CN103313730B - 用于治疗癌症的肽靶向系统的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于将siRNA或其它药物靶向进入肿瘤的蛋白质纳米系统。所述蛋白质系统的基础是一旦暴露于siRNA的核酸就自我装配的弹性蛋白样肽。通过标准基因工程技术将特异性靶向肽融合至核心ELP结构。此类靶向肽赋予纳米颗粒对肿瘤细胞表面上的受体的特异性结合,并且允许纳米颗粒被摄入肿瘤细胞。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2010年11月1日提交的美国临时申请No.61/436,127(将该临时申请通过引用整体并入本文)的权益。
发明背景
1.发明领域
本发明总的来说涉及医学和分子生物学领域。具体地,本发明涉及用于递送治疗性分子的多肽和其使用方法。
2.相关领域的描述
癌症、代谢和感染性疾病以及其它疾病由特定基因的不恰当活性引起。通过RNA干扰(RNAi)选择性地沉默干扰基因的能力,通过产生目的在于从细胞消除特定基因产物或蛋白质的新型种类的药物,提供了变革治疗疾病和病患的方式的潜能。RNAi已在肿瘤学、流感、肝炎、糖尿病、黄斑变性、帕金森病、亨廷顿病以及许多其它严重未满足的医学需要的领域的临床模型中令人信服地得到证明。
RNA干扰(基于短干扰RNA(siRNA)双链体的使用)对于有效治疗剂的快速发展具有许多有利方面。基于靶蛋白质的mRNA序列,可相对快速(与合成和筛选常规小分子药物所需的时间相比较)设计siRNA治疗剂。此外,基于siRNA的治疗剂可被设计来具有针对目标靶mRNA的极高特异性。
将siRNA靶向肿瘤的几种递送媒介物正在临床试验中,还未被FDA批准(Castanotto和Rossi,2009,Nature457:426-33;Zimmermann等人,2006,Nature441:111-4)。在此类试验中,利用非靶向纳米颗粒的siRNA的全身性施用可导致剂量依赖性肿瘤积累和靶基因表达的沉默(Juhasz等人,2006,OncolRep.15:1299-304.)。尽管有这些令人鼓舞的数据,但被此类siRNA靶向的基因在所有正常细胞中表达,虽然以比在许多肿瘤细胞中更低的水平表达(Cerqueira等人,2005,CurrMedChem.12:1283-94;Heidel等人,2007,ProcNatlAcadSciUSA.104:5715-21)。使用非靶向纳米颗粒的其它共同缺点是它们在肝、肾和脾中大量积累,导致潜在的脱靶效应和减少对其它器官的治疗有效负荷(therapeuticpayload)的有效剂量。
RNA在体内被RNA核酸酶快速降解,因此必须通过将siRNA封装在纳米颗粒中来保护其免受此类酶的降解,所述纳米颗粒可增加核苷酸在循环血液中的浓度。使用siRNA的不利方面是其被循环中的核酸酶快速降解。在哺乳动物中使用siRNA作为治疗剂的主要挑战是完整siRNA至表达靶基因的特定组织和器官的细胞内递送。两个重要因素对于成功使用siRNA治疗疾病而言是必需的:(1)选择负责特定疾病的增进的特定遗传靶,和(2)将siRNA直接靶向患病细胞的方法。在癌症治疗中,例如,选择特定的癌基因(作为siRNA的靶),以及将siRNA直接靶向肿瘤细胞的方法。
然而,还未获得此类必需靶向因子。因此,在本领域仍然需要用于将siRNA(和其它药物分子)靶向递送至细胞(尤其地癌细胞)以改善它们的治疗效力的试剂和方法。
发明概述
本发明通过提供治疗性组合物的多肽递送媒介物克服了现有技术的不足。本发明的多肽递送媒介物通常包含与治疗性分子复合的弹性蛋白样多肽(ELP)。例如,这样的ELP组合物可包含与治疗性小分子、多肽或核酸复合的ELP。在一些情况下,可将ELP共价地连接于治疗性分子。例如,ELP组合物可包含共价地连接至小分子的ELP结构域或通过肽键连接至治疗性多肽的ELP(即,ELP融合蛋白)。在一些其它情况下,可将ELP与结合治疗性分子的多肽融合。同样地,可将ELP与核酸适体例如结合治疗性分子的适体复合或共价缀合至所述适体。
所述纳米颗粒系统的模块性质提供了优于现有脂质体或纳米颗粒药物递送系统的有利的灵活性,所述有利的灵活性在于可通过化学合成或重组DNA技术将不同的药物结合肽或细胞靶向肽序列容易地引入分子的结构。在非限定性实施例中,可将编码根据本发明的多肽的核酸克隆进入用于制备纳米颗粒多肽的质粒载体。其中可将特定的靶向序列引入其特定的实施方案。另一个有利方面是制造的简单性,其中可将重组载体或表达构建体引入适当的细胞类型(例如,具有被引入细菌细胞的纳米颗粒多肽的DNA序列的质粒),其中大量产多肽,使用特异性结合,尤其DNA亲和柱来进行纯化。
附图简述
图1.ELP药物递送纳米颗粒的结构和结构域。本文中提供的ELP药物递送系统包括装配结构域(AD)、药物结合结构域(DBD)、核苷酸结合结构域(NBD)和与靶向细胞的生物分子相互作用的细胞靶向结构域(CTD)。
图2.ELP-纳米颗粒在溶液中的装配。每一种多肽的AD引起至大胶束内的装配。
图3.样品颗粒的核苷酸和肽序列。ELP1-60;K8序列(下划线,粗体);L1CAM序列(下划线,粗体,斜体字)。
图4.水中的K8ELP(1-60)-纳米颗粒的纯化。在分离含ELP纳米颗粒的逆转换循环法过程中的纯化的级分的SDS-PAGE分析。泳道1STD、泳道2BLR、泳道3BLR+K8ELP1-60、泳道4细胞破碎后、泳道5PEI后、泳道6热旋转上清液(HotSpinSup)、泳道7热旋转沉淀(HotSpinpellet)。纯化的K8-ELP(1-60)示于25kDa大小附近。
图5.siRNA至K8ELP(1-60)-纳米颗粒内的凝缩。结合至纳米颗粒的siRNA的凝胶阻滞分析。将siRNA(100pmol)与纳米颗粒的系列稀释物混合,并且在环境温度下温育30分钟。将产物在120V下在1%的于1XTAE缓冲液中的琼脂糖凝胶上经历电泳分离,进行30分钟。凝胶包含溴化乙锭以显现siRNA。泳道1Ladder,泳道2siRNA(100pmol),泳道3siRNA+1:320K8ELP1-60,泳道4siRNA+1:160K8ELP1-60,泳道5siRNA+1:80K8ELP1-60,泳道6siRNA+1:40K8ELP1-60,泳道7siRNA+1:20K8ELP1-60,泳道81:10K8ELP1-60。泳道8具有1.33ug的K8ELP(1-60)。
图6.利用全身生物发光成像(wholebodybioluminescenceimaging)来进行包含针对肿瘤的标记siRNA的纳米颗粒的定位。两只小鼠各用标记的裸露siRNA(Dy677-siEVI1)(作为对照)和K8ELP(1-60)(Dy677-ELP-siEVI1)中的标记siRNA(作为处理组)进行注射,并且与媒介物组一起显示。利用产生未被饱和的图像的图像的暴露光时间进行生物发光成像。使用与Dy677具有非常相似的Ex/Em的Cy5.5的参数进行降低本底自发荧光的光谱解混(spectralunmixing)。将所有时间点(0.5、4和24小时)的所有荧光和BLI图像置于相同的标度上,以便可在时间点之间进行直接比较。发现包含标记siRNA的基本K8ELP(1-60)纳米颗粒在4小时内特异性定位至肿瘤,并且被肿瘤代谢,因此到24小时时信号消失。
优选实施方案的详述
本领域技术人员公知的常规技术用于寡核苷酸合成,或化学多肽合成。按照制造商的说明书,或如本领域内通常实现的或如本文中所描述的,进行酶反应和纯化技术。通常按照本领域已知的常规方法以及如在本说明书中通篇引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所描述的,进行技术和方法。参见例如,Sambrook等人,2001,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.和Benoiton,N.,ChemistryofPeptideSynthesis,第1版,CRCPress(2005年8月12日),为了任何目的将所述参考资料通过引用并入本文。除非提供明确的定义,否则与本文中描述的分子生物学、基因工程、分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室方法和技术结合使用的命名法和用于所述方法和技术的命名法是本领域公知且常用的那些术语。可将标准技术用于化学合成、化学分析和患者的治疗。
除非由上下文另外要求,否则单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。
如根据本公开内容所使用的,除非另有说明,否则下列术语将被理解为具有下列含义。
1.多肽
在一个方面,本发明描述了包含核酸结合结构域(NBD)、装配结构域(AD)和细胞靶向结构域(CTD)的分离的多肽。在其它实施方案中,分离的多肽还包括药物结合结构域(DBD)。在某些实施方案中,分离的多肽包含下列区段:AD、CTD、NBD和DBD。本发明的多肽的结构域可以以任何顺序存在,这对于本领域技术人员来说是非常显然的。本发明还描述了包含多个AD、CTD、NBD和/或DBD结构域的单个多肽。
在某些实施方案中,本发明涉及包含至少一种多肽例如弹性蛋白样多肽的组合物。如本文中所用,“多肽”通常是指但不限于包含至少一种具有多个氨基酸的多肽的蛋白质。蛋白质可包含超过一种多肽例如二聚体或三聚体或其它三级结构。在一些其它实施方案中,蛋白质是指具有3个氨基酸或更多个氨基酸的多肽或具有3至100个氨基酸的肽。术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。
在某些实施方案中,多肽的大小可包括,或为至多或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600或更多个氨基酸的分子残基,以及可源自其的任何范围。此外,其可包含来自本文中提供的多肽例如弹性蛋白聚合物的连续氨基酸的这类长度。
本发明的多肽可通过本领域技术人员已知的任何技术来制造,包括通过标准分子生物学技术进行的蛋白质、多肽或肽的表达、多肽从天然来源的分离或多肽的化学合成。先前已公开了各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列,所述序列可见于本领域技术人员已知的计算机化数据库中。一个这样的数据库是美国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(在互联网的ncbi.nlm.nih.gov/上)。可使用本文中公开的技术扩增和/或表达此类已知基因的编码区,或所述基因编码区对于本领域技术人员来说是已知的。或者,蛋白质、多肽和肽的各种商业制剂对于本领域技术人员来说是已知的。
在某些实施方案中,多肽可被纯化。一般而言,“纯化的”是指已经历分级分离以除去各种其它蛋白质、多肽或肽的特定蛋白质、多肽或肽组合物,并且该组合物大体上保持其活性,这可以例如通过蛋白质测定来进行评估,所述对特定的或期望的蛋白质、多肽或肽的测定对于本领域技术人员来说是已知的。
在一些实施方案中,可能期望纯化蛋白质,例如本发明的多肽。蛋白质纯化技术对于本领域技术人员来说是公知的。此类技术包括在一个水平上将细胞环境初步分级分离成多肽和非多肽级分。在将多肽与其它蛋白质分离后,可使用层析和电泳技术进一步纯化目标多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至同质性)。特别适合于制备纯的肽或多肽的分析法是过滤、离子交换层析、排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析或等电聚焦。纯化肽的特别高效的方法是快速蛋白质液相层析或甚至HPLC。在ELP组合物的情况下,还可通过ELP结构域的热转变性质帮助蛋白质纯化,如美国专利No.6,852,834中所描述的。
根据本公开内容,用于定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法对本领域技术人员来说是已知的。此类方法包括例如测定活性级分的比活性,或利用SDS/PAGE分析评估级分内中的多肽的量。用于评估级分的纯度的优选方法是计算级分的比活性,将其与初始提取物的比活性相比较,从而计算纯度的程度。用于代表活性的量的实际单位将,当然,取决于被选择用以进行纯化的具体测定技术而无论表达的蛋白质或肽是否展示可检测的活性。
适用于蛋白质纯化的各种技术对于本领域技术人员来说是公知的。此类技术包括例如利用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀,随后离心;层析步骤例如离子交换、凝胶过滤、反相羟基磷灰石和亲和层析;等电聚焦;凝胶电泳;以及此类和其它技术的组合。这在本领域通常是已知的,据信进行各种纯化步骤的顺序可改变,或某些步骤可省略,并且仍然导致用于制备大体上纯化的蛋白质或肽的适当的方法。
2.多肽和基因表达
可通过常规分子生物学技术产生本发明的多肽。在一个方面,本发明描述了具有编码包含药物结合结构域(DBD)、装配结构域(AD)和细胞靶向结构域(CTD)的多肽的核苷酸的分离的多核苷酸。
如本文中所用,术语“分离的多核苷酸”意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其组合,根据其来源,所述“分离的多核苷酸”(1)不与在其中天然地发现所述“分离的多核苷酸”的所有或部分多核苷酸缔合,(2)连接至与其非天然连接的多核苷酸,或(3)在自然界中不作为更大序列的部分存在。
除非另有说明,否则单链多核苷酸序列的左手末端是5'末端;双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向称为转录方向;DNA链上与RNA具有相同序列并且对于RNA转录物的5'末端是5'的区域称为“上游序列”;DNA链上与RNA具有相同序列并且对于RNA转录物的3'末端是3'的区域称为“下游序列”。
