있다. 5'UTR은 예를 들어, 5'캡(cap)의 첨가에 의해 전사 후 변형될 수 있다.
본 발명에서, 5'UTR은 5'캡(cap) 및 시작 코돈 사이에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 바람직하게, 5'UTR은 5'캡(cap)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 바람직하게는 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드로부터, ORF의 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지, 바람직하게는 ORF의 시작 코돈의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 서열에 상응한다. 성숙 mRNA의 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드는 일반적으로 전사 시작부에 상응한다.
5'UTR 서열이 5'UTR 서열을 정의하기 위해 사용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열 또는 이와 같은 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있다. 유전자의 5'UTR은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 유전자의 5'UTR은 5'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
독창적인 mRNA는 (안정한 mRNA를 제공하는) 반감기가 향상된 RNA 발현카세트와 관련된 유전자로부터 유래될 수 있는 3'UTR 요소를 포함하며, 예를 들어, 하기 정의 및 설명된 바와 같은 3'UTR 요소이다.
3'UTR 요소는 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1(I) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR로부터 유래되거나, 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 타이로신 하이드록실라아제 유전자, 리폭시게나아제 유전자, 및 콜라겐 알파 유전자, 예컨대 콜라겐 알파 1(I) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 3'UTR의 변이체로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 3'UTR 요소는 알부민 유전자, 바람직하게는 척추동물 알부민 유전자, 더욱 바람직하게는 포유동물 알부민 유전자일 수 있다,
mRNA는 RNA의 코딩 영역에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본 발명에 따른 mRNA는 본원에 정의된 바와 같은 변형 중 적어도 하나의 유형을 포함한다. 대신에, 또는 다른 유형의 변형과 조합하여, 본원에 정의된 바와 같은 특정 변형, 예컨대 3'UTR, 히스톤 스템-루프 또는 폴리 C 서열은 또한 본 발명에 따른 mRNA에 하나 이상의 복제물(copy)로 존재할 수 있다. 이는 바이- 또는 멀티시스트론 RNA에 대해 특히 마찬가지이다. 본 발명에 따른 mRNA는 여러 별개의 변형의 조합을 포함할 수 있으며, 예컨대, 임의의, 예를 들어, 5'UTR, 폴리 C 서열, 폴리 A 서열, 3'UTR 또는 히스톤 스템-루프와 GC-풍부(GC-enrichment)를 조합한 변형, 여기서 각각 별개의 변형은 RNA 당 단일 복제물의 형태 또는 RNA 당 다수의 복제물 형태로 존재할 수 있다.
폴리(A) 서열
본 발명의 RNA 발현카세트는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.
폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 적어도 26, 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100개이고, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다.
폴리(A) 서열에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 5 ~ 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.
아데닐산중합반응(polyadenylation)은 일반적으로 RNA 분자, 예를 들어, 미성숙 RNA 발현카세트와 같은 핵산 분자에 폴리(A) 서열이 첨가되는 것으로 이해된다. 아데닐산중합반응은 소위 아데닐산중합반응 신호에 의해 유도될 수 있다. 이 신호는 아데닐산중합반응될, RNA 분자와 같은 핵산 분자의 3'말단의 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch) 내에 위치한다. 아데닐산중합반응 신호는 일반적으로 아데닌 및 우라실/티민 뉴클레오타이드로 이루어진 헥사머(hexamer), 헥사머 서열 AAUAAA 를 포함한다. 다른 서열, 헥사머 서열도 가능하다. 아데닐산중합반응은 프리-mRNA(미성숙-mRNA로도 불리우는)의 가공 중에 발생한다. RNA 성숙(프리-mRNA로부터 성숙 mRNA 까지)은 아데닐산중합반응의 단계를 포함한다.
본 발명의 mRNA는 폴리(A) 꼬리를 (선택적으로 다른 변형과 조합하여) 포함하고, 여기서 폴리(A) 꼬리는 적어도 30개, 바람직하게는 50개를 초과하는, 더욱 바람직하게는 100개를 초과하는, 더욱 더 바람직하게는 200개를 초과하는 아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, RNA는 64개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
적어도 하나의 ORF를 포함하는 mRNA는 RNA의 코딩 영역의 영역 3'에 폴리(C) 서열을 (선택적으로 다른 변형과 조합하여) 포함한다. 폴리(C) 서열은 일반적으로 다수의 사이토신 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 10 ~ 약 200개 사이티딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 10 ~ 약 100개 사이티딘 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 10 ~ 약 70개 사이티딘 뉴클레오타이드 또는 더욱 더 바람직하게는 약 20 ~ 약 50개 또는 심지어 약 20 ~ 약 30개 사이티딘 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)이다. 폴리(C) 서열은 바람직하게는 핵산에 의해 코딩 영역의 3'에 위치할 수 있다. 본 발명의 폴리(C) 서열은 폴리(A) 서열의 3'에 위치한다.
본 발명에 따른 mRNA는 적어도 하나의 변형으로서 이의 3' 말단에 히스톤 스템-루프를 포함하거나 코딩한다.
7.2. 자가 증폭 mRNA 구조체
상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA, SAM) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
SAM 구조체는 알파 바이러스 및 플라비 바이러스와 같은 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로부터 조작된 RNA 바이러스 게놈을 인코딩하는 레플리콘 (replicon)이라고 불리는 RNA로, 일반적으로 RNA 캡핑 및 복제를 돕는 비구조 단백질을 인코딩하는 ORF 및 바이러스 구조 단백질을 대체하는 항원을 발현하는 ORF를 포함한다.
SAM은 비복제 대응물에 비해 지속 기간 (약 2 개월) 및 발현의 크기를 연장시키는 것과 같은 몇 가지 매력적인 특징을 갖는다. 그러나, 자기 증폭 활성을 유지하기 위해, 이들 RNA 레플리콘은 많은 합성 뉴클레오티드 변형 및 서열 변경을 해야 한다. SAM의 다른 제한은 (1) 잠재적 숙주 반응을 유도할 수 있는 관련없는 단백질의 포함; 및 (2) 셀 내부화 효율을 제한할 수 있는 큰 레플리콘 크기 (~ 10kb) 등이다.
일반적으로, SAM은 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체 및 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공하고, 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 및 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘으로 나눌 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템에서, 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체, 복제효소에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함하는 시스템을 제공하고, 여기서 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 5'-캡을 포함한다. 5'-캡은 복제효소의 번역을 유도하는 목적을 제공한다. 5'-캡은 천연 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 복제효소의 번역을 유도하기 위한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함하지 않는다.
따라서, 트랜스-레플리콘은 2개의 핵산 분자인, 복제효소를 발현하기 위한(즉, 복제효소를 코딩하는) 제 1 RNA 분자; 및 제 2 RNA 분자 (레플리콘)를 포함하는 시스템을 제공한다. 복제효소를 발현하기 위한 RNA 구조체는 본 발명에서 동의어로 "복제효소 구성체"이라 지칭한다.
알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 (1) 5' UTR, (2) 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및 (3) 3' UTR를 포함할 수 있다. 5'UTR 및/또는 3' UTR은 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이 아닌 것을 특징으로 한다. 알파바이러스 복제효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RNA 복제에 필요한 비구조성 단백질에 대한 코딩영역(들)을 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 복제효소에 의해 복제될 수 없다.
RNA 레플리콘은: (1) 알파바이러스 5' 복제인식서열, 및 (2) 알파바이러스 3' 복제인식서열을 포함한다. 알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 복제효소의 존재 하에서 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다.
알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다. RNA 레플리콘은 이종 핵산을 포함한다. RNA 레플리콘은 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 복제효소가 유도된 알파바이러스에 고유한 것이 아니다.
관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현은 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 서브게놈 프로모터는 복제효소를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다. 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 구조 단백질에 대한 프로모터이다.
RNA 레플리콘은 3' 폴리(A) 서열 및 5'-캡을 포함한다.
복제효소의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함하는 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체이다. 알파바이러스 복제효소를 발현시키기 위한 RNA 구조체, RNA 레플리콘 또는 상기 시스템의 둘 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제조할 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템에서, 복제효소의 역할은 레플리콘을 트랜스로 증폭시키는 것이다. 그러므로 상기 레플리콘은 트랜스-레플리콘으로 지칭될 수 있다. 상기 레플리콘이 발현을 위한 목적 유전자를 코딩하면, 목적 유전자의 발현 수준 및/또는 발현 지속 시간은 복제효소의 수준을 변경함으로써 트랜스로 조절될 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템은 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 DNA 주형에서 시험관내 전사될 수 있다.
트랜스-레플리콘 시스템의 RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 IVT-RNA를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 시스템의 모든 RNA 분자는 IVT-RNA이다. 시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA)는 특정 치료법에 특히 중요하다.
트랜스-레플리콘 시스템은 적어도 2개의 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 정확히 2개의 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 분자, 레플리콘 및 복제효소 구성체를 함유한다.
시스템은 복제효소 구성체에 더하여, 각각 바람직하게는 적어도 하나의 관심 대상 폴리펩타이드를 코딩하는 둘 이상의 레플리콘을 포함한다. 복제효소 구성체에 의해 코딩된 복제효소는 각각의 레플리콘에 작용하여 복제 및 서브게놈 전사체의 생산을 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 약학적 활성 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 예를 들어 여러 다른 항원에 대해 대상체의 백신접종이 필요한 경우에 유리하다.
바람직하게는, 트랜스-레플리콘 시스템은 바이러스 입자, 특히 차세대 바이러스 입자를 형성할 수 없다.
바람직하게는, 복제효소 구성체는 표적 세포 또는 표적 유기체에서 자체 복제가 불가능하다.
