JP2012140448A - アルブミン融合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】治療用アルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合蛋白質、組成物、医薬組成物、処方およびキットに関する。該アルブミン融合蛋白質をコードする核酸分子、これらの核酸を含むベクター、これらの核酸ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、および該アルブミン融合蛋白質の調製方法、ならびにこれらの核酸、ベクターおよび/または宿主細胞の使用方法も包含される。さらに、アルブミン融合蛋白質を含有する医薬組成物および該アルブミン融合蛋白質を用いた疾患、障害または状態の処置、予防または改善方法も包含する。
【選択図】なし
Description
本発明は一般的に、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合させた治療用蛋白質(少なくとも1つのポリペプチド、抗体、ペプチドまたはその断片および変異体を含むが、これらに限定されない)に関する。本発明は、治療用アルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合蛋白質、組成物、医薬組成物、処方およびキットを包含する。治療用アルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換させた宿主細胞も本発明に含まれ、同様に、これらのポリヌクレオチドおよび/または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合蛋白質を調製する方法も本発明に含まれる。
本発明は、アルブミンまたはアルブミンの断片(部分)もしくは変異体に融合させた治療用蛋白質(例えば、ポリペプチド、抗体またはペプチド、またはその断片もしくは変異体)を含むアルブミン融合蛋白質を包含する。本発明は、アルブミンまたはアルブミンの断片(部分)もしくは変異体に融合させた治療用蛋白質(例えば、ポリペプチド、抗体、またはペプチド、またはその断片もしくは変異体)をコードする核酸分子を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドも包含する。本発明は、非融合状態の治療用蛋白質の血漿安定性と比べて、治療用蛋白質の貯蔵寿命を延長し、治療用蛋白質の血漿安定性を増大させ、および/またはインビトロおよび/またはインビボにおいて治療用蛋白質および/または溶液中(または医薬組成物中)でのその活性を安定化するのに十分なアルブミンまたはアルブミンの断片(部分)もしくは変異体に融合させた治療用蛋白質(例えば、ポリペプチド、抗体、またはペプチド、またはその断片もしくは変異体)を含む蛋白質をコードする核酸分子を含む或いはそれからなるポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合蛋白質も本発明に含まれ、同様に、本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換させた宿主細胞ならびに本発明のアルブミン融合蛋白質の調製方法および本発明のこれらのポリヌクレオチドおよび/または宿主細胞の使用方法も本発明に含まれる。
(定義)
本明細書を通して用いる特定の用語の理解を容易にするために、以下に定義する。
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは遺伝学的融合により互いに連結されている、治療用蛋白質の少なくとも1つの断片もしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む或いはそれからなる蛋白質をコードする。
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(配列番号:99)、ここで、X1はRまたはKであり、およびX2はAまたはVである(例えばコンストラクト番号;2875を参照のこと):
を含み得る。さらなる一の実施態様において、A/Dハイブリッドは、一般的なPvuIII制限部位に融合され、ここで、A/DハイブリッドのN−末端部分はインターフェロンアルファAのアミノ酸1〜91に対応し、およびC−末端部分はインターフェロンアルファDのアミノ酸93〜166に対応する。例えば、このA/Dハイブリッドはアミノ酸配列:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNX2DSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(配列番号:100)、ここで、X1はRまたはKであり、および第2のX2はAまたはVである(例えば、コンストラクト番号;2872を参照のこと):
を含み得る。これらのハイブリッドは米国特許第4,414,510号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRXISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDMEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE(配列番号:101)、ここで、X1はRまたはKのいずれかである(例えば、コンストラクト番号;2874を参照のこと):
を含み得る。これらのハイブリッドは米国特許第4,414,510号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。さらなる一の実施態様において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合蛋白質のアルファ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファBに融合されたインターフェロンアルファAからなる或いはそれを含む。さらなる一の実施態様において、A/Bハイブリッドは一般的なPvuIII制限部位にて融合され、ここで、A/BハイブリッドのN−末端部分はインターフェロンアルファAのアミノ酸1〜91に対応し、およびC−末端部分はインターフェロンアルファBのアミノ酸93〜166に対応する。例えば、このA/Bハイブリッドはアミノ酸配列:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX1ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEX2x3X4X5QEVGVIESPLMYEDSILAVRKYFQRITLYLTEKKYSSCAWEVVRAEIMRSFSLSINLQKRLKSKE(配列番号:102)、ここで、X1はRまたはKであり、およびX2〜X5はSCVMまたはVLCDである(例えば、コンストラクト番号;2873を参照のこと):
を含み得る。これらのハイブリッドは米国特許第4,414,510号にさらに記載されており該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNXDSILAVKKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(配列番号:103)、ここで、X1はAまたはVである:
を含み得る。これらのハイブリッドは米国特許第4,758,428号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
MCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(配列番号:104):
を含み得る。これらのハイブリッドは米国特許第4,758,428号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
表1
表2
断片
本発明は、表1に記載の治療用蛋白質、アルブミン蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質の断片をさらに対象とする。
「変異体」は、参照の核酸またはポリペプチドとは異なるがその必須な特性を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を言う。一般的に、変異体は全体としてその参照の核酸またはポリペプチドに対して非常に類似しており、および多くの領域において同一である。
「機能活性を有するポリペプチド」は、治療用蛋白質の全長、プロ蛋白質、および/または成熟形態に関連する1またはそれ以上の知られている機能活性を示し得るポリペプチドを言う。かかる機能活性は、生物活性、抗原性[抗−ポリペプチド抗体に結合する(または結合のためにポリペプチドと競合する)能力]、免疫原性(特定の本発明のポリペプチドに結合する抗体を生じる能力)、本発明のポリペプチドを用いて多量体を形成する能力、およびポリペプチドための受容体またはリガンド結合能力を含むが、これらに限定されない。
上記のように、本発明のアルブミン融合蛋白質は、好ましくは遺伝学的融合により互いに結合されている治療用蛋白質の少なくとも1つの断片もしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む。
本発明は、表1に記載の治療用蛋白質に特異的に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質も包含する。特に、用語「治療用蛋白質」が治療用蛋白質(例えば、表1の欄Iに記載されるような)およびその断片および変異体に結合する抗体を含むことが熟慮される。故に、本発明のアルブミン融合蛋白質は、治療用蛋白質の少なくとも1つの断片もしくは変異体および/または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含んでもよい。
基本的な抗体構造単位は4量体を含むことが知られている。各4量体は、2つの同一のポリペプチド鎖のペアからなり、各ペアは1つの「軽鎖」(約25kDa)および1つの「重鎖」(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ−末端部分は、主に抗原認識に関与する約100〜110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ−末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして規定する。一般的に、Fundamental Immunology Chapters 3−5(Paul,W.,ed.,4th ed.Raven Press,N.Y.(1998))(出典明示により全ての目的のためにその全てが本明細書の一部となる)を参照のこと。各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。
本発明は、治療用蛋白質(例えば、表1に開示したもの)またはその断片もしくは変異体に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質を包含する。
治療用蛋白質に結合し、および本発明のアルブミン融合蛋白質の治療用蛋白質部分に対応し得る抗体を、当該技術分野において知られている任意の適当な方法により産生させてもよい。対象の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該技術分野においてよく知られている様々な方法により産生できる。例えば、治療用蛋白質は、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物に投与され、抗原特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導してもよい。様々なアジュバントを用いて宿主種に応じた免疫応答を誘導してもよく、該アジュバントは、フロイント(完全および不完全)、水酸化物アルミニウムのごときミネラルゲル、リゾレシチンのごとき界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、BCG(bacille Calmette−Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(cornebacterium parvum)を含むが、これらに限定されない。かかるアジュバントはまた当該技術分野においてよく知られている。
本発明はさらに、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびその断片を提供する。本発明は、例えば上記したようなストリンジェントまたは別法ではより低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは、治療用蛋白質に特異的に結合する抗体、およびより好ましくは、表2の「配列番号:Z」の欄に開示されるような「治療用蛋白質:X」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドへハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
抗体またはその断片、誘導体またはアナログ(例えば、抗体の重鎖または軽鎖または一本鎖抗体)の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖をコードする本発明のポリヌクレオチドまたはその部分(好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含む)が得られると、抗体分子を産生するためのベクターは、当該技術分野においてよく知られている技法を用いる組換えDNA技法により作製されてもよい。故に、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることにより蛋白質を調製する方法が本明細書中に記載されている。当業者によく知られている方法を用いて、抗体をコードしている配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築ができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えDNA技法、合成技法およびインビボ遺伝子組換えを含む。故に、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、プロモーターに作動的に連結されたヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。かかるベクターは、抗体分子の定常領域(例えば、PCT公開 WO 86/05807;PCT公開 WO 89/01036;および米国特許第5,122,464号を参照のこと)をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、および抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖を完全に発現させるためにかかるベクター中へクローニングされてもよい。
治療用蛋白質に結合する抗体または断片もしくは変異体は、精製を促進するために、ペプチドのごときマーカー配列に融合され得る。好ましい実施態様において、該マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、pQEベクター(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中に提供されるタグであり、とりわけ、その多くは市販されている。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821−824(1989)において記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合蛋白質の都合のよい精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、肝炎赤血球凝集素蛋白質(Wilsonら.、細胞37:767(1984))に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素タグ(「HAタグ」とも言われる)および「flag」タグを含むが、これらに限定されない。
治療用蛋白質に結合し、および本発明のアルブミン融合蛋白質の治療用蛋白質部分に対応し得る抗体は、表1の「治療用蛋白質X」の欄に開示される治療用蛋白質に結合する抗体またはその断片もしくは変異体抗体を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体または治療用蛋白質(またはその断片もしくは変異体)に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質は、細胞株および生体試料のイムノフェノタイピングのために利用されてもよい。本発明の治療用蛋白質は、細胞特異的マーカー、またはより具体的には、特定の細胞型の分化および/または成熟の様々な段階において様々に発現される細胞マーカーとして有用であってもよい。特定のエピトープまたはエピトープの組み合わせに対して作製されたモノクローナル抗体(または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質)により、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングが可能になり得る。モノクローナル抗体(または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質)を用いる様々な技法を利用して、一または複数のマーカーを発現する細胞集団をスクリーニングする。該技法は、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリックス(すなわち、プレート)に結合された抗体を用いる「パニング」およびフローサイトメトリー(例えば、米国特許第5,985,660号;およびMorrisonら.,Cell,96:737−49(1999)を参照のこと)を含む。
本発明の抗体または治療用蛋白質(またはその断片もしくは変異体)に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質は、様々に特徴付けられる。特に、治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質は、本明細書に記載されている技法を用いて、または当該技術分野において知られている技法を慣例的に変更して用いて、アルブミン融合蛋白質の治療用蛋白質部分に結合する抗体に対応する治療用蛋白質に結合する抗体に特異的に結合された同じ抗原に特異的に結合する能力についてアッセイされてもよい。
本発明はさらに、1またはそれ以上の開示された疾患、障害または状態を処置するために、本発明の抗体または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質を動物、好ましくは哺乳類、および最も好ましくはヒト、患者に投与することを含む、抗体に基づく治療を対象とする。本発明の治療用化合物は、本発明の抗体(本明細書中記載されているような断片、そのアナログおよび誘導体を含む)、本発明の抗体をコードする核酸(本明細書中記載されているような断片、そのアナログおよび誘導体および抗−イディオタイプ抗体を含む)、治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質およびかかるアルブミン融合蛋白質をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質は、本明細書中記載されている任意の1またはそれ以上の疾患、障害または状態を含むがこれらに限定されない、治療用蛋白質の異常な発現および/または活性に関連する疾患、障害または状態を処置、阻害または予防するために用いられ得る。治療用蛋白質の異常な発現および/または活性に関連する疾患、障害または状態の処置および/または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連する兆候を改善することを含むが、これらに限定されない。本発明の抗体または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合蛋白質は、当該技術分野において知られているかまたは本明細書中記載されているような医薬上許容される組成物にて提供されてもよい。
特定の一の実施態様において、治療用蛋白質または治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質に結合する抗体をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子治療により、治療用蛋白質の異常な発現および/または活性に関連する疾患または障害を処置、阻害または予防する。遺伝子治療は、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することにより行われる治療を言う。本発明のこの実施態様において、核酸は、治療効果を介するそれらがコードした蛋白質を産生する。
好ましくは、本発明の化合物または医薬組成物は、ヒトにおいて使用する前に所望の治療または予防活性についてインビトロおよび次いでインビボにて試験される。例えば、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのインビトロアッセイは、細胞株または患者組織試料への化合物の効果を含む。細胞株および/または組織試料への化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを含むがこれらに限定されない当業者に知られている技法を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が必要であるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイは、患者組織試料を培地で成長させ、次いで、化合物に曝露するかまたは化合物を投与し、次いで、組織試料への該化合物の効果を観察する、インビトロ細胞培養アッセイを含む。
本発明は、有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象へ投与することによる処置、阻害および予防方法を提供する。好ましい一の実施態様において、化合物は実質的に精製されている(例えば、実質的にその効果を限定するまたは所望されない副作用を生じる物質ではない)。好ましくは、対象は、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含むがこれらに限定されない動物であり、および好ましくは哺乳類であり、および最も好ましくはヒトである。
治療用蛋白質(またはその断片もしくは変異体)(治療用蛋白質に結合する抗体の少なくとも1つの断片もしくは変異体を含むアルブミン融合蛋白質を含む)に結合する標識抗体およびその誘導体およびアナログを診断目的のために用いて、治療用蛋白質の異常な発現および/または活性に関連する疾患、障害および/または状態を検出、診断またはモニターすることができる。本発明は、治療用蛋白質の異常な発現の検出を提供し、これは、(a)目的のポリペプチドに特異的な1またはそれ以上の抗体を用いて、個体の細胞または体液における治療用蛋白質の発現をアッセイし、次いで、(b)標準的な遺伝子発現レベルとその遺伝子発現レベルを比較することを含んでなり、ここで、標準発現レベルと比較して、アッセイした治療用蛋白質の発現レベルにおける増大または減少が異常な発現の指標となる。
本発明は、上記方法において用いられ得るキットを提供する。一の実施態様において、キットは、1またはそれ以上の容器中に一の抗体、好ましくは精製された一の抗体を含む。一の特定の実施態様において、本発明のキットは、キット中に含まれる一の抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットはさらに、目的のポリペプチドと反応しない一の対照抗体を含む。別の特定の実施態様において、本発明のキットは、抗体と目的のポリペプチドの結合を検出するための手段を含む(例えば、抗体は、検出可能な基質、例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物にコンジュゲートされていてもよく、または一次抗体を認識する二次抗体が検出可能な基質にコンジュゲートされていてもよい)。
本発明は、一般的に、アルブミン融合蛋白質および疾患または障害の処置、予防、または改善方法に関する。本明細書中用いる「アルブミン融合蛋白質」は、アルブミン(またはその断片もしくは変異体)の少なくとも1つの分子と治療用蛋白質(またはその断片もしくは変異体)の少なくとも1つの分子の融合により形成された蛋白質を言う。本発明のアルブミン融合蛋白質は、治療用蛋白質の少なくとも1つの断片もしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも1つの断片もしくは変異体を含み、それらは好ましくは遺伝学的融合(すなわち、アルブミン融合蛋白質は核酸の翻訳により生じ、ここで、治療用蛋白質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドのフレーム内に連結される)により互いに関連付けられるかまたは互いを関連付ける。治療用蛋白質およびアルブミン蛋白質はアルブミン融合蛋白質の部分であるならば、それぞれ、アルブミン融合蛋白質の「部分」、「領域」または「一部」と言われてもよい。
HAまたはHAドメイン断片の1またはそれ以上のペプチドループ内でのアミノ酸のランダム突然変異。この方法により、1ループ内の1以上または全ての残基を突然変異させることができる;
1またはそれ以上のループへの、長さXn(ここで、Xはアミノ酸であり、およびnは残基の数である)の一または複数のランダム化ペプチドのHAまたはHAのドメイン断片(すなわち、内部融合)の置換または挿入;
(a)および/または(b)に加えて、N−,C−またはN−およびC−末端ペプチド/蛋白質融合。
本発明のアルブミン融合蛋白質は、酵母、細菌のごとき微生物またはヒトまたは動物細胞株からの分泌により、組換え分子として産生されてもよい。好ましくは、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
a)MPIF−1シグナル配列(例えば、GenBank寄託番号AAB51134のアミノ酸1−21)MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(配列番号:6)
b)スタニオカルシンシグナル配列(MLQNSAVLLLLVISASA、配列番号:7)
c)HSAシグナル配列のプレプロ領域(例えば、MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR、配列番号:8)
d)HSAシグナル配列のプレ領域(例えば、MKWVTFISLLFLFSSAYS、配列番号:9)または例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYS、(配列番号:10)のごときその変異体
e)インベルターゼシグナル配列(例えば、MLLQAFLFLLAGFAAKISA、配列番号:11)
f)酵母接合因子アルファシグナル配列(例えば、MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR、配列番号:12または
MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR、配列番号:12)
g)K.lactisキラー毒素リーダー配列
h)ハイブリッドシグナル配列(例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR、配列番号:13)
i)HSA/MFα−1ハイブリッドシグナル配列(HSA/kex2としても知られている)(例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR、配列番号:14)
j)K.lactisキラー/MFa−1融合リーダー配列(例えば、MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR、配列番号:15)
k)免疫グロブリンIgシグナル配列(例えば、MGWSCI1LFLVATATGVHS、配列番号:16)
1)フィブリンB前駆体シグナル配列(例えば、MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA、配列番号:17)
m)クラスター前駆体シグナル配列(例えば、MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG、配列番号:18)
n)インスリン様成長因子−結合蛋白質4シグナル配列(例えば、MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG、配列番号:19)
o)HSAシグナル配列のプレプロ−領域の変異体、例えば、
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(配列番号:20)、
MKWVTFISLLFLFAGVLG(配列番号:21)、
MKWVTFISLLFLFSGVLG(配列番号:22)、
MKWVTFISLLFLFGGVLG(配列番号:23)、
修飾されたHSAリーダーHSA#;64−MKWVTFISLLFLFAGVSG(配列番号:24);
修飾されたHSAリーダーHSA#;66−MKWVTFISLLFLFGGVSG(配列番号:25);
修飾されたHSA(A14)リーダー−MKWVTFISLLFLFAGVSG(配列番号26);
修飾されたHSA(S14)リーダー(修飾HSA#;65としても知られている)−MKWVTFISLLFLFSGVSG(配列番号:27)、
修飾されたHSA(G14)リーダー−MKWVTFISLLFLFGGVSG(配列番号:28)、またはMKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(配列番号:29)
p)コンセンサスシグナル配列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG、配列番号:30)
q)酸ホスファターゼ(PH05)リーダー(例えば、MFKSVVYSILAASLANA配列番号:31)
r)MFoz−1のプレ配列
s)Oグルカナーゼ(BGL2)のプレ配列
t)キラー毒素リーダー
u)キラー毒素のプレ配列
v)k.lactisキラー毒素プレプロ(29個のアミノ酸;プレの16個のアミノ酸およびプロの13個のアミノ酸)
MN1FYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(配列番号:32)
w)S.diastaticusグルコアミラーゼII分泌リーダー配列
x)S.carlsbergensisα−ガラクトシダーゼ(MEL1)分泌リーダー配列
y)カンジダグルコアルニラーゼリーダー配列
z)EP−A−387319(出典明示により本明細書の一部となる)において開示されるイブリッドリーダー
aa)(バキュロウイルス発現系と併せた)gp67シグナル配列(例えば、GenBank寄託番号AAA72759のアミノ酸1−19)または
bb)治療用蛋白質Xの天然のリーダー;
cc)JP 62−096086(911036516として特許されている、出典明示により本明細書の一部となる)において開示されるS.cerevisiaeインベルターゼ(SUC2)リーダー;または
dd)イヌリナーゼ−MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(配列番号:33).
