BRPI0712383A2

BRPI0712383A2 - proteìnas de fusão da albumina

Info

Publication number: BRPI0712383A2
Application number: BRPI0712383-3A
Authority: BR
Inventors: Craig A Rosen; Adam Bell; David W Lafleur; Douglas B Woods; Ping Feng; Rodger G Smith
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 2006-06-07
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2012-07-10
Also published as: US8969538B2; WO2007146038A9; IL195625A0; WO2007146038A2; EP2474318A1; AU2007258609A1; US20090029914A1; AU2007258609B2; CA2654055A1; EP2046367A2; US8334365B2; IL212538A0; US20130108606A1; IL222924A0; IL195625A; WO2007146038A3; EP2046367A4

Abstract

PROTEìNAS DE FUSãO DA ALBUMINA. A presente invenção se refere às proteínas de fusão da albumina. A invenção também se refere às moléculas de ácido nuclé iço codificando as proteínas de fusão da albumina, bem como aos vetores contendo esses ácidos nucléicos, células hospedeiras transformadas com esses vetores de ácido nucléico e aos métodos para obtenção das proteínas de fusão da albumina além do emprego desses ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras. Adicionalmente, a presente invenção se refere às composições farmacêuticas compreendendo as proteínas de fusão da albumina e aos métodos de tratamento, prevenção ou melhora das doenças, transtornos ou condições empregando as proteínas de fusão da invenção.

Description

"PROTEÍNAS DE FUSÃO DA ALBUMINA"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 U.S.C. § 119 (e) baseado no Pedido de Patente Provisório US número 60/811.405, depositado em 7 de junho de 2006. O 5 Pedido de Patente Provisório mencionado acima é incorporado aqui como referência, em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTA DE SEQÜÊNCIAS NO CD

Este pedido se refere a uma "Lista de Seqüências" relacionada abaixo, que é dada em forma de um documento eletrônico em quatro discos compactos idênticos (CD-R), rotulados "Cópia 1", "Cópia 2", "Cópia 3" e "CRF". Cada um destes discos compactos contém o arquivo "PF618PCT Sequence Listing. txt" (1.076.453 bytes criado em 7 de junho de 2007) que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere em linhas gerais às proteínas Terapêuticas (incluindo, sem limitação, pelo menos um polipeptídeo, anticorpo, peptídeo, ou seu fragmento e variante) fundidas a albumina ou a fragmentos ou variantes de albumina. A presente invenção abrange polinucleotídeos que codificam proteínas terapêuticas de fusão a albumina, proteínas terapêuticas de fusão a albumina, composições, composições farmacêuticas, formulações e kits. Células hospedeiras transformadas com os polinucleotídeos que codificam proteínas terapêuticas de fusão a albumina são também abrangidas pela invenção, assim como métodos de preparação de proteínas de fusão a albumina da invenção usando estes polinucleotídeos e/ou células hospedeiras.

A albumina sérica humana (HSA ou HA) uma proteína de 585 aminoácidos na sua forma madura (conforme mostrado na Figura 1 (SEQ ID NO: 1)) é responsável por uma 25 proporção significativa da pressão osmótica do soro e também funciona como um veículo de ligantes endógenos e exógenos. Atualmente, HA para uso clínico é produzida por extração do sangue humano. A produção de HA recombinante (HAr) em microorganismos foi descrita em EP 330 451 e em EP 361 991.

As proteínas terapêuticas no seu estado nativo ou quando produzidas de modo recombinante, tais como interferons e hormônios de crescimento, são tipicamente moléculas instáveis que apresentam vida útil em prateleira curta, especificamente quando formuladas em soluções aquosas. A instabilidade destas moléculas quando são formuladas para administração, determina que muitas das moléculas devem ser liofilizadas e refrigeradas durante toda a vida útil, tornando difícil o transporte e/ou armazenagem das moléculas. Os 35 problemas com a armazenagem são especificamente graves quando as formulações farmacêuticas devem ser armazenadas e dispensadas fora do ambiente hospitalar.

Poucas soluções práticas para os problemas de armazenagem de moléculas de proteínas instáveis foram propostas. Conseqüentemente, existe a necessidade de formulações estabilizadas, de longa duração de moléculas terapêuticas proteináceas que são facilmente dispensadas, de preferência com uma simples formulação exigindo um mínimo de manipulação pós-armazenagem.

Por administração in vivo, as proteínas terapêuticas no seu estado nativo ou quando são recombinantemente produzidas, tais como interferons e hormônios de crescimento, apresentam uma estabilidade curta no plasma devido à rápida eliminação da corrente sangüínea. Conseqüentemente, os efeitos terapêuticos providos por estas proteínas são também de curta duração. Portanto, para se sustentar o seu efeito terapêutico desejado in vivo, a eliminação rápida destas proteínas do sangue determina que as moléculas terapêuticas devam ser administradas com maior freqüência ou a uma dose mais alta. No entanto, aumentando-se o programa de dosagem para a administração da proteína terapêutica freqüentemente resulta em um aumento em reações no sítio da injeção, efeitos secundários e toxicidade no paciente. De modo análogo, a administração da proteína terapêutica a uma dose mais alta também resulta habitualmente em um aumento da toxicidade e dos efeitos secundários no paciente.

As poucas soluções práticas para se aumentar a estabilidade de moléculas terapêuticas no plasma que foram propostas, incluindo a conjugação química, forneceram um benefício limitado ao paciente. Geralmente, na maioria dos casos, estas moléculas terapêuticas quimicamente modificadas ainda são administradas num programa de dosagem freqüente, conservando um número significativo de reações no sítio da injeção, efeitos secundários e toxicidade nos pacientes. Conseqüentemente, há a necessidade de uma forma estabilizada de moléculas terapêuticas que conserve uma estabilidade mais elevada no plasma in vivo do que o produto terapêutico nativo ou o recombinantemente produzido sozinho e pode ser administrada com menor freqüência, reduzindo assim os efeitos secundários potenciais ao paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção abrange proteínas de fusão da albumina compreendendo uma proteína Terapêutica (um polipeptídeo, anticorpo ou peptídeo, ou seu fragmento ou variante) fundida à albumina ou a um fragmento (porção) ou variante da albumina. A presente invenção também abrange polinucleotídeos que compreendem, ou alternativamente que consistem em moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína Terapêutica (um polipeptídeo, anticorpo, ou peptídeo ou seu fragmento ou variante, por exemplo) fundida a albumina ou a um fragmento (porção) ou variante da albumina. A presente invenção 35 também abrange polinucleotídeos, compreendendo ou consistindo alternativamente em moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas compreendendo uma proteína Terapêutica (um polipeptídeo, anticorpo, ou peptídeo, ou seu fragmento ou variante, por exemplo) fundida à albumina ou a um fragmento (porção) ou variante da albumina, que é suficiente para prolongar o tempo de armazenagem da proteína Terapêutica para aumentar a estabilidade da proteína Terapêutica no plasma em comparação com o estado não fundido, e/ou estabilizar a proteína Terapêutica e/ou sua atividade em solução (ou em uma composição farmacêutica) in vitro e/ou in vivo. As proteínas de fusão da albumina codificadas por um polinucleotídeo da invenção são também abrangidas pela invenção, como são também as células hospedeiras transformadas com polinucleotídeos da invenção, e métodos de produzir as proteínas de fusão sa albumina da invenção e de se usar estes polinucleotídeos da invenção, e ou células hospedeiras.

Em um aspecto preferido da invenção, as proteínas de fusão da albumina incluem, mas sem limitação, as descritas na tabela 2 e os polinucleotídeos codificando tais proteínas.

A invenção também abrange formulações farmacêuticas compreendendo uma proteína de fusão da albumina da invenção e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Tais formulações podem se encontra em um kit ou em um recipiente. Tal kit ou 15 recipiente pode ser acondicionado com instruções referentes ao tempo de armazenagem da proteína Terapêutica. Tais formulações podem ser usadas em métodos de tratamento, prevenção, melhora ou diagnóstico de uma doença ou sintoma mórbido em um paciente, de preferência em um mamífero, sendo o mais preferível em um ser humano, compreendendo a etapa de se administrar a formulação farmacêutica ao paciente.

Em outras modalidades, a presente invenção abrange métodos de se prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou transtorno. Nas modalidades preferidas, a presente invenção abrange m método de se tratar uma doença ou transtorno relacionados na coluna "Indicação Preferida: Y" da Tabela 1 compreendendo a administração a um paciente em que tal tratamento, prevenção ou melhora é desejado, uma proteína de fusão da albumina da 25 presente invenção que compreende uma proteína Terapêutica ou porção correspondendo a uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) descritas na coluna "Proteína Terapêutica: X na Tabela 1 (na mesma carreira que a doença ou transtorno a ser tratado que foi relacionado na coluna "Indicação Preferida: Y" da Tabela 1) numa quantidade efetiva para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou transtorno. Em uma modalidade, uma proteína de fusão da albumina descrita na Tabela 1 ou 2

tem uma vida útil em prateleira prolongada.

Em uma segunda modalidade, uma proteína de fusão da albumina descrita na Tabela 1 ou 2 é mais estável do que a molécula Terapêutica não fundida correspondente descrita na Tabela 1.

A presente invenção inclui ainda organismos transgênicos modificados para conter as moléculas de ácido nucléico da invenção (incluindo, mas sem limitação, polinucleotídeos descritos nas Tabelas 1 e 2), modificadas, de preferência, para expressar uma proteína de fusão da albumina da presente invenção.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

A Figura 1 A-D mostra a seqüência de aminoácidos da forma madura da albumina humana (SEQ ID NO: 1) e um polinucleotídeo que a codifica (SEQ ID NO: 2). Nucleotídeos 5 1a 1755 de SEQ ID NO: 2 codificam a forma madura de albumina humana (SEQ ID NO: 1).

A Figura 2 mostra o mapa de restrição do vetor de clonagem pPPC0005 ATCC de depósito PTA-32378.

A Figura 3 mostra o mapa de restrição do vetor de expressão pSAC35 de S.cerevisiae (Sleep e outros., BioTechnoIogy 8:42 (1990)). 10

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições

As definições abaixo são dadas para facilitar a compreensão de determinados termos usados em todo o presente relatório.

Conforme empregado no presente, "polinucleotídeo" se refere a uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão que compreende, ou alternativamente consiste em, pelo menos uma molécula de albumina (ou seu fragmento ou variante) ligada em quadro a pelo - uma proteína Terapêutica X (ou seu fragmento ou variante); uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que compreende, ou alternativamente que consiste, na SEQ ID NO: de aminoácidos de SEQ ID NO: Y (conforme descrita na coluna 6 da Tabela 2) ou seu fragmento ou variante; uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que compreende ou que alternativamente consiste na seqüência mostrada em SEQ ID NO: X; uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que compreende ou 25 alternativamente conte na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: Z; uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão da albumina da invenção gerada conforme descrito na tabela 2 ou nos Exemplos; uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão da albumina Terapêutica da invenção, uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeos contida em uma construção de fusão da albumina descrita na tabela 2, uma molécula de ácido nucléico apresentando uma seqüência de nucleotídeos contida em uma construção de fusão da albumina depositada com a ATCC (conforme descrito na Tabela 3).

Conforme empregado no presente documento, "construção de fusão da albumina" se refere a uma molécula de ácido nucléico que compreende, ou alternativamente que consiste em um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de albumina (ou seu fragmento ou variante) ligada em quadro a pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante); uma molécula de ácido nucléico que compreende ou que alternativamente consiste em um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de albumina (ou seu fragmento ou variante) ligada em quadro a pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) gerada conforme descrito na tabela 2 ou nos Exemplos; ou uma molécula de ácido nucléico que compreende, ou alternativamente consiste em um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de albumina (ou seu fragmento ou variante) ligada em quadro a pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) compreendendo ainda, por exemplo, um ou mais dos seguintes elementos: (1) um vetor auto-replicante funcional (incluindo, sem limitação, um vetor de vaivém, um vetor de expressão, um vetor de integração e/ou um sistema de replicação), (2) uma região para a iniciação da transcrição (uma região de promotor, por exemplo, tal como, por exemplo, um promotor regulável ou induzível, um promotor constitutivo), (3) uma região para a terminação da transcrição, (4) uma seqüência líder, e (5) um marcador selecionável. O polinucleotídeo que codifica a proteína Terapêutica e a proteína de albumina, uma vez parte da construção de fusão da albumina, pode cada um deles ser designado como sendo "porção", "região" ou "fração" da construção de fusão de albumina

A presente invenção se refere em linhas gerais aos polínucleotídeos que codificam proteínas de fusão de albumina; proteínas de fusão de albumina; e métodos de tratamento, prevenção ou melhoramento de doenças ou transtornos usado proteínas de fusão de albumina ou polínucleotídeos que codificam proteínas de fusão de albumina. Conforme empregado no presente, "proteína de fusão da albumina" se refere a uma proteína formada pela fusão de pelo menos uma molécula de albumina (ou seu fragmento ou variante) a pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante). Uma proteína de fusão da albumina da presente invenção compreende pelo menos um fragmento ou variante sua de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante da albumina sérica humana, que são associados entre si pela fusão genética (isto é, a proteína de fusão da albumina é gerada por tradução de um ácido nucléico em que um polinucleotídeo que codifica toda a proteína Terapêutica ou uma porção dela está ligado em quadro com um polinucleotídeo que codifica toda a albumina ou uma porção dela). A proteína Terapêutica e a proteína da albumina, uma vez parte da proteína de fusão da albumina, pode cada uma delas ser designada como "porção", "região' ou "fração" da proteína de fusão da albumina (uma "porção de proteína Terapêutica" ou uma "porção de proteína da albumina"). Em uma modalidade extremamente preferida, uma proteína de fusão da albumina da invenção compreende pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica X ou seu fragmento ou variante (incluindo, sem limitação, uma forma madura da proteína Terapêutica X) e pelo menos uma molécula de albumina ou seu fragmento ou variante (incluindo, sem limitação, uma forma madura de albumina).

Em outra modalidade preferida, uma proteína de fusão de albumina da invenção é processada por uma célula hospedeira e secretada para dentro do meio de cultura envolvente. O processamento da proteína de fusão da albumina nascente que ocorre nos trajetos secretores da hospedeira usada para a expressão pode incluir, sem limitação, clivagem de sinal de peptídeo; formação de ligações dissulfeto; dobramento adequado, adição e processamento de carboidratos (tal como , por exemplo, a glicosilação associada a N e O); clivagens proteolíticas específicas; e montagem em proteínas multiméricas. Uma proteína de fusão da albumina da presente invenção se encontra, de preferência, na forma processada. Em uma modalidade extremamente preferida, a "forma processada de uma proteína de fusão da albumina" se refere a um produto de proteína de fusão da albumina que tenha sofrido a clivagem de peptídeo de sinal de término N a que se refere no presente documento como "proteína de fusão da albumina madura". Em diversos casos, um clone representativo contendo uma construção de fusão da

albumina da presente invenção foi depositado com a American Type Culture Collection (a que se refere no presente como "ATCC®"). Além disso, é possível se recuperar uma construção de fusão da albumina dada do depósito por técnicas conhecidas na técnica e descritas em outros pontos no presente documento. A ATCC® se localiza a 10801 University Boulevard1 Manassas, Virgínia 201102209, Estados Unidos. Os depósitos de ATCC® foram feitos consoante os termos do tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismos para os fins de procedimento de patentes.

Em uma modalidade, a invenção obtém um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente consiste em uma proteína Terapêutica e uma proteína albumina sérica. Em outra modalidade, a invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende ou alternativamente consiste em uma proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Em uma modalidade preferida, a invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente consiste em uma proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica codificada por um polinucleotídeo descrito na tabela 2. Em outra modalidade preferida, a invenção obtém um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina cuja seqüência é mostrada na SEQ ID NO: Y na Tabela 2. Em outras modalidades, a invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende ou alternativamente consiste em um fragmento biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo de uma proteína 35 Terapêutica e uma proteína de albumina séricas. Em outras modalidades, a invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente consiste em uma variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de uma proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Nas modalidades preferidas, o componente proteína de albumina sérica da proteína de fusão da albumina é a porção madura da albumina sérica. A invenção abrange ainda polinucleotídeos que codificam estas as proteínas de fusão da albumina.

Em outras modalidades, a presente invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente consiste em uma proteína Terapêutica e um fragmento biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo da albumina sérica. Em outras modalidades, a presente invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente consiste em uma proteína Terapêutica e uma variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de albumina sérica. Nas modalidades preferidas, a porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina é a porção madura da proteína Terapêutica; Em outra modalidade preferida, a porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina é o domínio solúvel extracelular da proteína Terapêutica. Em uma modalidade alternativa, a porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina é a forma ativa da proteína Terapêutica. A invenção abrange ainda polinucleotídeos que codifica estas as proteínas de fusão da albumina.

Em outras modalidades, a invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende ou alternativamente consiste em um fragmento ou variante biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo da albumina sérica. Nas modalidades preferidas, a presente invenção obtém uma proteína de fusão da albumina que compreende, ou alternativamente que consiste na porção madura de uma proteína Terapêutica e a porção madura de albumina sérica. A invenção ainda abrange polinucleotídeos que codificam estas as proteínas de fusão da albumina.

Proteínas Terapêuticas

Conforme declarado acima, um polinucleotídeo da invenção codifica uma proteína que compreende ou alternativamente consiste em pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante de albumina sérica humana que são associadas entre si, de preferência por fusão genética.

Uma modalidade adicional inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína que compreende ou que alternativamente consiste em pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante da albumina sérica humana, que são ligados entre si por conjugação química.

Conforme usado no presente documento, "proteína Terapêutica" se refere às proteínas, polipeptídeos, anticorpos, peptídeos ou fragmentos ou variantes sua, que têm uma ou mais atividades terapêuticas e/ou biológicas. As proteínas Terapêuticas abrangidas pela invenção incluem, sem limitação, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos e produtos biológicos. (Os termos peptídeos, proteínas e polipeptídeos são usados indiferentemente no presente documento). Especificamente se pretende que o termo "proteína Terapêutica" abranja anticorpos e fragmentos ou variantes suas. Portanto, uma proteína da invenção pode conter pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e/ou pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo. Além disso, o termo "proteína Terapêutica" pode se referir a correlatos de uma proteína Terapêutica endógenos ou que ocorrem naturalmente.

Um polipeptídeo que apresenta uma "atividade terapêutica" ou uma proteína que é "terapeuticamente ativa" significa um polipeptídeo que possui uma ou mais atividades biológicas e/ou terapêuticas conhecidas associadas com uma proteína terapêutica tal como uma ou mais das proteínas Terapêuticas descritas no presente documento ou de outro modo conhecidas na técnica. Como um exemplo não limitante, uma "proteína Terapêutica" é uma proteína que é útil para o tratamento, prevenção ou melhora de uma doença, condição ou transtorno. Como um exemplo não limitante, uma "proteína Terapêutica" pode ser uma que se liga especificamente a um tipo específico de célula (normal (linfócitos, por exemplo) ou anormais, por exemplo, (células cancerígenas)) e pode ser usada, portanto, para lançar um composto (medicamento, ou agente citotóxico) contra aquele tipo de célula especificamente.

Uma lista não exaustiva de porções "proteína Terapêutica", por exemplo, que podem ser constituídas por uma proteína de fusão da albumina da invenção inclui, mas sem limitação, oxintomodulina, CGRP, IGF-1, butiril colesterase, somatostatina-28, urocortina I, urocortina II, glicocerebrosidase, glucagon, e fenilalanina hidroxilase.

Em outro exemplo não limitante, uma "proteína Terapêutica" é uma proteína que tem uma atividade biológica, e especificamente uma atividade biológica que é útil para o tratamento, prevenção ou melhora de uma doença. Uma lista não inclusiva de atividades biológicas que podem ser apresentadas por uma proteína Terapêutica inclui a inibição de infecção de células por HIV-1, estimulação de proliferação de células epiteliais intestinais, redução da permeabilidade de células epiteliais intestinais, estimulação de secreção de insulina, indução de bronquiodilatação, e vasodilatação, inibição de secreção de aldosterona e de renina, regulação da pressão sangüínea, promoção de crescimento neuronal, intensificação de uma resposta imune, intensificação de inflamação, supressão de apetite ou qualquer uma ou mais das atividades biológicas descritas na Seção "Atividades Biológicas" abaixo e/ou conforme descrito para uma proteína Terapêutica dada na Tabela 1 (coluna 2)

Conforme empregado no presente, "atividade terapêutica" ou "atividade" pode se referir a uma atividade cujo efeito é consistente com um resultado terapêutico desejável em seres humanos ou a efeitos desejados em mamíferos não humanos ou em outras espécies ou organismos. A atividade terapêutica pode ser medida in vivo ou in vitro. Um efeito desejável, por exemplo, pode ser avaliado em cultura celular. Tais ensaios in vitro ou de cultura celular são habitualmente disponíveis para muitas proteínas Terapêuticas conforme descrito na técnica. Exemplos de ensaios incluem, sem limitação, aqueles descritos no presente documento na seção de Exemplos ou na coluna "Ensaio de Atividade Exemplar" (coluna 3) da Tabela 1.

As proteínas Terapêuticas que correspondem a uma porção da proteína

Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, tais como proteínas da superfície celular e secretoras são freqüentemente modificadas pela ligação de um ou mais grupos oligossacarídeos. A modificação a que se refere como glicosilação.pode afetar dramaticamente as propriedades físicas de proteínas e pode ser importante na estabilidade, secreção e localização da proteína. A glicosilação ocorre em locais específicos ao longo da estrutura principal do polipeptídeo. Há geralmente dois tipos principais de glicosilação: glicosilação caracterizada por oligossacarídeos ligados por O, que são ligados a resíduos de serina ou treonina; e glicosilação caracterizada por oligossacarídeos ligados por N que são ligados a resíduos de asparagina em uma seqüência Asn—X-Ser ou Asn-X-Thr, em que χ pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. O ácido N-acetil neurâmico (também conhecido como ácido siálico) é geralmente o resíduo término tanto de oligossacarídeos ligados por N como ligados por O. Variáveis tais como estrutura de proteína e tipo de célula influenciam o número e a natureza das unidades carboidrato no interior das cadeias a sítios de glicosilação diferentes. Os isômeros de glicosilação são também comuns no mesmo sítio no interior de um tipo dado de célula.

As proteínas Terapêuticas que correspondem a uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, assim como análogos e variantes suas, podem ser modificadas de modo tal, que a glicosilação em um ou mais sítios é alterada como resultado da(s) manipulação(ões) da sua seqüência de ácidos nucléicos, pela célula hospedeira em que elas foram expressas, ou devido a outras condições da sua expressão. Os isômeros de glicosilação, por exemplo, podem ser produzidos abolindo-se ou introduzindo-se sítios de glicosilação, por substituição ou deleção de resíduos de aminoácidos, por exemplo, tais como substituição de asparagina por glutamina ou as proteínas recombinantes não glicosiladas podem ser produzidas pela expressão de proteínas em células hospedeiras que não irão glicosilá-las, tais como em E. coli, ou levedura deficiente em glicosilação. Estas abordagens são descritas com mais detalhes abaixo e são conhecidas na técnica.

Proteínas Terapêuticas, especificamente as descritas na Tabela 1, e suas seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos são bem conhecidas na técnica e disponíveis 35 em bases de dados públicas tais como Chemical Abstracts Services Databases (o Registro CAS, por exemplo), GenBank e bases de dados providas por subscrição, tais como GenSeq (Derwent, por exemplo). As seqüências de nucleotídeos exemplares de proteínas Terapêuticas que podem ser usadas para se derivar um polinucleotídeo da invenção são apresentadas na coluna 7 "SEQ ID NO: X" da Tabela 2. As seqüências mostradas como SEQ ID NO: X podem ser uma seqüência de polinucleotídeo do tipo selvagem codificando uma proteína Terapêutica dada (ou de comprimento total ou madura, por exemplo) ou em alguns casos, a seqüência pode ser uma variante da seqüência de polinucleotídeo do tipo selvagem (um polinucleotídeo que codifica a proteína Terapêutica do tipo selvagem, por exemplo, em que a seqüência de DNA do polinucleotídeo foi otimizada para expressão em uma espécie específica, por exemplo; ou um polinucleotídeo que codifica uma variante da proteína Terapêutica do tipo selvagem (isto é, um mutante direcionado a sítio; uma variante alélica)). Os versados na técnica são perfeitamente capazes de usar a seqüência mostrada como SEQ ID NO: X para derivar a construção descrita na mesma carreira. Se SEQ ID NO: X corresponder, por exemplo, a uma proteína de comprimento total, mas somente uma porção daquela proteína for usada para gerar a CID específica, os versados na técnica serão capazes de se valer das técnicas de biologia molecular, tais como POR, para amplificar o fragmento específico e cloná-lo no vetor apropriado.

As proteínas Terapêuticas adicionais correspondentes a uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção incluem, sem limitação, uma ou mais das proteínas Terapêuticas ou peptídeos descritos na coluna "Proteína Terapêutica X" da Tabela 1 (coluna 1) ou seu fragmento ou variante. 20 A Tabela 1 proporciona uma lista não exaustiva de proteínas Terapêuticas que

correspondem à porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo da invenção.; A primeira coluna "Proteína Terapêutica X" descreve moléculas de proteína Terapêutica que podem ser seguida por parênteses contendo nomes científicos e comerciais de proteínas que compreendem, ou alternativamente consistem na molécula de proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante. "Proteína Terapêutica X", conforme empregado no presente, pode se referir ou a uma molécula de proteína Terapêutica individual ou ao grupo integral de proteínas Terapêuticas associadas com uma molécula de proteína Terapêutica dada descrita nesta coluna. A coluna "Atividade biológica!" (coluna 2) descreve atividades Biológicas associadas com a molécula de proteína Terapêutica. A coluna 3, "Ensaio de Atividade Exemplar", fornece referências que descrevem ensaios que podem ser usados para testar a atividade terapêutica e/ou biológica de uma proteína Terapêutica X ou uma proteína de fusão da albumina compreendendo uma porção proteína Terapêutica X (ou seu fragmento). Cada uma das referências citadas na coluna "Ensaio de Atividade Exemplar" são integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência, especificamente no tocante à descrição do ensaio de atividade respectivo descrito na referência (vide a seção de métodos ali, por exemplo) para se avaliar a atividade biológica correspondente apresentada na coluna "Atividade Biológica" da Tabela 1. A quarta coluna, "Indicação Preferida: Y" descreve doença, transtornos, e/ou condições que podem ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou melhoradas pela proteína Terapêutica χ ou por uma proteína de fusão da albumina compreendendo uma porção proteína Terapêutica X (ou seu fragmento). A coluna "ID de Construção" (coluna 5) proporciona uma ligação a uma construção de fusão de albumina exemplar descrita na Tabela 2 que codifica uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo na porção proteína Terapêutica X referenciada (ou seu fragmento).

Tabela 1

<table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table> <table>table see original document page 14</column></row><table> <table>table see original document page 15</column></row><table> <table>table see original document page 16</column></row><table> <table>table see original document page 17</column></row><table> <table>table see original document page 18</column></row><table> <table>table see original document page 19</column></row><table> <table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table> <table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table> <table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table>

A Tabela 2 fornece uma lista não exaustiva de polinucleotídeos da presente invenção que compreendem, ou alternativamente consistem em moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína de fusão da albumina. A primeira coluna, "Fusão No." dá um número de fusão a cada polinucleotídeo. A coluna 2, "ID da construção" fornece um identificador numérico singular para cada polinucleotídeo da invenção. As IDs das Construções podem ser usadas para se identificar polinucleotídeos que codificam as proteínas de fusão da albumina que compreendem ou alternativamente consistem em uma porção proteína Terapêutica que corresponde a uma proteína Terapêutica X relacionada na carreira correspondente da Tabela 1 em que aquela ID de Construção está relacionada na coluna 5. A coluna "Nome da Construção" (coluna 3) fornece o nome de uma construção de fusão de albumina dada ou polinucleotídeo.

A quarta coluna na tabela 2, "Descrição" fornece uma descrição geral de uma construção de fusão de albumina dada e a quinta coluna, "Vetor de Expressão" relaciona os vetor no qual um polinucleotídeo que compreende, ou alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão de albumina dada foi clonado. Os vetores são conhecidos na técnica, e são disponíveis no comércio ou descritos em outra parte. Conforme descrito nos exemplos, por exemplo, uma "cassete de expressão" que compreende ou alternativamente consiste em um ou mais de (1) um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina dada, (2) uma seqüência líder, (3) uma região promotora, e (4) um terminador transcricional, pode ser montada em um vetor de clonagem conveniente e ser subseqüentemente deslocada para um vetor alternativo, tal como, por exemplo, um vetor de expressão que inclui, por exemplo, um vetor de expressão de levedura ou um vetor de expressão de mamífero. Em uma modalidade, para expressão em S. cerevisiae, uma cassete de expressão que compreende ou alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão da albumina é clonada em pSAC35. Em outra modalidade, para expressão em células CHO1 uma cassete de expressão que compreende ou alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão da albumina é clonada em pC4. Em outra modalidade, um polinucleotídeo que compreende ou alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica a porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina é clonado em pC4:HSA. Em outra modalidade ainda, para a expressão em células NSO, uma cassete de expressão que compreende ou alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão da albumina é clonada em pEE12. Outros vetores de clonagem e/ou de expressão úteis serão do 35 conhecimento dos versados na técnica e incidem no âmbito da presente invenção. A coluna 6, "SEQ ID NO: Y" fornece a seqüência de aminoácidos de comprimento total da proteína de fusão da albumina da presente invenção. Na maior parte dos casos, SEQ ID NO: Y mostra a forma não processada da proteína de fusão da albumina codificada - em outras palavras, SEQ ID NO: Y mostra a seqüência de sinal, uma porção HSA e uma porção terapêutica todas codificadas pela construção específica. Mais especificamente reivindicados pela presente invenção são todos os polinucleotídeos que codificam SEQ ID NO: Y. Quando estes polinucleotídeos são usados para expressar a proteína codificada de uma célula, a secreção natural da célula e as etapas de processamento produzem uma proteína que é desprovida da seqüência de sinal relacionada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2. A seqüência de aminoácidos específica da seqüência de sinal relacionada é mostrada mais tarde no relatório ou é conhecida na técnica. Portanto, as modalidades mais preferidas da presente invenção incluem a proteína de fusão da albumina produzida por uma célula (que seria desprovida da seqüência líder mostrada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2). Além disso, extremamente preferidos são polipeptídeos que compreendem SEQ ID NO: Y sem a seqüência líder específica relacionada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela 2. As composições que compreendem estas duas modalidades preferidas que incluem composições farmacêuticas são também preferidas. Além disso, incide na capacidade dos versados na técnica a substituição da seqüência de sinal relacionada nas colunas 4 e/ou 11 da Tabela com uma seqüência de sinal diferente, tal como as descritas mais abaixo no relatório para facilitar a secreção da proteína de fusão da albumina processada.

A sétima coluna, "SEQ ID NO: X", fornece a seqüência genitora de ácidos nucléicos a partir da qual um polinucleotídeo que codifica uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina dada pode ser derivado. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácidos genitora a partir da qual um polinucleotídeo que codifica uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina pode ser derivado compreende uma seqüência de gene do tipo selvagem que codifica uma proteína Terapêutica apresentada na tAbela 1. Em uma modalidade alternativa, a seqüência de aminoácidos genitora a partir da qual pode ser derivada uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende uma variante ou derivado de uma seqüência de gene do tipo selvagem que codifica uma proteína Terapêutica apresentada na Tabela 1, tal como, por exemplo, uma variante otimizada por códon sintético de uma seqüência de gene do tipo selvagem que codifica uma proteína Terapêutica.

A oitava coluna, "SEQ ID NO: Z", fornece uma tradução prevista da seqüência de ácidos nucléicos genitora (SEQ ID NO: X). Esta seqüência genitora pode ser uma proteína genitora de comprimento total usada para derivar a construção específica, a porção madura de uma proteína genitora, uma variante ou fragmento de uma proteína do tipo selvagem ou uma seqüência artificial que pode ser usada para criar a construção descrita. Os versados na técnica podem usar esta seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: Z para determinar quais os resíduos de aminoácidos de uma proteína de fusão da albumina codificada por uma construção dada são fornecidos pela proteína terapêutica. Além disso, os versados na técnica são perfeitamente capazes de usar a seqüência mostrada como SEQ ID NO: Z para derivar a construção descrita na mesma carreira. Por exemplo, se SEQ ID NO: Z corresponder a uma proteína de comprimento total, mas somente uma porção daquela proteína for usada para gerar a CID específica, os versados na técnica serão capazes de se valer de técnicas de biologia molecular, tais como PCR, para amplificar o fragmento específico e cloná-lo no vetor adequado.

Os iniciadores de amplificação fornecidos nas colunas 9 e 10, "SEQ ID NO: A" e "SEQ ID NO: B", respectivamente, são iniciadores exemplares usados para gerar um polinucleotídeo que compreende ou que alternativamente consiste em uma molécula de ácido nucléico que codifica a porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina dada. Em uma modalidade da invenção, os iniciadores de oligonucleotídeos que têm as seqüências apresentadas nas colunas 9 e/ou 10 (SEQ ID NOS: A e/ou B) são usados para amplificar por PCR um polinucleotídeo que codifica a porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina usando uma molécula de ácido nucléico que compreende ou que alternativamente consiste em uma seqüência de nucleotídeos fornecida na coluna 7 (SEQ ID NO: X) da carreira correspondente como um DNA gabarito. Os métodos de PCR são bem estabelecidos na técnica. Os versados na técnica poderão facilmente prever e utilizar seqüências de iniciadores úteis adicionais.

Em uma dada alternativa, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser usados em reações PCR de sobreposição para gerar mutações no interior de uma seqüência de DNA gabarito. Os métodos de PCR são conhecidos na técnica.

Conforme apresentado na Tabela 3, determinadas construções de fusão de albumina descritas neste pedido foram depositadas com a ATCC ®.

Tabela 3

<table>table see original document page 33</column></row><table> E possível se recuperar uma construção de fusão de albumina do depósito por técnicas conhecidas na arte e descritas em outro ponto no presente documento (vide, 30 Exemplo 10). A ATCC se localiza a 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 201102209, Estados Unidos. Os depósitos com ATCC foram feitos consoante os termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microorganismos para os fins de procedimento de patentes.

Em outra modalidade da invenção, uma "cassete de expressão" compreende, ou alternativamente consiste em um ou mais de (1) um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina dada, (2) uma seqüência líder, (3) uma região promotora e (4) um terminador transcricional, pode ser deslocada ou "subclonada" de um vetor para um outro. Fragmentos a serem subclonados podem ser gerador por métodos bem conhecidos na técnica, tais como amplificação por PCR1 por exemplo (usando iniciadores de oligonucleotídeo que têm a seqüência mostrada em SEQ ID NO: A ou B, por exemplo) e/ou digestão por enzima de restrição.

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina da presente invenção são capazes de uma atividade terapêutica e/ou atividade biológica correspondendo à atividade terapêutica e/ou atividade biológica da proteína Terapêutica correspondente à porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina relacionada na carreira correspondente da Tabela 1. Em outras modalidades preferidas, as porções de proteína terapeuticamente ativas das proteínas de fusão da albumina da presente invenção são fragmentos ou variantes da proteína codificada pela seqüência mostrada na coluna SEQ ID NO: X da Tabela 2 e são capazes de atividade terapêutica e/ou atividade biológica da proteína Terapêutica correspondente.

Fragmentos e Variantes de Polipeptldeos e Polinucleotídeos

Fragmentos

A presente invenção se volta ainda a fragmentos das proteínas Terapêuticas 20 descritas na Tabela 1, das proteínas de albumina e/ou das proteínas de fusão da albumina da invenção.

A presente invenção é também voltada a polinucleotídeos codificando fragmentos das proteínas Terapêuticas descritas na Tabela 1, proteínas da albumina e/ou as proteínas de fusão da albumina da presente invenção.

Mesmo se a deleção de um ou mais aminoácidos provenientes do término N de uma proteína resultar na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas da proteína Terapêutica, da proteína de albumina e/ou da proteína de fusão da albumina da presente invenção, outras atividades Terapêuticas e/ou atividades funcionais (atividades biológicas, por exemplo, capacidade de se multimerizar, capacidade de se unir ao ligante, por exemplo) podem ainda ser conservadas. A capacidade que os polipeptídeos com deleções no término N têm de induzir e/ou de se ligar a anticorpos que reconhecem as formas completa ou madura dos polipeptídeos, por exemplo, geralmente será conservada quando menos da maioria dos resíduos do polipeptídeo completo tiver sido removido do término N. Se um polipeptídeo específico desprovido de resíduos de término N de um 35 polipeptídeo completo conserva ou não tais atividades imunológicas pode ser facilmente determinado por métodos de rotina descritos no presente documento e já conhecidos na técnica. Não é improvável que uma muteína com um grande número de resíduos de aminoácidos de término N deletados possa conservar algumas atividades biológicas ou imunogênicas. Na verdade, peptídeos compostos com uma quantidade pequena de resíduos tal como da ordem de seis resíduos de aminoácidos podem freqüentemente produzir uma resposta imune.

Conseqüentemente, fragmentos de uma proteína Terapêutica que correspondem a uma porção proteína Terapêutica ou de uma proteína de fusão da albumina da invenção incluem a proteína de comprimento total assim como polipeptídeos que tem um ou mais resíduos deletados do término amino da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de referência (isto é, de uma proteína Terapêutica a que se refere na Tabela 1, ou de uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou uma construção de fusão da albumina descrita na tabela 2). Mais especificamente, as deleções no término N podem ser descritas pela fórmula geral m para que em que q é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo de referência (em uma proteína Terapêutica a que se refere na Tabela 1, por exemplo, ou em uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, ou em uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na Tabela 2) e m é definido como um número inteiro que varia de 2 a q menos 6. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Além disso, fragmentos de polipeptídeos de albumina sérica que correspondem a uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção, incluem a proteína de comprimento total assim como polipeptídeos que têm um ou mais resíduos deletados do término amino da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de referência (isto é, albumina sérica, ou uma porção albumina sérica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na tabela 2). Nas modalidades preferidas, as deleções de término N podem ser descritas pela fórmula geral m para 585, em que 585 é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos na albumina sérica humana madura (SEQ ID NO: 1) e m é definido como qualquer número inteiro que varia de 2 a 579. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção. Em modalidades adicionais as deleções no término N podem ser descritas pela fórmula geral m para 609, em 609 é um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos na albumina sérica humana de comprimento total (SEQ ID NO: 3) e m é definido como qualquer número inteiro que varia de 2 a 603. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Além disso, os fragmentos das proteínas de fusão da albumina da invenção incluem a proteína de fusão da albumina de comprimento total assim como polipeptídeos que têm um ou mais resíduos deletados do término amino da proteína de fusão da albumina (uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina, por exemplo, descrita na Tabela 2; ou de uma proteína de fusão da albumina que tem uma seqüência de aminoácidos descrita na coluna 6 da Tabela 2). Mais especificamente, as deleções de término N podem ser descritas pela fórmula geral m para q, em que q é um número inteiro que representa o número total de resíduos de aminoácidos na proteína de fusão da albumina e m é definido como qualquer número inteiro que varia de 2 a 1 menos 6. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Também conforme mencionado acima, mesmo se a delação de um ou mais aminoácidos do término N ou dos término C de um polipeptídeo de referência (de uma proteína Terapêutica, por exemplo; proteína de albumina sérica; ou de proteína de fusão da albumina da presente invenção) resultar na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas da proteína, outras atividades funcionais (atividades biológicas, por exemplo, capacidade de se multimerizar, capacidade de se unir a um ligante) e/ou atividades Terapêuticas podem ainda ser conservadas. A capacidade de polipeptídeos com deleções no término C, por exemplo, de induzir e/ou de se ligar a anticorpos que reconhecem as formas completa ou madura do polipeptídeo geralmente será conservada quando menos da maioria dos resíduos do polipeptídeo completo ou maduro são removidos do término C. Se um polipeptídeo específico desprovido de resíduos no término N e/ou no término C de um polipeptídeo de referência conserva ou não uma atividade terapêutica pode ser facilmente determinado por métodos de rotina descritos no presente documento e/ou em outros locais na técnica.

A presente invenção obtém ainda polipeptídeos que têm um ou mais resíduos deletados do término carboxila da seqüência de aminoácidos de uma proteína Terapêutica que corresponde a um porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção (uma proteína Terapêutica a que se refere na tabela 1, por exemplo, ou uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na tabela 2). Mais especificamente, deleções do término C podem ser descritas pela fórmula geral 1 para n, em que η é qualquer número inteiro variando de 6 a q menos 1, sendo q um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo de referência (uma proteína Terapêutica a que se refere na Tabela 1, por exemplo, ou uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na Tabela 2). Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Além disso, a presente invenção obtém polipeptídeos que têm um ou mais resíduos deletados do término carbóxi da seqüência de aminoácidos de uma proteína de albumina correspondendo a uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção (de albumina sérica, por exemplo, ou de uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na tabela 2). Mais especificamente, as deleções de término C podem ser descritas pela fórmula geral 1 para n, em que η é qualquer número inteiro variando de 6 a 584, em que 584 é o número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos na albumina sérica humana madura (SEQ ID NO: 1) menos 1. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção. Mais especificamente, as deleções de término c podem ser descritas pela fórmula geral 1 para n, em que η é qualquer número inteiro que varia de 6 a 608, sendo 608 o número inteiro que representa o número total de resíduos de aminoácidos na albumina 15 sérica (SEQ ID NO: 3) menos 1. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Além disso a presente invenção obtém polipeptídeos que têm um ou mais resíduos deletados do término carbóxi de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Mais especificamente, as deleções no término C podem ser descritas pela fórmula geral 1 para n, em que η é qualquer número inteiro que varia de 6 a q menos 1, sendo q um número inteiro representando o número total de resíduos de aminoácidos em uma proteína de fusão da albumina da invenção. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Além disso, qualquer uma das deleções descritas acima no término N ou C podem ser combinadas para produzir um polipeptídeo de referência com deleções no término N e C. A invenção também obtém polipeptídeos que têm um ou mais aminoácidos deletados tanto do término amino como no carboxila, que podem ser descritos em geral como apresentando resíduos m para η de um polipeptídeo de referência (uma proteína Terapêutica a que se refere na tabela 1, por exemplo, ou uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, ou uma porção proteína Terapêutica codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na Tabela 2, ou albumina sérica (SEQ ID NO: 1, por exemplo) ou uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção, ou uma porção proteína de albumina codificada por um polinucleotídeo ou por uma construção de fusão da albumina descrita na tabela 2, ou uma proteína de fusão da albumina, ou uma proteína de fusão da albumina codificadas por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina da invenção) em que nem são números inteiros conforme descrito acima. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

O presente pedido é também voltado às proteínas contendo polipeptídeos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a uma seqüência de polipeptídeo de referência (uma proteína Terapêutica a que se refere na Tabela 1, por exemplo, ou uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, ou uma porção proteína Terapêutica codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na Tabela 2, ou albumina sérica (SEQ ID NO: 1, por exemplo) ou uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, ou uma porção proteína de albumina codificada por um polinucleotídeo ou por construção de fusão da albumina descrita na tabela 2, ou uma proteína de fusão da albumina, ou uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina da presente invenção) apresentado no presente documento, ou seus fragmentos. Nas modalidades preferidas, a aplicação é voltada a proteínas que compreendem polipeptídeos que pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 15 96%, 97%, 987% ou 99% idênticos aos polipeptídeos de referência que têm a seqüência de aminoácidos de deleções de término NeC conforme descrito acima. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Os fragmentos de polipeptídeos preferidos da invenção são fragmentos que compreendem, ou alternativamente consistem em uma seqüência de aminoácidos que apresenta uma atividade Terapêutica e/ou atividade funcional (atividade biológica, por exemplo) da seqüência de polipeptídeo da proteína Terapêutica ou da proteína de albumina sérica da qual a seqüência de aminoácidos é um fragmento.

Outros fragmentos de polipeptídeos preferidos são fragmentos biologicamente ativos. Fragmentos biologicamente ativos são aqueles que apresentam uma atividade similar, mas não necessariamente idêntica a uma atividade do polipeptídeo da presente invenção. A atividade biológica dos fragmentos pode incluir uma atividade desejada melhorada, ou uma atividade indesejável reduzida.

Variantes

"Variante" se refere a um polinucleotídeo ou ácido nucléico que difere do ácido nucléico dou polipeptídeo de referência, mas que conserva propriedades essenciais suas. Geralmente, variantes são em geral muito similares, e em muitas regiões, idênticas ao ácido nucléico ou polipeptídeo de referência.

Conforme empregado no presente, "variante" se refere a uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, porção albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção, ou proteína de fusão da albumina da invenção que difere em seqüência de uma proteína Terapêutica (vide a coluna "terapêutica" da Tabela 1, por exemplo), da proteína da albumina e/ou proteína de fusão da albumina, respectivamente, mas que conserva pelo menos uma propriedade funcional e/ou terapêutica sua conforme descrito em outro ponto do presente documento ou em outro ponto conhecido da técnica. Geralmente as variantes são muito similares, e, em muitas regiões idênticas à seqüência de aminoácidos da proteína Terapêutica que corresponde a uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina, proteína de albumina correspondendo à porção de proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina, e/ou uma proteína de fusão da albumina. Os ácidos nucléicos que codificam estas variantes também são englobados pela presente invenção.

A presente invenção é também voltada a proteínas que compreendem, ou alternativamente consistem em uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos à seqüência de aminoácidos de proteína Terapêutica correspondente a uma porção proteína Terapêutica, por exemplo, ou uma proteína de fusão da albumina da invenção (a seqüência de aminoácidos de uma proteína Terapêutica X descrita na tabela 1, por exemplo; ou a seqüência de aminoácidos de uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na tabela 1 e 2, ou fragmentos ou variantes suas), proteínas de albumina correspondendo a uma porção proteína albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção (a seqüência de aminoácidos de uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na tabela 1 e 2, por exemplo; a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1; ou fragmentos ou variantes suas) e/ou as proteínas de fusão da albumina. Fragmentos destes polipeptídeos são também propostos (os fragmentos descritos no presente documento, por exemplo). Outros polipeptídeos abrangidos pela invenção são polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que se hibridizam ao complemento de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão da albumina da presente invenção em condições drásticas de hibridização (hibridização para filtrar DNA ligado em 6 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), por exemplo, a aproximadamente 45 graus Celsius, seguida por uma ou mais lavagens de 0,2 X SSC, SDS a 0,1% a aproximadamente 50-65 graus Celsius) em condições extremamente drásticas (hibridização para filtrar DNA ligado, por exemplo, em 6 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45 graus Celsius, seguida por uma ou mais lavagens em 0,1 χ SSC, SDS a 0,2% a aproximadamente 68 graus Celsius) ou em outras condições drásticas de hibridização que são conhecidas dos versados na técnica (vide, por exemplo, Ausubel, F.M. e outros, eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., e John Wiley & Sons Inc., Nova York, nas páginas 6.3.1 -6.3.6 e 2.10.3). Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção. Polipeptídeo apresentando uma seqüência de aminoácidos 95% idênticos, por exemplo, com uma seqüência de aminoácidos de busca significa que a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo objeto da invenção é idêntica à seqüência de busca exceto pelo fato de que a seqüência de polipeptídeo objeto pode incluir até cinco alterações de aminoácidos para cada 100 aminoácidos da seqüência de aminoácidos de busca. Em outras palavras, para se obter um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácidos apresentando uma identidade de pelo menos 95% com uma seqüência de aminoácidos de busca, até 5% dos resíduos de aminoácidos na seqüência objeto podem ser inseridos, deletados ou substituídos com um outro aminoácido. Estas alterações da seqüência de referência podem ocorrer na posição de término amino ou de término carbóxi da seqüência de aminoácidos de referência ou em qualquer ponto entre essas posições terminais, intercalados ou individualmente dentre resíduos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos no interior da seqüência de referência.

Na prática, se qualquer polipeptídeo específico for pelo menos 80%, 85%, 90%, 15 95%, 96% 97%, 98% ou 99% idêntico em relação à seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou de um fragmento seu (tal como de uma porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina ou de uma porção albumina da proteína de fusão da albumina), por exemplo, pode ser determinado convencionalmente usando-se programas conhecidos de computador. Um método preferido para a determinação da melhor compatibilidade total entre uma seqüência de busca (a seqüência da presente invenção) e uma seqüência objeto, a que se refere também como um alinhamento global de seqüências, pode ser determinado usando-se o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag e outros. (Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). Em um alinhamento entre seqüências das seqüências de busca e objeto estão ou as duas seqüências de nucleotídeos ou as duas seqüências de aminoácidos. O resultado do citado alinhamento global de seqüências é expresso em porcentagem de igualdade. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácidos FASTDB são: Matriz = PAM 0, k-tuplo = 2, Penalidade por incompatibilidade = 1, Penalidade por Ligação = 20, Comprimento de grupo de Aleatorização = 0, Contagem Limite = 1, Tamanho da Janela = comprimento da seqüência, Penalidade por Intervalo = 5, Penalidade por Tamanho do intervalo = 0,05, Tamanho da Janela = 500 ou o comprimento da seqüência de aminoácidos objeto, aquela que for mais curta.

Se a seqüência objeto for mais curta do que a seqüência de busca devido às deleções no término N ou C,. não devido a deleções internas, deve ser feita uma correção 35 manual nos resultados. Isto é devido ao fato do programa FASTDB não levar em conta as truncagens de término N e C da seqüência objeto quando se calcula a porcentagem de identidade global. Para seqüências objeto truncadas nos terminais N e C, relativas à seqüência de busca, a porcentagem de identidade é corrigida calculando-se o número de resíduos da seqüência de busca que se encontram no término N ou C da seqüência objeto, que não apresentam compatibilidade/estão alinhados com um resíduo objeto correspondente, em forma de uma porcentagem das bases totais da seqüência de busca.

Se um resíduo apresenta compatibilidade/está alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento das seqüências por FASTDB. Esta porcentagem é então subtraída da porcentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB acima, usando-se os parâmetros especificados, para se chegar a uma contagem de porcentagem de identidade final. Esta contagem de porcentagem de identidade final é o que é usado para os fins da presente invenção. Somente resíduos dos terminais N e C da seqüência objeto que não estão compatíveis/alinhados com a seqüência de busca, são considerados com o fim de se ajustar manualmente a contagem da porcentagem de identidade. Isto é, somente as posições de resíduo de busca que se encontram fora dos resíduos de término N e C da seqüência objeto mais distantes.

Uma seqüência objeto de 90 resíduos de aminoácidos está alinhada, por exemplo, com uma seqüência de busca de 100 resíduos para se determinar a porcentagem de identidade. A deleção ocorre no término N da seqüência objeto e, portanto, o alinhamento por FASTDB não apresenta uma compatibilidade/alinhamento dos primeiros resíduos no término N. Os 10 resíduos incompatíveis representam 10 % da seqüência (número de resíduos nos terminais NeC incompatíveis/número total de resíduos na seqüência de busca) de modo que se subtraem 10 % da contagem de porcentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os restantes 90 resíduos estiverem perfeitamente compatíveis, a porcentagem de identidade final seria de 90 %. Em um outro exemplo, uma seqüência objeto de 90 resíduos é comparada com uma seqüência de busca de 100 resíduos. Desta vez as deleções são deleções internas, de modo que não há mais resíduos nos terminais N ou C da seqüência objeto incompatível/alinhado com a seqüência de busca. Neste caso a porcentagem de identidade calculada por FASTDB não é corrigida manualmente. Novamente, somente as posições de resíduos fora das extremidades NeC da seqüência objeto, conforme apresentadas no alinhamento FASTDB, que são incompatíveis/alinhadas com a seqüência de busca são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção manual é feita para os fins da presente invenção.

A variante geralmente será pelo menos 75 % (de preferência pelo menos 80 %, 90 %, 95 % ou 99 %) idêntica entre seqüências com um comprimento de uma proteína normal de HA ou de Terapêutico que tem o mesmo comprimento que a variante. A homologia ou identidade ao nível de seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos é determinada por análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico) usando o algoritmo empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Karlin e outros. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268 (1990) e Altschulp J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), integralmente incorporados ao presente documento a título de referência) que são adaptados para buscar similaridade entre seqüências.

A abordagem usada pelo programa BLAST é a de primeiro considerar segmentos similares entre uma seqüência de busca e uma seqüência de base de dados, avaliando-se em seguir as significâncias estatística de todas as compatibilidades que são identificadas e finalmente resumir somente aquelas compatibilidades que satisfazem um limite pré-selecionado de significância. Para uma discussão das questões básicas na busca de similaridade de bases de dados de seqüências, veja Altschul e outros., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994)) que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência. Os parâmetros de busca para histograma, descrições, alinhamentos, expectativa (isto é, o limite do significado estatístico para relatar incompatibilidades contra seqüências de bases de dados), limite, matriz e filtro são os ajustes padrão. A matriz de contagem padrão usada por blastp, blastx, tblastn, e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919 (1992) integralmente incorporado ao presente documento a título de referência). Para blastn, a matriz de contagem é ajustada pelas relações de M (isto é, a contagem de recompensa para uma par de resíduos compatíveis) para N (isto é a contagem de penalidade para resíduos incompatíveis), em que os valores padrão para MeN são 5 e -4, respectivamente. Quatro parâmetros de blastn podem ser ajustados do seguinte modo: Q = 10 (penalidade pela criação do intervalo); R = 10 (penalidade pelo prolongamento do intervalo); wink = 1 (gera acertos de palavras a cada posição de ordem wink ao longo da busca); e gapw = 16 (ajusta a largura da janela dentro da qual são gerados alinhamentos de intervalos). Os ajustes de parâmetros equivalentes de Blastp foram Q = 9; R = 2; wink = 1; e gapw = 32. Uma comparação por Bestfit entre seqüência disponível no pacote GCG versão 10,0, usa os parâmetros de DNA GAP = 50 (penalidade por criação de intervalo) e LEN = 3 (!penalidade por prolongamento do intervalo) e os ajustes equivalentes em comparações de proteínas são GAP = 8 e LEN = 2.

As variantes de polinucleotídeos da invenção podem conter alterações nas regiões de codificação, regiões não de codificação ou ambas. São especificamente preferidas variantes de polinucleotídeos contendo alterações que produzem substituições, adições, ou deleções silenciosas, mas que não altera as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. As variantes de nucleotídeos produzidas por substituições silenciosas devido à degeneração do código genético são preferidas. Além disso, são também preferidas as variantes de polipeptídeo em que menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10, ou 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 ou 1-2 aminoácidos são substituídos, deletados ou acrescentados em qualquer combinação. As variantes de polinucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de razões, tal como para otimizar a expressão de códons para uma hospedeira específica (alterar os códons em RNAm humano nos preferidos por uma hospedeira bacteriana, tal como de levedura ou de E. coli).

Em uma modalidade preferida, um polinucleotídeo da presente invenção que codifica a porção albumina de uma proteína de fusão da albumina é otimizada para expressão em células de levedura ou de mamífero. Em uma outra modalidade preferida, um polinucleotídeo da invenção que codifica a porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina é otimizado para expressão em células de levedura ou de mamífero. Em uma outra modalidade preferida, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina da invenção é otimizado para expressão em células de levedura ou de mamíferos.

Em uma modalidade alternativa, um polinucleotídeo com o códon otimizado e que codifica uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina não se hibridiza com o polinucleotídeo do tipo selvagem que codifica a proteína Terapêutica em condições drásticas de hibridização, conforme descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, um polinucleotídeo com o códon otimizado e que codifica uma porção albumina de uma proteína de fusão da albumina não se hibridiza com o polinucleotídeo do tipo selvagem que codifica a proteína de albumina em condições de hibridização drásticas, conforme descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, um polinucleotídeo com o códon otimizado e que codifica uma proteína de fusão da albumina não se hibridiza com o polinucleotídeo do tipo selvagem que codifica a porção de proteína Terapêutica ou a porção proteína de albumina em condições drásticas de hibridização conforme descrito no presente documento.

Em uma modalidade adicional, um polinucleotídeo que codifica uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina não compreende ou alternativamente não consiste na seqüência que ocorre naturalmente daquela proteína Terapêutica. Em uma outra modalidade, um polinucleotídeo que codifica uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina não compreende, ou alternativamente não consiste na seqüência que ocorre naturalmente da proteína de albumina. Em uma modalidade alternativa, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da albumina não compreende, ou alternativamente não consiste na seqüência que ocorre naturalmente de uma porção proteína Terapêutica ou da porção de proteína de albumina.

As variantes que ocorrem naturalmente são denominadas "variantes alélicas" e se referem a uma ou diversas formas alternativas de um gene que ocupa um lócus dado sobre um cromossomo de um organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova York (1958)). Estas variantes alélicas podem variar ou o nível do polinucleotídeo e/ou do polipeptídeo e estão incluídas na presente invenção. Alternativamente, variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

Usando-se métodos conhecidos de engenharia de proteína e tecnologia de DNA recombinante, podem se gerar variantes para melhorar ou alterar as características dos polipeptídeos da presente invenção. Um ou mais aminoácidos podem ser deletados do término N ou do término C do polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, sem uma perda substancial da função biológica. A título de exemplo, Ron e outros. (Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1933)) relataram proteínas variantes KGF apresentando uma atividade de ligação a heparína mesmo depois de se ter deletado 3, 8 ou 27 resíduos de aminoácidos de término amino. De modo análogo interferon gama apresentou até dez vezes mais atividade depois de se ter deletado 8-10 resíduos de aminoácidos do término carbóxi desta proteína. (Dobeli e outros., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988)).

Além disso, uma ampla evidência demonstra que variantes freqüentemente conservam uma atividade biológica análoga à da proteína que ocorre naturalmente. Gayle e colaboradores (J. Biol. Chem. 268: 22105-22111 (1993)), por exemplo, conduziram uma análise mutacional extensa da citocina IL-Ia humana. Eles usaram mutagênese aleatória para gerar mais de 3.500 mutantes individuais de IL-Ia que tinham uma média de 2,5 alterações de aminoácidos por variante em todo o comprimento da molécula. Múltiplas mutações foram examinadas em todas as posições possíveis de aminoácidos. Os investigadores constataram que "a maior parte da molécula poderia ser alterada com pouco efeito sobre qualquer uma (atividade de ligação ou atividade biológica)". Na verdade somente 23 seqüências de aminoácidos singulares, de mais de 3.500 seqüências de nucleotídeos examinadas, produziram uma proteína que diferia significativamente em atividade da do tipo selvagem.

Além disso, mesmo quando a deleção de um ou mais aminoácidos do término N ou do término C de um polipeptídeo resultar na modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas outras atividades biológicas poderão ainda ser conservadas. A capacidade de uma variante por deleção, por exemplo, de induzir e/ou de se ligar a anticorpos que reconhecem a forma secretada provavelmente será conservada quando menos da maioria dos resíduos da forma secretada for removida do término N ou do término C. Se um polipeptídeo específico desprovido de resíduos de término N ou término C de uma proteína conserva tais atividades imunogênicas pode ser facilmente determinado por métodos de rotina descritos no presente documento e conhecidos na técnica.

Portanto, a invenção inclui ainda variante de polipeptídeos que têm uma atividade funcional (atividade biológica e/ou atividade terapêutica, por exemplo). Em uma modalidade, a presente invenção obtém variantes de as proteínas de fusão da albumina que têm uma atividade funcional (atividade biológica e/ou atividade terapêutica, por exemplo) que corresponde a uma ou mais atividades biológicas e/ou terapêuticas da proteína Terapêutica que corresponde à porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina. Em uma outra modalidade, a invenção obtém variantes de as proteínas de fusão da albumina que têm uma atividade funcional (atividade biológica e/ou atividade terapêutica, por exemplo) que corresponde a uma ou mais atividades biológicas e/ou terapêuticas da proteína Terapêutica que corresponde à porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina. Tais variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições selecionadas de acordo com as regras gerais conhecidas na técnica como apresentando pouco efeito ou atividade. Os polinucleotídeos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção.

Nas modalidades preferidas, as variantes da invenção têm substituições conservadoras. "Substituições conservadoras" significam permutas no interior dos grupos tais como substituição de aminoácidos alifáticos ou hidrófobos Ala, Vai, Leu e He; substituição dos resíduos hidroxilados Ser e Thr; substituição dos resíduos ácidos Asp e Glu; substituição dos resíduos amidados Asn e Gln, substituição dos resíduos básicos Lys, Arg e His; substituição dos resíduos aromáticos Phe, Tyr1 e Trp e substituição de aminoácidos de pequeno tamanho Ala, Ser, Thr, Met e Gly.

São providas instruções no tocante ao modo de se produzir substituições fenotipicamente silenciosas de aminoácidos, por exemplo, em Bowie e outros, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), em que os autores indicam que há duas estratégias principais para se estudar a tolerância de uma seqüência de aminoácidos a alteração.

A primeira estratégia explora a tolerância de substituições de aminoácidos por seleção natural durante o processo de evolução. Comparando-se as seqüências de aminoácidos em diferentes espécies, podem ser identificados os aminoácidos conservados.Estes aminoácidos conservados têm a probabilidade de serem importantes para a função protéica. Por outro lado, as posições de aminoácidos nos casos em que as substituições foram toleradas pela seleção natural indicas m que estas posições não são críticas para a função da proteína. Portanto, as posições que toleram a substituição de aminoácidos poderiam ser modificadas, mantendo-se ao mesmo tempo a atividade biológica da proteína.

A segunda estratégia usa engenharia genética para introduzir alterações de aminoácidos em posições específicas de um gene clonado para identificar regiões críticas para a função da proteína. Pode ser usada a mutagênese direcionada a sítio, por exemplo, ou a mutagênese de varredura de alanina (introdução de mutações individuais de alanina em cada resíduo na molécula). Veja Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989). As moléculas mutantes resultantes podem então ser testadas para atividade biológica.

Conforme declarado pelos autores, estas duas estratégias revelaram que proteínas são surpreendentemente tolerantes de substituições de aminoácidos. Os autores indicam ainda quais as alterações de aminoácidos que têm a probabilidade de serem permissivos em determinadas posições de aminoácidos na proteína. A maioria dos resíduos de aminoácidos enterrados (no interior da estrutura terciária da processo), por exemplo, exigem cadeias secundárias não polares, ao passo que determinadas características das cadeias secundárias superficiais são geralmente conservadas. Além disso, as substituições conservadoras de aminoácidos toleradas envolvem a substituição de aminoácidos alifáticos ou hidrófobos Ala, Vai, Leu e lie; a substituição de resíduos hidroxilados Ser e Thr; a substituição dos resíduo ácidos Asp e Glu; a substituição dos resíduo amidados Asn e Gln, a substituição dos resíduos básicos Lys, Arg e His; a substituição dos resíduos aromáticos Phe, Tyr e Trp, e a substituição dos aminoácidos de pequeno tamanho Ala, Ser, Thr, Met e Gly. Além da substituição conservadora de aminoácidos, as variantes da presente invenção incluem (i) polipeptídeos contendo substituições de um ou mais dos resíduos não conservados de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos substituídos podem ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) polipeptídeos contendo substituições de um ou mais dos resíduos de aminoácidos que têm um grupo substituinte, ou (iii) polipeptídeos que foram fundidos com um outro composto, ou que tenham sido quimicamente conjugados a um outro composto, tal como um composto para aumentar a estabilidade e/ou solubilidade do polipeptídeo (polietileno glicol, por exemplo), (iv) polipeptídeo contendo aminoácidos adicionais, tais como, por exemplo, um peptídeo de região de fusão Fc de IgG. Tais polipeptídeos variantes são considerados como incidindo no âmbito dos versados na técnica a partir das instruções do presente documento.

As variantes de polipeptídeos contendo substituições de aminoácidos, por exemplo, de aminoácidos com carga com outros aminoácidos com carga ou neutros podem produzir proteínas com características melhoradas, tais como uma menor agregação. A agregação de formulações farmacêuticas tanto reduz a atividade como aumenta a eliminação devido à atividade imunogênico do agregado. Veja Pinckard e outros, Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins e outros, Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland e outros, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).

Em modalidades específicas, os polipeptídeos da invenção compreendem ou alternativamente consistem em fragmentos ou variantes da seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão da albumina, a seqüência de aminoácidos de uma proteína Terapêutica e/ou da albumina sérica humana, em que os fragmentos ou variantes têm 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ou 50-150, adições, substituições e/ou deleções de resíduos de aminoácidos quando comparadas com a seqüência de aminoácidos de referência. Nas modalidades preferidas, as substituições de aminoácidos são conservadoras. Os ácidos nucléicos que codificam estes polipeptídeos também são englobados pela presente invenção. O polípeptídeo da presente invenção pode ser composto de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas ou por ligações peptídicas modificadas, isto isóesteres peptídicos, e pode conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por gene. Os polipeptídeos podem ser modificados ou por processos naturais, tais como processamento pós-traducional ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias detalhadas, assim como em uma literatura volumosa de pesquisa. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar em um polípeptídeo, incluindo na estrutura peptídica, nas cadeias secundárias de aminoácidos e nos terminais amino ou carbóxi. Deveobservar que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou a graus variáveis em diversos sítios em um polípeptídeo dado. Além disso, um polípeptídeo dado pode conter muitos tipos de modificações. Os polipeptídeos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação e podem ser cíclicos com ou sem ramificação. Os polipeptídeos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou de um derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou de derivado de lipídio, ligação covalente de fosfotidil inositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristilação, oxidação pegilação, processamento proteolítico, fosforilação prenilação racemização, selenoilação, sulfação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas tais como arginilação e utiquitinação. (vide, por exemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a. Ed., Τ. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seiftere outros, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan e outros, Ann. N.Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992)).

Atividade Funcional

"Um polípeptídeo que apresenta atividade funcional" se refere a um polípeptídeo capaz de apresentar uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas com a forma de comprimento total, pró-proteína, e/ou madura de uma proteína Terapêutica. Tais atividades funcionais incluem, sem limitação, atividade biológica, antigenicidade [capacidade 35 de se ligar (ou de competir com um polípeptídeo por ligação) a um anticorpo anti-polipeptídeo), imunogenicidade (capacidade de gerar anticorpo que se ligue a um polípeptídeo específico da invenção), capacidade de formar multímeros com polipeptídeos da invenção, e capacidade de se ligar a um receptor ou ligante para um polipeptídeo.

"Um polipeptídeo que apresenta atividade biológica" se refere a um polipeptídeo que apresenta uma atividade similar, mas não necessariamente idêntica a uma atividade de uma proteína Terapêutica da presente invenção, incluindo formas maduras, conforme medido em um ensaio biológico específico, com ou sem dependência de dose. No caso em que a dependência de dose realmente existe, não precisa ser idêntica à do polipeptídeo, mas sim substancialmente similar à dependência de dose em uma atividade dada em comparação com o polipeptídeo da presente invenção (isto é, o polipeptídeo candidato apresentará uma atividade maior ou não acima de 25 vezes inferior, e de preferência uma atividade não acima de aproximadamente dez vezes inferior, sendo o mais preferível uma atividade não acima de aproximadamente três vezes menor em relação ao polipeptídeo da presente invenção).

Nas modalidades preferidas, uma proteína de fusão da albumina da invenção apresenta pelo menos uma atividade biológica e/ou terapêutica associada com a porção proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) quando ela não está fundida com a albumina.

Nas modalidades preferidas adicionais, a proteína de fusão da albumina de invenção apresenta uma estabilidade plasmática aumentada em comparação com a porção proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) em um estado não fundido. A estabilidade plasmática da proteína de fusão da albumina da inferior ou da porção proteína Terapêutica não fundida (ou seu fragmento ou variante) pode ser avaliada usando-se ensaios conhecidos na técnica ou modificando rotineiramente os mesmos.

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ter avaliada a sua atividade funcional (atividade biológica, por exemplo) usando ensaios conhecidos na técnica ou modificando os mesmos rotineiramente, assim como os ensaios descritos no presente documento. Além disso, os versados na técnica podem rotineiramente testar fragmentos de uma proteína Terapêutica que corresponde a uma porção proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina, para atividade usando ensaios relacionados na sua carreira correspondente da Tabela 1 (na coluna 3 da Tabela 1, por exemplo). Além disso, os versados na técnica podem rotineiramente testar fragmentos de uma proteína de albumina correspondendo a uma porção proteína de albumina de uma proteína de fusão da albumina para atividade usando ensaios conhecidos na técnica e/ou conforme descritos na seção de Exemplos abaixo.

Em uma modalidade, por exemplo, em que se testa a capacidade de uma proteína 35 de fusão da albumina se ligar ou competir com uma proteína Terapêutica para ligação a um anticorpo anti-polipeptídeo Terapêutico e/ou anticorpo anti-albumina, diversos imunoensaios conhecidos na técnica podem ser usados, incluindo, sem limitação, sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas tais como rádio-imunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), imunoensaios "em sanduíche", ensaios imuno-radiométricos, reações de precipitação de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando ouro coloidal, enzima ou rótulos de rádio-isótopos, por exemplo), western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (ensaios de aglutinação me gel, por exemplo, ensaios de hemaglutinação), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, e ensaios de imunoeletroforese etc. Em uma modalidade, a ligação a anticorpo é detectada detectando-se um rótulo no anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo primário é detectado detectando-se a ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo secundário é rotulado. Muitos meios são conhecidos na técnica para a detecção de ligação em um imunoensaio e incidem no âmbito da presente invenção.

Em uma modalidade preferida, em que um parceiro de ligação (um receptor ou um ligante, por exemplo) de uma proteína Terapêutica é identificado, a ligação àquele parceiro de ligação por uma proteína de fusão da albumina que compreende aquela proteína Terapêutica como a porção proteína Terapêutica da fusão pode ser avaliada por meios bem conhecidos na técnica, por exemplo, tais como, por exemplo, cromatografia de gel redutor e não redutor, cromatografia de afinidade de proteína e transferência por afinidade. Veja para as considerações gerais, Phizicky e outros, Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). Em uma outra modalidade a capacidade de correlatos fisiológicos de uma proteína de fusão da albumina de se ligar a um substrato(s) do polipeptídeo Terapêutico correspondendo à porção proteína Terapêutica da fusão pode ser rotineiramente avaliado usando-se técnicas conhecidas na técnica.

Em uma modalidade alternativa, em que a capacidade de uma proteína de fusão da albumina de se multimeriza está sendo avaliada, a associação com outros componentes do multímero pode ser avaliada, tal como, por meios conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, cromatografia de gel redutor e não redutor, cromatografia de afinidade de proteína, e transferência de afinidade. Veja para as considerações gerais, Phizicky e outros, acima. 30 Nas modalidades preferidas, uma proteína de fusão da albumina compreendendo

todo um anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica ou uma porção dele, tem pelo menos uma atividade biológica e/ou terapêutica (para se ligar especificamente a um polipeptídeo ou epítopo, por exemplo) associada com o anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) quando não está fundido à albumina. Em outras 35 modalidades preferidas, a atividade biológica e/ou atividade terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreendendo todo um anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica ou a uma porção dele consiste na inibição (isto é, antagonismo) ou ativação (isto é, agonismo) de uma ou mais das atividades biológicas e/ou atividades terapêuticas associadas com o polipeptídeo que está especificamente ligado por anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica.

As proteínas de fusão da albumina que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica podem ser caracterizadas de uma variedade de modos. Mais especificamente, as proteínas de fusão da albumina que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica podem ser avaliadas para a capacidade de se ligar especificamente aos mesmos antígenos são ligados especificamente pelo anticorpo que se liga a uma proteína Terapêutica que corresponde à porção proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina usando-se técnicas descritas no presente documento ou rotineiramente modificando técnicas conhecidas na técnica.

Os ensaios quanto à capacidade das proteínas de fusão da albumina (por exemplo, compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) de ligar (especificamente) uma proteína ou epítopo específico podem ser efetuados em solução (por exemplo, Houghten, Bio/Techniques 13:412-421 (1992)), sobre glóbulos (por exemplo, Lam, Nature 354:82-84 (1991)), sobre chips (por exemplo, Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), sobre bactérias (por exemplo, Patente US Número 5.223.409), sobre esporos (por exemplo, Patentes US Números 5.571.698; 5.403.484; e 5.223.409), sobre plasmídios (por exemplo, Cull e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865-1869 (1992)) ou sobre fago (por exemplo, Scott e Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990); e Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)) (cada uma destas referências é incorporada neste documento em sua totalidade por referência). As proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico podem também ser testadas quanto à sua especificidade e afinidade por uma proteína ou epítopo específico, usando ou modificando rotineiramente as práticas descritas neste documento ou de outro modo conhecidas na técnica.

As proteínas de fusão da albumina que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser testadas quanto à reatividade cruzada com outros antígenos (por exemplo, moléculas que têm conservação de seqüência/estrutura com a(s) molécula(s) especificamente ligada(s) pelo anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina da invenção) por qualquer método conhecido na técnica.

Os imunoensaios que podem ser usados para analisar a ligação (imunoespecífica) e a reatividade cruzada incluem, porém não estão limitados aos sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunológico por ligação com enzima), imunoensaio em "camadas", ensaios de imunoprecipitação, reações com precipitina, reações com precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A, para mencionar somente alguns. Tais ensaios são rotinas e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade). Os imunoensaios ilustrativos são descritos resumidamente abaixo (porém não são pretendidos como limitação).

Os protocolos de imunoprecipitação geralmente compreendem Iisar uma população de células em um tampão de lise, tal como o tampão RIPA (1% de NP-40 ou Triton X-100, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, NaCl a 0,15 M, fosfato de sódio a 0,01 M em pH 7,2, 1% de Trasylol), suplementado com inibidores de fosfatase e/ou protease protéica (por exemplo, EDTA, PMSF1 aprotinina, vanadato de sódio), adicionar a proteína de fusão da albumina da invenção (por exemplo, compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) ao lisado celular, incubar por um período de tempo (por exemplo, 1 a 4 horas) a 40 graus C, adicionar os glóbulos de sepharose acoplados a um anticorpo antialbumina, por exemplo, ao lisado celular, incubar por cerca de uma hora ou mais a 40 graus C, lavar os glóbulos em tampão de lise e suspender novamente os glóbulos em tampão de SDS/amostra. A capacidade da proteína de fusão da albumina de imunoprecipitar um antigeno específico pode ser avaliada através de, por exemplo, análise por Western blot. Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação da proteína de fusão da albumina a um antigeno e diminuir o secundário (por exemplo, pré-eliminar o lisado celular com glóbulos de Sepharose). Quanto a uma discussão adicional concernente aos protocolos de imunoprecipitação, ver, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nova York em 10.16.1.

A análise por Western blot geralmente compreende preparar as amostras de proteínas, eletroforese das amostras de proteínas em um gel de poliacrilamida (por exemplo, 8%-20% de SDS-PAGE, dependendo do peso molecular do antigeno), transferir a amostra de proteínas do gel de poliacrilamida para uma membrana, tal como a nitrocelulose, o PVDF ou o náilon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com 3% de BSA ou leite sem gordura), lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), aplicar a proteína de fusão da albumina da invenção (diluída em tampão de bloqueio) à membrana, lavar a membrana em tampão de lavagem, aplicar um anticorpo secundário (que reconhece a proteína de fusão da albumina, por exemplo, um anticorpo antialbumina sérica humana) conjugado a um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase da raiz forte ou fosfatase alcalina) ou molécula radioativa (por exemplo, 32P ou 125I) diluída em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detectar a presença do antígeno. Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado e reduzir o ruído de fundo. Quanto a uma discussão adicional referente aos protocolos de Western blot, ver, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova York em 10.8.1.

Os ELISAs compreendem preparar o antígeno, revestir o poço de uma placa de microtítulo com 96 poços com o antígeno, remover por lavagem o antígeno que não se ligou aos poços, adicionar a proteína de fusão da albumina (por exemplo, compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) da invenção conjugada a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase da raiz forte ou fosfatase alcalina), aos poços e incubar por um período de tempo, remover por lavagem as proteínas de fusão da albumina não ligadas ou não especificamente ligadas, e detectar a presença das proteínas de fusão da albumina especificamente ligadas ao antígeno que reveste o poço. Nos ELISAs, a proteína de fusão da albumina não tem de estar conjugada a um composto detectável; ao contrário, um segundo anticorpo (que reconhece a proteína de fusão da albumina) conjugado a um composto detectável pode ser adicionado ao poço. Ademais, em vez de revestir o poço com o antígeno, a proteína de fusão da albumina pode ser revestida ao poço. Neste caso, a molécula detectável poderia ser o antígeno conjugado a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, a peroxidase da raiz forte ou a fosfatase alcalina).Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado, bem como outras variações dos ELISAs, conhecidas na técnica. Quanto a uma discussão adicional referente aos ELISAs, vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley & Sons, Inc., Nova York em 11.2.1.

A afinidade de ligação de uma proteína de fusão da albumina a uma proteína, antígeno, ou epítopo e a taxa de dissociação ("off-rate") de uma interação entre proteína de fusão da albumina-proteína/antígeno/epítopo podem ser determinadas por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio que compreende a incubação de um antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com a proteína de fusão da albumina da invenção, na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade da proteína de fusão da albumina por uma proteína, antígeno, ou epítopo específico e as taxas de dissociação da ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise do gráfico de Scatchard. A competição com uma segunda proteína que liga a mesma proteína, antígeno ou epítopo que a proteína de fusão da albumina pode também ser determinada usando radioimunoensaios. Neste caso, a proteína, o antígeno ou o epítopo é incubado com uma proteína de fusão da albumina conjugada a um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I), na presença de quantidades crescentes de uma segunda proteína não marcada, que liga a mesma proteína, antígeno, ou epítopo que a proteína de fusão da albumina da invenção.

Em uma modalidade preferida, a análise cínética por BIAcore é usada para determinar as taxas de associação e dissociação da ligação das proteínas de fusão da albumina da invenção a uma proteína, antígeno ou epítopo. A análise cinética por BIAcore compreende analisar a ligação e a dissociação das proteínas de fusão da albumina, ou polipeptídeos, antígenos ou epítopos específicos a partir de chips com polipeptídeos, antígenos ou epítopos imobilizados específicos ou proteínas de fusão da albumina, respectivamente, sobre a sua superfície.

Os anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica correspondendo à porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina podem também ser descritos ou especificados em termos de sua afinidade de ligação por uma dada proteína ou antígeno, preferivelmente o antígeno que eles especificamente ligam. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10'2 M, 10"2 M, 5 X10"3 Μ, 10"3 M, 5 X 10"4 Μ, 10"4 M. As afinidades de ligação mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10~5 Μ, 10"5 M, 5 X 10"6 Μ, 10"6 M, 5 X 10'7 Μ, 107 M, 5 X 10'8 M ou 10"8 M. As afinidades de ligação ainda mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 X 10"10 Μ, 10"10 M, 5 X 10"11 Μ, 10"11 M, 5 X 10'12 Μ, 10"12 M, 5 X 10"13 Μ, 10"13 M, 5 X 10"14 Μ, 10"14 M, 5 X 10"15 M, ou 10"15 M. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica têm uma afinidade por uma dada proteína ou epítopo similar àquela do anticorpo correspondente (não fundido à albumina) que liga uma proteína Terapêutica, levando-se em consideração a valência da proteína de fusão da albumina (compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) e a valência do anticorpo correspondente. Além disso, os ensaios descritos neste documento (ver os Exemplos e a Tabela 1) e de outro modo conhecidos na técnica podem rotineiramente ser aplicados para medir a capacidade das proteínas de fusão 35 da albumina e dos seus fragmentos, variantes e derivados de produzir atividade biológica e/ou Atividade terapêutica (in vitro ou in vivo) relacionada à porção de proteína Terapêutica e/ou à porção de albumina da proteína de fusão da albumina. Outros métodos serão conhecidos para o profissional versado e estão dentro do escopo da invenção.

Albumina

Conforme descrito acima, uma proteína de fusão da albumina da invenção compreende pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante de albumina sérica humana, que estão associados um com o outro, preferivelmente por fusão genética.

Uma modalidade adicional compreende pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante de albumina sérica humana, os quais estão ligados um ao outro por conjugação química.

Os termos albumina sérica humana (HSA) e albumina humana (HA) são usados de modo intercambiável neste documento. Os termos "albumina" e "albumina sérica" são mais amplos e incluem a albumina sérica humana (e os seus fragmentos e variantes), bem como a albumina de outras espécies (e seus fragmentos e variantes).

Conforme usado neste documento, a "albumina" se refere coletivamente à proteína albumina ou à seqüência de aminoácidos, ou a um fragmento ou variante de albumina, tendo uma ou mais atividades funcionais (por exemplo, atividades biológicas) de albumina. Especificamente, a "albumina" se refere à albumina humana ou aos seus fragmentos (vide, por exemplo, EP 201 239, EP 322 094 WO 97/24445, W095/23857), especialmente à forma madura da albumina humana, como mostrada na Figura 1 e na SEQ ID NO: 1, ou à albumina de outros vertebrados ou seus fragmentos, ou análogos ou variantes destas moléculas ou seus fragmentos.

Nas modalidades preferidas, a proteína albumina sérica humana usada nas proteínas de fusão da albumina da invenção contém um ou ambos os grupos a seguir de mutações pontuais com referência à SEQ ID NO: 1: Leu-407 para Ala, Leu-408 para Val, Val-409 para Ala, e Arg-410 para Ala; ou Arg-410 para A, Lys-413 para Gln, e Lys-414 para Gln (vide, por exemplo, a Publicação Internacional N2 W095/23857, pelo presente, incorporada neste documento em sua totalidade por referência). Nas modalidades ainda mais preferidas, as proteínas de fusão da albumina da invenção, que contêm um ou ambos os grupos de mutações pontuais acima descritos, têm estabilidade/resistência aperfeiçoada 30 à clivagem proteolítica da levedura Yap3p, permitindo a produção aumentada de proteínas de fusão da albumina recombinantes, expressas nas células hospedeiras de leveduras.

Conforme usado aqui, uma porção de albumina suficiente para prolongar a atividade terapêutica ou a estabilidade plasmática ou a vida útil da proteína Terapêutica se refere a uma porção de albumina suficiente, no comprimento ou na estrutura, para estabilizar ou 35 prolongar a atividade terapêutica ou a estabilidade plasmática da proteína, de modo que a vida útil ou a estabilidade plasmática da porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina seja prolongada ou estendida, em comparação com a vida útil ou a estabilidade plasmática no estado de não fusão. A porção de albumina das proteínas de fusão da albumina pode compreender o tamanho total da seqüência de HA, como descrito acima, ou pode incluir um ou mais fragmentos desta que sejam capazes de estabilizar ou prolongar a atividade terapêutica. Tais fragmentos podem ser de 10 ou mais aminoácidos de comprimento ou podem incluir cerca de 15, 20, 25, 30, 50, ou mais aminoácidos contíguos a partir da seqüência de HA ou podem incluir parte ou todos os domínios específicos da HA. Por exemplo, podem ser usados um ou mais fragmentos da HA abrangendo os primeiros dois domínios similares à imunoglobulina. Em uma modalidade preferida, o fragmento da HA é a forma madura da HA.

A porção de albumina das proteínas de fusão da albumina da invenção pode ser uma variante da HA normal. A porção de proteína Terapêutica das proteínas de fusão da albumina da invenção pode também ser variantes das proteínas Terapêuticas, conforme descrito neste documento. O termo "variantes" inclui as inserções, as deleções e as substituições, conservativas ou não conservativas, onde tais mudanças não alteram substancialmente uma ou mais das propriedades da albumina de ligação ao ligante e não-imunogênicas úteis, oncóticas, ou o sítio ativo, ou o domínio ativo que confere as atividades terapêuticas das proteínas Terapêuticas.

Especificamente, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem incluir as variantes polimórficas de ocorrência natural da albumina humana e os fragmentos da albumina humana, por exemplo, aqueles fragmentos divulgados na EP 322 094 (a saber, HA (Pn), onde η é 369 a 419). A albumina pode ser derivada de qualquer vertebrado, especialmente qualquer mamífero, por exemplo, ser humano, vaca, ovelha, ou porco. As albuminas não mamíferas incluem, porém não estão limitadas à galinha e ao salmão. A porção de albumina da proteína de fusão da albumina pode ser a partir de um animal diferente que a porção de proteína Terapêutica.

De forma geral, um fragmento ou variante da HA terá pelo menos 100 aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 150 aminoácidos de comprimento. A variante da HA pode consistir em, ou alternativamente compreender, pelo menos um domínio inteiro da HA, por exemplo, os domínios 1 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO: 1), o domínio 2(aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO:1), o domínio 3 (aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO:1), os domínios 1 e 2 (1-387 de SEQ ID NO:1), os domínios 2 e 3 (195-585 de SEQ ID NO:1) ou os domínios 1 e 3 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO:1 e aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO:1). Cada domínio é, ele próprio, constituído de dois subdomínios homólogos, a saber, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 e 512-585, com as regiões Iigantes entre 35 os subdomínios flexíveis compreendendo os resíduos Lys106 a Glu 119, Glu292 a Val315 e Glu492 a Ala511.

De preferência, a porção de albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção compreende pelo menos um subdomínio ou domínio da HA ou suas modificações conservativas. Se a fusão for baseada em subdomínios, algo ou tudo do Iigante adjacente é preferivelmente usado para ligarse à porção de proteína Terapêutica.

Os anticorpos que ligam especificamente as proteínas terapêuticas são também proteínas Terapêuticas

A presente invenção também inclui as proteínas de fusão da albumina que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que especificamente liga uma proteína Terapêutica divulgada na Tabela 1. Contempla-se especificamente que o termo "proteína Terapêutica" inclui os anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica (por 0 exemplo, conforme descrito na coluna I da Tabela 1) e os seus fragmentos e variantes. Assim, uma proteína de fusão da albumina da invenção pode conter pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica, e/ou pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica.

Estrutura e base do anticorpo Temos o conhecimento de que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-término de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno. A porção de término carbóxi de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mi, delta, gama, alfa, ou epsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Vide, de um modo geral, Fundamental Immunology Capítulos 3-5 (Paul, W., ed., 4a. ed. Raven Press, N.Y. (1998)) (incorporado por referência em sua totalidade para todos os propósitos). As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo.

Assim, um anticorpo IgG intacto tem dois sítios de ligação. Exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são iguais.

Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões de suporte (FR) relativamente conservadas, unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes da complementariedade ou CDRs. As regiões CDR, em geral, são as porções do anticorpo que fazem contato com o antígeno e determinam a sua especificidade. As CDRs das cadeias pesadas e das leves de cada par são alinhadas pelas regiões de suporte, capacitando a ligação a um epítopo específico. A partir do término N até o término C, as regiões variáveis tanto das cadeias leves quanto das pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis são unidas à região constante da cadeia pesada ou leve. A designação dos aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia e Lesk J Moi Biol. 196:901-917 (1987); Chothia e outros, Nature 342:878-883 (1989).

Conforme usado neste documento, o "anticorpo" se refere às moléculas de imunoglobulina e às porções imunologicamente ativas das moléculas de imunoglobulina, isto é, as moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que liga especificamente um antígeno (por exemplo, uma molécula contendo uma ou mais regiões CDR de um anticorpo). Os anticorpos que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina incluem, porém não estão limitados aos anticorpos monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de uma única cadeia (por exemplo, Fvs de uma única cadeia), fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab'), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos antiidiotípicos (anti-ld) (incluindo, por exemplo, os anticorpos anti-ld específicos para os anticorpos da invenção), e fragmentos de ligação ao epítopo de quaisquer dos acima mencionados (por exemplo, os domínios VH, os domínios VL1 ou uma ou mais regiões CDR).

Anticorpos que ligam Proteínas Terapêuticas

A presente invenção inclui as proteínas de fusão da albumina que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma Proteína Terapêutica (por exemplo, conforme divulgado na Tabela 1) ou seu fragmento ou variante.

Os anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) podem ser a partir de qualquer origem animal, incluindo as aves e os mamíferos. De preferência, os anticorpos são anticorpos de seres humanos, murino (por exemplo, camundongo e rato), burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, cavalo, ou galinha. Mais preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos. Conforme usado aqui, os anticorpos "humanos" incluem os anticorpos apresentando a seqüencia de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem os anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas e xenocamundongos ou outros organismos que tenham sido geneticamente construídos para produzir anticorpos humanos.

As moléculas de anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Nas modalidades preferidas, as moléculas de anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina são a IgGI. Nas outras modalidades preferidas, as moléculas de imunoglobulina que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina são a lgG2. Em outras modalidades preferidas, as moléculas de imunoglobulina que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina são a Ig4.

Mais preferivelmente, os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina são os fragmentos de anticorpos de ligação a antígenos da presente invenção e incluem, porém não estão limitados ao Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de uma única cadeia (scFv), anticorpos de uma única cadeia, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv) e fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH. Os fragmentos de anticorpos de ligação a antígenos, incluindo os anticorpos de uma única cadeia, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma parte dos que se seguem: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, e CH3.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de multiespecificidade maior. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de uma proteína Terapêutica ou podem ser específicos tanto para uma proteína Terapêutica quanto para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Ver, por exemplo, as publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, e outros, J. Immunol. 147:60-69 (1991); Patentes US N- 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny e outros, J. Immunol. 148:1547-1553 25 (1992).

Os anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) podem ser biespecíficos ou bifuncionais, o que significa que o anticorpo é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares diferentes de cadeias pesadas/leves e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny e outros, J Immunol. 148:1547 1553 (1992). Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser formados como "diacorpos" (Holliger e outros, '"Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) ou "Janusinas" (Traunecker e outros, 35 "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic Iymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) e Traunecker e outros, "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Câncer Suppl 7:51-52 (1992)). A presente invenção também proporciona proteínas de fusão da albumina que compreendem os fragmentos ou as variantes (incluindo os derivados) de um anticorpo descrito neste documento ou conhecido alhures na técnica. As práticas padrões conhecidas para aqueles de habilidade na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeos que codifica uma molécula da invenção, incluindo, por exemplo, a mutagênese sítio-direcionada e a mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. De preferência, as variantes (incluindo os derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de 10 aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação ao domínio VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, domínio VL, VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3 de referência. Nas modalidades específicas, as variantes codificam as substituições de VHCDR3. Em uma modalidade preferida, as variantes têm substituições de aminoácidos conservativas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de uma proteína Terapêutica que eles reconhecem ou ligam especificamente. Os anticorpos que ligam especificamente uma proteína Terapêutica ou um epítopo específico de uma proteína Terapêutica podem também ser excluídos. Portanto, a presente invenção inclui os anticorpos que ligam especificamente as proteínas Terapêuticas, e permite a exclusão deles. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica ligam os mesmos epítopos que o fragmento ou a variante não fundida deste anticorpo propriamente dito.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina podem também ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Os anticorpos que não ligam nenhum outro análogo, ortólogo, ou homólogo de uma proteína Terapêutica estão incluídos. Os anticorpos que ligam polipeptídeos pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade de seqüência (como calculada usando métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) com uma proteína Terapêutica estão também incluídos na presente invenção. Nas modalidades específicas, os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina reagem cruzado com os homólogos de murinos, ratos e/ou coelhos das proteínas humanas e os seus epítopos correspondentes. Os anticorpos que não ligam polipeptídeos com menos 5 de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, e menos de 50% de identidade de seqüência (como calculada usando métodos conhecidos na técnica e descritos neste documento) com uma proteína Terapêutica estão também incluídos na presente invenção. Em uma modalidade específica, a reatividade cruzada acima descrita é em relação a qualquer polipeptídeo antigênico ou imunogênico específico individual, ou combinação(ões) de 2, 3, 4, 5, ou mais dos polipeptídeos antigênicos e/ou imunogênicos específicos divulgados neste documento. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica têm características de reatividade cruzada similares ou substancialmente idênticas, em comparação com o fragmento ou a variante deste anticorpo específico propriamente dito.

Estão adicionalmente incluídos na presente invenção os anticorpos que ligam polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que hibridizam com um polinucleotídeo codificando uma proteína Terapêutica sob condições de hibridização severas (conforme descritas neste documento). Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem também ser descritos ou especificados em termos de sua afinidade de ligação a um polipeptídeo da invenção. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10~2 Μ, 10"2 M, 5 X10"3 Μ, 10"3 M, 5 X 10"4 Μ, 10"4 M. As afinidades de ligação mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10"5 Μ, 10~5 M, 5 X 10~6 M, 10"6 M, 5 X 10~7 Μ, 107 M, 5 X 10~8 M ou 10"8 M. As afinidades de ligação ainda mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10'9 M, 10"9 M, 5 X 10~10 Μ, 10"10 M, 5 X 10 " Μ, 10 " M, 5 X 10"12 Μ, 10"12 M, 5 X 10"13 Μ, 10"13 M, 5 30 X 10"14 Μ, 10"14 M, 5 X 10"15 M, ou 10~15 M. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica têm uma afinidade por uma dada proteína ou epítopo similar àquela do anticorpo correspondente (não fundido à albumina) que liga uma proteína Terapêutica, levando-se em consideração a valência da proteína de fusão da albumina (compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) e a valência do anticorpo correspondente.

A invenção também proporciona anticorpos que inibem competitivamente a ligação de um anticorpo a um epítopo de uma proteína Terapêutica, conforme determinada por qualquer método conhecido na técnica para determinar a ligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios descritos neste documento. Nas modalidades preferidas, o anticorpo inibe competitivamente a ligação ao epítopo em pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica inibem competitivamente a ligação de um segundo anticorpo a um epítopo de uma proteína Terapêutica. Em outras modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica inibem competitivamente a ligação de um segundo anticorpo a um epítopo de uma proteína Terapêutica em pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85 %, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem atuar como agonistas ou antagonistas da proteína Terapêutica. Por exemplo, a presente invenção inclui os anticorpos que rompem parcial ou totalmente as interações do receptor/ligante com os polipeptídeos da invenção. A invenção caracteriza tanto os anticorpos específicos para os receptores quanto os anticorpos específicos para os ligantes. A invenção também caracteriza os anticorpos específicos para os receptores que não impedem a união do ligante, porém impedem a ativação do receptor. A ativação do receptor (isto é, a sinalização) pode ser determinada pelas técnicas descritas neste documento ou de outro modo conhecidas na técnica. Por exemplo, a ativação do receptor pode ser determinada detectando-se a fosforilação (por exemplo, tirosina ou serina/treonina) do receptor ou de seu substrato por imunoprecipitação, seguida por análise de Western blot (por exemplo, conforme descrita supra). Nas modalidades específicas, proporcionam-se anticorpos que inibem a atividade do ligante ou a atividade do receptor em pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%,pelo menos 60%, ou pelo menos 50% da atividade na ausência do anticorpo. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica têm características similares ou substancialmente similares em relação ao impedimento da união do ligante e/ou impedimento da ativação do receptor, comparadas a um fragmento ou 35 variante não fundida do anticorpo que liga a proteína Terapêutica.

A invenção também caracteriza os anticorpos específicos para os receptores que tanto impedem a união do ligante quanto a ativação do receptor, bem como os anticorpos que reconhecem o complexo de receptor-ligante e, preferivelmente, não reconhecem especificamente o receptor não ligado ou o Iigante não ligado. Também, estão incluídos na invenção os anticorpos de neutralização que ligam o ligante e impedem a união do ligante ao receptor, bem como os anticorpos que ligam o ligante, com isso impedindo a ativação do receptor, porém não impedem que o ligante ligue o receptor. Estão adicionalmente incluídos na invenção os anticorpos que ativam o receptor. Estes anticorpos podem atuar como agonistas dos receptores, isto é, potencializam ou ativam todas as, ou um subgrupo das, atividades biológicas da ativação do receptor mediada pelo ligante, por exemplo, através da indução da dimerização do receptor. Os anticorpos podem ser especificados como agonistas, antagonistas ou agonistas invertidos para as atividades biológicas compreendendo as atividades biológicas específicas das proteínas Terapêuticas (por exemplo, conforme divulgadas na Tabela 1). Os agonistas de anticorpos acima mencionados podem ser preparados usando métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, a publicação PCT WO 96/40281; a Patente US número 5.811.097; Deng e outros, 15 Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen e outros, Câncer Res. 58(16):3668-3678 (1998); Harrop e outros, J. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu e outros, Câncer Res. 58(15):3209-3214 (1998); Yoon e outros, J. Immunol. 160(7):3170-3179 (1998); Prat e outros, J. Cell. Sei. 111(Pt2):237-247 (1998); Pitard e outros, J. Immunol. Methods 205(2): 177-190 (1997); Liautard e outros, Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson e outros, J. Biol. Chem. 272(17): 11295-11301 (1997); Taryman e outros, Neuron 14(4):755-762 (1995); Muller e outros, Structure 6(9): 1153-1167 (1998); Bartunek e outros, Cytokine 8(l): 14-20 (1996) (os quais são todos incorporados por referência neste documento em suas totalidades). Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica têm propriedades agonistas ou antagonistas similares ou substancialmente idênticas a um fragmento ou variante não fundida do anticorpo que liga a proteína Terapêutica.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser usados, por exemplo, para purificar, detectar, e alvejar as proteínas Terapêuticas, incluindo os métodos diagnósticos e terapêuticos tanto in vitro quanto in vivo. Por exemplo, os anticorpos têm utilidade em imunoensaios para medir de modo qualitativo e quantitativo os níveis da proteína Terapêutica em amostras biológicas. Ver, por exemplo, Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ã ed. 1988); incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Também, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser usadas, por exemplo, para purificar, detectar, e alvejar as proteínas Terapêuticas, incluindo os métodos diagnósticos e terapêuticos tanto in vitro quanto in vivo.

