DE102011018499A1 - Topische Nanopartikel-Vakzine zur Immunstimulation der dendritischen Zellen in der Haut - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue topische Vakzine, die mit Hilfe eines Partikel-basierten Trägersystems gezielt die dendritischen Zellen der Haut adressieren und damit eine effektive prophylaktische und/oder therapeutische T-Zell-vermittelte Immunität induzieren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Zusammensetzung einer solchen Vakzine aus Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen und Helfer-T-Zellen sowie die Verwendung von synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als TLR-basierte Adjuvantien für die Verstärkung der spezifischen Immunantwort. Eine Kombination der Vakzinkomponenten wird an nanoskaligen Trägerpartikeln immobilisiert, nach Auftragen auf die Haut durch diese in einem aktiven Transportprozess in die Haarfollikel befördert und dort temporär deponiert. Die unter den physiologischen Bedingungen im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe diffundieren zu den Zielstrukturen in der Haut, stimulieren die Zelloberflachenrezeptoren der dendritischen Zellen und induzieren eine gezielte T-zelluläre Immunantwort. Die neuen topischen Nanopartikel-Vakzine und deren Formulierungen eignen sich einerseits zur Vorbeugung und andererseits zur Behandlung von Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien bei Mensch und Tier.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue topische Vakzine, die mit Hilfe eines Partikel-basierten Trägersystems gezielt die dendritischen Zellen (DC) der Haut über den Haarfollikel als Eintrittspforte adressieren und damit eine effektive prophylaktische und/oder therapeutische T-Zell-vermittelte Immunität induzieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Zusammensetzung einer solchen Vakzine aus Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen und Helfer-T-Zellen sowie die Verwendung von synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als TLR-basierte Adjuvantien für die Verstärkung der spezifischen Immunantwort.
  • Eine Kombination der Vakzinkomponenten wird an nanoskaligen Trägerpartikeln immobilisiert, nach Auftragen auf die Haut durch diese in einem aktiven Transportprozess in die Haarfollikel befördert und dort temporär deponiert. Die unter den physiologischen Bedingungen im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe diffundieren zu den Zielstrukturen in der Haut, stimulieren die Zelloberflächenrezeptoren der DCs und induzieren eine gezielte Vakzinantigen-spezifische T-zelluläre Immunantwort.
  • Die neuen topischen Nanopartikel-Vakzine und deren Formulierungen eignen sich als Arzneimittel einerseits zur Vorbeugung und andererseits zur Behandlung von Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien bei Mensch und Tier.
  • Stand der Technik
  • Die Suche nach Alternativen zu den üblichen Vakzinierungsverfahren über die parenteralen und oralen Applikationswege findet immer mehr Beachtung (O'Hagan et al. 2004).
  • Bei der systemischen Aufnahme der Wirkstoffe, die über das Blut- und Lymphsystem im gesamten Körper verteilt werden, kommt nur ein Bruchteil der pharmakologisch aktiven Bestandteile an den Zielstrukturen an. Zudem weisen viele Wirkstoffe aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften nur eine geringe Bioverfügbarkeit auf. Weniger stabile Verbindungen werden durch enzymatische Abbauprozesse, vor allem im Gastrointestinaltrakt, metabolisiert, bevor sie den Wirkort erreichen. Somit werden mit den bisher üblichen Vakzinierungsverfahren sehr oft hohe Dosierungen benötigt, um einen adäquaten Immunisierungserfolg zu erzielen, entsprechende Nebenwirkungen inbegriffen.
  • Deshalb wurden in der letzten Zeit zunehmende Anstrengungen unternommen, über gezielte Drug Delivery Systeme die Wirkstoffe kontrolliert, in stabilisierter Form und in ausreichend hoher Dosis an einen festgelegten Wirkort zu bringen und dort mit einem definierten Freisetzungsprofil abzugeben.
  • Weitere einschränkende Bedingungen sind die mit den systemischen, meist invasiven Applikationsformen verbundenen Risiken und Nebenwirkungen, wie z. B. Sekundärinfektionen, allergische Reaktionen, Reizungen, Intoxikation, Hämatome und ähnliches. Nicht zuletzt fällt durch die Injektionsnadeln eine große Menge potentiell infektiösen Sondermülls an.
  • Vorteile einer topischen Vakzinierung dagegen, sind neben der einfachen, flexiblen und schmerzarmen Handhabung auch die gezielte Adressierung von relevanten Strukturen des Immunsystems in der Haut, die eine effektive Immunisierung ermöglichen, ohne dabei den gesamten Organismus mit den oftmals wenig verträglichen Substanzen zu belasten, sowie die Vermeidung jeglichen Infektionsrisikos. Geschultes medizinisches Personal ist oftmals entbehrlich.
  • Die topische Anwendung von Arzneimitteln basiert auf der direkten Auftragung der Wirkstoffformulierung auf die Hautoberfläche, dem Durchtritt der gegebenenfalls Träger-gebundenen Wirkstoffe durch die Haut und der Penetration/Diffusion der aktiven Komponenten zum Wirkort.
  • Dazu wurden bereits einige Applikationsstrategien entwickelt. Jedoch wurden nur wenige Konzepte in die klinische Anwendung, d. h. in klinische Studien überführt.
  • Bereits im Jahr 1998 begründete die Firma lomai Corporation die Entwicklung der Pflaster-Technologie mit einer Patentanmeldung, die die transkutane Immunisierung über die Langerhans-Zellen der Haut durch Applikation von Antigen-Determinanten im Kombination mit ADP-ribosylierenden Exotoxinen oder anderen Adjuvantien direkt auf die Hautoberfläche, zum Gegenstand hat ( WO 1999/43350 ). Jedoch ist es auch Gegenstand dieser Anmeldung, dass der Penetrationsprozess durch die Haut durch die Anwendung von physikalischen oder chemischen Methoden zur Barriereschädigungen unterstützt wird.
  • In einer weiteren Anmeldung ( WO 2002/074244 ) wird die topische Applikation lediglich der Adjuvantien beschrieben, um die durch parenteral applizierte Vakzine ausgelöste Immunreaktion zu verstärken. Die angewandte Technologie zur Vermittlung der Hautpenetration entspricht dem oben genannten Prinzip, das eine Abtrennung der oberen Epidermisschicht beinhaltet. Danach wird das Pflaster aufgeklebt und die austretende Wundflüssigkeit benetzt den Impfstoff, der dann in die Haut diffundieren soll. Für den Mechanismus dieser Penetration werden u. a. die interzellulare Penetration innerhalb der Lipidschichten und, vorrangig für polare Substanzen, der Transfer durch flüssige interzelluläre Kanäle zwischen den Keratinozyten diskutiert. Den Haarfollikeln und Schweißdrüsen wird ausdrücklich eine „minimale Rolle” beim transkutanen Wirkstofftransport zugebilligt. Partikel werden lediglich zur besseren Stabilisierung von Suspensionen und als Depots für die verzögerte Freisetzung der Wirkstoffkomponenten vorgeschlagen. Eine Transportfunktion dieser Partikel ist nicht beschrieben.
  • Auf Basis dieser Erfindungen hat die Firma Intercell AG inzwischen ein Impf-Pflaster gegen Reise-Diarrhöe entwickelt ( WO 2005/103073 ). Das Zulassungsverfahren wurde allerdings gestoppt, da in den klinischen Studien der Phase III keine ausreichende Wirksamkeit nachgewiesen werden konnte. Ein System zur Impfung gegen Influenza, bei dem die immunisierende Wirkung von niedrigen Dosen der konventionell verabreichten Antigene durch ein ein toxisches Adjuvans enthaltendes Pflaster verstärkt wird sowie ein Impfstoff-Pflaster gegen Krankenhauskeime sind in der Entwicklung ( WO 2003/047602 , Glenn et al. 2007).
  • Andere Ansätze zur topischen Vakzinierung erzielen die transdermale/intradermale Applikation von Antigenen durch nadelfreie Injektion mittels Luft, Flüssigkeiten und/oder Druck ( WO 1999/31262 , Chen et al. 2000, 2002, Mitragotri 2006) oder Mikro-Nadeln (Choi et al. 2007). Mit Intanza® und IDflu® von Sanofi Pasteur wurde im Dezember 2008 das erste intradermale Mikroinjektions-Impfsystem für die saisonale Influenza-Impfung in der EU zugelassen. Durch die nur 1,5 mm langen Mikro-Nadeln wird das Antigen minimal-invasiv direkt in die Haut injiziert. Allerdings wird damit nicht die mit den immunkompetenten Zellen besonders dicht durchzogene Epidermis als ideale Zielregion erreicht. Sullivan et al. (2010) schlagen die Verwendung von Pflastern mit selbstauflösenden Mikro-Nadeln aus Polyvinylpyrrolidon vor, in die die Vakzine eingeschlossen sind.
  • Versuche mit zellpenetrierenden Peptiden hatten weniger Erfolg. Durch die Kopplung von TAT-Peptiden an Lipid-Nanopartikel konnten diese bis zu einer Tiefe von 120 μm in die Epidermis gelangen. Auch in den Haarfollikeln waren Partikel in dieser Tiefe nachweisbar. Für die Adressierung der für die Immunisierung notwendigen DCs reicht dies aber nicht aus (Patlolla et al. 2010). In anderen Arbeiten ist der Transporteffekt auf wenige Proteine beschränkt (Huang et al. 2010).
  • Seit einigen Jahren werden auch Liposomen als Transportsysteme für topisch applizierte Wirkstoffe in und durch die Barriere der menschliche Haut eingesetzt (Barry 2002). Untersuchungen ergaben, dass diese vesikulären Strukturen die Hautbarriere nicht als intakte Einheiten durchdringen, sondern die Wirkstoffe freisetzen, die dann eigenständig weiter penetrieren.
  • Es gibt jedoch Untersuchungen, dass Nanopartikel unterhalb einer bestimmten Größe in der Lage sind, die Hautbarriere nach Vorschädigung zu durchdringen. Vogt et al. applizierten beispielsweise Nanopartikel mit einem Durchmesser von 40–1.500 nm auf exzidierte Haut, deren Barriere vorher mit einem Cyanacrylat-Abriss geschädigt wurde. In diesem Fall konnte nachgewiesen werden, dass insbesondere die kleinsten untersuchten Partikel in das Gewebe eindringen konnten und dort von den Langerhans-Zellen aufgenommen wurden (Vogt et al. 2006). Eine darauf aufbauende Vakzinierungsstrategie mit klassischen Influenza-Vakzin-Suspensionen befindet sich in der klinischen Phase Ia (Combadière et al. 2010, WO 2006/136959 ). Dasselbe Prinzip beinhaltet der DNA-basierte HIV-Impfstoff DermaVir von Genetic Immunity (klinischen Phase II), bei dem die Nukleinsäuren an Nanopartikel aus mannosyliertem Polyethylenimin gebunden sind. Eine Freisetzung der Wirkstoffe ist in diesen Konzepten nicht vorgesehen. Vielmehr geht man von der partikulären Struktur der Antigene z. B. in Form von viralen Partikeln, Nanopartikel oder DNA aus.
  • Zahlreiche nanoskalige Trägersysteme sind entwickelt worden, deren Ziel vor allem darin besteht, die Träger-gebundenen Wirkstoffe direkt zu den und in die immunkompetenten Zellen zu befördern. In WO 2010/006753 werden SiO2-Nanopartikel einer Größe von 25 nm als Antigen-Träger eingesetzt, wobei die Effektivität der Aufnahme in die antigenpräsentierenden Zellen der Lymphknoten und damit der Immunisierung über die Größe der Partikel steuerbar ist. Auch in WO 2008/118861 wird die Adressierung der immunkompetenten Zellen durch Größe und Geometrie der Trägerpartikel, weitestgehend unabhängig von deren Zusammensetzung, erzielt. Die Applikation erfolgt in beiden Fällen parenteral durch intradermale oder subkutane Injektion. Die Trägerpartikel werden, zusammen mit den kovalent gebundenen Wirkstoffen, direkt von den antigenpräsentierenden Zellen der Lymphknoten aufgenommen. Ähnliche Ansätze basieren auf biologisch abbaubaren Trägerpartikeln ( WO 2008/048298 , WO 2007/067744 , WO 1998/28357 ), wobei die Wirkstoff-Komponenten in die Matrix integriert oder durch adsorptive Wechselwirkungen oder Komplexbildung an die Oberfläche gebunden sein können. Auch werden Trägerpartikel mit intrinsischem adjuvantem Effekt beschrieben (Chen et al. 2010, Florindo et al. 2010).
