ES2567634T3 - Proteínas de fusión de albúmina - Google Patents

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ES2567634T3 ES05722848.8T ES05722848T ES2567634T3 ES 2567634 T3 ES2567634 T3 ES 2567634T3 ES 05722848 T ES05722848 T ES 05722848T ES 2567634 T3 ES2567634 T3 ES 2567634T3
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Paul A. Moore
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Abstract

Una proteína de fusión de albúmina que comprende dos o más polipéptidos de Péptido 1 de Tipo Glucagón (GLP-1) orientados en tándem, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: (a) la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1; o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1; fusionada a: (i) una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; o (ii) una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HSA/kex2 modificada del SEQ ID NO: 112.

Description

Proteínas de fusión de albúmina
Referencia a la lista de secuencias en disco compacto
Esta solicitud se refiere a una ~Lista de Secuencias~ enumerada más abajo, que se proporciona como un documento electrónico en tres discos compactos idénticos (CD-R), marcados como quot;Copia 1quot;, quot;Copia 2,quot; y quot;Copia 3.quot; Estos discos compactos contienen, cada uno, el archivo quot;PF612PCT Sl.txtquot; (929.048 bytes, creado el 7 de Febrero de 2005), que se incorpora como referencia en su totalidad
Antecedentes de la invención
La invención se refiere en general a proteínas Terapéuticas (incluyendo, pero no limitadas a, al menos un polipéptido, anticuerpo, péptido, o fragmento y variante del mismo) fusionadas a albúmina o fragmentos o variantes de albúmina. La invención incluye polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina, proteínas de fusión de albúmina terapéuticas, composiciones, composiciones farmacéuticas, formulaciones y kits. Las células anfitrionas transformadas con los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina terapéuticas también están incluidas en la invención, como los métodos para elaborar las proteínas de fusión de albúmina de la invención utilizando estos polinucleótidos, y/o células anfitrionas
La albúmina de suero humana (HSA, o HA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 (SEO ID NO: 1)), es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como portador de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico es producida mediante extracción a partir de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos ha sido descrita en el documento EP 330 451 yen el documento EP 361 991 .
Las proteinas terapéuticas en su estado nativo o cuando son producidas recombinantemente, tales como los inlerferones y las hormonas de crecimiento, son típicamente moléculas lábiles que muestran vidas útiles cortas, particularmente cuando se formulan en disoluciones acuosas. La inestabilidad de estas moléculas cuando se formulan para la administración dicta que muchas moléculas deban ser liofilizadas y refrigeradas en todo momento durante el almacenamiento, haciendo de ese modo que las moléculas sean dificiles de transportar y/o almacenar Los problemas de almacenamiento SOfl particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas deben ser almacenadas y dispensadas fuera del entorno hospitalario.
Se han propuesto algunas soluciones prácticas para los problemas de almacenamiento de las moléculas de proteína lábiles. Por consiguiente, existe la necesidad de formulaciones de larga duración, estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que sean fácilmente dispensadas, preferiblemente con una formulación simple que requiera una manipulación post-almacenamiento minima.
Tras la administración in vivo, las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando SOfl producidas recombinantemente, tales como interferones y hormonas de crecimiento, muestran una breve estabilidad en plasma debido al rápido aclaramiento del torrente sanguíneo. Por consiguiente, los efectos terapéuticos proporcionados por estas proteínas también son efímeros. De este modo, con el fin de mantener su efecto terapéutico deseado in vivo, el rápido aclaramiento de la sangre de estas proteínas dicta que las moléculas terapéuticas deban ser administradas más frecuentemente o a una dosis superior. No obstante, el incremento del programa de dosificación para la administración de la protelna terapéutica a menudo da como resultado un aumento de las reacciones en los sitios de inyección, de los efectos secundarios, y de la toxicidad en el paciente. De un modo similar, la administración de la proteína terapéutica a una dosis más alta normalmente también da como resultado un aumento de la toxicidad y de los efectos secundarios en el paciente
Las pocas soluciones prácticas para incrementar la estabilidad en plasma de las moléculas terapéuticas que se han propuesto, incluyendo la conjugación química, han proporcionado beneficios limitados al paciente. Generalmente, en la mayoría de los casos, estas moléculas terapéuticas químicamente modificadas todavía se administran con un programa de dosificación frecuente, manteniendo reacciones significativas en los sitios de inyección, efectos secundarios, y toxicidad en los pacientes. Por consiguiente, existe la necesidad de una forma estabilizada de moléculas terapéuticas que mantengan una mayor estabilidad en plasma in vivo que el agente terapéutico nativo o producido de manera recombinante solo y se puedan administrar menos frecuentemente, disminuyendo de ese modo los efectos secundarios potenciales para el paciente.
Compendio de la invención
La presente invención incluye proteínas de fusión de albumina que comprenden dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1; o (e) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 fusionado a una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID
NO: 1 en donde la proteina de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112 . La presente invención también incluye polinucleótidos que comprenden, o alternativamente consisten en, moléculas de ácido nucleico que codifican dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1; o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 fusionado a una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112. La presente invenciórJ también incluye polinucleótidos, que comprenden, o alternativamente consisten en, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que comprenden las proteínas de fusión de albúmina de la invención, lo que es suficiente para prolongar la vida útil de la proteína de polipéptido GLP-1 , para incrementar la estabilidad en plasma del polipéptido GLP-1 en comparación con su estado no fusionado, ylo estabilizar el polipéptido GLP-1 n y/o su actividad en disolución (o en una composición farmacéutica) in vitro ylo in vivo. Las proteinas de fusión de albúmina codificadas por un polinucleótido de la invención también están incluidas en la invención, al igual que las células anfitrionas transformadas con los polinucleótidos de la invención, y los métodos de elaboración de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y la utilización de estos polinucleótidos de la invención, y/o células anfitrionas.
Asimismo se describen, proteínas de fusión de albúmina descritas en la Tabla 2 y los polinucleótidos que codifican ta les proteinas
La invención también incluye formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de albúmina de la invención y un diluyente o portador farmacéuticamenle aceptable. Tales formulaciones pueden estar en un kit o recipiente. Semejantes kit o recipiente pueden estar empaquetados con las instrucciones pertinentes a la vida útil prolongada del polipéptido GLP-1. Tales formulaciones se pueden utilizar en métodos de tratamiento, prevención, alivio o diagnóstico de una enfermedad o síntoma de enfermedad en un paciente, preferiblemente un mamifero, muy preferiblemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente
Asimismo se describen métodos de prevención, tratamiento, o alivio de una enfermedad o trastorno, incluyendo un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerados en la Tabla 1 que comprenden administrar a un paciente en el que se desea semejante tratamiento, prevención o alivio una proteína de fusión de albúmina de la invención en una cantidad eficaz para trata r, prevenir o aliviar la enfermedad o trastorno
En una realización, una proteína de fusión de albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 tiene una vida útil prolongada.
En una segunda realización, una proteína de fusión de albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 es más estable que la correspondiente molécula terapéutica no fusionada descrita en la Tabla 1.
También se describen organismos transgénicos modificados para que contengan moléculas de ácido nucleico de la invención (incluyendo, pero no limitados a, los polinucleótidos descritos en las Tablas 1 y 2), preferiblemente modificados para expresar una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 A-O muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEO ID NO· 1) Y un polinucleólido que la codifica (SEO ID NO: 2). Los nudeólidos 1 a 1755 del SEO ID NO: 2 codifican la forma madura de la albúmina humana (SEO ID NO: 1).
La Figura 2 muestra el mapa de restricciórJ del vector de clonación pPPCOOO5, depósito de la ATCC PTA-3278.
La Figura 3 muestra el mapa de restricción del vector de expresión de la levadura S. cerevisiae pSAC35 (Sleep et al., BioTechnology 8:42 (1990».
La Figura 4 muestra el efecto de diversas diluciones de las protelnas de fusión de IFNb y albúmina codificadas por el AON comprendido en CID 2011 Y 2053 sobre la actividad SEAP en células indicadoras ISRE-SEAP/293F (véase el Ejemplo 76). Las proteinas se diluyeron seriadamente de Se-7 a 1e-14 glml en OMEMfFBS al 10% y se utilizaron para tratar las células indicadoras ISRE-SEAPf293F. Después de 24 horas los sobrenadantes se separaron de las células informadoras y se analizaron para determinar la actividad SEAP. La proteina de fusiórJ de IFNb y albúmina se purificó a partir de tres clones estables: 293F/núm. 2011, CHO/núm. 2011 y NSO/núm. 2053. El IFNb derivado de mamífero, Avonex, procedla de Biogen y se informó de que tenia una actividad especifica de 2.0e5 Ulfug.
La Figura 5 compara la actividad anti-proliferativa de la proteína de fusión de albúmina e IFN codificada por CID 3165 (proteína CID 3165) e IFNa recombinante (rIFNa) sobre células de melanoma Hs294T. Las células se cultivaron con concentraciones variables de proteína CID 3165 o rlFNa y se midió la proliferación mediante la incorporación de 8rdU después de 3 días de cultivo. La proteína CID 3165 causó una inhibición medible de la proliferación celular a concentraciones por encima de 10 nglml con una inhibición de 50% lograda a aproximadamente 200 nglml. (. ) == proteina CID 3165, (+ ) == rlFNa
La Figura 6 muestra el efecto de diversas diluciones de proteínas de fusión de IFNa y albúmina sobre la actividad SEAP en las células indicadoras JSRE-SEAP/293F. Se sometió a ensayo una preparación de IFNa fusionado aguas arriba de la albúmina (+ ), así como dos preparaciones diferentes de IFNa fusionado aguas abajo de la albúmina (_) y(. )
La Figura 7 muestra el efecto del tiempo y la dosis de la proteína de fusión de IFNa y albúmina codificada por el AON comprendido en el constructo 2249 (proteina CID 2249) sobre el nível de ARNm de OAS (p41) en monos tratados (véase el Ejemplo 78). Por punto horario : primera barra:; Control con vehículo, 23 barra == 30 ¡.Jg/kg de proteína CID 2249 día I iv, tercera barra == 30 ¡.Jglkg de proteína CID 2249 día I sc, 4quot; barra == 300 ¡.Jglkg de proteína CID 2249 día I se, 5a barra == 40 ¡.Jglkg de IFNa recombinante día 1, 3 Y 5 sc
La Figura 8 muestra la relación dosis-respuesta de las proteínas de fusión de BNP y albúmina codificadas por AON comprendido en los constructos CID 3691 Y 3618 (proteína CID 3691 Y 3618) sobre la activación de la formación de cGMP en células indicadoras NPR-Al293F (véanse los Ejemplos 80 y 81). Se sometieron a ensayo tanto BNP recombinante (. ), como, dos preparaciones diferentes de BNP utilizadas aguas arriba de la albúmina (o) y (_)
La Figura 9 muestra el efecto de la proteína de fusión de BNP y albúmina sobre la presión arterial media en ratas espontáneamente hipertensas (véase el Ejemplo 80). Se suministraron vehículo (o), proteínas BNP recombinante (_), o proteina de fusión de BNP y albúmina (o) a través de inyección en la vena de la cola. Se registraron las presiones sanguineas sistólica y diastólica por el método del manguito en la cola
La Figura 10 muestra los niveles de GMPc en plasma en ratones C57/BL6 macho de 11 a 12 semanas de edad después de la inyección intravenosa de proteína BNP recombinante (+ ) o proteína de fusión de BNP y albúmina (o (véase el Ejemplo 80). Los niveles de GMPc se determinaron a partir de plasma preparado de tomas de muestras de sangre de la cola en diferentes momentos puntuales después de la inyección intravenosa.
La Figura 11 muestra los niveles de glucosa en sangre en ratones dbfdb diabéticos de 8 semanas de edad mantenidos en ayunas 24 horas después de la administración individual de fusión de GLP-1(7-36A8G)2x-HSA en tándem (CID 3610) (O), fusión de GLP-1(7-36A8G}-HSA monomérico (fi), o HSA sola (_). Los niveles de glucosa en sangre se midieron mediante un ensayo de tolerancia a la glucosa oral. La fusión de GLP-1(7-36A8G)2x-HSA en tándem (CID 3610) (O) tuvo una actividad normalizadora de la glucosa inesperada más potente que la fusión de GLP-1(7-36A8G)-HSA mooomérica (fi) 24 horas después de la administración individual a ratones dbfdb diabéticos de 8 semanas de edad mantenidos en ayunas.
Descripción detallada
Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados a lo largo de toda esta memoria descriptiva
Según se utiliza en la presente memoria, MpolinucleótidoH se refiera a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucle6tidos que codifica una proteina de fusión que comprende, o altemativamente consiste en, al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o una variante de la misma) unida en marco a al menos una Proteína terapéutica X (o fragmento o variante de la misma); una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucle6tidos que codifica una proteína de fusión que comprende, o altemativamente consiste en, la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: Y (como se describe en la columna 6 de la Tabla 2) o un fragmento o una variante de la misma; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o altemativamente consiste en la secuencia mostrada en el SEO ID NO: X; una molécula de ácido nudeico que tiene una secuencia de nudeótidos que codifica una proteina de fusión que comprende, o alternativamente consiste en, la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: Z; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención generada como se describe en la Tabla 2 o en los Ejemplos; una molécula de ácido nudeico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de albúmina Terapéutica de la invención, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en un constructo de fusión de albúmina descrito en la Tabla 2, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en un constructo de fusión de albúmina depositado en la ATCC (como se describe en la Tabla 3).
Según se utiliza en la presente memoria, quot;constructo de fusión de albúminaquot; se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende, o alternativamente consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o una variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al menos una molécula de una proteina Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma); una molécula de ácido nucleico que comprende, o altemativamente consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o una variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al menos una molécula de una proteína terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) generada como se describe en la Tabla 2 o en los Ejemplos; o una molécula de ácido nucleico que comprende, o altemativamente consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o una variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al menos una molécula de una proteína terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma), que comprende adicionalmente, por ejemplo, uno o más de los siguientes elementos: (1) un vector auto-replicante funcional (incluyendo pero no limitado a, un vector lanzadera, un vector de expresiÓfl, un vector de integración, y/o un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como por ejemplo, un promotor regulable o inducible, un promotor constitutivo), (3) una regiÓfl para la terminación de la transcripción, (4) una secuencia líder, y (5) un marcador seleccionable. El polinucleótido que codifica la proteína Terapéutica y la proteína de albúmina, una parte del constructo de fusión de albúmina, pueden ser referidos cada uno como ~porción,~ ~regiónquot; o quot;radicalquot; del constructo
de fusión de albúmina.
La presente invención se refiere en general a polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina; proteínas de fusión de albúmina; y describe métodos de tratamiento, prevención, o alivio de enfermedades o trastornos utilizando proteínas de fusiÓfl de albúmina o polinucleótidos que codifican proteinas de fusión de albúmina. Según se utiliza en la presente memoria, quot;proteina de fusión de albúminaquot; se refiere a una proteína formada por la fusión de al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o una variante de la misma) con al menos una molécula de una proteina Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma). Una proteina de fusión de albúmina de la invención comprende dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagán (GLP1 ) orientados en tándem en donde dicha proteina de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1;
o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia lider HASfKEX 2 modificada del SEO ID NO: 112, que están asociados entre sí por medio de fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina es generada por traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una parte de una proteína Terapéutica está unido en marco a un polinucleótido que codifica toda o parte de la albúmina). La proteína Terapéutica y la proteína de albúmina, que forman una parte de la proteína de fusión de albúmina, pueden ser referidas cada una como quot;porciónquot;, quot;regiÓflquot; o quot;radicalquot; de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., una quot;porción de una proteína Terapéuticaquot; o una quot;porción de una proteína de albúminaquot;). En una realización muy preferida, una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos una molécula de dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1 , o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y al menos una molécula de albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112
En una realización preferida adicional, una proteína de fusión de albúmina de la invención es procesada por una célula anfitriona y secretada al medio de cultivo circundante. El procesamiento de la proteína de fusión de albúmina naciente que se produce en las rutas secretoras del anfitrión utilizado para la expresión puede incluir, pero no se limita a, la escisión del péptido señal; la formación de enlaces disulfuro; el plegamiento apropiado; la adición y procesamiento de carbohidratos (tal como por ejemplo, glicosilaciÓfl unida a N-y 0 -); las escisiones proteoliticas específicas; y el ensamblaje en proteínas multiméricas. Una proteína de fusión de albúmina de la invención se encuentra preferiblemente en la forma procesada. La quot;forma procesada de una proteína de fusiÓfl de albúminaquot; se refiere a una proteína de fusión de albúmina producto que ha experimentado escisiÓfl del péptido señal N-terminal, también referido en la presente memoria como quot;proteína de fusión de albúmina maduraquot;.
En varios casos, se depositó un clon representativo que contenía un constructo de fusión de albúmina de la invención en la Colección de Cultivos Tipo Americana (referida en la presente memoria como quot;ATCC®quot;). Además, es posible recuperar un constructo de fusión de albúmina dado del depósito por medio de mecanismos conocidos en la técnica y descritos en alguna parte en la presente memoria. La ATCC® está localizada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA. Los depósitos de la ATCC® se realizaron de acuerdo con los términos del Tratado de Sudapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microoganismos para los fines del procedimiento de patentes
En una realización, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina que comprende, dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1 ) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1 , o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1· o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112. En una realización adicional, la invención proporciona una proteína de
fusión de albúmina que comprende dos o más polipéptidos del péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1 , o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 , Y una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1· o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112. Asimismo se describe un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina cuya secuencia se muestra como SEO ID NO: Y en la Tabla 2. En realizaciones preferidas, el componente de proteína de albúmina del suero de la proteína de fusiórJ de albúmina es la porción madura de la albúmina de suero La invención abarca adicionalmente polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusiórJ de albúmina
En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o altemativamente consiste en, dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1, o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1, Y un fragmento biológicamente activo y/o terapéutica mente activo de albúmina de suero. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente consiste en, dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucag6n (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1; o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y una variante biológicamente activa y/o terapéutica mente activa de albúmina de suero. En realizaciones preferidas, la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la proteína Terapéutica. En una realización preferida adicional, la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es el dominio soluble extracelular de la proteína Terapéutica. En una realización alternativa, la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es la forma activa de la proteína Terapéutica La invención abarca adicionalmente polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina.
Proteínas terapéuticas
Como se ha establecido anteriormente, un polinucleátido de la invenciórJ codifica una proteína que comprende dos o más pol ipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387; (b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO· 387, en donde dicha va riante tiene actividad GLP-1, o (e) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112, que están asociados entre sí, preferiblemente peor medio de fusión genética.
Una realización adicional incluye un polinucleótido que codifica una proteína que comprende dos o más polipéptidos de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1) orientados en tándem en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (a) la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387;
(b) una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1 , o (c) un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 y una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1. o una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO· 1 en donde la proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia líder HAS/KEX 2 modificada del SEO ID NO: 112, que están unidos entre sí mediante conjugación química
Según se utiliza en la presente memoria, Hprotelna TerapéuticaH se refiere a protelnas, polipéptidos, anticuerpos, péptidos o fragmentos o variantes de los mismos, que tienen una o más actividades terapéuticas y/o biológicas. Las proteínas terapéuticas descritas en la presente memoria incluyen, proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, y agentes biológicos. Los términos péptidos, proteínas, y polipéptidos se utilizan indistintamente en la presente memoria). Se contempla específicamente que el término quot;proteína TerapéuticaHabarque anticuerpos y fragmentos y variantes de los mismos. De este modo una proteína descrita en la presente memoria puede contener al menos un fragmento o variante de una proteína Terapéutica, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Adicionalmente, el término quot;proteína Terapéuticaquot; puede hacer referencia a un correlato, endógeno o de origen natural, de una proteína Terapéutica.
Por polipéptido que presenta una quot;actividad terapéuticaquot; o proteína que es quot;terapéuticamente activaquot; se quiere significar un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas conocidas asociadas con una proteína terapéutica tal como una o más de las proteínas Terapéuticas descritas en la presente memoria o
conocidas de otro modo en la técnica _Como ejemplo no limitante, una quot;proteína Terapéuticaquot; es una protelna que es útil para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad, afección o trastomo. Como ejemplo no limitante, una quot;proteína Terapéuticaquot; puede ser una que se une específicamente a un tipo de célula concreto (normal (p_ej_, linfocilos) o anormal p. ej., (células cancerosas)) y por lo tanto se puede utilizar para dirigir un compuesto (fármaco, o agente citotóxico) a ese tipo de célula específicamente.
Por ejemplo, una lista no exhaustiva de porciones de quot;proteínas Terapéuticasquot; que pueden estar incluidas en una proteína de fusión de albúmina descrita en la presente memoria incluye, pero no se limita a, GLP-1, GLP-2, PACAP27, PACAP-28, VIP, CD4M33, secretina, glicentina, oxintomodulina, PHM, IFNa, IFNp, ANP, BNP, NGF, BDNF, GDNF, Y somalostatina_
También se pueden fusionar híbridos de interferón al extremo amino o carboxi de la albúmina para formar una proteína de fusiÓfl de albúmina híbrida de interferón. La proteína de fusión de albúmina híbrida de interferón puede tener una actividad de interferón polenciada, o altemalivamente. suprimida. tal como larespuestaantiviral. la regulación del crecimienlo celular, y la modulaciÓfl de la respuesta inmunitaria (Lebleu et al., PNAS USA, 73:31073111 (1976); Gresser et al., Nature, 251 :543-545 (1974); y Johnson, Texas Reports Biol Med, 35:357-369 (1977». Cada proleína de fusión de albúmina híbrida de interferón se puede utilizar para tratar, prevenir, o aliviar infecciones virales (p. ej., hepatitis (p. ej ., VHC); o VIH), esclerosis múltiple o cáncer.
En otro ejemplo no limitante, la quot;proteína Terapéuticaquot; es una proteína GLP-1 que tiene una actividad biológica, y en particular, una actividad biológica que es útil para el tratamiento, la prevención o el alivio de una enfermedad. Una lista no inclusiva de actividades biológicas que pueden ser poseídas por la proteína Terapéutica incluye, estimulación de la secreción de insu lina, supresión del apetito, o una o más cualesquiera de las actividades biológicas descritas en la sección quot;Actividades Biológicasquot; de más abajo y/o como se describe para una proteína Terapéutica dada en la Tabla 1 (columna 2)
En una realización, se utilizan fusiones de GLP-l-HSA para regular los niveles de glucosa en pacientes diabéticos En una rea lización adicional, se utilizan fusiones en tándem de GLP-l de tipo salvaje o mutante para regular los niveles de glucosa en sangre en pacientes diabéticos. Por ejemplo, la capacidad de las fusiones de monómero de GLP-1(7-36A8G)-HSA y GLP-l(7-36A8G}-HSA (CID 3610) en tándem para regular los niveles de glucosa en sangre se evaluaron utilizando un ensayo de tolerancia a la glucosa oral (1 gramo de glucosafkg por gavaje oral), después de la inyección subcutánea de proteína GLP-l -HSA en ratones dbfdb diabéticos de 8 semanas de edad _ Este ensayo de tolerancia a la glucosa consistió en la inyección subcutánea de una fusión de GLP-l -HSA seguido de la administración de 1 gramo de glucosafkg por gavaje ora l. A los ratones db/db diabéticos mantenidos en ayunas se les administraron dosis equimolares (100 y 171 nmolesfkg) de proteína de fusiÓfl de GLP-1-HSA en monómero o en tándem y los ensayos de tolerancia a la glucosa oral se realizaron 6 o 24 horas después de una sola administración Bastante sorprendente e inesperadamente, la fusión GLP-1(7-36A8G}-HSA en tándem (CID 3610) redujo significativamente la glucosa en sangre a las 6 horas de la inyección cuando se comparó con la fusión GLP-1(736A8G)-HSA en monómero. Además, la diferencia entre las fusiones GLP-I(7-36A8G)-HSA en monómero y GLP1(7-36A8G)-HSA en tándem (CID 3610) fue incluso más drástica cuando se evaluaron los ratones db/db diabéticos 24 horas después de la inyección_ Como se muestra en la Figura 11, la fusión GLP-l(7-36A8G}-HSA en tándem (CID 3610) (O) poseía una actividad normalizadora de la glucosa inesperadamente potente mientras los niveles de glucosa en sangre en ayunas para la fusión GLP-1 (7-36A8G)-HAS (.6.) individual fue similar a la de los animales a los que se había administrado HSA sola (_) y eran claramente diabéticos por naturaleza
Según se utiliza en la presente memoria, quot;actividad terapéuticaquot; o quot;actividadquot; puede hacer referencia a una actividad cuyo efecto es compatible con un resultado terapéutico deseable en seres humanos, o a los efectos deseados en mamíferos no humanos o en otras especies u organismos. La actividad terapéutica se puede medir in vivo o in vitra. Por ejemplo, un efecto deseable puede ser analizado en cultivo celular. Tales análisis in vitra o cultivo celular se encuentran comúnmente disponibles para muchas proteínas Terapéuticas descritas en la técnica. Los ejemplos de los análisis incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos en la presente memoria en la sección Ejemplos o en la columna quot;Análisis de la Actividad Ilustrativaquot; (columna 3) de la Tabla 1.
Las proteínas Terapéuticas correspondientes a la porción de la proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, tal como la superficie celular y las proteínas secretoras, a menudo están modificadas por el anclaje de uno o más grupos de oligosacáridos_ La modificación, referida como glicosilación, puede afectar drásticamente a las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, la secreción, y la localización de la proteína. La glicosilación se produce en localizaciones específicas a lo largo de la cadena principal polipeptídica_ Existen normalmente dos tipos principales de glicosilaciÓfl: la glicosilación caracterizada por oligosacáridos conectados a 0, que están anclados a residuos de serina o Ireonina; y la glicosilaciÓll caracterizada por oligosacáridos conectados a N, que están anclados a residuos de asparragina en una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. El ácido N-acetilneurámico (también conocido como ácido siálico) es normalmente el residuo terminal de los oligosacáridos tanto unidos a N como unidos a O. Las variables tales como la estructura de la proteína y el tipo de célula inHuyen en el número y la naturaleza de las unidades de carbohidrato dentro de las cadenas en diferentes sitios de glicosilación Los isómeros de glicosilación también son comunes en el mismo sitio dentro de un tipo de célula dado.
Las proteínas Terapéuticas correspondientes a la porción de la proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, así como los análogos y las variantes de las mismas, se pueden modificar de manera que la glicosilación en uno o más sitios resulta alterada como resultado de la manipulación de su secuencia de ácido nucleico, por la célula anfitriona en la cual son expresadas, o debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, los isómeros de glicosilación pueden ser producidos anulando o introduciendo sitios de glicosilación, p. ej., mediante sustitución o deleciórJ de residuos de aminoácidos, tales como la sustitución de glutamina por asparragina,
o se pueden producir proteinas recombinantes no glicosiladas mediante la expresión de las proteinas en células anfitrionas que no las glicosilarán, p. ej., en F coli o levadura de glicosilación deficiente. Estos enfoques se describen con más detalle más abajo y son conocidos en la técnica.
Las proteínas terapéuticas, descritas en la Tabla 1, y sus secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos son bien conocidas en la técnica y se encuentran disponibles en las bases de datos públicas tales como Chemical Abstracts Services Oatabases (p. ej., CAS Registry), GenBank, y bases de datos proporcionadas por suscripción tales como GenSeq (p. ej., oerwent). Las secuencias de nucleótidos ilustrativas de proteínas Terapéuticas que se pueden utilizar para obtener un polinucleótido de la invenciórJ se muestran en la columna 7, quot;SEQ ID NO: X,quot; de la Tabla 2 Las secuencias mostradas como SEQ ID NO: X pueden ser una secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje que codifica una proteína Terapéutica dada (p. ej., completa o madura), o en algunas casos la secuencia puede ser una variante de dicha secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje (p. ej., un polinucleótido que codifica la proteína Terapéutica de tipo salvaje, en donde la secuencia de ADN de dicho polinucle6tido ha sido optimizada, por ejemplo, para su expresión en una especie concreta; o un polinucle6tido que codifica una variante de la proteína Terapéutica de tipo salvaje (es decir, un mutante dirigido al sitio; una variante alélica)). Está en el conocimiento práctico de los expertos en la técnica el uso de la secuencia mostrada como SEQ ID NO: X para obtener el constructo descrito en la misma fila. Por ejemplo, si el SEQ ID NO: X corresponde a una proteína completa, pero solamente se utiliza una porción de esa proteína para generar el CID específico, está en el conocimiento práctico del experto en la técnica contar con las técnicas de la biología molecular, tales como la PCR, para amplificar el fragmento específico y clonar1o en el vector apropiado
La Tabla 1 proporciona la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido de la invención. La primera columna, quot;Proteína Terapéutica X,quot; describe la molécula de proteína Terapéutica que puede estar seguida de paréntesis que contienen los nombre científicos y las marcas de las proteinas que comprenden, o alternatívamente consisten en, esa molécula de proteína Terapéutica o un fragmento o variante de la misma. La quot;proteína Terapéutica Xquot; según se utiliza en la presente memoria puede hacer referencia a una molécula de proteína Terapéutica individual, o al grupo completo de proteínas Terapéuticas asociadas con una molécula de proteína Terapéutica dada descrita en esta columna. La columna de quot;Actividad biológicaquot; (columna 2) describe Actividades biológicas asociadas con la molécula de proteína Terapéutica. La Columna 3, quot;Análisis de la Actividad Ilustrativaquot;, proporciona referencias que describen análisis que se pueden utilizar para someter a ensayo la actividad terapéutica y/o biológica de una proteína Terapéutica: X o una proteína de fusión de albúmina que comprende una porción de proteína Terapéutica X (o un fragmento de la misma). La cuarta columna, quot;Indicación preferida: Yquot;, describe las enfermedades, los trastomos, y/o las afecciones que pueden ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas, y/o aliviadas por la proteína Terapéutica X o una proteína de fusión de albúmina que comprende la porción de proteína Terapéutica X (o un fragmento de la misma). La columna quot;ID de constructoquot; (columna 5) proporciona una conexión con un constructo de fusión de albúmina ilustrativo descrito en la Tabla 2 que codifica una proteína de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente consiste en la porción de Proteína Terapéutica X referenciada (o fragmento de la misma).
Tabla 1
Péptido 1 de
Estimula la síntesis y la liberación La actividad GLP1 se puede analizar in vitro Hiperglicemia; Diabetes; Diabetes Insípida; Diabetes 3610, Véase la
Tipo Glucagón
de insulina; potencia la sensibilidad utilizando un análisis de absorción de [3-H) mellitus; Diabetes de tipo 1; Diabetes de tipo 2; 3696. Tabla 2,
(GLP1 ; GLP-1;
de tejidos adiposo, muscular, y glucosa. (J Biol Chem 22 Ocl. 1999; Resistencia a la insulina; Deficiencia de insulina; SEQID
Insulinotropina)
hepático hacia la insulina; estimula la absorción de glucosa; ralentiza el proceso digestivo; suprime el apetito; bloquea la secreción de glucagón. 274(43):30864-30873). Los efectos de GLP-1 sobre el aprendizaje se pueden investigar utilizando los paradigmas de evitación paSiva y el laberinto de agua de Morris (MWM) en ratas (Brain Res. 1996, 716:29-38 y Nature 1982,297:681-683). Hiperlipidemia; Hipercetonemia; Diabetes Mellitus no dependiente de insulina (DMNDI); Diabetes Melitus Insulino Dependiente (DMID); Una afección asociada a la diabetes incluyendo, pero no limitada a Obesidad, Enfermedad Carc;liaca, Hiperglicemia, Infecciones, Retinopatia, y/o Ulceras; Trastornos metabólicos; Trastornos Inmunitarios; Obesidad; Trastornos Vasculares; Supresión de peso corporal; Supresión del apetito; Síndrome X; Deterioro Cognitivo; Pérdida de memoria. Uso para potenciar el aprendizaje, la memoria, el aprendizaje asociativo, el aprendizaje espacial, la plasticidad del hipocampo, la cognición , y/o la neuroprotección. NO: Z para el constructo concreto.
Tabla 2
Fusión Num. 1 2 3
IDde Constructo 3422 3423 3424 Nombre del Constructo pSAC35:APsp. HSA.I FNa pSAC35: I NVsp. H SA.l F Na pSAC35:KTsp.HSA.IFNa Descripción Péptido señal fosfatasa ácida seguido de HSA madura e IFNa . Péptido señal invertasa seguido de HSA madura e IFNa. Péptido señal Toxina Asesina seguido de HSA madura e IFNa. Vector de Expresión pSAC35 pSAC35 pSAC35 SEa ID NO:V 149 150 151 SEa 10 NO:X 117 118 119 SEa 10 NO:Z 181 182 183 SEQ ID NO:A 213 215 217 SEQ ID NO:B 214 216 218 Secuencia Lider Fosfatasa ácida lnvertasa Toxina Asesina
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO: B Líder
4
2249 pSAC35:IFNa2-HSA también denominado: pSAC23:IFNa2-HSA I FNa2 maduro fusionado aguas arriba de H$A madura yaguas abajo de secuencia líder de HSNkex2. pSAC35 152 120 184 219 220 HSNkex2
5
2343 pSAC35.INV-IFNA2.HSA Interferón alfa2 maduro fusionado aguas arriba de HSA madura yaguas abajo de péptido señal invertasa. pSAC35 153 121 185 221 222 invertasa
6
2366 pSAC35.MAF-IFNa2.HSA IFNa maduro fusionado aguas arriba de H$A madura yaguas abajo de la secuencia lider del pSAC35 154 122 186 223 224 MFa-1
factor alfa de apareamiento de levadura.
7
2381 pC4 :HSA-1 FNa2(CJ7 -E181) Aminoácidos CJ7 a E181 de iFNa2 pC4 155 123 187 225 226 HSA
(fragmento mostrado como aminoácidos C 1 a
E165del SEO ID NO:61S) fusionados aguas abajo de HSA.
8
2382 pC4 :IFNa2-HSA I FNa2 fusionado aguas arriba de HSA madura. pC4 156 124 188 227 228 líder de IFNa2 nativo
9
2410 pSAC35INV:IFNa-HSA I FNa2 maduro fusionado aguas abajo del péptido señal de invertasa y aguas arriba de HSA pSAC35 157 125 189 229 230 invertasa
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO: B Líder
madura.
10
3165 pSAC35:HSA.IFNa también denominado CID 3165, pSAC35:HSA.INFa HSA fusionada aguas arriba de IFNa yaguas abajo del líder HSNkex2. pSAC35 158 126 190 HSNkex2
11
1778 pSAC35: I F N beta. M22-N 187:H SA Residuos M22-N187 de I FNb completo (mostrado como M1 a N166 del SEO ID NO: pSAC35 159 127 191 231 232 HSAlkex2
463) fusionados aguas arriba de HSA madura y aguas abajo de la secuencia líder
HSNkex2 .
12
1779 pSAC35:HSA:1 FNbe!a.M22-N 187 Residuos M22-N 187 de I FNb completo (mostrado como M1 a N166 del SEO ID NO: pSAC35 160 128 192 HSAlkex2
464) fusionado aguas abajo de HSA con la secuencia líder
HSAlkex2.
13
2011 pC4 :IFNb-HSA I FNb completo pC4 161 129 193 233 234 líder de IFNb
fusionado aguas arriba
nativo
de HSA madura.
14
2013 pC4:HSA-1 FNb.M22-N 187 Aminoácidos M22 a N187 de IFNb (fragmento mostrado como aminoácidos Ml a N166 del SEO ID NO: pC4 162 130 194 HSA
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO: B Líder
527) fusionados aguas
abajo de HSA.
15
2053 pEE12:IFNb-HSA también denominado I FNb completo pEE12.1 163 131 195 Líder de IFNb
pEE12.1:IFNbeta-HSA
fusionado aguas arriba nativo
de H$A madura.
16
2054 pEE12:HSA-IFNb IFNb maduro fusionado aguas abajo de HSA. pEE12.1 164 132 196 HSA
17
2492 pC4.IFNb(deltaM22).HSA INFbeta completo mutante fusionado pe4 165 133 197 Líder de IFNI3 nativo
aguas arriba de HSA madura. Primer residuo
de IFNbeta maduro, nativo (M22) ha sido suprimido.
18
2580 pC4 .IFNb(deltaM22,C38S).HSA I FNb fusionado aguas arriba de HSA madura. pe4 166 134 198 IFNI3 Nativo
EllFNb utilizado en esta fusión carece del primer residuo de la forma
madura de I FNb, que corresponde a M22 del SEQ ID NO:1687. También el aminoácido
38 del SEO ID NO: 1687
ha sido mutado de Cys a Ser.
19
2795 pe4:HSA(A14)-IFNb.M22-N 187 La forma madura de I FNb se fusiona al extremo e de HSA, que contiene un péptido pe4 167 135 199 HSA modificada (A 14)
Fusión Núm.
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO: B Líder
señal modificado,
diseñado para mejorar el
procesamiento y la
homogeneidad.
20
2796 pC4:HSA(S14).IFNb.M22-N 187 La forma madura de IFNb se fusiona al extremo e de HSA, que contiene un péptido señal modificado, diseñado para mejorar el procesamiento y la homogeneidad. pC4 166 136 200 HSA modificada (S14)
21
2797 pC4:HSA(G 14)-1FNb.M22-N187 La forma madura de I FNb se fusiona al pC4 169 137 201 HSA modificada
extremo e de HSA, que contiene un péptido señal modificado.
(G14)
22
2872 pSAC35:HSA.1 FNaA(C1 -Q91)1 D(l93E166) Este constructo contiene una forma híbrida de IFNaA e IFNaD fusionada aguas abajo de HSA madura. pSAC35 170 136 202 235 236 HSNkex2
23
2873 pSAC35:HSA.1 FNaA(C1 -Q91)1 B(l93E166) Este constructo contiene una forma híbrida de IFNaA e IFNaB fusionada aguas abajo de HSA madura. pSAC35 171 139 203 237 236 HSNkex2
24
2874 psAC35:HSA.IFNaA(C1 -Q91 )1 F(l 93 Este constructo contiene pSAC35 172 140 204 239 240 HSNkex2
E166)
una forma híbrida de
IFNaA e IFNaF
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ NO:A ID SEQ ID NO:B Secuencia Líder
fusionada aguas abajo de H$A madura.
25
2875 pSAC35: HSA.I FNaA(C 1 Q-62)1D( Q64E166) Este constructo contiene una forma hibrida de IFNaA e IFNaD fusionada aguas abajo de H$A madura. pSAC35 173 141 205 241 242 HSA/kex2
26
2876 pSAC35:HSA.1 FNaA(C1-Q91)I D(l 93E166); R23K,A113V Este constructo contiene una forma hibrida de IFNaA e IFNaD fusionada aguas abajo de H$A madura. pSAC35 174 142 206 243 244 HSA/kex2
27
1757 pSAC35:ll2.A21-T153.145C/S. HSA Il -2 humana madura con una única mutación de aminoácido (e por S en la posición 145) clonada aguas abajo del líder HSNKEX2 y de HSA madura pSAC35 175 143 207 HSA/kex2
28
1758 pSAC35:HSA.ll2.A21-T153.145C/S Il -2 humana madura con una única mutación de aminoácido (e por S en la posición 145) clonada aguas abajo de HSA con la secuencia líder de HSAlkex2. pSAe35 176 144 208 HSA/kex2
29
1812 pSAC35:I L2A21-T153. HSA Aminoácidos A21 a T153 de IL-2 fusionados aguas abajo dellider HSAlkex2 yaguas arriba pSAC35 177 145 209 HSNkex2
Fusión Núm.
lode Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ NO:A ID SEQ ID NO:B Secuencia Líder
de HSA madura.
30
1813 pSAC35:HSA.IL2.A21-T153 Aminoácidos A21 a T153 de IL-2 fusionados aguas abajo de HSA con la secuencia líder de HSAlkex2. pSAC35 178 146 210 HSNkex2
31
1952 pcDNA3.1 :ll2.HSA Il -2 humana completa , que tiene una mutación de Cisteina por Serina en el aminoácido 145, fusionada aguas arriba de H$A madura. pCDNA3.1 179 147 211 líder de Il-2 nativa
32
1954 pC4:IL2.HSA IL-2 humana completa , que tiene una mutación de Cisteina por Serina en el aminoácido 145, fusionada aguas arriba de HSA madura. pe4 180 148 212 líder de IL-2 nativa
33
3468 pSAC35:KTsp.HSA.GH Péptido señal de toxina asesina seguido de HSA madura seguido de hormona del crecimiento. pSAC35 313 245 381 449 450 PrePro toxina asesina
34
3469 pSAC35:INVsp.HSA.GH Péptido señal de invertasa seguido de HSA madura seguido de hormona del crecimiento. pSAC35 314 246 382 451 452 Invertasa
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO: B Líder
35
3470 pSAC35:APsp.HSA.GH Péptido señal de fosfatasa ácida seguido de HSA madura seguido de hormona del crecimiento. pSAC35 315 247 383 453 454 Fosfatasa ácida
36
3475 pSAC35:G19Rsp.HSA.GH Secuencia señal H$A:Kex2 modificada: pSAC35 316 248 384 455 456 HSAlKex2 modificado
seguida de HSA madura seguida de hormona del crecimiento
37
3476 pSAC35:G19Rsp. HSA.IFNa Secuencia señal H$Alkex2 modificada pSAC35 317 249 385 457 458 HSNKex2 modificado
seguida de HSA madura seguida de TNF-alfa.
38
3549 pSAC35:HSNkex2.BDNFc.HSA Líder HSAlkex2 seguido de BDNFc maduro pSAC35 318 250 386 Ninguno Ninguno HSAlKex2
(variante de empalme 6) seguido de HSA madura.
39
3610 pSAC35:(HSAlKEX(R19G))SP.G LP-1(736A8G)x2.HSA Líder HSAlkex2 modificado seguido de dímero de glp-1 de codón optimizado de levadura (donde el segundo codón ha sido alterado de manera que la posición de balanceo de cada codón es pSAC35 319 251 387 459 460 HSAlKex2 modificado
diferente del primer dimero) fusionado al
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ NO:A ID SEQ ID NO:B Secuencia Líder
extremo N de HSA.
40
3690 pC4 :MPI FSP.BNP/HSA Secuencia señal inhibidora del progenitor mieloide (MPIF) seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pC4 320 252 388 461 462 MPIF-1
4 1
3691 pC4.SPCON.BNP/HSA Una secuencia señal consenso seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pC4 321 253 389 463 464 Consenso
42
3696 pEE 12. 1:GlP-1 (7-36(A8G)x2. HSA Secuencia señal del factor 1 inhibidor del progenitor mieloide (MPIF ) seguida de dímero glp-1 de oodón optimizado de levadura (donde el segundo dimero ha sido alterado de manera que la posición de balanceo de cada codón es diferente del primer dímero) fusionado al extremo N de HSA. pEE12.1 322 254 390 465 466 MPIF-1
43
3715 pSAC35:BNP29/HSA.S65 Una única copia de BNP humano (aminoácidos 129) fusionado al extremo N de HSA (S65-L585), un truncamiento N pSAC35 323 255 391 467 468 HSAlKex2
Fusión Núm.
lode Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
terminal de HSA (delta 1-64). Esto es aguas abajo de la secuencia señal HSAlKex2.
44
3723 pEE12.1 :MPIFSP.BNP/HSA Secuencia señal del factor 1 inhibidor del progenitor mieloide (MPIF) seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pEE12.1 324 256 392 Ninguno Ninguno MPIF-1
45
3724 pEE12.1 :SPCON.BNP/HSA Una secuencia señal consenso seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pEE12.1 325 257 393 Ninguno Ninguno Consenso
46
3725 pEE12.1 :SPCON2.BNP/HSA Una secuencia señal consenso seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pEE12.1 326 258 394 Ninguno Ninguno Péptido señal consenso núm. 2
47
3736 pC4 :SPCON2.BNP/HSA Una secuencia señal consenso seguida de BNP fusionado al extremo N de HSA madura. pC4 327 259 395 469 470 Péptido señal consenso núm. 2
48
3769 pC4:BNP(R13G)/HSA Secuencia señal del factor 1 inhibidor del progenitor mieloide (MPIF) seguida de BNP mutante (R 13G) pC4 328 260 396 471 472 MPIF-1
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descri pción Vec tor de Exp resión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO: Z SEQ NO:A ID SEQ ID NO: B Secuencia Líder
fusionado al extremo N de HSA madura.
49
3778 pC4:SPCON.BNP29/HSA.S65 Una única copia de BNP humano (1-29) fusionada al extremo N de HSA (S65-L585), un truncamiento N-Iermi nal de HSA (delta 1-64). Esto está aguas abajo de una secuencia señal consenso. pC4 329 261 397 473 474 Consenso
50
3783 pC4 :SPCON.BNP(R13GYHSA Secuencia señal consenso seguida de BNP mutante (R13G) fusionado al extremo N de HSA madura . pC4 330 262 398 475 476 Consenso
51
3795 pC4:SPCON.BNP(K14GYHSA Secuencia señal consenso seguida de BNP mutante (K14G) fusionado al extremo N de H$A madura. pC4 331 263 399 477 478 Consenso
52
3796 pSAC35:HSAlBNP Seguido de HSA madura fusionada al extremo N de BNP. pSAC35 332 264 400 479 480 HSAlKex2
53
3809 pSAC35:BNP30(GGG)/HSA Secuencia señal HSAlKex2 seguida de BNP (aminoácidos1-3Q) fusionado a través de glicinas tripartitas al extremo N de H$A pSAC35 333 265 401 481 482 HSAlKex2
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
madura.
54
3886 pSAC35:HSNKEX2.l ANP.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de LANP fusionada al extremo N de HSA madura. LAN P corresponde a los aminoácidos 26-55 del SEO ID NO: 402 (referida en la presente como LANP). pSAC35 334 266 402 Ninguno Ninguno HSNKex2
55
3667 pSAC35:HSAlKEX2.HSA. l ANP Secuencia señal HSNKex2 seguida de H$A madura fusionada al extremo N de LAN P madura. pSAC35 335 267 403 Ninguno Ninguno HSAlKex2
56
3668 pSAC35:HSAlKEX2.VDP.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de VOP fusionada al extremo N de HSA madura. VDP corresponde a los aminoácidos 56-92 del SEO ID NO: 404 (referida en la presente como VOP). pSAC35 336 266 404 Ninguno Ninguno HSAlKex2
57
3889 pSAC35:HSNKEX2.HSA.VOP Secuencia señal H$NKex2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de VDP pSAC35 337 269 405 Ninguno Ninguno HSAlKex2
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
madura.
58
3890 pSAC35:HSNKEX2.KUP.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de KU P fusionada al extremo N de HSA madura. KUP corresponde a los aminoácidos 104-123 del SEO ID NO: 406 (referida en la presente como KUP). pSAC35 338 270 406 Ninguno Ninguno HSNKex2
59
3891 pSAC35:HSAlKEX2. HSA.KUP Secuencia señal HSNKex2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de KUP madura. pSAC35 339 271 407 Ninguno Ninguno HSAlKex2
60
3892 pSAC3S:HSAlKEX2.CNP.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de CNP fusionada al extremo N de HSA madura. CNP corresponde a los aminoácidos 105-123 del SEO ID NO: 408 (referida en la presente como KUP). pSAC35 340 272 408 Ninguno Ninguno HSAlKex2
61
3893 pSAC35:HSNKEX2.HSA.CNP Secuencia señal HSNKex2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de CNP pSAC35 341 273 409 Ninguno Ninguno HSAlKex2
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO:B Líder
madura.
62
3894 pSAC35:HSNKEX2.DNP.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de DNP fusionada al extremo N de HSA madura. pSAC35 342 274 41 0 Ninguno Ninguno HSNKex2
63
3895 pSAC35:HSNKEX2. HSA.DNP Secuencia señal HSNKex2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de ONP pSAC35 343 275 41 1 Ninguno Ninguno HSNKex2
madura.
64
3696 pSAC35:HSNKEX(R19G)BNP30(GGG).HSA Lider HSNKEX-2 modificado seguido de BNP (ami noácidos 1-30) fusionado a través de pSAC35 344 276 41 2 Ninguno Ninguno HSNKex2 modificado
conector de glicina tripartito al extremo N de HSA madura.
65
3897 pEE12:SPCON-BNP(K1 4G).HSA Una secuencia señal consenso seguida de BNP mutante (K1 4G) fusionado al extremo N de HSA madura. pEE12.1 345 277 41 3 Ninguno Ninguno Consenso
66
3698 pSAC35:HSNKex-2-BNP(K 14G).HSA Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de BNP mutante (K14G ) fusionado al extremo N pSAC35 346 276 41 4 Ninguno Ninguno HSNKex2
de HSA madura.
Fusión Núm .
lo de Nombre del Constructo Descripción Vector de SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Secuencia
Constructo
Expresión NO:Y NO:X NO:Z NO:A NO:B Líder
67
3899 pSAC35:HSA/Kex-2(R 19G)BNP(K14G).HSA Secuencia señal HSAJKEX-2 modificada seguida de BNP mutante (K14G) fusionado al extremo N pSAC35 347 279 41 5 Ninguno Ninguno HSA/Kex2 modificada
de HSA madura.
68
3900 pSAC35: HSA/Kex-2 -H SA.BN P(K 14G) Secuencia señal HSA/KEX-2 seguida de HSA madura fusionada pSAC35 348 280 41 6 Ninguno Ninguno HSAlKex2
al extremo N de BNP mutante (K1 4G).
69
3903 pC4:SPCON-Uricasa.HSA Una secuencia señal consenso seguida de uricasa de rala pC4 349 281 417 Ninguno Ninguno Consenso
fusionada al extremo N de HSA madura.
70
3904 pC4:HSA/Kex2-HSA.Uricasa Secuencia señal HSA/KEX-2 seguida de HSA madura fusionada pC4 350 282 418 Ninguno Ninguno HSA/Kex2
al extremo N de uricasa de rala.
71
39 10 pSAC35:HSAlKex-2-ADI.HSA Secuencia señal HSA/KEX-2 seguida de arginina desiminasa de micoplasma fusionada al extremo N de HSA pSAC35 351 283 419 Ninguno Ninguno HSAlKex2
madura.
72
39 15 pC4:SPCON-ADI.HSA Una secuencia señal pC4 352 284 420 Ninguno Ninguno Consenso
consenso seguida de
arginina desiminasa de
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
micoplasma fusionada al extremo N de H$A madura.
73
3917 pC4:HSAlKex-2-HSA.ADI Secuencia señal HSAlKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de arginina desiminasa de micoplasma. pC4 353 285 421 Ninguno Ninguno HSAlKex2
74
3918 pSAC35:HSA/Kex2-HSA.ADI Secuencia señal HSAlKEX-2 seguida de H$A madura fusionada al extremo N de arginina desiminasa de micoplasma. pSAC35 354 286 422 Ninguno Ninguno HSAlKex2
75
3919 pSAC35:KEX2 .TWEAKR.E28-F75. HSA Secuencia señal HSA/KEX-2 seguida de TweakR (aminoácidos 28-75) fusionada al extremo N de HSA madura. TweakR E28F75 corresponde a los aminoácidos 28-75 del SEO ID NO: 423 (referido en la presente como TweakR E28F75). pSAC35 355 287 423 Ninguno Ninguno HSA/Kex2
76
3920 pSAC35:HSA/Kex2-GCB.HSA Secuencia señal HSA/KEX-2 seguida de glucocerebrosidasa lisosomal fusionada al pSAC35 356 288 424 Ninguno Ninguno HSA/Kex2
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
extremo N de HSA madura.
71
3921 pC4:SPCON-GCB.HSA Una secuencia señal consenso seguida de glucocerebrosidasa liso5Omal fusionada al extremo N de HSA madura. pC4 357 289 425 Ninguno Ninguno Consenso
78
3922 pSAC35:HSNKex2-HSA.GCB Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de glucocerebrosidasa liS050mal. pSAC35 358 290 426 Ninguno Ninguno HSNKex2
79
3923 pC4: HSNKex2-HSA.GCB Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de glucocerebrosidasa liso5Omal. pC4 359 291 427 Ninguno Ninguno HSAlKex2
80
3924 pSAC35:HSNKex2-ADM.HSA Secuencia señal HSAlKEX-2 seguida de adrenomedulina fusionada al extremo N de HSA madura. pSAC35 360 292 428 Ninguno Ninguno HSNKex2
81
3925 pC4:SPCON-ADM.HSA Una secuencia señal consenso seguida de adrenomedulina fusionada al extremo N pC4 361 293 429 Ninguno Ninguno Consenso
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
de HSA madura.
82
3926 pSAC35:HSNKex2-HSA.ADM Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de adrenomedulina pSAC35 362 294 430 Ninguno Ninguno HSNKex2
83
3927 pC4:HSNKex2-HSA.ADM Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de adrenomedulina pC4 363 295 431 Ninguno Ninguno HSNKex2
84
3928 pc4 : HSA. Kiss. E20-0 145 La región Pre-pro de la secuencia señal de HSA seguida de HSA madura fusionada al extremo N de Kiss (aminoácidos 20-145). Kiss E20-Q145 corresponde a los aminoácidos 20-1 45 del SEO ID NO: 432 (referida en la presente como Kiss E20-Q145). pC4 364 296 432 Ninguno Ninguno HSA Pre-Pro
85
3929 pSAC35:KEX2.HSA.KISS-1.E20-0 145 Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de Kiss (aminoácidos 20-1 45). pSAC35 365 297 433 Ninguno Ninguno HSNKex2
86
3930 pSAC35:KEX2. EfrinaB1 .K30-D229.HSA Secuencia señal HSNKEX-2 seguida de Efrina B1 (aminoácidos pSAC35 366 298 434 Ninguno Ninguno HSNKex2
Fusión Núm.
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO: B Secuencia Líder
30-229) fusionada al extremo N de HSA madura. Efrina 81 K30D229 corresponde a los aminoácidos 30-229 del SEO ID NO: 434 (referida en la presente como Efrina B 1 K30.D229).
87
3931 pc4:EfrinaB1.M1-D229.HSA Efrina 81 (aminoácidos 1-229), incluyendo la secuencia señal de Efrina 81 nativa, fusionada al extremo N de HSA madura. pC4 367 299 435 Ninguno Ninguno Efrina B1 Nativa
88
3932 pc4:1WEAKR.M1 -F75. HSA TweakR (aminoácidos 175), incluyendo la secuencia señal de TweakR nativa, fusionada al extremo N de HSA madura. TweakR M1-F75 corresponde a los aminoácidos 1-75 del SEO ID NO: 436 (referida en la presente como TweakR M1-F75). pC4 368 300 436 Ninguno Ninguno TweakR Nativa
89
3933 pc4:87-H3.M1 -E247 .HSA 87-H3 (aminoácidos 1247), incluyendo la secuencia señal B7-H3 nativa, fusionada al extremo N de HSA pC4 369 301 437 Ninguno Ninguno B7-H3 nativa
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
madura.
90
3934 pc4 :HSA.EfrinaB 1.K30-D229 La región pre-pro de la secuencia señal de HSA seguida de HSA madura fusionada al extremo N de Efrina B1 (aminoácidos 30-229). pC4 370 302 438 Ninguno Ninguno H$A Pre-Pro
9'
3935 pSAC35:HSA. EfrinaB 1.K30-D229 Secuencia señal HSNKex2 seguida de HSA madura fusionada al extremo N de Efrina 81 (aminoácidos 30229). pSAC35 371 303 439 Ninguno Ninguno HSA/Kex2
92
3936 pc4 :SPCON.cUricasa. HSA Una secuencia señal consenso seguida de uricasa de chimpancé fusionada al extremo N de HSA madura. pC4 372 304 440 Ninguno Ninguno Consenso
93
3937 pc4: HSA.cUricasa La región pre-pro de la secuencia señal de HSA seguida de HSA madura fusionada al extremo N de uricasa de chimpancé. pC4 373 305 44 ' Ninguno Ninguno HSA Pre-Pro
94
3938 pc4 :SPCON.hUricasa. HSA Una secuencia señal consenso seguida de uricasa fusionada al extremo N de HSA madura. pC4 374 306 442 Ninguno Ninguno Consenso
Fusión Núm .
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ ID NO:A SEQ ID NO:B Secuencia Líder
95
3939 pc4: HSA.hUricasa La región pre-pro de la secuencia señal de HSA seguida de HSA madura fusionada al extremo N de uricasa. pC4 375 307 443 Ninguno Ninguno HSA Pre-Pro
96
3940 pc4 :SPCON.bUricasa. HSA Una secuencia señal consenso seguida de uricasa de babuino fusionada al extremo N de HSA madura. pC4 376 308 444 Ninguno Ninguno Consenso
97
3941 pc4 :HSA.bUricasa La región pre-pro de la secuencia señal de HSA seguida de HSA madura fusionada al extremo N de uricasa de babuino. pC4 377 309 445 Ninguno Ninguno HSA Pre-Pro
98
3942 p5AC35 :KEXZ.hUricasa.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de uricasa fusionada al extremo N de HSA madura. pSAC35 378 310 446 Ninguno Ninguno HSNKex2
99
3943 pSAC35:KEX2.cUricasa.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de uricasa de chimpancé fusionada al extremo N de HSA madura. pSAC35 379 311 447 Ninguno Ninguno HSNKex2
100
3944 pSAC35:KEX2 .bUricasa.HSA Secuencia señal HSNKex2 seguida de uricasa de babuino fusionada al extremo N pSAC35 380 312 448 Ninguno Ninguno HSAlKex2
Fusión Núm.
lo de Constructo Nombre del Constructo Descripción Vector de Expresión SEQ ID NO:Y SEQ ID NO:X SEQ ID NO:Z SEQ NO:A ID SEQ ID NO:B Secuencia Líder
de HSA madura.
101
3618 pC4:SPCON.BNP 1-32(2x)JHSA Una secuencia señal consenso seguida de dos copias en tándem de BNP maduro fusionado al extremo N de H$A madura. pC4 483 484 485 463 464 Consenso
La Tabla 2 proporciona una lista no exhaustiva de polinucle6tidos que comprende, o alternativamente consiste en,
moléculas de ácido nucleico que codifican una proteina de fusión de albúmina. La primera columna, quot;Fusion Númquot; proporciona un número de fusión a cada polinucleótido. La columna 2, quot;ID de Constructoquot; proporciona un identificador numérico único para cada polinucleótido de la invención. Los ID de constructo se pueden utilizar para identificar polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina que comprenden, o alternativamente consisten en, una porción de proteína Terapéutica correspondiente a una Proteína terapéutica: X dada enumerada en la correspondiente fila de la Tabla 1 en donde ese ID de Constructo se enumera en la columna s. La columna quot;Nombre del Constructoquot; (columna 3) proporciona el nombre de un constructo o polinucle6tido de fusión de albúmina dado.
La cuarta columna de la Tabla 2, quot;Descripciónquot; proporciona una descripción general de un constructo de fusión de albúmina dado, y la quinta columna, quot;Vector de ExpresiÓnquot; enumera el vector en el que se clonó un polinucleótido que comprende, o alternativamente consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusi6n de albúmina dada. Los vectores son conocidos en la técnica, y se encuentran disponibles en el mercado o se describen en alguna parte. Por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, un quot;casete de expresiÓnquot; que comprende, o alternativamente consiste en, uno o más de (1) un polinucle6tido que codifica una proteína de fusión de albúmina dada, (2) una secuencia líder, (3) una región promotora, y (4) un terminador transcripcional, se puede ensamblar en un vector de clonación conveniente y con posterioridad se puede mover a un vector alternativo, tal como, por ejemplo, un vector de expresi6n que incluye, por ejemplo, un vector de expresi6n de levadura o un vector de expresión de mamífero. En una rea lización, para la expresión en S. cerevisiae, se clona un casete de expresión que comprende, o alternativamente consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusi6n de albúmina en pSAC35. En otra realización, para la expresión en células CHO, se clona un casete de expresión que comprende, o alternativamente consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusi6n de albúmina en pC4. En una rea lización adicional, se clona un polinucle6tido que comprende o altemativamente consiste en una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina en pC4:HSA. En otra realización más, para la expresión en células NSO, se clona un casete de expresión que comprende, o alternativamente consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina en pEE12. otros vectores de clonación ylo expresión útiles serán conocidos para el experto en la técnica y están dentro del alcance de la invención.
La columna 6, quot;SEO ID NO: Y,quot; proporciona la secuencia de aminoácidos completa de la proteina de fusión de albúmina. En la mayoría de los casos, el SEO ID NO: Y muestra la forma no procesada de la proteína de fusión de albúmina codificada -en otras palabras, el SEO ID NO: Y muestra la secuencia señal, una porción de HSA, y una porción terapéutica, todas codificadas por el constructo concreto. Específicamente se contemplan todos los polinucleótidos que codifican SEO ID NO: Y. Cuando estos polinucleólidos se utilizan para expresar la proteína codificada a partir de una célula, las etapas de secreción y procesamiento naturales de la célula proclucen una proteína que carece de la secuencia señal enumerada en las columnas 4 y/u 11 de la Tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal enumerada se muestra más adelante en la memoria descriptiva o es bien conocida en la técnica. De este modo, incluye la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder mostrada en las columnas 4 y/u 11 de la Tabla 2). Asimismo los más preferidos son los polipéptidos que comprenden el SEO ID NO: Y sin la secuencia líder específica enumerada en las columnas 4 y/u 11 de la Tabla 2. También se prefieren las composiciones que comprenden estas dos realizaciones preferidas, incluyendo las composiciones farmacéuticas. Por otra parte, se encuentra dentro del conocimiento práctico de los expertos en la técnica remplazar la secuencia señal enumerada en las columnas 4 y/u 11 de la Tabla 2 por una secuencia señal diferente, tales como las descritas más adelante en la memoria descriptiva para facilitar la secreción de la proteína de fusión de albúmina procesada
La séptima columna, quot;SEO ID NO: Xquot;, proporciona la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede obtener un polinucleótido que codifica una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. En una realización, la secuencia de ácido nuc!eico parental de la cual se puede obtener un polinucleótido que codifica la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende la secuencia del gen de tipo salvaje que codifica la proteína Terapéutica mostrada en la Tabla 1 En una realización altemativa, la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede obtener un polinucleótido que codifica una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende una variante o derivado de una secuencia del gen de tipo salvaje que codifica una proteína Terapéutica mostrada en la Tabla 1, tal como, por ejemplo, una variante de codón optimizado sintética de una secuencia génica de tipo salvaje que codifica una proteína Terapéutica
La octava columna, quot;SEO ID NO: Z,quot; proporciona una traducción pronosticada de la secuencia de ácido nuc!eico parental (SEO ID NO: X). Esta secuencia parental puede ser una proteina parental completa utilizada para obtener el constructo concreto, la porción madura de una proteína parental, una va riante o fragmento de una proteína de tipo salvaje, o una secuencia artificial que se puede utilizar para crear el constructo descrito. Un experto en la técnica puede utilizar esta secuencia de aminoácidos mostrada en el SEO ID NO: Z para determinar qué residuos de aminoácido de una proteína de fusión de albúmina codificada por un constructo dado son proporcionados por la proteína terapéutica. Por otra parte, está dentro del conocimiento práctico del experto en la técnica utilizar la secuencia mostrada como SEO ID NO: Z para obtener el constructo descrito en la misma fila. Por ejemplo, si el SEO ID NO: Z corresponde a una proteína completa, pero solamente se utiliza una porción de esa proteína para generar
el CID específico, está dentro del conocimiento práctico de la técnica contar con técnicas de la biología molecular, tales como la PCR, para amplificar el fragmento especifico y clonarlo en el vector apropiado
Los cebadores de amplificación proporcionados en las columnas 9 y 10, quot;SEQ ID NO· N Y quot;SEO ID NO: Bquot; respectivamente, son cebadOfes ilustrativos utilizados para generar un polinucleótido que comprende o altemativamente consiste en una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. En una realizaciórl de la invención, se utilizan cebadores oligonucleotidicos que tienen las secuencias mostradas en las columnas 9 ylo 10 (SEO ID NOS: A y/o B) para amplificar por PCR un polinucleótido que codifica la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina utilizando una molécula de ácido nucleico que comprende o altemativamente consiste en la secuencia de nucleótidos proporcionada en la columna 7 (SEO ID NO: X) de la fila correspondiente como AoN molde. Los métodos de PCR están bien establecidos en la técnica. otras secuencias cebadoras útiles podrían ser fácilmente previstas y utilizadas por los expertos normales en la técnica
En una realización altemativa, se pueden utilizar cebadores oligonucleotidicos en reacciones de PCR solapantes para generar mutaciones en una secuencia de AoN molde. Los métodos de PCR son conocidos en la técnica
Como se muestra en la Tabla 3, ciertos constructos de fusión de albúmina descritos en esta solicitud han sido depositados en la ATCC®.
Tabla 3
ID de Constructo
Nombre del Constructo Núm. de depósito ATCC/ Fecha
1812
pSAC35:1L2.A21 -TJ 53.HSA PTA-3759 4 Oct., 2001
2053
pEE12.1FNb-HSA también denominado pEE12.1 ·IFN1 3-HSA PTA-3764 4 Oct., 2001
2054
pEEI2:HSA-IFNb PTA-394119 Dic., 2001
2249
pSAC35:I FNa2-HSA ta mbién denominado pSAC23:IFNa2-HSA PTA-3763 4 Oct., 2001
2343
pSAC35.1NV-IFNA2.HSA PTA-3940 19, Dic., 2001
2381
pC4:HSA-IFNa2(C17 -E181 ) PTA-3942 19 Dic., 2001
2382
pC4:IFNa2-HSA PTA-3939 19 Dic., 2001
2492
pC4.IFNb(deltaM22).HSA PTA-3943 19 Dic., 2001
3165
pSAC35:HSA.IFNa también denominado CID pSAC35:HSA.INFa 3165, PTA-4670 16 Sept., 2002
Es posible recuperar un constructo de fusión de albúmina dado del depósito mediante mecanismos conocidos en la técnica y descritos en alguna parte en la presente memoria (véase el Ejemplo 10). La ATCC está localizada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA. Los depósitos de la ATCC se realizaron en conformidad con los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del procedimiento de patentes.
En una realización adicional de la invención, un ~casete de expresión~ que comprende, o alternativamente consiste en uno o más de (1 ) un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina dada, (2) una secuencia líder,
(3) una región promotora, y (4) un terminador transcripcional se puede mover o quot;subclonarquot; de un vector a otro. Los fragmentos que se van a subclonar se pueden generar mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, amplificación por PCR (p. ej., utilizando cebadOfes oligonucleolídicos que tienen la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: A o B), y/o digestión con enzimas de restricción
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención son capaces de tener actividad terapéutica y/o actividad biológica correspondiente a la actividad terapéutica ylo la actividad biológica de la proteína Terapéutica correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina enumerada en la Tabla 1. En realizaciones adicionalmente preferidas, las porciones de proteína terapéuticamente activa de las proteínas de fusión de albúmina de la invención son fragmentos o variantes de la proteína codificada por la secuencia mostrada en la columna de SEO ID NO: X de la Tabla 2, y son capaces de tener actividad terapéutica ylo actividad biológica de la correspondiente proteína Terapéutica.
Fragmentos y variantes de pofipéptidos y pofinucleófidos
Fragmentos
La presente invenciÓfl está dirigida adicionalmente a fragmentos de la proteína Terapéutica descrita en la Tabla 1, proteínas de albúm ina , ylo proteínas de fusión de albúmina de la invención
La presente invención también está dirigida a polinucleótidos que codifican fragmentos de la proteína Terapéutica descrita en la Tabla 1, proteínas de albúmina, ylo proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención
Incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína Terapéutica , la proteína de albúmina , ylo la proteína de fusión de albúmina de la invención, todavía se pueden conservar otras actividades Terapéuticas ylo actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unirse a un ligando). Por ejemplo, la capacidad de los polipéptidos con deleciones N-terminales para inducir ylo unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras de los polipéptidos generalmente se conservarán cuando se eliminen menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo del extremo N. Se puede determinar fácilmente por medio de métodos rutina rios descritos en la presente memoria y conocidos de otro modo en la técnica si un polipéptido concreto que carece de residuos N-terminales de un polipéptido completo conserva tales actividades inmunológicas. No es improbable que una muteína con un número mayor de residuos de aminoácido N-terminales suprimidos pueda conservar ciertas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, los péptidos compuestos por tan solo seis residuos de aminoácido a menudo pueden provocar una respuesta inmunitaria.
Por consiguiente, los fragmentos de una proteína Terapéutica correspondiente a una porciÓfl de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, incluyen la proteína completa así como los polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia (es decir la proteina Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteina de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2). En particular, las deleciones N-terminales pueden ser descritas por la fórmula general m a q, donde q es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteina de fusión de albúmina de la invención, o una porción de proteina Terapéutica de una proteína de fusiÓfl de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2), y m se define como cualquier número entero que oscila entre 2 y q menos 6. Los polinucleótidos que codifican estos polipéplidos también están incluidos en la invención.
Además, los fragmentos de polipéptidos de albúmina de suero correspondientes a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención, incluyen la proteína completa así como los polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia (esto es, albumina de suero, o una porción de albúmina de suero de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2). En realizaciones preferidas, las deleciones N-terminales pueden ser descritas por la fórmula general m a 585, donde 585 es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en la albúmina de suero humana madura (SEO ID NO: 1), y m se define como cualquier número entero que oscila entre 2 y 579. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención. En realizaciones adicionales, las deleciones N-terminales pueden ser descritas por la fórmula general m a 609, donde 609 es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en la albúmina de suero humana completa (SEO ID NO: 3), y m se define como cualquier número entero que oscila entre 2 y 603. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención.
Por otra parte, los fragmentos de proteinas de fusiÓfl de albúmina de la invención, incluyen proteinas de fusión de albúmina completas así como polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo amino de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2; o una proteína de fusión de albúmina que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la columna 6 de la Tabla 2). En particular, las deleciones N-terminales pueden ser descritas por la fórmula general m a q, donde q es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en la proteína de fusión de albúmina, y m se define como cualquier número entero que oscile entre 2 a q menos 6. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención
Asimismo como se ha mencionado antes, incluso si la deleción de uno o más aminoécidos del extremo N o el extremo e de un polipéptido de referencia (p. ej., una proteína Terapéutica; una proteína de albúmina de suero; o una proteína de fusión de albúmina de la invención) da como resultado una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía se pueden conservar otras actividades funcionales (p. ej., actividades
biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unirse a un Ligando) ylo actividades Terapéuticas. Por ejemplo la capacidad de los polipéptidos con deleciones e -terminales para inducir ylo unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras del polipéptido generalmente será conservada cuando se elimine del extremo e menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro. El que un polipéptido concreto que carece de residuos N-terminales ylo e-terminales de un polipéptido de referencia conserve la actividad Terapéutica puede ser fácilmente determinado mediante métodos rutinarios descritos en la presente memoria y/o conocidos de otro modo en la técnica
La presente invención propOfciona adicionalmente polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de una proteina Terapéutica correspondiente a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., una proteína Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descrito en la Tabla 2). En particular, las deleciones e-terminales pueden ser descritas por la fórmula general 1 a n, donde n es cualquier número entero completo que oscila entre 6 a q menos 1, Y donde q es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en un polipéptido de referencia (p. ej., una proteína Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2). Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención
Además, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos de una proteína de albúmina correspondiente a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., albúmina de suero o una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2). En particular, las deleciones e -terminales pueden ser descritas por la formula general 1 a n, donde n es cualquier número entero completo que oscila entre 6 y 584, donde 584 es el número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en la albúmina de suero humana madura (SEO ID NO: 1) menos 1 Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención. En particular, las deleciones e -terminales pueden ser descritas por la fórmula general 1 a n, donde n es cualquier número entero completo que oscila entre 6 y 608, donde 608 es el número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido en la albúmina de suero (SEO ID NO:3) menos 1. Los polinucleótidos que codifican estos polipéplidos también están incluidos en la invención.
Por otra parte, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos suprimidos del extremo carboxi de una proteína de fusión de albúmina de la invención. En particular, las deleciones e-terminales se pueden describir mediante la fórmula genera 1 a n, donde n es cualquier número entero completo que oscila entre 6 y q menos 1, Y donde q es un número entero completo que representa el número total de residuos de aminoácido de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención.
Además, cualquiera de las deleciones N o e -terminales descritas anteriormente puede ser combinada para producir un polipéptido de referencia con supresiones N y e-terminales. La invención también proporciona polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos suprimidos a partir de los extremos amino y carboxilo, que pueden ser descritos generalmente por tener residuos m a n de un polipéptido de referencia (p. ej., la proteína Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de proteína Terapéutica codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2,
o albúmina de suero (p. ej., SEO ID NO: 1), o una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de proteína de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2, o una proteína de fusión de albúmina, o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina de la invención) donde n y m son números enteros como se ha descrito anteriormente. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención.
La presente solicitud también está dirigida a proteínas que contienen polipéptidos idénticos en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a una secuencia polipeptídica de referencia (p. ej., la protelna Terapéutica referida en la Tabla 1, o una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención,
o una porción de proteína Terapéutica codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2, o albúmina de suero (p. ej ., SEO ID NO: 1), o una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de proteina de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en la Tabla 2, o una proteína de fusión de albúmina, o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina de la invención) mostrados en la presente memoria, o fragmentos de los mismos. En realizaciones preferidas, la solicitud está dirigida a proteínas que comprenden polipéptidos idénticos en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a polipéptidos de referencia que tienen la secuencia de aminoácidos con las deleciones N y e -terminales descritas anteriormente. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención
Los fragmentos de polipéptidos preferidos de la invención son fragmentos que comprenden, o altemativamente,
consisten en, una secuencia de aminoácidos que presenta una actividad Terapéutica ylo actividad funcional (p. ej., actividad biológica) de la secuencia de polipéptido de la proteína Terapéutica o proteína de albúmina de suero cuya secuencia de aminoácidos es un fragmento
Otros fragmentos de polipéptido preferidos son los fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una mejor de la actividad deseada, o una disminución de la actividad no deseable.
Variantes
quot;Variantequot; se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difieren de un ácido nucleico o polipéptido de referencia, pero que conservan las propiedades esenciales de los mismos. Generalmente, las variantes son sobre todo muy similares, y, en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia.
Según se utiliza en la presente memoria, quot;variantequot;, se refiere a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, una porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una proteína de fusión de albúmina de la invención que tiene una secuencia diferente a la de una proteína Terapéutica (p. ej., véase la columna quot;Proteína Terapéuticaquot; de la Tabla 1), una proteína de albúmina, ylo una proteína de fusión de albúmina, respectivamente, pero que conservan al menos una propiedad funcional ylo terapéutica de las mismas como se describe en algún lugar en la presente memoria o conocidas de otro modo en la técnica. Generalmente, las variantes son sobre todo muy similares, y, en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína Terapéutica correspondiente a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina, proteína de albúmina que corresponde a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina, ylo proteína de fusión de albúmina. Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes también están incluidos en la invención.
La presente invención también está dirigida a proteínas que comprende, o altemativamente consisten en, una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, por ejemplo, a la secuencia de aminoácidos de la proteína Terapéutica correspondiente a una porción de proteína Terapéutica de una proteina de fusión de albúmina de la invención (p. ej., la secuencia de aminoácidos de la proteína Terapéutica: X descrita en la Tabla 1; o la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descritos en las Tablas 1 y 2, o fragmentos o variantes de los mismos), proteínas de albúmina correspondientes a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., la secuencia de aminoácidos de una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o coostructo de fusiÓfl de albúmina descritos en la Tabla 1 y 2; la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEO ID NO: 1, o fragmentos o variantes de la misma), ylo proteínas de fusión de albúmina. También se proporcionan los fragmentos de estos polipéptidos (p. ej., aquellos fragmentos descritos en la presente memoria). Otros polipéptidos incluidos en la invención son los polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con el complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención en condiciones de hibridación rigurosas (p. ej., hibridación a ADN unido a un filtro en 6X Cloruro de sodiolCitrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de uno o más lavados en O,2X SSC, SDS al 0,1% a aproximadamente 50 · 65 grados Celsius), en condiciones muy rigurosas (p. ej., hibridaciÓfl a ADN unido a un filtro en 6X cloruro de sodio/Citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de uno o más lavados en O,1X SSC, SDS al 0,2% a aproximadamente 68 grados Celsius), o en otras condiciones de hibridación rigurosas que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current Protocol in Molecular Biology. Green publishing associates, Inc., y John Wiley & Sons Inc., Nueva York, en las páginas 6.3.1 ·6.3.6 Y 2.10.3). Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos quot;idénticaquot; en al menos, por ejemplo, 95% a una secuencia de aminoácidos problema, se quiere significar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia problema excepto que la secuencia del polipéptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 95% a una secuencia de aminoácidos problema, se puede insertar, suprimir, o sustituir por otro aminoácido hasta 5% de los residuos de aminoácido de la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestión práctica, se puede determinar si cualquier polipéptido concreto es idéntico en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, por ejemplo, a la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusiÓfl de albúmina de la invención o un fragmento de la misma (tal como una porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina o una porción de albúmina de la proteína de fusión de albúmina), convencionalmente utilizando programas de ordenador conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global
entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también referida como alineamiento de secuencias global, se puede determinar utilizando el programa de ordenador FASTOS basándose en el algoritmo de Srutlag et al. (Comp. App. Biosci .6:237-245 (1990». En un alineamiento de secuencias, las secuencias problema y sujeto son o bien ambas secuencias de nucleótidos o bien ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global se expresa como porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en un alineamiento de aminoácidos FASTOS son: Matriz=PAM O, k· tuplo=2, Pena lización por emparejamiento erróneo=1, Penalización por Unión:::20, Aleatorización de la Longitud del Grupo=O, Puntuación de Corte=1 , Tamaño de la Ventana=longitud de la secuencia, Penalización por Espacio=5, Penalización por Tamaño del Espacio=O,05, Tamaño de la Ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, lo que sea más corto.
Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia problema debido a deleciones N o C-terminales, no debido a deleciones intemas, se debe realizar una corrección manual de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTOS no considera los truncamientos N y C-terminales de la secuencia sujeto cuando calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos N y C, con respecto a la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de residuos de la secuencia problema que son N y Cterminales de la secuencia sujeto, que no están emparejadosfalineados con un residuo sujeto correspondiente, como porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. El que un residuo esté emparejado/alineado se determina por los resultados del alineamiento de secuencias FASTOS. Este porcentaje se resta a continuación del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTOB anterior utilizando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación de porcentaje de identidad final es la que se utiliza para los fines de la presente invención. Solamente los residuos de los extremos N y C de la secuencia sujeto, que no están emparejados/alineados con la secuencia problema, son tenidos en cuenta para los fines del ajuste manual de la puntuación del porcentaje de identidad. Esto es, solamente las posiciones de los residuos problema fuera de los residuos N y C-terminales más lejanos de la secuencia sujeto
Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos de aminoácido se alinea con una secuencia problema de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N de la secuencia sujeto y por lo tanto, el alineamiento FASTOS no muestra un emparejamientofalineamiento de los 10 primeros residuos en el extremo N. Los 10 residuos no emparejados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N y C no emparejadosfnúmero total de residuos en la secuencia problema) de manera que e110% se resta de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTOB. Si los 90 residuos restantes estuvieran perfectamente emparejados, el porcentaje de identidad final seria de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 residuos con una secuencia problema de 100 residuos. Esta vez las deleciones son deleciones internas de manera que no hay residuos en los extremos N o C de la secuencia sujeto que no estén emparejadosfalineados con el problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por medio de FASTDS no se corrige manualmente. Una vez más, solamente las posiciones de los residuos fuera de los extremos N y Cterminales de la secuencia sujeto, presentadas en el alineamiento de FASTOS, que no están emparejadasfalineadas con la secuencia problema se corrigen manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.
La variante tendrá normalmente una identidad de secuencia de al menos 75% (preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99%) con una longitud de HA o proteína Terapéutica normal que tiene la misma longitud que la variante. La homología o identidad a nivel de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se determina mediante análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blas!n, blastx, tblastn y tblastx (Kar1in et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) Y Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), incorporados completamente como referencia) que están adaptados para la búsqueda de similitud de secuencia
El enfoque utilizado por el programa BLAST consiste en considerar primero los segmentos similares entre una secuencia problema y una secuencia de una base de datos, a continuación evaluar la significación estadística de todos los emparejamientos que se identifican y finalmente resumir solamente aquellos emparejamientos que satisfacen un umbral de significación previamente seleccionado. Para una discusión de las cuestiones básicas en la búsqueda de similitud de las bases de datos de secuencias, véase Altschul et al., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994» que se incorpora en su totalidad como referencia. Los parámetros de búsqueda para el histograma, las descripciones, los alineamientos, la esperanza (es decir, el umbral de significación estadistica para referir emparejamientos frente a secuencias de bases de datos), el corte, la matriz y el filtro están en los ajustes por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn, y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), incorporada en su tota lidad como referencia) Para blastn, la matriz de puntuación viene fijada por las razones de M (es decir, la puntuación de recompensa para un par de residuos de emparejamiento) con respecto a N (es decir, la puntuación de penalización para los residuos del emparejamiento erróneo), en donde los valores por defecto para M y N son 5 y -4, respectivamente. Cuatro parámetros blastn pueden ser ajustados como sigue: Q=10 (penalización de creación de espacio); R=10 (penalización de extensión de espacio); quot;wink~=1 (genera coincidencias en cada posición winklh a lo largo del problema); y gapw=16 (ajusta la anchura de la ventana dentro de la cual se generan los alineamientos con espacios). Los ajustes de los parámetros de Blasp equivalentes fueron Q=9; R=2; wink=1, y gapw=32. Una comparación Bestfit entre secuencias, disponible en la versión del paquete de GCG 10.0, utiliza los parámetros de ADN GAP=50 (penalización por creación de espacio) y LEN=3 (penalización por extensión de espacio) y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteinas son GAP=8 y LEN=2.
Las variantes de polinucleótidos de la invenciÓfl pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes, o ambas. Son especialmente preferidas las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren las variantes de nucleótidos producidas por las sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Por otra parte, también se prefieren las variantes de polipéptidos en las que menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, o 5-50, 5-25, 5-10, 1· 5, o 1-2 aminoácidos son sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación. Las variantes de polinucleótidos pueden ser producidas por una variedad de razones, p. ej., para optimizar la expresión de codones para un anfitrión concreto (cambiar codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por un anfitriÓfl bacteriano, tal como levadura o E. eoll)
En una realización preferida, un polinucleótido de la invención que codifica la porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina se optimiza para la expresiÓfl en células de levadura o mamífero. En una realización adicionalmente preferida, un polinucleótido de la invención que codifica la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina se optimiza para la expresión en células de levadura o mamífero. En una realización aún más preferida, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invenciÓfl se optimiza para la expresión en células de levadura o mamífero
En una realización altemativa, un polinucleótido de codón optimizado que codifica una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina no hibrida con el polinucleótido de tipo salvaje que codifica la proteína Terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en la presente memoria. En otra realización, un polinucleótido de codón optimizado que codifica una porción de albúmina de una proteína de fusión de albúmina no hibrida con el polinucle6tido de tipo salvaje que codifica la proteína de albúmina en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en la presente memoria. En otra realización, un polinucleótido de codón optimizado que codifica una proteína de fusión de albúmina no hibrida con el polinucleótido de tipo salvaje que codifica la porción de proteína Terapéutica o la porción de proteína de albúmina en condiciones de hibridación rigurosas como se describe en la presente memoria
En una realización adicional, un polinudeótido que codifica una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina no comprende, o alternativamente consiste en, la secuencia de origen natural de esa proteína Terapéutica. En una realización adicional, un polinucleótido que codifica una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina no comprende, o alternativamente consiste en, la secuencia de origen natural de la proteína de albúmina. En una realización altemativa, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina no comprende, o altemativamente consiste en, la secuencia de origen natural de una porción de proteína Terapéutica o la porción de proteína de albúmina.
Las variantes de origen natural se denominan quot;variantes alélicasquot; y hacen referencia a una de varias formas altemativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985». Estas variantes alélicas pueden variar a nivel de polinucleótido y/o polipéptido y están incluidas en la presente invención. Alternativamente, las variantes de origen no natural pueden ser producidas mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa
Utilizando métodos conocidos de diseño de proteinas y tecnologia de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden suprimir uno o más aminoácidos del extremo N o el extremo C del polipéptido de la presente invención sin pérdida sustancial de función biológica. Como ejemplo, Ron et al. (J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993» informaron sobre proteínas KGF variantes que tienen actividad de unión a heparina incluso después de suprimir 3, 8, o 27 residuos de aminoácido amino terminales. De un modo similar, el interierón gamma mostró una actividad hasta diez veces más alta después de suprimir 8-10 residuos de aminoácido del extremo carboxi de esta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988).)
Por otra parte, una amplia evidencia demuestra que las variantes a menudo conservan una actividad biológica similar a la de la proteína de origen natural. Por ejemplo, Gayte y col. (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993» llevaron a cabo análisis mutacionales exhaustivos de la citoquina IL-1a humana. Utilizaron la mutagénesis al azar para generar más de 3.500 mutantes de IL-1a individuales que promediaban 2,5 cambios de aminoácidos por variante a lo largo de toda la molécula. Se examinaron múltiples mutaciones en cada posible posición de aminoácido. Los investigadores encontraron que quot;lIa mayor parte de la molécula podía ser alterada con un pequeño efecto sobre la actividad de unión o biológica]quot;. De hecho, solamente 23 secuencias de aminoácidos, de más de
3.500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteina que diferia significativamente en su actividad de la de tipo salvaje.
Además, incluso si la supresión de uno o más aminoácidos del extremo N o el extremo C de un polipéptido produce una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, todavía se pueden conservar otras actividades biológicas. Por ejemplo, la capacidad de una variante por deleción para inducir y{o unirse a anticuerpos que
reconocen la forma secretada probablemente será conservada cuando menos de la mayoria de los residuos de la fOOlla secretada se elimine del extremo N o el extremo C. El que un polipéptido concreto que carece de residuos N o C-terminales de una proteina conserve tales actividades inmunogénicas puede ser fácilmente determinado por métodos rutinarios descritos en la presente memoria y conocidos de otro modo en la técnica.
De este modo, la invención incluye adicionalmente variantes de polipéptidos que tienen una actividad funcional (p ej., actividad biológica y{o actividad terapéutica). En una realización, la invención proporciona variantes de proteínas de fusión de albúmina que tienen una actividad funcional (p. ej., actividad biológica y{o actividad terapéutica) que corresponde a una o más actividades biológicas y{o terapéuticas de la proteína Terapéutica correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina. En otra realización, la invenciÓf'l proporciona variantes de proteínas de fusiÓf'l que tienen una actividad funcional (p. ej., actividad biológica y/o actividad terapéutica) que correponde a una o más actividades biológicas y{o terapéuticas de la proteína Terapéutica correspondíente a la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina. Tales variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y sustituciones seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica con el fin de que tengan poco efecto sobre la actividad. Los polinucleótidos que codifican tales variantes también están incluidos en la invención.
En realizaciones preferidas, las variantes de la invención tienen sustituciones conservativas. Por ~sustituciones conservativasquot; se quieren significar canjes dentro de grupos tales como el remplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e lIe; el remplazo de los residuos hidroxilados Ser y Thr; el remplazo de los residuos ácidos Asp Y Glu; el remplazo de los residuos amídicos Asn y Gln, el remplazo de los residuos alcalinos Lys, Arg, e His; el remplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, Y el remplazo de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly.
Las pautas concemientes a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas son proporcionadas, por ejemplo, por Bowie et al., ~Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Arnino Acid Substitutionsquot;, Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que existen dos estrategias principales para el estudio de la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio
La primera estrategia explota la tolerancia de las sustituciones de aminoácidos mediante selección natural durante el proceso de evolución. Comparando las secuencias de aminoácidos en diferentes especies, se pueden identificar aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados son probablemente importantes para la función de la proteína. En contraste, las posiciones de aminoácidos donde se han tolerado sustituciones por la selección natural indican que estas posiciones no son críticas para la función de la proteína. De este modo, las posiciones que toleran una sustitución de aminoácido podrían ser modificadas a la vez que conservarían la actividad biológica de la proteína
La segunda estrategia utiliza la modificación genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones críticas para la función de la proteína. Por ejemplo, se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido con alanina (introducción de sustituciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula). Véase Cunningham y Wells, Science 244:1081 -1085 (1989) Las moléculas mutantes resultantes se pueden someter a ensayo después para determinar la actividad biológica
Como establecen los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican adicionalmente qué cambios de aminoácidos es probable que sean permisivos en ciertas porciones de aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, los residuos de aminoácido más ocultos (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras que generalmente se conservan pocos rasgos de las cadenas laterales de la superficie. Por otra parle, las sustituciones de aminoácidos conservativas, toleradas implican el remplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu e lIe; el remplazo de los residuos hidroxilados Ser y Thr; el remplazo de los residuos ácidos Asp yd Glu; el remplazo de los residuos amídicos Asn y Gln, el remplazo de los residuos alcalinos Lys, Arg, e His; el remplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, Y el remplazo de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. Además de la sustitución de aminoácidos conservativa, las variantes de la presente invención incluyen (i) polipéptidos que contienen sustituciones de uno o más residuos de aminoácido no conservados, donde los residuos de aminoácido sustituidos pueden estar codificados o no por el código genético, o (ii) polipéptidos que contienen sustituciones de UIlO o más residuos de aminoácido que tienen un grupo sustituyente, o (iii) polipéptidos que han sido fusionados con o conjugados químicamente a otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), (iv) polipéptidos que contienen aminoácidos adicionales, tales como, por ejemplo, un péptido de la región de fusión de Fc de IgG. Se considera que tales polipéptidos variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente memoria.
Por ejemplo, las variantes de polipéptidos que contienen sustituciones de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados o neutros pueden producir proteínas con características mejoradas, tales como una menor agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas tanto reduce la actividad como aumenta el aclaramiento debido a la actividad inmunogénica de los productos agregados. Véanse Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Cri!. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)
En realizaciones especificas, los polipéptidos de la invención comprenden, o alternativamente, consisten en, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de albúmina, la secuencia de aminoácidos de una proteína Terapéutica y/o albúmina de suero humana, en donde los fragmentos o variantes tienen 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 o 50-150, adiciones, sustituciones, y/o deleciones de residuos de aminoácido cuando se comparan con la secuencia de aminoácidos de referencia. En realizaciones preferidas, las sustituciones de aminoácidos son conservativas. Los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos también están incluidos en la invención
El polipéptido de la presente invención puede estar compuesto por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y puede contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por los genes. Los polipéptidos pueden ser modificados mediante cualquier procedimiento natural, tal como el procesamiento post-traduccional, o mediante mecanismos de modificación química que son bien conocidos en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en voluminosas publicaciones de investigación. Las modificaciones se pueden producir en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de los aminoácidos o los extremos carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubicuitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos ciclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden resultar de procedimientos naturales post-traducción o se pueden elaborar mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, anclaje covalente de quot;avina, anclaje covalente de un radical hemo, anclaje covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, anclaje covalente de un lípido o derivado de lípido. anclaje covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, fonnación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por transferencia de ARN tal como arginilación, y ubicuitinación. (Véanse, por ejemplo, PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2quot; Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol. 182:626-646 (1990); Rallan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 663:48-62 (1992».
Actividad funcional
quot;Un polipéptido que tiene actividad funcionalquot; se refiere a un polipéptido capaz de presentar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con la pro-proteína completa, y/o la forma madura de la proteína Terapéutica. Tales actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, la actividad biológica, la antigenicidad [la capacidad para unirse (o competir con un polipéptido por la unión) a un anticuerpo anti-polipéptido], la inmunogenicidad (la capacidad para generar anticuerpos que se unen a un polipéptido específico de la invención), la capacidad para formar multímeros con polipéptidos de la invención, y la capacidad para unirse a un receptor o ligando para un polipéptido
quot;Un polipéptido que tiene actividad biológicaquot; se refiere a un polipéptido que muestra una actividad similar a, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de la proteína Terapéutica de la presente invención, incluyendo las formas maduras, medida en un análisis biológico concreto, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en el que existe dependencia de la dosis, no es necesario que esta sea idéntica a la del polipéptido, sino sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención (esto es, el polipéptido candidato mostrará una mayor actividad o una actividad no más de aproximadamente 25 veces menor y, preferiblemente, no más de aproximadamente diez veces menor, y muy preferiblemente, una actividad de no más de aproximadamente tres veces menor con respecto al polipéptido de la presente invención)
En realizaciones preferidas, una proteína de fusión de albúmina de la invención tiene al menos una actividad biológica y/o terapéutica asociada con la porción de proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) cuando ésta no está fusionada a albúmina.
En realizaciones preferidas adicionales, la proteína de fusión de albúmina de la invención tiene una mayor estabilidad en plasma en comparación con la porción de proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) en un estado no fusionado. La estabilidad en plasma de la proteína de fusión de albúmina de la invención o de la porción de proteina Terapéutica no fusionada (o un fragmento o una variante de la misma) se puede analizar utilizando o modificando de manera rutinaria análisis conocidos en la técnica.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden analizar para determinar la actividad funcional (p. ej., la actividad biológica) utilizando o modificando de manera rutinaria análisis conocidos en la técnica, así como análisis descritos en la presente memoria. Adicionalmente, un experto en la técnica puede analizar de manera
rutinaria fragmentos de una proteina Terapéutica correspondiente a una porción de proteina Terapéutica de una proteína de fusiÓfl de albúmina, para determinar la actividad utilizando análisis referidos en su correspondiente fila de la Tabla 1 (p. ej., en la columna 3 de la Tabla 1). Adicionalmente, un experto en la técnica puede analizar de manera rutinaria fragmentos de una proteína de albúmina cOfrespondiente a una porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina, para determinar la actividad utilizando análisis cOflocidos en la técnica yfo como se describe en la sección de Ejemplos de más abajo
Por ejemplo, en una realización donde se está analizando la capacidad de una proteína de fusión de albúmina para unirse o competir con una proteina Terapéutica por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido Terapéutico yfo un anticuerpo anti-albúmina, se pueden utilizar varios inmunoanálisis conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, sistemas de análisis competitivos y no competitivos utilizando mecanismos tales como radioinmunoanálisis, ELlSA (análisis de inmunoabsorci6n con enzima ligada), inmunoanálisis quot;sándwichquot;, análisis inmunorradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, análisis de inmunodifusión, inmunoanálisis in situ (utilizando oro coloidal, marcas enzimáticas o radioisótopos, por ejemplo), transferencias westem, reacciones de precipitación, análisis de aglutinación (p. ej., análisis de aglutinación en gel, análisis de hemaglutinación), análisis de fijación del complemento, análisis de inmunofluorescencia, análisis de proteína A, y análisis de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión al anticuerpo se detecta detectando una marca en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen en la técnica muchos métodos para detectar la unión en un inmunoanálisis y están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización preferida, en la que se identifica un compañero de unión (p. ej., un receptor o un ligando) de la proteína Terapéutica, se puede ana lizar la unión de ese compañero de unión por medio de una proteína de fusión de albúmina que comprende esa proteina Terapéutica como la porción de proteina Terapéutica de la fusión, p. ej., por medio de métodos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora y no reductora, cromatografía de afinidad con proteína, y transferencia por afinidad. Véase en general, Phizicky et al., Microbial. Rev. 59:94-123 (1995). En otra realización, se puede analizar la capacidad de correlacionarse fisiológicamente de una proteína de fusión de albúmina para unirse a uno o varios sustratos del polipéptido Terapéutico correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la fusión de manera rutinaria utilizando mecanismos conocidos en la técnica
En una realización alternativa, en la que se está evaluando la capacidad de una proteína de fusión de albúmina para formar multimeros, la asociación con otros componentes del multimero se puede analizar, p. ej., mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora y no reductora, cromatografía de afinidad con proteína, y transferencia por afinidad. Véase, en general Phizicky et al., supra.
En realizaciones preferidas, una proteína de fusión de albúmina que comprende la totalidad o una porción de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, tiene al menos una actividad biológica yfo terapéutica (p . ej ., para unirse específicamente a un polipéptido o epítopo) asociada con el anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) cuando ésta no está fusionada a albúmina. En otras realizaciones preferidas, la actividad biológica y/o la actividad terapéutica de una proteina de fusión de albúmina que comprende la totalidad o una porción de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica es la inhibición (es decir, antagonismo) o la activación (es decir, agonismo) de una o más actividades biológicas yfo actividades terapéuticas asociadas con el polipéptido que está específicamente unido a un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica.
Las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica pueden ser caracterizadas de diversas maneras. En particular, las proteinas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica pueden ser analizadas por su capacidad para unirse específicamente a los mismos antígenos unidos específicamente por el anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina utilizando mecanismos descritos en la presente memoria o mecanismos modificadores rutinarios conocidos en la técnica
Los análisis para determinar la capacidad de las proteínas de fusión de albúmina (p. ej., que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica) para unirse (específicamente) a una proteína o epítopo específico se pueden llevar a cabo en disolución (p. ej., Houghten, BiofTechniques 13:412421(1992», sobre cuentas (p. ej., Lam, Nature 354:82-84 (1991», sobre chips (p. ej ., Fodor, Nature 354:555-556 (1993» , sobre bacterias (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409), sobre esporas (p. ej., Patentes Núms. 5.571.698; 5.403.484; Y 5.223.409), sobre plásmidos (p. ej., Cull el al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 89:18651869 (1992» o sobre fa90s (p. ej., Scott y Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991» (cada una de estas referencias se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad). Las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o va riante de un anticuerpo Terapéutico también se pueden analizar para determinar su especificidad y afinidad por una proteína o epítopo específicos utilizando o modificando rutinariamente mecanismos descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la técnica.
Las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se
une a una proteina Terapéutica se pueden analizar para determinar la reaclividad cruzada con otros antígenos (p ej., moléculas que tienen conservación de la secuencias/estructura con las moléculas unidas específicamente por el anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina de la invención) mediante cualquier método conocido en la técnica.
Los inmunoanálisis que se pueden utilizar para analizar la unión (inmunoespecífica) y la reactividad cruzada incluyen, pero no se limitan a, sistemas de análisis competitivos y no competitivos utilizando técnicas tales como transferencias western, radioinmunoanálisis, ELlSA (análisis de inmunoabsorción con enzima ligada), inmunoanálisis ~sándwich~, análisis de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación del complemento, análisis inmunorradiométricos, inmunoanálisis fluorescentes, e inmunoanálisis con proteína A, por nombrar solamente unos pocos. Tales análisis son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva Yor1lt;, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad). Los inmunoanálisis ilustrativos se describen brevemente más abajo (pero no o a modo de limitación).
Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente la lisis de una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Triton X-100 aI1%, desoxicolato de sodio aI1%, SOS al 0,1%, NaCI 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,2, Trasylol al 1%) con un suplemento de inhibidOfes de proteína fosfatasa y/o proteasa (p. ej., EOTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), la adición de la proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) al producto lisado celular, la incubación durante un período de tiempo (p. ej., 1 a 4 horas) a 40 grados C, la adición de cuentas de sefarosa acopladas a un anticuerpo anti-albúmina, por ejemplo, al producto lisado celular, la incubación durante aproximadamemte una hora o más a 40 grados C, el lavado de las cuentas en tampón de lisis y la resuspensión de las cuentas en SOSltampón de muestra. La capacidad de la proteína de fusión de albúmina para inmunoprecipitar un antigeno concreto se puede evaluar, p. ej., mediante análisis de transferencia westem. Un experto en la técnica estaría informado de los parámetros que se pueden modificar para incrementar la unión de la proteina de fusión de albúmina a un antigeno y disminuir el fondo (p. ej., aclarando previamente el producto lisado celular con cuentas de sefarosa). Para una discusión adicional referente a los protocolos de inmunoprecipitación véase, p. ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.16.1.
El análisis de transferencia Westem comprende generalmente la preparación de muestras de proteínas, la electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (p. ej., SOS-PAGE al 8%-2QO,Io dependiendo del peso molecular del antigeno), la transferencia de la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, el bloqueo de la membrana en solución de bloqueo (p. ej., PBS con BSA al 3% o leche desnatada), el lavado de la membrana en tampón de lavado (p. ej., PBS-Tween 20), la aplicación de la proteína de fusión de albúmina de la invención (diluida en tampón de bloqueo) a la membrana, el lavado de la membrana en tampón de lavado, la aplicación de un anticuerpo secundario (que reconoce la proteína de fusión de albúmina, p. ej., anticuerpo anti-albúmina de suero humana) conjugado con un sustrato enzimático (p ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o con una molécula radiactiva (p. ej., 32p o 1251) d iluidos en tampón de bloqueo, el lavado de la membrana en tampón de lavado, y la detección de la presencia del antígeno. Un experto en la técnica tendría conocimientos sobre los parámetros que se podrían modificar para incrementar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional referente a los protocolos de transferencia westem véase, p. ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.8 .1.
Los ELlSA comprenden la preparación del antígeno, el recubrimiento del pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, el lavado del antígeno que no se unió a los pocillos, la adición de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., que comprende al menos un fragmento o variante de anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) de la invención conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) a los pocillos y la incubación durante un período de tiempo, el lavado de las proteínas de fusión de albúmina no unidas o unidas no específicamente, y la detección de la presencia de las proteínas de fusión de albúmina específicamente unidas al antígeno que recubre el pocillo. En los ELlSA la proteína de fusión de albúmina no tiene que estar conjugada con un compuesto detectable; en lugar de eso, se puede añadir al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce la proteína de fusión de albúmina) conjugado a un compuesto detectable. Adicionalmente, en lugar de recubrir el poci llo con el antígeno, la proteína de fusión de albúmina puede aplicarse como recubrimiento sobre el pocillo. En este caso, la molécula detectable podría ser el antígeno conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina). Un experto en la técnica tendria conocimiento de los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada así como otras variaciones de ELlSA conocidas en la técnica. Para una discusión adicional referente a los ELlSA véase, p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva Yor1lt; en 11.2.1
La afinidad de un ión de una proteína de fusión de albúmina a una proteína, antígeno, o epítopo y la velocidad de disociación de una interacción proteína de fusión de albúmina-proteína/antígenolepítopo se puede detenninar por medio de análisis de unión competitiva_ Un ejemplo de un análisis de unión competitiva es un radioinmunoanálisis que comprende la incubación de antigeno marcado (p. ej., 3H o 1251) con la proteína de fusión de albúmina de la invención en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad de la proteína de fusión de albúmina por una proteína, antígeno, o epítopo específicos y las velocidades de disociación de la unión se pueden determinar a partir de los datos mediante análisis de gráficos de Scatchard _La competición con una segunda proteina que se une a la misma proteina, antígeno o epítopo que la proteína de fusión de albúmina, también se puede determinar utilizando radioinmunoanálisis_ En este caso, la proteína, antígeno o epítopo se incuban con una proteína de fusión de albúmina conjugada con un compuesto marcado (p_ej_, 3H o 125 1) en presencia de cantidades crecientes de una segunda proteina no marcada
que se une a la misma proteína, antígeno, o epítopo que la proteína de fusión de albúmina de la invención.
En una rea lización preferida, se utiliza el análisis cinético BIAcore para determinar las velocidades de asociación y disociación de la unión de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a una proteína, antígeno o epítopo. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de las proteinas de fusión de albúmina, o polipéptidos, antígenos o epítopos especificos de los chips con polipéptidos, antigenos o epítopos o proteinas de fusión de albúmina específicos inmovilizados, respectivamente, sobre su superficie.
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión por una proteína o antígenos dados, preferiblemente el antígeno al que se pueden unir específicamente _ Las afinidades de unión preferidas incl~en aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.2 M, 10.2 M, 5 X 10-3 M, 10..3 M, 5 X 10-4 M, 10 M. Las afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.5 M, 10--5 M, 5 X 10--6 M, 10.6 M, 5 X 10.7 M, 107 M, 5 X 10·s M o 10--3 M. Las afinidades de unión aún más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.9 M 10.9 M 5 X 10.10 M 10.10 M 5 X 10.11 M 10.11 M 5 X 10.12 M 10.12 M 5 X 10.13 M 10.13 M 5 X 10.14 M 10.14 M 5 X '10.15 M:o 10.15 M. En reali~ciones pref~ridas, la~ proteínas de fusió~ de albúmin~ que ~mprenden al menos ~n fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica, tienen una afinidad por una proteína o epítopo dados similar a la del correspondiente anticuerpo (no fusionado a albúmina) que se une a una proteína Terapéutica, teniendo en cuenta la valencia de la proteina de fusión de albúmina (que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica) y la valencia del correspondiente anticuerpo. Además, los análisis descritos en la presente memoria (véanse los Ejemplos y la Tabla 1) y conocidos de otro modo en la técnica se pueden aplicar de manera rutina ria para medir la capacidad de las proteínas de fusión de albúmina y los fragmentos, variantes y derivados de los mismos para provocar una actividad biológica y/o una actividad Terapéutica (in vitro o in vivo) relacionadas con la porción de proteína Terapéutica y/o la porción de albúmina de la proteína de fusión de albúmina. Otros métodos serán conocidos por el experto en la técnica y están dentro del alcance de la invención
Albúmina
Como se ha descrito anteriOfTI1ente, una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos un fragmento o variante de una proteína Terapéutica y al menos un fragmento o variante de albúmina de suero humana, que están asociados entre sí , preferiblemente mediante fusión genética
Una realización adicional comprende al menos un fragmento o variante de una proteína Terapéutica y al menos un fragmento o variante de albúmina de suero humana, que están conectados entre sí por conjugación química.
Los términos, albúmina de suero humana (HSA) y albúmina humana (HA) se utilizan indistintamente en la presente memoria. Los términos, quot;albúminaquot; y quot;albúmina de sueroquot; son más amplios, e incluyen albúmina de suero humana (y fragmentos y variantes de la misma) así como albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma).
Según se utiliza en la presente memoria, quot;albúminaquot; se refiere colectivamente a la secuencia de proteína o aminoácidos de la albúmina, o un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de la albúmina. En particular, quot;albúminaquot; se refiere a albúmina humana o fragmentos de la misma (véanse por ejemplo, los documentos EP 201 239, EP 322 094 WO 97/24445, W095/23857) especialmente la forma madura de la albúmina humana como se muestra en la Figura 1 y en el SEa ID NO: 1, o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.
En realizaciones preferidas, la proteina albúmina de suero humana uti lizada en las proteínas de fusión de albúmina de la invención contiene uno o ambos de los siguientes conjuntos de mutaciones puntuales con referencia al SEO ID NO: 1. Leu-407 to Ala, Leu-408 a Val, Val-409 a Ala, y Arg-41 Oa Ala ; o Arg-41 Oa A, Lys-413 a Gln, y Lys-414 a Gln (véase, p_ ej _, la Publicación Internacional Núm _W095f23857, incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad)_En realizaciones incluso más preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención que contienen uno o ambos de los conjuntos de mutaciones puntuales descritos anteriormente tienen una estabilidad/resistencia mejoradas a la escisión proteolítica por Yap3p de levadura, permitiendo una mayor producción de proteínas de fusión de albúmina recombinantes expresadas en células anfitrionas de levadura.
Según se utiliza en la presente memoria, una porción de albúmina suficiente para prolongar la actividad terapéutica o
la estabilidad en plasma o la vida útil de la proteina Terapéutica se refiere a una porción de albúmina de longitud o estructura suficientes para estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la estabilidad en plasma de la proteína de manera que la vida útil o la estabilidad en plasma de la porción de proteína Terapéutica de la proteina de fusión de albúmina se prolonga o amplía en comparación con la vida útil o la estabilidad en plasma en el estado de no fusión. La porción de albúmina de las proteínas de fusiórJ de albúmina puede comprender la totalidad de la secuencia de HA como se ha descrito anteriormente, o puede incluir uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden tener 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50, o más aminoácidos contiguos de la secuencia de HA o pueden incluir parte o todos los dominios especificos de HA. Por ejemplo, se pueden utilizar uno o más fragmentos de HA que abarcan los dos primeros dominios de tipo inmunoglobu lina. En una realización preferida, el fragmento de HA es la forma madu ra de HA
La porciórJ de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la invención puede ser una variante de HA normal. La porción de proteina Terapéutica de las proteinas de fusión de albúmina de la invención también pueden ser variantes de las proteinas Terapéuticas como se describe en la presente memoria. El término quot;variantesquot; incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativa o no conservativas, donde tales cambios no alteran sustancialmente una o más de las propiedades oncóticas, de unión al ligando y no inmunogénicas útiles de la albúmina, o el sitio activo, o dominio activo que coofiere las actividades terapéuticas de las proteínas Terapéuticas.
En particular, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana, por ejemplo aquellos fragmentos descritos en el documento EP 322 094 (esto es HA (Pn), donde n es de 369 a 419). La albúmina puede derivar de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo ser humano, vaca , oveja, o cerdo. Las albúminas que no son de mamifero incluyen, pero no se limitan a, ga llina y salmón. La porción de albúmina de la proteina de fusión de albúmina puede ser de un animal diferente que la porción de proteína Terapéutica
En términos generales, un fragmento o variante de HA tendrá al menos 100 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 1SO aminoácidos de longitud. La variante de HA puede consistir en o altemativamente comprender al menos un dominio completo de HA, por ejemplo dominios 1 (aminoácidos 1-194 del SEa ID NO: 1), dominio 2 (aminoácidos 195-387 del SEO ID NO: 1), dominio 3 (aminoácidos 388-585 del SEO ID NO: 1), dominios 1 y 2 (1-387 del SEa ID NO:1), dominios 2 y 3 (195-585 del SEa ID NO:1) o dominios 1 y 3 (aminoácidos 1-194 del SEO ID NO: 1 y aminoácidos 388-585 del SEO ID NO: 1). Cada dominio está formado a su vez por dos subdominios homólogos, a saber 1-105, 120-194, 195-291 , 316-387, 388-491 Y 512-585, coo regiones conectoras intersubdominio flexibles que comprenden los residuos Lys 106 a Glu 119, Glu 292 a Va 1315 y Glu 492 a Ala 511.
Preferiblemente, la porción de albúmina de una proteina de fusión de albúmina de la invención comprende al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservativas del mismo. Si la fusión se basa en subdominios, algunos o todos los conectores adyacentes se utilizan preferiblemente para conectar al radical de la proteína Terapéutica.
Los anticuerpos que se unen específicamente a proteínas Terapéuticas también son proteínas Terapéuticas
La presente descripción también incluye proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína Terapéutica descrita en la Tabla 1 Se contempla específicamente que el término quot;proteína Terapéuticaquot; incluya anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica
(p. ej., como se describe en la columna 1 de la Tabla 1) Y a fragmentos y variantes de la misma. De este modo una proteína de fusión de albúmina de la descripción puede contener al menos un fragmento o variante de una proteína Terapéutica, yfo al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica .
Estructura de anticuerpo y antecedentes
Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básico comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptidicas, teniendo cada par una cadena quot;ligeraquot; (aproximadamente 25 koa) y una quot;pesadaquot; (aproximadamente SO-70 kOa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgO, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Véase en general, Fundamentallmmunology Capítulos 3-5 (Pau l, W., ed., 4a ed. Raven Press, N.Y. (1998)) (incOfPOrada como referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadenas ligerafpesada forman el sitio de unión al anticuerpo.
De este modo, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de uniórJ son los mismos.
Las cadenas muestran todas la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o COR Las regiones CDR, en general, son las porciones del anticuerpo que hacen contacto con el antígeno y determinan su especificidad _Las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de cada par están alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo especifico. Desde el extremo N al extremo C, ambas regiones variables de las cadenas tanto ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4_ Las regiones variables están conectadas a la región constante de la cadena pesada o ligera. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological interest (National lnstitutes of Health, Bethesda, Md_(1987 Y 1991)), o Chothia & Lesk J Mol. Biol
196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)
Según se utiliza en la presente memoria, quot;anticuerpoquot; hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunolágicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno (p_ ej _, una molécula que contiene una o más regiones CDR de un anticuerpo)_ Los anticuerpos que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos moooclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla (p_ ej _, Fv de cadena sencilla), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (antiId) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti-Id específicos para anticuerpos de la invención), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (p_ej_, dominios VH, dominios VL, o una o más regiones CDR)
Anticuerpos que se unen a Proteínas Terapéuticas
La presente descripción incluye proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una Proteína Terapéutica (p. ej., como se describe en la Tabla 1) o fragmento o variante de la misma.
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos (p_ ej_, de ratón y rata), de burro, oveja, cooejo, cabra, cobaya, camello, caballo, o pollo_ Muy preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos_Según se utiliza en la presente memoria, los anticuerpos quot;humanosquot; incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas y Xenomice u otros organismos que hayan sido modificados genéticamente para producir anticuerpos humanos.
Las moléculas de anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgO, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En realizaciones preferidas, las moléculas de anticuerpo que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina son IgG1 . En otras realizaciones preferidas, las moléculas de inmunoglobulina que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina son IgG2_En otras realizaciones preferidas, las moléculas de inmunoglobulina que se unen a una proteina Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina soo IgG4
Lo más preferiblemente los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina son fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno humanos de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab)2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv conectados por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluyendo los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender las regiones variables solas o combinadas con la totalidad o con una porción de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3.
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de una proteína Terapéutica o pueden ser específicos tanto para una proteína Terapéutica como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véanse, p. ej., las Publicaciones PCT WO 93117715; WO 92108802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tut!, et al., J_ ImmunoL 147:60-69 (1991 ); las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.474.893; 4.714.681 ; 4.925.648; 5.573.920; 5.601 .819; Kostelny et al., J. ImmunoL 148:1547-1553 (1992).
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) pueden ser biespecíficos o bifuncionales lo que significa que el anticuerpo es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadalligera diferentes y dos sitios de unión diferentes_ Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos por una variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o la cooexión de fragmentos Fab' Véase, p. ej., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. ImmunoL 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J ImmunoL 148:1547 1553 (1992) _Además, los anticuerpos biespecíficos se pueden formar como quot;diacuerposquot; (Hol liger et al_ quot;Diabodiesquot; small bivalent and bispecific antibody fragmentsquot; PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) o quot;Janusinasquot; (Traunecker el al.
~Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic Iymphocytes on HIV infected cellsquot; EMBO J 10:36553659 (1991) Y Traunecker et al. ~Janus¡n· new molecular design for bispecific reagents~ Jnt J Cancer Su pi 7:51 -52 (1992)).
La presente descripción tambiérJ proporciona proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos o variantes (incluyendo derivados) de un anticuerpo descrito en la presente memoria o conocido en otro lugar en la técnica. Se pueden utilizar los mecanismos convencionales conocidos pOIquot; los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de la invención, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR que dan como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluyendo los derivados) codifican sustituciones de menos de 50 aminoácidos, sustituciones de menos de 40 aminoácidos, sustituciones de menos de 30 aminoácidos, sustituciones de menos de 25 aminoácidos, sustituciones de menos de 20 aminoácidos, sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos, o sustituciones de menos de 2 aminoácidos con respecto al dominio VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, dominio VL, VLCDR1, VLCDR2, o VLCDR3 de referencia. En realizaciones especificas, las variantes codifican sustituciones de VHCDR3. En una realización preferida, las variantes tienen sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácido no esenciales pronosticados
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina pueden ser descritos o especificados en términos de los epítopos
o porciones de la proteína Terapéutica que reconocen o a la que se unen específicamente. Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Terapéutica o un epítopo específico de una proteína Terapéutica también se pueden excluir. Por lo tanto, la presente descripción incluye anticuerpos que se unen específicamente a proteínas Terapéuticas, y permite la exclusión de los mismos. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, se unen a los mismos epítopos que el fragmento o variante no fusionados de ese mismo anticuerpo.
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina también pueden ser descritos o especificados en términos de su reactividad cruzada. Están incluidos los anticuerpos que no se unen a ningún otro análogo, ortólogo, u homólogo de una proteína Terapéutica. Los anticuerpos que se unen a polipéptidos con una identidad de secuencia de al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% (calculada uti lizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria) con una proteína Terapéutica también están incluidos en la presente descripción. En realizaciones específicas, los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina presentan reacción cruzada con homólogos mu rinos, de rata y/o de conejo de proteínas humanas y los correspondientes epítopos de las mismas. Los anticuerpos que no se unen a polipéptidos con una identidad de secuencia de menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, y menos de 50% (calculada utilizando métodos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria) con una proteína Terapéutica también están incluidos en la presente invención. En una realización específica, la reactividad cruzada descrita anteriormente es con respecto a cualquier polipéptido antigénico o inmunogénico específico individual, o combinaciones de 2, 3, 4, 5, o más de los polipéptidos antigénicos y/o inmunogénicos específicos descritos en la presente memoria. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, tienen características de reactividad cruzada similares o sustancialmente idénticas en comparación con el fragmento o variante de ese mismo anticuerpo concreto.
También se describen anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con un polinucleótido que codifica la proteína Terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas (como se describe en la presente memoria). Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden describir
o especificar en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.2 M, 10.2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M. Las afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, 10-6 M, 5 X 10.7 M, 107 M, 5 X 10-6 M o 10-6 M. Las afinidades de unión aún más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10.9 M, 10.9 M, 5 X 10-10 M, 10.10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 a M, 5 X 10.12 M, 10-12 M, 5 X 10.13 M, 10.13 M, 5 X 10-14 M, 10.14 M, 5 X 10.15 M, o 10. 15 M. En
realizaciones preferidas, las proteinas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, tienen una afinidad por una proteína o epítopo dados similar a la del correspondiente anticuerpo (no fusionado a albúmina) que se une a una proteína Terapéutica, tomando en consideración la valencia de la proteína de fusión de albúmina (que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) y la valencia del correspondiente anticuerpo.
La invención también proporciona anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítopo de una proteína Terapéutica determinada mediante cualquier método conocido en la técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los inmunoanálisis descritos en la presente memoria. En realizaciones preferidas, el
anticuerpo inhibe competitivamente la unión al epítopo en al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%. En realizaciones preferidas, las proteinas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, inhiben competitivamente la unión de un segundo anticuerpo a un epítopo de una proteína Terapéutica. En otras realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, inhiben competitivamente la unión de un segundo anticuerpo a un epítopo de una proteína Terapéutica en al menos 95%, al menos 90%, al menos 85 %, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50%.
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica y que pueden corresponder a una porción de proteína Terapéutica de una proteina de fusión de albúmina de la invención pueden actuar como agonistas o antagonistas de la proteína Terapéutica. Por ejemplo, la presente descripción incluye anticuerpos que interrumpen las interacciones receptorfligando con los polipéptidos de la invención parcial o totalmente. La descripción proporciona tanto los anticuerpos especificos del receptor como los anticuerpos específicos del ligando. La descripción también proporciona anticuerpos específicos de receptores que no evitan la unión al ligando pero evitan la activación del receptor. La activación del receptor (esto es, la señalización) se puede determinar mediante mecanismos descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la técnica. Por ejemplo, la activación del receptor se puede determinar detectando la fosforilación (p. ej., tirosina o serina/treonina) del receptor o su sustrato mediante inmunoprecipitación seguida de análisis de transferencia westem (por ejemplo, como se ha descrito más arriba). En realizaciones específicas, se proporcionan anticuerpos que inhiben la actividad del ligando o la actividad del receptor en al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, o al menos 50% de la actividad en ausencia del anticuerpo. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, tienen características similares o sustancialmente similares con respecto a la prevención de la unión al ligando ylo la prevención de la activación del receptor en comparación con un fragmento o variante no fusionados del anticuerpo que se une a la proteína Terapéutica.
La descripción también proporciona anticuerpos específicos de receptores que evitan la unión al ligando como la activación del receptor así como anticuerpos que reconocen el complejo receptor-ligando, y, preferiblemente, no reconocen especificamente el receptor no unido o el ligando no unido. Del mismo modo, están incluidos en la invención anticuerpos neutralizadores que se unen al ligando y evitan la unión del ligando al receptor, asl como los anticuerpos que se unen al ligando, evitando de ese modo la activación del receptor, pero no evitan que el ligando se una al receptor. Adicionalmente se incluyen en la descripción anticuerpos que activan el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas de receptores, es decir, potencian o activan todas o un subgrupo de las actividades biológicas de la activación del receptor mediada por el ligando, por ejemplo, induciendo la dímeroización del receptor. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas, antagonistas o agonistas inversos para las actividades biológicas que comprenden las actividades biológicas especificas de las proteínas Terapéuticas (p. ej ., como se describe en la Tabla 1). Los anticuerpos agonistas anteriores se pueden elaborar utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Publicación PCT WO 96/40281 , la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.811.097; Deng et al., Blood 92(6):1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res. 58(16):3668-3678 (1998); Harrop et al. , J. Immunol. 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Cancer Res. 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol 160(7):3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. III(Pt2):237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol. Methods 205(2)· 177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14(4):755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20 (1996) (que se incorporan todas como referencia a la presente memoria en su totalidad). En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica, tienen propiedades agonísticas o antagónicas similares o sustancialmente idénticas a las de un fragmento o variante no fusionados del anticuerpo que se une a la proteína Terapéutica.
Los anticuerpos que se unen a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para purificar, detectar, y dirigir proteinas Terapéuticas, incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen utilidad en inmunoanálisis para la medición cualitativa y cuantitativa de los niveles de proteína Terapéutica en muestras biológicas. Véase, p. ej., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbar Laboratory Press, 23 ed. 1988); incorporada como referencia a la presente memoria en su totalidad. Del mismo modo, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, se pueden utilizar, por ejemplo, para purificar, detectar, y dirigir proteínas Terapéuticas, incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos tanto in vitro como in vivo
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica incluyen derivados que se modifican, esto es, mediante anclaje covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, p. ej., por medio de glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por medio de grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, conexión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante mecanismos conocidos, incluyendo, pero no limitados a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden modificar como se ha descrito anteriormente.
Métodos de producción de anticuerpos que se unen a Proteínas Terapéuticas
Los anticuerpos que se unen a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención pueden ser generados mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales para un antígeno de interés pueden ser producidos por medio de diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína Terapéutica puede ser administrada a diversos animales anfitriones incluyendo, pero llO limitados a, conejos, ratones, ratas, etc. para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Se pueden utilizar diversos coadyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies anfitrionas, e incluyen pero no se limitan a, el de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa ca liforniana, dinitrofenol, y coadyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales coadyuvantes también son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de mecanismos conocidos en la técnica incluyendo el uso de las tecnologias de hibridomas, recombinantes, y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando mecanismos de hibridomas incluyendo los conocidas en la técnica e ilustrados, por ejemplo, por Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbar Laboratory Press, 23 ed. 1988); Hammer1ing, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas referencias incorporadas como referencia en su totalidad). El término quot;anticuerpo monoclonalquot; según se utiliza en la presente memoria no está limitado a anticuerpos producidos por medio de la tecnología de hibridomas. El término quot;anticuerpo monoclonalquot; hace referencia a un anticuerpo que deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, proca riótico o de fago, y no el método por el cual es producido
Los métodos para producir y escrutar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de hibridomas son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitante, los ratones pueden ser inmunizados con una proteína Terapéutica o fragmento o variante de la misma, una proteína de fusión de albúmina, o una célula que expresa semejante proteina Terapéutica o fragmento o variante de la misma o proteína de fusión de albúmína. Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, p. ej., se detectan anticuerpos específicos para el antígellO en el suero de ratón, se cosecha el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Los esplellOcitos se fusionan a continuación mediante mecanismos bien conocidos a cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo células de la linea celular SP20 asequible de la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante dilución limitante. Los clones de hibridoma se analizan a continuación mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. Se puede generar fluido de ascitis, que contiene generalmente elevados niveles de anticuerpos, inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona métodos de generación de anticuerpos mOllOclonales así como anticuerpos producidos por el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo en donde, preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención con células de mieloma y escrutando a continuación los hibridomas resultantes de la fusión para determinar los clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención
otro método bien cOllOcido para producir líneas de células B humanas tanto policlonales como monoclonales es la transformación utilizando Virus de Epstein Barr (EBV). Los protocolos para generar líneas de células B transformadas con EBV son comúnmente conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el protocolo esbozado en el Capítulo 7.22 de Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., 1994, John W iley & Sons, NY, que se incorpora a la presente en su totalidad como referencia. La fuente de células B para la transformación es comúnmente sangre periférica humana, pero las células B para la transformación también pueden derivar de otras fuentes incluyendo, pero no limitadas a, ganglios linfáticos, amígdala, bazo, tejido tumoral, y tejidos infectados. Los tejidos se elaboran en general en suspensiones de una sola célula antes de la transformación con EBV. Adicionalmente, se pueden adoptar etapas para eliminar físicamente o inactivar células T (p. ej., mediante tratamiento con ciclosporina A) en muestras que contienen células B, debido a que las célula T de los individuos seropositivos para anticuerpos anti-EBV pueden suprimir la inmorlalización de las células B por EBV.
En general, a la muestra que contiene células B humanas se le inocula EBV, y se cultiva durante 3-4 semanas. Una fuente típica de EBV es el sobrenadante de cultivo de la línea celular B95-8 (ATCC núm. VR-1492). Los signos fisicos de transformación por EBV pueden ser generalmente observados hacia el final del periodo de cultivo de 3-4 semanas. Mediante microscopía de contraste de fases, las células transformadas pueden parecer grandes, claras, pilosas y tienden a agregarse en agrupaciones apretadas de células. Inicialmente, las lineas de EBV son generalmente policlonales. Sin embargo, a lo largo de períodos prolongados de cultivos celulares, las líneas de EBV pueden volverse monoclonales o policlonales como resultado del crecimiento selectivo de clones de células B concretos. Altemativamente, las líneas transformadas con EBV policlonal pueden ser subclonadas (p. ej., mediante
cultivo en dilución limitante) o fusionadas con un compañero de fusión adecuado y cultivadas en placa a una dilución limitante para obtener líneas de células B monoclonales. Los compañeros de fusión adecuados para líneas celulares transformadas con EBV incluyen lineas celulares de mieloma de ratón (p. ej., SP2/0, X63-Ag8.653), lineas celulares de heteromieloma (humano x ratón; p. ej., SPAM-8, SBC-H20, y CB-F7), y líneas celulares humanas (p. ej., GM 1500, SKO-007, RPMI 8226, Y KR-4). De este modo, la presente descripción también proporciona un método de generación de anticuerpos policlonales o monoclonales contra polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos, que comprende la transformación con EBV de células B humanas
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopos específicos pueden ser generados mediante mecanismos conocidos. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab)2 de la invención pueden ser producidos por escisión proteolitica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab)2). Los fragmentos F(ab)2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a la proteína Terapéutica también pueden ser generados utilizando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se presentan sobre la superticie de partículas de fa90s que portan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En una realización concreta, semejante fago puede ser utilizado para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (p. ej., humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés puede ser seleccionado o identificado con un antigeno, p. ej., utilizando antígeno marcado o antígeno unido a o capturado por una superficie sólida o cuenta. Los fagos utilizado en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión fd y M 13 expresados a partir de fagos con dominios de anticuerpos Fab, Fvo Fv estabilizados con disulfuro fusionados recombinantemente a la proteína del gen 111 o el gen VIII del fago. Los ejemplos de los métodos de presentación en fagos que se pueden utilizar para elaborar anticuerpos que se unen a la proteína Terapéutica incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., 1. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud PCT Núm PCT/GB91101134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92118619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484;5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 Y 5.969.108;.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección en fagos, las regiones codificantes de anticuerpo del fago pueden ser aisladas y utilizadas para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier airo fragmento de unión a antígeno deseado, y expresadas en cualquier anfitrión deseado, incluyendo células de mamifero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, p. ej., como se describe con detalle a continuación. Por ejemplo, los mecanismos para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también pueden ser empleados utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Betler et al., Science 240:1041-1043 (1988).
Los ejemplos de los mecanismos que se pueden utilizar para producir Fv de cadena sencilla y antícuerpos incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y análisis de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tales como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse p. ej., Morrison, Science 229:1202 (1985); Di el al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.807.715; 4.816.567; Y 4.816.397. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpos de especies no humanas que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos del marco de las regiones marco humanas serán sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donador de la CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antigeno. Estas sustituciones del marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante modelado de las interacciones de los residuos de la CDR y el marco para identificar los residuos del marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos inusuales del marco en posiciones concretas. (Véase, p. ej., Queen et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de mecanismos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967; Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.225.539; 5.530. O 1; Y 5.585.089), técnicas de remodelación o reconstrucción de la superticie (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska, et al., PNAS 91 :969-973 (1994», e intercambio de cadenas (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.565.332)
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de
pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser elaborados mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de presentación en fagos descritos anteriormente que utilizan bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véanse también, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.444.887 y4.716.111 , Y las publicaciones PCT WO 98f46645, WO 98f50433, WO 98124893, WO 98116654, WO 96f34096, WO 96f33735, y WO 91110741 , cada una de las cua les se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad
Los anticuerpos humanos también pueden ser producidos uti lizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humanas Por ejemplo, se pueden introducir complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humanas al azar o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante, y la región de diversidad humanas pueden ser introducidas en células madre embrionarias de ratón además de los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los genes de inmunoglobulina de las cadenas pesada y ligera de ratón se pueden volver no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmullOglubulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH evita la producción de anticuerpo endógeno. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. A continuación los ratones quiméricos se crían para producir una progenie homozigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de una manera normal con un antigeno seleccionado, p. ej., todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos moooclonales dirigidos contra el antígeno pueden ser obtenidos a partir de ratones trasgénicos, inmunizados utilizando la tecnologia de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B, y con posterioridad experimentan cambio de clase y mutación somática. De este modo, utilizando semejante técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéutica mente útiles Para una visión general de esta tecnologia para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, In!. Rev ImmunoL 13:65-93 (1995). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos moooclonales humanos y de los protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, p. ej., las publicaciones PCT WO 98124893; WO 92/01047; WO 96f34096; WO 96/33735; Patente Europea Núm. O 598 877; Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661 .016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771 ; 5.939.598; 6.075.181 ; Y 6.1 14.598, que se incorporan como referencia a la presente memoria en su totalidad. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden ser contratadas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antigeno seleccionado utilizando una tecnología similar a la descrita anteriormente
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado se pueden generar utilizando una técnica referida como quot;selección guiadaquot; En este enfoque se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, p. ej., un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al., Bioltechnology 12:899-903 (1988»
Pofinucfeótidos que codifican anticuerpos
La descripción proporciona adicionalmente polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucle6tidos que codifica un anticuerpo y fragmentos del mismo. La invención también incluye polinudeótidos que hibridan en condiciones de hibridación rigurosas o altemativamente, menos rigurosas, p. ej., como se define más arriba, con polinucleótidos que cod ifican un anticuerpo, preferiblemente, que se une específicamente a la proteína Terapéutica, y más preferiblemente, un anticuerpo que se une a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ~proteina Terapéutica: Xquot; descrita en la columna quot;SEQ ID NO: z~ de la Tabla 2
Se pueden obtener polinucleótidos, y determinar la secuencia de nucleótidos mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede reunir a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (p. ej., como describen Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994», que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la ligación de esos oligonucleótidos, y a continuación la amplificación de los o ligooucleótidos ligados por PCR.
Altemativamente, se puede generar un polinucleótido que codifica un anticuerpo a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo concreto no se encuentra disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina o se puede obtener a partir de una fuente adecuada (p. ej., una biblioteca de ADNc, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o un ácido nucleico. preferiblemente ARN poli A+, aislado de, cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clooación utilizando una sooda oligonucleotídica específica para la secuencia génica concreta a identificar, p. ej .. un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR se pueden clonar a continuación en vectores de clonación replicables utilizando cua lquier método bien conocido en la técn ica (Véase el Ejemplo 65).
Una vez que se determinan la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del
anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo se puede manipular utilizando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, p. ej., técnicas de ARN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas por Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 23 Ed., Cold Spring Harbar Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, que se incorporan ambas como referencia a la presente memoria en su totalidad), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones, y/o inserciones de aminoácidos
En una realización especifica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera se pueden inspeccionar para identificar las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de la secuencia. Utilizando técnicas de AON recombinante rutinarias, se pueden insertar una o más de las COR dentro de regiones marco, p. ej., en regiones marco humanas para humanizar un anticuerpo no humano, como se describe más arriba. Las regiones marco pueden ser regiones marco de origen natural o consenso, y preferiblemente regiones marco humanas (véase, p. ej., Chothia et al., J. Mol. Biol. 27S: 457-479 (199S) para una enumeración de regiones marco humanas). Preferiblemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones marco y las CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la invención. Preferiblemente, como se ha comentado más arriba, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones marco, y, preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente, tales métodos se pueden utilizar para realizar sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios. otras alteraciones del polinucleótido están incluidas en la presente invención y dentro del conocimiento práctico de la técnica
Adicionalmente, se pueden utilizar las técnicas desarrolladas para la producción de ~anticuerpos quiméricosquot; (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604--608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) mediante el empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón con una especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humana con una actividad biológica apropiada. Como se ha descrito más arriba, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, p. ej., anticuerpos humanizados
Altemativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Na!. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (19S8); y Ward el al., Nature 334:544-54 (19S9» se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman conectando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fva través de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. También se pueden utilizar las técnicas para ensamblar fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988))
Expresión recombinante de anticuerpos
La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo, (p. ej., una cadena pesada
o ligera de un anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla), requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o porción del mismo (preferiblemente que contiene el dominio variable de la cadena pesada o ligera), de la invención, se puede producir el vector para la producción de la molécula de anticuerpo mediante tecnología de AON recombinante utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. De este modo, los métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo se describen en la presente memoria. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de AON recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. La descripción, de este modo, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de la cadena pesada o ligera, conectados operablemente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, p. ej., la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la Patente de los Estados Unidos Núm 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo se puede clonar en semejante vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa
El vector de expresión se transfiere a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan a continuación mediante mecanismos convencionales para producir un anticuerpo. De ese modo, la invención incluye células anfitrionas que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla, conectados operablemente
a un promotor heterólogo_ En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera pueden ser expresados simultáneamente en la célula anfitriona para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla más abajo
Se puede utilizar una variedad de sistemas de anfitrión-vector de expresión para expresar las moléculas de anticuerpo_ Tales sistemas de anfitrión-vector de expresión representan vehículos por medio de los cuales pueden ser producidas las secuencias codificantes de interés y purificadas con posterioridad, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, una molécula de anticuerpo de la invención in situ _Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (p_ ej _, E_ coli, B_subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levaduras (p_ ej_, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p_ej_, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p_ej_, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p_ ej _, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (p. ej., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p_ ej_, promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia)_ Preferiblemente se utilizan células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, un sistema de expresión eficaz para anticuerpos consiste en células de mamifero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., BiofTechnology 8:2 (1990».
En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente numerosos vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que esté siendo expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de semejante proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de niveles elevados de productos de proteínas de fusión que son facilmente purificados. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J_ 2:1791 (1983», en el que la secuencia codificante del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z de manera que se produce una proteína de fusión; vectores plN (lnouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem_ 24:5503-5509 (1989)); y similares _También se pueden utilizar vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a cuentas de matriz de glutation-agarosa seguido de elución en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan sitios de escisión para las proteasas trombina o factor Xa de manera que el producto génico diana clonado pueda ser liberado del radical GST
En un sistema de insectos, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos_ El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de la polihedrina) del virus y se puede colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina).
En células anfitrionas de mamífero, se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus_En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés se puede ligar a un complejo de control de la transcripciónftraducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita_Este gen quimérico puede ser insertado a continuación en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en anfitriones infectados. (p. ej., véase Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984». También se pueden requerir señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de las secuencias codificantes de anticuerpo insertadas_Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes _Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden tener una variedad de origenes, tanto naturales como sintéticos_La eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc _(véase Bittner et al., Methods in EnzymoL 153: 51 -544 (1987))
Adicionalmente, se puede seleccionar una cepa de célula anfitriona que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada _Tales modificaciones (p_ ej _, glicosilación) y procesamiento (p_ ej _, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación post-traduccionales de las proteínas y productos génicos. Se pueden seleccionar líneas celulares o
sistemas anfitriones apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea expresada. Con esta final idad, se pueden utilizar células anfitrionas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilaciÓfl, y la fosforilación del producto génico. Tales células anfitrionas de mamífero incluyen pero no se limitan a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, yen particular, líneas celulares de cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 Y T47D, lineas celulares de glándula mamaria normal tales como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden modificar lineas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen origenes de replicación virales, las células anfitrionas se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (p. ej., promotores, potenciadores, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, se puede permitir que las células modificadas crezcan durante 1-2 dias en medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar loci que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede utilizar ventajosamente para modificar líneas celulares que expresan la molécula de anticuerpo. Tales líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles en el escrutinio y la evaluación de compuestos que interaccionan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo
Se pueden utilizar numerosos sistemas de selección, incluyendo pero no limitados a los genes de timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11 :223 (1977», hipoxantina-guanina fosforribosillransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nall. Acad. Sci. USA 48:202 (1992», y adenina fosforribosillransferasa (Lowy el al., Cell 22:817 (1980» en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Asimismo, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Natl Acad. Sei. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981»; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981»; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991 ); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); Mayo, 1993, TIB TECH 11(5):155-215 (1993)); e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnologia de ADN recombinante se pueden aplicar rutinaria mente para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos son descritos, por ejemplo, por Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); yen los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden incrementar mediante amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador del sistema de expresión que expresa el anticuerpo es amplificable, el incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula anfitriona incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará {Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983»
Los vectores que utilizan glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (p. ej., la línea celular de mieloma murino, NSO) que son glutamina sintasa negativas. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa {p. ej., células de ovario de hámster Chino (CHO» proporcionando un inhibidor adicional para prevenir el funcionamiento del gen endógeno. Un sistema de expresión de glutamina sintasa y los componentes del mismo se detallan en las publicaciones PCT: W087/04462; W086/05807; W089f01036; W089f10404; y W091106657. Adicionalmente, los vectores de expresión de glutamina sintasa que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención se encuentran disponibles en el mercado de proveedores, incluyendo, por ejemplo Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y producción de anticuerpos monoclonales que utilizan un sistema de expresión de GS en células de mieloma murino son descritas por Bebbington et al., Biotechnology 10: 169(1992) y por Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11 :1(1995)
La célula anfitriona se puede co-transfectar con dos vectores de expresiÓfl de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede utilizar un único vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos tanto de la cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se debe colocar antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature
322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)) Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que una molécula de anticuerpo ha sido producida por un animal, sintetizada químicamente, o expresada
recombinantemente, puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, de afinidad, concretamente de afinidad por el antígeno específico después de Proteína A, y clasificación por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención o fragmentos de la misma se pueden fusionar con secuencias de polipéptidos heterólogos descritas en la presente memoria o conocidas de olro modo en la técnica, para facilitar la purificación.
Modificaciones de anticuerpos
Los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica o fragmentos o variantes se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311 ), entre otras, muchas de las cuales se encuentran disponibles en el mercado. Como describen Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporcionar una pu rificación conveniente de la proteína de fusión. otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglulinina (también denominada quot;etiqueta de HN), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta quot;flagquot;
La presente descripción incluye adicionalmente anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos se pueden utilizar como diagnóstico, por ejemplo, para controlar el desarrollo o progreso de un tumor como parte de un procedimiento de ensayo clínico, p. ej., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo)
o indirectamente, a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la técnica) utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.741.900 para iones metálicos que pueden ser conjugados con anticuerpos para su uso como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidinalbiotina y avidinafbiotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequOfina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 1251, 1311, 111 1n o 99Tc. Otros ejemplos de sustancias detectables han sido descritos en otra parte en la presente memoria.
Adicionalmente, un anticuerpo se puede conjugar con un radical terapéutico tal como una citotoxina, p. ej., un agente citostático o cilocida, un agente terapéutico o un ión metálico radiactivo, p. ej., emisores alfa tales como, por ejemplo, 213Bi. Una citoloxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetína, mitomicina, etopásido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunofTubicina, dihidroxi antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actínomicina D, 1-lt;1eshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos y homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolilos (p. ej., metolrexato, 6-mercaptopurina, 6-tíoguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa dorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CeNU). ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina e, y cis-diclofOdiamina platino (11) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicinan (antes actinomicina), bleomicina, milramicina, y anlramicina (AMe», y agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina).
Los productos conjugados se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o radical farmacológico no se deben considerar limitados a agentes terapéuticos qulmicos clásicos. Por ejemplo, el radical farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posee una actívidad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal facto( de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, p. ej., TNFalfa, TNF-beta, AIM I (Véase la Publicación Intemacional Núm. WO 97f33899), AIM 11 (Véase la Publicación Internacional Núm. WO 97f34911) , Ligando Fas (Takahashi et al., Inl. Immunol. 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Véase la Publicación Intemacional Núm. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, p. ej., angiostalina o endostalina; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 (quot;IL-1quot;), interleuquina-2 (quot;IL-2quot;), interleuquina-6 (quot;IL-6quot;), factor estimulador de las colonias de granulocitos macrófagos (quot;GM-eSFquot;), factor estimulador de las colonias de granulocitos (quot;G-CSP'), u otros factores de crecimiento.
Los anticuerpos también se pueden anclar a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoanálisis o purificación del antígeno diana. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
Las técnicas para conjugar semejante radical terapéutico a anticuerpos son bien conocidas. Véanse, por ejemplo, Amon et al., quot;Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapyquot;, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., quot;Antibodies For Drug Oeliveryquot;, en Controlled Drug Delivery (23 Ed.), Robinson et al. (eds _), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, quot;Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Revievl', en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); quot;Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapyquot;, en Monoclonal Antibodies For Cancer Deteclion And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., quot;The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugatesquot;, Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)
Altemativamente, un anticuerpo se puede conjugar con un segundo anticuerpo para formar un producto heteroconjugado de anticuerpo como describe Segal en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980
Se puede utilizar como agente terapéutico un anticuerpo, con o sin un radical terapéutico conjugado a él, se administra solo o combinado con uno o varios factores citotóxicos ylo una o varias citoquinas.
Fusión de anticuerpo-albúmina
Los anticuerpos que se unen a una porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica descrita en la columna quot;Proteina Terapéutica Xquot; de la Tabla 1, o un fragmento o variante de la misma
En realizaciones específicas, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o alternativamente consiste en, el dominio VH. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a una proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, una, dos o tres COR de VH. En otras rea lizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunospecíficamente a la proteina Terapéutica comprende, o alternativamente consiste en, la CDR1 de VH. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecificamente a la proteína Terapéutica comprende, o alternativamente consiste en, la CDR2 de VH. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, la COR3 de VH.
En realizaciones especificas, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o alternativamente consiste en, el dominio VL. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecificamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, una, dos o tres CDR de VL. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o alternativamente consiste en, la CDR1 de VL. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, la CDR2 de VL. En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, la CDR3 de VL
En otras realizaciones, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDR de VH ylo VL.
En realizaciones preferidas, el fragmento o variante de un anticuerpo que se une inmunoespecificamente a la proteína Terapéutica comprende, o altemativamente consiste en, un scFv que comprende el dominio VH del anticuerpo Terapéutico, conectado al dominio VL del anticuerpo terapéutico por un conector peptídico tal como (Gly4Ser)3 (SEO ID NO: 4).
Inmunofenotipificación
Los anticuerpos o las proteínas de fusión de albúmina de la descripción que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) se pueden utilizar para la inmunofenotipificación de líneas celulares y muestras biológicas. Las proteínas Terapéuticas de la presente invención pueden ser útiles como marcadores especificos de células, o más específicamente como marcadores celulares que se expresan diferencialmente en diversas fases de diferenciación y/o maduración de tipos concretos de células. Los anticuerpos monoclonales (o protelnas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) dirigidos contra un epítopo específico, o combinación de epítopos, permitirán el escrutinio de poblaciones celulares que expresan el marcador. Se pueden utilizar diversas técnicas que emplean anticuerpos monoclonales (o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) para escrutar las poblaciones celulares que expresan el marcador o los marcadores, e incluyen separación magnética utilizando cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpo, quot;purificación por inmunoprecipitaciónquot; con anticuerpo anclado a una matriz sólida (esto es, placa), y citometría de flujo (Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos 5.985.660; y Morrison et al. Cell. 96:737-49 (1999))
Estas técnicas permiten el escrutinio de poblaciones concretas de células, tales como las que se podrian encontrar con ma lignidades hematol6gicas (esto es, enfermedad residual mínima (ERM) en pacientes con leucemia aguda) y células quot;no propias en transplantes para prevenir la enfermedad de Injerto contra a Anfitrión (El CA). Altemativamente, estas técnicas permiten el escrutinio de células madre hematopoyéticas y progenitoras capaces de experimentar proliferación y{o diferenciación, como las que se podrían encontrar en sangre de cordón umbilical humano.
Caracterización de anticuerpos que se unen a una proteína terapéutica y proteínas de fusión de albúmina que comprenden un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína terapéutica
Los anticuerpos de la descripción o las proteínas de fusión de albúmina de la descripción que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) se pueden caracterizar en una variedad de formas. En particular, las proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica se pueden ana lizar para determinar la capacidad para unirse especifica mente a los mismos antígenos unidos específicamente al anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica correspondiente al anticuerpo que se une a una porción de proteina Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina utilizando mecanismos descritos en la presente memoria o mecanismos de modificación rutinarios conocidos en la técnica
Los análisis para determinar la capacidad de los anticuerpos de la descripción o las proteínas de fusión de albúmina de la descripción que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) para unirse (específicamente) a una proteína o epitopo específicos se pueden realizar en solución (p. ej., Houghten, Biothechniques 13:412-421(1992)), sobre cuentas (p ej., Lam, Nature 354:82-84 (1991 )), sobre chips (p. ej., Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), sobre bacterias (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409), sobre esporas (p. ej., Patentes Núms. 5.571.698; 5.403.484; Y 5.223.409), sobre plásmidos (p. ej., Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 (1992)) o sobre fagos (p ej., Scott y Smith, Science 249:386-390 (1990); Oevlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991 )l. Los anticuerpos de la descripción o las proteínas de fusión de albúmina de la descripción que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) también pueden ser analizados para determinar su especificidad y afinidad por una proteina o epítopo específicos utilizando mecanismos de modificación rutinarios descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la técnica.
Las proteinas de fusión de albúmina de la descripción que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica se pueden ana lizar para determinar la reactividad cruzada con otros antígenos (p. ej., moléculas que tienen conservación de la secuenciafestructura con las moléculas unidas específicamente al anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteina de fusión de albúmina de la invención) mediante cualquier método conocidos en la técnica
Los inmunoanálisis que se pueden utilizar para analizar la unión (inmunoespecífica) y la reactividad cruzada incluyen, pero no se limitan a, sistemas de análisis competitivos y no competitivos utilizando mecanismos tales como transferencias western, radioinmunoanálisis, ELlSA (análisis de inmunoabsorci6n con enzima ligada), inmunoanálisis quot;sándwichquot;, análisis de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación del complemento, análisis inmunorradiométricos, inmunoanálisis fluorescentes, e inmunoanálisis de proteina A, por nombrar unos pocos. Tales análisis son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, que se incorpora como referencia a la presente memoria en su totalidad). Los inmunoanálisis ilustrativos se describen brevemente más abajo (pero no se pretende que sean limitantes).
Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente la lisis de una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Tritón X-lOO all %, desoxicolato de sodio al 1%, SOS al 0,1%, NaCI 0,15 M, fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,2, Trasylol al 1%) con un suplemento de proteina fosfatasa yfo inhibidores de proteasa (p. ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), la adición de un anticuerpo o proteína de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) al producto lisado celular, la incubación durante un período de tiempo (p. ej., 1 a 4 horas) a 40 9rados C, la adición de cuentas de sefarosa con proteína A y/o proteína G (o cuentas recu biertas con un anticuerpo anti-idiotípico o un anticuerpo anti-albúmina apropiado en el caso de una proteína de fusión de albúmina que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Terapéutico) al producto lisado celular, la incubación durante aproximadamente una hora o más a 40 grados e, el lavado de las cuentas en tampón de lisis y la resuspensión de las cuentas en SOS/tampón de muestra. La capacidad del anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina para inmunoprecipitar un antígeno concreto se puede evaluar, p. ej., mediante análisis de transferencia westem. Un experto en la técnica estaría informado de los parámetros que se pueden modificar para incrementar la unión del anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina a un antígeno y
disminuir el fondo (p _ej., pre-aclaramiento del producto lisado celular con cuentas de sefarosa)_ Para una discusión adicional con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación véase, p. ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John W iley & Sons, Inc_, Nueva York en 10 _16 _1
El análisis de transferencia Westem generalmente comprende la preparación de las muestras de proteínas, la electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (p. ej., SOS-PAGE al 8%-20% dependiendo del peso molecular del antígeno), la transferencia de la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVOF o nailon, el bloqueo de la membrana en solución de bloqueo (p. ej., PBS con BSA al 3% o leche desnatada), el lavado de la membrana en tampón de lavado (p_ ej. , PBS-Tween 20), la aplicación del anticuerpo o la proteina de fusión de albúmina (diluida en tampón de bloqueo) a la membrana, el lavado de la membrana en tampón de lavado, la aplicación de un anticuerpo secunda rio (que reconoce la proteína de fusión de albúmina, p_ ej_, un anticuerpo anti-albúmina de suero humana) conjugado con un sustrato enzimático (p _ ej. , peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o una molécula radiactiva (p _ ej.,32p o 1251) diluido en tampón de bloqueo, el lavado de la membrana en tampón de lavado, y la detección de la presencia del antígeno_ Un experto en la técnica estaría informado de los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional respecto a los protocolos de transferencia westem véase, p _ej_, Ausubel et al., eds, 1994, Curren! Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John W iley & Sons, Inc., Nueva York en 1Q8.1.
Los ELlSA comprenden la preparación del antígeno, el recubrimiento de los poci llos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, el lavado del antígeno que no se unió a los poci llos, la adición del anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina (que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica) conjugados con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (p _ ej. , peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) a los pocillos y la incubación durante un período de tiempo, el lavado de las proteínas de fusión de albúmina no unidas o unidas no específicamente, y la detección de la presencia del anticuerpo o las proteínas de fusión de albúmina específicamente unidas al antígeno que recubre el pocillo. En los ELlSA el anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina no tienen que ser conjugados a un compuesto detectable; en lugar de eso, se puede añadir al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina, respectivamente) conjugado con un compuesto detectable _Adicionalmente, en lugar de recubrir el pocillo con el antigeno, se pueden aplicar el anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina como recubrimiento al pocillo. En este caso, la molécula detectable podría ser el antígeno conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (p _ej. , peroxídasa de rábano pícante o fosfatasa alcalína)_ Un experto en la técnica estaría informado de los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada así como de otras variaciones de los ELlSA conocidas en la técnica. Para una discusión adicional referente a los ELlSA véase, p. ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11 _2 _1
La afinidad de unión de una proteína de fusión de albúmina a una proteína, antígeno, o epítopo y la velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo-o proteína de fusión de albúmina-proteínalantígenolepítopo se puede determinar mediante análisis de unión competitiva. Un ejemplo de un análisis de unión competitiva es un radioinmunoanálisis que comprende la incubación de un antígeno marcado (p. ej., 3H o 125 1) con el anticuerpo o proteína de fusión de albúmina en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina por una proteína, antígeno, o epítopo específicos y las velocidades de disociación de pueden determinar a partir de los datos mediante análisis de gráficos de Scatchard. La competición con una segunda proteína que se une a la misma proteína, antígeno o epítopo que el anticuerpo o la proteína de fusión de albúmina, también se puede determinar utilizando radioinmunoanálisis. En este caso, la proteina, antígeno o epitopo se incuban con un anticuerpo o proteína de fusión de albúmina de la invención conjugados con un compuesto marcado (p . ej., 3H o 1251) en presencia de cantidades crecientes de una segunda proteína no marcada que se une a la misma proteína, antígeno, o epítopo que la proteína de fusión de albúmina de la invención.
En una realización preferida, se utiliza un análisis cinético BIAcore para determinar las velocidades de asociación y disociación de la unión del anticuerpo o las proteínas de fusión de albúmina de la invención a una proteína, antígeno
o epítopo. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de anticuerpos, proteínas de fusión de albúmina, o polipéptidos, antígenos o epítopos específicos a partir de chips con polipéptidos, antígenos o epítopos específicos, anticuerpos o proteínas de fusión de albúmina inmovilizados, respectivamente, sobre su superficie
Usos terapéuticos
La presente invención está dirigida adicionalmente a terapias basadas en anticuerpos que implican la administración de anticuerpos o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica a un paciente animal, preferiblemente un mamífero, y muy preferiblemente un ser humano, para el tratamiento de una o más de las enfermedades, trastomos, o afecciones descritos_ Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos descritos en la presente memoria), ácido nucleicos que codifican anticuerpos (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos y anticuerpos anti-idiotípicos descritos en
la presente memoria), proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, y ácidos nucleicos que codifican tales proteinas de fusión de albúmina. Los anticuerpos o proteinas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica se pueden utilizar para tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastomos o afecciones asociados con la expresión ylo actividad aberrantes de una proteína Terapéutica, incluyendo, pero no limitadas a, una o más cualesquiera de las enfermedades, trastomos, o afecciones descritos en la presente memoria. El tratamiento ylo la prevención de enfermedades, trastomos o afecciones asociados con la expresión ylo actividad aberrante de una proteína Terapéutica incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los síntomas asociados con aquellas enfermedades, trastomos o afecciones. Los anticuerpos de la invención o proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica pueden ser proporcionados en composiciones farmacéuticamente aceptables como es sabido en la técn ica o como se describe en la presente memoria
En una realización especifica y preferida, la presente descripción está dirigida a terapias basadas en anticuerpos que implican la administración de anticuerpos o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica a un paciente animal, preferiblemente un mamífero, y muy preferiblemente un ser humallO, para el tratamiento de una o más enfermedades, trastomos, o afecciones, incluyendo pero no limitados a: trastorllOs neurales, trastomos del sistema inmunitario, trastornos musculares, trastomos reproductivos, trastornos gastrointestinales, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastomos proliferativos, ylo enfermedades y afecciones cancerosas, ylo como se describe en otra parte en la presente memoria. Los compuestos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (p. ej., anticuerpos dirigidos a la proteína completa expresada sobre la superficie celular de una célula de mamífero; anticuerpos dirigidos a un epítopo de una proteína Terapéutica y ácidos nucleicos que codifican anticuerpos (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos y anticuerpos anti-idiotípicos como se describe en la presente memOfia). Los anticuerpos se pueden utilizar para tratar, inhibir o prevenir enfennedades, trastomos o afecciones asociados con una expresión ylo actividad aberrante de una proteína Terapéutica, incluyendo, pero no limitados a, uno o más cualesquiera de las enfermedades, trastomos, o afecciones descritos en la presente memoria. El tratamiento ylo la prevención de enfermedades, trastomos, o afecciones asociados con la expresión ylo actividad aberrante de una proteína Terapéutica incluye, pero no se limita a, el alivio de los sintomas asociados con aquellas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos de la invención o las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica se pueden proporcionar en composiciones farmacéutica mente aceptables como es sabido en la técnica
o como se describe en la presente memoria
Un resumen de las maneras en las que los anticuerpos o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica pueden ser utilizados terapéutica mente incluye la unión de proteínas Terapéuticas localmente o sistémicamente en el organismo o mediante citotoxicidad directa del anticuerpo, p. ej., mediada por el complemento (CDC) o por células efectoras (CCDA). Algunos de estos enfoques se describen con más detalle a continuación. Con las ilustraciones proporcionadas en la presente memoria, un experto normal en la técnica sabrá cómo ut ilizar los anticuerpos de la invención o las proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica con fines diagnósticos, de controlo terapéuticos sin una experimentación indebida.
Los anticuerpos o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica se pueden utilizar ventajosamente combinados con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfoquinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, p. ej., IL-2, IL-3 e IL-7), por ejemplo, que sirven para incrementar el número o la actividad de las células efectoras que interaccionan con los anticuerpos.
Los anticuerpos o las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteina Terapéutica se pueden administrar solos o combinados con otros tipos de tratamientos (p. ej., terapia con radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes anti-tumorales) Generalmente, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o una reactividad de especie (en el caso de los anticuerpos) que son de la misma especie que la del paciente. De este modo, en una realización preferida, se administran anticuerpos humanos, fragmentos, derivados, análogos, o ácidos nucleicos a un paciente humano para la terapia o profilaxis
Se prefiere utilizar anticuerpos inhibidores ylo neutralizadores de alta afinidad ylo potentes in vivo contra proteinas Terapéuticas, fragmentos o regiones de los mismos, (o la proteina de fusión de albúmina correspondiente a semejante anticuerpo) tanto para inmunoanálisis dirigidos a, como para la terapia de trastomos relacionados con polinucleótidos o polipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos, de la presente invención. Tales anticuerpos, fragmentos, o regiones, tendrán preferiblemente afinidad por los polinucleótidos o polipéptidos de la invención, incluyendo los fragmentos de los mismos. Las afinidades de unión preferidas incluyen constantes de disociación o Kd menores de 5 X 10.2 M, 10.2 M, 5 X 10.3 M, 10-3 M, 5 X 10..4 M, 10..4 M. Las afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 X 10-5 M, 10.5 M, 5 X 10.5 M, 10-6 M, 5 X 10.7 M,
10. 1 M, 5 X 10.(1 M o 10-6 M. Las afinidades de unión incluso más preferidas incluyen aquellas con una constante de
disociación o Kd menor de 5 X 10.9 M, 10.9 M, 5 X 10.10 M, 10.10 M, 5 X 10.11 M, 10'quot; M, 5 X 10.12 M, 10.12 M, S X 10' 13 M, 10.13 M, 5 X 10.14 M, 10·14 M, 5 X 10.15 M, o 10.15 M.
Terapia génica
En una realización especifica, se administran ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos que se unen a proteínas terapéuticas o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociados con la expresioo y/o actividad aberrante de una proteina Terapéutica, a modo de terapia génica. Terapia génica hace referencia a la terapia rea lizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización de la invencioo, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico.
Se puede utilizar cualquiera de los métodos para la terapia génica disponibles en la técnica Los métodos ilustrativos se describen con más detalle en otra parte en esta solicitud
Demostración de la actividad terapéutica o profiláctica
Los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención se someten a ensayo preferiblemente in vitro, y a continuación in vivo para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su utilización en seres humanos. Por ejemplo, los análisis in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica incluyen el efecto de un compuesto sobre una línea celular o una muestra de tejido de un paciente. El efecto del compuesto o la composición sobre la linea celular y/o la muestra de tejido se puede determinar utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, análisis de formación de rosetas y análisis de lisis celular. De acuerdo con la invención, los análisis in vitro que se pueden utilizar para determinar si la administración de un compuesto específico está indicada, incluyen análisis de cultivo celular in vitro en los que una muestra de tejido de un paciente se hace crecer en cultivo y se expone a o se administra de otro modo un compuesto, y se observa el efecto de semejante compuesto sobre la muestra de tejido
Administración terapéutica/profiláctica y composición
La descripción proporciooa métodos de tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de la invencioo. En una rea lización preferida, el compuesto se purifica sustancialmente (p. ej., sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero no limitado a animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y muy preferiblemente un ser humano.
Las fonnulaciones y los métodos de administración que se pueden emplear cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina se han descrito anteriormente; las formulaciones y las rutas de administración adicionales apropiadas se pueden seleccionar entre las descritas en la presente memoria más abajo.
Se conocen varios sistemas de liberación y se pueden utilizar para administrar un compuesto de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptores (véase, p. ej., Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa ora l, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Adicionalmente, puede ser deseable introducir los compuestos farmacéuticos o las composiciones de la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo la inyección intraventricutar e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, anclado a un reservorio, tal como un reservorio Ommaya. También se pueden emplear la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosolización.
En una realización específica, puede ser deseable administrar los compuestos farmacéuticos o las composiciones de la invención localmente a la zona que necesita tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, p. ej., junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuerpo, de la invención, se debe tener cuidado de utilizar materiales en los cuales no se absorba la proteína.
En otra realización, el compuesto o la composición se pueden liberar en una vesicula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infeclious Disease and
Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, idem., págs. 317327; véase en general idem.)
En otra realización más, el compuesto o la composición se pueden liberar en un sistema de liberación controlada En una realización, se puede utilizar una bomba (véase Langer, más arriba; Sefton, CRC Cri!. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989». En la realización controlada, se pueden utilizar materiales poliméricos (véanse Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., MacromoJ. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véanse también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989». En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana terapéutica, p. ej., el cerebro, requiriendo de ese modo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, más arriba, vol 2, págs. 115-138 (1984».
otros sistemas de liberación controlada se comentan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990))
En una rea lización específica donde el compuesto es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada , construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se convierta en intracelular, p ej., mediante la utilización de un vector relroviral (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo con micropartículas (p. ej., una pistola génica; Biolislic, Dupon!), o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en conexión con un pép!ido de tipo homeobox que se sabe que penetra en el núcleo (véase p. ej., Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991), etc. Altemativamente, se puede introducir un ácido nucleico inlracelularmente e incorporarlo dentro del ADN de la célula anfitriona para su expresión, mediante recombinación homóloga.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica mente eficaz de un compuesto, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el térmiflO quot;farmacéutica mente aceptablequot; representa aprobado por una agencia reguladora del gobiemo Federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más concretamente en seres humanos. El término quot;portadorquot; hace referencia a un diluyente, coadyuvante, excipiente, o vehiculo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los que tienen su origen en el petróleo, o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra inlravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa acuosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, concretamente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, mOflOestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionante, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular en forma de supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en quot;Remington's Pharmaceutical Sciences~ de E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador con el fin de proporcionar la forma de administración apropiada para el paciente. La formulación se debe adaptar al modo de administración.
En una realización preferida, la composiciórJ se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composiciórJ también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lignocaina para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suminislran por separado o mezclados entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofi lizado seco o un producto concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar mediante infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyectables o solución salina de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administración
Los compuestos de la invención se pueden formular en forma neutra o de sales. Las sales farmacéulicamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad del compuesto de la invención que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastomo asociados con la expresión y/o actividad aberrante de una proteína Terapéutica se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales. Adicionalmente, se puede emplear análisis in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se vaya a emplear en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de acuerdo con el criterio del médico a cargo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o en modelos animales.
Para los anticuerpos, la dosificación administrada a un paciente es típicamente de 0,1 mglkg a 100 mglkg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación administrada a un paciente se encuentra entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 1 mglkg a 10 mglkg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga en el organismo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos foráneos. De este modo, a menudo es posible una dosificación inferior de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente Adicionalmente, la dosificación y la frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención se puede reducir potenciando la absorción y la penetración en el tejido (p. ej., en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, la lipidación.
Diagnóstico y formación de imágenes
Los anticuerpos marcados y los derivados y análogos de los mismos que se unen a una proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) (incluyendo proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica), se pueden utilizar con fines diagnósticos para detectar, diagnosticar, o controlar enfermedades, trastomos, y/o afecciones asociados con la expresión y/o actividad aberrante de una proteína Terapéutica. La invención proporciona la detección de la expresión aberrante de una proteína Terapéutica, que comprende (a) analizar la expresión de la proteína Terapéutica en células o fluido corporal de un individuo utilizando uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido de interés y
(b)
comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica patrón, por medio de lo cual un aumento
o una disminución del nivel de expresión de la proteína Terapéutica analizada comparados con el nivel de expresión patrón son indicativos de una expresión aberrante.
La invención proporciona un análisis de diagnóstico para diagnosticar un trastorno, que comprende (a) analizar la expresión de la proteína Terapéutica en células o fluido corporal de un individuo utilizando uno o más anticuerpos específicos para la proteína Terapéutica o proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento
o variante de un anticuerpo específico para una proteína Terapéutica, y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica coovencional, por medio de lo cual un aumento o una disminución del nivel de expresión de la proteína Terapéutica analizado en comparaciÓfl con el nivel de expresión convencional son indicativos de un trastorno concreto. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente elevada de transcrito en el tejido sometido a biopsia de un individuo puede indicar una predisposición al desarrollo de la enfermedad, o puede proporcionar un método para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud el empleo de medidas preventivas o de un tratamiento agresivo más temprano, evitando de ese modo el desarrollo o el progreso ad iciona l del cáncer
Los anticuerpos o las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo específico para una proteína Terapéutica se pueden utilizar para analizar los niveles de proteína en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistoquimicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., véanse Jalkanen el al., J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para la detección de la expresión génica de la proteina incluyen inmunoanálisis, tales como el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELlSA) y el radioinmunoanálisis (RIA) Las marcas adecuadas para el análisis de anticuerpos son conocidas en la técnica e incluyen marcas enzimáticas, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (1251, 1211), carbooo (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In), y tecnecio (99Tc); marcas luminiscentes, tales como luminol; y marcas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Una faceta de la descripción es la detección y el diagnóstico de una enfermedad o trastomo asociados con la expresión aberrante de una proteína Terapéutica en un animal, preferiblemente un mamífero y muy preferiblemente un ser humano. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente) a un sujeto una cantidad eficaz de una molécula marcada que se une específicamente al polipéptido de interés; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administraciÓfl para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en sitios del sujeto en los que se expresa la proteína Terapéutica (y para que la molécula marcada no unida sea aclarada a nivel del fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de manera que la detección de la molécula marcada por encima del nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno concretos asociados con la expresión aberrante de la proteína terapéutica. El nivel de fondo se puede determinar mediante diversos métodos incluyendo la comparación de la cantidad de molécula marcada detectada con un valor patrón previamente determinado para un sistema concreto
Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad necesaria de radical formador de imágenes para producir las imágenes de diagnóstico. En el caso de un radical radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. El anticuerpo, el fragmento de anticuerpo, o la proteína de fusión de albúmina que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica marcados se acumularán preferentemente en la loca lización de las células que contiene la proteína Terapéutica específica La formación de imágenes de un tumor in vivo es descrita por S.W Burchiel et al., quot;Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragmentsquot; (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982»
Dependiendo de diversas variables, incluyendo el tipo de marca utilizada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en los sitios del sujeto y la molécula marcada no unida se aclare al nivel del fondo es de 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o 5 a 10 días.
En una realización, el control de la enfermedad o trastomo se lleva a cabo repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicia l, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc
La presencia de la molécula marcada se puede detectar en un paciente utilizando métodos conocidos en la técnica para el barrido in vivo. Estos métodos dependen del tipo de marca utilizada. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar el método apropiado para detectar una marca concreta. Los métodos y dispositivos que se pueden utilizar en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no se limitan a, tomografía computa rizada (CT), barrido de todo el organismo tal como la tomografía de emisión de positrones (PET), la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y la sonografía
En una rea lización específica, la molécula se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente utilizando un aparato quirúrgico sensible a la radiación (Thurston et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.441.050). En otra realización, la molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente utilizando un aparato de barrido sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente utilizando la tomografia de emisión de positrones. En aira rea lización más, la molécula se marca coo una marca paramagnética y se detecta en un paciente utilizando la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI ). Los anticuerpos que detectan específicamente la proteína de fusión de albúmina pero no la albúmina o la proteína terapéutica sola son una realización preferida Estos se pueden utilizar para detectar la proteína de fusión de albúmina descrita en toda esta memoria descriptiva.
Kits
La presente invención proporciona kits que se pueden utilizar en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una realización específica, los kíts contíenen un polipeptido sustancialmente aislado que comprende un epítopo que es específicamente inmunorreaclivo con un anticuerpo incluido en el kit. Preferiblemente, los kils de la presente invención comprenden adicionalmente un anticuerpo de control que no reacciooa con el polipéptido de interés. En otra realización específica, los kils de la presente invención contienen un medio para detectar la unión de un anticuerpo a un polipéptido de interés (p. ej., el anticuerpo puede estar conjugado con un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo que puede estar conjugado con un sustrato detectable)
En otra rea lización específica de la presente invención, el kit es un kit de diagnóstico para su uso en el escrutinio de suero que contiene anticuerpos específicos contra polinucleótidos y polipéptidos proliferativos y{o cancerosos. Semejante kit puede incluir un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. Semejante kit puede incluir un antígeno polipeptídico sustancialmente aislado que comprende un epítopo que es específicamente inmunorreactivo con al menos un anticuerpo anti-antígeno polipeptídico. Adicionalmente, semejante kit incluye un medio para detectar la unión de dicho anticuerpo al antígeno (p. ej., el anticuerpo se puede conjugar coo un compuesto fluOfescente tal como fluoresceína o rodamina que se puede detectar mediante citometría de flujo). En realizaciones específicas, el kit puede incluir un antígeno polipeptídico producido recombinantemente o sintetizado químicamente. El antígeno polipeptídico del kit también puede ser anclado a un soporte sólido
En una realización más específica el medio de detección del kit anteriormente descrito incluye un soporte sólido al cual está anclado dicho antígeno polipeptídico. Semejante kit también incluye un anti-anticuerpo humano marcado con indicador no anclado. En esta rea lización, la unión del anticuerpo al antígeno polipeptídico se puede deteclar mediante la unión del anticuerpo marcado con el indicador mencionado.
En una realización adicional, la invención incluye un kit de diagnóstico para su uso en el escrutinio de suero que contiene antígenos del polipéptido de la invención. El kit de diagnóstico incluye un anticuerpo sustancialmente aislado específicamente inmunorreactivo con antígenos polipeptídicos o polinucleotídicos, y medios para detectar la
unión del antigeno polipeptidico o polinucleotidico al anticuerpo_ En una realización, el anticuerpo está anclado a un soporte sólido. En una realización específica, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los medios de detección del kit pueden incluir un segundo anticuerpo monoclonal marcado_Alternativamente, o adicionalmente, los medios de detección pueden incluir un antígeno competitivo marcado.
En una configuración de diagnóstico, el suero de ensayo se hace reaccionar con un reactivo en fase sólida que tiene un antígeno unido a la superficie obtenido mediante los métodos de la presente invención_ Después de la unión con el anticuerpo específico del antígeno al reactivo y la eliminación de los componentes del suero no unidos mediante lavado, el reactivo se hace reaccionar con anti-anticuerpo humano marcado con indicador para unir el indicador al reactivo en proporción a la cantidad de anticuerpo anti-anlígeno unido sobre el soporte sólido_ El reactivo se lava de nuevo para eliminar el anticuerpo marcado no unido, y se determina la cantidad de indicador asociado con el reactivo_ Típicamente, el indicador es una enzima que se detecta incubando la fase sólida en presencia de un sustrato fluorométrico, luminiscente o colorimétrico adecuados (Sigma, SI. Louis, MO).
El reactivo en superficie sólida del análisis anterior se prepara mediante mecanismos conocidos para el anclaje de material proteico a material de soporte sólido, tal como cuentas poliméricas, varillas medidoras, placas de 96 pocillos
o material de filtro_ Estos métodos de anclaje incluyen generalmente la adsorción no especifica de la proteina al soporte o el anclaje covalente de la proteína, típicamente a través de un grupo amino libre, a un grupo químicamente reactivo sobre el soporte sólido, tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldehído activados_Alternativamente, se puede utilizar placas recubiertas con estreptavidina junto con uno o varios antígenos biotinilados
De este modo, la invención proporciona un sistema de análisis o kit para llevar a cabo este método de diagnóstico. El kit incluye generalmente un soporte con antígenos recombinantes unidos a la superficie, y un anti-anticuerpo humano marcado con indicador para la detección de anticuerpo anti-antigeno unido a la superficie
Proteínas de fusíón de afbúmina
La presente invención se refiere en general a proteinas de fusión de albúmina y métodos de tratamiento, prevención,
o alivio de enfermedades o trastomos. Según se utiliza en la presente memoria, ~proteína de fusión de albúminaquot; hace referencia a una proteina formada por la fusión de al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) a al menos dos moléculas de la proteína Terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) Una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos un fragmento o variante de la proteína Terapéutica y al menos un fragmento o variante de albúmina de suero humallO, que están asociados entre sí, preferiblemente mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de una proteína Terapéutica está unido en marco con un polinucleótido que codifica toda o una porción de la albúmina) o entre sí. La proteína Terapéutica y la proteína de albúmina, una vez que son parte de la proteína de fusión de albúmina, pueden ser referidas, cada una, como quot;porción, ~regiónquot; o ~radicar de la proteína de fusión de albúmina.
En una realización preferida, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o constructo de fusión de albúmina descrito en la Tabla 1 o la Tabla 2_ Los polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina también están incluidos en la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina preferidas de la invención, incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión de albúmina codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprende, o alternativamente consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al menos una molécula de una proteína terapéutica (o un fragmento
o una de la misma); una molécula de ácido nucleico que comprende, o alternativamente consiste en, un polinucleótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al menos una molécula de una proteína terapéutica (o un fragmento
o variante de la misma) generada como se describe en la Tabla 1, Tabla 2 o en los Ejemplos; o una molécula de ácido nucleico que comprende, o alternativamente consiste en, un polinucieótido que codifica al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma) unida en marco a al menos un polinucleótido que codifica al mellOs una molécula de una proteína terapéutica (o un fragmento o variante de la misma), que comprende adicionalmente, por ejemplo, uno o más de los siguientes elementos: (1) un vector auto-replicante funcional (incluyendo pero no limitado a, un vector lanzadera, un vector de expresión, un vector de integración, ylo un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como por ejemplo, un promotor inducible o regulable, un promotor constitutivo), (3) una región para la terminación de la transcripción, (4) una secuencia líder, y (5) un ma rcador seleccionable
En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente consiste en, la proteína Terapéutica (p_ ej_, como se describe en la Tabla 1) y una proteina de albúmina del suero En otras real izaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento biológicamente activo ylo terapéutica mente activo de la proteína Terapéutica y una proteína de albúmina del suero_ En otras realizaciones, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente consiste en, a una variante biológicamente activa ylo terapéutica mente activa de la proteína Terapéutica y una proteína de albúmina del suero. En realizaciones preferidas, el componente de proteína de albúmina del suero de la proteina de fusión de albúmina es la porción madura de la albúmina del suero.
En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o altemativamente consiste en, la proteína Terapéutica, y un fragmento biológicamente activo y/o terapéutica mente activo de albúmina del suero. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o altemativamente consiste en, la proteína Terapéutica y una variante biológicamente activa y/o terapéuticamente de albúmina del suero. En realizaciones preferidas, la porción de proteína Terapéutica de la proteina de fusión de albúmina es la porción madura de la proteína Terapéutica
En realizaciones adicionales, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o altemativamente consiste en, un fragmento o variante biológicamente activos y/o terapéuticamente activos de la proteína Terapéutica y un fragmento o variante biológicamente activos y/o terapéuticamente activos de albúmina del suero. En realizaciones preferidas, la invención proporciona una proteina de fusión de albúmina que comprende, o altemativamente consiste en, la porción madura de una proteina Terapéutica y la porción madura de albúmina del suero.
Preferiblemente, la proteína de fusión de albúmina comprende HA como porción N-terminal, y una proteína Terapéutica como porción e-terminal. Alternativamente, también se puede utilizar una proteina de fusión de albúmina que comprende HA como porción e-terminal, y una proteína Terapéutica como porción N-terminal
En otras realizaciones, la proteina de fusión de albúmina tiene una proteina Terapéutica fusionada tanto al extremo N como al extremo e de la albúmina. En una realización preferida, las proteínas Terapéuticas fusionadas a los extremos N y e son las mismas proteinas Terapéuticas. En una realización alternativa preferida, las proteinas Terapéuticas fusionadas a los extremos N y e son proteínas Terapéuticas diferentes. En otra realización preferida, las proteínas Terapéuticas fusionadas a los extremos N ye son proteínas Terapéuticas diferentes que se pueden utilizar para tratar o prevenir la misma enfermedad, trastorno, o afección o una enfermedad, trastorno, o afección
relacionados (p. ej., como los enumerados en la columna ~Indicación preferida Yquot; de la Tabla 1). En otra realización preferida, las proteínas Terapéuticas fusionadas a los extremos N ye son proteínas Terapéuticas diferentes que se pueden utilizar para tratar, aliviar, o prevenir enfermedades o trastornos (p. ej ., como los enumerados en la columna quot;Indicación preferida Yquot; de la Tabla 1) que se sabe en la técnica que ocurren comúnmente en los pacientes de manera simultánea, coincidente, o consecutiva, o que ocu rren comúnmente en los pacientes asociados con otros
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen proteínas que contienen dos, tres, cuatro o más moléculas de una proteína Terapéutica X dada o una variante de la misma fusionada al extremo N o e de una proteína de fusión de albúmina de la invención, ylo al extremo N ylo e de la albúmina o una variante de la misma Las moléculas de una proteína Terapéutica X dada o variantes de la misma pueden estar en cualquiera de numerosas orientaciones, incluyendo, pero no limitadas a, una orientación 'cabeza a cabeza' (p. ej ., en donde el extremo N de una molécula de una proteína Terapéutica X está fusionado al extremo N de otra molécula de la proteína Terapéutica X), o una orientación 'cabeza a cola' (p. ej., en donde el extremo e de una molécula de una proteína Terapéutica X está fusionado al extremo N de otra molécula de proteina Terapéutica X)
En una realización, dos, tres, o más polipéptidos de proteína Terapéutica X orientados en tándem (o fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan al extremo N o e de una proteína de fusión de albúmina de la invención, ylo al extremo N o e de la albúmina o una variante de la misma.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención abarcan adicionalmente proteínas que contienen dos, tres, cuatro, o más moléculas de una proteína Terapéutica X dada o una variante de la misma fusionadas al extremo N o e de de una proteina de fusión de albúmina de la invención, ylo al extremo N ylo e de la albúmina o una variante de la misma, en donde las moléculas se unen a través de conectores peptídicos. Los ejemplos induyen aquellos conectores peptidicos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.073.627 (incorporada a la presente como referencia). Las proteínas de fusión de albúmina que comprenden múltiples polipéptidos de proteína Terapéutica X separados por conectores peplídicos se pueden producir utilizando la tecnologia de ADN recombinante convencional. Los conectores son particularmente importantes cuando fusionan un péptido pequeño a la molécula de HSA grande. El propio péptido puede ser un conector al fusionar copias en tándem del péptido o se pueden utilizar otros conectores conocidos. Los conslructos que incorporan conectores se describen en la Tabla 2 o resultan evidentes cuando se examina el SEO ID NO: Y.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden ser producidas fusionando una proteína Terapéutica X o variantes de la misma al extremo N-terminal ylo e-terminal de la albúmina o variantes de la misma de tal manera que se permita la formación de formas multiméricas intramoleculares ylo intermoleculares. En una realización de la invención, las proteinas de fusión de albúmina pueden estar en formas monoméricas o multiméricas (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). En una realización adicional de la invención, la porción de proteína Terapéutica de una proteina de fusión de albúmina puede estar un forma monomérica o en forma multímérica (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). En una realización específica, la porción de proteína Terapéutica de una proteína de fusión de albúmina está en forma multimérica (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores), y la porción de proteína de albúmina está en forma monomérica
Además de la proteína de fusión de albúmina en la cual la porción de albúmina está fusionada en posición N· term inal y/o C-terminal de la porción de proteína Terapéutica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden ser producidas insertando la proteína Terapéutica o péptido de interés (p. ej., una proteína Terapéutica X como se describe en la Tabla 1, o un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica o un fragmento o variante de la misma) en una región intema de HA. Por ejemplo, dentro de la secuencia de proteína de la molécula de HA existen numerosos bucles o giros entre el extremo y el principio de las hélices a, que están estabilizados por enlaces disulfuro. Los budes, como se determina a partir de la estructura cristalina de HA (identificadores POB 1A06, 1BJ5, 1BKE, 1BMO, 1E7E a 1E7I y 1UOR) para la mayor parte se extienden lejos del cuerpo de la molécula. Estos bucles son útiles para la inserción, o fusión interna, de los péptidos terapéuticamente activos, concretamente aquellos que requieren una estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas Terapéuticas, para generar esencialmente una molécula de albúmina con una actividad biológica específica.
Los budes de la estructura de la albúmina humana en los que se pueden insertar péptidos o polipéptidos para generar proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen: Val54-Asn61, Thr76-Asp89, Ala92-Glu100, Gln170-Ala176, His 247 -Glu252, Glu 266 -Glu277, Glu 280-His288, Ala362· Glu368, Lys439-Pr0447, Va1462Lys475, Thr478-Pr0486, y Lys560-Thr566. En realizaciones más preferidas, los péptidos o polipéptidos se insertan en los bucles Val54-Asn61, Gln170-Ala176, y/o Lys560-Thr566 de la albúmina humana madura (SEQ ID NO: 1)
Los péptidos que se van a insertar pueden derivar de bibliotecas de presentación en fagos o de péptidos sintéticos escrutadas para determinar la actividad biológica específica o a partir de las porciones activas de una molécula con la función deseada. Adicionalmente, se pueden generar bibliotecas de péptidos al azar dentro de bucles concretos o mediante inserciones de péptidos al azar en bucles concretos de la molécula de HA y en las que se representan todas las combinaciones posibles de aminoácidos
Tales bibliotecas se podrían generar sobre HA o fragmentos de dominios de HA mediante uno de los siguientes métodos·
mutación de aminoácidos al azar dentro de uno o más bucles de péptidos de HA o fragmentos de dominios de HA. Un cualquiera, más de uno o todos los residuos dentro de un bucle podrian ser mutados de esta manera;
remplazo de, o inserción en uno o más bucles de HA o fragmentos de dominios de HA (esto es, fusión interna) de uno o varios péptidos aleatorizados de longitud x,., (donde X es un aminoácido y n es el número de residuos;
fusiones de péptidoslproteínas N·, C-o N· y C-terminales además de (a) ylo (b)
La HA o un fragmento del dominio HA también se pueden volver multifuncionales injertando los péptidos derivados de diferentes escrutinios de diferentes bucles frente a diferentes dianas en la misma HA o fragmento del dominio HA
En realizaciones preferidas, los péptidos insertados en un bucle de albúmina de suero humana son fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de las proteínas Terapéuticas descritas en la Tabla 1 Más concretamente, la invención abarca proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos 40 aminoácidos de longitud insertados en un bucle de albúmina de suero humana. La invención también incluye protelnas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de al menos 7 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos 40 aminoácidos fusionados al extremo N de la albúmina de suero humana. La invención también incluye proteínas de fusión de albúmina que comprenden fragmentos de péptidos o variantes de péptidos de al menos 7 al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos 40 aminoácidos fusionados al extremo C de la albúmina de suero humana. Por ejemplo, los péptidos cortos descritos en las Tablas 1 y 2 (p. ej., Y Terapéutica) se pueden insertar en los bucles de albúmina
Generalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener una región derivada de HA y una región derivada de la proteína Terapéutica. Sin embargo, se pueden utilizar múltiples regiones de cada proteína para elaborar una proteína de fusión de albúmina de la invención. De un modo similar, se puede utilizar más de una proteína Terapéutica para elaborar una proteína de fusión de albúmina de la invención. Por ejemplo, se puede fusionar una proteína Terapéutica a ambos extremos N-y C-terminales de la HA. En semejante configuración, las porciones de proteína Terapéutica pueden ser moléculas de proteína Terapéutica iguales o diferentes. La estructura de las proteínas de fusión de albúmina bifuncionales puede estar representada como: X-HA-Yo Y-HA-X
Por ejemplo, se puede preparar una fusión scFv-HA-IFNa-2b anti-BLySTM para modular la respuesta inmunitaria a IFNa-2b mediante un scFv anti-BLySTM Una alternativa es elaborar una dosis bi-(o incluso multi-) funcional de fusiones de HA p. ej., la fusión HA-IFNa-2b mezclada con la fusión scFv HA-anti-BLySTM u otras fusiones de HA en diversas propOfciones dependiendo de la función, la vida media, etc
También se pueden preparar proteínas de fusión de albúmina bi-o multi-funcionales para dirigir la porción de proteína Terapéutica de una fusión a un órgano o un tipo de célula diana a través de la proteina o péptido en el extremo opuesto de HA.
Como alternativa a la fusión de moléculas terapéuticas conocidas, los péptidos se podrían obtener mediante escrutinio de bibliotecas construidas como fusiones a los extremos N-, C-o N-y C-de HA, o fragmentos del dominio de HA, típicamente de 6, 8, 12, 20 o 25 o x.. (donde X es un aminoácido (aa) y n es igual al número de residuos) aminoácidos al azar, y en las que están representadas todas las posibles combinaciones de aminoácidos. Una ventaja particular de este enfoque es que los péptidos se pueden seleccionar in situ sobre la molécula de HA y las propiedades del péptido por lo tanto serían seleccionadas, más que, potencialmente modificadas, como podría ser el caso para un péptído obtenido mediante cualquier otro método, siendo anclados después a HA
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incluir un péptido conector entre las porciones fusionadas para proporcionar una mayor separación física entre los radicales y de ese modo maximizar la accesibi lidad de la porción de proteina Terapéutica, por ejemplo, para la unión a su receptor cognado. El conector peptidioo puede consistir en aminoácidos de manera que sea flexible o más rigido
La secuencia conectora puede ser escindible por una proteasa o químicamente para producir el radical relacionado con la hormona del crecimiento. Preferiblemente, la proteasa es una producida naturalmente por el anfitrión, por ejemplo la proteasa kex2 de S. cerevisiae o proteasas equivalentes
Por lo tanto, como se ha descrito anteriormente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener la siguiente fórmula R1-L-R2; R2-L-R1; o R1-L-R2-L-R1, en donde R1 es al menos una proteina Terapéutica, secuencia peptídica o polipeptídica, y no necesariamente la misma proteína Terapéutica, L es un conector y R2 es una secuencia de albúmina de suero
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden la proteína Terapéutica tienen una mayor estabilidad en plasma en comparación con la estabilidad en plasma de la misma proteína Terapéutica cuando no está fusionada con albúmina. La estabilidad en plasma se refiere tipicamente al período de tiempo entre el momento en el que la proteína Terapéutica es administrada in vivo y portada en el torrente sanguíneo y el momento en el que la proteína terapéutica es degradada y aclarada del torrente sanguíneo, a un órgallO, tal como el riñón o el higado, que por ultimo aclara la proteina Terapéutica del organismo. La estabilidad en plasma se calcula en términos de la vida media de la proteina Terapéutica en el torrente sanguíneo La vida media de la proteina Terapéutica en el torrente sanguineo se puede determinar fácilmente mediante análisis comunes cOllOcidos en la técnica.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de Albúmina de la invención que comprenden una proteína Terapéutica tienen una vida util prolongada en comparación con la vida útil de la misma proteína Terapéutica cuando no está fusionada a albumina. La vida util se refiere típicamente al período de tiempo a lo largo del cual la actividad terapéutica de una proteína Terapéutica en solución o en alguna otra formulación de almacenamiento, es estable sin una pérdida indebida de actividad terapéutica. Muchas de las proteínas Terapéuticas son muy lábiles en su estado no fusionado. Como se describe más abajo, la vida útil tipica de estas proteínas Terapéuticas se prolonga notablemente tras la incorporación a la proteína de fusión de albumina de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención con una vida útil ~prolongadaquot; o quot;ampliadaquot; muestran una mayor actividad terapéutica con respecto al patrón que ha sido sometido a las mismas condiciones de almacenamiento y manipulación. El patrón puede ser la proteina Terapéutica completa no fusionada. Cuando una porción de proteína Terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es un análogo, una variante, o está alterada de otro modo o no incluye la secuencia completa para esa proteína, la prolongación de la actividad terapéutica se puede comparar alternativamente con la del equivalente no fusionado de ese análogo, variante, péptido alterado o secuencia incompleta. Como ejemplo, una proteína de fusión con albúmina de la invención puede conservar más de aproximadamente 100% de la actividad terapéutica, o más de aproximadamente 105%, 110%, 120%, 130%, 150%
o 200% de la actividad terapéutica de un patrón cuando se somete a las mismas condiciones de almacenamiento y manipulación que el patrón cuando se comparan en un punto temporal dado.
La vida util también se puede evaluar en términos de la actividad terapéutica que queda después del almacenamiento, IlOrmalizada para la actividad terapéutica cuando comenzó el almacenamiento. Las proteinas de fusión de albumina de la invención con una vida útil prolongada o extendida como se muestra por una actividad terapéutica prolongada o extendida pueden conservar más de aproximadamente 50% de la actividad terapéutica, aproximadamente 60%, 70%, 80%, o 90% o más de la actividad terapéutica de la proteína Terapéutica no fusionada equivalente cuando se somete a las mismas cond iciones.
Expresión de proteinas de fusión
Las proteínas de fusiÓfl de albumina de la invención pueden ser producidas como moléculas recombinantes mediante secreción a partir de levadura, un microorganismo tal como una bacteria, o una linea celular humana o animal. Preferiblemente, el polipéptido es secretado desde las células anfitrionas.
Una realización particular de la invención comprende un constructo de AoN que codifica una secuencia señal
efectiva para dirigir la secreción en levadura, concretamente una secuencia señal derivada de levadura (especialmente una que sea homóloga para el anfitrión de levadura), y la molécula fusionada del primer aspecto de la invención, no habiendo pro-secuencia derivada de levadura entre el polipéptido señal y maduro
La señal de invertasa de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo preferido de una secuencia señal derivada de levadura
No se contemplan los productos conjugados de la clase preparada por Poznansky et al., (FEBS Lett. 239:18 (1988» , en la que polipéptidos preparados por separado se unen mediante entrecruzamiento quimico
La presente invención también incluye una célula, preferiblemente una célula de levadura transformada para expresar una proteína de fusión de albúmina de la invención. Además de las propias células anfitrionas transformadas, la presente invenciÓfl también contempla un cultivo de esas células, preferiblemente un cultivo mOllOclonal (homogéneo clónica mente), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si el polipéptido es secretado, el medio contendrá el polipéptido, con las células, o sin las células si han sido filtradas o centrifugadas. Se conocen y se pueden utilizar muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), células vegetales, células animales y células de insectos.