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina incluem os derivados que são modificados, isto é, por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Por exemplo, porém não como forma de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que tenham sido modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer de diversas modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, porém não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. As proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser modificadas como descrito acima.

Métodos de Produzir Anticorpos que ligam Proteínas Terapêuticas

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser gerados por qualquer método adequado, conhecido na técnica. Os anticorpos policlonais para um antígeno de interesse podem ser produzidos por diversos procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma proteína Terapêutica pode ser administrada a diversos animais hospedeiros, incluindo, porém não limitados aos coelhos, camundongos, ratos, etc., para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antígeno. Podem ser usados diversos adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, e incluem, porém não estão limitados ao de Freund (completo e incompleto), géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas, tais como lísolecitina, polióis pluronic, poliânions, peptídeos, emulsões de óleos, hemocianinas "keyhole limpet", dinitrofenol, e adjuvantes potencialmente úteis, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e corynebacterium parvum. Tais adjuvantes são também bem conhecidos na técnica.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de práticas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridomas, recombinantes, de exposição em fagos, ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma, incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2- ed. 1988); Hammerling, e outros, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades). O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridomas. O termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico, ou de fago, e não ao método pelo qual ele é produzido.

Os métodos para a produção e a classificação de anticorpos específicos usando a tecnologia de hibridomas são rotinas e bem conhecidos na técnica. Em um exemplo não limitativo, os camundongos podem ser imunizados com uma proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante, uma proteína de fusão da albumina, ou uma célula expressando tal proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante ou proteína de fusão da albumina. Assim que uma resposta imune for detectada, por exemplo, os anticorpos específicos para o antígeno são detectados no soro de camundongo, o baço do camundongo é coletado e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bastante conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, as células da linhagem celular SP20 disponível da ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones dos hibridomas são então testados por métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de ligar um polipeptídeo da invenção. O fluido de ascites, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando os camundongos com clones dos hibridomas positivos.

Desse modo, a presente invenção proporciona métodos de gerar anticorpos monoclonaís, bem como anticorpos produzidos pelo método que compreende cultivar uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo onde, preferivelmente, o hibridoma é gerado por fusão dos esplenócitos isolados de um camundongo imunizado com um antígeno da invenção com as células de mieloma e então examinar os hibridomas resultantes da fusão quanto aos clones de hibridomas que secretam um anticorpo capaz de ligar um polipeptídeo da invenção.

Um outro método bem conhecido para produzir linhagens de células B humanas tanto policlonais quanto monoclonais é a transformação usando o Vírus Epstein Barr (EBV). Os protocolos para gerar as linhagens de células B transformadas com o EBV são comumente conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o protocolo resumido no Capítulo 7.22 do Current Protocols in Immunology, Coligan e outros, Eds., 1994, John Wiley & Sons, NY1 que é, pelo presente, incorporado em sua totalidade por referência. A fonte de células B para a transformação é comumente o sangue periférico humano, porém as células B para a transformação podem também ser derivadas de outras fontes, incluindo, porém não limitadas aos linfonodos, amídala, baço, tecido de tumor, e tecidos infectados. Os tecidos são geralmente transformados em suspensões celulares individuais antes da transformação com o EBV. Adicionalmente, podem ser requeridas etapas para remover fisicamente ou inativar as células T (por exemplo, por tratamento com a ciclosporina A) em amostras contendo células B, porque as células T de indivíduos soropositivos para anticorpos anti-EBV podem impedir a imortalização das células B pelo EBV.

Em geral, a amostra contendo as células B humanas é inoculada com o EBV, e cultivada por 3-4 semanas. Uma fonte típica de EBV é o sobrenadante da cultura da linhagem celular B95-8 (ATCC número VR-1492). Os sinais físicos da transformação com EBV podem ser geralmente vistos próximos ao final do período de cultura de 3-4 semanas. Por microscopia de contraste de fases, as células transformadas podem surgir grandes, claras, pilosas e tendem a agregar-se em aglomerados de células firmes. Inicialmente, as linhagens de EBV são geralmente policlonais. Entretanto, durante os períodos prolongados das culturas das células, as linhagens de EBV podem tornar-se monoclonais ou policlonais como um resultado do desenvolvimento seletivo de clones de células B específicoes. Alternativamente, as linhagens transformadas com EBV policlonais podem ser subclonadas (por exemplo, por cultura de diluição limitante) ou fundidas com um par de fusão adequado e preparadas em placas em diluição limitante para obter as linhagens de células B monoclonais. Os pares de fusão adequados para as linhagens celulares transformadas com EBV incluem as linhagens de células de mielomas de camundongos (por exemplo, SP2/0, X63-Ag8.653), as linhagens de células de heteromielomas (humanas χ camundongos; por exemplo, SPAM-8, SBC-H20, e CB-F7), e as linhagens celulares humanas (por exemplo, GM 1500, SKO-007, RPMI 8226, e KR-4). Assim, a presente invenção também proporciona um método de gerar anticorpos humanos policlonais ou monoclonais contra os polipeptídeos da invenção ou os seus fragmentos, compreendendo a transformação das células B humanas com o EBV.

Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab')2 da invenção podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como a papaína (para produzir os fragmentos Fab) ou a pepsina (para produzir os fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

Por exemplo, os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica podem também ser gerados usando diversos métodos de exposição em fagos, conhecidos na técnica. Nos métodos de exposição em fagos, os domínios dos anticorpos funcionais são expostos sobre a superfície de partículas de fagos, as quais carregam as seqüências de polinucleotídeos que os codificam. Em uma modalidade específico, tal fago pode ser utilizado para expor os domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatória (por exemplo, humana ou murino). O fago expressando um domínio de ligação ao antígeno que liga o antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou glóbulo. O fago usado nestes métodos é tipicamente um fago filamentoso incluindo os domínios de ligação fd e M13 expressos a partir do fago, com os domínios de anticorpos Fab1 Fv ou Fv estabilizado com dissulfeto fundidos de modo recombinante à proteína de gene III ou de gene VIII do fago. Os exemplos dos métodos de exposição em fagos que podem ser usados para preparar anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica incluem aqueles divulgados em Brinkman e outros, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames e outros, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough e outros, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic e outros, Gene 187 9-18 (1997); Burton e outros, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Pedido PCT número PCT/GB91 /01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes US números 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

Conforme descrito nas referências acima mencionadas, após a seleção do fago, o anticorpo que codifica as regiões a partir do fago pode ser isolado e usado para gerar anticorpos inteiros, incluindo os anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expresso em qualquer hospedeiro desejado, incluindo as células mamíferas, as células de insetos, as células de plantas, as leveduras, e as bactérias, por exemplo, conforme descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, as técnicas para produzir de modo recombinante os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax e outros, BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai e outros, AJRI 34:26-34 (1995); e Better e outros, Science 240:1041-1043 (1988) (as ditas referências 25 incorporadas por referência em suas totalidades).

Os exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de uma única cadeia e anticorpos incluem aqueles descritos nas Patentes US 4.946.778 e 5.258.498; Huston e outros, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu e outros, PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra e outros, Science 240:1038-1040 (1988). Para alguns usos, incluindo o uso in vivo de anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados, ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual são derivadas porções diferentes do anticorpo a partir de diferentes espécies de animais, tais como os anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante da imunoglobulina humana. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison1 Science 229:1202 (1985); Oi e outros, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies e outros, (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes US N25 5.807.715; 4.816.567; e 4.816397, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos a partir de um anticorpo de espécie não humana que liga o antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes da complementariedade (CDRs) a partir de espécies não humanas e uma região de suporte a partir de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, os resíduos do suporte nas regiões de suporte humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente aperfeiçoar, a ligação ao antígeno. Estas substituições do suporte são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações dos resíduos da CDR e do suporte para identificar os resíduos do suporte importantes para a ligação ao antígeno e comparação das seqüências para identificar os resíduos do suporte em posições especificadas (vide, por exemplo, Queen e outros, Patente US número 5.585.089; Riechmann e outros, Nature 332:323 (1988), que são incorporados neste documento por referência em suas totalidades.) Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de práticas conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, o enxerto da CDR (EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; Patentes US números 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), o revestimento ou o recobrimento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka e outros, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. e outros, PNAS 91:969-973 (1994)), e o rearranjo das cadeias (Patente US número 5.565.332).

Os anticorpos completamente humanos são especificamente desejáveis para o tratamento terapêutico dos pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo os métodos de exposição em fagos descritos acima, usando bibliotecas de anticorpos derivadas de seqüências de imunoglobulina humanas. Ver também as Patentes US números 4.444.887 e 4.716.111; e as publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos usando camundongos transgênicos, os quais são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, porém os quais podem expressar genes de imunoglobulinas humanas. Por exemplo, os complexos de genes humanos de imunoglobulinas de cadeias pesadas e leves podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga nas células-tronco embrionárias de camundongos. Alternativamente, a região variável, a região constante, e a região de diversidade humanas podem ser introduzidas nas células-tronco embrionárias de camundongos, além dos genes humanos das cadeias pesadas e leves. Os genes de imunoglobulinas de cadeias pesadas e leves de camundongos podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução dos Iocos de imunoglobulinas humanas por recombinação homóloga. Especificamente, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpo endógeno. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são então cruzados para produzir prole homozigótica que expressa anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados no modo normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma parte de um polipeptídeo da invenção. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos, imunizados, usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos rearranjam-se durante a diferenciação das células B, e subseqüentemente sofrem mudança de classe e mutação somática. Assim, usando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Quanto a uma visão geral desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Quanto a uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; a Patente Européia N5 O 598 877; as Patentes US Nes 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; 5.939.598; 6.075.181; e 6.114.598, que são incorporadas por referência neste documento em sua totalidade. Além disso, empresas tais como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA) podem estar empenhadas em proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antígeno selecionado, usando tecnologia similar àquela descrita acima.

Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção guiada". Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers e outros, Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Polinucleotídeos Codificando os Anticorpos

A invenção adicionalmente proporciona polinucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando um anticorpo e seus fragmentos. A invenção também inclui os polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibrídização severas ou, alternativamente, sob severidade menor, por exemplo, conforme definido supra, com polinucleotídeos que codificam um anticorpo, preferivelmente, que se liga especificamente a uma proteína Terapêutica, e mais preferivelmente, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo apresentando a seqüencia de aminoácidos de uma "proteína Terapêutica:X", como divulgado na coluna "SEQ ID NO:Z" da Tabela 2. Os polinucleotídeos podem ser obtidos, e a seqüência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência de nucleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo codificando o anticorpo pode ser construído a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, como descrito em Kutmeier e outros, BioTechniques 17:242 (1994)), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da seqüência codificando o anticorpo, o anelamento e a ligação destes oligonucleotídeos, e então a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

Alternativamente, um polinucleotídeo codificando um anticorpo pode ser gerado a partir de ácido nucléico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucléico codificando um anticorpo específico não estiver disponível, porém a seqüência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucléico codificando a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de DNAc de anticorpo, ou uma biblioteca de DNAc gerada a partir de um ácido nucléico, preferivelmente o poli A+ RNA, isolado de qualquer tecido ou células expressando o anticorpo, tais como as células de hibridomas selecionadas para expressar um anticorpo) através de amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis com as extremidades de 3' e 5' da seqüência, ou através de clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a seqüência de gene específico para identificar, por exemplo, um clone de DNAc a partir de uma biblioteca de DNAc que codifica o anticorpo. Os ácidos nucléicos amplificados gerados por PCR podem ser clonados nos vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica (vide Exemplo 65).

Assim que for determinada a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos correspondente do anticorpo, a seqüência de nucleotídeos do anticorpo pode 25 ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de seqüências de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese sítio dirigida, PCR, etc. (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook e outros, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel e outros, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY1 que são ambos incorporados por referência neste documento em suas totalidades), para gerar anticorpos tendo uma seqüência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos.

Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias pesadas e/ou leves pode ser inspecionada, para identificar as seqüências das regiões determinantes da complementariedade (CDRs), por métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, por comparação com seqüências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, para determinar as regiões de hipervariabilidade da seqüência. Usando técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs podem ser inseridas nas regiões de suporte, por exemplo, nas regiões de suporte humanas para humanizar um anticorpo não humano, como descrito supra. As regiões de suporte podem ser regiões de suporte de ocorrência natural ou de consenso, e preferivelmente regiões de suporte humanas (vide, por exemplo, Chotin e outros, J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) quanto a uma listagem das regiões de suporte humanas). De preferência, o polinucleotideo gerado pela combinação das regiões de suporte e as CDRs codifica um anticorpo que liga especificamente um polipeptídeo da invenção. De preferência, conforme discutido supra, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidos dentro das regiões de suporte e, preferivelmente, as substituições de aminoácidos aperfeiçoam a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para fazer substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam em uma ligação de dissulfeto intracadeia, para gerar moléculas de anticorpos não tendo uma ou mais ligações dissulfeto intracadeias. Outras alterações no polinucleotideo são incluídas pela presente invenção e estão dentro da habilidade da técnica.

Além disso, podem ser usadas as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quimérícos" (Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855 (1984); Neuberger e outros, Nature 312:604-608 (1984); Takeda e outros, Nature 314:452-454 (1985)) por emenda de genes a partir de uma molécula de anticorpo de camundongo de especificidade por antígeno apropriada com genes de uma molécula de anticorpo humana de atividade biológica apropriada. Conforme descrito supra, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as diferentes porções são derivadas de espécies de animais diferentes, tais como aqueles tendo uma região variável derivada de um mAb de murino e uma região constante da imunoglobulina humana, por exemplo, os anticorpos humanizados.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de uma única cadeia (Patente US número 4.946.778; Bird, Science 242:423- 42 (1988); Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988); e Ward e outros, Nature 334:544-54 (1989)) podem ser adaptadas para produzir os anticorpos de uma única cadeia. Os 30 anticorpos de uma única cadeia são formados por ligação dos fragmentos da região de Fv das cadeias pesadas e leves via uma ponte de aminoácido, resultando em um polipeptídeo de uma única cadeia. As técnicas para a construção de fragmentos de Fv funcionais em E.coli podem também ser usadas (Skerra e outros, Science 242:1038- 1041 (1988)).

Expressão Recombinante dos Anticorpos

A expressão recombinante de um anticorpo, ou de seu fragmento, derivado ou análogo, (por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de uma única cadeia), requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Assim que tiver sido obtido um polinucleotídeo codificando uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou a sua porção (preferivelmente contendo o domínio variável da cadeia pesada ou leve), da invenção, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante, usando práticas bastante conhecidas na técnica. Assim, descrevem-se neste documento os métodos para preparar uma proteína por expressão de um polinucleotídeo contendo uma seqüência de nucleotídeos codificando o anticorpo. Podem ser usados métodos que são bem conhecidos para aqueles versados na técnica para construir vetores de expressão contendo seqüências que codificam anticorpos e sinais de controle transcricionais e traducionais. Estes métodos incluem, por exemplo, as técnicas de DNA recombinantes in vitro, as técnicas sintéticas e a recombinação genética in vivo. A invenção, desse modo, proporciona vetores replicáveis compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve dele, ou um domínio variável da cadeia pesada ou leve, operavelmente ligados a um promotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeos codificando a região constante da molécula de anticorpo (vide, por exemplo, a Publicação PCT WO 86/05807; a Publicação PCT WO 89/01036; e a Patente US Ne 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para a expressão da cadeia pesada ou leve inteira.

O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo. Assim, a invenção inclui as células hospedeiras contendo um polinucleotídeo codificando um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve dele, ou um anticorpo de uma única cadeia, operavelmente ligadas a um promotor heterólogo. Nas modalidades preferidas para a expressão de anticorpos de cadeias duplas, os vetores codificando ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira, conforme detalhado abaixo.

Uma variedade de sistemas de vetores de expressão em hospedeiros pode ser utilizada para expressar a molécula de anticorpo da invenção. Tais sistemas de expressão em hospedeiros representam veículos pelos quais as seqüências de codificação de interesse podem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, porém também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as seqüências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estes incluem, porém não estão limitados aos microorganismos, tais como as bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com os vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídio ou DNA de cosmídio contendo seqüências de codificação de anticorpos; as leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com os vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo seqüências de codificação de anticorpos; os sistemas de células de insetos infectados com os vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, o baculovírus) contendo seqüências de codificação de anticorpos; os sistemas de células de plantas infectados com os vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, o vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; o vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com os vetores de expressão de plasmídios recombinantes (por exemplo, o plasmídio Ti) contendo seqüências de codificação de anticorpos; ou os sistemas de células de mamíferos (por exemplo, as células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) abrigando construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor de vírus da vacínia 7.5K). De preferência, as células bacterianas, tais como a Escherichia coli, e mais preferivelmente, as células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula inteira de anticorpo recombinante, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células de mamíferos, tais como as células do ovário de hamster chinês (CHO), em conjunção com um vetor, tal como o elemento promotor de gene inicial intermediário principal a partir do citomegalovírus humano, é um sistema de expressão efetivo para anticorpos (Foecking e outros, Gene 45:101 (1986); Cockett e outros, Bio/Technology 8:2 (1990)).

Nos sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados, dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo que está sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína for para ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, podem ser desejáveis vetores que orientem a expressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são prontamente purificados. Tais vetores incluem, porém não estão limitados ao vetor de expressão de E. coli (Ruther e outros, EMBO J. 2:1791 (1983)), em que a seqüência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente ao vetor em quadro com a região de codificação Iac Z, de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (lnouye e lnouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke e Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e similares. Os vetores pGEX podem também ser usados para expressar polipeptídeos exógenos como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas a partir de células Iisadas por adsorção e ligação aos glóbulos de glutationa-agarose de matriz, seguida por eluição na presença de glutationa 35 livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir sítios de clivagem de trombina ou fator Xa protease, de modo que o produto de gene-alvo clonado possa ser liberado da porção de GST. Em um sistema de insetos, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes exógenos. O vírus desenvolve-se em células de Spodoptera frugiperda. A seqüência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente nas regiões não-essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob o controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).

Nas células hospedeiras mamíferas, podem ser utilizados diversos sistemas de expressão baseados em vírus. Nos casos onde um adenovírus for usado como um vetor de expressão, a seqüência de codificação de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a seqüência líder tripartite. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não-essencial do genoma viral (por exemplo, a região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo nos hospedeiros infectados (por exemplo, ver, por exemplo, Logan e Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 :355-359 (1984)). Podem também ser requeridos sinais de iniciação específicos para a tradução eficiente das seqüências de codificação de anticorpos inseridas. Estes sinais incluem o códon de iniciação de ATG e as seqüências adjacentes. Além disso, o códon de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da seqüência de codificação desejada, para assegurar a tradução do inserto inteiro. Estes sinais de controle exógenos e códons de iniciação traducionais podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos reforçadores da transcrição, terminadores da transcrição, etc., adequados (ver Bittner e outros, Methods in Enzymol. 153:51-544(1987)).

Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa o produto de gene no modo específico desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos protéicos podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e a modificação pós-traducional de proteínas e produtos de genes. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento corretos da proteína exógena expressa. Para esta finalidade, podem ser usadas células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para o processamento adequado do transcrito primário, a glicosilação, e a fosforilação do produto de gene. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem, porém não estão limitadas às linhagens de células de CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e, especificamente, câncer de mama, tais como, por exemplo, BT483, Hs578T, ΗΤΒ2, ΒΤ20 e T47D, e linhagem da célula da glândula mamária normal, tal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção de proteínas recombinantes de longa duração, com alto rendimento, pse refere a expressão estável. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam 5 estavelmente a molécula de anticorpo podem ser construídasas. Em vez de usar vetores de expressão que contenham origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle da expressão apropriados (por exemplo, promotor, reforçador, seqüências, terminadores da transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA exógeno, as células construídasas podem ser deixadas desenvolver por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídio recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídio em seus cromossomos e desenvolvam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos nas linhagens celulares. Este método pode ser usado vantajosamente para engenheirar linhagens celulares que expressam a molécula de anticorpo. Tais linhagens celulares construídasas podem ser especificamente úteis na classificação e na avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Diversos sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, porém não limitados aos genes de timidina cinase do vírus do herpes simples (Wigler e outros, Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska e Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)), e adenina fosforribosiltransferase (Lowy e outros, Cell 22:817 (1980)) que podem ser empregados nas células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência ao antimetabólito pode ser usada como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler e outros, Natl. Acad. Sei. USA 77:357 (1980); 0'Hare e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); maio de 1993, TIB TECH 11(5):155-215 (1993)); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre e outros, Gene 30:147 (1984)). Os métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante podem ser rotineiramente aplicados para selecionar o clone recombinante desejado, e tais métodos são 35 descritos, por exemplo, em Ausubel e outros, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Draeopoli e outros, (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin e outros, J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados por referência neste documento em suas totalidades.

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação do vetor (quanto a uma revisão, vide Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nova York, 1987)). Quando um marcador no sistema de vetor expressando o anticorpo for amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse e outros, Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).

Os vetores que utilizam glutamina sintase (GS) ou DHFR como os marcadores selecionáveis podem ser amplificados na presença dos fármacos metionina sulfoximina ou metotrexato, respectivamente. Uma vantagem dos vetores baseados em glutamina sintase é a disponibilidade das linhagens celulares (por exemplo, a linhagem celular de mieloma de murino, NSO), que são negativas de glutamina sintase. Os sistemas de expressão de glutamina sintase podem também funcionar nas células que expressam a glutamina sintase (por exemplo, as células do Ovário de Hamster Chinês (CHO)) proporcionando inibidor adicional para impedir o funcionamento do gene endógeno. Um sistema de expressão de glutamina sintase e os seus componentes são detalhados nas publicações PCT: W087/04462; W086/05807; W089/01036; W089/10404; e W091/06657, que são incorporadas em suas totalidades por referência neste documento. Adicionalmente, os vetores de expressão de glutamina sintase que podem ser usados de acordo com a presente invenção estão comercialmente disponíveis de fornecedores que incluem, por exemplo, a Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). A expressão e a produção de anticorpos monoclonais usando um sistema de expressão de GS em células de mieloma de murino são descritas em Bebbington e outros, Bio/technology 10:169(1992) e em Biblia e Robinson BiotechnoL Prog. 11:1 (1995), que são incorporados em suas totalidades por referência neste documento.

A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos, os quais capacitam a expressão igual dos polipeptídeos das cadeias pesada e leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, 35 o qual codifica, e é capaz de expressar, os polipeptídeos de ambas as cadeias pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender DNAc ou DNA genômico.

Assim que uma molécula de anticorpo da invenção tiver sido produzida por um animal, quimicamente sintetizada, ou expressa de modo recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, através de cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica, por afinidade, especificamente por afinidade pelo antígeno específico após a Proteína A, e em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, ou os seus fragmentos, podem ser fundidos às seqüências de polípeptídeos heterólogas descritas neste documento ou de outro modo conhecidas na técnica, para facilitar a purificação.

Modificações dos Anticorpos

Os anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica ou os fragmentos ou as variantes podem ser fundidos a seqüências marcadoras, tais como um peptídeo, para facilitar a purificação. Nas modalidades preferidas, a seqüência de aminoácidos marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como a marca proporcionada em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteína de fusão. As outras marcas de peptídeos úteis para a purificação incluem, porém não estão limitadas à marca de hemaglutinina (também chamada a "marca de HA"), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da influenza (Wilson e outros, Cell 37:767 (1984)) e à marca "flag".

A presente invenção adicionalmente inclui os anticorpos ou os seus fragmentos conjugados a um agente diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos podem ser usados diagnosticamente para, por exemplo, monitorar o desenvolvimento ou a progressão de um tumor, como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada por acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem as diversas enzimas, os grupos protéticos, os materiais fluorescentes, os materiais luminescentes, os materiais bioluminescentes, os materiais radioativos, os metais emissores de pósitrons usando diversas tomografias de emissão de pósitrons, e os íons metálicos paramagnéticos não-radioativos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente ao anticorpo (ou ao seu fragmento) ou indiretamente, através de um intermediário (tal como, por exemplo, um Iigante conhecido na técnica) usando práticas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Patente US N- 4.741.900 quanto aos íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para uso como substâncias diagnosticas de acordo com a presente invenção. Os exemplos de enzimas adequadas incluem a peroxidase da raiz forte, a fosfatase alcalina, a beta-galactosidase, ou a acetilcolina esterase; os exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem a estreptavidina/biotina e a avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem a umbeliferona, a fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, a diclorotriazinilamina fluoresceína, o cloreto de dansila ou a ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente inclui o luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem a luciferase, a luciferina, e a equorina; e os exemplos de material radioativo adequado incluem o 1251, o 1311, o 111ln ou o 99Tc. Os outros exemplos de substâncias detectáveis tinham sido descritos alhures neste documento.

Adicionalmente, um anticorpo da invenção pode ser conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, os emissores alfa, tais como, por exemplo, o 213Bi. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células. Os exemplos incluem o paclitaxol, a citocalasina B, a gramicidina D, o brometo de etídio, a emetina, a mitomicina, a etoposida, a tenoposida, a vincristina, a vimblastina, a colquicina, a doxorrubicina, a daunorrubicina, a diidróxi antracina diona, a mitoxantrona, a mitramicina, a actinomicina D, a 1-desidrotestosterona, os glicocorticóides, a procaína, a tetracaína, a lidocaína, o propranolol, e a puromicina e os seus análogos ou homólogos. Os agentes terapêuticos incluem, porém não estão limitados aos antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfam, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e eis- diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vimblastina).

Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, a porção de agente terapêutico ou fármaco não é para ser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como a abrina, a ricina A, a exotoxina de pseudomonas, ou a toxina da difteria; uma proteína, tal como o fator de necrose tumoral, o alfa-interferon, o β-interferon, o fator de crescimento nervoso, o fator de crescimento dos derivados plaquetários, o ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, por exemplo, o TNF-alfa, o TNF-beta, o AIM I (vide a Publicação Internacional Número WO 97/33899), o AIM Il (vide, a Publicação Internacional Número WO 97/34911), o Ligante de Fas (Takahashi e outros, Int. Immunol, 6:1567-1574 (1994)), o VEGI (vide, a Publicação Internacional Número WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, por exemplo, a angiostatina ou a endostatina; ou, os modificadores das respostas biológicas, tais como, por exemplo, as linfocinas, a interleucina-1 ("IL-1"), a interleucina-2 ("IL-2"), a interleucina-6 ("IL-6"), o fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos ("GM-CSF"), o fator estimulador de colônias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.

Os anticorpos podem também ser unidos aos suportes sólidos, os quais são especificamente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno-alvo. Tais suportes sólidos incluem, porém não estão limitados ao vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, poli(cloreto de vinila) ou polipropileno.

As técnicas para conjugar tal porção terapêutica aos anticorpos são bastante conhecidas. Vide, por exemplo, Arnon e outros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld e outros, (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2- Ed.), Robinson e outros, (eds.), páginas 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera e outros, (eds.), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin e outros, (eds.), páginas 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe e outros, "The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).

Alternativamente, o anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo, para formar um heteroconjugado de anticorpos, conforme descrito por Segai na Patente US N-4.676.980, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

Um anticorpo, com ou sem uma porção terapêutica conjugada a ele, administrado sozinho ou em combinação com fator(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s), pode ser usado como uma substância terapêutica.

Fusão de anticorpo-albumina

Os anticorpos que se ligam a uma proteína Terapêutica e que podem corresponder a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados aos anticorpos que ligam uma proteína Terapêutica divulgada na coluna "Proteína Terapêutica X" da Tabela 1, ou um seu fragmento ou variante. Nas modalidades específicas, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende ou alternativamente consiste no,domínio VH. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende, ou alternativamente consiste em, uma, duas ou três CDRs do VH. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR1 do VH. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR2 do VH. Em outras modalidades, o fragmento ou a 15 variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR3 do VH.

Nas modalidades específicas, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende o, ou alternativamente consiste no, domínio VL. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende, ou alternativamente consiste em, uma, duas ou três CDRs do VL. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR1 do VL. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR2 do VL. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende a, ou alternativamente consiste na, CDR3 do VL. Em outras modalidades, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga

imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende, ou alternativamente consiste em, uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis CDRs do VH e/ou do VL.

Nas modalidades preferidas, o fragmento ou a variante de um anticorpo que liga imunoespecificamente uma proteína Terapêutica e que corresponde a uma porção de 5 proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina compreende, ou alternativamente consiste em, um scFv compreendendo o domínio VH do anticorpo Terapêutico, ligado ao domínio VL do anticorpo terapêutico por um Iigante de peptídeo, tal como (GIy4Ser)3 (SEQ ID NO:4).

Imunofenotipificação

Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) podem ser utilizados para a imunofenotipicação de linhagens celulares e amostras biológicas. As proteínas Terapêuticas da presente invenção podem ser úteis como marcadores específicos para as células, ou mais 15 especificamente, como marcadores celulares que são expressos diferencialmente em diversos estágios de diferenciação e/ou maturação de tipos específicos de células. Os anticorpos monoclonais (ou as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) orientados contra um epítopo específico, ou uma combinação de epítopos, permitirão a classificação de populações celulares que expressam o marcador. Diversas técnicas podem ser utilizadas usando anticorpos monoclonais (ou as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) para examinar as populações celulares expressando o(s) marcador(es), e incluem a separação magnética usando glóbulos magnéticos revestidos com anticorpos, o bateamento com o 25 anticorpo unido a uma matriz sólida (isto é, placa), e a citometria de fluxo (vide, por exemplo, a Patente US 5.985.660; e Morrison e outros, Cell, 96:737-49 (1999)).

Estas técnicas permitem a classificação de populações específicas de células, tais como poderiam ser verificadas com as malignidades hematológicas (isto é, a doença residual mínima (MRD) em pacientes leucêmicos agudos), e células "não-próprias" em transplantes para impedir a Doença do Enxerto versus Hospedeiro (GVHD). Alternativamente, estas técnicas permitem a classificação de células-tronco hematopoéticas e progenitoras, capazes de sofrer proliferação e/ou diferenciação, conforme poderia ser verificado no sangue do cordão umbilical humano.

Caracterização dos anticorpos que ligam uma proteína terapêutica e proteínas de 35 fusão da albumina compreendendo um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína terapêutica

Os anticorpos da invenção, ou as proteínas de fusão da albumina da invenção que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante), podem ser caracterizados em uma variedade de modos. Especificamente, as Proteínas de fusão da albumina da invenção, que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína 5 Terapêutica, podem ser testadas quanto à capacidade de ligar-se especificamente aos mesmos antígenos especificamente ligados pelo anticorpo que liga uma proteína Terapêutica correspondendo ao anticorpo que liga uma porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina usando as técnicas descritas neste documento ou rotineiramente modificando as práticas conhecidas na técnica.

Os ensaios quanto à capacidade dos anticorpos da invenção, ou das proteínas de fusão da albumina da invenção que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante), de ligar (especificamente) uma proteína ou epítopo específico podem ser efetuados em solução (por exemplo, Houghten, Bio/Techniques 13:412-421 (1992)), sobre glóbulos (por exemplo, Lam, Nature 354:82-84 (1991)), sobre chips (por exemplo, Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), sobre bactérias (por exemplo, Patente US númro 5.223.409), sobre esporos (por exemplo, Patentes US números 5.571.698; 5.403.484; e 5.223.409), sobre plasmídios (por exemplo, Cull e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865-1869 (1992)) ou sobre fago (por exemplo, Scott e Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990); e Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)) (cada uma destas referências é incorporada neste documento em sua totalidade por referência). Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) podem também ser testados quanto à sua especificidade e afinidade por uma proteína ou epítopo específico, usando ou modificando rotineiramente as práticas descritas neste documento ou de outro modo conhecidas na técnica.

As proteínas de fusão da albumina da invenção que compreendem pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser testadas quanto à reatividade cruzada com outros antígenos (por exemplo, moléculas que têm conservação de seqüência/estrutura com a(s) molécula(s) especificamente ligada(s) pelo anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) correspondendo à porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina da invenção) por qualquer método conhecido na técnica.

Os imunoensaios que podem ser usados para analisar a ligação (imunoespecífica) e a reatividade cruzada incluem, porém não estão limitados aos sistemas de ensaios competitivos e não competitivos usando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunológico por ligação com enzima), ímunoensaio em camadas, ensaios de imunoprecipitação, reações com precipitina, reações com precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A, para mencionar somente alguns. Tais ensaios são rotinas e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade). Os imunoensaios ilustrativos são descritos resumidamente abaixo (porém não são pretendidos como limitação).

Os protocolos de imunoprecipitação geralmente compreendem Iisar uma população de células em um tampão de lise, tal como o tampão RIPA (1% de NP-40 ou Triton X-100, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, NaCI a 0,15 M, fosfato de sódio a 0,01 M em pH 7,2, 1% de Trasylol), suplementado com inibidores de fosfatase e/ou protease protéica (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adicionar um anticorpo da invenção ou a proteína de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) ao Iisado celular, incubar por um período de tempo (por exemplo, 1 a 4 horas) a 40 graus C, adicionar os glóbulos de Sepharose de proteína A e/ou proteína G (ou os glóbulos revestidos com um anticorpo antiidiotípico ou anticorpo antialbumina apropriado no caso quando uma proteína de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico) ao lisado celular, incubar por cerca de uma hora ou mais a 40 graus C, lavar os glóbulos em tampão de Iise e suspender novamente os glóbulos em tampão de SDS/amostra. A capacidade do anticorpo ou da proteína de fusão da albumina da invenção de imunoprecipitar um antígeno específico pode ser avaliada 25 através de, por exemplo, análise por Western blot. Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo ou da proteína de fusão da albumina a um antígeno e diminuir o secundário (por exemplo, pré-eliminar o Iisado celular com glóbulos de Sepharose). Quanto a uma discussão adicional concernente aos protocolos de imunoprecipitação, ver, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nova York em 10.16.1.

A análise por Western blot geralmente compreende preparar as amostras de proteínas, eletroforese das amostras de proteínas em um gel de poliacrilamida (por exemplo, 8%-20% de SDS-PAGE, dependendo do peso molecular do antígeno), transferir a 35 amostra de proteínas do gel de poliacrilamida para uma membrana, tal como a nitrocelulose, o PVDF ou o náilon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com 3% de BSA ou leite sem gordura), lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), aplicar o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina da invenção (diluída em tampão de bloqueio) à membrana, lavar a membrana em tampão de lavagem, aplicar um anticorpo secundário (que reconhece a proteína de fusão da albumina, por exemplo, um anticorpo antialbumina sérica humana) conjugado a um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase da raiz forte ou fosfatase alcalina) ou molécula radioativa (por exemplo, 32P ou 125I) diluída em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detectar a presença do antígeno. Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado e reduzir o ruído de fundo. Quanto a uma discussão adicional referente aos protocolos de Western blot, ver, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., NovaYorkem 10.8.1.

Os ELISAs compreendem preparar o antígeno, revestir o poço de uma placa de microtítulo com 96 poços com o antígeno, remover por lavagem o antígeno que não se ligou aos poços, adicionar o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina (compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) da invenção conjugada a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase da raiz forte ou fosfatase alcalina), aos poços e incubar por um período de tempo, remover por lavagem as proteínas de fusão da albumina não ligadas ou não especificamente ligadas, e detectar a presença do anticorpo ou das proteínas de fusão da albumina especificamente ligadas ao antígeno que reveste o poço. Nos ELISAs, o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina não tem de estar conjugada a um composto detectável; ao contrário, um segundo anticorpo (que reconhece o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina, respectivamente) conjugado a um composto detectável pode ser adicionado ao poço. Ademais, em vez de revestir o poço com o antígeno, o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina pode ser revestida ao poço. Neste caso, a molécula detectável poderia ser o antígeno conjugado a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, a peroxidase da raiz forte ou a fosfatase alcalina). Alguém de habilidade na técnica estaria informado quanto aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado, bem como outras variações dos ELISAs, conhecidas na técnica. Quanto a uma discussão adicional referente aos ELISAs, ver, por exemplo, Ausubel e outros, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley & Sons, Inc., Nova York em 11.2.1.

A afinidade de ligação de uma proteína de fusão da albumina a uma proteína, antígeno, ou epítopo e a taxa de dissociação de uma interação entre anticorpo- ou proteína de fusão da albumina-proteína/antígeno/epítopo podem ser determinadas por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio que compreende a incubação de um antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina da invenção, na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo ou da proteína de fusão da albumina por uma proteína, antígeno, ou epítopo específico e as taxas de dissociação da ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise do gráfico de Scatchard. A competição com uma segunda proteína que liga a mesma proteína, antígeno ou epítopo que o anticorpo ou a proteína de fusão da albumina pode também ser determinada usando radioimunoensaios. Neste caso, a proteína, o antígeno ou o epítopo é incubado com um anticorpo ou uma proteína de fusão da albumina da invenção conjugada a um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I), na presença de quantidades crescentes de uma segunda proteína não marcada, que liga a mesma proteína, antígeno, ou epítopo que a proteína de fusão da albumina da invenção.

Em uma modalidade preferida, a análise cinética por BIAcore é usada para determinar as taxas de associação e dissociação da ligação do anticorpo ou das proteínas de fusão da albumina da invenção a uma proteína, antígeno ou epítopo. A análise cinética por BIAcore compreende analisar a ligação e a dissociação dos anticorpos, proteínas de fusão da albumina, ou polipeptídeos, antígenos ou epítopos específicos a partir de chips com polipeptídeos, antígenos ou epítopos imobilizados específicos, anticorpos ou proteínas de fusão da albumina, respectivamente, sobre a sua superfície.

Usos terapêuticos

A presente invenção é adicionalmente dirigida às terapias baseadas em anticorpos, as quais envolvem administrar os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica a um paciente animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um ser humano, para tratar uma ou mais das doenças, transtornos, ou condições divulgadas. Os compostos terapêuticos da invenção incluem, porém não estão limitados aos anticorpos da invenção (incluindo os seus fragmentos, análogos e derivados, como descritos neste documento), ácidos nucléicos codificando os anticorpos da invenção (incluindo os seus fragmentos, análogos e derivados e os anticorpos anti-idiotípicos, conforme descritos neste documento), proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica, e ácidos nucléicos codificando tais proteínas de fusão da albumina. Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser usadas para tratar, inibir ou prevenir doenças, transtornos ou condições associadas com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica, incluindo, porém não limitadas a qualquer uma ou mais das doenças, transtornos, ou condições descritas neste documento. O tratamento e/ou a prevenção de doenças, transtornos, ou condições associadas com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica inclui, porém não está limitada ao alívio dos sintomas associados com estas doenças, transtornos ou condições. Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser proporcionadas em composições farmaceuticamente aceitáveis, como conhecidas na técnica ou como descritas neste documento.

Em uma modalidade específica e preferida, a presente invenção é dirigida às terapias baseadas em anticorpos, as quais envolvem administrar os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica a um paciente animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um ser humano, para tratar uma ou mais doenças, transtornos, ou condições, incluindo, porém não limitadas aos: transtornos neurais, transtornos do sistema imunológico, transtornos musculares, transtornos reprodutivos, transtornos gastrointestinais, transtornos pulmonares, transtornos cardiovasculares, transtornos renais, transtornos proliferativos, e/ou doenças e condições cancerosas, e/ou como descritas alhures neste documento. Os compostos terapêuticos da invenção incluem, porém não estão limitados aos anticorpos da invenção (por exemplo, os anticorpos dirigidos para a proteína de tamanho natural expressada sobre a superfície celular de uma célula de mamífero; os anticorpos dirigidos para um epítopo de uma proteína Terapêutica e os ácidos nucléicos codificando os anticorpos da invenção (incluindo os seus fragmentos, análogos e derivados e os anticorpos anti-idiotípicos, conforme descritos neste documento). Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, inibir ou prevenir doenças, transtornos ou condições associadas com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica, incluindo, porém não limitadas a qualquer uma ou mais das doenças, transtornos, ou condições descritas neste documento. O tratamento e/ou a prevenção de doenças, transtornos, ou condições associadas com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica inclui, porém não está limitada ao alívio dos sintomas associados com estas doenças, transtornos ou condições. Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser proporcionadas em composições farmaceuticamente aceitáveis, como conhecidas na técnica ou como descritas neste documento.

Um resumo dos modos nos quais os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser usados terapeutícamente inclui ligar as proteínas Terapêuticas localmente ou sistemicamente no corpo ou por citotoxicidade direta do anticorpo, por exemplo, como mediada por complemento (CDC) ou por células efetoras (ADCC). Algumas destas abordagens são descritas em mais detalhe abaixo. Munido com os ensinamentos proporcionados neste documento, alguém de habilidade comum na técnica saberá como usar os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica para propósitos diagnósticos, de monitoramento ou terapêuticos, sem experimentação indevida.

Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser vantajosamente utilizados em combinação com outros anticorpos monoclonais ou quiméricos, ou com Iinfocinas ou fatores do crescimento hematopoéticos (tais como, por exemplo, IL-2 IL-3 e IL-7), por exemplo, que servem para aumentar o número ou a atividade das células efetoras que interagem com os anticorpos.

Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros tipos de tratamentos (por exemplo, terapia de radiação, quimioterapia, terapia hormonal, imunoterapia e agentes antitumor). Geralmente, pse refere a administração de produtos de uma origem de espécie ou reatividade da espécie (no caso dos anticorpos) que seja a mesma espécie que aquela do paciente. Assim, em uma modalidade preferida, os anticorpos, os fragmentos, os derivados, os análogos, ou os ácidos nucléicos humanos são administrados a um paciente humano para a terapia ou a profilaxia.

É preferido usar anticorpos inibidores e/ou neutralizantes de alta afinidade e/ou potentes contra as proteínas Terapêuticas, seus fragmentos ou regiões, (ou o correspondente da proteína de fusão da albumina de tal anticorpo) tanto para os imunoensaios dirigidos quanto para a terapia de transtornos relacionados aos polinucleotídeos ou polipeptídeos, incluindo os seus fragmentos, da presente invenção. Tais anticorpos, fragmentos, ou regiões preferivelmente terão uma afinidade pelos polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção, incluindo os seus fragmentos. As afinidades de ligação preferidas incluem as constantes de dissociação ou Kd's menores do que 5 X 10~2 Μ, 10"2 M, 5 X10"3 Μ, 10"3 M, 5 X 10"4 Μ, 10"4 M. As afinidades de ligação mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10"5 Μ, 10~5 M, 5 X 10"6 M1 10"6 M, 5 X 10"7 Μ, 107 M, 5 X 10"8 M ou 10"8 M. As afinidades de ligação ainda mais preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 X 10"9 M1 10"9 M, 5 X 10"10 Μ, 10'10 M, 5 X 10'11 Μ, 10"11 M, 5 X 10"12 Μ, 10'12 M, 5 X 10"13 Μ, 10"13 M, 5 X 10"14 Μ, 10"14 M, 5 X 10"15 M, ou 10"15 M. Terapia gênica

Em uma modalidade específica, os ácidos nucléicos, que compreendem seqüências que codificam anticorpos que ligam proteínas terapêuticas ou proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica, são administrados para tratar, inibir ou prevenir uma doença ou transtorno associado com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica, por meio de terapia gênica. A terapia gênica se refere à terapia efetuada pela administração a um paciente de um ácido nucléico expresso ou capaz de ser expresso. Nesta modalidade da invenção, os ácidos nucléicos produzem sua proteína codificada que media um efeito terapêutico.

Quaisquer dos métodos para a terapia gênica disponíveis na técnica podem ser usados de acordo com a presente invenção. Os métodos ilustrativos são descritos em mais detalhe alhures neste pedido.

Demonstração da atividade terapêutica ou profilática

Os compostos ou as composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente testados in vitro, e então in vivo, quanto à atividade terapêutica ou profilática desejada, antes do uso em seres humanos. Por exemplo, os ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica ou profilática de um composto ou composição farmacêutica incluem o efeito de um composto sobre uma linhagem celular ou uma amostra de tecido de um paciente. O efeito do composto ou da composição sobre a linhagem celular e/ou a amostra de tecido pode ser determinado utilizando práticas conhecidas para aqueles de habilidade na técnica, incluindo, porém não limitadas aos ensaios de formação de rosetas e ensaios da Iise celular. De acordo com a invenção, os ensaios in vitro que podem ser usados para determinar se a administração de um composto específico é indicada incluem os ensaios de culturas de células in vitro, nos quais uma amostra de tecido do paciente é desenvolvida na cultura, e exposta a, ou de outro modo administrada, um composto, e o efeito de tal composto sobre a amostra de tecido é observado.

Administração Terapêutica/Profilática e Composição

A invenção proporciona métodos de tratamento, inibição e profilaxia por administração a um paciente de uma quantidade efetiva de um composto ou composição farmacêutica da invenção. Em uma modalidade preferida, o composto é substancialmente purificado (por exemplo, substancialmente livre de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados). O paciente é preferivelmente um animal, incluindo, porém não limitado aos animais tais como vacas, porcos, cavalos, galinhas, gatos, cães, etc., e é preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente o ser humano.

As formulações e os métodos de administração que podem ser empregados quando o composto compreender um ácido nucléico ou uma imunoglobulina são descritos acima; podem ser selecionadas formulações e rotas de administração apropriadas adicionais dentre aquelas descritas neste documento, abaixo.

Diversos sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar um composto da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucléico como parte de um vetor retroviral ou outro, etc. Os métodos de introdução incluem, porém não estão limitados às rotas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, e oral. Os compostos ou as composições podem ser administradas por qualquer rota conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administradas com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os compostos ou as composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central, por qualquer rota adequada, incluindo a injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, unido a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar pode também ser empregada, por exemplo, por uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente na forma de aerossol.

Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar os compostos ou as composições farmacêuticas da invenção localmente à área que necessita de tratamento; isto pode ser obtido, por exemplo, e não como forma de limitação, através de infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunção com um curativo de ferida após cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso, incluindo as membranas, tais como as membranas sialásticas, ou as fibras. De preferência, quando administrando uma proteína, incluindo um anticorpo, da invenção, deve ser tomado cuidado ao usar os materiais aos quais a proteína não absorve.

Em uma outra modalidade, o composto ou a composição pode ser distribuída em uma vesícula, especificamente um Iipossomo (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat e outros, em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova York, páginas 353- 365 (1989); Lopez-Beresteiη, ibid., páginas 317-327; vide em geral ibid.)

Em mais uma outra modalidade, o composto ou a composição pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald e outros, Surgery 88:507 (1980); Saudek e outros, Ν. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Em uma outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados (vide Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova York (1984); Rangere Peppas, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61

(1983); vide também Levy e outros, Science 228:190 (1985); During e outros, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard e outros, J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Em mais uma outra modalidade, um sistema de liberação pode ser colocado na proximidade do alvo terapêutico, por exemplo, o cérebro, assim requerendo somente uma fração da dose sistêmica (vide,

Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138(1984)).

Os outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Em uma modalidade específica onde o composto da invenção for um ácido nucléico codificando uma proteína, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de sua proteína codificada, por sua construção como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e sua administração de modo que ele se torne intracelular, por exemplo, por uso de um vetor retroviral (ver a Patente US N2 4.980.286), ou por injeção direta, ou por uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipídios ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, ou por sua administração em ligação com um peptídeo similar ao homeobox, o qual é sabido entrar no núcleo (vide, Joliot e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para a expressão, por recombinação homóloga.

A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significada aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopéia US ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais especificamente em seres humanos. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual a substância terapêutica é administrada. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como a água e os óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como o óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo mineral, o óleo de gergelim e similares. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica for administrada intravenosamente. As soluções de salmoura e as soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregadas como veículos líquidos, especificamente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem o amido, a glicose, a lactose, a sacarose, a gelatina, o malte, o arroz, a farinha, a greda, a sílica gel, o estearato de sódio, o monoestearato de glicerol, o talco, o cloreto de sódio, o leite desnatado seco, o glicerol, o propileno, o glicol, a água, o etanol e similares. A composição, se desejado, pode também conter quantidades pequenas de agentes umidificantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação controlada e similar. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes tradicionais e veículos tais como os triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos padrões, tais como os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Os exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto, preferivelmente na forma purificada, com uma quantidade adequada de veículo, de modo a proporcionar a forma para a administração adequada ao paciente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração.

Em uma modalidade preferida, a composição é formulada de acordo com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, as composições para a administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como a lignocaína, para suavizar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados conjuntamente na forma dedosagem de unidade, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição for para ser administrada por infusão, ela pode ser distribuída com um frasco de infusão contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril. Onde a composição for administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou salina pode ser proporcionada de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Os compostos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions, tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

A quantidade do composto da invenção que será efetiva no tratamento, na inibição e na prevenção de uma doença ou transtorno associado com a expressão e/ou a atividade anormais de uma proteína Terapêutica pode ser determinada por técnicas clínicas padrões. Além disso, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para auxiliar a identificar as faixas de dosagem ótimas. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da rota de administração, e da gravidade da doença ou do transtorno, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e as circunstâncias de cada paciente. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de testes in vitro ou com modelos de animais.

Para os anticorpos, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corpóreo do paciente. De preferência, a dosagem administrada a um paciente é entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corpóreo do paciente, mais preferivelmente 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corpóreo do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies, devido à resposta imune aos polipeptídeos exógenos. Assim, são freqüentemente possíveis dosagens mais baixas de anticorpos humanos e uma administração menos freqüente. Ademais, a dosagem e a freqüência de administração dos anticorpos da invenção podem ser reduzidas aumentando-se a captação e a penetração no tecido (por exemplo, no cérebro) dos anticorpos por modificações tais como, por exemplo, a lipidação.

Diagnóstico e Imageamento

Os anticorpos marcados e os seus derivados e análogos que ligam uma proteína

Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) (incluindo as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica) podem ser usados para propósitos diagnósticos, para detectar, diagnosticar, ou monitorar as doenças, os transtornos, e/ou as condições associadas com a expressão e/ou a atividade anormais da proteína Terapêutica. A invenção proporciona a detecção da expressão anormal de uma proteína Terapêutica, compreendendo (a) testar a expressão da proteína Terapêutica em célula ou fluido corpóreo de um indivíduo usando um ou mais anticorpos específicos para o polipeptídeo de interesse e (b) comparar o nível de expressão gênica com um nível de expressão gêníca padrão, pelo que um aumento ou uma diminuição no nível de expressão da proteína Terapêutica testada, comparado ao nível de expressão padrão, é indicativa da expressão anormal.

A invenção proporciona um ensaio diagnóstico para diagnosticar um transtorno, compreendendo (a) testar a expressão da proteína Terapêutica em células ou fluido corpóreo de um indivíduo, usando um ou mais anticorpos específicos para a proteína 35 Terapêutica ou as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo específico para uma proteína Terapêutica, e (b) comparar o nível de expressão gênica com um nível de expressão gênica padrão, pelo que um aumento ou uma diminuição no nível de expressão gênica da proteína Terapêutica testada, comparado ao nível de expressão padrão, é indicativa de um transtorno específico. Com relação ao câncer, a presença de uma quantidade relativamente alta de transcrito no tecido de um indivíduo que sofreu biopsia pode indicar uma predisposição para o 5 desenvolvimento da doença, ou pode proporcionar um meio para detectar a doença antes do surgimento dos sintomas clínicos reais. Um diagnóstico mais definitivo deste tipo pode permitir que os profissionais da saúde empreguem medidas preventivas ou um tratamento agressivo mais cedo, com isso impedindo o desenvolvimento ou a progressão adicional do câncer.

Os anticorpos da invenção ou as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento de variante de um anticorpo específico para uma proteína Terapêutica podem ser usadas para testar os níveis protéicos em uma amostra biológica, usando métodos imunoistológicos clássicos, conhecidos para aqueles de habilidade na técnica (por exemplo, ver Jalkanen e outros, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen e outros, J. Cell . Biol. 105:3087-3096 (1987)). Os outros métodos à base de anticorpos, úteis para detectar a expressão gênica da proteína, incluem os imunoensaios, tais como o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). As marcas adequadas do ensaio com anticorpos são conhecidas na técnica e incluem as marcas de enzimas, tais como a glicose oxidase; os radioisótopos, tais como iodo (1251, 1211), o carbono (14C), o enxofre (35S), o trítio (3H), o índio (112ln), e o tecnécio (99Tc); as marcas luminescentes, tais como o luminol; e as marcas fluorescentes, tais como a fluoresceína e a rodamina, e a biotina.

Um aspecto de consideração da invenção se constitui na detecção e o diagnóstico de uma doença ou transtorno associado com a expressão anormal de uma proteína Terapêutica em um animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um ser humano. Em uma modalidade, o diagnóstico compreende: a) administrar (por exemplo, de modo parenteral, subcutâneo ou intraperitoneal) a um paciente uma quantidade efetiva de uma molécula marcada, a qual especificamente liga-se ao polipeptídeo de interesse; b) esperar por um intervalo de tempo após a administração para permitir que a molécula marcada concentre-se preferencialmente em locais no paciente onde a proteína Terapêutica é expressa (e para a molécula marcada não ligada ser depurada até um nível de base); c) determinar o nível de base; e d) detectar a molécula marcada no paciente, de modo tal que a detecção da molécula marcada acima do nível de base indique que o paciente tem uma doença ou transtorno específico associado com a expressão anormal da proteína terapêutica. O nível de base pode ser determinado por diversos métodos, incluindo a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão previamente determinado para um sistema específico. Será entendido na técnica que o tamanho do paciente e o sistema de imageamento usado determinarão a quantidade de porção de imageamento necessária para produzir as imagens diagnosticas. No caso de uma porção de radioisótopos, para um paciente humano, a quantidade de radioatividade injetada normalmente variará de cerca de 5 a 20 milicuries de 99mTc. O anticorpo marcado, o fragmento de anticorpo, ou a proteína de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica então preferencialmente acumular-se-á no local das células que contêm a proteína Terapêutica específica. O imageamento in vivo do tumor é descrito em S.W. Burchiel e outros, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 em Tumor lmaging: The Radiochemical Detection of Câncer, S.W. Burchiel e B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

Dependendo de diversas variáveis, incluindo o tipo de marca usada e o modo de administração, o intervalo de tempo após a administração para permitir que a molécula marcada preferencialmente concentre-se em locais no paciente e para a molécula marcada não ligada ser depurada até um nível de base é 6 a 48 horas ou 6 a 12 horas. Em uma outra modalidade, o intervalo de tempo após a administração é 5 a 20 dias ou 5 a 10 dias.

Em uma modalidade, o monitoramento da doença ou do transtorno é realizado repetindo-se o método para diagnosticar a doença ou o transtorno, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial, etc.

A presença da molécula marcada pode ser detectada no paciente usando métodos conhecidos na técnica para a varredura in vivo. Estes métodos dependem do tipo de marca usada. Os técnicos versados serão capazes de determinar o método apropriado para detectar uma marca específico. Os métodos e os dispositivos que podem ser usados nos métodos diagnósticos da invenção incluem, porém não estão limitados à, tomografia computadorizada (CT), varredura do corpo inteiro, tal como tomografia por emissão de pósitrons (PET), imagem de ressonância magnética (MRI), e sonografia.

Em uma modalidade específica, a molécula é marcada com um radioisótopo e é detectada no paciente usando um instrumento cirúrgico sensível à radiação (Thurston e outros, Patente US N- 5.441.050). Em uma outra modalidade, a molécula é marcada com um composto fluorescente e é detectada no paciente usando um instrumento de varredura sensível à fluorescência. Em uma outra modalidade, a molécula é marcada com um metal emissor de pósitron e é detectada no paciente usando a tomografia por emissão de pósitrons. Em mais uma outra modalidade, a molécula é marcada com uma marca paramagnética e é detectada em um paciente usando imagem de ressonância magnética (MRI). Os anticorpos que especificamente detectam a proteína de fusão da albumina, porém não a albumina ou a proteína terapêutica sozinha, são uma modalidade preferida. Estes podem ser usados para detectar a proteína de fusão da albumina como descrito por todo o relatório descritivo.

Kits

A presente invenção proporciona kits que podem ser usados nos métodos acima descritos. Em uma modalidade, um kit compreende um anticorpo, preferivelmente um anticorpo purificado, em um ou mais recipientes. Em uma modalidade específica, os kits da presente invenção contêm um polipeptídeo substancialmente isolado compreendendo um epítopo que é especificamente imunorreativo com um anticorpo incluído no kit. De preferência, os kits da presente invenção adicionalmente compreendem um anticorpo de controle, o qual não reage com o polipeptídeo de interesse. Em uma outra modalidade específica, os kits da presente invenção contêm um meio para detectar a ligação de um anticorpo a um polipeptídeo de interesse (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um substrato detectável, tal como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioativo ou um composto luminescente, ou um segundo anticorpo, o qual reconhece o primeiro anticorpo, pode ser conjugado a um substrato detectável).

Em uma outra modalidade específica da presente invenção, o kit é um kit diagnóstico para uso na classificação de soro contendo anticorpos específicos contra os polinucleotídeos e os polipeptídeos proliferativos e/ou cancerosos. Tal kit pode incluir um anticorpo de controle que não reage com o polipeptídeo de interesse. Tal kit pode incluir um antígeno do polipeptídeo substancialmente isolado, compreendendo um epítopo que é especificamente imunorreativo com pelo menos um anticorpo anti-antígeno do polipeptídeo. Ademais, tal kit inclui meios para detectar a ligação do dito anticorpo ao antígeno (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um composto fluorescente, tal como a fluoresceína ou a rodamina, que pode ser detectado por citometria de fluxo). Nas modalidades específicas, o kit pode incluir um antígeno do polipeptídeo recombinantemente produzido ou quimicamente sintetizado. O antígeno do polipeptídeo do kit pode também ser unido a um suporte sólido.

Em uma modalidade mais específica, o meio de detecção do kit acima descrito inclui um suporte sólido ao qual está unido o dito antígeno do polipeptídeo. Tal kit pode também incluir um anticorpo anti-humano marcado com relator não unido. Nesta modalidade, a ligação do anticorpo ao antígeno de polipeptídeo pode ser detectada por ligado do dito anticorpo marcado com relator.

Em uma modalidade adicional, a invenção inclui um kit diagnóstico para uso na classificação de soro contendo antígenos do polipeptídeo da invenção. O kit diagnóstico inclui um anticorpo substancialmente isolado, especificamente imunorreativo com os antígenos dos polipeptídeos ou polinucleotídeos, e meios para detectar a ligação do antígeno de polínucleotídeo ou polipeptídeo ao anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo está unido a um suporte sólido. Em uma modalidade específica, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. O meio de detecção do kit pode incluir um segundo anticorpo monoclonal marcado. Alternativamente, ou além disso, o meio de detecção pode incluir um antígeno competidor, marcado.

Em uma configuração diagnostica, o soro de teste é reagido com um reagente de fase sólida tendo um antígeno ligado à superfície obtido pelos métodos da presente invenção. Após a ligação do anticorpo para antígeno específico ao reagente e a remoção dos componentes do soro não ligados por lavagem, o reagente é reagido com o anticorpo anti-humano marcado com relator para ligar o relator ao reagente em proporção com a quantidade de anticorpo anti-antígeno ligado sobre o suporte sólido. O reagente é novamente lavado para remover o anticorpo marcado não ligado, e a quantidade de relator associado com o reagente é determinada. Tipicamente, o relator é uma enzima que é detectada por incubação da fase sólida na presença de um substrato fluorométrico, Iuminescente ou colorimétrico adequado (Sigma, St. Louis, MO).

O reagente de superfície sólido no ensaio acima descrito é preparado por técnicas conhecidas para unir o material protéico a um material de suporte sólido, tal como glóbulos poliméricos, bastões de imersão, placa com 96 poços ou material de filtro. Estes métodos de união geralmente incluem a adsorção não específica da proteína ao suporte ou a união covalente da proteína, tipicamente através de um grupo amina livre, a um grupo quimicamente reativo sobre o suporte sólido, tal como um grupo carboxila, hidroxila, ou aldeído ativado. Alternativamente, as placas revestidas com estreptavidina podem ser usadas em conjunção com o(s) antígeno(s) biotinilado(s).

Assim, a invenção proporciona um sistema de ensaio ou kit para realizar este método diagnóstico. O kit geralmente inclui um suporte com antígenos recombinantes ligados à superfície, e um anticorpo anti-humano marcado com relator para detectar o anticorpo anti-antígeno ligado à superfície.

Proteínas de Fusão da Albumina

A presente invenção se refere, de um modo geral, às proteínas de fusão da albumina e aos métodos de tratar, prevenir, ou melhorar as doenças ou os transtornos. Conforme usado neste documento, a "proteína de fusão da albumina" se refere a uma proteína formada pela fusão de pelo menos uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante) a pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante). Uma proteína de fusão da albumina da invenção compreende pelo menos um fragmento ou variante de uma proteína Terapêutica e pelo menos um fragmento ou variante da albumina sérica humana, que estão associados um com o outro, preferivelmente por fusão genética (isto é, a proteína de fusão da albumina é gerada por tradução de um ácido nucléico, no qual um polinucleotídeo codificando toda ou uma porção de uma proteína Terapêutica está unido em quadro com um polinucleotídeo codificando toda ou uma porção da albumina), ou um ao outro. A proteína Terapêutica e a proteína de albumina, uma vez parte da proteína de fusão da albumina, podem ser referidas, cada uma, como uma "parte", "região" ou "porção" da proteína de fusão da albumina.

Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina codificada por um polinucleotídeo ou construção de fusão da albumina descrita na Tabela 1 ou na Tabela 2. Os polinucleotídeos que codificam estas proteínas de fusão da albumina são também incluídos pela invenção.

As proteínas de fusão da albumina preferidas da invenção incluem, porém não estão limitadas às proteínas de fusão da albumina codificadas por uma molécula de ácido nucléico compreendendo, ou alternativamente consistindo em, um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante), unido em quadro a pelo menos um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante); uma molécula de ácido nucléico compreendendo, ou alternativamente consistindo em, um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante), unido em quadro a pelo menos um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante) gerada como descrita na Tabela 1, na Tabela 2 ou nos Exemplos; ou uma molécula de ácido nucléico compreendendo, ou alternativamente consistindo em, um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de albumina (ou um seu fragmento ou variante), unido em quadro a pelo menos um polinucleotídeo codificando pelo menos uma molécula de uma proteína Terapêutica (ou seu fragmento ou variante), adicionalmente compreendendo, por exemplo, um ou mais dos seguintes elementos: (1) um vetor auto-replicador funcional (incluindo, porém não limitado a um vetor 25 de transporte bidirecional, um vetor de expressão, um vetor de integração, e/ou um sistema de replicação), (2) uma região para a iniciação da transcrição (por exemplo, uma região de promotor, tal como, por exemplo, um promotor regulável ou induzível, um promotor constitutivo), (3) uma região para o término da transcrição, (4) uma seqüência líder, e (5) um marcador selecionável.

Em uma modalidade, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, uma proteína Terapêutica (por exemplo, conforme descrita na Tabela 1) e uma proteína de albumina sérica. Em outras modalidades, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, um fragmento biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo de uma proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Em outras modalidades, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, uma variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de uma proteína Terapêutica e uma proteína de albumina sérica. Nas modalidades preferidas, o componente de proteína de albumina sérica da proteína de fusão da albumina é a porção madura da albumina sérica.

Nas modalidades adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, uma proteína Terapêutica, e um fragmento biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo de albumina sérica. Nas modalidades adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, uma proteína Terapêutica e uma variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de albumina sérica. Nas modalidades preferidas, a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina é a porção madura da proteína Terapêutica.

Nas modalidades adicionais, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em, um fragmento ou variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de uma proteína Terapêutica e um fragmento ou variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa de albumina sérica. Nas modalidades preferidas, a invenção proporciona uma proteína de fusão da albumina compreendendo a, ou alternativamente consistindo na, porção madura de uma proteína Terapêutica e porção madura da albumina sérica.

De preferência, a proteína de fusão da albumina compreende HA como a porção término N, e uma proteína Terapêutica como a porção término C. Alternativamente, uma proteína de fusão da albumina compreendendo HA como a porção término C, e uma proteína Terapêutica como a porção término N pode também ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão da albumina tem uma proteína Terapêutica fundida tanto à extremidade de N quanto à extremidade de C da albumina. Em uma modalidade preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas nas extremidades de N e C são proteínas Terapêuticas iguais. Em uma modalidade preferida alternativa, as proteínas Terapêuticas fundidas nas extremidades de N e C são proteínas Terapêuticas diferentes. Em uma outra modalidade preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas nas extremidades de N e C são proteínas Terapêuticas diferentes que podem ser usadas para tratar ou prevenir uma doença, transtorno, ou condição igual ou relacionada (por exemplo, como listada na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1). Em uma outra modalidade preferida, as proteínas Terapêuticas fundidas nas extremidades de N e C são proteínas Terapêuticas diferentes que podem ser usadas para tratar, melhorar, ou prevenir doenças ou transtornos (por exemplo, como listados na coluna "Indicação Preferida Y" da Tabela 1) que são sabidos na técnica comumente ocorrerem nos pacientes de modo simultâneo, concomitante, ou consecutivo, ou que comumente ocorrem nos pacientes em associação um com o outro.

As proteínas de fusão da albumina da invenção incluem as proteínas contendo uma, duas, três, quatro, ou mais moléculas de uma dada proteína Terapêutica X, ou sua variante, fundidas à extremidade de N ou de C de uma proteína de fusão da albumina da invenção, e/ou à extremidade de N e/ou de C da albumina ou de sua variante. As moléculas de uma dada proteína Terapêutica X ou de suas variantes podem estar em qualquer número de orientações, incluindo, porém não limitadas a uma orientação 'cabeça com cabeça' (por exemplo, onde a extremidade de N de uma molécula de uma proteína Terapêutica X está fundida à extremidade de N de uma outra molécula da proteína Terapêutica X), ou uma orientação 'cabeça com cauda' (por exemplo, onde a extremidade de C de uma molécula de uma proteína Terapêutica X está fundida à extremidade de N de uma outra molécula de proteína Terapêutica X).

Em uma modalidade, um, dois, três, ou mais polipeptídeos da proteína Terapêutica X orientados em série (ou seus fragmentos ou variantes) estão fundidos à extremidade de N ou de C de uma proteína de fusão da albumina da invenção, e/ou à extremidade de N e/ou de C da albumina ou de sua variante.

As proteínas de fusão da albumina da invenção adicionalmente incluem as proteínas contendo uma, duas, três, quatro, ou mais moléculas de uma dada proteína Terapêutica X, ou sua variante, fundidas à extremidade de N ou de C de uma proteína de fusão da albumina da invenção, e/ou à extremidade de N e/ou de C da albumina ou de sua variante, onde as moléculas são unidas através de ligantes peptídicos. Os exemplos incluem aqueles ligantes peptídicos descritos na Pat. US N2 5.073.627 (pelo presente, incorporada por referência). As proteínas de fusão da albumina compreendendo múltiplos polipeptídeos da proteína Terapêutica X separados por Iigantes peptídicos podem também ser produzidas usando a tecnologia convencional de DNA recombinante. Os ligantes são especificamente importantes quando fundindo um pequeno peptídeo à molécula grande de HSA. O peptídeo, ele próprio, pode ser um ligante por fusão de cópias em série do peptídeo, ou podem ser usados outros lígantes conhecidos. As construções que incorporam Iigantes são descritas na Tabela 2 ou são aparentes quando se examinando a SEQ ID NO:Y.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser produzidas por fusão de uma proteína Terapêutica X, ou suas variantes, ao término N e/ou ao término C da albumina, ou de suas variantes, em um modo tal de forma a permitir a formação de formas multiméricas intramoleculares e/ou intermoleculares. Em uma modalidade da invenção, as proteínas de fusão da albumina podem estar em formas monoméricas ou multiméricas (i.ex., dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros maiores). Em uma modalidade adicional da invenção, a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina pode estar na forma monomérica ou na forma multimérica (isto é, dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros maiores). Em uma modalidade específica, a porção de proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina está na forma multimérica (isto é, dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros maiores), e a porção de proteína de albumina está na forma monomérica.

Além da proteína de fusão da albumina na qual a porção de albumina está fundida ao término N e/ou ao término C da porção de proteína Terapêutica, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser produzidas por inserção da proteína Terapêutica ou do peptídeo de interesse (por exemplo, uma proteína Terapêutica X como divulgada na Tabela 1, ou um anticorpo que liga uma proteína Terapêutica ou um seu fragmento ou variante) em uma região interna da HA. Por exemplo, dentro da seqüência de proteína da molécula de HA, existem diversos laços ou curvas entre a extremidade e o começo das hélices a, que são estabilizados por ligações de dissulfeto. Os laços, como determinados a partir da estrutura de cristal da HA (identificadores PDB 1A06, 1BJ5, 1BKE, 1BM0, 1E7E até 1E7I e 1UOR), geralmente se prolongam a partir do corpo da molécula. Estes laços são úteis para a inserção, ou a fusão interna, de peptídeos terapeuticamente ativos, especificamente aqueles requerendo uma estrutura secundária para serem funcionais, ou proteínas Terapêuticas, para essencialmente gerar uma molécula de albumina com atividade biológica específica.

Os laços na estrutura de albumina humana, nos quais os peptídeos ou os polipeptídeos podem ser inseridos para gerar as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem: Val54-Asn61, Thr76- Asp89, Ala92-Glu100, Gln170-Ala176, His 247 -Glu252, Glu 266 - Glu277, Glu 280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486, e Lys560-Thr566. Nas modalidades mais preferidas, os peptídeos ou os polipeptídeos são inseridos nos laços Val54-Asn61, Gln170-Ala176, e/ou Lys560-Thr566 da albumina humana madura (SEQ ID NO:1).

Os peptídeos a serem inseridos podem ser derivados de bibliotecas de exposição em fagos ou de peptídeos sintéticos, examinadas quanto à atividade biológica específica, ou a partir das porções ativas de uma molécula com a função desejada. Adicionalmente, podem ser geradas bibliotecas de peptídeos aleatórios dentro de laços específicos ou por inserções de peptídeos aleatorizados em laços específicos da molécula de HA e nas quais todas as combinações possíveis de aminoácidos estão representadas.

Tal(is) biblioteca(s) poderia(m) ser geradas sobre a HA ou os fragmentos dos domínios da HA por um dos seguintes métodos:

mutação aleatorizada de aminoácidos dentro de um ou mais laços com peptídeos da HA ou dos fragmentos dos domínios da HA. Um ou mais ou todos os resíduos dentro de um laço poderiam ser mutados neste modo.

substituição, ou inserção em um ou mais laços da HA ou dos fragmentos dos domínios da HA (isto é, fusão interna) de (um) peptídeo(s) aleatorizado(s) de comprimento Xn (onde X é um aminoácido e η é o número de resíduos); fusões de peptídeos/proteínas de término N-, C-, ou N- e C além de (a) e/ou (b). A HA ou o fragmento do domínio da HA pode também ser tornado multifuncional por enxerto dos peptídeos derivados de diferentes triagens de diferentes laços contra diferentes alvos na mesma HA ou fragmento do domínio da HA.

Nas modalidades preferidas, os peptídeos inseridos em um laço da albumina sérica humana são os fragmentos de peptídeos ou as variantes de peptídeos das proteínas Terapêuticas divulgadas na Tabela 1. Mais especificamente, a invenção inclui as proteínas de fusão da albumina que compreendem fragmentos de peptídeos ou variantes de peptídeos pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, ou pelo menos 40 aminoácidos de comprimento inseridos em um laço da albumina sérica humana. A invenção também inclui as proteínas de fusão da albumina que compreendem os fragmentos de peptídeos ou as variantes de peptídeos pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelomenos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, ou pelo menos 40 aminoácidos fundidas à extremidade de N da albumina sérica humana. A invenção também inclui as proteínas de fusão da albumina que compreendem os fragmentos de peptídeos ou as variantes de peptídeos pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13,pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, ou pelo menos 40 aminoácidos fundidas à extremidade de C da albumina sérica humana. Por exemplo, os peptídeos curtos descritos nas Tabelas 1 e 2 (por exemplo, Terapêutica Y) podem ser inseridos nos laços da albumina.

Geralmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ter uma região derivada da HA e uma região derivada da proteína Terapêutica. As regiões múltiplas de cada proteína, entretanto, podem ser usadas para preparar uma proteína de fusão da albumina da invenção. Similarmente, mais do que uma proteína Terapêutica pode ser usada para preparar uma proteína de fusão da albumina da invenção. Por exemplo, uma proteína Terapêutica pode ser fundida a ambas as extremidades NeC terminais da HA. Em tal configuração, as porções de proteína Terapêutica podem ser moléculas de proteínas Terapêuticas iguais ou diferentes. A estrutura das proteínas de fusão da albumina bifuncionais pode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Por exemplo, pode ser preparada uma fusão de scFv anti-BLyS®-HA-IFNa-2b para modular a resposta imune ao IFNa-2b pelo scFv anti-BLyS®. Uma alternativa é preparar uma dose bi (ou mesmo multi) funcional das fusões de HA, por exemplo, a fusão de HA-IFNa-2b misturada com a fusão de HA-scFv anti-BLyS® ou outras fusões de HA em diversas razões, dependendo da função, meia-vida etc. As proteínas de fusão da albumina bi- ou multifuncionais podem também ser preparadas para alvejar a porção de proteína Terapêutica de uma fusão para um órgão-alvo ou tipo de célula, via proteína ou peptídeo, na extremidade oposta da HA.

Como uma alternativa para a fusão de moléculas terapêuticas conhecidas, os peptídeos poderiam ser obtidos por exame das bibliotecas construídas como fusões às extremidades de N, C ou N e C da HA, ou do fragmento do domínio da HA, de tipicamente 6, 8, 12, 20 ou 25 ou Xn (onde X é um aminoácido (aa) e ? é igual ao número de resíduos) aminoácidos aleatorizados, e nas quais todas as combinações possíveis dos aminoácidos são representadas. Uma vantagem específica desta abordagem é que os peptídeos podem ser selecionados in situ sobre a molécula de HA e as propriedades do peptídeo, portanto, seriam como selecionadas para, em vez de, potencialmente, modificadas conforme poderia ser o caso para, um peptídeo derivado por qualquer outro método então sendo unido à HA.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem incluir um peptídeo ligante entre as porções fundidas, para proporcionar maior separação física entre as porções e, assim, maximizar a acessibilidade da porção de proteína Terapêutica, por exemplo, para ligar-se ao seu receptor cognato. O peptídeo ligante pode consistir em aminoácidos de modo tal que ele seja flexível ou mais rígido.

A seqüência ligante pode ser clivável por uma protease ou quimicamente, para produzir a porção relacionada de hormônio do crescimento. De preferência, a protease é 20 uma que é produzida naturalmente pelo hospedeiro, por exemplo, a protease de S. cerevisiae kex2 ou as proteases equivalentes.

Portanto, conforme descrito acima, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ter a seguinte fórmula R1-L-R2; R2-L-R1; ou R1-L-R2-L-R1, onde R1 é pelo menos uma proteína Terapêutica, peptídeo ou seqüência de polipeptídeos, e não necessariamente 25 a mesma proteína Terapêutica, L é um ligante e R2 é uma seqüência da albumina sérica.

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendendo uma proteína Terapêutica têm uma estabilidade plasmática maior, comparada à estabilidade plasmática da mesma proteína Terapêutica quando não fundida à albumina. A estabilidade plasmática tipicamente se refere ao período de tempo entre quando a proteína Terapêutica é administrada in vivo e carregada para a corrente sangüínea e quando a proteína terapêutica é degrada e depurada da corrente sangüínea, para um órgão, tal como o rim ou o fígado, que, no final, depura a proteína Terapêutica do corpo. A estabilidade plasmática é calculada em termos da meia-vida da proteína Terapêutica na corrente sangüínea. A meia-vida da proteína Terapêutica na corrente sangüínea pode ser prontamente determinada por ensaios comuns, conhecidos na técnica.

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina da invenção, que compreendem uma proteína Terapêutica, têm vida útil prolongada comparada à vida útil daa mesma proteína Terapêutica quando não fundida à albumina. A vida útil tipicamente se refere ao período de tempo durante o qual a atividade terapêutica de uma proteína Terapêutica em solução, ou em alguma outra formulação de armazenamento, é estável, sem perda indevida de atividade terapêutica. Muitas das proteínas Terapêuticas são altamente instáveis em seu estado não fundido. Conforme descrito acima, a vida útil típica destas proteínas Terapêuticas é acentuadamente prolongada com a incorporação na proteína de fusão da albumina da invenção.

As proteínas de fusão da albumina da invenção, com vida útil "prolongada" ou "estendida", exibem maior atividade terapêutica em relação a um padrão que tenha sido submetido às mesmas condições de armazenamento e manuseio. O padrão pode ser a proteína Terapêutica de tamanho natural não fundida. Quando a porção de proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina for um análogo, uma variante, ou estiver, de outro modo, alterada ou não incluir a seqüência completa para aquela proteína, o prolongamento da atividade terapêutica pode alternativamente ser comparado ao equivalente não fundido daquele análogo, variante, peptídeo alterado ou seqüência incompleta. Como um exemplo, uma proteína de fusão da albumina da invenção pode manter mais do que cerca de 100% da atividade terapêutica, ou mais do que cerca de 105%, 110%, 120%, 130%, 150% ou 200% da atividade terapêutica de um padrão, quando submetida às mesmas condições de armazenamento e manuseio que o padrão, quando comparada em um dado ponto de tempo.

A vida útil pode também ser avaliada em termos de atividade terapêutica que permanece após o armazenamento, normalizada à atividade terapêutica quando o armazenamento começou. As proteínas de fusão da albumina da invenção com vida útil prolongada ou estendida, como exibida por atividade terapêutica prolongada ou estendida, podem manter mais do que cerca de 50% da atividade terapêutica, aproximadamente 60%, 70%, 80%, ou 90% ou mais da atividade terapêutica da proteína Terapêutica não fundida equivalente, quando submetidas às mesmas condições.

Expressão das Proteínas de Fusão

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser produzidas como moléculas recombinantes por secreção a partir de levedura, um microorganismo, tal como uma bactéria, ou uma linhagem celular humana ou animal. De preferência, o polipeptídeo é secretado a partir das células hospedeiras.

Uma modalidade específica da invenção compreende uma construção de DNA que codifica uma seqüência de sinal efetiva para orientar a secreção na levedura, especificamente uma seqüência de sinal derivada da levedura (especialmente uma que seja homóloga ao hospedeiro de levedura), e a molécula fundida do primeiro aspecto da invenção, não havendo nenhuma pro seqüência derivada de levedura entre o sinal e o polipeptídeo maduro.

O sinal de invertase de Saccharomyces cerevisiae é um exemplo preferido de uma seqüência de sinal derivada de levedura.

Os conjugados do tipo preparado por Poznansky e outros, FEBS Lett. 239:18(1988)), em que os polipeptídeos preparados separadamente são unidos por reticulação química, não são contemplados.

A presente invenção também inclui uma célula, preferivelmente uma célula de levedura transformada para expressar uma proteína de fusão da albumina da invenção. Além das células hospedeiras transformadas propriamente ditas, a presente invenção também contempla uma cultura destas células, preferivelmente uma cultura monoclonal (clonalmente homogênea), ou uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, em um meio nutriente. Se o polipeptídeo for secretado, o meio conterá o polipeptídeo, com as células, ou sem as células se elas tiverem sido filtradas ou centrifugadas. Muitos sistemas de expressão são conhecidos e podem ser usados, incluindo as bactérias (por exemplo, E. eoli e Bacillus subtilis), as leveduras (por exemplo, Saccharomyees cerevisiae, Kluyveromyces Iaetis e Piehia pastoris), os fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus), as células de plantas, as células de animais e as células de insetos.

As cepas de leveduras preferidas, a serem usadas na produção das proteínas de fusão da albumina, são D88, DXY1 e BXP10. A D88 [leu2-3, leu2-122, eanl, pral, ube4\ é um derivado da cepa de origem AH22his* (também conhecida como DB1; ver, por exemplo, Sleep e outros, Biotechnology 8:42-46 (1990)). A cepa contém uma mutação de Ieu2 que permite a seleção auxotrópica de plasmídios à base de 2 micra que contêm o gene LEU2. A D88 também exibe uma desrepressão de PRB1 em excesso de glicose. O promotor PRB1 é normalmente controlado por dois pontos de controle que monitoram os níveis de glicose e o estágio de crescimento. O promotor é ativado na levedura do tipo selvagem com a redução da glicose e entra na fase estacionária. A cepa D88 exibe a repressão por glicose, porém mantém a indução com a entrada na fase estacionária. O gene PRA1 codifica uma protease vacuolar de levedura, a YscA endoprotease A, que está localizada no ER. O gene UBC4 está no caminho de ubiquitinação e está envolvido no alvejamento de proteínas de vida curta e anormais para a degradação dependente da ubiquitina. O isolamento desta mutação de ubc4 foi verificado aumentar o número de cópias de um plasmídio de expressão na célula e causar um nível diminuído de expressão de uma proteína desejada expressa a partir do plasmídio (vide, por exemplo, a Publicação Internacional número W099/00504, pelo presente, incorporada em sua totalidade por referência neste documento).

DXY1, uma derivada de D88, tem o seguinte genótipo: [leu2-3, Ieu2-122, eanl, pral, ubc4, ura3::yap3]. Além das mutações isoladas em D88, esta cepa também tem um nocaute da protease de YAP3. Esta protease causa a clivagem dos resíduos principalmente di- básicos (RR, RK, KR1 KK), porém pode também promover a clivagem em resíduos básicos individuais nas proteínas. O isolamento desta mutação de yap3 resultou em níveis mais elevados de produção da HSA de tamanho natural (vide, por exemplo, a Patente US N2 5.965.386 e Kerry-Williams' e outros, Yeast 14:161-169 (1998), pelo presente incorporados em suas totalidades por referência neste documento).

A BXP10 tem o seguinte genótipo: leu2-3, leu2-122, can1, pral, ubc4, ura3, yap3::URA3, Iys2, hsp150::LYS2, pmt1::URA3. Além das mutações isoladas em DXY1, esta cepa também tem um nocaute do gene PMT1 e do gene HSP150. O gene PMT1 é um membro da família de modo evolucionário conservada das doliquil-fosfato-D-manose Ο- manossiltransferases protéicas (Pmts). A topologia de transmembrana da Pmtlp sugere que ela é uma proteína de membrana integral do retículo endoplasmático, com uma função na glicosilação ligada ao O. Esta mutação serve para reduzir/eliminar a glicosilação ligada ao O das fusões da HSA (vide, por exemplo, a Publicação Internacional Número WOOO/44772, pelo presente incorporada em sua totalidade por referência neste documento). Os estudos revelaram que a proteína Hsp150 é separada de forma ineficaz da rHA através de cromatografia por troca iônica. A mutação no gene HSp150 remove um contaminante potencial que provou ser difícil de remover por técnicas padrões de purificação. Ver, por exemplo, a Patente US N- 5.783.423, pelo presente incorporada em sua totalidade por referência neste documento.

A proteína desejada é produzida nos modos convencionais, por exemplo, a partir de uma seqüência de codificação inserida no cromossomo do hospedeiro ou sobre um plasmídio livre. As leveduras são transformadas com uma seqüência de codificação para a proteína desejada em quaisquer dos modos usuais, por exemplo, a eletroporação. Os métodos para a transformação da levedura por eletroporação são divulgados em Becker e Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182.

As células transformadas com êxito, isto é, as células que contêm uma construção de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bastante conhecidas. Por exemplo, as células resultantes da introdução de uma construção de expressão podem ser desenvolvidas para produzir o polipeptídeo desejado. As células podem ser coletadas e lisadas e o seu teor de DNA examinado quanto à presença do DNA usando um método tal como aquele descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 ou Berent e outros, (1985) Biotech. 3, 208. Alternativamente, a presença da proteína no sobrenadante pode ser detectada usando anticorpos.

Os vetores de plasmídios de leveduras úteis incluem os pRS403-406 e os pRS413-416 e estão geralmente disponíveis na Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídios Integradores de Leveduras (YIps) e incorporam os marcadores selecionáveis de leveduras HIS3, 7RP1, LEU2 e URA3. Os plasmídios pRS413-416 são plasmídios de Centrômeros de Leveduras (Ycps).

Os vetores preferidos para preparar as proteínas de fusão da albumina, para a expressão em levedura, incluem o pPPCOOOõ, o pScCHSA, o pScNHSA, e o pC4:HSA, que são descritos em detalhe no Exemplo 1. A Figura 2 mostra um mapa do plasmídio pPPCOOOõ que pode ser usado como o vetor de base no qual os polinucleotídeos que codificam as proteínas Terapêuticas podem ser clonados para formar as fusões da HA. Ele contém um promotor de S. cerevisiae PRB1 (PRBIp)1 uma Seqüência líder de fusão (FL)1 DNA codificando HA (rHA) e uma seqüência terminadora de S. cerevisiae ADH1. A seqüência da seqüência líder de fusão consiste nos primeiros 19 aminoácidos do peptídeo de sinal da albumina sérica humana (SEQ ID NO:3) e nos últimos cinco aminoácidos do promotor do fator de cruzamento alfa 1 (SLDKR, vide a EP-A-387 319, que é incorporada como referência em sua totalidade).

Os plasmídios pPPCOOOõ, pScCHSA, pScNHSA, e pC4:HSA foram depositados em 11 de abril de 2001 no American Type Culture Collection, 1081 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, e receberam os números de acesso ATCC PTA-3278, PTA-3276, PTA-3279, e PTA-3277, respectivamente. Um outro vetor útil para expressar uma proteína de fusão da albumina na levedura é o vetor pSAC3õ, o qual é descrito em Sleep e outros, BioTechnoIogy 8:42 (1990), que é incorporado como referência em sua totalidade.

Um promotor de levedura que pode ser usado para expressar a proteína de fusão da albumina é o promotor MET2Õ. Ver, por exemplo, Dominik Mumburg, Rolf Muller e Martin Funk. Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, N2 25, páginas Õ767-Õ768. O promotor Met2õ é 383 bases de comprimento (bases -382 até -1) e os genes expressos por este promotor são também conhecidos como Metlõ, Met17, e YLR303W. Uma modalidade preferida utiliza a seqüência abaixo, onde, na extremidade de õ' da seqüência abaixo, o sítio de Not 1 usado na clonagem está sublinhado e, na extremidade de 3', o códon de iniciação de ATG está sublinhado:

GCGGCCGCCGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTT

TCTCTTGAGGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATA

TTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATC

CTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGT

CCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAG

CGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACT

ATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCC

CATCCATACAATG (SEQIDNO:5)

Os promotores adicionais que podem ser usados para expressar a proteína de fusão da albumina na levedura incluem os que seguem: a) o promotor cbhl:

TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCAT

CTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGA

AAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCT

GGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGT

TCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTA

AGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCT

CGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTAC

CCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACA

AGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT

TTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTG

GGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAG

AGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACG

GCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGC

AATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGT

TAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAG

TGGCTÁAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCA

ACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTC

AGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAG

AAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAG

GGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGC CAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGAC GAATACTGTATAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGT CGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGG CCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATG CAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAG GGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGA AAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAA CGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTC GAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATC CTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTC AACCGCGGACTGGCATC (SEQID N0:101)

b) o promotor cysD de Aspergillus nidulans: AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAGC

CGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGGAC

CGCTAGAAATAGACTCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCACGCAATTACGA

TAGTATITGGCtCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACGCGAT

CACGCCATTGTGGCCGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGCATATAA

ACAACCCCTCCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAATGCTGTACTCTATTTCA

AGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATATCAAAGAT

ATCAAAGCCATC (SEQ ID NO: 102)

c) um promotor cbhl modificado apresentando a seqüencia:

TCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCAT

CTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGA

AAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCT

GGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGT

TCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTA

AGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCT

CGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTAC

CCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGT ACCCGTACA

AGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT

TTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTG

GGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTA GAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCAC GGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCG CAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAG TTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAA GTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGC AACGGC AAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCT CAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAA GAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAA GGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGC CAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGAC GAATACTGTATAGTCACTTCTGGTGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGT CGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGC3G CCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGC AAATG

CAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAG

GGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGA

AAGAGAAGCTTAGCCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGC

TCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCT

CGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACA

AGGTCCTAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAA

ACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTT

CGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGAT

CCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGT

CAACCGCGGACTGGCATC (SEQID NO: 103)

d) um promotor cysD de Aspergillus nidulans apresentando a seqüencia:

AGATCTGGTTCCTGAGTACATCTACCGATGCGCCTCGATCCCCCTCTTAG

CCGCATGAGATTCCTACCATTTATGTCCTATCGTTCAGGGTCCTATTTGG

ACCGCT AGAAAT AGACrCTGCTCGATTTGTTTCCATTATTCACGC AATTA

CGATAGTATTTGGCTCTTTTCGTTTGGCCCAGGTCAATTCGGGTAAGACG

CGATCACGCCATTGTGGCCGCCGGCGCTGCAGCCTCTTATCGAGAAAGA

AATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAA

CCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTC

GTCACACAACAAGGTCCTACGCCGGCGTTGTGCTGCTGCTATTCCCCGC ATATAAACAACCCCTCCACCAGTTCGTTGGGCTTTGCGAATGCTGTACTC TATTTCAAGTTGTCAAAAGAGAGGATTCAAAAAATTATACCCCAGATAT CAAAGATATCAAAGCCATC (SEQID NO: 104)

Vários métodos foram desenvolvidos para ligar operavelmente DNA aos vetores via extremidades coesas complementares. Por exemplo, tratos de homopolímero complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido no DNA de vetor. O segmento de DNA e o vetor são então unidos por ligação de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinantes.

Ligantes sintéticos contendo um ou mais sítios de restrição fornecem um método alternativo de unir o segmento de DNA a vetores. O segmento de DNA, gerado por digestão de restrição de endonuclease, é tratado com polimerase de DNA T4 bacteriófago ou polimerase I de DNA de E.coli, enzimas que removem extremidades de fita única gama, saliente com suas atividades 3151 exonucleolíticas, e preenchem extremidades 31 rebaixadas com suas atividades de polimerização. A combinação dessas atividades gera, portanto, segmentos de DNA com extremidade sem corte. Os segmentos com extremidade sem corte são então incubados com um excesso molar grande de moléculas Iigantes na presença de uma enzima que é capaz de catalisar a ligação de moléculas de DNA com extremidade sem corte, como ligase de DNA T4 bacteriófago. Desse modo, os produtos da reação são segmentos de DNA que contêm seqüências Iigantes poliméricas em suas extremidades. Esses segmentos de DNA são a seguir clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor de expressão que foi clivado com uma enzima que produz extremidades compatíveis com aqueles do segmento de DNA.

Ligantes sintéticos contendo uma variedade de sítios de endonuclease de restrição são comercialmente disponíveis a partir de diversas fontes incluindo International Biotechnologies Inc., New Haven, CT1 EUA.

Um modo desejável para modificar o DNA de acordo com a invenção, se, por exemplo, variantes de HA devem ser preparadas, é utilizar a reação de cadeia de polimerase, como revelado por Saiki, e outros (1988) Science 239, 487-491. Nesse método o DNA a ser ampliado de forma enzimática, é flanqueado por dois iniciadores de oligonucleotídeo específicos que eles próprios se tornam incorporados no DNA ampliado. Os iniciadores específicos podem conter sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que podem ser utilizados para clonagem em vetores de expressão utilizando métodos conhecidos na arte.

Gêneros exemplares de leveduras consideradas como úteis na prática da presente invenção como hospedeiros para expressar as proteínas de fusão de albumina, são Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporídium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, e similares. Gêneros preferidos são aqueles selecionados do grupo que consiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia e Torulaspora. Os exemplos de Saccharomyces spp. são S. cerevisiae, S. italicus e S. rouxii.

Os exemplos de Kluyveromyces spp. são K. fragilis, K. lactis e K. marxianus. Uma espécie de Torulaspora apropriada é T. dellbrueckii. Os exemplos de Pichia (Hansenula) spp. São P. angusta (anteriormente H. polymorpha), P. anômala (anteriormente H. anômala) e P. pastoris. Os métodos para a transformação de S. cerevisiae são revelados genericamente em EP 251 744, EP 258 067 e WO 90/01063, todas as quais são incorporadas aqui a título de referência.

Espécies exemplares preferidas de Saccharomyces incluem S. cerevisiae, S. italicus, S. diastaticus e Zygosaccharomyces rouxii. Espécies exemplares preferidas de Kluyveromyces incluem K. fragilis e K. lactis. Espécies exemplares preferidas de Hansenula incluem Η. polymorpha (agora Pichia angusta), H. anômala (agora Pichia anômala) e Pichia capsulata. Espécies exemplares preferidas adicionais de Pichia incluem P. pastoris. Espécies exemplares preferidas de Aspergillus incluem A. niger e A. nidulans. Espécies exemplares preferidas de Yarrowia incluem Y. lipolytica. Muitas espécies preferidas de levedura são disponíveis junto a ATCC. Por exemplo, as seguintes espécies de levedura preferidas são disponíveis junto a ATCC e são úteis na expressão de proteínas de fusão de albumina: Saccaromyces cerevisiae Hansen1 cepa teleomorph BY4743 yap3 mutante (número de acesso ATCC 4022731); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorph BY4743 hsp150 mutante (número de acesso ATCC 4021266); Saccharomyces cerevisiae Hansen, cepa teleomorph BY4743 pmtl mutante (número de acesso ATCC 4023792); Saccharomyces cerevisiae Hansen, teleomorph (números de acesso ATCC 20626; 44773; 44774; e 62995); Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex van der Walt, teleomorph (número de acesso ATCC 62987); Kluyveromyces Iactis (Dombrowski) van der Walt, teleomorph (número de acesso ATCC 76492); Pichia angusta (Teunisson e outros) Kurtzman, teleomorph depositado como Hansenula polymorpha de Morais et Maia1 teleomorph (Número de acesso ATCC 26012); Aspergillus niger van Tieghem, anamorph (número de acesso ATCC 9029); Aspergillus niver van Tieghem, anamorph (número de acesso ATCC 16404); Aspergillus nidulans (Eidam) Winter, anamorph (número de acesso ATCC 48756); e Yarrowia lipolytica (Wickerham e outros) van der Walt et von Arx, teleomorph (Número de acesso ATCC 201847).

Promotores apropriados para S. cerevisiae incluem aqueles associados ao gene PGKI, genes GAL1 ou GAL10, CYC1, PH05, TRPI, ADHI, ADH2, os genes para desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato, hexocinase, decarboxilase de piruvato, fosfofructocinase, isomerase de fosfato triose, isomerase de fosfoglicose, glicocinase, feromona de fator de compatibilidade-alfa [um feromona de fator de compatibilidade], o promotor PRBI, o promotor GUT2, o promotor GPDI, e promotores híbridos envolvendo híbridos de partes de regiões reguladoras 5' com partes de regiões reguladoras 5' de outros promotores ou com sítios de ativação a montante (por exemplo, o promotor de EP-A-258 067).

Promotores reguláveis convenientes para uso em Schizosaccharomyces pombe são o promotor repressor de tiamina a partir de gene nmt como descrito por Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864 e o promotor de gene jbpl de repressão de glicose, como descrito por Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.

Métodos de transformar Piehia para expressão gênicas estranhos são revelados, por exemplo, por Cregg e outros (1993) e várias patentes de Philllips (por exemplo, US 4.857.467, incorporada aqui a título de referência) e kits de expressão de Pichia são comercialmente disponíveis junto a Invitrogen BV, Leek, Holanda, e Invitrogen Corp., San Diego, Califórnia. Promotores apropriados incluem AOXI e AOX2. Gleeson e outros (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 incluem informação sobre transformação e vetores Hansenula, os promotores apropriados sendo MOX1 e FMD1; enquanto E. 361 991, Fleer e outros (1991) e outras publicações da Rhone-Poulenc Rorer ensinam como expressar proteínas estranhas em Kluyveromyces spp., um promotor apropriado sendo PGKI.

O sinal de terminação de transcrição é preferivelmente a seqüência de flanquear 3' de um gene eucariótico que contém sinais adequados para poliadenilação e terminação de transcrição. Seqüências de flanquear 3' apropriadas podem, por exemplo, ser aquelas do gene naturalmente ligado à seqüência de controle de expressão utilizada, isto é, podem corresponder ao promotor. Alternativamente, podem ser diferentes em cujo caso o sinal de terminação do gene ADHI S. cerevisiae é preferido.