또는 RNA의 양상 및 이점이 본 발명에 기재되어 있지만, 트랜스-레플리콘 시스템은 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 것이 가능하다. 본 발명의 시스템의 임의의 하나 이상의 핵산 분자는, DNA 분자일 수 있다. 복제효소 구성체 및/또는 레플리콘이 DNA 분자인 것이 가능하다. DNA 분자의 경우, DNA 의존성 RNA 중합효소의 프로모터가 존재하는 것이 바람직하며, 이에 의해 감염되거나 백신 접종된 숙주세포 또는 숙주 유기체에서 전사가 가능해진다.
8. mRNA 발현카세트의 운반체
상기 핵산은 선형(linear) 단일가닥 RNA일 수 있고, mRNA일 수 있다. mRNA는 일반적으로 몇 가지 구조적 요소(structural elememt), 예를 들면, 코딩 지역에 뒤따르는 상부에 위치한 리보좀 바인딩 사이트, 선택적 5'-UTR, 폴리-A-꼬리(및/또는 폴리-C-꼬리) 뒤에 있을 수 있는 선택적 3'-UTR를 포함하는 RNA이다. mRNA는 모노(mono-), 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 RNA(multicistronic RNA)로 나타날 수 있으며, 즉 본원에서 정의된 바와 같이 하나, 둘 또는 더 많은(동일하거나 다른) 단백질 또는 펩타이드의 코딩 서열(coding sequence)을 운반하는 RNA이다. 다이(di-), 또는 심지어 멀티시스트로닉 mRNA(multicistronic mRNA)에서 그러한 코딩 서열은 적어도 하나의 내부 리보좀 유입점(internal ribosome entry site, IRES)서열에 의해 분리될 수 있다.
게다가, 상기 고분자 전달물 복합체의 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 핵산은 두개의 단일가닥 핵산들(분자들)의 비공유 결합 때문일 수 있다.
또는 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 핵산일 수 있고, 적어도 부분적으로 상보적으로 이들 모두다 부분적으로 이중가닥이거나 부분적으로 단일가닥인 핵산은 일반적으로 더 길고 더 짧은 단일가닥 핵산에 의해 만들어지거나 길이가 같은 두개의 단일가닥 핵산에 의해 만들어지고, 하나의 단일가닥 핵산은 다른 단일가닥 핵산에 부분적으로 상보적이며 따라서 둘은 이 부분에서 이중가닥 핵산 분자를 형성한다. 즉, 부분적으로 이중가닥 또는 부분적으로 단일가닥 핵산 (분자)를 형성한다.
바람직하게는, 핵산(분자)는 단일가닥 핵산 분자일 수 있다. 게다가, 핵산(분자)는 원형(circular) 또는 선형(linear) 핵산 분자일 수 있고, 바람직하게는 선형 핵산 분자일 수 있다.
RNA 전달체의 형질주입은 세포 외 및 세포 내 장벽에 직면한다. RNA 전달체는 혈청 핵산분해 효소 및 식세포 흡수에 노출되어 생물학적 반감기를 현저하게 감소시킨다. 또한, 세포외 기질(ECM) 뿐만 아니라 세포막의 음전하는 RNA 전달체가 표적에 도달하고 작용을 하는 것을 방해한다.
기능에 대한 많은 장벽 중 RNA는 세포질에 도달하기 위해 세포막을 가로 질러야한다. 세포막은 세포 내 전달에 대한 역동적이고 강력한 장벽이다. 다양한 이온 펌프 및 이온 채널이 음전위를 유지하는 데 도움이 된다. 세포막을 가로 질러 -40 ~ -80 mV), 대부분의 필수 금속 이온(예 : K +, Na +, Ca2 + 및 Mg2 +)의 균형을 조절하여 세포질 공간에 음전하를 유지한다.
세포막은 매우 음으로 하전된 RNA 분자에 대한 강력한 장벽을 생성한다. 불포화 지질, 특히 시스-이중 결합된 지질은 막 구조에 결함을 도입함으로써 세포막 유동성을 증가시킨다. 이중층의 다른 주요 성분은 스테롤(총 지질의 ~ 30%)을 포함한다. 지질 이중층의 주요 스테롤인 콜레스테롤은 이중층 결함을 생성하여 지질 이중층의 유동화와 응축 사이의 균형을 유지하는 데 도움이 된다.
핵산의 형질주입은 바이러스(viral) 또는 비바이러스(non-viral) 벡터를 사용하여 수행된다. 성공적인 운반을 위해서, 이러한 바이러스 또는 비바이러스 벡터들은 상기 언급된 장애들을 반드시 극복해야만 한다. 가장 성공적인 유전자 치료 전략은 오늘날 아데노바이러스 (adenoviruses), 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated viruses), 레트로바이러스 (retroviruses) 및 헤르페스 바이러스 (herpes viruses)와 같은 바이러스 벡터의 사용에 의존한다. 바이러스 벡터는 높은 효율과 장기간(long-term) 유전자 발현의 가능성을 갖는 유전자 도입을 매개할 수 있고, 3개의 가설 중에서 2개를 충족한다. 그러나, 유전자 치료 임상 실험에서 드러나는 급성 면역 반응(the acute immune response), 면역원(immunogenicity), 그리고 삽입 돌연변이 유발(insertional mutagenesis)은 흔히 사용되는 몇몇 바이러스 벡터들에 대한 안정성에 대한 심각한 염려를 일으킨다.
이러한 문제점에 대한 해결책은 비바이러스 벡터들의 사용에서 발견될 수도 있다. 비록 비바이러스 벡터들은 바이러스 벡터들만큼 효율이 좋지 않지만, 많은 비바이러스 벡터들은 유전자 치료법에서 더 안정적인 대안을 제공하고 있다.
비바이러스 유전자 운반 방법은 물리적(담체(carrier)를 사용하지 않는 유전자 운반) 그리고 화학적(합성 벡터에 기초한 유전자 운반) 접근법을 사용하여 연구되고 있다. 물리적 접근법은 보통 주사침(needle injection), 전기천공법(electroporation), 유전자총(gene gun), 초음파(ultrasound) 그리고 유체역학적 운반(hydrodynamic delivery)을 포함하고, 세포막을 투과하는 물리적 힘을 이용하며, 그리고 세포 내로 유전자 도입을 촉진한다. 화학적 접근법은 일반적으로 대상유전자를 세포 안으로 이동하기 위해 담체로써 합성되거나 자연적으로 발생된 화합물(양이온 지질(cationic lipids), 양이온 폴리머(cationic polymers), 지질-폴리머 혼성체(lipid-polymer hybrid systems))를 담체로 사용한다.
비록 기초과학분야와 다양한 비바이러스 유전자 운반 시스템에서 중요한 발전이 있지만 비바이러스 접근법의 대다수는 여전히 바이러스 벡터들보다 덜 효율적이고, 특히나 생체내 유전자 운반에서 더욱 그러하다.
본 발명의 RNA의 입체적 안정성을 달성하고 담체의 BD/PK 특성을 향상시키기 위해 다른 약제에서 FDA가 인간에게 사용하도록 승인한 폴리에틸렌글리콜 접합(PEGylated) 지질을 사용할 수 있다. 가능한 모든 면역 반응과 보체 시스템의 활성화가 최소화되도록 입자 표면 전체가 PEG로 덮여 있을 수도 있다.
고분자 전해질 복합체(Poly Electrolyte Complex, PEC)는 반대 전하의 두 중합체가 혼합될 때 자발적으로 형성되어 거대 분자가 주로 정전기적 상호작용에 의해 함께 결합되는 복합체를 형성한다. 또한, 용어 "나노 플렉스"는 양으로 하전된 나노 입자와 핵산, DNA 또는 RNA 사이에 형성된 복합체를 나타내기 위해 문헌에서 널리 사용된다. 양으로 하전된 성분이 키토산과 같은 양이온성 폴리펩타이드를 기반으로 하는 경우, 나노 플렉스는 폴리 플렉스로도 정의될 수 있다.
PEC는 주로 구형이며, 양이온 및 음이온성 중합체의 화학량론적 혼합물을 함유하고, 하전 안정화 쉘의 형성을 허용하는 과량의 고분자 전해질에 의해 둘러싸인 중성 코어로 구성된다는 것이 잘 알려져 있다.
PEC의 자체 조립은 가역적인 과정이므로 PEC와 매체 사이의 정전기 차폐 및 폴리 이온 교환으로 인해 다른 하전된 종의 존재 하에서 무결성이 손상될 수 있다. 따라서, PEC의 안정성은 하전된 단백질 및 고농도의 작은 전해질이 존재하는 생물학적 매질에서 심각한 영향을 받을 수 있다. 이 문제를 극복하기 위한 전략은 복합 다가 전해질을 공유 가교 결합하여 PEC로부터 폴리머 사슬의 분리를 방지함으로써 PEC의 안정성을 향상시키는 것이다. PEC 기반 나노 입자는 제조가 쉽고 비용 효율적이기 때문에 매력적이며, 정전기 상호작용의 가역성은 적절한 조건하에서 복합체의 무결성을 유지하면서 담체의 거동에 특별한 조정성을 제공하기 때문에 매력적이다.
RNA 전달을 위해 가장 많이 개발된 방법 중 하나는 지질 나노 입자(LNP) 로의 복합제제이다. LNP 제제는 일반적으로 (1) 폴리 음이온성 RNA를 캡슐화하기 위해 이온화 가능 또는 양이온성 지질 또는 3 차 또는 4 차 아민을 보유하는 고분자 재료로 구성된다. (2) 세포막의 지질과 유사한 양 이온성 지질(예를 들어, 1,2- 디오레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민 [DOPE]); (3) LNP의 지질 이중층을 안정화시키는 콜레스테롤; 및 (4) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질로 나노 입자에 수화층을 형성하여 콜로이드 안정성을 개선하며 단백질 흡수를 감소시킨다.