如本文中所用,术语“多核苷酸”意指在长度上为至少10个碱基的核苷酸的聚合物形式。在某些实施方案中,碱基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或核苷酸的任一类型的修饰形式。术语包括DNA或RNA的单链和双链形式。
如本文中所用,术语“寡核苷酸”包括通过天然存在的和/或非天然存在的寡核苷酸键联连接在一起的天然存在的核苷酸和修饰核苷酸。寡核苷酸是通常包含不超过200个核苷酸的多核苷酸亚组。在某些实施方案中,寡核苷酸在长度上为10至60个核苷酸。在某些实施方案中,寡核苷酸在长度上为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或30至40个碱基。寡核苷酸可以是单链的,例如用作反义RNA,或是双链的,用作小干扰RNA(siRNA)或小的(或短的)发夹RNA(shRNA)。寡核苷酸可包括可检测的标记物,例如放射性标记物、荧光标记物、抗原性标记物或半抗原。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。术语“修饰核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖部分等的核苷酸。术语“寡核苷酸键联”包括寡核苷酸键联例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯等。参见,例如,LaPlanche等人,1986,Nucl.AcidsRes.14:9081;Stec等人,1984,J.Am.Chem.Soc.106:6077;Stein等人,1988,Nucl.AcidsRes.16:3209;Zon等人,1991,Anti-CancerDrugDesign6:539;Zon等人,1991,OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES:APRACTICALAPPROACH(F.Eckstein编辑),OxfordUniversityPress,OxfordEngland,第87-108页;Stec等人,美国专利No.5,151,510;Uhlmann和Peyman,1990,ChemicalReviews90:543,为了所有目的,将所述文献和专利的每一个的公开内容通过引用并入本文。
在另一个方面,本发明描述了包含多核苷酸的重组表达构建体,所述多核苷酸具有编码装配结构域(AD)、细胞靶向结构域(CTD)和药物结合结构域(DBD)的核苷酸序列。
术语“重组表达构建体”用于指用于将编码信息转移至宿主细胞或靶细胞的分子(例如,核酸、质粒或病毒)。术语“重组表达构建体”和“载体”可互换使用。适用于本发明的方法的病毒载体包括来源于例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒。
术语“表达载体”是指适合于宿主细胞或靶细胞的转化并且包含含有指导和/或控制插入的核酸序列的表达的对照序列的核酸序列的载体。术语“表达”包括但不限于过程,例如转化和RNA剪接(如果内子存在的话)。
本发明的表达载体可包含具有与控制序列有效连接的编码序列的DNA或RNA序列。如本文中所用,术语“控制序列”或“控制元件”是指可影响它们所连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可视宿主生物体的不同而不同。根据某些实施方案,原核生物的控制序列可包括启动子、阻遏物、操纵子、核糖结合位点以及转录终止序列和反义mRNA。根据某些实施方案,真核生物的控制序列可包括启动子、增强子和转录终止序列或调节蛋白质降解、mRNA降解、细胞核定位、细胞核输出、细胞质保留、蛋白质磷酸化、蛋白质乙酰化、蛋白质泛素化(sumolation)或RNA抑制(RNAi)的序列。在某些实施方案中,“控制序列”可包括前导序列和/或融合伴侣序列。当“控制序列”实现它们所连接的编码序列的表达和加工时,“控制序列”被“有效地连接”至编码序列。
通常,用于宿主细胞或靶细胞的表达载体包含用于载体维持和用于外源核苷酸序列的表达的序列。此类序列,在某些实施方案中统称为“侧翼序列(flankingsequence)”,通常包括下列核苷酸序列的一个或多个:启动子、一个或多个增强子序列、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号序列、包含一个或多个用于插入编码待表达的siRNA的核酸的限制性内切核酸酶位点的多接头区域以及选择标记元件。
侧翼序列可以是同源的(即,来自与宿主细胞或靶细胞相同的物种和/或株系)、异源的(即,来自除宿主细胞或靶细胞物种或株系外的物种)、杂交体(即,来自超过一个来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。这样,侧翼序列的来源可以是任何原核生物或真核生物,任何脊椎或无脊椎动物或任何植物,只要侧翼序列在宿主细胞或靶细胞机器中具有功能,并且可被宿主细胞或靶细胞机器激活。
用于本发明的载体的侧翼序列可通过本领域已知的几种方法中的任何方法获得。通常,先前已通过作图和/或通过限制性内切核酸酶消化鉴定本文中有用的侧翼序列,因此可使用适当的限制性内切核酸酶从适当的组织来源分离所述侧翼序列。在一些情况下,侧翼序列的完全核苷酸序列可以是已知的。侧翼序列还可使用本文中描述的用于核酸合成或克隆的方法来合成。
在侧翼序列的全部或仅部分是已知的情况下,其可使用体外扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)和/或通过利用适当的寡核苷酸和/或来自相同或不同物种的侧翼序列片段筛选基因组文库来获得。当侧翼序列不是已知的时,可从包含例如编码序列或甚至另外的基因的更大片段的DNA分离包含侧翼序列的DNA的片段。可通过限制性内切核酸酶消化以产生适当的DNA片段,随后使用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen柱层析(Chatsworth,Calif)或本领域技术人员已知的其它方法进行分离来实现分离。实现该目的的适当的酶的选择对于本领域技术人员来说是很显然的。
转录终止序列通常位于多肽编码区的末端的3',用于终止转录。通常,原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段,随后是poly-T序列。虽然序列可容易地从文库克隆或甚至作为载体的部分商购获得,但其也可使用用于核酸合成的方法例如本文中描述的那些方法来容易地合成。真核生物具有用作转录终止信号和用作polyA信号(其是进行内切核酸酶切割,随后添加polyA残基所需的序列)(通常由约200个A残基组成)的序列。
本发明的表达和克隆载体通常包含被宿主生物体识别并且被有效地连接至编码基因的核酸的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即,5')的非转录序列(通常为约100至1000bp)。启动子按惯例将被分入两个种类之一:诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件的一些变化,例如营养物的存在或不存在或温度的改变,起始升高水平的处于它们的控制之下的DNA的转录。组成型启动子,在另一个方面,起始连续的基因产物产生;即,对基因表达几乎没有或没有实验控制。被许多种潜在宿主细胞或靶细胞识别的许多启动子是公知的。
与哺乳动物细胞一起使用的适当的启动子是公知的,包括但不限于获自真核生物病毒的那些启动子,所述病毒是例如多瘤病毒、鸡痘病毒(fowlpoxvirus)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒(bovinepapillomavirus)、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40)。其它适当的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子,例如,热激启动子和肌动蛋白启动子。
用于实践本发明的重组表达载体的具体启动子包括但不限于:SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,1981,Nature290:304-10)、CMV启动子、劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell22:787-97)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-45)和金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,1982,Nature296:39-42)。此外,还关注下列动物转录控制区,该区显示组织特异性并且已被用于转基因动物:在胰腺细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因的控制区域(Swift等人,1984,Cell38:639-46;Ornitz等人,1986,ColdSpringHarborSymp.Quaint.Biol.50:399409;MacDonald,1987,Hepatology7:425-515);在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因的控制区域(Hanahan,1985,Nature315:115-22);在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳房肿瘤病毒的控制区域(Leder等人,1986,Cell45:485-95);在髓样细胞中具有活性的β珠蛋白基因的控制区域(Mogram等人,1985,Nature315:338-40;Kollias等人,1986,Cell46:89-94);在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因的控制区域(Readhead等人,1987,Cell48:703-12);在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因的控制区域(Sani,1985,Nature314:283-86);在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因的控制区域(Mason等人,1986,Science234:1372-78);以及最特别地在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因的控制区域(Grosschedl等人,1984,Cell38:647-58;Adames等人,1985,Nature318:533-38;Alexander等人,1987,Mol.CellBiol.7:1436-44)。
优选,本发明的表达载体的启动子在靶细胞或宿主细胞所源自的组织中是有活性的。例如,如果细胞是肝细胞,则可有利地使用白蛋白基因控制区域(Pinkert等人,1987,GenesandDevel.1:268-76);甲胎蛋白基因控制区域(Krumlauf等人,1985,Mol.CellBiol.5:1639-48;Hammer等人,1987,Science235:53-58);或α1抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey等人,1987,GenesandDevel.1:161-71),全部所述控制区域在肝中都是有活性的。
本发明的载体还可包含在高等真核细胞中增加转录的增强子序列。增强子是DNA的顺式作用元件,长度通常为10-300bp,并且作用于启动子以增加转录。增强子相对地不依赖于定向(orientation)和位置,它们已被发现存在于内含子内以及距离转录单位的5'和3'数千碱基内。可从哺乳动物基因获得的几个增强子序列是已知的(例如,来自珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、胰岛素、转甲状腺素蛋白和HNF-6基因的增强子)。还可将来自病毒的增强子用于增加基因的表达。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子以及腺病毒增强子是用于激活真核生物启动子的示例性增强元件。虽然可将增强子在核酸分子的位置5'或3'上剪接进入载体,但其通常位于启动子5'的位置上。
可从方便的起始载体例如商购可得的载体构建本发明的表达载体。此类载体可以包含或可以不包含所有期望的侧翼序列。在一个或多个本文中描述的侧翼序列并非已存在于载体的情况下,可单独地获得它们并且将其连接进入载体。用于获得每个侧翼序列的方法是本领域技术人员已知的。
在已构建载体并且已将编码例如期望的ELP多肽的核酸分子插入载体的适当位点后,可将完成型载体插入适当的宿主细胞或靶细胞。所有编码所述ELP多肽的表达载体至选择的宿主细胞或靶细胞内的引入可通过公知的方法来实现,包括方法例如转染、感染、氯化钙法、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖法或上述的其它已知技术。选择的方法部分地是待使用的宿主细胞或靶细胞的类型的函数。此类方法和其它适当的方法对于本领域技术人员来说是公知的,例示于Sambrook等人,2001,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.中。