A proteína de fusão de albumina desejada pode ser inicialmente expressa com uma seqüência líder de secreção, que pode ser qualquer líder eficaz na levedura escolhida. Líderes úteis em levedura incluem qualquer uma das seguintes:

a) a seqüência de sinal MPIF-1 (por exemplo, aminoácidos 1-21 do número de acesso de GenBank AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEQ ID NO: 6)

b) a seqüência de sinal estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO: 7)

c) a região pré-pró da seqüência de sinal HSA (por exemplo, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEQ ID NO: 8)

d) a região pre da seqüência de sinal HSA (por exemplo, MKWVTFISLLFLFSSAYS,

SEQ ID NO: 9) ou variantes da mesma, como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID NO: 10)

e) a seqüência de sinal invertase (por exemplo, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID

NO: 11)

f) a seqüência de sinal alfa de fator de compatibilidade de levedura (por exemplo, MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNG LLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR, SEQ ID NO: 12 ou

MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN GLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID NO: 12) 30 g) seqüência líder de toxina exterminadora K. Iactis

h) uma seqüência de sinal híbrido (por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID NO: 13)

i) uma seqüência de sinal híbrido HSA/MFa-1 (também conhecida como HSA/kex2) (por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEQ ID NO: 14)

j) uma seqüência líder de fusão MFa-1/exterminadora K. Iactis (por exemplo,

MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID NO: 15)

k) a seqüência de sinal Ig de Imunoglobulína (por exemplo, MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID NO: 16)

I) a seqüência de sinal precursora de Fibulina B (por exemplo, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID NO: 17)

m) a seqüência de sinal precursora clusterina (por exemplo, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID NO: 18)

n) a seqüência de sinal de proteína de ligação 4-fator de crescimento insulino semelhante (por exemplo, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID NO: 19)

o) variantes da região pré-pró da seqüência de sinal HSA como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVGRR (SEQ ID NO: 20), MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ ID NO: 21),

MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID NO: 22), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ ID NO: 23),

HSA modificado HSA líder no. 64 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO: 24),

HSA modificado HSA líder no. 66 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO: 25); HSA modificado (A14) líder - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO: 26);

HSA modificado (S14) líder (também conhecido como HSA modificado no. 65) -

MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEQ ID NO: 27),

HSA modificado (G14) líder - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO: 28), ou

MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID NO: 29) p) uma seqüência de sinal de consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ

ID NO: 30)

q) fosfatase de ácido (PH05) líder (por exemplo, MFKSWYSILAASLANA SEQ ID NO: 3')

r) a pre-seqüência de Mfoz-1 25 s) a pre-seqüência de 0 glucanase (BGL2)

t) toxina exterminadora líder u) a preseqüência de toxina exterminadora

v) pré-pró de toxina exterminadora k. Lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre e 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID NO: 32) 30 w) seqüência líder de secreção de glucoamilase II S. diastaticus

x) seqüência líder de secreção de α-galactosidase (MEL1) de S. carlsbergensis y) seqüência líder de Candida glucoamilase

z) os líderes híbridos revelados em EP-A-387 319 (aqui incorporada a título de referência)

aa) a seqüência de sinal gp67 (em combinação com sistemas de expressão baculovirais) (por exemplo, aminoácidos 1-19 de número de acesso genBank AAA72759) ou bb) a proteína terapêutica X natural líder; cc) líder de S. Cerevisiae invertase (SUC2), como revelado em JP 62-096086 (concedido como 911036516, aqui incorporado a título de referência); ou

dd) Inulinase - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID NO: 33). ee) uma variante líder de propeptídeo TA57 modificado no. 1-5 MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDWGLIS MAKR (SEQ ID NO: 34)

ff) uma variante líder de propeptídeo TA57 modificado no. 2 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATAQTNSGGLDWGLIS MAEEGEPKR (SEQ ID NO: 35)

gg) um peptídeo de sinal de consenso - MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEQ ID NO: 99)

hh) uma seqüência de sinal kex2/HSA modificado MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR (SEQ ID NO: 100)

ii) um peptídeo de sinal de consenso no. 2 - MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO: 98)

Métodos adicionais de produção sintética e recombinante de proteínas de fusão de albumina

A presente invenção também se refere aos vetores contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, células hospedeiras, e a produção de proteínas de fusão de albumina por técnicas sintéticas e recombinantes. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor de fago, plasmídeo, viral ou retroviral. Vetores retrovirais podem ser competentes em replicação ou defectivo em replicação. No caso mencionado por último, a propagação viral ocorrerá genericamente somente na complementação de células hospedeiras. Os polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão de albumina da invenção

podem ser unidos a um vetor que contém um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro, genericamente, um vetor de plasmídeo é introduzido em um precipitado, como precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídeo carregado. Se o vetor for um vírus, pode ser acondicionado in vitro utilizando uma linhagem de célula concentrada apropriada e então transduzido para células hospedeiras.

A inserção de polinucleotídeo deve ser operativamente ligada a um promotor apropriado, como o promotor de fago lambda PL, os promotores E. coli lac, trp, phoA e tac, os promotores inicial e tardio SV40 e promotores de LTRs retrovirais, citando alguns. Outros promotores apropriados serão conhecidos pelo versado na técnica. As construções de expressão conterão ainda sítios para iniciação de transcrição, terminação, e na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução. A porção de codificação dos transcritos expressos pelas construções incluirá, preferivelmente, um códon de iniciar tradução no início e um códon de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado no final do polipeptídeo a ser traduzido.

Conforme indicado, os vetores de expressão incluirão, preferivelmente pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem reductase diidrofolato, G418, glutamina sintase, ou resistência a neomicina para cultura de células eucarióticas, e genes de resistência à tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura em E.coli e outras bactérias. Os exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem, porém não são limitados a, células bacterianas, como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimuríum; células fúngicas, como células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevísiae ou Pichia pastoris (Número de acesso ATCC 201178)); células de insetos como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais como células CHO1 COS, NSO1 293, e melanoma Bowes e células de plantas. Condições e meios de cultura apropriados para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na arte.

Entre vetores preferidos para uso em bactérias estão pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis junto a QIAGEN, Inc.; vetores pBluescript, vetores Phagescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponíveis junto a Stratagene Cloning Systems, Inc.; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis da Pharmacia Biotech, Inc. Entre vetores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, e pSG disponíveis junto a Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis junto a Pharmacia. Vetores de expressão preferidos para uso em sistemas de levedura incluem, porém não são limitados a, pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K e PA0815 (todos disponíveis junto a Invitrogen, Carlbad, CA). Outros vetores apropriados serão facilmente evidentes para o versado na técnica.

Em uma modalidade, polinucleotídeos que codificam uma proteína de fusão de albumina da invenção podem ser fundidos com seqüências de sinais que dirigirão a localização de uma proteína da invenção para compartimentos específicos de uma célula procariótica ou eucariótica e/ou dirigirão a secreção de uma proteína da invenção a partir de uma célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, pode-se desejar dirigir a expressão da proteína para o espaço periplásmico. Os exemplos de seqüências de sinais ou proteínas (ou seus fragmentos) aos quais as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser fundidas para dirigir a expressão do polipeptídeo para o espaço periplásmico de bactérias incluem, porém não são limitados a, seqüência de sinais pelB, a seqüência de sinais de proteína de ligação de maltose (MBP), MBP, a seqüência de sinais ompA, a seqüência de sinais da subunidade de enterotoxina B instável a calor de E.coli periplásmico e a seqüência de sinais de fosfatase alcalina. Vários vetores são comercialmente disponíveis para a construção de proteínas de fusão que dirigirão a localização de uma proteína, como a série de vetores pMAL (especificamente a série pMAL-p) disponível junto a New England Biolabs. Em uma modalidade específica, proteínas de fusão de albumina de polinucleotídeos da invenção podem ser fundidas com a seqüência de sinal de Iiase pectato pelB para aumentar a eficiência de expressão e purificação de tais polipeptídeos em bactérias Gram-negativas. Vide as patentes US números 5.576.195 e 5.846.818, cujos teores são incorporados aqui a título de referência na íntegra.

Os exemplos de peptídeos de sinais que podem ser fundidos com uma proteína de fusão de albumina da invenção para dirigir sua secreção em células mamíferas incluem, porém não são limitados a:

b) a seqüência de sinal estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO: 7)

d) a região pré da seqüência de sinal HSA (por exemplo, MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEQ ID NO: 9) ou variantes da mesma, como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID NO: 10)

e) a seqüência de sinal invertase (por exemplo, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID NO: 11)

f) a seqüência de sinal alfa de fator de compatibilidade de levedura (por exemplo, MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNG LLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR, SEQ ID NO: 12 ou MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNN GLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID NO: 12) 25 g) seqüência líder de toxina exterminadora K. Iactis

j) uma seqüência líder de fusão MFa-1/exterminadora K. Iactis (por exemplo, MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID NO: 15)

k) a seqüência de sinal Ig de Imunoglobulina (por exemplo, MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID NO: 16)

I) a seqüência de sinal precursora de Fibulin B (por exemplo, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID NO: 17)

m) a seqüência de sinal precursora clusterin (por exemplo, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID NO: 18) η) a seqüência de sinal de proteína de ligação 4-fator de crescimento insulino semelhante (por exemplo, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID NO: 19)

o) variantes da região pré-pró da seqüência de sinal HSA como, por exemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVGRR (SEQ ID NO: 20), 5 MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ ID NO: 21),

MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID NO: 22), MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ ID NO: 23), HSA modificado HSA Ieader no. 64 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO: 24), HSA modificado HSA Ieader no. 66 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO: 25);

HSA modificado (A14) Ieader - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO: 26);

HSA modificado (S14) líder (também conhecido como HSA modificado no. 65)

-MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEQ ID NO: 27),

HSA modificado (G14) líder - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO: 28), ou MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID NO: 29) p) uma seqüência de sinal de consenso (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO: 30)

r) a pré-seqüência de Mfoz-1 s) a pré-seqüência de 0 glucanase (BGL2)

t) líder de toxina exterminadora u) a pré-seqüência de toxina exterminadora

v) pré-pró de toxina exterminadora k. Lactis (29 aminoácidos; 16 aminoácidos de pre e 13 aminoácidos de pro) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID NO: 32) 25 w) seqüência Ieader de secreção de glucoarnylase II S. diastaticus

x) seqüência líder de secreção de α-galactosidase (MEL1) de S. carlsbergensis y) seqüência líder de Candida glucoarnylase

aa) a seqüência de sinal gp67 (em combinação com sistemas de expressão baculovirais) (por exemplo, aminoácidos 1-19 de número de acesso genBank AAA72759) ou

bb) o líder natural da proteína terapêutica X;

cc) líder de S. Cerevisiae invertase (SUC2), como revelado em JP 62-096086 (concedido como 911036516, aqui incorporado a título de referência); ou 35 dd) Inulinase - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID NO: 33).

ee) uma variante líder de propeptídeo TA57 modificado no. 1 -MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDWGLIS MAKR (SEQ ID NO: 34)

ff) uma variante líder de propeptídeo TA57 modificado no. 2 -MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATAQTNSGGLDWGLIS MAEEGEPKR (SEQ ID NO: 35)

gg) um peptídeo de sinal de consenso - MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEQ ID NO: 99)

jj) uma seqüência de sinal kex2/HSA modificado MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR (SEQ ID NO: 100)

kk) um peptídeo de sinal de consenso no. 2 - MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG 10 (SEQ ID NO: 98)

Em uma modalidade preferida, a seqüência de sinal kex2/HSA modificado (SEQ ID NO: 100) é fundida a extremidade amino de uma proteína de fusão de albumina, incluindo proteínas de fusão que compreendem albumina e uma proteína terapêutica como descrito aqui, bem como proteínas de fusão de albumina reveladas em W093/15199; W097/24445; W003/60071; W003-59934; e PCT/US04/01369, cada uma das quais é incorporada aqui a título de referência na íntegra. A seqüência de sinal kex2/HSA modificada se baseia na seqüência de sinal kex2/HSA (SEQ ID NO: 14) revelada, por exemplo, em Sleep e outros, Biotechnology 1990, vol. 8, pág. 42-46; e Patente US 5.302.697, as quais são ambas incorporadas aqui a título de referência na íntegra. A seqüência líder kex2/HSA modificada revelada aqui contém uma substituição de aminoácido não conservativo (Arg em Gly) no resíduo 19 do peptídeo de sinal de origem. Verificou-se que o peptídeo de sinal kex2/HSA modificado produz rendimento de expressão inesperadamente melhor e/ou melhor eficiência de clivagem de proteínas de fusão de albumina quando expresso em levedura do que a seqüência de sinal kex2/HSA não modificado. Variantes do peptídeo de sinal kex2/HSA modificado são também abrangidos pela invenção. Especificamente o resíduo Gly na posição 19 da SEQ ID NO: 100 pode ser substituído com um resíduo Pro. Outras variantes de substituição conservativa da seqüência de sinal kex2/HSA modificado são também consideradas. Ácidos nucléicos que codificam a seqüência de sinal kex2/HSA modificado da SEQ ID NO: 100, bem como suas variantes de substituição conservativa, são também abrangidas pela invenção.

Vetores que utilizam glutamina sintase (GS) ou DHFR como os marcadores selecionáveis podem ser ampliados na presença das drogas metionina sulfoximina ou metotrexato, respectivamente. Uma vantagem de vetores baseados em glutamina sintase é a disponibilidade de linhagens de células (por exemplo, a linhagem de células de mieloma de murino, NSO) que são negativos para glutamina sintase. Sistemas de expressão de glutamina sintase podem funcionar também em células que expressam glutamina sintase (por exemplo, células de Ovário de Hamster chinês (CHO)) pela provisão de inibidor adicional para evitar o funcionamento do gene endógeno. Um sistema de expressão de glutamina sintase e seus componentes são detalhados nas publicações PCT: W087/04462; W086/05807; W089/01036; W089/10404 e W091/06657, que são pelo presente incorporados na íntegra a título de referência aqui. Adicionalmente, vetores de expressão de glutamina sintase podem ser obtidos a partir da Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). A expressão e produção de anticorpos monoclonais utilizando um sistema de expressão GS em células de mieloma de murino são descritas em Bebbington e outros, Bio/technology 10:169 (1992) e em Biblia e Robison Biotechnol. Prog. 11:1 (1995) que são pelo presente incorporados a título de referência.

A presente invenção também se refere a células hospedeiras contendo as construções de vetor acima descritas e engloba adicionalmente células hospedeiras contendo seqüências de nucleotídeos da invenção que são operavelmente associadas a uma ou mais regiões de controle heterólogas (por exemplo, promotor e/ou intensificador) utilizando técnicas conhecidas na arte. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica mais elevada, como uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula derivada de ser humano), ou uma célula eucariótica inferior, como uma célula de levedura, ou a célula hospedeira pode ser uma célula procaríótica, como uma célula bacteriana. Uma cepa hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das seqüências de gene inseridas, ou modifica e processa o produto de gene no modo específico desejado. A expressão de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores; desse modo, a expressão do polipeptídeo geneticamente construída pode ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento traducional e pós-traducional e modificação (por exemplo, fosforilação, clivagem) de proteínas. Linhagens de células apropriadas podem ser escolhidas para assegurar as modificações desejadas e processamento da proteína estranha expresso.

A introdução dos ácidos nucléicos e construções de ácidos nucléicos da invenção na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por dextrano-DEAE, transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, como Davis e outros, Basic Methods in Molecular Biology (1986). É especificamente considerado que os polipeptídeos da presente invenção podem, na realidade, ser expressos por uma célula hospedeira que não tem um vetor recombinante.

Além de englobar células hospedeiras contendo as construções de vetor discutidas aqui, a invenção também engloba células hospedeiras primárias, secundárias e imortalizadas de origem vertebrada, especificamente de origem mamífera, que foram construídas para deletar ou substituir material genético endógeno (por exemplo, a seqüência de codificação correspondendo a uma proteína Terapêutica pode ser substituída com uma proteína de fusão de albumina correspondendo à proteína terapêutica), e/ou incluir material genético (por exemplo, seqüências de polinucleotídeo heterólogas como, por exemplo, uma proteína de fusão de albumina da invenção correspondendo à proteína terapêutica pode ser incluída). O material genético operavelmente associado ao polinucleotídeo endógeno pode ativar, alterar, e/ou amplificar polinucleotídeos endógenos.

Além disso, técnicas conhecidas na arte podem ser utilizadas para operavelmente associar polinucleotídeos heterólogos (por exemplo, polinucleotídeos codificando uma proteína de albumina, ou um seu fragmento ou variante) e/ou regiões de controle heterólogas (por exemplo, promotor e/ou intensificador) com seqüências de polinucleotídeos endógenas codificando uma proteína terapêutica via recombinação homóloga (vide, por exemplo, a Patente US número 5.641.670, expedida em 24 de junho de 1997; Número de publicação internacional WO 96/29411; número de publicação internacional WO 94/12650; Koller e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); e Zijlstra e outros, Nature 342: 435-438 (1989), cujas revelações são incorporadas a título de referência na íntegra).

Proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser recuperadas e purificadas a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração de ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatite, cromatografia de interação de carga hidrofóbica e cromatografia de lectina. Mais preferivelmente, cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") é empregada por purificação.

Nas modalidades preferidas as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia da permuta de ânion incluindo, porém não limitado a, cromatografia em Q-sefarose, DEAE sefarose, HQ poros, DEAE poros, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Recurso/Fonte Q e DEAE, Fractogel Q e colunas DEAE.

Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de troca de cátion incluindo, porém não limitado a, colunas SP-sefarose, CM sefarose, HS poros, CM poros, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Recurso/fonte S e CM, Fractogel S e CM e seus equivalentes e comparáveis.

Nas modalidades específicas as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de interação Hidrofóbica incluindo, porém não limitado a, colunas de fenila, butila, metila, octila, hexil-sefarose, fenila poros, butila, metila, octila, hexila, Toyopearl fenila, butila, metila, octila, fenila de fonte/recurso de hexila, butila, metila, octila, hexila, Fractogel Fenila, Butila, metila, octila, hexila e seus equivalentes e comparáveis.

Nas modalidades específicas as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de exclusão de tamanho incluindo, porém não limitado a, sefarose S100, S200, S300, colunas de resina superdex e seus equivalentes e comparáveis.

Nas modalidades específicas as proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando Cromatografia de afinidade incluindo, porém não limitada a, colunas de afinidade de Corante Mimético, afinidade de peptídeo e afinidade de anticorpos que são seletivas para HSA ou moléculas "alvo de fusão".

Nas modalidades preferidas proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando um ou mais métodos de cromatografia listados acima. Em outras modalidades preferidas, proteínas de fusão de albumina da invenção são purificadas utilizando uma ou mais das seguintes colunas de cromatografia, coluna FF sefarose Q, coluna FF sefarose SP, coluna de alto desempenho sefarose C, coluna FF de sefarose azul, coluna azul, coluna FF de sefarose de fenila, FF sefarose DEAE ou coluna de metila.

Adicionalmente, proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser purificadas utilizando o processo descrito na publicação Internacional PCT WO 00/44772, que é aqui incorporada a título de referência na íntegra. Uma pessoa versada na técnica pode facilmente modificar o processo descrito na mesma para uso na purificação de proteínas de fusão de albumina da invenção.

Proteínas de fusão de albumina da presente invenção podem ser recuperadas a partir de: produtos de procedimentos sintéticos químicos; e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura, de planta superior, inseto e de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, proteínas de fusão de albumina da invenção também podem incluir um resíduo de metionina modificado, inicial, em alguns casos como resultado de processos mediados por hospedeiro. Desse modo, é bem sabido na arte que a metionina término N codificada pelo códon de iniciação de translação é genericamente removida com alta eficiência a partir de qualquer proteína após tradução em todas as células eucarióticas. Embora a metionina término N na maioria das proteínas seja também eficientemente removida na maioria dos procariotes, para algumas proteínas, esse processo de remoção procariótica é ineficiente, dependendo da natureza do aminoácido ao qual a metionina término N é covalentemente ligada.

Em uma modalidade, a levedura Pichia pastoris é utilizada para expressar proteínas de fusão de albumina da invenção em um sistema eucariótico. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que pode metabolizar metanol como sua única fonte de carbono. Uma etapa principal na via de metabolização de metanol é a oxidação de metanol em formaldeído utilizando O2. Essa reação é catalisada pela oxidase de álcool de enzima. Para metabolizar metanol como sua única fonte de carbono, Pichia pastoris deve gerar altos níveis de oxidase de álcool devido, em parte, à afinidade relativamente baixa de oxidase de álcool por O2. Consequentemente, em um meio de crescimento dependendo de metanol como fonte de carbono principal, a região promotora de um dos dois genes de oxidase de álcool (AOXI) é altamente ativa. Na presença de metanol, oxidase de álcool produzido a partir do gene AOXI compreende até aproximadamente 30% da proteína solúvel total em Pichia pastoris. Vide Ellis, S.B., e outros, Mol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985); Koutz, P.J., e outros, Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., e outros, Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987). Desse modo, uma seqüência de codificação heteróloga, como, por exemplo, um polinucleotídeo da presente invenção, sob a regulação de transcrição de toda ou parte da seqüência reguladora AOXI é expressa em níveis excepcionalmente elevados em levedura Pichia cultivada na presença de metanol.

Em um exemplo, o vetor de plasmídeo pPIC9K é utilizado para expressar DNA codificando uma proteína de fusão de albumina da invenção, como exposto aqui, em um sistema de levedura Pichea essencialmente como descrito em "Pichia protocols: Methods in Molecular Biology," D.R. Higgins e J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Esse vetor de expressão permite expressão e secreção de um polipeptídeo da invenção em virtude do promotor AOXI forte ligado ao peptídeo de sinal secretor de fosfatase alcalina Pichia pastoris (PHO) (isto é, líder) localizado a montante de um sítio de clonagem múltiplo.

Muitos outros vetores de levedura poderiam ser utilizados no lugar de pPIC9K, como pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K e PA0815, como uma pessoa versada na técnica prontamente reconheceria, desde que a construção de expressa proposta forneça sinais apropriadamente localizados para transcrição, tradução, secreção (se desejado), e similares, incluindo um AUG em quadro como exigido.

Em outra modalidade, a expressão de alto nível de uma seqüência de codificação heteróloga, como, por exemplo, um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão de albumina da presente invenção, pode ser obtida por clonagem do polinucleotídeo heterólogo da invenção em um vetor de expressão como, por exemplo, pGAPZ ou pGAPZalpha, e cultivando a cultura de levedura na ausência de metanol.

Além disso, proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser quimicamente sintetizadas utilizando técnicas conhecidas na arte (por exemplo, vide Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y., e Hunkapiller e outros, Nature, 310:105 - 111 (1984)). Por exemplo, um polipeptídeo correspondendo a um fragmento de um polipeptídeo pode ser sintetizado pelo uso de um sintetizador de peptídeo. Além disso, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos de aminoácido químicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição na seqüência de polipeptídeos. Aminoácidos não clássicos incluem, porém não são limitados aos D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu1 ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahz, ácido 6-amino hexanóico, Aib1 ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxi prolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butil glicina, t-butil alanina, fenil glicina, ciclo hexil alanina, b-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos projetistas como aminoácidos b-metila, aminoácidos Ca-metila, aminoácidos Na-metila, e análogos de aminoácidos em geral. Além disso, o aminoácido pode ser D (dextrorrotatório) ou L (levorrotatório).

A invenção engloba proteínas de fusão de albumina da presente invenção que são diferencialmente modificadas durante ou após tradução, por exemplo, por glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de bloqueio/proteção conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc. Qualquer de inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo porém não limitado a, clivagem química específica por brometo de cianogênio, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8, NaBH4; acetilação, formilação, oxidação, redução; síntese metabólica na presença de tunicamicina; etc.

Modificações pós-traducionais adicionais abrangidas pela invenção incluem, por exemplo, cadeias de carboidrato ligadas por N ou ligadas por O, processamento de extremidades de término N ou término C, fixação de frações químicas na estrutura de aminoácido, modificações químicas de cadeias de carboidrato ligados por N ou ligados por O, e adição ou deleção de um resíduo de metionina de término N como resultado de expressão de célula hospedeira procariótica. As proteínas de fusão de albumina também podem ser modificadas com um rótulo detectável, como um rótulo enzimático, fluorescente, isotópico ou afinidade para permitir detecção e isolamento da proteína.

Os exemplos de enzimas apropriadas incluem peroxidase da raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetil colinestearase; os exemplos de complexos de grupo prostético apropriados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinil amina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e equorina; e exemplos de material radioativo apropriado incluem iodo (121I1 123I, 125I, 131I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnécio ("Tc, 99mTc), tálio (201Ti), gálio(68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh e 97Ru.

Nas modalidades específicas, proteínas de fusão de albumina da presente invenção ou seus fragmentos ou variantes são fixados em meios de quelação macrocílicos que associam a íons de radiometal, incluindo porém não limitados a, 177Lu, 90Y, 166Ho e 153Sm, a polipeptídeos. Em uma modalidade preferida, o íon de radiometal associado a meios de quelação macrocíclicos é 111In. Em outra modalidade preferida, o íon de radiometal associado ao meio de quelação macrocíclico é 90Y. Nas modalidades específicas, o meio de quelação macrocíclico é 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-ácido tetraacético (DOTA). Em outras modalidades específicas, DOTA é fixado em um anticorpo da invenção ou seu fragmento via molécula ligadora. Os exemplos de moléculas Iigantes úteis para conjugar DOTA com um polipeptídeo são comumente conhecidos na arte - vide, por exemplo, DeNardo e outros, Clin Câncer Res. 4(10):2483-90 (1998); Peterson e outros, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7 (1999); e Zimmerman e outros, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50 (1999); sendo incorporados aqui na íntegra a título de referência.

Conforme mencionado, as proteínas de fusão de albumina da invenção podem ser modificadas por processos naturais, como processamento pós-traducional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na arte. Será reconhecido que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variados em vários sítios em um dado polipeptídeo. Polipeptídeos da invenção podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados, e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-tradução ou podem ser feitos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma fração heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, fixação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, demetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de fixação GPI, hidroxilação, iodinação, metílação, miristilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição, mediada por RNA de transferência, de aminoácidos a proteínas como arginilação e ubiquitinação. (Vide, por exemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nova York (1993); POST- TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova York, pág. 1-12 (1983); Seifter e outros, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan e outros, Ann. N.Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992).

Proteínas de fusão de albumina da invenção e anticorpos que ligam uma proteína terapêutica ou seus fragmentos ou variantes podem ser fundidos com seqüências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a purificação. Nas modalidades preferidas, a seqüência de aminoácidos marcadores é um peptídeo de hexa-histidina, como o marcador fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue1 Chatsworth, CA, 91311) entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina provê purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para purificação incluem, porém não são limitados a, marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson e outros, Cell 37:767 (1984)) e o marcador "flag".

Além disso, uma proteína de fusão de albumina da invenção pode ser conjugada com uma fração terapêutica como uma citotoxina, por exemplo um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo, por exemplo, alfa-emissores como, por exemplo, 213Bi. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a células. Os exemplos, incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos incluem, porém não são limitados a antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e platina cis-diclorodiamina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Os conjugados da invenção podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, a fração de droga ou agente terapêutico não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração de droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína como fator de necrose de tumor, alfa-interferon, β-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-alfa, TNF- beta, AIM I (vide a publicação internacional no. WO 97/33899), AIM II (vide a publicação internacional no. WO 97/34911), Fas Ligand (Takahashi e outros, Int. Immunol. 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (vide a publicação internacional No. WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, por exemplo angiostatina ou endostatina; ou modificadores de resposta biológica como, por exemplo, linfocinas, interleucína-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito ("GM-CSF"), fator de estimulação de colônia de granulócito ("G-CSF"),ou outros fatores de crescimento. Técnicas para conjugar tal fração terapêutica com proteínas (por exemplo, proteínas de fusão de albumina) são bem conhecidas na arte.

Proteínas de fusão de albumina também podem ser fixadas em suportes sólidos, que são especificamente úteis para imunoensaios ou purificação de polipeptídeos que são ligados por, que se ligam a, ou associam a proteínas de fusão de albumina da invenção. Tais suportes sólidos incluem, porém não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinil ou polipropileno.

Proteínas de fusão da albumina, com ou sem uma fração terapêutica conjugada com as mesmas, administradas individualmente ou em combinação com fator(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s) podem ser utilizadas como terapêutica.

Nas modalidades onde a proteína de fusão da albumina da invenção compreende somente o domínio VH de um anticorpo que liga uma proteína terapêutica, pode ser necessário e/ou desejável coexpressar a proteína de fusão com o domínio VL do mesmo anticorpo que liga uma proteína Terapêutica, de tal modo que a proteína de fusão da albumina-VH e proteína VL associarão (covalente ou não covalentemente) de modo pós-traducional.

Nas modalidades onde a proteína de fusão da albumina da invenção compreende somente o domínio VL de um anticorpo que liga uma proteína terapêutica, pode ser necessário e/ou desejável co-expressar a proteína de fusão com o domínio VH do mesmo anticorpo que liga uma proteína Terapêutica, de tal modo que a proteína de fusão da albumina-VL e proteína VH associarão (covalente ou não covalentemente) de modo pós-traducional.

Alguns anticorpos terapêuticos são anticorpos biespecíficos, significando o anticorpo que liga uma proteína terapêutica é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Para criar uma proteína de fusão da albumina correspondendo àquela proteína terapêutica, é possível criar uma proteína de fusão da albumina que tenha um fragmento scFv fundido com extremidade tanto N como C da fração de proteína da albumina. Mais especificamente, o scFv fundido com extremidade N de albumina corresponderia a um dos pares pesado/leve (VH/VL) do anticorpo original que liga uma proteína terapêutica e o scFv fundido com extremidade-C de albumina corresponderia ao outro par pesado/leve (VH/VL) do anticorpo original que liga uma proteína terapêutica.

São também fornecidos pela invenção derivados quimicamente modificados das proteínas de fusão da albumina que podem fornecer vantagens adicionais como solubilidade, estabilidade e tempo de circulação aumentados do polipeptídeo, ou imunogenicidade diminuída (vide a Patente US número 4.179.337). As frações químicas para derivatização podem ser selecionadas de polímeros solúveis em água como polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carbóxi metil celulose, dextrano, álcool de polivinil e similares. As proteínas de fusão da albumina podem ser modificadas em posições aleatórias na molécula, ou em posições predeterminadas na molécula e podem incluir uma, duas, três ou mais frações químicas fixadas.

O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferido está entre aproximadamente IkDa e aproximadamente 100 kDa (o termo "aproximadamente" indicando que em preparados de polietileno glicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular mencionado) para facilidade em manipulação e fabricação. Outros tamanhos podem ser utilizados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação controlada desejada, os efeitos, se algum sobre a atividade biológica, a facilidade em manipulação, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno glicol para uma proteína terapêutica ou análogo). Por exemplo, o polietileno glicol pode ter um peso molecular médio de aproximadamente 200, 500, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9.500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 20 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 ou 100.000 kDa.

Conforme observado acima, o polietileno glicol pode ter uma estrutura ramificada. Polietileno glicóis ramificados são descritos, por exemplo, na Patente US número 5.643.575; Morpurgo e outros., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev e outros, Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); e Caliceti e outros, Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), e cujas revelações são aqui incorporadas a título de referência.

As moléculas de polietileno glicol (ou outras frações químicas) devem ser fixadas à proteína com consideração de efeitos sobre domínios funcionais ou antigênicos da proteína. Há diversos métodos de fixação disponíveis para aqueles versados na arte, como, por 30 exemplo, o método revelado em EP 0401 384 (acoplar PEG a G-CSF), aqui incorporado a título de referência; vide também Malik e outros, Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992), relatando peguilação de GM-CSF utilizando cloreto de tresila. Por exemplo, polietileno glicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácido via grupo reativo, como um grupo amino ou carboxila livre. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietileno glicol ativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoácido tendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácido término N; aqueles tendo um grupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido término C. Grupos de sulfidril também podem ser utilizados como um grupo reativo para fixar as moléculas de polietileno glicol. É preferido para fins terapêuticos a fixação em um grupo amino, como fixação na extremidade-N ou grupo de lisina.

Conforme sugerido acima, polietileno glicol pode ser fixado em proteínas via ligação a qualquer de um número de resíduos de aminoácido. Por exemplo, polietileno glicol pode ser ligado a proteínas via ligações covalentes a resíduos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína. Uma ou mais químicas de reação pode ser empregada para fixar polietileno glicol em resíduos de aminoácido específicos (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína) da proteína ou a mais de um tipo de resíduo de aminoácido (por exemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína e combinações dos mesmos) da proteína.

Pode-se desejar especificamente proteínas quimicamente modificadas na extremidade-N. Utilizando polietileno glicol como ilustração da presente composição, podese selecionar de uma variedade de moléculas de polietileno glicol (em peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietileno glicol para moléculas de proteína (polipeptídeo) na mistura de reação, o tipo de reação de peguilação a ser executada, e o método de obter a proteína peguilada de modo término N, selecionada. O método de obter a preparação peguilada de modo término N (isto é, separando essa fração a partir de outras frações monopeguiladas se necessário) pode ser por purificação do material peguilado de modo término N a partir de uma população de moléculas de proteína peguilada. Proteínas seletivas modificadas quimicamente na modificação de extremidade-N podem ser realizadas por alquilação redutiva que explora reatividade diferencial de tipos diferentes de grupos amino primário (lisina versus término N) disponíveis para derivatização em uma proteína específica. Sob as condições de reação apropriadas, a derivatização substancialmente seletiva da proteína na extremidade-N com um polímero contendo grupo de carbonila é obtida.

Conforme indicado acima, pegilação das proteínas de fusão da albumina da invenção pode ser realizada por qualquer número de meios. Por exemplo, polietileno glicol pode ser fixado na proteína de fusão da albumina diretamente ou por um ligador intermediário. Sistemas sem ligador para fixar polietileno glicol a proteínas são descritos em Delgado e outros, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis e outros, Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998): Patente US número 4.002.531; Patente US no. 5.349.052; WO 95/06058; e WO 98/32466, cujas revelações são aqui incorporadas a título de referência.

Um sistema para fixar polietileno glicol diretamente em resíduos de aminoácido de proteínas sem um ligador intermediário emprega MPEG tresilado, que é produzido pela modificação de monmetóxi polietileno glicol (MPEG) utilizando cloreto de tresila (CISO2CH2CF3). Após reação de proteína com MPEG tresilado, polietileno glicol é diretamente fixado em grupos de amina da proteína. Desse modo, a invenção inclui conjugados de proteína-polietileno glicol produzidos por reação de proteínas da invenção com uma molécula de polietileno glicol tendo um grupo de sulfonila 2,2,2-trifluoroetano.

Polietileno glicol também pode ser fixado em proteínas utilizando diversos ligantes intermediários diferentes. Por exemplo, a Patente US número 5.612.460, cuja revelação integral é incorporada aqui a título de referência, revela Iigantes de uretano para conectar polietileno glicol a proteínas. Conjugados de proteína-polietileno glicol onde o polietileno glicol é fixado na proteína por um Iigador também podem ser produzidos por reação de proteínas com compostos como MPEG-succinimidil succinato, MPEG ativado com 1,1'-carbonildiimidazol, MPEG-2,4,5-tricloropenil carbonato, MPEG-p-nitrofenol carbonato, e vários derivados MPEG-succinato. Diversos derivados de polietileno glicol adicionais e químicas de reação para fixar polietileno glicol em proteínas são descritos na publicação internacional no. WO 98/32466, cuja revelação integral é incorporada aqui a título de referência. Produtos de proteína peguilada produzidos utilizando as químicas de reação expostas aqui são incluídas no escopo da invenção.

O número de frações de polietileno glicol fixado em cada proteína de fusão da albumina da invenção (isto é, o grau de substituição) também pode variar. Por exemplo, as proteínas peguiladas da invenção podem ser ligadas, em média, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 ou mais moléculas de polietileno glicol. Similarmente, o grau médio de substituição compreendido nas faixas como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, ΙΟΙ 2, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 ou 18-20 frações de polietileno glicol por molécula de proteína. Os métodos para determinar o grau de substituição são discutidos, 25 por exemplo, em Delgado e outros, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).

Os polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados a partir de síntese química e culturas de células recombinantes por métodos padrão que incluem, porém não são limitados a, precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração de ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Mais preferivelmente, cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") é empregado para purificação. Técnicas bem conhecidas para redobrar proteína podem ser empregadas para regenerar conformação ativa quando o polipeptídeo é desnaturado durante isolamento e/ou purificação.

A presença e quantidade de proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser determinadas utilizando ELISA, um imunoensaio bem conhecido na arte. Em um protocolo ELISA que seria útil para detectar/quantificar proteínas de fusão da albumina da invenção, compreende as etapas de revestir uma placa ELISA com um anticorpo de albumina de soro anti-humano, bloquear a placa para evitar ligação não específica, lavar a placa ELISA, adicionar uma solução contendo a proteína de fusão da albumina da invenção (em uma ou mais concentrações diferentes), adicionar um anticorpo específico de proteína antiterapêutica secundário acoplado a um rótulo detectável (como descrito aqui ou de outro modo conhecido na arte), e detectar a presença do anticorpo secundário. Em uma versão alternativa desse protocolo, a placa ELISA poderia ser revestida com o anticorpo específico de proteína antiterapêutica e o reagente secundário marcado poderia ser o anticorpo específico de albumina anti-humana.

Usos dos polinucleotídeos

Cada um dos polinucleotídeos identificados aqui pode ser utilizado em inúmeros modos como reagentes. A seguinte descrição deve ser considerada exemplar e utiliza técnicas conhecidas.

Os polinucleotídeos da presente invenção são úteis para produzir as proteínas de fusão da albumina da invenção. Como descrito em mais detalhe abaixo, polinucleotídeos da invenção (codificando proteínas de fusão da albumina) podem ser utilizados em métodos de DNA recombinantes úteis em engenharia genética para fazer células, linhagens de células, ou tecidos que expressam a proteína de fusão da albumina codificada pelos polinucleotídeos que codificam proteínas de fusão da albumina da invenção.

Polinucleotídeos da presente invenção são também úteis em terapia gênica. Um objetivo de terapia gênica é inserir um gene normal em um organismo tendo um gene defectivo, em um esforço para corrigir o defeito genético. Os polinucleotídeos revelados na presente invenção oferecem um meio de alvejamento tais defeitos genéticos em um modo altamente preciso. Outro objetivo é inserir um gene novo que não estava presente no genoma hospedeiro, desse modo produzindo um novo traço na célula hospedeira. Exemplos não limitadores adicionais de métodos de terapia gênica abrangidos pela presente invenção são mais completamente descritos em outra parte da presente invenção (vide, por exemplo, as seções marcadas "Terapia gênica", e exemplos 61 e 62).

Usos dos polipeptídeos

Cada um dos polipeptídeos identificados aqui pode ser utilizado de diversas maneiras. A descrição a seguir deve ser considerada exemplar e utiliza técnicas conhecidas.

Proteínas de fusão da albumina da invenção são úteis para fornecer sondas imunológicas para identificação diferencial do(s) tecido(s) (por exemplo, ensaios de imunoistoquímica como, por exemplo, ABC imunoperoxidase (Hsu e outros, J. Histochem. Cytochem. 29:577-580 (1981)) ou tipo(s) de célula (por exemplo, ensaios de imunocitoquímica)).

Proteínas de fusão da albumina podem ser utilizadas para ensaiar níveis de polipeptídeos em uma amostra biológica utilizando métodos imunoistológicos clássicos conhecidos por aqueles versados na arte (por exemplo, vide Jalkanen, e outros, J.Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, e outros, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos úteis para detectar expressão gênica de proteína incluem imunoensaios, como o ensaio imunosorvente ligado por enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Marcadores de ensaio apropriados são conhecidos na arte e incluem marcadores de enzima, como glicose oxidase; radioisótopos, como iodo (131I1 125I, 123I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115mIn, 113mIn 112In, 111In), e tecnécio ("Tc, 99mTc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F)1 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; marcadores luminescentes, como luminol; e marcadores fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser detectadas in vivo por imageamento. Marcadores ou marcadores para imageamento in vivo de proteína incluem aqueles detectáveis por radiografia-X, ressonância magnética nuclear (NMR), ou relaxamento de giro de elétrons (ESR). Para radiografia-X, marcadores apropriados incluem radioisótopos como bário ou césio, que emitem radiação detectávej porém não são abertamente prejudiciais ao sujeito. Marcadores apropriados para NMR e ESR incluem aqueles com um giro característico detectável, como deutério, que pode ser incorporado na proteína de fusão da albumina por rotulação de nutrientes dados a uma linhagem de células que expressa a proteína de fusão da albumina da invenção.

Uma proteína de fusão da albumina que foi marcada com uma fração de imageamento detectável, apropriada, como um radioisótopo (por exemplo, 131I1 112In, 99mTc, (131I1 125I, 123I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H)1 índio (115mIn, 113mIn, 112In, 111In) e tecnécio (99Tc, 99mTc), tálio (201Ti), gálio (68Ga1 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F) 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Hol 90Y1 47Sc1 186Re, 188Re, 142Prl 105Rh e, 97Ru), uma substância radiopaca, ou um material detectável por ressonância nuclear magnética, é introduzida (por exemplo, por via parenteral, subeutânea ou intraperitoneal) no mamífero a ser examinado em relação a transtorno do sistema imune. Será entendido na arte que o tamanho do sujeito e o sistema de imageamento utilizado determinarão a quantidade de fração de imageamento necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma fração de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada variará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. A proteína de fusão da albumina marcada acumulará, então preferivelmente, em locais no corpo (por exemplo, órgãos, células, espaços ou matrizes extracelulares) onde um ou mais receptores, Iigandos ou substratos (correspondendo àquele da proteína Terapêutica utilizada para fazer a proteína de fusão da albumina da invenção) são localizados. Alternativamente, no caso onde a proteína de fusão da albumina compreende pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo terapêutico, a proteína de fusão da albumina marcada acumulará, então preferivelmente nos locais no corpo (por exemplo, órgãos, células, espaços ou matrizes extracelulares) onde os polipeptídeos/epítopos correspondendo àqueles ligados pelo anticorpo terapêutico (utilizado para fazer a proteína de fusão da albumina da invenção) são localizados. Imageamento de tumor in vivo é descrito em S.W. Burchiel e outros, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled antibodies and their fragments" (capítulo 13 em Tumor imaging: The radiochemical Detection of câncer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Os protocolos descritos nos mesmos poderiam ser facilmente modificados por uma pessoa versada na arte para uso com as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Em uma modalidade, a invenção provê um método para a distribuição específica de proteínas de fusão da albumina da invenção para células por administração de proteínas de fusão da albumina da invenção (por exemplo, polipeptídeos codificados por polinucleotídeos codificando proteínas e fusão da albumina da invenção e/ou anticorpos) que são associados a polipeptídeos heterólogos ou ácidos nucléicos. Em um exemplo, a invenção provê um método para distribuir uma proteína terapêutica para a célula alvejada. Em outro exemplo, a invenção provê um método para distribuir um ácido nucléico de fita única (por exemplo, anti-sentido ou ribozimas) ou ácido nucléico de fita dupla (por exemplo, DNA que pode integrar no genoma da célula ou replicar de forma epissomal e que pode ser transcrito) na célula alvejada.

Em outra modalidade, a invenção provê um método para a destruição específica de células (por exemplo, a destruição de células de tumor) por administração de proteínas de fusão da albumina da invenção em associação a toxinas ou pró-medicamentos citotóxicos. "Toxina" se refere a um ou mais compostos que ligam e ativam sistemas efetores

citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimas não normalmente presentes em ou na superfície de uma célula que sob condições definidas causam a morte da célula. Toxinas que podem ser utilizadas, de acordo com os métodos da invenção incluem, porém não são limitados a, radioisótopos conhecidos na arte, compostos como, por exemplo, anticorpos (ou complementam porções de contenção de fixação dos mesmos) que ligam um sistema efetor citotóxico endógeno inerente ou induzido, timidina cinase, endonuclease, RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, Pseudomonas exotoxina A, toxina de difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina de cólera."Toxina" também inclui um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo, por exemplo, alfa-emissores como, por exemplo, 213Bi, ou outros radioisótopos como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131I1 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn1 75Se1 113Snl 90Itrio1 117Estanho, 186Rênio, 166HoImiuml e 188Rênio; marcadores luminescentes, como luminol; e marcadores fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, e biotina. Em uma modalidade específica, a invenção provê um método para a destruição específica de células (por exemplo, a destruição de células de tumor) por administração de polipeptídeos da invenção ou anticorpos da invenção em associação ao radioisótopo 90Y. Em outra modalidade específica, a invenção provê um método para a destruição específica de células (por exemplo, a destruição de células de tumor) por administrar polipeptídeos da invenção ou anticorpos da invenção em associação ao radioisótopo 111In. Em uma modalidade específica adicional, a invenção provê um método para a destruição específica de células (por exemplo, a destruição de células de tumor) por administrar polipeptídeos da invenção ou anticorpos da invenção em associação ao radioisótopo 131L.

Técnicas conhecidas na arte podem ser aplicadas para marcar polipeptídeos da invenção. Tais técnicas incluem, porém não são limitadas ao uso de agentes de conjugação bifuncionais (vide, por exemplo, as patentes US números 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; e 5.808.003; cujos teores são pela presente incorporados a título de referência na íntegra).

As proteínas de fusão da albumina da presente invenção são úteis para diagnóstico, tratamento, prevenção e/ou prognóstico de vários transtornos em mamíferos, preferivelmente seres humanos. Tais transtornos incluem, porém não são limitados àqueles descritos aqui sob o título de seção "Atividades biológicas" abaixo.

Desse modo, a invenção provê um método de diagnóstico de um transtorno, que envolve (a) ensaiar o nível de expressão de um certo polipeptídeo em células ou fluido do corpo de um indivíduo utilizando uma proteína de fusão da albumina da invenção; e (b) comparar o nível de expressão de polipeptídeo ensaiado com um nível de expressão de polipeptídeo padrão, pelo que um aumento ou diminuição no nível de expressão de polipeptídeo ensaiado comparado com o nível de expressão padrão é indicativo de um transtorno. Com relação ao câncer, a presença de uma quantidade relativamente elevada de transcrito em tecido submetido à biopsia de um indivíduo pode indicar uma predisposição para o desenvolvimento da doença, ou pode fornecer um meio para detectar a doença antes do surgimento de sintomas clínicos efetivos. Um diagnóstico mais definitivo desse tipo pode permitir que profissionais da área de saúde empreguem medidas preventivas ou tratamento agressivo mais cedo desse modo evitando o desenvolvimento ou avanço adicional do câncer.

Além disso, proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser utilizadas para tratar ou prevenir doenças ou condições como, por exemplo, transtornos neurais, transtornos do sistema imune, transtornos musculares, transtornos reprodutivos, transtornos gastrintestinais, transtornos pulmonares, transtornos cardiovasculares, transtornos renais, transtornos protiferativos, e/ou doenças e condições cancerígenas. Por exemplo, pode-se administrar aos pacientes um polipeptídeo da presente invenção em um esforço para substituir níveis ausentes ou diminuídos do polipeptídeo (por exemplo, insulina), suplementar níveis ausentes ou diminuídos de um polipeptídeo diferente (por exemplo, hemoglobina S para hemoglobina B, SOD, catalase, proteínas de reparo de DNA), inibir a atividade de um polipeptídeo (por exemplo, por ligar-se a um receptor), reduzir a atividade de um receptor ligado por membrana por competir com o mesmo para ligando livre (por exemplo, receptores de TNF solúveis utilizados para reduzir inflamação), ou ocasionar uma resposta desejada (por exemplo, inibição de crescimento de vaso sangüíneo, intensificação da resposta imune a células ou tecidos proliferativos).

Especificamente, as proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo terapêutico também podem ser utilizadas para tratar doença (como descrito supra, e em outro lugar na presente invenção). Por exemplo, a administração de uma proteína de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico pode ligar-se e/ou neutralizar o polipeptídeo ao qual o anticorpo Terapêutico usou para fazer a proteína de fusão da albumina liga especificamente, e/ou reduzir produção em excesso do polipeptídeo ao qual o anticorpo Terapêutico usou para fazer a proteína de fusão da albumina especificamente liga. Similarmente, a administração de uma proteína de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo Terapêutico pode ativar o polipeptídeo ao qual o anticorpo Terapêutico usou para fazer a proteína de fusão da albumina especificamente liga, por ligar-se ao polipeptídeo ligado a uma membrana (receptor).

No mínimo, as proteínas de fusão da albumina da invenção da presente invenção podem ser utilizadas como marcadores de peso molecular em géis SDS-PAGE ou em colunas de filtração de gel de classificação molecular utilizando métodos bem conhecidos daqueles versados na arte. Proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser utilizadas também para criar anticorpos, que por sua vez podem ser utilizados para medir expressão de proteína da proteína Terapêutica, proteína de albumina e/ou a proteína de fusão da albumina da invenção a partir de uma célula recombinante, como um meio de avaliar a transformação da célula hospedeira, ou em uma amostra biológica. Além disso, as proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser utilizadas para testar as atividades biológicas descritas aqui.

Ensaios de diagnóstico

Os compostos da presente invenção são úteis para diagnóstico, tratamento, prevenção e/ou prognóstico de vários transtornos em mamíferos, preferivelmente seres humanos. Tais transtornos incluem, porém não são limitados àqueles descritos para cada proteína Terapêutica na linha correspondente da Tabela 1 e aqui sob os títulos de seção "Atividade Imune", "Transtornos relacionados ao sangue", "Transtornos hiperproliferativos", "Transtornos renais", "Transtornos cardiovasculares", "Transtornos respiratórios", "Atividade antiangiogênese", "Doenças no nível celular", "Cicatrização de ferimento e proliferação de células epiteliais", "Atividade neural e doenças neurológicas", "Transtornos endócrinos", "Transtornos do sistema reprodutivo", "Doença infecciosa", "Regeneração" e/ou Transtornos gastrintestinais", infra.

Para diversos transtornos, níveis substancialmente alterados (aumentado ou diminuído) de expressão gênica podem ser detectados em tecidos, células ou fluidos corpóreos (por exemplo, soro, plasma, urina, sêmen, fluido sinovial ou fluido espinhal) tirados de um indivíduo com um tal transtorno, em relação a um nível de expressão gênica "padrão", isto é, o nível de expressão em tecidos ou fluidos corpóreos a partir de um indivíduo não apresentando o transtorno. Desse modo, a invenção provê um método de diagnóstico útil durante diagnose de um transtorno, que envolve a medição do nível de expressão gênica codificando um polipeptídeo em tecidos, células ou fluido corpóreo a partir de um indivíduo e comparar o nível de expressão gênica medido com um nível de expressão gênica padrão, pelo que um aumento ou diminuição no(s) nível(is) de expressão gênica em comparação com o padrão é indicativo de um transtorno. Esses ensaios de diagnóstico podem ser executados in vivo ou in vitro, como, por exemplo, em amostras de sangue, tecido de biopsia ou tecido de autópsia.

A presente invenção também é útil conforme indicador de prognóstico, pelo que pacientes que apresentam expressão gênica aumentada ou diminuída experimentarão um resultado clínico pior.

"Ensaio do nível de expressão gênica codificando um polipeptídeo" se refere à medição ou estimativa, qualitativa ou quantitativamente, do nível de um polipeptídeo específico (por exemplo, um polipeptídeo correspondendo a uma proteína Terapêutica revelada na tabela 1) ou o nível de RNAm codificando o polipeptídeo da invenção em uma primeira amostra biológica diretamente (por exemplo, por determinar ou estimar o nível absoluto de proteína ou nível de RNAm) ou relativamente (por exemplo, por comparar com o nível de polipeptídeo ou nível de RNAm em uma segunda amostra biológica). Preferivelmente, o nível de expressão de polipeptídeo ou nível RNAm na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com um nível de polipeptídeo padrão ou nível de RNAm, o padrão sendo tirado de uma segunda amostra biológica obtida a partir de um indivíduo não apresentando o transtorno ou sendo determinado por mediar níveis de uma população de indivíduos não apresentando o transtorno. Como será reconhecido na técnica, após conhecer um nível de polipeptídeo padrão ou nível de RNAm, pode-se utilizar repetidamente como padrão para comparação. "Amostra biológica" se refere a qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linhagem de célula, cultura de tecido, ou outra fonte contendo polipeptídeos da invenção (incluindo suas porções) ou RNAm. Conforme indicado, amostras biológicas incluem fluidos corpóreos (como soro, plasma, urina, fluido sinovial e fluido espinal) e fontes de tecido encontradas para expressar o comprimento total ou seus fragmentos de um polipeptídeo ou RNAm. Métodos para obter biopsias de tecido e fluidos corpóreos a partir de mamíferos são bem conhecidos na arte. Quando a amostra biológica deve incluir RNAm, uma biopsia de tecido é a fonte preferida.

RNA celular total pode ser isolado de uma amostra biológica utilizando qualquer técnica apropriada como o método de guanidínio-tiocianato-fenol-clorofórmio de etapa única descrito em Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). Níveis de RNAm codificando os polipeptídeos da invenção são então ensaiados utilizando qualquer método apropriado. Esses incluem análise de Northern blot, mapeamento de nuclease S1, a reação de cadeia de polimerase (PCR), transcrição inversa em combinação com a reação de cadeia de polimerase (RT-PCR), e transcrição inversa em combinação com a reação de cadeia de Iigase (RT-LCR).

A presente invenção também se refere a ensaios diagnósticos como ensaios quantitativas e de diagnóstico para detectar níveis de polipeptídeos que ligam a, são ligados por, ou associam a proteínas de fusão da albumina da invenção, em uma amostra biológica (por exemplo, células e tecidos), incluindo determinação de níveis normais e anormais de polipeptídeos. Desse modo, por exemplo, um ensaio de diagnóstico de acordo com a invenção para detectar expressão anormal de polipeptídeos que se ligam a, são ligados por ou associam a proteínas de fusão da albumina comparados com amostras de tecido de controle normais pode ser utilizado para detectar a presença de tumores. Técnicas de ensaios que podem ser utilizadas para determinar níveis de um polipeptídeo que se ligam, são ligados ou se associam a proteínas de fusão da albumina da presente invenção em uma amostra derivada a partir de um hospedeiro são bem conhecidos por aqueles versados na arte. Tais métodos de ensaio incluem radioimunoensaios, ensaios de ligação competitiva, análise Western Blot e ensaios ELISA. O ensaio de níveis de polipeptídeo em uma amostra biológica pode ocorrer utilizando qualquer método conhecido na arte.

O ensaio de níveis de polipeptídeo em uma amostra biológica pode ocorrer utilizando uma variedade de técnicas. Por exemplo, expressão de polipeptídeo em tecidos pode ser estudada com métodos imunoistológicos clássicos (Jalkanen e outros, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., e outros, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros 35 métodos úteis para detectar expressão gênica de polipeptídeo incluem imunoensaios, como o ensaio imunosorvente ligado por enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Marcadores de ensaio de anticorpo apropriados são conhecidos na arte e incluem marcadores de enzimas, como, oxidase de glicose, e radioisótopos, como iodo (125I1 121I), carbono (14C)1 enxofre (35S), trítio (3Hx indi0 012In), e tecnécio (99mTc)1 e marcadores fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, e biotina.

O tipo de célula ou tecido a ser analisado incluirá, genericamente, aqueles que são conhecidos, ou que se suspeita expressarem o gene de interesse (como, por exemplo, câncer). Os métodos de isolamento de proteína empregados aqui podem, por exemplo, ser tais como aqueles descritos em Harlow e Lane (Harlow1 E. e Lane1 D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press1 Cold Spring Harbor1 Nova York) que é incorporado aqui a título de referência na íntegra. As células isoladas podem ser derivadas de cultura de células ou de um paciente. A análise de células tiradas de cultura pode ser uma etapa necessária na avaliação de células que poderiam ser utilizadas como parte de uma técnica de terapia gênica baseada em células ou alternativamente, para testar o efeito de compostos sobre a expressão gênica.

Por exemplo, as proteínas de fusão da albumina podem ser utilizadas para quantitativa ou qualitativamente detectar a presença de polipeptídeos que se Iigam1 são ligados ou associam-se às proteínas de fusão da albumina da presente invenção. Isso pode ser realizado, por exemplo, por técnicas de imunofluorescência empregando uma proteína de fusão da albumina marcada de modo fluorescente acoplada com detecção microscópica leve, citométrica de fluxo ou fluorimétrica.

Em uma modalidade preferida, proteínas de fusão da albumina compreendendo pelo menos um fragmento ou variante de um anticorpo que liga especificamente pelo menos uma proteína Terapêutica revelada aqui (por exemplo, as proteínas Terapêuticas reveladas na Tabela 1) ou de outro modo conhecido na técnica podem ser utilizadas para quantitativa ou qualitativamente detectar a presença de produtos de gene ou variantes conservadas ou seu fragmentos de peptídeo. Isso pode ser realizado, por exemplo, por técnicas de imunofluorescência que empregam um anticorpo marcado de modo fluorescente acoplado com detecção microscópica leve, citométrica de fluxo ou fluorimétrica.

As proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser, adicionalmente, empregadas histologicamente, como em ensaios de imunofluorescência,microscopia imunoelétron ou não imunológicos, para detecção no local de polipeptídeos que se ligam, são ligados ou se associam a uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. A detecção no local pode ser realizada retirando um espécime histológico de um paciente, e aplicando ao mesmo um anticorpo marcado ou polipeptídeo da presente invenção. As proteínas de fusão da albumina são preferivelmente aplicadas por 35 sobreposição das proteínas de fusão da albumina marcadas sobre uma amostra biológica. Através do uso desse procedimento, é possível determinar-se não somente a presença dos polipeptídeos que se ligam, são ligados ou se associam a proteínas de fusão da albumina, mas também sua distribuição tecido examinado. Utilizando a presente invenção, as pessoas com conhecimentos comuns na técnica perceberão prontamente que qualquer de uma ampla variedade de métodos histológicos (como procedimentos de coloração) pode ser modificado para obter essa detecção no local.

Imunoensaios e não-imunoensaios que detectam polipeptídeos que se ligam, são ligados ou se associam às proteínas de fusão da albumina compreenderão, tipicamente incubar uma amostra, como um fluido biológico, um extrato de tecido, células recentemente colhidas, ou Iisados de células que foram incubados em cultura de célula, na presença de um anticorpo marcado de forma detectável capaz de ligar produtos de gene ou variantes conservadas ou seus fragmentos de peptídeo, e detectar o anticorpo ligado por qualquer de diversas técnicas bem conhecidas na arte.

A amostra biológica pode ser colocada em contato e imobilizada sobre um suporte ou portador de fase sólida como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas de células ou proteínas solúveis. O suporte pode ser então lavado com tampões apropriados seguido por tratamento com a proteína de fusão da albumina marcada de forma detectável, da invenção. O suporte de fase sólida pode ser então lavado com o tampão uma segunda vez para retirar polipeptídeo ou anticorpo não ligado. Opcionalmente, o anticorpo é subseqüentemente marcado. A quantidade de rótulo ligado no suporte sólido pode ser então detectada por meio convencional.

"Portador ou suporte de fase sólida" se refere a qualquer suporte capaz de ligar um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína de fusão da albumina, ou polipeptídeo que se liga, é ligado ou se associa a uma proteína de fusão da albumina da invenção). Portadores ou suportes bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celulose natural e modificada, poliacrilamidas, gabbros e magnetita. A natureza do portador pode ser solúvel até um certo ponto ou insolúvel para fins da presente invenção. O material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de ligar-se a um polipeptídeo. Desse modo, a configuração de suporte pode ser esférica, como em uma microesfera ou cilíndrica, como na superfície interior de um tubo de teste, ou superfície externa de uma haste. Alternativamente, a superfície pode ser plana como uma folha, tira de teste, etc. Suportes preferidos incluem microesferas de poliestireno. Aqueles versados na arte conhecerão muitos outros portadores apropriados para ligar anticorpo ou antígeno, ou serão capazes de determinar os mesmos por uso de experimentação de rotina.

A atividade de ligação de um dado lote de proteínas de fusão da albumina pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Aqueles versados na arte serão capazes de determinar condições de ensaio operativa e ótima para cada determinação empregando experimentação de rotina. Além de ensaiar níveis de polipeptídeo em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, polipeptídeo pode também ser detectado in vivo por imageamento. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, proteínas de fusão da albumina da invenção são utilizadas para imagear células doentes ou neoplásicas.

Marcadores ou marcadores para imageamento in vivo de proteínas de fusão da albumina da invenção incluem aquelas detectáveis por radiografia-X, NMR1 MRI, CAT-scans ou ESR. Para radiografia-X, marcadores apropriados incluem radioisótopos como bário ou césio, que emitem radiação detectável porém não são abertamente prejudiciais ao sujeito. Marcadores apropriados para NMR e ESR incluem aqueles com um giro característico detectável, como deutério, que pode ser incorporado na proteína de fusão da albumina por rotulação de nutrientes de uma linhagem de células (ou cepa de levedura ou bacteriana) construídas.

Adicionalmente, proteínas de fusão da albumina da invenção cuja presença pode ser detectada, podem ser administradas. Por exemplo, proteínas de fusão da albumina da invenção marcadas com um radiopaco ou outro composto apropriado podem ser administradas e visualizadas in vivo, como discutido acima para anticorpos marcados. Além disso, tais polipeptídeos podem ser utilizados para procedimentos de diagnóstico in vitro.

Um anticorpo específico de polipeptídeo ou fragmento de anticorpo que foi marcado com uma fração de imageamento detectável apropriada, como um radioisótopo (por exemplo, 131I1 112In, 99mTc), uma substância radiopaca, ou um material detectável por ressonância nuclear magnética, é introduzido (por exemplo, por via parenteral, subcutânea ou intraperitoneal) no mamífero a ser examinado em relação a um transtorno. Será entendido na arte que o tamanho do sujeito e o sistema de imageamento utilizado determinarão a quantidade de fração de imageamento necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma fração de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada variará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. A proteína de fusão da albumina marcada acumulará então preferivelmente nos locais no corpo que contêm um polipeptídeo ou outra substância à qual se liga, é ligado por ou associa a uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. Imageamento de tumor in vivo é descrito em S.W. Burchíel e outros, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled antibodies and their fragments" (capítulo 13 em Tumor lmaging: The radiochemical detection of câncer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

Um dos modos nos quais uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode ser marcada de forma detectável é por ligar a mesma a uma enzima repórter e utilizar o produto ligado em um imunoensaio de enzima (EIA) (Voller, A., "The enzime Iinked immunosorbent assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates quarterly publication, Walkersville, MD); Voller e outros, J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler1 J.E. Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme lmmunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL.; Ishikawa1 E. e outros, (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tóquio). A enzima repórter que é ligada ao anticorpo reagirá com um substrato apropriado, preferivelmente um substrato cromogênico, de tal modo a produzir uma fração química que pode ser detectada, por exemplo, por meio espectrofotométrico, fluorimétrico ou por meio visual. Enzimas repórteres que podem ser utilizadas para marcar de forma detectável o anticorpo incluem, porém não são limitadas a, desidrogenase de malato, nuclease estafilococal, isomerase delta-5-esteróide, desidrogenase de álcool de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, isomerase de fosfato triose, peroxidase da raiz forte, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, desidrogenase glicose-6-fosfato, glucoamilase e acetilcolinesterase. Adicionalmente, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima repórter. A detecção também pode ser realizada por comparação visual da extensão de reação enzimática de um substrato em comparação com padrões similarmente preparados.

Proteínas de fusão da albumina também podem ser radiormarcadas e utilizadas em qualquer de uma variedade de outros imunoensaíos. Por exemplo, por marcar de forma radioativa as proteínas de fusão da albumina, é possível utilizar as proteínas de fusão da albumina em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay techniques, The Endocrine Society, março de 1986, que é incorporada aqui a título de referência). O isótopo radioativo pode ser detectado por meio incluindo, porém não limitado a, um contador gama, um contador de cintilação ou auto-radiografia.

Adicionalmente, moléculas de meio de quelação são conhecidas na arte e podem ser utilizadas para marcar as proteínas de fusão da albumina. Moléculas de meio de quelação podem ser fixadas em proteínas de fusão da albumina da invenção para facilitar rotulação da proteína com íons de metal incluindo radionuclídeos ou marcadores fluorescentes. Por exemplo, vide Subramanian, R. e Meares, C.F., "Bifunctional chelating agents for radiometal-labeled monoclonal antibodies," em Câncer imaging with radiolabeled antibodies (D.M. Goldenberg, Ed.) KIuwerAcademic Publications, Boston; Saji, H., "Targeted delivery of radiolabeled imaging and therapeutic agents: bifunctional radiopharmaceuticals." Crit. Rev. Ther. Drug Carrier syst. 16:209-244 (1999); Srivastava S.C. e Mease R.C., "Progress in research on Iigands1 nuclides and techniques for Iabeling monoclonal antibodies." Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 18:589-603 (1991); e Liu, S. e Edwards1 D.S., "Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals." Bioconjung. Chem. 12:7-34 (2001). Qualquer meio de quelação que pode ser covalentemente ligado às proteínas de fusão da albumína pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. O meio de quelação pode compreender ainda uma fração ligadora que conecta a fração de quelação com a proteína de fusão da albumina.

Em uma modalidade, a proteína de fusão da albumina da invenção é fixada em um meio de quelação acíclico como dietileno triamina-N,N,N',N",N"'-ácido pentaacético (DPTA)1 análogos de DPTA e derivados de DPTA. Como exemplos não limitadores, o meio de quelação pode ser 2-(p-isotiocianatobenzil)-6-ácido metil dietileno triamina pentaacético (1B4M-DPTA, também conhecido como MX-DTPA), 2-metil-6-(rho-nitrobenzil)-1,4,7-triazaeptano-N,N,N',N",N"'-ácido pentaacético (nitro-1 B4M-DTPA ou nitro-MX-DTPA); 2-(p-isotiocianatobenzil)-ácido ciclo hexil dietileno triaminopentaacético (CHX-DTPA), ou N-[2-amino-3-(rho-nitrofenil)propila]-trans-cicloexano-1,2-diamina-N,N',N"-ácido pentaacético (nitro-CHX-A-DTPA).

Em outra modalidade, a proteína de fusão da albumina da invenção é fixada em um meio de quelação de terpiridina acíclico como 6,6"-bis[[N,N,N",N"-tetra(carbóxi metil) amino] metila]-4'-(3-amino-4-metóxi fenila)-2,2':6',2"-terpiridina (TMT-amina).

Nas modalidades específicas, o meio de quelação macrocíclico que é fixado na proteína de fusão da albumina da invenção é 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-ácido tetraacético (DOTA). Em outras modalidades específicas, o DOTA é fixado na proteína de fusão da albumina da invenção via uma molécula ligadora. Exemplos de moléculas ligantes úteis para conjugar DOTA com um polipeptídeo são comumente conhecidos na arte - vide, por exemplo, DeNardo e outros, Clin. Câncer Res. 4(10):2483-90, 1998; Peterson e outros, Bioconjung. Chem. 10(4):553-7, 1999; e Zimmerman e outros, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, 1999 que são pela presente incorporados a título de referência na íntegra. Além disso, as patentes US 5.652.361 e 5.756.065, que revelam agentes de quelação que podem ser conjugados com anticorpos, e métodos para fazer e utilizar os mesmos, são pela presente incorporadas a título de referência na íntegra. Embora as Patentes US 5.652.361 e 5.756.065 focalizem em conjugar agentes de quelação com anticorpos, uma pessoa versada na arte poderia prontamente adaptar o método revelado nas mesmas para conjugar agentes de quelação com outros polipeptídeos. Meios de quelação bifuncionais baseados em Iigandos macrocíclicos nos quais a

conjugação é através de um braço ativado, ou grupo funcional, fixado a estrutura de carbono do ligando podem ser empregados como descrito por M.Moi e outros, J.Amer. Chem. Soe. 49:2639 (1989) (2-p-nitrobenzil-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-ácido tetraacético); S.V. Deshpande e outros, J. Nucl. Med. 31:473 (1990); G. Ruser e outros, Bioconj. Chem. 1:345 (1990); C.J. Broan e outros, J.C.S. Chem. Comm. 23:1739 (1990); e C.J. Anderson e outros, J. Nucl. Med. 36:850 (1995).

Em uma modalidade, um meio de quelação macrocíclico, como meios de quelação poliazamacrocíclicos, opcionalmente contendo um ou mais grupos de carbóxi, amino, hidroxamato, fosfonato ou fosfato, são fixados à proteína de fusão da albumina da invenção. Em outra modalidade, o meio de quelação é um meio de quelação selecionado a partir do grupo que consiste em DOTA, análogos de DOTA e derivados de DOTA.

Em uma modalidade, moléculas de meio de quelação apropriadas que podem ser fixadas na proteína de fusão da albumina da invenção incluem DOXA (1-oxa-4,7,10-ácido triazaciclododecanotriacético), NOTA (1,4,7-ácido triazacíclononanetriacético), TETA (1,4,8,11-ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético) e THT (4'-(3-amino-4-metóxi-fenila)-6,6"-bis(N',N'-dicarboximetil-N-metil hídra zino)-2,2':6',1"-terpiridina) e seus análogos e derivados. Vide, por exemplo, Ohmono e outros, J.Med. Chem. 35:157-162 (1992); Kung e outros, J. Nucl. Med. 25:326-332 (1984); Jurisson e outros, Chem. Rev. 93:1137-1156 (1993); e Patente US número 5.367.080. Outros meios de quelação apropriados incluem agentes de quelação revelados nas patentes US números 4.647.447; 4.687.659; 4.885.363; EP-A-71564; W089/00557 e EP-A-232751.

Em outra modalidade, meios de quelação de ácido carboxílico macrocíclico apropriados que podem ser utilizados na presente invenção incluem 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-ácidotetraacético (DOTA); 1,4,8,12- tetraazaciclopentadecano-N,N',N",N"'-ácido tetraacético (15N4); 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-ácido triacético (9N3); 1,5,9-triazaciclododecano-N,N',N"-ácido triacético (12N3); e 6-bromoacetamido-benzila-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",N"'-ácido tetraacético (ΒΑΤ).

Um meio de quelação preferido que pode ser fixado à proteína de fusão da albumina da invenção é a-(5-isotiocianato-2-metóxi fenila)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-ácido tetraacético, que também é conhecido como MeO-DOTA-NCS. Um sal ou éster de a-(5-isotiocianato-2-metóxi fenila)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-ácido tetraacético também pode ser utilizado.

Proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação, como aqueles descritos são covalentemente fixadas podem ser marcadas (via sítio de coordenação do meio de quelação) com radionuclídeos que são apropriados para finalidade terapêutica, diagnóstico ou tanto para finalidade terapêutica como para diagnóstico. Os exemplos de metais apropriados incluem Ag, At, Au, Bi, Cu, Ga, Ho, In, Lu, Pb, Pd, Pm, Pr, Rb, Re, Rh, Sc, Sr, Tc, Tl, Y e Yb. Os exemplos do radionuclídeo utilizado para fins de diagnóstico são Fe, Gd, 111In, 67Ga ou 68Ga. Em outra modalidade, o radionuclídeo utilizado para fins de diagnóstico é 111In ou 67Ga. Os exemplos do radionuclídeo utilizado para fins terapêuticos são 166Ho, 165Dy, 90Y, 115mIn, 52Fe ou 72Ga. Em uma modalidade, o radionuclídeo utilizado para fins de diagnóstico é 166Ho ou 90Y. Os exemplos dos radionuclídeos utilizados para fins tanto terapêutico como de diagnóstico incluem 153Sm, 177Lu, 159Gd, 175Yb ou 47Sc. Em uma modalidade, o radionuclídeo é 153Sm, 177Lu, 175Yb ou 159Gd.

Radionuclídeos de metal preferidos incluem 90Y1 99mTc1 111In, 47Sc1 67Ga1 51Crl 177mSnl 67Cu1 167Tml 97Ru1 188Rel 177Lul 199Aul 47Sc1 67Ga1 51Crl 177nSnl 67Cu1 167Tml 95Ru1 188Rel177Lul 199Aul203Pbe141Ce.

Em uma modalidade particular, proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação são covalentemente fixados podem ser marcadas com um íon de metal selecionado do grupo que consiste em 90Y, 111In, 177Lul 166Hol 215Bi e 225Ac.

Além disso, radionuclídeos de emissão de γ como 99mTc, 111In, 67Ga e 169Yb foram aprovados ou estão sob investigação para imageamento de diagnóstico, enquanto emissores-β, como 67Cu, 111Ag, 186Re e 90Y são úteis para as aplicações em terapia de tumor. Também outros radionuclídeos úteis incluem emissores-γ, como 99mTc, 111In, 67Ga e 169Yb, e emissores-β, como 67Cu, 111Ag, 186Re, 188Re e 90Y, bem como outros radionuclídeos de interesse como 211At, 212Bi, 177Lul 86Rb1 105Rhl 153Sml 198Pml 85Sr1 142Pr' 214Prl 109Pdl 166Hol 208TI1 e 44Sc. Proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação são covalentemente fixados podem ser marcados com os radionuclídeos descritos acima.

Em outra modalidade, proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação são covalentemente fixados podem ser marcadas com íons de metal paramagnético incluindo íons de transição e metal lantanídeo, tais como metais tendo números atômicos de 21-29, 42, 43, 44, ou 57-71, especificamente íons de Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb e Lu. Os metais paramagnéticos utilizados em composições para imageamento de ressonância magnética incluem os elementos tendo números atômicos de 22 a 29, 42, 44 e 58-70.

Em outra modalidade, proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação são covalentemente fixados podem ser marcadas com íons de metal fluorescente incluindo lantanídeos, especificamente La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu (por exemplo, 152Eu), Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb e Lu.

Em outra modalidade, proteínas de fusão da albumina da invenção às quais meios de quelação são covalentemente fixados podem ser marcadas com repórteres contendo metal pesado podem incluir átomos de Mo, Bi, Si e W.

Também é possível marcar as proteínas de fusão da albumina com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado de forma fluorescente é exposto à luz do comprimento de onda adequado, sua presença pode ser então detectada devido à fluorescência. Entre os compostos de rotulação fluorescente mais comumente utilizados estão isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, oftaldeído e fluorescamina.

A proteína de fusão da albumina também pode ser marcada de modo detectável utilizando metais de emissão de fluorescência como 152Eu, ou outros da série de lantanídeo. Esses metais podem ser fixados ao anticorpo utilizando tais grupos de quelação de metal como ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).

As proteínas de fusão da albumina também podem ser marcadas de forma detectável por acoplar as mesmas a um composto quimiluminescente. A presença de proteína de fusão da albumina marcada quimiluminescente é então determinada por detectar a presença de luminescência que se origina durante o curso de uma reação química. Os exemplos de compostos de rotulação quimiluminescente especificamente úteis são luminol, isoluminol, éster acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

De modo semelhante, um composto bioluminescente pode ser utilizado para marcar proteínas de fusão da albumina da presente invenção. Bioluminescência é um tipo de quimiluminescência encontrada em sistemas biológicos nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimiluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada por detectar a presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para fins de rotulação são luciferina, Iuciferase e equorina.

Organismos transgênicos

Organismos transgênicos que expressam as proteínas de fusão da albumina da invenção são também incluídos na invenção. Organismos transgênicos são organismos geneticamente modificados para dentro dos quais material genético recombinante, exógeno ou clonado foi transferido. Tal material genético é freqüentemente mencionado como transgene. A seqüência de ácidos nucléicos do transgene pode incluir uma ou mais seqüências reguladoras de transcrição e outras seqüências de ácidos nucléicos como íntrons, que podem ser necessárias para ótima expressão e secreção da proteína codificada. O transgene pode ser projetado para orientar a expressão da proteína codificada em um modo que facilita sua recuperação a partir do organismo ou a partir de um produto produzido pelo organismo, por exemplo, do leite, sangue, urina, ovos, cabelos ou sementes do organismo. O transgene pode consistir em seqüências de ácidos nucléicos derivadas do genoma da mesma espécie ou de uma espécie diferente da espécie do animal alvo. O transgene pode ser integrado em um local de um genoma onde aquela seqüência de ácidos nucléicos específica não é de outro modo normalmente encontrada ou no local normal para o transgene.

O termo "organismo transgênico de linhagem de célula germinativa" se refere a um organismo transgênico no qual a alteração genética ou informação genética foi introduzida em uma célula de linhagem germinativa, desse modo conferindo a capacidade do organismo transgênico de transferir as informações genéticas para a progênie. Se essa progênie possuir, na realidade, alguma ou toda aquela alteração ou informação genética, então eles também são organismos transgênicos. A alteração ou informação genética pode ser estranha à espécie de organismo ao qual o receptor pertence, estanha somente ao receptor individual específico, ou pode ser informação genética já possuída pelo receptor. No último caso, o gene introduzido ou alterado pode ser expresso de forma diferente do o gene nativo.

Um organismo transgênico pode ser um animal transgênico ou uma planta transgênica. Animais transgênicos podem ser produzidos por uma variedade de métodos diferentes incluindo transfecção, eletroporação, microinjeção, alvejamento de gene em células tronco embriônicas e infecção viral e retroviral recombinante (vide, por exemplo, a Patente US número 4.736.866; Patente US número 5.602.307; Mullins e outros (1993) Hypertension 22(4): 630-633; Brenin e outros (1997)Surg. Oncol. 6(2)99-110; Tuan (ed.), Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology no. 62, Humana Press (1997)). O método de introdução de fragmentos de ácido nucléico em células de mamíferos competentes de recombinação pode ser qualquer método que favoreça a co-transformação de múltiplas moléculas de ácido nucléico. Procedimentos detalhados para produzir animais transgênicos são prontamente disponíveis para uma pessoa versada na arte, incluindo as revelações na Patente US número 5.4589.743 e Patente US número 5.602.307.

Diversos camundongos recombinantes ou transgênicos foram produzidos, incluindo aqueles que expressam uma seqüência de oncogene ativada (Patente US número 4.736.866); expressam antígeno-T de símio SV50 (Patente US número 5.728.915); não tem a expressão de fator regulador de interferon 1 (IRF-1) (Patente US número 5.731.490); apresentam disfunção dopaminérgica (Patente US número 5.723.719); expressam pelo menos um gene humano que participa em controle de pressão de sangue (Patente US número 5.731.489); exibem maior similaridade às condições existentes em doença de Azlheimer de ocorrência natural (Patente US número 5.720.936); têm capacidade reduzida de mediar adesão celular (Patente US número 5.602.307); possuem um gene de hormônio de crescimento bovino (Clutter e outros (1996) Genetics 143(4): 1753-1760); ou são capazes de gerar uma resposta de anticorpo totalmente humana (McCarthy (1997) The Lancet 349(9049):405).

Embora camundongos e ratos permaneçam como os animais escolhidos para a maior parte das experimentações transgênicas, em algumas ocorrências é preferível ou mesmo necessário utilizar espécies alternativas de animais. Procedimentos transgênicos têm sido utilizados com sucesso em uma variedade de animais não murinos, incluindo ovelhas, cabras, porcos, cães, gatos, macacos, chimpanzés, hamsters, coelhos, vacas e porquinhos-da-índia (vide, por exemplo, Kim e outros (1997) Mol. Reprod. Dev. 46(4):515-526; Houdebine (1995) Reprod. Nutr. Dev. (6):609-617; Petters (1994) Reprod. Fértil. Dev. 6(5):643-645, Schníeke e outros (1997) Science 278(5346):2130-2133; e Amoah (1997) J. Animal Science 75(2):578-585).

Para orientar a secreção da proteína codificada por transgene da invenção para dentro do leite de mamíferos transgênicos, pode ser colocado sob o controle de um promotor que é preferivelmente ativado em células epiteliais mamárias. Promotores que controlam os genes codificando proteínas de leite são preferidos, por exemplo, o promotor para caseína, beta Iactoglobulina, proteína de ácido de soro de leite, ou Iactalbumina (vide, por exemplo, DiTuIIio (1992) BioTechnoIogy 10:74-77; Clark e outros (1989) BioTechnoIogy 7:487-492; Gorton e outros (1987) BioTechnoIogy 5:1183-1187; e Soulier e outros (1992) FEBS Letts 297:13). Os mamíferos transgênicos escolhidos produziriam grandes volumes de lente e teriam longos períodos de lactação, por exemplo, cabras, vacas, camelos ou ovelhas.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção também pode ser expressa em uma planta transgênica, por exemplo uma planta na qual o transgene de DNA é inserido no genoma nuclear ou plastídico. Procedimentos de transformação de planta utilizados para introduzir ácidos nucléicos estranhos em células de plantas ou protoplastos são conhecidos na arte. Vide, em geral, Methods in Enzymology vol. 153, ("Recombinant DNA Part D") 1987, Wu e Grossman Eds., Academic Press e pedido de patente européia EP 693554. Os métodos para geração de plantas geneticamente construídas são adicionalmente descritos na Patente US número 5.283.184, Patente US número 5.482.852 e pedido de patente 20 européia EP 693 554, todas as quais são pela presente incorporadas a título de referência.

Composições farmacêuticas ou terapêuticas

As proteínas de fusão da albumina da invenção ou suas formulações podem ser administradas por qualquer método convencional incluindo injeção parenteral (por exemplo, subcutânea ou intramuscular) ou infusão intravenosa. O tratamento pode consistir em uma única dose ou uma pluralidade de doses durante um período de tempo.

Embora seja possível para uma proteína de fusão da albumina da invenção ser administrada sozinha, é preferível apresentar a mesma como uma formulação farmacêutica, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis. 0(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitável(is)" no sentido de ser compatível com a proteína de fusão da albumina e não prejudicial aos seus receptores. Tipicamente, os veículos serão água ou solução salina que será estéril e isenta de pirogênio. Proteínas de fusão da albumina da invenção são especificamente bem adequadas para formulação em veículos aquosos como água isenta de pirogênio estéril, solução salina ou outras soluções isotônicas devido a sua vida útil prolongada em solução. Por exemplo, composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas bem antecipadamente em forma aquosa, por exemplo, semanas ou meses ou períodos de tempo mais longos antes de serem dispensadas.

Por exemplo, formulações contendo a proteína de fusão da albumina podem ser preparadas levando-se em consideração a vida útil prolongada da proteína de fusão da albumina em formulações aquosas. Como discutido acima, a vida útil de muitas dessas proteínas terapêuticas é acentuadamente aumentada ou prolongada após fusão com HA.

Em casos onde a administração em aerossol é apropriada, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser formuladas com aerossóis utilizando procedimentos padrão. O termo "aerossol" inclui qualquer fase suspensa carregada por gás de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção que é capaz de ser inalada nos bronquíolos ou passagens nasais. Especificamente, aerossol inclui uma suspensão carregada por gás de gotículas de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, como pode ser produzida em um nebulizador ou inalador de dose medida, ou em um pulverizador de névoa. O aerossol também inclui uma composição de pó seco de um composto da presente invenção suspenso em ar ou outro gás portador, que pode ser distribuída por insuflação a partir de um dispositivo inalador, por exemplo. Vide Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (19 87); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems 6:273-313; e Raeburn e outros (1992) Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159.

As formulações da invenção são também tipicamente não imunogênicas, em parte, devido ao uso dos componentes da proteína de fusão da albumina sendo derivados da espécie adequada. Por exemplo, para uso humano, tanto a proteína terapêutica como as porções de albumina da proteína de fusão da albumina será tipicamente humana. Em alguns casos, onde qualquer componente não é derivado de humano, aquele componente pode ser humanizado por substituição de aminoácidos chave de modo que epítopos específicos apareçam para o sistema imune humano como sendo de natureza humana em vez de estranha.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bem conhecidos na arte de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de colocar em associação a proteína de fusão da albumina com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas por colocar uniforme e intimamente em associação o ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e então, se necessário, moldar o produto.

Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéril aquosa e não aquosa que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação apropriada para o receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessar. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas vedadas, frascos ou seringas, e podem ser armazenadas em uma condição Iiofilizada que requer somente a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Suspensões e soluções de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis. Formulações de dosagem podem conter a porção de proteína terapêutica em uma concentração molar inferior ou dosagem inferior em comparação com a formulação padrão não fundida para a proteína terapêutica dada a meia-vida de soro prolongada exibida por muitas das proteínas de fusão da albumina da invenção.

Como exemplo, quando uma proteína de fusão da albumina da invenção compreende uma das proteínas listas na coluna "Proteína terapêutica X" da Tabela 1, como uma ou mais das regiões de proteína terapêutica, a forma de dosagem pode ser calculada com base na potência da proteína de fusão da albumina em relação à potência da proteína terapêutica sozinha, enquanto leva em consideração a meia-vida de soro prolongada e vida útil das proteínas de fusão da albumina em comparação com aquela da proteína terapêutica nativa. Por exemplo, se a proteína terapêutica for tipicamente administrada em 0,3 a 30,0 lU/kg/semana, ou 0,9 a 12,0 lU/kg/semana, dado em três ou sete doses divididas por um ano mais. Em uma proteína de fusão da albumina consistindo de HA de comprimento total fundido com uma proteína terapêutica, uma dose equivalente em termos de unidades representaria um peso maior de agente porém a freqüência de dosagem pode ser reduzida, por exemplo para duas vezes por semana, uma vez por semana ou menos.

Formulações ou composições da invenção podem ser acondicionadas em conjunto ou incluídas em um kit com, instruções ou uma inserção de acondicionamento referindo à vida útil prolongada do componente de proteína de fusão da albumina. Por exemplo, tais instruções ou inserções de acondicionamento podem tratar de condições recomendadas de armazenagem, como tempo, temperatura e luz, levando-se em consideração a meia-vida estendida ou prolongada das proteínas de fusão da albumina da invenção. Tais instruções ou inserções de acondicionamento podem tratar também das vantagens específicas das proteínas de fusão da albumina da invenção, como a facilidade de armazenagem para formulações que podem exigir uso no campo, fora de condições controladas em hospital, clínica ou consultório. Como descrito acima, formulações da invenção podem estar na forma aquosa e podem ser armazenadas sob circunstâncias inferiores às ideais sem perda significativa de atividade terapêutica.

As proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser incluídas em nutracêuticos. Por exemplo, certas proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser administradas em produtos naturais, incluindo leite ou produto de leite obtido a partir de um mamífero transgênico que expressa proteína de fusão da albumina. Tais composições também podem incluir planta ou produtos de planta obtidos a partir de uma planta transgênica que expressa a proteína de fusão da albumina. A proteína de fusão da albumina também pode ser fornecida em forma de pó ou comprimido, com ou sem outros aditivos conhecidos, veículos, cargas e diluentes. Nutracêuticos são descritos em Scott Hegenhart, Food Product Design, dezembro de 1993.

A invenção também provê métodos de tratamento e/ou prevenção de doenças ou transtornos (como, por exemplo, qualquer uma ou mais das doenças ou transtornos revelados na presente invenção) por administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção ("polinucleotídeo de fusão da albumina") em um veículo farmaceuticamente aceitável.

A proteína de fusão da albumina e/ou polinucleotídeo será formulado e dosado em um modo compatível com boa prática médica, levando-se em consideração a condição clínica do paciente individual (especialmente os efeitos colaterais de tratamento com a proteína de fusão da albumina e/ou polinucleotídeo sozinho), o local de distribuição, o método de administração, a programação de administração, e outros fatores conhecidos por médicos. A "quantidade eficaz" para fins da presente invenção é desse modo determinada por essas considerações.

Como proposição geral, a quantidade farmaceuticamente eficaz total da proteína de fusão da albumina administrada por via parenteral por dose estará na faixa de aproximadamente 1 ug/kg/dia a 10 mg/kg/dia de peso corpóreo do paciente, embora como mencionado acima, isso estará sujeito a critério terapêutico. Mais preferivelmente, essa dose é pelo menos 0,01 mg/kg/dia, e mais preferivelmente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 e 1 mg/kg/dia para o hormônio. Se dada continuamente, a proteína de fusão da albumina é tipicamente administrada em uma taxa de dose de aproximadamente 1 yg/kg/hora a aproximadamente 50 pg/kg/hora, por 1-4 injeções por dia ou por infusões subcutâneas contínuas, por exemplo, utilizando uma mini-bomba. Uma solução de bolsa intravenosa pode ser também empregada. A extensão de tratamento necessária para observar alterações e o intervalo após tratamento para ocorrência de respostas parecem variar dependendo do efeito desejado.

Conforme observado acima, a proteína de fusão da albumina da invenção tem uma estabilidade de plasma mais elevada em comparação com a porção de proteína terapêutica (ou seu fragmento ou variante) sozinha. Esse aumento em estabilidade de plasma deve ser levado em consideração ao determinar a quantidade eficaz da proteína de fusão da albumina a ser administrada por dose e a programação de administração de dosagem. Especificamente, estabilidade mais elevada de plasma pode permitir que a proteína de fusão da albumina seja administrada em uma dose inferior na mesma freqüência de administrações, ou alternativamente, pode permitir que a proteína de fusão da albumina seja administrada em menos dosagens. Preferivelmente, a estabilidade mais elevada permite que a proteína de fusão da albumina da invenção seja administrada menos freqüentemente em menos dosagens. Mais preferivelmente, a proteína de fusão da albumina pode ser administrada uma vez a cada duas semanas. Ainda mais preferivelmente, a proteína de fusão da albumina pode ser administrada uma vez a cada três, quatro, cinco ou mais semanas dependendo da farmacocinética da proteína de fusão da albumina.

A quantidade eficaz da proteína de fusão da albumina a ser administrada por dose pode ser também indicada como a concentração total formulada de proteína de fusão da albumina dada por dose. Em uma modalidade, a concentração total formulada de proteína de fusão da albumina administrada a um paciente por dose está na faixa de aproximadamente 10 ug/dose a aproximadamente 2000 ug/dose. Mais preferivelmente, a concentração total está na faixa de aproximadamente 100 ug/dose a aproximadamente 1000 ug/dose, ou alternativamente, aproximadamente 1000 ug/dose a aproximadamente 1200 ug/dose ou aproximadamente 900 ug/dose a aproximadamente 1800 ug/dose.

A concentração total formulada da proteína de fusão da albumina e o intervalo de dosagem em que o intervalo de dosagem no qual a proteína de fusão da albumina será administrada variarão dependendo do efeito desejado e da proteína terapêutica específica administrada. Em uma modalidade, a concentração total formulada da proteína de fusão da albumina administrada a um paciente por dose está na faixa de aproximadamente 10 ug/dose a aproximadamente 2000 ug/dose uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas ou mais. Mais preferivelmente, a concentração total está na faixa de aproximadamente 100 ug/dose a aproximadamente 1000 ug/dose uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas ou mais, ou alternativamente aproximadamente 1000 ug/dose a aproximadamente 1200 ug/dose ou aproximadamente 900 ug/dose a aproximadamente 1800 ug/dose uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas ou mais.

Proteínas de fusão da albumina e/ou polínucleotídeos podem ser administrados por via oral, retal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como por pós, unguentos, géis, gotas ou adesivo transdérmico), bucal ou como uma pulverização oral ou nasal. "Veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um sólido, semi-sólido ou carga líquida, diluente, material de encapsular ou auxiliar de formulação de qualquer um, não tóxico. O termo "parenteral" como utilizado aqui, se refere a modos de administração que incluem injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraestemal, subcutânea e intraarticular.

Proteínas de fusão da albumina e/ou polínucleotídeos da invenção são também adequadamente administrados por sistemas de liberação controlada. Os exemplos de proteínas de fusão da albumina e/ou polínucleotídeos de liberação controlada são administrados por via oral, retal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como por pós, unguentos, géis, gotas ou adesivo transdérmico), bucal, ou como uma pulverização oral ou nasal. "Veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um sólido, semi-sólido ou carga líquida, diluente, material de encapsular ou auxiliar de formulação de qualquer um, não tóxico. O termo "parenteral" como utilizado aqui, se refere a modos de administração que incluem injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutânea e intraarticular. Exemplos adicionais de proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos, de liberação controlada, incluem materiais poliméricos apropriados (como, por exemplo, matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas), materiais hidrofóbicos apropriados (por exemplo como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de íon, e derivados pouco solúveis (como, por exemplo, um sal pouco solúvel).

Matrizes de liberação controlada incluem polilactídeos (Patente US número 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman e outros, Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(2-hidróxi etil metacrilato) (Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), e Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de vinil etileno (Langer e outros, Id.) ou poli-D-(-)-3-ácido hidróxi butírico (EP 133.988).

Proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos, de liberação controlada, também incluem proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos, da invenção, retidos de forma lipossômica (vide genericamente Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat e outros, em Liposomes ín the Therapy of Infectious disease and câncer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova York, pág. 317-327 e 353-363 (1989)). Lipossomas contendo a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleotídeo são preparados por métodos conhecidos por si: DE 3.218.121; Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 82:3688-3692 ( 1985); Hwang e outros, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; pedido de patente japonesa 83-118008; pat. US números 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. Comumente, as lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (aproximadamente 200-800 Angstroms) no qual o teor de lipídeo é maior do que aproximadamente mol por cento de colesterol, a proporção selecionada 30 sendo ajustada para a terapêutica ótima.

Ainda em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são distribuídos por meio de uma bomba (vide Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 145:201 (1987); Buchwald e outros, Surgery88:507 (1980); Saudek e outros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)).

Outros sistemas de liberação controlada são discutidos no exame por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Para administração parenteral, em uma modalidade, a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleotídeo é formulado genericamente por mistura do mesmo no grau desejado de pureza, em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável, isto é, um que seja não tóxico a receptores nas dosagens e concentrações empregadas e seja compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação não inclui preferivelmente agentes de oxidação e outros compostos que são conhecidos como sendo prejudiciais à Terapêutica.

De modo geral, as formulações são preparadas pelo contato da proteína de fusão de albumina e/ou polinucleotídeo uniforme e intimamente com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos. Então, se necessário, o produto é moldado na formulação desejada. Preferivelmente o veículo é um veículo parenteral, mais preferivelmente uma solução que é isotônica com o sangue do receptor. Os exemplos de tais veículos incluem água, solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. Veículos não aquosos como óleos fixos e oleato de etila são também úteis aqui, bem como lipossomas.

O veículo contém adequadamente quantidades menores de aditivos como substâncias que aumentam a capacidade isotônica e estabilidade química. Tais materiais são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, e outros ácidos orgânicos ou seus sais; antioxidantes como ácido ascórbico; polipetídeos com baixo peso molecular (menor do que aproximadamente dez resíduos), por exemplo, poliarginina ou tripeptídeos; proteínas como soro, albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivínil pirrolidona; aminoácidos, como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação como EDTA; álcoois de açúcar como manitol ou sorbitol; contraíons como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como polisorbatos (incluindo, por exemplo, Tween-20), poloxâmeros, ou PEG.

A proteína de fusão da albumina é formulada, tipicamente, em tais veículos em uma concentração de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferivelmente 1-10 mg/ml, em um pH de aproximadamente 3 a 8. Será entendido que o uso de certos dos excipientes, veículos ou estabilizadores acima resultará na formação de sais de polipeptídeo.

Qualquer produto farmacêutico utilizado para administração terapêutico pode ser estéril. A esterilidade é facilmente realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis (por exemplo, membranas de 0,2 mícron). Proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos são genericamente colocados em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. Proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos serão normalmente armazenados em recipientes de dose unitária ou múltipla, por exemplo, ampolas ou frascos vedados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 ml são cheios de 5 ml de solução de proteína de fusão da albumina aquosa e/ou polinucleotídeo, a 1% (peso/v) filtrada estéril, e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão é preparada reconstituindo a proteína de fusão de albumina e/ou polinucleotídeo liofilizada utilizando Água para injeção bacteriostática.

Em uma modalidade específica e preferida, as formulações de proteína de fusão da albumina compreendem 0.01 M de fosfato de sódio, 0.15 mM de cloreto de sódio, 0.16 micromol de octanoato de sódio/miligrama de proteína de fusão, 15 microgramas/mililitro de polisorbato 80, pH 7,2. Em outra modalidade específica e preferida, as formulações de proteína de fusão da albumina consistem em 0.01 M de fosfato de sódio, 0.15 mM de cloreto de sódio, 0.16 micromol de octanoato de sódio/miligrama de proteína de fusão, 15 microgramas/mililitro de polisorbato 80, pH 7,2. O pH e tampão são escolhidos para casarem com condições fisiológicas e o sal é adicionado como um meio de tonicidade. Octanoato de sódio foi escolhido devido a sua capacidade reportada de aumentar a estabilidade térmica da proteína em solução. Finalmente, polisorbato foi adicionado como um tensoativo genérico, que diminui a tensão superficial da solução e reduz a adsorção não específica da proteína de fusão da albumina ao sistema de fechamento de recipiente.

A invenção também provê um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios de um ou mais dos ingredientes das proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção. Associado a tal(tais) recipiente(s) pode haver um aviso na forma prescrita por um órgão governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou produtos biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pelo órgão de fabricação, uso ou venda para administração humana. Além disso, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos podem ser empregados em combinação com outros compostos terapêuticos.

