JP2003528024A - 製剤化された核酸分子の無針注入 - Google Patents

製剤化された核酸分子の無針注入

Info

Publication number
JP2003528024A
JP2003528024A JP2000539160A JP2000539160A JP2003528024A JP 2003528024 A JP2003528024 A JP 2003528024A JP 2000539160 A JP2000539160 A JP 2000539160A JP 2000539160 A JP2000539160 A JP 2000539160A JP 2003528024 A JP2003528024 A JP 2003528024A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
skin
mammal
needleless
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000539160A
Other languages
English (en)
Inventor
バリー，マイケル
マンパー，ラス
スミス，ルー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Publication of JP2003528024A publication Critical patent/JP2003528024A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH

Abstract

(57)【要約】 無針注入により哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に核酸分子を輸送するための新規な方法が提供される。該方法は、製剤化された核酸分子と、分子を空気、液体および／または機械的圧力により注入するための装置とを組み合わせることを含む。哺乳動物への核酸の投与およびその取り込みを増強させる組成物および方法が開示される。開示される方法は、製剤化された核酸分子が広範な種類の細胞タイプにより同時に取り込まれることを可能とすることにより、増加した免疫応答を提供する。また、製剤化された核酸分子と無針注入方法との組み合わせにより、輸送の慣用的手段により得られるものより優れた免疫応答が得られることを示す例が開示される。輸送の方法、ならびに核酸分子を種々の化合物、例えばカチオン性複合体形成剤、ポリマー性および非ポリマー性製剤、保護性、相互作用性、非凝縮性システムとともに製剤化する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連する出願の記述 本出願は、"ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＳＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲＳ ＦＯ
Ｒ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ Ａ Ｃ
ＥＬＬ"と題する米国特許出願（出願番号０８／４８４，７７７、１９９５年７
月７日出願）、"ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲＳ ＦＯ
Ｒ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮＴＯ Ａ Ｃ
ＥＬＬ"と題する国際出願（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５６７９、１９９６年４月２
３日出願）および米国特許出願"ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲＳ ＦＯＲ ＳＰＥＣ
ＩＦＩＣ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＴＯ Ｃ
ＥＬＬＳ"（出願番号６０／０４５，２９５、１９９７年５月２日出願）に関連
し、これらはすべて、図面を含めてその内容の全てを本明細書の一部としてここ
に引用する。
【０００２】 序論 本発明は、製剤化された核酸分子を無針注入により輸送するのに有用な生成物
および方法に関する。
【０００３】 発明の背景 以下の情報は、読者の理解を助けるためにのみ提供され、いずれの情報も本発
明の特許請求の範囲に対する先行技術を記載または構成すると認めるものではな
い。
【０００４】 これまでに、核酸のインビボでの非ウイルス性投与が種々の方法により行われ
てきた。これらには、リポフェクチン／リポソーム融合：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，ｐｐ．７４１３−７４１７（１９９
３）；アデノウイルス増強とともにまたはなしの凝縮されたポリリシン：Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３，ｐｐ．１４７−１５４（
１９９２）；および核酸の細胞へのトランスフェリン：トランスフェリンレセプ
ター輸送：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌｕｍｅ ８７，ｐ
ｐ．３４１０−３４１４（１９９０）が含まれる。ポリアクリル酸からなる特定
の組成物の使用がＷＯ９４／２４９８３に開示されている。国際公開ＷＯ９０／
１１０９２に開示されているように、裸のＤＮＡが投与されている。
【０００５】 針シリンジが導入されて以来、注射技術はほとんど変化していない。注射は、
以前は医学療法の単純かつ無害の部分であると考えられていたが、現在では不吉
な結果となり始めている。注射針刺傷は生命を脅かす事象でありうる。ジェット
注入またはエアロゾル圧力による蛋白質の注入は、１９４７年に臨床使用に導入
され（Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｎｅ，５１６−５２４，１９
６３）、科学的データの基礎は、この注入方法の安全性および有効性を確認して
きた（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９
５．ｐ．８１５，１９８３）。現在のエアロゾル圧力注入器は、ユーザが浸透（
ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の正確な深度を選択することができるよう対応してお
り、筋肉内、皮下、または表皮注入のために設計されたシリンジとともに入手可
能である。
【０００６】 エアロゾル圧力注入を用いてＨｂｓＡｇ蛋白質に対してウサギを免疫すること
は、伝統的なシリンジと針の方法より優れていることが示され、通常のシリンジ
と針と比較したとき、８週間で抗体産生の４倍近い増加が得られた（Ｄａｖｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ｖｏｌ．１２（１６）：１５０３−９，１９
９４）。Ｄａｖｉｓらの研究においては、ＤＮＡをエンドトキシン非含有ダルベ
ッコＰＢＳ中に懸濁し、注入すべき領域は前処理しなかった。
【０００７】 エアロゾル注入による組織のトランスフェクションは、有針注入法より優れて
いると報告されている（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ０（２１Ａ
），１９９５）。また、ウサギパピローマウイルスゲノムをウサギ上皮内にエア
ロゾル注入すると乳頭腫が誘導されることが示されている（Ｂｒａｎｄｓｍａ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８．４８
１６−４８２０，１９９１）。生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳組織
をトランスフェクトするために、エアロゾル注入を用いて、ヒトサイトメガロウ
イルス極初期遺伝子１エンハンサー／プロモーター配列、細菌クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ、ホエー酸性蛋白質プロモーター配列、および
細菌ガラクトシダーゼ遺伝子が、皮膚表面を通して導入された（Ｆｕｒｔｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０５，３６
５−３６８，１９９２）。ＤＮＡの細胞取り込みを増強する溶液中にエアロゾル
注入ＤＮＡ構築物を懸濁することは、１回の注入でトランスフェクトされる細胞
の数を増加するかもしれないと述べられている（Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，上
掲）。
【０００８】 沈殿法により不活性粒子に結合させたＤＮＡが、無針注入により輸送された。
不活性粒子、例えば金マイクロ発射体を被覆し、これを無針装置により注入する
ことは、発射担体が細胞内に浸透するため、細胞への直接注入を提供する。Ｔａ
ｎｇらは、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡで被覆した金マイクロ発射体を
マウスに接種し、この方法はヒト成長ホルモンをコードするプラスミドの有針注
入より優れていると述べている。Ｔａｎｇらは、この技術が、蛋白質精製および
アジュバント投与の工程を排除することにより、特定の蛋白質に対する抗体を産
生するのに必要な工程を単純にし、時間を短縮することを報告している（Ｔａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３５６：．１５２−１５４ １９９
２）。
【０００９】 発明の概要 本発明は、核酸の哺乳動物への投与および取り込みを増強するための組成物お
よび方法を特徴とする。核酸のインビボでの無針輸送を増強するための有効な戦
略は、核酸を分解から保護し、このことにより、細胞へのその取り込みをさらに
増加させるために、投与された核酸を標的部位において維持することである。本
明細書に提示されるデータは、製剤化された核酸分子と無針注入方法との組み合
わせが相乗的であり、製剤化されていない核酸の無針注入または製剤化された核
酸の有針注入のいずれと比較しても、その結果発現される蛋白質に対する予測し
えないほど高い所望の抗体応答を提供することを示す。
【００１０】 本発明は、哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に空気によりまたは機
械的圧力により分子を投与するような形状および配置とされている装置を用いる
ことにより、製剤化された核酸分子を哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮
膚に輸送する方法を提供する。すなわち、本発明は、無針装置と製剤化された核
酸分子との組み合わせにより、核酸分子のインビボでの細胞への優れた輸送を可
能とする。さらに、本発明はまた、疾病の治療、ワクチン接種および筋肉疾患お
よび血清蛋白質不全の治療を可能とする。
【００１１】 第１の観点において、本発明は、無針注入装置を用いることにより、トランス
フェクション促進剤とともに製剤化された核酸分子を哺乳動物の皮膚を通してお
よび／または皮膚に輸送する方法を特徴とする。好ましくは、無針装置は、製剤
化された核酸を哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚にエアロゾル輸送す
るような形状および配置とされている。
【００１２】 "輸送"または"輸送する"とは、核酸分子を所望の細胞または任意の細胞に運搬
することを意味する。核酸分子は、所望の標的を含む多数の細胞系に輸送される
であろう。輸送の結果、核酸分子は、細胞表面、細胞膜、細胞エンドソーム、細
胞膜内、核または核内、または細胞の他の任意の所望の領域と接触し、そこから
種々の細胞系中でトランスフェクションが生じうる。細胞系としては、上皮細胞
、ランゲルハンス細胞、ラングハンス細胞、レテラー細胞、ケラチノサイト、樹
状細胞、マクロファージ細胞、クップファー細胞、リンパ球およびリンパ節が挙
げられるがこれらに限定されない。好ましくは、核酸分子は、皮膚を通しておよ