  • Durch nicht-kovalente Kopplung der Wirkstoffe an die Trägerpartikel auf der Basis von physikalisch-chemischen Wechselwirkungen, ergibt sich die Möglichkeit der kontrollierten Wirkstoff-Freisetzung nach Erreichen des Wirkortes ( WO 2009/046498 , WO 2007/067744 ).
  • Bisher ist es jedoch in keiner Anwendung gelungen, den transdermalen Wirkstofftransport für beliebige und beliebig viele Vakzinkomponenten ohne eine Vorschädigung der Haut oder Injektionssysteme und ohne Eintritt des Trägers in das lebende Körpergewebe zu realisieren (Prausnitz et al. 2008). Während die Penetration von Nanopartikeln in die Haarfollikel inzwischen recht gut erforscht ist, sind die Anwendung größerer und damit nicht zellgängiger Trägerpartikel, die effektive Bindung und gezielte Freisetzung der Wirkstoffe und auch die eigenständige Diffusion der Wirkstoffe zu den immunkompetenten Strukturen der Haut, noch Gegenstand aktueller Forschungen.
  • Die Entwicklung von Impfstoffen, weg von den kompletten Organismen hin zu hochreinen synthetischen Vakzinkomponenten, erhöht die Erfordernis von Adjuvantien zur Verstärkung der Immunantwort. Viele klassische Adjuvantien simulieren durch bestimmte molekulare Strukturen, Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), die immunologisch effektiven Komponenten der Pathogene und werden von den immunkompetenten Zellen des angeborenen Immunsystems, einschließlich der antigenpräsentierenden Zellen, wie z. B. DCs, bevorzugt über die Toll-Like-Rezeptoren (TLR) erkannt. Diese Zellen spielen durch die Präsentation der Antigene an die Lymphozyten und die Expression von Zytokinen auch eine wichtige Rolle bei der Ausprägung der Antigen-spezifischen adaptiven Immunantwort.
  • Unter einigen anderen kommt den bakteriellen Lipopeptiden, die vor allem die T-zelluläre Immunantwort stimulieren, eine große Bedeutung zu (Brown et al. 2005). Weil die TLR für Lipopeptide, im Gegensatz zu den TLR für die meisten anderen Immunmodulatoren, auf den Oberflächen der Zellen exprimiert werden, sind bakterielle Lipopeptide besonders gut zum Targeting geeignet. Zudem können diese durch synthetische Analoga ersetzt werden, die als charakteristisches Merkmal die ungewöhnliche Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-propyl]-[R]-cystein am N-Terminus, an die zwei oder drei Fettsäuren gebunden sind, aufweisen. So reagiert das TLR 1/TLR 2-Heterodimer ebenfalls auf triacylierte synthetische Lipopeptide, wie die Pam3Cys-Derivate ( EP 0210412 ). TLR 6/TLR 2-Heterodimere sind sensitiv für diacylierte synthetische Lipopeptide, wie die Pam2Cys-Derivate ( EP 0519327 ).
  • Z. B. wird von Mühlradt et al. ein diacyliertes Dihydroxypropylcystein-Peptid mit einem von der Spezies Mycoplasma fermentans abgeleiteten Peptid (MALP-2) für verschiedene Anwendungen in der Immunologischen Medizin beansprucht ( WO 1998/27110 , WO 1999/59610 , WO2002/028887 , WO 2003/084568 , WO 2004/108145 ).
  • Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurden bereits verschiedene Medikamente und Impfstoffe, die Zusätze von acylierten Lipopeptiden als Adjuvantien enthalten, zur Verwendung im Rahmen von immunmodulatorischen Therapien entwickelt. Typischerweise werden die Lipopeptide, bevorzugt Pam3Cys- und Pam2Cys-Derivate als TLR 2 targetierende Substanz, hierzu mit einer antigenen Komponente für B-Lymphozyten oder für zytotoxische T-Zellen sowie weiteren Hilfsstoffen vermischt, um synergistische Effekte zu induzieren ( WO 2007/103322 , WO 2006/104 389 , US 7,387,271 ). In WO 2006/040076 wird auch eine topische Applikation einer solchen Wirkstoff-Formulierung beschrieben.
  • Auch Formulierungen als Liposomen oder Virus Like Particles, die neben Antigenen und gegebenenfalls Zytostatika auch Lipopeptide, bevorzugt Pam3Cys, enthalten, werden für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Allergien beansprucht ( WO 2005/063201 , WO 2005/063288 ).
  • Ebenfalls werden Konjugate aus Pam2Cys- bzw. Pam3Cys-Derivaten und Antigenen als Impfstoffe beschrieben, um die Antigene spezifisch an die immunkompetenten Zellen zu binden bzw. in diese einzuschleusen; so in WO 2007/078879 eine Kombination aus einem Membran-Proteinen des Influenza-Virus und einem Pam3Cys-Derivat, in WO 2009/046498 eine DNA-Vakzine, die durch polare Aminosäuren an ein Pam2Cys-Derivat gekoppelt ist, in WO 2007/079448 ein lineares Tandem-Molekül aus einem B-Zell-Epitop, einem T-Zell-Epitop und Pam3Cys oder in WO 2004/014956 und WO 2004/014957 ein Molekül aus einem B-Zell- bzw. CTL-Epitop und einem Helfer-T-Zell-Epitop, die durch ein Pam3Cys-Lipopeptid miteinander verbrückt sind. Bereits Borges et al. (1994) beschreiben den immunverstärkenden Effekt durch die direkte Kopplung von Pam2Cys- und/oder Pam3Cys-Derivaten mit CTL- und/oder Helfer-T-Zell-Epitopen.
  • Im Zusammenhang mit partikulären Biotransportern für Lipopeptide sind sehr wenige konkrete Anwendungen bekannt. Schwerpunkt diesbezüglicher Patentanmeldungen ist die Beschaffenheit der Partikel. In der Regel sind die Wirkstoffkomponenten nicht näher spezifiziert. Lipopeptide werden unter einer Vielzahl möglicher Verbindungen als Immunzellen-targetierende Substanzen erwähnt. Eine Anwendung lipid-ähnlicher Strukturen sind nanoskalige Fett- und fettähnliche Tröpfchen als Wirkstoffträger ( EP 0605497 ). Heuking et al. 2009 beschreiben ein System aus Pam3Cys-PEG gekoppelt an Chitosan(Partikel) als potentielles Drug Delivery System, wobei das Lipopeptid als Ankermolekül zur Zielsteuerung der Chitosan-Biotransporter fungiert. Durch das Lipopeptid als TLR-Ligand sollen die Wirkstoffträger spezifisch an die immunkompetenten Zellen gebunden werden, um eine intensive Wechselwirkung bzw. Aufnahme in die Zelle zu ermöglichen.
  • Aufgabenstellung
  • Ausgehend vom Stand der Technik mit den dargestellten Vor- und Nachteilen sind neue Vakzinierungsstrategien für Prophylaxe und/oder Therapie gesucht, die die Vorteile einer topischen Vakzinierung gegenüber der bisher dominanten systemischen und invasiven Applikationsform nutzen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue trägerbasierte und topisch applizierbare prophylaktische und/oder therapeutische Vakzine zur Verfügung zu stellen, welche eine effektive und zugleich einfache wie schmerzarme Immunisierung ohne Nebenwirkungen und Risiken ermöglichen, indem sie mit den DCs die Sensorzellen des Immunorgans Haut direkt durch den Haarfollikel als Einrittspforte adressieren und zusätzlich durch ein TLR-basiertes Adjuvans stimulieren.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch erstmals beschriebene, topisch applizierbare Nanopartikel-Vakzine zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung bei Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen sowie entzündlichen und allergischen Leiden, wie sie in Anspruch 1 dargestellt sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Vakzine sind in den Ansprüchen 2 bis 4 beansprucht. Die Ansprüche 5 bis 8 betreffen bevorzugte Ausführungsformen der Vakzinkomponenten, Anspruch 9 pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine, sowie deren Herstellung. Die Ansprüche 10 bis 11 betreffen die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine und pharmazeutischen Präparate in der Human- und Veterinärmedizin.
  • Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Ausgehend von der Aufgabenstellung adressiert die vorliegende Erfindung direkt die Sensorzellen eines der wichtigsten Organe des Immunsystems, die DCs der Haut einschließlich der Langerhans-Zellen.
  • DCs haben in ihrer Rolle als Vermittler der Immunität zwei zeitlich voneinander klar abgrenzbare Schlüsselfunktionen. Als unreife Zellen sind sie zuständig für die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen. Nur wenig später nach der Aktivierung sorgen sie dann als reife Zellen für die Stimulierung hauptsächlich von T-Zellen und indirekt über die T-Zellen auch von B-Zellen, indem sie diesen das prozessierte Antigen in Form von MHC-Peptid-Komplexen, zusammen mit kostimulierenden Molekülen, an ihrer Oberfläche präsentieren und gleichzeitig Zytokine freisetzen, welche die Immunantworten unterstützen und stabilisieren. Gleichsam als Wachposten und Alarmgeber des Immunsystems üben sie somit eine übergeordnete Kontrollfunktion über die eigentlichen Akteure der zellulären Immunantwort aus. Hierbei ist nur eine DC notwendig, um 100 bis 3.000 Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren.
  • Aufgrund ihrer Fähigkeit, Immunantworten zu induzieren, zu verstärken sowie ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen, sind die DCs ein wichtiges zelluläres Hilfsmittel für die Immuntherapie geworden. Durch neue Ansätze für die vollständige Aktivierung und Differenzierung dieser immunkompetenten Zellen kann die Effizienz prophylaktischer und therapeutischer Vakzine entscheidend erhöht werden, da nur gereifte DCs eine spezifische T-Zell-basierte zytotoxische Immunantwort sowie die Expression proinflammatorischer Zytokine auslösen können. Gleichzeitig sind reife DCs in der Lage, die Wirkung durch Tumore gebildeter immunsuppressiver Faktoren aufzuheben.
  • Eine spezielle Form der DCs sind die Langerhans-Zellen. Es handelt sich hierbei um noch inaktive antigenpräsentierende Zellen, die in der Epidermis der Haut ein durchgängiges Netzwerk bilden. Nach Kontakt mit dem Antigen erfolgt ihre Aktivierung und Differenzierung zu reifen DCs, die die Antigene in die regionären Lymphknoten transportieren und dort an die T-Lymphozyten präsentieren.
  • Vor diesem Hintergrund sind die DCs der Haut ideale Zielstrukturen für eine topische Vakzinierung.
  • Als Eintrittspforte für die topischen Vakzine ist der Haarfollikel besonders gut geeignet, da die Epidermis in diesem Bereich mit einem besonders dichten Netz immunkompetenter Zellen durchzogen ist, das der Überwachung und Abwehr von durch die im Haarfollikel nicht geschlossene Hautbarriere eindringenden Fremdstoffe dient.
  • Mit den üblichen Verfahren zur topischen Vakzinierung ist es bisher jedoch nicht gelungen, diese Strukturen für die Überwindung der Hautbarriere zu nutzen. Alle bisher bekannten Verfahren basieren auf einer Penetration der Wirkstoffe direkt durch die Hornschicht der Haut oder auf der Penetration von nanoskaligen partikulären Antigenen direkt in die DCs der Haut, in den meisten Fällen nach chemischer oder physikalischer Vorschädigung oder Quellung der Haut. Für solide Partikel konnte zwar eine Penetration in die Haarfollikel nachgewiesen werden. Für den Durchtritt in den Bereich der lebenden Zellen ergaben sich jedoch keine Hinweise (Lademann et al. 2009).
  • Um so überraschender ist es, dass es mit dem System der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine erstmals gelungen ist, Träger-gebundene Wirkstoffe durch gezielte Ausnutzung eines natürlichen Transportmechanismus in den Haarfollikel und damit in die tieferen Schichten der Epidermis, bevorzugt das Stratum spinosum, zu befördern.
  • In dieser Region befindet sich die höchste Dichte an immunkompetenten Zellen der Haut, sodass die Vakzinkomponenten in unmittelbare Nähe zu den Zielstrukturen gelangen und nach Ablösung vom Trägerpartikel nur ein kurzes Stück diffundieren müssen.