As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com adjuvantes. Adjuvantes que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, alume, alume mais desoxicolato (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG (por exemplo, THERACYS®), MPL e preparados não viáveis de Corynebacterium parvum. Em uma modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com alume. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com QS-21. Adjuvantes adicionais que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, imunomodulador de lipídeo monofosforila, AdjuVax 100a, QS-21, QS18, CRL1005, sais de alumínio, MF-59, e tecnologia adjuvante Virosomal. Vacinas que podem ser administradas com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a vacinas dirigidas à proteção contra MMR (sarampo, caxumba, rubéola), pólio, varicela, tétano/difteria, hepatite A, hepatite B, Haemophilus influenzae B1 coqueluche, pneumonia, gripe, doença de Lyme, rotavírus, cólera, febre amarela, encefalite japonesa, poliomielite, raiva, febre tifóide, e coqueluche. Combinações podem ser administradas concomitantemente, por exemplo, como uma mistura, separadamente porém simultaneamente; ou seqüencialmente. Isso inclui apresentações nas quais os agentes combinados são administrados juntos como uma mistura terapêutica, e também procedimentos nos quais os agentes combinados são administrados separadamente porém simultaneamente, por exemplo, através de linhas intravenosas separadas para o mesmo indivíduo. A administração "em combinação" inclui ainda a administração separada de um dos compostos ou agentes dado primeiramente, seguido pelo segundo.

As proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Agentes de proteína de fusão de albumina e/ou polinucleotídeo que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem porém não são limitados a, agentes quimioterapêuticos, antibióticos, antiinflamatórios esteroidais e não esteroidais, agentes imunoterapêuticos convencionais, e/ou tratamentos terapêuticos descritos abaixo. Combinações podem ser administradas concomitantemente, por exemplo, como uma mistura, separadamente porém simultaneamente; ou seqüencialmente. Isso inclui apresentações nas quais os agentes combinados são administrados juntos como uma mistura terapêutica, e também procedimentos nos quais os agentes combinados são administrados separadamente porém simultaneamente, por exemplo, através de linhas intravenosas separadas para o mesmo indivíduo. A administração "em combinação" inclui ainda a administração separada de um dos compostos ou agentes dado primeiramente, seguido pelo segundo.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com um anticoagulante. Anticoagulantes que podem se administrados com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, heparina, heparina com baixo peso molecular, warfarin sódio (por exemplo, COUMADIN®), dicumarol, 4-hidroxicoumarin, anisindiona (por exemplo, MIRADOR™), acenocoumarol (por exemplo, nicoumalona, SINTHROME™),indan-1,3-diona, fenprocoumon (por exemplo, MARCUMAR™), biscoumaetato de etila (por exemplo, TROMEXAN™) e aspirina. Em uma modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com heparina e/ou warfarin. Em outra modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com warfarin. Em outra modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com warfarin e aspirina. Em outra modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com heparina. Em outra modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com heparina e aspirina.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com medicamentos trombolíticos. Medicamentos trombolíticos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, plasminogênio, lis-plasminogênio, alfa2-antiplasmina, estreptocinae (por exemplo, KABIKINASE™), antiresplace (por exemplo, EMINASE™), ativador de plasminogênio de tecido (t-PA, altevase, ACTIVASE™), urocinase (por exemplo, ABBOKINASE™),sauruplase, (Prourokinase, urocinase de cadeia única), e ácido aminocapróico (por exemplo, AMICAR™). Em uma modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com ativador de plasminogênio de tecido e aspirina.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com drogas antiplaqueta. Drogas antiplaqueta que podem ser administradas com as composições da invenção incluem, porém não são limitadas a, aspirina, dipiridamol (por exemplo, PERSANTINE™), e ticlopidina (por exemplo, TICLID™).

Nas modalidades específicas, o uso de anticoagulantes, drogas trombolíticas e/ou antiplaqueta em combinação com proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção é considerado para a prevenção, diagnóstico e/ou tratamento de trombose, trombose arterial, trombose venosa, tromboembolia, embolia pulmonar, aterosclerose, infarto do miocárdio, ataque isquêmico transiente, angina instável. Nas modalidades específicas, o uso de anticoagulantes, drogas trombolíticas e/ou drogas antiplaqueta em combinação com proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção é considerado para a prevenção ou oclusão de enxertos safenosos, para reduzir o risco de trombose periprocedimento como poderia acompanhar procedimentos de angioplastia, para reduzir o risco de derrame em pacientes com fibrilação atrial incluindo fibrilação atrial não reumática, para reduzir o risco de embolia associada a válvulas cardíacas mecânicas e ou doença de válvulas mitrais. Outros usos para a terapêutica da invenção, sozinha ou em combinação com drogas antiplaqueta, anticoagulante e/ou trombolítica, incluem porém não são limitados a, prevenção de oclusões em dispositivos extracorpóreos (por exemplo, cânulas intravasculares, shunts de acesso vascular em pacientes em hemodiálise, máquinas de hemodiálise e máquinas de bypass cardiopulmonar).

Em certas modalidades, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administradas em combinação com agentes anti-retrovirais, inibidores de transcriptase inversa de nucleoside/nucleotídeo (NRTIs), inibidores de transcriptase inversa não nucleoside (NNRTIs), e/ou inibidores de protease (Pis). NRTIs que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddi), HIVID™ (zalcitabina/ddC), ZERIT™ (estavudina/d4T), EPIVIR™ (lamivudina/3TC), e COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina). NNRTIs que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, VIRAMUNE™ (nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina), e SUSTIVA™ (efavirenz). Inibidores de protease que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir), e VIRACEPT™ (nelfinavir). Em uma modalidade específica, agentes anti-retrovirais, inibidores de transcriptase inversa de nucleoside, inibidores de transcriptase inversa não nucleoside, e/ou inibidores de protease podem ser utilizados em qualquer combinação com proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção para tratar AIDS e/ou evitar ou tratar infecção por HIV.

NRTIs adicionais incluem LODENOSINE™ (F-ddA; um NRTI de adenosina estável em ácido; Triangle/Abbott; COVIRACIL™ (emtricitabina/FTC; estruturalmente relacionado a lamivudina (3TC) porém com atividade 3 a 10 vezes maior in vitro; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, também estruturalmente relacionado a Iamivudina porém retém atividade contra uma proporção substancial de isolados resistentes a lamivudina; Biochem Pharma); Adefovir (aprovação recusada para terapia anti-HIV por FDA; Gilead Sciences); PREVEON® (Adefovir Dipivoxil, o pró-medicamento ativo de adefovir; sua forma ativa é PMEA-pp); TENOFOVIR™ (bis-POC PMPA, um pró-medicamento de PMPA; Gilead); DAPD/DXG (metabólito ativo de DAPD; Triangle/Abbott); D-D4FC (relacionado a 3TC, com atividade contra vírus resistente a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGEN™ (abacavir/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'azido-2',3'-dideóxiuridina; WO 99/66936); e formas de pró-medicamento contendo S-acil-2-tioetila (SATE) de P-L-FD4C e β-L-FddC (WO 98/17281).

NNRTIs adicionais incluem COACTINON™ (Emivirina/MKC-442, NNRTI potente da classe HEPT; Triangle/Abbott); CAPRAVIRINE™ (AG-1549/S-1153. um NNRTI da próxima geração com atividade contra vírus contendo a mutação K103N; Agouron); PNU-142721 (tem atividade 20 a 50 vezes maior do que seu predecessor delavirdina e é ativo contra mutantes K103N; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 e DPC-963 (derivados de segunda geração de efavirenz, elaborados para serem ativos contra vírus com a mutação K103N; DuPont); GW-420867X (tem atividade 25 vezes maior do que HBY097 e é ativo contra mutantes K103N; Glaxo Wellcome); CALANOLIDE A (agente de ocorrência natural da árvore de látex; ativo contra vírus contendo qualquer um ou ambas as mutações Y181C e K103N); e Propolis (WO 99/49830).

Inibidores de protease adicionais incluem LOPINAVIR™ (ABT378/r; Abbot Laboratories); BMS-232632 (um azapeptide; Bristol-Myres Squibb); TlPRANAVIR™ (PNU-140690, um diidropirona não péptico; Pharmacia & Upjohn); PD-178390 (um diidropirona não peptídico; Parke-Davis); BMS 232632 (um azapeptide; Bristol-Myers Squibb); L-756.423 (um análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (um composto de uréia cíclica; Avid & DuPont); AG-1776 (um peptidomimético com atividade in vitro contra vírus resistentes a inibidor de protease; Agouron); VX-175/GW-433908 (pró-medicamento de fosfato de amprenavir; Vertex & Glaxo Wellcome); CGP61755 (Ciba); e AGENERASE™ (amprenavir; Glaxo Wellcome Inc.).

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de fusão/aglutinantes gp41.

Inibidores de fusão/aglutinantes gp41 incluem T-20 (um peptídeo a partir de resíduos 643-678 do ectodomínio de proteína de transmembrana gp41 HIV que se liga a gp41 em seu estado de repouso e evita transformação no estado fusogênico; Trimeris) e T-1249 (um inibidor de fusão de segunda geração, Trimeris).

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de fusão/antagonistas de receptor de quimiocine. Inibidores de fusão/antagonistas de receptor de quimiocine incluem antagonistas CXCR4 como AMD 3100 (um biciclam), SDF-1 e seus análogos e ALX40-4C (um peptídeo catiônico), T22 (um peptídeo de 18 aminoácidos; Trimeris) e os análogos T22 T134 e T140; antagonistas CCR5 como RANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES, e TAK-779; e antagonistas CCR5/CXCR4 como NSC 651016 (um análogo de distamicina). São também incluídos antagonistas CCR2B, CCR3, e CCR6. Agonistas receptores de quimiocine como RANTES, SDF-1, ΜΙΡ-1α, MIP-1 β, etc., também podem inibir a fusão.

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de integrase. Inibidores de integrase incluem ácidos dicafeoilquinic (DFQA); ácido L-chicorico (um ácido dicafeoiltartárico (DCTA)); quinalizarin (QLC) e antraquinonas relacionadas; ZINTEVIR™ (AR 177, um oligonucleotídeo que provavelmente atua em superfície de célula em vez de ser um inibidor de integrase verdadeiro; Arondex); e naftóis como aqueles revelados em WO 98/50347.

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem compostos semelhantes a hidróxi uréia como BCX-34 (um inibidor de fosforilase de nucleoside de purina; Biocryst); inibidores de reductase de ribonucleotídeo como DIDOX™ (Molecules for Health); inibidores de desidrogenase de monofosfato de inosina (IMPDH) como VX-497 (Vertex); e ácidos micofólicos como CeIICept (micofenolato mofetil; Roche).

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibidores de integrase viral, inibidores de translocação nuclear de genoma viral como compostos de arileno bis(metilcetona); inibidores de entrada de HIV como AOP-RANTES, NNY-RANTES, RANTES-proteína de fusão IgG, complexos solúveis de RANTES e glicosaminoglicanos (GAG), e AMD-3100; inibidores de dedo de zinco nucleocápside como compostos de ditiane; alvos de HIV Tat e Rev; e farmacointensificadores como ABT-378.

Outras terapias anti-retrovirais e terapias auxiliares incluem citocinas e Iinfocinas como ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, SDF-Ia1 IL-2, PROLEUKIN™ (aldesleucina/L2-7001; Chiron); IL-4, IL-10, IL-12 e IL-13; interferons como IFN-alfa2a, IFN-alfa2b, ou IFN-beta; antagonistas de TNFs1 NFkB1 GM-CSF1 M-CSF1 e IL-10; agentes que modulam ativação imune como ciclosporina e prednisona; vacinas como Remune™ (HIV lmmunogen), APL 400-003 (ApoIIon)1 gp120 recombinante e fragmentos, glicoproteína de envoltório recombinante bivalente (B/E), rgp120CM235, MN rgp120, SF-2 rgp120, complexo de gp120/CD4 solúvel, proteína Delta JR-FL, peptídeo sintético ramificado derivado de domínio de C3/C4 gp120 descontínuo, imunógenos competentes de fusão e vacinas de Gag, Pol, Nef, e Tat; terapias baseadas em gene como elementos supressores genéticos (GSEs; WO 98/54366), e intracines (quimiocines CC geneticamente modificadas alvejadas no ER para bloquear expressão de superfície de CCR5 recentemente sintetizado (Yang e outros, PNAS 94: 11567-72 (1997); Chen e outros, Nat. Med. 3:1110-16 (1997)); anticorpos como o anticorpo anti-CXCR4 12G5, os anticorpos anti-CCR5 Q4120 e RPA0T4, o anticorpo anti-CCR3 7B11, os anticorpos anti-gp120 17b, 48d, 447-42D, 257-D, 268-D e 50.1, anticorpos anti-Tat, anticorpos anti-TNF-α, e anticorpo monoclonal 33A; agonistas e antagonistas receptores de hidrocarboneto de arila (AH) como TCDD, 3,3',4,4',5-pentaclorobifenila, 3,3',4,4'- tetraclorobifenila, e α-naftoflavona (WO 98/30213); e antioxidantes como γ-L-glutamil-L-éster de etila cisteína (γ-GCE; WO 99/56764).

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com um ou mais agente antiviral. Agentes antivirais que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, aciclovir, ribavirina, análogo de ribavirina, amantadina, remantidina, maxamina ou timalfasin. Em uma modalidade preferida, uma proteína de fusão da albumina da invenção é administrada em combinação com ribavirina ou um análogo de ribavirina. Em uma modalidade mais preferida, a ribavirina ou análogos de ribavirina que podem ser administrados em combinação com uma proteína de fusão da albumina incluem porém não são limitados a COPEGUS® (Hoffman-La Roche, Nutley, N.J.), REBETOL® (Schering Corp., Kenilworth, N.J.), VIRAZOLE® (Valeant, Costa Mesa, CA), RlBAVIN™ (Lupin1 Baltimore, MD), RlBAZID™ (Epla, Kirachi1 Paquistão), tribavirina, VIRAMIDINE™ (Valeant, Costa Mesa, CA) e RIBASPHERE™ (Three Rivers Pharmaceuticals, Cranberry Township, PA).

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes antivirais para o tratamento de infecção viral. Agentes antivirais que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, inibidores de molécula pequena de enzimas virais, inibidores de molécula pequena de polimerase RNA, agentes antivirais baseados em ácido nucléico, inibidores de oligonucleotídeo anti-sentido, tiazolides, agentes imunomoduladores novos, e intensificadores de interferon. Inibidores de enzima antivirais que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a VX-950 (inibidores de protease, Vertex, Cambridge, MA), VX-497 (merimepodib, inibidor IMPDH oral, Vertex, Cambridge, MA), BILB 1941 (inibidores de protease, Boehringer Ingelheim, Alemanha), SCH7 (inibidor de protease, Schering Corp., Kenilworth, N.J.), MX-3253 (inibidor de glucosidase, Migenix, Vancouver, BC), IDN-6556 (inibidor de caspase, Pfizer, Nova, York, NY), UT231B (inibidor de glucosidase; United Therapeutics, Silver Spring1 MD). Inibidores de polimerase antivirais que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser análogos de nucleoside ou inibidores não nucleoside (NNIs). Em uma modalidade preferida, os inibidores de polimerase antivirais inibem polimerase RNA HCV. Em uma modalidade, os inibidores de polimerase antivirais podem ser análogos de nucleotídeo incluindo, porém não limitados a, NM283 (pró-medicamento oral de 23'-C-metil-citidina, Idenix, Cambridge, MA), e nucleosides 2'-C-metila. Em outra modalidade, os inibidores de polimerase antivirais podem ser inibidores não nucleoside, incluindo, porém não limitado a, JTK-103, JTK-003 e JTK-109 (Japan Tabacco, Tóquio, Japão), R803 (Rigel, South San Francisco, CA), e HCV-371, HCV-086, e HCV-796 (ViroPharm, Exton, PA/Wyeth, Madison, NJ). Agentes baseados em ácido nucléico antivirais que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, oligonucleotídeos antisentido, ribozimas e siRNAs ou RNAs de hairpin curto (shRNA). Agentes inibidores de oligonucleotídeo anti-sentido antivirais que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, NEUGENE® AVI-4065 (AVI Biopharma, Portland, OR). Em outra modalidade uma tiazolida pode ser administrada em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção. Em uma modalidade preferida, tiazolidas que podem se administradas em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a ALINIA® (nitazoxanida, Romark Laboratories, L.C., Tampa, FL). Agentes imunomoduladores antivirais que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a ZADXIN® (timosin alfa 1, timalfasin, SciCIone Pharmaceuticals lnt'l, Hong Kong), e agonistas receptores como toll (TLR), incluindo porém não limitados a ANA245 (agonista TLR-7, Anadys Pharmaceuticals, San Diego, CA), ANA975 (pró-medicamento oral de ANA245, Anadys Pharmaceuticals, San Diego, CA), e CPF-10101 (ACTILON™, agonista TLR-9, Coley Pharmaceutical group, Wellesley, MA). Intensificadores de interferon que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a EMZ702 (Transition Therapeutics, Toronto, Ontário).

Em outras modalidades, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser administradas em combinação com agentes de infecção anti-oportunistas. Agentes anti-oportunistas que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE ™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF), e LEUKlNE™ (sargramostim/GM-CSF). Em uma modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ e/ou ATOVAQUONE™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção oportunista de pneumonia Pneumocystis carinii. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizadas em qualquer combinação com ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ e/ou ETHAMBUTOL™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção oportunista de complexo Mycobacterium avium. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™ e/ou AZITHROMYCIN™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção oportunista de Mycobacterium tuberculosis. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, e/ou CIFOVIR™ para tratar profilaticamente ou prevenir 35 uma infecção oportunista de citomegalovírus. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™ e/ou KETOCONAZOLE™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção fúngica oportunista. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com ACICLOVIR™ e/ou FAMCICOLVIR™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção oportunista de vírus de herpes simples tipo I e/ou tipo II. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com PYRIMETHAMINE™ e/ou LEUCOVORIN™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção oportunista por Toxoplasma gondii. Em outra modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são utilizados em qualquer combinação com LEUCOVORIN™ e/ou NEUPOGEN™ para tratar profilaticamente ou prevenir uma infecção bacteriana oportunista.

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com um agente antibiótico. Agentes antibióticos que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, amoxicilina, beta-lactamases, aminoglicosides, beta-lactam (glicopeptídeo), beta-lactamases, Clindamicina, cloramfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacin, eritormicina, fluoroquinolonas, macrolides, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rapamicina, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol e vancomicina.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com imunoestimulantes. Imunoestimulantes que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, Ievamisol (por exemplo, ERGAMISOL™), isoprinosina (por exemplo, INOSIPLEX™), interferons (por exemplo,interferon alfa) e interleucinas (por exemplo, II-2).

Em outras modalidades, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com agentes imunossupressores. Agentes imunossupressores que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, esteróides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida metil prednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15-desoxispergualina, e outros agentes imunossupressores que atuam por suprimir a função de responder a células T. Outros agentes imunossupressores que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, prednisolona, metotrexato, talidomida, metoxsalen, rapamicina, leflunomida, mizoribina (BREDININ™), brequinar, desoxispergualin e azaspirano (SKF 105685), ORTHOCLONE OKT® 3 (muromonab-CD3), SANDIMMUNE™, NEORAL™, SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF® (FK506, tacrolimus), CELLCEPT® (micofenolato motefil, do qual o metabólito ativo é ácido micofenólico), IMURAN™ (azatioprina), glicocorticosteróides, esteróides adrenocorticais como DELTASONE™ (prednisona) e HYDELTRASOL™ (prednisolona), FOLEX™ e MEXATE™ (metotrexato), OXSORALEN-ULTRA™ (metoxsalen) e RAPAMUNE™ (sirolimus). Em uma modalidade específica, imunossupressores podem ser utilizados para evitar rejeição de transplante de órgão ou medula óssea.

Em uma modalidade adicional, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados individualmente ou em combinação com um ou mais preparados de globulina imune intravenosa. Preparados de globulina imune intravenosa que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™, ATGAM™ (globulina antitimocite) e GAMIMUNE™. Em uma modalidade específica, proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com preparados de globulina imune intravenosa em terapia de transplante (por exemplo, transplante de medula óssea).

Em outra modalidade, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administradas individualmente ou como parte de uma terapia de combinação, quer in vivo a pacientes ou in vitro em células, para o tratamento de câncer. Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina, especificamente fusões de albumina-IL-2 são administradas repetidamente durante imunoterapia passiva para câncer, como terapia de transferência de células adotivas para melanoma metastático como descrito em Dudley e outros (Science Express, 19 de setembro de 2002, em www, scienceexpress. org., incorporado aqui na integral a título de referência).

Em certas modalidades, as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administradas individualmente ou em combinação com um agente antiinflamatório. Agentes antiinflamatórios que podem ser administrados com as proteínas de fusão de albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, corticosteróides (por exemplo, betametasona, budesonide, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metil prednisolona, prednisolona, prednisona, e triamcinolona), drogas antiinflamatórias não esteroidais (por exemplo, diclofenaco, diflunisal, etodolac, fenoprofen, floctafenina, flurbiprofen, ibuprofen, indometacina, cetoprofen, meclofenamato, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenil butazona, piroxicam, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofênico e tolmetin), bem como anti-hístaminas, derivados de ácido amino aril carboxílico, derivados de ácido aril acético, derivados de ácido arilbutírico, ácidos aril carboxílicos, derivados de ácido aril propiônico, pirazóis, pirazolonas, derivados de ácido salicílico, tiazinacarboxamidas, ácido e-acetamidocapróico, S-adenosil metionina, 3-amino-4-ácido hidróxi butírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteína, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, proquazona, proxazol e tenidap.

Em uma modalidade adicional, as composições da invenção são administradas individualmente ou em combinação com um agente antiangiogênico. Agentes antiangiogênicos que podem ser administrados com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a Angiostatina (Etrenmed, Rockville, MD), troponin-1 (Boston Life Sciences, Boston, MA), fator anti-invasivo, ácido retinóico e seus derivados, paclitaxel (Taxol), Suramin, Inibidor de tecido de Metaloproteinase-1, inibidor de tecido de metaloproteinase-2, VEGI, Inibidor de ativador de plasminogênio-1, inibidor de ativador de plasminogênio 2 e várias formas dos metais de transição de "grupo d" mais leves.

Metais de transição de "grupo d" mais leves incluem, por exemplo, espécies de vanádio, molibdênio, tungstênio, titânio, nióbio, e tântalo. Tais espécies de metal de transição podem formar complexos de metal de transição. Complexos apropriados das espécies de metal de transição acima mencionadas incluem complexos de metal de transição oxo.

Exemplos representativos de complexos de vanádio incluem complexos de vanádio oxo como complexos de vanadato e vanadil. Complexos de vanadato apropriados incluem complexos de metavanadato e ortovanadato como, por exemplo, metavanadato de amônio, metavanadato de sódio e ortovanadato de sódio. Complexos de vanadil apropriados incluem, por exemplo, acetil acetonato de vanadil e sulfato de vanadil incluindo hidratos de sulfato de vanadil como mono- e triidratos de sulfato de vanadil.

Os exemplos representativos de complexos de tungstênio e molibdênio também incluem complexos oxo. Complexos de tungstênio oxo apropriados incluem complexos de óxido de tungstênio e tungstato. Complexos de tungstato apropriados incluem tungstato de amônio, tungstato de cálcio, diidrato de tungstato de sódio e ácido tungstico. Óxidos de tungstênio apropriados incluem óxido de tungstênio (IV) e óxido de tungstênio (VI). Complexos de molibdênio oxo apropriados incluem complexos de molibdato, óxido de molibdênio e mobidenila. Complexos de molibdato apropriados incluem molibdato de amônio e seus hidratos, molibdato de sódio e seus hidratos e molibdato de potássio e seus hidratos. Óxidos de molibdênio apropriados incluem óxido de molibdênio (VI), óxido de molibdênio (VI) e ácido molibdico. Complexos de molibdenil apropriados incluem, por exemplo, acetil acetonato de molibdenil. Outros complexos de molibdênio e tungstênio apropriados incluem derivados hidroxo derivados, por exemplo, de glicerol, ácido tartárico, e açúcares.

Uma ampla variedade de outros fatores antiangiogênicos pode ser também utilizada no contexto da presente invenção. Exemplos representativos incluem, porém não são limitados a fator de plaqueta-4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparados a partir de cascas de caranquejo rainha), (Murata e outros, Câncer Res. 51:22-26, (1991)); Suphated polysaccharide Peptidoglycan Complex (SP - PG) (a função desse composto pode ser intensificada pela presença de esteróides como estrogênio, e citrato de tamoxifeno); Staurosporina; moduladores de metabolismo de matriz, incluindo, por exemplo, análogos de prolina, cisidróxiprolina, d,L-3,4-desidroprolina, Tiaprolina, alfa.alfa-dipiridil, fumarato de aminopropionitrila; 4-propil-5-(5-piridinil)-2(3H)-oxazolona; metotrexato; mitoxantrona; Heparina; interferons; 2 macroglobulina-soro; ChlMP-3 (Pavloff e outros, J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); quimostatina (Tomkinson e outros, Biochem. J. 286:475-480, (1992)); Tetradecasulfato de Ciclodextrina; eponemicina; camptotecina; fumagilina (lngber e outros, Nature 348:555-557 (1990)); Tiomalato de sódio de ouro ("GST", Matsubara e Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440-1446, (1987); anticolagenase-soro; alfa2-antiplasmina (Holmes e outros, J. Biol. Chem. 262(4): 1659-1664, (1987)); Bisantrene (National Câncer Institute); dissódio Lobenzarit (N-(2)-carboxifenil-4-dissódio de ácido cloroantronílico ou "CCA"; (Takeuchi e outros, Agents Actions 36:312-316, (1992)); e inibidores de metaloproteinase como BB94.

Fatores antiangiogênicos adicionais que também podem ser utilizados no contexto da presente invenção incluem Talidomida, (Celgene, Warren, NJ); esteróide angioestático AGM-1470 (H. Brem e J. Folkman J. Pediatr. Surg. 28:445-51 (1993)) carboxinaminolimdazol; carboxiamidotriazol (CAI) (National Câncer Institute, Bethesda, MD) conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); Squalamine (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL) ZD-0101 AstraZeneca (Londres, UK); APRA (CT2584); Benefin, Byrostatin-1 (SC339555) CGP-41251 (PKC 412); CM101; Dexrazoxano (ICRF187); DMXAA; Endostatina Flavopridiol; genesteína; GTE; ImmTher; Iressa (ZD1839); Octreotide (Somatostatin) Panretin; Penacilamina; Photopoint; PI-88; Prinomastat (AG-3340) Purlytin; Suradista (FCE26644); Tamoxifeno (Nolvadex); Tazaroteno; Tetratiomolibdato; Xeloda (Capecitabina); e 5-fluorouracil.

Agentes antiangiogênicos que podem ser administrados em combinação com os compostos da invenção podem trabalhar através de uma variedade de mecanismos incluindo, porém não limitados a, inibir proteólise da matriz extracelular, bloquear a função de moléculas de adesão de matriz extracelular-célula endotelial, por antagonizar a função de indutores de angiogênese como fatores de crescimento, e inibir receptores de integrina expressos em células endoteliais em proliferação. Os exemplos de inibidores antiangiogênicos que interferem na proteólise de matriz extracelular e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ), Marimastat (British Biotech1 Oxford, UK), e Metastat (Aeterna, St-Foy1 Quebec). Os exemplos de inibidores antiangiogênicos que atuam por bloquear a função de moléculas de adesão de matriz extracelular-célula endotelial e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, EMD- 121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Alemanha) e Vitaxina (Ixsys, La Joila, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD). Os exemplos de agentes antiangiogênicos que atuam por diretamente antagonizar ou inibir indutores de angiogênese e que podem ser administrados em combinação com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, Angiozyme (Ribozyme, Boulder, CO), anticorpo anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basiléia, Suíça), SU-101 (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ) e SU-6668 (Sugen). Outros agentes antiangiogênicos atuam para inibir indiretamente angiogênese. Os exemplos de inibidores indiretos de angiogênese que podem se administrados em combinação com as composições da invenção incluem, porém não são limitados a, IM-862 (Cytran, Kirkland, WA), Interferon-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) e polissulfato de Pentosan (Georgetown University, Washington, DC).

Nas modalidades específicas, o uso de composições da invenção em combinação com agentes antiangiogênicos é considerado para o tratamento, prevenção e/ou melhora de uma doença autoimune, como por exemplo, uma doença autoimune descrita aqui.

Em uma modalidade específica, o uso de composições da invenção em combinação com agentes antiangiogênicos é considerado para o tratamento, prevenção, e/ou melhora de artrite. Em uma modalidade mais específica, o uso de composições da invenção em combinação com agentes antiangiogênicos é considerado para o tratamento, prevenção e/ou melhora de artrite reumatóide.

Em outra modalidade, os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção são administrados em combinação com uma proteína angiogênica, ou polinucleotídeos que codificam uma proteína angiogênica. Os exemplos de proteínas angiogênicas que podem ser administradas com as composições da invenção incluem, porém não são limitadas a, fatores de crescimento de fibroblasto básico e acídico, VERGF-, VEGF-2, VEGF-3, fator de crescimento epidérmico alfa e beta, fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de necrose de tumor alfa, fator de crescimento de hepatócito, fator de crescimento insulino semelhante, fator estimulador de colônia, fator estimulador de colônia de macrófago, fator estimulador de colônia de macrófago/granulócito e sintase de óxido nítrico.

Nas modalidades adicionais, as composições da invenção são administradas em combinação com um agente quimioterapêutico. Agentes quimioterapêuticos que podem ser administrados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a agentes de alquilação como mostradas de nitrogênio (por exemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, Ciclofosfamida, lfosfamida, Melfalan (L-sarcolisina), e Clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (por exemplo, Hexametilmelamina e Tiotepa), sulfonatos de alquila (por exemplo, Busulfan), nitrosouréias (por exemplo, Carmustina (BCNU), Lomustina (CCNU), Semustina (metila-CCNU) e Estreptozocina (estreptozotocina)), triazenos (por exemplo, Dacarbazina (DTIC; dimetil triazeno imidazolcarboxamida)), análogos de ácido fólico (por exemplo, Metotrexato (ametopterina)), análogos de pirimidina (por exemplo, Fluorouacil (5-fluorouracil; 5-FU), Floxuridina (fluorodesoxiuridina; FudR), e Citarabina (citosina arabinoside)), análogos de purina e inibidores relacionados (por exemplo, Mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), Tioguanina (6-tioguanina; TG) e Pentostatina (2'-desoxicoformicina)), vinca alcalóides (por exemplo, Vinblastina (VLB, sulfato de vinblastina) e Vincristina (sulfato de vincristina)), epipodofilotoxinas (por exemplo, Etoposido e Teniposido), antibióticos (por exemplo, Dactinomicina (actinomicina D), Daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), Doxorubicina, 15 Bleomicina, Plicamicina (mitramicina), e Mitomicina (mitomicina C), enzimas (por exemplo, L-asparaginase), modificadores de resposta biológica (por exemplo, Interferon-alfa e interferon-alfa-2b), compostos de coordenação de platina (por exemplo, Cisplatina (cis-DDP) e Carboplatina), antracenediona (Mitoxantrona), uréias substituídas (por exemplo, Hidróxi uréia), derivados de metil hidrazina (por exemplo, Procarbazina (N-metil hidrazina; MIH); adrenocorticosteróides (por exemplo, Predinisona), progestinas (por exemplo, caproato de hidróxi progesterona, medróxi progesterona, acetato de medróxi progesterona, e acetato de Megestrol), estrogênios (por exemplo, dietilstilbestrol (DES), difosfato de dietilstilbestrol, estradiol, e estradiol de etinila), antiestrogênios (por exemplo, Tamoxifeno), andrógenos (propionato de Testosterona, e fluoximesterona), antiandrógenos (por exemplo, Flutamida), análogos de hormônio de liberação de gonadotropina (por exemplo, Leuprolide), outros hormônios e análogos de hormônio (por exemplo, metil testosterona, estramustina, sódio de fosfato de estramustina, clorotrianiseno e testolactona) e outros (por exemplo, dicarbazina, ácido glutâmico e mitotano).

Em uma modalidade, as composições da invenção são administradas em combinação com uma ou mais das seguintes drogas: infliximab (também conhecido como Remicade™ Centocor, Inc.), Trocade (Roche, RO-32-3555), Leflunomida (também conhecido como Arava™ da Hoechst Marion Roussel), Kineret™ (um antagonista receptor de IL-1 também conhecido como Anakinra da Amgen, Inc.).

Em uma modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisona) ou combinação de um ou mais dos componentes de CHOP. Em uma modalidade, as composições da invenção são administradas em combinação com anticorpos anti-CD20, anticorpos anti-CD20 monoclonais humanos. Em outra modalidade, as composições da invenção são administradas em combinação com anticorpos anti-CD20 e CHOP1 ou anticorpos anti-CD20 e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP1 especificamente ciclofosfamida e/ou prednisona. Em uma modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com Rituximab. Em uma modalidade adicional, composições da invenção são administradas com Rituximab e CHOP1 ou Rituximab e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, especificamente ciclofosfamida e/ou prednisona. Em uma modalidade específica, composições da invenção são administradas em combinação com tositumomab. Em uma modalidade, adicional, composições da invenção são administradas com tositumomab e CHOP, ou tositumomab e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP1 especificamente, ciclofosfamida e/ou prednisona. Os anticorpos anti-CD20 podem ser opcionalmente associados a radioisótopos, toxinas ou pró-medicamentos citotóxicos.

Em outra modalidade específica, as composições da invenção são administradas em combinação com Zevalin™. Em uma modalidade adicional, composições da invenção são administradas com Zevalin™ e CHOP, ou Zevalin™ e qualquer combinação de um ou mais dos componentes de CHOP, especificamente ciclofosfamida e/ou prednisona. Zevalin™ pode ser associado a um ou mais radioisótopos. Isótopos especificamente preferidos são 90Y e 111In.

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com citocinas. Citocinas que podem ser administradas com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-gama eTNF-alfa. Em outra modalidade, proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção podem ser administrados com qualquer interleucina, incluindo porém não limitado a IL-1 alfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 e IL-21.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com membros da família TNF. TNF, moléculasrelacionadas a TNF ou semelhantes a TNF que podem ser administradas com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, formas solúveis de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, também conhecida como TNF-beta), LT-beta (encontrada no heterotrímero complexo LT-alfa2-beta), OPGL, FasL1 CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-gama (Publicação internacional no. WO 5 96/14328), AIM-I (Publicação Internacional no. WO 97/33899), endocina-alfa (Publicação internacional no. WO 98/07880), OPG1 e neutrocina-alfa (Publicação internacional no. WO 98/18921, 0X40, e fator de crescimento de nervo (NGF), e formas solúveis de Fas1 CD30, CD27, CD40 e 4-IBB, TR2 (Publicação internacional no. WO 96/34095), DR3 (Publicação internacional no. WO 97/33904), DR4 (Publicação internacional no. WO 98/32856), TR5 (Publicação internacional no. WO 98/30693), TRANK, TR9 (publicação internacional no. WO 98/56892), TR10 (Publicação internacional no. WO 98/54202), 31202 (Publicação internacional no. WO 98/06842) e TR12, e formas solúveis CD154, CD70 e CD153.

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com proteínas angiogênicas. Proteínas angiogênicas que podem ser administradas com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitadas a, Fator de crescimento derivado de glioma (GDGF), como revelado na patente européia número EP-399816; Fator de Crescimento derivado de Plaqueta A (PDGF-A), como revelado na patente européia número EP-682110; Fator de Crescimento derivado de Plaqueta B (PDGF-B), como revelado na patente européia número WO 92/06194; Fator de crescimento placental 2 (PIGF-2), como revelado em Hauser e outros, Growth Factors, 4:259-268 (1993); Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), como revelado na Publicação internacional número WO 90/13649; Fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), como revelado na patente européia número EP-506477; Fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-2), como revelado na Publicação Internacional número WO 96/39515; Fator de crescimento endotelial Vascular B (VEGF-3); Fator de Crescimento Endotelial vascular B-186 (VEGF-B186), como revelado na Publicação Internacional número WO 96/26736; Fator de crescimento endotelial vascular D (VEGF-D), como revelado na publicação internacional número WO 98/02543; Fator de crescimento endotelial vascular D (VEGF-D), como revelado na publicação internacional número WO 98/07832; e Fator de crescimento endotelial Vascular E (VEGF-E), como revelado na patente alemã número DE19639602. As referências acima mencionadas são aqui incorporadas a título de referência na íntegra.

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com fatores de crescimento de fibroblasto. Fatores de crescimento de fibroblasto que podem ser administrados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 e FGF-15.

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com fatores de crescimento hematopoiético. Fatores de crescimento hematopoiético que podem se admoestados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, fator de estimular colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), (sargramostim, LEUKINE™, PROKINE™), fator de estimular colônia de granulócito (G-CSF) (filgrastim, NEUROPOGEN™), fator de estimular colônia de macrófago (M-CSF, CSF-1) eritropoietina (epoetina alfa, EPOGEN™, PROCRIT™), fator de célula tronco (SCF, ligando de kit-c, fator steel), fator de estimular colônia de megaocariocito, PIXY321 (uma proteína de fusão GMCSF/IL-3), interleucinas, especialmente qualquer uma ou mais de IL-1 até IL-12, interferon-gama, ou trombopoietina.

Em certas modalidades, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da presente invenção são administrados em combinação com bloqueadores adrenérgicos, como, por exemplo, acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, labetalol, metopropol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol e timolol.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com uma droga antiarrítmica (por exemplo, adenosina, amidoarona, bretílio, digittalis, digoxin, digitoxina, diliazem, disopiramida, esmolol, flecainida, lidocaína, mexiletina, moricizina, fenitoína, procainamida, N-acetil procainamida, propafenona, propranolol, quinidina, sotalol, tocainida e verapamil).

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com agentes diuréticos, como agentes de inibição de anidrase carbônico (por exemplo, acetazolamída, diclorfenamida e metazolamida), diuréticos osmóticos (por exemplo, glicerina, isosorbide, manitol e uréia), diuréticos que inibem Na+-K+-2C1" simporte (por exemplo, furosemida, bumetanida, azosemida, piretanida, tripamida, ácido etacrínico, muzolimina e torsemida), tiazida e diuréticos como tiazida (por exemplo, bendroflumetiazida, benztiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, politiazida, tricormetiazida, clortalidona, indapamida, metolazona e quinetazona), diuréticos com pouco potássio (por exemplo, amiloride e triamtereno) e antagonistas receptores de míneralcorticóide (por exemplo, espironolactona, canrenona e canrenoato de potássio).

Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com tratamentos para transtornos endócrinos e/ou desequilibro de hormônio. Os tratamentos para transtornos endócrinos e/ou desequilíbrio hormonal incluem, porém não são limitados a, 127I, isótopos radioativos de iodo como 131I e 123I; hormônio de crescimento recombinante, como HUMATROPE™ (somatropina recombinante); análogos de hormônio ode crescimento como PROTROPIN™ (somatrem); agonistas de dopamina como PARLODEL™ (bromocriptina); análogos de somatostatina como SANDOSTATIN™ (octreotide); preparados de gonadotropina como PREGNYL™. A.P.L.™ e PROFAST™ (gonadotropina coriônica (CG)), PERGONAL™ (menotropinas), e METRODIN™ (urofolitropina (uFSH); preparados de hormônio de liberação de gonadotropina humana sintéticos como FACTREL™ e LUTREPULSE™ (cloridreto de gonadorelina); agonistas de gonadotropína sintéticos como LUPRON™ (acetato de leuprolide), SUPPRELIN™ (acetato de histrelina), SYNAREL™ (acetato de nafarelina), e ZOLADEX™ (acetato de goserelina); preparados sintéticos de hormônio de liberação de tirotropina como RELEFACT TRH™ e THYPINONE™ (protirelin); THS humano recombinante como THYROGEN™; preparados sintéticos dos sais de sódio dos isômeros naturais de hormônios de tiróide como L-T4™, SYNTHROID™ e LEVOTHROID™ (sódio de levotiroxina), L-T3™, CYTOMEL™ e TRIOSTATrw (sódio de liotiroina) e THYROLAR™ (liotrix); compostos anti-tiróide como 6-n-propil tiouracil (propil tiouracil), 1-metil-2-mercaptoimidazol e TAPAZOLE™ (metimazol), NEO-MERCAZOLE™ (carbimazol); antagonistas de receptor beta-adrenérgico como propranolol e esmolol; bloqueadores de canal Ca2+; dexametasona e agentes de contraste radiológico iodado como TELEPAQUE™ (ácido iopanóico) e ORAGRAFIN™ (ipodato de sódio).

Tratamentos adicionais para transtornos endócrinos e/ou desequilíbrio hormonal incluem, porém não são limitados a, estrogênios ou estrogênios conjugados como ESTRACE™ (estradiol), ESTINYL™ (estradiol etinila), PREMARIN™, ESTRATAB™, ORTHO-EST™, OGEN™ e estropipato (estrona), ESTROVIS™ (quinestrol), ESTRADERM™ (estradiol), DELESTROGEN™ e VALERGEN™ (valerato de estradiol), DEPO-ESTRADIOL CYPIONATE™ e ESTROJ ECT LA™ (cipionato estradiol); antiestrogênios como NOLVADEX™ (tamoxifeno), SEROPHENE™ e CLOMID™ (clomifeno); progestinas como DURALUTIN™ (caproato de hidróxi progesterona), MPA™ e DEPO-PROVERA™ (acetato de medróxi progesterona), PROVERA™ e CYCRIN™ (MPA), MEGACE™ (acetato de megestrol), NORLUTIN™ (noretindrona) e NORLUTATE™ e AYGESTIN™ (acetato de noretindrona); implantes de progesterona como NORPLANT SYSTEM™ (implantes subdérmicos de norgestrel); antiprogestinas como RU 486™ (mifepristona); contraceptivos hormonais como ENOVID™ (noretrinodrel mais mestranol), PROGESTASERT™ (dispositivo intrauterino que libera progesterona), LOESTRIN™, BREVICON™, MODICON™, GENORA™, NELONA™, NORINYL™, OVACON-35™ e OVACON-50™ (estradiol etinila/noretindrona), LEVLEN™, NORDETTE™, TRI-LEVLEN™ e TRIPHASIL-21™ (estradiol etinila/levonorgestrel), LO/OVRAL™ e OVRAL™ (estradiol etinila/norgestrel), DEMULEN™ (estradiol etinila/diacetato de etinodiol), NORINYL™, ORTHO-NOVUM™, NORETHIN™, GENORA™ e NELOVA™ (noretindrona/mestranol), DESOGEN™ e ORTHO-CEPT™ (estradiol etinila/desogestrel), ORTHO-CYCLEN™ e ORTHO-TRICYCLEN™ (estradiol etinila/norgestimato), MICRONOR™ e NOR-QD™ (noretindrona) e OVRETTE™ (norgestrel).

Tratamentos adicionais para transtornos endócrinos e/ou desequilíbrio hormonal incluem, porém não são limitados a, ésteres de testosterona como acetato de metenolona e undecanoato de testosterona; andrógenos parenteral e oral como TESTOJECT-50™ (testosterona), TESTEX™ (propionato de testosterona), DELATESTRYL™ (enantato de testosterona), DEPO-TESTOSTERONE™ (cipionato de testosterona), DANOCRINE™ (danazol), HALOTESTIN™ (fluoximesterona), ORETON METHYL™, TESTRED™ e VIRILON™ (metil testosterona) e OXANDRIN™ (oxandrolona); sistemas transdérmicos de testosterona como TESTODERM™; antagonista receptor de andrógeno e inibidores de 5-alfa-reductase como ANDROCUR™ (acetato de ciproterona); EULEXIN™ (flutamida) e PROSCAR™ (finasteride); preparados de hormônio adrenocorticotrópico como CORTROSYN™ (cosintropina); esteróides adrenocorticais e seus análogos sintéticos como ACLOVATE™ (dipropionato alclometasona), CYCLOCORT™ (amcinonida), BECLOVENT™ e VANCERIL™ (dipropionato beclometasona), CELESTONE™ (betametasona), BENISONE™ e UTICORT™ (benzoato de betametasona), DIPROSONE™ (dipropionato de betametasona), CELESTONE PHOSPHATE™ (fosfato de sódio de betametasona), CELESTONE SOLUSPAN™ (acetato e fosfato de sódio de betametasona), BETA-VAL™ e VALISONE™ (valerato de betametasona), TEMOVATE™ (propionato de clobetasol), CLODERM™ (pivalato de clocortolona), CORTEF™ e HYDROCORTONE™ (hidrocortisona) de cortisol)), HYDROCORTONE ACETATE™ (acetato de (hidrocortisona) cortisol), LOCOID™ (butirato de (hidrocortisona) cortisol), HYDROCORTONE PHOSPHATE™ (fosfato de sódio (hidrocortisona) cortisol), A-HYDROCORT™ e SOLU CORTEF™ (succinato de sódio (hidrocortisona) cortisol), WESTCORT™ (valerato (hidrocortisona) cortisol), CORTISONE ACETATE™ (acetato de cortisona), DESOWEN™ e TRIDESILON™ (desonide), TOPICORT™ (desoximetasona), DECADRON™ (dexametasona), DECADRON LA™ (acetato de dexametasona), DECADRON PHOSPHATE™ e HEXADROL PHOSPHATE™ (fosfato de sódio dexametasona), FLORONE™ e MAXIFLOR™ (diacetato diflorasona), FLORINEF ACETATE™ (acetato fludrocortisona), AEROBID™ e NASALIDE™ (flunisolide), FLUONID™ e SYNALAR™ (acetonida fluocinolona), LIDEX™ (fluocinonida), FLUOR-OP™ e FML™ (fluorometolona), CORDRAN™ (flurandrenolide), HALOG™ (halcinonida), HMS LIZUIFILM™ (medrisona), MEDROL™ (metil prednisolona), DEPO-MEDROL™ e MEDROL ACETATE™ (acetato de metil prednisona), A-METHAPRED™ e SOLUMEDROL™ (succinato de sódio metil prednisolona), ELOCON™ (fluorato de mometasona), AHLDRONE™ (acetato de prametasona), DELTA-CORTEF™ (prednisolona), ECONOPRED™ (acetato de prednisolona), HYDELTRASOL™ (fosfato de sódio de prednisolona), HYLDELTRA-T.B.A™ (tebutato de prednisolona), DELTASONE™ (prednisona), ARISTOCORT™ e KENACORT™ (triamcinolona), KENALOG™ (acetonida 35 triamcinolona), ARISTOCORT™ e KENACORT DIACETATE™ (diacetato de triamcinolona), e ARISTOSPAN™ (hexacetonida triamcinolona); inibidores de biossíntese e ação de esteróides adrenocorticais como CYTADREN™ (aminoglutetimida), NIZORAL™ (cetoconazol), MODRASTANE™ (trilostano) e METOPIRONE™ (metirapone); insulina bovina, de porco ou humana ou suas misturas; análogos de insulina; insulina humana recombinante como HUMULIN™ e NOVOLIN™; agentes hipoglicêmicos orais como ORAMIDE™ e ORINASE™ (tolbutamida), DIABINESE™ (clorpropamida), TOLAMIDE™ e TOLINASE (tolazamida), DYMELOR™ (acetoexamida), glibenclamida, MICRONASE™, DI BETA™ e G LYNAS E™ (gliburide), GLUCOTROL™ (glipizide) e DIAMICRON™ (gliclazide), GLUCOPHAGE™ (metformin), ciglitazona, pioglitazona e inibidores de alfaglucosidase; glucagon bovino ou de porco; somatostatinas como SANDOSTATIN™ (octreotide); e diazoxidos como PROGLYCEM™ (diazoxido).

Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com tratamentos para transtornos de motilidade uterina. Os tratamentos para transtornos de motilidade uterina incluem, porém não são limitados a, drogas de estrogênio como estrogênios conjugados (por exemplo, PREMARIN® e ESTRATAB®), estradióis (por exemplo, CLIMARA® e ALORA®), estropipato, e clorotrianiseno; drogas de progestina (por exemplo, AMEN® (medroxiprogesterona), MICRONOR® (acetato de noretidrona), PROMETRIUM® progesterona e acetato de megestrol); e terapias de combinação de estrogênio/progesterona como, por exemplo, medróxi progesterona/estrogênios conjugados (por exemplo, PREMPRO™ e PREMPHASE®) e acetato de noretindrona/estradiol etinila (por exemplo, FEMHRT™).

Em uma modalidade adicional, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com drogas eficazes no tratamento de anemias hipocrônicas e deficiência de ferro, incluindo porém não limitado a sulfato ferroso (sulfato de ferro, FEOSOL™), fumarato ferroso (por exemplo, FEOSTAT™), gluconato ferroso (por exemplo, FERGON™), complexo de ferro-polissacarídeo (por exemplo, NIFEREX™), injeção de dextrano ferro (por exemplo, INFED™), sulfato cúprico, piroxidina, riboflavina, Vitamina B12, injeção de cianocbalamin (por exemplo, REDISOL™, RUBRAMIN tmpqtm) hidroxocobalamin, ácido fólico (por exemplo, FOLVITE™), Ieucovorin (ácido folínico, 5-CHOH4PteGlu, fator citrovorum) ou WELLCOVORIN (sal de cálcio de leucovorin), transferrina ou ferritina.

Em certas modalidades, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com agentes utilizados para tratar transtornos psiquiátricos. Drogas psiquiátricas que podem ser administradas com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, agentes antipsicóticos (por exemplo, clorpromazina, clorprotixeno, clozapina, flufenazina, haloperidol, loxapina, mesoridazina, molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, quetiapina, risperidona, tioridazina, tiotixeno, trífluoperazina e trifluopromazina), agentes antimânicos (por exemplo, carbamazepina, sódio divalproex, carbonato de lítio e citrato de lítio), antidepressantes (por exemplo, amitriptilina, amoxapina, bupropion, citalopram, clomipramina, desipramina, doxepin, fluvoxamina, fluoxetina, imipramina, isocarboxazid, maprotilina, mirtazapina, nefazodona, nortriptilina, paroxetina, fenelzina, protríptilina, sertralina, tranilcipromina, trazodona, trimipramina e venlafaxina), agentes antiansiedade (por exemplo, alprazolan, buspirona, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, halazepam, lorazepam, oxazepam e prazepam), e estimulantes (por exemplo, d-anfetamina, metilfenidato e pemolina).

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com agentes utilizados para tratar transtornos neurológicos. Agentes neurológicos que podem ser administrados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, agentes antiepilépticos (por exemplo, carbamazepina, clonazepam, etosuximida, fenobarbital, fenitoína, primidona, ácido valproico, sódio divalproex, felbamato, gabapentina, lamotrigina, levetiracetam, oxcarbazepina, tiagabina, topiramato, zonisamida, diazepam, lorazepam e clonazepam), agentes antiparkinsonianos (por exemplo, levodopa/carbidopa, selegilina, amantídina, bromocriptina, pergolide, ropinirol, pramípexol, benztropína; biperiden; etopropazina; prociclidina; triexifenidila, tolcapone), e agentes terapêuticos ALS (por exemplo, riluzol).

Em outra modalidade, proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com agentes de vasodilatação e/ou agentes bloqueadores de canal de cálcio. Agentes de vasodilatação que podem ser administrados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, inibidores de Enzima de Conversão de angiotensina (ACE) (por exemplo, papaverina, isoxsuprina, benazeprila, captoprila, cilazaprila, enalaprila, enalaprilat, fosinoprila, lisinoprila, moexiprila, perindoprila, quinaprila, ramiprila, espiraprila, trandolaprila e nilidrina) e nitratos (por exemplo, dínitrato de isosorbida, mononitrato de isosorbida e nitroglicerina). Os exemplos de agentes bloqueadores de canal de cálcio que podem ser administrados em combinação com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a amlodipina, bepridil, diltiazem, felodipina, flunarizina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina e verapamila.

Em certas modalidades, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com tratamentos para transtornos gastrintestinais. Os tratamentos para transtornos gastrintestinais que podem ser administrados com as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção incluem, porém não são limitados a, antagonistas receptores de histamina H2 (por exemplo, TAGAMET™ (cimetidina), ZANTAC™ (ranitidina), PEPCID™ (famotidina) e AXID™ (nizatidina)); inibidores de H+, K+ ATPase (por exemplo, PREVACID™ (IansoprazoI) e PRILOSEC™ (omeprazol)); compostos de bismuto (por exemplo, PEPTO-BISMOL™ (subsalicilatos de bismuto) e DE-NOL™ (subcitrato de bismuto)); vários antiácidos; sucralfato; análogos de prostaglandina (por exemplo, CYTOTEC™ (misoprostol)); antagonistas colinérgicos muscarínicos; laxantes (por exemplo, laxantes tensoativos, laxantes estimulantes, laxantes osmóticos e de solução salina); agentes antidiarréicos (por exemplo, LOMOTIL™ (difenoxilato), MOTOFEN™ (difenoxin) e IMODIUM™ (cloridreto de Ioperamida)), análogos sintéticos de somatostatina como SANDOSTATIN™ (octreotide), agentes antieméticos (por exemplo, ZOFRAN™ (ondansetron), KYTRIL™ (cloridreto de granisetron)), tropisetron, dolasetron, metoclopramida, clorpromazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, tietil perazina, triflupromazina, domperidona, haloperidol, droperidol, trimetobenzamida, dexametasona, metil prednisolona, dronabinol e nabilone); antagonistas D2 (por exemplo, metoclopramida, trimetobenzamida e clorpromazina); sais de bile; ácido quenodesoxicólico; ácido ursodesoxicólico; e preparados de enzima pancréatica como pancreatina e pancrelipase.

Nas modalidades adicionais, as proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos da invenção são administrados em combinação com outros regimes terapêuticos ou profiláticos, como por exemplo, terapia de radiação.

A invenção também provê um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios de um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas compreendendo proteínas de fusão da albumina da invenção. Opcionalmente associado a tal(tais) recipiente(s) pode haver um aviso na forma prescrita por um órgão governamental regulando a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou produtos biológicos, cujo aviso reflete aprovação pelo órgão de fabricação, uso ou venda para administração humana.

Terapia gênica

Construções codificando proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser utilizadas como parte de um protocolo de terapia gênica para distribuir doses terapeuticamente eficazes da proteína de fusão da albumina. Uma abordagem preferida para introdução in vivo de ácido nucléico em uma célula é pelo uso de um vetor viral contendo ácido nucléico, codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção. A infecção de células com um vetor viral tem a vantagem de que uma grande proporção das células alvejadas pode receber o ácido nucléico. Adicionalmente, moléculas codificadas no vetor viral, por exemplo, por um DNAc contido no vetor viral, são expressas eficientemente em células que absorveram o ácido nucléico de vetor viral.

Vetores de retrovírus e vetores de vírus adeno-associados podem ser utilizados como um sistema de distribuição de gene recombinação para a transferência de moléculas de ácido nucléico exógeno codificando proteínas de fusão da albumina in vivo. Esses vetores fornecem distribuição eficiente de ácidos nucléicos nas células, e os ácidos nucléicos transferidos são estavelmente integrados no DNA cromossômico do hospedeiro. O desenvolvimento de linhagens de células especializadas (denominadas "células concentradas") que produzem somente retrovírus defectivo em replicação aumentou a utilidade de retrovírus para terapia gênica, e retrovírus defectivo são caracterizados para uso em transferência de genes para fins de terapia gênica (para um exame vide Miller, A.D.

(1990) Blood 76:27 1). Um retrovírus defectivo de replicação pode ser acondicionado em virions que podem ser utilizados para infectar uma célula alvo através do uso de um vírus auxiliar por técnicas padrão. Protocolos para produzir retrovírus recombinante e para infectar células in vitro ou in vivo com tais vírus podem ser encontrados em Current Protocols in

Molecular Biology, Ausubel, F.M. e outros (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), seções 9.10-9.14 e outros manuais de laboratório padrão.

Outro sistema de distribuição de gene viral útil na presente invenção utiliza vetores derivados de adenovírus. O genoma de um adenovírus pode ser manipulado de tal modo que codifique e expresse um produto de gene de interesse, porém é inativado em termos de sua capacidade para replicar em um ciclo de vida viral lítica normal. Vide, por exemplo, Berkner e outros, BioTechniques 6:616 (1988); Rosenfeld e outros, Science 252:431-434

(1991); e Rosenfeld e outros, Cell 68:143-155 (1992). Vetores adenovirais apropriados derivados da cepa de adenovírus Ad tipo 5 d1324 ou outras cepas de adenovírus (por exemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) são conhecidos por aqueles versados na arte. Adenovírus recombinantes podem ser vantajosos em certas circunstâncias em que não são capazes de infectar células não divisoras e podem ser utilizados para infectar uma ampla variedade de tipos de células, incluindo células epiteliais (Rosenfeld e outros, (1992) citado supra). Além disso, a partícula de vírus é relativamente estável e sensível à purificação e concentração, e como acima, pode ser modificada de modo a afetar o espectro de infectuosidade. Adicionalmente, DNA adenoviral introduzido (e DNA estranho contido no mesmo) não é integrado no genoma de uma célula hospedeira porém permanece epissomal, desse modo evitando problemas em potencial que podem ocorrer como resultado de mutagênese de inserção em situações onde DNA introduzido se torna integrado no genoma hospedeiro (por exemplo, DNA retroviral). Além disso, a capacidade de transporte do genoma adenoviral para DNA estranho é grande (até 8 kilobases) em relação a outros vetores de distribuição de gene (Berkner e outros, citado supra; Haj-Ahmand e outros, J. Virol. 57-267 (1986)).

Em outra modalidade, sistemas de distribuição de gene não viral da presente invenção se baseiam em vias endocíticas para a absorção da molécula de nucleotídeo em questão pela célula alvejada. Sistemas de distribuição de gene exemplares desse tipo incluem sistemas derivados lipossomais, conjugados de poli-lisina, e envoltórios viróticas artificiais. Em uma modalidade representativa, uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção pode ser retida em Iipossomas contendo cargas positivas em sua superfície (por exemplo, lipofectinas) e (opcionalmente) que são marcados com anticorpos contra antígenos de superfície de célula do tecido alvo (Mizuno e outros (1992) No Shinkei Geka 20:547-5 5 1; PCT publicação WO 91/06309; pedido de patente japonesa 1047381; e publicação de patente européia EP-A-43075).

Sistemas de distribuição de gene para um gene codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser introduzidos em um paciente por qualquer um de diversos métodos. Por exemplo, um preparado farmacêutico do sistema de distribuição de gene pode ser introduzido sistemicamente, por exemplo, por injeção intravenosa, e transdução específica da proteína nas células alvo ocorre predominantemente a partir de especificidade de transfecção fornecida pelo veículo de distribuição de gene, expressão do tipo de tecido ou tipo de célula devido a seqüências reguladoras de transcrição controlando expressão gênica receptor, ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, a distribuição inicial do gene recombinante é mais limitada com introdução no animal sendo bem localizada. Por exemplo, o veículo de distribuição de gene pode ser introduzido por cateter (vide a Patente US 5.328.470) ou por injeção Estereotáctica (por exemplo, Chen e outros (1994) PNAS 91:3 054-3 05 7). O preparado farmacêutico da construção de terapia gênica pode consistir essencialmente no sistema de distribuição de gene em um diluente aceitável, ou pode compreender uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de distribuição de gene é incorporado. Onde a proteína de fusão da albumina pode ser produzida intacta a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, o preparado farmacêutico pode compreender uma ou mais células que produzem a proteína de fusão da albumina.

Métodos adicionais de terapia gênica

São também abrangidos pela invenção métodos de terapia gênica para tratar ou evitar transtornos, doenças e condições. Os métodos de terapia gênica se referem à introdução de seqüências de ácido nucléico (DNA, RNA e DNA ou RNA anti-sentido) em um animal para obter expressão de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Esse método requer um polinucleotídeo que codifica para uma proteína de fusão da albumina da presente invenção operativamente ligada a um promotor e quaisquer outros elementos genéticos necessários para a expressão da proteína de fusão pelo tecido alvo. Tal terapia gênica e técnicas de distribuição são conhecidas na arte, vide, por exemplo, W090/11092, que é aqui incorporada a título de referência. Desse modo, por exemplo, células de um paciente podem ser construídas com um polinucleotídeo (DNA ou RNA) compreendendo um promotor operavelmente ligado a um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção ex vivo, com as células construídas então sendo fornecidas a um paciente a ser tratado com a proteína de fusão da presente invenção. Tais métodos são conhecidos na arte. Por exemplo, vide Belldegrun, A., e outros, J. Natl. Câncer Inst. 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. e outros, Câncer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. e outros, J. Immunotogy 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., e outros, Int. J. Câncer 60: 221-229 (1995); Ogura, H. e outros, Câncer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L., e outros, Human Gene Therapy 7:1 - 10 (1996); Santodonato, L. e outros, Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); e Zhang, J. F e outros, Câncer Gene Therapy 3: 31-38 (1996)), que são pela presente incorporadas a título de referência. Em uma modalidade, as células que são construídas são células arteriais. As células arteriais podem ser reintroduzidas no paciente através de injeção direta na artéria, os tecidos circundando a artéria, ou através de injeção de cateter. Como discutido em mais detalhes abaixo, as construções de polinucleotídeos

podem ser distribuídas por qualquer método que distribui materiais injetáveis para as células de um animal, como, injeção no espaço intersticial de tecidos (coração, músculo, pele, pulmão, fígado e similar). As construções de polinucleotídeos podem ser distribuídas em um veículo aquoso ou líquido farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da presente invenção são distribuídos como um polinucleotídeo nu. O termo polinucleotídeo "nu", DNA ou RNA se refere a seqüências que são livres de qualquer veículo de distribuição que atue para auxiliar, promover ou facilitar entrada na célula, incluindo seqüências virais, partículas virais, formulações de lipossoma, Iipofectina ou agentes de precipitação e similares. Entretanto, polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da presente invenção também podem ser distribuídos em formulações de lipossoma e formulações de lipofectina e similares podem ser preparadas por métodos conhecidos por aqueles versados na arte. Tais métodos são descritos, por exemplo, nas patentes US nos. 5.593.972, 5.589.466 e 5.580.859, que são aqui incorporadas a título de referência.

As construções de vetor de polinucleotídeos utilizadas no método de terapia gênica são preferivelmente construções que não integrarão no genoma hospedeiro nem conterão seqüências que permitem replicação. Vetores apropriados incluem pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 e pSG disponíveis a partir de Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis a partir de Pharmacia; e pEF1/V5, pDNAc3.1 e pRc/CMV2 disponíveis a partir de Invitrogen. Outros vetores apropriados serão prontamente evidentes para o versado na técnica. Qualquer promotor forte conhecido por aqueles versados na arte pode ser utilizado para acionar a expressão da seqüência de polinucleotídeos. Promotores apropriados incluem promotores adenovirais, como o promotor tardio principal adenoviral; ou promotores heterólogos, como o promotor citomegalovírus (CMV); o promotor de vírus sincicial respiratório (RSV); promotores induzíveis, como o promotor MMT1 o promotor metalotioneína; promotores de choque térmico; promotor de albumina; promotor ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina cinase viral, como o promotor de timidina cinase de Herpes Simplex; LTRs retrovirais; o promotor de b-actina, e promotores de hormônio de crescimento humano. O promotor também pode ser o promotor nativo para o gene que corresponde à porção de proteína Terapêutica das proteínas de fusão da albumina da invenção.

Ao contrário de outras técnicas de terapia gênica, uma vantagem principal de introduzir seqüências de ácido nucléico puro em células alvo é a natureza transitória da síntese de polinucleotídeos nas células. Os estudos mostraram que seqüências de DNA de não replicação podem ser introduzidas em células para fornecer produção do polipeptídeo desejado por períodos de até seis meses.

A construção de polinucleotídeo pode ser distribuída ao espaço intersticial de tecidos em um animal, incluindo músculo, pele, cérebro, pulmão, fígado, baço, medula óssea, timo, coração, linfa, sangue, osso, cartilagem, pâncreas, rim, vesícula, estômago, intestino, testículos, ovário, útero, reto, sistema nervoso, olho, glândula e tecido conectivo. O espaço intersticial dos tecidos compreende a matriz de mucopolissacarídeo, fluido, intercelular, entre as fibras reticulares de tecidos de órgão, fibras elásticas nas paredes de vasos ou câmaras, fibras de colágeno de tecidos fibrosos, ou aquela mesma matriz no tecido conectivo cobrindo células de músculos ou nas lacunas de osso. É similarmente o espaço ocupado pelo plasma da circulação e o fluido de linfa dos canais linfáticos. A distribuição para o espaço intersticial de tecido de músculo é preferida pelos motivos discutidos abaixo. Podem ser convenientemente distribuídas por injeção nos tecidos compreendendo essas células. São preferivelmente distribuídas para e expressas em células não divisoras, persistentes que são diferenciados, embora a distribuição e expressão possam ser obtidas em células não diferenciadas ou menos totalmente diferenciadas, como, por exemplo, células tronco de sangue ou fibroblastos de pele. Células de músculo in vivo são especificamente competentes em sua capacidade de absorver e expressar polinucleotídeos.

Para a injeção de seqüência de ácido nucléico nu, uma quantidade de dosagem eficaz de DNA ou RNA estará compreendida na faixa de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corpóreo a aproximadamente 50 mg/kg de peso corpóreo. Preferivelmente a dosagem será de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg e mais preferivelmente de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 6 mg/kg. Evidentemente, como o técnico com conhecimentos comuns reconhecerá, essa dosagem variará de acordo com o sítio de injeção no tecido. A dosagem apropriada e eficaz de seqüência de ácido nucléico pode ser facilmente determinada por aqueles versados na arte e pode depender da condição sendo tratada e da via de administração.

A via de administração preferida é pela via de injeção parenteral no espaço intersticial de tecidos. Entretanto, outras vias parenterais também podem ser utilizadas, como, inalação de uma formulação de aerossol especificamente para distribuição para os pulmões ou tecidos bronquais, garganta ou membranas mucosas do nariz. Além disso, construções de DNA puro podem ser distribuídas para artérias durante angioplastia pelo cateter utilizado no procedimento.

Os polinucleotídeos nus são distribuídos por qualquer método conhecido na arte, incluindo, porém não limitado a, injeção direta por agulha no sítio de distribuição, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, e as denominadas "pistolas de gene". Esses métodos de distribuição são conhecidos na arte.

As construções podem ser distribuídas com veículos de distribuição, tais como, sequencias viróticas, partículas viróticas, formulaçõe de lipossoma, lipofectina, agentes de precipitação, etc. Tais métodos de distribuição são conhecidos na arte.

Em certas modalidades, as construções de polinucleotídeo são complexadas em uma preparação de lipossoma. Preparações de lipossoma para uso na presente invenção incluem preparações catiônicas (positivamente carregadas), aniônicas (negativamente carregadas) e neutras. Entretanto, Iipossomas catiônicos são especificamente preferidos porque um complexo de carga apertada pode ser formado entre o lipossoma catiônico e o ácido nucléico polianiônico. Lipossomas catiônicos foram mostrados como mediando distribuição intracelular de DNA de plasmídeo (Felgner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987) 84:7413-7416, que é aqui incorporado a título de referência); RNAm (Malone e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) 86:6077-6081, que é aqui incorporado a título de referência); e fatores de transcrição purificados (Debs e outros, J. Biol. Chem. (1990) 265:10189-10192, que é aqui incorporado a título de referência) em forma funcional.

Lipossomas catiônicos são prontamente disponíveis. Por exemplo, Iipossomas N[1- 2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trietil amônio (DOTMA) são especificamente úteis e são disponíveis sob a marca registrada Lipofectin, a partir da GIBCO BRL, Grand Island, N.Y. (vide, também, Felgner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987) 84:7413-7416, que é aqui incorporado a título de referência). Outros lipossomas comercialmente disponíveis incluem transfectace (DDAB/DOPE) e DOTAP/DOPE (Boehringer).

Outros lipossomas catiônicos podem ser preparados a partir de materiais prontamente disponíveis utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Vide, por exemplo, publicação PCT número WO 90/11092 (que é aqui incorporado a título de referência) para uma descrição da síntese de DOTAP Iipossomas (1,2-bis(oleoilóxi)-3-(trimetil amônio) propano). A preparação de Iipossomas DOTMA é explicada na literatura, vide, por exemplo, P. Felgner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417, que é aqui incorporado a título de referência. Métodos similares podem ser utilizados para preparar Iipossomas a partir de outros materiais de lipídeo catiônico.

Similarmente, Iipossomas aniônicos e neutros são prontamente disponíveis, como na Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.) ou podem ser facilmente preparados utilizando materiais prontamente disponíveis. Tais materiais incluem fosfatidila, colina, colesterol, fosfatidila etanol amina, dioleoil fosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleoil fosfatidil etanol amina (DOPE), entre outros. Esses materiais também podem ser misturados com os materiais de partida DOTMA e DOTAP em razões apropriadas. Os métodos para fazer Iipossomas utilizando esses materiais são bem conhecidos na arte.

Por exemplo, dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG) e dioleoilfosfatidil etanol amina (DOPE) comerciais podem ser utilizados em várias combinações para fazer Iipossomas convencionais, com ou sem a adição de colesterol. Desse modo, por exemplo, vesículas DOPG/DOPC podem ser preparadas por secagem de 50 mg de cada um entre DOPG e DOPC sob um fluxo de gás nitrogênio em um frasco de sonicação. A amostra é colocada sob uma bomba a vácuo durante a noite e é hidratada no dia seguinte com água deionizada. A amostra é então submetida a sonicação por 2 horas em um frasco com tampa, utilizando um sonicador Heat Systems modelo 350 equipado com uma sonda de copo invertido (tipo banho) no ajuste máximo enquanto o banho é circulado em 15 graus Celsius. Alternativamente, vesículas negativamente carregadas podem ser preparadas sem sonicação para produzir vesículas multilamelares ou por extrusão através de membranas de nucleoporo para produzir vesículas unilamelares de tamanho discreto. Outros métodos são conhecidos e disponíveis para aqueles versados na arte.

Os Iipossomas podem compreender vesículas multilamelares (MLVs), pequenas vesículas unilamelares (SUVs), ou vesículas unilamelares grandes (LUVs), com SUVs sendo preferidas. Os vários complexos de ácido nucléico-lipossoma são preparados utilizando métodos bem conhecidos na arte. Vide, por exemplo, Straubinger e outros, Methods of Immunology (1983), 101:512-527, que é aqui incorporado a título de referência. Por exemplo, MLVs contendo ácido nucléico podem ser preparados por depósito de uma película delgada de fosfolipídeo nas paredes de um tubo de vidro e hidratação subsequente com uma solução do material a ser encapsulado. SUVs são preparadas por sonicação prolongada de MLVs para produzir uma população homogênea de Iipossomas unilamelares. O material a ser retido é adicionado a uma suspensão de MLVs pré-formados e então sonicado. Ao utilizar Iipossomas contendo lipídeos catiônicos, a película de lipídeo seca é suspensa novamente em uma solução apropriada como água estéril ou uma solução de tampão isotônica como 10 mM Tris/NaCI sonicada, e então os lipossomas pré-formados são misturados diretamente com o DNA. O lipossoma e DNA formam um complexo muito estável devido à ligação dos lipossomas positivamente carregados com o DNA catiônico.

SUVs encontram uso com fragmentos de ácido nucléico pequenos. LUVs são preparados por diversos métodos, bem conhecidos na arte. Métodos comumente utilizados incluem quelação Ca2+-EDTA (Papahadjopoulos e outros, Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:483, Wilson e outros, Cell 17:77 (1979)); injeção de éter (Deamer, D. e Bangham1 A., Biochim. Biophys. Acta 443:629 (1976); Ostro e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun; 76:836 10 (1977); Fraley e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:3348 (1979)); diálise detergente (Enoch, H. e Strittmatter, P., Proc. Natl. Acad. Sci USA 76:145 (1979)); e evaporação de fase inversa (REV) (Fraley e outros, J. Biol. Chem. 255:10431 (1980); Szoka, F. e Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci USA 75:145 (1978); Schaefer-Ridder e outros, Science 215:166 (1982)), que são aqui incorporados a título de referência. Genericamente, a razão de DNA para lipossomas será de aproximadamente 10:1 a

aproximadamente 1:10. Preferivelmente, a razão será de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5. Mais preferivelmente, a razão será de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:3. Ainda mais preferivelmente, a razão será aproximadamente 1:1,

A Patente US número 5.676.954 (que é aqui incorporada a título de referência) se refere à injeção de material genético, complexado com veículos de Iipossomas catiônicos em camundongos. As patentes US 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e publicação internacional número WO 94/9469 (que são aqui incorporadas a título de referência) fornecem lipídeos catiônicos para uso na transfecção de DNA em células e mamíferos. As patentes US números 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e publicação internacional número WO 94/9469 fornecem métodos para distribuir complexos de lipídeo catiônico-DNA para mamíferos.

Em certas modalidades, células são construídas, ex vivo ou in vivo, utilizando uma partícula retroviral contendo RNA que compreende uma seqüência codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. Retrovírus a partir dos quais os vetores de plasmídeo retroviral podem ser derivados incluem, porém não são limitados a, Vírus de Leucemia de Murino Moloney, vírus de necrose de baço, Vírus de sarcoma Rouse, vírus de sarcoma Harvey, vírus de Ieucose aviária, vírus de leucemia de macaco gibbon, vírus de imunodeficiência humana, vírus de sarcoma Mieloproliferativa, e vírus de tumor mamário.

O vetor de plasmídeo retroviral é empregado para transduzir linhagens de células concentradas para formar linhagens de células produtoras. Os exemplos de células concentradas que podem ser transfectadas incluem, porém não são limitadas a, PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 e linhagens de células DAN como descrito em Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990), que é incorporado aqui a título de referência na íntegra. O vetor pode transduzir as células concentradas através de qualquer meio conhecido na arte. Tais meios incluem, porém não são limitados a, eletroporação, o uso de lipossomas, e precipitação CaPO4. Em uma alternativa, o vetor de plasmídeo retroviral pode ser encapsulado em um lipossoma, ou acoplado a um lipídeo, e então administrado a um hospedeiro.

A linhagem de célula produtora gera partículas de vetor retroviral infeccioso que inclui polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. Tais partículas de vetor retroviral podem ser então empregados, para transduzir células eucarióticas, in vitro ou in vivo. As células eucarióticas transduzidas expressarão uma proteína de fusão da presente invenção.

Em certas outras modalidades, células são construídas, ex vivo ou in vivo, com polinucleotídeo contido em um vetor adenovírus. Adenovírus pode ser manipulado de tal modo que codifica e expressa proteína de fusão da presente invenção, e ao mesmo tempo é inativado em termos de sua capacidade em replicar em um ciclo de vida viral lítica normal. A expressão de adenovírus é obtida sem integração do DNA viral no cromossomo de células hospedeiras, desse modo aliviando as preocupações sobre mutagênese de inserção. Além disso, adenovírus foi utilizado como vacinas entéricas vivas por muitos anos com um excelente perfil de segurança (Schwartz e outros Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238 (1974)). Finalmente, a transferência de gene mediada por adenovírus foi demonstrada em diversos casos incluindo transferência de alfa-1-antitripsina e CFTR para os pulmões de ratos de algodão (Rosenfeld, M.A. e outros (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld e outros (1992) Cell 68:143-155). Adicionalmente, estudos extensos para tentar estabelecer adenovírus como um agente causativo em câncer humano foram uniformemente negativos (Green, M. e outros (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:6606).

Vetores adenovírais apropriados úteis na presente invenção são descritos, por exemplo, em Kozarsky e Wilson, Curr. Opin. Genet. Devei. 3:499-503 (1993); Rosenfeld e outros, Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt e outros, Human Genet. Therp. 4:759-769 (1993); Yang e outros, Nature Genet. 7:362-369 (1994); Wilson e outros, Nature 365:691- 692 (1993); e Patente US número 5.652.224, que são aqui incorporados a título de referência. POr exemplo, o vetor adenovírus Ad 2 é útil e pode ser cultivados em 293 células humanas. Essas células contêm a região E1 de adenovírus e expressam, de modo constitutivo, Ela e Elb, que complementam os adenovírus defectivos pela provisão dos produtos dos genes deletados a partir do vetor. Além de Ad2, outras variedades de adenovírus (por exemplo, Ad3, Ad5, e Ad7) são também úteis na presente invenção.

Preferivelmente1 os adenovírus utilizados na presente invenção são deficientes em replicação. Adenovírus deficientes em replicação exigem o auxílio de um vírus auxiliar e/ou linhagem de célula concentrada para formar partículas infecciosas. O vírus resultante é capaz de infectar células e pode expressar um polinucleotídeo de interesse que é operavelmente ligado a um promotor, porém não pode replicar na maioria das células. Adenovírus deficientes em replicação podem ser deletados em um ou mais de todos ou uma porção dos seguintes genes: E1a, Elb1 E3, E4, E2a, ou Li até L5.

Em certas outras modalidades, as células são construídas, ex vivo ou in vivo, utilizando um vírus adeno associado (AAV). AAVs são vírus defectivos de ocorrência natural que exigem vírus auxiliar para produzir partículas infecciosas (Muzyczka, N., Curr. Topics in microbiol. Immunol. 158:97 (1992)). Também é um dos poucos vírus que pode integrar seu DNA em células não divisoras. Vetores contendo tão pouco quanto 300 pares base de AAV podem ser acondicionados e podem integrar, porém espaço para DNA exógeno é limitado a aproximadamente 4,5 kb. Os métodos para produzir e utilizar tais AAVs são conhecidos na arte. Vide, poro exemplo, as Patentes US números 5.139.941, 5.173.414, 5.354.678, 5.436.146, 5.474.935, 5.478.745 e 5.589.377.

Por exemplo, um vetor de AAV apropriado para uso na presente invenção inclui todas as seqüências necessárias para replicação de DNA, encapsidação, e integração de célula-hospedeiro. A construção de polinucleotídeo é inserida no vetor AAV utilizando métodos de clonagem padrão, como aqueles encontrados em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Iaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989). O vetor AAV recombinante é então transfectado para células concentradas que são infectadas com um vírus auxiliar, utilizando qualquer técnica padrão, incluindo lipofecção, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, etc. Vírus auxiliares apropriados incluem adenovírus, citomegalovírus, vírus de vacínia, ou vírus de herpes. Após as células concentradas serem transfectadas e infectadas, produzirão partículas viróticas AAV infecciosas que contêm a construção de polinucleotídeos. Essas partículas viróticas são então utilizadas para transduzir células eucarióticas, ex vivo ou in vivo. As células transluzidas conterão a construção de polinucleotídeo integrada em seu genoma, e expressarão uma proteína de fusão da invenção.

Outro método de terapia gênica envolve associar operavelmente regiões de controle heterólogas e seqüências de polinucleotídeo endógenas (por exemplo codificar um polipeptídeo da presente invenção) via recombinação homóloga (vide, por exemplo, a Patente US número 5.641.670, expedida em 24 de junho de 1997; publicação internacional número WO 96/29411, publicada em 26 de setembro de 1996; publicação internacional número WO 94/12650, publicada em 4 de agosto de 1994; Koller e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:8932-8935 (1989); e Zijlstra e outros, Nature 342: 435-438 (1989), que são aqui incorporadas a título de referência. Esse método envolve a ativação de um gene que está presente nas células alvo, porém que não é normalmente expresso nas células ou é expresso em um nível mais baixo do que desejado.

Construções de polinucleotídeos são feitas, utilizando técnicas padrão conhecidas na arte, que contêm o promotor com seqüências de alvejamento flanqueando o promotor. Promotores apropriados são descritos aqui. A seqüência de alvejamento é suficientemente complementar a uma seqüência endógena para permitir recombinação homóloga da seqüência de alvejamento promotor com a seqüência endógena. A seqüência de alvejamento estará suficientemente próxima à extremidade 5' da seqüência de polinucleotídeo endógeno desejada de modo que o promotor será ligado operavelmente a seqüência endógena após recombinação homóloga.

As seqüências de alvejamento e promotor podem ser ampliadas utilizando PCR.

Preferivelmente1 o promotor ampliado contém sítios de enzima de restrição distintos nas extremidades 5' e 3'. Preferivelmente, a extremidade 3' da primeira seqüência de alvejamento contém o mesmo sítio de enzima de restrição que a extremidade 5' do promotor ampliado e a extremidade 5' da segunda seqüência de alvejamento contém o mesmo sítio de restrição que a extremidade 3' do promotor ampliado. As seqüências de alvejamento e promotora ampliadas são digeridas e ligadas juntas.

A construção de seqüência de alvejamento-promotor é distribuída para as células, como polinucleotídeo nu, ou em combinação com agentes de facilitar transfecção, como lipossomas, seqüências virais, partículas virais, vírus inteiros, lipofecção, agentes de precipitação, etc., descritos em mais detalhe acima. A seqüência de alvejamento-promotora P pode ser distribuída por qualquer método, incluindo injeção direta de agulha, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, aceleradores de partícula, etc. Os métodos são descritos em mais detalhe abaixo.

A construção de seqüência de alvejamento-promotor é absorvida pelas células. A recombinação homóloga entre a construção e a seqüência endógena ocorre, de tal modo que uma seqüência endógena é colocada sob o controle do promotor. O promotor então aciona a expressão da seqüência endógena.

O polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode conter uma seqüência de sinal secretora que facilita secreção da proteína. Tipicamente, a seqüência de sinal é posicionada na região de codificação do polinucleotídeo a ser expressa em direção ou na extremidade 5' da região de codificação. A seqüência de sinal pode ser homóloga ou heteróloga ao polinucleotídeo de interesse e pode ser homóloga ou heteróloga às células a serem transfectadas. Adicionalmente, a seqüência de sinal pode se quimicamente sintetizada utilizando métodos conhecidos na arte.

Qualquer modo de administração de qualquer uma das construções de polinucleotídeos descritas acima pode ser utilizado desde que o modo resulte na expressão de uma ou mais moléculas em uma quantidade suficiente para fornecer um efeito terapêutico. Isso inclui injeção direta de agulha, injeção sistêmica, infusão por cateter, injetores biolísticos, aceleradores de partículas (isto é, "pistolas de gene"), depósitos de esponja de espuma de gel, outros materiais de depósito comercialmente disponíveis, bombas osmóticas (por exemplo, minibombas Alza), sólido de supositório ou oral (comprimido ou pílula), formulações farmacêuticas, e decantação ou aplicações tópicas durante cirurgia. Por exemplo, a injeção direta de plasmídeo precipitado por fosfato de cálcio puro no fígado do rato e baço do rato ou um plasmídeo revestido de proteína na veia portal resultou em expressão gênica do gene estranho nos fígados dos ratos (Kaneda e outros, Science 243:375(1989)). Um método preferido de administração local é por injeção direta. Preferivelmente, uma proteína de fusão da albumina da presente invenção complexada com um veículo de distribuição é administrada por injeção direta em ou localmente na área de artérias. A administração de uma composição localmente na área de artérias refere-se à injeção da composição centímetros e preferivelmente milímetros nas artérias.

Outro método de administração local é contatar uma construção de polinucleotídeos da presente invenção em ou em torno de uma incisão cirúrgica. Por exemplo, um paciente pode ser submetido à cirurgia e a construção de polinucleotídeos pode ser revestida na superfície de tecido dentro da incisão ou a construção pode ser injetada em áreas de tecido dentro da incisão.

Composições terapêuticas úteis em administração sistêmica incluem proteínas de fusão da presente invenção complexadas com um veículo de distribuição alvejada da presente invenção. Veículos de distribuição apropriados para uso com administração sistêmica compreendem Iipossomas compreendendo ligandos para alvejar o veículo em um sítio específico. Nas modalidades específicas, veículos de distribuição apropriados para uso com a administração sistêmica compreendem lipossomas compreendendo proteínas de fusão da albumina da invenção para alvejar o veículo em um sítio específico.

Métodos preferidos de administração sistêmica incluem injeção intravenosa, aerossol, distribuição oral e percutânea (tópica). Injeções intravenosas podem ser executadas utilizando métodos padrão na arte. A distribuição por aerossol pode ser também executada utilizando métodos padrão na arte (vide, por exemplo, Stribling e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 189: 11277-11281, 1992, que é incorporado aqui a título de referência). A distribuição oral pode ser executada por complexar uma construção de polinucleotídeos da presente invenção com um veículo capaz de resistir a degradação por enzimas digestivas no intestino de um animal. Os exemplos de tais veículos incluem comprimidos ou cápsulas de plástico, como aqueles conhecidos na arte. A distribuição tópica pode ser executada por misturar uma construção de polinucleotídeos da presente invenção com um reagente lipofílico (por exemplo, DMSO) que é capaz de passar para dentro da pele. A determinação de uma quantidade eficaz de substância a ser distribuída pode depender de diversos fatores incluindo, por exemplo, a estrutura química e atividade biológica da substância, a idade e peso do animal, a condição precisa que requer tratamento e sua gravidade, e a via de administração. A freqüência de tratamentos depende de diversos fatores, como a quantidade de construções de polinucleotídeos administradas por dose, bem como a saúde e histórico do sujeito. A quantidade precisa, número de doses, e timing de doses serão determinados pelo médico ou veterinário atendente.

Proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser administradas a qualquer animal, preferível mente a mamíferos e pássaros. Mamíferos preferidos incluem seres humanos, cães, gatos, camundongos, ratos, coelhos, ovelhas, gado, cavalos e porcos, com seres humanos sendo especificamente preferidos.

Atividades biológicas

Proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos codificando proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser utilizados em ensaios para testar uma ou mais atividades biológicas. Se uma proteína de fusão da albumina e/ou polinucleotídeo apresentar uma atividade em um ensaio específico, é provável que a proteína Terapêutica correspondendo à proteína de fusão possa estar envolvida nas doenças associadas à atividade biológica. Desse modo, a proteína de fusão poderia ser utilizada para tratar a doença associada.

Nas modalidades preferidas, a presente invenção engloba um método de tratar uma doença ou transtorno listado na coluna "Indicação preferida Y" da Tabela 1 compreendendo administrar a um paciente no qual esse tratamento, prevenção ou melhora é desejável, uma proteína de fusão da albumina da invenção que compreende uma porção de proteína Terapêutica correspondendo a uma proteína Terapêutica revelada na coluna "Proteína Terapêutica X" da Tabela 1 (na mesma linha que a doença ou transtorno a ser tratado é listada na coluna "Indicação preferida Y" da tabela 1) em uma quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou transtorno.

Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção engloba um método de tratar uma doença ou transtorno listado para uma proteína Terapêutica específica na coluna "Indicação preferida Y" da Tabela 1 compreendendo administrar a um paciente no qual esse tratamento, prevenção ou melhora é desejável, uma proteína de fusão da albumina da invenção que compreende uma porção de proteína Terapêutica correspondendo à proteína Terapêutica para a qual as indicações nos Exemplos são relacionadas em uma quantidade eficaz para tratar, prevenir ou melhorar a doença ou transtorno.

São especificamente consideradas pela presente invenção proteínas de fusão da albumina produzidas por uma célula quando codificada pelos polinucleotídeos que codificam SEQ ID NO: Y. Quando esses polinucleotídeos são utilizados para expressar a proteína codificada a partir de uma célula, as etapas de secreção natural e processamento da célula produzem uma proteína que não tem a seqüência de sinal explicitamente listada nas colunas 4 e/ou 11 da tabela 2. A seqüência de aminoácido específica da seqüência de sinal listada é mostrada no relatório descritivo ou é bem conhecida na arte. Desse modo, modalidades mais preferidas da presente invenção incluem a proteína de fusão da albumina produzida por uma célula (que não teria a seqüência líder mostrada nas colunas 4 e/ou 11 da tabela 2). Também são mais preferidos polipeptídeos compreendendo SEQ ID NO: Y sem a seqüência líder específica listada nas colunas 4 e/ou 11 da tabela 2. As composições compreendendo essas duas modalidades preferidas, incluindo composições farmacêuticas, são também preferidas. Essas proteínas de fusão da albumina são especificamente consideradas para tratar, prevenir ou melhorar uma doença ou transtorno listado para uma proteína Terapêutica específica na coluna "Indicação preferida: Y" da tabela 1.

Nas modalidades preferidas, proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou transtornos referentes a doenças e transtornos do sistema endócrino (vide, por exemplo, a seção "Transtornos endócrinos" abaixo), sistema nervoso (vide, por exemplo, a seção "Transtornos neurológicos" abaixo), sistema imune (vide, por exemplo, a seção "Atividade imune" abaixo), sistema respiratório (vide, por exemplo, a seção "Transtornos respiratórios abaixo), sistema cardiovascular (vide, por exemplo, a seção "Transtornos cardiovasculares" abaixo), sistema reprodutivo (vide, por exemplo, a seção "Transtornos do sistema reprodutivo" abaixo), sistema digestivo (vide, por exemplo, a seção "Transtornos gastrintestinais" abaixo), doenças e/ou transtornos referentes à proliferação de células (vide, por exemplo, a seção "Transtornos hiperproliferativos" abaixo), e/ou doenças ou transtornos referentes ao sangue (vide, por exemplo, a seção "Transtornos relacionados ao sangue" abaixo).

Em certas modalidades, uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode ser utilizada para diagnosticar e/ou prognosticar doenças e/ou transtornos associados ao(s) tecido(s) no(s) qual(is) o gene correspondendo à porção de proteína Terapêutica da 30 proteína de fusão da invenção é expresso.

Desse modo, proteínas de fusão da invenção e polinucleotídeos codificando proteínas de fusão da albumina da invenção são úteis no diagnóstico, detecção e/ou tratamento de doenças e/ou transtornos associados a atividades que incluem, porém não são limitadas a, ativação pró-hormônio, atividade neurotransmissora, sinalização celular, proliferação celular, diferenciação celular e migração de células.

Mais genericamente, proteínas de fusão da invenção e polinucleotídeos codificando proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis para o diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou transtornos associados aos seguintes sistemas.

Atividade imune

Proteínas de fusão da albumina da invenção e polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento prevenção, diagnóstico e/ou prognóstico de doenças, transtornos, e/ou condições do sistema imune, por exemplo, por ativação ou inibição da proliferação, diferenciação ou mobilização (quimiotaxia) das células imunes. Células imunes se desenvolvem através de um processo denominado hematopoiese, produzindo células mielóides (plaquetas, hemácias, neutrófilos, e macrófagos) e células línfóides (linfócitos BeT) de células tronco pluripotentes. A etiologia dessas doenças, transtornos e/ou condições imunes pode ser genética, somática, tal como, câncer e algumas doenças auto-imunes, adquirida (por exemplo, por quimioterapia ou toxinas) ou infecciosa. Além disso, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser utilizados como um marcador ou detector de uma doença ou transtorno específico do sistema imune.

Em outra modalidade, uma proteína de fusão da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção, podem ser empregados para tratar doenças e transtornos do sistema imune e/ou para inibir ou melhorar uma resposta imune gerada pelas células associadas ao(s) tecido(s) onde o polipeptídeo da invenção é expresso.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento prevenção, diagnóstico, e/ou prognóstico de imunodeficiências, incluindo ambas imunodeficiências congênitas e adquiridas. Exemplos de imunodeficiências da célula B onde os níveis de função da imunoglobulina da célula B e/ou os números da célula B são diminuídos incluem: agamaglobulinemia ligada ao X (doença de Bruton), agamaglobulinemia infantil ligada ao X, imunodeficiência ligada ao X com hiper IgM1 imunodeficiência não ligada ao X com hiper IgM1 síndrome Iinfoproliferativa ligada ao X (XLP), agamaglobulinemia incluindo agamaglobulinemia congênita e ligada ao X, agamablobulinemia de início em adulto, agamaglobulinemia de início tardio, disgamaglobulinemia, hipogamaglobulinemia, hipogamaglobulinemia não especificada, agamaglobulinemia recessiva (tipo Suíço), deficiência de IgM seletiva, deficiência de IgA seletiva, deficiências da subclasse IgG seletiva, deficiência da subclasse IgG (com ou sem deficiência de IgA), deficiência de Ig com IgM aumentado, deficiência de IgG e IgA com IgM diminuído, deficiência de anticorpo com Igs normais ou elevados, deleções de cadeia Ig pesada, deficiência de cadeia capa, transtorno Iinfoproliferativo da célula B (BLPD), imunodeficiência variável comum (CVID), imunodeficiência variável comum (CVI) (adquirida) e hipogamaglobulinemia transitória da infância.

Nas modalidades específicas, ataxia-telangiectasia ou condições associadas à ataxia-elangiectasia são tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Exemplos de imunodeficiências congênitas onde a célula T e/ou célula B funcionam e/ou o número é diminuído incluem, porém não estão limitados a: anomalia DiGeorge1 imunodeficiências graves combinadas (SCID) (incluindo, porém não limitado a SCID ligado a X, SCID recessivo autossômico, deficiência de adenosina desaminase, deficiência de nucleosídeo fosforilase pura (PNP), deficiência de MHC Classe II (síndrome de linfócito de Bare), síndrome de Wiskott-Aldrich e ataxia telangiectasia), hipoplasia tímica, síndrome da terceira e da quarta bolsas faríngeas, deleção de 22q11.2, candidíase mucocutânea crônica, deficiência de célula exterminadora natural (NK), Iinfocitopenia CD4+ T idiopática, imunodeficiência com defeito de célula T predominante (não especificado) e imunodeficiência não especificada de imunidade mediada por célula.

Nas modalidades específicas, anomalia DiGeorge ou condições associadas à anomalia DiGeorge são tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Outras imunodeficiências que podem ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem, porém não estão limitadas a doença granulomatosa crônica, síndrome de Chediak-Higashi, deficiência de mieloperoxidase, deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase de leucócito, síndrome 2 linfoproliferativa ligada ao X (XLP), deficiência de adesão de leucócito, deficiências de componente complementar (incluindo deficiências de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 e/ou C9), discinésia reticular, alinfoplasia-aplasia tímica, imunodeficiência com timoma, Ieucopecia congênita grave, displasia com imunodeficiência, neutropenia neonatal, nanismo de membro curto e síndrome de Nezelof-imunodeficiência combinada com Igs.

Em uma modalidade preferida, as imunodeficiências e/ou condições associadas às imunodeficiências citadas acima são tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Em uma modalidade preferida, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam utilizados como um agente para reforçar as respostas imunes entre os indivíduos imunodeficientes. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam empregados como um agente para reforçar a resposta imune entre os indivíduos imunodeficientes de célula B e/ou T.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis para tratamento, prevenção, diagnóstico e/ou prognóstico de transtornos auto-imunes. Muitos transtornos auto-imunes resultam do reconhecimento inadequado dos próprios como material estranho pelas células imunes. Esse reconhecimento inadequado resulta em uma resposta imune conduzindo à destruição do tecido hospedeiro. Portanto, a administração das proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção que possam inibir uma resposta imune, especificamente a proliferação, diferenciação ou quimiotaxia das células T, pode ser uma terapia eficaz na prevenção de transtornos auto-imunes.

As doenças ou transtornos auto-imunes que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a um ou mais dos que se seguem: lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, espondilite ancilosante, esclerose múltipla, tireoidite auto-imune, tireoidite de Hashimoto, anemia hemolítica auto-imune, anemia hemolítica, trombocitopenia, púrpura trombocitopenia auto-imune, trombocitopenia neonatal auto-imune, púrpura trombocitopênica idiopática, púrpura (por exemplo, púrpura de Henloch-Schõenlein), autoimunocitopenia, síndrome de Goodpasture, pênfigo vulgar, miastenia grave, doença de Grave (hipertíroidismo) e diabetes melito resistente à insulina.

Transtornos adicionais que são propensos a ter um componente auto-imune que pode ser tratado, prevenido e/ou diagnosticado com as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados à artrite induzida por colágeno do tipo II, síndrome de antifosfolipídeo, dermatite, encefalomielite alérgica, miocardite, policondrite recidivante, doença cardíaca reumática, neurite, oftalmia causada por uveíte, poliendocrinopatias, doença de Reiter, síndrome de Stiff-Main, inflamação pulmonar auto-imune, autismo, síndrome de Guillain-Barre, diabetes metlito insulino dependente, transtornos oculares inflamatórios auto-imunes.

Transtornos adicionais que provavelmente possuem um componente auto-imune que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados com as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados à esclerodermia com anticorpos anticolágeno (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos nucleolares e outros nucleares), doença do tecido conjuntivo misto (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos para antígenos nucleares extraíveis (por exemplo, ribonucleoproteína)), polimiosite (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por ANA não histona), anemia perniciosa (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por célula antiparietal, microssomas e anticorpos de fator intrínseco), doença de Addison idiopática (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por citotoxicidade humoral e adrenal mediada por célula, infertilidade (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos anti-espermatozóides), glomerulonefrite (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos de membrana de base glomerular ou complexos imunes), penfigóide bolhoso (freqüentemente caracterizado, por exemplo, por IgG e complemento na membrana de base), síndrome de Sjogren (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos de múltiplos tecidos, e/ou uma não histona ANA (SS-B)) específica, diabetes melito (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos de mediados por célula e de célula da ilhota humoral) e resistência ao medicamento adrenérgico (incluindo resistência ao medicamento adrenérgico com asma ou fibrose cística) (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos do receptor beta adrenérgico).