ee)修飾TA57プロペプチドリーダー変異体#;1−MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(配列番号:34)
ff)修飾TA57プロペプチドリーダー変異体#;2−MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDWGUSMAEEGEPKR(配列番号:35)
gg)コンセンサスシグナルペプチド−MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(配列番号:111)
hh)修飾HSA/kex2シグナル配列−MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(配列番号:112)
ii)コンセンサスシグナルペプチド#;2−MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(配列番号:105):
の任意を含む。
本発明は、本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞ならびに合成および組換え技法によるアルブミン融合蛋白質の産生にも関する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製能を有していてもまたは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に、宿主細胞を補う場合にしか起こらない。
a)MPIP−1シグナル配列(例えば、GenBank寄託番号AAB51134のアミノ酸1−21)MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(配列番号:6)
b)スタニオカルシンシグナル配列(MLQNSAVLLLLVISASA、配列番号:7)
c)HSAシグナル配列のプレプロ領域(例えば、MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR、配列番号:8)
d)HSAシグナル配列のプレ領域(例えば、MKWVTFISLLFLFSSAYS、配列番号:9)または例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYS、(配列番号:10)のごときその変異体、
e)インベルターゼシグナル配列(例えば、MLLQAFLFLLAGFAAKISA、配列番号:11)
f)酵母接合因子アルファシグナル配列(例えば、
MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR、配列番号:12または
MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR、配列番号:12)
g)K.lactisキラー毒素リーダー配列
h)ハイブリッドシグナル配列(例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR、配列番号:13)
i)HSA/MFα−1ハイブリッドシグナル配列(HSA/kex2としても知られている)(例えば、MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR、配列番号:14)
j)K.lactisキラー/MFa−I融合リーダー配列(例えば、MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR、配列番号:15)
k)免疫グロブリンIgシグナル配列(例えば、MGWSCIILFLVATATGVHS、配列番号:16)
1)フィブリンB前駆体シグナル配列(例えば、MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA、配列番号:17)
m)クラスター前駆体シグナル配列(例えば、MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG、配列番号:18)
n)インスリン様成長因子−結合蛋白質4シグナル配列(例えば、MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG、配列番号:19)
o)HSAシグナル配列のプレプロ−領域の変異体、例えば、
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR(配列番号:20)、
MKWVTFISLLFLFAGVLG(配列番号:21)、
MKWVTFISLLFLFSGVLG(配列番号:22)、
MKWVTFISLLFLFGGVLG(配列番号:23)、
修飾されたHSAリーダーHSA#;64−MKWVTFISLLFLFAGVSG(配列番号:24);
修飾されたHSAリーダーHSA#;66−MKWVTFISLLFLFGGVSG(配列番号:25);
修飾されたHSA(A14)リーダー−MKWVTFISLLFLFAGVSG(配列番号:26);
修飾されたHSA(S14)リーダー(修飾されたHSA#;65としても知られている)−MKWVTFISLLFLFSGVSG(配列番号:27)、
修飾されたHSA(G14)リーダー−MKWVTFISLLFLFGGVSG(配列番号:28)、またはMKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS(配列番号:29)
p)コンセンサスシグナル配列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG、配列番号:30)
q)酸ホスファターゼ(PH05)リーダー(例えば;MFKSVVYSILAASLANA配列番号:31)
r)MFoz−1のプレ配列
s)Oグルカナーゼ(BGL2)のプレ配列
t)キラー毒素リーダー
u)キラー毒素のプレ配列
v)k.lactisキラー毒素プレプロ(29個のアミノ酸;プレの16個のアミノ酸およびプロの13個のアミノ酸)
MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR(配列番号:32)
w)S.diastaticusグルコアルニラーゼIl分泌リーダー配列
x)S.carlsbergensis α−ガラクトシダーゼ(MEL1)分泌リーダー配列
y)カンジダグルコアルニラーゼリーダー配列
z)EP−A−387319(出典明示により本明細書の値伊部となる)にて開示されるハイブリッドリーダー
aa)(バキュロウイルス発現系と併せた)gp67シグナル配列(例えば、GenBank寄託番号AAA72759のアミノ酸1−19)または
bb)治療用蛋白質Xの天然のリーダー;
cc)JP 62 096086(911036516として特許される、出典明示により本明細書の一部となる)に開示されるようなS.cerevisiaeインベルターゼ(SUC2)リーダー;または
dd)イヌリラーゼ−MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR(配列番号:33);
ee)修飾されたTA57プロペプチドリーダー変異体#1−MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(配列番号:34)
ff)修飾されたTA57プロペプチドリーダー変異体#2−MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR(配列番号:35)
gg)コンセンサスシグナルペプチド−MWWRLWWLLLLLLLLwpMvwA(配列番号:111)
jj)修飾されたHSA/kex2シグナル配列−MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR(配列番号:112)
kk)コンセンサスシグナルペプチド#;2−MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(配列番号:105):を含むが、これらに限定されない。
本明細書中にて同定された各ポリヌクレオチドは、様々な方法において試薬として用いられ得る。以下の記載は例示と見なされるべきであり、および知られている技法を利用している。
本明細書中同定された各ポリペプチドは、様々な方法で用いられ得る。以下の記載は例示と見なされるべきであり、および知られている技法を利用している。
本発明の化合物は、哺乳類、好ましくはヒトにおける様々な障害を診断、処置、予防および/または予後するために有用である。かかる障害は、表1の対応する列において各治療用蛋白質について記載されているもの、および本明細書の以下の「免疫活性」「血液関連疾患」「過増殖性疾患」「腎障害」「心血管疾患」「呼吸器疾患」「抗−血管新生活性」「細胞レベルにおける疾患」「創傷治癒および上皮細胞増殖」「神経活性および神経疾患」「内分泌性障害」「生殖器系疾患」「感染症」「再生」および/または「胃腸障害」のセクションに記載のものを含むが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合蛋白質を発現するトランスジェニック生物も本発明に含まれる。トランスジェニック生物は遺伝学的に改変された生物であり、その中に組換え、外因性またはクローン化された遺伝物質が移入されている。かかる遺伝物質は多くの場合トランスジーンと言われる。トランスジーンの核酸配列は、コードされた蛋白質の最適な発現および分泌のために必要とされてもよい、1またはそれ以上の転写制御配列およびイントロンのごとき他の核酸配列を含んでもよい。トランスジーンは、生物体または生物体が産生する産物、例えば、生物体の乳、血液、尿、卵、髪または種からのその回収を高めるように、コードされた蛋白質の発現を指令するように設計されてもよい。トランスジーンは、標的動物の種と同種または異種のゲノムに由来する核酸配列からなる。トランスジーンは、そうでなければ特定の核酸配列が正常に見出されないゲノムの遺伝子座またはトランスジーンの正常な遺伝子座のいずれかに組み込まれてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質またはその処方は、非経口(例えば、皮下または筋内)注入または静脈内注入を含む任意の慣用的な方法により投与されてもよい。処置は、特定期間にわたって、単一回投与または複数回投与から構成されてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするコンストラクトは、治療上有効量のアルブミン融合蛋白質を送達するために、遺伝子治療プロトコルの一部として用いられ得る。細胞へ核酸をインビボ導入するための好ましい一のアプローチは、核酸を含み、本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするウイルスベクターの使用である。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、大部分の標的細胞が核酸を受け取ることができるという利点を有する。さらに、例えば、ウイルスベクター中に含まれるcDNAによりウイルスベクター内にコードされた分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞において効果的に発現される。
障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療も、本発明により含まれる。遺伝子治療は、核酸(DNA、RNAおよびアンチセンスDNAまたはRNA)配列を動物に導入し、本発明のアルブミン融合蛋白質の発現を成し遂げることに関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および標的組織による融合蛋白質の発現のために必要な任意の他の遺伝子エレメントを必要とする。かかる遺伝子治療およびデリバリー技法は、当該技術分野において知られており、例えば、W090/11092を参照のこと。該文献は出典明示により本明細書の一部となる。
アルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、1またはそれ以上の生物活性を試験するためのアッセイにおいて用いられ得る。アルブミン融合蛋白質および/またはポリヌクレオチドが、特定のアッセイにおいて活性を示すならば、その融合蛋白質に対応する治療用蛋白質は、その生物活性に関連する疾患に関与している可能性がある。故に、融合蛋白質を用いて、関連疾患を処置することができよう。
本発明のアルブミン融合蛋白質および本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化または動員(走化性)を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害および/または状態の処置、予防、診断および/または予後において有用であってもよい。免疫細胞は、血球新生と呼ばれる過程を通して発達し、多能性幹細胞からミエロイド(血小板、赤血球細胞、好中球およびマクロファージ)およびリンパ(BおよびTリンパ球)細胞を生じる。これらの免疫性疾患、障害および/または状態の病因は、癌および幾つかの自己免疫疾患のように遺伝的、体質的、後天的(例えば、化学療法または毒素による)なものかまたは感染性のものであってもよい。さらに、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出器として用いられ得る。
を処置するために用いられてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、止血性(出血を停止する)または血栓溶解性(血栓を溶解する)活性を調節するために用いられてもよい。例えば、止血性または血栓溶解性活性を増大させることにより、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、血液凝固疾患、障害および/または状態(例えば、無フィブリノゲン血症、因子欠損、血友病)、血液血小板疾患、障害および/または状態(例えば、血小板減少症)、または外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置または予防するために用いられ得る。別法では、止血性または血栓溶解性活性を減少し得る本発明の融合蛋白質および/またはポリヌクレオチドは、血栓を防ぐまたは溶解するために用いられ得る。これらの分子は、心臓発作(梗塞)、脳卒中または瘢痕化の処置または予防において有用であろう。
特定の実施態様において、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、新生物を含む過増殖性疾患を処置または検出するために用いられ得る。本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、直接的または間接的相互作用により、該障害の増殖を阻害してもよい。別法では、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖させてもよい。
または最も具体的には異形成症からなる非腫瘍性細胞成長が起こっている腫瘍または癌への進行に先行することが知られている、または先行すると考えられている状態において必要とされる(かかる異常な成長状態の報文については、RobbinsおよびAnge11,1976,Basic Pathology,2dEd.,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,pp.68−79を参照のこと)。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、腎臓障害、腎炎、腎臓の血管障害、代謝および先天的腎臓障害、腎臓の排尿障害、自己免疫疾患、硬化症および壊死、電解質異常、および腎臓癌を含むがこれらに限定されない、本発明の組成物を用いて診断、予後、予防および/または処置され得る腎系の傷害を処置、予防、診断、および/または予後するために用いられてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、末梢動脈疾患、例えば、肢虚血を含むがこれらに限定されない心血管疾患を処置、予防、診断、および/または予後するために用いられてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、呼吸器系の疾患および/または障害を処置、予防、診断および/または予後するために用いられてもよい。
内因性刺激因子および血管新生阻害剤の間の自然に発生する平衡は、阻害的作用が優性で
ある。Rastinejadら.,Cell56:345−355(1989)。通常の生理学的状態、例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生および女性生殖過程下にて新血管形成が生じるという稀な場合において、血管新生は、ストリンジェントに調節され、ならびに空間的および時間的に区切られている。特徴的な固形腫瘍成長のごとき病理学的な血管新生状態の下では、これらの制御調節は機能しなくなる。調節されていない血管新生は病理学的となり、そして、多くの腫瘍性および非腫瘍性疾患の進行を維持する。多数の重大な疾患は、固形腫瘍成長および転移、関節炎、ある種の眼障害、および乾癬を含む異常な新血管形成により支配される。例えば、報文については、Mosesら.,Biotech.9:630−634(1991);Folkmanら.,N.Engl.J.Med.,333:1757−1763(1995);Auerbachら.,J.Microvasc.Res.29:401411(1985);Folkman,Advances in Cancer Research, eds.KleinおよびWeinhouse,Academic Press,New York,pp.175−203(1985);Patz,Am.J.Opthalmol.94:715−743(1982);およびFolkmanら.,Science221:719−725(1983)を参照のこと。多数の病理学的状態において、血管新生過程はその疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍成長が血管新生に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。FolkmanおよびKlagsbrun,Science 235:442−447(1987)。
本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防、診断および/または予後され得る、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患は、癌(例えば、大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、メラノーマ、網膜芽細胞腫、グリオブラストーマ、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、胸癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌を含むがこれらに限定されない、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を伴う癌腫およびホルモン依存性腫瘍);自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および関節リウマチ)およびウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス、ポックス・ウイルスおよびアデノウイルス)、炎症、移植片対宿主病、急性移植拒絶反応および慢性移植拒絶反応を含む。
本発明のさらなる一層の一の態様に従って、治療を目的として、例えば、創傷治癒のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激し、および毛嚢産生および皮膚創傷の治癒を刺激するための、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを利用するための方法が提供される。本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、外科創傷、切除創傷、真皮および表皮の損傷を含む深い創傷、眼組織創傷、歯組織創傷、口腔創傷、糖尿病潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱への暴露または化学物質により生じる火傷および他の異常な創傷治癒状態、例えば、尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏ならびにステロイド、放射線療法および抗腫瘍剤および代謝拮抗剤を用いた全身処置に関連する合併症を含む創傷治癒の刺激において臨床上有用であってもよい。本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚喪失後の皮膚再生を改善するために用いることができる。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、脳および/または神経系の疾患、障害、損傷または傷害を診断および/または処置するために用いられてもよい。本発明の組成物(例えば、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド)を用いて処置され得る神経系障害は、軸索の断絶、ニューロンの減少または変性、または脱髄のいずれかをもたらす神経系傷害および疾患または障害を含むが、これらに限定されない。本発明の方法に従って、患者(ヒトおよびヒトでない哺乳類患者を含む)において処置されてもよい神経系病変は、中枢(脊髄、脳を含む)または末梢神経系いずれかの以下の病変を含むが、これらに限定されない:(1)虚血性病変、ここで、神経系の一部における酸素不足は、脳梗塞または虚血或いは脊髄梗塞または虚血を含む、ニューロンの傷害または死をもたらす;(2)外傷性病変、物理的傷害により惹起されるか、または手術に関連する病変、例えば、神経系の一部を断絶する病変、或いは圧迫損傷を含む;(3)悪性病変、ここで、神経系の一部は、悪性腫瘍に関連する神経系または非神経系組織に由来する悪性腫瘍のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される;(4)感染性病変、ここで、神経系の一部は、感染の結果として、例えば、化膿巣によるか、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹、または単純ヘルペスウイルスによる感染か、またはライム病、結核症または梅毒に関連して、破壊または損傷される;(5)変性病変、ここで、神経系の一部は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症(ALS)に関連する変性を含むがこれらに限定されない、変性過程の結果として、破壊または損傷される;(6)栄養疾患または障害に関連する病変、ここで、神経系の一部は、ビタミンB12欠乏、葉酸欠乏、ウェルニッケ疾患、タバコ−アルコール性弱視、マルキャファーバービニャ−ミ疾患(脳梁の原発性変性)およびアルコール性小脳変性を含むがこれらに限定されない、栄養障害または代謝障害により、破壊または損傷される;(7)糖尿病(糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺)、全身性エリテマトーデス、癌腫、またはサルコイドーシスを含むがこれらに限定されない、全身疾患に関連する神経病変;(8)アルコール、鉛または特定の神経毒素を含む、毒性物質により惹起される病変;および(9)脱髄病変、ここで、神経系の一部は、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横断性ミエロパシーまたは様々な病因、進行性多発性白質脳症、および橋中央ミエリン溶解を含むがこれらに限定されない脱髄疾患により、破壊または損傷される。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、ホルモン異常に関連する障害および/または疾患および/または内分泌系の障害または疾患を処置、予防、診断、および/または予後するために用いられてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、生殖器系の疾患および/または障害を診断、処置、または予防するために用いられてもよい。本発明の組成物により処置され得る生殖器系障害は、生殖器系傷害、感染、腫瘍性障害、先天的欠陥、ならびに不妊症、妊娠、陣痛または分娩に伴う合併症、および分娩後障害をもたらす疾患または障害を含むが、これらに限定されない。