术语“转染”用于指细胞对外来或外源被细胞的摄入,当外源DNA已被引入细胞内部时,细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域是公知的并且公开于本文中。参见,例如,Graham等人,1973,Virology52:456;Sambrook等人,2001,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;Davis等人,1986,BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY(Elsevier)和Chu等人,1981,Gene13:197。此类技术可用于将外源DNA引入适当的宿主细胞。
在其它实施方案中,本发明提供了包含本发明的载体的哺乳动物细胞,例如,人细胞。
3.装配结构域(AD)
在某些实施方案中,AD是基于蛋白质的聚合物。在其它实施方案中,AD包含弹性蛋白样多肽(ELP)。
如本文中所用,术语“弹性蛋白样多肽”或“弹性蛋白样重复”(ELP)可互换使用。ELP是指一种经历依赖于温度的构象变化的氨基酸聚合物。通过升高温度,ELP从高度可溶的细长链转变成高度折叠的具有大幅降低的溶解度的装配体(参见美国专利No.6,852,834)。ELP可以例如由该相变发生所处的中值温度来进行定义。因此,在本发明的某些方面,ELP将具有高于约37℃的中值相变温度。在一些其它实施方案中,ELP可具有在生理范围内的中值相变温度,例如约38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃或46℃的转变温度。在一些情况下,还可基于超过其相变就发生的温度范围来定义ELP。例如,在一些情况下,相变可在小于约5℃的温度范围内发生。例如,相变可在约4℃、3℃、2℃、1℃或更小的温度范围内发生。
在本发明的一些具体实施方案中,ELP结构域可通过其氨基酸序列来定义。例如,ELP结构域可包含多个重复的氨基酸序列VPGXG(SEQIDNo.57),其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。例如,本发明的ELP可包含10至500个重复的VPGXG序列。在一些具体的情况下,本发明的ELP可包含50至300个或80至200个氨基酸。在一些其它实施方案中,ELP中的“X”残基全都是相同的氨基酸,然而在某些其它情况下,ELP可在整个聚合物中在X位置上包含多种不同的残基。例如,在一些情况下,X可以是丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸残基,例如包含10个VPGXG(SEQIDNo.57)重复的ELP,其中对于前5个重复X=Val,对于随后的2个重复X=Ala,对于剩下的3个重复X=Gly(表示为V5:A2:G3)。
基于蛋白的聚合物例如ELP是一类这样的聚合物,其具有用于多种生物医学应用的有利性质。ELP是由来源于人原弹性蛋白的(Val-Pro-Gly-X-Gly)(SEQIDNo.57)重复组成的人工肽聚合物,其中X,称为“客体残基(guestresidue)”,可以是除脯氨酸外的氨基酸的任何混合物。(Urry,D.W.Prog.Biophys.Mol.Biol.57:23-57,1992.)。ELP作为有用的热敏生物材料的意义最初是由(D.T.McPherson,J.Xu和D.W.Urry.ProteinExpr.Purif.7:51-57(1996))提出的。
ELP因多个原因用作AD。第一,ELP在特征性转变温度(Tt)下在水溶液中经历反向相变(inversephasetransition),高于该温度它们脱盐并且相从主体水发生分离(UrryD.W.,1997,JournalofPhysicalChemistryB101:11007-11028.)。对于重组ELP嵌段共聚物,该相变行为促进自装配成纳米结构,所述自装配由一个嵌段的选择性脱盐驱动(Yamaoka等人,2003,Biomacromolecules4:1680-1685;Cappello等人,1998,JournalofControlledRelease53:105-117;Dreher等人,2008,JAmChemSoc130:687-694)。这可解释ELP将充足的两亲性赋予多肽/药物混合物以驱动其自装配成纳米颗粒的能力(Wright等人,2002,AdvancedDrugDeliveryReviews54:1057-1073;Megeed等人,2002,AdvancedDrugDeliveryReviews54:1075-1091)。第二,ELP是有用的生物聚合物,是无毒的(Urry等人,1991,JournalofBioactiveandCompatiblePolymers6:263-282;Liu等人,2006,JControlRelease116:170-178)、生物可降解的,并且显示良好的药代动力学(Chilkoti等人,2002,AdvDrugDelivRev54:1093-1111)。第三,因为ELP可通过基因工程产生,因此它们的组合物、分子量和多分散性可被精确地控制。第四,可在大肠杆菌(E.coli)中以高产率(~100-200mg/L)产生ELP,可通过利用它们的相变行为容易且快速地纯化它们(Meyer和Chilkoti,1999,NatureBiotechnology17:1112-1115),以便容易且廉价地获得高纯度临床级材料。构建的简单性给纳米颗粒制造和siRNA配制带来一致性(cGMP的生产和质量控制的关键问题)。ELP的效用和安全性已在糖尿病治疗的I期临床评估中得到证明(PhaseBioPharmaceuticals,Inc.)。
在本发明的其它方面,应理解可修饰ELP结构域的序列以改变ELP、ELP组合物或纳米颗粒的相变特征。例如,在一些情况下,ELP结构域包括序列(Val-Pro-Gly-X-Gly)(SEQIDNo.57),其中X包含除脯氨酸之外的任意氨基酸。通过X位置上不同氨基酸的置换,可改变ELP结构域的特征。例如,在其中期望更低的转变温度的情况下,可在X上置换更具疏水性的残基。相反地,为了升高转变温度,可在X位置上置换不太疏水的残基。疏水性或亲水性(hydropathic)氨基酸指数在赋予蛋白质生物功能中的重要性在本领域通常为人所理解(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157:105-132)。应接受,氨基酸的相对亲水的特征促成所得蛋白质的二级结构,其反过来确定蛋白质与其它分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
如美国专利No.4,554,101中所详细描述的,已将下列疏水性值赋予氨基酸残基:精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。因此,应理解,当位置X上的氨基酸具有高亲水性值时,ELP转化温度可升高,然而为了降低转变温度,可使用具有更低的亲水性值的氨基酸。
在某些实施方案中,设计分离的多肽,通过基于递归定向连接(RDL)(通过常规细菌培养表达实现的简易生物合成途径(14))的重组DNA技术合成所述多肽以用于基因递送。在某些实施方案中,多肽包含氨基酸序列氨基酸序列(Val-Pro-Gly-X-Gly)n(SEQIDNo.57),其中X为包含Val、Ala和Gly的肽;并且n为等于或大于1的整数。在其它实施方案中,n为2、5、10、20、50、100或更大。在更具体的实施方案中,X是以约5:2:3的比率包含Val、Ala和Gly的肽。在具体的实施方案中,n是60,记录为ELP(1-60)。ELP(1-60)已描述于Chen等人2007,Pharm.Res.25:683-691中,并且来源于如Meyer&Chilkoti,1999,Nat.Biotech.17,1112-1115(将所述文献各自通过引用整体并入本文)中描述的ELP(1-30)。其它嵌段共聚物可按照先前的研究通过递归定向连接来合成。
还应理解,可通过改变ELP结构域中的弹性蛋白样重复的数目来改变ELP结构域、ELP组合物或纳米颗粒的转变温度。例如,为了升高由ELP结构域赋予的转变温度,可减少ELP重复的数目。相反地,增加ELP结构域中ELP重复的数目通常将降低ELP结构域、ELP组合物或纳米颗粒的转变温度。在某些实施方案中,肽或多肽可包含与参照序列或参照序列的特定区域相同或相似的氨基酸序列。在某些实施方案中,肽或多肽与特定多肽的氨基酸序列或特定多肽的区域内的氨基酸序列具有至少或至多60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、100%的同一性。在一些情况下,ELP结构域序列可被修饰来与人弹性蛋白结构域的序列更加密切匹配。此类修饰可以例如被产生来进一步减小ELP结构域或ELP组合物(例如,ELP融合蛋白)的免疫原性。例如,在本发明的一些实施方案中,ELP结构域可被确定为与人弹性蛋白重复序列具有至少60、65、70、75、80、85、90或95%的同一性。
4.细胞靶向结构域(CTD)
在具体的有利的实施方案中,本发明的多肽包含一个或多个细胞靶向结构域(CTD)。通过使用常规基因工程技术(包括重组DNA),可包括不同细胞靶向结构域的核苷酸序列以测定它们对多肽或纳米颗粒的靶向的影响。
本发明的多肽可包括含有AD和CTD的融合蛋白,在其它情况下这样的融合蛋白还可包含NBD,在其它情况下这样的融合蛋白还可包含DBD。
在本发明的一些实施方案中,多肽包括作为抗体或其特异性结合部分的CTD、配体、细胞因子、趋化因子或核酸适体。“特异性结合部分”被定义为抗体的与抗原相互作用的肽结构域。可将这样的结构域缀合至本发明的ELP组合物。细胞靶向抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段或人源化抗体。在另一个实例中,细胞靶向配体可以是VEGF或来源于其的介导受体结合的氨基酸。CTD可优先结合某些种类的细胞例如免疫细胞、癌细胞或来自特定组织或谱系的细胞。在本发明的某些方面,CTD还可介导基于ELP的组合物的内化。
在本发明的某些实施方案中,CTD可与存在于靶细胞表面上的生物分子相互作用。在其它实施方案中,CTD可与存在于靶细胞外表面上的生物分子相互作用。在其它实施方案中,CTD可与存在于靶细胞内表面上的生物分子相互作用。在其它实施方案中,CTD可与存在于细胞外部的生物分子相互作用。在其它实施方案中,CTD可与存在于细胞内部的生物分子相互作用。纳米颗粒可凝缩(condense),以便纳米颗粒对于细胞膜是可渗透的。在此类替代性实施方案中,纳米颗粒可接触细胞内部的生物分子。
在其它实施方案中,生物分子包括受体分子。在某些实施方案中,生物分子包括细胞粘着分子。在其它具体实施方案中,生物分子包含迁连蛋白或层粘连蛋白。在某些实施方案中,生物分子存在于靶细胞的外表面上,意指生物分子的任何部分完全或部分地暴露于细胞的外部。在具体的实施方案中,本发明描述了包含结合癌细胞的表面上的肿瘤生物标志的CTD的多肽。
CTD不限于任何具体的多肽序列。其可被设计来靶向任何期望的生物分子。在特别具体的实施方案中,生物分子特异性地在期望的细胞类型中表达。作为非限定性实例,CTD被设计来靶向在肿瘤细胞中表达但不在非肿瘤细胞中表达的生物分子。在某些实施方案中,多肽的CTD包含对肿瘤细胞特异的肽配体。肿瘤特异性CTD多肽序列的非限定性实例示于表1中。在一个实施方案中,CTD包括结合L1细胞粘着分子(L1CAM)的肽配体。由于因在亲肿瘤(tumor-seeking)ELP纳米颗粒中递送的药物的特异性靶向而产生的癌症疗法的副作用的减少,靶向特定肿瘤细胞是有利的。特异性靶向可维持或增强疗法(虽然使用更低浓度的药物试剂)的效力。在一个实施方案中,CTD包含肽序列(GSQRKHSKRHIHKDHV)(SEQID.No.19)。
表1.肿瘤特异性肽配体
SEQ ID No. | 癌症 | 肽 |
SEQ ID No.1 | 膀胱癌 | CSNRDARRC |
SEQ ID No.2 | 乳腺癌 | VSQTMRQTAVPLLWFWTGSL |
SEQ ID No.3 | 乳腺癌 | MTVCNASQRQAHAQATAVSL |
SEQ ID No.4 | 乳腺癌 | RGDLATLRQIAQEDGVVGVR |
SEQ ID No.5 | 乳腺癌 | DMPGTVLP |
SEQ ID No.6 | 层粘连蛋白a5 | RLVSYNGIIFFLK |
SEQ ID No.7 | 结肠癌 | VHLGYAT |
SEQ ID No.8 | 结肠癌 | CPIEDRPMC |
SEQ ID No.9 | 纤连蛋白 | RGD |
SEQ ID No.10 | 肝癌 | TACHQHVRMVRP |
SEQ ID No.11 | 层粘连蛋白b1 | YIGSRA |
SEQ ID No.12 | 肺癌 | VSQTMRQTAVPLLWFWTGSL |
SEQ ID No.13 | 肺癌 | MTVCNASQRQAHAQATAVSL |
SEQ ID No.14 | 肺癌 | RGDLATLRQLAQEDGVVGVR |
SEQ ID No.15 | 肺癌 | CGKRK |
SEQ ID No.16 | 肺癌 | CDTRL |
SEQ ID No.17 | 肺癌 | NGXGXX |
SEQ ID No.18 | 神经母细胞瘤 | VPWMEPAYQRFL |
SEQ ID No.19 | 卵巢癌 | GSQRKHSKRHIHKDHV |
SEQ ID No.20 | 卵巢癌 | DGXGXX |
SEQ ID N0.21 | 胰腺癌 | KAA |