Las cepas de levadura preferidas que se van a utilizar en la producción de proteínas de fusión de albúmina son 088, OXYI y BXPIO. 088 [leu2-3,1ev 2-122. can 1quot; pra1 , ubc4) es un derivado de la cepa parental AH22his~ (tam bién conocida como oB 1; véase, p. ej., Sleep et al. Biotechnology 8:42-46 (1990». La cepa contiene una mutación leu2 que permite la selección auxótrofa de plásmidos basados en el de 2 micras que contienen el gen LEU2 gene. 088 también muestra una des-represión de PRBI en exceso de glucosa. El promotor PRB I es controlado normalmente por dos puntos de verificación que controlan los niveles de glucosa y la fase de crecimiento. El promotor es activado en levadura de tipo salvaje tras el agotamiento de la glucosa y entra en fase estacionaria. La cepa 088 muestra la represión por glucosa pero mantiene la inducción tras la entrada en la fase estacionaria. El gen PRAl codifica una proteasa vacuolar de levadura, la endoproteasa A YscA, que está localizada en el RE . El gen UBC4 se encuentra en la ruta de ubicuitinación y está implicado en el direccionamiento de proteínas de vida corta y anormales para la degradación dependiente de ubicuitina. Se encontró que el aislamiento de esta mutación ubc4 incrementaba el número de copias de un plásmido de expresión en la célula y causaba un mayor nivel de expresión de una proteína deseada expresada a partir del plásmido (véase, p. ej., la Publicación Intemacional Núm. W099/00504, incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad)
OXY1 , un derivado de 088, tiene el siguiente genotipo: [leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4. ura3::yap3]. Además de las mutaciones aisladas en 088, esta cepa también tiene una modificación genética para inactivar la proteasa YAP3 Esta proteasa causa la escisión de la mayoría de los residuos di-básicos (RR, RK, KR, KK) pero también puede promover la escisión en residuos básicos individuales en las proteínas. El aislamiento de esta mutación yap3 dio como resultado mayores niveles de producción de HSA completa (véanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.965.386 y Keny-Williams et al., Yeast 14:161-169 (1998), incorporados a la presente memoria como referencia en su totalidad)
BXP10 tiene el siguiente genotipo: leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::L YS2, pmt1 ::URA3. Además de las mutaciones aisladas en OXY1, esta cepa también tiene una modificación genética para inactivar el gen PMT1 y el gen HSP150. El gen PMT1 es un miembro de la familia conservada evolutivamente de la proteína dolicil-fosfato-D-mallOsa O-manosiltransferasas (Pmts). La topologia transmembrana de Pmt1p sugiere que ésta es una proteína integrante de membrana del retículo endoplásmico con un papel en la glicosilación ligada a O. Esta mutación sirve para reducirleliminar la glicosilación unida a O de las fusiones de HSA (véase, p. ej., la Publicación Intemacional Núm. WOOOI44772, incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad). Los estudios revelaron que la proteina Hsp150 es separada de manera ineficaz de la rHA mediante cromatografia de intercambio iónico. La mutación en el gen HSP150 elimina un contaminante potencial que se ha demostrado que es difícil de eliminar mediante las técnicas de purificación convencionales. Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.783.423, incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad.
La proteína deseada es producida de las maneras convencionales, por ejemplo a partir de una secuencia codificante insertada en el cromosoma anfitrión o en un plásmido libre. Las levaduras son transformadas con una secuencia codificante de la proteína deseada en cualquiera de las maneras habituales, por ejemplo electroporaciórJ. Los métodos de transformación de levadura mediante eleclroporación son descritos por Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182
Las células transformadas satisfactoriamente, es decir, las células que contienen un constructo de AON de la presente invención, pueden ser identificadas mediante mecanismos bien conocidos. Por ejemplo, las células resultantes de la introducciórJ de un constructo de expresión se pueden hacer crecer para producir el polipéptido deseado. Las células pueden ser cosechadas y lisadas y su contenido de AON puede ser examinado para determinar la presencia del AON utilizando un método tal como el descrito por Southem (1975) J. Mol Biol. 98, 503 o Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede
detectar utilizando anticuerpos.
Los vectOfes plasmídicos de levadura útiles incluyen pRS403-406 y pRS413-416 Y son asequibles generalmente de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos Integrativos de Levadura (Ylp) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, 7RP1 , LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos Centroméricos de Levadura (Ycp).
Los vectores preferidos para elaborar proteínas de fusión de albúmina para su expresión en levadura incluyen pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA, y pC4:HSA que se describen con detalle en el Ejemplo 1. La Figura 2 muestra un mapa del plásmido pPPC0005 que se puede utilizar como vector base en el cual se pueden clonar los polinucleótidos que codifican las proteínas Terapéuticas para formar fusiones con HA. Contiene un promotor PRB1 de S. cerevisiae (PRB1p), una secuencia líder de Fusión (FL), ADN que codifica HA (rHA) y una secuencia tenn inadora ADH1 de S. cerevisiae. La secuencia de la secuencia líder de fusión consiste en los primeros 19 aminoácidos del péptido señal de la albúmina de suero humana (SEO ID NO: 3) y los últimos cinco aminoácidos del promotor del factor de apareamiento alfa I (SLDKR, véase EP-A-387 319 que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad)
Los plásmidos, pPPCOO05, pScCHSA, pScNHSA, y pC4:HSA se depositaron el 11 de Abril de 2001 en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y se les asignaron los números de acceso ATCC PTA-3278, PTA-3276, PTA-3279, Y PTA-3277, respectivamente. Otro vector útil para expresar una proteína de fusión de albúmina en levadura es el vector pSAC35 que es descrito por Sleep et al., BioTechnology 8:42 (1990) que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.
Un promotor de levadura que se puede utilizar para expresar la proteína de fusión de albúmina es el promotor MET25. Véase, por ejemplo, oominik Mumburg, Rolf Muller y Martín Funk. Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, Núm. 25, págs. 5767-5768. El promotor Met25tiene 383 bases de longitud (bases -382 a -1 ) y los genes expresados por este promotor también son conocidos como Met15, Met17, y YLR303W. Una realización preferida utiliza la secuencia de más abajo, donde, en el extremo 5' de la secuencia de más abajo, el sitio Not 1 utiliz.ado en la clonación está subrayado y en el extremo 3', el coclón de inicio ATG está subrayado·
()CQGCCQCCCG ...Tlt;iCA...GCiOlTOGMTCCClTMJCTCTC...lT....TTfTJTGCTT1TfCTCTTO...GGTCAC ...ro...iCOCquot;'M.ATGGCMA TGGCACOTG.v.GCiGTC(¡AT...TTGGQGA.ACTGTGGTOGTTGGC\A.ATO ...cr......TI.... AOlTAGTCAAGGlt;:GCCATCCtquot;CATG...A.AACf OTOTAAC...TAATAACCOAAOTGTOGAAAAOOTGGCACCTTGnocAATTOAACAOGCTCOArOAAAAAAATAAGATATATATA.AGGTT
AAGTAAAOCGTC~AGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTOCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTOGTGTAATACA~T
CAGATACATAGATACMTTCTATTACCCCCATCCATACNilli (SEQ ID NO:$)
1. a) el promotor cbh1 .
TCTAOAGTTOTOMGTCGOTAATCCCGCTGTATAGTMTACGAOTCOCATCTAAJt. TACTCCOAAGCTGCTOCGMCCCGGA CMTeGAGATGTocrcoAAAGCT1'CTAGCGAGCGGCTAAATfAOCATGAAACGCquot;TATOAGMATICTOOAOAeGGC1TGT TOAATCATGGCGTTCCArrcneGACMGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAQGCACTCAlTCCCOMAAAACTCOOAOA TTOCTAAGTAGOGATGGAAOOGGAATM TATAATAGGCAATACATTGAGTTOCCTOGAOGOTTOCAATOCAOGGOTACTG
AGCTTOGACA·I Mlt;quot;:lquot;UrTCCOTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTOGCG1TTccctc;....TTCAGCOTACCCGTACAAGlCOTAA TCACTATTAAOCCAGACTGAOCQGAOQTOTTTTOOCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTOOGATOTGTAATTTOCCTGCT TGACOGACTQGGGCTGTTCGAAGCCCGAATOTAGOATTGTTATCOGAACTCTGCTOGTAOAOGCATGTTCtGAA1CTGIGI OGGGCAGOACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCOAíAGCAQTOTCTAGTAOCAAOCTGTAAAGCOGCAA TGeAGCATCACTOOAAAATACAAAOCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGOCTAAAGAAGTCATATACCAGCGOCTAA TAATTGTACAAíCA.AGTGGCTAÁACOíACOJTAATTTOCCAACGGCTTGTGGCiGTIGCAGMGCMCGGCAAAGCCCCAC TTCCCCAOGTrTGlTTClTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTOATquot;CCCCCAATTGOGTCOCITGTrTlt;lTTCCGOTOAAOTGA AAGAAGACAOAOQTAAGAATGTCTGACTQGGAOOGTnITGCATACAAOCAAGOGeAGroATOGAAGACAGTGAAATOTT GACATTCAAOOAGTATTTAOCCAGOOATOCTIGAGTGíATOGTOTAAGGAGOTITGTCTGCCOATACOACOAATACTGTAT
AGTCACTTCTCGTGAAGTCGTCCATATTGAAATGTAAOTCGGCACTGAACAGGCAAAAGA~AOTTGAAACTOCCTAAG
ATCTCOQGCCCTCGGGCCTTOOGCctnOGGTGTACATGTTTOTQCTOCGGGCAA.ATGCAAJt.GTOTGGTAOOATCOAACAC
ACTGCTGCCTTT Jt.CCAAGCAGCTGAGGGT A TOTOAT AGQCAAATGTTCAGGOGCCACTCCATOGrneGAAT AGAAAGAO
AAGCTTAOOCAAGAACAATAGCCGATAAAOATAOCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAOOCAAAOTCAGCGAATGTGT
ATATATAAAGOTTOGAGGTCCG~ATGCJCTCCOCATCTACTCATCAACTCAOATCCTCCAGGAGACTTGTAC
AOCATCTITTGAOOCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGlt;iACTGOCATe (SEQ lO 1'0quot;0:113)
2. b) el promotor cysD de Aspergillus nidulans:
AOA~TTCCTGAOTACA~ACCGATGCGCCTCOATCCOCCTCTTAGCCGCATOAGATTCCTACCATTTATGTOCTATOG
lquot;TCAGGGTCCTATrTOOACCGCTAOAAATAOACTCTOCTCGATITGlTTCCATIAquot;IiCACOCMTTACCATAOTATTTOOCTC TTTTCGTTTGGCCCAOOTCAAlTCGOGTAAOACOCGATCACOCCArroTGGCCOCCGGCGTfQTGCTGCTOCTATTCCCCOC
ATATAAACAAOCCCTOCAOCAGTTC~GOGAATOCTGTACTCTATTnCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAA
AATTATACCCCAGATATCAAAGATATCAAAOCCA TC (SEQ ID NO:1 14)
3. c) un promotor cbh1 modificado que tiene la secuencia:
TCTAOquot;GTTGTOAAOTC(;OTAATCCCCCTOTATAOTIoATACGAOTCOCATCTMATACTCOOAAOCTOCTOCOMCCCOOA
OAATCQAOA~OCTOOAAAGCTTCTAGCGAOOGGCTAAATTAOCATOAAAGGCTATOAGAAATTCTGGAOA~T
TOMTCA TOOCOTTCCA lTCTTCGACAAOCAAAGCOTTceGTCGCAGTAGCAGGCquot;CTCATTCCCGAAquot;A.MCTOOOAGA
TTQCTAAOTACOGATQGAAOOGOAATAATATAATAQGCAATACATTGAGTTGOCTCOAQGGTTGCAATGCAGGCGTACTO
AOC1TG(;quot;CATAACTOlTCCGTACCCCACCTCTICTCAACCTTTOGclt;iTTTCCCTOATICAGCOTACCCOTACAAOTCOTAA
TcACTATTAACOCAOACTQACOGOACOTOTTTTGCCCTTCATTTGGAOAAATquot;ATQTCATTGOGATVTGTAATlTQOCTGCT
TGACOGACTGGGGCTGTTCOAAGOOOGAATOTAOGATTGTTATCCGAACTCTOCTCGTAGAOGCATGTTOTGAATCT~T
OOGGCAGGACACGOCTCOAAGGTTCACQGCAAOGGAAACCAQCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAOOCGCAA
TGCAGCATCAClGGAAAATACAAAOCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATOOCTAAAOAAGTCATATAOCA~AA
TAATTGTACAATCAAGTGGCTAAAOGTACCOTAATTnGCCAACOGCTTGTQGOGTTGCAGAAOCAACGGCAAAOCCCCAC TTCCCCAeGTTTGTTTCTTCACJquot;CAGTCCAATCTCAOCTOOTGATCCCCCAATTGOOTCGCTTGTTTGTTCCOOTGAAGTGA
AAOAAGACAOAGGTAAOAATOTCTGACTCOGAO~GCATACAAOCMOOGCAGTGATOOAAGACAGTGAAATGTT
GACATTCAAOOAGTATITAOCCAGOOATGCrroAOTOTATCOTGTAAOOquot;GOTTTGTCTOCCQATACOACGAATACTGquot;fAT AGTCACfTCTGGTCAAOTCGTCCATATTGAAATGTAAOTOGOCACTOAACAGGCAAAAGATTGAGTrGAAACTGCCTAAG ATCTCGGGCCCTCGGGCCrTCGGGGGTGTACATGlTTGTGCTCCOOGCAMTGCAAAGTGTOGTAOGATCGAACAC ACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGquot;GGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAOOGGCCACTOCATOOTTTCGAATAOAAAGAG AAGC1TAGCCTOCAGecrCIT A TCGAGAAAGAAATIACOOTCOCTCGTGATTTOTTTOCAAAAAOAACAAAACTOAAAAA ACCCAGACACGCTCCiAcrrcCTOTCTTCCTATIOArTOCAOCTfCCAAT1TCGTCA.CACAACAAOOTCCTAOCTTAOCCAA
GAACAATAGCOGATAAAGATAOCCTCATIAAACGOAATGAGCTAOTAGGCAAAGTCAGOGAATGTGTATATAT~OCTT
OOAOOTCanOCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAOATCCTOCAGGAOACTTGTACAOCATCrnTGAOO CACAOAAACCCAATAGTCAAOCúCOOACTGOCATC (SEQ ID NO: 11 S)
4 d) un promotor cysD de Aspergillus nidulans que tiene la secuencia· AGATCTGQTTOCTOAQTACATCTAOCGAnGCOOCTCOATOCOCCTCTTAOCCOCATOAGATTCCTAOCATTTATGTOCTATC OTTCAGOGTCCTATTTOOACCCCTAG/VV.TAGACTCIGCTCCATTTOTTTCCATTATTc.o..COCAATTACOA.TAGTA TTTGCC
TCI t 1 ¡ CG1TTGGCCCAOOTCAATTCOOGTAAGACGOGATCACúCCATTGTCOOCCGCCGOCOCTGCAOCCTClT A TCCiAGA
AAOAMTTACCOTOOCTCGTQArrrGTTTOCAAAAAGAACA.MACTGAAAAAACCCAGACACOCTOOACITCCTGTCITCC
TATTCATTOCAOCTTOCAATTTCOTCACACAACAAOGTOCTACGOCCGOOTTGTGCTCCTOCTATTCCCCCCATATAAACA
AOOCCTCCACCAQTT~GCGAATCCTGTACTCTATTTCAAGTTGTCAAAAOAOAGGATTCAAAAAATTATAC
CCCAGATATCAAAOAT A TCAAAGOCATC (SEQ ID ,,quot;O: 116)
Se ha desarrollado una variedad de métodos para conectar operable mente ADN a vectores a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se puede añadir tramos de homopolímeros complementarios al segmento de ADN que se va a insertar en el ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se puede unir a continuación mediante puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante .
Los conectores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un método altemativo de unión del segmento de ADN a vectores. El segmento de ADN, generado mediante digestión con endonucleasas de restricción, se trata con ADN polimerasa del bacteriófago T4 o ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos de hebra sencilla gamma sobresalientes con sus actividades exonucleolíticas 3' 5', Y rellenan los extremos 3' vaciados con sus acti vidades polimerizadoras
La combinación de estas actividades por lo tanto genera segmentos de ADN con extremos romos Los segmentos con extremos romos se incuban a continuación con un gran exceso molar de moléculas conectoras en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligación de moléculas de ADN con extremos romos, tal como la ADN ligasa de bacteriófago T4. De este modo, los productos de la reacción son segmentos de ADN que portan secuencias conectoras poliméricas en sus extremos. Estos segmentos de ADN se escinden a continuación con la enzima de restricción apropiada y se ligan a un vector de expresión que ha sido escindido con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN
Los conectores sintéticos que contienen una variedad de sitios para endonucleasas de restricción se encuentran disponibles en el mercado a partir de numerosas fuentes, incluyendo Intemational Biotechnologies Inc, New Haven, CT, USA.
Un modo deseable de modificar el ADN de acuerdo con la invención, si, por ejemplo, se van a preparar variantes de HA, consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa como describen Saiki et al. (1988) Science 239, 487· 491 En este método el ADN que se va a amplificar enzimáticamente se flanquea por dos cebadores oligonucleotídicos específicos que se incorporan a su vez al ADN amplificado. Los cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción que se pueden utilizar para la donación en vectores de expresión utilizando métodos conocidos en la técnica
Los géneros ilustrativos de levadura que se contempla que son útiles en la práctica de la presente invención como anfitriones para expresar las proteínas de fusión de albúmina son Pichia (Hansenula), Saccharomyces
K1uyveromyces, Gandida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Giteromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporldium, 8otryoascus, Sporldiobolus, Endomycopsis, y similares_ Los géneros preferidos son aquellos seleccionados del grupo que consiste en Saccharomyoos, Schizosaccharomyces, K1uyveromyces, Pichia y Torulaspora. Los ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxil.
Los ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie adecuada de Torulaspora es T delbrueckiL Los ejemplos de Pichia (Hansenula) spp_son P_ angusta (antes H_ polymorpha), P_ anomala (antes H_ anomala) y P_ pastoris_ Los métodos para la transformación de S_ cerevisiae se ilustran en general en los documentos EP 251 744 , EP 258 067 Y WO 90fOl063 , todos los cuales se incorporan a la presente memoria como referencia
Las especies ilustrativas preferidas de Saccharomyces incluyen S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus, y Zygosaccharomyces rouxii. Las especies ilustrativas preferidas de Kluyveromyces incluyen K. fragilis y K. lactis. Las especies ilustrativas preferidas de Hansenula incluyen H. polymorpha (ahora Pichia angusta), H. anomala (ahora Pichia anomala), y Pichia capsulata. Las especies ilustrativas preferidas adicionales de Pichia incluyen P. pastoris Las especies ilustrativas preferidas de Aspergillus incluyen A_niger y A_ nidulans _ Las especies ilustrativas preferidas de Yarrowia incluyen Y. lipolytica. Muchas especies de levadura preferidas se encuentran disponibles en la ATCC. Por ejemplo, las siguientes especies de levadura preferidas se encuentran disponibles en la ATCC y son útiles en la expresión de proteínas de fusión de albúmina: Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743 yap3 mutante (Núm_ Acceso ATCC 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743 hsp150 mutante (Núm _Acceso ATCC 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorfa BY4743 pmt1 mutante (Núm_Acceso ATCC 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, leleomorfa (Núms _Acceso ATCC 20626; 44773; 44774; Y 62995); Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt, teleomorfa (Núm. Acceso ATCC 62987); Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorfa (Núm. Acceso ATCC 76492); Pichia angusta (Teunisson et aL) Kurtzman, teleomorfa depositada como Hansenula polimorfa de Morais et Maia, leleomorfa (Núm Acceso ATCC 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (Núm_ Acceso ATCC 9029); Aspergillus niger van Tieghem, anamorfa (Núm. Acceso ATCC 16404); Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, anamorfa (Núm. Acceso ATCC 48756); y Yarrowia lipolytica (Wickerham et aL) van der Walt et von Arx, teleomorfa (Núm. Acceso ATCC 201847)
Los promotores adecuados para S. cerevisiae incluyen aquellos asociados con el gen PGK1 , los genes GAL 1 o GAL 10, CYC1 , PH05, TRP1 , ADH1 , ADH2, los genes para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, triosa fosfatasa isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, feromona de factor de apareamiento alfa, [feromona de factor de apareamiento al, el promotor PRB1, el promotor GUT2, el promotor GPOI, y los promotores híbridos que implican híbridos de partes de las regiones reguladoras 5' con partes de regiones reguladoras 5' de otros promotores o con sitios de activación aguas arriba (p. ej., el promotor
del documento EP-A-258 067)
Los promotores regulables convenientes para su uso en Schizosaccharomyces pombe son el promotor represible por tiamina del gen nml descrito por Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 Y el promotor del gen jbp1 reprimible por glucosa descrito por Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.
Los métodos de transformación de Pichia para la expresión de genes foraneos son ilustrados, por ejemplo, por Cregg el al. (1993), y diversas patentes de Phillips (p_ ej _, US 4 857467, incorporada a la presente memoria como referencia), y los kits de expresión de Pichia se encuentran disponibles en el mercado de Invitrogen BV, Leek, Netherlands, e Invitrogen Carp., San Diego, Califomia. Los promotores adecuados incluyen AOXl y AOX2.. Gleeson et al. (1986) J_ Gen_ MicrobioL 132, 3459-3465 incluyen información sobre veclores y transformación de Hansenula, siendo los promotores adecuados MOXl y FMD1, mientras el documento EP 361 991 , Fleer et al. (1991) y otras publicaciones de Rhone-Poulenc Rorer ilustran cómo expresar proteínas foraneas en K1uyveromyces spp., siendo un promotor adecuado PGK1.
La señal de terminación de la transcripción es preferiblemente la secuencia limítrofe 3' de un gen eucariótico que contiene señales apropiadas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Las secuencias limítrofes 3' adecuadas pueden ser, por ejemplo, las del gen naturalmente ligado a la secuencia de control de la expresión utilizada, esto es, pueden corresponder al promotor. Altemativamente, pueden ser diferentes en cuyo caso se
prefiere la señal de terminación del gen AoHI de S_ cerevisiae
La proteína de fusión de albúmina deseada puede ser expresada inicialmente con una secuencia líder de secreción, que puede ser cualquier líder eficaz en la levadura seleccionada. Los líderes útiles en levadura incluyen cualquiera de los siguientes·
a) la secuencia señal MPIF-1 (p. ej. , aminoácidos 1-21 de Núms. Acceso GenBank AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSOA (SEO ID NO: 6)
b) la secuencia señal de slanniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEO ID NO: 7)
c) la región pre-pro de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEO ID NO: 8)
d) la región pre de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEO ID NO: 9) o variantes de la misma, tales como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEO ID NO: 10) e) la secuencia señal de invertasa (p. ej., MLLOAFLFLLAGFAAKISA, SEa ID NO· 11)
f) la secuencia señal del faclor de apareamiento alfa de levadura (p. ej., MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTIEoETAalPAEAVIGYSoLEGoFoVAVLPFSNSTNNGLLFINIT1ASlAAKEEGV SLEKR, SEO ID NO: 12 o
MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTITEoETAalPAEAVIGYSOLEGOFOVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGV SLOKR, SEO ID NO: 12) g) la secuencia líder de la toxina asesina de K. lactis
h) una secuencia señal híbrida (p. ej., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEO ID NO· 13) i) una secuencia señal hibrida HSAlMFo-1 (también conocida como HSAlkex2) (p ej., MKWVSF1SLLFLFSSAYSRSLOKR, SEO ID NO: 14)
j) una secuencia líder de la fusión asesina de K. lactislMFo-1 (p. ej., MNIFYIFLFLLSFVOGSLOKR, SEO ID NO: 15) k) la secuencia señal de Inmunoglobulina 19 (p. ej., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEO ID NO: 16) 1) la secuencia señal del precursor de Fibulina B (p. ej., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVOA, SEO ID NO: 17) m) la secuencia señal del precursor de cluslerina (p. ej., MMKTLLLFVGLLLlWESGaVLG, SEO ID NO: 18) n) la secuencia señal de la proteína 4 de unión a factor de crecimiento de tipo insulínico (p. ej.,
MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEO ID NO: 19) o) variantes de la región pre-pro de la secuencia señal de HSA tal como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEQ ID NO: 20), MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEO ID NO: 21 ), MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEO ID NO: 22), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEO ID NO: 23), Líder de HSA modificado HSA núm. 64 -MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEO ID NO: 24); Líder de HSA modificado HSA núm. 66 • MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEO ID NO: 25); Líder HSA modificado (A1 4) -MKWVTF1SLLFLFAGVSG (SEO ID NO: 26); Líder de HSA modificado (S1 4) (también conocido como HSA núm. 65) -MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEO ID NO: 27),
Líder de HSA modificado (G14). MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEO ID NO: 28), o MKWVTFISLLFLFGGVLGOLHKS (SEO ID NO: 29) p) una secuencia señal consenso (MP1WAWWLFLVLLLALWAPARG, SEO ID NO: 30) q) líder de la fosfatasa ácida (PH05) (p. ej., MFKSWYSILAASLANA SEO ID NO: 31 ) r) la pre-secuencia de MFoz-1 s) la pre-secuencia de glucanasa O (BGL2) t) líder de toxina asesina u) la presecuencia de toxina asesina v) prepro de la toxina asesina de k. lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre y 13 aminoácidos de pro)
MNIFYIFLFLLSFVOGLEHTHRRGSLOKR (SEO ID NO: 32) w) secuencia líder de secreción de glucoamilasa 11 de S. diastaticus x) secuencia líder de secreción de o-galactosidasa (MEL1) de S. carlsbergensis y) secuencia líder de glucoamilasa de Candida z) Los líderes hibridos descritos en el documento EP·A-387 319 (incorporado a la presente memoria como
referencia) aa) la secuencia señal de gp67 (junto con sistemas de expresión baculovirales) (p ej., aminoácidos 1-19 de Número de Acceso GenBank AAA72759) o
bb) el líder natural de la proteína terapéutica X;
ce) el líder de invertasa de S. cerevisiae (SUC2), como se describe en el documento JP 62-096086 (concedida como 911036516, incorporada a la presente memoria como referencia); o
dd) Inulinasa -MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEO ID NO: 33).
ee) Una variante núm. 1 del líder de propéptido TA57 modificado MKLKTVRSAVLSSLFASOVLGOPloOTESOTISVNLMAooTESAFATOTNSGGLOWGLISMAKR (SEO ID NO: 34)
ff) Una variante núm. 2 del líder de propéptido TA57 modificadoMKLKTVRSAVLSSLFASOVLGOPloOTESOTISVNLMADoTESAFATOTNSGGLOWGLISMAEEGEPKR (SEO ID NO: 35)
gg) Un péptido señal consenso -MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEO ID NO: 111 )
hh) Una secuencia señal de HSAlkex2 modificada -MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLOKR (SEO ID NO: 112)
ii) Un péptido señal consenso núm. 2 -MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEO ID NO: 105)
Métodos adicionales de producción recombinante y sintética de proteinas de fusión de albúmina
La presente invención también se refiere a vectores que contienen un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, a células anfitrionas, ya la producción de proteínas de fusión de albúmina mediante mecanismos sintéticos y recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plásmido, virus, o retrovirus. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral se producirá generalmente solo en células anfitrionas de complementación.
Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciórJ se pueden unir a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un anfitrión. Generalmente, se introduce un vector plasmídico en un producto precipitado, tal como un producto precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lipido cargado. Si el vector es un virus, se puede empaquetar in vitro utilizando una linea celular de empaquetamiento apropiada y después se puede transducir a células anfitrionas
El inserto de polinucleótido debe estar conectado operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lae, trp, phoA y tae de E. eOli, los promotores temprano y ta rdío de SV40 y los promotores de las L TR retrovirales, por nombrar unos pocos. Otros promotores adecuados serán conocidos por el experto en la técnica. Los constructos de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de la transcripción, la terminación, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos expresados por los constructos incluirá preferiblemente un codón de inicio de la traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) situado apropiadamente al final del polipéptido que se vaya a traducir
Como se indica, los vectores de expresión induirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen los genes de la dihidrofolato reductasa, G418, glutamina sintasa, o de resistencia a neomicina para el cultivo de células eucarióticas, y de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de los anfitriones apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como células de E. eoli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura (p. ej., Saecharomyees cerevisiae o Pichia pastoris (Núm. Acceso ATCC 201178)); células de insecto tales como células de orosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, NSO, 293, y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios de cultivo y las condiciones apropiados para las células anfitrionas descritas anteriormente son conocidos en la técnica
Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pOE70, pOE60 y pOE-9, disponibles en OIAGEN, Inc., vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pOR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia Biotech, Inc Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXT1 Y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG Y pSVL disponibles en Pharmacia. Los vectores de expresión preferidos para su uso en sistemas de levadura incluyen, pero no se limitan a pYES2, py01 , pTEF1/Zeo, pYES2IGS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-02, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, Y PA0815 (todos disponibles de Invitrogen, Carlbad, CA). otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experlo en la técnica.
En una realización, los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden fusionar a secuencias señal que dirigirán la loca lización de una proteína de la invención a compartimentos concretos de una célula procariótica o eucariótica y/o dirigirán la secreción de una proteína de la invención desde una célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, en E. eoli, se puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Los ejemplos de las secuencias señal o las proteínas (o fragmentos de las mismas) a las cuales se
pueden fusionar las proteínas de fusión de albúmina de la invención con el fin de dirigir la expresión del polipéptido al espacio periplásmico de bacterias induyen, pero no se limitan a, la secuencia señal petB, la secuencia señal de la proteína de unión a maltosa (MBP), MBP, la secuencia señal ompA , la secuencia señal de la subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli periplásmica, y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina. Se encuentran disponibles diversos vectores para la construcción de proteínas de fusión que dirigirán la localización de una proteína, tales como la serie de vectores pMAL (concretamente la serie pMAL-p) asequible de New England Biolabs. En una realización específica, los polinucleótidos de las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden fusionar a la secuencia señal de la pectato 1iasa pelB para incrementar la eficacia de expresión y purificación de tales polipéptidos en bacterias Gram-negativas. Véanse, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.576.195 y 5.846.818, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad
Los ejemplos de los péptidos señal que se pueden fusionar a una proteína de fusión de albúmina de la invención con el fin de dirigir su secreción en células de mamífero incluyen, pero no se limitan a
a) la secuencia señal de MPIF-1 (p ej., aminoácidos 1-21 del Núm Acceso GenBank AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSOA (SEO ID NO: 6)
b) la secuencia señal de slanniocalcina (MLONSAVLLLLVISASA, SEO ID NO: 7)
c) la región pre-pro de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTF1SLLFLFSSAYSRGVFRR, SEO ID NO: 8)
d) la región pre de la secuencia señal de HSA (p. ej., MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEO ID NO: 9) o variantes de la misma, tales como, por ejemplo, MKWVSF1SLLFLFSSAYS, (SEO ID NO: 10)
el la secuencia señal de invertasa (p. ej., MLLOAFLFLLAGFAAKISA, SEO ID NO: 11 )
f) la secuencia señal del factor de apareamiento alfa de levadura (p. ej., MRFPS1FTAVLAFAASSALAAPVNTTTEOETAOIPAEAVIGYSOLEGOFOVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGV SLEKR, SEO ID NO: 12 o MRFPS1FTAVLAFAASSALAAPVNTITEOETAOIPAEAVIGYSOLEGOFOVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVS LOKR, SEO ID NO: 12)
g) la secuencia líder de la toxina asesina de K. lactis
h) una secuencia señal híbrida (p. ej., MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEO ID NO· 13)
i) una secuencia señal hibrida de HSAlMFa-1 (también conocida como HSAlkex2) (p. ej., MKWVSF1SLLFLFSSAYSRSLDKR, SEO ID NO: 14)
j) una secuencia líder de la fusión asesina de K. lactislMFa-1 (p. ej., MNIFYIFLFLLSFVOGSLDKR, SEO ID NO: 15)
k) la secuencia señal de inmunoglobulina Ig (p. ej., MGWSCIILFLVATATGVHS, SEO ID NO: 16)
1) la secuencia señal del precursor de Fibulina B (p. ej., MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEO ID NO: 17)
m) la secuencia señal del precursor de clusterina (p. ej., MMKTLLLFVGLLL TWESGOVLG, SEO ID NO: 18)
n) la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulínico (p. ej., MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEO ID NO: 19)
o) variantes de la región pre-pro de la secuencia señal de HSA tales como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEO ID NO: 20), MKWVTF1SLLFLFAGVLG (SEO ID NO: 21 ), MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEO ID NO: 22), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEO ID NO: 23), El líder de HSA modificado HSA núm. 64 -MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEO ID NO: 24); Ellider de HSA modificado HSA núm. 66 -MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEO ID NO: 25); El líder de HSA modificado (A14) -MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEO ID NO: 26); El líder de HS modificado (S14) (también conocido como HSA modificado núm. 65) -MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEO ID NO: 27), El lider de HSA modificado (G14) -MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEO ID NO: 28), o MKWVTFISLLFLFGGVLGOLHKS (SEQ ID NO: 29)
p) una secuencia señal consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO: 30)
q) líder de la fosfatasa ácida (PH05) (p. ej., MFKSVVYSILAASLANA SEO ID NO: 31 )
r) la pre-secuencia de MFoz-1
s) la pre-secuencia de O glucanasa (BGL2)
t) líder de la toxina asesina
u) la presecuencia de la toxina asesina
v) prepro toxina asesina de k. lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre y 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVOGLEHTHRRGSLOKR (SEO ID NO: 32)
w) secuencia líder de secreción de glucoamilasa II de S. diastaticus
x) secuencia líder de secreción de a-galactosidasa (MEL 1) de S. carlsbergensis
y) secuencia líder de glucoamilasa de Gandida
z) Los líderes híbridos descritos en el documento EP-A-387 319 (incorporado a la presente memoria como referencia)
aa) la secuencia señal de gp67 (junto con sistemas de expresión baculovirales) (p ej., aminoácidos 1-19 de Número de Acceso GenBank AAA72759) o
bb) el lider natural de la proteína terapéutica X;
ce) el líder de invertasa de S. cerevisiae (SUC2), como se describe en el documento JP 62-096086 (concedido como 911036516, incorporado a la presente memoria como referencia); o
dd) Inulinasa -MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEO ID NO: 33).
ee) Una variante del líder del propéptido TA57 modificada núm. 1 MKLKTVRSAVLSSLFASOVLGOPloOTESOTISVNLMAooTESAFATOTNSGGLOWGLISMAKR (SEO ID NO: 34)
ff) Una variante del líder del propéptido TA57 modificada núm. 2 MKLKTVRSAVLSSLFASOVLGOPloOTESOTISVNLMADoTESAFATOTNSGGLOWGLlSMAEEGEPKR (SEO ID NO: 35)
gg) Un péptido señal consenso -MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEO ID NO· 111)
jj) Una secuencia señal de HSA/kex2 modificada -MKWVSF1SLLFLFSSAYSGSLoKR (SEO ID NO: 112)
kk) Un péptido señal consenso núm. 2 · MRPlWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEO ID NO: 105)
En una realización preferida, la secuencia señal de HSAlkex2 modificada (SEO ID NO: 112) se fusiona al extremo amino de una proteína de fusión de albúmina, incluyendo proteinas de fusión que comprenden albúmina y una proteína terapéutica como se describe en la presente memoria, así como proteínas de fusión de albúmina descritas en los documentos W093f15199; W097f2444S; W003f60071 ;WOO3/59934; y PCTfUS04f01369, cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. La secuencia señal de HSAlkex2 modificada se basa en la secuencia señal de HSAlkex2 (SEO ID NO: 14) descrita, p. ej., por Sleep et al Biotechnology 1990, vol. S, págs. 42-46; y en la Patente de los Estados Unidos 5.302.697, ambas las cuales se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. La secuencia líder de HSA/kex2 modificada descrita en la presente memoria contiene una sustitución de amillDácidos no conservativa (Arg por Gly) en el residuo 19 del péptido señal parental. Se ha encontrado que el péptido señal de HSA/kex2 modificado produce un rendimiento de expresión inesperadamente mejor y/o una eficacia de escisión mejor de las proteínas de fusión de albúmina cuando se expresan en levadura que la secuencia señal de HSA/kex2 no modificada. Las variantes del péptido señal de HSAlkex2 modificado también están incluidas en la invención. En particular el residuo Gly de la posición 19 del SEO ID NO: 112 puede ser sustituido por un residuo Pro. También se contemplan otras variantes por sustitución conservativa de la secuencia señal de HSAlkex2 modificada. Los ácidos nucleicos que codifican la secuencia señal de HSAlkex2 modificada del SEO ID NO: 112, así como las variantes por sustitución conservativa de la misma, también están incluidos en la invención.
Los vectores que utilizan glutamina sintasa (GS) o OHFR como marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en la glutamina sintasa es la disponibilidad de lineas celulares (p. ej., la linea de células de mieloma murino, NSO) que son negativas para la glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células de Ovario de Hámster Chino (CHO» proporcionando un inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógellD. Un sistema de expresión de glutamina sintasa y los componentes del mismo se detallan en las publicaciones PCT: WOS7/04462; WOS6/05S07; WOS9/01036; W089/10404; y W091/06657, que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. Adicionalmente, los vectores de expresión de glutamina sintasa se pueden obtener a partir de Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y la producción de anticuerpos mOllDclonales utilizando un sistema de expresión de GS en células de mieloma murino son descritos por Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) y por Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995) que se incorporan a la presente memoria como referencia La presente invención también se refiere a células anfitrionas que contienen los constructos vectores descritos
anteriormente descritos en la presente memoria, y adicionalmente incluye células anfitrionas que contienen secuencias de nucleótidos de la invención que están asociadas operablemente con una o más regiones de control heterólogas (p. ej., promotor y/o potenciador) utilizando mecanismos conocidos en la técnica. La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero (p. ej., una célula derivada de ser humano), o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula anfitriona puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. Se puede seleccionar una célula anfitriona que modula la expresión de las secuencias génicas insertadas, o modifica y procesa el producto génico de una manera específica deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de ciertos inductores; de ese modo la expresión del polipéptido modificado genéticamente se puede controlar. Además, diferentes células anfitrionas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación traduccionales y posttraduccionales (p. ej., fosforilación, escisión) de las proteinas. Se pueden seleccionar lineas celulares apropiadas para garantizar las modificaciones y el procesamiento deseados de la proteína foránea expresada
La introducción de los ácidos nucleicos y constructos de ácido nudeico de la invención en la célula anfitriona se puede efectuar mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección, u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Específicamente se contempla que los polipéptidos de la presente invención puedan ser expresados de hecho por una célula anfitriona que carezca de un vector recombinante. Además de las células anfitrionas que contienen los constructos vectores comentadas en la presente memoria, la invención también incluye células anfitrionas primarias, secundarias, e inmortalizadas de origen vertebrado, concretamente de origen mamifero, que han sido modificadas para suprimir o remplazar material genético endógeno (p. ej., la secuencia codificante correspondiente a un proteína Terapéutica puede ser remplazada por una proteína de fusión de albúmina correspondiente a la proteína Terapéutica), y/o para incluir material genético (p. ej., se pueden incluir secuencias de polinucleótidos heterólogas tales como por ejemplo, una proteína de fusión de albúmina de la invención correspondiente a la proteína Terapéutica). El material genético asociado operablemente con el polinucleótido endógeno puede activar, alterar, y/o amplificar polinucleótidos endógenos.
Adicionalmente, se pueden utilizar mecanismos conocidos en la técnica para asociar operablemente polinucleótidos heterólogos (p. ej., polinucleótidos que codifican una proteina de albúmina, o un fragmento o variante de la misma) y/o regiones de control heterólogas (p. ej., promotor yfo potenciador) con secuencias de polinucleótidos endógenas que codifican una proteína Terapéutica a través de una recombinación homóloga (véanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641 .670, expedida el 24 de Junio de 1997; la Publicación Internacional Número WO 96129411 , la Publicación Intemacional Número WO 94/12650 ; KoIler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), cuyas descripciones de incorporan como referencia en su totalidad)
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la cromatografía con hidroxilapatita, la cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía oon lectina. Muy preferiblemente, se emplea la cromatografía líquida de alta resolución CHPLCquot;) para la purificación.
En realizaciones preferidas las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando la Cromatografía de Intercambio Aniónico incluyendo, pero no limitada a, cromatografía sobre columnas de Q-sefarosa, DEAE sefarosa, poros Ha, poros OEAE, Toyopearl a , Toyopearl aAE, Toyopearl OEAE, ResourcefSource a y DEAE, Fractogel a y OEAE
En realizaciones especificas las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando la Cromatografía de Intercambio Catiónico incluyendo, pero no limitada a, columnas SP-sefarosa, CM sefarosa, poros HS, poros CM, Toyopear1 SP, Toyopear1 CM, ResourcefSource S y CM, Fractogel S y CM Y sus equivalentes y comparables
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando la Cromatografía de Interacción Hidrófoba incluyendo, pero no limitada a, columnas de Fenil-, Butil-, Metil-, Octil-, Hexilsefarosa, Poros Fenil, Butil, Metil, Octil, Hexil, Toyopear1 Fenil, Butil, Metil, Octil, Hexil, ResourcefSource Fenil, Butil, Metil, Octil, Hexil, Fractogel Fenil, Butil, Metil, Octil, Hexil y sus equivalentes y comparables.
En realizaciones específicas las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando la Cromatografía de Exclusión por Tamaño incluyendo, pero no limitada a, columnas de sefarosa S100, S200, S300, resina superdex y sus equivalentes y comparables
En realizaciones específicas las proteinas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando una Cromatografía de Afinidad incluyendo, pero no limitada a, columnas Mimetic Oye affinity, de afinidad con péptido y de afinidad con anticuerpo que son selectivas o bien para la HSA o bien para las moléculas quot;diana de fusiónquot;.
En realizaciones preferidas las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando uno o más de
los métodos de Cromatografía enumerados más arriba_ En otras realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican utilizando una o más de las siguientes columnas de Cromatografía, columna de Q sefarosa FF, columna de SP Sefarosa FF, columna de Q Sefarosa de Alta Resolución, columna de Blue Sefarosa FF, Columna Blue, columna Fenil Sefarosa FF, OEAE Sefarosa FF, o Columna Metil.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar utilizando el procedimiento descrito en la Publicación Internacional PCT WO 00f44772 que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Un experto en la técnica podría modificar fácilmente el procedimiento descrito allí para su uso en la purificación de proteínas de fusión de albúmina de la invención
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden recuperar de: productos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un anfitrión procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto, y de mamífero_ Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados y pueden ser no glicosilados_Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por el anfitrión_ De este modo, es bien sabido en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codón de inicio de la traducción generalmente se elimina con una elevada eficacia de cualquier proteína después de la traducción en todas las células eucarióticas _ Si bien la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también es eliminada eficazmente en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas, este procedimiento de eliminación proca riótica es ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual está anclada covalentemente la metionina N-terminal.
En una realización, se utiliza la levadura Pichia pastoris para expresar proteínas de fusión de albúmina de la invención en un sistema eucariótico. Pichia pastoris es una levadura metilotrófica que puede metabolizar el metanol como su única fuente de carbono. Una etapa principal en la ruta de metabolización del metanol es la oxidación del metanol a formaldehído uti lizando 0 2_ Esta reacción es catalizada por la enzima alcohol oxidasa_ Con el fin de meta bol izar el metanol como su única fuente de carbono, Pichia pastorls debe generar elevados niveles de alcohol oxidasa debido, en parte, a la relativamente baja afinidad de la alcohol oxidasa por el 0 2. Por consiguiente, en un medio de crecimiento dependiente de metanol como principal fuente de carbono, la región promotora de uno de los dos genes de alcohol oxidasa (AOXI) es altamente activa_ En presencia de metanol, la alcohol oxidasa producida a partir del gen AOXI comprende hasta aproximadamente 30% de la proteína soluble total en Pichia pasforis_Véanse Ellis, S.s., et al., Mol. CelL BioL 5:1111-21 (1985); Koutz, P_J_, et al., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, JF , et al., Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987). De este modo, una secuencia codificante heteróloga, tal como, por ejemplo, un polinucleótido de la presente invención, bajo la regulación transcripcional de toda o de parle de la secuencia reguladora AOXI es expresada a niveles excepcionalmente elevados en la levadura Pichia desarrollada en presencia de metanol
En un ejemplo, se uti liza el vector plasmídico pPIC9K para expresar el AON que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención, como se expone en la presente memoria, en un sistema de levadura de Pichia esencialmente como se describe en quot;Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology,quot; O.R. Higgins y J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa, NJ_1998_ Este vector de expresión permite la expresión y secreción de un polipéptido de la invención en virtud del promotor AOXI fuerte conectado al péptido señal secretor (es decir, líder) de fosfalasa alcalina (PHO) de Pichia pastoris localizado aguas arriba de un sitio de clonación múltiple
Muchos otros vectores de levadura podrían ser utilizados en lugar de pPIC9K, tales como, pYES2, pYD1 , pTEF1/Zeo, pYES2fGS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalfa, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-02, pHIL-S1, pPIC3.5K, y PA0815, como apreciará fácilmente un experto en la técnica, con tal que el constructo de expresión propuesto proporcione señales localizadas apropiadamente para la transcripción, la traducción, la secreción (si se desea), y similares, incluyendo un AUG en marco si se requiere.
En otra realización, se puede lograr un elevado nivel de expresión de una secuencia codificante heteróloga, tal como, por ejemplo, un polinucleólido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, mediante la clonación del polinucleótido heterólogo de la invención en un vector de expresión tal como, por ejemplo, pGAPZ o pGAPZalfa, y el desarrollo del cultivo de levadura en ausencia de metanol.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden sintetizar químicamente utilizando mecanismos conocidos en la técnica (p. ej., véanse Creighton, 1983, Proteins: Struclures and Molecular Principies, WH Freeman & Co_, NY, y Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984» _Por ejemplo, se puede sintetizar un polipéptido correspondiente a un fragmento de un polipéptido mediante el uso de un sintetizador peptídico _ Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como sustitución o adición en la secuencia del polipéptido_Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butirico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, tbutilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como b-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos, y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser O (dextrógiro) o L (levógiro)
La invención incluye proteínas de fusión de albúmina de la presente invención que son modificadas diferencial mente durante o después de la traducción, p. ej ., mediante glicosilación, acetilaci6n, fosforilaci6n, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, conexión con una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante mecanismos conocidos, incluyendo, pero no limitados a, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc
Las modificaciones post-traduccionales adicionales abarcadas por la invención incluyen, por ejemplo, p. ej., cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, procesamiento de extremos N terminales o C terminales), anclaje de radicales químicos a la cadena principal de aminoácido, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, y adición o deleción de un residuo de metionina N tenninal como resultado de la expresión de una célula anfitriona procariótica. Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden modificar con una marca detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína
Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos del grupo prostético adecuado incluyen estreptavidinalbiotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamin-f1uoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de los materiales bioluminiscentes inclul.en luciferasa,¡ luciferina, ~ aequorina; y los ejemRlos del material radiactivo adecuado incluyen yodo '2\1231, 1251 13 1), carbooo eC), azufre ( 5S), tritio ~H), indio (1 11n 112ln,113rnln, 115rnln1, tecnecio ~w,-c, 99rn-Jquot;c), talio ( 1Ti), galio (sGa, 67 Ga), oaladio C03Pd), molibdeno ( Mo), xenon (bXe), flúor eSF), 15 Sm, 177Lu, 59Gd,149pm,
140La, nSVb, 166Ho, 9OY, 47SC, I16Re, 188Re, 14 Pr, lOSRh, y 9}Ru
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención o los fragmentos o variantes de las mismas están anclados a ~uelantes macrocíclicos que se asocian con iooes radiometálicos, incluyendo pero no limitados a, 177Lu, 1M:ly, 1 Ho, y 153Sm, a polipéptidos. En una realización preferida, el ión radiometálico asociado con los quelantes macrocíclicos es 111In. En otra realización preferida, el ión radiometálico asociado coo el quelante macrocíclico es 9Oy. En realizaciones específicas, el quelante macrocídico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',Nquot;,W'-tetraacético (DOTA). En otras realizaciones específicas, el DOTA está anclado a un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo a través de una molécula conectora. Los ejemplos de las moléculas conectoras útiles para conjugar DOTA a un polipéptido son comúnmente conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, DeNardo et al., Clin Cancer Res. 4(10):2483-90 (1998); Peterson et al., Biocoojug. Chem. 10(4):553-7 (1999); y Zimmerman et al., Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50 (1999); que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad.
Como se ha mencionado, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser modificadas por medio de procedimientos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional, o por medio de mecanismos de modificación química que son bien conocidos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en diversos sitios en un pol ipéptido dado. Los polipéptidos de la invención pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubicuitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales post-traduccionales o se pueden elaborar mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, anclaje covalente de flavina, anclaje covalente de un radical hemo, anclaje covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, anclaje covalente de un lípido o derivado de lípido, anclaje covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, tratamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfaci6n, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tales como arginilación, y ubicuitinación. (Véanse, por ejemplo, PROTEINS -STRUCTURE ANO MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W H Freeman and Company, Nueva York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed ., Academic Press, Nueva York., págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); RaHan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992».
Las proteínas de fusión de la invención y los anticuerpos que se unen a una proteína Terapéutica o fragmentos o variantes de la misma se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pOE (OIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311 ), entre otras, muchas de las cuales se encuentran disponibles en el mercado. Como se describe en Genlz et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de ~HN, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Gell 37:767 (1984» y la etiqueta quot;flag~
Adicionalmente, una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede conjugar con un radical terapéutico tal como una citotoxina, p. ej ., un agente citostático o citocida, un agente radiactivo o un ioo metálico radiactivo, p. ej., emisores alfa tales como, por ejemplo, 2138i. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1,1-dihidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos y homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citara bina, 5-fluorouracil-descarbazina), agentes alqu ilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (GCNU), cidofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina-platino (ID (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramidna, y antramicina (AMC) , Y agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina)
Los productos conjugados de la invención se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o radical farmacéutico no se debe considerar limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el radical farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón b, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, p. ej ., TNF-alfa, TNF-beta, AIM' (Véase, la Publicación Internacional Núm. WO 97(33899), AIM 11 (Véase, la Publicación Intemacional Núm. WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Inl. Immunol. 6:1567-1574 (1994», VEGI (Véase, la Publicación Internacional Núm. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfaquinas, interleuquina-1 (quot;IL-1 quot;l, inter1euquina-2 (~IL-2quot;), interleuquina-6 r IL ..~n, factor estimulador de las colonias de granulocitos macrófagos rGM-CSFquot;), factor estimulador de las colonias de granulocitos rG-CSFquot;l, u otros factores de crecimiento. Los mecanismos para conjugar semejante radical terapéutico a proteínas (p ej., proteínas de fusión de albúmina) son bien conocidos en la técnica
Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden anclar a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoanálisis o purificación de polipéptidos que están unidos por, que se unen a, o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilol o polipropileno.
Las proteínas de fusión de albúmina, con o sin un radical terapéutico conjugado, administradas solas o combinadas con uno o varios factores citotóxicos ylo una o varias citoquinas se pueden utilizar como agentes terapéuticos.
En realizaciones en las que la proteína de fusión de albúmina de la descripción comprende solamente el dominio VH de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, puede ser necesario ylo deseable expresar simultáneamente la proteína de fusión con el dominio VL del mismo anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, de manera que la proteína de fusión de VH-albúmina se asociará (covalentemente o no covalentemente) post-Iraduccionalmente
En realizaciones en las que la proteína de fusión de albúmina de la descripción comprende solamente el dominio VL de un anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, puede ser necesario ylo deseable expresar simultáneamente la proteína de fusión con el dominio VH del mismo anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica, de manera que la proteina de fusión de VL-albúmina y la proteína VH se asociarán (covalentemente o no covalentemente) post-traduccionalmente.
Algunos anticuerpos Terapéuticos son anticuerpos biespecíficos, lo que significa que el anticuerpo que se une a una proteína Terapéutica es un anticuerpo hibrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadalligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Con el fin de crear una proteína de fusión de albúmina correspondiente a esa proteína Terapéutica, es posible crear una proteína de fusión de albúmina que tiene un fragmento scFv fusionado tanto al extremo N como al C del radical de la proteína de albúm ina. Más concretamente, el scFv fusionado al extremo N de la albúmina correspondería a uno de los pares pesadafligera (VHNL) del anticuerpo original que se une a una proteína Terapéutica y el scFv fusionado al extremo G de la albúmina correspondería a otro par pesadafligera (VHNL) del anticuerpo original que se une a una proteína Terapéutica
También se proporcionan en la invención derivados químicamente modificados de las proteínas de fusión de albúmina de la invención que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como una mayor solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido, o una menor inmunogenicidad (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.179.337). Los radicales químicos para la derivatización se pueden seleccionar entre polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinilico) y similares. Las proteínas de fusión de albúmina se pueden modificar en posiciones al azar dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más radicales quimicos anclados
El poli mero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término quot;aproximadamentequot; que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido) para facilitar la manipulación y la fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (p. ej., la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hubiera, sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para la proteína Terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000,2500, 3000, 3500,4000,4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o 100.000 kDa
Como se ha observado anteriOfmente, el metilenglicol puede tener una estructura ramificada. Los polietilenglicoles ramificados se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.643.575; Morpurgo el al., Appl Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconju9. Chem. 10:638-646 (1999), cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia
Las moléculas de polietilenglicol (u otros radicales químicos) deben estar ancladas a la proteína teniendo en cuenta los dominios fucionales o antigénicos de la proteína. Existen numerosos métodos de anclaje disponibles para los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el método descrito en el documento EP O401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF), incorporado a la presente memoria como referencia; véase también Malik et al., Exp. Hematol 20:1028-1035 (1992), que se refiere a la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo. Por ejemplo, el polietilenglicol puede estar unido covalentemente a través de residuos de aminoácido por un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activada_ Los residuos de aminoácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y residuos de aminoácido N terminales; los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C terminal. Los grupos sulfhidrilo también se pueden utilizar como grupo reactivo para el anclaje de moléculas de polietilenglicoL Para fines terapéuticos se prefiere el anclaje en un grupo amino, tal como el anclaje en el extremo N o el grupo lisina.
Como se ha sugerido anteriormente, el polietilenglicol se puede anclar a proteínas por medio de cualquiera de numerosos residuos de aminoácido. Por ejemplo, el pol ietilenglicol se puede ligar a proteínas a través de enlaces covalentes con residuos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o cisteina. Se pueden emplear una o más químicas de reacción para anclar el polietilenglicol a residuos de aminoácido específicos (p. ej., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o cisteína) de la proteína o a más de un tipo de residuo de aminoácido (p. ej., lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y combinaciones de los mismos) de la proteína.
Se pueden desear especificamente proteinas modificadas químicamente en el extremo N. Utilizando polietilenglicol como ilustración de la presente composición, se puede seleccionar entre una variedad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol con respecto a moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a llevar a cabo, y el método de obtención de la proteína pegilada N-terminalmente seleccionada. El método de obtención de la preparación pegilada N-terminalmente (esto es, separando este radical de otros radicales monopegilados si fuera necesario) puede ser mediante purificación del material pegilado N-terminalmente de una población de moléculas de proteína pegiladas. Se puede lograr la modificación de proteinas selectivas modificadas quimicamente en el extremo N mediante alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial de tipos diferentes de grupos amino primarios (Iisina versus N-terminal) disponibles para la derivatización en una proteína concreta. En condiciones de reacción apropiadas, se logra la derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene un grupo carbonilo.
Como se ha indicado anteriormente, la pegilación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención se puede lograr mediante cualquiera de numerosos medios. Por ejemplo, se puede anclar polietilenglicol a la proteína de fusión de albúmina directamente o a través de un conector intermedio. Se describen sistemas sin conectores para anclar polietilenglicol a proteínas en Delgado et al., Cri!. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intem. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.002.531, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.349.052; documentos WO 95/06058; y WO 98/32466, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria como referencia
Un sistema para anclar polietilenglicol directamente a residuos de aminoácido de proteínas sin un conector intermedio emplea MPEG tresilado, que es producido mediante la modificación de monometoxipolietilenglicol (MPEG) utilizando cloruro de tresilo (CIS02CH2CF3). Tras la reacción de la proteína con MPEG tresilado, el polietilenglicol se ancla directamente a grupos amino de la proteína. De este modo, la invención incluye productos conjugados de proteína-polietilenglicol producidos haciendo reaccionar las proteínas de la invención con una
molécula de polietilenglicol que tiene un grupo 2,2,2-trifluoroetanosulfonilo.
El polietilenglicol también se puede anclar a proteínas utilizando numerosos conectores intermedios diferentes. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.612.460, cuya descripción se incorpOfa a la presente memoria como referencia, describe conectores de uretano para conectar polietilenglicol a proteínas. Los productos conjugados de proteína-polietilenglicol en donde el polietilenglicol está anclado a la proteína por medio de un conector también pueden ser producidos por reacción de proteínas con compuestos tales como MPEGsuccinimidilsuccinato, MPEG activado con 1,1'-carbonildiimidazol, MPEG-2,4,5-triclorofenilcarbonato, MPEG-pnitrofenilcarbonato, y diversos derivados de MPEG-succinato. Numerosos derivados de polietilenglicol adicionales y químicas de reacción para el anclaje de polietilenglicol a proteínas se describen en la Publicación Intemacional Núm WO 98132466, cuya descripción se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Los productos de proteína pegilados producidos utilizando las químicas de reacción expuestas en la presente memoria están incluidos en el alcance de la invención
El número de radicales de polietilenglicol anclados a cada proteína de fusión de albúmina de la invención (es decir, el grado de sustitución) también puede variar. Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención pueden ser conectadas, por término medio, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15,17,20 , o más moléculas de polietilenglicol. De un modo similar, el grado medio de sustitución estará dentro de intervalos tales como 1-3, 24, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 810,9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16,15-17, 16-18, 17-19, o 18-20 radicales de polietilenglicol por molécula de proteína. Los métodos para determinar el grado de sustitución se comentan, por ejemplo, en Delgado et al., Crit Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)
Los polipéptidos de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de la síntesis química y los cultivos de células recombinantes mediante métodos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Muy preferiblemente, se emplea la cromatografía líquida de alta resolución (quot;HPLCquot;) para la purificación. Se pueden emplear técnicas conocidas para el replegamiento de proteínas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido se desnaturalice durante el aislamiento y/o la purificación
La presencia y la cantidad de proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se pueden determinar utilizando ELlSA, un inmunoanálisis bien conocido en la técnica. Un protocolo de ELlSA que fuera útil para detectar/cuantificar proteínas de fusión de albúmina de la invención, comprendería las etapas de recubrimiento de una placa de ELlSA con un anticuerpo anti-albúmina de suero humana, bloqueo de la placa para evitar la unión no específica, lavado de la placa de ELlSA, adición de una solución que contenga la proteína de fusión de albúmina de la invención (a una o más concentraciones diferentes), la adición de un anticuerpo secundario especifico anti-proteina Terapéutica acoplado a una marca detectable (como se describe en la presente memoria o conocido de otro modo en la técnica), y la detección de la presencia del anticuerpo secundario. En una versión altemativa de este protocolo, la placa de ELlSA se podría recubrir con el anticuerpo específico anti-proteína Terapéutica y el reactivo secundario marcado podría ser un anticuerpo específico anti-albúmina humana.
Usos de los Polinuc/eótidos
Cada uno de los polinucleótidos identificados en la presente memoria se puede utilizar de numerosas maneras como reactivos. La siguiente descripción se debe considerar ilustrativa y utiliza técnicas conocidas
Los po linucleótidos de la presente invención son útiles para producir las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Como se describe con más detalle a continuación, los polinucleótidos de la invención (que codifican las proteínas de fusión de albúmina) se pueden utilizar en métodos de ADN recombinantes útiles en la modificación genética para elaborar células, líneas celulares, o tejidos que expresan la proteína de fusión de albúmina codificada por los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención
Los polinucleótidos de la presente invenciÓfl también son útiles en la terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo para corregir el defecto genético. Los polinucleÓtidos descritos en la presente invención ofrecen un método para localizar tales defectos genéticos de una manera muy precisa. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del anfitrión, produciendo de ese modo un nuevo rasgo en la célula anfitriona. Los ejemplos no limitantes adicionales de métodos de terapia génica abarcados por la presente invención se describen muy exhaustivamente en alguna parte en la presente memoria (véanse, p. ej., las secciones denominadas quot;Terapia Génicaquot;, y los Ejemplos 61 y 62).
Usos de los Pofipéptidos
Cada uno de los polipéptidos identificados en la presente memoria se puede utilizar de numerosas maneras. La siguiente descripción se debe considerar ilustrativa y utiliza técnicas conocidas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del tejido o los tejidos (p. ej., análisis inmunohistoquímicos tales como, por ejemplo, ABC inmunoperoxidasa (Hsu et al., J. Histochem. Cytochem. 29:577-580 (1981)) o del tipo o los tipos de células (p. ej.,
análisis inmunocitoquímicos).
Las proteínas de fusión de albúmina se pueden utilizar para analizar los niveles de polipéptidos en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., véase Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Bioi. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos útiles para detectar la expresión de genes de proteínas incluyen inmunoanálisis, tales como el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELlSA) y el radioimunoanálisis (RIA). Las marcas de análisis adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen marcas enzimáticas, tales como , ~Iucosa oxidasa; radioisótopos, tales como
~~?,O C\ 1231 12\ 1311), carbono C4C) , azufre (35S), tritio (3H), indio ( ll ln, 112ln, 113mln , 15m1 In) y tecnecio (nrc, e), talio (2b1 Ti), #alio ~Ga, 67GaJ, paladio C03Pd), molibdeno b99Mo) , xenon (n3Xe), flúor (\sF), 1S3Sm, 177Lu, 159Gd, 149pm, 140La, 5yb, Ho, 9Oy, 4 Sc, 186Re, 199Re, 142pr, 105Rh, 7Ru; marcas luminiscentes, tales como luminol; y marcas fluorescentes, tales como fluoresceina y rodamina, y biotina
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención también se pueden detectar in vivo mediante formación de imágenes. Las marcas o marcadores para la formación de imágenes in vivo de proteínas incluyen aquellos detectables mediante radiografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) o relajación de espín electrónico (ESR). Para la radiografía de rayos X, las marcas adecuadas incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no son manifiestamente nocivos para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN o ESR incluyen aquellos con un espín característico detectable, tales como deuterio, que se puede incorporar a la proteína de fusión de albúmina mediante marcaje de nutrientes proporcionados a una linea celular que expresa la proteína de fusión de albúmina de la invención
Una proteína de fusión de albúmina ~ue ha sido marcada con un radical de formación de imágenes detectable, tal como un radioisóto~(pqr ejemplo, 12 1, 1231, 1251, 131 1), carbono e4C), azufre (35S), tritio eH~indio e 11 1n, 1121n, 113mln, 115mln),J. tecnecio ( Te, 99m-fquot;c), talio e01T[), galio (68Ga, 61Ga), paladio ,03Pd~, molibdeno J; Mo), xenon ( 133Xe), flúor ( 18F), Sm, 177Lu, 159Gd, 149pm, 140La, 17~b, 168Ho, 9Oy, 47SC, lBe Re , 1 Re, 41 Pr,105Rh, Ru), una sustancia radio
opaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, es introducida (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente) en el mamífero que se va a examinar para determinar un trastomo inmunitario. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad de radical formador de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un radical radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente entre aproximadamente 5 y 20 milicuries de 99m-¡-c. La proteína de fusión de albúmina marcada se acumulará a continuación preferentemente en localizaciones del organismo (p. ej., órganos, células, espacios exlracelulares o matrices) en las que se localizan uno o más receptores, ligandos o sustratos (correspondientes a la de la proteína Terapéutica utilizada para elaborar la proteína de fusión de albúmina de la invención). Altemativamente, en el caso en el que la proleína de fusión de albúmina comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Terapéutico, la proteína de fusión de albúmina marcada se acumulará preferentemente en las localizaciones del organismo (p. ej., órganos, células, espacios exlracelulares o matrices) en las que se localizan los polipéptidos/epítopos correspondientes a aquellos unidos por el anticuerpo Terapéutico (utilizado para elaborar la proteína de fusión de albúmina de la invención). La formación de imágenes in vivo es descrita por S.W. Burchiel et al., quot;Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragmentsquot; (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Deteclion of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982» . Los protocolos descritos allí podrían ser modificados fácilmente por un experto en la técnica para su uso con las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
En una realización, la invención proporciona un método para la liberación específica de proteínas de fusión de albúmina de la invención en células mediante la administración de proteinas de fusión de albúmina de la invención
(p. ej., polipéptidos codificados por polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo anticuerpos) que están asociadas con polipéptidos o ácidos nucleicos heterólogos. En un ejemplo, la invención proporciona un método para liberar una proteína Terapéutica en la célula elegida como diana. En otro ejemplo, la invención proporciona un método para liberar un ácido nucleico de hebra sencilla (p. ej., antisentido o ribozimas) o un ácido nucleico de doble hebra (p. ej., ADN que se puede integrar en el genoma de una célula o replicar episómicamente y que se puede transcribir) en la célula elegida como diana.
En otra realización, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) mediante la administración de protelnas de fusión de albúmina de la invención asociadas con toxinas o profármacos citotóxicos
Por quot;toxinaquot; se quiere significar uno o más compuestos que se unen y activan sistemas efectores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades cataliticas de toxinas, o cualquier molécula
o enzima normalmente no presente en o sobre la superficie de una célula que en condiciones definidas causan la muerte de la célula. Las toxinas que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos conocidos en la técnica, compuestos tales como, por ejemplo, anticuerpos (o porciones que contienen fijadores del complemento de los mismos) que se unen a un sistema efector citotóxico endógeno inducido o inherente, timidina quinasa, endonucieasa, ARNasa, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de la difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de hierba carmín, alfa-sarcina y toxina del cólera. quot;Toxinaquot; también incluye un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ión metálico
radiactivo, D. ej., emisores alfa tales como'APor elquot;emplo; 213Bi¡ u olros radioisótoDQs tales como, por eiemplq .. 103pd, 13132p wy 15 Sm 1~3Gd 5'Cr 9Oylrio ''''''Renio
133Xe 1 '68Ge 57CO 65Zn 85Sr 35S 69Yb 54Mn 15Se 113Sn l11Tin 166HOlmiO: y 188ReniO; mar~s lu'mini~cenies, t~les 00;quot;0 IU~inOI; y' mar~s f1u~resc~ntes, t~les co~o ftuo~esceína y rodamina, y biotina. En una realización específica, la invención proporciona un método para la destrucción especifica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) mediante la administración de polipéplidos de la invención o anticuerpos de la invención asociados con el radiois61opo 1«.Iy. En otra realización específica, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (p_ ej .. la destrucción de células tumorales) mediante la administración de polipéptidos de la invención o anticuerpos de la invención asociados con el radiois6topo 111 1n. En una realización específica adicional, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) mediante la administración de polipéptidos de la invención o anticuerpos de la invenciórJ asociados con el radioisótopo 131 1.
Los mecanismos conocidos en la técnica se pueden aplicar a los polipéptidos idóneos de la invención. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan, al uso de agentes de conjugación bifuncionales (véanse p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; Y5.808.003
Las proteinas de fusión de albúmina de la presente invención son útiles para el diagnóstico, el tratamiento, la prevención ylo el pronóstico de diversos trastomos en mamíferos, preferiblemente humanos. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en el encabezamiento quot;Actividades Bilógicasquot; de más abajo
De este modo, la invención proporciona un método de diagnóstico de un trastorno, que implica (a) analizar el nivel de expresión de un cierto polipéptido en las células o el fluido corporal de un individuo utilizando una proteína de fusión de albúmina de la invención; y (b) comparar el nivel de expresión del polipéptido ana lizado con un nivel de expresión del polipéptido patrón, por medio de lo cual un incremento o un descenso en el nivel de expresión de polipéptido analizado en comparación con el nivel de expresión patrón es indicativo de un trastomo. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente elevada de transcrito en el tejido sometido a biopsia de un individuo puede indicar una predisposición al desarrollo de la enfermedad, o puede proporcionar un método para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamientos agresivos antes, evitando de ese modo el desarrollo o progreso adicional del cáncer
Por otra parte, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades o afecciones tales como, por ejemplo, trastornos neurales, trastomos del sistema inmunitario, trastomos musculares, trastornos reproductivos, trastornos gastrointestinales, trastomos pulmonares, trastomos cardiovasculares, trastomos renales, trastornos proliferativos, ylo enfermedades y afecciones cancerosas. Por ejemplo, se puede administrar a los pacientes un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo para remplazar niveles ausentes o reducidos del polipéptido (p. ej., insulina), para complementar niveles ausentes o reducidos de un polipéptido diferente (p. ej ., hemoglobina S por hemoglobina B, SOO, catalasa, proteínas de reparación de AON), para inhibir la actividad de un polipéptido (p. ej., un oncogén o un supresor tumoral), para activar la actividad de un polipéptido (p. ej., mediante unión a un receptor), para reducir la actividad de un receptor unido a membrana compitiendo con él por el ligando libre (p. ej., receptores de TNF solubles utilizados en la reducción de la inflamación), o para ocasionar una respuesta deseada (p. ej., inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos, potenciación de la respuesta inmunitaria células o tejidos proliferativos).
En particular, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Terapéutico también se pueden utilizar para tratar la enfermedad (como se ha descrito más arriba, yen otra parte en la presente memoria). Por ejemplo, la administración de una proteína de fusión de albúmina que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Terapéutico se puede unir a, y/o neutralizar el polipéptido al cual se une específicamente el anticuerpo Terapéutico utilizado para elaborar la proteína de fusión de albúmina, ylo reducir la producción en exceso del polipéptido al cual se une específicamente el anticuerpo Terapéutico utilizado para elaborar la proteína de fusión de albúmina. De un modo similar, la administraciórJ de una proteína de fusión de albúmina que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo Terapéutico puede activar el polipéptido al cual se une específicamente el anticuerpo Terapéutico utilizado para elaborar la proteína de fusión de albúmina, mediante la unión al polipéptido unido a una membrana (receptor).
Como mínimo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención de la presente invención se pueden utilizar como marcadores de peso molecular sobre geles de SOS-PAGE o sobre columnas de filtración en gel con tamices moleculares utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden utilizar para originar anticuerpos, que a su vez se pueden utilizar para medir la expresión de proteína de la proteína Terapéutica, la proteína de albúmina, y/o la proteína de fusión de albúm ina de la invención a partir de una célula recombinante, como modo de evaluación de la transformación de la célula anfitriona, o en una muestra biológica. Por otra parte, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden uti lizar para someter a ensayo las actividades biológicas descritas en la presente memoria.
Análisis de diagnóstico
Los compuestos de la presente invención son útiles para el diagnóstico, el tratamiento, la prevención y/o el prollÓstico de diversos trastornos en mamíferos, preferiblemente seres humanos. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos para cada proteína Terapéutica en la correspondiente fila de la Tabla 1 y en la presente memoria bajo los encabezamientos quot;Actividad Inmunitariaquot;, nTrastomos Relacionados con la Sangrequot;, quot;Trastornos Hiperproliferativosquot;, quot;Trastornos Renalesquot;, quot;Trastornos Cardiovascularesquot;, nTrastornos Respiratoriosquot;, quot;Actividad Anti-Angiogénesisquot;, quot;Enfermedades a Nivel Celularquot;, quot;Curación de Heridas y Proliferación de Células Epitelialesquot;, quot;Actividad Neural y Enfermedades Neurol6gicasquot;, quot;Trastornos Endocrinosquot;, quot;Trastornos del Sistema Reproductorquot;, quot;Enfermedad Infecciosaquot;, quot;Regeneraciónquot; ylo quot;Trastornos Gastrointestinalesquot;, de más abajo
Para numerosos trastornos, se pueden detectar niveles sustancialmente alterados (incrementados o disminuidos) de expresión génica en tejidos, células o fluidos corporales (p. ej., sueros, plasma, orina, semen, fluido sinovial o líquido cefalorraquídeo) tomados de un individuo que tiene semejante trastorno, con respecto a un nivel de expresión génica quot;patrónquot;, esto es, el nivel de expresión en tejidos o fluidos corporales de un individuo que no tiene el trastorno. De este modo, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de un trastorno, que implica medir el nivel de expresión del gen que codifica un polipéptido en tejidos, células o fluido corporal de un individuo y comparar el nivel de expresión génica medido con un nivel de expresión génica patrón, por medio de 10 cual un incremento o una disminución en los niveles de expresión del gen en comparación con el patrón es indicativo de un trastorno. Estos análisis de diagnóstico se pueden llevar a cabo in vivo o in vitre, tal como, por ejemplo, en muestras de sangre, tejido de biopsia o tejido de autopsia
La presente invención también es útil como indicador pronóstico, por medio de lo cual los pacientes que muestran una expresión del gen potenciada o deprimida experimentarán un resultado clínico peor.
Por quot;análisis del nivel de expresiÓfl del gen que codifica un polipéptidoquot; se quiere significar la medición o estimación cualitativa o cuantitativa del nivel de un polipéptido concreto (p. ej., un polipéptido correspondiente a una proteína Terapéutica descrita en la Tabla 1) o el nivel del ARNm que codifica el polipéptido de la invención en una primera muestra biológica ya sea directamente (p. ej., determinando o estimando el nivel absoluto de proteina o el nivel de ARNm) ya sea relativamente (p. ej., comparando el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm en una segunda muestra biológica). Preferiblemente, el nivel de expresión del polipéptido o el nivet de ARNm en la primera muestra biológica se miden o se estiman y se comparan con un nivel de polipéptido o un nivel de ARNm patrón, tomándose el patrón de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o determinándose mediante el cálculo de la media de los niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm patrón, éste se puede uti lizar repetidamente como patrón para la comparación.
Por quot;muestra biológicaquot; se quiere significar cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, línea celular, u otra fuente que contenga polipéptidos de la invención (incluyendo porciones de los mismos) o ARNm. Como se ha indicado, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como suero, plasma, orina, fluido sinovial y liquido cefa lorraquídeo) y fuentes de tejido que se ha encontrado que expresan la totalidad o fragmentos de un polipéptido o ARNm. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica_ Cuando la muestra biol6gica inctuye ARNm, el tejido de biopsia es la fuente preferida
El ARN celular total se puede aislar de una muestra biológica utilizando aJalquier mecanismo adecuado tal como el método de tiocianato-fenol cloroformo de una sola etapa descrito por Chomezynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). Los niveles de ARNm que codifica los polipéptidos de la invención se analizan a continuación utilizando cualquier método apropiado. Estos incluyen análisis de transferencia Northem, mapeo con nucleasa S1 , reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcripciÓfl inversa combinada con reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), y transcripción inversa combinada con reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).
La presente invención también se refiere a análisis de diagnóstico tales como análisis cuantitativos y de diagnóstico para la detección de niveles de polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención, en una muestra biológica (p. ej., células y tejidos), incluyendo la determinación de niveles normales y anormales de polipéptidos. De este modo, por ejemplo, se puede utilizar un análisis de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la expresión anormal de polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con proteínas de fusión de albúmina en comparación con muestras de tejido de control normal para detectar la presencia de tumores. Los mecanismos de análisis que se pueden utilizar para determinar los niveles de un polipéptido que se une a, está unido a, o se asocia con proteínas de fusión de albúmina de la presente invenciÓfl en una muestra derivada de un anfitrión son bien conocidos por expertos en la técnica. Tales métodos de análisis incluyen radioinmunoanálisis, análisis de unión competitiva, análisis de Trasferencia Westem y análisis ELlSA. El análisis de los niveles de polipéptido en una muestra biol6gica se puede producir utilizando cualquier método conocido en la técnica
El análisis de los niveles de polipéptido en una muestra biológica se puede producir utilizando una variedad de mecanismos Por ejemplo, se puede estudiar la expresiÓfl del polipéptido en tejidos mediante métodos inmunohistol6gicos clásicos (Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol.
105:3087-3096 (1987)}. Otros métodos útiles para detectar la expresión del gen del polipéptido incluyen
inmunoanálisis, tales como análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELlSA) y radioinmunoanálisis (RIA). Las marcas para análisis de anticuerpos adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen marcas enzimáticas, tales como, glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (1 251, 1211), carbono C4C), azufre (35S), tritio e H), indio (1121n), y tecnecio (99m-yc ), y marcas fluorescentes, tales como fluoresceína y roda mina, y biotina.
El tipo de tejido o célula que se vaya a analizar incluirá generalmente aquellos que se sabe, o se sospecha, que expresan el gen de interés (tal como, por ejemplo, canceroso). Los métodos de aislamiento de proteínas empleados en la presente memoria pueden ser, por ejemplo, los descritos por Harlow y Lane (Harlow, E. y Lane, D., 1988, ~Antibodies: A Laboratory Manual~, Cold Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbar, Nueva York), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. Las células aisladas pueden derivar de un cultivo celular o de un paciente. Los análisis de células tomadas de un cultivo pueden ser una etapa necesaria en la evaluación de células que se podría utilizar como parte de un mecanismo de terapia génica basado en células o, altemativamente, para someter a ensayo el efecto de los compuestos sobre la expresión del gen.
Por ejemplo, las proteínas de fusión de albúmina se pueden utilizar para detectar cuantitativamente o cualitativamente la presencia de polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la presente invención Esto se puede completar, por ejemplo, mediante mecanismos de inmunofluorescencia que emplean una proteína de fusión de albúmina marcada fluorescentemente acoplados a una detección con microscopio óptico, citometria de flujo, o ftuorimétrica
En una realización preferida, las proteínas de fusión de albúmina que comprenden al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une específicamente a al menos una proteína Terapéutica descrita en la presente memoria
(p. ej., las proteínas Terapéuticas descritas en la Tabla 1) o conocida de otro modo en la técnica se pueden utilizar para detectar cuantitativamente o cua litativamente la presencia de productos gérlicos o variantes conservadas o fragmentos de péptidos de las mismas Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente acopladas a una detección mediante microscopia óptica, citometria de flujo, o detección fluorimétrica
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden emplear, adicionalmente histológicamente, como en los análisis de inmunoftuorescencia, de microscopía inmunoelectrónica o no inmunológicos, para la detección in situ de polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. La detección in situ se puede completar eliminando un espécimen histológico de un paciente, y aplicando a este un anticuerpo marcado o un polipéptido de la presente invención. Las proteínas de fusión de albúmina se aplican preferiblemente superponiendo las proteínas de fusión de albúmina marcadas sobre una muestra biológica. Utilizando semejante procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de los polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con proteínas de fusión de albúmina, sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, los expertos normales en la técnica percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como los procedimientos de tinción) puede ser modificado con el fin de lograr semejante detección in situ.
Los inmunoanálisis y los no inmunoanálisis que detectan polipéptidos que se unen a, están unidos a, o se asocian con las proteínas de fusión de albúmina comprenderán típicamente la incubación de una muestra, tal como un fluido biológico, un extracto tisular, células recién cosechadas, o productos lisados de células que han sido incubadas en cultivo celular, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente capaz de unirse a productos génicos o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos, y la detección del anticuerpo unido mediante cualquiera de los numerosos mecanismos bien conocidos en la técnica
La muestra biológica se puede poner en contacto con, e inmovilizar sobre, un soporte en fase sólida o un portador tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte se puede lavar a continuación con tampones adecuados, seguido de tratamiento con la proteína de fusión de albúmina marcada detectablemente de la invención. El soporte en fase sólida se puede lavar a continuación con el tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo o polipéptido no unidos. Opcionalmente el anticuerpo se marca con posterioridad. La cantidad de marca unida sobre el soporte sólido se puede detectar a continuación mediante métodos convencionales.
Por ~soporte en fase sólida o portadorquot; se quiere significar cualquier soporte capaz de unirse a un polipéptido (p. ej., una proteína de fusión de albúmina, o un polipéptido que se une a, está unido a, o se asocia con una proteína de fusión de albúmina de la invención). Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dex1rano, nailon, ami lasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble para los fines de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible con tal que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un polipéptido. De este modo, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una cuenta, o cilíndrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie extema de una varilla. Altemativamente, la superticie puede ser plana tal como una lámina, una tira de ensayo, etc Los soportes preferidos incluyen cuentas de poliestireno. Los expertos en la técn ica conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión del anticuerpo o antígeno, o serán capaces de averiguar los mismos mediante el uso de la experimentación rutinaria.
La actividad de unión de un lote dado de proteína de fusión de albúmina se puede determinar de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de análisis operativas y óptimas para cada determinación empleando la experimentación rutinaria .
Además de analizar los niveles de polipéptido en una muestra biológica obtenida de un individuo, el polipéptido también se puede detectar in vivo mediante formación de imágenes Por ejemplo, en una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para formar imágenes de células enfermas o neoplásicas
Las marcas o marcadores para la formación de imágenes in vivo de proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen aquellos detectables mediante radiografía de rayos X, NMR, MRI, barridos por CAT o ESR. Para la radiografía por rayos X, las marcas adecuadas incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no son abiertamente nocivas para el sujeto. Los marcadores adecuados por NMR y ESR incluyen aquellos con un espín característico detectable, tal como deuterio, que se puede incorporar a la proteína de fusión de albúmina mediante marcaje de nutrientes de una línea celular (o cepa bacteriana o de levadura) modificada.
Adicionalmente, se pueden administrar las proteínas de fusión de albúmina de la invención cuya presencia se puede detectar. Por ejemplo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención marcadas con un compuesto radio-opaco u otro compuesto apropiado se pueden administrar y visualizar in vivo, como se ha comentado anteriormente para los anticuerpos marcados. Adicionalmente, tales polipéptidos se pueden utilizar para procedimientos de diagnóstico
in vitro
Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo especifico del polipéptido que ha sido marcado con un radical de formación de imágenes detectable apropiado, tal como un radioisólopo (por ejemplo, 13\ 1121n, ~c), una sustancia radioopaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, es introducido (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente) en el mamífero que va a ser examinado para determinar un trastorno. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad de radical de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un radical radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente entre aproximadamente S y 20 milicuries de 99mtc. La proteína de fusión de albúmina marcada se acumulará a continuación preferentemente en localizaciones del organismo que contienen un polipéptido u otra sustancia que se une a, está unida a, o se asocia con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención La formación de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., ~Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments~ (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Oetection of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982))
Una de las maneras en las que una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se puede marcar detectablemente es mediante la conexión de la misma con una enzima indicadora y la utilización del producto conectado en un inmunoanálisis enzimático (E1A) (Voller, A., quot;The Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELlSA)quot;, 1978, Diagnostic Horizons 2:1 -7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MO); Voller et al., J Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed .), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL., Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo). La enzima indicadora que se une al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato cromogénico, de tal manera que se produzca un radical químico que pueda ser detectado, por ejemplo, por métodos espectrofotométricos, ftuorimétricos o visuales. Las enzimas indicadoras que se pueden utilizar para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, deltaS-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfatasa, deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparraginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucose-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Adicionalmente, la detección se puede completar mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima indicadora. La detección se puede completar mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparaciórJ con patrones preparados de un modo similar.
Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden radiomarcar y utilizar en cualquiera de una variedad de otros inmullOanálisis. Por ejemplo, marcando radiactivamente las proteinas de fusión de albúmina, es posible utilizar las proteínas de fusión de albúmina en un radioinmunoanálisis (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986, que se incorpora como referencia a la presente memoria). El isótopo radiactivo se puede detectar por métodos que incluyen, pero no se limitan a, un contador gamma, un contador de centelleo, o autorradiografía
Adicionalmente, se conocen en la técnica y se pueden utilizar moléculas quelantes para marcar las proteínas de fusión de Albúmina. Las moléculas quelantes se pueden anclar a proteínas de fusión de Albúmina de la invención para facilitar el marcaje de dicha proteína con iones metálicos incluyendo radionúclidos o marcas ftuorescentes. Por ejemplo, véanse Subramanian, R. y Meares, C.F., quot;Bifunctional Chelating Agents for Radiometal-Iabeled monoclonal Antibodiesquot; en Cancer Imaging with Radiolabeled Anlibodies (D. M. Goldenberg, Ed.) Kluwer Academic Publications, Boston; Saji, H., quot;Targeted delivery of radiolabeled imaging and therapeutic agents: bifunctional
radiopharmaeeuticalsquot; Crit. Rev Ther. Orug Carner Syst. 16:209-244 (1999); Srivastava S.C. y Mease R.C., quot;Progress in research on ligands, nuclides and techniques for labeling monoclonal antibodiesquot;. Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 18:589-603 (1991); y Liu, S. y Edwards, O.S., quot;Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaeeuticalsquot;. Bioconjug. Chem. 12:7-34 (2001 ). Se puede utilizar cualquier quelante que se pueda unir covalentemente a dichas proteínas de fusión de Albúmina de acuerdo con la presente invención. El quelante puede comprender adicionalmente un radical conector que conecte el radical quelante a la proteina de fusión de Albúmina
En una realización, la proteína de fusión de Albúmina de la invenciórJ se ancla a un quelante acíclico tal como ácido dietilentriamillO-N,N,N',Nquot;,Nquot;-pentaacético (OPTA), análogos de OPTA, y derivados de OPTA. Como ejemplos no limitantes, el quelante puede ser ácido 2-(p-isotiocianatobencil)-6-metildietilentriaminopentaacético(1 B4M-OPTA, también conocido como MX-OTPA), ácido 2-metil-6-(rtlO-nitrobencil)-1 ,4,7 -triazaheptano-N,N,N',Nquot;,Nquot; -pentaacético (nitro-1 B4M-OTPA o nitro-MX-DTPA); ácido 2-(p-isotiocianatobencil)-ciclohexildietilentriaminopentaacético (CHXDTP A), o ácido N-[2-amino-3(rho-n itrofen il)propil)-trans-ciclohexano-1 ,2-d iamino-N, N', Nquot; -pentaacetico (nitro-CHX-ADTPA)
En otra realización, la proteína de fusión de Albúmina de la invención se ancla a un quelante de terpiridina acíclico tal como 6,6quot;-bis[[N,N,Nquot;,Nquot;-tetra(carboximetil)amino]metil)4'-(3-amin04-metoxifenil}-2,2':6',2quot;-terpiridina (TMTamina).
En realizaciones específicas, el quelante macrocíclico que está anclado a la proteína de fusión de Albúmina de la invención es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',Nquot;,N'quot;-tetraacetico (DOTA). En otras realizaciones específicas, el DOTA está anclado a la proteína de fusión de albúmina de la invención a través de una molécula conectora. Los ejemplos de moléculas conectoras útiles para conjugar DOTA a un polipéptido son comúnmente conocidos en la técnica -véanse, por ejemplo, OeNardo et al., Clin. Caneer Res. 4(10):2483-90, 1998; Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999; y limmerman et al., Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, 1999 que se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad. Adicionalmente, las Patentes de los Estados Unidos
5.652.361 Y 5.756.065, que describen agentes quelantes que se pueden conjugar con anticuerpos, y los métodos para elaborarlos y utilizar1os, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Aunque las Patentes de los Estados Unidos 5.652.361 y 5.756.065 se centran en la conjugación de agentes quelantes con anticuerpos, un experto en la técnica podría adaptar fácilmente el método allí descrito con el fin de conjugar los agentes quelantes con otros polipéptidos.
Los quelantes bifunciona les basados en ligandos macrocíclicos en los que la conjugación es a través de un brazo activado, o un grupo funcional, anclado a la cadena principal carbonada del ligando, se pueden emplear como describen M. Moi et al., J. Amer. Chem. Soco 49:2639 (1989) (ácido 2-p-nitrobencil-1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecanoN,N',Nquot; ,Nquot;'-tetraacetico); S. V. Oeshpande et al., J Nucl. Med. 31:473 (1990); G. Ruser et al., Bioconj Chem. 1:345 (1990); C. J. Broan et al., J. C. S. Chem. Comm. 23:1739 (1990); y C. J. Anderson el al., J. Nucl. Med. 36:850 (1995).
En una realización, se ancla un quelante macrociclico, tal como quelantes poliazamacrociclicos, que contienen opcionalmente uno o más grupos carboxi, amino, hidroxamato, fosfonato, o fosfato, a la proteina de fusión de Albúmina de la invención. En olra realización, el quelanle es un quelante seleccionado del grupo que consisle en DOTA, análogos de DOTA, y derivados de DOTA.
En una realización, las moléculas quelantes adecuadas que se pueden anclar a la proteína de fusión de Albúmina de la invención incluyen DOXA (ácido 1-oxa4,7,10-triazaciclododecanotriacetico), NOTA (ácido 1,4,7lriazaciclononanolriacetico), TETA (ácido 1,4,8, 11-telraazaciclotelradecanotelraaeelico), y THT (4'-(3-amino-4metoxi-fenil)-6,6quot;-bis(N',N,-dicarboximetil-N-metilhidrazino)-2,2':6',2quot;-terpiridina), y análogos y derivados de los mismos. Véanse, p. ej., OhmollO et al., J. Med. Chem. 35: 157-162 (1992); Kung et al., J. Nucl. Med. 25: 326-332 (1984); Jurisson et al., Chem. Rev. 93:1137-1156 (1993); y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.367.080. otros quelantes adecuados incluyen agentes quelantes descritos en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.647.447; 4.687.659; 4.885.363; los documentos EP-A-71564; W089f00557 ; y EP-A-232751 .
En otra realizaciórJ, los quelantes de ácido carboxílico macrociclicos adecuados que se pueden utilizar en la presente invención incluyen ácido 1,4,7 ,10-letraazaciclododecano-N, N'Nquot;,Nquot;'-lelraacelico (DOTA); ácido 1,4,8,12tetraazaciclopentadecano-N,N',Nquot;,Nquot;-tetraacetico (15N4); ácido 1,4,7 -triazaciclononano-N,N',Nquot; -triacetico (9N3); ácido 1,5,9-triazaciclododecano-N,N',Nquot;-triacetico (12N3); y ácido 6-bromoacetamido-bencil-1,4,8,11tetraazaciclotetradecano-N,N'Nquot;,Nquot;'-tetraacetico (BAT)
Un quelante preferido que se puede andar a la proteína de Fusión de Albúmina de la invención es el ácido a-(5isotiocianato-2-metoxifenil)-1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano-1 ,4,7,10-tetraacetico, que también es conocido como MeO-DOTA-NCS. También se puede utilizar una sal o éster de ácido a-(5-isotiocianalo-2-metoxifenil)-1,4,7,10tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacelico
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención a las que se anclan covalentemente quelantes tales como los descritos se pueden marcar (a través del sitio de coordinación del quelante) con radionúclidos que son adecuados para fines terapéuticos, de diagnóstico, o tanto terapéuticos como de diagnóstico. Los ejemplos de los metales apropiados incluyen Ag, Al, Au, Si, Cu, Ga, Ha, In, Lu, Pb, Pd, Pm, Pr, Rb, Re, Rh, Se, Sr, Te, Tl, Y, Y Yb. Los ejemplos del radiooúclido utilizado para fines de diavnóstico son Fe, Gd, 111 1n, 67Ga, o 69Ga. En otra realización, el radionúclido utilizado con fines de diagnóstico es 1 'In, o 67Ga. Los ejemplos del radionúclido utilizado con fines terapéuticos son 166Ho, 1650y, Wv, 115rii1n, 52Fe, o 72Ga. En una realización, el radionúc1ido utilizado con fines de diagnóstico es lt:1t1Ho o \lUy' Los ejemplos de los radionúclidos utilizados para fines tanto terapéuticos como de diagnóstico incluyen lS3 Sm,117Lu, l~Gd, H5yb, o 47SC. En una realización, el radionúclido es 153Sm, 177Lu, 115yb, o
Gd
En una realización concreta, las proteínas de fusión de Albúmina de la invención a las cuales están anclados covalentemente los quelantes Rueden estar marcadas con un ión metálico seleccionado del grupo que consiste en
9OY, 1111n, 177Lu, 166Ho, 2158i, y 5Ac
Por otra parte, los radionúclidos emisores de y, tales como ~c, 1111n, 67Ga, y 169yb han sido aprobados o están bajo investigación para la formación de imágenes de diagnóstico, mienlras los emisores de ~, tales como 67CU, 111Ag, 186Re, y 90y son útiles para las ap,licaciones en terapia de tumores. Asimismo otros radiooúclidos útiles Incluyen emisores de y, tales como ~c, 111n, 67Ga, y 169yb, Y emisores de [3, tales como 67CU, 111Ag, 186Re, 188Re y 9Oy, así como airas radionúclidos de interés tales como 211At, 212Si, 177Lu, 86Rb, 105Rh, 153Sm, 198Au, 149pm, 83Sr, 142pr, 214Pb,l09pd, 166Ho, ~, Y 44SC. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención a las cuales se anclan
covalentemente quelantes pueden estar marcadas con los radionúclidos descritos más arriba.
En otra realización, las proteinas de fusión de Albúmina de la invención a las cuales están unidos covalentemente los quelantes pueden estar marcadas con iones metálicos paramagnéticos que incluyen iones de transición y metales lantánidos, tales como metales que tienen números atómicos de 21-29, 42, 43, 44, o 57-71, en particular iones de Cr, V, Mn, Fe, Ca, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, y Lu. Los metales paramagnéticos utilizados en composiciones para la formación de imágenes por resonancia magnética incluyen los elementos que tienen números atómicos de 22 a 29, 42, 44 Y58-70.
En aira realización, las proteínas de fusión de Albúmina de la invención a las cuales se anclan covalenlemenle los quelantes se pueden marcar con iones metálicos fluorescentes incluyendo lantánidos, en particular La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu (p. ej., mEu), Gd, Tb, Dy, Ha, Er, Tm, Yb, y lu
En aira realización, las proteínas de fusión de Albúmina de la invención a las cuales se anclan covalentemente los quelantes se pueden marcar con indicadores que contienen metales pesados que pueden incluir átomos de Mo, Si, Si, yW.
También es posible marcar las proteínas de fusión de albúmina con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado fluorescentemente se expone a luz de longitud de onda apropiada, su presencia se puede detectar debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más comúnmente utilizados se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, ftaldehído y f1uorescamina.
La proteína de fusión de albúmina también se puede marcar detectablemente utilizando metales que emiten
fluorescencia tales como 152Eu, u airas de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden anclar al anticuerpo utilizando grupos quelantes metálicos como ácido dietilentriaminopentacetico (DTPA) o ácido etilendiamintetraacético (EDTA).
Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden marcar detectablemente acoplándolas a un compuesto quimioluminiscente. La presencia de la proteína de fusión de albúmina etiquetada con quimioluminiscente se determina a continuación detectando la presencia de luminiscencia que se produce durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de los compuestos de marcaje luminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato
Del mismo modo, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrado en sistemas biológicos, en el que una proteina catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia Los compuestos bioluminiscentes importantes con fines de marcaje son la luciferina, la luciferasa y la aequorina.
Organ;smos transgénicos
Los organismos transgénicos que expresan las proteínas de fusión de albúmina de la invención también están incluidos en la invención. Los organismos Iransgénicos son organismos modificados genéticamente a los cuales se ha transferido material genético exógeno o clonado, recombinante. Semejante material genético es referido a menudo como transgén. La secuencia de ácido nucleico del transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y olras secuencias de ácido nucleico tales como intrones, que pueden ser necesarias
para la expresión y secreción óptimas de la proteína codificada. El transgén se puede diseñar para dirigir la expresión de la proteína codificada de una manera que facilite su recuperación del organismo o de un producto producido por el organismo, p. ej., de leche, sangre, orina, huevos, pelo o semillas del organismo. El transgén puede consistir en secuencias de ácido nucleico derivadas del genoma de la misma especie o de una especie diferente que la especie del animal diana. Eltransgén se puede integrar o bien en un locus de un genoma donde esa secuencia de ácido nucleico concreta no se encuentra normalmente de otra manera o en ellocus normal para el transgén
El térm ino ~organismo Iransgénico para una línea celular germinar hace referencia a un organismo transgénico en el que la alteración genética o la información genética fue introducida en una célula de la linea germinal, confiriendo de ese modo la capacidad del organismo transgénico para transferir la información genética a los vástagos. Si semejantes vástagos poseen de hecho alguna o toda esa información genética, también son organismos transgénicos. La alteración o la información genética pueden ser foráneas para la especie de organismo a la que pertenece el receptor, foráneas solamente para el receptor individual concreto, o puede ser información genética ya poseída por el receptor. En el último caso, el gen introducido o alterado puede ser expresado de manera diferente al gen nativo
Un organismo transgénico puede ser un animal transgénico o una planta transgénica. Los animales transgérlicos pueden ser producidos por una variedad de métodos diferentes incluyendo Iransfección, eleclroporación, microinyección, direccionamiento génico en células madre embrionarias e infección viral y retroviral recombinante (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.736.866; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.602.307; Mullins et al. (1993) Hypertension 22(4):630-633; Brenin et al. (1997) Surg. OncaL 6(2)99.110; Tuan (ed.), Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology No. 62, Humana Press (1997». El método de introducción de fragmentos de ácido nucleico en células de mamífero de recombinación competente puede ser cualquier método que favorezca la transformación simultánea de múltiples moléculas de ácido nucleico. Los procedimientos detallados para producir animales transgénicos son fácilmente asequibles para un experto en la técnica, incluyendo las descripciones de la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.489.743 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.602.307.
Se han producido numerosos ratones recombinantes o transgénicos, incluyendo aquellos que expresan una secuencia de oncogén activo (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.736.866); expresan el antígeno T de SV40 de simios (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.728.915); carecen de la expresión del factor regulador 1 de interferón (IRF.1) (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.731.490); muestran una disfunción dopaminérgica (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.723.719); expresan al menos un gen humano que participa en el control de la presión sanguínea (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.731 .489); presentan mayor similitud con afecciones que existen en la enfermedad de Alzheimer natural (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.720.936); tienen una capacidad reducida para mediar la adherencia celular (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.602.307); poseen un gen de hormona de crecimiento bovina (Cluller et al. (1996) Genetics 143(4):1753-1760); o, son capaces de generar una respuesta de anticuerpos completamente humana (McCarthy (1997) The l ancet 349(9049):405)
Si bien los ratones y ratas siguen siendo los animales de elección para la mayor parte de la experimentación con transgénicos, en algunos casos es preferible, o incluso necesario, utilizar especies de animales altemativas. Los procedimientos transgénicos han sido utilizados satisfactoriamente en una variedad de animales no murinos, incluyendo ovejas, cabras, cerdos, perros, gatos, monos, chimpancés, hámsters, conejos, vacas y cobayas (véase,
p. ej., Kim et al. (1997) Mol. Reprod. Dev. 46(4):515-526; Houdebme (1995) Keprod. Nutr. Dev. 35(6):609--617; Pelters (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6(5):643-645; Schnieke et al. (1997) Science 278(5346):2130-2133; y Amoah (1997) J. Animal Science 75(2):578-585)
Para dirigir la secreción de la proteina codificada por un transgén de la invención a la leche de mamíferos transgénicos, se puede poner bajo el control de un promotor que está activado preferentemente en células epiteliales mamarias. Se prefieren los promotores que controlan los genes que codifican las proteinas de la leche, por ejemplo el promotor para caseína, beta lactoglobulina, proteína ácida del suero, o lactoalbumina (véanse, p. ej., DiTullio (1992) BioTechnology 10:74-77; Clark et al. (1989) BioTechnology 7:487-492; Gorton el al. (1987) BioTechnology 5:1183-1187; y Soulier et al. (1992) FEBS Letts. 297: 13). Los mamiferos transgénicos de elección producirían grandes volúmenes de leche y tendrían períodos de lactancia prolongados, por ejemplo cabras, camellos u ovejas.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también puede ser expresada en una planta transgénica, p. ej., una planta en la que el transgén de ADN se inserta en el genoma nuclear o plastídico. Los procedimientos de transformación de plantas utilizados para introducir ácidos nucleicos foráneos en células vegetales o proloplastos son conocidos en la técnica. Véanse, en general, Methods in Enzymology Vol. 153 (quot;Recombinant DNA Part D~) 1987, Wu y Grossman Eds., Academic Press y Solicitud de Patente Europea EP 693554. Los métodos para la generación de plantas modificadas genéticamente se describen adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.283.184, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.482.852, y la Solicitud de Patente Europea EP 693 554, todas las cuales se incorporan a la presente como referencia.
Composiciones farmacéuticas o terapéuticas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención o las formulaciones de las mismas se pueden administrar mediante cualquier método convencional incluyendo la inyección parenteral (p. ej., subcutánea o intramuscular) o la infusión intravenosa. El tratamiento puede coosistir en una única dosis o una pluralidad de dosis a lo largo de un período de tiempo.
Si bien es posible administrar sola una proteína de fusión de albúmina de la invención, es preferible presentarla como una formulación farmacéutica, junto con uno o más portadores aceptables. El portador o los portadores deben ser ~aceptables~ en el sentido de ser compatibles con la proteina de fusión de albúmina y no perjudiciales para los receptores de los mismos. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina que serán estériles y estarán libres de pirógenos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención son particularmente adecuadas para la formulación en portadores acuosos tales como agua estéril libre de pirógenos, solución salina u otras soluciones isotónicas debido a su larga vida útil en solución. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invenciórJ se pueden formular bien de antemano en forma acuosa, por ejemplo, semanas o meses o períodos de tiempo más largos antes de ser dispensadas
Por ejemplo, las formulaciones que contienen la proteína de fusión de albúmina se pueden preparar tomando en consideración la prolongada vida útil de la proteína de fusión de albúmina en formulaciones acuosas. Como se ha comentado anteriormente, la vida útil de muchas de estas proteínas Terapéuticas aumenta notablemente o se prolonga después de la fusión con HA
En los casos en los que la administración de aerosol es apropiada, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden formular en forma de aerosoles utilizando procedimientos coovencionales. El término ~aerosolquot; incluye cualquier fase en suspensión gaseosa de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención que sea susceptible de ser inhalada hacia los bronquiolos o canales nasales. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión de gotitas de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención en suspensión gaseosa, como la que se puede producir en un inhalador o nebulizador de dosis medida, o en un pulverizador de rocío. El aerosol también incluye una composición de polvo seco de un compuesto de la presente invención suspendido en aire u otro gas portador, que puede ser liberado por insuflación desde un dispositivo inhalador, por ejemplo. Véanse Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract. Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical RevieW'S in Tllerapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313; y Raebum et al., (1992) Pharmacal. Toxicol. Methods 27:143-159.
Las formulaciones de la invención también son típicamente no inmunogénicas, en parte, debido al uso de los componentes de la proteína de fusión de albúmina que están derivados de la especie apropiada. Por ejemplo, para su uso en seres humanos, tanto la proteína Terapéutica como las porciones de albúmina de la proteina de fusión de albúmina serán típicamente humanas. En algunos casos, en doode cualquiera de los componentes no está derivado de ser humano, ese componente puede ser humanizado mediante sustituciórJ de aminoácidos clave de manera que epítopos específicos se manifiesten como humanos al sistema inmunitario humano en lugar de como foráneos.
Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Tales métodos incluyen la etapa de asociar la proteína de fusión de albúmina con el portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si fuera necesario, conformando el producto.
Las formulaciones adecuadas para la administraciórJ parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación apropiada para el receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis únicas o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas selladas, viales o jeringas, y se pueden almacenar en condiciones de secado por congelación (liofilizadas) que requieren solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos estériles. Las formulaciones de dosificación pueden contener la porción de proteína Terapéutica a una concentración molar inferior o una dosificación inferior en comparación con la formulación convencional no fusionada para la proteína Terapéutica dada la vida media en suero ampliada que muestran muchas de las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Como ejemplo, la proteína de fusión de albúmina de la invenciórJ comprende la proteína enumerada en la columna ~Proteína Terapéutica: Xquot; de la Tabla 1 como una o más de las regiones de proteína Terapéutica, la forma de dosificación se puede calcular basándose en la potencia de la proteína de fusión de albúmina con respecto a la potencia de la proteína terapéutica sola, a la vez que se tiene en cuenta la vida media en suero y la vida útil prolongada de las proteínas de fusión de albúmina en comparación con la de la proteína terapéutica nativa. Por ejemplo, si la proteína terapéutica se administra típicamente a 0,3 a 30,0 Ul/kg/semana, o 0,9 a 12,0 Ulfkg/semana, administrada en tres o siete dosis divididas durante un año o más. En una proteína de fusión de albúmina que consiste en HA completa fusionada a una proteína terapéutica, una dosis equivalente en términos de unidades representaría un mayor peso de agente pero la frecuencia de dosificación se podría reducir, por ejemplo a dos veces por semana, una vez por semana o menos
Las formulaciones o composiciones de la invención se pueden empaquetar junto con, o incluídas en un kit con, instrucciones o un prospecto referente a la vida útil prolongada del componente de proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, tales instrucciones o prospectos pueden tratar sobre las condiciones de almacenamiento recomendadas, tales como tiempo, temperatura y luz, teniendo en cuenta la vida útil ampliada o prolongada de las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención. Tales instrucciones o prospectos tambiérJ pueden tratar sobre las ventajas particulares de las proteínas de fusión de albúmina de la invención, tales como la facilidad de almacenamiento para las formulaciones que puede requerir el uso en condiciones sobre el terreno, fuera del hospital controlado, dínicas o en el despacho. Como se ha descrito anteriormente, las formulaciones de la invención pueden estar en forma acuosa y se pueden almacenar en circunstancias por debajo de las ideales sin una pérdida significativa de actividad terapéutica
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden incluir en nutracéuticos. Por ejemplo, ciertas proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar en productos naturales, incluyendo leche o producto lácteo obtenido de un mamífero transgénico que expresa la proteína de fusión de albúmina. Tales composiciones también pueden incluir plantas o productos vegetales obtenidos de una planta transgénica que expresa la proteína de fusiÓfl de albúmina. La proteína de fusión de albúmina también se puede proporcionar en forma de polvo o comprimido, con o sin otros aditivos, portadores, cargas y diluyentes conocidos. Los nutracéuticos son descritos por Scott Hegenhart, Food Product Design, Dic. 1993
La invención también proporciona métodos de tratam iento yfo prevención de enfermedades o trastomos (tales como, por ejemplo, uno o más cualesquiera de las enfermedades o trastomos descritos en la presente memoria) mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención o un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención (quot;polinucle6tido de fusión de albúminaquot;) en un portador farmacéuticamente aceptable.
La proteína y/o el polinucleótido de fusión de albúmina se formularán y dosificarán de una manera compatible con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con la protelna y/o el polinucle6tido de fusión de albúmina solos), el lugar del suministro, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por los médicos. La quot;cantidad eficazquot; para los fines de la presente memoria se determina de ese modo mediante tales consideraciones
Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de la proteína de fusión de albúmina administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 ¡.Jgfkg/día a 10 mglkg/día de peso corporal de paciente, aunque, como se ha observado anteriormente, estará sujeta a la discreción terapéutica Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mglkg/día, y muy preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y 1 mg/kgfdía para la hormona. Si se administra cootinuamente, la proteína de fusión de albúmina se administra típicamente a una tasa de dosificación de aproximadamente 1 1J9lkglhora a aproximadamente 50 ¡.Jglkglhora, o bien mediante 1-4 inyecciones por dla o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, utilizando una mini-bomba. También se puede emplear una solución en bolsa intravenosa La longitud del tratamiento necesaria para observar cam bios y el intervalo después del tratamiento para que se produzcan las respuestas parecen variar dependiendo del efecto deseado.
Como se ha observado anteriormente, la proteína de fusión de albúmina de la invención tiene una estabilidad en plasma mayor en comparación con la porción de proteína Terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) sola. Este incremento en la estabilidad en plasma se debe tener en cuenta cuando se determinan la cantidad eficaz de la proteina de fusión de albúmina que se va a administrar por dosis y el programa de administración de las dosis. En particular, la mayor estabilidad en plasma puede permitir que la proteína de fusión de albúmina sea administrada a una dosis inferior a la misma frecuencia de administraciones, o alternativamente, puede permitir que la proteína de fusión de albúmina sea administrada a dosis inferiores. Preferiblemente, la mayor estabilidad permite que la proteína de fusión de albúmina de la invención sea administrada menos a menudo en menos dosis. Más preferiblemente, la proteína de fusión de albúmina se puede administrar una vez cada dos semanas. Aún más preferiblemente, la proteína de fusiÓfl de albúmina se puede administrar una vez cada tres, cuatro, cinco, o más semanas dependiendo de la farmacocinética de la proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, como se ha comentado anteriormente, la farmacocinética de una proteína de fusión de IFN-alfa-HSA apoya un régimen de dosificación de una vez cada 2-4 semanas o más, e incluso una dosificación a intervalos de 4 semanas o más de cada 4 semanas.
Las proteínas yfo polinucleótidos de fusión de Albúmina se pueden administrar oralmente, rectalmente, parenleralmenle, inlracislernalmenle, intravaginalmenle, inlraperilonealmenle, tópicamente (como polvos, pomadas, geles, gotas o parches transdérmicos), bucalmente, o como una pulverización oral o nasal. quot;Portador farmacéuticamente aceptablequot; hace referencia a una carga, diluyente, material encapsulante o coadyuvante de formulación de cualquier tipo sólido, semisólido o líquido no tóxico. El término quot;parenteralquot; según se utiliza en la presente memoria hace referencia a modos de administración que incluyen la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraestemal, subcutánea e intraarticular
Las proteínas y/o los polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención también se administran adecuadamente
por medio de sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos de las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de liberación sostenida se administran oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tépicamente (como polvos, pomadas, geles, gotas, o parches transdérmicos), bucalmente, o como una pulverización oral o nasal. quot;Portador farmacéuticamente aceptablequot; hace referencia a una carga, diluyente, material encapsulante o coadyuvante de formulación de cualquier lipo sólido, semisólido o líquido no tóxico. El término quot;parenteralquot; según se utiliza en la presente memoria hace referencia a los modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperiloneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. Los ejemplos adicionales de las proteínas y/o polinucleótidos de fusiórJ de albúmina de liberación sostenida incluyen materiales poliméricos adecuados (tales como, por ejemplo, matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcépsulas), materiales hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, y derivados escasamente solubles (tales como, por ejemplo, una sal escasamente soluble)
Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma--etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), vinilacetato de etileno (Langer et al., Id.) o ácido poli-D-(-)--3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).
Las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de liberación soslenida también incluyen proteínas y/o polinucleólidos de fusión de albúmina de la invención atrapados lisosomalmente (véanse en general, Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in !he Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBereslein y Fidler (eds .), Liss, Nueva York, págs. 317 -327 Y 353-365 (1989». Los liposomas que contienen la proteína y/o polinucleólido de fusión de albúmina se preparan mediante métodos conocidos per se: documento DE
3.218.121; Epslein el al., Proc. Nall. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad Sci.(USA) 77:4030-4034 (1980); documento EP 52,322; documento EP 36,676; documenlo EP 88,046; documento EP 143,949; documento EP 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.485.045 y 4.544.545; Y documento EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en el que el contenido de lípido es mayor de aproximadamente 30 por ciento en moles de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para una Terapia óptima
En otra realización adicional más, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se liberan por medio de una bomba (véanse, Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek el al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)).
otros sistemas de liberación controlada se comentan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990»
Para la administración parenteral, en una realización, la proteína y/o polinucleótido de fusión de albúmina se formulan generalmente mezclándolos con el grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptabte, esto es, uno que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son pe~udiciales para la Terapia.
Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto la proteína y/o el polinucleótido de fusión de albúmina uniformemente e íntimamente con portadores liquidas o portadores sólidos finamente divididos o ambos. A continuación, si fuera necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferiblemente el portador es un portador parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como los aceites fijados y el oleato de etilo también son útiles en la presente memoria, así como los liposomas_
El portador contiene adecuadamente cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabi lidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórllico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina,
o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; motlOsacáridos, disacáridos, y oros carllohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorllitol; contraiones tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (incluyendo, por ejemplo, Tween-20), poloxámeros, o PEG
La proteína de fusión de albúmina se formula típicamente en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, portadores, o estabilizadores anteriores dará como resultado la formación de sales de polipéptidos.
Cualquier fármaco utilizado para la administración terapéutica puede ser estéril. La esterilidad se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej. , membranas de 0,2 micras). Las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica
Las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina normalmente se almacenarán en recipientes de dosis unitarias o múltiples, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se cargan quot;iales de 10 mi con 5 mi de solución de proteína y/o polinucleótido de fusión de albúmina acuosa filtrada en condiciones estériles a11% (p/v), y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la proteina y/o el polinucleótido de fusión de albúmina liofilizados utilizando agua para inyectables bacteriostática.
En una realización específica y preferida, las formulaciones de proteína de fusión de Albúmina comprenden fosfato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,15 mM, 0,16 micromoles de octanoato de sodio/miligramo de proteína de fusión, 15 microgramoslmili litro de polisorbato 80, pH 7,2. En otra realización específica y preferida, las formulaciones de proteína de fusión de Albúmina consisten en fosfato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,15 mM, 0,16 micromoles de octanoato de sodio/miligramo de proteina de fusión, 15 microgramos/mitilitro de polisorbato 80, pH 7,2. El pH Y el tampón se selea:ionan para que coincidan con las condiciones fisiológicas y la sal se añade como agente de tonicidad. Se ha elegido octanoato de sodio debido a su habilidad reconocida para incrementar la estabilidad térmica de la proteína en la solución. Finalmente, se ha añadido polisorbato como tensioactivo genérico, que disminuye la tensión superficial de la solución y disminuye la adsorción no específica de la proteína de fusión de albúmina al sistema de cierre del recipiente
La invención también proporciona un paquete o kit que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de tas proteinas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención. Asociada con tales recipientes puede haber una comunicación en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los fármacos o productos biológicos, cuya comunicación refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para la administración a seres humanos. Adicionalmente, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
Las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar solos o combinados con coadyuvantes. Los coadyuvantes que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, alumbre, alumbre más desoxicolato (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), OS21 (Genentech, Inc.), BCG (p. ej., THERACYS®), MPL y preparaciones no quot;iables de Corynebacterium parvum. En una realizaciórJ específica, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con alumbre. En otra realizaciórJ específica, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con QS-21 Otros coadyuvantes que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, inmunomodulador de Monofosforil lipido, AdjuVax 100a, OS-21, OS-18, CRL1005, sales de Aluminio, MF-59, y tecnología de coadyuvante Virosomal. Las vacunas que se pueden administrar con las proteínas ylo pol inucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, vacunas dirigidas a la protección contra MMR (sarampión, paperas, rubeola), polio, varicela, tétanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, Haemophilus influenzae B, tos convulsiva, pneumonia, influenza, Enfermedad de Lyme, rotavirus, cólera, fiebre amarilla, encefalitis Japonesa, poliomielitis, rabia, fiebre tifoidea, y pertussis. Las combinaciones se pueden administrar concomitantemente, p. ej., en forma de una mezcla, por separado pero simultáneamente o concurrentemente; o sucesivamente. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica, y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultáneamente, p. ej., por medio de líneas intravenosas separadas en el mismo individuo. La administración quot;combinadaquot; incluye adicionalmente la administración separada de uno de los compuestos o agentes proporcionados primero, seguida del segundo.
Las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar solos o combinados con otros agentes terapéuticos. Los agentes de proteína ylo polinucleótido de fusión de albúmina que se pueden administrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención, incluyen pero no se limitan a, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, agentes antiinftamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, ylo tratamientos terapéuticos descritos más abajo. Las combinaciones se pueden administrar concomitantemente, p. ej., en foona de una mezcla, por separado pero simultáneamente o concurrentemente; o secuencialmente. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica, y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultáneamente, p. ej., por medio de líneas intravenosas separadas al mismo individuo. La administración quot;combinadaquot; incluye adicionalmente la administración separada de uno de los compuestos o agentes proporcionado primero, seguida del segundo
En una realización, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con un anticoagulante. Los anticoagulantes que se pueden administrar con las composiciooes de la
invención incluyen, pero no se limitan a, heparina, heparina de bajo peso molecular, warfarina sódica (p. ej., COUMADIN®), dicumarol, 4-hidroxicoumarina, anisindiona (p. ej., MIRADON ..... ), acenocumarol (p. ej., nicoumalonea SINTHROME™), indan-1,3-diona, fenprocumon (p ej., MARCUMARTId), biscoumacetato de etilo (p. ej., TROMEXAN ..... ), y aspirina. En una realizaciÓfl específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con heparina ylo warfarina. En otra realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con warfarina. En olra realización especifica, las composiciones de la invención se administran combinadas con warfarina y aspirina. En otra rea lización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con heparina. En otra realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con heparina y aspirina
En olra realización, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con fármacos trombolíticos Los fármacos trombol íticos que se pueden administrar con las composiciones de la invenciÓfl incluyen, pero no se limitan a, plasminógeno, Iys-plasminógeno, alfa2-antiplasmina, eslreptoquinasa (p. ej., KABIKINASETId), anislreplasa (p. ej., EMINASE™), activador de plasminógeno tisular (t-PA, altevasa, ACTiVASE ..... ), uroquinasa (p. ej., ABBOKINASPId), sauruplasa, (Prourokinase, uroquinasa de cadena sencilla), y ácido aminocaproico (p. ej., AMICAR TM). En una realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con activador de plasminógeno tisular y aspirina
En olra realización, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con fármacos antiplaquetarios. Los fármacos antiplaquetarios que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, aspirina, dipiridamol (p. ej., PERSANTINETId), y ticlopidina (p. ej., TICLlD TId).
En realizaciones específicas, el uso de fármacos anti-coagulantes, trombolíticos ylo antiplaquetarios combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se contempla para la prevención, el diagnóstico, ylo el tratamiento de trombosis, trombosis arterial, trombosis venosa, tromboembolia, embolia pulmooar, aterosclerosis, infarto de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. En realizaciones específicas, el uso de fármacos anticoagulantes, Iromboliticos ylo fármacos antiplaquetarios combinados con las proteínas ylo polinucle6tidos de fusión de albúmina de la invenciÓfl se cootempla para la prevención de la oclusión de injertos de la vena safena, para reducir el riesgo de trombosis periprocedimental que podría acompañar los procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de accidente cerebrovascular en pacientes con fibrilación atrial incluyendo fibrilación atrial no reumática, para reducir el riesgo de embolia asociado con enfermedad de las válvulas cardiacas mecánicas ylo las válvulas mitra les. otros usos para los agentes terapéuticos de la invención, solos o combinados con fármacos antiplaquetarios, anticoagulantes, ylo trombolíticos, incluyen, pero no se limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (p. ej., cánulas intravasculares, derivaciones de acceso vascular en pacientes de hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis, y máquinas de bypass cardiopulmonar)
En ciertas realizaciones, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la transcriptasa inversa (NRTI), inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa (NNRTI), ylo inhibidores de proteasa (PI). Los NRTI que se pueden adminislrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, RETROVIRTM (zidovudina/AZT), V1DEXTM (didanosina/ddl), HIVIOTM (zalcitabina/ddC), ZERITTId (estavudina/d4T), EPIVIRTId (lamivudina/3TC), y COMBIVIRTM (zidovudinallamivudina). Los NNRTI que se pueden adminislrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, VIRAMUNETM (nevirapina), RESCRIPTORTId (delavirdina), y SUSTIVATM (efavirenz). Los inhibidores de proteasa que se pueden adminislrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invenciÓfl, incluyen, pero no se limitan a, CRIXIVAN ..... (indinavir), NORVIR..... (ritonavir), INVIRASETId (saquinavir), y VIRACEPTTId (nelfinavir). En una realización especifica, se pueden utilizar agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa, y/o inhibidores de proteasa en cualquier combinación con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención para tratar el SIDA ylo para prevenir o tratar la infección por VIH
otros NRTI incluyen LODENOSINE ..... (F-ddA; un NRTI de adenosina estable frente a los ácidos; Triangle/Abbott; COVIRACIL..... (emlricitabina/FTC; estructuralmente relacionado con lamivudina (3TC) pero con una actividad in vitro 3-a 10-veces mayor; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, también relacionado estructuralmente con lamivudina pero conserva actividad conlra una proporciÓfl sustancial de productos aislados resistentes a lamivudina; Biochem Pharma); Adefovir (aprobación denegada para la terapia anti-VIH por la FDA; Gilead Sciences); PREVEON® (Adefovir Dipivoxil, el profármaco activo de adefovir; su forma activa es PMEA-pp); TENOFOVIRTM (bis-POC PMPA, un profármaco de PMPA; Gilead); DAPOfDXG (mela bolito activo de DAPD; TrianglefAbbott); D-D4FC (relacionado con 3TC, con actividad cootra virus resistentes a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGEN '1d (abacavir/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'azido-2',3'-didesoxiuridina; documento WO 99/66936) ; y formas profármaco que portan S-acil-2-tioetil (SATE) de ¡gt;-L-FD4C y ~-L-FddC (documento WO 98/17281)
otros NNRTI incluyen COACTINON TM (Emivirina/MKC-442, NNRTI potente de la clase HEPT; Triangle/Abbolt); CAPRAVIRINE ..... (AG-1549/S-1153, un NNRTI de la siguiente generaci6n con actividad contra virus que contienen la mutación K103N; Agouron); PNU-142721 (tiene una actividad 20 a 50 veces mayor que su predecesor delavirdina y es activo contra mutantes K103N; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 y DPC-963 (derivados de segunda generación
de efavirenz, diseñado para que sea activo contra virus con la mutación K103N; DuPont); GW-420B67X (tiene una actividad 25 veces mayor que HBY097 y es activo contra mutantes K103N; Glaxo Wellcome); CALANOLlDE A (agente de origen natural del árbol del látex; activo contra virus que contienen cualquiera o ambas de las mutaciones Y181C y K103N); y Propóleos (documento WO 99f49830).
Otros inhibidores de proteasa incluyen lOPINAVIRTM (ABT378fr; Abbotl Laboratories); BMS-232632 (un azapéptido; Bristol-Myres Squibb); TIPRANAVIRTM (PNU-140690, una dihidropirona no peptídica; Pharmacia & Upjohn); PD178390 (una dihidropirona no peptídica; Parke-Davis); BMS 232632 (un azapéptido; Bristol-Myers Squibb); L756,423 (un análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (un compuesto de urea cíclica; Avid & DuPont); AG-1776 (un peptidomimético con actividad in vitro contra virus resistentes a inhibidores de proteasas; Agouron); VX-175fCW433908 (profármaco fosfato de amprenavir; Vertex & Glaxo Welcome); CGP61755 (Ciba); y AGENERASETM (amprenavir; Glaxo Wellcome Inc.)
otros agentes antirretrovirales incluyen inhibidores de fusión/aglutinantes de gp41 Los inhibidores de fusiónfaglutinantes de gp41 incluyen T-20 (un péptido desde los residuos 643-678 del eclodominio de la proteína transmembrana gp41 de VIH que se une a gp41 en su estado en reposo y evita la transformación al estado fusogénico; Trimeris) y T-1249 (un inhibidor de fusión de segunda generación; Trimeris)
otros agentes antirretrovirales incluyen inhibidores de fusiónfantagonistas de receptores de quimioquinas. Los inhibidores de fusiónfantagonistas de receptores de quimioquinas incluyen antagonistas de CXCR4 tales como AMO 3100 (un biciclamo), SDF-1 y sus análogos, y ALX40-4C (un péptido catiónico), T22 (un péptido de 18 aminoácidos; Trimeris) y los análogos de T22 T134 Y T140; antagonistas de CCR5 tales como RANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES, y TAK-779; Y antagonistas de CCR5/CXCR4 tales como NSC 651016 (un análogo de distamicina). También se incluyen los antagonistas de CCR2B, CCR3, y CCR6. Los antagonistas de receptores de quimioquinas tales como RANTES, SDF-1, MIP-1a, MIP-1~, etc., también pueden inhibir la fusión
otros agentes antirretrovirales incluyen inhibidores de integrasa. Los inhibidores de integrasa incluyen ácidos dicafeoilquinicos (DFOA); ácido L-chicorico (un ácido a dicafeoiltartarico (ácido DCTA»; quinalizarina (OLC) y antraquinonas relacionadas; ZINTEVIRTM (AR 177, un oligonucle6tido que probablemente actúa en la superficie celular en lugar de ser un inhibidor de integrasa auténtico; Arondex); y nafloles tales como los descritos en el documento WO 98/50347.
Otros agentes antirretrovirales incluyen compuestos de tipo hidroxiurea tales como BCX-34 (un inhibidor de purina nucleosido fosforilasa; Biocryst); inhibidores de ribonucleótido reductasa tales como DIDOXTM (Molecules for Health); inhibidores de inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) tales como VX-497 (Vertex); y ácidos micofólicos tales como CellCept (micofenolato de mofetilo; Roche).
Otras agentes antirretrovirales incluyen inhibidores de integrasa viral, inhibidores de la translocación nuclear del genoma viral tales como compuestos de arileno bis(metilcetona); inhibidores de la entrada de VIH tales como AOPRANTES, NNY-RANTES, proteína de fusión de RANTES-lgG, complejos solubles de RANTES y glicosaminoglicanos (GAG), y AMO-3100; inhibidores de dedo de cinc de la nucleocápside tales como compuestos de ditiano; dianas de VIH Tat y Rev; y potenciadores de fármacos tales como ABT-378.
Otras terapias antirretrovirales y terapias complementarias incluyen citoquinas y linfoquinas tales como MIP-1a, MIP1~, SDF-1a, IL-2, PROlEUKIN (aldesleuquinafL2-7001; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12, y IL-13; interferones tales como IFN-alfa2a, IFN-alfa2b, o IFN-beta; antagonistas de TNF, NFKB, GM-CSF, M-CSF, e IL-10; agentes que modulan la activación inmunitaria tales como ciclosporina y prednisona; vacunas tales como Remune™ (HIV Immunogen), APL 400-003 (Apollon), gp120 recombinante y fragmentos, glicoproteina de la envoltura recombinante (BfE) bivalente, rgp120CM235, MN rgp120, SF-2 rgp120, complejo de gp120fC04 soluble, proteína Delta JR-FL, péptido sintético ramificado derivado del dominio C3/C4 de gp120 discontinuo, inmunógenos de fusión competente, y vacunas de Gag, Poi, Net, y Tat; terapias basadas en genes tales como elementos supresores de genes (GSE; documento WO 98f54366), e intraquinas (quimioquinas CC modificadas genéticamente dirigidas al ER para bloquear la expresión en la superficie de CCR5 recién sintetizado (Yang et al., PNAS 94:11567-72 (1997); Chen et al., Nat. Med. 3:1110-16 (1997»; anticuerpos tales como el anticuerpo anti-CXCR4 12G5, los anticuerpos anti-CCR5 207, 5C7, PAB, PA9, PA10, PA11, PA12, Y PA14, los anticuerpos anti-CD4 04120 y RPA-T4, el anticuerpo anti-CCR3 7B11, los anticuerpos anti-gp120 17b, 48d, 447-520, 257-0, 268-0 Y 50.1, anticuerpos anti-Tat, anticuerpos anti-TNF-a, y anticuerpo monoclonal 33A; agonistas y antagonistas del receptor de aril-hidrocarburo (AH) tales como TCDD, 3,3',4,4',5-pentaclorobifenilo, 3,3',4,4'-tetraclorobifen ilo, y a-naftoflavona (documento WO 98f30213); y antioxidantes tales como éster etí lico de y-L-glutamil-L-cisteina (y-GCE; documento WO 99f56764)
En una realización adicional, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con un agente antiviral. Los agentes antivirales que se pueden administrar con las proteínas yfo polinucieótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, maxamina, o timalfasina. Específicamente, la proteína de fusión de interferon-albúmina se puede administrar combinada con cualquiera de estos agentes. Por otra parte, la proteína de fusión de interferon alfaalbúmina también se puede administrar con cualquiera de estos agentes, y preferiblemente, la proteína de fusión de interferon alfa 2a o 2b-albúmina se puede administrar con cualquiera de estos agentes. Además, la proteína de
fusión de interferon beta-albúmina también se puede administrar con cualquiera de estos agentes. Adicionalmente, cualquiera de las proteínas de fusión de híbridos de IFN-albúmina se puede administrar combinada con cualquiera de estos agentes
En una realización muy preferida, la proteína de fusión de interferón-albúmina se administra combinada con ribavirina. En una realización preferida adicional, la proteina de fusión de interferon alfa-albúmina se administra combinada con ribavirina. En una realización preferida adicional, la proteína de fusión de interferon alfa 2a-albúmina se administra combinada con ribavirina. En una realización preferida adicional, la proteína de fusión de interferon alfa 2b-albúmina se administra combinada con ribavirina. En una realización preferida adicional, la proteina de fusión de interferon beta-albúmina se administra combinada con ribavirina. En una realización preferida adicional, la proteína de fusión de híbrido de interferón-albúmina se administra combinada con ribavirina
En otras realizaciones, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar combinados con agentes anti-infección oportunista. Los agentes anti-oportunistas que se pueden administrar combinados con las proteinas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE TM, DAPSONE TM, PENTAMIDINE TM, ATOVAQUONE TM, ISONIAZIDTM, RIFAMPINTId, PYRAZINAMIDETId, ETHAMBUTOLTM, RIFABUTIN TId, CLARITHROMYCINTM, AZITHROMYCINTM, GANCICLOVIRTM, FOSCARNETTM, CIOOFOVIRTM, FLUCONAZOLE TM, ITRACONAZOLETM, KETOCONAZOLE TM, ACYCLOVIRTM, FAMCICOLVIRTM, PYRIMETHAMINE..... , LEUCOVORIN ....., NEUPOGEN ..... (filgrastimlG-CSF), y LEUKINETM (sargramostim/GM-CSF). En una realización específica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan oombinados con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE ..... , DAPSONE ....., PENTAMIDINE TM, ylo ATOVAQUONE TId para tratar profilácticamente o prevenir una infección de neumonía por Pneumocystis carinii oportunista. En otra realización especifica, las proteinas ylo potinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en cualquier combinación con ISONtAZIO ..... , RIFAMPIN ....., PYRAZINAMIDETId, ylo ETHAMBUTOLTM para tratar profilácticamente o prevenir una infección compleja por Mycobacterium avium oportunista. En otra realización específica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en cualquier combinación con RIFABUTIN ..... , CLARITHROMYCIWId, ylo AZITHROMYCIW Id para tratar profilácticamente o prevenir una infección por Mycobacterium tuberculosis oportunista. En otra realización especifica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en aJalquier combinación con GANCICLOVIR..... , FOSCARNET ..... , ylo CIDOFOVIWId para tratar profilácticamente o prevenir una infección por citomegalovirus oportunista. En otra realización específica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan en cualquier combinación con FLUCONAZOLEquot;quot;, ITRACONAZOLEquot;quot;, ylo KETOCONAZOLE ..... para tratar profilácticamente o prevenir una infección fúngica oportunista. En otra realización específica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en cualquier combinación con ACYCLOVIR TM ylo FAMCICLOVIRTM para tratar profiláctica mente o prevenir una infección por virus herpes simplex tipo I ylo tipo 11 oportunista. En otra realización especifica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en cualquier combinación con PYRIMETHAMINETM ylo LEUCOVORINTM para tratar profilácticamente o preveni r una infección por Toxoplasma gondii oportunista. En otra realización específica, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se utilizan en aJalquier combinación con LEUCOVORINTM ylo NEUPOGENTM para tratar profiláctica mente o prevenir una infección bacteriana oportunista
En una realización adicional, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, amoxicilina, beta-Iactamasas, aminoglicosidos, beta-Iactama (glicopéptido), beta-lacta masas, Clindamicina, cloramfenicol, cefalosporinas, ciproftoxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rapamicina, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol, y vancomicina
En otras realizaciooes , las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con inmunoestimuladores. Los inmunoestimuladores que se pueden administrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, levamisol (p. ej., ERGAMISOLTId), isoprinosina (p. ej., INOSIPLEXTM), interferones (p. ej., interferon alfa), e interteuquinas (p. ej., IL2).
En otras realízaciooes , las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la ínvención se administran combinados con agentes inmunosupresores. Los agentes inmunosupresores que se pueden administrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15desoxiespergualina, y otros agentes inmunosupresores que actúan suprimiendo la función de las células T correspondientes. otros agentes inmunosupresores que se pueden administrar combinados con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, prednisolona, melotrexalo, talidomida, metoxsalen, rapamicina, leftunomida, mizoribina (BREDININTM), brequinar, desoxiespergualina, y azaspirano (SKF 105685), ORTHOCLONE OKT® 3 (muromonab-CD3), SANDIMMUNE....., NEORALTId, SANGDYNId (ciclosporina), PROGRAF® (FK506, tacrolimus), CELLCEPT® (micofenolato mofetilo, del cual el meta bolito activo es el ácido micofenólico), IMURANTM (azatioprina), glucocorticoesteroides, esteroides adrenocorticales tales como DEL TASONE TM (prednisona) e HYDEL TRASOL TM (prednisolona), FOLEX TM y
MEXATETM (metotrexato), OXSORALEN-ULTRATM (metoxsalen) y RAPAMUNET .. (sirolimus). En una realización específica, los inmullOsupresores se pueden utilizar para prevenir el rechazo de órganos o el transplante de médula ósea
En una realización adicional, las proteínas y/o polinucle6tidos de fusión de albúmina de la invención se administran solos o combinados con una o más preparaciones inlravenosas de inmunoglobulina. Las preparaciones intravenosas de inmunoglobulina que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, GAMMARTquot;, IVEEGAM TM, SANOOGLOBULlN TM , GAMMAGARD S/OTquot;, ATGAMTM (globu lina antitimocitica), y GAMIMUNETM En una realización especifica, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con preparaciones intravenosas de inmunoglobulina en terapia de transplantes (p. ej., Iransplante de médula ósea)
En otra realización, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran solos o como parte de una terapia combinada, o bien in vivo a pacientes o bien in vitro a células, para el tratamiento del cánceL En una realización especifica, las proteínas de fusión de albúmina, concretamente las fusiones de IL-2· albúmina, se administran repetidamente durante la inmullOterapia pasiva para el cáncer, tal como la terapia de transferencia de células adoptivas para el melanoma metaslásico como describen Oudley et al. (Science Express, 19 Septiembre 2002., en www.scienceexpress.org. incorporada a la presente como referencia en su totalidad).
En ciertas realizaciones, las proteínas yfo polinucle6tidos de fusión de albúmina de la invención se administran solos
o combinados con un agente anti-inflamatorio. Los agentes anti-inflamatorios que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, corticoesteroides
(p. ej., betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, y triamcinolona), fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (p. ej., diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenoprofellO, floctafenina, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofellO, meclofenamato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozin, fen ilbutazona, piroxicam, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofénico, y tolmetina), así como antihistaminas, derivados de ácido aminoarilcarboxílico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutirico, ácidos arilcarboxílicos, derivados de ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido salicílico, tiazinocarboxamidas, ácido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, proquazona, proxazol, y tenidap.
En una realización adicional, las composiciones de la invención se administran solas o combinadas con un agente anti-angiogénico. Los agentes anti-angiogénicos que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, Angiostatina (Entremed, Rockvi lle, MO), Troponina-1 (Boston Life Sciences, Boston, MA), Factor anti-Invasivo, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel (laxol), Suramina, Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-1, Inhibidor Tisular de Metaloproteinasa-2, VEGI, Inhibidor de Activador de PlasminógellO-1, Inhibidor de ActivadOf de Plasminógeno-2, y diversas formas de metales de transición del Mgrupo d~ más ligeros.
Los metales de transición del ~grupo dquot; más ligeros incluyen, por ejemplo, las especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio, y tántalo. Tales especies de metales de transición pueden formar complejos metálicos de transición. Los complejos adecuados de las especies de metales de transición mencionadas anteriormente incluyen oxocomplejos de metales de transición.
Los ejemplos representativos de los complejos de paladio incluyen oxocomplejos de vanadio tales como complejos de vanadato y vanad ilo. Los complejos de vanadato adecuados incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato tales como, por ejemplo, metavanadato de amonio, metavanadato de sodio, y ortovanadato de sodio. Los complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanad ilo incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo tales como monohidratos y trihidratos de sulfato de vanadilo.
Los ejemplos representativos de los complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen oxocomplejos. Los oxocomplejos de tungsteno adecuados incluyen complejos de óxido de tungstato y tungsteno. Los complejos de tungstato adecuados incluyen iungstato de amonio, iungstato de calcio, iungstato de sodio dihidratado, y ácido túngstico. Los óxidos de tungsteno adecuados incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Los oxocomplejos de molibdeno incluyen complejos de molibdato, óxido de molibdeno, y molibdenilo. Los complejos de molibdato adecuados incluyen molibdato de amonio y sus hidratos, y molibdato de potasio y sus hidratos. Los óxidos de molibdeno adecuados incluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI), y ácido molíbdico. Los complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo obtenidos, por ejemplo, a partir de glicerol, ácido tartárico, y azúcares
También se puede utilizar una amplia variedad de olros factores anti-angiogénicos denlro del contexto de la presente invención. Los ejemplos representativos incluyen, pero no se limitan a, factor de plaquetas 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de cangrejo de las nieves), (Murata et al., Cancer Res. 51 :22-26, (1991»; Complejo de Peptidoglicano Polisacárido Sulfatado (SP-PG) (la función de este compuesto se puede potenciar mediante la presencia de esteroides tales como estrógeno, y citrato de tamoxifeno); Staurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo por ejemplo, análogos de prolina,
cishidroxiprolina, d,L-3,4-deshidroprolina, Tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4piridinil)-2(3H)oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferones; 2 Macroglobulina-suero; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992» ; Quimostatina (Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, (1992»; Tetradecasulfato de Ciclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber et al., Nature 348:555557, (1990»; Tiomalato de Sodio y Oro CGSTquot;; Matsubara y liff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987»; anticolagenasa-suero; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J. BioL Chem. 262(4):1659-1664, (1987» ; Bisantreno (National Cancer Institute); Lobenzarit disódico (ácido N-(2)-carboxifenil-4--cloroantranilico disódico o ~CCN; (Takeuchi et al., Agents Actions 36:312-316, (1992»; e inhibidores de metaloproteinasas tales como BB94.
otros factores anti-angiogénicos que también se pueden utilizar dentro del contexto de la presente invención incluyen Talidomida, (Celgene, Warren, NJ); esteroide angiostático; AGM-1470 (H. Brem y J. Folkman J Pediatr Surg. 28:445-51 (1993)); un antagonista de integrina alfa v beta 3 (C. Storgard et al., J Clin. Invest 103:47-54 (1999»; carboxinaminoimidazol; Carboxiamidotriazol (CAl) (National Cancer Institute, Bethesda, MD); Conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); Esqualamina (Magainin Phannaceuticals, Plymooth Meeting, PA); TNP-470. (Tap Pharmaceuticals, Oeerfield, IL); lO-0101 Astraleneca (Londres, Reino Unido); APRA (CT2584); Benefina, Birostatina-1 (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101 , Dexrazoxana (ICRF187); DMXAA; Endostatina; Flavopridiol; Genesteina; GTE; ImmTher; Iressa (l01839); Octreotide (Somatostatina); Panretina; Penacilamina; Photopoint; PI-88; Prinomastat (AG-3340) Pur1itin; Suradista (FCE26644); Tamoxifeno (Nolvadex); Tazaroteno; Tetratiomolibdato; Xeloda (Capecitabina); y 5-Fluorouracilo
Los agentes anti-angiogénicos que se pueden administrar combinados con los compuestos de la invención pueden funcionar a través una variedad de mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, inhibición de la proteolisis de la matriz extracelular, bloqueo de la función de las moléculas de adherencia célula endotelial-matriz extracelular, suscitando antagonismo de la función de los inductores de la angiogénesis tales como factores de crecimiento, e inhibiendo los receptores de integrina expresados sobre células endoteliales en proliferación. Los ejemplos de inhibidores anti-angiogénicos que interfieren en la proteolisis de la matriz extracelular y que se pueden administrar combinados con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ), Marimastat (British Biotech, Oxford, Reino Unido), y Metastat (Aetema, St-Foy, Quebec). Los ejemplos de inhibidores anti-angiogénicos que actúan bloqueando la función de las moléculas de adherencia de célula endotelial-matriz exlracelular y que se pueden administrar combinados con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, EMO-121974 (Merck KcgaA Oannstadl, Alemania) y Vitaxin (Ixsys, La Jolla, CAlMedimmune, Gaithersburg, MO). Los ejemplos de los agentes anti-angiogénicos que actúan suscitando antagonismo directamente o inhibiendo los inductores de la angiogénesis y que se pueden administrar combinados con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, Angiozyme (Ribozyme, Boulder, COl, anticuerpo Anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/lK-225846 (Novartis, Basilea, Suiza), SU-101 (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugenf Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ), y SU-666S (Sugen). otros agentes anti-angiogénicos actúan inhibiendo indirectamente la angiogénesis. Los ejemplos de los inhibidores indirectos de la angiogénesis que se pueden administrar combinados con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, IM-862 (Cytran, Kirkland, WA), Interferon-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ), y Pentosano polisulfato (GeorgetoWll University, Washington, OC)
En realizaciones concretas, el uso de las composiciones de la invención combinadas con agentes anli-angiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención, y/o alivio de una enfermedad auloinmunitaria, tal como por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria descrita en la presente memoria.
En una realización concreta, el uso de composiciones de la invención combinadas con agentes anti-angiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención, yfo alivio de la artritis. En una realización más concreta, el uso de composiciones de la invención combinadas con agentes anti-angiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención, yfo alivio de la ar1ritis reumatoide.
En otra realización, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención se administran combinados con una proteína angiogénica, o con polinucleótidos que codifican una proteína angiogénica. Los ejemplos de proteínas angiogénicas que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos, VEGF-1 , VEGF-2, VEGF-3, factor de crecimiento epidérmico alfa y beta, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de necrosis tumoral alfa, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de tipo insulínico, factor estimulador de colonias, factor estimulador de colonias de macrófagos, factor estimulador de colonias de granulocitosfmacrófagos, y óxido nítrico sintasa
En realizaciones adicionales, las composiciones de la invención se administran combinadas con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo, Mecloretamina, ciclofosfamida, CicJofosfamida Ifosfamida, Melfalan (L-sarcolisina), y Clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (por ejemplo, Hexametilmelamina y Tiotepa), sulfonalos de alqu ilo (por ejemplo, Busulfan), nitrosoureas (por ejemplo, Carmustina (BCNU), Lomustina (CCNU), Semustina (metil-CCNU), y Estreptozocina (estreptozotocina», triazenos (por ejemplo, Dacarbazina (DTIC;
dimetiltriazenoimidazolcarboxamida)), análogos de ácido fólico (por ejemplo, Metotrexato (ametopterina», análogos de pirimidina (por ejemplo, Fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), Floxuridina (fluoroclesoxiuridina; FudR), y Citarabina (citosinarabinósido» , análogos de purina e inhibidores relacionados (por ejemplo, Mercaptopurina (6. mercaptopurina; 6-MP), Tioguanina (6-tioguanina; TG), y Pentostatina (2'-desoxicoformicina», alcaloides de vinca (por ejemplo, Vinblastina (VLB, sulfato de vinblastina» y Vincristina (sulfato de vincristina», epipodofilotoxinas (por ejemplo, Etoposido y Teniposido), antibióticos (por ejemplo, Daclinomicina (actinomicina O), Daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), Doxorrubicina, Bleomicina, Plicamicina (mitramicina), y Mitomicina (mitomicina C), enzimas (por ejemplo, L-Asparraginasa), modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, Interferon-alfa e interferon-alfa-2b), compuestos de coordinación de platino (por ejemplo, Cisplatino (cis-DDP) y Carboplatino), antracenodiona (Mitoxantrona), ureas sustituidas (por ejemplo, Hidro:xiurea), derivados de metilhidrazina (por ejemplo, Procarbazina (N-metilhidrazina; MIH), adrenocorticoesteroides (por ejemplo, Prednisona), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, Medroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, y acetato de megestrol), estrógenos (por ejemplo, Dietilestilbestrol (DES), Oifosfalo de dietileslilbestrol, Estradiol, y Elinil estradiol), antiestr6genos (por ejemplo, Tamoxifeno), andrógenos (Propionato de testosterona, y Fluoximesterona), antiandrógenos (pOIquot; ejemplo, Flutamida), análogos de hormonas liberadora de gonadotropina (por ejemplo, Leuprolida), otras hormonas o análogos de hormonas (por ejemplo, metiltestosterona, estramustina, estramustina fosfato sódico, clorotrianisellO, y testolactona), y otros (por ejemplo, dicarbazina, ácido glutámico, y mitotano)
En una realización, las composiciones de la invenciórl se administran combinadas con uno o más de los siguientes fármacos: infliximab (también conocido como Remicade™ Centocor, Inc.), Trocade (Roche, RO-32-3555), Leflunomida (también conocido como Aravalld de Hoechst Marion Roussel), Kineret™ (un antagonista del receptor de IL-l también conocido como Anakinra de Amgen, Inc.)
En una realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisona) o combinaciones de dos o más de los componentes de CHOPo En una realización, las composiciones de la invención se adm inistran combinadas con anticuerpos antiCD20, anticuerpos monoclonales anti-CD20 humanos. En otra realización, las composiciones de la invención se administran combinadas con anticuerpos anti-CD20 y CHOP, o anticuerpos anti-CD20 y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, concretamente ciclofosfamida y/o prednisona. En una realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con Rituximab. En una realización adicional, las composiciones de la invención se administran con Rituximab y CHOP, o Rituximab y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, concretamente ciclofosfamida y/o prednisona. En una realización específica, las composiciones de la invenciórl se administran combinadas con tositumomab. En una realización adicional, las composiciones de la invención se administran con tositumomab y CHOP, o tositumomab y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, concretamente ciclofosfamida y/o prednisona. Los anticuerpos anti-CD20 se pueden asociar opcionalmente con radioisótopos, toxinas o fármacos citotóxicos
En otra realización específica, las composiciones de la invención se administran combinadas con Zeva lin™. En una realización adicional, las composiciones de la invención se administran con Zevalin™ y CHOP, o Zevalin™ y cualquier combinación de uno o más de los componentes de CHOP, concretamente ciclofosfamida y/o prednisona. Zeval in lid puede estar asociado con uno o más radioisótopos. Los isótopos particularmente preferidos son 90y e
l l l ln
En una realización adicional, las proteinas y/o polinudeótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con citoquinas. Las citoquinas que se pueden administrar con las proteínas yfo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, ILI2, 1L13, ILI5, antiCD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa. En otra rea lización, las proteínas y/o polinucleótidos de fusiórl de albúmina de la invención se pueden administrar con cualquier inter1euquina, incluyendo, pero no limitada a, IL-l alfa, IL-l beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-l0, IL-l1, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, e IL
21 .
En una rea lización , las proteínas yfo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con miembros de la familia de TNF. Las moléculas de TNF, relacionadas con TNF o de tipo TNF que se pueden administrar con las proteínas y/o polinucleólidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, formas solubles de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (L T-alfa, también conocida como TNF-beta), L T-beta (encontrado en el heterotrimero complejo LT-alfa2-beta), OPGL, FasL. CD27L, CD30L, CD40L, 4· 1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (Publicación Internacional Núm. WO 96/14328), AIM-l (Publicación Internacional Núm. WO 97f33899), endoquina-alfa (Publicación Internacional Núm. WO 98fOI880), OPG, y neutroquina-alfa (Publicación Internacional Núm. WO 98/18921 , OX40, y factor de crecimiento nervioso (NGF), y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 Y 4-18B, TR2 (Publicación Internacional Núm. WO 96/34095), DR3 (Publicación Internacional Núm WO 91 /33904), DR4 (Publicación Internacional Núm. WO 98/32856), TR5 (Publicación Intemacional Núm. WO 98f30693), TRANK, TR9 (Publicación Internacional Núm. WO 98/56892), TRIO (Publicación Internacional Núm. WO 98f54202), 312C2 (Publicación Internacional Núm. WO 98106842), y TRI2, formas solubles de CDI54, C070, y CD153
En una realización adicional, las proteínas y/o polinudeótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con proteínas angiogénicas. Las proteínas angiogénicas que se pueden administrar con las proteínas
ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, Factor de Crecimiento Derivado de Glioma (GDGF), como se describe en la Patente Europea Número EP-399816; Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas-A (PDGF.A), como se describe en la Patente Europea Número EP-682110; Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas-8 (PDGF-B), como se describe en la Patente Europea Número EP-282317; Factor de Crecimiento Placenta rio (PIGF), como se describe en la Publicación Intemacional Número WO 92/06194; Factor de Crecimiento Placentario-2 (PIGF+2), como describen Hauser et al., Growth Factors, 4:259-268 (1993); Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), como se describe en la Publicación Internacional Número WO 90113649; Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-A (VEGF-A), como se describe en la Patente Europea Número EP-506477; Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-2 (VEGF-2), como se describe en la Publicación Internacional Número WO 96/39515; Factor de Crecimiento Endotelial vascular 8 (VEGF-3); Factor de Crecimiento Endotelial Vascular 8-186 (VEGF-8186), como se describe en la Publicación Internacional Número WO 96126736 ; Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-D (VEGF-D), como se describe en la Publicación Internacional Número WO 98102543 ; Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-D (VEGF-D), como se describe en la Publicación Intemacional Número WO 98/07832 ; y Factor de Crecimiento Endotelial vascular-E (VEGF·E), como se describe en la Patente Alemana Número DE 19639601 Las referencias anteriormente mencionadas se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad.
En una realización adicional, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con Factores de Crecimiento de Fibroblastos. Los Factores de Crecimiento de Fibroblastos que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleólidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, FGF41 , FGF-2, FGF~3, FGF-4. FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF·9, FGF-10, FGF-11, FGF.12, FGF-13, FGF-14, Y FGF-15
En una realización adicional, las proteinas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con factores de crecimiento hematopoyéticos. Los factores de crecimiento hematopoyéticos que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, factor estimulador de las colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) (sargramostim, LEUKINETM, PROKINETM), factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF) (filgrastim, NEUPOGENTId), factor estimulador de las colonias de macrófagos (M-CSF, CSF.1) eritropoyetina (epoetin alfa, EPOGEN TM, PROCRlpld), factor de células madre (SCF, ligando e-kit, factor de Steel), factor estimulador de las colonias de megacariocitos, PIXY321 (una proteína de fusión de GMCSFIIL-3), interleuquinas, especialmente uno o más cualesquiera de IL-1 a IL-12, interíerón-gamma, o trombopoyetina.
En cierlas realizaciones, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la presente invención se administran combinados con bloqueadores adrenérgicos, tales como, por ejemplo, acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, labetalol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, y timolol
En otra realización, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con un fánnaco anti-arrítmico (p. ej., adenosina, amidoarona, bretilio, digitalis, digoxina, digitoxina, diliazem, disopiramida, esmolol, flecainida, lidocaina, mexiletina, moricizina, fenitoína, procainamida, N-acetil procainamida, propafenona, propranolol, quinidina, sotalol, tocainida, y verapamilo)
En otra realización, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con agentes diuréticos, tales como agentes inhibidores de anhidrasa carbónica (p. ej., acetazolamida, dicloríenamida, y metazolamida), diuréticos (p. ej., glicerina, isosorbida, mannitol, y urea), diuréticos que inhiben el simporte de Na' -K'-2Cr (p. ej., furosemida, bumetanida, azosemida, piretanida, tripamida, ácido etacrinico, muzolimina, y torsemida), tiazida y diuréticos de tipo tiazida (p. ej., bendroflumetiazida, benzotiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, poltiazida, tricormetiazida, clorlalidona, indapamida, metolazona, y quinetazona), diuréticos economizadores de potasio (p. ej., amilorida y triamtereno), y antagonistas de receptores de mineralocorticoides (p. ej ., espironolactona, canrenona, y canrenoato de potasio).
En una rea lización , las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con tratamientos para trastornos de desequilibrios endocrinos ylu hormonales. Los tratamientos para los trastornos endocrinos y/u honnonales incluyen, pero no se limitan a, mi, isótopos radiactivos de yodo tales como 1311 e 1231; honnona de crecimiento recombinante, tal como HUMATROPE TId (somatotropina recombinante); análogos de hormona de crecimiento tales como PROTROPINTId (somatrem); agonistas de dopamina tales como PARLODEL TId (bromocriptina); análogos de somatostatina tales como SANDOSTATINTM (octreotide); preparaciones de gonadotropina tales como PREGNYL TM, A.P.L. TM and PROFASpTM (gonadotropina coriónica (CG», PERGONAL TM (menotropinas), y METRODINTM (urofolitropina (uFSH)); preparaciones de honnona liberadora de gonadotropina humana sintéticas tales como FACTREL TM y LUTREPULSETM (hidrocloruro de gonadorelina); agonistas de gonadotropina sintéticos tales como LUPRON TM (acetato de leuprolida), SUPPRELlN TM (acetato de histrelina), SYNARELTId (acetato de nafarelina), y ZOLADEXTM (acetato de goserelina); preparaciones sintéticas de hormona liberadora de tirotropina tales como RELEFACT TRH TM y THYPINONE TM (protirelina); TSH humana recombinante tal como THYROGENTId; preparaciones sintéticas de las sales de sodio de los isómeros naturales de hormonas tiroideas tales como L_T4 T1d , SYNTHROIDTM y LEVOTHROIDTId (Ievotiroxina sódica), L_T3TM, CYTOMELTM y TRIOSTATTId (Iiotironina sódica), y THYROLARTM (Iiotrix); compuestos antitiroideos tales como 6-n-propiltiouracilo (propiltiouracilo), 1-metil-2-mercaptoimidazol y TAPAZOLE TM (metimazol), NEO-MERCAZOLETM (carbimazol);
antagonistas de receptores beta-adrenerglcos tales como propranolol y esmolol; bloqueadores del canal de Ca2 ; dexametasooa y agentes de contraste radiológico yodados tales como TELEPAQUE™ (ácido iopanoico) y ORAGRAFINTId (ipodato sódico)
Los tratamientos adicionales para los trastornos de desequilibrio endocrino yfu hormonal incluyen, pero no se limitan a, estrógenos o eslrógenos conjugados tales como ESTRACETId (estradiol), ESTINYL TId (etinil estradiol), PREMARINTM, ESTRATABTM, ORTHO-ESTTM, OGENTM y estropipato (estrona), ESTROVISTM (quinestrol), ESTRAOERMTM (eslradiol), OELESTROGENTTM y VALERGEN TM (valerato de estradiol ), OEPO-ESTRADIOL CYPIONATETM y ESTROJECT LA TM (cipionato de estradiol); antieslrógenos tales como NOLVAOEXTM (tamoxifeno), SEROPHENETId y CLOMIOTM (clomifeno); progestinas tales como OURALUTINTId (caproato de hidroxiprogesterona), MPNId y OEPO-PROVERATM (acetato de medroxiprogesterona), PROVERATM y CYCRINTM (MPA), MEGACETM (acetato de megestrol), NORLUTIWId (noretindrona), y NORLUTATETM y AYGESTIN TM (acetato de noretindrona); implantes de progesterona tales como NORPLANT SYSTEMTM (implantes subdérmicos de norgestrel); antiprogestinas tales como RU 486™ (mifepristona); cootraceptivos hormonales tales como ENOVIDTId (IlOretinodrel plus mestranol), PROGESTASERTTM (dispositivo inlrauterino que libera progesterona), LOESTRIWId, BREVICONTM, MODICONTM, GENORATM, NELONATM, NORINYLTM, OVACON-35™ and OVACON-50™ (etinil eslradiolfnoretindrona), LEVLENTM, NORDETIETM, TRI-LEVLENTM Y TRIPHASIL-2pld (etinil estradiolflevonorgestrel) LOfOVRAL TM y OVRAL TM (etinil estradiolfnorgestrel), OEMULENTM (etinil estradiolfdiacetato de etinOOiol), NORINYL TM, ORTHO-NOVUMTM, NORETHINTM, GENORA TM, Y NELOVATId (noretindrooafmestranol), DESOGENTM y ORTHO-CEPTTM (etinil estradiolfdesogestrel), ORTHO-CYCLENTM y ORTHO-TRICYCLENTM (etinil eslradiolfnorgestimato), MICRONORTM y NOR-QD TM (noretindrona), y OVRETIETM (norgestrel)
Otros tratamientos para los trastornos de desequilibrio endocrino yfu hormonal incluyen, pero no se limitan a, ésteres de testosterona tales como acetato de metenolona y undecanoato de testosterona; andrógenos parenterales y orales tales como TESTOJECT-50™ (testosterona), TESTEXN (propionato de testosterooa), DELATESTRYLTId (enantato de testosterona), OEPO-TESTOSTERONETM (cipionato de testosterona), DANOCRINETM (danazol), HALOTESTINTM (f1uoximesterona), ORETON METHYLTId, TESTREDTId Y VIRILONTM (metiltestosterona), y OXANORINTM (oxandrolona); sistemas transdérmicos de testosterona tales como TESTOOERMTId; antagonista de receptor de andrógeno e inhibidores de 5-alfa-reductasa tales como ANDROCURTM (acetato de ciproterona),
EULEXIN™ (nutamida), y PROSCAR™ (finasterida); preparaciones de hormona adrenocorticolrópica tales como CORTROSYWId (cosintropina); esteroides adrenocorticales y sus análogos sintéticos tales como ACLOVATE TM (dipropionato de alclometasona), CYCLOCORTTM (amcinonida), BECLOVENTTM y VANCERILTM (dipropionato de beclometasona), CELESTONETId (betametasona), BENISONETM y UTICORT TM (benzoato de betametasona), DIPROSONETM (dipropionato de betametasona), CELESTONE PHOSPHATETM (fosfato de betametasona sódica), CELESTONE SOLUSPAN TM (fosfato y acetato de betametasona sódica), BETA-VALTM y VALlSONE TM (valerato de betametasona), TEMOVATETM (propionato de clobetasol), CLOOERMTM (pivalato de clocortolona), CORTEFTM e HYDROCORTONETM (cortisol (hidrocortisona», HYOROCORTONE ACETATETM (acetato de cortisol (hidrocortisooa», LOCOIOTId (butirato de cortisol (hidrocortisooa)), HYOROCORTONE PHOSPHATETId (fosfato sódico de cortisol (hidrocortisooa)), A-HYOROCORTTM y SOLU CORTEXTM (succinato sódico de cortisol (hidrocortisooa)), WESTCORTTM (valerato de cortisol (hidrocortisona)), CORTISONE ACETATETM (acetato de cortisona), DESOWENTM y TRIOESILOWId (desonida), TOPICORpld (desoximetasona), OECAOROWId (dexametasona), DECADRON LA Tid (acetato de dexametasona), DECADRON PHOSPHATETM y HEXAOROL PHOSPHATETM (fosfato sódico de dexametasona), FLORONETM y MAXIFLORTM (diacetato de diflorasona), FLORINEF ACETATETM (acetato de f1udrocortisona), AEROBIOTId y NASALlOETM (flunisolida), FLUONIDTM y SYNALAWId (nuocinolona acetónido), LlDEXTM (f1uocinooida), FLUOR-OPTId y FMLTM (f1uorometolona), CORORANTM (nurandrenolida), HALOGTM (halcinonida), HMS LIZUIFILMTM (medrisona), MEDROLTM (metilprednisolona), DEPO-MEDROL TM y MEDROL ACETATE™ (acetato de metilprednisona), A-METHAPRED™ y SOLUMEDROLTM (succinato sódico de metilprednisolona), ELOCONTM (furoato de mometasona), HALDRONETId (acetato de parametasona), DELTA-CORTEFTM (prednisolona), ECONOPREDTM (acetato de prednisolona), HYDEL TRASOL ™ (fosfato sódico de prednisolona), HYDEL TRA-T.B.A TM (tebutato de prednisolona), DELTASONE™ (prednisona), ARISTOCORpld y KENACORTTM (triamcinolona), KENALOGTM (acetónido de triamcinolona), ARISTOCORpM y KENACORT OlACETATE1M (diacetato de triamcinolona), y ARISTOSPAN TM (hexacetónido de lriamcinolooa); inhibidores de la biosíntesis y la acción de esteroides adrenocorticales tales como CYTADRENTM (aminoglutetimida), NIZORALTM (ketoconazol), MODRASTANETM (trilostano), y METOPIRONETM (metirapona); insulina bovina, porcina o humana o mezclas de las mismas; análogos de insulina; insulina humana recombinante tal como HUMULlN TM y NOVOLlNTM; agentes hipoglicémicos orales tales como ORAMIDE™ y ORINASETM (tolbutamida), OIABINESETM (clorpropamida), TOLAMIDETM y TOLlNASETM (tolazamida), DYMELORTM (acetohexamida), glibenciamida, MICRONASETId, DIBETA TM Y GL YNASE TId (gliburida), GLUCOTROLTM (glipizida), y DIAMICRONTM (gliclazida), GLUCOPHAGETM (metformina), ciglitazona, pioglitazona, e inhibidores de alfaglucosidasa; glucagón bovino o porcino; somatostatinas tales como SANDOSTATINTM (octreotide); y diazóxidos tales como PROGL YCEM TM (diazóxido)
En una rea lización, las proteínas yfo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con tratamientos para trastornos de la motilidad uterina. Los tratamientos para trastornos de la motilidad uterina incluyen, pero no se limitan a, fármacos de estrógenos tales como estrágenos conjugados (p. ej.,
PREMARI~ YESTRATAB~, estradioles (p. ej., CLlMARAe y ALORA*), estropipato, y clorotrianiseno; fármacos de
progestlna (p. ej., AMEN (medroxlprogesterona), MICRONOR® (acetato de norelldrona), PROMETHIUMe progesterona, y acetato de megestrol); y terapias combinadas de estrógeno/progesterona tales como, por ejemplo, estrógenoslmedroxiprogesterona conjugados (p. ej., PREMPROTId y PREMPHASE*) y acetato de noretindronafetinil estradiol (p. ej., FEMHRTTM).
En una realización adicional, las proteinas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con fármacos eficaces en el tratamiento de la deficiencia de hierro y las anemias hipocrómicas, incluyendo pero no limitados a, sulfato ferroso (sulfato de hierro, FEOSOL TM), fumarato ferroso (p. ej., FEOSTApld), gluconato ferroso (p. ej., FERGONTM), complejo de polisacárido~hierro (p. ej., NIFEREXTM), inyección de hierro dexlrano (p. ej., INFEDTM), sulfato cúprico, piroxidina, riboflavina, Vitamina 812, inyección de ciancobalamina (p. ej., REOISOLTId, RU8RAMIN PCTId), hidroxocobalamina, ácido fólico (p. ej., FOLVITETId), leucovorina (ácido folínico, 5CHOH4PteGlu, factor citrovorum) o WELLCOVORIN (Sal de calcio de leucovorina), transferrina o ferritina
En ciertas rea lizaciones, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con agentes utilizados para tratar trastomos psiquiátricos. Los fármacos psiquiátricos que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, agentes antipsicóticos (p ej., clorpromazina, clorprotixeno, clozapina, flufenazina, haloperidol, loxapina, mesoridazina, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, quetiapina, risperidona, tioridazina, tiotixeno, triftuoperazina, y triflupromazina), agentes antimaníacos (p. ej., carbamazepina, divalproex sódico, carbonato de litio, y citrato de litio), antidepresivos (p. ej., amitriptilina, amoxapina, bupropion, citalopram, clomipramina, desipramina, doxepin, ftuvoxamina, fluoxetina, imipramina, isocarboxazida, maprotilina, mirtazapina, nefazodona, nortriptilina, paroxetina, fenelzina, protriptilina, sertralina, tranilcipromina, trazodona, trimipramina, y venlafaxina), agentes antiansiedad (p. ej., alprazolam, buspirona, clordiazepoxido, clorazepato, diazepam, halazepam, lorazepam, oxazepam, y prazepam), y estimulantes (p. ej., d-anfetamina, metilfenidato, y pemolina)
En otras realizaciones , las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con agentes utilizados para tratar trastomos neurológicos. Los agentes neurológicos que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, agentes antiepilépticos (p. ej., carbamazepina, clonazepam, etosuximida, fenobarbital, fenitoína, primidona, ácido valproico, divalproex sódico, felbamato, gabapentina, lamotrigina, levetiracetam, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato, zonisamida, diazepam, lorazepam, y clonazepam), agentes anti-parkinsonianos (p. ej., levodopalcarbidopa, selegilina, amantidina, bromocriptina, pergolida, ropinirol, pramipexol, benzotropina; biperideno; etopropazina; prociclidina; trihexifenidilo, tolcapona), y agentes terapéuticos para ElA (p. ej., riluzol)
En otra realización, las proteínas y/o polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con agentes vasodilatadores ylo agentes bloqueadores del canal del calcio Los agentes vasodilatadores que se pueden administrar con las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la Enzima Conversora de Angiotensina (ACE) (p. ej., papaverina, isoxsuprina, benazepril, captopril, cilazapril, enalapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril, quinapril, ramipril, espirapril, Irandolapril, y nilidrina), y nilralos (p. ej ., dinilralo de isosorbida, mononitrato de isosorbida, y nitroglicerina). Los ejemplos de los agentes bloqueadores del canal de calcio que se pueden administrar combinados con las proteínas ylo polinucle6tidos de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a amlodipina, bepridil, diltiazem, felodipina, ftunarizina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, y verapamilo
En ciertas realizaciones, las proteínas ylo polinucleólidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con tratamientos para trastomos gastrointestinales. Los tratamientos para los trastornos gastrointestinales que se pueden administrar con la proteína ylo el polinucleótido de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, antagonistas del receptor de histamina H2 (p. ej., TAGAMETTM (cimetidina), ZANTACTM (ranitidina), PEPCIDTM (famotidina), y AXIOTM (nizatidina)); inhibidores de ATPasa H', Kgt; (p. ej., PREVACIDTM (Iansoprazol) y PRILOSEC TM (omeprazol»; compuestos de Bismuto (p. ej., PEPTO-BISMOL TM (subsalicilato de bismuto) y DE-NOL™ (subcitrato de bismuto)); diversos antiácidos; sucralfato; análogos de prostaglandinas (p. ej., CYTOTECTM (misoprostol»; antagonistas colinérgicos muscarínicos; laxantes (p. ej., laxantes tensioactivos, laxantes estimulantes, laxantes salinos y osmóticos); agentes anti-diarreicos (p. ej., LOMOTIL TM (difenoxilato), MOTOFEWId (difenoxina), y IMODIUM..... (hidrocloruro de loperamida)), análogos sintéticos de somatostatina tales como SANOOSTAT1WId (octreotide), agentes antieméticos (p. ej., ZOFRAWId (ondansetron), KYTRILTM (hidrocloruro de granisetron), tropisetron, dolasetron, metoclopramida, clorpromazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, tietilperazina, triftupromazina, domperidona, haloperidol, droperidol, trimetobenzamida, dexametasooa, metilprednisolona, dronabinol, y nabilona); antagonistas 02 (p ej., metoclopramida, trimetobenzamida y clorpromazina); sales biliares; ácido quenodesoxicólico; ácido ursodesoxicólico; y preparaciones de enzimas pancreáticas tales como pancreatina y pancrelipasa
En realizaciones adicionales, las proteínas ylo polinucleótidos de fusión de albúmina de la invención se administran combinados con otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales como, por ejemplo, terapia de radiación
La invención también propOfciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión de
albúmina de la invención. Opcionalmente asociada con tales recipientes puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de fármaros o productos biológicos, cuya notificación refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración a seres humanos.
Terapia Génica
Los constructos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar como parte de un protocolo de terapia génica para liberar dosis terapéuticamente eficaces de la proteína de fusión de albúmina. Un enfoque preferido para la introducción in vivo de ácido nucleico en una célula es mediante el uso de un vector viral que contiene ácido nucleico, que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención. La infección de células con un vector viral liene la ventaja de que una gran proporción de las células elegidas como diana puede recibir el ácido nucleico. Adicionalmente, las moléculas codificadas dentro del vector viral, p. ej., por un AONc contenido en el vector viral, se expresan eficazmente en células que han absorbido ácido nucleico viral
Los vectores de retrovirus y los vectores de virus adeno-asociados se pueden utilizar como un sistema de liberación génica recombinante para la transferencia de moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican proteínas de fusión de albúmina in vivo. Estos vectores proporcionan un suministro eficaz de ácidos nucleicos a las células, y los ácidos nucleicos transferidos se integran establemente en el ADN cromosómico del anfitrión. El desarrollo de líneas celulares especializadas (denominadas quot;células de empaquetamientoquot;) que producen solamente retrovirus de replicación defectuosa ha incrementado la utilidad de los retrovirus para la terapia génica, y los retrovirus defectuosos se caracterizan para su uso en la transferencia de genes para la terapia génica (para una revisión véase Miller, AD. (1990) Blood 76:27 1). Un retrovirus de replicación defectuosa se puede empaquetar en viriones que se pueden utilizar para infectar una célula diana por medio del uso de un virus coadyuvante mediante técnicas convencionales. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14 Y otros manuales de laboratorio convencionales
Otro sistema de suministro de genes virales útil en la presente invención utiliza vectores derivados de adenovirus. El genoma de adeoovirus se puede manipular de manera que éste codifique y exprese un producto gérlico de interés pero esté inactivado en términos de su capacidad para replicar en un ciclo de vida viral lítico normal. Véanse, por ejemplo, Berk.ner et al., BioTechniques 6:616 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Y Rosenfeld et al., Cell 68:143·155 (1992). Los vectores adeoovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (p . ej. , Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son conocidos por los expertos la técnica. Los adenovirus recombinantes pueden resultar ventajosos en algunas circunstancias ya que no son capaces de infectar células que no están en división y se pueden uti lizar para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo células epiteliales (Rosenfeld et al., (1992) citado más arriba). Además, la partícula de virus es relativamente estable y susceptible de purificación y concentración, y como antes, se puede modificar con el fin de influir en el espectro de infectividad. Adicionalmente, el AON adenoviral introducido (y el ADN foráneo contenido en él) no es integrado en el genoma de una célula anfitrionas sino que sigue siendo episómico, evitando de ese modo potenciales problemas que se pueden producir como resultado de la mutagénesis insercional en situaciones en las que el ADN introducido se integra en el genoma del anfitrión (p. ej., AON retroviral). Por otra parte, la capacidad portadora del geooma adenoviral para el AON foráneo es grande (hasta 8 kilobases) con respecto a otros vectores de suministro de genes (Berkner el al., citado más arriba; Haj-Ahmand et al., J. Virol. 57:267 (1986»
En otra realización, los sistemas de suministro de genes no virales de la presente invención se basan en rutas endocíticas para la absorción de la molécula de nucleótido sujeto por la célula elegida como diana. Los sistemas de suministro de genes ilustrativos de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, productos conjugados de poli-lisina, y envolturas virales artificiales. En una rea lización representativa, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención puede ser atrapada en liposomas que portan cargas positivas sobre su superficie (p. ej., lipofectinas) y (opcionalmente) que están etiquetadas con anticuerpos contra antígenos de la superficie celular del tejido diana (Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551, Publicación PCT W091 f06309; Solicitud de Patente Japonesa 1047381; Y Publicación de patente Europea EP-A-43075)
Los sistemas de suministro de genes para un gen que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden introducir en un paciente mediante cualquiera de numerosos métodos. Por ejemplo, se puede introducir una preparación farmacéutica del sistema de suministro de genes sistémicamente, p. ej., mediante inyección intravenosa, y la transducción específica de la proteína en las células diana se produce predominantemente a partir de la especificidad de la transfección proporcionada por el vehículo de suministro de genes, la expresión del tipo de célula o tipo de tejido debida a las secuencias reguladoras de la transcripción que controlan la expresión del receptor del gen, o una combinación de las mismas. En otras rea lizaciones, el suministro inicial del gen recombinante está más limitado con una introducción en el animal que está bastante localizada. Por ejemplo, el vehículo de suministro génico se puede introducir por medio de un catéter (véase la Patente de los Estados Unidos 5.328.470) o por medio de inyección Estereotáctica (p. ej., Chen et al. (1994) PNAS 91 ' 3054-3057). La preparación farmacéutica del constructo de terapia génica puede consistir esencialmente en el sistema de suministro génico en un diluyente farmacéuticamente aceptable, o puede romprender una matriz de liberación lenta en la que está incluido el vehículo de suministro génico. Cuando la proteína de fusión de albúmina puede ser producida intacta a partir de células recombinantes, p. ej., vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o más células que producen la proteína de fusión de albúm ina.
Métodos adicionales de terapia génica
También están incluidos en la invención los métodos de terapia génica para el tratamiento o la prevención de trastornos, enfermedades y afecdones. Los métodos de terapia génica hacen referencia a la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudo (AON, ARN, y ADN o ARN antisentido) en un animal para lograr la expresión de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Este método requiere un polinucleótido que codifique una proteína de fusión de albúmina de la presente invención conectado operativamente a un promotor y cualquier otro elemento genético necesario para la expresión de la proteína de fusión por el tejido diana. Tales mecanismos de terapia y suministro génicos se conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, el documento W090/11092, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
De este modo, por ejemplo, se pueden modificar las células de un paciente con un polinucleólido (ADN o ARN) que comprende un promotor conectado operablemente a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención ex vivo, proporcionándose a continuación las células modificadas a un paciente que va a ser tratado con la proteína de fusión de la presente invención. Tales métodos de PCR son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véanse Belldegrun, A., et al., J. Natl. Cancer Insl. 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al., Inl. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura, H. et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L, et al., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al., Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); y Zhang, J.-F. et al., Cancer Gene Therapy 3: 31-38 (1996)) que se incorporan a la presente memoria como referencia. En una realización, las células que se modifican son células arteriales. Las células arteriales se pueden reintroducir en el paciente a través de la inyección directa en la arteria, los tejidos que circundan la arteria, o a través de inyección mediante catéter.
Como se comenta con más detalle a continuación, los constructos de polinucleótido se pueden suministrar mediante cualquier método que suministre materiales inyectables a las células de un animal, tal como, inyección en el espacio
o los tejidos intersticiales (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, y similares). Los constructos de polinucleótido se pueden suministrar en un portador líquido o acuoso farmacéuticamente aceptable.
En una realización, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se suministran como polinucleótidos desnudos. El término polinucleótido, AON o ARN quot;desnudoquot;, hace referencia a secuencias que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúa ayudando, promoviendo, o facilitando la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones en liposomas, lipofectina o agentes de precipitación y similares. No obstante, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención también se pueden suministrar en formulaciones con liposomas y formulaciones con lipafectina y similares que se pueden preparar mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica Tales métodos se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.593.972, 5.589.466, Y 5.580.859, que se incorporan a la presente memoria como referencia
Los constructos vectores de polinucleótidos utilizados en el método de terapia génica son preferiblemente conslructos que no se integra rán en el genoma del anfitrión ni contendrán secuencias que permitan la replicación Los vectores apropiados incluyen pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXT1 Y pSG disponibles en Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. y pEF1N5, pcDNA3.1, y pRcJCMV2 disponible en Invitrogen. otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el e:xperto en técnica.
Se puede utilizar cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica para dirigir la expresión de la secuencia de polinucle6tido. Los promotores adecuados incluyen promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (RSV); los promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de la metalotioneína; los promotores de choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAl; los promotores de la globina humana; los promotores de la timidina quinasa viral, tales como el promotor de la timidina quinasa de Herpes Simplex; las L TR retrovirales; el promotor de la b-actina; y los promotores de la hormona del crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo para el gen correspondiente a la porción de la proteína Terapéutica de las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
A diferencia de otras técnicas de terapia génica, una ventaja principal de la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudas en células diana es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en las células Estudios han demostrado que se pueden introducir secuencias de ADN no replicantes en las células para proporcionar la producción del polipéptido deseado durante períodos de hasta seis meses.
El constructo de polinucleótido se puede suministar al espacio o los tejidos intersticiales dentro de un animal, incluyendo músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz de mucopolisacáridos fluida, intercelular,
entre las fibras reticulares de los tejidos de los órganos, las fibras elásticas de las paredes de los vasos o cámaras, las fibras de colágeno de tejidos fibrosos, o esa misma matriz dentro del tejido conectivo que envuelve las células musculares o en las lagunas del hueso. Es, de un modo similar, el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Se prefiere el suministro al espacio intersticial del tejido muscular por las razones comentadas más abajo. Se pueden suministrar convenientemente mediante inyección en los tejidos que comprenden estas células. Se suministran y se expresan preferiblemente en células que no están en división persistentes que están diferenciadas, aunque el suministro y la expresión se pueden lograr en células no diferenciadas o diferenciadas menos completamente, tales como, por ejemplo, células madre de la sangre o fibroblastos de la piel. Las células musculares in vivo son particularmente competentes en su capacidad para absorber y expresar polinucleótidos.
Para la inyección de polinucleótido desnudo, una cantidad de dosificación eficaz de ADN o ARN oscilará en el intervalo de aproximadamente 0,05 glkg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Preferiblemente la dosificación será de aproximadamente 0,005 mgfkg a aproximadamente 20 mg/kg y más preferiblemente de aproximadamente 0,05 mgfkg a aproximadamente 5 mglkg. Por supuesto, como apreciará el experto normal, esta dosificación variará de acuerdo con el sitio tisular de la inyección. La dosificación apropiada y eficaz de la secuencia de ácido nucleico puede ser determinada fácilmente por los expertos normales en la técnica y puede depender de la afecciórJ que se esté tratando y de la ruta de administración.
La ruta de administración preferida es mediante la ruta parenteral de inyección en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también se pueden utilizar otras rutas parenterales, tales como, la inhalación de una formulación en aerosol concretamente para el suministro a los pulmones o a los tejidos bronquiales, la garganta o las membranas mucosas de la nariz. Adicionalmente, los constructos de ADN desnudo se pueden suministrar a las arterias durante la angioplastia por medio de un catéter utilizado en el procedimiento
Los polinucleótidos desnudos se suministran mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, inyección con aguja directa en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración tépica, infusión con catéter, y las denominadas quot;pistolas génicasquot; Estos métodos de suministro son bien conocidos en la técnica
Los construclos también pueden ser suministrados con vehículos de suministro tales como secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina, agentes de precipitación, etc. Tales métodos de suministro son conocidos en la técnica
En ciertas realizaciones, los constructos de polinucleólido forman complejos en una preparación de liposoma. Las preparaciones liposomales para su uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. No obstantes, los liposomas catiónicos son particularmente preferidos debido a que se puede formar un complejo de carga densa entre elliposoma catiónico y el ácido nucleico polianiónico. Se ha demostrado que los liposomas cati6nicos median el suministro intracelular del ADN plasmidico (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416, que se incorpora a la presente memoria como referencia); ARNm (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6077-6081, que se incorpora a la presente memoria como referencia); y factores de transcripción purificados (Debs et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:10189-10192, que se incorpora a la presente memoria como referencia), en forma funcional
Los liposomas catiónicos son fácilmente asequibles. Por ejemplo, los liposomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,Ntrietilamonio (DOTMA) son particularmente útiles y se encuentran disponibles bajo la marca de fábrica Lipofectin, de GIBCO BRL, Granel Island, N.Y. (Véase, también, Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Otros liposomas disponibles en el mercado incluyen transfeclace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Bochringer).
Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente asequibles utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Publicación PCT Núm. WO 90/11092 (que se incorpora a la presente memoria como referencia) para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1 ,2-bis(0Ieoiloxi)-3(trimetilamonio)propano). La preparación de liposomas de DOTMA se explica en la bibliografía, véase, p. ej., P. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, que se incorpora a la presente memoria como referencia Se pueden uti lizar métodos similares para preparar liposomas a partir de otros materiales lipidicos catiónicos.
De un modo similar, los liposomas aniónicos y neutros son fácilmente asequibles, por ejemplo de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.), o se pueden preparar fácilmente utilizando materiales asequibles. Tales materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfalidiletanolamina (DOPE), entre airas. Estos maleriales también se pueden mezclar con los materiales de partida DOTMA y DOTAP en las proporciones apropiadas. Los métodos para elaborar liposomas utilizando estos materiales son bien conocidos en la técnica
Por ejemplo, se pueden utilizar dioleoilfosfalidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) comercialmente en diversas combinaciones para elaborar liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. De este modo, por ejemplo, se pueden preparar vesículas de DOPGfDOPC secando 50 mg de cada uno de DOPG y DOPC bajo una corriente de gas nitrógeno en un vial de
sonicacián. La muestra se coloca bajo una bomba de vacío durante la noche y se hidrata al dia siguiente con agua desionizada. La muestra se somete a sonicacián con posterioridad durante 2 horas en un vial tapado, utilizando un sonicador Heat Systems modelo 350 equipado con una sonda de copa invertida (tipo baño) al máximo ajuste mientras el baño se hace circular a 15 grados celsius. Altemativamente, se pueden preparar vesículas cargadas negativamente sin sonicación para producir vesículas mullilamelares mediante exlrusión a través de membranas con nucleoporos para producir vesiculas unilamelares de tamaño discreto. otros métodos son conocidos y se encuentran disponibles para los expertos en la técnica
Los liposomas pueden comprender vesiculas multilamelares (MLV), vesiculas unilamelares pequeñas (SUV), o vesiculas unilamelares grandes (LUV), prefiriéndose las SUYo Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Straubinger et al., Methods of Immunology (1983), 101:512-527, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Por ejemplo, las MLV que contienen ácido nudeico se pueden preparar depositando una película fina de fosfolípido sobre las paredes de un tubo de vidrio e hidratando con posterioridad con una solución del material que se va a encapsular. Las SUV se preparan mediante sonicación ampliada de las MLV para producir una población homogénea de liposomas unilamelares. El material que va a ser atrapado se añade a una suspensión de MLV preformadas y a continuación se somete a sonicación. Cuando se utilizan liposomas que contienen lípidos catiónicos, la película de lípido seca se vuelve a suspender en una solución apropiada tal como agua estéril o solución de tampón isotónico tal como Tris/NaCll0 mM, se somete a sonicación, ya continuación los liposomas preformados se mezclan directamente con el ADN. El liposoma y el ADN forman un complejo muy estable debido a la unián de los liposomas cargados positivamente al ADN catiónico. Las SUV encuentran uso con pequeños fragmentos de ácido nucleico. Las LUV se preparan mediante numerosos métodos, bien conocidos en la técnica. Los métodos comúnmente utilizados incluyen quelación con Ca2+-EDTA (Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:483; Wilson et al., Cell17:77 (1979»; inyección de éter (Deamer, D. y Bangham, A., Btochim. Biophys. Acta 443:629 (1976); Ostro et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 76:836 (1977); Fraley et al., Proc. NatL Acad. Sa. USA 76:3348 (1979»; diálisis con detergente (Enoch, H. y Strittmatter, P., Proc. NatL Acad. Sci. USA 76:145 (1979»; y evaporación en fase inversa (REV) (Fraley et al., J. BioL Chem. 255:10431 (1980); Szoka, F. y Papahadjopoulos, D., Proc. NalJ. Acad. Sci. USA
75:145 (1978); Schaefer-Ridder et al., Science 215:166 (1982)), que se incorporan a la presente memoria como referencia
Generalmente, la razón de ADN con respecto a liposomas será de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1 :10. Preferiblemente, la razón será de aproximadamente 5:1 to aproximadamente 1 :5. Más preferiblemente, la razón será de aproximadamente 3: 1 a aproximadamente 1:3. Aún más preferiblemente, la razón será de aproximadamente 1:1
La Patente de los Estados Unidos Núm. 5.676.954 (que se incorpora a la presente memoria como referencia) se refiere la inyección de material genético, formando complejo con portadores de liposomas catiónicos, en ratones. Las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, Y la Publicación Intemacional Núm. WO 94/9469 (que se incorporan a la presente memoria como referencia) proporcionan lípidos catiónicos para su uso en la transfección de ADN a células y mamíferos. Las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, Y la Publicación Intemacional Núm. WO 94/9469 proporcionan métodos para el suministro de complejos de ADN-lípido catiónico a mamíferos
En ciertas realizaciones, las células se modifican, ex vivo o in vivo, utilizando una partícula retroviral que contiene ARN que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Los retrovirus a partir de los cuales se pueden obtener los vectores plasmídicos retrovirales incluyen, pero no se limitan a, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de necrosis del bazo, Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del gibán, virus de la inmunodeficiencia humana, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus de tumor mamario
El vector plasmídico relroviral se emplea para transducir lineas celulares de empaquetamiento para formar lineas celulares productoras. Los ejemplos de las líneas celulares de empaquetamiento que se pueden transfectar incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAmI2, y DAN descritas por Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaquetamiento mediante cualquier método conocido en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la electroporaciórJ, el uso de liposomas, y la precipitación con CaP04. En una altemativa, el vector plasmidico retroviral se puede encapsular en un liposoma, o acoplar a un lípido, ya cootinuación se puede administrar a un anfitrión.
La línea celular productora genera partículas de vector retroviral infeccioso que incluyen polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Tales partículas de vector retroviral se pueden emplear a continuación para transducir células eucariotas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán una proteína de fusión de la presente invención.
En otras ciertas realizaciones, las células se modifican, ex vivo o in vivo, con polinucleótido contenido en un vector de adenovirus. El adenovirus se puede manipular de manera que éste codifique y exprese una proteína de fusión de la presente invención, y al mismo tiempo esté inactivado en términos de su capacidad para replicar en un ciclo de vida viral lítico normal. La expresión del adenovirus se logra sin la integración del AON viral en el cromosoma de la
célula anfitriona, aliviando de ese modo los problemas de mutagérlesis insercionaL Además, se han utilizado adenovirus como vacunas entéricas vivas durante muchos años con un excelente perfil de seguridad (Schwartz et al. Am. Rev. Respir. Ois.109:233-238 (1974». Finalmente, se ha demostrado en numerosos casos la transferencia génica mediada por adenovirus, incluyendo la transferencia de alfa-1-antitripsina y CFTR a los pulmones de ratas algodoneras (Rosenfeld, M. A. et al. (1991) Science 252:431 -434; Rosenfeld et al., (1992) CeIl68:143-155). Además, los estudios exhaustivos para intentar establecer los adenovirus como agentes causantes en el cáncer humano fueron uniformemente negativos (Green, M. et al. (1979) Proc. NatL Acad. ScL USA 76:6606)
Los vectores adenovirales adecuados útiles en la presente invención son descritos, por ejemplo, por Kozarsky y Wilson, Curro Opino Gene!. OeveL 3:499-503 (1993); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt et al., Human Gene!. Ther. 4:759-769 (1993); Yang et al., Nature Gene!. 7:362-369 (1994); Wilson et al., Nature 365:691692 (1993); Y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.652.224, que se incorporan a la presente memoria como referencia. Por ejemplo, el vector de adenovirus Ad2 es útil y se puede hacer crecer en células 293 humanas. Estas células contienen la región E1 de adenovirus y expresan constitutivamente E1a y E1 b, que complementan los adenovirus defectuosos propOfcionando los productos de los genes suprimidos del vector. Además de Ad2, otras variedades de adenovirus (p. ej ., Ad3, Ad5, Y Ad7) también son útiles en la presente invención.
Preferiblemente, los adenovirus uti lizados en la presente invención son de replicación deficiente. Los adenovirus de replicación deficiente requieren la ayuda de un virus coadyuvante y/o una línea celular de empaquetamiento para formar partículas infecciosas. El virus resultante es capaz de infectar células y puede expresar un polinucleótido de interés que está conectado operablemente a un promotor, pero no puede replicar en la mayor parte de las célu las Los adenovirus de replicación deficiente se pueden suprimir en uno o más de todos o una porción de los siguientes genes: E1a, E1b, E3, E4, E2a, o L 1 a L5.
En otras ciertas realizaciones, las células se modifican, ex vivo o in vivo, utilizando un virus adeno-asociado (AAV). Los AAV son virus defectuosos de origen natural que requieren virus coadyuvantes para producir partículas infecciosas (Muzyczka, N., Curro Topics in MicrobioL ImmunoL 158:97 (1992)). También son uno de los pocos virus que pueden integrar su AON en células que no están en división. Los vectores que contienen tan pocos como 300 pares de bases de AAV se pueden empaquetar y se pueden integrar, pero el espacio para el AON exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb Los métodos para producir y utilizar tales AAV son conocidos en la técnica Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.139.941, 5.173.414, 5.354.678, 5.436.146, 5.474.935, 5.478.745, Y 5.589.377.
Por ejemplo, un vector de AAV apropiado para su uso en la presente invención incluirá todas las secuencias necesarias para la replicación, encapsidación, e integración en la célula anfitriona del AON. El constructo polinucleotidico se inserta en el vector de AAV utilizando métodos de clonación convencionales, tales como los encontrados en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989). El vector de AAV recombinante es transfectado a continuación en células de empaquetamiento que se infectan con un virus coadyuvante, utilizando cualquier mecanismo convenciooal, incluyendo lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, etc. Los virus coadyuvantes apropiados incluyen adenovirus, citomegalovirus, virus vaccinia, o virus herpes. Una vez que las células de empaquetamiento son transfectadas e infectadas, producirán partículas virales de AAV infecciosas que contendrán el constructo polinucleotídico. Estas partículas virales se utilizan a continuación para transducir células eucarióticas, ya sea ex vivo o in vivo. Las célu las transducidas contendrán el constructo polinucleotidico integrado en su genoma, y expresarán una proteína de fusión de la invención.
Otro método de terapia génica implica asociar operablemente regiones de control heterólogas y secuencias de polinucleótidos endógenas (p. ej., que codifican un polipéptido de la presente invención) por medio de recombinación homóloga (véanse, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641 .670, presentada el 4 de Junio, 1997; la Publicación Internacional Núm. WO 96/29411, publicada el 26 de Septiembre, 1996; la Publicación Internacional Núm. WO 94/12650, publicada el4 de Agosto, 1994; Kol1er et al., Proc. NatL Acad. ScL USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), que se incorporan a la presente memoria como referencia. Este método implica la activación de un gen que está presente en las células diana, pero que no es expresado normalmente en las células, o es expresado a un nivel inferior al deseado.
Los constructos polinucleotídicos se elaboran, utilizando mecanismos convencionales conocidos en la técnica, que contienen el promotor con secuencias de direccionamiento que flanquean el promotor. Los promotores adecuados se describen en la presente memoria. La secuencia de direccionamiento es suficientemente complementaria a una secuencia endógena para permitir la recombinación homóloga del promotor-secuencia de direccionamiento con la secuencia endógena. La secuencia de direccionamiento estará suficientemente cerca del extremo 5' de la secuencia polinucleotídica endógena deseada de manera que el promotor estará conectado operablemente a la secuencia endógena tras la recombinación homóloga.
El promotor y las secuencias de direccionamiento se pueden amplificar utilizando la PCR. Preferiblemente, el promotor amplificado contiene distintos sitios para enzimas de restricción en los extremos 5' y 3' Preferiblemente, el extremo 3' de la primera secuencia de direccionamiento contiene el mismo sitio para enzima de restricción que el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia de direccionamiento contiene el mismo sitio para la enzima de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. El promotor amplificado y las secuencias de direccionamiento se digieren y se ligan entre sí.
El constructo de promotor-secuencia de direccionamiento es suministrado a las células, como polinucleótido desnudo, o junto con agentes que facilitan la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, virus completos, lipofección, agentes de precipitación, etc., descritos con más detalle más arriba. El promotor P-secuencia de direccionamiento se puede suministrar mediante cualquier método, incluyendo la inyección con aguja directa, la inyección intravenosa, la administración tópica, la infusión con catéter, los aceleradores de particulas, etc. Los métodos se describen con más detalle más abajo
El constructo de promotor-secuencia de direccionamiento es absorbido por las células. La recombinación homóloga entre el constructo y la secuencia endógena tiene lugar, de manera que la secuencia endógena se coloca bajo el control del promotor. A continuación el promotor conduce la expresión de la secuencia endógena.
