KR20230024471A - 분비되고 안정화된 융합 단백질 mRNA 및 이의 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신호 펩타이드, 생리활성 펩타이드, 링커 및 혈중 반감기를 증가시키는 펩타이드를 포함하는 오픈 리딩 프레임(orf), 상기 오픈 리딩 프레임의 생산을 증가시키고 반감기를 연장시키는 적어도 하나의 5'-UTR 요소 및/또는 적어도 하나의 3'-UTR 요소를 포함하는 mRNA에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 유전자 치료 및/또는 유전자 백신 접종에 이러한 mRNA의 용도에 관한 것이다.

Description

분비되고 안정화된 융합 단백질 mRNA 및 이의 조성물{Secreted and stabilized fusion protein mRNA and composition thereof}
본 발명은 신호 펩타이드, 생리활성 펩타이드, 링커 및 혈중 반감기를 증가시키는 펩타이드를 포함하는 오픈 리딩 프레임(orf), 상기 오픈 리딩 프레임의 반감기를 연장시키는 적어도 하나의 5'-UTR 요소 및/또는 적어도 하나의 3'-UTR 요소를 포함하는 mRNA에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 유전자 치료 및/또는 유전자 백신 접종에 이러한 mRNA의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체, 항체 단편 및 백신, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 응고 인자, 효소, 융합 단백질 및 기타 단백질과 같은, 단백질 치료제가 점점 더 많은 수로 개발 중에 있는데, 전체 항체 및 Fc-융합 단백질을 제외하고는, 50 kDa 이하의 분자량을 보유하는 많은 것들은 신장 여과 및 분해를 통해 신속하게 제거되어 짧은 혈장 반감기를 야기시킨다.
많은 치료제, 특히 펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 제제들의 이용은 불충분한 혈청 반감기라는 약점을 가지고 있다.
치료적 효과를 보장하기 위해서, 이러한 결점은 높고 빈번한 투약을 요구하여 그 결과로서 예를 들어, 다발성 경화증을 앓는 환자에서 인터페론 약물, 또는 당뇨병에 대한 인슐린과 같은 치료제의 전신 투여가 빈번한 환자에게 특히 유해하고, 매우 부정적인 부작용이 존재한다. 반감기 연장 전략의 연구는 분명한 치료적 이득 뿐만 아니라 경제적 이득때문에 생명공학 및 약학 산업에서 높은 관심이 존재한다.
이는 치료 효과에 필요한 혈청 농도를 유지하기 위하여 해당 치료제를 고빈도 및/또는 고투여량으로 투여하게 하거나, 또는 지속 방출 제제를 사용하게 한다. 약물의 빈번한 전신성 투여는 상당히 좋지 않은 부작용과 연관된다. 예를 들어, 빈번한 전신성 주사는 대상체에게 상당한 불편함을 초래하며, 높은 투여 관련 감염 위험성을 야기하고, 특히 치료제가 정맥내로 투여되어야 하는 경우에는 입원 또는 빈번한 병원 방문을 요할 수 있다. 또한, 장기 치료시, 일상적인 정맥내 주사는 반복되는 혈관 천자에 의해 야기되는 조직 손상 및 혈관 병리라는 상당한 부작용으로 이어질 수도 있다. 예를 들면 당뇨병에 대한 인슐린 또는 다발성 경화증에 걸린 환자에서의 인터페론 약물의 투여와 같은 모든 빈번한 전신성 치료제 투여에 대하여 유사한 문제점이 알려져 있다. 이러한 모든 요인들은 환자 순응도의 감소 및 보건 시스템 비용의 증가로 이어진다.
또한, 치료 약효를 나타내는 API(active pharmaceutical ingredient), 즉 생리활성 물질 자체의 치료 효과는 유지시키면서도 생리활성 물질에 의한 불필요한 면역반응을 일어나지 않도록 하는 방법의 개발이 요구된다.
본원에서는 펩티드 및/또는 단백질을 인코딩하는 mRNA 신약은 제약 특성이 개선된 생성물을 생성하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 일부 경우에서, mRNA 신약에 의해 제공되는 펩티드 및/또는 단백질을 통해 펩티드 및/또는 단백질 기반 치료제에서의 안정성, 생체이용률, 선택성, 및 효과 지속 기간은 개선될 수 있다.
mRNA 치료 및 백신 접종은 환자에 핵산 분자의 투여 및 이후의 코딩된 유전적 정보의 단백질 발현, 단백질의 이동 및/또는 단백질의 기능에 본질적으로 기초한다.
본 발명은 번역가능한 시스템에서 분비되고 안정성이 있고 생리활성 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공할 수 있는 mRNA를 제공하기 위해서, 생체내 반감기가 매우 짧은 생리활성 펩타이드의 혈중 반감기를 연장시키는 펩타이드, 올바른 번역 및 분비를 위한 신호펩타이드 및 이들 펩타이드의 올바른 공간적인 배열을 위한 링커를 포함하는 융합단백질을 설계해야 한다.
상기 설계된 융합단백질을 역번역(reverse-translation)한 오픈 리딩 프레임(orf)은 효율적인 번역을 위한 구조, 안정성과 번역을 고려한 적어도 하나의 5'-UTR 요소 및/또는 적어도 하나의 3'-UTR 요소를 포함하도록 mRNA를 설계해야 한다.
추가로 본 발명은 mRNA 치료 및/또는 백신 접종에 이러한 mRNA의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 번역가능한 시스템에서 분비되고 안정성이 있고 생리활성 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공할 수 있는 mRNA를 제공하기 위해서, 생체내 반감기가 매우 짧은 생리활성 펩타이드의 혈중 반감기를 연장시키는 펩타이드, 올바른 번역 및 분비를 위한 신호펩타이드 및 이들 펩타이드의 올바른 공간적인 배열을 위한 링커를 포함하는 융합단백질을 설계해야 한다.
1. 신호펩타이드
분비된 단백질을 번역하는 동안 신호 펩티드는 리보솜에서 나올 때 인식된다. 신호 인식 입자(signal recognition particle, SRP)에 묶여 번역이 중단된다. 이 전체 복합체는 SRP 수용체에 결합하는 ER의 외부면으로 수송되고 신호 서열은 트랜스로콘(translocon)으로 전달된다. 트랜스로콘에 결합되어 있는 동안 번역이 다시 시작되고 단백질이 ER 막을 통과하여 내강으로 전달된다. 이렇게 함으로써 신호 펩타이드는 신호 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되어 고전적인 분비 경로를 통해 세포에서 분비되기 전에 골지 네트워크를 통해 트래피킹될 수 있는 성숙한 단백질을 생성한다.
신호 펩티드 서열은 1975년에 세포에서 제거할 단백질을 표시하는 짧은 제거 가능한 N-말단 서열로 처음 기술되었다. 그 결과, 이들 펩타이드 서열은 길이와 아미노산 조성이 매우 다양하고 원핵생물과 진핵생물 모두에서 발견되지만 보존된 삼중 구조를 공유한다는 것이 밝혀졌다. 각 신호 펩티드(~20~30개의 잔기 길이)는 기본 "N 도메인", 약 7~13개의 잔기 소수성 "H 도메인" 및 약간 극성인 "C 도메인"으로 구성된다. 이 공통 구조에 더하여, 포유류 신호 펩티드 서열의 특정 위치에 있는 잔기의 보존이 나타났다. 예를 들어, 작은 중성 아미노산은 위치 -1(신호 펩티드의 마지막 아미노산)과 -3에서 우세한 반면 부피가 큰 방향족 아미노산은 종종 -2 위치에서 발견된다. 흥미롭게도 프롤린 잔기는 -3에서 +1(성숙한 펩타이드의 첫 번째 아미노산)까지의 모든 위치에 거의 없다. 그러나 이러한 신호 펩티드의 매우 다양한 1차 서열은 내인성 신호 펩티드가 세포로부터 특정 단백질의 생리학적 분비 수준을 조절하는 역할을 하고 신호 펩티드를 대체함으로써 단백질을 수정할 수 있다. 실제로 이것은 많은 연구에서 천연 신호 펩티드를 높은 수준에서 분비하는 것으로 알려진 단백질(예: 루시퍼라제, 조직 플라스미노겐 활성화제)의 것으로 교체하면 분비 수준을 크게 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다.
단백질 수율을 향상시키기 위해 고도로 분비된 단백질의 이종 신호 펩티드를 활용함으로써 제기된 잠재력은 매력적인 것이며 모든 재조합 단백질에 대해 단일 신호 펩티드를 사용하는 것과 관련된 보편적으로 적용 가능한 전략의 식별이 이상적인 시나리오를 구성할 수 있다. 이 잠재력을 더 조사하기 위해 널리 사용되는 모델 분비 단백질인 SEAP(분비된 알칼리성 인산 가수분해효소)의 발현을 연구하기로 선택했지만 비천연 신호 펩타이드의 맥락에서. SEAP의 분비를 위한 최적의 신호 펩타이드를 식별하지만 중요하게는 성숙 단백질(위치 +1 및 +2)에서 아미노산의 중요한 역할도 고려하였다. +1 위치에 삽입될 때 SEAP의 발현에 부정적인 영향을 미치는 아미노산을 식별하고 불리한 기본 +1 아미노산을 가진 단백질의 발현을 조사함으로써 신호 펩타이드를 교체하거나 작은 +1/+2 위치의 중성 아미노산. 이러한 발견은 생물의약 산업뿐만 아니라 생물학 연구의 많은 영역에서 중요한 단백질 생산을 개선하는 데 널리 적용될 수 있다.