Transtornos adicionais que podem ter um componente auto-imune e que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados com as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não são limitados à hepatite ativa crônica (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos da musculatura lisa), cirrose biliar primária (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos de mitocôndrias), outra falência da glândula endócrina (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos de tecido específico, em alguns casos), vitiligo (freqüentemente caracterizado, por exemplo, por anticorpos de melanócito), vasculite (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por Ig e complemento nas paredes dos vasos e/ou complemento de soro baixo), pós-MI (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos miocardiais), síndrome de cardiotomia (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por anticorpos miocardianos), urticária (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por IgG e anticorpos de IgM para IgE), dermatite atópica (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por IgG e anticorpos de IgM para IgE), asma (freqüentemente caracterizada, por exemplo, por IgG e anticorpos de IgM para IgE) e muitos outros transtornos inflamatórios, granulomatosos, degenerativos e atróficos.

Em uma modalidade preferida, as doenças e transtornos e/ou condições autoimunes associados às doenças e transtornos citados acima são tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados empregando, por exemplo, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Em uma modalidade específica, artrite reumatóide é tratada, prevenida e/ou diagnosticada empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Em outra modalidade específica preferida, lúpus eritematoso sistêmico é tratado, prevenido e/ou diagnosticado empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Em outra modalidade específica preferida, púrpura trombocitopênica idiopática é tratada, prevenida e/ou diagnosticada empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Em outra modalidade específica preferida, nefropatia por IgA é tratada, prevenida e/ou diagnosticada empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Em uma modalidade preferida, as doenças e transtornos e/ou condições auto-imunes associados às doenças e transtornos citados acima são tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente(s) iimunossupressivo(s).

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção, prognóstico e/ou diagnóstico de doenças, transtornos, e/ou condições das células hematopoiéticas. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser empregadas para aumentar a diferenciação e proliferação das células hematopoiéticas, incluindo as células tronco pluripotentes, em um esforço de tratar ou prevenir aquelas doenças, transtornos, e/ou condições associados com o aumento em determinados (ou muitos) tipos de células hematopoiéticas, incluindo, porém, não limitado à leucopenia, neutropenia, anemia e trombocitopenia. Alternativamente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos 30 codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser empregados para aumentar a diferenciação e proliferação das células hematopoiéticas, incluindo as células tronco pluripotentes, em um esforço de tratar ou prevenir aquelas doenças, transtornos, e/ou condições associados com um aumento em determinados (ou muitos) tipos de células hematopoiéticas, incluindo, porém ,não limitado a histiocitose.

Reações e condições alérgicas, tais como, asma (especificamente asma alérgica) ou outros problemas respiratórios, podem também ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados empregando proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Além disso, essas moléculas podem ser usadas para tratar, prevenir, prognosticar e/ou diagnosticar anafilaxia, hipersensibilidade a uma molécula antigênica ou incompatibilidade de grupo sangüíneo.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser utilizados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar reações alérgicas mediadas por IgE. Tais reações alérgicas incluem, porém não estão limitadas a asma, rinite e eczema. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para modular as concentrações de IgE in vitro ou in vivo.

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção encontram uso no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento das condições inflamatórias. Por exemplo, uma vez que as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem inibir a ativação, proliferação e/ou diferenciação das células envolvidas em uma resposta inflamatória, essas moléculas podem ser empregadas para prevenir e/ou tratar condições inflamatórias agudas e crônicas. Tais condições inflamatórias incluem, porém não estão limitadas, por exemplo, à inflamação associada à infecção (por exemplo, choque séptico, septicemia ou síndrome de resposta inflamatória sistêmica), lesão por isquemia-reperfusão, letalidade por endotoxina, rejeição hiperaguda mediada por complemento, nefrite, lesão pulmonar induzida por citocina ou quimiocina, doença dos intestinos inflamados, doença de Crohn, produção de citocinas em excesso (por exemplo, TNF ou IL-L), transtornos respiratórios (por exemplo, asma e alergia); transtornos gastrintestinais (por exemplo, doença dos intestinos inflamados); cânceres (por exemplo, gástrico, ovariano, pulmonar, bexiga, fígado e mama); CNS transtornos (por exemplo, esclerose múltipla; lesão cerebral isquêmica e/ou acidente vascular, lesão cerebral traumática, transtornos neurodegenerativos (por exemplo, doença de Parkinson e doença de Alzheimer); demência relacionada à AIDS; e doença do Príon); transtornos cardiovasculares (por exemplo, aterosclerose, miocardite, doença cardiovascular, e complicações por desvio cardiopulmonar); bem como muitas doenças adicionais, condições e transtornos que são caracterizados por inflamação (por exemplo, hepatite, artrite reumatóide, gota, trauma, pancreatite, sarcoidose, dermatite, lesão renal por isquemia-reperfusão, doença de Grave, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes melito, e rejeição ao transplante alogênico).

Uma vez que a inflamação é um mecanismo de defesa fundamental, os transtornos inflamatórios podem afetar virtualmente qualquer tecido do corpo. Conseqüentemente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, encontram isso no tratamento dos transtornos inflamatórios específicos de tecido incluindo, porém não limitado a, adrenalite, alveolite, angiocolecistite, apendicite, balanite, blefarite, bronquite, bursite, cardite, celulite, cervicite, colecistite, cordite, cocleíte, colite, conjuntivite, cistite, dermatite, diverticulite, encefalite, endocardite, esofagite, inflamação da mucosa da tuba de Eustáquio, fibrosite, foliculite, gastrite, gastrenterite, gengivite, glossite, hepatosplenite, ceratite, labirintite, laringite, linfangite, mastite, media otite, meningite, metrite, mucite, miocardite, miositite, miringite, nefrite, neurite, orcite, osteocondrite, otite, pericardite, peritendonite, peritonite, faringite, flebite, poliomielite, prostatite, pulpite, retinite, rinite, salpingite, esclerite, esclerocoroidite, escrotite, sinusite, espondilite, esteatite, estomatite, sinovite, siringite, tendinite, tonsilite, uretrite e vaginite.

Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são úteis para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar rejeições de transplante de órgãos e doença de enxerto versus hospedeiro. A rejeição de órgãos ocorre em razão da destruição da célula imune hospedeira do tecido transplantado através de uma resposta imune. De modo semelhante, uma resposta imune também está envolvida em GVHD1 porém, nesse caso, as células imunes transplantadas estranhas destroem os tecidos hospedeiros. Os polipeptídeos, anticorpos ou polinucleotídeos da invenção e/ou seus agonistas ou antagonistas, que inibem uma resposta imune, especificamente a ativação, proliferação, diferenciação ou quimiotaxia das células T podem ser uma terapia eficaz na prevenção da rejeição do órgão ou GVHD. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, que inibem uma resposta imune, especificamente a ativação, proliferação, diferenciação ou quimiotaxia das células T podem ser uma terapia eficaz na prevenção da rejeição alérgica experimental e de xenoenxerto aguda.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, são úteis para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar doenças imunes complexas incluindo, porém não limitado a doença do soro, glomerulonefrite pós-estreptocócica, poliarterite nodosa e vasculite induzida por complexo imune.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser utilizados para tratar, detectar e/ou prevenir agentes infecciosos. Por exemplo, por aumento da resposta imune, especificamente aumento da ativação de proliferação e/ou diferenciação das células B e/ou T, doenças infecciosas podem ser tratadas, detectadas e/ou prevenidas. A resposta imune pode ser aumentada por melhora de uma resposta imune existente ou por início de uma nova resposta imune. Alternativamente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também inibir diretamente o agente infeccioso (vide a seção de listagem de aplicação dos agentes infecciosos, etc.) sem necessariamente promover uma resposta imune.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um coadjuvante de vacina que melhora a resposta imune a um antígeno. Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um coadjuvante para melhorar as respostas imunes específicas para tumor.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um adjuvante para melhorar as respostas imunes antiviróticas. As respostas imunes antiviróticas que podem ser melhoradas empregando as composições da invenção como um adjuvante incluem doenças viróticas e associadas ao vírus ou sintomas descritos aqui ou de outra forma conhecidos na técnica. Nas modalidades específicas, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune a um vírus, doença ou sintoma selecionado do grupo consistindo em: AIDS, meningite, dengue, EBV e hepatite (por exemplo, hepatite B). Em outra modalidade específica, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune a um vírus, doença ou sintoma selecionado do grupo consistindo em: vírus HIV/AIDS, vírus sincicial respiratório, vírus da dengue, rotavírus, vírus da encefalite B japonesa, vírus influenza A e parainfluenza B5, sarampo, citomegalovirus, vírus da raiva, vírus Junin, vírus Chikungunya, vírus da febre do vale Rift, vírus da herpes simples e vírus 25 da febre amarela.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um adjuvante para melhorar respostas imunes antibacterianas ou antifungicas. Respostas imunes antibacterianas ou antifungo que podem ser melhoradas empregando as composições da invenção como um adjuvante incluem bactérias ou fungos e doenças associadas às bactérias ou fungos ou sintomas descritos aqui ou de outra forma conhecidos na técnica. Nas modalidades específicas, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune para bactéria ou fungos, doença ou sintoma selecionado do grupo consistindo em: tétano, difteria, botulismo e meningite do tipo B.

Em outra modalidade específica, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune a uma bactéria ou fungo, doença ou sintoma selecionado do grupo consistindo em: Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Meisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, estreptococos do Grupo B, Shigella spp., Eseheriehia eoli Enterotoxigênica, E. eoli Enteroemorrágico e Borrelia burgdorferi.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um adjuvante para melhorar respostas imunes antiparasíticas. Respostas imunes antiparasíticas que podem ser melhoradas empregando as composições da invenção com um adjuvante incluem doenças parasitárias ou associadas a parasitas ou sintomas descritos aqui ou de outra forma conhecidos na técnica. Nas modalidades específicas, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune a um parasita. Em outra modalidade específica, as composições da invenção são empregadas como um adjuvante para melhorar uma resposta imune ao Plasmodium (malária) ou Leishmania.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para tratar doenças infecciosas incluindo silicose, sarcoidose e fibrose pulmonar idiopática; por exemplo, pela prevenção do recrutamento e ativação dos fagócitos mononucleares.

Em outra modalidade específica, proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um antígeno para a geração de anticorpos para inibir ou melhorar as respostas imunes mediadas contra polipeptídeos da invenção.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são administradas a um animal (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster, porquinho-da-índia, porcos, microporcos, galinhas, camelos, cabrito, cavalo, gado, carneiro, cão, gato, primata não humano, e humanos, mais preferívelmente humanos) para reforçar o sistema imune a produzir quantidades aumentadas de um ou mais anticorpos (por exemplo, IgG, IgA, IgM, e IgE), para induzir a produção de anticorpos de afinidade maior e comutação de classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgA, IgM e IgE), e/ou para aumentar uma resposta imune.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um estimulador de resposta da célula B aos agentes patogênicos.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um ativador das células T.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente que eleva o estado imune de um indivíduo antes do mesmo receber as terapias imunossupressivas.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para induzir anticorpos de afinidade mais alta.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para aumentar concentrações séricas de imunoglobulina.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para acelerar a recuperação de indivíduos 15 imunocomprometidos.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para reforçar as respostas imunes entre a população mais velha e/ou de neonatos.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um intensificador do sistema imune antes, durante ou após transplante de medula óssea e/ou outros transplantes (por exemplo, transplante de órgão alogênico ou xenogênico). Com relação ao transplante, as composições da invenção podem ser administradas antes, concomitantemente ou após o transplante. Em uma modalidade específica, as composições da invenção são administradas após o transplante, antes do começo da recuperação das populações de células T. Em outra modalidade específica, as composições da invenção são administradas primeiro após o transplante após o começo da recuperação das populações de células T, porém antes da recuperação completa das populações de células B.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para reforçar respostas imunes entre indivíduos apresentando uma perda adquirida da função da célula B. As condições que resultam em uma perda adquirida da função da célula B que podem ser melhoradas ou tratadas por administração das proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a infecção por HIV, AIDS, transplante de medula óssea, e leucemia linfocítica crônica (CLL) de célula B.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para reforçar respostas imunes entre indivíduos apresentando uma deficiência imune temporária. As condições que resultam em uma deficiência imune temporária que pode ser melhorada ou tratada por administração das proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitadas a, recuperação de infecções viróticas (por exemplo, influenza), condições associadas à má nutrição, recuperação de mononucleose infecciosa ou condições associadas ao estresse, recuperação de sarampo, recuperação transfusão de sangue e recuperação de cirurgias.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um regulador de apresentação de antígeno pelos monócitos, células dendríticas e/ou células B. Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção melhoram a apresentação do antígeno ou antagonizam a apresentação do antígeno in vitro ou in vivo. Além disso, nas modalidades correlatas, essa intensificação ou antagonismo da apresentação de antígeno pode ser útil como um tratamento antitumor ou para modular o sistema imune.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um agente para direcionar o sistema imune do indivíduo a desenvolver uma resposta humoral (isto é, TH2) oposta à resposta celular de TH1.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um meio para indução de proliferação do tumor e assim tornar o mesmo mais suscetível aos agentes antineoplásticos. Por exemplo, mieloma múltiplo é uma doença de divisão lenta e assim virtualmente refratária a todos os regimes antineoplásticos. Se essas células forem forçadas a proliferar mais rapidamente, seu perfil de suscetibilidade provavelmente mudaria.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um estimulador de produção de célula B nas patologias, tais como, AIDS, doença linfocítica crônica e/ou Imunodeficiência Variável Comum.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como uma terapia para geração e/ou regeneração de tecidos linfóides seguindo-se cirurgia, trauma ou defeito genético. Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados no pré-tratamento de amostras de medula óssea antes do transplante.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como uma terapia com base no gene para transtornos herdados geneticamente resultando em imunoincompetência/imunodeficiência tais como os observados entre os pacientes com SCID.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um meio para ativação de monócitos/macrófagos para defesa contra doenças parasitárias que afetam os monócitos tais como, Leishmania.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um meio de regular as citocinas secretadas que são promovidas pelos polipeptídeos da invenção. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou

polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados em uma ou mais aplicações descritas aqui, uma vez que se aplicam à medicina veterinária.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um meio de bloquear os vários aspectos das respostas imunes aos agentes estranhos ou próprios. Exemplos de doenças ou condições nas quais o bloqueio de determinados aspectos das respostas imunes pode ser desejável incluem transtornos auto-imunes, tais como, lúpus e artrite, bem como respostas imunes às alergias da pele, inflamação, doença dos intestinos, lesão e doenças/transtornos associados aos agentes patogênicos.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como uma terapia para prevenir a proliferação da célula B e secreção de Ig associada às doenças auto-imunes, tais como, púrpura trombocitopênica idiopática, lúpus eritematoso sistêmico e esclerose múltipla.

Em outra modalidade específica, polipeptídeos, anticorpos, polinucleotídeos e/ou agonistas ou antagonistas das proteínas de fusão da presente invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um inibidor de migração da célula B e/ou T nas células endoteliais. Essa atividade interrompe a arquitetura do tecido ou respostas cognatas e é útil, por exemplo, para interromper respostas imunes e bloquear a septicemia.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como uma terapia para hipergamaglobulinemia crônica evidente em doenças, tais como gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS), doença de Waldenstrom, gamopatia monoclonais idiopáticas e plasmacitomas.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados, por exemplo, para inibir quimiotaxia de polipeptídeo e ativação dos macrófagos e seus precursores e dos neutrófilos, basófilos, linfócitos B e alguns subconjuntos de célula T, por exemplo, células T ativadas e citotóxicas CD8 e células exterminadoras naturais, em determinadas doenças auto-imunes, inflamatórias crônicas e infecciosas. Exemplos de doenças auto-imunes são descritos aqui e incluem esclerose múltipla e diabetes insulinodependente.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados também para tratar síndrome hiper-eosinófila idiopática, por exemplo, por prevenção da produção e migração do eosinófilo.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para intensificar ou inibir lise celular mediada por complemento.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para intensificar ou inibir citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para tratamento de aterosclerose, por exemplo, prevenindo infiltração de monócito na parede da artéria.

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar síndrome de angústia respiratória do adulto (ARDS).

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis para estimular cura de ferimentos e tecido, estimulação da angiogênese, e/ou estimulação do cura de doenças ou transtornos vasculares ou linfáticos. Adicionalmente, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para estimular a regeneração das superfícies das mucosas.

Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para diagnosticar, prognosticar, tratar e/ou prevenir um transtorno caracterizado por imunodeficiência primária ou adquirida, produção deficiente de imunoglobulina sérica, infecções recorrentes e/ou disfunção do sistema imune. Além disso, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar ou prevenir infecções das articulações, ossos, pele, e/ou glândulas parótidas, infecções inerentes ao sangue (por exemplo, septicemia, meningite, artrite séptica, e/ou osteomielite), doenças auto-imunes (por exemplo, aquelas reveladas aqui), transtornos inflamatórios, e malignidades, e/ou qualquer doença, transtorno ou condição associada a essas infecções, doenças, transtornos e/ou malignidades) incluindo, porém não limitado a, CVID, outras imunodeficiências primárias, doença de HTV, CLL, bronquite recorrente, sinusite, otite média, conjuntivite, pneumonia, hepatite, meningite, herpes zoster (por exemplo, herpes zoster grave), e/ou Pneumocystis carnii. Outras doenças e transtornos que podem ser prevenidos, diagnosticados, prognosticados e/ou tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a infecção por HIV, infecção por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunção bactericida de fagócito, trombocitopenia e hemoglobinuria.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar e/ou diagnosticar um indivíduo apresentando doença de imunodeficiência variável comum ("CVID"; também conhecida como "agammaglobulinemia adquirida" e "hipogamaglobulemia adquirida") ou um subconjunto dessa doença.

Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar cânceres ou neoplasmas incluindo cânceres relacionados ao tecido imune ou célula imune ou neoplasmas. Exemplos de cânceres ou neoplasmas que podem ser prevenidos, diagnosticados ou tratados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados à leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, doença de Hodgkin, Iinfoma não-Hodgkin, anemia linfocítica aguda, (ALL) Leucemia linfocítica crônica, plasmacitomas, mieloma múltiplo, linfoma de Burkitt, doenças transformadas por EBV, e/ou doenças e transtornos descritos na seção intitulada aqui como "Transtornos Hiperproliferativos".

Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como uma terapia para diminuir proliferação celular dos Iinfomas de célula B grande.

Em outra modalidade específica, proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados como um meio de diminuir o envolvimento das células B e associadas à Ig com leucemia mielógena crônica.

Nas modalidades específicas, as composições da invenção são empregadas como um agente para reforçar respostas imunes entre indivíduos imunodeficientes de célula B, tais como, por exemplo, indivíduos que tenham sofrido esplenectomia parcial ou completa.

Transtornos Relacionados ao Sangue

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregadas para modular a atividade hemostática (a parada do sangramento) ou trombolítica (dissolução de coágulo). Por exemplo, aumentando-se a atividade hemostática ou trombolítica, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser usadas para tratar ou prevenir doenças, transtornos e/ou condições de coagulação sangüínea (por exemplo, afibrinogenemia, deficiências de fator, hemofilia), doenças, transtornos e/ou condições das plaquetas sangüíneas, (por exemplo, trombocitopenia) ou ferimentos resultantes de trauma, cirurgia ou outras causas. Alternativamente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção que podem diminuir a atividade hemostática ou trombolítica poderiam ser usadas para inibir ou dissolver coágulos. Essas moléculas seriam importantes no tratamento ou prevenção dos ataques cardíacos (infarto), acidentes vasculares ou cicatrizes.

Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para prevenir, diagnosticar, prognosticar e/ou tratar trombose, trombose arterial, trombose venosa, tromboembolismo, embolismo pulmonar, aterosclerose, infarto do miocárdio, ataque isquêmico transitório, angina estável. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para prevenção de oclusão de enxertos safenosos para reduzir o risco de trombose periprocedural que pode acompanhar os procedimentos de angioplastia, para reduzir o risco de acidente vascular em pacientes com fibrilação atrial incluindo fibrilação atrial não reumática, para reduzir o risco de embolismo associado às válvulas mecânicas do coração e ou doença das válvulas mitrais. Outros empregos das proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem, porém não estão limitados à prevenção de oclusões nos dispositivos extracorpóreos (por exemplo, cânulas intravasculares, shunts de acesso vascular em pacientes de hemodiálise, máquinas de hemodiálise e máquinas de desvio cardiopulmonar).

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser usados para prevenir, diagnosticar, prognosticar e/ou tratar doenças e transtornos do sangue e/ou órgãos de formação sangüínea associados ao(s) tecido(s) no(s) qual(is) o polipeptídeo da invenção é expresso.

As proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usados para modular a atividade hematopoiética (a formação de hemácias). Por exemplo, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregadas para aumentar a quantidade de todas ou de subconjuntos de células sangüíneas, tais como, eritrócitos, linfócitos (células B ou T), células mielóides (por exemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastóides, macrófagos) e plaquetas. A capacidade de diminuir a quantidade de células sangüíneas ou subconjuntos de células sangüíneas pode ser útil na prevenção, detecção, diagnóstico e/ou tratamento de anemias e Ieucopenias descritas a seguir. Alternativamente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para diminuir a quantidade de todas ou de subconjuntos de células sangüíneas, tais como, por exemplo, eritrócitos, linfócitos (células B ou T), células mielóides (por exemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células mastóides, macrófagos) e plaquetas. A capacidade de diminuir a quantidade de células sangüíneas ou subconjuntos de células sangüíneas pode ser útil na prevenção, detecção, diagnóstico e/ou tratamento de leucocitose, tal como, por exemplo eosinofilia.

As proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para prevenir, tratar ou diagnosticar díscrasias sangüíneas.

As anemias são condições nas quais o número de hemácias ou quantidade de hemoglobina (a proteína que transporta oxigênio) nas quais se encontra abaixo do normal. A anemia pode ser causada por sangramento excessivo, produção de hemácias diminuída ou destruição de hemácias aumentada (hemólise). As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de anemias. As anemias que podem ser tratadas, prevenidas ou diagnosticadas pelas proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem anemia por deficiência de ferro, anemia hipocrômica, anemia microcítica, clorose, anemia sideroblástica, anemia sideroblástica idiopática adquirida, aplasia de hemácia, anemia megaloblástica (por exemplo, anemia perniciosa, (deficiência de vitamina B 12) e anemia por deficiência de ácido fólico, anemia aplástica, anemias hemolíticas (por exemplo, anemia helolítica auto-imune, anemia hemolítica microangiopática e hemoglubinuria paroxística noturna). As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de anemias associadas às doenças incluindo porém não limitado as anemias associadas ao lúpus eritematoso sistêmico, cânceres, linfomas, doença renal crônica e baços aumentados. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de anemias que surgem dos tratamentos medicamentosos tais como anemias associadas aos medicamentos metildopa, dapsona e/ou de sulfa. Adicionalmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de anemias associadas à arquitetura anormal das hemácias incluindo, porém não limitado a esferocitose hereditária, eliptocitose hereditária, deficiência da glicose-6-fosfato desidrogenase, e anemia de célula falsiforme.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de anormalidades da hemoglobina (por exemplo, aquelas associadas à anemia da célula falsiforme, doença da hemoglobina C, doença da hemoglobina S-C e doença da hemoglobina E). Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de talassemias, incluindo, porém não limitado as formas maior e menor da alfa-talassemia e beta-talassemia.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de transtornos de sangramento incluindo, porém não limitado a trombocitopenia (por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática, e púrpura trombocitopênica trombótica), doença de Von Willebrand, transtornos hereditários de plaqueta (por exemplo, doença de depósito de agrupamento, tal como, síndromes de Chediak-Higashi e Hermansky-Pudlak, disfunção de tromboxano A2, tromboastenia e síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítica-urêmica, hemofilias, tais como, hemofilia A ou deficiência de Fator Vll e doença de Christmas ou deficiência de Fator DC1 telangiectasia hemorrágica hereditária, também conhecida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) e coagulação intravascular disseminada.

O efeito das proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção no tempo de coagulação do sangue pode ser monitorado empregando qualquer um dos testes de coagulação conhecido na técnica incluindo, porém não limitado ao tempo de tromboplastina parcial de sangue integral (PTT)1 o tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT), o tempo de coagulação ativado (ACT), o tempo de coagulação ativado de recalcifeito ou o tempo de coagulação Lee-White.

Várias doenças e vários medicamentos podem causar disfunção das plaquetas. Assim, em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de disfunção das plaquetas adquirida, tal como disfunção das plaquetas seguindo-se uma falência renal, leucemia, mieloma múltiplo, cirrose hepática e lúpus eritematoso sistêmico, bem como disfunção das plaquetas associada aos tratamentos medicamentosos, incluindo tratamento com aspirina, ticlopidina, medicamentos antiinflamatórios não esteróides (usados para artrite, dores e entorses) e penicilina em altas doses.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e transtornos caracterizados por ou associados aos números aumentados ou diminuídos de leucócitos. Leucopenia ocorre quando o número de leucócitos cai abaixo do normal. Leucopenias incluem, porém não estão limitadas a neutropenia e linfocitopenia. Um aumento no número de leucócitos em comparação ao normal é conhecido como leucocitose. O corpo gera números aumentados de leucócitos durante a infecção, Assim, a leucocitose pode simplesmente ser um parâmetro fisiológico normal que reflete a infecção. Alternativamente, a leucocitose pode ser um indicador de lesão ou outra doença, tal como câncer. A leucocitose inclui, porém não está limitada á eosinofilia e acúmulos de macrófagos. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento da leucopenia. Em outras modalidades específicas, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento da leucocitose.

A leucopenia pode ser uma diminuição generalizada em todos os tipos de leucócitos ou pode ser um esgotamento especifico de tipos específicos de leucócitos. Assim, nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento da diminuição no número de neutrófilos, conhecido como neutropenia. As neutropenias que podem ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas e/ou tratadas pelas proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitadas a agranulocitose genética infantil, neutropenia familiar, neutropenia cíclica, neutropenias resultantes ou associadas às deficiências de dietas (por exemplo, deficiência de vitamina 12 ou de ácido fólico), neutropenias resultantes ou associadas aos tratamentos medicamentosos (por exemplo, regimes com antibiótico, tais como, tratamento com penicilina, tratamento com sulfonamida, tratamento com anticoagulante, medicamentos anticonvulsivos, medicamentos antitireóide, e quimioterapia para câncer), e neutropenias resultantes da destruição aumentada do neutrófilo que pode ocorrer em associação com algumas infecções bacterianas ou viróticas, transtornos alérgicos, doenças auto-imunes, condições nas quais um indivíduo tem um baço aumentado (por exemplo, síndrome de Felty, malária e sarcoidose) e alguns regimes de tratamento com medicamentos.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de linfocitopenias (números diminuídos de linfócitos B e/ ou T) incluindo, porém não limitado as Iinfocitopenias resultantes ou associadas ao estresse, tratamentos medicamentosos (por exemplo, tratamento medicamentoso com corticosteróides, quimioterapias para câncer e/ou terapias de radiação), infecção por AIDS e/ou outras doenças, tais como, por exemplo, câncer, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, infecções crônicas, algumas infecções viróticas e/ou transtornos hereditários (por exemplo, síndrome de DiGeorge, síndrome de Wiskott-AIdrich, imunodeficiência combinada grave, ataxia telangiectasia).

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e transtornos associados ao número de macrófagos e/ou função dos macrófagos incluindo, porém não limitado a doença de Gaucher, doença de Niemann-Pick, doença de Letterer-Siwe e doença de Hand-Schuller-Christian.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e transtornos associados à quantidade de eosinófilos e/ou função do eosinófilo incluindo, porém não limitado a síndrome hipereosinofílica idiopática, síndrome de eosinofilia-mialgia e doença de Hand-Schuller-Christian.

Ainda em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de Ieucemias e Iinfomas incluindo, porém não limitado à leucemia linfocítica aguda (linfoblástica) (ALL), leucemia mielóide aguda (mielocítica, mielógena, mioblástica ou mielomonocítica), leucemia linfocítica crônica (por exemplo, Ieucemias de célula B, Ieucemias de célula T, síndrome de Sezary e leucemia de célula capilar), leucemia mielocítica crônica (mileóide, mielógena ou granulocítica), Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma não-Hodgkin, linfoma de Burkitt e micose por fungo.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças e transtornos das células plasmócito incluindo, porém não limitado as discrasias da célula plasmócito, discrasias de célula plasmócito, gamopatias monoclonais, gamopatias monoclonais de significado indeterminado, mieloma múltiplo, macroglobulinemia, macroglobulinemia de 20 Waldenstrom, crioglobulinemia, e fenômeno de Raynaud.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de transtornos mieloproliferativos, incluindo porém não limitado a, policitemia vera, policitemia relativa, policitemia secundária, mielofibrose, mielofíbrose aguda, metaplasia mielóide agnogênica, trombocitemia, (incluindo ambas trombocitemia primária e secundária) e leucemia mielocítica crônica.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um tratamento antes da cirurgia, para aumentar produção de células sangüíneas.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um agente para melhorar a migração, fagocitose, produção de superóxido, citotoxícidade celular dependente de anticorpo dos neutrófilos, eosinófilos e macrófagos.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um agente para aumentar o número de células tronco em circulação antes da ferese das células tronco. Em outra modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um agente para aumentar o número de células tronco em circulação antes da ferese das plaquetas.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um agente para aumentar a produção de citocína.

Em outras modalidades, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis na prevenção, diagnóstico e/ou tratamento dos transtornos hematopoiéticos primários.

Transtornos hiperproliferativos

Em determinadas modalidades, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usadas para tratar ou detectar transtornos hiperproliferativos, incluindo neoplasmas. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem exibir a proliferação do transtorno através de interações diretas ou indiretas. Alternativamente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem proliferam outras células que podem inibir o transtorno hiperproliferativo.

Por exemplo, aumentando-se uma resposta imune, especificamente aumentandose as qualidades antigênicas do transtorno hiperproliferativo ou por proliferação, diferenciação ou mobilização das células T, os transtornos hiperproliferativos podem ser tratados. Essa resposta imune pode ser aumentada tanto por melhora de uma resposta imune existente ou por início de uma nova resposta imune. Alternativamente, a diminuição de uma resposta imune pode também ser um método para tratamento dos transtornos hiperproliferativos, tais como um agente quimioterapêutico.

Exemplos de transtornos hiperproliferativos que podem ser tratados ou detectados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados aos neoplasmas localizados no: cólon, abdômen, ossos, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olhos, cabeça e pescoço, nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvis, pele, tecido mole, baço, tórax e trato urogenital.

De modo semelhante, outros transtornos hiperproliferativos podem também ser tratados ou detectados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Exemplos de tais transtornos hiperproliferativos incluem, porém não estão limitados a leucemia linfoblástica aguda da infância, leucemia linfoblástica aguda, Ieucemina linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma adrenocortical, câncer hepatocelular (primário) do adulto, câncer hepático (primário) do adulto, leucemia linfocítica aguda do adulto, leucemia mielóide aguda do adulto, doença de Hodgkin do adulto, Iinfoma de Hodgkin do adulto, Iinfoma não-Hodgkin do adulto, leucemia linfocítica do adulto, Iinfoma não Hodgkin do adulto, câncer hepático primário do adulto, sarcoma do tecido mole de adulto, Iinfoma relacionado a AIDS, malignidades relacionadas à AIDS, câncer anal, astrocitoma, câncer do duto biliar, câncer da bexiga, câncer dos ossos, glioma tronco encefálico, tumores do cérebro, câncer de mama, câncer da pélvis renal e uretra, Iinfoma do sistema nervoso central (primário), linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, câncer cervical, câncer hepatocelular (primário) da infância, câncer hepático da infância (primário), leucemia linfoblástica aguda da infância, leucemia mielóide aguda da infância, glioma tronco encefálico da infância, astrocitoma cerebelar da infância, astrocitoma cerebral da infância, tumores da célula germinativa extra cranianos da infância, doença de Hodgkin da infância, linfoma de Hodgkin da infância, glioma da via visual e hipotalâmica da infância, leucemia linfoblástica da infância, medulo blastoma da infância, Iinfoma não Hodgkin da infância, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais e pineais da infância, câncer hepático primário da infância, rabdomiosarcoma da infância, sarcoma do tecido mole da infância, gioma da via visual e hipotalâmica da infância, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, câncer de cólon, linfoma cutâneo de célula T, carcinoma de célula de ilhota endócrino do pâncreas, câncer endometrial, ependimoma, câncer epitelial, câncer esofageano, sarcoma de Ewing e tumores correlatos, câncer pancreático exócrino, tumor de célula germinativa extracraniana, tumor de célula germinativa extragonadal, câncer do duto biliar extra-hepático, câncer dos olhos, câncer de mama, doença de Gaucher, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinóide gastrintestinal, tumores gastrintestinais, tumores de células germinativas, tumor trofoblástico gestacional, leucemia da célula capilar, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular, doença de Hodgkin, Iinfoma de Hodgkin, hipergamaglobulinemia, câncer hipofaríngeo, cânceres intestinais, melanoma intra-ocultar, carcinoma da célula de ilhota, câncer pancreático da célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, câncer laríngeo, câncer dos lábios e cavidade oral, câncer hepático, câncer pulmonar, transtornos linfoproliferativos, macroblobulinemia, câncer de mama nos homens, mesotelioma maligno, timona maligno, medulo blastoma, melanoma, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso primário, oculto, metastático, câncer de pescoço escamoso, primário, metastático, câncer de pescoço escamoso metastático, mieloma múltiplo, mieloma múltiplo/neoplasma de célula plasmócito, síndrome mielodisplástica, leucemia mielógena, leucemia mielóide, transtornos mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal e seio paranasal, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, Iinfoma não Hodgkin durante gravidez, câncer de pele não melanoma, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer de pescoço escamoso, metastático, primário, oculto, câncer orofaríngeo, sarcoma ósteo-maligno fibroso, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno dos ossos, câncer epitelial ovariano, tumor de célula germinativa ovariana, tumor em potencial de malignidade baixa ovariano, câncer pancreático, paraproteinemias, púrpura, câncer para paratireóide, câncer do pênis, feocromocitoma, tumor da pituitária, neoplasma de célula plasmócito/mieloma múltiplo, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer hepático primário, câncer da próstata, câncer retal, câncer de célula renal, câncer da pélvis renal e uretra, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, câncer das glândulas salivares, sarcoma sarcoidose, síndrome de Sezary, câncer da pele, câncer pulmonar de célula pequena, câncer do intestino delgado, sarcoma do tecido mole, câncer escamoso do pescoço, câncer do estômago, tumores neuroectodérmicos e pineais primitivos supersensoriais, linfoma de célula T, câncer testicular, timoma, câncer da tireóide, câncer de célula da pélvis renal e uretra transitório, câncer da pélvis renal e uretra transitório, tumores trofoblásticos, câncer da célula da pélvis renal e uretra, câncer da uretra, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer vaginal, glioma da via visual e hipotalâmica, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilm e qualquer outra doença hiperproliferativa além da neoplasia, localizada em um sistema de órgão listado acima.

Em outra modalidade preferida, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar condições pré-malígnas e para prevenir progressão a um estado neoplásico ou maligno, incluindo porém não limitado aos transtornos descritos aqui acima. Tais usos são indicados nas condições conhecidas ou suspeitas de precederem a progressão para neoplasia ou câncer, especificamente, quando o desenvolvimento não neoplásico da célula consistindo em hiperplasia, metaplasia ou mais especificamente, displasia tenha ocorrido (para revisão de tais condições de desenvolvimento anormais vide Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79.)

A hiperplasia é uma forma de proliferação celular controlada, envolvendo um aumento no número de células em um tecido ou órgão, sem alteração significativa na estrutura ou função. Os transtornos hiperplásicos que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos e/ou tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a hiperplasia dos linfonodos mediastinais angiofolicular, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de célula basal, hiperplasia de linfonodos gigantes benigna, hiperplasia do cimento, hiperplasia congênita da supra-renal, hiperplasia congênita sebácea, hiperplasia cística, hiperplasia cística da mama, hiperplasia fibrosa inflamatória, hiperplasia ductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial focai, hiperplasia gengival, hiperplasia fibrose inflamatória, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia da próstata nodular, hiperplasia regenerativa nodular, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperplasia sebácea senil e hiperplasia verrucosa.

A metaplasia é uma forma de desenvolvimento de célula controlado onde um tipo de célula adulta ou completamente diferenciada substitui outro tipo de célula adulta. Os transtornos metaplásicos que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos e/ou tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a metaplasia mielóide agnogênica, metaplasia apócrina, metaplasia atípica, metaplasia autoparenquimatosa, metaplasia de tecido conjuntivo, metaplasia epitelial, metaplasia intestinal, anemia metaplásica, ossificação metaplásica, pólipos metaplásicos, metaplasia mielóide, metaplasia mielóide primária, metaplasia mielóide secundária, metaplasia escamosa, metaplasia escamosa de âmnio e metaplasia mielóide sintomática.

A displasia é freqüentemente uma forma de câncer e é encontrada principalmente nos epitélios; ela é a forma mais desordenada de desenvolvimento da célula não neoplásica, envolvendo a perda de uniformidade da célula individual e na orientação arquitetônica das células. As células displástcas freqüentemente possuem núcleos anormalmente grandes, profundamente corados e exibem pleomorfismo. A displasia ocorre, caracteristicamente, onde existe irritação crônica ou inflamação. Os transtornos displásicos que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos e/ou tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados a displasia anidrótica ectodérmica, displasia anterofacial, displasia toráxica asfixiante, displasia atriodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraniana, displasia congênita ectodérmica, displasia craniodiafisária, displasia craniocarptársica, displasia craniometafisária, displasia da dentina, displasia diafisária, displasia ectodérmica, displasia do esmalte, displasia encéfalo-oftálmica, displasia epifisária hemimélica, displasia epifisária múltipla, displasia epifisária pontilhada, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital, displasia fibrosa familiar das mandíbulas, displasia pregueada branca familiar, displasia fibromuscular, displasia fibrosa do osso, displasia óssea florida, displasia renal-retinal hereditária, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipoidrótica, displasia tímica linfopênica, displasia mamária, displasia mandibulofacial, displasia metafisária, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mucoepitelial, displasia epifisária múltipla, displasia oculoauriculovertebral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasia odontogênica, displasia oftalmomandibulomélica, displasia de cimento periapical, displasia poliostótica fibrosa, displasia espondiloepifisária pseudo-acondoplástica, displasia retinal, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisáia e displasia ventriculradial.

Transtornos pré-neoplásicos adicionais que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos, e/ou tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados aos transtornos disproliferativos benignos (por exemplo, tumores benignos, condições fibrocísticas, hipertrofia do tecido, pólipos intestinais, pólipos do cólon e displasias esofágicas), leucoplasia, cetaroses, doença de Bowen, doença de pele de Farmer, queilitie e ceratose solar.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para diagnosticar e/ou prognosticar transtornos associados ao(s) tecido(s) no(s) qual(is) o polipeptídeo da invenção é expresso.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção conjugados a uma toxina ou um isótopo radioativo, conforme descrito aqui podem ser empregados para tratar cânceres e neoplasmas, incluindo, porém não limitado aos descritos aqui. Em uma modalidade adicionalmente preferida, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção conjugados a toxina ou um isótopo radioativo, conforme descrito aqui podem ser empregados para tratar leucemia mielógena aguda.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem afetar a apoptose e, portanto seriam úteis no tratamento de inúmeras doenças associadas a sobrevivência celular aumentada ou a inibição da apoptose. Por exemplo, doenças associadas a sobrevivência celular aumentada ou a inibição da apoptose que poderiam ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas e/ou tratadas pelos polinucleotídeos, polipeptídeos, e/ou agonistas ou antagonistas da invenção, incluem cânceres (tais como, linfoma foliculares, carcinomas com mutações de p53, and tumores hormônio dependentes, incluindo, porém não limitado ao câncer de cólon, tumores cardíacos, câncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, câncer de pulmão, câncer intestinal, câncer testicular, câncer de estômago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, câncer de mama, câncer de próstata, sarcoma de Kaposi e câncer ovariano); transtornos auto-imunes tais como, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, tiroidite de Hashimoto, cirrose biliar, doença de Behcet, doença de Crohn, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite relacionada ao sistema imune and artrite reumatóide) e infecções viróticas (tais como, herpes vírus, pox vírus e adenovírus), inflamação, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição aguda ao enxerto e rejeição crônica ao enxerto.

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para inibir o desenvolvimento, progressão e/ou metástase dos cânceres, especificamente aqueles listados acima.

Doenças ou condições adicionais associadas à sobrevivência aumentada que poderiam ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas e/ou tratadas pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem, porém não estão limitadas a progressão e/ou metástases de malignidades e transtornos relacionados, tais como, leucemia, incluindo leucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e leucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia vera, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença não-Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e tumores sólidos incluindo, porém não limitado aos sarcomas e carcinomas, tais como, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcínomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, atrocitoma, medulo blastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

As doenças associadas à apoptose aumentada que poderiam ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas e/ou tratadas pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem AIDS; transtornos neurodegenerativos (tais como, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, degeneração cerebelar e tumor cerebral ou doença prévia associada); transtornos auto-imunes (tais como, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, tiroidite de Hashimoto1 cirrose biliar, doença de Behcet1 doença de Crohn, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite relacionada ao sistema imune e artrite reumatóide) síndromes de mielodisplasia (tais como, anemia aplástica), doença de enxerto versus hospedeiro, lesão isquêmica (tal como, aquela causada por infarto do miocárdio, acidente vascular e lesão por reperfusão), lesão hepática (por exemplo, lesão hepática relacionada à hepatite, lesão por isquemia/reperfusão, colestose (lesão do duto biliar) e câncer hepático); doença hepática induzida por toxina (tal como aquela causada por álcool), choque séptico, caquexia e anorexia.

Doenças hiperproliferativas e/ou transtornos que poderiam ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos e/ou tratados por proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem, porém não estão limitados aos neoplasmas localizados no fígado, abdômen, ossos, mama, sistema digestivo, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olhos, coração e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvis, pele, tecido mole, baço, tórax e trato urogenital.

De modo semelhante, outros transtornos hiperproliferativos também podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos, e/ou tratados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Exemplos de tais transtornos hiperproliferativos incluem, porém não estão limitados a hipergamaglobulinemia, transtornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, doença de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença hiperproliferativa, além da neoplasia, localizada em um sistema de órgão listado acima.

Outra modalidade preferimentoutiliza polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção para inibir divisão celular aberrante por terapia gênica empregando a presente invenção e/ou fusões de proteínas ou fragmentos das mesmas.

Assim, a presente invenção obtém um método para tratamento de transtornos proliferativos celulares por inserção na célula de proliferação anormal de um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, pelo que o dito polinucleotídeo reprime a dita expressão.

Outra modalidade da presente invenção obtém um método para tratamento de transtornos proliferativos celulares em indivíduos compreendendo administração de uma ou mais cópias de gene ativas da presente invenção a uma célula ou células de proliferação anormal. Em uma modalidade preferida, os polinucleotídeos da presente invenção constituem uma construção de DNA compreendendo um vetor de expressão recombinante eficaz na expressão de uma seqüência de DNA codificando os ditos polinucleotídeos. Em outra modalidade preferimentoda presente invenção, a construção de DNA codificando a proteína de fusão da presente invenção é inserida nas células a serem tratadas empregando um retrovírus ou mais preferível mente um vetor adenoviral (vide G J. Nabel, e outros, PNAS 1999 96: 324-326, que é incorporado aqui como referência). Em uma modalidade mais preferida, o vetor virótico é defeituoso e não transformará as células de não proliferação, apenas as células de proliferação. Além disso, em uma modalidade preferida, os polinucleotídeos da presente invenção inseridos nas células de proliferação tanto sozinhos quanto em combinação ou fundidos a outros polinucleotídeos, podem então ser modulados através de estímulos externos (isto é, magnéticos, de molécula pequena específica, químicas ou administração de medicamento, etc.), que atuam mediante a corrente a jusante do promotor dos ditos polinucleotídeos para induzir expressão do produto de proteína codificado. Como tal, o efeito terapêutico benéfico da presente invenção pode ser modulado expressamente (isto é, para aumentar, diminuir ou inibir a expressão da presente invenção) com base nos estímulos externos.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser úteis na repressão da expressão dos genes ou antígenos oncogênicos. "Repressão da expressão dos genes oncogênicos" se destina a suprimir a transcrição do gene, a degradação da transcrição gênica (RNA pré-mensageiro), a inibição da recomposição, a destruição do RNA mensageiro, a prevenção das modificações pós-translacionais da proteína, a destruição da proteína ou a inibição da função normal da proteína.

Para administração local às células de proliferação anormal, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser administrados por qualquer método conhecido dos versados na técnica incluindo, porém não limitado a transfecção, eletroporação, microinjeção de células ou em veículos, tais como lipossomas, lipofectina ou como polinucleotídeos nus ou qualquer outro método descrito através do relatório descritivo. O polinucleotídeo da presente invenção pode ser distribuído por sistemas de distribuição de gene conhecidos, tais como, porém não limitado aos vetores retroviróticos (Gilboa, J. Virology 44:845 (1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilson, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:3014), sistema do vírus vacínia (Chakrabarty e outros, Mol. Cell Biol. 5:3403 (1985) ou outros sistemas de liberação de DNA eficazes (Yates e outros, Nature 313:812 (1985)) conhecidos dos versados na técnica. Essas citações são apenas exemplares e são incorporadas aqui como referência. De modo a liberar especificamente ou transfectar as células que proliferam anormalmente e substituir células de não divisão, é preferido utilizar um sistema de liberação de retrovírus ou adenovírus (conforme descrito na técnica e aqui) conhecido dos versados na técnica. Uma vez que a replicação do DNA hospedeiro é necessária para que o DNA do retrovírus se integre e o retrovírus será incapaz de auto replicar devido à falta dos genes de retrovírus necessários ao seu ciclo de vida. A utilização de tal sistema de liberação de retrovírus aos polinucleotídeos da presente invenção alvejará os ditos gene e construções para proliferação celular anormal e substituirá as células normais de não divisão.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser liberados diretamente aos sítios de transtorno/doença proliferativa celular nos órgãos internos, cavidades dos órgãos e semelhantes por emprego de um dispositivo de imageamento usado para guiar uma agulha de injeção diretamente ao sítio da doença. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser administrados aos sítios da doença ao mesmo tempo da intervenção cirúrgica.

"Doença proliferativa celular" significa qualquer doença ou transtorno animal ou humano, que afeta qualquer um ou qualquer combinação de órgãos, cavidades ou partes do corpo que é caracterizado por proliferações celulares anormais locais simples ou múltiplas, grupos de células ou tecidos, se benignos ou malignos.

Qualquer quantidade de polinucleotídeos da presente invenção pode ser administrada, à medida que tenha um efeito inibidor biológico na proliferação das células tratadas. Além disso, é possível administrar mais de um polinucleotídeo da presente invenção simultaneamente ao mesmo sítio. "Inibição biológica" significa inibição parcial ou total do desenvolvimento, bem como diminuição na taxa de proliferação ou desenvolvimento das células. A dose biologicamente inibidora pode ser determinada por avaliação dos efeitos dos polinucleotídeos da presente invenção no desenvolvimento proliferativo celular maligno ou anormal alvo, desenvolvimento de tumor em animais e culturas celulares ou qualquer outro método conhecido do versado na técnica comum.

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção da presente invenção são úteis para inibição da angiogênese das células ou tecidos proliferativos, tanto sozinhos, como uma proteína de fusão ou em combinação direta ou indireta com outros polipeptídeos, conforme descrito aqui. Em uma modalidade mais preferida, o efeito de antiangionêse pode ser obtido indiretamente, por exemplo, través da inibição das células específicas de tumor, hematopoiéticas, tais como, macrófagos associados ao tumor (vide Joseph IB, e outros J Natl Câncer Inst, 90(21): 1648-53 (1998), que é incorporado aqui como referência).

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis na inibição das células ou tecidos proliferativos através da indução da apoptose. Essas proteínas de fusão e/ou polinucleotídeos podem atuar tanto direta quanto indiretamente para induzir apoptose das células e tecidos proliferativos, por exemplo, na ativação de um receptor de domínio-extermínio, tal como um receptor-1 de fator de necrose tumoral (TNF), CD95 (Fas/APO-1), proteína mediada por apoptose relacionada ao receptor de TNF (TRAMP) e receptor-1 e 2 de ligante de indução de apoptose (TRAIL)relacionado ao TNF (vide Schulze-Osthoff K, e outros, Eur J Biochem 254(3):439-59 (1998), que é incorporado aqui como referência). Além disso, em outra modalidade preferimentoda presente invenção, essas proteínas de fusão e/ou polinucleotídeos podem induzir apoptose através de outros mecanismos, tais como, na ativação de outras proteínas que ativaram a apoptose ou através do estímulo a expressão dessas proteínas, tanto sozinho quando em combinação com medicamentos ou adjuvantes de molécula pequena, tais como, apoptonina, galectinas, tioredoxinas, proteínas antiinflamatórias (vide, por exemplo, Mutat Res 400(l-2):447-55 (1998), Med Hypotheses. 50(5):423-33 (1998), Chem Biol Interact. 24 de abril; 111-112:23-34 (1998), J Mol Med.76(6):402-12 (1998), Int J Tissue React; 20(l):3-15 (1998), que são todos incorporados aqui como referência).

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são úteis na inibição da metástase das células ou tecidos proliferativos. A inibição pode ocorrer como um resultado direto da administração dessas proteínas de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos ou indiretamente, tal como ativação da expressão das proteínas conhecidas para inibir a metástase, por exemplo, integrinas alfa 4, (vide, por exemplo, Curr Top Microbiol Immunol 1998; 231:125-41, que é incorporado aqui como referência). Tais efeitos terapêuticos da presente invenção podem ser obtidos tanto sozinhos quanto em combinação com medicamentos de molécula pequena ou adjuvantes.

Em outra modalidade, a invenção obtém um método para distribuição de composições contendo as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção para células alvejadas expressando o polipeptídeo ligado por, que se liga a ou associa a uma proteína de fusão da albumina da invenção. As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser associadas aos polipeptídeos heterólogos, ácidos nucléicos heterólogos, toxinas ou promedicamentos através de interações hidrófobas, hidrófilas, iônicas e/ou covalentes.

As proteínas de fusão da albumina da invenção são úteis para melhorar a imunogenicidade e/ou antigenicidade das células ou tecidos de proliferação, tanto diretamente, tal como ocorreria se as proteínas de fusão da albumina da invenção "vacinassem" a resposta imune para responder aos antígenos e imunógenos proliferativos ou indiretamente, tal como na ativação da expressão das proteínas conhecidas por melhorarem a resposta imune (por exemplo, quimiocinas) em relação aos ditos antígenos e imunógenos.

Transtornos Renais

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar transtornos do sistema renal. Os transtornos renais que podem ser diagnosticados, prognosticados, prevenidos, e/ou tratados com as composições da invenção incluem, porém não estão limitados a falência renal, nefrite, transtornos dos vasos sangüíneos dos rins, transtornos metabólicos e congênitos dos rins, transtornos urinários dos rins, transtornos auto-imunes, esclerose e necrose, desequilíbrio de eletrólitos e cânceres renais.

As doenças renais que podem ser diagnosticadas, prognosticadas, prevenidas, e/ou tratadas com as composições da invenção incluem, porém não estão limitados a falência renal aguda, falência renal crônica, falência renal ateroembólica, doença renal em estágio final, doenças renais inflamatórias (por exemplo, glomerulonefrite aguda, glomerulonefrite pós-infecciosa, glomerulonefrite de progressão rápida, síndrome nefrótica, glomerulonefrite membranosa, síndrome nefrótica familiar, glomerulonefrite I e II proliferativa de membrana, glomerulonefrite proliferativa mesangial, glomerulonefrite crônica, nefrite tubulointesticial aguda, nefrite tubulointersticial crônica, glomerulonefrite pós-estreptococos aguda (PSGN), pielonefrite, lúpus nefrite, nefrite crônica, nefrite intersticial e glomerulonefrite pós-estreptococos), transtornos dos vasos sangüíneos renais (por exemplo, infarto renal, doença ateroembólica renal, necrose cortical, nefroesclerose maligna, trombose da veia renal, subperfusão renal, retinopatia renal, isquemia-reperfusão renal, embolismo da artéria renal, e estenose da artéria renal) e transtornos renais resultantes de doença do trato urinário (por exemplo, pielonefrite, hidronefrose, urolitíase (litíase renal, nefrolitíase), nefropatia de refluxo, infecções do trato urinário, retenção urinária, uropatia obstrutiva unilateral aguda ou crônica).

Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar transtornos metabólicos e congênitos dos rins (por exemplo, uremia, amiloidose renal, osteodistrofia renal, acidose tubular renal, glicosuria renal, diabetes insípido nefrogênico, cistínuria, síndrome de Fanconi, osteose fíbrocística renal (raquitismo renal), doença de Hartnup, síndrome de Bartller, síndrome de Liddle, doença renal policística, doença cística medular, rins esponjosos medulares, síndrome de Alport, síndrome da unha-patela, síndrome nefrótica congênita, síndrome de CRUSH, rim em forma de ferradura nefropatia diabética, diabete insípida nefrogênica, nefropatia analgésica, pedra nos rins e nefropatia membranosa), além de transtornos auto-imunes dos rins (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de Goodpasture, nefropatia por IgA e glomerulonefrite proliferativa mesangial por IgM).

As composições da invenção também podem ser empregadas para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar transtornos escleróticos ou necróticos dos rins (por exemplo, glomeruloesclerose, nefropatia diabética, glomeruloesclerose segmentai focai (FSGS), glomerulonefrite necrozante e necrose papilar renal), cânceres renais (por exemplo, nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, câncer da célula renal, câncer da célula transitória, adenocarcinoma renal, câncer de célula escamosa e tumor de Wilm) além de desequilíbrios dos eletrólitos (por exemplo, nefrocalcinose, piúria, edema, hidronefrite, proteinúria, hiponatremia, hipernatremia, hipocalemia, hipercalemia, hipocalcemia, hipercalcemia, hipofosfatemia e hiperfosfatemia).

As composições da invenção podem ser administradas empregando qualquer método conhecido na arte incluindo, porém não limitado a injeção direta por agulha no sítio de distribuição, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, injetores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de espuma-gel, outros materiais de depósito disponíveis comercialmente, bombas osmóticas, formulações farmacêuticas orais ou sólidas para supositório, decantação ou aplicações tópicas durante a cirurgia, distribuição em aerossol. Tais métodos são conhecidos na técnica. As composições da invenção podem ser administradas como parte de uma Terapêutica descrita em maiores detalhes aqui a seguir. Os métodos para distribuição dos polinucleotídeos da invenção são descritos aqui em maiores detalhes.

Transtornos Cardiovasculares

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar transtornos cardiovasculares, incluindo, porém não limitado a doença da artéria periférica, tais como, isquemia dos membros.

Os transtornos cardiovasculares incluem, porém não limitados às anormalidades cardiovasculares, tais como, fístula artério-arterial, fístula arteriovenosa, má formação da artéria cerebral, defeitos cardíacos congênitos, atresia pulmonar e síndrome de Scimitar. Os defeitos cardíacos congênitos incluem, porém não estão limitados a coarctação aórtica, cor triatriatum, anormalidades dos vasos coronarianos, coração entrecruzado, dextrocardia, persistência do canal arterial, anormalidade de Ebstein, complexo de Eisenmenger, síndrome do coração esquerdo hipoplástica, levocardia, tetralogia de Fallot1 transposição dos vasos maiores, ventrículo direito de saída dupla, atresia da tricúspide, artério tronco persistente e defeitos do septo coronário, tais como, defeito do septo aortopulmonar, defeitos do coxim endocárdico, síndrome de Lutembacher, trilogia de Fallot, defeito do septo intraventricular.

Transtornos cardiovasculares também incluem, porém não estão limitados à doenças do coração, tais como, arritmias, doença carcinóide do coração, saída cardíaca alta, saída cardíaca baixa, tampão cardíaco, endocardite (incluindo bacteriana), aneurisma do coração, parada cardíaca, falência cardíaca congestiva, cardiomiopatia congestiva, dispnéia paroxística, edema cardíaco, hipertrofia do coração, cardiomiopatia congestiva, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, ruptura do coração pós-infarto, ruptura do septo intraventricular, doenças das válvulas do coração, doenças do miocárdio, isquemia do miocárdio, efusão pericardial, pericardite (incluindo obstrutiva e tuberculosa), pneumopericárdio, síndrome pós-pericardiotomia, doença cardíaca pulmonar, doença cardíaca reumática, disfunção ventricular, hiperemia, complicações cardiovasculares na gravidez, síndrome de Scimitar, sífilis cardiovascular e tuberculose cardiovascular.

Arritmias incluem, porém não estão limitadas a arritmia do sino, fibrilação atrial, atrial flutuador, bradicardia, extra-sistólica, síndrome de Adams-Stokes1 bloco de ramificação em feixe, bloco sinoatrial, síndrome de QT longa, para sistólica, síndrome de Lown-Ganong-Vevine, síndrome de pré-excitação do tipo Mahaim, síndrome de Wolff-parkinson-White, síndrome do seio doente, taquicardias e fibrilação ventricular. Taquicardias incluem taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal atrioventricular, taquicardia ectópica atrial, taquicardia ectópica juncional, taquicardia de reentrada sinoatrial nodal, taquicardia do sino, Torsades de Pointes e taquicardia ventricular.

Doenças da válvula do coração incluem, porém não estão limitadas a insuficiência da válvula aórtica, estenose da válvula aórtica, sopros, prolapso da válvula aórtica, prolapso da válvula mitral, prolápso da válvula tricúspide, insuficiência da válvula mitral, estenose da válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, estenose da válvula pulmonar, atresia da tricúspide, insuficiência da válvula tricúspide e estenose da válvula tricúspide.

Doenças do miocárdio incluem, porém não estão limitadas a cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia congestiva, cardiomiopatia hipertrófica, estenose subvalvular aórtica, estenose subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia de Chagas, fibroelastose endocardíaca, fibrose endomiocardíaca, síndrome de Kearns, lesão por reperfusão miocardíaca e miocardite.

Isquemias miocárdicas incluem, porém não estão limitadas às doenças coronarianas, tais como, angina pectoris, aneurisma coronário, arteroesclerose coronária, trombose coronária, vasoespasmo coronário, infarto do miocárdio e atordoamento miocardíaco.

Doenças cardiovasculares também incluem doenças vasculares, tais como, aneurismas, angiodisplasia, angiomatose, angiomatose bacilar, doença de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, doenças aórticas, arterite de Takayasu, aortite, síndrome de Leriche, doenças arterianas oclusivas, arterite, enarterite, poliarterite nodosa, transtornos cerebrovasculares, angiopatias diabéticas, retinopatia diabética, embolismos, trombose, eritromelalgia, hemorróidas, doença veno-oclusiva hepática, hipertensão, hipotensão, isquemia, doenças vasculares periféricas, flebite, doença veno-oclusiva pulmonar, doença de Raynaud, síndrome CREST, oclusão da veia retinal, síndrome de Scimitar, síndrome da veia cava superior, telangiectasia, atacia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditária, varicocele, veias de varicose, úlcera por varicose, vasculite e insuficiência venosa.

Os aneurismas incluem, porém não estão limitados aos aneurismas dissecantes, falsos aneurismas, aneurismas infectados, aneurismas rompidos, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrais, aneurismas coronários, aneurismas do coração e aneurismas ilíacos.

Doenças oclusivas arteriais incluem, porém não estão limitadas a aterosclerose, claudicação intermitente, estenose carótida, displasias fibromusculares, oclusão vascular mesentérica, doença Moyamoya, obstrução da artéria renal, oclusão da artéria retinal e tromboangeíte obliterante.

Transtornos cerebrovasculares incluem, porém não estão limitados as doenças da artéria carótida, angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, má formação arteriovenosa cerebral, doenças da artéria cerebral, embolismo e trombose cerebrais, trombose da artéria carótida, trombose do seio, síndrome de Walemberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnóide, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluindo transitória), síndrome do roubo subclávio, Ieucomalacia periventricular, dor de cabeça vascular, dor de cabeça em salvas, enxaqueca e insuficiência vertebrobasilar.

Embolismos incluem, porém não estão limitados aos embolismos de ar, embolismos de fluido amniótico, embolismos de colesterol, síndrome do dedo azul, embolismos de gordura, embolismos pulmonares e tromboembolismos. A trombose inclui, porém não está limitada à trombose coronária, trombose da veia hepática, oclusão da veia retinal, trombose da artéria carótida, trombose do sino, síndrome de Wilenberg e tromboflebite.

Transtornos isquêmicos incluem, porém não estão limitados à isquemia cerebral, colite esquêmica, síndromes de compartimento, síndrome de compartimento anterior, isquemia miocárdica, lesões por reperfusão e isquemia periférica do membro. As vasculites incluem, porém não estão limitadas a aortite, arterite, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-Strauss, síndrome do Iinfonodo micocutâneo, tromboangite obliterante, vasculite por hipersensibilidade, Schoenlein-Henoch púrpura, vasculite cutânea alérgica e granulomatose de Wegener.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser administradas empregando qualquer método conhecido na arte, incluindo, porém não limitado a injeção direta por agulha no sítio de distribuição, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, injetores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de espumagel, outros materiais de depósito disponíveis comercialmente, bombas osmóticas, formulações farmacêuticas orais ou sólidas para supositório, decantação ou aplicações tópicas durante a cirurgia, distribuição em aerossol. Tais métodos são conhecidos na técnica. Os métodos para distribuição dos polinucleotídeos da invenção são descritos aqui em maiores detalhes.

Transtornos Respiratórios

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar doenças e/ou transtornos do sistema respiratório.

Doenças e transtornos do sistema respiratório incluem, porém não estão limitados à vestibulite nasal, rinite não alérgica (por exemplo, rinite aguda, rinite crônica, rinite atrófica, rinite vasomotora), pólipos nasais e sinusite, angiofibromas juvenis, câncer de papilomas do nariz e juvenis, pólipos das cordas vocais, nódulos (nódulos de Singer), úlceras de contato, paralisia das cordas vocais, laringoceles, faringite (por exemplo, viral e bacteriana), tonsilite, celular tonsillar, abscesso parafaríngeno, laringite, laringoceles e cânceres da garganta (por exemplo, câncer nasofaríngeo, câncer de tonsil, câncer da laringe), câncer do pulmão (por exemplo, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula pequena (célula de oat), carcinoma de célula grande e adenocarcinoma), transtornos alérgicos (pneumonia eosinófila, pneumonite por hipersensibilidade (por exemplo, alveolite alérgica extrínseca, pneumonite intersticial alérgica, pneumoconiose orgânica por pó, aspergilose broncopulmonar alérgica, asma, granulomatose de Wegener (vasculite granulomatosa), síndrome de Goodpasture)), pneumonia (por exemplo, pneumonia bacteriana (por exemplo,Streptococcus pneumoniae (pneumonia pneumocócica), Staphylocoeeus aureus (pneumonia esfatilocócica), pneumonia bacteriana gram negativa (causada, por exemplo, por Klebsiella e Pseudomas spp.), pneumonia causada por Mycoplasma pneumoniae, pneumonia causada por Hemophilus influenzae, Legionella pneumophila (doença de Legionnaires) e Chlamydia psittaci (Psitacose)), além de pneumonia virótica (por exemplo, influenza e varicela).

Doenças e transtornos adicionais do sistema respiratório incluem, porém não estão limitados à bronquiolite, pólio (poliomielite), crupe, infecção virótica sincicial respiratória, caxumba, eritema infeccioso (quinta doença), exantema súbito, panencefalite por rubéola progressiva, rubéola e panencefalite esclerosante subaguda), pneumonia por fungos (por exemplo, histoplasmose, cocidioidomicose, blastisomicose, infecções por fungos em pessoas com os sistemas imunes gravemente inibidos (por exemplo, criptocose, causada por Cryptococcus neoformans; aspergilose, causada por Aspergillus spp.; candidíase, causada por Candida; e mucormicose)), Pneumocystis carinii (pneumonia causada por pneumócito), pneumonias atípicas (causadas por exemplo, por Mycoplasma e Chlamydia spp.), pneumonia infecciosa oportunista, pneumonia nosocomial, pneumonite química e pneumonia por aspiração, transtornos pleurais (por exemplo, pleurisia, efusão pleural e pneumotórax (por exemplo, pneumotórax espontâneo simples, pneumotórax espontâneo complicado, pneumotórax por tensão)), doenças obstrutivas das vias aéreas (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)1 enfisema, bronquite crônica ou aguda) doenças pulmonares ocupacionais (por exemplo, silicone, pulmão negro (pneumoconiose de trabalhadores de carvão), asbestose, beriliose, asma ocupacional, bissinose e pneumoconioses benignas), doença infiltrativa dos pulmões (por exemplo, fibrose pulmonar (por exemplo, alveolite por fibrose, pneumonia intersticial comum), fibrose idiopática pulmonar, pneumonia intersticial descamativa, pneumonia intersticial linfóide, histiocitose X (por exemplo, doença de Letterer-Siwe, doença de Hand-Schüller-Christian, granuloma eosinófilo) hemosiderose idiopática pulmonar, sarcoidose e proteinose alveolar pulmonar), síndrome de angústia respiratória aguda (também denominada, por exemplo, síndrome de angústia respiratória do adulto), edema, embolismo pulmonar, bronquite (por exemplo, virótica, bacteriana), bronquiectase, atelectase, abscesso pulmonar (causado, por exemplo, por Staphylococcus aureus ou Legionella pneumophila) e fibrose cística.

Atividade de antiangiogênese

O equilíbrio que ocorre naturalmente entre os estimuladores endógenos e inibidores da angiogênese é um onde as influencias inibidoras predominam. Rastinejad e outros, Cell 56:345-355 (1989). Naqueles raros momentos nos quais a neovascularização ocorre sob condições fisiológicas normais, tais como, cura de ferimento, regeneração de órgão, desenvolvimento embriogênico e processos reprodutivos femininos, a angiogênese é regulada estringentemente e delimitada espacial e temporariamente. Sob condições de angiogênese patológica, tais como aquelas caracterizando desenvolvimento de tumor sólido, esses controles reguladores falham. A angiogênese não regulada se torna patológica e mantém a progressão de muitas doenças neoplásicas e não neoplásicas. Várias doenças graves são denominadas por neovascularização anormal incluindo crescimento de tumor sólido e metástases, artrite, alguns tipos de transtornos dos olhos e psoríase. Vide, por exemplo, revisões de Moses e outros, Biotech. P:630-634 (1991); Folkman e outros N. Engl. J. Med., 353:1757-1763 (1995); Auerbach e outros, J. Microvasc. Res. 2P:401-411 (1985); Folkman, Advances in Câncer Research, eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203 (1985); Patz, Am. J. Opthalmol. 94:115-743 (1982); e Folkman e outros, Science 221:719-725 (1983). Em várias condições patológicas, o processo da angiogênese contribui para o estado da doença. Por exemplo, dados significativos foram acumulados sugerindo que o crescimento dos tumores sólidos depende da angiogênese. Folkman and Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987).

A presente invenção obtém o tratamento de doenças ou transtornos associados à neovascularização por administração das proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. As condições malignas e metastáticas que podem ser tratadas com os polinucleotídeos e polipeptídeos ou agonistas ou antagonistas da invenção incluem, porém não estão limitadas às malignidades, tumores sólidos e cânceres descritos aqui e de outra forma conhecidos na técnica (para uma revisão de tais transtornos, vide Fishman e outros, Medicine, 2a Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)). Assim, a presente invenção obtém um método para tratamento de doença e/ou transtorno relacionado à angiogênese, compreendendo administração a um indivíduo que necessite, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção. Por exemplo, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados em uma variedade de métodos adicionais de modo a tratar terapeuticamente um câncer ou tumor. Os cânceres que podem ser tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados aos tumores sólidos, incluindo da próstata, pulmão, mama, ovários, estômago, pâncreas, laringe, esôfago, testículos, fígado, parótida, trato biliar, cólon, reto, colo do útero, útero, endométrio, rins, bexiga, câncer da tireóide, tumores primários e metástases; melanomas; glioblastomas; sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; câncer de pulmão de célula não pequena; câncer coloretal, malignidades avançadas e tumores inerentes ao sangue, tais como, leucemias. Por exemplo, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser distribuídos topicamente, de modo a tratar cânceres, tais como, câncer de pele e tumores de cabeça e pescoço, tumores de mama e sarcoma de Kaposi.

Ainda dentro de outros aspectos, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser utilizadas para tratar formas superficiais de câncer da bexiga, por exemplo, por administração intravesical. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser distribuídas diretamente no tumor ou próximo ao sítio do tumor através de injeção ou de um cateter. Naturalmente, um versado na técnica comum apreciará que o modo apropriado de administração variará de acordo com o câncer a ser tratado. Outros modos de distribuição são discutidos aqui.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis no tratamento de outros transtornos, além dos cânceres, os quais envolvem angiogênese. Esses transtornos incluem, porém não estão limitados aos tumores benignos, por exemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogênicos; placas ateroscleróticas; doenças angiogênicas oculares, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, degeneração macular, rejeição de enxerto córneo, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeose, retinoblastoma, uveíte e ptergia (crescimento anormal do vaso sangüíneo) dos olhos; artrite reumatóide; psoríase; cura retardada de ferimento; endometriose; vasculogênese; granulações; cicatrizes hipertróficas (quelóides); fraturas sem união; esclerodermia; tracoma; adesões vasculares; angiogênese miocardial; colaterais coronários; colaterais cerebrais; má formações arteriovenosas;

5 angiogênese isquêmica de membro; síndrome de Osler-Webber; neovascularização de placa, telangiectasia; articulações hemofilíacas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulação de ferimento; doença de Crohn e aterosclerose.

Por exemplo, dentro de um aspecto da presente invenção, são obtidos métodos para tratamento de cicatrizes hipertróficas e quelóides compreendendo a etapa de administração de proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção a uma cicatriz hipertrófica ou quelóide.

Em uma modalidade da presente invenção as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são diretamente injetadas em uma cicatriz hipertrófica ou quelóide, de modo a prevenir a progressão dessas lesões. Essa terapia é de valor específico no tratamento profilático das condições que são conhecidas por resultarem no tratamento de cicatrizes hipertróficas e quelóides (por exemplo, queimaduras) e é preferivelmente iniciada após a fase proliferativa ter tido tempo de progredir (aproximadamente 14 dias após a lesão inicial), porém antes da cicatriz hipertrófica ou quelóide se desenvolver. Conforme observado acima, a presente invenção também obtém métodos para tratamento das doenças neovasculares dos olhos, incluindo, por exemplo, neovascularização corneana, glaucoma neovascular, retinopatia diabética proliferativa, fibroplasia retrolenticular e degeneração macular.

Além disso, os transtornos oculares associados à neovascularização que podem ser tratados com as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados ao glaucoma neovascular, retinopatia diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolenticular, uveíte, retinopatia de degeneração macular da prematuridade, neovascularização do enxerto córneo, bem como outras doenças inflamatórias dos olhos, tumores oculares e doenças associadas à neovascularização do coróide ou da íris. Vide, por exemplo, revisões por Waltman e outros, Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) e Gartner e outros Surv. Ophthal. 22:291-312 (1978).

Assim, dentro de um aspecto da presente invenção são obtidos métodos para o tratamento de doenças neovasculares dos olhos, tais como, neovascularização corneana (incluindo neovascularização de enxerto corneano), compreendendo a etapa de administração à córnea de um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto (por exemplo, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção), tal que, a formação dos vasos sangüíneos é inibida. Em resumo, a córnea é um tecido que normalmente não possui vasos sangüíneos. Contudo, em determinadas condições patológicas, os capilares podem se estender para dentro da córnea a partir do plexo vascular pericórneo do limbo. Quando a córnea alcança um estado vascularizado, ela também se torna turva, resultando em um declínio na acuidade visual do paciente. A perda visual pode se tornar completa se a córnea sofrer opacidade completa. Uma ampla variedade de transtornos pode resultar em neovascularização corneana incluindo, por exemplo, infecções corneanas (por exemplo, tracoma, ceratite por herpes simples, leishmaníase e oncocercíase), processos imunológicos (por exemplo, rejeição ao enxerto e síndrome de Stevens-Johnson), queimaduras alcalinas, trauma, infecção (de qualquer causa), estados de deficiência tóxica e nutricional e como uma complicação do uso de lentes de contato.

Nas modalidades especificamente preferidas da invenção, pode ser preparada administração tópica em salmoura (combinada com qualquer um dos preservantes e agentes antimicrobianos geralmente usados nas preparações oculares) e administrada na forma de colírios. A solução ou suspensão pode ser preparada em sua forma pura e administrada várias vezes ao dia. Alternativamente, as composições antiangiogênicas, preparadas conforme descrito acima,podem também ser administradas diretamente a córnea. Nas modalidades preferidas, a composição antiangiogênica é preparada com um polímero muco-adesivo que se liga à córnea. Nas modalidades adicionais, fatores antiangiogênicos ou composições antiangiogênicas podem ser utilizados como um adjuvante para terapia convencional com esteróides. A terapia tópica pode também ser útil profilaticamente nas lesões corneanas que são conhecidas por possuírem uma alta probabilidade de indução de resposta angiogênica (tal como, queimaduras químicas). Nesses momentos, o tratamento, provavelmente em combinação com os esteróides, pode ser instituído imediatamente para ajudar a prevenir complicações subseqüentes.

Em outras modalidades, os compostos descritos acima podem ser injetados diretamente no estroma córneo por um oftalmologista de acordo com diretrizes microscópicas. O sítio preferido de injeção pode variar com a morfologia da lesão individual, porém o objetivo da administração seria colocar a composição na frente de avanço da vasculatura (isto é, interdispersa entre os vasos sangüíneos e a córnea normal). Na maioria dos casos, isso envolveria injeção corneana perilímbica para "proteger" a córnea do avanço dos vasos sangüíneos. Esse método também pode ser utilizado pouco após uma lesão corneana a fim de prevenir profilaticamente a neovascularização corneana. Nessa situação, o material seria injetado na córnea perilímbica interdispersa entre a lesão corneana e seu fornecimento de sangue límbico em potencial indesejado. Tais métodos podem também ser utilizados em um modo semelhante para prevenir a invasão capilar das córneas transplantadas. Em uma forma de liberação prolongada, as injeções podem ser necessárias apenas 2-3 vezes a ano. Um esteróide poderia também ser adicionado á solução de injeção para reduzir a inflamação resultante da injeção propriamente.

Em outro aspecto da presente invenção são obtidos métodos para tratamento de glaucoma neovascular, compreendendo a etapa de administração ao olho do paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção, tal que, a formação dos vasos sangüíneos é inibida. Em uma modalidade, o composto pode ser administrado topicamente aos olhos, a fim de tratar as formas precoces de glaucoma neovascular. Em outras modalidades, o composto pode ser implantado por injeção na região de ângulo da câmara anterior. Em outras modalidades, o composto pode também ser colocado em qualquer local, tal que, o composto seja liberado continuamente no humor aquoso. Em outro aspecto da presente invenção, são providos métodos para tratar retinoptia diabética proliferativa, compreendendo a etapa de administração aos olhos do paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção, tal que a formação dos vasos sangüíneos é inibida.

Nas modalidades especificamente preferidas da invenção, a retinopatia diabética proliferativa pode ser tratada por injeção ao humor aquoso ou vítreo, a fim de aumentar a concentração local do polinucleotídeo, polipeptídeo, antagonista e/ou agonista na retina. De preferência, esse tratamento seria iniciado antes do surgimento de doença grave que requeira fotocoagulação.

Em outro aspecto da presente invenção são obtidos métodos para tratamento de fibroplasia retrolenticular, compreendendo a etapa de administração ao olho de um paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção, de modo que a formação dos vasos sangüíneos é inibida. O composto pode ser administrado topicamente, através de injeção intravítrea e/ou implantes intra-ocultares.

Adicionalmente, os transtornos que podem ser tratados com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitados ao hemangioma, artrite, psoríase, angiofibroma, placas ateroscleróticas, cura retardada de ferimento, granulações, articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, fraturas sem união, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogênico, escleroderma, tracoma e adesões vasculares.

Além disso, transtornos e/ou estados, que podem ser tratados, prevenidos, diagnosticados e/ou prognosticados com as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção da invenção incluem, porém não estão limitados aos tumores sólidos, tumores inerentes ao sangue tais como leucemias, timetástase de tumor, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por exemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogênicos, artrite reumatóide, psoríase, doenças oculares angiogênicas, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, degeneração macular, rejeição de enxerto córneo, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeóse, retinoblastoma e uveíte, cura retardada de ferimento, endometriose, vasculogênese, granulações, cicatrizes hipertróficas (quelóides), fraturas sem união, esclerodermia, tracoma, adesões vasculares, angiogênese miocardíaca, colaterais coronários, colaterais cerebrais, má formação arteriovenosa, angiogênese isquêmica de membro, síndrome de Osier-Webber, neovascularização de placa, telangiectasia, articulações hemofílicas, displasia fibromuscular de angiofibroma, granulação de ferimento, doença de Crohn, aterosclerose, agente de controle de natalidade por prevenção de vascularização necessária para implantação de embrião por controle de menstruação, doenças que apresentam a angiogênese como uma conseqüência patológica , tais como, doença causada por arranhão de gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelose e angiomatose bacilar.

Em um aspeto do método de controle de natalidade, uma quantidade do composto suficiente para bloquear a implantação do embrião é administrada antes ou após o intercurso e fertilização terem ocorrido, assim provendo um método eficaz de controle de natalidade, possivelmente um método "do dia seguinte". As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser usadas no controle da menstruação ou administradas tanto como um fluido de lavagem peritoneal quanto para implantação peritoneal no tratamento da endometriose.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser incorporadas às suturas cirúrgicas a fim de prevenir sutura dos granulomas.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados em uma ampla variedade de procedimentos cirúrgicos. Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, as composições (na forma, por exemplo, de uma aspersão ou película) podem ser usadas para revestir ou serem aspergidas em uma área antes da remoção de um tumor, de modo a isolar os tecidos circundantes normais do tecido maligno, e/ou prevenir a dispersão da doença para os tecidos circundantes. Em outros aspectos da presente invenção, as composições (por exemplo, na forma de uma aspersão) podem ser distribuídas através de procedimentos endoscópicos, a fim de revestir os tumores ou inibir a angiogênese em um local desejado. Ainda em outros aspectos da presente invenção, telas cirúrgicas que foram revestidas com composições antiangiogênicas da presente invenção podem ser utilizadas em qualquer procedimento onde uma malha cirúrgica pode ser usada. Por exemplo, em uma concretização da invenção, a malha cirúrgica carregada com uma composição antiangiogênica pode ser utilizada durante cirurgia de ressecção de câncer abdominal (por exemplo, subseqüente à ressecção do cólon), a fim de prover suporte para a estrutura e para liberação de uma quantidade do fator antiangiogênico.

Nos aspectos adicionais da presente invenção, são providos métodos para tratar os sítios de excisão de tumor, compreendendo administração das proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando proteínas de fusão da albumina da invenção às margens de ressecção de um tumor após a excisão, tal que, é inibida a recorrência local do câncer e a formação de novos vasos sangüíneos no sítio. Em uma concretização da invenção, o composto antiangiogênico é administrado diretamente ao sítio de excisão do tumor (por exemplo, aplicado por esfrega, escovamento ou de outra forma revestimento das margens de ressecção do tumor com composto antiantiogênico).Alternativamente, os compostos antiangiogênicos podem ser incorporados às pastas cirúrgicas conhecidas antes da administração. Nas concretizações especificamente preferidas da invenção, os compostos antiangiogênicos são aplicados após ressecções hepáticas para extirpar malignidades e após operações neurocirúrgicas.

Em um aspecto da presente invenção, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser administrados à margem de ressecção de uma ampla variedade de tumores, incluindo, por exemplo, tumores de mama, cólon, cérebro e hepáticos. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, os compostos antiangiogênicos podem ser administrados ao sítio de um tumor neurológico subseqüente à excisão, tal que, a formação de novos vasos sangüíneos no sítio é inibida.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser administradas em conjunto com outros fatores antiangiogênicos. Exemplos representativos de outros fatores antiangiogênicos incluem: fator antiinvasivo, ácido retinóico e derivados do mesmo, paclitaxel, suramina, inibidor de tecido de metaloproteinase-1, inibidor de tecido de metaloproteínase-2, inibidor-1 de ativador de plasminogênio, inibidor-2 de ativador de plasminogênio e várias formas de metais de transição do "grupo d" mais leves.

Metais de transição do "grupo d" mais leves incluem, por exemplo, espécies de vanádio, molibdênio, tungstênio, titânio, nióbio e tântalo. Tais espécies de metal de transição podem formar complexos de metal de transição. Complexos apropriados das espécies de metal de transição mencionadas acima incluem complexos de metal de transição oxo.

Exemplos representativos de complexos de vanádio incluem complexos de vanádio oxo, tais como, complexos de vanadato e vanadila. Complexos de vanadato apropriados incluem complexos de metavanadato e ortovanadato, tais como, por exemplo, metavanadato de amônio, metavanadato de sódio e ortovanadato de sódio. Complexos de vanadila apropriados incluem, por exemplo, acetilacetonato de vanadila e sulfato de vanadila incluindo hidratos sulfato de vanadila tais como, mono e triidratos sulfato de vanadila.

Exemplos representativos de complexos de tungstênio e molibdênio também incluem complexos oxo. Complexos de tungstênio oxo apropriados incluem complexos de tungstato e óxido de tungstênio. Complexos de tungstato apropriados incluem tungstato de amônio, tungstato de cálcio, diidrato tungstato de sódio e ácido túngsto. Óxidos de tungstênio apropriados incluem óxido de tungstênio (IV) e óxido de tungstênio (VI). Complexos de molibdênio oxo apropriados molibdato, óxido de molibdênio e complexos de molibdenila. Complexos de molibdato apropriados incluem molibdato de amônio e seus hidratos, molibdato de sódio e seus hidratos e molibdato de potássio e seus hidratos. Óxidos de molibdênio apropriados incluem óxido de molibdênio (IV), óxido de molibdênio (VI) e ácido molibídico. Complexos de molibdenila apropriados incluem, por exemplo, acetilacetonato de molibdenila. Outros complexos de tungstênio e molibdênio apropriados incluem derivados de hidroxo originados, por exemplo, de glicerol, ácido tartárico e açúcar.

Uma ampla variedade de fatores antiangiogênicos pode também ser utilizada dentro do contexto da invenção. Exemplos representativos incluem fator de plaqueta 4; sulfato de protamina, derivados de quitina sulfatados (preparados de conchas de crab Queen), (Murata e outros, Câncer Res. 51:22-26, 1991); complexo de peptidoglicano polissacarídeo sulfatado (SP-PG) (a função desse composto pode ser melhorada pela presença de esteróides, tais como, estrogênio e citrato de tamoxifeno); estaurosporina; moduladores de metabolismo de matriz, incluindo, por exemplo, análogos de prolina, cisidroxipropila, d,L-3,4-desidroprolina, tiaprolina, alfa,alfa-dipiridila, fumarato de aminopropionitrila; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; metotrexato; mitoxantrona; heparina; interferons; 2 soro-macroglobulina; ChlMP-3 (Pavloff e outros, J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); quimiostatina (Tomkinson e outros, Biochem J. 286:475-480, (1992)); tetrassulfato de ciclodextrina; eponemicina; camptotecina; furmagilina (lngber e outros, Nature 348:555-557, 1990); tiomalato de sódio ouro ("GST"; Matsubara and Ziff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987)); anticolagenase-soro; alfa-2-antiplasmino (Hobnes e outros, J. Biol. Chem. 262(4): 1659-1664, (1987)); Bisantreno (National Câncer Institute); Lobenzarit ácido dissódio (N-(2)-carboxifenil-4-cloroantronílico ou "CCA"; Takeuchi e outros, Agents Actions 36:312-316, (1992)); talidomida; esteróide agnostático; AGM-1470; carboxinaminolmidazol; e inibidores de metaloproteinase, tais como, BB94.

Doenças ao nível celular

Doenças associadas à sobrevivência celular aumentada ou a inibição da apoptose que poderiam ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem cânceres (tais como, folicular linfomas, carcinomas com mutações de p53 e tumores hormônio dependentes, incluindo, porém não limitado ao câncer de cólon, tumores cardíacos, câncer pancreático, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, câncer de pulmão, câncer intestinal, câncer testicular, câncer do estômago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, câncer de mama, câncer de próstata, sarcoma de Kaposi e câncer ovariano); transtornos auto-imunes (tais como, esclerose múltipla, síndrome de 10 Sjogren, tiroidite de Hashimoto, cirrose biliar, doença de Behcet, doença de Crohn, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite relacionada ao sistema imune e artrite reumatóide) além de infecções viróticas (tais como, herpes vírus, pox vírus e adenovírus), inflamação, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição aguda de enxerto e rejeição crônica de enxerto.

Nas modalidades preferidas, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para inibir o crescimento, progressão e/ou metástase dos cânceres, especificamente aqueles listados acima.

Doenças adicionais ou condições associadas à sobrevivência celular aumentada poderiam ser tratadas ou detectadas pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não estão limitadas à progressão e/ou metástase das malignidades e transtornos correlatos, tais como, leucemia (incluindo Ieucemias agudas (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e Ieucemias crônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) e leucemia linfocítica crônica)), policitemia vera, linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença não-Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada e tumores sólidos incluindo, porém não limitado aos sarcomas e carcinomas, tais como, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, línfangiossarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de célula escanosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcínoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.

Doenças associadas à apoptose aumentada que poderiam ser tratadas, prevenidas, diagnosticadas e/ou prognosticadas empregando as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, incluem, porém não estão limitados a AIDS; transtornos neurodegenerativos (tais como, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, degeneração cerebelar e tumor cerebral ou doença anterior associada); transtornos auto-imunes (tais como, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, tiroidite de Hashimoto1 cirrose biliar, doença de Behcet1 doença de Crohn, polimiosite, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite relacionada ao sistema imune e artrite reumatóide) síndromes mielodisplásticas (tais como, anemia aplástica), doença de enxerto versus 15 hospedeiro, lesão isquêmica (tal como aquela causada por infarto do miocárdio, acidente vascular e lesão por reperfusão), lesão do hepática (por exemplo, hepatite relacionada à lesão hepática, lesão isquêmica/reperfusão, colestose (lesão do duto biliar) e câncer hepático); doença hepática induzida por toxina (tal como aquela causada por álcool), choque séptico, caquexia e anorexia.

Cura de ferimento e proliferação celular epitelial Ainda de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um processo para utilização das proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, para fins terapêuticos, por exemplo, para estimular a proliferação celular epitelial e ceratinócitos basais com a finalidade de sarar o ferimento e para estimular a produção do folículo capilar e cura dos ferimentos dérmicoss. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser clinicamente úteis na estimulação da cura do ferimento incluindo ferimentos cirúrgicos, ferimentos por excisão, ferimentos profundos envolvendo lesão da derme e epiderme, ferimentos do tecido ocular, ferimentos do tecido dentário, ferimentos da cavidade oral, úlceras diabéticas, úlceras dérmicas, úlceras no cotovelo, úlceras arteriais, úlceras da estase venosa, queimaduras resultantes de exposição ao calor ou substâncias químicas e outras condições anormais de cura de ferimentos, tais como, uremia, má nutrição, deficiências vitamínicas e complicações associadas ao tratamento sistêmico com esteróides, terapia por radiação e medicamentos antineoplásticos e antimetabólitos. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, poderiam ser usadas para promover o restabelecimento dérmico após a perda dérmica. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, poderiam ser empregados para aumentar a aderência dos enxertos de pele a um leito de ferimentoe estimular a reepitelização do leito do ferimento. O que se segue são tipos de enxertos onde as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, poderiam ser empregados para aumentar a aderência a um leito do ferimento: auto-enxertos, pele artificial, alo enxertos, enxerto autodérmico, enxertos auto-epdérmicos, enxertos avaculares, enxertos Blair-Brown, enxertos ósseos, enxertos brefoplásticos, enxertos de cútis, enxerto retardado, enxerto dérmico, enxerto epidérmico, enxerto de face, enxerto de espessura plena, enxertos heterólogo, xenoenxerto, enxerto homólogo, enxerto hiperplásico, enxerto lamelar, enxerto em malha, enxerto mucosal, enxerto Ollier-Thiersch, enxerto Omental, enxerto com emplasto, enxerto pediculado, enxerto penetrante, enxerto de pele de espessura parcial, enxerto de espessura grossa. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usadas para promover a resistência da pele e aperfeiçoar a aparência da pele envelhecida.

Acredita-se que as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, também produzirão alterações na proliferação dos hepatóticos e proliferação celular epitelial no pulmão, mama, pâncreas,estômago, intestino delgado e intestino grosso. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, promoveriam a proliferação das células epiteliais, tais como, sebócitos, folículos capilares, hepatócítos, pneumócitos do tipo II, células caliciformes de produção de mucina e outras células epiteliais e suas progenitoras contidas na pele, pulmão, fígado e trato gastrintestinal. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem promover a proliferação das células endoteliais, ceratinócitos e ceratinócitos basais.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também poderiam ser usados para reduzir os efeitos colaterais de toxicidade do intestino que resultam dos tratamentos com radiação, quimioterapia ou infecções viróticas. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ter um efeito citoprotetor na mucosa do intestino delgado. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem também estimular a cura da mucosite (ulceradas da borda) que resultam da quimioterapia e infecções viróticas.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser usadas na regeneração completa da pele em lesões da pele de espessura plena e parcial, incluindo queimaduras, (isto é, repopulação dos folículos capilares, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas), tratamento de outras lesões da pele tais como psoríase. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam usados para tratar epidermólise bolhosa, um defeito na aderência da epiderme à derme subjacente que resulta em bolhas freqüentes, abertas e dolorosas por aceleração da reepitelização dessas lesões. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, seriam usados também para tratar úlceras duodenais e gástricas e ajudar a cura por formação de cicatriz do revestimento da mucosa e regeneração da mucosa glandular e revestimento da mucosa duodenal mais rapidamente. Doenças inflamatórias dos intestinos, tais como, doença de Crohn e colite ulcerativa são doenças que resultam na destruição da superfície da mucosa do intestino delgado ou grosso, respectivamente. Assim, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser usadas para promover a nova formação de superfície da superfície da mucosa e ajudar a curar mais rapidamente e a prevenir a progressão da doença inflamatória dos intestinos inflamados. Espera-se que o tratamento com proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção tenha um efeito significativo na produção do muco através de todo o trato gastrintestinal seria usado para proteger a mucosa do intestino de substâncias prejudiciais que são ingeridas ou após cirurgia. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam usados para tratar doenças associadas à infra-expressão.

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam usados para prevenir e curar lesão aos pulmões devido aos vários estados patológicos. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam estimular a proliferação e diferenciação e promoveriam a reconstituição dos alvéolos e epitélio brônquico, de modo a prevenir ou tratar lesão pulmonar aguda ou crônica. Por exemplo, o enfisema que resulta em perda progressiva dos alvéolos e lesões por inalação, isto é, resultando da inalação de fumaças e combustões, que causam necrose do epitélio brônquico e alvéolos seria tratado eficazmente empregando os polinucleotídeos ou polipeptídeos, agonistas ou antagonistas da presente invenção. Também as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção poderiam ser usados para estimular a proliferação e diferenciação dos pneumócitos do tipo II, que podem ajudar a tratar ou prevenir doenças, tais como, doenças da membrana hialina, tais como, síndrome de angústia respiratória de bebês e displasia broncopulmonar, em bebês prematuros.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção estimulariam a proliferação e diferenciação 5 dos hepatócitos e, assim seriam usados para aliviar ou tratar doenças hepáticas e patologias, tais como, falência hepática fulminante causada por cirrose, lesão hepática causada por hepatite virótica e substâncias tóxicas (isto é, acetaminofeno, tetracloreto de carbono e outras hepatotoxinas conhecidas na técnica).

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam tratadas para prevenir o início do diabetes melito. Nos pacientes com diabetes dos tipos I e II diagnosticados recentemente, onde alguma função da célula de ilhota permanece, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da invenção seriam usados para manter a função da ilhota, de modo a aliviar, retardar ou prevenir manifestação permanente da doença. Também, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam usadas como um auxiliar no transplante da célula de ilhota de modo a aperfeiçoar ou promover a função da célula de ilhota.

Doenças neurológicas e da atividade neural

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para o diagnóstico e/ou tratamento de doenças, transtornos, lesão do cérebro e/ou sistema nervoso. Os transtornos do sistema nervoso que podem ser tratados com as composições da invenção (por exemplo, proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção), incluem, porém não estão limitados a lesões do sistema nervoso e doenças ou transtornos que resultam tanto em uma desconexão dos axônios, uma diminuição ou degeneração dos neurônios ou desmielinização. As lesões do sistema nervoso que podem ser tratadas em um paciente (incluindo pacientes humanos e mamíferos não humanos) de acordo com os métodos da invenção, incluem porém não estão limitados às lesões que se seguem tanto do sistema nervoso central (incluindo medula espinal, cérebro) ou sistema nervoso periférico: (1) lesões isquêmicas, nas quais uma falta de oxigênio em uma porção do sistema nervoso resulta em lesão neuronal ou morte, incluindo infarto ou isquemia cerebral ou infarto ou isquemia da medula espinal; (2) lesões traumáticas, incluindo lesões causadas por lesão física ou associada a cirurgia, por exemplo, lesões que separa uma porção do sistema nervoso ou lesões por compressão; (3) lesões malignas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou Iesionada por tecido maligno que é tanto uma malignidade associada ao sistema nervoso ou malignidade derivada do tecido do sistema não nervoso; (4) lesões infecciosas, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruída ou lesionada como resultado da infecção, por exemplo, por um abscesso ou associada a infecção por vírus da imunodeficiência humana, herpes zoster ou vírus herpes simples ou com doença de Lyme, tuberculose ou sífilis; (5) lesões degenerativas, nas quais uma porção do sistema nervoso central é destruída ou lesionada como resultado de um processo degenerativo incluindo, porém não limitado a degeneração associada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, coréia de Huntington ou esclerose lateral amiotrófica (ALS); (6) lesões associadas a doenças nutricionais ou transtornos, nas quais uma porção do sistema nervoso é destruído ou lesíonado por um transtorno nutricional ou transtorno do metabolismo incluindo, porém não limitado a deficiência de vitamina B12, deficiência de ácido fólico, doença de Werneck, ambliopia de tabaco-álcool, doença de Marchiafava-Bignami (degeneração primária do corpos caloso) e degeneração cerebelar alcoólica; (7) lesões neurológicas associadas as doenças sistêmicas incluindo, porém não limitadas ao diabetes (neuropatia diabética, paralisia de Bell), lúpus eritematoso sistêmico, carcinoma ou sarcoidose; (8) lesões causadas por substâncias tóxicas incluindo álcool, chumbo ou neurotoxinas específicas; e (9) lesões desmielinizadas nas quais uma porção do sistema nervoso central é destruída ou Iesionada por uma doença desmielinizante incluindo, porém não limitado a esclerose múltipla, mielopatia associada ao vírus da imunodeficiência humana, mielopatia transversal ou várias etiologias, leucoencefalopatia multifocal progressiva e mielinólise pontina central.

Em uma modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para proteger as células neurais dos efeitos lesionantes da hipoxia. Em uma modalidade adicionalmente preferida, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para proteger as células neurais dos efeitos lesionais da hipoxia cerebral. De acordo com essa modalidade, as composições da invenção são empregadas para tratar ou prevenir lesão a célula neural associada a hipoxia cerebral. Em um aspecto não exclusivo dessa modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são usados para tratar ou prevenir lesão a célula neural associada a isquemia cerebral. Em outro aspecto não exclusivo dessa modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar ou prevenir lesão da célula neural associada ao infarto cerebral.

Em outra modalidade preferida, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar ou prevenir lesão da célula neural associada a um acidente vascular. Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar ou prevenir cerebral lesão a célula neuronal associada a um acidente vascular.

Em outra modalidade preferida, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar ou prevenir lesão a célula neuronal associada ao ataque cardíaco. Em uma modalidade específica, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar ou prevenir cerebral lesão a célula neuronal associada a um ataque cardíaco.

As composições da invenção que são úteis para o tratamento ou prevenção de um transtorno do sistema nervoso podem ser selecionadas por teste da atividade biológica na promoção de sobrevivência ou diferenciação dos neurônios. Por exemplo, e não como uma limitação, as composições da invenção que promovem qualquer um dos efeitos que se seguem podem ser úteis de acordo com a invenção: (1) tempo de sobrevivência aumentado dos neurônios na cultura tanto na presença quanto na ausência de hipoxia ou condições hipóxicas; (2) brotamento aumentado dos neurônios na cultura ou in vivo ; (3) produção aumentada de uma molécula associada ao neurônio na cultura ou in vivo, por exemplo, colina acetiltransferase ou acetilcolinaesterase com relação aos neurônios motores; ou (4) sintomas de disfunção neuronal in vivo diminuídos. Tais efeitos podem ser medidos por qualquer método conhecido na técnica. Nas concretizações não limitantes, preferidas, a sobrevivência aumentada dos neurônios pode ser medida rotineiramente empregando um método estabelecido aqui ou de outra forma conhecido na técnica, tal como, por exemplo, em Zhang e outros, Proc Natl Acad Sei. USA 97:3637-42 (2000) ou em Arakawa e outros, J. Neurosci., 10:35017-15 (1990); brotamento aumentado dos neurônios pode ser detectado por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os métodos estabelecidos em Pestronk e outros, Exp. Neurol, 70:65-82 (1980) ou Brown e outros, Ann. Rev. Neurosci., 4:17-42 (1981); produção aumentada de moléculas associadas aos neurônios pode ser medida por bioensaio, ensaio enzimático, ligação de anticorpo, ensaio Northern blot, etc. usando técnicas conhecidas na arte e dependendo da molécula a ser medida e disfunção neuronal motora pode ser medida por avaliação da manifestação física do transtorno neuronal motor, por exemplo, fraqueza, velocidade de condução neuronal motora ou incapacidade funcional.