상기 캡슐화하여 제조하는 가장 대표적인 입자는 지질 나노 입자로 인지질은 생체 적합성, 대규모 생산의 상대적 용이성 및 임상 시험에서 사용되는 최근 승인으로 인해 RNA의 가장 유망한 전달체 중 하나로 인식되고 있다.
인지질은 물에 분산되면 자발적인 이중층 구조를 형성하는 양친매성 분자이며 분산된 친수성 하중을 성형 구조물의 수성 코어 내에 포집한다. 따라서 양이온성 폴리펩타이드로 이들 분자의 헤드 그룹을 화학적으로 변형시키면 정전기적 상호 작용을 통한 음으로 하전된 본 발명에서 제조하는 RNA의 포획이 촉진되어 전달체의 유망한 구성 요소가 된다.
본 발명의 RNA 전달체는 혈장 안정성 및 순환 시간 정도뿐 아니라 세포의 유입 측면에서 RNA 전달체의 약물 동태의 향상에 두고 있다.
본 발명의 RNA를 구성하는 핵산은 강력하게 음으로 하전된 폴리머로 입자를 제조하는 과정에서 양이온 폴리머가 매우 중요한 역할을 한다. 양이온성 폴리펩타이드는 정전기 상호작용, 세포 흡수, 양성자 스폰지 매개 엔도솜 탈출을 통해 음으로 하전된 RNA 발현카세트와의 복잡한 형성을 촉진하는 능력을 포함하는 몇 가지 이점을 제공한다. 그러나 양이온 폴리머의 단점은 세포막의 무결성 변화와 높은 면역원성 때문에 높은 독성이 있다는 것이다.
더 나아가 유전자 치료에서 더 전도유망한 접근법은 양이온 폴리머(cationic polymers)를 사용하는 것이다. 양이온 폴리머는 단단히 복합체를 형성하고 음전하를 띈 핵산을 응축하기 때문에 핵산의 형질주입에서 효용성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 많은 양이온 폴리머가 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 유전자 운반을 위한 담체로써 연구되고 있다.
이런 양이온 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine (PEI)), 폴리아미도아민 덴드리머(polyamidoamine dendrimers) 폴리프로필아민 덴드리머(polypropylamine dendrimers), 폴리아릴아민(polyallylamine), 양이온 덱스트란(cationic dextran), 키토산(chitosan), 양이온 단백질(cationic proteins) 및 양이온 펩타이드(cationic peptides)를 포함한다.
비록 대부분의 양이온 폴리머는 작은 입자(particles) 안에 DNA를 응축하고 세포 표면의 음이온 위치와 전하-전하 반응을 통한 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 흡수를 촉진하는 기능을 갖지만, 형질주입 활성(transfection activity)과 독성(toxicity)은 현저히 차이가 난다.
양이온 폴리머는 음전하를 띄는 핵산 전달물의 더 강력한 복합체화 때문에 분자량이 커질수록 더 나은 형질주입 능력을 보인다. 그러나, 분자량이 증가할수록 양이온 폴리머의 독성이 더욱 증가한다. 폴리에틸렌이민(PEI)는 아마 가장 활성이 좋고, 유전자 운반 분야에서 가장 많이 연구된 폴리머이지만, 형질주입 시약으로서 폴리에틸렌이민의 가장 큰 약점은 생물 분해성이 없는(non-biodegradable)성질 및 독성과 관련이 있다.
유전자 치료법에서 한 가지 특이한 접근법은 양이온 지질(cationic lipids)을 사용한다는 것이다. 그러나, 비록 많은 양이온 지질들이 세포 배양에서 우수한 형질주입 활성을 나타내지만, 대부분은 혈청의 존재 하에서는 잘 수행되지 않고 몇몇만이 생체 내에서 활성을 가진다. 리포플렉스(lipoplexes)가 압도적으로 많은 양의 음전하 및 혈액, 점액 상피 라이닝 유체(mucus epithelial lining fluid) 또는 조직 매트릭스(tissue matrix)에 존재하는 양친매성 단백질과 다당류에 노출될 때 사이즈, 표면 전하 그리고 지질 구조에서 현저한 변화가 일어난다.
생체 내로 일단 투여된 리포플렉스(lipoplexes)는 음전하로 하전된 혈액 성분과 반응하고, 큰 집합체(aggregates)를 형성하는 경향이 있으며, 이러한 큰 집합체는 순환하는 적혈구 세포의 표면에 흡착되거나, 두꺼운 점액층에 붙잡히게 되거나, 미소혈관계에 색전증(embolize)을 발생하게 하여, 리포플렉스가 먼 거리(distal location)에 있는 계획된 타겟 세포에 도달하는데 방해가 되게 한다.
게다가, 리포플렉스에 의한 유전자 도입(gene transfer)과 관련된 독성은 특히 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 유발을 포함한다. 사람에게서, 리포플렉스를 받은 환자들 사이에서 독감-유사 증상들을 포함한 다양한 정도의 부정적인 염증성 반응들이 보고되었다. 따라서, 리포플렉스가 모든 사람에게 안전하게 이용될 수 있는지는 여전히 의문이 남는다.
게다가, 비록 높은 분자량을 갖는 폴리머에 의해 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 향상된 안정성을 나타내지만, 그러한 폴리머들은 벡터 언팩킹(vector unpacking)을 방해할 수 있다. 예를 들어, 19와 36 폴리 엘 라이신(poly L-lysine, PLL) 잔기는 명백히 향상된 숏텀 유전자 발현(short-term gene expression)의 결과로 180 잔기 폴리 엘 라이신(poly L-lysine, PLL)보다 더 빠르게 DNA로부터 해리된다. 수용체 매개 유전자 운반에 활성된 구조 안으로 DNA를 채워 넣기 위해서는 최소한 6에서 8의 양이온 아미노산 길이가 필요하다. 그러나, 짧은 다양이온으로 만들어진 폴리플렉스는 생리학적 조건하에서 안정하지 않고 일반적으로 생리 식염수 내에서 빠르게 응집체(aggregate)가 된다.
이러한 부정적인 면을 극복하기 위하여 핵산의 방출을 촉진하기 위하여 세포내 환경에 의해 절단될 수 있는 Cys-Lys10-Cys 펩타이드의 산화 중축합(oxidative polycondensation)에 의해 만들어진 선형의(linear) 환원성 다양이온(reducible polycation, RPC)에 기초를 둔 새로운 형태의 합성 벡터를 개발했다. 그들은 RPC에 의해 만들어지는 폴리플렉스들은 DNA와 mRNA의 효과적인 방출을 가능하게 하는 환원 상태에 의해 불안정해질 수 있다는 것을 보여주었다.
양이온성 펩타이드 프로타민은 혈청 RNases에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 것으로 나타났다. 그러나 프로타민과 복합체를 형성한 mRNA만으로는 프로타민과 mRNA 사이의 강력한 결합력 때문에 암 백신 모델에서 제한된 단백질 발현과 효능을 보여주었다. 이 문제는 프로타민 제형 RNA가 발현 벡터가 아닌 면역 활성제로만 작용하는 RmRNAtive 백신 플랫폼을 개발함으로써 해결되었다.
CureVac은 Th1 T 세포 반응을 유도하는 TLR 7/8 작용제 역할을 하는 프로타민-제조된 RNA 복합체에 기반한 RNActive 백신 플랫폼을 개발한 반면, 뉴클레오티드-개질된 mRNA는 항원 생산자로서 기능한다. 이 백신 플랫폼은 전임상 동물 모델과 환자 모두에서 암과 전염병에 대해 유리한 면역 활성화를 일으켰다.
핵산의 세포 운반은 또한 단백질 형질전환 도메인(protein-transduction domains, PTDs)으로 표현하기도 하는 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptides, CPPs)의 물리적 조립(assembly) 또는 화학적 결합(ligation)에 기인한다는 흥미로운 전망이 발표되었다. CPP는 약 10에서 30개의 아미노산 서열을 가지고 있는 짧은 펩타이드에 해당하고 이것은 포유류 세포의 원형질막(plaa membrane)을 통과할 수 있고 따라서 세포의 약물 운반에 대해 전례가 없는 가능성을 제공할 수 있다.
이러한 펩타이드들의 거의 대부분은 낮은 pH에서 알파-헬릭스(α-helix)형태인 서열들의 조합에서 양이온 아미노산 시리즈를 포함한다. pH가 생체 내(in vivo)에서 양성자 펌프로 인하여 계속적으로 더욱 낮아질 때, 펩타이드의 형태적 변화는 보통 빠르게 개시된다.
이러한 헬릭스 모티브(helix motif)는 세포질(cytoplaa) 안으로 내용물의 방출을 유도하는 엔도좀의 막 안으로 삽입을 매개한다. *?**?*절단된 HIV-1 Tat 단백질(HIV-1 Tat protein) 기본 도메인은 원형질막을 통과하고 세포 핵에 축적된다*?**?*. 이러한 장점에도 불구하고, CPP로 매개된 약물 운반에 대한 주요 장애물은 종종 상피(epithelia)와 내피(endothelia)의 효소 장벽에 부딪히거나 통과할 때, 펩타이드의 빠른 대사 제거(metabolic clearance)를 포함하는 것으로 생각한다.
세포 전달 펩티드(CPP)는 핵산 전달의 세포내 전달을 위한 벡터로서의 잠재력에 대해 연구되었다. 그들의 내재화 메카니즘은 완전히 이해되지는 않지만, CPP는 세포 표면에서 음으로 하전된 글리코사미노 글리칸의 클러스터링을 촉진할 수 있다고 가정된다. 이는 거시 피노사이토시스 및 측면 확산을 유발하거나 지질 이중층을 직접 방해한다. 아르기닌이 풍부한 양친 매성 RALA 서열 반복을 갖는 CPP는 수지상 세포에 대한 mRNA 벡터로서 기능하고 T 세포 면역을 유발하는 것으로 보고되었다.