시그날 펩타이드는 폴리펩타이드 전구체가 내형질 망사 (endoplasmic reticulum; ER) 막을 통과하여 효과적으로 이동할 수 있게 한다. 이 시그날 펩타이드는 다시 이동 과정 중에 시그날 펩티다제 (signal peptidae)에 의해 절단되어 성숙한 폴리펩타이드 (시그날 펩타이드가 없는 폴리펩타이드)가 된다. 폴리펩타이드는 일단 ER 내로 들어가면, 골지체 (Golgi apparatus)로 이동한 다음 폴리펩타이드 특성과 시그날 펩타이드의 존재 여부에 따라 분비 경로의 다양한 과정 중에서 하나를 거치게 된다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 외부 배지로 분비되거나 엔도좀 및 리소좀 기관 (compartment)과 같은 세포 기관으로 향하거나 세포막에 고정될 수 있다. 폴리펩타이드의 당화 (glycosylation), 디설파이드 결합 형성 및 단백분해 절단와 같은 많은 번역후 수식 과정이 ER 및 골지체에서 일어날 수 있다는 사실은 당업계에 잘 알려져 있다. 올바르지 못한 번역후 수식은 불활성 (inactive) 폴리펩타이드를 만들어 외래 (heterogenous) 폴리펩타이드 산물을 생산하는 과정에서 효과적이지 못한 시그날 펩티다제 절단을 야기하므로, 특별히 인간에게는 사용될 수 없다.
2. 혈중감반기를 증가를 위한 펩타이드
"제거 반감기"는 문헌(Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, and Alfred Gilman, eds., 6th ed. 1980))에 기재된 바와 같이 그의 통상의 의미로 사용된다. 요약하건대, 상기 용어는 약물 제거의 시간 경과의 정량적 측정치를 포괄하기 위한 것이다. 약물 농도가 통상적으로 제거 과정의 포화를 위해 요구된 약물 농도에 도달하지 않기 때문에, 대부분의 약물의 제거는 기하급수적이다(즉, 1차 반응식을 따른다). 기하급수적 과정의 속도는 그의 속도 상수, 즉 시간의 단위당 비율 변화를 표현하는 k, 또는 그의 반감기, 즉 상기 과정의 50% 완료를 위해 요구된 시간인 t1/2로 표현될 수 있다. 이들 두 상수들의 단위는 각각 시간-1 및 시간이다. 반응의 1차 속도 상수 및 반감기는 단순하게 관련되어 있으므로(k×t1/2=0.693) 상호교환될 수 있다. 1차 제거 반응식은 단위 시간당 일정한 비율의 약물이 손실되는 것을 좌우하기 때문에, 약물 농도의 로그 대 시간의 도표는 초기 분포기 후(즉, 약물 흡수 및 분포가 완료된 후) 모든 시간에서 선형이다. 약물 제거를 위한 반감기는 이러한 그래프로부터 정확히 측정될 수 있다.
용어 "결합 친화성"은 그의 결합 표적에 대한 본 개시에 기재된 단백질의 친화성을 지칭하고, "Kd" 값을 사용함으로써 수치적으로 표현된다. 2개 이상의 단백질들이 그들의 결합 표적들에 대한 필적할만한 결합 친화성을 가진 것으로 표시되는 경우, 그들의 결합 표적들에 대한 각각의 단백질의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배 이내에 있다. 2개 이상의 단백질들이 단일 결합 표적에 대한 필적할만한 결합 친화성을 가진 것으로 표시되는 경우, 상기 단일 결합 표적에 대한 각각의 단백질의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배이내에 있다. 단백질이 필적할만한 결합 친화성으로 2개 이상의 표적들에 결합하는 것으로 표시되는 경우, 상기 단백질과 2개 이상의 표적들의 결합에 대한 Kd 값은 서로의 ±2배 이내에 있다. 일반적으로, 더 높은 Kd 값은 더 약한 결합에 상응한다. 일부 실시양태에서, "Kd"는 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용함으로써 방사성표지된 항원 결합 어세이(RIA) 또는 표면 플라스몬 공명 어세이에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, "on-속도" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon", 및 "off-속도" 또는 "해리의 속도" 또는 "해리 속도" 또는 "koff"도 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용함으로써 표준 플라스몬 공명 기법에 의해 측정된다. 추가 실시양태에서, "Kd", "kon" 및 "koff"는 Octet® 시스템(Pall Life Sciences)을 이용함으로써 측정된다.
신 청소(renal clearance)를 통한 생물치료 분자의 신속한 제거는 제한된 임상적 유효성 또는 환자에 대한 더 빈번한 투여의 원인이 된다. 분자량이 50,000 달톤 초과인 분자의 경우에 신장 여과의 속도가 크게 감소되므로, 사구체 여과로 인한 신 청소는 더 작은 생물치료제와 주로 연계된다. 몇몇 승인된 생물치료 약물은 단독으로 여과 한계 미만이 되는 활성 부분을 함유하므로 빠르게 청소된다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 신장 여과를 감소시키기 위한 치료 분자의 크기 및 이에 따른 반감기를 효과적으로 증가시키기 위한 다수의 기술이 도입되었다.
알부민과의 비-공유결합은 짧은 생존 단백질의 제거 반감기를 연장시킨다. 예를 들면, 알부민 결합 도메인과 Fab 단편의 재조합 융합은 마우스 및 토끼에게 정맥내로 투여될 때 Fab 단편 단독의 투여에 비해 생체내 제거를 각각 25배 및 58배 감소시켰고 반감기를 각각 26배 및 37배 연장시켰다. 또 다른 예에서, 인슐린이 알부민과의 결합을 촉진하기 위해 지방산에 의해 아실화된 경우, 토끼 또는 돼지에게 피하 주사되었을 때 오래 지속된 효과가 관찰되었다. 종합하건대, 이 연구들은 알부민 결합과 연장된 작용/혈청 반감기 사이의 연관성을 입증한다.
치료제를 항체 Fc 영역에 커플링하여 Fc-융합 단백질을 생성시키는 단계를 사용하여 치료 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 면역글로불린은, 그들의 큰 크기 및 FcRn을 통한 재순환으로 인해 인간에게서 수주 가량의 긴 반감기를 나타낼 수 있다. TNF 수용체 2, LFA-3, CTLA-4, IL-1R, 및 TPO-유사 펩티드 분자는 모두 Fc-융합체로서 생성된 승인된 치료제이다. 몇몇 이유로 인해, Fc-융합 단백질이 모든 치료 클래스에 있어서 이상적인 것은 아니다. Fc 영역의 동종이량체성 성질은 이량체성 치료 단백질의 생성을 유발하며, 이는 수용체 클러스터링으로 인한 세포 활성화를 유발할 가능성이 있다. Fc-융합체는 또한 포유류 발현 시스템에서 제조되어야 하며, 이는 원핵생물 시스템보다 비용이 더 많이 들 수 있다.
본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 혈청 알부민에 특이적인 단일 도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 낙타과 유래의 sdAb의 가변 도메인(VHH), 펩타이드, 리간드 또는 소분자 물질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 HSA에 특이적인 단일도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 낙타과 유래의 sdAb의 가변 도메인(VHH), 펩타이드, 리간드 또는 소분자 물질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 혈청 알부민 결합도메인은 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체로부터의 도메인들을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 혈청 알부민에 결합하는 임의의 도메인이다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 단일 도메인 항체이다. 다른 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 펩타이드이다. 추가 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 도메인은 소분자이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 꽤 작고 25 kD 이하, 20 kD 이하, 15 kD 이하 또는 10 kD 이하인 것으로 생각된다. 일부 경우, 단일 도메인 혈청 알부민결합 단백질은 펩타이드 또는 소분자 물질인 경우 5 kD 이하이다.
본원에 기재된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질 그 자체의 변경된 약물력학 및 약물동력학을 제공하는 반감기 연장 도메인이다. 전술된 바와 같이, 반감기연장 도메인은 제거 반감기를 연장시킨다. 반감기 연장 도메인은 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 조직분포, 침투 및 확산의 변경을 포함하는 약물력학적 성질도 변경시킨다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 도메인은 반감기 연장 도메인을 갖지 않는 단백질에 비해 개선된 조직(종양을 포함함) 표적화, 조직 분포, 조직 침투, 조직 내부에서의 확산 및 향상된 효능을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료 방법은 감소된 양의 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 효과적으로 및 효율적으로 사용하여, 부작용, 예컨대, 비-종양 세포 세포독성을 감소시킨다.
일부 혈장 단백질 예컨대 혈청 알부민 및 IgG 분자는 신생 Fc 수용체 (FcRn, 브람벨 (Brambell) 수용체)를 통한 재순환 기전 때문에 2주 내지 4주 범위의 대단히 긴 반감기를 보유한다. 세포에 의해 흡수된 알부민 및 IgG는 초기 엔도솜 내 산성 환경에서 pH-의존적 방식으로 FcRn에 결합한다. 이러한 결합은 알부민 및 IgG가 리소솜 구획 내 분해를 벗어나게 하여 그들을 혈장막으로 전송하고, 거기서 그들은 중성 pH 덕분에 혈액 혈장으로 다시 방출된다. 이 기전은 예를 들어 알부민 또는 IgG의 Fc 영역과의 융합을 통해서, 단백질의 반감기를 연장시키기 위해 활용되어왔다. 혈청 알부민은 또한 알부민과 비공유적으로 상호작용하는 능력을 갖는 모듈을 통해 반감기 연장에 관여될 수 있다. 이들 접근법에서, 알부민-결합 모이어티는 치료적 단백질과 접합되거나 또는 유전자적으로 융합된다. 알부민에 대해 내재된 친화성을 갖는 분자 뿐만 아니라 알부민 결합 활성을 나타내도록 생성시켜 선별된 다른 분자 예컨대 펩티드, 항체 단편, 대체 스캐폴드 및 소형 화학물을 포함하여 광범위하게 상이한 모이어티가 적용되었다.