El polinucleólido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención puede contener una secuencia señal secretora que facilita la secreción de la proteína. Típicamente, la secuencia señal se posiciona en la región codificante del polinucleótido que se va a expresar hacia o en el extremo 5' de la región codificante. La secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga con respecto al polinucleótido de interés y puede ser homóloga o heteróloga con respecto a las células que se van a transfectar. Adicionalmente, la secuencia señal puede ser sintetizada químicamente utilizando métodos conocidos en la técnica
Se puede utilizar cualquier modo de administración de cualquiera de los constructos polinucleotídicos descritos anteriormente con tal que el modo de como resultado la expresión de una o más moléculas en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Esto incluye la inyección con aguja directa, la inyección sistémica, la infusión con catéter, los inyectores biolísticos, los aceleradores de partículas (esto es, ~pistolas génicas~), depósitos de esponja Gelfoam, otros materiales de depósito disponibles en el mercado, bombas osmóticas (p. ej ., minibombas Alza), formulaciones farmacéuticas sólidas orales (comprimidos o pildoras) o en supositorios, y aplicaciones de decantación o tópicas durante la cirugia. Por ejemplo, la inyección directa de plásmido desnudo precipitado con fosfato de calcio en el hígado de rata o bazo de rata o un plásmido recubierto con proteína en la vena porta ha dado como resultado la expresión génica del gen foráneo en los higados de rata (Kaneda et al., Science 243:375 (1989» .
Un método preferido de administración local es mediante inyección directa. Preferiblemente, una proteina de fusión de albúmina de la presente invención que forma complejo con un vehículo de suministro se administra mediante inyección directa en o localmente dentro de la zona de las arterias. La administración de una composición localmente dentro de la zona de las arterias hace referencia a la inyección de la composición centímetros y preferiblemente, milímetros dentro de las arterias.
otro método de administración local consiste en poner en contacto un constructo polinucleotídico de la presente invención en o alrededor de una herida quirúrgica. Por ejemplo, se puede someter a cirugía un paciente y el constructo polinucleotídico se puede aplicar como recubrimiento sobre la superficie del tejido del interior de la herida
o el constructo se puede inyectar en zonas de tejido en el interior de la herida.
Las composiciones terapéuticas útiles en la administración sistémica, incluyen proteínas de fusión de la presente invención que forman complejo con un vehículo de suministro dirigido de la presente invención. Los vehículos de suministro adecuados para su uso con la administración sistémica comprenden liposomas que comprenden ligandos para el direccionamiento del vehículo a un sitio concreto. En realizaciones específicas, los vehículos de suministro adecuados para su uso con la administración sistémica comprenden liposomas que comprenden proteínas de fusión de albúmina de la invención para el direccionamiento del vehículo a un sitio concreto
Los métodos preferidos de administración sistémica incluyen el suministro mediante inyección intravenosa, aerosol, oral y percutánea (tópica). Las inyecciones intravenosas se pueden rea lizar utilizando métodos convencionales en la técnica. El suministro mediante aerosol también se puede realizar utilizando métodos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling et al., Proc. NatL Acad. Scí. USA 189:11277-11281, 1992, que se incorpora a la presente memooa como referencia). El suministro oral se puede realizar formando complejo de un constructo de polinucleótido de la presente invención con un portador capaz de resistir la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Los ejemplos de tales portadores incluyen cápsulas de plástico o comprimidos, tales como los conocidos en la técnica. El suministro tópico se puede llevar a cabo mezclando un constructo polinucleotidico de la presente invención con un reactivo lipófilo (p. ej., DMSO) que es capaz de atravesar la piel
La determinación de la cantidad eficaz de sustancia que se va a suministrar puede depender de numerosos factores incluyendo, por ejemplo, la estructura química y la actividad biológica de la sustancia, la edad y el peso del animal, la afección precisa que requiere tratamiento y su gravedad, y la ruta de administración. La frecuencia de los tratamientos depende de numerosos factores, tales como la cantidad de constructos polinucleotídicos administrados por dosis, así como de la salud y el historial del sujeto. La cantidad precisa, el número de dosis, y la programación de las dosis serán determinados por el médico o veterina rio a cargo.
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden administrar a cualquier animal, preferiblemente a mamiferos y aves. Los mamiferos preferidos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, conejos, ovejas, ganado vacuno, caballos y cerdos, siendo particularmente preferidos los seres humanos.
Actividades biológicas
Las proteinas de fusión de albúmina ylo polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la presente invención, se pueden utilizar en análisis para someter a ensayo una o más actividades biológicas. Si una proteína de fusión de albúmina ylo polinucleótido muestran una actividad en un análisis concreto, es probable que la proteína terapéutica correspondiente a la proteína de fusión puede estar implicada en las enfennedades asociadas con la actividad biológica. De este modo, la proteína de fusión podría ser utilizada para tratar la enfennedad asociada.
En realizaciones preferidas, la presente invención incluye un método para tratar una enfennedad o trastomo que aparece en la columna ~Indicación Preferida Yquot; de la Tabla 1 que comprende la administración a un paciente, en el que se desea dicho tratamiento, prevención o alivio, de una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende una porción de proteína Terapéutica que corresponde a la proteína Terapéutica descrita en la columna ~Proteína Terapéutica Xquot; de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno a tratar se enumera en la
columna quot;Indicación Preferida Yquot; de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o aliviar la enfennedad o trastorno
En una realización preferida adicional, la presente invención abarca un método de tratamiento de una enfennedad o
trastorno enumerados para una proteina Terapéutica particular en la columna ~Indicación Preferida: Yquot; de la Tabla 1 que comprende la administración a un paciente, en el que se desea dicho tratamiento, prevención o alivio, de una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende una porción de proteina Terapéutica correspondiente a la proteína Terapéutica para la que las indicaciones de los Ejemplos están relacionadas en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o aliviar la enfennedad o trastomo.
Se contemplan específicamente por la presente invención las proteínas de fusión de albúmina producidas por una célula cuando están codificadas por los polinucleótidos que codifican el SEO ID NO: Y. Cuando se utilizan estos polinucleótidos para expresar la proteina codificada de una célula, la secreción natural de la célula y las etapas de procesamiento producen una proteína que carece de la secuencia señal que aparece de manera explicita en las columnas 4 ylu 11 de la Tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal enumerada se muestra en la especificación o es bien conocida en la técnica. Por lo tanto, las realizaciones más preferidas de la presente invención incluyen la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder mostrada en las columnas 4 ylu 11 de la Tabla 2). También son muy preferidos los polipéptidos que comprenden el SEO ID NO: Y sin la secuencia líder específica enumerados en las columnas 4 ylu 11 de la Tabla 2 También se prefieren las composiciones que comprenden estas dos realizaciones preferidas, incluyendo las composiciones farmacéuticas. Estas proteínas de fusión de albúmina se contemplan específicamente para tratar, prevenir, o aliviar una enfermedad o trastomo enumerados para una proteina Terapéutica particular en la columna ~Indicación Preferida: Yquot; de la Tabla 1.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden utilizar en el diagnóstico, pronóstico, prevención ylo tratamiento de enfermedades ylo trastomos relativos a enfermedades y tras tomos del sistema endocrino (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastomos endocrinos~ a continuación), el sistema nervioso (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastornos neurológicosquot; a continuación), el sistema inmunitario (véase, por ejemplo, la sección ~Actividad inmunitariaquot; a continuación), el sistema respiratorio (véase, por ejemplo, la sección quot;Trasto mas respiratoriosquot; a continuación), el sistema cardiovascular (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastornos cardiovascularesquot; a continuación), el sistema reproductivo (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastornos del aparato reproductorquot; a continuación), el sistema digestivo (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastornos gastrointestinalesquot; a continuación), las enfermedades ylo trastornos relacionados con la proliferación celular (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastomos hiperproliferativosquot; a continuación), ylo las enfermedades o trastomos relacionados con la sangre (véase, por ejemplo, la sección quot;Trastornos relacionados con la sangrequot; a continuación).
En ciertas realizaciones, una proteina de fusión de albúmina de la presente invención se pueden utilizar para diagnosticar ylo pronostica r enfermedades ylo trastomos asociados con el tejido o los tejidos en los que se expresa el gen correspondiente a la porción de proteína Terapéutica de la proteina de fusión de la invención
Por lo tanto, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención son útiles en el diagnóstico, detección ylo tratamiento de enfermedades ylo trastornos asociados con actividades que incluyen, pero no se limitan a, la activación prohormonal, la actividad de los neurotransmisores, la señalización celular, la proliferación celular,la diferenciación celular, y la migración celular.
De manera más general, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para el diagnóstico, pronóstico, prevención ylo tratamiento de enfermedades ylo trastornos asociados con los siguientes sistemas.
Actividad inmunitaria
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevenciÓfl, diagnóstico ylo pronóstico de enfermedades, trastomos ylo afecciooes del sistema inmunitario, por ejemplo, mediante la activación o la inhibición de la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotaxis) de células inmunitarias. Las células inmunitarias se desarrollan a través de un proceso denominado hematopoyesis, que produce células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y 1infoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotentes. La etiología de estas enfermedades, trastornos ylo afecciooes inmunitarias puede ser genética, somática, tal como cáncer y algunas enfermedades autoinmunitaria, adquiridas (por ejemplo, por quimioterapia o toxinas) o infecciosas. Además, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario en particular
En otra realización, una proteina de fusión de la invención ylo un polinudeótido que codifica una proteina de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunitario ylo para inhibir o potenciar una respuesta inmunitaria generada por células asociadas con el tejido o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invenciÓfl
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico ylo pronóstico de inmunodeficiencias, incluyendo inmunodeficiencias tanto congénitas como adquiridas. Los ejemplos de inmunadeficiencias de células B en las que los niveles de inmunoglobulina, la función de las células B ylo el número de células B disminuyen incluyen: agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (enfermedad de Bruton), agammaglobulinemia infantil ligada al cromosoma X, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X con hiper IgM, inmunadeficiencia no ligada al cromosoma X con hiper IgM, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP), agammaglobulinemia incluyendo agammaglobulinemia congénita y adquirida, agammaglobulinemia de inicio en la edad adulta, agammaglobulinemia de IniCIO tardío, disgammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia no especificada, agammaglobulinemia recesiva (tipo Suizo), deficiencia de IgM selectiva, deficiencia de IgA selectiva, deficiencias de subclase IgG selectivas, deficiencia de subclase IgG (con o sin deficiencia de IgA), deficiencia de Ig con el aumento de la deficiencia de IgM, IgG e IgA con aumento de 19M, deficiencia de anticuerpos con Ig normales o elevadas, deleciones de cadenas pesadas de Ig, deficiencia de cadena kappa, trastomo linfoproliferativo de células B (ELPB), inmunodeficiencia variable común (IDCV), inmunodeficiencia variable común (IVC) (adquirida), e hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia
En realizaciones especificas, la ataxia-telangiectasia o las afecciones asociadas con ataxia-telangiectasia se tratan, previenen, diagnostican, ylo pronostican usando las proteínas de fusión de la invenciÓfl ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Los ejemplos de inmunodeficiencias congénitas en la que se reduce la función ylo el número de células T ylo células B incluyen, pero no se limitan a: anomalía de DiGeorge, inmunodeficiencias combinadas graves (IDCG) (incluyendo, pero no limitadas a, IDCG ligada al cromosoma X, IDCG autosómica recesiva, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de purina nucleósido fosforilasa (PNP), deficiencia de MHC de Clase 11 (síndrome de linfocitos desnudos), síndrome de Wiskoll-Aldrich, y ataxia telangiectasia), hipoplasia del timo, síndrome de tercera y cuarta bolsa faríngea, deleción 22q 11.2, candidiasis mucocutánea crónica, deficiencia de células asesinas naturales (NK), linfocitopenia de células T CD4+ idiopática, inmunodeficiencia con defecto de las células T predominante (no especificada), e inmunodeficiencia no especificada de la inmunidad mediada por células
En realizaciones específicas, la anomalía de DiGeorge o las afecciones asociadas con la anomalia de DiGeorge son tratadas, prevenidas, diagnosticadas, ylo pronosticadas usando las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención.
Otras inmunodeficiencias que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar ylo prooosticar usando proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, enfermedad granulomatosa crónica, Chediak síndrome de Higashi, deficiencia de mieloperoxidasa, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en leucocitos, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP), deficiencia de adhesiÓfl leucocitaria, deficiencias de componentes del complemento (incluyendo deficiencias de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, ca ylo C9), disgenesia reticular, alinfoplasia-aplasia del timo, inmunodeficiencia con timoma, leucopenia congénita grave, displasia con inmunodeficiencia, neutropenia neonatal, enanismo de extremidades cortas, y sindrome de Nezelof-inmunodeficiencia combinada con Ig
En una realización preferida, las inmunodeficiencias ylo afecciones asociadas con las inmunodeficiencias citadas anteriormente son tratadas, prevenidas, diagnosticadas ylo pronosticadas usando proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusióri de albúmina de la invención
En una realización preferida las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían ser utilizadas como un agente para reforzar la inmunosensibilidad entre los individuos inmunodeficientes. En realizaciooes específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se podrían utilizar como un agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos con inmunodeficiencias de células B y/o células T.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de trastornos autoinmunitarios. Muchos trastornos autoinmunitarios son el resultado de un reconocimiento inadecuado de lo propio como material foráneo por parte de las células inmunitarias. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmunitaria que conduce a la destrucción del tejido anfitrión. Por lo tanto, la administración de proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención que pueden inhibir una respuesta inmunitara, particularmente la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de trastornos autoinmunitarios
Las enfermedades o trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar por las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica, trombocitopenia, trombocitopenia púrpura autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, púrpura (por ejemplo, púrpura de Henloch-Scoenlein), autoimmunocitopenia, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, miastenia grave, enfermedad de Grave (hipertiroidismo), y diabetes mellitus resistente a la insulina
Otros trastornos adicionales que son propensos a tener un componente autoinmunitario que se puede tratar, prevenir y/o diagnosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, artritis inducida por colágeno tipo 11, síndrome antifosfolípido, dermatitis, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis recidivante, cardiopatía reumática, neuritis, oftalmia uveítis, poliendocrinopalías, enfermedad de Reiter, síndrome de la persona rigida, inflamación pulmonar autoinmunitaria, autismo, síndrome de Guillain-Barré, diabetes mellitus insulinodependiente, y trastornos oculares inflamatorios autoinmunitarios
Otros trastornos que son propensos a tener un componente autoinmunitario que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invenciórJ y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, esclerodermia con anticuerpos anti-colágeno (con frecuencia se caracteriza, p. ej., por anticuerpos nucleolares y otros anticuerpos nucleares), enfermedad mixta del tejido conectivo (a menudo se caracteriza, p. ej., por anticuerpos contra antígenos nucleares extraíbles (p. ej ., ribonucleoproteina», polimiositis (a menudo caracterizada, p. ej., por ANA no histónico), anemia pemiciosa (a menudo se caracteriza, p. ej., por células anti-pa rietales, microsomas, y anticuerpos del factor intrínseco), enfermedad idiopática de Addison (a menudo se caracteriza, p. ej., por citotoxicidad adrenal humoral y mediada por células, infertilidad (a menudo caracterizada, p. ej ., por anticuerpos antispermatozoicos), glomerulonefritis (con frecuencia caracterizada, p. ej., por anticuerpos de la membrana basal glomerular o complejos inmunita rios), penfigoide ampolloso (a menudo se caracteriza, p. ej., por IgG y complemento en la membrana basal), sindrome de Sjogren (a menudo se caracteriza, p. ej., por anticuerpos de tejidos múltiples, y/o ANA no histónico específico (SS-8)), diabetes mellitus (a menudo se caracteriza, p. ej., por anticuerpos de células de los islotes mediados por células y humoral), y resistencia a fármacos adrenérgicos (incluyendo resistencia a fármacos adrenérgicos con asma o fibrosis quistica) (a menudo se caracteriza, p. ej., por anticuerpos contra el receptor betaadrenérgico).
Otros trastornos que pueden tener un componente autoinmunitario que se puede tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinudeótidos que codifican las proteínas de fusiórJ de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hepatitis crónica activa (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos de músculo liso), cirrosis biliar primaria (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos contra mitocondrias), otra insuficiencia de glándulas endocrinas (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos específicos de tejido en algunos casos), vitiligo (a menudo caracterizado, p. ej., por anticuerpos de melanocitos), vasculitis (a menudo caracterizada, p. ej., por Ig y complemento en las paredes de los vasos y/o bajo complemento en suero ), post-1M (a menudo caracterizado, p. ej., por anticuerpos antimiocárdicos), síndrome de cardiotomla (a menudo caracterizado, p. ej., por anticuerpos antimiocárdicos), urticaria (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), dermatitis atópica (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), asma (a menudo caracterizada, p. ej., por anticuerpos IgG e 19M contra IgE), y muchos otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos, y atróficos.
En una realización preferida, las enfermedades autoinmunitarias y los trastornos y/o afecciones asociados con las enfermedades y trastornos indicados anteriormente se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican utilizando, por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. En una realizaciórJ preferida específica, la artritis reumatoide se tratar, previene y/o diagnostica por medio de las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusi6n de albúmina de la invención
En otra realización preferida específica, el lupus eritematoso sistémico se trata, previene y/o diagnostica utilizando
las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. En otra forma de realización preferida específica, la púrpura trombocitopénica idiopática se trata, previene y/o diagnostica utilizando las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
En otra realización específica preferida la nefropatia por IgA, se trata, previene y/o diagnostica utilizando las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
En una realización preferida, las enfermedades autoinmunitarias y los trastomos y/o afecciones asociados con las enfermedades y trastornos indicados anteriormente se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican utilizando las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como agente o agentes inmunosupresores.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir, pronosticar y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o afecciones de las células hematopoyéticas. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían utilizar para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir las enfermedades, trastomos y/o afecciones asociados con una disminución en ciertos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero no limitados a, leucopenia, neutropenia, anemia y trombocitopenia. Altemativamente, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían utilizar para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, induyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo para tratar o prevenir esas enfermedades, trastomos y/o afecciones asociados con un aumento de ciertos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, pero no limitados a, histiocitosis.
Las reacciones y afecciones alérgicas, tales como el asma (particularmente el asma alérgica) u otros problemas respiratorios, también se pueden trata r, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar utilizando las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Además, estas moléculas se pueden utilizar para tratar, prevenir, pronosticar y/o diagnosticar la anafilaxis, la hipersensibilidad a una molécula antigénica, o la incompatibilidad de grupo sanguíneo.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar reacciones alérgicas mediadas por IgE. Tales reacciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis y eczema. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para modular las concentraciones de IgE in vitro o in vivo
Por otra parle, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención tienen utilidad en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las afecciones inflamatorias. Por ejemplo, ya que las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden inhibir la activación, proliferación y/o diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria, estas moléculas se pueden utilizar para prevenir y/o tratar afecciones inflamatorias agudas o crónicas. Tales afecciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inflamación asociada con infección (p. ej., choque séptico, sepsis, o sindrome de respuesta inflamatoria sistémica), lesión por isquemia-reperfusión, letalidad por endotoxinas, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citoquinas o quimioquinas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, producción en exceso de citoquinas (p. ej., TNF o IL-1), trastornos respiratorios (p. ej., asma y alergia); trastornos gastrointestinales (p. ej., enfermedad inflamatoria intestinal); cánceres (p. ej., gástrico, de ovario, de pulmón, de vejiga, de hígado y de mama); trastornos del SNC (p. ej., esclerosis múltiple; lesión cerebral isquémica y/o accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática, trastornos neurodegenerativos (p. ej., enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer); demencia relacionada con el SIDA, y enfermedades de priones); trastomos cardiovasculares (p. ej., aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular y complicaciones de derivación cardiopulmonar); así como muchas otras enfermedades, afecciones y trastornos que se caracterizan por inflamación (p. ej., hepatitis, artritis reumatoide, gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión renal por isquemia-reperfusi6n, enfermedad de Grave, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus, y rechazo de trasplante alogénico).
Debido a que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar virtualmente a cualquier tejido del cuerpo. Por consiguiente, las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, tienen utilidad en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejidos, incluyendo, pero no limitados a, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, coclitis, colitis,
conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustaquitis, fibrositis, folicu litis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatosplenitis, queratitis, laberintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miosititis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis, tendinitis, amigdalitis, uretritis, y vaginitis
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, son útiles para diagnostica r, pronosticar, prevenir y/o tratar los rechazos de trasplantes de órganos y la enfermedad de injerto contra anfitrión. El rechazo de órganos se produce por la destrucción de las células inmunitarias del anfitrión del tejido trasplantado a través de una respuesta inmunitaria. Del mismo modo, una respuesta inmunitaria también está implicada en la GVHD, pero, en este caso, las células inmunitarias trasplantadas foráneas destruyen los tejidos del anfitrión. Los polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la invención, y/o los agonistas o antagonistas de los mismos, que inhiben una respuesta inmunitaria, particularmente la activación, proliferación, diferenciación o quimiotaxis de las células T, pueden ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo de órganos o GVHD. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, que inhiben una respuesta inmunitaria, particularmente la activación, proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, pueden ser una terapia eficaz en la prevención rechazo de xenoinjerto alérgico y hiperagudo experimental
En otras realizaciones, las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, son útiles para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar enfermedades del compleja inmunitario, incluyendo, pero no limitadas a, enfermedad del suero, glomerulonefritis post-estreptocócica, poliarteritis nodosa, vasculitis inducida por el complejo inmunitario
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar, detectar y/o evitar los agentes infecciosos. Por ejemplo, mediante el aumento de la respuesta inmunitaria, en particular el aumento de la proliferación, activación y/o diferenciación de las células By/o T, las enfermedades infecciosas pueden ser tratadas, detectadas, y/o prevenidas. La respuesta inmunitaria se puede incrementar potenciando una respuesta inmunitaria existente, o iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Altemativamente, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención también pueden inhibir directamente el agente infeccioso (remitirse a la sección del listado de aplicación de agentes infecciosos, etc.), sin provocar necesariamente una respuesta inmunitaria.
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un coadyuvante de vacuna que mejora la capacidad de respuesta inmunitaria a un antígeno. En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un coadyuvante para potenciar las respuestas inmunitarias específicas de tumores.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yio los polinucle61idos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un coadyuvante para potenciar las respuestas inmunitarias antivirales. Las respuestas inmunitarias antivirales que se pueden potenciar utilizando las composiciones de la invención como coadyuvante, incluyen virus y enfermedades o síntomas asociados con virus descritos en la presente memoria o conocidos de otra manera en la técnica. En realizaciones especificas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a un virus, enfermedad, o sintoma seleccionados del grupo que consiste en: SIDA, meningitis, Dengue, EBV, y hepatitis (p. ej., hepatitis B). En otra realización específica, las composiCiones de la invención se usan como un coadyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a un virus, enfermedad, o sintoma seleccionados del grupo que consiste en: VIH/SIDA, virus sincitial respiratorio, Dengue, rotavirus, encefalitis B japonesa, influenza A y B, parainfluenza, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chikungunya, fiebre del Valle del Rift, herpes simple y fiebre amarilla.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yio los polinucle6tidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un coadyuvante para potenciar respuestas inmunitarias antibaclerianas o antifúngicas. Las respuestas inmunitarias antibaclerianas o antifúngicas que se pueden potenciar utilizando las composiciones de la invención como un coadyuvante, incluyen bacterias u hongos y enfermedades asociadas con bacterias u hongos o síntomas descritos en la presente memoria o conocidos de otra manera en la técnica. En rea lizaciones especificas, las composiciones de la invención se utilizan como un coadyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionados del grupo que consiste en: tétanos, difteria, botulismo y meningitis tipo B.
En otra realización específica, las composiciones de la invención se utilizan como un coadyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionados del grupo que consiste en'
Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Neisseria meningitidis,
Streptococcus pneumoniae, estreptococo del grupo B, Shigella spp., Escherichia coli enterotoxigénica, E. coli enterohemorrágica, y Borrelia burgdorteri
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan como un coadyuvante para potenciar respuestas inmunitarias antiparasitarias. Las respuestas inmunitarias antiparasitarias que se pueden potenciar utilizando las composiciones de la invenciÓfl como un coadyuvante, incluyen parásitos y enfermedades o sintomas asociados con parásitos descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la técnica. En realizaciones específicas, las composiciones de la invenciÓfl se utilizan como un coadyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a un parásito. En otra realización especifica, las composiciones de la invenciÓfl se utilizan como un coadyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a Plasmodium (malaria) o Leishmania
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para el tratamiento de enfermedades infecciosas incluyendo silicosis, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, mediante la prevención del reclutamiento y la activación de los fagocitos mononucleares
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un antígeno para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas mediadas por el sistema inmunitario contra polipéptidos de la invención
En una rea lización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se administran a un animal (p. ej., ratÓfl, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdo, micro-cerdo, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano, y ser humano, más preferiblemente ser humano) para reforzar el sistema inmunitario para producir mayores cantidades de uno o más anticuerpos (p. ej., IgG, IgA, 19M, e IgE), para inducir la producción de anticuerpos de mayor afinidad y el cambio de clase de inmunoglobulinas (p. ej., IgG, IgA, IgM e IgE), y/o para aumentar una respuesta inmunitaria
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las protefnas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un estimulador de la respuesta de las células B a los patógenos
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan como un activador de células T.
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un agente que eleva el estado inmunitario de un individuo antes de su recepción de terapias inmunosupresoras.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan como un agente para inducir anticuerpos de mayor afinidad
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan como un agente para aumentar las concentraciones de inmunoglobulinas séricas
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un agente para acelerar la recuperación de individuos inmunocomprometidos.
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un agente para aumentar la inmunosensibilidad entre las poblaciones de edad y/o los neonatos
En otra realización especifica, las proteinas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un potenciador del sistema inmunitario antes de, durante, o después del trasplante de médula ósea y/o de otros trasplantes (p. ej., transplante de órganos alogénico o xenogénico ). Con respecto al trasplante, las composiciones de la invenciÓfl se pueden administrar antes de, concomitante con, y/o después del trasplante. En una realización específica, las composiciones de la invención se administran después del trasplante, antes del comienzo de la recuperación de las poblaciones de células T. En otra realización especifica, las composiciones de la invención se administran primero después del trasplante, después del comienzo de la recuperación de las poblaciones de células T, pero antes de la plena recuperación de las poblaciones de células B.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención se utilizan como un agente para reforzar la inmunosensibilidad entre individuos que tienen una pérdida adquirida de función de las células B. Las afecciones
que dan como resultado una pérdida adquirida de función de las células B que se pueden mejorar o tratar mediante la administración de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, infección por VIH, SIDA, trasplante de médula ósea, y leucemia linfocítica crónica de células B (LLC).
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se utilizan como un agente para aumentar la inmunosensibilidad entre individuos que tienen una inmunodeficiencia tempora l. Las afecciones que dan como resultado una inmunodeficiencia temporal que se puede mejorar o tratar mediante la administración de las proteínas de fusión de albúmina de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, la recuperación de infecciones virales (p. ej., influenza), afecciones asociadas con la malnutrición, recuperación de mononucleosis infecciosa o afecciones asociadas con estrés, recuperación del sarampión, recuperación de la transfusión de sangre, y recuperación de la cirugía.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleÓtidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un regulador de la presentación de antígenos por monocitos, células dendríticas, yfo células B. En una realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención mejoran la presentación de antígenos o suscitan antagonismo sobre la presentación de antígenos in vitro o in vivo . Por otra parte, en realizaciones relacionadas, esta mejora o antagonismo de la presentación de antígenos pueden ser útíles como un tratamiento antitumoral o para modular el sistema inmunitario
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un agente para dirigir el sistema inmunitario de un individuo hacia el desarrollo de una respuesta humoral (es decir, TH2) en oposición a una respuesta celular TH1 .
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un medio para inducir la proliferación de tumores y por lo tanto hacer10s más susceptible a los agentes anti-neoplásicos. Por ejemplo, el mieloma múltiple es una enfermedad de división lenta y por lo tanto refractaria a prácticamente todos los regímenes antineoplásicos. Si estas células se ven obligadas a proliferar más rápidamente su perfil de susceptibilidad probablemente cambiará
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un estimulador de la producción de células B en patologías tales como el SIDA, el trastomo de linfocitos crónico yfo la Inmunodificiencia Variable Común .
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como una terapia para la generación ylo regeneración de tejidos linfoides después de cirugía, traumatísmo o defecto genético. En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan en el tratamiento previo de muestras de médula ósea antes del trasplante.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como una terapia basada en genes para trastomos heredados genéticamente que dan como resultado inmuno-incompetencialinmunodeficiencia tales como las observadas entre pacientes con IDCG.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un medio de activación de monocitoslmacrófagos para la defensa contra enfermedades parasitarias que afectan a los monocitos tales como Leishmania.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un medio de regulación de las citoquinas secretadas que son provocadas por los polipéptidos de la invención.
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan en una o más de las aplicaciooes descritas en la presente memoria, ya que pueden aplicarse a la medicina veterinaria.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un medio para bloquear diversos aspectos de las respuestas inmunitarias a agentes foráneos o propios. Los ejemplos de las enfermedades o afecciones en las que se puede desearse el bloqueo de algunos aspectos de las respuestas inmunitarias incluyen trastomos autoinmunitarios tales como lupus y artritis, así como inmunosensibilidad a las alergias de la piel, inflamación, enfermedad del intestino, lesión y enfermedades/trastomos asociados con patógenos
En otra realización especifica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como una terapia para la prevención de la proliferación de células B y la secreción de Ig asociada con enfermedades autoinmunitarias tales como púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple
En otra realización específica, los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos y/o agonistas o antagonistas de las presentes proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un inhibidor de la migración de células B y/o T en las células endoteliales Esta actividad perturba la arquitectura del tejido o las respuestas afines y es útil, por ejemplo en la interrupción de la respuesta inmunitaria, y el bloqueo de la sepsis.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como una terapia para la hipergammaglobulinemia crónica evidente en enfermedades tales como la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), enfermedad de Waldenstrom, gammapatías monoclonales idiopáticas relacionadas y plasmacitomas.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden emplear por ejemplo para inhibir la quimiotaxis de polipéptidos y la activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de células T, p. ej., células T activadas y CDa citotóxicas y células asesinas naturales, en cierta enfermedades autoinmunitarias e infecciosas e inflamatorias crónicas. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias se describen en la presente memoria e incluyen la esclerosis múltiple, y la diabetes dependiente de insulina.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para tratar el síndrome hiper-eosinofílico idiopático, por ejemplo, previniendo la producción y la migración de eosinófilos.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para mejorar o inhibir la lisis celular mediada por el complemento.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para mejorar o inhibir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para el tratamiento de la aterosclerosis, por ejemplo, mediante la prevención de la infiltración de monocitos en la pared arterial
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden emplear para tratar el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA)
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yl o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para estimular la reparación de heridas y tejidos, estimular la angiogénesis, y/o estimular la reparación de enfermedades o trastomos vasculares o linfáticos. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para estimular la regeneración de superficies mucosas
En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para diagnosticar, pronosticar, tratar y/o prevenir un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción deficiente de inmunoglobulina en suero, infecciones recurrentes y/o disfunción del sistema inmunitario. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar o prevenir infecciones de las articulaciones, huesos, piel, ylo glándulas parótidas, infecciones transmitidas por la sangre (p. ej., sepsis, meningitis séptica, artritis, y/o osteomielitis), enfermedades autoínmunítarias (p. ej., los descritos en la presente memoria), trastomos inflamatorios, y neoplasias malignas, y/o cualquier enfermedad o trastorno o afección asociados con estas infecciones, enfermedades, trastornos ylo neoplasias malignas) incluyendo, pero no limitados a, IDCV, otras inmunodeficiencias inmunitarias primarias, enfermedad de VIH, LLC, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zoster (p. ej., herpes zoster grave), y/o Pneumocystis carinii. otras enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, diagnosticar, pronosticar, y/o tratar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción de los fagocitos bactericidas, trombocitopenia y hemoglobinuria
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar y/o diagnosticar a un individuo que tiene una enfermedad de inmunodeficiencia variable común (quot;IDCVquot;, también conocida como quot;agammaglobulinemia adquiridaquot; e quot;hipogammaglobulinemia adquiridaquot;) o un subconjunto de esta enfermedad
En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar cánceres o neoplasmas incluyendo cánceres o neoplasmas de células inmunitarias incluyendo o relacionados con tejido inmunitario. Los ejemplos de los cánceres o neoplasmas que se pueden prevenir, diagnosticar o tratar por proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena aguda, leucemia miel6gena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, anemia linfocítica aguda (ALL) leucemia linfocitaria crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkill, enfermedades transformadas por EBV, y/o enfermedades y trastomos descritos en la sección titulada quot;Trastomos hiperproliferativosquot; en la presente memoria.
En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan como una terapia para disminuir la proliferación celular de linfomas de células B grandes
En olra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yJo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan como un medio de disminuir la implicación de las células B y de las Ig asociadas con la leucemia mielógena crónica
En realizaciooes específicas, las composiciones de la invención se usan como un agente para aumentar la inmunosensibilidad entre individuos con inmunodeficiencias de células B, tales como, por ejemplo, un individuo que se ha sometido a una esplenectomía parcial o completa
Trastornos relacionados con fa sangre
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para modular la actividad hemostática (detención del sangrado) o trombolítica (disolución de coágulos). Por ejemplo, mediante el aumento de la actividad hemostática o trombolítica, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían utilizar para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y/o afecciones de la coagulación sanguínea (p. ej ., afibrinogenemia, deficiencias de factores, hemofilia), enfermedades, trastomos y/o afecciones de las plaquetas de la sangre (p. ej., trombocitopenia), o las heridas resu ltantes de trauma, cirugía u otras causas. Altemativamente, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención que pueden disminuir la actividad hemostática o trombolítica podrían utilizarse para inhibir o disolver la coagulación. Estas moléculas podrían ser importantes en el tratamiento o la prevención de ataques al corazón (infarto), accidentes cerebrovasculares o cicatrización.
En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención se pueden utilizar para prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tralar la trombosis, trombosis arterial, trombosis venosa, trombo embolia, embolia pulmonar, aterosclerosis, infarto de miocardio, ataque isquémico transitorio, angina inestable. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para la prevención de la oclusión de los injertos de safena, para reducir el riesgo de trombosis periprocedimental como la que podría acompañar a los procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de accidentes cerebrovasculares en pacientes con fibrilación auricular incluyendo fibrilación auricular no reumática, para reducir el riesgo de embolia asociado con enfermedad mecánica de las válvulas cardiacas y las válvulas mitra les. Otros usos para las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (p. ej., cánulas intravasculares, shunts de acceso vascular en pacientes de hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis, y máquinas de derivación cardiopulmonar)
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para preven ir, diagnosticar, pronosticar, y/o tralar enfermedades y trastomos de la sangre yfu órganos formadores de sangre asociados con el tejido o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención.
Las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para modular la actividad hematopoyética (la formación de células sanguíneas). Por ejemplo, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para aumentar la cantidad de todas o de subconjuntos de células sanguineas, tales como, por ejemplo, erilrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (p. ej., basófilos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, macrófagos) y plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células
sanguíneas o subconjuntos de células sanguíneas puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de anemias y leucopenias descritas a continuación. Alternativamente, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para disminuir la cantidad de todas o de subconjuntos de células sanguíneas, tales como, por ejemplo, eritrocitos, linfocitos (células 8 o T), células mieloides (p. ej., basófilos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, macrófagos) y plaquetas. La capacidad de disminuir la cantidad de células sanguíneas o subconjuntos de células sanguíneas puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de leucocitosis, tal como, por ejemplo la eosinofilia.
Las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para prevenir, tratar, o diagnosticar la discrasia sanguínea
Las anemias son las afecciones en las que el número glóbulos rojos de la sangre o la cantidad de hemoglobina (la proteína que transporta el oxígeno) en ellos está por debajo de 10 normal. La anemia puede estar causada por sangrado excesivo, disminución de la producción de glóbulos rojos, o aumento de la destrucción de glóbulos rojos (hemólisis). Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleólidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar anemias. Las anemias que se pueden tratar, prevenir, o diagnosticar por medio de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen la anemia por deficiencia de hierro, anemia hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica adquirida idiopática, aplasia de glóbulos rojos, anemia megaloblástica (p. ej., anemia pemiciosa, (deficiencia de vitamina 812) y anemia por deficiencia de ácido fólico), anemia aplásica, anemias hemolíticas (p. ej., anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica microangiopática y hemoglobinuria paroxística noctuma). Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar anemias asociadas con enfermedades incluyendo, pero no limitadas a, anemias asociadas con lupus eritematoso sistémico, cánceres, linfomas, enfermedad renal crónica y bazos agrandados. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar anemias derivadas de tratamientos con fármacos tales como las anemias asociadas con metildopa, dapsona y/o sulfofármacos. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar anemias asociadas con la arquitectura anormal de los glóbulos rojos incluyendo, pero no limitadas a, esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y anemia de células falciformes.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar anomalías de la hemoglobina, (p. ej., las asociadas con anemia de células falciformes, enfermedad de la hemoglobina C, enfermedad de la hemoglobina S-C, y enfermedad de la hemoglobina E). Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, prollÓstico, prevención y/o tratamiento de las talasemias, incluyendo, pero no limitadas a, las formas mayor y menor de alfa-talasemia y beta-talasemia
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de trastomos de la coagulación que incluyen, pero no se limitan a, trombocitopenia (p. ej., púrpura trombocitopénica idiopática y púrpura trombocitopénica trombótica), enfermedad de Von Willebrand, trastomos plaquetarios hereditarios (p. ej., enfermedad de almacenamiento del pool, tales como síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción del tromboxano A2, tromboastenia, y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico hemolítico-u rémico, hemofilias tales como hemofilia A o deficiencia de Factor VII y enfermedad de Christmas o deficiencia de Factor IX, Telangiectsia Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.
El efecto de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención sobre el tiempo de coagulación de la sangre puede ser controlado usando cualquiera de las pruebas de coagulación conocidas en la técnica incluyendo, pero no limitadas a, tiempo de tromboplastina parcial de sangre completa (TTP), el tiempo de tromboplastina parcial activado (TIPa), el tiempo de coagulación activado (TCA), el tiempo de coagulación activado recalcificado, o el tiempo de coagulación Lee-White.
Varias enfermedades y una variedad de medicamentos pueden causar disfunción plaquetaria. Por 10 tanto, en una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la disfunción plaquetaria adquirida tal como la disfunción de plaquetas que acompaña a la insuficiencia renal, la leucemia, el mieloma múltiple, la cirrosis hepática, y el lupus eritematoso sistémico, así como la disfunción plaquetaria asociada con los tratamientos con fármacos, incluyendo el tratamiento con aspirina, ticlopidina, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (utilizados para la artritis, el dolor y los esguinces), y penicilina en dosis altas
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastomos caracterizados por o asociados con el aumento o disminución del número de glóbulos blancos de la sangre. La leucopenia se produce cuando el número de glóbulos blancos de la sangre disminuye por debajo del normal. Las leucopenias incluyen, pero no se limitan a, neutropenia y linfocitopenia. Un aumento en el número de glóbulos blancos de la sangre en comparación con el normal se conoce como leucocitosis. El organismo genera un mayor número de glóbulos blancos de la sangre durante la infección. Por lo tanto, la leucocitosis puede ser simplemente un parámetro fisiológico normal que refleja infección. Altemativamente, la leucocitosis puede ser un indicador de lesión o de otra enfermedad tal como cáncer. Las leucocitosis, incluyen, pero no se limitan a, eosinofilia y acumulación de macrófagos. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la leucopenia. En otras realizaciones específicas, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleólidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la leucocitosis
La leucopenia puede ser una disminución generalizada de todos los tipos de glóbulos blancos de la sangre, o puede ser un agotamiento específico de determinados tipos de glóbulos blancos de la sangre. Por lo tanto, en realizaciones especificas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la disminución en el número de neutrófilos, conocida como neutropenia. Las neutropenias que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar por medio de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que coclifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, agranulocitosis genética infantil, neutropenia familiar, neutropenia cíclica, neutropenias resultantes de o asociadas con deficiencias en la dieta (p. ej., deficiencia de vitamina 812 o deficiencia de ácido fólico), neutropenias resultantes de o asociadas con los tratamientos farmacológicos (p. ej., regímenes de antibióticos como tratamiento con penicilina, tratamiento con sulfonamida, tratamiento con anticoagulantes, fármacos anticonvulsivos, fármacos antiliroideos y quimioterapia contra el cáncer), y neutropenias resultantes del aumento de la destrucción de neutrófilos que puede ocurrir en asociación con algunas infecciones bacterianas o virales, trastomos alérgicos, enfermedades autoinmunitarias, afecciones en las que un individuo tiene un agrandamiento del bazo (p. ej., síndrome de Felty, malaria y sarcoidosis), y algunos regímenes de tratamiento con fármacos
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de tinfocitopenias (disminución del número de linfocitos By/o T), incluyendo, pero no limitadas a, linfocitopenias resultantes de o asociadas con el estrés, tratamientos farmacológicos (p. ej., tratamiento farmacológico con corticosteroides, quimioterapias de cáncer, y/o terapia de radiación), infección por SIDA y/u otras enfermedades tales como, por ejemplo, cáncer, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, infecciones crónicas, algunas infecciones virales y/o trastornos hereditarios (p. ej., síndrome de DiGeorge, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada severa, ataxia telangiectsia)
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con el número de macrófagos y/o la función de los macrófagos, incluyendo, pero no limitados a, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-pick, enfermedad de Letterer-Siwe y enfermedad de Hand-Schuller -Christian
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagllÓstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastomos asociados con el número de eosinófilos y/o la función de los eosinófilos, incluyendo, pero no limitados a, síndrome hipereosinofílico idiopático, síndrome de eosillOfilia-mialgia y enfermedad de Hand-Schuller-Christian.
En otra realización más, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de leucemias y linfomas, incluyendo, pero no limitados a, leucemia linfocítica (Iinfoblástica) aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (mielocítica, mielógena, mieloblástica, o mielomonocítica), leucemia linfocítica crónica (p. ej., leucemias de células B, leucemias de células T, síndrome de Sezary, y leucemia de células pilosas), leucemia mielocítica crónica (mieloide, mielógena o granulocílica), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, y micosis fungoide.
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronostico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos de células plasmáticas, incluyendo, pero no limitados a, discrasias de células plasmáticas, gammapatías monoclonales, gammapatías monoclonales de significado incierto, mieloma múltiple, macroglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, crioglobulinemia, y fenómeno de Raynaud
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de trastornos mieloproliferativos, incluyendo, pero no limitados a, policitemia vera, policitemia relativa, policitemia secundaria, mielofibrosis, mielofibrosis aguda, metaplasia mielode agnágena, trombocitemia, (incluyendo trombocitemia tanto primaria como secundaria) y leucemia mieloide crónica
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como tratamiento antes de la cirugía, para aumentar la producción de células sanguíneas.
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como agente para mejorar la migración, fagocitosis, producción de superóxido, citotoxicidad celular dependiente anticuerpos de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos.
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como agente para aumentar el número de células madre en circulación antes de la féresis de células madre. En otra realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinudeótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como agente para aumentar el número de células madre en circulación antes de la féresis de plaquetas.
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como agente para aumentar la producción de citoquinas
En otras realizaciones, las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de trastornos hematopoyéticos primarios
Trastornos hiperproliferativos
En ciertas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluyendo neoplasmas. Las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden inhibir la proliferación del trastomo a través de interacciones directas o indirectas. Altemativamente, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden hacer proliferar otras células que pueden inhibir el trastomo hiperproliferativo.
Por ejemplo, mediante el aumento de una respuesta inmunitaria, particularmente aumentando las cualidades antigénicas del trastorllO hiperproliferativo o mediante la proliferación, diferenciación, o movilización de células T, se pueden tratar los trastornos hiperproliferativos. Esta respuesta inmunitaria se puede aumentar o bien potenciando una respuesta inmunitaria existente o bien iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, la disminución de una respuesta inmunitaria puede ser también un método de tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como un agente quimioterapéutico
Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a neoplasmas localizados en el: colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, pituitaria, testlculos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y tracto urogenital.
De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos también se pueden tratar o delectar mediante las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Los ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: Leucemia linfobláslica aguda infantil, Leucemia linfoblástica aguda, Leucemia linfocítica aguda, Leucemia mieloide aguda, Carcinoma adrenocortical, Cáncer hepatocelular en adulto (Primario), Cáncer de hfgado en adulto (Primaria), Leucemia linfocflica aguda en adulto, Leucemia mieloide aguda en adulto, enfermedad de Hodgkin en adulto, linfoma de Hodgkin en adulto, Leucemia lintocítica en adulto, Lintoma de no Hodgkin en adulto, Cáncer de hígado primario en adulto, Sarcoma de tejido blando en adulto, Linfoma relacionado con SIDA, Neoplasias malignas relacionadas con SIDA, Cáncer anal, Astrociloma, Cáncer de la vesicula biliar, Cáncer de vejiga, Cáncer de hueso, Glioma del tronco cerebral, Tumores cerebrales, Cáncer de mama, Cáncer de la pelvis renal y el uréter, Linfoma del sistema nervioso central (primario), Linfoma del sistema nervioso central, Astrocitoma cerebeloso, Astrociloma cerebral, Cáncer de cuello de útero, Cáncer hepatocelular infantil (prima rio), Cáncer de hígado infantil (prima rio), Leucemia linfoblástica aguda infantil,
Leucemia mieloide aguda infantil, Glioma del tronco encefálico, Astrocitoma cerebeloso infantil, Astrocitoma cerebral infantil, Tumores de células genninales extracraneales infantiles, Enfennedad de Hodgkin infantil, Linfoma de Hodgkin infantil, Glioma hipotalámico y de la ruta visual infantil, Leucemia linfoblástica infantil, Meduloblastoma infantil, Linfoma no Hodgkin infantil, Tumores neuroectodénnicos primitivos supratentoriales, y pineales infantiles, Cáncer de hígado primario infantil, Rabdomiosarcoma infantil, Sarcoma de tejido blando infantil, Glioma hipotalámico y de la ruta visual infantil, Leucemia linfocitica crónica, Leucemia mielógena crónica, Cáncer de colon, Linfoma de células T cutáneo, Carcinoma endocrino de células de los islotes de páncreas, Cáncer endometrial, Ependimoma, Cáncer epitelial, Cáncer de esófago, Sarcoma de Ewing y tumores relacionados, Cáncer pancreático exocrino, Tumor de células germinales extracraneales, Tumor de células germinales extragonadales, Cáncer del conducto biliar extrahepático, Cáncer de ojo, Cáncer de mama femenino, Enfermedad de Gaucher, Cáncer de vesícula biliar, Cáncer gástrico, Tumor carcinoide gastrointestinal, Tumores gastrointestinales, Tumores de células germinales, Tumor trofoblástico gestacional, Leucemia de células pilosas, Cáncer de cabeza y cuello, Cáncer hepatocelular, Enfermedad de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, Hipergammaglobulinemia, Cáncer de hipofaringe, Cánceres intestinales, Melanoma intraocular, Carcinoma de células de los islotes, Cáncer de pancreático de células de los islotes, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de riñón, Cáncer de laringe, Cáncer del labio y la cavidad oral, Cáncer de hígado, Cáncer de pulmón, Trastornos linfoproliferalivos, Macroglobulinemia, Cáncer de mama masculino, Mesotelioma maligno, Timoma maligno, Meduloblastoma, Melanoma, Mesotelioma, Cáncer de cuello escamoso primario oculto metastásico, Cáncer de cuello escamoso primario metastásico, Cáncer de cuello escamoso metastásico, Mieloma múltiple, Mieloma múltiple/neoplasma de células de plasma, Síndrome mielodisplásico, Leucemia mielógena, Leucemia mieloide, Trastomos mieloproliferativos, Cáncer de la cavidad nasal y los senos paranasales, Cáncer de la nasofaringe, Neuroblastoma, Linfoma no Hodgkin durante el embarazo, Cáncer de piel distinto de melanoma, Cáncer de pulmón de células no pequeñas, Cáncer de cuello escamoso metastásico primario oculto, Cáncer de la orofaringe, Osteocarcoma fibroso maligno, Osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, Osteosarcomafhistiocitoma fibroso maligno del hueso, Cáncer epitelial de ovario, Tumor de células germinales de ovario, Tumor de bajo potencial maligno de ovario, Cáncer de páncreas, Paraproteinemias, Púrpura, Cáncer de paratiroides, Cáncer de pene, Feocromocitoma, Tumor de la hipófisis, Neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiple, Lintoma del sistema nervioso central primario, Cáncer de hígado primario, Cáncer de próstata, Cáncer de recto, Cáncer de células renales, Cáncer de pelvis renal y uréter, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de glándula salival, Sarcoidosis, Sarcomas, Síndrome de Sezary, Cáncer de piel, Cáncer de pulmón de células pequeñas, Cáncer del intestino delgado, Sarcoma de tejido blando, Cáncer de cuello escamoso, Cáncer de estómago, Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineales, Linfoma de células T, Cáncer testicular, Timoma, Cáncer de tiroides, Cáncer de células de transición de la pelvis renal y el uréter, Cáncer de transición de la pelvis renal y el uréter, Tumores trofoblásticos, Cáncer de células del uréter y pelvis renal, Cáncer de la uretra, Cáncer uterino, Sarcoma uterino, Cáncer vaginal, Glioma de las rutas ópticas y del hipotálamo, Cáncer de vulva, Macroglobu linemia de Waldenstrom, Tumor de Wilms, y cualquier otra enfennedad hiperproliferativa, además de las neoplasias, situada en un sistema de órganos enumerado anteriormente.
En otra realización preferida, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar afecciones premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo, pero no limitado a los trastornos descritos anteriormente. Tales usos están indicados en las afecciones que se sabe o sospecha que preceden la progresión a neoplasia o cáncer, en particular, cuando el crecimiento de células no neoplásicas consiste en hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, se ha producido displasia (para una revisión de tales afecciones de crecimiento anormal, véase Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2quot; Ed., WB Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-79)
La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada, que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. Los trastomos hiperplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia de los ganglios linfáticos mediastinal angiotolicular, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia de melanocitos atípica, hiperplasia de células basales, hiperplasia gigante benigna de los ganglios linfáticos, hiperplasia del cemento, hiperplasia suprarrenal congénita, hiperplasia congénita sebácea, hiperplasia quística, hiperplasia quistica de la mama, hiperplasia de la dentadura, hiperplasia ductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar inlravascular, hiperplasia nodular de la próstata, hiperplasia nodular regenerativa, hiperplasia seudoepiteliomatosa, hiperplasia sebácea sen il, e hiperplasia verrucosa
La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en la que un tipo de células adultas o completamente diferenciadas sustituye a olro tipo de célula adulta. Los traslomos metaplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proleinas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, metaplasia mieloide agnogénica, metaplasia apocrina, metaplasia atípica, metaplasia autoparenquimatosa, metaplasia del tejido conectivo, metaplasia epitelial, metaplasia intestinal, anemia metaplásica, osificación metaplásica, pólipos metaplásicos, metaplasia mieloide, metaplasia mieloide primaria, metaplasia mieloide secundaria, metaplasia escamosa, metaplasia escamosa del amnios, y metaplasia mieloide sintomática
La displasia es frecuentemente un precursor del cáncer, y se encuentra principalmente en los epitelios; es la fonna más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, que implica una pérdida en la uniformidad celular individual y en la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas a menudo tienen núcleos anormalmente grandes, profundamente teñidos, y exhiben pleomorfismo. La displasia se produce caracteristicamente cuando existe una irritación o inflamación crónicas. Los trastornos displásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, displasia ectodénnica anhidrótica, displasia anterofacial, displasia torácica asfixiante, displasia atriodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroeclodérmica, displasia cleidocraneal, displasia ectodérmica congénita, displasia craniodiafisaria, displasia craniocarpotarsal, displasia craniometafisaria, displasia dentina, displasia diafisaria, displasia ectodérmica, displasia del esmalte, displasia encéfalo-oftálmica, displasia epifisaria hemimélica, displasia epifisaria múltiple, displasia epifisaria punctata, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital, displasia fibrosa familiar de mandíbulas, displasia familiar de pliegues blancos, displasia fibromuscular, displasia fibrosa, displasia ósea florida, displasia renal-retiniana hereditaria, displasia ectodénnica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica, displasia timica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial, displasia metafisaria, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mucoepitelial, displasia epifisaria múltiple, displasia oculoauriculovertebral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasia odontogénica, displasia oftalmomandibulomélica, displasia del cemento periapical, displasia fibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisaria pseudoacondroplásica, displasia de retina, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisaria, y displasia ventriculorradial
Los trastomos pre-neoplásicos adicionales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir yfo tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastomos disproliferativos benignos (p. ej., tumores benignos, afecciones fibroquísticas, hipertrofia del tejido, pólipos intestinales, pólipos en el colon, y displasia esofágica), leucoplasia, queratosis, enfennedad de Bowen, Piel del granjero, queilitis solar, y la queratosis solar.
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para diagnosticar y/o pronosticar trastomos asociados con el tejido o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención.
En otra realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención conjugados con una toxina o un isótopo radiactivo, como se describe en la presente memoria, se pueden utilizar para tratar cánceres y neoplasmas, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la presente memoria. En una realización preferida adicional, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención conjugados con una toxina o un isótopo radiactivo, como se describe en la presente memoria, se pueden utilizar para tratar la leucemia miel6gena aguda.
Además, las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenci6n pueden afectar a la apoptosis, y por ID tanto, serían útiles en el tratamiento de numerosas enfennedades asociadas con el aumento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis. Por ejemplo, las enfermedades asociadas con el aumento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que podrian ser diagnosticadas, pronosticadas, prevenidas y/o tratadas mediante los polinucleótidos, polipéptidos, y/o agonistas o antagonistas de la invención, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones de p53 y tumores dependientes de honnonas, incluyendo, pero no limitados a cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunitarios tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfennedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto v. anfitrión, rechazo agudo de injerto, y rechazo crónico de injerto.
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de cánceres, en particular de los mencionados anteriormente.
Otras enfermedades o afecciones asociados con el aumento de la supervivencia celular que podrían ser diagnosticados, pronosticados, prevenidos y/o tratados mediante proteínas de fusión de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, progresión yfo metástasis de neoplasias malignas y trastornos relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (p. ej., leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluyendo leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (p. ej., leucemia mielocítica (granulocítica) crónica y leucemia linfocítica crónica», policitemia vera, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin y
enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenslrom, enfermedad de la cadena pesada y tumores sólidos incluyendo, pero no limitados a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de W ilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblasloma
Las enfermedades asociadas con el aumento de la apoptosis que podrían ser diagnosticadas, pronosticadas prevenidas ylo tratadas mediante las proteínas de fusión de la invenciórl ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen SIDA; trastomos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Par1lt;inson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada con priones); trastornos autoinmunitarios (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario y artritis reumatoide) síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad de injerto v anfitrión, lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y lesión por reperfusión), lesión de hígado (p. ej., lesión hepática relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis (lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado); enfermedad del hígado inducida por toxinas (tales como las causadas por el alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia
Las enfermedades y/o trastomos hiperproliferativos que podrían ser diagnosticados, pronosticados, prevenidos ylo tratados mediante las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, neoplasmas situados en el hígado, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y tracto urogenital.
De manera similar, otros trastomos hiperproliferativos también pueden ser diagnosticados, pronosticados, prevenidos ylo tratados mediante las proteínas de fusión de la invenciórl y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Los ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, localizada en un sistema de órganos enumerado anteriormente.
otra realización preferida utiliza polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención para inhibir la división celular aberrante, mediante terapia génica utilizando la presente invención, ylo fusiones de proteínas o fragmentos de las mismas.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para tratar trastornos de proliferación celular insertando en una célula en proliferación anormal un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, en donde dicha polinucleótido reprime dicha expresión.
otra realización de la presente invención proporciona un método de tratamiento de trastornos de proliferación de células en individuos que comprende la administración de una o más copias de genes activos de la presente invención a una célula o células que proliferan anormalmente. En una rea lización preferida, los polinucleótidos de la presente invención son un constructo de ADN que comprende un vector de expresión recombinante eficaz para expresar una secuencia de ADN que codifica dichos polinucleótidos. En otra realización preferida de la presente invención, el constructo de ADN que codifica la proteína de fusión de la presente invención se introduce en las células a tratar utilizando un retrovirus, o más preferiblemente un vector adenoviral (Véase G J. Nabel, el. al., PNAS 199996: 324-326, que se incorpora a la presente memoria como referencia). En una realización muy preferida, el vector viral es defectuoso y no transformará las células que no están en proliferación, solamente las células que están en proliferación. Además, en una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención insertados en células en proliferación, ya sean solos, o combinados o fusionados con otros polinucleótidos, pueden ser modulados a través de un estímulo externo (es decir, magnético, específico de molécula pequeña, producto químico,
o administración de fármaco, etc.), que actúa sobre el promotor aguas arriba de dichos pol inucleótidos para inducir la expresión del producto proteico codificado. Como tal, el efecto terapéutico beneficioso de la presente invención puede ser modulado expresamente (es decir, para aumentar, disminuir o inhibir la expresión de la presente invención) basándose en dicho estímulo extemo Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser útiles en la represión de la expresión de los genes
oncogénicos o antigenos. Por ~reprimir la expresión de los genes oncogénicos~ se quiere significar la supresión de la transcripción del gen, la degradación del transcrito génico (pre-ARN mensajero), la inhibición del corte y empalme, la destrucción del ARN mensajero, la prevención de las modificaciones post-traduccionales de la proteína, la destrucción de la proteína, o la inhibición de la función normal de la proteína.
Para la administración local a células que proliferan anormalmente, los polinucleótidos de la presente invención se pueden administrar por cualquier método conocido por los expertos en la técnica incluyendo, pero no limitado a transfecdón, electroporación, microinyección de células, o en vehículos tales como liposomas, lipofectina, o en forma de polinucleólidos desnudos, o cualquier otro método descrito en toda la memoria descriptiva. El polinucleótido de la presente invención se puede suministrar por sistemas de suministro de genes conocidos tales como, pero llO limitados a, vectores retrovirales (Gilboa, J. Virology 44: 845 (1982); Hocke, Nature 320: 275 (1986); Wilson, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 3014), sistemas de virus vaccinia (Chakrabarty et al., Mol Cell Biol 5: 3403 (1985) u otros sistemas de suministro de AON eficientes (Yates et al., Nature 313: 812 (1985)) conocidos por los expertos en la técnica. Estas referencias son solamente ilustrativas y se incorporan a la presente como referencia Con el fin de suministrar especificamente o transfectar células que están proliferando de manera anormal y evitar las células que no están en división, es preferible utilizar un sistema de suministro de retrovirus, o adellOviral (como se describe en la técnica yen otra parte en la presente memoria) conocidos por los expertos en la técnica. Puesto que se requiere la replicación del ADN del anfitrión para que el AON retroviral se integre y el retrovirus sea incapaz de auto-replicarse debido a la falta de los genes de retrovirus necesarios para su ciclo de vida, la utilización de semejante sistema de suministro retroviral para los polinucleótidos de la presente invención dirigirá dicho gen y conslructos a células que están en proliferación anormalmente y evitará las células normales que no estén en división
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden suministrar directamente a los sitios de trastorno/enfermedad proliferativos celulares en órganos internos, cavidades corporales y similares mediante el uso de dispositivos de formación de imágenes utilizados para guiar una aguja de inyección directamente al sitio de la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden administrar en sitios de la enfermedad en el momento de una intervención quirúrgica
Por ~enfermedad proliferativa celularquot; se entiende cualquier enfermedad o trastorllO humano o animal, que afecta a uno cualquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades, o partes del cuerpo, que se caracteriza por proliferaciones anormales locales únicas o múltiples de células, grupos de células, o tejidos, ya sean benignos o malignos
Se puede administrar cualquier cantidad de los polinucleótidos de la presente invención con tal que tenga un efecto biológicamente inhibidor sobre la proliferación de las células tratadas. Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos de la presente invención simultáneamente al mismo sitio. Por ~ inhibir biol6gicamente~ se quiere significar la inhibición del crecimiento parcial o total, así como la disminución de la tasa de proliferación o crecimiento de las células. La dosis biológicamente inhibidora se puede determinar mediante la evaluación de los efectos de los polinucleótidos de la presente invención sobre la neoplasia maligna diana o el crecimiento de células que proliferan anormalmente en un cultivo de tejidos, el crecimiento del tumor en animales y cultivos celulares, o cualquier otro método conocido para un experto ordinario en la técnica
Por otra parte, las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención de la presente invención son útiles en la inhibición de la angiogénesis de las células o tejidos proliferativos, ya sea solos, como una proteina de fusión, o combinados con otro polipéptidos directa o indirectamente, como se describe en la presente memoria. En una realización muy preferida, dicho efecto antiangiogénico se puede lograr indirectamente, por ejemplo, a través de la inhibición de células específicas de tumores, hematopoyéticas, tales como macrófagos asociados al tumor (Véase Joseph lB, et al., J Natl Cancer Inst, 90 (21): 1648-1653 (1998), que se incorpora a la presente como referencia).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en la inhibición de células o tejidos proliferativos a través de la inducción de la apoptosis. Estas proteínas de fusión y/o polinucleótidos pueden actuar directamente, o indirectamente para inducir la apoptosis de células y tejidos proliferativos, por ejemplo, en la activación de un receptor de dominio muerte, tal como el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNF), CD95 (Fas/APO-1), proteina mediadora de apoptosis relacionada con receptor de TNF (TRAMP) Y receptor 1 y 2 del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) (Véase Schulze-Osthoff K, et al., Eu r J Biochem 254 (3): 439-59 (1998), que se incorpora a la presente como referencia). Por otra parte, en otra realización preferida de la presente invención, estas proteinas de fusión y/o polinucleótidos pueden inducir la apoptosis a través de otros mecanismos, tales como la activación de otras proteínas que activarán la apoptosis, o a través de la estimulación de la expresión de estas proteínas, ya sea solos o combinados con fármacos de molécula pequeña o coadyuvantes, como apoptonina, galectinas, tiorredoxinas, proteínas antiinflamatorias (Véanse por ejemplo, Mutat Res 400 (1-2): 447-55 (1998), Med Hypotheses. 50(5): 423-33 (1998), Chem Biol lnteract 24 Abr; 111-112:. 23-34 (1998), J Mol Med 76(6): 402-12 (1998), In! J Tissue React; 20(1): 3-15 (1998), que se incorporan todos a la presente como referencia) Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles en la inhibición de la metástasis de células o tejidos proliferativos. La inhibición se puede producir como resultado directo de la administración de estas proteínas de fusión de albúmina yfo polinucleótidos, o indirectamente, por ejemplo activando la expresión de proteinas conocidas por inhibir la metástasis, por ejemplo alfa 4 integrinas, (Véase, p. ej., Curr Top Microbiol Immunol 1998; 231. 125-41, que se incorpora a la presente como referencia). Semejantes efectos terapéuticos de la presente invención se pueden lograr solos, o combinados con fármacos de molécula pequeña o coadyuvantes
En otra realización, la invenciórJ proporciona un procedimiento de suministro de las composiciones que contienen las proteínas de fusión de albúmina de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención a células diana que expresan el polipéptido unido por, que se une a, o asociado con una proteína fuison albúmina de la invención. Las proteinas de fusión de albúmina de la invención pueden estar asociadas con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos a traves de interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles en la mejora de la inmunogenicidad yfo antigenicidad de las células o tejidos en proliferación, ya sea directamente, tal como ocurriría si las proteínas de fusión de albúmina de la invención 'vacunaran' la respuesta inmunitaria para responder a antigenos e inmunógenos proliferativos, o indirectamente, como en la activación de la expresión de proteínas conocidas por mejorar la respuesta inmunitaria (p ej., quimioquinas), a dichos antígenos e inmunógenos
Trastornos renafes
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar yfo pronosticar trastomos del sistema renal. Los trastornos renales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir yfo tratar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal, nefritis, trastomos de los vasos sanguíneos de los riñones, trastornos renales metabólicos y congénitos, trastornos urinarios del riñón, trastornos autoinmunitarios, esclerosis y necrosis, desequilibrio electrolitico, y cánceres de riñón
Las enfermedades del riñón que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica, enfermedad renal en fase terminal, enfermedades inHamatorias del riñón (p. ej., glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis postinfecciosa, glomerulonefritis rápidamente progresiva, sindrome nefrótico, glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrótico familiar, glomerulonefritis membranoproliferativa I y 11, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis crÓflica, nefritis tubulointersticial aguda, nefritis tubulointersticial crÓflica, glomerulonefritis post-estreptocócica aguda (GNPE), pielonefritis, nefritis por lupus, nefritis crónica, nefritis intersticial y glomerulonefritis post-estreptocócica), trastomos de los vasos sanguíneos de los riñones
(p. ej., infarto de riñón, enfermedad ateroembólica del riñón, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis de la vena renal, hipopertusión renal, retinopatia renal, isquemia-repertusión renal, embolia de la arteria renal y estenosis de la arteria renal), y trastornos renales resultantes de enfermedad del tracto urinario (p. ej., pielonefritis, hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis), nefropatía por reHujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria, y uropatía obslructiva unilateral aguda o crónica)
Además, las composiciones de la invención se pueden utilizar para diagnosticar, pronosticar, prevenir yfo tratar trastomos metabólicos y congénitos del riñón (p. ej., uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, glucosuria renal, diabetes insipida nefrogénica, cistinuria, sindrome de Fanconi, osteosis fibroquistica renal (raquitismo renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddle, enfermedad renal poliquística, enfermedad quistica medular, riñón en esponja medular, sindrome de Alport, síndrome uña-rótula, sindrome nefrótico congénito, síndrome de aplastamiento, riñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes insípida nefrogénica, nefropatía analgésica, cálculos renales y nefropatía membranosa), y trastornos autoinmunitarias del riñón (p. ej., lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Goodpasture, nefropatía por IgA, glomerulonefritis proliferativa mesangial por IgM).
Las composiciones de la invención también se pueden utilizar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón (p. ej., glomeruloesclerosis, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS), glomerulonefritis necrotizante, y mecrosis papilar renal), cánceres de riñón (p. ej., nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células renales, cáncer de células de transición, adenocarcinoma renal, cáncer de células escamosas y tumor de Wilm), y desequilibrios de eleclrolitos (p. ej., nefrocalcinosis, piuria, edema, hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipematremia, hipopotasemia, hiperpotasemia, hipocalcemia, hipercalcemia, hipofosfatemia e hiperfosfatemia)
Las composiciones de la invención se pueden administrar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, inyección directa con aguja en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración tópica, infusión con catéter, inyectores biolisticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja Gelfoam, otros materiales de depósito disponibles en el mercado, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o en supositorios, aplicaciones tópicas o de decantación durante la cirugía, suministro en aerosol.
Tales métodos son conocidos en la técnica. Las composiciones de la invención se pueden administrar como parte de un agente terapéutico, descrito con más detalle a continuación Los métodos de suministro de polinucleótidos de la invención se describen con más deta lle en la presente memoria.
Trastornos cardiovasculares
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar ylo pronosticar trastornos cardiovasculares, incluyendo, pero no limitados a, enfermedad de las arterias periféricas, tal como isquemia de las eld:remidades
Los trastornos cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, anomalías cardiovasculares, tales como fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos congénitos del corazón, atresia pulmonar y Síndrome de la cimitarra. Los defectos cardíacos congénitos incluyen, pero no se limitan a, coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos corona rios, corazón en Criss CfOSS, deld:rocardia, ductus arterioso persistente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia tricúspide, tronco arterioso persistente y defectos del tabique del corazón, tales como defecto del septo aortopulmonar, defectos del relieve endocárdico, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales ventriculares del corazón
Los trastornos cardiovasculares también incluyen, pero no se limitan a, enfermedades del corazón, tales como arritmias, enfermedad carcinoide cardíaca, gasto cardíaco alto, gasto cardíaco bajo, taponamiento cardiaco, endocarditis (incluyendo bacteriana), aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, rotura cardíaca después del infarto, ruptura septal ventricular, enfermedades de las válvulas del corazón, enfermedades del miocardio, isquemia de miocardio, derrame pericárdico, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), neumopericardio, síndrome postpericardiotomía, enfermedad cardíaca pulmonar, cardiopatía reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares del embarazo, síndrome de la Cimitarra, sífi lis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
Las arritmias incluyen, pero no se limitan a, arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, eld:rasístole, Síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo sinoauricular, síndrome de QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitacián de tipo Mahaim, síndrome de WolffParkinson-White, síndrome del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia por reentrada nodal atrioventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia por reentrada nodal sinusal, taquicardia sinusal, taquicardia ventricular en entorchado y taquicardia ventricular.
Las enfermedades de las válvulas cardíacas incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.
Las enfermedades miocárdicas incluyen, pero no se limitan a, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía por Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, Síndrome de Keams, lesión por repertusión del miocardio, y miocarditis.
Las isquemias miocárdicas incluyen, pero no se limitan a, enfermedad corooaria, tal como angina de pecho, aneurisma coronario, arterioesclerosis coronaria, trombosis corona ria, vasoespasmo corona rio, infarto de miocardio y disfunción contráctil postisquémica.
Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, Enfermedad de Hippel-Lindau, Síndrome de Klippel-TrenaunayWeber, Síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades de la aorta, arteritis de Takayasu, aortitis, Síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nadosa, trastornos cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno-oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retiniana, síndrome de la Cimitarra, síndrome de vena cava superior, telangiectasia, ataxia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vascu litis e insuficiencia venosa
Los aneurismas incluyen, pero no se limitan a, aneurismas desecantes, falsos aneurismas, aneurismas infectados, aneurismas rotos, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarios, aneurismas cardíacos y aneurismas ilíacos.
Las enfermedades oclusivas arteriales incluyen, pero no se limitan a, arteriosclerosis, claudicación intermitente, estenosis de la carótida, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción de la arteria renal, oclusión de la arteria retiniana, y tromboangeitis obliterante.
Los trastornos cerebrovasculares incluyen, pero no se limitan a, enfermedades de la arteria carótida, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de la arteria cerebral, embolia y trombosis cerebral, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria), síndrome de robo de la subclavia, leucomalacia periventricular, dolor de cabeza vascular, dolor de cabeza en racimos, migraña e insuficiencia vertebrobasilar
Las embolias incluyen, pero no se limitan a, embolias de aire, embolias de líquido amniótico, embolias de colesterol, síndrome del dedo del pie azul, embolias de grasa, embolias pulmonares, y tromoboembolias. Las trombosis incluyen, pero no se limitan a, trombosis coronaria, trombosis de la vena hepática, oclusión de la vena retiniana, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, sindrome de Wallenberg y tromboflebitis
Los trastorllOs isquémicos incluyen, pero no se limitan a, isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes de compartimiento, síndrome del compartimiento anterior, isquemia miocárdica, lesiones de reperfusiórJ e isquemia del miembro periférico. Las vasculitis incluyen, pero no se limitan a, aortitis, arteritis, Síndrome de Behcet, Síndrome de Churg-Strauss, síndrome del ganglio linfático mucocutáneo, tromboangeitis obliterante, vasculitis por hipersensibilidad, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, inyección directa con aguja en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósito de esponja de Gelfoam, otros materiales de depósito disponibles en el mercado, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o en supositorios, aplicaciones de decantación o tópicas durante la cirugía, suministro en aerosol. Tales métodos son conocidos en la técnica. Los métodos de suministro de polinucleótidos se describen con más deta lle en la presente memOfia.
Trastornos respiratorios
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar, y/o pronosticar las enfermedades y/o trastornos del sistema respiratorio
Las enfermedades y trastomos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a, vestibulitis nasal, rinitis llO alérgica (p. ej., rinitis aguda, rinitis crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotora), pólipos nasales, y sinusitis, angiofibromas juveniles, cáncer de la nariz y papilomas juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos (nódulos de cantante), úlceras de contacto, parálisis de las cuerdas vocales, laringoceles, faringitis (p. ej., viral y bacteriana), amigdalitis, celulitis tonsilar, absceso parafaríngeo, laringitis, laringoceles, y cánceres de garganta (p. ej., cáncer de nasofaringe, cáncer de amígdalas, cáncer de laringe), cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas (células de avena), carcillOma de células grandes, y adenocarcinoma), trastornos alérgicos (neumonía eosinófila, neumonitis por hipersensibilidad (p. ej., alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica, neumoconiosis por polvo orgánico, aspergilosis broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener (vasculitis granulomatosa), síndrome de Goodpasture», neumonía (p. ej., neumonía bacteriana (p. ej ., Streptococcus pneumoniae (neumooia pneumoc6cica), Staphylococcus aureus (neumonía estafiloc6cica), neumonia bacteriana Gram-negativa (causada por, p. ej., Klebsiella y Pseudomonas spp.), neumonía por Mycoplasma pneumoniae, neumonía por Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila (enfermedad del legionario), y Ghlamydia psittaci (psitacosis)), y neumonía viral (p. ej ., gripe, varicela (varicela).
otras enfermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, pero no se limitan a bronquiolitis, polio (poliomelitis), croup, infección por virus respiratorio sincitial, paperas, eritema infeccioso (quinta enfermedad), roseola infantum, panencefalitis por rubéola progresiva, sarampión alemán y panencefa litis esclerosante subaguda), neumonía por hongos (p. ej., histoplasmosis, coccidioidomicosis, blastomicosis, infecciooes por hongos en personas con sistemas inmunológicos gravemente deprimidos (p. ej., criptococosis, causada por Cryptococcus neoformans; aspergilosis, causada por Aspergillus spp., candidiasis, causadas por Gandida; y mucormicosis», Pneumocystis carinii (neumonía por Pneumocystis), neumonías atípicas (por ejemplo, Mycoplasma y Ghlamydia spp.), neumonía oportunista por infección, neumonía nosocomial, neumonitis química, y neumonía por aspiración, trastornos pleurales (p. ej., pleuresía, derrame pleural, y neumotórax (p. ej., neumotórax espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax por tensión)), enfermedades obstructivas de las vías respiratOfias (p. ej., asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, brooquitis crónica o aguda ), enfermedades laborales de los pulmones (p. ej., silicosis, pulmón negro (neumoconiosis de los mineros del carbón), asbestosis, beriliosis, asma ocupacional, bisinosis, y neumoconiosis benigna), enfermedad pulmonar infiltrativa (p. ej., fibrosis pulmonar (p ej., alveolitis fibrosante, neumonía intersticial usual), fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial descamativa, neumonía intersticial linfoide, histiocitosis X (p. ej., enfermedad de Letterer-Siwe, enfermedad Hand-Schüller
Christian, granuloma eosinófilo), hemosiderosis pulmonar idiopática, sarcoidosis y proteinosis alveolar pulmonar), sindrome de dificultad respiratoria aguda (también llamado, p. ej., síndrome de distrés respiratorio), edema, embolia pulmonar, bronquitis (p. ej., bacteriana viral), bronquiectasia, atelectasia, abscesos del pulmón (causados, p. ej., Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila), y fibrosis quística
Actividad anti-angiogénesis
El equilibrio natural entre estimuladores e inhibidores endógenos de la angiogénesis es uno equilibrio en el que predominan las influencias inhibidoras. Rastinejad et al., Cell 56: 345-355 (1989). En aquellos raros casos en los que la neovascularización ocurre bajo condiciones fisiológicas normales, tales como la curación de heridas, la regeneración de órganos, el desarrollo embrionario, y los procesos reproductivos femeninos, la angiogénesis está estrictamente regulada y espacial y temporalmente delimitada. En condiciones de angiogénesis patológica, tales como las que caracterizan el crecimiento de los tumores sólidos, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis no regulada se convierte en patológica y mantiene la progresión de muchas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. Numerosas enfermedades graves están dominadas por una neovascularización anormal induyendo el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos, la artritis, algunos tipos de trastomos oculares, y la psoriasis. Véanse, p. ej., las revisiones de Mases et al., Biotech. 9: 630-634 (1991); Folkman et al., N. Engl. J. Med., 333· 1757-1763 (1995); Auerbach et al., J. Microvasc. Res. 29: 401-411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Research, eds. Klein y Weinhouse, Academic Press, Nueva York, págs. 175-203 (1985); Patz, Am. J. Opthalmol. 94: 715-743 (1982); Y Folkman et al., Science 227: 719-725 (1983). En numerosas afecciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de enfermedad. Por ejemplo, se han acumulado datos significativos que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos depende de la angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 255: 442-447 (1987).
La presente invención proporciona el tratamiento de enfermedades o trastomos asociados con la neovascularización mediante la administración de proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Las afecciones malignas y metastásicas que se pueden tratar con los polinucleótidos y polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores malignos, tumores sólidos y cánceres descritos en este documento y conocidos de otra manera en la técnica (para una revisión de tales trastornos, véase Fishman et al., Medicina, 2a ed., J.B. Lippincott Ca., Filadelfia (1985». Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad y/o trastorno relacionado con la angiogénesis, que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteina de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteina de fusión de albúmina de la invención. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar en una variedad de métodos adicionales con el fin de tratar terapéuticamente un cáncer o tumor. Los cánceres que se pueden tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículo, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, tiroides; tumores primarios y metástasis; mela nomas; glioblastoma; Sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorrectal; neoplasias malignas avanzadas; y tumores presentes en la sangre tales como leucemias. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden suministrar por vía tópica, con el fin de tratar cánceres tales como cáncer de piel, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama, y sarcoma de Kaposi
En otros aspectos adicionales, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar formas superticiales de cáncer de vejiga mediante, por ejemplo, administración intravesical. Las proteínas de fusión de albúmína de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser suministrados directamente en el tumor, o cerca del sitio del tumor, a través de una inyección o un catéter. Por supuesto, como apreciará el experto en la técnica, el modo apropiado de administración variará según el cáncer a tratar. otros modos de administración se comentan en la presente memoria.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útites en el tratamiento de otros trastomos, además de cánceres, que implican angiogénesis. Estos trastomos incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos, pOf ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piógenos; placas arterioescleróticas; enfermedades oculares angiogénicas, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de cómea, glaucoma neovascular, fibroplasia relrolenlal, rubeosis, retinoblasloma, uveílis y pterigión (crecimiento anormal de los vasos sanguineos) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatrización de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de extremidades isquémicas; Síndrome de Osler-Webber; neovascularización de la placa; telangiectasia; articulaciones hemofilicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; Enfermedad de Crohn; yaterosclerosis Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para el tratamiento de cicatrices hipertróficas y queloides, que comprenden la etapa de administrar proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención a una cicatriz hipertrófica o queloide
En una realización de la presente invención, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se inyectan directamente en una cicatriz hipertrófica o queloide, con el fin de prevenir la progresión de estas lesiones. Esta terapia tiene un especial valor en el tratamiento profiláctico de afecciones que se sabe que dan como resultado el desarrollo de cicatrices hipertróficas y queloides
(p. ej., quemaduras), y se inicia preferiblemente después de que la fase proliferativa haya tenido tiempo para progresar (aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de la cicatriz hipertrófica
o queloide. Como se ha señalado anteriormente, la presente invención también proporciona métodos para tratar enfermedades neovasculares del ojo, incluyendo por ejemplo, neovascularización de la cómea, glaucoma neovascular, retinopatía diabética proliferativa, fibroplasia retrolental y degeneración macular.
Además, los trastomos oculares asociados con la neovascularización que se pueden tratar con las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a: glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveítis, retinopalía del prematuro, degeneración macular, neovascularización de injerto comeal, así como otras enfermedades inquot;amatorias del ojo, tumores oculares y enfermedades asociadas con la coroides o neovascularización del iris. Véanse, p. ej., las revisiones Waltman et al., Am. J. OphthaL 85: 704-710 (1978) Y Gartner et Cil, Surv. OphthaL 22: 291 -312 (1978)
Por lo tanto, en un aspecto de la presente invenciÓfl se proporcionan métodos para el tratamiento de enfermedades neovasculares del ojo, tales como neovascularización comeal (incluyendo neovascularización del injerto comeal), que comprenden la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéutica mente eficaz de un compuesto (p ej., proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓn) a la cómea, de manera que la formación de vasos sanguíneos sea inhibida. En pocas palabras, la cómea es un tejido que normalmente carece de vasos sanguíneos. En ciertas condiciones patológicas, sin embargo, los capilares pueden extenderse a la cómea desde el plexo vascular pericomeal del limbo. Cuando la córnea se vasculariza, también se enturbia, dando lugar a una disminución de la agudeza visual del paciente. La pérdida visual puede llegar a ser completa si la cómea se opacifica por completo. Una amplia variedad de trastornos pueden dar lugar a la neovascularización corneal, incluyendo, por ejemplo, infecciones de la córnea (p. ej., tracoma, queratitis por herpes simple, leishmaniasis y oncocerciasis), procesos inmunológicos (por ejemplo, rechazo de injerto y síndrome de Stevens-Johnson), quemaduras alcalinas, trauma, inquot;amación (de cualquier causa), estados de deficiencia nutricional y tóxicos, y como complicación del uso de lentes de contacto.
En realizaciooes particularmente preferidas de la invención, se pueden preparar para la administración tópica en solución salina (combinados con cualquiera de los conservantes y agentes antimicrobianos utilizados comúnmente en preparaciones oculares), y administrar en forma de colirio. La solución o suspensión se puede preparar en su forma pura y administrar varias veces al día. Alternativamente, las composiciones anti-angiogénicas, preparadas como se ha descrito anteriormente, se pueden administrar también directamente a la córnea. En realizaciones preferidas, la composición anti-angiogénica se prepara con un polímero mucoadhesivo que se une a la cómea. En realizaciones adicionales, los factores anti-angiogénicos o las composiciones anti-angiogénicas se pueden utilizar como un complemento a la terapia convencional con esteroides. La terapia tópica puede ser útil también profilácticamente en lesiones de la córnea que se sabe que tienen una alta probabilidad de inducir una respuesta angiogénica (tales como quemaduras químicas). En estos casos el tratamiento, probablemente combinado con esteroides, se puede instituir inmediatamente para ayudar a prevenir las posteriores complicaciones
En otras realizaciones, los compuestos descritos anteriormente pueden ser inyectados directamente en el estroma corneal por un oftalmólogo con la ayuda de un microscopio. El sitio preferido de inyección puede variar con la morfología de la lesión individual, pero el objetivo de la administración sería colocar la composición en el frente de avance de la vasculatura (es decir, intercalado entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En la mayoría de los casos esto implicaría una inyección comeal perilímbica para quot;protegerquot; la cómea de los vasos sanguíneos que avanzan. Este método también se puede utilizar poco después de un insulto corneal con el fin de prevenir profilácticamente la neovascularización comeaL En esta situación el material podrla inyectarse en la córnea perilímbica intercalado entre la lesión comeal y su suministro potencial de sangre límbica no deseado. Tales métodos también se pueden utilizar de una manera similar para evitar la invasión capilar de las córneas trasplantadas. En una forma de liberaciÓfl sostenida, las inyecciones solamente podrían ser necesarias 2-3 veces por año. También se podria añadir un esteroide a la solución de inyección para reducir la inflamación resultante de la propia inyección
En otro aspecto de la presente invenciÓfl, se proporcionan métodos para tratar el glaucoma neovascular, que comprenden la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo polinucleótidos que codifican una proteina de fusión de albúmina de la invención al ojo, de tal manera que se inhibe la formación de vasos sanguíneos. En una realización, el compuesto se puede administrar tépicamente alojo con el fin de tratar las formas tempranas de glaucoma neovascular. En otras realizaciones, el compuesto se puede implantar mediante inyección en la región del ángulo de la cámara anterior. En
otras rea lizaciones, el compuesto también se puede colocar en cualquier ubicación de manera que el compuesto se libera continuamente en el humor acuoso. En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar la retinopatia diabética proliferativa, que comprenden la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéutica mente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención a los ojos, de manera que se inhibe la formación de vasos sanguíneos
En realizaciones particularmente preferidas de la invención, la retinopatía diabética proliferativa se puede tratar por inyección en el humor acuoso o el vitreo, con el fin de aumentar la concentración local del polinudeótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en la retina. Preferiblemente, este tratamiento debe iniciarse antes de contraer una enfermedad grave que requiera fotocoagulación
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar la fibroplasia retrolental, que comprenden la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican una proteina de fusión de albúmina de la invención al ojo, de tal manera que se inhiba la formación de vasos sanguíneos. El compuesto se puede administrar por vía tópica, mediante inyección intravítrea y/o mediante implantes intraoculares
Además, los trastornos que se pueden tratar con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemangioma, artritis, psoriasis, angiofibroma, placas ateroscleróticas, curación de heridas retardada, granulaciooes, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome Osler-Weber, granuloma piógeno, esclerodermia, tracoma y adherencias vasculares.
Por otra parte, los trastomos y/o estados, que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores de origen sanguineo tales como leucemias, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas pi6genos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatia diabética, retinopatía del prematuro, degeneraciÓfl macular, rechazo de injerto de cómea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveítis, retraso en la cicatrización de heridas, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas sin unión, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, angiogénesis miocárdica, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis del miembro isquémico, síndrome de OslerWebber, neovascularización de placa, telangiectasia, articulaciones hemofilicas, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, agente de control de la natalidad al impedir la vascularización requerida para la implantación del embrión controlando la menstruación, enfermedades que presentan angiogénesis como consecuencia patológica tal como la enfermedad por arañazo de gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacilar.
En un aspecto del método de control de natalidad, se administra una cantidad del compuesto suficiente para bloquear la implantación del embrión antes o después de que se hayan producido el coito y la fertilización, lo que proporciooa un método efectivo de control de la natalidad, posiblemente un método del quot;día despuésquot;. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden utilizar en el control de la menstruación o administrarse ya sea como un líquido de lavado peritoneal o para implantación peritoneal en el tratamiento de endometriosis
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se pueden incorporar a suturas quirúrgicas coo el fin de prevenir granulomas por las puntadas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser utilizados en una amplia variedad de procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, en un aspecto de la presente invención se puede utilizar una composición (en forma de, por ejemplo, una pulverización o película) para recubrir o pulverizar un área antes de la extirpación de un tumor, con el fin de aislar los tejidos normales circundantes del tejido maligno, y/o para prevenir la propagación de la enfermedad a los tejidos circundantes. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones (p. ej., en forma de una pulverización) se pueden administrar mediante procedimientos endoscópicos con el fin de recubrir tumores, o inhibir la angiogénesis en un entorno local deseado. En otros aspectos adicionales de la presente invención, se pueden utilizar mallas quirúrgicas que se han recubierto con composiciones anti-angiogénicas de la presente invención en cualquier procedimiento en el que se pueda utilizar una malla quirúrgica. Por ejemplo, en una realización de la invención, se puede utilizar una malla quirúrgica cargada con una composición anti-angiogénica durante la cirugía de resección de cáncer abdominal (p. ej., posterior a la resección de colon) con el fin de proporCionar apoyo a la estructura, y para liberar una cantidad del factor anti-angiogénico
En otros aspectos de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar sitios de extirpación de tumores,
que comprenden administrar las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl a los márgenes de resección de un tumor después de la extirpación, de manera que se inhiba la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio. En una realizaciÓfl de la invención, el compuesto anti-angiogénico se administra directamente al sitio de escisión del tumor (p. ej., aplicado mediante hisopo, cepillo o recubriendo de otro modo los bordes de resección del tumor con el compuesto anti-angiogénico). Alternativamente, los compuestos anli-angiogénicos se pueden incorporar a pastas quirúrgicas conocidas antes de la administración. En rea lizaciones particularmente preferidas de la invención, los compuestos anti-angiogénicos se aplican después de las resecciones hepáticas de neoplasias malignas, y después de operaciones neuroquifÚrgicas
En un aspecto de la presente invenciÓfl, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención se pueden administrar al margen de resección de una amplia variedad de tumores, incluyendo, por ejemplo, de mama, de colon, de cerebro y hepáticos. Por ejemplo, en una realización de la invención, los compuestos anti-angiogénicos se pueden administrar al silio de un tumor neurológico después de la extirpación, de tal manera que se inhiba la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden administrar junto coo otros factores anti-angiogénicos. Los ejemplos representativos de otros factores anti-angiogénicos incluyen: Factor Anti-Invasivo, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel, Suramin, inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 , inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2, inhibidor del activador del plasminógeno 1, inhibidor del activador del plasminógeno 2 y diversas formas de los metales de transición más ligeros del ~grupo d~.
Los metales de transición más ligeros del ~grupo d~ incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio, y tántalo. Estas especies de metales de transición pueden formar complejos de metales de transición. Los complejos adecuados de las especies de metales de transición menciooadas anteriormente incluyen oxocomplejos de metales de transición
Los ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen oxocomplejos de vanadio tales como complejos de vanadato y vanadilo. Los complejos de vanadato adecuados incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato tales como, por ejemplo, metavanadato de amonio, metavanadalo sódico y ortovanadato sódico. Los complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo. incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo, tales como mono-y tri-hidratos de sulfato de vanadilo.
Los ejemplos representativos de complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen oxocomplejos. Los oxocomplejos de tungstellO adecuados incluyen oxocomplejos de óxido de tungstato y tungsteno. Los complejos de tungstato adecuados incluyen tungstato de amonio, tungstato de calcio, dihidrato de tungstato sódico y ácido túngstico. Los óxidos de tungsteno adecuados incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI ). Los oxocomplejos de molibdeno adecuados incluyen molibdato, óxido de molibdeno y complejos de molibdenilo. Los complejos de molibdato adecuados incluyen molibdato amónico y sus hidratos, molibdato sódico y sus hidratos, y molibdato de potasio y sus hidratos. Los óxidos de molibdeno adecuados incluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI) y ácido molibdico. Los complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acelilacelonalo de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo que derivan, por ejemplo, de glicerol, ácido tartárico, y azúcares
Se puede utilizar una amplia variedad de otros factores anti-angiogénicos en el contexto de la presente invención Los ejemplos representativos incluyen factor plaquetario 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de cangrejo reina), (Murata et al., Cancer Res 51 . 22-26, 1991 ); complejos de polisacárido sulfatado-peptidoglicano (SP-PG) (la función de este compuesto puede ser mejorada por la presencia de esteroides tales como estrógeno y citrato de tamoxifeno); estaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-deshidroprolina, tiaprolina, alfa,alfadipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H}-oxazolona; metotrexato; mitoxantrona; heparina; interferones; 2 macroglobulina de suero; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio Chem. 267: 17321-17326, (1992»; Quimostatina (Tomkinson et al., Biochem J. 286: 475-480, (1992).); ciclodextrina tetradecasulfato; eponemicina; camplotecina; fumagilina (Ingber et al., Nature 348: 555-557, 1990); tiomalalo de oro y sodio (~GST~; Matsubara y Ziff, J. Clin Invest 79: 1440-1446, (1987)); anticolagenasa de suero; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J. Biol Chem 262 (4): 1659-1664, (1987)); bisantreno (Instituto Nacional del Cáncer); Lobenzarit disódico (ácido N-(2}-carboxifenil4-cloroantranilico disódico o ~CCN; Takeuchi et al., Agents Actions 36: 312-316, (1992)); talidomida; esteroides angiostáticos; AGM-1470;carboxinaminoimidazol; e inhibidores de metaloproteinasas tales como BB94
Enfermedades a nivel celular
Las enfermedades asociadas con el aumento de la supeNivencia celular o la inhibición de la apoplosis que se podrlan Ira lar, prevenir, diagnosticar ylo pronosticar ulilizando proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones de p53 y tumores dependientes de hormonas, incluyendo, pero no limitados a cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer
intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); trastornos autoinmunitarios (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad de injerto v. anfitrión, rechazo agudo del injerto, y rechazo crónico del injerto
En realizaciones preferidas, se utilizan las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiÓf'l de albúmina de la invención para inhibir el crecimiento, la progresión, y/o la metástasis de cánceres, en particular los mencionados anteriormente
Otras enfermedades o afecciones asociadas con el aumento de la supervivencia celular que se podrían tratar o detectar mediante las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, la progresión, y/o la metástasis de neoplasias malignas y trastomos relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (p. ej., leucemia linfodtica aguda, leucemia mieloide aguda (incluyendo mieloblástica, promielocitica, mielomonocítica, monocitica y eritroleucemia» y leucemias crónicas (p. ej., leucemia mieloide crónica (granulodtica) y leucemia linfodtica crónica)), policitemia vera, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada, y tumores sólidos, incluyendo, pero no limitados a, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma , condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogérJico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Witm, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangloma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma.
Las enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis que se podrian tratar, prevenir, diagnosticar ylo pronosticar utilizando las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, incluyen, pero no se limitan a, SIDA; trastomos neurodegeneralivos (tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar y tumor cerebral o enfermedad asociada con priones); trastomos autoinmunitarios (tales como, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario y artritis reumatoide) síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica ), enfermedad de injerto v. anfitrión, lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y lesión por reperfusión), lesión de hígado (p. ej., lesión hepática relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis (lesión de los conductos biliares) y cáncer de hígado); enfermedad del hígado inducida por toxinas (tal como la causada por el alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia
Curación de heridas y proliferación de células epiteliales
De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la utilización de proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, con fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación de células epiteliales y queratinocitos basales con el fin de cicatrizar heridas, y para estimular la producción de folículos pilosos y cicatrización de heridas dérmicas. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, pueden ser clínicamente útiles en la estimulación de la curación de heridas incluyendo heridas quirúrgicas, heridas por escisión, heridas profundas que implican daños de la dermis y epidermis, heridas del tejido ocular, heridas del tejido dental, heridas de la cavidad oral, úlceras diabéticas, úlceras dérmicas, úlceras de decúbito, úlceras arteriales, úlceras por estasis venosa, quemaduras que resultan de la exposición al calor o productos químicos, y otras afecciones de curación de heridas anormales tales como uremia, malnutrición, deficiencias de vitaminas y complicaciones asociadas con el tratamiento sistémico con esteroides, radioterapia y medicamentos antineoplásicos y antimetabolitos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl ylo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, se podrían utilizar para promover el restablecimiento dérmico posterior a la pérdida dérmica
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrian utilizar para aumentar la adherencia de injertos de piel a un lecho de la herida y estimular la reepitelización del lecho de la herida. Los siguientes son tipos de injertos en los que las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, podrían ser utilizados para aumentar la adherencia al lecho de la herida: autoinjertos, piel artificial, aloinjertos,
injertos autodérmicos, injertos autoepidérmicos, injertos avasculares, injertos de Blair-BroWT'l, injertos óseos, injertos brefoblásticos, injerto de cutis, injertos retardados, injerto dérmico, injerto epidérmico, injerto de fascia, injerto de espesor total, injerto heterólogo, xenoinjerto, injerto homólogo, injerto hiperplásico, injerto lamelar, injerto de malla, injerto de mucosa, Ollier-Thiersch, injerto omenpal, injerto de parche, injerto pediculado, injerto penetrante, injerto laminar de piel, injerto de todas las capas de piel. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para promover la fuerza de la piel y para mejorar el aspecto de la piel envejecida
Se cree que las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleólidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, también producirán cambios en la proliferación de hepatocitos, y la proliferación de células epiteliales en el pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado, e intestino grueso. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invenciÓfl, podrían promover la proliferación de células epiteliales tales como sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo IJ , células caliciformes productoras de mucina, y otras células epiteliales y sus progenitoras contenidas en la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, pueden promover la proliferación de células endoteliales, queratinocitos, y queratinocitos basales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, también se podrían utilizar para reducir los efectos secundarios de la toxicidad intestinal que resulta de los tratamientos de radiación, quimioterapia o infecciones virales. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, pueden tener un efecto ciloprotector sobre la mucosa del intestino delgado. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, también pueden estimular la curación de mucositis (úlceras en la boca) que resultan de la quimioterapia e infecciones virales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrían utilizar adicionalmente en la regeneración de la piel en defectos en el grosor parcial o completo de la piel, incluyendo quemaduras (es decir, repoblación de folículos pilosos, glándulas sudoríparas y glándulas sebáceas), tratamiento de otras defectos de la piel como la psoriasis. Las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, podrían utilizarse para tratar la epidermolisis bullosa, un defecto en la adherencia de la epidermis a la dermis subyacente que da lugar a ampollas frecuentes, abiertas y dolorosas acelerando la reepitelizacián de estas lesiones. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, también se podrían utilizar para tratar úlceras gástricas y duodenales y ayudar a curar mediante la formación de cicatrices del revestimiento de la mucosa y la regeneración de la mucosa glandular y el revestimiento de la mucosa duodenal más rápidamente. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis I-Ilcerosa, son enfermedades que dan lugar a la destrucción de la superficie mucosa del intestino delgado o grueso, respectivamente. Así, las proteínas de fusión de la invenciórJ y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiÓfl de albúmina de la invención, se podrían utilizar para promover el rejuvenecimiento de la superficie mucosa para ayudar a una curación más rápida y a prevenir la progresión de la enfermedad inflamatoria intestinal. Se espera que el tratamiento con proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención tenga un efecto significativo en la producción de moco en todo el tracto gastrointestinal y se podría utilizar para proteger la mucosa intestinal de sustancias nocivas que se ingieren o después de la cirugía. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrían utilizar para el tratamiento de enfermedades que se asocian con una reducción de la expresión.
Por otra parte, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, podrian ser utilizados para prevenir y curar el daño en los pulmones debido a diversos estados patológicos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleólidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, podrían estimular la proliferación y diferenciación y promover la reparación del epitelio de los alvéolos y bronquiolar para prevenir o tratar el daño pulmonar agudo o crónico. Por ejemplo, el enfisema, que da lugar a la pérdida progresiva de alvéolos, y las lesiones por inhalación, es decir, resultantes de la inhalación de humo y quemaduras, que causan necrosis del epitelio bronquiolar y los alvéolos pueden ser tratados eficazmente utilizando los polinucleólidos o polipéptidos, agonistas o antagonistas de la presente invención. También las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciórJ, podrían utilizarse para estimular la proliferación y diferenciación de neumocitos de tipo 11, que pueden ayudar a tratar o prevenir enfermedades tales como las enfermedades de la membrana hialina, tales como el síndrome de dificultad respiratoria infantil y la displasia broncopulmonar, en los bebés prematuros
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, podrían estimular la proliferación y diferenciación de hepatocitos y, por lo tanto, se podrían utilizar para aliviar o tratar enfermedades y patologías del hígado tales como la insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis, daño hepático causado por hepatitis viral y sustancias tóxicas (es decir, acetaminofeno, tetracloruro de carbono y otras hepatotoxinas conocidas en la técnica)
Además, las proteinas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrían utilizar para tratar o prevenir la aparición de la diabetes mellitus. En pacientes con diabetes Tipos I y 11 recién diagnosticada, en los que queda alguna función de las células de los islotes, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrían utilizar para mantener la función de los islotes con el fin de aliviar, retrasar o prevenir la manifestación permanente de la enfermedad. Asimismo, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se podrian utilizar como un coadyuvante en el trasplante de células de los islotes para mejorar o promover la función de las células de los islotes
Actividad neuronal y enfermedades neurológicas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades, trastomos, daños o lesiones del cerebro y/o sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que se pueden tratar con las composiciones de la invención (p. ej., proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención) incluyen, pero no se limitan a, lesiones del sistema nervioso, y enfermedades o trastornos que dan corno resultado una desconexión de axones, una disminución o degeneración de neuronas, o una desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, las siguientes lesiones de los sistemas nerviosos central (incluyendo médula espinal, cerebro) o periférico: (1) lesiones isquémicas, en las que una carencia de oxígeno en una parte del sistema nervioso da como resultado lesión o muerte neuronal, incluyendo infarto cerebral o isquemia, o infarto de la médula espinal o isquemia;
(2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones causadas por lesión física o asociadas con cirugía, por ejemplo, lesiones que seccionan una porción del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que una porción del sistema nervioso es destruida o lesionada por tejido maligno que es una neoplasia maligna asociada al sistema nervioso o una neoplasia maligna derivada de tejido que no es del sistema nervioso; (4) lesiones infecciosas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de la infección, por ejemplo, por un absceso o asociada con una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, herpes zoster, o virus del herpes simple o con la enfermedad de Lyme, la tuberculosis o la sífilis; (5) lesiones degenerativas, en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona como resultado de un proceso degenerativo que incluye, pero no se limita a, la degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, el corea de Huntington o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA); (6) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nulricionales, en los que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona por un trastomo nutricional o un trastomo del metabolismo incluyendo, pero no limitado a, la deficiencia de vitamina 812, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopia por tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-8ignami (degeneración primaria del cuerpo calloso) y degeneración cerebelosa alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas, incluyendo, pero no limitadas a, diabetes (neuropalía diabética, parálisis de 8ell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma, o sarcoidosis; (8) lesiones causadas por sustancias tóxicas, incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas concretas; y (9) lesiones desmielinizantes en las que una parte del sistema nervioso se destruye o lesiona por una enfermedad desmielinizante, incluyendo, pero no limitadas a, esclerosis múltiple, inmunodeficiencia mielopatía asociada al virus de la inmunodeficiencia humana, mielopatia transversa o diversas etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva, y mielinólisis pontina central.
En una realización, las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia. En una realización preferida adiciona l, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia cerebral. De acuerdo con esta realización, las composiciones de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neurales asociada con la hipoxia cerebral. En un aspecto no exclusivo de esta realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neuronales asociada con la isquemia cerebral. En otro aspecto no exclusivo de esta realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neurales asociada con el infarto cerebral
En otra realización preferida, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albú mina de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neurales asociada con un accidente cerebrovascular. En una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neuronales cerebrales asociada con un accidente cerebrovascular En otra realización preferida, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucle6tidos que
codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neurales asociada con un ataque al corazón. En una realización especifica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar o prevenir la lesión de las células neuronales cerebrales asociada con un ataque al corazón.
Las composiciones de la invención que son útiles para tratar o prevenir un trastomo del sistema nervioso se pueden seleccionar sometiendo a ensayo la actividad biológica en la promoción de la supervivencia o diferenciación de neuronas. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las composiciooes de la invención que provocan cualquiera de los siguientes efectos pueden ser útiles de acuerdo con la invención: (1) aumento del tiempo de supervivencia de las neuronas en cultivo, ya sea en presencia o ausencia de hipoxia o condiciones de hipoxia condiciones; (2) aumento de la germinación de las neuronas en cu ltivo o in vivo; (3) aumento de la producción de una molécula asociada con neuronas en cultivo o in vivo, p. ej., acetilcolintransferasa o acetiloolinesterasa con respecto a las neuronas motoras;
o (4) disminución de los sintomas de disfunción neuronal in vivo. Tales efectos se pueden medir por cualquier método conocido en la técnica. En realizaciones no limitantes preferidas, el aumento de la supervivencia de las neuronas se puede medir rutinariamente uti lizando un método expuesto en la presente memoria o conocido de otra manera en la técnica, tal como, por ejemplo, Zhang et al., en Proc Natl Acad Sci USA 97:3637-42 (2000) o por Arakawa et al., en J. Neurosci, 70: 3507-15 (1990); el aumento de la proliferación de neuronas se puede detectar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, los métodos expuestos por Pestronk et al., en Exp. Neurol, 70: 65-82 (1980), o Brown et al., en Ann. Rev. Neurosci, 4: 11-42 (1981); el aumento de la producción de moléculas asociadas coo neuronas se puede medir por medio de bioanálisis, análisis enzimático, unión de anticuerpos, análisis de transferencia Northem, etc., utilizando mecanismos conocidos en la técnica y en función de la molécula que se vaya a medir; y la disfunción de las neuronas motoras se puede medir evaluando la manifestación física del trastorno de neuronas motoras, p. ej., debilidad, velocidad de conducción de las neuronas motoras, o discapacidad funcional
En realizaciones específicas, los trastornos de las neuronas motoras que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, trastomos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o neoplasia maligna que pueden afectar a las neuronas motoras, así como otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan selectivamente a las neuronas, tales como la esclerosis lateral amiolrófica, y que incluyen, pero no se limitan a, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juveni l, parálisis bulbar progresiva de la infancia (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome postpolio, y la neuropatía motosensorial hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth)
Además, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden jugar un papel en la supervivencia neuronal; la formación de sinapsis; la conductancia; la diferenciación neural, etc. Por lo tanto, las composiciones de la invención (incluyendo las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención) se pueden utilizar para diagnosticar ylo tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con estos papeles, incluyendo, pero no limitados a, los trastornos del aprendizaje ylo la cognición. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de estados de enfermedad neurodegenerativos ylo trastornos del comportamiento. Tales estados de enfermedad neurodegenerativos ylo trastornos del comportamiento incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Touretle, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastomo de pánico, discapacidades de aprendizaje, ELA, psicosis, autismo, y comportamientos alterados, incluyendo trastornos en la alimentación, los patrones de sueño, el equi librio y la percepción. Además, las composiciones de la invención también pueden jugar un papel en el tratamiento, prevención ylo detección de trastornos del desarrollo asociados con el desarrollo del embrión, o trastornos ligados al sexo
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucle6tidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, pueden ser útiles en la protección de células neuronales de enfermedades, daños, trastornos o lesiones, asociados con trastomos cerebrovasculares, incluyendo, pero no limitados a, enfermedades de la arteria carótida (p. ej., trombosis de la arteria carótida, estenosis de la carótida, o enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de la arteria cerebral, embolia cerebral y trombosis (p. ej., trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, o síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (p. ej., hematoma epidural o subdural, o hemorragia subaracnoidea), infarto cerebral, isquemia cerebral (p. ej., isquemia cerebral transitoria, síndrome de robo de la subclavia o insuficiencia vertebrobasilar), demencia vascular (p. ej., multi-infarto), leucomalacia, periventricular, y dolor de cabeza vascular (p. ej., cefalea en racimos o migraña)
De acuerdo con otro aspecto ad icional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la utilización de proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, con fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación ylo diferenciación de las célu las neurológicas. Por lo tanto, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que cod ifican las proteínas de fusi6n de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar ylo detectar enfermedades neurológicas. Por otra parte, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de
albúmina de la invención, se pueden utilizar como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno del sistema nelVioso en particular
Los ejemplos de las enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, enfermedades cerebrales, tales como enfermedades cerebrales metabólicas que incluyen fenilcetonuria, tal como fenilcetonuria materna, deficiencia de piruvato carboxilasa, deficiencia de complejo piruvato deshidrogenasa, encefalopatía de Wemicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroideo, neoplasmas hipotalámicos, neoplasmas supratentoriales, enfermedad de Canavan, enfermedades cerebelares tales como ataxia cerebelosa, que incluyen la degeneración espillOcerebelosa tales como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelosa, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, esclerosis cerebral difusa, tal como encefalitis periaxialis, leucodistrofia de células globosas, leucodistrofia metacromática y panencefalitis esclerosante subaguda.
Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de la arteria carótida que incluyen trombosis de la arteria carótida, estenosis de la carótida y enfermedad de Moyamoya), angiopalía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovellOsas cerebrales, enfermedades de la arteria cerebral, embolia cerebral y trombosis tales como trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno y síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral tal como hematoma epidural, hematoma subdural y hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome de robo de la subclavia e insuficiencia vertebmbasilar, demencia vascular tal como demencia mullí-infarto, leucomalacia periventricular, dolor de cabeza vascular tal como cefalea en racimos y migraña
Las enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen demencias tales como complejo de demencias por SIDA, demencias preseniles, tales como enfermedad de Alzheimer y el sindrome de Creutzfeldt-Jakob, demencias seniles tales como enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear progresiva, demencias vasculares tales como demencia mulli-infarto, encefalitis, que incluyen encefalitis periaxialis, encefalitis virales, tales como encefalitis epidémica, encefalitis japonesa, encefalitis de SI. Louis, encefalitis transmitida por garrapatas y fiebre del Nilo occidental, encefalomielitis aguda diseminada, meningoencefalilis lales como sindrome uveomeningoencefálico, enfermedad de Par1lt;inson poslencefalítica y panencefalitis esclerosanle subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsias tales como epilepsia generalizada, que incluye espasmos infantiles, epilepsia de ausencia, epilepsia mioclónica que incluye síndrome MERRF, epilepsia tónicoclónica, epilepsias parciales tales como la epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo tempOfal, epilepsia postraumálica, estado epiléptico lal como epilepsia parcial continua, y síndrome de HallelVordenSpatz
otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen hidrocefalia tal como Síndrome de Dandy-Walker e hidrocefalia de presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasmas hipotalémicos, malaria cerebral, narcolepsia, que incluye cataplexia, poliomielitis bulbar, seudotumor cerebral, Sindrome de Rett, Sindrome de Reye, enfermedades talámicas, loxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nelVioso central, tales como complejo de demencias por SIDA, absceso cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tales como Encefalomielitis equina, encefalomielitis equina venezolana, Encefalomielitis hemorrágica necrotizanle, Visna, y malaria cerebral
otras enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen meningitis tal como aracnoiditis, meningtitis asépticas tales como meningtitis viral que incluye la coriomeningitis linfocítica, meningtitis bacteriana que incluye meningitis por Haemophilus, meningitis por Listeria, Meningtitis meningocócicas tales como sindrome de Waterhouse-Friderichsen, meningitis neumocócica y tuberculosis meningea, meningitis por hongos tales como meningitis por Cryptococcus, derrame subdural, meningoencefalitis, tales como síndrome uveomeningoencefálico, mielitis tales como mielitis transversa, neurosifilis, tal como tabes dorsal, poliomielitis que incluye poliomielitis bulbar y sindrome postpoliomielilis, enfermedades priónicas (tales como el sindrome de Creutzfeldt-Jakob, encefalopalía espongiforme bovina, el síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, Scrapie), y toxoplasmosis cerebral.
Otras enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen los tumores del sistema nervioso central tales como neoplasmas cerebrales que incluyen neoplasmas cerebelares tales como neoplasias infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroideo, neoplasmas hipotalámicos y neoplasmas supratentoriales, neoplasmas meningeos, neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales, enfermedades desmielinizanles tales como las enfermedades de Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefa litis periaxialis, leucodistrofia de células globosas, esclerosis cerebral difusa tal como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis
hemorrágica necrotizante, leucoencefalopatia multifocal progresiva, esclerosis múltiple, mielinólisis pontina central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, Scrapie, Swayback, síndrome de fatiga crónica, Visna, sindrome nervioso de alta presión, meningismo, enfermedades de la médula espinal como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales, siringomielia, Tabes Dorsalis, síndrome de la persona rígida, retraso mental, tal como el síndrome de Angelman, síndrome de Cri-du-Chat, síndrome de de Lange, Síndrome de Down, gangliosidosis tales como gangliosidosis G (M1), enfermedad de Sandhoff, enfermedad de TaySachs, enfermedad de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon-Biedl, síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de la orina de jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, lipofuscinosis neuronal ceroidea, síndrome oculocerebrorrenal, fenilcetonuria tal como fen ilcetonuria materna, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, sindrome WAGR, anomalias del sistema nervioso tales como holoprosencefalia, defectos del tubo neural tal como la anencefalia que incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, mielomeningocele, espina bífida, tal como espina bífida quística y espina bífida ocu lta .
Otras enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invendón y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen neuropatías motoras y sensoriales hereditarias que incluyen enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Werdnig-Hoffmann y neuropatías sensoriales y autónomas hereditarias tales como analgesia congénita y disautonomía familiar, manifestaciones neurológicas (como agnosia que incluyen síndrome de Gerstmarm, amnesia tal como amnesia retrógrada, apraxia, vejiga neurogénica, cataplejía, trastornos de comunicación, tales como trastornos de la audición que incluyen sordera, sordera parcial, reclutamiento de sonoridad y tinnitus, trastomos del lenguaje tales como afasia, que incluye agrafía, anomia, afasia de Broca y afasia de Wemicke, dislexia, tal como dislexia adquirida, trastornos del desarrollo del lenguaje, trastornos del habla como la afasia que incluye anomia, afasia de Broca y afasia de Wemicke, trastornos de la articulación, trastomos de la comunicación tales como trastomos del habla, que incluyen disartria, ecolalia, mutismo y tartamudeo, trastornos de la voz, tales como afonia y ronquera, estado de descerebración, delirio, fasciculación, alucinaciones, meningismo, trastomos del movimiento tales como síndrome de Angelman, ataxia, atetosis, corea, distonía, hipocinesia, hipotonía muscular, mioclono, tic, torticolis y temblor, hipertonia muscular, tal como rigidez musaJlar tal como síndrome de la persona rigida, espasticidad muscular, parálisis tal como parálisis facial que incluye Herpes Zoster ótico, gastroparesia, hemiplejia, oftalmoplejía como diplopía, slndrome de Duane, slndrome de Horner, oftalmoplejia extema progresiva crónica tal como slndrome de Keams, parálisis bulbar, paraparesia espástica tropical, paraplejia, tal como sindrome de Brown-Sequard, tetraplejia, parálisis respiratoria y parálisis de las cuerdas vocales, paresia, miembro fantasma, trastomos del gusto, tales como ageusia y disgeusia, trastomos de la visión tales como la ambliopía, ceguera, defectos de la visión del color, diplopía, hemianopsia, escotoma y visión subnormal, trastornos del sueño como la hipersomnia que incluye el síndrome de Kleine-Levin, insomnio, y sonambulismo, espasmos tales como trismo, pérdida del conocimiento, tal como coma, estado vegetativo persistente y sincope y vértigo, enfermedades neuromusculares ta les como la amiotonia congénita, esclerosis lateral amiotrófica, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad de las neuronas motoras, atrofia muscular, tal como la atrofia muscular espinal, enfermedad de Charcot-Marie y la enfermedad de Werdnig-Hoffmann, sindrome de postpoliomielitis, distrofia muscular, míastenia gravis, miotonia atrófica, miotonia congénita, miopatía nemalinica, parálisis periódica familiar, paramioclollO múltiple, para paresia espástica tropical y síndrome de la persona rígida, enfermedades del sistema nervioso periférico, tales como acrodinia, neuropatías amiloides, enfermedades del sistema nervioso autónomo, tales como síndrome de Adie, síndrome de Barré-Lieou, disautonomía familiar, sindrome de Homer, distrofia simpática refleja y síndrome de Shy-Drager, enfermedades de los nervios craneales tales como enfermedades del nervio acústico, tales como neuroma acústico que incluye Neurofibromatosis 2, enfermedades del nervio facial tales como neuralgia facial, sindrome de Melkelsson-Rosenthal, trastornos de la motilidad ocular, que incluyen ambliopía, nistagmo, parálisis del nervio oculomotor, oftalmoplejia tal como el Síndrome de Duane, síndrome de Homer, oftalmoplejia externa crónica progresiva que incluye síndrome de Kearns, estrabismos tales como esotropía y exotropía, parálisis del nervio oculomotor, enfermedades del nervio óptico, tales como atrofia óptica que incluye atrofia óptica hereditaria, drusen del disco óptico, neuritis óptica, tal como neuromielitis óptica, edema de papila, neuralgia del trigémino, parálisis de las cuerdas vocales, enfermedades desmielinizantes como neuromielitis óptica y Swayback, y neuropatías diabéticas tales como pie diabético
Otras enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de la invendón y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen los sindromes de compresión del nervio tales como el síndrome del túnel carpiano, síndrome del túnel tarsiano, sindrome de salida torácica, tal como síndrome de la costilla cervical, síndrome de compresión del nervio cubital, neuralgia tal como causalgia, neuralgia cervico-braquial, neuralgia facial y neuralgia del trigémino, neuritis, tal como neuritis alérgica experimental, neuritis óptica, polineuritis, polirradiculoneuritis y radiculitis tal como polirradicu litis, neuropatías sensoriales y motoras hereditarias tales como enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria de atrofia, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatias autónomas y sensoriales hereditarias que incluyen analgesia congérJita y disautonomía familiar, síndrome POEMS, ciática, sudoración gustativa y tetania).
Trastornos endocrinos
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar, ylo pronosticar trastomos ylo enfermedades relacionadas con el desequilibrio hormonal, ylo trastomos o enfermedades del sistema endocrino.
Las hormonas secretadas por las glándulas del sistema endocrino controlan el crecimiento físico, la función sexual, el metabolismo y otras funciones. Los trastomos se pueden clasificar de dos formas: alteraciones en la producción de hormonas, e incapacidad de los tejidos para responder a las hormonas. La etiología de estas enfermedades, trastornos o afecciones de desequilibrio hormonal o del sistema endocrino puede ser genética, somática, tal como el cáncer y algunas enfermedades autoinmunitarias, adquirida (p. ej., por quimioterapia, lesión o toxinas) o infecciosa Por otra parte, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar como un marcador o detector de una enfermedad o trastomo concretos relacionados con el sistema endocrino y/o el desequilibrio hormonal.
Las enfermedades del sistema endocrino ylo el desequilibrio hormonal abarcan trastornos de la motilidad uterina, incluyendo, pero no limitados a: complicaCiones con el embarazo y el parto (p. ej ., parto prematuro, embarazo a término, aborto espontáneo, y parto lento o detenido); y trastomos ylo enfermedades del ciclo menstrual (p ej., dismenorrea yendometriosis).
Los trastornos ylo enfermedades del sistema endocrino ylo el desequilibrio hormonal incluyen trastornos ylo enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agenesia pancreática congénita, feocromocitoma-síndrome de tumor de células de los islotes; trastomos ylo enfermedades de las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, enfermedad de Addison, deficiencia de corticoesteroides, enfermedad virilizante, hirsutismo, sindrome de Cushing, hiperaldosteronismo, feocromocitoma; trastornos ylo enfermedades de la glándula pituitaria, tales como, por ejemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanismo pituitario, adenoma de la pituitaria, panhipopituita rismo, acromegalia, gigantismo; trastornos ylo enfermedades de tiroides, que incluyen pero no se limitan a, hipertiroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer, enfermedad de Graves (bocio difuso tóxico), bocio tóxico nodular, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silenciosa), síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de hormona tiroidea, aplasia tímica, tumores de células de Hürthle de tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides , carcinoma medular de tiroides; trastomos ylo enfermedades de la paratiroides, tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo; trastomos ylo enfermedades del hipotálamo
Adicionalmente, los trastomos ylo enfermedades del sistema endocrino ylo el desequilibrio hormonal también pueden incluir trastornos ylo enfermedades de los testiculos o los ovarios, incluyendo cáncer. otros trastornos ylo enfermedades de los testículos o los ovarios incluyen adicionalmente, por ejemplo, cáncer de ovario, sindrome de ovario poliquístico, síndrome de Klinefe1ter, síndrome de los testículos desaparecidos (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidia, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangioma capilar del testiculo (benigno), neoplasias de los testiculos y neo-testículos
Por otra parte, los trastomos ylo enfermedades del sistema endocrino ylo el desequilibrio hormonal también pueden incluir trastOfnos ylo enfermedades tales como, por ejemplo, síndromes de deficiencia poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple, y trastomos ylo cánceres de tejidos endocrinos.
En otra realización, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para diagnosticar, pronosticar, prevenir ylo tratar enfermedades endocrinas ylo trastornos asociados con el tejido o los tejidos en los que se expresa la proteína Terapéutica que corresponde a la porción de proteina terapéutica de la proteina de la albúmina de la invención.
Trastornos del aparato reproductor
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser utilizados para el diagnóstico, tratamiento, o prevención de enfermedades ylo trastornos del sistema reproductor. Los trastomos del sistema reproductor que se pueden tratar por medio de las composiciones de la invención, incluyen, pero no se limitan a, lesiones del sistema reproductor, infecciones, trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y las enfermedades o trastornos que dan como resultado infertilidad, complicaciones con el embarazo, el parto, o alumbramiento, y dificultades postparto.
Los trastomos ylo enfermedades del sistema reproductor incluyen enfermedades ylo trastornos de los testiculos, incluyendo atrofia testicular, feminización testicular, criptorquidia (unilateral y bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimitis y orquitis (típicamente como resultado de infecciones, tales como, por ejemplo, gonorrea, paperas, tuberculosis y sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa, tumores de células germinales (p. ej., seminomas, carcinomas de células embrionarias, teratocarcinomas, coriocarcinomas, tumores del saco vitelino, y teratomas), tumores estromales (p. ej ., tumores de células de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hernia inguinal y trastornos de la producción de esperma (p. ej., el síndrome de inmovilidad ciliar, aspermia, astenozoospermia, azoospermia, oligospermia, y teratozoospermia).
Los trastornos del aparato reproductor tambiérJ incluyen trastomos de la glándula de la próstata, tales como
prostatitis aguda no bacteriana, prostatitis crónica no bacteriana, prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica, prostatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa, malacoplaquia, hipertrofia o hiperplasia benigna de próstata, y trastomos neoplásicos de la próstata, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas de células transicionales, carcinomas ductales y carcinomas de células escamosas.
Adicionalmente, las composiciones de la invenciÓfl pueden ser útiles en et diagnóstico, tratamiento ylo prevención de trastornos o enfermedades del pene y la uretra, que incluyen trastornos inflamatorios, tales como balanopostitis, balanitis xerótica obliterante, fimosis, parafimosis, sífilis, virus del herpes simple, gonorrea, uretritis no gonocócica, clamidia, micoplasma, !ricomonas, VIH, SIDA, síndrome de Reiter, conditoma acuminado, condiloma la!um, y pápulas perladas del pene; anomalías uretrales, tales como hipospadias, epispadias, y fimosis; lesiones premalignas, incluyendo eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, paplosis bowenoide, condiloma gigante de Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrugoso; cánceres de pene, incluyendo los carcinomas de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrugoso y carcinoma de pene diseminado; trastomos neoplásicos de la uretra, incluyendo carcinoma uretral de pene, carcinoma uretral bulbomembranoso, y carcinoma uretral prostático; y trastornos eréctiles, tales como priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunción eréctil e impotencia
Por otra parte, las enfermedades y/o trastomos de los vasos deferentes incluyen vasculititis y ABCCD (ausencia bilateral congérJita de los conductos deferentes); además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser utilizados en el diagnóstico, tratamiento ylo prevención de enfermedades ylo trastornos de las vesículas seminales, que incluyen enfermedad hidatídica, clorhidrorrea congénita y enfermedad renal poliquística
Otros trastornos ylo enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, el síndrome de Klinefetter, sindrome de Young, eyaculación prematura, diabetes mellitus, fibrosis quistica, sindrome de Kartagener, fiebre elevada, esclerosis múltiple y ginecomastia
Adicionalmente, los polinucleótidos, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de enfermedades ylo trastomos de la vagina y vulva, incluyendo vaginosis bacteriana, vaginitis por Candida, virus del herpes simple, chancroide, granuloma inguinal, linfogranuloma venéreo, sama, virus del papiloma humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenosis, vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas, condiloma acuminado, sifilis, molusco contagioso, vaginitis atrófica, enfermedad de Paget, liquen escleroso, liquen plano, vulvodinia, sindrome de choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis, vestibulitis vulvar, y trastomos neoplásicos, tales como hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células claras, carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de la glándula de Bartolina, y neoplasia intraepitelial vulvar.
Los trastomos ylo enfermedades del útero incluyen dismenorrea, retroversión del útero, endometriosis, fibroides, adenomiosis, sangrado anovulatorio, amenorrea, síndrome de Cushing, mola hidatidiforme, síndrome de Asherman, menopausia prematura, pubertad precoz, pólipos uterinos, hemorragia uterina disfuncional (p. ej., debido a señales hormonales aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas, leiomiosarcomas, y sarcomas. Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los pol inudeótidos que cod ifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como marcador o detector, así como en el diagnóstico, tratamiento ylo prevención de las anomalías uterinas congénitas, tales como útero bicorne, útero septado, útero simple unicome, útero unicorne con un cuemo rudimentario no cavitario, útero unicome con un cuerno rudimentario cavitario no comunicante, útero unicorne con un cuerno cavitario comunicante, útero en forma de arco, útero didelfo y útero en forma de T
Las enfermedades ylo trastornos de ovario incluyen anovulaciórJ, sindrome de ovario poliquistico (síndrome de Stein-Leventhal), quistes ováricos, hipofunción ovárica, falta de sensibilidad ovárica a las gonadotropinas, sobreproducción ovárica de andrógenos, sindrome de la vena ovárica derecha, amenorrea, hirsutismo, y cáncer de ovario (incluyendo, pero no limitado a, crecimiento canceroso primario y secundario, tumores de Sertoli-Leydig, carcinoma endometrial del ovario, adenocarcinoma seroso papilar ovárico, adenocarcinoma mucinoso ovárico, y tumores de ovario de Krukenberg).
Las enfermedades y/o trastomos del cuello del útero incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta, displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian, erosión cervical, incompetencia cervical, y neoplasmas cervicales (que incluyen, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa, carcinoma de células escamosas, neoplasia celular adenoescamosa, y neoplasia de células columna res).
Además, las enfermedades ylo trastornos del sistema reproductor incluyen trastornos ylo enfermedades del embarazo, incluyendo aborto involuntario y muerle fetal, tal como aborto precoz, aborto tardío, aborto espontáneo, aborto inducido, aborto terapéutico, amenaza de aborto, aborto retenido, aborto incompleto, aborto completo, aborto habitual, aborto retenido y aborto séptico; embarazo ectópico, anemia, incompatibilidad de Rh, sangrado vaginal durante el embarazo, diabetes gestacional, retraso del crecimiento intrauterino, polihidramnios, sindrome HELLP, desprendimiento prematuro de placenta, placenta previa, hiperemesis, preeclampsia, eclampsia, herpes gestacional, y la urticaria del embarazo. Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar en el diagnóstico, tratamiento ylo
prevención de enfermedades que pueden complicar el embarazo, incluyendo enfermedad cardiaca, insuficiencia cardiaca, cardiopatía reumática, enfermedad cardiaca congénita, prolapso de la válvula mitral, presión arterial alta, anemia, enfermedades renales, enfermedades infecciosas (p. ej., rubéola, citomegalovirus, toxoplasmosis, hepatitis infecciosa, clamidia, VIH, SIDA y herpes genital), diabetes mellitus, enfermedad de Graves, tiroiditis, hipotiroidismo, tiroiditis de Hashimoto, hepatitis activa crónica, cirrosis hepática, cirrosis biliar primaria, asma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura trombocitopénica idiopática, apendicitis, quistes ováricos, trastornos de la vesícu la biliar, y obstrucción del intestino
Entre las complicaciones asociadas con el parto y el alumbramiento se incluyen ruptura prematura de membranas, parto prematuro, embarazo prolongado, post-madurez, parto que avanza muy lentamente, sufrimiento fetal (p. ej., ritmo cardíaco anormal (fetal o materno), problemas respiratorios, y posición anormal del feto), distocia de hombros, prolapso del cordón umbilical, embolia de líquido amniótico y sangrado uterino anormal
Además, las enfermedades ylo trastornos del periodo posparto, incluyendo endometritis, miometritis, parametritis, peritonitis, tromboflebitis pélvica, embolia pulmonar, endotoxemia, pielonefritis, tromboflebitis safena, mastitis, cistitis, hemorragia después del parto, y útero invertido.
Otros trastornos ylo enfermedades del sistema reproductor femenino que se pueden diagnosticar, tratar y{o prevenir por medio de las proteinas de fusión de albúmina de la invencioo y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención incluyen, por ejemplo, síndrome de Turner, pseudohermafroditismo, síndrome premenstrual, enfermedad inflamatoria pélvica, congestión pélvica (congestión vascular), frigidez, anorgasmia, dispareunia, rotura de trompa de Falopio, y dolor abdominal durante la ovulacioo.
Enfermedad infecciosa
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, mediante el aumento de la respuesta inmunitaria, en particular el aumento de la proliferación y diferenciación de células B ylo T, se pueden tratar las enfermedades infecciosas. La respuesta inmunitaria se puede aumentar o bien potenciando una respuesta inmunitaria existente o bien iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención también pueden inhibir directamente el agente infeccioso, sin provocar necesariamente una respuesta inmunitaria
Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede causar enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invencioo. Los ejemplos de virus, incluyen, pero no se limitan a los siguientes virus de ADN y ARN Y familias virales: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, EBV, HIV, Flaviviridae, Hepadnaviridae (hepatitis), Herpesviridae (tales como, Cytomegalovirus, Herpes Simplex, Herpes Zoster), Mononegavirus (p ej., Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdovirídae), Orthomyxoviridae (p. ej., Influenza A, Influenza B, y para influenza), virus de Papiloma, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tales como viruela o vaccinia), Reoviridae (p. ej., Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, Lentivirus) y Togaviridae (p. ej., Rubivirus). Los virus incluidos en estas fam ilias pueden causar una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo, pero no limitados a: artritis, bronquiolitis, virus sincitial respiratorio, encefalitis, infecciones oculares (p. ej., conjuntivitis, queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, crónica activa, delta), encefalitis japonesa B, Junin, Chikungunya, fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla, meningitis, infecciones oportunistas (p. ej., SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabia, resfriado común, polio, leucemia, rubeola, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel (p. ej ., Kaposi, verrugas) y viremia. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar o detectar cualquiera de estos sintomas o enfermedades. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar: meningitis, dengue, EBV y/o hepatitis (p. ej., hepatitis B). En una realización adicional las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se uti lizan para tratar a los pacientes que no responden a una o más de otras vacunas contra la hepatitis disponibles comercialmente. En una realizacioo específica adicional las proteínas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las protelnas de fusión de albúmina de la invencioo se utilizan para tratar el SIDA.
De manera similar, los agentes bacterianos y fúngicos que pueden causar enfermedades o síntomas y que se pueden tratar o detectar por medio de las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes bacterias gram positivas y gram negativas, familias de bacterias y hongos: Actinomyces (p. ej., Norcardia), Acinetobacter, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (p_ ej., Bacillus anthrasis) , Bacteroides (p. ej., Bacteroides fragilis), Blastomicosis, Bordetella, Borrelia (p. ej., Borrelia burgdorfen), Brucella, Candida, Campy1obacter, Chlamydia, Chlostridium (p. ej ., Chlosln-dium botulinum, Chloslridium diffcile, Chlostridium perfringens, Chloslridium tetan/) , Coccidioides, Corynebacterium (p. ej., Corynebacterium diptheriae), Cryptococcus, Dermatocycosis, F coli (p. ej., E. eoli enterotoxigénica y E. eoli enterohemorrágica), Enterobacter (p. ej., Enterobaeter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (p. ej., Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhl), Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (p. ej., Haemophilus influenza tipo B) , Helicobacter, Legionella (p. ej., Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (p. ej., Listeria monocytogenes) , Mycoplasma, Mycobacterium (p. ej., Myeobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (p. ej., Vibrio cholerae), Neisseriaceae (p. ej., Neisseria gonorrea, Neisseria meningitidis) , Pasteurellacea, Proteus, Pseudomonas (p. ej., Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, espiroquetas (p. ej., Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (p. ej., Staphylococcus aureus) , Meningococcus, Pneumococcus y Streptococcus (p ej ., Streptococcus pneumoniae y los Grupos A, B, Y C de estreptococos), y ureaplasmas. Estas familias bacterianas, parasitarias y fúngicas pueden causar enfermedades o sintomas, induyendo, pero no limitados a: las infecciones resistentes a los antibióticos, bacteriemia, endocarditis, septicemia, infecciones oculares (p. ej., conjuntivitis), uveítis, tuberculosis, gingivitis, diarrea bacteriana, infecciones oportunistas (p. ej., infecciones relacionadas con SIDA), paroniquia, infecciones relacionadas con prótesis, caries dental, enfermedad de Reiter, infecciones de las vías respiratorias, como la tos ferina o empiema, sepsis, enfermedad de Lyme, enfermedad por arañazo de gato, disentería, fiebre paratifoidea, envenenamiento por alimentos, enfermedad Legionella, inflamación crónica y aguda, eritema, infecciones por levadura, fiebre tifoidea, neumonía, gonorrea, meningitis (p. ej., meningitis tipos A y B), damidia, sífilis, difteria, lepra, brucelosis, úlceras pépticas, ántrax, abortos espontáneos, defectos de nacimiento, neumonía, infecciones pulmonares, infecciones del oido, sordera, ceguera, letargo, malestar, vómitos, diarrea crónica, enfermedad de Crohn, colitis, vaginosis, esterilidad, enfermedades inflamatorias de la pelvis, candidiasis, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, escar1atina, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel (p. ej., celulitis, dermatomicosis), toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas, infecciones nosocomiales. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinudeótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden uti lizar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se utilizan para tratar: tétanos, difteria, botulismo ylo meningitis de tipo B
Por otra parte , los agentes parásitos que causan enfermedades o síntomas que se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar por medio de las proteínas de fusión de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias o clases: amebiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, durina, ectoparásitos, giardias, helmintiasis, leishmaniasis, Schistosoma, teileriasis, toxoplasmosis, tripanosomiasis, y Trichomonas y esporozoos (p. ej., Plasmodium virax, Plasmodium faleiparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale l. Estos parásitos pueden causar una variedad de enfermedades o sintomas, incluyendo, pero no limitados a: sama, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedad intestinal (p. ej., disentería, giardiasis), enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, infecciones oportunistas (p. ej., relacionadas con el SIDA), malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En realizaciones especificas, las proteinas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl se usan para tratar, prevenir ylo diagnosticar la malaria
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían utilizar o bien mediante la administración de una cantidad eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención al paciente, o bien mediante la eliminación de células del paciente, el suministro a las células de un polinucleótido de la presente invención, y la devolución de las células modificadas al paciente (terapia ex vivo). Por otra parte, las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar como un antígeno en una vacuna para originar una respuesta inmunitaria contra enfermedades infecciosas.
Regeneración
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención se pueden utilizar para diferenciar, proliferar, y atraer células, llevando a la regeneración de los tejidos. (Véase, Science 276: 59-87 (1997». La regeneración de tejidos se podría utilizar para reparar, sustituir o proteger el tejido dañado por defectos congénitos, trauma (heridas, quemaduras, incisiones o úlceras), edad, enfermedad (p. ej ., osteoporosis, osteoartritis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo la cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por reperfusiÓfl o daño sistémico de citoquinas
Los tejidos que se podrían regenerar utilizando la presente invención incluyen órganos (p. ej ., páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardiaco), vasculatura (incluyendo vascular y linfática), tejido nervioso, hematopoyético, y esquelético (hueso, cartilago, tendón y ligamento) Preferiblemente, la regeneración se produce sin cicatrización o con una cicatrización reducida. La regeneración también puede induir angiogénesis
Por otra parte, las proteinas de fusión de la invención ylo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, pueden aumentar la regeneración de tejidos difíciles de curar. Por ejemplo, el aumento de la regeneración del tendón/ligamento podría acelerar el tiempo de recuperación después de los daños. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la
invendón también se podrían utilizar profiláctica mente en un esfuerzo por evitar el daño. Las enfermedades específicas que podrían ser tratadas incluyen tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros defectos de tendones o ligamentos. Un ejemplo adicional de regeneración del tejido de las heridas que no cicatrizan incluye úlceras de presión, úlceras asociadas COfl insuficiencia vascular, quirúrgicas y heridas traumáticas.
De manera similar, los tejidos nervioso y cerebral también se podrían regenerar mediante el uso de proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, para proliferar y diferenciar células nerviosas. Las enfermedades que se podrían tratar mediante este método incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatias, o trastomos mecánicos y traumáticos (p. ej., trastornos de la médula espinal, trauma en la cabeza, enfermedad cerebrovascular, y accidente cerebrovascular) Especificamente, las enfermedades asociadas con las lesiones de nervios periféricos, neuropatia periférica (p. ej., resultante de quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y sindrome de Shy-Drager), se podrían tratar todos utilizando las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención
Trastornos gastrointestinales
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención, se pueden utilizar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos gastrointestinales, incluyendo enfermedades inflamatorias y/o afecciones, infecciones, cánceres (p. ej., neoplasmas intestinales (tumor carcinoide del intestino delgado, linfoma no Hodgkin del intestino delgado, linfoma del intestino delgado», y úlceras, tales como úlceras pépticas.
Los trastomos gastrointestinales incluyen disfagia, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis submucosa y estenosis, lesiones deMallory-Weiss. leiomiomas. lipomas, cánceres epidérmicos, adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástricos/de estómago, pólipos de estómago, trastornos autoinmunitarios como la anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, viral, eosinofílica, inducida por el estrés, erosiva crónica, de células plasmáticas, y de Menetrier), y enfermedades peritoneales (p. ej., quiloperitoneo, hemoperitoneo, quiste mesentérico, linfadenitis mesentérica, oclusión vascular mesentérica, panicu litis, neoplasmas, peritonitis, neumoperitoneo, absceso subfrénico).
Los trastornos gastrointestinales incluyen también trastornos asociados con el intestino delgado, tales como los síndromes de mala absorción, distensión, síndrome de intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celiaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprue tropical, enfermedad de Whipple, linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del ileo, diverticulo de Meckel, diverticulos múltiples, fracaso de la rotación completa del intestino delgado y grueso, linfoma, y enfermedades bacterianas y parasitarias (tales como diarrea del viajero, fiebre tifoidea y paratifoidea, cólera, infecciones por gusanos redondos (Ascaridiasis lumbricoides), anquilostomas (Ancylostoma duodena/e), nematodos (Enterobius vermicularis) , tenias (Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothn'um spp., y T sofium)
Las enfermedades y/o trastornos del hígado incluyen colestasis intrahepática (síndrome de Alagille, cirrosis hepática biliar), hígado graso (hígado graso no alcohólico, síndrome de Reye), trombosis de la vena hepática, degeneración hepatolentricular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorrenal, hipertensión portal (várices esofágicas y gástricas), absceso hepático (absceso hepático amebiano), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades alcohólicas del higado (higado graso, hepatitis, cirrosis), parasitarias (equinococosis hepática, fascioliasis, absceso hepático amebiano), ictericia (hemolitica, hepatocelular y colestática), colestasis, hipertensión portal, agrandamiento del higado, ascitis, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis animal, hepatitis crónica (autoinmunitaria, hepatitiS B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis humana viral (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, la hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de W ilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis biliar secundaria, encefalopatia hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatia hepática, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, hemangiomas, piedras biliares, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda), y neoplasmas hepáticos (angiomiolipoma, metástasis hepáticas calcificadas, metástasis quísticas hepáticas, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, adenoma hepático, cistoadenoma hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer de higado, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimal, tumores mesenquimales del hígado, hiperplasia nodular regenerativa, tumores hepáticos benignos (quistes hepáticos [quistes simples, enfermedad del hígado poliquístico, cistoadenoma hepatobiliar, quiste de colédoco], tumores mesenquimales [hamartoma mesenquimal, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, peliosis hepática, lipomas, seudotumor inflamatorio, Varios], tumores epiteliales [epitelio de los conductos biliares (hamartoma del conducto biliar, adenoma de las vías biliares), hepatocitos (adenoma, hiperplasia nodular focal, hiperplasia nodular regenerativa)], tumores hepáticos malignos [hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumores de los vasos sanguíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma, carcinoide, carcinoma escamoso, linfoma primario]), peliosis hepática, porfiria eritropoyética, porfiria hepática (porfiria aguda intermitente, porfiria cutánea tardía), sindrome de Zellweger)
Las enfermedades y/o trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis aguda necrotizante, pancreatitis alcohólica), neoplasmas (adenocarcinoma del páncreas, cistadenocarcinoma, insulinoma, gastrinoma, y glucagOfloma, neoplasmas quísticos, tumores de células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades pancreáticas (p. ej., fibrosis quistica, quiste (seudoquistes pancreáticos, fístula pancreática, insuficiencia»
Las enfermedades de la vesicula biliar incluyen cálculos biliares (colelitiasis y coledocolitiasis), síndrome de poscolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar, colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores del conducto biliar, y mucocele.
Las enfermedades y/o trastornos del intestino grueso incluyen colitis asociada a antibióticos, diverticulitis, colitis ¡Jlcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorrectales (p. ej., fisuras, hemorroides), enfermedades del colon (colitis, neoplasmas de colon [cáncer de colon, pólipos adenomatosos de colon (p. ej., adenoma velloso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal], diverticu litis colónica, diverticulosis colónica, megacolon [enfermedad de Hirschsprung, megacolon tóxico]: enfermedades sigmoideas [proctocolitis, neoplasmas sigmoidesJ), estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis), enteritis (enterocolitis), enteropatía por VIH, enfermedades ileales (neoplasias ileales, ileitis), enfermedad inmunopoliferativa del intestino delgado, enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ¡Jlcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parasitarias (anisakiasis, balantidiasis, infecciones por Blastocystis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, disentería amebiana, giardiasis), fístula intestinal (fístula rectal), neoplasmas intestinales (neoplasmas cecales, neoplasias de colon, neoplasias duodenales, neoplasias ileales, pólipos intestinales, neoplasias yeyunales, neoplasias rectales), obstrucción intestinal (síndrome de asa aferente, obstrucción duodenal, heces impactadas, pseudo-obstrucción intestinal [vólvulo ceca~, intususcepción), perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos colónicos, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers), enfermedades yeyunales (neoplasmas yeyunales), síndromes de mala absorción (sindrome de bucle ciego, enfermedad celiaca, intolerancia a la lactosa, sindrome de intestino corto, esprue tropical, enfermedad de Whipple), oclusión vascular mesentérica, neumatosis quística intestinal, enteropatías con pérdida de proteínas (Iinfagiectasis intestinal), enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia, perforación, úlcera de estómago, síndrome de Zollinger-Ellison), sindromes gastrectomizados (síndrome de evacuación gástrica rápida), enfermedades del estómago (p. ej., aclortlidria, reflujo duodenogástrico (reflujo biliar), ectasia vascular antral gástrica, fístula gástrica, obstrucción de la salida gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica), gastroparesia, dilatación del estómago, divertículo en el estómago, neoplasmas del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, pÓlipo gástrico hiperplásico), rotura del estómago, úlcera de estómago, vólvulo de estómago), tuberculosis, visceroptosis, vómitos (p. ej., hematemesis, hiperemesis gravídica, náuseas y vómitos postoperatorios) y cotitis hemorrágica_
otras enfermedades y/o trastomos del sistema gastrointestinal incluyen las enfermedades del traclo biliar, tales como, gastrosquisis, fistula (p. ej., fistula biliar, fistula esofágica, fistula gástrica, fístula intestinal, fistula pancreática), neoplasias (p. ej., neoplasias del tracto biliar, neoplasias esofágicas, tales como adenocarcinoma de esófago, carcinoma de células escamosas de esófago, neoplasias gastrointestinales, neoplasias pancreáticas, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasia quistica mucinosa del páncreas, neoplasias quísticas pancreáticas, pancreatoblastoma, y neoplasias peritoneales), enfermedad esofágica (p. ej., enfermedades ampollosas, candidiasis, acantosis glucogénica, ¡Jlceración, varices del esófago de Barrelt, atresia, quistes, diverticulos (p. ej., divertículo de Zenker), fistula (p. ej., fistula traqueoesofágica), trastornos de la motilidad (p. ej., sindrome CREST, trastornos de la deglución, acalasia, espasmo, reflujo gastroesofágico), neoplasias, pelioración (p. ej., sindrome de Boertlaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia diafragmática (p. ej., hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como, gastroenteritis (p. ej., Cholera morbus, infección por virus de Norwalk), hemorragia (p. ej., hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica), neoplasias del estómago (cáncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, cáncer de estómago», hernia (p. ej., hernia diafragmática congénita, hernia femoral, hemia inguinal, hemia obturatriz, hernia umbilical, hernia ventral), y enfermedades intestinales (p. ej., enfermedades ceca les (apendicitis, neoplasias ceca les)).
Quimiotaxis
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener actividad quimiotáctica. Una molécula quimiotáclica atrae o moviliza células
(p. ej., monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastocitos, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio concreto del organismo, tal como un sitio de inflamación, infección, o hiperproliferaciórJ. Las células movilizadas pueden entonces combatir y/o curar el trauma o anomalía concretos.
Las proteinas de fusión de albúmina de la invención y/o los polinucleótidos que codifican las proteinas de fusión de albúmina de la invención pueden aumentar la actividad quimiotáctica de células concretas. Estas moléculas quimiotácticas se pueden utilizar para tratar la inflamación, infección, trastomos hiperproliferativos, o cualquier trastomo del sistema inmunitario aumentando el número de células dirigidas a una localización particular en el
organismo. Por ejemplo, las moléculas quimiotácticas se pueden utilizar para el tratamiento de heridas y otros traumatismos de los tejidos atrayendo células inmunitarias a la localización lesionada. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer fibroblastos, que se pueden uti lizar para tratar heridas
También se contempla que las proteínas de fusión de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención puedan inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas también se podrían utilizar para tratar trastornos. Así, las proteínas de fusión de la invención yfo los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusiórJ de albúmina de la invención se podrían utilizar como inhibidores de la quimiotaxis.
Actividad de unión
Las proteínas de fusión de albúm ina de la invenciórJ pueden ser utilizadas para la detección de moléculas que se unen a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión o para moléculas a las que se une la porción de proteína terapéutica de la proteina de fusión. La unión de la proteína de fusión y la molécula puede activar (agonista), aumentar, inhibir (antagonista), o disminuir la actividad de la proteína de fusión o de la molécula unida Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleólidos, proteínas (p. ej., receptores), o moléculas pequeñas
Preferiblemente, la molécula esta estrechamente relacionada con el ligando natural de la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de la invención, p. ej., un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional. (Véase, Coligan et al., Current Protocols in Immunology I (2): Capítulo 5 (1991 ». De manera similar, la molécula puede estar estrechamente relacionada con el receptor natural al que se une la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o al menos, un fragmento del receptor susceptible de ser unido a la porción de proteina terapéutica de una proteina fusión de albúmina de la invención (p. ej., sitio activo). En cualquier caso, la molécula puede diseñarse racionalmente usando técnicas conocidas .
Preferiblemente, el escrutinio de estas moléculas implica la producción de células apropiadas que expresan las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Las células preferidas incluyen células de mamíferos, levaduras, Drosophila, o E. coli.
El análisis puede simplemente someter a ensayo la unión de un compuesto candidato a una proteína de fusión de albúmina de la invención, en donde la unión se detecta mediante una marca, o en un ensayo que implica competición con un competidor marcado. Adicionalmente, el análisis puede someter a ensayo si el compuesto candidato da como resultado una señal generada mediante la unión a la proteína de fusión.
Altemativamente, el ensayo se puede llevar a cabo utilizando preparaciones libres de células, proteína de fusiÓflfmolécula fijada a un soporte sólido, bibliotecas quimicas, o mezclas de productos naturales. El análisis también puede comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene una proteína de fusión de albúmina, medir la actividad o la unión de la proteína de fusión/molécula, y comparar la actividad o la unión de la proteína de fusiónfmolécula a un patrón.
Preferiblemente, un análisis ELISA puede medir el nivel o la actividad de proteína de fusión en una muestra (p. ej., muestra biológica) utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel o la actividad de proteína de fusión ya sea mediante unión, directa o indirectamente, a la proteína de fusión de albúmina o mediante competición con la proteína de fusión de albúmina por un sustrato
Además, el receptor al que se une una porción de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención puede ser identificado mediante numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, inmunoabsorción del ligando y clasificación FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capitulo 5, (1991». Por ejemplo, en casos en los que la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión corresponde a FGF, se puede emplear la clonación de la expresión en donde se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula sensible a la proteína de fusión de albúmina, por ejemplo, células NIH3T3 que se sabe que contienen múltiples receptores para las proteínas de la familia FGF, y células SC-3, y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en agrupaciones y se utiliza para transfectar células cas u otras células que no responden a la proteína de fusión de albúmina. Las células transfectadas que se cultivan en portaobjetos de vidrio se exponen a la proteína de fusión de albúmina de la presente invención, después de que han sido etiquetados. Las proteínas de fusión de albúmina pueden marcarse mediante una variedad de medios que incluyen yodaciÓfl o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio
Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis auto-radiográfico. Se identifican las agrupaciones positivas y se preparan subagrupaciones y se vuelven a transfectar utilizando un procedimiento de sub-agrupamiento y re-escrutinio iterativo, obteniéndose finalmente un solo clan que codifica el supuesto receptor
Como enfoque alternativo para la identificación del receptor, una proteína de fusión de albúmina marcada puede ser conectada mediante fotoafinidad a preparaciones de membrana celular o extractos que expresan la molécula del receptor para el componente de proteína terapéutica de una proteína de fusiÓfl de albúmina de la invención , el material conectado puede ser resuelto mediante análisis PAGE y expuesto a película de rayos X. El complejo
marcado que contiene los receptores de la proteina de fusión se puede escindir, resolver en fragmentos de péptidos, y someter a microsecuenciación de proteinas. La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación se utilizaria para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para escrutar una biblioteca de ADNc para identificar los genes que codifican los supuestos receptores.
Por otra parte, se pueden emplear técnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones, y/o barajado de codones (denominadas colectivamente como quot;barajado de ADW) para modular las actividades de la proteína de fusión, y/o la porción de proteína terapéutica o componente de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, generando de ese modo eficazmente agonistas y antagonistas de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Véanse, en general, las Patentes de Estados Unidos Núms 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, Y 5.837.458, Y Patten, PA, et al., Curr. Opinion BiotechnoL 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, OC, et al., J. Mll. Biol. 287:265-76 (1999); y Lorenzo, MM y Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13 (1998); cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan a la presente memoria como referencia). En una realización, la alteración de los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención y por lo tanto, las proteínas de fusión de albúmina codificadas por los mismos, se puede lograr por barajado de ADN. El barajado de ADN implica el ensamblaje de dos
o más segmentos de ADN en una molécula deseada por recombinación homóloga o específica de sitio. En otra realización, los polinucleátidos que codifican las proteínas de fusiórJ de albúmina de la invención y por lo tanto, las proteínas de fusión de albúmina codificadas por los mismos, pueden ser alterados al ser sometidos a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a error, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. En otra realización, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se pueden recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas. En realizaciones preferidas, las moléculas heterólogas son miembros de la familia. En otras realizaciones preferidas, la molécula heteróloga es un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I), factor de crecimiento transformante (TGF) alfa, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), TGF-beta, proteína mortogenética ósea (BMP}-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, activinas A y B, decapentaplégico (dpp), 60A, OP-2, dorsalina, factores de diferenciación de crecimiento (GDF), nodal, MIS, inhibina-alfa, TGF-beta 1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5, y factor neurotrófico derivado de la glia (GDNF)
otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos de la porción de proteína terapéutica y/o componente de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de una porción de la proteína terapéutica y/o componente de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una mejora de la actividad deseada, o una disminución de la actividad no deseada.
Adicionalmente, esta invención proporciona un método de escrutinio de compuestos para identificar aquellos que modulan la acción de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Un ejemplo de dicho análisis comprende combinar un fibroblasto de mamífero, una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, yel compuesto a escrutar y 3{H]_timidina en condiciones de cultivo celular en el que el fibroblasto normalmente proliferaría. Se puede realizar un ensayo de control en ausencia del compuesto a escrutar y en comparaciórJ con la cantidad de proliferación de fibroblastos en presencia del compuesto para determinar si el compuesto estimula la proliferación mediante la determinación de la absorción de 3[H]-timidina en cada caso. La cantidad de froliferaciórJ de fibroblastos se mide mediante cromatografía de centelleo líquido que mide la incorporación de (H]-timidina. Ambos compuestos agonistas y antagonistas se pueden identificar mediante este procedimiento.
En otro método, se incuban una célula de mamífero o una preparaciórJ de membrana que expresan un receptor para el componente de proteína terapéutica de una proteína de fusión de la invención con una proteína de fusión marcada de la presente invención en presencia del compuesto. La capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción podria medirse a continuación. Altemativamente, se mide la respuesta de un sistema de segundo mensajero conocido después de la interacción de un compuesto a escrutar y el receptor y se mide la capacidad del compuesto para unirse al receptor y provocar una respuesta de segundo mensajero para determinar si el compuesto es una proteína de fusión potencial. Dichos sistemas de segundo mensajero incluyen, pero no se limitan a, AMPc guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinosítidos
Todos estos ensayos anteriores se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico o pronóstico. Las moléculas descubiertas utilizando estos análisis pueden usarse para tratar la enfermedad o para lograr un resultado concreto en un paciente (p. ej., crecimiento de vasos sanguíneos) activando o inhibiendo la proteína de fusión/molécula. Por otra parte, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente
Por lo tanto, la invención incluye un método para identificar compuestos que se unen a una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención; y (b) determinar si se ha producido la unión. Por otra parte, la invención incluye un método para identificar agonistas/antagonistas que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con una proteina de fusión de albúmina de la presente invención, (b) analizar la actividad biológica, y (b) deteOllinar si se ha alterado la actividad biológica de la proteína de fusión.
Suministro Dirigido
En otra realización, la invención proporciona un método para suministrar composiciones a células diana que expresan un receptor para un componente de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Como se comenta en la presente memoria, las proteínas de fusión de la invención pueden estar asociadas a polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicDS heterólogos, toxinas o profármacos a través de interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes. En una realización, la invención proporciona un método para el suministro especifico de las composiciones de la invención a las células mediante la administración de proteínas de fusión de la invención (incluyendo anticuerpos) que están asociadas a polipéptidos heterólogos o ácidos nucleicos. En un ejemplo, la invención proporciona un método para suministrar una proteína terapéutica a la célula diana. En otro ejemplo, la invención proporciona un método para el suministro de un ácido nucleico de hebra sencilla (p. ej., antisentido o ribozimas) o ácido nucleico de doble hebra (p. ej., AON que puede integrarse en el genoma de la célula
o replicarse episomalmente y que se puede transcribir) a la célula diana
En otra realización, la invención proporciona un método para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) mediante la administración de una proteína de fusión de albúmina de la invención
(p. ej., polipéptidos de la invención o anticuerpos de la invención) en asociación con toxinas o profármacos citotóxicos
Por quot;toxinaquot; se quieren sígnificar compuestos que se unen y activan sistemas efectoras citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas, o moléculas o enzimas cualesquiera no presentes nOfmalmente en o sobre la superficie de una célu la que bajo condiciones definidas causan la muerte de la célula. Las toxinas que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos conocidos en la técnica, compuestos tales como, por ejemplo, anticuerpos (o porciones de los mismos que contienen fijación del complemento) que se unen a un sistema efector citotóxico endógeno inherente o inducido, timidina quinasa, endonucleasa, ARNasa, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de la difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de fitolaca, alfa sarcina y toxina del cólera. Mediante quot;profáOllaco citotóxicoquot; se quiere significar un compuesto no tóxico que es convertido por una enzima, noOllalmente presente en la célula, en un compuesto citotóxico. Los profáOllacos citotóxicos que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, derivados glutam ilo de agente alquilante de mostaza del ácido benzoico, derivados fosfato de etopósido o mitomicina C, arabinósido de citosina, daunorrubicina, y derivados fenoxiacetamida de doxorrubicina
Escrutinio de fármacos
Adicionalmente se contempla el uso de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención, o los polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión, para el escrutinio de moléculas que modifican la actividad de la proteína de fusión de albúmina de la presente invención o proteínas correspondientes a la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albumina. Tal método podría incluir poner en contacto la proteína de fusión con uno o varios compuestos seleccionados que se sospecha que tiene actividad antagónica o agonistica, y analizando la actividad de la proteína de fusión después de la unión.
Esta invención es particularmente útil para el escrutinio de compuestos terapéuticos mediante el uso de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención, o sus fragmentos de unión, en cualquiera de una variedad de técnicas de escrutinio de fáOllacos. La proteina de fusión de albúmina empleada en tal ensayo puede estar fijada a un soporte sólido, ser expresada sobre una superficie celular, estar libre en solución, o estar localizada intracelulaOllente. Un método de escrutinio de fármacos utiliza células anfitrionas eucariotas o procariotas que se transforman de foOlla estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan la proteína de fusión de albúmina. Los fármacos se escrutan contra tales células transformadas o sobrenadantes obtenidos a partir del cultivo de tales células, en análisis de unión competitiva. Se puede medir, por ejemplo, la fonnulación de complejos entre el agente que se está sometiendo a ensayo y una proteína de fusión de albúmina de la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos de escrutinio de fármacos o cualquier otro agente que afectan a las actividades mediadas por las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención. Estos métodos comprenden poner en contacto tal agente con una proteina de fusión de albúmina de la presente invención o un fragmento de la misma y analizar la presencia de un complejo entre el agente y la proteína de fusión de albúmina o un fragmento de la misma, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En tal análisis de unión competitiva, los agentes para el escrutinio suelen estar etiquetados. Después de la incubación, el agente libre se separa del presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada es una medida de la capacidad de un agente concreto para unirse a la proteína de fusión de albúm ina de la presente invención.
Otra técnica para el escrutinio de fármacos proporciona el escrutinio de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, y se describe en gran detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el13 de Septiembre de 1984, que se incorpora a la
presente memoria como referencia. En pocas palabras, un gran número de diferentes compuestos de ensayo peptidicos pequeños se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo peptidicos se hacen reacciona r con una proteína de fusión de albúmina de la presente invención y se lavan. Los péptidos unidos son detectados por métodos bien conocidos en la técnica. La proteína de fusión de albúmina purificada puede ser aplicada como revestimiento directamente sobre placas para su uso en las técnicas de escrutinio de fármacos anteriormente mencionadas. Además, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizadores para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido
Esta invención también contempla el uso de análisis de escrutinio de fármacos competitivos en los que anticuerpos neutralizadores capaces de unirse a una proteina de fusión de albúmina de la presente invención compiten especificamente con un compuesto de ensayo por la unión a la proteína de fusión de albúmina o fragmentos de la misma. De esta manera, los anticuerpos se utilizan para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más epítopos antigénicos con una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Péptidos de Unión y otras Moléculas
La invención también abarca procedimientos de escrutinio para identificar polipéptidos y no polipéptidos que se unen a las proteínas de fusión de albúmina de la invención, y las moléculas de unión identificadas de este modo. Estas moléculas de unión son útiles, por ejemplo, como agonistas y antagonistas de las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Tales agooistas y antagonistas se pueden utilizar, de acuerdo con la invención, en las realizaciones terapéuticas descritas en detalle, a continuación.
Este método comprende las etapas de: poner en contacto una proteína de fusión de albúmina de la invención con una pluralidad de moléculas; e identificar una molécula que se une la proteína de fusión de albúmina
La etapa de poner en contacto la proteína de fusión de albúmina de la invención con la pluralidad de moléculas se puede efectuar de diversas maneras. Por ejemplo, se puede contemplar la inmovilización de la proteína de fusión de albúmina sobre un soporte sólido y poner en contacto una solución de la pluralidad de moléculas con los polipéptidos inmovilizados. Tal procedimiento sería similar a un procedimiento de cromatografía de afinidad, comprendiendo la matriz de afinidad la proteina de fusión de albúmina inmovilizada de la invención. Las moléculas que tienen una afinidad selectiva por la proteína de fusión de albúmina se pueden purificar a continuación mediante selección de afinidad. La naturaleza del soporte sólido, el procedimiento para el anclaje de la proteína de fusión de albúmina al soporte sólido, el disolvente y las condiciones de la aislamiento por afinidad o selección son en gran parte convencionales y bien conocidos por los expertos normales en la técnica.
Altemativamente, se puede también separar una pluralidad de polipéptidos en fracciones sustancialmente separadas que comprenden un subconjunto de polipéptidos individuales. Por ejemplo, se puede separar la pluralidad de polipéptidos mediante eleclroforesis en gel, cromatografía en columna, o un método conocido por los expertos normales en la técnica para la separación de polipéptidos. Los polipéptidos individuales también pueden ser producidos por una célula anfitriona transformada de tal manera que tal que se expresen en o aproximadamente en su superficie exterior (p. ej., un fago recombinante). Los productos aislados individuales a continuación, pueden ser ~sondeados~ con una proteína de fusión de albúmina de la invención, opcionalmente en presencia de un inductor que debe ser uno necesario para la expresión, para determinar si tiene lugar cualquier interacción de afinidad selectiva entre la proteína de fusión de albúmina y el clon individual. Antes de poner en contacto la proteína de fusión de albúmina con cada fracción que comprende polipéptidos individuales, los polipéptidos podrían en primer lugar transferirse a un soporte sólido para mayor comodidad. Tal soporte sólido puede ser simplemente un trozo de membrana de filtro, tal como una elaborada de nitrocelulosa o nailon. De esta manera, los clones positivos pueden ser identificados a partir de una colección de células anfitrionas transformadas de una biblioteca de expresión, que albergan un constructo de ADN que codifica un polipéptido que tiene una afinidad selectiva por una proteína de fusión de albúmina de la invención. Además, la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene una afinidad selectiva por una proteína de fusión de albúmina de la invención puede ser determinada directamente por medios convencionales o la secuencia codificante de ADN que codifica el polipéptido con frecuencia puede ser determinada con mayor comodidad. La secuencia primaria puede deducirse a continuación a partir de la secuencia de ADN correspondiente. Si la secuencia de aminoácidos se va a determinar a partir del propio polipéptido, se pueden utilizar técnicas de microsecuenciación. La técnica de secuenciación puede incluir espectroscopia de masas.
En ciertas situaciones, puede ser deseable separar mediante lavado cualquier polipéptido no unidos de una mezcla de una proteína de fusión de albúmina de la invención y la pluralidad de polipéptidos antes de tratar de determinar o detectar la presencia de una interacción de afinidad selectiva. Tal etapa de lavado puede ser particularmente deseable cuando la proteína de fusión de albúmina de la invención o la pluralidad de polipéptidos están unidos a un soporte sólido.
La pluralidad de moléculas proporcionadas de acuerdo con este método se puede proporcionar por medio de bibliotecas de diversidad, como bibliotecas peptídicas o no peptídicas aleatorias o combinatorias que pueden ser escrutadas para determinar moléculas que se unen específicamente a una proteína de fusión de albúmina de la invención. Muchas bibliotecas son conocidas en la técnica que se puede utilizar, p. ej., bibliotecas sintetizadas químicamente, recombinantes (p. ej ., bibliotecas de presentación en fagos), y bibliotecas basadas en traducción in
vitro. Los ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente son descritas por Fodor et al., en Science 251 :767-773 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991); Lam et al., Nature 354:82-84 (1991); Medynski, BiofTechnology 12:709-710 (1994); Gallop et al., J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA. 90:10922-10926 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:11422-11426 (1994); Houghten el al., Biolechniques 13:412 (1992); Jayawickreme el al., Proc. NatJ. Acad. Sci. USA. 91:1614-1618 (1994); Salmoo el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:11708-11712 (1993); Publicación PCT Núm. WO 93120242 ; y Brenner y Lerner, Proc Na!1. Acad. Sci. USA. 89:5381·5383 (1992)
Los ejemplos de bibliotecas de presentación de fagos son descritos por Scoll et al., en Science 249: 386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711 -718 1992); Lenstra, J Immunol. Meth. 152:149-157 (1992); Kay et al., Gene 128:59-65 (1993); y la Publicación PCT Núm. WO 94/18318 de fecha 18 de Agosto de 1994
Las bibliotecas basadas en traducción in vitro incluyen pero no se limitan a las descritas en la Publicación PCT Núm WO 91/05058 de fecha 18 de Abril 1991; y Matlheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:9022-9026 (1994)
A modo de ejemplos de bibliotecas no peptidicas, se puede adaptar para su uso una biblioteca de benzodiazepina (véase p. ej., Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4.708-4712 (1994)). También se pueden utilizar bibliotecas de peptoides (Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:9367-9371 (1992» . Otro ejemplo de una biblioteca que se puede utilizar, en la que las funcionalidades amida en los péptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria transformada químicamente, es descrito por Ostresh el al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:1113811142 (1994».
La variedad de bibliotecas no peptídicas que son útiles en la presente invención es grande Por ejemplo, Ecker y Crooke (BiofTechnology 13:351-360 (1995)) enumeran benzodiazepinas, hidantoinas, piperazinodionas, bifenilos, análogos de azúcares, beta-mercaptocetooas, ácidos arilacélicos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas, y oxazolonas entre las especies químicas que forman la base de varias bibliotecas.
Las bibliotecas no peptídicas se pueden clasificar en dos tipos: monómeros y olig6meros decorados. Las bibliotecas de monómero decorados emplean una estructura de armazón relativamente simple en la que se añade una variedad de grupos funcionales. A menudo, el armazón sera una molécula con una actividad farmacológica útil conocida. Por ejemplo, el armazón podría ser la estructura de la benzodiazepina
Las bibliotecas de ol igómeros no peptídicos utilizan un gran número de monómeros que se ensamblan entre si de manera que se crean nuevas formas que dependen del orden de los monómeros. Entre las unidades monoméricas que se han utilizado se encuentran los carbamatos , las pirrolinonas y las morfolinas. Los peptoides, oligómeros similares a péptidos en los que la cadena lateral está anclada al grupo amino alfa en lugar de al carbono alfa, forman la base de otra versión de las bibliotecas de oligómeros no peptídicos. Las primeras bibliotecas de oligómeros no peptidicos utilizaban un solo tipo de monómero y de este modo contenían una cadena principal de repetición. Las bibliotecas recientes han utilizado más de un monómero, confiriendo a las bibliotecas de flexibilidad añadida
El escrutinio de las bibliotecas se puede lograr por cualquiera de una variedad de métodos comúnmente conocidos. Véanse, p. ej ., las siguientes referencias, que describen el escrutinio de bibliotecas de peptidos: Parmley et al., Adv. Exp. Med. Biol. 251 :215-218 (1989); Scoll et al,. Science 249:386-390 (1990); Fowlkes et al., BioTechniques 13:422· 427 (1992); Oldenburg el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5393-5397 (1992); Yu el al., Cell 76:933-945 (1994); Staudt et al., Science 241 :577-580 (1988); Bock et al., Nature 355:564-566 (1992); Tuerk et al., Proc. NatJ. Acad. Sci USA. 89: 6988-6992 (1992); Ellington et al., Nature 355:850-852 (1992); Patente de Estados Unidos. Núm. 5.096.815, Patente de los Estados Unidos. Núm. 5.223.409, y Patente de los Estados Unidos. Núm. 5.198.346, todas de Ladner et al.; Rebar et al., Science 263:671 -673 (1993); y Publicación PCT Núm. WO 94/18318
En una realización específica, el escrutinio para identificar una molécula que se une una proteína de fusión de albúmina de la invención puede llevarse a cabo poniendo en contacto los miembros de la biblioteca con una proteína de fusión de albúmina de la invención inmovilizada sobre una fase sólida y cosechar los miembros de la biblioteca que se une a la proteína de fusión de albúmina. Los ejemplos de tales métodos de escrutinio, denominados técnicas de ~inmunoabsorción~ son descrilas a modo de ejemplo por Parmley el al., Gene 73:305-318 (1988); Fowlkes et al., BioTechniques 13:422-427 (1992); Publicación PCT Núm. WO 94/18318; yen las referencias citadas en la presente memoria.
En otra realización, se puede utilizar el sistema de dos híbridos para seleccionar proteínas que interactúan en levadura (Fields y otros, Nature 340:245-246 (1989); Chien el al., Proc. Natl. Acad. Sa. USA. 88:9578-9582 (1991) para identificar moléculas que se unen específicamente a polipéptidos de la invención.
Cuando la molécula de unión es un polipéptido, el polipéptido puede ser convenientemente seleccionado de cualquier biblioteca de péplidos, incluyendo bibliotecas de péplidos al azar, bibliotecas combinatorias de péptidos, o bibliotecas sesgadas de péptidos. El término quot;sesgadaquot; se utiliza en la presente memoria para significar que el método de generación de la biblioteca se manipula coo el fin de limitar uno o más parámetros que rigen la diversidad de la colección de moléculas resultante, en este caso péptidos De este modo, una biblioteca de péptidos verdaderamente aleatoria generaría una colección de péptidos en la que la
probabilidad de encontrar un aminoácido concreto en una posición dada del péptido es la misma para los 20 aminoácidos. Se puede introducir un sesgo en la biblioteca, sin embargo, especificando, por ejemplo, que se produce una lisina cada quinto aminoácido o que se fijan las posiciones 4, 8, Y 9 de una biblioteca de decapéptidos para incluir solamente arginina. Claramente, se pueden contemplar muchos tipos de sesgos, y la presente invención no se limita a ningún sesgo concreto. Además, la presente invención contempla tipos específicos de bibliotecas de péptidos, tales como bibliotecas de péptidos presentadas por fagos y las que utilizan un constructo de ADN que comprende un vector de fago lambda con un inserto de ADN
Como se mencionó anteriormente, en el caso de una molécula de unión que es un polipéptido, el polipéptido puede tener de aproximadamente 6 a menos de aproximadamente 60 residuos de amillOácido, preferiblemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 residuos de aminoácido, y lo más preferiblemente, de aproximadamente 6 a aproximadamente 22 aminoácidos. En otra realización, un polipéptido de unión está en el intervalo de 15-100 aminoácidos, o 20-50 aminoácidos.
El polipéptido de unión seleccionado se puede obtener mediante síntesis química o expresión recombinante
Otras Actividades
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención, se pueden emplear en el tratamiento para estimular la revascularización de tejidos isquémicos debido a diversas enfermedades tales como trombosis, arteriosclerosis, y otras afecciones cardiovascular. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención ylo polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden emplearse para estimular la angiogénesis y la regeneración de miembros, como se comentó anteriormente
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para tratar heridas debidas a lesiones, quemaduras, reparación de tejido después de operación, y las úlceras ya que son mitogénicos para varias células de diferentes orígenes, tales como fibroblastos y células del músculo esquelético, y por lo tanto, facilitan la reparación o sustitución de tejido dañado o enfermo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para estimular el crecimiento neuronal y para tratar y prevenir el daño neuronal que se produce en ciertos trastomos neuronales o afecciones neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad, la enfermedad de Par1lt;inson, y el complejo relacionado con el SIDA. Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención puede tener la capacidad de estimular el crecimiento de condrocitos, por lo tanto, se pueden emplear para mejorar la regeneración ósea y periodontal y ayudar en eltransplante de tejidos o injertos óseos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para prevenir el envejecimiento cutáneo debido a quemaduras solares mediante la estimulación de crecimiento de queratinocitos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invenciÓfl también se pueden emplear para la prevención de la pérdida del cabello. En la misma línea, una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o el polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden emplear para estimular el crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas y células de médula ósea cuando se utilizan combinados con otras citoquinas.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para mantener órganos antes del trasplante o para apoyar el cultivo de células de tejidos primarios. Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el pol inucleótido que codifica una proteina de fusión de albúmina de la invención también se pueden emplear para la inducción de tejido de origen mesodérmico para su diferenciación en embriones tempranos
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o el polinucleótido que codifica una proteína de albúmina de fusión de la invención también puede aumentar o disminuir la diferenciación o proliferación de células madre embrionarias, aparte de, como se comentó anteriormente, el linaje hematopoyético.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención tambíén se pueden utilizar para modular características de mamlferos, tales como la altura del cuerpo, peso, color de pelo, color de los ojos, piel, porcentaje de tejido adiposo, pigmentación, tamaño y forma
(p. ej., cirugía estética). Del mismo modo, una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o el polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden uti lizar para modular el metabolismo de mamíferos que afecta al catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía
Una proteína de fusión de albúmina de la invención ylo el polinucleátido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede utilizar para cambiar el estado mental o el estado físico de un mamífero
inHuyendo en los biorritmos, los ritmos circadianos, la depresión (incluyendo trastornos depresivos), la tendencia a la violencia, la tolerancia al dolor, las capacidades reproductivas (preferiblemente mediante actividad de tipo Activina o Inhibina), los niveles hormonales o endocrinos, el apetito, la libido, la memoria, el estrés u otras cualidades cogn itivas.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o el polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden utilizar como aditivo alimentario o conservante, por ejemplo para aumentar o disminuir las capacidades de almacenamiento, el contenido de grasa, los lípidos, las proteínas, los carbohidralos, las vitaminas, los minerales, los cofactores u otros componentes nulricionales.
Las aplicaciones anteriormente citadas tienen usos en una amplia variedad de anfitriones. Tales anfitriones incluyen , pero no se limitan a, seres humanos, múridos, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos, ratones, ratas, hámster, cerdos, micro-cerdos, pollos, cabras, vacas, ovejas, perros, gatos, primates no humanos, y humanos. En realizaciones específicas, el anfitrión es un ratón, conejo, cabra, cobaya, pollo, rata, hámster, cerdo, oveja, perro o gato. En realizaciones preferidas, el anfitrión es un mamífero. En realizaciones más preferidas, el anfitrión es un ser humano.
Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretende que sean limitantes
Sin descripción adicional, se cree que un experto normal en la técnica puede, utilizando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, llevar a cabo y utilizar las alteraciones detectadas en la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo por lo tanto, apuntan específicamente a realizaciones preferidas de la presente invención, y no se deben interpretar como limitantes el resto de la descripción de ninguna manera
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de pScNHSA y pScCHSA.
Los vectores pScNHSA (Núm. de depósito ATCC PTA-3279) y pScCHSA (Núm. de depósito ATCC PTA-3276) están derivados de pPPCOOOS (Núm. de depósito ATCC PTA-3278) y se utilizan como vectores de clonación en los que los polinucleótidos que codifican una protelna terapéutica o un fragmento o variante de la misma se insertan adyacentes a y en marco de traducción con los polinucleótidos que codifican la albúmina de suero humana ~HSAquot;. El pScCHSA se puede utilizar para la generación de fusiones de proteína terapéutica-HSA, mientras que pScNHSA se puede utilizar para generar fusiones de HSA-proteína terapéutica
Generación de pScCHSA: fusión de albúmina con el radical de albúmina C-terminal con respecto a la porción terapéutica.
Se preparó un vector para facilitar la clonación de AON que codifica una proteína terapéutica N-terminal a AON que codifica la proteína de la albúmina madura mediante la alteración de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de HSA quimérico en pPPC0005 para incluir los sitios de restricción Xho I y G/a I
En primer lugar, se eliminaron los sitios Xho I y Cla I inherentes a pPPC0005 (localizados 3' de la secuencia terminadora de AOHL) mediante digestión de pPPCOO05 con Xho 1 y C/a 1, rellenando los extremos cohesivos con AON polimerasa de 14, y religando los extremos romos para crear pPPC0006.
En segundo lugar, los sitios de restricción Xho I y ela I fueron diseñados en la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de HSA (una quimera del líder de HSA y un sitio KEX2 del factor alfa de apareamiento, ~MAF~) en pPPC0006 utilizando dos rondas de PCR. En la primera ronda de PCR, se llevó a cabo la amplificación con los cebadores que se muestran como SEO ID NO: 36 y SEO ID NO: 37. El cebador cuya secuencia se muestra como SEO ID NO: 36 comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica parte de la secuencia del péptido señal de HSA, un sitio kex2 de la secuencia lider del factor de apareamiento alfa, y parte del extremo amino de la forma madura de HSA. Se introdujeron cuatro mutaciones puntuales en la secuencia, creando los sitios Xho I y Cla I que se encuentran en el empalme del péptido señal quimérico y la forma madura de la HSA. Estas cuatro mutaciones están subrayadas en la secuencia mostrada a continuación. En pPPC0005 los nucleótidos en estas cuatro posiciones de 5' a 3' son T, G, T, Y G. 5'-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTIAAAGATnGGG-3' (SEO ID NO: 36) y 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3' (SEO ID NO: 37). A continuación, se realizó una segunda ronda de PCR con un cebador flanqueante corriente arriba, 5'TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3' (SEO ID NOquot; 38) Y un cebador f1anqueante 5' aguas abajo CACTTCTCTAGAGTGGTnCATATGTCTT-3' (SEO ID NO: 39). El producto de PCR resultante se purificó y se digirió con AFIII y Xba I y se ligó en los mismos sitios en pPPC0006 creando pScCHSA. El plásmido resultante tiene sitios Xho J y e/a 1 mod ificados genéticamente en la secuencia seña l. La presencia del sitio Xho 1 crea un único cambio de aminoácido en el extremo de la secuencia señal de LOKR para LEKR. El cambio de O a E no estará presente en el plásmido de expresión de la proteína de fusión de albúmina final cuando se liga una secuencia de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica la porción terapéutica de la proteína de fusión de albúmina con un sitio Sal t 5' (que es compatibte con et sitio Xho t) y un sitio G/a t 3' a tos sitios Xho t y G/a t de pScCHSA. La ligación de Sa/ I a Xho 1 restaura la secuencia de aminoácidos original de la secuencia del péptido señal. El AON que codifica la porción terapéutica de la proteina de fusión de albúmina se puede insertar después del sitio Kex2 (Kex2 escinde después de la secuencia de aminoácidos dibásica de KR en el extremo del péptido señal) y antes del sitio G/a I
Generación de pScNHSA: fusión de albúmina con el radical de albúmina de N-terminal a la porción terapéutica
Se preparó un vector para facilitar la clonación de AON que codifica una porción de proteína terapéutica C-terminal a AoN que codifica la proteína de la albúmina madura, mediante la adición de tres sitios de restricción de ocho pares de bases a pScCHSA. Los sitios de restricción Ase 1, Fse 1, y Pme I se añad ieron entre los sitios Bsu36 I y Hind 111 al extremo de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína HSA madura. Esto se logró mediante el uso de dos cebadores sintéticos complementarios que contenían los sitios de restricción Ase 1, Fse 1, y Pme I subrayados (SEO ID NO: 40 y SEO ID NO: 41) 5'-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3' (SEO ID NO: 40 ) y 5-AGAATTAAGCTTAGTTIAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3' (SEO ID NO· 41). Estos cebadores se hibridaron y se digirieron con Bsu36 1 y Hind 111 y se ligaron en los mismos sitios en pScCHSA creando pScNHSA
Ejemplo 2: Generación del constructo general para la transformación de levaduras
Los vectores pScNHSA y pScCHSA pueden ser utilizados como vectores de clonación en los que los polinucleótidos que codifican una proteína terapéutica o un fragmento o variante de la misma se insertan adyacentes a polinucleótidos que codifican albúmina de suero humana madura -HSAquot; El pScCHSA se utiliza para la generación de fusiones de proteína terapéutica-HSA, mientras que el pScNHSA se puede utilizar para generar fusiones de HSAproteína terapéutica
Generación de constructos de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión de HSA-proteína terapéutica.
El AoN que codifica una proteína terapéutica (p. ej., las secuencias mostradas en SEO ID NO: X o conocidas en la técnica) puede ser amplificado mediante PCR utilizando los cebadores que facilitan la generación de un constructo de fusión (p. ej., mediante la adición de sitios de restricción, fusiones continuas codificantes, secuencias conectoras codificantes, etc.) Por ejemplo, un experto en la técnica podría diseñar un cebador 5' que añade polinucleótidos que codifican los últimos cuatro aminoácidos de la forma madura de HSA (y que contiene el sitio Bsu361) en el extremo 5' del AoN que codifica una proteína terapéutica; y un cebador 3' que añade un codón de PARADA y sitios de clonación apropiados en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína terapéutica. Por ejemplo, el cebador directo utilizado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica puede tener la secuencia, 5'aagctGCCTTAGGCTTA(N)w3' (SEO ID NO: 42) donde la secuencia subrayada es un sitio Bsu361, los nucleótidos en mayúscula codifican los últimos cuatro aminoácidos de la proteína madura de HSA (ALGL), y (N)15 es idéntico a los primeros 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Del mismo modo, el cebador inverso utilizado para amplificar el AoN que codifica una proteína terapéutica puede tener la secuencia, 5'GCGCGCCTTTAAAGGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTA(N)lS-3' (SEO ED NO: 43), donde la secuencia en cursiva es un sitio Pma 1, la secuencia subrayada doble es un sitio Fsa 1, la secuencia subrayada individualmente es un sitio Ase 1, los nucleótidos en el recuadro son el complemento inverso de dos codones de parada en tándem, y (N)15 es idérJtico al complemento inverso de los últimos 15 nucleótidos que codifican la proteína de interés terapéutico. Una vez que el produclo de la PCR se amplifica se puede cortar con Bsu361 y ligar uno de (Ase 1, Fse 1, o Pma 1) a pScNHSA.
La presencia del sitio Xho I en la secuencia líder quimérica de HSA crea un único cambio de aminoácido en el extremo de la secuencia señal quimérica, es decir, la secuencia señal de HSA-kex2, de LoKR (SEO ID NO: 44) a LEKR (SEO ID NO: 45).
Generación del constructo de fusión de albúmina que comprende productos de fusión de genes de HSA.
Al igual que en el metodo descrito anteriormente, el AoN que codifica una proteína terapéutica puede ser amplificado mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: un cebador 5' que añade polinucleólidos que contiene un sitio Sal! y que codifica los tres últimos aminoácidos de la secuencia líder de HSA, OKR, en el extremo 5' del AoN que codifica una proteína terapéutica; y un cebador que añade los polinucleólidos que codifican los primeros aminoácidos de la HSA madura que contiene un sitio G/a I en el extremo 3' del AoN que cod ifica una proteína terapéutica. Por ejemplo, el cebador efector se utiliza para amplificar el AON que codifica una proteina terapéutica puede tener la secuencia, 5'-aggagcgtcGACAAAAGA(N)w 3' (SEO ID NO: 46) doode la secuencia subrayada es un sitio Sa/I, los nucleótidos en mayúsculas codifican los tres últimos aminoácidos de la secuencia líder de HSA (DKR), y (N)lSes idéntico a los primeros 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Del mismo modo, el cebador inverso utilizado para amplificar el ADN que codifica una proteína terapéutica puede tener la secuencia, 5'-CTTIAAATGGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)lS-3' (SEO ID NO: 47), donde la
secuencia en cursiva es un sitio G/a 1, los nucleólidos subrayados son el complemento inverso del AoN que codifica los primeros 9 aminoácidos de la fonna madura de HSA (DAHKSEVAH, SEO ID NO: 48), y (Nhs es idéntico al complemento inverso de los últimos 15 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés_ Una vez que el producto de la PCR se amplifica puede ser cortado con Sal I y Gla I y ligado a pScCHSA digerido con Xho I y G/a I Se puede desear una secuencia seña lo líder diferenle, por ejemplo, se pueden subclonar invertasa quot;INVquot; (Acceso de Swiss-Prot P00724), factor alfa de apareamiento quot;MAFquot; (Acceso de Genbank AAA18405), MPIF (Geneseq AAF82936), Fibulina B (Acceso de Swiss-Prot P23142). dusterina (Acceso de Swiss-Prot Pi 0909), Proteína 4 de Unión al Factor de Crecimiento Similar a Insulina (Acceso de Swiss-Prot P22692), y permutaciones de la secuencia líder de HSA en el vector apropiado pOf medio de métodos convencionales conocidos en la técnica
Generación de constructo de fusión de albúmina compatible para la expresión en la levadura S, cerevisiae,
El fragmento Not I que contiene el ADN que cod ifica una proteína de fusión de albúmina de N-tenninal o C-tenninal generada a partir de pScNHSA o pScCHSA se puede clonar a continuación en el sitio Not l de pSAC35 que tiene un marcador de selección LEU2_ El vector resultante se utiliza después en la transformación de un sistema de expresión de levadura de S. cerevisiae.
Ejemplo 3: Expresión general en la levadura S, cerevisiae,
Un vector de expresión compatible con la expresión en levaduras se puede transformar en la levadura S. cerevisiae mediante transformación con acetato de litio, electroporación, u otros métodos conocidos en la técnica y/o como describen o en parte, Sambrook, Fritsch, y Maniatis_1989_ en quot;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 a ediciónquot;, volúmenes 1-3, y en Ausubel et al. 2000. Hospital General de Massachuselts y la Escuela Médica de Harvard quot;Current Protocols in Molecular Biologyquot;, volúmenes 1-4_Los vectores de expresión se introducen en cepas de S cerevisiae DXY1, 088, o BXP10 mediante transformación, los transformantes individuales e pueden cu ltivar, por ejemplo, durante 3 días a 30Q C en 10 mL de YEPD (extracto de levadura al 1% plv, peptona al 2 % plv, dextrosa al 2% plv), y las células se pueden recoger en la fase estacionaria después de 60 horas de crecimiento_ Los sobrenadantes se recogen aclarando las células a 3_000 g durante 10 minutos
El pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42 y véase la figura 3) comprende, además del marcador seleccionable LEU2, el plásmido de 2 IJm de levadura completo para propOfcionar las funciones de replicación, el promotor PRB1, y la señal de terminación de ADH1
Ejemplo 4: Purificación general de una proteína de fusión de albúmina expresada a partir de una fusión de albúmina en la levadura S, cerevisiae,
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden la forma madura de HSA fusionada a cualquiera de los extremos N-o C-terminales de la forma madura de una proteína terapéutica o porciones de la misma (p_ej_, la forma madura de una proteína terapéutica enumerada en la Tabla 1, o la forma madura de una proteína terapéutica mostrada en la Tabla 2 como SEQ ID NO: Z). En una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden adicionalmente una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente en las rutas de secreción del anfitrión utilizado para la expreSión. En una realización preferida, el péptido señal codificado por la secuencia de señal se retira, y la proteína de fusión de albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo_ Las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden preferiblemente secuencias señal heterólogas (p. ej., la secuencia señal no nativa de una proteína terapéutica concreta), incluyendo, pero no limitadas a, MAF, INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, Proteína 4 de Unión al Factor de Crecimiento Similar a la Insulina, secuencias líder de HSA variantes, incluyendo, pero no limitadas a, una secuencia líder de HSAlMAF quimérica, u otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. Son especialmente preferidas las secuencias señal enumeradas en la Tabla 2 ylo la secuencia señal enumerada en la sección de quot;Expresión de Proteínas de Fusiónquot; y/o quot;Métodos Ad iciona les de Producción Recombinante y Sintética de Proteínas de Fusión de Albúminaquot; de la memoria descriptiva anterioL En rea lizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención comprenden adicionalmente un residuo de metionina N-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluyendo fragmentos ylo variantes, también están abarcados por la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina expresadas en levadura como se ha descrito anteriormente se pueden purificar a pequeña escala a través de una columna de afinidad de péptido Dyax como sigue_ Los sobrenadantes de levadura que expresan una proteína de fusión de albúmina se someten a diafiltración frente a tampón de fosfato 3 mM de pH 6,2, NaCI20 mM y Tween 20 al 0,01% para reducir el volumen y para eliminar los pigmentos. La solución se filtra a continuación a través de un dispositivo de 0_22 IJm_El producto filtrado se carga en una columna de afinidad de péptido Dyax_La columna se eluye con TrislHCI100 mM, tampón de pH 8,2_ Las fracciones del pico que contienen la proteína se recogen y se analizan en SDS-PAGE después de concentrar 5 veces.
Para la purificación a gran escala, se puede utilizar el siguiente método_El sobrenadante en exceso de 2 L se somete a diafiltración y se concentra hasta 500 mL en Tris/HCI 20 mM pH 8,0. La solución de proteína concentrada se carga en una columna de Flujo Rápido de DEAE-Sefarosa de 50 mL pre-equilibrada, la columna se lava, y la proteína se hace eluir con un gradiente lineal de NaCI de NaCI de O a 0,4 M en TrisfHCI20 mM, pH 8,0. Las fracciones que contenían la proteína se reúnen, se ajustan a pH 6,8 con fosfato de sodio (NaH2P0 4) 0,5 M. Se añade una concentración final 0,9 M de (NH4)2S04 a la solución de proteina y toda la solución se carga en una columna Butyl650S de 50 mL pre-equilibrada. La proteína se eluye con un gradiente lineal de sulfato de amonio «NH4)2S04 de 0,9 a O M). Las fracciones con la fusión de albúmina se agrupan de nuevo, se someten a diafillración frente a tampón de Na2HP04fácido cítrico 10 mM de pH 5,75, Y se cargan en una columna de Flujo Rápido de SPSefarosa pre-equilibrada de 50 mL. La proteína se eluye con un gradiente lineal de NaCI de O a 0,5 M. Las fracciones que contienen la proteína de interés se combinan, el tampén se cambia a Na2HPOJácido cítrico 10 mM de pH 6,25 con un concentrador Amicon, la conductividad es lt; 2,5 mS/cm. Esta solución de proteína se carga en una columna de alto rendimiento de O-Sefarosa pre-equilibrada de 15 mL, la columna se lava, y la proteína se eluye con un gradiente lineal de NaCI de NaCI de O a 0,15 M. La proteína purificada se puede formular a continuación en una composición del tampón específica mediante intercambio de tampén.
Ejemplo 5: Generación de constructo general para la transfección de células de mamífero.
Generación de constructo de fusión de albúmina compatible para su expresión en líneas celulares de mamíferos.
Los constructos de fusión de albúmina pueden ser generados en vectores de expresión para su uso en sistemas de cultivo de células de mamíferos. El AoN que codifica una proteína terapéutica se puede clonar en el extremo N o el extremo C a HSA en un vector de expresión de mamífero por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica (p. ej., amplificación mediante PCR, digestión de restricción y ligación). Una vez que se ha construido el vector de expresión, puede proseguir la transfección en un sistema de expresión de mamífero. Los vectores adecuados son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, por ejemplo, el vector pC4, ylo vectores disponibles de Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).
El AoN que codifica la albúmina de suero humana se ha clonado en el vector pC4 que es adecuado para sistemas de cultivo de mamíferos, creando el plásmido pC4:HSA (Núm. de Depósito de la ATCC PTA 3277 ). Este vector tiene un gen de la dihidrofolalo reduclasa, quot;OHFRquot;, que va a permitir la selección en presencia de metotrexato
El vector pC4:HSA es adecuado para la expresión de proteínas de fusión de albúmina en células CHO. Para su expresión, en otros sistemas de cultivo de células de mamífero, puede ser deseable subclonar un fragmento que comprende, o consiste altemativamente en, AON que codifica una proteína de fusión de albúmina en un vector de expresión alternativo. Por ejemplo, un fragmento que comprende, o consiste alternativamente en, AON que codifica una proteína de fusión de albúmina madura puede subclonarse en otro vector de expresión que incluye, pero no está limitado a, cualquiera de los vectores de expresión de mamíferos descritos en la presente memoria.
En una realización preferida, el AoN que codifica un constructo de fusión de albúmina se subclona en vectores proporcionados por Lanza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) mediante procedimientos conocidos en la técnica para la expresión en células NSO.
Generación de constructos de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión de HSA-proteína terapéutica
Utilizando pC4:HSA (Núm. de depósito de la ATCC PTA-3277), se pueden generar construclos de fusión de albúmina en los que la porción de proteína terapéutica es terminal C con respecto a la secuencia de la albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar el AON que codifica una proteína terapéutica o fragmento o variante de la misma entre los sitios de restricción Bsu 361 y Ase I del vector. Cuando se clona en Bsu 361 y Ase 1, se puede emplear el mismo diseño de cebador utilizado para la clonación en el sistema de vector de levadura (SEO ID NO: 42 y 43) (véase el Ejemplo 2).
Generación de constructos de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión de genes de HSA.