  • Den Trägerpartikeln kommt dabei eine vierfache Funktion zu. Sie müssen
    • (i) als Vektoren für eine effiziente Zielfindung der Vakzine den aktiven Transport in die Haarfollikel unter Nutzung eines biomimetischen Prinzips ermöglichen,
    • (ii) als multifunktionale Träger die molekularen Einzelkomponenten der Vakzine in hoch-wirksamer räumlicher Nähe zueinander organisieren,
    • (iii) nach erfolgtem Transport als Modulatoren der gezielten Freisetzung der Vakzinkomponenten fungieren und
    • (iv) durch die multivalente Organisation der Vakzinkomponenten, deren Wirkung verstärken.
  • In den Untersuchungen konnte überraschend gefunden werden, dass durch die Bewegung des Haares im Haarfollikel eine Art Pumpmechanismus in Gang gesetzt wird, der den Transport von Partikeln in den Haarfollikel bewirkt. Für diesen rein mechanischen Effekt sind die partikuläre Struktur der Trägermaterialien sowie das Einmassieren essentiell. Der Transportmechanismus ist umso effektiver, je besser die Partikelgröße und die Schuppendichte des Haares aufeinander abgestimmt sind. Geringeren Einfluss haben die Struktur und die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel.
  • Es konnte gezeigt werden, dass sphärische Partikel in einem Größenbereich von 100 nm–3.000 nm, bevorzugt 300 nm–1.500 nm, besonders gut geeignet sind, um die verschiedenen Vakzinkomponenten durch den beschriebenen Pumpmechanismus an die optimale Position im Haarfollikel zu transportieren, wobei die Penetrationstiefe über die Partikelgröße eingestellt werden kann (7). Bereits nach 1 h ist das Infundibulum in 600 μm Tiefe erreicht, wo sich beim menschlichen Terminalhaar die höchste Dichte an DCs der Haut befindet. Eine weitere Penetration innerhalb der folgenden 24 h ist unwesentlich für den Vakzinierungserfolg.
  • Außerdem konnte überraschend gefunden werden, dass zusätzlich zu dem Transport in den Haarfollikel eine Langzeitspeicherung der Trägerpartikel erfolgt (8). Erst nach einem Zeitintervall von ca. 5–10 Tagen werden die Trägerpartikel durch Sebumsekretion und Haarwuchs wieder aus dem Haarfollikel heraustransportiert, während die im Stratum corneum liegenden Partikel durch die kontinuierliche Abschilferung der Hornzellen relativ schnell wieder abgestoßen werden. Dies ermöglicht die Entwicklung retardierender topischer Formulierungen. Gleichzeitig ist über natürliche Prozesse garantiert, dass die Trägerpartikel wieder aus dem Haarfollikel heraustransportiert werden.
  • Die Möglichkeit einer transfollikulären Penetration der Partikel durch die Barriere des Haarfollikels in den Bereich der lebenden Zellen ist nicht auszuschließen, konnten aber bisher nicht nachgewiesen werden. Ein solcher Übergang wurde nur nach Vorschädigung der Hautstruktur, beispielsweise durch Cyanacrylat-Abriss und für Partikelgrößen unterhalb 50 nm beobachtet. Lediglich die freigesetzten Wirkstoffe diffundieren in das Körpergewebe, wo sie die DCs als Zielstrukturen erreichen und eine spezifische Immunantwort auslösen.
  • Für die effektive Beladung der Trägerpartikel mit den Vakzinkomponenten, deren stabile Bindung und sicheren Transport in den Haarfollikel sowie die gezielte Freisetzung der weiterhin uneingeschränkt wirksamen Wirkstoffe an den Zielstrukturen, kann ein reversibler Kopplungsmechanismus auf der Basis physikalischer oder chemischer Wechselwirkungen genutzt werden.
  • Besonders bevorzugt ist hierbei eine reversible Adsorption auf der Grundlage elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen der polarisierten Oberfläche der Trägerpartikel und den durch einen Ladungs-Tag polarisierten Strukturabschnitten der Vakzinkomponenten.
  • Als Triggerung für die Freisetzung der Vakzinkomponenten am Zielort wird erfindungsgemäß der pH-Shift innerhalb des Haarfollikels genutzt. Es wurden Partikel konstruiert, deren Oberflächenpotential (ζ-Potential) sich in Abhängigkeit vom pH-Wert in der Weise ändert, dass die Vakzinkomponenten während der Beladung und des Transports stabil an den Trägerpartikel binden und unter den physiologischen Bedingungen in den Haarfollikeln wieder desorbieren.
  • Dazu wurden Partikel im Layer-by-Layer (LBL) Verfahren beschichtet. Die LBL®-Technologie nutzt die elektrostatische Wechselwirkung zwischen geladenen Polymeren (Polyelektrolyten) und Oberflächen. Durch Adsorption von Polymeren an den entgegengesetzt geladenen Partikeloberflächen, in der vorliegenden Erfindung bevorzugt an Silika-Partikeln mit negativem Oberflächenpotential, findet eine Umladung der Partikel statt, wodurch sich die abgeschiedene Polymermenge von selbst auf eine Dicke von etwa 2–7 nm einreguliert. Für eine zweite Schicht lässt sich der Vorgang entsprechend mit einem entgegengesetzt geladenen Polymer wiederholen. Auf diese Weise lassen sich beliebig viele Schichten auf Substraten aufbauen.
  • Für die gegebene Anwendung haben sich als kationische Polymere Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH), Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) (PDA) und Poly(acryloyloxyethyltrimethylammoniumchlorid) (PAOET) sowie als anionische Polymere die Natriumsalze von Poly(vinylsulfat) (PVS), Sulfoethylcellulose und Polystyrolsulfonat (PSS) als besonders geeignet erwiesen.
  • In der vorliegenden Erfindung werden LBL®-Oberflächen mit 2 bis 20 Schichten eingesetzt, wobei für mindestens die äußerste Schicht ein schwaches Polyanion- bzw. Polykation verwendet wird, welches seine Ladung in Abhängigkeit vom pH-Wert ändert, wie z. B. Chitosan, Polyvinylpyridin, Polyvinylcarbazol, Polyacrylat (PAA) oder Polymethacrylat (PMAA). Auch natürliche Proteine sind in Abhängigkeit von ihrem isoelektrischen Punkt als pH-schaltbare Materialien geeignet.
  • Für die Polarisation der Vakzinkomponenten wurden diese mit einem Tag versehen, der bevorzugt aus 4–10 geladenen Aminosäuren aufgebaut ist. Dabei kommen die basischen Lysin-, Histidin- und Arginin-Einheiten für eine positive Polarisation bzw. Glutaminsäure- oder Asparaginsäure-Einheiten für eine negative Polarisation zum Einsatz. Sie gewährleisten, dass sich die Vakzinkomponenten in Analogie zu den Polymeren an den entgegengesetzt geladenen Partikeln anlagern und bei pH-bedingter Umladung der Partikeloberfläche wieder desorbiert werden.
  • Die Länge und Zusammensetzung der Ladungs-Tags sowie ein gegebenenfalls einzufügender Spacer müssen individuell auf die jeweilige Vakzinkomponente zugeschnitten werden, da diese Moleküle sterisch behindert sein oder weitere Wechselwirkungen, wie z. B. Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophobe Wechselwirkungen, mit den Polymeroberflächen eingehen können. Zudem sind die Kapazität und die Effektivität des Beladungsvorganges sowie die Ablösekinetik durch Modifikation der Ladungs-Tags individuell einstellbar.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben sich (PAH/PSS)2PAH/PMAA-beschichtete Silika-Partikel als besonders geeignet erwiesen. Während die Beladung der LBL®-Partikel bevorzugt unter basischen Bedingungen stattfindet, erfolgt die Desorption der Vakzinkomponenten nach dem Transportprozess im sauren Milieu des Haarfollikels. Durch die erhöhte Wasserstoffionen-Konzentration kommt es unterhalb von pH 7 zur Protonierung der PMAA–-Gruppen, wodurch sich die äußere LBL®-Schicht entlädt bzw. durch die daruntergelegene PAH-Schicht wieder kationisch auflädt. Das führt zur Abstoßung der positiv polarisierten Vakzinkomponenten von der Partikeloberfläche (1). Einen zusätzlichen positiven Effekt auf die Freisetzung der Vakzine hat die erhöhte Salzkonzentration im Haarfollikel.
  • Mit diesem Verfahren ließen sich zwischen 20 μg und 150 μg der einzelnen, mit entsprechenden Oligoaminosäure-Tags modifizierten Vakzinkomponenten pro 1 mg der Silika-Trägerpartikel adsorbieren. Mit der zugegebenen Menge, der Adsorptionszeit, der Tag-Länge sowie der Tag-Struktur kann die Beladung für jede Vakzinkomponente individuell eingestellt werden. Dadurch ist die stöchiometrische Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine entsprechend der individuellen medizinischen Indikation, der Applikationsform und des Wirkungsgrades der Vakzinkomponenten einstellbar (Ausführungsbeispiel B).
  • Neben der sortenreinen Beladung konnten für die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine auch die gleichzeitige Beladung eines Trägerpartikels mit verschiedenen, unterschiedlich wechselwirkenden Vakzinkomponenten in einem definierten molaren Verhältnis, sowie deren simultane und gleichmäßige Freisetzung am Wirkort, am Beispiel einiger Wirkstoffkombinationen realisiert werden.
  • Somit konnte mit den hier beschriebenen LBL®-Partikeln ein System gefunden werden, welches die stabile, effektive und gleichmäßige Adsorption der Vakzinkomponenten sowie deren gleichmäßige Freisetzung im Haarfollikel ermöglicht. Insbesondere die Ausbeuten der im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe in der Größenordnung von 30–90% der adsorbierten Menge, liegen in einer für die Vakzinierung ausreichenden Größenordnung. Unerwünschte Aggregationseffekte konnten durch entsprechende Beladungsverfahren, die Auswahl der Beschichtungsmaterialien sowie die Reihenfolge der Polymerschichten verhindert werden.
  • Durch die direkte Adressierung der immunkompetenten Zellen der Haut mit der Möglichkeit, zusätzlich zur Antikörper-vermittelten Immunität eine T-Zell-vermittelte Immunität zu induzieren, kann die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen topischen Nanopartikel-Vakzine auf ein Mindestmaß an Komponenten und geringste Mengen an Wirkstoffen beschränkt werden.
  • Für die Untersuchungen wurde eine synthetische Minimalvakzine als Modell entwickelt, die zur Adressierung verschiedener synergistisch wirkender Targets, aus den folgenden essentiellen Grundkomponenten besteht:
    • (i) Epitop für zytotoxische Effektor-T-Zellen (CTL),
    • (ii) Epitop für Helfer-T-Zellen, bevorzugt Pan-DR-Epitope und
    • (iii) bakterielles Lipopeptid als Immunmodulator.
  • Für eine reale Vakzine sind diese Komponenten entsprechend der medizinischen Indikation austausch- und in beliebigem Verhältnis kombinierbar. Anstatt einzelner Epitope könnten beliebige Antigen-Determinanten für T-Zellen, wie z. B. mehrere Peptide, Polyepitope, Biopolymere oder auch andere Träger antigener Information, wie DNA oder RNA, eingesetzt werden. Die Antigen-Determinanten für CTL-Epitope werden entsprechend der gewünschten Immunisierung ausgewählt. Das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E ist universell für alle HLA-DR-Allotypen, muss jedoch artspezifisch angepasst werden. Letztendlich sollte eine Vakzine immer eine Mehrzahl an Antigen-Determinanten/Epitopen enthalten, um einen ausreichenden Impfschutz in einer immungenetisch heterogenen Population erreichen zu können.
  • Die dritte Grundkomponente ist ein Immunmodulator, bevorzugt ein synthetisches bakterielles Lipopeptid. Lipopeptide sind Bestandteil der bakteriellen Zellwand und werden durch die Toll-Like-Rezeptoren TLR 1, 2, 6 und 10 der dendritischen und anderer immunkompetenter Zellen erkannt. Über eine biochemische Signalkaskade wird in den TLR-Trägerzellen ein entsprechender intrazellulärer Mechanismus, meist die Expression bestimmter, der Antigen-spezifischen Abwehr von Krankheitserregern dienender Gene, ausgelöst, der zur Differenzierung Erreger-spezifischer T-Zellen führt. Infolgedessen wird in der ersten Stufe der Infektionsabwehr die unspezifische Immunantwort initiiert, der im weiteren Verlauf die Reaktion durch das erworbene Immunsystem, mit der Bildung spezifischer Antikörper, folgt.