알부민은 FcRn 재순환으로 인해 생체내에서 긴 반감기를 나타낸다. 대략 40 g/L의 농도로, 인간 혈청 알부민(HSA)은 혈액 내에서 확인되는 가장 풍부한 단백질이다. FcRn 재순환은 인간에게서 대략 19 일의 긴 반감기를 유발한다. 부가적으로, 생체분포 연구는 체내에서 염증을 일으킨 관절 또는 종양과 같이 질환 표적화에 중요한 영역에 알부민이 분포될 수 있음을 제시한다. 따라서, 단백질을 HSA에 대한 C-말단 또는 N-말단 융합체로서 생성시킴으로써 다수의 단백질의 혈청반감기가 증가되었다. 성공적인 융합체는 인터페론 알파, 인간 성장 호르몬, 종양 괴사 인자, 응고 인자 IX, 응고 인자 VIIa, 인슐린, 유로키나아제, 히루딘, 및 이중특이적 항체 단편을 포함한다. HSA융합 단백질은 긴 혈청 반감기를 가질 수 있지만, 이들 융합 단백질의 대규모 생성은 주로 효모 발현 시스템으로 제한된다. 부가적으로, HSA의 큰 크기는 입체 방해로 인해 치료제의 활성 손실을 유발할 수 있다.
치료 단백질은 또한, 혈류 내에서 혈청 알부민에 결합하여 그들의 반감기를 증가시키는 펩티드 또는 단백질에 대한 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 이러한 알부민 결합 펩티드는 알부민에 대한 항체 단편 또는 시스테인-속박(cysteine-constrained) 펩티드를 포함한다. 시스테인-속박 펩티드에 대한 융합체로서의 Fab 항체 단편의 발현은 Fab의 혈청 반감기를 현저하게 증가시켰다. 시스테인-속박 펩티드를 항체 단편에 커플링하는 것은 동일한 항원을 표적화하는 Fab 및 mAb 분자에 비교하여 더 양호한 피크 종양 축적(peak tumor accumulation) 및 더 균질한 종양 분포를 유발했다. 추가로, 알부민에 특이적으로 결합하는 다수의 항체 단편을 치료 부분(therapeutic moiety)에 커플링하여 치료제의 반감기를 증가시켰다.
HSA에 결합하는 낙타과 VHH 항체 단편(나노바디즈(Nanobodies) (등록상표))을 TNF-알파에 결합하는 다른 나노바디(등록상표) 또는 항-EGFR 나노바디즈(등록상표)에 융합시켰다. 알부민에 결합하는 항-알부민도메인 항체(dAb)를 생성시키고, 예를 들어, 인터류킨-1 수용체 및 인터페론 알파 2b에 융합시켜 그들의 반감기를 개선하였다.
낙타류는 그들 단일 N-말단 도메인을 갖는 경쇄없는 기능성 항체, 도메인 쌍형성의 필요없이 항원에 결합하는 Nanobody®라고도 불리는 VHH를 생산한다. 이러한 VHH는 그들의 소형 크기, 높은 안정성, 유전자 융합에 의한 변형의 용이함 및 미생물에서의 양호한 생산 수준 덕분에 흥미로운 치료 가능성을 제시한다. 그러나, VHH의 소형 크기는 또한 환자에게 투여했을 때 순환계로부터의 그들의 신속한 제거 때문에 치료적 단점이다. 다른 한편으로, 이것은 또한 그들의 반감기 연장 분자와의 커플링, 또는 특이적 약물과의 커플링 (예를 들어, 항체-약물 접합체의 형성)을 위한 기회를 제공한다. 다양한 커플링 방법이 당분야에 기술되어 있고 (예를 들어, 특히 단일클론 항체의 변형 분야에서 적용), 이들 기술은 예를 들어 각각 아실화 또는 알킬화에 의해서, 시스테인 또는 1차 아민기 (리신 잔기 및 N-말단)를 통한 접합에 집중한다.
마우스 및 래트에서, 혈청 알부민의 자연 반감기는 대략 1.5일 내지 2.5일이고, 상이한 혈청 알부민 결합제는 비슷한 반감기, 즉 대략 2일을 나타내는 것으로 확인되었다. 마우스 알부민에 특이적인 Nanobody®는 2개의 길항성 항-EGFR Nanobody®와 융합되어서 이특이적, 삼특이적 분자를 생성시켰고, 동물 모델에서 반감기가 1시간에서 44시간으로 증가되었으며 EGFR-양성 종양의 과성장을 효율적으로 지연시켰다. 전임상 연구와 관련하여, 래트의 물질대사 생리학은 그러나 마우스의 것보다 인간에 더 가까워서, 래트가 약물의 약동학/약력학 특징 및 인간 독성학을 연구하는데 더 양호한 종이 된다. 또한, 마우스와 비교하여 크기가 더 큰 래트는 정교한 외과적 조작, 및 최적 실험 판독을 위한 더 많은 부피의 혈액/CSF 및 조직을 가능하게 한다. 유전자 변형 래트 모델은 또한 약물 효능 및 안전성 연구를 이제 가능하게 하므로, 효능과 동일한 균주 및 종을 사용하는 안전성 연구를 수행하기 위한 전임상 연구에서 마우스에 비해 래트가 본질적으로 더욱 번역되어진다. 상이한 종, 예컨대 설치류, 영장류 및 인간에서 알부민 결합제의 반감기는 최적 투약을 허용하고 효능 연구에서 바람직한 노출에 도달하는데 핵심적이고, 보다 신뢰할만한 종간 노출 예측을 가능하게 한다. 그리하여, 이의 치료적 표적 종, 즉 인간에서 혈청 알부민 결합 단백질의 반감기 뿐만 아니라, 전임상 개발 환경에서 각각의 관심 동물 종의 알부민에 대한 반감기에 의존하는 것도 분명히 중요하다. 치료적 단백질의 반감기를 연장시키도록 인간 알부민에 대해 충분히 높은 친화성을 갖는 혈청 알부민 결합제 또는 폴리펩티드를 찾을 뿐만 아니라, 전임상 결과의 번역가능성 및 성공률을 증가시키도록, 빈번하게 사용되는 시험 동물, 예컨대 설치류에서 최고 친화성 또는 최장 반감기를 갖는 혈청알부민 결합제를 동정하는 것이 유리할 것이다.
VHH는 1가 또는 다가 또는 다중특이적 구조로서 그들의 작은 크기에 기인하여, 그리고 혈청 알부민 항원을 표적으로 하는 VHH와의 융합을 통한 치료적 단백질 반감기의 연장 가능성에 기인하여, 치료적 표적화에 유리하다. 혈청 알부민 결합 VHH의 다른 예는 환자에서 다른 (치료적) 단백질 (예컨대 바람직한 표적에 대해 유도된 하나 이상의 다른 Nanobody®)과 환자에서 상기 (치료적) 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 연결될 수 있는, 혈청 알부민, 특히 인간 혈청 알부민에 대해 유도된 Nanobody®를 기술한 Ablynx　N.V. (WO 2004/041865, 및 WO2006/122787)가 제공하였다.
그리하여 결론적으로, 혈청 알부민 결합 VHH는 인간외 영장류에서의 보다 많은 연구 또는 추적관찰 임상 연구 이전에 보다 광대한 전임상 데이타 수집이 가능하도록, 인간 뿐만 아니라, 시험 종에서도, 혈청 알부민 결합 VHH의 융합 파트너로서, 치료적 단백질, 가능하게는 또한 VHH의 반감기를 증가시키기 위해 흥미로울 것이다. 이러한 혈청 알부민 결합 VHH는 신규 치료제의 보다 신뢰할만하고 보다 용이한 개발을 가능하게 한다. 그리고, VHH가 또한 예를 들어 항체-약물 접합체로서 종양 표적화에서 유용한 것으로 확인되었으므로, 혈청 알부민에 대한 결합 기능을 방해하지 않고, 접합할 수 있고, 이상적으로 신규한 치료제의 효율적인 R&D를 증가시키도록 상기 2개 특성의 조합일 수 있는 특이적 VHH를 동정하는 것이 바람직할 것이다. 마지막으로, 치료적 용도로 개발하려는 VHH는 또한 그들의 생화학적 성질이 적합해야 한다.
알부민에 결합하는 다수의 단백질 도메인 또는 펩티드가 혈청 반감기를 연장하고 치료 단백질의 더 유익한 생체분포 패턴을 생성시킬 수 있다. 이들 알부민 결합 도메인을 치료적 응용에 사용하기 위해서는, 숙주 내에서의 높은 발현 수준, 용해도 및 안정성, 및 최소의 면역원성과 같은 다수의 생물리학적 요건을 충족시킬 필요가 있다. 알부민 결합 부분은, 알부민에 결합한 경우와 결합하지 않은 경우의 치료 부분의 활성과 혈청 반감기 및 생체분포가 효과적으로 균형을 이루는 친화력으로 혈청 알부민에 결합해야 한다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질, 약학 조성물뿐만 아니라, 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 이러한 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질의 제조를 위한 숙주 세포도 본원에 기재되어 있다. 질환, 질병 및 장애의 예방 및/또는 치료에 있어서 개시된 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질을 사용하는 방법도 제공된다. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 추가 도메인, 예컨대, CD3 결합 도메인뿐만 아니라, 다른 표적 항원에 대한 결합 도메인도 포함한다.
단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질이 본원에서 고려된다. 혈청 알부민은 간에 의해 생성되고, 혈액 혈장에 용해된 상태로 존재하고, 포유동물에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다. 알부민은 혈관과 체조직 사이의 체액의 적절한 분포를 위해 필요한 삼투압을 유지하는 데 필수적이이고; 알부민이 없는 경우, 혈관 내의 높은 압력은 더 많은 유체가 조직 내로 들어가게 할 것이다. 알부민은 여러 소수성 스테로이드 호르몬들에 비-특이적으로 결합함으로써 혈장 담체로서도 작용하고 헤민(hemin) 및 지방산을 위한 수송 단백질로서도 작용한다. 인간 혈청 알부민(HSA)(분자 질량 약 67 kDa)은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고, 약 50 mg/㎖(600 μM)로 존재하고, 인간에서 약 20일의 반감기를 가진다. HSA는 혈장 pH를 유지하는 데 기여하고, 콜로이드성 혈압에 기여하고, 많은 대사물질들 및 지방산들의 담체로서 작용하고, 혈장에서 주요 약물 수송 단백질로서 기여한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 원숭이로부터의 혈청 알부민 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 사이노몰구스 원숭이로부터의 HSA 및 혈청 알부민 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질은 마우스 혈청 알부민 단백질에도 결합한다. 일부 실시양태에서, 마우스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성은 인간 또는 사이노몰구스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성보다 약 1.5배 내지 약 20배 더 약하다.