び／または皮膚にエアロゾル圧力により輸送することができ、これは有意には剪
断されない。
【００１３】 本明細書において用いる場合、"核酸"との用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方
を意味し、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは凝縮され
た（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）核酸、カチオン性脂質とともに製剤化された核酸、ペ
プチドとともに製剤化された核酸、アンチセンス分子、カチオン性物質、ＲＮＡ
またはｍＲＮＡが挙げられる。好ましい態様においては、投与される核酸は"ベ
クター"を含むプラスミドＤＮＡである。核酸は、ヒト成長ホルモンを発現する
真核生物プロモーターを有するプラスミドＤＮＡベクター、例えば実施例に与え
られるようなものでありうるが、これに限定されない。
【００１４】 本明細書において用いる場合、"製剤化された"との用語は、核酸分子をより安
定に、保護されるように、したがってより容易に輸送可能にする様式で、核酸分
子をトランスフェクション促進剤と組み合わせる工程を意味する。
【００１５】 本明細書において用いる場合、"トランスフェクション促進剤"との用語は、核
酸とともに複合体を形成する薬剤を表す。この分子複合体は、共有結合によりま
たは非共有結合により核酸分子と会合する。トランスフェクション促進剤は、核
酸分子を安定な状態で運搬し、結合した核酸分子を細胞内部に放出することが可
能でなければならない。トランスフェクション促進剤はまた、核酸分子に結合す
ることができなければならず、凍結乾燥し、無針輸送の前に再水和するかまたは
微粉体として無針輸送により輸送することができなければならない。
【００１６】 さらに、トランスフェクション促進剤は、エンドソーム溶解による核酸分子の
リソソーム分解も防止するかもしれない。さらに、トランスフェクション促進剤
は、核酸分子を細胞の細胞質を通って核膜へ、さらに核内に効率的に運搬し、保
護を与えることを可能とする。
【００１７】 好ましい態様においては、トランスフェクション促進剤は、非凝縮性ポリマー
、油、および界面活性剤である。これらは核酸の局所的生体利用性を長期化させ
る化合物として用いるのに適しているであろう：ポリビニルピロリドン；ポリビ
ニルアルコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ポリビニル
アセテート；ポロキサマー（プルロニクス）（プロピレンオキシドとエチレンオ
キシドとのブロックコポリマー、２つのサブユニットの相対量は異なるポロキサ
マーで様々でありうる）；ポロキサミン（テトロニクス）；エチレンビニルアセ
テート；セルロース（カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの塩を含む）；
ヒアルロン酸塩；アルギン酸塩；ヘテロポリサッカライド（ペクチン）；デキス
トラン；キトサン；ホスファチジルコリン（レクチン）；ミグリオール；ポリ酢
酸；ポリヒドロキシ酪酸。これらの化合物のいくつかは、保護性、相互作用性、
非凝縮性化合物として用いることができ、別のものは徐放性化合物として用いる
ことができるが、いくつかはそれぞれ適当な条件下でいずれかの様式で用いるこ
とができる。
【００１８】 別の態様においては、カチオン性凝縮剤、例えばカチオン性脂質、ペプチド、
またはリポペプチドは、核酸分子と会合し、トランスフェクションを容易にする
であろう。
【００１９】 さらに別の態様においては、これらの化合物のいくつかは金粒子に共有結合さ
せることができ、このことにより本発明の核酸分子と結合する。本発明のポリマ
ー（単数または複数）により被覆された金粒子は、無針注入装置により輸送され
た場合、細胞中に浸透することにより、核酸分子を細胞内に輸送することができ
る。
【００２０】 本明細書において用いる場合、"保護する"または"保護性"または"保護された"
との用語は、核酸の分解の速度が特定の環境中で減少し、このことにより核酸分
子の局所的生体利用性を長期化するように、そのような化合物と核酸との間の相
互作用に影響を及ぼすことを表す。そのような分解は、種々の異なる因子による
ものでありえ、特にヌクレアーゼの酵素作用を含む。保護性作用は、種々の方法
、例えば、ヌクレアーゼ分子の排除によりまたは水の排除により提供することが
できる。
【００２１】 核酸を保護し、および／または核酸の局所的生体利用性を長期化する化合物は
、その物理学的、化学的またはレオロジー特性のため、以下の効果の１またはそ
れ以上を与えるであろう：（１）核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）を立体配置、
粘度のためヌクレアーゼから保護し、または他の効果、例えば剪断から保護する
；（２）核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）が、細胞外マトリクスを通しかつ細胞
膜を越えて、接触する領域を増加させ、核酸をその中に取り込ませる；（３）水
の排除により核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）を細胞表面で濃縮する；（４）浸
透圧、疎水性または溶解性効果により、細胞膜を破壊することにより核酸（例え
ばプラスミドＤＮＡ）の取り込みを間接的に促進する；および（５）保護された
核酸鎖の投与部位の組織を通した拡散を可能とすることにより、核酸の取り込み
を間接的に促進する。
【００２２】 "核酸の局所的生体利用性を長期化させる"とは、核酸をそのような化合物を含
む組成物中で生物に投与したとき、核酸が、そのような化合物なしの組成物とし
て投与されたとき、例えば食塩水溶液中で投与された場合よりもより長期間、細
胞による取り込みについて利用可能であろうことを意味する。核酸の細胞にとっ
てのこの増加した利用可能性は、例えば、核酸を含有する組成物と細胞との間の
接触時間が増加するため、または核酸がヌクレアーゼによる攻撃から保護される
ために生ずる。核酸の局所的生体利用性を長期化させる化合物は、内部投与に適
している。
【００２３】 "内部投与に適した"とは、化合物が生物の組織内に、例えば、筋肉中または関
節空間内、表皮、皮内、または皮下に投与されるのに適していることを意味する
。化合物を内部投与に適したようにする特性としては、例えば、全体として高レ
ベルの毒性を生物に与えないことが含まれる。
【００２４】 本明細書において用いる場合、"無針注入装置"との用語は、空気および／また
は機械的圧力により哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に、そして組織
内にエアロゾルを注入することができる装置に関する。このタイプの慣用的な装
置は、当業者が所望の注入深度を選択するおよび／または調節することを可能と
するよう対応していることが理解され、したがって、この機能を行う将来の装置
もまた同様に対応するであろうことが予測される。このタイプの装置は、次にエ
アロゾル化され、無針手段により輸送される溶液を採取するためにのみ用いられ
る針を有していてもよいこともまた理解されるであろう。注入装置のタイプは本
発明の限定的観点であるとは考えられない。実際には、無針装置の主として重要
な点は、装置が製剤化された核酸分子のエアロゾルを哺乳動物の皮膚を通してお
よび／または皮膚に輸送する能力である。無針注入装置は、例えば米国特許５，
４８０，３８１に記載されているようなＧｅｎｅ Ｇｕｎもしくは無針注射器ま
たはＰＣＴ ＷＯ／０９７／１３４６５２に記載されているような粉体輸送装置
を含む。
【００２５】 本明細書において用いる場合、"装置"との用語は、組み合わせたときに哺乳動
物の皮膚を通しておよび／または皮膚にエアロゾルを輸送することを可能とする
構成要素のセットに関する。構成要素は、製剤化された核酸分子を採取および／
または投与することができるノズルまたは無針シリンジ、および哺乳動物の皮膚
を浸透しうるエアロゾルを作り出す様式で、製剤化された核酸分子をノズルまた
は無針シリンジから強制的に排出させる空気圧を作り出すためのポンプまたはス
プリングでありうる。空気圧を作り出すためには、装置はガス圧、ガススプリン
グまたはスプリング力を用いることができる。
【００２６】 好ましくは、装置は、輸送の深度の選択を可能とするように対応させることが
できる。したがって、輸送は皮膚を通してまたは皮膚へ行うことができる。
【００２７】 本明細書において用いる場合、"エアロゾル"との用語は、製剤化された核酸分
子の微粒子ミストの形態での懸濁物である。エアロゾルは、ガス中に分散されガ
スに囲まれた非常に微細に再分割された液体または粒子からなるコロイド系とし
て定義されてきた。本発明のエアロゾルは、製剤化された核酸分子の微細ミスト
を発生するための液化もしくは圧縮ガスまたは機械的スプリングの力に依存しう
る。エアロゾルの粒子は１−５０μｍより小さい範囲でありうる。粒子は比較的
長い時間空気中に浮遊したままであるといわれる。粒子のサイズは、慣用的な方
法、例えばエアロゾル粒子サイズを測定するためのミルケン（Ｍｉｌｋｅｎ）油
滴実験により測定することができるが、特定のサイズを測定する必要はなくなり
つつある（Ｓｃｉａｒｒａ， ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．ｃｈａｐｔｅｒ
９２，１９９０）。エアロゾルは、液体、粉体、または液相および固相の両方
を含む不均一ミストでありうる。
【００２８】 "皮膚"との用語は、表皮および皮膚組織、および汗腺管および毛包等の付属器
からなる、哺乳動物の外部被覆を表す。皮膚は、哺乳動物が体毛に覆われた表皮
を有する場合には、哺乳動物の体毛を含む。毛皮または生皮と考えるべき多くの
体毛を有する哺乳動物においては、体毛を剃って主に皮膚を残すことが好ましい
。
【００２９】 "哺乳動物"との用語は、任意の温血生物を表す。好ましくは哺乳動物はヒトで
ある。
【００３０】 好ましい態様においては、該方法により、核酸分子によりコードされる蛋白質
産物を標的とする免疫応答、好ましくは体液性免疫応答が得られる。例えば、食
塩水中に懸濁した核酸分子によりコードされる蛋白質産物の有針注入により引き
起こされる抗体応答より好ましくは少なくとも３倍高い抗体応答、およびトラン
スフェクション促進剤とともに製剤化された核酸分子の有針注入により引き起こ
される抗体応答より少なくとも１０倍高い抗体応答が得られる。別の状況におい
ては、免疫応答は好ましくは細胞毒性Ｔ−リンパ球応答である。
【００３１】 本明細書において用いる場合、"免疫応答"との用語は、外来物質が内面化され
たときに起こりうる哺乳動物の自然の防御メカニズムを表す。免疫応答は、免疫
系成分の全体が関与する全体的免疫応答でありうる。好ましくは、免疫応答は、
製剤化された核酸分子によりコードされた蛋白質産物により生ずる。免疫応答は
、抗体産生、Ｔ−細胞増殖／分化、細胞毒性Ｔ−リンパ球の活性化、および／ま
たはナチュラルキラー細胞の活性化でありうるが、これらに限定されない。好ま
しくは、免疫応答は体液性免疫応答である。しかし、上述したように、別の状況
においては、免疫応答は好ましくは細胞毒性Ｔ−リンパ球応答である。
【００３２】 "体液性免疫応答"との用語は、内面化した外来物質に応答した抗体の産生を表
す。好ましくは外来物質は、無針装置を用いた注入により内面化された、製剤化
された核酸分子によりコードされる蛋白質産物である。
【００３３】 さらに別の態様においては、無針装置は、Ｍｅｄｉｊｅｃｔ，Ｂｉｏｊｅｃｔ
，Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ，Ｍｅｓｏｆｌａｓｈ，Ｐｅｄ−Ｏ−ｊｅｃｔおよびＰｏｗ
ｄｅｒ−Ｊｅｃｔからなる群より選択される。一般に、そのような装置は使用の
指針を伴うことが理解される。
【００３４】 別の観点においては、本発明はキットを特徴とする。キットは、トランスフェ
クション促進剤とともに製剤化された核酸分子を提供するためのプロバイダおよ
び核酸分子を哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に輸送するための無針