Utilizando pC4:HSA (Núm. de depósito de la ATCC PTA-3277), se pueden generar constructos de fusión de albúmina en los que una porción de la proteína terapéutica se clona N-Ierminal con respecto a la secuencia de la albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar el AoN que codifica una proteína terapéutica que tiene su propia secuencia señal entre los sitios Bam HI (o Hind 111) y G/a I de pC4:HSA. Cuando la clonación es en el sitio Bam HI o Hind 111, es preferible incluir una secuencia de Kozak (CCGCCACCATG, SEO ID NO: 49) antes del codón de inicio de la traducción del AoN que codifica la proteína terapéutica. Si una proteína terapéutica no tiene una secuencia señal, el AON que codifica esa proteína terapéutica puede ser clonado entre los sitios Xho I y Gla I de pC4:HSA. Cuando se utiliza el sitio Xho 1, se pueden utilizar los siguientes cebadores de PCR 5' (SEO ID NO: 50) y 3' (SEO ID NO: 51 ) ilustrativos:
5'-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTICGTCGA(N)w 3' (SEO ID NO: 50)
5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)1s-3' (SEO ID NO: 51 )
En el cebador 5' (SEO ID NO: 50), la secuencia subrayada es un sitio Xho 1; y el sitio Xhol y el ONA que sigue el sitio Xhol codifica los últimos siete aminoácidos de la secuencia líder de la albúmina de suero humana natural. En el SEO ID NO: 50, quot;(N)Jaquot; es un AoN idéntico a los primeros 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés.
En el cebador 3' (SEO ID NO: 51), la secuencia subrayada es un sitio G/a 1; y el sitio G/a I y el AoN que lo sigue son el complemento inverso del AoN que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína HSA madura (SEO ID NO: 1). En el SEO ID NO: 51 quot;(N)lSquot; es el complemento inverso del AoN que codifica los últimos 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Utilizando estos dos cebadores, se puede amplificar mediante PCR la proteína terapéutica de interés, purificar el producto de PCR, digerir10 con enzimas de restricción Xho I y G/a I y clonar1o en los sitios Xho I y C/a I en el vector pC4:HSA
Si se desea una secuencia líder alternativa, la secuencia líder de la albúmina nativa se puede remplazar por el líder de albúmina quimérico, es decir, el péptido señal HSA-kex2, o un líder alternativo por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica. (Por ejemplo, un experto en la técnica podría rutinariamente amplificar mediante PCR un líder alternativo y subdonar el producto de PCR en un conslructo de fusión de albúmina en lugar del líder de albúmina mientras se mantiene el marco de lectura)
Ejemplo 6: Expresión general en líneas celulares de mamíferos.
Un constructo de fusión de albúmina generado en un vector de expresión compatible con la expresión en líneas celulares de mamífero se pueden transfectar a líneas celulares apropiadas mediante precipitación con fosfato de calcio, lipofectamina, electroporación, u otros métodos de transfección conocidos en la técnica y/o como describen Sambrook, Fritsch, y Maniatis. 1989. en quot;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 23 ediciónquot; y en Ausubel et al 2000. Hospital General de Massachusetls y Escuela Médica de Harvard quot;Current Protocols in Molecular Biolog( , volúmenes 1-4. Las células transfectadas se seleccionan a continuación por la presencia de un agente de selección determinado mediante el marcador seleccionable en el vector de expresión.
El vector de expresión pC4 (Núm. de Acceso de la ATCC 209646) es un derivado del plásmido pSV2-oHFR (Núm de Acceso de la ATCC 37146). El pC4 contiene el promotor fuerte de Repeticiones Terminales Largas quot;LTRquot; del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Marzo de 1985, Molecular and Cellular Biology, 438-447) y un fragmento del potenciador de citomegalovirus quot;CMVquot; (Boshart et al., 1985, Cell 41' 521-530). El vector también contiene el inlrón 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de la preproinsulina de rata y el gen oHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40. Para la transfección se utilizan células de ovario de hámster chino OCHOquot; u otras líneas celulares que carecen de un gen de oHFR activo. La transfección de un constructo de fusión de albúmina en pC4 a células CHO por medio de métodos conocidos en la técn ica permitirá la expresión de la proteína de fusión de albúmina en células CHO, seguida de la secuencia líder de escisión, y la secreción al sobrenadante. La proteína de fusión de albúmina se purificado adicionalmente a continuación a partir del sobrenadante
El vector de expresión pEE12.1 es suministrado por Lanza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) y es un derivado de pEE6 (Stephens y Cocketl, 1989, Nucl. Acids Res. 17:7110). Este vector comprende un promotor, potenciador y región no traducida 5' completa del gen Temprano Inmediato Principal del citomegalovirus humano, quot;hCMV-MIEquot; (Publicación Intemacional Núm. W089/D1036), aguas arriba de una secuencia de interés, y una gen de la glutamina sintetasa (Murphy et al., 1991, Biochem J. 227:277-279; Bebbington et al., 1992, BiofTechnology 10:169-175; Patente de Estados Unidos 5.122.464) para los propÓSitos de selección de células transfectadas en medio selectivo que contiene metionina sulfoximina. La transfección de constructos de fusión de albúmina preparados en pEE12.1 a células NSO (Publicación Intemacional Núm. W086/05807) por medio de métodos conocidos en la técnica permitirá la expresión de la proteína de fusión de albúmina en células NSO, seguido de escisión de la secuencia líder, y la secreción en el sobrenadante. La proteína de fusión de albúmina se purifica adicionalmente a continuación a partir del sobrenadante utilizando mecanismos descritos en la presente memoria o conocidos de otro modo en la técnica.
La expresión de una proteína de fusión de albúmina puede ser analizada, por ejemplo, mediante SoS-PAGE y transferencia Westem, análisis mediante HPLC de fase inversa, u otros métodos conocidos en la técnica.
Se generan líneas celulares CHO y NSO estables transfectadas con constructos de fusión de albúmina por medio de métodos conocidos en la técnica (p. ej., Iransfección con lipofectamina) y se seleccionan, por ejemplo, con metotrexato 100 nM para vectores que tienen el gen de la oiHidrofolato Reductasa 'oHFR' como marcador seleccionable o mediante cultivo en ausencia de glutamina. Los niveles de expresión pueden ser examinadas por ejemplo, mediante inmunolransferencia, principalmente, con un suero anti-HSA como anticuerpo primario, o, secundariamente, con suero que contiene anticuerpos dirigidos a la porción de proteina terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada como anticuerpo primario
Los niveles de expreSión se examinan mediante detección por inmunotransferencia con suero anti-HSA como anticuerpo primario. Las tasas de productividad específicas se determinan por medio de ELlSA en el que el anticuerpo de captura puede ser un anticuerpo monoclonal contra la porción de proteína terapéutica de la fusión de albúmina y el anticuerpo de detección puede ser el anticuerpo monoclonal anti-HSA-biotinilado (o viceversa), seguido de unión de peroxidasa de rábano picante/estreptavidina y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante
Ejemplo 7: Expresión de una proteína de fusión de albúmína en células de mamífero.
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden expresar en una célula de mamífero. Un vector de expresión de mamífero típico contiene un elemento promotor, que media el inicio de la transcripción del
ARNm, una secuencia codificante de proteina, y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación del transcrito. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intermedias nanqueadas por sitios donadores y aceptores de corte y empalme de ARN. Se logra una transcripción altamente eficiente con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de Retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden utilizar elementos celulares (p. ej., el promotor de la actina humana)
Los vectores de expresión adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como, pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0. Las células anfitrionas de mamífero que podrían usarse incluyen, pero no se limitan a, células Hela, 293, H9 Y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C 127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV1, células QCI-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO)
Altemativamente, la proteína de fusión de albúmina puede ser expresada en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como DHFR, gpt, neomicina, o higromicina permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas
El polinucleótido transfectado que cod ifica la proteína de fusión también puede amplificarse para expresar grandes cantidades de la proteína de fusión codificada. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil en el desarrollo de lineas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. (Véase, p. ej., Alt el al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin et al., Biochem et Biophys Acta, 1097:107-143 (1990); Page et al., Biotechnology 9:64-68 (1991». Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., BiofT echnology 10: 169-175 (1992). Utilizando estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con la resistencia más alta. Estas líneas celulares contienen el gen o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Con frecuencia se utilizan células de ova rio de hámster chino (CHO) y NSO para la producción de proteínas
Los derivados del plásmido pSV2-dhfr (Núm. de Acceso de la ATCC 37146), los vectores de expresión de pC4 (Núm. de Acceso ATCC 209646) y pC6 (Núm. de Acceso de la ATCC 209647) contienen el promotor fuerte (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo, 1985» más un fragmento del potenciador de CMV (Boshart et al., Cell 41· 521-530 (1985)). Los múltiples sitios de clonación, p. ej., con los sitios de escisión de enzimas de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores también contienen el intrón 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata y el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40.
Específicamente, el plásmido pC6, por ejemplo, se digiere con enzimas de restricción apropiadas y después se desfosforila utilizando fosfatos de intestino de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector se aísla a continuación a partir de un gel de agarosa al 1 %
Se genera un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención utilizando técnicas conocidas en la técnica y este polinucleótido se amplifica utilizando la tecnología de PCR conocida en la técnica. Si se uti liza una secuencia de señal natural para producir la proteína de fusión de la presente invención, el vector no necesita un segundo péptido señal. Altemativamente, si no se utiliza una secuencia de señal natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteról09a. (Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Núm. WO 96f34891 )
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de la invención se aísla de un gel de agarosa al 1% utilizando un kit disponible comercialmente ( quot;Genecleanquot;, BID 101 Inc. , La Jolla, Ca.). El fragmento se digiere a continuación con enzimas de restricción apropiadas y se purifica de nuevo en un gel de agarosa a11 %
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de albúmina de la invención se digiere a continuación con la misma enzima de restricción y se purifica en un gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con DNA ligasa T4. Las células de E. coli HB101 o XL-1 Blue se transforman a continuación y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC6 utilizando, por ejemplo, análisis de enzimas de restricción
Las células de ovario de hámster chino que carecen de un gen DHFR activo se utilizan para la transfección. Cinco I-Ig del plásmido de expresión de pC6 o pC4 se co-transfectan con 0,5 I-Ig del plásmido pSVneo utilizando lipofectina (Felgner et al., más arriba ). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en MEM alfa menos con un suplemento de 1 mgfmL de G418. Después de 2 días, las células se tratan con tripsina y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM alfa menos con un suplemento de 10, 25, 050 ng/mL de metotrexato más 1 mg/mL de G418 . Después de aproximadamente 10-14 días los clones individuales se tratan con tripsina y a continuación se siembran en placas Petri de 6 pocillos o matraces de 10 mL utilizando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las mayores concentraciones de metotrexato se transfieren después a nuevas placas de 6
pocillos que contienen concentraciones incluso mayores de metotrexato (1 ~M, 2 ~M, 5 ~M, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta Que se obtienen clones Que crecen a una concentración de 100 a 200 ¡.1M. La expresión de la proteina de fusión deseada se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y transferencia Westem o mediante análisis HPLC de fase inversa.
Ejemplo 8: Purificación general de una proteína de fusión de albúmina expresada a partir de un constructo de fusión de albúmina en líneas celulares de mamífero
En realizaciones preferidas, proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden la forma madura de HSA fusionada a cualquiera de los extremos N o C de la forma madura de una proteína terapéutica o porciones de la misma (p. ej., la forma madura de una proteína terapéutica enumerada en la Tabla 1, o la forma madura de una proteína terapéutica mostrada en la Tabla 2 como SEQ ID NO: Z). En una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden adicionalmente una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente en las rutas de secreción del anfitrión utilizado para la expresión. En una realización preferida, el péptido señal codificado por la secuencia de señal se retira, y la proteina de fusión de albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de albúmina de la invenciÓfl comprenden preferiblemente secuencias señal heterólogas (p. ej., la secuencia señal no nativa de una proteína terapéutica concreta), incluyendo, pero no limitada a, MAF, INV, '9, Fibulina B, Clusterina, Proteína 4 de Unión al Factor de Crecimiento Similar a la Insulina, secuencias de líder de HSA variantes, incluyendo, pero no limitadas a, una secuencia líder de HSAlMAF quimérica, u otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. Se prefiere especialmente que las secuencia señal enumeradas en la Tabla 2 y/o la secuencia señal enumerada en la sección quot;Expresión de Proteínas de Fusiónquot; y/o quot;Métodos Adicionales de Producción Sintética y Recombinante de Proteínas de Fusión de Albúminaquot; de la memoria descriptiva, anteriormente. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención comprenden adicionalmente un residuo de metionina N-terminal Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluyendo fragmentos y/o variantes, también están incluídos en la invención
Las proteínas de fusiÓfl de albúmina de sobrenadantes de la linea de células de mamiferos se purifican de acuerdo con diferentes protocolos, dependiendo del sistema de expresión utilizado
Purificación de lineas de células CHO y 293T
La purificación de una proteína de fusión de albúmina a partir del sobrenadante de células CHO o de sobrenadante de células 293T transfectadas transitoriamente puede implicar la captura inicial con una resina HQ aniónica utilizando un tampón de fosfato de sodio y una eluci6n en gradiente de fosfato, seguido por cromatografía de afinidad en una columna Blue Sefarosa FF utilizando una elución en gradiente de sal. Blue Sefarosa FF elimina los principales contaminantes de BSAlfetuina. La purificación adicional sobre la resina Poros PISO con un gradiente de fosfato puede eliminar y reducir la contaminación de endotoxina así como concentrar la proteína de fusión de albúmina.
Purificación de la línea celular NSO
La purificación de una proteína de fusión de albúmina a partir de sobrenadante de células NSO puede implicar cromatografía de íntercambío aníooíco con Q-Sefarosa, seguído de purificación con SP-Sefarosa con una etapa de elución, seguido de pu rificaciÓfl con Phenil-650M con una etapa de elución, y, en última instancia, diafiltración
La proteína purificada puede ser formulada a continuación mediante intercambio de tampón
Ejemplo 9: Expresión bacteriana de una proteína de fusion de albúmina
Un polinucle6tido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención que comprende una secuencia señal bacteriana se amplifica utilizando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a los extremos S' y 3' de la secuencia de ADN, para sintetizar fragmentos de inserción. Los cebadores uti lizados para amplificar el polinudeótido que codifica el inserto deben contener preferiblemente sitios de restricción, tales como BamHI y Xbal, en el extremo 5' de los cebadores con el fin de clonar el producto amplificado en el vector de expresión. Por ejemplo, BamHI y Xbal corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano pOE-9. (Oiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este vector plasmídico codifica la resistencia a antibióticos (Amp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta de 6-histidina (6-His), y sitios de donación de enzimas de restricción.
El vector pOE-9 se digiere con BamHI y Xbal y el fragmento amplificado se liga al vector pOE-9 manteniendo el marco de lectura iniciada en el RBS bacteriano. La mezcla de ligación se utiliza a continuación para transformar la cepa de E. coli M15/rep4 (Oiagen, Inc.) que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kan'). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilinalkanamicina. El ADN del plásmido se aisla y se confirma mediante análisis de restricción
Los clones que contienen los constructos deseados se cultivan durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB con un suplemento tanto de Amp (100 ¡..Ig/ml) como de Kan (25¡..1g/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cu ltivo grande en una proporción de 1 :100 a 1 :250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica 600 (0.0.600) de entre 0,4 y 0,6. Se añade IPTG (isopropil-BD-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce mediante inactivación el represor lacl, aclarando el P/O lo que conduce a un aumento de la expresión génica
Las células se cultivan durante un 3 a 4 horas adicionales. Después las células se recogen mediante centrifugación (20 minutos a 6000Xg). El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico de Guanidina HCI 6 Molar o preferiblemente en urea 8 M Y concentraciones superiores a 2-mercaptoetanol 0,14 M mediante agitación durante 34 horas a 4Q C (véase, p. ej., Burton et al., Eur. J. Biochem. 179:379-387 (1989». Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación, y el sobrenadante que contiene el polipéptido se carga en una columna de resina de afinidad de níquel-ácido nilrilo-tri-acético (quot;Ni-NTAquot;) (disponible de QIAGEN, Inc., más arnba). Las proteínas con una etiqueta 6 x His se unen a la resina de Ni -NTA con alta afinidad y pueden purificarse en un procedimiento sencillo de una sola etapa (para más detalles véase: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., más arriba).
En resumen, el sobrenadante se carga en la columna en guanidina -HCI 6 M, pH 8. La columna se lava primero con 10 volúmenes de guanidina 6 M-HCI, pH 8, después se lava con 10 volúmenes de guanidine-HCI 6 M de pH 6, y, finalmente, el palipéptido se eluye con guanidina-HCl6 M, pH 5.
La proteína purificada se renaturaliza continuación dializándola frente a solución salina tampanada con fosfato (PBS) o tampón de Na-acetato 50 mM, de pH 6 más NaCI 200 mM. Alternativamente, la proteína puede replegarse con éxito mientras está inmovilizada en la columna de Ni-NTA. Las condiciones ilustrativas son las siguientes renaturalizar utilizando un gradiente lineal de urea 6M-1M en NaCI500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCI20 mM de pH 7,4, que contiene inhibidores de proteasa. La renaturalización debe realizarse durante un período de 1,5 horas o más. Después de la renaturalización las proteínas se eluyen mediante la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se elimina mediante una etapa final de diálisis frente a PBS o tampón de acetato de sodio 50 mM de pH 6 más NaCI 200 mM. La proteína purificada se almacena a 4Q C o se congela a -80Q C
Además del vector de expresión anterior, la presente invención incluye adicionalmente un vector de expresión, denominado pHE4a (Número de Acceso de la ATCC 209645, depositado el 25 de Febrero, 1998) que contiene elementos operadores y promotores del fago conectados operativa mente a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, denominado pHE4a. (Número de Acceso de la ATCC 209645, depositado el 25 de febrero, 1998.) Este vector contiene: 1) un gen de neomicinfosfotransferasa como marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli, 3) una secuencia del promotor del fago T5, 4) dos secuencias del operador lac, 5) una secuencia de Shine-Delgarno, y 6) el gen represor del operÓfl lactosa (Iaclq). El origen de replicación (oriC) deriva de pUC19 (L TI , Gaithersburg, Mo). Las secuencias del promotor y del operador se preparan sintéticamente.
El AoN se puede insertar en pHE4a mediante la restricción del vector con Ndel y Xbal, BamHI, Xhol o Asp718, ejecutando el producto restringido en un gel, y aislando el fragmento mayor (el fragmento de relleno debe tener aproximadamente 310 pares de bases). El inserto de ADN se genera de acuerdo a los protocolos de PCR descritos en la presente memoria o de otra manera conocida en la técnica, utilizando cebadores de PCR que tienen sitios de restricción para Ndel (cebador 5') y Xbal, BamHI, Xhol o Asp718 (cebador 3'). El inserto de PCR es purificado en gel y restringido con enzimas compatibles. Et inserto y el vector se ligan de acuerdo con protocolos convencionales
El vector de modificado genéticamente puede ser sustituido en el protocolo anterior para expresar proteína en un sistema bacteriano.
Ejemplo 10; Aislamiento de un clan de ADNc seleccionado de la muestra depositada.
Muchas de los constructos de fusión de ta albúmina de la invención se han depositado en la ATCC como se muestra en la Tabla 3. Los constructos de fusión de albúmina pueden comprender uno cualquiera de los siguientes vectores de expresión: el vector de expresión de levadura S. cerevisiae pSAC35, el vector de expresión de mamífero pC4, o el vector de expresión de mamífero pEE12.1.
Los vectores pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (Núm. de Acceso de la ATCC 209646; Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985); Boshart et al., Cel! 41. 521-530 (1985)), Y pEE12.1 (Lonza Biologics, Inc., Stephens y Cockett, Nucl Acids Res 17:7110 (1989); Publicación Intemacional Núm. W089101036; Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Biorrechnology 10:169-175 (1992); Patente de Estados Unidos 5.122.464; Publicación internacional Núm. W086/05807) comprenden un gen de resistencia a la ampicilina para el crecimiento en células bacterianas. Estos vectores y/o un constructo de fusión de albúmina que los comprende pueden ser transformados en una cepa de E. coli tal como Stratagene XL-I Blue (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) utilizando mecanismos descritos en la técnica tales como Hanahan, se extendieron en placas de agar Caldo Luria que contienen 100 ¡..IgfmL de ampicilina, y se cultivan durante la noche a 3rC
El material depositado en la muestra asignada al número de depósito de la ATCC citado en la Tabla 3 para cualquier constructo de fusión de albúmina dado también puede contener uno o más constructos de fusión de albúmina, codificando cada uno diferentes proteínas de fusión de la albúmina. Por lo tanto, los depósitos que comparten el mismo número de depósito de la ATCC contienen al menos un constructo de fusión de albúmina identificado en la fila correspondiente de la Tabla 3
Se pueden utilizar dos enfoques para aislar un constructo de fusión de albúmina concreto, a partir de la muestra depositada de los ADN plasmídicos citados para ese constructo de fusión de albúmina en la Tabla 3.
Método 1: Escrutinio
En primer lugar, se puede aislar directamente un constructo de fusión de albúmina escrutando la muestra de AoN plasmídicos depositados utilizando una sonda polinucleotidica correspondiente al SEO ID NO: X para un número de ID de constructo individuo en la Tabla 1, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar un polinucleótido específico con 30-40 nucleótidos utilizando un sintetizador de AoN de Ap~lied Biosystems de acuerdo con la secuencia refenda. El ollgonucle6l1do se puede marcar, por ejemplo, con 2P_y_ATP utilizando
polinucleótido quinasa de 14 y purificar de acuerdo con métodos rutinarios (p. ej ., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Press, Cold Spring, NY (1982)). El constructo de fusión de albúmina de un depósito ATCC dado se transforma en un anfitrión adecuado, como se indica anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los proporcionados por el proveedor del vector o en publicaciones o patentes relacionadas citadas anteriormente. Los transformantes se siembran en placas de agar al 1,5% (que contiene el agente de selección apropiado, p. ej., ampicilina) a una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por placa. Estas placas son seleccionadas utilizando membranas de nailon de acuerdo con métodos rutinarios para la detección de colonias bacterianas (p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 23 Edición, (1989), Cold Spring Harbar Laboratory Press, páginas
1.93 a 1.104), u otros mecanismos conocidos por los expertos en la técnica.
Método 2: PCR
Altemativamente, el AoN que codifica una proteína de fusión de albúmina dada puede amplificarse a partir de una muestra de un constructo de fusión de albúmina depositado con el SEO 10 NO: X, por ejemplo, utilizando dos cebadores de 17-20 nucleótidos que se hibridan al constructo de fusión de albúmina depositado 5' y 3' con respecto al AoN que codifica una proteína de fusión de albúmina dada. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo en condiciones rutinarias, por ejemplo, en 25 ~I de mezcla de reacción con 0,5 ~g del molde de ADNc anterior. Una mezcla de reacción conveniente es MgCI2 de 1,5 a 5 mM, gelatina al 0,01% (plv), 20 IJM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmoles de cada cebador y 0,25 Unidades de polimerasa Taq. Se realizan treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94quot;C durante 1 min; hibridación a 55quot;C durante 1 min; elongación a 72quot;C durante 1 min) con un ciclador térmico automatizado Perkin-Elmer Cetus. El producto amplificado se analiza por electroforesis en gel de agarosa y la banda de AoN con el peso molecular esperado se escinde y se pu rifica. Se verifica que el producto de PCR es la secuencia seleccionada subclonando y secuenciando el producto de ADN
Hay varios métodos disponibles para la identificación de las porciones no codificante 5' o 3' de un gen que puede no estar presente en el clon depositado. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, sondeo del filtro, enriquecimiento del clon utilizando sondas específicas y protocolos similares o idénticos a protocolos ~RACE~ 5' y 3' que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, está disponible un método similar a RACE 5' para generar el extremo 5' perdido de un transcrito completo deseado. (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res, 21 (7):1683-1684 (1993».
En resumen, un oligonucleótido de ARN específico se liga a los extremos 5' de una población de ARN que contiene presumiblemente transcritos de ARN del gen completo. Se utilizan un conjunto de cebadores que contiene un cebador específico para el oligonucle6tido de ARN ligado y un cebador especifico para una secuencia conocida del gen de interés se utiliza para amplificar mediante PCR la porción 5' del gen completo deseado. Este producto amplificado puede ser a continuación secuenciado y utilizado para generar el gen completo.
Este método anterior empieza con el ARN total aislado de la fuente deseada, aunque se puede uti lizar poli A + ARN. La preparación de ARN puede tratarse a continuación con fosfatasa si fuera necesario para eliminar grupos fosfato 5' en ARN degradado o dañado que puede interferir con la posterior etapa de ARN ligasa. La fosfatasa debe ser inactivada a continuación y el ARN se trata con pirofosfatasa ácida de tabaco con el fin de quitar la estructura de protección terminal presente en los extremos 5' de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato 5' en el extremo 5' del ARN con la protección terminal escindida que puede ser ligado a continuación a un oligonucleótido de ARN utilizando ARN ligasa de T4
Esta preparación de ARN modificado se usa como molde para la síntesis de la primera cadena de ADNc utilizando un oligonucleótido especifico del gen. La primera reacción de sintesis de la cadena se usa como molde para la amplificación mediante PCR del extremo 5' deseado, utilizando un cebador específico para el oligonucieótido de ARN ligado y un cebador específico para la secuencia conocida del gen de interés. El producto resultante se secuencia y se analiza después para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen deseado
Ejemplo 11: Fusiones muftifusión
Las proteínas de fusión de albúmina (p ej., que contienen una proteína terapéutica (o un fragmento o variante de la misma) fusionada a albúmina (o un fragmento o variante de la misma», se puede fusionar además a otras proteínas
para generar ~proteínas mult ifusión~. Estas proteínas multifusión se pueden utilizar para diversas aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a etiqueta His, etiqueta HA, proteína A, dominios de IgG, y proteína de unión a maltosa faci lita la purificación. (Véase, p. ej ., EP A 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Las señales de localización nuclear fusionadas con los polipéptidos de la presente invención pueden dirigir la proteína a una localización subcelular específica, mientras que el heterodímero covalente u homodímeros pueden aumentar o disminuir la actividad de una proteína de fusión de albúmina. Además, la fusión de secuencias de proteínas adicionales a las proteínas de fusión de albúmina de la invención puede aumentar adicionalmente la solubilidad y/o estabilidad de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden preparase utilizando o modificando rutinariamente mecanismos conocidos en la técnica y/o modificando el siguiente protocolo, que esboza la fusión de un polipéptido a una molécula de IgG
En resumen, la porción Fc humana de la molécula de IgG se puede amplificar mediante PCR, utilizando cebadores que abarcan los extremos 5' y 3' de la secuencia descrita a continuación. Estos cebadores también deberían tener sitios de enzimas de restricción convenientes que facilitarán la clonación en un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión de mamífero o de levadura
Por ejemplo, si se usa pC4 (Núm. de Acceso de la ATCC 209646), la porción Fc humana puede ligarse al sitio de clonación BamHI. Observese que el sitio BamHI 3' debe ser destruido. A continuación, el vector que contiene la porción Fc humana se vuelve a someter a restricción con BamHI, linealizando el vector, y un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención (generado y aislado utilizando mecanismos conocidos en la técnica), se liga a este sitio BamHI. Obsérvese que el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención se dona sin un codón de parada, de lo contra rio no se producirá una proteína de fusión que contiene Fc.
Si se utiliza la secuencia señal de origen natural para producir la proteína de fusión de albúmina de la presente invención, pC4 no necesita un segundo péptido señal. Altemativamente, si no se utiliza la secuencia señal natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, p. ej., la Publicación Intemacional Núm. WO 96/34891 .)
RegiÓfl Fc de IgG humana:
GG(¡Alquot;CCCGAGCCCAAATCTTCTOACUAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAOCACCTGAATTCGAGOOTGCACCGTCAGTCrTCC
IC!IOCCCCCAAAACOCAAOGACACCCTCATGATCTCOCOOACTCCTOAGOTCACATGOOTOO~GOACGTAA~AAGACC
~~~CAAOrrC~CTGGTACOTOOAOGGOGTOGAGGTCCATAATGOCAAOACAAAGCCOOQOQAGOAGCAfjTACAACAOCAOO
TACCOTOTOGTCAfjCOTCCTCACCOTCcrocACCAGOACTQOCTOAATOGCAAOOAGTACM(ITOCMGOTCTCCAACIVVI.GCCCTC
CCAACCCCCA TCQAGAAAACCA TCTCCAAAGCCM.ACOGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCA TCCCClt;iGA TeA
OCTGACCAAGAACCAGúTCAGCCTGAccroCCTOOTCAA.o\GGC1TCTATCCAAGCGACATCGCCGTCGAGTGGGAGAOCAATOOGe
AGCCOCACAACAACTACMGACCACGa::Tcccc.rocrOOACTCCGACGaC1CCTTc n CCTCTACAGCAAGCTCACCOTOOAc.v.OA
OCACGTGGCAOCAOOGOAACGTCTTCTCATOCTOCGTGATGeATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGACCCTCrCCCTOT
CTCCGGGTAAATGAGTGCCACQOCCCCOACTCTAOAOOAT (SEQ ID NO:s.2)
Ejemplo 12: Producción de un anticuerpo a partir de una proteina de fusión de albúmina
Tecnología de hibridoma
Los anticuerpos que se unen las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención y porciones de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención (p. ej., la porción de proteína terapéutica o una porción de la proteína de fusión de albúmina) se pueden preparar por medio de una variedad de métodos. (Véase, Current Protocols, Capítulo 2). Como ejemplo de tales métodos, se prepara una preparación de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención y se purifica para dejar1a sustancialmente libre de contaminantes naturales. Tal preparación se introduce después en un animal para producir antisueros policlonales de mayor actividad específica
Los anticuerpos monoclonales específicos para una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se preparan utilizando tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammer1ing et al., en: Monoclonal Antibodies and T·Cell hibridomas, Elsevier, NY., págs. 563-681 (1981)). En general, un animal (preferiblemente un ratón) se inmuniza con una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los esplenocitos de tales ratones se extraen y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Se puede emplear cualquier línea celular de mieloma adecuada de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la linea celular de mieloma parental (SP20), disponible de la ATCC. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y a continuación se clonan mediante dilución limitante como describen Wands et al. (Gastroenterology 80:225·232 (1981 »). Las células de hibridoma obtenidas a través de tal selección se analizan a continuación para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención
Alternativamente, se pueden producir anticuerpos adicionales capaces de unirse a una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteina de fusión de albúmina de la invención en un procedimiento de dos etapas utilizando anticuerpos anti-idiotípicos. Tal método hace uso del hecho de que los propios anticuerpos son antígenos, y por lo tanto, es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, se utilizan anticuerpos específicos de la proteína para inmunizar a un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de tal animal se utilizan después para producir células de hibridoma, y se escrutan las células de hibridoma para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de la proteína de fusión de albúmina de la invención (o porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención) puede ser bloqueada por la proteína de fusión de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Tales anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos contra el anticuerpo específico de la proteína de fusión de la invenciórJ (o porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención) y se utilizan para inmunizar un animal para inducir la formación de más anticuerpos especificos de la proteína de fusión de la invención (o porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención)
Para el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos, el anticuerpo es quot;humanizadoquot;. Tales anticuerpos pueden producirse utilizando constructos genéticos derivados de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados son conocidos en la técnica y se comentan en la presente memoria. (Véanse, para su revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Di et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.567; Taniguchi et al., documento EP 171.496; Morrison et al., documento EP 173.494.; Neuberger et al., documento WO 8601533; Robinson et al., publicación intemacional Núm. WO 8702671, Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985))
Aislamiento de Fragmentos de Anticuerpos Dirigidos contra una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención de una Biblioteca de scFv. Se construyen genes V de origen natural aislados de PBL humanos en una biblioteca de fragmentos de anticuerpo que contienen reactividades contra una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención, a la que el donante puede haber sido o puede no haber sido expuesto (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos 5.885.793 incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad)
Rescate de la Biblioteca. Se construye una biblioteca de scFv a partir del ARN de PBL humanos como se describe en la Publicación Internacional Núm. WO 92101047. Para rescatar los fragmentos de anticuerpos de presentación en fagos, se utilizan aproximadamente 109 E. coli que albergaban el fagémido para inocular 50 mL de 2xTY que contiene glucosa al 1% y 100 ¡Jg/mL de ampicilina (2xTY-AMP-GLU) y se cultivan hasta una 0 .0 . de 0,8 con sacudimiento. Cinco mililitros de este cultivo se utilizan para inocular 50 mL de 2xTY-AMP-GLU, se añaden 2 x 108 UT de coadyuvante de gen 3 delta (gen 111 delta de M13, véase la Publicación Intemacional Núm. WO 92/01047) y el cu ltivo se incuba a 3rC durante 45 minutos sin sacudimiento y a continuación a 37quot;C durante 45 minutos con sacudimiento. El cultivo se centrifuga a 4000 rpm durante 10 mino y el sedimento se resuspende en 2 litros de 2xTY que contienen 100 mgfmL de ampicilina y 50 ¡Jg/mL de kanamicina y se cultivan durante la noche. El fago se prepara como se describe en la Publicación Internacional Núm. WO 92/01047.
El gen III delta de M13 se prepara como sigue: el fago auxiliar del gen III delta M13 no codifica la proteína del gen 111, por lo tanto, el fago o fagémido que presenta fragmentos de anticuerpo tiene una mayor avidez de unión a antígeno Se preparan partículas infecciosas del gen 111 delta de M13 cultivando el fago auxiliar en células que albergan un derivado de pUC19 que suministra la proteina del gen 111 de tipo salvaje durante la mortogénesis del fago. El cultivo se incuba durante 1 hora a 37quot;C sin sacudimiento y después durante una hora más a 3rC con sacudimiento. Las células se centrifugan (lEC-Centra 8.400 rpm durante 10 min), se resuspenden en 300 mL de caldo 2xTY que contiene 100 IJg de ampicilinafmL y 25 I-Ig de kanamicinafmL (2xTY-AMP-KAN) y se cultivan durante la noche, con sacudimiento a 37quot;C. Las particulas de fago se purifican y se concentran a partir del medio de cultivo mediante dos precipitaciones con PEG (Sambrook et al., 1990), se resuspenden en 2 mL de PBS y se hacen pasar a través de un filtro de 0,45 IJm (Minisarl NML; Sarlorius) para proporcionar una concentración final de aproximadamente 10quot; de unidades de transducci6nfmL (clones resistentes a ampicilina)
Inmunoabsorción de la Biblioteca. Se recubren durante la noche inmunotubos (Nunc) en PBS con 4 mL o de 100 ¡Jg/mL o de 10 ¡Jg/mL de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los tubos se bloquean con Marvel-PBS al 2% durante 2 horas a 3rC y después se lavan 3 veces en PBS. Se aplican al tubo aproximadamente 1013 UT de fagos y se incuba du rante 30 minutos mediante volteo a temperatura ambiente encima y debajo de una plataforma giratoria y a continuación se deja reposar durante otras 1,5 horas. Los tubos se lavan 10 veces con PBS, Tween-20 al 0,1% y 10 veces con PBS. Los fagos se eluyen mediante la adición de 1 mL de trietilamina 100 mM y haciendo girar durante 15 minutos debajo y encima de una plataforma giratoria después de lo cual la solución se neutraliza inmediatamente con 0,5 mL de TrisHCll,O M, pH 7,4. Los fagos se utilizan después para infectar 10 mL de TGI de E. coli semilogarítmica mediante la incubación del fago eluido con las bacterias durante 30 minutos a 37quot;C. Las E. coli se siembran en placas de TYE que contienen glucosa a11% y 100 IJg/mL de ampicilina. La biblioteca bacteriana resultante se rescató entonces con el fago auxiliar del gen 3 delta como se ha descrito anteriormente para preparar el fago para una posterior ronda de selección. Este procedimiento se repite a continuación durante un total de 4 rondas de purificación por afinidad aumentando el lavado de los tubos a 20 veces con PBS, Tween-20 al 0,1% y 20 veces con PBS para las rondas 3 y
4.
Caracterización de aglutinantes . Los fagos eluidos de la 3a y 4a rondas de selección se utilizan para infectar E. coli HB 2151 Y se produce scFv soluble (Marks, el al., 1991) a partir de colonias individuales para el ensayo. Los ElISA se realizan con placas de microtitulaci6n recubiertas con 10 pgfmL de una proteína de fusión de albúmina de la invención, o una porción de una proteína de fusión de albúmina de la invención, en bicarbonato 50 mM de pH 9,6. Los clones positivos en ELlSA se caracterizan adicionalmente por la huella dactilar de PCR (véase, por ejemplo, la publicación internacional Núm. WO 92/01047) y a continuación mediante secuenciación. Estos clones positivos de ELlSA también pueden caracterizarse adicionalmente mediante mecanismos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, mapeo de epítopos, afinidad de unión, transducción de señales del receptor, capacidad para bloquear o inhibir competitiva mente la unión anticuerpo/antígeno y actividad agonistica o antagónica competitiva
Ejemplo 13: Análisis de absorción de fHj-2-desoxiglucosa,
El tejido adiposo, el músculo esquelético y el hígado son los tejidos sensibles a la insulina. La insulina puede estimular la captaciónltransporte de glucosa en estos tejidos. En el caso del tejido adiposo y el músculo esquelético, la insulina inicia la transducción de señales que finalmente conduce a la translocación de la molécula de transportador de glucosa 4, GLUT4, desde un compartimento intracelular especializado a la superticie celular Una vez en la superticie celular, GLUT4 permite la captaciórJ/transporte de glucosa.
Captación de rH]-2-desoxiglucosa
Se pueden utilizar varias líneas celulares relacionada con tejido adiposo y músculo para someter a ensayo la actividad de captaciórJ/transporte de glucosa en la ausencia o presencia de una combinación de uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de la diabetes mellitus. En particular, los fibroblastos murinos 3T3-L 1 Y las células del músculo esquelético murino L6 pueden diferenciarse a adipocitos 3T3L 1 ya miotubos, respectivamente, para servir cuando sea apropiado en modelos in vitro para el análisis de captación de ¡3Hj-2--desoxiglucosa (Urso et al., J Biol Chem, 274 (43):30864-73 (1999); Wang el al., J Mol Endocrinol, 19 (3):241-8 (1997); Haspel et al., J Membr Biol, 169 (1 ):45-53 (1999); Tsakiridis et al., Endocrinology, 136(10): 4315-22 (1995». Brevemente, se transfieren 2 x 105 células/lOO ¡.JL de adipocitos o células L6 diferenciadas a placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos, ~TCquot;, tratadas, es decir, recubiertas con 50 ¡.Jg/mL de poli-L-lisina, en medio post· diferenciación y se incuban durante la noche a 3r C en CO2 al 5%. Las células se lavan primero una vez con medio OMEM de bajo contenido de glucosa libre de suero y a continuación se hacen ayunar con 100 ¡.JI/pocillo del mismo medio y con 100 ¡.JI/pocillo de tampón o de una combinación de uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de la diabetes mellitus, por ejemplo, concentraciones crecientes de 1 nM, 10 nM, y 100 nM de los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej., fusiones especificas descritas como SEO ID NO:Y y fragmentos y variantes de las mismas) durante 16 horas a 37quot;C en ausencia o presencia de insulina 1 nM Las placas se lavan tres veces con 100 I-'I/pocillo de solución salina tamponada con HEPES. Se añade la insulina a 1 nM en solución sa lina tamponada con HEPES durante 30 minutos a 37quot;C en presencia de [3H] -2-desoxiglucosa marcada 10 mM (Amersham, Núm. TRK672) y 2-desoxiglucosa no marcada 10 M (SIGMA, O· 3179). Como control, se llevan a cabo las mismas condiciones, excepto por la ausencia de insulina. Se añade una concentración final de citocalasina B 10 mM (Sigma, C6762) alOa ¡.JUpocillo en un pocillo separado para medir la absorción no específica Las células se lavan tres veces con solución salina tamponada con HEPES. Se añaden, [3H] -2-desoxiglucosa marcada, es decir, 10 ¡.JM, Y no marcada, es decir, 2-desoxiglucosa 10 ¡.JM, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato fria, npBS~ Las célu las se lisan con la adición de 150 ¡.JI/pocillo de Na OH 0,2 N Y posterior incubación con sacudimiento durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se transfieren a continuación a un vial de centelleo al cual se añaden 5 mL de líquido de centelleo. Los viales se cuentan en un contador de Centelleo Beta. La captación en condiciones duplicadas, siendo la diferencia la ausencia o presencia de insulina, se determina con la siguiente ecuación· I(Recuento de insulina por minuto quot;cpmquot; -Cpm no específicas)/(Cpm no de insulina -Cpm no específicas)]. Las respuestas promedio caen dentro de los limites de aproximadamente 5 veces y 3 veces las de los controles para adipocitos y miotubos, respectivamente
Diferenciación de células
Se permite que las células se conviertan en completamente confluentes en un matraz T -75 cm2. El medio se retira y se reemplaza por 25 mL de medio de pre-diferenciación durante 48 horas. Las células se incuban a 3rC, en C02 al 5%, humedad de 85%. Después de 48 horas, el medio de pre-diferenciación se elimina y se reemplaza por 25 mL de medio de diferenciación durante 48 horas. Las células se incuban de nuevo a 37quot;C, en C02 al 5%, humedad de 85%. Después de 48 horas, el medio se elimina y se reemplaza por 30 mL de medio post-diferenciación. El medio post-diferenciación se mantiene durante 14-20 días o hasta que se consigue la diferenciación completa El medio se cambia cada 2-3 días. Los adipocitos humanos se pueden adquirir de Zen-Bio, INC (Núm. SA-1096).
Ejemplo 14: Análisis in vitro de incorporación de fHj-fimidina a líneas celulares de páncreas.
Recientemente se ha demostrado que GLP-1 induce la diferenciación de la línea celular de epitelio ductal pancreático de rata ARIP de una manera dependiente del tiempo y de la dosis que se asocia con un aumento del Homeobox-1 Duodenal de los islotes (IDX-I) (Hui et al., 2001, Diabetes, 50(4): 785-96) y los niveles de ARNm de insulina. EIIOX-I a su vez aumenta los niveles de ARNm del receptor de GLP-1
Tipos celulares sometidos a ensayo
Células RIN-M: Estas células están disponibles en la Colección de Cultivos Tipo Americana (Número de Linea Celular ATCC CRL-2057). La línea celular RIN-M se deriva de un tumor de células de los islotes de rata transplantable inducido por la radiación. La línea se estableció a partir de un xenoinjerto del tumor de ratón carente de sistema inmunitario. Las células producen y secretan hormonas polipeptídicas de los islotes, y producen L-dopa descarboxilasa (un marcador para células que tienen la actividad de captación y descarboxilación del precursor de amina, o APUO)
Células ARIP: Estas son células exocrinas pancreáticas de mortología epitelial disponibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana (Número de Línea Celular ATCC CRL-1674). Véanse también, las referencias: Jessop,
N.W. y Hay, RJ., quot;Characleristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors,quot; In Vitro 16:212, (1980); Cockell, M. et al., quot;Identification of a cell -specific ONA-binding activity !hat interacls with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreasquot;, Mol. Cell. Biol. 9:2464-2476, (1989); Roux, E., et al. quot;The cell-specific transcription factor PTF1 contains two different subunits that interact with!he ONAquot; Genes Dev 3:1613-1624, (1989); y, Hui, H., et al., quot;Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homeobox-1positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells,quot; Diabetes 50:785-796 (2001)
Preparación de las células
La línea celular RIN-M se cultiva en medio RPMI 1640 (Hyclone, Núm SH300027.01 ) con suero bovino fetal al 10%
(Hyclone, Núm. SH30088.0 3) y se subcultivan cada 6 a 8 dias a una razón de 1:3 a 1 :6. El medio se cambia cada 3
a 4 días.
La línea celular ARIP (ATCC Núm CRL-1674) se cultiva en un medio de Ham F12K (ATCC, Núm. 30-2004) con L
glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 gIL de bicarbonato de sodio y suero bovino fetal al 10%. La línea celular
ARIP se subcultiva a una razÓfl de 1:3 a 1:6 dos veces por semana. El medio se cambia cada 3 a 4 días.
Protocolo de análisis
Las células se siembran a 4000 célulaslpocillo en placas de 96 pocillos y se cultivan durante 48 a 72 horas hasta una conftuencia de SOo/o. Las células se cambian a medio libre de suero a 100 ¡Jlfpocillo. Después de la incubación durante 48-72 horas, se añaden al poci llo el suero ylo los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej., proteínas de albúmina de fusión de la invención y fragmentos y variantes de las mismas). La incubación continúa durante 36 horas adicionales. Se diluye [3H]-timidina (5-20 Cilmmol) (Amersham Pharmacia, Núm. TRK120) a 1
microCurie/5 microlitros. Después de la incubación durante 36 horas, se añaden 5 microlitros por pocillo durante 24 horas adicionales. La reacción se termina lavando las células suavemente con solución salina tamponada con fosfato, quot;PBSquot;, una vez. Las células se fijan con 100 microlitros de TCA enfriado con hielo al 10% durante 15 min a Q C. El PBS se retira y se añaden 200 microlitros de NaOH 0,2 N. Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La solución se transfiere a un vial de centelleo y se añaden 5 mL de líquido de centelleo compatible con soluciones acuosas y se mezcla vigorosamente. Los viales se cuentan en un contador de centelleo beta. Como control negativo, se utiliza sólo tampón Como control positivo se utiliza suero de ternera fetal
Ejemplo 15: Análisis de la glucosuria.
La glucosuria (es decir, el exceso de azúcar en la orina), se puede analizar fácilmente para proporcionar un índice del estado de enfermedad de la diabetes mellitus. El exceso de orina en una muestra del paciente en comparación con una muestra normal paciente es sintomático de DMID y OMNID. La eficacia del tratamiento de un tal paciente que tiene 100M y DMNID se indica por una disminución resultante en la cantidad de exceso de glucosa en la orina. En una realización preferida para el seguimiento de la OMIO y la OMNID, se analizan muestras de orina de los pacientes para determinar la presencia de de glucosa utilizando mecanismos conocidos en la técnica. La glucosuria en los seres humanos se define por una concentración de glucosa urinaria superior a 100 mg por 100 mL El exceso de los niveles de azúcar en aquellos pacientes que presentan glucosuria se pueden medir con mayor precisiÓfl mediante la obtención de muestras de sangre y analizando la glucosa en suero.
Ejemplo 16: Ensayos de detección de la estimulación o inhibición de la proliferación y diferenciación de Células B
La generación de respuestas inmunitarias humorales funcionales requiere la señalización tanto soluble como cognada entre las células de linaje B y su microentomo. Las señales pueden conferir un estímulo positivo que permite que una célula de linaje B continúe su desarrollo programado, o un estímulo negativo que indica que la célula detiene su ruta de desarrollo actual. Hasta la fecha, se han encontrado numerosas señales estimuladoras e inhibidoras que influyen en la capacidad de respuesta de las células B incluyendo IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL55 13, IL-14 e IL-15. Curiosamente, estas señales son por sí mismas efectores débiles pero pueden, combinadas con diferentes proteínas co-estimuladoras, inducir la activación, proliferación, diferenciación, alojamiento, tolerancia y
muerte entre las poblaciones de células B.
Una de las clases más estudiadas de proteínas co-estimuladoras de células B es la superfamilia de TNF. Dentro de esta fami lia se ha encontrado que C040, C02l, y C030 junto con sus respectivos ligandos C0154, COlO, y CD153 regulan una variedad de respuestas inmunitarias. Los análisis que permiten la detección y/o la observación de la proliferación y diferenciación de estas poblaciones de células B y sus precursores son herramientas valiosas en la determinación de los efectos que diferentes proteínas pueden tener en estas poblaciones de células B en términos de proliferación y diferenciación. A continuación se enumeran dos análisis diseñados para permitir la detección de la diferenciación, proliferación, o la inhibición de poblaciones de células 8 y sus precursores.
Análisis in vitro • las proteínas de fusión de albúmina de la invención (incluyendo proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de proteínas terapéuticas y/o albúmina o fragmentos o variantes de albúmina) se pueden evaluar para determinar su capacidad para inducir la activación, la proliferación, la diferenciación o la inhibición y/o la muerte en las poblaciones de células B y sus precursores. La actividad de una proteína de fusión de albúmina de la invención en las células 8 de amígdalas humanas purificadas, medida cua litativamente a lo largo del intervalo de dosis de 0,1 a 10.000 ng/mL, se evalúa en un análisis de co-estimulación de linfocitos 8 convencional en el que las células 8 de las amígdalas pu rificadas se cultivan en presencia de cualquiera de Staphylococcus aureus Cowan I (SAC) fijado con formalina o anticuerpo anti-lgM humana inmovilizado como agente de cebado. Las segundas señales, tales como IL-2 e IL-15 ejercen sinergia con entrecruzamiento de SAC e IgM para provocar la proliferación de células 8, medida por la incorporación de timidina tritiada. Los agentes que ejercen sinergia novedosos se pueden identificar fácilmente utilizando este análisis. El análisis implica el aislamiento de células 8 humanas de las amígdalas mediante agotamiento de cuentas magnéticas (MACS) de células positivas para C03. La población de células resultante es mayor que 95% de células 8 según se evaluó mediante la expresión de CD45R (8220).
Se colocan varias diluciones de cada muestra en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos a los que se añaden 105 células 8 en suspensión en medio de cultivo (RPMI 1640 que contiene F8S al 10%, 2ME 5 X 10-5 M, 100 U/mL de penicilina, 10 jJg/mL de estreptomicina, y dilución 10.5 de SAC) en un volumen total de 150 jJl. La proliferación o inhibición se cuantifica mediante un pulso de 20 h (1 uCifpocillo) con 3H-timidina (6 ,7 CifmM) empezando 72h después de la adición del factor. Los controles positivos y negativos son IL2 y medio respectivamente.
Análisis in vivo -A ratones BALBfc se les inyectan (i.p.) dos veces al día tampón solamente, o 2 mgfKg de una proteína de fusión de albúmina de la invención (incluyendo las proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de proteínas terapéuticas yfo albúmina o fragmentos o variantes de albúmina). Los ratones reciben este tratamiento durante 4 días consecutivos, momento en el cual se sacrifican y se recogen para su análisis diversos tejidos y suero. La comparación de secciones H y E de bazos normales y bazos tratados con la proteina de fusión de albúmina de la invención identifican los resultados de la actividad de la proteína de fusión en células de bazo, tales como la difusión de vainas linfáticas peri-arteriales, y/o un aumento significativo en la celularidad nucleada de las regiones de pulpa roja, lo que puede indicar la activación de la diferenciación y proliferación de poblaciones de células B. Los estudios inmunohistoquímicos utilizando un marcador de células 8, anti-CD45R(8220), se utilizan para determinar si cualquier cambio fisiológico de las células del bazo, tal como la desorganización esplénica, se deben al aumento de representación de células 8 dentro de las zonas de células 8 vagamente definidas que infiltran regiones de células T
Los análisis de citometría de flujo de los bazos de ratones tratados con la proteína de fusión de albúmina se utilizan para indicar si la proteína de fusión de albúmina aumenta específicamente la proporción de células 8 Th8+, C045R(8220) mates pOIquot; encima de la que se observa en los ratones de control
Asimismo, una consecuencia predicha del aumento de representación de células 8 maduras in vivo es un aumento relativo en los títulos séricos de Ig. Por consiguiente, los niveles de IgM e IgA en suero se comparan entre los ratones tratados con tampón y proteína de fusión.
Ejemplo 17: Análisis de proliferación de células T
Se realiza un análisis de proliferación inducida por CD3 en PBMC y se mide por la captación de 3H-timidina. El análisis se realiza de la siguiente manera. Se recubren placas de noventa y seis de pocillos con 100 jJl/pocillo de mAb contra C03 (HIT3a, Pharmingen) o mAb de control de isotipo (833.1) durante una noche a 4 grados Celsius (1 jJg/mL en tampón de bicarbonato 0,05 M, pH 9,5 ), después se lavan tres veces con P8S. Las P8MC se aíslan mediante centrifugación en gradiente FfH a partir de sangre periférica humana y se añaden a pocillos por cuadruplicado (5 x 104/pocillo) de placas recubiertas con mAb en medio RPMI que contiene FCS al 10% y PIS en presencia de concentraciones variables de una proteína de fusión de albúmina de la invención (incluyendo proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de proteínas terapéuticas y/o la albúmina o fragmentos o variantes de albúmina) (volumen total de 200 jJl). El tampón de proteína relevante y el medio solo son los controles. Después de 48 horas de cultivo a 37 grados Celsius, las placas se centrifugan durante 2 mino a 1000 rpm y se retiran 100 jJl de sobrenadante y se almacenan -20 grados Celsius para medir la IL-2 (u otras citoquinas) si se observa efecto sobre la proliferación. Los pocillos se complementan con 100 jJl de medio que contiene 0,5 uCi de 3H-timidina y se cultivan a 37 grados Celsius durante 18-24 horas. Los pocillos se cosechan y la incorporación de 3H-timidina se utiliza como una medida de la proliferación. Anti-Co3 solo es el control positivo para la proliferación. La IL-2 (100
U/ml) también se utiliza como un control que potencia la proliferación. El anticuerpo de control que no induce proliferación de células T se utiliza como el control negativo para los efectos de las proteinas de fusión de la invendón
Ejemplo 18: Efecto de las proteinas de fusión de la invención sobre la expresión de MHC de clase 1/, moléculas coestimuladoras y de adherencia y diferenciación celular de monocitos y células dendriticas humanas derivadas de monocitos
Las células dendríticas se generan por la expansión de la proliferación de precursores que se encuentran en la sangre periférica: se cultivan PBMC adherentes o fracciones monocíticas elutriadas durante 7-10 días con GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Estas células dendríticas tienen el fenotipo característico de células inmaduras (expresión de antígenos C01, CoBO, CoB6, C040 y MHC de clase 11). El tratamiento con factores de activación, tales como TNF-a, provoca un rápido cambio en el fenotipo de la superficie (aumento de la expresión de MHC de clase I y 11, moléculas coestimuladoras y de adherencia, regulación a la baja de FCyRll, regulación al alza de CoB3) Estos cambios se correlacionan con un aumento de la capacidad presentadora de antígenos y con la maduración funcional de las células dendríticas.
El análisis FACS de los antígenos de superficie se realiza de la siguiente manera. Las células se tratan 1-3 días con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención o LPS (control positivo), se lavan con PBS que contiene BSA al 1% y azida de sodio 0,02 mM, y a contínuación se incuban con dilución 1:20 de anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE apropiados durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Después de un lavado adicional, las células marcadas se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton oickinson).
Efecto sobre la producción de citoquinas Las citoquinas generadas por las células dendríticas, en particular, IL-12, son importantes en el inicio de las respuestas inmunitarias dependientes de células T. La IL-12 influye fuertemente en el desarrollo de la respuesta inmunitaria de células T colaboradoras Th1 , e induce la función de las células T y NK citotóxicas. Un ELlSA se utiliza para medir la liberación de IL-12 de la siguiente manera. Las células dendríticas (106/ml) se tratan con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención durante 24 horas. Se añaden LPS (100 ng/ml) al cultivo celular como control positivo. Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogen a continuación y se analizan para determinar el contenido de IL-12 utilizando el kit de ELlSA comercial (p. ej., R & O Systems (Minneapolis, MN)). Se utilizan los protocolos convencionales propOfcionados con los kits .
Efecto sobre la expresión de MHC de clase 11, moléculas coestimuladoras y de adherencia. Se pueden identificar en los monocitos tres grandes familias de antígenos de superticie celular: moléculas de adherencia, moléculas implicadas en la presentación de antígenos, y receptor de Fc. La modulación de la expresión de antígenos del MHC de clase 11 y otras moléculas coestimuladoras, tales como B7 e ICAM-I, puede da como resultado cambios en la capaddad presentadora de antígeno de los monocitos y la capacidad de inducir la activación de células T. El aumento de expreSión de receptores de Fc se puede correlacionar con la mejora de la actividad citotóx ica de los monocitos, la liberación de citoquinas y la fagocitosis
El análisis FACS se utiliza para examinar los antígenos de superficie de la siguiente manera. Los monocitos son tratados 1-5 días con concentraciones credentes de una proteína de fusión de albúmina de la invención o LPS (control positivo), se lavan con PBS que contiene BSA al 1% y azida de sodio 0,02 mM, y después se incuban con dilución 1 :20 de anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE apropiados durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Después de un lavado adicional, las células marcadas se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton o ickinson).
Activación de monocitos y/o aumento de la supervivencia Los análisis para moléculas que activan (o alternativamente, inactivan) monodtos y/o aumentan la supervivencia de monocitos (o altemativamente, disminuyen la supervivencia de monocitos) son conocidos en la técnica y pueden aplicarse rutinaria mente para determinar si una molécula de la invención funciona como inhibidor o activador de monodtos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden seleccionar utilizando los tres análisis descritos a continuación. Para cada uno de estos análisis, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se pu rifican a partir de leukopacks de donantes individuales (Cruz Roja Americana, Baltimore, Mo) mediante centrifugación a través de un gradiente Histopaque (Sigma). Los monocitos se aíslan a partir de PBMC por elutriacián centrífuga a contracorriente.
Ensayo de Supervivencia de monocitos. Los monocitos de sangre periférica humana pierden progresivamente la viabilidad cuando se cultivan en ausencia de suero u otros estímulos. Su muerte resulta de procesos regulados intemamente (apoptosis). La adición al cultivo de factores activadores, tales como TNF-alfa mejora drásticamente la supervivencia celular y previene la fragmentación del AoN. Se utiliza tindón con yoduro de propidio (PI) para medir la apoptosis de la siguiente manera. Los monocitos se cultivan durante 48 horas en tubos de polipropileno en medio libre de suero (control positivo), en presencia de 100 ng/mL de TNF-alfa (control negativo), y en presencia de concentraciones variables de la proteína de fusión que se va a someter a ensayo. Las células se suspenden a una concentración de 2 x 106/ml en PBS que contiene PI a una concentración final de 5 ~g/mL, y a continuación se
incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos antes del análisis FACScan. Se ha demostrado que la captación de PI se correlaciona con la fragmentación de ADN en este paradigma experimental
Efecto sobre la liberación de citoquinas. Una función importante de los monocitoslmacrófagos es su actividad reguladora sobre otras poblaciones celulares del sistema inmunitario a través de la liberación de citoquinas después de la estimulación. Un ELlSA para medir la liberación de citoquinas se realiza de la siguiente manera. Se incuban mOllOcitos humanos a una densidad de 5x105 célulaslmL con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención y en las mismas condiciones, pero en ausencia de la proteína de fusión. Para la producción de IL-12, las células se ceban durante la noche con IFN (100 U/mi) en presencia de la proteína de fusión. A continuación se añade LPS (10 ng/ml). Los medios condicionados se recogen después de 24 horas y se mantienen congeladas hasta su uso. La medición de TNF-alfa, IL-10, MCP-1 e IL-8 se realiza a continuación utilizando un kit de ELlSA disponible en el mercado (p. ej., R & D Systems (Minneapolis, MN» y aplicando los protocolos convenciooa les proporcionados coo el kit
Explosión oxidativa. Los monocitos purificados se siembran en placas de 96 pocillos a 2-1x105 célulasfpocillo. Se añaden a los pocillos concentraciones crecientes de una proteina de fusión de albúmina de la invención en un volumen total de medio de cultivo 0,2 mL (RPMI1640 + FCS al 10%, glutamina y antibióticos). Después de 3 días de incubación, las placas se centrifugan y se retira el medio de los poci llos. A las mooocapas de macrófagos, se les añaden 0,2 mL por pocillo de solución de rojo fenal (NaCI 140 mM, tampón de fosfato potásico 10 mM pH 7,0, dextrosa 5,5 mM, rojo fenal 0,56 mM y 19 UfmL de HRPO), junto con el estimulador (PMA 200 nM). Las placas se incuban a 3r C durante 2 horas y la reacción se detiene añadiendo 20 ¡JI de NaOH 1 N por pocillo. La absorbancia se lee a 610 nm. Para calcular la cantidad de H202 producido por los macrófagos, se realiza una curva patrón de una solución de H2Ü:lt; de molaridad conocida para cada experimento.
Ejemplo 19: Efecto de las proteínas de fusión albúmina de la invención sobre el crecimiento de las células endoteliales vasculares
En el día 1, se siembran células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) a 2_5x104 célulasf35 mm de densidad de placa en medio M199 que contiene suero bovino fetal (FBS) al 4%, 16 unidadesJmL de heparina y 50 unidadesfmL de suplementos de crecimiento de células endoteliales (ECG, Biotechnique, Inc.). El día 2, el medio se sustituye por M199 que cootiene FBS al 10%, 8 unidadesfmL de hepa rina. Se añaden una proteína de fusión de albúmina de la invención, y controles positivos, tales como VEGF y FGF básico (bFGF), a concentraciones variables. Los días 4 y 6, se sustituye el medio. Et día 8, se determina el número de células con un contador Coulter
Un aumento del número de células HUVEC indica que la proteína de fusión puede hacer proliferar las células endoteliales vasculares, mientras que una disminución del número de células HUVEC indica que la proteína de fusión inhibe las célu las endotel iales vasculares
Ejemplo 20: Modelo de cicatrización de herida corneal de Rata
Este modelo animal muestra el efecto de una proteína de fusión de albúmina de la invención sobre la neovascularización. El protocolo experimental incluye:
Realización de una incisión larga 1-1,5 mm desde el centro de la córnea en la capa estromal.
Inserción de una espátula por debajo det labio de la incisión frente a la esquina exterior del ojo.
Preparar un bolsillo (su base es de 1-1,5 mm desde el borde del ojo).
Colocación de una pastilla, que contiene 50 ng-5 ¡Jg de una proteína de fusión de albúmina de la invención, dentro del bolsillo.
También se puede aplicar tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención tópicamente a las heridas de la córnea en un intervalo de dosificación de 20 mg -500 mg (tratamiento diario durante cinco días).
Ejemplo 21: Modelos de ratón diabético y de cicatrización de heridas alterada por glucocorlicoides
Modelo de ratón diabético db+/db+
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención acelera el proceso de cicatrización, se utiliza el modelo de ratón genéticamente diabético de cicatrización de heridas. El modelo de cicatrización de herida en todo su espesor en el ratón db+fdb+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducible de cicatrización alterada de heridas. La curación de la herida diabética depende de la formación de tejido de granulación y reepitelización en lugar de contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg Res 52:389 (1992); Greenhalgh,
D.G. et al., Am J. Pathol. 756:1235 (1990)).
Los animales diabéticos tienen muchos de los rasgos característicos observados en la diabetes mellitus tipo 11. Los ratones (db+/db+) homocigotos son obesos en comparación con sus hermanos de camada heterocigotos (db+/+m) normales. Los ratones diabéticos (db+/db+) mutantes tienen una sola mutación recesiva aulosómica en el
cromosoma 4 (db+) (Coleman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982». Los animales muestran polifagia,
polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos (db+/db+) mutantes tienen alta glucosa en sangre, niveles de insulina elevados o normales, e inmunidad mediada por células suprimida (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. ImmullOl. 51(1):1-7 (1983); Leiter et al., Am J. Pathol. 114:46-55 (1985)). En estos animales se han descrito neuropalía periférica, complicaciones miocárdicas y lesiones microvasculares, engrosamiento de la membrana basal y anomalías en la filtración glomerular (NOfido, F. et al., Exp Neurol 83(2):221232 (1984); Rober1son et al., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Supl): 1-6 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigotos desarrollan hiperglucemia que es resistente a los análogos de insulina para la diabetes de tipo 11 humana (Mandel et al., J. Immunol720:1375-1377 (1978))
Las caracteristicas observadas en estos animales sugieren que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 755:1235-1246 (1990».
En este estudio se utilizan ratones hembra C57BUKsJ (db+/db+) genéticamente diabéticos y sus hermanos de camada heterocigotos (db+/+m) no diabéticos (Jack.son Laboratories). Los animales se adquieren a las 6 semanas de edad y tienen 8 semanas de edad al inicio del estudio. Los animales se alojan individualmente y reciben comida y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se realizan utilizando técnicas asépticas. Los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las normas y directrices de Human Genome Sciences, Inc. Comité Institucional para Cuidado y Uso de Animales y las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
El protocolo de laceración se lleva a cabo de acuerdo con métodos previamente referidos (Tsuboi, R. y Rifkin, D.B.,
J. Exp. Med. 172:245-251 (1990». En resumen, en el día de la laceración, los animales se anestesian con una inyección intraperitoneal de Avertin (0,01 mg/ml), 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol disueltos en agua desionizada. La región dorsal del animal se afeita y la piel se lava con solución de etanol del 70% y yodo. El área quirúrgica se seca con gasa estéril antes de la herida. A continuación se crea una herida de un espesor total de 8 mm, utilizando un bisturí circular Keyes. Inmediatamente después de la laceración, la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansiórl de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante la duración del experimento. La aplicación del tratamiento se administra por vía tópica durante 5 días consecutivos comenzando el día de la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina y esponjas de gasa estéril
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el dia de la cirugía ya intervalos de dos dias después de eso. El cierre de la herida se determina midiendo diariamente los días 1-5 y el dia 8. Las heridas se miden horizontal y verticalmente utilizando un ca librador Jameson calibrado. Se consideran heridas cicatrizadas si el tejido de granulación ya no es visible y la herida está cubierta por un epitelio continuo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se administra utilizando un intervalo de dosis diferentes, de 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos de control reciben 50 mL de solución de vehiculo
Los animales se sacrifican el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mglkg). Las heridas y la piel circundante se recogen a continuación para la histología e inmunohistoquímica. Las muestras de tejido se colocan en forma lina tamponada neutra al 10% en bandejas de tejido entre esponjas de biopsia para su posterior procesamiento
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 controles diabéticos y 5 no diabéticos): 1) Control de placebo con vehículo, 2) grupo no tratado y 3) grupo tratado.
El cierre de la herida se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área cuadrada total de la herida. La contracción se estima a continuación estableciendo las diferencias entre la superficie de la herida inicial (día O) y la de después del tratamiento (dia 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente al perforador dérmico. Los cálculos se rea lizan utilizando la fórmula siguiente:
a. [Área abierta el dia 8] -[Área abierta el día 1]1[Área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en forma lina a110% y los bloques incluidos en parafina se seccionan perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan utilizando un microtomo Reichert-Jung. Se realiza la tinción de hematoxilina-eosina (H y E) de rutina en las secciones transversales de las heridas bisecadas. El examen histológico de las heridas se utiliza para valorar si el proceso de curación y la apariencia morfológica de la piel reparada se alteran mediante el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Esta evaluación incluye la verificación de la presencia de acumulación celular, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, reepitelización y madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990» Un micrómetro óptico ca librado es utilizado por un observador ciego
Las secciones de tejido también se tiñen inmunohistoquímicamente con un anticuerpo anti-queratina humana policlonal de conejo utilizando el sistema de detección ABC Elite. La piel humana se utiliza como un control de tejido positivo mientras que se utiliza IgG no inmune como un control negativo. El crecimiento de queratinocitos se
determina evaluando el grado de reepitelización de la herida utilizando un micrómetro óptico calibrado.
El antígeno nuclear de células en proliferación/ciclina (PCNA) en muestras de piel se demuestra mediante el uso de anticuerpos anti-PCNA (1 :50) con un sistema de detección ABC Elite. El cáncer de colon humano sirve como control de tejido positivo y el tejido cerebral humano se utiliza como control de tejido negativo. Cada muestra incluye una sección con omisión del anticuerpo primario y sustitución por IgG de ratón no inmune. La clasificación de estas secciones se basa en el grado de proliferación en una escala de 0-8, reflejando el lado inferior de la escala ligera proliferación y reflejando el lado superior proliferación intensa
Los datos experimentales se analizan mediante una prueba t no pareada. Un valor de p lt;0,05 se considera significativo
Modelo de rata alterado por esteroides
La inhibición de la cicatrización de heridas por esteroides ha sido bien documentada en diversos sistemas in vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. en: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahlet al., J. Immunol. 115: 476-481 (1975); Werb et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978». Los glucocorticoides retardan la cicatrización de heridas mediante la inhibición de la angiogénesis, disminuyendo la permeabilidad vascular (Ebert et al., An. Intem. Med. 37:701-705 (1952», la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno (Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61· 703-797 (1978» y produciendo una reducción transitoria de los monocitos circulantes (Haynes et al., J. Clin. Invest. 61 . 703-797 (1978); Wahl, ~Glucocorlicoids and wound healing~, En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New Yor1lt;, págs. 280-302 (1989». La administración sistémica de esteroides a la cicatrización de heridas alterada es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, ~Glucocorticoids and wound healing~, En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, págs. 280-302 (1989); Pierce el al., Proc. Nat!. Acad Sci. USA 86: 2229-2233 (1989».
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención puede acelerar el proceso de cicatrización, se evalúan los efectos de múltiples aplicaciones tópicas de la proteína de fusión en heridas de la piel por escisión de espesor total en ratas en las que la curación ha sido alterada por la administración sistémica de metilprednisolona.
En este ejemplo se utilizan ratas Sprague Dawley macho adultas jóvenes con un peso de 250-300 g (Charles River Laboratories). Los animales se adquieren a las 8 semanas de edad y tienen 9 semanas de edad al inicio del estudio La respuesta de curación de las ratas se altera por la administración sistémica de metilprednisolona (17 mglkg/rata por via intramuscular) en el momento de la laceración. Los animales se alojan individualmente y reciben comida y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se realizan utilizando técnicas asépticas. Este estudio se lleva a cabo de acuerdo con las normas y directrices de Human Genome Sciences, Inc. Comité Institucional para Cuidado y Uso de Animales y las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
El protocolo de laceración se sigue de acuerdo el descrito anteriormente. En el día de la laceración, los animales se anestesian con una inyección intramuscular de cetamina (SO mgfkg) y xilazina (5 mgfkg). La región dorsal del animal se afeita y la piel se lava con etanol del 70% y soluciones de yodo. La zona quirúrgica se seca con gasa estéril antes de la laceración. Se crea una herida de un grosor total de 8 mm utílizando un bisturí circular Keyes. Las heridas se dejan abiertas durante la duración del experimento. Las aplicaciones de los materiales de ensayo se proporcionan por vía tópica una vez al día durante 7 días consecutivos comenzando en el día de la herida y posteriormente a la administración de metilprednisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina y esponjas de gasa estéril.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la herida y al final del tratamiento El cierre de la herida se determina midiendo diariamente los días 1-5 y el día 8. Las heridas se miden horizontal y verticalmente utilizando un calibrador Jameson calibrado. Las heridas se consideran cicatrizadas si el tejido de granulación ya no es visible y la herida está cubierta por un epitelio continuo.
La proteína de fusión de la invención se administra utilizando un intervalo de dosis diferentes, de 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos de control reciben 50 mL de solución de vehículo.
Los animales se sacrifican el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Las heridas y la piel circundante se recogen a continuación para la histología. Las muestras de tejido se colocan en formalina tamponada neutra al 10% en bandejas de tejido entre esponjas de biopsia para su procesamiento adicional.
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 sin glucocorlicoides)· 1) Grupo sin tratamiento 2) Control de placebo con vehículo 3) Grupos tratados.
El cierre de la herida se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo la superticie total de la herida El cierre se estima a continuación mediante el establecimiento de las diferencias entre la superticie de la herida inicial (día O) y la de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es 64 mm2, el tamaño correspondiente al perforador dérmico. Los cálculos se realizan utilizando la fÓfTTlula siguiente:
b. [Área abierta el día 8] -[Área abierta el día 1V[área abierta el día 1]
Los especímenes se fijan en formalina al 10% y los bloques incluidos en parafina se seccionan perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan utilizando un micrótomo Olympus. Se realiza lindón de hematoxilinaeosina (H y E) de rulina en las secciones transversales de las heridas bisecadas. El examen histológico de las heridas permite la evaluación de si el proceso de curación y la apariencia morfológica de la piel reparada se mejoran mediante el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Un micrómetro óptico calibrado es utilizado por un observador ciego para determinar la distancia del hueco de la herida
Los datos experimentales se analizan mediante una prueba t no pareada. Un valor de p lt;0,05 se considera significativo
Ejemplo 22: Modelo de linfedema animal
El propósito de este enfoque experimental es crear un modelo de linfedema apropiado y compatible para someter a ensayo de los efectos terapéuticos de una proteína de fusión de albúmina de la invención en la linfangiogénesis y el reestablecimiento del sistema circulatorio linfático en la extremidad trasera de la rata. La eficacia se mide mediante el volumen de hinchazón de la extremidad afectada, la cuantificación de la cantidad de vasculatura linfática, la proteína en plasma sanguíneo total, y la histopatología. Se observa linfedema agudo durante 7-10 días. Quizás lo más importante, el progreso crónico del edema es seguido durante hasta 3-4 semanas.
Antes de comenzar la cirugía, se toman muestras de sangre para el análisis de la concentración de proteínas. A ratas macho que pesan aproximadamente 350 g -se les aplican dosis de pentobarbita l. Posteriormente, las patas derechas se afeitan desde la rodi lla hasta la cadera. La zona afeitada se limpia con una gasa empapada en EtOH del 70%. Se extrae sangre para el ensayo de la proteína total en suero. Se realizan mediciones de la circunferencia y volumétricas antes de inyectar un colorante en las patas después de marcar 2 niveles de medida (0,5 cm por encima del talón, en pt-medio de la pata dorsal). Al dorso intradérmico de ambas patas derecha e izquierda se le inyectan 0,05 mL de azul de Evan al 1%. A continuación se realizan mediciones de la circunferencia y volumétricas después de la inyección de un colorante en las patas
Utilizando la articulación de la rodilla como un punto de referencia, se realiza circunferencialmente una incisión inguinal a mitad de la pata lo que permite localizar los vasos femorales. Se utilizan fórceps y pinzas para diseccionar y separar los colgajos cutáneos. Después de localizar los vasos femorales, se localiza el vaso linfático que corre a lo largo de lado y por debajo de los vasos. Los vasos linfáticos principales en esta zona son a continuación coagulados eléctricamente o ligados con sutura
Utilizando un microscopio, se realiza una disección roma de los músculos de parte trasera de la pierna (cerca del semitendillOso y aductores). A continuación se localiza el ganglio linfático poplíteo. A continuación se ligan mediante sutura los 2 vasos linfáticos proximales y los 2 distales y el suministro sanguíneo distal del ganglio poplíteo. A continuación se elimina el ganglio linfático poplíteo y cualquier tejido adiposo acompaí'iante, cortando los tejidos conectivos
Hay que tener cuidado para controlar cualquier leve hemorragia resultante de este procedimiento. Después se ocluyen los vasos linfáticos, los colgajos cutáneos se sellan utilizando piel líquida (Vetbond) (AJ Buck). Los bordes de la piel separados se sellan al tejido muscular subyacente mientras que se deja un hueco de -0,5 cm alrededor de la pierna. La piel también se puede anclar mediante sutura al músculo subyacente cuando sea necesario.
Para evitar la infección, los animales se alojan individualmente con una malla (sin lecho). Los animales que se recuperan se comprueban todos los días a través del pico edematoso óptimo, que se produce típicamente sobre el día 5-7. A continuación se observa el pico edematoso meseta. Para evaluar la intensidad dellinfedema, se miden la circunferencia y 2 volúmenes de los lugares designados en cada pata antes de la operación y diariamente durante 7 días. Se determina el efecto de las proteínas plasmáticas durante el linfedema y también se investiga si el análisis de proteínas es un parámetro de ensayo útil. Los pesos de las extremidades, tanto de control como edematosas son evaluados en 2 lugares. El análisis se rea liza de una manera ciega.
Mediciones de la circunferencia: Bajo una breve anestesia con gas para evitar el movimiento de las extremidades, se utiliza una cinta de tela para medir la circunferencia de la extremidad. Las mediciones se realizan en el hueso del tobillo y la pata dorsal por 2 personas diferentes y esas 2 lecturas se promedian. Las lecturas se toman tanto de las extremidades de control como edematosas.
Mediciones volumétricas: El día de la cirugía, los animales se anestesian con Pentobarbital y se someten a ensayo antes de la cirugía. Para la volumetría diarias los animales están bajo una breve anestesia con halotano (inmovilización rápida y recuperación rápida), y ambas patas se afeitan y se marcan igualmente utilizando marcador indeleble en las patas. Las patas se sumergen primero en agua, a continuación se sumergen en el aparato hasta cada nivel marcado y a continuación se miden mediante el soporte lógico de edema Buxco (ChenNictor). Los datos son registrados por una persona, mientras que la otra está sumergiendo la extremidad hasta la zona marcada.
Mediciones de proteína de plasma sanguíneo: La sangre se extrae, se centrifuga, y se separa el suero antes de la cirugía y después a la conclusión de la comparación de proteína total y Ca2+
Comparación del Peso de las Extremidades: Después de la extracción de sangre, el animal se prepara para la recogida de tejidos. Las extremidades se amputan utilizando una guillotina, a continuación, las patas tanto experimentales como de control se cortan en la ligadura y se pesan. Se realiza un segundo pesaje a medida que la articulación tibio-calcaneal es desarticulada y se pesa el pie
Preparaciones histológicas: El músculo transverso situado detrás de la zona de la rodilla (poplítea) se disecan y se disponen en un molde metálico, se carga de Gel congelado, se sumerge en metilbutallO frío, se coloca en bolsas de muestra marcadas a -aOEC hasta el corte. Tras el corte, el músculo se observa bajo microscopio fluorescente para vasos linfáticos.
Ejemplo 23: Supresión de la expresión de moléculas de adherencia inducida por TNF affa mediante una proteina de fusión de albúmina de la invención
El reclutamiento de linfocitos a las zonas de inflamación y angiogénesis implica interacciones receptor-ligando específicas entre moléculas de adherencia de la superficie celular (CAM) en los linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adherencia, tanto en entomos normales como patológicos, sigue una cascada de múltiples etapas que implica la expresión de la molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1), de la molécula de adherencia de células vasculares 1 (VCAM-I), y de la molécula de adherencia de leucocitos endoteliales 1 (E-selectina) en las células endoteliales (CE). La expresión de estas moléculas y otras en el endotelio vascular determina la eficacia con que los leucocitos se pueden adherir a la vasculatura local y extravasarse al tejido local durante el desa rrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citoquinas y factor de crecimiento participa en la modulación de la expresión de estas CAM
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), una potente citoquina pfOinflamatoria, es un estimulador de las tres CAM sobre las células endoteliales y puede estar implicado en una amplia variedad de respuestas inflamatorias, que a menudo dan lugar a un resultado patológico
Se puede examinar el potencial de una proteína de fusión de albúmina de la invención para mediar la supresión de TNF-a inducida por la expresión de CAM. Se emplea un ensayo de ELlSA modificado que usa las CE como un absorbente de fase sólida para medir la cantidad de expresión de CAM en CE tratadas con TNF-a cuando se coestimulan con un miembro de la familia FGF de proteínas
Para rea lizar el experimento, se obtienen cultivos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) a partir de cosechas de cordón agrupadas y se mantienen en medio de crecimiento (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA) con un suplemento de FCS a110% y penicilina/estreptomicina a11 % en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius que contiene C02 al 5%. Las HUVEC se siembran en placas de 96 pocillos a concentraciones de 1 x 104 células/pocillo en medio EGM a 37 grados Celsius durante 18-24 horas o hasta la confluencia. Las monocapas se lavan con posterioridad 3 veces con una solución sin suero de RPMI 1640 con un suplemento de 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina, y se tratan con una citoquina dada y/o factores de crecimiento durante 24 horas a 37 grados Celsius. Después de la incubación, las células se evalúan a continuación para determinar la expresión de CAM.
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se cultivan en una placa de 96 pocillos convencional hasta la confluencia. El medio de crecimiento se retira de las células y se reemplaza por 90 ¡JI de medio 199 (FBS al 10%). Las muestras para el ensayo y los controles positivos o negativos se agregan a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 ¡.JI). Las placas se incuban a 37 grados Celsius, ya sea durante 5 h (expresión de selectina y de integrina) o 24 h (sólo expresión de inteprina). Las placas se aspiran para eliminar el medio y se añaden 100 ¡JI de paraformaldehído al 0,1%-PBS (con Ca· y Mg··) a cada poci llo. Las placas se mantienen a 4Q C durante 30 mino
El fijador se retira a continuación de los pocillos y los poeíllos se lavan IX con PBS (+Ca,Mg) + BSA al 0,5% y se drena. No se permite que los pocillos se sequen. Se añaden 10 ¡.JI de anticuerpo primario diluido a los pocillos de ensayo y de control. Se utilizan Anti-ICAM-1-Biotina, Anti-VCAM-1-Biotina y Anti-E-selectina-Biotina a una concentración de 10 ¡Jg/mL (diluciÓfl1 :10 de anticuerpo de partida a 0,1 mg/mL). Las células se incuban a 37Q C durante 30 mino En un entomo humidificado. Los poci llos se lavan X3 con PBS (+Ca,Mg) + BSA al 0,5%.
A continuación, se añaden 20 ¡JI de ExtrAvidin-Fosfatasa Alcalina diluida (dilución 1:5000) a cada pocillo y se incuban a 37quot;C durante 30 mino Los pocillos se lavan X3 con PBS (+Ca,Mg) + BSA al 0,5%. Se disuelve 1 comprimido de fosfalo de p-nilrofenol pNPP en 5 mL de lampón de glicina (pH 10,4). Se añaden a cada pocillo de ensayo 10.0 ¡JI de sustrato de pNPP en tampón glicina. Se preparan pocillos convencionales, por t~licado, a partir de la diluclÓfl de trabajO de la ExtrAvldln-Fosfatasa Alcalina en tampón de gliCina: 1:5000 (10quot;) gt; 10 5gt; 10.1 gt; 101.5 Se añaden 0,5 ¡JI de cada dilución a pocillos por triplicado y el contenido de AP resultante en cada poci llo es de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. A continuación, se deben añadir 100 ¡JI de reactivo pNNP a cada uno de los pocillos convencionales. La placa se debe incubar a 37quot;C durante 4 h. Se añade un volumen de 50 ¡JI de NaOH 3M a todos los pocillos. Los resultados se cuantifican en un lector de placas a 405 nm. La opción de sustracción del fondo se utiliza en los pocillos de blanco solo cargados con tampón de glicina. El molde se ajusta para indicar la
concentración de producto conjugado de AP en cada pocillo convencional [5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng]. Los resultados se indican como cantidad de producto conjugado de AP unido en cada muestra
Ejemplo 24: Construcción del constructo informador de GAS
Una ruta de transducción de señales implicada en la diferenciación y proliferación de células se denomina ruta Jaks-STAT. Las proteinas activadas en la ruta Jak-STAT se unen a elementos del sitio de activación gamma quot;GASquot; o elemento de respuesta sensible a interferón r ISREquot;), loca lizado en el promotor de muchos genes. La unión de una proteína a estos elementos altera la expresión del gen asociado.
Los elementos GAS e ISRE son reconocidos por una clase de factores de transcripción denominados Transductores de Señales y Activadores de la Transcripción, o quot;STATquot;. Hay seis miembros de la familia STAT. Statl y Stat3 están presentes en muchos tipos de células, como lo está Stat2 (puesto que la respuesta a IFN-alfa es generalizada). El Stat4 está más restringido y no se encuentra en muchos tipos de células, aunque se ha encontrado en la clase I de células T colaboradoras, después del tratamiento con IL-12 El Stat5 fue originalmente denominado factor de crecimiento mamario, pero se ha encontrado en concentraciones más altas en otras células, incluyendo células mieloides. Puede ser activado en células de cultivo de tejidos por muchas citoquinas.
Los STAT se activan para translocarse desde el citoplasma al núcleo después de la fosforilación de la tirosina mediante un conjunto de quinasas conocidas como la familia de Ouinasas Janus rJakquot;). Las Jak representan una familia distinta de tirosina quinasas solubles e incluyen Tyk2, Jak1, Jak2 y Jak3. Estas quinasas exhiben similitud de secuencia significativa y generalmente son catalíticamenle inactivas en las células en reposo.
Las Jak son activadas por una amplia gama de receptores resumidos en la siguiente Tabla. (Adaptada de la revisión por Schidler y Darnell, Ann Rev. Biochem. 64:621-51 (1995». Una familia de receptores de citoquina, capaz de activar Jak, se divide en dos grupos: (a) la Clase 1 incluye receptores para IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11 , IL12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, UF, CNTF y trombopoyetina; y (b) la Clase 2 incluye IFN-a, IFN-g, e IL
10. Los receptores de la Clase 1 comparten un motivo conservado de cisteína (un conjunto de cuatro cisteinas conservadas y un triptófano) y un motivo WSXWS (una región de membrana proximal que codifica Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (SEO ID NO: 53)).
De este modo, durante la unión de un ligando a un receptor, las Jak se activan, lo que a su vez activa los STAT, que a continuación se translocan y se unen a elementos de GAS. Todo este proceso se enmarca en la ruta de transducción de señales Jak-STAT. Por lo tanto, la activación de la ruta de Jaks-STAT, reflejada por la unión del elemento GAS o ISRE, puede usarse para indicar las proteínas implicadas en la proliferación y diferenciación de las células. Por ejemplo, se sabe qué factores de crecimiento y citoquinas activan la ruta Jak-STAT (véase la Tabla 5, a continuación). Por lo tanto, mediante el uso de elementos GAS conectados a moléculas informadoras, se pueden identificar los activadores de la ruta de Jak-STAT.
Tabla 5
Ligando de JAK
lyk2 STATS Jakl Jak2 Jak3 GAS (elementos ) o ISRE
Familia de IFN
IFN-a/B
+ + - - 1,2,3 ISRE
IFN-g
+ + - 1 GAS (IRF1gt;Lys6gt;IFP)
11-10
+ ? ? - 1,3
Familia de g130
lL-6 (Pleiotrópico)
+ + + ? 1,3 GAS(IRF1 gt;Lys6gt;IFP)
lL-l1 (Pleiotrópico)
? + ? ? 1,3
OnM (Pleiotrópico)
? + + ? 1,3
ligando de JAK
tyk2 STATS Jak1 Jak2 Jak3 GAS (elementos) o ISRE
UF (Pleiotrópico)
? + + ? 1,3
CNTF (Pleiotrópico)
-1+ + + ? 1,3
G-CSF (Pleiolrópico)
? + ? ? 1,3
lL-12 (Pleiotrópico)
+ - + + 1,3
Famili a de g-C
lL-2 (linfocitos)
- + - + 1,3,5 GAS
lL-4 (linfa/mieloide)
- + - + 6 GAS(IRF1-IFP»Ly6)(lgH)
IL-7 (linfocitos)
- + - + 5 GAS
lL-9 (linfocitos)
- + - + 5 GAS
IL-13 (linfocito)
- + ? ? 6 GAS
lL15
? + ? + 5 GAS
Famili a de gp140
IL-3 (mieloide)
- - + - 5 GAS(IRF1 gt;IFP»Ly6)
IL-5 (mieloide)
- - + - 5 GAS
GM-CSF (mieloide)
- - + - 5 GAS
Famili a de la hormona del crecimiento
GH
? - + - 5
PRL
? +1 + - 1,3,5
EPa
? - + - 5 GAS (B-CASgt;IRF1-IFP»Ly6)
Tirosina Quinasas de Receptores
ligando de JAK
tyk2 STATS Jak1 Jak2 Jak3 GAS (elementos) o ISRE
EGF
? + + - 1,3 GAS (IRF1)
POGF
? + + - 1,3
CSF-1
? + + - 1,3 GAS (no IRF1)
Para construir un elemento promotor que contiene GAS sintético, que se utiliza en los Análisis Biológicos descritos en los Ejemplos 27-29, se emplea una estrategia basada en PCR para generar una secuencia promotora de GASSV40_ El cebador 5' contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión a GAS que encontrado en el promotor IRFL Y que se ha demostrado previamente que se une a STAT tras la inducción con una variedad de citoquinas (Rothman et al., Immunity 1 :457-468 (1994» , aunque se pueden utilizar otros elementos GAS o ISRE en su lugar. El cebador 5' también contiene 18 pb de la secuencia complementaria a la secuencia del promotor temprano de SV40 y está flanqueado con un sitio XhoL La secuencia de cebador 5' es:
5' GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTG CCATCTCAATTAG: 3' (SEO ID NO: 54)
El cebador aguas abajo es complementario al promotor de SV40 y está flanqueado con un sitio Hind 111: 5'· GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC: 3' (SEO ID NO: 55)
La amplificación mediante PCR se realiza utilizando el molde del promotor de SV40 presente en el plásmido promotor gal B:obtenido de Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XholfHind 111 y se subclona en BLSK2 _La secuenciación con cebadores directo e inverso (Stratagene) confirma que el inserto contiene la siguiente secuencia:
S';C!COAGATITCCCCGAAATCTAGATITCCCClt;iAAATGAlTrCCCCOAAATGAlTICCCCGMATATCTOCCATCTCAATTAGTCAGe
AACCATACiTCCCOCCCCTMCTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTICCGCCCATICTOCGCCCCATGGCTGActAATITITT
TTATTTATGCAGAGGOCGAGGOOGCCTCGGOCTCTGAQCTATTCCAGAAGTAGTOAGGAGGCI I I I I IQGAOGCCTAGG~A
AAAGCTT:3' (SEQlDNO:S6)
Con este elemento promotor GAS conectado al promotor de SV40, se modifica genéticamente un constructo indicador GAS:SEAP2 _ Aquí, la molécula indicadora es una fosfatasa alcalina secretada, o ~SEAP~. Claramente, sin embargo, puede ser cualquier molécula indicadora en lugar de SEAP, en este o en cualquiera de los otros ejemplos. Las moléculas informadoras bien conocidas que se pueden utilizar en lugar de SEAP incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, proteina fluorescente verde (GFP), o cualquier proteína detectable por un anticuerpo.
La secuencia anterior confirmó que el elemento promotor GAS-SV40 sintético se subclona en el vector pSEAP-Promotor obtenido de Clontech utilizando Hindlll y Xhol, reemplazando de manera efectiva el promotor de SV40 por el elemento promotor GAS:SV40 amplificado, para crear el vector GAS-SEAP_ Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por lo tanto, no se prefiere para sistemas de expresión de mamiferos
Por lo tanto, con el fin de generar líneas celulares estables de mamífero que expresan el indicador GAS-SEAP, el casete de GAS-SEAP se retira del vector GAS-SEAP utilizando Sall y Notl, y se inserta en un vector de la cadena principal que contiene el gen de resistencia a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), utilizando estos sitios de restricción en el sitio de clonación múltiple, para crear el vector GAS-SEAP/Neo_ Una vez que este vector se transfecta a células de mamífero, este vector se puede usar a continuación como una molécula indicadora para la unión de GAS como se describe en los Ejemplos 27-29.
Se pueden preparar olros constructos utilizando la descripción anterior y sustituyendo GAS por una secuencia promotora diferente. Por ejemplo, la construcción de moléculas indicadoras que contienen secuencias promotoras de EGR y NF-KB se describen en los Ejemplos 27-31 Sin embargo, muchos otros promotores pueden ser sustituidos utilizando los protocolos descritos en estos Ejemplos_ Por ejemplo, los promotores de SRE, IL-2, NFAT, o osteocalcina pueden ser sustituidos, solos o combinados (p. ej., GASfNF-KB/EGR, GAS/NF-KB, 11-21NFAT, o NFKBfGAS). Del mismo modo, se pueden utilizar otras líneas celulares para someter a ensayo la actividad del constructo indicador, tales como HELA (epitelial), HUVEC (endotelial), Reh (célula B), Saos-2 (osteoblastos), HUVAC (aórtica), o Cardiomiocitos.
Ejemplo 25: Anáfisis de fa actividad de SEAP
Como molécula indicadora para los análisis descritos en los ejemplos descritos en la presente memoria, la actividad SEAP se somete a ensayo utilizando el kit Tropix Phospho-ligth (Cat BP-400) de acuerdo con el siguiente procedimiento general. El kit Tropix Phospho-ligth suministra la Dilución, el Análisis, y los Tampones de Reacción
5 utilizados a continuación.
Cebar un dispensador con el tampón de dilución 2,5x y dispensar 15 ¡.JI de tampón de dilución 2,5x en OptiPlates que contienen 35 ¡.JI de una solución que contiene una proteina de fusión de albúmina de la invención. Sellar las placas con un sellador plástico e incubar a 65 grados Celsius durante 30 mino Separar las OptiPlates para evitar un calentamiento desigual
10 Enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de ensayo. Añadir 50 mL de Tampón de Ensayo e incubar a temperatura ambiente durante 5 mino Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de reacción (véase la tabla siguiente). Añadir 50 ¡.JI de tampón de reacciÓfl e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Dado que la intensidad de la señal quimioluminiscente es dependiente del tiempo, y se tarda aproximadamente 10 minutos en leer 5 placas en un luminómetro, se deben tratar 5 placas en
15 cada momento y comenzar el segundo grupo 10 minutos más tarde
Leer la unidad de luz relativa en elluminómetro. Establecer H12 como blanco, e imprimir los resultados Un aumento de la quimioluminiscencia indica actividad indicadora.
Tabla 6
Núm, de placas
Diluyente tampón Rxn (mi) CSPD(ml) Núm. de placas Diluyente tampón Rxn (mi) CSPD (mi)
10
60 3 31 165 8,25
11
65 3,25 32 170 8,5
12
70 3,5 33 175 8,75
13
75 3,75 34 180 9
14
80 4 35 185 9,25
15
85 4 ,25 36 190 9,5
16
90 4,5 37 195 9,75
17
95 4 ,75 38 200 10
18
100 5 39 205 10,25
19
105 5,25 40 210 10,5
20
110 5,5 41 215 10, 75
21
115 5,75 42 220 11
22
120 6 43 225 11 ,25
23
125 6,25 44 230 11 ,5
24
130 6,5 45 235 11 ,75
25
135 6,75 46 240 12
Núm, de placas
Diluyente lampón Rxn (mi) CSPD(ml) Núm. de placas Diluyente lampón Rxn (mi) CSPD (mi)
26
140 7 47 245 12,25
27
145 7,25 48 250 12,5
28
150 7,5 49 255 12,75
29
155 7,75 50 260 13
30
160 8

Ejemplo 26: Ensayo de identificación de la actividad neuronal
Cuando las células experimentan diferenciación y proliferación, un grupo de genes se activan a través de diferentes rutas de transduccián de señales. Uno de eslos genes, EGR1 (gen de respuesta de crecimiento lemprallO 1), es inducido en diversos tejidos y tipos celulares tras la activación. El promotor de EGR1 es responsable de dicha inducción. Utilizando el promotor de EGR1 ligado a moléculas indicadoras, se puede evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para activar las células
En particular, se utiliza el siguiente protocolo para evaluar la actividad neuronal en líneas celulares PC12. Se sabe que las células PC12 (células de fenocromocitoma de rata) proliferan y/o se diferencian mediante activación con varios mitógenos, tales como TPA (acetato de tetradecanoilforbol), NGF (factor de crecimiento nervioso), y EGF (factor de crecimiento epidérmico). la expresión del gen EGR1 se activa durante este tratamiento. Por lo tanto, transfectando de manera estable células PC12 con un constructo que contiene un promotor de EGR conectado a un indicador SEAP, se puede evaluarse la activación de las células PC12 por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención
El constructo indicador EGRlSEAP se puede ensamblar mediante el siguiente protocolo. la secuencia del promotor de EGR1 (-633 a +1) (Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871 (1991» se puede amplificar mediante PCR a partir de AON genómico humallO utilizando los siguientes cebadores:
Primer cebador: 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (SEO ID NO: 57)
Segundo cebador: 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (SEO ID NO: 58)
Utilizando el vector GAS:SEAP/Neo producido en el Ejemplo 24, se puede insertar a continuación el producto amplificado de EGR1 en este vector. Linealizar el vector GAS:SEAPfNeo utilizando enzimas de restricción Xhol/Hindlll, eliminando el relleno de GAS/SV40. Restringir el producto amplificado de EGR1 con estas mismas enzimas. ligar el vector y el promotor EGR1 .
Para preparar placas de 96 pocillos para el cultivo celular, se añaden dos ml de una solución de recubrimiento (dilución 1:30 de colágeno de tipo I (Upstate Biotech Inc. Núm de Cal. 08-115) en etanol del 30% (esterilizado mediante filtración» por placa de 10 cm o 50 ml por pocillo de la placa de 96 pocillos, y se deja secar al aire durante 2 hr.
las células PC12 se cultivan de forma rutinaria en medio RPMI-1640 (Bio Whittaker) que contiene suero de caballo al 10% (JRH Biosciences, Núm. de Cal. 12449-78P), suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 5% con un suplemento de 100 unidades/ml de penicilina y 100 j..Ig/mL de estreptomicina en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm prerrevestida. Se realizan de una a cuatro divisiones cada tres o cuatro dias. las células se retiran de las placas med iante raspado y se resuspenden pipeteando arriba y abajo durante más de 15 veces
Transfectar el constructo EGRlSEAP/Neo en PC12 utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Se obtienen células estables EGR-SEAP/PC12 mediante el cultivo de las células en 300 j..Ig/mL de G418. El medio libre de G418 se uti liza para el crecimiento de rutina, pero cada uno a dos meses, las células se deben volver a cultivar en 300 j..Ig/ml de G418 para un par de pases.
Para someter a ensayo para la actividad neuronal, ase escruta una placa de 10 cm con células con aproximadamente 70 a 80% de confluencia eliminando el medio antiguo. Lavar las células una vez con PBS (Tampón Fosfato Salino). A continuación mantener en ayunas las células en medio bajo en suero (RPMI -1640 que contiene suero de caballo al 1% y FBS al 0,5% con antibióticos) durante la noche.
A la mañana siguiente, retirar el medio y lavar las células con PBS. Raspar las células de la placa, suspender las células bien en 2 mL de medio con bajo contenido de suero. Contar el número de células y añadir más medio con bajo contenido de suero para alcanzar la densidad celular final de 5x105 célulaslmL
Añad ir 200 ~I de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (equivalente a 1x105 células/pocillo) Añadir una serie de diferentes concentraciones de una proteína de fusión de albúmina de la invención, 37 grados Celsius durante 48 a 72 h. Como control positivo, se puede utilizar un factor de crecimiento conocido para activar células las PC12 a través de EGR, tal como 50 nglul de Factor de Crecimiento Neuronal (NGF). Se observa típicamente más de cincuenta veces de inducción de SEAP en los pocillos de control positivo. El análisis SEAP se puede llevar a cabo de forma rutinaria utilizando mecanismos conocidos en la técnica y/o como se describe en el Ejemplo 25
Ejemplo 27: Ensayo para determinar la actividad de las células T
Se utiliza el siguiente protocolo para evaluar la actividad de las células T identificando los factores, y determinando si una proteína de fusión de albúmina de la invención hace proliferar ylo diferenciar células-T. La actividad de las células T se evalúa utilizando el constructo GAS/SEAP/Neo producido en el Ejemplo 24. De este modo, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la ruta de transducción de la señal de Jaks-STATS. Las células T utilizadas en este análisis son células T de Jur1lt;at (Núm. de Acceso de la ATCC TIB-152), aunque también se pueden utilizar células Molt-3 (Núm. de Acceso de la ATCC CRL-1552) y células Molt-4 (Núm. de Acceso de la ATCC CRL-1582)
Las células T de Jurkat son células colaboradoras Th1 CD4+ linfoblásticas. Con el fin de generar líneas celulares estables, se transfectan aproximadamente 2 millones de células Jur1lt;at con el vector GAS-SEAP/neo utilizando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimiento de transfección descrito a continuación). Las células transfectadas se siembran a una densidad de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se seleccionan los transfectantes resistentes a 1 mg/mL de geneticina. Las colonias resistentes se expanden y a continuación se someten a ensayo para determinar su respuesta a concentraciones crecientes de interferón gamma. Se demuestra la respuesta a la dosis de un clon seleccionado
Específicamente, el siguiente protocolo producirá células suficientes para 75 poci llos que contienen 200 ~I de células. Por lo tanto, o bien se amplia, o bien se lleva a cabo múltiples veces para generar células suficientes para placas múltiples de 96 pocillos. Las células Jur1lt;at se mantienen en RPMI -+ suero al 10% conPen-Strep al 1 %. Combinar 2,5 mL de OPTI -MEM (Life Technologies) con 10 ~g de ADN plasmíd ico en un matraz T25. Añad ir 2,5 mL de OPTt-MEM que contiene 50 ¡JI de DMRIE-C e incubar a temperatura ambiente durante 15 a 45 minutos
Durante el periodo de incubación, contar la concentración de células, centrifugar el número requerido de células (10por transfección) y resuspender en OPTI-MEM a una concentración final de 107 células/mL. A continuación, añadir 1 mL de 1 x 107 células en OPTI-MEM al matraz T25 e incubar a 37 grados Celsius durante 6 horas. Después de la incubación, añadir 10 mL de RPMI + suero al 15%.
Las líneas indicadoras estables Jurkat:GAS-SEAP se mantienen en RPMI + suero al 10%, 1 mg/mL de genticina, y Pen-Strep al 1%. Estas células se tratan con diversas concentraciones de una o más proteínas de fusión de la presente invención.
En el día del tratamiento con la proteína de fusión , las cétulas se deben lavar y resuspender en RPMI + suero a110% de nueva aportación a una densidad de 500.000 células por mL. El número exacto de células necesarias dependerá de la cantidad de proteínas de fusión y el número de diferentes concentraciones de proteínas de fusión que se vaya a escrutar. Para una placa de 96 pocillos, son necesarios aproximadamente 10 millones de células (para 10 placas, 100 millones de célu las) .
Los poci llos que contienen células Jur1lt;at tratadas con la proteína de fusión se colocan en una incubadora durante 48 horas (nota: este tiempo es variable entre 48-72 horas). Se transfieren a continuaciórJ muestras de 35 ~I de cada pocillo a una placa opaca de 96 pocillos utilizando una pipeta de 12 canales. Las placas opacas se deben cubrir (utilizando cubiertas de Sellophene) y almacenar a -20 grados Celsius hasta que se realizan los análisis de SEAP de acuerdo con el Ejemplo 25. Las placas que contienen las células tratadas restantes se colocan a 4 grados Celsius y sirven como una fuente de material para repetir el análisis en un pocillo específico si se desea.
Como control positivo, se pueden utilizar 100 unidadeslmL de interferón gamma que se sabe que activa las células T Jurkat. Se observa típicamente una inducción de más de 30 veces en los poci llos de control positivo.
El protocolo anterior se puede utilizar en la generación de células transfectadas de manera tanto transitoria como estables, lo que sería evidente para los expertos en la técníca.
Ejemplo 28: Ensayo para determinar la actividad de las células T
El NF-KB (Factor Nuclear KB) es un factor de transcripción activado por una amplia variedad de agentes, incluyendo las citoquinas inflamatorias IL-1 y TNF, CD30 Y CD40, linfotoxina-alfa y linfotoxina-beta, mediante exposiciórJ a LPS
o trombina, y mediante la expresión de ciertos productos génicos virales. Como factor de transcripción, el NF-KB
regula la expresión de genes implicados en la activación de células inmunitarias, el control de la apoptosis (NF-KB parece proteger a las células de la apoptosis), el desarrollo de células B y T, las respuestas antivirales y antimicrobianas, y múltiples las respuestas al estrés.
En coodiciones no estimuladas, NF-KB es retenido en el citoplasma con I-KB (Inhibidor KB). Sin embargo, tras la estimulación, I-KB se fosforila y se degrada, haciendo que NF-KB se traslade al núcleo, activando de este modo la transcripción de los genes diana. Los genes diana activados por NF-KB incluyen IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-l y MHC de clase 1
Debido a su papel central y a la capacidad de responder a una serie de estímulos, los constructos indicadores que utilizan el elemento promotor de NF-KB se utilizan para detectar la proteína de fusión. Los activadores o inhibidores de NF-KB serían útiles en el tratamiento, la prevención, y/o el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, los inhibidores de NF-KB se podrían utilizar para el tratamiento de aquellas enfermedades relacionadas con la activación aguda o crónica de NF-KB, tales como la artritis reumatoide.
Para construir un vector que contiene el elemento promotor de NF-KB, se emplea una estrategia basada en PCR. El cebador aguas arriba contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión de NF-KB (GGGGACTTICCC) (SEO ID NO: 59), 18 pb de la secuencia complementaria al extremo 5' de la secuencia del promotor temprano de SV40, y está flanqueado con un sitio Xhol:
5': GCGGCCTCGAGGGGACTTICCCGGGGACTTICCGGGGACTTICCGGGACTTICCATCCTGCCATCTCAA T TAG: 3' (SEO ID NO: 60)
El cebador aguas abajo es complementario al extremo 3' del promotor de SV40 y está flanqueado por un sitio Hind In·
5': GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC: 3' (SEO ID NO: 55)
La amplificación mediante PCR se realiza utilizando el molde del promotor de SV40 presente en el plásmido PBgal:promotor obtenido de Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con Xhol y Hind 111 y se subclona en BLSK2-(Stratagene). La secuenciación con los cebadores de T7 y T3 confinna que el inserto contiene la siguiente secuencia·
S'~CGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCAT~AATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGC
CCCfAACTCCGCCCATCCCGOCCCTAACTa:::GCCCAGnClt;XXX:CAlTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA I 11\1 i j IATrrATGCAGAG
GCCGAGGCCOccrcooccrcrOAGCTAlTCCAGAAQTAOTOAGGAGGCll l1 i IGQAGGCCTAGOcrrrrlt;iCAÁAAAGCTT:1' (SEQ
ID NO:6 1)
A continuaciÓfl, reemplazar el elemento promotor mínimo de SV40 presente en el plásmido pSEAP2-promotor (Clontech) por este fragmento NF-KBfSV40 utilizando Xhol y Hindlll. Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por lo tanto, no se prefiere para sistemas de expresión de mamíferos.
Con el fin de generar líneas celulares de mamífero estables, el casete NF-KBfSV40fSEAP se retira del vector NFKBfSEAP anterior uti lizando las enzimas de restricción Sall y Notl, y se inserta en un vector que contiene resistencia a neomicina. En particular, el casete NF-KBfSV40/SEAP se inserta en pGFP-1 (Clontech), reemplazando el gen GFP, después de someter pGFP-1 a las enzimas de restricción Sall y Notl.
Una vez que se crea el vector NF-KB/SV40/SEAPfNeo, las células T Jurkat estables se crean y se mantienen de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 25. Del mismo modo, el método para analizar las proteínas de fusión con estas células T Jurkat estables también se describe en el Ejemplo 25. Como control positivo, se añade TNF alfa exógeno (0,1, quot; 10 ng) a los pocillos H9, HLO, Y Hl' , observándose típicamente una activación de 5-10 veces
Ej emplo 29: Ensayo de identificación de la actividad mieloide
El siguiente protocolo se utiliza para evaluar la actividad mieloide de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención mediante la determinación de si la proteína de fusión hace proliferar y/o diferenciar células mieloides. La actividad de las células mieloides se evalúa utilizando el constructo GAS/SEAP/Neo producido en el Ejemplo 24. De este modo, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la ruta de transducción de señales Jaks-STATS. La célula mieloide uti lizada en este análisis es U937, una línea celular premonocítica, aunque se pueden utilizar TF-1, HL60, o KG1.
Para transfectar de forma transitoria células U937 con el coostructo GAS/SEAP/Neo producido en el Ejemplo 24, se utiliza un método de OEAE-dextrano (Kharbanda el. al., 1994, Cell Growth & Oifferentiation, 5:259 -265). En primer lugar, cosechar 2x107 células U937 y lavar con PBS. Las células U937 se cultivan generalmente en RPMI 1640 que contiene suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, con un suplemento de 100 unidades/mL de penicilina y 100 mglmL de estreptomicina.
A continuación, suspender las células en 1 mL de Tris-HCI 20 mM (pH 7,4) que contiene 0,5 mgfmL de oEAEdextrano, 8 ~g de AON del plásmido GAS-SEAP2, NaCI 140 mM, KCI5 mM, NazHP04 ·7HzO 375 uM, MgClz 1 mM, y CaClz 675 uM. Incubar a 37 grados Celsius durante 45 min
Lavar las células con medio RPMI 1640 que contiene FBS al 10% y a continuación volver a suspender en 10 mL de medio completo e incubar a 37 grados Celsius durante 36 hr.
Las células GAS-SEAPfU937 estables se obtienen mediante el cultivo de las células en 400 J.lg/mL de G418. El medio sin G418 se utiliza para el crecimiento de rutina, pero cada uno a dos meses, las células se deben volver a cultivar en 400 ~glmL de G418 para un par de pases.
Estas células son sometidas a ensayo cosechando 1x106 células (esto es suficiente para un análisis con diez placas de 96 pocillos) y se lavan con PBS. Susp.:ender las células en 200 mL del medio de crecimiento descrito anteriormente, con una densidad final de 5x105 células/mL. Cultivar en placa 200 ~I de células por pocillo en la placa de 96 pocillos (o 1x10s células/pocillo).
Añadir diferentes concentraciones de la proteína de fusión Incubar a 37 grados Celsius durante 48 a 72 h. Como control positivo, se pueden utilizar 100 unidadeslmL de interferón gamma que se sabe que activa las células U937. Se observa típicamente una inducción de más de 30 veces en los pocillos de control positivo. Analizar SEAP del sobrenadante de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y/o el protocolo descrito en el Ejemplo 25.
Ejemplo 30; Análisis que identifica cambios en la concentración y la permeabifidad de la membrana de moléculas pequeñas
Se sabe que la unión de un ligando a un receptor altera los niveles intracelulares de moléculas pequeñas, tales como calcio, potasio, sodio, y el pH, así como altera el potencial de membrana. Estas alteraciones pueden medirse en un análisis para identificar proteínas de fusión que se unen a receptores de una célula concreta. Aunque el siguiente protocolo describe un análisis para el calcio, este protocolo puede modificarse fácilmente para detectar cambios en el potasio, el sodio, el pH, el potencial de membrana, o cualquier otra molécula pequeña que sea detectable mediante una sonda fluorescente
El siguiente análisis utiliza Fluorometric Imaging Plate Reader (~FLlPRquot;) para medir cambios en moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se unen moléculas pequeñas. Claramente, se puede utilizar aJalquier molécula fluorescente que detecte una molécula pequeña en lugar de la molécula fluorescente de calcio, fluo-4
(Molecular Probes, Inc.; Núm. de catálogo. F-14202), que se utiliza aquí.
Para células adherentes, sembrar las células a 10.000-20.000 células/poci llo en una placa de 96 pocillos de color negro Costar con fondo transparente. La placa se incuba en una incubadora con COz durante 20 horas. Las células adherentes se lavan dos veces en una lavadora Biotek con 200 ~I de HBSS (solución salina equilibrada de Hank) dejando 100 J.l1 de tampón después del lavado final.
Se prepara una solución de partida de 1 mg/mL de fluo-4 en OMSO con ácido plurónico al 10%. Para cargar las células con fluo-4, se añaden 50 J.l1 de fluo-4 de 12 ~g/mL a cada pocillo. La placa se incuba a 37 grados Celsius en una incubadora con COz durante 60 minutos. La placa se lava cuatro veces en la lavadora Biotek con HBSS dejando 100 J.l1 de tampón
Para las células no adherentes, las células se centrifugan de los medios de cultivo. Las células se vuelven a suspender a 2-Sx106 células/mL con HBSS en un tubo cónico de 50 mL. Se añaden 4 J.l1 de solución de fluo-4 de 1 mg/mL en OMSO con ácido plurónico al 10% de a cada mL de suspensión celular. El tubo se coloca a continuación en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 a 60 mino Las células se lavan dos veces con HBSS, se vuelven a suspender a 1x106 células/mL, y se dispensan a una microplaca, 100 J.lllpocillo. La placa se centrifuga a 1000 rpm durante 5 mino La placa se lava una vez en Denley Cell Wash con 200 ~I , seguido de una etapa de aspiración hasta un volumen final 100 ~1.
Para un análisis no basado en células, cada pocillo contiene una molécula fluorescente, tal como fluo-4. La proteína de fusión de la invención se añade al pocillo, y se detecta un cambio en la fluorescencia
Para medir la fluorescencia del calcio intracelular, el FLlPR se ajusta los siguientes parámetros: (1) La ganancia del sistema es de 300-800 mW; (2) El tiempo de exposición es de 0,4 segundos; (3) La Cámara F/parada es Ff2 ; (4) La excitación es de 488 nm; (5) La emisión es de 530 nm; y (6) La adición de la muestra es 50 ~1. El aumento de emisión a 530 nm indica un acontecimiento de señalización extracelular causada por una proteína de fusión de albúmina de la presente invenciórJ o una molécula inducida por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, que da como resultado un aumento de la concentración de Ca H intracelular.
Ejemplo 31; Ensayo de identificación de la actividad tirosina quinasa
Las proteinas tirosina quinasas (PTK) representan un grupo diverso de quinasas transmembrana y citoplasmáticas Dentro del grupo de la Proteína Tirosina Quinasa del Receptor (RPTK) son receptores para una serie de factores de crecimiento mitogénicos y metabólicos, incluyendo PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF Y subfamilias del receptor de insulina. Además, hay una gran familia de RPTK para la que el correspondiente ligando es desconocido. Los ligandos para RPTK incluyen pequeñas proteínas secretadas principalmente, pero también proteinas unidas a la membrana y de la matriz extracelular.
La activación de RPTK por ligandos implica la dimerización del receptor mediada por ligando, que da como resultado la transfosforilación de las subunidades del receptor y la activación de las tirosina quinasas citoplásmicas. Las tirosina quinasas citoplásmicas incluyen tirosina quinasas asociadas a receptores de la familia Src (p. ej., src, yes, Ick, Iyn, fyn) y proteínas tirosina quinasas no unidas a receptor y citosólicas, tales como la familia Jak, miembros de la cual median en la transducción de señales provocada por la superfamilia de receptores de citoquinas (p. ej., las interleucinas, interferones, GM-CSF, y Leptina)
Debido a la amplia gama de factores conocidos capaces de estimular la actividad tirosina quinasa, es de interés la identificación de si una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de la presente invención es capaz de activar las rutas de transducción de señales de tirosina quinasa. Por lo tanto, el siguiente protocolo está diseñado para identificar tales moléculas capaces de activar las rutas de transducción de señales de tirosina quinasa
Sembrar células diana (p. ej., queratinocitos prima rios) a una densidad de aproximadamente 25.000 células por pocillo en placas Loprodyne Silent Screen de 96 pocillos adquiridas a Nalge Nunc (Naperville, IL). Las placas se esterilizan con dos enjuagues de 30 minutos con etanol del 100%, se aclaran con agua y se secan durante la noche Algunas placas se recubren durante 2 h con 100 mL de colágeno de tipo I de grado de cultivo celular (50 mg/ml), gelatina (2%) o polilisina (SO mg/ml), todos los cuales pueden ser adquiridos de Sigma Chemicals (SI. Louis, MO) o Matrigel al 10% adquirido a Becton Dickinson (Bedford, MA), o suero de temera, se enjuagan con PBS y se almacenan a 4 grados Celsius. Se somete a ensayo el crecimiento celular en estas placas sembrando 5.000 células/pocillo en medio de crecimiento y cuantificando indirectamente el número de células a través del uso de azul Alamar como describe el fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) después de 48 hr. Se utilizan cubres de placas FalcOfl Núm. 3071 de Becton DickinsOfl (Bedford, MA) para cubrir las placas Loprodyne Silent Screen. También se pueden utilizar placas de cultivo celular Falcon Microtest 111 en algunos experimentos de proliferación
Para preparar los extractos, las células A431 se siembran en las membranas de nailon de placas Loprodyne (20 .000/200 ml/pocillo) y se cultivan durante la noche en medio completo. Las células se llevan aquiescencia mediante incubación en medio basal libre de suero durante 24 hr. Después del tratamiento de 5-20 minutos con EGF (60 ng/ml) o a diferentes concentraciones de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se retira el medio y se añaden a cada pocillo 100 mL de tampón de extracción «HEPES 20 mM pH 7,5, NaCI 0,15 M, Triton X-100 al 1%, SOS al 0,1%, NaN 04 2 mM, Na4P201 2 mM y un cóctel de inhibidores de proteasa (Núm. 1836170) obtenido de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN» y la placa se agita en un aparato de sacudimiento giratorio durante 5 minutos a 4quot;C. La placa se coloca a continuación en un colector de transferencia de vacio y el extracto se filtra a traves de los fondos de membrana de 0,45 mm de cada pocillos util izando vacío domestico. Los extractos se recogen en una placa de captura/análisis de 96 pocillos en la parte inferior del colector de vacío y se colocan inmediatamente en hielo. Para obtener extractos aclarados mediante centrifugación, se retira el contenido de cada pocillo, después de la solubilización con detergente durante 5 minutos, y se centrifuga durante 15 minutos a 4 grados Celsius a 16.000 x 9
Someter a ensayo los extractos filtrados para determinar los niveles de actividad de la lirosina quinasa. Aunque se conocen muchos métodos de detección de la actividad de la tirosina quinasa, se describe aqui un método
En general, la actividad de la quinasa de tirosina de una proteína de fusión de albúmina de la invención se evalúa mediante la determinación de su capacidad para fosforilar un residuo de tirosina en un sustrato específico (un peptido biotinilado). Los peptidos biolinilados que se pueden utilizar para este propósito incluyen PSKI (correspondiente a los aminoácidos 6-20 de la quinasa de división celular cdc2-p34) y PSK2 (correspondiente a los aminoácidos 1-17 de la gastrina). Ambos péptidos son sustratos para una variedad de tirosina quinasas y están disponibles de Boehringer Mannheim
La reacción de tirosina quinasa se establece mediante la adición de los siguientes componentes en orden. En primer lugar, añadir 10 IJI de Péptido Biotinilado 5 uM, a continuación, 10 ¡JI de ATP/Mg2' (ATP 5 mM! MgCI2 50 mM), a continuación 10 ¡JI de 5x Tampón de Análisis (hidrocloruro de imidazol 40 mM, pH 7,3, beta-glicerofosfato 40 mM, EGTA 1 mM, MgCI2 100 mM, MnCI2 5 mM, BSA de 0,5 mg/mL), a continuación 5 ¡JI de Vanadato de Sodio (1 mM), y después 5 IJI de agua. Mezclar los componentes suavemente y preincubar la mezcla de reacción a 30 grados Celsius durante 2 mino Iniciar la reacción mediante la adición de 10 IJI de la enzima de control o del sobrenadante filtrado.
La reacción de análisis de la ¡irosina quinasa se termina a continuación añadiendo 10 ¡JI de EDTA 120 mm y colocando las reacciones en hielo
La actividad lirosina quinasa se determina transfiriendo alícuotas de SO IJI de la mezcla de reacción a un módulo de placa de microtitulación (MTP) e incubando a 37 grados Celsius durante 20 mino Esto permite que la placa de 96 pocillos recubierta de estreptavidina se asocie con el peptido biotinilado. Lavar el módulo de MTP con 300 ¡Jl/pocillo de PBS cuatro veces. A continuación añadir 75 ~I de anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante (anti-P-Tyr-POD (0,5 Ulml)) a cada pocillo y e incubar a 37 grados Celsius durante una hora. Lavar el pocillo como antes.
A cootinuación añadir 100 ¡JI de solución de sustrato de peroxidasa (Boehringer Mannheim) e incubar a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos (hasta 30 minutos). Medir la absorbancia de la muestra a 405 nm mediante el uso de lector de ELlSA. El nivel de actividad peroxidasa unida se cuantifica utilizando un lector de ELlSA y refleja el nivel de actividad tirosina quinasa
Ejemplo 32: Análisis de identificación de la actividad de fosforilación
Como una altemativa potencial y/o complemento del análisis de la actividad de proteína tirosina quinasa descrito en el Ejemplo 31 , también se puede utilizar un análisis que detecta la activación (fosforilación) de los principales intermedios de transducción de señales intracelulares. Por ejemplo, como se describe a continuación un análisis concreto puede detectar la fosforilación de la tirosina de las quinasas Erk-l y Erk-2. Sin embargo, la fosforilación de otras moléculas, tales como Rat, JNK, p38 MAP, Map quinasa quinasas (MEK), MEK quinasa, Src, quinasa específica de Músculo (MuSK), IRAK, Tec y Janus, así como cualquier otra molécula de fosfoserina, fosfotirosina o fosfotreonina, se puede detectar mediante la sustitución de estas moléculas por Erk-1 o ERK-2 en el siguiente análisis.
En concreto, se preparan placas de análisis mediante el recubrimiento de los pocillos de una placa de 96 pocillos de ELlSA con 0,1 mL de proteína G (1 ~g/ml) durante 2 horas a temperatura ambiente, (RT). Las placas se adara n con PBS y se bloquean con BSA al 3%!PBS durante 1 hora a RT. Las placas de la proteína G se tratan a continuación con 2 anticuerpos monoclonales comerciales (10 ng/pocillo) contra Erk-l y Erk-2 (1 hora a RT) (Santa Cruz Biotechnology). (Para detectar otras moléculas, esta etapa se puede modificar fácilmente mediante la sustitución de un anticuerpo monoclonal que detecta cualquiera de las moléculas anteriormente descritas). Después de 3 a 5 lavados con PBS, las placas se almacenan a 4 grados Celsius hasta su uso.
Las células A431 se siembran a 20.000/pocillo en una placa filtrante de 96 pocillos LopfOdyne y se cultivan durante la noche en medio de crecimiento. Las células se mantienen a continuación en ayunas durante 48 horas en medio basal (DMEM) y después se tratan con EGF (6 ng/pocillo) o concentraciones variables de la proteína de fusión de la invención durante 5-2D minutos. Las células se solubilizan y se filtran los extractos directamente a la placa de análisis
Después de la incubación con el extracto durante 1 hora a temperatura ambiente, los pocillos se aclaran de nuevo. Como control positivo, se utiliza una preparación comercial de quinasa I'v1AP (Longlpocillo) en lugar de extracto de A431 Las placas se tratan a continuación con un anticuerpo policlonal comercial (de conejo) (1 ¡Jglml) que reconoce específicamente el epítopo fosforilado de las quinasas Erk-l y Erk-2 (1 hora a RT). Este anticuerpo se biotinila mediante procedimientos coovencionales. El anticuerpo policlonal unido se cuantifica a continuación mediante incubaciones sucesivas con reactivo potenciador de la fluorescencia de Europio-estreptavidina y Europio en el aparato Wallac DELFIA (fluorescencia resuelta en el tiempo). Una aumento de la señal fluorescente sobre el foodo indica una fosforilación por la proteina de fusión de la presente invención o una molécula inducida por una proteina de fusión de albúmina de la presente invención.
Ejemplo 33: Análisis de fosforilación
Con el fin de analizar la actividad de fosforilación de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se utiliza un análisis de fosforilación como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.958.405 (que se incorpora a la presente memoria como referencia). En pocas palabras, la actividad de fosfonlación puede medirse mediante fostonlación de un sustrato de proteína utilizando 32p_ATP marcado en gamma y cuantificación de la radiactividad incorporada utilizando un contador gamma de radioisótopos. La proteína de fusión de la invención se incuba con el sustrato de proteína, 32p_ATP, y un tampón de quinasa. El 32p incorporado al sustrato se separa a continuación del 32p_ATP libre mediante electroforesis y el 32p incorporado se cuenta y se compara con un control negativo. Los recuentos de radiactividad por encima del control negativo son indicativos de actividad de fosforitación de la proteina de fusión
Ejemplo 34: Detección de la actividad de fosforilación (activación) de una proteína de fusión de albúmina de la invención en presencia de ligandos polipeptídicos
Los métodos conocidos en la técnica o descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar la actividad de fosforilaciórJ de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Un método preferido para determinar la actividad de fosforilación es por medio del uso del análisis de fosforilación de tirosina como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. US 5.817.471 (que se incorpora a la presente memoria como referencia)
Ejemplo 35: Análisis para determinar la estimulación de la proliferación de células CD34+ de médula ósea
Este análisis se basa en la capacidad de CD34+ humanas para proliferar en presencia de factores de crecimiento hematopoyéticos y evalúa la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para estimular la proliferación de células CD34+.
Se ha demostrado previamente que los precursores más maduros responderán a solamente a una única señal. Los precursores más inmaduros requieren al menos dos señales para responder. Por lo tanto, para someter a ensayo el efecto de las proteínas de fusión de la invención sobre la actividad hematopoyética de una amplia variedad de células progenitoras, el análisis contiene una proteína de fusión dada de la invención en presencia o ausencia de factores de crecimiento hematopoyéticos. Las células aisladas se cultivan durante 5 días en presencia de Factor de Células Madre (SCF) combinado con la muestra analizada. El SCF solo tiene un efecto muy limitado sobre la proliferación de células de médula ósea (BM), actuando en tales condiciones sólo como un factor de ~supervivencia~. Sin embargo, combinado con cualquier factor que exhiba efecto estimulador en estas células (p. ej., IL.3), el SCF causará un efecto sinérgico. Por lo tanto, si la proteína de fusión sometida a ensayo tiene un efecto estimulador sobre los progenitores hematopoyéticos, tal actividad puede ser detectada fácilmente. Puesto que las células de BM normales tienen un bajo nivel de células en cido, es probable que cualquier efecto inhibidor de una proteína de fusión dada pudiera no ser detectado. En consecuencia, los análisis para determinar un efecto inhibidor sobre progenitores se someten a ensayo preferiblemente en células que se someten primero a la estimulación in vitro con SCF+IL+3, y después se ponen en contacto con el compuesto que se está evaluando para la inhibición de tal proliferación inducida.
En resumen, las células CD34+ se aíslan utilizando métodos conocidos en la técnica. Las células se descongelan y se resuspenden en medio (medio libre de suero QBSF 60 con L.glutamina al 1% (500 mi) Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD Núm. Cat. 160-204-101). Después de varias etapas de centrifugación suave a 200 xg, se dejan las células en reposo durante una hora. El recuento de células se ajusta a 2,5 x 10s células/mL. Durante este tiempo, se añaden 100 ¡.JI de agua estéril a los pocillos periféricos de una placa de 96 pocillos. La citoquina que se puede someter a ensayo con una proteína de fusión de albúmina de la invención en este análisis es rtJSCF (R & D Systems, Minneapolis, MN, Núm. Cat. 255-SC) a 50 ng/mL sola y combinada con rtJSCF y rhlL·3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, Núm. Cat. 203-ML) a 30 ng/mL. Después de una hora, se añaden 10 ¡JI de las citoquinas preparadas, concentraciones variables de una proteína de fusión de albúmina de la invención, y 20 ¡.JI de células diluidas al medio que ya está presente en los pocillos para permitir un volumen total final de 100 ¡JI. Las placas se colocan a continuación en una a 37quot;C/C02 al 5% durante cinco días
Dieciocho horas antes de cosechar el ensayo, se añaden 0,5 ¡JCi/pocillo de [3H]Timidina en un volumen de 10 ¡JI a cada pocillo para determinar la tasa de proliferación. El experimento se termina mediante la recolección de las células de cada placa de 96 pocillos en un Filtermat utilizando el Tomtec Harvester 96. Después de la cosecha, los Filtermat se secan, se cortan y se colocan en conjuntos OmniFilter que consisten en una placa OmniFilter y una bandeja OmniFilter. Se añaden 60 ¡.JI de Microscint a cada pocillo y la placa se sella con película de sellado a presión TopSeal-A. Se fija a la primera placa una etiqueta 15 de código de barras para el recuento. Las placas selladas se cargan y se determina el nivel de radiactividad mediante el Packard Top Count y los datos impresos se recogen para su análisis. El nivel de radioactividad refleja la cantidad de proliferación celular
Los estudios descritos en este ejemplo de ensayo de la actividad de una proteína de fusión dada para estimular la médula ósea la proliferación de células CD34+. Un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de proteínas y polinucleótidos de fusión de la invención (p. ej., terapia génica), así como agonistas y antagonistas de los mismos. La capacidad de una proteína de fusión de albúmina de la invención para estimular la proliferación de células CD34+ de la médula ósea indica que la proteína y/o el polinucleótido de fusión de albúmina que corresponden a la proteína de fusión son útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos que afectan el sistema inmunitario y la hematopoyesis. Los usos representativos se describen en las secciones de ~Actividad Inmunitaria~ y quot;Enfermedad infecciosa~ anteriores, yen otras partes de la presente memoria
Ejemplo 36: Análisis de la respuesta celular mejorada por la matriz extraeelular (RCMME)
El objetivo del análisis de respuesta celular mejorada por la matriz exlracelular (RCMME) es evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para actuar sobre las células madre hematopoyéticas en el contexto de la señal inducida por la matriz extracelular (MEC).
Las células responden a los factores reguladores en el contexto de la señal o señales recibidas desde el microentomo circundante. POf ejemplo, los fibroblastos y las células madre endoteliales y epiteliales dejan de replicarse en ausencia de señales de la MEC. Las células madre hematopoyéticas pueden experimentar autorenovación en la médula ósea, pero no en cultivo en suspensión in vitro. La capacidad de las células madre para experimentar auto-renovación in vitro depende de su interacción con las células del estroma y la proteína fibronectina de la MEC (fn). La adhesiÓn de las células a la fn está mediada por los receptores de integrina as.J3, y a.tJ31, que se expresan pOf las células madre hematopoyéticas humanas y de ratón. El factor o los factores que se integran con el entorno de la MEC y son responsables de la eslimulación de la autorrenovaciÓfl de las células madre aún no han sido identificados. El descubrimiento de estos factores debe ser de gran interés en aplicaciones de terapia génica y trasplante de médula ósea
En resumen, placas de 96 pocillos de poliestireno, sin tratamiento para cultivo de tejido, se recubren con el fragmento fn a una concentración de recubrimiento de 0,2 ~g/cm2. Se cultivan en placa célu las de médula ósea de ratón (1.000 células/pocillo) en 0,2 mL de medio libre de suero. Las células cultivadas en presencia de IL·3 (5 ng/ml)
+ SCF (50 ng/ml) servirla n como el control positivo, condiciones en las que se podrían esperar poca auto-renovación pero pronunciada diferenciación de las células madre. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se someten a ensayo con controles negativos apropiados en presencia y ausencia de SCF (5,0 ng/ml), donde el volumen de la composición administrada que contiene la proteína de fusión de albúmina de la invención representa 10% del volumen tota l de ensayo. Las células cultivadas en placa se dejan crecer a continuación mediante incubación en un entorno con poco oxígeno (5% de CO2, 7% O2, y 88% N2) en una incubadora para cultivo de tejidos durante 7 días. El número de células en proliferación dentro de los pocillos se cuantifica a continuación midiendo la incorporación de timidina al ADN celular. La verificación de los éxitos positivos en el análisis requerirá la caracterización fenotípica de las células, lo que se puede lograr aumentando a escala el sistema de cultivo y utilizando reactivos de anticuerpos apropiados contra los antígenos de la superficie celular y FACScan
Si se encuentra que una proteína de fusión concreta de la presente invención es un estimulador de los progenitores hematopoyéticos, la proteína de fusión y los polinucleótidos correspondientes a la proteína de fusión pueden ser útiles por ejemplo, en el diagnóstico y tratamiento de trastomos que afectan al sistema inmunitario y la hematopoyesis. Los usos representativos se describen en las secciones de ~Actividad Inmunitaria~ y ~Enfermedad Infecciosa~ anteriores, yen otras partes en la presente memoria. La proteína de fusión también puede ser útil en la expansión de células madre y progenitores comprometidos de diversas estirpes sanguíneas y en la diferenciación y/o proliferación de diversos tipos de células
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, también se pueden emplear para inhibir la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y por lo tanto se pueden emplear para proteger las células madre de la médula ósea de los agentes quimioterapéuticos durante la quimioterapia. Este efecto antiproliferativo puede permitir la administración de dosis mayores de agentes quimioterapéutícos y, por lo tanto, tratamiento quimioterapéutico más eficaz
Por otra parte, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden ser útiles para el tratamiento y diagnóstico de trastomos hematopoyéticos relacionados tales como, anemia, pancitopenia, leucopenia, trombocitopenia o leucemia, ya que las células estroma les son importantes en la producción de células de linajes hematopoyéticos. Los usos incluyen el cultivo de células de médula ósea ex vivo, el trasplante de médula ósea, la reconstitución de médula ósea, la radioterapia o la quimioterapia de la neoplasia.
Ejemplo 37: Proliferación de fibroblastos dérmicos y células de músculo liso aórtico humanos
Se añade una proteína de fusión de albúmina de la invención a cultivos de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHOF) y células de músculo liso aórtico humanas (AoSMC) y se realizan dos análisis simultáneos con cada muestra. El primer análisis examina el efecto de la proteína de fusión sobre la proliferación de los fibroblastos dérmicos humanos nonnales (NHDF) o las células del músculo liso aórtico (AoSMC). El crecimiento aberrante de fibroblastos o células del músculo liso es una parte de varios procesos patológicos, incluyendo la fibrosis, y la restenosis. El segundo análisis examina la producción de IL6 por NHDF y SMC. La producción de IL6 es una indicación de activación funciona l. Las células activadas habrán aumentado la producción de diversas citoquinas y otros factores, lo que puede dar lugar a un resultado proinflamatorio o inmunomodulador. Los análisis se realizan con y sin co-estimulación con TNFa, con el fin de comprobar la actividad co-estimuladora o inhibidora
En resumen, el día 1, placas de 96 pocillos de color negro se disponen con 1000 células/pocillo (NHDF) o 2000 células/pocillo (AoSMC) en medios de cultivo de 100 ~I. El medio de cultivo NHOF contiene: medio basal FB Clonetics, 1 mg/mL de hFGF, 5 mg/mL de insulina, 50 mg/mL de gentamicina, FBS al 2%, mientras que los medios de cultivo AoSMC contiene medio basal SM Clonetics, 0,5!JgfmL de hEGF, 5 mgfmL de insulina, 1 !Jg/mL de hFGF, 50 mg/mL de gentamicina, 50 ~gfmL de Anfotericina B, FBS al 5%. Después de la incubación a 3rC durante al menos 4-5 horas los medios de cultivo se aspiran y se reemplazan por medio de detención del crecimiento. Los medios de detención del crecimiento para NHDF contienen medio basal de fibroblastos, 50 mg/mL de gentamicina, FBS al 2%, mientras que los medios para la detención del crecimiento para AoSMC contienen medio basal SM, 50 mg/mL de gentamicina, 50 ~g/mL de Anfotericina B, FBS al 0,4%. Se incuba a 3rC hasta el día 2.
El día 2, se diseñan diluciones seriadas y moldes de una proteína de fusión de albúmina de la invención de manera que siempre incluyan controles de medios y controles de proteína conocida. Para ambos experimentos de estimulación e inhibición, las proteínas se diluyen en medios de detención del crecimiento. Para los experimentos de inhibición, se añade TNFa a una concentración final de 2 ng/mL (NHDF) 05 ng/mL (AoSMC). Añadir controles que contienen 1/3 de vol de medio o una proteína de fusión de albúmina de la invención e incubar a 37 9rados Celsius/5% de CO 2 hasta el día 5.
Transferir 60 !JI de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos marcada, cubierta con un sellador de placas, y almacenar a 4quot;C hasta el Día 6 (para ELlSA de IL-6). A los 100 !JI restantes de la placa de cultivo celular, añadir aséptica mente Azul Alamar en una cantidad igual al 10% del volumen de cultivo (10 !JI). Devolver placas a la incubadora durante 3 a 4 horas. A continuación, medir la fluorescencia con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm utilizando CytoFluor.
Esto produce los datos de estimulación/inhibición del crecimiento.
El día 5, se lleva a cabo el ELlSA para IL6 recubriendo una placa de 96 pocillos con 50 a 100 ~I/pocillo de anticuerpo mOllOclonal anti-IL6 humana diluido en PBS, pH 7,4, incubar ON a temperatura ambiente
El dia 6, vaciar los platos en el fregadero y secar con papel absorbente. Preparar Tampón de Ensayo que contiene PBS con BSA al 4%. Bloquear las placas con 200 ¡JI/pocillo de tampón de bloqueo Pierce Super Block en PBS durante 1-2 horas y a continuación lavar las placas con tampón de lavado (PBS, Tween-20 al 0,05%). Secar la placas sobre papel absorbente. A continuación, añadir 50 ~lfpocillo de anticuerpo marcado con Biotina monoclonal Anti-IL-6 humana diluido, en 0,50 mg/mL. Preparar diluciones de partida de IL-6 en los medios (30, 10, 3, 1, 0,3, O ng/ml). Añadir muestras por duplicado a la fila superior de la placa. Cubrir las placas e incubar durante 2 horas a RT en un agitador.
Las placas se lavan con tampón de lavado y se transfieren a papel absorbente. Diluir la estreptavidina marcada con EU 1 :1000 en Tampón de análisis, y añadir 100 ¡Jl/pocillo. Cubrir la placa e incubar 1 hora a RT. Las placas se lavan de nuevo con tampón de lavado y se transfieren a papel absorbente
Añadir 100 ¡JI/pocillo de Solución de Mejora. Agitar durante 5 minutos. Leer la placa en el Fluorómetro DELFIA Wallac. Las lecturas de las muestras por triplicado en cada análisis se tabulan y se promedian.
Un resultado positivo en este análisis sugiere la proliferación de células AoSMC y que la proteína de fusión de albúmina puede estar implicada en la proliferación de fibroblastos dérmicos y/o la proliferación de células del músculo liso. Un resultado positivo también sugiere muchos usos potenciales de la proteína y polinucleótidos de fusión que codifican la proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, la inflamación y la respuesta inmunitaria, la curación de heridas y la angiogénesis, como se detalla a lo largo de esta memoria descriptiva. En particular, las proteínas de fusión se pueden utilizar en la cicatrización de heridas y la regeneración dérmica, así como la promoción de la vasculogénesis, tanto de vasos sanguíneos como linfáticos. El crecimiento de los vasos puede ser utilizado en el tratamiento de, por ejemplo, las enfermedades cardiovasculares. Además, las proteinas de fusión que muestran actividad antagónica en este análisis pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastomos y/o afecciones que implican angiogénesis, actuando como un agente anti-vascular (p. ej., anti-angiogénesis). Estas enfermedades, trastornos y/o afecciones son conocidos en la técnica y/o se describen en la presente memoria, tal como, por ejemplo, tumores malignos, tumores sólidos, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piógenos; placas arterioscleróticas; enfermedades oculares angiogénicas, por ejemplo, retinopatia diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de cómea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y pterigión (crecimiento anormal de los vasos sanguíneos) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatrización de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de extremidades isquémicas; Síndrome de Qsier-Webber; neovascularización de la placa; telangiectasia; articulaciones hemofilicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis. Por otra parte, las proteínas de fusión de albúmina que actúan como antagonistas en este análisis pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades antihiperpmliferativas ylo anti-inflamatorias conocidas en la técnica ylo descritas en la presente memoria
Ejemplo 38: Expresión de moléculas de adherencia celular (CAM) en células endoteliales
El reclutamiento de linfocitos a las áreas de inflamación y angiogénesis implica interacciones receptor-ligando específicas entre moléculas de adherencia de la superficie celular (CAM) en los linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adherencia, tanto en entomos normales como patológicos, sigue una cascada de múltiples etapas que implica la expresión de la molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1), la molécula de adherencia celular vascular 1 (VCAM-I), y la molécula de adherencia leucocitaria al endotelio 1 (E-selectina) en las células endoteliales (EC). La expresión de estas moléculas y otras en el endotelio vascular determina la eficacia con que los leucocitos se pueden adherir a la vasculatura local y extravasarse al tejido local durante el desarrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citoquinas y factor de crecimiento participan en la modulación de la expresión de estas CAM.
Brevemente, las células endoteliales (p. ej., células Endoteliales de Vena Umbilical Humana (HUVEC) se cultivan en una placa convencional de 96 pocillos hasta la confluencia, el medio de cultivo se retira de las células y se reemplaza por 100 ¡JI de Medio 199 (suero bovino fetal (FBS) al 10%). Las muestras para el ensayo (que contiene una proteina de fusión de albúmina de la invención) y los controles positivos o negativos se agregan a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 ¡JI). Las placas se incuban a 37quot;C, ya sea durante 5 h (expresión de selectina e inlegrina) o 24 h (expresión de integrina solamente). Las placas se aspiran para eliminar el medio y se añade a cada pocillo 100 ~I de paraformaldehído al O,1%-PBS (con Caquot; y MgH ). Las placas se mantienen a 4Q C durante 30 mino El fijador se elimina de los pocillos y los pocillos se lavan 1X con PBS (+Ca,Mg) + BSA al 0,5% y se drenan. Se añaden a los pocillos de ensayo y de control 10 ¡JI de anticuerpo primario diluido. Se utilizan anti-ICAM-1-Biotina, anti-VCAM-1-Biotina y Anti-E-selectina-Biotina a una concentración de 10 ~g/mL (dilución 1:10 de anticuerpo de partida de 0,1 mg/mL). Las células se incuban a 37quot;C durante 30 mino en un ambiente humidificado. Los pocillos se lavan tres veces con PBS (+Ca,Mg) + 0,5% de BSA. Se añaden a cada pocillo 20 ¡JI de ExtrAvidin-fosfatasa alca lina diluida (diluciÓfl 1 :5000, referida en la presente memoria como dilución de trabajo) y se incuban a 3rC durante 30
min_Los pocillos se lavan tres veces con PBS (+Ca,Mg) + BSA al 0,5%_Se disuelve 1 comprimido de fosfato pnilrofenol pNPP por cada 5 mL de tampón de glicina (pH 10,4). Se añaden a cada pocillo de ensayo 100 !JI de sustrato pNPP en tampón glicina. Se preparan pocillos convencionales, por t~licadOl a pa':tir de la d ilución de trabajo de la ExtrAvidin-fosfatasa alca lina en tampón de glicina: 1:5000 (10°» 10 .5 gt; 10· gt; 10. 15. Se añaden 51J1 de cada dilución a pocillos por triplicado y el cootenido de AP resultante en cada pocillo es 5,50 quot;9, 1,74 n9, 0,55 ng, 0,18 ng_A continuación se añaden 100 !JI de reactivo pNNP a cada uno de los pocillos convencionales. La placa se incuba a 3rC durante 4 h. Se añade un volumen de 50 1-11de NaOH 3M a todos los pocillos. La placa se lee en un lector de placas a 405 nm utilizando la opción de sustracción del fondo de los pocillos del blanco cargados solo con tampón de glicina. Además, se ajusta el molde para indicar la concentración de producto conjugado de AP en cada pocillo convencional [5.50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng] . Los resultados se indican como cantidad de producto conjugado de AP unido en cada muestra
Ejemplo 39: Análisis de proliferación de células endoteliales con Azul Alamar
Este análisis se puede utilizar para determinar cuantitativamente la inhibición mediada por proteína de la proliferación de Células Endoteliales Linfáticas Bovinas (LEC), Células Endoteliales Aórticas Bovinas (BAEC) o Células Miometriales Uterinas Microvasculares Humanas (UTMEC) inducida por bFGF. Este análisis incorpora un indicador de crecimiento fluorométrico basado en la detección de la actividad metabólica. Se prepara un análisis de proliferación con Azul Alamar convencional en EGM-2MV con 10 ngfmL de bFGF añadido como una fuente de estimulación de las células endoteliales_ Este análisis se puede usar con una variedad de células endoteliales con ligeros cambios en el medio de crecimiento y la concentración celular. Las diluciones de los lotes de proteína que se van a someter a ensayo se diluyen según sea apropiado. Se utiliza medio libre de suero (GIBCO SFM) sin bFGF como control no estimulado y se incluyen angiostatina o TSP-I como controles inhibidores conocidos.
En resumen, se siembran LEC, BAEC o UTMEC en medio de cultivo a una densidad de 5.000 a 2.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se dejó a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación durante la noche de las células, el medio de crecimiento se retira y se reemplaza por EC-SFM GIBCO. Las células se tratan con las diluciones apropiadas de una proteina de fusión de albúmina de la invención o una o varias muestras de proteína de control (preparadas en SFM) en pocillos por triplicado con bFGF adicional a una concentración de 10 ng/mL Una vez que las células han sido tratadas con las muestras, la placa o placas es/son colocadas de nuevo en la incubadora a 37°C durante tres días. Después de tres días se añaden 10 mL de azul alamar de partida (Biosource Núm. Cal. DAL 1100) a cada pocillo y la placa o las placas esfson colocadas de nuevo en la incubadora a 3rC durante cuatro horas. La placa o las placas se leen a continuación en 530 nm de excitación y 590 nm de emisión utilizando el lector de fluorescencia CyloFluor. La salida directa se registra en unidades de fluorescencia relativa.
El azul Alamar es un indicador de oxidación-reducción que emite fluorescencia y cambia de color en respuesta a la reducción química del medio de crecimiento resultante del crecimiento celular. A medida que las células crecen en cultivo, la actividad metabólica innata da como resultado una reducción química del entorno circundante inmediato. La reducción relacionada con el crecimiento hace que el indicador cambie de la forma oxidada (azul no fluorescente) a la forma reducida (rojo fluorescente) (es decir, la proliferación estimulada producirá una señal más fuerte y la proliferación inhibida producirá una señal más débil y la señal total es proporcional al número total de células, asi como a su actividad metabólica). El nivel de fondo de la actividad se observa con el medio en condiciones de privación de nutrientes. Esto se compara con la salida observada de las muestras de control positivas (bFGF en el medio de crecimiento) y las diluciones de proteina
Ejemplo 40: Detección de la inhibición de una reacción mixta de linfocitos
Este amilisis se puede usar para detectar y evaluar la inhibición de una Reacción Mixta de Linfocitos (MLR) por las proteínas de fusión de la invención. La inhibición de una MLR puede ser debida a un efecto directo sobre la proliferación y la viabilidad celular, la modulación de moléculas coestimuladoras en las células que interactúan, la modulación de adherencia entre linfocitos y células accesorias, o la modulación de la producción de citoquinas por las células accesorias. Múltiples células pueden ser la diana de las proteínas de fusión de albúmina que inhiben la MLR ya que la fracción mononuclear de sangre periférica utilizada en este análisis incluye linfocitos T, B y asesinos naturales, así como monocitos y células dendríticas.
Las protefnas de fusión de albúmina de la invención que se ha encontrado que inhiben la MLR pueden encontrar aplicación en enfermedades asociadas con la activación o proliferación de linfocitos y monocitos. Estas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades tales como asma, artritis, diabetes, afecciones inflamatorias de la piel, psoriasis, eczema, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis jJlcerosa, arteriosclerosis, cirrosis, enfermedad de injerto contra anfitrión, enfermedad de anfitrión contra injerto, hepatitis, leucemia y linfoma.
En resumen, las PBMC de donantes humanos se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Medio de Separación de Linfocitos (LS~. densidad 1,0770 g/mL, Organon Teknika Corporation, West Chester, PAlo Las PBMC de dos donantes se ajustan a 2 x 106 célulaslmL en RPMI-1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) con un suplemento de FCS al 10% y glutamina 2 mM. Las PBMC de un tercer donante se ajustan a 2 x 10~ célulaslmL. Se añaden 50 ¡JI de PBMC de cada donante a los pocillos de una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos. Se añaden diluciones de la sustancia de ensayo proteína de fusión (50 ¡JI) por triplicado a pocillos de microtitulaci6n. Se añaden muestras de ensayo (de la proteina de interés) para la dilución final de 1 :4; se añade rhulL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, número de catálogo 202-IL) a una concentración final de 1 ¡JglmL; anti-C04 mAb (R&D Systems, clon 34930.11, número de catálogo MAB379) a una concentración final de 10 ¡Jg/mL. Las célu las se cultivan durante 7-8 días a 3rC en C02 al 5%, y se añade 1 ¡JC de CHjtimidina a los pocillos durante las últimas 16 horas de cultivo. Las células se recogen y se determina la incorporación de timidina utilizando un Packard TopCounL Los datos se expresan como la media y la desviación típica de determinaciones por triplicado
Las muestras de la proteína de fusión de interés se escrutan en experimentos separados y se comparan con el tratamiento de control negativo, mAb anti-C04, que inhibe la proliferación de linfocitos y el tratamiento de control positivo, IL-2 (ya sea como sustancia recombinante o sobrenadante), lo que aumenta la proliferación de linfocitos
Ejemplo 41: Análisis para determinar la actividad proteasa
El siguiente análisis se puede utilizar para evaluar la actividad proteasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Se realizó una zimografía de gelatina y caseína esencialmente como se ha descrito (Heusen et al., Anal. Biochem., 102:196-202 (1980); Wilson et al., Joumal of Urology, 149:653-658 (1993)). Las muestras se ejecutan en geles de poliacrilamida al 10%/SOS al 0,1% que contienen gelatina o caseína al 1%, empapados en Triton al 2,5% a temperatura ambiente durante 1 hora y, en glicina 0,1 M, pH 8,3 a 3rC durante 5 a 16 horas. Después de la tinción con negro amido aparecen zonas de proteolisis en forma de zonas daras frente al fondo de color azul -negro. La tripsina (Sigma T8642) se utiliza como control positivo.
La actividad proteasa se determina también mediante el control de la escisión de éster etílico de n-a-benzoil-Larginina (BAEE) (Sigma B-4500). Las reacciones se establecieron en (NaP04 25 mM, EDTA 1 mM, y BAEE 1 mM), pH 7,5. Se añaden las muestras y el cambio en la absorbancia a 260 nm se controla en el espectrofotémetro Beckman OU-6 en el modo accionado por tiempo. La tripsina se utiliza como control positivo
Los análisis adicionales en base a la liberación de péptidos solubles en ácido a partir de caseína o hemoglobina medida como la absOfbancia a 280 nm o calorimétrica mente utilizando el método de Fa lin se llevan a cabo como describen Bergmeyer, et al., en Methods of Enzymatic Analysis, 5 (1984). Otros análisis implican la solubilización de sustratos cromogénicos (Ward, Applied Science, 251 -317 (1983))
Ejemplo 42: Identificación de la especificidad de sustrato de la serina proteasa
Los métodos conocidos en la técnica o descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar la especificidad de sustrato de las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención que tienen actividad serina proteasa. Un método preferido para la determinación de la especificidad de sustrato es mediante el uso de bibliotecas combinatorias sintéticas de barrido posicional como se describe en el documento GB 2 324 529 (incorporado a la presente memoria en su totalidad) .
Ejemplo 43: Análisis de unión al ligando
El siguiente análisis se puede utilizar para evaluar la actividad de unión al ligando de una proteína de fusión de albúmina de la invención
Los análisis de unión a ligando proporcionan un método directo para determinar la farmacologia del receptor y son adaptables a un formato de alto rendimiento. El ligando pu rificado de una proteína de fusión de albúmina de la invención está radiomarcado con alta actividad especifica (50-2000 Ci/mmol) para los estudios de unión. A continuación se realiza la determinación de que el procedimiento de radiomarcaje no disminuye la actividad del ligando hacia la proteina de fusión. Las condiciones de análisis para tampones, iones, el pH y otros moduladores tales como nucleótidos se optimizan para establecer una señal viable con respecto a la proporción de ruido para fuentes de polipéptidos tanto de membrana como de células completas. Para estos análisis, la unión del polipéptido específico se define como la radiactividad total asociada menos la radioactividad medida en presencia de un exceso de ligando competitivo no marcado. Siempre que sea posible, se utiliza más de un ligando competitivo para definir la unión no especifica residual
Ejemplo 44: Análisis funcional en ovocitos de Xenopus
Se sintetizan in vitro transcritos de ARN protegidos terminalmente a parlir de moldes de plásmido linealizado que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención con ARN polimerasas de acuerdo con procedimientos convencionales. Los transcritos in vitro se suspenden en agua a una concentración final de 0,2 mg/mi. Los lóbulos ováricos se retiran de sapos hembra adultos, se obtienen ovocitos desfoliculados en Fase V, y los transcritos de ARN (10 ngfoocito) se inyectan en un bolo de 50 ni utilizando un aparato de microinyección. Se una abrazadera de voltaje con dos electrodos para medir las corrientes desde los ovocitos de Xenopus individuales en respuesta a la exposiciórJ a la proteína de fusión y al agonista polipeptídico. Las grabaciones se realizan en medio de Barth libre de Ca2• a temperatura ambiente. El sistema de Xenopus se puede usar para escrutar ligandos conocidos y extractos de tejidofcélula para la activación de ligandos
Ejemplo 45: Análisis microfisiométricos
La activación de una amplia variedad de sistemas de mensajero secundario da como resultado la extrusión de pequeñas cantidades de ácido desde una célula. El ácido formado es en gran parte como resultado de la mayor actividad metabólica necesaria para alimentar el proceso de seña lización intracelular. Los cambios de pH en el medio que rodea la célula son muy pequeños pero son detectables por el microfisiómetro CYTOSENSOR (Molecular Devices Ud., Menlo Palilt;, Calif.). El CYTOSENSOR es por lo tanto capaz de detectar la capacidad de una proteína de fusión de albúmina de la invención para activar mensajeros secundarios que se acoplan a una energía que utiliza la ruta de señalización intracelular.
Ejemplo 46: Escrutinio del extracto/sobrenadante celufar
Existe un gran número de receptores de mamíferos para los queda, todavía, ligando activador no cognado (agonista). Por lo tanto, los ligandos activos para estos receptores pueden no estar incluidos dentro de los bancos de ligandos identificados hasta la fecha. Por consiguiente, las proteinas de fusión de albúmina de la invención también se pueden seleccionar funcionalmente (utilizando calcio, AMPc, microfisiómetro, electrofisiología de ovocitos, etc., escrutinios) en contra de los extractos de tejido para identificar ligandos naturales para la porción de proteína terapéutica yfo la porción de la proteína albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los extractos que producen respuestas funcionales positivas se pueden subfraccionar sucesivamente hasta que se aísla e identifica un ligando de activación
Ejemplo 47: Análisis de unión a ATP
El siguiente análisis se puede utilizar para evaluar la actividad de unión a ATP de las proteínas de fusión de la invención
La actividad de unión a ATP de una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede detectar utilizando el análisis de unión a ATP descrito en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.858.719, que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad. En pocas palabras, la unión a ATP de una proteína de fusión de albúmina de la invención se mide a través de marcaje de fotoafinidad con 8-azido-ATP en un análisis de competición. Las mezclas de reacción que contienen 1 mg/mL de proteína de transporte ABC se incuban con diferentes concentraciones de ATP, o el análogo no hidrolizable de ATP adenil-5'-imidodifosfato durante 10 minutos a 4Q C. Se añade una mezcla de 8-azido-ATP (Sigma Chem. Corp., SI. Louis, MO.) más 8-azido-ATP (32p_ATP) (5 mCi/mmol, ICN, Irvine CA.) a una concentración final de 100 mM y se colocan alícuotas de 0,5 mL en los pocillos de una placa de toque de porcelana sobre hielo. La placa se irradia utilizando una lámpara UV a 254 nm de onda corta a una distancia de 2,5 cm desde la placa durante dos intervalos de un minuto, intercalando intervalos de enfriamiento de un minuto. La reacción se detuvo mediante adición de ditiotreitol a una concentración final 2 mM. Las incubaciones se someten a electroforesis en SDS-PAGE, se secan, y se autorradiografian. Las bandas de proteína correspondientes a las proteínas de fusión de albúmina de la invención se escinden, y se cuantifica la radiactividad. Una disminución de la radiactividad con aumento de ATP o de adenil-5'-imidodifosfato proporciona una medida de la afinidad ATP por la proteína de fusión.
Ejemplo 48: Identificación de proteinas de transducción de señales que interactuan con una proteina de fusión de albúmina de la presente invención
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden servir como herramientas de investigación para la identificación, caracterización y purificación de proteínas de la ruta de transducción de señales o proteínas receptoras. En resumen, una proteína de fusión marcada de la invención es útil como un reactivo para la purificación de moléculas con las que interactúa. En una realización de purificación por afinidad, una proteína de fusión de albúmina de la invención se acopla covalentemente a una columna de cromatografía. El extracto sin células derivado de las supuestas células diana, tales como tejidos de carcinoma, se hace pasar sobre la columna, y las moléculas con afinidad adecuada se unen a la proteina de fusión de albúmina. El complejo de la proteína se recupera de la columna, se disocia, y la molécula recuperada se somete a secuenciaci6n de proteínas N-terminal. Esta secuencia de aminoácidos se utiliza a continuación para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados para la clonación del gen relevante a partir de una biblioteca de ADNc apropiada.
Ejemplo 49: Bioanálisis de IL-6
Una variedad de análisis son conocidos en la técnica para someter a ensayo los efectos proliferativos de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Por ejemplo, uno de tales análisis es el 8ioanálisis de IL-6 como describen Marz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 95:3251-56 (1998), que se incorpora a la presente memoria como referencia). Después de 68 horas a 3rC, el número de células viables se mide mediante la adición de la sal de tetrazolio azul de tiazoli lo (MTI) y la incubación durante otras 4 horas a 3rC. Las células 89 se lisan mediante SOS y la densidad óptica se mide a 570 nm. Se utilizan controles que contienen IL-6 (positivo) y sin citoquina (negativo). En resumen, células murinas 89 dependientes de IL-6 se lavan tres veces en medio libre de IL-6 y se siembran a una concentración de 5.000 células pOf pocillo en 50 ~I , Y se añaden 50 ~I de proteína de fusión de la
invención. El aumento de proliferación en la muestra o muestras de ensayo (que contienen una proteina de fusión de albúmina de la invención) en relación con el control negativo es indicativo de efectos pro liferativos mediados por la proteína de fusión
Ejemplo 50: Ayuda a la supelVivencia de neuronas de embrión de pollo
Para probar si la viabilidad de las células neuronales simpáticas se apoya en una proteína de fusión de albúmina de la invención, se puede utilizar el análisis de supervivencia neuronal de embrión de pollo de Senaldi et al (Proc. NatJ. Acad. Sci., U.S.A., 96:11458-63 (1998), que se incorpora a la presente memoria como referencia). En pocas palabras, neuronas motoras y simpáticas se aíslan a partir de embriones de pollo, se resuspenden en medio L 15 (con FeS al 10%, glucosa, selenito de sodio, progesterona, conalbúmina, putrescina, e insulina; Life Technologies, Rockville, MO.) y medio de Eagle modificado por Oulbecco [con FCS al 10%, glutamina, penicilina, y tampón Hepes 25 mM (pH 7,2); Life Technologies, Rockville, MO.), respectivamente, y se incuban a 3rC en COl al 5% en presencia de diferentes concentraciones de la proteína de fusión purificada de la invención, así como de un control negativo carente de cualquier citoquina. Después de 3 días, la supervivencia neuronal se determina mediante evaluación de la morfología celular, y mediante el uso del análisis colorimétrico de Mosmann (Mosmann, T., J. Immunol Methods, 65:55-63 (1983)). El aumento de la viabilidad celular neuronal en comparación con los controles que carecen de citoquina es indicativo de la capacidad de la proteína de fusión de albúmina para mejorar la supervivencia de las células neuronales
Ejemplo 51: Análisis de la actividad fosfatasa
El siguiente análisis se puede usar para evaluar la actividad serinaftreonina fosfatasa (PTPasa) de una proteína de fusión de albúmina de la invención
Con el fin de analizar la actividad serinaltreonina fosfatasa (PTPasa), se pueden utilizar análisis que son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la actividad serinaltreonina fosfatasa (PSPasa) de una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede medir utilizando un kit de ensayo PSPasa de New England Biolabs, Inc. La proteína básica de mielina (MyBP), un sustrato para la PSPasa;;l se fosforila los r esiduos de senna y treonlna con la Proteína QUlnasa dependiente de AMPc en presencia de 3 [P]ATP. La actividad de la proteína serinaftreonina fosfatasa se determina a continuación mediante la medición de la liberación de fosfato inOfgánico a partir MyBP marcada con 32P
Ejemplo 52: Interacción de serina/treonina fosfatasas con otras proteínas
Las proteínas de fusión de la invención que tienen actividad serinaflreonina fosfatasa (p ej., según se determina en el Ejemplo 51) son útiles, por ejemplo, como herramientas de investigación para la identificación, caracterización y purificación de proteínas de interacción o proteínas receptoras adicionales, u otra proteínas de la ruta de transducción de señales. En resumen, una proteina de fusión marcada de la invención es útil como un reactivo para la purificación de moléculas con las que interactúa. En una realización de purificación por afinidad, una proteína de fusión de albúmina de la invención se acopla covalentemente a una columna de cromatografía. El extracto libre de células derivado de las supuestas células diana, tales como células neuronales o del hígado, se hace pasar sobre la columna, y las moléculas con afinidad adecuada se unen a la proteína de fusión. El complejo de proteína de fusión se recupera de la columna, se disocia, y la molécula recuperada se somete a secuenciación de la proteína Nterminal. Esta secuencia de aminoácidos se utiliza después para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados para la clonación del gen relevante a partir de una biblioteca de ADNc apropiada.
Ejemplo 53: Análisis de la actividad heparanasa
Existen numerosos análisis conocidos en la técnica que se puede emplear para someter a ensayo la actividad heparanasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención. En un ejemplo, la actividad heparanasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención se somete a ensayo como describen Vlodavsky et al., (VlocIavsky et al., Nat. Med., 5:793-802 (1999)). En resumen, los productos lisados celulares, el medio acondicionado, las células intactas (1 x 106 células por placa de 35 mm), el sobrenadante de cultivo celular, o la proteína de fusión purificada se incuban durante 18 horas a 3rC, pH 6,2 a 6,6, con MEC marcada con 35S_ o MEC soluble derivada del pico I proteoglicanos. El medio de incubación se centrifuga y el sobrenadante se analiza mediante filtración en gel en una columna de Sefarosa CL-6B (0,9 x 30 cm). Las fracciones se eluyen con PBS y se mide su radiactividad. Los fragmentos de degradación de las cadenas laterales de sulfato de heparán se hacen eluir en Sefarosa 6B en 0,5
lt;K.v lt; 0,8 (pico 11). Cada experimento se realiza al menos tres veces. Los fragmentos de degradación correspondientes al ~pico II~, como describen por Vlodavsky et al., son indicativos de la actividad de una proteína de fusión de albúmina de la invención en la escisión de heparán sulfato
Ejemplo 54: Inmovifización de biomo/éculas
Este ejemplo proporciona un método para la estabilización de una proteína de fusión de albúmina de la invención en constuctos de bicapa lipídica de células no anfitrionas celular (véase, por ejemplo, Bieri et al., Nature Biotech 17:1105-1108 (1999), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad ) que puede ser
adaptado para el estudio de proteínas de fusión de la invención en los diversos análisis funcionales descritos anteriormente. En resumen, la química de carbohidratos especifica para biotinilación se utiliza para confinar una etiqueta de biotina a una proteína de fusión de albúmina de la invención, permitiendo de este modo la orientación uniforme después de la inmovilización. Una solución 50 uM de una proteína de fusión de albúmina de la invención en membranas lavadas se incuba con Nal04 20 mM y 1,5 mgfmL (4 mM) de BACH o 2 mgfmL (7,5 mM) de biotinahidrazida durante 1 hora a temperatura ambiente (volumen de reacción , 150 ¡JI). A continuación, la muestra se somete a diálisis (Pieree Slidealizer Cassett, corte a 10 kOa; Pierce Chemical Co., Rockford IL) a 4Q C primero durante 5 h, cambiando el tampón después de cada ho ra, y finalmente durante 12 h contra sao mL de tampón R (NaCI 0,15 M, MgCI2 1 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 7). Inmediatamente antes de la adición a una cubeta, la muestra se diluyó 1:5 en tampón ROGSO (Buffer R con un suplemento de octilgluc6sido 50 mM).
Ejemplo 55: Anáfisis para determinar la actividad metaloproteinasa
Las metaloproteinasas son hidrolasas peptidicas que utilizan iones metálicos, tales como Zn2+, como mecanismo catalítico. La actividad metaloproteinasa de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se puede someter a ensayo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Se proporcionan los siguientes métodos
ilustrativos ·
Proteólisis de la alfa-2-macroglobulina
Para confirmar la actividad proteasa, una proteína de fusión purificada de la invención se mezcla con el sustrato de alfa-2-macroglobulina (0,2 unidad/mL; Boehringer Mannheim, Alemania) en tampón de análisis 1x (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCI 0,2 M, CaCI¡ 10 mM, ZnCI2 25 mM y Brij-35 al 0,05%) y se incuba a 3rC durante 1-5 días. La tripsina se utiliza como control positivo. Los controles negativos solo contienen alfa-2-macroglobulina en tampón de análisis Las muestras se recogen y se hierven en tampÓfl de muestra de SOS-PAGE que contiene 2-mercaptoetanol al 5% durante 5 min, a continuación se cargan en gel de SOS-poliacrilamida al 8%. Después de la electroforesis, las proteínas se visualizan mediante tinción con plata. La proteólisis es evidente por la aparición de bandas de peso molecular inferior en comparación con el control negativo
Inhibición de la proteolisis de alfa-2-macrogfobulina por los inhibidores de las metafoproteinasas
También se pueden utilizar inhibidores de metaloproteinasas conocidos (quelantes de metales (EOTA, EGTA, y HgCI2), inhibidores de péptidos de la metaloproteinasa (TIMP-I y TEV1P-2), e inhibidores de MMP de molécula pequeña comerciales) para caracterizar la actividad proteolítica de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Tres inhibidores de MMP sintéticos que se pueden utilizar son: inhibidOf I de MMP, [CI 50 = 1,0 ¡.1M contra MMP-1 y MMP-8; CI 50 = 30 ¡JM contra MMP-9; CI50 = 150 ¡JM contra MMP-3]; inhibidor I MMP-3 (estromelisina-1) [Clso = 5 M contra MMP-3], e inhibidor 11 de MMP-3 [K.¡ = 130 nM contra MMP-3]; inhibidores disponibles de Calbiochem, Núm. de catálogo 444250, 444218, Y 444225, respectivamente). En pocas palabras, se mezclan diferentes concentraciones de los inhibidores de MMP de molécula pequeña con una proteína de fusión purificada de la invención (50 ¡Jg/ml) en 22,9 ¡JI de tampón de 1x HEPES (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCI 0,2 M, CaCI 2 10 mM, ZnCI2 25 ¡JM Y Brij-35 al 0,05%) y se incuban a temperatura ambiente (24QC) durante 2 horas, a continuación, se añaden 7,1 ¡JI de sustrato de alfa-2-macroglobulina (0,2 unidades/mi) y se incuban a 3rC durante 20 horas. Las reacciones se detienen med iante la ad ición de tampón de muestra 4x y se hierven inmediatamente durante 5 minutos. Después de la SOS-PAGE, las bandas de proteina se visualizan mediante tinción de plata
Análisis de escisión de sustratos peptídicos ffuorogénicos sintéticos
La especificidad de sustrato para las proteínas de fusión de la invención con actividad metaloproteinasa demostrada puede determinarse utilizando mecanismos conocidos en la técnica, tales como el uso de sustratos peptidicos fluorogénicos sintéticos (adquiridos de Bachem Bioscience Inc). Los sustratos de ensayo incluyen, M-1985, M-2225, M-2105, M-2110 Y M-2255. Los cuatro primeros son sustratos de MMP y el último es un sustrato de la enzima de conversión de factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) (TACE). Estos sustratos se preparan preferiblemente en dimetil sulfóxido 1:1 (OMSO) yagua. Las soluciones de partida son 50-500 mM. Los análisis fluorescentes se llevan a cabo mediante el uso de un espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS 50B equipado con un baño de agua a temperatura constante . La quot;A de excitación es a 328 nm y la quot;A de emisión es a 393 nm. En resumen, el análisis se lleva a cabo incubando 176 ¡JI de tampón de 1x HEPES (NaCI 0,2 M, CaCI2 10 mM, Brij-35 al 0,05% y HEPES 50 mM, pH 7,5) con 4 ¡JI de solución de sustrato (50 ¡JM) a 25Q C durante 15 minutos, ya continuación añadiendo 20 ¡JI de una proteina de fusión purificado de la invención a la cubeta de análisis. La concentración final de sustrato es 1 ¡JM. las velocidades de hidrólisis iniciales se verifican durante 30 min
Ejemplo 56: Aparición de diabetes en ratones NOD
Los ratones NOO hembra (diabéticos no obesos) se caracterizan por mostrar OMIO con un curso que es similar al encontrado en los seres humanos, aunque la enfermedad es más pronunciada en ratones NOO hembra que los macho. De aqui en adelante, a menos que se indique lo contrario, el término quot;ratón NOOquot; se refiere a un ratón NOO hembra. Los ratones NOO tienen una destrucción progresiva de las células beta que es causada por una enfermedad autoinmuntaria crónica. Por lo tanto, los ratones NOO comienzan su vida con normoglucemia, o niveles normales de glucosa en la sangre. A alrededor de 15 a 16 semanas de edad, sin embargo, los ratones NOD
comienzan a ser hiperglucémicos, lo que indica la destrucción de la mayoría de sus células beta del páncreas y la correspondiente incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina. Así, tanto la causa como el progreso de la enfermedad son simi lares a los pacientes DMID humanos
Los análisis in vivo de eficacia de los regímenes de inmunización pueden ser evaluados en ratones hembra NODfLtJ (disponible comercialmente de The Jack.son Laboratory, Bar Harbor, Me.). En la bibliografía, se informa de que 80% de los ratones hembra desarrollan diabetes a las 24 semanas de edad y el inicio de la insu1itis comienza entre 6-8 semanas de edad. Los ratones NOD son endogámicos y altamente sensibles a una variedad de estrategias inmunorreguladoras. Los ratones NOD adultos (6-8 semanas de edad) tienen una masa media de 20 a 25 9
Estos ratones pueden ser no tratados (control), tratados con los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej., proteínas de albúmina de fusión de la invenciÓfl y fragmentos y variantes de los mismos ), solos o combinados con otros compuestos terapéuticos mencionados anteriormente. El efecto de los diferentes tratamientos en el progreso de la diabetes se puede medir de la siguiente manera·
A las 14 semanas de edad, los ratones NOD hembra se puede fenotipificar de acuerdo con la tolerancia a la glucosa. La tolerancia a la glucosa se puede medir con la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTI). En resumen, se extrae sangre del plexo paraorbital a los O minutos y a los 60 minutos después de la inyección intraperitoneal de glucosa (1 glkg de peso corporal). La tolerancia normal se define como la glucosa en plasma a los O minutos de menos de 144 mg %, o a los 60 minutos de menos de 160 mg %. Los niveles de glucosa en sangre se determinan con un aparato Glucometer Elite.
En base a este análisis fenotípico, los animales se pueden aSignar a los diferentes grupos experimentales. En particular, los animales con los niveles más elevados de glucosa en sangre se pueden asignar al grupo de tolerancia alterada a la glucosa. Los ratones pueden ser alimentados ad libitum y se les puede suministrar agua acidulada (pH 2,3).
Los ratones tolerantes e intolerantes a la glucosa se pueden subdividir adicionalmente en control, proteinas de fusión de albúmina de la presente invención, y grupos de combinación de proteínas de fusión de albúminafcompuestos terapéuticos. Los ratones en el grupo control pueden recibir una inyección intraperitoneal de vehículo al día, seis veces por semana. Los ratones en el grupo de fusión de albúmina puede recibir una inyección intraperitoneal de los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej., proteinas de fusiÓfl de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de los mismos) en vehículo al dia, seis veces por semana. Los ratones en el grupo de combinación de proteínas de fusión de albúminafcompuestos terapéuticos pueden recibir tanto las proteínas de fusión de albúmina como las combinaciones de compuestos terapéuticos como se describe anteriormente.
El nivel de glucosa en la orina de los ratones NOD se puede determinar de forma quincenal utilizando Labstix (Bayer Diagnostics, Hampshire, Inglaterra). El peso y la ingesta de líquidos también se pueden determinar de forma quincenal. La apariciÓfl de la diabetes se produce después de la aparición de glucosuria en dos determinaciones consecutivas. Después de 10 semanas de tratamiento, se puede realizar una IPGTI adicional y los animales se pueden sacrificar el dia siguiente
En el curso 10 semanas de tratamiento, los animales de control en los grupos tolerantes la glucosa e intolerantes a la glucosa desarrollan diabetes en una proporciÓfl de 60% y 86%, respectivamente (véase la patente de Estados Unidos Núm. 5.866.546 , Gross et aL). Por lo tanto, se producen altas tasas de diabetes incluso en los ratones NOD que inicialmente son tolerantes a la glucosa si no se realiza ninguna intervención
Los resultados se pueden confirmar mediante la medición de los niveles de glucosa en sangre en ratones NOD, antes y después del tratamiento. Los niveles de glucosa en la sangre se miden como se describe anteriormente tanto en ratones tolerantes como intolerantes a la glucosa en todos los grupos descritos.
En una realización alternativa, los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej .. fusiones específicas descritas como SEO ID NO: Y y fragmentos y variantes de los mismos) se pueden cuantificar utilizando análisis espectrométrico y las cantidades de proteínas adecuadas se pueden resuspender antes de la inyección en 50 ~I de solución salina tamponada fosfato (PBS) por dosis. Se pueden administrar dos inyecciones, con una semana de diferencia, por vía subcutánea debajo de la piel dorsal de cada ratón. El seguimiento puede llevarse a cabo en dos ocasiones separadas antes de la inmunización y se puede realizar semanalmente durante todo el tratamiento y continuar después de eso. La orina se puede someter a ensayo para determinar la glucosa cada semana (Keto Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, 111.) y los ratones glicosúricos se pueden comprobar para determinar la glucosa en suero (ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). La diabetes se diagnostica cuando la glucemia en ayunas es superior a 2,5 gil.
Ejemplo 57: Examen histológico de los ratones NOD
El examen histológico de muestras de tejido de los ratones NOD puede demostrar la capacidad de las composiciones de la presente invención, ylo una combinación de las composiciones de la presente invención con otros agentes terapéuticos para la diabetes, para aumentar la concentración relativa de células beta en el páncreas El método experimental es el siguiente:
Los ratones del Ejemplo 56 se pueden sacrificar al final del período de tratamiento y las muestras de tejido se pueden tomar del páncreas. Las muestras se pueden fijar en formalina al 10% en solución salina al 0,9% y embeber en cera. Se pueden cortar dos series de 5 secciones de 5 .mu.m para el inmunomarcaje en un intervalo de corte de 150 .mu.m. Las secciones se pueden inmunomarcar para determinar la insulina (dilución 1:1000 de antisueros antiinsulina de cobaya, ICN Thames Reino Unido) y el glucagón (dilución 1: 2000 de antisuero de conejo anti-glucagón pancreático) y se detectan con peroxidasa coojugada anti-cobaya (Dako, High Wycombe, Reino Unido) o antiantisuero de conejo conjugado con peroxidasa (dilución 1 :50, Dako).
La composición de la presente invención pueden tener o pueden no tener un efecto tan fuerte sobre la masa visible de las células beta como lo hace sobre las manifestaciones clínicas de diabetes en animales tolerantes a la glucosa e intolerantes a la glucosa.
Ejemplo 58: Modelo de ratón in vivo de DMNID
Se pueden obtener ratones macho C57BU6J de Jackson Laboratory (Bar Harbar, ME) a las 3 semanas de edad y alimentar con pienso convencional o dietas enriquecidas en cualquiera de grasa convencional (35,5% en p/p; Bioserv. Frenchtown, NJ) o fructosa (60% peso/peso; Harlan Teklad, Madison, WI). El pienso normal se compone de 4,5% en p/p de grasa, 23% en p/p de proteína, 31 ,9% en p/p de almidón, 3,7% en p/p fructosa, y 5,3% en p/p de fibra. La dieta con alto contenido de grasa (manteca de cerdo) se compone de 35,5% en p/p de grasa, 20% en p/p de proteína, 36,4% en p/p de almidón, 0,0% en p/p de fructosa, y 0,1% en p/p de fibra. La dieta de alto contenido de fructosa se compone de 5% en p/p de grasa, 20% en p/p de proteína, 0,0% en p/p de almidón, 60% en p/p de fructosa, y 9,4% en plp de fibra. Los ratones pueden ser alojados no más de cinco por jaula a 22Q +/ -3Q C de temperatura y 50% +1-20% de humedad ambiente controlada con un ciclo de luz (06 a.m.--6 p.m.)/oscuridad de 12 horas (Luo et al., 1998, Metabolism 47(6):663-8, ~Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus~; Larsen et al., Diabetes 50(11): 2530-9 (2001 ), quot;Systemic administration ofthe long-acting GLP-1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese ralsquot;). Después de la exposición a las dietas respectivas durante 3 semanas, a los ratones se les pueden inyectar intraperitonealmente estreptozotocina, ~SlZ~ (Sigma, SI. Louis, MO), a 100 mg/kg de peso corporal o vehículo (ácido cítrico de 0,05 moles/I, pH 4,5) Y mantener la misma dieta durante los siguientes 4 semanas. En condiciones postprandiales, se obtuvo sangre 1, 2 Y 4 semanas después de la SlZ pellizcando la parte distal de la cola. Las muestras se utilizan para medir las concentraciones postprandiales de glucosa e insulina en plasma. El peso corporal y la ingesta de alimentos se registran semanalmente
Para determinar directamente el efecto de la dieta con alto contenido de grasa sobre la capacidad de la insulina para estimular la utilización de glucosa, los experimentos se pueden iniciar en tres grupos de ratones, los alimentados con grasa, los alimentados con pienso a los que se inyecta vehículo, y los alimentados con grasa a los que se inyecta STZ al final del período de 7 semanas descrito anteriormente. Los ratones pueden estar en ayunas durante 4 horas antes de los experimentos. En la primera serie de experimentos, los ratones pueden ser anestesiados con inhalación de metoxiflurano (Pitman-Moer, Mundelein, IL). Se puede inyectar insulina regular (Sigma) por via intravenosa ([IV] a 0,1 Ulkg de peso corporal) a través de una vena de la cola, y la sangre se puede recoger 3, 6, 9, 12, Y 15 minutos después de la inyección de una vena de la cola diferente. Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar en estas muestras, y la vida media (t112) de la desaparición de la glucosa del plasma se puede calcular utilizando WinNonlin (Scientific Consulting, Apex, Carolina del Norte), un programa de soporte lógico de farmacocinéticalfarmacodinámica .
En la segunda serie de experimentos, los ratones pueden ser anestesiados con pentobarbital sódico intraperitooeal (Sigma). Se abre la cavidad abdominal y la vena abdominal principal se expone y se cateteriza con un catéler IV de calibre 24 (Johnson-Johnson Medical, Arlington, TX). El catéter se asegura al tejido muscular adyacente a la vena abdominal, se corta en la parte inferior de la conexión de la jeringa, y se conecta a un tubo de plástico PESO precargado, que a su vez está conectado a una jeringa con una solución de infusión. La cavidad abdominal se cierra mediante sutura. Con este enfoque, no habría ninguna obstrucción del flujo de retomo de la sangre desde la parte inferior del cuerpo. Los ratones pueden ser infundidos continuamente con glucosa (24,1 mg/kg/min) e insulina (10 mU/kg/min) a un volumen de infusión de 10 ~I/min. Las muestras de sangre retro-orbital (70 ~I cada una) se pueden tomar de 90, 105, 120, Y 135 minutos después del inicio de la infusión para la medición de las concentraciones de glucosa en plasma e insulina. La media de estas cuatro muestras se utiliza para estimar las concentraciones glucosa en plasma (SSPG) y de insulina (SSPI) en estado estacionario para cada animal.
Finalmente, los experimentos para evaluar la capacidad de las proteinas de fusión de la albúmina, las composiciones terapéuticas de la presente solicitud, ya sea solas o combinadas con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de diabetes mellitus, para disminuir la glucosa en plasma se puede realizar en los dos grupos siguientes de modelos de ratones quot;NDMIDquot; a los que se inyecta STZ: (1) alimentados con grasa C57BU6J, y (2) alimentados con fructosa C57BU6J. Las concentraciones de glucosa en plasma de los ratones para estos estudios pueden oscilar de 255 hasta 555 mg/dL Los ratones se asignan aleatoriamente al tratamiento con vehículo, agentes terapéuticos de fusión de albúmina de la presente invención, ya sea solos o combinados con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de la diabetes mellitus. Se pueden administrar un total de tres dosis. Se pueden tomar muestras de sangre de la vena de la cola para la medición de la concentración de glucosa plasmática antes de la primera dosis y 3 horas después de la dosis final.
Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar utilizando el Kit de Diagnóstico de Glucosa de Sigma (Sigma Núm. 315), un análisis colorimétrico de la enzima. Los niveles de insulina en plasma se pueden determinar utilizando el Kit RIA de insulina de Rata de Linco Research (Núm. RI·13K; St. Charles, MO)
Ejemplo 59: Análisis indicadores de H4I1e·SEAP in vitro que establecen la participación en la acción de la insulina
Los diversos informadores H4/1E
H411E1rMEP-SEAP: El promotor de la enzima málica aislado de rata (rMEP) contiene un elemento de PPAR·gamma, que está en la ruta de la insulina. Este constructo indicador se transfecta de forma estable a la línea celular H411E de hígado.
H411E1SREBP-SEAP: La proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP-Ic) es un factor de transcripción que actúa sobre los promotores de una serie de genes sensibles a la insulina, por ejemplo, la sintetasa de ácidos grasos (FAS), y que regula la expresión de genes clave en el metabolismo de ácidos grasos en los fibroblastos, adipocitos, y hepatocitos. SREBP-Ic, también conocido como factor de determinación y diferenciación de los adipocitos I (ADD-1), se considera el principal mediador de los efectos de la insulina sobre la expresión génica en las células adiposas. Su actividad está modulada por los niveles de insulina, esteroles, y glucosa. Este coostructo indicador se transfecta de forma estable a la línea celular H4I1E de hígado
H411E1FAS-SEAP: Los constructos indicadores de ácido graso sintetasa contienen un promotor FAS sensible a SREBP mínimo. Este constructo indicador se transfecta de forma estable a la línea celular H411E de hígado.
H411E1PEPCK-SEAP; El promotor de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), es el sitio principal de la regulación hormonal de la actividad de PEPCK que modula la transcripción del gen PEPCK. El PEPCK cata liza un paso comprometido y limitante de la velocidad en la gluconeogénesis hepática y por lo tanto se debe controlar cuidadosamente para mantener los niveles de glucosa en sangre dentro de limites normales. Este coostruclo indicador se transfecta de forma estable a la línea celular H4I1E de hígado.
Estos constructos indicadores también pueden ser transfectados de forma estable a fibroblastos 3T3-L 1 Y mioblastos L6. Estas líneas celulares estables se diferencian a continuación a adipocitos 3T3-L 1 Y miotubos LB descritos anteriormente en el Ejemplo 13. Las líneas de células diferenciadas se pueden utilizar a continuación, en el análisis de SEAP descrito a continuación.
Crecimiento y medio de análisis
El medio de crecimiento comprende suero bovino fetal al 10% (FBS), Suero de Ternera al 10%, NEAA al 1%, 1x penicilina/estreptomicina y 0,75 mg/mL de G418 (para H411E1RFA-SEAP y H411E1SREBP-SEAP) o 0,50 mg/mL de G418 (para H411E1rMEP-SEAP). Para H411E1PEPCK-SEAP, el medio de cultivo consiste en FBS al 10%, penicilina/estreptomicina aI1%, solución sa lina tamponada con HEPES 15 mM, y 0,50 mglmL de G418.
El medio de análisis consiste en medio DMEM de bajo contenido de glucosa (Life Technologies), NEAA al 1%, 1x penicilina/estreptomicina para los indicadores H411E1RFA-SEAP, H411E1SREBP-SEAP, H411E1rMEP-SEAP. El medio de análisis para el indicador H4I1E/PEPCK-SEAP coosiste en FBS al 0,1%, penicilina/estreptomicina al 1% y solución salina tamponada HEPES 15 mM
Método
Las placas de 96 pocillos se siembran a 75.000 células/pocillo en 100 ~l/pocillo de medio de crecimiento hasta que las células en fase de crecimiento lag se vuelven adherentes. Las células se mantienen en ayunas durante 48 horas mediante la sustitución del medio de crecimiento por medio de análisis, 200 ~I/pocillo). (Para las célu las H411E1PEPCK-SEAP, se añade medio de análisis que contiene 0,5 ~M de dexametasona a 100 ~lfpocillo y se incuba durante aproximadamente 20 horas). El medio de análisis se sustituye después de eso por 100 ~lIpocillo de medio de análisis de nueva aportación, y se añade al pocillo una alícuota de 50 ~I de sobrenadante de células obtenido a partir de líneas celulares transfectadas que expresan los agentes terapéuticos de la presente invención (p. ej., proteínas de albúmina de fusión de la invenciÓf'l y fragmentos y variantes de la misma). Los sobrenadantes de las líneas celulares transfectadas con el vector vacío se utilizan como control negativo. La adición de 10 nM y/o 100 nM de insulina a los pocillos se utiliza como control positivo. Después de 48 horas de incubación, el medio condicionado se recoge y se mide la actividad de SEAP (protocolo Phospha-Light System, Tropix Núm. BP2500). En resumen, las muestras se diluyen 1:4 en tampón de dilución y se incuban a 65°C durante 30 minutos para inactivar la forma no placentaria endógena de SEAP. Una alícuota de 50 ~I de las muestras d iluidas se mezcla con 50 ~I de Tampón de Análisis SEAP que contiene una mezcla de inhibidores activos contra las isoenzimas SEAP no placentarias y se incuba durante otros 5 minutos. Se añade a la mezcla una alícuota de 50 ~I de sustrato quimioluminiscente CSPD que se diluye 1 :20 en potenciador de luminiscencia Emerald y se incuba durante 15-20 minutos. Las placas se leen en un luminómetro de placas Dynex
Ejemplo 60: Animafes transgénicos
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden expresar en animales transgénicos. Los animales de cualquier especie, incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayas, cerdos, micro-cerdos, cabras, ovejas, vacas y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés pueden ser utilizados para generar animales transgénicos. En una realización específica, los mecanismos descritos en la presente memoria o conocidos de otra manera en la técnica, se utilizan para expresar las proteínas de fusión de la invención en seres humanos, como parte de un protocolo de terapia génica
Se puede utilizar cualquier mecanismo conocido en la técnica para introducir los polinucleólidos que codifican las proteínas de fusión de la albúmina de la invención en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Tales mecanismos incluyen, pero no se limitan a, microinyección pronuclear (Paterson et al., Appl Microbiol Biotechnol 40:691-698 (1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 11· 1263-1270 (1993); Wright et al., Biotechnology (NY) 9: 830-834 (1991); y Hoppe et al., Patente de Estados Unidos Núm. 4.873.191 (1989»; transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Pullen et al., Proc Natl Acad Sci, USA. 82· 61 48-6152 (1985», blastocistos o embriones; direccionamiento génico en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell56: 313-321 (1989»; electroporación de células o embriones (Lo, 1983, Mol Cell Biol 3: 1803-1814 (1983»; introdua:ión de los polinucleótidos de la invención utilizando una pistola génica (véase, p. ej., Ulmer el al., Science
259: 1745 (1993); introducción de constructos de ácido nucleico en células madre pluripotentes embrionarias y transferencia de las células madre de nuevo a blastocistos; y transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano y otros, Cell 57: 717-723 (1989); etc. Para una revisión de dichos mecanismos, véase Gordon, ~Transgenic animalsquot;, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229 (1989), que se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad
Se puede utilizar cualquier mecanismo conocido en la técnica para producir clones transgénicos que contienen polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la albúmina de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear a oocitos enucleados de los núcleos de células embrionarias, fetales, o adultas cultivadas en las que se induce quiescencia (Campell el al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilmut et al., Nature 385: 810-813 (1997».
La presente invención proporciona animales transgénicos que portan polinucleólidos que codifican las proteínas de fusión de la albúmina de la invención en todas sus células, así como animales que llevan estos polinucleótidos en algunas, pero no todas sus células, es decir, animales mosaico o quiméricos. El transgén se puede integrar como un único transgén o como múltiples copias, tales como en roncatámeros, por ejemplo, tándems de cabeza a cabeza o tándems de cabeza a la cola. Eltransgén también se puede introducir selectivamente y activar en un tipo de célula concreto siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:6.2326236 (1992». Las secuencias reguladoras requeridas para semejante activación específica del tipo de célula dependerán del tipo de célula particular de interés, y serán evidentes para los expertos en la técnica. Cuando se desea que el polinucleótido que codifica la proteina de fusión de la invención se integre en el sitio cromosómico del gen endógeno correspondiente a la porción de proteína terapéutica o una porción de la proteína de fusión de albúmina de la invención, se prefiere el direccionamiento de genes. En pocas palabras, cuando se va a utilizar dicha técnica, se diseñan los vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homólogas al gen endógeno con el fin de integrar, mediante la recombinación homóloga con secuencias cromosómicas, e interrumpir la función de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno. El transgén también se puede introducir selectivamente en un tipo celular concreto, inactivando de este modo el gen endógeno sólo en ese tipo de célula, siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Gu et al. (Gu et al., Science 265: 103-106 (1994». Las secuencias reguladoras requeridas para semejante inactivación específica del tipo de célula dependerán del tipo de la célula concreta de interés, y serán evidentes para los expertos en la técnica.
Una vez que se han generado los animales transgénicos, la expresión del gen recombinante se puede analizar utilizando mecanismos convencionales. El escrutinio inicial se puede realizar mediante análisis por PCR o técnicas de transferencia Southern para analizar tejidos animales para verificar que la integración del polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención ha tenido lugar. El nivel de expresión de ARNm del polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención en los tejidos de los animales transgénicos también se puede evaluar utilizando mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, análisis de hibridación in situ, y transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR). Las muestras de tejido que expresan la proteína de fusión también se pueden evaluar inmunocitoquímicamente o inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos específicos para la proteína de fusión
Una vez que se producen los animales fundadores, éstos se pueden reproducir, someter a cruzamiento endogámico, someter a cruzamiento exogámico, o cruzar para producir colonias del animal concreto. Los ejemplos de tales estrategias de reproducción incluyen, pero no se limitan a: cruzamiento exogámico de animales fundadores con más de un sitio de integración con el fin de establecer lineas separadas; cruzamiento endogámico de líneas separadas con el fin de producir compuestos transgénicos que expresan el transgén a niveles más altos a causa de los efectos de la expresión aditiva de cada transgén; cruce de animales transgénicos heterocigotos para producir animales homocigotos para un sitio de integración dado con el fin de aumentar la expresión y eliminar la necesidad de
escrutinio de los animales mediante análisis de ADN; cruce de lineas homocigóticas separadas para producir líneas heterocigotas u homocigotas compuestas; y cría para colocar el transgén (es decir, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina de la invención) en un fondo distinto que sea apropiado para un modelo experimental de interés. Los animales transgénicos de la invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de modelos animales útiles en la elaboración de la función biológica de las proteínas de fusión de la invención y la proteína terapéutica y/o el componente de albúmina de la proteína de fusión de la invención, el estudio de las afecciones y/o trastornos asociados con la expresión aberrante, y el escrutinio de compuestos eficaces en la mejora de tales afecciones y/o trastornos.