결론적으로, CPPs의 대사 안정성(metabolic stability)은 그들의 세포 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 위한 중요한 생물약제학(biopharmaceutical)의 요인을 나타낸다. 그러나, 한편으로는 그들이 대사적으로(metabolically) 절단되기 전에 그들의 전달물을 타깃으로 운반할 만큼 충분히 안정한 반면, 다른 한편으로는 그들이 독성수준을 축적하고 도달할 수 있기 전에 조직에서 완전히 없어질 수 있는 CPPs를 종래에는 이용할 수 없었다.
세포막의 장벽 외에도, RNA는 피부 및 혈액에 풍부하게 존재하는 세포 외 리보뉴클레아제에 의해 분해에 직면한다. 뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하고 그것의 음전하를 보호하기 위해, 아민-함유 물질은 일반적으로 비바이러스성 벡터로서 사용된다.
RNA 복합입자는 RNA를 효소 분해로부터 완전히 보호할 수 있는 능력이 있어야 하며, 신장 제거를 방지하면서 표적 부위의 혈관 외 유출 및 체류를 허용하는 적절한 크기를 가져야 한다. 그것은 또한 혈청 단백질 상호 작용을 방지하고 phagolysosomes을 회피하면서 세포에 의해 효율적인 유입을 허용하는 적절한 표면 특성을 소유해야 한다. 임상 적용을 용이하게 하는 다른 바람직한 특성은 조직 특이성, 생체 적합성을 향상시키고 독성을 감소시키기 위해 리간드를 표적으로 하는 용이한 기능화이다. 또한 RNA의 전달체는 세포질에 위치한 단백질 합성 장소에 RNA를 전달하기 위해 적시에 엔도솜을 벗어나는 문제에 직면한다.
본 발명의RNA 복합입자를 구성하는 mRNA의 골격은 핵산으로 핵산분해 효소들로부터 보호를 받아 혈액내에서 안정성이 확보되어야 하며, 본 발명의 이상적인 전달체는 상기 목적을 달성할 수 있어야 한다.
본 발명에서는 핵산의 화학적 변형, 핵산 말단의 보호 등을 실시할 수 있으며, 상기 RNA를 고분자 물질로 캡슐화하여 입자를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
RPC(reducible polycation)의 절단은 적은 분자량을 갖는 펩타이드와 비교할 수 있는 수준으로 다양이온의 독성을 감소시켰다. 이러한 접근법의 단점은 적절한 수준의 형질주입 효율을 향상시키기 위해 엔도좀 붕괴능(endosomolytic)약품 클로로퀸(chloroquine) 또는 양이온 지질 DOTAP가 추가적으로 필요하다는 것이었다. 결과적으로 환원성 다양이온(RPCs)에 엔도좀의(endosomal) 완충 능력이 있는 것으로 알려진 히시티딘 잔기를 포함할 수 있다.
그들은 히스티딘이 많은 환원성 다양이온은 엔도좀 붕괴능 약품 클로로퀸을 필요로 하지 않는 플라스미드 DNA, mRNA, 그리고 siRNA 분자를 포함하는 다양한 범위의 핵산의 충분한 세포질 운반이 가능하도록 하는 세포 내 환원 환경에 의해 절단될 수 있다는 것을 보일 수 있었다.
불행하게도, 히스티딘이 많은 환원성 다양이온을 바로 생체 내에 적용하는 것이 가능한 지에 대해 밝히지 못했다는 것이다. 형질주입은 세포 흡수를 제한하는 폴리플렉스에 혈청 단백질이 결합되어 유전자 도입을 향상시킬 수 있는 히스티딘 잔기의 능력이 가려지는 것을 피하기 위해 혈청이 없을 때 수행되었다. 히스티딘이 많은 환원성 다양이온 폴리플렉스의 형질주입 능력은 10% 우아혈청(FCS, fetal calf serum)에서 관찰된 GFP-양성 세포의 50% 감소된 혈청 단백질의 있을 때 영향을 받는다.
세포안으로 전달물 분자를 운반하는 기술에 대한 다른 접근법, 예를 들면, 유전자 치료법은 펩타이드 리간드(ligands)를 포함한다. 펩타이드 리간드는 타겟 암세포(target cancer cell)에 사용되는 EGF 펩타이드와 같은 수용체 인식에 필요한 필수아미노산을 대표하는 더 큰 단백질로부터 떨어져 나온 짧은 서열(sequences)일 수 있다. 다른 펩타이드 리간드는 렉틴 유사 산화 LDL 수용체(lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1))를 타겟으로 하는데 사용되는 리간드를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
상피 세포에서 LOX-1의 상향조절(Up-regulation)은 고혈압(hypertension) 및 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)과 같은 장애상태와 관련이 있다. 그러나, 펩타이드 리간드들은 복합체화나 부착에 의해 그들의 전달물 분자에 연결될 수 없고 공유결합을 필요로 하기 때문에 많은 유전자 치료학적 접근법에 적합하지 않으며, 일반적으로 세포 내에서 세포독성효과를 갖는 가교제(crosslinkers)를 예로들 수 있다.
유전자 치료와 다른 치료학적 응용의 목적을 위하여 핵산을 응집화(condensation)하고 안정화할 수 있고, 특히 생체내에서 핵산 전달물의 효과적인 방출 및 낮거나 전혀 없는 독성의 조합 측면에서, 효과적인 형질주입 활성을 보일 수 있는 적절한 방법이나 담체가 오늘날까지 나타나고 있지 않다.
유전자 운반의 목적을 위한 담체를 제공하기 위한 기술분야에서 여전히 강력한 요구가 있고, 이러한 강력한 요구는 그들이 대사적으로 절단되기 이전에 그들의 전달물을 타깃에 운반할 만큼 충분히 안정적이며, 다른 한편으로는 그들이 유독한 수준에까지 축적되거나 도달하기 이전에 조직으로부터 제거되어야 한다는 것이다.
RNA-기반 제제의 치료적 성공은 생체 내에서 RNA 전달과 관련된 많은 도전을 극복하는데 달려있다. 안전하고 효과적인 RNA 전달체의 개발은 RNA 기반 요법의 성공적인 적용을 위해 결정적이다. 나노 구조화된 전달체는 조기 분해로부터의 보호 및 생물학적 환경과의 개선된 상호 작용과 같은 고유한 장점을 제공한다. 또한 조직 흡수를 향상시키고 RNA 체류 시간을 연장하며 세포 내재화를 향상 시키며 RNA가 표적 세포의 세포질로 이동하는 것을 가능하게 한다.
RNA를 전달하는 전신적으로 전달된 LNP는 전달에 대한 다중 장벽에 직면한다. 특히 간과 비장에 있는 단핵식 포식작용 시스템 (MPS)은 나노 크기의 감염원에 대한 신체의 보호기능의 본래의 역할 때문에 주입된 나노 입자의 빈번한 목적지이다. 신장은 naked mRNA 또는 5.5 nm 미만의 유체 역학적 직경을 갖는 임의의 나노 입자를 걸러낸다.
대부분의 LNP는 직경이 약 100nm이고 MPS를 빠져 나가서 다른 관심 기관에 도달하지 못할 만큼 충분히 크다. MPS의 주요 기관인 간은 작은 구멍이 있는 혈관 구조를 가지며 양이온성 LNP를 보유하는 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 있다. 또한, 큰 양이온성 LNP는 폐에서 발견된 모세혈관에서 유출되지 않고 신장에 의해 혈류로 여과될 수 없다.
이것은 간, 폐 또는 다른 기관에 전달 물질이 축적될 수 있다. 따라서, 전달체 구성 요소의 클리어런스 및 생분해성은 mRNA 전달 물질을 개발할 때 한 가지 고려 사항이다.
에스테르 그룹은 생체 물질의 생분해성을 향상시키기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기능 그룹이지만 다른 에스테르 결합의 생체내 분해는 분자 및 제형의 전체 화학에 따라 달라질 수 있다. LP-01 및 지질 5 (토론됨) DLin-MC3-DMA (t1/2> 50 h)와 비교하여 단백질 발현이 더 적지 않은 경우에 비해 간에서 빠르게 반감되는 것으로 보고되었다(반감기 [t1/2] ~ 6 h).
특정 조직에서, 에스테르 작용기의 존재는 LNP의 분해를 가속화시켜 잠재적으로 단백질 발현을 제한할 수 있다. 예를 들어, OF-Deg-Lin은 간 세포에 도달할 수 있었지만 비장에서 단백질 발현을 선택적으로 유도했다. 간 효소에 의한 LNP의 급속한 분해 때문일 수 있다고 가정했다. 폴리 에스테르 또는 폴리 카보네이트에 기초한 분해성 지질 또는 중합체의 합리적인 설계는 전달체의 분해를 보다 잘 제어할 수 있다.
LNP로 간 이외의 특정 장기 또는 조직을 표적으로 하는 것이 더 어려운 것으로 입증되었다. 일부 LNP는 아포지 단백질 E-의존적 방식을 통해 간에서 축적되거나 흡수된다. APE의 경우, 중합체의 3 차 아미노 알코올의 핵심 구조가 특정 장기를 표적으로 하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
최근 수지상 세포 표면에서 시알 산-말단 당 단백질의 시험 관내 활성 표적화를 보고했다. 글루탐산-알라닌-류신-알라닌 (GALA)을 갖는 30- 아미노산 합성 펩티드는 EGFP-mRNA를 운반하는 폴리 플렉스에 접합된 반복 물이다. 그러나, 단백질 코로나를 형성하는 LNP의 임의의 옵소닌화는 표적화 리간드의 마스킹으로 인해 활성 표적화 전략에 해로울 수 있다. 따라서, 특정 조직을 표적화하는 새로운 전략이 임상적 과제를 해결하기 위해 연구될 필요가 있다.