  • Der Einsatz des Lipopeptid-Immunmodulators ist besonders vorteilhaft, da mit den erfindungsgemäßen topischen Nanopartikel-Vakzinen speziell die DCs der Haut adressiert werden, die über eine hohe Dichte aller TLR und in ihrer Wächterfunktion für die Entrittspforte Haut über besonders effektive Mechanismen als erste Abwehrkette des angeborenen Immunsystems verfügen. Zudem sind die TLR für die Lipopeptide auf den Oberflächen der Zellen exprimiert sodass die Lipopeptide direkt, ggf. auch partikelgebunden auf die Zellen wirken können, ohne vorher aufgenommen zu werden.
  • Durch die direkte Kopplung der Antigen-spezifischen Vakzinkomponenten mit dem immunmodulatorisch wirksamen Adjuvans, konnte eine hochgradig fokussierte Aufhebung des konditioniert immunsuppressiven Zustandes der Haut und damit eine deutliche Steigerung der durch die erfindungsgemäße Nanopartikel-Vakzine induzierten T-Zell-basierten spezifischen Immunantwort, erzielt werden. Dadurch wird die Möglichkeit immunologischer Nebenwirkungen weiter minimiert.
  • Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Lipopeptid-Immunmodulators der folgenden allgemeinen Struktur,
    Figure 00130001
    wobei
    R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, bevorzugt für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen,
    R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, bevorzugt für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen, oder H und
    R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid, bevorzugt mit der Aminosäuresequenz GDPKHPKSF, stehen.
    Jedoch ist auch der Einsatz anderer bekannter Adjuvantien, wie z. B. Squalen oder Aluminiumoxid, nicht ausgeschlossen.
  • Die Induktion der gewünschten immunologischen Reaktion ist in jedem Fall von der gleichzeitigen Gabe aller drei Komponenten abhängig, die jedoch je nach Situation und Antigen auf demselben oder verschiedenen Trägerpartikeln gekoppelt sein sollten (Ausführungsbeispiel D).
  • Zur gleichzeitigen Beladung eines Trägerpartikels mit mehreren Vakzinkomponenten kann jede Komponente über einen eigenen Ladungs-Tag an der polarisierten Partikeloberfläche gebunden werden (4).
  • Eine weitere Möglichkeit ist die kovalente Verknüpfung der bevorzugt peptidischen Vakzinkomponenten zu Konjugaten der folgenden allgemeinen Strukturen (II), (III) oder (IV).
    Figure 00140001
    wobei
    n jeweils für eine natürliche Zahl von 0 bis 6,
    R1, R2, R3, R4, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, für einen Aminosäure-Spacer mit einer Länge von 0 bis 6 Aminosäuren,
    T-Zell-Epitop, und T-Zell-Epitop2, die gleich oder verschieden sein können, für eine Aminosäure-Sequenz eines Epitops für zytotoxische Effektor-T-Zellen oder eines Epitops für Helfer-T-Zellen,
    Lipopeptid für einen Immunmodulator gemäß Formel (I) und
    Tag für eine Folge von 4–10 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren stehen.
  • Dieses Konjugat wird dann, wie in 5 dargestellt, über den Ladungs-Tag an dem polarisierten Trägerpartikel immobilisiert.
  • Für welche Vakzine solche oder ähnliche Konjugate vorteilhaft sind, ist abhängig von der medizinischen Indikation sowie den enthaltenen Vakzinkomponenten und Antigen-Determinanten. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich die räumliche Nähe bestimmter Epitope in einigen Fällen vorteilhaft auf den Immunisierungserfolg auswirkt, in anderen Fällen aber keinen Einfluss hat.
  • Wie die Komponenten der Nanopartikel-Vakzine und deren molare Verhältnisse, müssen auch die Form der Bindung an die Trägerpartikel (Ladungs-Tags, einzelne/gemischte Beladung) sowie die Art der Konjugation spezifisch eingestellt werden.
  • Ausgehend von diesen Untersuchungen konnte ein überraschend effektives System zur topischen Vakzinierung gefunden und gezeigt werden, dass die Vakzinkomponenten nach Applikation auf die Hautoberfläche mit Hilfe von nanoskaligen Trägerpartikeln in einem aktiven Transportprozess und unter Nutzung eines biomimetischen Prinzips, in den Haarfollikel und somit in die unmittelbare Nähe der immunkompetenten Zellen der Haut gelangen, wo sie nach Diffusion zu den Zielstrukturen, den DCs der Haut, die gewünschte spezifischen T-zelluläre Immunantwort auslösen.
  • Dies überrascht um so mehr, als dass alle bisherigen topischen Impfstrategien von einer Notwendigkeit der direkten Penetration der Wirkstoffe durch die Haut ausgehen, teilweise sogar den Transport durch die Haarfollikel als möglichen Weg zur Überwindung der Hautbarriere explizit ausschließen.
  • Weiter konnte überraschend festgestellt werden, dass durch die unmittelbare Anwesenheit des Lipopeptid-Immunmodulators in räumlicher Nähe zu den anderen Vakzinkomponenten, eine deutliche Steigerung der T-Zell-basierten spezifischen Immunantwort erzielt werden konnte.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher topische Nanopartikel-Vakzine zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung mindestens bestehend aus den Grundkomponenten
    • (i) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen (CTL-Epitope, Polyepitope, Biopolymere, Proteine, DNA, RNA, Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine oder ähnliche Träger antigener Informationen),
    • (ii) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für Helfer-T-Zellen, bevorzugt Pan-DR-Epitope als degenerierte Peptide für alle HLA-DR-Allotypen, und
    • (iii) ein oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentierenden DCs, bevorzugt synthetische Analoga bakterieller Lipopeptide,
    als einzelne Moleküle oder Konjugate,
    bei denen
    • (a) die Vakzinkomponenten durch einen Ladungs-Tag reversibel an nanoskalige Trägerpartikel gekoppelt sind,
    • (b) die nach topischer Applikation auf die Hautoberfläche aktiv in den Haarfollikel transportiert und dort temporär deponiert werden, bei denen
    • (c) die Vakzinkomponenten unter den dort herrschenden physiologischen Bedingungen gezielt freigesetzt werden und dann
    • (d) durch Diffusion zu den Zielstrukturen, den DCs in der Epidermis der Haut, gelangen,
    • (e) wo sie eine T-Zell-basierte Vakzinantigen-spezifische Immunreaktion auslösen,
    sowie deren Verwendung für verschiedene medizinische Indikationen, bevorzugt zur prophylaktischen spezifischen Immunisierung gegen und/oder zur therapeutischen Vakzinierung bei Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden, sowie zur Verstärkung der Immunantwort nach einer durch konventionelle Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung in der Human- und Veterinärmedizin.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine sowie der Vakzinkomponenten werden in den Unteransprüchen sowie den Ausführungsbeispielen dargestellt.
  • Das immunologische Potential der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine wurde anhand von in vitro Experimenten mit Modellvakzinen, die die CTL-Epitope GILGFVFTL aus dem Influenza-Matrixprotein M1 bzw. NLVPMVATV aus dem frühen Antigen pp65 des Zytomegalovirus CMV, das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E (aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C) sowie Pam2Cys-GDPKHPKSF als Immunmodulator enthielten, nachgewiesen (Ausführungsbeispiele C und D).
  • Im Einzelnen konnte in den weiterführenden Experimenten gezeigt werden, dass
    • (i) eine definiert einstellbare Beladung der Trägerpartikel und eine unter Beladungs-, Lagerungs- und Transportbedingungen stabile Bindung der Vakzinkomponenten an der polarisierten Oberfläche der Partikel möglich ist;
    • (ii) ein zuverlässiger aktiver Transport der Vakzinkomponenten in den Haarfollikel bis zu ca. 600 μm Tiefe erfolgt;
    • (iii) die Trägerpartikel für ca. 5–10 Tage in den Haarfollikeln deponiert und durch einen natürlichen Reinigungsprozess wieder ausgeschieden werden;
    • (iv) eine gleichmäßige und simultane Freisetzung der Vakzinkomponenten in der gewünschten Tiefe der Follikelstruktur erfolgt;
    • (v) die freigesetzten Vakzinkomponenten zu den DCs der Haut (Langerhans-Zellen) diffundieren und von diesen aufgenommen werden;
    • (vi) die freigesetzten Vakzinkomponenten weiterhin uneingeschränkt immunologisch aktiv sind;
    • (vii) die Partikel-gebundenen Vakzinkomponenten der Modellvakzine bei humanen Effektor-T-Zellen eine spezifische T-Zell-vermittelte Immunantwort auslösen, die qualitativ und quantitativ vergleichbar zur Reaktion auf die ungebundenen Vakzinkomponenten ist und auch die Ladungs-Tags keinen nachteiligen Effekt auf die immunologische Wirksamkeit der Vakzinkomponenten haben;
    • (viii) die Lipopeptide zur Aktivierung der antigenpräsentierenden DCs führen, was eine Steigerung der T-Zell-basierten spezifischen Immunantwort und eine deutliche Verstärkung des Vakzinierungseffektes hervorruft;
    • (ix) das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E die T-Zellen und über die T-Zellen auch die DCs zusätzlich stimuliert;
    • (x) der Vorteil der räumlichen Nähe der Vakzinkomponenten, speziell deren Konjugation mit dem Lipopeptid, individuell von den verwendeten Antigen-Determinanten für CTL-Zellen abhängig ist;
    • (xi) die Kombination von Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E und Lipopeptid-Immunmodulator die Proliferation und Differenzierung von naïven T-Zellen verstärkt oder erst möglich macht.
  • Toxische Effekte oder Unverträglichkeiten der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine wurden bei den bisherigen in vitro und in vivo Tests in den relevanten Konzentrationsbereichen, sowie bei Zytotoxizitätstests an RKO-Zellen nicht beobachtet.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzinkomponenten sowie deren Modifizierung mit den Ladungs-Tags, wie in Ausführungsbeispiel A näher beschrieben.
  • Die Synthese der Epitope, wie auch der Ladungs-Tags, erfindungsgemäß bevorzugt bestehend aus einer Folge von 4–10 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren, erfolgt in Lösungs- oder Festphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Verfahren der Schutzgruppenchemie. Dabei werden die Ladungs-Tags, die N- oder C-terminal, bevorzugt C-terminal, angefügt werden, bereits beim Aufbau der Aminosäuresequenz berücksichtigt.
  • Für die Herstellung der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide nach Formel (I) wird die ungewöhnliche Aminosäure Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RS-Dhc-OH) in Lösung oder an fester Phase mit dem an einem Synthese-Harz aufgebauten Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft. Diese Vorstufe kann nachfolgend an den Hydroxygruppen bisacyliert werden. Bei der Synthese des Pam3Cys-Derivates erfolgt zusätzlich die Acylierung der N-terminalen Aminogruppe.
  • Wird die Synthese der erfindungsgemäßen Lipopeptide mit dem Baustein Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2R)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RR-Dhc-OH) durchgeführt, wird die Zielverbindung als stereochemisch definiertes Derivat erhalten, welches aus L-Aminosäuren, aus der modifizierten Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-(2R)-propyl]-[R]-cystein sowie aus zwei oder drei Acyl-Resten aufgebaut ist und eine höhere biologische Aktivität aufweist.
  • Die erfindungsgemäßen Vakzinkomponenten können auch als Prodrug-Verbindungen, vorzugsweise als Prodrug-Ester, Prodrug-Peptide oder ähnliches modifiziert werden. In bestimmten Fällen kann durch die Kopplung von die Zellpenetration fördernden Molekülen, wie z. B. Biotin oder Maleimidopropionsäure, optional über geeignete Spacermoleküle, an die primäre Aminogruppe oder die Acylierung der Aminogruppe die Bioverfügbarkeit und damit die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen verbessert werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für Mensch und Tier für die prophylaktische spezifische Immunisierung gegen und/oder für die therapeutische Vakzinierung bei Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden sowie für die Unterstützung von konventionellen Impfungen.
  • Diese immunstimulatorisch wirksamen Zusammensetzungen, enthaltend eine therapeutisch effektive Menge wenigstens einer erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine, können weiterhin die immunologische Wirkung verstärkende Adjuvantien, pharmazeutisch geeignete Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe, wie z. B. Detergentien, Lösungsvermittler, Stabilisatoren oder Konservierungsmittel, sowie gegebenenfalls anderweitig therapierelevante Wirkstoffe oder Hautpflegeprodukte enthalten.
  • Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
  • Die Effekte, die durch die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine hervorgerufen werden, sind auch abhängig von deren Formulierung. Entsprechende pharmazeutische Präparate sollten die direkte Applikation des Arzneimittels auf die unbehandelte Haut ermöglichen. Zur topischen Applikation geeigneten Formulierungen für die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine können beispielsweise Pasten, Salben, Cremes, Lotionen, Emulsionen, Gele, Hydrogele, Suspensionen, Lösungen, Sprays oder Pflaster, bevorzugt wässrige oder ethanolische Gele sowie Suspensionen oder Öl-Wasser-Emulsionen sein.
  • Aufgrund der Langzeitspeicherung (Depotwirkung) der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine im Haarfollikel bieten sich auch Retard-Formulierungen an, die nach dem Fachmann bekannten Methoden der pharmazeutischen Galenik hergestellt werden können.
  • Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie in den einschlägigen Arzneibüchern beschrieben, wobei die Bestandteile miteinander vermischt, gelöst oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert sein können. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate können zusätzlich sterilisiert werden.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine oder eines diese enthaltenden pharmazeutischen Präparates zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen bei Mensch und Tier, die mit Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden in Zusammenhang stehen.
  • Hierzu trägt man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine therapeutisch effektive Menge einer erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine oder eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates direkt auf die unbehandelte Haut auf und massiert die Formulierung mit dem Finger oder gegebenenfalls mit einem Massageapplikator ein. Zur exakten Dosierung können zusätzlich Schablonen für die Größe des behandelten Haut-Areals verwendet werden. Die Auftragmenge kann durch die Verpackungseinheit vorgegeben werden.
  • Durch eine Vorbehandlung des zu behandelnden Haut-Areals durch Stripping oder einen Cyanacrylat-Abriss, bei der bereits abgestorbene Hornhautzellen, abgestorbene Korneozyten und getrocknetes Sebum aus der Öffnung der Haarfollikel entfernt werden, kann gegebenenfalls die Effektivität der Aufnahme der Nanopartikel-Vakzine erhöht werden. Okklusivverbände oder Pflaster sind weitere Möglichkeiten, die Wirkstoffapplikation vorzunehmen.
  • Die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine und pharmazeutischen Präparate können allein, in Kombination mit anderen, in der vorliegenden Erfindung enthaltenen, Nanopartikel-Vakzinen bzw. pharmazeutischen Präparaten oder in Kombination mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die für die jeweilige medizinische Indikation relevant sind, angewendet werden. Die zeitliche Abfolge der Applikation ist dabei nicht eingeschränkt. Sie kann entweder zeitgleich, vor oder nach den anderen Wirkstoffen, als separates Arzneimittel oder Kombinationspräparat und auf demselben oder unterschiedlichen Applikationswegen verabreicht werden. Auch die Applikation verschiedener Vakzine oder Teilen davon an unterschiedlichen Stellen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten entspricht dem Gegenstand der Erfindung.
  • Die exakte therapeutisch effektive Menge für ein zu behandelndes Subjekt sowie die molare Zusammensetzung der Vakzine oder Vakzinkombination hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem von Art und Verlauf der Erkrankung, von Größe, Statur, Alter und Gesundheitszustand des Patienten, vom Applikationsweg, von den angewandten konkreten Antigen-Determinanten und gegebenenfalls von den weiteren verwendeten Arzneimitteln ab. Somit ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll, die exakte Menge zu spezifizieren. Jedoch kann man prinzipiell von einer 1- bis 3-fachen Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate über einen Zeitraum von wenigen Wochen bis zu einem halben Jahr ausgehen. Die eingesetzte Wirkstoffmenge sollte im Bereich von 0,5 μg bis 2,0 mg pro Applikation und Vakzinkomponente liegen. Die genaue Spezifikation der Dosierung ist abhängig von der konkreten Anwendung und Zusammensetzung der Nanopartikel-Vakzine und erfordert weitere Untersuchungen in den klinischen Studien.
  • Die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung bestehen in der nicht-invasiven Applikation, dem direkten Transport der Vakzinkomponenten durch den Haarfollikel zu den Zielstrukturen und der Verstärkung der Immunreaktion durch die Lipopeptid-Immunmodulatoren.
  • Mit den DCs der Haut wird eine ideale Zielstruktur adressiert.
  • Durch Einbeziehen der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als Modulatoren für das angeborene Immunsystem ist eine deutliche Steigerung der Effektivität der Immunisierung möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit zur Verstärkung des Immunisierungserfolges von konventionell verabreichten Vakzinen durch die zusätzliche Applikation einer topischen Nanopartikel-Vakzine.
  • Die topische Applikationsform der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine ist einfach und flexibel handhabbar und als solche unabhängig von medizinischem Personal. Die mit der parenteralen Applikation verbundenen Nebenwirkungen und Risiken, wie z. B. Sekundärinfektionen, können vermieden, bei enteraler Gabe übliche Metabolismen umgangen werden.
  • Die Beschränkung auf ein Mindestmaß und geringste Mengen von Vakzinkomponenten, vermindert das potentielle Risiko von Unverträglichkeiten bei dennoch guter immunstimulatorischer Wirkung. Negative Einflüsse wurden in den bisherigen in vitro und in vivo Modellen nicht beobachtet.
  • Damit ist die topische Vakzinierung mit den neuen erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzinen der bisher dominanten systemischen und invasiven Applikationsform überlegen.
  • Die neuen topischen Nanopartikel-Vakzine eignen sich einerseits zur Vorbeugung von Infektionskrankheiten. Aufgrund des unspezifischen Ansatzes der erfindungsgemäßen Vakzinierungsstrategie kann durch die Auswahl und Kombination der T-Zell-Epitope und Antigene für B-Zellen, eine große Breite bekannter Infektionskrankheiten abgedeckt werden.
  • Einsatzgebiete sind vor allem Impfkampagnen gegen weit verbreitete Infektionskrankheiten, Pandemien sowie Schutzimpfungen vor allem in der Pädiatrie. Auch die therapeutische Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen wie Infektionskrankheiten, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien sind erfolgversprechende Anwendungsfelder für das dargestellte Prinzip der topischen Vakzinierung.
  • Nicht zuletzt weisen die erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine entscheidende Vorteile bei der Selbstmedikation chronisch Kranker und der Immunisierung bei Impfstoff-Unverträglichkeiten auf. Ebenso ist die topische Vakzinierung für die Schutzimpfung von Kindern außerordentlich vorteilhaft, da sie den Kindern die mit der Injektion verbundenen schmerzhaften Erfahrungen erspart.
  • Zudem reduziert das nicht-invasive Prinzip der Nanopartikel-Vakzine das Infektionsrisiko bei Vakzinationen erheblich und vermeidet erhebliche Mengen an klinischen Abfällen.
  • Mit den erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzinen wird eine neue Dimension der Vakzinentwicklung eröffnet, die anhand des bekannten immunologischen Wissens und durch die spezifische Auswahl der Epitope ein rationales Vakzindesign erlaubt.
  • Das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip zur Überwindung der Hautbarriere ist auch für die Weiterentwicklung als allgemeines Prinzip für topisch applizierbare Drug Delivery Systeme offen.
  • Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. Die folgenden Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
  • Abbildungen
  • 1 Prinzip der pH-Wert getriggerten Adsorption und Desorption der durch einen Ladungs-Tag polarisierten Vakzinkomponenten auf einem im LBL®-Verfahren mit geladenen Polymeren beschichteten Trägerpartikel. Die Freisetzung der Vakzinkomponenten erfolgt durch Umladung der obersten Polymerschicht in Abhängigkeit vom pH-Wert, in deren Folge die elektrostatische Anziehung aufgehoben wird.
  • 2 Abhängigkeit der Beladung der Trägerpartikel von der Reihenfolge der Zugabe der Vakzinkomponenten und der Verweildauer in der Beladungslösung bei sequentieller Zugabe (GILG = GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein, P2C = Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra, Cha = aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5).
  • 3 Freisetzungskinetik der drei Vakzinkomponenten GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein (GILG), Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra (P2C) und aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5 (Cha) nach Überführung in eine 10 mM Acetatpuffer-Lösung pH 5 mit Zusatz von 0,1 M Natriumchlorid (1%-ige Suspension).
  • 4 Schematische Zeichnung eines mit den einzelnen Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikels. Die Zahl der Komponenten, die Beladung der Partikel sowie die realen stöchiometrischen Verhältnisse sind entsprechend dem Wirkspektrum der Vakzine variabel einstellbar (beispielhaft für die Antigen-Determinanten sind die Epitope dargestellt).
  • 5 Schematische Zeichnung eines mit einem Konjugat der Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikels. Die Beladung der Partikel ist entsprechend dem Wirkspektrum der Vakzine variabel einstellbar (beispielhaft für die Antigen-Determinanten sind die Epitope dargestellt).
  • 6 Penetration der Nanopartikel-Vakzine in den Haarfollikel des Schweineohr-Modells (Laser-Scan-Mikroskopische Aufnahme der Kryoschnitte) 60 min nach Auftragen auf die Haut. Das mit Rhodamin markierte Epitop GILGFVFTL-K4 dringt nach Ablösen vom Trägerpartikel (mit Cy5 markiert) weiter in den Haarfollikel ein.
  • 7 Penetrationstiefe der Trägerpartikel in Abhängigkeit von der Partikelgröße im Vergleich zur Länge der Terminalhaar-/Vellushaar-Follikel. Die Zielregion Infundibulum ist bei ca. 600 μm Tiefe erreicht.
  • 8 Anreicherung und Aufenthaltsdauer der Trägerpartikel in den Haarfollikeln und sowie im Stratum corneum.
  • 9 Auswirkung der Oligoaminosäure-Tags auf die immunologische Aktivität des CTL-Epitops GILGFVFTL im Zytotoxizitäts-Assay mit der humanen CD8-T-Zelllinie 10–21A und der B-lymphoblastoiden Zielzelllinie JY (Titration im Radiochromfreisetzungs-Assay). Im Insert sind die nach Clark transformierten Werte dargestellt. Die funktionellen Aviditätswerte in der Tabelle geben die Peptidkonzentration für halbmaximale Zytolyse an. Die Faktoren für die Aktivitätsverluste sind auf die funktionelle Avidität des ungetagten Peptids bezogen.
  • 10 Vergleich der immunologischen Aktivität der Partikel-gebundenen und der freien Einzelkomponenten im ELISpot-Assay auf IFN-γ mit humanen CD8-T-Zellen.
  • 11 Titration der immunologischen Aktivität von Gemischen der Partikel-gebundenen und der freien Vakzinkomponenten im ELISpot-Assay auf IFN-γ mit humanen CD8-T-Zellen (Ordinate: optische Einheiten der densitometrischen Messung).
  • 12 Differenzierung und Reifung von DCs unter Verwendung von Gemischen unterschiedlich beladener Trägerpartikel anhand der Expression der kostimulatorischen Zelloberflächenmoleküle CD80 (A) und CD86 (C) sowie des DC-Aktivierungsmarkers CD83 (B). Komponenten in Klammern wurden zusammen an einen Trägerpartikel gekoppelt.
  • 13 Aktivierung von DCs unter Verwendung von Gemischen unterschiedlich beladener Trägerpartikel anhand der Expression der kostimulatorischen Zelloberflächenmoleküle CD80, CD86, CD40 und HLA-DR sowie des DC-Aktivierungsmarkers CD83. Komponenten in Klammern wurden zusammen an einen Trägerpartikel gekoppelt. TNF-α, IL-1-β und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle.
  • 14 Differentielle biologische Effekte bei der Induktion von T-Zellen und Zusammenwirken des Helfer-T-Zell-Epitops PADRE und des Immunmodulators P2C bei der Proliferation und Differenzierung von naïven T-Zellen durch mit Nanopartikel-Vakzinen aktivierte DCs. TNF, IL-4 und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle. (oben: Anteil gebildeter Gedächtnis-T-Zellen, unten: Proliferationsrate).
  • 15 Differentielle biologische Effekte bei der Induktion von T-Zellen und Zusammenwirken des Helfer-T-Zell-Epitops PADRE und des Immunmodulators P2C bei der Proliferation von Gedächtnis-T-Zellen durch mit Nanopartikel-Vakzinen aktivierte DCs. TNF, IL-4 und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle. (Proliferationsrate).
  • 16 Induktion Antigen-spezifischer T-Zellreaktionen durch verschiedene Kombinationen der Vakzinkomponenten auf den Partikeln am Beispiel des CMV-Epitops NLVPMVATV, nachgewiesen anhand der rekombinanten tetramerisierten MHC-Peptidkomplexe.