박테리아로부터 천연적으로 발생하는 다수의 단백질 도메인이, 알부민과 상호작용하여 아마도 이러한 박테리아가 숙주 유기체 전체에 분포되도록 보조하는 것으로 공지되어 있다. 이들은 크기가 대략 6 kDa인 3-나선 번들단백질 도메인이며, 이는 3-나선 번들의 일면을 사용하여 혈청 알부민과 상호작용한다. 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유도된 하나의 이러한 알부민 결합 도메인이, 단백질의 혈청 반감기를 연장하기 위해 가장 널리 사용되어 왔다. 이 도메인에 대한 융합체는 가용성 보체 수용체 유형 1, 이중특이적 항체, GCSF, 및 다수의 표적에 결합하는 어피바디(affibody) 분자의 감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 환자에게서 상기 도메인에 대한 항체 생성이 보고되었으며, 따라서 상기 분자를 치료적 응용에 사용하는 것은 어려울 수 있다.
HSA는 인간에서 혈청 농도가 600 μM이고 t1/2이 19일이다. HSA의 연장된 t1/2은 부분적으로는, 신생 Fc 수용체(FcRn)를 통한 그의 재순환에 기인한다. HSA는 엔도좀에 의한 내피 세포 내로의 흡수 후에 pH-의존 방식으로 FcRn에 결합하고; 상기 상호작용은 HSA를 혈류 내로 재순환시켜, 리소솜에 의한 분해로부터 벗어나게 한다. FcRn은 널리 발현되고, 재순환 경로는 구성적인 것으로 생각된다. 대부분의 세포 종류에서, 대부분의 FcRn은 세포내 분류 엔도좀에 존재한다. HSA는 유체상 세포흡수 작용 (pinocytosis)의 비특이적 메카니즘에 의해 쉽게 내재화되고, FcRn에 의해 리소솜에서의 분해로부터 구제된다. 엔도좀에서 발견되는 산성 pH에서, FcRn에 대한 HSA의 친화도는 증가한다 (pH 6.0에서 5 μM). FcRn에 결합한 후, HSA는 리소솜에 의한 분해 경로로부터 벗어나고, 세포 횡단 운송을 거쳐 세포 표면에서 방출된다.
혈청 알부민
혈청 알부민은 포유류 혈청 중에 가장 풍부한 단백질(40 g/l; 인간에서 대략 0.7 mM)이며, 그 기능 중 하나는 지질과 빌리루빈(bilirubin) 등의 분자에 결합하는 것이다. 혈청 알부민의 반감기는 동물의 크기에 정비례하는데, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)의 반감기는 19일이고, 토끼의 혈청 알부민의 반감기는 약 5일이다. 인간 혈청 알부민은 몸 전체에, 특히, 간질 및 혈액 구분에 널리 분포되어 삼투압의 유지에 주로 관여하고 있다. 구조적으로, 알부민은 세 개의 상동 도메인(domain)과 총 584개 또는 585개의 아미노산을 포함하는 단일 사슬 단백질이다. 알부민은 17개의 디설파이드 가교 및 한개의 반응성 티올(thiol), C34를 포함하지만, N-결합 및 O-결합 탄수화물 잔기가 결여되어있다. 글리코실화(glycosylation)의 결여는 알부민의 재조합 발현을 단순화한다. 알부민의 이런 특성은 알부민의 삼차원 구조가 알려져 있다는 사실과 함께(He XM and Carter DC, Nature 358:209 1992), 알부민을 재조합 융합단백질로 사용하는데 매력적인 후보가 되게 했다. 이러한 융합 단백질들은 일반적으로 치료용 단백질(단백질의 투여 시 그 자체로 빠른 시간 내에 체외로 배출될 수 있음) 및 단일 폴리펩타이드 사슬의 혈장 단백질(자연적으로 느린 속도로 제거됨)을 결합한다. 이러한 융합단백질은 생체 내에서 더 낮은 빈도로 주사 및 더 높은 수준의 치료용 단백질을 요구하는 임상적 이점을 제공한다.
HSA와의 융합 또는 결합은 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키게 된다.
혈청 알부민은 임의의 효소적 또는 면역학적 기능이 결여되어 있으며, 따라서 생체활성 폴리펩타이드에 결합 시에 바람직하지 않은 부작용을 나타내서는 안된다. 더욱이, HSA는 치료용 분자들뿐만 아니라 많은 자연 분자들의 내인성 물질 수송 및 운송에 관여하는 자연 매개체이다. 생체 내에서 혈청 알부민과 결합할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 또는 혈청 알부민에 단백질을 직접 공유결합시키기 위한 여러 전략들이 보고되었다. 후자 접근법에 관한 실시예는 예를 들면 WO91/01743에서 기술되어 있다. 이 문헌은 특히 다른 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 연쇄상 구균의 G단백질(protein G)로부터 유래한 알부민 결합 펩타이드 또는 단백질의 사용을 기술한다. 그 발상은 치료 목적의 펩타이드/단백질에 박테리아 유래의 알부민 결합 펩타이드/단백질을 융합하는 것이며, 이는 혈액으로부터 빠른 속도로 제거되는 것으로 나타났다. 이렇게 생성된 융합단백질은 생체 내에서 혈청 알부민에 결합하여, 더 긴 반감기로부터 이익을 얻으며, 이것은 치료 목적의 융합 펩타이드/단백질의 알짜 반감기를 증가시킨다.
HSA와의 결합은 면역원성을 감소시키게 된다.
생물학적 활성 단백질의 생체 내 반감기에 대한 효과 외에도, 생물학적 활성 단백질 및 알부민 결합 단백질 사이의 융합 알부민의 비공유 결합이 생물학적 활성 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키는 작용을 한다는 것이 제안되었다. 따라서 WO2005/097202에는 생물학적 활성 단백질에 대한 면역 반응을 감소 또는 제거하기 위한 원리 설명의 사용이 기술되어 있다.
3.생리활성펩타이드
3.1. 인슐린
또 다른 측면에서, 본 발명은 SABA 및 인슐린 융합 분자를 기술한다. 인슐린은 신체에서 에너지 및 글루코스 대사를 조절하는 호르몬이다. 상기 폴리펩티드는 췌장 β-섬 세포에 의해 혈액으로 분비되어, 간, 근육 및 지방 세포에 의한 혈액으로부터의 글루코스 흡수를 자극하며, 글리코겐생성 및 지질생성을 촉진한다. 인슐린 분비 및/또는 작용 중 임의 단계(들)에서의 기능장애는 산소 이용, 지방생성, 글리코겐생성, 지질생성, 글루코스 흡수, 단백질 합성, 열생성, 및 기초 대사율 유지의 조절장애를 포함한 여러 장애로 이어질 수 있다. 이와 같은 기능장애는 비제한적으로 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 인슐린 결핍, 고혈당, 고지질혈증, 고케톤혈증, 당뇨병, 및 당뇨병성 신병증을 포함한 질환 및/또는 장애들을 초래한다. 따라서, 본원에서 기술되는 SABA-인슐린 융합 폴리펩티드는 이와 같은 질환 및/또는 장애에 걸린 대상체를 치료하는 데에 유용할 수 있다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명에 적용될 수 있는 인슐린 모이어티에는 자연 발생 인슐린, 생합성 인슐린, 인슐린 유도체 및 유사체가 포함된다. 인슐린 유사체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 첨가 및/또는 제거된, 인간 인슐린 또는 동물 형태의 인슐린과 같은 자연-발생 인슐린 단백질의 유사체이다. 그와 같은 아미노산은 합성 또는 변형된 아미노산일 수 있다. 인슐린 유도체는 예를 들면 하나 이상 아미노산에 대한 하나 이상 특정 화학 기의 첨가에 의해 화학적으로 변형된, 자연-발생 인슐린 또는 인슐린 유사체 중 어느 하나의 유도체이다. 대표적인 인슐린 유사체들이 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 7,476,652에 기술되어 있다.
3.2. 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)/엑센딘-4
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)은 영양소 섭취에 반응하여 장내분비(enteroendocrine) L 세포로부터 방출되는 30 또는 31개 아미노산 펩티드이다. 이와 같은 호르몬은 다수의 기작에 의해 글루코스 항상성을 조절하고 항당뇨병 효과를 제공하는 작용을 할 수 있다. GLP-1 신호전달은 동물 모델에서 글루코스-의존성 인슐린 분비를 향상시키며, 글루코스-의존성 방식으로 글루카곤 분비를 억제하고, 위 배출을 지연시키며, 음식물 섭취 및 체중의 감소를 초래하고, 베타 세포 질량의 증가를 야기한다.
천연 GLP-1의 치료적 효용은 제한되는데, 도처에 존재하는 프로테아제인 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의한 그의 빠른 분해로 인하여, 그것이 생체내에서 2분 미만의 반감기를 가지기 때문이다. DPP-IV는 우선적으로 두번째 위치에 알라닌 또는 프롤린을 갖는 아미노 말단 디펩티드를 절단하므로, 반감기를 증가시키는 한 가지 전략은 활성 GLP-1에서 두 번째 아미노산 (위치 8)을 변경시킴으로써, 펩티드가 더 이상 DPP-IV 기질이 되지 않도록 하는 것이다. DPP-IV 내성 GLP-1 유사체를 생성시키기 위하여, 위치 8의 알라닌은 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린을 포함한 매우 다양한 자연 (또는 비자연) 아미노산으로 대체될 수 있다. 그러나, DPP-IV 내성 GLP1 유사체는 여전히 비교적 짧은 약동학적 반감기를 갖는데, 그것이 신장 청소(renal clearance)를 통하여 제거되기 때문이다. 예를 들면, 그것이 신장에 의해 빠르게 청소되기 때문에, 인간 당뇨병 환자에서는, 강력하고 DPP-IV 내성인 GLP-1 수용체 효능제인 합성 엑센딘-4 (서열 228; 바이에타(Byetta)의 활성인 약제학적 성분)가 여전히 하루에 2회 투여되어야 한다. 장기-작용성 GLP-1 수용체 효능제를 생성시키기 위한 또 다른 접근법은 알부민 또는 트랜스페린과 같은 장기-생존 단백질과 동일한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서 DPP-IV 내성인 GLP-1 유사체를 발현시키는 것이었다. 한 가지 그와 같은 융합 단백질로써, 인간 혈청 알부민에 융합된 DPP-IV 내성 GLP-1 유사체인 알비글루티드(albiglutide)가 현재 단계 III 임상 시험에서 평가중이다. 보고된 모든 경우에서, 활성 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단에 DPP-IV 내성 GLP-1 수용체 효능제를 가졌으며; c-말단 융합체는 현저하게 덜 강력하였다.