RNA 기반 치료제를 세포에 전달하는 분야에서, 그 최종 종점에는 엔도좀 탈출이 자리하고 있다. 간으로의 ASO 및 siRNA 전달은 ASGPR 표적 GalNAc-siRNA 접합체에 의해 해결될 수 있고, LNP에 의한 mRNA 및 CRISPR 전달은 확실해 보이지만, 효과적이고 임상적으로 준비된 RNA 기반 치료제를 간 이외의 전신에 전달하기 위한 접근은 아직 최종 종점 단계에 머물러 있다.
정확한 이유는 알려져 있지 않지만, ASGPR은 거대 분자 약물이 간세포로 전달되는 데 매우 적합한 특성을 가지고 있다. ASGPR은 혈중 asialoglycoproteins에 결합하여 그들을 clathrin-coated endosome으로 끌어 들여 분해를 위해 리소좀에 유입시킨다. ASGPR 결합된 asi-aloglycoproteins은 세포질로 빠져 나가는 것으로는 생각되지 않는다.
그러나 간세포는 수많은 ASGPR를 세포 표면에 발현하는데, 이것들은 매 10~15분의 속도로 놀랄만큼 빠르게 순환한다. 최대의 RNAi 반응을 위해서는 최소 5,000개의 siRNA가 필요하다. ASGPR의 GalNAc 결합은 아주 드물게 막의 불안정성을 유발하며, 이는 수백만의 siRNA 분자가 ASGPR 엔도좀으로 매 15분 마다 들어가고, 0.01%보다 낮은 탈출 효율을 가짐으로써, GalNAc 전달을 통해 하루 동안 5,000개가 넘는 분자를 전달할 수 있다. 불행히도, 이렇게 빠른 속도로 수용체를 발현시키거나 엔도좀으로 빠르게 순환시킬 수 있는 다른 리간드-수용체 시스템은 존재하지 않는다.
사실, 대부분의 세포 표면 수용체는 10,000-100,000 범위(또는 그 이하)로 발현되며, 카베올린 및 클라트린 매개 세포막 포집은 일반적으로 90분 단위로 회전된다. 이론적으로, 수용체를 표적으로 하는 전달법은 매 2시간마다 세포의 엔도좀에 ~ 100,000개 이상의 siRNA를 가져올 수 있다. 그러나 엔도좀 탈출 효율이 0.01% 미만으로 추정되는 경우 최소 5,000개인 필요 임계점에 도달하기가 어렵게 된다. 현재 여러 연구 그룹이 엔도좀 탈출 문제에 대한 해결책을 연구하고 있다.
고전적인 접근법은 저분자성 엔도좀 분해 인자인 클로로퀸을 사용하는 것이다. 클로로퀸(chloroquine)은 세포막을 통해 수동적으로 확산하여 pH가 떨어지면 양성자가 되어 엔도좀 내부에 갇히게 되어 엔도좀 내 농도가 급격히 증가한다. 클로로퀸은 소수성 모티프를 지질 이중층에 삽입하고 일정 농도에서 엔도좀을 용해시킨다. 그러나 효과를 나타내는 농도에서 이러한 엔도좀 분해 인자들은 비 특이적으로 siRNA 화합물을 포함하는 엔도좀 뿐만 아니라 다른 세포 내 엔도좀을 용해시켜 독성을 일으킨다. 결과적으로, 이러한 저분자 엔도좀 분해 인자들은 개발 단계에서 주목을 받았지만, 현재 임상 용도로 쓰기에는 잠재적 독성 위험이 있다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 나노입자, Polyectrolyte complex(PEC) 및 젤등을 제공하도록 한다.
상기 관심 폴리펩타이드 mRNA 발현카세트는 주사제, 크림 및 구강 점막 투여, 연고, 젤, 흡수제, 먹든 약을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 방법 이상을 제공하도록 한다.
본 발명의 목적은 상기 문제점을 포함한 추가적인 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 관신 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA 발현카세트 전략으로 질병 예방 및 악화 방지 효과, 특히 종양 조직에서의 항암물질의 이동 촉진을 통한 높은 항암 치료 성적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실시자를 돕기 위해, 본 발명에 대한 실험적 뒷받침을 제공하기 위해, 그리고 모델 프로토콜을 제공하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1. 체내 세포에서 합성되고 체액으로 분비하여 세포를 투과하여 다기능 키메라 분자의 설계, 합성 및 평가
본 발명에서, 체내 세포에서 직접 합성되어; 체액으로 분비되고; 세포막을 투과하여 세포질로 이동하며, 생물학적 기능을 수행하는 관심 폴리펩타이드(POI)의 효능 극대화를 위해, POI를 코팅하는 mRNA 발현카세트를 제공하고자한다.
상기 POI mRNA 발현카세트의 구성은 (일반식 1)과 같다. 상기 POI mRNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수도 있다.
5'CAP-5‘UTR-POI ORF-3'UTR (일반식 1)
상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 ORF(open reading frame): (b) 5' UTR; (C) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 발현카세트일 수도 있다.
상기 POI mRNA 발현카세트가 체내 세포에 도입되어 직접 합성된 POI의 구성은 (일반식 2)와 같다.
본 발명의 체내 세포에서 직접 합성되는 POI는 체액으로 이동하도록 하는 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP); 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP) 또는 세포의 표면에 잇는 RECEPTOR에 결합하는 펩타이드 리간드; 및 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드;를 포함하도록 한다. SSP는 POI의 N 말단에 있으며 나머지는 순서에 무관할 수도 있다.
생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드와 CPP 또는 결합 펩타이드 리간드 사이에 엔도펩타이다제, 예를 들어 Cathepsin B에 절단되는 아미노산을 추가할 수도 있다.
분비 신호 펩타이드-생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드-세포 투과성 펩타이드 (일반식 2)
본 실시에에서 분비 신호 펩타이드는 다른 신호 펩타이드 서열의 비교를 수행하고 계산적으로 설계된 서열인 secrecon로 서열번호 1이다.
secrecon: MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (서열번호 1)
*Secrecon에 알라닌이 한 개 또는 두 개를 추가할 수도 있다.
세포 투과성 펩타이드(CPP)는 폴리 아르기닌 (D-Arg) 8이고 서열번호 2이다, 펩타이드의 C 말단에 융합되어 세포로의 침투를 촉진하였다.
(D-Arg) 8 : RRRRRRRR (서열번호 2)
본 실시예는 EGFR에 결합 펩타이드 리간드는 12개 아미노산으로 이루어진 서열번호 3이다.
GE11: YHWYGYTPQNVI. (서열번호 3)
Transferrin receptor 결합 펩타이드 리간드는 12개 아미노산으로 이루어진 서열번호 4이다.
TfR-T12: THRPPMWSPVWP (서열번호 4)
본 실시례에서 표적 폴리펩타이드(Target Polypeptide, Tp)를 녹다운시키는 전략을 제시하고자하는데, 이에 따라 POI는 표적 폴리펩타이드를 분해하여 녹다운시키는 E3 ligase 또는 p-PROTAC이며, 구체적으로 이를 체내에서 합성하는 전략으로 E3 ligase 또는 p-PROTAC mRNA 발현카세트를 제시한다.
1.1. E3 ligase Parkin
먼저, 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드는 E3 ligase Parkin이고, 세포 투과성 펩타이드(CPP), 분비 신호펩타이드를 N-말단에 배치하여 키메라 폴리펩타이드를 설계하였다.
이어서, 이를 역번역(reverse-translation)하여 이를 코딩하는 RNA를 설계하였다. 설계된 RNA를 mRNA 발현카세트에 재조합하여 E3 ligase mRNA 발현카세트를 완성할 수 있다.
본 실시례에서 생물학적 기능이 있는 단백질로 465aa인 E3 ubiquitin-protein ligase parkin [EC 2.3.2.31] (Parkin)이고 아미노산 서열은 서열번호 5이다. 유전자는 prkn이라고 하며 genbank NM_004562이다.
MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVPADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQQSIVHIVQRPWRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV (서열번호 5)
Parkin 폴리펩티드는 E3 리가제로서, 대표적인 운동 장애 신경퇴행성 질환인 파킨슨 질환 및 여러 암에서 변이가 있다. 신경퇴행성 질환에서의 연구가 가장 활발히 진행되어 왔으며, 파킨슨 질환에서 도파민 신경세포의 사멸을 매개하는데 있어서 돌연변이 혹은 산화 스트레스에 의한 Parkin의 효소 활성 이상이 중요한 역할을 한다. Parkin의 결손 혹은 기능 이상 모델의 경우 도파민 신경세포 사멸이 유도되고, 반대로 산화 스트레스를 유발하는 독소 마우스 모델의 경우 Parkin의 과발현으로 도파민 신경세포 사멸을 억제한다.
또한, parkin의 보호 효과가 알츠하이머 독성 단백질인 베타-아밀로이드에 대해서도 있으며, 근육 세포를 사용한 실험에서도 산화 스트레스에 대한 parkin의 보호 효과가 있다.
다중 단백질 E3 유비퀴틴 리가제 복합체 내에서 기능하여 유비퀴틴 모이어티가 BCL2, SYT11, CCNE1, GPR37, RHOT1 / MIRO1, MFN1, MFN2, STUB1, SNCAIP, SEPTIN5, TOMM20, USP30, ZNF746 및 AIMP2와 같은 기질 단백질에 공유 결합하는 것을 촉매한다.