SEQ ID No.22 | 前列腺癌 | DPRATPGS |
SEQ ID No.23 | 前列腺癌 | IAGLATPGWSHWLAL |
SEQ ID No.24 | 前列腺癌 | DNRIRLQAKXX |
SEQ ID No.25 | 前列腺癌 | LNNIVSVNGRHX |
SEQ ID No.26 | 前列腺癌 | KIKMVISWKG |
SEQ ID No.27 | 皮肤癌 | CSRPRRSEC |
在本发明的另一个方面,提供了用于将药物试剂靶向靶细胞的方法,所述方法包括使用一种或多种包含装配结构域(AD)、药物结合结构域(DBD)和细胞靶向结构域(CTD)的多肽;将药物试剂与一种或多种多肽的DBD接触;装配一种或多种多肽的AD以产生装配的多肽;将装配的多肽与靶细胞接触;以及将装配的多肽的CTD与存在于靶细胞的外部的生物分子接触。术语“获得”意指获得生理样本的实体占有(physicalpossession)。其中获得材料的方式不限于任何具体的方法。在某些实施方案中,装配的多肽包含药物试剂。在其它实施方案中,装配的多肽可凝缩和形成纳米颗粒。在其它实施方案,装配的多肽可与药物试剂一起凝缩,形成纳米颗粒。
在某些实施方案中,本发明的方法将药物试剂靶向期望的细胞。可选择任何细胞用于靶向。在某些实施方案中,靶细胞是真核细胞,更优选哺乳动物细胞,最优选啮齿类动物或人细胞。在具体的实施方案中,靶细胞是肿瘤细胞。本发明涉及的肿瘤细胞的非限定性实例是人膀胱细胞、人乳腺细胞、人结肠细胞、人肝细胞、人肺细胞、人神经母细胞瘤细胞、人卵巢细胞、人胰腺细胞、人前列腺细胞或人皮肤细胞的肿瘤细胞。此外,可基于影响将利用本发明的方法进行治疗的患者的疾病或病况选择靶细胞。
5.药物结合结构域(DBD)
在本发明的某些方面,多肽包含药物结合结构域(DBD)。DBD可包含结合药物试剂的任何多肽序列。术语“试剂”或“药物试剂”在本文中用于指化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制备的提取物。药物试剂包括烷化剂、抗代谢药、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂以及其它抗肿瘤试剂。其它药物试剂包括阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃坡霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲需要分类、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在某些实施方案中,DBD可结合常规药或试验药。在其它实施方案,DBD可结合抗瘤形成药物。在其它实施方案中,多肽包含多个DBD。
在某些实施方案中,DBD结合治疗剂。在一些其它实施方案中,治疗剂是生物活性蛋白质。适当的蛋白质包括在医学、农业和其它科学和工业领域中具有益处的蛋白质,特别地包括治疗性蛋白质例如促红细胞生成素、干扰素、胰岛素、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白细胞介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子(TNF)和酶。此类治疗性蛋白质的特定实例包括但不限于用于替代疗法的酶;促进动物的生长或在细胞培养中促进细胞生长的激素;和用于各种应用例如生物技术学或医学诊断的活性蛋白质性质。具体实例包括但不限于:超氧物歧化酶、干扰素、门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶(papin)、胰岛素、降钙素、ACTH、高血糖素(glucagon)、生长抑素(somatosin)、生长激素、促生长因子(somatomedin)、甲状旁腺素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳术、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽和加压素。在本发明的其它实施方案中,DBD包含治疗性多肽结构域。在本发明的某些方面中,可将DBD化学缀合至ELP结构域,然而在某些情况下,可在融合蛋白中包含ELP和治疗性多肽结构域。用于本发明的治疗性多肽包括但不限于细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子。在一些具体实例中,治疗性多肽可以是干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、HIF-1、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、NF-kB抑制性序列、共有干扰素序列、白细胞介素(IL)-2、IL-12、IL-4、IL-8或单链抗体序列(scFv)例如VEGF特异性scFv。在本发明的某些方面,治疗性多肽可包含受体蛋白质的细胞外结构域,例如VEGF受体(VEGFR)-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)或VEGFR-3。
在某些实施方案中,试剂为诊断剂或成像剂。本发明使得能够精确地靶向成像或治疗。术语“成像剂”是指被设计来靶向哺乳动物的特定生理学或病理生理学并且可在其体内或体外施用后被检测的化合物。成像剂的非限定性实例是荧光标记物。其它标记物在本领域是公知的。
在某些实施方案中,DBD包含核酸结合部分。在某些实施方案中,本发明的多肽包含DBD结构域,所述结构域包含结合核酸的阳离子结构域。在具体的实施方案中,核酸为siRNA分子。在其它实施方案中,药物试剂为siRNA分子。
6.核酸结合结构域(NBD)
在本发明的某些方面,多肽包含核酸结合结构域(NBD)。在某些实施方案中,多肽包含DBD和NBD。在一些其它实施方案中,DBD和NBD可结合核酸。在具体的实施方案中,NBD包含siRNA结合结构域。在某些情况下,可将缀合至ELP,例如通过共价化学缀合。可通过间隔肽分隔NBD与多肽的其它结构域。在一些其它情况下,包含NBD的多肽可以是包含NBD、AD和CTD的融合蛋白。
本领域已知的任何核酸结合多肽可用于本发明的NBD。例如,NBD可结合特定核酸序列例如铁调节蛋白(IRP)1或2的RNA结合结构域。在某些其它情况下,NBD可非特异性地结合核酸,例如富含阳离子残基的氨基酸聚合物。例如,NBD可具有25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多的在生理pH下带正电荷的残基,例如赖氨酸。在某些情况下,NBD可包含氨基酸序列VK或VKG的重复。例如,序列可具有4至100个VK或VKG重复或其混合物,例如具有4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96或100个VK或VKG重复的核酸结合结构域。因此,可将药物例如GA与根据本发明的NBD复合。
在某些实施方案中,NBD包含寡聚赖氨酸结构域,其以连续的顺序包含多个赖氨酸残基。寡聚赖氨酸结构域结合核酸。在某些实施方案中,NBD包含氨基酸序列(K)n,其中n是大于4的整数。在优选实施方案中,n是8(SEQ.ID.No.58)。在具体的实施方案中,NBD包含氨基酸序列(K8)(SEQ.ID.No.58)。在另一个优选实施方案中,寡聚赖氨酸结构域包含氨基酸序列Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-。(K8;SEQ.ID.No.58)。
在其它实施方案中,NBD包含寡聚精氨酸结构域,所述结构域以连续的顺序包含多个精氨酸残基。在某些实施方案中,NBD包含氨基酸序列(R)n,其中n为大于4的整数。在具体的实施方案中,n=9(R9;SEQIDNo.59)。
在具体的实施方案中,分离的多肽由寡聚赖氨酸(K8)(SEQ.ID.No.58)或寡聚精氨酸(R9)(SEQ.ID.No.59)和具有60个重复五肽单位的ELP嵌段(表示为(Val-Pro-Gly-X-Gly)60或(VPGXG)60)组成(Val-Pro-Gly-X-Gly=VPGXG=SEQ.ID.No.57),其中X是以5:2:3的比率存在的Val、Ala和Gly。
在具体的实施方案中,药物试剂包含siRNA分子。在某些实施方案中,药物试剂包含具有识别从癌基因表达的RNA的一部分的序列的核苷酸。
在本发明的一个实施方案中,药物试剂包含具有识别从EVI1基因表达的RNA的部分的序列的核苷酸。细胞内EVI1的表达的抑制引起细胞分裂的阻止和/或细胞凋亡的激活。在本发明的一个实施方案中,核苷酸通过沃尔森-克里克序列互补性结合EVI1基因序列以阻断其表达。核苷酸可以是长度足以在DNA或RNA水平上抑制EVI1基因的表达的DNA寡核苷酸。在另一个实施方案中,核苷酸可以是与RNA加工机制相关、下调EVI1的表达的双链RNA(dsRNA)。该dsRNA可以是具有约20个碱基对的小干扰RNA(siRNA)。
在某些实施方案中,本申请涉及双链RNA(dsRNA)和RNAi构建体。本文中使用的术语“dsRNA”是指能够进行RNA干扰(RNAi)的双链RNA分子,包括siRNA。此外,RNAi是最初用于在植物和蠕虫中观察到的现象,其中双链RNA(dsRNA)以特异性的转录后方式阻断基因表达。RNAi提供了在体外或体内抑制或减少基因表达的有用方法。
如本文中所用,术语“短干扰RNA”、“siRNA”或“短干扰核酸”是指当被细胞适当地加工时能够介导RNAi或基因沉默的任何核酸。例如,siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子,其中反义区域包含对靶基因的互补性。siRNA可以是具有自身互补的有义和反义区域的单链发夹多核苷酸,其中反义区域包含对靶基因的互补性。siRNA可以是具有两个或更多个环结构的环状单链多核苷酸和包含自身互补的有义和反义区域的茎,其中反义区域包含对靶基因的互补性,并且其中环状多核苷酸可在体内或体外被加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。siRNA还可包含具有对靶基因的互补性的单链多核苷酸,其中单链多核苷酸还可包含末端磷酸基团,例如5'-磷酸或5',3'-二磷酸。在某些实施方案中,siRNA是结合靶核酸并且改变靶核酸的活性的非酶促核酸。siRNA的结合和/或活性可通过与一种或多种蛋白质或蛋白质复合物例如RNA诱导沉默复合体(或RISC)的相互作用来进行促进。在某些实施方案中,siRNA包含沿着siRNA分子的一条链的单个连续序列与靶序列互补的序列。
任选地,本申请的siRNA包含在生理条件下(例如,在细胞环境中)与待抑制的基因(“靶”基因)的mRNA转录物的至少一部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。双链RNA仅需与天然RNA足够相似以便其具有介导RNAi的能力。因此,本申请具有能够耐受预期可能因基因突变、株系多态性或进化趋异而导致的序列变异的有利方面。靶序列与siRNA序列之间耐受的核苷酸错配的数目不超过5个碱基对中有1个碱基对,或10个碱基对中有1个碱基对或20个碱基对中有1个碱基对,或50个碱基对中有1个碱基对。siRNA双链体中心的错配是最关键的,基本上可消除靶RNA的切割。相反地,与靶RNA互补的siRNA链的3'末端上的核苷酸未显著地促成靶识别的特异性。序列同一性可通过本领域已知的序列比较和比对算法来进行最优化,利用例如使用缺省参数的Smith-Waterman算法(如在BESTFIT软件程序中执行的)来计算核苷酸序列之间的百分比差异。siRNA与靶基因的部分之间的大于90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,或甚至100%的序列同一性是优选的。或者,可将RNA的双链体区域在功能上定义为能够在严格条件(例如,在400mMNaCl,40mMPIPESpH6.4,1mMEDTA,50℃或70℃中杂交12-16小时;然后进行洗涤)下与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列。
dsRNA的双链结构可由单个自身互补的RNA链、两个互补的RNA链或DNA链与及互补的RNA链形成。任选地,可在细胞内部或外部起始RNA双链体的形成。可以以允许每细胞至少一个拷贝的递送的量引入RNA。更高剂量(例如,至少5、10、100、500或1000个拷贝/细胞)的双链材料可产生更有效的抑制,然而更低的剂量也可用于特殊应用。抑制是序列特异性的,因为相应于RNA的双链区的核苷酸序列被靶向抑制。
如本文中所用,主题siRNA包括在长度上为约19-30个核苷酸,在长度上为约21-27个核苷酸,在长度上为约21-25个核苷酸或在长度上为约21-23个核苷酸的双链体区域。应理解siRNA招募核酸酶复合物,通过与特定序列的配对将复合物导向靶基因转录物。作为结果,靶基因转录物被蛋白质复合体中的核酸酶降解。在某些实施方案中,siRNA分子包含3'羟基。在某些实施方案中,siRNA构建体可通过例如在dicer酶存在的情况下,加工更长的双链RNA来产生。在一个实施方案中,使用果蝇体外系统。在该实施方案中,将dsRNA与来源于果蝇胚胎的可溶性提取物组合,从而产生组合。在其中将dsRNA加工成约21至约27个核苷酸的RNA分子的条件下维持组合。可使用本领域技术人员已知的许多技术纯化siRNA分子。例如,可使用凝胶电泳来纯化siRNA。或者,可使用非变性方法例如非变性柱层析来纯化siRNA。此外,可使用层析(例如,大小排阻层析)、甘油梯度离心、利用抗体的亲和层析来纯化siRNA。