手段を含む。
【００３５】 "プロバイダ"は、当業者が製剤化された核酸分子を作成することを可能とする
ように与えられる教示であってもよい。教示は、核酸分子を製剤化するために用
いられる化合物を作成する工程を与えるであろう。さらに、教示は、製剤化され
た核酸分子が無針装置から注入されるときに傷害を受けたか否かを確認するため
の、製剤化された核酸分子を試験する方法を含むであろう。プロバイダはまた、
製剤化された核酸分子そのものであってもよい。
【００３６】 本明細書において用いる場合、"トランスフェクション"との用語は、ＤＮＡ（
例えば製剤化されたＤＮＡ発現ベクター）を細胞内に導入し、このことにより細
胞の形質転換を可能とする工程を表す。細胞内に入った後、トランスフェクトさ
れたＤＮＡは、（１）宿主ＤＮＡと組み換える；（２）プラスミドまたは溶原性
ファージとして独立して複製する；または（３）排除されるまで複製せずにエピ
ソームとして維持される。
【００３７】 本明細書において用いる場合、"形質転換"とは、その細胞によるベクターの取
り込みにより誘導された、細胞の特徴（発現される表現型）の過渡的または永久
的な変化を表す。遺伝的物質を、それが特定の遺伝子産物を発現するか外来遺伝
子産物の発現または影響を変更する形態で、細胞中に導入する。
【００３８】 細胞の形質転換には、蛋白質およびＲＮＡ等の種々の遺伝子産物の産生が伴っ
ていてもよい。これらの産物は、細胞内もしくは細胞外構造要素、リガンド、ホ
ルモン、神経伝達物質、成長制御因子、酵素、ケモタキシン、血清蛋白質、レセ
プター、低分子量化合物のための担体、薬剤、免疫調節剤、オンコジン、サイト
カイン、腫瘍抑制因子、トキシン、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、三本
鎖形成阻害剤、リボザイム、またはその活性を調節する目的で細胞構造上の特定
の構造決定要素を認識するリガンドとして機能するであろう。この一覧は例示に
すぎず、限定することを意味するものではない。
【００３９】 別の観点においては、本発明はキットを作成する方法を特徴とする。好ましく
は、該方法は、トランスフェクション促進剤とともに製剤化された核酸を提供す
るためのプロバイダと、哺乳動物に核酸を輸送するための無針手段とを組み合わ
せる工程を含む。核酸を提供するためのプロバイダは、核酸分子を製剤化するた
めの教示または単に製剤化された核酸分子でありうる。
【００４０】 さらに別の観点においては、本発明はまた、慣用的にヒト成長ホルモンを投与
することにより治療されている疾患を患う哺乳動物を治療する方法を特徴とする
。該方法は、ヒト成長ホルモンをコードし、トランスフェクション促進剤ととも
に製剤化された核酸分子を、無針装置を用いて哺乳動物の皮膚を通しておよび／
または皮膚に投与することを必要とする。
【００４１】 別の観点においては、本発明は、適当な癌抗原をコードする核酸分子を投与す
ることにより、癌を患う哺乳動物を治療する方法を特徴とする。該方法は、癌抗
原をコードし、トランスフェクション促進剤とともに製剤化された核酸分子を、
無針装置を用いて、哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に投与すること
を必要とする。
【００４２】 好ましくは、癌は黒腫であり、適当な癌抗原はＭＡＧＥ１である。 さらに別の観点において、本発明はまた、感染性疾病の抗原をコードする核酸
分子を投与することにより、感染性疾病を患う哺乳動物を治療する方法を特徴と
する。該方法は、感染性疾病の抗原をコードし、トランスフェクション促進剤と
ともに製剤化された核酸分子を、無針装置を用いて哺乳動物の皮膚を通しておよ
び／または皮膚に投与することを必要とする。
【００４３】 好ましい態様においては、感染性疾病は慢性肝炎であり、抗原はＨＢＶコア抗
原である。
【００４４】 本明細書において用いられる場合、投与とは、本発明の製剤化された核酸分子
を細胞または生物の体内に導入する経路を表す。投与は、無針装置により哺乳動
物体内の標的領域、例えば筋肉およびリンパ節に提供されるエアロゾル圧の使用
を含む。
【００４５】 投与前に、本発明の核酸分子を少なくとも１つの他のタイプの分子とともに製
剤化することができる。例えば、分子複合体は、他の分子、例えば本明細書に記
載されるポリビニル−ピロリドンとともに製剤化することができる。製剤技術は
本明細書において例によって提供される。
【００４６】 好ましい態様においては、投与は、表皮、皮内および皮下層を通して筋肉組織
に行われる。本発明は、慣用の有針注入技術によっては１回の注入の間に接触し
ない種々のタイプの哺乳動物細胞との接触を引き起こす様式で、製剤化された核
酸分子を投与する。本発明にしたがう注入により接触される細胞系としては、上
皮細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、樹状細胞、マクロファージ細胞
、クップファー細胞、リンパ球およびリンパ節が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【００４７】 本発明の別の観点は、最初に不活性粒子を発煙硝酸溶液中または硫酸と混合し
た硝酸の溶液中で洗浄し、次に不活性粒子をシステイン末端カチオン性ＤＮＡ結
合ペプチドと結合させて単層ペプチド被覆を形成することにより、不活性粒子を
修飾する方法を特徴とする。好ましくは、ＤＮＡ結合ペプチドは、設計されたプ
ラスミド中の特定の核酸配列を認識してこれに結合する。したがって、１分子の
ＤＮＡ結合ペプチドが不活性粒子とプラスミドとに結合し、したがって不活性粒
子間の架橋の量を減少させる。不活性粒子は金粒子でありうるが、これに限定さ
れない。好ましくは、不活性粒子を核酸分子と結合させ、無針装置により哺乳動
物の皮膚を通して細胞に輸送する。
【００４８】 "不活性粒子"との用語は、生物学的に不活性な粒子を表す。これは、フェライ
ト結晶、金粒子またはビーズ、タングステン球、約１５−２０ｇ／ｃｍ3の密度
および約１−３μｍのサイズの他の金属または生物学的に不活性な化合物からな
る群より選択される粒子でありうるが、これらに限定されない。一般に、最適な
粒子は、細胞傷害を最小とするのに十分小さいものである。粒子のサイズは限定
的な特徴ではない。当業者には、粒子は細胞に浸透するのに十分な運動量を獲得
するのに十分に大きくなければならないことが知られている。運動量は、サイズ
、密度および速度の関数であり、慣行によれば、粒子サイズは標的細胞より約１
０倍小さくあるべきである。
【００４９】 本発明のさらに別の観点は、修飾不活性粒子とともに製剤化された核酸分子を
、無針注入装置を用いて、哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に投与す
る方法を特徴とする。好ましくは、無針装置は、製剤化された核酸を哺乳動物の
皮膚を通しておよび／または皮膚にエアロゾル輸送するような形状および配置と
されている。
【００５０】 上述の本発明の概要は、限定的なものではなく、本発明の他の特徴および利点
は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００５１】 好ましい態様の詳細な説明 無針装置を用いる製剤化された核酸分子の輸送は、遺伝子輸送の新規な方法で
ある。本発明は、従来の方法と比較して増加した免疫応答を与える核酸輸送装置
を提供する。本発明は、製剤化された核酸分子が広範な種類の細胞によって同時
に取り込まれることを可能とするという利点を提供する。無針装置により製剤化
された核酸分子を注入することにより、製剤化された核酸分子を、慣用的な有針
注入におけるよりはるかに多くの種類の細胞と直接接触させることができる。す
なわち、本発明は、核酸分子の増強された輸送を提供し、また免疫応答を生じさ
せるために用いることができる、より効率のよい遺伝子輸送システムを提供する
。
【００５２】 製剤化された核酸分子を哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に無針輸
送することは、以下に議論するいくつかの因子、例えばトランスフェクション効
率および製剤化された核酸分子の組成に依存する。
【００５３】 Ｉ．ＤＮＡ注入変数 以下の変数を変更することにより、本発明を用いて達成可能な免疫応答の強度
、および遺伝子輸送および発現のレベルを最適化することができる（対照の＞５
倍有効）。変数は以下のとおりである：製剤（組成物、プラスミドのトポロジー
）、注入の技術および手順（注入の角度、筋肉の状態）、および筋毒性（ｍｙｏ
ｔｏｘｉｃ）剤による筋肉の前処理。免疫応答は、注入された核酸分子によりコ
ードされ発現される蛋白質に対して産生された抗体の量により測定することがで
きるが、これに限定されない。
【００５４】 本発明の無針注入方法により提供される製剤化された核酸分子によりコードさ
れる蛋白質に応答して産生される、抗体および／または細胞毒性Ｔ−リンパ球の
レベルに有意に影響を与えるために用いることができる他の注入変数は、注入さ
れつつある筋肉の状態および注入技術である。変数の例には、筋肉刺激、筋肉収
縮、筋肉マッサージ、輸送角度および装置の操作である。筋肉をマッサージする
ことは、直接またはリンパ排液によりプラスミドを筋肉から出すよう作用する。
浸透の深度および／または筋肉繊維に対して無針装置を置く角度を変更すること
により、本発明は、注入領域全体のプラスミド分配を改良することができ、この
ことは次にプラスミドによりコードされ発現される蛋白質に対する抗体応答を増
加させる。
【００５５】 無針注入システムは、筋肉内免疫を目的とするプラスミドＤＮＡの投与のため
の魅力的な方法を提供する。これらは注射針刺傷を回避するという一般的な利点
を提供するのみならず、注入された物質の筋肉内におけるより良い分配を生じう
る。直接遺伝子運搬は、最初にＰｅｄ−Ｏ−Ｊｅｔシステムを用いて哺乳動物組
織において示された。しかしこの装置は、主に皮内または皮下注入用に設計され
たものである（Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５
：３６５−３６８．，１９９２）。
【００５６】 我々は、イヌモデルにおいて、製剤化された核酸の無針注入が伝統的な有針注
入より優れていることを見いだした。我々は、食塩水に懸濁したヒト成長ホルモ
ンの遺伝子を含有するプラスミドを、無針および有針注入によりイヌ筋肉に注入
し、抗体産生を測定した。無針注入では第１４および２８日およびブースト前に
測定可能な抗体タイターが得られたのに対し、有針注入ではタイターがほとんど
測定できなかったことがわかった。
【００５７】 ＩＩ．核酸に基づくワクチン 本発明を用いて、核酸ワクチンを、現在慣用的に行われているよりも効率的に
輸送することができる。核酸ワクチン、または抗原または治療的分子（例えばヒ
ト成長ホルモン）をコードするプラスミドの使用は、ここ５年間において研究開
発が集中的に行われている分野となっている。核酸に基づくワクチンの包括的総
説が出版されている［Ｍ．Ａ．Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），１９９５
，ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．７７２，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ；Ｋｕｍａｒ，Ｖ．，ａｎｄ Ｓｅｒｃａｒｚ，Ｅ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｍ
ｅｄ，２：８５７−８５９；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ
．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；８：５３
１−５３６．Ｖｏｌ．７７２，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ］。ウイルス蛋白質をコードするプラスミドを用いた保護性免疫は、動物
モデルにおいて１９９３年にＵｌｍｅｒらにより最初に観察された［Ｕｌｍｅｒ
，Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−
１７４９］。それ以来、いくつかの疾病標的に対するいくつかの研究が保護性免
疫を示し、ヒト臨床試験が開始された。多くの疾病標的が研究されてきた。例と
しては、ボレリア ブルグドルフェリの抗原、ライム病のダニ媒介感染性因子（
Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：９１−９７，１
９９７），ヒト免疫不全ウイルス−１（Ｌｅｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９４：９３７８−９３８３，１９９７
）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｓｙｒｅｎｇｅｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ ２：１０３８−４１，１９９６）、ヘルペス単純ウイルス（Ｂ
ｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓ．１７３：８０
０−８０７，１９９６）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｔｅｄｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．
，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５：４５９−４６２，１９９７）、狂犬病ウイルス
（Ｘｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９：５６９−５７９，１
９９５）、ミコバクテリウム・ツバクローシス（Ｌｏｗｒｉｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ ＣＡ Ｔｈｉｂｅａｕｌｔ，ｅｄ．Ｉｎｔｌ Ｂｕｓ Ｃｏｍｍ，
Ｉｎｃ．，ｓｏｕｔｈ ｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ ０１７７２，ｐｐ．８７−１２
２，１９９６）、および熱帯熱マラリア原虫（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｖａｃｃｉｎｅ １５：８４２−８４５，１９９７）が挙げられる。
【００５８】 遺伝子治療の重要な目標は、細胞により核酸を取り込ませ、このことにより注
入された核酸によりコードされる蛋白質に対する免疫応答を引き起こすことであ
る。細胞による核酸の取り込みは、多くの因子に依存し、その１つは、核酸が細
胞表面の近くに存在する時間の長さである。本発明は、核酸が細胞表面の近くに
存在する時間の長さを増加し細胞に浸透させ、このことにより核酸分子を細胞に
輸送する製剤を提供する。
【００５９】 核酸に基づくワクチンは、サブユニットワクチン、精製ウイルス蛋白質ワクチ
ンまたはウイルスベクターワクチンに対する魅力的な代替ワクチン療法戦略であ
る。伝統的な方法のそれぞれは、抗原（単数または複数）を身体の細胞内で直接
発現させることができれば解決する制限を有する。さらに、これらの伝統的なワ
クチンは、株特異的様式においてのみ保護性であるにすぎない。すなわち、伝統
的なワクチン方法を用いて、いくつかの血清型を有するウイルスまたは変異しや
すいウイルスに対して長期間持続する免疫を得ることは、非常に困難であり、ほ
とんど不可能である。
【００６０】 核酸に基づくワクチンは、非常に保存的な、例えばウイルスの核酸蛋白質を有
するウイルスエピトープに対して長期間持続する免疫を生ずる可能性を提供する
。本発明により特定の蛋白質をコードするプラスミドを注入することにより、抗
体産生により測定して、増加した免疫応答が得られる。すなわち、本発明は、本
明細書に記載される無針装置を用いて製剤化された核酸分子を輸送することによ
り核酸ワクチンを提供する新規な方法を含有する。
【００６１】 核酸ワクチンの効力は、以下の少なくとも３つの方法の１つにより増強される
：（１）筋肉内でのプラスミドの安定性および分配を増加させるための輸送シス
テムの利用、（２）抗原提示／転移を促進するための分子の発現（または輸送）
、または（３）免疫応答を調節しうるアジュバントの使用。
【００６２】 ＩＩＩ．プラスミドを筋肉に輸送するためのポリマー性および非ポリマー性製
剤 本発明は、食塩水中に懸濁した核酸の注入に伴う問題点を解決するポリマー性
および非ポリマー性製剤を提供する。食塩水中に懸濁したプラスミドは、細胞外
ヌクレアーゼによるプラスミドの急速な分解のため、筋肉における生体利用性が
低い。生体利用性の低さを解決する１つの可能な方法は、プラスミドを慣用的に
用いられるカチオン性複合体形成剤とともに凝縮させることにより、プラスミド
を急速なヌクレアーゼ分解から保護することである。しかし、筋肉の生理学のた
め、プラスミドを含有する堅い凝縮粒子をより多数の筋肉細胞の有効なトランス
フェクションに用いることはこれまでに成功しなかった。カチオン性脂質および
ポリリシンプラスミド複合体は外部膜を通過せず、小包およびＴ系細管にアクセ
スすることができない［Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ
Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０３：１２４９−１２５９］。
【００６３】 すなわち、プラスミドの筋肉内における生体利用性を増加させると確認された
方法は、急速な細胞外ヌクレアーゼ分解からプラスミドを保護し、無傷のプラス
ミドを筋肉内に分散させて保持し、筋肉細胞によるプラスミドの取り込みを容易
にすることであった。これを達成するための、好ましくは無針輸送と組み合わせ
て用いられる２つの特定の方法は、（ａ）保護性、相互作用性、非凝縮性システ
ムの使用、および（ｂ）修飾金粒子の使用である。
【００６４】 核酸の輸送および発現は、生物の成分、例えばヌクレアーゼによる核酸の分解
のために限定されている。すなわち、インビボで輸送されたときの核酸の保護は
、得られる発現を非常に増強し、このことにより所望の薬学的または治療的効果
を増強することができる。溶液中の核酸（例えばＤＮＡ）と相互作用するが核酸
を凝縮しないある種の化合物が、核酸に対するインビボ保護を提供し、これに対
応してコードされる遺伝子産物の発現を増強することが見いだされた。本発明に
おいて用いることができる製剤の詳細な説明は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０
５６７９において見いだされ、図面を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する。上述したように、好ましくはそのような製剤は、本明細書に記載さ
れる無針装置を用いて輸送される。
【００６５】 ＤＮＡで被覆された不活性粒子は、遺伝子を細胞に輸送するために用いられて
きた。不活性粒子、例えば金ビーズを核酸で被覆することの利点は、粒子担体が
実際に細胞内に浸透することである。したがって、核酸は細胞の内部に輸送され
、より効率的な様式で取り込まれ発現されるはずである。しかし、ＤＮＡ被覆金
粒子の製造のための慣用的方法によれば、ＤＮＡは粒子間で不均一に分配され、
このことにより細胞間で発現が変動する（Ｂｕｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６４：２６５−２７８，１９９６）。
【００６６】 試料間で変動する結果を生ずる核酸ワクチンを作成することは望ましくない。
すなわち、本発明は、システイン末端化ＤＮＡ結合ペプチドを金表面に共有結合
させることにより、ＤＮＡで均一に被覆された金粒子を提供する。さらに、本発
明は、核局在化配列を含有する高親和性ＤＮＡ結合ペプチドとプラスミドとを非
共有結合的に会合させることにより、金粒子から放出されたＤＮＡの細胞内輸送
を増強する。製剤は、粒子の直径にかかわらず、最も再現性のある量のプラスミ
ドを金粒子上に提供する。好ましくは、そのような修飾金粒子製剤は、本明細書
に記載される無針装置を用いて輸送される。
【００６７】 ＶＩ．筋肉内プラスミド輸送のための疾病および病態 本明細書に開示される本発明は、多くの異なるコーディング配列の輸送および
発現に用いることができる。特に、筋肉への輸送のためのＰＩＮＣシステム（国
際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５６７９）について示された有効性は、そのような
製剤が無針注入により広範な種類のコーディング配列を筋肉に輸送するのに有効
であることを示す。本発明の無針装置を用いるコーディング配列の筋肉への輸送
についての特定の示唆には、以下の表Ｉにまとめられるものが含まれる。
【００６８】
【表１】
【００６９】 実施例 以下の実施例は、例示のためにのみ提供されるものであり、いかなる意味にお
いても本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者は、実施例
に開示される種々の分子および／または量は、より多い量（より大きいスケール
の実験のため）または異なるトランスフェクション促進剤を含有することにより
、調節または置換が可能であることを認識するであろう。
【００７０】 実施例１ トランスフェクション促進剤プラスミドＤＮＡ複合体の形成の証明 ＰＶＰ製剤化核酸分子の調製 濃縮ｐＤＮＡ保存溶液は、ｐＤＮＡを凍結乾燥し、水で再水和させて最終ｐＤ
ＮＡ濃度３−５ｍｇ／ｍｌとすることにより作成した。製剤は、ｐＤＮＡ、５Ｍ
ＮａＣｌおよびポリマーの適当な容量の無菌保存溶液のアリコートを取り出し、
等張ポリマー溶液中の最終ｐＤＮＡ濃度を得た。保存溶液を次の順序で加えた：
水、プラスミド、ポリマーおよび５ＭＮａＣｌ。プラスミドおよびポリマーは、
室温で１５分間インキュベートし、次に塩またはラクトースを加えて浸透圧を調
節した。同様に、プラスミドおよびポリマーを室温で１５分間インキュベートし
た後に、０．９％ＮａＣｌ中のクエン酸ナトリウム緩衝液を加えた。選択された
製剤の浸透圧は、Ｆｉｓｋｅ Ｏｎｅ−Ｔｅｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｓａｍｐｌｅ Ｏ
ｓｍｏｍｅｔｅｒを用いて測定した（ｎ＝３）。すべての製剤のｐＨは、Ａｃｃ
ｕｍｅｔ Ｍｏｄｅｌ １５ ｐＨ Ｍｅｔｅｒを用いて測定し、すべての製剤
の粘度は、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＤＶ
−ＩＩＩを用いて測定した。
【００７１】 種々の相互作用性ポリマー製剤とともに動的透析を用いて、ＰＶＰとプラスミ
ドＤＮＡとの間の結合を測定した。１ｍｌの製剤および対応する対照をあらかじ
め洗浄した透析嚢に入れた。透析嚢を閉じ、撹拌食塩水溶液（１００ｍｌ）に２
５℃で支持した。時間ごとに受容区画から１ｍｌのアリコートを取り出し、新鮮
な媒体と交換した。時間ごとに回収した拡散試料中のＰＶＰの濃度を、２２０ｎ
ｍで分光学的に測定した。
【００７２】 すべての場合において、透析膜を通るＰＶＰの拡散の速度は、プラスミドＤＮ
Ａの存在下で減少し、このことは、ＰＶＰとプラスミドＤＮＡとの間に複合体が
形成されたことを示す。プラスミドＤＮＡの存在下におけるＰＶＰの拡散速度の
減少は、透析嚢中のＰＶＰの初期量に直接比例した。また、実験の間透析嚢の容
量は一定に維持され、ＰＶＰの膜への付着は無視しうるものであることがわかっ
た。
【００７３】 修飾金粒子とともに製剤化した核酸分子の調製 １００ｍｇの２．３μｍの金粒子を発煙硝酸中に２３℃で一夜置いた。次に粒
子を真空下で脱気した１８Ω脱イオン水で徹底的に洗浄した。Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−（Ｌｙｓ）8−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（ＣＫ８）の溶液を１０ｍＭジ
チオスレイトールで１時間処理し、次に脱気水中で調製した脱塩カラムを通した
。最終溶液である１ｍＭＣＫ８を作成するのに十分なペプチドを洗浄した金粒子