1.2. p-AUTOTAC의 설계
본 발명의 pAUTOTACC mRNA 발현카세트는 POI의 체내 세포에서 발현할 수 있도록 하는 염기서열 및 변형을 포함하고 있으며, pAUTOTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 분비 신호 펩타이드는 체액으로 분비, CPP는 POI의 세포투과를 용이하게 하여 pAUTOTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 p-AUTOTAC이 표적 폴리펩타이드에 결합하도록 하며, 마지막으로, p62 단백질 결합 모티프는 체내 단백질 제거 메커니즘 중 자가포식(Autophagy)을 하도록 하여 궁극으로 표적 폴리펩타이드를 효율적으로 분해하는 전략이다.
AUTOTAC은 일반적으로 표적 폴리펩타이드의 후속 분해를 유도하기 위해 표적 폴리펩타이드와 p62 단백질 사이의 다리 역할을 하는 이중 기능성 분자이다.
p-AUTOTAC은 펩타이드 기반 표적 폴리펩타이드 결합 성분, 펩타이드 링커 및 p62에 대한 결합 펩타이드 결합성분으로 구성된다.
키메라 펩타이드 p-AUTOTAC는 다음의 일반적인 구조를 갖는다.
TpBM-L-p62BM
여기에서, TpBM은 표적 폴리펩타이드 결합 모티프(Target Polypeptide binding motif, TpBM)를 나타내고, p62BM(p62 ligase binding motif)은 p62 단백질 결합 펩타이드, 서열번호 6 및 7를 포함하고, 모티프는 연결기, 예를 들어, 결합부 또는 펩타이드 연결 모티프를 나타낸다.
R-11 peptide: Arg Ile Phe Ser Thr Ile Glu Gly Arg Thr Tyr Lys (서열번호 6)
W-11 peptide: Trp Ile Phe Ser Thr Ile Glu Gly Arg Thr Tyr Lys (서열번호 7)
당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 폴리펩타이드는 각각의 기능적 펩타이드의 수 및 위치가 목적하는 대로 변경될 수 있도록 합성될 수 있다.
특정 실시예에서, TpBM의 표적 폴리펩타이드는 타우뿐만 아니라 p62 단백질과 상호작용하는 폴리펩타이드일 수도 있다. TpBM은 하기 서열번호 8 또는 9일수도 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 기술된 키메라 폴리펩타이드은 다수의 TpBM, 다수의 펩타이드 연결기 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 기술된 바와 같은 유효량의 mRNA 발현카세트 또는 이의 염 형태, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
1.3. p-PROTAC의 설계
본 발명의 pPROTAC mRNA 발현카세트는 POI의 체내 세포에서 발현할 수 있도록 하는 염기서열 및 변형을 포함하고 있으며, pPROTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 분비 신호 펩타이드는 체액으로 분비, CPP는 POI의 세포투과를 용이하게 하여 pPROTAC mRNA 발현카세트가 코딩하는 p-PROTAC이 표적 폴리펩타이드에 결합하도록 하며, 마지막으로, proteasome-targeting 모티프는 표적 폴리펩타이드의 분해를 하도록 하여 궁극으로 표적 폴리펩타이드를 효율적으로 분해하는 전략이다.
PROTAC은 일반적으로 표적 폴리펩타이드의 후속 분해를 유도하기 위해 표적 폴리펩타이드와 E3 리가아제 사이의 다리 역할을 하는 이중 기능성 분자이다.
p-PROTAC은 펩타이드 기반 표적 폴리펩타이드 결합 성분, 펩타이드 링커 및 E3 유비퀴틴 리가아제에 대한 결합 펩타이드 결합성분으로 구성된다.
키메라 펩타이드 p-PROTAC는 다음의 일반적인 구조를 갖는다.
TpBM-L-UBM
특정 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 다음의 일반적인 구조 (A)를 갖는다.
TpBM-L-VBM (A)
특정 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 다음의 일반적인 구조 (B)를 갖는다.
TpBM-L-CBM (B)
여기에서, TpBM은 표적 폴리펩타이드 결합 모티프(Target Polypeptide binding motif, TpBM)를 나타내고, UBM(Ubiquitin ligase binding motif)은 VBM(VHL 리가아제-결합 모티프) 및 CBM(세레블론 리가아제-결합 모티프)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 E3 유비퀴틴 리가아제 결합 모티프를 나타내고, 모티프는 연결기, 예를 들어, 결합부 또는 펩타이드 연결 모티프를 나타낸다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 폴리펩타이드는 각각의 기능적 펩타이드의 수 및 위치가 목적하는 대로 변경될 수 있도록 합성될 수 있다.
특정 실시예에서, 구조체 (A)의 TpBM은 타우뿐만 아니라 VHL E3 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 리간드이다.
특정 실시예에서, 구조체 (B)의 TpBM은 타우뿐만 아니라 CLM E3 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 리간드이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 기술된 키메라 폴리펩타이드은 다수의 UBM, 다수의 TpBM, 다수의 펩타이드 연결기 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명에 기술된 바와 같은 유효량의 mRNA 발현카세트 또는 이의 염 형태, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공한다.
1.4. Tau를 분해하는 p-PROTAC의 설계
본 발명의 POI mRNA 발현카세트에서 코딩하는 생물학적 기능이 있는 폴리펩타이드는 Tau를 분해를 유도할 수 있는 다기능 키메라 p-PROTAC로 (1) Tau를 인식할 수 있는 TpBM, (2) E3 리가제에 결합하기 위한 UBM, (3) 세포 침투 펩타이드의 세 부분으로 구성하였다.
Tau는 구조화되지 않은 유연한 폴리펩타이드로 세포 내 Tau의 인식 및 분해를 촉진하기 위해 일련의 다기능 키메라 p-PROTAC를 합성하였다(표 1).
먼저, Tau를 선택적으로 인식하기 위해 Tau와 상호 작용하는 것으로 알려진 α- 및 β-tubulin에서 두 가지 펩타이드를 선택하였다. α (430-441) KDYEEVGVDSVE (서열번호 8) 및 β (422-434) : YQQYQDATADEQG (서열번호 9).
동시에, 3개의 E3 리가제의 기질에 기초한 3개의 펩타이드를 E3 리가제를 모집 모티프를 선택하였다. 하나의 펩타이드는 Skp1-cullin-F 박스 (SCF) E3 리가제에 결합된 IκBα에서 유래된 DRHDS(p)GLDS(p)M (서열번호 10)이었다. 다른 하나는 E3 리가제의 기질인 von Hippel-Lindau 종양 억제 폴리펩타이드 (VHL)에 결합하는 HIF-1α에서 유래한 ALAPYIP (서열번호 11)이다. 나머지는 E3 리가제의 기질인 Keap1에 결합 펩타이드 리간드는 LDPETGEYL (서열번호 12)이다.
링커로 Tau 인식 모이어티는 유연성을 높이기 위해 짧은 펩타이드인 GSGS (서열번호 13) 또는 GGSGG (서열번호 14)를 사용하여 E3-리가제 결합 모이어티에 연결하였다.
이러한 다기능 펩타이드가 세포막을 관통하여 세포 내 Tau 폴리펩타이드와 E3 리가제에 결합할 수 있다.
<표 2>에 제시한 일련의 다기능 키메라 펩타이드는 Tau 분해를 유도하기 위한 후보이다.
Tau 분해 목적 p-PROTAC의 예시
Figure pat00003
Entity Recognize Tau Linker Recruit E3 Ligase
TH001 KDYEEVGVDSVE (서열번호 8) GSGS (서열번호 13) DRHDS(p)GLDS(p)M (서열번호 10)
TH002 YQQYQDATADEQG (서열번호 9) GSGS (서열번호 13) DRHDS(p)GLDS(p)M (서열번호 10)
TH003 KDYEEVGVDSVE (서열번호 8) GSGS (서열번호 13) ALAPYIP (서열번호 11)
TH004 YQQYQDATADEQG (서열번호 9) GSGS (서열번호 13) ALAPYIP (서열번호 11)
TH005 KDYEEVGVDSVE (서열번호 8) GSGS (서열번호 13) LDPETGEYL (서열번호 12)
TH006 YQQYQDATADEQG (서열번호 9) GSGS (서열번호 13) LDPETGEYL (서열번호 12)
1.5.면역글로불린 Fc의 설계
Hinge가 포함되거나 포함되지 않은 면역글로불린 Fc (IgG1-Fc (힌지 불포함: 서열번호 15; HIgG1-Fc (힌지 포함; [서열번호 14]-[서열번호 15])가 POI목적 폴리펩타이드와 융합된 융합 폴리펩타이드 POI-IgG1, POI-HIgG1를 제조하였다. 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 각 부분의 아미노산 서열을 아래의 표 3에 정리하였다.
면역글로불린 Fc 및 링커의 아미노산 서열
항목 아미노산 서열
IgG1 Fc Hinge DKTHTCPPCP (서열번호 14)
CH2-CH3 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (서열번호 15)
Linker GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (서열번호 16)
실시예 2. 다기능 키메라 분자 mRNA 발현카세트의 제조
<도 1>과 같이 제시한 mRNA 발현카세트의 구성은 실시례 1항에서 제시된 생물학적 기능을 하는 E3 ligase 일종인 parkin 및 <표 2>에 제시한 설계된 키메라 펩타이드 p-PROTAC를 역번역(Reverse Translate)하여 설계된 RNA 및 5‘UTR, 3'UTR 및 5’ Cap 구조로 설계하였다.
E3 ligase mRNA 발현 카세트는 5‘CAP-5'UTR-서열번호 1-E3 ligase-CPP 또는 결합 페타이드 리간드-3’UTR일수 있다.