主题dsRNA(例如,siRNA)的产生可利用化学合成法或通过重组核酸技术来进行。处理的细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录,或克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。如本文中所用,本申请的dsRNA或siRNA分子不一定限制于仅包含RNA的那些分子,其还可包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。例如,dsRNA可包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰例如,以减小对细胞核酸酶的敏感性,提高生物利用度,改善配制特征和/或改变其它药代动力学性质。为了举例说明,可修饰天然RNA的磷酸二酯键以包括至少一个氮或硫杂原子。可定制RNA结构的修饰以允许特定的基因抑制同时避免对dsRNA的一般反应。同样地,可修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。dsRNA可酶促产生或通过部分/完全有机合成产生,可通过体外酶促或有机合成引入任何修饰核糖核苷酸。化学修饰RNA分子的方法可经改造用于修饰dsRNA。仅为了举例说明,可利用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯、肽核酸、含有5-丙炔基-嘧啶的寡聚物或糖修饰(例如,2'-取代的核糖核苷,a-构型)来修饰dsRNA或siRNA的主链。在某些情况下,本申请的dsRNA缺乏含2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在某些实施方案中,siRNA分子包含硫代磷酸酯有义链。在某些实施方案中,siRNA分子包含磷酸二酯反义链。
在具体的实施方案中,siRNA分子的至少一条链具有长度为约1至约10个核苷酸,长度为约1至5个核苷酸,长度为约1至3个核苷酸或长度为约2至4个核苷酸的3'悬突。在某些实施方案中,siRNA可包含具有3'悬突的一条链并且另一条链在3'末端是平端的(例如,不具有3'悬突)。在另一个实施方案中,siRNA可在两条链上包含3'悬突。悬突的长度对于每一条链可以是相同的或不同的。为了进一步增强siRNA的稳定性,可稳定化3'悬突以抗降解。在一个实施方案中,通过包含嘌呤核苷酸例如腺嘌呤或鸟嘌呤核苷酸来稳定RNA。或者,修饰类似物对嘧啶核苷酸的置换,例如2'-脱氧胸苷置换尿嘧啶核苷酸3'悬突是被耐受的,并且不影响RNAi的效力。2'羟基的不存在显著增强悬突在组织培养基中的核酸酶抗性,并且在体内可以是有益的。
在另一个具体的实施方案中,主题dsRNA还可以呈长双链RNA的形式。例如,dsRNA为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在一些情况下,dsRNA在长度上为400-800个碱基。任选地,细胞内消化dsRNA例如以在细胞中产生siRNA序列。然而,假定地由于可由不依赖于序列的dsRNA反应引起的有害作用,长双链RNA在体内的使用不总是实用的。在此类实施方案中,减少干扰素或PKR的作用的局部递送系统和/或试剂的使用是优选的。
在其它具体的实施方案中,dsRNA或siRNA呈短的发夹结构(shRNA)的形式。可外源地合成shRNA,或可通过在体内从RNA聚合酶III启动子转录来形成shRNA。优选,在细胞或动物中工程化此类shRNA以确保靶基因的连续且稳定的抑制。在本领域已知可通过在细胞中加工发夹RNA来产生siRNA。
在某些实施方案中,本发明提供的药物试剂是短干扰RNA(siRNA)的种类。如本文中所用,术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指能够RNA干扰或“RNAi”的双链核酸分子,如例如在Bass,2001,Nature411:428-429;Elbashir等人,2001,Nature411:494-498;和Kreutzer等人,国际PCT公布No.WO00/44895;Zernicka-Goetz等人,国际PCT公布No.WO01/36646;Fire,国际PCT公布No.WO99/32619;Plaetinck等人,国际PCT公布No.WO00/01846;Mello和Fire,国际PCT公布No.WO01/29058;Deschamps-Depaillette,国际PCT公布No.WO99/07409;和Li等人,国际PCT公布No.WO00/44914中公开的。如本文中所用,siRNA分子不一定限定于仅包含RNA的分子,而且还可包括具有RNAi能力或活性的化学修饰核苷酸和非核苷酸。
RNA干扰是指由短RNA(siRNA)介导的动物的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人,1998,Nature391:806)。长dsRNA在细胞中的存在刺激了称为“dicer”的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与长dsRNA至为dsRNA的短的种类siRNA的加工(Berstein等人,2001,Nature409:363)。来源于dicer活性的短干扰RNA在长度上通常为约21-23个核苷酸,包含约19个碱基对的双链体。Dicer也已参与从具有保守结构的前体RNA切割21和22个核苷酸的时序小RNA(smalltemporalRNA)(stRNA),所述时序小RNA参与翻译控制(Hutvagner等人,2001,Science293:834)。RNAi反应也表征了包含siRNA的内切核酸酶复合体,通常称为RNA诱导的沉默复合体(RISC),其介导与siRNA具有序列同源性的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的引导序列互补的区域的中间(Elbashir等人,2001,GenesDev.15:188)。
已在多种系统中研究了短干扰RNA介导的RNAi。Fire等人首先在秀丽隐杆线虫中观察到RNAi(1998,Nature391:806)。Wianny和Goetz描述了在小鼠胚胎中通过dsRNA介导的RNAi(1999,NatureCellBiol.2:70)。Hammond等人描述了利用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi(2000,Nature404:293)。Elbashir等人描述了通过在培养的哺乳动物细胞(包括人胚胎肾细胞和HeLa细胞)中引入合成的21个核苷酸的RNA的双链体而诱导的RNAi(2001,Nature411:494)。
关于果蝇胚胎裂解物的最近的研究工作已显示对介导高效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求。这些研究已显示包含21个核苷酸的siRNA双链体,当包含两个核苷酸3'悬突时,活性最高。此外,利用2'-脱氧或2'-O-甲基核苷酸对一条或两条siRNA链的置换消除了RNAi活性,然而已显示利用脱氧核苷酸对3'-末端siRNA核苷酸的置换可被耐受。还显示siRNA双链体的中央的错配序列消除了RNAi活性。此外,这些研究还表明靶RNA中的切割位点由siRNA引导链的5'末端而非3'末端限定(Elbashir等人,2001,EMBOJ.20:6877)。其它研究已表明,siRNA双链体的靶互补链上的5'磷酸对siRNA活性是需要的并且ATP在细胞中被用来维持siRNA上的S'-磷酸部分(Nykanen等人,2001,Cell107:309)。然而,不存在5'磷酸的siRNA分子,当外源地引入时,是有活性的,这表明siRNA构建体的5'磷酸化可在体内发生。
本发明的药物试剂可以是包含自身互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子,其中反义区域包含与核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列,并且有义区域具有相应于核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA分子可从两个单独的寡核苷酸装配而来,其中一条链为有义链,另一条链为反义链,其中反义和有义链是自身互补的。siRNA分子还可从具有通过基于核酸或基于非核酸的接头连接的自身互补的有义和反义区域的单个寡核苷酸装配而来。siRNA分子可以是可形成大体上对称的双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸。siRNA分子还可包含具有与核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸,其中单链多核苷酸还可包含末端磷酸基团,例如5',3'-二磷酸或5'-磷酸,如例如Martinez等人,2002,Cell110:563-574和Schwarz等人,2002,Molecular:Cell10:537-568中论述的。
在某些实施方案中,根据本发明的siRNA分子和其它药物试剂可包含用于给受试者施用的递送媒介物,包括脂质体和纳米颗粒;载体和稀释剂以及其盐;并且可存在于药物组合物中。具体地,将siRNA与根据本发明的ELP纳米颗粒结合在一起递送。用于递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等人,1992,TrendsCellBio.2:139;DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar,1995,Maurer等人,1999,Mol.Membr.Biol.16:129-140;Hofland和Huang,1999,Handb.Exp.Pharmacol,137:165-192;以及Lee等人,2000,ACSSymp.Ser.752:184-192(将所有所述文献通过引用并入本文)中。Beigelman等人,美国专利No.6,395,713和Sullivan等人,PCTWO94/02595还描述了用于将核酸分子递送入细胞和组织的一般方法。此类方案可用于将实际上任何核酸分子递送入细胞。可利用本领域技术人员已知的多种方法将核酸分子施用至细胞,包括但不限于封装在脂质体中,通过电离子透入疗法,或通过至其它递送媒介物例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊和生物粘附微球体内的掺入,或利用蛋白质性质的载体(参见,例如,O'Hare和Normand,国际PCT公布No.WO00/53722)。
或者,可通过直接注射或通过使用输液泵局部递送核酸/媒介物组合。本发明的核酸分子的直接注射,无论是皮下、肌内还是真皮内注射,可使用标准针及注射器法,或利用无针技术例如Corny等人,1999,Clin.CancerRes.5:2330-2337和Barry等人,国际PCT公布No.WO99/31262中描述的那些技术来进行。本领域内的许多实例描述了利用渗透泵(参见Chun等人,1998,NeuroscienceLetters257:135-138,DAldin等人,1998,Mol.BrainResearch55:151-164,Dryden等人,1998,J.Endocrinol.157:169-175,Ghirnikar等人,1998,NeuroscienceLetters247:21-24)或直接输注(Broaddus等人,1997,Neurosurg.Focus3,article4)进行的寡核苷酸的递送方法。其它递送途径包括但不限于口服递送(例如以片剂或丸剂形式)和/或硬膜内递送(Gold,1997,Neuroscience76:1153-1158)。核酸递送和施用的更详细描述提供于Sullivan等人,PCTWO94/02595,Draper等人,PCTW093/23569,Beigelman等人,PCTWO99/05094和Klimuk等人,PCTWO99/04819(将所有所述专利公布通过引用并入本文)中。
或者,可在细胞内从真核启动子(参见例如,Izant和Weintraub,1985,Science229:345;McGarry和Lindquist,1986,Proc.Natl.Acad.SciUSA83:399;Scanlon等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10591-5;Kashani-Sabet等人,1992,AntisenseRes.Dev.2:3-15;Dropulic等人,1992,J.Virol.66:1432-41;Weerasinghe等人,1991,J.Virol.65:5531-4;Ojwang等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10802-6;Chen等人,1992,NucleicAcidsRes.20:4581-9;Sarver等人,1990,Science247:1222-1225;Thompson等人,1995,NucleicAcidsRes.23:2259;Good等人,1997,GeneTherapy4:45)表达本发明的多核苷酸。本领域技术人员将承认,可使用适当的DNA/RNA载体在真核细胞中表达任何核酸。此类核酸的活性可通过它们从初级转录物的释放(通过酶促核酸)来增强(Draper等人,PCTWO93/23569和Sullivan等人,PCTWO94/02595;Ohkawa等人,1992,NucleicAcidsSymp.Ser.27:15-6;Taira等人,1991,NucleicAcidsRes.19:5125-30;Ventura等人,1993,NucleicAcidsRes.21:3249-55;Chowrira等人,1994,J.Biol.Chem.269:25856)。