Nas modalidades específicas, os transtornos neuronais motores que podem ser tratados de açodo com a invenção incluem, porém não estão limitados aos transtornos, tais como, infarto, infecção, exposição a toxina, trauma, lesão cirúrgica, doença degenerativa ou malignidade que pode afetar os neurônios motores, bem como outros componentes do sistema nervoso e transtornos que afetam seletivamente os neurônios, tais como, esclerose lateral amiotrófica e incluindo, porém não limitado a atrofia muscular espinal progressiva, paralisia bulbar progressiva, esclerose lateral primária, atrofia muscular infantil e juvenil, paralisia bulbar progressiva de crianças (síndrome de Fazio-Londe), poliomielite e a síndrome pós-pólio e neuropatia motossensora hereditária (doença de Charcot-Marie-Tooth).

Adicionalmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem desempenhar um papel na sobrevivência neuronal, formação da sinapse; condutância; diferenciação neuronal, etc. Assim, as composições da invenção (incluindo proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção) podem ser empregados para diagnosticar e/ou tratar ou prevenir doenças ou transtornos associados a esses papéis, incluindo, porém não limitado aos transtornos de aprendizado e/ou cognição. As composições da invenção também podem ser úteis no tratamento ou prevenção dos estados de doença neurodegenerativa e/ou transtornos comportamentais. Tais estados de doença neurodegenerativa e/ou transtornos comportamentais incluem, porém não estão limitados a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, mania, demência, paranóia, transtorno obsessivo-compulsivo, transtorno do pânico, incapacidades de aprendizado, ALS, psicoses, autismo ecomportamentos alterados, incluindo transtornos de alimentação, padrão do sono, equilíbrio e percepção. Além disso, as composições da invenção também podem desempenhar um papel no tratamento, prevenção e/ou detecção de transtornos comportamentais associados ao desenvolvimento do embrião ou transtornos ligados à sexualidade.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser úteis na proteção das células neuronais contra doenças, lesão, transtornos associados ou danos associados aos transtornos cerebrovasculares incluindo, porém não limitado as doenças da artéria carótida (por exemplo, trombose da artéria da carótida, estenose da carótida ou doença Moyamoya), angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, má formação arteriovenosa cerebral, doenças arteriais cerebrais, embolismo cerebral e trombose (por exemplo, trombose da artéria carótida, trombose do seio venoso ou síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (por exemplo, hematoma epidural ou subdural ou hemorragia subaracnóide), infarto cerebral, isquemia cerebral (por exemplo, isquemia cerebral transitória, síndrome de Subclavian Steal ou insuficiência 35 vertebrobasial), demência vascular (por exemplo, infarto múltiplo), leucomalacia, periventricular e dor de cabeça vascular (por exemplo, dor de cabeça em salvas ou enxaquecas). Ainda de acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é obtido um processo para emprego das proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, para fins terapêuticos, por exemplo, para estimular a proliferação e/ou diferenciação da célula neurológica. Portanto, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar e/ou detectar doenças neurológicas. Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser usados como um marcador ou detector de uma doença ou transtorno específico do sistema nervoso.

Exemplos de doenças neurológicas que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem doenças cerebrais, tais como, doenças cerebrais metabólicas que incluem fenilcetonúria, tais como, fenilcetonúria materna, deficiência de piruvato carboxilase, deficiência de complexo de piruvato desidrogenase, encefalopatia de Wernicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrais, tais como, neoplasmas cerebelares que incluem neoplasmas infratentoriais, neoplasmas ventriculares cerebrais, tais como, neoplasmas plexo coróide, neoplasmas hipotalâmicos, neoplasmas supra-sensoriais, doença de Canavan, doenças cerebelares, tais como, ataxia cerebelar que incluem degeneração espinocerebelar, tal como, ataxia telangiectasia, dissinergia cerebelar, ataxia de Friedrich, doença de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmas cerebelares, tais como, neoplasmas infratentoriais, esclerose cerebral difusa, tal como, encefalite periaxiale, leucodistrofia celular globóide, leucodistrofia metacromática e panencefalite esclerosaste subcutânea.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem transtornos cerebrovasculares (tais como, doenças da artéria carótida que incluem trombose da artéria carótida, estenose da carótida e doença de Moyamoya), angiopatia amilóide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, má formação arteriovenosa cerebral, doenças da artéria cerebral, embolismo cerebral e trombose, tal como, trombose da artéria carótida, trombose do seio venoso e síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, tal como, hematoma epidural, hematoma subdural e hemorragia subaracnóide, infarto cerebral, isquemia cerebral, tal como, isquemia cerebral transitória, síndrome de Subclavian Steal e insuficiência vertebrobasilar, demência vascular, tal como, demência por infarto múltiplo, leucomalacia periventricular, dor de cabeça vascular, tal como, dor de cabeça em salvas e enxaqueca.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem demência, tal como complexo de demência por AIDS, pré-demência senil, tal côo, doença de Alzheimer e síndrome de Creutzfeldt-Jakob1 demência senil, tal como, doença de Alzheimer e paralisia supra nuclear progressiva, demência vascular, tal como, demência por múltiplo infarto que incluem encefalite periaxial, encefalite virótica, tal como, encefalite epidêmica, encefalite japonesa, encefalite de St. Louis, encefalite inerente ao carrapato e doença febril causada pelo vírus West Nile, encefalomielite disseminada aguda, meningoencefalite, tal como, síndrome oveomemingoencefalítica, doença de Parkinson pós-encefalite e panencefalite esclerosante subaguda, enceflomalacia, tal como, leucomalácia periventricular, epilepsia, tal como, epilepsia generalizada que inclui espasmos infantis, epilepsia por ausência, epilepsia mielocrônica que inclui síndrome de MERRP, epilepsia tônica-clônica, epilepsia parcial, tal como, epilepsia parcial complexa, epilepsia do lobo frontal e epilepsia do lobo temporal, epilepsia pós-traumática, estado epiléptico, tal como, Epilepsia parcial contínua e síndrome de Hallervorden-Spatz.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem hidrocéfalo, tais como, síndrome de Dandy-Walker e hidrocéfalo de pressão normal, doenças hipotalâmicas, tais como, neoplasmas hipotalâmicos, malária cerebral, narcolepsía que inclui cataplexia, poliomielite bulbar, pseudotumor cerebral, síndrome de Rett, síndrome de Reye, doenças talâmicas, toxoplasmose cerebral, tuberculoma intracraniano e síndrome de Zellweger, infecções do sistema nervoso central, tais como, complexo de demência por AIDS, abscesso cerebral, empiema subdural, encefalomielite, tal como, encefalomielite eqüina, encefalomielite eqüina venezuelana, encefalomielite hemorrágica necrozante, visna e malária cerebral.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem meningite, tais como, meningite aracnóidite, asséptica, tal como, meningite virótica que inclui coriomeningite linfocítica, meningite bacteriana que inclui meningite causada por Haemophilus, meningite causada por Listeria, meningite meningocócica, tal como, síndrome de Waterhouse-Friderichsen, meningite pneumocócica e tuberculose meningeana, meningite causada por fungos, tal como, meningite criptocócica, efusão subdural, meningoencefalite, tal como, síndrome uvemeningoencefalítica, mielite, tal como, mielite transversa, neurossífilís, tais como, tabes (debilitações) dorsais, poliomielite que inclui poliomielite bular e síndrome pós-poliomielite, doenças do Príon (tais como, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatia espongiforme bovina, síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, Scrapie) e toxoplasmose cerebral.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem neoplasmas do sistema nervoso central, tais como, neoplasmas cerebrais que incluem neoplasmas cerebelares, tais como, neoplasma infratentoriais, neoplasmas ventriculares cerebrais, tais como, neoplasmas do plexo coróide, neoplasmas hipotalâmico e neoplasmas supratentoriais, neoplasmas meningeanos, neoplasmas da medula espinal que incluem neoplasmas epidurais, doenças desmielinizantes, tais como, doença de Canavan, esclerose cerebral difusa que inclui adrenoleucodistrofia, encefalite periaxial, eucodistrofia celular globóide, esclerose cerebral difusa, tal como, leucodistrofia metacromática, encefalomielite alérgica, encefalomielite hemorrágica necrozante, leucoencefalopatia multifocal progressiva, esclerose múltipla, mielinólise pontina central, mielite transversa, neuromielite óptica, Scrapie, Swayback, síndrome de fadiga crônica, visna, síndrome nervosa de pressão alta, meningismo, doenças da medula espinal, tais como, aniotonia congênita, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, tal como, doença de Werdnin-Hoffmann, compressão da medula espinal, neoplasmas da medula espinal, tais como, neoplasmas epidurais, siringomielia, tabes dorsais, síndrome de Stiff-man, retardo mental, tal como, síndrome de Angelman, síndrome de Cri-du-Chat, síndrome de De Lange, síndrome de Down, gangliosidoses, tais como, gangliosidose G(MI), doença de Sandhoff, doença de Tay-Sachs, doença de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon-Biedl, síndrome de Lesch-Nyhan, doença da urina em xarope de ácer, mucolipidose, tal como, fucosidose, ceróide-lipofuscinóse neuronal, síndrome oculocerebrorenal, fenilcetonúria, tal como, fenilcetonúri materna, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerose tuberosa, síndrome de WAGR, anormalidades do sistema nervoso, tais como, holoprosencefalia, defeitos do tubo neuronal, tal como, anencefalia que inclui hidrangecefalia, deformidade de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrafismo espinal, tal como, bífida espinal cística e bífida espinal oculta.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem neuropatia sensoriais e motoras hereditárias que incluem doença de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditária, doença de Refsum, paraplegia espástica hereditária, doença de Werdnig-Hoffmann, neuropatias autonômicas e sensoriais hereditárias, tais como, analgesia congênita e disautonomia familiar, manifestações neurológicas (tais como, agnosia que incluem síndrome de Gestmann, amnésia, tal como, amnésia retrógrada, apraxia, bexiga neurogênica, cataplexia, transtornos comunicativos, tais como, transtornos auditivos que incluem surdez, perda parcial da audição, recrutamento de ruído e tinidos, transtornos de linguagem, tais como, afasia que incluem agrafia, anomia, broca afasia e afasia Wernicke, dislexia, tal como, dislexia adquirida, transtornos de desenvolvimento da linguagem, transtornos da fala, tais como, afasia que inclui anomia, broca afasia e afasia Wernicke, transtornos de articulação, transtornos comunicativos, tais como, transtornos da fala que incluem disartria, ecolalia, mudismo e gagueira, transtornos da voz, tais como, afonia e rouquidão, estado descerebrado, delírio, fasciculação, alucinações, meningismo, transtornos do movimento, tais como, síndrome de Angelman, ataxia, atetose, coréia, distonia, hipocinésia, hipotonia muscular, mioclono, tique, torcicolo e tremor, hipertonia muscular, tal como, rigidez muscular, tal como, síndrome de Stiffman1 espasticidade muscular, paralisia, tal como, paralisia fácil que inclui Herpes zoster ótico, gastroparese, hemiplegia, oftalmoplegia, tal como, diplopia, síndrome de Duane, síndrome de Homer, oftalmoplegia externa progressiva crônica, tal como, síndrome de Kearns, paralisia bulbar, paraparesia espástica tropical, paraplegia, tal como, síndrome de Brown-Sequard, quadriplegia, paralisia respiratória e paralisia das cordas vocais, parese, membro fantasma, transtornos de gosto, tais como, ageusia e disgeusia, transtornos de visão, tais como, ambliopia, cegueira, defeitos de visão de cor, diplopia, hemianopsia, escotoma e visão subnormal, transtornos do sono, tais como, hipersonia que inclui síndrome de Kleine-Levin, insônia e sonambulismo, espasmo, tal como, trismo, inconsciência, tal como, como, estado vegetativo persistente e síncope e vertigo, doenças neuromusculares, tais como, amiotonia congênita, esclerose lateral amiotrófica, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, doença neuromotora, atrofia muscular, tal como, atrofia muscular espinal, doença de Charcot-Marie e doença de Werdnig-Hoffmann, síndrome pós-poliomielite, distrofia muscular, miastenia grave, miotonia atrófica, miotonia congênita, miopatia da nemalina, paralisia periódica familiar, paramioclono multiplexo, paraparesia espática trópica e síndrome de Stiff-Man, doenças do sistema nervoso periférico, tais como, acrodinia, neuroptias amilóides, doenças do sistema nervoso autônomo, tais como, síndrome de Adie, síndrome de Barre-Lieou, disautonomia familiar, síndrome de Homer, distrofia simpática reflexa e síndrome de Shy-Drager, doenças do nervo craniano, tais como, neuroma acústico que inclui neurofibromatose 2, doenças do nervo facial, tais como, neuralgia facial, síndrome de Melkersson-Rosenthal, transtornos de motilidade ocular que incluem ambliopia, nistagmo, paralisia do nervo oculomotor, oftalmoplegia, tal como, síndrome de Duane, síndrome de Homer, oftalmoplegia externa progressiva crônica que inclui síndrome de Keams, estrabismo, tal como, esotropia e exotropia, paralisia do nervo oculomotor, doenças do nervo óptico, tal como, atrofia óptica que inclui atrofia óptica hereditária, drusas do disco óptico, neurite óptica, tal como, neuromicelite óptica, papíledema, neuralgia trigeminal, paralisia das cordas vocais, doenças de desmielinização, tais como, neuromielite óptica e Swayback e neuropatias diabéticas, tais como, pé diabético.

Doenças neurológicas adicionais que podem ser tratadas ou detectadas com as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem síndromes de compressão do nervo, tais como, síndrome do túnel do carpo, síndrome do túnel do tarso, síndrome de saída do desfiladeiro torácico, tal como, síndrome da costela cervical, síndrome de compressão do nervo ulnar, neuralgia, tal como causalgia, neuralgia cérvico-bracnina, neuralgia facial e neuralgia trigeminal, neurite, tal como, neurite alérgica experimental, neurite óptica, polineurite, poliradiculoneurite e radiculites, tais como, poliradiculite, neuropatias motores e sensoras hereditárias, tais como, doença de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditária, doença de Refsum, paraplegia espástíca hereditária e doença de Werdnig-Hoffman, neuropatias sensoras e autônomas hereditárias que incluem analgesia congênita e disautonomia familiar, síndrome de POEMS, ciático, transpiração gustatória e tétano).

Transtornos Endócrinos

Proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser empregados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar transtornos e/ou doenças relacionadas ao desequilíbrio hormonal e/ou transtornos ou doenças do sistema endócrino.

Hormônios secretados pelas glândulas do sistema endócrino controlam o crescimento físico, função sexual, metabolismo e outras funções. Os transtornos podem ser classificados de dois modos: distúrbios em uma produção de hormônios e a incapacidade dos tecidos de responder aos hormônios. A etiologia desse desequilíbrio hormonal ou doenças do sistema endócrino, transtornos ou condições pode ser genética, somática, tal como, câncer e algumas doenças auto-imunes, adquirida (por exemplo, por quimioterapia, lesões ou toxinas) ou infecciosa. Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados como um marcador ou detector de uma doença ou transtorno específico relacionado ao sistema endócrino e/ou desequilíbrio hormonal.

O desequilíbrio do sistema endócrino e/ou hormonal e/ou doenças englobam transtornos de motilidade uterina incluindo, porém não limitado as complicações com gravidez e trabalho de parto (por exemplo, trabalho de parto pré-termo, gravidez pós-termo, aborto espontâneo e trabalho de parto lento ou parado) além de transtornos e/ou doenças do ciclo menstrual (por exemplo, dismenorréia e endometriose).

Transtornos do sistema endócrino e/ou desequilíbrio hormonal e/ou doenças incluem transtornos e/ou doenças do pâncreas, tais como, por exemplo, diabetes melito, diabetes insípido, agênese pancreática congênita, síndrome de tumor celular de ilhota do feocromocitoma, transtornos e/ou doenças das glândulas adrenais, tais como, por exemplo, doença de Addison, deficiência corticosteróide, doença virilizante, hirsutismo, síndrome de Cushing, hiperaldoesteronismo, feocromocitoma, transtornos e/ou doenças da glândula pituitária, tais como, por exemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, ananismo pituitário, adenoma pituitário, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo, transtornos e/ou doenças da tireóide, incluindo, porém não limitado ao hipertiroidismo, hipotiroidismo, doença de Pummer1 doença de Graves (bócio difuso tóxico), bócio nodular tóxico, tiroidite (tiroidite de Hashimoto, tiroidite granulomatosa subaguda e tiroidite linfocítica silenciosa), síndrome de Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicose, defeito de acoplamento do hormônio da tireóide, aplasia, tumores de célula de Hurthle da tireóide, câncer da tireóide, carcinoma da tireóide, carcinoma medular da tireóide, transtornos e/ou doenças da paratireóide, tais como, por exemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo, transtornos e/ou doenças do hipotálamo.

Além disso, os transtornos do sistema endócrino e/ou desequilíbrio hormonal e/ou doenças podem também incluir transtornos e/ou doenças dos testículos ou ovários, incluindo câncer. Outros transtornos e/ou doenças dos testículos ou ovários incluem, adicionalmente, por exemplo, câncer ovariano, síndrome do ovário policístico, síndrome de Klinefelter, síndrome de desaparecimento dos testículos (anorcia bilateral), ausência congênita das células de Leydig, criptoquídismo, síndrome de Noonan, distrofia miotônica, hemangioma capilar dos testículos (benigno), neoplasias dos testículos e neo-testículos.

Além disso, os transtornos do sistema endócrino e/ou desequilíbrio hormonal e/ou doenças podem também incluir transtornos e/ou doenças tais como, por exemplo, síndromes de deficiência poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endócrina múltipla e transtornos e/ou cânceres dos tecidos endócrinos.

Em outra modalidade, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser empregados para diagnosticar, prognosticar, prevenir e/ou tratar doenças endócrinas e/ou transtornos associados ao(s) tecido(s) nos quais a proteína Terapêutica correspondendo à porção da proteína Terapêutica da proteína da albumina da invenção é expressa.

Transtornos do Sistema Reprodutivo

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para diagnóstico, tratamento ou prevenção das doenças e/ou transtornos do sistema reprodutivo. Os transtornos do sistema reprodutivo que podem ser tratados pelas composições da invenção incluem, porém não estão limitados as lesões do sistema reprodutivo, infecções, transtornos neoplásicos, defeitos congênitos e doenças ou transtornos que resultam em infertilidade, complicações com a gravidez, trabalho de parto e dificuldades pós-parto.

Transtornos do sistema reprodutivo e/ou doenças incluem doenças e/ou transtornos dos testículos incluindo atrofia testicular, feminização testicular, críptorcismo (unilateral e bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimite e orquite (tipicamente resultando de infecções, tais como, gonorréia, caxumba, tuberculose e sífilis), torsão testicular, vasite nodosa, tumores de célula germinativa (por exemplo, seminomas, carcinomas de célula embrionária, teratocarcinomas, coriocarcinomas, tumores do saco vitelino e teratomas), tumores estromais (por exemplo, tumores celulares de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hérnia ungueal e transtornos de produção de esperma (por exemplo, síndrome dos cílios imóveis, aspermia, astenozoospermia, azoospermia, oligospermia e teratozoospermia).

Transtornos do sistema reprodutivo também incluem transtornos da glândula prostática, tais como, prostatite não bacteriana aguda, prostatite não bacteriana crônica, prostatite bacteriana aguda, prostatite bacteriana crônica, prostatodistonia, prostatose, prostatite granulomatosa, malacoplacia, malacoplaquia, hipertrofia prostática benigna ou hiperplasia e transtornos neoplásicos prostáticos incluindo adenocarcinomas, carcinomas transitórios celulares, carcinomas dutais e carcinomas de célula escamosa.

Adicionalmente, as composições da invenção podem ser úteis no diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de transtornos ou doenças do pênis e uretra, incluindo transtornos inflamatórios tais como, balanofostite, balanite xerótica obliterante, fimose, parafimose, sífilis, vírus da herpes simples, gonorréia, uretrite não gonocócica, clamídia, micoplasma, tricomonas, HIV, AIDS, síndrome de Reiter, condiloma acuminado, condiloma plano e pápulas peroladas do pênis, anormalidades da uretra, tais como, hipospadias, epispadias e fimose, lesões pré-malignas, incluindo eritroplasia de Queyrat, doença de Bowen, "Bowenoid paplosis", condiloma gigante de Buscke-Lowenstein e carcinoma verrucoso, cânceres do pênis, incluindo carcinomas de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrucoso e carcinoma disseminado do pênis, transtornos neoplásicos da uretra, incluindo carcinoma uretral do pênis, carcinoma uretral bulbo membranoso e carcinoma uretral prostático além de transtornos eréteis, tais como, priaprismo, doença de Peyronie, disfunção erétil e impotência.

Além disso, doenças e/ou transtornos dos dutos deferentes incluem vasculitite e CBAVD (ausência bilateral congênita dos dutos deferentes); adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polínucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados no diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de doenças e/ou transtornos da vesículas seminais incluindo doença hidática, diarréia do veral congênita e doença renal policística.

Outros transtornos e/ou doenças do sistema reprodutivo masculino incluem, por exemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, ejaculação prematura, diabetes melito, fibrose cística, síndrome de Kartagener, febre alta, esclerose múltipla e ginecomastia.

Adicionalmente, os polínucleotídeos, proteínas de fusão da invenção e/ou polínucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados no diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de doenças e/ou transtornos da vacina e vulva incluindo vaginose bacteriana, vaginite por Candida, vírus da herpes simples, cancróide, granuloma ungueal, Linfogranuloma venéreo, sarnas, papilomavírus humano, trauma vaginal, trauma vulvar, adenose, vaginite por Chamydia, gonorréia, vaginite por tricomonas, condiloma acuminado, sífilis, molusco contagioso, vaginite atrófica, doença de paget, líquen escleroso, líquen plano, vulvodinia, síndrome de choque tóxico, vaginismo, vulvovaginite, vestibulite vulvar e transtornos neoplásicos, tais como, hiperplasia de célula escamosa, carcinoma de célula clara, carcinoma de célula basal, melanomas, câncer da glândula de Bartholin e neoplasia intraepitelial vulvar.

Transtornos e/ou doenças do útero incluem dismenorréia, útero retroinvertido, endometriose, fibróide, adenomiose, sangramento anovulatório, amenorréia, síndrome de Cushing, mola hidatidiforme, síndrome de Asherman, menopausa prematura, puberdade precoce, pólipos uterinos, sangramento uterino disfuncional (por exemplo, devido aos sinais hormonais aberrantes) e transtornos neoplásicos, tais como, adenocarcinomas, queimiosarcomas e sarcomas. Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser úteis como um marcador ou detector, bem como no diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de anormalidades uterinas congênitas, tais como, útero bicorne, útero septado, útero unicorne simples, útero unicorne com um corno rudimentar não cavitário, útero unicorne com um corno rudimentar cavitário de não comunicação, útero unicorne com um corno cavitário de comunicação, útero arqueado, útero didelfo e útero em forma de T.

As doenças ovarianas e/ou transtornos incluem anovulação, síndrome do ovário policístico (síndrome de Stein-Leventhal), cistos ovarianos, hipofunção ovariana, insensibilidade ovariana as gonadotropinas, superprodução de andrógeno no ovário, síndrome da veia ovariana direita, amenorréia, hirustismo e câncer ovariano (incluindo, porém não limitado ao crescimento de câncer primário e secundário, tumores SertoH-Leydig, carcinoma do endométrio ovariano, adenocarcinoma seroso papilar ovariano, adenocarcinoma mucoso ovariano e tumores ovarianos de Krukenberg).

Doenças cervicais e/ou transtornos incluem cervicite, cervicite crônica, cervicite mucopurulenta, displasia cervical, pólipos cervicais, cistos de Nabothian, erosão cervical, incompetência cervical e neoplasmas cervicais (incluindo, por exemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa, carcinoma de célula escamosa, neoplasia de célula adenoescamosa e neoplasia de célula colunar).

Adicionalmente, doenças e/ou transtornos do sistema reprodutivo incluem transtornos e/ou doenças da gravidez, incluindo aborto e nascimento de um feto que morreu antes do aprto, tais como, aborto precoce, aborto tardio, aborto espontâneo, aborto induzido, aborto terapêutico, ameaça de aborto, aborto oculto, aborto incompleto, aborto completo, aborto habitual, aborto missed e aborto séptico; gravidez ectópica, anemia, incompatibilidade de Rh, sangramento vaginal durante gravidez, diabetes gestacional, retardo do crescimento intrauterino, poliidrâmnio, síndrome de HELLP, placenta abrupta, placenta prévia, hiperêmese, pré-eclampsia, eclampsia, herpes gestacional e urticária da gravidez. Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados no diagnóstico, tratamento e/ou prevenção de doenças que podem complicar a gravidez, incluindo doença do coração, falência cardíaca, doença cardíaca reumática, doença cardíaca congênita, prolapso da válvula mitral, pressão sangüínea alta, anemia, doenças renal, doença infecciosa (por exemplo, rubéola, citomegalovírus, toxoplasmose, hepatite infecciosa, chlamydia, HTV, AIDS e herpes genital), diabetes melito, doença de Graves, tiroidite, hipotiroidismo, tiroidite de Hashimoto, hepatite ativa crônica, cirrose hepática, cirrose biliar primária, asma, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática, apendicite, cistos ovarianos, transtornos da vesícula biliar e obstrução do intestino.

Complicações associadas ao trabalho de parto e parturiente incluem ruptura prematura das membranas, trabalho de parto prematuro, gravidez post-term, pós-maturidade, trabalho de parto que progride muito lentamente, sofrimento fetal (por exemplo, batida cardíaca anormal (feto e materna), problemas respiratórios e posição anormal do feto), distocia do ombro, prolapso do cordão umbilical, embolismo por fluido amniótico e sangramento uteríno exagerado.

Adicionalmente, doenças e/ou transtornos do período de pós-distribuição, incluindo endometrite, miometrite, parametrite, peritonite, tromboflebite pélvica, embolismo pulmonar, endotexemia, pielonefrite, tromboflebite safenosa, mastite, cistite, hemorragia pós-parto e útero invertido.

Outros transtornos e/ou doenças do sistema reprodutivo feminino que podem ser diagnosticadas, tratadas e/ou prevenidas pelas proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, por exemplo, síndrome de Turner, pseudo-hermafroditismo, síndrome pré-menstrual, doença pélvica inflamatória, congestão pélvica (ingurgitamento vascular), frigidez, anorgasmia, dispareunia, tubo falopiano rompido e Mittelschmerz.

Doenças infecciosas

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar ou detectar agentes infecciosos. Por exemplo, as doenças infecciosas podem ser tratadas por aumento da resposta imune, especificamente aumentando a proliferação e diferenciação das células B e/ou Τ. A resposta imune pode ser aumentada por melhora da resposta imune existe ou por início de uma nova resposta imune. Alternativamente, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também inibir diretamente o agente infeccioso, sem necessariamente promover uma resposta imune.

Os vírus são um exemplo de um agente infeccioso que pode causar doença ou sintomas que podem ser tratados ou detectados pelas proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção. Exemplos de vírus incluem, porém não estão limitados aos DNA e RNA vírus que se seguem e famílias viróticas: Arbovírus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, EBV, HW1 Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatite), Herpesviridae (tais como, citomegalovírus, herpes simples, herpes zoster), Mononegavírus (por exemplo, Paramyxoviridae, Morbilivírus, Rhabdoviridae), Ortomixoviridae (por exemplo, Influenza A, Influenza B e parainfluenza), Papiloma vírus, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tais como, vírus da varíola ou vírus da vacínia), Reoviridae (por exemplo, rotavírus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, lentivírus), e Togaviridae (por exemplo, rubivírus). Os vírus que se encontram nessas famílias podem causar várias doenças ou sintomas incluindo, porém não limitado a artrite, bronquiolite, vírus sincicial respiratório, encefalite, infecções oculares (por exemplo, conjuntivite, ceratite), síndrome de fadiga crônica, hepatite (A, B, C, E, ativa crônica, Delta), encefalite B japonesa, Junin, Chikungunya, febre do vale Rift, febre amarela, meningite, infecções oportunistas (por exemplo, AIDS), pneumonia, Iinfoma de Burkitt, catapora, febre hemorrágica, sarampo, caxumba, parainfluenza, raiva, resfriado comum, pólio, leucemia, rubéola, doenças sexualmente transmitidas, doenças de pele (por exemplo, verrugas de Kaposi) e viremia. Proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usadas para tratar ou detectar quaisquer desses sintomas ou doenças. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar: meningite, Dengue, EBV, e/ou hepatite (por exemplo, hepatite B). Em uma modalidade específica, adicional, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar pacientes que não respondem a uma ou mais das vacinas contra hepatite comercialmente disponíveis. Em uma modalidade adicional e específica, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar AIDS.

De modo semelhante, os agentes bacteríanos e fungicos que podem causar doença ou sintomas e que podem ser tratados ou detectados por proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não limitados as seguintes bactérias gram negativas e gram positivas, famílias bacterianas e fungos: Actinomices (por exemplo, Norcardia), Acinetobacteria, Cryptococcus neoformans, Aspergilos, Baciláceas (por exemplo, Bacillus anthrasis), Bacteróides (por exemplo, Baeteroides fragilis), Blastomicose, Bordetela, Borrelia (por exemplo, Borrelia burgdorferi), Brucela, Cândida, Campilobacter, Clamídia, Clostrídio (por exemplo, Clostridium botulinum, Clostridium difieile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Cocidióides, Corinebacterium (por exemplo, Corynebaeterium diptheriae), Criptocócos, Dermatocicoses, E coli (por exemplo, E eoli enterotoxigênico e E eoli enteroemorrágico), Enterobacter (por exemplo, Enterobaeter aerogenes), Enterobacteriáceas (Klebsiella, Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia, Yersinia, Shigella), Erisipelotrix, Hemófilos (por exemplo, Haemophilus influenza tipo B), Helicobacter, Legionela (por exemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (por exemplo, Listeria monoeytogenes), Micoplasma, Micobactéria (por exemplo, Myeobacterium Ieprae e Myeobaeterium tubereulosis), Vibrio (por exemplo, Vibrio eholerae), Neisseriáceas (por exemplo, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurelácea. Proteus, Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), Riquetsiáceas, espiroquetas (por exemplo, Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., estafilococos (por exemplo, Staphylococcus aureus), Meningococos, Pneumococos e estreptococos (por exemplo, Streptoeoceus pneumoniae e os estreptococos dos Grupos A, B, e C) e Ureaplasmas. Essas famílias bacterianas, parasíticas e fúngicas podem causar doenças ou sintomas incluindo, porém não limitado as infecções resistentes a antibióticos, bacteremia, endocardite, septicemia, infecções oculares (por exemplo, conjuntivite), uveíte, tuberculose, gengivite, diarréia bacteriana, infecções oportunistas (por exemplo, infecções relacionadas a AIDS), paroníquia, infecções relacionadas a prótese, cáries dentárias, doença de Reiter, infecções do trato respiratório, tais como, tosse estridora ou enfisema, septicemia, doença de Lyme, doença do arranhão de gato, febre paratifóide, envenenamento alimentar, doença de Legionella, inflamação crônica e aguda, eritema, infecções por levedura, tifóide, pneumonia, gonorréia, meningite (por exemplo, meningite dos tipos A e B), clamídia, sífilis, difteria, lepra, brucelose, úlceras pépticas, antraz, abortos espontâneos, defeitos de nascimento, pneumonia, infecções pulmonares, infecções do ouvido, surdez, cegueira, letargia, indisposição, vômito, diarréia crônica, doença de Crohn, colite, vaginose, esterilidade, doenças pélvicas inflamatórias, candidíase, paratuberculose, tuberculose, lúpus, botulismo, gangrena, tétano, impetigo, febre reumática, febre de Scarlet, doenças sexualmente transmissíveis, doenças de pele (por exemplo, celulite, dermatocicoses), toxemia, infecções do trato urínário, infecções de feridas, infecções noscomianas. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser usadas para tratar ou deter quaisquer desses sintomas ou doenças. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar tétano, difteria, botulismo e/ou meningite do tipo B.

Além disso, os agentes parasitários causadores de doença ou sintomas que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados pelas proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção incluem, porém não limitado as seguintes famílias ou classes: Amebiase, Babesiose, Cocidiose, Criptoporidiose, Dientamoebiase, Dourina, Ectoparasitas, Giardias, Helmintos, Leishmaniose, Esquistossoma, Teleiriase, Toxoplasmose, Tripanossomiase, Tricomonas e Esporozoários (por exemplo, Plasmodium vlrax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae e plasmodium ovale). Esses parasitas podem causar várias doenças ou sintomas, incluindo porém não limitado a escabiose, trombiculiase, infecções oculares, doenças intestinais (por exemplo, desinteria, giardíase), doença hepática, doença pulmonar, infecções oportunistas (por exemplo, relacionadas a AIDS), malária, complicações na gravidez e toxoplasmose. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, podem ser usadas para tratar, prevenir e/ou diagnosticar quaisquer desses sintomas ou doenças. Nas modalidades específicas, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção são empregados para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a malária.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem tanto ser administrados em uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão da albumina da invenção ao paciente ou por remoção das células do paciente, fornecimento das células com um polinucleotídeo da presente invenção e retorno das células construídas ao paciente (terapia ex vivo). Além disso, as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usados como um antígeno em uma vacina para promover uma resposta imune contra doença infecciosa.

Regeneração

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser usadas para diferenciar, proliferar e atrair células, conduzindo à regeneração dos tecidos. (Vide, Science 276:59-87 (1997)). A regeneração dos tecidos poderia ser empregada para reparar, substituir ou proteger o tecido danificado por defeitos congênitos, trauma (feridas, queimaduras, incisões ou úlceras), idade, doença (por exemplo, osteoporose, osteocartrite, doença periodontal, falência hepática), cirurgia, incluindo cirurgia plástica cosmética, fibrose, lesão por reperfusão ou lesão sistêmica por citocina.

Os tecidos que poderiam ser regenerados empregando a presente invenção incluem tecidos dos órgãos (por exemplo, pâncreas, fígado, intestino, rins, pele, endotélio), músculos (liso, esqueletal ou cardíaco), vasculatura (incluindo vascular e linfáticos), nervos, hematopoiético e esqueletal (ossos, cartilagens, tendões e ligamentos) De preferência, a regeneração ocorre sem ou com poucas cicatrizes. A regeneração também pode incluir angiogênese.

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem aumentar a regeneração de tecidos de cura difícil. Por exemplo, a regeneração de tendões/ligamentos aumentada poderia tornar rápido o tempo de recuperação após a lesão. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também seriam usados profilaticamente em um esforço de evitar a lesão. As doenças específicas que poderiam ser tratadas incluem tendinite, síndrome do túnel do carpo e outros defeitos do tendão ou ligamento. Um exemplo adicional de regeneração do tecido de feridas que não curam inclui úlceras por pressão, úlceras associadas à insuficiência vascular, feridas cirúrgicas e traumáticas.

De modo semelhante, o tecido do nervo e cérebro poderia também ser regenerado por emprego das proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção de modo a proliferar e diferenciar as células nervosas. As doenças que poderiam ser tratadas empregando esse método incluem doenças do sistema nervoso central e periférico, neuropatias ou transtornos mecânicos e traumáticos (por exemplo, transtornos da medula espinal, trauma da cabeça, doença cerebrovascular e acidente vascular). Especificamente, as doenças associadas as lesões do nervo periférico, neuropatia periférica (por exemplo, resultantes de quimioterapia ou outras terapias médicas), neuropatias localizadas e doenças do sistema nervoso central (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Shy-Drager) também poderiam ser tratadas empregando as proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção.

Transtornos gastrintestinais

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para tratar, prevenir, diagnosticar e/ou prognosticar transtornos gastrintestinais, incluindo doenças inflamatórias e/ou condições, infecções, cânceres (por exemplo, neoplasmos intestinais (tumor carcinóide do intestino delgado, Iinfoma não-Hodgkin do intestino delgado, Iinfoma do intestino delgado) e úlceras, tais como, úlceras pépticas. Os transtornos gastrintestinais incluem disfagia, odinofagia, inflamação do esôfago, esofagite péptica, refluxo gástrico, fibrose submucosal e estreitamento, lesões de Mallory-Weiss, leiomiomas, lipomas, cânceres epidérmicos, adenocarcinomas, transtornos de retenção gástrica, gastrenterite, atrofia gástrica, cânceres gástricos/estomacais, pólipos do estômago, transtornos automimunes, tais como, anemia perniciosa, estenose pilórica, gastrite (bacteriana, virótica, eosinófila, induzida por tensão, erosiva crônica, atrófica, de célula plasmática e de Ménétrier) e doenças peritoneais (por exemplo, quiloperitôneo, hemoperitôneo, cisto mesentérico, linfadenite mesentérica, oclusão vascular mesentérica, paniculite, neoplasmas, peritonite, pneumoperitôneo, abscesso bubfrênico).

Transtornos gastrintestinais também incluem transtornos associados ao intestino Delgado, tais como, síndromes de má absorção, distensão, síndrome dos intestinos irritados, intolerância ao açúcar, doença celíaca, úlceras duodenais, duodenite, espru trópico, doença de Whipple1 linfangiectasia intestinal, doença de Crohn, apendicite, obstruções do íleo, divertículo de Meckel, diverticulite múltipla, falência de rotação completa do intestino delgado e grosso, linfoma e doenças bacterianas e parasitárias (tais como, diarréia de viajante, tifóide e paratifóide, cólera, infecção por Ascariasídeos (Ascariasis lumbricoides), Ancilostomatídeo (Ancylostoma duodenale), Nematódeo (Enterobius vermicularis), Tênias (Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp., e T. solium).

Doenças hepáticas e/ou transtornos incluem colestase intra-hepática (síndrome de Alsgille, cirrose hepática biliar), fígado gorduroso (fígado gorduroso alcoólico, síndrome de Reye), trombose da veia hepática, degeneração hepatoventricular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorenal, hipertensão portal (varizes esofageanas e gástricas), abscesso hepático (abscesso hepático amébico), cirrose hepática (alcoólica, biliar e experimental), doenças hepáticas alcoólicas (fígado gorduroso, hepatite, cirrose), parasitárias (equinocócica hepática, fascioliase, abscesso hepático amético), icterícia (hemolítica, hepatocelular e colestática), colestase, hipertensão portal, aumento do fígado, ascitos, hepatite (hepatite alcoólica, hepatite animal, hepatite crônica (auto-imune, hepatite B, hepatite C, hepatite D, induzida por medicamento), hepatite tóxica, hepatite virótica humana (hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E), doença de Wilson, hepatite granulomatosa, cirrose biliar secundária, encefalopatia hepática, hipertensão portal, varizes, encefalopatia hepática, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, adenoma hepatocelular, hemangiomas, pedras biliares, falência hepática (encefalopatia hepática, falência hepática aguda) e neoplasmos hepáticos (angiomiolipoma, metástases hepáticas calcificadas, metástases hepáticas císticas, tumores epiteliais, hepatocarcinoma fibrolamelar, hipeplasia nodular focai, adenoma hepático, cistoadenoma hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, hepatoma, câncer hepático, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimal, tumores hepáticos mesenquimais, hiperplasia regenerativa nodular, tumores hepáticos benignos (cistos hepáticos [cistos simples, doença hepática policística, cistadenoma hepatobiliar, cisto coledocal], tumores mesenquimais [hamartoma mesenquinal, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, hepatite Peliose, lipomas, pseudotumor inflamatório, diversos], tumores epiteliais [epitélio do duto biliar (hamartoma do duto biliar, adenoma do duto biliar), hepatócito (adenoma, hiperplasia nodular focai, hiperplasia regenerativa nodular)], tumores hepáticos malignos [hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma, tumores dos vasos sangüíneos, angiosarcoma, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, outros tumores, sarcoma embrionário, fibrossarcoma, leiomiossarcoma, rabidomiossarcoma, carcinossarcoma, teratoma, carcinóide, carcinoma escamoso, linfoma primário]), hepatite peliose, porfiria eritrohepática, porfiria hepática (porfiria intermitente aguda, porfiria cutânea tardia), síndrome de Zellweger).

Doenças e/ou transtornos pancreáticos incluem pancreatite aguda, pancreatite crônica (pancreatite necrotizante aguda, pancreatite alcoólica), neoplasmos (adenocarcinoma do pâncreas, cistadenocarcinoma, insulinoma, gastrinoma e glucagonoma, neoplasmos císticos, tumores de células de ilhota, pancreoblastoma) e outras doenças pancreáticas (por exemplo, fibrose cística, cisto (pseudocisto pancreático, fistula pancreática, insuficiência)).

Doenças da vesícula biliar incluem pedra na vesícula (coletitiase e coledocolitiase), síndrome de pós-colecistectomia, diverticulose da vesícula biliar, colecistite aguda, colecistite crônica, tumores do duto biliar e mucocele.

Doenças e/ou transtornos do intestino grosso incluem colite associada a antibiótico, diverticulite, colite ulcerativa, megacólon adquirido, abscessos, infecções por fungos e bactérias, transtornos anoretais (por exemplo, fissuras, hemorróidas), doenças colônicas (colite, neoplasmos colônicos, [câncer de cólon, pólipos adenomatosos do cólon (por exemplo, adenoma viloso), carcinoma do cólon, câncer coloretal], diverticulite colônica, diveticulose colônica, megacólon [doença de Hirschprung, megacólon tóxico]; doenças sigmóides [proctocolite, neoplasmos de sigmoina]), constipação, doença de Crohn, diarréia (diarréia infantil, disenteria), doenças duodenais (neoplasmos duodenais, obstrução duodenal, úlcera duodenal, duodenite), enterite (enterocolite), enteropatia por HIV, doenças do íleo (neoplasmas do íleo, ileite), doença imunoproliferativa do intestino delgado, doença dos intestinos inflamados (colite ulcerativa, doença de Crohn), atresia intestinal, doenças parasitárias (infecções por anisaquiase, balantidiase, blastociste, criptoesporidiose, dientamoebiase, desinteria amébica, giardise), fistula intestinal (fistula retal), neoplasmos intestinais (neoplasmos cecais, neoplasmos colônicos, neoplasmos duodenais, neoplasmos ileais, pólipos lintestinais, neoplasmos jejunais, neoplasmos retais), obstrução intestinal (síndrome do laço aferente, obstrução duodenal, fezes impactadas, pseudo-obstrução intestinal [vólvulo cecal], intussuscepção), perfuração intestinal, pólipos intestinais (pólicos colônicos, síndrome de Gardner, síndrome Peutz-Jeghers), doença celíaca, intolerância à lactose, síndrome dos intestinos curtos, sprue trópico, doença de Whipple), oclusão vascular mesentérica, pneumatose cistóide intestinal, entropatias de perda de proteína (linfagiectase intestinal), doenças retais (doenças do ânus, incontinência fecal, hemorróidas, proctite, fístula retal, prolapso retal, retocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagite péptica, hemorragia, perfuração, úlcera estomacal, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes pós-gastrectomia (síndrome de dumping), doenças estomacais (por exemplo, acloridria, refluxo duodenogástrico (refluxo biliar), ectasia vascular antral gástrica, fístula gástrica, obstrução de saída gástrica, gastrite (atrófica ou hipertrófica), gastroparese, dilatação estomacal, diverticulite estomacal, neoplasmos estomacais (câncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipo gástrico hiperplástico), ruptura estomacal, úlcera estomacal, vólvulo estomacal), tuberculose, visceroptose, vômito (por exemplo, hematemese, hiperemese na gravidez, náusea pós-operatória e vômito) além de colite hemorrágica.

Doenças e/ou transtornos adicionais do sistema gastrintestinal incluem doenças do trato biliar, tais como, gastroesquise, fístula (por exemplo, fístula biliar, fístula esofágica, fístula gástrica, fístula intestinal, fístula pancreática), neoplasmos (por exemplo, neoplasmos do trato biliar, neoplasmos esofágicos, tais como, adenocarcinoma do esôfago, carcinoma esofágico de célula escamosa, neoplasmos gastrintestinais, neoplasmos pancreáticos, tais como, adenocarcinoma do pâncreas, neoplasmo cístico mucinoso do pâncreas, neoplasmos císticos pancreáticos, pancreatoblastoma e neoplasmos peritônios), doença esofágica (por exemplo, doenças bolhosas, candidíase, acantose glicogênica, ulceração, varizes esofágicas de Barret, atresia, cisto, divertículo (por exemplo, divertículo de Zenker), fístula (por exemplo, fístula traquoesofágea), transtornos de motilidade (por exemplo, síndrome de CREST, transtornos de deglutição, acalasia, espasmo, refluxo gastresofágico), neoplasmos, perfuração (por exemplo, síndrome de Boerhaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenose, esofagite, hérnia diafragmática (por exemplo, hérnia de hiato); doenças gastrintestinais, tais como, gastrenterite (por exemplo, cólera mórbida, infecção por vírus norwalk), hemorragia (por exemplo, hematemese, melena, hemorragia ulcerativa péptica), neoplasmos estomacais (câncer gástrico, pólipos gástricos, adenocarcinoma gástrico, câncer estomacal)), hérnia (por exemplo, hérnia diafragmática congênita, hérnia femoral, hérnia ungueal, hérnia do obturador, hérnia umbilical, hérnia ventral) e doenças do intestino (por exemplo, apendicite, neoplasmos cecais)).

Quimiotaxia

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem apresentar atividade de quimiotaxia. Uma molécula quimiotática atrai ou mobiliza células (por exemplo, monócitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células mastóides, eosinófilos, células epiteliais e/ou endoteliais) para um sítio de hiperproliferação. As células mobilizadas podem então não se enfrentarem e/ou curar o trauma específico ou anormalidade.

As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem aumentar a atividade quimiotáxica de células específicas. Essas moléculas quimiotáticas podem então ser empregadas para tratar inflamação, infecção, transtornos hiperproliferativos ou qualquer transtorno do sistema imune por aumento do número de células alvejadas em um local específico no corpo. Por exemplo, as moléculas quimiotáxicas podem então ser usadas para tratar feridas e outros traumas dos tecidos por atração das células imunes para o local lesionado. As moléculas quimiotáticas da presente invenção podem também atrair fibroblastos que podem ser empregados para tratar feridas.

É também contemplado que as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção podem inibir a atividade quimiotática. Essas moléculas poderiam também ser usadas para tratar transtornos. Assim, as proteínas de fusão da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção seriam usados como inibidores da qimiotaxia.

Atividade de ligação

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser empregadas para classificar as moléculas que se ligam a porção da proteína Terapêutica da proteína de fusão ou as moléculas nas quais a porção da proteína Terapêutica da proteína de fusão se liga. A ligação da proteína de fusão e da molécula pode ativar (agonista), aumentar, inibir (antagonista) ou diminuir a atividade da proteína de fusão ou ligação da molécula. Exemplos de tais moléculas incluem anticorpos, oligonucleotídeos, proteínas (por exemplo, receptores) ou moléculas pequenas.

De preferência, a molécula está proximamente relacionada ao ligante natural da porção da proteína Terapêutica da proteína de fusão da invenção, por exemplo, um fragmento do ligante ou um substrato natural, um ligante, um mimético estrutural ou funcional, (vide, Coligan e outros, Current Protocols in Immunology l(2):Capítulo 5 (1991)). De modo semelhante, a molécula pode estar proximamente relacionada ao receptor natural ao qual a porção da proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção se liga ou pelo menos, um fragmento do receptor capaz de ser ligado pela porção da proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção (por exemplo,sítio ativo). Em cada caso, a molécula pode ser projetada racionalmente empregando técnicas conhecidas. De preferência, a classificação dessas moléculas envolve a produção de células apropriadas que expressam as proteínas de fusão da albumina da invenção. Células preferidas incluem células de mamíferos, levedura, Drosophila ou E. coli.

O ensaio pode testar simplesmente a ligação de um composto candidato a uma proteína de fusão da albumina da invenção, onde a ligação é detectada por um marcador ou em um ensaio envolvendo competição com um competidor marcado. Adicionalmente, o ensaio pode testar se o composto candidato resulta em um sinal gerado por ligação à proteína de fusão.

Alternativamente, o ensaio pode ser realizado empregando preparações isentas de célula, proteína/molécula de fusão fixada a um suporte sólido, bibliotecas químicas ou misturas de produto natural. O ensaio pode também compreender, simplesmente, as etapas de mistura de um composto candidato com uma solução contendo uma proteína de fusão da albumina, medição da atividade de fusão da proteína/molécula ou ligação e comparação da atividade da proteína/molécula de fusão ou ligação a um padrão.

De preferência, um ensaio ELISA pode medir o nível ou atividade da proteína de fusão em uma amostra (por exemplo, amostra biológica) empregando um anticorpo monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode medir o nível ou atividade da proteína de fusão tanto por ligação, direta ou indireta a proteína de fusão da albumina ou por competição com a proteína de fusão da albumina por um substrato.

Adicionalmente, o receptor ao qual uma porção da proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção se liga pode ser identificado por vários métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, bateamento de um ligante e classificação por FACS (Coligan, e outros, Current Protocols in Immun., 1(2), capítulo 5, (1991)). Por exemplo, nos casos onde a porção da proteína Terapêutica da proteína de fusão corresponde ao FGF, a clonagem da expressão pode ser empregada quando o RNA poliadenilado é preparado de uma célula sensível à proteína de fusão da albumina, por exemplo, células N1H3T3 que são conhecidas por conter múltiplos receptores para proteínas da família FGF e células SC-3, e uma biblioteca de DNAc criada desse RNA é dividida em grupos e usada para transfectar as células COS ou outras células que não respondem à proteína de fusão da albumina. As células transfectadas que se desenvolvem em lâminas de vidro são expostas a proteína de fusão da albumina da presente invenção, após terem sido marcadas. As proteínas de fusão da albumina podem ser marcadas de vários modos incluindo iodinação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteínocinase específica de sítio.

Seguindo-se a fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise auto- radiográfica. Grupos positivos são identificados e subgrupos são preparados e retransfectados empregando um processo de subgrupamento e reanálise interativa, eventualmente rendendo clones simples que codificam o receptor putativo.

Como uma abordagem alternativa para identificação do receptor, uma proteína de fusão da albumina marcada pode ser ligada por foto afinidade à membrana celular ou preparações de extrato que expressam a molécula receptora para o componente da proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da albumina da invenção, o material ligado podendo ser decomposto por análise PAGE e exposto à película de raios-X. O complexo marcado contendo os receptores da proteína de fusão podem ser excisados, decompostos em fragmentos de peptídeo e submetidos ao microsequenciamento da proteína. A seqüência de aminoácido obtida do microsequenciamento seria empregada para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeo degeneradas para avaliar uma biblioteca de DNAc de modo a identificar os genes codificando os receptores putativos.

Além disso, as técnicas de embalharamento do gene, embalharamento do motivo, embaralamento do éxon e/ou embaralhamento do códon, (coletivamente referidas como "embaralhamento do DNA") podem ser empregadas para modular as atividades da proteína de fusão e/ou porção da proteína Terapêutica ou componente albumina de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, pelo que gerando eficazmente agonistas e antagonistas de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. Vide, de modo geral, Patentes US números 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, e 5.837.458 além de Patten. Ρ. A.. e outros, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, L. O., e outros, J. MoL Biol. 287:265-76 (1999); e Lorenzo, Μ. M. and Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13 (1998); cada uma dessas patentes e publicações sendo incorporada aqui como referência). Em uma modalidade, a alteração dos polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção e assim, a proteína de fusão da albuminas codificada dessa forma, pode ser obtida por shuffling de DNA. O shuffling do DNA envolve a reunião de dois ou mais segmentos de DNA em uma molécula desejada por recombinação homóloga ou específica do sítio. Em outra modalidade, os polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção e assim, a proteína de fusão da albuminas dessa forma codificada, podem ser alterados por serem submetidos a mutagênese aleatória por PCR propensa a erro, inserção aleatória de nucleotídeo ou outros métodos antes da recombinação. Em outra modalidade, um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode ser recombinados com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas. Nas modalidades preferidas, as moléculas heterólogas são elementos da família. Nas concretizações adicionalmente preferidas, a molécula heteróloga é um fator de crescimento, tal como, por exemplo, um fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulino-símile (IGI), fator transformador do crescimento alfa (TGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento dos fibroblastos (FGF), TGF-beta, proteína morfogenética dos ossos (BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, activinas AeB, decapentaplegica(dpp), 60A, OP-2, dorsalina, fatores diferenciadores do crescimento (GDFs), nodal, MIS,fator de inibição alfa, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5, e fator neurotrófico derivado de glial (GDNF).

Outros fragmentos preferidos são fragmentos biologicamente ativos da porção da proteína Terapêutica e/ou componente albumina das proteínas de fusão da albumina da presente invenção. Fragmentos biologicamente ativos são aqueles exibindo atividade semelhante, porém não necessariamente idêntica a uma atividade da porção da proteína Terapêutica e/ou componente albumina das proteínas de fusão das albumina da presente invenção. A atividade biológica dos fragmentos pode incluir uma atividade desejada melhorada ou uma atividade indesejada diminuída.

Adicionalmente, essa invenção obtém um método para classificação dos compostos, de modo a identificar aqueles que modulam a ação de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção. Um exemplo de tal ensaio compreende combinação de uma célula de fibroblasto de mamífero, uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, e o composto a ser classificado e 3[H]timidina sob condições de cultivo de célula, onde a célula de fibroblasto normalmente proliferaria. Um ensaio de controle pode ser realizado na ausência do composto a ser classificado e comparado a quantidade de proliferação do fibroblasto na presença do composto, de modo a determinar se o composto estimula a proliferação por determinação da absorção de 3[H] timidina em cada caso. A quantidade de proliferação celular do fibroblasto é medida por cromatografia de cintilação de líquido que mede a incorporação de 3[H]timidina. Ambos os compostos agonista e antagonista podem ser identificados por esse procedimento.

Em outro método, uma célula de mamífero ou preparação de membrana expressando um receptor para o componente da proteína Terapêutica de uma proteína de fusão da invenção é incubada com uma proteína de fusão marcada da presente invenção, na presença do composto. A capacidade do composto de melhorar ou bloquear essa interação então poderia ser medida. Alternativamente, a resposta de um segundo sistema mensageiro conhecido seguindo-se a interação de um composto a ser classificado e o receptor é medida e a capacidade do composto de se ligar ao receptor e promover uma resposta do segundo mensageiro é medida de modo a determinar se o composto é uma proteína de fusão em potencial. Tais segundos sistemas mensageiros incluem, porém não estão limitados a guanilato ciclase AMPc, canais de íon ou hidrólise de fosfoinositídeo.

Todos esses ensaios acima podem ser empregados como marcadores de diagnóstico ou prognóstico. As moléculas reveladas empregando esses ensaios podem ser usadas para tratar uma doença ou obter um resultado específico em um paciente (por exemplo, crescimento do vaso sangüíneo), por ativação ou inibição da proteína/molécula de fusão. Além disso, os ensaios podem descobrir agentes que podem inibir ou melhorar a produção das proteínas de fusão da albumina da invenção de células ou tecidos apropriadamente manipulados.

Portanto, a invenção inclui um método para identificar os compostos que se ligam a uma proteína de fusão da albumina da invenção compreendendo as etapas de: (a) incubação de um composto de ligação candidato com uma proteína de fusão da albumina da presente invenção; e (b) determinação se a ligação ocorreu. Além disso, a invenção inclui um método para identificar os agonistas/antagonistas compreendendo as etapas de: (a) incubação de um composto candidato com uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, (b) ensaio da atividade biológica e (c) determinação se a atividade biológica da proteína de fusão foi alterada.

Disbribuição alvejada

Em outra modalidade, a invenção obtém um método para distribuição de composições para células alvejadas expressando um receptor para um componente de uma proteína de fusão da albumina da invenção.

Conforme discutido aqui, as proteínas de fusão da invenção podem ser associadas aos polipeptídeos heterólogos, ácidos nucléicos heterólogos, toxinas ou promedicamentos através de interações hidrófobas, hidrófilas, iônicas e/ou covalentes. Em uma modalidade, a invenção obtém um método para a distribuição específica das composições da invenção às células por administração das proteínas de fusão da invenção (incluindo anticorpos) que são associadas aos polipeptídeos heterólogos ou ácidos nucléicos. Em um exemplo, a invenção obtém um método para distribuição de uma proteína Terapêutica dentro de uma célula alvejada. Em outro exemplo, a invenção obtém um método para distribuição de um ácido nucléico de filamento simples (por exemplo, antisentido ou ribozimas) ou ácido nucléico de filamento duplo (por exemplo, DNA que pode integrar o genoma das células ou replicar epissomicamente e que pode ser transcrito) dentro da célula alvo.

Em outra modalidade, a invenção obtém um método para a destruição específica das células (por exemplo, a destruição das células tumorais) por administração de uma proteína de fusão da albumina da invenção (por exemplo, polipeptídeos da invenção ou anticorpos da invenção) em associação às toxinas ou promedicamentos citotóxicos.

"Toxina" significa compostos que se ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas ou quaisquer moléculas ou enzimas que normalmente não estão presentes na ou sobre a superfície de uma célula, as quais sob condições definidas causam a morte celular. As toxinas que podem ser empregadas de acordo com os métodos da invenção incluem, porém não estão limitadas aos radioisótopos conhecidos na técnica, compostos, tais como, por exemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo suas porções) que se ligam a um sistema efetor citotóxico endógeno induzido, timidina cinase, endonuclease, RNAse, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antivirótica da erva dos cancros, alfa-sarcina e toxina do cólera. "Promedicamento citotóxico" significa um composto não tóxico que é convertido por uma enzima, normalmente presente na célula, em um composto citotóxico. Os promedicamentos citotóxicos que podem ser empregados de acordo com os métodos da invenção incluem, porém não estão limitados aos derivados de glutamila do agente alquilante de mostarda ácido benzóico, derivados de fosfato de etoposídeo ou mitomicina C, arabinosídeo de citosina, daunorubisina e derivados de fenoxiacetamida de doxorubicina.

Classificação do medicamento

É adicionalmente contemplado o emprego das proteínas de fusão da albumina da presente invenção ou os polinucleotídeos codificando essas proteínas de fusão para classificar as moléculas que modificam as atividades da proteína de fusão da albumina da presente invenção ou proteínas correspondendo à porção da proteína Terapêutica da proteína de fusão da albumina. Tal método incluiria contato da proteína de fusão com composto(s) selecionado(s) suspeitos de terem atividade antagonista ou agonista e ensaio da atividade da proteína de fusão seguindo-se a ligação.

Essa invenção é especificamente útil para classificação dos compostos terapêuticos para emprego das proteínas de fusão da albumina da presente invenção ou seus fragmentos de ligação, em qualquer uma das várias técnicas de classificação de medicamentos. A proteína de fusão da albumina empregada em tal teste pode ser fixada a um suporte sólido, expressa em uma superfície celular, livre na solução ou localizada intracelularmente. Um método pra classificação do medicamento utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são transformadas estavelmente com ácidos nucléicos recombinatórios expressando a proteína de fusão da albumina. Os medicamentos são classificados contra tais células transformadas ou sobrenadantes obtidos do cultivo de tais células nos ensaios de ligação competitivos. Pode-se medir, por exemplo, a formulação dos complexos entre o agente sendo testado e uma proteína de fusão da albumina da presente invenção.

Assim, a presente invenção obtém métodos para classificação dos medicamentos ou quaisquer outros agentes que afetam as atividades mediadas pelas proteínas de fusão da albumina da presente invenção. Esses métodos compreendem contato de tal agente com uma proteína de fusão da albumina da presente invenção ou seu fragmento e classificação quanto a presença de um complexo entre o agente e a proteína de fusão da albumina ou seu fragmento, por métodos bem conhecidos na arte. Em tal ensaio de ligação competitivo, os agentes para classificação são tipicamente marcados. Seguindo-se a incubação, o agente livre é separado daquele presente na forma ligada e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma mistura da capacidade do agente específico de se ligar a proteína de fusão da albumina da presente invenção.

Outra técnica para classificação de medicamento obtém classificação de alto rendimento para compostos possuindo afinidade de ligação apropriada a uma proteína de fusão da albumina da presente invenção e é descrita em maiores detalhes no Pedido de Patente Europeu 84/03564, publicado em 13 de setembro de 1984, que é incorporado aqui como referência. Em resumo, um grande número de compostos de teste de peptídeo pequenos diferentes são sintetizados em um substrato sólido, tal como, pinos de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de teste de peptídeo são reagidos com uma proteína de fusão da albumina da presente invenção e lavados. Os peptídeos ligados são então detectados pelos métodos conhecidos na técnica. A proteína de fusão da albumina purificada pode ser revestida diretamente sobre as placas para uso nas técnicas de classificação de medicamento mencionadas anteriormente. Além disso, os anticorpos não neutralizantes podem ser empregados para capturar o peptídeo e imobilizar o mesmo sobre o suporte sólido.

Essa invenção também contempla o uso de ensaios de classificação de medicamento competitivos nos quais os anticorpos neutralizantes capazes de ligar uma proteína de fusão da albumina da presente invenção competem especificamente com um composto de teste para ligação a proteína de fusão da albumina ou seus fragmentos. Dessa maneira, os anticorpos são usados de modo a detectar a presença de qualquer peptídeo que compartilha um ou mais epítopos antigênicos com uma proteína de fusão da albumina da invenção.

Peptídeos de ligação e outras moléculas

A invenção também engloba métodos de classificação para identificar polipeptídeos e não polipeptídeos que ligam as proteínas de fusão da albumina da invenção e as moléculas de ligação identificadas dessa forma. Essas moléculas de ligação são úteis, por exemplo, como agonistas e antagonistas das proteínas de fusão da albumina da invenção. Tais agonistas e antagonistas podem ser empregados, de acordo com a invenção, nas modalidades terapêuticas descritas em detalhes aqui a seguir.

Esse método compreende as etapas de: contato de uma proteína de fusão da albumina da invenção com várias moléculas e identificação da molécula que se liga a proteína de fusão da albumina.

A etapa de contatar a proteína de fusão da albumina da invenção com várias moléculas pode ser efetuada de vários modos. Por exemplo, pode-se contemplar a imobilização da proteína de fusão da albumina em um suporte sólido e colocando a solução das várias moléculas em contato com os polipeptídeos imobilizados. Tal procedimento seria útil a um processo cromatográfico de afinidade, com a matriz de afinidade sendo compreendida da proteína de fusão da albumina da invenção imobilizada. As moléculas possuindo uma afinidade seletiva para a proteína de fusão da albumina podem ser purificadas por seleção de afinidade. A natureza do suporte sólido, processo para anexação da proteína de fusão da albumina ao suporte sólido, solvente e condições de isolamento por afinidade ou seleção são convencionais e bem conhecidos dos versados na técnica comum.

Alternativamente, pode-se também separar vários polipeptídeos em frações substancialmente separadas compreendendo um subconjunto ou polipeptídeos individuais. Por exemplo, pode-se separar vários polipeptídeos por eletroforese de gel, cromatografia de coluna ou método semelhante conhecido dos versados na técnica comum para separação dos polipeptídeos. Os polipeptídeos individuais também podem ser produzidos por uma célula hospedeira transformada de modo a serem expressos na ou ao redor de sua superfície externa (por exemplo, um fago recombinatório). Os isolados individuais podem então ser "sondados" por uma proteína de fusão da albumina da invenção, opcionalmente na presença de um indutor caso seja necessário para expressão, para determinar se qualquer interação de afinidade seletiva acontece entre a proteína de fusão da albumina e o clone individual. Antes do contato da proteína de fusão da albumina com cada fração compreendendo polipeptídeos individuais, os polipeptídeos seriam primeiro transferidos para um suporte sólido para conveniência adicional. Tal suporte sólido pode ser simplesmente uma peça de membrana de filtro, tal como uma fabricada de nitrocelulose ou náilon. Dessa maneira, os clones positivos seriam identificados de uma coleção de células hospedeiras transformadas de uma biblioteca de expressão, os quais trabalham uma construção de DNA codificando um polipeptídeo possuindo uma afinidade seletiva para uma proteína de fusão da albumina da invenção. Adicionalmente, a seqüência de aminoácido do polipeptídeo possuindo uma afinidade seletiva para uma proteína de fusão da albumina da invenção pode ser determinada diretametne por meios convencionais ou a seqüência de codificação do DNA codificando o polipeptídeo pode ser freqüentemente determinada mais convenientemente. A seqüência primária pode então ser deduzida da seqüência de DNA correspondente. Se a seqüência de aminoácido for determinada do polipeptídeo propriamente, pode-se usar técnicas de microsequenciamento. A técnica de seqüenciamento pode incluir espectroscopia de massa.

Em determinadas situações, pode ser desejável lavar quaisquer polipeptídeos não ligados da mistura de uma proteína de fusão da albumina da invenção e os vários polipeptídeos antes de tentar determinar ou de modo a detectar a presença de uma interação de afinidade seletiva. Tal etapa de lavagem pode ser especificamente desejável quando a proteína de fusão da albumina da invenção ou os vários polipeptídeos forem ligados a um suporte sólido. As várias moléculas obtidas de acordo com esse método pode ser obtidas por várias bibliotecas, tais como, bibliotecas de peptídeo ou não peptídeo aleatórias ou combinadas que podem ser classificadas quanto a moléculas que se ligam especificamente a uma proteína de fusão da albumina da invenção. Muitas bibliotecas são conhecidas na arte e podem ser usadas, por exemplo, bibliotecas quimicamente sintetizadas, recombinatórios (por exemplo, bibliotecas que revelam fago) e bibliotecas á base de tradução in vitro . Exemplos de bibliotecas sintetizadas quimicamente são descritos em Fodor e outros, Science 251:767-773 (1991); Houghten e outros, Nature 354:84-86 (1991); Lam e outros, Nature 354:82- 84 (1991); Medynski, Bio/Technology 12:709-710 (1994); Gallop e outros, J. Medicinal Chemistry 37(9): 1233-1251 (1994); Ohlmeyer e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Erb e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994); Houghten e outros, Biotechniques 13:412 (1992); Jayawickreme e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614- 1618 (1994); Salmon e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993); PCT Publication No. WO 93/20242; and Brenner and 15 Leraer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992).

Exemplos de bibliotecas de mostra de fago são descritos em Scott e outros, Science 249:386-390 (1990); Devlin e outros, Science, 249:404-406 (1990); Christian e outros, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718 1992); Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-157 (1992); Kay e outros, Gene 128:59-65 (1993); e Publicação PCT número WO 94/18318 datada de 18 de agosto de 1994.

As bibliotecas à base de tradução incluem porém não estão limitadas aquelas descritas na Publicação PCT número WO 91/05058 datada de 18 de abril de 1991; e Mattheakis e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994).

Como exemplos de bibliotecas de não peptídeo, uma biblioteca de benzodiazepina (vide por exemplo, Bunin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994)) pode ser adaptada para emprego. As bibliotecas de peptóide (Simon e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)) também podem ser usadas. Outro exemplo de uma biblioteca que pode ser empregada, onde as funcionalidades amida nos peptídeos foram permetiladas, de modo a gerar uma biblioteca combinatória quimicamente transformada é descrito em Ostresh e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142 (1994)).

A variedade de bibliotecas não peptídeo que são úteis na presente invenção é grande. Por exemplo, Ecker and Crooke (Bio/Technology 13:351-360 (1995) listam benzodiazepinas, hidantoínas, piperazinadionas, bifenilas, análogos de açúcar, beta-mercaptocetonas, ácidos arilacéticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas e oxazolonas como estando entre as espécies químicas que forma a base das várias bibliotecas.

As bibliotecas não peptídeo podem ser classificadas amplamente em dois tipos: monômeros decorados e oligômeros. As bibliotecas de monômero decorado empregam uma estrutura de revestimento relativamente simples pela qual uma variedade de grupos adicionais são acrescentados. Freqüentemente, o scaffold será uma molécula com uma atividade farmacológica útil conhecida. Por exemplo, o scaffold pode ser a estrutura de benzodiazepina.

Bibliotecas oligoméricas não peptídeo utilizam um grande número de monômeros que são conjugados de modo a criar novas formas que dependem da ordem dos monômeros. Entre as unidades monoméricas que foram usadas estão os carbamatos, pirrolinonas e morfolinos. Os peptóides, oligômeros semelhantes a peptídeo, onde a cadeia lateral é anexada a um grupo amino ao invés de um alfa carbono formam a base de outra versão de bibliotecas de oligômero não peptídeo. As primeiras bibliotecas de oligômero não peptídeo utilizaram um tipo simples de monômero e assim continham uma estrutura repetida. As bibliotecas recentes utilizaram mais de um monômero, fornecendo assim bibliotecas com flexibilidade adicionada.

A classificação das bibliotecas pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos geralmente conhecidos. Vide, por exemplo, as referências que se seguem que revelam a classificação das bibliotecas de peptídeo: Parmley e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218 (1989); Scott e outros,. Science 249:386-390 (1990); Fowlkes e outros, BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-20 5397 (1992); Yu e outros, Cell 76:933-945 (1994); Staudt e outros, Science 241:577-580 (1988); Bock e outros, Nature 355:564-566 (1992); Tuerk e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992 (1992); Ellington e outros, Nature 355:850-852 (1992); Patentes US números 5.096.815, 5.223.409 e 5.198.346, todas de Ladner e outros; Rebar e outros, Science 263:671-673 (1993); e Publicação PCT número WO 94/18318.

Em uma modalidade específica, a classificação para identificar uma molécula que se liga uma proteína de fusão da albumina da invenção pode ser realizada por contato dos elementos da biblioteca com uma proteína de fusão da albumina da invenção imobilizada em uma fase sólida e colhendo aqueles elementos da biblioteca que se ligam a proteína de fusão da albumina. Exemplos de tais métodos de classificação, denominados técnicas de "bateamento" são descritos como exemplo em Parmley e outros, Gene 73:305-318 (1988); Fowlkes e outros, BioTechniques 13:422-427 (1992); Publicação PCT número WO 94/18318 e nas referências citadas aqui.

Em outra modalidade, o sistema biídrico para seleção de proteínas de interação na levedura (Fields e outros, Nature 340:245-246 (1989); Chien e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991) pode ser usado para identificar moléculas que se ligam especificamente aos polipeptídeos da invenção.

Quando a molécula de ligação for um polipeptídeo, o polipeptídeo pode ser convenientemente selecionado de qualquer biblioteca de peptídeo incluindo bibliotecas de peptídeo aleatórias, bibliotecas de peptídeo combinatórias ou bibliotecas de peptídeo distorcidas. O termo "distorcida" é empregado aqui para significar que o método de geração da biblioteca é manipulado de modo a restringir um ou mais parâmetros que governam a diversidade da coleção de moléculas resultante, nesse caso os peptídeos.

Assim, uma biblioteca de peptídeo verdadeiramente aleatória geraria uma coleção de peptídeos nos quais a probabilidade de encontrar um aminoácido específico em uma dada posição do peptídeo é a mesma para todos os 20 aminoácidos. Um bias pode ser introduzido na biblioteca, contudo, por especificação, por exemplo, que uma lisina ocorra a cada quinto aminoácido ou que as posições 4, 8 e 9 de uma biblioteca de decapeptídeo sejam fixadas para incluir apenas arginina. Claramente, muitos tipos de distorções podem ser contemplados e a presente invenção não se restringe a qualquer bias específica. Adicionalmente, a presente invenção contempla tipos específicos de bibliotecas de peptídeo, tais como, bibliotecas de peptídeo revelado em fago e aquelas que utilizam uma construção de DNA compreendendo um vetor de lambda fago com uma inserção de DNA.

Conforme mencionado acima, no caso de uma molécula de ligação ser um polipeptídeo, o polipeptídeo pode ter cerca de 6 a menos de 60 resíduos de aminoácido, de preferência cerca de 6 a 10 resíduos de aminoácido e, mais preferivelmente, cerca de 6 a 22 aminoácidos. Em outra modalidade, um polipeptídeo de ligação está na faixa de 15-100 aminoácidos ou 20-50 aminoácidos.

O polipeptídeo de ligação selecionado pode ser obtido por síntese química ou expressão recombinatório.

Outras Atividades

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção, podem ser empregados no tratamento para estimular a revascularização de tecidos isquêmicos devido à várias condições de doença, tais como, trombose, arteriosclerose e outras condições cardiovasculares. As proteínas de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para estimular a angiogênese e regeneração de membro, conforme discutido acima.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para tratamento de feridas causadas por lesões, queimaduras, reconstituição de tecido em pós-operatório e úlceras uma vez que eles são mítogênicos a várias células de origens diferentes, tais como, células de fibroblasto e células de músculo esqueletal e, portanto facilitam a reconstituição ou substituição do tecido danificado ou doente.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para estimular o crescimento neuronal e tratar e prevenir lesão neuronal que ocorre em determinados transtornos neuronais ou condições neurodegenerativas, tais como, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e complexo relacionado a AIDS. Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ter a capacidade de estimular o crescimento de condrócito, portanto, eles podem ser empregados para melhorar a regeneração óssea e periodontal e auxiliar nos transplantes de tecidos ou enxertos ósseos.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem também ser empregados para prevenir o envelhecimento da pele devido a queimaduras solares por estímulo do crescimento de ceratinócito.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para prevenir queda capilar. Ao longo das mesmas linhas, uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para estimular o crescimento e diferenciação das células hematopoiéticas e células da medula óssea em combinação com outras citocinas.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para manter órgãos antes do transplante ou para sustentar uma cultura de células de tecidos primários. Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção também podem ser empregados para induzir tecido de origem mesodérmica a se diferenciar nos embriões anteriores.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem também aumentar ou diminuir a diferenciação ou proliferação das células tronco embriônicas, além da linhagem hematopoiética, conforme discutido acima.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem também ser usados para modular as características dos mamíferos, tais como, altura corpórea, peso, cor dos cabelos, cor dos olhos, pele, porcentagem de tecido adiposo, pigmentação, tamanho e forma (por exemplo, cirurgia cosmética). De modo semelhante, uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para modular o metabolismo afetando o catabolismo, anabolismo, processamento, utilização e armazenamento de energia.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser empregados para alterar o estado mental ou estado físico do mamífero por influência dos biorritmos, batidas cardíacas, depressão (incluindo transtornos depressivos), tendência a violência, tolerância a dor, capacidades reprodutoras (de preferência por Activina ou atividade semelhante de inibição), níveis hormonais ou endócrinos, apetite, libido, memória, tensão ou outras qualidades cognitivas.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção e/ou polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem também ser empregados como aditivo alimentar ou preservante, tal como, para aumentar ou diminuir as capacidades de armazenamento, teor de gordura, lipídeos, proteínas, carboidrato, vitaminas, minerais, co-fatores ou outros componentes nutricionais.

As aplicações citadas acima possuem emprego em uma ampla variedade de hospedeiros. Tais hospedeiros incluem, porém não estão limitados ao ser humano, murino, coelho, cabrito, porquinho-da-índia, camelo, cavalo, camundongo, rato, hamster, porco, micro porco, galinha, cabrito, gado, carneiro, cão, gato, primata não humano. Nas modalidades específicas, o hospedeiro é um camundongo, coelho, cabrito, porquinho-da-índia, galinhas, rato, hamster, porco, carneiro, cão ou gato. Nas modalidades preferidas, o hospedeiro é um mamífero. Nas modalidades mais preferidas o hospedeiro é um ser humano.

Tendo assim descrito a invenção de modo geral, a mesma será mais prontamente entendida com referência aos exemplos que se seguem, os quais são obtidos apenas como ilustração e não devem ser tidos como limitantes.

Sem descrição adicional, acredita-se que um versado na prática comum possa realizar e empregar as alterações detectadas na presente invenção empregando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos que se seguem, além de praticar os métodos reivindicados. Os exemplos de trabalho que se seguem, portanto ressaltam especificamente as modalidades preferidas da presente invenção e não devem ser tidos como limitando de que forma for o restante da revelação.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Geração de pScNHSA e pScCHSA

Os vetores pScNHSA (Depósito ATCC número PTA-3279) e pScCHSA (Depósito ATCC número PTA-3276) são derivados do pPPC0005 (Depósito ATCC número PTA-3278) e são empregados como vetores de clonagem nos quais os polinucleotídeos codificando uma proteína Terapêutica ou fragmento ou suas variantes são inseridos adjacentes e no quadro de tradução com os polinucleotídeos codificando albumina de soro humano "HSA". pScCHSA pode ser empregado para gerar fusões de proteína Terapêutica-HSA, enquanto o pScNHSA pode ser empregado de modo a gerar fusões de proteína terapêutica-HSA. Geração de pScCHSA: fusão da albumina com a fração albumina de término C à porção terapêutica

Um vetor para facilitar a clonagem de DNA codificando uma proteína Terapêutica de término N ao DNA codificando a proteína de albumina madura foi obtido por alteração da seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo de sinal HSA quimérico em pPPC0005 para incluir os sítios de restrição Xhol e Clal.

Primeiro, os sítios Xhol e Clal inerentes ao pPPC0005 (localizados na 3' da seqüência terminadora ADHI) foram eliminados por digestão de pPPCOOOõ com Xhol e Clal, enchendo as extremidades viscosas com T4 DNA polimerase e religando as extremidades cegas para criar o pPPC0006.

Em segundo lugar, os sítios de restrição Xhol e Clal foram construídos na seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo de sinal de HSA (uma quimera de HSA líder e um sítio kex2 do fator alfa combinatório "MAF") em pPPC0006 empregando duas rodadas de PCR. Na primeira rodada da PCR1 foi realizada a ampliação com os iniciadores mostrados SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37. O iniciador cuja seqüência é mostrada como SEQ ID NO:36 compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica parte da seqüência de peptídeo de sinal de HSA, um sítio kex2 da seqüência líder fator alfa combinatório e parte do término amino da forma madura de HSA. Mutações de quatro pontos foram introduzidas na seqüência, criando os sítios Xhol e Clal encontrados na junção do peptídeo de sinal quimérico e a forma madura de HSA. Essas quatro mutações são sublinhadas na seqüência mostrada a seguir. No pPPCOOOõ os nucleotídeos nessas quarto posições a partir de 5' para 3' são T, G, T e G.

5'-G CÇTÇG AG AAAAG AG ATG C ACAC AAG AGTG AG GTTG CTCATCG ATTTAAAG A TTTGGG-3' (SEQ ID NO:36) e 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGA ATAAGC-3' (SEQ ID NO:37). Uma segunda rodada da PCR foi então realizada com o iniciador flanqueando a montante, 5'-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3' (SEQ ID NO:38) e um iniciador flanqueando a jusante õ'-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3' (SEQ ID NO: 39). O produto da PCR resultante foi então purificado e digerido com Afl W e Xbal e ligado aos mesmos sítios em pPPC0006 criando pScCHSA. O plasmídeo resultante possui sítios Xhol e Clal tranformados na seqüência de sinal. A presença do sítio Xhol cria uma alteração no aminoácido simples na extremidade da seqüência de sinal de LDKR para LEKR. A alteração DaE não estará presente no plasmídeo de expressão da proteína de fusão da albumina final quando a seqüência de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo codificando a porção Terapêutica da proteína de fusão da albumina com um sítio 5' SalI (que é compatível com o sítio Xhol) e um sítio 3' Call forem ligados nos sítios Xhol e Clal de pScCHSA. A ligação de Sall ao Xhol restaura a seqüência de aminoácido original da seqüência de peptídeo de sinal. DNA codificando a porção Terapêutica da proteína de fusão da albumina pode ser inserido após o sítio Kex2 (Kex2 cliva após a seqüência de aminoácido dibásica KR na extremidade do peptídeo de sinal) e antes do sítio Clal.

Geração do pScNHSA: fusão da albumina com a fração da albumina de término N à porção terapêutica

Um vetor que facilitasse a clonagem de DNA codificando uma porção da proteína Terapêutica de término C ao DNA codificando a proteína de albumina madura foi obtido por adição de três sítios de restrição de oito pares de base ao pScCHSA. Os sítios de restrição Ascl, Fsel e Pmel foram adicionados entre os sítios Bsu36l e HindIII na extremidade da seqüência de ácido nucléico codificando a proteína de HSA madura. Isso foi realizado através do emprego de dois iniciadores sintéticos complementares contendo os sítios de restrição Ascl, Fsel e Pmel sublinhados (SEQ ID N0:40 e SEQ IDNO:41).

5'-AAGCTGCCTTAGGCTT AT AAT AAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTT AAACT AAGC TTAATTCT-3' (SEQ ID N0:40) e 5-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTT ATT AT AAGCCT AAG GCAGCTT-3' (SEQ ID NO:41). Esses iniciadores foram anelados e digeridos com Bsu36l e HindIII e ligados aos mesmos sítios em pScCHSA criando pScNHSA.

EXEMPLO 2: Geração de construção geral para transformação de levedura

Os vetores pScNHSA e pScCHSA podem ser empregados como vetores de clonagem dentro dos quais os polinucleotídeos empregando uma proteína Terapêutica ou seu fragmento ou variante são inseridos adjacentes aos polinucleotídeos codificando albumina de soro humano madura "HSA". pScCHSA é empregado para gerar fusões da proteína Terapêutica-HSA, enquanto pScNHSA pode ser usado para gerar fusões de proteína terapêutica-HSA.

Geração das construções de fusão da albumina compreendendo produtos de fusão de proteína Terapêutica-HSA

DNA codificando uma proteína Terapêutica (por exemplo, seqüências mostradas na SEQ ID NO:X ou conhecidas na técnica) pode ser ampliado por PCR usando os iniciadores que facilitam a geração da construção de fusão (por exemplo, por adição de sítios de restrição, codificação de fusões sem costura, codificação de seqüências ligantes, etc.). Por exemplo, um versado na técnica projetaria um iniciador 5' que adicione polinucleotídeos codificando os últimos quatro aminoácidos da forma madura de HSA (e contendo o sítio Bsu36l) na extremidade 5' do DNA codificando uma proteína Terapêutica; e um iniciador 3' que adiciona um códon STOP e sítios de clonagem apropriados na extremidade 3' da seqüência de codificação da proteína Terapêutica. Por exemplo, o iniciador a frente usado para ampliar o DNA codificando uma proteína Terapêutica pode apresentar a seqüência 5'-aaqctGCCTTAGGCTTA(NW3' (SEQ ID NO:42), onde a seqüência sublinhada é um sítio Bsu36l, os nucleotídeos do caso acima codificam os últimos quatro aminoácidos da proteína HSA madura (ALGL) e (N)15 é idêntico aos primeiros quinze nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. De modo semelhante, o iniciador reverso empregado para ampliar o DNA codificando uma proteína Terapêutica pode apresentar a seqüência,

5'-GCGCGCGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCC TTATATA (Ν)15 -3' (SEQ ID NO:43) onde a seqüência com itálico é um sítio PmeI site, a seqüência com sublinhado duplo é um sítio Fsel, a seqüência com sublinhado simples é um sítio Ascl, os nucleotídeos na caixa são o complemento reverso dos dois códons STOP em tandem e (N)15 é idêntico ao complemento reverso dos últimos quinze nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. Uma vez que o produto da PCR é ampliado, ele pode ser cortado com Bsu36l e um dentre (Ascl, Fsel ou PmeI) e ligado ao pScNHSA.

A presença do sítio Xhol na seqüência líder quimérica HAS cria uma alteração de amínoácido simples no final da seqüência de sinal quimérica, isto é, a seqüência de sinal HSA-kex2, de LDKR (SEQ ID NO:44) para LEKR (SEQ ID NO:45).

Geração de construções de fusão da albumina compreendendo produtos de fusão de pene-HSA

De modo semelhante ao método descrito acima, o DNA codificando uma proteína Terapêutica pode ser ampliado por PCR empregando os seguintes iniciadores: um iniciador 5' que adiciona polinucleotídeos contendo um sítio SalI e codificando os últimos três aminoácidos da seqüência líder HSA, DKR na extremidade 5' do DNA codificando uma proteína terapêutica; e um iniciador 3' que adiciona polinucleotídeos codificando os primeiros poucos aminoácidos de HSA madura contendo um sítio Clal na extremidade 3' do DNA codificando uma proteína Terapêutica. Por exemplo, o iniciador a frente usado para ampliar o DNA codificando uma proteína Terapêutica pode ter a seqüência, 5'-aqqagcqtcGACAAAAGA(N)15-3' (SEQ ID NO:46) onde a seqüência sublinhada é um sítio SalI, os nucleotídeos do caso acima codificam os últimos três aminoácidos da seqüência líder HSA (DKR) e (N)15 é idêntico aos quinze primeiros nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. De modo semelhante, o iniciador reverso usado para ampliar o DNA codificando uma proteína Terapêutica pode ter a seqüência, S-CTTTAAiATCGA7GAAGCAACCTCACTCTTGTGCATC(NW3' (SEQ ID NO:47) onde a seqüência em itálico é um sito Call, os nucleotídeos sublinhados são o complemento reverso do DNA codificando os primeiros nove aminoácidos da forma madura de HSA (DAHKSEVAH, SEQ ID NO:48), e (N)15 é idêntico ao complemento reverso dos últimos quinze nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. Uma vez que o produto da PCR é ampliado, ele pode ser cortado com SalI e Clal e ligado ao pScCHSA digerido com Xhol e Clal. Uma seqüência de sinal ou líder diferente pode ser desejada, por exemplo, uma seqüência líder ou sinal diferente pode ser desejado, por exemplo, invertase "INV" (Acesso ao protocolo suíço P00724), fator alfa combinatório "MAF" (Acesso ao Genbank AAA18405), MPIF (Geneseq AAF82936), Fibulina B (Acesso ao protocolo suíço P23142), Clusterina (Acesso ao protocolo suíço P 10909), Proteína de ligação 4-fator de crescimento insulino símile, (Acesso ao protocolo suíço P22692), e permutações da seqüência líder HSA podem ser subclonados no vetor apropriado por meio de métodos padrão conhecidos na técnica.

Geração de construção de fusão da albumina compatível para expressão em levedura S. cerevisiae

O fragmento Notl contendo o DNA codificando tanto uma proteína de fusão da albumina de término N ou término C gerada de pScNHSA ou pScCHSA pode então ser clonado no sítio Notl de pSAC35 que possui um marcador selecionável LEU2. O vetor resultante é então empregado na transformação de um sistema de expressão da levedura S. cerevisiae.

EXEMPLO 3: Expressão peral na Levedura S. cerevisiae

Um vetor de expressão compatível com a expressão de levedura pode ser transformado em levedura S. cerevisiae por transformação com acetato de lítio, eletroporação ou outros métodos conhecidos na arte e/ou conforme descrito em parte em Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição", volumes 1-3, e em Ausubel e outros 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medicai School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. Os vetores de expressão são introduzidos nas cepas de S. cerevisiae, DXYI, D88 ou BXPIO por transformação, transformantes individuais podem ser desenvolvidos, por exemplo, por 3 dias a 30°C em 10 mL de YEPD (1% peso/volume de extrato de levedura, 2% peso/volume, peptona, 2% peso/volume de dextrose), e as células podem ser coletadas na fase estacionária após 60 horas de crescimento. Os sobrenadantes são coletados por clarificação das células a 3.000 g por 10 minutos.

pSAC35 (Sleep e outros, 1990, Biotechnology 8:42 e vide Figura 3) compreende, além disso o marcador selecionável LEU2, toda a levedura 2 pm de plasmídeo para prover funções de replicação, o promotor PRB1 e o sinal de terminação ADH1.

EXEMPLO 4: Purificação geral de uma proteína de fusão da albumina expressa de uma fusão da albumina na levedura S. cerevisiae

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendem a forma madura de HSA fundida tanto ao término N quanto C da forma madura de uma proteína Terapêutica ou porções da mesma (por exemplo, a forma madura de uma proteína Terapêutica listada na Tabela 1 ou a forma madura de uma proteína Terapêutica mostrada na Tabela 2 como SEQ ID NO:Z). Em uma modalidade da invenção, as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendem, adicionalmente, uma seqüência de sinal que direciona o polipeptídeo de fusão nascente nas vias secretórias do hospedeiro usado para expressão. Em uma modalidade preferida, o peptídeo de sinal codificado pela seqüência de sinal é removido e a proteína de fusão da albumina madura é secretada diretametne no meio de cultura. As proteínas de fusão da albumina da invenção de preferência compreendem seqüências de sinal heterólogas (por exemplo, a seqüência de sinal não nativa de uma proteína terapêutica específica), incluindo, porém não limitada a, MAF, ESTV, Ig1 Fibulina B, Clusterina, Proteína de ligação do fator de crescimento insulino símile, variante de seqüências líder de HSA incluindo, porém não limitado a seqüência líder quimérica HSA/MAF ou outras seqüências de sinal heterólogas conhecidas na arte. Especificamente preferidas são aquelas seqüências de sinal listadas na Tabela 2 e/ou seqüência de sinal listada na seção "Expressão das Proteínas de Fusão" e/ou Métodos Adicionais de Produção Recombinante e Sintética das Proteínas de Fusão da Albumina" do relatório descritivo acima. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da invenção compreendem, adicionalmente, resíduo de metionina de término N. Os polinucleotídeos codificando esses polipeptídeos incluindo fragmentos e/ou variantes são também englobados pela invenção.

As proteínas de fusão da albumina expressas na levedura, conforme descrito acima, podem ser purificadas em pequena escala em uma coluna de afinidade de peptídeo Dyax como se segue. Os sobrenadantes da levedura expressando uma proteína de fusão da albumina são diafiltrados contra 3 mM tampão fosfato, pH 6,2, 20 mM de NaCI e 0,01% Tween 20 de modo a reduzir o volume e para remover os pigmentos. A solução é então filtrada através de um dispositivo de 0,22 pm. O filtrado é carregado em uma coluna de afinidade de peptídeo Dyax. A coluna é eluída com 100 mM de tampão Tris/HCI, pH 8,2 . As frações máximas contendo a proteína são coletadas e analisadas em SDS-PAGE após concentração de 5 vezes.

Para purificação em grande escala, o método que se segue pode ser utilizado. O sobrenadante em excesso de 2 litros é diafiltrado e concentrado para 500 mL em 20 mM Tris/HCI pH 8,0. A solução de proteína concentrada é carregada em uma coluna de fluxo rápido DEAE-Sefarose de 50 mL pré-equilibrada, a coluna é lavada e a proteína é eluída com um gradiente linear de NaCI de 0 a 0,4 M de NaCI em 20 mM de Tris/HCI, pH 8,0. Aquelas frações contendo a proteína são agrupadas, ajustadas para pH 6,8 com 0,5 M de fosfato de sódio (NaH2PO4). Uma concentração final de 0,9 M (NH4)2SO4 é adicionada à solução de proteína e a solução total é carregada em uma coluna de Butila650S de 50 mL pré-equilibrada. A proteína é eluída com um gradiente linear de sulfato de amônio (0,9 a 0 M (NH4)2SO4). Aquelas frações com a fusão da albumina são novamente agrupadas, diafiltradas contra 10 mM de tampão Na2HPO4^cido cítrico, pH 5,75 e carregadas em uma coluna de fluxo rápido SP-Sepharose pré-equilibrada. A proteína é eluída com um gradiente linear NaCI de 0 a 0,5 M. As frações contendo a proteína de interesse são combinadas, o tampão é alterado para 10 mM de Na2HPO4^cido cítrico, pH 6,25 com concentrador 5 Amicon, a condutividade é < 2,5 mS/cm. Essa solução da proteína é carregada em uma coluna de desempenho alto de Q-Sepharose pré-equilibrada de 15 ml_, a coluna é lavada e a proteína é eluída com um gradiente linear de NaCI de 0 a 0,15 M NaCI. A proteína purificada pode então ser formulada em uma composição de tampão específico por troca do tampão.

EXEMPLO 5: Geração de construção geral para transfecção de célula de mamífero

Geração de constrção de fusão da albumina compatível para expressão das linhagens de células de mamíferos

As construções de fusão da albumina podem ser geradas nos vetores de expressão por uso nos sistemas de cultura de célula de mamífero. O DNA codificando uma proteína Terapêutica pode ser clnado no término N ou término C para HSA em um vetor de expressão de mamífero por métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ampliação por PCR, digestão por restrição e ligação). Uma vez que o vetor de expressão tiver sido construído, a transfecção em um sistema de expressão de mamífero pode ser conduzida. Os vetores apropriados são conhecidos na técnica incluindo, porém não limitado por exemplo ao vetor pC4 e/ou vetores disponíveis na Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).

O DNA codificando albumina de soro humano foi clonado no vetor pC4 que é apropriado para sistema de cultura de mamíferos, criando o plasmídeo pC4:HSA (Depósito ATCC número PTA-3277). Esse vetor possui um gene e Diidrofolato reductase, "DHFR", que permitirá a seleção na presença de meetrotrexato.

O vetor pC4:HSA é apropriado para expressão das proteínas de fusão da albumina nas células CHO. Para expressão em outros sistemas de cultura de célula de mamíferos, pode ser desejável subclonar um fragmento compreendendo ou consistindo alternativamente em DNA que codifica uma proteína de fusão da albumina em um vetor de expressão alternativo. Por exemplo, um fragmento compreendendo ou consistindo alternativamente no DNA que codifica uma proteína de fusão da albumina madura pode ser subclonado em outro vetor de expressão incluindo, porém não limitado a quaisquer vetores de expressão de mamífero descritos aqui.

Em uma modalidade preferida, DNA codificando uma construção de fusão da albumina é subclonado em vetores providos pela Lonza Biologies, Inc. (Portsmouth, NH) por procedimentos conhecidos na arte de expressão em células NSO.

Geração de construções de fusão da albumina compreendendo produtos de fusão de proteína Terapêutica-HSA Quando do emprego de pC4:HSA (Depósito ATCC número PTA-3277), as construções de fusão da albumina podem ser geradas, onde uma porção da proteína Terapêutica possui término C para a seqüência de albumina madura. Por exemplo, pode-se clonar o DNA codificando uma proteína Terapêutica de fragmento ou sua variante entre os sítios de restrição Bsu36\ e >Ascl do vetor. Quando da clonagem em Bsu36\ e >4scl, pode ser empregado o mesmo projeto de iniciador usado para clonar o sistema de vetor de levedura (SEQ ID NOs:42 e 43) (vide Exemplo 2).

Geração de construções de fusão da albumina compreendendo gene-orodutos de fusão de HSA

Quando do emprego de pC4:HSA (Depósito ATCC número PTA-3277), as construções de fusão da albumina podem ser geradas, onde uma porção da proteína Terapêutica possui término N para a seqüência de albumina madura. Por exemplo, pode-se clonar o DNA codificando uma proteína Terapêutica que tenha sua própria seqüência de sinal entre os sítios SamHI (ou Hind\\\) e C/al do vetor. Quando da clonagem no sítio BamHI (ou Hind III), é preferível incluir uma seqüência Kozak (CCGCCACCATG, SEQ ID NO:49) antes do códon de partida translacional do DNA codificando a proteína Terapêutica. Se a proteína Terapêutica não tiver uma seqüência de sinal, o DNA codificando aquela proteína Terapêutica pode ser clonado entre os Xftol e Cla I de pC4:HSA. Quando se emprega o sítio Xftol, os iniciadores da PCR exemplares 5' (SEQ ID N0:50) e 3' (SEQ ID NO:51) podem ser empregados:

5'-CCGCCGÇTÇGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3· (SEQ IDNO: 50)

5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)iR-3' (SEQ ID

NO:51).

No iniciador 5' (SEQ ID NO: 50), a seqüência sublinhada é o sítio Xftol; e o sítio Xftol e o DNA seguindo-se o sítio Xftol codificam os últimos sete aminoácidos da seqüência líder da albumina de soro humano natural. Na SEQ ID NO: 50 "(N)18" possui DNA idêntico aos dezoito primeiros nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. No iniciador 3' (SEQ ID NO: 51), a seqüência sublinhada é um sítio C/al; e o sítio C/al e o DNA seguindo o mesmo são o complemento reverso do DNA codificando os primeiros dez aminoácidos da proteína HSA madura (SEQ ID NO: 1). Na SEQ ID NO: 51 "(N)18" é o complemento reverso do DNA codificando os últimos dezoito nucleotídeos codificando a proteína Terapêutica de interesse. Com o emprego desses dois iniciadores, pode-se ampliar a PCR da proteína Terapêutica de interesse, purificar o produto da PCR, digerir a mesma com as enzima de restrição Xftol e C/al e clonar a mesma nos sítios Xftol e C/al no vetor pC4:HSA.

Se uma seqüência líder alternativa for desejada, a seqüência líder de albumina nativa pode ser substituída com uma líder da albumina quimérica, isto é, o peptídeo de sinal HSA-kex2 ou uma líder alternativa por métodos padrão conhecidos na arte. (Por exemplo, um versado na técnica poderia ampliar rotineiramente a PCR de uma líder alternada e subclonar o produto da PCR em uma construção de fusão da albumina no lugar da líder de albumina, enquanto mantendo o quadro de leitura).