に加え、Ｎ2雰囲気下で２３℃で一夜置いた。次に粒子を２８０ｎｍに吸収がな
くなるまで脱気水で洗浄し、次に凍結乾燥した。水中の１μｇのＣＭＶ−ルシフ
ェラーゼを０．４５ｍｇの修飾金粒子に加え、次にデシケータ中で乾燥した。Ｄ
ＮＡのＣＫ８修飾粒子への結合は、１．５ｍＭリン酸により溶出し、アガロース
ゲル上の溶出された弛緩およびスーパーコイルプラスミドを臭化エチジウムによ
り可視化することにより示した。対照として、ＤＮＡをＣａ++で沈殿させ、乾燥
し、１００％エタノール中のカプトン担体膜の中心に加えた。修飾金粒子ととも
に製剤化したＤＮＡを水中および１００％エタノール中のカプトン膜に移した（
図３）。
【００７４】 製剤を１００％エタノールおよび、より重要なことには水中の、両方の中のカ
プトン膜に移したとき、修飾金粒子とともに製剤化したＤＮＡについて、インビ
ボで有意なルシフェラーゼ発現が観察された（図３）。転移溶媒として水を用い
た場合には平均発現が低かったが、この結果は、蛋白質、例えば転写因子をＤＮ
Ａとともに含有させることが可能であろうことを示唆する。
【００７５】 実施例２ 無針装置を通して注入した際の製剤化核酸の安定性の証明 製剤化プラスミドは、２ｍｌの１回投与バイアル中で無菌的に以下のように調
製した。
【００７６】
【表２】
【００７７】 ＤＮＡ製剤は、"高衝撃"最悪事例シナリオを示すものとして無針装置により５
０ｍｌポリプロピレン管に注入した。さらに、無針装置を、製品使用説明書に記
載されているように、最大浸透にセットした。
【００７８】 ＤＮＡ安定性は、注入前および後に試料をアガロースゲル電気泳動することに
より決定した。安定性の測定値は、可視的分解の量、すなわちスメアリングによ
り、およびスーパーコイルおよび開環ＤＮＡを定量することにより決定した 我々のデータは、この極端な例においてさえ、製剤化ＤＮＡ試料はわずかな分解
しか示さなかったことを表す。
【００７９】 実施例３ 種々の無針装置輸送ノズルを通して注入した際の製剤化核酸の安定性の証明 製剤化核酸分子は、以下のようにして無菌的に調製した。 ０．１ｍｇ ｐＣＴ０１２９／ｍＬ、ＤＯＴＭＡ：Ｃｈｏｌ（１：１ｍ／ｍ）中
；１：３（−／＋）；１０％ラクトース ３．０ｍｇ ｐＣＴ０１２９／ｍＬ、５％ＰＶＰ（５０ｋＤａ）中；１５０ｍＭ
ＮａＣｌ 非製剤化試料： ０．１ｍｇ ｐＣＴ０１２９／ｍＬ、１５０ｍＭＮａＣｌ中 ３．０ｍｇ ｐＣＴ０１２９／ｍＬ、１５０ｍＭＮａＣｌ中 これらの製剤のそれぞれを、異なるサイズの無針注入ノズルを通して注入した
。各実験について、非注入製剤を対照として用いた。製剤を５０ｍＬ円錐管に注
入した。注入後、各試料をアガロース電気泳動した。
【００８０】 安定性の測定値は、可視的分解の量、すなわちスメアリングにより、およびス
ーパーコイルおよび開環ＤＮＡを定量することにより決定した。我々のデータは
、この最も極端な注入パラメータを用いる例においてさえも、ノズルのサイズは
製剤化ＤＮＡの状態に影響しなかったことを示す。
【００８１】 実施例４ プラスミドの筋肉内注入後の免疫応答の誘出 この研究においては、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現プラスミドをイヌおよ
びブタの筋肉内に注入して、抗ｈＧＨ抗体の産生を調べた（図１，２）。
【００８２】 発現プラスミドを無針装置によりまたは針を用いて注入して、免疫応答の大き
さが注入方法または製剤により影響されるか否かを調べた。
【００８３】 免疫応答を引き出すため、ｐＣＭＶ−ｈＧＨプラスミドを食塩水に懸濁するか
またはＰＶＰとともに製剤化し、無針装置または２２ゲージ針を用いて、イヌの
大腿二頭筋および半腱様筋内に注入した。プラスミド注入の前および注入後週に
１回血液を採取した。血液試料は４℃で一夜保存し、２０００ｇで１５分間遠心
分離し、血清を回収してＥＬＩＳＡにより抗ｈＧＨ抗体を検出した。
【００８４】 ジェット（エアロゾル）注入動物において、ｈＧＨプラスミドの筋肉内１回投
与の１４日後に、有意なレベルのｈＧＨ抗体が検出可能であった。ｈＧＨ抗体の
レベルは、時間とともに増加し、２１日までにプラトーに達し、１１２日間の前
ブースト期間の間上昇したまま維持された。第１１２日にプラスミド投与を繰り
返すことにより、抗体応答は１００倍増加した。
【００８５】 これに対し、ＰＶＰとともに製剤化したｈＧＨプラスミドの有針注入は、有意
に検出可能なレベルのｈＧＨ抗体を産生しなかった。有針注入により有意な抗体
応答を達成するためにはブースター投与が必要であった。エアロゾル注入により
得られたピーク抗体レベルは、有針注入によるものより約２０倍高かった。対照
動物にはＰＶＰとともに製剤化したｈＧＨ遺伝子なしのＣＭＶ−ＣＡＴプラスミ
ドを投与し、動物は抗ｈＧＨ抗体を産生しなかった。
【００８６】 食塩水中に懸濁したｈＧＨプラスミドの無針注入によっても、抗ｈＧＨ抗体が
産生された。無針装置により投与した場合、裸のＤＮＡの１回投与は、有意なレ
ベルのｈＧＨ抗体を達成するのに十分であった。
【００８７】 これに対し、有針注入により抗体応答を引き起こすためには、多数回投与が必
要であった。無針注入により得られた抗体応答は、有針注入と比較して５倍高か
った。
【００８８】 同じ実験において、プラスミドをＰＶＰとともに製剤化したとき、無針注入は
有針注入と比較して１５−２０倍高い免疫応答を与えた。
【００８９】 当業者は、本発明が目的を実行し、そして記載されおよび内含された結果およ
び利益を得るために充分適合することを容易に理解するであろう。本明細書に記
載される分子複合体および方法、手順、治療、分子、特定の化合物は、現在好ま
しい態様の代表的なものであって、例示的なものであり、本発明の範囲を制限す
ることを意図するものではない。当業者によって行われるであろう、本発明の思
想の範囲に含まれる変更および他の用途は、特許請求の範囲により規定される。
【００９０】 当業者には、本明細書に開示された本発明に対して、本発明の範囲および思想
を逸脱することなく置換および改変を加えることができることが明らかであろう
。
【００９１】 本明細書に記載された全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の
当業者の水準を表す。全ての特許および刊行物は、あたかも各々の個別の刊行物
が特異的に個々に本明細書の一部として引用されるのと同程度に、本明細書の一
部としてここに引用される。
【００９２】 本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に特異的に記載されていな
い、いかなる要素または制限なしで適当に実施してもよい。従って、例えば、本
明細書中でそれぞれの場合、“・・・を含む”、“本質的に・・・からなる”お
よび“・・・からなる”のいずれの用語も他の二つのいずれかと置き換えてもよ
い。使用した用語および表現は、制限のためではなく説明のための用語として用
いられており、そしてそのような用語および表現の使用においては、示され記載
された特徴のいかなる均等物またはその一部分を除外することを意図するもので
はなく、本発明の特許請求の範囲内で種々の改変が可能であることが理解される
。従って、本発明は、好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示されて
いるが、本明細書で開示された概念の改変および変更が当業者によって行われて
もよく、そしてそのような改変および変更は、特許請求の範囲に定義された本発
明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【００９３】 さらに、本発明の特徴または観点がマーカッシュグループの用語で記載されて
いる場合、当業者は、このことにより本発明はまたいかなる個々のメンバーまた
はマーカッシュグループのメンバーのサブグループの用語でも記載されているこ
とを理解するであろう。例えば、Ｘが臭素、塩素、およびヨウ素からなる群より
選択される、と記載されている場合、Ｘが臭素である請求項およびＸが臭素およ
び塩素である請求項が完全に記載されている。
【００９４】 本明細書の一部としてここに引用されていなかった文献は、特許および非特許
文献を含め、すべての目的のために明白に本明細書の一部としてここに引用する
。他の態様は、特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、トランスフェクション促進剤で製剤化したｐＣＭＶ−ｈ
ＧＨを有針および無針注入によりイヌに投与した後の、ｈＧＨに対するイヌの体
液性免疫応答を示す。各データ時点における抗体タイターは、２匹のイヌの平均
である。
【図２】 図２は、食塩水中に懸濁したｐＣＭＶ−ｈＧＨとトランスフェク
ション促進剤で製剤化したｐＣＭＶ−ｈＧＨが、無針注入後にイヌにおいてｈＧ
Ｈに対する体液性免疫応答を引き出すことの比較を示す。各データ時点における
抗体タイターは、２匹のイヌの平均である。
【図３】 図３は、ＣＭＶ−ルシフェラーゼをコードするプラスミドをＣｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−（Ｌｙｓ）8−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（ＣＫ８）で被覆
したまたは被覆していない修飾金粒子とともに製剤化した条件で発現したルシフ
ェラーゼの量を示す。次に、製剤をエタノール、水中でカプトン（Ｋａｐｔｏｎ
）担体膜上に負荷するか、またはＣａ2+で沈殿させ、次にエタノール中で負荷し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/32 Ａ６１Ｋ 47/32 ４Ｃ０８６ 47/42 47/42 47/44 47/44 48/00 48/00 Ａ６１Ｍ 5/30 Ａ６１Ｍ 5/30 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 5/10 5/10 31/20 31/20 35/00 35/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バリー，マイケル アメリカ合衆国テキサス州77584，ペアラ ンド，プライムウッド・コート 2215 (72)発明者 マンパー，ラス アメリカ合衆国テキサス州77381，ザ・ウ ッドランズ，ヘザー・ウィスプ・プレイス 19 (72)発明者 スミス，ルー アメリカ合衆国テキサス州77098，ヒュー ストン，サウス・ブールバード 2339 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA19 AA20 BA01 BA33 BA36 CA02 CA12 DA03 EA04 FA02 GA11 GA13 HA17 HA20 4B029 AA23 AA27 BB20 CC01 4C066 AA10 BB01 CC10 DD04 DD13 4C076 AA19 AA24 BB31 CC27 CC30 CC35 EE16 EE41 EE60 FF34 4C084 AA13 MA13 MA24 MA63 NA11 ZA752 ZB262 ZB332 ZC042 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 MA07 MA13 MA24 MA63 ZA75 ZB26 ZB33 ZC04

Claims (79)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸分子を哺乳動物に輸送する方法であって、トランスフェ
    クション促進剤とともに製剤化された前記核酸分子を、前記哺乳動物の皮膚を通
    しておよび／または皮膚に前記核酸分子をエアロゾル輸送するような形状および
    配置とされている無針装置を用いることにより、前記哺乳動物の皮膚を通してお
    よび／または皮膚に提供する工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 前記核酸分子がＤＮＡである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記核酸分子が治療的分子を発現する真核生物プロモーター