  • 17 Induktion Antigen-spezifischer T-Zellreaktionen durch verschiedene Kombinationen der Vakzinkomponenten auf den Partikeln am Beispiel des Influenza-Epitops GILGFVFTL, nachgewiesen anhand der rekombinanten tetramerisierten MHC-Peptidkomplexe.
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  • Ausführungsbeispiele
  • Beispiel A – Herstellung und Modifizierung der Vakzinkomponenten
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzinkomponenten, bevorzugt der peptidischen Epitope und der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide, sowie deren Modifizierung mit den peptidischen Ladungs-Tags mit den Methoden der Festphasensynthese beschrieben. Strukturmodifikationen können durch das Auslassen einzelner Syntheseschritte bzw. das Hinzufügen von, dem erfahrenen Synthesechemiker bekannten, Schritten vorgenommen werden.
  • a) Synthese der Aminosäuresequenzen mit automatisierter Festphasensynthese
  • Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, literaturbekannten Methoden in Lösung oder in einem automatisierten Verfahren an der festen Phase. Die Verfahrensschritte für die Synthese an fester Phase sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. Aus diesem Grund wird in dem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide einzugehen.
  • Die Peptide werden mit einem Syntheseroboter ausgehend von einem mit Fmoc-L-Lys(Boc) beladenen Synthese-Harz nach der Fmoc-Peptidsynthese-Methode aufgebaut. Werden andere Aminosäuren für den C-terminalen Ladungs-Tag verwendet, beginnt man in analoger Weise mit den entsprechenden Fmoc-geschützten Derivaten. Dazu wird das beladene Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (8 mg; 7 μmol) in einen Reaktor eingewogen. Die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M in N,N-Dimethylformamid) zu 0,5 molaren Lösungen gelöst. Anschließend werden die befüllten Reaktoren und Vials auf die vorgesehenen Positionen des Syntheseroboters gestellt. Im ersten Syntheseschritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe nach dem in Tab. 1 dargestellten Programmablauf. Tab. 1: Zyklus zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe.
    Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μL] Dauer [min]
    Start Harz quellen N,N-Dimethylformamid 800 2
    1. Deblockierung 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 200 5
    2. Waschen, 3× N,N-Dimethylformamid 300 1
    3. Deblockierung 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 200 10
    4. Waschen, 7× N,N-Dimethylformamid 300 1
  • Anschließend wird das entsprechende Peptid, beginnend vom C-terminalen Ende aufgebaut. Dies erfolgt durch die schrittweise Verknüpfung der jeweiligen Aminosäuren. Unmittelbar nach jeder Kupplung wird die Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure abgespalten, um die Anbindung der nächsten Aminosäure an der freigewordenen Aminogruppe zu ermöglichen. Der Programmablauf des Syntheseroboters ist in der folgenden Tabelle dargestellt. Tab. 2: Zyklus zur Synthese der Peptide.
    Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μL] Dauer [min]
    1. Kupplung 3 M N,N-Diisopropylethylamin 25 120
    3 M N,N-Diisopropylcarbodiimid in N,N-Dimethylformamid, 25
    Aminosäure-Lösung 100
    2. Waschen, 3× N,N-Dimethylformamid 300 1
    3. Deblockierung 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 200 5
    4. Waschen, 3× N,N-Dimethylformamid 300 1
    5. Deblockierung 30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid 200 10
    6. Waschen, 7× N,N-Dimethylformamid 300 1
    7. weiter bei Schritt 1.
  • b) Synthese von N,N-Bis(fluorenylmethoxycarbonyl)-[R]-cystein-bis-tert.-butylester (Fmoc-Cys-OtBu)2 – als Baustein für die Lipopeptid-Komponente
  • L-Cystein-bis-tert.-butylester (5,5 g; 13 mmol) und Fmoc-N-hydroxysuccinimidylester (7,04 g; 21 mmol) werden in Tetrahydrofuran (15 mL) gelöst. Unter Rühren wird N-Ethylmorpholin (3,83 g; 4,2 mL; 30 mmol) in Tetrahydrofuran (7,5 mL) dazugegeben. Die Reaktionslösung wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Hilfe des Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat (100 mL) gelöst und im Scheidetrichter mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 3 × 80 mL) sowie Wasser (3 × 80 mL) gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer eingedampft und als Rückstand ein Öl erhalten. Dieser Rückstand wird mit Hilfe eines Ultraschallbades in Dichlormethan/Methanol (1:4; 385 mL) gelöst und umkristallisiert (18 h; –20°C). Der erhaltene farblose Niederschlag wird über eine Filternutsche abfiltriert, mit tert.-Butylalkohol/2-Propanol (1:1; 2 × 100 mL) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
    Ausbeute (Fmoc-Cys-OtBu)2: 7,48 g (72%); [M+H]+: 797
  • c) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-tert.-butylester (Fmoc-RS-Dhc-OtBu) – Einführung von Dhc
  • Das (Fmoc-Cys-OtBu)2 (4,96 g; 6,2 mmol) wird in Dichlormethan (39 mL) gelöst. Anschließend werden Zink (2,84 g; 43,4 mmol) sowie eine Lösung aus Methanol, Salzsäure (32%) und Schwefelsäure (98%) (100:7:1; 20,7 mL) unter starker Rühren zugegeben. Nach 15 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird RS-2,3-Epoxy-1-propanol (45,9 g; 41,3 mL; 62 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Ganze wird im Ölbad (5 h; 40°C) weiter gerührt. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen eingedampft, mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 5,2 mL) versetzt und 16 h bei –2°C aufbewahrt. Das Produkt wird mit Dichlormethan (3 × 50 mL) extrahiert. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft.
    Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OtBu): 5,67 g (96%); [M+H]+: 474
  • Wird bei der Synthese, wie oben beschrieben, der außergewöhnlichen Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Dhc) der racemische Synthesebaustein RS-2,3-Epoxy-1-propanol verwendet, erhält man ein Diastereomeren-Gemisch der Zielverbindung. Durch Einsatz des Enantiomers R-2,3-Epoxy-1-propanol wird in analoger Weise das immunmodulatorisch aktivere RR-Stereoisomer von Dhc erhalten.
  • d) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-RS-Dhc-OH) – Hydrolyse des tert.-Butylesters
  • Fmoc-RS-Dhc-OtBu (5,67 g; 12 mmol) wird in Trifluoressigsäure (99%; 142 mL) gelöst und das Reaktionsgemisch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird anschließend am Rotationsverdampfer eingedampft, mit N-Hexan (50 mL) und Diethylether (30 mL) versetzt und wieder am Rotationsverdampfer eingedampft. Der zähflüssige, ölige Rückstand wird anschließend in tert.-Butylalkohol/Wasser (80%; 100 mL) gelöst und lyophilisiert (64 h).
    Ausbeute (Fmoc-RS-Dhc-OH): 3,03 g (60%); [M+H]+: 418
  • e) Synthese von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK – Kopplung der Aminosäuresequenz
  • Ein mit dem Seitenketten-geschützten Peptid GDPKHPKSF-KKKK beladenes Synthese-Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente), Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein (15,5 mg in 100 μL einer 0,5 M 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung in N,N-Dimethylformamid; 36,6 μmol; 7 Equivalente) und N,N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen.
  • f) Veresterung von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK mit Palmitinsäure
  • Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK beladene Harz (5,22 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1); 104 μL; 104 μmol; 20 Equivalente) und N,N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 24,4 μL; 73,2 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Nach 5 min wird 4-Dimethylaminopyridin (1 M in N,N-Dimethylformamid; 30 μL; 30 μmol; 5,7 Equivalente) zugegeben. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Die Veresterung wird ein weiteres Mal unter den gleichen Versuchsbedingungen wiederholt.
  • g) Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen
  • Das mit Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK beladene Harz (5,22 μmol) wird mit Dichlormethan (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des Dichlormethan-Überstandes wird Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zum Harz pipettiert und die Mischung 10 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) gewaschen. Anschließend wird nochmals Piperidin (30% in N,N-Dimethylformamid; 200 μL) zu dem Harz pipettiert und die Suspension 20 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL), Dichlormethan (3 × 600 μL) und Diethylether (4 × 600 μL) gewaschen. Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit Hilfe des Ninhydrin-Testes kontrolliert.
  • In analoger Weise erfolgt die Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen von den Aminosäuresequenzen der Epitop-Peptide.
  • h) Abspaltung des Lipopeptides S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK bzw. der Epitop-Peptide vom Synthese-Harz
  • Die Abspaltlösung Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser (92,5:5:2,5; 300 μL) wird zu dem Harz (2,6 μmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wird die Abspaltlösung mit Druckluft in ein Reagenzglas filtriert. Nachfolgend werden weitere 200 μL Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert und die Suspension nochmals 30 min bei Raumtemperatur belassen. Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung mit Druckluft wird das Harz mit Dichlormethan (200 μL) gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösung werden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit Diethylether (3 × 300 μL) digeriert und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1; 2 mL) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h).
    Ausbeute (Pam2-(2RS)-Dhc-GDPKHPKSF-KKKK): 5,5 mg (97%);
    M: 2179; [M+2H]2+: 1091; [M+3H]3+: 727
  • i) Acylierung von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK mit Palmitinsäure
  • Das mit S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK beladene Harz (2,6 μmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid-Überstandes werden N,N-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N,N-Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1); 52 μL; 52 μmol; 10 Equivalente) und N,N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 μL; 36,6 μmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N,N-Dimethylformamid (3 × 600 μL) und Dichlormethan (3 × 600 μL) gewaschen. Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt nach dem unter h) beschriebenen Verfahren.
    Ausbeute (Pam3-(2RS)-Dhc-GDPKHPKSF-KKKK): 5,6 mg (89%);
    M: 2417; [M+2H]2+: 1210; [M+3H]3+: 807
  • Beispiel B – Reversible Immobilisierung der Vakzinkomponenten an den Trägerpartikeln
  • Silika-Partikel mit einem Durchmesser von 1.000 nm wurden mittels LBL®-Technologie mit der Schichtsequenz PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/PMAA beschichtet und nach mehrfachem Waschen mit 10 mM TRIS-Puffer auf pH 8 gebracht. Sodann wurde eine sequentielle Beladung mit jeweils 20%-igen DMSO-Lösungen der verschiedenen Vakzinkomponenten durchgeführt, wobei die adsorbierte Menge je Komponente durch die Reihenfolge und Menge der zugegebenen Vakzinkomponenten sowie die Inkubationszeit definiert wurde.
  • Zur Kalibrierung der Beladungsmenge wurden die Vakzinkomponenten mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt und die Abnahme der Färbung im Überstand der Beladungslösungen mit UV/Vis- bzw. Fluoreszenzspektroskopie verfolgt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle sowie 2 dargestellt. Tab. 3: Prozentualer Anteil der bei pH 8 auf den Trägerpartikeln adsorbierten und bei pH 5 desorbierten Masse der Vakzinkomponenten bezogen auf die Masse der Trägerpartikel. (GILG = GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein, P2C = Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra, Cha = aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5).
    auf Partikeln adsorbierte Menge GILG [%] P2C [%] Cha [%]
    Zugabe GILG, 30 min 2,0 - -
    Zugabe GILG, 120 min 2,09 - -
    Zugabe P2C, 30 min 17,6 16,6 -
    Zugabe P2C, 120 min 16,7 15,3 -
    Zugabe Cha, 30 min 12,4 12,0 6,3
    Zugabe Cha, 120 min 8,3 9,5 8,4
    Desorption in 10 mM Acetat 3,2 4,4 2,5
    Desorption in 10 mM Acetat + 0,1 M NaCl 2,2 3,6 1,1
    Desorption in 10 mM Acetat + 20% DMSO 1,9 6,1 3,2
  • Mit den beladenen Trägerpartikeln wurden Freisetzungsversuche in wässriger Lösung durchgeführt, wobei verschiedene Freisetzungsmedien simuliert wurden. Einerseits wurden die Vakzinkomponenten in einer 10 mM wässrigen Acetatpuffer-Lösung bei pH 5 freigesetzt. Zur Simulation von potentiellen Löslichkeitsvermittlern in den Haarfollikeln, wie Lipiden oder Salzen, wurden der Lösung auch NaCl bzw. 20% DMSO zugesetzt.
  • Die Ergebnisse in Tab. 3 zeigen, dass der Freisetzungsgrad und damit das Verhältnis der freigesetzten Vakzinkomponenten stark von der Zusammensetzung des Freisetzungsmediums und der Zusammensetzung der Nanopartikel-Vakzine abhängen.