前立腺腫瘍性障害も包含する。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、感染物質を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を増大させる、特に、Bおよび/またはT細胞の増殖および分化を増大させることにより、感染症は処置されてもよい。免疫応答は、存在する免疫応答を高めるか、または新しい免疫応答を開始させるかのいずれかにより、増大されてもよい。別法では、本発明の融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を必ずしも導くことなく、感染物質を直接的に阻害してもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞を分化、増殖および誘引させ、組織の再生をもたらすことができる(Science 276:59−87(1997)を参照のこと)。組織の再生は、先天的欠損、外傷(創傷、火傷、切断、または潰瘍)、年齢、疾患(例えば、骨粗しょう症、骨関節炎、歯周病、肝臓障害)、美容形成術を含む手術、繊維症、再灌流傷害または全身サイトカイン損傷による組織損傷を修復、置換または保護するために用いることができる。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性疾患および/または状態、感染、癌(例えば、腸新生物(小腸のカルチノイド腫瘍、小腸の非ホジキンリンパ腫、小腸リンパ腫))および潰瘍、例えば、消化性潰瘍を含む胃腸疾患を処置、予防、診断、および/または予後するために用いられてもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を有してもよい。走化性分子は、炎症、感染または増殖過剰部位のごとき体内の特定部位へ、細胞(例えば、単球、線維芽、好中球、T−細胞、肥満細胞、好酸球上皮および/または内皮細胞)を誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退および/または治癒し得る。
本発明のアルブミン融合蛋白質は、融合蛋白質の治療用蛋白質部分に結合する分子か、または融合蛋白質の治療用蛋白質部分が結合する分子についてスクリーニングするために用いられてもよい。融合蛋白質と分子の結合は、融合蛋白質または分子の結合活性を活性化(アゴニスト)、増大、阻害(アンタゴニスト)または減少してもよい。かかる分子の例は、抗体、オリゴヌクレオチド、蛋白質(例えば、受容体)または小分子を含む。
別の実施態様において、本発明は、本発明のアルブミン融合蛋白質の成分についての受容体を発現している標的細胞へ組成物を送達する方法を提供する。
本発明のアルブミン融合蛋白質またはアルブミン融合蛋白質の治療用蛋白質部分に対応する蛋白質の活性を修飾する分子についてスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合蛋白質またはこれらの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの使用がさらに熟慮される。かかる方法は、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有すると考えられる一または複数の選択された化合物と融合蛋白質を接触させ、次いで、結合後の融合蛋白質の活性をアッセイすることを含み得る。
本発明は、本発明のアルブミン融合蛋白質に結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法ならびにそれにより同定される結合分子も包含する。これらの結合分子は、例えば、本発明のアルブミン融合蛋白質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。かかるアゴニストおよびアンタゴニストは、以下に詳細に記載する治療的な実施態様において、本発明に従って用いることができる。
本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈硬化症のごとき様々な疾患状態および他の心血管状態に起因する、虚血組織の再血管新生を刺激するための処置において用いられてもよい。本発明のアルブミン融合蛋白質および/または本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように、血管新生および肢再生を刺激するために用いられてもよい。
ベクターpScNHSA(ATCC受託番号PTA−3279)およびpScCHSA(ATCC受託番号PTA−3276)は、pPPC0005(ATCC受託番号PTA−3278)の派生物である。それらをクローニングベクターとして用いる。そこでは、治療用蛋白質、またはその断片または変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「HSA」をコードするポリヌクレオチドと隣接し、かつ翻訳フレーム内に挿入されている。pScCHSAを治療用蛋白質−HSA融合物を生成するために用い、一方pScNHSAをHSA−治療用蛋白質融合物を生成するために用い得る。
pPPC0005のキメラHSAシグナルペプチドをコードする核酸配列を変えて、XhoIおよびClaI制限酵素認識部位を含ませることで、治療用蛋白質のN−末端をコードするDNAの成熟アルブミン蛋白質をコードするDNAへのクローニングを促進するベクターを作製した。
5’-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3’(配列番号:36)、および
5’-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3’(配列番号:37)。次に、2ラウンド目のPCRを上流に隣接するプライマー5’-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3’(配列番号:38)、および下流に隣接するプライマー5’−CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3’(配列番号:39)を用いて行った。次に、生じたPCR産物を精製し、AflIIおよびXbaIで消化し、pPPC0006の同じ部位にライゲーションして、pScCHSAを作製した。生じたプラスミドは、シグナル配列内に設計したXhoIおよびClaI部位を有する。XhoI部位の存在により、シグナル配列の最後に1アミノ酸の変化(LDKRからLEKR)が作製される。5’SalI部位(これはXhoI部位と互換性がある)および3’ClaI部位を有するアルブミン融合蛋白質の治療用部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が、pScCHSAのXhoIおよびClaI部位にライゲーションされると、DからEへの変化は、最終的なアルブミン融合蛋白質の発現プラスミド中に存在しなくなる。SalIのXhoIへのライゲーションは、シグナルペプチド配列のオリジナルのアミノ酸配列を保存する。アルブミン融合蛋白質の治療用部分をコードするDNAを、Kex2部位(Kex2は、シグナルペプチドの終わりにある2塩基性アミノ酸配列KRに結合する)の後、ClaI部位の前で挿入する。
3個の8塩基対制限酵素認識部位をpScCHSAに付加することで、治療用蛋白質のC末端をコードするDNAの成熟アルブミン蛋白質をコードするDNAへのクローニングを促進するベクターを作製した。成熟HSA蛋白質をコードする核酸配列の終わりのBsu36IとHindIII部位の間に、AscI、FseI、およびPmeI制限酵素認識部位を付加した。これは、下線を付したAscI、FseI、およびPmeI制限酵素認識部位を含有する2つの相補的合成プライマー(配列番号:40および配列番号:41)の使用により、なし得た。
5’-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3’(配列番号:40)、および
5’-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’(配列番号:41)。これらのプライマーをアニーリングし、Bsu36IおよびHindIIIで消化し、pScCHSAの同じ部位にライゲーションして、pScNHSAを作製した。
ベクターpScNHSAおよびpScCHSAをクローニングベクターとして用い得る。そこでは、治療用蛋白質、またはその断片または変異体をコードするポリヌクレオチドが、成熟ヒト血清アルブミンである「HSA」をコードするポリヌクレオチドに隣接して挿入されている。pScCHSAを治療用蛋白質−HSA融合物の生成に用い、一方pScNHSAをHSA−治療用蛋白質融合物の生成に用いることができる。
融合コンストラクトの生成を(例えば、制限酵素認識部位の付加、シームレスな融合物のコード化、リンカー配列のコード化などにより)促進するプライマーを用いて、治療用蛋白質をコードするDNA(例えば、配列番号:Xにおいて示す配列、または当該技術分野で知られた配列)をPCR増幅する。例えば、当業者は、治療用蛋白質をコードするDNAの5’末端に、成熟型HSAの最後の4アミノ酸をコードする(かつ、Bsu36I部位を含有する)ポリヌクレオチドを付加した5’プライマー;および治療用蛋白質コード配列の3’末端に、終止コドンおよび適当なクローニングサイトを付加した3’プライマーを設計し得る。例えば、治療用蛋白質をコードするDNAの増幅に用いられるフォワードプライマーは、配列5’-aagctGCCTTAGGCTTA(N)15−3’(配列番号:42)(下線を付した配列はBsu36I部位であり、大文字のヌクレオチドは成熟HSA蛋白質の最後の4アミノ酸(ALGL)をコードし、そして(N)15は目的の治療用蛋白質をコードする最初の15ヌクレオチドと一致する)を有し得る。同様に、治療用蛋白質をコードするDNAの増幅に用いられるリバースプライマーは、配列
上述の方法と同様に、次のプライマー:治療用蛋白質をコードする5’末端に、SalI部位を含有し、HSAリーダー配列の最後の3アミノ酸DKRをコードするポリヌクレオチドを付加した5’プライマー;および治療用蛋白質をコードするDNAの3’末端に、ClaI部位を含有する成熟HSAの最初の数アミノ酸を付加した3’プライマーを用いて、治療用蛋白質をコードするDNAを増幅する。例えば、治療用蛋白質をコードするDNAの増幅に用いられるフォワードプライマーは、配列5’−aggagcgtcGACAAAAGA(N)15−3’(配列番号:46)(下線を付した配列は、SalI部位であり、大文字のヌクレオチドはHSAリーダー配列の最後の3アミノ酸(DKR)をコードし、そして(N)15は目的の治療用蛋白質をコードする最初の15ヌクレオチドと一致する)を有し得る。同様に、治療用蛋白質をコードするDNAの増幅に用いられるリバースプライマーは、配列
次に、LEU2選択マーカーを有するpSAC35のNotI部位に、pScNHSAまたはpScCHSAから生成したN−末端またはC−末端アルブミン融合蛋白質のいずれかをコードするDNAを含有するNotI断片をクローニングする。
酢酸リチウム形質転換法、エレクトロポレーション法、または当該技術分野で知られた他の方法および/またはSambrook,Fritsch,and Maniatis.1989.“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition”,volumes1−3、およびAusubel ら.2000.Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School“Current Protocols in Molecular Biology”,volumes1−4の一部に記載の他の方法により、酵母発現に合った発現ベクターを酵母に形質転換することができる。形質転換により、エス・セレビシア株DXY1、D88、またはBXP20に発現ベクターを導入し、個々の形質転換体を、例えば、YEPD(1%w/v 酵母エキス、2%w/v ペプトン、2%w/v デキストロース)10mL中、30℃にて3日間成長させ、成長の60時間後の静止期で、細胞を回収することができる。3000gで10分間遠心して、細胞を回収する。
好ましい実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質は、成熟型治療用蛋白質またはその部分(例えば、表1に挙げた成熟型治療用蛋白質、または表2において配列番号:Zとして示す成熟型治療用蛋白質)のN−またはC−末端のいずれかと融合した成熟型HSAを含む。本発明の1つの実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質はさらに、発現に用いられる宿主の分泌経路において新生融合ポリペプチドを指示するシグナル配列を含む。好ましい実施態様において、シグナル配列によりコードされるシグナルペプチドが取り除かれ、成熟アルブミン融合蛋白質が培地に直接分泌される。好ましくは、本発明のアルブミン融合蛋白質は、MAF、INV、Ig、フィブリンB、クラスタリン、インスリン様成長因子結合蛋白質4を含む(しかし、これらに限定されない)異種性シグナル配列(例えば、特定の治療用蛋白質の本来ないシグナル配列)、キメラHSA/MAFリーダー配列を含む(しかし、これに限定されない)変異体HSAリーダー配列、または当該技術分野で知られた他の異種性シグナル配列を含む。特に好ましくは、表2に挙げたシグナル配列、および/または明細書の上記セクション「融合蛋白質の発現」および/または「アルブミン融合蛋白質の組換え体および合成産生のさらなる方法」において挙げたシグナル配列である。好ましい実施態様において、本発明の融合蛋白質はさらに、N−末端メチオニン残基を含む。断片および/または変異体を含むこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
哺乳類細胞株における発現に合ったアルブミン融合コンストラクトの生成
哺乳類細胞培養系で用いる発現ベクターにおいて、アルブミン融合コンストラクトを生成することができる。当該技術分野で知られた標準的方法(例えば、PCR増幅、制限酵素消化、およびライゲーション)により、哺乳類の発現ベクター中のHSAのN−末端またはC−末端に、治療用蛋白質をコードするDNAをクローニングすることができる。発現ベクターを構築すると、哺乳類発現系への形質移入を行うことができる。適当なベクターが当該技術分野で知られており、例えば、pC4ベクター、および/またはLonza Biologics,Inc.(Portsmouth,NH)より入手可能なベクターを含むが、これらに限定されない。
pC4:HSA(ATCC受託番号PTA−3277)を用いて、治療用蛋白質部分が成熟アルブミン配列のC末端にクローニングしたアルブミン融合コンストラクトを生成できる。例えば、治療用蛋白質、またはその断片または変異体をコードするDNAを、ベクターのBsu36IとAscI制限酵素認識部位との間にクローニングすることができる。Bsu36IおよびAscIにクローニングする際、酵母ベクター系へのクローニングに用いるのと同じプライマーデザイン(配列番号:42および43)を利用できる(実施例2参照)。
pC4:HSA(ATCC受託番号PTA−3277)を用いて、治療用蛋白質部分が成熟アルブミン配列のN末端にクローニングしたアルブミン融合コンストラクトを生成できる。例えば、それ自体のシグナル配列を有する治療用蛋白質をコードするDNAを、pC4:HSAのBamHI(または、HindIII)とClaI部位との間にクローニングすることができる。BamHIまたはHindIII部位のいずれかにクローニングする場合、治療用蛋白質をコードするDNAの翻訳開始コドンの前にコザック配列(CCGCCACCATG、配列番号:49)を含むことが好ましい。治療用蛋白質がシグナル配列を有しないなら、治療用蛋白質をコードするDNAは、pC4:HSAのXhoIとClaI部位の間にクローニングされてもよい。XhoI部位を用いる場合、次の5’(配列番号:50)および3’(配列番号:51)の典型的なPCRプライマー:
5’-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3’(配列番号:50)
5’-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3’(配列番号:51)
を用いてもよい。
リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクタミン法、エレクトロポレーション法、または当該技術分野で知られた他の形質移入方法、および/またはSambrook,Fritsch,and Maniatis.1989.“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition”およびAusubelら.2000.Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School“Current Protocols in Molecular Biology”,volumes1−4に記載の他の形質移入方法により、哺乳類細胞株での発現に合った発現ベクターにおいて生成したアルブミン融合コンストラクトを適当な細胞株に形質移入できる。次に、発現ベクター中の選択マーカーにより決定するスクリーニング因子の存在により、形質移入した細胞を選択する。
本発明のアルブミン融合蛋白質を哺乳類細胞で発現させることができる。典型的な哺乳類発現ベクターはプロモーターエレメントを含有し、そしてそれが、mRNA、蛋白質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルの転写の開始を仲介する。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、およびRNAスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在性配列を含む。非常に効率的な転写を、SV40由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の末端反復配列(LTR)、例えば、RSV、HTLVI、HIVI、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを用いて達成する。しかしながら、細胞エレメントも用いることができる(例えば、ヒトのアクチンプロモーター)。
好ましい実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質は、成熟型治療蛋白質またはその部分(例えば、表1に挙げた成熟型治療蛋白質、または表2において配列番号:Zとして示す成熟型治療用蛋白質)のN−またはC−末端のいずれかと融合した成熟型HSAを含む。本発明の1つの実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質はさらに、発現に用いる宿主の分泌経路において新生融合ポリペプチドを指示するシグナル配列を含む。好ましい実施態様において、シグナル配列によりコードされるシグナルペプチドを取り除き、成熟アルブミン融合蛋白質を細胞培地に直接分泌させる。好ましくは、本発明のアルブミン融合蛋白質は、MAF、INV、Ig、フィブリンB、クラスタリン、インスリン様成長因子−結合蛋白質4を含む(しかし、これらに限定されない)異種性シグナル配列(例えば、特定の治療用蛋白質に本来存在しないシグナル配列)、キメラHSA/MAFを含む(しかし、これに限定されない)変異体HSAリーダー配列、または当該技術分野で知られた他の異種性シグナル配列を含む。特に好ましくは、表2に挙げたシグナル配列、および/または本明細書の上記セクション「融合蛋白質の発現」および/または「アルブミン融合蛋白質の組換え体および合成産生のさらなる方法」において挙げたシグナル配列である。好ましい実施態様において、本発明の融合蛋白質はさらに、N−末端メチオニン残基を含む。断片および/または変異体を含むこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
CHO細胞上清または一過性形質移入293T細胞上清からのアルブミン融合蛋白質の精製は、リン酸ナトリウムバッファーおよびリン酸塩濃度勾配溶出を用いたアニオン性HQ樹脂での捕獲、次に、塩勾配溶出を用いたブルーセファロースFFカラムでのアフィニティークロマトグラフィーを含む。ブルーセファロースFFは、主なBSA/フェチュイン混入物を除去する。リン酸塩勾配を用いたPoros PI 50樹脂でのさらなる精製により、エンドトキシン混入物を除去し、低下させ、並びにアルブミン融合蛋白質を濃縮する。
NS0細胞上清からのアルブミン融合蛋白質の精製は、Q−セファロースアニオン交換クロマトグラフィー、次に、溶出工程を含むSP−セファロース精製、溶出工程を含むPhenyl−650M精製、最後に、ダイアフィルトレーションを含み得る。
DNA配列の5’および3’末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、バクテリアシグナル配列を含む本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、インサート断片を合成する。インサートをコードするポリヌクレオチドの増幅に用いられるプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするためにプライマーの5’末端にBamHIおよびXbaIのような制限酵素認識部位を含有する。例えば、BamHIおよびXbaIは、バクテリア発現ベクターpQE−9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)の制限酵素認識部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性(Ampr)、バクテリアの複製起点(ori)、IPTG誘導性プロモーター/オペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ、および制限酵素クローニングサイトをコードする。
表3に示す通り、たいていの本発明のアルブミン融合コンストラクトはATCCに寄託されたものである。アルブミン融合コンストラクトは、次の発現ベクター:酵母発現ベクターpSAC35、哺乳類発現ベクターpC4、または哺乳類発現ベクターpEE12.1のいずれか1つを含み得る。
まず、当該技術分野で知られた方法により、表1の個々のコンストラクト番号の配列番号:Xに対応するポリヌクレオチドプローブを用いて寄託プラスミドDNA試料をスクリーニングすることにより、アルブミン融合コンストラクトを直接単離することができる。例えば、Applied BiosystemsのDNAの合成装置を用いて、報告された配列に従い、30〜40ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを合成してもよい。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、例えば、32P−γ−ATPでオリゴヌクレオチドを標識し、通常の方法により精製することができる(例えば、Maniatisら.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring, NY(1982))。当業者に既知の技術(例えば、ベクター供給源により提供されるもの、または上で引用した関連公報または特許)を用いて、上記の適当な宿主(例えば、XL−1(Stratagene))に所定のATCC寄託物由来のアルブミン融合コンストラクトを形質転換する。1.5%のアガロースプレート(適当な選択剤、例えば、アンピシリンを含有する)上に、1プレート当たり約150個の形質転換体(クローン)密度で形質転換体を播種する。バクテリアのコロニースクリーニングの通常の方法(例えば、Sambrookら.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edit.,(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,p.1.93〜1.104)、または当業者に既知の他の技術により、ナイロンメンブレンを用いてこれらのプレートをスクリーニングする。