    を有するプラスミドである、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記治療的分子がヒト成長ホルモンである、請求項３記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記トランスフェクション促進剤が、保護性、相互作用性か
    つ非凝縮性化合物である、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上のポ
    リビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以上
    のリポソーム、１またはそれ以上のペプチド、１またはそれ以上の修飾金粒子、
    および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項１記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 前記方法が抗体応答を引き起こす、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記抗体応答が食塩水中に懸濁した核酸分子の有針注射によ
    り引き起こされる抗体応答より少なくとも３倍高い、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記抗体応答が、ポリビニル−ピロリドンとともに製剤化
    された核酸分子の有針注射により引き起こされる抗体応答より少なくとも１０倍
    高い、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記方法が免疫応答を誘導する、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記免疫応答が体液性免疫応答である、請求項１１記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 前記免疫応答がＴ−細胞媒介性免疫応答である、請求項１
    １記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記免疫応答が予防的免疫応答である、請求項１１記載の
    方法。
  15. 【請求項１５】 前記免疫応答が治療的免疫応答である、請求項１１記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記輸送用無針手段が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記輸送用無針手段がガス圧装置である、請求項１記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 前記輸送用無針手段が機械的スプリング装置である、請求
    項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記輸送用無針手段が多ポート装置である、請求項１記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 トランスフェクション促進剤とともに製剤化された核酸分
    子を提供するためのプロバイダ、および前記核酸分子を哺乳動物の皮膚を通して
    および／または皮膚に輸送するための無針装置を含むキット。
  22. 【請求項２２】 前記核酸分子がＤＮＡである、請求項２１記載のキット。
  23. 【請求項２３】 前記核酸分子が遺伝子を発現する真核生物プロモーターを
    有するプラスミドである、請求項２１記載のキット。
  24. 【請求項２４】 前記遺伝子がヒト成長ホルモンである、請求項２３記載の
    キット。
  25. 【請求項２５】 前記核酸分子がＲＮＡである、請求項２１記載のキット。
  26. 【請求項２６】 前記トランスフェクション促進剤が、保護性、相互作用性
    かつ非凝縮性化合物である、請求項２１記載のキット。
  27. 【請求項２７】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上の
    ポリビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以
    上のリポソーム、１またはそれ以上の修飾金粒子、１またはそれ以上のペプチド
    、および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項２
    １記載のキット。
  28. 【請求項２８】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項２１記載のキット。
  29. 【請求項２９】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項２１記載
    のキット。
  30. 【請求項３０】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項２１記載のキット。
  31. 【請求項３１】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項２１記
    載のキット。
  32. 【請求項３２】 キットを製造する方法であって、（ｉ）トランスフェクシ
    ョン促進剤とともに製剤化された核酸分子を提供するためのプロバイダと、（ｉ
    ｉ）哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に前記核酸分子を輸送するため
    の無針装置とを組み合わせる工程を含む方法。
  33. 【請求項３３】 前記核酸分子がＤＮＡである、請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記核酸分子が、遺伝子を発現する真核生物プロモーター
    を有するプラスミドである、請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記遺伝子がヒト成長ホルモン用である、請求項３４記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 前記核酸分子がＲＮＡである、請求項３２記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記トランスフェクション促進剤が保護性、相互作用性か
    つ非凝縮性化合物である、請求項３２記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上の
    ポリビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以
    上のリポソーム，１またはそれ以上の修飾金粒子、１またはそれ以上のペプチド
    、および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項３
    ２記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項３２記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項３２記載
    の方法。
  41. 【請求項４１】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項３２記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項３２記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】 ヒト成長ホルモンを投与することにより慣用的に治療され
    ている疾患を患う哺乳動物を治療する方法であって、トランスフェクション促進
    剤とともに製剤化されたヒト成長ホルモンをコードする核酸分子を、前記哺乳動
    物の皮膚を通しておよび／または皮膚への前記核酸分子のエアロゾル輸送を引き
    起こすような形状および配置とされている無針装置を使用することにより、前記
    哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に提供する工程を含む方法。
  44. 【請求項４４】 前記哺乳動物がヒトである、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記トランスフェクション促進剤が、保護性、相互作用性
    かつ非凝縮性化合物である、請求項４３記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上の
    ポリビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以
    上のリポソーム、１またはそれ以上の修飾金粒子、１またはそれ以上のペプチド
    、および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項４
    ３記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項４３記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項４３記載
    の方法。
  49. 【請求項４９】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項４３記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項４３記
    載の方法。
  51. 【請求項５１】 癌を患う哺乳動物を治療する方法であって、トランスフェ
    クション促進剤とともに製剤化された核酸分子を、前記哺乳動物の皮膚を通して
    および／または皮膚への前記核酸分子のエアロゾル輸送を引き起こすような形状
    および配置とされている無針装置を使用することにより、前記哺乳動物の皮膚を
    通しておよび／または皮膚に提供する工程を含み、ここで前記分子は癌抗原をコ
    ードすることを特徴とする方法。
  52. 【請求項５２】 前記哺乳動物がヒトである、請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記癌抗原がＭＡＧＥ１であり、前記癌が黒腫である、請
    求項５１記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記トランスフェクション促進剤が保護性、相互作用性か
    つ非凝縮性化合物である、請求項５１記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上の
    ポリビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以
    上のリポソーム、１またはそれ以上の修飾金粒子、１またはそれ以上のペプチド
    、および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項５
    １記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項５１記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項５１記載
    の方法。
  58. 【請求項５８】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項５１記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項５１記
    載の方法。
  60. 【請求項６０】 感染性疾病を患う哺乳動物を治療する方法であって、トラ
    ンスフェクション促進剤とともに製剤化された核酸分子を、前記哺乳動物の皮膚
    を通しておよび／または皮膚への前記核酸分子のエアロゾル輸送を引き起こすよ
    うな形状および配置とされている無針装置を使用することにより、前記哺乳動物
    の皮膚を通しておよび／または皮膚に提供する工程を含み、ここで前記分子は前