GLP-1 및 엑센딘 융합 폴리펩티드의 대표적인 용도에는 혈장 글루코스를 저하시키거나, 위 및/또는 장 운동성을 억제하고 위 및/또는 장 배출을 억제하거나, 또는 음식물 섭취를 억제함으로써 이익을 얻게 되는 당뇨병, 비만, 과민성 대장 증후군 및 기타 이상의 치료가 포함된다.
일 측면에서, 본 출원은 혈청 알부민 결합성 도메일에 융합된 GLP-1 또는 엑센딘, 및 본원에서 일반적으로 GLP-1 또는 엑센딘 융합체로 지칭되는 해당 융합체의 용도를 제공한다.
3.3. GDF15
TGFβ 패밀리의 구성원인 GDF15는 25 kDa 동종이량체로서 혈장 중에서 순환되는 분비 단백질이다. GDF15의 혈장 수준은 대부분의 개체에서 150 내지 1150 pg/ml의 범위이다. GDF15의 혈장 수준은 손상, 심혈관 질병 및 소정 유형의 암의 상태 하에서 증가된다. 이러한 상향조절은 세포보호 기전인 것으로 여겨진다. GDF15의 높은 혈장 수준은 암에서, 그리고 신부전 및 심부전에서 식욕 부진 및 악액질로 인한 체중 손실과 관련되어 있다. 임상 시험에서, GDF15 수준은 비만상태의 비당뇨병 대상체에서 인슐린 저항성의 독립적인 예측인자였다. 쌍둥이들에서의 연구는 쌍둥이 쌍들 내에서의 GDF15 수준의 차이가 그러한 쌍 내에서의 BMI의 차이와 상관되어 있음을 보여주었는데, 이는 GDF15가 에너지 항상성의 장기 조절인자(long-term regulator)로서의 역할을 함을 시사한다.
GDF15는 몇몇 심혈관 및 다른 질병 상태에 대한 바이오마커로서 광범위하게 연구되어 왔지만, 또한 심근 비대 및 허혈성 손상에서의 GDF15의 보호 역할이 기재되어 있다. GDF15는 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 마우스 모델에서 신세뇨관 및 신간질성 손상으로부터의 보호에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. GDF15는 연령-관련 감각 및 운동 신경 손실에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 제안되고, 그것은 말초 신경 손상으로 인한 회복을 개선한다. 실제로, GDF15 유전자도입 마우스는 그들의 한배 새끼 대조군보다 더 긴 수명을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이 분자가 장기간 생존 인자로서의 역할을 함을 나타낼 수 있다.
다수의 보고는 GDF15 단백질에 의한 치료 시에 마우스 모델에서의 글루코스 내성 및 인슐린 감수성의 개선을 입증해 왔다. GDF15를 과발현하는 유전자도입 마우스의 2개의 독립적인 개통은 감소된 체중 및 체지방량뿐만 아니라 개선된 글루코스 내성을 갖는다. 전신 에너지 소비 및 산화적 대사의 증가가 GDF15 유전자도입 마우스에서 보고되었다. 이들에는, 갈색 지방 조직에서의 발열성(thermogenic) 유전자 발현의 증가 및 백색 지방 조직에서의 지방분해 유전자 발현의 증가가 동반되었다. GDF15 유전자가 결여되어 있는 마우스는 증가된 체중 및 체지방량을 갖는다. GDF15의 Fc-융합체는, 비만 상태의 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 모델에서, 6주의 기간에 걸쳐 매주 투여될 때, 체중을 감소시키고 글루코스 내성뿐만 아니라 인슐린 감수성을 개선하는 것으로 밝혀졌다 (국제 특허 출원 공개 WO 2013/113008호).
체중에 미치는 GDF15의 영향은 음식 섭취량의 감소 및 증가된 에너지 소비를 통해 매개되는 것으로 여겨진다. GDF15는 체중-의존적 및 비의존적 기전을 통해 혈당 조절을 개선할 수 있다.
종합하면, 이들 관찰은 GDF15 수준의 증가가 대사 질병에 대한 요법으로서 유익할 수 있음을 시사한다. 대사질병, 장애, 또는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 GDF15-기반 조성물에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
3.4. FGF21
섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)은 신호전달 단백질들 중 FGF 패밀리의 구성원이다. 이들 단백질은 세포 표면 티로신 키나제 패밀리의 구성원인 FGF 수용체에 결합하여 그것을 활성화시킴으로써 기능한다. FGF21은 전형적인 패밀리 구성원이 아닌데, 그것이 헤파린에 결합되지 않고, 대신 활성을 위한 보조-수용체로서 단일 통과 막횡단 단백질인 β-클로토를 필요로 하기 때문이다. 해당 수용체는 광범위한 조직 분포를 가지나, β-클로토 발현이 소정의 조직 (간, 지방 및 췌장)으로 제한되므로, FGF21에 대하여 표적 특이성을 부여하는 것은 β-클로토의 조직 선택성 발현이다. 시험관내 연구는 FGFR1c (FGFR1의 동형) 및 FGFR4가 각각 백색 지방 조직 및 간에서 바람직한 수용체임을 나타낸다.
FGF21은 대사 조절인자로 기능하기 때문에, FGF21의 조절장애는 다양한 대사 장애로 이어질 수 있다. FGF21은 3T3-L1 지방세포 및 1차 인간 지방세포 배양물에서 ERK 인산화 및 GLUT1 발현을 유도함으로써 글루코스 흡수를 증가시킨다. INS-1E 세포 및 단리된 섬(islet)에서, FGF21은 ERK 및 AKT 인산화를 유도한다. 간 세포주에서, FGF21은 통상적인 FGF 신호전달 (ERK 인산화)를 자극하고, 글루코스 생성을 감소시켰다. 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 FGF21 융합체는 다양한 대사 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다.
FGF21은 대사 조절인자로 기능하기 때문에, FGF21의 조절장애는 다양한 대사 장애로 이어질 수 있다. FGF21은 3T3-L1 지방세포 및 1차 인간 지방세포 배양물에서 ERK 인산화 및 GLUT1 발현을 유도함으로써 글루코스 흡수를 증가시킨다. INS-1E 세포 및 단리된 섬(islet)에서, FGF21은 ERK 및 AKT 인산화를 유도한다. 간 세포주에서, FGF21은 통상적인 FGF 신호전달 (ERK 인산화)를 자극하고, 글루코스 생성을 감소시켰다. 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 FGF21 융합체는 다양한 대사 질환 및 장애를 치료 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다.
4. 접합/링커
융합간백질은 공유 또는 비-공유로 연결될 수 있다. 혈청 알부민 결합성 10Fn3은 직접적으로, 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 간접적으로 이종성 분자에 연결될 수 있다. 해당 단백질에 SABA를 연결하기 위한 적합한 링커는 별도의 도메인들이 서로 독립적으로 접힘으로써, 융합 단백질 중 어떠한 구성원의 기능성도 붕괴시키지 않는 3차원 구조를 형성하도록 해주는 것들이다.
본 개시는 글리신-세린 기재 링커, 글리신-프롤린 기재 링커는 물론, PSTSTST의 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함한 수많은 적합한 링커들을 제공한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 기재의 링커이다. 이러한 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하며, 길이가 8 내지 50, 10 내지 30, 및 10 내지 20개 아미노산 사이일 수 있다. 그 예에는 (GS)7, G(GS)6, 및 G(GS)7G의 아미노산 서열을 갖는 링커들이 포함된다. 다른 링커는 글루탐산을 포함하는데, 거기에는 예를 들면 (GSE)5 및 GGSE GGSE이 포함된다. 다른 대표적인 글리신-세린 링커에는 (GS)4, (GGGGS)7, (GGGGS)5, 및 (GGGGS)3G가 포함된다. 링커는 글리신-프롤린 기재 링커이다. 이러한 링커는 글리신 및 프롤린 잔기를 포함하며, 길이가 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산 사이일 수 있다. 그 예에는 (GP)3G, (GP)5G, 및 GPG의 아미노산 서열을 갖는 링커가 포함된다. 다른 실시양태에서, 링커는 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산 사이의 길이를 갖는 프롤린-알라닌 기재의 링커일 수 있다. 프롤린 알라닌 기재 링커의 예에는 예를 들면 (PA)3, (PA)6 및 (PA)9이 포함된다. 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의한 일상적인 실험에 의해 최적의 링커 길이 및 아미노산 조성이 결정될 수 있을 것으로 생각된다.
본원에서 기술되는 융합단백질은 혈액 또는 표적 조직에서 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 부위를 갖는 폴리펩티드 링커를 통하여 설계될 수 있다. 더 우수한 전달 또는 치료 특성, 또는 더 효율적인 생성을 위하여 치료 단백질을 방출하는 데에 사용될 수 있다.
생리활성 펩타이드는 직접적으로, 또는 링커를 통하여 간접적으로 융합단백질에 연결될 수 있다. 링커는 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 융합단백질을 생성시키기 위하여 융합단백질 각 성분 사이의 거리를 최적으로 변화시키는 데에 사용될 수 있다: 1) 해당 단백질에 결합될 때, 하나 이상 단백질 도메인 결합의 감소 또는 증가된 입체 장애, 2) 증가된 단백질 안정성 또는 용해도, 3) 감소된 단백질 응집, 및 4) 증가된 단백질의 전체적 친화력 또는 친화성.