別法では、例えば、寄託した所定のアルブミン融合蛋白質をコードするDNAの5’および3’アルブミン融合コンストラクトとハイブリダイズする17〜20ヌクレオチドからなる2つのプライマーを用いて、配列番号:Xを有する寄託したアルブミン融合コンストラクト試料から、所定のアルブミン融合蛋白質をコードするDNAを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、通常の条件、例えば、上記cDNAテンプレート0.5μgを含む反応混合物25μlにおいて行う。好ましい反応混合物は、1.5〜5mMのMgCl2、0.01%(w/v)のゼラチン、20μMの各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、25pmolの各プライマー、および0.25UのTaqポリメラーゼである。Perkin−Elmer Cetus自動化サーマルサイクラーを用いて、35サイクルのPCR(変性94℃、1分;アニーリング55℃、1分;伸長72℃、1分)を行う。アガロースゲル電気泳動により、増幅産物を分析し、予測分子量を有するDNAバンドを切り出し、精製する。DNA産物をサブクローニングし、配列決定することで、PCR産物が選択配列のものであることを証明する。
アルブミン融合蛋白質(例えば、アルブミン(またはその断片または変異体)と融合した治療用蛋白質(またはその断片または変異体)を含有する)をさらに他の蛋白質と融合させ、「複数融合した融合物」を生成する。これらの複数融合した蛋白質を様々な応用に用いることができる。例えば、本発明のアルブミン融合蛋白質のHis−タグ、HA−タグ、蛋白質A、IgGドメイン、およびマルトース結合タンパク質との融合物は、精製を促進する(例えば、EP A 394,827;Trauneckerら.,Nature 331:84−86(1988))。本発明のポリペプチドに融合した核局在性シグナルは、細胞内局在性に特異的な蛋白質を標的とすることができるが、共有結合ヘテロ2量体、ホモ2量体は、アルブミン融合蛋白質の活性を増大または低減することができる。さらに、本発明のアルブミン融合蛋白質とのさらなる蛋白質配列の融合物は、融合蛋白質の溶解性および/または安定性をさらに増大させることができる。当該技術分野で知られた技術を用いて、またはそれを一般的に変形して、および/または次のプロトコルを変形して上記融合蛋白質を作製する。ポリペプチドのIgG分子との融合物の要点を述べる。
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(配列番号:52)
ハイブリドーマ技術
本発明のアルブミン融合蛋白質、および本発明のアルブミン融合蛋白質の部分(例えば、治療用蛋白質部分、または融合蛋白質のアルブミン部分)を種々の方法により製造することができる(Current Protocols, Chapter 2.を参照)。かかる方法の1つの例として、本発明のアルブミン融合蛋白質または本発明のアルブミン融合蛋白質の部分の調製物を製造し、精製して、実質的に天然の混入物がない状態にする。次に、より高い特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために、かかる調製物を動物に導入する。
ヒトPBLから単離した天然に存在するV遺伝子を、本発明のアルブミン融合蛋白質、または本発明のアルブミン融合蛋白質の部分に対する反応性を含有する抗体断片ライブラリーに構築し、それに対してドナーを曝露するか、あるいはしない(例えば、米国特許第5,885,793(引用により全体として本明細書に取り込まれる)参照)。
scFvsライブラリーを国際公開番号WO92/01047において記載のヒトPBLのRNAから構築する。抗体断片をディスプレーするファージをレスキューするため、ファージミドを宿す大腸菌約109個を1%のグルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含有する2×TY(2×TY−AMP−GLU)50mlに播種し、振盪しながらO.D.0.8まで成長させる。この培養液5mlを用いて、2×TY−AMP−GLU 50mlに播種し、δ遺伝子3ヘルパー2×108TU(M13δ遺伝子III、国際公報番号WO92/01047参照)を添加し、培養物を37℃で45分間、振盪せずにインキュベーションし、次に37℃で45分間、振盪しながらインキュベーションする。培養物を4000rpmにて10分間遠心し、ペレットを100μg/mlのアンピシリンおよび50μg/mlのカナマイシン含有2×TY 2L中に再懸濁し、一晩成長させる。ファージを国際公報番号WO92/01047に記載の通り調製する。
脂肪、骨格筋、および肝臓はインスリン感受性組織である。インスリンは、グルコース取り込み/これらの組織への輸送を刺激することができる。脂肪および骨格筋の場合、インスリンは、実際に特定の細胞内区画から細胞表面へのグルコース輸送体4分子GLUT4の転位を導くシグナル伝達を開始させる。細胞表面上で、GLUT4はグルコース取り込み/輸送が可能になる。
多数の脂肪および筋肉関連細胞株を用いて、糖尿病の処置のために挙げた治療剤の任意の1種以上の組合せの不存または存在下でグルコース取り込み/輸送活性を試験することができる。具体的には、[3H]−2−デオキシグルコース取り込みアッセイの適当なインビトロモデルとなるように、3T3−L1マウス線維芽細胞およびL6マウス骨格筋細胞をそれぞれ3T3−L1脂肪細胞および筋管に分化させる(Ursoら.,J Biol Chem,274(43):30864−73(1999);Wangら.,J Mol Endocrinol,19(3):241−8(1997);Haspelら.,J Membr Biol,169(1):45−53(1999);Tsakiridisら.,Endocrinology,136(10):4315−22(1995))。簡単にいうと、2×105細胞/100μL 脂肪細胞または分化したL6細胞を、分化後培地を入れた処理(すなわち、50μg/mL ポリ−L−リジンでコート)96ウェル組織培養「TC」に移し、37℃、5% CO2にて一晩インキュベーションする。まず、細胞を無血清低グルコースDMAM培地で1回洗浄し、次に、100μL/ウェル 同じ培地、および100μL/ウェル バッファーまたは糖尿病の処置のために挙げた治療剤の任意の1種以上の組合せ、例えば、1nM、10nM、および100nMの増加濃度の本発明の治療剤(例えば、配列番号:Yとして開示した特定の融合物、およびその断片および変異体)のいずれかと、1nM インスリンの不存または存在下、37℃で16時間飢餓状態におく。プレートを、100μL/ウェルのHEPES緩衝食塩水で3回洗浄する。インスリンをHEPES緩衝食塩水中1nMにて添加し、10μMの[3H]−2−デオキシグルコース(Amercham、番号TRK672)および10μMの非標識2−デオキシグルコース(SIGMA、D−3179)の存在下、37℃で30分間インキュベーションする。対照として、インスリン不存以外同じ条件のものを行う。最終濃度10μMのサイトカラシンB(SIGMA、C6762)を別々のウェルに10μL/ウェルにて添加し、非特異的な取り込みを測定する。細胞をHEPES緩衝食塩水で3回洗浄する。標識、すなわち、10μMの[3H]−2−デオキシグルコース、および非標識、すなわち、10μMの2−デオキシグルコースを添加し、室温にて10分間インキュベーションする。細胞を冷リン酸緩衝食塩水「PBS」で3回洗浄する。0.2のNaOHを150μL/ウェルにて添加して、細胞を溶解し、次に、室温で20分間振盪しながらインキュベーションする。次に、試料をシンチレーションバイアルに移し、それにシンチレーション溶液5mLを添加する。バイアルをβ−シンチレーションカウンターにてカウントする。インスリンの不存または存在が異なるデュプリケートの条件下での取り込みを、次の方程式:[(1分間当たりのインスリンカウント「cpm」−非特異的cpm)/(インスリンなしのcpm−非特異的cpm)]を用いて決定する。応答平均は、脂肪細胞および筋管それぞれについて、対照の約5倍から3倍の範囲内となる。
細胞を、T−75cm2フラスコ中完全なコンフルエントとする。培地を除去し、前分化培地25mLと置き換え、48時間インキュベーションする。細胞を37℃、5%のCO2、湿度85%にてインキュベーションする。48時間後、前分化培地を除去し、分化培地25mLと置き換え、48時間インキュベーションする。細胞を再び37℃、5%のCO2、湿度85%にてインキュベーションする。48時間後、培地を除去し、分化後培地30mLと置き換える。14〜20日間、あるいは分化を完全に達成するまで、分化後培地を維持する。培地を2〜3日毎に交換する。ヒト脂肪細胞はZen−Bio,INC(番号SA−1096)から購入できる。
最近、GLP−1が、膵島十二指腸ホメオボックス−1(IDX−1)およびインスリンmRNAレベルの増大と関連する時間および用量に依存した方法でラット膵管上皮細胞株ARIPの分化を誘導することが示された(Huiら.,2001,Diabetes,50(4):785−96)。IDX−1は順に、GLP−1受容体のmRNAレベルを増大させる。
RIN−M細胞:これらの細胞は、American Type Tissue Culture Collection(ATCC細胞株番号CRL−2057)より入手可能である。RIN−M細胞株は、放射線誘発性の移植可能なラット膵島細胞腫瘍からもたらされたものである。腫瘍のヌードマウス異種移植から細胞株を確立した。細胞は、膵島ポリペプチドホルモンを産生して分泌し、かつL−ドーパデカルボキシラーゼ(アミン前駆体取り込みおよび脱炭酸反応、またはAPUD、活性を有する細胞のマーカー)を産生する。
RIN−M細胞株を10%のウシ胎児血清(HyClone、番号SH30088.03)を含むRPMI 1640培地(HyClone、番号SH300027.01)にて成長させ、1:3から1:6の比で6から8日毎に継代培養する。培地を3〜4日毎に交換する。
96ウェルプレート中4000細胞/ウェルにて細胞を播種し、50%のコンフルエントまで48〜72時間培養する。100μL/ウェルの無血清培地に細胞を切り換える。48〜72時間インキュベーション後、血清および/または本発明の治療剤(例えば、本発明のアルブミン融合蛋白質、およびその断片および変異体)をウェルに添加する。インキュベーションをさらに36時間続ける。[3H]−チミジン(5〜20Ci/mmol)(Amersham Pharmacia、番号TRK120)を、1μCi/マイクロタイターに希釈する。36時間インキュベーション後、1ウェル当たり5マイクロタイターを添加し、さらに24時間インキュベーションする。細胞を冷リン酸緩衝食塩水「PBS」にて1回軽く洗浄することで、反応を終結させる。次に、10%の氷冷TCA 100マイクロタイターを用いて、4℃にて15分間細胞を固定する。PBSを除去し、0.2 NaOH 200マイクロタイターを添加する。プレートを室温にて1時間、振盪しながらインキュベーションする。溶液をシンチレーションバイアルに移し、水溶液に合ったシンチレーション液5mLを添加し、勢いよく混合する。バイアルをβシンチレーションカウンターにてカウントする。負対照として、バッファーのみを用いる。正対照として、ウシ胎児血清を用いる。
糖尿(すなわち、尿中の過剰な糖)は容易にアッセイでき、これは糖尿病の疾患状態の指標とおなる。正常患者試料と比較して、患者試料中の過剰な尿は、IDDMおよびNIDDMの徴候である。結果として、生じた尿中の過剰なグルコースの量の低減により、かかるIDDMおよびNIDDMを有する患者の処置の有効性を示す。IDDMおよびNIDDMのモニタリングの好ましい実施態様において、当該技術分野で知られた技術を用いて、患者由来の尿試料をグルコースの存在についてアッセイする。ヒトの糖尿は尿のグルコース濃度が100mlあたり100mgを超えるものと定義する。血液試料を採取し、血清グルコースをアッセイして、糖尿を示すそれらの患者の過剰な糖濃度をより正確に測定できる。
機能的な液性免疫応答の作製は、B細胞系統とそれらの微小環境の間の溶解性および同族シグナル伝達経路を必要とする。シグナルは、B細胞系統にそのプログラム化された発生を続けさせる陽性刺激、またはその現行の発生経路を阻止することを細胞に指示するネガティブな刺激を伝え得る。これまでに、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL10、IL−13、IL−14およびIL−15を含む多数の刺激および阻害シグナルが、B細胞応答に影響することが見出されてきた。興味深いことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、様々な同時刺激蛋白質と組み合わされてB細胞集団間での活性化、増殖、分化、ホーミング、寛容、および死を誘導することができる。
CD3誘発性増殖アッセイをPBMCにおいて行い、3H−チミジンの取り込みにより測定する。アッセイを次のように行う。96ウェルプレートを、100μl/ウェルのCD30に対するmAb(HIT3a、Pharmingen)またはアイソタイプ一致対照mAb(B33.1)を用いて4℃にて一晩コートし(0.5Mの重炭酸バッファー、pH9.5中1μg/ml)、次に、PBSで3回洗浄する。F/H勾配遠心法により、ヒト末梢血からPBMCを単離し、mAbコートプレートの4組のウェルに(5×104/ウェル)10%のFBSおよびP/S含有RPMI中、各濃度の本発明のアルブミン融合蛋白質(治療用蛋白質の断片または変異体および/またはアルブミンまたはアルブミンの断片または変異体を含有する融合蛋白質を含む)の存在下(合計容量200μl)で添加する。対照は、関連する蛋白質バッファーおよび培地のみのものである。37℃で48時間培養後、増殖に対する効果を観察したなら、プレートを1000rpmで2分間遠心し、上清100μlを取り出し、IL−2(または他のサイトカイン)を測定するため−20℃で保存する。ウェルに0.5μCiの3H−チミジン含有培地100μlを添加し、37℃で18〜24時間培養する。ウェルを回収し、3H−チミジンの取り込みを増殖の目安として用いる。増殖の正対照は、抗CD30のみのものである。増殖を増強させる対照として、IL−2(100U/ml)も用いる。本発明の融合蛋白質の効果の負対照として、T細胞の増殖を誘導しない対照抗体を用いる。
末梢血に見られる前駆体を増殖させて拡大し、樹状細胞を生成する:接着性PBMCまたは洗浄単球画分をGM−CSF(50ng/ml)およびIL−4(20ng/ml)と共に7〜10日間培養する。これらの樹状細胞は、未成熟細胞の特徴的表現型(CD1、CD80、CD86、CD40、およびMHCクラスII抗原の発現)を有する。TNF−αの様な活性化因子での処置により、表面表現型の急激な変化(MHCクラスIおよびII、同時刺激分子、および接着分子の発現の増大、FCγRIIのダウンレギュレーション、CD83のアップレギュレーション)を引き起こす。これらの変化は、樹状細胞の抗原提示能の増大および機能的成熟と関連する。
樹状細胞により生成されるサイトカイン、特に、IL−12は、T細胞依存性免疫応答の開始に重要である。IL−12は、Th1ヘルパーT細胞免疫応答の発生に強く影響し、細胞障害性T細胞およびNK細胞機能を誘導する。ELISAを用いて、次の通りIL−12の放出を測定する。樹状細胞(106/ml)を、増加濃度の本発明のアルブミン融合蛋白質で24時間処理する。正対照として、LPS(100ng/ml)を細胞培養物に添加する。次に、細胞培養物由来上清を回収し、市販のELISAキット(例えば、R&D Systems(Minneapolis,MN))を用いて、IL−12含有量について分析する。キットの標準的プロトコルを用いる。
細胞表面抗原の3つの主要なファミリー:接着分子、抗原提示に関与する分子、およびFc受容体を単球上で同定することができる。MHCクラスII抗原、およびB7およびICAM−1のような他の共刺激分子の発現の調節は、単球の抗原提示能およびT細胞活性化誘導能の変化を引き起こし得る。Fc受容体発現の増大は、単球の細胞障害活性、サイトカイン放出、および食作用の改善と関連し得る。
単球を活性化(別法では、不活性化)、および/または単球の生存率を増大させる(別法では、単球の生存率の低減)分子についてのアッセイは当該技術分野で知られており、通常には、本発明の分子が単球の阻害因子または活性化因子として機能するかどうかの決定に用いるために適用され得る。以下に記載の3種類のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質をスクリーニングすることができる。これらのアッセイのそれぞれについて、Histopaque勾配(Sigma)を通した遠心分離により、単一ドナーの白血球パック(American Red Cross,Baltimore,MD)から末梢血単核球(PBMC)を精製する。向流遠心分離洗浄により、PBMCから単球を単離する。
ヒト末梢血単球は血清または他の刺激物質の不存下で培養すると、生存率が徐々に低下する。それらの死は内部の調節過程(アポトーシス)から生じる。TNF−αのような活性化因子の培養物への添加は、細胞生存率を劇的に改善し、DNAの断片化を阻止する。ヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて、次の通りアポトーシスを測定する。単球をポリプロピレンチューブにて無血清培地(正対照)中、100ng/mlのTNF−α(負対照)、試験すべき各濃度の融合蛋白質の存在下で48時間培養する。細胞を最終濃度5μg/mlのPI含有PBS中、2×106/mlの密度で懸濁し、次に、室温にて5分間インキュベーションし、FACScan分析する。PIの取り込みは、この実験系におけるDNA断片化との関連を示す。
単球/マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカイン放出を介した、免疫系の他の細胞集団に対するそれらの調節活性である。サイトカイン放出を測定するELISAを次の通り行う。増加濃度の本発明のアルブミン融合蛋白質と共に同じ条件下だが融合蛋白質の不存下で、密度5×105細胞/mlにてヒト単球をインキュベーションする。IL−12を産生させるため、融合蛋白質の存在下でIFN(100U/ml)を用いて細胞を一晩刺激する。次に、LPS(10ng/ml)を添加する。24時間後、条件培地を回収し、使用するまで凍結したままにする。次に、市販のELISAキット(例えば、R&D Systems(Minneapolis,MN))を用いて、TNF−α、IL−10、MCP−1およびIL−8の測定を行う。キットの標準的プロトコルを適用する。
精製した単球を96ウェルプレートに2〜1×105細胞/ウェルにて入れる。増加濃度の本発明のアルブミン融合蛋白質を合計容量0.2mlの培地(10%のFCS、グルアミン、および抗生物質を含むRPMI)に添加する。3日間インキュベーションした後、プレートを遠心し、培地を各ウェルから除去する。単層のマクロファージに0.2ml/ウェル フェノールレッド溶液(140mMのNaCl、10mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、5.5mMのデキストロース、0.56mMのフェノールレッド、および19U/mlのHRPO)を刺激剤(200nMのPMA)と共に添加する。プレートを37℃で2時間インキュベーションし、1NのNaOHを20μl/ウェルにて添加して反応を停止させる。610nmの吸光度を読む。マクロファージが産生したH2O2の量を測定するために、各実験について既知のモル濃度のH2O2溶液の標準曲線を作成する。
1日目に、4% ウシ胎児血清(FBS)、16U/mlのヘパリン、および50U/mlの内皮細胞成長補助剤(ECGS、Biotechnique,Inc.)含有M199培地中、2〜5×104細胞/35mmのディッシュ密度で、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を播種する。2日目に、10%のFBS、8U/mlのヘパリン含有M199と培地を置き換える。本発明のアルブミン融合蛋白質、およびVEGFおよび塩基性FGF(bFGF)のような正対照を各濃度で添加する。4日目および6日目に培地を交換する。8日目に、Coluterカウンターを用いて、細胞数を決定する。
この動物モデルは、本発明のアルブミン融合蛋白質の血管新生に対する効果を示す。実験プロトコルは:
角膜中心から間質細胞層に、1〜1.5mm切開すること、
目尻と接する切開の端の下に、へらを挿入すること、
くぼみ(その土台は目の端から1〜1.5mmにある)をつくること、
本発明のアルブミン融合蛋白質50ng〜5μg含有ペレットのくぼみ内の位置を決定すること、
を含む。
本発明のアルブミン融合蛋白質での処置を、20mg〜500mgの用量範囲(5日間毎日処置)で角膜創傷に局所適用することもできる。
糖尿病db+/db+マウスモデル
本発明のアルブミン融合蛋白質が治癒過程を加速するかどうかを示すため、一般的に、創傷治癒の糖尿病マウスモデルを用いる。db+/db+マウスにおける全層創傷治癒モデルは十分に特徴付けられた、臨床上適切かつ再現可能な障害性創傷治癒モデルである。糖尿病創傷の治癒は、萎縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する(Gartner,M.H.ら.,J. Surg Res.52:389(1992);Greenhalgh,D.G.ら.,Am.J.Pathol.136:1235(1990))。
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボシステムにおいて十分に示されている(Wahl,Glucocorticoids and Wound healing.In:Anti−Inflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects. 280−302(1989);Wahlら.,J Immunol.115:476−481(1975);Werbら.,J.Exp.Med.147:1684−1694(1978))。血管新生を阻害し、血管透過性(Ebertら.,An.Intern.Med.37:701−705(1952))、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成(Beckら.,Growth Factors.5:295−304(1991);Haynesら.,J.Clin.Invest.61:703−797(1978))を低減し、循環単球を一過性に低減すること(Haynesら.,J.Clin.Invest.61:703−797(1978);Wahl,”Glucocorticoids and healing”,In:Antiinflammatory Steroid Acion:Basic and Clinical Aspects,Academic Press,New York,pp.280−302(1989))により、糖質コルチコイドは創傷治癒を遅延させる。障害された創傷治癒に対するステロイドの全身投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である(Beckら.,Growth Factors.5:295−304(1991);Haynesら.,J.Clin.Invest.61:703−797(1978);Wahl,”Glucocorticoids and wound healing”,In:Antiinflammatory Steroid Action:Basic and Clinical Aspects,Academic Press,New York,pp.280−302(1989);Pierceら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2229−2233(1989))。
この実験アプローチの目的は、ラットの後足のリンパ性循環系のリンパ脈管新生および再確立における本発明のアルブミン融合蛋白質の治療効果を試験するための適切かつ首尾一貫した、リンパ浮腫モデルを作製することである。影響を受けた足の浮腫容積、リンパ脈管構造の定量、総血漿蛋白質、および組織病理により、有効性を測定する。急性リンパ浮腫は7〜10日間観察される。より重要なことに、おそらく浮腫の臨床上の進行は3〜4週間まで続く。