    記感染性疾病の抗原をコードすることを特徴とする方法。
  61. 【請求項６１】 前記哺乳動物がヒトである、請求項６０記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記感染性疾病抗原がＨＢＶコア抗原であり、前記感染性
    疾病が慢性肝炎である、請求項６０記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記トランスフェクション促進剤が、保護性、相互作用性
    かつ非凝縮性化合物である、請求項６０記載の方法。
  64. 【請求項６４】 前記トランスフェクション促進剤が、１またはそれ以上の
    ポリビニル−ピロリドン、１またはそれ以上のカチオン性脂質、１またはそれ以
    上のリポソーム、１またはそれ以上の修飾金粒子、１またはそれ以上のペプチド
    、および１またはそれ以上のリポペプチドからなる群より選択される、請求項６
    ０記載の方法。
  65. 【請求項６５】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項６０記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項６０記載
    の方法。
  67. 【請求項６７】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項６０記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項６０記
    載の方法。
  69. 【請求項６９】 核酸分子を修飾不活性粒子とともに製剤化する方法であっ
    て、水性環境中で前記核酸分子を前記修飾不活性粒子と結合させる工程を含む方
    法。
  70. 【請求項７０】 前記修飾不活性粒子が修飾金粒子である、請求項６９記載
    の方法。
  71. 【請求項７１】 金粒子を修飾する方法であって、前記金粒子を発煙酸また
    は混酸溶液中で洗浄し、前記金粒子をカチオン性ＤＮＡ結合ペプチドと結合させ
    て単層被覆を形成する、の各工程を含む方法。
  72. 【請求項７２】 前記カチオン性ＤＮＡ結合ペプチドが末端残基としてシス
    テインを有する、請求項７１記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記発煙酸が硝酸である、請求項７１記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記混酸が硝酸および硫酸を含む、請求項７１記載の方法
    。
  75. 【請求項７５】 核酸分子を哺乳動物に輸送する方法であって、修飾金粒子
    とともに製剤化された前記核酸分子を、前記哺乳動物の皮膚を通しておよび／ま
    たは皮膚へのエアロゾル輸送を引き起こすような形状および配置とされている無
    針装置を用いることにより、前記哺乳動物の皮膚を通しておよび／または皮膚に
    提供する工程を含む方法。
  76. 【請求項７６】 前記輸送用無針装置が、哺乳動物の皮膚を通しておよび／
    または皮膚へのエアロゾル輸送により前記核酸分子を注入する無針装置である、
    請求項７４記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記輸送用無針装置がガス圧装置である、請求項７４記載
    の方法。
  78. 【請求項７８】 前記輸送用無針装置が機械的スプリング装置である、請求
    項７４記載の方法。
  79. 【請求項７９】 前記輸送用無針装置が多ポート装置である、請求項７４記
    載の方法。
JP2000539160A 1997-12-16 1998-12-16 製剤化された核酸分子の無針注入 Pending JP2003528024A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6975497P 1997-12-16 1997-12-16
US60/069,754 1997-12-16
PCT/US1998/026823 WO1999031262A2 (en) 1997-12-16 1998-12-16 Needle-free injection of formulated nucleic acid molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003528024A true JP2003528024A (ja) 2003-09-24

Family

ID=22091009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000539160A Pending JP2003528024A (ja) 1997-12-16 1998-12-16 製剤化された核酸分子の無針注入

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1038016A2 (ja)
JP (1) JP2003528024A (ja)
AU (1) AU1922999A (ja)
CA (1) CA2315256A1 (ja)
WO (1) WO1999031262A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005335054A (ja) * 2004-04-27 2005-12-08 Japan Science & Technology Agency 金属ナノワイヤー及びその製造方法
JP2008521522A (ja) * 2004-12-01 2008-06-26 ダブリューエルティ ディストリビューターズ インク 無針注射器
WO2022149550A1 (ja) * 2021-01-05 2022-07-14 株式会社ダイセル 注入器

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7393529B2 (en) 1998-04-09 2008-07-01 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for inhibiting binding of IgE to a high affinity receptor
CA2379852A1 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 Pharmexa A/S Method for down-regulating gdf-8 activity
US6562623B1 (en) 1999-07-21 2003-05-13 Immunoporation Ltd Method for introducing a substance into a cell
US7196066B1 (en) * 1999-11-03 2007-03-27 Powderject Vaccines, Inc. DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
EP1278551A2 (en) 2000-04-21 2003-01-29 Vical Incorporated Compositions and methods for (in vivo) delivery of polynucleotide-based therapeutics
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
FR2835749B1 (fr) 2002-02-08 2006-04-14 Inst Nat Sante Rech Med Composition pharmaceutique ameliorant le transfert de gene in vivo
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2535799A1 (en) 2003-08-15 2005-03-03 University Of Florida Identification of porphyromonas gingivalis virulence polynucleotides for diagnosis, treatment, and monitoring of periodontal diseases
US20070293447A1 (en) * 2003-08-29 2007-12-20 Yasuo Kunugiza Gene Therapy for Skin Disorders Using Needleless Syringes
US7700280B2 (en) 2003-12-31 2010-04-20 The Penn State Research Foundation Methods for assessing cisplatin resistance, disease progression, and treatment efficacy in ovarian cancer
US20060040882A1 (en) 2004-05-04 2006-02-23 Lishan Chen Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20100098663A2 (en) 2004-06-22 2010-04-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods of Inhibiting Tumor Cell Proliferation with FoxM1 siRNA
EP3936621A1 (en) 2006-01-20 2022-01-12 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
WO2009051846A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
DK2447359T3 (en) 2006-04-14 2016-02-08 Cell Signaling Technology Inc Genetic defects and mutated ALK kinase in human solid tumors
JP2009544281A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 サイレンス・セラピューティクス・アーゲー プロテインキナーゼ３の発現を阻害するための手段
DK2918598T3 (en) 2007-02-28 2019-04-29 The Govt Of U S A As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Brachyury polypeptides and methods of use
EP2157982B1 (en) 2007-05-04 2014-12-17 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
CA2720363A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Bira Arya Compositions and methods for delivering inhibitory oligonucleotides
US20110212021A1 (en) 2008-05-30 2011-09-01 Slack Frank J Targeted oligonucleotide compositions for modifying gene expression
US20100112042A1 (en) 2008-10-16 2010-05-06 Mdrna, Inc. Processes and Compositions for Liposomal and Efficient Delivery of Gene Silencing Therapeutics