Ejemplo 61: Método de tratamiento utifizando la terapia génica ex-vivo
Un método de terapia génica trasplanta fibroblastos, que son capaces de expresar una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, a un paciente. Generalmente, los fibroblastos se obtienen de un sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo de tejidos y se separa en pequeños trozos. Los pequeños trozos del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, se colocan aproximadamente diez piezas en cada matraz. El matraz se pone al revés, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los trozos de tejido permanecen fijos al fondo del matraz y se añade medio de nueva aportación (p. ej., medio F12 de Ham, con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina). Los matraces se incuban a continuación a 37 grados Celsius durante aproximadamente una semana
En este momento, se añade medio de nueva aportación y posteriormente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se trata con tripsina y se aumenta a escala en matraces de mayor tamaño
Se digiere pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney con EcoRI y Hindlll y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal de temera. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, utilizando cuentas de vidrio
Los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden generar utilizando mecanismos conocidos en la técnica, amplificar utilizando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias de los extremos 5' y 3' y, opcionalmente, tienen sitios de restricción apropiados y codones de iniciación/parada, si es necesario. Preferiblemente, el cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye un sitio Hindlll. Se añaden cantidades iguales de la cadena principal del virus del sarcoma murino de Moloney lineal y el fragmento EcoRI y Hindlll amplificado, en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se utiliza a continuación para transformar bacterias HB101 , que luego se cultivan en placa sobre agar que contiene kanamicina con el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de interés adecuadamente insertado.
Las células de empaquetamiento pA317 o GP+am12 anfotrópicas se hacen crecer en cultivo de tejido hasta una densidad de confluencia en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de ternera (CS) al 10%, penicilina y estreptomicina. A continuación se añade al medio el vector MSV que contiene el gen y las células de empaquetamiento se transducen con el vector. Las células de empaquetamiento producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células de empaquetamiento se denominan ahora células productoras)
Se añade medio de nueva aportación a las células productoras transducidas, y posteriormente, se cosecha el medio de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contienen las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro Millipore para eliminar las células productoras desprendidas y este medio se utiliza después para infectar fibroblastos. Se retira el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y rápidamente se reemplaza por el medio de las células productoras. Este medio se elimina y se reemplaza por medio de nueva aportación. Si el título de virus es alto, prácticamente todos los fibroblastos se infectarán y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos se han infectado de manera eficiente, se analizan los fibroblastos para determinar si se produce la proteina de fusión de albúmina
Los fibroblastos modificados son luego trasplantados al anfitrión, ya sea solos o después de haber sido cultivados hasta la confluencia sobre cuentas microportadoras Cytodex 3.
Ejemplo 62: Método de tratamiento utilizando terapia génica -in vivo
otro aspecto de la presente invención consiste en utilizar los métodos de terapia génica in vivo para tratar trastornos, enfermedades y afecciones. El método de terapia génica se refiere a la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudo (ADN, ARN, Y ADN o ARN antisentido) que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención en un animal. Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden unir operativamente a (es decir, asociar con) un promotor u cualquier otro elemento genético necesario para la expresión del polipéptido por el tejido diana. Semejante terapia y mecanismos o métodos de suministro son conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, los documentos W090f11092, W098/11779; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5693622, 5705151, 5580859; Tabata et al., Cardiovasc. Res. 35 (3): 470-479 (1997); Chao et al., Pharmacol. Res. 35 (6): 517-522 (1997); Wolff, Neuromuscul. Disorders. 7 (5): 314-318 (1997); Schwartz et al., Gene Ther. 3 (5): 405-411 (1996); Tsurumi et al., Circulation 94 (12): 3281 -3290 (1996) (incorporados a la presente memoria como referencia)
Los constructos de polinucleótidos se pueden suministrar por cualquier método que proporcione materiales inyectables a las células de un animal, tal como, inyección en el espacio intersticial de los tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, intestino y similares). Los constructos de polinucleótidos se pueden suministrar en un portador líquido o acuoso farmacéuticamente aceptable.
El término polinucleótido quot;desnudoquot;, ADN o ARN, se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de administración que actúa para ayudar a promover o facilitar la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes precipitantes y similares. Sin embargo, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención también se pueden suministrar en formulaciones de liposomas (tales como las que ilustran Feigner P.L. et al., (1995) Ann NY Acad Sci
772: 126-139 y Abdallah B. et al., (1995) Cell Biol 85(1 )· 1-7) que se pueden preparar mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los constructos vectores de polinucle6tidos utilizados en el método de terapia génica son preferiblemente constructos que no se integrarán en el genoma del anfitrión ni contendrán secuencias que permitan la replicación Cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica se puede utilizar para conducir la expresión del AON. A diferencia de otras técnicas de terapia génica, una ventaja principal de la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudo en las células diana es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en las células. Los estudios han demostrado que las secuencias de AON no replicativas se pueden introducir en las células para proporcionar la producción del polipéptido deseado durante periodos de hasta seis meses
El constructo de polinucleótido puede ser suministrado al espacio intersticial de los tejidos dentro de un animal, incluyendo músculo, piel, cerebro, pulmón, higado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testlculo, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende el fluido intercelular, la matriz de mucopolisacárido entre las fibras reticulares de los tejidos de órganos, las fibras elásticas en las paredes de los vasos o cámaras, las fibras de colágeno de tejidos fibrosos o esa misma matriz dentro del tejido conectivo que envuelve las células musculares o en las lagunas de hueso. Es igualmente el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Se prefiere el suministro al espacio intersticial del tejido muscular por las razones expuestas a continuación. Se puede suministrar convenientemente mediante inyección en los tejidos que comprenden estas células. Se suministra preferiblemente a y se expresa en células persistentes, que no están en división que se diferencian, aunque el suministro y la expresión se pueden lograr en células llO diferenciadas o mellOs completamente diferenciadas, tales como, por ejemplo, las células madre de la sangre o los fibroblastos de la piel. En las células musculares in vivo son particularmente competentes en su capacidad para captar y expresar polinucleótidos.
Para la inyección de polinucleótido desnudo, una cantidad de dosificación eficaz de AON o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 g/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mglkg de peso. Preferiblemente, la dosis será de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg y más preferiblemente de aproximadamente 0,05 mglkg a aproximadamente 5 mglkg. Por supuesto, como apreciará el experto en la técnica, esta dosis variará de acuerdo con el sitio del tejido de la inyección. La dosificación apropiada y eficaz de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar fácilmente por los expertos normales en la técnica y puede depender de la afección a tratar y de la vía de administración. La ruta preferida de administración es la inyección por vía parenteral en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también se pueden utilizar otras vías parenterales, tales como, inhalación de una formulación en aerosol especialmente para la administración a los pulmones o tejidos bronquiales, garganta o membranas mucosas de la nariz. Además, los constructos de polinucleótidos desnudos se pueden suministrar a las arterias durante la angioplastia por el catéter utilizado en el procedimiento.
Los efectos de respuesta a la dosis de polinucleótido inyectado en el músculo in vivo se determinan de la siguiente manera. El ADN molde adecuado para la producción de ARNm que codifica el polipéptido de la presente invención se prepara de acuerdo con la metodología de ADN recombinante convencional. El AON molde, que puede ser circular o lineal, se utiliza como ADN desnudo o formando complejo con liposomas. Se inyectan en músculos del cuádriceps de los ratones diversas cantidades del ADN molde.
Se anestesian ratones Balb/c hembra y macho de cinco a seis semanas de edad mediante inyección intraperitoneal con 0,3 mL de Avertin al 2,5%. Se realiza una incisión de 1,5 cm sobre la cara anterior del muslo, y se visualiza directamente el músculo cuádriceps. El ADM molde se inyecta en 0,1 mL de portador en una jeringa de 1 ce a través de una aguja de calibre 27 durante un minuto, aproximadamente a 0,5 cm del sitio de inserción distal del músculo dentro de la rodilla y a aproximadamente 0,2 cm de profundidad. Se realiza una sutura sobre el sitio de la inyección para la futura localización, y la piel se cierra con grapas de acero inoxidable
Después de un tiempo de incubación apropiado (p. ej., 7 días) se preparan extractos musculares mediante la
escisión de todo el cuádriceps. Una de cada cinco secciones transversales de 15 flm de los músculos del cuádriceps individuales se tiñe histoquímicamente para determinar la expresión de la proteina. Se puede realizar la secuencia tempOfal para la expresión de la proteina de fusión de una manera similar excepto que los cuád riceps de los diferentes ratones se cosechan en diferentes momentos. La persistencia de ADN en el músculo después de la inyección se puede determinar mediante análisis de transferencia Southem después de la preparación de ADN celular total y los sobrenadantes HIRT de los ratones que recibireron la inyección y de control. Los resultados de la experimentación anterior en los ratones se pueden utilizar para extrapolar dosis adecuadas Y otros parámetros de tratamiento en seres humanos y otros an imales utilizando ADN desnudo.
Ejemplo 63: Efectos biológicos de las proteinas de fusión de la invención
Análisis de astrocitos y neuronales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden someter a ensayo para determinar la actividad de promoción de la supervivencia, el crecimiento de neuritas, o la diferenciación fenotípica de células neuronales corticales y para inducir la proliferación de las células inmunopositivas para la proteína ácida fibrilar glial, astrocitos. La selección de células corticales para el bioanálisis se basa en la expresión predominante de FGF·1 y FGF-2 en las estructuras corticales y en la potenciación previamente referida de la supervivencia neuronal cortical que resulta del tratamiento con FGF-2. Se puede utilizar un análisis de incorporación de timidina, por ejemplo, para d ilucidar la actividad de una proteína de fusión de albúmina de la invención sobre estas células
Por otra parte, los informes anteriores que describen los efectos biológicos de FGF-2 (FGF básico) sobre las
neuronas corticales o del hipocampo in vitro han demostrado aumentos en el análisis tanto de la supervivencia neuronal como del crecimiento de neuritas (Walicke et al., ~Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension~ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 3012-3016 (1986), incorporada a la presente memoria como referencia en su totalidad). Sin embargo, los informes de experimentos hechos en células PC-12 sugieren que estas dos respuestas no son necesariamente sinónimas y pueden depender no sólo de qué FGF se esté sometiendo a ensayo, sino también de qué receptor o receptores se expresen en las células diana. Utilizando el paradigma de cultivo neuronal cortical primario, se puede comparar la capacidad de una proteína de fusión de albúmina de la invención para inducir el crecimiento de neu ritas con la respuesta conseguida con FGF-2 uti lizando, por ejemplo, un análisis de incorporación de timidina.
Análisis de fibroblastos y células endoteliales
Se obtienen fibroblastos de pulmón humano de Clonetics (San Diego, CA) y se mantienen en medio de crecimiento de Clonetics. Las células endoteliales microvasculares dérmicas se obtienen de Cell Applications (San Diego, CA) Para los análisis de proliferación, los fibroblastos de pulmón humano y las células endoteliales microvasculares dérmicas pueden ser cultivados a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día en medio de crecimiento. Las células se incuban a continuación durante un dia en medio basal de BSA al 0,1%. Después de sustituir el medio por medio de BSA al 0,1% de nueva aportación, las células se incuban con la proteína de fusión de ensayo de la invención durante 3 dias. Se añade Azul Alamar (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) a cada pocillo a una concentración final de 10%. Las células se incuban durante 4 hr. La viabilidad celular se mide mediante la lectura en un lector de fluorescencia CytoFluor. Para los análisis de PGE2, los fibroblastos de pulmón humano se cultivan a 5.000 célulaslpocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de cambiar el medio a medio basal de BSA al 0,1%, las células se incuban con FGF-2 o proteína de fusión de la invención con o sin IL-1a durante 24 horas. Se recoge el sobrenadante y se analiza para determinar la PGE2 mediante un kit de EIA (Cayman, Ann Arbor, MI). Para los análisis de IL-6, los fibroblastos de pulmón humano se cultivan a 5.000 células/poci llo en una placa de 96 pocillos durante un dia. Después de un cambio de medio a medio basal de BSA al 0,1%, las células se incuban con FGF-2 o con o sin una proteína de fusión de albúmina de la invención VIo IL-1a durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogen V se analizan para determinar la IL-6 med iante un kit de ELlSA (Endogen, Cambridge,
MAl
Se cultivan fibroblastos de pulmón humano con FGF-2 o una proteína de fusión de albúmina de la invención durante 3 dias en medio basal antes de la adición de Azul Alamar para evaluar los efectos sobre el crecimiento de los fibroblastos. El FGF·2 debe mostrar una estimulación a 10 • 2500 nglmL que se puede utilizar para comparar la estimulación con la proteina de fusión de la invención
Proliferación celular basada en la incorporación de {3H}timidina
El siguiente análisis de incOfpOfación de [3H]timidina se puede utilizar para medir el efecto de una proteína Terapéutica, por ejemplo, las proteínas del factor de crecimiento, sobre la proliferación de células tales como fibroblastos, células epiteliales o células musculares inmaduras
Se detienen cultivos subconfluentes en la fase G1 mediante una incubación durante 18 h en medio libre de suero. Después se añaden las proteínas terapéuticas durante 24 h V durante las últimas 4 h, los cultivos se marcan con 13H]timidina, a una concentración final de 0,33 ¡..1M (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). La [3H]timidina incorporada se hace precipitar con ácido tricloroacético al 10% enfriado con hielo durante 24 h. Con posterioridad, las células se enjuagan secuencialmente con ácido tricloroacético al 10% enfriado con hielo y después con agua enfriada con hielo. Después de la lisis en NaOH 0,5 M, los productos lisados y los productos enjuagados con PBS (500 mi) se combinan, y se mide la cantidad de radiactividad.
Modelos de Parkinson
La pérdida de la función motora en la enfermedad de Parkinson se atribuye a una deficiencia de dopamina estriatal que resulta de la degeneración de las neuronas de proyección dopaminérgica nigroestriatal. Un modelo animal para el Parkinson que se ha caracterizado extensamente implica la administración sistémica de 1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6telrahidropiridina (MPTP). En el SNC, la MPTP es absorbida por los astrocitos y calabolizada por la monoamina oxidasa B a l -metil-4-fen ilpiridina (MPP') y liberada. Posteriormente, la MPP' se acumula activamente en las neuronas dopaminérgicas por el transportador de reabsorción de alta afinidad para dopam ina. La MPp· se concentra a continuación en las mitocondrias por el gradiente electroquímico e inhibe selectivamente el difosfato de nicotidamida y adenina: ubiquinona oxidorreductasa (complejo 1), interfiriendo de este modo en el transporte de electrones y, finalmente, generando radicales de oxigeno
Se ha demostrado en paradigmas de cultivos de tejidos que el FGF-2 (FGF básico) tiene actividad trófica hacia las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra (Ferrari et al., Dev. BioL 1989). Recientemente, el grupo del Dr Unsicker ha demostrado que la administración de FGF-2 en implantes de Gelfoam en el cuerpo estriado dan como resultado la protección casi completa de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra de la toxicidad asociada con la exposición a MPTP (0110 Y Unsicker, J. Neuroscience, 1990)
Basándose en los datos con FGF-2, se puede evaluar una proteina de fusión de albúmina de la invención para determinar si tiene una acción similar a la de FGF-2 en la mejora de la supervivencia neuronal dopaminérgica in vitro y también se puede someter a ensayo in vivo para determinar la protección de las neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado frente a los daños asociados con el tratamiento con MPTP. El efecto potencial de una proteína de fusión de albúmina de la invención se examina primero in vitro en un paradigma de cultivo de células neuronales dopaminérgicas. Los cultivos se preparan mediante la disección de la placa del piso del mesencéfalo a partir del dia 14 de geslación de embriones de ralas Wislar. El tejido se disocia con tripsina y se siembra a una densidad de
200.000 células/cm2 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poliomitina-Iaminina. Las células se mantienen en medio de Eagle Modificado de Dulbecco y medio F12 que contiene suplementos hormonales (NI ). Los cultivos se fijan con paraformaldehído al cabo de 8 días in vitro y se procesan para determinar la tirosina hidroxilasa, un marcador específico para las neuronas dopaminérgicas, tinción inmunohistoquimica_ Los cultivos de células disociadas se preparan a partir de ralas embrionarias. El medio de cultivo se cambia cada tres dias y en ese momento también se aí'iaden los factores .
Puesto que las neuronas dopaminérgicas se aislan de animales en el dia de gestación 14, un momento del desarrollo en el que se ha pasado la fase en la que las células precursoras dopaminérgicas están proliferando, un aumento en el número de neuronas inmunopositivas para tirosina hidroxilasa representaría un aumento en el número de neuronas dopaminérgicas que sobreviven in vitro. Por lo tanto, si una proteína terapéutica de la invención actúa prolongando la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, esto sugeriria que la proteina de fusión podria eslar implicada en la enfermedad de Par1lt;inson
Ejemplo 64: Terapia combinada con trasplante de células beta-pancreáticas
El trasplante es una forma común de tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria, especialmente cuando el propio tejido diana ha sido severamente dañado. Por ejemplo, y no a modo de limitación, trasplante de páncreas y el trasplante de células de los islotes son las opciones de tratamiento comunes para la DMID (Véase, p. ej., Stewart et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984-988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138-40 (1996); Kenda ll & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157-163 (1996); Hamano et al., Kobe J. Med ScL 42: 93-104 (1996); Larsen & Stratta, Diabetes Melab. 22: 139-146 (1996); Y Kinkhabwala, et al., Am J. Surg 171· 516-520 (1996)). Al igual que con cualquier método de trasplante, las terapias de trasplante para los pacientes de enfermedades autoinmunitarias incluyen tratamientos para reducir al mínimo el riesgo de rechazo del anfitrión al tejido trasplantado. Sin embargo, la enfermedad autoinmunitaria implica el riesgo adicional, independiente de que la respuesla autoinmunitaria del anfitrión pre--existente que dañó el propio tejido original ejerza el mismo efecto perjudicial sobre el tejido trasplantado. En consecuencia, la presente invención abarca métodos y composiciones para ellralamiento de la enfermedad pancreática autoinmunilaria utilizando las proteínas de fusión de albúmina de la invención sujeto combinadas con inmunomoduladoresfinmunosupresores en individuos sometidos a la terapia de trasplante de la enfermedad autoinmunitaria.
De acuerdo con la invención, las composiciones y formulaciones basadas en la fusi6n con albúmina descritas anteriormente, se administran para prevenir y tratar el daño a los órganos, tejidos o células trasplantados resultante de la respuesta autoinmunitaria del individuo anfitrión dirigida inicialmente contra el propio tejido original. La administración se puede llevar a cabo lanto antes como después del trasplante en 2 a 4 dosis con una semana de diferencia
Los siguientes inmunomoduladoresfinmunosupresores, incluyendo, pero no limitados a, Al-401 , CDP-571
(anticuerpo monoclonal anti-TNF), CG-1088, Oiamyd (vacuna contra la diabetes), ICM3 (anticuerpo monoaonal anti
ICAM-3), linomida (Roquinimex), NBI-6024 (ligando peptídico alterado), TM-27, VX-740 (HMR-3480), inhibidores de la proteasa caspasa 8, talidomida, hOKT3gamma1 (Ala-ala) (anticuerpo monoclonal anti-CD3), Interferón-alfa oral, lactobacillus oral, y LymphoStat-BTM se pueden utilizar junto con los agentes terapéuticos de fusión de albúmina de la presente invención en el trasplante de células de los islotes o páncreas.
Ejemplo 65: Identificación y cfonación de dominios VH y VL
Un método para identificar y clonar los dominios VH y VL dominios de lineas celulares que expresan un anticuerpo concreto consiste en llevar a cabo una PCR con cebadores especificos de VH y VL sobre ADNc elaborado a partir de lineas celulares que expresan el anticuerpo. Brevemente, el ARN se aísla de las lineas celulares y se utiliza como molde para la RT-PCR diseñada para amplificar los dominios VH y VL de los anticuerpos expresados por las lineas celulares de EBV. Las células se pueden lisar en el reactivo TRlzol® (Life Technologies, Rockville. MO) y extraer con un quinto de volumen de cloroformo. Después de la adiciórJ de cloroformo, la solución se incuba a la temperatura ambiente durante 10 minutos, y se centrifuga a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4quot;C en una centrifuga de mesa. El sobrenadante se recoge y el ARN se precipita utilizando un volumen igual de isopropanoL El ARN precipitado se sedimenta por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4quot;C en una centrífuga de mesa. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta y se lava con etanol del 75%. Después del lavado, el ARN se centrifuga de nuevo a 800 rpm durante 5 minutos a 4quot;C. El sobrenadante se desecha y el sedimento se deja secar al aire. El ARN se disuelve en agua DEPC y se calienta a 60quot;C durante 10 minutos. Las cantidades de ARN se pueden determinar utilizando medidas de densidad óptica
El AONc se puede sintetizar, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, a partir de 1,5-2,5 microgramos de ARN utilizando transcriptasa inversa y cebadores hexaméricos aleatorios. El ADNc se utiliza a continuación como molde para la amplificación mediante PCR de los dominios VH y VL Los cebadores utilizados para amplificar los genes VH y VL se muestran en la Tabla 7. Típicamente una reacción de PCR hace uso de un único cebadO( 5' y un único cebador 3'. Algunas veces, cuando la cantidad de molde de ARN disponible es limitante, o para una mayor eficiencia, se pueden utilizar grupos de cebadores 5' y/o 3' Por ejemplo, algunas veces los cinco cebadores VH-5' y todos los cebadores JH-3' se usan en una sola reacción de PCR La reacción de PCR se lleva a cabo en un volumen de 50 microlitros que contiene tampón de 1X tampón de PCR, 2 mM de cada dNTP, 0,7 unidades polimerasa Taq de alta fidelidad, mezcla de cebadores 5', mezcla de cebadores 3' y 7,5 microlitros de AONc. La mezcla de cebadores 5' y 3' de VH y VL se puede elaborar reuniendo 22 pmoles y 28 pmoles, respectivamente, de cada uno de los cebadores individuales. Las condiciones de la PCR son: 96quot;C durante 5 minutos; seguido por 2S ciclos de 94quot;C durante 1 minuto, 50quot;C durante 1 minuto, y 72quot;C durante 1 minuto; seguido de un ciclo de extensión de 72quot;C durante 10 minutos. Después de completar la reacción, los tubos de muestra se almacenan 4quot;C.
Tabla 7: Secuencias de cebadores utilizados para amplificar los dominios VH y VL
Nombre del Cebador
SEQIONO Secuencia del Cebador (5'-3')
Cebadores VH
Hu VH1-S'
62 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
Hu VH2-5'
63 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
Hu VH3-S'
64 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
Hu VH4-S'
65 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
Hu VHS-S'
66 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
Hu VH6-S'
67 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
Hu JH1 ,2-5'
68 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
Hu JH3-S'
69 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC
Hu JH4,S-5'
70 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
Hu JH6-S'
71 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC
Nombre del Cebador
SEQIDNO Secuencia del Cebador (5'-3')
Cebadores VL
Hu Vkappa1-5'
72 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa2a-5'
73 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC
Hu Vkappa2b-5'
74 GATATTGTGATGACTCAGTCTCC
Hu Vkappa3-5'
75 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
Hu Vkappa4-5'
76 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
Hu Vkappa5-5'
77 GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
Hu Vkappa6-5'
76 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
Hu Vlambda1-5'
79 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
Hu Vlambda2-5'
60 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
Hu Vlambda3-5'
61 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
Hu Vlambda3b-5'
62 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
Hu Vlambda4-5'
63 CACGTTATACTGACTCAACCGCC
Hu Vlambda5-5'
64 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
Hu Vlambda6-5'
65 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
Hu Jkappa1-3'
66 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
Hu Jkappa2-3'
67 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
Hu Jkappa3-3'
66 ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC
Hu Jkappa4-3'
69 ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC
Hu Jkappa5-3'
90 ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC
Hu Jlambdal-3'
91 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
Hu Jlambda2-3'
92 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
Hu Jlambda3-3'
93 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
Hu Jlambda3b-3'
94 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
Hu Jlambda4-3'
95 CACGTTATACTGACTCAACCGCC
Hu Jlambda5-3'
96 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC
SEQIDNO
Secuencia del Cebador (5'-3')
Nombre del Cebador
I
Hu Jlambda6-3'
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
I
Las muestras de PCR se someten a continuación a electroforesis en un gel de agarosa al 1,3%. Las bandas de ADN de los tamaños esperados (-506 pares de bases para dominios los VH, y 344 pares de bases para los dominios VL) se pueden cortar del gel y se purifican utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los productos de la PCR purificados se pueden ligar en un vector de clonación de PCR (Vector TA de Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Los productos de la PCR clonados individuales se pueden aislar después de la Iransfección de E. coli y la selección de color azulfblanco. Los productos de la PCR clonados se secuencian a continuación utilizando métodos comúnmente conocidos en la técnica.
Las bandas de PCR que contienen el dominio VH y los dominios VL también se pueden utilizar para crear vectores de expresión de Ig de larga duración. Los dominios VH y VL se pueden clonar en vectores que contienen las secuencias de nucleótidos de regiones constantes de una cadena pesada (p. ej., IgG1 humana o IgG4 humana) o ligera (kappa humana o lambda humana) de tal manera que se pueda expresar una molécula de cadena pesada o ligera completa a partir de estos vectores cuando se transfectan a una célula anfitriona apropiada. Además, cuando las cadenas pesada y ligera donadas se expresan ambas en una línea celular (a partir de uno o dos vectores), se pueden ensamblar en una molécula de anticuerpo funcional completa que se secreta al medio de cultivo celular. Los métodos que utilizan los polinucleótidos que codifican los dominios de anticuerpo VH y VL para generar vectores de expresión que codifican moléculas de anticuerpo completas son bien conocidos en la técnica
Ejemplo 66: Preparación de proteínas de fusión de HA-citoquina o HA-factor de crecimiento (tales como NGF, BDNFa, BDNFb y BDNF)
El AONc para la citoquina o el factor de crecimiento de interés, tal como NGF, se puede aislar por una variedad de medios, incluyendo bibliotecas de AONc, RT-PCR o PCR utilizando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos solapantes, todos utílizando métodos convencionales. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas son conocidas y se encuentran disponibles. El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que los conectores de oligonucleótidos se pueden utilizar para la clonación del AONc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de NGF (u otra citoquina) se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y pu rificar a continuación del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamifero, se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 67: Preparación de proteínas de fusión de HA-IFN (tal como IFNa
El AONc para el interferón de interés, tal como IFNa se pueden aislar por una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de AONc, RT-PCR o PCR utilizando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. Se conocen las secuencias de nucleótidos para los interferones, tales como IFNa y se encuenlran disponibles, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos
5.326.859 y 4.588.585, en el documento EP 32134, así como en bases de datos públicas tales como GenBank. El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que los conectores de oligonucleótidos se pueden utilizar para clonar el ADNc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C de la secuencia de HA, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc de IFNa (u otro interferón) se clona en un vector tal como pPPCOO05 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar después del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en lineas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar, excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia lider y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserla en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamifero.
Recuperación máxima de proteína de los viales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención tienen un alto grado de estabilidad incluso cuando se empaquetan a concentraciones bajas. Además, a pesar de la baja concentración de proteína, se observa una buena recuperación de proteína de fusión, incluso cuando la solución acuosa no incluye ninguna olra proteína añadida para minimizar la unión a las paredes del vial. La recuperación de las soluciones de HA-IFN almacenadas en los viales se comparó con una solución de partida_ Se colocaron soluciones de 6 o 30 ~g/mL de HA-IFN en via les y se almacenaron a 4quot;C. Después de 48 ó 72 horas se retiró un volumen inicialmente equivalente a 10 ng de muestra y se midió en un ELlSA sándwich para IFN. Los valores estimados se compararon con los de una solución de partida de alta concentración. Como se muestra, no hay esencialmente pérdida de la muestra en estos viales, lo que indica que la ad ición de un material ex6geno tal como la albúmina no es necesaria para evitar la pérd ida de muestra en la pared de los viales
Estabilidad in vivo y biodisponibifidad de las fusiones de HA-IFNa
Para determinar la estabilidad in vivo y la biodisponibilidad de una molécula de fusión de HA-IFNa, se administró la molécula de fusión purificada (a partir de levadura) a monos. Las composiciones farmacéuticas formuladas a partir de fusiones de HA-IFNa pueden explicar la vida media prolongada en suero y la biodisponibilidad. De acuerdo con ello, se pueden formular composiciones farmacéuticas para que contengan dosis más bajas de actividad interferónalfa en comparación con la molécula de interferón alfa nativa
Las composiciones farmacéuticas que contienen fusiones de HA-IFNa se pueden utilizar para tratar o prevenir la enfermedad en pacientes con cualquier enfermedad o estado de enfermedad que puedan ser modulados por la administración de IFNa. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, verrugas genitales y anales, hepatitis B crónica, hepatitis no A crónica, hepatitis no B, en particular la hepatitis C, hepatitis D, leucemia mielógena crónica, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, carcinoma de ovario y de cuello uterino, cáncer de piel, papilomatosis respiratoria recurrente, linfomas no Hodgkin y de células T cutáneos, melanoma, mieloma múltiple, SIDA, esclerosis múltiple, glioblastoma, etc. (véase Interferon Alpha, en: AHFS Drug Information, 1997.
Por consiguiente, la invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen una proteína, polipéptido o péptido de fusión de HA-IFNa formuladas con la dosis adecuada para la administración a seres humanos. La invención incluye también métodos de tratamiento de pacientes que necesitan semejante tratamiento que comprenden al menos la etapa de administrar una composición farmacéutica que contiene al menos una proteína, polipéptido o péptido de fusión de HA-a-IFN.
Fusiones de HA-IFNa difuncionafes
Un vector de expresión de HA-IFNa se puede modificar para que incluya una inserción para la expresión de proteínas de fusión de HA-IFNa bifuncionales. Por ejemplo, se puede insertar el ADNc para una segunda proteína de interés en marco aguas abajo de la secuencia de quot;rHA-IFNquot; después de haber eliminado o desplazado aguas abajo el doble codón de parada de la secuencia codificante
En una versión de una proteína de fusión de HA-IFNa, se puede fusionar un anticuerpo o fragmento contra la proteína estimuladora de linfocitos B (GenBank Acc. 4455139) o se puede fusionar el polipéptido a un extremo del componente HA de la molécula de fusión. Esta proteína bifuncional es útil para la modulación de cualquier respuesta inmunitaria generada por el componente IFNa de la fusión.
Ejemplo 68: Preparación de proteína de fusión de HA-hormona
El ADNc para la hormona de interés se puede aislar mediante una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, RT-PCR o PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas son conocidas y se encuentran disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas tales como GenBank El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonucleótidos para la clonación del ADNc en un vector que contiene el ADNc para HA. Esto puede ser en el extremo N o e , con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc de la hormona se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión uti lizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1 l. Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 69: Preparación de proteína de fusión de HA-receptor soluble o HA-proteina de fusión
El ADNc para el receptor soluble o la proteína de unión de interés se puede aislar mediante una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, RT-PCR y PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. Las secuencias de nucleótidos para todas estas proteínas son conocidas y se encuentran disponibles, por ejemplo, en GenBank. El ADNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonucleótidos para la clonación del ADNc en un vector que contiene el ADNc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc del receptor se clona en un vector tal como
pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteina de fusión de albúmina en la levadura. La proteina de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar a partir del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero
Ejemplo 70: Preparación HA-factores de crecimiento
El AONc para el factor de crecimiento de interés se puede aislar mediante una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de AONc, RT-PCR y PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando los métodos convencionales (véase Núm. Acc. de GenBank NP 000609). El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar los conectores de oligonudeótidos para la donación del AONc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc del factor de crecimiento se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC3s para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio y someler a ensayo para determinar su aclividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamifero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 71: Preparación de proteínas de fusión de HA-anticuerpo de cadena sencifla
Los anticuerpos de cadena sencilla son producidos por varios métodos, induyendo pero no limitados a· selección de bibliotecas de fagos, mediante clonación de la región variable de un anticuerpo específico por clonación del AONc del anticuerpo y utilización de las regiones conslanles f1anqueantes como cebador para donar la región variable, o mediante sintesis de un oligonucleótido que corresponde a la región variable de cualquier anticuerpo especifico. El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonucle6tidos, para la clonación del AONc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc de las células se clona en un vector tal como pPPCOOOs (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura
En las moléculas de fusión de la invención, VH y VL pueden estar unidos por uno de los siguientes medios o una combinación de los mismos: un conector peptidico entre el extremo C de VH y el extremo N de Vl:; un sitio de escisión de la proteasa Kex2p entre VH y VL de tal manera que los dos se escinden después de la secreción y luego se auto-asocian; y residuos de cistina posicionados de tal manera que VH y Vl pueden formar un enlace disulfuro entre ellos para unirlos. Una opción alternativa sería colocar VH en el extremo N de HA o un fragmento del dominio de HA y VL en el extremo C HA o un fragmento del dominio de HA.
La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar a continuación del medio y someter a ensayo su actividad. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero. El anticuerpo prodUCido de esta manera se puede purificar del medio y someter a ensayo la unión a su antigeno utilizando procedimientos inmunoquímicos convencionales
Ejemplo 72: Preparación de proteínas de fusión de HA-moléculas de adherencia celular
El AONc para la molécula de adherencia celular de interés se puede aislar mediante una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de AONc, RT-PCR y PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. Las secuencias de nudeótidos de las moléculas de adherencia celular conocidas son conocidas y se encuentran disponibles, por ejemplo, en GenBank. El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonudeótidos, para la clonación del AONc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N oC, con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc de la molécula de adherencia celular se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC3s para permitir la expresión de la proteina de fusión de albúmina en levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión
S
utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 73: Preparación de factores ínhibidores y péptidos como proteínas de fusíón de HA (tales como HAantivíral, HA-antibiótic o, HA-inhibidor enzimático y HA-anti-proteínas alérgicas)
El AoNc para el péptido de interés, tal como un péptido antibiótico se puede aislar por una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de AoNc, RT-peR y PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. El AONc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonucleótidos, para la clonación del AONc en un vector que contiene el AoNc para HA. Esto puede ser en el extremo N o e , con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc del péptido se clona en un vector tal como pPPCOOOS (Figura 2), pSceHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde a continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAC3S para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y un terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero
Ejemplo 74: Preparación de proteínas de fusión de HA específicas.
El AoNc para la proteína de interés se puede aislar de la biblioteca de AONc o se puede elaborar sintéticamente utilizando varios oligonucleótidos solapantes empleando métodos convencionales de la biología molecular. Los nucleótidos adecuados pueden ser modificados en el AONc para formar sitios de restricción convenientes y también permitir el anclaje del AoNc de la proteína al AoNc de albúmina. También se puede fusiooar un AoNc de una proteína o péptido de direccionamiento tal como anticuerpo de cadena sencilla o péptido, tales como señales de localización nuclear, que pueden di rigir las proteínas al interior de las células coo el otro extremo de la albúmina. La proteína de interés y el péptido de direccionamiento se clonan en un vector tal como pPPCOOOS (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA para permitir la fusión con el AONc de albúmina. De esta manera ambos extremos N y e de la albúmina se fusionan con otras proteínas. El AONc fusionado se escinde luego de pppe0005 y se inserta en un plásmido tal como pSAC3S para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura. Todos los procedimientos anteriores se pueden realizar utilizando métodos convencionales de la biología molecular. La proteína de fusión de albúmina secretada a partir de levadura se puede recoger y purificar del medio y someter a ensayó para determinar su actividad biológica y su actividad de direccionamiento mediante ensayos bioquímicos y biológicos apropiados
Ejemplo 75: Preparación de fusiones de HA-enzima
El AONc para la enzima de interés se puede aislar mediante una variedad de medios que incluyen, pero no exclusivamente, bibliotecas de AONc, RT-PCR y PCR utilizando una serie de cebadores de oligonucleótidos sintéticos solapantes, todos utilizando métodos convencionales. El AoNc se puede adaptar a los extremos 5' y 3' para generar sitios de restricción, de modo que se pueden utilizar conectores de oligonucleótidos, para la clonación del AONc en un vector que contiene el AONc para HA. Esto puede ser en el extremo N o C con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El AONc de la enzima se clona en un vector tal como pPPCOO05 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA a partir del cual se escinde continuación el casete de expresión completo y se inserta en el plásmido pSAe35 para permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en la levadura. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger y purificar después del medio y someter a ensayo para determinar su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar excepto Que el casete de expresión utilizado emplea un promotor, una secuencia líder y ¡JI terminador de mamífero (Véase el Ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde a continuación, y se inserta en un plásmido adecuado para la transfección de líneas celulares de mamífero.
Ejemplo 76: Constructo ID 2053. IFNb-HSA. Generación.
El ID de constructo 2053, pEE12.1:1FNb.HSA, comprende AON que codifica una proteína de fusión de IFNb y albúmina que tiene la proteína IFNb completa incluyendo la secuencia líder de IFNb nativo fusiooada al extremo amino de la forma madura de HSA en el vector de expresión NSO pEE 12.1.
Clonación de ADNc de IFNb
El polinucleótido que codificaba IFNb se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores IFNb· 1 e IFNb-2, descritos a continuación , se cortó con Bam HI/Cla 1, y se ligó en pC4:HSA cortada con Bam HI/Cla 1, dando como resu ltado el constructo 2011 . El fragmento Eco RIIEco RI del Constructo ID núm. 2011 se subclonó en el sitio Eco RI de pEE12.1 generando el ID de constructo núm. 2053 que comprendía el AON que codificaba una proteína de fusión de albúmina que contenía la secuencia líder y la forma madura de IFNb, seguida de la proteína madura HSA.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos adecuados para la amplificación por PCR del polinucleótido que codificaba la totalidad de IFNb, IFNb~1 Y IFNb-2·
IfNb-l, S'-GCQCGGAICCGAAnCCOCCGCCATQACCAACAAGTOTCTCCTCCAAATIGCTCTCCTGTIGTOCTT
CTCCACTACAGCTCliTCCATGAOCTACAACITGCJTGG-)' (SEQ 10 NO:I07)
IFNb-2 : S'-GCGCGCATACGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCGTTTCGGA GGTAACCTGT-3' (SEQ ID NO: 108)
El cebador IFNb-1 incorpora un sitio de donación Bam HI (que se muestra subrayado), un sitio de clonación Eco RI , y una secuencia Kozak (que se muestra en cursiva), seguido de 80 nucleótidos que codifican los primeros 27 aminoácidos de la forma completa de IFNb. En IFNb-2, el sitio G/a 1 (que se muestra subrayado) y el ADN que lo sigue soo el complemento inverso del AON que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína HSA madura (SEQ ID NO: 1) y los últimos 18 nucleótidos son el complemento inverso del AON que codifica los últimos 6 residuos de aminoácido de IFNb (véase el Ejemplo 2). Se generó un amplímero de PCR utilizando estos cebadores, se purificó, se digirió con las enzimas de restricción Bam HI y G/a 1, Y se clonó en los sitios BamHI y G/a I del vector pC4:HSA. Una vez confirmada la secuencia, se subclonó un fragmento Eco RI que contenía el casete de expresión de IFNb y albúmina en pEE12.1 digerido con Eco RI.
Adiciooalmente, el análisis del extremo N de la proteína de fusión de albúmina expresada mediante secuenciación de aminoácidos puede confirmar la presencia de la secuencia de IFNb esperada (véase más abajo)
Las proteinas de fusión de IFNb y albúmina de la invención comprenden preferiblemente la forma madura de HSA, es decir, Asp-25 a Leu-609, fusionada al extremo N o C de la forma madura de IFNb, es decir, Met-22 a Asn-187. En una realización de la invención, las proteínas de fusión de IFNb y albúmina de la invención comprenden adicionalmente una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente a las rutas secretoras del anfitrión utilizadas para la expresión. En una realizaciÓfl preferida adicional, el péptido señal codificado por la secuencia señal se retira, y la proteína de fusión de IFNb y albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de IFNb y albúmina de la invención pueden comprender secuencias señal heterólogas incluyendo, pero no limitadas a, MAF, INV, Ig, Fibutina B, Clusterina, Proteína 4 de Unión al Factor de Crecimiento de tipo Insulínico, secuencias líder de HSA variantes incluyendo, pero no limitadas a, secuencia líder HSAlMAF quimérica, u otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. En una realización preferida, las proteínas de fusión de IFNb y albúmina de la invención comprenden el IFNb nativo. En otras realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de IFNb y albúmina de la invención comprenden adiciooalmente un residuo de metionina Nterminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluyendo los fragmentos y/o variantes, también están incluidos en la invención
Expresión y purificación de/ID de constructo 2053.
Expresión en líneas celu/ares NSO de mie/oma murino
EllO de constructo núm. 2053, pEE12.1 :IFNb-HSA, se sometió a electroporación en células NSO mediante métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 6).
Purificación del sobrenadante de células NSO
La purificación de IFNb-HSA del sobrenadante de células NSO puede implicar cromatografía de intercambio aniónico con Q-Sefarosa a pH 7,4 utilizando un gradiente de NaCI de O a 1 M en Tris-HC120 mM, seguida de cromatografía de intercambio aniónico en Poros PISO a pH 6,5 con un gradiente de citrato de sodio de 5 a 40 mM, y diafiltración 6 DV en citrato 10 mM, pH 6,5 Y NaCI 140 mM, la composición final de tampón. La secuenciación N-terminal proporciooaría la secuencia MSYNLL que es el extremo amino de la forma madura de IFNb. La proteína tiene un PM aproximado de 88,5 kDa.
Para una pu rificación a mayor escala, p ej., se pueden concentrar 50 L de sobrenadante de células NSO, en -8 a 10
L. La muestra concentrada se puede hacer pasar a continuación sobre una columna de intercambio aniónico con Q. Sefarosa (10 x 19 cm, 1,5 L) a pH 7,5 utilizando una elución por etapas que consiste en NaOAc 50 mM, pH 6,0 Y NaCI 150 mM. La muestra eluida se puede inactivar viralmente a continuación con Triton-X 100 al 75% durante 60 min a la temperatura ambiente. La cromatografía de fase inversa SOR (10 cm x 10 cm , 0,8 L) se puede emplear después a pH 6,0 con NaOAc 50 mM y NaCI 150 mM, o alternativamente, se puede hacer pasar la muestra sobre una columna de SP-sefarosa a pH 4,8 utilizando una diluciÓfl por etapas de NaOAc 50 mM, pH 6,0, Y NaCI150 mM Seguiría una filtración DV 50 para eliminar cualquier contenido viral. Puede estar seguido de una cromatografía con Fenil-650M (20 cm x 12 cm, 3,8 L) a pH 6,0 utilizando una elución por etapas que consiste en (NH4}2S04 350 mM y NaOAc50 mM, o alternativamente consiste en NaOAc 50 mM pH 6,0. La diafiltración durante 6-8 DV permitirá el intercambio de tampón en el tampón de la formulación final deseada de Na2HP04 10 mM + sacarosa 58 mM + NaCI 120 mM, pH 7,2 o citrato 10 mM, pH 6,5, Y NaCI140 mM o Na2HP04 25 mM, NaCI100 mM, pH 7,2.
La actividad de IFNb se puede analizar utilizando un análisis ISRE-SEAP in vitro
Todas las proteínas de interterón de tipo 1 señalizan a través de un complejo receptor común y una ruta de señalización JaklSTAT similar que culmina en la activación de los genes sensibles a Interterón, quot;IFNquot; por medio del Elemento de Respuesta a la Secuencia de Interter6n, quot;ISREquot;. Un análisis conveniente para la actividad de IFN de tipo 1 es un sistema de análisis basado en el promotor-indicador que contiene múltiples copias del elemento ISRE fusionado a un gen indicador aguas abajo. Se puede generar una línea celular HEK293 estable y contiene una copia integrada establemente de un gen indicador ISRE-SEAP que es extremadamente sensible a los IFN de tipo 1 Y presenta linealidad a lo largo de 5 logs de concentración.
Método de escrutinio de clones estables en NSO con /FNb-HSA
El constructo 2053 se sometió a electroforesis en células NSO como se describe en el Ejemplo 6 Las células NSO
transfectadas con el ID de constructo núm. 2053 se escrutaron para determinar la actividad sometiendo a ensayo el medio de crecimiento acondicionado en el análisis ISRE-SEAP. Las células indicadoras ISRE-SEAP/293F se cultivaron en placa a 3 x 104 célulaslpocillo en placas recubiertas con poli-D-lisina, de 96 pocillos, un día antes del tratamiento. Las células indicadoras se trataron con diferentes diluciones (incluyendo pero no limitadas a 1:500 y 1:5000) de sobrenadante acondicionado o preparaciones pu rificadas de proteína de fusión de IFNb y albúmina codificada por el ID de constructo 2053 o rhlFNb como control. Las células ind icadoras se incubaron a continuación du rante horas antes de separa r 40 ~L para su uso en el Análisis de Quimioluminiscencia de Gen Indicador SEAP (Catálogo Rache núm 1779842). Se utilizó Interteron beta humano recombinante, quot;rhIFNbquot; (Biogen), como control positivo.
Resultado
La preparación pu rificada de IFNb-HSA expresada por NSO tenía una CESO de 9,3 x 10-9 glmL mayor la de rhlFNb (Biogen) que tenía una CE50 de 1,8 x 10. 10 glmL (véase la Figura 4).
Inducción in vivo de OAS por un interlerón
Método
La enzima OAS, 2'-5'-OligoAdenilato Sintasa, es activada a nivel transcripcional por el interterón en respuesta a una infección antivira l. El efecto de los constructos de interterón se puede medir obteniendo muestras de sangre de monos tratados y ana lizando estas muestras para determinar la activación transcripcional de dos ARNm de OAS, p41 y p69. Se puede obtener un volumen de 0,5 mL de sangre completa de 4 animales por grupo en 7 puntos tempOfales diferentes, día O, día 1, día 2, día 4, día 8, día 10, y día 14 por animal. Los diversos grupos pueden incluir inyección de control de vehículo, inyección intravenosa ylo subcutánea de 30 ~gfkg y/o 300 ~gfkg de proteína de fusión de IFN y albúmina el día 1, e inyección subcutánea de 40 ~glkg de Interteron alfa (Schering-Plough) como control positivo los días 1, 3, Y5. Los niveles de los transcritos de ARNm p41 y p69 se pueden determinar mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman) utilizando sondas específicas para p41-0AS y p69-0AS. Los niveles de ARNm de OAS se pueden cuantificar con respecto al control endógeno de ARN ribosomal18S.
Inducción in vivo de DAS por proteína de fusión de interferán beta y albúmina codificada por el ID de constructo 2053.
Método
La actividad de la protelna de fusión de HSA-IFNb codificada por el constructo 2053 se puede analizar en el análisis de OAS in vivo como se ha descrito anteriormente en el encabezamiento de la subsección quot;Inducción in vivo de OAS por un interterórJquot;.
Ejemplo 77: Indicaciones para proteinas de fusión de IFNa2 y albúmina
La proteína de fusiÓfl de IFNa2 y albúmina (incluyendo, pero no limitado a, las codificada por el oonstructo 2053) se puede utilizar para tratar, prevenir, mejorar y/o detectar la esclerosis múltiple. Otras indicaciones incluyen, pero no se limitan a infecciones virales, incluyendo síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y otras infecciones por coronavirus; filovirus, incluyendo pero no limitados, virus Ébola y virus Martlurg; Arenavirus, incluyendo pero no limitados a, virus Pichende, virus de Lassa, virus Junín, virus Machupo, virus Guanarito; y virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV); Bunyavirus, incluyendo pero no limitados a, virus de Punta Toro, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea -Congo, virus de la fiebre de flebótomos, virus de la fiebre del Valle del Rif!, virus de La Crosse, y hantavirus; Flavivirus, incluyendo pero no limitados a, fiebre amarilla, virus Banzi, virus del Nilo Occidental, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre hemorrágica de Omsk, y virus de la enfermedad de la selva de Kyasanur; Togavirus, incluyendo pero no limitados a, virus de la encefalitis equina de Venezuela, este y oeste, virus del río Ross, y virus de la rubéola; Ortopoxvirus, incluyendo pero no limitados a, Vaccinia, viruela bovina, viruela, y viruela del mono; Virus del herpes; InftuenzaAlB; virus respiratorio sincitial (VSR); parainfluenza; sarampión; rinovirus; adenovirus; virus del bosque de Semliki; fiebres hemorrágicas virales; Rhabdovirus; Paramixovirus, incluyendo pero no limitados a, virus Nipah y virus Hendra; y otros agentes virales identificados por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos como agentes de enfermedades de alta prioridad (es decir, agentes de Categoria A, B, Y C; véanse, por ejemplo, I\I1oran, Emerg Med Clin. North. Am. 2002; 20(2): 311-30 y Oar1ing et al., Emerg. Med. Clin. North. Am. 2002; 20 (2):273-309).
Ejemplo 78: ID de constructo Núm. 3691. IFNa2·HSA, Generación.
El ID de constructo 2249, pSAC35:IFNa2.HSA, comprende AON que codifica una proteina de fusión de IFNa2 y albúmina que tiene la secuencia líder quimérica de HSA, seguida de la forma madura de la proteína IFNa2, es decir, C1-E165, fusionada al extremo amino de la forma madura de HSA en el vector de expresión pSAC35 de levadura S.
cereVISlae
Clonación del ADNc de IFNa2
El polinucleótido que codificaba IFNa2 se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores IFNa2-1 e IFNa2-2, descritos a continuación. Se cortó el amplímero de la PCR con Sal I/Gla 1, y se ligó en pScCHSA cortado con Xho l/G/a 1. El ID de constructo núm. 2249 codifica una protefna de fusión de albúmina que contiene la secuencia líder quimérica de HSA, la forma madura de IFNa2, seguida de la proteína madura HSA.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos adecuados para la amplificación por PCR del polinucleótido que codificaba la forma madura de IFNa2, IFNa2-1 y IFNa2-2·
IFNa2-1 . 5'-CGCGCGCGTCGACMAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCACA-3' (SEO ID NO: 109)
IFNa2-2 5'-GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAACTTICT-3' (SEO ID NO: 11 0)
El cebador IFNa2·1 incorpora un sitio de clonación Sal I (que se muestra subrayado), nucleótidos que codifican los últimos tres residuos de aminoácido de la secuencia lider de HS quimérica, así como 22 nucleótidos (que se muestran en negrita) que codifican los primeros 7 residuos de aminoácido de la forma madura de IFNa2. En IFNa22, el sitio Gla I (que se muestra subrayado) y el AON que le sigue son el complemento inverso del AO que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína madura HSA y los últimos 22 nucleótidos (que se muestran en negrita) son el complemento inverso del ADN que codifica los últimos 7 residuos de aminoácido de IFNa2 (véase el Ejemplo 2). Se generó un amplímero de PCR de IFNa2-HSA uti lizando estos cebadores, se purificó, se digirió con las enzimas de restricción 5a/1 y Gla 1, y se clonó en los sitios Xho I y Gla I del vector pScCHSA. Una vez confiOllada la secuencia, el casete de expresión que codificaba esta proteína de fusión de IFNa2 y albúmina se subclonó en pSAC35 digerido con Not 1.
Adicionalmente, el análisis del extremo N de la proteína de fusión de albúmina expresada mediante secuenciación de aminoácidos puede confiOllar la presencia de la secuencia de IFNa2 esperada (véase más abajo).
Se han construido otras proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina utilizando diferentes secuencias líder mediante métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 2). Los Ejemplos de las diversas secuencias líder incluyen, pero no se limitan a, inver1asa quot;INVquot; (constructos 2343 y 2410) Y factor de apareamiento alfa quot;MAFquot; (constructo 2366) Estas proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina se pueden subclonar en vectores de expresión de mamífero tales como pC4 (constructos 2382) y pEE12.1 como se ha descrito previamente (véase el Ejemplo 5). También se pueden construir proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina con la porción terapéutica fusionada en el extremo C a HSA (constructo 2381)
Las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina de la invención preferiblemente comprenden la foOlla madura de HSA, es decir, Asp-25 a Leu-609, fusionada al extremo N o C de la forma madura de IFNa2, es decir Cys-1 a Glu-165. En una realización de la invención, las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina de la invención comprenden adicionalmente una secuencia señal que di rige el polipéptido de fusión naciente a las rutas secretoras del anfitrión utilizado para la expresión. En una realización preferida adicional, el péptido señal codificado por la secuencia señal se retira, y la proteína de fusión de IFNa2 y albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina de la invención pueden comprender secuencias señal heterólogas incluyendo, pero no limitadas a, MAF, INV, Ig, Fibu lina B, Clusterina, Proteína 4 de Unión al Factor de Crecimiento de tipo Insulinico, secuencias lider de HSA variantes incluyendo, pero no limitadas a, una secuencia lider de HSAlMAF quimérica, u otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. En una realización preferida, las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina de la invención comprende el IFNa2 nativo. En otras realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina de la invención comprenden adicionalmente un residuo de metionina N-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluyendo los fragmentos y/o variantes, también están íncluidos en la ínvención.
Expresión y purificación del ID de constructo 2249
Expresión en levadura S. cerevisiae
La transformación del constructo 2249 en la levadura S. cerevisiae cepa BXP10 se llevó a cabo med iante métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 3). Las células se pueden recoger en la fase estacionaria después de 72
horas de crecimiento. Los sobrenadantes se recogen aclarando las células a 30009 durante 10 mino Los niveles de expresión se examinan mediante detección por inmunotransferencia con suero anti-HSA (Kent Laboratories) o como anticuerpo primario. Se puede obtener una proteína de fusión de IFNa2 y albúmina con un peso molecular aproximado de 88,5 koa.
Purificación de sobrenadante de células de la levadura S. cerevisiae
El sobrenadante de células que contienen la proteína de fusión de IFNa2 y albúmina expresada a partir del ID de constructo núm. 2249 en células de levadura S. cerevisiae se puede purificar a pequeña escala sobre una columna de afinidad de péptido Dyax (véase el Ejemplo 4) o a gran escala siguiendo 5 etapas: diafiltración, cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna de Flujo Rápido de DEAE-Sefarosa, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) utilizando una columna de Butil 650S, cromatografía de intercambio catiónico uti lizando una columna de Flujo Rápido de SP-Sefarosa o una cromatografía de Blue-Sefarosa, y cromatografía de alto rendimiento utilizando una columna de alto rendimiento de Q-Sefarosa (véase el Ejemplo 4). La proteína de fusión de IFNa2 y albúmina se puede hacer eluir de la columna de Flujo Rápido de o EAE-Sefarosa con NaCI 100 -250 mM, de la columna de Flujo Rápido de SP-Sefarosa con NaCI 150 -250 mM, y de la columna de Alto Rendimiento de QSefarosa a 5 -7,5 mS/cm. La secuenciación N-terminal debe proporcionar la secuencia COLPa (SEO ID NO' 98) que corresponde a la forma madura de IFNa2.
La actividad de IFNa2 se puede analizar utifizando un análisis ISRE-SEAP in vitre
Método
La proteína de fusión de IFNa2 y albúmina codificada por ellO de constructo núm. 2249 se puede someter a ensayo para determinar la actividad en el análisis ISRE-SEAP como se ha descrito previamente en el Ejemplo 76. En resumen, los sobrenadantes de levadura acondicionados se sometieron a ensayo a una dilución 1:1000 para determinar su capacidad para una transducción de la señal ISRE directa sobre la línea celular indicadora ISRESEAPf293F. Las células indicadoras ISRE-SEAPf293F se cultivaron en placa a 3 x 104 célulasfpoci llo en placas recubiertas con poli-D-lisina, de 96 pocillos, un día antes del tratamiento. A continuación las células indicadoras se incubaron durante 18 o 24 horas antes de separa r 40 IJL para su uso en el Análisis de ouimioluminiscencia del Gen Indicador SEAP (Roche núm catálogo 1779842). Se utilizó el interferón beta humano recombinante, quot;rhIFNbquot; (Biogen), como control positivo
Resultado
La preparación purificada de IFNa2-HSA demostró un incremento relativamente lineal en el análisis ISRE~SEAP a lo
largo de concentraciones que oscilaban de 10-a 10' ng/mL (véase la Figura 5) o 10-10 a 10.6 ng/mL (véase la Figura 6).
Inducción in vivo de DAS porla fusión con interferon alfa codificada por el ID de constructo 2249
Método
La enzima OAS, 2'-5'-DligoAdenilato Sintasa, se activa a nivel transcripcional por el interferón en respuesta a la infección antiviral. El efecto de los constructos de interferón se puede medir obteniendo muestras de sangre de monos tratados y analizando estas muestras para determinar la activación transcripcional de dos ARNm de OAS, p41 y p69. Se obtuvo un volumen de 0,5 mL de sangre completa de 4 animales por grupo a 7 puntos temporales diferentes, dia O, dia 1, día 2, día 4, día 8, día 10, y dia 14 por animal. Los diversos grupos incluyen vehiculo de control, inyección intravenosa de 30 1J9lkg de HSA-IFN el día 1, inyección subcutánea de 30 1J9fkg de HSA-IFN el día 1, inyección subcutánea de 300 IJg/kg de HSA-IFN el día 1, e inyección subcutánea de 40 IJglkg de Interferon alfa (Schering-Plough) como control positivo los días 1, 3, Y 5. Los niveles de los transcritos de ARNm de p41 y p69 se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman) utilizando sondas específicas para p41-0AS y p69-0AS. Los niveles de ARNm de OAS se cuantificaron con respecto a un control endógeno de ARN ribosomal 18S. La fusión de albúmina codificada por el constructo 2249 se puede someter a experimentación similar
Resultados
Se observó un incremento significativo en los niveles de transcrito de ARNm para las DAS p41 Y p69 en monos tratados con HSA-interferón en contraste con los monos tratados con IFNa (véase la Figura 7 para los datos de p41 ). El efecto duró casi 10 días.
Ejemplo 79: Indicaciones para las proteínas de fusión de IFNa2 y albúmina
Se puede utilizar la proteína de fusión de IFN alfa y albúmina (incluyendo, pero no limitada a, aquellas codificadas por los constructos 2249, 2343, 2410, 2366, 2382, Y 2381 ) para tratar, prevenir, aliviar, ylo detectar la esclerosis múltiple. Otras indicaciooes incluyen, pero no se limitan a infecciones virales que incluyen Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SRAG) y otras infecciones por coronavirus; filovirus, incluyendo pero no limitados a virus del Ebola y
virus Marburg; Arenavirus, incluyendo pero no limitados a virus Pichende, virus Lassa, virus Junin, virus Machupo,
virus Guanarito; y virus de la coriomeningitis linfocitica (VCML); Bunyavirus, incluyendo pero no limitados a virus Punta toro, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la fiebre los flebotomos, virus de la fiebre del Valle del Rif!, virus La Crosse, y hantavirus; Flavivirus, incluyendo pero no limitados a fiebre amari lla, virus Banzi, virus del Nilo Occidental, virus del Dengue, virus de la encefalitis japonesa, encefa litis transmitida por garrapatas, fiebre hemorrágica de Omsk, y virus de la enfermedad de la selva de Kyasanur; Togavirus, incluyendo pero no limitados a, virus de la encefalitis equina de Venezuela, este y oeste, virus del río Ross, y virus de la rubéola; Ortopoxvirus, incluyendo pero no limitados a, Vaccinia, viruela bovina, viruela, y viruela del mono; Virus del herpes; InfluenzaAlB; virus respiratorio sincitial (VSR); parainfluenza; sarampión; rinovirus; adenovirus; virus del bosque de Semliki; fiebres hemorrágicas virales; Rhabdovirus; Paramixovirus, incluyendo pero no limitados a, virus Nipah y virus Hendra; y otros agentes virales identificados por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos como agentes de enfermedades de alta prioridad (es decir, agentes de Categoría A, B, Y C; véanse, por ejemplo, Moran, Emerg. Med. Clin. North. Am. 2002; 20(2): 311-30 y oarling et al., Emerg. Med. Clin North. Am. 2002; 20 (2):273-309).
Preferiblemente, la proteína de fusión de IFNCl-albúmina o la proteína de fusión de híbrido de IFN se administran combinadas con un antagonista de CCRS, adicionalmente asociado con al menos uno de ribavirina, IL-2, IL-12, pentafusida sola o combinada con una terapia con fármacos anti-VIH, p. ej., HAART, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones por VIH-1, VHC o infecciones simultáneas de VIH-1 y VHC en pacientes adultos y pediátricos no sometidos a tratamiento previo así como que han experimentado tratamiento
Ejemplo 80: ID de constructo núm. 3691, BNP-HSA, Generación
EllO de constructo núm. 3691, pC4:SPCON.BNP1-321HSA, comprende AoN que codifica una proteína de fusión de BNP y albúmina que tiene una secuencia líder consenso, secreción, seguida del péptido BNP activo, procesado (aminoácidos 1-32) fusionado al extremo amino de la forma madura de HSA en el vector de expresión de mamífero pC4 .
Clonación del ADNc de BNP para el constructo 3691
El polinucleótido que codificaba BNP se amplificó por PCR utilizando los cebadores BNP-1 y BNP-2, descritos más abajo, se cortó con Bam HI/Cla 1, y se ligó en pC4:HSA cortado con Bam H1ICla I dando como resultado el ID de constructo núm. 3691 . EllO de constructo núm . 3691 codifica una proteína de fusión de albúmina que contiene una secuencia líder consenso (SEO ID NO: 111) y la forma activa, procesada de BNP, seguida de la proteína madura de HSA (véase el SEO ID NO: 321 para el constructo 3691 en la Tabla 2).
Se sintetizaron dos oligonucle6tidos adecuados para la amplificación por PCR del polinucleótido que codificaba la forma procesada, activa de BNP, BNP-1 YBNP-2:
BNP-l: S'.QAGCGCGGATCCAAGCITCOOCCATCAT010GTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTOCTOCTGCTOCTGTG
.GCCCATGOTGTGGGCCAOCCCCAAGCTGGTGCA.AGG -J' (SEQ ID NO:46J)
BNP-2: 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTIGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTIGC-3' (SEO ID NO: 464).
BNP-1 incorpora un sitio de clonación Bam HI (subrayado), los polinucleótidos que codifican la secuencia líder consenso (SEO ID No: 111) (en cursiva), y los polinucleótidos que codifican la secuencia de los primeros siete aminoácidos de BNP (en negrita). En BNP-2, la secuencia subrayada es un sitio C/a 1, y los polinucleótidos que siguen contienen el complemento inverso del AON que codifica los últimos 6 aminoácidos de BNP (en negrita) y los primeros 10 aminoácidos de la proteína madura de HSA. Utilizando estos dos cebadores se amplificó mediante PCR la proteína BNP. Las temperaturas y los tiempos de hibridación y extensión se deben determinar empíricamente para cada par de cebadores y molde específicos
El producto de la PCR se purificó (por ejemplo, utilizando Wizard PCR Preps ONA Purification System (Promega Corp)) y a continuación se digirió con Bam HI y G/a L Después de una purificación adicional del fragmento Bam HI-G/a I mediante eleclroforesis en gel, el producto se clonó en pC4:HSA digerido con Bam HI /Gla t para producir el ID de constructo núm. 3691 . Se verificó la secuencia del constructo de expresión.
Expresión y Purificación de/ID de constructo 3691
Expresión en células 293F
El ID de constructo numo 3691, pC4:SPCON.BNP1 -321HSA, se transfectó en células 293F mediante métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 6)
Purificación de sobrenadante de células 293F
Se recogieron dos lilros de sobrenadanle 3 días después de la transfección. La proteína recombinante se capturó mediante una columna de 5 mi de Blue Sefarosa CL-5B (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EEUU) y se hizo
eluir por medio de NaCI 2 M. El material se unión a una columna HiPrep 16/10 Fenil FF rHigh subquot;) y se hizo eluir mediante MES 20 mM, pH 6,7. BNP-HSA se purificó adicionalmente mediante cromatografia en columna de hidroxiapatita en gradiente de tampón fosfato de sodio (0-20 mSfcm en 200 mi) a pH 6,8. El producto final se cambió a PBS pH 7,2 por medio de una columna de eliminación de la sal HiPrep 26f10 (Amersham Biosciences).
La actividad de BNP-HSA se puede analizar utilizando un análisis NPR-AlcGMP in vitro
El receptor del péptido natrurético A (NPR-A) es el receptor de señalización para BNP, y como tal es responsable de la mayoría de los efectos biológicos de BNP. La bioactividad de BNP está mediada por el dominio guanilil cidasa de NPR-A que convierte GTP en GMPc tras la activación. Un análisis conveniente para la actividad de BNP consiste en medir la estimulación por BNP de una línea celular 293F que expresa en exceso de manera estable NPR-A. La producción de cGMP en las células después de la exposición a BNP puede ser medida por un ELlSA para cGMP.
Método de escrutinio de clones estables de 293F para NPR-A
Se construyó el marco de lectura abierto de NPR-A humana en el vector de expresión pcONA3.1 (Invitrogen ). Se transfectaron establemente célu las 293F con el AON plasmíd ico mediante el método de Lipofectamine y se seleccionaron por medio de 0,8 !Jgfml de G418. Los clones 293FfNPR-A estables se escrutaron para determinar la mejor respuesta a BNP recombinante
Medición de la activación de cGMP
La activación de cGMP por BNP se llevó a cabo en células 293F/NPR-A y se midió por medio del kit de análisis de GMP cíclico CatchPoint (Molecular Oevices, Sunnyvale, CA, USA). En resumen, se lavaroo 50.000 células/pocillo de células 293F/NPR-A cultivadas en una placa de 96 pocillos en 80 !JI de tampón de prestimulación (Tampón Bicarbonato de Krebs-Ringer con glucosa 10 mM, pH 7,4, bicarbonato de sodio 15 nM, y 3-isobutil-1-metilxantina 0,75 mM). Se añadió BNP-HSA o BNP recombinante en 40 !JI de tampón de prestimulación a las células a 37quot;C durante 10 mino Las células se lisaron con 40 !JI de Tampón de Lisis durante 10 min con sacudimiento Las cantidades de cGMP en los productos lisados se cuantificaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultado
Se determinó la relación dosis-respuesta de BNP-HSA y BNP recombinante (véase la Figura 8). Las actividades máximas del Constructo ID núm. 3691 y BNP recombinante fueron similares (1,63 ± 0,016 vs 1,80 ±O,016 pm, respectivamente), con valOfes de CESO de 28,4 ± 1,2, Y0,46 ± 1,1 nM, respectivamente
BNP-HSA disminuye la presión sanguinea in vivo
Método
BNP reduce la presión sanguínea mediante vasodilatación directa asi como mediante supresión de los sistemas renina/angiotensinafendotelinafaldosterona. Se sometió a ensayo la capacidad de BNP-HSA para disminuir la presión sanguínea arterial en ratas espontáneamente hipertensas macho de tres meses de edad adquiridas de Taconic (Germantown, NY. USA). Las ratas espontáneamente hipertensas son hipertensas genéticamente con un inicio de presión sanguínea elevada después de los tres meses de edad. Se reconstituyó BNP-HSA o BNP recombinante en 0,3 cc de PBS por rata. Los fármacos se suministraron por medio de inyección en la vena de la cola. Se registraron las presiones sanguíneas sistólica y diastólica mediante el método del manguito en la cola utilizando el Sistema XBP-1000 (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Para cada dato de presión sanguínea, se tomaron 4-5 lecturas consecutivas y se promediaron. Se calculó la presión arterial media (PAM) como 1/3 presión sistólica + 213 presión diastólica. Para la determinación de la respuesta a la dosis, se midieroo las presiones sanguíneas 20 h después de la administración de pC4:SPCON.BNP1-321HSA a dosis de 0,5, 2, 6, Y 18 nmolesfkg.
Resultado
La presión sistólica típica de las ratas espontáneamente hipertensas fue de 180-200 mmHg antes de la administración de la dosis Un único bolo de 6 nmolesfkg de BNP-HSA suministrado por medio de inyección intravenosa en la vena de la cola disminuyó la presión tanto sistólica como diastólica, lo que representó una reducción de la presión arterial media (PAM) de más de 30 mmHg. La disminución de la presión sanguínea fue estacionaria y continuó durante un dia y luego volvió gradualmente a la del momento inicial a lo largo de varios días (véase la Figura 9). En contraste, debido a su aclaramiento espontáneo, un único bolo de 6 nmolesfkg de BNP recombinante, produjo solamente un descenso de la PA; muy transitorio de aproximadamente -15 mmHg.
Adicionalmente, se determinó la respuesta a la dosis 20 horas después de la inyección de un bolo de BNP-HSA en cuatro ratas espontáneamente hipertensas. Cero con cinco nmoles/kg de BNP-HSA produjeron una reducción media de 7 mmHg de PAM, mientras 6 nmolesfkg de BNP-HSA produjeron una reducción media de 30 mmHg de PAM, y una dosis elevada de 18 nmolesfkg de BNP-HSA solamente disminuyó la presión sanguinea ligeramente más que los 6 nmoles/kg
Inducción in vivo de cGMP en plasma por BNP-HSA
Método
La activación de cGMP intracelular por BNP da como resultado su liberación desde la celula a la circulación. El nivel de cGMP en plasma se correlaciona con la fisiología cardiovascular y renal inducida por BNP. Se ha utilizado el cGMP en plasma como un biomarcador para la acción de BNP in vivo. Para someter a ensayo la inducción de cGMP en plasma por BNP-HSA in vivo, ratones C57fBL6 macho de 11 a 12 semanas de edad recibieron un único bolo de BNP recombinante o BNP-HSA a una dosis de 6 nmoleslkg a traves de la vena de la cola. Se preparó plasma a partir de tomas de sangre de la cola a los S, 10, 20, 40, Y 80 min para el grupo que recibía las dosis de BNP recombinante ya los 640, 1440, 2880, Y 5760 min adicionales para el grupo con BNP-HSA. Los niveles en plasma de los ratones tratados con PBS como vehículo de control se recogieron como momentos cero. Los niveles de cGMP se determinaron mediante un kit de análisis fluorescente para GMP cíclico CatchPoint de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultado
Después de un único bolo intravenoso de 6 nmolesfkg de BNP recombinante o BNP-HSA, los niveles pico de cGMP en plasma sobre el momento inicial se incrementaron 3,9 o 5,6 veces, respectivamente (véase la Figura 10). Adicionalmente, la vida media del deterioro exponencial en la fase uno de cGMP después del tratamiento con BNP fue de 16 min (10 a 42 min, 95%CI ), mientras la vida media del deterioro exponencial en la fase uno de cGMP después de la administración de BNP-HSA fue de 1538 min (1017 a 3153 min, CI95%).
Análisis farmacocinético in vivo de la proteína de fusión de BNP y albúmina codificada por el ID de constructo 3691
Método
Los ratones C57/BL6 macho de 11 a 12 semanas de edad (obtenidos de Ace Animals, Boyertown, PA, USA) pesaban 25,1 ± 0,12 g en el momento del estudio. Todos los animales recibieron dosis a un volumen de 10 ml/kg de peso corporal. Se administró PBS a los animales antes de la dosis Se les inyectó intravenosamente BNP recombinante en la cola o subcutáneamente en la región escapular media
El análisis farmacocinélico se realizó en los siguientes grupos:
Tabla 8.
Grupo
Fármaco Dosis (mg/kg) Ruta Nftiempo Tiempo (horas)
1
BNP-HSA 2,19 Subcutánea 3 0,5, 2, 6, 16, 24 , 32, 48, 72 , 96
2
BNP-HSA 2,19 Intravenosa 3 0,083, 2, 6, 16, 24, 32, 48, 72 , 96
3
Vehículo O Subcutánea 3 Predosis
4
Vehículo O Intravenosa 3 Predosis
Se tomaron muestras de sangre de la vena cava inferior, se colocaron en un microrrecipiente recubierto con EDTA, y se almacenaron en hielo. Las muestras se centrifugaron en una microcentrífuga a 14.000 rpm (16.000 xg) durante 10 minutos a la temperatura ambiente. El plasma se transfirió a tubos agrupados y se almacenó a -80quot;C
Se determinaron las concentraciones de BNP-HSA en muestras de plasma utilizando el Kit de EIA para BNP (Phoenix Pharmaceutical, Belmont, CA, USA). Se generaron las curvas patrón al mismo tiempo sobre la misma placa con muestras de ensayo. El límite de detección fue de 0,11 ng/mL para el BNP recombinante. El análisis detecta BNP recombinante y no presenta reacción cruzada con BNP de ratón
El análisis se llevó a cabo mediante métodos no compartimentales (WinNonlin; versión 4.1, Pharsight Corp., Mountain View, CA, USA). En el análisis se utilizó la concentraciÓfl media en plasma en cada momento. Se utilizó un método trapezoidal lineal arriba/lag abajo para calcular el AUCe, . La extrapolación para AUCo-.. en el infinito se realizó dividiendo la última concentración observada por la constante de la velocidad d de eliminación terminal. Los datos se pesaron uniformemente para estos análisis.
Resultado
la concentración media en el momento inicial de BNP-HSA en plasma detectada en las muestras pre-dosis fue de aproximadamente 0,081-0,095 I-Ig/mL Después de una única inyección intravenosa o subcutánea, BNP-HSA tuvo una vida media de eliminación terminal de 11.2 (suministro intravenoso) o 19,3 h (suministro subcutáneo), mientras la vida media de BNP recombinante en los ratones fue de 3,1 mino El análisis no compartimental de BNP-HSA reveló que BNP-HSA tenia las siguientes características'
Tabla 9
Unidad
Intravenoso Su bcutáneo
.....
h NA 16
C~,
¡Jg/ml NA 11,2
tll2.term
h 11 ,2 19,3
AUCo....
I h~g/mlYlmglkg) 658,9 227,9
Vquot;
mllkg 37 NA
V, o V,/F
mllkg 53,5 268
Cl o CUF
ml/hlkg 3,3 9,6
MRT
h 11 ,2 19,8
Biodisponibilidad
% 34,6
Cmax , concentración pico en plasma del fármaco; tm.x, tiempo de max concentración en plasma mum; AUCo... área bajo la curva de concentración de fármaco en plasma-tiempo desde tiempo O a infinito; tIl2.tem, vida media en la fase de eliminación terminal; Cl, aclaramiento después de la dosificación intravenosa; CUF, aclaramiento aparente después de la dosificación subcutánea; Vquot; , volumen de distribución en estado estacionario después de la dosificación intravenosa; V, : volumen de distribución durante la fase terminal después de la dosificación intravenosa; Vz/F, volumen de distribución durante la fase terminal después de la dosificación subcutánea; NA, no aplicable
Se seleccionaron cinco puntos en la fase terminal del perfil intravenoso y cuatro puntos en la fase terminal del perfil
10 subcutáneo para el cálculo de la vida media terminal. El AUC resultante durante esta fase terminal fue aproximadamente 10% del AUC total para los perfiles intravenoso y subcutáneo, respectivamente. Esto se compara con solamente 2% y 4% del AUC total para el perfil intravenoso y subcutáneo, respectivamente, cuando se seleccionaron los últimos tres puntos para el cálculo de la vida media terminal
Ejemplo 81: Constructo ID núm. 3618, BNP(2X)-HSA, Generación
15 El ID de constructo núm. 3618, pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA, comprende ADN que codifica una proteina de fusión de BNP y albúmina que tiene una secuencia líder consenso, quot;secretanquot;, seguida de dos péptidos BNP activos, procesados (aminoácidos 1-32) en tándem fusionados al extremo amino de la forma madura de HSA en el vector de expresión de mamifero pC4
Clonación de AONc de BNP para el constructo 3618
20 Primero se amplificó el polinucleótido que codificaba el radical BNP duplicado a partir de la forma activa procesada de BNP (aminoácidos 1-32) utilizando cuatro cebadores BNP-1, BNP-2, BNP-3, Y BNP4, descritos más abajo, para crear dos fragmentos A y B. Después de la amplificación, se mezclaron dos fragmentos purificados (A y B) en una cantidad equimolar y se utilizaron como molde para la PCR y se amplificaron con dos cebadores BNP-5 y BNP-6, como se describe a continuación. El inserto BNP(2X) se digirió a continuación con BamHI and G/al y se ligó en un
25 vector pC4HSA previamente digerido con 8amHI y G/al dando como resultado el constructo 3618. El ID de constructo núm. 3618 codifica una proteína de fusión de albúmina que contiene una secuencia líder consenso, ~secreton~ (SEO ID NO: 111), y dos copias en tándem de la forma activa, procesada de BNP, seguidas de la proteína madura HSA (véase el SEO ID No: 483 para el constructo 3618 en la Tabla 2).
Primero se sintetizaron cuatro oligonucleótidos adecuadas para la amplificación por PCR de los polinucleótidos que codificaban dos fragmentos de proteína BNP:
BNP-l S'AGCCCCAAGATOOTGCAAGGOTCrGGCTGClTTGGGAGGAAGATQGACCOGATCAGCfCCTCCAGTG
GCTGGGcr OCAAAGTGCTGAGGCGGCAT -3' (SEQ ID NO:4$6)
BNP-2 5'-CCTIGCACCATCTIGGGGCTATGCCGCCCCAGCACTITGC-3' (SEO ID NO: 487) BNP-3 5'-GCAAAGTGCTGAGGCGGCATAGCCCCAAGATGGTGCAACG-3' (SEO ID NO: 488) BNP-4 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTIGTGTGCATCATGCCGCCTC AGCACTTIGC-3' (SEO ID NO: 489)
Utilizando el grupo de cebadOfes BNP-1fBNP-2 y BNP-3/BNP-4, se amplificaron por PCR dos fragmentos de proteínas BNP (A Y B, respectivamente). Las temperaturas y los tiempos de hibridación y extensión se deben determinar empíricamente para cada par de cebadores específicos y molde. Los fragmentos A y B se purificaron (por ejemplo, utilizando Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp», se mezclaron en cantidades equimolares, y se utilizaron como molde para la amplificación por PCR utilizando dos oligonucleótidos adicionales adecuados para la amplificación por PCR, BNP-5 y BNP-6:
BNP-S: S'-GAGCGCQQA.I!XAAGCITCCGCCATCA TGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT
GTGGCCCATGGTGTGGGCCAGCCCCAAOCTGOTGCAAGG .3'(SEQ ID NO:46J)
BNP-6: 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTIGC-3' (SEO ID NO: 464)
BNP-5 incorpora un sitio de clonación Bam HI (subrayado), polinucleótidos que codifican una secuencia líder consenso (SEO ID No: 111 ) (en cursiva), y polinucleótidos que codifican la secuencia de los primeros siete aminoácido de BNP (en negrita). En BNP-6, la secuencia subrayada es un sitio G/a 1, y los polinucleótidos que la siguen contienen el complemento inverso de AON que codifica los últimos 6 aminoácidos de BNP (en negrita) y los primeros 10 aminoácidos de la proteína madura HSA. Utilizando estos dos cebadores, se amplificaron mediante PCR una secuencia líder consenso y dos copias en tándem de péptidos BNP activos. Las temperaturas y los tiempos de hibridación y extensión se deben determinar empíricamente para cada par de cebadores específico y molde.
El producto de la PCR se purificó (por ejemplo, utilizando Wizard PCR Preps ONA Purification System (Promega Corp» y después se digiriÓ con Bam HI y G/a 1. Después de una purificación adicional del fragmento Bam HI-G/a I mediante electroforesis en gel, el producto se clonó en pC4:HSA digerido con Bam HI/C/a I para producir el ID de constructo núm. 3618. Se verificó la secuencia del constructo de expresión
Expresión y purificación del ID de constructo núm. 3618
Expresión en células 293F
El ID de constructo núm. 3618, pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA, se transfect6 en células 293F mediante métodos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 6)
Purificación de sobrenadante de células 293F
Se purificó pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA codificada por el ID de Constructo núm. 3618 como se ha descrito previamente en el Ejemplo 80 en la subsección de encabezamiento ~Purificación de sobrenadante de células 203F~
La actividad de BNP(2X)-HSA se puede analizar utilizando un análisis NPR-AlcGMP in vitro
Se puede analizar la actividad de BNP(2X)-HSA codificada por el Constructo ID núm. 3618 in vifro util izando un análisis NPR-AlcGMP como se ha descrito previamente en el Ejemplo 80 en la subsección de encabezamiento ~La actividad de BNP-HSA se puede ana lizar utilizando un anál isis NPR-AlcGMP in vitro~, y ~Método de escrutinio de clones estables NPR-A 203F~.
Resultado
Se determinó la relación dosis-respuesta de BNP(2X)-HSA y BNP recombinante (véase la Figura 8). Las actividades máximas de BNP(2X)-HSA codificada por el Constructo ID núm. 3618, y BNP recombinante fueron similares (1,68 ± 0,021, vs. 1,80 ± 0,016 pm, respectivamente), con valores de CE50 de 9,8 ± 1,1, Y 0,46 ± 1,1 nM respectivamente.
La descripción completa de cada documento citado (incluyendo patentes, solicitudes de patente, publicaciones de patente, artículos de revistas, resúmenes, manuales de laboratorio, libros, u otras descripciones) así como la
información disponible a través de Identificadores específicos para bases de datos tales como GenBank, GeneSeq,
o el Registro CAS, referidos en esta solicitud se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad
Además, la memoria descriptiva y la lista de secuencias de cada una de las siguientes solicitudes de los Estados Unidos se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad: Solicitud de los Estados Unidos Núm. 601542 .274, presentada el 4 de Febrero de 2005; Solicitud de los Estados Unidos Núm. 601549.901 , presentada el 5 de Marzo de 2004; Solicitud de los Estados Unidos Núm. 60/556.906, presentada el 29 de Marzo de 2004; y Solicitud de los Estados Unidos Núm. 601636 .603, presentada el 17 de Diciembre de 2004
wo 2005/0n042---------------------------------------PCTfU5/20051004041
Expediente del Solicitante
Solicitud Internacional
Número de Referencia: PF612PCT
Número: No cedida
INDICACIONES RELACIONADAS CON EL MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO (Norma PCT 13bis)
A. La indicaciones realizadas más abajo se refieren al material biológico depositado referido en la Tabla 3,
página 25 de la descripción
B. IDENTIFICACiÓN DEL DEPÓSITO:
Otros depósitos se identifican
en una página adicional :
Nombre del Depósito:
Dirección del Depósito: 10801 Universily Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 Estados Unidos de América
Número de Acceso
Fecha del Depósito Número de Acceso Fecha del Depósito
1
PTA 3759 04 Oct 2001 2 PTA 3764 04 Oc! 2001
3
PTA3941 19 Dic 2001 4 PTA 3763 04 Oc! 2001
5
PTA-3940 19-Dic-2001 6 PTA-3942 19-Dic-2001
7
PTA 3939 19 Dic 2001 8 PTA 3943 19 Dic 2001
9
PTA-4670 16-Sept-2002 10
CANADÁ
El solicitante reclama que, hasta que una patente Canadiense haya sido expedida basándose en una solicitud o la solicitud haya sido rechazada, o se abandone y no sea susceptible de reposición, o se retire, el Comisionado de Patentes autorice solamente la entrega de una muestra del material biológico depositado referido en la solicitud a un experto independiente nombrado por el Comisionado, el solicitante debe, mediante una declaración descrita, informar a la Oficina Intemacional en este sentido antes de completar las preparaciooes técnicas para la publicación de la solicitud internacional.
NORUEGA
El solicitante de la presente reclama que la solicitud haya sido abierta a la inspección pública (por la Oficina de Patentes Noruega), o haya sido finalmente resuelta por la Oficina de Patentes Noruega sin haber sido abierta a la inspección pública, la entrega de una muestra deberá ser efectuada solamente a un experto en la técnica. La petición a este efecto debe ser presentada por el solicitante a la Oficina de Patentes Noruega a más tardar en el momento en el que esta solicitud esté disponible al público en las Secciones 22 y 33(3) del Acta de Patentes Noruega. Si semejante petición ha sido presentada por el solicitante, cualquier petición rea lizada por una tercera parte para la entrega de una muestra indicará el experto que la vaya a utilizar. El experto puede ser cualquier persona incluida en la lista de expertos reconocidos elaborada por la Oficina de Patentes Noruega o cualquier persooa aprobada por el solicitante en el caso individual.
AUSTRALIA
El solicitante de la presente comunica que la entrega de una muestra de un microorganismo debe ser efectuada solamente antes de la concesión de una patente, o antes de la prescripción, denegación o retirada de la solicitud, a una persooa que sea un destinatario experto sin un interés en la invención (Regulación 3.25(3) de las Regulaciones de Patentes Australiana).
FINLANDIA
El solicitante de la presente reclama que, hasta que la solicitud haya sido abierta a la inspección (por el Consejo Naciooal de Patentes y Regulaciones), o haya sido finalmente decidido por el Consejo Nacional de Patentes y Registro sin haber sido abierta a la inspecciórJ pública, la entrega de una muestra se deberá efectuar solamente a un experto en la técnica
REINO UNIDO
El solicitante de la presente reclama que la entrega de una muestra de un microorganismo se realice solamente a un experto. La petición a este efecto debe ser presentada por el solicitante en la Oficina Intemacional antes de completar las preparaciones técnicas para la publicación intemacional de la solicitud.
DINAMARCA
El solicitante de la presente reclama que, hasta que la solicitud se haya abierto a la inspección pública (por la Oficina de Patentes Danesa), o haya sido finalmente decidido por la Oficina de Patentes Danesa sin haber sido abierta a la inspección pública, la entrega de una muestra se deberá efectuar solamente a un experto en la técnica. La petición a este efecto deberá ser presentada por el solicitante a la Oficina de Patentes Danesa a más tardar en el momento en el que la solicitud esté disponible al público en las Secciones 22 y 33(3) del Acta de Patentes danesa. Si semejante petición ha sido presentada por el solicitante, cualquier petición realizada por una tercera parte para la entrega de una muestra indicará el experto que la vaya a utilizar. Ese experto puede ser cualquier persona incluida en una lista de expertos recooocidos proporcionada por la Oficina de Patentes Danesa o cualquier persona aprobada por el solicitante en el caso individual
SUECIA
El solicitante de la presente reclama que, hasta que la solicitud haya sido abierta a la inspección pública (por la Oficina de Patentes Sueca), o haya sido finalmente decidido por la Oficina de Patentes Sueca sin haber sido abierta a la inspección pública, la entrega de una muestra se efectuará solamente a un experto en la técnica. La petición a este efecto será presentada por el solicitante a la Oficina Internacional antes de expiración de 16 meses desde la fecha de prioridad (preferiblemente en el Impreso PCTfROf134 reproducido en el anexo Z del volumen I de la Guia del Solicitante de PCT). Si semejante petición ha sido presentada por el solicitante cualquier petición realizada por una tercera parte para la entrega de una muestra indicará el experto que la vaya a utilizar. El experto puede ser cualquier persona incluida en una lista de expertos reconocidos proporcionada por la Oficina de Patentes Sueca o cualquier persona aprobada por un solicitante en el caso individual
PAíSES BAJOS
El solicitante de la presente reclama que hasta la fecha de una concesión de una patente de los Países Bajos o hasta la fecha en la que la solicitud sea rechazada o retirada o extinguida, el microorganismo deberá estar disponible como se dispooe en 31F(1) de las Normas de Patentes solamente para el préstamo de una muestra a un experto. La petición a este efecto debe ser proporcionada por el solicitante a la Oficina de la Propiedad Industrial de los Países bajos antes de la fecha en la cual la solicitud está disponible al público en la Sección 22C o la Sección 25 del Acta de Patentes del Reino de los Países bajos, con independencia de cuál de las dos fechas suceda primero.
Lista de secuencias
lt;110gt; Human Genome Sciences, Inc.
lt;120gt; Proteínas de fusión de albúmina
lt;130gt; PF612PCT
lt;150gt; 60/542,274
lt;151gt; 2004-02-09
lt;150gt; 60/549,901
lt;151gt; 2004-03-05
lt;150gt; 60/556,906
lt;151gt; 2004-03-29
lt;150gt; 60/636,603
lt;151gt; 2004-12-17
lt;160gt; 489
lt;170gt; Patentin Ver. 2.0
lt;210gt; 1
lt;211gt; 585
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 1
Asp Ala HiG Lys Ser Glu Val Al~ Hia Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15
Glu Asn ~he Lya Ala Lcu val Leu 11c Al. Phe Ala Cln Tyr Lcu Gln 20 25 30
Gln Cys Pro phe clu Asp !lis val Lya Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 4S
Ph. Al. Ly. Thr Cys Val Al. A.p Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Ly. SO SS 60
Ser quot;eu His Thr Leu Ph. Gly Asp Lys Leu eys ,quot;, Val Ala Thr Leu 6S 70 75 .0
ArO (JIu Thr Tyr Gly Glu Me:t Ala Asp e,quot; eys Al. Ly. Gln Glu Pro
85 .0 9S
Glu Arg Asn Glu eya Phe Leu Cln His Ly. Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 lOS 110
Pro A.ro¡ Leu v.l A.rg Pro Glu v.l Asp v.l Met Cys Thr Al. Phe His 115 120 125
Aep Aso Glu Glu Thr Phe Leu Lya Lys Tyr Lcu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140
Arg His Pro Tyr Phc Tyr Al. Pro Glu Leu Leu Ph. Phe Ala Lys ArO 150 lSS 160
'lYr Lys Ala Ala Phs Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala ASp Lys Al. Al. 165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu A:r:g AS'I Glu Gly Lys A14 Ser 180 185 190
Ser Ala Ly, Gln Arg Leu Lys CY!l Ala Ser LeLL Gln Ly. Ph. Gly Glu 195 200 205
Alt;q Al. Ph. Lys Ala Trp Al. val Ala Argo Len Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys Mis Gly Asp Leu Len Glu Cys Ala Asp 'lt;5 250 255
ArO Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser 1le Ser 260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser Hls 275 280 285
Cys !le Ala Glu Val Glu Asn ASp Glu Met Prcl Ala Aap Leu Pro Ser 290 295 300
Leu Ala Ala AGp Phe Val elu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala JOS 310 3l~¡ 320
elu Ala Lys ASP Val Phe Leu Cly Met ph. LeLL Tyr elu TyJ: Ala Arg 325 3JO 3JS
Arg His !;'ro ASp Tyr Ser Val Val Leu Leu Len Arg Leu Ala Ly!!gt; Thr 340 345 350
Tyr elu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ahl Ala ASO Pro His Glu 355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe .l\.sp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 3.0
Gln ASn Leu Ile Lys Gln Asn Cys elu Leu PhE~ Glu Gln Leu Gly Glu
3.5 390 39~; 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Al. Leu Leu Val Aro Tyr-ThJ: Lys Lys v., Pro 405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu v.l Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 '30
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys Hi. Pro Glu Ala, Lys Met Pro Cys 435 440
1\la Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu Hi~ 450 455 460
Glu Lys Thr Pro val Ser quot;P Arg Val Thr Ly¡;; Cys Cys Thr Glu Ser ••5 470 475 ••0
Leu Val Asn Arg ArO Pro Cy. Phe Ser Al. Le!,;1 Glu Val Asp Glu Thr ••5 490 49•
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr phe, Thr phe His Al. AsO
500 50s 51.
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys LY$ Gln Thr Ala 515 520 525
Leu Val Glu Leu Vul Lys Hia Lya Pro Lys Al~ Thr Lya Glu Gln Leu 530 535 540
Lys Ala val Mel: Asp Asp Phe Ala Ala phe Val Clu Lys Cy~ Cys Lys 545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys phe Ala Glu Glu Gly Lys Ly$ Leu Val 565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 ses
lt;210gt; 2
lt;211gt; 1782
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 2 gal:qcacaca aqagtgagqt tgctcatcgg ttt.aaagatt tgggagaaga aaat.t.tcaaa gcCttg-gtgt tgattgcct.t tgct.cagti!llt cttco!Igcagt gtccatttga agatcatgta 12.
aaattagtga aattgtgaca cgtgaaacct tgct.t.cttgc gatgtgatgt gaaattgc:c:a tataaagct.g aagctcgatg gccagtctcc cogagatttc
atgaagtaac I:gaat.ttgca aaaacat.gt.g ttgctgatga gtcagctgaa 18. aatcacttca caceettttt ggagacaaa~ tatgcacagt tgcaactctt
quot;.
atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa J •• aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt
quot;.
gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat tt~~gaaaaa atacttatat
42. gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 48. cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctottocca 54. aacttcooga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt
,..
aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgccegagc quot;. ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 72.
gtccacacgo aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 99cggacctt 78. gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa
...
,..
aaacctctgt t ggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt ganagtaagg atgtttgcaa aaactatgct quot;. gaggcaaagg atgtcttcct gg9catgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcat cctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccBctct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgct8t gCCaaa9tgt tcgatgaatt t aaacctctt 1140 ~t99aa9agc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactctt9 tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaaca t 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1390 tgtgtgttgC atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc 1440 ttqgtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaa8catt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaaqagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgsg gagggtaaa~ aectt gttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag octtataaca tctacattta aaagcatctc ag 1792
lt;210gt; 3
lt;211gt; 609 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 3
Me' Lys Trp Val Thr Phe lle Ser Leu Leu Phl~ Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10
quot;
Tyr Ser Arg Gly Val Phc Arg Arg ,quot;O Al. Hil; Lys Ser Glu Val Al. 20 25 30
His Arg Phe Lya Jgt;.sp Leu Gly Glu alv Asn PhI'! Lys Al. Leu Val Leu 35 40 45
11e Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro) Phe Glu Asp His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala LYI; Thr Cys Val Ala Asp 65 70 7!i 80
Gl u Ser Ala Glu Asn Cys ASp Lys Ser LeU Hil! Thr Leu phe Gly ASP 85 90 95
Lys Leu Cya Thr Val Ala Thr Leu Argo Glu Th:r Tyr Gly Glu Mat Ala 100 lOS 110
ASP Cys Cys Ala Lys Gln Glu pro Glu Ar9 1'.51:'1 Glu Cys phe Leu Gln quot;' 120 125
His Lys Asp Asp ASO Pro Asn Leu pro 1'.r9 Leu val Arg pro Glu Val 130 135 140
ASp Val Mat Cys Thr Al . Phe His ASP Asn Glv Glu Thr Phe Leo..: 145 150 15:5
Lya Tyr Leu Tyr Glu :rie Ala Arg Arg Mis Pe') Tyr Phe Tyr Ala Pro 170 175
16'
Glu Leu Leu Ph. Phe Ala Lys Arg Tyr Lyo Al;!. Ala Phe Thr Glu Cya 180 18' 190
Cys Gln Al. Al. Jgt;.sp Lys Ala Al. Cys Leu Le'll Pro Ly. Lev Asp Glu 195 200 20S
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ly,s; Gln Arg Leu Lys Cys
210 21' 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly clu Arg Ala Ph~ Lys Ala Trp Ala val 225 230 21,S 240
Al. Arg Leu Ser Gln Aro Phe pro Lys Ala Glo Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Ly:;; t.eu Val Thr quot;O Leu Thr Lys val His Th:r Glu Cys Cy. His Gly 260 26' 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala ASp A·O Arg Ala ASID Leu Ala Lya Tyr !le 275 280 28'
Cys Glu Asn eln ASp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Ly. Glu Cys Cys Glu 295 300
quot;O
Lya Pro Leu Leu Glu Ly~ Ser His Cys lle Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 31:5 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al,i ASP Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys ASp val ey, Ly' Asn 'ryr Ala G1u gt;la Lys Asp Val .h. L.u G1y 340 345 350
Het Phe Lou ')'yr elu Tyr Ala ArO gt;rO His Pro Asp TYr Ser Val Val 355 360 355
Leu t..u t.eu ArQ Leu Ala Ly, Thr 'lYr elu Thr Thr Leu elu Lys Cys no 375 380
Cys A.la Ala Ala Asp Pro His Glu CyS Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu
385 3:10 395 400
Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gln Asn Leu 11e Lys Gln Asn Cys 405 410 415
elu Leo phe Glu Gln Leu Gly Clu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
val Arg Tyr Thr Lys LyS Val Pro Oln Val Ser Thr Pro Thr Leo Val 435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Cly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Het Pro Cys Ala elu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 415 480
Leo A~n Clo Leu Cys Val Leu Hi5 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495
val Thr Lys Cys Cys Thr elu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe SOO 505 510
Ser Ala t.eu G1u Val Asp Glu Thr TYr val Pro Lys G1u Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Tnr Phe Thr Phe His Al. Aop :I:le Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Ar. G1n Ile Lys Lys G1n Thr Ala Leu Val G1u t.eu Val Lys His Ly, 5lt;5 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Clrt Léu Lys Ala Val Mét ASp ASP Phé Ala 565 570 51S
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Al~ ASP Asp Lys GIu Thr Cys Phe SBO 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu
lt;210gt; 4
lt;211gt; 15
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; giro
lt;223gt; Péptido en lazador que puede usarse pa ra unir los dom inios VH y VL en un scFv.
lt;400gt; 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10 1 5 10 15
lt;210gt; 5
lt;211gt; 394
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 5
gcggccgccg gatgcaaggg ttcgaatccc ttogctctca ttattttttg ctttttctc;t 60
tgaggtcaca tgatcgcaaa atg9caaatg gcacgtgaag ctgtcgatat tggggaactg 120 t99t9gttgg caaatgacta attaagttag tcaaggcgcc-atcctcatga oaactgtgta 180 acataataac cgaagt.gtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa 2'0 aaaataagat atatataagg ttaagt.aaag cgtct;gttag aaaggGlBgtt ttt;cct.ttt;t 300 cttgctctct tgtctt.tt.ca tctactattt ccttcgtgta ataca99gtc gtcagataca 360 tagatacaat tc:tattaccc ccatccatac aatg 39.
lt;210gt; 6
lt;211gt;21 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 6
Met Lys val Ser val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu val Thr Ala 1 5 10 15
Leu Gly Ser Gln Al. 20
lt;210gt; 7 10 lt;211gt; 17
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Péplido señal de la eslaniocalcina
15 lt;400gt; 7 Mer Leu Gln Asn Ser Ala Val Le\.! Leu Leu Leu Val 11e Ser Al. Ser 1 5 10 15
Ala
lt;210gt; 8
lt;211gt; 24
lt;212gt; PRT 20 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 8
Mer Lys Trp Val Thr Phe !le Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 la
quot;
Tyr Ser Arg Gly val Phe Arg Arg 20
25 lt;210gt; 9
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 9
Mer Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser 5er Al. 1 5 10 15
Tyr Ser
lt;210gt; 10
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
35 lt;400gt; 10 Mer Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser
lt;210gt; 11
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 11
Mct Lcu Leu Gln Ala Pne Leu Pne LeU Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15
5 ¡le Ser Ala
lt;210gt; 12
lt;211gt; 86
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (84)
lt;223gt; Xaa es igual a uno cualquiera de Glu o Asp
lt;400gt; 12
Met Arg Phe Pro Ser t le Phe Thr Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser 1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Aso Thr Thr Thr Glu Asp G1u Thr Ala 20 25 30
Gln Ile Pr o Ala Glu Ala Val tle Cly Tyr Ser Asp Leu Glu G1y Asp 35 40 4S
15 Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu
50 55 60
Leu Ph. tle Aso Thr Thr Ile Ala ser I1e Al . Al. Lys Glu Glu Gly 6S 70 75 BD
Val Ser Leu quot;aa Lys Aro 85
lt;210gt; 13
lt;211gt; 24 20 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 13
Mer Lys Trp val Ser Phe tle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser S.. Al. 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Glu Lys Arg 20
lt;210gt; 14 25 lt;211gt; 24
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 14
Mer Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu phe ser Ser Ala 1 5 10 iS
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg 20
30 lt;210gt; 15 lt;211gt;21
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 15
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly 1 5 10 15
Ser Leu quot;. Ly' Ar.
lt;210gt; 16
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 16
Met Gly Trp Ser Oy. lle Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15
Vd Kis Ser
lt;210gt; 17
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 17
Met Glu Arg Ala Ah Pro Ser Arg Arg Vesl Pro Leu pro Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Gly Oly Leu Al. Leu Leu Ala Al. Oly Val Asp Ala 20 2S
lt;210gt; 18
lt;211gt; 22
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 18
Met Met Lys Thr Leu LElU Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu 1 5 10 15
Ser Gly Oln Val Leu Oly 20
lt;210gt; 19
lt;211gt;21
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 19
Mee Leu Pro Leu eye Lcu Val Ala Ala Leu Lcu Leu Ala Ala Oly Pro 1 5 10 15
Oly Pro Ser Leu Oly 20
lt;210gt; 20
lt;211gt; 24
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 20
Met Lys Trp val Ser Phe 1 le Ser Leu Leu Phe Leu phe Ser Ser Al. 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Oly V., Phe Arg Arg 20
lt;210gt; 21
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 21
Me' Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly V(J. l 1 5 10 15
Leu Gly
lt;210gt; 22
lt;211 gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 22
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gl y Val 1 5 10 15
Leu Gly
lt;210gt; 23
lt;211 gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 23
Het Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val 1 5 10 15
Leu Gly
lt;210gt; 24
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 24
Mquot;, Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Al a Gly Val 1 5 10 15
Ser Gly
lt;210gt; 25
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 25
Met Lys Trp val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val 1 5 10 15
Ser G1y
lt;210gt; 26
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 26
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu phe Leu Phe Ala Gly Val 1 5 10 15
Ser Gly
lt;210gt; 27
lt;211 gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 27
Melt; Lys Trp val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Val 1 5 10 15
Ser G1y
lt;210gt; 28
lt;211gt; 18
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221 gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (18)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 28
Mer Lys Trp Val Thr Phe 11e Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly G1y Val 1 5 10 15
Ser Gly
lt;210gt; 29
lt;211 gt; 23
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (14) a (23)
lt;223gt; Variante de la secuencia líder nativa de HSA
lt;400gt; 29 Het Lys Trp Val Thr Phe I1e Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly val
1 5 10
Léu Gly Asp Leu His Lys Ser 20
lt;210gt; 30
lt;211gt; 22
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Péptido señal sintético
lt;400gt; 30
Met Pro Thr Trp 'la Trp Trp Leu Phe Leu V.l Leu Leu Leu Al. Leu 1 5 10 15
Trp Al. Pro Al a Ar. Gly 20
lt;210gt; 31
lt;211gt; 17
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 31
Me, Phe Lys Ser Val val Tyr Ser 11c Leu Ala Ala Ser Leu Ala Aso 1 5 10 15
Al.
lt;210gt; 32
lt;211gt; 29
10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 32
Me' Asn 11e Phe Tyr rle Phe Leu Phe Leu Leu ser Phe Val Gl0 Gly 1 5 10 15
Leu olu Mis Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys 1gt;.rg 20 25
lt;210gt; 33 15 lt;211gt; 23
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 33
Me, Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Al. 1 5 10 IS
Ser Val ne quot;n Tyr Lys Arg '0
20 lt;210gt; 34
lt;211gt; 65
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 34
Me' Lys Leu Lys Thr Val ArO Ser Ala val Leu Ser Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15
Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro rle quot;,p ASP Thr Glu SQr Gln Thr Thr 20 25 30
Ser Val AS:l Leu Met Ala quot;p quot;p Thr Olu Ser Ala Phe Ala Thr Gln 35 40 45
Thr ICSn Ser Gly Gly Leu Asp v.l Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Ly~ 50 55 60
Arg 25 65
lt;210gt; 35
lt;211gt; 70
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
30 lt;400gt; 35
Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Al~ Val Leu Ser Ser Lcu Phe Al a 1 5 10 15
Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro l1e Aop Aop Thr Glu Ser Gln Thr Thr 20 25 30
Ser Val quot;n Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ale Thr Gln 3S 40 45
Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Vagt; Val Gly Leu Ue Ser y.et Ala Glu SO 55 60
Glu Gly Glu Pro Lys Arg 65 70
lt;210gt; 36
lt;211gt; 58
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador usado para generar un sitio Xhol 'i Glal en pPPG0006
lt;400gt; 36 gcctcgagaa aagagalgca cacaagagtg aggllgclca tcgatttaaa gatltggg 58
10 lt;210gt; 37
lt;211 gt; 59
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 15 lt;223gt; cebador usado para generar un sitio Xhol 'i Glal en pPPG0006
lt;400gt; 37 aatcgatgag caacctcact ctlgtgtgca tctctlltct cgaggctcct ggaataagc 59
lt;210gt; 38
lt;211 gt; 24 20 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador usado para generar un sitio Xhol 'i Glal en pPPG0006
lt;400gt; 38 25 tacaaaclla agagtccaat tagc 24
lt;210gt; 39
lt;211 gt; 29
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
30 lt;220gt;
lt;223gt; cebador usado para generar un sitio Xhol 'i Glal en pPPG0006
lt;400gt; 39 cactlctda gagtgglltc atatgtctl 29
lt;210gt; 40 35 lt;211gt;60
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; Misc Slructure 40 lt;223gt; Oligooucleótido sintético usado para alterar los sitios de restricción en pPPCOOO7
lt;400gt; 40 aagctgcctt aggctlataa taaggcgcgc cggccggccg tllaaactaa gcllaattct 60
lt;210gt; 41
lt;211gt; 60
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; Misc Structure
lt;223gt; Oligonucleótido sintético usado para alterar los sitios de restricción en pPPCOOO7
lt;400gt; 41 agaattaagc ttagtttaaa cggccggccg gcgcgcctta ttataagcct aaggcagctt 60
lt;210gt; 42
lt;211gt; 32
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador directo útil para la generación de la proteína de fusión de albúmina en la que el resto de albúmina está en el extremo N-terminal de la Proteína Terapéutica
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (18) lt;223gt;n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; característica miscelánea
lt;222gt; (19)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (20)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (21)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (22)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (23)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (24)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (25)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (26)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (27) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (28)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (29)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (30)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (31)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (32)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;400gt; 42 aagctgcctt aggcttannn nnnnnnnnnn nn 32
lt;210gt;43 lt;211gt;51
lt;2 12gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador inverso úti l para la generación de la proteína de fusión de albúmina en la que el resto de albúmina está en el extremo N-terminal de la Proteína Terapéutica
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (37)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (38) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (39)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (40)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea lt;222gt;(41)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (42)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (43)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (44) lt;223gt;n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (45)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (46)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (47)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (48)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (49)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (50)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (51)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;400gt; 43 gcgcgcgtlt aaacggccgg ccggcgcgcc lIatlannnn nnnnnnnnnn n 51
lt;210gt; 44
lt;211gt; 4
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 44
Leu 1.sp Lys Arg 1
lt;210gt; 45 lt;211gt;4
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 45 Leu Glu Lys Arg
lt;210gt; 46
lt;211gt; 33
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador directo útil para la generación de la proteína de fusión de albúmina en la que el resto de albúmina está en el extremo C-terminal de la Proteína Terapéutica
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (19)
lt;223gt; n = a, t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (20) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (21)
lt;223gt; n = a, t, 9 o c
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (22) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (23) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (24) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (25) lt;223gt;n= a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (26)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (27)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (28)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (29) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (30)
lt;223gt; n =a, t, goc lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (31)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (32)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (33)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;400gt; 46 aggagcgtcg acaaaagann nnnnnnnnnn nnn 33
lt;210gt; 47
lt;211gt; 52
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador inverso úti l para la generación de la proteína de fusión de albúmina en la que el resto de albúmina está en el extremo e-terminal de la Proteína Terapéutica
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (38)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (39)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (40)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (41)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (42) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (43) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (44) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (45) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (46)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (47) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (48) lt;223gt;n=a,t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (49) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (50)
lt;223gt; n =a, t, 9 o c
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (51) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (52) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;400gt; 47 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nn 52
lt;210gt;48 lt;211gt;9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 48
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His 1 5
lt;210gt; 49
lt;211gt; 11
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (1) a (11)
lt;223gt; Secuencia de Kozak
lt;400gt; 49 ccgccaccat 9 11
lt;210gt; 50 lt;211gt;46
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador directo útil para la inserción de la proteína terapéutica en el vector pC4: HSA
lt;220gt; lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (29)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (30)
lt;223gt; n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (31 )
lt;223gt; n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (32) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (33)
lt;223gt; n =a, t, 9 o c
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (34) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (35) lt;223gt;n =a,l, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (36) lt;223gt;n = a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (37) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (38)
lt;223gt; n= a, t, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (39)
lt;223gt; n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (40)
lt;223gt; n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (41 ) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (42)
lt;223gt; n= a, t, goc lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (43)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (44)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (45)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (46)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;400gt; 50 ccgccgctcg a9999t9t9t ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn 46
lt;210gt; 51 lt;211gt;55
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador inverso útil para la inserción de la proteína terapéutica en el vector pC4: HSA
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (38)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (39)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (40)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (41 )
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (42)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (43)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (44)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (45) lt;223gt;n=a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (46)
lt;223gt; n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (47)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (48)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (49)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (50)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (51) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (52) lt;223gt;n =a,t,goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (53)
lt;223gt; n =a, t, goc
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (54)
lt;223gt; n :: a, t, 9 o c
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (55)
lt;223gt; n :: a, t, 9 o c
lt;400gt; 51 agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nnnnn
lt;210gt;52
lt;211gt; 733
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 52
999at.ccgga gcccaaat.ct. tctgacaaaa ct.cacacatg cccaccgt.gc ccagcacct.g .0 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttCCtct tccccccaaa acccaaggac accct.catga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg ,.0 tcaagtecaa ceggt.acgt.9 gac99c9t99 aggtgcat.lt;lll tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta. caelcagctlcg tllcCgtgtgg tCelgcgtcct caccgeccq¡ ctlccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 3.0 agaaaaccat ctccaatlgcc aaagggcagc cccgagaacc acaggcgtac accctgcccc: 420 catcccggga tgagct gacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 4.0 atcc:aagcga catc9cc9t9 gagtg99aga gcaacg9'9'ca gccggagaac aactacaaga 540
ccacgcctcC cgtgctggac tccgacggc:t c:cttcttcct. ctacagct!lag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct t ctciltgctc cgtgiltgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgac9gcc9c 720 gactctagag gat 733
lt;210gt; 53
lt;211gt; 5
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERíSTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (3)
lt;223gt; Xaa es igual a cualquiera de los veinte L-aminoácidos de origen natural
lt;400gt; 53
Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5
lt;210gt; 54 lt;211gt;86
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; secuencia sintética con 4 copias en tándem del sitio de unión a GAS que se encuentra en el promotor de IRF 1 (Rothman et al., Immunity 1 :457-468 (1994»), 18 nucleótidos complementarios al promotor temprano de SV40, y un sitio de restricción Xhol.
lt;400gt; 54
gcgcctcgag atttccccga eatctagatt tccccgaaat 9atttccccg aaatgatttc 60 cccgaaatat ctgccatctc aattag 86
lt;210gt; 55 lt;211gt;27
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; secuencia sintética complementaria al promotor de SV40; incluye un sitio de restricción Hindlll.
lt;400gt; 55 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27
lt;210gt; 56 lt;211gt;271
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;221 gt; Protein_Bind
lt;223gt; Promotor sintético para uso en ensayos biológicos; incluye sitios de unión a GAS que se encuentran en el promotor de IRF 1
lt;400gt; 56 ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60 aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 120
gcccctaact ccocccagtt ccgcccattc tccgccccar: 90ctgactaa ttttttttat 180
ttatgcag8g gccgsggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 240
ttttgoaggc ctaggctttt gcaaaaagct t 271
lt;210gt; 57
lt;211gt; 32
lt;212gt; DNA 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador sintético complementario a la secuencia genómica humana del promotor de EGR.1 ; incluye un sitio de restricción Xhol .
lt;400gt; 57 10 gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32
lt;210gt; 58 lt;211gt;31
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
15 lt;220gt;
lt;223gt; Cebador sintético complementario a la secuencia genómica humana del promotor de EGR·1; incluye un sitio de restricción Hind 111
lt;400gt; 58 gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31
20 lt;210gt;59
lt;211gt; 12
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 59 25 ggggactttc cc 12
lt;210gt; 60
lt;211gt; 73
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
30 lt;220gt;
lt;223gt; Cebador sintético con 4 copias en tándem del sitio de unión a NF-KB (GGGGACTTICCC), 18 nucleótidos complementarios al extremo 5 'de la secuencia de promotor temprano de SV40, y un sitio de restricción Xhol.
lt;400gt; 60 gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatccto 60 ccatctcaat tag 73
35 lt;210gt; 61
lt;211gt; 256
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 40 lt;221gt; uniónJlroteína
lt;223gt; Promotor sintético para uso en ensayos biológicos; incluye sitios de unión a NF-KB.
lt;400gt; 61
ctcgagggga ctttcccggg gactttccgg ggactttccg ggsctttcca tctgccatct 60 csattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 120 cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt t t tat ttatg cagaggccgs 180
ggc:cgcctcg gcctctgagc tattccsgaa gt:aytgagga. ggct:tttt:tg gaggcctagg 240 ctt ttgcaaa aagctt 256
lt;210gt; 62 45 lt;211gt;23
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 62 cagglgcagc Igglgcaglc Igg 23
lt;210gt; 63
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 63 caggtcaacl taagggagtc tgg 23
lt;210gt; 64
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 64 gagglgcagc tggtggaglc Igg 23
lt;210gt; 65
lt;211 gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 65 cagglgcagc Igcaggagtc ggg 23
lt;210gt; 66 lt;211gt;23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 66 gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23
lt;210gt; 67
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de VH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 67 caggtacagc tgcagcagtc agg 23
lt;210gt;68
lt;211gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de JH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos lt;400gt; 68 Igaggagacg gtgaccaggg Igcc 24
lt;210gt; 69
lt;211gt; 24
lt;212gt;ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de JH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 69 Igaagagacg gtgaccatlg Ieee 24
lt;210gt; 70
lt;211gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de JH degenerado úlil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 70 Igaggagacg gtgaccaggg tlee 24
lt;210gt; 71 lt;211gt;24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de JH degenerado útil para amplificar los dominios de VH humanos
lt;400gt; 71 Igaggagacg gtgaccglgg Ieee 24
lt;210gt; 72
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 72 gacalccaga Igacccaglc lec 23
lt;210gt;73
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 73 galgllglga tgacleaglc lec 23
lt;210gt; 74
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 74 galallgtga tgacleagtc tcc 23
lt;210gt; 75
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 75 gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23
lt;210gt; 76 lt;211gt;23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 76 gacalcglga tgacccaglc tcc 23
lt;210gt; 77
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 77 gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23
lt;210gt;78
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 78 gaaattgtgc Igactcaglc Icc 23
lt;210gt; 79
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 79 cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23
lt;210gt; 80
lt;211gt; 23
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 80 cagtclgccc tgactcagcc tgc 23
lt;210gt; 81 lt;211gt;23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 81 tcctatgtgc tgactcagcc acc 23
lt;210gt; 82
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 82 tcttctgagc tgactcagga cee 23
lt;210gt; 83 lt;211gt;23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 83 cacgttatac tgactcaacc gcc 23
lt;210gt; 84
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 84 caggctgtgc tcactcagcc gtc 23
lt;210gt;85
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador directo de Vlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 85 aattttalgc tgaclcagcc cca 23
lt;210gt; 86
lt;211gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 86 acgttlgatt tccaccttgg Icce 24
lt;210gt; 87
lt;211gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador inverso de Jkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 87 acgtttgatc tccagcttgg tcee 24
lt;210gt; 88 lt;211gt;24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 88 acgtttgata tccactttgg tcee 24
lt;210gt; 89
lt;211 gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 89 acgtttgatc tccaccttgg teec 24
lt;210gt;90
lt;211gt; 24
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jkappa degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 90 acgtttaatc tccagtcgtg Icee 24
lt;210gt; 91
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 91 cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23
lt;210gt; 92
lt;211 gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 92 cagtctgcee tgactcagcc tgc 23
lt;210gt; 93
lt;211 gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 93 tcctalgtgc tgactcagcc acc 23
lt;210gt; 94
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para ampl ificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 94 tcllctgagc tgaclcagga cee 23
lt;210gt; 95
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para ampl ificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 95 cacgttalac Igactcaacc gcc 23
lt;210gt; 96
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 96 caggctgtgc tcactcagcc gtc 23
lt;210gt; 97
lt;211gt; 23
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Cebador inverso de Jlambda degenerado útil para amplificar los dominios de VL humanos
lt;400gt; 97 aallllalgc tgaclcagcc cca 23
lt;210gt; 98 lt;211gt;5
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 98
Cys Asp Leu Pro Gln 1 5
lt;210gt;99
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (23)
lt;223gt; Xaa es igual a Arg o Lys
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA lt;222gt;(113)
lt;223gt; Xaa es igual a Ala o Val
lt;400gt; 99
eys ~sp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Ar9 Arg Thr Leu Me' l 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Alt;g Xaa Ile Ser Leu ?he Ser Oy. Leu Ly. As, 20 25 30
Arg His ,quot;p phe Gly phe Pro Gln Glu Glu phe Gly ~sn Gln Phe Gln
35 .0 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Mee I le Gln Gln Ile Phc SO SS 60
Asn Leu Phe Thr Thr Lys Ser Ser Ala Al. Trp ASp Glu ASp Leu
65 70 'quot; 75 'O
Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln eln Leu Asn Asp Leu elu 85 90 95
Ala Cys Val Met eln Glu Cl u Arg Vel Gl, Glu Thr Pro Leu Met Asn 100 105 110
Xaa Asp Ser Ile Leu Ala Val Ly. Lys Tyr Phe Arg Ar. Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 13S 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg 145 150 155 160
Leu Arg Arg Lys Glu 165
5 lt;210gt; 100
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt; 10 lt;221gt; CARACTERíSTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (23)
lt;223gt; Xaa es igual a Arg o Lys
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICA MISCELÁNEA 15 lt;222gt; (113)
lt;223gt; Xaa es igual a Ala o Val
lt;400gt; 100
Cys ASp Leu Pro Gln Thr HilO Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr LCU Met 1 5 10 15
Le... Le... Ala Gln Met Arg Xaa 11e Ser Leu Phe Ser Cys Le.... Lys Asp 20 25 30
Arg Kis AS~ Phe Gly Phe pro Gln Gl.... Gl.... Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 4S
Ly, Al. Glquot; Thr Ile Pro V.l Leu His Glu Met 11e Gln Gln Ile Phe 50 60
quot;
gt;sn Lequot; Phe Ser Thr Ly. gt;SO Ser Ser 1\.la Al. Trp 1\.sp Gl.... Thr Leu 65 70 75 8.
Leu ASP Lys Phc Tyr Thr Gl.... Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 9. 95
Ala Cys val Met Gln Glu Gl.... Arg Val Gly Gl.... Thr PrO Leu Met Asn 100 lOS 110
Xaa A.sp Ser Ile Leu Ala Val Ly~ Lys TYr Phe Arg Arg Ile Thr Le.... 115 120 125
Tyr Le.... Thr G1... Lys LyS Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Clu Val Val Arg 130 135 140
Ala el... l1e Met Arg Ser Le.... Ser Le.... Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg 145 150 155 160
Leu Arg Arg Lys Cl... lOS
lt;210gt; 101
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (23)
lt;223gt; Xaa es igual a Arg o Lys
10 lt;400gt; 101
Oy' Asp Lcu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Lou Met l 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Are Xaa Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ly. AsO 20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Piquot;.e Pro Gln Glu Glu 'he Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45
Ly, Al. Glu Thr Ile Pro Vel Leu !lis Glu Mee Ile Gln Gln rito! ph. 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys quot;O Ser Ser Ala Ala Trp quot;O alu Thr Leu 65 75 80
quot;
Leu Aep Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Met Glu .5 'O 95
Ala Oy. Val 11. Gln alu val Gly Val Glu elu Thr Pro Leu Met Asn 100 lOS 110
Val Asp Ser lle Leu Ala val Lys Lys Tyr Phe Gln Aro Ile Thr Leu l1S 120 125
Tyr Leu Thr Glu Lys Lyo Tyr Ser 'ro Oy. Ala Tro Gl u Val Val Arg 130 135 140
Al. Glu Ile Met Ar. Ser Phe Ser Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Are 150 155 160
Leu ~g Arg Lys Glu
lt;210gt; 102
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (23)
lt;223gt; Xaa es igual a Arg o Lys
10 lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (97)
lt;223gt; Xaa es igual a Ser o Val
lt;220gt;
15 lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (98)
lt;223gt; Xaa es igual a Cys o Leu
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
20 lt;222gt; (99)
lt;223gt; Xaa es igual a Val o Cys
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (100) 25 lt;223gt; Xaa es igual a Met o Asp
lt;400gt; 102
Cys ASp Leu Pro Cln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Me' ArO' Xaa l l e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ly. ASO 20 25 30
Arg His Asp Phe el y Phe Pro Gln Glu Glu fhe Gly ASn Gln Phe Gln
35 .0
quot;
Ly. .lo Glu 't'hr 11e Pro Val Leu tlis clu y.et. ne Gln Gln 11e Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Ly~ Asp S~r Ser Ala Ala Trp Asp elu Thr Leu 65 70 75 80
Leu ASp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr eln eln Leu Asn A&P Leu Glu 85 90 9S
Xaa Xas Xaa Xaa Gln Glu val Gly Val 11e Glu Ser Pro Leu Mee Tyr 100 105 110
Glu ASp Ser Ile Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe eln Arg Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val val ArO' 130 135 140
Ala Glu 11e Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg 145 150 155 160
Leu Lys Ser Lys alu 165
lt;210gt; 103
lt;211 gt; 167
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (115)
lt;223gt; Xaa es igual a Ala o Val
10 lt;400gt; 103 Met Ser Tyr Asn Leu LeU Gly Pha Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15
Cys eln Lys Lev Lev Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu elu Tyr Cys Leu 20 25 30
Lys ASP Arg Met Asn Ph.e Asp tle pro elu Glu Ile Lys eln Leu eln 35 40 45
Gln phe elo Lys elu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr alu Met Leu Gln 50 55 60
Aon Ile phe Ala tle phe Arg Gln Asp Ser Ser Ala Ala. Trp Asp Glu 65 '0 75 80
Mp Leu Leu ASp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 8' 95
quot;
Leu Glu Ala Cys Val Met Oln Glu elu Ar. val Gly Glu Thr Pro Leu 100 105 110
Met Asn Xaa Asp Ser Ile Leu Ala. Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile 115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Thr Clu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 1]0 135 140
Val ~g Ala Glu tIe Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 145 1.50 155 160
Glu Arg Leu Arg A~g Lys Glu 165
lt;210gt; 104
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 104
Met Cy s ASP Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu 1 S 10 15
Het Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg IIe Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met 20 25 30
Asp Arg His quot;p Phe Gly Phe Pro eln Glu Glu Phe Aop ely Asn eln 35 40 45
'he Glr. Lys Ala Pro Ala 11e Ser Val Leu His elu Leu Ile Gln Gln 50 SS 60
Ile phe Asn Leu 'he Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 80
quot;
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His eln Ile Asn 85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ASp Phe Thr 100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu Hiquot;s Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly A.rg 115 120 125
lle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Hi., Cys Ala Trp Thr 1]0 1]5 140
Ile Val Arg val Glu Ile Leu Arg Asn Ph.e Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 16'
10 lt;210gt; 105
lt;211gt; 23
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt;
lt;223gt; Péptido seña l sintético
lt;400gt; 105
Met Ar~ Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15
Trp Ala Pro Ala Arg Gly
2.
lt;210gt; 106 lt;211gt;0
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador (suprimido)
lt;400gt; 106
lt;210gt; 107
lt;211gt; 106
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador para la amplificación de IFNb de longitud completa, tiene sitio de clonación BamH I
lt;400gt; 107
gcgcggatcc gaattccgcc gccatgacca acaagtgtct cctccaaatt gctctcctgt 60 tgtgcttctc cactacagct ctttccatga 9ctacaactt gcttgg 106
lt;210gt; 108
lt;211gt; 55
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; cebador para la amplificación de IFNb de longitud completa, tiene sitio de clonación Clal
lt;400gt; 108 gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcgtt tcggaggtaa cctgt 55
lt;210gt; 109
lt;211gt; 41
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Hamo sapiens
lt;400gt; 109 cgcgcgcgtc gacaaaagat gtgatctgcc tcaaacccac a 41
lt;210gt; 110
lt;211gt; 59
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Hamo sapiens
lt;400gt;11 0 gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcllc cllacltcll aaactttct 59
lt;210gt; 111 lt;211gt;21
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Hamo sapiens
lt;400gt; 111
Melt; Trp Trp A:n¡ Leu Trp Trp Leu 1 5
pro Mee val Trp Al. 20
lt;210gt; 112
lt;211gt; 24
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt;112
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 10 15
Me' Lys Trp Val Ser Phe tle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5
Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg 20
lt;210gt; 113
lt;211 gt; 1497
10 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Hypocrea jecorina
lt;400gt; 113 tctagagttq tgaagtcggt. aatcccgctg cgaagctgct gcga8cccgg agaatcgaga attagcatga aaggctatga gaaattctgq cttcgacaag cao!lagc:gtcc cgtcgcagta attcctaagt agcgatggaa ccggaataat g'ólt.tgcaatg caggggtact gagcttggac: cct.ttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga ctgcttgacc gactgqggct gttcgaagcc cgtagag9ca tgttgtgaat ctgtgtcggg gaaaccaccg atagcagtgt ctagt.agcaa aaatacaaac Ca.iltggctaa aagt.acataa gct.aataatt gtacaa.tcaa gtggctaaac t.gcagaagca acggcaaagc cccact.t.cc::c
agctggt gat cccccaattg ggtcgcttgt taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat aat.gtt.gaca ttcaaggagt attt.agccag tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt gtaagtcggc actgaacagg caaaagattg gggccttt:99 cctttgg gtg tacatgtttg tcgaacacac tgc;tgccttt Ac ca4gcAgc gccactgcat ggtttcgaat agaaaqagaa agcctcatta aaclt;¡gaatga gctagtaggc cgaggtcclt;¡t gcctccctca tgctctcccc acttgtacac catcttttga ggcacaglli!.l.a
15 lt;210gt;114
lt;211 gt; 366
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Aspergillus nidulans
20 lt;400gt; 114 agatctggtt cctgagtaca tctaccgatq ttcctaccat ttatgtccta tcgttcaggg ctcgat.tt gt ttccattatt cacgcaatta aggtcaattc gggtaao;racg cgatcllcgcc ttccccgcat. ataaacaacc cctccaccag tttcaagttg tcaaaagaoga ggattcaaaa gccatc
lt;210gt; 115
lt;211 gt; 1646
lt;212gt; DNA 25 lt;213gt; Hypocrea jecorina
lt;400gt; 115
10 15
tatagtaat a cgagtcgcat ctaaatactc 60 tgtgctggdill agcttctagc 989C99ct44 120 agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 180 gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240 ataataggca atacal:tgaq ttgcct.cgac JOO ataac:tgttc: c:gtaccccac ctcttctc8a J60 gtacaagt.cg taatcactat taacccagac lt;20 gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 480 cgaatgtagg Ilttgttatcc gaactctgct 540 caggacacgc ctcgaaggtt. cacggcaagg 600 cct.gtaaagc cgcaatgcag cat.cact.gga 660 gttaatgt:t:t aaagaagtca tatacca.gcg 720 gtaccgtaat ttgccaacgg ctt9t9999t '80 c::acgt.ttgtt tcttcactca gtccaatctc:: 840
ttgttccggt:. gélagtgaaag aagacagagg 900 acaaccaagg gcagtgat99 a.agacagtga 960 ggatgcttga gtgtatcgt.g taaggaggtt 1020 cacttctggt:. gaagtggtcc atattga.!lat 1080 agttgaaact 9cctaagatc tcgggccctc ll40 tgctccgggc aaatgcaa80g t9t 99t8ogga 1:200 tgag9gt.8t'] tgataggcaa atgttcaggg 1260 gcttagccaa. gaacaatagc cgataaagat 1320 aaagtcaqc9 aatgtgtata tata80aggtt 1380 atctactcat. caactcagat cctccaggag 1G40 cccaatagtc aaccgcggac tggcatc 1497
cgcctcgatc cccct.cttag ccgcatgaga
'O tcctatttgg accgctagaa atagactctg 120 cgatagtatt tggctctttt cgtttggccc 180 attgtggccg ccggcgt.tgt gctgctgcta 240 ttcgttgggc tttgcgaatg ctgtactcta JOO aatt.ao taccc-cagatat.caa agatatcaaa 360 366
tctagagttg tgaagtcggt aatcccgctg tatagtaata cgagtcgcat ctaaatactc 00 cgaaqctgct gcgaacccqg 3gaatcgaog3 tg tgctggaa agcttctagc gagcggctaa 120 attagcatga aag9c tatga gaaattctgg 3g3CggCttg ttgaatcat.g gcgttccatt ,.0 cttcgacaag caaagcgt.t.c cgt.cgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240 attcc::taagt. agcgatggaa ccggaat.aat atal:ltaggcCll atacatt.gag ttgcctcgac 300 g-9ttg-C331:9 cag9gg1:act gagcttggac atquot;,actgttc cgtaccccac ctcttctcaa 360 cctttggcgt tt.ccctgatt c3gcgtaccc gt.acaagtcg taatcactat taacccagac 420 tgoccggacg tgttttgccC ttcat.tt.gga gaaat.aatgt cattgcgat.g tgtaat.tt.gc 480 ct.gcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaat.gtagg attgttlltcc gaactctgct. 540 cgtagaggc8 tgttgtgaat. ct.gt9tcg99 caggaco.cgc ctcgaaggt.t cacggcaagg 600 gaaaccaccg atagcagtgt ctagt.agcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 660 aaatacaaac caatggc.taa aagtacataa gttaatlilcct anagaagtca tataccagcg 720 gctaataatt gtacaatcaa gtggct88ac gt.accgtaat: I:l:gccaacgg cttgt9g99t 780 tgcagaagca acggcaaaqc cccacttccc C8Clt;¡t.tt.gtt: tct.tca ctca gtccaatctc 840 agctglt;¡tgat. cccccaattg ggtcgcttgt ttgttccggt= gaagtgaaag quot;agacagagg 900 taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat acaaccaagg gcagtO'atO'g aagacagtga 960 aatgttgaca ttcaaggagt attt.agccag ggat.gctt.gll. qtqtatcqtg taaqgaggtt 1020 tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt cact:tctggt gaagtggtcc quot;tattgaaa!: 1080 gl:aa9tcg9c act.gaacagg caa8agattq agttgaaact gcctaagatc tcgglilccctc 1140 gggccttcgg cctl:t99O't O' t.acatgttl:g t gctccgggc alt;lal:gcaaag tOtggt89g8 1200 tcgaacacac tgctgccttt accaagcaqc tgag'ggtatg I:gataggcaa atgttcaggg 1260 gccactgcat gqtttcgaat agaaagagaa gcttagcctg cagcct.cl:ta tcgagaaaga 1320 aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aaoaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacqc 1380 tcgac ttcct gtcttcctat t9atl:9Ca9c ttccaal:etc gtcacac:aac: aaggtcctag 1440 ct.tagccaag aacaat.aacc: gataaagaea gcctcattaa acggaatgalt;¡ t;t.agtaggca 1500 aalt;¡tcagcga atgtgtatat a taaaggt tc gaggeccgtg cctccctcat gctcl:cccca 1560 tctact.catc aactcagatc ctccaggaga cttgtacacc atcttttgag gcacagaaac 1620
ccaatagtca accqcggact ggcatc 1646
lt;210gt; 116 5 lt;211gt;516
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Aspergillus nidulans
lt;400gt; 116
agatctggtt cctgagtaca tctaccgatg cgcctcgatc cccctcttag c:cgcat.gaga 60 ttcctaccat ttlt;ltgtccta tcgl:tcaggg tcctatttgg accgctagaa atagactctq 120 ctcgatttgt ttccattatt cacgcaat.ta cgati!'lgti!'ltt tggctctt.tt cgtttgg-ccc 180 aggtcaattc gg'ltaagacg cgatcacgcc att!,itggccg ccggcgCtgc a'1cctcttat 240 cgagaaagaa attaccgtcg ctcgtgattt gttt.gcaaaa agaacaaaac tgaaaaaacc 300 cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt gattgcagct tccaatttcg tcacacaaca 360 aggtc:c:tacg cc:ggcgttgt gc:tgctgcta ttccccqcat ataaacaacc cctecaccag .20 ttcgttgggc tttgc'1aatg ct.gtactcta tttcaagttg tcaaaagaga. ggattcaaaa 480 aattataccc cagatatcaa agatlltcaaa gccatc 510
10 lt;210gt; 117
lt;211gt; 495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt;117
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga cc:tt.gatgct cC!:l;Jgcacag 60 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120 gagga.gtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc: 180 cagcagatct t caatctctt cagcacaaag g!lctcatctg ctgctt.ggga tgagac::cctc 240 cta'1acaaat t.ctacac:t:ga actctaccag c:agc:tgaatg acctggaagc ctgt'1tgat.a 300 cn'1'1'1ggt'1g gggl:gac:aga gac:tcc:;cctg atgaagg39g actccattct ggc:tgtgagg 360 aaquot;-tacttcc a1111g.1atcac tctc:tat.ctg aaa'1agaaga aatacagccc ttgtgcct.gg 420 gaggttgtea gagcagaaat catgagatct ttttctttgt eaacaaactt gcaagaaagt .quot; ttaagaagta aggao. .,.
lt;210gt; 118 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
20 lt;400gt; 118
t.gtgat.ctgc ctcaaaccca cagcctgqgt. tct.agaagga ccttgatgct cctggcaeag 60 atgaggagaa tetetctttt etectgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaglt;;lct gaaaccatce ctgt.cctcca tlt;;Jalt;;Jatgatc lBO cagcagatct tcaat.etctt cagcaeaaag gactcatctg ctget:tggga tgagacccte 240 ctagacaaat. tet.¡sc¡sctga actctaccag cagct.gaatg acctggaagc ctgtgtgata '00 cagggggtgg gggtgacaga. gactcccctg atgaalt;;J9a 9lt;;l actccattct ggctgtgagg 360 aaatacttcc aaa9¿HI tCIlC tctetatctg aaagagaaga aataeagccc tt.gtgcctgg 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480 ttaagaagta aggaa 495
lt;210gt; 119 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 119
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcct999t tctagaagga ccttgatgct cctggcaeag 60 atgagljJagaa tetct.ctttt ctcctgct.tg aaggaeagac atgactttgg atttccecag 120 gaggaqtttg geaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc lBO
cagcagat.ct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240 ct.agacaaélt: t.ctacactgquot; actCtaCcag cagctgaat.g acctggaagc ctgtgtgata 'quot; cagggg9t99 99gt.9acaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360 aaatacttcc aaagaatcac tct.ctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 4BO ttaagaagta aggaa 49'
lt;210gt; 120
lt;211gt; 498
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 120
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga ccttgatgct cctgocacag 60 atgaggagaa tctct.ctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120 gaggagtttg gca8ccagtt cC6a88g9ct ga aaceatcc ctgtcctcca tgagat.gatc lSO cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgct.t.ggga tgagaccctc 2lt;0 ctagacaaat tctacactga actctaccag caget.gaatg acctggaagc ctgtgtgat.a '00 cagggggtgg gggt.gacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggct.gtgagg 360 aaat.,cttcc aaagaateac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcCtgg 420 gaggtt.gtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 4BO tt.aagaagta aggaataa 498
lt;210gt; 121 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 121
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt tctagaagga cctto;atgct cctggcacag 60
o.tgaggagaa tctctctttt Ctcct.gcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120
gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcetcca tgagatgatc 180
cagc8gatct. t.eaatetett cagcacaaag gaetcatctg ctgct.t.ggga tgagaccctc 240
ctagaeaaat tctacactga actetaccag eagct.gaatg acctggaagc etgt.gtgat.a
cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atga&.gga9g actccattct 99'Ct l1t ga'1g 36.
aaatacttcc aaagaatcae t.ctctatctg aaagagaaga aataeagccc ttgtgcctgg 420
gaggttgtca gagcogaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaa'1t 4SO
tt.aagaagta aggaa 495
'quot;
lt;210gt; 122 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 122
tgtgatctge ctcaaacc:ea eagc:etgggt tctagaagga ccttgatgc:t cctggc:acag 60 IlItgaggagaa tctctctttt c:tc:ctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccc:cag 120 g399a9ttt 9 gcaac:cagt t ccaaaag9Ct gaaaccatcc c:tquot;,tcctcca tgagatgatc lBO c:agca'1atc:t tc:aatctctt cagcac:aaag '1actc:atctg ctgcttggga tgagac:c:ctc 240 ctagacaaat tc:tac:actga ac:tc:ti!!lccag c:a'1c:tglultg ac:c:tggaagc ct9t9tgata 300 c:a'1'1'1'1'1t'1'1 '1'1'1tgaca'1a gac:tcccct'1 atgaagga'1g actc:c:at.tct 9'1ct9tgagg 360 aaatacttcc aaagaatcac tc:tctatctg aaagaglllaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggttgtc:a '1agcagaaat catgagatct ttttc:tttgt c:aacaaactt gcaagaaagt 480 ttaagaagta asgquot;'''' 49S
lt;210gt; 123 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 123
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcc:tgggt tctagaagga cc:ttgatgct cc:tggcacag 60 atgaggagaa tc:tCtctttt c:tcctgcttg aaggacagac atgactttgg 81tttccccag 120 gaggagttt'1 gc¡;¡accagtt ccaaaaggct gaaaccatcc: ctgtcc:tcc:a tgagatgatc: 1.0 cagcagat.ct tcaatc:tct.t cagcac8aag gactcatctg ctgcttggga tga'1accctc 240 ctagacaaat t.c:tacactga actctac:cag cagc:tgaatg llcctggaagc: ct.gt.gtgo9ta 300 C:09gO'0'99t9''1 gggtoacaga gactcccctg at9aagga99' actccattct ggctgt.gagg 360 aaatac:ttc:c: o9aa9'aatc:ac tc:tctat.c:tg aaagagaa9'a aatac:agecc ttgtgc:ct9'g 420 gaggttgtca gageag8laat catgagatct. ttttctttgt caacaaactt gc:aagaaagt 480 ttaagaagta aggaa 49'
lt;210gt; 124 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 124
tgtgatct.gc ctcaaac:cca cagcctgggt tctagaagga ccttgat.gct. c:ct.ggcacag 60 atgag'1agaa t.ctctctttt ctcc:tgc:tts aaggacagae atgactttgg a t t tcc:cca9 120 9a99a9ttt9 geaaecagtt ecaaaaggct gaaaceatcc: c:tgtc:cteca tgagatgatc: 1.0 ca'1cagatct teaatctett cagc:ace.e.ag gac:tcatctg ct'1cttgg'1a t gage.c:cc:tc: quot;O ctagac:allat tct.acactga actctaccag cagct'1aat.'1 acctg'1aagc: ct.gtgt.gat.o9 300 cagg'1ggtgg gggtgacaga gact.cccctg atgaaggagg actccatt.ct. g'1ct.gtgagg ,, 360 aaatactt.cc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aata.cagc:c:c tt.gtgcct'1g 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatc:t. ttt.tctttgt. ca.acaaac:tt gcaagaaagt 480 ttaagaagta aggaa 49'
lt;210gt; 125
lt;211gt; 495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 125
tgtgatctgc: ctcaaaccca cagc:c:tgggt tc:tagaagga ccttgatgc:t cctggcacag 60 atgaggagaa tctctctt.t.t ctcc:tgcttg aaggacagac a tgactttgg at.ttccccag 120 gaggagtttg gcaacClO'iJtt cc:aaaaggct gaaaccatc:c ctgtc:ctcca tgagatgatc 1'0 cagc:agatct tc:uatctctt c:agcacaaag gactcatct.g ctgc:tt999a tgagacc:c:tc 240 Ctagacaaat tctacac:t.ga ac:t.ctaccag cagctgaat.g acctggllagc ctgtgt'1at.a JOO cagggggt.gg gggt.gacaga qactclt;:;cct.g éltgaaggaogg ult;:;tccattct. ggctgt.gugg 360 aaat.ac:ttc:c: aaagaatc:ac tc:tc:tatctg a.:lquot;,gagaaga aataca'1ccc ttgt.gc:c:t.g'1 .20 gaggt.tgtc:a gagcagaaat c:atgagatct ttttc:t.ttgt. caac:aaac:tt. gc:aagaaagt 480 ttaaoaagta aggaa 49.
lt;210gt; 126 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 126
tgtgatc:tgc: ctcaaalt;:;lt;:;ca cagcctgggt tctagaagga c:ct.t'1atgct. cc:tggcacag 60 atgaggagaa tctc:tctttt ctcctgcttg a.aggac:agac atga.ctttgg atttccccag 120 oaggagtttg gcaac:cagtt c:c:aaaaggct. gaaaccatcc ctgt.cctcca tgagatgatc: 1.0 cagcagatct t.eaat.ctct.t. cagc:acaaag gac:tc:atctg ct.gcttgquot;,ga tgagaccctc 240 ctagac:aaat tctacact.ga ac:t.ctaccag cagc:t.gaat.g ac:c:tggaagc ctgtgtgac.a 300 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg 4tgaaggagg actccattct. ggc:t.gtgagg 360
aaatacttcc e.aagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct Uttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480 ttaagaagta aggaa 495
lt;210gt; 127 lt;211gt;501
lt;212gt; DNA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 127
atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttc:agtg tcagaagctc 60 ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatat tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120 c::ctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt qaccatc:tat 180 gagatgc:tcc agaacatctt tgctattttc agacae.gatt catctagcac tggctgge.at 240 gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agate.ae.cca tctgaagaca 300 gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360 cncctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420 tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc ctaagge.act tttacttce.t taacagactt 48. acaggttacc tccgaa,:quot;cta a 501
lt;210gt; 128
lt;211gt;501 10 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 128
atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60
c::tgtggc¡o~t t.gaatgggag gcttgaatat. tgcctcaagg acaggatgaa c;:tttl1~catc 12'
cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat. ,.,
gagatgctcc agaacatctt tgetattt.tc a g.:lcaagatt. c;:¡tctagcac tggctggaat
gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 'quot;
lO. gt.cctggaag aaaaactgga gaaagaagat. t.tcaccaggg gaaaact.cat gagcagtctg 360 c¡¡,cctgaalt;:la gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gta.cagtcac 42. tgtgcctgga ccatagtcag ageggaaatc ctaaggaact tetacttcat taacagactt 48. acaqgttacc tccgaaacta a SOl
lt;210gt; 129 15 lt;211gt;561
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 129
at.gaccaaca agtgtctCct ccaaattgct cecct.Q'tt.gt gct.t.ct.ccac t.acagctctt 60 t.ccatgagce acaacttgce t.ggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 12. ctcctgtggc aatt9aatgg gaggcttgaa tattgcct.ca aggacaggat. gaact.ttgac lO. atccctgagg a.gattaagca gctgcagcag t t ccagaagg aggacgccgc at.t.gaccatc 24. eatgagatgc tccagaacae ctetgctatt ttcagacaag attcatctag cactggct.gg lO. aatgagact.a ttgttgagaa cCtcctg9ct aatgtctatc atcagataaa ccat.ct.gaag 360 acagt.cctgg aagaaalulCt. ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact cat 9agcagt 42. ctgcacctga aaagatatt.a tgggaggat.t ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 4•• cactgtgcct. ggaccat.agt cagagtggaa atcct.aagga act.t.t.tactt cattaa~aga 54. ct.tacaggtt acctccgaaa c 561
20 lt;210gt; 130
lt;211gt; 498
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 130
atgagctaca acttgctl:gg al:.tcctacaa agaagcagca attt.tcagt:g tcagaagctc 6. ctgtggcaat I:gaatg9quot;gag gcttgaatat tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 12. cctgaggaga ttaagcagct 'ilcagcagttc cagaaggag9 acgccgcatt gaccatctat 180 gagatgctcc agaacatctt tgctattt.tc agacaagatt catctaocac t.ggctggaat 24. gagact.attg t.t9agaacct cctggctaat. gtctatcatc agataaacca tctgAagaca 300 gtcctlt;¡gaag aaaaact.9ga gaaagaagilt tt.caccagg9 gae.aact.cat. ga'ijcagt.ctg 36. cacctlt;¡Jaaaa ge.tattatgg gaggattctg cilttacctga aggccaagga gtacagtcac 420
tgtgcctgga ccat.agt:cag agtggaaatc ctaaggaact tttactt:cat taacagactt 480 acaggttacc tccgaaac
quot;.
lt;210gt; 131 lt;211gt;561
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 131
a t 9accaaCel agtgtc!;.cct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60 tccatgagct ocaactt;gct. t.ggattccta C/:laquot;g/:l/:lgca gcaattttca gtgtcagaag 120 ctcctqtggc aattgaatgq gaggcttgsa t attgcctca aggacaggat gaactttglic 180 atccctgsgg Ilgattaa.gcll gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 24. tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactlllt;;lctgg 3•• aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagquot;'tquot;,aa ceatctgaag 36. lt;Ilocagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt 42. ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc egaaggccaa ggagtacagt 48. cactgtgcct ggaccat;agt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 54. cttacaggtt acctccgaaa c '61
5 lt;210gt; 132 lt;211gt;501
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 132
atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagequot;'gca attttcagtg tcagaagctc 60 ctgtggcaat tgaatg9ga 9 gcttgaat.at tgcct.caagg acaggatgaa ctttgacatc 120 cctgaggaga ttaagcagct qcagcagttc cagaaggagq acgccgciltt gilccatctat 18. gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaquot;,gatt catctagcac tggctggaat 24. gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 300 gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaClctcat gagcClgtctg 36' cacctgaaaa g a tattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420 !;.gtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt ...
10 acaggttacc tccgaaacta a SOl
lt;210gt; 133 lt;211gt;561
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
15 lt;400gt; 133 atgaccaaca agtgtct.cct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 6. tccatgagct acaacttgct t.ggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 12. ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 18. atccctgagq agattaagca gctgca9cag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 24. tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt t t cagacaag attcatctag cactggctgg 3•• aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 36. acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt 42. ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa !Jgagtacagt 48.
cactgtgcct ggaccilltagt cagagtgg&a atcctaagga acttttactt cattaacaga 54. cttacaggtt acctccgaaa e 561
lt;210gt; 134 20 lt;211gt;561
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 134
atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 6. tccatgaget acaacttgct tggattecta caaagaagca geaattttca gtgt.cagaag 12. ctcctgtggc aatt gaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 18. atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg e.ggacgccgc attgacc¿!¡tc 24. tatgagatgc tccagaaci!lt ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg '.0 aatgagacca ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 36. Bocagt cc:tgg aagaaaaact ggaga.aagaa gatttcacca. ggggaaaact catgagcagt 42. ctgcacctga aaagatatt a tg99a9gat.t ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt. 48. C¿!¡ctgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttt;tactt cattaacaga gt;lt;. cteacaggtt acctccgaaa c 561
25 lt;210gt; 135
lt;211gt; 498
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 135
at.gagctaca acttgcttgg Ilttcctacall agllagcagca attttcagtg tCllgaagctc 60
c tgtgglt;;a6lt t961atg9ga'.1 gcttgaatat tgcctcaa'.1g acaggatgaa ctttgacatc 120
cct'.1aggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgclltt gaccatctat ,.0
gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt ciltctagc:ac tl19ctggailt 240
gagactattg ttgaga8cct cctggCt8e:t gtc:t8tcatc agataaacca tctgaagac8 300
gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gllllallctcat gagcagtctg 360
cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420
tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaaec ctaaggaac:t tttacttcat taacagoaett '.0
acaggttilC:C: tccgaaac 'quot;
lt;210gt; 136
lt;211gt; 498 5 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 136
atgagctaca 8cttgcttgg attcctac:&a agaagcagca attttc:agtg tc:agaagctc: .0
ctgtggc:aat tgaatgggag gcttgaatat tgcctcaagg ac:aggatgaa ctt tgacatc 120
cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc eagaaggagg aegccgcatt gaecatetat 180
gagat.gctcc agaacatctt t9ctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240
gagac tattg ttgag81:11cCt cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 300
gtcctggaag aaaaactgga gaal:llgaag8t ttcaccaggg ga8aactcat gageagtctg 3'0
cacctgaaaa gaeattatgg gaggattctg cattaectga aggccaagga gtacagtcac 420
tqt:gcctgga ccatagtcag agtggao.atc ctaaggaact ttt actt.cat tail;cagactt 480
acaggttaec tccgaaac
'quot;
lt;210gt; 137 10 lt;211gt; 498
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400,. 137
atgagctaca acttgcttgg attcetacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60
ctgtggeaat tgaatgggag gctegaatat tgccteaagQ' aeaggat:gaa ctttgacatc 120
cctgaggaga ttaagcagct gea.gcagctc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat ,.0
gagatgctcc aqaac:atctt tgctattctc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240
gagactattg ttgagaacct Cctggctaat gtctatcate agataaacca t.ctgaagaca 300
gtcct.ggaag l:laaaacCgga gaaagaagat ctcac:caggg gaaaacCcat gagcagtct.g 3'0
cacctgaaaa gatattatgg gaggactctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac '20
tgtgcctgga ccatagtcag agtqqaaatc ct.aaggaac t tttacttCat t.aacagactt 4.0
acaggttacc tcegattttc 4'.
lt;210gt; 138 15 lt;211gt; 495
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 138
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt il¡;jcaggogga ccttgntget cctggcacag .0
atgaggagaa t.ctet.ctt.t.t ctcetgctt:.g aaggaeagac atgac:t.ttgg ..tttecccag 120
gaggagtttg gcaaecagtt ccaaaaggct gaaaccatec ctgtcctcca tgagatgatc 180
cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg Ctgcttggga tgagaceetc 240
ctagacaaat tctacactga actct.accag cagctgaatg acttggaagc ctgtgtgatg 300
caggagga9a gggtqggaga aact.cccctg acgaatgcgg actccatctt ggctgtgaag 3.0
aaatacttec gaagaatcttC t.ctctatc:tg acagagaaga aatacagcce ttgtgcctgg 420
gaggttlt;;ltctt gagcagaaat catgagatcc ctctct.ttat caacaaaett gcaagaaaga '.0
ttaaggagga aggaa 49'
20 lt;210gt; 139
lt;211gt; 495
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 139
tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60
atgaggagaa t.ctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120
98ggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 160
cagcagatct tCllatctctt cagcllcllaag go!lctcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240
ctagacaquot;at tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaotc ctgtgtgatg 300
caggaagtgg gggtgataga gtctcccctg atge&cgagg actccatcct ggctgtgagg 360
aaatacttcc aaagaatcac tctatatctg acagagaaga aatacagctc ttgtgcctgg 420
gaggttgtca gagcagaaat catgagatcc ttctctttat caatcaactt gcaaaaaaga 460
ttgaagagta aggaa
'quot;
lt;210gt; 140 lt;211gt;495
lt;212gt; DNA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 140
tgegatctgc ctcaaaccca cagcctggge agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60
ato;Jaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120
gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca egagatgatc 160
cagcagatc:t tc:aatctctt c:agcllcaaag gactcatctg ct9cttggga tgagaccctc 240
ct.aglt;lcaaat tctacllctga actctaccag cagc:tgllllt:g 8catggaagc ctgcgtgllta. 300
cll991l99tt9 999t ggaa9a gactcccctg atgsatgt.gg-actccatctt ggctgtgaag 360
aaatllcttcc Illlagalltcac tctttatctg acagagaaga 81ltacagccc ttgtgcttOg 420
gaggttgtca gagcagaaat catgagatcc ttctctttat Caaaaatttt tcaagaaaga 460
ttaaggagga aggaa 495
lt;210gt; 141 lt;211gt;495 10 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 141
t.gtgatctgc ctcaaaccca cagcct'ól9gt agcaggagga ccttgatgct cct9gcacag 60
atgllggagaa tctctctttt ctcctgcttg 81lggaca9ac atgactttgg atttccccag 120
gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaago;Jct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 160
cagcagatct tcaacctctt taccaeaaaa gattcatctg ctgcttggga tgaggaectc 24 0
etagacaaat tctgcaecga actctaccag cagctgalltg lIcttggllagc: ctgtgtgatg 300
cagg'llggllga g99t9993ga aactcccctg acgaatgcgg actccatctt ggctgtgaag 360
aaatacttcc gaagaatc:ac tctctlltctg aCllgagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420
gaggttgtca gagcagaaat catgagatcc ctctctttat c:aac:allactt gcaagaaaga 460
ttaaggllggll aggaa 495
lt;210gt; 142 15 lt;211gt; 495
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 142
t gtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agca glt;¡j'agga ccttgatgc:t cctlt;¡j'ocacag 60 atgaggagaa tctctc:tttt c:tcctgcttg aaggllcagac atgactttgg atttccccag 120 galt;¡j'gagtttg gc:aaccagtt c:caaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgaga t gatc 160 cagcagatct tcaatctcet cagcacquot;aag gactcatctg ctgcttggg.... t:.gagaccctc 240 ctagacaaat tctllcactga actctaccag cagctgaatg aCl:l:ggaagc: ctgto;Jt gal:g 300 caggaggaga gggtgggaga aactcccctg atgaatgc9g actccatctt ggctgtgaa'l 360 aaatacttcc gaagaatc:ac tctctatctg acagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggtt'ltcll gagcagaaat catgagatcc ctctCtttllt c:aacaaactt gcaagaaaga 460 ttaagqaO'la aggaa 495
20 lt;210gt; 143
lt;211 gt; 462
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 143
atgtacagga tgcaacccct gtcttgcact lt;¡cactailgtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 g-cacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tg9agcattt actgctggat no ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac c a9ga t9ctc 180 acatttaagt tttace.tgcc caagaag9cc acagaactga aacatcttca gtlt;¡tctagaa 240 gaagaactca aacctctoga ggaagtgcta aatttagctc aaaocaaaaa ctttcactta JOO ilIgillc;;ccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagtte tggotlctaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca tt'itagaatt tctgaacaga 420 tggatt acct tttgtcaaag catcatetca acaetgaett .a 462
lt;210gt; 144
lt;211 gt; 462
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 144 atgtacagga tgcaactcet gtcttgcatt gcactaagtc ttgeaettgt cacaaacagt 60 gcacct aett caagttcte.c aaagaaaace. cagctacaae tgga.geattt actget.ggat 120 ttacagatoa ttttgaat.go aattaataat taeaagaatc ceaaactcac cagoatgctc 180
actltttaagt tttacatocc caagaaggcc acagaactga aacatct.tca gtgtctalt;¡aa 2lt;0 gaagaactca aacctctgga ggaagtgct.a ClClttt.ag:ctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccag:gg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca t tgtaqilat t t ctgaacaga 420 tugat tacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462
10 lt;210gt; 145 lt;211gt;462
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 145 at.gtacagga tgcaaetcct gtcttgcatt gcaetaagtc ttgcacttgt c:acaaacagt. 60 gcacctactt caag-ttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctqgat 120
t.t acagat ga ttttgaatgg aattaataquot;,t tlt;lcaagaatc ccaaactcac c:aggatgctc 180 aeottt..quot;agt tttacat.gcc;; caagaoggc:e acagaaetga aaeatett.ca gtgtc:tagalt;l 2lt;0 gaagaactca aacctctgga 9gaagtgeta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactt.a 300 agaeceaggo acttaatcag caatatcaae gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgct9at9quot;'9 aeagcaacca ttgtagae.tt tctgaaeaga 420 15 tOgat taeet t.ttgteoaag catcatctca acaetgaett g. '.2
lt;210gt; 146
lt;211 gt; 462
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
20 lt;400gt; 146 atgtacagga tgcaactcct ot.cttgcatt gcactaagt.e ttgcacttgt. cacaaacagt .0 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctaeaac tggagcattt actgct-ggat 120 t-t:acagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaat-c ceaaactcac caggatgctc 180 acat-t-taagt tttacatgcc caagaaggcc acagaaetga aacatcttca gtgt c t-agaa 240 gaagaactea aaectctgga glt;¡aagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ct-ttcactta 300 agacc:caggg acttaaecag caatatcaac gtaatagttc tggaaetaaa 9ggatctgaa 36. acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt t ctgaacaga 420 tggatt.acct tttgtc:aaag catcatctca acactgactt .quot; 462
lt;210gt; 147 lt;211gt;453
lt;212gt; ONA 25 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 147 atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg tcacaaacag t:gcacctact 60 tcaagttcta caaagaaaac acagctacaa ctggagcatt. tactgctgga tttacagatg 120 attttgaatg gaattaataa ttacaagaat cccaaactca ccaggatgct cacatttaaQ 180 ttttacatgc ccaagaaggc eaeagaactg aaaeatcttc agtgtctll.ga agaagaactc 240 aaaectctgg aggaaqtgct aaatt.tagct caaagcaaaa acttt.Cilctt a agacccagg JOO gacttaatca 9caatatcaa cgtaatagtt ctggaactaa agggatctga aacaacattc 360 atgtgtgaat atgctgatga gacagcaacc attgtagaat ttctgaacag atggattacc 420 tt.ttctcaga geateatete: aaeactgact 'Ya 453
lt;210gt; 148
lt;211gt;453
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 148
atgcaactcc tcaagttcta attttgaatg ttttacatgc ailacctctgg gilcttaatca atgtgtgaat ttttctcaga
lt;210gt; 149
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lt;212gt; PRT
tgtcttgcat caaagaaaac gaattaataa ccaagaaggc aqgaaqtgct gcaatatcaa atgctgatga gcatcatctc
tgcactaagt cttgcacttg tcquot;caaacquot;g tgClt;lcctact 60 acagctacaa ctggagcatt tactgctgga tttacagatg 120 ttacaagaat cccaaactca ccaggatgct cacatttaag lB' cacagaactg aaacatcttc agtgtctaga agaagaactc 240 aaatttagct caaagcaaaa acttt cactt aagaccc:agg 300 cgtaatagtt ctggaactaa agggatctga aacaacattc 360 gacagcaacc attgtagaat ttctgaacag atgqattacc 420 aquot;cactgact tg. 453
lt;213gt; Horno sapiens 10 lt;400gt; 149
Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn 1 5 10 15
Ala ASp Ala H'. Lys Ser Glu val Al. His Arg Phe Lys As. Leu Gly 20 25 30
Glu Glu ASn Phe Lys Ala Leu V.l Leu lle Ala Phe quot;. Gln Tyr Leu 3S .0 4S
Gln Gln Cyo Pro' Phe Glu gt;o. His val Lya Lcu Val gt;on Glo Val Thl:quot; 50 55 60
Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Al~ Asp Glu Sér Ala Glu Asn Cys Asp 65 70 15 80
Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr 85 90 95
Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Het Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu 100 105 110
Pro Glu Arg Asn G1u Cys Phe Leu Cln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn 115 120 125
Leu Pro Arg Leu val Arg pco Glu Val Asp Val Het Cys Thr Ala Phe 130 135 140
His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala 145 150 155 160
Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 165 170 175
Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala ASp Lys Ala 180 185 190
Alquot; Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg ASp Glu Gly Lys Ala 195 lOO 205
Ser Ser Ala Lys eln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu eln Lys Phe ely 210 215 220
Glu Arg Ala ph@ Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe 225 230 235 240
pro Lys Ala Glu Ph. Ala Clu Val Ser Lys Lo... val Thr ASP Leu Thr 245 250 255
Lys Val His Thr elu Cya Cys His ely As. Leu Leu Glu Cys Ale As. 260 265 270
Asp Arg Al. quot;. Ltlu Ala Lys Tyr ne Cys Cl ... Asn e ln ... Ser 1:le
275 280 28'
Ser Ser LY' LeU Lyo .,u eys eys Glu Lyll Pro Leu Leu Glu Lys Ser 290 2quot; 300
His Cys Ile Ala Clu V.l Clu Asn Asp Glu Hee Pro Ala Asp Leu Pro 305 310 31$ 320
Su Leu Ala Ala As. Ph. val Glu Ser Lys A9(:1 Val Cys Lys Asn Tyr 325 330 335
Ala Clu Al;l. Lys ••• Val Phe I.eu ely Helt; Ph., t..u Tyr • ,u Tyr Al• 340 345 350
Arg Ar'íJ Mis Pro ASp Tyr Ser val Val Leu Leu Leu Ar. Leu Ala Lys 355 360 365
Thr Tyr Glu Thr Thc LOU elu Lys Cys CyB Ala Ala Ala Asp Pro Mis 310 375 380
elu Cy. Tyr Ala Lys Val Phe Asp Clu Phe Ly!1 Pro Leu Val Glu elu 38S 390 39$ 400
Pro Gln Asn Leu ne Ly. Cln Asn Cys Clu Le. Phe Glu Gln Leu Cly 405 410 415
Glu Tyr t.ys Phe Cln ASI\ Ala Leu LeU Val ArO Tyr TI\%' LyS Lys Val
420 .25 430
Pro Gln val Ser Thr Pro Thr t.eu Val Clu Val Ser Ar9 Asn Leu Gly 435 440 445
Lys Val Gly Ser Lys Cy. eys Ly$ Hia Pro GI u Ale Lys Arg Met Pro
450 .55 .60
_-_____ __ __ nl
~~ ~
465 470 47e: 480
His Glu Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg Val 'l'hl~ Lys Cys Cys Thr Clu 485 490 ••5
Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Vel ASp Glu
'00 505 510
Thl: Tye Val PI:O Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala
515 520 525
quot;P n. eys Thl: l.eu Ser .'u Lys Glu Arg Glt~ n. Lys Lys Gln The 530 535 540
Ala Leu Val Glu Leu Vel Ly. His Lys pro Ly6: Ale Thr Lys Glu Gln 550 55gt;
'45
Leu Lys Ala Val Helt; quot;. Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cyo
565 510
Lys Ala ASP ,.quot; Ly. (;1u Thr Cys Phe Al. el.... Glu Gly Lys Ly, Leu sao 585 590
Vol Ala Al. Ser Clo Ala Alo. Leu ely Leu Cys Asp Leu Pro Cln Thr 595 600 605
IHs Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met. Leu Leu Al. Gln Met Arg 610 615 620
Arg Ilc Ser Leu Pbe Ser Cys Leo Lys Asp Arg His Aep Phe Gly Phe 625 630 635 64Q
Pro aln Glu elu Phe Gly Asn Gln phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro 645 650 655
Val Leu His Glu Met 11e eln Gln tIc Phe Asn Leu Phc Ser Thr Lys 660 665 670
Asp Ser Ser Ala Ale T~ Asp el.... Thr Leo Leo Asp Lys Phe Tyr Thr 675 680 685
Glu Leu TYr Gln Gt o Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val 11e Gln ely 690 695 700
val ely Val Thr Gl.... Thr Pro Leu Met Lys el.... Asp Ser Ile Leu Ala 70S 710 715 720
Val Arg Lys Tyr Phe eln Arg tIc Thr Leu Tyr Leu Lys elu Lys Lys 725 730 735
Tyr Ser Pro Cys quot; a Trp GIu val Val 'r9 Ala el.... tle Melt; 'rg Ser 7'0 745 750
Phe Ser Leu Ser 'rhr Asn Leo eln elu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 755 760 765
lt;210gt; 150
lt;211gt; 769
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 150
Melt; Leu Leu Gln Ala phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala .,. Ly. 1 5 10 15
Ile Ser Ala Asp Ala His Lys ser Glu val Ala His Arg phe Lys Asp 20 2S 30
Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Al a Leu Val Lau Ile Ala Phe Ala Gl n 35 40 4.S
Tyr Leu Gln Gln Cys Pro ph. elu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 50 55 60
Val Thr Glu Phe Al a Lyo Thr Cys Val Ala 's. Clu ser Ala Glu ASn 65 70 75 BO
Cy, A.sp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly AS. Lys Leu Cys Thr val
85 90
Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ah! ASp Cys eys Ala Lys 100 105 110
Gln GI... Pro Olu Arg Asn Gl... ey. Phe Leu Gln His eyo A~p Asp Asn 115 120 125
Pro Asn Leu Pro Argo Leu Val ArO Pro Glu Val. Asp Val Met Cys 'rhr 130 135 140
Ala phe His Asp Asn Olu Olu Thr Phc Leu LY~L Lye Tyr Leu Tyr Glu 145 150 155 160
Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe 165 170 175
Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr el... Cy!L Cys Gln Al. Ala ASP lSO 185 190
Lys Ala Ala Cy. Leu Leu P.co Lys Leu Asp Glu Leu Aro Asp Glu Gly, 195 200 205
eys Al. Ser Ser Ala Lys Oln ArO Leu Lys CY~L Al. Ser Le... Gln Lys 210 215 220
phe Oly Glu Arg Ala phe Lys Ala Trp Ala Val. Al . Arg Leu Ser Oln 225 230 23S 240
Arg Phe Pro Lys Ala el... Phe Ala Cl... val Se!: Lys Leu Va.l Thr 245 250 255
Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys ey. His Gly ASP Leu Leu Olu eys 260 265 270
A.la Asp As. Aro Ala Asp Leu Al. ey. Tyr IlE! Cys Olu Asn Gln ASP 275 2.0 285
Ser !le Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys GI ll Lye Pro Leu Leu el... 290 295 300
Lys Ser His Cys rle Al. Glu Val Glu Asn As¡) G1u Met pro Ala Asp 305 310 315 320
t.eu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Vel Glu Ser Lys Asp Vel Cys Lys 325 330 315
Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gl}' Met Phe Leu Tyr Clu 3lt;0 345 350
Tyr Ala Arg Arg His pro Jt.sp 'I'yr S..r Val Val l.p-u I.P-U T..,,, Jt.rg Leu 355 360 365
gt;l. Ly. Thr Tyr elu Thr Thr Leu Clu Lys CYSI Cy. Al. Ale Ale Asp 370 )75 3.0
Pro Hi. Glu Cy9 Tyr Al. Lygt; V.l Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu V., 3'5 390 39S 400
Glu Glu Pro Gln .1\.$0 Leu Ile Lys Gln Agt;n Cy~: Glu Leu Phe Glu Gln 405 410 415
Leu Gly Clu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val ~rg Tyr Thr Lys 420 425 430
Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu val Glu Val Ser Arg Asn 435 4.40 445
Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 450 455 460
Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser v a l val Leu Asn Gln Leu Cys 465 410 415 480
Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys Cys Cys 485 490 495
Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 500 505 510
Asp Glu Thlt; Tyr V6Il Pro Lys Olu 'he Asn Ala Glu Thr ' ha Thr Phe 51S 520 52S
His Ala AOP Ile Cys 'l'hr Leu Ser Glu Lys Glu Ar. Oln Ile Lys Lys 530 53S 540
Gln Thr Ala Leu val Olu Leu Val Lys Hla Lys 'ro Lys Al a 'l'hr Lys Slt;S SSO SSS 560
elu eln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val elu Lys 565 510 575
Cya Cys Lys Ala Asp Asp Lys elu Thr Cys Phc Ala elu Glu Gly Lys 580 585 590
Lys Leu V., Al. Ala Ser cln ... Ala LeU Gly Leu Cys Asp Leu Pro 595 600 60S
Oln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln 610 6lS 620
Met Ar. Ar. Ile Ser Leu 'ha Ser Cys Leu Ly. ,quot;p Arg His Asp 'he 625 630 635 640
Gly phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn e l n Phe eln Lys Ala Glu Thr 645 650 655
Ile Pro Val Leu His elu Met Ile eln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser 660 665 670
Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe 675 680 685
Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln LeU Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val rle 690 695 700
eln Gly Val ely Val Thr elu Thr Pro Leu Mee Lys Glu Asp Ser I1e 705 710 715 720
Leu Ala Val Arg LY5 TYr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Clu 725 730 735
Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu r le Met 740 745 750
Arg Ser Phc Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Sor Leu Arg Ser Lys 755 760 765
Glu
lt;210gt; 151 5 lt;211gt;779
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 151
Mee Asn 1le ehe Tyr rle phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly 1 S 10 15
LeU Glu His Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys ArO' Asp Ala 20 2S 30 quot;quot;
Lys Segt;:quot; Glu V.l Ala H1S Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn phe 3S 40 4S
Ly. Al. Leu Val Leu 110. Ala ph. Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro SO 60
quot;
ph. Glu Asp His Val Lys Leu Val ASn Glu v ..l Thr Glu Phe Ala Lys 6S 75 80
quot;
Thr Cys Val Ala Asp Clu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His 85 9S
,O
Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr V.l Ala Thr Leu Ar. Glu Thr 100 lOS 110
'l'yr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Al. Lys Gln Glu pro Glu Arg Asn 115 120 125
Glu eys phe Leu Gln lIis Lys aop Asp Asn Pro Asn Leu pro Arg Leu 130 135 140
V.l Ara Pro Glu Val As. Val Met Cys Thr Al. phe Hia ASP Asn Glu 145 150 155 160
Glu Thr Phe Lcu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro 165 170 175
'l'yr Phe Tyr Al. Pro Glu Leu Leu phe phe Ala Lys Arg Tyr Lys Al. 180 185 190
Ala PhI!! Thr Glu Cys Cys Gln Al. Al. Asp Lys Ala Ala equot; Leu Leu 195 200 205
Pro Lys Leu Asp Glu Leu Ara Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys 210 220
'quot;
aln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe 225 230 235 240
Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg LeU Ser Glo ArQ' quot;he quot;ro Lys Al. Olu 24' 250 25'
quot;he Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Alt;p Leu, Thr Lys V.l His Thr 260 265 270
Glu Cys Cys His Cly Asp Leu t.eu Olu Cys Ala. Asp ',p Ar. Ala ASp 275 2.0 2.5
t.eu Ala t.ya Tyr !le Cys Olu 'an Gln Asp Ser' Ile Ser Ser Lys Leu 290 295 300
t.ys Glu Cys Cys Glu t.ys Pro Leu Leu Glu Lys, Sor His Cy¡¡; :lIe Ala JOS J10 n5 320
Glu Val Olu Asn ',p Olu Me' quot;ro Ala quot;0 Leu, Pro Ser t.eu .quot; Ala 325 330 3quot;
Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys t.ya Asn. Tyr Ala Ol u Al. t.ys HO HS JSO
ASp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr' Ala Aro Aro¡ His quot;ro 3S5 J60 J6S
Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala. Lys Thr Tyr Glu Thr 370 375 3.0
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala ASp pro !lis Glu Cys TyIC quot;a
3.5 390 395 400
Lys Val Phe Asp Clu Phe Lys pro Leu val Clu Glu pro eln Asn Leu 405 410 415
lIé Lys eln Asn Cys Glu Leu Phe Olu Cln LeuLGly clu 'I'Yr Lys Phe 420 425 430
Gln Asn Ala Leu Leu Val ArO' Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gl n Val Ser
43' 440 445
Thr Pro Thr Leu val Glu Val Ser ArO' Asn Leu, Oly Lys val Gly Ser 450 455 460
Lys Cya Cys Lys His Pro Olu Ala Lys Arg Me' Pro Cys Al a Glu Asp 465 470 475 4.0
Tyr Leu Ser val Val Lou Asn Cl n Leu Cys Vel Leu His Glu t.y, The 485 490 495
pro Val Ser ASp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val quot;sn 500 SOS 510
Arg Ar~ PrQ Cy$ phe Ser Ala Leu Glu Val As~, Clu Thr Tyr Val Pro 515 520 525
Lya Glu Phe Asn ....la Glu lt;hr Pho Thr Phe HilO quot;a ASP Ile Cys Thr 530 535 540
Leu Ser Glu Lys Glu Ar. Ol n l l e Lys Ly» Glo lt;hr Ala Leu Val Olu
5.5 SSO SSS 560 Leu val Ly$ Aia Lys Pro Lys Ala Thr Lys Olu Gln Lcu Lys Ala Val
565 570 575
Met ASp Asp ph. Al. Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Al. As. As. 580 ses 590
Ly$ Glu Thr Cys Phe Ala Clu Glu ely Lys Lys Leu val Ala Ala Ser 595 600 60S
eln Ala Ala Leu Gly Leu Cy, As. Leu Pro Gln Thr Hle Ser Leu Gly 610 615 620
Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Het Arg Arq 1118 Ser Leu 625 630 635 640
Ph. Ser eya Leu Lyo Asp Arg His Asp Ph. Gly Phe Pro Gl n Glu Glu 6' 5 650 65'
Phe GIl' Asn Gln Ph. Gln LYS Ala Glu Thr lIO!!: Pro Val Leu His elu 660 665 670
Met rle Gln Gln 11e Phe Asn Leu Ph. Ser Thr Lys Aquot;p Ser Ser Ala 675 680 685
quot;. Trp As. Glu Thr Leu Leu As. Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr eln 690 695 100
Gln Leu Asn Asp Leu Glu Al. eya Val 1118 Gln Gly Val ell' Val Thr 105 710 115 120
elu 'I'hr Pro Leu He' Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr 125 no n,
Phe eln Arg 11e Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro eya 740 745 750
Ala Trp Glu Val Val Arg Ala alu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser 7ss 760 765
Thr Asn Leu Gln alu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 770 775
lt;210gt; 152
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 152
Het Lys Trp Val Ser Phe Ile Se~ Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 1'0 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser 20 25 30
Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile 35 40 45
Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys As~ Arg His ASp Poe Gly Phe Pro G1n 50 SS 60
Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr rle Pro Val Leu
65 70 75. .0 His Glu Met 11e Gln Gln lle Phe Asn Leu Phe, ser Thr Lys AS. Ser
.5 90 95
Ser Al~ Al a Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp LY5' Phe Tyr Thr Glu Leu 100 105 110
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly 115 120 125
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Lys Tyr Phe Gln Aro ¡le Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser 145 150 155, 160
pro Cys Al a Trp Glu Va.l val Arg Al a Glu Ile, Met Arg Ser phe Ser 165 170 175
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arlt;;l Serquot; Lys Glu Asp Al a His laO 185 190
Lys Ser Glu Val Ala His Arq Phe Lys Asp Lcu Gly Glu Glu Asn Phe 195 200 205
Lys Ala Leu Val Leu Ile Al. Phe Ala Gln Tyrquot; Leu Gln Gln Cys PrQ 210 215 '20
Phe Glu ASp His val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys 225 230 235 240
Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His 245 250 255
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Tyr Gly Clu Met Ala Asp Cys ey. Alquot; Lys Glfll alu Pro Glu Arg Asn 275 2.0 2.5
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325 330 335 'l'yr quot;ne Tyr Al;o Pro Glu t.eu Leu phe Phe Ala Lys :a.r g Tyl'quot; Cys Ala 340 345 350 Ala Phe Thr Glu Cys Cys Glo Ala Ale I\.sp Lys Ala Ala eys Leu Leu 355 360 365 Pro Lys Leu AS\) Glu Leu Aro As. Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys 310 315 3.0 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ab. Phe
3.5 390 395 400
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Phe Ala elu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr
.20 ." .30
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450 .55 460
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ASp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr 530 535 54.0
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Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys v.l Leu His Glu Lys Thr 645 650 655
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~rg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val ASP Glu Thr Tyr val Pro 675 680 685
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690 695 700
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Met ASp Asp phe Ala Ala l'he Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala A,p Asp 740 745 750
Lys Glu Thr Cya Phe Ala Glu Glu Dly Lys Lys Leu Val Al. Ala Ser 755 7'0 765
eln Ala Ala Leu Gly Leu 770
lt;210gt; 153 5 lt;211gt;769
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 153
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elo Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala T~ Asp 85 90 95
Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn 100 105 110
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Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Va l Arg LyS Tyr Phe G1n Arg 130 135 140
Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Clu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu 145 150 155 160
Val val Arg Ala Olu Ile Met Arlt;;;l' Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 165 170 175
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tle Ala Phe Ala elo Tyr Leu eln Gl n Cys Pro Phe Glu Asp His Val 210 215 220 5
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Asp Cys eys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Ph. Leu Gln 275 280 285
tlis Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Va l Ar'1 Pro Glu Val 290 295 300
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Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Ar9 Ala Ph{, Lys Ala Trp Ala Val 385 390 39S 400
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Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Tht: Glu Cys His Gly 420 425
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Lys Pro Leu Leu Glu Lyo Ser Bis Cys Ile Allt;:1 Olu Val Glu Aso Asp 465 470 4ni 480
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Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lyo Thr Tyr Glu Th:: Thr Leu Glu LyS Cys 530 535 540
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595 600 605
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Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val Met Asp ASp phe Ala 725 730 735
Ala Phe Val Glu LYs Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 740 745 750
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5
lt;210gt; 154 lt;211 gt; 835 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
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Ala Leu Ala Ala Pro Val 20
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Val Ala Hi9 Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phc Lys Ala Leu 260 265 270
val Leu 1le Ala Phe Ala Gln 'I'yr Leu Gln Glrn Cys Pro Phe Glu Asp 275 280 28S
Hi s Val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu PhE' Ala Lys Thr Cys Val 290 295 JOO
Ala ASp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe JOS 310 315 320
Gly Asp Ly!! Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Ar~r Glu Thr Tyr ely elu J2S 330 JJS
Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phc 340 J4S 350
Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu prco Arg Leu Val Arg Pro JSS 360 J6S
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Leu Lys Lys 'l'yr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Ar9 Hia Pro Tyr Phe Tyr
3.5 390 H~) 400 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyl~ Lys Ala Ala Phe Thr 405 410 415 Glu CY5 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Al. Alo CyB Leu Leu pro Lys Leu 420 425 430 Asp Glu Leu Arg ASp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 435 440 445 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys phe Gly Glu Aru Al. Phe I.ys Ala 'f'rp 450 455 460
Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Aro¡ Phe Pro Ly!gt; Ala Glu Phe Ala elu 4 65 470 475 480 Val Ser Lys Leu Va l Thr Asp Leu Thr Lys V..,,:l His Thr' Glu Cya Cya
,.,
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500 505 510
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Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser HiB Cy!~ 11e Ala Glu Val Glu
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elu Ser Lys ASp val CyO Lys Aso Tyr Al, Glu Ala Lys Asp V.l Phe 565 570 575
Leu Cly Met Ph. Lau Tyr Glu Tyr Al. Arg J\r~l Hia Pro AsO Tyr Ser 580 5.5 590
Val val Leu Leu Leu Arg Leu Al . Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Clu 595 600 605
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Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu 1 le Lys Gln 625 630 63!) 640
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645 650 655
Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro GIl} Val Ser Thr Pro Thr 660 665 670
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Ly. His Pro Glu Ala Lys ArO 'et Pro Cys Ahl G1u Asp 'I'yr Leu Ser 690 695 700
V.l Val Leu Asn eln Leu Cy. Val Leu His Glu Ly. Thr Pro Val Ser
70s 710 715
Asp An} Val Thr Ly. Cy, Cys Th.:-Glu Ser Leu val Asn Arg quot;quot;9 Pro 725 730 735
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Lys elu Arg Cln Ile Lys Lys eln Thr Ala Leu Val Clu Leu val Lys 770 775 780
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Phe A13 Ala Phe Val Glu Lys Cy$ Cys Lys Ala Asp ASp Lys Glu Thr 805 810 815
Cys phe Ala Glu elu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 820 825 830
Leu Gly Leu 835
lt;210gt; 155
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 155
Met Lys Trp Val Thr Phe lle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 la 15
Tyr Ser Arg Gly Val Pha Arq Arg Asp Ala Hi$ Lys Ser el... Val Ala 20 25 30
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Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn G1u Val Tnr Glu Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ala. Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu H's Thr Leu Phe G1y AsO
.5 ,.
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu ArO elu Thr Tyr Gly G1u Me' hi. 100 105 110
Asp Cys Cy, Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 12. 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Va.l 130 135 140
Asp Val Met CyS Thr Ala Pho His Asp Asn G1u Glu Thr Phe Leu Lys
145 155. 16.
15'
Lys Tyr Leu Tyr Clu Ile ~la Arg Ar g His Prc. Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 11. 175
Glquot;. Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Allquot; Ala Phe Thr Gl u CyS 18' 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Le\.l Pro Lys Le\.! Asp Glu 195 200 205
Leu Arg ASp el\! Cly Lys Al. Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 21' 215 22.
Ala Ser Le\! Gln Lys phe Gly elu Arg Ala PhEt Lys Ala Tn' Ala Val
225 quot;. 23$ 24.
Ala Arg Leu ser Gln Arg phe Pro Lys Ala Ch., Phe Ala Glu Vol Ser 245 25. 255
Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys V.l Hís Thr Glu Cys ey. HilO Gly
26. 265 27'
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Alquot;, Lys Tyr tle 275 280 285
Cys Glu Asn Gln ASP Ser He Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Clu
29. 295 3••
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser Hia Cys tIc ALm Glu Val Clu Asn Asp
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Glu Het Pro Ala ASP Leu pro Ser Leu Ala Ah, ASp Phe Val elu Ser 325 33' 335
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...
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Th~ p~o Val Se~ Asp Arg
485 490 495
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Ser Ala Leu elu Val ASP Glu Thr Tyr Val Pro Lys elu Phe Asn Ala 515 520 525
elu Thr Phe Thr Phe His Al. Asp Ile Cys Th~ Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu val Lys His Lys 545 550 555 560.
Pro Lys Ala Thr Lys elu Gln Leu Lys Ala V.l Het Asp Asp Phe Al. 565 570 575
Ala Phe val elu Ly. Cys Cys Lyo Al. quot;p Asp Lys Glu Thr eys Phe 580 585 590
Ala Glu elu ely Lys Ly$ Leu vquot; Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 .05
Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Th~ Leu 610 615 620
Met Leu Leu A1.a Gln Met Arg Arg I1e Ser Leu Phe ser Cys Leu Lys 625 630 635 640
ASp Arg His Asp Phe Cly Phe Pro Gln Clu Gtu Phe Gly Asn eln Phe 645 650 655
Cln Lys Ala Glu Thr 11e Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile 660 665 610
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 675 680 685
Leu Leu Mp Lya pquot;e Tyr Thr elti Leu Tyr eln eln Leti Asn Asp Leu .90 .95 700
elti Al. Cys VaL Il. eln ely Val Gly Val Thr elu Thr Pro Leu Melt; 705 710 715 720
Lya Glu ASp Ser Ile Leu Ala Val Aro LY' Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 725 730 735
Leu Tyr Lau Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 740 745 750
Arg Ala Glu Ile Y.et Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 755 760 765
Ser Leu Arg Ser Lys Glu 770
lt;210gt; 156
lt;211gt; 773
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 156
Me' Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Al. Leu Leu Val Leu Sor Cys 1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val cly Cys Asp Leu PrQ Gln Thr His Ser Leu 20 JO
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Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phu Tyr Thr Glu Leu Tyr 100 105 110
eln Gln Leu Asn Asp Leu elu Al. Cys Val Il~~ eln Gly Val Gly Val 115 120 125
Thr elu Thr Pro Leu Met Lys elu Asp Ser IlE~ Leu Ala Val Arg Lys 130 135 140
Tyr phe Gln 1\.rg Ile orhe Leu Tyr Leu Lys GIl! Lys Lys 'I'yr Ser Pro 145 150 lSS 160
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Ser Thr Aso Leu Gln clu Ser Leu Arg Ser Lyn Glu Asp Al. His Lys 160 185 190
Ser elu Val Ala His Arg Phe Lya As. Leu GIl' Glu Glu Aon Phe Lys 195 200 205
Ala Lcu Val Le u r le Ala Phe Ala Olo Tyr Leu Gln Oln Cys Pro Phe 210 215 220
Glu ASP His Val Lys Leu val A.!In Gtu val ThI: GIu Phe Ala Lys Thr 225 230 235 240
Cys val Ala Asp GIu Ser Ala GIu Asn Cys ASp Lys Ser Leu His Thr 245 250 255
Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr
2.0 2'5 270
cly GIu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys eln Glu Pro GIu Arg Asn GIu 275 280 285
Cya Phe Leu eln Hi~ Lys ASp Asn Pro Aso Leu Pro Argo Le u val
290. 300
'ro p~o elu V31 Asp V.l Met Cys Thr Ala Ph,~ His Asp Asn Glu Glu 305 310 31.'5 320
Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu n. Ala Arg Arg His Pro Tyr 325 330 335
Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe gt;l. Ly:; Arg 'I'yr Lys Ala Ala 340 345 350
Phe Thr Glu eY' Cys Gln Ala gt;la quot;P Lys Alei 1\1a ey. Leu Leu Pro
3quot; '60 '65
Lys Leu ASp Glu Leu Arg Aop Glu Gly Lys Ala Sor Ser Ala Lys eln 370 375 380
Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Ly. 385 39~;
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Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phj~ Pro Lys Ala elu Pho 405 410 .15
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Cys Cys His Gly Asp Glu Ala Asp Asp Arq Ala Asp LeuLeu Leu .quot; Cys
435 445 Ala Lys Tyr l l e CyS Olu Asn eln Asp Ser 110 Ser Ser Lys Leu Lys
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GJ.u Cys Cys Glu Ly9 Ptquot;o Leu Leu Glu Lys Sel~ Mis Cy!l 1 1e Ala G:lu 465 410 47~j 480
val Glu Asn ASP Glu Met Pro Ala Asp Leu Pr() Ser Leu Ala Ala ASP ••5 '90 quot;5
Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyl~ Ala Glu Ala Lys Asp SOO 50S 510
Val Phe Leu Gly He' Phe Leu Tylt; Glo Tyr Al~l Arg Arg liis Pro Asp 5gt;5 520 525
Tyr Ser V.l Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Ly~; Thr Tyr Glu Thr Thr 530 535 540
Leu Clu Lys Cy:s Cys Ala .,. Ala Asp Pro liill Glu Cys Tyr Ala Ly. 545 55~i 5quot;
Squot;
Val Phe A'sp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Ghl Pro Gln Asn Leu 11e 565 570 575
Lys Glo ASO Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Ch' Glu Tyr Lys Phe Glo
5.0 5.5 590
Aso Ala Leu Leu Val Are¡ Tyr Thlt; Lys Lys val Plt;o Gln Val Ser Thr 595 600 605
Pro Thr Leo Val Glu val Ser Arg Asn Leu Gl~' Lyo V.l Gly Ser Lys 610 615 620
Cys eyo Lys His Pro Glu gt;l. Lys Arg Met Preo eys Ala Clu Asp Tyr
625 630 635 640
Leu Ser Val Val Leu quot;n Gln Leu Cys val Leu His Glu Lys Thr Pro 64S 650 65S
Val Ser Asp Ar. Val Thr Lys Cys Cy. Thr Glu Ser Leu Vol quot;n Aro 660 66S 670
Arg Pro ey, Phe Ser Ala Leu Olu Val A¡¡;p Glu Thr Tyr Val Pro Lys 67S 680 68S
Glu phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala ASp Ile Cy5 Thr Leu 690 695 700
Ser Glu Lys Glu Arg Gln I le Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu 705 710 715 720
Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val Met 72S 7JO 735
ASp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASp Lys
740 745
Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 755 760
Ala Ala Leu Gly Leu 770
lt;210gt; 157
lt;211gt; 769
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 157
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu 1 5 10 750
Leu Val Ala Ala Ser Gln 765
Ala Gly Phe Ala Ala Lys 15
I1e Ser Ala Cys Asp Leu Pro Cln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg 20 25 30
Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys 35 40 45
Lcu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu elu Phe Cly Asn 50 55 60
Oln 'he Gln Lys Ala. Olu The Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln 65 70 75 80
Gln Ile Phe Asn Leu 'he Ser Thr Lys quot;p Ser Ser Ala Ala Trp Asp 8S 90 .5
Glu Thr Leu Leu Asp Lys phe 'I'yr Thr Olu Leu Tyr Gln Gln Leu Aon 100 lOS 110
Asp Leu Glu Ala Cys val Ila Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro 115 120 125
L~u Met Lys Glu ASP Ser Ile Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg
130 135 140
n. Thr Leu Tyr Leu Ly, Glu Lys Lys Tyr Sel: Pro Cys Ala Trp Glu 145 150 lS~; 160
Val Val Arg Ala Glu 11e Met Arq Ser Phe Selquot; Leu Ser Thr Asn Leu 165 170 175
cln elu ser Leu Arg Ser Lys G~u AsO Ala UÜ: Lys Ser Glu Val Ala 180 las 190
Hia Arg phe Lys Asp Leu ely cIquot; Glu Asn PhE~ Lys quot;. Leu Val Leu 195 200 20S
Ile Ala Phe Ala eln Tyr Leu Gln Gln Cys Prc, Phe elu Asp His Val 210 215 220
Lys Leu val Asn elu Val Thr elu Phe Ala Lys: Thr Cys Val Ala ASp 225 230 23~, 240
Clu Ser Ala GI" Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hit Thr Leu Phe Gly Asp 245 250 255
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu quot;Arg elu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 260 265 270
ASP Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Aro Asrn Glu Cys Phe Leu Gln 275 280 285
Uis Lys ASp ASp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Le\ll val 1'.r9 Pro Glu val 290 295 300
Asp val Met Cys Thr Ala phe His ASP Asn Gl u elu Thr Phe Leu Lys 30S no 315, 320
Lys Tyr Leu Tyr elu I1e Ala 1I.rg 1'.r9 His prco Tyr Phe 'I'yr Ala Pro 325 330 335
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala, Ala Phe Thr Glu Cys 340 34S 3SO
Cys Gl" Ala Ala A8p Lys Ala Ala CyS Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 355 360 365
Leu Arg A.sp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala LYflquot; Gln Arg Leu Lys Cys 370 375 360
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe: Lys Ala Trp Ala Val 38S 390 39s 400
Ala Arg [.elgt; S8~ Gl n A~'1 Phe Pro l,ys Ala Glu Phe Alquot;, GIlgt; Va] Ser C05 410 415
Lys Leu Val Thr ASp Leu Thr Lys Val His Thr Clu Cys Cys Mis Gly 420 425 430
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Ara Al.. Asp. I.eu Ala Lys Tyr rle 435 440 445
CyS Glu Asn eln Asp Ser rle Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 450 455 lt;60
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 11e Ala Glu Val Glu Aso Aop 465 470 475 480
Glu Melt; Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Al. Al. Asp Phe Val Glu Ser
4.5 490 495
Lys 1\sp va.l Cy. Ly. Asn 'I'yr Ala Glu Al. Lys Asp Va.l Phe Leu Cly 500 505 510
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Aro Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 515 520 525
Leu Leu Leu Arg ~u Ala Ly. Thr 'IYr Glu Thr Thr Leu clu Lys Cys 530 535 5'0
Cy. Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Al. Ly. val Phe Asp Clu 545 SSO 55S 560
Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro eln A.n Leu ¡le Lys Gln Asn Cye 565 570 575
Glu Leu Phe GIu Gln Leu Gly GIu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 580 585 590
val A~ Tyr Thr Lys Lys Val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 595 600 605
Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 610 615 620
Pro Glu Ala Lys Ar9 Mct Pro Cys Al~ Glu A~p Tyr Leu Ser Val val 625 630 635 640
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His GIu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 645 650 655
Val Thr Lys CyS Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 660 665 670
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 675 680 685
Glu Thr Phe Thr Phe His Al. Aop 1le Cys Thr Leu Solt; Glu Lya Glu .90 .95 700
Ar. Gln 1le Lys Lys Gln Thr Al. Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 705 710 715 720
Pro Lys Ala Thr Ly. Glu Gln Leu LY6 Ala v.l Met Asp Asp Phe Al. 725 730 735
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASP Asp Lys Glu Thr Cys Phe 740 745 750
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Cln Ala Ala Leu Gly 755 760 765
Leu
lt;210gt; 158
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 158
Mee Lys Trp Val Ser Phe Ile ser Leu Leu l'hE~ Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10 lS
Tyr Ser Arg Ser Leu ASp Lys Arg quot;p Al. Hü, Lys Ser Glu V.l Al. 20 2S 30
His quot;rg Phe Lye Asp Leu Gly Glu Glu Asn PhE! Lys Ala Leu Val Leu 3S 40 4S
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys PrCl Ph. Clu Asp His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Ly~: Thr Cys Val Al a Aeo 65 70 75 BO
Glu Ser Ala Glu Asn Cys A.sp Lys Ser Leu HÜI Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 9S
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Th:z: Tyr Gly Glu Me!: Al a 100 105 110
ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Clu Arg Asn Clu Cye Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140
Asp Val Mee Cys Thr Al. phe His Asp Asn Glu Glu Thr phe Leu Lye 14S ISO 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Clu Ile Ala Arg Arg Hia prco Tyr Ph.. Tyr Al. Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lya Ala. Al a Phe Thr Glu Cya
180 18S '90
Cys Gln Al. Al. Asp Lys Ala Ala Cys Leu LeUl Pro Lys Leu Asp Glu 19S 200 20S
Leu Arg AsO Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ale Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 21S 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ale ehe Lys Ala Trp Ala Val
22S 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro LY6 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 24S 250 255
Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys V.l Mis Thr Glu Cys Cys Mis Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Al a Lys Tyr Ile 275 280 2aS
Cys Glu Asn Gln Asp Ser I l e Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
'90 29S 300
Lyo Pro Leu Leu elu Lya Ser His Cys ne U. Glu Val Glu Asn As. 30S 310 31' 320
Gl. Met Pro Ala ••• Leu Pro Ser Leu Al. U. ASP pl'le Val Glu Ser 325 330 33S
Lya Asp Val Cya Lys Asn Tyr Ala Glu Al. Lys Asp Val . he Leu Gly 340 345 350
Met Phe Lel.l Tyr Glu Tyr Alo. Ar. Arg Mis Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Aclt;¡ Leu Ala Lya Thr Tyr elu Th:r Thr Leu Glu Lys Cys 370 37S 380
eys Al. Ala Ala Asp 'ro His alu Cys Tyr 11.11,. Lya v.l Phe Asp Glu 385 quot;O H5 .00
Ph. Ly. Pro Leu Val Glu olu Pro Gln Asn Leu Ila Lys Cln Asn eY' 405 410 quot;S
elu Leu PhI'), elu Cl n Leu Gly elu Tyr Lya Phe Cln Aan Ala Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu V.l Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Se:,quot; Lys ey. ey. Lys His 450 455 quot;0
Pro Glu Ala Lys Arg Me' Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser val val lt;65 470 48O
47'
Leu Asn Cln Leu eys Vol Leu Mis Glu Lyo Thr Pro Val Ser As. 'lt;. 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr alu Ser Leu val Asn Aeg Arg Pro Cys Phe
500 50S 510
Se¡;-Ala Leu elu Val Asp e lu Thr Tyr Val l'co Lyquot; Glu Phe Asn Ala 515 520 52S
Glu The Phe ThJ: Phe His Ala Asp Ile Cys Thl~ Leu Ser elu Lys Clu 530 535 540
Arg Gln lle Lys Lys Glquot; Thr Ala Le... Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Gl... Gln Leu LY5 V;, 1 Mee quot;'sr quot;'8['gt; phe ...108.