EXEMPLO 6: Expressão geral nas Iinhapens de células de mamíferos

Uma construção de fusão da albumina gerada em um vetor de expressão compatível com a expressão nas linhagens de células de mamíferos pode ser transfectada nas linhagens celulares apropriadas por precipitação de fosfato de cálcio, lipofectamina, eletroporação ou outros métodos de transfecção conhecidos na arte e/ou conforme descrito em Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição" e em Ausubel e outros 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medicai School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4. As células transfectadas são então selecionadas quanto à presença de um agente de seleção determinado pelo marcador selecionável em um vetor de expressão.

O vetor de expressão pC4 (Número de acesso ATCC 209646) é um derivado do plasmídeo pSV2-DHFR (Número de acesso ATCC 37146). pC4 contém as Repetições de Terminal Longo "LTR" do promotor mais fortes do Virus Rous Sarcoma (Cullen e outros, Março de 1985, Molecular and Cellular Biology, 438-447) e um fragmento do melhorador do Citomegalovírus "CMV" (Boshart e outros, 1985, Cell 41: 521-530). O vetor também contém o íntron 3', o sinal de poliadenilação e terminação do gene de pré-pró-insulina e o gene do camundongo DHFR sob controle do promotor anterior SV40. As células de ovário de hamster chinês "CHO" ou outras linhagens de células que não possuem um gene DHFR ativo são usadas para transfecção. A transfecção de uma construção de fusão da albumina em pC4 nas células CHO por métodos conhecidos na arte permitirá uma expressão da proteína de fusão da albumina nas células CHO, seguido por clivagem da seqüência líder e secreção no sobrenadante. A proteína de fusão da albumina é então adicionalmente purificada do sobrenadante.

O vetor de expressão pEE12.1 é obtido na Lonza Biologies, Inc. (Portsmouth, NH) e é um derivado de pEE6 (Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. H: 7110). Esse vetor compreende um promoter, melhorador e região não traduzida 5' completa do gene Anterior Imediato principal do Citomegalovírus humano "hCMV-MIE" (Publicação Internacional número W089/01036), a montante de uma seqüência de interesse e um gene de Glutamina Sintetase (Murphy e outros, 1991, Biochem J. 227: 277-279; Bebbington e outros, 1992, Bio/Technology 10:169-175; Patente US número 5.122.464) para fins de seleção das células transfectadas no meio contendo sulfoximina de metionina. A transfecção das construções de fusão da albumina realizada nas células pEE12.1 em células NSO (Publicação Internacional número W086/05807) pelos métodos conhecidos na arte permitirá a expressão da proteína de fusão da albumina nas células NSO, seguido por clivagem da seqüência líder e secreção no sobrenadante. A proteína de fusão da albumina é então adicionalmente purificada do sobrenadante empregando técnicas descritas aqui ou de outra forma conhecidas na arte.

A expressão de uma proteína de fusão da albumina pode ser analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e Western blot, análise de HPLC de fase reversa ou outros métodos conhecidos na arte.

Linhagens de células estáveis CHO e NOS transfectadas com construções de fusão da albumina são geradas pelos métodos conhecidos na arte (por exemplo, transfecção por lipofectamina) e selecionadas, por exemplo, com 100 nM de metotrexato para vetores possuindo o gene de Diidrofolato reductase "DHFR" como um marcador selecionável ou através do crescimento na ausência de glutamina. Os níveis de expressão podem ser examinados, por exemplo, por immunobloting, primariamente com um soro anti-HSA como o anticorpo primário ou, em secundariamente, com soro contendo anticorpos direcionados a uma porção da proteína Terapêutica de uma dada proteína de fusão da albumina como o anticorpo primário.

Os níveis de expressão são examinados por detecção de immunoblot com soro anti-HSA como o anticorpo primário. As taxas de produtividade específicas são determinadas através de ELISA onde o anticorpo de captura pode ser um anticorpo monoclonar na direção da porção da proteína Terapêutica da fusão da albumina e o anticorpo de detecção pode ser o anticorpo anti-HSA-biotinilado monoclonal (ou vice versa), seguido por ligação de peroxidase de raiz-forte/estreptavidina e análise de acordo com o protocolo do fabricante.

EXEMPLO 7: Expressão de uma proteína de fusão da albumina nas células de mamíferos

As proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser expressas em uma célula de mamífero. Um vetor de expressão de mamífero típico contém um elemento promotor, que media o início da transcrição de RNAm,uma seqüência de codificação da proteína e sinais necessários para terminação da transcrição e poliadenilação do transcrito. Elementos adicionais incluem melhoradores, seqüências Kozak e seqüências de intervenção flanqueadas por sítios doadores e aceitadores para recomposição do RNA. A transcrição altamente eficaz é obtida com os promotores anteriores e posteriores de SV40, as repetições de terminal longa (LTRs) de Retrovírus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor anterior do citomegalovírus (CMV). Contudo, elementos celulares podem também ser usados (por exemplo, o promotor de actina humano).Vetores de expressão apropriados para uso na prática da presente invenção

incluem, por exemplo, vetores, tais como, pSVL e pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), ρRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 e pCMVSport 3.0. As células hospedeiras de mamíferos que poderiam ser usadas incluem, porém não estão limitadas a Hela humana, 293, células H9 e Jurkat, de camundongo N1H3T3 e células C127, células Cos 1, Cos 7 e CVI, células de codorna QCI-3, células L de camundongo e células de ovário de hamster chinês (CHO).

Alternativamente, a proteína de fusão da albumina pode ser expressa em linhagens de células estáveis contendo o polinucleotídeo codificando a proteína de fusão da albumina integrada ao cromossoma. A co-transfecção com um marcador selecionável, tal como DHFR, gpt, neomicina ou higromicina permite a identificação e isolamento das células transfectadas.

O polinucleotídeo transfectado codificando a proteína de fusão também pode ser ampliado para expressar grandes quantidades da proteína de fusão codificada. O marcador DHFR (diidrofolato reductase) é útil no desenvolvimento das linhagens celulares que portam várias centenas e mesmo vários milhares de cópias de gene de interesse. (Vide, por exemplo, Alt e outros, J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin e outros, Biochem. et 5 Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page e outros, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Outro marcador de seleção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy e outros, Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington e outros, Bio/Technology 10:169- 175 (1992). Empregando-se esses marcadores, as células de mamíferos se desenvolvem em meio seletivo e as células com a maior resistência são selecionadas. Essas linhagens de célula contém o(s) 20 gene(s) ampliado(s) integrado9s) a um cromossomo. As células de ovário de hamster chinês (CHO) e NOS são freqüentemente usadas para a produção de proteínas.

Os derivados do plasmídeo pSV2-dhfr (Número de acesso ATCC 37146), aos vetores de expressão pC4 (Número de acesso ATCC 209646) e pC6 (Número de acesso ATCC209647) contêm o promotor forte (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (Cullen e 25 outros, Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Março de 1985)) mais um fragmento do melhorador de CMV (Boshart e outros, Cell 41:521-530 (1985)). Sítios de clonagem múltipla, por exemplo, com sítios de clivagem de enzima de restrição BamH\, Xba\ e Asp718, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vetores também contêm o íntron 3', o sinal de poliadenilação e terminação do gene de pré-pró-insulina de rato e o gene DHFR do camundongo sob controle do promotor anterior SV40.

Especificamente, o plasmídeo pC6, por exemplo, é digerido com enzimas de restrição apropriadas e então desfosforilado empregando fosfatos de intestino de bezerro por procedimentos conhecidos na arte. O vetor é então isolado de um gel agarose a 1%.

Um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção é gerado empregando técnicas conhecidas na arte e esse polinucleotídeo é ampliado empregando tecnologia da PCR conhecida na arte. Se uma seqüência de sinal ocorrendo naturalmente for empregada para produzir a proteína de fusão da presente invenção, o vetor não precisa de um segundo peptídeo de sinal. Alternativamente, se a seqüência de sinal ocorrendo naturalmente não for empregada, o vetor pode ser modificado para incluir uma seqüência de sinal heteróloga. (Vide, por exemplo, Publicação Internacional Número WO 96/34891.)

O fragmento ampliado codificando a proteína de fusão da invenção é isolado de um gel de agarose a 1% empregando um kit disponível comercialmente ("Geneclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). O fragmento então é digerido com enzimas de restrição apropriadas e novamente purificado com um gel de agarose a 1%.

O fragmento ampliado codificando a proteína de fusão da albumina da invenção é então digerido com a mesma enzima de restrição e purificado em um gel de agarose a 1%. O fragmento isolado e o vetor desfosforilado são então ligados com T4 DNA ligase. As células de E. coli HBIOI ou XL-I Blue são então transformadas e as bactérias são identificadas contendo o fragmento inserido no plasmídeo pC6 usando, por exemplo, análise de enzima de restrição.

Células de ovário de hamster chinês que não possuem o gene DHFR são empregadas para transfecção. Cinco pg do plasmídeo de expressão pC6 ou pC4 são co-transfectados com 0,5 pg do plasmídeo pSVneo empregando Iipofectina (Feigner e outros, supra). O plasmídeo pSV2-neo contém um marcador selecionável dominante, o gene neo de Tn5 codificando uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas em alfa menos MEM suplementado com 1 mg/mL de G418. Após 2 dias, as células são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em alfa menos MEM suplementado com 10, 25 ou 50 ng/mL de metotrexato mais 1 mg/mL de G418. Após cerca de 10-14 dias os clones simples são tripsinizados e então semeados em placas de petri de 6 poços ou frascos de 10 mL empregando concentrações diferentes do metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Os clones se desenvolvendo em concentrações de metrotexato maiores são então transfectados para novas placas de 6 poços contendo concentrações de metotrexato mesmo maiores (1 μΜ, 2 μΜ, 5 μΜ, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repetido, até serem obtidos clones que crescem a uma concentração de 100-200 μΜ. A expressão da proteína de fusão desejada é analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e Western blot ou por análise de HPLC de fase inversa.

EXEMPLO 8: Purificação geral de uma proteína de fusão da albumina expressa de uma construção de fusão da albumina em linhagens de células de mamíferos

Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendem a forma madura de HSA fundida tanto ao término N quanto C da forma madura de uma proteína Terapêutica ou porções da mesma (por exemplo, a forma madura de uma proteína Terapêutica listada na Tabela 1 ou a forma madura de uma proteína Terapêutica mostrada na Tabela 2 como SEQ ID NO:Z). Em uma modalidade da invenção, as proteínas de fusão da albumina da invenção compreendem, adicionalmente, uma seqüência de sinal que direciona o polipeptídeo de fusão nascente nas vias secretoras do hospedeiro usadas para expressão. Em uma modalidade preferida, o peptídeo de sinal codificado pela seqüência de sinal é removido e a proteína de fusão da albumina madura é secretada diretamente no meio de cultivo. As proteínas de fusão da albumina da invenção de preferência compreendem seqüências de sinal heterólogas (por exemplo, a seqüência de sinal não nativa de uma proteína terapêutica específica) incluindo, porém não limitado a MAF, INV1 lg, Fibulina B, Clusterina, proteína 4 do fator de crescimento insulino símile, seqüências líder HSA variantes incluindo, porém não limitadas a seqüência líder HSA/MAF quimérica ou outras seqüências de sinal heterólogas conhecidas na arte. Especialmente preferidas são aquelas seqüências de sinal listadas na Tabela 2 e/ou a seqüência de sinal listada na seção "Expressão das Proteínas de Fusão" e/ou "Métodos Adicionais de Produção Recombinante e Sintética de Proteínas de Fusão da Albumina" do relatório descritivo acima. Nas modalidades preferidas, as proteínas de fusão da invenção compreendem, adicionalmente, resíduo de metionina de término N. Os polinucleotídeos codificando esses polipeptídeos incluindo fragmentos e/ou variantes são também englobados pela invenção.

As proteínas de fusão da albumina dos sobrenadantes de linhagem de célula de mamífero são purificadas de acordo com protocolos diferentes dependendo do sistema de expressão utilizado.

Purificação das linhagens de células CHO e 293T

A purificação de uma proteína de fusão da albumina do sobrenadante de célula CHO ou sobrenadante de célula 293T transfectada transitoriamente pode envolver a captura inicial com uma resina HQ aniônica empregando tampão fosfato de sódio e uma eluição de gradiente fosfato, seguido por cromatografia de afinidade em uma coluna de Blue Sepharose FF empregando uma eluição de gradiente sal. A Blue Sepharose FF remove os principais contaminantes BSA/fetuína. A purificação adicional sobre a resina Poros Pl 50 com um gradiente fosfato pode remover e abaixar a contaminação por endotoxina, bem como concentrar a proteína de fusão da albumina.

Purificação da linhagem celular de NSO

A purificação da proteína de fusão-albumina do sobrenadante de célula NSO pode envolver cromatografia de troca de ânion de Q-Sepharose1 seguido por purificação de SP-Sepharose com eluição de uma etapa, seguido por purificação com Phenyl-650M com eluição de uma etapa e, de forma final, a diafiltração.

A proteína purificada pode então ser formulada por troca de tampão.

Exemplo 9: Expressão bacteriana de uma proteína de fusão da albumina Um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção compreendendo uma seqüência de sinal bacteriana é ampliada empregando iniciadores de oligonucleotídeo da PCR correspondendo às extremidades 5' e 3' da seqüência de DNA1 para sintetizar inserção de fragmentos. Os iniciadores usados para ampliar o polinucleotídeo codificando a inserção preferivelmente contêm sítios de restrição, tais como, BamH\ e XbaI na extremidade 5' dos iniciadores, a fim de clonar o produto ampliado no vetor de expressão. Por exemplo, BamH\ e Xba\ correspondem aos sítios da enzima de restrição no vetor de expressão bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Esse vetor de plasmídeo codifica resistência antibiótica (ampr), uma origem bacteriana de replicação (ori), um operador/promotor regulável de IPTG (P/O), um sítio de ligação de ribossoma (RBS), um marcador de 6-histidina (6-His) e sítios de clonagem de enzima de restrição.

O vetor pQE-9 é digerido com BamH\ e Xbal e o fragmento ampliado é ligado ao vetor de pQE-9 mantendo o quadro de leitura iniciado no RBS bacteriano. A mistura de ligação é então usada para transformar a cepa de E.coli M15/rep4 (Qiagen, lnc.O que contém cópias múltiplas do plasmídeo pREP4, que expressa o repressor lac\ e também confere resistência à canamicina (Kanr). Os transformantes são identificados por sua capacidade de desenvolvimento nas placas LB e colônias resistentes a ampicilina/canamicina são selecionadas. O DNA de plasmídeo é isolado e confirmado por análise de restrição.

Os clones contendo as construções desejadas são desenvolvidos por toda a noite (O/N) na cultura líquida em meios LB suplementados com ambos Amp (10 pg/mL) e Kan (25 pg/mL). A cultura O/N é empregada para inocular uma cultura grande em uma razão de 1:100 a 1:250. As células são desenvolvidas a uma densidade óptica de 600 (O.D.600) entre 0,4 e 0,6. IPTG (isopropil-B-D-tiogalacto piranosídeo) é então adicionada a uma concentração final de 1 mM. IPTG induz a inativação do repressor /acl, limpando P/O conduzindo à expressão gênica aumentada.

As células são desenvolvidas por 3 a 4 horas extras. As células são então colhidas por centrifugação (20 minutos a 6.000 Xg). A microesfera celular é solubilizada no agente caotrópico 6 Molar Guanidina HCl ou preferivelmente na uréia 8M e concentrações superiores a 0,14 M 2-mercaptoetanol por agitação por 3-4 horas a 4°C (vide, por exemplo, Burton e outros, Eur. J. Biochem. 179:379-387 (1989)). Os fragmentos celulares são removidos por centrifugação e o sobrenadante contendo o polipeptídeo é carregado em uma coluna de resina de afinidade de níquel-nitrilo-tri-ácido triacético ("Ni-NTA") (disponível na QIAGEN, Inc., supra). As proteínas com um marcador 6 χ His se ligam à resina Ni-NTA com alta afinidade e podem ser purificadas em um procedimento simples de uma etapa (para detalhes vide: The QIA expressionist (1995) QIAGEN, Inc., supra). Em resumo, o sobrenadante é carregado à coluna em 6 M guanidina-HCI, pH 8. A coluna é primeiro lavada com 10 volumes de 6 M guanidina-HCI, pH 8, então lavada com 10 volumes de 6 M guanidina-HCI pH 6, e finalmente o polipeptídeo é eluído com 6 M guanidina-HCI, pH 5.

A proteína purificada é então renaturada por dialização contra salmoura tamponada com fosfato (PBS) ou 50 mM de Na-acetato, pH 6 tampão mais 200 mM de NaCl. Alternativamente, a proteína pode ser redobrada com sucesso, enquanto imobilizada na coluna Ni-NTA. As condições exemplares são como se segue: a renaturação usando um gradiente de uréia 6M-1M linear em 500 mM de NaCl, glicerol a 20%, 20 mM de Tris/HCl pH 10 7,4 contendo inibidores de protease. A renaturação seria realizada por um período de 1 hora e meia ou mais. Após renaturação as proteínas são eluídas por adição de 250 mM de imidazol. O imidazol é removido por uma etapa de dialização final contra PBS u 50 mM de acetato de sódio, pH 6 tampão mais 200 mM de NaCI. A proteína purificada é armazenada a 4°C ou congelada a -80°C. 15 Além do vetor de expressão acima, a presente invenção inclui, adicionalmente, um

vetor de expressão, denominado pHE4a (número de acesso ATCC 209645, depositado em 25 de fevereiro de 1998) que contém um operador de fago e elementos promotores operativamente ligados a um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, denominada pHE4a. (Número de acesso ATCC 209645, depositada 20 em de fevereiro de 1998). Esse vetor contém: 1) um gene de neomicinfosfotransferase como um marcador de seleção, 2) uma origem E.coli de replicação, 3) uma seqüência promotora de fago T5, 4) duas seqüências do operador lac, 5) uma seqüência Shine-Delgarno e 6) um gene repressor operon lactose (laclq). A origem de replicação (oriC) é derivada de pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). As seqüências promotora e de operador são 25 fabricadas sinteticamente.

DNA pode ser inserido em pHE4a por restrição do vetor com NdeI e Xba\, BamH\, Xho\ ou Asp718, operando o produto restrito em um gel e isolando o fragmento maior (o fragmento acumulador teria cerca de 310 pares de base). A inserção de DNA é gerada de acordo com os protocolos da PCR descritos aqui ou de outra forma conhecidos na arte empregando iniciadores da PCR possuindo sítios de restrição para NdeI (iniciador 5') e Xba\, BamH\, Xho\ ou Asp718 (iniciador 3'). A inserção da PCR é purificada com gel e restrita às enzimas compatíveis. A inserção e o vetor são ligados de acordo com os protocolos padrão.

O vetor construído pode ser substituído no protocolo acima para expressar a proteína em um sistema bacteriano.

EXEMPLO 10: Isolamento de um clone de DNAc selecionado da amostra depositada Muitas das construções de fusão da albumina da invenção foram depositadas na ATCC conforme mostrado na Tabela 3. As construções de fusão da albumina podem compreender qualquer um dos seguintes vetores de expressão: o vetor de expressão S. cerevisiae de levedura pSAC35, o vetor de expressão de mamífero pC4 ou o vetor de expressão de mamífero pEE12.1.

Os vetores pSAC35 (Sleep e outros, 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (Número de acesso ATCC 209646; Cullen e outros, Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985); Boshart e outros, Cell 41: 521-530 (1985)), e pEE12.1 (Lonza Biologies, Inc.; Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110 (1989); Publicação Internacional número W089/01036; Murphy e outros, Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington e outros, Bio/Technology 10:169-175 (1992); Patente US número 5.122.464; Publicação Internacional número W086/05807) compreendem um gene resistente à ampicilina para desenvolvimento das células bacterianas. Esses vetores e/ou uma construção de fusão da albumina compreendendo os mesmos podem ser transformados na cepa de E.coli tal como Stratagene XL-I Blue (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) empregando técnicas descritas na arte, tais como Hanahan, dispersão sobre placas de caldo Luria contendo 100 p]g/mL de ampicillina e desenvolvendo por toda a noite a 37°C.

O material depositado na amostra recebeu o número de depósito ATCC citado naTabela 3 para qualquer dada construção de fusão da albumina pode também conter uma ou mais construções de fusão da albumina, cada uma codificando proteínas de fusão da albumina diferentes. Assim, os depósitos compartilhando o mesmo número de depósito ATCC contêm pelo menos uma construção de fusão da albumina identificada na fileira correspondendo à Tabela 3.

Duas abordagens podem ser usadas para isolar uma construção de fusão da albumina específica da amostra depositada de DNAs de plasmídeo citados para aquela construção de fusão da albumina na Tabela 3.

Método 1: Classificação

Primeiro, uma construção de fusão da albumina pode ser isolada diretamente por classificação da amostra de DNAs de plasmídeo isolados empregando uma sonda de polinucleotídeo correspondendo à SEQ ID NO:X para uma número ID de construção individual na Tabela 1, usando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, um polinucleotídeo específico com 30-40 nucleotídeos pode ser sintetizado empregando um sintetizador de DNA da Applied Biosystems de acordo com a seqüência reportada. O oligonucleotídeo pode ser marcado, por exemplo, com 32Ρ-γ-ΑΡΤ usando T4 polinucleotídeo cinase e purificado de acordo com os métodos de rotina. (Por exemplo, Maniatis e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). A construção de fusão da albumina de um dado depósito ATCC é transformada em um hospedeiro apropriado, conforme indicado acima (tal como, XL-I Blue (Stratagene)) empregando técnicas conhecidas dos versados na arte, tais como aquelas obtidas do fornecedor do vetor ou em publicações correlatas ou patentes citadas acima. Os transformantes são colocados em placas de ágar a 1,5% (contendo o agente de seleção apropriado, por exemplo, ampicilina) a uma densidade de cerca de 150 transformantes (colônias) por placa. Essas placas são classificadas usando membranas de náilon de acordo com os métodos de rotina para classificação de colônia bacteriana (por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 1.93 to 1.104) ou outras técnicas conhecidas dos versados na arte.

Método 2: PCR

Alternativamente, DNA codificando uma dada proteína de fusão da albumina pode ser ampliado de uma amostra de uma construção de fusão da albumina depositada com a SEQ I NO: X, por exemplo, por emprego de dois iniciadores de 17-20 nucleotídeos que hibridizam a construção de fusão da albumina depositada 5' e 3' em relação ao DNA codificando uma dada proteína de fusão da albumina. A reação de cadeia da polimerase é realizada em condições de rotina, por exemplo, em 25 pL da mistura de reação com 0,5 pg do gabarito de DNAc acima. Uma mistura de reação conveniente é 1,5-5 mM de MgCI2, 0,01% (peso/volume) de gelatina, 20 μΜ cada de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol de cada iniciador e 0,25 Unit de Taq polimerase. Trinta e cinco ciclos da PCR (desnaturação a 94°C por 1 minuto; recombinação a 55°C por 1 minuto; alongamento a 72°C por 1 minuto) são realizados com um ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus automatizado. O produto ampliado é analisado por eletroforese de gel agarose e faixa de DNA com peso molecular esperado é excisada e purificada. O produto da PCR é verificado de modo a ser a seqüência selecionada por subclonagem e seqüenciamento do produto de DNA.

Vários métodos estão disponíveis para identificação das porções de não codificação 5' ou 3' de um gene que não pode estar presente no clone depositado. Esses métodos incluem, porém não estão limitados à sondagem do filtro, enriquecimento do clone empregando sondas específicas e protocolos específicos ou idênticos aos protocolos "RACE" 5' e 3' que são conhecidos na arte. Por exemplo, um método semelhante a RACE 5' está disponível para geração de extremidade 5' faltante da transcrição de comprimento pleno desejada. (Fromont-Racine e outros, Nucleic Acids Res., 21(7):1683-1684 (1993)).

Em resumo, um oligonucleotídeo RNA específico é ligado às extremidades 5' da população de RNA contendo presumivelmente transcrições de RNA de gene de comprimento pleno. Um conjunto iniciador contendo um iniciador específico para o oligonucleotídeo de RNA ligado e um iniciador específico para uma seqüência conhecida do gene de interesse é empregada para ampliar a PCR da porção 5' do gene de comprimento pleno desejado. O produto ampliado pode então ser seqüenciado e usado de modo a gerar o gene de comprimento pleno.

Esse método acima inicia com o RNA total isolado da fonte desejada, embora poli- A+ RNA possa ser usado. A preparação de RNA pode então ser tratada com fosfatase, caso desejado, para eliminar os grupos fosfato 5' em RNA degradado ou danificado que pode interferir com a última etapa de Iigase de RNA. A fosfatase então seria inativada e o RNA tratado com pirofosfatase de ácido de tabaco a fim de remover a estrutura de capeamento presente nas extremidades 5' do RNAs mensageiro. Essa reação deixa um grupo 5' fosfato na extremidade 5' do RNA clivado com capeamento que pode então ser ligado a um oligonucleotídeo de RNA usando T4 RNA ligase.

Essa preparação de RNA modificado é empregada como um gabarito para a síntese de DNAc de primeiro filamento empregando um oligonucleotídeo específico de gene. A reação de síntese de primeiro filamento é usada como um gabarito para ampliação da PCR da extremidade 5' desejada usando um iniciador específico para o oligonucleotídeo de RNA ligado e um iniciador específico para a seqüência conhecida do gene de interesse. O produto resultante é então seqüenciado e analisado de modo a confirmar que a seqüência de extremidade 5' pertence ao gene desejado.

EXEMPLO 11: Fusões de multifusão

As proteínas de fusão da albumina (por exemplo, contendo uma proteína

Terapêutica (ou fragmento ou suas variantes) fundida à albumina (ou seu fragmento ou variante)) pode adicionalmente ser fundida a outras proteínas, de modo a gerar "proteínas de multifusão". Essas proteínas de multifusão podem ser usadas para uma variedade de aplicações. Por exemplo, a fusão das proteínas de fusão da albumina da invenção ao marcador His, marcador Há, proteína A, domínios IgG e proteína de ligação da maltose facilita a purificação. (Vide por exemplo, EP A 394.827; Traunecker e outros, Nature 331:84-86 (1988)). Sinais de localização nuclear fundidos aos polipeptídeos da presente invenção podem alvejar a proteína a uma localização subcelular específica, enquanto o heterodímero monovalente ou homodímeros podem aumentar ou diminuir a atividade da proteína de fusão da albumina. Adicionalmente, a fusão das seqüências de proteína adicionais às proteínas de fusão da albumina da invenção pode aumentar adicionalmente a solubilidade e/ou estabilidade da proteína de fusão. As proteínas de fusão descritas acima podem ser fabricadas usando ou modificando rotineiramente as técnicas conhecidas na arte e/ou por modificação do protocolo que se segue, o que ressalta a fusão do polipeptídeo a uma 35 molécula de IgG.

Em resumo, a porção Fc humana da molécula de IgG pode ser ampliada por PCR usando iniciadores que transpõem as extremidades 5' e 3' da seqüência descrita a seguir. Esses iniciadores também teriam sítios de enzima de restrição convenientes que facilitariam a clonagem em um vetor de expressão, preferivelmente um vetor de expressão de mamífero ou levedura.

Por exemplo, se pC4 (Número de acesso ATCC 209646) for usado, a porção Fc humana pode ser ligada no sítio de clonagem BamH\. Observe que o sítio BamH\ 3' seria destruído. Em seguida, o vetor contendo a porção Fc humana é restrito novamente com BamH\, Iinearizando o vetor e um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da presente invenção (gerada e isolada usando técnicas conhecidas na arte) é ligado a esse sítio BamHI. Observe que o polinucleotídeo codificando a proteína de fusão da invenção é clonado sem um códon de parada, de outra forma, uma proteína de fusão contendo Fc não será produzida.

Se a seqüência de sinal ocorrendo naturalmente for usada para produzir a proteína de fusão da albumina da presente invenção, pC4 não precisa de um segundo peptídeo de sinal. Alternativamente, se a seqüência de sinal ocorrendo naturalmente não for empregada, o vetor pode ser modificado para incluir uma seqüência de sinal heteróloga. (Vide, por exemplo, Publicação Internacional número WO 96/34891).

Região IgG Fc humana: GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAATTCGAGGGTGCACOGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGT GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT (SEQID NO:S2)

EXEMPLO 12: Produção de um anticorpo a partir de uma proteína de fusão da albumina

Tecnologia de Hibridoma

Anticorpos que ligam as proteínas de fusão da albumina da presente invenção e porções das proteínas de fusão da albumina da presente invenção (por exemplo, a porção da proteína Terapêutica ou porção da albumina da proteína de fusão) podem ser preparadas por vários métodos. (Vide, Current Protocols, capítulo 2). Como um exemplo de tais métodos, a preparação de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção é preparada e purificada para tornar a mesma substancialmente isenta de contaminantes naturais. Tal preparação é então introduzida em um animal, de modo a produzir antisoros policlonais de atividade específica maior.

Anticorpos monoclonais específicos para uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção são preparados empregando tecnologia de hibridroma (Kohler e outros, Nature 256:495 (1975); Kohler e outros, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler e outros, Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling e outros, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). Em geral, um animal (de preferência um camundongo) é imunizado com uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Os esplenócitos de tais camundongos são extraídos e fundidos com uma linhagem de células de mieloma apropriada. Qualquer linhagem de célula de mieloma apropriada pode ser empregada de acordo com a presente invenção; contudo, é preferível empregar a linhagem de célula de mieloma de origem (SP20), disponível na ATCC. Após fusão, as células de hibridoma resultantes são mantidas seletivamente em meio HAT e então clonadas por limitação da diluição conforme descrito em Wands e outros (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). As células de hibridoma obtidas através de tal seleção são então analisadas para identificar clones que secretam anticorpos capazes de ligar uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção.

Alternativamente, anticorpos adicionais que são capazes de se ligar a uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser produzidos em um procedimento de duas etapas empregando anticorpos anti-idiotípicos. Tal método faz uso do fato de que os anticorpos são propriamente antígenos e, portanto, é possível obter um anticorpo que se liga a um anticorpo secundário. De acordo com esse método, anticorpos específicos de proteína são usados para imunizar um animal, de preferência a camundongo. Os esplenócitos de tal animal são então usados para produzir células de hibridoma e as células de hibridoma são analisadas para identificar clones que produzem um anticorpo cuja capacidade de se ligar a um anticorpo específico para uma proteína de fusão da albumina da invenção (ou porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção) pode ser bloqueada pela proteína de fusão da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Tais anticorpos compreendem anticorpos anti-idiotípicos para anticorpo específico para a proteína de fusão da invenção (ou porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção) e são usados para imunizar um animal de modo a induzir a formação de anticorpos específicos para a proteína de fusão adicional da invenção (ou porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção).

Para uso in vivo dos anticorpos em seres humanos, um anticorpo é "humanizado".

Tais anticorpos podem ser produzidos empregando construções genéticas derivadas de células de hibridoma produzindo os anticorpos monoclonais descritos acima. Os métodos para produção de anticorpos quiméricos e humanizados são conhecidos na arte e são discutidos aqui. (Para revisão vide Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi e outros, BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly e outros Patente US número 4.816.567; Taniguchi e outros, EP 171496; Morrison e outros, EP 173494; Neuberger e outros, WO 8601533; Robinson e outros, Publicação Internacional Número WO 8702671; Boulianne e outros, Nature 312:643 (1984); Neuberger e outros, Nature 314:268 (1985)).

Isolamento de Fragmentos de Anticorpo Direcionados Contra uma Proteína de Fusão da Albumina da Invenção ou uma Porção de uma Proteína de Fusão da Albumina da Invenção a partir de uma Biblioteca de scFvs

Os genes V ocorrendo naturalmente isolados de PBLs humanos são construídos em uma biblioteca de fragmentos de anticorpo que contém reatividades contra uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção, a qual o doador pode ou não ter s ido exposto (vide, por exemplo, Patente US número 5.885.793 incorporada aqui como referência em sua totalidade).

Resgate da Biblioteca - Uma biblioteca de scFvs é construída do RNA de PBLs humanos conforme descrito em Publicação Internacional Número WO 92/01047. Para resgatar os fragmentos de anticorpo mostrando fago, aproximadamente 109 E.coli abrigando o fagemido são usados para inocular 50 mL de 2xTY contendo glicose a 1% e 100 Mg/mL de ampilicina (2xTY- AMP-GLU) e crescem a um O.D. de 0,8 com agitação. Cinco mL dessa cultura são usados para inocular 50 mL de 2xTY- AMP-GLU, 2 χ 108 TU do gene delta 3 auxiliar (Ml 3 delta gene IH, vide Publicação Internacional Número WO 92/01047) são adicionados e a cultura incubada a 37°C por 45 minutos sem agitação e então a 37°C por 45 minutos com agitação. A cultura é centrifugada a 4000 r.p.m. por 10 minutos e a microesfera ressuspensa em 2 litros de 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e 50 pg/mL de canamicina e cresceu por toda a noite. Os fagos são preparados conforme descrito na Publicação Internacional Número WO 92/01047.

M13 delta gene Ill é preparado como se segue: o fago auxiliar M13 delta gene III não codifica a proteeína do gene III, conseqüentemente, os fragmentos de anticorpo mostrando fago(fagemido) possuem uma avidez maior de ligação ao antígeno. As partículas de M13 delta gene Ill infecciosas são obtidas por crescimento do fago auxiliar nas células abrigando um derivado pUC19 fornecendo a proteína do gene III tipo selvagem durante a morfogênese do fago. A cultura é incubada por 1 hora a 37°C sem agitação e então por mais uma hora a 37°C com agitação. As células são rotacionadas (IEC-Centra 8,400 r.p.m. por 10 minutos), ressuspensas em 300 mL de caldo 2xTY contendo 100 pg de ampicilina/mL e 25 5 pg de canamicina/mL (2xTY- AMP-KIAN) e cresceram por toda a noite, agitando a 37°C. As partículas de fago são purificadas e concentradas do meio de cultura por duas precipitações de PEG (Sambrook e outros, 1990), ressuspensas em 2 mL de PBS e passadas através de um filtro de 0,45 pm (Minisart NML; Sartorius) para fornecer uma concentração final de aproximadamente 1013 unidades de transdução/mL (clones resistentes à ampicilina).

Bateamento da Biblioteca. Imunotubos (Nunc) são revestidos por toda a noite em PBS com 4 mL tanto de 100 pg/mL quanto 10 pg/mL de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Os tubos são bloqueados com 2% MarveI-PBS por 2 horas a 37°C e então lavados 3 vezes em PBS. Aproximadamente 1013 TU de fago são aplicados ao tubo e incubados por 30 minutos a temperatura ambiente por tombamento de um lado para outro em plataforma giratória e então deixados descansar por mais uma hora e meia. Os tubos são lavados 10 vezes com PBS 0,1% Tween-20 e 10 vezes com PBS. Os fagos são eluídos por adição de 1 mL de 100 mM de trietilamina e são girados por 15 minutos em um plataforma girável após o que a solução é imediatamente neutralizada com 0,5 mL de 1.0M Tris-HCI, pH 7,4. Os fagos são então empregados para infectar 10 mL de E.coli meio-log TGI por incubação do fago eluído com bactéria por 30 minutos a 37°C. Os E.coli são então colocados em placas TYE contendo glicose a 1% e 100 pg/mL de ampicilina. A biblioteca bacteriana resultante é então resgatada com fago auxiliar delta gene 3 conforme descrito acima para preparar os fagos para uma rodada subseqüente de seleção. Esse processo é então repetido por um total de 4 rodadas de purificação por afinidade com lavagem em tubo aumentada para 20 vezes com PBS, 0,1% Tween-20 e 20 vezes com PBS para rodadas 3 e 4.

Caracterização dos Ligantes. Os fagos eluídos das terceira e quarta rodadas de seleção são empregados para infectar E. coli HB 2151 e scFv solúvel é produzido (Marks, e outros, 1991) a partir de colônias simples para ensaio. Os ELISAs são realizados com placas de microtitulação revestidas tanto com 10 pg/mL de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou uma porção de uma proteína de fusão da albumina da invenção, em 50 mM de bicarbonato, pH 9.6. Clones positivos no ELISA são adicionalmente caracterizados por análise com PCR (vide, por exemplo, Publicação Internacional Número WO 92/01047) e então por seqüenciamento. Esses clones positivos para ELISA podem também ser adicionalmente caracterizados por técnicas conhecidas na arte, tais como, por exemplo, mapeamento de epítopo, afinidade por ligação, transdução de sinal do receptor, capacidade de bloquear ou inibir competitivamente a ligação do anticorpo/antígeno e atividade agonística ou antagonística competitiva.

EXEMPLO 13: Ensaio de absorção de í3Hl-2-desoxiQlicose

Adipose1 músculo esqueletal e fígado são tecidos sensíveis à insulina. A insulina pode estimular a absorção/transporte da glicose nesses tecidos. No caso da adipose e músculo esqueletal, a insulina inicia a transdução do sinal que eventualmente conduz à translocação da molécula 4 transportadora da glicose, GLUT4, de um compartimento intracelular especializado para a superfície da célula. Uma vez na superfície da célula, GLUT4 permite a absorção/transporte da glicose.

Absorção de í3H]-2-desoxiglicose Várias linhagens de célula relacionadas à adipose e músculos podem ser usadas

para testar a atividade de absorção/transporte de glicose na ausência ou presença de uma combinação de qualquer um ou mais dos medicamentos terapêuticos listados para o tratamento do diabetes melito. Especificamente, as células de fibroblasto de murino, 3T3-L1 e as células musculares esqueletais de murino, L6, podem ser diferenciadas em adipóticos de 3T2-L1 e em miotubos, respectivamente, para servirem como modelos in vitro apropriados para o ensaio de absorção de [3H]-2-desoxiglicose (Urso e outros, J Biol Chem, 274(43): 30864-73 (1999); Wang e outros, J Mol Endocrinol, 19(3): 241-8 (1997); Haspel e outros, J Membr Biol, 169 (1): 45-53 (1999); Tsakiridis e outros, Endocrinology, 136(10): 4315-22 (1995)). Em resumo, 2 χ IO5 células/100 μL de adipócitos ou células L6 diferenciadas são transferidas para placas de Tecido-Cultura de 96 poços "TC", tratadas, isto é, revestidas com 50 pg/mL de poli-L-lisina, em meio de pós-diferenciação e são incubadas por toda a noite a 37°C em 5% CO2. As células são primeiro lavadas com meio DMEM com baixo teor de glicose e isento de soro e são então pouco alimentadas com 100 pL/poço do mesmo meio e com 100 pL/poço de cada um dentre tampão ou uma combinação de qualquer um ou mais dos medicamentos terapêuticos listados para o tratamento do diabetes melito, por exemplo, aumentando as concentrações de 1 nM, 10 nM, e 100 nM das substâncias terapêuticas da presente invenção (por exemplo, fusões específicas reveladas como SEQ ID NO:Y e seus fragmentos e variantes) por 16 horas a 37°C na ausência ou presença de 1 nM de insulina. As placas são lavadas três vezes com 100 pL/poço de salmoura tamponada HEPES. A insulina é adicionada em 1 nM em salmoura tamponada HEPES por 30 minutos a 37°C na presença de 10 mM de [3H]-2-desoxiglicose marcada (Amersham, número TRK672) e 10 mM de 2-desoxiglicose não marcada (SIGMA, D-3179). Como um controle, as mesmas condições são realizadas exceto na ausência da insulina. Uma concentração final de 10 mM de citocalasina B(SIGMA, C6762) é adicionada em 100 pL/poço em uma poça separada para medir a absorção não específica. As células são lavadas três vezes com salmoura tamponada HEPES. 10 mM de [3H]-2-desoxiglicose marcada , isto é, 10 mM e 2-desoxiglicose não marcada, isto é, 10 mM são adicionados por 10 minutos a temperatura ambiente. As células são lavadas três vezes com Salmoura Tamponada de Fosfato "PBS". As células são lisadas quando da adição de 150 pL/poço de 0,2 N NaOH e incubação subseqüente com agitação por 20 minutos a temperatura ambiente. As amostras são então transferidas para um frasco de cintilação ao qual são adicionados 5 mL de fluido de cintilação. Os fracos são contados em um contador Beta-Scintillation. A absorção em condições de duplicata, a diferença sendo a ausência ou presença de insulina, é determinada com a seguinte equação: [(contagens de insulina por minuto "cpm" - com não específica)/(cpm sem insulina - cpm não específica)]. As respostas ponderadas se encontram dentro dos limites de cerca de 5 vezes e 3 vezes aquela dos controles pra os adipócitos e miotubos, respectivamente.

Diferenciação das células

As células podem se tornar completamente confluentes em um frasco T-75 cm2. O meio é removido e substituído por 25 mL de meio pré-diferenciação por 48 horas. As células são incubadas a 37°C em CO2 a 5% e umidade a 85%. Após 48 horas, o meio de prédiferenciação é removido e substituído com 25 mL de meio de diferenciação por 48 horas. As células são novamente incubadas a 37°C em CO2 a 5%, umidade a 85%. Após 48 horas, o meio é removido e substituído por 30 mL de meio de pós-diferenciação. O meio de pós-diferenciação é mantido por 14-20 dias ou até a diferenciação completa ser obtida. O meio é trocado a cada 2-3 dias. Os adipócitos humanos podem ser adquiridos na 20 Zen-Bio, INC (número SA-1096).

EXEMPLO 14: Ensaio in vitro de Incorporação de [3HhTimidina nas Linhagens de Células Pancreáticas

Foi mostrado recentemente que GLP-1 induz a diferenciação da linhagem celular epitelial dutal pancreática de rato ARIP em um modo dependente de tempo e dose, que está associado a um aumento nos níveis da Homeobox-1 Duodenal de Ilhota (IDX-1) e insulina em RNAm (Hui e outros, 2001, Diabetes, 50(4): 785-96). A IDX-1 por sua vez aumenta os níveis de RNAm do receptor de GLP-1.

Tipos de Células Testadas

Células RTN-M: Estas células estão disponíveis na American Type Tissue Culture Collection (Número de linhagem de célula da ATCC, CRL-2057 ). A linhagem de células RIN-M derivou de um tumor de célula de ilhota de rato transplantável induzido por radiação. A linhagem foi estabelecida de um xenoenxerto de tumor de camundongo nu. As células produzem e secretam hormônios de polipeptídeo de ilhota e produzem L-dopa descarboxilase (um marcador para células possuindo atividade de absorção de precursor de amina e descarboxilação ou APUD).

Células ARIP: Essas são células exócrinas pancreáticas de morfologia epitelial disponíveis na American Type Tissue Culture Collection (Número de linhagem de célula ATCC1 CRL-1674). Vide também as referências: Jessop, N.W. and Hay, RJ., "Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell Iines derived from transplantable tumors," In Vitro 16: 212, (1980); Cockell1 M. e outros, "Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas," Mol. Cell. Biol. 9: 2464-2476, (1989); Roux1 E., e outros "The cell-specific transcription factor PTFI contains two different subunits that interact with the DNA" Genes Dev. 3: 1613-1624, (1989); e Hui1 H., e outros, "Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homeobox-1 -positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells," Diabetes 50: 785-796 (2001).

Preparação das Células

A linhagem de células RIN-M cresceu em meio RPMI 1640 (Hyclone, número SH300027.01) com 10% soro bovino fetal (HyClone, número SH30088.03) e é subcultivada a cada 6 a 8 dias em uma razão de 1:3 a 1:6. O meio é alterado a cada 3 a 4 dias.

A linhagem de célula ARIP (ATCC número CRL-1674) cresceu em meio F12K de Ham (ATCC, número 30-2004) com 2 mM de L-glutamina ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 10% soro bovino fetal. A linhagem de células ARIP é subcultivadas em uma razão de 1:3 a 1:6, duas vezes por semana. O meio é trocado cada 3 a 4 dias. Protocolo do Ensaio

As células são semeadas em 4.000 células/poço em placas de 96 poços e cultivadas por 48 a 72 horas para confluência a 50%. As células são comutadas para meio isento de soro em 100 pL/poço. Após incubação por 48-72 horas, o soro e/ou substâncias terapêuticas da presente invenção (por exemplo, proteínas de fusão da albumina da invenção seus fragmentos e variantes) são adicionados ao poço. A incubação continua por mais 36 horas. [3H]-Timidina (5-20 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia, número TRK120) é diluída para 1 microCuries/5 microlitros. Após as 36 horas de incubação, 5 microlitros são adicionados por poço por mais 24horas. A reação é terminada por lavagem branda, uma vez, das células com Salmoura Tamponada com Fosfato "BPS". As células são então fixadas com 100 microlitros de TCA resfriada em gelo a 10% por 15 minutos a 4°C. A PBS é removida e 200 microlitros de 0,2 N NaOH são adicionados. As placas são incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com agitação. A solução é transferida para um frasco de cintilação e 5 mL de fluido de cintilação compatível com as soluções aquosas são adicionados e misturados vigorosamente. Os frascos são contados em um contador de cintilação beta. Tampão será usado como controle negativo. Soro bovino fetal será usado como controle positivo.

EXEMPLO 15: Ensaio para Glicosúria

Glicosúria (isto é, excesso de açúcar na urina) pode ser prontamente analisada de modo a obter um índice do estado de doença do diabetes melito. Urina em excesso em uma amostra de paciente comparada a uma amostra de paciente normal é sintomática de IDDM e NIDDM. A eficácia do tratamento de tal paciente possuindo IDDM e NIDDM é indicada por uma diminuição resultante na quantidade de glicose em excesso na urina. Em uma concretização preferida para monitoramento de IDDM e NIDDM, as amostras de urina dos pacientes são analisadas quanto à presença de glicose usando técnicas conhecidas na arte. A glicosúria em humanos é definida por uma concentração de glicose na urina excedendo a 100 mg por 100 mL. Níveis de açúcar em excesso naqueles pacientes exibindo glicosúria podem ser medidos mesmo mais precisamente por obtenção das amostras de sangue e análise de glicose no soro.

EXEMPLO 16: Ensaios detectando estímulo ou inibição de proliferação de célula B e diferenciação

A geração de respostas imunes humorais funcionais requer ambas a sinalização solúvel e cognata entre as células de linhagem B e seu microambiente. Os sinais podem fornecer um estímulo positivo que permite que a célula de linhagem B continue seu desenvolvimento programado ou um estímulo negativo que instrua a célula a parar sua via de desenvolvimento corrente. Até hoje, vários sinais estimulatórios e inibidores foram encontrados para estimular a resposta da célula B incluindo IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-14 e IL-15. De modo interessante, esses sinais são propriamente efetores fracos porém podem, em combinação com várias proteínas co-estimuladoras, induzir a ativação,proliferação, diferenciação, residência, tolerância e morte entre as populações de células B.

Uma das melhores classes estudadas das proteínas co-estimuladoras da célula B é a superfamília TNF. Dentro dessa família, foi verificado que CD40, CD27 e CD30 juntamente com seus respectivos Ligantes CD154, CD70 e CD 153 regulam uma variedade de respostas imunes. Os ensaios que permitem a detecção e/ou observação da proliferação e diferenciação dessas populações de células B e seus precursores são ferramentas valiosas na determinação dos efeitos que as várias proteínas possuem nas populações de células B em termos de proliferação e diferenciação. Abaixo são encontrados dois ensaios projetados para permitir a detecção da diferenciação, proliferação ou inibição das populações de células B e seus precursores.

Ensaio In vitro - As proteínas de fusão da albumina da invenção (incluindo proteínas de fusão contendo fragmentos ou variantes das proteínas Terapêuticas e/ou albumina ou fragmentos ou variantes da albumina) podem ser avaliadas quanto a sua capacidade de induzir a ativação, proliferação, diferenciação ou inibição e/ou morte nas populações de células B e seus precursores. A atividade de uma proteína de fusão da albumina da invenção nas células B tonsilares humanas purificadas, medida qualitativamente na faixa de dose de 0,1 a 10.000 ng/mL é avaliada em um ensaio de co-estimulação de linfócito B padrão onde as células B tonsilares purificadas são cultivadas na presença de Staphylococcus aureus fixados em formalina Cowan I (SAC) ou anticorpo IgM anti-humano imobilizado como o agente de iniciação. Sinais secundários, tais como, IL-2 e IL-15 sinergizam com SAC e IgM reticulando para promover a proliferação da célula B conforme medido por incorporação de timidina tritiada. Novos agentes de sinergia podem ser prontamente identificados usando esse ensaio. O ensaio envolve isolamento das células B tonsilares humanas por esgotamento de microesferas magnéticas (MACS) das células positivas CD3. A população de célula resultante é superior a 95% das células B conforme avaliado pela expressão de CD45R(B220).

Várias diluições de cada amostra são colocadas em poços individuais de uma placa de 96 poços a qual são adicionadas 105 células B suspensas em meio de cultura (RPMI 1640 contendo FBS a 10%, 5 χ IO5M 2ME, 100 U/mL de penicilina, 10 pg/mL de estreptomicina e 10"5 diluição de SAC) em um volume total de 150 μΙ_. A proliferação ou inibição é quantificada por um pulso de 20 horas (1 pCi/poço) com 3H-timidina (6,7 Ci/mM) começando 72 horas após a adição do fator. Os controles positivo e negativo são IL2 e meio respectivamente.

Ensaio In vivo - Camundongos BALB/C recebem injeção (intraperitoneal) duas vezes ao dia apenas com tampão ou 2 mg/kg de uma proteína de fusão da albumina da invenção (incluindo proteínas de fusão contendo fragmentos ou variantes de proteínas Terapêuticas e/ou albumina ou fragmentos ou variantes da albumina). Os camundongos receberam esse tratamento por 4 dias consecutivos, quando então foram sacrificados e vários tecidos e soro coletados para análise. A comparação das seções H&E dos baços normais e baços tratados com a proteína de fusão da albumina da invenção identifica os resultados da atividade da proteína de fusão nas células do baço, tal como, a difusão dos invólucros linfáticos periarteriais e/ou aumentos significativos na celularidade nucleada das regiões de polpa vermelha, que podem indicar a ativação da diferenciação e proliferação das populações de células B. Estudos ímunohistoquímicos empregando um marcador de célula B1 anti-CD45R(B220), são usados para determinar se quaisquer alterações fisiológicas nas células esplênicas, tais como, desorganização esplênica, devem-se à representação da célula B aumentada dentro das zonas de célula B fracamente definidas que infiltram regiões de célula T estabelecidas.

Análises citométricas de fluxo dos baços dos camundongos tratados com a proteína de fusão da albumina são usadas para indicar se a proteína de fusão da albumina aumenta especificamente a proporção de ThB+, células B inertes CD45R(B220) em relação aquela que é observada nos camundongos de controle.

Da mesma forma, uma conseqüência prevista de representação de célula B madura aumentada in vivo é um aumento relativo nas titulações Ig do soro. Conseqüentemente, os níveis de IgM no soro e IgA são comparados entre os camundongos tratados com o tampão e proteína de fusão.

EXEMPLO 17: Ensaio de Proliferação de Célula T

Um ensaio de proliferação induzido com CD3 é realizado em PBMCs e é medido por absorção da 3H-timidina. O ensaio é realizado como se segue. Placas de 96 poços são revestidas com 100 pL/poço de mAb para CD3 (HIT3a, Pharmingen) ou mAb de controle compatibilizada com isotipo (B33.1) por toda a noite a 4°C (1 pg/mL em 0,05M de tampão bicarbonato, pH 9.5), então lavadas três vezes com PBS. PBMC são isoladas por centrifugação gradiente F/H de sangue periférico humano e adicionadas aos poços em quadruplicata (5 χ 104/poço) das placas revestidas com mAb em RPMI contendo 10% FCS e P/S na presença de concentrações variadas de uma proteína de fusão da albumina da invenção (incluindo proteínas de fusão contendo fragmentos ou variantes de proteínas Terapêuticas e/ou albumina ou fragmentos ou variantes da albumina) (volume total de 200 pL). Tampão de proteína relevante e meio sozinho são os controles. Após 48 horas e cultura a 37°C, as placas são rotacionadas por 2 minutos a 1.000 rpm e 100 pL de sobrenadante são removidos e armazenados a -20°C para medição de IL-2 (ou outras citocinas) se for observado efeito na proliferação. Os poços são suplementados com 100 pL de meio contendo 0,5 uCi de 3H-timidina e cultivados a 37°C por 18-24 horas. Os poços são colhidos e a incorporação da 3H-timidina usada como uma medida de proliferação. Anti-CD3 sozinho é o controle positivo para proliferação. IL-2 (100 U/mL) é também empregado como um controle que melhora a proliferação. O anticorpo de controle que não induz proliferação das células T é usado como o controle negativo para os efeitos das proteínas de fusão da invenção.

EXEMPLO 18: Efeito das proteínas de fusão da invenção nas moléculas MHC classe II, co-estimulatórias e de adesão e diferenciação celular das células dendríticas humanas derivadas de monócito e monócitos

As células dendríticas são geradas pela expansão dos precursores de proliferação encontrados no sangue periférico: PBMC aderente ou frações monocíticas eluídas são cultivadas por 7-10 dias com GM-CSF (50 ng/mL e IL-4 (20 ng/mL). Essas células dendríticas possuem o fenótipo característico de células imaturas (expressão de antígenos 30 de CDI1 CD80, CD86, CD40 e de classe II de MHC ). O tratamento com fatores de ativação, tais como, TNF-α causa uma alteração rápida no fenótico de superfície (expressão aumentada de MHC classe I e II, co-estimuIadores e moléculas de adesão, infra-regulação de FCyRII, supra-regulação de CD83). Essas alterações se correlacionam á capacidade apresentando antígeno aumentada e com maturação funcional das células dendríticas.

Análise de FACS dos antígenos de superfície é realizada como se segue. As células são tratadas 1-3 dias com concentrações aumentadas de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou LPC (controle positivo), lavadas com PBS contendo BSA a 1 % e azida de sódio a 0,02 mM e então incubadas com diluição 1:20 de anticorpos monoclonais marcados com FITC- ou PE por 30 minutos a 4°C. Após uma lavagem adicional, as células marcadas são analisadas por citometria de fluxo em um FACScan (Becton Dickinson).

Efeito na produção de citocinas - As citocinas geradas por células dendríticas, especificamente IL-12, são importantes no início das respostas imunes dependentes de célula T. IL-12 influencia fortemente o desenvolvimento da resposta imune de célula T auxiliar Th1, e induz função de célula T e NK citotóxica. Um ELISA é usado para medir a liberação de IL-12 como se segue. As células dendríticas (IO6AnL) são tratadas com concentrações aumentadas de uma proteína de fusão de albumina da invenção por 24 horas. LPS (100 ng/mL) é adicionado à cultura de célula como controle positivo. Os sobrenadantes das culturas de célula são então coletados e analisados quanto ao teor de IL-12 usando kit ELISA comercial (por exemplo, R & D Systems (Minneapolis, MN)). São usados os protocolos padrão fornecidos com os kits.

Efeito na expressão de MHC Classe II, moléculas coestimulatórias e de adesão

Três famílias principais de antígenos de superfície de célula podem ser identificadas nos monócitos: moléculas de adesão, moléculas envolvidas na apresentação do antígeno e receptor Fe. A modulação da expressão dos antígenos MHC Classe II e outras moléculas coestimulatórias, tais como B7 e ICAM-I, pode resultar em alterações no antígeno apresentando a capacidade dos monócitos e capacidade de induzir ativação de célula Τ. A expressão aumentada dos receptores Fc pode estar correlacionada à atividade citotóxica do monócito aperfeiçoada, liberação da citocina e fagocitose.

A análise FACS é empregada para examinar os antígenos de superfície como se segue. Os monócitos são tratados 1-5 dias com concentrações crescentes de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou LPS (controle positivo), lavados com PBS contendo 1% BSA e 0,02 mM de azida de sódio e então incubados com diluição 1:20 de anticorpos monoclonais marcados FITC ou PE por 30 minutos a 4°C. Após uma lavagem adicional, as células marcadas são analisadas por citometria de fluxo em um FACScan (Becton Dickinson).

Ativação do Monócito e/ou sobrevivência aumentada. Os ensaios para moléculas que ativam (ou alternativamente, desativam) os monócitos e/ou aumentam a sobrevivência do monócito (ou alternativamente, diminuem a sobrevivência do monócito) são conhecidos na arte e podem ser aplicados rotineiramente de modo a determinar se a molécula da invenção funciona como um inibidor ou ativador dos monócitos. As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser classificadas empregando os três ensaios descritos a seguir. Para cada um desses ensaios, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) são purificadas de leukopacks de doador simples (American Red Cross, Baltimore, MD) por centrifugação através de um gradiente Histopaque (Sigma). Os monócitos são isolados de PBMC por elutriação centrífuga de contra-corrente.

Ensaio de sobrevivência de monócito. Os monócitos de sangue periférico humano perdem progressivamente a viabilidade quando cultivados na ausência de soro ou outros estímulos. Sua morte resulta de processos regulados internamente (apoptose). A adição à cultura de fatores de ativação, tais como, TNF-alfa aperfeiçoa dramaticamente a sobrevivência da célula e impede a fragmentação do DNA. Coloração com iodeto de propídio (PI) é usada para medir a apoptose como se segue. Os monócitos são cultivados por 48 horas em tubos de polipropileno em meio isento de soro (controle positivo), na presença de 100 ng/mL de TNF-alfa (controle negativo) e na presença de concentrações 1variadas da proteína de fusão a ser testada. As células são suspensas em uma concentração de 2 χ 106/mL em PBS contendo Pl a uma concentração final de 5 pg/mL, e então incubadas a temperatura ambiente por 5 minutos, antes da análise por FACScan. A absorção de Pl demonstrou se correlacionar à fragmentação de DNA nesse paradigma experimental.

Efeito na liberação da citocina. Uma função importante dos monócitos/macrófagos é sua atividade reguladora em outras populações celulares do sistema imune través da liberação das citocinas após estimulação. Um ELISA para medir a liberação da citocina é realizado como se segue. Monócitos humanos são incubados a uma densidade de 5 χ 105 células/mL com concentrações crescentes da proteína de fusão da albumina da invenção e sob as mesmas condições, porém na ausência da proteína de fusão. Para produção de IL-12, as células são iniciadas por toda a noite com IFN (100 U/mL) na presença da proteína de fusão. LPS (10 ng/mL) é então adicionado. Os meios condicionados são coletados após 24 horas e mantidos congelados até o uso. A medição de TNF-alfa. IL-10, MCP-I e IL-8 é então realizada empregando um kit ELISA disponível comercialmente (por exemplo, R & D Systems (Minneapolis, MN)) e aplicando os protocolos padrão obtidos com o kit.

Explosão oxidativa. Monócitos purificados são colocados em placas de 96 poços em 2-1x105 células/poço. Concentrações crescentes de uma proteína de fusão da albumina da invenção são adicionadas aos poços em um volume total de 0,2 mL de meio de cultura (RPMI 1640 + 10% FCS, glutamina e antibióticos). Após 3 dias de incubação, as placas são centrifugadas e o meio é removido dos poços. Foram adicionados às monocamadas de macrófago, 0,2 mL por poço de solução vermelha de fenol (140 mM NaCI, 10 mM tampão fosfato de potássio, pH 7,0, 5,5 mM de dextrose, 0,56 mM de vermelho fenol e 19 U/mL de HRPO), em conjunto com o estimulante (200 nM PMA). As placas são incubadas a 37°C por 2 horas e a reação é parada por adição de 20 pL de 1N NaOH por poço. A absorvência é lida em 610 nm. Para calcular a quantidade de H2O2 produzida pelos macrófagos, uma curva padrão de uma solução de H2O2 de molaridade conhecida é realizada para cada experimento. EXEMPLO 19: O efeito das proteínas de fusão da albumina da invenção no crescimento das células endoteliais vasculares

No dia 1, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são semeadas em 2-5x104 células/35 mm de densidade de placa em meio M199 contendo 4% soro bovino fetal (FBS), 16 unidades/mL de heparina e 50 unidades/mL de suplementos de crescimento celular endotelial (ECGS, Biotechnique, Inc.). No dia 2, o meio é substituído por Ml 99 contendo 10% FBS, 8 unidades/mL de heparina. Uma proteína de fusão da albumina da invenção e controle positivos, tais como VEGF e FGF (bFGF) básico são adicionados, em concentrações variadas. Nos dias 4 e 6, o meio é substituído. No dia 8, o número de células é determinado com um Contador Coulter.

Um aumento no número de células HUVEC indica que a proteína de fusão pode proliferar células endoteliais vasculares, enquanto uma diminuição no número de células HUVC indica que a proteína de fusão inibe as células endoteliais vasculares.

EXEMPLO 20: Modelo de cura de ferimento na córnea de rato

Esse modelo animal mostra o efeito de uma proteína de fusão da albumina da invenção na neovascularização. O protocolo experimental inclui:

realizar uma incisão de 1-1,5 cm a partir do centro da córnea para dentro da camada estromal.

inserção da espátula abaixo da borda da incisão faceando a córnea externa do olho.

confecção de uma bolsa (sua base sendo de 1-1,5 mm a partir da borda do olho)

posicionamento de uma microesfera, contendo 50 ng-5 ug de uma proteína de albumina da invenção da invenção dentro da bolsa.

Tratamento com a proteína de fusão da albumina da invenção pode também ser aplicado topicamente às feridas da córnea em uma faixa de dosagem de 20 mg-500 mg (tratamento diário por cinco dias).

EXEMPLO 21: Modelos de Camundongo diabético e cura de ferimento prejudicada por glicocorticóide

Modelo de Camundongo Diabético dB/dB+

De modo a demonstrar que uma proteína de fusão da albumina da invenção acelera o processo de cura, o modelo de cura de ferida de camundongo geneticamente diabético é empregado. O modelo de cura de ferida no camundongo db+/db+ é um modelo bem caracterizado, clinicamente relevante e que pode ser reproduzido de cura de ferida prejudicada. A cura da ferida diabética depende da formação de tecido de granulação e reepitelização ao invés da contração (Gartner, M.H. e outros, J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. e outros, Am. J. Pathol 136:1235 (1990)).

Os animais diabéticos possuem muitas das características observadas no diabetes melito do tipo II. Camundongos homozigotos (db+/db+) são obesos em comparação às suas proles heterozigotas (db+/+m). Camundongos diabéticos mutantes (db+/db+) possuem uma mutação recessiva autossômica simples no cromossoma 4 (db+) (Coleman e outros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)). Os animais mostraram polifagia, polidipsia e poliúria. Os camundongos diabéticos mutantes (db+/db+) possuem glicose no sangue elevada, níveis de insulina aumentados ou normais e imunidade mediada por célula suprimida (Mandei e outros, J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. e outros, Clin. Exp. Immunol. 51(l):l-l (1983); Leiter e outros, Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). Neuropatia periférica, complicações do miocárdio e lesões microvasculares, espessamento da membrana de base e anormalidades de filtração glomerular foram descritas nesses animais (Norido, F. e outros, Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson e outros, Diabetes 29(l):60-67 (1980); Giacomelli e outros, Lab Invest. 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):l~6 (1982)). Esses camundongos diabéticos homozigotos podem desenvolver hiperglicemia que é resistente à insulina análoga ao diabetes do tipo II humana (Mandei e outros, J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)).

As características observadas nesses animais sugerem que a cura nesse modelo pode ser semelhante à cura observada no diabetes humano (Greenhalgh, e outros, Am. J. of Pathol 136:1235-1246(1990)).

Geneticamente, os camundongos fêmea diabéticos C57BL/KsJ (db+/db+) e suas proles heterozigotas não diabéticas (dB+/m+m) são úteis nesse estudo (Jackson Laboratories). Os animais foram adquiridos com 6 semanas de vida e têm 8 semanas de idade no começo do estudo. Os animais são alojados individualmente e receberam alimentos e água a vontade. Todas as manipulações são realizadas empregando técnicas assépticas. Os experimentos são conduzidos de acordo com as regras e diretrizes da Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animais.

O protocolo de ferimento é realizado de acordo com os métodos reportados anteriormente (Tsuboi, R. and Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)). Em resumo, no dia do ferimento, os animais são anestesiados com uma injeção intraperpitoneal de Avertina (0,01 mg/mL), 2,2,2-tribromoetanol e 2-metil-2-butanol dissolvido em água deionizada. A região dorsal do animal é raspada e a pele lavada com solução de etanol e iodo a 70%. A área cirúrgica é seca com gaze estéril antes do ferimento. Uma ferida de 8 mm de profundidade total é então criada empregando a punção de tecido Keyes. Imediatamente após o ferimento, a pele circundante é suavemente esticada para eliminar a expansão da ferida. As feridas são deixadas aberta pela duração do experimento. A aplicação do tratamento é fornecida topicamente por 5 dias consecutivos, começando no dia do ferimento. Antes do tratamento as feridas são limpas suavemente com salmoura estéril e esponjas de gaze.

Os ferimentos são visualmente examinados e fotografados a uma distância fixa no dia da cirurgia e em intervalos de dois dias após isso. O fechamento do ferimento é determinado por medição diária nos dias 1-5 e no dia 8. Os ferimentos são medidos horizontal e verticalmente empregando um compasso Jameson calibrado. Os ferimentos são considerados curados se o tecido de granulação não for mais visível e a ferida estiver coberta por um epitélio contínuo.

Uma proteína de fusão da albumina da invenção é administrada usando uma faixa diferente de doses, de 4 mg a 500 mg por ferida por dia por 8 dias no veículo. Os grupos de controle de veículo receberam 50 mL de solução de veículo.

Os animais sofreram eutanásia no dia 8 com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (300 mg/Kg). As feridas e a pele circundante são então colhidas para histologia e imunohistoquímica. Os espécimes de tecido são colocados em formalina tamponada neutra a 10% em cassetes de tecido entre esponjas de biópsia para processamento ulterior.

Três grupos de dez animais cada (5 diabéticos e 5 controles não diabéticos) são avaliados: 1) controle de placebo veículo, 2) grupo não tratado e 3) grupo tratado.

O fechamento do ferimento é analisado por medição da área no eixo geométrico vertical e horizontal e obtendo a área quadrada total do ferimento. A contração é então estimada por estabelecimento das diferenças entre a área da ferida inicial (dia 0) e aquela do pós tratamento (dia 8). A área da ferida no dia 1 é de 64 mm2, correspondendo ao tamanho da punção dérmica. Os cálculos são feitos usando a seguinte fórmula: a. [área aberta no dia 8]-[área aberta no dia 1]/[área aberta no dia 1] Os espécimes são fixados em formalina tamponada a 10% e os blocos embutidos em parafina são seccionados perpendicularmente à superfície da ferida (5 mm) e cortados usando um micrótomo Reichert-Jung. A coloração rotineira de hematoxilina-eosina (H&E) é realizado nas seções transversais das feridas bisseccionadas. O exame histológico das feridas é usado para avaliar o processo de cura e a aparência morfológica da pele reparada é alterada por tratamento com uma proteína de fusão da albumina da invenção. Essa avaliação incluiu verificação da presença de acúmulo de células, células inflamatórias, capilaridade, fibroblastos, reepitelização e maturidade epidérmica (Greenhalgh, D. G. e outros, Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Um micrômetro de lentes calibradas é usado por um observador as cegas.

As seções de tecido são também coloridas imunohistoquimicamente com um 35 anticorpo de ceratina anti-humano de coelho políclonal usando sistema de detecção ABC Elite. A pele humana é usada como um controle de tecido positivo enquanto IgG não imune é usada como um controle negativo. O crescimento do ceratinócito é determinado por avaliação da extensão de reepitelização da ferida empregando um micrômetro de lentes calibradas.

Proliferação de antígeno/ciclina nuclear de célula (PCNA) nos espécimes de pele é demonstrada por emprego de anticorpo anti-PCNA (1:50) com um sistema de detecção ABC Elite. O câncer de cólon humano serviu como um controle de tecido positivo e o tecido cerebral de humano é usado como um controle de tecido negativo. Cada espécime incluía uma seção com omissão do anticorpo primário e substituição com IgG de camundongo não imune. A classificação dessas seções se baseia na extensão da proliferação em uma escala de 0-8, o lado mais baixo da escala refletindo proliferação leve para o lado mais alto refletindo proliferação intensa.

Dados experimentais são analisados usando um teste t não emparelhado. Um valor ρ de < 0,05 é considerado significativo.

Modelo de Rato Não Prejudicado por Esteróide

A inibição da cura da ferida por esteróides foi bem documentada em vários sistemas in vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. In: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinicai Aspects. 280-302 (1989); Wahle outros, J. Immunol. 115: 476-481 (1975); Werb e outros, J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)). Glicocorticóides retardam a cura da ferida por inibição da angiogênese, diminuindo a pemeabilidade vascular (Ebert e outros, An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)), proliferação de fibroblasto e síntese de colágeno (Beck e outros, Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes e outros, J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978)) e produção de redução transitória de circulação de monócitos (Haynes e outros, J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinicai Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989)). A administração sistêmica de esteróides prejudicando a cura da ferida é um fenômeno bem estabelecido em ratos (Beck e outros, Growth Factors. 5:295-304 (1991); Haynes e outros, J. CHn. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinicai Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989); Pierce e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 2229-2233 (1989)). 30 De modo a demonstrar que uma proteína de fusão da albumina da invenção pode

acelerar o processo de cura, foram avaliados os efeitos de múltiplas aplicações tópicas da proteína de fusão nas feridas excisionais de espessura plena em ratos nos quais a cura foi prejudicada por administração sistêmica de metílprednisolona.

Ratos Sprague Dawley adultos, jovens pesando 250-300 g (Charles River Laboratories) são usados nesse exemplo. Os animais são adquiridos com 8 semanas de idade e apresentam 9 semanas de idade no começo do estudo. A resposta de cura dos ratos é prejudicada pela administração sistêmica de metílprednisolona (17mg/kg/rato, intramusculamente) na época do ferimento. Os animais são individualmente alojados e receberam alimentos e água a vontade. Todas as manipulações são realizadas usando técnicas assépticas. O estudo é conduzido de acordo com as regras e diretrizes da Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animais.

O protocolo de ferimento é realizado de acordo com o descrito acima. No dia do ferimento, os animais são anestesiados com uma injeção intramuscular de Cetamina (50 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). A região dorsal do animal é raspada e a pele lavada com solução de etanol e iodo a 70%. A área cirúrgica é seca com gaze estéril antes do ferimento. Uma ferida de 8 mm de profundidade total é então criada empregando a punção de tecido Keyes. Os feridmentos são deixados abertos pela duração do experimento. Aplicações dos materiais de teste são fornecidas topicamente uma vez ao dia, por 7 dias consecutivos, começando no dia do ferimento e subseqüente à administração de metilprednisolona. Antes do tratamento as feridas são limpas suavemente com salmoura estéril e esponjas de gaze.

Os ferimentos são visualmente examinados e fotografados a uma distância fixa no dia do ferimento e ao final do tratamento. O fechamento da ferida é determinado por medição diária nos dias 1-5 e no dia 8. As feridas são medidas horizontal e verticalmente empregando um compasso Jameson calibrado. As feridas são consideradas curadas se o tecido de granulação não for mais visível e a ferida estiver coberta por um epitélio contínuo.

A proteína de fusão da albumina da invenção é administrada usando uma faixa diferente de doses, de 4 mg a 500 mg por ferida por dia por 8 dias no veículo. Os grupos de controle de veículo receberam 50 mL de solução de veículo.

Os animais sofreram eutanásia no dia 8 com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (300 mg/Kg). Os ferimentos e a pele circundante são então colhidos para histologia. Os espécimes de tecido são colocados em formalina tamponada neutra a 10% em cassetes de tecido entre esponjas de biópsia para processamento ulterior.

Três grupos de dez animais cada (5 com metilprednisolona e 5 sem glicocorticóide) são avaliados: 1) grupo não tratado, 2) controle de placebo veículo, 3) grupos tratados.

O fechamento do ferimento é analisado por medição da área no eixo geométrico vertical e horizontal e obtendo a área quadrada total da ferida. O fechamento é estimado por estabelecimento das diferenças entre a área da ferida inicial (dia 0) e aquela do pós tratamento (dia 8). A área de ferimento no dia 1 é de 64 mm2, correspondendo ao tamanho da punção dérmica. Os cálculos são feitos usando a seguinte fórmula:

b. [área aberta no dia 8]-[área aberta no dia 1]/[área aberta no dia 1]

Os espécimes são fixados em formalina tamponada a 10% e os blocos embutidos em parafina são seccionados perpendicularmente à superfície da ferida (5 mm) e cortados usando um mícrótomo Reichert-Jung. A coloração rotineira de hematoxilina-eosina (H&E) é realizado nas seções transversais das feridas bisseccionadas. O exame histológico das feridas permite avaliar se o processo de cura e a aparência morfológica da pele reparada foram alterados por tratamento com uma proteína de fusão da albumina da invenção. Um micrômetro de lentes calibradas é usado por um observador as cegas para determinar a distância da fenda da ferida.

EXEMPLO 22: Modelo de Iinfedema animal

A finalidade dessa abordagem experimental é criar um modelo de linfedema apropriado e consistente para testar os efeitos terapêuticos de uma proteína de fusão da albumina da invenção na linfangiogênese e restabelecimento do sistema circulatório linfático na pata posterior do rato. A eficácia é medida por volume de intumescimento da pata afetada, quantificação da vasculatura linfática, proteína total no plasma sangüíneo e histopatologia. O Iinfedema agudo é observado por 7-10 dias. Talvez de forma mais importante, o progresso crônico do edema é seguido por até 3-4 semanas.

Antes do começo da cirurgia, a amostra de sangue é retirada para análise da concentração da proteína. Ratos machos pesando aproximadamente 350 g são dosados com Pentobarbital. Subseqüentemente, as pernas direitas são raspadas do joelho ao quadril. A área raspada é esfregada com gaze ensopada em EtOH a 70%. O sangue é drenado para teste da proteína total no soro. Medições de circunferência e volumétrica são realizadas antes da injeção do corante nas patas após marcação de 2 níveis de medição (0,5 cm acima do calcanhar e meio ponto da pata dorsal). O dorso intradérmico das patas direita e esquerda recebe injeção de 0,05 mL de Evan's Blue a 1%. As medições de circunferência e volumétrica são então realizadas seguindo-se a injeção de corante nas patas.

Usando a articulação do joelho como um marco divisório, uma incisão inguinal de meia perna é feita circunferencialmente permitindo que os vasos femorais sejam localizados. Fórceps e hemostatos são empregados para dissecar e separar as abas da pele. Após localizar os vasos femorais, o vaso linfático que corre ao longo da lateral e abaixo do(s) vaso(s) é localizado. Os vasos linfáticos principais nessa área são então eletricamente coagulados ou ligados por sutura.

Usando um microscópio, os músculos na parte posterior da perna (próximo a semitendinose e adutores) são dissecados às cegas. O Iinfonodo popliteal é então localizado. Os 2 vasos linfáticos proximais e 2 distais e fornecimento de sangue distai do nodo popliteal são então ligados por sutura. O Iinfonodo popliteal e qualquer tecido adiposo anexo são então removidos por corte dos tecidos conjuntivos.

Deve-se tomar cuidado para controlar qualquer sangramento brando resultante desse procedimento. Após os linfáticos serem ocluídos, as abas da pele são vedadas por uso de pele líquida (Vetbond) (AJ Buck). As bordas da pele separadas são vedadas ao tecido muscular subjacente enquanto deixando uma fenda de cerca de 0,5 cm ao redor da perna. A pele também pode ser presa por sutura do músculo subjacente quando necessário.

Para evitar infecções, os animais são alojados individualmente com esteiras (sem camas). Os animais em recuperação são verificados diariamente através da máxima edematosa ótima que tipicamente ocorre por volta dos dias 5-7. As máximas edematosas platô são então observadas. Para avaliar a intensidade do linfedema, são medidos a circunferência e os volumes de 2 locais designados em cada pata antes da operação e diariamente por 7 dias. O efeito das proteínas do plasma no linfedema é determinado e também se a análise de proteína está em um perímetro de teste útil. Os pesos de ambos os membros de controle e edematosos são avaliados nos dois lugares. A análise é realizada de uma maneira as cegas.

Medições de circunferência: Sob ligeiro anestésico de gás de modo a prevenir o movimento do membro, uma fita de pano é usada para medir a circunferência do membro. As medições são realizadas no osso do tornozelo e pata dorsal por 2 pessoas diferentes e aquelas duas leituras são ponderadas. As leituras são feitas nos membros de controle e edematosos.

Medições volumétricas: No dia da cirurgia, os animais são anestesiados com Pentobarbital e são testados antes da cirurgia. Para volumetria diária, os animais estão sob leve efeito de anestésico halotano (imobilização rápida e recuperação rápida) e ambas as pernas são raspadas e igualmente marcadas usando marcador a prova de água nas pernas. As pernas são primeiro imersas em água, então imersas dentro do instrumento a cada nível marcado que então é medido pelo Buxco edema software (Chen/Victor). Os dados são registrados por uma pessoa, enquanto a outra está imergindo o membro na área marcada.

Medições de proteína sangue-plasma: O sangue é drenado, rotacionado e o soro separado antes da cirurgia e então ao término pra comparação a proteína total e Ca2+.

Comparação do peso dos membros: Após drenagem do sangue, o animal é preparado para coleta do tecido. Os membros são amputados usando uma quilitina, então ambas as pernas experimental e de controle são cortadas na ligadura e pesadas. Uma segunda pesagem é realizada conforme a articulação tíbio-cacaneal é desarticulada e o pé é pesado.

Preparações histológicas: a musculatura transversal localizada atrás da área do joelho (popliteal) é dissecada e disposta em um molde de metal, enchida com gel congelado, imersa em metilbutano frio, colocada em sacos de amostra marcados em 80EC até o seccionamento. Quando do seccionamento, o músculo é observado sob microscopia fluorescente quanto aos linfáticos.

EXEMPLO 23: Supressão da expressão da molécula de adesão induziria por TNF-alfa por uma proteína de fusão da albumina da invenção

O recrutamento dos linfócitos para áreas de inflamação e angiogênese envolve interações de receptor-ligante específicas entre as moléculas de adesão de superfície celular (CAMs) nos linfócitos e endotélio vascular. O processo de adesão, em ambos ajustes normal e patológico, segue uma cascata de múltiplas etapas que envolve expressão da molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), molécula-1 de adesão de célula vascular (VCAM-1) e molécula-1 de adesão de leucócito endotelial (E-selectina) nas células endoteliais (EC). A expressão dessas moléculas e outras no endotélio determina a eficácia com a qual os leucócitos podem aderir à vasculatura local e extravazar para o tecido local durante o desenvolvimento de uma resposta inflamatória. A concentração local de citocinas e o fator de crescimento participam na modulação da expressão dessas CAMs.

O fator alfa de necrose de tumor (TNF-a), uma citocina pró-inflamatória potente, é um estimulador de todas as três CAMs nas células endoteliais e pode estar envolvido em uma ampla variedade de respostas inflamatórias, freqüentemente resultando em um resultado patológico.

O potencial de uma proteína de fusão da albumina da invenção de mediar uma supressão de expressão de CAM induzida por TNF-a pode ser examinado. Um ensaio ELISA modificado que utiliza ECs como um absorvente de fase sólida é empregado para medir a quantidade de expressão de CAM nos ECs tratados com TNF-a, quando co-estimulados com um elemento da família FGF das proteínas.

Para realizar o experimento, culturas de célula da veia umbilical humana (HUVEC) são obtidas de colheitas de cordão agrupadas e mantidas em meio de crescimento (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA) suplementado com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina em um incubador umidificado a 37°C contendo 5% CO2. HUVECs são semeadas em placas de 96 poças em concentrações de 1 χ 104 células/poço em meio EGM a 37°C por 18-24 horas ou até confluência. As monocamadas são subseqüentemente lavadas 3 vezes com uma solução isenta de soro de RPMI-1640 suplementada com 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina e tratadas com uma dada citocina e/ou fator(ES) de crescimento por 24horas a 37°C. Seguindo-se incubação, as células são então avaliadas quanto à expressão de CAM.

Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) crescem em uma placa de 96 poços padrão até confluência. O meio de crescimento é removido das células e substituído por 90 pL de Meio 199 (10% FBS). As amostras para teste e controles positivo ou negativo são adicionados à placa, em triplicata (em volumes de 10 μL). As placas são incubadas a 37°C tanto por 5 horas (expressão de selectina e integrina) ou 24 horas (apenas expressão de integrina). As placas são aspiradas para remover o meio e 100 pL de 0,1% aldeído parafórmico-PBS (com Ca++ e Mg++) sendo adicionado a cada placa. As placas são mantidas a 4°C por 30 minutos.

O fixador é então removido dos poços e os poços são lavados 1 vez com PBS(+Ca,Mg)+0,5% BSA e drenados. Os poços não devem secar. São adicionados 10 μl de anticorpo primário diluído aos poços de teste e controle. Anti-ICAM-1-Biotina1 Anti-VCAM-1-Biotina e Anti-E-Selectina-Biotina são empregadas a uma concentração de 10 μg/mL (diluição de 1:10 de 0,1 mg/ml_ de anticorpo de estoque). As células são incubadas a 37°C por 30 minutos em um ambiente umidificado. Os poços são lavados 3 vezes com PBS(+Ca,Mg)+0,5% BSA.

São então adicionados 20 μL de ExtrAvidina-Fosfatase Alcalina (diluição 1:5.000) a cada poço e incubados a 37°C por 30 minutos. Os poços são lavados três vezes com PBS(+Ca,Mg)+0,5% BSA. Um comprimido de fosfato de p-nitrofenol pNPP é adicionado em 5 mL de tampão glicina (pH 10,4). 100 μL de substrato de pNPP em tampão de glicina são adicionados a cada poço de teste. Os poços padrão em triplicata são preparados da diluição de trabalho de ExtrAvidina-Fosfatase alcalina em tampão glicina: 1:5.000 (10°) > 10~0,5 > 10~1 > 1015. 5 μL de cada diluição são adicionados aos poços em triplicata e o teor de AP resultante em cada poço é de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. 100 μL de reagente pNNP devem ser adicionados a cada um dos poços padrão. A placa deve ser incubada a 37°C por 4 horas. Um volume de 50 μL de 3M NaOH é adicionado a todos os poços. Os resultados são quantificados em um leitor de placa a 405 nm. A opção de subtração da base é usada em poços vazios enchidos apenas com tampão de glicina. O gabarito é ajustado para indicar a concentração do conjugado de AP em cada poço padrão [5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng], Os resultados são indicados como quantidade de conjugado de AP ligado em cada amostra.

EXEMPLO 24: Formação da construção de repórter de GAS

Uma via de transdução de sinal que está envolvida na diferenciação e proliferação das células é denominada a via Jaks-STATs. As proteínas ativadas na via Jaks-STATs se ligam aos elementos de sítio de ativação gama "GAS" ou elemento responsivo sensível ao interferon ("ISRE"), localizado no promotor de muitos genes. A ligação de uma proteína a esses elementos altera a expressão do gene associado.

Os elementos GAS e ISRE são reconhecidos por uma classe de fatores de transcrição denominados Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição ou "STATs". Existem seis elementos da família STATs. Statl e Stat3 estão presentes em muitos tipos de células, como o Stat2 (como resposta ao IFN-alfa ser difundido). Stat4 é mais restrito e não se encontra em muitos tipos de células, embora tenha sido encontrado nas células T da classe I auxiliares após tratamento com IL-12. Stat5 era originalmente denominado fator de crescimento mamário, porém foi encontrado em concentrações maiores em outras células incluindo células mielóides. Ele pode ser ativado nas células de cultura de tecido por muitas citocinas.

Os STATs são ativados para translocarem-se do citoplasma para o núcleo quando da fosforilação da tirosina por um conjunto de cinases conhecido como família da Cinase Janus ("Jaks"). Jaks representam uma família distinta de tirosina cinases solúveis e incluem Tyk2, Jak1, Jak2 e Jak3. Essas cinases revelam similaridade de seqüência significante e são geral e cataliticamente inativas nas células restantes.

Os Jaks são ativados por uma ampla faixa de receptores resumidos na Tabela a seguir. (Adaptado da revisão de Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51 (1995)). Uma família de receptor de citocina capaz de ativação de Jaks é dividida em dois grupos: (a) Classe 1 inclui receptores para IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo1 PRL, GH1 G-CSF1 GM-CSF, LIF1 CNTF e trombopoietina; e (b) Classe 2 inclui IFN-a, IFN-g e IL-10. Os receptores da classe 1 compartilham um motivo de cisteína conservado (um conjunto de quatro cisteínas conservadas e um triptofano) e um motivo WSXWS (uma região proximal de membrana codificando Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (SEQ ID NO:53)).

Assim, na união de um Iigante a um receptor, Jaks são ativados, os quais por sua vez ativam STATs, que então translocam e se ligam aos elementos de GAS. Esse processo inteiro é englobado na via de transdução de sinal Jaks-STATs. Portanto, a ativação da via 20 Jaks-STATs, refletida por união do GAS ou o elemento de ISRE, pode ser usada para indicar proteínas envolvidas na proliferação e diferenciação das células. Por exemplo, os fatores de crescimento e citocinas são conhecidos por ativarem a via Jaks-STATs (Vide Tabela 5, a seguir). Assim, por emprego dos elementos de GAS ligados às moléculas repórter, os ativadores da via Jaks-STATs podem ser identificados.

Tabela 5

<table>table see original document page 305</column></row><table> <table>table see original document page 306</column></row><table> <table>table see original document page 307</column></row><table>

De modo a construir um elemento promotor contendo GAS sintético, que é usado nos Ensaios Biológicos descritos nos Exemplos 27-29, é empregada uma estratégia com base na PCR, de modo a gerar uma seqüência promotora GAS-SV40. O iniciador 5' contém quatro cópias em tandem do sítio de ligação GAS encontrado no promotor IRF1 e demonstrado previamente como se ligando aos STATs mediante indução com uma faixa de citocinas (Rothman e outros, Immunity 1:457-468 (1994).), embora outros elementos GAS ou ISRE possam também ser usados. O iniciador 5' também contém 18 pares de base da seqüência complementares à seqüência promotora inicial SV40 e é flanqueado com m sítio Xho\. A seqüência do iniciador 5' é:

5':GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAA 1Q TGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAG:3' (SEQIDNO:54)

O iniciador a jusante é complementar ao promotor SV40 e é flanqueado com um sítio HindWY. 5 GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEQ ID NO:55)

A ampliação da PCR é realizada empregando o gabarito de promoter SV40 presente no plasmídeo B-ga1:promotor obtido na Clontech. O fragmento da PCR resultante é digerido com Xho\/HindIII: e subclonado em BLSK2 (Stratagene). O seqüenciamento com iniciadores a frente e reverso confirma que a inserção contém a seqüência que se segue: S^CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGAT TTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGG CTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTA TTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTITGCAAAAA^CIX: 3' (SEQJDNO:56)

Com esse elemento promotor GAS ligado ao promotor SV40, uma construção repórter GAS:SEAP2 é em seguida construída. Aqui, a molécula repórter é uma fosfatase alcalina secretada ou "SEAP". Contudo, claramente, qualquer molécula repórter pode ser usada ao invés da SEAP, nesse ou em qualquer um dos outros Exemplos. Moléculas repórter bem conhecidas que podem ser usadas ao invés da SEAP incluem cloranfenicol acetiltransferase (GTP) ou qualquer proteína detectável por um anticorpo. A seqüência acima confirmou que o elemento promoter GAS-SV40 sintético é subclonado no vetor pSEAP-Promotor obtido na Clontech usando HindIll e Xhol1 substituindo eficazmente o promoter SV40 pelo elemento promoter de GAS:SV40 ampliado, para criar o vetor GAS-SEAP. Contudo, esse vetor não contém um gene resistente à neomicina e portanto, não é preferido para sistemas de expressão de mamíferos.

Assim, a fim de gerar linhagens de células estáveis de mamíferos expressando o repórter GAS-SEAP, o cassete GAS-SEAP é removido do vetor GAS-SEAP usando Sall e Notl e inserido em um vetor de estrutura contendo o gene resistente à neomicina, tal como, pGFP-1 (Clontech), empregando esses sítios de restrição no sítio de clonagem múltipla, de modo a criar o vetor GAS-SEAP/Neo. Uma vez que esse vetor é transfectado nas células de mamífero, esse vetor pode então ser usado como uma molécula repórter para ligação de GAS conforme descrito nos Exemplos 27-29.

Outras construções podem ser feitas empregando a descrição acima e substituindo GAS por uma seqüência promotora diferente. Por exemplo, a construção de moléculas repórter contendo seqüências de operador EGR e NF-KB é descrita nos Exemplos 27-31. Contudo, muitos outros promotores podem ser substituídos empregando os protocolos descritos nesses Exemplos. Por exemplo, os promotores SRE, IL-2, NFAT ou promotores de Osteocalcina podem ser substituídos, sozinhos ou em combinação (por exemplo, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, IL-2/NFAT ou NF-KB/GAS). De modo semelhante, outras linhagens de célula podem ser usadas para testar a atividade da construção de repórter, tais como, HELA (epitelial), HUVEC (endotelial), Reh (célula B), Saos-2 (osteoblasto), HUVAC (aórtica) ou Cardiomiócito.

EXEMPLO 25: Ensaio para atividade SEAP

Como uma molécula repórter para os ensaios descritos nos exemplos revelados aqui, a atividade de SEAP é analisando usando o kit Tropix Phospho-Iight Kit (Cat. BP-400) de acordo com o seguinte procedimento geral. O kitTropix Phospho-Iight Kit fornece tampões de diluição, ensaio e reação empregados a seguir.

Inicie em um dispensador com o tampão de diluição 2,5 vezes e dispensa 15 μL de tampão de diluição 2,5 vezes nas Optiplates contendo 35 μL de uma solução contendo uma proteína de fusão da albumina da invenção. Vede as placas com um vedante plástico e incube a 65°C por 30 minutos. Separe as Optiplates para evitar aquecimento irregular.

Resfrie as amostras para temperatura ambiente por 15 minutos. Esvazie o dispensador e inicie com o tampão de ensaio. Adicione 50 mL de tampão e incube a temperatura ambiente por 5 minutos. Esvazie o dispensensador e inicie com o tampão de reação (vide tabela abaixo). Adicione 50 μL de tampão de reação e incube a temperatura ambiente por 20 minutos. Uma vez que a intensidade do sinal quimioluminescente depende do tempo, e são necessários 10 minutos para ler a 5 placas em um luminômetro, assim poderemos tratar 5 placas por vez e iniciar o segundo conjunto 10 minutos mais tarde.

Leia a unidade de luz relativa no luminômetro. Ajuste H12 como vazio e imprima os resultados. Um aumento na quimiluminescência indica atividade repórter. Tabela 6

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EXEMPLO 26: Ensaio identificando atividade neuronal

Quando as células sofrem diferenciação e proliferação, um grupo de genes é ativado através de muitas vias de transdução de sinal diferentes. Um desses genes, o EGR1 (gene de resposta de crescimento inicial 1), é induzido nos vários tecidos e tipos de célula mediante ativação. O promotor de EGR1 é sensível a tal indução. Usando o promotor EGR1 ligado às moléculas repórter, a capacidade das proteínas de fusão da invenção de ativar as células pode ser avaliada.

Especificamente, o protocolo que se segue é usado para avaliar a atividade neuronal nas linhagens de célula PC12. As células PC12 (células de fenocromocitoma de rato) são conhecidas por proliferarem e/ou difrenciarem por ativação com vários mitógenos, tais como, TPA (acetato de tetradecanoil forbol), NGF (fator de crescimento neuronal) e EGF (fator de crescimento epidérmico). A expressão gênica EGR1 é ativada durante esse tratamento. Assim, por transfecção estável das células PC12 com uma construção contendo um promotor de EGR ligado ao promotor SEAP, a ativação das células PC12 por uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode ser avaliada.

A construção repórter EGR/SEAP pode ser montada pelo protocolo que se segue. A seqüência promotora de EGR-1 (-633 a +1)(Sakamoto K e outros, Oncogene 6:867-871 (1991)) pode ser ampliada por PCR do DNA genômico humano usando os seguintes iniciadores:

Primeiro iniciador: 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (SEQ ID NO:57)

Segundo iniciador: 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3" (SEQ ID NO:58)

Empregando o vetor GAS:SEAP/Neo produzido no Exemplo 24, o produto ampliado de EGR1 pode então ser inserido nesse vetor. Linearize o vetor GAS:SEAP/Neo empregando enzimas de restrição Xho\/HindIII, removendo o acumulador GAS/SV40. Restrinja o produto ampliado de EGR1 com essas mesmas enzimas. Ligue o vetor e o promotor de EGR1.

De modo a preparar as placas de 96 poços para a cultura de células, 2 mL de uma solução de revestimento (diluição 1:30 de colágeno do Tipo I (Upstate Biotech Inc. Cat 15 número 08-115) em 30% de etanol (filtro esterilizado) são adicionados a cada 10 cm de placa ou 50 mL por poço da placa de 96 poços e deixado secar ao ar por 2 horas.

Células PC12 crescem rotineiramente em meio RPMI-1640 (Bio Whittaker) contendo 10% de soro de cavalo (JRH BIOSCIENCES, Cat. número 12449-78P), 5% soro bovino fetal inativo em aquecimento (FBS) suplementado com 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina em um placa de cultura de tecido de 10 cm pré-revestida. Uma a quatro divisões são feitas a cada três a quatro dias. As células são removidas das placas por raspagem e ressuspensas com pipetagem a montante e a jusante por mais de 15 minutos.

Transfecte a construção EGR/SEAP/Neo para PC12 usando técnicas conhecidas na arte. Células estáveis de EGR-SEAP/PC12 são obtidas por crescimento das células em 300 pg/mL de G418. O meio isento de G418 é usado para crescimento de rotina, porém em cada uma dois meses a células deverão crescer novamente em 300 pg/mL de G418 para acoplar as passagens.

Para ensaiar quanto a atividade neuronal, uma placa com 10 cm e células ao redor de 70 a 80% de confluência é classificada por remoção do meio antigo. Lave as células uma vez com PBS (solução de salmoura tamponada com fosfato). Então submeta as células a inanição em meio com baixo teor de soro (RPMI-1640 contendo soro de cavalo e FBS a 0,5% com antibióticos) por toda a noite.

Na manhã seguinte, remova o meio e lave as células com PBS. Raspe as células da placa, suspenda as células em 2 mL de meio com baixo teor de soro. Conte o número de células e adicione mais meio com baixo ter de soro para alcançar uma densidade de célula final de 5 χ 105 células/mL. Adicione 200 pL da suspensão de célula a cada poço da placa de 96 poços (equivalente a 1 χ 105 células/poço). Adicione uma série de concentrações diferentes da proteína de fusão da albumina da invenção, 37°C ou 48 a 72 horas. Pode ser usado, como um controle positivo, um fator de crescimento conhecido por ativar as células PC12 através de EGR, tal c Orno, 50 ng/pL do fator de crescimento neuronal (NGF). A indução de cinco vezes de SEAP é tipicamente vista nos poços de controle positivo. O ensaio SEAP pode ser realizado rotineiramente usando técnicas conhecidas na arte e/ou conforme descrito no

Exemplo 25.

EXEMPLO 27: Ensaio para atividade da célula T

O protocolo que se segue é empregado para avaliar a atividade da célula T por fatores de identificação e determinação se uma proteína de fusão da albumina da invenção prolifera e/ou diferencia células Τ. A atividade da célula T é avaliada usando a construção GAS/SEAP/Neo produzida no Exemplo 24. Assim, fatores que aumentam a atividade de SEAP indicam a capacidade de ativar a via de transdução de sinal Jaks-STATS. A célula T usada nesse ensaio é célula T Jurkat (ATCC número de acesso TIB- 152), embora células Molt-3 (ATCC número de acesso CRL-1552) e Molt-4 (ATCC número de acesso CRL-1582) possam também ser usadas.

As células T Jurkat são células auxiliares CD4+ Th1 linfoblásticas. A fim de gerar linhagens de células estáveis, aproximadamente 2 milhões de células Jurkat são transfectadas com o vetor GAS-SEAP/neo empregando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimento de transfecção descrito a seguir). As células transfectadas são semeadas a uma densidade de aproximadamente 20.000 células por poço e os transfectantes resistentes a 1 mg/mL de genticina são selecionados. As colônias resistentes sao expandidas e então testadas quanto a sua resposta as concentrações crescentes de interferon gama. A reposta de dose de um clone selecionado é demonstrada.

Especificamente, o protocolo que se segue renderá células suficientes para 75 poços contendo 200 pL de células. Assim, é tanto escalonado ou realizado em multiplicidade para gerar células suficientes para múltiplas placas de 96 poços. As células Jurkat são mantidas em RPMI + soro a 10% com 1% Pen-Strep. Combine 2,5 mL de OPTI-MEM (Life Technologies) com 10 pg de DNA de plasmídeo em um frasco T25. Adicione 2,5 mL de OPTI-MEM contendo 50 μΙ de DMRJE-C e incube a temperatura ambiente por 15-45 minutos.