또 다른 Tau 분해 p-PROTAC mRNA 발현 카세트는 5‘CAP-5'UTR-서열번호 1- TH01, THO2, TH03, TH04, TH05 또는 TH06-CPP 또는 결합 페타이드 리간드-3’UTR일수 있다.
2.1. RNA 발현카세트 주형의 설계 및 제조
본 발명의 RNA 발현카세트는 세포에서 단백질 합성이 가능한 구조를 갖는 RNA를 제안하였다. 본 발명에서 사용되는 RNA 발현카세트의 POI를 코딩하는 ORF를 포함하며 제한되는 것은 아니다. 상기 POI를 포함한 다양한 단백질들이 안정적으로 발현할 수 있는 특히, 발현카세트가 선형 핵-비의존적으로 세포질 발현이 가능한 RNA 발현카세트는 다음과 같이 제조하였다.
1) RNA 발현카세트 주형의 설계
상기 RNA 발현카세트는 비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체 등이 있다. 상기 비증폭 mRNA 구조체는 (a) 상기 POI를 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF): (b) 5' UTR; (c) 3' UTR; 및 (d) 5' 캡 구조(cap structure) 또는 IRES;를 포함한다. 상기 자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체는 (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및 (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 POI를 코딩하는 ORF를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며, 여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함한다.
본 발명의 RNA 발현카세트를 제조하기 위해, POI ORF를 제조할 수 있는 T7 프로모터가 있는 POI DNA를 설계하고 제작하여 pUC19 클로닝 벡터에 재조합하고, 재조합 pUC19 벡터에서 얻은 T7 프로모터가 있는 POI DNA를 주형으로 체외전사한 후, 5′Cap 구조를 전사체에 부가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 E3 ligase mRNA 발현 카세트의 주형 DNA 절편은 <T7 promoter - 5'UTR - 서열번호 1 - E3 ligase - CPP 또는 결합 펩타이드 리간드 - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조하였다. 264+1395=1659
또 다른 Tau 분해 p-PROTAC mRNA 발현 카세트의 주형 DNA 절편은 <T7 promoter - 5'UTR - 서열번호 1 - TH01, THO2, TH03, TH04, TH05 또는 TH06-CPP 또는 결합 펩타이드 리간드 - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조하였다. 264+53=339
본 발명의 POI DNA는 POI orf를 효율적으로 합성할 수 있는 DNA 절편으로 <T7 프로모터 다음에 5'UTR, POI를 코딩하는 ORF, 3'UTR>로 구성된 DNA 절편을 설계하였다.
본 발명의 POI DNA는 pUC19 벡터에서 T7 promoter와 5'UTR의 하류에 위치하면서, muag (mutated alpha-globin-3′UTR), A64 폴리(A) 서열, 폴리(C) 서열(C30) 및 히스톤 스템-루프 서열(히스톤-SL)서열의 상류에 위치하게 하였다.
상기 POI DNA 절편을 구성하는 단위 요소들은 <표 4>과 같다.
POI RNA 발현카세트를 구성하는 염기서열
Backbone DNA or amino acid sequences
T7 promoter TAATACGACT CACTATAGGG (서열번호 17)
hAg-Kozak ATTCTTCTGG TCCCCACAGA CTCAGAGAGA ACCCGCCACC(서열번호 18)
muag - A64 - C30 - 히스톤S GCCCGATGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCGAGATTA ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATGCA TCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCAAAGGCTC TTTTCAGAGC CACCA (서열번호 19)
2 BgUTR CCGAGAGCTC GUCGGCCAAC AAAAGGTTCU TGCCCAAGTC CAACA CAAAC TGGGGGATAT TATGAAGGGC CTTGAGCATC TGGATTCTGC CTAATAAAAA ACATTTACAT TGCTGCGTCG AGAGCTCGCT TCTTGCTGTC CAATTTCTAT TAAAGGTTCC TTTGTTCCCT AAGTCCAACT ACTAAACTGG GGGATATTAT GAAGGGCCTT GAGCATCTGG ATTCTGCCTA ATAAAAAACA TTTACATTGC TGCGTC (서열번호 20)
A30LA70 GAGACCTGGT CCAGAGTCGC TAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCATAT GACTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA(서열번호 21)
본 발명의 5'UTR는 마우스 리보솜 단백질 라지 35A (mRPL35A)일 수 있으며, 그 염기서열은 서열번호 22이다.
GGGCCATCTT GGCGCCTGTG GAGGCCTGCT GGGAACAGGA CTTCTAACAG CAAGTAAGCT TGAGGATG (서열번호 22)
5'UTR 요소는 5' 말단 올리고피리미딘관이 결여된 인간 리보솜 단백질 라지(Large) 32의 5'-UTR: human ribosamal protein Large 32 lacking the 5' terminal oligopyrimidine tract GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC (서열번호 23)
바람직하게는 인간 하이드록시스테로이드 (17-베타) 디하이드로게나아제 4 유전자(HSD17B4)로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며 서열번호 24이다.
GGGTCCCGCA GTCGGCGTCC AGCGGCTCTG CTTGTTCGTG TGTGTGTCGT TGCAGGCCTT ATTCAAGCTT ACCATG (서열번호 24)
바람직하게, 상기 5'UTR는 hAg-Kozak로 서열번호 18이다
상기 5'UTR는 Kozak 컨센서스를 포함하며, Kozak 컨센서스 서열은 ACCATGG (서열번호 25) 일 수도 있다.
3'UTR는 muag - A64 - C30 - 히스톤-SL 및 2 BgUTR-A30LA70을 포함하는 구조에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다. POI이 융합단백질인 경우는 링커는 (G4S)3-linker 그리고. POI을 세포외부로 분비하는 목적으로 Sec을 사용할 수 있다.
여기에서 3'UTR은 서열 5'-GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3'(서열번호 26; muag; 밑줄 친 뉴클레오타이드는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이임) (알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR, 폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닌 뉴클레오타이드, 폴리(C) 서열은 30개의 사이토신 뉴클레오타이드, 히스톤 스템-루프는 (5'-CAAAGGCUCU UUUCAGAGCC ACCA-3' 서열번호 27)로 이루어진 RNA 서열이다.
A64: GGACTAGTAG ATCTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA (서열번호 28)
C30: TGCATCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCTCTA G (서열번호 29)
본 발명에 사용하는 POI는 E3 ligase를 포함하는 치료용 단백질; p-PROTAC을 포함하는 단백질을 사용하였으며, 이들에 국한되는 것은 아니다.
2) POI RNA 발현카세트의 제조
본 발명에서 사용되는 POI RNA 발현카세트의 POI는 E3 ligase를 포함하는 치료용 단백질; p-PROTAC을 포함하는 단백질을 코딩하는 ORF를 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 POI DNA 절편은 <T7 promoter - 5'UTR - POI ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 합성하였으며(TriLink Biotenologies 사, 미국), 이를 주형으로 정방향 플라이머 5'-GAATTC TAAT ACGACTCACT ATAGGGGAGA CCACAACGGT TTCCCTCTAG AAAGAACCAT GAACACGATT AACA-3' (서열번호 30) 및 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 31)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 EcoRI/BamHI 인식서열이 포함되어 있다.
증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 재조합하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 EcoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 2).
본 발명에서는 캡된 화학적 변형이 있는 뉴클레오타이드를 포함하는 POI ORF으로 이루어진 RNA 발현카세트를 아래와 같이 제작하였다.
캡된 POI mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 <T7 promoter - 5'UTR - POI ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>을 가지는 DNA가 삽인된 pUC19 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 서열번호 26 및 역방향 프라이머 서열번호 27을 사용하여 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 주형으로 체외전사하였다(도 3).
상기 PCR 산물, T7 promoter-POI DNA를 주형으로 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioSCienCe, 미국)를 이용하여 캡된 POI 변형 mRNA를 포함하는 발현카세트를 시험관 내에서 합성하였다.
구체적으로 살펴보면, anti-reverse Cap analog[(ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G Cap analog라고도 부름)] 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드 포함하는 반응용액 (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP)에서 체외전사를 실시하였다. dsDNA 주형을를 제거하기 위해서 DNA nuclease를 첨가하였고, 남아있는 캡된 표적단백질 변형 mRNA는 에탄올 침전법 또는 spin Column membrane을 이용하여 정제하였다.
대조군으로 T7 promoter-POI DNA 주형에서 얻은 RNA 전사체에 5′Cap 구조를 부가한 캡된 POI mRNA 합성은 Hiscribe™ T7 ARCA mRNA Kit(NEB, 미국)를 이용하여 실시하였는데, 천연 캡(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG)을 부가하여 제조하였다.
2.2. 콜레스테롤의 부가 및 안정성
본 발명의 oligo-chol은 상기 RNA 발현카세트의 3‘말단의 20개의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드와 cholesterol(chol)이 접합된 구조체로 제조하였다(바이오니아, 한국).
상기 항에서 제조한 캡된 RNA 발현카세트 또는 캡된 변형 RNA 발현카세트와 하기 제조된 oligo-chol을 혼성화하여 RNA 발현카세트(RNA)와 oligo-chol이 상보적인 결합을 한 RNA-oligo-chol 발현카세트 hybrid를 제조하였다.
여러 종류의 RNA 발현카세트 15 pmole과 oligo-chol 15 pmole을 섞어 총 5 ul가 되도록 nuclease free water를 넣어준 뒤 95℃에서 5분간 가열한 후 25℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 혼성화 비율은 RNA 발현카세트와 oligo-chol의 몰 비율로 1:1, 1:5, 1:10으로 하고 2% agarose gel로 retardation assay를 통해 확인한 결과 1:1로 혼성화하였을 때 단일밴드로 확인되었다.