炎症および血管形成領域へのリンパ球の動員は、リンパ球の細胞表面接着分子(CAM)と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用を含む。正常および病理学的設定における結合工程は、内皮細胞(EC)上の細胞接着分子1(ICM−1)、血管細胞接着分子1(VCAM−1)、および内皮白血球接着分子1(E−セレクチン)の発現を含む複数工程のカスケードが続く。血管内皮でのこれらの分子および他の分子の発現は、炎症反応の発生中、白血球が局所脈管構造と結合し、局所組織に侵出する確率を決定する。サイトカインおよび成長因子の局所濃度は、これらのCAMの発現の調節に関与する。
細胞の分化および増殖に関与する1つのシグナル伝達経路は、Jak−STAT経路と呼ばれる。Jak−STAT経路の活性化蛋白質は、多くの遺伝子のプロモーターに位置するガンマ活性化部位「GAS」エレメントまたはインターフェロン−感受性応答エレメント(「ISRE」)と結合する。蛋白質のこれらのエレメントとの結合は、関連遺伝子の発現を変化させる。
5’:GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG:3’(配列番号:54)である。
5’:CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3’(配列番号:56)を含有することを確認する。
Tropix Phospho−lightキット(カタログ番号BP−400)を用いて、以下の一般的な方法により、本明細書に開示の実施例に記載のアッセイの受容体分子としてのSEAP活性をアッセイする。Tropix Phospho−lightキットは、以下で用いる希釈バッファー、アッセイバッファー、および反応バッファーを含む。
細胞が分化および増殖するとき、多くの異なるシグナル伝達経路を介して、1群の遺伝子が活性化される。これらの遺伝子の1つであるEGFR1(初期成長応答遺伝子1)は、活性化の際種々の組織および細胞種類で誘導される。EGFR1のプロモーターはかかる誘導に関与する。受容体分子と結合したEGFR1プロモーターを用いて、本発明の融合蛋白質の細胞を活性化する能力を評価することができる。
第1プライマー:5’GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3’(配列番号:57)
第2プライマー:5’GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3’(配列番号:58)
を用いて、ヒトゲノムDNAからEGR−1プロモーター配列(−633から+1)(SakamotoKら.,Oncogene6:867−871(1991))をPCR増幅する。
次のプロトコルを用いて、因子を同定し、本発明のアルブミン融合蛋白質がT細胞を増殖および/または分化させるかどうかを決定して、T細胞活性を評価する。実施例24で生成したGAS/SEAP/Neoコンストラクトを用いて、T細胞活性を評価する。従って、SEAP活性を増大させる因子は、Jak−STATシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイで用いたT細胞は、ジャーカットT細胞(ATCCアクセッション番号TIB−152)であるが、Molt−3細胞(ATCCアクセッション番号CRL−1552)、およびMolt4細胞(ATCCアクセッション番号CRL−1582)も用いることができる。
NF−KB(核因子KB)は、炎症性サイトカインIL−1およびTNF、CD30およびCD40、リンホトキシン−αおよびリンホトキシン−βを含む広範な因子により、LPSまたはトロンビンへの曝露により、およびある種のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転写因子としてNF−KBは、免疫細胞の活性化、アポトーシスの制御(NF−KBはアポトーシスから細胞を守るようである)、BおよびT細胞発生、抗ウイルスおよび抗菌応答、および複数のストレス性応答に関与する遺伝子の発現を調節する。
5’:GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG:3’(配列番号:60)。
5’GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG:3’(配列番号:60)。
5’:CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3’(配列番号:61)
を含有することを確認する。
次のプロトコルを用いて、融合蛋白質が骨髄細胞を増殖および/または分化させるかどうかを決定することにより、本発明のアルブミン融合蛋白質の骨髄活性を評価する。実施例24で生成したGAS/SEAP/Neoコンストラクトを用いて、骨髄細胞活性を評価する。従って、SEAP活性を増大する因子は、Jak−STATシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイで用いた骨髄細胞は前単球細胞株のU937であるが、TF−1、HL60、またはKG1も用いることができる。
リガンドの受容体との結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのような小分子の細胞内濃度、およびpHを変化させ、ならびに膜電位を変化させることが知られている。特定の細胞の受容体と結合する融合蛋白質を同定するためのアッセイにおいて、これらの変化を測定できる。次のプロトコルはカルシウムのアッセイについて記載するが、このプロトコルを変形して、カリウム、ナトリウム、pH、膜電位、または蛍光プローブにより検出可能な任意の他の小分子の変化を容易に検出することができる。
蛋白質チロシンキナーゼ(PTK)は、多様なグループの膜貫通型および細胞質キナーゼである。受容体蛋白質チロシンキナーゼ(RPTK)のグループの中には、PDGF、FGF、EGF、NGF、HGFおよびインスリン受容体サブファミリーを含む、様々な分裂促進因子および代謝成長因子に対する受容体がある。加えて、対応するリガンドが知られていない大きなRPTKsファミリーがある。RPTKsについてのリガンドは、主に、分泌される小蛋白質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックス蛋白質も含む。
実施例31に記載した蛋白質チロシンキナーゼ活性のアッセイに対する潜在的な代替および/または補助として、主要な細胞内シグナル伝達中間体の活性化(リン酸化)を検出するアッセイを用いることもできる。例えば、以下に記載するように、一の特定のアッセイは、Erk−1およびErk−2キナーゼのチロシンリン酸化を検出できる。しかし、他の分子、例えば、Raf、JNK、p38MAP、Mapキナーゼキナーゼ(MEK)、MEKキナーゼ、Src、筋肉特異的キナーゼ(MuSK)、IRAK、Tecおよびヤヌスならびに任意の他のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホトレオニン分子のリン酸化は、以下のアッセイにおいて、Erk−1またはErk−2の代わりにこれらの分子をを用いることにより検出することができる。
本発明のアルブミン融合蛋白質のリン酸化活性をアッセイするために、米特許第5,958,405号(該文献は出典明示により本明細書の一部となる)に記載されているリン酸化アッセイを利用する。すなわち、ガンマ標識32P−ATPを用いて蛋白質基質をリン酸化し、次いで、ガンマ放射性同位元素カウンターを用いて取り込まれた放射能を定量することにより、リン酸化活性を測定してもよい。本発明の融合蛋白質を、蛋白質基質、32P−ATPおよびキナーゼバッファーと一緒にインキュベーションする。次いで、電気泳動により、基質に取り込まれた32Pを遊離の32P−ATPから分離し、次いで取り込まれた32Pをカウントし、次いで、負対照と比較する。負対照を超える放射能カウントは、融合蛋白質のリン酸化活性の指標となる。
当該技術分野において知られているかまたは本明細書中記載されている方法を用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質のリン酸化活性を測定する。リン酸化活性の好ましい測定方法は、米国特許第5,817,471号(出典明示により本明細書の一部となる)に記載されているように、チロシンリン酸化アッセイを用いることによる。
このアッセイは、造血成長因子の存在下でのヒトCD34+の増殖能力に基づき、およびCD34+細胞の増殖を刺激する本発明の融合蛋白質の能力を評価する。
細胞外マトリックス増強細胞応答(EMECR)アッセイの目的は、細胞外マトリックス(ECM)誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用するための本発明の融合蛋白質の能力を評価することである。
本発明のアルブミン融合蛋白質を、正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)およびヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の培養液へ加え、そして各試料について2つの共アッセイを行う。初めのアッセイは、正常なヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)または大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の増殖への融合蛋白質の効果を調べる。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な成長は、繊維症および再狭窄を含む幾つかの病理学的過程の一部である。第2のアッセイは、NHDFおよびSMCの両方によるIL6産生を調べる。IL6産生は、機能活性化の指標である。活性化された細胞は、多数のサイトカインおよび他の因子の産生を増大させ、炎症誘発または免疫調節の成果をもたらし得る。アッセイは、共TNFa刺激を伴うおよび伴わずに行い、共刺激性または阻害性活性を調べる。
炎症および血管新生領域へのリンパ球の動員は、リンパ球上の細胞表面接着分子(CAMs)と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用を含む。通常の環境および病理学的環境のいずれにおいても、接着過程は、内皮細胞(EC)での細胞内接着分子−1(ICAM−1)、血管細胞接着分子−1(VCAM−I)および内皮白血球接着分子−1(E−セレクチン)発現を含む多段階カスケードに従う。血管内皮でのこれらの分子および他の分子の発現は、炎症応答の発生中に、白血球が局部脈管構造に接着し、そして局部組織中へ血管外遊出し得る効率を決定する。サイトカインおよび成長因子の局所濃度は、これらのCAMsの発現の調節に関与する。
このアッセイを用いて、ウシリンパ管内皮細胞(LECs)、ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)またはヒト微小血管子宮筋層細胞(UTMEC)のbFGF誘導増殖の蛋白質介在阻害を定量的に測定してもよい。このアッセイには、代謝活性の検出に基づく蛍光定量的成長指標(fluorometric growth indicator)が組み込まれる。標準的なAlamar Blue増殖アッセイは、内皮細胞刺激のソースとして添加される10ng/mlのbFGFを有するEGM−2MV中で調製される。成長培地および細胞濃度を若干変化させで、様々な内皮細胞について、このアッセイを用いてもよい。試験される蛋白質バッチの希釈は適宜、希釈される。bFGF不含の無血清培地(GIBCOSFM)を無刺激対照として用い、およびアンジオスタチンまたはTSP−1を既知の刺激対照として用いる。
このアッセイを用いて、本発明の融合蛋白質による混合リンパ球反応(MLR)の阻害を検出および評価できる。MLRの阻害は、細胞増殖および生存率への直接的効果、相互作用細胞に対する共刺激分子の調節、リンパ球とアクセサリー細胞との間の接着の調節またはアクセサリー細胞によるサイトカイン産生の調節に起因してもよい。このアッセイにおいて用いられる末梢血単核フラクションは、T、Bおよびナチュラルキラーリンパ球ならびに単球および樹枝状細胞を含むので、MLRを阻害するアルブミン融合蛋白質により複数の細胞が標的されてもよい。
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質のプロテアーゼ活性を評価してもよい。
当該技術分野において知られているかまたは本明細書中記載されている方法を用いて、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合蛋白質の基質特異性を測定してもよい。基質特異性測定の好ましい一の方法は、GB2 324 529(出典明示により本明細書の一部となる)に記載されているような、ポジショナルスキャニング合成コンビナトリアルライブラリーの使用である。
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質のリガンド結合活性を評価してもよい。
標準的な方法により、RNAポリメラーゼを用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質をコードする線状化プラスミド鋳型からのキャップRNA転写物をインビトロで合成する。0.2mg/miの最終濃度でインビトロ転写物を水中に懸濁する。成体雌ヒキガエルから卵巣葉を取り出し、第V期の濾胞除去した卵母細胞を得、次いで、マイクロインジェクション装置を用いて、RNA転写物(10ng/卵母細胞)を50nlボーラスで注入する。2つの電極電圧クランプを用いて、融合蛋白質およびポリペプチドアゴニストの曝露に応答する、個々のツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。室温、Ca2+不含のBarth’s培地で記録を行う。ツメガエル系を用いて、知られているリガンドおよび組織/細胞抽出物を活性化リガンドについてスクリーニングすることもできる。
多種多様な二次性メッセンジャー系の活性化は、細胞から少量の酸の放出をもたらす。概して、生成される酸は、細胞内シグナル伝達過程を刺激するために必要な代謝活性が増大された結果である。細胞周囲の培地のpH変化は、非常に小さいが、CYTOSENSORマイクロフィジオメーター(Molecular Devices Ltd.,Menlo Park,Calif.)により検出可能である。故に、CYTOSENSORは、エネルギーを利用する細胞内シグナル伝達経路に連動した2次メッセンジャーを活性化させる本発明のアルブミン融合蛋白質の能力を検出することができる。
未だにコグネイトな活性化リガンド(アゴニスト)が見出されていない多数の哺乳類受容体が存在する。故に、これらの受容体に対する活性リガンドは、今日までに同定されたリガンドバンク内に含まれていない可能性がある。従って、本発明のアルブミン融合蛋白質は、組織抽出物に対して機能的にスクリーニングされ(カルシウム、cAMP、マイクロフィジオメーター、卵母細胞の電気生理学など機能的スクリーニングを用いて)、治療用蛋白質部分および/または本発明のアルブミン融合蛋白質のアルブミン蛋白質部分のための天然リガンドを同定することができる。活性化リガンドが単離かつ同定されるまで、陽性の機能応答を生じる抽出物を逐次、細分画することができる。
以下のアッセイを用いて、本発明の融合蛋白質のATP−結合活性を評価してもよい。
本発明のアルブミン融合蛋白質を、シグナル伝達経路蛋白質または受容体蛋白質の同定、特徴付けおよび精製のための研究ツールとして用いてもよい。すなわち、標識された本発明の融合蛋白質は、それと相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の一の実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。癌腫組織のごとき推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、そして適切な親和性を有する分子をアルブミン融合蛋白質に結合させる。蛋白質複合体をカラムから回収し、解離させ、次いで、回収した分子をN−末端蛋白質シークエンスに付す。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を同定するか、または適切なcDNAライブラリーから該当する遺伝子をクローン化するための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
本発明のアルブミン融合蛋白質の増殖効果を試験するために、様々なアッセイが当該技術分野において知られている。例えば、かかる一のアッセイは、Marzら.(Proc.Natl.AcadSci.,U.S.A.,95:3251−56(1998);該文献は出典明示により本明細書の一部となる)により記載のようなIL−6バイオアッセイである。37℃で68時間後、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー(MTT)を加え、次いで、さらに37℃で4時間インキュベーションすることにより、生存細胞の数を測定する。B9細胞をSDSにより溶解させ、次いで、570nmにおける光学密度を測定する。対照は、IL−6(正対照)を含むものおよびサイトカインを含まないもの(負対照)である。すなわち、IL−6依存性B9ネズミ細胞をIL−6不含培地で3回洗浄し、次いで、50μl中5,000細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、次いで、50μlの本発明の融合蛋白質を加え、利用する。負対照と比べた、一または複数の試験試料(本発明のアルブミン融合蛋白質を含む)における増殖の増大は、融合蛋白質により介される増殖効果の指標である。
交感ニューロン細胞の生存率が本発明のアルブミン融合蛋白質により支持されるかを試験するために、Senaldiらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイを利用してもよい(Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,96:11458−63(1998)。該文献は出典明示により本明細書の一部となる。すなわち、運動および交感ニューロンをニワトリ胚から単離し、それぞれL15培地(10%のFCS、グルコース、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシンおよびインスリン;Life Technologies,Rockville,MD.を添加)およびダルベッコ改変イーグル培地[10%のFCS、グルタミン、ペニシリンおよび25mMのHepesバッファー(pH7.2);Life Technologies,Rockville,MD.を添加]中に再懸濁し、次いで、異なる濃度の精製された本発明の融合蛋白質の存在下で、ならびにいかなるサイトカインも欠損している負対照として、5%のCO2中にて37℃でインキュベーションする。3日後、細胞形態を評価し、およびMosmannの比色アッセイ(Mosmann, T.,J.Immunol.Nethods,65:55−63(1983))を用いることにより、ニューロン生存を測定する。サイトカインを欠損している対照と比較して増強されたニューロン細胞の生存能力は、ニューロン細胞の生存を増強するアルブミン融合蛋白質の能力の指標である。
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質のセリン/トレオニンホスファターゼ(PTPase)活性を評価してもよい。
セリン/トレオニンホスファターゼ活性(例えば、実施例51にて測定されるような)を有する本発明の融合蛋白質は、例えば、さらなる相互作用蛋白質または受容体蛋白質または他のシグナル伝達経路蛋白質の同定、特徴付けおよび精製のための研究ツールとして有用である。すなわち、標識された本発明の融合蛋白質は、それが相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の一の実施態様において、本発明のアルブミン融合蛋白質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。神経または肝臓細胞のごとき推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、そして、適切な親和性を有する分子は融合蛋白質に結合させる。融合蛋白質−複合体をカラムから回収し、解離させ、次いで、回収した分子をN−末端蛋白質シークエンスに付す。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を同定するか、または適切なcDNAライブラリーから該当する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
本発明のアルブミン融合蛋白質のヘパラナーゼ活性をアッセイするために用いられてもよい様々なアッセイが当該技術分野において知られている。一例として、本発明のアルブミン融合蛋白質のヘパラナーゼ活性は、Vlodavskyら,(Viodavskyら.,Nat.Med.,5:793−802(1999))により記載されているように、アッセイされる。すなわち、細胞溶解物、条件培地、インタクト細胞(35−mmディッシュあたり1×106細胞)、細胞培養上清または精製された融合蛋白質を、35S−標識ECMまたは可溶性ECM誘導ピ−クIプロテオグリカンと共に、37℃で18時間、pH6.2〜6.6でインキュベーションする。インキュベーション培地を遠心分離し、次いで、上清をセファロースCL−6Bカラム(0.9×30cm)でゲル濾過することにより、分析する。PBSでフラクションを溶離し、次いで、その放射能を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解断片を、0.5<K,V<0.8(ピ−クII)でセファロース6Bから溶離させる。各実験を少なくとも3回行う。Vlodavskyら.により記載のような「ピ−クII」に対応する分解断片は、ヘパラン硫酸の切断における本発明のアルブミン融合蛋白質の活性の指標である。
この実施例は、非宿主細胞脂質二重層コンストラクト中で本発明のアルブミン融合蛋白質を安定化するための方法(例えば、Bieriら.,Nature Biotech 17:1105−1108(1999)を参照のこと。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる)を提供し、該方法は、上記の様々な機能アッセイにおける本発明の融合蛋白質の研究に適用できる。すなわち、ビオチン化のための炭水化物特異的化学を用いて、ビオチンタグを本発明のアルブミン融合蛋白質に拘束し、固定化に均一な配向を可能とさせる。洗浄されたメンブレン中の50uMの本発明のアルブミン融合蛋白質の溶液を、20mMのNaI04および1.5mg/ml(4mM)のBACHまたは2mg/ml(7.5mM)のビオチン−ヒドラジドと共に、室温で1時間インキュベーションする(反応容量,150ul)。次いで、試料を透析し(Pierce Slidealizer Cassett,10kDa cutoff;Pierce Chemical Co.,Rockford IL)、1時間ごとにバッファーを交換しながら、最初の5時間は4℃で、そして最後にに500mlのバッファーR(0.15MのNaCl,1mMのMgC12,10mMのリン酸ナトリウム,pH7)に対して12時間透析する。キュベットに加える直前に、バッファーROG50(50mMのオクチルグルコシドを加えたバッファーR)中に試料を1:5で希釈する。
メタロプロテイナーゼは、触媒機序として金属イオン、例えば、Zn2+を利用するペプチド加水分解酵素である。本発明のアルブミン融合蛋白質のメタロプロテイナーゼ活性は、当該技術分野において知られている方法に従ってアッセイすることができる。以下の例示的方法が提供される:
プロテアーゼ活性を確認するために、精製した本発明の融合蛋白質を、1×アッセイバッファー(50mMのHEPES、pH7.5、0.2MのNaCl、10mMのCal2、25uMのZnC12および0.05%のBrij−35)中、基質アルファ−2−マクログロブリン(0.2ユニット/ml;Boehrlinger Mannheim,Germany)と混合し、次いで、37℃で1〜5日間インキュベーションする。トリプシンを正対照として用いる。負対照は、アッセイバッファー中、アルファ−2−マクログロブリンのみを含む。試料を集め、次いで、5%の2−メルカプトエタノールを含有するSDS−PAGE試料バッファー中で5分間ボイルし、次いで、8%のSDS−ポリアクリルアミドゲルにローディングする。電気泳動した後、蛋白質を銀染色により視覚化する。負対照と比べてより低い分子量のバンドが出現することにより、蛋白質分解が実証される。
知られているメタロプロテイナーゼ阻害剤(金属キレート剤(EDTA、EGTAおよびHgCl2)、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP−1およびTIMP−2)および市販の小分子MMP阻害剤)を用いて、本発明のアルブミン融合蛋白質の蛋白質分解活性を特徴付けてもよい。用いられてもよい3つの合成MMP阻害剤は:MMP阻害剤I、[MMP−1およびMMP−8に対してIC50=1.0μM;MMP−9に対してIC50=30μM;MMP−3に対してIC50=150μM];MMP−3(ストロメライシン−1)阻害剤I[MMP−3に対してIC50=5μM]およびMMP−3阻害剤II[MMP−3に対してKi;=130nM];であり、それぞれCalbiochemカタログ番号;444250、444218、および444225から入手可能な阻害剤である。すなわち、異なる濃度の小分子MMP阻害剤を、22.9μlの1×HEPESバッファー(50mMのHEPES,pH7.5,0.2MのNaCl,10mMのCaC12,25uMのZnC12および0.05%のBrij−35)中、精製した本発明の融合蛋白質(50ug/ml)と混合し、次いで、室温(24℃)で2時間インキュベーションし、次いで、7.1μlの基質アルファ−2−マクログロブリン(0.2ユニット/ml)を加え、次いで、37℃で20時間インキュベーションする。4×試料バッファーを加え、その後直ぐに5分間ボイルすることにより、反応を停止させる。SDS−PAGEの後、蛋白質バンドを銀染色により視覚化する。
メタロプロテイナーゼ活性が実証されている本発明の融合蛋白質の基質特異性は、当該技術分野において知られている技法、例えば、合成蛍光性ペプチド基質(BACHEM Bioscience Incから購入)を用いて測定されてもよい。試験基質は、M−1985、M−2225、M−2105、M−2110およびM−2255を含む。初めの4つはMMP基質であり、および最後の1つは腫瘍壊死因子−α(TNF−α)転換酵素(TACE)の基質である。好ましくは、これらの基質を、1:1ジメチルスルフォキシド(DMSO)および水中にて調製する。ストック溶液は50〜500uMである。恒温水浴を備えたPerkinElmerLS50Bルミネセンス分光計を用いて、蛍光アッセイを行う。励起λは328nmであり、および放出λは393nmである。すなわち、176μlの1×HEPESバッファー(0.2MのNaCl、10mMのCaC12、0.05%のBrij−35および50mMのHEPES、pH7.5)を4μlの基質溶液(50μM)と一緒に25℃で15分間インキュベーションし、次いで、20μ1の精製した本発明の融合蛋白質をアッセイキュベットに加えることにより、アッセイを行う。基質の最終濃度は1μMである。初期の加水分解速度を30分間モニタリングする。
ヒトにおいて見出されるものと同様の経過を有するIDDMを示すことにより、雌NOD(非肥満糖尿病)マウスを特徴付けた。該疾患は雄NODマウスよりも雌においてより明白である。以後、別記しない限り、用語「NODマウス」は、雌NODマウスを言う。NODマウスは、慢性自己免疫疾患により惹起されるベータ細胞の進行性破壊を有する。かくして、NODマウスは正常血糖または正常な血液グルコースレベルを伴って育つ。しかし、約15〜16週齢までに、NODマウスは高血糖になり始め、それらの膵臓ベータ細胞の大部分の破壊を示し、そしてそれに対応して膵臓が十分なインスリンを産生することができなくなる。故に、疾患の原因および進行はいずれもヒトIDDM患者と同様である。
NODマウスからの組織試料の組織学的試験は、膵臓のベータ細胞の相対濃度を増大させる、本発明の組成物および/または他の糖尿病用治療剤と本発明の組成物の組み合わせの能力を示すことができる。実験的方法は以下の通りである:
Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)からの雄C57BL/6Jマウスは、3週齢から入手でき、および慣用的な食飼或いは脂肪(35.5重量%;Bioserv.Frenchtown,NJ)またはフルクトース(60重量%;Harlan Teklad,Madison,Wl)のいずれかが豊富な食飼を与える。標準食飼は、4.5重量%の脂肪、23重量%の蛋白質、31.9重量%のデンプン、3.7重量%のフルクトースおよび5.3重量%の繊維からなる。高脂肪(ラード)食は、35.5重量%の脂肪、20重量%の蛋白質、36.4重量%のデンプン、0.0重量%のフルクトースおよび0.1重量%の繊維からなる。高フルクトース食は、5重量%の脂肪、20重量%の蛋白質、0.0重量%のデンプン、60重量%のフルクトースおよび9.4重量%の繊維からなる。12−時間の明(午前6時から午後6時まで)/暗サイクルを伴う22°+/−3℃の温度および50%+/−20%の湿度に制御された部屋に置かれたケージにて、マウスは1ケージあたりわずか5匹ずつ飼育されてもよい(Luoら.,1998,Metabolism 47(6):663−8,”Nongenetic ouse models of non−insulin−dependent diabetes mellitus”;Larsenら.,Diabetes 50(11):2530−9(2001),”Systemic administration of the long−acting GLP−1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese rat”)。3週間マウスをそれぞれに摂食させた後、100mg/kg体重のストレプトゾトシン、「STZ」(Sigma,St.Louis,MO)またはビヒクル(0.05mol/Lクエン酸,pH4.5)のいずれかを用いて、マウスに腹腔内注入でき、次いで、次の4週間は同じ食飼を与えることができる。STZの1、2および4週後に非空腹条件下にて、尾部の遠位部から血液を採取する。試料を用いて非空腹時血漿グルコースおよびインスリン濃度を測定する。体重および食飼取り込みを1週間に1回記録する。
様々なH4IIeレポーター
H4IIe/rMEP−SEAP:ラットから単離されたリンゴ酸酵素プロモーター(rMEP)は、インスリン経路にあるPPAR−ガンマエレメントを含む。このレポーターコンストラクトは、肝臓H4Ue細胞系中に安定にトランスフェクションされる。
成長培地は、10%のウシ胎児血清(FBS)、10%の仔ウシ血清、1%のNEAA、lxペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.75mg/mLのG418(H4IIe/rFAS−SEAPおよびH4IIe/SREBP−SEAPのために)または0.50mg/mLG418(H4IIe/rMEP−SEAPのために)を含む。H4IIe/PEPCK−SEAPのために、成長培地は、10%のFBS、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、15mMのHEPESバッファー生理的食塩水および0.50mg/mLのG418からなる。
対数増殖期の細胞が接着するまで、75,000細胞/ウェルで100μL/ウェルの成長培地の96−ウェルプレートに播種する。成長培地を200μL/ウェルのアッセイ培地(H4IIe/PEPCK−SEAP細胞のために、0.5μMのデキサメサゾン含有のアッセイ培地を100μL/ウェルにて加え、次いで、約20時間インキュベーションする)と交換することにより、細胞を48時間かけて飢餓状態とする。その後、アッセイ培地を100μL/ウェルの新鮮なアッセイ培地と交換し、次いで、本発明の治療剤(例えば、本発明のアルブミン融合蛋白質およびその断片および変異体)を発現する、トランスフェクションさせた細胞系から得られた50μLアリコートの細胞上清をそのウェルに加える。空のベクターにトランスフェクションさせた細胞系からの上清を負対照として用いる。ウェルへ10nMおよび/または100nMのインスリンを添加したものを正対照として用いる。インキュベーションの48時間後、条件培地を回収し、次いで、SEAP活性を測定する(Phospha−Light Systemプロトコル、Tropix #;BP2500)。すなわち、希釈バッファー中に試料を1:4で希釈し、次いで、65℃で30分間インキュベーションし、内因性非胎盤形態のSEAPを不活性化する。希釈した試料の50μLアリコートを、非胎盤SEAPアイソザイムに対して活性のある阻害剤の混合物を含む、50μLのSEAPアッセイバッファーと混合し、さらに5分間インキュベーションする。Emerald発光増強剤中に1:20希釈した50μLアリコートのCSPD化学発光基質をその混合物へ加え、次いで、15〜20分間インキュベーションする。Dynexプレートルミノメーターでプレートを読み取る。
本発明のアルブミン融合蛋白質は、トランスジェニック動物中で発現させることもできる。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ(micro−pig)、ヤギ、ヒツジ、ウシならびにヒトでない霊長類、例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジ−を含むがこれらに限定されない任意の種の動物を用いて、トランスジェニック動物を作製してもよい。特定の実施態様において、本明細書に記載されているまたは当技術分野で知られている方法を用いて、遺伝子治療プロトコルの一部としてヒトにおいて本発明の融合蛋白質を発現させる。
遺伝子治療の一の方法では、本発明のアルブミン融合蛋白質を発現し得る繊維芽細胞が患者に移植される。一般的には、皮膚生検により対象から繊維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に配置する。約10片をそれぞれのフラスコ中に配置する。フラスコを上下逆さまにし、密閉して室温で一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底部に固定された状態に保持し、新鮮な培地(たとえば、10%のPBS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するHam’sF12培地)を加える。次いで、フラスコを37℃で約1週間インキュベーションする。
本発明の他の態様は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボでの遺伝子治療を用いることである。遺伝子治療は、本発明のアルブミン融合蛋白質をコードする裸の核酸(DNA、RNAおよびアンチセンスDNAまたはRNA)配列を動物に導入することに関連する。本発明のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、標的組織によるポリペプチドの発現に必要なプロモーターまたは任意の他の遺伝的エレメントに作動可能に連結(すなわち、結合)されてもよい。かかる遺伝子治療および送達の技法および方法は当技術分野にて知られている。例えば、WO90/11092,WO98/11779;米国特許第5693622号,第5705151号,第5580859号;Tabataら.,Cardiovasc.Res.35(3):470−479(1997);Chaoら.,Pharmacol.Res.35(6):517−522(1997);Wolff,Neuromuscul.Disord.7(5):314−318(1997);Schwartzら.,Gene Ther.3(5):405−411(1996);Tsurumiら.,Circulation94(12):3281−3290(1996)を参照のこと(出典明示により本明細書の一部となる)。
星状細胞およびニューロンアッセイ
皮質ニューロン細胞の生存、神経突起伸長または表現型分化を促進する活性に関して、およびグリア繊維酸性蛋白質免疫陽性細胞である星状細胞の増殖の誘導に関して、本発明のアルブミン融合蛋白質を試験することができる。バイオアッセイのための皮質細胞の選択は、皮質構造中でのFGF−1およびFGF−2の優勢な発現ならびに既に報告されているFGF−2処理から生じる皮質ニューロン生存の増強に基づく。例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、これらの細胞に対する本発明のアルブミン融合蛋白質の活性を解明することができる。
ヒト肺繊維芽細胞をClonetics(San Diego,CA)から入手し、そしてClonetics製の成長培地中で保持する。真皮微小血管内皮細胞をCell Applications(San Diego,CA)から入手する。増殖アッセイのために、ヒト肺繊維芽細胞および真皮微小血管内皮細胞を、96ウェルプレートの増殖培地中、5,000細胞/ウェルで1日培養することができる。次いで、0.1%のBSA基本培地中で細胞を1日インキュベーションする。培地を新鮮な0.1%のBSA培地と交換した後、本発明の蛋白質の試験融合蛋白質と共に細胞を3日間インキュベーションする。Alamar Blue(Alamar Biosciences,Sacramento,CA)を10%の最終濃度になるように各ウェルに加える。細胞を4時間インキュベーションする。CytoFluor蛍光リーダーで読み取ることにより細胞生存能力を測定する。PGE2アッセイのために、96ウェルプレート中、5,000細胞/ウェルでヒト肺繊維芽細胞を1日培養する。培地を0.1%のBSA基本培地と変換した後、IL−1αを用いてまたは用いずにFGF−2または本発明の融合蛋白質と共に細胞を24時間インキュベーションする。上清を採取し、そしてEIAキット(Cayman,Ann Arbor,MI)によりPGE2についてアッセイする。IL−6アッセイのために、96ウェルプレート中、5,000細胞/ウェルでヒト肺繊維芽細胞を1日培養する。培地を0.1%のBSA基本培地と変換した後、FGF−2と共にまたは本発明のアルブミン融合蛋白質および/またはIL−1αを用いてまたは用いずに、細胞を24時間インキュベーションする。上清を採取し、そしてELISAキット(Endogen,Cambridge,MA)によりIL−6についてアッセイする。
以下の[3H]チミジン取り込みアッセイを用いて、繊維芽細胞、上皮細胞または未熟筋肉細胞のごとき細胞の増殖への増殖因子蛋白質のごとき治療用蛋白質の効果を測定することができる。
パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴付けられているパーキンソン病のための動物モデルは、1−メチル−4フェニル1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)の全身的投与を伴う。CNSの場合、MPTPは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼBにより1−メチル−4−フェニルピリジン(MPP+)に異化され、そして放出される。続いて、MPP+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポ−タ−によりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積される。次いで、MPP+は、電気化学的勾配によりミトコンドリア中に濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸:ユビキノン酸化レダクターゼ(複合体I)を選択的に阻害し、それにより電子伝達を妨害し、最終的に酸素ラジカルを生成する。
移植は、自己免疫疾患の処置、特に標的組織それ自体がひどく損傷している場合の処置において一般的な形態である。例えば、これらに限定されるものではないが、膵臓移植および島細胞移植は、IDDMのための一般的な処置選択である(例えば、Stewartら.,Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism 86(3):984−988(2001);Brunicardi, Transplant.Proc.28:2138−40(1996);Kendall&Robertson,Diabetes Metab.22:157−163(1996);Hamanoら.,Kobe J.Med.Sci.42:93−104(1996);Larsen&Stratta,Diabetes Metab.22:139−146(1996);およびKinkhabwala,ら.,Am.J.Surg.171:516−520(1996)を参照のこと)。任意の移植方法に関して、自己免疫疾患患者のための移植療法は、移植された組織の宿主拒絶反応の危険性を最小限にするための処置を含む。しかし、自己免疫疾患は、元々の組織自体を損傷する既に存在する宿主自己免疫応答が、移植された組織に対して同じ損傷効果を及ぼし得るというさらなる独立した危険性を含む。従って、本発明は、自己免疫疾患の移植療法を受けている個体において、免疫調製剤/免疫抑制剤と組み合わせて本発明のアルブミン融合蛋白質を用いて自己免疫膵臓疾患を処置するための方法および組成物を包含する。
特定の抗体を発現する細胞系に由来するVHおよびVLドメインを同定およびクローニングする一つの方法は、抗体発現細胞系から作製されたcDNAについてVHおよびVLに特異的なプライマーを用いてPCRを行うことである。すなわち、RNAを細胞系から単離し、そしてEBV細胞系により発現される抗体のVHおよびVLドメインを増幅するように設計されたRT−PCR用の鋳型として用いる。TRIzol(登録商標)試薬(Life Technologies;Rockville,MD)中で細胞を溶解して、1/5容量のクロロホルムで抽出してもよい。クロロホルムを加えた後、溶液を室温で10分間インキュベーションしておき、次いで、卓上用遠心機にて14,000rpm、15分間、4℃で遠心分離する。上清を収集し、そして等量のイソプロパノールを用いてRNAを沈澱させる。卓上用遠心機にて14,000rpm、15分間、4℃で遠心処理することにより、沈澱させたRNAをペレット化する。遠心処理の後、上清を捨て、75%のエタノールで洗浄する。洗浄の後、800rpm、5分間、4℃でRNAを再び遠心分離する。上清を捨て、ペレットを空気乾燥させる。RNAをDEPC水に溶解させ、10分間で60℃に加熱する。RNAの量は、光学密度測定を用いて算出することができる。
NGFのごとき目的のサイトカインまたは成長因子についてのcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、RT−PCRおよび一連のオーバーラッピング合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRを含む様々な手段により単離され得る。これらの蛋白質の全てについてのヌクレオチド配列は知られており、かつ入手可能である。cDNAをHAのcDNAを含むベクター中にクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを用いることができるように、cDNAの5’および3’末端を調節して、制限部位を作製する。これは、スペ−サ−配列を伴うまたは伴わないNまたはC−末端であり得る。NGF(または他のサイトカイン)cDNAは、ベクター、例えば、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSA中にクローニングされ、次いで、そこから、完全発現カセットを切り取り、次いで、プラスミドpSAC35中に挿入し、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現を可能にする。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を集め、次いで、培地から精製し、次いで、その生物活性について試験する。哺乳類細胞株の発現について、用いる発現カセットが哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用することを除き同様の手法を適用する。次いで、この発現カセットを切り取り、次いで、哺乳類細胞株のトランスフェクションに適するプラスミド中に挿入する。
IFNaのごとき目的のインターフェロンについてのcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、RT−PCRおよび一連のオーバーラッピング合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRを含む様々な手段により単離され得る。インターフェロン、例えばIFNaについてのヌクレオチド配列は、例えば、米国特許第5,326,859号および第4,588,585号、EP32134ならびにGenBankのごとき公共データベースにおいて知られており、かつ入手可能である。cDNAをHAのcDNAを含むベクター中にクロ−にグするためにオリゴヌクレオチドリンカーを用いることができるように、cDNAの5’および3’末端を調節して、制限部位を作製する。これは、スペ−サ−配列を伴うまたは伴わない、HA配列のNまたはC−末端であり得る。IFNa(または他のインターフェロン)cDNAは、ベクター、例えば、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSA中にクローニングされ、次いで、そこから、完全発現カセットを切り取り、次いで、プラスミドpSAC35中に挿入し、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現を可能にする。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を集め、次いで、培地から精製し、次いで、その生物活性について試験する。哺乳類細胞株の発現について、用いる発現カセットが哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用することを除き同様の手法を適用する。次いで、この発現カセットを切り取り、次いで、哺乳類細胞株のトランスフェクションに適するプラスミド中に挿入する。
本発明のアルブミン融合蛋白質は、低濃度でパッケージングした場合でさえも、高度の安定性を有する。さらに、低い蛋白質濃度にも関わらず、水溶液が、バイアル壁への結合を最小限に抑えるべく添加される他の蛋白質を含んでいない場合でさえも、良好な融合蛋白質回収率が観察される。バイアルに保存されたHA−IFN溶液の回収率をストック溶液と比較した。6または30μg/mlのHA−IFN溶液をバイアルに入れて4℃で保存した。48または72時間後、最初の10ngに相当する容量の試料を取り出し、IFNサンドイッチELISAで測定した。その推定値を、高濃度ストック溶液のものと比較した。示されるように、これらのバイアル中では本質的にサンプルの損失はなく、バイアル壁へのサンプル損失を防止するためにアルブミンのような外因性物質を添加することは必ずしも必要ではないことを示す。
HA−α−IFN融合分子のインビボ安定性および生物学的利用能を調べるために、精製された融合分子(酵母由来)をサルに投与した。HA−α−IFN融合物から処方された医薬組成物は、増大された血清半減期および生物学的利用能を呈してもよい。従って、医薬組成物は、天然のアルファ−インターフェロン分子と比較して、より低い用量のアルファ−インターフェロン活性を含むように処方されてもよい。
二重機能性HA−α−IFN融合蛋白質を発現させるために、HA−α−IFN発現ベクターを改変して、インサートを挿入してもよい。例えば、二重終止コドンを除去するかまたはコーディング配列の下流に移動させた後、対象の第2の蛋白質のcDNAを「rHA−IFN」配列の下流のフレーム内に挿入してもよい。