5. 융합단백질 mRNA 구조
본 발명의 융합단백질 mRNA 구조는 생리활성 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 인코딩하는 mRNA의 발현을 증가시키기 위한 세포내 번역이 가능한 구조를 융합단백질 mRNA로, (i)세포내 번역을 가능하게 하는 구조; (ii) 5'UTR; 및 (iii) 3'UTR를 포함하는 RNA 구조체를 포함할 수 있다.
세포 번역이 가능한 구조
키메라 효소를 발현시키기 위한 키메라 효소 mRNA는 5'캡 또는 IRES를 포함하는 5'UTR를 포함할 수 있다.
용어 "5'cap", "캡", "캡된" 및 ""5'cap 구조"는 일부 진핵세포의 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 동의어로 사용된다. 5'cap은 5' 트리포스페이트 결합(또는 특정 캡 유사체의 경우 화학적 변형된 트리포스페이트 결합)에서 5'를 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (임의로 화학적 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 용어는 종래의 cap 또는 cap 유사체를 지칭할 수 있다.
예를 들어, RNA를 5'캡과 함께 제공하는 것은 상기 5'캡의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'캡은 생성된 RNA 가닥에 공동-전사적으로 혼입되거나, RNA는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있으며, 5'cap은 캡핑효소, 예를 들어 종두증 바이러스의 캡핑효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다. 캡핑된 RNA에서, (캡핑된) RNA 분자의 제 1 염기의 3' 위치는 인산디에스터 결합을 통해 RNA 분자의 후속 염기("제 2 염기")의 5' 위치에서 연결된다.
"종래의 5'캡"이란 용어는 자연성 발생적인 5'캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡을 의미한다. 7-메틸구아노신 캡에서, 캡의 구아노신은 화학적 변형된 구아노신이며, 여기서 변형은 7-위치에서의 메틸화로 이루어진다.
키메라 효소의 번역이 키메라 효소 mRNA 상의 5'캡에 의해 유도된다. 키메라 효소 mRNA 상의 5'캡이 키메라 효소의 발현뿐만 아니라 시스템 전체의 성능에 매우 긍정적인 영향을 미친다. 트랜스로 코딩된 목적 RNA의 효율적인 생산을 달성할 수 있다.
본 발명의 키메라 효소 mRNA는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함하지 않는다. 일반적으로, 내부 리보솜 진입 부위, 약칭 IRES는 키메라 효소 mRNA 서열의 5' 말단과 다른 위치, 예컨대 키메라 효소 mRNA 서열의 중앙에서의 위치로부터의 메신저 RNA (mRNA)로부터의 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열로 mRNA 서열의 중간에 위치한다.
본 발명에서 5'캡으로 IRES의 치환은 키메라 효소 mRNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 RNA 분자의 특정 변형이다(비-폴리펩티드-서열 개질성 변형). 예를 들어, 진핵세포 메신저 RNA의 경우, 비-폴리펩티드-서열 개질성 변형은 특정 비번역된 영역의 선택, 인트론의 도입, 예를 들어 토끼 베타-글로빈 인트론 II 서열), 또는 코딩 서열의 침묵 변형, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드 서열의 변형없이(침묵 변형) 대상세포 또는 대상 유기체에서 우선 코돈 사용법에 적응하는 것에 의한 것을 포함한다.
본 발명에 따른 에 의해 코딩되는 표적 단백질의 생산은 캡이 키메라 효소 mRNA 상에 존재할 때 효율적이다.
진핵세포 mRNA에서 5'캡의 존재는 그 중에서도 특히 mRNA의 핵내 방출 조절과 가공, 특히 5′ 근위부 인트론 절제의 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 키메라 효소 mRNA는 전형적으로 핵으로부터 배출되거나 가공될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 키메라 효소 mRNA 상에 5'캡이 존재하는 것이 유리하다.
진핵세포 mRNA의 경우, 5'캡은 또한 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여한다고 일반적으로 기술되어 있다: 일반적으로 진핵세포에서 번역은 IRES가 없는 한 메신저 RNA (mRNA) 분자의 5' 말단에서만 개시된다.
진핵세포는 핵 내 전사 중에 5'캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 새로 합성된 mRNA는 통상적으로 전사체가 20 ~ 30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때 5'캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'말단 뉴클레오타이드 pppN(ppp는 트리포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5' GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용된 5'캡은 자연성 5'캡이다.
본 발명에서, 자연성 5'캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 키메라 효소 mRNA는 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 대상세포 내로 형질주입되는 경우, 본 발명의 DdRp mRNA는 전형적으로 세포 핵, 즉 전형적인 진핵세포에서 캡핑이 일어나는 부위에 국한되지 않는 것으로 여겨진다.
종래 기술 에서 IRES와 유사하게, 키메라 효소 mRNA 상의 5'캡은 키메라 효소의 번역 개시를 유발하는데 유용하다. 진핵세포 번역 개시 인자 elF4E는 캡핑된 mRNA를 리보솜과 결합시키는 데 관여하는 것으로 생각될 수 있다. 5'캡의 존재가 성능을 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 키메라 효소 mRNA는 5'캡을 포함한다.
5'캡의 존재는 또한 본 발명의 트랜스-복제 시스템에서 예기치 않은 상승적인 효과를 제공한다. 캡핑된 키메라 효소 mRNA가 RNA에 대해 트랜스로 제공될 때 캡핑된 키메라 효소 mRNA가 목적 단백질의 생산을 유발하는 것이 보다 효율적이다. 따라서, 트랜스로 5'캡 및 복제의 상승 효과, 즉 시스로 복제하는 것보다 우수한 효과가 있다.
본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다.
RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제2 염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5 ~ 10으로 설정함으로써 억제된다.
5'캡은 5'캡 유사체이다. RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.
이전에 기재된 조작된 복제 시스템과 대조적으로, 본 발명의 DdRp mRNA는 바람직하게는 캡 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 시스템의 DdRp의 번역은 바람직하게는 캡 유사체에 의해 유도된다.
이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다. 따라서, 본 발명은 임의의 변형을 함유하지 않고 천연 캡 [(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG라고도하며, 시판된 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnology사에 의해 첨가할 수 있음)]을 포함하는 발현 시스템을 제시하고 있다.
UTR
Untranslated region(비번역 영역) 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. UTR은 오픈 리딩 프레임의 상류 및/또는 키메라 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 하류에 존재할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 키메라 효소 mRNA에서, "3'UTR"은 키메라 효소에 대한 코딩영역의 3'에 위치하는 영역에 관한 것이고, "5'UTR" 이는 키메라 효소에 대한 코딩영역의 5'에 위치하는 영역에 관한 것이다.
3'UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'말단에 위치하지만, "3'UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).
5'UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'UTR은 5'캡의 하류, 예를 들어 5'캡 바로 옆에 있다(존재한다면).
5' 및/또는 3'UTR은 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 관련되어 안정성 및/또는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.
UTR은 RNA의 운반을 이용한 효과적인 운반의 전제 조건인 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 선택함으로써, 5'캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다.
UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'UTR이 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 키메라 효소 mRNA는 DdRp가 유래된 에 대해 이종 또는 고유하지 않은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 포함한다. 이것은 원하는 번역 효율 및 RNA 안정성에 따라 비번역 영역을 설계할 수 있게 한다.
본 발명의 3'UTR은 엑소리보뉴클레아제의 장벽으로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호작용하는 스템-루프 구조를 제공하기 위해 폴딩할 수 있는 하나 이상의 역반복을 포함할 수 있다.
인간 베타-글로빈 3'UTR, 특히 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본은 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다.
따라서, 본 발명의 키메라 효소 mRNA는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'UTR; (b) 키메라 효소를 코딩하는 오픈 리딩 프레임; (c) 3'UTR; 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'UTR을 포함한다.
본 발명의 키메라 효소 mRNA는 의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화하지만 인간 베타-글로빈 3'UTR, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편이 아닌, 3'UTR을 포함한다.
본 발명의 키메라 효소 mRNA는 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'UTR을 포함한다.
본 발명에 따른 UTR-함유 RNA는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이들은 5'UTR 및/또는 3'UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자(예컨대 DNA)의 발현을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
3'UTR은 일반적으로 mRNA의 단백질 코딩 영역(즉, 오픈 리딩 프레임) 및 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'UTR은 아미노산 서열내로 번역되지 않는다. 3'UTR은 일반적으로 유전자 발현 과정 중 각각의 mRNA 내로 전사되는 유전자에 의해 코딩된다. 게놈 서열은 먼저 선택적인 인트론을 포함하는 미성숙 mRNA로 전사된다. 그 이후, 미성숙 mRNA는 성숙 과정을 거쳐 성숙 mRNA로 되도록 추가로 처리된다. 이러한 성숙 과정은 5'캡핑(capping), 추가적인 인트로을 절단하기 위한 미성숙 mRNA 스플라이싱(splicing) 및 미성숙 mRNA 3'말단의 아데닐산중합반응 및 추가적인 엔도-(endo-) 또는 엑소(exo)뉴클레아제 절단 등과 같은 3'말단의 변형을 포함한다. 본 발명에서, 3'UTR는 단백질 코딩 영역의 정지 코돈의 3'말단에, 바람직하게는 단백질 코딩 영역의 정지 코돈의 3' 말단 바로 옆에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응하며, 폴리(A) 서열의 5'측면, 바람직하게는 폴리(A) 서열의 5'말단 바로 옆 뉴클레오타이드까지 이어진다. 본 발명에서, 유전자의 3'UTR, 예컨대 알파 또는 베타 글로빈의 3'UTR는 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 3'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 용어 "유전자의 3'UTR"은 3'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'UTR은 일반적으로 전령 RNA(mRNA)의 특정 부분(section)으로 이해된다. 이는 mRNA의 오픈 리딩 프레임의 5'에 위치한다. 일반적으로, 5'UTR은 전사 시작부(transcriptional start site)와 함께 시작하고 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈의 하나의 뉴클레오타이드 전에 종료된다. 5'UTR은 조절 요소라고도 불리우는 유전자 발현을 조절하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이와 같은 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합부 또는 5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract)일 수 있다. 5'UTR은 예를 들어, 5'캡(cap)의 첨가에 의해 전사 후 변형될 수 있다. 본 발명에서, 5'UTR은 5'캡(cap) 및 시작 코돈 사이에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 바람직하게, 5'UTR은 5'캡(cap)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 바람직하게는 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드로부터, 단백질 코딩 영역의 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지, 바람직하게는 단백질 코딩 영역의 시작 코돈의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 서열에 상응한다. 성숙 mRNA의 5'캡(cap)의 3' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드는 일반적으로 전사 시작부에 상응한다.