在本发明的另一个方面,可从插入DNA或RNA载体的转录单位(参见例如,Couture等人,1996,TIG12:510)表达本发明的多肽。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。可基于但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒(alphavirus)构建表达siRNA的病毒载体。在另一个实施方案中,将基于polIII的构建体用于表达本发明的核酸分子(参见例如,Thompson,美国专利No.5,902,880和6,146,886)。可如上所述递送能够表达siRNA分子的重组载体,将所述载体保持在靶细胞中。必要时可重复施用此类载体。一旦表达,siRNA分子与靶mRNA相互作用并且产生RNAi反应。表达siRNA分子的载体的递送可以是全身性的,例如通过静脉内或肌内施用,通过给从受试者外植入的靶细胞施用,随后再将所述细胞引入受试者,或通过允许进行至期望的靶细胞内引入的任何其他方法(关于综述,参见Couture等人,1996,TIG.12:510)。
在其它方面,本发明提供了表达盒,其包含:a)转录起始区(例如,真核细胞polI、II或III起始区);b)转录终止区(例如,真核polI、II或III终止区);和c)编码至少一种本发明的siRNA分子的核酸序列;其中所述序列以允许siRNA分子表达和/或递送的方式有效地连接至所述起始区和所述终止区。载体可任选地包括有效地连接在编码本发明的siRNA的序列的5'侧或3'侧上的开放阅读框架(ORF);和/或内含子(间插序列)。
可从真核RNA聚合酶I(polI)、RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII)的启动子驱动siRNA分子的转录。来自polII和polIII启动子的转录物以高水平在所有细胞中表达;给定的polII启动子在给定的细胞类型中的水平取决于存在于附近的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。也可使用原核RNA聚合酶启动子,只要原核RNA聚合酶在适当的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6743-7;Gao和Huang1993,NucleicAcidsRes.21:2867-72;Lieber等人,1993,MethodsEnzymol.217:47-66;Zhou等人,1990,MolCellBiol.10:4529-37)。几个研究者已证明从此类启动子表达的核酸分子可在哺乳动物中具有功能(例如,Kashani-Sabet等人,1992,AntisenseRes.Dev.2:3-15;Ojwang等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10802-6;Chen等人,1992,NucleicAcidsRes.20:4581-9;Yu等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6340-4;L'Huillier等人,1992,EMBOJ.11:4411-8;Lisziewicz等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A90:8000-4;Thompson等人,1995,NucleicAcidsRes.23:2259;Sullenger和Cech,1993,Science262:1566)。更具体地,转录单位,例如来源于编码U6小核RNA(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VARNA的基因的转录单位在细胞中产生高浓度的期望的RNA分子例如siRNA中是有用的(Thompson等人,1995,NucleicAcids.Res.23:2259;Couture等人,1996,TIG12:510,Noonberg等人,1994,NucleicAcidRes.22:2830;Noonberg等人,美国专利No.5,624,803;Good等人,1997,GeneTher.4:45;Beigelman等人,国际PCT公布No.WO96/18736。可将上述siRNA转录单位整合入多种用于引入哺乳动物细胞的载体,包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒载体)或病毒RNA载体(例如逆转录病毒或甲病毒载体)(关于综述参见Couture等人,1996,TIG12:510)。
在本发明的实施中有用的表达载体包括这样的表达载体,所述表达载体包含以允许该包含发夹环的siRNA分子表达的方式编码通过小核苷酸间隔序列分隔的siRNA分子的两个互补序列的核酸序列。一般而言,有用的表达载体包含:a)转录起始区;b)转录终止区;和c)编码通过小核苷酸间隔序列分隔的siRNA分子的两个互补序列的核酸序列;其中所述序列以允许包含小发夹环的siRNA分子表达和/或递送的方式有效地连接至起始区和终止区。
在某些实施方案中,本发明提供了药物组合物,所述药物组合物包含治疗有效量的本文中提供的多肽、纳米颗粒或药物试剂以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本发明还提供了包含本文中提供的多肽、纳米颗粒或药物试剂的药物组合物。具体地,将siRNA和其它药物试剂与根据本发明的ELP纳米颗粒结合在一起递送。
可接受的配制材料优选在使用的剂量和浓度上对接受者是无毒的。药物组合物可包含用于改变、维持或保持例如组合物的pH、重量克分子渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性(sterility)、稳定性、溶解或释放的速率、吸收或穿透的速率的配制材料。适当的配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸);抗微生物剂;抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠);缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它无机酸);填充剂(例如甘露醇或甘氨酸);螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA));络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精);填充剂;单糖、二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精);蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白);着色剂、调味剂和稀释剂;乳化剂;亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮);低分子量多肽;成盐抗衡离子(例如钠);防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢);溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇);糖醇(例如甘露醇或山梨醇);悬浮剂;表面活性剂或湿润剂(例如普郎尼克、聚乙二醇(PEG)、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨酯20和聚山梨酯80、Triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal));稳定增强剂(例如蔗糖或山梨醇);张力增强剂(例如碱金属卤化物,优选氯化钠或氯化钾、甘露醇或山梨醇);递送媒介物;稀释剂;赋形剂和/或药物佐剂。参见,例如,《雷氏药学大全》(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES),第18增补版,(A.R.Gennaro编辑),1990,MackPublishingCompany。
7.纳米颗粒
在另一个方面,本发明描述包含一种或多种包含装配结构域(AD)和细胞靶向结构域(CTD)、加上核酸结合结构域(NBD)和/或药物结合结构域(DBD)的多肽的纳米颗粒。在某些实施方案中,纳米颗粒还包含药物试剂。在其它实施方案中,纳米颗粒还包含siRNA分子。
纳米颗粒通常在化学上基于壳结构,所述壳结构包裹核苷酸或药物试剂并且在血液中稳定分子。纳米颗粒通常包含糖、葡聚糖、磷酸钙、壳聚糖、肽和/或塑料聚合物。用于癌症药物递送的负载药物试剂的纳米颗粒优选具有下列性质:1)易于在少数步骤中以高产率和纯度合成;2)装配成具有小于100nm的大小的单分散载药纳米颗粒;3)允许封装不同药物;4)显示有利的药代动力学和肿瘤积蓄;5)以受控可调的动力学释放药物;6)导致治疗反应;和7)降解成无毒组分以使得能够从身体清除而无有害毒性。虽然已提出了用于癌症疗法的许多不同的纳米尺度递送系统,但大多数不能满足这些标准,所述标准对于将此类系统移至临床实践是至关重要的。
在一个实施方案中,本发明描述了在药物附着后装配成近单分散的不足100nm大小的纳米颗粒的多肽纳米颗粒的第一个实例,所述多肽纳米颗粒是可生物降解的并且在鼠肿瘤模型中(通过使用靶向肽将siRNA递送至肿瘤细胞)显示良好的药代动力学和肿瘤积蓄、低毒性和优良的体内功效。在具体的实施方案中,本发明的多肽在与siRNA、寡聚(赖氨酸)/siRNA(核心)和ELP/抗受体肽(壳)混合后形成核心-壳纳米颗粒。
在具体的实施方案中,本发明的多肽在溶液中容易地装配并且形成纳米颗粒。术语“装配”被定义为集合或聚集在团块中以便形成颗粒。溶液可具有任何类型。溶液可以是含水的。本发明的ELP多肽经历可逆的反向温度转变:它们在低于转变温度(Tt)下在水中是结构无序的并且是高度可溶的,但当温度上升至高于Tt,显示急剧的(2-3度)混乱至有序的相变,从而导致多肽的去溶剂化和装配。当达到足够的大小时,可通过离心容易地将ELP装配体从溶液取出或与之分离。重要地,这样的相变是可逆的,当温度返回至低于ELP的Tt时,分离的ELP装配体可被完全再溶解于缓冲液中。
通过装配产生的本发明的纳米颗粒驱动亚单位组织进入具有确定大小(取决于嵌段重复的数目)(~50-100nm)的胶束(图2)。纳米颗粒多肽的模块性质提供了优于现有脂质体或纳米药物递送系统的灵活性的有利方面,因为不同的结构域序列,例如包含细胞靶向配体的序列,可容易地被克隆进入用于制备ELP的质粒载体。
在某些实施方案中,纳米颗粒包含单个多肽。这可以是与其自身AD相互作用(分子内装配)的单个多肽。在其它实施方案中,纳米颗粒包含多个肽。在该实施方案,肽的AD与不同多肽的AD结构域相互作用(分子间装配)。在其它实施方案中,纳米颗粒是嵌合型的。
在本发明的一些其它方面,纳米颗粒包含与本发明的多肽复合的治疗性药物,其中将NBD与核酸复合。例如,本发明的纳米颗粒可包含含有与治疗性核酸复合的NBD的多肽。本发明的纳米颗粒可包含DNA或RNA分子。例如,可用于本发明的纳米颗粒的核酸包括但不限于DNA表达载体、RNA表达载体、siRNA、miRNA、适体和核酶。纳米颗粒核酸在一些情况下可以是可用于基因疗法的治疗性核酸。例如,治疗性核酸可诱导癌细胞的细胞凋亡或恢复突变基因的功能以修正遗传障碍。本领域技术人员应理解,在本发明的一些方面,包含结合的核酸的纳米颗粒将在高于纳米颗粒的转变温度的温度下释放至少20、30、40、50、60、70、80、90、95%或更多的结合的核酸。
在其它实施方案中,提供了用于制造纳米颗粒的方法,其包括将本发明的多肽与核酸分子混合。在一些情况下,应理解,可将可溶性纳米颗粒用于利用核酸转染细胞。然而,在本发明的某些方面,可将纳米颗粒转变成不溶性形式以转染细胞。可在将细胞与纳米颗粒接触之前或之后将纳米颗粒转变成不溶性形式(即,聚集体)。在一些具体的情况下,可通过加热(即,通过升高纳米颗粒的温度)将纳米颗粒转变成不溶性形式。纳米颗粒制剂通常描述于Merisko-Liversidge等人,ToxicolPathol(2008)36:43中。
在某些实施方案中,纳米颗粒在与药物试剂结合时大小小于100nm。将临床上批准的药物包装进入纳米尺度递送媒介物(10-100nm的直径)对于癌症疗法具有特别的益处,因为许多研究已显示在该尺度范围内的物体在实体瘤中积累。这据认为因增强的通透性和滞留(EPR)效应而发生,所述效应由肿瘤血液和淋巴脉管系统的异常引起。
本发明不限于ELP纳米颗粒。本发明的其它实施方案可利用脂质体、葡聚糖或其它聚合物,所述聚合物(1)可携带核苷酸分子,(2)可以携带或可以不携带常规化学治疗剂,和(3)可容纳靶向特定肿瘤类型或阻断肿瘤转移的肽分子。
预期脂质体组合物可包含用于递送至组织的其它材料。例如,在本发明的某些实施方案中,可将脂质或脂质体与血凝病毒(HVJ)结合。已显示这促进与细胞膜的融合,有利于脂质体封装的DNA进入细胞(Kanada等人,1989,Science243:375-378)。在另一个实例中,可将脂质或脂质体与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与所述染色体蛋白结合在一起使用(Kato等人,1991,J.Biol.Chem.,266:3361-3364)。在其它实施方案中,可将脂质与HVJ和HMG-1复合,或与其结合使用。