対象のホルモンのcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる。これらの蛋白質の全てのヌクレオチド配列は知られており、例えば、GenBankのごとき公共のデータベースにて利用できる。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。ホルモンcDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
対象の可溶性受容体または結合性蛋白質のcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる。これらの蛋白質の全てのヌクレオチド配列は知られており、例えば、GenBankにて利用できる。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。受容体cDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性について試験することができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
対象の増殖因子のcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる(GenBank寄託番号NP_000609を参照のこと)。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。増殖因子cDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性について試験することができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
一本鎖抗体は、ファージライブラリーからの選択、抗体のcDNAをクローン化し、可変領域をクローニングするためのプライマーとしてフランキング定常領域を用いるかまたは任意の特異的抗体の可変領域に対応するオリゴヌクレオチドを合成することによる特異的抗体の可変領域のクローニング:を含むがこれらに限定されない、幾つかの方法により産生される。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。細胞cDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。
対象の細胞接着分子のcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる。既知の細胞接着分子のヌクレオチド配列は知られており、例えば、GenBankにて利用できる。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。細胞接着分子cDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性について試験することができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
抗生物質ペプチドのごとき対象のペプチドのcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。ペプチドcDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性について試験することができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
対象の蛋白質のcDNAは、標準的な分子生物学的手法を用いて、cDNAライブラリーから単離するか、またはいくつかの重複オリゴヌクレオチドを用いて合成的に作製することができる。適切なヌクレオチドを遺伝子工学的にcDNAに導入し、都合のよい制限部位を形成し、そして、アルブミンcDNAへの蛋白質cDNAの結合を可能にもする。また、細胞内部の蛋白質に向かうことのできる一本鎖抗体またはペプチド、例えば、核局在化シグナルのごとき標的蛋白質またはペプチドcDNAを、アルブミンの他方の末端に融合させることができる。対象の蛋白質および標的ペプチドは、アルブミンcDNAとの融合を可能にするpPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされる。このように、アルブミンのN−およびC−末端の両方を他の蛋白質に融合させる。次いで、融合されたcDNAをpPPC0005から切り出して、pSAC35のごときプラスミドに挿入し、酵母においてアルブミン融合蛋白質を発現させる。上記の手順はすべて、分子生物学における標準的方法を用いて行うことができる。酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、適切な生化学的および生物学的試験を用いて、その生物活性およびそのターゲッティング活性について調べることができる。
対象の酵素のcDNAは、全て標準的な方法を用いる、cDNAライブラリー、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT−PCRによりおよびPCRを含むがこれらに限定されない、様々な手段により単離することができる。HAのcDNAを含むベクター中に上記cDNAをクローニングするためにオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5’および3’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペ−サ−配列を用いてまたは用いずに、NまたはC末端で行うことができる。酵素cDNAは、pPPC0005(図2)、pScCHSA、pScNHSAまたはpC4:HSAのごときベクター中にクローニングされ、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合蛋白質の発現が可能となる。次いで、酵母から分泌されたアルブミン融合蛋白質を培地から回収して精製し、その生物活性について試験することができる。哺乳類細胞系における発現については、用いる発現カセットとして哺乳類のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター(実施例1を参照のこと)を利用する点を除けば、同様の手順を適用する。次いで、この発現カセットを切り出して、哺乳類細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
コンストラクト番号2053、pEE12.1:IFNb.HASは、NSO発現ベクターpEE12.1.にある成熟形態のHASのアミノ−末端に融合された天然のIFNbリーダー配列を含む全長IFNb蛋白質を有するIFNbアルブミン融合蛋白質をコードするDNAを含む。
IFNbをコードするポリヌクレオチドは、以下に記載のプライマーIFNb−1およびIFNb−2を用いてPCR増幅され、Bam HI/Cla Iを用いて開裂され、次いで、Bam HI/Cla Iで開裂されたpC4:HAS中にライゲーションされ、コンストラクト2011を生じた。コンストラクト番号2011からのEco RI/Eco RI断片は、pEE12.1のEco RI部位へサブクローニングされ、成熟HAS蛋白質が後に続く、リーダー配列および成熟形態のIFNbを含むアルブミン融合蛋白質をコードするDNAを含むコンストラクト番号2053を生じた。
IFNb-1: 5' GCGCGGATCCGAATTCCGCCGCCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTT CTCCACTACAGCTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGG-3’ (配列番号:107)
IFNb-2: 5’ GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCGTTTCGGA GGTAACCTGT 3’ (配列番 号:108)
ネズミミエローマNSO細胞系における発現
当該技術分野において知られている方法により、コンストラクト番号;2053、pEE12.1:IFNb−HASをNSO細胞中に電気穿孔処理した(実施例6を参照のこと)。
NSO細胞上清からのIFNb−HASの精製は、20mMのトリス−HCl中、0〜1MのNaCI勾配を用いるpH7.4でのQ−セファロースアニオン交換クロマトグラフィー、次いで、5〜40mMのクエン酸ナトリウム勾配を用いるpH6.5でのPorosPI50アニオン交換クロマトグラフィー、および10mMのクエン酸、pH6.5および140mMのNaCIの最終バッファー組成物中への6DVについてのダイアフィルトレーションを含んでもよい。N−末端配列は、成熟形態のIFNbのアミノ末端である配列MSYNLLを産生し得る。蛋白質は約88.5kDaの分子量を有する。
全てのI型インターフェロン蛋白質は、インターフェロン配列応答性エレメント「ISRE」を介する応答性遺伝子、インターフェロン、「IFN」の活性化をもたらす、一般的な受容体複合体および類似するJak/STATシグナル経路を介してシグナルを送る。I型IFN活性のために有用なアッセイは、下流レポーター遺伝子に融合されたISREエレメントの複数コピーを含む、プロモーター−レポーターに基づくアッセイ系である。適当なHEK293細胞系を産生することができ、そして、それは、I型IFNsに非常に感受性があるISRE−SEAPレポーター遺伝子の安定に統合されたコピーを含み、および濃度の5ログよりも高い直線性を示す。
実施例6において記載したように、コンストラクト2053をNSO細胞中に電気穿孔処理した。ISRE−SEAPアッセイにおいて条件成長培地を試験することにより、コンストラクト番号;2053を用いてトランスフェクションされたNSO細胞を活性についてスクリーニングした。処置1日前に、ISRE−SEAP/293Fレポーター細胞を、96−ウェルのポリ−D−リジンコーティングされたプレート中に、3×104細胞/ウェルで配置した。レポーター細胞を、コンストラクト番号2053によりコードされたIFNbアルブミン融合蛋白質の、様々な希釈(1:500および1:5000を含むがこれらに限定されない)の条件化上清または精製した調製物アルイ派対照としてrhIFNbを用いて処理した。次いで、レポーター細胞を24時間インキュベーションし、その後、SEAPレポーター遺伝子化学発光アッセイ(Rocheカタログ番号;1779842)において用いるために、40μLを取り出した。組換えヒトインターフェロンベータ“rhIFNb”(Biogen)を正対照として用いた。
IFNb−HSA発現したNS0の精製調製物は、1.8×10−10g/mLのEC50を有するrhIFNb(Biogen)よりも高い9.3×10−9g/mLのEC50を有する(図4参照のこと)。
方法
OAS酵素2’−5’−オリゴアデニラート合成酵素は、抗ウイルス感染に応答して、インターフェロンにより転写レベルで活性化される。処置するサルから血液試料を得、次いで、これらの試料を2つのOASmRNA、p41およびp69の転写活性化について分析することにより、インターフェロンコンストラクトの効果は、測定できる。全血液の0.5mL量を動物につき異なる7つの時間ポイント、0日目、1日目、2日目、4日目、8日目、10日目および14日目にて1群あたり4匹の動物から得ることができる。様々な群は、ビヒクル対照の注入、1日目における30ug/kgおよび/または300pg/kgいずれかのIFNアルブミン融合蛋白質の静脈内および/または皮下注入、および1、3、5日目の正対照としての40ug/kgのインターフェロンアルファ(Schering−Plough)の皮下注入を含む。p41−OASおよびp69−OASに特異的なプローブを用いるリアルタイム定量的PCR(Taqman)により、p41およびp69mRNA転写物のレベルを測定することができる。OASmRNAレベルは、18SリボソームRNA内因性対照に対して定量できる。
方法
コンストラクト2053によりコードされたHSA−IFNb融合蛋白質の活性は、「インターフェロンによるOASのインビボ誘導」と題するサブセクションにて既に上記したように、インビボOASアッセイにおいてアッセイできる。
IFNベータアルブミン融合蛋白質(コンストラクト2053によりコードされたものを含むが、これらに限定されない)を用いて、多発性硬化症を処置、予防、改善および/または検出することができる。他の適応症は、重症急性呼吸症候群(SARS)および他のコロナウイルス感染;エボラウイルスおよびマールブルグウイルスを含むがこれらに限定されないフィロウイルス;Pichendeウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マクポウイルス、Guanaritoウイルスを含むがこれらに限定されないアレナウイルス;およびリンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV);Punta toroウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスおよびfly熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、およびハンタウイルスを含むがこれらに限定されないブンヤウイルス;黄熱病、Banziウイルス、ウエスト・ナイルウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎、オムスク出血熱およびキャサヌ−ル森林病ウイルスを含むがこれらに限定されないフラビウイルス;ベネズエラ、西部および西部ウマ脳炎ウイルス、Ross Riverウイルス、および風疹ウイルスを含むがこれらに限定されないトガウイルス;ワクシニア、牛痘、天然痘、およびサル痘を含むがこれらに限定されないオルトポックス・ウイルス;ヘルペスウイルス;インフルエンザA/B;呼吸Sincytialウイルス(RSV);paraflu;はしか;ライノウイルス;アデノウイルスセムリキ森林熱ウイルス;ウイルス出血熱;ラブドウイルス;ニパウイルスおよびヘンドラウイルスを含むがこれらに限定されないパラミクソウイルス;および最優先疾患物質(すなわち、カテゴリーA、BおよびC物質;例えば、Moran、Emerg.Med.Clin.North.Am.2002;20(2):311−30およびDarlingら.、Emerg.Med.Clin.North Am.2002;20(2):273−309を参照のこと)として疾患制御および予防のために米国センターにより同定されている他のウイルス物質を含むウイルス感染を含むが、これらに限定されない。
コンストラクト番号2249、pSAC35:IFNa2.HASは、成熟形態のIFNa2蛋白質、すなわち、酵母(yeast S.cerevisiae)発現ベクターpSAC35中の成熟形態のHASのアミノ−末端に融合されたCl−E165が後に続く、HSAキメラリーダー配列を有するIFNa2アルブミン融合蛋白質をコードするDNAを含む。
IFNa2をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載のプライマー、IFNa2−1およびIFNa2−2を用いてPCR増幅した。PCR増幅産物をSal1/Cla1を用いて開裂し、次いで、Xho 1/Cla Iで開裂したpScCHSA中にライゲーションした。コンストラクト番号;2249は、成熟HSA蛋白質が後に続く、HASのキメラリーダー配列、成熟形態のIFNa2を含む、アルブミン融合蛋白質をコードする。
成熟形態のIFNa2、IFNa2−1およびIFNa2−2をコードするポリヌクレオチドのPCR増幅に適する2つのオリゴヌクレオチドを合成した:
IFNa2-1: 5’ CGCGCGCGTCGACAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCACA-3’ (配列番号:109)
IFNa2-2: 5’ GCGCGCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT 3’ ( 配列番号:110)
酵母(yeast S.cerevisiae)における発現
当該技術分野において知られている方法(実施例3を参照のこと)を用いて、酵母(yeast S.cerevisiae)系BXP10へのコンストラクト2249の形質転換を行った。成長の72時間後の静止期に細胞を収集できる。3000gで10分間細胞を澄明化することにより、上清を集める。抗−HSA血清(KentLaboratories)を用いる免疫ブロット検出か一次抗体として、発現レベルを調べる。適切な分子量、88.5kDaのIFNa2アルブミン融合蛋白質を得ることができる。
酵母(yeast S.cerevisiae)細胞のコンストラクト番号;2249から発現されたIFNa2アルブミン融合蛋白質を含む細胞上清は、小規模なDyaxペプチドアフィニティーカラム(実施例4を参照のこと)によるか、または大規模の以下の5工程:ダイアフィルトレーション、DEAE−セファロースFastFlowカラムを用いるアニオン交換クロマトグラフィー、ブチル650Sカラムを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、SP−セファロースFast FlowカラムまたはBlue−セファロースクロマトグラフィーを用いるカチオン交換クロマトグラフィーならびにQ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを用いる高速クロマトグラフィー(実施例4を参照のこと)のいずれかにより精製できる。IFNa2アルブミン融合蛋白質は、100〜250mMのNaCIを用いてDEAE−セファロースFast Flowカラムから、100−250mMのNaClを用いてSP−セファロースFast Flowカラムから、および5〜7.5mS/cmでQ−セファロース高速カラムから溶離されてもよい。N−末端配列は、成熟形態のIFNa2に対応する配列CDLPQ(配列番号:98)を産生する。
方法
コンストラクト番号;2249によりコードされたIFNa2アルブミン融合蛋白質は、実施例76にて既に述べたように、ISRE−SEAPアッセイにおいて、活性について試験できる。すなわち、条件化酵母上清を1:1000希釈にて、ISRE−SEAP/293Fレポーター細胞系へISREシグナル伝達をもたらすそれらの能力について試験した。処置1日前に、ISRE−SEAP/293Fレポーター細胞を、96−ウェルのポリ−D−リジンコーティングされたプレート中に、3×104細胞/ウェルで配置した。次いで、レポーター細胞を18または24時間インキュベーションし、その後、SEAPレポーター遺伝子化学発光アッセイ(Rocheカタログ番号;1779842)において用いるために、40μLを取り出した。組換えヒトインターフェロンベータ“rhIFNb”(Biogen)を正対照として用いた。
IFNa2−HASの精製した調製物は、10−1〜101ng/mL(図5を参照のこと)または10−10〜10−8ng/mL(図6を参照のこと)の範囲の濃度にわたるISRE−SEAPアッセイにおいて相対的に直線的増大を示した。
方法
OAS酵素、2’−5’−オリゴアデニラート合成酵素は、抗ウイルス感染に応答して、インターフェロンにより転写レベルで活性化される。処置するサルから血液試料を得、次いで、これらの試料を2つのOASmRNA、p41およびp69の転写活性化について分析することにより、インターフェロンコンストラクトの効果は、測定できる。全血液の0.5mL量を動物につき異なる7つの時間ポイント、0日目、1日目、2日目、4日目、8日目、10日目および14日目にて1群あたり4匹の動物から得ることができる。様々な群は、ビヒクル対照の注入、1日目における30ug/kgのIFNの静脈内注入、1日目における30ug/kgのIFNの皮下注入、1日目における300ug/kgのIFNの皮下注入、および1、3、5日目の正対照としての40ug/kgのインターフェロンアルファ(Schering−Plough)の皮下注入を含む。p41−OASおよびp69−OASに特異的なプローブを用いるリアルタイム定量的PCR(Taqman)により、p41およびp69mRNA転写物のレベルを測定することができる。OASmRNAレベルは、18SリボソームRNA内因性対照に対して定量できる。コンストラクト2249によりコードされたアルブミン融合物に類似する実験を行うことができる。
IFNaで処置したサルと対照的に、HSインターフェロンで処置したサルにおいて、p41およびp69OASの両方についてのmRNA転写物レベルにおける有意な増大が観察された(p41データについては図7を参照のこと)。効果は約10日間続いた。
IFNアルファアルブミン融合蛋白質は(コンストラクト2249、2343、2410、2366、2382および2381によりコードされたものを含むが、これらに限定されない)を用いて、多発性硬化症を処置、予防、改善および/または検出することができる。他の適応症は、重症急性呼吸症候群(SARS)および他のコロナウイルス感染;エボラウイルスおよびマールブルグウイルスを含むがこれらに限定されないフィロウイルス;Pichendeウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マクポウイルス、Guanaritoウイルスを含むがこれらに限定されないアレナウイルス;およびリンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV);Punta toroウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスおよびfly熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、およびハンタウイルスを含むがこれらに限定されないブンヤウイルス;黄熱病、Banziウイルス、ウエスト・ナイルウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎、オムスク出血熱およびキャサヌ−ル森林病ウイルスを含むがこれらに限定されないフラビウイルス;ベネズエラ、西部および西部ウマ脳炎ウイルス、Ross Riverウイルス、および風疹ウイルスを含むがこれらに限定されないトガウイルス;ワクシニア、牛痘、天然痘、およびサル痘を含むがこれらに限定されないオルトポックス・ウイルス;ヘルペスウイルス;インフルエンザA/B;呼吸Sincytialウイルス(RSV);paraflu;はしか;ライノウイルス;アデノウイルスセムリキ森林熱ウイルス;ウイルス出血熱;ラブドウイルス;ニパウイルスおよびヘンドラウイルスを含むがこれらに限定されないパラミクソウイルス;および最優先疾患物質(すなわち、カテゴリーA、BおよびC物質;例えば、Moran、Emerg.Med.Clin.North.Am.2002;20(2):311−30およびDarlingら.、Emerg.Med.Clin.North Am.2002;20(2):273−309を参照のこと)として疾患制御および予防のために米国センターにより同定されている他のウイルス物質を含むウイルス感染を含むが、これらに限定されない。
コンストラクト番号;3691、pC4:SPCON.BNPI−32/HASは、哺乳類の発現ベクターpC4中の成熟形態のHASのアミノ−末端に融合された処理された活性のあるBNPペプチド(アミノ酸1−32)が後に続く、コンセンサスリーダー配列、secreconを有するBNPアルブミン融合蛋白質をコードするDNAを含む。
BNPをコードするポリヌクレオチドを以下に記載のプライマー、BNP−1およびBNP−2を用いてPCR増幅し、Bam HIlCla 1を用いて開裂し、次いで、Bam Hl/Cla Iで開裂されたpC4:HASにライゲーションし、コンストラクト番号;3691を生じる。コンストラクト番号;3691は、コンセンサスリーダー配列(配列番号:111)および成熟HAS蛋白質が後に続く、BNPの処理された活性形態を含むアルブミン融合蛋白質をコードする(コンストラクト3691については表2の配列番号:321を参照のこと)。
BNP-1: 5'-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTG CTGCTGTG GCCCATGGTGTGGGCCAGCCCCAAGCTGGTGCAAGG -3' (配列番号:463)
BNP-2: 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3' (配 列番号:464).