  • Fluoreszenzspektrometrische Untersuchungen zur Kinetik der Freisetzung der drei Vakzinkomponenten in 1%-igen Suspensionen der beladenen Trägerpartikel in 10 mM wässriger Acetatpuffer-Lösung mit Zusatz von 0,1 M NaCl bei pH 5, zeigen die unterschiedlichen Freisetzungskinetiken der Vakzinkomponenten (3). Innerhalb von 20 min wurden jedoch alle drei Komponenten zu mehr als 50% des Maximalwertes freigesetzt. 80% des Maximalwertes der Freisetzung wurden nach ca. 1 h erreicht.
  • Für die biologischen Tests wurden, in Analogie zu der jeweils optimierten Beladungsstrategie, die ungelabelten Vakzinkomponenten auf der Oberfläche der Trägerpartikel adsorbiert.
  • Zur Herstellung gebrauchsfertiger Muster für die Applikation wurden die Partikel bei pH 8 (10 mM TRIS-Puffer) in wässriges Agarose-Gel 0,5% eingearbeitet. Nach Zugabe eines Konservierungsmittels (Ethylparaben, Benzalkoniumchlorid, Hydrobenzoesäureethylester) wurden die fertigen und lagerstabilen Formulierungen bis zur Anwendung aufbewahrt.
  • Beispiel C – Transport der Nanopartikel-Vakzine in die Haarfollikel und zu den Zielstrukturen
  • In diesem Ausführungsbeispiel wird die Effektivität des Transportes der Vakzinkomponenten zu den Zielstrukturen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Trägerpartikel beschrieben.
  • a) Steuerung der Penetrationstiefe über die Partikelgröße
  • Die Untersuchungen zur Abhängigkeit der im Haarfollikel erzielten Penetrationstiefe von der Größe und dem Material der Partikel erfolgten in vitro am Modellgewebe Schweineohr, welches sowohl in Struktur als auch bezüglich der physiologischen Eigenschaften der menschlichen Haut sehr ähnlich ist. Die Bestimmung der Penetrationstiefe erfolgte nach topischer Applikation von fluoreszenzmarkierten Trägerpartikeln, Entnahme von Stanzbiopsien und Auswertung der angefertigten Kryoschnitte mittels Laser-Scan-Mikroskopie. Es konnte gezeigt werden, dass die Penetrationstiefe der Partikel durch die Partikelgröße steuerbar ist, wobei die Beschaffenheit der Partikel fast keine Rolle spielt. Während Partikel mit einem Durchmesser von ca. 500 nm bis 600 nm Penetrationstiefen von > 1000 μm erreichen, penetrieren kleinere und größere Partikel deutlich weniger tief (7). Erklärung für dieses Phänomen ist ein hauptsächlich mechanischer Effekt. Da die Dicke der Haarschuppen ebenfalls etwa 500 nm beträgt, lässt sich ein Zahnradpumpeneffekt vermuten, der durch die Bewegung des Haares im Haarfollikel in Gang gesetzt wird. Dieser ist umso deutlicher ausgeprägt, je ähnlicher Partikelgröße und Haarschuppendicke sind. In vitro kann dieser Effekt durch Massage simuliert werden. Die Zielstrukturen der topischen Vakzine, die DCs, sind vor allem im Infundibulum-Bereich der Haarfollikel in besonders großer Anzahl vorhanden. Dieser ist in einer Tiefe von bis zu 600 μm lokalisiert und wird von den Vakzinkomponenten bereits nach 1 h erreicht. Innerhalb der nächsten 24 h findet eine minimal weitere Diffusion statt, die für die Vakzinierung aber von geringer Bedeutung ist. Für die Herstellung einer topischen Vakzine zur Anwendung beim Menschen haben sich deshalb sphärische Silika-Partikel mit einem Durchmesser von 300 nm–1.500 nm als besonders gut geeignete Trägerpartikel erwiesen.
  • b) Langzeitspeicherung der Trägerpartikel im Haarfollikel
  • Zur Bestimmung der in vivo Aufenthaltsdauer der Trägerpartikel in der menschlichen Haut wurden fluoreszenzmarkierte Partikel auf die Wadenhaut freiwilliger Probanden appliziert. Anschließend wurde die Menge der im Stratum corneum bzw. in den Haarfollikeln eingelagerten Partikel mit Hilfe des Differentiellen Strippings (Teichmann et al. 2005) erfasst. Bereits nach einem Tag waren nahezu keine Partikel mehr in den oberen Hautschichten (Stratum corneum) nachweisbar, während noch etwa 80% der Ausgangsmenge im Haarfollikel wiedergefunden werden konnten. Auch nach 10 Tagen waren noch etwa 20% der Partikel im Haarfollikel nachweisbar (8).
  • c) Kinetik der Freisetzung
  • Die Kinetik der Freisetzung wurde mit Cy5-gelabelten Silika-Partikeln, die mit Rhodamin-gelabelten Vakzinkomponenten beladen wurden, am Schweineohr-Modell untersucht. Es wurden erneut Kryoschnitte angefertigt und die Penetrationstiefen der beiden Fluoreszenzfarbstoffe Laser-Scan-Mikroskopisch untersucht. Anhand der unterschiedlichen Penetrationstiefen konnte gezeigt werden, dass die Vakzinkomponenten im Haarfollikel freigesetzt werden und signifikant tiefer penetrieren als die transportierenden Partikel (6).
  • d) Aufnahme der Vakzinkomponenten in die Langerhans-Zellen
  • Für diese Untersuchungen wurden doppelt gelabelte Nanopartikel-Vakzine auf menschliche exzidierte Haut topisch appliziert. Anhand der Fluoreszenz-Färbung von ca. 80% der untersuchten Langerhans-Zellen konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinkomponenten in das Zellinnere der Langerhans-Zellen aufgenommen wurden. Dagegen konnte eine Aufnahme der Trägerpartikel durch die Langerhans-Zellen nicht beobachtet werden. Auch dies spricht für die effektive Freisetzung der Vakzinkomponenten in räumlicher Nähe zu den Zielstrukturen.
  • Beispiel D – Immunologische Aktivität der Nanopartikel-Vakzine und ihrer Komponenten
  • Die immunologische Aktivität einer Modell-Vakzine mit den Komponenten:
    • (i) GILGFVFTL aus dem Influenza-Matrixprotein M1 (GILG) bzw. NLVPMVATV aus dem frühen Antigen pp65 des Zytomegalovirus CMV (NLVP) als Modelle für ein Epitop für CD8-Effektor-T-Zellen,
    • (ii) Pan-DR-Epitop aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C (PADRE) als Modell für ein Epitop für Helfer-T-Zellen sowie
    • (iii) Pam2Cys-GDPKHPKSF (P2C)
    als Modell für einen Immunmodulator,
    wurde in in vitro Zellkulturen humaner Zellsysteme untersucht. Dabei kamen je nach spezifischer Fragestellung etablierte T-Zell-Klone, periphere weiße Blutzellen (PBMC), Subfraktionen dieser PBMC (Monozyten, CD8-T-Zellen, CD4-T-Zellen, naïve T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen) oder aus diesen Zellen generierte differenzierte Zelltypen (unreife dendritische Zellen (iDC), reife dendritische Zellen (mDC)) zum Einsatz. Getestet wurden die Einzelkomponenten in freier wie in Partikel-gebundener Form sowie verschiedene Kombinationen dieser Komponenten auf den Trägerpartikeln.
  • a) Auswirkung der Modifizierung der Epitope mit Oligoaminosäure-Tags
  • In einem Radiochromfreisetzungs-Assay wurde das Modellepitop GILG mit unterschiedlichen Varianten einer C-terminalen Verlängerung durch Histidin (H), Lysin (K) oder Glutamat (E) über 12 Größenordnungen titriert und die Induktion der zytolytischen Aktivität im humanen zytotoxischen T-Zell-Klon 10–21A gegen die B-lymphoblastoide Zelllinie JY getestet. Wie aus den in 9 dargestellten Ergebnissen zu erkennen ist, führt die Modifikation des C-Terminus des Epitops erwartungsgemäß zu einer Reduktion der stimulatorischen Kapazität. Das Epitop mit dem H4-Tag ist 45-fach, das mit K4-Tag 131-fach und das mit E4-Tag 708-fach weniger potent als das unmodifizierte Epitop. Dieser Aktivitätsverlust ist angesichts der sehr hohen funktionellen Avidität des Epitops von 1,52 pM (Peptidkonzentration, die für halbmaximale Zytolyse erforderlich ist), zumindest bei dem H4- und dem K4-Tag tolerabel.
  • b) Immunologische Aktivität Partikel-gebundener Vakzinkomponenten
  • Zum Vergleich der immunologischen Aktivitäten der Nanopartikel-Vakzine mit der der freien Vakzinkomponenten, wurden primäre humane T-Zellen aus peripherem Blut eines gesunden Spenders mit den freien Komponenten, Gemischen derselben, den einzeln oder in Kombination an die Trägerpartikel gebundenen Komponenten sowie Gemischen beladener Partikel über 14 Tage inkubiert. Alle Komponenten waren mit einem K4-Tag versehen. Die Induktion Vakzinantigen-spezifischer CD8-T-Zellen wurde im ELISpot-Assay auf IFN-γ quantifiziert.
  • Die erzielten Ergebnisse sind repräsentativ für den Erfolg von prophylaktischen Vakzinierungen, weil die T-zellulären Immunreaktionen im Zellkultursystem ohne vorherige in vivo Vakzinierung induziert werden. Es zeigte sich, dass das Partikel-gekoppelte Epitop GILG im Zellkultursystem gleichermaßen aktiv ist, wie das freie Peptid. D. h., dass die Trägerpartikel sowie die Ladungs-Tags die biologische Aktivität der Vakzinkomponenten nicht wesentlich beeinflussen (10). Bei der Titration von Gemischen Partikel-gebundener und freier Vakzinkomponenten konnte eine höhere Aktivität für die Partikel-gebundene Vakzine gegenüber einem Gemisch der freien Komponenten nachgewiesen werden (11).
  • c) Induktion der Reifung und Aktivierung von iDCs durch den Immunmodulator
  • Der Vakzinierungseffekt, d. h. die Stimulation des adaptiven Immunsystems und besonders der Effektor-T-Zellen, hängt von der erfolgreichen Induktion der Differenzierung der iDCs zu mDCs und deren Aktivierung zu potenten immunstimulatorischen Zellen ab. Dieser Prozess kann anhand der Expression von kostimulatorischen Oberflächenmolekülen auf den DCs verfolgt werden. CD80, CD86 und CD40, wie auch der DC-Aktivierungsmarker CD83, sollten hochreguliert werden. Diese immunmodulierende Funktion der Nanopartikel-Vakzine wurde mit iDCs aus dem peripheren Blut freiwilliger Spender untersucht. Hierzu wurden PBMC in Plastikgefäßen inkubiert und die adhärenten Monozyten für 5 Tage in Zellkulturmedium mit IL-4 und GM-CSF kultiviert, wodurch sich diese zu nichtadhärenten iDCs entwickelten. Diese wurden dann zur Reifung und Aktivierung mit unterschiedlich beladenen Trägerpartikeln inkubiert. Nach zwei Tagen wurde die Expression der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle und des Aktivierungsmarkers per Durchflusszytometrie untersucht. Diese Untersuchungen wurden in unabhängigen Experimenten mit PBMC von 10 Probanden durchgeführt, um die Variationen in humanen Populationen abzubilden. Die Daten belegen, dass der Partikel-gekoppelte Immunmodulator P2C allein oder in Kombination mit anderen Vakzinkomponenten die Differenzierung, Reifung und Aktivierung der iDCs induziert (12A–C). Durch das Helfer-T-Zell-Epitop PADRE wird die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 und des DC-Aktivierungsmarkers CD83 induziert, jedoch nicht die von MHC-Klasse-II-Molekülen (HLA-DR) und von CD40, einem kostimulatorischen Molekül auf DCs, das für die primäre Induktion von zytotoxischen Effektor-T-Zellen erforderlich ist. Eine komplette Aktivierung der DCs wird dagegen mit P2C erreicht (13).