ES2637174T3 (es) 2009-02-12 2017-10-11 Cell Signaling Technology, Inc. Expresión de ROS mutante en el cáncer de hígado humano
ES2573981T3 (es) 2009-04-10 2016-06-13 Association Institut De Myologie Oligonucleótidos antisentido de triciclo-ADN, composiciones, y métodos para el tratamiento de enfermedades
KR101692063B1 (ko) 2009-12-09 2017-01-03 닛토덴코 가부시키가이샤 hsp47 발현의 조절
WO2011120023A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting survivin gene expression uses thereof
WO2011133584A2 (en) 2010-04-19 2011-10-27 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hras gene expression and uses thereof
WO2011139843A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Multi-sirna compositions for reducing gene expression
EP2571987B1 (en) 2010-05-21 2017-03-01 Peptimed, Inc. Reagents for treating cancer
KR101553753B1 (ko) 2010-06-24 2015-09-16 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
WO2012027206A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
US9260471B2 (en) 2010-10-29 2016-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA)
SG190088A1 (en) 2010-11-01 2013-06-28 Peptimed Inc Compositions of a peptide targeting system for treating cancer
US9205100B2 (en) 2011-03-03 2015-12-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
DE102011018499A1 (de) 2011-04-23 2012-10-25 Emc Microcollections Gmbh Topische Nanopartikel-Vakzine zur Immunstimulation der dendritischen Zellen in der Haut
EP2581448B1 (en) 2011-10-13 2015-01-28 Association Institut de Myologie Tricyclo-phosphorothioate DNA
WO2013106494A1 (en) 2012-01-12 2013-07-18 Quark Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hearing and balance disorders
DK2838998T3 (en) 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
EP3358013B1 (en) 2012-05-02 2020-06-24 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
EP2895608B1 (en) 2012-09-12 2018-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
CA2880290C (en) 2012-09-12 2020-10-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules targeting p53 and methods of use thereof
KR20150090917A (ko) 2012-12-06 2015-08-06 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 디술피드-차폐 전구약물 조성물 및 방법
WO2015020960A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Novartis Ag Novel lncrna polynucleotides
WO2016032595A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Peptimed, Inc. Anti-tumor compositions and methods
US20190255143A1 (en) 2016-04-18 2019-08-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic targets involved in the progression of nonalcoholic steatohepatitis (nash)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2200016T3 (es) * 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
TW360548B (en) * 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
EP0695186A1 (en) * 1993-04-28 1996-02-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Ocular delivery of nucleic acid
EP0800403A2 (en) * 1994-12-30 1997-10-15 Chiron Corporation Non-traumatic administration of gene delivery vehicles
US5766901A (en) * 1995-05-04 1998-06-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apparatus and method for delivering a nucleotide into cell nuclei
AU705035B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005335054A (ja) * 2004-04-27 2005-12-08 Japan Science & Technology Agency 金属ナノワイヤー及びその製造方法
JP2008521522A (ja) * 2004-12-01 2008-06-26 ダブリューエルティ ディストリビューターズ インク 無針注射器
JP2012035099A (ja) * 2004-12-01 2012-02-23 Acushot Inc 無針注射装置
WO2022149550A1 (ja) * 2021-01-05 2022-07-14 株式会社ダイセル 注入器

Also Published As

Publication number Publication date
EP1038016A2 (en) 2000-09-27
WO1999031262A2 (en) 1999-06-24
CA2315256A1 (en) 1999-06-24
WO1999031262A3 (en) 1999-09-10
AU1922999A (en) 1999-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003528024A (ja) 製剤化された核酸分子の無針注入
Li et al. Nanoscale platforms for messenger RNA delivery
EP1150918B1 (en) Method of manufacturing therapeutic calcium phosphate particles
WO2001065911A2 (en) Improved poloxamer and poloxamine compositions for nucleic acid delivery
Ye et al. Enhancing therapeutic performance of personalized cancer vaccine via delivery vectors
JP7033582B2 (ja) 薄肉シェル型ポリマーナノ粒子及びその使用
JP2002517519A (ja) エレクトロポレーション用製剤
JP2002527483A (ja) アデノウィルスベクターを投与する方法
Somvanshi et al. Peptide-based DNA delivery system
CN112121180B (zh) 泊洛沙姆和或泊洛沙胺与peg脂质组合的复合物纳米粒
Fang et al. Applications and challenges of biomaterial mediated mRNA delivery
Yihunie et al. Recent advances in messenger ribonucleic acid (mRNA) vaccines and their delivery systems: a review
Loehr et al. Immunization of livestock with DNA vaccines: current studies and future prospects
Manthorpe et al. Plasmid vaccines and therapeutics: from design to applications
Bramwell et al. Liposome/DNA complexes coated with biodegradable PLA improve immune responses to plasmid encoding hepatitis B surface antigen
Israel et al. Polymers in gene therapy: antisense delivery systems
Dong et al. Nano-delivery vehicles/adjuvants for DNA vaccination against HIV
JP2003504320A (ja) 生物学的材料の送達系
Xin et al. mRNA-Based Cancer Therapy and Challenges
Little et al. Nonviral delivery of cancer genetic vaccines
Pan et al. The potential of mRNA vaccines in cancer nanomedicine and immunotherapy
Ericson et al. 399. Homogeneous Reducible Polypeptides for Nucleic Acid Delivery
WO2001008709A1 (en) Sonoporation of tumors
Kanazawa et al. Delivery Strategies for Developing Vaginal DNA Vaccine Combining Cell-Penetrating Peptide and Jet Injection
EP1471034A2 (en) Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use