565 575
Ala ~he Val elu Ly. Cy8 Cy$ Lys Als Asp quot;sp Lys Ght Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Cly LY8 Lys Leu v.l quot;la Ala SeI· Gln ,'a ...la l.@u Cly
595 600 60S
Leu Cys Asp Le... Pro Gln Thr His Ser Leu G\y Ser quot;rg quot;rg Thr Leu 610 615 620
Me' Leu Leu Ala Gln quot;quot; 1\rg Arg ¡le Ser Leu Phe Ser Cys r.,eu Ly. 625 630 6]S 640
Asp A.rg His J\.sp Ph. Oly Phe Pro eln Olu Glu Phe Gly Asn Oln Phe 64S 650 655
eln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln ne 660 665 670
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Gl... Thr 675 680 685
Leu Leu quot;p Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Cln Gln t.eu Asn A$p Leu 6quot;
695 700
Olu Al. eya val lle Oln Oly val Cly Val Thr Olu Thr Pro Leu Me' 705 710 7,. 720
Ly. elu Asp Ser ne Leu Ala Va) Ar. Ly. Tyr Phe eln Arg ne Thr 725 730 735
Leu TYr Leu Lys elu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala T~ Glu Val val 740 745 750
Arg Ala Glu 11e Met Arg ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln elu 755 760 765
Ser Leu Arg Ser Lys alu 770
lt;210gt; 159
lt;211 gt; 775
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 159
Met Lys Trp val Ser phe lle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser 1\r9 Ser t.eu Asp Lys Arg Me' Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 25 30
Leu Gln Ar. Ser Ser quot;n, Phe Gln Cy. Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu 35 40 4S
Asn Gly Ar. Leu elu Tyr Cy. Leu Lys Asp Arg Me' Asn Phe ASp ¡le 60
" quot;
Pro Glu Glu Ile Lys Oln Leu Glo Gln Phe Gln Ly. Glu Asp Ala Al. 65 70 7S 80
t.eu Thr l1e Tyr Glu Me' Leu aln Asn ne Phe Al. Ile Phe Ar. oln .S 90 9S
ASp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Aso Giu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110
Alo Asn Vol Tyr H~s Glo Ile Aso His Leu Lys Thr Val Leu Giu Glu ll5 120 125
Ly. Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr A.rg Gly Lyili Leu Het Ser Ser Leu 130 135 140
His Leu Lys 1\r9 Tyr Tyr ely Aro rle Leu Ni:3 Tyr Leu Lys Ala Ly, 145 lSO lS!i 160
elu Tyr Ser His Cy, Ala Trp Thr Ile V.l Ar!;J Val Glu l1e Leu Aro 165 170 175
Asn Phe Tyr Phe l1e Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn A.sp Ala 180 16gt; 190
His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys As);) Leu Gly Glu Glu Asn 195 200 205
Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu eln eln Cys 210 215 220
pro Phe Glu Asp His val Lys Leu Val A.sn Glu Val Thr Glu Phe Ala 225 230 235 240
Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala elv quot;Sil Cys Asp Lys Ser Leu 245 250 255
His Thr Leu Ph. ely Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Ar9 elu 260 265 270
Thr Tyr ely elu Met Ala Asp Cy. Cy, Ala Ly,~ Gln elu Pro Glu Aro 275 280 285
Aon elu Cys l'he Leu Gln Hl. Ly. Asp 1gt;.sp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
2.0 295 300
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thl~ Ala Phe His Asp Asn 305 310 315 320
Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu :Ile Ala Arg Arg His
325 330 335
peo Tyr Phe Tye Ala Pro Glu Leu Leu Phe E'hl~ Ala Lys Aro Tyr Lys 3lt;0 345 350
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala l\la Asp Lys Al. Ala Cys Leu 355 360 365
Leu Pro Lys Leu ASp Glu Leu ArO Asp Glu GI~, Ly. Ala Ser See Ala 370 375 380
Ly. eln Arg Leu Lys Cyo Ala Ser Leu Gln Ly~¡ Phe Gly Glu Arg Al. 385 3.0 39~; 400
Phe Lys Ala Trp Al. Val Jola Jorg Leu Ser GIrl Arg phe Pro Ly. Al. 405 410 415
Glu Phe Ala Clu Val Ser Lys Leu val Thr 1.sp Leu ThJ:quot; Lyo Val His
42. 425 430
The Clu Cys Cys His Gly ASP Leu Leu GIu Cys; Ala ASp Arg Ala 435 440
AsO Leu Ala Lys Tyr rle Oys GIu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys 450 455 460
Leu LV' Clu Cys Cys Glu Ly, Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile 465 470 475 480
Al. Glu Val Clu Asn Asp Glu Het ero Al' A,p Leu Pro Ser Lou Al. 485 4••
4quot; Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys A,sp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala 500 505 510 Lys Asp Val Phc Lcu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His 515 520 525 Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Gl u 530 535 540
Thr Thr Leu Clu Lys ey, Oy, Ala Ala Ala A,p Pro His Glu Cys Tyr 545 55. 555 560 Al. Lys Val Ohe Asp Glu Phe Ly!! Pro Leu Vquot;, Glu Glu Pro Gln ASn
5.5 570 575 Leu I1e Lys Gln Asn Cys Clu Leu Phe Glu cln Leu Gly Glu Tyr Ly, 580 58' 590 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro eln Val 595 600 60S Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg han Leu Gly Lys Val Gly &10 615 620
Ser Lys Cys cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu 625 630 635 640 ASp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn eln Leu Cys val Leu His Glu Lys
645 650 655 Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val 660 665 670 Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val ASp Glu Thr Tyr Val 675 68~ 685 Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe Hls Ala Asp Ile Cys 690 695 700
Thr Leu Ser Glu Ly!:l GIu Arg Gln :rIc Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 705 710 715 720 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu eln Leu Lys AI~
725 730 73S val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp 740 745 750 ASp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala 75S 760 765 Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 710 775
lt;210gt; 160 5 lt;211gt;775
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 160
Me' Lys Trp Val Ser Phe 11e Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Ar9 Ser Leu lI.Sp Lys Arg A•• Al. Hi's Lys SOr Glu Val Al. 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly olu olu Asn Phe Lys Ala Leu Val LOu J5 40
quot;
¡le Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val SO ss 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Ly:s Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75
'0
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hi s Thr Leu Phe Gly ASp 85 90 9S
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 1\.rg Glu Th:1:quot; Tquot;yr Gly Glu Met Ala 100 105 110
A SP Cys eya Ala Lys Gln Glu Pro Olu Arg 11.511 Glu ey, Phe Leu Gln 115 120 125
His Ly. Asp Asp Asn Pro Aso Leu Pro Ar9 Leu Val Aro Pro Glu Val 130 135 140
A,p Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Ol u Thr Phe Leu Lya 145 150 15~; 160
Lyo Tyr Leu Tyr Olu 11e Ala Arg Arg Hi~ Prlt;~ Tyr phe Tyr Al. Pr o 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lya Ala Ala Phe Thr Olu eya lBO 185 190
Cys Gln Ala Ala ASe Lys Alo Al. ey. LCll Leu Pro Ly' Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Ar9 Asp Glu ely Lys Ser Ser Ala Ly~, 010 Arg Leu Lys CYI5
Aquot;
210 215 220
Ala Ser Lcu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Tr p Ala Val 225 230 23S 2lt;0
Ala Aro Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Ghl Phe Ala Glu Val Ser 245 250 gt;SS
Lys Leu val Thr Asp LeU Thr Lys Val Mis ThI~ Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp As·p Arg Ala Asp Lcu Ala Lys Tyr Ile
280 '85
'quot;
Cy. Glu Aso CIn Asp Ser 11e Ser Ser Lys Leu Ly. Glu Cys Cys Glu
quot;O '95 300
Ly. Pro Leu. Leu Glu Lyo Ser His Cys ne Ale. Glu val GIu Asn Asp 30' 320
310 31~,
Glu Met PrO Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala, Asp Phe Val Gl. Ser 330
3quot;
Lys Asp V.,l Cys Lys Asn Tyr-Ala Glu Ala Lys: Asp Val Phe Leu Gly 340 350
'"
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Preo Asp Tyr Ser Val Val 3quot; 360 365
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala ABp Pro His Glu Cys Tyr A1III Lys Val Phe Asquot;, Glu 385 390 395 .00
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 40' 410 .15
Glu Leu Phe Glu Cln Leu Gly Clu Tyr Lys Phe, Cln Asn Ala Leu Leu quot;0 .25 430
val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Cln Val Ser Thr Pro Thr Leu va1 quot;O 445
'quot;
Clu val Ser 1gt;.rg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu As¡:, Tyr Leu Ser val Val 465 470 475, 480
Leu Asn elo Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thx· Pro Val Ser ~sp Ar!l ,quot;S .90 .95
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu S e r Leu Val Asn Ar!l Aro PrQ Cys Phe '00 505 510
Ser Ala Leu Gl u Val Asp Glu Thr Tyr Val PrQ Lys Glu Phe Asn Ala
quot;O
'" 'quot;
Glu Thr Phe 'l'hr Phe His Ala Asp Ile Cl's Thlquot;· Leu Ser Glu Ly$ Glu 530 540
'quot;
Arg Gl n lle LY5 l.yquot; Gln Thr Al.. t...quot; Val Gl ... Leu Vn' l.y... His.
Lquot;
545 550 555· 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Het AS.p ASP Phe Ala 570 575
'6'
Ala Phe val Glu Lys Cys Cl's Lys Ala AS(J ASpl LY!il Glu Thr Cl's Phe 580 585 590
Ala Glu Clu GIl' Lys Lys Leu V.l Ala Ala Ser Cln Ala Ala Leu Cly 59' 600 60'
Leu Met Ser Tyr ~sn Leu Leu Cly Phe Leu Glo ~r9 Ser Ser Asn Phe 610 615 620
Gl. Cys Gln Lys Leu Leu Tlt;p Gln Leu Asn Gly Aro Leu Glu Tyr Cy!l 625 630 635 640
Leu Lys Asp Arg Melt; Asn Phe Asp tle Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu 645 650 655
Gln Glr: phe Glo Ly, Glu A.sp Ala Al. Leu Thr Ile Tyr Glu Melt; Leu 660 665 670
Cln Asn lt;le Phe Ala Ile Phe Ar. Gln Asp Ser Ser Ser Thr Cly Trp 675 680 68'
Aso Glu Thr Ile Val Glu Aso Leu Leu Ala ASn Val Tyr His Gln Ile 690 69' 700
ASn Ri. Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe 70s 710 715 720
Thr Arg Gly Lys Leu Melt; Ser Ser Leu }lis Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly72' ?lO 735
J\,.rg rle Leu His Tyr Leu Ly!l Ala Lys Glu 'I'yr Ser His Cy. Ala Trp 740 745 750
Thr Ile Val Aro Val Glu Ile Leu Ar. Asn Phe Tyr Phe lt;le Asn Arq 755 760 765
Leu Thr Gly Tyr Leu J\,.rg Asn 770 715
lt;210gt; 161
lt;211 gt; 772
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 161
Met Thr J\,.sn Lys Cys I.eu Leu Gln Ile Ala {,eu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr AOn Leu Leu Gly Phc Leu Gln Arg 20 25 30
Ser Ser A,n Phe GlD Cys Cln Lys Leu Leu Trp Gln Leu ASn Gly Arg
35 .0 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp ArO Met Asn pha Asp lt;le Pro Glu Glu 50 55 60
tIa Lys Gln Leu Cln Cln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 7S 80
Tyr Clu Met Leu GIn Asn lle Phe Ala Ile Phe Arg Cln Asp Ser Ser 85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Clu Thr 1le Val Glu J\,.sn Leu Leu Ala Asn Val 100 lOS 110
Tyr Kis Gln Ile Asn His Leu Lyo Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125
Lys Glu ,quot;p Pha Thr Arg-ely LY' Leu Met Sel~ Ser Leu His Leu Lys 130 135 140
~rg Tyr: Tyr ely gt;.rO Ile Leu His Tyr Leu Lys Al. Lys Glu Tyr Ser 145 150 l5S 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ill! Leu Arg Asn Ph@ Tyr 165 170 175
Phe lle Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Asp Ali!l. Bis t..y$ Ser 180 185 quot;0
Olu Va.l Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala 195 200 20S
Leu Val Leu Ile Ala Pho Ala Gln Tyr Leu Gln Gl. Cys Pro Phe Glu 210 215 220
Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys ;):25 230 23S 240
Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu A:m Cy8 Asp LYli Ser Leu HiB Thr Leu 245 250 255
Phe ely Asp Lys Leu Cys Thr Val Al. Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly 260 265 270
Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Cln Glu Pro alu Arg Asn Gl u Cys 275 280 285
Ph. Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Aso Leu Pro Arg Leu Val Arg
2.0 2'5 300
Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Aso Glu Glu Thr 305 310 31!i 320
Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr elu Ile Ala Aro Arg His Pro Tyr Phe 325 330 335
Tyr Ala Pro Glu Leu Leu phc Phe A,quot; Lys Aql Tyr Lys Al. Ala Phe 340 345 350
Thr Glu Cys eys Gln Ala Ala Aop Lys Ala Al.1 Cys Leu Leu Pro Lys 3SS 360 365
Leu Alt;p elu Leu Arg Asp elu Gl, Lys Ala Sel~ Ser Al. Lys Gl n Arg 370 375 380
Leu LyO Cys Ala Ser Leu el. LY' Phe Gly Glu gt;.r. Ala Phe Lys Ala 385 390 39~) 400
Trp Ala Val Ala Ar9 Leu Sar Gln Arg Phe Pr() Lys Ala Glu PhI!! Ala 405 410 415
Glu Val Ser Lys Leu Val Thr ASP Leu Thr LyEl Val His Thr elu Cys 420 4quot; 430
Cys His Gly ~sp Leu Leu Glu Cys ~la Asp Asp ~~g Ala Asp Leu Ala 435 440 445
Lys Tyr ne Cys Glu Asn Oln Asp Ser lle Ser Ser Lys Leu Lys Glu 'SO quot;0
4SS
Cy. Cys Glu Ly:s; pro Leu Leu Glu Ly:s; Se~ Mis Cys lle Ala Glu val 465 470 .75 480
Olu Asn Asp Glu Mee Pro Ala Asp Lcu Pro Ser Leu ~la ~la Asp Phe
4.5 490 495
Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Ty~ Ala Glu Ala Lys ~sp Val 500 505 510
Phe Leu Gly Met Phe Leu Ty~ Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 515 520 525
Ser Vol Val Leu Lcu LCu gt;rg Leu Ala Lys Thr Tyr Olu Thr 'l'hr Leu 530 535 540
Glu LY' Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 545 SSO 555 560
Phe Asp Glu Phe Ly. Pro Leu Val Glu Olu Pro Gln Asn Leu n. Lya 565 quot;O quot;5
Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Oly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn 580 585 590
Ala Leu Leu val Argo Tyr Thr Lys Lyo Val Pro Gln val Ser Thr Pro 595 600 60S
Thr LeU Val Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys CyA '10
HS 620
Cys Lys !lis Pro Glu A13 Lys Arg Me t Pro Cys Ala Glu ASp Tyr Leu 625 630 635 640
Ser val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu Hi s Glu Lys Thr Pro Val 645 650 655
Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg 660 665 670
Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 675 680 685
Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lle Cys Thr Leu Ser 690 695 100
Glu Lys Glu Arg Gln Ile Ly$ Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val 105 710 715 720
LY' His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu eln Leu Lys Ala Val Melt; Asp 725 730 73'
Asp Phe .\la Al. Ph. Val Glu Lys CY' eys Lys Ala Asp Asp Lys 01. 740 745 150
Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lya LY' Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala
755 7'0 765
Ala Leu Gly Leu 770
lt;210gt; 162 5 lt;211gt;775
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 162
Melt; Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu PhE~ Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10 15
Tyr Ser Arg-Gl y Val Phe Arg quot;rg Aop Ala Hhl Lys Ser Glu Val Al. 20 25 30
His Arg 'he Lya Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe! Lys Al. Leu Val Leu 35 40 45
rle Ala Phe Ala Gln 'lyr Leu eln Gln Cys Prcgt; 'he Glu Asp His Val 50 60
quot;
LyS Leu Val Asn Glu Val Thr Clu Phe Ala LyE: Thr Cys Val Ala Asp
65 70 n; 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His, Thr Leu Phe Gly Asp 95 90
quot;
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Aro Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 lOS 110
Asp Cys Cys Al. Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys 'he Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Peo Aon Leu Pro Arg Leu. Val Ar. Pro Glu Val 130 1)5 140
Aso Val Mee Cys Thr Ala 'he His Asp Asn Glu Olu Thr Phe Leu Lys 145 150 160
'quot;
Lys Tyr Leu 'I'yr Glu 1le Ala Arg ArO' His Pr e, Tyr Phe 'J'yr .10 'ro 1 65 170 175
Glu Leu Leu Phe phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala, Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
cys Gln Ala Ala ASP Lys Ala Al . Cys Leu Ley. pro Lyo Leu ASP Glu lOS 200 205
Leu Arg Jl,sp e l u Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys: Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Al. Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe' Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 2lt;0
Ala Arg Leu Ser Gl n Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr ASp Leu Thr Lys val His Thr' Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp 1'.r9 Ala ASI;) Leu Ala Lys Tyr l1e
275 280 285
Cyo Glu Mquot; Cln Asp Ser llo Ser Ser Lys LeIJ Lys Glu eya Cys Glu 290 295 300
Ly' Pro Leu Leu Glu Lys Ser HhCys Ile Alél Glv val Glu Asn -'P 305 310 31 ~1 320
Glu Met Pro Ale. ASp Leu Pro Ser Leu Al. 11.111 Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lya Aquot;p Val Phe Leu Gly 340 350
'45
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala AJ:g Arg His Pro Asp Tyr Sel: val val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Th]~ Thr Leu Glu Lys Cys
'70 '75 '80
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Al¡1 Lys Val Phe ASp Glu 385 390 J9~;¡ 400
Phe LyS Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Aso Cys 405 410 415
Glu Leu Phe GIl: Cln Leu Gly Glu Tyr Lys phl~ Cln Aso Ala Leu Leu
420 425 430
Val Ar9 Tyr Thr Lys Lys Val pro Glo Val SeJ~ Thr Pro Thr Leu val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly SeJ~ Ly. Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arr¡ .a, Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Lau Ser Val Val 465 470 47S 480
Leu Asn Gln Leu Cy. Val Leu His Glu Lys Thl: P¡:-o Val Ser Asp Aro 485 490 4gt;5
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Lau val Asn Arg quot;'rg Pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Vo 1 Pro Lys Glu phc Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe 'l'h..-Phe Hi.s Alquot; ASP TIe Cl(S Thr Leu Ser Gl.. Lys 01quot; 530 535 540
Ar. Gln Ile Lys Lys Gln Thr Aló!l Leu val G1I.:L Lsu Val Lys His Lys 545 550 55$ 560
Pro Ll(s Ala Thr LY' Glu Gln Leu Ll(s Al. va.l Mee Asp Asp • he Al • 565 570
quot;5
quot;'la phe Val Glu Ly. Cys Cys Lys Al. Asp Asp Lys Glu Thr Cye Phe 5SO 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu G)y 595 600 605
Leu Ket Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn ?he
61. 615 quot;.
eln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu ASln Gly Aro Leu Glu Tyr Cys
...
625 quot;. 635
Leu Lys Asp Arg Me t quot;n Phe Asp 'Ile Pro Glu Glu ¡le Lys Gln Leu quot;5 650 '55
Gln Gl n Phe Gln Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu 660 665 670
eln Asn Ile phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp 675 680 685
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His eln Ile
6'. '95 100
Asn His LeU Lys Tnr Vel Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe 105 110 115 720
Thr Ar9 Cly Lys Leu Me' Ser Ser Leu His Leu Lys Argo Tyr Tyr Gly 725 quot;O 735
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Al a Lys Cl u Tyr Ser His Cys Ala Trp 740 745 750
Thr Xlc v~l Arg Va l Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe rle Asn Arg 755 760 765
Leu Thr Gly '.ryr Léu Arg Asn 770 775
lt;210gt; 163
lt;211 gt; 772
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (240)
lt;223gt; Xaa es igual a cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural
10 lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (270)
lt;223gt; Xaa es igual a cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural
lt;400gt; 163
Me' Thr Asn Lyo Cys Leu LeU Gln Ile Ale Lcu Leu Leu Cys Phe Ser 1 S 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
2. 2S 30
Ser Ser Asn Ph. Gln Cys eln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn ely Arg
15 35
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met: Asn Phei quot;, 11e Pro Glu Gl u
SO 55 60
n. Lya Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys GIu Asp Al. Ala. Leu Thr n. 65 70 75 '0
l'yr Glu Mee Leu eln quot;n !le Phe Ala Be phe, A.rg Gln ASp Ser Ser 85 90 9S
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val e1u ASr.l Leu Leu Al, quot;n V.1 100 105 110
'I'yr His Gln lle Asn His Leu Lys 7hr v al Leu GIu G1u Lys t.eu Glu 115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Het Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu Mis Tyr Leu Ly.s: Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155, 160
Kis Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val G1u rlE' t..eu Ar9 Asn Phe Tyr 165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Asp Ale-quot;quot; Lys Ser
180 185 190
Glu val Al. His Arg Phe Lys AsO Leu Gly Ch.1 GIU Mn Phe Lys Ala 195 200 205
Leu v.1 Leu :tIe Ala Ph. Al. G1n Tyr Leu Gln G1n Cys Pro Phe Glu 210 215 220
Asp His Val Lys Leu Val Mn GIu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr xaa 225 230 2J~j 240
Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys AsO Ly~' Ser Leu His Thr Leu
245 250 255
Phc Gly Asp Lys Leu Cys Thc Val Ala Thr Leu Arg Glu Xaa Tyr Gly 260 265 270
Glu Mee Ala ASp Cys Cys Ala Lyo Cln Gl u Prc. Clu TucO Asn Glu Cys 275 280 285
phe Leu Gln His Lys ASP ASP Asn Pro Aso Leu Pro Arg Leu Val Arg 290 295 300
Pro Glu Val lI.sp Val Mee Cy .o; Thr Ala Phe Hü: Aap Asn Glu Glu Thr 305 310 315. 320
Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Aro His Pro Tyr Phe 325 330 335
Tyr quot;10/1 Pro Glu Leu Leu Phe Phe Al. Ly. Arg Tyr Ly. Ala Al. Phe
34. 345 350
Thr Glu Cyo Cys Glo 1\180 Ala Asp Lys Ala Alal Cys Leu Leu Pro Lys 355 360 365
Leu gt;00 Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln II.rg 370 375 380
L.u Ly. Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Cly Cl. Aro Ala Phe Lys Al. 385 390 3quot; 1,00
p~o,
Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg phe Lys Ala Glu Ph. Ala 405 'lO 415
Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys: Val His Thr Glu Cys 420 425 430
Cys His Cly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala 435 440 445
Ly, Tyr Ita Cys Glu Asn Gln ASp Ser Ile SeJ:quot; Ser Lys Leu Lys Glu 450 455 460
eys eys Clu Lys Pro Leu Leu Clu Lys Ser His: Cy, IIe Ala Glu v.l 465 470 .7gt; 480
elu Asn Asp GIu Me' Pro Ala Asp Leu pro SeJ:quot; Leu Ala Ala ASO Ph. 485 quot;O 495
val Glu Ser Lys Asp val Cys Lys Asn T'yr Alal CIu Ala Lys II.sp Val 500 SOS 510
phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Ar91 Arg His pro ASp Tyr 515 520 525
Ser val Va 1 Leu Leu L~u 1'.:1:9 Leu Ala Lys Thgt;;quot; T'yr Glu Thr Thr Leu 530 535 540
elu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val 545 SSO 555 560
Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Clu Glu Preo Gln Asn Leu 11e Lys 565 570 575
Gln Asn Cys Glu Lcu Phe Glu Gln Leu Gly Clu Tyr Lys Phe Gln Asn 580 585 590
Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pre, Gln val Ser Thr Pro 595 600 605
Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys' Val Gly Ser Lys Cys 610 615 620
Lys His Pro Glu Ala Lys Aro Met Pro Cys Ala Glu ASP Tyr Leu
Cquot;
625 630 635, 640
Ser Val val Leu Asn Gln Lf'lU Cys Val Leu His' Glu Lys Thr Pro Val 645 650 655
Ser Asp Aro Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser-Leu Val Asn Aro¡ Aro¡ 660 665 670
Pro Cys phe Ser Ala Leu Glu V.l Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 675 680 685
Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr phc quot;is Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser 690 695 700 ·
alu Ly' Glu Arg Gln He Ly, Lys Gln Thr Al. Leu Val Glu Llt;:!u V.l 705 710 715 720
Lya His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu aln Leu Lys Ala Val Met Asp 725 no n5
Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cya Cys Lys Ala ASp Asp Lyo alu 740 745 750
Thr Cys Phe Ala Glu Glu ely Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 755 760 765
Ala Leu Gly Leu
lt;210gt; 164
lt;211gt; 775
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICA MISCELÁNEA
lt;222gt; (487)
lt;223gt; Xaa es igual a cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural
10 lt;400gt; 164 Me. Ly!: Trp Val Thr Phe xle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser hla 1 5 la 15
Tyr Ser Arg aly Val Phe Arg Arg AsO Ala Hls Ly. Ser alu val Ala 20 25 30
H18 Arg Phe Lys ASP Leu Gly Glu Glu Asn Phe Ly. Ala Leu Val Leu J5
'O ..
ne Al. ehe Ala Gln Tyr Leu aln Gln Cys Pro Ph. alu ASP His Val 50 55
quot;
Ly. Leu Vquot;l Asn Glu Val 'he Glu Phe Ala Ly. 'he Cys Val Ala Asp 65 70 75 80
alu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe aly Asp 85 90 OS
Lys Leu Cys Thr Val Alquot; Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110
ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln lIS 120 125
Hls Ly. AsO ASP Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Ar. Pro Glu Val 130 135 140
AsO Val Met Cys Thr Al. phe Hia Asp Asn alu alu Thr Phe Leu Ly. 145 lSO 155 160
Ly. 'T'yr Leu Tyr GIu He Ala Arg Arg H1s pro Tyr Phe Tyr Alquot; Pro
165 170
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys AlaL Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cy~ Gln Ala Alá Asp Lys Ala Ala Cys Leu Le~ Pro Ly~ Leu J\sp Glu 195 200 205
Leu Arg Asp elu Gly Lys Ala Ser Ser Alquot; Lys: Glo Jl,rg Leu Lys Cys 210 215 220
Ah Ser Leu Gln Lys Phe Gly elu Arg Ala Pha, Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 2.0
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Gl~ Phe Ala elu val Ser 245 2SO 255
Lys Lou Val Thr ASp Leu Thr Lys V.l His Th:cquot; Glu Cys o,e His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg }r.la AS&::' Leu Ala Lys Tyr lle
275 280 285 ...
Cys elu Asn Gln Asp Ser ne Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Alquot;, elu Val elu Aan Asp 305 310 3lS 320
elu Melt; Pro l\la 'quot; t.eu Pro Ser Leu Ala Ala. 1\.sp Phe Val elu Ser 'quot; 330 335
Lys Asp Val Cy. Ly, Asn Tyr I\.la Glu Ala Lys ASp Val 'he Lequot; Gly 340 345 350
Me' Phc Leu Tyr Glu Tyr Ala Are ArO His Pre. ASP Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu ThJ:' Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys ....la ...la J\.la Asp Pro His Gl... Cy$ Tyr Ale, L)'$ Val quot;he Asp Clu 385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410
4l'
Glu Leu Phe Cl... Cln Leu Gly Gl... Tyr Lys PhE! Gln Asn Ala Le... Leu 420 425 430
Val Arl) TYr Thr Lys Lvs Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu Val Ser Arg: quot;'sn Le... Gly Lys Val ely Ser:' Lys Cys Cys Lys His
.50 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asquot; Tvr Leu Ser Val Val 465 470 475 480 __ ~__ Rl __ G~ ____,S__ _
485 490 495
val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Clu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Clu phe Asn Ala 515 520 525
Clu Thr Phe Thr Phe His Ala A.p lle Cys Thr Leu Ser Glu Lys elu 530 535 540
Arg Cln :Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Clu Leu Val Lys His Ly, 545 SSO SSS 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met ASP ASP Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val e lu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Cly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Al. Al. Leu Gly 595 600 60S
Leu Ker Sor Tyr A,¡;n Leu Leu Cly Phe Leu Gln Alt;g Ser Ser Asn phe 610 615 620
Cln Oy, Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn ely Arg Leu Glu Tyr Cy, 625 630 635 640
Leu Lys Asp Arg Me t Asn Phe ASP lle Pro Glu Glu lle Lys eln Leu 645 650 655
Gln Gln Phe Gl n Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Xle Tyr Glu Het Leu 660 665 670
Gln A..sn Ile Phe Ala Ile Phe ArO Gln A9p Ser Ser Sor Thr Gly Trp 675 680 685
A,n Glu Thr lle Val Glu Aan Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln lle 690 69' 700
Asn Mis Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ASP Phe 70S 710 71S no
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Aro Tyr Tyr Gly 725 730 735
Arg lle Leu His Tyr Leu LyS Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp 740 745 750
Thr lle Val Arg Val Glu lle Leu Arg ASn Phe Tyr Phe rle Asn Arg 755 760 765
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Aso 770 775
lt;210gt; 165 lt;211gt;771
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 165
M" Thr Aso Lyo Cys Leu Leu Gln Ile Ala 1..ell Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Aro Ser 20 25 JO
SelC Asn Phe Gln Cys Cln Lys Leu Leu Trp Gltn Leu Asn Gly Arg Leu 35 4S
4.
Glu Tyr Cy$ Leu Ly13 Asp ArS Mer Asn Phe quot;51;) 11e 'ro Glu Glu Ile 50 55 60
Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Al;!!. Ala Leu Thr 11. Tyr
7. 7.5 80
Glu Met Leu Oln Aso Ile phe Ala Ile Phe A~~ Gln Asp Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Gly Trp Asn Glu Thr tle Val elu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr
100 105 110
His Gln Ile Aso His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Gl u Lys 115 120 125
elu Asp Phe quot;rhr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg
130 135 140
Tyr Tyr Gly Arg lle Leu His Tyr Leu Lys Lys Glu Tyr Ser His
145 150 160
Cys A.la Trp Thr Ile Val Arg val elu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe 165 170 175
rle A.sn Arg Leu Thr ely Tyr Leu Arg Asn Asp Ala His Lys Ser Glu 180 185 190
val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn phe Lys Ala loeu
195 200 20S
vol Leu n. AJa rhe Ala Gln Tyr Leu Gln Gl1\ Cy. 'ro quot;he Glu ASp 210 215 220
quot;i. Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu quot;ht~ Al. Lys Thr Cys Val 225 230 23!i 24.
Al. ASp Glll Ser Al. Glu ASO Cys ASp Lys Sel: Le u His Thr Leu Ph. 245 250 25S
Gly ASp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Ar~1 Gl u Thr 'I'yr GIl' Glu
260 265 270
Met Ala ASP Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Ghl Arg Asn Glu Cys Phe 275 280 285
Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pn) Arg Leu Val Arg Pro 290 295 JOO
Glu Val Asp Val Het Cy. Thr Ala Phe Hi s A9p Asn Glu Glu Thr Ph. JOS 310 3l~i 320
Leu Lys Lys Tyr Leu 'IYr Glu lle A18 Aro Ar~;J His Pro Tyr Phe Tyr 325 330 335
Ala Pro Glu Leu Leu phe Phc Ala Lya Arg Ty:r Lys Ala Al. Phe Thr 34' 345 350
Glu Cys Cya Gln Ala Ala Asp Lyo Ala Ala Cyl~ Leu Leu Pro Lys Leu 355 36' 365
Asp Glu Lau Acg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Se:r Ala Lys Gln Arg Leu 37'
375 380
Lys Cys Ala Ser Leu Gl n Lys Phe Gly Glu Ala Phe Lys Ala Tro lSS 390 400
Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro LYlS Ala Glu Phe Ala Glu
405 lt;1, 415
Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 420 425 430
HilO Gly Asp LeU Leu Glu Cy$ Ala ASp Leu Ala Lys 435 440 445
ne Cys Glu Aso Gln Asp Ser l l e Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 450 455
..,
Cys Gll.I Lys Pco Lel.l Leu Glu Lys Ser His Cy:~ lle Ala Glu Va l Glu 465 470 4 7S 480
ASR ASp Glu Het Pro Ala Asp Leu 'ro Ser L eu Ala Ala Asp Phe Val 485 490 4'5
Glu Ser Lys 'quot;' Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 'he soo soS 510
Leu Gly MOC ph. Leu Tyr Glu Tyr Al. Arg A:ql His Pro As, Tyr Ser 515 520 525
Val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyl~ Glu Thr Thr Leu Glu 530 535 54'
Lys Cys Cys AI~ Ala Al. 1'.Sp Pro His Glu CYquot; Tyr Ala Lys Val Phe 545 5SO 55~¡ 560
Asp Glu phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu lle LyS Gln 565 570 575
Asn Cys Glu Leu Phe G11.I Gln Leu Gly Glu Tyl~ Lys Phe Gln Asn Ala seo 585 590
Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Se r Thr Pro Thr 595 600 605
Leu val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Selquot; Lys Cys Cys 610 615 620
Lyquot; His PrO Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Alu Glu Asp Tyr Leu S8r 625 630 635 640
Val Val Lcu Asn Gln Leu Cys Val Leu His GIu Lys Thr Pro Val Ser
645 650
Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu val Asn Arg Arg Pro 660 66~ 670
Cys Phe Ser Ala Leu Glu val Asp Clu Thr Tyr val Pro Lys Glu Phe 675 680 685
Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser CJu 690 695 700
Lys Glu Arg Gln IIe Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 705 710 715 720
His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 725 730 735
phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys alu Thr 740 745 750
Cys phe Ala alu Glu Cly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 755 760 765
Leu Gly Leu 170
lt;210gt; 166 lt;211gt;771
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 166
Met Thr Aso Lys Cys Leu Leu Oln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 S 10 15
Thr Thr Ala Leu Se r Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser 20 25 30
Ser Asn Phe Gln Ser aln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu 35 40 45
Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Pbe Asp l le Pro Glu Glu rle SO SS 60
Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr rle Tyr 65 70 75 80
Glu Ket Leu Gln Asn lle Phe Ala lle Phe Arg Gln ASP Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Gly Trp Asn Glu Thr tle Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr 100 105 110
His Gln lle Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leo Glu Lys 115 120 125
Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg 130 135 140
Tyr Tyr Gly Arg lle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His
145 150 155 160
Cys Ala Trp Thr 11e V.l }gt;.rg Val Glu 11e Lel.! Arg ,.sn I?he Tyr Phe 165 170 175
Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu 'ro ••n Asp Ala His Ly. Ser Glu 180 185 190
Val Ala His Aro Phe Lys Asp Leu Gl y Glu GIIJ Asn phe Lyo Ala Leu 195 200 205
Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gll1. Cys Pro Phe Glu Asp 210 215 220
Hl. val Lys Leu Val ..n Glu Val Thr Glu Ph,~ quot;. Lys Thr Cys Val 22' 230 2) ~) 240
Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Ly' Ser Leu !lis Thr Leu Phe '45 250 'SS
Gly AGP Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Ar!;!' Olu Thr Tyr Gly Glu 260 '65 270
Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg gt;on Glu Cys phe
27' 280 285
Leu Gln His Lys ASP ASP Asn Pro Asn Leu Pr.) Arg Leu Val Arg Pro 290 300
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Olu val Asp Val Met Cy. Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe 305 310 3l~j 320
Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Ar!l His Pro Tyr Phe Tyr 325 330 335
Ala pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg TYr Lys Ala Ala Phe Thr 340 345 350
Olu Cys Cys eln Ala Ala ASp Lys Ala Ala. Cy~i Leu Leu Pro Lys Leu 355 360 365
ASp Gl u Leu Arg ASP Glu Gly Lys Ala Ser Sel~ Ala Lys Gln Arg Leu 370 375 380
Lys Cys Ala Ser Leu e ln Lys Phe Gly Glu Aru Ala Phe Lys Ala Trp 38' 390 39~¡ 400
Ala val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Ly!l Ala Glu Phe Ala Glu 405 410 415
Val Ser I.y.. L..,u Vnl Thr Asp Leu 'Thr T.y'J Va:!' f.li s 'Thr Glu Cys Cys 420 425 430
His Gly ASp Leu Leu Glu Cys Al. Asp ASp Ar~, Ala quot;p Leu Ala Lys43' 440 44'
Tyr Ile Cys Glu Asn Gln }'r.quot;SI) Ser Ile Ser Sel' Lys Leu Lys Glu Cys 450 455 460
Cys Glu Lys Pro Leu Leu e lu Lys Ser f.lis Cy~; Ile Ala elu Val Glu 465 470 47S 480
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485 490 495
Glu Ser Lys Asp Val Cys Ly$ Aso Tyr Al. Glu Ala Lys Asp Val Phe 500 505 510
Leu Gly Me' 'he Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Argo His 'ro Asp Tyr Ser 515 520 525
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Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His GIu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 545 550 555 560
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Leu Leu Val Aro Tyr Thr Lys Ly. Val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr 595 600 605
Leu Val Glu Val Ser Aeg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 610 615 620
Lys Kis Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 625 630 635 640
Val Val Leu Asn eln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro val Ser 645 650 655
Asp Arg val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser L~u Val Asn Arg Arg Pro 660 665 670
Cys phe Ser Ala Leu Glu Val ASP Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 675 680 685
Asn Ala Clu Thr Phe Thr Phe His Ala ASp lle Cys Thr Leu Ser Gl u 690 695 700
Lys Clu Arg Gln Ile Lys Lys eln Thr Ala Leu Val Glu Lcu Val Lys 705 710 715 720
Hi$ Lys Pro Lys Ala Thr Lys elu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 725 730 735
Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASp Lys Glu Thr 740 745 750
Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 755 760 765
Leu Gly Leu 770
lt;210gt; 167
lt;211gt; 769
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 167
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,
1 lO 1S
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20 30
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Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu ,quot;p His Val Lye; Leu Val Asn Clu Va.l
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'quot;
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Ala Arg Arg His Pro Tyr Phc 'I'yr Ala Pro G1u; Leu Leu Phe Phe Ala 170
17'
Lys Arq Tyr Lys Ala Ala Phe Thr G1u Cys Cys: Gln Ala Ala Asp Lys 180 185 190
Ala Ala Cys Leu Leu Pro Ly~ Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Cly Lys 19' 200 205
Ala Ser Ser Ala Lys Cln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe
210 215 220 Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Alo Arg Leu Ser Gln Arg
225 230 235 24' Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu va l Ser Lys Leu Val Thr ASp Leu
245 250 255
Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys Hio Cly Asp Leu Leu Glu Cys Ala 260 265 270
Asp ASp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln ASp Ser 275 280 285
I le Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys 290 295 300
Ser His Cys Ile 1\.la Glu Val Glu Asn quot;,sp Glu Melt; Pro Ala Asp Leu 305 310 31,5-320
Pro Ser Leu Ala Al. Asp Phe Val Glu Ser Lys; Asp Val Cys Ly. Asn ]25 330 ]35
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Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala ]55 ]60 ]65
Lya Thr Tyr alu Thr Thr Leu Clu Lys Cys Cysl Alo Ala Ala Asp Pro 370 ]75 380
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Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln ASR ey. Glu Leu Phe Glu Gln Leu 405 610 015
Gly Glu Tyr Lya Phe aln Asn Ala Leu Leu Val Aro:¡ Tyr Thr Lya Lys 420 42' 430
Val p,o Gln Val Ser Thr pro Thr Leu Val Glu val Ser Ar9 ASR Leu 435' 440 445
Oly Ly. Val Gly Ser Lys oy. eye Lys His Prc, Olu Ala Lys Arg Met 450 455 460
Pro eys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val 46' 470 '.0
47'
Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg val. Thr Lys Cys ey.
4.5 4.0 495
Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cyo Phe Ser-Ala Leu Glu Val Asp 500 505 510
Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His 515 520 525
Ala ASP Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Ar~ Oln I le Lys Lys Gln 530 535 540
Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pr~ Lys Ala Thr Lys Glu 545 550 555 560
Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala. Phe val Glu Lys 565 570 575
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr ey. Phe Ala. Glu Glu Gly Lys J.,ys 580 5.5 590
Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu. Met Ser Tyr A¡¡;n Leu 595 600 605
Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu 610 615 620
Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn
625 630 635
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Asp 1gt;.10. Ala Leu Th. lle Tyr Glu Me' Leu Gln quot;'~n Ile Phe Alo ne 660 665 670
Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser The Oly Trp Asn Clu 'he U. Val Glu 675 680 685
Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln lle Asn His Leu Lys Thr Val 690 695 700
Leu Glu alu Lys Leu Glu Lys alu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met 705 110 715 720
Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Cly Arg Ile Leu His Tyr Leu 725 730 13S
Lys Ala Lys alu TYr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val alu 140 745 750
Zle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe 11e Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg 155 160 765
Asn
lt;210gt; 168
lt;211gt; 769
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 168
Mee Lys Trp Val Thr Phe l1e Ser Leu Leu Phe Leu Phe S~r Gly val 1 5 la 15
Se. Gly ASP Ala His Lys Ser alu Val Ala His Arg Phe Lyo Asp Leu 20 25 30
Gly Glu Olu A,n Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala eln Tyr
35 .0 45
Leu Gln Oln CyS Pro Phe Olu Asp His val Lys Leu Val Asn Glu Val 50 55
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Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly A~p Lya Leu Cys Thr V~l Ala 8S 90 9S
Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Clu Met Ala Aep Cys Cys Ala Lys Gln 100 105 110
Clu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Cln His Lys ASP Asp Asn pro ll5 120 125
Asn Leu pro Aro Lcu Val Arg Pro Glu val Asp Val Met Cys Thr Ala 130 135 140
Phe His Asp Aso Glu Glu Thr Phe Leu Lys Ly:s Tyr Leu Tyr GlU ne 145 150 155 160
Ala Agt;::g Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala P,o Gll..I Leu Leu Phe Phe quot;.16S 170 l1S
Lys Arll Tyr Ly, Al. Ala Pha Thr Glo Cye Cy:s Gln Ala Al. Agt;p Lye 180 185 190
Ala Ala Cys Leu Leu pro Lys I..cu ASp Glu Lel.l A.rg ASp Glu Gly Lys 195 200 205
Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe 210 215 220
Gly Glu Arg Ala Phe Ly' Ala Trp Ala Val A111 ArO Leu Ser eln Aro 225 230 23~) 240
Phe Pro Lys Ala Glu Ph. Alquot;. elu Val Ser LyiO Leu Val Thr AS, Leu 245 250 2SS
Thr LyS Val Hin Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cye quot;a 260 265 270
Asp As p Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cy!. Glu Asn Gln Asp Ser 275 290 285
1:1e Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Ly!~ Pro Leu Leu Glu Lys 290 295 300
Ser His Cys Ile Ala Glu val Glu Asn Asp Gll1 Met Pro Ala Asp Leu 305 310 320
Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Ly!; ASp Val Cys Lys Aso
325 330 335
Tyr Ala Glu Al~ Lya Asp val Phe Leu Cly Met: Phe Leu Tyr Glu 'I'yr 340 345 350
Ala Arq Arg Hi~ Pro Asp Tyr Ser Val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 355 360 365
Lys Thr Ty' Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cy!: Ala Ala Ala ASp Pro 370 37S 380
His Glu Cys Tyr Ala Ly' Val Phe Asp Glu PhE! Lys Pro Leu Val Glo 395 390 39!; 400
Glu Pro Glquot; Asn Leu Ile Lys elquot; Asn Cys ell;L Leo phe Glu Gln Leu 405 410 415
ely Clu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val ArO' Tyr Thr Lys Lys
420 425 430
val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Gl\.l Val Ser Arg Asn Leu
435 .40 4'5
Gly Lys Val Cly Ser Lys Cys Cys Lys His Prc, Glu Ala Lys ArO' Met: 450 455 .60
Pro Cys A.la Gl\1 ASP Tyr Leu Ser Val Val Leu 1\.sn Cln Leu Cys Val 465 'quot; 475 4.0
Leu His elu Lys Thr 'ro Val Ser ,,quot;sp Arg V.l Thr Lys Cys lt;:y. Thr
4.5 490 quot;5
Glu Ser Leu V., Asn Arg Arg Pro Cy. quot;e Ser Ala Leu Glu Val Asp 500 SOS 510
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Ala Asp 11e Cys Thr Leu Sor GI\! Lys Glu Arg Gln 11e Lys Lys eln 530 535 540
Thr Al. Leu Val Glu Leu V.l Lys His Lys Pro Lyo Ala Thr Lys Glu 545 SSO 555 560
Gln Le\! Lys Alill v.l Melt; ASp Asp Phe Al. Al. Phe Val Glu Lys eys 565 570 575
Cys Lys Ala quot;p As. Lys Glu Thr Cys Phs Ala elu elu Gly Ly. Lys 580 5.5 590
Leo Val Al. Als Ser eln Ala Al. Leu Gly Leu Met Ser Tyr ASO Leu 595 600 605
Leu Gly Phe Leu eln Arg Ser Ser Asn .Phe eln Cys Glo Lye Leu Leu 610 615 620
Trp Glo Leu ASO Cly Ar. Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp }\rg Het Aso 625 630 635 640
Phe ASP 11e Pro GI\! elu 1le Lys Gln Leu Glo e ln Phe eln Lys Glu 645 650 655
Asp Ala Ala Le\! Thr tle Tyr elu Met Leu eln Asn 11e Phe Ala l1e 660 665 670
Phe Arg elo ASP Sor Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu 675 680 685
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Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp phe Thr Arg Gly Lys Leu Met 705 710 715 720
Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Cly Arg Ile Leu His Tyr Leu 725 730 735
Lys Ala Ly$ Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr lle Val Arg Val Glu 740 745 750
11e Leu Arg Asn Phe Tyr Phe 11e Asn Arg Leu Thr G1y Tyr Leu ~rg 755 760 765
Aso
lt;210gt; 169
lt;211gt; 769
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 169
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Ser Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala Hi:¡ Aro;¡ Phe Ly. Asp Leu 20 25 30
Cly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu ¡le Ala Ph. Ala elquot; Tyr 35 40 45
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85 .,
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Glu Pro Glu Aro Asn elu Cys Ph. Leu eln His Lys Asp As. Asn Pro 115 120 125
Asn Leu Pro Arg Leu Val gt;rg Pro Glu Val Asp Val Mee Cys Thr Ala 130 135 140
Phe His ASp ,quot;-so Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu n. 145 150 1SS 160
Ala Arg Arg His Pro Tyr phe Tyr Ala Pro elu Leu Leu Phe Phe Ala 165 170 175
Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cyu Cln Ala Ala ASp Lys 180 185 190
Ala Ala Cys Lequot;, Leu Pro Lys Leu ASp Glu Len Arg ASp Glu Gly Lys 195 200 20S
Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Alll Ser Leu Gln Lys Phe 210 215 220
G~y Glu A~g Ala Phe Lys Ala Trp quot;la Val AlfL A.rg Leu Ser Gln quot;rg 225 230 23S 240
Ph. Pro Lys Ala Glu Ph. quot;la Glu Val Ser LYló Leu Va.l Thr Asp Leu 245 250 255
Thr Lys val Hi. Thr Clu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cy. Ala 260 265 270
Asp Asp Ar. Ala Asp Leu Ala Ly. Tyr Ile Cy!: Glu Asn Gln Asp Se~ 275 280 285
lle Se~ Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Ly.!!L Pro Leu Leu Clu Lys
2.0 2.5 300
Ser His Cys Ile Ala Glv Val Glu Asn ASP Gl u Mee Pro Ala Asp Lev 305 310 3I' 320
Pro Ser LlI'!u Ala Ala Phe Val Glu Ser Ly$ ASP Val Cys Ly, quot;n 325 'quot; 330 335
'I'yr Ala Glu Ala Ly. Asp Val phe Leu Gly Meto Phe Leu Tyr Glu Tyr 340 345 350
Ala Arg gt;r9 Mis Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Lev gt;r. Le... Ala 35S 360 365
Ly. Thr Tyr olu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys: Ala Al. Ala Asp Pro no 305 380
Hi$ Glv Cys Tyr Al a Ly. Val Phe ASP Glu phe, Ly. Pro Leu Val Glv 305 390 395 400
Olu Pro eln Asn Lev Ile Lys Cln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu 405 410 415
Gly Glu Tyr Lys Phe elo Asn Ala Leu Leu Val. Arg Tyr Thr Lys Lys 420 425 430
Val Pro Cln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Clu Val Ser Arg ASo Leu 435 lt;40 445
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met: 455
4" quot;O
Pro CyS Ala Glu Asp 'l'yr Leu Ser Val Val Leu Asn Cln Leu Cys Val 465 470 475; 480
Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr .85 490 495
Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys PhI:! SeJ;quot; Ala Leu Olu Val ASp 500 505 510
Glu Thr TYr val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe Mis 515 520 525
Ala As~ rle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Ar9r Gln rle Lys Lys Gln 530 535 540
Thr Ala Leu Val Gru Leu Val Lys His Lys Prc, Lys Ala Thr Lys Glv 545 550 55S, 560
Gln Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe Ala A1& Phe Val Glu Lys Cys 565 510 575
Cys Lys Ala Asp Asp Lys alu Thr Cys Phe Al80 Glu Glu G1y Lys Lys 580 585 5'0
Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala gt;1. Leu Gly Leu Met Ser 595 600 605
Leu Gly Phe Leu Gln Aro Ser Ser Asn Phe Gl~ Cys Gln Lys Leu Leu 610 615 620
Trp Gln Leu Asn Gly 'lt;. Leu Glu Tyr CyS Leu Lys Asp Arg Mct A,n62' 6quot; 63' 640
Phe Asp l1e Pro elu elu Ile Lys Gln Leu eln Gln phe Gln Ly. elu 6., 650 655
Asp Ala Ala Leu Thr 11e Tyr GI u quot;elt; Leu Gln Asn Ile phe quot;. Xle 660 66' 670
Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr tle Val Glu 675 680 685
Asn Leu Leu AlA Asn Val Tyr His Gln lle Asn His Leu Lys Thr val 690 695 700
Leu Glu GIu Lys Leu Glu Lys GIu ASP Phc Thr Arg Gly Lys Leu Met
70S 710 715 720
Sor Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr ely Arg Ile Leu His Tyr Leu 725 730 73'
Lys Ala Lys e l u Tyr Ser His Cys quot;a Trp Thr lle Val Ar. Val elu 740 74' 750
lle Leu Aro Aon Phe Tyr Phe Il. A,n Arg Leu Thr e ly Tyr Leu Arg 755 760 765
lt;210gt; 170
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 170
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser GIu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn ?hc Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
l1e ~la phe Ala e1n Tyr Lcu G1n G1n Cys Pro Phc C1u Asp His Val 50 SS 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr G1u Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 65 70 75 SO
Glu Ser Ala G1u Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe cly Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr LeU Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Het Ala 100 105 110
ASp Cys Cys Ala Lys cln Glu Pro G1u Ar~ Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp ASp Asn Peo Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro G1u Val
130 135 140
quot;,sp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phc Leu Lys 145 ISO 15'5 160
L)'S Tyr Leu Tyr Gtu 11e Ala 1\.c9 1'.1:9 His Pr.:) Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Al;1 Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Al. Cys Leu Leu Pro Ly. Leu Asp Ol u 195 200 20S
Leu Arg ASp Gtu Gly Lys Al. Ser Ser Ala LYl) Gln Arg Leu Lys Cys
21. 215 22.
Al. Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala. ph,~ Ly. Ala Trp Ala V.l 225 230 23~; 240
Ala Arg Leu Ser Gln Aro Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 24S 25. 255
Lys Leu Val Thr ,quot;p Leu Thr Lys val His Thl' Glu Cys Cy. Higt; Gly 260 265 '7'
ASp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 11e 275 280 28S
Cys otu Asn CIn ASp Ser ne Ser Ser Lys Leu Lys G1u Cys Cys Glu 2quot; 295 300
Lys pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ite 1'.1.1 Glu Val. Glu Asn ASp 305 310 3I!gt; 320
olu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala quot;quot;sp Phe val Glo Ser 325 330 335
Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lyn Asp VIII Phe Leu Gly 340 345 3S0
Met Phe Leo Tyr Glu Tyr Ala ArO ArO His Pr() Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leo Leo Arg Leu Ala Ly. Thr Tyr Glu ThJ~ Thr Leu GIu Lys Cys 3'0 3'S 380
Cy. Al. Ala Ala Asp Pro His Giu Cys l'yr Aht Ly. Val Phe Asp Glo 385 390 39!j 400
Phe Lys Pro T..eu VAl GI u Glu Pro Gl n Asn Leu l:le t.ys Gln Asn Cys 405 '10 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gi u Tyr Ly8 PhE~ Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Aro Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln val Ser Thr Pro Thr Leu Val 43S 440 445
Ciu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gl y Ser Lys Cys Cys LytJ His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys AlD Glu Asp Tyr Leu Ser val Val 465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Lcu Hie Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 4135 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe sao sos 510
Ser Ala Leu Glu val ASP Glu Thr Tyr val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala quot;. lle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Aro Gln lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Al. Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
~la Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASP Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Glo Ala Ala Leu Gly 595 600 60S
Leu Cys Asp Leu Pro Glo Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 610 615 620
Mct Leu Leu Ala GLn Met Arg Arg 11e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lyc 625 630 635 640
Asp Arg His ASp phe Gly Phe Pro Gln Gle Glu Phe Gly Asn eln Phe 645 650 655
Gln Lys Ala Glu Thr lle pro val Leu His Glu Met 11e Gln Gln lle 660 665 670
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 615 680 685
Leu Leu ASp Lys Phe Tyr Thr G1u Leu Tyr Gln Gln Leu ~Bn Asp LCu 690 695 700
Glu Ala Cys Val Mee Cln Glu Glu Arg Val Gly Clu Thr Pro Leu Met 705 710 115 120
Asn Ala Asp Ser tle Leu ~la Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg ¡le Thr 125 730 735
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val val 740 145 750
Arg Ala Glu [le Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 155 160 165
Arg I, rm Arg Arg Lys Glu 710
lt;210gt; 171
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 171
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,
1 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys }l.r-g AOlp Ala Hifl Lys Ser Glu V.l Ala 20 25 30
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Glu Ser Ala elu Asn oquot;s Asp Lys Ser Leu Hif, Thr Leu Phe Gly Asp 85 ,O 95
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Ala Arq LeU Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250
2quot;
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Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Al. Lys Tyr !le 275 280 285
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340 345 350
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Glu Leu Phe Glu Oln Leu Gly Glu Tyr Lys PhE' Gln Asn Ala Le. Le. 420 425 430
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Glt'l. Lys Ala Glu Thr Ile pro Val Leu His Clu Het Ile Gln Gln ne 660 665 670
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys ASp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 675 680 685
Leu Leu ASP Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Le u Asn Asp Leu 690 695 700
Glu Ser Cys Val Met Gln Glu Val Gly Val I1e Clu Ser Pro Leu Met 70S 710 715 720
Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 725 730 735
Le u Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser cys Ala Trp Glu Val val 740 7~S 750
/lo.rg Ala Glu tle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser I le Asn Leu Gln Lys 755 760 765
Arg Leu Lys Ser Lys Glu 770
lt;210gt; 172
lt;211gt; 774
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lt;400gt; 172
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115 120 125
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Asp Val Met Cys Thr Ala Phe Hia Asp Asn clu elu Thr Phe Leu Lyo 145 lSO 15~5 160
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Leu Arg Aop Olu Cly Lys Al. Ser Ser Ala Ly¡; Gln Ar. Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu GIn Lys Phe G1y Olu Arg Ala Ph.~ Lya Ala Trp Ala val 225 2JO 23!) 2.0
Ala Arg Leu Ser Cln Arg Phe Pro Lys quot;'la Glu Phe Ala Gtu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg Ala ASI~ Leu Lys Tyr 1le
quot;a
275 280 2.5
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Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser HlB CyS Ile Aln Glu val Glu ASR ASp 305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lyo Asp Va l Phe Leu Gly 340 345 350
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Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lya Thr 'I'yr GIu Thl: Thr Leu GIu Lys Cys 3'0 375 3.0
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Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phll'~ Gln Asn Al. Lell Leu 420 425 lt;30
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val SeJ:' Thr Pro Thr Leu Val 435 .0140 445
Glu v~l ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 4~5 460
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Leu Asn Gl n Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser As, Arg 485 490
quot;5
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Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Ly. 545 SSO 555 560
Pro Lys Ala Thr Ly. Glu Gln Leu Lys Al. v.l Met Asp Asp Phe Al. 565 570 575
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Ala Glu Clu Gl y Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Cl n Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Cl y Ser Arg Arg Thr Leu 610 615 620
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg 11e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys 625 630 635 640
Asp Arg His Asp Phe Cly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe 645 650 655
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Hia Glu Mee Ile Gln Gln lle 660 665 670
ph e Asn Leu Phe Ser Thr Lys As p Ser Ser Ala Ala Trp ASp Glu The 675 680 685
Leu Leu ASp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr CID Gln Leu ASn Asp Met 690 695 700
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Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Clu val Val 740 745 750
Arg Ala Glu Ile Me e Axg Ser Phe Ser Leu Ser Lys lle Phe Gl n Glu 755 760 765
Arg Leu Arg Arg Lys Glu 770
lt;210gt; 173 5 lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 173
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Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Aln Ala Phe Thr elu eye 180 185 lOO
Cys Glo Al. Ala ASP Lys Ala Al. ey. Leu Leu Pro Ly. Leu ASp Glu 195 200 205
Leu Ar. Asp Clu Gly LY!iI Al. Ser Ser Ala Lys Gln Ar. Leu Lys Cya 210 215 220
Al. Ser Leu Gln Lys ph. Oly Glu ArO' Ala pht! Ly. Ala Trp Ala val 225 230 23S 240
Al. Arg Leu Ser Cln Ar. Phe Ptquot;Q Lys Al. GIl! Phe Ala. Clu val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys v.l His Thquot; Clu Cys Cys His Cly 260 'OS 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Al. Lys Tyr ll@ 275 280 285
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2.0 2.5 JOO
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Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly~: Asp Val Phe Leu Gly
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Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Ar9 Arg His Prc. Asp Tyr Ser val val 355 360 JOS
Leu Leu Leu ArQ' Lcu Alquot;, Lys Thr Tyr Glu ThI' Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Al. I\.l a Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ah, Lys V.l Phe Aquot;quot;p elu 385 390 39$ 400
Phe Ly' Pro LCu Val Clu Clu Pro Gln Mn Leu Ile Lys Gln Asn Cys .0' 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe~ Gln Asn Ala Leu t.eu
.20 425 430
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Leu Asn Gln Leu Cys Vol Leu His Clu Lys Thr pro val Ser Asp Ar. .85 490 .95
V.l Thr Lys Cys -Cys Thr Glu Ser Lcu v.l Asrn Arg 1\rg Pro Cys Phc SOO SOS 510
Ser Ala Leu Clu Val Asp Glu Thr Tyr Val prlt;::. Lys elu Phe Asn Ala SlS 520 525
Clu Thr Phc Thr Phe His Al. Mp rle Cys ThI' Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 5lt;0
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Ch Leu V.l Lys His Ly~ 5lt;5 SSO SSS 560
Pro Lys Ala Thr Lys elu Gln Leu Lys Ala Val Met ASp Asp Phe Ala 56' 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp AS¡;J' Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser-Gln Ala Ala Leu Gly
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Leu Cys Asp Leu ~ro Cln thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 610 615 620
Het Leu Leu Ala Cln Het Arg Arg rle Ser Lcu ~he Ser Cys Leu Lys 625 630 635 640
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Phe Aso Leu Phe Thr Thr Lys AOp Ser Ser Ala Ala Trp gt;Sp Glu Asp
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Leu Leu Asp Lys ~he cys Thr Glu Leu Tyr Gln CIn Leu Asn ASp Leu 690 695 700
Glu Ala Cys Val Mat GI n Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Mel: 70S 710 71S 720
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg }\rg Ile Thr 725 730 735
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val val 7~O 745 750
Arg Ala Glu Ile Hel: Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr ABO Leu CIo Glu 755 760 765
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77.
lt;210gt; 174
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 174
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Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp ~la His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
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Lys Leu Val A~n Glu val Thr Glu phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95
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His Lys A •• Asp Asn pro A.n Leu pro Arg Lel.ll Val ArO Pro Glu Val 130 135 140
As. Val Met Cys Thr Al. Phe Kis Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu LY' 145 150 15gt; 160
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Glu Leu Leu Ph. Phe Ala Lys Argo Tyr Lquot; Ala. ;tgt;.la Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Al. Al. Asp Lys Ala Ala Cys Leu LeUl Pro Lys Leu J\sp Glu 195 200 205
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Ala Ser Leu Gln Lys Phe ely Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 2JO 23gt; 2.0
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe pro Lys Ala Gl\11 Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
val Th:t-quot;. His ely 260 265
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ASP Leu Leu Glu Cys Ala ASp Asp Arg Ala As~, Leu Al. Lys Tyr l1e 275 280 285
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Lys Asp Val Cys Lys A.sn Tyr A.la Clu A.la Lys, A.sp Val Phe Leu Cly J40 Jquot; 350
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Cys A.la A.la quot;la Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala. Lys val Phe ASp Glu 385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln A sn Leu II.. Lys Glo Aso Cys 405 410 415
Glu Leu Phe Gl u Cln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe· Glo A.sn Ala Leu Leu 420 425 430
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Glu Val Ser Arg Asn Leu GIy Lys Val Gly Ser Ly. Cy. Cys Lys Mis lt;sO 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg ~et Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 46gt; 470 475 480
Leu Asn Glo Leu Cyo Val Leu His Gl u Lys Thr pro Val Ser Asp Arg .es 490 4'5
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Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr phe His Ala Asp tle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Ly~ Glu Glo Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys G)u Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Clu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Cys Asp Leu pro eln Thr Mis Ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu 610 615 620
Het Leu Leu Ala elo Met Arg Lys I1e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys 625 630 635 640
Asp Arg kis Asp Phe Gly Phe Pro Glo Glu Glu Phe Gly Asn Glo Phe 645 650 655
Gln Lys Aloa elu Thr Ile Pro Val Leu Hi$ Clu Met Ile Gln Gln Ile 660 665 670
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys ASp Ser Ser Ala Ala Trp ASp Glu Thr 675 680 685
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 690 695 700
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 705 710 715 720
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 725 730 735
Leu Tyr Leu Thr Gl u Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 740 745 750
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr ASO Leu Gln Glu 755 760 765
Arg Leu Arq Arg Lys Glu 770
lt;210gt; 175 5 lt;211gt;742
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 175
Mee Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu PhE~ Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10 15
Tyr Ser Ar9 Ser Leu Asp Lys Arg quot;. Pro Tht: Ser Ser Ser Thr Lys 20 25 30
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Lel.l Asp Leu Gln Mquot;, u.
35 .0 45
Leu Asn Cly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Ly€1 Leu Thr ArO Met Leu 50 55 60
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala ThI: Glu Leu Lys His Leu
6S 70 75 80
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Lcu Asn Lcu 85 95
quot;
Ala eln Ser Lys Asn Phc H15 Leu 1'.r9 Pro Ar~r Asp Leu 11e Ser Asn 100 105 110
11e Asn Val 11e val Leu Glu Leu Lys Gly Sexo Glu Thr Thr Phe Met 115 120 125
Cys Glu Tyr Ala Asp Clu Thr Ala Thr Ile Val. Gl u Phe Leu Asn Arg 130 135 140
Trp 11e Thr PhI!! Ser Gln Ser I1e Ile Ser Thlquot; Leu Thr Asp 1'.10 His 145 150 155 160
Lys Ser Glu Val Ala His Aro Phe Lya ASp Leu Gly Glu Glu Aan gt;he 165 170 175
Lys Ala Leu Val Leu l1e Ala Phe Ala Gln 'l'yt-Leu eln Gln Cys Pro 180 185 190
Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val ASo Glu Val 'l'hr Glu Phe Ala Lys 195 200 205
Thr Cys val Ala ASP Glu Ser Ala Glu Asn Cys: Aop Lys Ser Leu lIis 210 215 220
Thr Leu phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr va1 Ale. Thr Leu Ar9 Glu Thr 225 230 235, 240
Tyr Gly Clu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Cln Glu Pro Glu Arg Asn 245 250 255
Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pr.) Asn Leu Pro Arg Leu
2.0 2quot; 270 Val Arg pro Olu Val Asp Val Me' Cys Thc Al,,, Phe Mis quot;o Asn Glu
215 280
'quot;
Olu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu ll.! Al. Arg Ar9 His Pro 290 29' 300
Tyr Phe Tyr Ala Pro Olu Leu Leu Phe Pbe Ala Ly. Arg Tyr Lys Al. 3quot; 310 Jl~) 320
Al. Phc Thc Glu eys ey. Gln Ala Ala Aso Lys Ala Ala Cys Leu Leu 325 330 335
Pro Lys Leu Asp Olu Leu Ar9 Asp olu Oly LY!J Ala Ser Ser Ah Lys 340 345 3SO
Gln Ara Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phl~ Gly Olu Aro Al. Phe 355 3.0 3'5
Ly. Ala Tro Ala Val Ala M. Leu Ser Gln ArU Phe Pro Lys Ala Glu 370 375 380
phe Al. Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr 385 390 J9~) 400
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu eys Ala Asp ASp ACg Al. ASp 40S 410 415
Leu Ala Lys Tyr rle Cys Glu Asn Gln Asp Ser 1le Ser Ser Lys Leu 420 425 4JO
Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lyu Ser His Cys lle Ala 435 440
'quot;
Glu Val Glu Asn Asp GIu M« Pro Ala Asp Leu Pro Ser Le\! Ala Ala 4SO 455 4.0
ASp Phe Val Glu Ser Lys ASp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Gl... Ala Lys 465 470 47S 480
Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyz: Ala AC9' Arg His ,as 490 49'
Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ahl Lys Thr Tyr Glu Thr SOO Squot; 510
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Prc) His Olu Cys Tyr Ala 51' 520 525
Lys va.l Phe Asp GI... 5quot; Pro Leu Val GIu Glu Pro Gln Asn Leu
Phc Lys 530 540
1le Lys Gln Asn Cys Olu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Pho 545 550 55~i 560
Gln Asn ~a Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln val Ser 565 570 575
Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gl y Ser
580 58' quot;0
Lys Cys ey. Ly. His Pro Glu Ale LY' Ar9 Met quot;O eys Al. Glu Asp 59' 600 60S
'l'ylt; L .. Ser Val Val Leu Aso Cln Leu Cys Val Leu His Clu Lys Thr 610 61S 620
,lt;o Val Ser Asp Arg Val Th, Lys Cys Cys The Clu Ser Le\.! val Asn 6quot; 6'0 635 640
Arg Pro Cys 'he Squot;, Ala Leu Glu V.l ASp Glu Thr Tyr V.l Plt;o
6SO
'" 6quot;
quot;5
Lys Glu phc quot;o Al. Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile ey!gt; Thr 660 670
.quot;
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Cln Ile Lys Lys Cln Thr Al. Leu val Glu
6quot; '60 .quot;
Leu v.l Lquot; Hle Lys Pro Lys Al. Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val
,,,
690 700
Mer Asp Asp ph8 Ala Al. 'he Vquot;l Glu Lys Cys eys Lys Ala Asp Asp 705 710 71S 720
Lys Glu Thr Cys 'he Ala Glu Glu GIl' Lyo Lys Leu Val Ala Al. Ser 72' 730 735
Cln Ala Ala Leu Gly Leu 740
lt;210gt; 176
lt;211gt; 742
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 176 Melt; Lys Trp V.l Ser Phe Ile Se'r Leu LeU Phe Leu Phe Ser Selt; Al.
,
1 10 15
Ty' Ser Arg Su Leu Asp Lys Arg quot;p Al. His Lys Ser Clu V.l Al. 20 30
quot;
His Arg 'h. Lys Asp Leu Gly Clu Glu Aso phe Lys Al. Leu Val Leu 3S 40
quot;
Ile Al. phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys PrO' 'he Glu ASp Hia Val SO SS 60
Lys Leu Val Aso Glu V.l Th, Glu Phe Ala Lyo Th, Cys Val Ala Aop 6S 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn ey. Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phc Gly Asp 8S 90 '5
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Clu Thr Tyr Gly Glu Me' Al. 100 lOS llO
Asp Cys Cys Al. Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe l.eu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 1\1:quot;9 Le'u Val Argo Pro Glu Val 130 135 1lt;0
Aop V.l Mee Cys 'I'hr gt;1. Phe Mis Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Ly. 1lt;5 150 15.'5 160
Ly. Tyr Leu Tyr e1u 11. Ala Arg 1'.r9 His Pro:gt; Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Ph. Ala. Lys Are¡ 'l'yr Ly. Ala Ala Phe Thr e1u Cya 180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Al. Cys Leu Leu Pro Ly. Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Arg Asp Glu ely Lys Ala Ser Ser Ala Lyl~ Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gl n Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phl~ Lys Ala Trp Ala Val 225 230 23~5 240
Ala Argo Leu Ser eln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Pha Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Le u Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thlr Glu Cys Cye His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg Ala Asp Leu Alo Lys Tyr l1e 275 280 285
Cys Glu Asn Gln ASP Ser Ile Ser Ser Lys Leu Ly, Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Ly. Pro Leu Leu Glu Lys Ser His CyS l1e Alu Glu val Glu Asn Asp 305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu gt;1a AI'l Asp Phe Val Clu Ser 325 330 335
Lys A sp val Cys Lys Asn 'I'yr Ala Glu Ala LY!i ASp Val Phe Leu Gly 340 34S 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Prc) Aap Tyr Ser Val Val 355 350 365
Leu Leu Leu Arg Leu Al a Ly. 'I'hr Tyr Glu Thl: Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Alquot; Ala Al ./l Asp Peo f.ljquot;, Glo Cys 'I'yr Al~, Lys Val PhQ ASP (,:10
395 390 395 400
Phe Ly. Pro Leu Val elu Glu Pro Gln Aen Lel.L Ile Lys Gl n 'sn Cys 405 410 415
Glu LeU Phe elu e1n Leu Gly Glu 'l'yr Lyo PhE' Gl n Asn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro e1n val SeJ:quot; Thr Pro Thr Leu Val 435 440
'quot;
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Mer pro Cys Ala Glu ,quot;p Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480
L.u Asn Gln Leu Cys V.l Leu His Glu Lys Thr Pro, Val S.r As. Aro
4.5 490 495
Val Thr Lys lt;:y, Cy, The Glu Ser Lou Val Asn Arg Ar!il Pro Cy. Ph. 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr val Pea Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr phe His Ala Asp I1e Cys Thr Leu Ser e1u Lys Glu 530 535 540
Arg Gln 11e Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala The Lys elu eln Leu Lys Ala Val Mee ASp ASp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASP Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Ala PrQ Thr Ser Ser Ser ThT L~ Lys Thr eln Leu Gln Leu elu 610 615 620
His Leu Leu LeU ASp Leu Gln Met Ile Leu ASo Gly l1e Asn Asn Tyr 625 630 6JS 640
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Mee Pro 645 650 655
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu eln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 660 665 670
Lys Pro, Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys A~n Phe His 675 680 685
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 690 695 700
Leu Lys Gly Ser elu Thr Thr Phe Met Cys Clu Tye Ala Asp elu Thr 705 710 715 720
Ala Thr 11e Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln See 725 730 735
11e 11e Ser Thr Leu Thr 740
lt;210gt; 177
lt;211gt; 742
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 177
Me' Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu LeU Ph,e Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu 1I.sp Lys A.rg Al. Pro ThT Ser Ser Ser Thr Ly. 20 25 30
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Hls LeU Leu Lcu Asp Leu Gln Me' 11e 35 40 45
Leu Aso Gly rle p.!U\ Aso Tyr Lya Aso Pro Lyl~ Leu Thr Arg Mee Leu 50 SS 60
Thr Phc Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Th~ Glu Leu Lys HiB Leu 65 10 75 .0
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lya Pro Leu G1u Glu Val Leu Asn Leu
85 90 95
Ala Glo Ser Lys Asn Phe Hi8 Leu Ar. Pro Arll Asp Leu 11e Selt; Asn lOO 105 110
:lIe Aso V.l He Val Leu G~U Leu Lys Gly Sel~ Glu Thr Thr Phe Mee 115 12. 125
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Al. Thr Ile vquot;,l Glu Phe Leu Asn Arg no 135 ..O
Trp !le Thr Phe Cys Gln Ser lle :lIe Ser Thr Leu Thr Asp Ala HiB 145 150 lSS 160
Ly. Ser elu val Al. HiD Argo Phe Ly.. As. Leu Gly elu Glu J\!;)n Phe
165 quot;. quot;5
Lys Ala Leu v.l Leu !le Ala phe Al. Gln Tyl~ Leu Gln Gln Cys Pro quot;O
,.5 ..O
Phe el\! n.p His Val Lya Le... val n.n Glu Val Thr Glu phe Ala Lya 195 lO. 205
Thr CyS val Al quot; ASP Glu Ser Ala Glu Asn Cy!l ASp Lys Ser Leu His 210 215 220
Thr Leu Phe Gly ~~p Lys Leu Cys Thr Val Alquot; Thr Leu ~rg GII,l Thr 225 230 23~i 240
Tyr Gly Glu Met Al. AsO Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Gll,l Ar. Asn 245 250 255
Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Prcgt; Asn Leu Pro quot;. Leu 260 265 270
Val ~rg Pro Glu Val ~sp Val Me' Cys Thr Alquot;, Phe His ASp Asn Glu 275 280 2.5
Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr GIu Ile, ~la Arg Arg His Pro
295 300
quot;0
Tyr Phe Tyr Ala Pro elu Leu Leu Phe Phe AlE, Lys Arg Tyr Lys Al. 305 310 31:i 320
Al. Phe Thr Glu Cys Cys Cln Ala Ala Mp Ly.,;, Ala Ala Cys Leu Leu 325 330 335
PlCa LY5 Leu Mp elu Leu Arq Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser quot;. Lys 340 345 350
Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu GIn Lys PhE! Gly GIu Arg Ala Phe 355 360 365
Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Cln Ar!;;r phe pro Lys Ala G1u 370 375 380
phe Ala GIu Val Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys val His Thr 385 390 395 400
GIu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu GIu Cys AlaL Asp Asp 11.1:9
quot;.
405 410 415
Leu Ala Lys Tyr lle Cys GIu Aso Gln ASP Ser Ile Ser Ser Lys Leu 420 425 430
Lys GIu Cys Cys GIu Lys pro I..eu Lcu GIu Ly.s: Ser His Cys 1:1e A18 435 440 445
Glu Val GIu ASO Asp GIu Met Vro Ala ASP Leu pro Ser Leu Ala Ala 450 455
'60
Asp Phe Val GIu Ser Lys Asp Val CyS Lys Asn Tyr Ala GIu Ala Lys
465
470 475 480
Asp Val
Phe Leu Gly Mee phe Leu Tyr 485 Glu 490 Tyl:' Ala Arq Arg His 495 Pro
A3P Tyr Ser Val Val Lcu Leu Leu 500
Leu Alalt; Lys Thr 'J'yr 510 Glu Thr
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 5quot;
Al. 520 Ala Asp Pro His Glu 525 Cys Tyr Ala
Ly¡¡ val Phe ASp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gln Asn Leu 530 535 540
11e Lys Gl n Asn Cys Glu Leu Phe Glu Cln Leu Cly Glu Tyr Lys Phe 545 550 555, 560
Gln Asn Ala Leu Leu Val Aro Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln V.l Ser 565 570 575
Thr Pro Thr Leu Val Glu val Ser Ar. Asn Leu, Gly LY5 vol Gly Ser 580 585 590
Lys,Cys Cys Lys His Pro Glu Al . Lys Arg Met Pro Cys Al. Gl u Asp 595 600 605
Tyr Leu Ser val Val Leu Asn Gln L~u Cys Val Leu His Glu Lys Thr 610 615 620
Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys Cys Cys Thr' Gl u Ser Leu Val J\.sn
625 630 635 640
Ar9 Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val ,quot;p Glu Thr Tyr Val Pro 645 650 655
Lys Glu Phe Aon gt;1a Clu Thr Phe Thr Phe His 1\1.. Asp Ile eyo Thr
660 665 670
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Ly¡; Ly5 eln Thr Ala Leu Val Glu 675 680 685
Leu Val Lys His Lys Pro Lys ~la Thr Lys Clu Gln Leu Lys Ala Val 690 695 700
Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Oys eys Lys Ala ASP Aop 705 710 715 720
Lya Glu Thr Cys Pha Ala Glu Glu ely Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser 725 730 735
Gln Ala Ala Lau Gly Leu 740
lt;210gt; 178
lt;211gt; 742
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 178 MeC Lys Trp Val Ser Phe 11e Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Al.
,
1 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu ASP LYIigt; Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arq Phe Lyo I\$P Leu ely Olu elu Asn Phe L)',!;: gt;1a Leu Val Lvu 35 40
quot;
He Ala phe Ala elo Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe elu Asp His Val 50 55 60
Lyo Leu Vtll Asn GJu Val Thr Glu Phe Al.. Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 80
" quot;
Clu Ser Ala Glu Asn Cys ASp Lys Ser Leu His Thr Leu phe Gly ASP 85 90 95
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110
Asp Cys Cys Ala ~ys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys ,,quot;p Asp Asn Pro 'sn Leu Pro Arg Leu Val Ar. Pro G1u Val 130 135 140
Asp val Met Cys Thr gt;1a Phe HlS Asp Asn elu elu Thr Phe Leu Lya 145 1SO 15S 160
Ly. Tyr Leu Tyr Glu 11e Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170
Glu Leu Leu Phe phe Ala Lys ArIJ Tyr Lys Al;!l Ala Phe Thr elu Cys
180 185 190
Cy:s Gln Al. Al. Asp Lya Ala. Al. ey. Leu Lel..l Pro Lys Leu ASP Glu 195 200 205
Leu Ar. AsD Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala LylS Gln Ar. Leu Lys CyS 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys quot;e Gly Glu Arg Ala Phi:: Ly. Ala Trp Ala V.l 225 230 2)~5 240
Ala l'.rg Leu Ser Gln Ar. phe Pro Lys Al. GIIJ Phe Ala Glu Val Ser 2lt;5 250 2SS
Lys Leu val Thr quot;o Leu Thr Lys Val His Th:r Glu Cys eys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu eya Ala Asp Aso gt;rO Ala AS!;) Leu Ala Lys Tyr :rlO:! 275 280 285
eys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys elu Cys Cys Glu 290 295 lOO
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His eys tle 11.111 Glu Val Glu Asn Asp 305 310 31~) 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser 325 330 335
LyS ASp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala. Lyu Asp val Phe Leu Gly
340 345 350
Mel: Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pn) A5p Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr; T~I'T Glu Thl~ Thr Leu Glu I..ys Cys 370 375 380
cya Ala Alo Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Alu Lyo Vol Phe Asp Glu 385 390 39S 400
Pne Lys Pro Leu Vol Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410
'15
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gll,l Tyr Lys Pht! Gln Asn quot;a Lou Leu 420 425 430
Val Ar'1 'l'yTquot; Thr l.y.. T.yquot;, v3l Pro Gln Val Sel~ 'I'hr Pro Thr t.eu V31 435 440 44S
Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Sel: Lys eys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Me' 'ro Cys Ala Glu ASI) Tyr Leu Ser val Val '65 ~ 70 47S 480
Leu Asn Gln Leu Cyo Val Leu His Glu Lys Thl: Pro Val Ser ASP Arg .85 495
quot;0
val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Gl. Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys elu Phe Asn Ala 515 520 525
Gl. Thr Phe Thr Phe His Al. Asp lle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Ar. Gln lle Lys Lys eln Thr Ala Lcu Val elu Lau Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Cly 595 600 605
Leu Ala Pro Thr Sor Ser Ser Thr Lys Lys Thr eln Leu Gln Leu Glu 610 615 620
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met 11e Leu Asn Gly 11e Asn Asn Tyr 625 630 635 640
Lys Asn pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 645 650 655
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Mis Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 660 665 670
Lys Pro Leu elu elu Val Leu Asn Leu Ala eln Ser Lys Asn Phe Mis 675 680 685
LeU Arg Pro Arg ASp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Clu 690 695 700
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Pha Met Cys G1u Tyr Ala Asp Glu Thr 705 710 715 720
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys eln Ser 725 730 735
Ilc 1 le Ser Thr Lou Thr 740
lt;210gt; 179
lt;211gt; 738
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 179
Melt; Tyr Arg Melt; Gln Leu Leu Ser Cys 11e Ala Leu Ser Leu Ala Le• 1 10
,.
•
Val Thr Asn Sor Al. Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr eln Leu 20 25 JO
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu quot;p Leu Gln Met; 11e Leu Asn Gly lle )5 45
quot;
As n quot;n TYr Lys Asn Pro Lyo Leu 'lquot;hr Arg Met; Leu Thr Phe Lys Phe SO SS 60
TYr Me' Pro Lys Lys Ala Thr Glu
Ll'!u Lys HiII,; Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn LeU Ala Gln Ser Lys 85 95
'O
Asn phe His Leu Arg Pro Arg ASp Leu Ile Sel:: Asn lle Asn Val Ile 100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys G1y Ser Glu 'Ihr Thr ph,,! Hst Glu Tyr Ala 115 120
Asp Glu 'lquot;hr Ala 'lquot;hr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lle Thr Phe 130 135 140
Cy. G1n Ser Ile lle Ser Thr Leu Thr Asp Ahl His Lys Ser Glu Val 145 150 155 160
Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Gl u Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val 165 170 115
Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cy.!:1 Pro Phe Glu ASp Mis 180 185 190
Val Lys Leu Vel Asn Clu Val Thr Glu Phe Al.quot; Lys Thr Cys Val Ala 195 200 205
ASp Glu Ser Ala Glu Asn Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 210 220
As~ Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Gll;l Thr Tyr Gly Glu He' 225 230 23~¡ 240
Al a Asp Cys Cys Ala Lys G1n G1u Pro G1u Arlt;;;r Asn Glu CY5 Phe Leu 245 2SO 2SS
Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Ar-;;r Leu Val Arg Pro Glu
,,,
:a60 265
Val ASP Val Met Cys Thr Ala Phe Hi s ASp Asn Glu Glu Thr Phe Leu 275 280 '85
Lya Lys Tyr Leu Tyr Glu ne Ala J\.rq Arq Hi.!¡1 Pro Tyr Phe Tyr Ala 290 295 300
Pro Glu Leu L@u Phe Phe Ala Lys Arq Tyr Ly'!; Ala Ala phe Thr Glu JOS 310 31~; 320
Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cy. Le\JI Leu Pro Lys Leu Asp 325 330 335
Glu Leu Arq As p Glu Gly Lys Ala Ser Ser Al~ Lys Gln Arq Leu Lys 340 345 350
Cys Ala Ser Leu Gln Lys phe Gly elu ArO' Al~1 Phe Ly. Ala Trp Ata
360 36'
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Val quot;. quot;9 Leu Ser eln gt;.r9 Phe Pro Lys Ahl Glu Phe Ala elu Val 370 37S 360
Ser Ly. Leu val Thr Mp Leu Thr Lys Val Hi!¡ Thr Glu Cys Cys His 365 390 39~; 400
Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp ArO' A!EI Asp Leu Ala Ly. Tyr 405 410 415
Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Ly~¡ Leu Lys Glu Cys Cys 420 425 430
Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys rLE, Ala Glu val Glu Asn
'quot; 440 445
Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu A!EI Al. ASp Phe Val Glu 450 455 460
Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Al~1 Lys Asp Val Phe Leu 465 470 475 480
Gly Met phe Leu Tyr Glu TYr Ala ArO' Arl¡ Hh¡ Pro Asp TYr Ser val lt;8' 490 49'
Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys SOO 510
'OS
Cys Cys Ala Ala Ala ASP Pro His Glu Cys Tyl: Ala Lys Val I?he Asp 515 520 525
Glu phe Lys pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asrl Leu ne Lys Gln Asn 530 535 540
ey. Glu Leu Phe Glu Cln Leu Gly Glu Tyr Ly~¡ Phe Gln Asn Ala Leu 545 5S~; 560
quot;O
Leu Val Argo Tyr Thr Ly. Lys Val pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu 56' 510 Squot;
Val elu Val Ser quot;9 1\.5n Leu aly Ly. v.l al)o' Ser Lys ey. egt;, Ly.
'60 585 590
His pro Glu Al. Lys Arl¡ Met Pro ey. Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val
595 '00 .o,
Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu LyS: Thr Pro Val Ser Asp'10 615 620
ArO' Val Thr Lys Cys eyo Thr Glu Ser Leu Val. Asn Argo ArO' Pro Cys 625 630 63S 640
Phe Ser Ala Leu Glu vquot;' ASp G1u Thr Tyr val. Pro Lys G1u phe Asn 645 650 655
Ala alu Thr Phe Thr I?he His Ala quot;p no CYli' Thr Leu Ser Glu Ly. 660 665 670
G1u 1U:1¡ Gln Ile Lys Lys eln Thr Ala Leu Val. Glu Leu Val Lys Mis
615 680 685
Ly' Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala v.l Met quot;ASP ASP phe690 695 700
Ala Al. Phc Ve.l GIu Lys CY' Cys Lys Ala Asp AS' Lys GIu Thr Cys 705 710 715 720
Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Cln Ala Al. Leu 725 730 735
Gly Leu
lt;210gt; 180
lt;211 gt; 738
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 180
Met Tyr Arg Mee Cln Leu Leu Ser Cys l1e Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 2S 30
Gln Leu GIu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Mee 11c Leu Asn Gly Ile 3S 40 4S
Asn Aso Tyr Lys Asn Pro Lys Lcu Thr Arg Met Leu Thr Phc Lys Phe SO 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Mis Leu Cln Cys Leu GIu 6S 70 7S BO
Glu Glu Leu Lys Pro Leu GIu GIu Val Leu Asn Leu Ala Cln Ser Lys 85 90 95
Asn Phe His Leu Arg pro Arg Asp Leu tIc Ser Asn 11e Asn Val 11e 100 lOS 110
Val Leu GIu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Mee Cys Glu Tyr Ala 11quot;5 120 ¡¡¡5
Asp alu Thr Ala Thr !le v., Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140
Cys aln Ser !le Ile Ser Thr Leu Thr ASp Ala His Lys Ser Glu Val 145 1SO 1SS 160
quot;. His Ar9 Phe Lyo quot;p Leu Gly (Hu. Glu AOn Phe Lys Alll Leu val 165 170 175
Leu I1e Ala Phe Ala Gln Ty~ Leu. Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His 180 185 190
Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Clu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala 195 200 205
Asp Clu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 210 215 220
,quot;p Lys Leu Cys Thr Vquot; Ala Thr Leu A1::g Glu Thr Tytquot; Gly Glu Me' 225 2JO 2J~; 240
Al. ASp Cys Cys Al. Lys Gln Glu 'ro e1u Arg Asn Clu Cys 'he Leu 245 250 255
elo His Lys 'SO gt;sp Asn Pro Asn Leu 'ro Arg Leu Val Aro 'ro Glu 260 265 270
Val ASP Val Met Cys Thr Ala 'he His ASP Asn Glu Olu Thr Phe Leu 275 280 285
Lys Lys Tyr Leu Tyr elu Ile Ala Arg Arg Hi:s: Pro Tyr Phe Tyr Ala 2'0 295 300
'ro e1u Leu Leu phe 'he Ala Lys Arg Tyr Lyl5: Ala Ala Phe Thr G1u )05 gt;10 gt;1, )20
Cya Cys Oln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu quot;p325 330 »5
elu Leu 1'.rg Asp G1u ely Lys Ala Ser Ser A181 Lys cln Ar. Leu Lys )40 gt;45 350
Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg 11.10111 Phe Lys Ala Trp Ala 355 360 365
Val Ala Arg Leu Ser Olo Arg Phe Pro Lys Ala Olu Phe Ala Glu Val 370 315 380
Ser Ly.!ll Leu Val Thr '9p Leu Thr Lya Val Hi:s, Thr Olu Cys Cys His
3.5 390 39!:. 400
e1y Asp Leu Leu G1u Cys Ala Asp Asp quot;'. Ala, ASp Leu Ala LyS Tyr 405 410 415
Ile Cys Glu Asn Cln Asp Ser Ile Ser Ser LYI5' Leu Lys Clu Cys Cy. 420 425 4gt;0
Glu Lys 'ro Leu Leu Glu Lys Sor Mis Cys rIEL Ala Glu Val Glu A!ln 435 440 445
As. Glu Me' Pro Ala Asp Leu 'ro Ser Leu quot;AlaL Ala As. Phe val Glu 450 455 460
Ser Lys ASp Val Cys Lys quot;n Tyr Ala alu Ala, Lys Asp Val 'he Leu 465 470 475, 4.0
Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala 1'.(quot;9 Arg Hi:!3; Pro ASP Tyr Ser Val 485 490 495
Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys
500 505 510
Cys Cys Ala Al a Ala ASP Pro His Glu Cys 'IYr' Ala Lys Val Phe Asp
515 520 525
Gl u phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn. Le u tle Lys Gln Asn 530 535 540
Cyo Glu Leu Phe Clu Gln Lcu Gly Glu Tyr Ly' Phe Gln Asn Ala Leu 545 550 555 560
Leu Val Arg Tyr Thr Ly' Lys Val Pro G1n V.1 Ser 'I'br pro Thr Leu 565 570 575
val Glu Val Ser Arg 1!.5n Leu Gly Ly. v.1 Gly Ser Lys Cy, Cy. Ly' 580 585 590
His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val 595 600 605
v.1 Leu Mn eln Leu Cys V., Leu HiD Glu Lys 1'1Ir Pro Val Ser Asp 610 615 620
Arg V., Thr Lys CySil 0quot; Thr Glu Ser Leu V.l Asn Ar9 Arg Pro lt;ys
625 63' 635 64' Phe Ser Ala Leu GLu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn
645 55' 655 Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp rle Cys Thr Leu Ser Glu Lys 660 665 670 Clu Arg eln rle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu val Lyl:gt; His 675 680 685 Lys ?ro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe 690 695 700
Ala Ala Phe Val Glu Lyl:gt; Cys Cys Lyl:gt; Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys 705 710 715 720 Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Al a Ala Leu
725 730 735 Gly Leu
lt;210gt; 181
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 181
Cys ASp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Cly Ser Arg Arg Thr Leu Mct 1 S 10 15
Leu Leu Ala Gln Het Arg Arg Ile Ser Leu Phc Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30
Arg His ASP Phe Gly Phe Pro Gln Glu Clu Phe Gly Asn Gln Phe Cln 35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp ASp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu A.Sp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
.5 90
Ala Cys Val l1e Oln Gly Val Gly val Thr Olu Thr Pro Leu Melt; Lys 100 lOS 110
alu 1\.sp Ser l1a Leu Ala Val Aro Lys Tyr Ph. Gln Ar9 na Thr Leu 115 120 125
Tyr lAU Ly. Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg !JO 135 140
Ala Glu lle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr ..n Leu Gln Glu Ser 145 150 155 lOO
Leu Arg Ser Lys Olu 165
lt;210gt; 182
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 182
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gl y Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ila Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys ASp 20 25 30
Arg Mis Asp Phe Gly Phe pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45
Lys Ala Glu Thr IIe Pro Val Leu His Glu Met lle eln Cln lle Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu ASp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr eln cln Leu Asn Asp ~eu alu 85 90 95
Ala Cys Val lle Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala val Arg Lys ~r Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Lcu LyS Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala Glu zle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu G1n Glu Ser 145 150 155 160
Leu Ar9 Ser Lys Glu 165
lt;210gt; 183
lt;211gt; 165 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 183
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser 1'.r9 Arg Thr Leu Met 1 S 10 15
Leu Leu Ala Gln Me' Arg Arg lle Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ly. ASp 20 2S 30
Arg His A.p Phe e1y Phe Pro Gln Glu Glu Phe e1y A.n Gln Phe eln J5 '0 45
Lys Ala elu Thr l1e Pro Val Leu His elu Met lle eln eln l1e Phe 50 55 60
~sn Leu Phe Ser Thr Lys ASp Ser Ser Ala Ala Trp Asp elu Thr Leu 65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Clu Leu Tyr Cln eln Leu Asn ASP Leu elu 85 90 95
Ala Cys Val lle eln ely Val ely Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110
G1u Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg 11e Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Lys Clu Lys Lys Tyr Sor ProCys Ala Trp Clu val val Ar9 1JO 135 140
Ala Clu 11e Het Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln elu Ser 145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu 165
lt;210gt; 184
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 184
Cys ASp Leu Pro eln Thr His Ser Leu Cly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
Leu Leu Ala eln Het Arg Arg 11e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 JO
Arg His A3p Phc Cly Phe Pro Gln Gl u Glu Phc Gly Asn Gln Phe Gln J5 40 45
Lys Ala Clu Thr I l e Pro Val Leu His Clu Met Ile Cln eln Ile Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu A$p Lys Phe Tyr Thr elu Leu Tyr Gln Gln Leu Aso Asp Leu Clu 85 90 95
Ala Cys Val Ile eln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser lle Leu Ala Val Aro Ly. Tyr Phc Gln Arg 11. Thr Leu 115 120 125
Tyr Lou Ly. Glu Lys LyS Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Gl u Val val Arg 130 135 140
Ala Glu lle Met Arg Ser Phe SRr Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Leu Arg SeX' Lys Glu 165
lt;210gt; 185
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 185
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
LeU Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys ASp 20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn eln Phe elo 35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Oln Ile phe 50 55 60
Aso Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Olu Thr Leu 6S 70 7S 80
Leu ASp Lys phe Tyr Thr Olu Leu Tyr Oln Glo Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95
Ala Cys Val Ilc Glo ely Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110
Glu ASp Ser Ile Leu Ala Val Arg Ly~ Tyr Phe Gln Arg Ile Tbr Leu 115 120 125
Tyr Leu Lys Glu LY9 Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 13S 140
Ala Olu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Glo Glu Ser 145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys elu 16S
lt;210gt; 186
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 186
Cys Asp Leu pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Alll eln Met Arg }Uquot;g rle Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ly, Mp 20 25 30
Arg Mis ,quot;p Phe Gly Phe Pro eln elu Glu Phe Gly Aen eln phe Cln 35 40 45
Ly, Ala elu Thr Ile Pro Val Leu His clu Met: n. eln eln Ile phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Clu Thr Leu
65 70 75 80
Leu ~p Lys Phe Tyr Thr Clu Leu Tyr Cln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 9S
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr pro Leu Met Lys 100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg 1le Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala Glu Ile Mee Arg Ser phe ·Ser Leu Ser Thr Asn Leu cln Clu Ser 145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu 165
lt;210gt; 187
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 187
Cys ASp Leu pro Gl n Thr His Ser Leu c l y Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ly$ A$P 20 25 30
Aro;; His 'quot;quot; 'h. Gl.y Phc Pro Gln e l u Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45
Lys Alo elu Thr l le Pro Val Leu His Glu Met !le Gln eln 11e Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 9S
Ala Cys Val lle Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110
Glu ASP Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lle Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu LyS Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala Glu lle Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 ISO 155 160
Leu Arg Ser Lys Olu 165
10 lt;210gt; 188
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 188
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu G)y Ser Arg ATg Thr Lea Mee
1 5 10 El
Lea Leu Ala Gln Mee Arg Arg 11e Ser Lea Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 2S 30
Arg His quot;p Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly quot;'sn Gl n Phe Gln 3S .0 4S
Ly' quot;a Glu Thr Ile pro val Leu His Glu Mel: He Gln Gln H. Phe 50 55 60
Asn Leu Phc Ser Thr Ly, A,p Ser Ser Ala Ala Trp Asp Gl u Thr Leu 65 10 15 '0
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn ASp Leu Ola 85 90 9S
Ala Cys val ¡le Cln Cly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Lea Met Lys 100 lOS 110
Gla Asp Ser 11e Leu quot;'la val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lle Thr Lea llS 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val I\rg 130 135 140
~la alu I l e Mee Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr quot;'sn l~u Gln Gla Ser 145 ISO lSS 160
Leu Arg Ser Lys Glu 5 165
lt;210gt; 189
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 189
Cys ASp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arq Arg Thr Leu M~t 1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Me t ~rg Arg Ile Ser Leu Phc Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30
Arg Kis A$P Phe Gl y 1'1'.9 Pro Cln Clu Glu Phe Gly quot;n Cln Phe Gln
35 .0 45
Lys ...Clu Th, Ile Pro val Leu Mis elu Met-Ile Cln Cln 11e Phe SO 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Ly. ASP Ser Ser Ala Al. T,p Asp Glu Thr Leu 6S 70 7S 60
Leu ASp Lys phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu SS 90 ~5
Ala cys Val Ile Gln Gly Val Gly val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 ·
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe eln ~g Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Ly$ Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 I SO 155 160
Lea Arg Ser Lys GJa 165
lt;2 10gt; 190
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 190
Cys Asp Leu Pro Gln Thr Mis Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Lea Met 1 5 10 15
Leu Leu 1'.18 Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 2S 30
Arg Mis Asp Phe ely Phe pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln phe Gln 35 40 45
Lys Ala Glu Thr I1e Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe SO SS 60
quot;n Leu Phe Ser Thr Lys quot;O Ser Ser ~la Ala Tlt;p Asp Glu Thr Leu 65 70 7S .0
Leu Asp Lys Phe Ty' Thr Glu Leu Tyr Cln Cln Leu Asn Asp Leu Clu 90 OS
Ala Cys Val Ile Cln Gly Val Gly Val Th, Glu Thr Pr o Leu Met Lys 100 lOS 110
Glu Asp Se' Ile Leu Ala Va l Arg Lyo Tyr Phe GJ.n Arg Ile Thr Leu 115 120 125
Ty' Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser pro Cys Ala Tro Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala clu Ile Met Acg Ser phe Ser Leu Ser Th, Asn Leu Gln Glu Scr 145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Clu 165
10 lt;210gt; 191
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 191
M" Ser Tyr Asn Lou Lcu Gly Phe Leu G1n Arg Ser Ser Asn Phe G1n 1 5 10 15
Cys Gln Lys LeU Leu Trp Gln Leu quot;n G1y Arg Leu Glu Tyr Cya Leu 20 JO
quot;
Lys ASP Aro .quot; Asn Phe ASP 11. Pro Glu Glu Ile Ly. G1n Leu Gln J5 40
quot;
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60
Asn Ile Phc Ala 11e Phe Arg Cln ASp Ser Ser Ser Thr' Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 9 O 95
His Leu Lys Thr Val Leu Clu Glu LyS Leu Clu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
~rg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Hi~ Cys Ala Trp Thr 130 135 140
Ile Val Aro val Glu I1e Leu Arg Asn Phc Tyr Phe lle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Ar. ASn 165
lt;210gt; 192
lt;211gt; 166 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 192
M" Ser Tyr ..n Leu Leu Gly Phe Lcu G1n Arg Ser Ser Asn phe G1n 1 S 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Cl n Leu Asn G1y Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 30
quot;
Lys ASP Arg Met Asn Phe hsp I1e Fro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45
Cln Fhe cln Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr I1e Tyr Glu Met Leu G1n 50 55 60
Asn Ile Phe Ala l1e Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser 'l'hr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr Ile val Glu Asn Leu Leu Ala ASO Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95
His t.eu Lys Thr Val Leu Glu Glu Ly. Leu Glu Ly$ Glu As. Phe Thr 100 105 110
Arg Gly Ly. Leu Met Ser Ser Leu quot;,. Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125
11. Leu His Tyr Leu Lys Al. Lys G1u Tyr Ser-His Cys Ala Trp Thr 130 135 140
Ile val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile ASO Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg ASO 10 165
lt;210gt; 193
lt;211gt; 187
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 193
Mct Thr Asn Lys Cys Leu Leu eln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu .Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30
Ser Ser quot;n Phe Gln Cys Gln Ly. Leu Leu Trp Gln Lo:..! 'sn Gly Arg
35 4. 4S
Leu elu Tyr Cys Leu Lys quot;O Arg Met Asn Phe Asp ne Pro Gl u Glu 50 55
,.
n. Lys Glo Leu Gln Oln Phe Gln Lys Glu Asp Al. J\lquot;, Leu Thr ne 65 75
7. S.
Tyr Glu Met Leu Gln Asn 11e Phe Ala 11e Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 9S
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110
Tyr His Gln 115
I1e Asn His Leu Lys Thr val LeU 120 Glu Glu Lys 125 Leu Glu
Lys Glu Asp 130
Phe Thr Arg Gly Lys 135 Leu Met Ser Ser Leu His 140 Leu Lys
Arg 'l'yr 'I'yr Gly Arg !le l,eu 145 150
His Tyr Leu Lys 155 Ala Lys Glu Tyr Ser 160
Hi&
Cys Al a Trp Thr Ile Val lG5 Arg Val clu Ile Leu Arg 170 Asn Phe 175 Tyr
Phe
Ile ASR Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Aso 180 185
10
lt;210gt; 194 lt;211gt; 166 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 194
Me' Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu eln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 S 10 15
Cys Glo Lys Leu Leu Trp Gln Leu quot;n Gly Arg Leu Glu '!yr Cy. Leu 20 25 30
Lys 1\.sp Arg Me, Asn phe Asp rle 'lt;o Glu alu 11e Ly. Gln Leu all'1 'O 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu aln 50 55 60
A$n Ile phc Ala 11e Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 60
Gl u The Ile Val Glu quot;n Leu Leu Ala quot;n Val Tyr Mis Glo He Asn
85 .0 OS
His I.eu Lys The Val Leu Clu Clu Lys Leu alu Lys Glu Asp phe Thr 100 105 HO
Arg Gly Ly. Leu Hct Ser Ser Leu His Leu Lys Aeg Tyr Tyr Gly 1\rg 1lS 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 13S 140
11e Val Arg val Glu 11e Leu Arg Aso Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160
The Gly Tyr Leu Aro ASn 165
lt;210gt; 195
lt;211gt; 187
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 195
Met Thr Asn Ly. Cys Leu Leu Gln ¡le Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Het Ser Tyr Aso Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn 'he Gln Cys Glo Lys quot;quot;u Le\! trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 .0 45
Leu O'u Tyr Cyfl Leu Lys Asp Mg Het Aso Phe Asp Ile Pro Glu Glu SO 55 60
11e Ly. Gln Leu Gln Oln 'he Gln Lys Glu quot;,p Al. 1\.la Leu Thr ne 65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu O'n Asn Ile Phe Ala 11e 'he Arg Gln Asp Ser ser .5 9O 95
Ser Thr Gly Tr, Asn Glu Thr Ile Val Olu Aso Leu Leu Al. Aon Val 100 105 110
'I'yr His Oln Ile Aso His Leu Lys Thr Val Leu Glu Olu Ly. Leu Glu 115 no 125
Lys Olu Agt;p Phe Thr Arg 01y Ly. Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys DO 135 1lt;0
Ar9 Tyr Tyr Gly Arg 11e Leu His Tyr Leu Ly. Al. Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 gt;60
Hio Cys Ala Trp Thr 11e val Arg Val 01u Ile Leu Arg ASO 'he Tyr gt;65 no n5
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn a, gt;85
lt;210gt; 196
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 196
Met Ser Tyr quot;n Leu Leu Gly Phe Leu Oln Arg Ser Ser ASO 'he Gln 1 5
" quot;
Cy, eln Lys quot;Leu Leu Trp Gln Leu quot;n 01y Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30
Lys ASP ArO Melt; ASo Phe ASp Ile Pro elu elu l1e Lquot; Cln Leu eln 35 40 45
01n Phe O'n Lys Glu ASp quot;. quot;. Leu Thr Ile Tyr 01u Met Leu Gln
50 60
quot;
Aso ne Phc Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Cly Trp Asn 65 70 75 80
Olu Thr Ile Val Clu Asn Leu Leu Ala quot;n Val Tyr His Gln Ile Asn 85 9O 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Ly. Leu Glu Lys Glu quot;O Phe Thr '00 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu H', Leu Lys Aro Tyr Tyr Gly -'rgo
115 120 125
rlQ Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140
Ile Val Arg Val Clu Ile Leu Arg Asn phe Tyr Phc Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
10 lt;210gt; 197
lt;211gt; 187
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 197
Met Thr AGn Lys Cys Leu Leu Oln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 S 10 lS
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly phe Leu Cln Arg 20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys As p Arg Met Asn Phe ASp Ile Pro Glu Glu SO 5S 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80
Tyr Olu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95
Ser Thr Gly Trp Aso Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Aso Val 1~0 105 110
Tyr His elo Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Clu Clu Lys Leu Glu 115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 1]0 1)S 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160
Hi5 Cys Ala Trp Thr 11e Val Arg Val Glu tle Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 5 180 185
lt;210gt; 198
lt;211 gt; 187
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 198
Melt; Tbr Asn Lys Cy. Leu L(!u Gln lle Ala Leu Leu Leu Cys Ph. Ser 1 S 10 15
Thr 'rhe Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Oln Arg 20 25 30
Ser Ser ..n phe GLn Cys eln Lys Leu Leu Trp Gln Leu hn Gly Arg 35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Plle Asp Xle Pro Glu Glu SO SS 60
Xle Lys G11'\ Leu Gln Oln Phe Gln Lys Gh.l quot;P Ala Ala Leu Thr Xle 6S 70 .0
quot;
Tyr Glu Met Leu Oln Asn lle Plle Ala Xle Phe AIg eln ASp Sor Ser .S 95
quot;
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Olu ASO Leu LeU Ala Asn Vel 100 lOS 110
Tyr His eln ne Aso His Leu Lys Thr Val Leu Glu Olu Lyo Leu Glu 11S 120 125
Lye Glu Aso Phe Thr ArO' Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lya 130 135 1lt;0
ArO Tyr Tyr Gly ArO' ne Leu Hi,. Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 14S 150 15S 160
Mis Cyo Ala Trp Thr no Val Arg Val quot;,u quot;a Leu Arg 1\$1quot;1 Phe TYr 16S 170 17S
Phe lle Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185
lt;210gt; 199
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 199
Me Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Oln Arg Ser Sel:quot; Aso 'he Oln 1 5 10 15
Cys Oln Lys Leu Leu Trp Glo Leu Asn Gly l'.rg Leu Glu Tyr Cy. Leu 20 25 30
Lys Asp Ar. Mee 1\sn Phe Asp ne Pro Glu Glu lle Lys Oln Leu Gln 35 40 4S
e ln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 SS 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr 11e Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95
Hic LQU Lys Thr val Leu Clu Glu Lya Leu Glu Lys Glu Asp phe Thr 100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 1 15 120 125
l1e Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 14.0
11e val Arg Val Glu lle Leu Arg Asn phe Tyr Phe IIe Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr GIy Tyr Leu Arg Asn
lt;210gt; 200
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 200
Me~ Ser Tyr Asn Leu Leu Cly Phe Leu Glo A~ Ser Ser Aso Phe Cln 1 S 10 1S
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 2S 30
LyS Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu lle Lys Glo Leu Cln 3S 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Al. Al. Leu 'I'hr I le Tyr Glu Me' Leu Gln 55 60
Asn rle Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr I le val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 'I'yr His Gln n. Asn 8' 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Clu Clu Lys Leu Glu Lys Clu Asp Phe 'I'hr 100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg 'I'yr Tyr Gly Arg 115 120 125
Ile Leu His 'I'yr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp 'I'hr 130 135 140
Ile Val Arg val Glu lle Leu Arg Asn Phe Tyr phe Ile A~n Arg Leu 145 ISO 155 160
Thr Cly Tyr Leu Arg Aso 16'
lt;210gt; 201
lt;211gt; 166
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 201
Met · S~r Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Aso Phe Gln 1 5 10 15
Cy' Glo Lys Leu Leu Trp Gln Leu A;n ely Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30
Lys Asp ArO Met Asn Ph~ Asp quot;e Pro Glu Glu 11e Lys Gln Leu Gln
.,
35 40
eln 'he eln Lys Glu ASp Ala .,. Leu Thr Ile Tyr elu Mee Leu Gln quot; 55 60
Asn 11e Phe Ala l1e Phe Arg Gln ASp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Aso LeU Leu Ala Asn Val Tyr His Gln I le Asn 85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125
11e Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140
11e Val Arg Val Glu Ile LeU Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160
Thr Gly Tyr Le. Ar. Aon 165
lt;210gt; 202
lt;211 gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 202
Cys Asp Leu Pro eln Thr His Ser Leu ely Ser Arg Arg Thr Leu Mer 1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg 11e Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Aap 20 25 30
Arg His ASP Phe Gly Phe pro G1n Glu Glu phe Gly Asn G1n Phe Gln 35 40 45
Lys Ala Glu Thr 11e pro val Leu His Glu Met 11e Gln Gln 11e Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lquot; quot;. Ser Ser Al a Al. Tro ASp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu A.sp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr eln Gln Leu Asn Asp Leu Glu .5 95
quot;
Ala Cys Val Me' eln Glu Glu Arg Val ely Glu Thr Pro Leu Me' 'sn 100 105 110
Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Gl u Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 1 30 135 140
Ala Glu I1e Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu G1n Glu Arg 145 150 155 160
Leu Arg Arg Lys Glu 165
10 lt;210gt; 203
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 203
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Mee 1 S 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Acg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30
Arg His A.p Phe Cly Phe Pro Oln Olu Glu Phe Oly Mn Oln Phe Cln
35 .0 45
Ly. Al. Olu Thr Ile Pro v.l Lequot; Kis Glu Y.ee He Oln Gln Ile Phe 50 55 60
Asn I.eu Phe Ser Thr Ly. Asp Ser Ser Ala Aquot; Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr eln Gln Leu Asn ASp Leu Glu 85 90 95
Ser Cys val Mee Oln Glu Val Gly Val ne Glu Ser pro Lequot; Melt; Tyr 100 105 110
Glu Asp Ser ne Leu Ala Val Aro Lys Tyr Phe eln ArO quot;e Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Olu Val Val Arg 130 135 lO'
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln LYs Arg \45 lSO l SS 160
Leu Lys Ser Lys GLu 5 165
lt;210gt; 204
lt;211 gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 204
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Het Arg ~rg ~le Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30
Arg Ki~ Acp Phe G~y Phe Pro Cln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45
Lys Al~ Glu Thr l1e pro Val Leu His Glu Met l1e Gln Gln lle Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Met Clu 95 90 95
Ala Cys Val ne Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr l'ro Leu Me' A.n 100 lOS 110
vlt;:Il Asp Ser lle Leu Ala Val Ly. Lys TYr Phe Gln Arg lle Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Clu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Aro 130 135 140
Ala Glu 11e Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys lle Phe Gln Glu Arg 145 150 155 160
Leu Arg Arg Lys Clu 165
lt;210gt; 205
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 205 Cys Asp Leu Pro Gln Thr H1s Ser Leu Cly Ser Aro Arg Thr Leu Het 1 5 10 15 Leu Leu Ala Cln Met ArgArg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 2S 30 Arg His Asp Phe ely phe pro eln el~ elu Phe ely Asn Gln Phe eln 35 40 4S Lys Ala Glu Thr tle Pro Val Leu His Glu Met tle Gln Gln tle Phe SO SS 60 Asn Lcu Phe Thr Thr Lys ASp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Clu ASp Lcu 6S 70 7S 80 Leu ASP Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn ASp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Mee eln Glu Glu Arg Val Cly Glu Thr Pro Leu Mee Asn 100 lOS 110 Ala ASP Ser ¡le Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg tle Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Thr Clu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140 Ala Glu I le Mee Arg Ser Leu ser Leu Ser Thr ASn Leu Gln clu Arg HS 150 155 160
Leu Arg Arg LyS Glu 165 10 lt;210gt; 206
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 206
Cys Asp Leu Pro Cl n Thr His ser Leu Cly ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15
LQu Leu Ala Cln Met Arg Arg ~lc Ser Leu phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 )0
J\rg \-lis A,p Phe Cl y Phe Pro Oln Glu Clu Phe Cly A,n Gln Phe G1n J5 40 45
Ly. Al. Glu Thr lle Pro Val Leu His Cl u Met. ne Gln Gln ne Phe 50 55 60
Asn Leu Phe Ser 'l'hr Lyo A,p Ser Ser Ala Al. Trp ....sp clu Thr Leu 6S 'O OS
quot;
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr alu Leu Tyr Cln Gln Leu Asn Asp Leu Glu SS 90 95
Ala Cys V6l Met Gl n Glu Glu Arg V61 Gly Clu Thr Pro Leu Met Asn 100 105 110
Ala ASp Ser lle Leu Ala Val Ly~ Lys Tyr Phe Arg Arg lle Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Thr Clu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140
Ala Glu lle Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr A~n Leu Cln Glu Arg 145 150 155 160
Leu A.rg Arg Ly~ elu 5 165
lt;210gt; 207
lt;211gt; 153
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 207 Mee Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys lle Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Cln Leu 20 25 30
Gln Leu elu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ilc Leu Asn Gly l l e 3S 40 45
Aon un Tyr Lys Asn pro Ly' Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe SO 55 60
Tyr Melt; Pro Lys Lys Al. Thr Clu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 .0
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala G1n Ser Lys
.5 'O OS
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu ¡le Ser Asn 11e Asn Val rle 100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly SeXquot; Glu Thr 'thr Phe Met Cys Glu Tyr #\la 115 120 125
Asp Olu Thr Ala 'I'hr !le Val Olu Phe Leu Aso Arg Tro !le Thr Phe 130 135 140
Cyo Oln Ser Xle U.e Ser Thr Leu Thr 145 150
lt;210gt; 208
lt;211gt; 153
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 208
Met Tyr Arg Met eln Lequot;u Leu Ser Cys 11e Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15
val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30
Gln Leu Glu Kis Leu Leu Leu Asp Leu Glo Met tle Leu Asn Gly l}e 35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala 'l'hr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Clu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 11e Ser Asn Ile Asn val Ile 100 105 110
Val Leu G1u LcU Lys ely Ser Glu Thr Thr Phc Met Cys G1u Tyr Ala 115 120 125
ASp elu Thr Ala Thr l1e Val Glu Phe LCU Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140
Cy~ Gln Ser Ile I le Ser Thr Leu Thr 145 ISO
lt;210gt; 209 10 lt;211gt; 153
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 209
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15
Val Thr Asn Ser A1a Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Cln Leu 20 25 30
Glo Leu Glu His Leu Leu Leu ASp Leu Clo Yoet Ile Leu Asn Gly l1e 3S 40 45
Mn AOn 'l'Yr Lys Asn Pro Ly. Lou Tnr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 SS 60
'l'Yr He. Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu G1n Cys Leu Glu 65 10 15 ao
Glu Glu Leu Lys pro Leu Glu Glu val Leu A.n Leu Al a. Cln Ser I:.ys a, 90 os
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu lle Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125
Asp Glu The Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp 11e Thr Phe 130 135 140
Cys Gln Ser 11e I1e Ser Thr Leu Thr 145 150
15 lt;210gt; 210
lt;211gt; 153
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 210
Met Tyr Arg Met Gln Lea Lea Ser Cys lle Ala Leu Ser Lea Ala Lea 1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Al. Pro Thr Ser Ser Ser 'I'br Lys Lys Thr Oln Leu 20 25 30
G1n Lea Olu His Lea Leu Leu quot;quot; Leu Oln Met: Ile Leu Asn Gly Ile 35 40
quot;
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60
Tyr MS' Pro Lys Lys Ala Thr Glu Lell Lys Hi.s Leu Gln Cys Leu 01u 65 70 75 80
Olu Glu Lell Lys Pro Leu Glll Glu Val Leu Asn Leu Alll Gln Ser Lys 85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 1 00 105 110
Val Leu Glu Lea Lys Gly Ser Glu Thr Thr phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125
Asp Glu Th r Ala Tnr tle Val Glu Phe LeU Asn Arg Trp Zle Thr Phe 130 135 140
Cys Gln Ser tle 11e Ser Thr Leu Thr 145 150
lt;210gt; 211
lt;211gt; 153
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 211
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys 11e Ala Lell Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15
val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30
Gln Leu Glu KLs Lea Leu Leu Asp Leu Gln Met tle Leu Asn Gly t1e 35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pr o Lys Leu Thr Arg Met Lell Thr Phe Lys Phe 50 55 60
Tyr MS' Pro Lys Lys Ala Thr Gl u Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 60
Olu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu val Leu quot;n Lea Ala eln Ser Ly. 65 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg ASp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Het Cys Glu Tyr Al~ 115 120 125
Asp Glu Th~ Ala Th~ Xle V~l Glu phc Leu Asn A~g Trp tle Thr Phe 130 135 140
Ser Gln Ser I le rle Ser Thr Leu Thr 145 150
lt;210gt; 212
lt;211gt; 153 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 212
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys tle Ala Leu Ser Leu Ala Leu
5 1 s 10 15
val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lyo Thr Gln Leu 20 2S JO
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gl n t:et He Leu Asn Gly Ile 35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Ly. Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe SO SS 60
Tyr Met Pro Lys Lys Al. Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cyo Leu Glu OS 70 75 .0
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Ly. as 90 95
Asn ?he His Leu Ar. Pro ArO Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Xle 100 105 llO
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe M&t Cyo Glu Tyr Ala 115 120 125
AsO Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Aro Trp Ile Thr Phe 130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr ~eu Thr 145 150
lt;210gt; 213
lt;211gt; 20
lt;212gt; DNA 10 lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 214
lt;211gt; 56 15 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 214 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcagc gttagccaaa gaagca 56
lt;210gt; 215 20 lt;211gt;20
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 215 catacaaact taagagtcca 20
25 lt;210gt; 216
lt;211gt; 56
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 216 30 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctgc cgatattttg gctgca 56
lt;210gt; 217
lt;211gt; 20
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 217 catacaaact taagagtcca 20
lt;210gt; 218
lt;211gt; 56
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 218 ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatctct cttatccaaa gaacct 56
lt;210gt; 219 lt;211gt;41
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 220
lt;211gt; 59
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
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lt;211gt; 27
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lt;210gt; 222
lt;211gt; 59
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;212gt; ONA
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lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 226
gaattcggcg cgccttattc cHacltctt aaactttct 39
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lt;400gt; 227
gcgcgcggat ccgccaccat 9gccttgacc tttgctttac tggtggccct cctggtgctc .0 8gctgcaagt caagctgctc t9t99gct9t gatctgcctc aaaccca 107
lt;210gt; 228
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lt;211gt; 59
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lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 230
gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcttc cttacltctt aaactttct 59
lt;210gt; 231 lt;211gt;40
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 231
cgcgcgcgtc gacaaaagaa tgagctacaa cttgcttgga 40
lt;210gt; 232
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lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 232 gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcglt tcggaggtaa cctgt 55
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gcgc9gatcc gaactccgcc gccatgacc a acaag-t.gtct cctccaaatt gctctcctgt 60 t.gtgcttct.c cactacagct ctttccatga gctacaact.t gct.t.gg
lO'
lt;210gt; 234
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 237
lt;211gt; 38
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 238
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 239
lt;211gt; 38
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 240
lt;211gt; 39
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 242
lt;211gt; 39
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lt;213gt; Horno sapiens
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lt;210gt; 243 lt;211gt;21
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lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 243 agaaglgctg caaggclgac 9 21
5 lt;210gt; 244
lt;211gt; 20
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lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 244 10 acctgaccta caggaaagag 20
lt;210gt; 245
lt;211gt; 2418
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
15 lt;400gt; 245 atgaacattt tctacatttt cttgttcctg ttgtctt:tcg tt:caaggttt ggaacacact 60 cacagaagag gttctttgga taagagagat gcacacaaga gtgaggttgc t.catcgattt 120 aaagattt:gg gagaagaaaa t:t:tcaaagcc ttggtgt:tga ttgcctttgc tcagtatctt 180 cagClt;l9t9tc catttgaaga tcatgtaaaa ttagtgaatg a.agtaactga atttgcaaaa 240 acatgtgttg ctgatgagtc agctgaaaat tgtgacaaat cacttcatac cctttttgga 300 gacaaattat gcacagttg-c aactcttcgt gaaacctatg gtgaaatggc tgactgctgt 360 gcaaaacaag aacctgagag aaatgaatgc ttcttgcaac acaaagatga caacccaaac 420 ctcccccgat tggtgagace agaggttgat gtgatgtgca ctgcttt.tca tgacaatgaa 480 gagacatttt tgaaaaaata cttatatgaa attgccagaa gacatcctta cttttatgcc 540 ccggaactcc ttttctttgc taaaaggtat aaagctgctt ttacagaatg ttgccaagct 600 gctgataaag ctgcctgcct gttgccaaag ctcgatgaac ttcgggatga quot;,gg9aa9gct 660 tcgtct.gcca aacagagact caagtgtgcc agtctccaaa aatttggaga aaga9ctttc 120 aaagcatggg cagtagctcg cctgagccag agatttccca aagctgagtt tgC4'iJa.&gtt 780 tccaagtt.ag tgacagatct taccaaagtc cacacg'1aat fJctgccatgg agatctgctt 840 gaatgtgctg atgacagggc ggaccttg(::c aagtatatct. gtgaaaat.ca agattCgatc 900 tccagtaaac tgaaggaatg I:tgtgaaaaa cct ctgttgg aaaaatccca ctgcattgcc 960 gaagtggaaa atgatgagat gl:ctgl:tgac ttgccttcat tagctgctga ttttgt.tgaa 1020 agtaaggatg tttgcaaaaa ctatgctgag gcaaaggatg tcttcctggg catgtttttg 1060 tatgaatatg caa'1aaggca tcctgattac tctgtcgtgc tgctgc:tgag acttgccaag 1140 acatatgaaa ccactctaga gaagt.'1ctgt gccgctgcag atcctcatga atgctatgcc 1 200 aaagtgttcg atgaatttaa acctcttgtg gaag8gcctc agaatttaat caaacaallat 1260 tgtgagcttt ttgagc:agct tggagagt.ac aaattccaga atgcgctatt ilgttcgttac 1320 accaagaaag taccccaagt gtcaactcca actcttgtag aggtctcaag aaacctagga 1380 aaaqtgggca gcaaatgttg taaacatcct gaagcaaaaa gaatgcc::ctg tgcagaagac 1440 tatct.Atccg tggtcct:gaa ccagttatgt gtgttgcatg agaaaacgcc agtaagtgac 1500 ago.gtC.!lcca aatgctgcac agaatccttg gtgaacaggc g8ccatgctt ttcagctctg 1560 gaagtcgatg aaacatacgt tcccaaagag tttaat!lctg aaacattcac cttccatgca 1620 gatatatgca cactttctga gaaggagaga caaatcaaga aacaaactgc ac:ttgttgag 1680 ctq¡¡tgaaac acaagcccaa ggcaacaaaa qagcaactga aagct.gttat. ggatgattt.c 1740 gcagctttto tagagaa9tq ctgcaaggct gaC:gataagg agacctgctt tgccgaggag 1800 ggtaaaaaac ttgtt9c tlt;;JC aagtcaagct '1ccttaggct tat tcccallc aattccctta 1860 tccaggcttt tt'1&caacgc tatgctccgc: gcccatcgtc t gcaccagct. ggcctttgac: 1 920 ac:c:taccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaugtattc attcctgcag 1980 aacccccaga cctccc:tctg tttctcagag tctattccga ca.ccctccaa cagggaggaa 20110 acacaacaga aatccaacc:t agagctgctc cgcatctccc: tQctgctca.t ccagtcgtg'l 2100 ct.ggagcccg tgcagttcct. caggagtgtc t.t.cgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 2160 gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 2220 aggctg'laag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagacct.a cagc:aagttc 2280 gac:acaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctac:tgcttc 2340 aggaaggaca tggacaaggt. cgagaeatte et'1Cgeate g tgcaotgcccr ctctcrtaaag 2400 ggatcctgtg gcttctaa 2418
lt;210gt; 246
lt;211gt; 2388
lt;212gt; DNA 20 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 246
atgctttt.gc aagct.tt.cct tttccttttg gctggt.tttg cagccaaaat atcggcagat 60 gcacacaaga gtgaggtt:gc tc:atcgattt aaagatttgg gagaagaaaa tttcaaagcc 120 ttggtgttga ttgcctttgc tc:agtatc:tt cagcagtgtc catttgaaga tcatgtaaaa 1'0 t tagtqllatg aagtaactga atttgcaaBa acatgtgttg ctgatgagt.c agctgaaaat. 240 t.gtgacaaat cac:ttc:atac c:c:tttttgga gac:aaattat gcacagttgc aactc:ttcgt 300
gaaac:ctatg gtgaaatggc tgactgct!jJt gcaaaacaag aacctgagag aaatgaatgc 360 ttcttgcaac acaaagatga caacccaaBC ctcccccgat tggtgagacc agaggttc¡at 420 lt;} tgatgtgca ctgcctttca tgacaatgaa gagacatttt cgaaaaaata cttatllt.gaa 480 actgccagaa gacatcctta. cttttatgcc ccggaactcc t tttctt t gc taaaaggtat 540 aaagctgctt tt.acaqaatg ttgccaagct gctgatao1lag ctgcct.gcct gttgccaaag 600 cccgacgaac ttcgggatga agggaaggct tcgtctgcca aacagagact caagtgtgcc 660 agtccccaaa aatttggaga aagagctttc aaagcatggg cagtagctcg cctgagccag 720 agatttccca aagctgagtt. tgcagaagtt tccaagttag tgacagatct taccaaagtc 780 Co1lcacggaat gctgccatgg agatctgctt gaatgtgct.g aCgacagggc ggaccttgcc 6'0 aagt.atatct g tgaaaatca agattcgatc tc:cagtaaac tgasggaatg ctgtgaaalla 900 cctctgttgg aaaaatccco1l ctgc:attgc:c gaagtggaaa atgatgagat QCctgctgac 960 ttgc:c:ttcat. tagctgctga ttttgttgaa agtaaggatg tttgcaaaaa ctat.gct.gag 1020 gc:aaaggatg t.cttcctggg cat.gttttt.g t.at.gaatatg caaga&ggca tcctgattac 1080 . tctgt.cgtgc tgctgctgag acttgcc:aag acatatgaaa ccactctaga gaagtgctgt 1140 gccgctgcag atcctcatga atgct.atgcc aaagtgttcg atgaatttaa acctcttgt.g 1200 gaagagcctc agaatttaat caaacaaaat t.gcgagcttt ttgagcagct tggagagt.ac 1260 aaatt.ccaga atgcgctatt agttcgtcac accaagaaag taccccaagt gt.caactcca 1320 ilctctt.gtag aggtctc:aag aaacctagga aaagtgggca gcaaatgtt.g taaacat.cct 1380 gaagcaaaall gaatgccctg tgC8gaagac tatctatccq tggtcctgaa ccagttatgt 1440 gcgttgcatg agaaaacgcc agtaagtgac agagtci!l.cc4 aatgctgcac aqaatccttg 1500 gtgllac4g9C gaccatgctt ttcagctctg gaagtcgatg aaacatacgt ccccaaagag 1560 tttaatgctg aa acattcac cttccatgc:a gatatatgca cactttctga gaaggagaga 1620 caalltco1laga aacaaactgc acttgttgag ctcgtgo1li!l.ac acaagccci!l.a ggcaacaaaa 1680 gagcaactga aagctgttat ggatgatttc gcagcttttg tagagaagtg ctgcaaggct 1740 gacgataagg agacctgctt tgccgaggag ggtaaaaaac ttgttgc:tgc aagtcaagct 1800 gc:c:ttaggct tattcccaac aattccctta tccaggcttt. ttgacaacgc tatgctccgc 1860 gcccatcatc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtt tgaaga agcctatatc 1920 ccaaaQquot;gaac agllllllgtattc attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag 1980 tctattccga caccctccaa cagggaggaa acacaac:aga aatccaacct agagctgctc 2040 cgca~ct.ccc tgc~getctlt. ccaglocgtg9' ctggGgcccg tgcagttcct. c Gggagtgtc 2100 ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct gacagcllllcg tctatgacct cctaaaggac 2160 ctagaggaaq c¡catccaaac gctgatgggg aggctggaag atggcagccc ccg9e.Ct.999 2220 cagatcttca ageaga.ccta. eagcaagttc gacacaaact ca.ca.caacga tga.cgcacta 2280 ctcaagaact acgqgctgct ctactgcttc aggaaggaca tggaeaaggt cgagacattc 2340 ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag ggatcctgtg gcttctaa 2388
lt;210gt; 247 S lt;211gt; 2382
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 247
atgttcaagt ctgt.tgttta ctctattttg gctgcttctt: tggctaac:gc tgatgcacac 60 aaga'ij't'ij'agg tt'ij'ctcl!ltcg atttaaagat ttQ'ij'QagaaQ aaaatttcaa agccttggtg 120 ttgattgcct ttgctcagta t.ctt.cagcag tgtccattt.g aagatcatgt aaaattagtg 1'0 aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgc:tgatg agtcagctga aaattgtgac 24' aaatcacttc ataccctttt t ggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc JOO tat.ggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg a gagaaatga atgctt.ctt.g 36' caacacaaag atgacai!llccc aaacctcccc: cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg 420 tgcactgctt ttco1ltgacaa tgaagagaca ttttt.gaaaa aatacttata tgaaattgcc
quot;O
agaagacatc ct.tactttta tgccccggaa ct.ccttttct. ttgctaaaag gtataaagct 540 gctttta.cag aatgttgcca agctgc:toat aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat 600 gaacttcggg atgaagggaa ggCttcgtct gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc 660 caaaaat.ttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag ccagagattt no cccaaagct g agtttgcaga. agtttccaaq ttagtgacag atcttaccaa agt.ccacacg 760 gaatgc tgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat 840 atctgtgaaa atcaagattc gatc:tecagt aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg 900 ttggaaaaat ccc:actgca t t.gccgaagtg gaaaatgatg agatgectgc tgac:ttgcct 960 tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gaCgtttgca aaaactatgc tgaggcllaag 1020 glltgtcttcc tgggC&tgtt tttgt.&tgaa tatgcaagaa ggcatcctgll ttactctgtc 1080 gtgctgctgc tgagacttgc cougucatat go1laaccllctc tagagaagtg ctgtgCCgct 1140 10
gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatga&t ttaaacctct tgtggaagag 1200 cctcagaatt t.aatc8laaca aaattgtgag ctttttgag-c agctt ggaga gtacaaattc 1260 cagaatgt;gc tattélgttcg ttacaccaag aaagt.acccc aagtgtcaac tccaactctt 1320 gtagaggt.ct caag¡UIBlcCt. aggaaaagtg ggcagcaaat gt.t.gtaaaca t.cctgaagca 1380 aaaagaatgc cctgtgcaga agactat.cta tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg 1440 catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc accaaatgct gcacagaatc cttggtgaac HOO ag:9cgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa agagtttlllat. 1560 gctgaaacat. tcaccttcca tgcagatata tgcacacttt ctgagaagga gagac8ll1at.c 1620 aagaaacaaa ct.gcacttgt tgagctcgtg aaacacaagc ccaaggcaac aaaagl'lgcaa 1680 ctga8.agctg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgct.gcaa 9gctgacgat 1740 aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa aaacttgt.t.g ctgcaagt.ca agct.gcctta 1800 ggct.tat.t.cc caacaatt.cc ctt.at.cca!;l'g ctttttgaca IlIcgctatgct c:cgcgcccat 1860 cgtctgcacc agctggcctt tgacacctac ca.ggagtttg aag.!laaccta tatcccaaag 1920 gaaca.gaagt attcatecct gcagaacccc cagacct.ccc tctgtttctc agagtctatt 1980 ccgacaccct. ccaacaggga agaaacacaa cagaaat.cca acctagagct 9ctccgcatc 2040 tccctqctgc tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc 2100 aacagcctgg tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa 'ilglt;lcctagag 2160 gaaggcatcc aaacgctgat gggga9gcl:g gaagatggca gcccccggac t.gggcagatc 2220 ttcaagcaga cctacagcaa gttcgacac::a aactcacaca acgatgacgc actactcaag 22M aactacgggc tgct.ctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac at.t.cctgcgc 2340 atcgtgcagt gccgctctgt ggagggatcc tgtggcttct. aa 2382
lt;210gt; 248
lt;211gt; 2403
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 248
atgaagtagg taagcttt.at ttccct.tctt tt.t.ctcttt.a gctcggctta ttccggttct 60, ttggat:aaga gagatgcaca caagagtgao gttgctcatc gat.ttaaaga tttgggagaa 120 gaaaatttca aagcct.tggt. gt.taattgcc tt.tgCtCdgt att;ttcagca gtgtccattt. 180 gaagatcatg taaaat.tagt. gaat.gaagta act.gaat.ttg caaaaacatg tgttgctgat 240 gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300 gttg'caactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcquot;aa acaagaaéct 360 gaga9quot;aatg aatgcttctt gcaacacaaa gat.gacaacc caaacctccc ccgattggtg 420 8gaccagagg ttgatgtgat gtgcac:tgcl: tttcatgaca at.gaagagac attttt.gaaa 480 aaatact.tat atgaaattgc cagaagaca.t cct.tactttt a tgcccc:gga actccttttc 540 tttgctaaaa ggt.ataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgcctgttgc caaagcccga tgaact.tcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacao 660 agactcaagt gtgc:cagtct c:caaaaattt ggagaaagag cttt.caaagc atgggcagta 720 gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtt.tccaa gt.t.agtgaca 780 gat.cttacca aalt;¡tccacac ggaatgctgc catggagatc t.gct.t.gaatg tgct.gatgac B'O agggcggacc tt.gccas \;Jta tatct.gtgaa aatc:aagatt cgatctc:cag taaactgaag 900 gaatgctgtg alloaacct.ct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat. 960 gagatgcct g ctgacttgcc ttcllltt.agc:t. gctgattttg t.tgaaagtaa ggatgtttgc 1020 aaaaactatg ctgaggc:aaa ggatgt.cttc c:tgggcatgt t.tt.t.gta.tga at.atgcaaga 1080 aggca tectg attactctgt cgtgctgctg ctgagac:ttg ccaagaC:,!,ta tgaaa.ccact 1140 c:tagagaagt gc:tgtgc:cgc tgcagatect. catgaatgct. atgccaaagt gttcgatgaa 1200 tttaaacctc tt.gt.ggaaga gcctcagaat tt.aatcaaac aaaattgtga gctttttgaQ 1260 cagct.tggag agtacaaat.t cca9aatgcg ct.attagttc gttacaccaa gaaélgtaccc 1320 caagt.gt.caa ctccaactct tgtagaggtc t.caagaaacc t.aggaaaagt gg9cagcaaa 1380 tgttgtaaac at.cctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggt.c 1440 ctgaaccagt tatgtgtgt.t gcatgagaaa acgcc:agtaa. gtgacagagt c:accaaatgc 1500 tgcacagaat cctt.ggtgaa caggcgacca tgct t t tcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560 tac:gt.t.ccca quot;agagt.tt.aa tgc: tgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620 t.ctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg t.tgagctcgt. gaaacacaag 1680 cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gt.tatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740 aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggag9gtaa aaaacttgtt 1800 gctgcaagtc aagctgcct.t aggcttattc ccaacaatt.c ccttatc:cag gctttttgac 1860 llIacgctatgc tcc:gcgccca tcgtct.gcac cagctggcct ttgacacc:ta ccaggagttt 1920 gaagaagcct at.atccc:aaa ggaacagaag tatt.cattcc: tgcagaaccc ccagacctcc 1980
ctctgtttct cagagt.ctat. tccgacacc:c tccaacaggg aggaaacaca acagaaatcc 2040 aacctagagc tgc:tccgcat ctccctgctg ctcat.ccagt cgtggct.gga gcccgt.gcag 2100 ttcctcagga gtgtcttcgc caac:agcctg gt9tacggcg c:c:tctgacag caacgtctat 2160 gacctcc:taa aggacctaga ggaaggcatc caaacgctga tggggaggct ggaagatggc 2220 agcccccgga ctgggcagat cttcaagcag acctacagca agttcg'acac aélactcacac 2280 aacgat.gacg cactactcaa gaactacggg ctgctctac:t gcttcaggaa ggacat.ggac 2340 aaggtcgaga clllttcctgcg catcgtgcag tgccgctctg tggagggatc ctgtggctt.c 2400 toa 2403
10 lt;210gt; 249 lt;211gt; 2325
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 249
atgaaqtggg taagctttat ttcccttcet tttctcttta gctcggctca ttccggttct 60 ttggataaga gagatgcaea callgagtgag gttgctcatc gatttallaga tttgggagaa 120 gaaaatttca aagccttggt gtt.gattgcc tttgctcagt: atcttcagca gtgtccattt lBO gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacat:g tgttgctgat 240 gagt.cagctg aaaattgtga caaatc:ac:tt catacccttt t tggagacaa attatgcaca 300 gttgcaactc ttcgtga.aac ctatggt!jJaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360 gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctc:cc ccgattggtg 420 agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac: atttttgaaa 480 aaatacttat atgaaattgc cagaagacol: ccttactttt atgccccgga actccttttc 540 tttgctaaaa ggtataaagc tgettttac:a gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600 tgcctgttgc: c:aaagctcga tgaac:ttcgg 9atgaag99a aggcttc:gtc tlt;¡ccaaacag 660 agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ettteaaagc atgggcagta 720 gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780 gatc:ttacca ilagtccac:ac ggaat.gctgc cat.ggagatc tgc:t.tgaatg tgc:tgatgac quot;0 agggcgqacc ttgccaagta tatctgtgaa aatc:aagatt. cgatctccag t.aaact.gaag 900 gaat.gctgtg aaaaaCc:tct gttggaaaaa t.cccaetgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960 Oagatgcctg ctgacttgc:c: ttc:attaget gc:tgattttg ttgaaagtail ggatgtttgc 1020 aaaaactatg ctgaggc:aaa ggatgt.cttc ct.gggcatgt ttttgt.at.ga atatgcaaga 1080 aggcatcct.g attactc:tgt cgtgctgctg ctgagacttg cc:aagacata tgllaaccact 1140 ctagagaagt gctgtgccgc tgca9atcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200 tttaaacetc ttgtggaaga gcc:tc:agaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260 cagcttggag agtacaaatt c:c:agaatgcg c:tattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320 caagtgtcaa ctccilactc:t tgtagagotc tcaagaa8cc taggaaaagt gggcagcaaa 1380 tgttgtaaac ateCtgaagc aaaaagaatg ccc: tgtgcag aagactatct atc:egt.ggtc 1440 c:tgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc: 1500 tgcacagaat ccttggtgaa caggcgac:ca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaac:a 1560 tacgtyccca aagagtttaa tgctgaaaea ttcaccttcc atgc:agatat atgcacactt 1620 tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagc:tcgt gaaacacaag 1680 cccaaggcaa caaquot;,agagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgta9ag 1740 aaquot;gtgc:tgca aggctgac:ga taaggagacc: tgctttgccg aggagggtaa oaaacttgtt 1800 gctgcaagtc 1Hlgc:tgcctt aggctta::gt gatctgcctc aaacccacag cctgggttct 1860 agaaggacct tgatgctcct qqcacagatg alt;¡gagaatct ctcttttctc ctgcttgaag 1920 gacagacatg actttggatt tccccaggag gagtttggca ac:cagttcea aaaggctgaa 1980 accatccctg tcctccatga gatgatceag cagatcttca atctcttcag cacaaaggae 2040 tcatctgc:tg cttggga.tga gaccctccta gacaaattct acactgaact ctaccagcag 2100 ctgaatgacc tggaagcc:tg tgtgatac:ag ggt¡jgtggggg tgacagagac tcc:c:c:tgatg 2160 aaggaggact c:c:attc:tggc tt¡jtgaggaaa tacttccaaa gaatcaet ct ctatctgaaa 2220 gagaagaaat acagcc:ct.tg t9c:ct 9ggag gttgtcagag cagaaatc:at gagatctttt 2280 tctttq tcaa caaacttgca agaaagttta agaagtaagg aataa 2325
5 lt;210gt; 250
lt;211gt; 357
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 250 cactctgilcc ct.gcccgceg aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag t.gagtgggta 60 acggcqgc:ag acaaaaagac tgcagtggac atgtcgggcg ggac:ggtcac agtccttgaa 120 aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc 180 atgggttaca c:aaaagaagg ctgc:aggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc 240 cgaactaccc agtcgtacgt gcgggccctt ac:catggata gcaaaaagag aattggctgg 300 cgattcataa ggatagacac ttcttgtgta tgtacattga ccat.taaaag gggaaga 357
lt;210gt; 251
lt;211gt; 90
lt;212gt; DNA 15 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 251
cacggtgaag gtactttcac ttctgatgtt gaattcattg cttgt;Jt.tggt taagggtaga
lt;210gt; 252
lt;211gt; 96 20 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
tcttcctacc tggaaggtc8 agctgctaag 60 90
lt;400gt; 252
agccccaaoa tggtc¡caagg gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatca.gctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cg9cat quot;
lt;210gt; 253
lt;211gt; 96 5 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 253
agccccaaga tggtgcaagg gt.ctggctgc tttgggagga agat.ggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctqagg cggcat 96
lt;210gt; 254 10 lt;211gt; 2004
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 254
at.gaaggtct ccgt.ggctgc cctct.cctgc c:tcatgctt.g tt.ac:tgccct. t.ggat.cccag 60 gcccacggtg aaggt.acctt cllcttctgat. gt.ttcCtctt actt.ggaagg tcaagctgct 120 aaggaattc!l ttgct.tggtt ggttaagggt agacacggtg aaggtact.tt cac:ttctgat 180 gtt.t.c:t.tctt acttggaai¡j'g t.caagctgct aaggaattca t.t.gcttggtt ggttaagggt 240 agagatgcac acaagagtga ggttgctcat cgatttaaag att tgggaga agaaaatttc JOO aaagccttgg tgt.tgattgc cttt.gc:tc:ag tatc:tt.c:agc agtgtc:c!!lt.t t.gaag!!lt.cat 360 gtaaaattag tgaat.gaagt aact.gaat.tt gcaaaaacat gtgtcgctga t.gagt.cagc:t. .20 gaaaa ttgtg acaaatc:act. tcataccct.t tt.tggagaca aat.tatgcac agt.t.gcaact '80 ct.tcgtga¿oa cct.atggt..ga aatggctgac t..gct..gt.gclla llaCaagillllcc t.gagagaaat: 540 gaatgctt..ct.. t..gcaacacaa agatgllca&c ccaaacc t.cc CC:C9!1t.t.9gt. gagaccagag .00 gt.t.gatgtga tgt.gcactgc ttttcat.gac aatgaagaga cattt.ttgaa aaaatactta 660 t..at.gaaat.t.g ccagaagaca t.cctt.actt.t t.atgccccgg aac:tccttt..t.. ct..t.t..gct..aaa 720 aQgt.at..aaag ctgcttt.tac: agaat.gttgc caagc:tgc:t.g ataaagct.gc ctgcctgttg 780 ccaaagctcg atgaacttcg ggatg¿oaggg aaggcttcgt ctgccaal'ca gagactcaag 8'0 t.gtgccagtc t ccaaaaatt tggagaaaga gctttcaaag catgggcagt agctcgcctg '00 agccagagat t..tcccaaagc t..gagt.ttgca gaagt..ttcca agtt.agtgac agatc:t.t.acc 960 aaagt..ccaca c:ggaatgct..g ccatggag&t. ctgcttgaat. gtgctgatga cagc¡gcggac 1020 cttgccaagt atatctgtga aaat..caagat tcgat..ctcca gtaaact.gaa ggaatgctgt 1080 gaaaaacctc tgttggaaaa atcccClctgc attgccgaag tggaaaatga t..gagatgcct 1140 gctgacttgc: ct.tc.at.tagc: t.gct.gatt.t.t gt.tga.a8gt..a aggat.gtt t..g caaaaactat. 1200 gctgaggcaa aggatgtctt. cct.gggcatg ttt.tt.gt.at.g aat.at.gc8a9 aaggcatcct 1260
15 gatt.actctg tcgtgctgct. gct9agactt gccallgacat. at..gaaaccac t.ctagagaag 1320 t.gCt.gtgccg ctgcagatcc t.catga!ltgc tatgccaaag tgttcgat.ga atttaaacc:t 1380 ct.t.gtggaag agcc:tcagaa t.t.taat.caaa caaaat..tgt..g agctttt.tga gca.gct.tgga 1440 gagtacaaat tc:cagaatgc gctattagt.t cgttacacca agaaac¡tacc ccaac¡tgtca 1500 act.ccaactc t t gtagaggt ctcaagaaac ctaggaaaag tgggcagcaa atgttgtaaa 1560 cat.cctgaag caaaaagl:lat gccetgtgca gaagact.atc tatccgtggt. cctgaaccag 1620 ttatgtgtgt tgcatgagaa aacgccagt.a agtgacagag tcaccaaat.g c tgcacagaa 1680 tccttggtga acaggcgac:c atgcttt.tca gctct.ggaag tcgatgaaac: atac9t tccc 1740 aaagaqttta atgctgaaac attcacct.tc catgcagat.a tatgcacact tt.c:tgagaag 1800 gagagaca aa tcaagaaaca aact.gcactt gttgagctcg t.gaaacacaa gcccaaggca 1860 acaaaag.agc aactgaal!lgc: tgtt.atggat gatttci¡Jcag ctt.tt.gt.aga gaagtgct.gc 1920
aaggctgacg ataaggagac: ctgcttt..gcc gaggagggt.a caagctgcct. taggct..t.ata atsa
lt;210gt; 255
lt;211gt; 87
lt;212gt; DNA 20 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 255
agccccaaga tggtgcaagg gtCtggctgc t.t.tgggagga tccagt.ggcc tgggctgcaa agtgctg
lt;210gt; 256
lt;211gt; 96 25 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 256
aaaaact.t.gt. t.gc:tgcaa gt. 1980 2004
agat ggaccg gatcagctcc 60 S7
agccccaaga tggtgcaagg gtcto¡gctgc t.tt.gggagga agatggaccg gat.cagctcc
..60
t.ccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcat
lt;210gt; 257
lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 257
agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgAgg cggcat
quot;
lt;210gt; 258
lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 258
agccccaaga tggtgcaagq gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcat 96
lt;210gt; 259
lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 259
agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatcagctcc 60 t:;ccag~ggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcat 96
lt;210gt; 260
lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 260
agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggggta agatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc t!i1ggctgcaa agtgctgagg cggcat 96
lt;210gt; 261
lt;211 gt; 1716
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 261
8t.9t.99t99c gcct.gtggtg gctgctgct.g ctgctgctgc tgct.gtggcc catggt.gt.99 60 gccagcccca agatggt.gca agggt.ctggc tgctt.t.ggga g'g'allg'at99a ccggatcagc l20 tcctccagtg gcctgggctq cllaagtgctg tcacttcata ccctttttgg agacaaatta l80 tgcacagttg cllactcttcg tgallacctat. g'gtgllaatg'g ctgactg'ctg tg'caaaacaa 24O gaacctgaga gaa&tg8atg cttCttgcaa CtlC&tlag8tlt;;l acaacccaaa cctcccccg& 300 ttggtgagac cagaggttg& tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga Ilgagacattt 36O ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 420 ctt.ttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgct..-at.aaa
4quot;
gctgcctgcc tgt.tgccaaa gctc'ij'atgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 540 Ilaacagagac tCllagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatg9 600 gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 660 gtgllcagatc ttllccaaaqt ccacacggaa tgctgccat.g gagatctgct t.gaatgtgct 72O gatgacaggg cggacctt gc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa 78o ctgaaggaat gctgtgaaaa ac:ctctgttg gaaaaatccc actgcat.tgc cgaagtggaa .00 aatgatgaga tgcctgctga ctt.gcctt.ca ttagctgctg attt tgttga aagtaaggat 900 gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt g-tatgaatat 96O gcaagaaggc atcctgatta ct.ctgtcgtg ctgctgct.ga gacttgccaa gacatatgaa 1020 accactctag 8gaagtgctg tgccgctgcquot; gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc ~080 gatgaattta 8acctcttgt ggaagagcct cagaat.ttaa tcaaacaaaa t.tgtgagctt 1140 tttgagcagc ttgg8gagta caaat.tccag aatgcgctat tagt.tcgtta caccaagaaIJ. 1200 gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gagIJt.ctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1260 agcaaat.gtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctat.cc 1)20 gtggtcctga accagttat.g tgtgttgcat. gagaaaacgc cagtaagtga cagagt.cacc 1380 aaat.gctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagct.ct 9gaagtcgat 1440 gaaacatacg ttcccaaaga gt.ttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc 1500 acactttctg aQ'aagllc.gag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gctcgtgaaa 1560 cacaagccc,,quot; aqgcaacaaa a.ga.gcaact.g aaagctgtta tggatgattt cgca9ctttt 1620 gtagagaagt gctgcaaogc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga g9gtaaaaaa 1680 cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttataa 1716
lt;210gt; 262
lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 262 agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgag\1\1ca agatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcat 9.
lt;210gt; 263
lt;211gt; 96 10 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 263
agccccaaga tggtgcaag9 gtctggctgc tttgO'9agO'g gcat.gO'accg gatcagctcc 'O tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagq cqgcat
lt;210gt; 264 15 lt;211 gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 264 agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggagO'a agatggaccg glltcagctcc 'O tccagtqgcc tgggctgcaa aotgctgagg cggcat
quot;
20 lt;210gt; 265
lt;211 gt; 1929
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 265
atgaagtggg taagctttat t.t.cccttctt t.t.t.ct.ct.t.t.a goctCggoctt.il t.tccaggagc 60 ctcgacaaaa gaagccccaa gatggtgcaa gggtctggct gct.t.tgggag ga{l,gatggac 120 cggat.c4gct. cctccagtgg cCt999ctgc aaagtgctga 9999tggtgg tgatgcacac 180 aagagtgagg ttgctcatcg atttaaagat ttgggagaag aaaatttcaa agccttggt.g 240 t:.tgatt.gcct. ttgctcagta tcttcagcag tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg JOO aatgaagtaa ctgaatttgc aaa0l4catgt gt.tgct.gat.g aqteagct.ga aaatt.gtgac quot;O aaatcact.t.c ataccct.ttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct. t.cgt.gaaI:lCC 420 tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga atgcttcttg 4.0 caac&caaag atgacaaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt t.gatgtgatg 540 tgcactgc:tt ttcatgacaa t.gaagagaca tt.tttgaaaa aatac:ttata t.gaaat.tgc:c: 600 agaagacat.c cttac:tttta t.gccccggaa ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct 660 gcttttacag aat.gttgcca agct.gctgat aaagc:tgcct. gectgttgcc aaagctcgat 720 gaacttcggg atgaaQ'agaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc 700 caaaaatttg gagaaagél.gc tt.t.caaagca tgggc:ageag ctcgcctgag ccagagattt 840 cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag ttagtgacac¡ atcttaccaa llgtccaco!llcc¡ '00 gaatgctgcc atggoac¡atct gcttgaatgt lt;¡Jctgatlt;¡Jaca gggcggacct tgccaagtat 960 atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg 1020 ttgga.aaaat ccc:actgeat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc tgact.tgcct 1080 tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag 1140 gatgtcttce tgggeatgtt ttt.gtatga4 eatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc 1200 gtgctgc:tgc: tgagacttgc caagacatat gao,tlccactc tagagaagt.g ctgtgccgct 1260 gcagatcct.c atgaatgcta tgecaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct tgtogaagag 1320 cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga otacaaattc 1380 cagaatgcgc t a t.tagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtc:aac tccaact.ctt 1440 gtac¡aggtct caagaaacct aggaaaagtg ggcagcaaat. gttgtaaaca tcctgaagc:a 1500 aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtc¡gtcc tgaaccagtt. atgt.gtgttg 1560 catgagaaaa cgccagtaag tg-acagagtlt;;; accaaat.gct gcacagaatc c:ttggtgaac 1620 aO'gegaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat 1660 gctgaaac:at tcaccttcca tgcaQatata tgcac...cttt. ctgagaagga gagacaaatc 1740 aagaaacaaa ctgc:acttgt tgagcttg.tg aaacaeaagc ccaaggcaac aaaagagcaa 1800 etgaaagetg ttatggatga tttcgcagct tttgtagaga agtgctscaa ggctgac:gat 1860 aaggagacct 9cttt9ccga ggagggtaaa 4aactegttg ctgcaagtca agctgcctta 1920 ggcttataa 1929
lt;210gt; 266
lt;211gt; 456
lt;212gt; DNA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 266
atgagctcct tctccaccac cac:cgtgagc ttcc:tcc:ttt tactggcatt c:cagctcct.a 60 ggt.cagacea gagctaatcc catgtacaat gccgtgtcca acgcagacct gatggatttc 120 aagaat.ttgc: tggaccattt gga{l,gaaaag atgcctt.tag aagatgaggt cgtgccccca 100 caagtgctca gtgagec:gaa tgaagaagcg' 9g'9gctgctc tcagccccct ccctgaggtgo 240 cctccctgga cegg9gaagt cagcccagcc cagagagatg gaggtgccct C99gc99O'gc JOO c:cctgggact cctctgatcg atctgccctc etaaaaagca. agctgagggc gct.gctcact 360
gcccctcgga gcctgcggag atecagctgc ttcgggggea ggatggaca9 gattggagcc 420 Ca9ag cggac tgggctgtaa cagctt.ccgg tactga 456
10 lt;210gt; 267 lt;211gt;456
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 267
atgagctcct tctccaccac caccgt.gagc t.tcctccttt tactggcatt ccagctccta 60 ggtcagacca gagctaatcc catgtacaat gccgtgtcca acgcagacct gatggatttc 120 aagaatttgc t ggaccattt ggaa..,aaaag atgcctttag aagatgaggt c:gtgccccca 100 caagtgctca gt.gagccqaa tgaa..,aagc:g ggggctgctc tcagccccct ccctgaggtg 240 cctccctgga ccggqgaagt c:agcccagcc cagagagatg gaggtgccct cgggcggggc JOO ccctgggact cctctgatcg atctgccctc ctaaaaagca agctgagggc gctgct.cact 360 gcccctcgaa gcctgcgaag atccagctgc ttcgggg9C8 ogatggacag gattggagcc 420 cagagcggac t gggctgtaa cagcttccgg tactga 456
lt;210gt; 268 lt;211gt;456
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
20 lt;400gt; 268
atgagctcct tctccaccac caccgtglt;gt;gc ttcctccttt tactlt;;j'gcatt ccagctccta ,O ggtcagacca gagctaatcc catgtacaat gccgtgtCC¡) acgcagacct gatggatttc 120 aagaatttgc tggaccattt ggaagaaaag atgcctttag aagatgaggt cgtgccccca 190 caagtgctca gtg8gccgaa tgaagaagcg ggggctgctc tcagccccct ccctgaggtg 240 cCtccctg9a ccggggai!lgt cagcCcagcc cagag.agatg gaggtgccct c99gc9g9gc 300 ccctgggact cctctgateg atctgccetc ctaaaaagca a getgagggc qctgc:tcact 360 gccccccgga gcctgcggag acccagctgc tCcgggggca ggatggacag 9acc99agcc 420 cagagcggac Cgggctgtaa cagcttccgg tactga 45'
lt;210gt; 269
lt;211 gt; 456
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 269
atgagctcct tctccaccac caccgtgagc ttcctccttt tactggcatt ccagctccta 60 ggtcagacca Oagctaatce catgtacaat. gccgtgtcca acgcagacct gatggatttc 120 aagaatttgc tggaccatU. ggaagaaaag atgccttt.ag aagatgaggt cgQlccccca 180 caagtgctca gtgagccgaa tgaagluIgcg ggggctllctc tcagccccct ccctgaggtg 240 cctccctgga ccggggaagt cagcccagcc cagagagatg gaggtgccct cgggcggggc 300 ccctgggact cctctgatcg atctgccctc ctaaaaagca agctgagggc gctgctcact 360 gcccctegga gcctgcggag atccagctgc ttcgggggca ggatggacag gattggagcc 420 cagagcggac tgggctgtaa cagcttccgg tactga 456
lt;210gt; 270 lt;211gt;456 10 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 270
atgagctcct tctccaceac eaccgtgagc ttcctccttt tactggcatt ceagctccta 'o ggtcagacca g a gctaatcc catgt.acaat gccgtgtcca acgcagacct gatggatttc 120 aagaatttge tggaccattt gg8oaga8o&8g a tgcctttag aagatgaggt cgtgccccca 180 caagtgct.ca gtgagccgaa tgaagaagcg ggggctgct.c tcagcccc.'!ct ccct.gaggtg 240 cctccctgga ccggggaagt eagcccagcc cagagagat.g gaggt¡¡,ccct cgggcggggc 300 ccctgggact cctctgatcg atctg'ccete ctaaaaagca agctgagggc gctgctcact 360 gcccctcgga gcct.gcggag atccagct.gc ttcgggggca ggatggacag gattggagcc 420
cagagcggac t999ctgtaa cagcttccgg tac:tga 456
lt;210gt; 271
lt;211 gt; 456
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
20 lt;400gt; 271 atgagctcct tctccaccac ca.ccgtg'agc ttcct.ccttt tactggcatt c:cagctccta 60 ggtcagacca gagctaatcc catgtacaat gccgtgtcca acgcagacct gatggatttc 120 aagaatttgc tggacca.ttt ggaagaaaag atgcctttag aagatg80ggt cgtgccccca 180 caagtg'ctca gtgagccgaa tgaagaagcg ggggctgctc tcagceecet ccctgaggtg' 240 cctccctgg'a eeggggaagt eagcccagcc cagagagatg gaggtgccct c999cg99gc 300 ccctgggact cctctgatcg atctgcCCtc ctaa3aagca agctgag'ggc gctgctcaet 360 gcccctcgga gcctgcggag atccagctgc ttcgggggca ggatggacag gattggagcc 420 cagagcggac tgggctgtaa cagcttccgg tactga 45'
lt;210gt; 272 lt;211gt;381
lt;212gt; ONA 25 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 272
atgcatctct cccagctgct ggcctgcgcc ctgctgctca cgCtgctctc cctccggccc 60 tccgaagcclll agccc9999c gccgccgaag gtcccgcgaa ccccgccggc agaggagctg 120 gccgagccgc aggctgcggg cggcogtcag lI.agall.gggcg lI.caaggctcc cgggggcggg 180 ggcgccaatc tcai!lgggcga ccggtcgcga ctgctccggg acctgcgcgt ggacaccaag 240 tcgcgggC3; cgtgggctcg ccttct.gcaa !;Jagcacccca aC!;Jcgcgcaa atacaaaoga 300 gCcaacaaga agggctt.gt.c cai!lgggctgc ttcggcctca agctggaccg aatcggctcc 360 at.gagcggcc t.ggglt;lltgtta 9 381
lt;210gt; 273 lt;211gt;381
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 273 atgcatctct cccagctgct ggcctgcgcc ctgctgctca cgctgctctc cctccggccc 60 tccgaagcca agcccgqgQ'C gccgccgaag gtcccgcgaa ccccgccggc agaggagctg 120 gccgagccgc aggct.gcggg cg!ijcggt.cag aagaagggcg acaaggcccc cgggggcggg lBO 9qcgccaatc t.caagggcga. ccggt.cgcga ct;gctccggg acctgcgcgt ggaca.ccaag 240 t.cgcgggcag cgtgggctcg cct.t.ctgcaa gagcacccca acgcgcgcaa atacaaagga 300 gccaacaagil agggcttgtc caagggctgc ttc99cctca agctggaccg aatcggctcc 360 atgagcggcc t.g9gatgtta • 381
5 lt;210gt; 274
lt;211gt; 114
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Oendroaspis angusticeps
lt;400gt; 274 gaagttaagt acgatccatg t.ttcggtcac aagattgata gaattaaCca cgt.tt.ct.aac 60 ttgggttg'tc catctt.t.gag agat.ccaaga ccaa80cgctc cat.ct.act.t.c tgct 114
lt;210gt; 275
lt;211gt; 114
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Oendroaspis angusticeps
15 lt;400gt; 275 gaagt taagt a cgAtCcatg tttcggtcac aaqattgata gaattaacca cgtttctaac 60
ttgggttgtc catctttgag agatccaaga ccaaacgctc catctacttc tgct
quot;'
lt;210gt; 276 20 lt;211gt; 1929
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 276 at9aagtg99 ts.::tgctquot;ttat ttcccttctt ttt.ctcttta gctcggctta ttccggtagc 60 ctcgacaaaa gaagccccaa gat.ggtgcaa Oggtctggct 9cttt 9gga9 gaagatggac 120 cggatcagct cctccagt.gg cct.gggct9C aaagt.gctga goa9t ggt..-g t.gatgcacac 180 aagagtgagg ttgctcatcg atttaaagat ttgggagaag aaaat ttcaa 8gccttggtg 240 ttgattgcct ttgctcagta tcttcao;¡rcag tatccatttg aagatcatgt &lIaattagtg 300 a lltgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt gttgctgatg agtcagctga aaattgtgac 360 aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa ttatgcacag ttgcaactct t.cgtgaaacc 420 t.atggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa caagaacctg agagaaatga atgcttcttg 480 caacacaaag atga.caaccc aaacctcccc cgattggtga gaccagaggt. tgatgtgatg 540 tgcllctgctt ttcat gacaa tgaagagaca tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc quot;O agaagacat c cttactttta tgccccggaa ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct '60 gctttta ClIg aatgttgcca agctgctgat aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat 720 gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc '80 caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca tgggcagtag ctcgcctgag ccagagattt '40 cccaaagctg agtttgcaga agttt.ccaag ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg 900 gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt gctgatgaca gggcggacct tgcc&agtat 960 atct.gt.gaaa atcaagatt.c gatctce:agt aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg 1020 ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct. 1080 tcattagctg ct.gattttgt tgaaagt.aag gatgtttgca aaaactatgc t.gaggcaallg H40 gatgtcttcc tgggcatgtt t.ttgtatga tl tatgcaagaa g9cat.cctga ttactctgtc 1200 gtgctgct.gc tgagact.tgc caagacatat gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct 1260 gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag 1320 cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc 1.380 cagaatgcgc t a ttagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt 1440 g ta9aggt ct catlgaaacct aggaaaagtg Ilgcagcaaat gtt.Qtaaaca tcctgaaQca 1500 aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta tccgtggtCC tgaaccagtt atgtgtgttg 1560 catga.gaaa.a cgccagtaag tgacagagtc acca.aatgct gca.cagaatc cttggtgaac 1.620 a ggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat 1680 gctgaaacat tcacctt.cca tgcagatata tgcaca.cttt e:tgagaagga gagacaaatc 1740 aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa 1800 ctgaaagctg ttatggatga tttegeagct tt.tgtagaga agtgetgea.a. ggetgacgat 1.860 aaggagacct 9ctt t gccga 99ag9gta8a aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctt.a 1920 ggcttataa 1.929
lt;210gt; 277
lt;211gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 277 agccccaaga tggtgcAagg gtctgc¡ctgc ttt9ggaggg gcatggQccg gatcagctcc ,O tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgag-g cggcat .,
lt;210gt; 278
lt;211gt; 96
lt;212gt; ONA 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 278
agccccaaga tggtgcaagg gtctc¡c¡ctgc ttt999&.999 gcatggaccg gatcagctcc 'O tccagtggcc tgggctgcall agtgctgagg cggcat '6
lt;210gt; 279
lt;211gt; 96 15 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 279
agccccaaga tggtgcaaglJ gtctgl¡ctgc tttgggaggg gcatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctc¡agg cggcat .,
lt;210gt; 280 20 lt;211gt; 96
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 280
agccccaaga tggtgcaagg e¡tctggctgc ttt999a999 gcatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgClil1l ilgtgctgilgg cggcllt '6
25 lt;210gt; 281 lt;211gt;912
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Rattus nONegicus
lt;400gt; 281
a t l1gcccatt accatgacga ct.atc¡gIlIlGlg aatgatgaag tggagtt.tg-t. ccgaactggc 'O tatg-gg-aag-g IIclltggtcaa agttctccat attcagaggg IItggaaaatll ccacagcatc 120 a,),)ga99't9'quot; cgacttc99t. gcagttgact ctgaggtcca aaaaggatta cctccat9quot;,t 180 gataattccg acatcatccc cacalt;¡acacc atcaagaaca cagt.gcatgt cctggcgaag 240 tt.caaaggga tcaaaagcat cgagacct.t.c gctatgaaca t.ctgcgagca cttcctctct JOO tec:t.ttagcc at:gtcacccg agcccatgtc tacgt.ggaag aggtcccctg gaagcgtttt 360 gaaaagaatg gagtcaaa.ca cgtccatgcc ttcatc:caca ccc:cgacgge¡ aactcac:t.tc 420 t9t9ac9t99 agcaggtgag gaacggacct cccatcattc actctggaat caaagacctc 480 aaggtcetga aaacaaccca gtctgga:tt gaaggattca tcaaggacca gt.tcactact 540 ctccccgagg tgaaggaccg atgctttgcc actcaagtgt actgcaagtg gcgctaccag '00 aatcgggilcg tggatttcga ggctacctgg ggcgctgtcc gggacattgt: cctc¡aagaaa 660 1; t toc t999c cctatgacag aggtgaatac tcaccttccg tgcagaagac cctctatgac 720 atacaagtgc tgaccctgag ccagcttcct gagatagaag a.catggaaat cagcc:ttcca 780 aaca:t: t.cact actttallcat cgacatgtcc aaaatggggc tgatcaacaa ggaagaggtt quot;,O ttgctoQ'cctc tggacaaccc ct.llcggcaaa ataaccggga c:ggtga99ag gaagctquot;,cct '00 tccaggctgt •• 91'30
lt;210gt; 282 lt;211gt;912
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Rattus norvegicus
35 lt;400gt; 282
atggcccatt accatgacga ct.atggaaag aatgatgaag tggagttt!jJt ccgaact9'i1C 6. tatgggaagg acat.ggtcaa agtt.ctccat at::tcagaggg at::ggaaaata ccacagc4tc 12. aaagaggtgg cgactt.cggt. 9cagttgact ctgaggtcca aaaaqgatta cctccatggt 180 gataattccg acaecatecc caeagaeacc a.teaagaaea cagt::gcatgt cctggcgaag 240 ttcaaaggga teaaaagcat cgagaccttc gctatgaaca t.ct.gcgagca ct::t.cetct.et. 3•• teetttagce atgteiSceeg acrcceatgtc t::acgt99aag aggtcccctg gaagcgtttt 36. gaaaagaatg gagtcaaaca cgtccat.gcc ttcatccaca ccc!;gacggg aactcacttc 42. tgtgacgtgg ag!;aggtgag gaacggacct:: eeeateattc actctggaat caa.agacctc 48. aaggtcttga aaacaaccca gtctggattt gaaggattca tcaaggacca gtteactact 54. ctccccgagg tgaaggaccg atgctttgcc actcaagtgt actgcaagtg gcgetaccag 6•• 8atcgogacg tggatttcga ggctacetgg ggcgctgtcc gggaeattgt. cctgaagaaa 66. ttt.gctgggc cctatgaeag aggtglt;latac tcacct.tccg tgcagaagac cctctatgae 72. atacaagtgc tgaccctga9 ccagettcct 9agatagaa9 acat.ggaaat. cageettcca 78.
aacattcact actttaacat cgacatgt.cc aaaat.ggggc ttgctgcctc tggacaaccc ctacggeaaa ataaccggga
tccaggctgt ga
lt;210gt; 283
lt;211gt; 1233
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 283
tgatcaacaa ggaagaggtt 84. cgg tgaggag gaagct9cct 900
atgtctgtat:: ttgacagtaa at.ttaaaoga attcacgttt attcagaaat tgqtgaatta 60 gaatcagttc taqttcacga accaggacgc galt;lattgact. atatt.acacc agctagacta 120 Q'atgaattat tattctcagc tatcttagaa agceacgatg ctagaaaaga acacaaacaa 18. ttcgtagcag aattaaaagc aaaegacatc aatgttgttq aattaatt.ga tt.tagttgct 24. gaaacatatg att.tagcatc acaagaagct aaagataaat taatcgaaga at.t.tt.tagaa 3•• gactcagaac eagttetatc agaagaacac alt;lagt agttg taagaaaett cttaaaagl;;t 36. aaaaaaacat caagaaaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcaeaaa atac:gattta 42. ggtatcgaag cagatcacga attaat.eget gaeccaatgl;; cao..::scct.ata ctt.cacacgt. lt;8. gacceatttg catcagtagg taatggtgt.a acaatccact. acatgc!iltta caaagtt.aga '40 caacgtgaaa cattattctc aagattt.gta tt.ctcaaatc accct.aaact aattaacact. 6•• ccatggtact acgaccctt.c actaaaat.ta tcaatcgaag gtggagacgt atttatct.ac 66. aacaat.gaca cattagt.agt tggtgttt.ct gaaagalt;lctg acttacaaac agttactt.ta 720 ttagctaaaa acatt9t tgc taataaagaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaattaac 780 gttccaaaat ggacaaactt aatgcactta gacacatggc taacaatgtt agacaag08c 84. aaatt.cctat actcacc,)at cgct.aaegac gtatetaaat t.ctgggatta tgacttagta
,..