5'UTR 서열이 5'UTR 서열을 정의하기 위해 사용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열 또는 이와 같은 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있다. 유전자의 5'UTR은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR에 상응하는 서열, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA에 상응하는 서열이다. 유전자의 5'UTR은 5'UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'말단 올리고피리미딘관(Oligopyrimidine Tract, TOP)은 일반적으로 핵산 분자의 5'말단 영역, 예컨대 특정 mRNA 분자의 5'말단 영역 또는 특정 유전자의 기능성 독립체 예를 들어, 전사영역의 5'말단 영역에 위치한 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)이다. 서열은 보통 전사 시작부에 상응하는 사이티딘과 함께 시작하고, 보통 약 3 ~ 30개의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치가 이어진다. 피리미딘 스트레치 그리하여 5' TOP는 TOP의 다운스트림에 위치한 제1 퓨린 뉴클레오타이드의 5'의 하나의 뉴클레오타이드로 종료된다. 5'말단 올리고피리미딘관을 함유하는 전령 RNA는 종종 TOP mRNA로서 언급된다. 따라서, 이와 같은 전령 RNA를 제공하는 유전자는 TOP 유전자로서 언급된다. TOP 서열은 예를 들어, 유전자 및 펩타이드 신장 인자를 코딩하는 mRNA 및 리보솜 단백질에서 발견된다.
본 발명에서, TOP 모티프(motif)는 상기 정의된 바와 같은 5'TOP에 상응하는 핵산 서열이다. 따라서, 본 발명에서, TOP 모티프는 바람직하게 3 ~ 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 피리미딘 뉴클레오타이드 스트레치이다. 바람직하게, TOP-모티프는 적어도 3개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 4개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 5개 피리미딘 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 6개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 7개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 적어도 8개 피리미딘 뉴클레오타이드로 이루어지고, 여기서 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 사이토신 뉴클레오타이드와 함께 이의 5'말단에서 시작한다. TOP 유전자 및 TOP mRNA에서, TOP-모티프는 바람직하게 전사 시작부와 함께 이의 5'말단에서 시작하고 상기 유전자 또는 mRNA에 제 1 퓨린 잔기의 5'의 하나의 뉴클레오타이드로 종료된다. 본 발명의 의미에서 TOP 모티프는 바람직하게 5'UTR을 나타내는 서열의 5'말단에 위치하거나 5'UTR을 코딩하는 서열의 5'말단에 위치한다. 따라서, 바람직하게, 만약 이러한 스트레치가 각각의 서열의 5'말단, 예컨대 본 발명에 따른 SM_mRNAi, 본 발명에 따른 SM_mRNAi의 5'UTR 요소, 또는 본원에 설명된 바와 같은 TOP 유전자의 5'UTR로부터 유래된 핵산 서열에 위치한다면 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 본 발명의 의미에서 "TOP 모티프"로 불리운다. 다시 말해서, 5'UTR 또는 5'UTR 요소의 5'말단에 위치하지 않고, 5'UTR 또는 5'UTR 요소 내 어디든 위치한 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 "TOP 모티프"로서 언급되지 않는다.
TOP 유전자는 일반적으로 5' 말단 올리고피리미딘관의 존재를 특징으로 한다. 더욱이, 대부분의 TOP 유전자는 성장-연관 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 갖는 TOP 유전자도 알려져 있다. TOP 유전자의 5'UTR은 TOP 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'UTR의 서열에 상응하며, 5'캡(CAP)의 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어진다. TOP 유전자의 5'UTR은 일반적으로 임의의 시작 코돈, 업스트림(upstream) AUGs(uAUGs) 또는 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORFs)을 포함하지 않는다. 거기에서, 업스트림 AUGs 및 업스트림오픈 리딩 프레임은 일반적으로 번역되어야 할 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈(AUG)의 5'에 나타나는 AUGs 및 오픈 리딩 프레임으로 이해된다. TOP 유전자의 5'UTR은 일반적으로 상대적으로 짧다. TOP 유전자의 5'UTR 길이는 20 뉴클레오타이드 ~ 500개 뉴클레오타이드까지 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 200개 뉴클레오타이드 미만이고, 약 150개 뉴클레오타이드 미만이며, 약 100개 뉴클레오타이드 미만이다. 본 발명의 의미에서, TOP 유전자의 5'UTR 예시는 위치 5의 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈(예를 들어, ATG)의 5' 바로 옆에 위치한 뉴클레오타이드까지 이어지는 핵산 서열이다. 특히 바람직한 TOP 유전자의 5'UTR의 절편은 5'TOP 모티프가 결여된 TOP 유전자의 5'UTR이다. 'TOP 유전자의 5'UTR'은 바람직하게 자연적으로 발생하는 TOP 유전자의 5'UTR을 나타낸다.
폴리(A) 서열
본 발명의 키메라 효소 RNA 발현 카세트는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.
폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 적어도 26, 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100개이고, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다.
폴리(A) 서열에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.
본 발명은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기반하여, RNA 전사 동안, 즉 시험관내 전사된 RNA의 제조 중에 부착되는 3' 폴리(A) 서열을 제공한다. 폴리(A) 서열을 코딩하는 DNA 서열(코딩 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.
DNA의 코딩 가닥에 존재하는 3' 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 ~ 50개, 바람직하게는 10 ~ 30개, 보다 바람직하게는 10 ~ 20개일 수 있다.
본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 5 ~ 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 DNA 수준에서 E.coli에서의 plasmid DNA의 일정한 증식을 나타내며, RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.
결과적으로, 본원에 기술된 RNA 분자에 함유된 3' 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 구성되지만, 4개의 뉴클레오타이드(A, C, G, U)가 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 ~ 50개, 10 ~ 30개, 10 ~ 20개일 수 있다.
아데닐산중합반응(polyadenylation)은 일반적으로 RNA 분자, 예를 들어, 미성숙 mRNA와 같은 핵산 분자에 폴리(A) 서열이 첨가되는 것으로 이해된다. 아데닐산중합반응은 소위 아데닐산중합반응 신호에 의해 유도될 수 있다. 이 신호는 아데닐산중합반응될, RNA 분자와 같은 핵산 분자의 3'말단의 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch) 내에 위치한다. 아데닐산중합반응 신호는 일반적으로 아데닌 및 우라실/티민 뉴클레오타이드로 이루어진 헥사머(hexamer), 헥사머 서열 AAUAAA 를 포함한다. 다른 서열, 헥사머 서열도 가능하다. 아데닐산중합반응은 프리-mRNA(미성숙-mRNA로도 불리우는)의 가공 중에 발생한다. RNA 성숙(프리-mRNA로부터 성숙 mRNA 까지)은 아데닐산중합반응의 단계를 포함한다.
6. mRNA의 운반체
mRNA의 운반체는 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질이라면 제한없이 포함된다. 구체적으로, 상기 전달체는 리포좀, 폴리머 기반의 나노입자(nanoparticle), 덴드리머(dendrimer), 금 나노입자(gold nanoparticle)일 수 있으며, 보다 구체적으로 유전물질 전달에 일반적으로 사용되는 양이온성 리포좀일 수 있으며, 상기 리포좀은 DC-Chol/DOPE 리포좀, DMRIE/DOPE 리포좀, EDMPC/Chol 리포좀, GL-67/DOPE/DMPE/PEG 리포좀, 또는 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 리포좀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
6.1. 폴리머
mRNA 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산(Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological propertii of soluble chitosan and chitosan microspheri. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.
6.2. 리포좀 및 니오좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질주입에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호 작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
리포좀이 인지질을 이용하여 만들어지는 것에 반하여 니오좀(niosome)은 사용하고 비-이온성 계면활성제(nonionic surfactant) 및 콜레스테롤(choliterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있으며, 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고, 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.
6.3. 나노입자
본 명세서 상의 용어 나노입자는 수 ~ 수백 나노미터의 크기를 갖는 생체 적합성 고분자 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락티드코글리콜리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 또는 혈청 알부민이 이에 해당할 수 있다.
한편, 상술한 본 발명의 mRNA 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.
본 발명의 mRNA 및 이의 조성물을 포함하는 본 발명의 생리활성 펩타이드를 포함하는 융합단백질 mRNA는 세포질 내에서 융합단백질의 번역을 5'캡구조, 5'UTR 요소 및 3'UTR 요소 부가를 통해 융합단백질 mRNA의 발현을 향상시키고, 분비되고 안정성이 있는 생리활성 펩타이드를 제공할 수 있는바, 투여 회수를 줄이면서도 장기간의 생리활성 펩타이드가 요구되는 질환의 치료 표적으로 활용될 수 있다.
도 1은 제조된 mRNA, Protamine 및 Hyaluronic acid를 일정한 몰비로 혼합하여 제조된 HuPNP의 제조의 흐름도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시례 1. 융합단백질 mRNA 제조
프로타민 및 히알루론산은 주사용 의료 등급으로 구매하였다. 시판 중이거나 임상 2상 이상 진행 중인 생리 활성 펩타이드를 포함하는 의료용 융합단백질들을 대상으로 본 발명에 사용할 생리활성 펩타이드로 인슐린, GLP1, GDF15 및 FGF21 등을 선정하였다.