상기 제조한 다양한 RNA-발현카세트와 oligo-chol로 제조한 hybrid의 혈청에서 안정성을 조사하였는데, 혈청 용액에 제조한 다양한 RNA-oligo-chol 발현카세트를 처리하여 시간별 시료를 채취하여 남아있는 hybrid를 분석하였다.
<도 4>에서 제시한 결과처럼, 상기 제조한 캡된 RNA 발현카세트, 캡된 변형 RNA 발현카세트 및 3'말단에 cholesterol이 부가된 캡된 변형 RNA 발현카세트를 세포 배양액에 다양한 시간 동안 처리한 후 RT-PCR하여 in vitro 안정성을 확인하였다.
상기 제조한 캡된 변형 RNA 발현카세트는 캡된 RNA 발현카세트보다 in vitro 안전성이 매우 우수하였으며, 3'말단에 cholesterol이 부가된 캡된 변형 RNA-oligo-chol 발현카세트 접합체가 가장 안정성이 높았다.
실시예 3. 다기능 키메라 분자 mRNA 발현카세트의 기능 평가
3.1. Neuro-2a에 pRK5-EGFP-Tau P301L의 형질전환
Tau 분해를 유도하는 이러한 다기능 펩타이드의 능력을 조사하기 위해 EGFP (Tau-EGFP)에 융합된 Tau 폴리펩타이드를 발현하는 안정적인 마우스 신경 모세포종 N2a 기반 세포주를 구축하였다. 마우스 Neuro-2a (ATCC® CCL-131™)은 Thermofisher 사(미국)로부터 구입하였다. 세포를 Dulbecco의 변형 된 Eagle 's 배지와 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 OPTI-MEM의 1 : 1 혼합물에서 배양하고 37℃에서 5 % CO2에서 배양하였다. 플라스미드 pRK5-EGFP-Tau P301L는 Addgene사(미국)에서 구입하였다. 형질 감염 전에 세포를 5 × 104 세포 / cm2의 밀도로 접종 하였다. 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)을 사용하여 플라스미드로 형질 감염하였다. 달리 명시되지 않는 한, 분석은 형질 감염 후 48 시간에 수행하였다.
3.2. mRNA 발현카세트 유입 및 평가
정량적 세포 투과성을 위해, <5‘CAP - 5'UTR - 서열번호 1 - TH04 - CPP - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서로 제조된 mRNA 발현카세트를 Magic™ mRNA Transfection Reagent(Creative Biolab, 미국)의 지침에 따라 human embryonic kidney 293 cells 형질전환하였다.
Corning Trans well plate(Sigma-Aldrich 사, 미국)의 상층에 본 발명에서 제조한 mRNA 발현카세트가 형질도입된 293 세포를, 그리고 하층에 pRK5-EGFP-Tau P301L이 형질주입된 Neuro-2a 세포를 DMEM 배지에서 공동배양하면서 본 발명의 mRNA 발현 카세트의 성능을 분석하였다. 공동 배양 시간에 따라 형질주입된 Neuro-2a 세포에서 tau 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석하였다(도 5).
웨스턴 블로팅은 Cell Signaling Technology (미국)에서 제공하는 표준 지침을 사용하여 수행하였다. 공동 배양시간별로 수확된 형질주입된 Neuro-2a 세포에서 추출된 단백질 (40μg)을 Tris-HCl (125mm (pH 6.8)), SDS (4 %), 글리세롤 (20 %), DTT (10mm) 및 브롬페놀블루염료 (0.002 %)를 포함하는 2x 샘플 버퍼에 용해시켰다. 샘플을 95℃에서 10 분 동안 끓여서 스핀다운시킨 다음 단백질 (40μg)을 SDS-PAGE에 적용하고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 2.5 % BSA 및 TBS-T (0.1 % Tween20으로 보충된 Tris 완충 식염수)에서 1 시간 동안 차단한 다음 anti-tau (최종 희석 1:1000, Dako, A0024) 및 액틴 항체 (최종 희석 1:1000, Beyotine사, 미국)가 1차 항체로 사용하였다. HRP 접합체 (1:5000 희석, Thermofisher사, 미국)를 2차 항체로 사용하였다. 밴드는 ECL (Enhanced chemiluminescence) 키트 (GE Healthcare 사, 미국)를 사용하여 탐지하고 ChemiDoc XRS 시스템 (Bio-Rad 사, 미국)으로 시각화하였다(도 5). 단백질 정량은 Quantity One 버전 4.6.2를 사용하여 액틴에 상대적으로 표준화하여 수행되었습니다.

Claims (23)

  1. (a) 체내 세포에서 합성 및 분비되고;
    (b) 세포막을 투과하여,
    (c) 생물학적 기능을 수행하는 관심 폴리펩타이드(Polypeptide of interest, POI)를 코딩하는 발현카세트 및 이의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현카세트는 DNA 유형 또는 RNA 유형을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  3. 제2항에 있어서, 상기 DNA 유형은 플라스미드 또는 바이러스 운반체를 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  4. 제2항에 있어서, 상기 mRNA 유형은 선형 RNA인 mRNA 발현카세트 또는 바이러스 운반체를 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 mRNA 발현카세트는
    비증폭 mRNA(non-amplifying mRNA) 구조체; 및
    자가 증폭 mRNA(self-amplifying mRNA) 구조체;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비증폭 mRNA 구조체는
    (a) 상기 POI를 코딩하는 ORF(open reading frame):
    (b) 5' UTR;
    (C) 3' UTR; 및
    (d) 5' 캡 구조(Cap structure) 또는 IRES(internal ribosome entry site);를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 발현카세트 및 이의 용도.
  7. 제5항에 있어서, 상기 자가 증폭 mRNA 구조체는
    (a) RNA dependent RNA polymerase(RdRp)를 발현시키기 위한 mRNA 구조; 및
    (b) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있고 상기 POI를 코딩하는 ORF;를 포함하는 mRNA 레플리콘(replicon)을 포함하며,
    여기서, 상기 두 종류의 구성요소가 동일한 한 개의 RNA에 있는 시스-레플리콘 RNA 구조체 또는 각각 상이한 두 개의 RNA에 있는 트렌스 레플리콘 RNA 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  8. 제4항 내지 제7항에 있어서, 상기 RNA 발현카세트는
    당 변형, 염기 변형, 백본 변형 및 지질 변형을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 화학적 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  9. 제4항 내지 제8항에 있어서, 상기 RNA 발현카세트는
    G/C 함량, 코돈 최적화(optimization), UTR 변형, 30개 초과의 아데노신 뉴클레오타이드를 갖는 폴리(A) 꼬리, 폴리(C) 서열, 5'캡(CAP) 구조 및 히스톤-스템-루프 서열을 포함하는 염기서열 변형으로부터 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  10. 제4항 내지 제9항에 있어서, 상기 발현카세트는 콜레스테롤(Cholesterol)과 비공유결합 또는 공유결합을 하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  11. 제1항에 있어서, 상기 POI는
    (a) 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP);
    (b) 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP) 또는 세포 표면에 있는 수용체에 결합하는 펩타이드 항체의 절편 또는 항체; 및
    (c) 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드;를 포함하는 구성성분을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  12. 제11항에 있어서, 상기 POI에
    (a) IgG1의 Fc 영역; 및
    (b) IgG4의 Fc 영역;을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역에서 선택되어진 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  13. 제11항에 있어서, 상기 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP)는
    관심 폴리펩타이드를 체액으로 이송하며, 하기 특징을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, 분비 신호 펩타이드(Secretory Signal Peptide, SSP)이며,
    (a) N-말단의 양성 전하 부위;,
    (b) 중앙의 소수성 코아(hydrophobic core) 부위; 및
    (c) C-말단의 절단 부위로 구성되어 신호 펩티다제 (signal peptidase)에 의해 인지되는 부위;를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  14. 제11항에 있어서, 상기 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)는
    POI를 원형질 막 내로 전달하며, 하기 특성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, 세포 또는 조직 투과성을 갖는 펩타이드(CPP)이며,
    (a) 아미노산 길이: 9 - 13
    (b) 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P)
    (c) 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60
    (d) 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
    (e) 소수성 지수(Hydropathy): 소수성 지수의 전체 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY): 2.1 - 2.6; 및
    (f) 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임;을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 12개 아미노산 서열로 구성된 하기 일반식을 갖는 것인 CPP:
    (일반식 3)
    Figure pat00004

    상기 일반식 3에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있으며; 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성되고, 12'에 있는 P는 프롤린임을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  16. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 기능을 하는 폴리펩타이드는
    E3 ligase, p-PROTAC(Peptide-Proteolysis targeting chimera) 및 p-AUTOTAC(Peptide-Autophagy-targeting chimera)을 포함하는 융합단백질, p62, 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 p-PROTAC는
    (a) 표적폴리펩타이드의 결합 펩타이드;
    (b) E3 ligase의 결합 펩타이드; 및
    (c) 링커 펩타이드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  18. 제16항에 있어서, E3 ligase 및 p-PROTAC를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  19. 제1항에 있어서, 상기 발현카세트는 2종류 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  20. 제1항에 있어서, 상기 체내 세포로 2종류 이상의 발현카세트를 도입하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  21. 제1항 내지 제20항에 있어서, 상기 발현카세트는 나노입자,나노 구조체, 에멀젠, Polyectrolyte complex(PEC) 및 젤을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  22. 제1항 내지 제21항에 있어서, 상기 발현카세트는
    주사제, 크림 및 구강 점막 투여, 연고, 젤, 흡수제, 먹든 약을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 방법이상을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 구강 점막 투여는
    유효성분으로 상기 발현카세트하고 최외각층을 히알루론산로 하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트 및 이의 용도.
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