aacggtggag cagaaccaca accagttgaa aacggattac ctetagaagg at::tattaeaa '6. tcaatcatt.. ar;;;aaaaaacc agttttaatt cctatcgeag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020 gaaatcgaaa gagaaacaca ct.t.cgat.ggt. acaaactact tagcaatt.ag accaggt.gtt 1080 gtaat tggtt acteaegtaa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagetgc aggcattaaa 1140 qttct tecat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200 atgectttat cacgt.aaquot;,oa tgttaagtgg ea. ~2J3
10 lt;210gt; 284
lt;211gt; 1233
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 284
atgtctgtat ttgacagtaa atttaaagga attcacgttt quot;,ttcagaaat. tggtgaatta ,O gquot;,,,,tcagttc ta.gttcacga accaggacgc gaaattgact quot;,tattlt;lcacc agctagacta 120 gatgaattquot;'t tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga aeacaaacaa 180 ttcgtagcag aattaaa.agc a.&&cgacatc aatgtt.gt.tg aattaat.tga tttagttgct. 240 gaaaeatatg atttagcate acaagaagct aaagat.8s;¡!It taategaaga ~tt.t.ttagaa 300 gacteagaac eagttel:ate agaaqaacac aaagtagttg taagaaactt cttaaaagct 360 aaaaaaacat caagaaaatt agtagaaatc atgatg9cag ggatcacaaa atacgattta lt;20 ggtatcgaag cagatcaega attaatcgtt. gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480 gaeccatttg catcagtagg taat9gt.gta acaatccact acatgcgtta caaalt;¡t.taga 540 caacgtgaaa cat.tattcte aagattt.gta ttctcaaat.c accctaaact aattaacact '00 ceatggtact acgacccttc actaaaatta tcaat.cgaag gtggagacgt. attt.at.ct.ac 660 aacaatgaca cattagtagt tggtlt;¡tttct gaaalt;¡aactg act.ta.caaac agttacttta 720 ttagctaaaa acattgttgc t.aataaagaa tgtgaattca aacgtattgt tgcaatt.aac 780 gtt.ccaaaat ggacaaactt aatgcactta gacacatggc taacaatgtt. agacaaggac 840 aaattcctat actcaccaat cgct.J.acgac gtatttaaat tct.gggat.ta tgact.t.agta 900 aacggtg9a9 cagaaccaca accagttgua aacggattac ctctagaagg attattacaa 960 tcaat.catta acaaaaaacc agttttaatt cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020 gaaat.cgaaa gagaaacaca ctt.cgatggt. acaaact.act. tagcaatt.ag accaggtgtt 1080 gtaatt.ggtt. act.cacat.aa cgaaaaaaca aacgctgctc tagaagctgc 1lIj;¡'j;¡'cattalt;la 1140 Q'ttcttccat tccacggtaa ccaattatca ttaggtatgg gtaacgctcg ttgtatgtca 1200 at.gcctt.t.at. cacgtaaaga tgt.t.aagtgg lt;a. 1233
lt;210gt; 285
lt;211gt; 1233
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 285
atgtetgt&t. t.tgacagtaa. at.ttaaagga attcacgttt attcagaaat tggtgaatta 'O gaat.cagt.tc tagt.tcacga accagga.cgc gaaattgact atattacacc agc:t.agacta 120 gatg.J.Bttat tattctcagc tatcttagaa agccacgatg ctagaaaaga acaca.aacaa 180 t.tcgt.agcag aat.taaaagc aaac:gac:at.c aatgttgt.tg aattaattga tt.tagttgct 240 gaaacatatg atttagcatc acaagaagct aaagat.aaat taat.cg.:laga att.t.tt.agaa '00 g'aetcagaac cagttctatc agaagaacac aaagtagttg taagaaactt cttaaaagct 36. aaaaaaacat. caagaaaatt agtagaaatc atgatggcag ggatcacaaa atacgattta 42. ggt.atcgaag caglt;ltcacga attaatcgtt gacccaatgc caaacctata cttcacacgt 480 gacccattt9 cutcagtag9 t.aatggtgta acaatccact acatgcgtta caaagttaga 540 caacgtgaaa cattattctc aagattt.gta ttctcaaatc accctaaact. aattaacact '00 ccatg9t ll.ct acgaccc:ttc actaaaatta tcaatcgaag gtggagacgt atttatctac 660 aacaatgaca cat.t.agtll.gt tggtgtttct gaaaliJaactg acttacaaac agttacttta 720 ttagctaaaa acattgttgc taat,¡oaagaa t.gt.gaat.tca aacgtatt.gt tgcaatt.alt;lc 780 gttccaaaat ggacaaactt. aatgcactta gacacatggc taacaatgtt a.gacaaggac 840 aaatt.cct.at actcaccaat cgctaa.cgac gtatttaaat tctgggatta tgactt.agta 900 aacggtggag caliJaaccaca accagttgaa aacggquot;ttac ctctagaagg attattacaquot;, 960 tcaatcatta acaaaaaacc agttttaatt. cctatcgcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020 gaaat.cgaaa gagaaacaca cttcgat.ggt acaaactact tagcaattag accaggt:gtt 1080 gtaattggtt actcacgtaa cgaaaaaaca aacgctgctc ta'gaagctge aggcateaaa 1140 gttcttccat. t.ccacggtlt;la ccaattatca ttaggtatgg gt.aacgctcg ttgtatgtca 1200 atgectttat eacgtaaaga tgttaagtgg ta. 123)
lt;210gt; 286
lt;211gt; 1233 10 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 286
atgt.ctgtat ttgac:agtaa atttaaagga attcac:gt.tt attc:agaaat tggtgaatt.a 60 ºquot;quot;t.cagttc tagtt.c:acga accaggac:gc gaaattgact atat tacquot;c:c agctagacta 120 gatgaquot;ttat t;/l.ttctcagc t:atcttagaa agc:cac:gatg ctagaa4aga acacaaac:aa 180 ttcgtagcag aattaaaagc aaacgaeatc aatgt:tgt:tg aatta.a.ttga tttagttgct 240 gaaacatatg atttagcatc acaagaagct aaagataaat taatcgaaga atttttagaa 300 gactc:agaac c:agttc:t:atc &Q'aa.qaac:ac aaagtagttg taa9,,-aac:tt c:ttaaaagct 360 aaaaaaacat caagaquot;aatt quot;gt.agaaatc atgat.ggcag ggatcacquot;aa atquot;cgquot;-tttquot; 420 ggtatcgaag cquot;gatcacga attaatcott gaccca..tgc caaacctata cttcacacgt '80 gaec:catttg c:atcagtagg taatggtO'ta acaatccaet aeatgcgtta caaagttaga 540 CllllCg tgalla cllttattctc aaga tttgt.a ttctcaaatc accc:taaact aattaacact 600 cc:atggtact acgacccttc actaaaatta tcaatc!ilaa!il gtggagacgt atttatctac 660 aacllatgaca c:attagtagt tggtgtttct gaallgaac:tO' aettacaaae agttacttta 720 t t;/l.gc: tquot;-aaa ac:at.tgttgc taataaagaa tgtgaat.tca aac:gtattgt tgcaquot;-tt.aac 780 gttcc:aaaat gg,,-c:aaac:tt aatgc:aett.a gac:ac:at.ggc: taac:aatgtt. agaeaaggae 840 aaatt cetat actcaccaat cgctaaegac gtattt.aaat. t.ctgggatta tgaettagta .00 aacggt99quot;-9 cagaaccaca accagttgaa aac9gllttac ctct.agaagg atcatt.aCquot;-4 960 tcaatcat.ta ac:aaaaaacc agtttt.aatt cctatc:gcag gtgaaggtgc ttcacaaatg 1020 gaaatcgaaa gagaaacaca cttcgatggt ac:aaactact. tagco!llaccag accIIggtgtt 1080 I1taattggtt ac:tcac'illt.aa cgaaaaaaca aac:gccllctc t.agaagctgc agg'cattaaa 1140 gtCcttccat t.c:cacggtaa ccaattatca. ttaggtatgg gtaacgc:tCg ttgtatgtca 1200 atgcctttat cquot;-cgCquot;-4quot;,ga tgctquot;,agcgg t·O 1233
lt;210gt; 287
lt;211gt; 390
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 287
atggctc999 gctcgctgcg ccggttgetg cggctcc:tcg tgc:tggggct ctggctggcg 60 t tgc:tqcoct Cc:gtg9ccgg ggagcaagcg CCaggcacc:g ceccctQct.C Ccgcggeagc 120
ccctggagcg cggacetgga caagtgeatg gactgcgcgt cttgcaggge gegaccgcae 180 agcgact.tct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc cctt.ccggct gctt.tggcec 240 atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg cCttttggtc 300 tggagacgat gecgcaggag agagaagttc accaccccc:a t.agaggagae cO'9cg9quot;-gag 360 ggctgcccag ctgtggCgct gatccagt.ga quot;0
10 lt;210gt; 288
lt;211gt; 1494
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 288
gcc:cgcccct gc:a.tccccaa aagcctcggc cac:agctcgg t.ggtgtgtgt ctgcaat.gcc 60 acatact.gt.g ac:tcc:tttga eccc:ccgacc tttc:ctgc:cc ttggtac:ct.t cagcc:gct.at 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaateac 180 ac:gggcacag gcctgctact gaceetgc41l c:c:agaacaga agttcc:agaa agtgaaggga 240 tttggagggg cc:atgaeaga tgctgctgct ct.c:aacatcc: ttgccctgt c acc:ccctgcc 300 e,,-aquot;-a t t tgc: tact.taaat:c gt.actt.ctet. gaagaaggaa tcggatataa cateatc:c:gg 360 gtacc:cat.gg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctquot;-tgcaga cacccctgat 420 gatttcc:agt tgcacaactt. cagcctccc:a gaggaagata ccall9'ctcaa gatac:ecc:tg .80 attc:quot;c:cgag cc:etgcagtt ggeeeagegt ceegtt.tcae tec:ttgccag cccctggaea 510 tcacccact.t ggctcaagac caatggagc:g gtgaatggga aggggtcac:t caagggacag 600 cecggagac:a tct.accacc:a gacctgggcc: agatacttt.g tgaagtt.cct. ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ct.gggcagtg acagct.gaaa atgagcctt.c: tgc:tgggctg 720 ttgquot;gtggat accce ttcca gtgect999c ttcquot;cc:cctg quot; aeatcagcg agacttcatt 780 gccc:gtgac:c tagg-tcctac cctc:gccaac agt.actcacc acaatgtcc:g ectact.catg quot;O etggatgac:c aacgctt.gct gctgccccac tgggcaaagg tggt.actgac agacccagaa .00 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta c:attggtquot;-cc: tggactttet. ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acacc9'cet.g t.tccccaaca ccatgc:tctt tgc:ct.cagag 1020 gcct:gtlt;;jtgg gctccaagtt ctgQ'gagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gc:cacagc:ac catcacgaac: ctcctgtacc atgtggtc:gg ctggaecgac 1140 tggaaec:ttg c:cetgaaccc cgaaggagga cecaat.tggg tgc:gtaactt tgtcgacagt 1200 cc:catcattg t.ag,,-catcac: c:aaggacacg ttttac:aaac agcccat.gt.t et.accacctt 1260 Q'Qccacttc:a gcaagtteat tcctgagggc tcc:eagagag t9g9getO'ot. tgecagteag 1320 ,,-agaacgacc tggac:gc,,-gt g9cactgquot;-tg c:atccc:gatg gctctgc:tgt. tgtggtcgcg 1380 etaaaccgct c:ctc:t.aagga. tgtgcc:tett. accatc:aagg atcct.gct.gt gggcttcct.g 1440 gagac:aatct c:,,-ec:tggcta ct.ccattcac acct.acctgt ggcatc:gcea gtga 1494
lt;210gt; 289
lt;211gt; 1494
lt;212gt; ONA lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 289
gcccgcccc:t gcatccctaa aagcttcggc t acagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtaectt cagccgctat. 120 g/lOgagtac/lOc gca'Olt.gggcg acgg/lOtgga.g ctgagtatgg ggCCC/lOtcC/lO ggc:taat.cac quot;0 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccogaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggaQggg ccatgacaga tgCtgctgct ctcaacat.cc tegcccegtc accccctgcc 300 ca88atttgc tactt...aatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatat aa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtgo, cttctccatc cgcacctaca cctatgcago. cacccctgat lt;20 gatttccagt. tgcacaactt cllgcct.ccca gaggaagata ccaagctcaa g-atacccctg 480 attcac:cgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag c.ccctqgaca 540 tC/lOcccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggdgaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct. ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagt.t ctgggcagtg «cagctg...aa a t.gagcct.t.c tgctgggctg no ttgageggat accccttcca. gtgcctgggc tecaccC:Ct9 aac:atcagcg agactecatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctc:qc:caac agtactcacc ac:aatgtccg cctactcatg '40 ctgga t gacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtquot;'ctgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccacce tllggggagac acaccgcctg ttccccaacquot;, c:catgctctt tgcctcagag 1020
gcctgtgtgg gctccaagtt ct99g8gcag quot;,gtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 at9cagtaca gccac&.gcat catcacgaac ctc:ctgtacc atgt99tc99 ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaacc:c cgaaggagga ccc:aat.eggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tag8catcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag t9999lt;:t991; tgcc:agtcag 1320 aagaacgacc: tggacgcagt ggcactgatg catcc:cgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctetaagga tgtgcctctt accatcllagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gaga¡;aatct cacctggcta ctccattca c acc:tacctgt ggcatcgcca gtga 1194
lt;210gt; 290
lt;211gt; 1494
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 290 gcccgcccct gcatccctaa aag¡;ttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgc:aatgc:c: 60 acatactgtg actc¡;tttc¡a Cccc¡;cgacc tttcctgccc ttggtllcctt cag¡;cgctat 120 gagagtacac gcaotgggcg acggatggag ctgagtatg9 ggc:c:catcca 9gctaatcac: ,.0 acgggctlcag gect.gctact gacc:c:tgcag ccagaac:aga agttccagaa IIIgtgaaggga 240 tttggagggg cc.atgacac¡a tgctgctgct ctC:aacatcc ttgccc:tgtc accccctgcc JOO caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg c¡;agctgtga cttctc:catc cgcacctaca cctatgcaga cacccc:tgat 420 gatttc::cagt tgcllcaac:t t c«gc¡;tccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 4.0 attcaccgag c¡;cegcagt t ggc:ccagc:gt cc:cgtttcac: tcc:ttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggc:tcaa.gac caat'iHJft'íl'cg gtgaatg'íl'ga ag'íl'ggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gac¡;tgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcct at 660 gc tgagcac:a agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat Ilccccttcca gtgcc:tgggc ttcaccc:ctg aacatcagcg 5gacttcatt 7.0 gc:ccgtgacc taggt¡;ctac cctcgccaac agtactcac:c acaatgt::ccg cct.actcatg 840 ctggatgac¡; aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtacegac agac¡;cagaa 900 gcagcta.:sat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactt.tct ggctccagcc 960 a aagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gc:ctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagc:at ¡;at¡;acgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaacc:ttg ccctgaaccc ¡;gaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtc:gacagt 1200 cccatcattg tagacateae caaggacacg ttttacaaac agcccat.gtt cta¡;cacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgllg99c tcccagagag t9gg9ceggl: tgccagtc:ag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg Clt;ltcccgatg gct¡;tgctgt tgeggtcgtg 1380 ct.llaaccgct cctctaagga tgtgc:ctctt accatcllagg aecctgctgt. gggcttcctg 1440 gagacaatct cacc:tggcta ctccattcac acctacctgt ggcatcgcca gega 1494
lt;210gt; 291
lt;211 gt; 1494
lt;212gt; ONA 15 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 291
gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc: taclIgctcgg tggtgtgtgt ct.gcaat.gcc ,O acatactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgCCC: ttggtacctt cagccgctat 120 g3ga9 tacac gcagt.9!J9c9 acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctlllat.cac 180 acgggclllcag gcctgctact yaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 ttt9gagggg c:catgacaga tgctgctgct ctcllaCatCC ttgccctgtc accccctgcc 300 caaquot;quot;tttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa c;e¡.t.c;e¡.t.ccgg 360 gt;e¡.cccatgg ccagctgtgs ct.tct.ccatc cgcacctaca cct.atgCllga cacccctg;e¡.t 420 gatt.tccagt. tgcacaactt c;e¡.gcctccca gquot;gg;e¡.agat.a ccaagctcaa gatacccctg 480 a t tcaccgag ccctgcagt.t ggc:c:c:agcgt cccgtt tcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccact.t ggc t caagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag '00 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca Ilgttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atqagccttc tgctgggctg 720 ttll'agtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac: cctcgccaac agtactcacc IIcaatgtccg cctact.cat.g 840
ctggat gacc aacgctt.gct. gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagct.aaat atgttcatgg cllttgctgtll clltt.9'gtacc tggactttct gIJctcc:agcc 960 aaagecaccc taggg9a911C acaccgcctg ttccceaquot;-ca ccatgctctt. t.9cctCquot;gquot;g 1020 gcctc¡tgtgg gctccllagtt ctgggllgcag a9t9t9c99c t aggctcctg ggatcgaggg 1 080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtllcc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgllaccc cgaagIJaIJ9a cccallttgIJg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggc:cacttca gcaagttcat lcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgcclt;lgtcag 1320 aagaacgacc tggquot;cgcagt ggcactgat:.g catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacct.gt ggcatcgcca gtga 1494
lt;210gt; 292 5 lt;211gt; 156
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 292
taccgccaga gcatglllaCall cttccllgggc ctccggagct ttggctgccg cttcggg8Cg ,O tgcacggtac ag.!lac¡ct.c¡gc acaCC3c¡atc tac(:llIgttca C/lgataagga caaggacaac 120 gtcgccccca ggagcaagat cagcccccac¡ ggctac 156
10 lt;210gt; 293
lt;211gt; 156
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 293
taccgccaga gcatgaacaa cttccagggc ctccggagct ttggctgccg cttcgggacg ,o tgcacggtgc Ilgaagctggc acaccagatc tacca.gttca cagataagga c:aaggaca.ac 120 gtcgccccca ggagcaagat cagcccccag ggctac 156
lt;210gt; 294
lt;211gt; 156
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
20 lt;400gt; 294 taccgccaga gcatgaacaa cttccagggc ctccggagct t tggctgccg cttcgggllcg ,O tgcacggtgc agaagctggc acaccagatc taccagttca cagataagga caaggacaac 120 9tc9ccccca ggagcaagat cagccccclllg ggctac 156
lt;210gt; 295
lt;211gt; 156
lt;212gt; ONA 25 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 295
taccgccaga gcatgaacall cttccagggc ctccggagct ttggc:tgcc:g c:ttcgggacg ,O tgcacggtgc agaagctggc acaccagatc taccac¡ttca cagataagga caaggacaac 120 gtcgccccca gc¡agcaagat cagcccccag ggctac 156
lt;210gt; 296
lt;211gt; 438 30 lt;212gt; ONA lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 296
atgOlactcac t.ggtttctt.g gcagctactg cttttcctct gtgccaccca ctt.tggggag 60 ccattagaaa aggt.ggcctc tgtggggaat tctagaccca ca99ccagca gctagaatcc 120 Ctgggcctcc t.ggcccccgg gg'agcagagc ct.gccgtgca ccgagaggaa gccagctgct. 180
actgccaggc tgagccgtcg ggggacctcg ctgtccccgC cccccgagag c:tccgggagc 240 ccccagcagc cgggcctgt.c cgccccccac agccgccaga tccccgcacc ccaggQ'cgcg 300 gtgctqgtgc agcgggagaa ggacctgccg aactacaact ggaactcctt. cqgcctgcgc 360 ttcggcaar;zc gggaggcggc accagggaac cacggcagaa gcgctgggc:.g gggctggggc 420 gcagg t gcgg ggcagtga 438
5 lt;210gt; 297
lt;211gt; 438
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 297
atgaactcac tggtttcttg gcagctact.g cttttcctct gtgccaccca ctttggggag 60 ccattogOlaa aggtggcctc t9tg9ggaat tctagaccca caggccagca gctllgaatcc 120 ctgggcctcc tqgcccccgg ggagcagagc ctgccgtgca ccgagaggoa !jJccagctgct 180 actgccaggc tgagccgtcg ggggacctcg ctgtccccgc cccccgagag ctccgggagc 240 ccccagcagc cgggcctgtc cgccccccac agccgccaga tccccgc acc ccagggcgcg 300 gtgctggtgc ag'cgggagaa ggacctgccg aactacaact ggaactcctt cggc:ctgcgc 360 ttcggcaagc gggaggc:ggc accagggaac cacggcagaa gcgctgggcg gggctggggc 420 gcaggtgcgg ggcagtga 438
lt;210gt; 298
lt;211 gt; 1041
lt;212gt; ONA 15 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 298
atggctcggc ctgggclIgcg ttggctcggc aagtggcttg tggcgatggt cgtgtgggcg .. ctgtgccggc tcgccacllcc gctggccllag aacctggllQC ccgtatc:ctg gagctccctc 120 aaccccaagt tcctgagtgg gaagggcttg gtgatctatc cgaaaatt.gg agacaagct.g 180 gacatcatct gcccccgagc agaagcaggg cgg(;cctatg' agtac-tacaa gctgtacctg 240 gtgcggcctg agcaggcagc tgcctgtagc acagttctcg accccaacgt gttggtcllcc 300 tgcaataQ9c cagagcagga a,atacgcttt accatcaagt tccaggagtt cagccccaac 360 tacatgggcc tggagttcaa gaagcaccat gattactaca ttllcctcaac atccaatgga 420 agcctggagg ggctggaaaa ccgggllgggc ggtgtgtgcc gcaca cgc.!!lc c.!!ltgllagatc 480 atcatgaagg ttgggcaaga tcccaatgct gtgacgcctg agcagctgac t.accagcagg 540 ccclIgcaagg aggcalt;¡acaa CII(;tgtcaag atggccacac aggcccctlt;¡g tagtcggggc 600 tccctgggtg actctgatgg caagcatgag actgtgaacc aggaagagaa gagtggccca 660 9gtgcaagtg ggggcagcag cggggaccct gat ggcttct t caactccaa ggtglt;¡cattg no tt.cgcggctg tcggtgccgg ttgcgtcaec ttcctgctca t cat.catctt cctgacggtc quot;O ctactactgquot;, agctacgcaa gcggcaccgc aagcacacac a.gcagcgggc ggctgccctc 640 tcgctcagta ccctgc;ccag tcccaagggg ggcagtggca cagcgggcac cgagcccagc 900 gacat:catca ctcccttacg gactacagag aacaactact gcccccacto tgagaaggtg 960 agtggggact acgggcaccc tgtctacatc gtccallgaga tgccgcccca gagc:ccggcg 1020 aacatctact acaaggtceg • 1041
lt;210gt; 299
lt;211 gt; 1041 20 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 299
atggctcggc ctgggcaogcg ttggctcggc aagtggcttg tggcg-atggt cgtgtgggcg 60 ctgtgccggc tcgccacacc gctggccai1g aacctggagc cegtatcctg gagctccctc 120 aaccccaagt tcctgagtgg gaagggcttg gtgatct.atc cgaaaattgg aogacaagctg lBO gacatcatc:t gcccccgagc agllagca'1gg cggccctatg agt.actacaa gctgtacctg 240 gtgcggcctg agcaggcagc tgc:ctgtagc Acagttctcg accccaacgt gtt ggtcacc 300 tgcaa t aggc cagagcagga aatacgcttt accatcaagt tccaggagtt cagccccaac 300 tllclltgggcc tggagttcaa gaagcaccat gattactace. ttacctcaac atccaatggo. 420 agcctggagg ggc tggaaaa c:cgggagggc 99't9t9tgcc gcacacgcac cat gaagatc 480 a t catgaagg ttg9gcaaga tcccalltgct QtgacI;Jcctg agcagctgac taccagcagg 540
cccagcaagg aggcagaca8 cactgtcaag atgQccacac a9g-cccctgg tagtcggggc 600 tccct99gt9 actctgatgg caagcatglllg actgtgaacc aggaagagaa gagtggccca
quot;O
ggtgcaagtg 99g9cagcag cggggaccct gatggcttct tcaactccaa ggtggcattg 120 ttcgcggctg tcggtgccgg ttgcgtcatc ttcctgctca tcatcatctt c:ctgacqgtc 780 ctac:tactga agctacgcaa gcggcacc9'C lIquot;gclIcac:ac egcagcgggc ggctgccctc 840 tcgctc:agta ccctggccag tcccaagg'ji'i ggcagtggca cagc999caC C'1agc:cca'iC '00 gacatcatca ttcccttacg gactacagag a.!:llc.!:llactact gccccc:acta tgagaaggtg 960 agtggggac:t acgggcaccc tgt ctacatc gtccaagaga tgccgcccca gagcccggcg 1020 aacatctact acaaggtctg a 1041
lt;210gt; 300
lt;211gt; 390
lt;212gt; DNA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 300
atggctcggg gCtcgctgcg ccggttgctg cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg 60 ttgctgcgct ccgtggccgg 9ga9caagcg ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc 120 tcctggagcg cggacctgga caagtgcatg gactgcgcgt cttgcagggc gcgaccgcac lBO agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct 9c:ttt 9gccc 240 atccttgggg gcgctctgag cctgacct.te gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300 tggagac9at 9cc9clt;l.99ag agagaagttc accaecccca tagaggagac cggcggagag 360 ggctgccc.ag ctgtggcgct gatccagtga 3gt;0
lt;210gt; 301
lt;211gt; 741 10 lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 301
at.gctgcgtc ggcggggcag ccctlt;¡lt;Jcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60 ctgtyqttct gcctcacallg agccctgga.g gtccallgtcc ctgaagaccc agtllgtggca 120 ctggtgggcCl ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctg9 cttcagcctg 180 geaeagctca acctcatc:tg gcagctgaca gacaccaaac agetggtgca cagctttgct 240 g¿llgggccagg accagggcag cgcc:tatgcc aacegc¿llcgg ccetcttcct ggacctgctg 300 gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggC8gcttc 360 8cctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420 ccctac tcga agcccagcat ga.ccctggag cccaacaagg acctgcggcc agg9gacac9 4'0 gtga ccatca cgtgctccag ctaccggggc taccctgagll ctgaggtgtt ctggcaggat 540 gquot;ggcagggtg tgcccc:tgac tggcaacgtg acca.cgtcgc a.gatggccaa cgagc8999c 600 ttgtttgatg tgcacagcgt cctgcgggtg gtgct999t 9 cgaatggcac ctacagctgc 660 ctggtgcgca accccg tgct gcagcaggat gcgcacggct ctgtcaccat cacagggcag 720 cctatgacat tccccccaga 9 74'
lt;210gt; 302 15 lt;211gt; 1041
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 302
atggctcO'gc ct999C8.O'C9 ttggctcggc aagtggcttg tggcgatggt cgtgtgggcg 60 Ctgtgccggc tcgcca.cacc gCl:ggCClUI'1 aacctggagc ccgtat cctg gagctccctc 120 a.accccaagt tcctgagtgg gaagggcttg gtgatctatc egaaaattgg agacaagctg '80 gac.atcatct gccCCCg8gC ao¡aao¡ca999 cggccctotg agtactac.aa gctg-tacctg '40 gtgcggcctg agcaQO'cagc: t gcctgtagc acagttctcg accccaacgt gtt.ggtc8cC 300 tgcaataggc cagagcoggo aatacgct.tt accatcaagt tccaggagtt cagccccaac 360 tacatgggcc tggag-ttcaa gaagcllccat gattactaca ttacctcaac ,¡)tccaatgga 420 agcct99a 99 ggctggaaaa ccgggagggc g-gtgtgtgcc geacacgcac catgaagat:c .80 atcat...aagg ttgggcaaga tcccaatgct gtgacgcctg a.gcagctO'ac taccagcagg 540 cccagcaagg aggca';¡3caa cactgtcaag atggccacac aggcccctgg tagtcggggc 600 tccct.gggtg actctgatgg caageatgag actgtgaacc a9O'aaga9aa gagtggccca 660
20 gqtgcaagtg gqgqcagcag cggggacect gatggcttct tcaactccaa ggtggcattg 720 ttcgcggctg tcggtgccgg ttgcgtc:atc ttcctgctca tcatcatctt cctgacggtc 780 ctactactga agctacgcaa gcgqcaccgc aagcac.ac.ac agcagcgggc ggctgccctc 840 tC9ctcagta ccctO'gccag tcccaagggg ggcagtggca cagcgggcac cgagcccagc 900 gacatCatc~ ttcccttacO' O'a ctacagag aac:aactact gcccccacta tgagaaggtg 960 agtgqggact acgO'gcaccc tgtctacatc gtccaagaga tgccgcccca 9 a gcccg9c9 1020 aacatctact acaaggtctg a 1041
lt;210gt; 303
lt;211 gt; 1041 lt;212gt; ONA
lt;213gt; Hamo sapiens
lt;400gt; 303
o.tggctcggc ctgggcagcg ttggctcggc aagtggcttg tggcgatggt cgtgtgggcg 60 ct:gtgccggc tcgccacacc gctggccaag aacctggagc ccgtatcctg g.uJ'ctccctc 120 aaccccaagt tcctgagtgg gaagggcttg gtgatctatc cgaaaattgg agacaagctg 1SO gacatcatct gcccccgagc agaagcaggg cggccctatg agtacto.caa gctgtacctg 240 gtgcggcctg agcaggcagc tgcctgtagc acagttctcg accccaacgt gttggtcacc 300 tgcaataggc cagagcagga aatacgcttt accatcaagt tccaggagtt cagccccaac 360 tacatgg9cc tggagttcaa gaagcaccat gattactaca ttacctcallc atccaatgga 420 agcctggagg ggctggaaaa ccgggagggc ggtgtgtgcc gcacacgcac catgaagatc 4.0 atcatgaagg ttgggcaaga tcccaatgct gtgacgcctg agcagctgac taccagcagg 540 cccagcaagg aggcagacaa cactgtC.lélg litggccacac aggcccctgg tagtcggggc 600 tccctgggtg actctgatgg caagcatgag actgtgaacc a9g309a9aa gagtggccca 660 ggtgcaagtg ggggcagcag cggggaccct gatggcttct tcaactccaa ggtggcattg 720 ttcgcggctg tcggtgccgg ttgcgtcatc ttcctgctca tcatcatctt cctgacggtc 780 ctactactga agctacgcaa gcggcaccgc aagCBcacac agcagcg99c ggctgccctc '40 tc:gctcagta ccctggc:cag tcccaagggg ggcagtggc:a cagcgggcac cgegc:c:c:agc '00 gacatcatca ttcccttacq gactacagag aacaactact gcccccacta tgagaaggtg quot;O agt9gg98ct acgggcaccc tgtctacatc gtccaagBga tgccgcccctl. 90.9ccc9gcg 1020 aacatctact tl.ca tl.ggtctg ti. 1041
5 lt;210gt; 304
lt;211 gt; 960
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Pan troglodytes
lt;220gt; 10 lt;221 gt; diferencia mise
lt;222gt; (88) a (90)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
lt;400gt; 304
at,gcctgtgt tttcattgca gaatgatgag gtggagtttg tccgaactgg ctatgggaag 60 gatatagtaa aagttc:tc:ca tattcagcga gatggaaaat atcacagca t taaagl!lggtg 120 gcaac:ttcag tgc:atl.cttac tctaagttcc aaaaaagatt acctgcatgg agataillt.tca lBO gacat.c:atcc ctacagacac catcaagaac aC:lt;lgttcatg tcttggcaaa gtttaaagaá 240 aatgaaccag caaacatagll tggggcto.tg gaaaaagcat tttgtttctt tttactl.tl.atc JOO aaaagcatag aagcctttgg tgtgaatatt tgtgagcatt ttctttcttc ttttaaccat 360 gtaatc:cgag ctcaagtcta tgtggaagaa atcccttgga agc:atcttga aaagaatgga 420 gttaagcatg tccatqcatt tattcacact cccactqgaa cacacttc:gg tgaagttgaa 4.0 cagc:tg.e.gaa gtggacccc:a .e.quot;tc:attcat tctggaatca aagacctcaa gctcttgaaa 540 acaacacagt ctggat.ttga aggtttc:atc aaggaccagt tcactac:cct ccctgaggtt 600 tttaaatgca tgatgagaac: gttac:ctcag tcttctttcc ctttatttca agtgctctcc quot;O atgQlt;;Icalt;;lca gcctgatgga cac:cattcgg c¡accttQ'tca tgQagaaatc tgctgggccc 720 't.atgacaaag atljjJiIlatactc quot;ccctctgtg cagaagaccc tc:tgtgatat ccaggtgct.c 790 tccctgagc:c gagttcctgc gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa cattcactac .40 ttcaacatag acatgt.c:caa aatgggtctg atcaacaagg aagaggtctt gctgccatl:a '00 gacaatccat atggaaaaat t.actggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactgtga quot;O
15 lt;210gt; 305
lt;211 gt; 960
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Pan troglodytes
lt;220gt; 20 lt;221gt; diferencia_mise
lt;222gt; (88) a (90)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
lt;400gt; 305
atgcctgtgt tttcatl:gca gaatgatgag gl:ggaqUtg tccgaactgg ctal:gggaag 60 gatatagtaa 88gttctcca ta.ttcagcga gatggllllaat atcacagcat taaagaggtg 120 gcaacttcag tgcaact-tac tctaagttcc aaaaaagatt acctgcatgg agataattca 180 gacatcatcc ctacaqacac catcaaqaac acagttcatg tcttggcaaa gtttaaagaa 240 aatgaaccag caaacataga tggggctatg gaaaaagcat tttgtttctt t..ttacaaatc 300 aaaagcatag aagcctt..tgg tgtgaatal:t tgtgagcatt ttctttcttc t-tttaaccat
quot;O
gtaatccgag ctcaagt..cta tgtggaagaa atcccttgga agcatcttga. aaaaaatgga 420 gttaagcatg tccatgcatt tattca.cact cccactggaa cacacttcgg tgaagttgaa 480 cagctgagaa gtggacccca agtcattcat tctggaatca aagacctcaa gctcttgaaa 540 acaacacagt ctggatttga aggtttc:atc aaggaccagt tcac:tacc:c:t ccctgaggtt 600 tttaaatgca tgatgagaac gttacctcag tcttctttcc ctttatttca agtgc:tctCc 660 atgggeagca gcetgat..gga caccattcgg gaccttgtca tggagaaatc tgctgggccc
12'
tatgaellae.g atgaatacte gccctctgtg cagaagaccc tctgtgatat ccaggtgctc 780 tccctgagcc gagttcctgc gatagaagat atggaaat-ca gcctgccaaa cattcactac 040 ttcaacatag acatgtccaa aatgggtctg atca.acaagg aagaggtctt gctgccatta 900 gac8atecat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga aattgtcttc aagactgtga 960
lt;210gt; 306
lt;211gt; 1186
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Hamo sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; diferencia mise
lt;222gt; (310) a (312)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
10 lt;220gt;
lt;221gt; diferencia mise
lt;222gt; (829) a (831)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
lt;220gt; 15 lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (1186) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;400gt; 306 atgga.gaaat tcatttogta cetggtgcat ttgtacactg aaa.tgaccaa gtettctccc 60 tcctgccgcc tcgtggc:tag ttgtcagacc gtggcaaaag 8actggggga gaacagcctc 120 g9ttatggtc caggccat.ta tctgctcttt gggtgeaggg Cltgcttttgg gtgtcccatg 180 ccaggetcgt.. tccacctgct ecaggatcag atgattggtt cccttcatac agaetcattg 240 ccaaatgatg aggtg9agtt tgtccgaact ggctatggga aggaaatggt aaaagttctc 300 catattcagc gagatggaaa atatcacagc attaaaoagg tggcaacttc aogtgcaactt 360 actCtaagtt ccaaaaaaga ttacctgcat ogagataatt cagacatcat ccctacagac 420 accatcaaga acacagttca tgtcttggca aagtttaaag aaaatgllccc lIIQcallacata 480 gatggggc:ta tggaaaaagc attttgtttc t.ttttacaaa tcaaaagcat agaagccttt 540 ggtgt9a8t8 tttgtgaoca ttttctttct tlt;::ttttaalt;::lt;:: at9taatccg agctc8Sgtc 600 l:acat09aag aaatcccttg gaagcatctt 9gaaagaatg gi:lgttaagca tgtecatgca 660 tttattcaca ctcccac:t.gg aacacaettc tgtgaagttg aaC8gctgag aagtggaccc 720 20 caagtcattc attctggaat caaagacct.c aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt 780 gaaggtttca tcaaggacca gttcactacc ctccctgagg tgaaggaccg atqctttgcc 840 acccaagtgt actgcaagtg gcgctaccac eagtgcaggg atgtggactt caaggctacc 900 tgggacacca ttcgggacct tgtcatggag aaatctgctg ggccctatga caaaggtgaa 960 tacttgacct ctgtgcagaa gacectctgt gate.tccagg tgctctccct gagccgagtt 1020 cctgcgatag aagatatgga aatcaqcct9 ccaaacatt::c actacttcaa catagacatg 1080 tccaaaatgg gtctgat-caa caaggaagag gtctl:gctgc cattagacaa tccatatgga 1140 aaaattactg gtacagtcaa gaogaagttg tcttcaagae tgtgan 1186
lt;210gt; 307 lt;211gt;1186
lt;212gt; ONA 25 lt;213gt; Hamo sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; diferencia_mise
lt;222gt; (310) a (312)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
30 lt;220gt; lt;221gt; diferencia_mise
lt;222gt; (829) a (831)
lt;223gt; Codón naturalde parada reemplazado por Arg
lt;220> 5 lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (1186) lt;223gt;n=a, t, goc
lt;400gt; 307 at9gagaaat tcatttggta cctggtgca.t t:tqte.ce.ctg ae.at gaccaa gtcttctccc 60 tcctgccqcc tcgtggctag ttgtcagacc gtg'1caaaag aactggg9ga gaacagcctc 120 9gttatggtc caggccatta tctgctcttt 99gt9ca9gg atgcttttgg gtgtcccat'1 180 ccaggctt'1t tccacctgct ccaggat.cag at.gatt.ggt.t cccttcatac agactcattg 2lt;0 ccaaatgatg aggtggagtt tgtccgaact '1gctatgg9a aggaaatggt aaaagttctc 300 catattcagc gagatgqaaa atatcacagc attaaaqagg tggcaacttc agtgcaact t 360 actctaagtt ccaaaaaaga ttacctgcat ggagataat.t cagacatcat ccctacagac 420 a.ccatcaaga acacagttca tgtcttggca aagtttaaag aaaatgaccc agcae.acata 480 gatggQ\1cta tggaaaaagc attttgtt.tc tttttacaaa tcaaaagcat agaagccttt 5lt;0 ggtgtgaata tttgtgagca ttttctttct tcttttaa.cc atgta.atccg agctcaagtc 600 tacatggaag aaatcccttg gaagcatctt ggaaagalltg ga'1ttaagca tgtccatgca 660 tttattcaca ctcccactgg aacacacttc tgtgaagttg aa.ca.gctgag aagtggaccc 720 caa'1tcattc attctggaat caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt 780 gaaggtttca tcaaggacca gttcactacc ctccctgagg tgaagg9ccg atgctttgcc 840 8CCCquot;a.gtgt actgca8.gtg gcgctaccac cagtgcagg'1 at'1tgga.ctt caaggctacc 900 tgggacacca ttcgggacet tgtcat.ggag aaat.ctgctg ggccctlltga caaaggtgaa 960 tacttgacct ctgtgcagaa gaccctc:.gt gatatccagg tgctctccct gagccgagtt ~O20 cct.gcgatag aagat8tg9a aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa catagacatg l.0&0 tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga 1140 aaaatt.actg gtacagteaa gaggaagttg tcttcaagac tgtgan 1186
10 lt;210gt; 308
lt;211gt; 927
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Papio hamadryas
lt;220gt; 15 lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (927) lt;223gt;n =a,t, goc
lt;400gt; 308 atggccgact acc:atailcaa c:tat aaaaag aatgatgaat tggagtttgt ccga.actggc 60 tatgggaagg at.atggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata tc:acagcatt 120 aaagaggtgg' cllacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta cctgcatgga 180 ga.taattcag atatcatccc tac:agacacc atcaagaaca cagttcatgt c ttggcquot;quot;ag 240 tttaagggaa tcaaaalOlcat agaagccttt 99tgtgaata tttgtgagta ttttctttct 300 tettttaacc at:gt:aat.ccg agctcailgtc tacgtg'1aag aaatcccttg gaagcgtctt 360 gaaaagaat'1 gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg aacacacttc 420 tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat caaagacctc 480 aaggtctt,ga aaacaacaca g tctggattt gaaggtttca tcaaggaCca gttcacca.cc 540 ctccctga99 tgaaggaccg atgctttOcc acccaagtgt actgcaagtg gcqctaccac 600 cagtgcaggg atgtOgactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct tgtCctggag 660 aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa gaccctctat 720 gatat'Ccagg tgctctccc:t gagccg8'1tt cctgagata'1 aagatatg'1a aatcagcctg 760 ccaaacattc actacttcaa tataglt;lcatg tccaaaatgg gtctgatc:aa caaggaagag 840 gtcttgctgc cattagac:aa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa gaggaagttg 900 tcttcaagac: tgtqac:attg tggccan 9quot;
20 lt;210gt; 309
lt;211gt; 927
lt;212gt; ONA
lt;213gt; Papio hamadryas
lt;220gt; 25 lt;221gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (927)
lt;223gt; n=a,t, goc
lt;400gt; 309
atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt ccgaactggc 60 tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggeaaata ecacagcatt 120 aaagaggtgg c:aac:ttcaqt gcaacttact ctgagt:tcca aaaaagat ta cct:gcatgga 180 gatae.ttcag atatcal:ccc tacage.cacc atcaagaaca cagttcatgt cttggcaae.g 240 ttt:aagggaa tcaaaagcat agaagcct:tt ggtgtgaata tttgtgagta ttttctetct. 300 tctttte.acc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg gae.gcgt.ctt. 360 gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca ttta.ttcaca ctcccactgg a.acaca.cttC 420 t gtgaagttg aacaacl:gag aagtggaccc cccgtcatta cttctqgaat caaag,,quot;cctc 480 aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca gttcaccacc 540 ctcccty8gg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg gcgctlt;lccac 600 cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct tgt:cctggag 660 aaatttgctg gqccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa gaccctCtat 720 gatatccagg tgct:ctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgoa aatcagcctg 780 ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag 840 gtct t.qctgc cattagacaa tccatatgga aG.8ottactg gtac::agt.caa gaggaagttg '00 tcttcaagac t.gtgacattg tggccan 927
lt;210gt; 310
lt;211gt; 1186
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;220gt;
lt;221gt; diferencia mlsc
lt;222gt; (310) a (312)
lt;223gt; Codón naturalde parada reemplazado por Arg
10 lt;220gt;
lt;221gt; diferencia mlsc
lt;222gt; (829) a (831 )
lt;223gt; Codón naturalde parada reemplazado por Arg
lt;220gt; 15 lt;221 gt; Característica miscelánea
lt;222gt; (1186)
lt;223gt;n=a, t, goc
lt;400gt; 310 atggagaaat tcatttggta cctggtgcat ttgtacactg aaatgaccaa gtcttctccc 60 tcctgccgcc tcgtggctag ttgtcagacc gtggcaaaag aactggggga gaacagcctc l20 ggttatggtc caggccatta tctgctcttt gggtgcaggg atgcttttgg gtgtcccatg l80 ccaggcttgt tccacctgct ccaggatcag atgattggtt cccttcatac agactcattg 240 ccaaatgatg aggtggagtt tgtccgaact ggctatggga aggaaatggt aaaagttctc 300 catattcagc gagatggaaa atatcacagc attaaagagg tggceecttc agtgcaactt 360 actctaagtt ccaaaaaaga ttacctgcat ggagat:aatt cagacatca.t ccctacagac 420 accatcaaga acacagttca tgtcttggca ae.gtttaaag aaaatgaccc agc8aacata 4.0 qatggggcta t.qgaaaaagc attttgtttc ttttt.acaaa tcaaaagcat agaagccttt 540 qgtgtgaata tttgtgagco ttttctttct t.cttttaacc atgtaatccg agctcaagtc 600 tacatggaag aaatcccttg gaagcatctt ggaaagaatg gagttaagca tgtccatgca 660 tt.tat tcaca CtCCC8Ctgq aacacacttc tgtgaagttg aacagctgag aagtggaccc 720 caagtcattc att.ct:ggaat caaagacctc aagqtcttga aaacaacaca gtctggattt 780 gaaggtt.tca tcaaggacca gtt.ca.cta.cc ctccct.gagg tgae.ggaccg atgctttqcc 840 acccaagt'gt;lt. actg-caagtg gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt caaggctacc 900 tgggace.cca ttc9ggacct tgtcatggag aaatctgctg ggccctatga eaaaggtgaa 960 tacttgacct ctgtgcagaa gaccctctgt gatatccagg tgctctccct gagccgaqtt 1020 cctgcgat:ag aagatatgga aatcagcctg ccaaacat:tc actacttcaa catagacatg 1080 tccaaaatgg gtctgatcaa caaggaagag gtcttgctgc cattlt;:lgacaa tccatatgga 1140 aaaattactg gtacagtcaa gaqgaagttg tcttcaagac t:gt:gan .1186
20 lt;210gt;311
lt;211 gt; 960
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Pan troglodytes
lt;220gt; 25 lt;221 gt; diferencia_mise
lt;222gt; (88) a (90)
lt;223gt; Codón naturalde parada reemplazado por Arg
lt;400gt; 311 atgcctgtgt tttcattgca gaatgatglt;llt;;¡' gtqgaqtttg tccgaactgg ctatgggaag 60
gatatagtaa aagttcccca cattcagcga gatggaaaat atcacagcat taaagaggtg 120
gcaact tcag tgcalt;!lcttac tctlt;!lagttcc aaaaaagatt acctgcatgg agataattca 180
gacatcatcc ctacagacac catcaagaac acagttcatg tcttlt;;¡,gcaaa gtttaaagaa 240
aatgaaccag caaacataga tggggctatg gaaaaagcat tttgtttctt tttacaaatc 300
aaailgcatag o.agcctttgg tlt;;¡,tgaatlt;!ltt tgtgsgcatt ttctttcttc tttta8.ccat. 360
gtaa.tccgag ctcailgtcta tgtggaagaa atcccttgga agcatcttga aaagaatgga 420
gttaagcatq tccatqcatt tattcacact cccactggaa cacacttcgg tgaagttgalt;!l '80
cagctgagaa gtggacccca agtcattcat tctggaatca Clagacctcaa gctcttgaaa 540
acaacacagt ctggatttga aggtttcatc aaggaccagt tcactaccct ccctgaggtt 600
tttaaatgca tgatgagaac gttacctcag tcttctttcc ctttatttc8 agto¡ctctcc 6quot;
atgggcagca gcctgatgga cacca.ttcgg ga.ccttgtca tggagaaatc tgctgggccc no
tatgacaaag atgaatactc gccctctgtg cagaagaccc tctgtgatat ccaggtgctc 180
tccctgagcc gagttcctgc gatagaagat atggaaatca glt;:;:ctgccaaa cattcactac 840
ttcaacatag 8.catgtcc44 aatgggtctg ate:aacaagg aagaggtctt gctgccatta .00
gacaatccat 3tgg3aaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtctte: aagactgtga .quot;
lt;210gt; 312
lt;211gt; 927
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Papio hamadryas
lt;220gt;
lt;221gt; Caracteristica miscelánea
lt;222gt; (927) lt;223gt;n=a, t,9 0c
10 lt;400gt; 312
o.tQ'gccgact accataGllcaa ctataaaaag aatgatgaat tggagttcgt ccgaactggc 60
tatggllaaQ''1 atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata tcacagcatt 120
a3ag4ggtgg c3acttcagt gC3acttact ctgagtte:ca aaaaagatta cctgcatggBl 180
gataattcag atatcatccc tacagilcacc atcaag3aca c3gttcatgt cttggcaaag 240
tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt 99tgtgaata tttgtgagta ttttCtttct 300
tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtglt;;¡,aag aaatcccttg gaagcgtctt 360
gaaaagaatg Q'agttaa.gca tgtcca.tgca tttattcilca ctcccactgg aacacacttc 420
tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat c:aaagacctc 480
aaggtcttgll aa.acaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca gttcaccacc 540
ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg gcgctaccac 600
c:agtgc8ggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct t:gtcctggag 660
aaatttgctg gge:cctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa gaccctctat 720
gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga aatcagcctg 180
ccaaacattc ilctacttcaa tatagacatg tccaaa3tg9 gtctgatcaa caaggaagag 840
gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga 3aaattactg gtacllgtcaa gaggaagttg .00
tcttcaagac tgtgac3ttg tggccan .21
lt;210gt; 313
lt;211gt; 805
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 313
Mquot;, M:n Ile Phe Tyr 11. Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val eln Gly
,
1 10
quot;
Leu Gl u His Thr His Arv Arg Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Al. His 20 25 30
Lys Sel:' Glu v.l l'.la Hia Arg 'he Ly. Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe 35 40 45
Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln 'l'yr' Leu Gln Gln Cys pro SO SS 60
Phe Glu Asp lIis Val Lys Leu va l Asn Glu val Thr ah,l phI'! Ala Lys 65 70 7S 80
Thr Cys Val Ala Asp elu Ser Ala Glu Asn Cys: Asp Lys Ser Leu Hia as 90 9S
Thr Leu Phe Gly ASP Lys Leu Cys Thr Val Ala. Thr Leu Arg Clu Thr 100 lOS 110
'l'yr Gly Glu Mquot;, Ala Asp Cys Cy. Ala Lys GIn. Glu 'ro elu Arg Asn 11S 120 12S
Glu Cyo .he Leu Gln His Lyo Asp Alip ASR Pro. Asn Leu Pro Aro Leu 130 135 140
Val Arg Pro Glu val ASO Val Met Cys Thr Ala. 'he His ASp Asn elu 145 ISO lSS 160
Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr elu Ile Ala Arg Arg His Pro 165 170 175
T'yr Phe Tyr Al. Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ahl Lys Arg Tyr Ly!! Ala 180 lB' 190
Al. Phe Thr Glu Cys Cys Gln Al. Al. 1I.sp LyiS; Ala Ala eyo Leu Leu 19' 200 205
Pro Lys Leu Asp Glu Leu Ar. As, Glu Gly LySl Ala Ser Ser Ala Lys no quot;S 220
Oln Arg Leu Lys Cys Al. Ser Leu Gln Lys PhE~ Gly Glu Arg Ala Phe 225 230 235. 240
Lys Al a Trp A.la Val Ala A.rg Lou Ser elo Arg Phe Pro Lys Ala Glu 245 250 'SS
Phe Al a Glu Val Ser Lys LeU val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr 260 265 270
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Alel Asp ASP Arg Ala Asp 275 290 295
Leu Al. Ly. 'l'yr Ile Cys Glu quot;n elo ASp Sel:~ Ile Ser Ser Lys Leu 290 295 ]00
Lya Glu CYG Cys Glu Ly. Pro Leu Leu Glu LY151 Ser His Cys I18 Al a 30S 310 3l~; 320
Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala M, Leu Pro Ser Leu Ala Ala 325 330 335
1I.sp Phe Val Glu Ser Lys Asp val eya Lys Asr. Tyr Ala Cl u Ala Lys ]lt;0 ]4S 350
Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyl~ Alquot; Arg Arg His pro 355 360 365
Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Ara Leu Alel Lys Thr Tyr Glu Thr 370 375 390
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Al a Ala ASP l'r() Hls G1u Cys Tyr Al. ]85 3$10 39!; . 00
Lys Val Pho Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Clu elu pro elo ASO Leu 405 41D 415
Ile Lys Gln Asn eys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe 420 42' lt;30
eln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Ly~, Val Pro Gln V.l Ser 43' 440 445
Thr quot;,o Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Aso Leu Gly Ly' Val Gly Ser 450 4SS 460
Lys Cys Cys Lys HJ.s ?ro elu 1\l a Lys Arg Met: Pro Cys Ala Glu Aop 465 470 47~i 480
Tyr Leu Ser Vquot;,l vel Leu Asn Gln Leu ey. Val Leu His Gl u Ly. Thr 485 490 49'
Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys Cys ey. Th,¡: Glu Ser Leu V.l Asn
500 505
Arg Arg Pro Cy. Phe Ser Ala Leu Glu val Asp clu Thr Tyr Val Pro 515 520 525
Ly. Glu Phe ....sn ....la GI\'! quot;r Phe Thr Phe HilO Al. Ao. 1quot;10 Cys Thr 530 535 540
Leu Ser Glu Lys elu Arg eln rle Lys Lys eln Thr Ala Leu Val elu 545 550 555 560
Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Tnr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val 565 570 515
Met Asp Asp Phe Ala Ala Pha Va1 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp S80 585 590
Lys Glu Thr Cy~ Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser 595 600 605
Gln Ala Ala Leu Gly Leu Phe Pro Thr Ile pro Leu Ser Arg Leu Phe 610 615 620
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp 625 630 635 640
Thr Tyr eln Glu Phe elu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys alu Gln Lys Tyr 645 650 655
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser elu Ser Ila 660 665 670
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr eln Gln LyS Ser Asn Leu Glu 67S 680 685
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 690 695 700
eln Phe Leu Ar9 Ser Val Ph. Ala Asn Ser Leu V.l Tyr Gly Ala Ser 705 710 715 720
Asp Ser Asn val Tyr quot;p Leu Leu Lys Mp LeU Glu Glu Gly ne Gln 725 7JO 735
Thr Leu Met ely Arg Leu Glu ASp Gly Ser pro Arg Thr ely eln l1e 740 745 750
Phe Lys Glo Thr Tyr Ser Lys Phe ASp Thr Aso Ser His Asn Asp Asp 755 760 765
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Glv Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Het
770 775 780
Asp Lys Val Glu Tnr Phe Leu Aro Ile Val Gln Cy$ Arg Ser Val alu 785 790 795 800
Gly Ser Cys Gly Phc 805
lt;210gt; 314
lt;211gt; 795
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 314
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10 15
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Ala Phe His Asp Asn clu Glu Thr Phe Leu Ly~; Lys Tyr Leu Tyr Glu 145 150 15$ 160
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Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu CyEI Cys eln Ala Ala ASp 180 185 190
_--_---_-_____ Glumy 1 95 200 205
Lys Ala Ser Ser Ala Lys eln Aro Leu Lys Cy!1 Ala Ser Leu Gln Lys 210 215 220
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Leu Thr Lys Val His Thr Clu Cys Cys His Gl)' Asp Leu Leu Glu Cys 260 265 270
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Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Ly$ Pro Leu Leu Clu
290 295 300
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Leu Pro Ser Leu Ala Ala ASp Phe Val Olu Sel:' Lys A9P Val Cya Ly. 325 330 335
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340 '45 350
Tyr Ala Arg Arg His pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu 355 360 365
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Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Lequot;'l Val Ar~ Tyr Thr Lys 420 425 430
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785 790 795
lt;210gt; 315
lt;211 gt; 793
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lt;400gt; 315
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Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Th.r ASP Leu Thr 245 250 255
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Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys lt;:ys Glu Lys quot;,o Leu Leu Glu Lys Ser 290 295 JOO
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Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Ty~ 325 330 335
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Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys ~sp Leu elu 705 710 715 120
Glu Gly lle Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arq 72!1 730 73S
Thr Gly Glo lle phe Lys eln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 740 745 750
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Aso Tyr Gly Leu Leu 1yr Cys Phe 755 760 765
Arg Lys Asp Met Asp Lys val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 770 775 7BO
Arg Ser val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 785 790
lt;210gt; 316 5 lt;211gt;800
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens lt;400gt; 316
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 1S
Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser .'u v.l Al. 20 2S 30
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Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu phe Ala Lys Thr Cys val Ala ASP 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Mis Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Mee Ala 100 105 110
ASP Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp ASp Asn Pr o Asn Leu pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140
ASp Val Mee Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Clu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 115
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Léu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 ~OO 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Cly Glu Arg Ala phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg phe Pro Lys Ala Gl u Phe Ala Glu Vquot; Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Aop Leu Thr Lys Val nis ThJ: Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala ASp ASP ArO Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 11e 275 2.0 2.'
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Lelol Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Lys Pro LeU Leu Glu Lys Ser His Cys rle AIC!l Clu val Glu Asn As!;gt; 305 310 315 320
Clu Met Pro Ala A~p Leu Pro Ser Leu Ala Allt;El Asp Phe Val Glu Ser 325 330 :ns
Lys ASp Val Cys Lys Asn 'l'Yr Ala Glu Al. Ly~\ ASp Val phe L.u Gly
340. 34. 350
Me, Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala quot;. Ar. Mis Prc) Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
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Cys Ala Ala Ala ASp Pro Mis Clu Cys Tyr Lys Val Phe Asp Glu 3•• 390 400
Phe Lys Pro Leu Val Clu Glu Pro Cln Asn Leu Ile Lys Cln A:!ln Cys
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Ser Ala Leu Clu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Olu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe lIis Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln r 1e Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Gl\:L Leu Val Lys Hitgt; Lys SSO 560
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Pro Lys Ala. Thr Ly. Glu Gln Leu Lys Ala Val. Met Asp Asp Phe Al. S6S 570 S7S
Ala Phe val .'u L., Cys Cys Lys Ala AsO Asp Lys Glu Thr Cy. quot;he SSO SSS 590
Ala Glu .'u .'y Lys Lys Leu Val Al. Ala Ser Gln Al. Al. Ll:!u Gly 595 600 60S
Leu Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu 610 615 620
Aro Ala Mis Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr G1n G1u Phe 625 630 635 640
Glu Glu Ala Tyr 11e Pro Lys Glu eln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn 645 650 655
Pro Gln Thr Ser Leu Cys phe Ser Glu Ser l1e Pro Thr Pro Ser Asn 660 665 670
Arg Glu elu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu elu Leu Leu Arg l le Ser 675 680 6aS
Leu Leu Leu 11e Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 690 695 700
val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr ely Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 70S 710 715 720
Asp Leu Leu Lys ~p Leu elu elu e ly Ile Gln Thr Leu Het Gly Arg 725 730 735
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly eln lle Phe Lys Gln Thr Tyr 740 745 750
Ser Lys PhI:! Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 7SS 760 765
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys phe Arg Lys ASP Met ASp Lys val Clu Thr 7 70 775 780
Phe Leu Arg lle val G1n Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly PhI:! 785 790 79; 800
lt;210gt; 317
lt;211gt; 774
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 317
Met Lys Trp Val Ser Phe 11e Ser Leu Leu Phe Leu Pne Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys ASp Leu Gly Glu Glu Asn phc Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
11e Alo Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Prc, Ph. Glu Asp His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys: Thr Cys Val Ala 's. 65 70 7S, SO
G1u Ser AID Glu Asn Cy. Asp Lys Ser Leu HiJ9' Thr Leu phe G1y Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr' Tyr Gly Glu Mer Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu pro Gl u Arg Asru alu Cys Phe Leu eln 115 120 125
u is Lys As. ASp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Le1,;l Val Ar. Pro Glu Val
130 135 quot;O
AS. Vs1 Mcr Cys Thr Ala Ph. His Asp 1\sn Glu G1u Thr Phe Leu Ly. 145 150 155. 160
Lys 'lYr Leu Tyr G1u 11e Ala Arg Ar9 quot;quot; Prc, 'lYr Pnc 'I'yr A,quot; Pro quot;5
170 175
Glu Leu Leu Ph. Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Alo Alip Lys Ala A1s Cy, Leu LelJl Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Ar9 quot;o Glu Gly Lys Al. Ser Ser Ala Ly~~ Gln Ar. Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala PhE! Lys I\.la Trp Ala Val 225 230 235 240
Ala Ar9 Leu Ser Gln Ar9 Phe Pro Lys Als Glu Phe Ala Gl\.! Val Ser 245 250 2SS
Lys Leu val Thr AsO Leu Thr Ly~ Val His Thl: Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu L,u Glu Cys Ala AsO Asp Ar. Ala Asp Leu Al. Lquot; Tyr n. 275 2SO 285
Cys G1u Asn Gln ASp Se:-ne Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 JOO
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Alal Glu val Glu Asn Asp 305 310 315; )20
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Alal Asp Phe Val Glu Ser 325 3JO 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly~' A.sp val Phc Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala J\rg ArQ His Prcl Asp Tyr Ser Val val 3SS 360 365
Leu Leu Leu 1gt;.rg Leu Al~ Lys Thr Tyr Glu Thr-Thr l.eu Glu Lys Cys 370 375 380
eys Ala Ala Ala Asp Pro His Clu Cys Tyr Alal Lys Val Phe Asp Glu 385 390 '00
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Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln ASO Leu l1e Lys Gln Aso Cys 405 410 415
Glu Leu phe Glu Cln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe, Cln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
val 1\[quot;g Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser-Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Sel:quot; Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Al.. Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser val Val quot;5
470 475 480
LeU Asn Cln Leu eyo Vd Leu His Glu Ly. 'J'hr Pro Val Ser Asp Arg .85 490 495
Val Thr Lys eys eyo Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cyo phe 500 quot;5 510
Ser Ala Leu elu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pre. Lys Olu Phe Asn Ala 515 520 525
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Pro t.ys Ala 'l'hr Lyo Glu Gln Leu Lys Ala v..l Met A.sp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val elu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser GIquot; Al. Ala Leu ely 595 600 605
Leu Cys Asp Leu pro eln Thr Hin Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 610 615 620
Meo Leu Leu Ala Gln Me' Are Arg lle Ser Lequot;;l phe Ser Cys Leu Lys 625 630 635
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ASp Arg Mis ASP Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Aso Glo Phe 645 650 655
Gln Lys Ala Glu Thr He Pro val Leu His Glu Met: He Glo 010 Ilo 660 665 670
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser AI.!!I Ala Trp As p Glu Thr
675 680 685
690 695 700
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Lya Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Ar9 Lya Tyr Phe GJ.n Arg ne Thr 725 710 7lS
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser PrO Cys Ala Trp Glu v.l V.l 740 745 750
Arg Ala Glu 11e Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 755 760 765
Ser Leu Ar9 Ser Lys Glu
lt;210gt; 318
lt;211gt; 728
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 318
Met Lys Trp Val Ser Phe 1le Ser Leu Leu phc Leu Phe Ser Ser Ala
1. 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg His Ser Asp Pro Al a Arg Arg ely 20 25 ]0
Glu Leu Ser val Cy$ Asp Ser ne Ser Glu Trp Val Thr ». Ala Asp 35 40 45
Lyo Lys Thr Ala Val Asp Mee Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu 50 55 60
Lya V.l Pro Val Ser Lya Gly Gln Leu Lys Gln Tyr I'hc Tyr Glu Thr 65 70 7S 80
Lyo Cys Asn Pro Hee Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Ar9 Gly Ile AsO .5 90
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Lys Ar9 His Tro 'an Ser Gln Cys .r. Thr Thr Gln Ser Tyr val gt;r. 100 110
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Ala Leu Thr Mee ASP Ser Lys Ly. gt;ro Ile Gly Trp gt;r. Phe Ile Jl.rg
115 120 125
He 'sp Thr Ser Cys Val Cy. Thr Leu Thr Ilc Ly. Ara Gly Ar9 ASp 130 135 140
gt;L. His Lys Ser Glu v., Al. Mis Arg Phe Lquot; quot;P Leu Gly Glu Glu 145 150 155 160
Asn Phe Lys Ala Leu Val Lequot; Ile Ala Ph. Al. Gln Tyr Leu Gln Gln 165 170 175
Cys Pro phe Glu Asp Mis Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe 180 185 190
Ala Lys Thr Cys Val Ala ASp Glu Ser Ala Glu ASO Cys ASp Lys Ser 195 200 20'
Le u His Thr Leu quot;he Gly A,quot; Lys Leu Cys 'I'hl: Val Ala Thr Leu Arg 210 215 220
Glu Thr Tyr Gly Glu Mee Ala ASP Cys Cys Al.!!l Ly. Gln Glu Pro Glu 225 230 2l~, 240
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys ASp ASp Asn Pro Asn Leu Pro 245 250 255
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met. CyC¡ 'I'hr Ala phe His Asp 260 265 270
Asn Glu Glu 'I'hr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Ty.l: Glu Ile Ala Arg Arg 275 280 285
Hi. Pro Tyr Phe Tyr Al.. Pro Glu Leu Leu Phl!:~ Phe Ala Lyo A¡;g Tyr 290 295 300
Lys Ala Al. Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Alj!l 'quot;. Lys Ala Ala Cys 305 310 31 Sgt; 320
Leu Leu pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser 325 330 335
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Glrl Lys Phe Gl y Glu Arg 340 34' 350
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser eln Arg Phe Pro Lys 360 365
Ala Glu phe Ala Glu Val Ser Lys Leu val 'I'hl: Asp Leu 'I'hr Lys Val 370 37' 380
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Lcu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg 385 390 395, 400
Ala ASP Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Glr.t ASp Ser rle Se r Ser 405 410 415
Lys Leu Lys Clu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 420 425 430
lle Ala Clu Val Clu Asn ASp Glu Met. Pro Al& Asp Leu Pro Ser Leu
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435 440 Ala Ala ASp Phe val Glu Ser Lys Asp Val Cy~ Lys Asn Tyr Ala Glu 450 455 460 Ala Lys ....sp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr· Glu 'I'yr Ala Arg Arg465 470 475. 4.0 His Pro Asp Tyr Ser Val val Leu Leu Lou Arg: Leu Ala Lys Thr Tyr
4.' 490 .95
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala. Asp Pro His Glu Cys SOO S05 '10
Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
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Asn quot;eu 11e Lys Gln Asn Cy' G1u Leu Phe olu Gln quot;cu Gly Clu Tyr
quot;O 5" gt;40
L,. phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Ly. LYlgt; val Pro Gln '45 550 'SS '60
V.1 Sér Thr Pro Thr Leu Val olu Val Ser Ar. Asn Leu Gly quot;y, Val 565 570 575
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met PrQ Cys Ala 580 585 590
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His otu 595 600 605
Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 610 615 620
Val Asn Arg Aro pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val As~ Olu Thr Tyr 625 630 635 640
Val Pro Lys Ol u Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile 645 650 655
Cys Thr Leu Ser Olu Lys otu Arg eln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu 660 665 670
Val Olu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Olu eln Leu Lys 675 680 685
Ala val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 690 695 700
Asp ASP Lys Olu Thr Cys Phe Al~ Clu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala 70S 710 715 720
Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 725
lt;210gt; 319
lt;211gt; 669
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 319
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Gly Ser Leu ASp Lys Arg His Gly Glu Cly Thr Phe Thr Ser 20 JO
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ASP Val Ser Ser Tyr Leu Glu G1y G1n Ala Ala Lys G1u Phe Ile Ala J5 40 45
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Asp ~u Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ah Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 100 105 110
Gln Tyr LeU Gln Gln Cys pro Phe Glu Asp Hhl val Lys Leu val Asn 115 120 125
Glu Val Thr Glu Phe ...la Lys Thr CyS Vol 1\.le, Asp Glu Ser Ala Glu 130 135 140
Asn Cys ASP Lys Ser Leu Hls Thr Leu Phe ely Asp Lys Leu Cys Thr 145 150 1SS 160
val Ala Tor Leu Aro Glquot; Thr Tyr Gly G1quot; Met: Ala Asp Cys Cys Al. 165 170
'quot;
Lys Gln Glu 'ro G1u Arg J\.sn Glu Cys 'he Le..' Gln His · Lys As, Asp 180 185 190
Asn Pro ABn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu val Asp Val Hct Cys 195 200 205
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Glquot; 11e Ala Argo Arg His quot;,o TYr ?he Tyr Al. 'ro Glu Leu Leu 'he 225 2gt;0 235-240
'he Ala Lys Arg Tyr LY' Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ah Ala 245 250 255
As p Lys Al" Al. eya Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Ar. As, G1u 260 265 210
ely Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys CylO Ah Ser Leu Gln 215 280 285
phe ely Gl u Arg Ala Phe Lya Ala Trp Al~ Val Ala Arg L....u S....r
7.90 295 300
Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val. Ser Lys Llt;!u Val Thr 305 310 315· 320
ASP Leu Thr ~ys val His Thr Glu Cys Cyo His Gly Asp Leu Leu Glquot; 325 330 335
Cys Al.. Asl' Asp Aro Ala Asp 1.al1 Al. T.ys Tyr 1:1e Cys Glu Asn Gln 340 345 350
Aap Ser I1e Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Ly. Pro Leu Leu 355 360 365
Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asl' Glu Met Pro Ala 310 315 380
Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Aal' Phe Val Glu Ser Lya Asp Val Cys 185 390 395 .00
Lys Asn Tyr Al" Glu Ala Lys 1\sp V,,} phe Lel.l Gly Met. Phe Leu Tyr 405 410 4lS
G11.I Tyr 1\1a. Aro Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 420 425 430
Lel.l Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Gl1,1 Lys Cys Cya Ala Ala Ala 435 440 445
Aep Pro His Gl l.1 Cys Tyr Ala Lys val phe Asp Gll.I Phe Lys pro Leu 450 455 460
Val Glu Glu Pro Gln Asn Lel.l lle Lys Gln 1\on Cys Glu Leu Phe Glu 465 470 415 480
Gln Leu Gly Glu Tyr Lys phe G}n Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr Thr 485 490 495
Lys Lys val Pro Gln val Ser Thr 'ro Thr Leu v.a l Glu V.l Ser Arg SOO SOS 510
Asn Leu Gly Lya val Gly Ser Ly. Cy. Cys Lys Hls Pro Glu Ala Lys 515 520 525
Arg Melt; Pro Cys 1üa Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 530 535 540
Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg Val Thr Lys Cys 545 550 555 560
Cy5 Thr Glu Ser Leu Va.l As o Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 565 510 515
val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe ASn Al a Cl u Thr Phe Thr 580 585 590
Phe HlB Ala Asp lle CyS Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln l le Lys 595 600 605
Lya Glo Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Ly. Pro Lys Ala Thr
'10 '15 '20
Ly. Glu Gln Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe Al. Ala Phe Va.l Glu
,,,
625 630 635
Lys Cys Cys Lys Al. quot;,p ASP Lys Glu Thr Cys phe Ala Glu Glu Gly 6quot; 650 6SS
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Le\! Gly Leu 660 665
lt;210gt; 320
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 320 Met. Lys val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Het Leu Val Thr Ala
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20 25 30
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val Leu Arg 1'.rg His Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala His Arg phe 50 55
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145 150 15:) 160
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195 200 20'
Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Al a Phe Thr Gl u Cys Cys Gln Ala 210 215 220
Ala ,quot;o Lys Ala Ala Cys Leu L@u Pro Lys Leu ,quot;p Glu Leu Arg ASp 225 230 235 240
Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Aro Leu Lys Cys Ala Ser Leu 24' 2quot; 255
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Thr ,quot;p Leu Thr Lys Val Hla Thr Clu Cys Cy~¡ His Gly Asp Leu Leu 290 29' 300
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Leu Glu Lys Ser His Cys 1le Ala Glu val Glu Asn Asp Glu Met Pro
340 345 350
Ala ~sp Leu Pro Ser LeU Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val 355 360 365
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp vol Phe Leu Gly Het Phc Leu 370 375 380
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro ASp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu 385 390 395 400
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala 405 410 415
Ala ASP Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu phe Lys Pro 420 425 430
Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe 435 440 445
Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr 450 «55 460
Tbr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 465 470 475 480
Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala 485 490 495
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Leu CyS Val Lou His Glu Lys Thr Pro val Ser ASp Arg val Thr Lys 515 520 525
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Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 580 585 590
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Glu Lys Cys Cys Lys Ala A~p Asp Lys Glu Th~ Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 6J5
lt;210gt; 321
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 321
Me' Trp Trp Arg t.eu Trp Trp Leu Leu t.eu Leu Leu Leu Leu t.eu Trp 1 5 10 15
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Gly Arg Lquot; Mee Asp Arg !le Ser Ser Ser Ser' Gly I.eu G1y Cys Lya JS 40 45
Val Leu Arg Arg Mis Asp Ala His Lys Ser Gl~ Val Ala HilO Arg Phe 50 55 60
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Al. Oln Tyr Leu G1n G1n Cys ero Phe 01u Asp His val Lys t.eu Vd 85 90 95
Asn Glu Val Thr G1u Phe Ala t.ys Thr Cys val Ala Asp G1u Ser Al. 100 10' 110
Clu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hia Thr Leu Phe Gly ASp Lys Leu Cys 115 120 125
Thr Val Ala Thr Leu Arg Clu Thr Tyr Gly Glu. Met Ala Asp Cy9 Cy9 130 135 140
Ala Lys Cln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe! Leu Gln His Lys Asp 145 150 155 160
Asp Aan Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu val ASp Val Me' 165 170 17'
Cys Thr Ala phe His Asp Asn Glu Glu The Pha' Leu Lys t.ys Tyr Leu 180 185 190
Tyr Glu Ila Ala Arg Arg His Pro 'I'ye Phe Tyr Ala Pro Glu Lcu Leu
195 200 205
Phe Phe Ala Lys Acg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr G1u Cys Cys Gln 1\.la 210 215 220
Al . Asp Lys 1\.la 1\.la Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arq Asp 225 230 2H 240
Glu Gly Lys Al a Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Selt; Leu 245 250 255
Gln Lys Phe Oly 01. Arg Ala Phe Lys Al. Trp Ala Val Al. ArO I.eu 260 265 270
Ser Gln ArO Phe Pro Lys Ala 01u Phe Ala Clu Val Ser LV' Leu Val 215 2.0 2.5
Thr Asp Lou Thr Lys val His Thr G11.I Cys Cys quot;lo Gly 1\.sp Leu Leu 290 295 300
Glu Cys Ale. Asp Asp Ar. Ala Asp Leu A.la Lyquot; Tyr lle Cys Glu ASn 3quot;
310 315 320
Gln Asp Sor !le Ser Ser Lys Leu Lys elu Cys Cys Clu Lys Pro Leu 325 330 335
Leu Glu Lys Ser His Cyquot; Ile Ala elu Val Glu han Asp Olu Me' Pro 340 345 350
Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al. Asp Phe Val elu Ser Lys Asp Val 3gt;5 360 365
Cys Lys Asn Tyr Jüa Glu Ala Lya Asp val Phe Leu ely Mee Phe Leu 370 315 380
Tyr Glu Tyr Ala Arg Ar. His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu 385 390 395 '00
Arg Leu Ala Lys Thr TYr Glu Thr Thr Leu Glu LyS Cys Cys Ala Ala 40S 410 415
Ala Asp Pro His atu CYS Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro 420 425 4)0
Leu Val Glu Glu Pro Cln Aso Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe 435 440 145
Olu Glo Leu Cly Glu Tyr Lys Phe eln Asn Ala Leu Leu Val Arq Tyr 450 455 460
Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 465 470 475 480
Arg Aso Leu Gly Lys val Cly Ser Lys Cys CyS LyS His Pro Glu Ala 485 490 495
Lys Arg Met Pro ·Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn eln 500 505 510
Leu Cys Val Leu Mis Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys 515 520 525
Cys Cys Thr elu Ser Leu val Asn Arg Arg pro Cys Phe Ser Ala Leu 530 535 540
Glu Val ASp elu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Al a Glu Thr Phe 545 550 555 560
Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg eln Ile 565 570 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 580 585 590
Thr Lys Glu eln Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val 595 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Al a ASP Asp Lys Clu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635
lt;210gt; 322 5 lt;211gt;666
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 322
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Leu Gly Ser Gln Al. His Gly Olu Gly Thr Phe Thr Ser Mp Val Ser
20 30
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,.5 190
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Arg Arg His pro Tyr phe Tyr Ala Pro Glu Le,..a Leu Phe phe Ala Lys 225 230 235 240
Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala 245 2SO
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Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Ar!~ Asp Glu Gly Lys Ala 260 265 270
Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Sel~ Leu Gln Lya Phe Gly 275 280
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Glu A,. Ala Phe Lys Ala 'Trp Ala Va1 Ala Ar!;f Leu Selt; Gln Arg 'he 290 295 300
quot;,o Ly. Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr 305 310 31~¡ 320
Lquot; Val His Thr Glu ey. Cys His Gly Aso Leu Leu Glu Cys Al. Asp 325 330 335
Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 1le C'ys Glu Asn Gln ASp Ser 1le 340 345 350
Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Llt;!u Leu Glu Lya Ser 355 360 365
quot;'a Oy. Ile Ala Glu val Glu Aan ASp Glu Met: pro Ala ASp Leu Pro 370 375 380
Se, Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys ASP val Cys Lys Asn Tyr 385 390 39~; 400
Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met. Pheo, Leu Tyr Glu Tyr Ala 405 410 415
Argo Arg His Pro Asp Tyr Ser Val V.l Leu Lel;L Leu Arg Leu Ala Ly. 420 425 430
Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lya Cys Cys Al;!!. Ala Ala Asp Pro His 435 440 445
Glu Cys Tyr Ala Lys val Phc Asp Glu phe Ly.!;¡ Pro Leu Val alu Glu 450 455 460
Pro Gln Asn Leu 1le Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 465 470 475 480
Glu Tyr Lya Phe Gln quot;n Ala Leu Leu Val Ar'Cr Tyr Thr Lys Ly. Val 485 quot;0 495
Pro Gln Val Selt; Thr Pro Thr Leu Val Glu Val. Ser Arg quot;n Leu Gly 500 505 510
Lya Val Gly Se, Lys Cys Cys Ly. quot;,. Pro Gh.~ Ala Ly. Alt;g Met Pro 515 520 525
Cy. Al. Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 530 535 540
His Glu Lys Thr Pro V.l Su Asp Arg Val Th.tquot; Ly. eyo Cys Thr Glu 545 550 55'5, 560
Ser Leu Val Asn quot;. 'lt;g Pro Cys 'he Ser Ala. Leu Glu Val Asp Glu 565 570 575
Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Gl\,l Th:r;' Phe Thr Phe His Ala 580 585 590
ASP 1le Cy. Th, Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 1le Ly. Ly. Gln Thr 595 600 605
Ala Leu Val Glu Leu Val Ly. His Lys Pro LYSI Ala Th, Lys elu Gln 610 615 620
Leu Lquot; Ala Val Hct quot;p Asp Phe Ala Ala phE! Va l Glu Lys Cys ey. 625 630 63S 640
Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Gll;L Glu Gly Lys Lys Leu 645 650 655
Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 660 665
lt;210gt; 323
lt;211gt; 574
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 323
Met Lya Trp val Ser Phe tIa Ser Leu Ley Phe Leu phe Ser Ser Ala 1 S 10 15
Tyr Ser Arg Ser Ley Asp Lys Arg Ser Pro Lys Met Val Cln Cly Ser 20 25 30
Gly Cys Phe Cly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Cly Ley 35 '0 45
Cly Cys Lys Val Leu Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys SO 55 60
Thr Val 1\quot;1a Thr Leu Arg Clu Th:r Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys 65 70 75 BO
Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Clu Cys phe Leu Gln His Lys Asp 85 90 95
Asp Aso Pro ASO Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp val Met 100 105 UO
Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 115 120 125
Ty:r Glu tIa Ala Arg Arg His pro Tyr Phe Tyr Ala pro Glu Leu Leu 130 135 140
Phe Phe Ala Lys Arq TYr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala 145 150 155 160
Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp 165 170 175
elu Gly Lys Ala Ser Ser Al~ Lys eln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu 180 lB5 190
eln Lys Phe Gly clu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu 195 200 205
Ser Gln Arg Phe pro Lys Ala elu Phe Ala Clu Val Ser Lys Leu Val 210 215 220
Thr quot;o Leu Thr Lys Val Hia Thr Glu Cys Cys His Cly Asp Leu Leu 225 230 235 240
Olu Cys Ala ASp ASp Arg Ala Asp Leu Ala Lya Tyr :tle Cys Olu A.n 245 250 255
Cln Asp Ser quot;e Ser Ser Lys Leu Ly. Olu Cys Cys Clu Lyo oro Leu 260 265 270
Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala elu val Glu Asn ASp Glu Met Pro 275 280 285
Al. Asp Leu Pro Ser Leu Al. Al. Asp phe Val Glu Ser Lys Asp Val 295 300
Cys Ly. Asn Tyr Ala Glu Al. Lys ASp Val phe Leu ely Met Ph. Lsu 305 310 315 320
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser val Val Leu Leu Leu 325 330 335
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu ,Thr Thr Leu Clu Lys Cys Cys Ala Ala
~40 345 350
Ala Asp pro His Clu Cys Tyr Ala Lys val Phe ASp Clu Phe Ly~ Pro ~55 360 J65
Leu val Glu Glu Pro eln Asn Leu Ile Lys Gl n Asn Cys Glu Leu Phe 370 375 380
Glu Cln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr 385 390 395 400
Thr Lys Lys Val pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu val Ser 405 410 U5
Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala 420 425 430
Lys Arg Mee Pro Cys Ala alu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gl n 4J5 440 445
Leu Cy9 Val Leu Mis Glu Lys Thr Pro val Ser ASp Arg Val Thr Lys 450 455 460
Cys cy$ Thr Glu Ser Leu Val Aso Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu 465 lt;::70 475 480
Glu Val Asp elu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe 495 490 495
Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu ~ys Glu ArQ Gln Ila 500 SOS 510
Lys Ly5 Gl n Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 515 520 525
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val Met ASP Asp Phe AI~ Ala Phe val 530 535 540
Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASP Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 545 550 555 560
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 565 570
lt;210gt; 324 5 lt;211gt;638
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 324
Mct Lys val Ser val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Mee Leu val Thr Ala 1 5 10 15
Leu Gly Ser Gl n Ala Ser Pro Lys Me~ Val Cln Gly Se r ely Cys Phe 20 2S 30
ely Arg Lys Melt; Asp Arg tle Ser Ser Ser Ser ely Leu Gly Cys Lys 35 '0 4S
Val Leu Arg Arg lI i a A.ep Alo Mis Lys Ser Glu V.1 gt;1. lIia Arg Phe 50 55 60
Lys Asp Leu Gly Glu Glu quot;n Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Ptquot;:e 6S 70 75 SO
Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp Hin Val Lys Leu Val 65 90 95
Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala 100 105 110
elu A.5n Cys A5p Ly5 Ser Leu His Thr Leu phe ely Asp Lys Leu Cys 115 120 125
Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gl)' Glu Met Ala Asp Cys Cya 130 135 140
Ala Lys Gln Clu Pro Clu ArQ Aso elu Cys Phe Leu eln His Lys Asp 145 150 155 160
Asp ASO Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met 165 170 175
Cy.s Thr Ala Phe His Asp Asn Glu. G1u quot;r Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 180 lOS 19O
Tyr Glu Ile U. ArO Arg His Pro Tyr quot;he Tyr Ala Pro G1u Leu Leu 19' 200 'OS
Phe Phe gt;1. Lys Arg: Tyr Ly. Ala Ala Phe Thr G1u Cys Cys Gln Ala 210 215 220
Ala Aap Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lya Leu Asp Clu Leu Aro ASP 225 230 2]5 240
Glu Gly Lys Ala Soc Ser Ala Lya Gln gt;rO Leu Lya Cys ....la Ser Leu 245 250 255
eln Lys Phe Gly Glu Arg ....la Phe Ly. Al. Tr,p Ala Val Ala Ar. Leu 260 265 270
Ser eln Ar. 'he Pro Lys Ala Glu Ph. Ala el'u Val Ser Lys Leu val 275 280 285
Thr Aap Leu Thr Lya Val His Thr elu Cys Cys His Gly Aap Leu Leu
290 295 300
Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala ASp Leu Ala Ly.os Tyr :lle Cys Glu Asn 305 310 315 320
Gln Asp Ser lle Su Ser Lys Leu Lys Glu Cy., Cys Glu Lya Pro Leu 325 330 335
Leu elu loys Ser His Cys IleAliI Glu Val el... Asn Asp Glu Me' Pro 340 345 350
Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al. gt;sp Phe val elu Ser Ly' Aep val 3SS 360 365
CY5 Lys Asn Tyr Ala Glu Alquot;, LY5 ASP Val Ph,~ Leu ely Met Phe Leu 370 375 380
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His pro ASP Tyr Ser. Val Val Leu Leu Leu
3.5 390 39!) 400
Arg Leu Ala Lys Thr 'IYr Glu Thr Thr Leu Clu Lys Cys Cys Ala Ala 405 410 415
Ala Asp Pro H1s Glu Cys Tyr Ala Lys val Phl~ Asp Clu Phe Lys pro 420 425 430
loeu val elu elu Pro Gln Asn Leu lle Ly$ eln Asn Cys Glu Leu Phe 435 440 44S
Glu Gln Leu e ly Glu 'l'yr Ly, Phe Gln Asn Alu Leu Leu Val ArlJ 'l'yr 450 4SS 460
Thr Lyo Lya Val Pro Gln Val Ser Thr pro 'lquot;hl~ Leu Val Clu Val Ser 465 470 47S 480
Ar. Asn Leu Gly Lya Val Gly Ser Lya Cy, Cyn L)'s His Pro Glu Al. ••5 490 495
Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu ASP Tyr Leu Se1: Val Val Leu Asn eln 500 50S 510
Leu Cys Val L.eu His Glu loys Thr Pro Val Set: ASP l\r:g Val Thr Lys
515 520 525
Cys Cys Thr Glu Ser: Leu Val Asn Arg Arg Pr() Cys Phe Ser Ala. Leu
530 535 540
Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe, Asn Ala Glu Thr Phe 545 SSO SSS 560
Thr Phe Hi$ Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser elu Lys Glu Ax-g Oln Ile 565 570 575
Lys Lys Gln Thr Alo Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Ly. gt;1a 56O 585 590
Thr Lys Olu Oln Lcu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala phe Val 59' 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASp Asp Lys elu Thr Cys Phe Ala GlU Glu 610 615 620
ely Lys Lys Leu Val Ala Ala Se~ Gln Ala Ala Leu ely Leu 625 630 635
lt;210gt; 325
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 325
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu .Leu Trp 1 5 10 15
Px-o Met Val Trp Ala Ser Pro Lys Mee Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe 20 25 30
Gly Arg Lys Met Asp Arg I1e Ser Ser Ser Ser ely Leu ely Cys Lys 35 40 45
Val Leu Arg Arg His J\sp Ala His Lys Ser elu Val .\gt;la His Arg Phe 50 SS 60
Lys Asp Leu Gly Glu Olu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 1le Ala phe 65 70 75 80
Ala Gln Tyr Leu Gln Oln Cys Pro Phe Olu Aop His Val Lys Leu Val 85 90 95
Asn Olu Val Thr 0Iu Phe All:! Lys Thr Cys Val Ala Asp Olu Ser Ala 100 105 110
Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys 115 120 125
Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys 130 135 140
Ala Lys Glo Glu Pro Glu Arg ASO elu Cys Phe Leu Gln His Lys ASp 145 150 lSS 160
ASP ASO Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Mee 165 170 175
CyS Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 180 185 190
Tyr elu Ile Ala Arg Arg Mis Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu 195 200 205
Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 'rbr Glu Cys Cys Gln Ala 210 215 220
Ala quot;. Lys Ala Ala Cys L.u Leu Pro Lys Llt;eu quot;.Glu Leu I\r9 AsO 225 230 2:15 240
Gl u Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln gt;rg L4E!U Lys Cys Ala Selt; Leu 'quot; 250 255
Gln Lys phe Gly Glu I\rg Ala Phe Ly. ola T:r:p Ala Val ola Ar. Leu 260 265 270
Ser Cln Arg Phe Pro Lys Ala Glu pne Ala Glu Val Ser Lyil Leu Val 275 280 285
.,.
'l'hr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys Gly Asp Leu Leu 290 295 300
Glu Cys Ala ASp ASp gt;ro Ala Asp Leu Ala Lys TYr lle Cys Glu Asn 305 310 JlS 320
Gln I\sp Ser lle Sar Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu 325 330 335
Leu Glu Lys Ser .His Cy' lle Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Mer Pro 340 345 350
Ala Asp Leu Pro ser Leu Ala Ala AS. Pne V;Slil Glu Ser Lys Asp Val 355 360 365
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly:gt; Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu 310 315 380
Tyr Glu Tyr Ala Arg Ar. His Pro Asp Tyr S,er val val Leu Leu Leu 385 390 J:~5 400
Ar. Leu Ala Ly$ Thr Tyr Clu Thr Thr L.u G:Lu LYs Cys Cys Ala Ala 405 410 415
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys V.l Phe Asp Glu • h. Ly• Pro 420 425 430
Leu va.l Clu Glu Pro G1n Asn Leu I1e Lys Gln Asn Cys elu Leu Phe 435 440 445
clu C1n Leu ely Clu Tyr Lys Phe Cln quot; sn Ala Leu Lcu val Arg Tyr 45Cl 455 460
Thr Lys Lys Val Pro Cln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 465 470 475 480
Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cy. Cys Lys His Pro Glu Ala 485 '90 '95
Lys Arg Me t Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Sl~r Val Val Le\! Asn eln 500 505 510
LeU Cys val Leu His el\! Lys Thr Pro Val Sl~r ASp Arg Val Thr Lys 515 520 525
eys ey. Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu 535 540
Squot;
Glu val ASP Glu Thr Tyr Val Pro Lys Clu 'he Asn Ala Glo Thr 'he 545 550 SS5 560
'I'hr Phe His Ala Asp ne Cys Thr Leu Ser Olu Lys Glu Arg Gln ne 565 570 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 580 585 590
Thr Lys Glu Cln Leu Lys Ala Val Mee ASp Asp Phe Ala Ala Phe Val 595 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Al~ Asp ASp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
Cly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635
lt;210gt; 326
lt;211gt; 640
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 326
Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Vol Leu Leo Léu Ala 1 5 10 15
Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Ser pro Lys Met Val Cln Cly Ser Gl y 20 25 30
Cys Phe Gly Arg Lys Mee ASP Arg He Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly 35 ,o 45
Cys Lys Val Leu Arg Arg His ASO Ala Mis Lys Ser Glu Val Ala His 50 55 60
Aro Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lya Al. Leu Val Leu 11e 65 70 75 SO
Al~ Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu ASp His Val Lys 85 90 95
Leu val Asn Glu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp Glu 100 lOS 110
Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu 'he Oly Asp Lys 115 120 125
Lou eys Thr Val Ala Thr Leu Aro Glu Thr Tyr Oly Glu Met: Ala ASP
13. 135 140
Cys Cys Ala Lys eln elu 'ro elu Argo Asn Glu Cya Phe Leu Gln His 145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro G1u Val ASp 165 170 175
Val Het Cys Thr 11.180 Phe His Asp Aon Glu Gl\l Thr ,he Leu Lys Lys 180 lBS 190
Tyr Leu Tyr 01u !le 11.1lt;1 Jl.rg Aro His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 195 200 205
Leu Leu 'he Phe Ala Lys Aro Tyr Lys Ala A1i!' Phe ..hr G1u Cys Cy¡¡ 210 215 220
01n Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pre) Lquot; Leu Asp Olu Leu 225 230 23~¡ 240
Aro Asp Clu Gly Ly. Al. Ser Ser Ala Lys Gl~, Ar'1 Leu Lys Cy. Al. 245 250 255
Ser Leu Gln Ly. Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala T¡rp Ala Val Ala 260 265 270
Ar'il' Leu Ser 01n Acg Phe Pro Lys Ala Glu PhEI Ala Olu Val Ser Lys 275 2.0 285
Leu val Thr ASp Leu Thr Lys Val Hia Thr GIu lt;ys Cys Mis GIy ASp 290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala A$p ASp Arg Ala ASP Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 305 )10 31~¡ 320
C l u A5n Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Ly!!:: G1u Cys Cys Glu Ly. 325 330 335
Pro Leu Leu GIu Lys Ser His Cys tle Ala Glu Val Glu Asn ASp Glu 140 345 350
Mct PrO Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala AS¡=¡ Phe Val Clu Ser Lys 355 160 365
ASP Val Cys Lys A.sn Tyr Ala Glu Ala. Lys AS¡=¡ Val Leu Gly Het
,.0 Phe
370 375
Phe Leu TVr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro lI.s¡:, Tyr Se r val Val Leu 385 390 395, 400
Leu Leu Arg Leu Al a Lys Thr Tyr Glu Thr 'I'hr· Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Ala Ala Ala ASp pro Bis Glu Cys Tyr Ala Lys. val Phe Asp Glu phe 420 425 430
Lys pro Leu Val Glu Glu pro 01n A.sn Leu Ile, Lys Ol n Asn Cys Glu 435 440 445
Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln. Asn Ala Leu Leu Val 450 455 460
Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu .65 470 415 480
Val Ser Ar'il' Asn ~u Gly Lys Val Gly Ser Lya Cys Cys Lys Mis Pro
4.5 .90 495
Glu Ala Lys Arg Mee Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 500 50S 510
Asn Gln Leu ey. Val Leu His elu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val 51gt; 520 525
Thr Ly. ey. Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg ArO Pro Cys Phe Ser 530 535 540
Ala Leu Glu Val Agp Glu Thr 'IYr Val Pro Ly. Glu phe Asn Ala elu 545 550 555 5'0
Thr Phe Thr Phe HLS Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg 555 570 575
Glo Ile Lys Lya eln Thr Ala Leu Val elu Leu Val Lys HLS Ly. Pro 580 585 590
Lys Ala Thr Lya Glu Gln Leu Ly. .'a Val Met Asp Asp phe Ala Ala 595 600 '05
ph. Val elu Lys Cys Cys Lys .'a Asp Asp Lys elu Thr Cye Phc Ala 610 615 .20
alu alu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser cln Ala Ala Leu Cly Leu 625 630 635 640
lt;210gt; 327
lt;211 gt; 640
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 327
Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu ~la 1 5 10 15
Leu Trp Al a pro Ala Arg Gly Ser Pro LyS Met Val Gln Gly Ser Gly 20 25 30
Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg ¡lc Ser Ser Ser Ser Gly Leu Cly 35 4Q 45
Cys Lys Val Leu Arg Arg His Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His 50 55 60
Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Aso Phe Lys Ala Leu Val Leu ¡le 65 70 75 80
Ala Phe Ala eln TYr Leu Cln Gln Cys Pro phe Glu ASP His Val Lys 85 90 95
Leu Val Asn Glu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu 100 105 110
Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly ASp Lys 11S 120 125
Leu Cys Thr V~l Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Mee Ala Asp 130 135 140
eys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Gll.l Arg Asn Gl'u eys Phe Leu eln His ISO 155 lOO
Lys Asp quot;,quot;sp Asn Pro ,quot;n Leu Pro Argo Leu Val quot;. Pro Glu Val Asp 165 170 175
Val Met Cys Thr quot;. phe Iiia ASp Asn Glu Gl'U Thr Phc Leu Ly. LyS 180 185 quot;0
Tyr Leu Tyr Glu r l e Ala Arg 1\.rg His Pro Ty:r Phe 'I'yr Ala pro Glu 1 95 200 205
Leu Leu phe phe Ala Lys 1'.r9 Tyr Lys Ala Al,,, PhI! Thr Glu Cys Cys
210 215 220
Gln quot;a Ala Asp Lys Al. Ala eya Leu Leu Pn) Lys Leu Asp Glu Leu 225 230 23:$ 240
Arg Asp Glu Gly Ly. Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys eys quot;. 245 250 255
Ser Leu Gln Lys Phe Cly Glu Arg Al. Phe Ly!~ Ala Trp Al' Val Al. 260 265 270
1\r9 Leu Ser eln 1\rg Phe Pro Lys Ala Glu Ph.~ Ala Glu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys val Hi s Thr Gl u ey, Cys His ely Asp 2'0 295 300
Leu Leu Clu Cys Ala Asp Mp Arg Ala ASp LClJ Al. Ly, Tyr Il. eys 305 310 JI!i 320
Glu 1\5n eln Asp Ser Il. Ser Ser Lys Leu LY!1 Glu Cys Cys Glu Ly, 325 330 335
Pro Leu Leu G1u Lyo Ser His Cys He Ala Glu Val Glu Asn ASP Glu 340 345 3SO
Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Al, Ala ASp Phe V.l Glu Ser Lys 355 360 365
ASp Vol eyo Lys Asn Tyr Ala G1u Ala Lys l\sl) Val Phe Leu Gly Mct 370 375 lBO
Phe Leu Tyr Glu 'I'yr Ala Arg Arg His pro Asp Tyr Ser Val Val Leu 385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Altl Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys eys eya 405 410 415
Ala Ala Al a ASp Pro His Glu Cys TYr Al a Ly!¡ Val Phe Asp Glu Phe 420 425 430
Lys Pro Leu val Clu Glu pro Gln a.n Leu 11E~ Lys Gln a.n Cy.o Glu 435 440 445
Leu Phe Glu Cln LIIIU Gly Glu Tyr Lya I?he Gln Asn Ala Leu Leu Val 450 45S 460
aro Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln val Ser Th:quot; Pro Thr Leu Val Gl u
465 470 475
Val Ser Arg ABn quot;eu Oly Lys val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro
4.5 490 495
el\.1 Al.. Lys Arg Melt; Pro Cys Ala Glu ASp TYr LreU Ser Val Val Leu SOO 50s 510
Asn Gln Leu Cys Vquot;,l Leu His_Glu LYs Thr Pro Val Ser AOp Arg Val 51' '20 525
Thr Lys Cys CyS Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Aro Pro Cys Phe Ser S30 535 540
Ala Leu Glu Val ASP Olu Thr TyJ:quot; Val Pro Ly. Ol u Phe Asn Ala Olu S45 SSO SSS 560
Thr Phe Thr Pbe Hill Ala Asp 1:1e Cys Thr Leu Ser elu Lys Olu Ar. 56S 570 575
Gln rle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Gl u Leo Val Lys His Lys Pro 580 SBS 590
Lys Ala Thr Lys elu Gln Leu Lys Al a Val Met Asp Asp Phe Ala Ala 595 600 605
Phe Val elu ¡.ys Cys cys r,Y!iI A18 Asp J\.!'Ip I.ya Glu Thr lt;:ya Phe Ala 610 615 620
Glu Glu ely Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635 640
lt;210gt; 328
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 328
Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 1 S 10 15
Leu GIl' Ser Gln Ala Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Ph@ 20 25 30
Gl y Gly Lys Mee Asp Arg lle Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys 3S 40 4S
Val Leu Arg Arg His Asp Ala Hie Lys Ser Glu Val Al a His Arg Phe 5' SS 6.
Lys Asp Leu Gly Glu Glu Aso Phe Lys Ala Leu Val Leu tle Ala Phe 65 70 15 80
Al a Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp Hie Val Lya Leu Val 85 90 95
Aso Glu Val Thr GLu Phe Ala Lya Thr Cys Va~ Ala Asp Glu Ser Ala IDO 105 110
Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hia Thr Leu Phe Gly ASP Lys Leu Cys
115 120 125
Thr v.l Al. Thr Leu Arg elu Thr Tyr Gly G1'I.I MoC Al. ASp Cys Cys UO U5 140
Al. Ly. Cln Glu Pro e lu Ar. ASIl Clu Cys Ph,e Lau Cln His Lys Aop 145 150 15.'5 160
AsO Asn Pro A~n Leu Pro )\r9 Leu Val Ar. Pr,:) Glu Val Asp Val Met 16' 170 175
Cys Thr Ala Phe Ris Asp Asn Clu Glu Thr Ph,~ Leu Lys Lys Tyr Leu
180 185 190
Tyr Glu 11e Al. Arg Arg His pro Tyr Phe Ty;~ Ala Pro elu Leu Leu 195 200 20S
ph. Phe Al. Lys Arg Tyr Lys Al. Ala Phe Th:r Clu Cy. CY3 Cln Ala 210 215 220
Al. AsO Lys Ala Ala Cy. Leu Leu pro Lys Leu Aop GIl) Leu Arg AsO 225 2quot; 2:3S 240
Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys CIn Arg Leu Lys Cys Ala Ser 245 250 2SS
CIn Lya Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala TrI) Ala val Ala Arg Leu 260 265 270
Ser C1n Ar. Phe Pro Lys Ala Clu phe Ala Glu Val Ser LY' Leu Val 27' 280 285
Thr As. Leu Thr Lys Val Hi s Thr Glu Cys Cy!3 His ely Asp Leu Leu 2'0 2.5 300
Clu Cys Ala 1quot;.sp ASP Ar. Al. Asp Leu Ala Lyn Tyr lle Cys Glu ASO 305 310 3lS 320
Clo Asp Ser 11e Sor Ser Lys Leu Lys elu Cy.. Cys Glu Lys 'ro Leu 325 330 335
Leu Glu Lys Ser Hio Cy. 1le Ala Clu V.l Glu Aso Asp Clu Helt; ero 340 345 350
Ala Asp Leu 'ro Ser Leu Ala Ala MO phc val Glu Ser Lys Asp Val 3SS 360 365
Cys Lys Aon Tyr Al. elu gt;l. Lys Asp Val PhEI Leu ely Me' Phe Lau 370 375 380
Tyr elu Tyr Ala Aro Aro His Oro A$quot; 1'yr Se~-v.l v.l T.egt;.gt; Len 1.e ... 385 3quot; 39S 400
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Al. 405 410 415
Ala Asp Pro Mis Glu Cys TYr Ata Lys Val Phe, Asp Gl u gt;he Lys Pro
420 425 430
Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Le\.gt; Ite Lys Glr.1 Asn Cys Glu Leu Pbe 435 440 445
Glu Gl. Leu Gly Glu Tyr Ly. Phe Gln Asn 1\.18 Leu Leu Val Ar9 Tyr 450 455 460
Thr Ly. Lys Val Pro Gl. Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 465 470 475 480
Arg ASll Leu Gly Lys v.l Gly Sf':r Lys eys eys Lys His Pro Glu Al. .85 490 495
Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr LeU Ser Val Val Leo Asn Gln 500 50S 510
Leu Cys val Leu Kis Glo Lys Thr Pro Val Ser ASP Arg Val Thr Ly$ 515 520 525
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys phe Ser Ala Leu 530 535 5'0
Glu val Asp Glu Thr Tyr val Pro Lys Glu phe Asn Ala Glu Thr Phe 545 550 555 560
Thr Phe His Ala Asp Ile eys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gl. Ile 565 570 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu val Glu Leu v.l Lys His Lys pro ·Y' Ala 5'0 5'5 590
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp ph. Al. Al. Phe Val 595 600 605
Clu Lyn Cy~ Cys Lys Ala Asp Asp Ly& Clu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
ely Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly L~u 625 630 635
lt;210gt; 329 lt;211gt;571
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 329
Met Trp Trp Arq Leu 'I'rp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Pro Het Val Trp Ala Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe 20 2S 30
G1y Arq Lys Met Asp Arg l1e Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys 3S 40 45
val Leu Ser Leu Hi.s Thr Leu Phe Gly ASP Lys Leu Cy$ Thr Val Ala 50 55 60
Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala AsO lt;:y. Cys Ala Ly. Gln 65 70 75 'O
Glu pro Glu Arg As. Glu ey. phe Leu Gl. His Lys ASP 1I.sp As. Pro 85 90 95
Asn Leu Pro Aro Leu Val Arg Pro Glu Val As:p Val Met ey. Thr Ala
100 lOS 110
Phe His quot;p Asn elu Glu Thr phe Leu Lys Ly:s Tyr Leu Tyr Glu Ile 115 120 125
Al. Ar. Ar. quot;quot; Pro Tyr Phe Tyr Al. Pro el1..1 Leu Leu Phe Phe Ala 130 135 140
Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr elu Cys Cy$ Gln Ala Ala Asp Lys 145 150 15,5 160
Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp G1u Le1J Arg ASp Glu Gly Lys 165 170 175
Ala Ser Ser Ala Lys eln Ar!iJ Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe 180 185 190
ely elu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 1\1;:1, Arg Leu Ser eln Arg 195 200 205
Pne Pro Lys Ala elu Phe Ala e11.1 Va.l Ser Lyi~ Leu Val Thr Asp Lcu 210 215 220
Thr Lys Val His Thr elu Cys Cys His Gly ASp Leu Leu elu Cys Ala 225 230 235 240
Asp Asp Arg Ala ASp Leu Ala Lys Tyr Ile cY:J G1u Asn eln Aap Ser 245 250 255
Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Ly,~ Pro Leu Leu Glu Lys 260 265 270
Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp elll Mee Pro Al. Asp Leu 275 280 285
Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Ly¡. Asp Val Cys Lys Asn 290 295 300
Tyr Al. Glu Ala Lys Asp V.l Phe Leu Gly Me!: Phe Leu Tyr Glu Tyr 305 310 3lS 320
Ala Arg Arg His pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala 325 330 335
Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cy!l Ala Ala Ala ASp Pro 340 345 350
Mis elu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp elu PhE! Lys Pro Leu Val Glu 355 360 365
Glu pro Cln Asn Leu Zle Lys Cln Asn Cys GI~I Leu Phe elu eln Leu 370 315 380
Gly GIu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu val. Ar!iJ Tyr Thr Ly!l 385 390 395i
Val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Gl~l Val Ser I\rg Asn Leu 405 410 415
Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys quot;ls Pro Glu Ala Lys Arg Met 420 425 430
Pro Cys Al. Glu Asp Tyr Leu Ser V.l val Leu Asn Gln Uu Cys Val '35 4lt;0 445
Leu quot;1$ Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr
450 .55 .quot;
Glu Ser [,eu Val Asn Arg Ara PrO Cys Phe Ser Al. Leu Glu Val Asp 465 470 475 480
Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His 485 UO 495
Ala Asp Ile Cya Thr Leu Ser Glu Lya Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln 500 505 510
Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Al. Thr Lys elu 515 520 525
Gln Leu Lys Ala Val Met AóO AsO phe Ala Ala Ph. val Glu Lys Cys 530 535 540
Cys Lys Ala Asp Asp Lys elu Th~ Cys Phe Ala Glu elu Gly Ly$ Ly$ 545 550 555 560
Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 565 570
lt;210gt; 330
lt;211 gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 330
Melt; Trp Trp Ara Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tqgt; 1 5 10 15
Pro Met Val Trp Ala Ser Pro Lys Met Val Gln Cly Ser Gly Cys Phe 20 25 JO
Gly Gl y Lys Met ASp Arq Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys 3S 40 45
Val Leu Arg Arg His Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe 50 55 60
Lys Asp Leu Gly Glu clu Asn phe Lys Ala Leu V.l Leu !le Ala Phe 65 70 75 80
Ala Gln Tyr Leu Cln Cln ey, Pro 'he clu AsO Hls Val Lys Leu Val .5 90 .5
Asn Glu Val Thr Gh 'he Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala 100 lOS 110
Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe G1y ASp Lys Leu Cys 115 120 125
Thr Val Ala The Lea Arg Glu Thr Tyr Gly Gh1 Helt; Ala AS!) Cys Cys 130 135 140
Ala Lya Cln Glu Pro Glu Ar. Asn Glu Cys I'hEi LeU Gln His Lys Asp 145 150 155, 160
Ao. Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Prco Glu Val Asp V.l Me' 165 170 175
Cys Thr Ala. Phe Hia Asp Asn Glu Gla Thr Phe, Lea Lys Lyo Tyr Leo 180 185 190
Tyr Gla lle Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr' 11.111 Pro Glu Lea Leo 195 200 205
Phe Phe Ala Lya Arg Tyr Lys 11.181 Ala Phe Thl' Glu Cys Cys Gln Ala 21e 215 220
Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leo Pro Lys Le~ A~p Glu Lea Arg Asp 225 230 235, 240
Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys alo Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu 245 250 255
Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala phe Lys Ala Tr¡:, 1I.1a val Al. Arg Leu 260 265 270
Ser aln Arg phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Gl~ Val Ser Lyquot; Leu Val 275 280 285
Thr Aap Leu Thr Lys Val Hia The Glu Cys Cy~ Hla Gly Asp Leu Leu 290 295 300
Clu Cya Ala ASp ASp Arg Ala Asp Leu Ala Lys. Tyr 11e Cys ala ASO 305 310 315· 320
aln ASp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys: Cys Glu Lys Pro Leu 325 330 335
Leu Glu Lys Ser His o,s Ile Ala Gl u val Glu. Asn Asp Glu He' Pro 340 345 350
Ala Asp Leu Pro Ser Leu 1\la gt;1. ,quot;p Phc Vquot;,l Glu Ser Lya Asp Val 355 360 365
Cyo Lys Asn 'l'yr Ala Glu Al. Lya ASp Val Phe' Leu Gl, He' Phe Leu 370 375 300
'l'yr Glu Tyr Ala ArQ Arg His pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Le... Leu 385 390 395 .00
A~g Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys cys Cys Ala Ala 405 410 415
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe ASp Glu Phe Lys Pro 420 425 430
Leu Val Clu Glu Pro Cln Asn Leu 11e Lys COln Asn Cys Glu Leu Phe
43' ." 445
Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Aso Ale Leu Leu Val Arg Tyr 450 455 460
Thr Ly' Lys Val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser 46S 470 47S 'quot;O
Arg Asn Leu Gly Ly, V.l Gly Ser Lys Cy. Cy. Lys His Pro Glu Al. 490 495
'quot;'
Lys Arg Met Pro Cy, Ala Glu Asp TYr Leu Ser val Val Leu Aon eln 500 SOS 510
Leu Cys Val Leu His Glu Ly~ Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys SlS 520 525
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro CyS Phe Ser Ala Leu 530 535 540
Glu V.l ASp Glu Thr TYr Val Pro Lys Glu Phe Mn Ala Glu Thr phe 545 550 555 560
Thr Phe His Ala As, Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg eln Ile 565 570 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu val Glu Leu va l Lys His Lys Pro Ly. Al. SSO ,as S90
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Al a Val Met Asp Asp Phc Ala Ala Phe Val 595 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys alu Thr Cys Phe Ala alu elu 610 615 620
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635
lt;210gt; 331
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 331
Met. Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 S 10 15
Pro Met Val Trp Ala Ser Pro Lys Met Val aln Gly Ser Gly Cys Phe 20 25 30
Gly Arg ely Her Asp Arg lle Ser Ser Ser Ser aly Leu ely Cys Lys )5 40 45
Val Leu Aro Arg His Asp Al. His Lys Ser alu Val Ala His ArO' Phe 50 55 60
Lys Asp Leu Gly alu Glu Aon Phe Lys Alllo Leu Val Leu Ile Alquot; Phe 65 10 75 80
Ala Gln Tyr Leu aln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu val 85 90 95
Aso Glu Val The Glu Phe Ala Lys The Cys Veol Ala ASP elu Ser Ala 100 lOS 110
Glu Aso Cys ,quot;O Lys Ser Leu His Thr Leu Ph,e Gly AsO Ly. Leu Cys 115 120 125
The v.l Ala Thr Leu Arg Glu Thr 'I'yr Gly Gh! Mct Al. Astl Cys Cys 130 135 140
Ala Lys Gln Glu Pro Gl u Arg Asn Glu Cys Ph,a Leu Gln His Lys As p 145 150 155 . 160
ASp Asn Pro Aso Leu Pro Arg Leu Val Arq Pr.:gt; Clu Val Asp val Met 165 170 175
Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Clu Clu Thr Ph,a Leu Lys Lys Tyr Leu 180 185 1':10
Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Ty.r Ala pro Glu Leu Leu
quot;5 200 205
Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Th:r Glu Cys Cys Gln Ala 210 215 220
Ala Asp Lys Ala Ala Cyo Leu Leu Pro Lys Lel.1 Asp Glu Leu Arg As. 225 230 23!5 240
Cl u Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln quot;Q Leu Lys Cys Ala Ser Leu 245 250 255
Gln Lys Phe G1y Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Ar9 Leu 260 265 270
Ser Gln Arg Phe Pro LyD Ala Clu Phe Ala Clu Val Ser Lys Leu Val 275 280 2.5
Thr ASp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys CY:3 His Gly Asp Leu Leu 290 295 300
Glu Cy. Ala Asp ASp ArQ .'a Asp Leu Ala Ly:~ Tyr 1le Cys Glu Asn 305 310 3IS 320
Gln Asp Ser Ile Ser Ser Ly$ Leu Lys Glu Cy:5 Cys Glu Lys Pro quot;eu 325 330 335
Leu Glu Lys Ser Hls Cys He Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Me' Pro 340 345 350
Ala 1gt;.sp Leu pro Ser Leu Ala Ala ASP Phe Val Glu Ser Lys Asp Val 355 360 365
.1.Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Lys Asp Val ph~~ quot;eu Gly Met Phe Leu
370 375 380
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu 385 390 395 400
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glll Lys Cys Cys Ala Ala
405 410 41S
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu phe Lys Pro 420 425 430
Leu Val Glu Glu Pro eln Asn Leu 11e Lys Gln Asn cys Glu Leu Phe 435 440 445
Clu Glo Leu ely elu Tyr Lya Phe Glo AsO Ala Leu Leu Val Arg Tyr 450 455 460
Thr Lya Lys Val Peo Gln val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu val Ser
'65 47. ." .B.
Ar. Asn Leu Gly Lya Val Gly Ser Lys Cya eye Lys His Pro Glu U.
'95
'B, .,.
Lys Arg !'Jet: Pro Cya Ala Glu Asp 'lVr Leu Ser Val Val Leu Aan Gln
50. 50' 510
Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Va l Thr Lys 5~5 520 525
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Ar9 Pro Cy8 Phe Ser Ala Leu 530 535 540
Glu Val ASP Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe 545 550 555 560
Thr Phe His Ala ASp 11e Cys Thr Leu Ser Glu Lys elu Arg elquot; Ile 565 570 575
Ly$ Ly$ Gln Thr Ala Leu val Glu Leu Vol Lys His Lya Pro Ly5 Ala 580 585 590
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met: AsO Asp Phe Ala Ala Phe Val 595 600 605
Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
Gly Lys Lys Leu Val Al a Ala Ser Cln Ala Ala Lcu Gly Leu 625 630 6JS
lt;210gt; 332 lt;211gt;641
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 332
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phc Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Aap Ala Hi s Lys Ser Glu V.l hl. 20 25 3.
His Arg Phe Ly. Asp Leu Gly Gl u Glu Asn Phe Lys Ua Leu Val Leu
35 .0 45
11e Ala ph. Ala Gln Tyr Leu Glo Gln Cys pro Phe Glu Asp His Val SO 55 60
Lys Leu val Aso Glu Vol Thr Glu Phe Ala Ly:;; Thr Cys Val Ala Aop 65 70 7$ 80
Glu Ser Ala Glu AOn Cys Asp Ly8 Ser Leu Hi le: Thr Leu Phe Gly Aop es 'O 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu ArO Glu ThJ;: Tyr Gly Glu Me' Al, 100 105 110
ASP Cys Cys Ala Lys elo GIu Pro Glu Arg Asn GIu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Ar9 Leu Val Arg Pro GIu Val 130 13S 140
Asp val Met Cys Thr Ala Phe Hi s ASP Asn Glu GIu Thr Phe Leu Lys 145 150 155. 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu 1le Ala Arg Arg His Prc, Tyr Phe 'IYr Ala pro 165 170 175
GIu LCU Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala, Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Al. Al. Asp Lys Ala Al, Cys Leu Leu Pro Lys LeU Asp Glu 195 200 205
Leu Aro quot;p Glu ely Lys Al. Ser Ser Ala Lys, Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Al, Ser Leu Gln Lys Phe Gly Clu Arg Ala PhI'quot; Lyo Ala Trp Ala v.l 225 230 23' 240
Al . Arg Leu Ser Gln Aro Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val Ser 245 250 255
Ly~ Leu Val Thr Leu Thr Lys Val His Thx' GIu Cys Cya His Gly 260 'quot; 265 270
ASp Leu Leu Glu Cys Ala Asp n.p Arg 1gt;.la Asp, Leu Ala Lya Ty(quot; tle 275 280 285
cya Glu Asn eln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 lOO
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys rle Al. Glu v~l Glu Aun Asp 305 310 315 320
G1u Met Pro 1gt;.la 1gt;.sp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Gl u Ser 325 llO 335
Lys Asp Val Cy$ Lys Asn Tyr Ala G1u Ala Lys, Asp Val Phe Leu Gl y 340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg Hi s Pro' Asp Tyr Ser Val Val 355 360 l65
LeU Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr:' Thr Leu Glu Lys Cys 170 315 380
Cys 1gt;.la Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 '00
Phe Lys PrO Leu Val Glu Glu Pro CIn Asn Leu IIc Lys Cln 'sn eys '05 410 415
elu Leu Phe Olu CIn Leu Cly Glu Tyr Lyo Phe Cln ....sn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Arg TYr Thr Lys Lys Val pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 quot;O quot;,
Glu val Ser Aro Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro elu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp TYr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Cln Leu Cys Val Leu His elu Lys Thr Pro Val Ser ASP Arg 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr elu Ser Leu Val Asn Arg Arg pro Cys Phe 500 SOS 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
elu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln ·lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys HlS Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Cln Leu Lys Ala val Met ASp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala phe Val Glu Ly. Cys Cys Lys Al. Aso Asp Lys Glu Thr Oy. Phe 560 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu V.l .,. A)a Ser Gln Al. Ala Leu Gly '95 600 '05 Leu Ser Pro Lys Het Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met 610 61' '20
~p ~rg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg 625 630 635 640
His
lt;210gt; 333
lt;211gt; 642
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 333
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser
30 GIy Cys Phe Gly Aro Lys Met Asp I\rg Ile Ser-Ser Ser Ser Gll' Leu
20 25
35 40
quot;
Gly Cys Lys Val Leu 1gt;.rg ely Gll' Cly ASp A1el quot;lo Lys Ser Glu Val 50 55 60
Ala His Argo Phe Lys ASp Leu Gly Glu Glu ASln Phe Lys Ala Leu Val 6S 70 7~; 80
Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tye Leu Gln Gln Cy~; Pro Phe elu Asp His SS 90 os
Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Alal Lys Thr Cy, Val Ala 100 105 110
Asp Clu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thlt; Leu Phe GIl' l1S 120 125
Asp Lys Leu Cys Thr Val Ale Thr Leu Aro Glu Thr Tyr Gly Glu Met 130 135 140
Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Clu Pro GJ u Aequot;'l Asn Clu Cys Phe Leu 145 150 155: 160
Cln Hia Lys Asp Asp Aso Pro Aso Leu Pro Arg Leu Val Acg Pro Glu 165 170 175
val Asp val He' Cys Thr Ala phe His ASp Aso Glu Glu Thlt; Ph. Leu 180 185 lOO
Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Aro¡ His: Pro Tyr Phe Tyr Ala 195 200 205
Plt;o Glu Leu Leu phe Phe Ala Ly, 1gt;.r9 Tye Lys: Al. Al. Phe Thr Clu 210 215 220
Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Le. Lau Pro Lys Leu Asp 225 230 235, 240
Glu Leu Aitquot;\1 Al;p Glu Gly Lys Ala SO!!r Ser 11.10. Lys Gln Arg L,..,u Lys 245 250 255
Cys Al a Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala, Phe Lys Ala T~ Ala 260 26gt; 270
val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala. Olu Phe Ala Glu Val 27' 280 285
Sér Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys V~l His Thr G lu Cys Cys His 290 2~5 300
Gly Asp Leu Leu alu Cquot; Ala Asp ASP Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr no 31' 320
30'
Xle Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys 325 330 335
Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser Cys Ile 11.111 Clu Val Olu Asn 340 345 350
quot;"
Asp Glu Met Pro Al a Asp Leu Pro Ser Leu Aia Ala gt;sp Phe val Glu
155 360 365
Ser Lys gt;s. val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly. ,quot;P Val Phe Leu 370 375 380
Gly Mee Phe Leu Tyr Glu Tyr Al a Arg Aro His Pro Asp Tyr Ser Val 385 390 395 400
Val Le u Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys 405 410 415
Cys Cys Ala Al. Alo Asp Pro His Glu ey. Tyr Ala Lys Val Phe Ao. 420 425 430
Glu Phe Ly. Pro Leu Val Glu Glv Pro Gln Asn Leu ne Lys G1n Asn 435 '40 445
ey. Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu 4SO 455 4quot;
Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu 465 470 475 480
Val Glu Val Ser ArO Aon Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys, Cys Cys Ly& 485 490 495
His Pro Glu Ala Lys Aro Met pro Cys ALA Glu ASp Tyr Leu Ser Val 500 505 510
Val Leu Asn Gln Leu Cys val Leu His Glu Lys Thr pro val Ser A5P 515 520 525
Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys 530 535 540
phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Gl u Thr Tyr Val Pro Lys Gl u Phe Asn 545 550 555 560
Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys 565 570 575
Glu Argo Oln n. Ly. Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His 580 585 590
LYll pro Lys Al. Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala VCll Mec Asp Asp Phe 595 quot;O 605
Al. Ala Phe val Glu Lys eys lt;yo Lys Ala Asp Asp Ly. Gl u Thr Cys 610 615 620
Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gl n Ala Ala Leu Ó2S 630 635 640
Gly Leu
lt;210gt; 334
lt;211gt; 639
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 334
Helt; Lys Trp Val Ser Phe tle Ser Leu Leu phE! Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Aon Pro Met: Tyr Aso Al. v.l Ser 20 25 30
..n Ala ASp Leu Mete ASp Phe Lys Asn Leu Lequot;:l ASp His Leu Clu Glu 35 'O 4S
Lys Melt; Pro Leu Glu A!lD ASP Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 50 55 60
Phe Lyo Asp Leu Gly Glu Clu Asn Phe Lys Alal Leu Val Leu Ue Ala 6S 70 7~, 'O
Phe Ala e l n Tyr Leu Gln Gln Cys pro phe Glu ASp His Val Lys Leu 85 90 95
Vlt;11 Asn Glu vill Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cy!!:: Val Ala ,quot;,p Glu Ser
100 105 110
Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Lel.ol Phe Gly Asp Lys Leu 115 120 125
eys Thr Val Ala Tnr Leu gt;rg Glu Thr Tyr Gly Glu Mer Ala Asp Cys 130 135 lOO
Cys Ala Lys Gln Glu 'ro Glu Argo Asn Glu Cy'!;i 'he Leu elo Bis Lys
145 . 150 lSS; 160
AS. Asp Asn Pro Asn Lcu Pro Arg LC!u Val Ar~r pro Glu Val Aop Val 165 170 175
Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn elu Glu Thx' phe Leu Lys Lys Tyr lOO lOS 190
Leu Tyr Clu lle Ala Arg Acg His Fro Tyr phE! Tye Ala Pro Glu Leu
195 200 205
Leu 'he Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala PhE' Thr Glu Cys Cys Gln 210 215 220
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Lau Pro Ly:s:
23, Lcu Asp Glu Leu Arg
225 230 240
Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Aro Leu Lys Cys Aquot; Ser
245 250 255
Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala, Trp Ala Val Ala Arg 260 265 270
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Aquot; Glu Phe Ala. Glu Val Ser Lys Leu
275 290 295
val Thr Asp Leu Thr Lys V.l Jlis Thr Glu Cys: eya Mis Cly ASp Leu 290 295 300
Leu Glu Cys Ala ASp ASP Ar9 Ala Asp Leu Al. Lys Tyr Ile Cys Glu
305 310 315 320
Asn Gln Asp Ser He Ser Ser Lys Leu Ly. Glu Cys Cys Glu Lys Pro 325 330 335
Leu Leu Glu LY' Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Aso Asp Glu MeC 340 345 350
Pro Ala AsO Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys A!lp 355 360 365
Val Cy. Ly. Asn Tyr Ala Glu Al. Lys Asp Val Phe Leu G!y Met. Phe 310 375 3.0
Leu Tyr Glu Tyr Ala Ar. Aro quot;e Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
3.5 390 395 400
Leu hrg Leu Al... Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 405 410 415
Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys 420 425 430
Pro Leu Val alu Clu Pro Gln Asn Leu 11e Lys Gln Aso Cys Glu Leu 435 440 445
Phe Glu Gln Leu Gly alu Tyr Lys Phe Gln Aso Ala LeU Leu Val Arg 450 455 460
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 465 470 475 4BO
Ser Arg Asn Leu ely Lys Val Cly Ser Lys Cys CyS Lys His Pro Glu 485 490 495
Ala Lys Arg Het. Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 500 505 510
Gln Leu Cys val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 515 520 525
Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 530 535 540
Leu Glu Val .l'.Sp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 545 550 555 560
Phe Thr Phe Hi9 .la ASO 1le Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Ar. Gln 565 510 575
1le Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Ly. Pro Lys
5.0 5.5 590
.1'.15 Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 595 600 605
val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Clu Thr Cys ?he Ala Glu 610 615 620
Glu Gly LY$ Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630 635
lt;210gt; 335 5 lt;211gt;639
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 335
Met .....ys Trp Val Ser Phe lle Ser Leu Leu ph€~ Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Axg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala Hi:!;1 Lys Ser elu Val Ala 20 30
quot;
Mis Arg Ph. Ly. Asp Leu Gly Glu Glu Aso Ph~, Lys Al. Leu Val Leu 35 40 45
.11e Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Glo e l n Cys Prcl Phc Glu Asp Hts Val 50 55 60
Lys LeU Val ASn Glu Val Thr Glu Phe Ala Ly,;; Thr Cys Val Ale Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ala Clu Aso Cys Asp Lys Ser Leu Hi~; Thr Leu Phc Gly Asp 85 90 95
Lys LeU Cys Thr Val Ala 'l'hr LeU Mt;I' Glu Thx' Tyr e1y Glu Met Ala 100 lOS 110
J\sp Cys Cys Ala Lys eln Glu Pr o elu Arg As~ alu Cy, Phe Leu eln 115 120 125
His Lys Asp Asp Asn PrO Aso Leu Pro Arij Leu Val Arg pro Glu Val 130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Aso elu elu Thr Phe Leu Lyo 145 150 155, 160
Lyo Tyr Leu Tyr Glu He Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Al. Pro 165 170 175
Glu Leu LeiJ Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lya Ala. Ala Phe Thr Glu (ys 180 195 ,.0
Cys eln Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu. Pro Lys Leu Asp Glu
,.5 Ala
200 205
Leu Ar. Asp elu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Ar. Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu eln LyS phe Gly Glu Arg Ala Ph. Ly, Ala Trp Ala v.l 225 230 235 240
Al. Art;l' Leu Ser eln Arg Phe Pro Lys Ala Glu. Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys LeU Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr elu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Ar~ Ala Asp Leu Ala Lys Tyr I le 275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cy9 Cys Glu 290 295 300
LY' Pro Leu Leu Glu Lys S@r His Cys 11e gt;l_ Olu Val Gl u Asn AsO 305 310 315 320
Glu Me' Pro Al" AsO Leu pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Olu Ser 325 330 335
LYs Asp Val Cy. Ly. Asn Tyr Ala Gl u Ala LY' Asp Val Phe Leu Gly 340 350
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Mct Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Al a Ala ASp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 3B5 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Clu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe eln Asn Ala Leu Leu 420 425 '30
vlIl Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gl. V.l Ser Thr Pro Thr Leu Val
.quot; quot;O quot;5
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lyo Val Cly Ser Lys Cy. Cys Lys quot; is 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg I':et Pro Cys Ala Glu AsO Tyr Leu Ser val Val 465 470 415 480
Leu Asn eln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu VlIl Asn Arg Arg pro Cys Phe 500 SOS 510
Ser Ala Leu Glu Val ASp Glu Thr Tyr val Pro Lys elu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala A~p Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg G1n Ila Lys Lys Cln Thr Ala LeU Val C1u heu Val Lys Bis Loys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASp Asp Lys Clu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe 610 615 620
Lys Asn Leu Leu ASp His Leu Glu Glu Ly$ Met Pro Leu Glu Asp 625 630 635
lt;210gt; 336 5 lt;211gt;646
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 336
Met Lys T~p Val Ser Phe Ile Se~ Leu Leu Phe Leu Phe Ser Se~ Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Aro Ser Leu Asp Lys Arg Glu Val Val p~o Pro Gln Val Leu 20 25 30
Ser Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Al. Al a Leu Ser Pro Leu Pro Glu 35 40 4S
Val pro Pro Trp Thr Gly Glu val Ser p~o Ala Gln Arg Asp Ala His 50 55 60
Ly. Ser Glu Val Ala liis Arg Phe Lys Asp Leu Gly Olu Glu Asn Phe 65 70 75 80
Lys Ala Leu Val Leu 11e Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Cln Cys Pro 85 90 9S
Phe G1u Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Clu Phe Ala Lys 100 105 110
Thr Cys Val Ala Asp Clu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hi n l1S 120 125
Thr ~u Pha Cly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu A~g C1u Thr 130 135 140
'l'yr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu pro Glu Arg Asn 145 150 155 160
Glu Cys pha Leu Cln His Lys ASP Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu 165 170 17S
val Arg P~o Glu Val ASp Val Mee Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu 180 18S 190
Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Lou Tyr G1u Ile Ala ArO Ar. His Pro 195 200 205
Tyr phe Tyr Ala Peo Glu Leu Leu Phe Phe Ala Ly. ArO 'l'yr Lys Ala 210 215 220
Al. Phe Thr Glu Cys Cy. Ol n Ala Ala Asp Ly. Al. Ala Cys Leu Leu 225 230 235 240
Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Ly~~ 1I.1a Ser Ser quot;. Lys 245 250 25gt;
Glo Arg Leu Lys Cys 1I.1a Ser Leu Gln Lyo PhEI Gly elu Ar. Al. Ph. 260 265 270
Lys Ala Trp Ah Val Ala Argo Leu Ser Cln Ar~r Plle Pro Lys Ala Glu 275 280 285
Ph. Ala Glu val Ser Lys Leu Val Thr Asp Le1,;, Thr Lys Val His Thr 290 295 300
elu Cya Cys Hi$ ely ..O Leu Leu Glu Cys Ah, Asp Asp Aro Ala Asp 305 310 3l~j 320
Leu Ala Lys Tyr Ile eys Glu Asn Cln AsO Ser Ile Ser Ser Lys Leu 325 330 335
Lys elu Cys Cys elu Lys Pro Leu Leu Clu Lys, Ser Mis Cys Ile 1I.1a 340 345 350
Glu Val elu Asn A~p elu Het Pro Ala ASp LelO Pro Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Asp phe V.l Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ah Clu Ala Lys 370 '75 '.0
Asp V., phe Leu Gly Mer Ph. Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg ArO' His Pro
3.5 390 39~; 400
ASO Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Al~, Lys Thr Tyr Glu Thr 405 410 415
.quot; Asp Prquot; His Glu Cy, Tyr AlaThr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala
420 430
Lys Val Phe ASP Glu Phe Lys Pro Leu Val eh, elu Pro eln Asn Leu 435 440 445
:Ile LyS Gln Asn Cys Glu Leu Plle elu Gln Leu Gly elu Tyr Lys phe
4SO 455 '60
Gln Asn Ala Leu Leu v.l Arg Tyr Thr Lya LYf' Val Pro Gln Va l Ser 465 4gt;0 47~¡ 4.0
Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser 485 490 quot;S
Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met: Pro Cys Ala Glu Asp 500 SOS 510
Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val. Leu Hi$ Glu Ly!l Thr 515 520 525
Pro Val Ser Asp Argo Val Thr Lys Cys Cys Thr Clu Ser Leu val Asn
530 535 540
Arg Aro Pro Cy$ Phe Ser Ala Leu Glu Val As¡=¡ elu Thr Tyr Val Pro 545 5SO 55Si 560
Lys Glu Ph e Asn Ala Glu 't'hr Phc Thr Phe His Ala Asp 11e Cys Thr 505 570 515
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu 580 585 590
Leu val Lyo His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val 595 600 605
Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp 610 615 620
Ly. Glu Thr Cys Phe Al. Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser 62S 630 635 640
Gln Ala Ala Leu Gly Leu 6lt;5
lt;210gt; 337
lt;211gt; 646
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 337
Mquot;, Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Al . 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys ~p Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
I l e Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His val 50 55 60
LyS Leu Val Asn Glu Val Th r Glu Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu ABn Cys ASP Lys Ser Leu His Thr Leu phe Gly ASp 8S 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 lOS 110
ASP Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Aso Gl u Cya Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp ASp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140
,quot;p V.l Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Gl u Gl u Thr Phe Leu Lys 145 lSO lSS 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile II.la 1\rg I\rg His P,o Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Ph. Ala Lys Arg Tyr Lys Al a Ala. phe Thr Olu Cys 180 18S 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cya Leu Le!,., Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Arg Agt;p Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ly.s: Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys 'he Gly Glu Arg Ala phe, Ly. Ala Trp Ala. Val 225 230 235. 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro LyS Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Le\.! Val Thr Asp Leu Thr Lys Val Hís Thr Glu Cys C,. Hís Gly 260 265 270
Asp Le\.! Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala ASIj:' Le\.! Al. Lys Tyr Ile 275 280 285
Cys elu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu LyS Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Ly. Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile AIl!l' Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315; 320
Glu Met Pro Ala A$p Leu Pro Ser Leu Ala Al.!!, ASP phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Al. Ly!: Asp Val 'he Leu Gly 340 345 350
Mer Phe Leu Tyr elu Tyr Ala Arg Arg His Pre. Asp Tyr Ser VOlI Val 355 360 365
Leu LeU Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr el \.! Thtquot; Thr Leu Glu Lys Cys 310 375 380
Cys Ala p.la Ala Asp Pro His elu Cys Tyr Al& Lys val phe ASp Glu 385 390 395gt; 400
Phe Ly. Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Glu Leu quot;e Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys phe, Gln Asn Ala Leu Leu .20 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln Val Serquot; Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu eIy Lys val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Me' Pro Cys Ala elu AS~, Tyr Leu Ser val Val 465 470 475, 48;0
LeU Asn GIn Leu Cquot; V.l Leu His Clu Lys Tht, Pro Val Ser Asp Aro .85 lt;90 495
Val Thr Lys Cys eys Thr elu Ser Lequot; Val quot;sn. Arg Arg pro Cy, phe SOO 50s 510
Ser Ala Leu Glu val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 51S 520 52S
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 53S 540
Aro Gln lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu val Glu Leu Val Lys His Lys
,lt;S 'SO SS, '60
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Al a Val Mee Asp Asp Phe Ala 565 570 S75
Ala Phe val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 SBS 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro Asn Glu Glu Ala 610 615 620
Oly Ala Ala Leu Ser Pro Leu pro Gl u Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu 625 630 635 640
Val Ser Pro Alo Gln Arg quot;S
lt;210gt; 338
lt;211gt; 629
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 338
Met Lys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu phe Ser Ser Ala 1 S 10 15
Tyr Ser Aro;¡' Ser Leu A!!p Ly!! Arg Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Lcu 20 2S 30
Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Aro Asp Ala His Lys 35 40 45
Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Lau cly Glu Glu Asn Phe Lys 50 55 60
Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Cln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe 'O ?S 80
Glu Asp His Val Lys Leu val Asn Glu val Thr Clu Phe Ala Ly• Thr
• S 90 OS
Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu ASn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr 100 lOS llO
Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr 115 120 125
Gly Glu Mee Ala ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Clu 130 135 140
Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu pro Arg Leu Val 145 ISO 15~; 160
Ar. Pro Olu Val AOp Val Met Cys Thr gt;la PhE' His ASP AsO Olu Olu 165 170 175
Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ilo Ale, Arg 1.r9 His Pro Tyr leo 18' 190
Phe 'I'yr Ala Pro Glu Leu Leu Phe I?he Ala Ly~¡ Ar9 Tyr Lys Ala Ala
19' 200 20;
Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Aap LY5 Al~L gt;la Cys Leu Leu Pro
210 215 220 ___ ~~u __ mu __ A~S__ __
~
225 230 2J~; 240 Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu eln Lys Phe Gly Clu Arg 11.1;:0 Phe Lys 245 250 255 Ala Trp Ala val Ala Arg Leu Ser Gln Arg PhE' O'ro Lys Al. Olu Phe
260 :165 270 Ala Glu Val Ser Lys Leu VIII Thr gt;00 Leu ThI: Lys Val His Thr Glu 275 280 295 Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala ASp As. Ar. Ala Asp Leu 290 29gt; JOO
Ala Lys TYr I la Cys Glu Asn Cl n ASp Ser 11E' Ser Ser Lys Leu Lys 305 310 315 320 Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Sel: His Cys Ile Ala Glu
325 330 335
Val Glu Aso Asp Glu Met pro Ala ASp Leu Prlt;) Ser Leu Ala Ala Asp 340 345 350
Phe Val Clu Ser Lys Asp val Cys Lys Asn Tyl: Ala Glu Ala Lys Asp 355 360 365
Val Phe Leu ely Met Phe Leu Tyr elu Tyr AH. Arg Aro:¡, Bis Pro Asp 370 375 380
Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Ly~¡ Thr Tyr elu Thr Thr 38' 390 J9~i 400
Leu elu Lys Cys Cys Ala Ala Ala ASP Pro Hl!1 elu Cys 'l'yr Al. Lys 405 410 415
Val Phe ASp Glu Phe Lys Pro Leu Val elu Glu Pro eln ....s n Leu Ile
420 42' 430
Lys eln Asn Cya elu Leu Phe Glu eln Leu Cl}' Glu Tyr Lys Phe Gln 435 440 44'
Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val. Pro Gln val Ser Thr 450 'S; 460
P,o Th:r Leu val Glu Val Ser Arg }l,sn Leu ely Lys Val Gly Ser Ly.4quot; 470 475 480.
Cyo Cys Lys His Pro elu Ala Lys Arg to:et P,O Cys Ala Glu Mp Tyr 485 490 495
Leu Se:r Val Val Leu ....sn G11quot;1 Leu Cy. Val Leu His Glu Lyo Th, P,o 500 505 510
val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg 515 52Q 525
Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys 530 535 540
e1u phe Asn Alquot; Glu Th, Phe Thr Phe Hia Al. Asp 11e Cys Thr Leu 545 550 555 560
Se, Glu Lys Glu Aro e1n Ile Lys Lys e1n Thr Ala Leu Val elu Leu 565 570 575
Val Lys Hia Ly. Pro Lys Ala Thr Lys C1u Gln Leu Lys Ala val Me, 580 585 590
Asp ASp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys 595 600 605
Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln 610 615 620
Ala Ala Leu Gly Leu 625
lt;210gt; 339
lt;211gt; 629
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 339
Met t.ys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu phe r,eu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Aro Ser Leu Asp Lys Arg Asp Al a His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys ASp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
~le Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu ASP His Val 50 55 60
Lys Leu Val quot;sn Gl u Val Th, Glu Phe Ala Lys Th, Cys Val gt;1. As. .5 70 75 80
G1u Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Lcu His 'Ihr Leu Phe Gly As. 85 95
quot;
Lys Leu Cys Th, Val Ala Thr Leu quot;. e1u Thr Tyr Gly e1u Holt; Al. 100 105 UO
ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu PI:O Glu Al:g Asn Glu Cys Phe Leu GIn
115 120 125
His Lys ASO Asp Asn PI:O Asn Leu PI:O Al:g Lel,:l Val Ar. pro Glu Val 130 135 140
AsO val Met Cys Thr Ala Phe His ASp Asn Glo Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155· 16O
Ly, Tyl: Leu Tyl: Glo 11. Ala 10,.(9 Arg Mis Preo Tyr phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe AIll Lys Arg Tyr Lyo Ala. Ala Phe Thr Glu Cys 180 '.5 19O
Cys Gln Al. Ala Asp Lys A.la Ala ey, Leu LeUl pro Lys Leu J\sp Glu 195 '00 '05
Leu Ar. Asp Glu Gly Lys Ala 5.r Ser A.la Lys: Gl. Ar. Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala PhE! Lys Ala Trp Ala Val
225 230 240
'quot;
Ala Ar9 Leu Sel: Gln Ar9 Phe Pro Lys Al. Gll,:1 Phe Ala Glu Val Sor 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lye V.l His Thz' Glu Cys Cy. uis Gly
'60 270
'quot;
}\SP Le... Leu 01, Cys Ala Asp Asp Arg Ala As,quot; Leu Al. Ly, Tyr Ile 275 '.0 285
Cys Glu quot;n Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Le\:! Lys Glu Cys Cys Glu 29O 'OS 300
Lys Pro Leu Leu Glu Ly. Ser His Cys Il. Al. Glu Val Glu Asn AsO 305 310 31$ 320
Glu Me' Pro Ala As. Leu Pro Ser Leu Ala Al. Asp Phe Val Glu Sor 325 330 335
Lys ASp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Olu Ala Lys' ASp val phe Leu Gly 340 345 350
Y.et Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Ar. Mis Preo Asp Tyr Ser Val Val 355 36O 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Th¡:' Thr Leu Glu Lys Cys )70 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp pro His Glu Cys Tyr Al. Phe Asp Glu
Lys val
385 390 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leult; IIe Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Glu Leu phe Clu Gln Leu Cly Clu Tylt; Lys Phe, Gln Asn Al. Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Cln Vquot;quot;l Ser Thr Pro 'rh.r Leo Val 435 440 ~45
alu vol Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser quot;y. ey. Cys Lys Mis 450 455 460
Pro alu Ala Lys Arg Me' quot;,o Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 47' 480
Leu Asn Cln Leu ey. Val Leu Mis Glu quot;ys Tnr Pro Val Ser A,p Ar. 485 490 49S
Val Thr Lys Cy. eys Thr Clu Ser Leu val Asn Arg Ar9 Pro Cy. Pne SOO 50S 510
Ser Ala quot; eu alu Val Asp Glu Tnr Tyr val Pro Lys Glu pne Asn Ala 520 '25
51'
Glu Tnr Pne Thr Phe tlis Ala Asp 1le Cys Thr quot;eu Ser Gl u Lys Glu 530 53' 540
Arg Cln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys Mis Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Al. Phe Val Glu Ly. Cys Cys Lys Ala Asp ASp Lys Glu Thr Cy. Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lygt;l Leu val A,quot; Ala Ser Gln Al. Al. Leu Gly 59' '00 60S
,,quot;u Ser Ser Asp Arg Ser Ala quot;eu Leu Lys Ser quot;ys Leu Ar9 Ala Leu 610 620
'quot;
Leu Thr Ala Pro Arg 625
lt;210gt; 340 lt;211gt;631
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 340
Met Lys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu ASP Lys Ar9 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly 20 25 30
Leu Lys Leu Asp Ar g 11e Gly Ser Met Ser Cly Leu Gly Cys ASP Ala 3S 40 4S
Mis Lys Ser Glu Val Ala Mis Ar9 Phe Lys Asp Leu Gly Clu Glu Asn 50 55 60
Phe Lys Ala Leu Val LeU Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys 65 10 15 80
Pro Phe Glu Asp Kis Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Clu Phe Al. as 90 95
Lys Thr Cys vd Al. Asp Glu Ser Ala Clo Asn Cys Asp Lye Ser Leo '00 lOS 110
His Thr: Leo Phe Gly Anp Lys Leo Cy. Thr Val Ala Thr Leo Aro¡¡ Gl u 115 120 125
Thr Tyr Cly Glu Met Ala Asp Cye Cys Ala Ly.!E: Cln Clo Pro Glu Arg 135 140
quot;O
Asn Clo Cys Phe Leu Cln His Lys Asp Asp Asn Pro ASI'I Leu Pro Arg 145 ISO l.S~i 160
Leo Val Arg Pro C1u Val Asp Val Mee Cy. Thl: Ala Phe His¡; a.p Asn
165 quot;O quot;5
Glu Glu Thr phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu :Ue Ala Arg Arg Kis 'quot; 185 190
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe:. Ala Lys Arg Tyr Lyfl 195 200 205
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala As);gt; Lys .1\.180 Ala Cys Leu 210 215 220
Leo Pro Lys Leu Asp G1u Leu ArIO Asp Gl u Gly Lys Ala Ser Ser Ala 225 230 21S 240
Lye Gln Arg Leu Ly. Cy. Ala Ser Leu Cln Ly.!E: Phe Gly Glu Arg Al a '45 250 255
Phe Ly!i Ala Trp Al. Val Ala Ar q Leo Ser Gln Arg Phe Pro Lyo Al.
26' 270
'quot;
Glu Phe Ala C10 Val Ser Lys Leo Val Thr As¡:) Leu Thr Ly. Val His 275 280 285
Thr Clo Cye Cys HiG Gly Aap Leo Leu Glu Cy~: Ala Asp ASp Aro;¡' Ala 290 quot;S 300
A,p Leo Ala Lys Tyr Ile ey, Glu Asn Gln As;quot; Ser lle Ser Ser Lyo 305 310 llS 320
Leo Lys Glu Cys Cy, Clo Ly, Pro Leu Leo Glu Lye Ser His Cye Ile 325 330 335
Al a Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala As¡;o Leu · Pro Ser Leu Alquot;quot; 34' 345 3SO
Al a Asp Phe val Clu Ser Lys Asp Val Cys LyS: Asn Tyr: Ala Clu Ala 355 360 365
Asp Val Phe Leu Gly Me' Phe Leu Tyr GIUl Tyr Ala 1\.r:g Arg His
370 315 3quot;
Pr:O .l\.sp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Aro Al a Lys Thr Tyr Glu 385 390 40'
Thr Thr LCU Glu Cyo Cys CY!J Ala 1'.la Al. ASP Pro His Glu eys Tyr 'OS 010 OlS
Ala Lys Val 'he AsO Glu Phe Lys Pro Ceu Val Glu Glu 'ro Gln Asn 430
'" 'quot;
Leu Ile Lys Gln As n Cys Glu Leu 'he Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 43S 44O 445
'he Gln Asn 1\la Leu Leu Val Aro Tyr Thr Lys Ly. Val Pro eln val 45' 45S 46'
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Ceu Gly Lys Val Gly 465 470 475
'quot;
Ser Lys Cys Cys Cya Hia Pro Glu Ala Cya ArO Met: Pro Cys Al. Gl u .8S
49' 49'
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys val Leu His Glu Lys 500 SOS 510
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Sl5 520 525
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 530 535 540
Pro Lys Glu Phe As n Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala ASp I le Cys 545 550 555 560
Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 565 570 575
Glu Leu Val Lys His Ly9 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala 580 585 590
val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp 595 600 60S
ASp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Al. Ala 610 615 620
Ser eln Ala Ala Leu Gly Leu 625 630
lt;210gt; 341 lt;211gt;631
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 341
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Al~ 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Gl u Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys ASP Leu Gly Glu Glu Aso Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
11e Ala Phe Ala Oln Tyr Leu Gln Gln Cys PX:Q 'he Glu Asp Híe Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn olu val Thr olu Phe Ala Ly~1 Thr Cys Val Ala AsO 65 70 ,-80
-
'
elu Ser Ala Glu ..n eys Asp Lys Ser Leu Hi~: Thr 1,eu Phe ely 'quot;O 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Aro Glu Th:rquot; 'I'yr Gly elu Het Ala 100 105 110
Asp Cys ey. Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asr. Olu Cys Phe Leu Oln 115 120 12'
His Lys Aep Asp Aso Pro Aso Leu Pro Ar9 Leu Val Arg Pro Glu Val 130 13S lOO
As p Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Aso Glu Glu Thr Phe Leu Lys 14S ISO lS~ 160
Lys 'I'yr Leu Tyr elu 11. Ala Arg Aq¡ His Prcl 'lYr phI!! Tyr Al. 'ro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe 'he Ala Lys ArO' Tyr Lys 11.1& Ala Phe Thr elquot; eys 180 185 190
Cys Gln Al. Ala Asp Lys Ala Ala eys Leu Leu Pro Lyo Leu Asp Glu 195 200 20S
Leu Arg A.o Olu Gly Lys Al. Sar Ser AIquot;,-LYIiI: eln Arg L~u Lys Cys 210 215 220
Al. Ser Leu Gln Lys Phe ely Glu Arg Ala Pha, Lys Ala Trp Ala Val 225 230 23gt; 240
Ala Arg Leu Ser eln ArO Phe Pro Lys Ala elu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu val Thc Asp Leu Thr Lys Val His Thrquot; Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala As,_ Leu Ala Lys Tyr: Ile 275 280 2.5
Cys Glu Asn Gln Asp Ser 11e Ser Ser Lys Leu Lys Glu C'ys Cys Glu 290 295 300
Ly. Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys tle Ala Glu Val Glu. Asn ASp 30S 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala. ASp Phe Val Ser 325 330
Lys ASP Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gl y
3lt;0 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Jt.rg His Pro· Asp Tyr Ser Val val ]55 360 365
Leu Leu Leu ~rg LeU Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Al. Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp alu 385 390 395 400
phe Lys Pro Leu Val elu Glu Pro Gln ASn Leu Ile Lys Gln Asn Cya 405 110 415
Glu Leu Phe alu aln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu LeU 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Ly.!l Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
elu Val Ser Arg Asn Leu aly Lya val Gly Ser Lya Cys Cys; Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala I..ys Arg-Met Pro Cys Ala Gl u Asp Tyr Leu Ser VlIl Val 465 470 475 480
Leu Asn Glo Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 4B5 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 50S 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr val Pro Lys Olu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Glo Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 S8S 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 60S
Leu Gly Leu Ser Lys G1y Cys Phe G1y Leu Lys Leu Asp Arg Ilc Gly 610 615 620
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
625 630
lt;210gt; 342
lt;211gt; 647
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 342
Met Lys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg ser Leu ASP Lys Arg Glu Val Ly~; Tyr Asp Pro Cys Phe 20 2S 30
Gly liie Lys Ile Asp Arg Ile Asn liis val Ser Asn Leu Cly Cys Pro
.,
35 40 Ser Leu Aro AsO Pro A1:quot;g ero Asn Ala pro Sel' Thr Ser Ala Asp Ala 50 SS .0
His Lya Ser Glu val Al. His Aro Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn .5 70 7S, .0 Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Al. Gln Tyr Leu Gln Gln eya
.5 .0 95 Pro Phe Glu Asp Hi~ val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala 100 105 110 Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys ASp Lys Ser Leu 115 120 125 liiS Thr Leu Ph~ Cly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg G1u 130 135 140
Thr Tyr ely G1u Met Ala Asp Cys Cys Ala Ly.s; Gln Glu Pro Glu Arg 10;5 150 15S 160 Asn G1u Cys phe Leu Gln Hie Lys Asp AsO 11.5111 pro Asn Leu Pro Arg
,.5
170 175
Leu Val Arg Pro Glu Vol Asp val Met lt;:ya Thl:' Ala Phe Hia 180 190
,.5
Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glul Ile Ala Arg Arg His quot; 5 200 205
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe, Ala Lys Ar9 Tyr Lys 210 215 220
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala ASp Lye Ala Ala Cys Lcu 225 230 235 240
Leu Pro Ly¡¡; Leu Asp Glu Leu Argo ASP Glu Gly' Lys Ala Ser Sel: Ala 245 2S0 2SS
Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe ely Glu Arg Ala 260 265 270
Phe Lys Ala Trp Ala val Ala 11.1:quot;9 Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala 275 280 2.5
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu val Thr Asp Leu Thr Lys Val His 290 295 300
Thr Glu Cys Cys His Gly ASP Leu Leu Glu Cys Ala Asp A9P Arg Ala 30S 310 315 320
ASP Leu Ala LyS Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys 325 330 335
Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys p~o Leu Leu Glu LyS Ser His Cys 11e 340 345 350
Ala Clu Vol Glu Asn Asp Glu Mer Pr o Ala ASp LeY Pro Ser Leu Ala 3SS 360 365
Al. Asp ph. Val Glu Ser Ly, Asp Val Cys Lys A.n Tyr Ala Glu }gt;'la 370 375 380
Lya Aop Val Phe Leu Gly y.et Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His 385 390 400
'quot;
pro Asp Ty~ Ser val val Leu Leu L.eu Ar. Leu Ala Lys Th~ Tyr elu 405 410 415
Th~ 'I'hr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Al. Ala Asp Pro His Gl u ey. Tyr 420 425 430
Ala Lys Val Ph. ASP Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln ABn 435 440 445
Leu lle Lys Gln As n Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 450 455 460
Phe Gln Asn Ala Leu Leu val Arg Tyr Thr Lys Lys Val pro Gln Val 465 470 475 480
Ser Thr Pro Thx Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 465 490 495
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Al~ Lys Arg Mot Pro Cyn Ala Clu 500 505 510
Asp Tyr Leu Ser Va.l Val Lou Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys 515 520 525
Thr Pro Val Ser Asp ArO val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu val 530 535 540
Asn Arg Arg Pro Cys phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 545 550 SS5 560
Pro Lys Glu phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lle Cys 565 570 515
Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 580 585 590
Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala 595 600 605
Val Me~ ASp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys LyS Ala Asp 610 615 620
Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala 625 630 635 640
Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 645
lt;210gt; 343
lt;211gt; 647
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 343
Mel Lys Ttquot;p Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phc~ Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
'l'Yr Ser ArO S.r Leu Asp Lys Ar9 A,. Ala Hl:!:; Lya Ser Glu val Ala 20 25 30
His Arg Phe Ly. ASp Leu Gly Glu Glu Asn PhE~ Lys quot;a Leu val Leu 35 40 45
11e Ala Phe Ala eln Tyr Leu eln Gln Cys Prc. Phe Glu ASp His Val 50 55 60
Ly. Leu VAl Asn Clu Val Thr elu Phe Ala Thr Cys Val Ala Asp 65 70 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu HieL Thr Leu phe Cly Asp 85 90 9S.
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Are¡ Glu Thr;quot; Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 HO
ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu pro Glu Ar9 Asrll elu Cyo Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro 1gt;.r9 L8~ val 1'.r9 Pro Glu val 130 13S 140
A •• val Met Cys Thr Ala 'he His ASP Asn elu elu Thr phe Leu Ly. 145 lSO lsS 160
Ly, 'J'yr Le\! Tyr elu lt;l, Ala Arg Arg His. freo Tyr Phe 'l'yr Ala quot;,o 165 170 175
Glu Leu Leu ,h, ,h, Ala Lys Arg Tyr .y. Ala, Ala 'he Thr elu Cy, 180 185 190
Cys eln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Arg Asp elu Gly Lys Al, Ser Ser Ala Lys; eln Arg Leu Lys Cyz 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Ly$ 'h. Gly Glu Ar'ij' Ala Phe .y. Ala Trp Ala val 225 230 235, 240
Ala Ar'ij' Leu Ser Gln Arg Phe Pro 'Lys Ala elu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys val His Thr' Glu Cys Cys Hia Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp ArO Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 11e 275 2BO 2.5
Cy. Glu Asn Gln AsP Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gl u 2'0 295 300
Lyo Pro Leu Leu Glu Ly. Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn As. 305 310 315 320
Olu Met pro Ala AS. Leu Pro Ser Leu Al. quot;. AsO' Phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp val Phe Leu ely 340 345 350
Met Phe Leu Tyr Gl u Tyr Ala Arg ArQ His Pro ASp Tyr Ser Val val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 315 380
Cys Ala Ala Ala Aop Pro His Gl u Cys Tyr Ala Lys Val Pbe Asp Glu 385 390 395 400
Phe Lys pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu tle Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Clu Leu Phe Glu Gln Leu ely Glu Tyr Lys phe eln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln Val ser Thr Pro Thr Leu val 435 440 445
Glu val Ser Arg Asn Leu ely Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 4SS 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 465 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arq Pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Clu Val Asp Glu Thr Tyr val pro Lys Glu phc Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr phe His Ala Asp lle Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 5lS 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met ASp ASp Phe Al a 565 570 575
Ala Phe val Glu Lya Cys Cys Lys gt;1. As. Asp Ly& Clu Thr Cys Phe SBO 585 590
Ala Glu Glu Oly Lys Lys Leu Val Al. Al a Ser Gln Ala Al. Leu Gly 595 600 60S
Leu Glu val Lys Tyr Asp Pro Cys Phe Gly His Lys 11e Asp AT9 lle
610 615 620
Asn His Val Ser Asn Leu Gly Cys Pro Ser Leu Arg ASP pro Arg pro 625 UO 635 640
Asn Ala Pro Ser Thr Ser Ala 645
lt;210gt; 344 5 lt;211gt;642
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 344
Melt; Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Gly Ser Leu A9p Lys Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser 20 25 30
Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met ASP Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu 35 40 4~
Gly Cys Lys val Leu Arg e l y ely Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val SO SS 60
Ala Kis Arg Phe LyS Asp Lcu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Lcu Val 65 70 75 80
Leu Lle Ala Phe A~a Gln Tyr Leu Gln Gln Cys pro Phe Glu A$P His 65 90 95
val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala 100 105 110
Asp Glu Ser Ala Olu Asn Cys Asp Lys Ser Le u His Thr Leu Phe e ly l IS 120 125
ASp ~ys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly G1u Met 130 135 140
Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 145 ISO 155 160
Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu 165 170 175
Val A$p Val Y.et Cys Thr Ala Phe His Asp Asn 01u Glu Thr Phe Leu 180 185 190
Ly5 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg lIis Pro Tyr Phe Tyr Ala 195 200 205
Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu 210 215 220
Cys Cys eln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp 225 230 235 240
Glu Leu Arg ASp Glu Gly Ly¡¡ Ala Ser Ser Ahl Lys Gln Arg Leu Lys 245 250 255
Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Olu Ar. 1'.18' Phe Lys Ala Trp Ala 260 265 270
Val Ala Arq Leu Ser Glo 1'.rg ehe Pro Lys Ala Glu phe Ala Glu Val 2quot;
280 285
Selt; Ly. Leu Val Thr 1\Sp Leu Thr LyS Val HÜI Thr Olv Cys Cys His 2'0 295 300
Gly Mp Leu Leu GIu Cys Ala Asp 1\sp 1\rg Ala ASp Leu Ala Lys Tyr 305 310 3lS¡ 320
11e Cys Glu Aso Gln Asp Ser Ile Ser Ser Ly~; Leu Lys Glu Cys eys 325 330
'quot;
GIu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys IIE! Ala Glu Val Glu Aso 340 345 quot;0
Asp Glu Met. Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu A18l Ala Asp Phe val Glu
355 360 365
Ser Lys Asp Val Cys Lys 1\sn Tyr Ala Glu Ah, Lys Asp Val Phe Leu 370 ]75 380
Oly Het Phe Leu Tyr Clu Tyr Ala Arg Arg HiJ¡: Pro ASp Tyr Ser val 385 390 39$ 400
Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Ly$ Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Olv Lys 405 410 415
Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro Mis GIu Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp 420 425 430
Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Gl u Pro Gln ASI1L Leu Ile Lys Glo Aso
435 440 445
eyo Glu Lsu Phe Glu Gln Leu Oly Glu Tyr Lys: Phe Oln Asn Ala Leu lt;SO lt;SS 460
I,eu Val Mil Tyr Thr Lya Lys Val Pro Gln Val. Ser Thr ?ro Thr Leu 465 47O 475, 480
Val Glu Val Ser Ar. As· Leu Gly Lys Val Gh' Ser Lys Cys ey. Lys 485 49O 495
His Pro Glu Ala Lys 1'.rg Mct Pro eys Ala Glu 1\sp Tyr Leu Ser Val 500 505 510
Val Leu Asn eln Leu Cys Val Lev His Glu LYliL: Thr Pro val Ser J\sp 515 520 525
Ar. Val Thr Lys Cys Cys Thr Olv Ser LeU Val Asn Arg Arq Pro Cys 530 535 540
Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Tnr Tyc Val Pro Lys GIu Phe Asn 545 SSO SSS 560
Ala Glu Thr Phe Thc Phe His Ala A$P !le Cys. Thr Lcu Ser Glu LY'
565 570
Glu Arg Gln ne Lya Lys GI n Thr Al. Leu Val Glu Leu Val Ly. His 580 585 590
Lys Pro Lya Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Hquot; As. Asp Phe 595 600 60S
Ala Ala phe Vquot;l Glu Lys ey. eya Lys Ala Asp Asp Lya Clu Thr Cys 610 61S 620
Phe Ala Glu Glu ely Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu 625 6JO 635 640
Gly Leu
lt;210gt; 345
lt;211gt; 638
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 345
Met Trp Trp Ar9 Leu Trp Trp Lcu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
PrQ Met val T~ Ala Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gl y Cys Phe 20 2S 30
Gly Arg Gly Mee Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys 35 40 45
Val Leu Arg Arg His Asp Ala H~s Lys Ser Glu Val Ala His Arq Phe 50 55 60
Lys As. Leu Cly Glu Glu .,n Phe Lys Ala Leu Vel Leu Ile P.la Phe 65 70 75 80
Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro phe Glu Asp His Val Lys Leu Val 85 90 9S
Asn Glu Val Th, Glu Phe Ala Lys Th, eya Val 1'I1a A5P Glu Se, Ala 100 lOS UO
Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Mis Thr Leu Phe Cly Asp Lys Leu Cys 115 120 125
Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp CyS CyS 130 135 140
Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn G1u Cys Phe Leu Gln His Lys Asp 145 150 155 160
Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp val Met 165 170 175
Cys Thr Ala Phe HLS Asp Asn G1u Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu 1BO lBS 190
Tyr G1u lle Al a Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala pro Glu Leu Leu 195 200 205
quot;he quot;he Ala Lys A~g Tyr Ly. Ala Ala Phe Thl: Glu Cys Cys Gln Ala 210 215 220
Ala AsO Lys Ala Ala Cy. Leu Leu Pro Lys Let.! AsO Glu Leu Arg AsO 225 230 2)~; 240
Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Cln Arg Let.l Lys Cys Ala Ser Leu 245 250 255
Cln Lys Phe ely Glu Are¡ Ala Phe Ly. Ala Tr-p Ala Viii! Ala Arg Leu 260 265 270
Ser Cln Arg Phe Pro Lys Ala Clu Phe Ala GltL val Ser Lys Leu Val 275 200 285
Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu
290 29' 300
Glu Cy. Ala Asp Asp Ala Asp Leu Ala loyquot;: Tyr Ile Cys Glu Asn 30' 'quot;310 31S 320
Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cyt:: Cys Glu Lys Pro Leu 325 330 335
LCu Clu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Mer Pro 340 345 350
Ala ASp Leu Pro Ser Leu 1I.l a Ala Asp Phe Val. Clu Ser Lys Asp Val
355 360 365 Cys Lys ASD Tyr Ala Gll,l Al. Lys Asp val PhE~ Leu Gly Met: Phe Leou
no n, 380
Tyr Glu Tyr Ala Porgo Are¡ His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Léu Leu 385 390 39~; 400
Aro Leu Ala Lys Thr Tyr Clu Thr Thr Leu elu Lys Cya Cys Ala Ala 405 410 .15
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val ph¡¡;! Asp Glu Phe Lys Pro
120 425 430
Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Aso Cys Glu Leu Phe 435 440 445
Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Le u val ArO Tyr
450 4SS lt;6,
Thr Lys Lys Val pro Gln Val Ser Thr Pro Leu Val Glu val Ser 465 lt;70 480
Arg Asn Leu Gl y Lys Val Gly Ser Lys Cy. Cys: Lys His Pro Glu Ala 48' 490
4quot;
Lys Arg Mer: Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln 500 50S 510
Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val SetO l\sp Arg Val Thr Lys
515 520
'2'
Oy. ey. Thr Glu Ser Leu Val Asn A'l'(J ArQ pro eys Phe Ser Ala Leu 530 535 540
Glu V.l Asp Olu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe quot;n Al a Glu Thr Phe 545 550 555 560
Thr pho His Ala Asp 11. Cys Thr Leu Ser Glu LyD Glu Arg Gln ne 565 S70 575
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 580 S8S 590
Thr Lys Gtu Glo Leu Lys Ala Val Met ASP Asp Phe Ala Ala Phe Val 595 600 605
Olu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASp LyS Gl u Thr Cys Phe Ala Glu Glu 610 615 620
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Al a Leu ely Leu 625 630 635
lt;210gt; 346 lt;211gt;641
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 346
Met Lys Trp Val Ser Phe t le Ser Leu Leu Phe Lea Phe Sor Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Ser Pro Lys Met Val eln Gly Ser 20 2S 30
Gly Cys Ph. Gl, Arg Gly M8t gt;op Ar. Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu 35 40 45
Gly Cyo Ly. Val Leu Arg Arg His ASP Ala His Ly. Ser Clu Val Ala 50 SS 60
His Arg phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu 65 70 75 80
rle Ala Phe Ala eln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Gl u ASp His val 85 90 95
Lys l.e\.! Val Asn Gl u Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 100 105 110
Glu Ser Al . Glu Asn Cys Asp Lys Se, Leu His Thr Leu Phe Gly Asp ll5 120 125
Ly. Leu ey. Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 130 135 140
ASP eys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu lu:g Asn Glu Cys Phe Le\.! Gl n 145 I SO 155 160
His Lys ASp Asp Aso Pro Asn Le\.! Pro Arg Leu Val Arg Pro Gl\.! Val 165 170 liS
Asp val Met Cya Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 180 lOS 190
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Ar. Ar. His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 195 200 20S
Glu Leu Leu phe phe Ala Lys ArO 'l'yr Lys AhL Ala quot;he Thr Glu Cys 210 2iS 220
Cyo Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp
.'u
22S 230 235 240
Leu Arg Asp Glu Oly Lys Ala Ser Ser Ala Ly~; Gln Arg Leu Lys Cys 24S 250 25S
Al a Ser Leu Gln Lys Phe Cly Glu Arg Ala PhE~ Lys Ala Trp Ala Val quot;O
265 270 Ala Arg Leu Ser eln Arg phe Pro Lys Ala Gl1,:L Phe Ala Glu Val Ser 275 280 lBS Leu val Thr Asp Leu Thr Lys Val Hls Thl: Glu Cys Cys Hi.9 ely 290 295 '00 ASp Leu Leu Glu Cys Ala ASp Asp Aro Al8 ASp Leu Ala Lys Tyr ne
,Ogt; 310 315 320 Cys Glu Asn eln Asp Ser 11e Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 325 330 335 Lys Pro Leu Leu Gl u Lys Ser His Cys 11e AlaL Gl u Val Glu Asn AS);gt; 340 345 350 Clu Mct Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala AlaL Asp Phe Val Glu Ser 35S 360 365 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala LY5' ASp Val Phe Le u Gly 310 315 380
Me' Phe Leu 'I'yr elu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser val Val 385 390 395 400 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr .'u Thr Thr Leu elu Lys Cys
'05 410 lt;15 Cys Al a Ala Al. Asp pro His Glu Cyo Tyr Al. Lys Val Phe ASp Glu 420 425 430 Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Cln Asn Leu 11e Lys Gln Asn Cys
43' 440 445
Glu Leu Phe Glu Clo Leu Gly Glu 'l'yr Lys Phe Oln Aso Al a Leu Leu 450 455 460
Val Ar9 Tyr Thr Lys Lys Val pro eln val Ser Thr Pro Thr Leu Val 46S 470 475 480
Glu Val Ser 1I.rg 1I.sn Leu Gly Lys Val Cly Ser Lys Cys Cys Lys His 485 490 495
Pro Glu Ala Lys A~g Mee Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 500 505 510
Leu A,sn Oln Leu Cys Val Leu His olu Lys Thr Pro Val Ser ASP Arg'15 520 52' Val Thr Lys Cys Cys Thr Olu Ser Leu val Asn Aro ArO Pro Cys quot;he 530 535 540
Ser Al. Leu Glu Val Asp Olu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Aquot; 545 SSO 555 560
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 565 570 575
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 580 585 590
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lya Ala Val Met quot;p quot;0 phe Ala '95 600 60S
Al. Phe Val Glu Lys Cys Cyo Lya Ala Asp Asp quot;,s Glu Thr Cys Phe 610 61S 620
Al. Glu Clu Gly Lys Ly. Leu val Ala Ala Sar Oln Ala Ala Leu Oly 625 630 635 640
Leu
lt;210gt; 347 lt;211gt;641
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 347
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Se~ Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Gly Ser Leu Asp LyS Arg Ser pro Lys Het Val Gln Gly Ser 20 25 30
Gly Cys Phe Gly Arg Gly Met ASO Ar9 Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu 35 40 4S
Gly Cy. Lys Val Leu Arg Aro His .l\.sp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 50 55 60
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 65 70 75 80
~le Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 85 90 95
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Pne Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 100 105 110
Glu Ser .l\.la Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu ..he Gly ASp 115 120 125
Lys Leu Cys Thr Va l Ala Tnr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
130 135 140
Agt;p Cya Cys Ala Lya G1n Glu Pro Glu A.rg Asn Glu Cy. phe Leu G1n 145 150 lSS 160
]-lis Lys Asp Asp A9n Pro Asn Leu Pro Ar. LEn, Val Arg Pro Glu val 165 110 175
Asp Val Met Cya Thr Ala Phe His quot;p Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lya 180 185 190
Lys Tyr Leu Tyr Glu 11e Ala Ar. 1\1:9 His Pro Tyr phe Tyr Ala Pro 195 200 205
G1u Leu Leu Phe Phe Ala Lyo Arg Tyr Lys Al~l Ala Phe Thr Glu Cys 210 215 220
Cya G1n Ala Ala Asp Lya Al. Ala cys Leu Lequot; Pro Lya LeU ....sp Glu 225 230 23S 240
Leu Arg Asp Olu G1y Lya Ala Ser Ser Ala LyB Cln Arg Leu Lya Cya 24gt; 250 255
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Ph~! Lyii Ala T:r;p Ala Val 260 265 270
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Gl u phe Ala alu Val Ser 27S 280 285
Lys Leu Val Thr ASP Leu Thr Lys Val His Thl; Glu Cys Cys His cly 290 295 300
AsO Leu Leu Glu Cys Ala Aso ASp Arg 1\.18 Asp Leu Ala Lys Tyr ne 305 310 31~¡ 320
Cys clu Asn cln Aso Ser 11e Sf'!r Ser Lys Lell Lys Glu Cys Cyo Glu 325 330 33'
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys !l. Alu Glu val Glu Asn ASo 340 34gt; 350
Olu Het Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al~. Asp Phe Val Clu Ser 355 360 365
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala LY~I Aso val Phe Leu Gly
370 375 380
Mee Phe Leu Tyr Glu Tyr Al. Arg Aro His Prcl Aso Tyr Ser Val V.l 385 390 39~; 400 Leu Leu Leu Aro Leu Al. Lys Thr Tyr Glu Thl: Thr Leu Glu Lya CYO
.., 410 415
Cys Ala Ala Al. Aso Pro His Glu Cy' Tyr Al~L Lys val Ph. Aso Glu 420 425 430
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile LyS Gln Asn Cys 435 440 445
Glu LCu Phe Glu Gln Leu G1y Glu Tyr Lys PhE~ Gln Asn Ala Lcu Leu
450 .55 460
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 465 410 415 460
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys Hi. '.5 490 'OS
Pro Glu Al.. Ly. Aro Me' Pro eys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
500 505 510
Leu A!!In Gl n Leu Cye Val Leu lIis Glu Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg 515 520 525
V.1 Thr LyS Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg ArO Pro Cys Phe 530 535 540
Ser Al. Leu Glu Val A,. Glu Thr Tyr Val Pro LY' Glu Phe Asn Al. 545 550 555 560
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lle ey. Thr Leu Ser Glu Ly. Glu 565 570 5quot;
Aro Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu val Lys His LyS 560 585 590
Pro Ly Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 595 600 605
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 610 615 620
Ala Glu Glu Gly Lys Lys L~u Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 625 630 635 640
Leu
lt;210gt; 348 lt;211gt;641
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 348
Mct Lys Trp Val Ser Phe lle Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 S 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
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ne Al. Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys pro Phe Glu ASp lIis Val 50 55 60
Lyo Leu Vel Asn Glu v.l Thr Glu Phc Ala Lyo Thr Cys Val Ala ,quot;p 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn eyo Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arq Glu ThI: Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys eln alu p~o Clu Arg Asn Clu Cys Phe Leu Gln ll5 120 125
His Lys Jt.,quot;p AS!, Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu Val 130 135 1(,0
Asp Val Met Cys Thr Al. Phe His Asp Asn Clu Glu Thr Phe Leu Ly~ 145 150 15~ 160
Lys Tyr Leu T'yr Glu rle Ala Arg Arg His Fre, Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Pbe Ala Lys Arg Tyr Lys Al& Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
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Leu A~g Asp Glu Gly Lys Al. Ser Ser Ala Lys, Gln Arg Leu Lys lt;=Ys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe, Lys Ala Trp Ala Val 225 2'0 235. 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val Hia Thl;quot; Glu cys Cya His Gly 260 265 270
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Glu Me!: Pro Al.!!. ASP Leu Pro Ser Leu Ala Ala. Asp Phe Val Glu Ser )25 no ))5
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Met Phe Leu TYr elu TVr Ala Arg Aro His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Ly$ 'l'hr Tyr elu 'l'hr Thr Leu elu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His elu Cy$ Tyr Ala Lys Val Phe A$P elu
385 390 '95 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu tle Lys Gln Asn Cys 40S 410 415
elu Leu Phe elu Gln Leu ely elu Tyr Ly. Phe Gln Asn Al. Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 44. 445
elu Val Ser Ar9 Asn Leu ely Ly. Val ely Ser Ly. ey. Cys Lys His
45. 455
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Ser Ala LeU elu Val Asp elu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
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Ala Phe Val elu Lys Cys Cys Lys Ala Asp A~p Lys Glu Thr Cys p.he 580 565 590
Ala elu Gl\! Gly Lys Lys Leu Val Al a Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Ser Pro Lys Met Val e l n Gly Ser Gly Cys Phe Gly Ar9 Gly Met 610 615 620
Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys val Leu Arg Arg 625 630 635 640
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lt;210gt; 349
lt;211gt; 909
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 349
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
pro Met Val Trp Ala Met Ala His Tyr His Asp Asp Tyr Gly Lys Asn 20 25 30
ASP Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Cly Lys Asp Mct Val Lys 35 40 45
Val Leu His tle Gln Arg quot;quot;p Gly Lys Tyr HiB Ser Ile Lys Clu Val
50 55 60
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Cly J\.sp Asn Ser Asp n. Ile Pro Thr Asp Thr l1e Lys Asn Thr Val 85 90 95
His Val Leu Ala LyS Phe Lys ely ne Lys Sel: tle Glu Tnr Phe Ala
100 105 110
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115 120 125
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ely lle Lys ASP Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr eln Ser Cly Ph. Clu 180 lB5 190
ely Phe n. Lys ASP Gln eh. Thr Thr Leu Pregt; Glu Val Lyo Asp Arg 195 200 205
Cy. Ph. Al, Thr Gln VO;l Tyr Cys Lys Trp Ar~r Tyr Cln Asn Arg Asp 210 215 220
val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Cly Ala Val Ar~r ASP Ile Val Leu Lys 225 230 215 240
Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Ar{l' Gly Clu Tyr Ser Pro Ser val Cln 245 250 255
Lys Thr Leu Tyr ASp Ile eln Val Leu Thr Leu Ser eln Leu Pro Glu 260 265 270
Ile Glu ~sp Met Glu Ile Ser Leu PTO Asn IIE! His '!'yT Phe Asn Ile 275 280 285
ASP Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu PTO 290 295 JOO
Leu Asp Asn P~o Ty~ ely Lys lle Thr Gly Vlll Arg Arg Lys Leu 305 310 320
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Asp Leu Gly Glu Glu Aan Phe Lys Ala Le\,!. Val. Leu Ile Ala ..he Ala 340 345 350
Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu hsp His Val Lys Leu Val Asn )55 360 365
Glu val Th~ Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Alal Asp Glu ser Ala Glu 370 375 380
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Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cy. Phe Leu Gln His Lyo Asp Asp 420 425 430
Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Gl u val Asp Val Het Cys 435 440 .45
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Glu Ile Ala Arg Ar9 His Pro Tyr Phe Tyr Al. Pro Glu Leu Leu Phe 465 470 4quot; quot;O
Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glv Cys Cys Gln Al. Al. 485 490 495
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Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys: Cys Al. Ser Leu Gln 515 520 525
Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala. val Ala ArO Leu Ser 530 535 540
Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu val ser Lys Leu val Thr 545 550 555 560
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ASp Leu Pro Sor Leu Al. Ala Asp Phe Val Glu.· Ser Lys Asp Val Cys 625 630 635 640
Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu. Gly Met Phe Leu Tyr 645 650 655
Glu Tyr Ala Arg Arg Hi~ Pro Asp Tyr Ser val Val Leu Leu Leu Argo 660 665 670
Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cyo Ala Ala Ala 675 680 685
690 695 700
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aln Leu ely Glu Tyr Ly, phe Gln Asn Al. Leu Leu Val Argo 'Yr Thr 725 73O. 735
Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val elu V., Ser Arg 740 745 750
Asn l~u Gly Lys Val ely Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 755 760 165
Arg Met Pro Cys Ala Glu ASP Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 170 715 780
Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser quot;. Aro Val Thr Lys Cy. 785 790 795 800
Cy, Thr elu Ser Leu val 1\.sn Arg Arg Pro Cy. Phe Ser Ala Leu Glu
.05 810 .quot;
val Asp Glu Thr Tyr Val pro Lys Glu Phe Asn Ala elu Thr phe Thr .20 825 830
Phe Mis Al. Asp Ile Cys Thr Leu Ser elu Lys Glu Aro Gln 11e Lys 835 840 .45
Lys aln Thr Ala Leu val Glu Leu Val Lys His Ly. Pro Lys Ala Th.: 850 855 .quot;
Ly. Glu Gln Leu Lys Ala V.l Met ASp Asp 'he Al. Ala Phe Val Glu 865 870 875 880
Ly. Cys Cys Lys Ah Asp 1\sp Lys elu Thr Cyo Phe Ala Glu Glu Gly
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Lys t-ys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu ely Leu
900 'OS
lt;210gt; 350 lt;211gt;912
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 350
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Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala 20 25 30
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Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60
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65 70 7-,' 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Mi(: '1'hr Leu I?he Oly AsO
85 .0 95
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Lys Tyr Leu Tyr Olu quot;e Ala Argo Ar9 His Prlt;;' Tylt; quot;he Tyr Ala Pro 165 170 175
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Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Lel.ll Pro Ly, Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Ar9 ASP Glu Gly Lys Ale Ser Ser Ala 1.yt¡, Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Al. Selt; Leu Gln Lys Ph. 0 1y elu Ar9 Ala Phe, Lys Ala Trp Ala Val 225 230 23gt; 240
Al. Ar9 Leu Ser Oln 'lt;g quot;he Pro Lys Al. 01u Phe Ala Glu Val Selt; 245 250 255
Lys Leu Val Thlt; Aso Leu Thr Lys val Mis Thrquot; Glu Cys eys His ely 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Ar'1 Ala Asp Leu Ala Lys Tyr rle 275 280 285
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Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ahquot; Clu Val Clu Asn AIiIP 305 310 315 320
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Lys Asp V~1 Cys Lys A6n Tyr Ala Glu Ala Lys A,:¡p Val Phe Leu Gly 340 345 350
Met Plle Leu Tyr Glu Tyr Ala ArO' Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
eys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Al. Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu V.l Glu Glu Pro Gln Aso Leu Ile LyS eln Mo Cys 405 410 415
Glu Leu Phe Glu Glo Leu Gly Glu Ty. Lys PhE! Gln Asn Al. Leu Leu .20 425 430
val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Glo val Sel-Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu Val Ser Aro¡ Asn Le1.L Gly Lyo Val ely Ser: Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala elu Asquot; Tyr Leu Ser Val val ••5 470 475, '80
Leu Asn Gln Lcu Cyo val Leu His Clu Lys ThI: Pro Val Ser Asp ArO
485 quot;O .OS
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Glu Th. Phe Thr Phe His Al. AsO l1e Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
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Pro Ly$ Ala Thr Lys G1u Gln Leu Lys Ala Val_ Met A~p Asp phe 565 570 575
Ala Phe Val G1u Lys Cys Cys Lys Ala ASp ASp Lys G1u Thr Cys Phe 580 585 590
Alquot;, Glu G1u G1y Lys Lys Leu V.l Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Cly 595 600 605
Leu Met Al. His Tyr His Mp Asp Tyr Gly Ly~¡ Aso Asp Glu Val G1u 610 615 620
Phe Val Arg Thr ely Tyr Gly Lys Asp Mct Val Lys val Leu His Ile 625 630 635 640
Glo Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Ly. ehquot; Val Ala Thr Se. V.l 645 650 655
Glo Leu Thr Leu Ar9 Ser Lys Lys Asp Ty. Le\.l His Gly Mp Aso Ser 660 665 670
Asp Ile Il. Pro Thr Asp Thr ne Lys Aso Tht-Val His Val Lcu p.la
675 .80 685
Lys ph. Lys ely Ile Lys Ser Ile énu Thr l'he! Al . Mee Asn Ile Cys 690 695 700
G1u His Phe Leu Ser Ser Phe Ser His Val Thl-Arg Ala Ais Val Tyr 705 710 115, 720
Val Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His ,25 no 735
Val His Ala Phe Ile His Thr PrO Thr Gly Thr His Phe Cy. A,,, Val 740 745 750
Glu Glo Val Ar. Asn Gly Pro Pro Il. rle His Ser Gly Il. Lys Asp 755 760 765
Le. Ly. Val Leu Lys Thr Thr Oln Ser Gly phe Gl. Gly Phe rle Lys 770 775 780
Asp Gln Phe Ttlr Thr Le. quot;,o Glu Val Lys A,., Aro Cys Phe Al~ Thr
785 790 79' .00
Gln Val Tyr Cys LyS Trp Arg Tyr Gln A,n Arg Asp Val Asp Phe Glu .0S BlO BlS
Ala. Thr Trp Gly Ala Val Argo Asp ne Val Leu Lys Lys Phe Ala Gly
.20 825 830
Pro Tyr Asp quot;o CLy Glu Tyr Ser frO Ser val Cln Lya Thr Leu Tyr 835 840 845
A'p Ile Gln val Leu Thr Leu Ser Gln Leu Pro Glu Ile Glu Asp Met
850 '55 '60
Glu Il. Ser Leu Pro Aon ne Hia 'I'yr Phe Asn Ile A.p Met Ser Lyo 865 870 87' .80
MoL Cly Leu :Il.e Asn Lyo Glu Glu Val. Leu Leu Pro Le'.l ASO A.n Pro 885 890 895
'I'yr Gly Lys !le Thr Gly Thr Val Ar. Arg Lys Leu Pro Ser Arg Lou 900 9quot; 910
lt;210gt; 351
lt;211gt; 1019
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 351
Melt; Lys Trp Val Ser Phe rle Ser Leu Le. Phe Leu phe Ser Ser Ala 1 , 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Met Ser V.l Phe Asp Ser Lys Phe 20 25 30
Lys Gly 11e Mis Val Tyr Ser Glu rle Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu 35 40 45
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Vol Leu Ser elu Glu His quot;,s val Val Val Arg Asn phe Leu Lys Ala 130 135 140
Lys Lys Thr Ser Arg t.ys t.eu Val Glu He Met: Me' Ala Cly Ile Thr 145 150 15~¡ 160
Lys Tyr Asp Ltlu Gly lle Glu Ala Asp His elu Leu Ile Val ASP Pro 165 170 175
Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro phEt Ala Ser Val Gly ABn 180 185 190
Gly val Thr Ile His Tyr Met Arg Tyr Lys Val Arg CIn Arg Glu Thr 195 200 205
Leu Phe Ser Arg phe Val Phe Ser Asn HiB prc. Lys Leu Ile Asn Thr 210 215 no
Pro Trp Tyr Tyr Asp pro Ser Leu Lys Leu Ser Ile Clu Gly Gly Asp 225 230 23S 240
Val Phe lle 'I'yr Asn Asn Asp Thr Leu val val Gly Val Ser Glu Arg 2lt;5 250 255
Thr Asp Leu CIn Thr Val Thr Leu Leu Ala Lys; Asn Ile Val Ala Asn 260 265 270
LY5 Clu CyS Glu Phe Lylil Arg ne val Al. IIE' Asn val Pro Lys Trp 275 280 285
Thr Asn t.eu Mee His Leu Asp Thr T rp Leu Thxquot; Me' Leu Asp Lys Asp 290 295 JOO
Lys Phe Leu Tyr Ser Pro n. Ala A!in AIOp Val. Phe Lys Phe Trp '.0 305 310 31~' 320
Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu Pro Gln Pro Val Clu A.n Gly 325 330 335
Leu Pro Leu Glu Gly Leu Lcu e l quot; Ser Ile lle, Agn Lys Lys Pro Val 340 345 350
Leu Ile Pro Ile Aja Gly Glu Gly Ala Ser Gl~ Me t elquot; Ile Glu Arg 355 360 365
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala. 11. Ar. Pro Gly Val 37' 375 380
vAl ne Gly Tyr Ser Aro Mn Glu Lys Thr Asn Al. Ala Leu Glu Ala 38'
390 395 400
Ala Gly Ile Ly!; Val Leu Pro Phe His Gly A!in. Gln Leu Ser t.eu Gly '05 'lO 415
Me~ Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Me, Pro LeLI Ser Arg Lys Asp Val 420 425 430
Lys Trp ASP Ala I-lis Lys Ser Glu Val Ala Hi~~ Arg Ph_ Lys }gt;.sp Leu 435 440 445
Gly Glu Glu Aso Phe Lys Al. Leu val Leu rlE' Al. Phe Ala Gln Tyr 450 455 '60
Leu Gln Glo Cys Pro .he Glu Asp I-lis Val Lys~ Leu Val Asn Gl u Val 465 470 47~ 480
Thr Gl u Phe Ala Lys Thc Cys val Ala Asp Ghl Ser Ala Glu Asn Cys 485 490 495
Asp Lys Ser Leu His Thr Leu E'he Gly Asp Lyf: Leu Cys Thr Val Ala 500 SOS 510
Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Atilquot; Cys Cy. Ala Lys Gln 515 520 525
Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cy. Phe Leu Gln Hi!~ Lys Asp Asp Asn Pro 530 535 540
Asn LeU Pro Arq Leu Val Arg Pro Glu Val ASP Val Met Cys Thr Ala 545 550 555 560
Phe His ASP Asn Glu Glu Thr phe Leu Ly. Lyf: Tyr Leu Tyr Glu Ile 565 570 575
Ala Acg Arg Hi s Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu 'he Phe Ala sao S8S 590
Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cy!~ Gln Ala Ala Asp Lys 595 600 60S
Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys 610 61S 620
Al. Se, Ser Ala Lys Gln A,. Leu Lys Cys AlaL Se, Lcu Gln Lys 'he 625 630 635 6quot;
Gly Glu Arg Ala .h, Lys Ala Trp Ala Vol Al. Arg Leu Ser Gln 645 650 655 'quot;
Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Selt; Ly$ Leu Val Th, 'sp Leu
660 665 .quot;
Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala
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As~ ASp Arg Ala ASp Leu Ala Lys Tyr Ile CYl!l: Glu Asn Gln Asp Ser 6.. 695 700
:Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu LyS. Pro Leu Leu Glu Lys 705 710 715 720
Ser His Cys Ile Ala elu Val Glu Asn Asp Glu. Met Pro Ala ASP Leu 725 730 735
Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn 740 745 750
Tyr Ala Glu quot;. Lys ASP Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr 755 760 76gt;
Al. Arg Arg flis Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Ar9 Leu Ala 770 780
77'
Ly, Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys ey, Al. Ala Ala Asp Pro 785 790 79' 800
His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Pne Lys Pro Leu val Glu 805 810 815
Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu 820 825 aJO
Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn A1& Leu Leu Val Arq Tyr Thr Lys Lys 835 840 845
Val Pro Gln Val Ser Thr pro Thr Leu Val Glu val Ser Arg Asn Leu 850 855 860
ely Ly. va.l Gly Ser Ly. ey. Cys Lys H.is Pro elu Ala Lys Arg Me' 8quot; 870 87' 680
Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu ey. V.l 83' 890 89'
Leu Rís GIu Lya Thr Pro Vquot;'l Ser ASp Ar. Vquot;,l Thr Lys eya lt;:ya Thr 900 quot;90S 910
Glu Ser Leu v.l Asn Arg Mg Pro lt;ya Phe SOr Ala Leu elu Val Asp 915 92. 925
elu Thr Tyr Val Pro Lys elu Ph. Asn .\la Glu Thr Phe Thr Phe Hís 930 935
'40
Al. Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys GIu Arg Gln Ile Lys Ly, Gln 945 950 9SS 960
Thr Ala Leu val Glu Leu val Lys His Lys pro Lys Ala Thr Lys Glu 965 970 975
Gln Leu Lys Ala Val Het .\sp ASp Phe Ala .\la Phe Val Glu Lys Cys 980 985 990
Cys Lys .\la ASP ASp Lys Glu Thr Cys phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys 995 1000 1005
Leu Val .\la .\la Ser Gln Ala Jlr.la Leu Gly Leu 1010 1015
lt;210gt; 352
lt;211gt; 1016
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 352
Mer Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Lell Leu Leu Leu Leu Trp 1 S 10 15
Pro Met Val Trp Al. Met Ser Val Ph, A,p Sel: Lys phe Lyo Gl y Ile 20 25 30
H:is Val Tyr Ser Glu 11e Gly G1u Leu Glu Sez: Vtl l Leu Val His Glu
35 .0 45
Pro Gly AJ:g Glu :rle Asp Tyr 1 le Thr Pro Alal Ar. Leu Asp Glu Leu SO SS 60
Leu Phe Ser Al a rle Leu elu Ser His Asp Ah, Arg Lys Glu His Lys 65 70 7~. 80
Gln Phe Val Ala Glu Leu Lys Ala Asn Asp rlE' Asn Val Val G1u Leu OS 9. 9S
¡le Asp Leu Val Ala elu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys 100 lOS 110
A.sp Lys Leu rlc Glu elu Phe Leu Glu Asp SeJ:' Glu pro Val Leu Ser 115 120 125
Glu Glu His Lys Val Val Val Arg Asn Phe Leu Lya PoIa Lys Lys Thr 130 135 140
Ser 1\rg Lys Leu val Glu I le Met Met Ala el}quot; Ile Thr Lys Tyr Asp 145 lSO lSS 160
Leu Gly Ile e l u Ala Asp His Clu Leu I1e Va l. Asp Pro Met Pro Asn 165 170 175
Leu Tyr Phe Thr Ar9 A9p Pro Phe Al . Ser Val Gly A!in Gly Val Thr 190 lOS 190
:Ile His Tyr Met ;gt;.r9 'IYr Lys Val Arg Gln Argr Glu Thr Leu Phe Ser 195 200 205
Argo Phe Val Phe Ser Asn His Pro Lys Leu rlc: 1\sn Thr pro Trp Tyr 210 215 220
Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Leu Ser Ile Glu Gl y Gly Asp Val Phe !le 225 230 235, 240
Tyr Asn Asn Asp The Leu Val Val Gly Val Ser' GIl,¡ Argo Thr Asp Leu 245 250 2SS
Gln Thr Val Thr Leu Leu Ala Lys Asn 1le Val Ala Asn Lyo Glu Cys 260 265 270
Glu Phe Lys Arg 1le Val Ala 1le Asn Val pro, Lys Trp Thr Asn Leu 275 290 285
Met His LeU Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys phq Leu 290 295 300
Tyr Ser Pro Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr ASP Leu 305 310 315 320
val Asn Gly Gly Ua Glu Pro Gln Pro Val GIIlL Asn Gly Leu Pro Leu 325 330 3)5
Glu Gly Lcu Leu Gln Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu 11e Pro
340 345 3SO
1:1e Ala Gly Glu GIy Ala Ser Gln Het Glu IlEi GIu Aro Glu Thr His 3SS 360 365
Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Arg Prc. Gly Val Val Ile Gly 370 375 380
Tyr Ser Arg Asn Glu Lys Thr Asn Ala Al a Leu Glu Ala Ala Gly 11e 385 390 395 400
Lya Val Leu Pro Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Mee Gly Asn 405 410 415
Ala Arg Cys Met Sor Mot Pro Leu Ser Arg Lysl Asp Val Lys Trp Asp 420 425 430
Ala His Ly. Ser Glu Val Ala His gt;.rO Phe LySI Asp Leu Gly Glu Glu ,)5 410 445
Asn sh. Lyo Ala Lcu Val Leu 11e Ala Phe Ale, Gln Tyr Leu Gln Gln 'SO 4SS 460
Cyo sro Pha Glu Asp His Val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu she lt;65 410 475i 480
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser '85 490 495
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Th%~ Val Ala Thr Leu Arg 500 SOS 510
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Alquot;, ASp CyS Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu 515 520 525
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys ASP As¡=gt; Asn Pro Asn Leu Pro SJO 535 540
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met CYlil Thr. Ala Phe HilO Asp 545 550 555 560
Aa. Clu Glu 'I'hr she Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala ArO Arg 565 570 575
Mis Pro Tyr she Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phei Phe Ala Lys Aro Tyr 580 585 590
Lys Ala U. gt;he Thr Glu Cys Cys Gln Ala A.lal Asp Ly. Al. Ala Cys 595 600 60S
••u Leu Pro Lys Lcu Asp Glu Leu Arg Asp GIu Gly Lys Ala Ser Ser 610 615 620
Ala Lquot; Gln Arq Leu .ys lt;;ys Alquot;, Ser Leu Gl. Ly. Phquot;, Gly Glu Aro 625 630 63gt; 640
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln AJ:quot;g Pbe Pro Lys
,ss
quot;S 650
~la Glu Phe Ala clu val Ser Lys Leu v~l Thr Asp Leu Thr Lys Val 660 655 670
His 'l'hr 01quot; Cys Cys His e l y Mp Lequot; Leu Glu Cys gt;la Asp Asp Arg 680 '8S
quot;S
Al. Asp Leu Ala Lys Tyr ne eys Glu Asn cln AsO Ser Ile Ser Ser 69O 695 7.0
Lys Leu Lys Glu Cys o,s Glu Lys Pro Leu Leu Glquot; Lys Ser His Cys 70S 710 715 72.
lle Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 725 730 735
~la Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala olu 140 745 750
Ala Lys Asp val Phe Leu Gly Me~ Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
755 760 765
Mis Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr 710 17S 780
Glu Thr Thr LeU Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala ASP Pro His Glu Cys 785 790 195 800
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gln 805 810 815
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Clu Tyr 820 825 830
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val ArO Tyr Thr Lys LYs val pro Gln 'lgt;
840 845
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glquot; Val Ser Arg Asn Loquot; Gly Lys Val 8S0 855 860
Gly Ser Lys Cys CYs Lys His Pro Glu Ala Lys gt;rg Met. Pro Cys Al.
e.s 870 875 '80
Glu Asp Tyr LeU Ser Val Val Leu Aso Gln Leu Cys Val Leu His Glu 885 890 895
Lys Thr Pro Val Ser ASP Arg val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu 900 90S 910
val Asn 'rg ArO Pro Cys Phe Ser Ala Lcu Glu Val Asp Glu Thr Tyr 915 920 925
Va' Pro Lya Glu Phe Asn Ala G'quot; Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 11e 93O 94O
'quot;
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glv Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Lev 950 955 quot;0
quot;S
val Glu Leu Val Lys Kis Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys 955 970 975
Ala Val Het Asp Asp Phc Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala 980 985 990
Asp ASP Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly LyS Lys Leu Val Ala 995 1000 1005
Ala Ser 1010
Gln Ala Ala Leu Gly 1015 Lev
5
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lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 353
Mee Lys Trp Val Ser Phe I le Ser Leu Leu Phe Leu phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala Hla Lys Ser Gl~ Val Ala 2Q 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln TYr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu ASP His Val 50 55 60
Lys Leu Val Aan Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu ala Thr Leu Phe G1y Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110
Asp Cys Cya Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Gl u Cys Phe Leu Gln 115 120 125
Kis Lys Asp Asp hsn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg pro Glu Val 130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu I1e Ala Arg Aro Hia Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 165 190
Cys G1n Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cya Leu Leu Pro Lys LeU Asp G1u 195 200 205
LeU ArO Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Ly& Ph~ Gly Glv Arq Ala P~e ~ys Ala Trp Ala Val 5
225 2JO 240
Al, Arg Leu Ser Gln Aro Ptle Pro LyS Al. chl Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Aa. Leu Thr Lys Val His Thl: Glu Cys Cy. Hi. Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp As. Ar. Ala Asp Leu Al. Lys Tyr 11e 275 280 285
Cys Glu Asn eln Asp Ser !le Ser Ser Lys Leu Ly. Olu Cys Cys Glu 290 295 JOO
LyS Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys !le Ala Glu V31 Glu Asn ASP 305 310 3l~; 320
clu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al!!. Asp phe val Glu Ser 32' 330 335
Lys Asp Val Cyo Lys Asn Tyr Ala Glu Ala LY'H Asp Val Phe Leu cly
340 34' 350
Met Phe Leu 'I'yr Glu Tyr Ala Arg Arg Hi s Prco Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu 1\rg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pco His Glu Cys Tyr Ala Lys val phe ASP Glu 385 390 39$ lt;00
Phe Lys Pro Leu val Glu Glu pro Gln Aan Leu 11e Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Glu Leu phe clu Gln Leu Gly GIu Tyr Lys PhEquot; Gln Asn quot;a Leu Leu 420 425 4JO
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Can val Sezquot; Thr Pro Thr Leu val 435 440 .4S
Clu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Selquot; Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu As¡:, Tyr Lcu Ser Val Val
465 470 4.75,
'SO
Leu Asn Gln Leu Cys V..l Leu His Glu Lys Tht:-Pro Val Ser Asp Ar9 .85 .90 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Clu S~r t~u Val A~n Arg Arg pro Cys Phe 500 50S 510
Ser Ala Leu clu V...l Asp Glu Thc Tyc Val Pro, Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thc Phe Thr Phe His gt;la 'eo Ile Cys Thr' Lau Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Ar. Gln Ile Lys Lys Gln Thc Ala Leu Val Glu Lcu Val Lys His Lye 545 5SO 555 560
Pro Lys Ala Thr Ly. Glu Gln Leu Lys Al. Valquot; Met Asp I\sp Phe Al. 565 570 575
Ala Phe val Glu Lyo Cys Cys Lys Ala Asp As¡:gt; Lys Glu Thr Cy. Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Al. Ala Sexquot; Gln Ala Al. Leu Gly 595 600 60S
Leu Melt; Ser Val Phe Asp Ser Lyo Phe Lys Gh' 11e His Val Ty.r Ser 610 615 620
Glu 11e Cly Clu Leu Glu Ser V.l Leu valquot; Hi5: Glu PXquot;o Gly I\Xquot;g Glu 625 630 635 6.0
11a Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Gl\ll Leu Leu Phe Ser Ala 550 655
Ile Leu Glu Ser Hi 9 A9p Ala Arg Ly9 Glu His: Lys Gln Phe val Ala 660 665 670
Glu Leu Lys Ala Aan Asp Ile Asn Val Val Gl~ Leu Ile Asp Leu Val
615 680 6quot;
Ala Glu Thr Tyr ASP Leu Al. Ser Gln Gl u J\la Lys Asp Lys Leu Ilo 690 695 700
Glu Glu Phe Leu Glu ASp Ser Glu Pro Val Le\ll Ser Glu Glu His Lys 70S 710 715 720
Ve.l Vl!Il val A:rg Asn Phe Leu Lys Al a Lys Lys: Thr Ser Arg Lys Leu 12S 130 135
Val Glu 11e Het Met Ala Gly Ile Thr LyS Tyrquot; ASP Leu Gly !le Glu 7lt;0 7lt;5 750
Ala Asp His Glu Leu Ile Val A,. Pro Met Pre Asn Leu Tyr Phe Thr 755 760 765
Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Aan Gly Val Thr Ile His Tyr Met 110 115 180
Arg Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe 785 790 795 .00
Ser Asn His Pro Lys Leu rle Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser .05 810 815
Leu Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn ASP 820 825 830
Thr Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr ASp Leu Gln Thr Val Thr 835 840 .45
Leu Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cy, Glu Phe Lys Arg 850 855 .60
I1e Val Ala tle Asn Val Pro Lys Trp Thr A,n Leu Met His Leu Asp .65 870 '75 880
Thr Trp Leu Thr Mer t.eu ASP Lys Asp Lys Phe Leu 'l'y.l' Ser Pro 11e
'.5 890 .quot;
Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val As. Gly Cly 900 905 910
Ale. Glu Pro Gl. Pro val Glu As. Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu 915 920 925
eln Ser lle Ile Asn Lys Lys pro Val Leu Ile Pro I le Ala Gly Glu 930 935 !H,O
Gly Al. Ser Gln Met. Glu !lo Glu Arg elu Thr His phe ASp Gly Thr 945 950 955 960
As. 'I'yr Leu Al a lle Ar. Pro Gly Val v.l ne Gl y 'l'Yr Ser Arg As.
9.S 970 975
elu Lys Thr As. Ala Ala Leu Glu Al. Ala ely I1e Lys Val Leu Pro
9.0 985 990
Phe Kis G1y Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met 995 1000 1005
Ser Het Pro Leu Ser Arg Lys ASp Val Lys Trp 1010 1015
lt;210gt; 354
lt;211gt; 1019
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 354
Met Lys Trp val Ser Phe I l e Ser Lcu Lau Phe Leu Phe Sal' Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Cly Glu Clu Asn Phc Lys Ala Leu val Leu 35 40 45
Ila Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys pro Phe Glu Asp His Val SO 55 60
Lys Leu Val Asn Clu Val Thr clu Phe Ala Lys Thr Cys Val Al a ASP 65 70 75 80
Glu Ser Ala Clu Asn Cys ASP Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly ASp 85 90 95
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His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140
ASp Val Met Cys Thr Al. Phe His Asp Asn e1u Clu 'I'hr Phe Leu Lys 145 1quot; 15~¡ 160
Lyo Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His ¡gt;r() Tyr Phc Tyr Al. Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lyo Alll Ala Phe Thr Glu eys 180 185 190
Cys Cln Al. Al. Asp Lys Ala Ala ey. L8U Le\1 Pro Ly. Leu Asp Glu 195 200 20'
Leu Ar. Asp Glu Gly LY6 Al. Ser Ser Ala Ly~, Gln Aro Leu Lys Cys 210 21' 220
Al. Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu .l\.rg Ala PhE~ Lys Ala Trp Ala Val 22' 230 2 3!' 240
Al. Arg Leu Ser Gln Aro Phe Pro Lys Al. Gil! phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val 7hr Asp Leu Thr Lys V.l His ThJ~ Glu Cys eys quot;is Gly 270
26' 2quot;
A&p Leu Leu Glu eya Ala. Asp Asp Arg Ala Asp Leu Als Lys Tyr Ile 27' 280 285
ey. Glu Asn Gln ~p Ser Ile Ser Ser Lys Le\! Ly. Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Ly. Pro Leu Lel.l Glu Lys Ser His Cys Ile Aln Glu Val Glu Asn Asp 305 310 3l~; 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu PrQ Ser Leu Al. AloEl Asp Phe val Gl, Ser 325 330 335
Lys Asp Val eys Lquot; Asn Tyr Ala Glu Al. Lys ASP Val Phe Lequot; Gly 340 345 350
Met phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Aro ArO quot;i, Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lyo 7hr Tyr el\1 ThJ: Thr Leu Glu Lys Cys 370 3quot; 380
Cy, Al. Ala Ala ASP Pro His Glu Cys Tyr Ahl Ly' Val Phe Asp Glu 385 390 39~; 400
Fhe Lys Fro Lcu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ila Lys Gln Asn Cys 405 410 415
Glu Leu Fhe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys PhE! Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Sel: Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys val Gly Sel: Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Mer Pro Cys Ala elu Asp Tyr Leu Ser Val Val 46' lt;70 47!i 48O
Leu Asn Cln Leu ey. val Leu His elu Ly. Thl: Pro Val Ser Aop Ar.
485 .quot;
'quot;
val Thr Lys 0,. ey. Thr Glu Ser Leu val Asn Ar9 Arg Pro eY' Phe
'00 SO, 'lO
ser Ala Leu Glu Val ASP Glu Thr Tyr v a l Prc, Lys Glu Phe Asn Ala 51' 520 525
Glu Thr Phc Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thx· Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln lle Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys lIis Lys 545 550 55S 560
Pro Lys Ala Th r Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Hct Asp Asp Phe Ala 5quot; 570 575
Ala. Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Alo Ala Leu Gly59' 600 605
Leu Met Ser val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly 11e His val 'l'yr Ser 610 615 620
Glu Xle Gly Glu Leu Glu Selquot; Val Leu Va.l His. Clu Pro Gly Arg Glu 625 630 63~ 640
tle Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Ar9 Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala 650
'45 quot;5
1:1e Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Ly~ Glo Phc Val Ala 660 665 670
Glu Leu Lys Ala Aso Asp rle Asn Val Val Gl~ Leu Ile Asp Leu Val 675 680 685
Ala Clu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Cln Clu Ala, Lys A¡¡;p Lys Leu rle 690 695 700
Glu Glu Phe Leu Glu gt;op Ser Glu Pro Val Leu. Ser Glu Glu His Lys 705 71,0 715· 720
Val Val Val Arg Aon Phe Leu Lys Ala Lys Lys, Thr Ser Are¡ Lys Leu 725 730 735
Val Clu Ile Mer Me' Ala Cly Ile Thr Lya Tyr Asp Leu Gly 11e Glu 740 745 750
Ala ASp Mis Glu Leu Ile val ASp Pro Me' Pro' Asn Leu Tyr Phe Thr quot;5 760 765
Arg Asp Pro Phe Ala Ser Vol Gly Asn Gl y Val Thr 11e His Tyr Met. 770 77' 780
Arg Tyr Lys val Arg Gln Arg Clu Thr Ley Phe Ser Arg Phc val Phe
790 quot;/95
785 800
Selt; Asn Hls pro Lys Leu ¡le Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser '05 810 815
Le1,l Ly$ Leu Sor ne G1u ely Gly Asp val Phe Ile Tyr 1\:.n l'I.¡:n Asp 820 8quot; 830
Thr Leu Val Val Cly Val Ser G1u gt;lt;9 Thr Asp LeU G1n Thr Val Thr 835 840 845
Leu 1.eu Ala Lys Asn l1e val Ala Asn Ly¡: G1u Cys G1u Phe Lys Arg 850 855 860
n . Val Ala 11e Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met Hls Leu Asp 865 quot;,O 875 880
Thr Trp Leu Thr He' Leu Igt;.sp Lys ASp Ly. Ph. Leu Tyr Ser Pro ne 885 quot;O quot;5
Ala A.sn ASp Val Phe Lys phe Trp Mp Tyr As. 1.eu val Asn ely G1y .00 .OS 910
Ala G1u pro eln pro Val G1u Asn Gly 1.eu Pro Leu G1u e ly Leu Leu 915 920 925
Gln Ser 1le Ile Asn Lys Lys pro Val Leu 11e Pro 11e Al a Gly G1u 930 9)5 940
Gly Ala Ser eln Met G1u 11e Glu Arg G1u Thr His phe Asp Gly The 9(,5 950 9~S 960
Asn Tyr 1.eu Ala 11e Arg Pro ely Val Val 11e Gl y Tyr Ser Arg Asn 965 970 975
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Phe Mis Gly Asn GJ.n Lcu Ser Leu Cly Met Gly Asn Ala Arg Cys !'Jet 995 10nO 1005
Ser Met Pro Lcu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 1010 1015
lt;210gt; 355
lt;211gt; 657
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 355
Met Lys Trp Val Ser Phe 11e Ser Leu Leu Ph@ Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro 20 25 30
Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp 35 40 45
Cy. quot;. Ser Cys Arg Ala Alt;. Pro His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys SO SS 60
Al. Al. Ah Pro pro Al. Plt;o Phe Asp Ala HiB Lys Ser Glu Val Al. 65 70 7·-80
.'