在本发明的另一个实施方案中,将药物试剂封装在脂质体或纳米颗粒中,所述脂质或纳米颗粒可在循环血液中保护药物并且将药物试剂浓缩在靶向组织中。在某些实施方案中,药物试剂是核苷酸。脂质体是形成围绕核苷酸的层的脂质表面分子。通常,阳离子脂质体用于封装带负电荷的核苷酸。
在本发明的其它实施方案中,将其它靶向配体与包含药物试剂的脂质体或纳米颗粒结合,所述靶向配体靶向被指定进行细胞凋亡破坏的肿瘤细胞上的受体。还可用聚乙二醇包被(即,PEG化)脂质体以延长脂质体在循环中的寿命。类似地,可这样包被纳米颗粒。
靶向分子可以是称为适体的有机化学接头,其可特异性结合靶细胞表面上的受体。可将适体共价地连接至脂质体的质脂或纳米颗粒的聚合物。可用于将脂质体或纳米颗粒靶向肿瘤细胞的其它分子是肽、蛋白质或针对肿瘤细胞表面上的特定受体的抗体。
本发明的某些方面涉及通过将细胞与纳米颗粒接触来将药物递送至细胞的方法。应理解,此类方法可包括体外、离体或体内核酸递送。因此,在一些情况下,可给人施用本发明的纳米颗粒。
如本文中所用,术语“药物组合物”是指包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂以及本文中所述的化合物、肽或组合物的组合物,所述组合物当正确地给患者施用时能够诱导期望的治疗作用。
术语“治疗有效量”是提经测定在哺乳动物中产生治疗反应的本发明的药物组合物或在本发明的筛选方法中鉴定的化合物的量。这样的治疗有效量可容易地由本领域技术人员和使用本文中描述的方法来确定。
如本文中所用,“大体上纯的”意指作为主要种类存在(即,基于摩尔数其比组合物中的任何其它单独的种类更丰富)的目标种类。在某些实施方案中,大体上纯的级分是其中目标种类包含至少约50%(基于摩尔数或基于重量或数目)的所有存在的大分子种类的组合物。在某些实施方案中,大体上纯的组合物可包含超过约80%、85%、90%、95%或99%的存在于组合物中的所有大分子种类。在某些实施方案中,将目标种类纯化至基本上均质(其中不能通过常规检测法在组合物中检测到污染性种类),其中组合物基本上由单种大分子种类组成。
术语“患者”包括人和动物受试者。
可由本领域技术人员,根据例如期望的施用途径、递送形式和期望的剂量,确定最佳药物组合物。参见,例如,《雷氏药学大全》“REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES”,同上文。此类组合物可影响本发明的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中的主要媒介物或载体可包括但不限于注射用水、生理盐水或人工脑脊液(可能地补充有通常用于用于胃肠外施用的组合物的其它材料)。中性缓冲盐溶液或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。药物组合物可包括约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液,所述组合物还可包括山梨醇或其适当的替代物。可通过将选择的具有期望纯度的组合物与呈冻干的饼状物或水溶液形式的任选的配制试剂(《雷氏药学大全》“REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES”,同上文)混合,来制备本发明的药物组合物。此外,可使用适当的赋形剂例如蔗糖将纳米颗粒配制为冷冻干产物。
配制组分以对于施用位置是可接受的浓度存在。有利地将缓冲剂用于将组合物维持在生理pH下或略低的pH下,通常在约5至约8的pH范围内。
可胃肠外递送本发明的药物组合物。当考虑胃肠外施用时,用于本发明的药物组合物可以呈无热原的胃肠外可接受的水溶液(包含本发明的期望的纳米颗粒)的形式。制备可包括利用试剂例如可注射微球体、生物可蚀解的颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体来配制期望的分子,所述试剂可提供产物的受控或持续释放,随后可通过贮库注射(depotinjection)递送所述产物。利用透明质酸的配制具有在循环中延长持续时间的作用。可将可植入的药物递送装置用于引入期望的分子。
可通过消化道例如口服递送本发明的药物组合物。此类药学上可接受的组合物制备在本领域技术人员的能力范围内。可用或可以不用常规用于固体剂型例如片剂和胶囊的混配(compounding)的那些载体来配制以这样的形式施用的纳米颗粒。胶囊可被设计来在胃肠道中的点上释放制剂的活性部分,此时生物利用度被最大化并且系统前降解(pre-systemicdegradation)被降至最低程度。可包括其它试剂来促进本文中公开的纳米颗粒的摄入。还可应用稀释剂、调味剂、低熔点石蜡、植物油、润滑剂、混悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。
药物组合物可包括与适用于片剂制造的无毒赋形剂混合的有效量的本文中公开的纳米颗粒。通过将片剂溶解在无菌水或另一种适当的媒介物中,可以以单位剂型的形式制备溶液。适当的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙;或粘合剂例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶;或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其它药物组合物对于本领域技术人员来说是显然的,包括在持续或受控递送制剂中包含本发明的纳米颗粒或化合物的制剂。用于配制多种其它持续或受控递送工具例如脂质体载体、生物可蚀解的微粒或多孔珠粒以及贮库注射的技术对于本领域技术人员来说也是已知的。参见,例如,PCT申请No.PCT/US93/00829,该PCT申请描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂可包括以成型制品的形式(例如,薄膜或微胶囊、聚酯、水凝胶、聚乳酸(美国专利No.3,773,919和EP058,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers22:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277)和Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人,同上文)或聚-D(-)-3-羟丁酸(EP133.988))存在的半透性聚合物基质。持续释放组合物还可包括脂质体,其可通过本领域已知的几种方法的任何方法来制备。参见,例如,Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692;EP036,676;EP088,046和EP143,949。
待用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中,这可利用通过无菌滤膜的过滤来实现。在某些实施方案中,当对组合物进行冷冻干燥时,可在冷冻干燥和重建之前或之后进行使用该方法的灭菌。在某些实施方案中,用于胃肠外施用的组合物可以以冻干形式或水溶液形式存在。在某些实施方案中,通常将胃肠外组合物置于具有无菌入口的容器中,例如具有可利用皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在已配制本发明的药物组合物后,可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或作为脱水的或冻干的粉剂贮存在无菌小瓶中。可将此类制剂以即用型或以在施用前重建的形式(例如,冻干的)贮存。
可单独地或与其它治疗剂组合地,特别地与其它癌症治疗剂组合地施用本发明的药物组合物。此类试剂通常包括放射疗法或化学疗法。化学疗法,例如,可包括利用下列试剂的一种或多种的治疗:蒽环类药物、紫杉醇、他莫昔芬、多柔比星、5-氟尿嘧啶以及本领域技术人员已知的其它药物。可使用本领域已知的或本文中描述的任何方法来将本发明的纳米颗粒引入细胞。例如,可通过直接注射来实现纳米颗粒的局部递送。(Hefti,1994,Neurobiology25:1418-35.)。
实施例
下列实施例举例说明了上述方法和有利结果的某些方面。下列实施例通过举例说明而非限定的方式显示。
对于本文中公开的本发明,提供了描述将siRNA配制入包含肿瘤特异性受体的配体的基于ELP的纳米颗粒的实施例。进行一系列评估此类纳米颗粒(负载了siRNA或未负载siRNA)的物理化学性质的测定以测定颗粒大小和ζ电位(表面电荷)、siRNA掺入效率和血清稳定性。对本文中描述的基本纳米颗粒进行工程化以具有60个五聚体重复,其中客体残基Xaa=Val:Ala:Gly[5:2:3]。该纳米颗粒是具有Tt=60℃的亲水性聚合物(MW=24.5kD),以便其在体温下显示高溶解度,并且具有长血浆循环,如通过其浓度-时间曲线下面积(AUC)(13)看到的。将寡聚赖氨酸(K8;SEQIDNo.58)或寡聚精氨酸(R9;SEQIDNo.59)区段附着在纳米颗粒的N末端以提供siRNA附着位点并且赋予聚合物充足的两亲性。该区段提供了8或9个赖氨酸或精氨酸残基的药物附着点(分别地簇聚在纳米颗粒的N末端)。
实施例1.载有siRNA的受体靶向的基于ELP的纳米颗粒的制备及其在培养的人癌细胞中的物理化学和体外表征
也在此类细胞系中检查mRNA(qPCR)和蛋白质(Western印迹)水平上下调其靶基因的能力。通过下列研究确认载有siRNA的含ELP纳米颗粒保护其免受核酸酶降解、通过受体介导的胞吞作用促进其被卵巢癌细胞摄取的能力。
对具有下列构造:(i)用于siRNA凝缩的寡聚(赖氨酸);(ii)具有V5:A2:G3的X置换比率的弹性蛋白样多肽(ELP)嵌段-(VPGXG)n(SEQIDNo.57)(对于非色谱纯化和纳米颗粒稳定性)的模块化阳离子三嵌段生物聚合物的小文库进行遗传工程以用于卵巢、乳腺、前列腺、结肠、肺和皮肤癌细胞寻靶。这形成了质粒K8ELP(1-60)/pET25b。该重组法通过易行的模块交换提供了对生物聚合物结构和分子量精确控制,并且相较于常规合成聚合物不使用有害的有机溶剂。重组生物聚合物在与siRNA、寡聚(赖氨酸)/siRNA(核心)和ELP/抗受体肽(壳)混合后形成核心-壳纳米颗粒。
将人L1CAM蛋白(NM000425.3)的抗-L1CAM序列(GSQRKHSKRHIHKDHV)(SEQIDNo.19)克隆在K8ELP(1-60)/pET25b+细菌表达质粒的位点Xbal/HindIII上。通过DNA测序确认以正确方向进行的克隆。这形成了LK8ELP质粒,所表达的肽称为LK8ELP。将该表达质粒引入大肠杆菌并且生长过夜。添加异丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)(1mM)以刺激蛋白质产生。通过利用ELP的热敏感性的非色谱ITC技术纯化含ELP纳米颗粒。通过SDS-PAGE分析确认生物聚合物的纯度,产生具有25kDa的预期大小的单一蛋白质条带(参见图4,泳道7)。
还将表达肿瘤特异性CTD肽的其它核苷酸克隆进入K8ELP(1-60)/pET25b+细菌表达质粒。编码此类其它CTD肽的核苷酸序列示于表5中。如对于LK8ELP所描述的,测试所得多肽的每一种多肽。
实施例2:纳米颗粒物理化学凝缩测定(PhysicochemicalCondensationAssays)
通过凝胶阻滞测定和Scatchard型分析确认siRNA至纯化的K8ELP多肽的静电凝缩。利用DY547(Dharmacon)或用于细胞运输研究的其它适当的荧光标记物在5'有义链上标记siRNA。将标记的siRNA以0.2-2N/P(来自生物聚合物的阳离子赖氨酸的胺与siRNA的阴离子型磷酸基团的摩尔比)混合,在室温下于1Xtris碱、醋酸和EDTA(TAE)、5%葡萄糖缓冲液中温育30分钟。通过Microcon-100旋转离心将生物聚合物/siRNA纳米颗粒与游离siRNA分离。通过荧光分光光度测定定量游离siRNA和凝缩siRNA的浓度。将混合物经历通过Microcon-100的离心,所述Microcon-100保留纳米颗粒和结合的siRNA,但允许游离siRNA流过。使用荧光分光光度计和已知浓度的DY547siRNA(Ex/Em547/574)的标准曲线来测定游离和结合的siRNA的浓度。利用斯卡恰特作图分析(Scatchardplotanalysis)计算生物聚合物对于siRNA的亲和常数(Kd),将获得低微摩尔范围。对所有具有CTD的K8ELP多肽进行该制备。
通过结合至纳米颗粒的siRNA的凝胶阻滞分析来分析K8ELP(1-60)纳米颗粒的物理化学特征。在该测定中,将siRNA(100pmol)与纳米颗粒的系列稀释物混合,在环境温度下温育30分钟。将产物在1%的1XTAE缓冲液中的琼脂糖凝胶上于120V下经历电泳分离,进行30分钟。凝胶包含用于siRNA的显现的溴化乙锭。通过K8ELP(1-60)纳米颗粒凝缩的siRNA不离开孔(图5,泳道8)。也对所有具有CTD的K8ELP多肽进行该凝阻滞分析。还利用动态光散射和扫描电子显微镜术评估K8ELP(1-60)纳米颗粒的物理化学表征,所述纳米颗粒显示了具有狭窄分布的小于100nm的平均大小。还通过ζ电位和RAN酶保护来评估所K8ELP纳米颗粒的物理化学表征。
还可通过凝胶迁移、SDS-PAGE评估纳米颗粒在100%人血清中的稳定性,以及利用荧光分光光度法评估siRNA从纳米颗粒的释放。
实施例3.细胞靶向结构域的结合测定