  • d) Induktion von T-Zellen durch DCs, die mittels Nanopartikel-Vakzine aktiviert wurden
  • DCs, die wie unter c) beschrieben, mit Hilfe unterschiedlich beladener Trägerpartikel differenziert und aktiviert wurden oder die wegen des fehlenden Immunmodulators nicht oder nur unvollständig ausgereift waren, wurden mit T-Zellen des gleichen Spenders, aus dessen PBMC die DCs generiert worden sind, für 7 Tage inkubiert. Die T-Zellen wurden anschließend per Durchflusszytometrie hinsichtlich Proliferation und Differenzierung untersucht. Zur getrennten Erfassung der CD45RA-exprimierenden naïven T-Zellen und der CD45RO-exprimierenden Gedächtnis-T-Zellen wurden diese auf der Basis spezifischer Antikörper mittels Magnetseparation aus PBMC separiert und getrennt mit den DCs inkubiert. Die Proliferation wurde mittels CFSE-Assay nachgewiesen. Bei diesem Assay werden die T-Zellen vor der Stimulation mit dem zellstabilen Fluoreszenzfarbstoff CFSE markiert. Bei jeder Zellteilung wird der Farbstoff 1:1 verdünnt, sodass sich anhand des Abfalls der zellassoziierten Fluoreszenz die Proliferationsrate bestimmen lässt. Die Differenzierung von naïven zu Gedächtnis-T-Zellen konnte mit Differenzierungsmarkern nachgewiesen werden. Bei naïven T-Zellen (14) induzieren DCs, die mit mit dem P2C-Immunmodulator beladenen Partikeln vorinkubiert worden waren, Proliferation aber kaum Differenzierung, ähnlich wie bei einem entzündlichen Zytokin-Cocktail (TNF + IL-4 + IL-6). Das Helfer-T-Zell-Epitop PADRE hat einen ähnlichen, jedoch deutlich schwächeren Effekt. Im Gegensatz dazu induzieren DCs, die mit P2C- und PADRE-tragenden Partikeln vorbehandelt wurden, sowohl eine starke Proliferation als auch die Differenzierung eines hohen Anteils der naïven T-Zellen und damit genau den immunologischen Effekt, der von einer prophylaktischen Vakzine erwartet wird. Bei Gedächtnis-T-Zellen (15) induzieren die DCs nach Inkubation mit dem Immunmodulator P2C oder dem Helfer-T-Zell-Epitop PADRE, ebenso wie mit dem Zytokin-Cocktail, eine Proliferation. Hier ist erwartungsgemäß keine qualitative Differenzierung zu beobachten, allerdings eine deutliche Verstärkung des Effektes, wenn PADRE- und P2C-tragende Partikel kombiniert werden. Dieser Effekt spiegelt die Situation einer therapeutischen Vakzinierung oder einer Revakzinierung von Immunindividuen wider.
  • e) Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Reaktionen durch die Nanopartikel-Vakzine
  • Zur Untersuchung der Induktion spezifischer Immunantworten durch die Nanopartikel-Vakzine wurden iDCs aus peripherem humanem Blut für zwei Tage mit Trägerpartikeln kultiviert, die mit den T-Zell-Epitopen NLVPMVATV (16) oder GILGFVFTL (17), dem Immunmodulator P2C oder Kombinationen davon beladen waren und anschließend mit CD8-T-Zellen zusammengegeben und für 7 Tage inkubiert. Danach wurde in den Zellkulturen die Proliferation von Effektor-T-Zellen mit Spezifität für Influenza bzw. CMV über rekombinante tetramerisierte MHC-Peptidkomplexe (HLA-A 2.1-Moleküle, die die jeweiligen Peptide GILG bzw. NLVP trugen) per Durchflusszytometrie untersucht. Die iDCs und Effektor-T-Zellen wurden dabei jeweils aus peripherem Blut derselben gesunden Spender generiert. Gegen das CMV-Epitop konnten mit das Epitop allein tragenden Partikeln, schwache T-Zell-Reaktivitäten induziert werden. Von Partikeln, die mit dem Epitop und dem Immunmodulator gleichzeitig beladen waren, wurde eine deutliche stärkere Reaktion hervorgerufen. Dieser Effekt belegt, dass das CMV-Epitop und der Immunmodulator gekoppelt sein müssen, um eine optimale Wirksamkeit zu entfalten. Im für das Influenza-Epitop gezeigten Beispiel hingegen wurde die stärkste Immunstimulation mit einer Mischung von Partikeln erreicht, die das Epitop und den Immunmodulator separat trugen. Hier liegt also keine Kopplungsanforderung vor. Ein Gemisch der Partikel ist vorteilhafter. In jedem Fall ist die Induktion Antigen-spezifischer T-Zellen, wie bereits in den vorhergehenden Experimenten gezeigt, von der gleichzeitigen Gabe des spezifischen Epitops und des Immunmodulators abhängig, die je nach Situation und Antigen gekoppelt auf denselben Partikeln oder ungekoppelt vorliegen sollten. Die wenigen Tetramer- und CD8-postiven Zellen, die bereits in den T-Zell-Kulturen mit oder ohne iDCs nachgewiesen werden konnten, zeigen, dass die Spender in diesen Beispielen bereits längere Zeit zuvor mit den Viren, aus denen die Epitope stammen, Kontakt gehabt hatten. Die durchgeführten Experimente entsprechen damit der Situation einer therapeutischen oder Revakzinierung.
  • Beispiel E – Toxizität der Modellvakzine
  • In den Zellkultur-, Organkultur- und in vivo Untersuchungen ergaben sich im untersuchten Konzentrationsbereich von 1 fM bis 500 μM für die Modell-Epitope Pan-DR-E, GILGFVFTL und NLVPMVATV sowie für die Lipopeptid-Adjuvantien keine Hinweise auf eine toxische Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel-Vakzine.
  • Bei Untersuchungen zur Zytotoxizität der Trägerpartikel auf RKO-Zellen konnte für 2%-ige Suspensionen unterschiedlich beschichteter Trägerpartikel keine Beeinflussung der Überlebensrate festgestellt werden.
  • Auch im Tierexperiment am Schwein konnten nach Auftragen von 2 mL einer 1%-igen, in Agarose-Gel formulierten Nanopartikel-Vakzine, keine Nebenwirkungen beobachtet werden.
  • Insgesamt konnte in den experimentellen Untersuchungen gezeigt werden, dass die mit den Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikel effektiv in die Haarfollikel transportiert werden und dort für ca. 5–10 Tage verbleiben sowie dass die Wirkstoffe erst im Haarfollikel gezielt freigesetzt werden, anschließend zu den DCs in der Epidermis der Haut diffundieren und von diesen aufgenommen werden. Des weiteren wurde gezeigt, dass die Partikel-gekoppelten Vakzinkomponenten eine zu den freien Wirkstoffen vergleichbare und teilweise effektivere spezifische T-Zell-Reaktion induzieren, die von den peptidischen Ladungs-Tags nicht beeinträchtigt wird.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (11)

  1. Nanopartikel-Vakzine zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung mindestens bestehend aus den Grundkomponenten (i) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen (CTL-Epitope, Polyepitope, Biopolymere, Proteine, DNA, RNA, Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine oder ähnliche Träger antigener Informationen), (ii) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für Helfer-T-Zellen, bevorzugt Pan-DR-Epitope als degenerierte Peptide für alle HLA-DR-Allotypen, und (iii) ein oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentierenden dendritischen Zellen, bevorzugt synthetische Analoga bakterieller Lipopeptide, als einzelne Moleküle oder Konjugate, dadurch gekennzeichnet, dass die Vakzinkomponenten an nanoskalige Trägerpartikel gekoppelt sind, die nach topischer Applikation auf die Hautoberfläche aktiv in die Haarfollikel transportiert und dort temporär deponiert werden, und dass die Vakzinkomponenten über die Stimulierung der dendritischen Zellen der Haut eine T-Zell-vermittelte Immunität induzieren.
  2. Nanopartikel-Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nanoskaligen Trägerpartikel zum Erreichen der immunologisch relevanten Tiefe in den Haarfollikeln einen spezifizierten Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 3.000 nm, bevorzugt von 300 nm bis 1.500 nm aufweisen.
  3. Nanopartikel-Vakzine nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung der Vakzinkomponenten an den nanoskaligen Trägerpartikel durch chemische oder physikalische Wechselwirkungen, bevorzugt kovalent, ionisch, durch Van-der-Waals-Kräfte, durch H-Brückenbindungen, adhäsiv, elektrostatisch oder magnetisch und besonders bevorzugt durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen der polarisierten Oberfläche eines mit einer Folge geladener Polymere beschichteten Kerns und den durch Ladungs-Tags, bevorzugt bestehend aus einer Folge von 4–10 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren, polarisierten Vakzinkomponenten, erfolgt.
  4. Nanopartikel-Vakzine nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die reversibel gekoppelten Vakzinkomponenten (i) unter den im Haarfollikel herrschenden physiologischen Bedingungen gezielt freigesetzt werden, (ii) durch Diffusion zu den Zielstrukturen, den dendritischen Zellen in der Epidermis der Haut, gelangen und (iii) dort eine T-Zell-basierte Vakzinantigen-spezifische Immunreaktion auslösen.
  5. Nanopartikel-Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunmodulator ein Lipopeptid mit der folgenden allgemeinen Struktur ist,
    Figure 00400001
    wobei R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, bevorzugt für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen, R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen, bevorzugt für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen, oder H und R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid, bevorzugt mit der Aminosäuresequenz GDPKHPKSF, stehen einschließlich der entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, Tautomere, Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische oder Prodrug-Verbindungen, bevorzugt Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide.
  6. Nanopartikel-Vakzine nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopeptid als RR-Stereoisomer des Dihydroxypropylcysteins vorliegt.
  7. Nanopartikel-Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Trägerpartikel jeweils eine, mehrere oder alle Vakzinkomponenten in einem entsprechend dem Wirkspektrum der Vakzine definierten molaren Verhältnis trägt, wobei die Vakzinkomponenten einzeln oder als Konjugat an den Trägerpartikel gekoppelt sein können.
  8. Nanopartikel-Vakzine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vakzinkomponenten zu einem Konjugat nach einer der folgenden allgemeinen Strukturen (II), (III) der (IV) verknüpft sind,
    Figure 00410001
    wobei n jeweils für eine natürliche Zahl von 0 bis 6, R1, R2, R3, R4, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, für einen Aminosäure-Spacer mit einer Länge von 0 bis 6 Aminosäuren, T-Zell-Epitop, und T-Zell-Epitop2, die gleich oder verschieden sein können, für eine Aminosäure-Sequenz eines Epitops für zytotoxische Effektor-T-Zellen oder eines Epitops für Helfer-T-Zellen, Lipopeptid für einen Immunmodulator gemäß Formel (I) nach einem der Ansprüche 5 und 6 und Tag für eine Folge von 4–10 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren stehen, einschließlich der entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, Tautomere, Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische oder Prodrug-Verbindungen, bevorzugt Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide.
  9. Pharmazeutisches Präparat enthaltend eine therapeutisch effektive Menge einer Nanopartikel-Vakzine nach einem der vorhergehenden Ansprüche allein oder in Kombination, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer zur topischen Applikation geeigneten Formulierung, bevorzugt als Paste, Salbe, Creme, Lotion, Emulsion, Gel, Hydrogel, Suspension, Lösung, Spray oder Pflaster, vorliegt, die gegebenenfalls weitere Bestandteile wie anderweitig therapierelevante pharmazeutische Wirkstoffe und Adjuvantien sowie weitere pharmazeutisch geeignete Inhaltsstoffe, wie z. B. Trägersubstanzen, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe (u. a. Detergentien, Stabilisatoren und Konservierungsmittel) enthält, wobei die Bestandteile gemischt, gelöst oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert sein können.
  10. Verwendung einer Nanopartikel-Vakzine oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der vorhergehenden Ansprüche für verschiedene medizinische Indikationen, bevorzugt zur Herstellung eines Arzneimittels für Mensch und Tier zur prophylaktischen spezifischen Immunisierung gegen und/oder zur therapeutischen Vakzinierung bei Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden sowie zur Verstärkung der Immunantwort nach einer durch konventionelle Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung.
  11. Verwendung einer Nanopartikel-Vakzine oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen bei Mensch und Tier, die mit Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden in Zusammenhang stehen bzw. zur Unterstützung einer konventionellen Impfung, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei dem behandelten Subjekt nach Applikation einer therapeutisch effektiven Menge einer oder mehrerer Vakzine durch Einmassieren in die Haut an einer oder mehreren räumlich getrennten Stellen sowie zum gleichen oder unterschiedlichen Zeitpunkten, eine für die eingesetzten Antigen-Determinanten spezifische Immunantwort hervorrufen.
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