His Jgt;.rg Phe Lys AoO quot;eu Gly Glu Glu Asn Phll:! Lys Al a Lcu Val Leu 85 9S
quot;
lle Ala Phe Ala Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pregt; Phe Glu '00 His Val 100 lOS llO
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Ly:;; Thr Cys Val Ala Asp
llS 120 125
Glu Selt; Ala Glu Asn Cys AsO Lys Ser Leu HiE; Thlt; Leu Phe Gly Asp 130 135 quot;O
LyS Leu Cys Thr Val Al. Thlt; Leu Arg Glu Thr Tylt; Gly Glu Met Al. HS lSO 15$ 160
ASO Cys Cys Jl.la Lys Gln Glu Pro Glu Aro Asrn Glu Cys 'h. Leu Gln 165 170 175
His Lys ASP Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu val Arg Pro Glu val
180 185 190
JIo.sp val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn el!,:L Glu Thr Phe Leu Lys 195 200 205
Lyo Tyr LeU Tyr Glu Ile Al. Ar. Arg His Pre. Tylt; Phe Tyr:' Ala Pro 210 2lS 220
Glu quot;eu Leu Phe Phe Al. Ly. Arg Tyr Lys Ah, Al. Phe Thr Glu Cys 225 230 Z3~¡ 240
Cy. Cln Ala Ala M, Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu M, Glu 245 250 255
Leu Arg Asp GIu GIy Lys Ala Ser Selt; Ala Ly¡¡, Gln Arg Leu Lys Cy. 260 265 270
Ala Ser Leu GIn Lyo Phe Gly Glu Alt;9 Ala ph('! Lys Ala Tlt;O Ala Val 275 280 285
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Lyo Leu Val Thr Asp Le\.! Th:c Lys val His ThIquot; Glu Cys Cys His GIy 305 310 31gt; 320
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala A!I~I Leu Ala Lys 'l'yr Ile 325 330 335
Cys Glu Asn Gln ASP Ser Ile Se:c Se:c Lys Leo Lys Glu Cy. Cys Glu 340 345 350
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Glu Met. Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Al quot;, ....sp Phe Val Glu Ser
gt;70 375 380
Ly. A,p Val Cys Lys ..n 'tyr Ala Glu Ala Lys ,,quot;p Val Phe Leu Gly '85 390 3.5 400
Mo, Phe Leu Tyr Olu 'tyr .1\.18 Ar-g Arg Hia PrO Asp Tyr Ser Val Val '05 410 415
Leu Leu Leu Ar. Leu Ala LyS Thr 'tyr Olu Thr Thr Le:u Glu Lys Cy, lt;20 425 430
Cys Ala Ala Ala Asp Pro Hie Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 435 440 445
Phe Lys Pro Leu V81 Glu Glu Pro Gln Asn Leu lle Lys Gln Asn Cys 450 455 460
Glu L~u Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 465 470 475 480
val Arg Tyr Thr Lys Lys Val pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu val 485 490 495
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys Hia 500 505 510
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 515 520 525
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 530 535 540
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5er Ala Lcu e l u Val quot;p Glu Thr Tyr Va l Pro Lys Glu Phe A,n Ala 565 570 575
Glu Thr Phe Thr Phe His )..la )..sp !le ey. Thr Leu Ser Olu Lys Olu 580 585 5.0
Arg Gln !le Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
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Ala Phe val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr CyS Phe 625 610 635 640 Ala G1u Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
645 650 655 Leu
lt;210gt; 356
lt;211gt; 1106
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 356
Melt; Lys Trp Val Ser Phe I l e Ser Leu Leu phe! Leu quot;he Ser Ser Ala 1 5 10 15
quot;yr Ser /Irq Ser Leu Asp Lys Ary Ala Arg prc. Cys I l e pro Ly. Ser 20 25 30
Phe Gly Tyr Ser Ser val Val Cys Val Cys 111m Al a Thr 'Yr Cys Asp 35 40 45
Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr phe Ser Arg Tyr 50 55 60
Clu Ser Thr /Irq Ser Gly /lrg /Irq Met Glu Leu Ser Met Gly pro Il. 65 70 75 80
Gln Ala IIsn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu LeUl Thr Leu Gln Pro Glu
.,
quot;
c l n Lys phe Gln Lys Val Lys Gly phe Gly Chquot; Al a Met Th r Asp Ala 1 00 105 110
1II.la Ala Leu Asn Ile Leu Ala Lcu Ser Pro Pre. Ala Gln Asn LeU Leu 115 120 125
Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Clu Gly I1e Gly Tyr Asn l1e I1e Arg 130 135 140
Val Pro Met lil a Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Th r '!yr Ala 145 150 155-160
Asp Thr Pro Asp Asp Phe eln Leu Mis Asn Phe, Ser Leu Pro Olu Ol u 165 170 175
ASp Thr Lys Leu Ly, Ile Pro Leu Ile Mis Arljl Al a Leu Gln Leu Al a 180 185 190
Gln ,ll.rg pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp 19S 200 205
Leu Lys The Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gl}quot; Ser Leu Lys Gly Gln 210 215 220
Peo Gl y ASp lle 't'ye His Gln The Trp Al a Tyr Phe v3l Lys Phe 225 230 240
Leu Asp Ala Tyr Ala Glu H~s Lys Leu Gln PhEi Trp Ala Val Thr Ala 245 2SO 255
Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro fhe Gln Cys 260 265 270
Leu Gly Phe Thr Pro Glu Hi s Gln Arg Asp PhEi Ile Ala Acg Asp Leu 275 280 2as
oly Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Argo Leu Lcu Met 295 300
1.eu Asp Asp Gln Argo Leu Leu Leu Pro H1s TrEl' Ala Lys Val val Leu 305 310 31 5· 320
.,. Ala Lys Tyr Val quot;,. Trp
Thr Asp pro Glu His Gly lle Ala Val
325 330 ]ls
Tyr Leu 1\sp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Al. Thr Leu Gly G1u Thr
quot;'s 3lt;0 345 350
Arg Leu phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser' Glu Al. eys Val Gly 355 360 365
Ser Lys phe Trp Glu Gln Ser v.l Arg Leu Gly ser Trp Asp Argo Gly 370 375 380
MeL G1a Tyr Ser His Ser quot;e lle Thr 1\sn Leu Leu Tyr His Val Val 385 390 395 400
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Trp Val Aq;¡ quot;'so Phe Véll Asp Ser Pro 11e l l e val Asp rle Thr Lys 420 425 430
Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His: Leu Gly His Phe Ser 435 440 445
phe lle Pro Glu Gly Ser Glo Arg val Gly' Leu Val Ala Ser Gln 450 455 460
Lys Asn Asp Leu ASp Ala val Ala Leu Met His Pro ASP Gly Ser Ala 465 470 475 480
Val Val Val Val Leu ASO ArO' Ser Ser Lys Aspo Val Plquot;Q Leu Thr lle 485 490 495
Lys ASP Pro Ala Val Gly phe Leu G1u Thr Ile, ser pro Gly Tyr Ser soo SOS 510
l 1e His Thlquot; Tyr Leu Trp Ar9 Ara Gln Asp Alo. His Ly. Ser Glu Val 515 520 525
Ala His Ar9 Phe Lys ASP Leu Gly Glu Glu ASO Phe Lys Ala Leu Val 530 535 540
Leu lle Ala Phe Al a Gln Tyr Leu Glo Glo Cys Pro phe Glu Asp His '45 550 555 560
Val Lys Leu Val ASO Glu Val Thr Glu Phe Ala. Lys Thr Cys Val Ala 565 570 5gt;5
Asp Glu Ser Ala Glu ASO Cys Asp Ly. Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 580 585 5.0
Jl.sp Lys Leu Cys Thr Val Ala. .hr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Me t
5.5 600 605
• 3. Asp Cy• Cys Ala Lys Gln Glu Pro Clu /l.rg Asn Glu Cy. quot;he Leu 610 615 620
Gln His Lys Asp Asp Asn plt;o Asn Leu Pro Ar. Leu Val Arg Pro Glu 625 630 635 640
val ASp Val Mct Cys Thr /l.la Phe His Asp Asn Clu Glu Thr Phe Leu
645 650 655
Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile ,.14 Arg Arg Hi~¡ Pro Tyr Phe Tyr Ala 660 665 670
Pro Clu Leu Leu Phe Phe Ala Lys 1Uquot;g Tyr Lyo Al a Ala Phe Thr Glu 675 680 685
Cys CyS Gln Alquot; Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp 695 700
Glu Leu Arg ASp Glu Gly Lys 1gt;.1... Ser Ser Ah, Lys Gln Arg Leu Lys 70s 710 7lS 720
Cys Ala Ser Leu Gln Lys phe Cly Gl u Arg Ale, Phc Lys Ala Tn;. Al. 725 730 735
val Ala Arg-Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ah, Glu Phe Al. Glu Val 740 745 7SO
Ser Ly!'; Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val Hi~L Thr Glu Cys Cys Hili 7SS 760 765
Gly Asp Leu Leu Clu Cys Ala ASp Asp Arg Ala ASp Leu Al a Lys Tyr 770 775 780
l1e Cys Glu ABn Gln A'P Ser Ile Ser Ser Ly.E; Leu Lys Glu Cys Cys 785 790 79~; SOO
Glu Lyo Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys rlE' Ala Glu Val Glu Asn SOS quot;0 quot;5
Asp Glu Mee Pro Al . ASp Leu Pro Sor Leu Ah, Ala ASp Ohe Val Glu 820 825 830
Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Al. Glu Al& Lvs Sop v.l Phe Leu 835 940 945
Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Ar'41 Aro¡ His: Pro Asp Tyr Ser v~l 950 955 960
Val Leu ~u Leu Arg Leu Ala Lys Tbr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys 865 870 875 880
Cys Cys Ala Ala Ala Asp PrQ His Glu Cys Tyrquot; Ala Lys Val Phe 1\.1,p
quot;5 8" .quot;
Glu phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn LCu lle Lys Gln Asn 900 90S 910
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Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pz:o G1n Val Ser Thr Pro Thr Leu 930 935 940
val Glu Val Ser Arg A.!In Leu Gly Lys val Gly Se.: Lys Cys Cys Lys 945 955 960
quot;O
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val L@u Asn Glo L@u Cys Va l Leu Hi$ Glu Lys Thr PrO Val Ser Asp 980 985 990
Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Lcu Val Asn Arg Arg Pro Cys 995 1000 1005
Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Clu Thr Tyr Val Pro Lys Clu Phe Asn 1010 1015 1020
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 11e Cys Thr Leu Ser Glu Lys 1030 1035 1040
G1u Arg Gln Ila Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Clu Leu Val Lys His 1045 lOSO 1055
Lys Pro Lys Ala Thr Lys elu eln LeU Lys Ala Val Met Asp 1'.sp Phe 1060 1065 1070
1\la Ala Phe Val Glu Lys Cys cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys 1075 10aO 1085
Phe Ala Clu Glu Oly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser c l n Ala Ala Leu 1090 1095 1100
Gly Leu 1105
lt;210gt; 357
lt;211gt; 1103
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 357
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Lcu Leu Lou Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Pro Het Val Trp Ala Ala Arg Pro CyS Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr 20 2S 30
Ser Ser Val val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp 35 40 45
Pro Pro Thr phe Pro Ala Leu Cly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr 50 55 60
Arg Ser e l y Arg Arg Met GIu Leu Ser Met Gly Pro 11e 010 Ala Asn 65 70 75 80
Hi s Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe 85 90 95
Cln Lys Va l Lyo Gly Phe Gly Gly Ala quot;oC Thr Asp Ala Al. Ala Leu 100 105 110
Asn tlquot;, Leu Al. Leu Ser Pro ''0 Al. Gln Asn Leu Leu Lau Lys Ser 115 120 125
Tyr Phquot;, Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn IIe Ile ArS Val Pro Met
130 135 140
Al. Ser Cys Asp Phe Ser 11e Arg Thr Tyr Thr Tyr U. ,quot;p Thr Pro 145 lSO lS~¡ 160
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Leu Lys lle Pro Leu Ile Ah Arg .,.Leu Gln Leu Ala Gln Ar. Pro 180 185 190
Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Tqgt; Thr Ser Prquot; Thr Trp Leu Lys Thr 195 '00 'OS
Asn Gly Al. val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Ly~: Gly Gln Pro Gly ASp 210 215 220
ne Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val. Lys Phe Leu Asp Al. 225 230 23Si 240
Tyr Ala Glu Mis Lys Leu GIn Phe Trp Ua val Thr Ala Glu Asn Glu '45 250 255
Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro PhEt Oln Cys Leu ely Phe 260 265 270
Thr Pro Glu Ais Gln Arg ASP Phe 11e Ala Ar~r ASP Leu Gly Pro Thr 275 280 285
Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Mee Leu Asp ASP 290 295 300
Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala L:ys Val. Val Lequot;.! Thr Asp Pro 305 310 3lS 320
Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Al. val His Trp Tyr Leu Asp '25 330 335
Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Gl\ll Thr His Aro Leu Phe 340 345 350
Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cy$ Val Gly Ser Ly~ Phe 355 360 365
Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Cly Ser Trp quot;s~, Arg Gly Met Gln Tyr
370 375 '80
ser His Ser Xle Xle Thr Asn Leu Leu Tyr His; Val Val Cly Trp Thr '85 390 395 400
Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly G] y· Prl) Asno Trp Val Arg 405 410 415
Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile· Thr Lys Mp Thr Phe 420 425 430
Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile
435 440 445
pro Glu Gly Ser Glo Arg V.l Gly Leu Val Ala ser Gln Lys Asn Asp 450 455 460
Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His pro Asp el)' Ser Ala Val Val Val quot;S 470 475 480
Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys ASp Val Pro Lel.' Thr Ile Lys A,O Pro 485 490 495
Ala Val Gly quot;he Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gb' Tyr Ser Ile Mis Thr 500 50S 510
Tyr Leu Trp Arg Arg Cln ASP Ala Mis Lys Sel' Glu val Ala Mis Arg 515 520 525
Phe Lys ASp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Al& Leu val Leu Ile Ala 530 535 540
Phe Ala Cln Tyr Leu Cln Cln Cys Pro Phe Gl~ ASp His Val Lys Leu 545 550 555 560
V.1 Asn Glu Val Thr 01u Phe Ala Lys; Thr Cys: Val Ala ASP 01u Ser 565 570 57'
Ala Glu Asn Cy. AsO Lys Ser Leu His Thr Leu: Phe Gly AaO Ly. Leu
5.0 5.5 590 Cys Thr Val gt;..1a Thr Leu Arg 01u Thr Tyr cl:y' Glu Melt; Ala Asp Cy!il 595 600 605 Cyo Ala Lys Cln Glu Pro G1u Arg Asn Glu Cys. Phe Leu CIn His Lys 610 615 620
Asp 1\sp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Ar~r Pro Clu Val AflP Val 625 630 635 640 Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn alu 01u Thr' phe Leu Lyo: Ly. Tyr
645 650 655 Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg Mis pro Tyr phe, Tyr Ala Pro Glu Leu 660 665 670 Lou Phe Pho Ala Lys Arg Tyr Lys Al. Ala pr.e· Thr 01u Cys Cys Gln 6quot; 680 685 Al. Al. AaO Lys Ala Ala Cy' Leu Leu Pro Lys Leu AaO Glu Leu Arg 690 695 700 Asp 01u Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Cys Ala Ser
Lys Gln quot;quot;. Leu
705 710 715 720
Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg 725 730 735
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys L~u 740 745 750
val Thr J\.!lp Leu Thr l.ys Val His Thr Glu Cys Cys ¡¡is Gly J\.sp Leu 755 760 765
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg7quot; Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 710
'.0
ASn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro 765 790 600
79'
Leu Leu Glu Ly¡¡; Ser His Cys Ile Ala Glu val Glu l\SO Asp Glu MeL 605 610 615
Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala. Ala Alt;p Phe Val Glu Ser Lys Asp 620 6quot; 6quot;
Val Cys Lys Aso TYr Ala Gl u Ala Lys ASp Val Phe Leu Cly Met Phe 835 840 845
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val val Leu Leu 850 855 860
Leu Aro Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Al. 6'5 670 .7' 660
Ala Ala ASP pro H.is Glu Cys Tyr Ala Lyo val Phe Asp Glu Phe Lys
6.5 6" 895
Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 900 quot;0
'05
Phe Glu Gln Leu ely Glu Tyr Lys Phe eln Asn Ala Leu Leu Val Arg 915 92 O 925
Tyr Thr Lya. Lys Val Pro elo Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Clu Val 930 935 940
Ser Arq Asn Lou ely Lyc Val ely Ser Lyc Cys cYs Ly~ Hin Pro Glu 945 950 955 960
Ala Lys Arq Met pro Cys Ala alu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Aso 9155 970 975
Gln Leu Cys val Leu His Glu Lys Thr pro Val Ser Asp Arg val Thr 980 985 990
Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 995 1000 1005
Leu Glu Val Asp C1u Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn .Ala Glu Thr l010 1015 1020
Phe Thr Phe lIis Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys G1u Arg Gln
1.025 1030 1.035 1040
Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 1045 1050 1055
Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 1060 1065 1070
Val elu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys elu Thr Cys Phe Ala Glu 1075 1()S0 1085
Glu Gly 1090
Lys Lys Leu Val Ala 1095 Ala Ser eln Ala Ala 1100 Leu Gly Leu
5
lt;210gt; 358 lt;211gt; 1106 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 358
Me' Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu phEI Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Mg ,quot;p Ala Hin Lys Ser Glu Val Al. 20 25 30
Iiis P.eg Phe Ly. ASp Leu Gly Glu Glu Asn PhE! Lys Al. Leu Val Leu ]S 40 45
11e Ala Phe Ala Gln 'I'yr Leu Gln Gln Cys Prc. Phe Glu Anp quot;iquot; Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu val Tbr Glu Phe Ala Ly~; Thr Cy$ Val Ala Aop
65 70 7'· .0
-
'
Glu Ser Ala Glu Asn Cys ASp Lys Ser Leu Hi~1 Thr Leu Phe Gly ASP 85 90 95
Lys LCu CylO Thr Val Ala Thr Leu Are¡ Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 lOS 110
ASp Cys Cys Ala Lys eln Glu Pro Glu Are¡ Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Ly!l Asp Asp Aafl Pro Asn Leu Pro Arg LeLI val Are¡ Pro Glu Val 130 135 140
Asp Val Mel: Cys Thr Ala 'he His ASp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Ly. 145 150 15~; 160
Lys 'I'yr Leu 'I'yr Glu ,,-Ala Ax:g Arg His Prc. Tyr Phe Tyr Al. pro 165 170 175
Glu Leu Leu Oh. Ohe Ala Lys Arg Tyr Lys Alal Ala Oh. Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Al. Asp J.ya Ala Al. Cys Leu Leu Pro Ly. Leu Asp Glu 195 200 205
Lau Arg Aop Glu Gl1' Lys Al. Ser Ser Alquot;, Lys: Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Ly. ehe Gly Glu Arg Ala Phe, Lya Ala Trp Ala Val 225 230 235, 240
Ala Arg r..eu Ser Gln Arg phe Pro Lya Ah Gl. Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Vquot;,l Thr Asp Leu Thr Lys V.l Hi$ Thr Glu Cys lt;y. His Gly 260 265 210
Al'IP Leu Leu elu Cys 11.14 Asp Aop A,. 11.14 I\.S¡¡' Leu Ala Ly. Tyr Ile 275 280 285
C., Glu ASn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys LelU Ly. elu Cys Cys Glu 290 295 300
Lys quot;o Leu Lel.l Glu Lys Ser His Cys Tle Ala Clu Val Glu Asn Asp 305 310 31~5 320
G1u Met Pro Ala Aop Leu Pro Ser Lequot;, Al. Al.quot; Asp pha val alu Ser 325 330 335
Lys ASP Val Cya Ly. Asn Tyr Ala Glu Al. Ly:!I quot;sp va 1 Phe Leu Gly 340 345 350
Melt; phe Leu Tyr Olu Tyr Ala Arg Arg His Pr., Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lyo Thr Tyr Glu Th:r Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro Hit; Glu Cys Tyr Al.quot; Lys Val Phe Asp elu 385 390 395 400
Phe Lys pro Leu Val Olu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cy$
405 410 415
Glu Leu Phe elu GIquot; Leu Gly Glu Tyr Lys Ph,~ Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
val Arg Tye Thr Lys Lys val Pro eln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Gl u Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 4SO 455 460
Pro Glu Ala Lys Argo Met pro Cys Ala Glu Asp 'l'Yr Leu Ser Val val quot;5 .;0 480
Lcu Asn Gln Leu Cys Val Lcu His Glu Ly!;l Thl~ Pro Val Ser ASp Arg
485 490 495
v a l Thr Lya Cys Cys Thr Glu Ser Le\.! Val Asn Argo Arg Pro Cys phe 500 505 510
Ser Ala Leu Clu Val Asp Glu Thr Tyl: Val PI:U LylO elu Phe Aso Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Aap Ile Cys Thl~ Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg eln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu val Clu Leu Val Lys His Ly. 545 550 55~¡ 560
Pro Lys Ala Thr Ly. Glu Gln Leu Lys Al. Vale Mee Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Al. ASp ASp Lys Glu Thr Cy. Phe 580 585 590
A1.a Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Sel~ Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Ala Argo Pro Cys Ilc Pro Lys Ser Phe el)' Tyr Setquot; Ser Val Val
61S 620
Cyo Vquot; Cys l'.sn }gt;,la Thr Tyr Cys Asp Ser p~€, AsP Pro Pro Thr Phe 625 630 63~i 640
Pro 1\lel Leu Gly Thr phe Ser Arg Tyr Glu Sezquot; Thr Arg Ser Gly Aro 64S 650 65S
Arg Met Glu L'u Ser Met Gly Pro !le Oln Ahl Asn His Thr Oly Thr 660 66S 670
Gly Leu Lcu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Ly~1 Phe Gln Lya val Lys 67S 680 685
Oly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala 1'.1quot;1 LeU Asn 11e Leu Ala 690 695 700
Leu Ser PJ:'o Pro 1\.1a Gln Aon Leu Leu Leu LyEI Ser Tyr Phe Ser Glu 70s 710 71Si 720
.'u Gly !le Gly TYr Asn Ile Ile Arg val Prc. Met. Ala Ser Cyo ASp 725 730 735
Phe Ser 11e Arq Thr Tyr Thr Tyr gt;l. Asp ThJ:quot; Pro Asp Asp Phe Gln 740 745 750
Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thlquot; Lys Leu Lys Ile Pro 755 760 165
Leu 11e His Arq Ala Leu Gln Lcu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu 770 ns '80
Ala Ser Pro Trp Thr Sor Pro Thr Trp Leu Ly~: Thr Asn Gly Ala V.l 785 790 79~; 800
Aon Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gl:,.' Asp Ile Tyr His Oln 80S 810 8lS
'J'hr Trp Ala Aro Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Al. Glu Hls 820 825 830
Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ale Gl u Aso Glu Pro Ser Al a G1y 835 840 845
Leu Leu Ser Gly Tyr pro Phe Gln Cys Leu Gl)¡' Phe Thr Pro Glu His 850 855 860
Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Lev Gly lt;,re, Thr Leu Ala Asn Ser 865 870 87; 880
Thr His His Asn Val Aro Leu Leu Met Leu As.p ASP Gln Arg Leu Leu 885 890 895
Leu Pro His Trp Ala Lys val Val Leu Thr ASP Pro Glu Al. Ala Ly9 900 905 910
Tyr Val His Gly Ile Ala val His Trp Tyr Leu. ASP Phe Leu Ala Pro 915 920 925
Ala Lys Ala Thr Leu G1y Glu Thr His Arg Leu, 'he Pro Asn Thr Het 930 935 940
Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser 945 950 955 960
Val Arg Leu ely Ser Trp Asp Arg Gly Met eln Tyr Ser Kis Ser I1e 965 970 975
~le Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu 980 985 990
Ala Leu Asn Pro Glu ely Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp 995 1000 lOaSquot;
Ser Pro ~le ~le Val ASp ~le Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys e1n Pro 1010 1015 1020
Me' Phe Tyr His Leu G1y His phe Ser Lys Phe I1e Pro Glu Gly Ser 1025 1030 1035 1040
eln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val 1045 1050 1055
Ala Leu Het His Pro Asp Gly Ser Ala val Val Val Val Leu Asn Arg 1060 1065 1070
Ser Ser Lys Asp Val Pro Lcu Thr Ile Lys Asp Pro Ala val Gly Phe 1075 1080 1085
Leu Glu Thr 11e Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp ArQ 1090 1095 1100
Argo eln 1105
lt;210gt; 359
lt;211gt; 1106
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 359
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 la 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly G1u G1u Asn Phe Lys Ala Leu val Leu 3S 40 4S
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp Hls Val SO 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala ASP 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe G1y Asp as 90 9S
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg G1u Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 lOS 110
Asp Cys Cys ....la Lys Gln Glu Pro GIl;. Arg ASin Glu cya Phe Leu Glquot; 115 120 125
His Lyo Asp Asp Asn PIquot;O Asn Leu Pro Arg Le1..l val Ar. Pro Glu Val 130 135 140
AaO V.l Met Cys Thr Ala phe His Asp Asn GIIJ elu Thr Phe Leu Lys 145 150 15!~ 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile A18 Ar9 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Al. Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala phe Thr elu Cys 180 185 190
(;ya eln Al. Al. Asp Lys Ala Al. Cy. Leu Lel.l Pro Lys Leu ASp Glu 195 200 205
Leu Ar. ASO Glu G1l' Lys Al. Ser Ser Ala Lyl~ a1n Ar. Leu Lys Cys 210 215 2quot;
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala phl~ Lys Ala Trp Ala Val 225 230 2)!5 2quot;
Ala Arg Leu Ser Glquot; Arg Phe Pro Lys .Ala GIIJ Phe Ala GIu val Ser 245 250 255
Lys loeu Va l Thr Asp Leu Thr Lys v.l Hia Thl~ Glu Cys Cys His GIl' 260 2quot; 270
Asp Leu Leu Glu Cys Al a Asp Asp Arg Ala As¡;¡ Leu Al a Lys Tyr lle 275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys LeIJ Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 JOO
Lya Pro Leu Leu Glu Lys Ssr His Cys I le Alu Glu Val Glu Asn Asp lOS 310 J1!5 320
Glu Melt; Pro Alel Asp L.. Pr o Ser-Leu Al. Allt;~ Asp Phe Val Glu Ser 325 no ns
Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala LY!l ASp Val Phe r.cu Cly J40 345 JSO
Met phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Prc) Asp Tyr Ser val Val 3SS 360 365
L@u Leu Leu Aro Leu Ala Lys Tn.r Tyr Glu Thr 'J'hr. t .eu Glu l-ys Cys 370 37S 380
Cys Ala Ala Al a Asp Pro H1s Cl u Cys Tyr Altl Lys val Phe ASp Glu
3.5 390 39~; 400
Phe 'Lys Pro Leu Va l Glu Glu Pro Gln Asn Leu r le Lys Gl n Asn Cys 405 4.10 415
Glu Lcu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Ty, Lys phE~ Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
val ~rg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Se:r Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu Val Ser ~rg ~sn Leu Gly Lys Val Gly Se:r Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu ~lquot;, Lys Arg quot;lt;' Pro Cys Ala GIu A91.. Tyr Leu Ser Val Val
465 .70 47~) 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His GIu Ly. Th:r I'ro Val Ser Asp Ar. 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Tbr Glu Ser Leu Val ASI'!. Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Gl u Val Asp' Glu Thr 1'yr Val Pr,) LyEl Clu ..he Asn Ala 515 520 525
Glu Tnr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Th:r Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Ar. Gln Ile LyS Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Vd! Lys His Ly. 545 550 55S 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Al. Asp ASI? LyS Glu Thr Cys I'he 580 585 590
Ala GIu Glu Gly Lys Lys Leu Val ~la Ala SeX' Cln gt;1. Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val
610 . 615 620
Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys ASP Ser Phl~ Asp Pro Pro Thr Phe 625 630 635 640
Pro Ala Leu Gly Thr phe Ser ~rg 7:yr Glu Sel~ Thr Are¡ Ser CI, Aro 645 650 655
Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro lle Gln Alu Asn His Thr Gl, Thr 660 665 670
Gly Leu Leu Leu Thr LcU Gln Pro elu GIn Lyf: Phe eln Lys Val Lys 675 680 685
Gly Phe GIy Gly ~la Met Thr ASp Ala Ala Altl Leu Asn 1112 Leu Ala 690 695 700
Leu Ser pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu LyH Ser Tyr Phe S~r Glu 70S 710 7l~; 720
Glu Gly Ile GIy Tyr Asn 1112 Ile Arg Val Pro Met Al a Ser Cy$ Asp 725 730 735
Phe Ser lle Arg Thr Tyr Thr Tyr Al. ASp Thl~ Pro Asp ,quot;p Phe Gln 740 745 750
Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Clu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro 7SS 760 765
Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu ....la Gln Arg 'ro V.l Ser Leu Leu 770 77S 780
Al. Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr ....sn Gl y A.la v.l 765 790 795 800
Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys ely Gln Pro Gly ASP Ile Tyr His Gln 80S 810 815
Thr Trp Ala ArO Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Al. Glu Hi$ 820 82S 830
Lys Leu Gln ,he Trp Ala val Thr Ala elu Asn Glu 'ro Ser Ala Gly 83S 840 84S
Leu Leu Ser ely Tyr Pro 'h. Gln Cys Leu Gly 'he Thr Pro Glu His aso ass 860
Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu ely Pro Thr Leu Ala Asn Ser 865 870 875 880
Thr Kis His Asn val Arg Leu Leu Met Leu Asp ASp Gl n Arg Leu Leu geS 990 995
Leu Pro His Trp Al a Lys val val Leu Thr ASP Pro Glu Ala Ala Lys 900 90S 910
Tyr Val Hia Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp 'he Leu Ala Pro OlS 920 '2S
Al. Lys Al. Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu ,he Pro Asn Thr Mee 930 93S 940
Leu 'he Ala Ser Glu Ala Cyo val Gly Ser LY' 'h. Trp elu Gln Ser
,,,
950 quot;S '60
val Arg Leu ely Ser Trp ASp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile 965 970 975
Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val val Cly Trp Thr As p Trp Asn Leu 990 985 990
Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe val quot;quot;quot;p 995 1000 1005
Ser Pro Ile Ile Val ASp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr t.ys Gln Pro 1010 1015 1020
Me' Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile pro Glu Gly Se~ 1025 1030 1035 1040
Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser eln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val 1045 lOSO 1055
Ala Leu Met His Pro ASp Gl y Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg
1060
1065 lOJO
Ser Ser Lys
Asp val Pro Leu Thr lle Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe
1 075
1080 108S
Leu C;lu
Thr Ile Ser pro Gly Tyr Ser Ile His T~r Tyr Leu Trp Ar¡¡
1090
1095 1100
Arg
Gln
1105
lt;210gt; 360
5 lt;211 gt; 661
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 360
Melt; Lys Trp Val Ser Phe I le Ser Leu Lau Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 S 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met ASn Aso Phe 20 2S 30
Gln Gly Leu Ar. Ser Phe Gly eys Ar. Phe Gly Thr eys Thr Val Gln JS 40
quot;
Lys Leu Aquot; His Gln Ile Tyr eln Phe Thr ASP cys Asp Lya ASp Asn SO SS 60
val Al, Pro Aro;¡ Ser Lys Ile Ser Pro Gln ely Tyr Asp Ala His Lys 65 70 80
quot;
Ser Glu V.:o.l 1I.la His Arg Phe Lys Jl.sp Leu Gly Glquot;, Glu Asn Phe Lys
.,
85 90
Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys pro Phe lCO lOS 110
elu Asp His Val Lys Leu val ASn elu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr 115 120 125
Cys Val Ala ASp Glu Ser Al a Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr 1 30 135 140
Leu Phe Gly 1I.sp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr 145 150 155 160
Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gl n Glu Pro Glu Arg Asn Glu 165 170 175
Cys Phe Leu Gln His Lys 1I.sp Asp Asn Pro ASo Leu Pro Arg Leu Val 180 185 190
Arg Pro elu Val Asp Val Met eys Thr Ala Phe His Asp Asquot; Glu Glu 200 205
Thr phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala ArO Aro His Pro 'I'yr 210 215 220
Phe Tyr Ala. pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala ns 230 :ns 240
Phe Thr Glu Cys Cy. Gll\ Ala Ala Asp Ly. Ahl Ala Cys Leu LoU Pro '45 '50 '55
Lys L~u II.sp Glu Leu II.rg Asp Glu Gly Lys Al~1 Ser Ser Al. Ly. Gln
260 265
'quot;
Arg Leu Lys Cyo Al... Ser Leu Gln Lys Phe Gllo' Glu Arg Al. Phe Lys 275 280 285
Al. Trp Al. Val Ala Arq LeU Ser Gln ArO phlt;!~ Pro Ly. Ala Glu Phe 290 29S 300
Alo Glu Val Ser Lys Leu Vol Thr ASp Lcu Th.z: Lyo Val His Thr Glu 30S 310 31~i 3'0
lt;ys Cys His Gly Aap Leu Leu Glu Cys Alo 1gt;.sp Asp 1\.rg 1gt;.la Asp Leu 325 330 335
Ala Lys Tyr lle Cys Glu Asn Gln Aap Ser 11(, Ser Ser Ly. Leu Lys 340 34S 350
Glu Cys Cys Glu Ly$ Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys rle Ala G1u 355 360 365
Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala ASp Leu pr() Ser Leu Ala Ala Asp 370 375 3BO
Phe Val Glu Ser Lys ASp Val Cys Lys Asn Ty.z: Ala Glu Ala Lys Asp 3BS 390 39~i 400
V.l Phe Leu Gly Melt; Phe Leu Tyr Glu Tyr Al.:, ArQ Arg His Pro Asp 405 410 415
'I'yr Ser Val v.l LeU Leu Leu Arg Leu Al. Lys Thr Tyr GIu Thr Thr 420 42' 430
Leu Glu Ly. Cy. Cys Ala. Ala Alo Asp Pro His GIu Cy. Tyr Ala Lys 435 440 445
Val Phe ASP GIu Phe Lys Pro Leu Val GIu GIl! Pro Gln Asn Leu Ile 450 4SS 460
Ly. GIn Asn Cys Glu Leu Phe GIu Gln Leu el)' GIu Tyr Lys Phe Gln . 6S 470 47~i 'BO
Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Ly. Val Pro Gln Val Ser Thr .BS 490 49S
Pro Thr Leu V.l Glu va.l Ser Arg Asn Leu Gl)' Lys Val Gly Ser Ly. SOO 50S 510
Cys Cys Ly. Hquot; Pro Glu Ala Ly. Ar. Met Prco Cys Al. Glu ASp Tyr 51S 520 52S
LeU Ser v.l Val Lcu Asn Gln Leu Cys val Leu Hb. elu Lys Thr Pro 530 53S 540
Val Ser 1gt;.sp Arg Val Thr Ly. Cys Cys Thr Glo Ser Leu Val Asn Aro 54S SSO SSS 560
Arg P~o Cys Phe Ser Ah !.eu Glu val Asp Glo Thr Tyr Val 'ro Ly.
565 570 575
Glu Phe Asn A', Glu Thr ~he 'l'hr Ph. His 1\1a Asp 'Ile Cys 'hr Leu 580 585 590
Ser Glu Lyo Glu Arg eln Ila Ly. Lyo Gln Thr Ala Lou Val Glu Leu 595 600 60s
Val Lyo His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lyo Ala Val Met. 610 615 620
AsO Asp Phe Ala Ala ehe Val Glu Lys Cys Cy$ Lys Ala Asp Asp Lys 625 6JO 635 640
Glu Thr Cys Phc Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln 645 650 655
Ala Alti
Leu Gl y 660 Leu
5
lt;210gt; 361 lt;211gt; 658 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 361 Melt; Trp Trp Ar. Leu Trp Trp Leu l 5
Lau Leu Leu 10 Leu Leu Leu Leu Trp 15
Pro Met val Trp Agt;a Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu 20 25 JO
Arg Ser Phe Gly Cys 1'.rg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala 35 40 4S
His Gln Ile Tyr eln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp A~n val Ala Pro 50 55 60
Arg Ser Lys Ile Ser Pro eln Gly Tyr Asp Ala Hls Lys Ser Glu Val 65 70 75 80
Ala Hla Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu GIu Asn Phe Lys Ala Leu Val 85 90 9S
Leu Ile Ala Phe ALa Gln Tyr Leu eln eln Cys Pro phc Glu Asp His 100 lOS 110
val Lys Leu Val Asn Glu val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala l1S 120 125
Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 130 135 140
Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly C1u Met 145 150 155 160
Ala Asp Cys Cys Ala Lys Cln C1u Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 165 170 175
Gln His Lys ,quot;p Asp Asn Pro Asn Leu Pro Ar~, Leu Val ArO Pro Glu 180 185 gt;90
Val Asp Val quot;olt; CY8 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu 195 200 205
Lyo Lyo Tyr Leu Tyr Glu He Ala Arg Aro Hi!: Pro Tyr Phe Tyr Ala 210 215 220
Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Ala Ala Phe Thr elu 225 230 240
Cys Cys eln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp 245 250 255
Glu Leu Arg Asp elu Cly Lys Ala Ser Ser A1II' Lys Gln Arg Leu Lys 260 265 270
Cys Ala Ser Leu eln Lys Phe ely Glu Arg Ala, Phe Ly. Ala Trp Ala 275 280 285
Val Ala Aro Leu Ser Gln Arg Pho Pro Lys Ale' elu Phe Ala Glu Val 290 295 300
Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val HÜ5: Thr Glu Cys Cys His 305 310 31S 320
Gly Asp Leu Leu elu Cys Ala Asp Asp Aro Al~ Asp Leu Ala Lyo Tyr 325 330 335
¡le Cys elu Asn eln Asp Ser Ile Ser Ser Lys: Leu Lys Clu CyS Cys 340 345 350
elu Lys pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys IlE~ Ala Glu val Glu Asn 355 360 365
Asp Clu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu 11.18, Ala Asp Phe Val elu 370 375 380
Ser Lyo ASP Val Cys Lyo AOn Tyr Ala G1u Ala. Ly. Asp Val phe Leu 385 390 395, 400
Gly Met Phe toeu Tyr Glu Tyr Ala Arg Aro Hili¡; Pro Asp Tyr Ser Val lt;os 410 415
Val Leu Leu Leu ArO Leu Ala Lys Thr Tyr elu. Thr Thr Leu Glu Lyo 420 425 '30
Cys Cys Al. Al. Ala ASp Pro His Glu Cys Tyr' Ala Lyo V.l Phe ASp 435 .lt;0 445
Glu Phe LY' pro Leu Val elu elu Pro Gln Asn Leu He Lys Gln Asn 450 455 460
Cyo Glu Leu Phe Glu eln Leu Gly elu Tyr Lyo Phe e1n ASO Ala Leu 465 470 475 480
Leu Val Arg Tyr Thr Lya Lys Val Pro Glo Val Ser Thr Pro Thr Leu 485 490 495
Val G1u Val Ser Arg ASO Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys
500 sos
Mis Pro Glu Ala Lys A~g Met Pro Cys Ala Glu ASP Tyr Leu Ser Val S15 520 525
Val Leu Asn Gln Leu Cy$ V31 Leu His Glu Lys Thr pro Val Ser Asp 530 535 540
Aro Val Thr Lys Cys eys Thr Glu Ser Leu val Aon Arg Arg Pro eys 545 SSO SS5 560
Phe Ser Ala Leu Glu v.l Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn 565 570 575
Ala GIu Thr ehe Thr phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys 580 585 590
Glu Arg Gto Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu val Lys His 595 600 605
Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe 6 10 615 620
Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys GIu Thr Cys 625 630 635 640
Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu 645 650 655
Gly Leu
lt;210gt; 362 lt;211gt;661
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 362
Met Lys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arq Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 lO
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu val Leu 15 40 45
I le Ala Phe Ala Gln 'i:yr Leu Gln Gln Cys pro. Phs Clu Asp Kis Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys val Ala Asp 65 70 75 80
Glu Ser Abo Gl u Asn eys Asp Lys Ser Leu His Thr Le',.l Phe Gly Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Ar. Glu Thr Tyr Gly Glu Met Al. 100 105 110
A¡¡¡P Cys Cys Al. Lys Gln Glu 'ro Glu Arg Asn Glu ey. ' he Leu Gln llS 120 125
His Ly. ASp ASp Asn Pro quot;n Leu Pro Arg Leu val Arg Pro elu Val 130 l3S 140
Asp Val Met Cys Thr Al. Phe His Asp Aso Glu elu 'l'hr Phc Leu Lys 145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr elu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro lOS 170 17S
Glu Leu Leu 'he Phe Ala Lys Arg Tyr Ly$ Al~l Ah, Phe Thr Glu Cys
180 lBS 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp elu 19S 200 20S
Leu Aro Asp elu Gly Lys Al. Ser Ser 1\.la LY~I eln Ar. Leu LYIgt; Cys 2gt;0 2gt;5 no
Al. Ser Leu eln Lys Phe ely elu Arg Ala PhEI Lys Ala Trp All!. v.l 22S 230 2J~¡ 240
Al. Arg LeU Ser elo Aro Phe pro Lys Al. GIl! Phe Ala elu Val Ser 24S 250 25S
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
ASp Leu Leu elu Cys Ala Asp Asp Arg Al a ASP Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 28S
Cy. elu Aso eln Asp Ser He Ser Ser Lys Lel.l Ly. elu Cys Cys Glu 29' 29S
Lys Pro Leu Leu elu Lys Ser Mis Cys lle Ahl Glu val Glu Asn Asp 30S 310 Jl~¡ 320
Gl u M~t Pro Ala Asp LeU Pro Ser Leu Al. Al;el Asp Phe Val Glu Ser 325 330 33S
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala elu Ala Ly.!!1 Asp Va l 'he Leu Gly 340 345 3SO
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg Hi s Prc. Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu ArlJ Leu Ala Lys Thr Tyr elu Thr' Thr Leu Glu Lys Cys 370 37S 380
Cys Ala Ala Ala Asp 'ro Hi~ GI\!. Cys Tyr AlaL Lys V.l Phe Asp elu 38S 390 395,
40'
Phe Lys Pro Leu Val elu elu Pro Gln As n Leu, Ile Lys Gln Asn Cys 40S 410 '15
Glu Leu phe elu Gln Leu Gly Gl u Tyr Lys Phe, eln Asn Ala Leu Leu .20 quot;5 030
val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln val Ser' Thr pro Thr Leu Val
OlS ..O .45
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Ly$ Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg r.et Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480
Leu Asn Cln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 ~95
Val Thr Lys Cys Cys Thr elu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 50S 510
Ser Ala Leu elu Val Asp Glu Thr Tyr V.l Pro Lys elu Phe Asn Ala
51' 520 52' elu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser elu Lys Glu
,.o
'lO 53'
Ar. eln Ile Lys Lys eln Thr Ala Leu Val elu Leu Val Lys Mis Lys S4S '50 SSS 560
Pro Lys Ala Thr Lys elu Cln Leu Lys Ala Val Met: Asp ASP Phe Ala 56' 570 575
Ala Phe Val elu Lys Cys Cys Lys Al. Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu elu ely Lys Ly$ Leu Val Ala Ala Ser Cln Ala Ala Leu Cly 595 600 60S
Leu Tyr Ar. Cln Ser Met: ,gt;n Aon phe Cln Gly Leu Ars Ser phe Gly 610 615 620
Cya quot;. Phe Gly 'l'hr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala tUs Cln 11e Tyr 625 630 635 640
eln phe 'l'hr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Al. Pro Arg Ser Lys 11e 6'5 550 quot;S
Ser Pro Cln ely TYr 6..
5
lt;210gt; 363 lt;211gt;661 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 363 Me' Lys Trp Val 1
Ser Phe 5 Ile Ser Leu Leu 10 Phe Leu Phe Ser Ser Al. IS
TYr
Ser Arg Su Leu Asp Lys Arg 20 AsO 25 Al. His Lys Ser elu Val Ala 30
His Arg
Phe Lys Asp 3S Leu Gly Glu elu Aso 40 Phe Lys Ala Leu 45 Val Leu
Ile Ala 50
Phe Ala el.n Tyr Leu Cln Cln Cys 55 Pro Phe elu Asp 60 His Val
Ly, Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala LY'iJ Thr Cys Val Ala ASp 6S 70 7'-., 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu Hi:; Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 .5
Lys Leu Cys Th, V.l Ala Thr Leu Alt;g Glu Thr Tyr Gly Glu Mct Ala 100 lOS 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu quot;lt;o Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
m. ______ __ -nl_-Ghnl
~
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Al. Phe His Asp Asn elu Glu Thr Phe Leu Lys quot;5 ISO 15~1 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Argo Arg His Prc) Tyr Phe 'lYr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Aln Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Ly, Leu Asp Glu 195 200 20S
Leu Arg ASp Glu e ly Lys Ala Ser Ser Ala LYII Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe el)' Glu Arg Ala PhI! Lys Ala Trp Ala Val 225 230 23!; 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arq Phe Pro Lys Al. Glu Phe Ala Glu V.l Ser 245 2SO 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thl: Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Argo Ala 1\sp Leu Ala Lys Tyr lle 275 280 285
Cys Glu Asn Glo Asp Ser lle Ser Ser Lys Le\! Lys Glu Cys Cys Glu
2.0 2.5 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lle AiLel Glu Val Glu Asn Asp 30S 310 31~; 320
Glu Met Pro Ala Asp Le u Pro Ser Leu Al. Alel Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys ASP V~l Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly~1 Al5P val Phe LE!u Gly 3lt;0 345 3SO
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Prcgt; Al5p Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu LeU Leu Arg Leu Ala Ly. Thr Tyr e l u Thr Thr Leu Glu LyS Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys val Phe Asp Glu 385 390 395 400
Phe Lys Pro ~eu val Glu Glu Pro Gln '-n Leu lle Lys Cln 'sn Cys .OS 410 '15
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Al. Leu Leu
420 ." 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Lel.l Val 43S quot;0 44S
Glu Val Ser Arg Asn Lcl.I Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser val Val 465 470 475 480
Leu Asn Cln Leu Cys Val Leu His Clu Lys Thr PrO val Ser Asp Arg 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr ell.l Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Clu Thr Tyr Val pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
elu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lle Cys Thr Leu Ser elu Lys elu 530 535 540
Arg Gln 1le Lys Lys eln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys alu eln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val elu Lys Cys Cys Lys Ala A~p Asp Lys elu Thr Cys Phe S80 585 590
Ala Glu G1u Gly Lys Lys Leu Vol Ala Ala Ser eln Al. Al. Leu Gly 59S 600 60S
Leu Tyr ArO Gln Ser Met '-n '-n Phe Gln Gly Leu ArO Ser Phe Cly
610 61S
Cys Aro Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu 62S 630 63S
eln Phe Thr Asp Lys ASp Ly$ Asp Asn Val Ala 645 650
Ser Pro eln Gly Tyr 660
lt;210gt; 364
lt;211gt; 735
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 364
Al. His eln lle Tyr 640
Pro Arg Ser Lys lle 655
Me' Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu ph,e Leu phe Ser Ser Al. 1 S 10 15
'l'Yr Ser Arg Oly vol Phe Arg Aro Asp Ala Hi:5 Lys Ser olu Val Ala 20 25 30
His Arg phe LY' ASP Leu Gly Olu Olu Aso Phlt;S! L)'s Al. Leu Val Leu
.,
3S 40
ne Al. Phe Ala GIn 'T'yr Leu Oln Glo Cys Pro;) Phe Olu ASp His Val 50 SS 60
Ly. Leu Val Asn Glu Val Thr Olu Phe Ala LyJS Thr Cys VlIl Ala asp 65 70 7!5 ea
elu Ser Ala Glu Asn ey. 1\sp Lys Ser Leu Hi13 Thr Leu Phe ely Asp BS 95
quot;
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Arg Glu Th:r 'IYr Gly Glu Met Ala 100 105 110
ASp Cys Cys Ala Lys GIn Glu Pro Glu Arg Asn alu ey. Phe t.eu GIn 115 120 125
His Lys ASP Asp Asn Pro Aso Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140
Asp Val Met Cys Thr al. Phe His Asp ASO CllJ alu Thr Phe Leu Lys 145 150 15::' 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Prquot; Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Gl u Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Allt Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys GIn Ala Ala ASP Lys Ala al. Cys Leu Lell Pro Ly. Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys ala Ser Ser Ala Ly!gt; Oln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Gln L Ylil Phe Gly Glu ArO Ala Pnt! Lys Ala Trp Ale val 225 230 23!j 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Al. Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thl~ Glu Cys Cys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala ASp Leu ala Lys Tyr Ile 275 280 2es
Cys Glu Asn Gln Asp Ser 1 l e Ser Ser Lys LeU Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ah¡ Glu Val Glu Asn Asp 30S 310 315 320
Clu Met pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ah, Asp phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys ASp Val Cys Ly$ As!'1 Tyr Ala Clu Ala Ly~; ASP val pne Leu Gly 3lt;0 3lt;5 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tye Ala Arg Arg HilO Pec, Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Aeo¡J Leu Al a Ly. Thr Tyr quot;lu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 310 315 390
ey, Al. Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Al. LYS Val Phe ASP Glu 3as 390 395. '00
Ph. Lquot; pro Leu Val Glu clu Pro Gln gt;sn Leu lle Lys Gln Asn eyo 405 no 415
alu Leu Phe elu eln Leu ely elu Tyr Lys Phe eln hsn Al . Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro eln val Ser' Thr Pro Thr Leu val 435 quot;O 445
elu Val Ser Arg ASR Leu Gly Lys Val Gly Ser' Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro elu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu ASp Tyr Leu Ser Va l Val 465 470 .?5 480
Leu Asn Cln Leu eya Val Leu His Glu Lys Thr-pro Val Sor Asp quot;quot;O ••5 490 .quot;
Val Thr Lys eys eY' Thr Glu Ser Leu Val Asn_ Arg Arg Pro ey, pne 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Vol pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr phe His Ala ASp :!le Cys Thr-Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 54'
ArO eln Ite Lys Lys eln Thr Ala Leu Val Glu_ LeU Val Lys His Lys 5lt;5 SSO 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys elu Gln Leu Lys Al. Val Met Asp Asp Ph. Ala 565 570 575
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Ala elu elu ely Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser eln ». Ala Leu Gly 595 600 605
Leu Glu Pro Leu elu Lys Val Ala Ser Val Gly gt;sn Ser Acg Pro Thr 610 615 620
ely Gln Gln Leu elu Ser Leu ely Leu Leu Ala Pro Gly Glu eln Ser 625 630 635 640
Leu Pro Cys Thr elu Aro Lys Pro Alt1. Altl. Thr Ala J\.rg Leu Ser Aro
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eln Pro el, Leu Ser Ala Pro Hia Ser Arg Gln Ile Pro quot;,O Pro Gln 675 68O ,as
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lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 365
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Lys Leu val Asn Olu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 6S 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Aan Cys ASP Lys Ser Leu Hia Thr Leu Phe Oly quot;p85 'O 95
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As. Val Met Cys Thr Al. Phe His Asp Asn Olu Glu Thr Phe Leu Ly, 145 150 155 160
Ly. Tyr Leu Tyr Olu ne Ala Arg Arg His pro Tyr Phe Tyr Al. Pro ,.5 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu pro Lys Leu Asp elu 195 200 205
Leu Ar. Asp Clu Gly Lys Al. Ser Ser Ala Ly~1 eln Arg Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu Cln Lys Phe Gly GIu Arg Ala I:'hE! Lys Ala Trp Ala Val 230 23S 240
22'
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu i'he Ala Glu Val Ser 245 250 255
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LyS Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly5' ASp val Phe Leu Gly 340 34' 350
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Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 'l'Yr Glu Thr Thr Leu GIu Lys Cys 370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala. Lys Val Phe Asp Glu 3aS 390 395, quot;O
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405 410 41'
Glu Leu phe elu Cln Leu Gly Glu Tyr Lys pht!, eln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser' Thr pro Thr Leu Val 435 440 445
Gl\J Val Ser Aro Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser' Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
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Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys GI u Thr Cys Phe
580 585 590
Ala GIu Glu e l y Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala LCU Gly 595 600 60S
Leu GIu p~o Lcu GIu Lys val Ala Ser Val ely Asn Ser Arg Pro Thr 610 615 620
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Arg Gly Thr Selt; Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser 0lt;0 Oln 660 665 '70
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690 695 700
Asn Ser Phe Gly Leu Ar. Phe Gly Lys Arg Olu Al. Al . Pro Oly Asn 70s 710 715 720
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lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 366
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Tyr Ser Arg Ser Leu A.sp Ly.!l Arg Lys 'sn Leu Glu Pro Val Ser Tlt;p 20 2S 30
Ser Ser Leu Asn Pro Lys Phe Leu Ser Gly Lys Gly Leu Val lle Tyr 35 40 45
Pro Lys Ile Gly Asp Lys Leu ASp lle lle Cys Pro Arg Ala Glu Ala 50 55 60
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180 . 185 190
Ser Arg Gly Ser Leu Gly Asp Ser Asp Gly Lys: Hia Glu Thr val Asn 195 200 205
Gln Glu Glu Lys Ser Cly Pro Cly Ala Ser Gly Gly Ser Ser Gly ASO' 210 215 220
Aop Ala Hia Lys Ser Glu Val Ala Hia Arg Phe, Lquot; Asp Leu Cly Glu 225 230 235 240
Glu Jl.sn Phe Lys Ala Leu Val Leu l1e Ala Phe, Ala Gln Tyr Leu Gln 24' 250 255
Gln Cys Pz-o Ph. Glu Asp His vul Lys Leu Val. Asn Gl u Val Thr Glu 260 265 270
Phe Alquot;, Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser 11.181 G1u Asn Cys Asp Lys 275 2.0 2.5
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys: Thr V., Ala Thr Leu
'90 295 300
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325 330 335
Pro Arg Leu Val Arg pro Glu Val ASP Val Met. Cys Thr Ala Phe His 340 345 350
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Ar. Hquot; pro Tyr Phe 'l'yr Al. Pro Glu Leu Leu. Phe Phe Ala Lys Arg 370 375
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385 390 39S, 400
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Ser Ala Lys Gln gt;rO Leu Lys Cys gt;la Ser Leu eln Lys Phe Gly alu 420 425 430
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1\rg Ala ASp Leu Ala Ly~ Tyr 11e Cys G1u Asn Gln Asp Ser 11e Ser 485 490 495
Ser Lys Leu Lys Glu CyS Cys Glu Lys Pro Leu~ Leu Glu Lyo Ser His 500 505 510
Cys 1le Ala Glu Val Glu Asn Aop Glu Met Pro Ala gt;Sp Leu Pro Ser 515 520 525
Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys ASP Val. Cys Lys Asn Tyr Ala 530 535 540
Glu Ala Lys Aap Val Phe Leu Gly Met phe Leu. Tyr Glu Tyr Ala Arg 545 5SO 555 560
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610 6quot; 620
'NI Lys Phe eln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 630 635 '10
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Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 725 730 735
Ile C:ys Thr Leu Ser Clu Lys Glu gt;c. Gln Ile Lys Lys Gln l'he Ala 740 745 750
Leu Val Glu Leu vllIl Lys Hia Ly. pro Lys Ala Thr Lys Glu Cln Leu 760 765
7quot;
Cy. Al. Val Met Asp ASp 'he Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 770 775 780
Ala Asp Asp LyS Glu Thr Cys Phe Ala Glu Gl u Gly Lys Lys Leu Val 785 790 795 800
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 805
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Met Ala Arg Pro Gly Gln Arg Trp Leu Gly Lys Trp Leu Val Ala Met 1 5 10 15
Val Val Trp Ala Leu Cys Arg Leu Ala Thr Pro Leu Ala Ly. Asn Leu 20 25 30
Glu Pro Val Ser Trp Ser Ser Leu quot;n PI:quot;O Lys Phe Leu Ser Gly Lys 35 40 45
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Val Aro Pro Glu eln Ala Ala Ala Cys Ser Thr Val Leu Asp Pro Asn 85 90 95
Val Leu Val Thr Cys Asn Arg Pro elu Gln Glu Ile Arg Phe Thr Ilc 100 105 110
Lys Phe eln elu Phe Ser Pro Asn Tyr Met Gly Leu Glu Phe Lys Lys 115 120 125
H1s His Asp Tyr Tyr lle Thr Ser Thr Ser Aso Gly Ser Leu Glu Gly 130 135 140
Leu Glu Asn Arg Glu Gly Gly Val Cys Arg Thr Arg Thr Met Lys Ile 145 150 155 160
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Thr Thr Ser Arg Pro Ser Lys Olu Ala Asp Asn Thr vlJIl Lys Mer Al.
180 las lOO
Thr Gln Al~ Pro Gly ser Arg Gly Ser Leu Gly Asp Scr lI.Sp Gly Lys 195 200 205
His Glu Thr Val Asn Gln Glu Clu Lys Ser Gly Pro Gly Ala Ser Gly 210 215 220
G1y Ser Ser Gly Asp Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala. Mis Arg Phe 225 230 23~i 240
Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Al. Leu Val Leu rle Ala Phe 245 250 255
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Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu PhE' G1y Asp Lys Leu Cys 290 295 300
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Ala Lys Gln Glu pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe, Leu Gln Mis Lys Asp 325 330 335
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Cys Thr Ala Phe His ASp Asn Glu Glu Thr phe, Leu Lys Lys Tyr Leu 355 360 365
Tyr Glu lle Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr' Ala Pro Glu Leu Leu 370 375 380
Phe Phe Ala Lya Ar9 Ty~ Lys Ala Ala Phe Th~' Glu Cys Cys Cln Al. 385 390 395 400
Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu ASp Glu Leu Arg ASP 405 410 415
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Gln Lys Phe Gly Clu Arg Ala Phe Ly s Ala Trp Ala V.1 Ala Arg Lcu 435 440 445
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Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro ASP Tyr 405 410 415
Ser Val val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Olu Thr Thr Leu 420 425 430
Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 435 440 445
?hc Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys 450 455 460
Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phc Gln Ann 465 470 475 480
Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys val Pro Gln val Ser Thr ~ro 485 490 495
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. Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Aro Arg 545 550 555 560
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Ala Leu Gly Leu 660
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val Peo Ol u ASP Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr a.p Ala Thr Leu JS 40 4S
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Pro Val Leu Glo eln ASP Ala His ely Se~ Val Thr Ile Thr ely eln 225 230 235 240
Pro Met Thr Phe gt;ro pro Glu .Asp Ala His Lyl: Ser Glu Val Ala His 245 250 255
Arg Phe Lys AsO Le. Gly Glu Glu Aso 'he Ly~¡ Aja Leu Val Le. Ile 260 265 270
Ala Phe Ala Glo Tyr LeU Gln Ola Cy, Pro PhE~ Glu Asp His Val Lys 27' 280 285
Leu Val Aso Glu val Thr Olu 'he Ala Lys Thz: Cys Vsl Al.'!l Asp Glu 290 295 300
Ser Al. Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His ThI: Leu Phe Gly Asp Lys 30'
310 3l~i 320
Leu Cy$ Thr Val Ala .hr Leu Arg Glu 'hr Tyt: Gly Glu Met Al. AsO 325 330 335
Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Gl1,:L Cys Phe Leu Gln His
340 345 350
Lys ASP AsO Aso Pro Asn Leu 'ro Arg Leu val Arg 'ro elu val J\sp 3SS 360 365
Val Mer Cys Thr Ala Phe His AsO Asn Glu Glu Thr 'he Loeu Lys Lys 370 375 380
Tyr Le. Tyr Glu 11e Ala Arg Arg His Pro Tyr 'he Tyr Ala Pro elu 385 390 39~i 400
Leu Leu Phe Phc Ala Lys Arg Tyr Lys Al. Ala phe Thr Glu Cys Cys 405 410 415
Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu ASp Glu Leu 420 425 430
Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala 435 440 445
Ser Leu elo Lys Phe Gly Gl. Aro Ala Phe Ly~; Ala Trp Ala Val Ala 450 455 460
Arg Le. Ser Gln Arg 'he Pro Lys Ala Glu phE~ Ala Glu Val 5er Loys 465 470 475i 480
Le. val Thr Asp Leu Thr Lys Vill His Thr Olu Cys Cys His Oly Asp 485 490 495
Leu Leu Glu Cys Ala ASp Asp Arq Al. Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 500 505 510
Glu Asn Gln ASp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys: Glu Cya Cys Glu Lys 515 520 525
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys 1le Ala Glu Val Clu ASO ASP Glu 530 535 5lt;0
Met pro Ala ASp Leu Pro Ser Leu Ala Ala As¡:, Phe Val Glu Ser Lys 545 550 555, 560
Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met 565 570 575
Phe Leu Tyr elu Tyr Ala Arg Aro His Pro Asp Tyr Ser Val val Leu 580 585 5'0
Leu Leu Aro Leu Al.a Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Le u Glu Lya Cys Cys S9S 600 'OS
Al. Al. Al. Asp Pro His Glu Cye Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu phe 610 615 620
Lys Pro Leu Val. Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile LyS eln Asn Cys Glu 625 630 6J5 640
Leu Phe elu Gln Leu e l y elu Tyr Lys Phe eln Asn Ala Leu Leu Val 645 650 655
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Clu 660 655 670
val Ser Ar~ Asn Leu ely Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro 675 680 685
GIu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu 690 695 700
Asn GIn Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser ASp Arg Val 70S 710 715 720
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Va l Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 725 730 7H
Ala Leu Glu val ASP Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 740 745 750
Thr Phe Thr Phe Hi s Al a Asp Ile Cys Thr Leu Ser elu Lys Glu Arg 755 760 765
Cln rle Lys Lys eln Thr Ala Leu Va l Glu Leu Val Lys His Lys Pro 770 77S 780
Lys Ala Thr Lys Gl u Cln Leu Lys Ala Val MeC Asp Asp Phe Ala Ala 785 790 795 800
Phe val elu Lys Oy, Cy. Lys Ala Asp Aop Lys Glu Thr Cys Phe Ala 80S 810 815
Glu Glu Gly Lyo Lya Lcu Val /l.la Al a Ser Cln /l.la Ala Leu ely Leu 820 825 830
lt;210gt; 370
lt;211 gt; 809
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 370
Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala Hi~1 Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30
Iiis Arg Phe Ly. Asp Leu G1y Glu Glu Asn PhE~ Lys Al. Leu Val Leu 35 40 45
n. Al. Phe Ala Gln Tyr Leu eln Gln Cys Pro Phe elu Asp His Val 50 60
quot;
Lya Leu val Asn G1u V.l Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Al. Asp 65 10 ?' .0
-
'
Glu Ser Al;:!. Glu Asn Cy. Asp Lys Ser Leu Hisl Thr Leu Phe Gly A.p .5 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Th!~ Tyr G1y Glu Me' Al. quot;O lOS UO
A SP Cys Cys Ala LY!:l Cln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Cln 115 120 125
His Lys Asp ASp Aso Pro Asn Leu Pro Arg Le1,;1 V.l Arg pro Glu Val 130 135 140
ASp Val Met Cys Thr Al. Phe Mis Asp Asn Glu Glu 'l'hr Phe Leu Lys 145 150 155 160
Lys Tyr Leu 'l'yr Glu Ile Ala Arg Arg HilO PrcI Tyr Phe 'l'yr Ala pro 165 110 175
Glu Leu Leu phe Phe Ala Lys Ar9 Tyr Ala Phe Thr Glu Cys
Lys A1m
'quot;
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Al. Cys Leu Lc1,;, Pro Lya Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Ar9 ASp Glu GIl' LyS Ala ser Ser Ala Ly~i Cln Ar9 Leu Lys Cys 210 215 220
Al. Ser Leu Gln Lys phe Gly G1u Arg Ala Ph,,! Ly. Ala Trp Ala Val 225 230 23~; 240
Al. Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Al. Clu Phe Ala C1u v.l Ser
quot;5 255
quot;.
Lys Leu Val Thr gt;Sp Leu Thr Lys V.l Mi. ThI· G1u Cys Cy. His Gly 260 265 210
Asp Leu Leu G1u Cys Ala I\.sp I\.sp I\.rg Ala As¡¡:' Leu Ala Lys Tyr I1e 275 280 2.5
Cys G1u Asn Cln Asp Ser Ile Ser Ser LyS Lequot;, Ly. Glu Cys Cys Glu 2quot; 295 300
Ly. Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala, Clu Val G1u Asn gt;00 JOS 310 315, 320
G1u Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Al. Ah, Asp Phe Val Glu Selt; 325 330 335
Lys Asp val Cy. Lys Asn TYr Ala Olu Al~ Ly~¡ AS-P Val Phe Leu Gly
34. 34S 3quot;
Melt; Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Ar. Ar. Hic Pre. Asp Tyr Ser Val Val 3SS 360 36S
Leu Leu Leu Arg Leu Jl.la Lquot; Thr Tyr elu ThIquot; Thr Leu elu Lys CyS 370 375 380
lt;ya Al. Ala Ala A.sp pro His Glu Cy.s Tyr Alquot;, Ly. V.l Phe Asp Olu 385 390 39$ 400
Phe Lya Pro Leu Val Olu elu Pro Gln Asn Lc,,;, tIc Lys Gln Asn C,. 405 41' 415
Glu Leu Phe Olu Oln Leu Gly Glu Tyr L,. PhE' Gln Asn Al. Leu Leu 420 42S 43.
Val I\rlt;¡ Tyr Thr Lya Lys val Pro Oln V~l Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 44' 44S
Olu V.l Ser Mg Asn Leu Oly Lya Val Gly Ser Ly. Cya Cys Lys His 4quot;
455 460
Pro Olu Ala Lys Arg Me' quot;,o Cys 1gt;ola elu 1gt;osp Tyr Leu Ser Val V.l '.S .quot; 47$ 4.'
Leu I\sn eln Leu CyS val Leu His Glu Lya Thr Pro Val Ser Asp Arg'.S 49. 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr G1u Ser Leu Val ASI1' Ar!iJ Arg Pro Cys phe 500 505 51'
Ser Ala Leu Glu val Asp G1u Thr Tyr Val Prcl Lys Olu Phe Asn Ala
515 52. 52S
Glu Thr phe Thr quot;he His Ala Asp Ile Cy$ Th:¡;· Leu Ser Glu Lys Glu 51' 53S 54'
Arg eln 11e Lys Lys Oln Thr Ala Leu Va l Olu Leu Val Lys His Lya 545 SS, 555, 56'
Pro Lys Ala Thr Ly¡;¡ alu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp ASp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASJ;' Lys Glu Thr Cys phe
58. 5B5 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Jl.la Ala Se:¡;· Gln Al. Ala Leu Gly
595 600 60S
Leu Lys Aso Leu Glu quot;rQ Val Ser Trp Ser Sel:· Leu Asn Pro Lys Phe
610 615 620
Leu Ser G1y Lys Gly Leu val lle Tyr Pro LyS: 1le Gly Asp Lys Leu 625 630 635, 640 As. Ile :lle Cys Pro Ar. Ala Glu Ala 01, Arg· Pro Tyr Glu Tyr Tyr
645 650 6SS Ly~ Leu Tyr Leu V., Arg Pro Glu aln Ala Ala_ Ala Cys Ser Thr V.,
660 665 670
Leu Asp Pro Asn Val Leu val Thr Oys Aso Arq Pro Glu Gln Glu Ile 675 680 685
'ro Ph. Thr Ile Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro ASn Tyr Mee Gly Leu 695 700
Glu Phe Lys Lys His His Aogt; Tyr Tyr Ile Thr Ser Tnr Ser Aso Gly 70S 710 115 no
Ser Leu Clu Cly Leu Glu Asn Arg Clu Gly Gly val Cys Arg Thr Arg 72S 730 735
Thr Met Lys I1e I le Met Lys V~l Gl y Glo ASp pro ASO Ala Val Thr 740 745 750
Pro Glu Olo Leu Thr Thr Ser Arg pro Ser Lys Cl u Ala Asp Aso Thr 755 760 765
val Lys Met Ala Thr Gln Ala Pro Gly Ser Arg Gly Ser Le u Gly Asp
770 775 780
Ser ASp Gly LyS His Glu Thr Val As n Gl0 Glu Glu Lys Ser Gly Pro 785 790 795 800
Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp 805 '
lt;210gt; 371
lt;211gt; 809
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 371
Met Lys Trp val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser ArQ Ser Leu Asp Lys Arg ASP Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 2S JO
His Arg Phe Lys Aep Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys AI~ Leu V~l Leu 35 40 45
Ile AIB Phe Ala eln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala ASP
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly ASP SS 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110
ASp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Azn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125
His Lys Asp Asp ASn P~O quot;quot;O Leu Pro A~9 Leu Val A~9' P~o Glu Val 130 135 140
's. Val Met Cys Th%quot; Ala phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Ly. 145 150 l5~j 160
Lys Tyr Leu Ty%" Glu 11e Ala Arg Arg His Prcl Tyr Phe Ty~ Al. Pro 165 170 175
Glu Leu LeU Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ahl Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190
Cys eln Ala Ala ASP Lys Ala Al. Cys Le u Leu Pro Ly. Leu Asquot; Glu 195 200 205
Leu Arg AO. Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Ly~~ Glo ArO Leu Lys Cys 210 215 220
Ala Ser Leu eln Lys Phe Gly Glu Ara Ala Phe! Ly. Ala T%quot;p Ala Val 225 230 23~; 2lt;0
Ala Ara Leu Ser Gln Arg Phe pro Lya Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr ASp Leu Th~ Lys val His Thr Glu Cys Cy. His Gly 260 265 270
A.squot; Leu Leu elu Cys Ala ASp Asp A~g Ala ASp Leu Al a Lys Ty%quot; .lle 275 280 265
CyS Clu Asn Gln ASP Se~ Jle Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Clu 290 295 300
Lys P~o Leu Leu Glu LyS Se~ His Cys lle Ahl Glu val Glu Mn 305 310 315 quot;'quot;
Glu Met Pro Ala ASp Leu Pro Ser Leu Ala AI¡:l Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys ASquot; Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys ASquot; Val Phgt; Leu Gly 340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg A%quot;9' His Prcl ASquot; Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu L..-U Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thl: Thr Leu Clu Lys Cys 370 375 380
Cquot; Al. Ala Ala ASP Pro Hi.. Glu CyS Tyr A.l.el Lys Val Phe ASP Glu 385 390 395; .00
Phe Ly. Pro Leu V.l Glu Glu Pro eln quot;n Leu Ile Lys eln quot;n Cys .05 410 415
elu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Clu Tyr Ly. Phf;' Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Aro;¡ Tyr Thr Lys Lys Val ero Gln V.l Sel' Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Ly. val Gly Set' Lys Cy' Cys Lys His
450 460
45'
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val val 465 470 475 480
Leu Asn Cln Leu Cys val Leu Hi5 Glu Ly5 Thr Pro val Ser A~p Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val ~sn Arg Arg pro Cys Phe 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pr~ Lys Glu phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr phe Thr Phe His Ala Asp ¡le Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
~rg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Ly~ Hi~ Lys 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met ASP Asp Phe Ala 565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASp ASp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lye Lys Leu Val Ala Ala Ser Cln Ala Ala Leu Gly 595 600 60S
Leu Lye Aen Leu Glu Pro Val Ser Trp Ser Ser Lou Asn Pro Lys Phe 610 620
'quot;
Lou Ser Gly Lys Gly Leu Val Ile Tyr Pro Lys 11e Gly ASP Lys LeU 625 630 635 640
Asp 1 le rle Cys pro Aro Ala Glu Ala Cly Ar. Pro Tyr Glu Tyr Tyr 645 650 655
Lys Leu Tyr Leu Val ....rg Pro Glu Gln Ala Ala Ala CyS Ser Thr Val 660 665 670
Leu Asp Pro Asn Val Leu Val Thr Cys Asn Arg Pro Glu Gln Glu rle 675 680 685
Ar. quot;he Thr Ile Lys Phe Cln Clu phe Ser Pro Asn Tyr Met Gly Leu 690 'quot; 700
Clu Phe Lys Lys Kis His Asp Tyr Tyr Ile Thr Ser Thr Ser Asn Cly 70s 710 71' 720
Ser Leu Glu Gly Leu Clu Asn Ar9 Glu Gly Gly Val Cys Arg Thr Aro 725 730 735
Thr Met Lys Ile tle Mee Lys Val Gly Gln ASP Pro Asn Ala Val Thr 740 7'5 750
Pro Glu Gln Leu Thr Thr Ser quot;quot;rg pro Ser Lys Glu Ala ASp Aso Thr 7SS 760 765
Val Lys Mee Ala Thr Gln Ala Pro Gly Ser Ar9 Gly Ser Leu Gly ASP 170 715 7BO
Ser ASP Gly Lys His Glu Thr val Asn Gln Glu Glu Lys Ser Gly Pro 785 790 795 600
Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp 80S
lt;210gt; 372 5 lt;211gt;925
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens lt;400gt; 372
Met Trp 'l'rp Ar. Leu Trp Trp Lcu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 S 10 15
Pro Met Val Trp Al. Me' Pro Va l Phe Ser Leu Gln Asn Asp Glu Val 20 2' 30
Glu Phe V.l Ar. '!'hr ely Tyr Gly Lya Asp lle val Lys Vol Leu His 35 40 OS
Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser 50 55 60
Val Gln Leu 'l'hr Leu Ser Ser Lys Lys ASP Tyr Leu His Gly Asp Asn 65 70 75 80
Ser Asp lle lle Pro Thr ASP Thr lle Lys Asn Thr Val His Val Leu 85 90 9S
Ala Lys Phe Lys Glu Asn e lu Pro Ala Asn Ile Asp Gly Ala Met Glu 100 105 110
Lys Ala Phe Cys phe phe Leu Gln 1 1e Lys Ser Ile Clu Ala Phe G1y l1S 120 125
val Asn Ile Cys Glu His phe Leu Ser Ser phe Asn His Val t le Arg
1.30 135 140
Ala aln Val Tyr Val Glu Glu tIc Pro Trp Lys His Leu Glu Lys Asn 145 150 155 160
Gly Val Lys Hia Val His Ala Phe lle lIia Thr Pro Thr G1y Thr Mis 165 170 175
Phe G1y Glu Val Glu Gln Leu Arg Ser Gly Pro Gln val Ile His Ser 180 185 190
Gly lle Lys ASp Leu Lys Leu Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe elu 195 200 205
ely Fhe Ile Lys Asp eln Phe 'l'hr Thr Leu Pro Clu Val Phe Lys Cys 210 215 220
Met Met Arg Thr Leu Pro e l n Ser Ser Phe Pro Leu Phe eln Val Leu 225 230 235 240
Ser Met Cly Ser Ser LeU Met Asp Thr tIc Arg ~sp Leu Val Mee Clu
,,, 255
'quot;
Lys Ser Al a Gly Pro Tyr Asp Lys Asp Glu 'l'yJ:' Ser PrQ Ser Val Gln '60 265 27.
Lys Thr Leu Cys ASp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg val Pro Ala 275 280 '85
l1e Glu Asp Met Gl u l 1e Ser Leu Pro ASI'l. Ile, His Tyr Phe Asn !le
29. 295 lO'
Asp Met Ser Lys Met G1y Leu Ile Asn Lys G1quot; Glu Val Leu Leu Pro
305 31. 315. 32.
Leu Asp Aso Pro Tyr G1y LY' Ilc Thr G1y Th¡;' Val Lys 1gt;.rg Lys Leu 325 33. 3),
Segt;: Ser Arg Leu AsO Ala His Lys Ser G1u Val. Ala Uis Aro Phe Ly. 340 345 3quot;
ASp Leu G1y G1u Glu l\sn Phe Ly. Al. Leu val Leu ne Ala Phe Ala
'55 36. 365 Gln Tyr Leu Glo Gln Cys pro Phe Clu ASp His , V.1.. Lys Leu Val Asn
370 '75
G1u Val Thr alu Phe Ala Lys Thr Cys val Al!!. Asp Glu Ser Ala G1u
39. 395
3" •••
ksn Cys Asp Lys Sel:' Leu Hi s Thr Leu 'he Gly Asp Lys Leu Cya Thr 405 410 .quot;
Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr G1y Glu Met: Ala ASP Cys lt;:ya Ala
42. 425 43.
Lys Gl n Glu Pro Glu Arg A$n Clu Cys phe Leu Gln His Lys Asp Asp 4035 440
'quot;
Asn Pro Asn Leu pro Arg Leu Va l Arg Pro Glu val Asp Val Het Cys • 55 46•
.quot;
Thr Ala Phe Hla Asp Asn Glu Gl u Thr Phe Leu Lys Lya Tyr Leu Tyr 465 470 415 480
_,~U.
__ His ____ __
~
~~_
485 490 495
Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala phe Thr Glu Cys Cys G1n Ala Ala
SO, 505 510
Asp Lys Ala Al.. eys Leu L@u Pro Lys JA U A9f' Glu Leu Aro Asp Glu 515 520 525
Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys' Cys Ala Ser Leu Gl n 530 535 50.
Lys Ph@ Gly Glu quot;ro Ala Phe Lys quot;la Trp Ala, Va 1 quot;1 i'I. ArO Leu Ser 545 550 555,
S.,
Gln Arg Phe pro Ly~ Ala Clu Phe Ala G1u Val Ser Lys Leu Val Thr
S.,
570 575
Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His C;ly Asp Leu Leu Glu 580 585 590
Cys Ala Asp Asp gt;rO Ala ASP Leu Ala Lys Tyr lle Cys Glu Asn Gln 595 '00 '05
ASp Ser 11e Ser Ser Lys Leu Lys. Gl. Cys Cys Glu Lyo Pro Leu Leu 610 615 620
Glu Lyo Ser His Cys 11e Al. Glu Val Glu Asn Aso Glu Met Pro Al. 625 630 635 640
Asp Leu Pro Ser Le. Al. Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cya 645 650 655
Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys ASp Val Phe Leu Gly Mee Phe Leu Tyr 660 665 670
Glu Tyr Ala Acg Arg Hls Pro ASP Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 675 680 685
Leu Al. Lyo Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 690 '95 700
ASp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe A'O Glu Phe Lys Pro Lau 705 710 quot;5 no
Val Glu Glu PrO Gln ..n Leu 11e Lys Gln ASn Cys Glu Leu Ph. Glu 725 no 735
Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 740 74.5 750
Lys Lys Val Pro e l n Val Ser Thr Pro 7hr Leu Val Glu Val Ser Arg
755 760 765
Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys CyS Cys Lys Hia Pro Glu Ala Lys
770 775 780
Ar. Melt; pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 785 790 795 800
C,. Val Leu His Glu Lya Thr Pro Val Ser Asp Arg val Thr Lys Cy. 805 810 815
Cys Thr Glu Ser Leu val ASO Arg gt;ro Pro Cys Phe Ser Al. Leu Glu 820 825 830
Val A.sp Glu Thr Tyr Val P.ro Ly. Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 835 84. 845
Phe Hi s Al. ASp Ile Cy-s Thr Leu Ser Glu Lys Glu Ar. Gln Ile Lys
850 855 86.
Lya Gln Thr Ala Leu v.l Glu Leu val Lys H19 Lya Pro Lys Ala Thr 865 870 875 880
Lys Glu Gln Leu Lys Al a Val Met ASp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 885 890 895
Lys Cys Cys Lys Al a ASp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 900 905 910
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln ~la Ala Leu Gly Leu 915 920 925
lt;210gt; 373 5 lt;211gt;928
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 373
Mee Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Ph,e Leu Phe Ser Ser Al. 1 5 10 15
Tyr Ser 1\.rg Gly val Phe Arg Arg AsO Al. H11;' Lys Ser Glu val Al.
20 25
quot;
His Arg Ph, quot;ye Asp Leu Gly elu Glu Aso Ph.quot; Lys Ala quot;eu Val Leu 35 40
quot;
I le Ala Phe Ala Gln 'I'yr Leu Gln Gln Cys Prquot; Phe Glu Asp His Val SO SS 60
Lys Leu Val Asn 'Gl u Val Thr Glu Phe Ala Ly'J Thr Cys V.,.l Alquot; Asp 6S 70 7~} 80
Glu Sel;quot; Ala Glu Asn Cy. Asp Lys Ser Leu H1'5 Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Th, v.l Ala Thr Leu Arg Glu Thr 'l'yr Gly Glu Melt; Al. 100 lOS 110
A.sp Cys eyo Ala Lys aln Glu PrO Glu -'rg Asn Glu eys Phe Leu elo 115 120 125
lIi5 Lys Asp Asp Asn Pro Aso Leu Pro Arg LeIJ Val ArQ' Pro clu Val
130 135 140
A6p Val M~t Cys Thr Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lyo
quot;.
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Clu lle Ala Arg Arg His P.r:o Tyr Phc Tyr Ala Pro 165 170 17S
Glu Leu Leu phe quot;e Ala Lys Arg 1'y, Lys Alu Ala Phe Thr Glu eys 180 lBS 190
Cys Gln Ala Al. Asp Lys Ala Ala Cyo Leu Leu Pro Ly. Leu Asp alu 195 200 205
Leu Ar. AsO Glu Gly Lys Al. Ser Ser Ala LyH Gln aro Leu Lys Cys 210 215 220
Ha Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 1\rg 1\la Ph~~ Lys 1\l a Trp Ala val 225 230 23S 240
Ala Arg Leu Ser Gln 1\rg Phe Pro Lys Al. Glu pha Ala Glu v.1 Ser 245 2SO 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr LyS Val His Th:r Glu Cys lt;:ys His Gly 260 265 270
Asp Leu Leu Olu Cys Ala Asp ...Arg Ala As;p Leu Ala Lys 'l'yr Ile
,
275 280 285
lt;:ys Olu Asn Gln Asp Ser ne Ser Ser Lys Leu Lys Olu Cys Cys Glu 290 295 JOO
Lys Pro Leu Leu GIu Lys Ser His Cys ne Al,!!. Olu Vd.l Glu Asn gt;Sp JOS 310 31$ J20
Olu Met Pro Ala Asp Leu Pro S~r Leu Ala 1'1.1,,,-Asp phe Val Olu Ser 325 330 335
Lys ASp Val Cys Lys Asn 'IYr Ala Glu Ala LY,$ Asp Val Phe Leu Oly 340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr GIu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380
~AlaA~Ala __ ~ _
Us ___ ____
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Olu Glu Pro Gln ..n Le'u Ile LyS Gln As • lt;:ys 405 410 415
Gll.1 Lel.l Phe Gl. O'quot; Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430
Val Arg Tyr Thr ~ys Lys val Pro oln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445
alu val Ser Arg Asn LeU Gly Lys Val Cly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460
Pro Olu Ala Lys Arg Mee pro Cys AIIlO Glu As;p Tyr Leu Ser Val Vquot;' 465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu eya Val Leu His Glu Lyo Th.r Pro val Ser Asp Arg '65 490 4.5
Val Thr Lys Cys Cys Thr Clu Ser Leu Val A5:n Arg Arg Pro Cys phe 500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp GII.I Thr Tyr Va 1 Pro Lys Olu Phe Asn Ala 515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Th.r Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Va 1 Gl. Leu val Lys His Ly, 545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Cln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 510 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Al. Asp Asp Lys Glll Thr Cys Phe
'80 '85 590
Ala GIu Glu Gly Lys Lys Leu Val Al. Ala Ser GIn .lA Ala Leu Gly 595 600 605
l.eu Me' Pro val Phe Ser l.eu Gln Asn A!ilp Glu Val Glu Phe Val Arg 610 615 620
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Gly Lys Tyr His Ser lle Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr 645 650 655
Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp lle lle 660 665 610
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680 68'
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Val His Ala Phe lle His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Gly Glu val 155 160 165
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lt;210gt; 374 5 lt;211gt; 1000
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 374
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Ala Val Het ASp Asp ehe Ala Ala Phe Val Olu Lys Cys Cys Lys Ala 965 970 975
Asp Asp Lys elu Thr Cys Phe Ala Olu elu Gly Lys Lys LEu Val Ala 980 985 990
Ala Ser Oln Ala Ala Leu Gly Leu 995 1000
lt;210gt; 375
lt;211 gt; 1003
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 375
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Ile Al. 'he Ala CIn T:r' r Leu Oln Gln Cys P:-o Ph. Glu Asp His Val 50 55 60
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Glu Ser Ala Glu Asn Cys ASp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Het Ala 100 105 110
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Lys Tyr Leu TYr Glu rle Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Lcu Leu Phe Phe A1~ Lys ArO Tyr Lys Ala Ala phe Thr Glu Cys
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Ala Arv Leu Ser Gln Aro Phe Pro Lys Al. Glu Pha Ala Gl u Val Ser 145 150 255
Lys Leu Val Thr ASP Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cy. His Gly 160 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp ASp Arg Ala As p Leu Al. Ly. Tyt' rle 175 ,.0 ,.5
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Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ab. Lys Val Phe Asp Glu 385 3.0 395· 400 Phe Lya Pro Leu Vl!.l Glu Glu Pro Gln Asn Lev_ rle Lya Gln quot;sn Cys
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450 ." .60
Pro Glu Ala Ly$ Arg Me' Pro Cys Ala Glu Asp, Tyr Leu Ser Val Val .65 470 .75 .80
Leu ....sn Gln Lcu Cys val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Aap quot;ro 485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn quot;rg Arg Pro Cys Phe 500 SOS 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pre. Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525
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Ar. Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 560
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Pro Lys Ala Thr LYS Glu Gln Leu Ly$ Al. val. Me:. Asp Asp ph. Al. 565 570 575
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Leu Mee Glu Lya Phe Ile Trp Tyr Leu Val H18lt; Leu Tyr '!quot;hr Glu Mee 610 615 620
Thr Lyo Ser Ser Pro Ser Cys Arg Leu Val Al. Sor Cys Gln Thr v.l 625 630 635 640
Al. Lys Glu Leu ely Glu Asn Ser Leu Gly Tyr Gly pro ely His. Tyr 645 650 655
Leu Leu ph@ Gly Cys Arg Asp Ala Phe Gly Cy!;; Pro Mee Pro Gly Leu 660 665 670
Phe His Leu Leu Gln Asp eln Mee lle ely Ser· Leu His Thr Asp Ser 675 680 685
Leu Pro Asn ASp GIu Val elu Phe Val Arg Thr· Gly Tyr Gly Lys Glu 690 695 700
Me. v., Lys val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lquot; Tyr His Ser Ila 705 710 715 720
Lys Gl... Val Ala Thr Ser val Gln Leu Thr Le. Ser Ser Lys Ly. As. 725 730 735
Tyr Leu His Giy Asp Asn Ser Asp Ile Ile prc. Thr Asp Thr Iic Lys 740 745 750
Asn Thr Val Hls Val Leu Ala Lys phe LyS GlU'. Asn ASp Pro Ala Asn 755 760 765
Ile Asp Gly Ale. Met Glu Lys Ale. Phe Cys Ph&. Phe Leu Gln Ile Lys 770 775 780
Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn 1le Cys Glu. His Phe Leu Ser Ser 785 790 795 800
ph@ ~sn Hia val 1le Arg Ala Gln Val Tyr Mee Glu Glu Ile Pro Trp 805 810 815
Lys His Leu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe lle His 820 825 830
Thr Pro Tnr Gly Thr His Phe Cyo Glu Val Glu Gln Leu Arg Ser Gly 835 840 845
Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Th:¡;850 855 860
Tnr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ila Lys As, Gln Phe Thr Thr Leu ••5 870 875 880
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Arg Tyr His Gln Cys ArQ ASp Val As. Pne Lys Ala Thr Trp Anp Tn, 900 905 910
Ile Arg ASP Leu Vquot;,l Het Glu Lys Ser Ala G1y Pro Tyr ASp Lys Gly 915 920 925
Glo Ty' Leu Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Cys Asp Ile G1n Val Leu
.30 93' 940
Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala 11a Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro 945 950 955 960
Asn l1e Hi s Tyr Phe Asn l1e ASp Met Ser Lys Het Gly Leu l1e Asn 965 970 975
Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu ASp Asn Pro Tyr G1y Lys l1e Thr 980 985 990
Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 995 1000
lt;210gt; 376 lt;211gt;910
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 376
Met Trp Trp Arg Lcu Trp Trp Leu Leu LeU [,eU Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Pro Met Val Trp ~a Met Ala ASp TYr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn 20 25 30
ASP Glu Leu Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys 35 40 45
Val Leu His Ila Gln Arg ASP Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val 50 55 60
Alo. Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lyr. {,ya Asp Tyr;-Leu His 65 70 7S 80
Gly Asp Asn Ser Asp 11e Ile pro Thr Asp Thr l1e Lys Asn Thr;-Val 85 !}O 95
His Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser 11e Glu Ala Phe Gly 100 105 110
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Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu 11. Pro 'I'rp LY~i Arg L.u Glu Lys Aso 130 llS 140
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Phe Cys Glu val GIu Glo Leu Arg Ser Gly Prc. Pro Val lle His Ser 16' 170 17gt;
Gly lle Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr ThI: Gln Ser Gly Phe Glu 180 lOO
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Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Gly Thr rIEl Arg Asp Leu val Leu 225 210 23S 240
Glu Lya Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser val 245 250 255
Gln Lys Thr Leu Tyr Asp lIt! GIn val Leu Se:!:: Leu Ser Arg Val Pro 260 265 270
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Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys lle Thr Gl)' 'I'hr Val Lys Arg Lyo 305 310 315 320
Leu Ser Ser Arg Lea }\sp Ala His Lys Se!:quot; Glu Val Ala His Ar9 Phe 330 335
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Lys ASp Leu Gly GI\.! Glu .lilao Phe Lya Ala Lcu Val Leu 11e Ala phe 340 345 350
Ala Gln Tyr Leu Gln GIn Cys pro phe Glu Asp His Val Lys Leu Val 355 360
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..n Glu Val Thr Glu Phc Ala Ly• Tbr Cys Val. Ala Asp Glu Ser Ala 370 375 380
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Al a Lys Gln Glu Pro Glu A1;quot;g Asn Glu Cys phE! Leu Gln His Lys Asp 420 425 430
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Tyr Glu :Ile Ala 10rg Aro His Pro Tyr Phe Ty•. Ala Pro Clu Leu Leu 465 475 480
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Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr elu Cys Cys Gln Ala '85 490 495 Ala Asp Lys Ala Ala Cya Leu Leu Pro Lys Lel..l Asp elu Leu ArO Asp SOO SOS 510
elu ely Lya Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg LelJl Lys Cys Ala Ser Leu 51S 520 52S
Gln Lys Phe Gly Glu Arg quot;a Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu 530 53S 540
Ser Gln Arg phc Pro Lys Ala Glu Phe Ala elu val Ser Lys Leu Val S4S SSO 5SS 560
Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr elu Cys CyE: HiB Gly Asp Leu Leu 56S S,quot; SH
Glu Cys Ala ASp Asp Aro Ala Asp Leu Ala Ly~: Tyr Ile Cys Glu Asn 580 58S 590
Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys elu Cy:Ol Cys elu Lys Pr-o Leu 595 600 605
Leu elu Lys Ser Mis Cys Ile Ala elu Val GlI.n Asn Asp Glu Met Pro 610 6lS 620
Ala As, Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe val Glu Ser Lys ASP val 625 630 6350 640
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys ASp Val PnEI Leu ely Met phe Leu 645 650 6SS
Tyr elu Tyr Al a Arg Arg His pro Asp Tyr Ser Val Vtll Leu Leu Leu 660 665 610
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Lcu ehJl Lys Cyo Cys Ala Ala 675 680 685
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phlt;l!' Asp Glu Phc Lys Pro 690 695 700
Leu Val Glu Glu ero Glo quot;sn [~u TI.. Lyquot; Gln ..n Cys Clu Leu .he 70s 710 715 720
.'u eln Leu Gly Glu Ty, Lys Phe Gln quot;n Ala. Leu Leu Val ArO Tyr 725 730 735
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Lys Arg Me~ Pro Cys Ala G1u Aop Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln
770 775 780
Leu Cys Vquot;,l Leu Hia Glu LY' Thr Pro Vlll Ser gt;sp Arg Val Thr Lys 785 790 795 800
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Aso Arl1 Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu 805 810
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G11.1 Val ASP Olu Thr Tyr val Pro Lys Olu Phe Asn Ala Olu Thr Phe 820 825 830
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Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Mee Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val 865 870 875 880
Gl u Lys Cys Cys Lys Ala Asp ASp Lys Olu Thr Cys Phe Ala Olu Olu
8.S 890
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Gly J,.ya ¡'ys Leu Val Ala Ala Ser Oln Ala Ala Leu ely Leu 900 905 910
lt;210gt; 377
lt;211 gt; 913
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 377
Me' Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15
Tyr Ser Arg Cly Val Phe Arg Arg As. Al. His Lys Ser Olu v.l gt;l. 20 25 30
His Arg Phe Ly. Asp Lcu Gly Glu olu Asn Phc Lyu Ala Leu Val Leu 35 40 45
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Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala As. 65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Scr Leu His Thr Leu Phe Oly As. .5 90 95
Lys Leu Cys Thr val Ala Thr Leu Aro Olu Thr-Tyr ely Olu Me' Ala 100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Ar9 Asn Glu Cy. Phe Leu Gln lIS 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro gt;sn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu val 130 135 140
ASO Val Mee Cys Thr gt;la phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 quot;O 15gt; 160
Ly. Tyr Leu Tyr Glu Il. Al a Arg Ar9 His Preo Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175
Glu Leu Leu ,hc Ph. Ala Lys Ar9 Tyr Ly. AlaL Ala phe Thr G1u eyo I SO 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205
Leu Ar9 Asp Glu GIl( Lys ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Ly8 Cys 210 215 220
Al. Ser Leu Gln Lys ,hc Gly Glu I\rg Ala phEi Ly. Ala Trp Ala val 225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln arg phe Pro Lys Al. Gl. Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255
Lys Leu Val Thr As, Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys Hi. Gly 260 265 270
___ U. ___---~-__ ~ r~
275 280 Z8S
Cys Glu Aen Gln Asp Ser Ilo Ser Ser Lys Leu Lys Gll.l Cys Cys Glu 290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala, Glu Val Glu Asn Asp 305 310 31~ 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ua Allt;!l Asp phe Val Glu Ser 325 330 335
Lys Asp val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Ly~1 Asp Val phe Leu Gll(
340 345 350
Met. Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg Hi s Prcl ASp Tyr Ser Val Val 355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 3iS 3SO
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lt;210gt; 378
lt;211gt; 1003
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 378
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410 415
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lt;210gt; 379
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lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 379
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lt;210gt; 380 lt;211gt;913
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 380
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Tyr Leu His Gly ASP Asn Ser ASP Ile Ile Pro Thr ASP Thr Ile Lys
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Glu Lys Asn Gly Val Lys HilO Val His Ala PhE' rle His Thr Pro Thr 145 150 155, 160
Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Leu Art;;r Ser Gly Pro Pro Val 165 170 175
l1e HilO Ser Cly Ile Lys Asp Leu Lys Val Lequot;, LyS Thr Thr Gln Ser 180 185 1'0
Gly Phe Glu Cly Phe Ile LyS Asp eln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val 195 200 205
Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cyfl Ly. Trp Arg Tyr His 210 215 220
Gln Cys Arg Asp val Asp Phe Gtu Ala Thr Trp Gly 'l'hr l1e Arg Asp 225 230 235 240
Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Cly Pro Tyr ASP Lys Gly Glu Tyr Ser 245 250 255
Pro Ser Val elo Lys Thr Leu Tyr Asp 11e Gln Val Leu Ser Leu Ser 260 265 270
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Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met G~y Lell Ile Asn Lys Glu Glu 290 295 300
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Lys Arg Lys LeU Ser Sor Arg Leu Asp gt;la Hh ¡ Ly, Ser Glu Val Ala J25 JJO 335
His Arg Phe Ly. ASp Leu Gly Glu Clu Asn Ph.~ Lys Ala Leu Val Leu 340 345 350
11.. Ala _h. Al. Gln Tyr Lt!lU e l n eln Cys pro Phe Glu Asp Hin Val 3SS 360 365
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elu Sor Al.. Glu Asn Cys quot;p Lys Ser Leu Hi ~; Thr Leu Phe Gly quot;p385 '90 395i 400
Lys Léu Cys Thr Val gt;la Thr Leu Arg-Glu Thr: Tyr Gly Glu Melt; Ala .05 410 4lS
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu CyS Phe Leu Gln 420 425 430
His Lys As. Aen Pro Asn Leu pro Arg Leu val Arg Pro Glu Val'quot;435 4lt;0 445
Ao. val Mee Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 450 455 46'
Lys Tyr Leu Tyr Gl u He Ala Arg Arg His Prc. Tyr Phe Tyr Ala. Pro 465 470 -n~ 480
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Al~ Ala Phe Thr Gl. 485 490 495
Cys Gln Ala Al. As. Ly!! Ala Ala Oy. Leu Leu Pro Lys Leu As. Gl. SOO SOS 510
Leu Arg Asp Glu Gly Lya ,.,la Ser Ser ,.,la Lys: Gln Ar. Leu Lys Cys S15 S20 S25
Ala Ser Le. GIn Lys Phe Gly Glu Ar9 Ala PhE' Lys Al. Trp Ala Val 530 535 54'
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Lya Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys val Hi. Thr-Glu Cys Cys Hia Gly 565 570 575
Aap I.eu Le\. Glu lt;:ys 1\la quot;'sp 1\sp 1\rg Al a Asp Leu Ala Lys Tyr :Ue 580 585 590
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Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala, Glu Val Glu Asn Asp 610 615 620
Glu Met pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Al a Al;!!, Asp Phe Val Glu Ser 625 630 635-64'
Lys ASP Val Cys Lys Aen Tyr Ala Glu Ala Ly~ Asp val Phe Leu Gly 645 650 655
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg ArO lIis Prc:, quot;'sp Tyr Ser Val Val 66' 665 670
Leu Leu Leu Ar. Leu quot;'la Lys Thr Tyr Glu Thr· Thr Leu Glu Lys Cys 615 680 685
Cys Al. Ala Ala Asp Pro H'. Olu Cys Tyr Ala. L,. V.l Phe Asp Glu 690 695 700
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Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn J\l.a Leu Leu 725 730 735
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Glu val Ser Arg Asn Leu Gly Ly. Val Gly Ser Lys Cy. Cys Lys His 755 760 765
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Ala Glu Glu Gl y Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser eln Ala Ala Leu Gly 900 905 910
Leu
lt;210gt; 381
lt;211gt; 805
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
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Met Asn Ile Phe Tyr lle Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val eln Gly 1 S 10 15
Leu Glu His Thr Hls Arg Aro Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His 20 25 30
Lys Ser Glu Val Ala Hls Arg Phe Lys ASP Leu Gly Glu Glu Asn Phe J5 40 45
Lys Ala Leu Val Leu lle Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln eln Cys Pro SO 55 60
Phe Glu ASp Hls Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys 6S 70 75 80
Thr Cys Val Ala Asp elu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His 85 90 95
Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thlt; Val Ahl Thr Leu
quot;quot;. Glu Thr
100 lOS 110
Tyr Gly Glu Me' Ala Aap Cys Cya Ala Lys Gl n Glu Pro Glu Arg Asn 115 120 125
Glu Cy' Phe Leu Gln His Ly. Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu DO 135 1lt;0
Val Met Cys Thr AlaL Phe His Asp Asn Glu
'lt;. Pro Glu Val AsO V.l
145 150 lS5. 160
Glu Thr Phe Leu Lya Lys Tyr Leu 'Iquot;yr Glu n . Ala Arlt;¡j' Arlt;¡j' His quot;,o 165 170 175
Tyr Phe Tyr Alo Plt;o Glu Leu Leu Phe Phe AlaL Lys Arlt;¡j' Tylt; Lys Ala 180 lBS 190
Ala Phe Thlt; Glu Cys Cys Gln Al. Ala Asp Lys Ala Ala eya Leu Leu 195 200 20S
P'o Lys Leu Asp alu Leu Alt;. gt;Sp alu Gly Lys: Ala S., Ser Ala LyS 210 215 220
Gln 'lt;. Leu Lys Cys Al e Selt; Leu aln Lys Phe: Gl y Glu Arg Ala Phe 225 230 235, 240
Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Lea Ser Gln Argr Phe P:.:-o Lys Al. Glu 245 250 255
Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr 260 265 270
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu elu Cys Ala. Asp As, Arg Ala Asp 275 280 285
Leu Al a Lys Tyr 1le Cys Glu ¡o,sn Gln Asp Serquot; ae Ser Ser Lys Leu 290 295 300
Lys Glu Cys Cys a lu Lys Pro Leu Leu Glu Lys, Ser His Cys Ile Al. 305 310 315 320
alu val Glu Asn Asp Glu Met Pro Al a ASP Leu, pro Ser Leu Ala Ala 325 330 335
ASp Phe Val Glu Ser Lys ASp Val Cys Lys ASn. Tyr Ala Glu Ala Lys 340 345 350
Asp val Phe Leu Gly Met ·Phe Leu Tyr alu Tyr' Ala Arg Arg His pro 355 360 365
Asp Tyr Ser Val Val Leu Lou Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr alu Thr 370 375 380
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala P.la Ala Asp Plt;o lIis Glu Cys Tyr Ala 385 390 395 400
Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu val Glu Glu Pro Gln Asn Leu 405 410 415
Ile Lys Gln Aon Cy9 Clu Leu Phe Glu eln Leu Gly Glu 1Yr Lys Phe 420 425 430
Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 1Yr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser 435 440 445
Thr Pro Thr Leu val Glu Val Ser Arg Aso Leu Gly Lys Val Gly Ser 450 455 460
Lys Cy. Cys Lys Mis Pro Glu Ala Lys Arg Met: Pro Cys Ala Glu Asp 465 470 47~; 4.0
1Yr Leu Ser Val Val Leu Aso Gln Leu Cy. Val. Leu His Glu Ly. Thr ••5 490
'OS
Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn 500 SOS 510
1\.rg Arg pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro 515 520 525
Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe Hi:;; Ala Asp Ile Cys Thr
530 535 540
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln I l e Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu S45 550 55~i 560
Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala val
565 570 S7S
Mel: ASp Asp 'h. Ala Ala Phe Va.l Glu Lys Cy~; Cys Lys Ala Asp Asp
5.0 5.5 S90
Lys Glu Thr Cys .Phe Ala GIu Glu Gly Lys Ly.E: Leu Val Ala Ala. Ser 59S 600 60S
Gln Ala Ala Leu-Gly Leu Phe Pro Thr lle Prlt;:' Leu Ser Arg Leu Phe 610 6lS 620
Asp Asn Ala Mel: Leu Arg Ala His Arg Leu His G1n Leu Ala Phe ASp 625 630 635, 6quot;
Thr Tyr eln Glu Phe G1u Glu Ala Tyr 11. Preo Lys Glu eln Lys Tyr 645 650 655
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys, Phe Ser Glu Ser Ile 660 665 670
Pro Thr pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr GIn e1n Lys Ser Asn Leu Glu 675 6'0 ••5
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu lle GIn Ser· Trp Leu Glu Pro val 690 695 700
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser 105 710 115 720
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys ASp Leu. Glu Glu Gly Ile G1n
725 730 135
Thr Leu Met G1y Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro' Arg Thr Gl y Gl n Ile
740 74S 750
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys ehe quot;p Thr Asn Ser His quot;n ....sp Asp 7SS 160 76S
Al. quot;quot;u Leu Lys ASquot; Tyr Gly Leu Leu Tyr Cy=-ph. Ar. Lys Asp Met no 71S 780
Aap Ly. val Clu Thr ph. LeU Arg !le Val Gln Cy. Arg Ser Val Glu 78S 790 79S .00
Gly Ser Cys Cly Phe 'OS
lt;210gt; 382
lt;211gt; 191
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 382
Phe Pro Thr tle Pro Leu Ser Arg Leu Phe ....sp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15
Ala Kis Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr ,Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30
Glu Ala Tyr 11e Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser 11e Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Ly. Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg :Ile Ser Leu 65 70 .0
7'
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro V.l Gln Pl,,~ Leu Arg Ser Val
BS 'O 95
Phe A.la Asn Ser Leu Val Tyr Gly Al. Ser Asp Ser Asn Val Tyr Aap 100 lOS 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Clu Gly lle Gln Thr Leu Met Cly Arg Leu 115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln 11e Phe Lys Gln Th~ Tyr SC~ 130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr L45 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175
Leu Arg lle Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser (ys Gly Phe 180 185 190
lt;210gt; 383
lt;211gt; 191 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 383
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe 1\sp Asn Ala Met Leu Aro 1 5 10 15
Al. quot;1$ 11.quot;:9 Leu His Gln Leu Ala Phe A.p Thr Tyr Cln e1u Phe G1u 20 25 3.
Glu A.la Tyr Ile Pro Lys elu .'0 Lys Tyr Ser phe Leu e1n Asn Pro 35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser clu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60
elu elu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg I1e Ser Leu 65 70 75 80
Leu Leu Zle eln Ser Trp Leu elu Pro Val Gln Phe Leu Ar9 Ser Val 85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val 'iYr Gly Al. Ser Asp Ser Asn Ud Tyr AsO 100 lOS HO
Leu Leu Lyo AsO Leu Glu elu e1y Il. eln Thr Leu Melt; e1y ArlJ Leu 115 120 125
e1u quot;O e1y Ser Pro Arg Thr e1y Gln Ile phe LYo e1n Thr Tyr Ser 130 13' 140
Lys Phe ASP Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr eyo Pho Arg Lyo Asp Met Asp Lys Val elu Tnr Phe 165 110 175
Leu Ar9 Ile Val G1n Cys Arg Ser Val e1u Cly Ser Cys e1y Phe 180 185 190
lt;210gt; 384
lt;211gt; 191
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 384
Phe pro Thr ne Pro Leu Ser Arg Leu Phe ....sp Asn Ala Met Leu Aro 1 , 10 15
Al. His Arg Leu His Cln Leu Ala Phe A·O Thr Tyr Gln e1u phe e1u 20 30
quot;
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu G1n Asn Pro 35 40 45
G1n Thr Ser Leu Cys Phe Ser e1u Ser Ile Pro Thr pro Ser Asn Arg 50 55 60
elu elu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln ser Tro Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser V.l .5 'O 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr ely Al. Ser Asp Ser Asn Val Tyr As. 100 lOS 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile eln Th:r Leu Met Oly }l,rg Leu 115 120 125
Olu AsO Oly Ser Pro Arg Thr Oly Gln Ile Phe Ly!l Oln Thr Tyr Ser 130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser Hia Aan Asp Asp Al. Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160
Oly Leu Leu 'I'yr Cys phe Arg Lys Asp Het AsO Lys Val elu Thr Phe 165 170 17'
Leu Arg Ile Val Oln Cyquot; Arg Ser Val Olu Gly Ser Cys Oly Ph. lBO 185 190
lt;210gt; 385
lt;211gt; 165
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 385 Cys Asquot; Leu Pro Oln Thr His Ser Leu Oly Ser Arg Arg Thr Leu Met
,
1 10 15
Leu Leu ~la Gln Met Arg Arg !le Ser Leu Phe Ser CyS Leu Lys Asp 20 2S 30
Arg His Alt;p Phe Gly phe Pro Oln Glu ehz Phe Gly ..n Oln Phe Gln
], 40 4'
Lys quot;. Olu Thr Ile Pro Val Leu His e lu Mel: Ile Gln Oln Ile Phe SO 55 60
Asn Leu phe Ser Thr LyS ASP Ser Ser Ala Ala Trp Asp elu Thr Leu 65 70 75 80
Leu ASp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Oln Oln Leu Asn Asp Leu Glu .5 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly val Gly Val Thr Glu Thr pro Leu Me, Lyo 100 lOS 110
Gl u ASP Ser Ile Leu Ala Val Aro Lyo 'I'yr Phe Gln Ar. Ile Thr Leu 115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu val Val Arg 130 135 140
Ala Glu Ile Mel: Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu eln Gl u Ser 145 ISO 155 160
Leu Arg Ser LyS Gl u
10 lt;210gt; 386
lt;211gt; 119
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 386
HilO Ser Asp Pro quot;. Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser ne
1 , 10
quot;
Ser Glu Trp val Thr Ala Ala gt;Op Lys Lys Thr Ala Val ASP Met Ser 20 25 30
Gly ely Thr Val Thr Val Leu Glu Lys V.l Pro Val Ser Ly. Gly Gln 40 45
Leu Lyo Gln Tyr Phe TYr elu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly TYr Thr SO 60
quot;
Lys Glu ely Cys Arg ely 11e AsO Lys Arg His-Trp Asn Ser Gln Cys 6S 70 7S 80
Aro Thr Thr Gln Ser TYr Val Arg quot;. Leu Thr He' Asp Ser Ly. Ly.
a, ,o quot;
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg ne Asp Thr Ser C:ys v.l Cys Thr 100 105 110
t.eu Thr ne Ly. Ar. Gly Arg
quot;'
lt;210gt; 387
lt;211gt; 60
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 387
quot;io Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp V.l Ser Ser Tyr Lcu Glu Gly 1 5 10
quot;
Gln Ala Ala Lys elu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Aro His Gly 20 25 30
Gll.I Gly Thr Phe 'l'hr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 40 45
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Llt;u Val Lys Gly Arg SO 55 60
lt;210gt; 388
lt;211gt; 32 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 388
Ser pro Lys Het. val eln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Ly.!l Het AsO 1 5 10
quot;
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cy. Lys Val Leu Aro Aro His 20 25 30
lt;210gt; 389 15 lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 389
Ser pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys I?he Gly Arg Ly.!! Het AsO 1 , 10
quot;
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30
20 lt;210gt; 390
lt;211gt; 60
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 390
!-lis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gln Ah. Ala Ly. Glu 'he Ile Ala Trp Leu val Lys Gly Ar. His Gly 20 25 30
Glu Gly Thr 'he Thr Ser A.p val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala '5 .0 45
Ala J..ys Glu Phe Il.e Ala Trp Leu Val Lys Gly Ar. 50 55 60
lt;210gt; 391
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 391
Ser ?ro Ly. Met val Gln Gly Ser Gly Cys .he Gly Arg Lys Melt; Asp 1 5 JO 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys-Val Leu 20 25
lt;210gt; 392
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 392
Ser Pro Lys Met Vol Gln Gly Ser Gly Cy. 'he G,y Arg Lys Melt; ASp l 5 10 15
Aro !le Ser Ser Ser Ser Gly Lau ely Cys Lys Val Leu Ar. Ars His 20 25 30
lt;210gt; 393
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 393
Ser Pro Lys Met. Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met ASp 1 5 10 15
ArS rle Ser Ser Ser S~r Gly Leu Gly Cys Lys V.al Leu Ar. Ar. .io 20 25 30
lt;210gt; 394
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 394
Ser Pro Lya Met val eln Gly Ser Gly Cy. Phe Gly Arg Lys Met AS. 1 5 10 15
Aro Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu ArO ArS His 20 25 30
lt;210gt; 395
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
30 lt;400gt; 395 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met As. 1 5 10 15
ArS Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys-Val Leu Arg Ar. His
20 30
"
lt;210gt; 396
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 396
Ser Pro Lys Met val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Gly Lys Met Asp 1 5 10 15
Ar. Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys val Leu Arg Ar. His 20 25 JO
lt;210gt; 397
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 397
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Her AsO 1 5 10
quot;
Ar. I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cy. Lys VlIl Leu 20 25
lt;210gt; 398
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 398
Ser Pro Lys Mct Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Gly Lys Mer ASp 1 5 10
quot;
Ar. I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Ar. Arg H1. 20 25 30
lt;210gt; 399
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 399
Ser Pro Lys Met val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Gly Mer AsO 1 5 10 15
Aquot;, I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys val Leu 'rg 'rg His 20 25 30
lt;210gt; 400
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 400
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly lt;ys Phe Gly Arg Lys Mer Asp 1 5 10 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Ar. Arg His 20 25 30
lt;210gt; 401
lt;211gt; 30
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 401
Ser Pro Lys Mer v.l eln Gly Ser Gly Cy. Phe Gly Arg Lys Mer 'sp
1 5 gt;O
quot;
Arg I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys val Leu Arg 20 2' 30
lt;210gt; 402
lt;211gt; 151
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 402
Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Tnr val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15
phe Glo Leu Leu G~y Gln Thr ATg Ala ASO Pro Met Tyr Asn Ala val 20 25 30
Ser Asn Ala Asp Leu Mee ASp Phe Lys ASO Leu Leu Asp His Leu olu 35 40 45
Glu Lys Met Pro Leu Glu ASp Glu Val Val Pro Pro Gln val Leu Ser SO 55 60
Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val 6S 70 75 .0
Pro Pro Trp Thr C1y Glu Val Ser Pro Al. Cln Arg Asp Gly Gly Ala
.5
90 95
Lcu Cly Arg Cly Pro Trp ASp Ser Ser A.p Arg Ser Ala Leu t.cu Lyo 100 lOS 110
Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser 115 120 125
Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile aly Ala aln Se r Gly Leu 130 135 140
Cly Cquot; ASO Ser Phe quot;. Tyr
145 150
lt;210gt; 403
lt;211gt; 151
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 403
Me' Ser Ser phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 la 15
Phe Gln Leu Leu Gly aln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Aso Ala Val 20 25 30
Ser Asn Ala Asp Leu Met ASp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu 35 40 45
Glu Lys Melt; Pro Leu Glu Ao. Glu Val Val Pro feo Gln Val Leu Ser 50 55 60
Clu Pro Asn Glu olu Al. G1y Ala Ala Leu Ser Pro ¡.eu Pro Glu Val .5 70 75
Pro Pro Trp Thr G1y Glu Val Ser Pro Al. Gln Arg Asp oly Gly Al.
• 5 ,. 95
Leu Cly Arg C1y Pro Trp Asp Ser Ser ~sp Arg S~r Ala Leu Leu Lys 100 105 110
Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala pro Arg Ser LeU Arg Arg Ser 115 120 125
Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg I1e Gly Ala G1n ser Gly Leu 130 135 140
Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 145 150
15 lt;210gt; 404 lt;211gt; 151
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 404
Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Va~ Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala 1 S 10 15
Phe G1n Leu Leu G'y Gln Thr Arg Al' ..n Pro Met 'IYr Asn Al. Val 20 25 30
Ser Asn Al. Asp Leu Met ASp phe Ly. Asn Leu Leu ASP His Leu G1u l5 ,O 45
Gl u Lys Melt; pro Leu Glu Asp Glu Val Val pro Pro Gln V.l Leu Ser 50 55 60
Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu pro Glu val 65 10 75 60
Pro pro Trp Thr Gly Glu VAl Ser pro Ala Gln Arg ASp Gly Gly Ala 85 90 9S
Leu Gly Ar9 Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu LyS 100 lOS 110
Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser 115 120 125
Ser Cys phe Gly Gly Arg Met Asp Arg lle Gly Ala Gln ser Gly Leu 130 135 140
Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 5 145 150
lt;210gt; 405
lt;211 gt; 151
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;400gt; 405 Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr VDI Ser Phe Leu Leu Leu Lcu Ala 1 5 10 15
phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr A~n Ala val 20 25 30
Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp phe Lys Asn Leu Leu ASP Hls Leu Glu 35 40 45
Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Cln Val Leu Ser SO SS 60
Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val 65 70 75 BO
Pro Pro Trp Thr Gl y Glu Val Ser pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala 85 90 95
Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Lcu Leu Lys 100 105 110
Ser ~ys Leu ~9 Al a Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser 115 120 125
Ser Cys Phe Gly Gly Arg Mel Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu 1 30 135 140
Gly Cys Asn Ser Phe Aro Tyr 145 1 50
lt;210gt; 406
lt;211 gt; 151 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 406
Het Ser Ser Pho Ser Thr Thr Thr Val Ser phe Leu Leu Leu Leu Al a 1 5 10 15
Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn ~la Val 20 25 30
Ser Asn Ala 1\.sp I.eu Het Asp Phe Lys Asn Leu Leu 1\.sp His Leu Gl u 35 40 45
Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val pro Pro Gln Val Leu Ser SO 55 60
Glu pro Asn Glu Glu Ala Cly Ala Ala Leu Ser pro Leu Pro Clu Val 65 70 75 80
Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala eln Arg Asp Gly ely Ala 5 85 90 95
Leu Gly Arg ely pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys 100 105 110
Ser ~ys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser 115 120 125
Ser Cys Phe Gly ely Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu 1 30 135 140
Gl y Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 145 150
lt;210gt; 407
lt;211gt; 151
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 407
Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr val Ser phe Leu Leu Leu Leu Al a 1 5 10 15
Phe Glo Leu LeU Gly Gln Thr Arg Ala ASO Pro Met Tyr Asn Ala Val 20 25 30
Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp phe Lys Asn Leu Leu ASP His Leu Glu 35 40 45
Glu Lys Het Pro Leu Glu Asp Glu Val val Pro Pro Gln Val Leu Ser 50 55 60
Glu Pro ~$n Glu Glu Al~ Gly Ala Ala L~u Ser Pro Leu Pro Glu Val 6S 70 7S 80
Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala 85 90 95
Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys 100 105 110
Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Tnr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Ar9 Ser 115 120 125
Ser Cys phe Gly Gl y Arg Met A3P Arg lle Gly Ala Gln Ser Gly Leu 130 135 140
Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 145 150
lt;210gt; 408
lt;211gt; 126
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 408 Met nis Leu Ser Gl n Leu Leu Al a Cys Al a Leu Leu Leu Thr Leu Leu
5 1 s 10 15
Ser L@u Aro¡¡ Pro Ser Glu Ala Lys Pro Gly Ala Pro Pro Lyo val ero 2D 25 30
Arg Thr Pro Pro Ala Glu Glu Leu Al. Glu Pro Gl n Al. Al. Gly Gly 35 40 45
Gly Gln Lyo Lys Gly Asp Lys Ala Pro Cly Cly Gl, Gl, Ala Asn Leu 50 60
quot;
Ly$ Gly ASP Aro¡¡ Ser Arg Leu L@u Arg Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys 65 70 75 80
Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Cln Glu His Pro Asn Ala Arg 65 90 95
Lys Tyr Lys Cl y Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys phe Gl y 100 105 110
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gl y Ser Met ser Gl y LeU Gl y Cys 115 120 125
lt;210gt; 409
lt;211gt; 126
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 409
Met Mis Leu Ser Gln Leu Leu Ala Cys Ala Leu Leu Leu 7hr Leu Leu 1 S 10 15
Ser Leu Arg pro Ser Glu Ala Lys Pro Gly Ala Pro Pro Lys Val Pro 20 25 30
Arg Thr Pro Pro Ala Glu Clu Leu Ala Clu Pro Gln Ala Ala Gly Gly 35 40 45
Gly Gln Lys Lys Gly ASP Lys Ala pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn Leu 50 55 60
Lys Gly Asp Aro¡¡ Ser Aro¡¡ Leu Leu Ar g Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys 65 70 75 80
Ser Arg Ala Al a Trp Ala Ar o¡¡ Leu Leu Gln Clu His Pro Asn Ala Arg 85 90 95
Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gl y Cys phc Gly 100 105 110
Leu Lys Lcu Asp Aro¡¡ ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 115 120 125
lt;210gt; 410
lt;211gt; 38 15 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Dendroaspis angusticeps
lt;400gt;410
Glu Val Lys 'l'yr Asp Pro Cys Pho Gly His Lys Ile Asp Ar9 11e ASn
,
1 10
quot;
His Val Ser Asn Leu Gly Cys Pro Ser Leu .1It.rg Asp Pro Arg Pro Asn 20 25 30
Ala Pro Ser Thr Ser Ala 3S
lt;210gt;411
lt;211gt; 38
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Dendroaspis angusticeps
lt;400gt;411
Glu val Lys 'Yr Asp pro cys Phe Gly His Ly9 Ile ASp Ar9 ne Asn
,
1 10
quot;
His Val Ser Asn Leu Gly Cys Pro Ser Leu 1U:q Asp Pro Ar. Pro Asn 20 25 30
Ala Pro Ser Thr Sel; Ala J5
lt;210gt;412
lt;211gt; 30
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 412 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Ar9 Lys Met Asp
,
1 10
quot;
Arg I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cy. Lys Val Leu Arg 20 25 30
lt;210gt; 413
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 413
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Aro¡ Gly Het Asp
,
1 10
quot;
Arg I le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30
lt;210gt;414
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 414 Ser Pro Lys Met: Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Cly He' Asp
,
1 10 15
ArO Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys val Leu Arg ArO Hi s 20 25 30
lt;210gt; 415
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 415
Ser pro Lys t'oet Val Gln Gl y Ser Gly cys phe Gly I\rg Gly He' quot;p
1 , 10
quot;
~rq lle Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cy$ Lys Val Leu Aro ArO His 20 25 30
lt;210gt; 416
lt;211gt; 32
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
5 lt;400gt; 416 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gl y Cyo Phe Gly Arg Gly Mer Aso 1 5 10 15
Arg ¡le Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly 0,. Lys Val Leu gt;lt;g Arg Mis 20 25 30
lt;210gt;417
lt;211gt; 303
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Rattus norvegicus
lt;400gt;417
Mer Ala His Tyr Hi~ A~p Asp Tyr Gly Lys Alt;quot; ASP Glu Val Glu Phe 1 5 10 15
Val l\rg Thr Gly Tyr Gly Lyo Asp Mer Val Ly. Val Leu His lle Gln 20 25 30
Ar. Mp Gly Lys Tyr His Ser 11e Lys Glu val Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45
Leu Thr Leu Ar. Ser Ly. Ly. Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60
He Ile Pro Thr Asp Th:r He Lys Asn Thr val His val Leu Ala Lys 6S 70 75 80
Pno LYs Gly 11. Lys Ser ¡ le Glu Thr Ph. Ala Met Asn ¡le Cys Glu 8S
go
quot;
Mis Ph. Leu S.r Ser Phe Ser His Val Thr Arg Ala His Val Tyr Val 100 lOS llO
Glu Glu Val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys ASrl Gly val quot;,s His Val
115 12' 125
Hi. Al. ,h. Ile His Thr 'm Ohr Gly Thr His gt;h. ey. A.sp Val Glu 130 135 lOO
Gln val 1\~9 jit.,,,n CLy Pro pro 1116 Ile His Solt; Gly Ile Lys Acp Leu 145 lSO 15; 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Cly Ph. Glu Gly Phc 11e Lys Asp 165 170 175
eln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Ly. Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln lSO 185 190
val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr Gln Asn Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala 195 200 205
Thr Trp Gly Ala Val Arg ASp Ile val Leu Lys Lys Phe Ala Gly pro 210 215 220
Tyr Asp Arg Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln L,. Thr Leu Tyr Asp 225 230 235 2quot;
n. Gln Val Leu Thr Leu Ser eln Leu Pro Glu Ile Glu Asp Me' Glu 245 2SO 255
:tIa Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn 11e ASp Mee Ser Lys Melt; 260 265 270
Cly Leu ne Aon Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asquot; Asquot; Pro Tyr 275 280 285
Gly Lys l1c Thr Gly Thr Val Arg Arg Lys Leu pro Ser Arg Leu 290 295 )00
lt;210gt;418
lt;211gt; 303
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Rattus norvegicus
lt;400gt; 418
Mee Ala His Tyr His Acp ASP Tyr Gly Lys hsn Asp Glu Val Olu Phe 1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys ASp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 JO
Arg Asp Gly Lys Tyr Mis Ser Ile Lys Glu Val Ala 7hr Ser Val Gln 35 40 45
Leu Thr Lcu Aro Ser Lys Ly& Asp TYr Leu Hi~ Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60
Ile Ile pro Thr Asp 7hr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 7S 80
Phe Lys Gly Ile Lys Ser rle Glu Thr Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu 85 90 95
His Phe Lea Ser Ser Pne Ser His Val Thr Arg Ala His Val 'l'yr Val 100 lOS 110
Gla Glu val Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125
H'. Ala Ph. Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe ey. Asp Val Glu 130 135 ,.0
Gln val Arg Asn GLy Pro Pro l1e lle His Ser Gly lle Lys Asp Leu 145 ISQ 155 160
Lys Val Lea Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Gla Gly Phe lle Lys Asp 165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu pro Gla val Lys Asp Arg Cys phe Ala Thr Gln 180 185 190
v~l Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr Gln Asn Arg ASP Val ASp Phe Glu Ala 195 200 205
Thr Trp Gly Ala Val Arg ASP Ile Val Leu Lys Lys Ph. Ala Gly Pro 210 215 220
Tyr ASP Arg Gly Gla Tyr Ser Pro Ser V~l Gln Lys Thr Leu Tyr Asp 225 230 235 240
lle Gln Val Leu Thr Leu Ser Gln Leu Pro Glu lle Glu Asp Met Gla 245 250 255
Ile Squot;,r L@u Pro A91l lle flis Tyr Phe A .. 1l 11e Asp Met Ser Lys Het 260 265 270
Gly Lea tle Asn Lys Gla Glu Val Leu Lea Pro Leu ASp Asn Pro Tyr 275 280 285
Gly Lys tle Tnr Gly Thr val Arg Arg Lys Leu Pro Ser Arg Lea 290 295 300
lt;210gt; 419 lt;211gt;410
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt;419
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phc Lys Gly 1 1e Hia Val Tyr Ser Glo 1 5 10 15
lle Gly Glu Leo Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu lle 20 2S 30
Asp Tyr tle Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leo Phe Ser Ala lle ]5 40 45
Lea Glu Ser His Asp 11.10 Arg Lys Glu His Lys Gln Phe val Ala Glu 50 55 60
Lea Lys Ala Asn ASp Ile Asn val Val Glu Leu Ile Asp Leo Val Ala 65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile G1u
8S 9S
"
Glu Phe Leu G1u ASp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val 100 lOS 110
v.quot;l val Aro Asn Phe LeU Lys Al. Lys Lys Thr Ser ArO LY' Leu Val 115 120 125
Glu Ile Met Met Ala Gly lle Thr Lys Tyr Asp Leu Gly lle Glu Ala no 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Mee Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg 145 1S0 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly A~n Gly Val Thr lle His Tyr Met Arg 165 UO 115
Tyr Lys Val Aro G1n Arg Glu Thr Leu phe Ser Arg Phe Val Phe Ser 180 185 190
Asn His Pro Lys Leu 11e Asn Th r Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu 195 200 20S
Lys Leu Ser Ile Glu Gly G1y As. Val Phe lle Tyr Asn Asn Asp Thr 210 '15 220
Le u Val val Gly Val Ser Glu Arg Thr ASp Leu Gln Thr val Thr Leu 225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn 11e Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu phe Lys Arg lle 245 250 255
val Ala lle Asn val pro Lys Trp Thr Asn Leu Met Hi$ Leu ASP Thr 260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys phe Leu Tyr Ser Pro 1 1e Ala 275 280 285
Asn ASP Val Phe Lys Phe Trp ASp 'ryr Asp Leu Val As n Gly Gl y Ala 290 29S 300
Glu Pro cln Pro val Cl u Asn Gly Leu Pro Leu Glu ely Leu Leu eln 305 310 31S 320
Ser lle lle Asn Lys Lys Pro val Leu 11e Pro I l e Ala Gly Glu Gly 325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe ASP Gly Thr Asn 340 345 350
Tyr Leu Ala lle Arg Pro Gly Val Val lle Gly Tyr Ser Arg Asn Glu 355 360 365
Lys Thr Asn Ala Al a Leu G1u Ale Ala Cly J:le Lys Val Leu Pro Phe
,,,
370 380
Hi. G1y Asn Gln Leu Ser Leu Gly Mee Gly Asn Al. Arg Cys Me e Ser '.S HO 3.S 'O.
Me t Pro Llquot;!U Ser Arg Ly. ASP Val Lys Trp
,o5 410
lt;210gt; 420 5 lt;211gt;410
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 420
Melt; Ser val phi! Asp Ser Lys Phe Lys ely Ih~ tiis Val Tyr Ser elu 5 10 15
ne Gly elu Leu elu Ser val Leu Val His G1\,;L Pro Gly Aro elu ne 20 25 30
Asp Tyr ne Thr Pro Ala 1\.rg Leu A'P Glu Leu Leu phe Ser Ala Ile 35 40 45
Leu Glu Ser His ASp Ala. Arg Lys e l u Uis Lys eln Phe Val Ala Glu 50 60
quot;
Leu Lys Al a Aso Asp ¡le Asn Val Val Glu Leu t l e ASp Leu Val Ala
65 70 15lt; 80
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Glu Phc Leu elu Asp Ser Glu Pro Val Leu Set' Glu Glu Kis Lys Val 100 lOS 110
val Val II.r9 Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr-Ser Arg Lys Leu Val 115 120 125
Glu tle Mct Mct Ala Cly 11e 'I'hr Lys 'I'yr ASp Leu Gly Ile Glu Ala 130 135 140
Asp His Cl u Leu IIe val ,quot;p Pro Met Pro ,quot;o Leu Tyr phe Thr Arg 145 150 155, 160
,quot;p Pro Phe Ala Ser val Gly Asn Gly v.l Thrquot; Ile Hia Tyr Mo' Arg 165 170 l7S
'IYr Lys Val Ar. eln Arg Glu Thr LeU Phe Ser' 1I.r9 Phe val Phe Ser 180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr' Tyr ASp Pro Ser Leu 195 200 20S
Ly. Leu Ser Ile elu Gl y ely ASP Val Phe Ile Tyr ASn Asn Asp Thr 210 215 220
LeU val val Gly Val Ser elu Arg Thr Asp LeU eln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu ~la Lys Asn Ile Val Ala quot;,sn Lys elu Cys Clu Phe Lys Ar. 11e 245 250 255
Val Ala Ile Aen va l Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr 260 265 270
Trp Leu Th~ Met Leu Asp Lys Asp LyS Phe Leu Tyr Se~ Pro tle Ala 275 280 285
A," A.p Val phe Lys Phe Trp Aop Tyr Asp Leu Vol Asn Gly Gly Ala 290 295 300
Glu 'ro Gln Pro val elu A&n Gly Leu Pro Leu elu Gly Leu Leu eln 305 310 315
Ser Ile tle ....SR Ly' Ly. Pro Val Leu n. Pro tle Ala Gly elu ely 325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr Mis Phe Asp Gly Thr Asn 340 345 350
Tyr Leu Ala ne Arg Pro Gly Val Vol Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu )SS 360 quot;5
Ly, Thr ADn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly !le Ly' val Leu Pro phc
37. 375 ,..
H'. Gly ASn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Alo Arg Cyll Met Ser
3.5 '90 395 400
Met P~o Leu Ser Arg Lys A.p Val Lys Trp 405 410
lt;210gt; 421 lt;211gt;410
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 421
Met Ser val Phe ASP Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15
tle Gly Glu Leu Glu Ser Va l Leu Val Mis Glu Pro Gly Arg Glu tle 20 2S JO
ASp Tyr tle Thr pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala tle 35 40 45
Leu Clu Ser His ASp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Al~ Clu SO SS 60
Leu Lys Ala Asn Asp tle Asn Val val Glu Leu tle Asp Leu Val Ala 65 70 75 80
Glu Thr Tyr ASp Leu Ala . Ser Gln Glu Ala Ly. Asp Lys Leu Ile elu .5 90 95
Glu Phe Leu Glu gt;Sp Ser Glu Pro Val Leu Ser Clu Glu Hquot; Lyo Vol 100 lOS 110
Val val Aro Mn phe Leu Lys Al. Ly. Lys Thr Ser Aro Ly. Leu Val 115 120 125
Glu tle Met Met Ala Cly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala 130 135 140
Asp H1s Glu Leu lle v~l Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Fhe Thr Arg 145 150 155 160
,quot;p Pro Phe Al a Ser val G1y Asn Gly Val Thr Ile His 'I'yr Met Arg 165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arq Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser 180 185 190
Asn His Pro Ly. Leu lle Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr ,quot;O Pro Ser Leu 195 200 205
Lys Leu Ser Ile G1u Gly Gly Asp val Phe lle Tyr Asn Asn A~p Thr 210 215 220
Leu val Val Gly val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr val Th.r Leu 225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn lle Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu phe Lys Arg Ile 245 250 255
Val Ala lle Asn v~l Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu ASP Thr 260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro lle Ala 275 280 285
Asn Asp val Phc Lys Phc Tro Asp Tyr Asp Leu Val quot;n Gly Gly Ala 29O 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Len Gln 305 llO llS 320
Ser 11e lle Asn Lya Lys PrO val Len n. Pro Ile Ala Gly Glu Gly 325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu lle Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn 340 345 350
Tyr Leu Ala lle Arg Pro Gly Val Val 11e Gly Tyr Ser Arg Asn Glu 355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys val Leu Pro Phe 370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser 385 390 395 400
Met Pr~ Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 405 410
lt;210gt; 422 lt;211gt;410
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Mycoplasma arginini
lt;400gt; 422
Met Ser val Fhe ASP Ser Lys Fhe Lys Gly lle His Val TYr Ser Glu
1 5 10 15
He Gly alu Leu G1u Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Aro G1u lle 20 25 30
Asp 'I'yr He Thr Pro Ala 1\rg Leu Ao. Clu Le\ll Le.... 'he Ser Ala :Ile 35 'O 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Ly, Glu His Lys Gln ,he Val Ala elu 50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu LI!\ll Ile Asp Leu Val Ala 65 70 75, .0
Glu Thr Tyr Aup Leu Ala Ser Cln Glu Ala Lys: Asp Lys Leu Ile Clu 85 90 95
Glu Phe Leu Clu Asp Ser Clu Pro val Leu Serquot; elu Glu His Lys Val 100 lOS 110
Val Val Arg Asn PhI! Leu Lys Al. Ly, Lys Thrquot; Ser Arg Lys L~u Val 115 120 125
Glu ne Me, Mee Ala Gly ne Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile elu Ala 130 135 140
As. His elu Leu I1e Val As, Pro Met Pro ASn Leu Tyr Phe 'I'hr ArO 145 150 155, 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thrquot; Ile His Tyr Mee Mil 165 170 175
'ryr Lys Val Arg Gln 1\.rg Glu Thr Leu Phe Serquot; Arg Phe Val Phe Ser lBO 185 190
Asn His pro Lys Leu ¡le ASO Thr pro Trp Tyrquot; Tyr Asp Pro Ser Leu 195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Cly Gly ASp Val Phe Ile-Tyr Aan Asn Asp Thr 210 215 220
Leu val val Gly val Ser Olu Arg Thr Asp Leu. 010 Thr val Thr Leu 225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn ne Vol Ala Asn Lys Glu eys Glu Phe Lys Ar. Ile 245 250 255
Val Ala n. Aso Val Pro Lys Trp Thr ASn Leu Met His Leu Asp Thr 260 265 270
Trp LéU Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser ~ro ¡le Ala 215 280 285
Asn A•• Val Phe Lys Phe Tr. As. Tyr Asp Leu Val Aso Gly Gly Ala 290 295 300
Gl u Pro Gln Pro Val Glu quot;o Gly L@u Pro Leu G1u Gly Leu Leu Glo 30S 310 315 320
Ser lle Ile Asn Ly, Ly. Pro Val Leu n. Pro 11e Ala Gly G1u G1y 325 330 335
Ala Ser Gl n Met Glu quot;Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp ely Thr Asn 340 345 350
Tyr Leu Al. Ile Arg pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg 1!,sn Gl u
355 360 365
Ly. Thr quot;n Ala Ala Leu 01u Al. Ala ely Ile Ly. V., Lou Pro phe 310 315 380
His Oly Asn eln Leu Ser Leu Cly Met Gly Asn ...Arg Cys Met Ser 385 390 395 .00
Melt; Pro Lcu Ser Aro LY' Asp Val Lys Tro . 05 410
lt;210gt; 423
lt;211gt; 129
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 423
Me Ala Arg 01y Ser Leu Arg Arg Lcu Leu Arg Leu Leu Val Leu Oly 1 5 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Vol Ala Cly Clu eln Ala Pro Gly 20 25 30
Thr Ala Pro ey, Ser Aro Cl y Ser Ser Trp Ser Ala Asp LeU Asp Lys 35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe CYs 50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Al. Pro Pro Ala Pro Ph. Aro Leu Leu Trp Pro 65 'o ;S 80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser 85 90 9S
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg ArO Glu Lys phe Thr Thr 100 105 110
Pro Ile Glu elu Thr Gly Gly Gl u Gly Cys pro Ala Val Ala Leu 11e l1S 120 125
Gln
lt;210gt; 424
lt;211gt;497 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 424
Ala Arg Pro Cys 1le Pro Lys Ser phe Cly Tyr Ser Ser val Val Cys 1 5 10 15
Val Cys 1!,sn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro
30 1I.la Leu Oly Thr Phe Ser 1\.rg Tyr Ol u Ser Thr Ar9' Ser Oly Arg Arg
20 2S
35
40 45
Melt;
Olu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asr. Hio Thr Gly Tnr Gly
SO
SS 60
Leu Leu Leu
Thr Le\! Gln Pro GI\! Gln Lys Phel Oln Lys Val Lys Gly
65
70 7gt; '0
Phe Gly Gly Ala Met
Thr Asp Ala Ala Ala Le~ Asn 11e Leu 11.10 Leu
85
90 95
Ser Pro
Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Serquot; Tyr Phe Ser Glu Glu
100
105 1'0
Gly
Ile Gly Tyr Asn lle IIe Arg val pro Met. Ala Ser Cys Asp phe
115
120 125
Ser 11e Ar9' Thr Tyr Thr Tyr
Ala Asp Thr Prc Asp ASp ('he Gln Leu
130
13S 140
His Asn
Phe Ser Leu Pro Glu Glu ASp Thr Leu Lys 11e Pro quot;eu
145
150 160
lle His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg
Pro Val Ser Leu Leu Ala
165
170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Tbr Trp Leu Lys Thrquot; Asn Gly Ala Val Asn lBO lB5 190
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly ASp 11e Tyr His GIr. Thr 195 200 205
Trp Ale Alt;. Tyr Phe val Lys Phe Leu ASp Ala, Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220
quot;eu Gln Phe Trp ... l a Vel Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235, 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe G~n Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255
Aro Asp Phe !le Ala Arg Asp Leu Cly Pro Thr' 1.eu Ala Asn Ser Thr 260 265 270
His Mis Asn Vel Arg Leu Leu M.' LeU ASP A!ilp Gln Arg LeU Leu loeu 275 2S0 'S5
Plt;o His ~lt;p Ala Ly.. vill Va) Lequot; quot;Iquot;hr A..:p Pro ~lu Al. Ala Lys Tyr 290 295 JOO
Val His Gly !le Ala Val His Trp Tyr Leu AsO 'he Leu Altl. Pro quot;a '05 310 315 320
Lys Ala Thr Leu ely Glu 1'hr lIis ).rg Leu Phe Pro Aso Thr Mquot;, Leu 325 ))0 J35
Phe Ala Ser Clu Ala CyS Val ,Gly Ser Lys Phe TrI' Glu Gln Ser Val 340 345 J50
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Mee Gln Tyr Ser Mi s Ser Ile Ile 355 360 365
Th Aon Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Aop Trp Asn Leu Ala 370 375 3.0
Leu Aon Pro Glu Gly ely Plt;o Asn Trp Val quot;o AS:l Phe Val '.p Ser
3.5 390 395 400
Plt;o Ile I1e val ASp Ile Thr Lys Asp Thlt; Phe Tyr Lys eln Plt;o MOC 405 410 415
Phe Tyr His Leu cly His Phe Ser Lys Phe I le pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp .la val Ala 435 440 445
Leu Met His Pro Asp Cly Ser .la Vill V.,l Val val Leu Asn Arg Ser 450 455 4.0
Selt; Lys Asp Val Pro Lsu Thr 11e Lys Asp Pro U. Val Gly Phe Leu 465 470 475 480
Clu Thr lle Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495
Gl n
5
lt;210gt; 425 lt;211gt; 497 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 425 Ala Arg Pro Cys 1
l1e Pro Lys 5 Ser phe Gly Tyr Ser Ser Val 10 Val CyA 15
val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30
Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr alu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45
Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60
Leu Leu Leu Thr Leu eln Pro Clu cln Lys phe eln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80
Phe Gly aly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 9S
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu alu 100 lOS 110
Gly tle aly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Mct Ala Ser Cya Asp Ph9 115 120 125
Ser lle Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr pro ASP Asp Phe Glo Leu 130 135 140
His Asn Phe Ser Leu pro Glu Glu A$p Thr Cys ¡,eu Cys lle Pro Leu 145 150 155 160
Ile His Arg Ala Ceu Gln Leu Ala Gln ArO quot;,o Vtll Ser Leu Leu Ala 165 170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn ely Ala Val Asn 180 lB5 190
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Cly ASp lle Tyr His Gln Thr 195 200 205
Trp Ala Ar. Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Al. Glu Hi!! Lys 210 220
H'
Leu Gln Phe TrIgt; Ala V.l Thr Ala Glu Asn Glu pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe eln Cys Leu Gly Phe Thr Pro elu His Gln 245 250 255
Arg Asp Phe lle Ala Arg Asp Leu Gly pro Thr Leu Ala ASO Ser Thr 260 2GS 270
tÜ5 His Asn val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arq Leu Leu Leu 275 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300
val Mis Gly lle Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320
Lys Ala Thr Lcu Gly Gl u Thr His Arg Lcu Phe Pro Aso Thr Met Leu 325 330 335
quot;'he Ala Ser elu Ala Cys v a l ely Ser Lys Phe Trp Glu elo Ser Val 340 345 l50
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln TyXquot; Ser His Ser Ile lle 355 360 365
Thr hn Leu Leu Tyr His Val Val ely Trp Thr Asp Tro ASO Leu Ala 370 375 3.0
Ceu AOn PXquot;o Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Ar. Asn Phe Val Asp Ser
3.5 390 395 400
Pro lle lle Val Asp lle Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415
Phe Tyr His LCu Cly His phe Se r Lys Phe lle Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430
AXquot;g Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn ASP Leu ASp Ala Val Ala 435 440 445
Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Aso Arg Ser
455 460
'50
Ser Lys ASp Val pro Leu Thr lle Lys ASP Pro Ala Va l Gly Phe Leu 465 470 4?5 480
Glu Tnr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser lle His T~r Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495
Gln
lt;210gt; 426 5 lt;211gt;497
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 426
Ala Axg Pro Cys ¡le Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val val Cys 1 5 10 15
Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30
Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr e l u Ser Thr Ar9 Ser Gly Arg Ar9 35 40 45
Melt; Giu Leu Ser Het Gly Pro 11e Gln Ala ASR His Thr Gly Thr el)' 50 ss 60
Leu Leu Leu Thr Le\! eln Pro Glu Gln Lys Phe eln Lys Val LY' Gly 65 70 75 80
Phe Gly Gly Ala Me' Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn 1le Le\! Ala Leu B5 90 95
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr phe Ser Gl u Gl u 100 105 110
Gly r l e Gly Tyr Asn lle 11e Arg Val pro Met Ala Ser Cys ASp phe 115 120 125
Ser rle Ar9 Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 1JO 135 140
Hi s Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys 1l e Pro Le\! 145 150 155 160
ne His Arg Ala Leu Cln Leu Ala Gln Ar. Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys 'l'hr Asn Gly Ala Val Asn l BO lBS lOO
ely Lys ely Ser loeu loys COly eln Pro Gly Asp 11. Tyr His Gln Thr 195 200 205
Trp Ala Arg Tyr Phe val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Al a Glu His Lys 210 215 220
Le\! Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Aan COlu pro Ser Ala ely Leu 5
225 230 235 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Oly Phe Tl'lr Pro Glu quot; 's Oln 245 250 255
Arg Asp pl'le Ile Ala Arg Asp Leu Oly Pro Thr Loeu Alquot; Asn Ser Thr 260 26S 270
His His 'sn Val Arq Leu Leu Melt; Leu Asp Asp Gln 'ro Leu Leu LéU 27S 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 ]00
val His Gly rle Ala Val Mis Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 )1S 320
Lys Ala Thr Leu Cly elu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 )]5
Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp elu Gln Ser Val 340 345 350
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Glo Tyr Ser His Ser I le 11e 355 360 365
'{'hr Aso Leu Leu Tyr Mis Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 310 375 380
Lea Asn pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400
Pro I1e 11e val Asp I1e Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lye Gln Pro Met 405 410 415
Phe Tyr His Leu Oly Mis Phe Ser Ly. phe Il. Pro Glu Gly Selt; Oln 420 425 .30
Arg Val Oly Leu val Ala Ser Oln Lys Asn Asp Leu A,p Ala Val Ala quot;S «o lt;4S
Leu Ke' His Pro Asp Gly Sor Al. val val val Val Leu Asn Arg Ser.SO 4SS 460
Ser Lys ~p val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
465 470 475 480
Glu Thr Ile Ser p~o Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arq Arg 485 490 495
Oln
lt;210gt; 427
lt;211gt; 497
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 427 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys
1 s 10 15
Val Cys ~sn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Th, Pne Pro 20 2S 30
Ala I..eu Gly quot;, phe Ser Arg quot;quot; Glu Ser Thl' Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 4S
Me' Glu Leu Ser Met Gl y Pro Ile eln Al a Asn His Thr Gly Th.r Gly SO 55 60
Leu Leu Leu Thr Leu G1n quot;,o Glu cln Lys PhE' Gln Ly'!!: Val Lys Gly 65 70 7' 80
-
'
Pbe Gly ely Al a M~t Thr Asp Ala Ala Ala Le¡;, A~n Ile Leu quot;. Leu SS 90 OS
Ser Pro Pro Ala Cln Asn Leu Leu Leu Lys Serquot; Tyr Phe Ser Glu Glu 100 lOS 110
ely Ile ely Tyr Asn lle I l e Arg Val Pro Met. Ala Selt; Cys Asp Phe 115 120 125
Ser 11e Arg Thr Tyr Thr 'IYr Ala ASp Thr Pro. Asp Asp Phe CIn Leu 130 135 140
His Asn Pbe Ser Leu pro Glu Glu ASp Thr LY15: Leu Lys Ile pro Leu 145 150 155 160
:Ile His Arg Ala Leu Cln Leu Ala Cln Arg Prc, val Ser Leu Leu Ala 165 170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Th:tquot; Asn Gly Ala Val Asn 180 lSS 190
Glv LyS ely Ser Leu Lys ely Gln Pro ely AS¡:' Ile Tyr His Cln Thr . 195 200 205
Trp Ala Arg Tyr Phe val Lys Phe Leu Asp Al a. Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220
Leu aln phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn alu. Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235. 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Pne Thr Pro Glu His Gln 245 250 255
Arg ASp Phe lle Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr· Leu Ala Asn Se r Thr 260 265 270
H j 'S His Asn Val ArQ T.quot;,,, r ... quot; Met Ceu Asp quot;,SIgt; Gln ATg Leu LelJ Lel.l 275 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Al. Ala Lys Tyr 290 295 300
Val Hia Gly Ile Ala Val Hia Trp Tyr Lfltu As. ehe Leu Ala Pro Al. 305 310 315 320
LY' Ala Thr Leu G1y Glu Thr His Arq Lou Phe PrO Asn Tnr Mee Leu 325 330 335
Phe A.la Ser Olu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Oln Ser Val 3lt;0 345 3SO
Arg Leu Oly Ser Trp ASP Arg Oly Me ' Gln Tyr Ser His Selt; Ile I le 3SS 360 365
Thr Aen Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp 'I'hr Aep Trp Asn Leu Ala 370 315 380
Leu Aon pro Glu Gly Oly Pro Asn Trp Val Ar9 Aon Phe Val Asp Ser 385 390 395 400
Pro Ile Ile Val Asp ne Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Melt; 405 410 415
Phe Tyr His Leu Oly His Phe Ser LY' Phe Ile Pro Glu Oly Ser Oln 420 425 430
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445
Leu Met His Pro ASp Gly Ser Ala val Val Val Val Leu As n Arg Ser 450 45S 460
Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr rle Lys Asp Pro Al~ Val Gly Phe Leu 465 470 475 480
Glu Thr I le Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg:Arg 485 490 495
Cln
lt;210gt; 428
lt;211gt; 52
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 428
Tyr Arg Gln Ser Ket Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 11e Tyr Gln 20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser LyS 1le Ser 35 40 45
Pro Gln G1y Tyr SO
lt;210gt; 429
lt;211gt; 52
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 429
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30
Phe Thr ASP Lys ASP Lys Asp Asn Val Ala pro Arg Ser Lys I1e Ser 35 40 45
Pro Gln Cly Tyr 50
lt;210gt; 430
lt;211gt; 52
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens lt;400gt; 430
Tyr 1\..r9 Cln Ser Met Asn Asn Phe eln ely Lea Arg Ser Phe ely Cy. 1 5 10 15
Arg Phe ely Thr Cys Thr Val Gln Lya Leu Ala. His eln Ile Tyr Cln 20 25 lO
Phe Thr Aap Ly. ASP Lys Asp Asn V.l Ala Pro Arg Ser Lya Ile Ser 35 40 45
pro eln Cly Tyr 50
lt;210gt; 431
lt;211gt; 52 5 lt;212gt;PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 431
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe eln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 S 10 El
Arg Phc G1y Thr Cys Thr Val e1n Lys Leu Ala His eln Ile Tyr Gln 20 25 30
Phe Thr Asp Lys ASp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45
Pro eln G1y Tyr 50
lt;210gt; 432 10 lt;211gt; 145
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 432
Met Asn Ser Leu Val Ser Trp cln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15
His Phe Gly Clu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg 20 25 30 15 Pro Thr ely eln eln Leu Glu Ser LeU ely Leu Leu Ala Pro ely Clu 3S 40 45
eln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu 50 SS 60
Ser Arg Arg Cly Thr Ser Leu Ser Pro Pro pro Glu Ser Ser Gly Ser 6S 70 7S 80
Pro Gln eln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg eln Ile Pro Ala 85 90 9S
Pro eln Gly Al. val Leu Val Gln Ar. Glu Ly s 1\sp Leu Pro A,quot; Tyr 100 lOS 110
Asn Trp Aen Ser Phe Gly Leu ArO Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125
Gly Asn His Gly Arg Ser Al. Cly Arg Gly Trp Cly Al. Gly Ala Gly 130 135 140
Cln 145
lt;210gt; 433
lt;211gt; 145
lt;212gt; PRT 20 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 433
Met Asn Ser Leu Val Scr Trp Gln Lcu Leu Leu phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15
Mis Phe Gly Glu Pro Leu Glu Ly$ val Al. Ser Val Gly Asn Selt; quot;.
20 25 JO
Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Al. Pro aly Glu
35 .0 45
Gln Selt; Leu Pro Cys Thr Glu 'lt;o Lys Pro Ala Al. Thlt; Ala Arg Leu 50 55 60
Selt; 'lt;. Arg Gly Thr Selt; Leu Ser Pro pro quot;,o Glu Ser Ser Gly Selt; 65 70 75 BO
Pro Gln Cln Pro Gly Leu Ser Ala Pro .i.Ser Arg Gln Ilc Pro Al.
.5 'O quot;
Pro Gllquot;. Gly Ala Val Leu Val Gln 'lt;0 Glu Ly. Asp Leu Pro Asn quot;quot;100 105 110
Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Aro phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125
Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly 130 115 140
Gln 145
lt;210gt; 434
lt;211 gt; 346
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 434
Me' Ala Arg Pro Gly Gln Arg Trp Leu Gly Lys Trp Leu Val Al. He'
,
1 10 15
Val Val Trp Ala Leu Cys Aro Leu Ala Thr Pro Le... Ala Ly. A.n Leu 20 25 30
Glu Pro val Ser Trp Ser Ser Leu ,quot;n Pro Lys Phe Leu Ser Gly Lys 35 40 45
Gly Leu Val Ile Tyr Pro Lys Ile Gly Asp Lys Leu Asp Ile Ile Cys 50 55 60
Pro Arg Ala Glu Ala Gly Arg Pro Tyr Glu Tyr Tyr Lys Leu Tyr Leu 65 10 15 80
val Arg Pro elu Gln Ala Ala Ala Cys Ser Thr Val Leu Asp Pro Asn 85 90 9S
Val Leu Val Thr Cys AsnArg pro Glu Gln Clu Ile Ar9 Phe Thr Ile '100 105 110
Lyo phe 01n O'u Phe Ser Pro Aon Tyr Met Gly Leu O'u Phe Lys Lys 120 125
11'
His Mis Aop Tyr Tyr Ile Thr Ser Thr Ser 1\sn 01y Ser Leu elu Gly 130 135 140
Leu G'u Asn Arg Glu 01y O'y val Cys Arg Thr ArO Thr Met Lys 11. 145 150 15S 160
Ile Mee Lys val Gly G1n Asp Pro Asn Ala val Thr ~ro Glu Gln Leu 165 170 175
Thr Thr Ser Ar9 pro Ser Lys elu Ala Asp Asn Thr val Lys Met Ala 180 185 190
Thr eln Ala Pro Gly Ser Arg Gly S~r Leu Gly Asp Ser Asp Gly Lys 195 200 205
His Clu Thr Val Asn Gln Glu Glu Lys S~~ Gly P~o Gly Ala S~r Gly 210 215 220
Gly Ser Ser Gly ASp Pro ~sp Gly Phe Phe Asn Ser Lys val Al~ Leu
27.5 230 235 240
Phe Ala Ala Val Gl y Ala Gly Cys Val Ile Phe Leu Leu Ile Ile Ile 245 250 255
Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Lys Leu Arg Ly$ Arg His Arg Lys His 260 265 270
Thr Cln Gln Arg Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ser Tbr Leu Ala Se~ Pro 275 280 285
Lys Gly Gly Ser GLy Thr Ala Gly Thr Glu Pro Ser Asp Ile Ile Ile 290 295 300
pro Leu Arg Thr Thr Glu Asn Aso Tyr Cys Pro His Tyr Olu Lys Val 305 310 315 320
Ser Gly ASP Tyr Cl v His Pro Val Tyr Ile Val Gln Glu Met Pro Pro 325 330 335
Gln Ser Pro Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Val 340 345
lt;210gt; 435 5 lt;211 gt; 346
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 435
Met Ala Ar9 Pro Gl, Gln Arg Trp Leu Gly Lys Trp Leu val Al. Met 1 S 10 lS
val Val Trp Al. Leu Cys Ar9 Leu Ala Thr FeO !.eu Ala Lyo Asn Leu 20 25 30
Glu Pro val Ser Trp Ser Ser Leu quot;n Pro 1.YIOgt; phe Leu Ser Gly Lys
35 'O
quot;
Gly Leu Val lle Tyr Pro Lys 11e Gly Asp Lys Leu Asp Ile Ile Cya SO SS 60
Pro Ar9 Ala Glu Ala ely Ar9 Pro Tyr Clu Tyr Tyr Lys Leu Tyr Leu 6S 70 7~ 80
val Argo Pro Glu Gln Ala Ala Ala Cys Ser Thr val Leu Asp pro Asn BS 90 95
Val Leu Val Thr Cys Asn Arg Pro elu eln Glu 11e Ar9 Phe Thr 11e 100 lOS 110
Lys Phe eln Glu Phe Ser Pro Asn Tyr Met Gly Leu elu Phe Lys Ly.s 115 120 125
!lis His ASP Tyr Tyr 11e Thr ~er Thr Ser Asn Gly Ser Leu Clu Gly 130 135 140
Leu Glu Asn Ar9 Glu Gly ely Val Cys Arg Thr Aro Thr Met Lys I le 145 150 l55 160
11. Met. Lys Val el, eln Asp Pro Asn Ala Val Thr Pro Clu Gln Leu lOS 170 17S
Thr Thr Ser Ar. Pro Ser Lys Glu Ala quot;,p Asn Thr val Lys I':et quot;a 180 lBS 190
Thr eln Ala Pro ely Ser Arg ely Ser Leu Gly Asp Ser Asp ely Lys 195 200 205
Mis Glu Thr val Asn Gln Glu Glu Lyo Ser Gly Pro Cly Ala Ser Gly 210 215 220
Gly Ser Ser Gly Asp Pro Asp Gly Phe Phe Asn Ser Lys Val Ala Leu 225 230 235 240
phe Ala Ala val Gly Ala Gly Cys Val Ile Phe Leu Leu Ile lle Ile 245 250 255
Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Lys Leu Arg Ly~ Arg Hia Arg Lys His 260 265 270
Thr Gln Gln Arg Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ser Pro 275 280 285
Ly. ely Gly Ser Gly Thr Ala ely Thr Glu pro Ser gt;sp Ile lle lle 290 29' 300
Pro Leu Arg Thr Thr Gl. Asn Asn Tyr Cys Pro His Tyr Glu Lya Val 305 310 315 320
Ser Gly Asp Tyr ely Kia Pro Val Tyr Ila Val Gln Glu Met Pro Pro 32S 330 335
Gln Ser pro Al a Asn Ile Tyr Tyr Lys Val 340 345
lt;210gt; 436 5 lt;211gt; 129
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 436
Met Ala Arg Gly Ser Leu Aro Arg Leu Leu Arg Lcu Leu Val Leu Gly 1 5 10 15
t.eu Trp Leu Al. Leu Leu Arg Ser V.l Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly 20 2S 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser 'I'rp Ser Ala AsO Leu Asp Lys 3S 40
quot;
Cys Me, AsO Cys Ala Ser Cys Ar9 Ala Arg Pro His Ser ASP Phe Cys 50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro pro .Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp pro 6S 70 75 80
11. Leu Gly Gly gt;la Leu Ser Leu Thr .5
Phe val 90 Leu Gly Leu Leu 95 Ser
Gly phe Leu val 100 Trp Arg Arg Cys Arg lOS Arg Arg
GIu Lys .he Thr Thr 110
pro
Ile Glu 115 GIu Thr Gly Gly Glu Gly 120 Cys Pro Ala Val gt;la 125 Leu Ile
Gln
5
lt;210gt; 437 lt;211gt; 247 lt;212gt; PRT lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 437
Ket Leu Aro Arg Aro Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala 1 S 10 15
Al. Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Cly Ala Leu Olu Vol Oln 20 25 30
Val Pro Olu Aquot;p Pro Val val Al. Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 '0 45
Cys Cys Ser Phe Ser pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Cln Leu Asn SO SS 60
Leu Ila Trp aln Leu Thr Asp Thr Lys e lo Leu val Mis Ser PhB Ala 65 70 75 80
Glu Gly eln Asp G~n ely Serquot;Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Leu Asp Leu Leu Al. eln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Ar. Val 100 lOS 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser n. Ar., Asp 120 125
11'
ph. Gly Ser Alquot; Ala Val Ser Leu eln val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys lJO 13' 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg pro Gly ASP Thr
H.5 150 155 160
val Thr Ila Thr Cys Ser Ser TYr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val 165 170 175
Phe Trp eln Asp Gly eln ely Val PrO Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr 180 185 190
Ser eln Met Ala Asn elu eln ely Leu Phe ASP Val Mis Ser Val L@u 195 200 205
Arg Val Val Leu Cly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn 210 215 220
Pro val Leu Gln eln Asp Ala Mis Cly Ser Val Thr lle Thr Gly eln 225 230 235 240
Pro Met Thr Phe Pro Pro Clu 245
lt;210gt; 438
lt;211gt; 346
lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 438
Met Ala Arg pro Gly Gln Arg Trp Leu Gly Lys Trp Leu Val Ala Met 1 S la 15
Val Val Trp Ala Leu Cys Arg Leu Al. Thr Pro Leu Ala Lyo Alt;n Leu 20 25 JO
Glu Pro Val Ser 'l'rp Ser Ser Leu Asn Pro Lys Phe LeU Ser Gly LYIii 35 40 45
Gly Leu Val Ile TYr pro Lyo !le Gly Asp Lys Leu gt;O, !le Ile Cys 50 55 60
Pro Aro Ala Glu Ala Gly Aro Pro Tyr Glu Tyr Tyr Lys Leu 'l'yr Leu 65 10 15 80
v.l Arg Pro Glu Gln Al. Ala Ala Cys Ser Thr val Leu Asp pro Asn 8' 90
Val Leu Val Thr Cy. Asn Arg Pro Glu Gln Glu. I le Arg Phe Thr !le 100 lO' 110
Lys Phe G1n Glu Phe Ser Pro Asn Tyr Mee Gly Leu Glu Phe Lys Lys 115 120 125
His His Acp Tyr Tyr Ile Thr Ser Thr Ser hsn Gly Ser Leu Glu Gly 130 135 140
Leu Glu Asn Arg GIu Cly Cly Val Cys Arg 'l'hr Arg Thr Mee Lys Ile 145 150 155 160
I1e Met Lys Val Gly Gln Asp pro Asn Ala Val Thr pro GIu Gln Leu 165 170 115
Thr Thr Ser Arg Pro Ser Lys Glu Ala Asp Asn Thr Val Lys Met Ala l BO lB5 190
Thr Gln Ala Pro Gly Ser Arg Gly Ser Leu G1y Asp Ser Asp Gly Lys 195 200 205
His Glu Thr Val Asn GI n Glu Glu Lys Ser Gly Pro Gly Ala Ser Gly 210 215 220
Cly Ser Ser Gly A~p Pro ACP Cly Phe Phe Asn Ser Ly~ val Ala Leu 225 230 235 240
Phe Ala Ala Val Gly Ala Gly Cys Val Ile Phe Leu Leu Ile Ile Ile 245 250 255
Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Lys Leu gt;rg Lya Arg aia Arv Lys Mis 260 26' 210
Thr Gln Gln Aro Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ser 'rhr Leu Al a Ser Pro 215 2.0 285
Lya Gly Gly Ser GJ.y Thr Ala Gly Thr Glu Pro Ser quot;p Ile Ile I le 290 295 300
Pro Leu Arg Thr Thr GIu Asn Asn Tyr Cys Pro His TYr Glu Lys Val 305 310 315 320
Ser Gly Asp Tyr Cly His Pro Val Tyr I le Val Gln Gl u Met Pro Pro
32' 330 335
Gln Ser Pro Ala Aso Ile Tyr Tyr Lys Val 340 345
lt;210gt; 439
5 lt;211gt;346
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 439
Me' quot;la 1gt;.rg Pro G1y Gln Arg Trp Leu Gly Lys Trp Leu Val Ala Me' 1 S 10 15
Val Val Trp Ala Leu Cys Arg Leu Ala Th, Pro Leu Ala Ly, Asn Leu 20 25 30
Glu Pro Val Ser Trp Ser Ser Leu Mn Pro Lys -fhe Leu Ser Gly Lys 35 40 45
Gly Leu Val 11e Tyr Pro Lys 11e Gly Asp Lys Leu ASp 11e rle Cys 50 55 60
Pro Arg Ala -Glu Ala Gly Arg Pro Tyr Glu Tyr Tyr LyS Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Val Arg Pro Glu Gln 'la Al.. Ala CY8 Solt; Thr Val Leu Asp Pro Asn 8S 90 95
Val Le.... Val Thr Cy, Asn Arg Pro Glu Gln GI.... !le Arg Phe Thr He 100 lOS 110
Lys ?he Gln Glu Phe Ser Pro quot;n Tyr Ket Gly Leu Glu Phe Lys Lys 11S 120 125
His His Asp Tyr Tyr 1le Thr Ser Thr Ser Asn Gly Ser Leu elu Cly 130 135 140
Leu Glu Asn Arg Glu G1y Gly Val Cys Arg Thr Arg Thr Met l.quot; 11e 145 150 15S 160
11e Met Lys Val Gly Gln Asp Pro Asn Al. V.l Thr Pro GI.... Gln Leu 16S 170 175
Thr Thr Ser Ar. Pro Ser Lys Glu Al. Mo Asn Thr Val quot;y. Her .,. 190 185 190
Thr Gln Ala pro Gly Ser Arg Gly Ser Leu Gly ASP Ser Asp Gly Lys 195 200 205
His Glu Thr Val Asn Gln Gl. Gl. Lys Ser Gly Pro Gly Ala Ser ely 210 215 220
Gly Ser Ser Gly Asp Pro A,p Gly Phe Phe Asn Ser Lys val Al(l quot;.u 22S 230 235 2.0
Phe Ala Ala Val Gly Ala Gly Cys V1J l He Phe Leu LeU Ile He Ile
2.5 250 255
Phe Leu The val Leu Leu Leu Lys Leu Ar. Lyo;¡; Arg His At. quot;y. Hl. 260 265 270
'l'he Gln Glo Atg Ala Ala Ala Le. Ser Leu Ser Thr quot;.u Ala Ser Pro 27S 280 2BS
Ly' Gly Gly Ser Gly Thr Al. Cly Thr Glu Pro, Ser quot;o Ile Ile Ile 290 295 300
Pro Leu Arg Thr Thr Glu Asn Aen Tyr Cys Pro His Tyr Glu Lys Val 305 310 315 320
Ser Gly Asp Tyr Gly His Pro Val Tyr I le Val Cln Glu Met Pro Pro 325 330 335
Gln Ser Pro Ala Asn lle Tyr Tyr Lys val 340 345
lt;210gt; 440 5 lt;211gt; 319
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Pan troglodytes
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (30)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
lt;400gt; 440
Met Pro val Phe Ser Leu Gln Asn ASp Glu val Glu Phe Val 1\rg Thr 1 S 10 15
Gly Tyr Gly Lys Asp Ile Val Lys Val Leu His Ile Gln Arg 1\sp Gl y 20 25 30
Lys Tyr His ser 11e Lys Glu val Ala Thr Ser Val Glo Leu Thr Leu 35 40 45
Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Aso Ser Asp Ile Ile Pro 50 SS 60
Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thlt; val HilO val Leu Al a Lys phe Lys elu 70 75 80
Asn Clu Pro Ala Asn Ile Asp Cl y Al a Me' elu Lys Ala Phe Cya Phe 85 90 95
Phe Leu Glo Ile Ly, Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Aso ne eya Clu 100 105 110
His Phe Leu Selt; Ser Phe Aso His val Ile Arg Ala Cln Val Tyr Val 115 120 125
Glu Clu ne Pro Trp Lys His Leu Glu Lys ASO Gly val Ly. His Val 130 135 140
His A.la Phe Ile His Thlt; ''0 'T'hr Gl y Thr His Phe Gly Glu Val Clu 145 150 155 160 5 eln Leu Arg Ser Cly ,lt;o Gl n val Ile lIis Ser Gly Ile Lys Asp Leu 165 170 175
Lys Leu Leu Lya Thlt; Thr Gln Ser Cly Phe Glu Gly Phe ne Lys Asp ISO 185 190
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Va l Phe Lys Cys Met Me' ArO Thr Leu 195 200 205
Pro Cln Ser Ser Pbe Pro Leu Phe Gln Val Leu Ser Met Gly Ser Ser 210 215 220
Leu Met Asp Thr Ile Arg Asp Lcu Val Met Glu Lys Ser Ala Gly Pro 225 230 235 240
Tyr Asp Lys Asp Clu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Cys Asp 245 250 255
Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met Glu 260 265 210
Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn 11e Asp Mct Ser Lys Het 275 280 285
Gly Leu 11e Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr 290 295 300
Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 305 310 315
lt;210gt; 441 lt;211gt;319
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Pan troglodytes
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (30)
lt;223gt; Codón natural de parada reemplazado por Arg
lt;400gt; 441
Mst Pro val Phe Ser Leu Glo Asn ASp Glu val Glu Phe val Arg Thr 1 S 10 15
Cly TYr Gly Lys ASP lle v~l Lys Val Leu His lle Gln Arg Asp Gly 20 25 30
Lys TYr HilO Ser l1e Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Glo Leu Thr Leu 35 40 45
Ser Ser Lys Lys Asp TYr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp l1e l1e Pro 50 55 60
Thr ASp Thr ¡le Lya ASn Thr Val His Val Leu Al. Lys Phe Lys Olu 65 70 75 80
Asn Glu Pro Ala ASn Ile Asp Gly Ala Het Glu LyJl Ala Phe Cys 'he 85 90
quot;
Phe Leu Gln Ile Lys Ser 11e Glu Ala Phe Gly Val Aso Il. Cys Olu 100 lOS 110
His Phe Leu Ser Se r Phe Aso His Val 11e Arg Ala Oln Val Tyr Val 115 120 125
Glu Glu Ile Pro Trp Lys His Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys HilO Val 130 135 140
quot;'s Ala Phe 118 His Thr Peo Thr Gly Thr Phe Gly Glu Val Glu
Hquot;
145 I SO 15' 160
Gln ~u Arg Ser Cly pro Gln Val lle His Ser Gly ¡le Lys Asp Le~ 165 170 175
Lys Leu Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Gl u Gly phc llc Lys Asp 180 185 190
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Phe Lys Cys ~et Met Arg Thr Leu 1 95 200 205
Pro Gln Ser Ser Phe Pro Leu Phe Gln val Leu Ser Met Gly Ser Ser 210 215 220
Leu Met Asp Thr Ile Ar. Asp Leu Val Met 01u Lys Ser Ala Oly Pro 225 230 235 2quot;
Tyr Asp Lys Asp Glu Tyr Ser Pro Ser Val Oln Lys Thr Leu Cys Asp 245 250 255
l 1e Gln Val LBU Ser Leu Ser Arg Val pro Al. I1e Glu Asp Met Glu
260 26' 270
Ile Ser Leu Pro ASO Ile His Tyr Phe Asn l1e ASp Met Ser Lys Met 275 280 285
Gly Leu l1e Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr 290 295 300
Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Ley 5 305 310 315
lt;210gt; 442
lt;211gt; 394
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
10 lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
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5 lt;400gt; 442
Met Glu Lys Phe 11e Trp Tyr Leu Val His Leu TYr T~r Glu Met Thr
1 5 10
quot;
Lys Ser Ser pro Ser Cys Arg Leu Val Ala Se~ Cys Gln Thr Val Ala 20 25 30
Lys Glu Leu Gly Glu Asn Ser Leu Cly Tyr Gly pro Cly His Tyr Leu 35 40 45
Leu Phe Gly Cys Arg Asp Ala Phe Gly Cys Pro ~et Pro Gly Leu Phe 50 55 60
His Leu Leu Gln Asp Gln Met Ile Gly Ser Leu His Thr Asp Ser Leu 65 70 75 80
Pro A~n Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Cly Tyr Gly Lys alu Met 95 90 95
Val Lys Val Leu Aia Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser lIé Lys 100 105 110
alu val Ala Thr Ser Val Glo Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr 115 120 125
Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn ~30 135 140
Thr V.l His Val Leu Al. Ly. Phe Lys Glu A.n ,quot;p Pro lila Asn Ile 'quot; l SO lSS 160
Asp Cly Al a Met Oíu LyS Ala Phe Cys Phe phe Leu Gln Ile Lys Ser 165 170 175
:I1e Glu Ala Phe Oly val lIsn 11e Cys Olu His Phe Leu Ser Ser Phe 180 185 190
Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Met Glu Glu Ile Pro Trp Lys 195 200 205
Hia Leu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala phe Ile Mis Thr 210 215 220
Pro Thr Gly Thr Mis Phe Cys Glu Val Glu Gln Leu Arg Ser Gly Pro 225 230 235 240
Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 245 250 255
Gln Ser Gly Pne Glu Gly Phe I 1e Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro 260 265 270
Glu Val Lys IIsp Arg Cys Phe AID Thr Gln Val Tyr Cy3 Lys Trp Arg 275 280 285
Tyr His Gln Cys Arg ASp Val ASp Phe Lys Ala Thr Trp ASp Thr I1e 290 295 300
Arg Asp Leu Val Met Glu Lys Ser Ala Gly Pro Tyr IIsp Lys Gly Glu 305 310 315 320
Tyr Leu Thr Ser Val Glo Lys Thr Leu Cy$ ASp Ile Gln Val Leu Ser 32S 330 33S
Leu Ser Arg Val Pro Ala ¡l@ G1u AsO Met Glu I1e Ser Leu Pro Asn 340
34' 3'0
I1c His Tyr phe Asn I1e Asp Me' Ser Lys Met C1y Leu Ile Asn Lyo 3quot; 360 36'
C1u Clu val Leu Leu Pro Leu AsO Asn Pro Tyr C1y Lys rIe Thr G1y
370 37' 380
Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 38' 390
lt;210gt; 443
lt;211gt; 394
lt;212gt; PRT
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lt;220gt;
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Me' Glu Lys Phe Ile Tro Tyr LeU Val Mis Leu Tyr Thr Glu Me' Thr
,
1 10
quot;
Lyo Ser Ser PrO Ser Cys Arg Leu Val Ala Ser Cys G1n Thr Val Ala 20 25 30
Ly. C1u Leu Oly Glu Asn Ser Leu Gl y Tyr Gly Pro 01y Mis Tyr Leu 3' 40
quot;
Leu Phe C1y Cys Aro AsO Al. Phe Cly Cys Pro Me' Pro Gly Leu Phe
'O '5 60
His Leu Leu GIn Asp C1n Melt; 11_ Gly Ser Leu His Thr Asp Ser Leu 6S 70 75 80
Pro Asn Asp C1u Val C1u Phc Val Arg Thr Gly Tyr G1)' Lys Glu Me' 8' 90 .5
val Lquot; val Leu His Ile CIo Aro quot;O G1y Lys Tyr His Ser 11e Lys 100 105 110
Glu V.eol Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr 115 120 125
Leu Mis Gly AsO Asn Ser AsO Ile I le Pro Thr Asp Thr Ile Lys quot;n 1 30 135 140
Thr Val Kis val Leu Al. Lys Phe L)'s Glu Asn Asp Pro Ala Asn Ile 145 150 155 160
Asp Gly Ala Met Glu Lys Ala Phe Cys Phe Phe Leu Gln Ile I,ys Ser 165 110 115
Ile Glu A14 phc Gly Val ASo lle Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe 180 185 190
Asn Kis Val 11e Arq Ala Gln Val Tyr Met Glu Glu l le Pro Trp Lys 195 200 205
His ~eu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe lle His Thr 210 215 220
Pro Thr G1y Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Leu Arg Ser Gly Pro 225 230 235 240
Gln Val lle His Ser ely lle LyS ASP Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 245 250 255
Gln Ser Gly Ph. G1u Gly Phe 11e LY5 Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro 260 265 270
Glu Val Ly. Asp Ar9 Cys Phe Al. Thr eln Val Tyr Cys Lys Trp Ar'J
'75 28. 285
Tyr Hi s Gln Cys Ar9 ASP Val Asp Phe Lys t\.la Thr Trp Asp Thr 11e 290 295 300
Arg Asp Leu Val Met Clu Lys Ser Ala ely Pro Tyr Asp Lys Cly Clu 305 310 315 320
TYr Leu Thr Ser va l Cln Lys Thr Leu Cys Asp Ile elo val Leu Se r 325 330 335
Leu Ser Arg Val Pro Ala l1e Glu ASP Mee Cl u lle Ser Leu Pro Asn 340 345 350
lle His Tyr Phe Asn lle Asp Met Ser Lys Mee Gly Leu lle ASo Lys 355 360 365
Glu Clu val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gl y Lys Ile Thr Gly 370 315 380
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lt;400gt; 444
Met Ala Asp Tyr Hi9 Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Mee Val Lys Val Leu His ¿le Cl n 20 25 JO
Ar9 Asp Gly LyS Tyr His Ser Ile Lys Glu val Ala Thr Ser Val Gln 35 4U 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp SO SS 60
n e !le Pro Thr ASp Thr ne Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 75 80
quot;
Phe Lys Gly 11e Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn I l e Cys Gl u 85 95
'O
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val 100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu G1u Lys Asn G1y Val Lys His Val 11S 120 125
His Ala Phe 11e His Thr Pro Thr G1y Thr His Phe Cys G1u Val Glu lJO 135 140
G1n Leu Arg Ser Gly Pro pro val 11e Hi5 Ser Gl y 11e Lys Asp Leu 145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gl n Ser Gly Phe Glu Gly Phe 11e Lys Asp 165 170 175
Cln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln 180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205
Ala Thr Trp Gly Thr Ile ArO Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly 210 215 220
Pro Tyr ASp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240
Mp 11e GIo Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro CIu Ile Glu ,quot;p He' 245 250 255
Glu Lle Ser Leu pro Aso I le His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270
Met Gly Leu I le Asn Lys Gl u Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lyquot; Ar'iJ Lys Leu Ser Ser Aro Leu 290 295 300
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lt;211gt; 304
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Met ~la Asp Tyc His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 1 S 10 15
Val ~rg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gl n 20 25 JO
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln J5 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Ly, Aop 'I'yr Leu IHs Gly Aop .,n Ser Asp 50 55 60
n e ne Pro Thr Afgt;p Thr ne LY8 Asn Thr V.l Ris Val Leu Ala Ly, 65 70 75 80
Phe Lys Gly Ile Ly, Ser Ile Glu Ala phe ely Val Asn Ile ey, Glu 85 90 95
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn Ris val ne Arg Ala eln Val Tyr Val lO' 105 110
Glu Glu !l. Pro Trp Lys Arg Leu elu Lys Asn Gly Val Lya His Val 115 120 125
His Al. Phe Ile His Thr Pro Thr Gly 'I'hr His Phe eys Glu Val Glu 130 140
'quot;
Oln Leu Arg S .. r Gly Pro Pro Val Ile His Ser Oly Ile Lys Asp Leu 145 15' 155 160
Ly. Val Leu Ly. Thr Thr Gln Ser Gly Phe Olu Gly Phe Ile Ly. A'p 16' 170 175
quot;
eln P'he Thr Thr Leu Pro Glu Val Lya A,p Arg Cys Phe Al. Thr Oln 180 185 190
val Tyr eyo Ly. 'l'rp 11.:(:9 Tyr H', Oln Cys J'.rg A5p Vol Asp Phe Glu 195 200 205
Ala' Thr Trp Gly Thr Ile Aro up Leu Val Leu elu Lye Phe Ala Gly 210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly elu Tyr Ser Pro Ser v.l eln Lys Thr Leu Tyr
225 235 20'
'quot;
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arq Val Pro Glu Ile Glu Asp Het 245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile Ris Tyr Phe As n rle ASp ~et Ser Lys 260 265 270
Met Gly Leu Ile J'.sn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu ASP Asn Pro 275 280 285
Tyr Cly Lys Ile Thr Cly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser ArQ Leu 290 295 300
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Melt; Glu Lys Phe Ile Trp Tyr Leu Val His Leu Tyr Thr elu Hee Thr 1 5 10 15
Ly, Ser Ser 'ro Ser Cys Arg Leu V.l Ala Sel~ Cys Gln Thr V.l Al. 20 25 30
Lys elu Leu Gly Glu Asn Ser Leu G1y Tyr Gl~r Pro Gly quot;1, Tyr Leu
J5 40
quot;
Leu Phe Gly Cys Arg Asp Ale ehe Gly Cys Pro Melt; Pro Gly Leu Phe 50 55 60
Mis Leu Leu Gln Asp Gln Melt; quot;lle Gly Ser Leu His Thr Asp Ser Leu 65 70 7'·., 80
Pro Asn Asp Glu V.1 Glu Phe va.l Arg Thr Gl~r Tyr Gly L;r'S Glu Melt; es 9S
quot;
Val LyS Val Leu Mis Ile Gln Arg Asp Gly LYIi Tyr Mis Ser :rla Lys 100 105 110
Glu Val Ala Thr Ser va! Gln Leu Thr Leu SCI~ Ser Lys Lys ASp Tyr 115 120 125
Leu His G1y ASP Asn Ser Aop Il. Ile Pro Thl~ Aep Thr lle Lys Asn 130 135 140
Thr V.l His Val Leu Al . Lygt; Phe Lys Glu Asn Asp pro Ala Asn lie 145 150 15~' 160
A,o Gly Ala Met Glu LAla flhe Cys Phe pho Leu Gl n lle Lye Ser
quot;
165 170 175
lle Glu Alll Phe Gly Val Asn lle Glu His Phe Leu Ser Ser phe 180 lOO
Asn His Val lIe Arg Ala Gln Val Tyr Met: Gil! Glu ne pro Trp Lys 195 200 205
His Leu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val Hü¡ Ala phe Ile His Thr 210 215 220
Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Leu Arg Ser Gly Pro 225 230 235 240
Gln Val :Ile His Ser Gly Ile LyS Asp Leu Ly~1 Val Leu Lys Thr Thr 245 250 255
Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gltl Phe Thr 'hr Leu Pro 260 265 270
Glu Val Lya Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cy. Lys Trp Arg 275 280 285
Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp phe Lys Ahl Thr Trp Asp Thr l1e 290 295 JOO
Arg Asp Leu Val Het G1u Lys Ser Ala Gly PCCI Tyr Asp Lys Gly Glu 305 310 3l~i 320
Tyr Leu Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Cya Asquot; Ile Gln Val Leu Ser 325 330 335
Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met Glu I1e Ser Leu Pro Asn 340 345 350
11e His Tyr Phe Asn !le Asp Met Ser Ly$ Met: Gly Leu !le Asn Lys 355 360 365
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Gly Tyr ely Lys Asp tle Val Lys val Leu Hi~ lle Cln Arg Asp Gly 20 2S 30
Lys Tyr His Ser Ile Lys elu val Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu 35 40 45
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Thr Asp Thr t1e Lys Asn Thr Val His val Leu Ala Lys Phe Lys elu 65 70 75 80
Asn Glu pro Ala ASn 11e Asp Gly Ala Hee Glu Lys Ala phe Cys Phe 85 90 95
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eln Leu Arg Ser Gly Pro e1n Val 11e His Ser ely lle Lys Asp Leu 165 170 175
Lys Leu Leu Lys Thr Thr G1n Ser ely Phe elu G1y Phe 11e Lys ASp 180 185 190
eln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Phe Lys Cys Met Met Arg Thr quot;Leu 195 200 205
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'I'yr Asp Lquot; ,quot;p G1u Tyr Ser Pro Ser V.1 G1n Lys Thr Leu Cys Aop 245 250 255
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lt;210gt; 450
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lt;213gt; Horno sapiens
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20
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tcactcttgt gtgcatctct cttatccaaa gaaccggaat 60 61
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tcactcttgt otgcatctct cttatccaaa gaaccggaat 6. 67
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60 95
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60 103
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lt;400gt; 462 aglcccatcg algagcaacc tcactcttgl glgcatcalg ccgcclcagc actttgc
57
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lt;400gt; 463 gagcgcaagc ttccgccatc atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg gccagcccca agatggt9ca ag9
60 103
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lt;400gt; 464 aglcccalcg algagcaacc tcaclcttgl glgcalcalg ccgcclcagc acttlgc
57
lt;210gt; 465 lt;211gt; 104 lt;212gt; ONA lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 465 tcccccgggg ccgccaccat gaaggtctcc gtggctgccc tctcctgcct catgcttgtt actgcccttg gatcccaggc ccacggtgaa ggtactttca cttc
60 104
lt;210gt; 466 lt;211gt; 49 lt;212gt; DNA lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 466 cgattgalca ttallalaag cctaaggcag cttgacllgc agcaacaag
49
lt;210gt; 467
lt;211gt; 38
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 467 aggagcglcg acaaaagaag ccccaagalg glgcaagg 38
lt;210gt; 468
lt;211gt; 26
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 468 ttalaagccl aaggcagcll gacllg 26
lt;210gt; 469
lt;211gt; 115
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 469
gagcgcggat ccaagcttcc gccatcatgc gccccacctg ggcctggtgg ctgttcctgg tgctgctgct ggccctgtgg gcccccgccc gcggcagccc caagatggtg caagg
lt;210gt; 470
lt;211gt; 57
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 470 aglcccalcg algagcaacc lcactcllgt gtgcalcalg ccgcclcagc aclltgc 57
lt;210gt; 471 lt;211gt;29
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 471 gagcgcggat ccaagcttcc gccatcatg 29
lt;210gt; 472
lt;211gt; 26
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 472 cttlaaatcg algagcaacc tcaclc 26
lt;210gt; 473
lt;211gt; 109
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 473
gagcgcggat ccaaqcttcc gccatcatgt 99t9gcgcct gtggtggctg ctgCtgctgc tgctgctgct gtggcccatg gtgtgggcca gccccaagat ggtgcaagg
lt;210gt; 474
lt;211gt; 38
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 474 glcglcggla ccttalaagc ctaaggcagc ttgacllg 38
lt;210gt; 475
lt;211gt; 80
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
60 115
60 109
lt;400gt; 475
gagcgcggat ccaagcttcc gccatcatgt ggtggegcct 9t99t99ct9 ctgctgctgc tgctgctgct gtggcccatg
lt;210gt; 476
lt;211gt; 57
lt;212gt;DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 476 aglcccalcg algagcaacc lcaclctlgl glgcalcalg ccgcclcagc acltlgc 57
lt;210gt; 477 lt;211gt;80
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 477 gagegcggat ccaagcttcc gccatcatgt ggtggcgcct gtggtggctg ctgctgctgc tgctgctgct gtggcccatg
lt;210gt; 478
lt;211gt; 57
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 478 aglcccalcg atgagcaacc tcactcttgl glgcalcalg ccgcctcagc actllgc 57
lt;210gt; 479
lt;211gt; 80
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 479
aagctgcctt aggcttaagc cccaagatgg tgcaagggtc tggctgcttt 99ga9gaaga tggaccggat cagctcctcc
lt;210gt; 480
lt;211gt; 64
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 480 gcacc99gc9 cgccttaatg ccgcctcagc aetttgcagc ecaggccact ggagga9ctg atce
lt;210gt; 481
lt;211gt; 37
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 481 aggagcglcg acaaaagaag ccccaagatg 919caag 37
lt;210gt; 482 lt;211gt;56
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 482 cgcgcatcga tgagcaacct cactcttgtg tgcatcatgc cgcctcagca ctttgc 56
lt;210gt; 483
lt;211gt; 670
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 483
60 80
60 80
60 80
60 64
Mec Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Lequot;;l Lcu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Pro Met Val Trp 'la Ser Pro Lys Mec Vel GlrL aly Se.r Gly ey, Phe 20 25 'O
Oly Arg Lyo MeL Asp Arg He Ser Ser Ser Sel: Gly Leu Gly Cys LY5 15 40 45
V.l Leu MO Arg His Ser Pro Lys I':et. Val Gil':! Gly Ser ely cys Phe 50 55 60
Gly gt;lt;0 Lys Het Asp 'ro He Ser Ser Ser Sel: Gly Leu ely Cys Lys 65 10 7' 80
-
'
Val Leu Arg Ara His Asp Ala His Lys Ser Glu Val 1'1.10. His Aro Phe 85 90 95
LyS ASp Leu ely Glu Cl u Asn Phe Lys Ala Leu Val Lcu Ile Ala Phe 100 lOS 110
Ala Gln Tyr Leu eln eln Cys Pro Phe Glu AS,. His Val Lys Leu val 115 120 125
Asn Glu Val Thr Glu Phe Lys Thr Cys v.al. Ala ASp Glu Ser Ala
quot;a
no 115 140
Glu Asn Cys A.sp Lys Ser LeU His Thr Leu Phe~ Gly ASp Lys Leu eys 145 150 155, 160
Thr Val Ala Thr Leu Alt;o Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys eys 165 170 175
Ala Lys eln Glu Pro Glu Arg Asn Glu ey. Phl!! Leu eln His Lys quot;0 lBO 185 190
Asp Aso Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val ....rg pro Glu val Asp Val Met 195 200 205
Cy, Thr gt;l. Phe liia ASp quot;0 Glu Glu Thr Phe Leu Ly' Lys Tyr Leu 210 215 220
Tyr Glu Ile Ala Arg ArO His Pro Tyr Phe Ty.r Al. pro Glu Leu Leu 225 230 23'5
quot;O
Phe Phe Ala Ly$ Arg Tyr LyS Ala Ala Phe Th:r Glu Cys Cys Gln 245 250 255
Ala Asp Lys Ala Ala CySJ. Leu Leu Pro Lys Le'u A¡¡;P elu Leu Arg Asp 260 265 270
Clu Cly Lys Ala Ser Ser Ala Lya eln ....rg Leu Lys Cys Ala Ser Leu 275 280 285
Gln Lya Ph. Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Al. v.l Ala Arg Leu 29O 295 300
Ser Gln Arg phe pro Ly, Al. Glu phe Ala Glquot; Val Ser Lys Leu Val 305 310 315 320
Thr ASP Leu Thr Ly. v.l His Thr Glu Cya Cy.'9 Hia Gly Asp Leu Leu 325 33O 335
Glu Cys Ala ASp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Ly:S Tyr Ile Cys Glu Asn 340 345 350
Gln Asp Ser rle Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cyquot; Cys Glu LyO!! t'ro Leu 355 360 365
Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn ASp Glu Met pro 370 375 l80
Ala ASp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys ASp val l85 390 395 400
Cys Lya Asn Tyr Ala Glu Ala Lys ASp val ph,~ Leu Cly Met phe Leu 405 410 415
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His pro 1\sp Tyr Se:r Val Val Leu Leu Leu 420 425 430
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glll Lys Cys Cys Ala Ala 435 440 445
Ala ASP Pro His el... Cys Tyr Ala Lys val phl~ ASp elu phe Lys pro 450 455 460
Lau Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Ohe 465 470 4 7~; 4.0
Glu eln Leu Gly el... Tyr Lys Phe Gln Asn Alu Leu Leu Val Tyr
'ro
485 490 495
Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro ThJ~ Leu Val Glu Val Ser 500 505 510
Arg Aan Leu Gly Lys val Cly Ser Lys Cys Cys Lys Hls Pro Glu Ala 515 520 525
Lys Arg Me' ,quot;o Cy. Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val V.l Leu Asn G1n 530 535 540
Leu Cys Val Leu His Glu Ly. Thr Pro Val Ser Asp Ar. Val Thr Ly. 545 55' 555 56'
Cy. Cy' Thr elu Ser Leu val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Al. Leu 565 570 575
Glu val Asp-Glu Thr Tyr Val Pro Ly. Glu Phe Asn Ala Glu Thr Ph. 580 585
5quot;
Thr Phe His Ala Aop Ilo CYG Thr Leu Ser Glu Ly. Olu Arg Gln Ile
595 '00 605
Ly. Ly. Oln Thr Ala Leu Val Olu Leu Val Lys His Ly' Pro Lys Ala 010 015 620
Thr Ly, elu Cln Leu Lyo Al. val Het Asp Asp Phe Ala Ala Ph. Val 625 'JO 635 640
Glu Lys Cys Cys Lys Ala ASp ASP Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu 6 45 650 655
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Al a Leu Gly Lev 660 665 670
lt;210gt; 484
lt;211gt; 96
lt;212gt; ONA 5 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 484
agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatcagctcc 60 tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcat 96
lt;210gt; 485
lt;211gt; 32 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 485
Ser Pro Lys Met val eln Gly Ser cly CyS Phe Gly Arg LYS Met Asp 1 5 10 15
Arg 1le Ser Ser Ser Ser cly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg Ifis 20 25 30
lt;210gt; 486 15 lt;211gt;95
lt;212gt; DNA
lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 486 agccccaaga tggtgcaa9g gtctggctgc tttqggagqa agatqgaccg 9atcagctcc 60
20 tccagtggct gggctgcaaa gtgctgag9c ggcat 95
lt;210gt; 487 lt;211gt;40
lt;212gt; DNA 25 lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 487 ccttgcacca Icttggggcl algccgcclc agcactttgc 40
lt;210gt; 488
lt;211gt; 40
lt;212gt; ONA lt;213gt; Horno sapiens
lt;400gt; 488 gcaaagtgct gaggcggcat agccccaaga tggtgcaagg 40
5
lt;210gt;489 lt;211gt; 57 lt;212gt; DNA lt;213gt; Horno sapiens
10
lt;400gt; 489 agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcatg ccgcctcagc actttgc 57

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteína de fusión de albúmina que comprende dos o más polipéptidos de Péptido 1 de Tipo Glucagón (GLP1) orientados en tándem, en donde dicha proteína de fusión de albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
    (a)
    la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387;
    (b)
    una variante de (a) que es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387, en donde dicha variante tiene actividad GLP-1; o
    (c)
    un fragmento de (a) o (b) en donde dicho fragmento tiene actividad GLP-1 , fusionada a'
    (i)
    una albúmina que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1; o
    (ii)
    una variante de albúmina cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 90% a la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 1,
    en donde la proteína de fusiórJ de albúmina comprende la secuencia líder HSA/kex2 modificada del SEO ID NO: 112.
  2. 2.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, producida a partir de una célula anfitriona que comprende un constructo que expresa dicha proteína de fusión de albúmina, en donde dicho constructo es el lO de Constructo 3610.
  3. 3.
    La proteína de fusión de albúmina de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO: 387.
  4. 4.
    La protelna de fusión de albúmina de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos del SEO ID NO:319
  5. 5.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos al menos dos polipéptidos GLP-1 orientados en tándem están fusionados en el extremo N o en el extremo C a dicha albúmina, fragmento de albúmina, o variante de albúmina de los mismos
  6. 6.
    La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha albúmina es albúmina humana
  7. 7.
    La proteina de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el SEO ID NO:
    8 La proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichos dos o más polipéptidos GLP-1 orientados en tándem están fusionados genéticamente a dicha albúmina, fragmento de albúmina, o variante de albúmina de los mismos.
  8. 9.
    Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  9. 10.
    Un vector que comprende un promotor asociado operablemente con el polinucleótido de la reivindicación 9. 11 Un vector de la reivindicación 10, en donde el promotor se selecciona entre
    (a)
    un promotor Met2S;
    (b)
    un promotor cbh1 ; y
    (c)
    un promotor cysO de Aspergillus nidulans. 12 Una célula anfitriona aislada que comprende un vector de la reivindicaci6n 10 u 11 13 La célula anfitriona aislada de la reivindicación 12, que es una célula de levadura o una célula de mamífero
  10. 14.
    La célula anfitriona aislada de la reivindicación 13, en donde dicha célula anfitriona es una célula de levadura seleccionada entre S. cerevisiae, K. lacfis o P. Pasforis.
  11. 15.
    La célula anfitriona aislada de la reivindicación 13 o 14, en donde dicha levadura presenta deficiencia en gl icosilación
  12. 16.
    La célula anfitriona aislada de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde dicha levadura presenta deficiencia en glicosilación y proteasa
  13. 17. La célula anfitriona aislada de la reivindicación 13, en donde dicha célula de mamífero es una célula CHO, una célula COS, o una célu la NSO
  14. 18. Una composición que comprende la proteina de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador farmareuticamente aceptable.
    S
    19. Un método para producir una proteína de fusión de albúmina que comprende·
    (a) transformar una célula anfitriona que comprende al menos un vector de la reivind icación 10 u 11 ,
    (b) cultivar la célula anfitriona en cond iciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de albúm ina; y
    (e) aislar la proteína de fusión de albúmina
    10
    20. El método de la reivind icación 19, en donde la procesamiento adiciona l para eliminar la secuencia líder proteína de fusión de albúmina aislada experimenta un
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