通过免疫沉淀测定检查LK8ELP的L1CAM肽结合肿瘤细胞的能力。评估所有包含CTD的其它K8ELP肽。利用蛋白G预包被的蛋白GMagnaBind珠粒(Pierce,Rockford,IL,Cat#21356)提供了用于纯化各自亲和靶的即用型方法。除利用非常严苛的条件(例如在上样缓冲液中煮沸以用于SDS-PAGE或于8M盐酸胍,pH1.5中)外,否则蛋白G与抗体之间的高亲和力相互作用不能高效离解。对于离心或重力法选择磁珠以避免在沉淀中非特异性地包含纳米颗粒。
利用标准多克隆抗体产生技术在黄山羊(BethylLaboratories,MontgomeryTX)中制备抗受体抗体。将受体结合肽缀合至钥孔血蓝蛋白(keyholelimpetprotein),反复地注射入山羊。8周后从山羊分离抗血清,通过Western印迹分析从肿瘤细胞分离的靶向蛋白来确认抗肿瘤细胞结合。
在4℃下利用和不利用10μg山羊抗人受体抗体温育ELP纳米颗粒(0.75mg/样品)过夜。将蛋白GMagnaBind珠粒添加至96深孔板(0.5mg或0.25mg/孔)。通过使用磁力架,利用含0.1%Tween-20的Tris缓冲盐溶液洗涤珠粒,用纳米颗粒样品/抗体混合物温育1小时,洗涤3次,随后在96℃下利用SDS-PAGE还原性样品缓冲液洗脱10分钟。利用SDS-PAGE分离洗脱物,利用抗受体抗体通过Western印迹进行分析。
实施例4.纳米颗粒至肿瘤的定位
通过完整动物生物发光成像(BLI)来非侵入性地监测肿瘤的大小和位置。制备包含荧光(Dy677)标记的siRNA的两种不同的纳米颗粒制剂,一种包含肿瘤特异性受体LK8ELP(1-60)的配体,另一种不存在该肽K8ELP(1-60)。荷瘤小鼠的组(n=3)以3个剂量水平(对于siRNA,1、3或10mg/kg)之一接受每一种纳米颗粒制剂的单次静脉内注射。在3个施用后时间点(O.5、4和24小时)上,通过完整动物生物发光成像测量两种K8ELP(1-60)纳米颗粒的定位。
利用100,000个SKOV3ip2.1uc-D3转移人卵巢肿瘤细胞在左卵巢中囊内(intrabursally)单向注射小鼠(20g)。对于靶向其它癌症的CTD肽,注射相应的肿瘤细胞系而非卵巢肿瘤细胞(参见表2)。基于测试的癌症类型,注射位置也将改变(例如,注射入肺、结肠、脑)。注射后1周,通过在IVISSpectrum上进行BLI成像来确认肿瘤的存在。使用下列激发/发射滤光器以及通过自动曝光来进行荧光成像:EX:605nm;EM:640、660、680、700、720、740、760、780nm;以及EX:675;EM:720、740、760、780nm。
表2.癌细胞系
癌症类型 | 细胞系 |
卵巢癌 | A1847,OVCAR3,OVCAR5,和SKOV3 |
结肠癌 | HCT116,HT29 |
肺癌 | SW900,H460,A549 |
膀胱癌 | HT1376,HT11197,RT4 |
乳腺癌 | MDA-MB-231,MCF-7 |
神经母细胞瘤 | SK-N-BE(1),SK-N-BE(2) |
前列腺癌 | LNCaP和PC3 |
黑色素瘤 | WM-266-4 |
胰腺癌 | HPAFII,PANC-1,PANC03.27,或SW1990 |
肝癌 | SK-HEP1,SNU-398 |
利用标记的裸露siRNA(Dy677-siEVI1)(作为对照)和K8ELP(1-60)中的标记的siRNA(Dy677-ELP-siEVI1)(作为处理组)注射两只小鼠,结果与媒介物组一起示于图6中。利用产生未被饱和的图像的暴露时间进行生物发光成像。使用与Dy677具有非常相似的Ex/Em的Cy5.5的参数进行降低本底自发荧光的光谱解混。将所有时间点(O.5、4和24小时)的所有荧光和BLI图像置于相同的标度上,以便可在时间点之间进行直接比较。发现包含标记siRNA的基本K8ELP(1-60)纳米颗粒在4小时内特异性定位至肿瘤,并且被肿瘤代谢,因此到24小时时信号消失(参见图6)。
实施例5.siRNA至肿瘤的递送
还按照表2,在癌细胞系中检查siRNA在mRNA(qPCR)和蛋白质(Western印迹)水平上下调其靶基因的能力。利用5'RACE技术测量RNA干扰的确认。用于原理认证的siRNA是致癌转录因子EVI1的siRNA。在尸检时切除小鼠的肿瘤,将其贮存在异硫氰酸胍TRIZol溶液中并且进行冷冻。按照制造商的说明书,使用TRIZol法(Invitrogen,Carlsbad,CA)从小鼠肿瘤分离总RNA。在反转录后,使用随机引物和AMV-逆转录酶进行PCR。
聚合酶链式反应(PCR)测定:进行PCR测定以检测在本文中描述的siRNA试剂存在的情况下EVI1基因表达的变化。为了进行这些测定,使用的PCR反应条件是95℃的解链温度(进行60秒);进行25-30轮热循环(在95℃下进行30秒,在60℃下进行30秒,以及在72℃下进行30秒),以及在72℃下延伸60秒。
在这些测定中,使用TRIZol从小鼠肿瘤分离总RNA。使用从IntegratedDNATechnologies(Coralville,Iowa)获得的靶特异性探针和引物进行定量PCR(qPCR)。使用CloneManager程序(Sci-Ed软件)设计EVI1和β-肌动蛋白mRNA的引物和受体,正向和反向引物的序列示于下面。使用ThermoFisherVersocDNA分析试剂盒制备PCR模板cDNA。通过使用从总RNA制备的cDNA,显示在核酸浓度的三-log范围(three-logrange)中样品浓度与扩增动力学之间的线性关系来验证所有qPCR试剂。Taqman通用主混合物(Fermentas)用于PCR反应,使用ABIPrism7900序列检测仪收集扩增数据,使用来自AppliedBiosystems(Carlsbad,CA)的序列检测系统软件(SDSV2.0)进行分析。除非另有说明,否则通过针对β-肌动蛋白进行标准化ΔCT=CT靶-CTβ-肌动蛋白以及针对未处理的肿瘤细胞的mRNA丰度进行校正(ΔΔCT=ΔCTEVIRNAΔCTsiGlo)来计算mRNA存度。
将癌细胞中的EVI1mRNA丰度针对β-肌动蛋白进行标准化,以及针对HFC细胞进行校正。用SigmaStat的Mann-WhitneyRankSum分析功能进行QPCR结果的统计分析。
表3:EVI1siRNA序列
5'-RLM-RACE:按照具有改进的InvitrogenGeneRacer手册进行5'-RLM-RACE。在37℃下使用T4RNA连接酶(5个单位)将2至8微克的总RNA直接连接至250ngGeneRacerRNA衔接头(adaptor):(5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3')(SEQIDNo.64),进行1小时。在苯酚提取和乙醇沉淀后,使用SuperScriptIII(Invitrogen)和EVI1基因特异性逆转录引物(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(SEQIDNo.61)在55℃下反转录纯化的连接产物,进行45分钟,随后在70℃下进行灭活。使用GeneRacer5'引物(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3')(SEQIDNo.66)和EVI1基因特异性反向引物(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(SEQIDNo.61)进行5'-RLM-RACE-PCR。使用ABIPrism7900序列检测仪进行PCR,使用ABI的序列检测系统软件(SDSV2.0),利用如下PCR条件进行分析:在95℃下进行3分钟(1个循环),40个循环(在95℃下进行30秒,在60℃下进行30秒,在72℃下进行1分钟),在72℃进行10分钟(1个循环)。
随后使用GeneRacer5'巢式引物(5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3')(SEQIDNo.66)和EVI1基因特异性巢式引物(5'-TAGTCATCCTCAGGGTTTCC-3')(SEQIDNo.61)进行第二轮巢式PCR。将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳,利用1μgμl-1溴化乙锭进行染色。从凝胶切取PCR产物,对其进行直接测序以确认RACE条带的身份。对于细胞培养物RACE实验,使用LipofectamineRNAiMax(Invitrogen)利用20nMEVI1siRNA转染500,000个HT-144黑色素瘤细胞。转染后48小时,如早前所述,提取RNA以进行RLM-RACE。
Western印迹:将来自小鼠肿瘤的蛋白质制剂(80ng/泳道)在10%SDS-PAGE凝胶上进行分离,利用标准方法对免疫印迹进行显色。将OVCAR3细胞系用作L1CAM免疫印迹的阳性对照。使用山羊抗人受体(1/50)、偶联有双氯吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑底物系统的兔抗山羊碱性磷酸酶(1/2000)对免疫印迹进行显色。使用Epson扫描仪以6000d.p.i.的分辨率获得L1CAM的光密度面积,利用MacBASv2.0定量软件(FujiInc.,Stamford,CT)分析数据。使用EVI1作为测试siRNA分子,如所描述的测试每一种含有CTD的肽。
本文中引用的所有专利、专利申请、科学论文和其它资源和参考文献通过引用将其教导的完整内容通过引用明确地并入本文,就如同它们的全部内容明确地在本申请中显示的一样。
应当理解,前述公开内容强调了本发明的某些具体实施方案以及与其等同的所有变动或改变在所附权利要求所示的本发明的精神和范围内。
表4.肿瘤特异性配体核苷酸序列
表5.其它序列
引用的参考资料
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Claims (25)
1.一种分离的多肽,其包含装配结构域(AD)、细胞靶向结构域(CTD)和核酸结合结构域(NBD),其中所述CTD包含SEQIDNo.1-27中任一个的序列。
2.根据权利要求1所述的多肽,其还包含药物结合结构域(DBD)。
3.根据权利要求1所述的多肽,其中所述分离的多肽包含SEQIDNo.56。
4.根据权利要求1所述的多肽,其中所述核酸结合结构域(NBD)包含阳离子结构域,其任选地包含:
寡聚赖氨酸结构域,其包含氨基酸序列(Val-Gly-LysK-Gly),其中K是大于1的整数,和/或
寡聚精氨酸结构域,其包含氨基酸序列(Val-Gly-ArgR-Gly),其中R是大于1的整数。
5.根据权利要求4所述的多肽,其中K等于8和/或R等于9。
6.权利要求1所述的多肽,其中所述AD包含:
弹性蛋白样多肽(ELP),和/或
氨基酸序列(Val-Pro-Gly-X-Gly)N(SEQIDNo.57),其中X是包含Val、Ala和Gly的肽,并且N是等于或大于1的整数。
7.根据权利要求6所述的多肽,其中N等于60,和/或X是以约5:2:3的比率包含Val、Ala和Gly的肽。
8.权利要求1所述的多肽,其中所述CTD包含SEQIDNo.19。
9.权利要求1所述的多肽,其中所述CTD与存在于靶细胞外部、存在于靶细胞内部、存在于靶细胞的外表面上、存在于靶细胞的内表面上、和/或存在于靶细胞的任何其他表面上的生物分子相互作用。
10.一种分离的多核苷酸,其包含编码根据权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸包含SEQIDNo.55。
12.一种宿主细胞和/或重组表达构建体,其包含根据权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.一种纳米颗粒,其包含根据权利要求1所述的一种或多种多肽,其中所述纳米颗粒在溶液中装配。
14.根据权利要求13所述的纳米颗粒,其还包含药物试剂。
15.一种或多种包含装配结构域(AD)、细胞靶向结构域(CTD)和核苷酸的结合结构域(NBD)和/或药物结合结构域(DBD)的多肽在制备用于将药物试剂靶向靶细胞的方法的组合物中的用途,所述方法包括:
获得一种或多种包含装配结构域(AD)、细胞靶向结构域(CTD)和核苷酸的结合结构域(NBD)和/或药物结合结构域(DBD)的多肽,其中所述CTD包含SEQIDNo.1-27中任一个的序列;
将所述药物试剂与一种或多种多肽的NBD和/或DBD接触;
装配一种或多种多肽的AD以产生装配的多肽:
将所述装配的多肽与所述靶细胞接触;和
将所述装配的多肽的CTD与存在于所述靶细胞外部和/或内部的生物分子接触。
16.根据权利要求15所述的用途,其中所述一种或多种多肽包含SEQIDNo.56。
17.权利要求14所述的纳米颗粒,其中所述药物试剂包含siRNA、shRNA、miRNA、单链核酸、双链核酸、DNA表达载体、RNA表达载体、寡核苷酸和/或化学化合物。
18.权利要求15或16所述的用途,其中所述靶细胞是肿瘤细胞,所述肿瘤细胞包含人膀胱细胞、人乳腺细胞、人结肠细胞、人肝细胞、人肺细胞、人神经母细胞瘤细胞、人卵巢细胞、人胰腺细胞、人前列腺细胞或人皮肤细胞。
19.权利要求9所述的多肽,其中所述生物分子包含细胞粘着分子。
20.权利要求9所述的多肽,其中所述生物分子包含受体分子。
21.权利要求9所述的多肽,其中所述生物分子包含纤连蛋白或层粘连蛋白。
22.权利要求15或16所述的用途,其中所述药物试剂包含siRNA、shRNA、miRNA、单链核酸、双链核酸、DNA表达载体、RNA表达载体、寡核苷酸和/或化学化合物。
23.权利要求15所述的用途,其中所述生物分子包含细胞粘着分子。
24.权利要求15所述的多肽,其中所述生物分子包含受体分子。
25.权利要求15所述的多肽,其中所述生物分子包含纤连蛋白或层粘连蛋白。
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