실시례 2. 관심 오픈 리딩 프레임(ORF) mRNA의 설계
생리활성 펩타이드를 포함하는 융합단백질, 관심 단백질(POI)를 인코딩하는 mRNA가 형질주입된 세포는 POI를 효율적으로 분비하고 혈액 내 안정성을 확보하여 효능을 실현할 수 있도록 하는 ORF를 설계해야 한다.
설계된 ORF의 구조는 Signal peptide, 관심 단백질의 활성 도메인, 링커 및 혈액에서 안정화를 위한 도메인으로 구성하며, 아래와 그림과 같이 설계된 ORF에서 Signal Peptide는 Secrecon-AA; linker는 GS(GGGGS)4; 및 혈액에서 안정성을 위한 도메인은 알부민 결합 도메인(ABD)들에서 ABD-H를 선정하거나 Fc를 사용할 수 있다.
Figure pat00001
설계된 ORF를 Reverse-translation하여 관심 mRNA의 염기서열을 결정하였다.
관심 mRNA의 제조는 mRNA template를 먼저 제조하며 이의 구성성분은 디음과 같다.
> T7 Promoter:
주형 디자인은 모든 전사의 필수적인 부분으로 CleanCap GG는 시작 시퀀스 5' GGG 3'과 함께 사용함. 그림 2는 CleanCap GG의 올바른 T7 프로모터 서열(밑줄)과 개시자 서열(이탤릭체)임.
Figure pat00002
> 5'-UTR:
5’-GGGACATTTG CTTCTGACAT AGTTGTGTTG ACTCACAACC CCAGAAACAG ACATCC-3’
여기서, 상기 서열에 5’CAP 구조가 필요하면 CleanCap의 부가를 위해서, 상기 서열의 5’말단에 5’-GGG-3’를 추가함.
> 3’-UTR-A64-C30-SL
5’-GCCCGATGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCGAGATTA ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATGCA TCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCAAAGGCTC TTTTCAGAGC CACCA-3’ .
mRNA template는 <T7 Promoter-5’UTR-0RF-3’-UTR-A64-C30-SL> DNA로 주문 제작하였다.
mRNA의 제조는 mRNA template에 대해 CleanCap AG (Trilink사, 미국) 및 Modified NTP를 포함하도록 하는 세포외 전사 방법(NEB 사, 미국)으로 제조하였다. mRNA의 구조는 아래 그림과 같다.
Figure pat00003
제조된 mRNA를 분석 하였다.
실시례 2. HuPNP 제조 및 물리화학적 평가
제조 mRNA 운반시스템은 HuPNP를 사용하였으며 도1과 같이 제조된 음이온성 고분자 mRNA, 양이온성 고분자 프로타민 및 음이온성 고분자 히알루론산을 일정한 몰비로 혼합하여 제조된 mRNA-HuPNP를 Extraction하여 균질화 HuPNP를 제조하였다. 제조된 mRNA-HuPNP의 물리화학적 성질 분석, 제조된 mRNA-HuPNP의 동결건조 및 재수화 평가 그리고 mRNA-HuPNP에서 mRNA의 방출 패턴 분석하였다.
실시례 3. mRNA HuPNP의 효능 평가
세포내 관심 단백질 합성 평가을 하였다. ICR 마우스 웅성 7주령 24마리를 1주일간 실험동물실 환경에서 적응시킨 후 8마리씩 세 그룹으로 나눈 후 15시간 동안 fasting 시킨다. mRNA-HuPNP 0.1μg/㎏ ~ 10 μg/㎏ 구간을 적절하게 배분하여 선정된 정량을 PBS에 현탁하여 투여하고 동시에 glucose 3 g/㎏을 경구 투여한 그룹과 glucose와 PBS를 경구 투여한 그룹의 혈당을 투여 후 30분 간격으로 210분간 혈당을 측정한다. 혈당 측정을 위한 혈액 샘플은 ICR 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈당 측정용 기기를 이용하여 측정한다.
마우스 약동학적 특성: 정량의 mRNA-HuPNP를 PBS(pH 7)에 현탁하여 ICR 마우스 웅성 7주령에 투여한다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈장을 처리하고, 둘 모두의 투여 경로 후 최대 4일까지 관심 단백질 농도를 측정한다. 마우스에서 단백질 발현이 mRNA에 대해 선형 용량 의존성을 확인하기 위해, mRNA 용량의 3배 및 10배 증가에 따라 단백질 활성의 3배 및 10배 증가를 가져올지 분석하였다.
ICR 마우스 웅성 7주령 24마리를 1주일간 실험동물실 환경에서 적응시킨 후 8마리씩 세 그룹으로 나눈 후 15시간 동안 fasting 시킨다. 상기 용량 결정시험으로 결정된 두 종류의 mRNA-HuPNP의 정량을 PBS에 현탁하여 투여하고 동시에 glucose 3 g/㎏을 경구 투여한 그룹과 glucose와 PBS를 경구 투여한 그룹의 혈당을 투여 후 30분 간격으로 210분간 혈당을 측정한다. 혈당 측정을 위한 혈액 샘플은 ICR 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈당 측정용 기기를 이용하여 측정한다.
실시 4. mRNA HuPNP의 안정성 평가
일반적으로 사용하는 지질 시스템인 LNP의 한계는 내약성 및 치료 지수에 영향을 미칠 수 있는 단일 및 반복 투여시 염증 반응의 가능성임. 평가대상 HuPNP 시스템은 생체 내 반복 투여에도 내성이 높고 HuPNP 비히클 관련 독성을 최소화할 수 있는 가정에서 개발한 내용은 면역 체계를 피하고 생분해되는 인체유래 고분자전해질 분자를 사용한 것임. 마우스에 0.2mg/kg 정맥으로 투여된 평가대상 HuPNP는 혈장 및 투여 후 12시간 후 다양한 기관에서 HuPNP의 신속한 제거에 의한 잔류 상태 분석하였다.
평가대상 HuPNP 구성성분이 유도 면역 자극이 잠재적으로 면역의 효과를 높일 수 있는 가정에도, 원치 않는 국소 면역 반응을 줄이면서 mRNA는 원하는 면역 반응 또는 반응 원성을 유지할 수 있지를 확인. 0.1mg의 mRNA를 포함하는 HuPNP를 마우스에 단일 근육 투여 2일 후 헤마톡살린 및 에오신으로 염색된 근육의 조직 시료를 관찰하여 염증과 근육 세포 괴사 분석하였다.

Claims (19)

  1. (a) 5'CAP 구조 또는 IRES;
    (b) 5‘UTR;
    (c) (i) 신호 펩타이드; (ii) 생리활성 펩타이드 군에서 선택되어진 어느 하나 이상; (iii) 링커; 및 (iv) 혈중 반감기를 증가시키는 펩타이드;를 포함하는 오픈 리딩 프레임(Open reading frame, ORF); 및
    (d) 3'UTR를 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    (e) 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 추가적으로 포함하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호는 3'-UTR 요소의 3'에 위치한 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(C) 서열 및 히스톤 스템-루프를 추가적으로 포함하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 신호 펩타이드는 분비신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는
    호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 또는 수용체 길항물질인, 결합체를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드는
    글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 (GIP), 성장 분화 인자 15(GDF15: growth differentiation factor 15), 글루카곤, 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 옥신토모듈린, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민,α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 결합체를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커는
    글리신-세린 기재 링커, 글리신-프롤린 기재 링커, 프롤린 알라닌 기재 링커 및 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 부위를 갖는 폴리펩티드 링커를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 혈중 반감기를 증가시키는 펩타이드는
    면역글로불린 Fc 단편, 알부민, 알부민 결합펩타이드, XTEN 또는 트랜스페린의 전장, 절단된 또는 변이체 형태를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임은 추가적으로 세포 침투 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항에 있어서, 상기 mRNA는
    양이온성 또는 다가양이온성 화합물 또는 폴리머 담체와 관련되거나 또는 복합화되며, 바람직하게 양이온성 또는 다가양이온성 화합물 및/또는 폴리머 담체와 함께 대비 mRNA의 약 6:1 (w/w) 내지 약 0.25:1(w/w), 더욱 바람직하게 약 5:1 (w/w) 내지 약 0.5:1 (w/w), 더욱 더 바람직하게 약 4:1 (w/w) 내지 약 1:1(w/w) 또는 약 3:1 (w/w) 내지 약 1:1 (w/w) 및 가장 바람직하게 약 3:1 (w/w) 내지 약 2:1 (w/w)의 비율의 범위로부터 선택된 중량비로; 또는
    선택적으로 약 0.1-10의 범위, 바람직하게 약 0.3-4 또는 0.3-1의 범위, 및 더욱 바람직하게 약 0.5-1 또는 0.7-1의 범위, 및 가장 바람직하게 약 0.3-0.9 또는 0.5-0.9의 범위로 양이온성 또는 다가양이온성 화합물 및/또는 폴리머 담체 대비 mRNA의 질소/인 비율로, 양이온성 또는 다가양이온성 화합물 또는 폴리머 담체와 관련되거나 또는 복합화되는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 mRNA은 양이온성 단백질 또는 펩타이드, 바람직하게 프로타민과 관련되거나 또는 복합화되는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  13. 제11항 내지 제12항에 있어서, 상기 조성물에 추가적으로 음이온성 또는 다가음이온성 화합물 또는 폴리머 담체와 관련되거나 또는 복합화되는 것을 특징으로 하는 mRNA 및 mRNA의 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 mRNA를 포함하는 세포.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle), 희석제 및/또는 부형제 및/또는 하나 이상의 어쥬번트(adjuvants)를 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항에 따른 약학적 조성물의 백신 용도 또는 유전자 치료 용도.
  17. 제1항 내지 제16항에 따른 약학적 조성물을 이것이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환(disorder)을 치료 또는 예방하는 방법.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 mRNA를 세포에 형질주입하는 단계를 포함하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포의 형질주입은 인비트로(in vitro)/엑스비보(ex vivo)에서 수행되며, 형질주입된 세포는 이것이 필요한 개체, 바람직하게 인간 환자에 투여되는 방법.
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