BNP−1は、Bam HIクローニング部位(下線)、コンセンサスリーダー配列をコードするヌクレオチド(配列番号:111)(イタリック体)およびBNPの初めの7個のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド(太字)を組み込む。BNP−2では、下線を引いた配列はCla I部位であり、それに続くポリヌクレオチドは、BNP(太字)の最後の6個のアミノ酸および成熟HAS蛋白質の初めの10個のアミノ酸をコードするDNAの逆相補を含む。これらの2つのプライマーを用いて、BNP蛋白質をPCR増幅した。アニーリングおよび伸長温度および回数は、特定のプライマーおよび鋳型それぞれについて実験により決定される必要がある。
293F細胞における発現
当該技術分野において知られている方法(実施例6を参照のこと)により、コンストラクト番号3691、pC4:SPCON.BNP1−32/HASを293F細胞フェートランスフェクションした。
トランスフェクションから3日後、2リットルの上清を集めた。組み換え蛋白質を5mlのBlueセファロースCL−6Bカラム(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ、USA)により捕らえ、次いで、2MのNaClにより溶離した。その物質はHiPrep16/10フェニルFF(high sub)カラムに結合され、次いで、20mMのMES、pH6.7により溶離される。リン酸ナトリウムバッファー勾配(200ml中、0−20mS/cm)、pH6.8中のヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにより、BNP−HSAをさらに精製する。最終産物をHiPrep26/10脱塩カラム(AmershamBiosciences)によりPBSpH7.2中へ交換する。
ナトリウム利尿ペプチド受容体−A(NPR−A)はBNPのためのシグナル受容体であり、そしてそのようなものとして、BNPの生物学的効果のほとんどに関与する。BNP生物活性は、活性化の際にGTPをcGMPへ変換する、NPR−Aグアニリルシクラーゼドメインにより介される。BNP活性のための有意なアッセイは、NPR−Aを安定に過剰発現する293F細胞系のBNP刺激を測定することである。BNPに暴露した後の該細胞におけるcGMP産生をcGMPELISAにより測定することができる。
ヒトNPR−AのオープンリーディングフレームをpcDNA3.1発現ベクター(Invitogen)中に構築した。リポフェクタミン法により293F細胞は安定にプラスミドDNAにトランスフェクションされ、次いで、0.8/lg/mlのG418により選択された。293F/NPR−A安定クローンを、組換えBNPの最良の応答についてスクリーニングした。
BNPによるcGMP活性化を293F/NPR−A細胞にて行い、次いで、CatchPoint環状−GMP蛍光アッセイキット(Molecular Devices Sunnyvale,CA,USA)により測定した。すなわち、96−ウェルプレートにて培養した50,000細胞/ウェルの293F/NPR−A細胞を洗浄して、80μlの予備刺激バッファー(10mMのグルコース、pH7.4、15nMの重炭酸ナトリウムおよび0.75mMの3−イソブチル−l−メチルキサンチンを加えたKrebs−Ringer重炭酸塩バッファー)へ加えた。40μlの予備刺激バッファー中のBNP−HSAまたは組換えBNPを、37℃で10分間、細胞へ加えた。40μlの溶解バッファーを用いて10分間攪拌しながら細胞を溶解した。溶解物中のcGMPの量を、製造元の指示に従って定量した。
BNP−HSAおよび組換えBNPの用量応答関係を測定した(図8を参照のこと)。コンストラクト番号;3691および組換えBNPの最大活性は類似しており(それぞれ、1.63±0.016、対して、1.80±0.016pm)、それぞれ、28.4±1.2、および0.46±1.1nMのEC50値を有した。
方法
直接的な血管拡張ならびにレニン/アンジオテンシン/エンドセリン/アルドステロン系の抑制により、BNPは血圧を減少させる。Taconic(Germantown,NY,USA)から購入した3ヶ月齢雄の自然発生的な高血圧ラットにおいて、動脈圧を減少させるBNP−HASの能力を試験した。自然発生的な高血圧ラットは遺伝的に高血圧であり、3ヶ月齢後に高血圧を発症する。ラット1匹あたり0.3ccのPBS中にBNP−HSAまたは組換えBNPを復元した。尾部への静脈注入により薬剤を投与した。XBP−1000系(Kent Scientific,Torrington,CT,USA)を用いてcuff−tail法により、収縮期および拡張期血圧を記録した。それぞれの血圧データポイントにおいて、4−5回、連続してリーディングを行い、ついで、平均した。1/3の収縮期血圧+2/3の拡張期血圧として平均動脈圧(MAP)を算出した。用量応答を測定するために、pC4:SPCONの20時間後に血圧を測定した。BNPI−32/HSAを、0.5、2、6および18nmol/kgの用量で投与した。
自然発生的な高血圧ラットの投与前の典型的な収縮期血圧は180−200mmHgだった。尾部への静脈内注入により投与された単一ボーラスの6nmol/kgのBNP−HASは、収縮期および拡張期血圧を共に低下させ、30mmHgの平均動脈圧(MAP)減少を示した。低下した血圧は安定であり、そして1日間持続し、次いで、数日かけて徐々にベースラインへと戻った(図9を参照のこと)。対照的に、その即時のクリアランスに起因して、単一ボーラスの6nmol/kgの組換えBNPは、非常に一過性である約15mmHgのMAPの減少のみを生じた。
方法
BNPによる細胞内cGMP活性化は、細胞から循環へのその放出をもたらす。血漿cGMPレベルは、BNPが誘導する心血管および腎の生理機能に対応する。血漿cGMPは、インビボBNP作用のためのバイオマーカーとして用いられている。インビボでのBNP−HASによる血漿cGMPの誘導を試験するために、11〜12−週齢の雄C57/BL6マウスに、単一ボーラスの組換えBNPまたはBNP−HASを、6nmol/kg用量で、尾部静脈へ投与した。組換えBNP投与群については5、10、20、40および80分の時間ポイントにて、およびBNP−HAS群についてはさらに640、1440、2880および5760分にて、血漿を尾部血液から調製した。ビヒクル対照としてPBSを用いて処置したマウスからの血漿試料を時間ポイントゼロにて集めた。CatchPoint環状−GMP蛍光アッセイキットにより、製造元の指示に従って、cGMPレベルを測定した。
6nmol/kgの組換えBNPまたはBNP−HASの単一静脈内ボーラスの後、ピ−ク血漿cGMPレベルはそれぞれベースラインの3.9−または5.6−倍に増大した(図10を参照のこと)。加えて、組換えBNP処置の後のcGMPの1相崩壊半減期は16分であり(10〜42分、95%のCI)、一方で、BNP−HSA投与後のcGMPの1相崩壊半減期は1538分(1017〜3153分、95%のCI)だった。
方法
11〜12週齢の雄C57/BL6マウス(Ace Animals,Boyertown,PA,USAから得た)は、研究時にて、25.1±0.12gの体重だった。全ての動物は10ml/kg体重の用量で投与された。予め投与の動物はPBSを注入した。組換えBNPを、尾部または肩甲骨中間領域の皮下に静脈内注入した。
予め投与した試料中に検出された、血漿中のBNP−HASの平均ベースライン濃度は約0.081−0.095μg/mlだった。単一の静脈内または皮下注入の後、BNP−HASは、11.2(静脈内デリバリー)または19.3時間(皮下デリバリー)の終末排出半減期を有し、一方で、マウスにおける組換えBNPの半減期は3.1分だった。BNP−HASのノンコンパートメント分析は、BNP−HASが以下の特徴を有することを明らかにした:
表9.
コンストラクト番号;3618、pC4:SPCON.BNP1−32(2×)/HASは、哺乳類の発現ベクターpC4中の成熟形態のHASのアミノ−末端にタンデム融合された2つのプロセッシングされた活性のあるBNPペプチド(アミノ酸1−32)が後に続く、コンセンサスリーダー配列、セクレトンを有するBNPアルブミン融合蛋白質をコードするDNAを含む。
複製BNP部分をコードするポリヌクレオチドを初めに、以下に述べるように4つのプライマーBNP−1、BNP−2、BNP−3およびBNP−4を用いてBNP(アミノ酸1−32)のプロセッシングされた活性形態からPCR増幅して、2つの断片AおよびBを作製する。増幅後、2つの精製された断片(AおよびB)を等モル量で混合し、そして、PCR鋳型として用い、次いで、以下に述べるようにプライマーBNP−5およびBNP−6を用いて増幅した。次いで、BNP(2×)インサートをBamHIおよびClaIを用いて消化し、次いで、BamHIおよびClaIを用いて予め消化されたpC4HSAベクターにライゲーションし、コンストラクト3618を産生する。コンストラクト番号;3618は、成熟HSA蛋白質が後に続く、コンセンサスリーダー配列、セクレコン(配列番号:lll)およびBNPのプロセッシングされた活性形態の2つのタンデムコピーを含むアルブミン融合蛋白質をコードする(コンストラクト3618については表2の配列番号:483を参照のこと)。
BNP-1 5'AGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTG GCTGGGCT GCAAAGTGCTGAGGCGGCAT-3' (配列番号:486)
BNP-2 5'-CCTTGCACCATCTTGGGGCTATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3' (配列番号:487)
BNP-3 5'-GCAAAGTGCTGAGGCGGCATAGCCCCAAGATGGTGCAAGG-3' (配列番号:488)
BNP-4 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTC AGCACTTTGC-3' (配列番号:489)
BNP-5: 5'-GAGCGCGGATCCAAGCTTCCGCCATCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT GTGGCCCATGGTGTGGGCCAGCCCCAAGCTGGTGCAAGG -3' (配列番号:463)
BNP-6: 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCATGCCGCCTCAGCACTTTGC-3' (配列番号:464)
293F細胞における発現
当該技術分野において知られている方法(実施例6を参照のこと)により、コンストラクト番号;3618、pC4:SPCON.BNP1−32(2×)/HASを293F細胞にトランスフェクションした。
コンストラクト番号;3618によりコードされたpC4:SPCON.BNP1−32(2×)/HSAを、実施例80、「203F細胞上清からの精製」と題するサブセクションにおいて既に述べたように精製した。
コンストラクト番号;3618によりコードされたBNP(2×)−HSAの活性は、実施例80、「BNP−HASのアッセイはインビトロNPR−A/cGMPアッセイを用いてアッセイできる」および「NPR−A203F安定クローンのスクリーニング方法」と題するサブセクションにおいて既に述べたように、NPR−A/cGMPアッセイを用いてインビトロでアッセイできる。
BNP(2×)−HSAおよび組換えBNPの用量応答関係を測定した(図8を参照のこと)。コンストラクト番号;3618によりコードされるBNP(2×)−HASおよび組換えBNPの最大活性は類似しており(それぞれ、1.680.021、対して、1.800.016pm)、それぞれ9.8±1.1、および0.46±1.1nMのEC50値を有する。
A.以下の指示は、明細書の表3に記載の寄託した生物材料に関連する。
B.寄託物の特定:受託機関名:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
受託機関住所:10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110−2209
United States of America
出願人は、出願を基礎としてカナダ特許が発行されたか、または出願が拒絶され、もしくは放棄されかつ回復の可能性がないか、もしくは取下げされるまでは、特許庁長官は、出願に引用されている寄託生物材料のサンプルを、長官に指名された個々の専門家にのみ提供する権限を有するよう、請求する。本出願人は、国際出願の公開のための手続的準備が完了する前に、上申書により国際事務局へ通知する必要がある。
出願人は、(ノルウェー特許庁によって)出願が公衆の閲覧のために公開されるか、または公開されずにノルウェー特許庁によって最終決定されるまでは、当該分野の専門家にのみサンプルを提供されるよう、請求する。この効果の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公衆に利用可能となる時点より前に、出願人がノルウェー特許庁に提出するものとする。出願人によってそのような請求が申請された場合、第三者によるサンプル提供のいかなる要求も、専門家がそれを用いることを示さなくてはならない。その専門家は、ノルウェー特許庁が作成した公認専門家のリストに記載された任意の者、または個々の場合には出願人が認めた任意の者であればよい。
出願人は、特許付与の前、または出願の失効、拒絶もしくは取下げの前に、微生物のサンプルは、本発明に利害関係を有しない技術者の受け取り手に対してのみ提供されるよう、ここに強調する(オーストラリア特許法規則 規則3.25(3))。
出願人は、(国家特許登録庁によって)出願が公衆の閲覧のために公開されたか、または公開されずに国家特許登録庁によって最終決定されるまでは、サンプルは当該分野の専門家にのみ提供されるよう、ここに請求する。
出願人は、微生物サンプルは専門家にのみが入手可能なように提供されるよう、ここに請求する。この効果の請求は、出願の国際公開の手続的準備が完了する前に、出願人が国際事務局へ提出するものとする。
出願人は、(デンマーク特許庁によって)出願が公衆の閲覧のために公開されるか、または公開されずにデンマーク特許庁によって最終決定される前に、サンプルは当該分野の専門家にのみ提供されるよう、ここに請求する。この効果の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条(3)に基づき出願が公衆に利用可能となる時点より前に、出願人がデンマーク特許庁に提出するものとする。出願人によってそのような請求が申請された場合、第三者によるサンプル提供のいかなる要求も、専門家がそれを用いることを示さなくてはならない。専門家は、デンマーク特許庁が作成した公認専門家のリストに記載された者、または個々の場合には出願人が認めた任意の者であればよい。
出願人は、(スウェーデン特許庁によって)出願が公衆の閲覧のために公開されるか、または公開されずにスウェーデン特許庁によって最終決定される前に、サンプルは当該分野の専門家にのみ提供されるよう、ここに請求する。この効果の請求は、優先日から16月以内に、出願人が国際事務局に提出するものとする(PCT出願人ガイド第1貫の付録Zに掲載された様式PCT/RO/134が好ましい)。出願人によってそのような請求が申請された場合、第三者によるサンプル提供のいかなる要求も、専門家がそれを用いることを示さなくてはならない。その専門家はスウェーデン特許庁が作製した公認専門家のリストに記載された者、または個々の場合には出願人が認めた任意の者であればよい。
出願人は、オランダ特許が登録される日まで、または出願が拒絶もしくは取下げもしくは失効される日までに、特許規則第31F(1)で規定されるように、微生物サンプルは専門家のみが入手可能となるよう供給されるように、ここに請求する。この効果の請求は、出願がオランダ王国特許法第22条Cまたは第25条に基づいて利用可能となる日のいずれか早い日よりも前に、出願人がオランダ知的財産庁に提出するものとする。
Claims (29)
- (a)治療用蛋白質:Xと、配列番号:1のアミノ酸配列を含むアルブミン;
(b)治療用蛋白質:Xと、アルブミン活性を有する配列番号:1のアミノ酸配列の断片もしくは変異体;
(c)治療用蛋白質:Xと、非融合状態の治療用蛋白質:Xの貯蔵寿命と比べて治療用蛋白質:Xの貯蔵寿命を延長し得るアルブミン活性をさらに有する、配列番号:1のアミノ酸配列の断片もしくは変異体;
(d)治療用蛋白質:Xと、アルブミン活性を有し、さらに配列番号:1のアミノ酸1〜387のアミノ酸配列を含む、配列番号:1のアミノ酸配列の断片もしくは変異体;
(e)治療用蛋白質:Xの生物活性を有する治療用蛋白質:Xの断片もしくは変異体と、配列番号:1のアミノ酸配列を含むアルブミン;
(f)治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(e)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのN−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のN−末端に融合されている;
(g)治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(e)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのC−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のC−末端に融合されている;
(h)治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(e)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのN−末端およびC−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のN−末端およびC−末端に融合されている;
(i)第一の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体、および第二の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体を含み、第一の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体は第二の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と異なるものである、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(e)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体;
(j)治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(i)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体はリンカーによりアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体から分離されている;および
(k)治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体と、(a)〜(j)のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、アルブミン融合蛋白質は、以下の式:
R1−L−R2;R2−L−R1;またはR1−L−R2−L−R1
を有し、さらに、R1は治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体であり、Lはペプチドリンカーであり、およびR2は配列番号:1のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体である;
からなる群より選択されるメンバーを含む、アルブミン融合蛋白質。 - アルブミン融合蛋白質の貯蔵寿命または血漿安定性が、非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性よりも大きい、請求項1記載のアルブミン融合蛋白質。
- アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性が、非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性よりも大きい、請求項1記載のアルブミン融合蛋白質。
- アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性が、非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性よりも大きい、請求項1記載のアルブミン融合蛋白質。
- 配列番号:1のアミノ酸配列またはその断片もしくは変異体を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体に挿入された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体を含む、アルブミン融合蛋白質。
- (a)配列番号:1のアミノ酸54〜61;
(b)配列番号:1のアミノ酸76〜89;
(c)配列番号:1のアミノ酸92〜100;
(d)配列番号:1のアミノ酸170〜176;
(e)配列番号:1のアミノ酸247〜252;
(f)配列番号:1のアミノ酸266〜277;
(g)配列番号:1のアミノ酸280〜288;
(h)配列番号:1のアミノ酸362〜368;
(i)配列番号:1のアミノ酸439〜447;
(j)配列番号:1のアミノ酸462〜475;
(k)配列番号:1のアミノ酸478〜486;および
(1)配列番号:1のアミノ酸560〜566:
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体に挿入された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体を含む、アルブミン融合蛋白質。 - 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性と比べて、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項5記載のアルブミン融合蛋白質。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性と比べて、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項6記載のアルブミン融合蛋白質。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性と比べて、アルブミンに融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項5記載のアルブミン融合蛋白質。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性と比べて、アルブミンに融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビトロ生物活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項6記載のアルブミン融合蛋白質。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性と比べて、アルブミンに融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項5記載のアルブミン融合蛋白質。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性と比べて、アルブミンに融合された治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体のインビボ生物活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項6記載のアルブミン融合蛋白質。
- グリコシル化されていない、請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質。
- 酵母において発現される、請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質。
- 酵母がグリコシル化欠損である、請求項14記載のアルブミン融合蛋白質。
- 酵母がグリコシル化およびプロテアーゼ欠損である、請求項14記載のアルブミン融合蛋白質。
- 哺乳類細胞により発現される、請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質。
- アルブミン融合蛋白質が培養下の哺乳類細胞により発現される、請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質。
- アルブミン融合蛋白質が分泌リーダー配列をさらに含む、請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質および医薬上許容される担体を含む、組成物。
- 請求項20記載の組成物を含むキット。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質を投与する段階を含む、患者における疾患または障害の処置方法。
- 該疾患または障害が適応症:Yを含む、請求項22記載の方法。
- 有効量の請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質を投与する段階を含む、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体により調節される疾患または障害を有する患者の処置方法。
- 該疾患または障害が適応症:Yである、請求項24記載の方法。
- 非融合状態の治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命と比べて、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンまたはその断片もしくは変異体に治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体を融合させる工程を含む、治療用蛋白質:Xまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命または血漿安定性を延長する方法。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載のアルブミン融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
- 請求項27記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項28記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
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