Durante o período de incubação, conte a concentração de células, gire a jusante o número necessário de células (107 por transfecção), e resusspenda em OPTI-MEM a uma concentração final de 107 células/mL. Então, adicione 1 mL de 1 χ 107 células em OPTI-MEM ao frasco T25 e incube a 37°C por 6 horas. Após a incubação, adicione 10 mL de RPMI + 15% soro. As linhagens repórter estáveis Jurkat:GAS-SEAP são mantidas em RPMI + 10% soro, 1 mg/mL de Genticina e 1% Pen-Strep. Essas células são tratadas com concentrações

variadas de uma ou mais proteínas de fusão da presente invenção.

No dia do tratamento com a proteína de fusão, as células devem ser lavadas e ressuspensas em RPMI fresco + 10% soro a uma densidade de 500.000 células por mL. O número exato de células necessárias dependerá do número de proteínas de fusão e do número de concentrações diferentes das proteínas de fusão sendo analisadas. Para uma placa de 96 poços, aproximadamente 10 milhões de células (para 10 placas, 100 milhões de

células) são necessárias.

As placas com poços contendo células Jurkat tratadas com a proteína de fusão são colocadas em um incubador por 48 horas (observação: esse tempo varia entre 48-72 horas).

Amostras de 35 μl de cada poço são então transferidas para uma placa de 96 poços opaca empregando uma pipeta de 12 canais. As placas opacas deverão ser cobertas (usando revestimentos de celofane) e armazenadas a -20°C até os ensaios SEAP serem realizados de acordo com o Exemplo 25. As placas contendo o restante das células tratadas são colocadas a 4°C e servem como uma fonte de material para repetição do ensaio em um poço específico, caso desejado.

100 Unidade/mL de interferon gama podem se usados como um controle positivo, sendo conhecido por ativar células T Jurkat. Uma indução superior a 30 vezes é tipicamente observada nos poços de controle positivo.

O protocolo acima pode ser usado na geração de células transfectadas transitórias, bem como estáveis o que ficaria claro aos versados na técnica.

EXEMPLO 28: Ensaio quanto a atividade da célula T

NF-KB (Fator nuclear KB) é um fator de transcrição ativado por uma ampla variedade de agentes incluindo citocinas inflamatórias IL-1 e TNF, CD30 e CD40, Iinfotoxina-alfa e linfotoxina-beta, por exposição a LPS ou trombina e por expressão de determinados produtos de gene virótico. Como um fator de transcrição, NF-KB regula a expressão gênica envolvida na ativação da célula imune, controla a apoptose (NF-KB parece proteger as células da apoptose), desenvolvimento de célula BeT, respostas antivirais e antimicrobianas e múltiplas respostas ao estresse.

Nas condições não estimuladas, NF-KB é retido no citoplasma com I-KB (Inibidor KB). Contudo, quando do estímulo, I-KB é fosforilado e degradado, fazendo com que NF-KB apresente transporte bidirecional para o núcleo, dessa forma ativando a transcrição dos genes alvo. Os genes alvo ativados por NF-KB incluem IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 e MHC classe 1.

Em razão de seu papel central e capacidade de responder a uma ampla faixa de estímulos, as construções repórter que utilizam o elemento promotor NF-KB são empregadas para classificar a proteína de fusão. Os ativadores ou inibidores de NF-KB seriam úteis no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de doenças. Por exemplo, os inibidores de NF-KB seriam usados para tratar aquelas doença relacionadas à ativação crônica ou aguda de NF-KB, tais como, artrite reumatóide.

Para construir um vetor contendo o elemento promotor NF-KB, uma estratégia à base da PCR é empregada. O iniciador a montante contém quatro cópias em tandem do sítio de ligação de NF-KB (GGGGACTTTCCC) (SEQ ID NO:59), 18 pares de base em complementaridade de seqüência para a extremidade 5' da seqüência promotora anterior SV40 e é flanqueado com um sítio Xho\: 5':GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTT CCATCCTGCCATCTCAATTAG:3' (SEQ ID N0:60).

O iniciador a jusante possui complementaridade na extremidade 3' do promoter SV40 e é flanqueado com um sítio HindWY. 5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEQ ID NO:55).

A ampliação da PCR é realizada usando o gabarito do promotor SV40 presente no plasmídeo PB-ga1:promotor obtido na Clontech. O fragmento da PCR resultante é digerido com Xho\ e Hind\\\ e subclonado em BLSK2-. (Stratagene). O seqüenciamento com os iniciadores T7 e T3 confirma que a inserção contém a seqüência que se segue: 5':CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGC CCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTT TATTT ATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTG AGGAGGC Illll TGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3" (SEQ ID NO:61).

Em seguida, substitua o elemento promoter mínimo SV40 presente no plasmídeo ppSEAP2-promotor (Clontech) por esse fragmento de NF-KB/SV40 empregando Xho\ e Hind\\\. Contudo, esse vetor não contém um gene resistente à neomicina e, portanto, não é preferido pra sistemas de expressão de mamífero.

De modo a gerar linhagens de células de mamífero estáveis, o cassete NF-KB/SV40/SEAP é removido do vetor NF-KB/SEAP acima empregando enzimas de restrição Sall e Notl, e inserido no vetor contendo resistência à neomicina. Especificamente, o cassete NF-KB/SV40/SEAP foi inserido no pGFP-1 (Clontech), substituindo o gene GFP1 após restrição de pGFP-1 com Sall e Notl.

Uma vez que o vetor NF-KB/SV40/SEAP/Neo é criado, células T Jurkat estáveis são criadas e mantidas de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 25. De modo semelhante, o método para analisar as proteínas de fusão com essas células T Jurkat estáveis é também descrito no Exemplo 25. Como um controle positivo, TNF alfa exógeno (0,1,1,10 ng) é adicionado aos poços H9, H10 e H11, com uma ativação de 5-10 vezes O protocolo que se segue é usado para avaliar atividí de fusão da albumina da presente invenção determinando se e/ou diferencia as células mielóides. A atividade da célula η construção GAS/SEAP/Neo produzida no Exemplo 24. Assim atividade SEAP indicam a capacidade de ativar a via de transd célula mielóide usada nesse ensaio é U937, uma linhagem de TF-1, HL60 ou KG1 possam ser usadas.

De modo a transfectar transitoriamente as célula GAS/SEAP/Neo produzida no Exemplo 24, um método DEAE-1994, Cell Growth & Diferenciação, 5:259-265) é empregado. U937 e lave as mesmas com PBS. As células U937 crescer 1640 contendo soro bovino fetal a 10% inativado em aquecime 100 unidades/mL de penicilina e 100 mg/ml_ de estreptomicina.

Em seguida, suspenda as células em 1 mL de 20 mM contendo 0,5 mg/mL de DEAE-Dextran, 8 pg GAS-SEAP2 de de NaCI, 5 mM de KCI, 375 μΜ de Na2HPO4JH2O, 1 mM d< Incube a 37°C por 45 minutos.

Lave as células com meio RPMI 1640 contendo FBS em 10 mL de meio complete e incube a 37°C por 36 horas.

As células estáveis de GAS-SEAP/U937 são obtidas em 400 pg/mL de G418. O meio isento de G418 é usado para de um a dois meses, as células deverão crescer novamente acoplar as passagens.

Essas células são testadas por colheita de 1x10 céli ensaio em dez placas de 96 poços) e lavadas com PBS. Suspe meio de crescimento descrito acima, com uma densidade final -em placa 200 pL de células por poço em placa de 96 poços (ou Adicione concentrações diferentes da proteína de fusâ

EXEMPLO 30: Ensaio identificando alterações na concentração da molécula pequena e permeabilidade da membrana

A união de um ligante a um receptor é conhecida por alterar os níveis intracelulares das moléculas pequenas, tais como, cálcio, potássio, sódio e pH, bem como alteração do potencial da membrana. Essas alterações podem ser medidas no ensaio para identificar as proteínas de fusão que se ligam aos receptores de uma célula específica. Embora o protocolo que se segue descreva um ensaio para cálcio, esse protocolo pode ser facilmente modificado de modo a detectar alterações no potássio, sódio, pH, potencial da membrana ou qualquer outra molécula pequena que seja detectável por uma sonda fluorescente.

O ensaio que se segue emprega Leitor de Placa de Imageamento Fluormétrico ("FLIPR") para medir as alterações nas moléculas fluorescentes (sondas moleculares) que ligam moléculas pequenas. Claramente, qualquer molécula florescente detectando uma molécula pequena pode ser empregada ao invés da molécula fluorescente de cálcio, fluo-4 (Molecular Probes, Inc.; número do catálogo F- 14202), usado aqui.

Para células aderentes, semeie as células em 10.000-20.000 células/poço em uma placa de 96 poços preta Co-star com fundo límpido. A placa é incubada em um incubador de CO2 por 20 horas. As células aderentes são lavadas duas vezes no lavador Biotek com 200 pL de HBSS (Solução de Salmoura Equilibrada de Hank) deixando 100 pL de tampão após a lavagem final.

Uma solução de estoque de 1 mg/mL de fluo-4 é fabricada em DMSO de ácido plurônico a 10%. Para carregar as células com fluo-4, 50 pL de 12 pg/mL de fluo-4 são adicionados a cada poço. A placa é incubada a 37°C com HBSS deixando 100 pL do tampão.

Para células não aderentes, as células são rotacionadas dos meios de cultura. As células são resusspensas para 2-5x106 células/mL com HBSS em um tubo cônico de 50 mL. 4 pL de 1 mg/mL de solução de fluo-4 em DMSO de ácido plurônico a 10% são adicionados a cada mL da suspensão de célula. O tubo é então colocado em um banho de água a 37°C por 30-60 minutos. As células são lavadas duas vezes com HBSS, ressuspensas para 1 χ 106 células/mL e dispensadas em uma microplaca, 100 pL/poço. A placa é centrifugada a 1.000 rpm por 5 minutos. A placa é então lavada uma vez em Lavagem para Célula Denley com 200 pL, seguido por uma etapa de aspiração para 100 pL de volume final.

Para um ensaio que não tenha base em célula, cada poço contém uma molécula fluorescente, tal como, fluo-4. A proteína de fusão da invenção é adicionada ao poço e uma alteração na fluorescência é detectada.

De modo a medir a fluorescência do cálcio intracelular, FLIPR é ajustado para os seguintes parâmetros: (1) O ganho do sistema é de 300-800 mW; (2) Tempo de exposição é de 0,4 segundos; (3) Câmera F/parada é F/2; (4) Excitação é de 488 nm; (5) Emissão é de 530 nm; e (6) Adição da amostra é de 50 pL. A emissão aumentada em 530 nm indica um evento de sinalização extracelular causado por uma proteína de fusão da albumina da presente invenção ou uma molécula induzida por uma proteína de fusão da albumina da presente invenção, que resultou em um aumento na concentração Ca++ intracelular.

EXEMPLO 31: Ensaio identificando a atividade da tirosina cinase

As Proteínas Tirosina Cinases (PTK) representam um grupo diverso de cinases de transmembrana e citoplásmicas. Dentro do grupo da proteína de Tirosina Cinase Receptora (RPTK) estão os receptores para uma ampla faixa de fatores de crescimento mitogênico e metabólico incluindo o PDGF, FGF, EGF, NGF1 HGF e subfamílias de receptor de insulina. Além disso, existe uma grande família de RPTKs para os quais o Iigante correspondente não é conhecido. Os Iigantes para RPTKs incluem principalmente proteínas pequenas secretadas, porém também proteínas de ligação de membrana e matriz extracelular.

Ativação de RPTK por Iigantes envolve dimerização do receptor mediada por ligante, resultando na transfosforilação das subunidades do receptor e ativação das tirosina cinases citoplásmicas. As tirosina cinases citoplásmicas incluem tirosina cinases associadas ao receptor da subfamília src (por exemplo, src, yes, Ick1 lyn, fyn) e tirosina cinases de proteína ligada a não receptor e citossólica, tais como, família Jak, membros da qual mediam transdução de sinal desencadeado pela superfamília de receptores da citocina (por exemplo, as interleucinas, interferons, GM-SF e Leptina).

Em razão de uma ampla faixa de fatores conhecidos, capazes de estimular a atividade da tirosina cinase, a identificação se uma proteína de fusão da albumina da presente invenção ou uma molécula induzida por uma proteína de fusão da presente invenção é capaz de ativar as vias de transdução de sinal da tirosina cinase é de interesse. Portanto, o protocolo que se segue é projetado para identificar tais moléculas capazes de ativar as vias de transdução de sinal de tirosina cinase.

Semeie as células alvo (por exemplo, ceratinócitos primários) em uma densidade de aproximadamente 25.000 células por poço em Placas de Avaliação Loprodyne Silent de 96 poços adquiridas na Nalge Nunc (Naperville, IL). As placas são esterilizadas com dois enxágües de 30 minutos com etanol a 100%, enxaguadas com água e secas por toda a noite. Algumas placas são revestida por 2 horas com 100 mL de cultura de célula classificação colágeno do tipo I (50 mg/mL), gelatina (2%) ou polilisina (50 mg/mL), todas as quais podendo ser adquiridas na Sigma Chemicals (St. Louis, MO) ou 10% Matrigel adquirido na Becton Dickinson (Bedford1MA) ou soro bovino, enxaguado com PBS e armazenado a 4°C.

O crescimento celular nessas placas é analisado por semeadura de 5.000 células/poço no meio de crescimento e quantificação indireta desse número de células através do uso de Alamar Blue, conforme descrito pelo fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) após 48 horas. Revestimentos de placa Falcon número 3071 da Becton Dickinson (Bedford, MA) são empregados para cobrir as Placas de Avaliação Loprodyme Silent. Placas de cultura de célula Microtest Ill Falcon podem ser também usadas em alguns experimentos de proliferação. Para preparar os extratos, as células A431 são semeadas sobre membranas de náilon das placas Loprodyne (20.000/200 mL/poço) e cultivadas por toda a noite em meio completo. As células são imobilizadas por incubação no meio basal isento de soro por 24 horas. Após 5-20 minutos de tratamento com EGF (60 ng/mL) ou concentrações diferentes de uma proteína de fusão da albumina da invenção, o meio foi removido e 100 mL de tampão de extração ((20 mM de HEPES pH 7,5, 0,15 M de NaCI, 1% Triton X-100, 0.1% SDS5 2 mM Na3V04, 2 mM Na4P207 e um coquetel de inibidores de protease (número 1836170) obtido na Boeheringer Mannheim (Indianápolis, IN)) são adicionados a cada poço e a placa é agitada em um agitador de rotação por 5 minutos a 4°C. A placa é então colocada em uma tubulação de transferência a vácuo e o extrato filtrado através dos fundos de membrana de 0,45 mm de cada poço empregando vácuo doméstico. Os extratos são coletados em uma placa de ensaio/captura de 96 poços na parte inferior da tubulação de vácuo e imediatamente colocados sobre gelo. De modo a obter os extratos clarificados por centrifugação, o conteúdo de cada poço, após solubilização com detergente por 5 minutos é removido e centrifugado por 15 minutos a 4°C em 16.000 χ g.

Teste os extratos filtrados quanto aos níveis de atividade da tirosina cinases. Embora muitos métodos de detecção da atividade de tirosina cinase sejam conhecidos, um método é descrito aqui.

De modo geral, a atividade da tirosina cinase de uma proteína de fusão da albumina da invenção é avaliada por determinação de sua capacidade de fosforilar um resíduo de tirosina em um substrato especifico (um peptídeo biotinilado). Os peptídeos biotínilados que podem ser usados para esses fins incluem PSK1 (correspondendo aos aminoácidos 6-20 da divisão celular de cinase cdc2-p34) e PSK2 (correspondendo aos animoácidos 1-17 da gastrina). Ambas os peptídeos são substratos para uma ampla faixa de 25 tirosina cinases e estão disponíveis na Boehringer Mannheim.

A reação da tirosina cinase é ajustada por adição dos componentes que se seguem, em ordem. Primeiro, adicione 10 μL de 5 μΜ de peptídeo biotinilado, entãolO μL de ATP/Mg2+ (5mM ATP/50 mM MgCl2), entãolO μL de 5 χ Tampão de ensaio (40 mM cloridrato de imidazol, pH 7,3, 40 mM de beta-glícerofosfato, 1 mM de EGTA, 100 mM de MgCl2, 5 mM de MnCl2, 0,5 mg/mL BSA), então 5 μL de vanadato de sódio (1 mM), então 5 μL de água. Misture os componentes brandamente e pré-incube a mistura de reação a 30°C por 2 minutos. Inicie a reação por adição de 10 μL da enzima de controle ou o sobrenadante filtrado.

A reação de ensaio de tirosina cinase é então terminada por adição de 10 μl. de 120 mm de EDTA e as reações são colocadas sobre gelo.

A atividade da tirosina cinase é determinada por transferência de uma alíquota de 50 μl da mistura de reação para um módulo de placa de microtitulação (MTP) e incubação a 37°C por 20 minutos. Isso permite que a placa de 96 poços revestida com a estreptavidina se associe ao peptídeo biotinilado. Lave o módulo MTP com 300 pL/poço de PBS quatro vezes. Em seguida, adicione 75 μL do anticorpo anti-fosfotirosina conjugado à peroxidase de raiz-forte (anti-P-Tyr-POD(0,5 μ/mL)) a cada poço e incube a 37°C por uma hora. Lave o 5 poço conforme acima.

Em seguida, adicione 100 pL de solução de substrato de peroxidase (Boehringer Mannheim) e incube a temperatura ambiente por pelo menos 5 minutos (até 30 minutos). Meça a absorvência da amostra a 405 nm por emprego de leitor de ELISA. O nível de atividade de peroxidase ligada é quantificado usando um leitor de ELISA e reflete o nível de atividade da tirosina cinase.

EXEMPLO 32: Ensaio de identificação da atividade de fosforilação.

Como uma alternativa em potencial e/ou complemento ao ensaio da atividade da tirosina cinase descrito no Exemplo 31, um ensaio que detecta a ativação (fosforilação) dos intermediários de transdução de sinal intracelular principal pode também ser empregado. 1Por exemplo, conforme descrito a seguir, um ensaio específico pode detectar a fosforilação das tirosina cinases Erk-1 e Erk2. Contudo, a fosforilação de outras moléculas, tais como, Raf, JNK, p38 MAP, Map cinase cinase (MEK), MEK cinase, Src, cinase específica muscular (MuSK), IRAK, Tec e Janus, bem como qualquer outra molécula de fosfoserina, fosfotirisona ou fosfotreonina pode ser detectada por substituição dessas moléculas por Erk-1 ou Erk-2 no ensaio de que segue.

Especificamente, as placas de ensaio são fabricadas apor revestimento dos poços de uma placa de ELISA de 96 poços com 0,1 mL da proteína G (1 pg/mL) por 2 horas a temperatura ambiente. As placas são então enxaguadas com PBS e bloqueadas com BSA/PBS a 3% por 1 hora a temperatura ambiente. As placas contendo proteína G são então tratadas com 2 anticorpos monoclonais comerciais (100 ng/poço) contra Erk-1 e Erk-2 (1 hora a temperatura ambiente) (Santa Cruz Biotechnology). (De modo a detectar outras moléculas, essa etapa pode ser facilmente modificada por substituição de um anticorpo monoclonal detectando quaisquer das moléculas descritas acima). Após 3-5 enxágües com PBS, as placas são armazenadas a 4°C até o uso.

Células A431 são semeadas em 20.000/poços em uma placa de filtro Loprodyne de 96 poços e cultivadas por toda a noite em meio de crescimento. As células então não recebem alimento por 48 horas em meio basal (DMEM) e então gravadas com EGF (6 ng/poço) ou concentrações variadas da proteína de fusão da invenção por 5-20 minutos. As células são então solubilizadas e os extratos filtrados diretamente na placa de ensaio.

Após incubação com o extrato por 1 hora a temperatura ambiente, os poços são novamente enxaguados. Como um controle positivo, uma preparação comercial de MAP cinase (10 ng/poço) é usada no lugar do extrato A431. As placas são então tratadas com um anticorpo policlonal comercial (coelho) (1 pg/mL) que reconhece especificamente o epítopo fosforilado das cinases Erk-1 e Erk-2 (1 hora a temperatura ambiente). Esse anticorpo é biotinilado por procedimentos padrão. O anticorpo policlonal ligado é então quantificado por incubações sucessivas com reagente melhorador Europium-estreptavidina e fluoresceína Europium no instrumento Wallac DELFIA (fluorescência decomposta com o tempo). Um sinal fluorescente aumentado em relação à base indica uma fosforilação pela proteína de fusão da presente invenção ou uma molécula induzida por proteína de fusão da albumina da presente invenção.

EXEMPLO 33: Ensaio de fosforilação

De modo a ensaiar a atividade de fosforilação de uma proteína de fusão da albumina da invenção é empregado um ensaio de fosforilação conforme descrito na Patente US número 5.958.405 (que é incorporada aqui como referência). Em resumo, a atividade de fosforilação pode ser medida por fosforilação de um substrato de proteína empregando 32P-ATP marcado com gama e quantificação da radioatividade incorporada empregando um contador gama radioisótopo. A proteína de fusão da invenção é incubada com o substrato da proteína, 32P-ATP e um tampão de cinase. O 32P incorporado ao substrato é então separado do 32P-ATP livre por eletroforese e o 32P incorporado é contado e comparado a um controle negativo. As contagens de radioatividade acima do controle negativo indicam a atividade de fosforilação da proteína de fusão.

EXEMPLO 34: Detecção da atividade de fosforilação (ativação) de uma proteína de fusão da albumina da invenção na presença de Iigantes de polipeptídeo

Os métodos conhecidos na arte ou descritos aqui podem ser empregados PR determinar a atividade de fosforilação de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Um método preferido para determinar a atividade de fosforilação é empregar o ensaio de fosforilação de tirosina conforme descrito na US 5.817.471 (incorporada aqui como referência).

EXEMPLO 35: Ensaio para a estimulação da proliferação de célula CD34+ da medula óssea

Esse ensaio se baseia na capacidade da CD34+ humana de proliferar na presença de fatores de crescimento hematopoiético e avaliar a capacidade das proteínas de fusão da invenção para estimular a proliferação das células CD34+.

Foi descrito anteriormente que a maioria dos precursores maduros responderá apenas a um sinal simples. Precursores mais imaturos requerem pelo menos dois sinais para resposta. Portanto, para testar o efeito das proteínas de fusão da invenção na atividade hematopoiética de uma ampla faixa de células progenitoras, o ensaio contém uma dada proteína de fusão da invenção na presença ou ausência de fatores de crescimento hematopoiético. As células isoladas são cultivadas por 5 dias na presença de Fator de Célula Tronco (SCF) em combinação com a amostra testada. O SCF sozinho possui um efeito muito limitado na proliferação das células da medula óssea (BM), atuando em tais condições apenas como um fator "de sobrevivência". Contudo, combinado com qualquer fator que exiba efeito estimulador nessas células (por exemplo, IL-3), SCF causará um efeito 5 sinergístico. Portanto, se a proteína de fusão testada tiver um efeito estimulador nos progenitores hematopoiéticos, tal atividade pode ser facilmente detectada. Uma vez eu tais células BM normais possuem um baixo nível de células de ciclagem, é provável que qualquer efeito inibidor de uma dada proteína de fusão possa não ser detectado. Conseqüentemente, os ensaios para um efeito inibidor nos progenitores é preferivelmente testado nas células que são primeiro submetidas ao estímulo in vitro com SCF+IL+3, e então contatadas com o composto que está sendo avaliado quanto à inibição de tal proliferação induzida.

Em resumo, as células CD34+ são isoladas usando métodos conhecidos na técnica. As células são descongeladas e ressuspensas em meio (WBSF 60 meio isento de soro com 1% L-glutamina (500 mL) Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD Cat número 160-204-101). Após várias etapas de centrifugação branda a 200 χ g, as células são deixadas repousar por uma hora. A contagem celular é ajustada para 2,5 χ 105 células/mL. Durante esse tempo, 100 pL de água estéril são adicionados aos poços periféricos de uma placa de 96 poços. As citocinas que podem ser testadas com uma proteína de fusão da 20 albumina da invenção nesse ensaio são rhSCF (R&D Systems, Minneapolis, MN1 Cat número 255- SC) a 50 ng/mL sozinhas e em combinação com rhSCF e rhlL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat número 203-ML) a 30 ng/ml. Após uma hora, 10 pL das citocinas preparadas, variando as concentrações de uma proteína de fusão da albumina da invenção e 20 μL das células diluídas são adicionadas ao meio que já está presente nos poços para permitir um volume total final de 100 μL. As placas são então colocadas em um incubador a 37°C/5% CO2 por cinco dias.

Dezoito horas antes do ensaio ser colhido, 0,5 μCi/poço de [3H]Timidina é adicionado em um volume de 10 μL a cada poço para determinar a taxa de proliferação. O experimento é terminado por colheita das células de cada placa de 96 poços para uma esteira de filtro usando o Tomtec Harvester 96. Após a colheita, as esteiras de filtro são secas, aparadas e colocadas em conjuntos OmniFiIter consistindo em uma placa OmniFilter e uma bandeja OmniFiIter. 60 μL de Microscint são adicionados a cada poço e a placa vedada com uma película de vedação TopSeal-A-de prensagem. Um código de barras 15 com cola é afixado à primeira placa para contagem. As placas vedadas são então carregadas e o nível de radioatividade determinado através do Contador Packard Top e os dados impressos coletados para análise. O nível de radioatividade reflete a quantidade de proliferação celular. Os estudos descritos nesse exemplo testam a atividade de uma dada proteína de fusão para estimular a proliferação celular de CD34+ de medula óssea. Um versado na técnica modificaria facilmente os estudos exemplificados para testar a atividade das proteínas de fusão e polinucleotídeos da invenção (por exemplo, terapia gênica) bem como agonistas e antagonistas dos mesmos. A capacidade de uma proteína de fusão da albumina da invenção de estimular a proliferação das células CD34+ da medula óssea indica que a proteína de fusão da albumina e/ou polinucleotídeos correspondendo à proteína de fusão são úteis para o diagnóstico e tratamento de transtornos que afetam o sistema imune e hematopoiese. Usos representativos são descritos nas seções "Atividade Imune" e "Doenças Infecciosas" acima e em outro lugar aqui.

EXEMPLO 36: Ensaio para resposta de célula melhorada por matriz extracelular (EMECR).

O objetivo do ensaio para resposta de célula melhorada por matriz extracelular (EMECR) é avaliar a capacidade das proteínas de fusão da invenção de agirem nas células tronco hematopoiéticas no contexto do sinal induzido por matriz extracelular (ECM).

As células respondem aos fatores reguladores no contexto do(s) sinal(is) recebidos do microambiente circundante. Por exemplo, os fibroblastos e células tronco endoteliais e epiteliais falham em replicar na ausência de sinais de ECM. As células tronco hematopoiéticas podem sofrer auto-renovação na medula óssea,porém não em cultura em suspensão in vitro . A capacidade das células tronco de sofrer auto-renovação in vitro depende de sua interação com as células estromais e a fibronectina de proteína (fn) de ECM. A adesão das células à fn é medida por receptores de integrina O5^1 e α4.βι, que são expressos por células tronco hematopoiéticas de seres humanos e camundongos. O(s) fator(ES) que interage(m) com o ambiente ECM e são sensíveis à estimulação da autorenovação da célula tronco ainda não foram identificados. A descoberta de tais fatores seria de grande interesse na terapia gênica e aplicações de transplante da medula óssea.

Em resumo, placas de 96 poços de poliestireno, tratadas com cultura de não tecido são revestidas com fragmento de fn em uma concentração de revestimento de 0,2 pg/cm2. As células de medula óssea de camundongo são colocadas em placas (1.000 células/poço) 30 em 0,2 mL de meio isento de soro. As células cultivadas na presença de IL-3 (5 ng/mL) + SCF (50 ng/mL) serviriam como o controle positivo, condições sob as quais pouca auto-renovação porém diferenciação pronunciada das células tronco deve ser esperada. As proteínas de fusão da albumina da invenção são testadas com controles negativos apropriados na presença e ausência de SCF (5,0 ng/mL), onde o volume da composição administrada contendo a proteína de fusão da albumina da invenção representa 10% do volume de ensaio total. As células colocadas em placas são então deixadas crescer por incubação em um incubador de cultura de tecido de ambiente com baixo teor de oxigênio (5% CO2, 7% O2 e 88% N2) por 7 dias. O número células proliferando dentro dos poços é então quantificado por medição de incorporação de timidina ao DNA celular. A verificação dos pontos altos positivos no ensaio precisará de caracterização fenotípica das células, o que pode ser realizado por escalonamento do sistema de cultura e uso de reagentes de anticorpo apropriados contra antígenos de superfície da célula e FACScan.

Se for verificado que uma proteína de fusão específica da presente invenção fé um estimulador de progenitores hematopoiéticos, a proteína de fusão e os polinucleotídeos correspondendo à proteína de fusão podem ser úteis, por exemplo, no diagnóstico e tratamento de transtornos que afetam o sistema imune e hematopoiese. Os usos representativos são descritos na seções "Atividade Imune" e "Doenças Infecciosas" acima e em qualquer lugar aqui. A proteína de fusão também pode ser útil na expansão das células tronco e progenitores comprometidas de várias linhagens sangüíneas e na diferenciação

e/ou proliferação de vários tipos de células.

Adicionalmente, as proteínas de fusão da albumina da invenção e polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, também podem ser empregados para inibir a proliferação e diferenciação das células hematopoiéticas e, portanto, podem ser empregados para proteger as células tronco da medula óssea dos agentes quimioterapêuticos durante a quimioterapia. Esse efeito antiproliferativo pode permitir administração de doses maiores de agentes quimioterapêuticos e, portanto, tratamento quimioterapêutico mais eficaz.

Além disso, as proteínas de fusão da invenção e polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção também podem ser úteis para o tratamento e diagnóstico de transtornos correlatos hematopoiéticos, tais como, anemia, pancitopenia, leucopenia, trombocitopenia ou leucemia, uma vez que as células estromais são importantes na produção das células das linhagens hematopoiéticas. Os empregos incluem cultura ex vivo de células da medula óssea, transplante de medula óssea, reconstituição da medula óssea, radioterapia ou quimioterapia de neoplasia.

EXEMPLO 37: Proliferação de fibroblasto dérmico humano e células musculares

lisas aórticas

Uma proteína de fusão da albumina da invenção é adicionada as cultura de fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) e células musculares lisas aórticas humanas (AoSMC) e dois co-ensaios foram realizados com cada amostra. O primeiro ensaio examina o efeito da proteína de fusão na proliferação dos fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) ou células musculares lisas aórticas. O crescimento anormal dos fibroblastos ou células musculares lisas é uma parte dos vários processos patológicos, incluindo fibrose e restenose. O segundo ensaio examina a produção de IL6 por ambos NHDF e SMC. A produção de IL6 é uma indicação da ativação funcional. As células ativadas terão produção aumentada de várias citocinas e outros fatores que podem resultar em um resultado pró-inflamatório ou imunomodulador. Os ensaios são operados com e sem estímulo co-TNFa, a fim de verificara atividade co-estimuladora ou inibidora.

Em resumo, no dia 1, placas pretas de 96 poços são ajustadas com 1.000 células/poço (NHDF) ou 2.000 células/poço (AoSMC) em meios de cultura de 100 μΙ_. Os meios de cultura NHDF contêm: meios basais FB Clonetics1 1 mg/mL de hFGF, 5 mg/mL de insulina, 50 mg/mL de gentamicina, 2% FBS1 enquanto os meios de cultura AoSMC contêm menos basais SM Clonetics, 0,5 pg/mL de hEGF, 5 mg/mL de insulina, 1 pg/mL de hFGF, 50 mg/mL de gentamicina, 50 pg/mL de anfotericina B, 5% FBS. Após incubação a 37°C por pelo menos 4-5 horas, os meios de cultura são aspirados e substituídos com meios de parada de crescimento. Os meios de parada de crescimento NHDF contêm meios basais de fibroblasto, 50 mg/mL de gentamicina, 2% FBS, enquanto os meios de parada de crescimento para AoSMC contêm meios basais de SM, 50 mg/mL de gentamicina, 50 pg/mL de anfotericina B, 0,4% FBS. Incube a 37°C até o dia 2.

No dia 2, as diluições em série e gabaritos de uma proteína de fusão da albumina da invenção são projetados, tal que, eles sempre incluam controles de meios e controles de proteína conhecidos. Para ambos os experimentos de estimulação e inibição, as proteínas são diluídas em meios de parada de crescimento. Para experimentos de inibição, TNFa é adicionado a uma concentração final de 2 ng/mL (NHDF) ou 5 ng/mL (AoSMC). Adicione 1/3 do volume do meio contendo controles ou uma proteína de fusão da albumina da invenção e incube a 37°C/5% CO2 até o dia 5.

Transfira 60 pL de cada poço para outra placa de 96 poços marcada, cubra com um vedante de placa e armazene a 4°C até o dia 6 (para IL6 ELISA). Ao restante dos 100 pL na placa de cultura de célula, adicione assepticamente Alamar Blue em uma quantidade igual a 10% do volume da cultura (10 pL). Retorne as placas para o incubador por 3 a 4 horas. Então meça a fluorescência com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm usando o CytoFIuor. Isso rende os dados de estimulação/ínibição do crescimento.

No dia 5, o IL6 ELISA é realizado por revestimento de uma placa de 96 poços com 50-100 pL/poço de anticorpo monoclonal IL6 anti-humano diluído em PBS, pH 7,4, incubando a temperatura ambiente.

No dia 6, esvazie as placas na pia e em toalhas de papel absorventes. Prepare o tampão de ensaio contendo PBS com 4% BSA. Bloqueie as placas com 200 pL/poço de tampão de bloqueio Pierce Super Block em PBS por 1-2 horas e então lave as Iacas com tampão de lavagem (PBS, 0,05% Tween-20). Coloque as placas em papel toalha. Então adicione 50 pL/poço de anticorpo marcado com biotina, monoclonal, IL-6 anti-humano a 0,50 mg/mL. Faça diluições de estoque de IL-6 nos meios (30, 10, 3, 1, 0,3, 0 ng/mL). Adicione amostras em duplicada à fileira superior da placa. Revista as placas e incube por 2 horas a temperatura ambiente no agitador.

As placas são lavadas com tampão de lavagem e colocadas em papel toalha. Dilua estreptavidina marcada com EU 1:1.000 em tampão de ensaio e adicione 100 pg/poço. Revista a placa e incube 1 hora a temperatura ambiente. As placas são novamente lavadas com tampão de lavagem e colocadas em papel toalha.

Adicione 100 pg/poço de Solução Melhoradora. Agite por 5 minutos. Leia a placa em um fluorímetro Wallac DELFIA. As leituras de placas em triplicata em cada ensaio foram tabuladas e ponderadas.

Um resultado positivo nesse ensaio sugere que a proliferação celular em AoSMC e que a proteína de fusão da albumina pode estar envolvida na proliferação de fibroblastos dérmicos e/ou proliferação de células musculares lisas. Um resultado positivo também sugere muitos usos em potencial da proteína de fusão e polinucleotídeos codificando a proteína de fusão da albumina. Por exemplo, inflamação e respostas imunes, cura de ferimentos e angiogênese, conforme detalhadas completamente nesse relatório descritivo. Especificamente, as proteínas de fusão podem também ser usadas na cura de feridas e regeneração dérmica, bem como promoção de vasculogênese, de ambos os vasos sangüíneos e linfáticos. O crescimento dos vasos pode ser usado no tratamento, por exemplo, de doenças cardiovasculares. Adicionalmente, as proteínas de fusão mostrando atividade antagonística nesse ensaio podem ser úteis no tratamento de doenças, transtornos e/ou condições que envolvem angiogênese, por atuação como agente antivascular (por exemplo, antiangiogênese). Essas doenças, transtornos e/ou condições são conhecidos na técnica e/ou descritos aqui, tais como, por exemplo, malignidade, tumores sólidos, tumores benignos, por exemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogênicos; placas arterioscleróticas; doenças angiogênicas oculares, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, degeneração macular, rejeição de enxerto córneo, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeose, retinoblastoma, uveíte e Pterigia (crescimento anormal do vaso sangüíneo) dos olhos; artrite reumatóide, psoríase; cura retardada de ferida; endometriose; vasculogenese; granulações; cicatrizes hipertróficas (quelóides); fraturas sem união; esclerodermía; tracoma; adesões vasculares; angiogênese miocardial; colaterais coronários; colaterais cerebrais; má formações arteriovenosas; angiogênese isquêmica de membro; síndrome de Osler-Webber; neovascularização de placa, telangiectasia; articulações hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulação de ferida; doença de Crohn e aterosclerose. Além disso, as proteínas de fusão da albumina que atuam como antagonistas nesse ensaio podem ser úteis no tratamento de doenças anti-hiperproliferativas e/ou antiinflamatórias conhecidas na arte e/ou descritas aqui.

EXEMPLO 38: Expressão da molécula de adesão celular (CAM) nas células endoteliais

O recrutamento de linfócitos para áreas de inflamação e angiogênese envolve interações de ligante-receptor específicas entre as moléculas de adesão de superfície celular (CAMs) nos linfócitos e endotélio vascular. O processo de adesão, em ambos ajuste normal e patológico, segue uma cascata de múltiplas etapas que envolve expressão da molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), molécula-1 de adesão de célula vascular (VCAM-1) e molécula-1 de adesão de leucócito endotelial (E-selectina) nas células endoteliais (EC). A expressão dessas moléculas e outras no endotélio determina a eficácia com a qual os leucócitos podem aderir à vasculatura local e extravasar para o tecido local durante o desenvolvimento de uma resposta inflamatória. A concentração local de citocinas e o fator de crescimento participam na modulação da expressão dessas CAMs.

Em resumo, células endoteliais (por exemplo, células endoteliais da veia umbilical humana (HU VEC) crescem em uma placa padrão de 96 poças para confluência, meio de crescimento é removido das células e substituído com 100 μL de Meio 199 (10% de soro bovino fetal (FBS)). As amostras para teste (contendo uma proteína de fusão da albumina da invenção) e controles positivo ou negativo são adicionados à placa, em triplicata (em volumes de 10 pL). As placas são então incubadas a 37°C tanto por 5 horas (expressão de selectina e integrina) ou 24 horas (apenas expressão de integrina). As placas são aspiradas para remover o meio e 100 μL de 0,1% aldeído parafórmico-PBS (com Ca++ e Mg++) sendo 20 adicionado a cada placa. As placas são mantidas a 4°C por 30 minutos. O fixador é removido dos poços e os poços são lavados 1 vez com PBS(+Ca,Mg) + 0,5% BSA e drenados. 10 μL do anticorpo primário diluídos são adicionados aos poços de teste e controle. Anti-ICAM-1-Biotina, Anti-VCAM-1 -Biotina e Anti-E-Selectina-Biotina são empregadas a uma concentração de 10 pg/mL (diluição de 1:10 de 0,1 mg/mL de anticorpo 25 de estoque). As células são incubadas a 37°C por 30 minutos em um ambiente umidificado. Os poços são lavados 3 vezes com PBS(+Ca,Mg) + 0,5% BSA. São adicionados 20μL de ExtrAvidina-Fosfatase Alcalina (diluição 1:5.000, referida aqui como diluição de trabalho) a cada poço e incubados a 37°C por 30 minutos. Os poços são lavados três vezes com PBS(+Ca,Mg) + 0,5% BSA. Dissolva um comprimido de fosfato de p-nitrofenol pNPP em 5 mL de tampão glicina (pH 10,4). 100 μL de substrato de pNPP em tampão de glicina são adicionados a cada poço de teste. Os poços padrão em triplicata são preparados da diluição de trabalho de ExtrAvidina-Fosfatase alcalina em tampão glicina: 1:5.000 (10°) > 10~°'5 > 10"1 > 10"1'5. 5 pL de cada diluição são adicionados aos poços em triplicata e o teor de AP resultante em cada poço é de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. 100 μL de reagente pNNP devem ser adicionados a cada um dos poços padrão. A placa é incubada a 37°C por 4 horas. Um volume de 50 pL de 3M NaOH é adicionado a todos os poços. A placa é lida em um leitor de placa a 405 nm usando a opção de subtração de base nos poços vazios enchidos apenas com tampão de glicina. Adicionalmente, o gabarito é ajustado para indicar a concentração do conjugado de AP em cada poço padrão [5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng], Os resultados são indicados como quantidade de conjugado de AP ligado em cada amostra.

EXEMPLO 39: Ensaio de proliferação de células endoteliais em Alamar Blue

Esse ensaio pode ser empregado para determinar quantitativamente a inibição mediada por proteína da proliferação induzida de bFGF de células endoteliais linfáticas bovinas (LECs), células endoteliais aórticas bovinas (BAECs) ou células miometriais uterinas microvasculares humanas (UTMECs). Esse ensaio incorpora um indicador de crescimento fluormétrico com Bse na detecção da atividade metabólica. Um Ensaio de Proliferação Alamar Blue padrão é preparado por EGM-2MV com 10 ng/mL de bFGF adicionado como uma fonte de estimulação celular endotelial. Esse ensaio pode ser usado com uma variedade de células endoteliais com leves alterações no meio de crescimento e concentração celular. As diluições de bateladas de proteína a serem testadas são diluídas conforme apropriado. Meio isento de soro (GIBVO SFM) sem bFGF é usado como um controle não estimulado e Angioestatina ou TSP-1 é incluído como um controle inibidor conhecido.

Em resumo, LEC, BAECs ou UTMECs são semeados em meios de crescimento a uma densidade de 5.000 a 2.000 células/poço em uma placa de 96 poços e colocadas a 37°C por toda a noite. Após a incubação por toda a noite das células, os meios de crescimento são removidos e substituídos por GIBCOEC-SFM. As células são tratadas com diluições apropriadas de uma proteína de fusão da albumina da invenção ou amostra(s) da proteína de controle (preparadas em SFM) em poços em triplicata com bFGF adicional a uma concentração de 10 ng/mL. Uma vez que as células foram tratadas com as amostras, a(s) placa(s) é/são colocadas de volta no incubador a 37°C por três dias. Após três dias, 10 mL de estoque alamar blue [(Biosource Cat. número DAL1100) são adicionados a cada poço e a(s) placa(s) é/são colocadas no incubador a 37°C por quatro horas. A(s) placa(s) é/são então lida(s) a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão usando o leitor de fluorescência CytoFIuor. A saída direta é registrada em unidades de fluorescência relativa.

Alamar Blue é um indicador de redução de oxidação que ambos fluoresce e altera a cor em resposta à redução química do meio de crescimento resultante do crescimento celular. Conforme células crescem na cultura, a atividade metabólica inata resulta em uma redução química do meio ambiente circundante imediato. A redução relacionada ao crescimento faz com que o indicador altere da forma oxidada (azul não fluorescente) para a forma reduzida (vermelho fluorescente) (isto é, proliferação estimulada produzirá um sinal mais forte e a proliferação inibida produzirá um sinal mais fraco e o sinal total é proporcional ao número total de células, bem como sua atividade metabólica). O nível de base da atividade é observado com o meio de não alimentação sozinho. Isso é comparado à saída observada das amostras de controle positivo (bFGF no meio de crescimento) e diluições da proteína.

EXEMPLO 40: Detecção da inibicão de uma reação de linfócito misturada

Esse ensaio pode ser usado de modo a detectar e avaliar a inibição de uma reação de linfócito mista (MLR) pelas proteínas de fusão da invenção. Inibição de MLR pode se dever a um efeito direto na proliferação e viabilidade celular, modulação de moléculas co-estimuladoras ou células de interação, modulação da adesividade entre os linfócitos e células acessórias ou modulação de produção de citocina para células acessórias. Múltiplas células podem ser alvejadas pelas proteínas de fusão da albumina que inibem MLR uma vez que a fração mononuclear de sangue periférico empregada nesse ensaio inclui linfócitos exterminadores Τ, B e naturais, bem como os monócitos e células dendríticas.

Foi verificado que as proteínas de fusão da albumina da invenção que inibem MLR podem encontrar aplicação nas doenças associadas à ativação de linfócito e monócito ou proliferação. Essas incluem, porém, não se limitam as doenças, tais como, asma, artrite, diabetes, doenças inflamatórias de pele, psoríase, eczema, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, glomerulonefrite, doença dos intestinos inflamados, doença de Crohn, colite ulcerativa, colite, arteriosclerose, cirrose, doença de enxerto versus hospedeiro, doença de hospedeiro versus enxerto, hepatite, leucemia e linfoma.

Em resumo, PBMCs de doadores humanos são purificados por centrifugação de gradiente de densidade usando Meio de Separação de Linfócito (LSM®, densidade de 1.0770 g/mL, Organon Teknika Corporation, West Chester, PA). PBMCs de dois doadores são ajustados para 2 χ 106 células/mL em RPMI-1640 (Life Technologies, Grand Island1 NY) suplementado com 10% FCS e 2 mM de glutamína. PBMCs de um terceiro doador são ajustados para 2 χ 105 células/mL. Cinqüenta microlitros de PBMCs de cada doador são adicionados aos poços de uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços. As diluições do material de teste da proteína de fusão (50 pL) são adicionadas em triplicata aos poços de microtitulação. As amostras de teste (da proteína de interesse) são adicionadas para diluição final de 1:4; rhulL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, número de catálogo 202-IL) é adicionado a uma concentração final de 1 pg/mL; anti-CD4 mAb (R&D Systems, clone 34930.11, número de catálogo MAB379) é adicionado a uma concentração final de 10 pg/mL. As células são cultivadas por 7-8 dias a 37°C em 5% de CO2 e 1 μC de [3Hjtimidina é adicionado aos poços pela últimas 16 horas da cultura. As células são cultivadas e a incorporação da timidina determinada por emprego de um Packard TopCount. O dado é expresso como a média e o desvio padrão de determinações em triplicata.

As amostras da proteína de fusão de interesse são classificadas em experimentos de separação e comparadas ao tratamento de controle negativo, anti-CD4 mAb, que inibe a proliferação dos linfócitos e o tratamento de controle positivo, IL-2 (tanto como material recombinante quanto sobrenadante), que melhora a proliferação dos linfócitos.

EXEMPLO 41: Ensaios para Atividade da Protease

O ensaio que se segue pode ser usado para avaliar a atividade da protease de uma proteína de fusão da albumina da invenção.

A zincografia da gelatina e da caseína é realizada essencialmente conforme

descrito

(Heusen e outros, Anal. Biochem., 102:196-202 (1980); Wilson e outros, Journal of Urology, 149:653-658 (1993)). As amostras são operadas em 10% poliacrilamida/0,1% géis de SDS contendo 1% de gelatina ou caseína, encharcadas em 2,5% triton a temperatura ambiente por 1 hora e em 0,1 M glicina, pH 8,3 a 37°C por 5 a 16 horas. Após coloração em amido, as áreas negras da proteólise aparecem como áreas claras contra o fundo preto azulado. A tripsina (Sigma T8642) é usada como um controle positivo.

A atividade da protease é também determinada por monitoramento da clivagem de éster n-a-benzoil-L-arginina etílico (BAEE) (Sigma B-4500). As reações são ajustadas em 25 mM NaPO4, 1 mM EDTA e 1 mM BAEE), pH 7,5. As amostras são adicionadas e a alteração na absorvância em 260 nm é monitorada no espectrofotômetro Beckman DU-6 no modo de acionamento por tempo. A tripsina é empregada como um controle positivo.

Ensaios adicionais com base na liberação dos peptídeos solúveis em ácido da caseína ou hemoglobina medidos como absorvência em 280 nm ou colorimetricamente usando o método de Folina são realizados conforme descrito em Bergmeyer, e outros, Methods of Enzymatic Analysis, 5 (1984). Outros ensaios envolvem a solubilização de substratos cromogênicos (Ward, Applied Science, 251-317 (1983)).

EXEMPLO 42: Identificação da especificidade do substrato de serina protease

Os métodos conhecidos na arte ou descritos aqui podem ser empregados para determinar a especificidade do substrato das proteínas de fusão da albumina da presente invenção possuindo atividade de serina protease. Um método preferido de determinação da especificidade do substrato é por emprego das bibliotecas de combinação sintética de varredura posicionai conforme descrito na GB 2324 529 (incorporada aqui em sua totalidade).

EXEMPLO 43: Ensaios de união de lipante

O ensaio que se segue pode ser empregado para avaliar a atividade de união do ligante de uma proteína de fusão da albumina da invenção.

Os ensaios de união de Iigante obtêm um método direto para determinar a farmacologia do receptor e são adaptáveis a um formato de rendimento alto. O ligante purificado para uma proteína de fusão da albumina da invenção é radiomarcado para atividade específica alta (50-2.000 Cí/mmol) para estudos de ligação. É realizada determinação de que o processo de radiomarcação não diminui a atividade do ligante na direção da proteína de fusão. As condições de ensaio para tampões, íons, pH e outros moduladores, tais como, nucleotídeos são otimizadas para estabelecerem um sinal que pode ser trabalhado para razão de ruído para ambas a membrana e fontes de polipeptídeo de célula integral. Para esses ensaios, a ligação de polipeptídeo específica é definida como radioatividade associada total menos a radioatividade medida na presença de um excesso de Iigante de competição não marcado. Quando possível, mais de um Iigante de competição é empregado para definir a ligação não específica residual.

EXEMPLO 44: Ensaio funcional em oócitos Xenoous

Transcritos de RNA capeado de gabaritos de plasmídeo linearizado codificando uma protéina de fusão da albumina da invenção são sintetizados in vitro com RNA polimerases de acordo com procedimentos padrão. Os transcritos in vitro são suspensos em água a uma concentração final de 0,2 mg/mL. Os lóbulos ovarianos são removidos de todas fêmeas adultas, os oócitos desfoliculados de estágio V são obtidos e transcritos de RNA (10 ng/oócito) são injetados em um bolo de 50 mL usando um aparelho de microinjeção. Dois grampos de tensão de eletrodo são usados para medir as correntes de oócitos Xenopus individuais, em resposta a exposição à proteína de fusão e agonista de polipeptídeo. Os registros são feitos em meio Barth isento de Ca2+ a temperatura ambiente. O sistema Xenopus pode ser usado para avaliar ligantes conhecidos e extratos de tecido/célula quanto aos ligantes de ativação.

EXEMPLO 45: Ensaios microfisiométricos

A ativação de uma ampla variedade de sistemas mensageiros secundários resulta na extrusão de pequenas quantidades de ácido de uma célula. O ácido formado é aumentado como resultado do aumento da atividade metabólica necessária como combustível no processo de sinalização intracelular. As variações de pH nos meios circundando a célula são muito pequenas, porém são detectáveis pelo microfisiômetro CYTOSENSOR (Molecular Devices Ltd., Menlo Park1 Calif.). O CYTOSENSOR é assim capaz de detector a capacidade de uma proteína de fusão da albumina da invenção de ativar mensageiros secundários que são acoplados a uma via de sinalização intracelular

usando energia.

EXEMPLO 46: Classificação de sobrenadante de extrato/célula

Existe um grande número de receptor de mamífero para os quais não existe, ainda, Iigante de ativação cognato (agonista). Assim, os Iigantes ativos para esses receptores podem não estar incluídos nos bancos de ligantes identificados até hoje. Conseqüentemente, as proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser funcionalmente avaliadas (usando cálcio, AMPc, microfisiômetro, eletrofisíologia de óocito, etc. classificações funcionais) contra extratos de tecido para identificar ligantes naturais para a porção da proteína Terapêutica e/ou proteína da albumina de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Os extratos que produzem respostas funcionais positivas podem ser seqüencialmente subfracionados até um Iigante de ativação ser isolado e identificado.

EXEMPLO 47: Ensaio de ligação de ATP

O ensaio que se segue pode ser empregado para avaliar a atividade de ligação de ATP das proteínas de fusão da invenção.

A atividade de ligação de ATP de uma proteína de fusão da albumina da invenção pode ser detectada empregando o ensaio de ligação de ATP descrito na Patente US número 5.858.719, que é incorporado aqui como referência em sua totalidade. Em resumo, a ligação de ATP a uma proteína de fusão da albumina da presente invenção é medida através da marcação de fotoafinidade com 8-azido-ATP em um ensaio de competição. As misturas de reação contendo 1 mg/mL de proteína de transporte ABC são incubadas com concentrações variadas de ATP ou do análogo de ATP não hidrolisável adenil-5'-imidodifosfato por 10 minutos a 4°C. Uma mistura de 8-azido-ATP (Sigma Chem. Corp., St. Louis, MO.) mais 8-azido-ATP (32P-ATP) (5 mCi/pmol, ICN, Irvine CA.) é adicionada a uma concentração final de 100 μΜ e alíquotas de 0,5 mL são colocadas nos poços de uma placa de mancha de porcelana sobre gelo. A placa é irradiada usando uma lâmpada UV de ondas curtas 254 nm a uma distância de 2,5 cm da placa por dois intervalos de um minuto com um intervalo de resfriamento de um minuto. A reação é parada por adição de ditiotreitol a uma concentração final de 2 mM. As incubações são submetidas à eletroforese de SDS-PAGE, secas e autoradiografadas. As faixas de proteína correspondendo às proteínas de fusão da albumina da invenção são excísadas e a radioatividade quantificada. Uma diminuição na radioatividade com aumento de ATP ou adenil-5'-imidodifofato obtém uma medida de afinidade ATP para a proteína de fusão.

EXEMPLO 48: Identificação das proteínas de transdução de sinal aue interagem com uma proteína de fusão da albumina da presente invenção.

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem servir como ferramentas de pesquisa para a identificação, caracterização e purificação das proteínas da via de transdução de sinal ou proteínas receptoras. Em resumo, uma proteína de fusão marcada da invenção é útil como um reagente para a purificação das moléculas com as quais interage. Em um modalidade de purificação por afinidade, uma proteína de fusão da albumina da invenção é covalentemente acoplada a uma coluna de cromatografia. O extrato isento de célula derivado das células alvo putativas, tais como, tecidos de carcinoma, é passado sobre a coluna e as molécula com afinidade apropriada se ligam á proteína de fusão da albumina. O complexo de proteína é recuperado da coluna, dissociado e a molécula recuperada submetida ao seqüenciamento da proteína de término N. Essa seqüência de aminoácido é então empregada para identificar a molécula capturada ou projetar as ondas de oligonucleotídeo degenerado para clonagem do gene relevante de uma biblioteca de DNAc apropriado.

EXEMPLO 49: Bioensaio de IL-6

Uma variedade de ensaios é conhecida na técnica para testar os efeitos proliferativos de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Por exemplo, um desses ensaios é o Bioensaio de IL-6 conforme descrito por Marz e outros (Proc. Natl. Acad. Sei, U.S.A., 95:3251-56 (1998), que é incorporado aqui como referência). Após 68 horas a 37°C, o número de células viáveis é medido por adição de tiazolil blue sal de tetrazólio (MTT) e incubação por mais 4 horas a 37°C. As células B9 são lisadas por SDS e a densidade óptica é medida a 570 nm. Os controles contendo IL-6 (positivo) e nenhuma citocina (negativo) são em resumo, células de murino B9 dependente de IL-6 que são lavadas três vezes em meio livre IL-6 e colocadas em placas a uma concentração de 5.000 células por poço em 50 pL e 50 pL de proteína de fusão da invenção são adicionadas. A proliferação melhorada na(s) amostra(s) de teste (contendo uma proteína de fusão da albumina da invenção) em relação ao controle negativo é indicativa dos efeitos proliferativos mediados pela proteína de fusão.

EXEMPLO 50: Suporte da sobrevivência neuronal no embrião de patinha

De modo a testar se a viabilidade da célula neuronal simpática é suportada por uma proteína de fusão da albumina da invenção, o ensaio de sobrevivência neuronal de embrião de galinha de Senaldi e outros pode ser utilizado (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96:11458-63 (1998), o qual é incorporado aqui como referência). Em resumo, os neurônios motores e simpáticos são isolados de embriões de galinha, ressuspensos em meio L15 (com 10% FCS, glicose, selenita e sódio, progesterona, conalbumina, putrescina e insulina: Life Technologies, Rockville, MD.) e meio Eagles modificado da Dulbecco [com 10% FCS, glutamina, penicilína e 25 mM de tampão Hepes (pH 7,2); Life Technologies, Rockville, MD.], respectivamente e incubados a 37°C em 5% CO2 na presença de concentrações diferentes da proteína de fusão purificada da invenção, bem como uma falta de controle negativo de qualquer citocina. Após 3 dias, a sobrevivência neuronal é determinada por avaliação da morfologia celular e através do uso do ensaio colorimétrico de Mosmann (Mosmann, T., J. Immunoi. Methods, 65:55-63 (1983)). A viabilidade da célula neuronal melhorada quando comparado aos controles isentos de citocina é indicativa da capacidade da proteína de fusão da albumina de melhorar a sobrevivência das células neuronais.

EXEMPLO 51: Ensaio para atividade da fosfatase

O ensaio que se segue pode ser empregado para avaliar a atividade da serina/treonina fosfatase (PTPase) de uma proteína de fusão da albumina da invenção.

De modo a ensaiar a atividade da serina/treonina fosfatase (PTPase) podem ser utilizados os ensaios que são amplamente conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, a atividade da serina/treonina fosfatase (PASPase) da invenção pode ser medida usando um kit de ensaio PSPase da New England Biolabs, Inc. Proteína básica de mielona (MyBP)1 um substrato para PSPase é fosforilada nos resíduos de serina e treonina com proteínocinase dependente de AMPc na presença de [32P]ATP. A atividade da proteína serina/treonina fosfatase é então determinada por medição da liberação de fosfatase inorgânica de MyBP marcada com 32P.

EXEMPLO 52: Interação de serina/treonina fosfatases com outras proteínas

Proteínas de fusão da invenção possuindo atividade de serina/treonina fosfatase (por exemplo, conforme determinado no Exemplo 51) são úteis, por exemplo, como ferramentas de pesquisa para a identificação, caracterização e purificação de proteínas de interação adicionais ou proteínas receptores ou outras proteína de via de transdução de sinal. Em resumo, uma proteína de fusão marcada da invenção é útil como reagente para a purificação das moléculas com as quais interage. Em uma modalidade de purificação por afinidade, a proteína de fusão da albumina da invenção é acoplada covalentemente a uma coluna de cromatografia. O extrato isento de célula derivado de células alvo putativas, ais como, células neurais ou do fígado, é passado pela coluna e as moléculas com afinidade apropriada se ligam à proteína de fusão. O complexo de proteína de fusão é registrado da coluna, dissociado e a molécula recuperada submetida ao seqüenciamento da proteína de término N. Essa seqüência de aminoácido é então usada para identificar a molécula capturada ou projetar sondas de oligonucleotídeo degenerado para clonagem do gene relevante de uma biblioteca de DNAc apropriada.

EXEMPLO 53: Ensaio quanto à atividade de Heparanase

Existem vários ensaios conhecidos na técnica que podem ser empregados para ensaiar a atividade da heparanase de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Em um exemplo, a atividade da heparanase de uma proteína de fusão da albumina da invenção, é ensaiada conforme descrito por Vlodavsky e outros, (Vlodavsky e outros, Nat. Med., 5:793-802 (1999)). Em resumo, Iisados de célula, meios condicionados, células intactas ( 1 χ 106 células por placa de 35 mm) , sobrenadantes de cultura de célula u proteína de fusão purificada são incubados por 18 horas a 37°C, pH 6,2-6,6, com EMC marcado com 35S ou ECM solúvel derivado de proteoglicanos de máxima I. O meio de incubação é centrifugado e o sobrenadante é analisado por filtração com gel em uma coluna Sepharose CL-6B (0,9 x 30 cm). As frações são eluídas com PBS e sua radioatividade é medida. Os fragmentos de degradação das cadeias laterais de sulfato de heparano são eluídos de Sepharose 6B em 0,5 < Kav < 0,8 (máxima II). Cada experimento é realizado pelo menos três vezes. Os fragmentos correspondentes à "máxima II" são descritos por Vlodavsky e outros, sendo indicativos da atividade de uma proteína de fusão da albumina da invenção na clivagem de sulfato de heparano.

EXEMPLO 54: !mobilização das biomoléculas Esse exemplo prove um método para a estabilização de uma proteína de fusão da albumina da invenção nas construções de bicamada de lipídeo de célula não hospedeira (vide, por exemplo, Bieri e outros, Nature Biotech 17:1105-1108 (1999), incorporado aqui como referência em sua totalidade) que pode ser adaptado para o estudo das proteínas de fusão da invenção nos vários ensaios funcionais descritos acima. Em resumo, a química específica do carboidrato para biotinilação é empregada para confinar um marcador de biotina a uma proteína de fusão da albumina da invenção, permitindo assim orientação uniforme mediante imobilização. Uma solução de 50 uM de uma proteína de fusão da albumina da invenção nas membranas lavadas é incubada com 20 mM de NaIO4 e 1,5 mg/mL (4 mM) de BACH ou 2 ng/mL (7,5 mM) de hidrazido de biotina por 1 hora a temperatura ambiente (volume de reação, 150 μL). Então a amostra é dialisada (Pierce Slidealizer Cassett, 10 kDa corte; Pierce Chemical Co., Rockford IL) a 4°C primeiro por 5 horas, trocando o tampão após cada hora e finalmente por 12 horas contra 500 mL de tampão R (0,15 M NaCI, 1 mM MgCI2, 10 mM de fosfato de sódio, pH 7). Imediatamente antes da adição em uma cuveta, a amostra é diluída 1:5 em tampão ROGõO (Tampão R suplementado com 50 mM de octilgiosídeo).

EXEMPLO 55: Ensaios quanto à atividade da metaloproteinase As metaloproteinases são hidrolases peptídicas que utilizam íons de metal, tais como, Zn2+ como o mecanismo catalítico. A atividade de metaloproteinase de uma proteína de fusão da albumina da presente invenção pode ser ensaiada de acordo com métodos conhecidos na arte. Os métodos exemplares que se seguem são providos: Proteólise de alfa-2-macroglobulina

De modo a confirmar a atividade da protease, uma proteína de fusão purificada da invenção é misturada com um substrato alfa-2-macroglobulina (0,2 unidade/mL, Boehringer Mannheim, Alemanha) em 1 χ tampão de ensaio (50 mM HEPES, pH 7,5, 0,2 M de NaCL, 10 mM de CaCl2, 25 μΜ de ZnCI2 e 0,05% Brij-35) é incubada a 37°C por 1-5 dias. A tripsina é usada como controle positivo. Os controles negativos contêm apenas alfa-2-macroglobulina no tampão de ensaio. As amostras são coletadas e fervidas no tampão de amostra SDS-PAGE contendo 5% de 2-mercaptoetanol por 5 minutos, então carregadas em 8% SDS-gel de poliacrilamida. Após a eletroforese as proteínas são visualizadas por coloração prata. A proteólise é evidente pelo aparecimento de faixas de peso molecular mais baixas, quando comparado ao controle negativo.

Inibição da proteólise de alfa-2-macroglobulina por inibidores de metaloproteinases Inibidores de metaloproteinase conhecidos (quelantes de metal (EDTA, EGTA e 35 HgCl2), inibidores de metaloproteinase de peptídeo (TIMP-1 e TIMP-2) e inibidores de MMP de molécula pequena comerciais) podem também ser usados para caracterizar a atividade proteolítica de uma proteína de fusão da albumina da invenção. Três inibidores sintéticos de MMP que podem ser usados são: Inibidor I de MMP1 [IC50 = 1,0 μΜ contra MMP-1 e MMP-8; IC50 = 30 μΜ contra MMP-9; IC50 = 150 μΜ contra MMP-3]; inibidor I de MMP-3 (estromelisina-1) [IC50 = 5 μΜ contra MMP-3] e inibidor Il de MMP-3 [Ki = 130 nM contra MMP-3]; inibidores disponíveis na Calbiochem1 número do catálogo 444250, 444218 e 444225, respectivamente). Em resumo, concentrações diferentes de inibidores de MMP de molécula pequena são misturados com uma proteína de fusão purificada da invenção (50 pg/mL) em 22,98 μL de tampão HEPES 1 χ (50 mM de HEPES, pH 7,5, 0,2 M NaCI, 10 mM de CaCl2, 25 μΜ de ZnCI2 e 0,05% Brij-35) e temperatura ambiente incubada (24°C) por 2 horas, então 7,1 μL de substrato alfa-2-macroglobulina (0,2 unidade/mL) são adicionados e incubados a 37°C por 20 horas. As reações são paradas por adição de tampão de amostra 4 χ e fervidas imediatamente por 5 minutos. Após SDS-PAGE, as faixas de proteína são visualizadas por coloração prata.

Ensaio de clivagem de substratos de peptídeo fluorgênicos sintéticos A especificidade do substrato para proteínas de fusão da invenção com atividade da metaloproteinase demonstrada pode ser determinada por uso de técnicas conhecidas na arte, tais como, empregando substratos de peptídeo fluorgênico sintético (adquiridos na BACHEM Bioscience lnc). Os substratos de teste incluem, M-1985, M-2225, M-2105, M-2110 e M-2255. Os primeiros quatro são substratos MMP e o último é um substrato da enzima de conversão (TACE) de fator alfa de necrose de tumor (TNF-α). Esses substratos são preferivelmente preparados em sulfóxido de dimetila 1:1 (DMSO) e água. As soluções de estoque são de 50-500 μΜ. Os ensaios fluorescentes são realizados por emprego de espectrômetro de luminescência Perkin Elmer LS 50B equipado com um banho de água de temperatura constante. A excitação λ é de 328 nm e a emissão λ é de 393 nm. Em resumo, o ensaio é realizado por incubação a 176 pL de 1 χ de tampão HEPES (0,2 M NaCI1 10 mM CaCI2, 0,05% Brij-35 e 50 mM HEPES, pH 7,5) com 4 μL de solução de substrato (50 μΜ) a 25°C por 15 minutos e então adição de 20 μL de uma proteína de fusão purificada da invenção na cuveta de ensaio. A concentração final do substrato é de 1 μΜ. As taxas de hidrólise inicial são monitoradas por 30 minutos.

EXEMPLO 56: Ocorrência do diabetes em camundongos NOD

Camundongos NOD fêmea (diabéticos não obesos) são caracterizados por mostra de IDDM com um curso que é semelhante aquele encontrado nos seres humanos, embora a doença seja mais pronunciada em fêmeas que em camundongos NOD machos. Doravante, a menos que de outra forma declarado, o termo "camundongo NOD" se refere a um camundongo NOD fêmea. Os camundongos NOD possuem uma destruição progressiva das células beta que é causada por uma doença auto-imune crônica. Assim, os camundongos NOD começam a vida com euglicemia ou níveis de glicose normais no sangue. Com cerca de 15 a 16 semanas de idade, contudo, os camundongos NOD se tornam hiperglicêmicos, indicando a destruição da maior parte de suas células beta pancreáticas e a incapacidade correspondente do pâncreas para produzir insulina suficiente. Assim, ambas a causa e progressão da doença são semelhante a dos pacientes com IDDM humanos.

Ensaios in vivo da eficácia dos regimes de imunização podem ser avaliados em camundongos fêmea NOD/LtJ (comercialmente disponíveis no [The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.). Na literatura, é reportado que 80% dos camundongos fêmea desenvolvem diabetes com 24 semanas de idade e início da insulite começa entre 6-8 semanas de idade. Os camundongos NOD são congênitos e altamente sensíveis a uma variedade de estratégias imunoreguladoras. Os camundongos NOD adultos (6-8 semanas de idade) possuem uma massa média de 20-25 g.

Esses camundongos podem ser tanto não tratados (controle), tratados com a terapêutica da presente invenção (por exemplo, proteínas de fusão da albumina da invenção e seus fragmentos e variantes), sozinha ou em combinação com outros compostos terapêuticos listados acima. O efeito desses vários tratamentos na progressão do diabetes pode ser medida como se segue:

Com 14 semanas de idade os camundongos NOD fêmea podem ser fenotipados de acordo com a tolerância à glicose. A tolerância à glicose pode ser medida com teste de tolerância à glicose interaperitoneal (IPGTT). Em resumo, o sangue é drenado do plexo paraorbital em O minuto e 60 minutos após a injeção intraperitoneal de glicose (1g/kg peso corpóreo). A tolerância normal é definida com glicose no plasma em 0 minutos de menos de 144 mg% ou em 60 minutos de menos de 160 mg%. Os níveis de glicose no sangue são determinados com um aparelho Glucometer Elite.

Com base na análise fenotípica, os animais podem ser alocados em diferentes grupos experimentais. Especificamente, os animais com níveis de glicose no sangue mais elevados podem ser cedidos ao grupo de tolerância à glicose prejudicada. Os camundongos podem ser alimentados a vontade e podem receber água acidificada (pH 2,3).

Os camundongos tolerantes e não tolerantes à glicose podem ser adicionalmente subdivididos em grupos de controle, proteínas de fusão da albumina da presente invenção e de combinação de proteína de fusão da albumina/compostos terapêuticos. Os camundongos no grupo de controle podem receber uma injeção intraperitoneal de veículo diariamente, seis vezes por semana. Os camundongos no grupo de fusão da albumina podem receber uma injeção intraperitoneal das substâncias terapêuticas da presente invenção (por exemplo, proteínas de fusão da albumina da invenção e seus fragmentos e variantes) no veiculo diariamente, seis vezes por semana. Os camundongos no grupo de combinação de proteínas de fusão da albumina/compostos terapêuticos podem receber as proteínas de fusão da albumina e combinações dos compostos terapêuticos conforme descrito acima.

O nível de glicose na urina nos camundongos NOD pode ser determinado em uma base bissemanal empregando Labstix (Bayer Diagnostícs, Hampshire, Inglaterra). Peso e a ingestão de fluido podem também ser determinados em uma base bissemanal. O início do diabetes é definido após o aparecimento da glicosuria em duas determinações consecutivas. Após 10 semanas de tratamento, um IPGTT adicional pode ser realizado e os animais

podem ser sacrificados no dia seguinte.

No curso de 10 semanas de tratamento, os animais de controle nos grupos tolerantes a glicose e não tolerantes a glicose desenvolvem diabetes em uma taxa de 60% e 86%, respectivamente (vide Patente US número 5.866.546, Gross e outros). Assim, altas taxas de diabetes ocorrem mesmo nos camundongos NOD que são inicialmente tolerantes a glicose se nenhuma intervenção for feita.

Os resultados podem ser confirmados por medição dos níveis de glicose no sangue nos camundongos NOD, antes e após tratamento. Os níveis de glicose no sangue são medidos conforme descrito acima em ambos camundongos tolerantes a glicose e não tolerantes a glicose em todos os grupos descritos.

Em uma modalidade alternativa, as terapêuticas da presente invenção (por exemplo, fusões específicas descritas como SEQ ID NO: Y e seus fragmentos e variantes) podem ser quantificadas usando análise espectrométrica e quantidades de proteína apropriadas podem ser ressuspensas antes da injeção em 500 pL de salmoura de fosfato tamponada (PBS) por dose. Duas injeções, com uma semana de diferença, podem ser administradas subcutaneamente sob a pele dorsal de cada camundongo. O monitoramento pode ser realizado em duas ocasiões separadas antes da imunização e podem ser realizadas semanalmente através de todo o tratamento e continuado após isso. A urina pode ser testada por glicose a cada semana (Keto-Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, 111.) e os camundongos glicosúricos podem ser verificados quanto a glicose no soro (ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). O diabetes é diagnosticado quando da glicemia em jejum for superior a 2,5 g/L.

EXEMPLO 57: Exame histolóaico dos camundongos NOD

O exame histológico das amostras de tecido dos camundongos NOD pode demonstrar a capacidade das composições da presente invenção e/ou uma combinação das composições da presente invenção com outros agentes terapêuticos de aumentar a concentração relativa das células beta no pâncreas. O método experimental é como se segue:

Os camundongos do Exemplo 56 podem ser sacrificados ao final do período de tratamento e as amostras de tecido podem ser tomadas do pâncreas. As amostras podem ser fixadas em 10% formalina em 0,9% salmoura e embebidas em cera. Dois conjuntos de 5 séries de seções de 5 pm podem ser cortados para imunomarcação em um intervalo de corte de 150 pm. As seções podem ser imunomarcadas quanto a insulina (antisoros de anti- insulina de porquinho da índia 1:1.000, ICN Thames Reino Unido) e glucagon (antisoros de glucacon anti-pancreático de coelho diluição 1:2.000) e detectadas com peroxidase conjugada anti-porquinho da índia (Dako, High Wycombe, Reino Unido) ou antisoros de anti-colho conjugados com peroxidase (diluição 1:50, Dako).

A composição da presente invenção pode ou não ter um efeito tão forte na massa visível das células beta, como acontece nas manifestações clínicas do diabetes em animais tolerantes e não tolerantes a glicose.

EXEMPLO 58: Modelo em camundongo in vivo de NIDDM

Camundongos machos C57BL/6J da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) podem ser obtidos com 3 semanas de idade e alimentados com ração convencional ou dietas enriquecidas tanto em gordura (35,5% peso/peso; Bioserv.Frenchtown, NJ) ou frutose (60% peso/peso; Harlan Teklad, Madison, Wl). A ração normal é composta de 4,5% peso/peso de gordura, 23% peso/peso de proteína, 31,9% peso/peso de amido, 3,7% peso/peso de frutose e 5,3% peso/peso de fibra. A dieta com alto teor de gordura é composta de 35,5% peso/peso de gordura, 20% peso/peso de proteína, 36,4% peso/peso de amido, 0,0% peso/peso de frutose e 0,1% peso/peso de fibra. A dieta composta com alto teor de frutose é composta de 5% peso/peso de gordura, 20% peso/peso de proteína, 0,0% peso/peso de amido, 60% peso/peso de frutose e 9,4% peso/peso de fibra. Os camundongos podem ser alojados em não mais de cinco por gaiola a 22°C +/- 3°C de temperatura e em ambiente de umidade controlada de 50% +/-20% com ciclo de 12 horas de luz (6 da manhã as 6 da noite)/de escuro (Luo e outros, 1998, Metabolism 47(6): 663-8, "Nongenetic camundongo models of non-insulin-dependent diabetes melito"; Larsen e outros, Diabetes 50(11): 2530-9 (2001), "Systemic administration of the long-acting GLP-I derivative NN2211 induces Iasting and reversible weight Ioss in both normal and obese rats"). Após exposição às respectivas dietas por 3 semanas, os camundongos podem receber injeção intraperitoneal tanto com estreptozotocina, "STZ" (Sigma, St. Louis, MO)5 a 100 mg/kg de peso corpóreo ou veículo (0,05 mol/L de ácido cítrico, pH 4,5) e mantidos na mesma dieta pelas próximas 4 semanas. Sob condições diferentes do jejum, o sangue é obtido 1, 2 e 4 semanas após STZ por penetração da parte distai da cauda. As amostras são usadas para medir a glicose no plasma e concentrações de insulina com ingestão de alimentos. O peso corpóreo e ingestão de alimentos são registrados semanalmente.

De modo a determinar diretamente o efeito da dieta com alto teor de gordura na capacidade da insulina de estimular o descarte da glicose, os experimentos podem ser iniciados em três grupos de camundongos, alimentados com gordura, alimentados com ração e recebendo veiculo injetável e alimentados com ração e recebendo STZ injetável ao final do período de 7 semanas descrito acima. Os camundongos podem jejuar por 4 horas antes dos experimentos. Na primeira série de experimentos, os camundongos podem ser anestesiados com inalação de metoxiflurano (Pitman-Moor, Mundelein, IL). Insulina regular (Sigma) pode ser injetada intravenosamente ([IV] 0,1 U/kg de peso corpóreo) através da veia da cauda e o sangue pode ser coletado 3, 6, 9, 12 e 15 minutos após injeção de uma veia da cauda diferente. As concentrações de glicose no plasma podem ser determinadas nessas amostras e a meia vida (tn/2) de desaparecimento da glicose do plasma pode ser calculada usando WinNonlin (Scientific Consulting, Apex, NC), um programa de software farmacocinético/farmacodinâmico.

Na segunda série de experimentos, os camundongos podem ser anestesiados com pentobarbital sódio intraperitoneal (Sigma). A cavidade abdominal é aberta e a veia abdominal principal é exposta e cateterizada com um cateter IV calibre 24 (Johnson-Johnson Medicai, Arlington, TX). O cateter é preso ao tecido muscular adjacente à veia abdominal, cortado no fundo da conexão da seringa e içado a um tubo de plástico pré-enchido PE50, que por sua vez é conectado a uma seringa com solução de infusão. A cavidade abdominal é então fechada por sutura. Com essa abordagem, não haveria bloqueio de retorno de fluxo do sangue da parte inferior do corpo. Os camundongos podem receber infusão com glicose continuamente (24,1 mg/kg/min) e insulina (10 mU/kg/min) em um volume de infusão de 10 μL/minuto. Amostras de sangue retro-orbitais (70 uL cada) podem ser tomadas 90, 105, 120 e 135 minutos após o início da infusão por medição da glicose no plasma e concentrações de insulina. A média dessas quatro amostras é usada para estimar a glicose no plasma em estado firme (SSPG) e concentrações de insulina no

estado firme (SSPI) para cada animal.

Finalmente, os experimentos para avaliar a capacidade da proteína de fusão da albuminas, das composições terapêuticas do presente pedido, tanto sozinhas quanto em combinação com qualquer um ou mais medicamentos terapêuticos listados para o tratamento de diabetes melito, para diminuir a glicose no plasma podem ser realizados nos dois grupos que se seguem de modelos de camundongo "NIDDM" que são injetados com STZ: (1) C57BL/6J alimentado com gordura e (2) C57BL/6J alimentado com frutose. As concentrações de glicose no plasma desses camundongos para esses estudos podem variar de 255 a 555 mg/dL. Os camundongos são escolhidos aleatoriamente para tratamento com cada veículo, terapêuticas de fusão da albumina da presente invenção tanto sozinhas quanto em combinação com qualquer um ou mais dos medicamentos terapêuticos listados para o tratamento do diabetes melito. Um total de três doses podem ser administradas. Amostras de sangue da veia da cauda podem ser retiradas para medição da concentração da glicose no plasma antes da primeira dose e 3 horas após a dose final.

As concentrações de glicose no plasma podem ser determinadas empregando o Kit de Diagnóstico de Glicose da Sigma (Sigma Número 315), um ensaio colorimétrico da enzima. Os níveis de insulina no plasma podem ser determinados empregando o kit RIA de 338

insulina de rato da Linco Research (número RI-13K; St. Charles, MO).

EXEMPLO 59: Ensaios repórter H4lle-SEAP in vitro estabelecendo o envolvimento

na ação da insulina

Os vários repórteres H4lle:

H4lle/rMEP-SEAP·. O promotor de enzima málica isolada do rato (rMEP) contém um elemento gama PPAR que está na via da insulina. Essa construção repórter é transfectada estavelmente na linhagem de células H4lle do fígado.

H4lle/SREBP-SEAP: A proteína de ligação do elemento regulador de esterol (SREBP-Ic) é um fator de transcrição que atua nos promotores de vários genes sensíveis à insulina, por exemplo, sintetase de ácido graxo (FAS)1 e que regula a expressão dos genes chave no metabolismo do ácido graxo nos fibroblastos, adipócitos e hepatócitos. SREBP-lc, também conhecido como o fator 1 de determinação e diferenciação do adipócito (ADD-1 é considerado com o mediador primário dos efeitos na insulina na expressão gênica em células de adipose. Sua atividade é modulada pelos níveis de insulina, esteróis e glicose. Essa construção repórter é transfectada estavelmente na linhagem de células H4IIe do fígado.

H4lle/FAS-SEAP: As construções repórter de ácido graxo sintetase contêm um promotor mínimo FAS sensível à SREBP. Essa construção repórter é transfectada estavelmente na linhagem de células do fígado H4lle.

H4Ile/PEPCK-SEAΡ: O promoter de fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) é o sítio primário da regulação hormonal da atividade de PEPCK modulando a transcrição do genePEPCK. PEPCK catalisa uma etapa comprometida e de limitação de taxa na gliconeogênese hepática e deve portanto ser controlada com cuidado de modo a manter os níveis de glicose sangüínea dentro dos limites normais. Essa construção repórter é transfectada estavelmente na linhagem de células H4lle do fígado.

Essas construções repórter podem também ser transfectadas estavelmente em fibroblastos 3T3-L1 e mioblastos L6. Essas linhagens de célula estável são então diferenciadas em adipócitos 3T3-L1 e miotubos L6 conforme descrito anteriormente no Exemplo 13. As linhagens de célula diferenciadas podem então ser empregada no ensaio SEAP descrito a seguir.

Meio de Crescimento e Ensaio

O meio de crescimento compreende 10% soro bovino fetal (FBS), 10% soro de bezerro, 1% NEAA.1 χ penicilina/estreptomicina e 0,75 mg/mL G418 (para H4lle/rFAS-SEAP e H4IIe/SREBP-SEAP) ou 0,50 mg/mL de G418 (para H4lle/rMEP-SEAP). Para H4IIe/PEPCK-SEAP, o meio de crescimento consiste em 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 15 mM de salmoura tamponada HEPES e 0,50 mg/mL de G418.

O meio de ensaio consiste em meio DMEM com baixo teor de glicose (Life Technologies), 1% NEAA, 1 χ penicilina/estreptomicina para os repórteres H4lle/rFAS-SΕΑΡ, H4Ile/SREBP-SEAP, H4lle/rMEP-SEAP. O meio de ensaio para o repórter H4lle/PEPCK-SEAP consiste em 0,1% FBS1 1% penicilina/estreptomicina e 15 mM salmoura tamponada HEPES.

Método

Placas de 96 poços são semeadas a 75.000 células/poço em 100 pL/poço de meio de crescimento até as células na fase de crescimento Iog se tornarem aderente. As células não são alimentadas por 48 horas por substituição do meio de crescimento pelo meio de ensaio, 200 pL/poço. (Para as células de H4lle/PEPCK-SEAP, o meio de ensaio contendo 0,5 mM dexametasona é adicionado a 100 pL/poço e incubado por aproximadamente 20 horas). O meio de ensaio é substituído após isso com 100 pL/poço de meio de ensaio fresco e uma alíquota de 50 pL de sobrenadante celular obtida das linhagens de células transfectadas expressando a terapêutica da presente invenção (por exemplo, proteínas de fusão da albumina da invenção e seus fragmentos e variantes) é adicionada ao poço. Os sobrenadantes das linhagens de célula transfectadas isentas de vetor são usados como controle negativo. A adição de 10 nM e/ou 100 nM de insulina aos poços é usada como controle positivo. Após 48 horas de incubação, os meios condicionados são colhidos e a atividade SEAP medida (Phospha-Light System protocol, Tropix número BP2500). Em resumo, as amostras são diluídas 1:4 em tampão de diluição e incubadas a 65°C por 30 minutos para inativar a forma não placentária endógena de SEAP. Uma alíquota de 50 pL de amostras diluída é misturada com 50 pL de Tampão de Ensaio SEAP que contém uma mistura de inibidores ativos contra as isoenzimas SEAP não placentárias e é incubada por mais 5 minutos. Uma alíquota de 50 μL de substrato quimioluminescente CSPD que é diluída 1:20 em melhorador de luminescência Emerald é adicionada à mistura e incubada por 15-20 minutos. As placas são lidas em um luminômetro de placa Dynex.

EXEMPLO 60: Animais transpênicos

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem também ser expressas nos animais transgênicos. Os animais de quaisquer espécies, incluindo, porém não limitado aos camundongos, ratos, coelhos, hamsters, porquinhos da índia, porcos, micro-porcos, cabritos, carneiro, gado e primatas não humanos, por exemplo, babuínos, macacos e chimpanzés podem ser empregados de modo a gerar animais transgênicos. Em uma modalidade específica, as técnicas descritas aqui ou de outra forma conhecidas na arte são empregadas para expressar as proteínas de fusão da invenção nos seres humanos, como parte de um protocolo de terapia gênica.

Qualquer técnica conhecida na arte pode ser empregada para introduzir os polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção nos animais de modo a produzir as linhagens dos animais criadores transgênicos. Tais técnicas incluem, porém não estão limitadas a microinjeção pronuclear (Paterson e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-698 (1994); Carver e outros, Biotechnology (NY) 11:1263-1270 (1993); Wright e outros, Biotechnology (NY) 9:830- 834 (1991); e Hoppe e outros, Patente US número 4.873.191 (1989)); transferência de gene mediada por retrovírus em linhagens germinais (Van der Putten e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985)), blastócitos ou embriões, alvejamento de gene nas células tronco embriônicas (Thompson e outros, Cell 56:313-321 (1989)); eletroporação de células ou embriões (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); introdução dos polinucleotídeos da invenção empregando uma pistola de genes (vide, por exemplo, Ulmer e outros, Science 259:1745 (1993); introdução das construções de ácido nucléico nas células tronco pleuripotentes embriônicas e transferência das células tronco de volta para o blastócito; e transferência de gene mediada por esperma (Lavitrano e outros, Cell 57:717-723 (1989); etc. Para uma revisão de tais técnicas vide Gordon, "Transgenic Animais," Intl. Rev. Cytol. 115:171- 229 (1989), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Qualquer técnica conhecida na arte pode ser empregada para produzir clones transgênicos contendo polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção, por exemplo, transferência nuclear para os oócitos enucleados do núcleo de células embriônicas, fetais ou adultas cultivadas induzidas a quiescência (Campell e outros, Nature 380:64-66 (1996); Wilmut e outros, Nature 385:810-813 (1997)).

A presente invenção obtêm animais transgênicos que portam os polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da invenção em todas as suas células, bem como animais que portam esses polinucleotídeos em algumas, porém não em todas as células, isto é, animais mosaicos ou quiméricos. O transgene pode ser integrado como um transgene simples ou como múltiplas cópias, tais como, concatâmeros, por exemplo, tandem cabeça-a-cabeça ou tandem cabeça-a-cauda. O transgene pode também ser seletivamente introduzido e ativado em um tipo de célula específico, por exemplo, o ensinamento de Lasko e outros (Lasko e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232- 6236 (1992)). As seqüências reguladoras necessárias pra tal ativação específica de tipo de célula dependerá do tipo de célula específico de interesse e ficará claro aos versados na técnica. Quando se deseja que o polinucleotídeo codificando a proteína de fusão da invenção seja integrado ao sítio cromossômico do gene endógeno correspondendo à porção da proteína Terapêutica ou porção da albumina da proteína de fusão da invenção, o alvejamento do gene é preferido. Em resumo, quando tal técnica for utilizada, os vetores contendo algumas seqüências de nucleotídeo homólogas ao gene endógeno são projetados pra a finalidade de integração, através da recombinação homóloga com as seqüências cromossômicas, e interrupção da função da seqüência de nucleotídeo do gene endógeno. O transgene também pode ser seletivamente introduzido em um tipo de célula específico, assim inativando o gene endógeno apenas naquele tipo de célula, seguindo, por exemplo, o ensinamento de Gu e outros (Gu e outros, Science 265:103-106 (1994)). As seqüências reguladoras necessárias pra tal inativação específica do tipo de célula dependerão do tipo específico de célula de interesse e ficarão claras aos versados na arte.

Uma vez que os animais transgênicos tenham sido gerados, a expressão gênica recombinante pode ser ensaiada utilizando técnicas padrão. A classificação inicial pode ser realizada por análise Southern blot ou técnicas da PCR de modo a analisar os tecidos animais e verificar que a integração do polinucleotídeo codificando a proteína de fusão da invenção tenha ocorrido. O nível de expressão de RNAm do polinucleotídeo codificando a proteína de fusão da invenção nos tecidos dos animais transgênicos também pode ser avaliado empregando técnicas que incluem, porém não estão limitadas a análise Northern blot das amostras de tecido obtidas do animal, análise de hibridização in situ e transcriptase inversa-PCR (rt-PCR). As amostras do tecido expressão proteína de fusão podem também ser avaliadas imunocitoquimicamente ou imunohistoquímicamente usando anticorpos específicos para a proteína de fusão.

Uma vez que os animais criadores são produzidos, eles podem ser reproduzidos, reproduzidos por endogamia ou cruzados de modo a produzir colônias de animais específicos. Exemplos de tais estratégias de reprodução incluem, porém não estão limitados a reprodução dos animais criadores com mais de um sítio de integração, de modo a estabelecer linhagens separadas; reprodução por endogamia de linhagens separadas a fim de produzir transgênicos compostos que expressam o transgene em níveis mais altos em razão dos efeitos da expressão aditiva de cada transgene; cruzamento de animais transgênicos heterozigotos para produzir animais homozigotos para um dado sítio de integração, a fim de aumentar a expressão e eliminar a necessidade de classificação dos animais por análise de DNA; cruzamento de linhagens homozigotas separadas para produzir linhagens heterozigotas ou homozigotas compostas; e reprodução para colocar o transgene (isto é, polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção) em uma base distinta, que é apropriada para um modelo experimental de interesse.

Os animais transgênicos da invenção são empregados, porém não estão limitados aos sistemas de modelo de animal úteis na elaboração da função biológica das proteínas de fusão da invenção e a proteína Terapêutica e/ou componente da albumina da proteína de fusão da invenção, no estudo das condições e/ou transtornos associados à expressão anormal e na classificação de compostos eficazes para melhorar as condições e/ou transtornos.

EXEMPLO 61: Método de tratamento empregando terapia gênica Ex vivo

Um método de terapia gênica transplanta os fibroblastos que são capazes de expressar uma proteína de fusão da albumina da presente invenção para um paciente. De modo geral, os fibroblastos são obtidos de um indivíduo por biópsia da pele. O tecido resultante é colocado em meio de cultura de tecido e separado em pequenos pedaços. Pequenos montes de tecido são colocados em uma superfície úmida de um frasco de cultura de tecido, aproximadamente dez peças são colocadas em cada frasco. O frasco é girado para cima e para baixo, fechado hermeticamente e deixado a temperatura ambiente por toda noite. Após 24 horas a temperatura ambiente, o frasco é invertido e os montes de tecido permanecem fixados ao fundo do frasco e meios frescos (por exemplo, meios F12 de Ham, com 10% FBS, penicilina e estreptomicina) são adicionados. Os frascos são então incubados a 37°C por aproximadamente uma semana.

Nesse momento, os meios frescos são adicionados e subseqüentemente mudados cada um por vários dias. Após um adicional de duas semanas na cultura, uma monocamada de fibroblastos emerge. A monocamada é tripsinizada e transferida para frascos maiores.

pMV-7 (Kirschmeier, P.T. e outros, DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por repetições de terminal longo do vírus de sarcoma de murino Moloney é digerido com EcoRI e HindIII e subseqüentemente tratado com fosfatase intestinal de bezerro. O vetor linear é fracionado em gel agarose e purificado usando microesferas de vidro.

Polinucleotídeos codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção podem ser gerados empregando técnicas conhecidas na arte ampliadas usando iniciadores de PCR que correspondem às seqüências de extremidade 5' e 3' e opcionalmente possuindo sítios apropriados de restrição e códons de iniciação/parada, caso necessário. De preferência o iniciador de 5' contém um sítio EcoRI e o iniciador de 3' inclui um sítio HindlII. Quantidades iguais da estrutura linear do vírus de sarcoma de murino Moloney e fragmento de EcoRI e Hindlll ampliado são adicionadas em conjunto, na presença de T4 DNA ligase. A mistura resultante é mantida sob condições apropriadas para ligação de dois fragmentos. A mistura de ligação é então usada para transformar as bactérias HB101, que são então colocadas em placas em canamicina contendo ágar com a finalidade de confirmar que o vetor possui o gene de interesse propriamente inserido.

Concentração de células anfotrópicas pA317 ou GP+am12 crescem em cultura de tecido para densidade confluente em Meio Eagles Modificado da Dulbecco (DMEM) com 10% de soro de bezerro (CS), penicilina e estreptomicina. O vetor MSV contendo o gene é então adicionado ao meio e a concentração de células transduzida com o vetor. A concentração de células agora produz partículas viróticas infecciosas contendo o gene (a concentração de células é agora referida como células produtoras).

Meio fresco é adicionado às células produtoras transduzidas e subseqüentemente, o meio é colhido de um aplaca de 10 cm de células produtoras confluentes. O meio gasto, contendo as partículas viróticas infecciosas é filtrado através de filtro Millipore para remover células produtora destacas e esse meio é então usado para infectar células de fibroblasto. O meio é removido de uma placa de fibroblastos subconfluente e rapidamente substituído pelo meio das células produtoras. Esse meio é removido e substituído por meio frasco. Se a titulação do vírus for alta, então virtualmente todos os fibroblastos serão infectados e nenhuma seleção será necessária. Se a titulação foi muito baixa, então será necessário usar o retrovetor virótico que possui um marcador selecionável, tal como neo ou his. Uma vez que os fibroblastos tenham sido eficazmente infectados, os fibroblastos são analisados para determinar se a proteína de fusão da albumina foi produzida.

Os fibroblastos construídos são então transplantados para o hospedeiro, tanto sozinhos ou após terem crescido até confluência em 3 microesferas de microveículo de citodex.

EXEMPLO 62: Método de tratamento empregando terapia gênica - In vivo

Outro aspecto da presente invenção é o emprego de métodos de terapia gênica in vivo para tratar transtornos, doenças e condições. O método de terapia gênica se refere à introdução de seqüências de ácido nucléico puro (DNA, RNA, e DNA e RNA de antisentido) codificando uma proteína de fusão da albumina da invenção em um animal. Polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem ser operativamente ligados (isto é, associados) a um promotor ou quaisquer elementos genéticos necessários para a expressão do polipeptídeo pelo tecido alvo. Tal terapia gênica e técnicas de distribuição e métodos são conhecidos na arte, vide, por exemplo, W090/11092, W098/11779; Patentes US números 5693622, 5705151, 5580859; Tabata e outros, Cardiovasc. Res. 35(3):470-479 (1997); Chao e outros, Pharmacol. Res. 35(6):517-522 (1997); Wolff1 Neuromuscul. Disord. 7(5):314-318 (1997); Schwartz e outros, Gene Ther. 3(5):405-411 (1996); Tsurumi e outros, Circulation 94(12):3281-3290 (1996) (incorporados aqui como referência).

As construções de polinucleotídeo podem ser distribuídas por qualquer método que libere materiais injetáveis para as células de um animal, tais como, injeção no espaço intersticial dos tecidos coração, músculo, pele, pulmão, fígado, intestino e semelhantes). As construções de polinucleotídeo podem ser distribuídas em um líquido farmaceuticamente aceitável ou veículo aquoso.

O termo polinucleotídeo, DNA ou RNA "puro", se refere às seqüências que estão isentas de qualquer veículo de distribuição que atue para ajudar, promotor ou facilitar a entrada na célula, incluindo seqüências viróticas, partículas viróticas, formulações de lipossoma, lipofectina ou agentes de precipitação e semelhantes. Contudo, os polinucleotídeos codificando as proteínas de fusão da albumina da presente invenção podem também ser liberados nas formulações de lipossoma (tais como aquelas ensinadas em Feigner P.L. e outros (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 and Abdallah B. e outros (1995) Biol. Cell 85(l):l-7) que podem ser preparadas por métodos bem conhecidos dos versados na técnica.

As construções de vetor de polinucleotídeo usadas no método de terapia gênica são preferivelmente construções que não serão integradas ao genoma do hospedeiro nem conterão seqüências que permitem a replicação. Qualquer promotor forte conhecido dos versados na técnica pode ser usado para direcionar a expressão do DNA. Diferente de outras técnicas de terapia gênica, uma vantagem maior da introdução de seqüências de ácido nucléico puro nas células alvo é a natureza transitória da síntese do polinucleotídeo nas células. Estudos mostraram que seqüências de DNA não replicantes podem ser introduzidas nas células para prover produção de polipepídeo desejado por períodos de até seis meses.

A construção de polinucleotídeo pode ser liberada para o espaço intersticial dos tecidos dentro de um animal, incluindo músculo, pele, cérebro, pulmão, baço, medula óssea, timo, coração, linfa, sangue, osso, cartílagem, pâncreas, rins, vesícula biliar, estômago, intestino, testículos, ovário, útero, reto, sistema nervoso, olhos, glândulas e tecido conjuntivo. O espaço intersticial dos tecidos compreende o fluido intercelular, matriz de mucopolissacarídeo entre as fibras reticulares dos tecidos do órgão, fibras elásticas nas paredes dos vasos ou câmaras, fibras de colágeno dos tecidos fibrosos ou que a mesma matriz dentro do tecido conjuntivo embainhe células musculares ou nas lacunas do osso. E similarmente o espaço ocupado pelo plasma de circulação e o fluido linfático dos canais linfáticos. A distribuição para o espaço intersticial do tecido muscular é preferida pelas razões apresentadas abaixo. Eles podem ser convenientemente distribuídos por injeção aos tecidos compreendendo essas células. Eles são preferivelmente distribuídos e expressos em células persistentes, que não se dividem, as quais são diferenciadas, embora a distribuição e expressão possa ser obtida nas células não diferenciadas ou menos completamente diferenciadas, tais como, por exemplo, células troco do sangue ou fibroblastos da pele. As células musculares in vivo são especificamente competentes em sua capacidade de absorver e expressar polinucleotídeos.

Para a injeção de polinucleotídeo puro, uma quantidade de dosagem eficaz de DNA ou RNA estará na faixa de cerca de 0,5 g/kg de peso corpóreo a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo. Preferivelmente, a dosagem será de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e mais preferivelmente de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. Naturalmente, conforme um versado na técnica comum apreciará, essa dosagem variará de acordo com o sítio do tecido de injeção. A dosagem apropriada e eficaz da seqüência de ácido nucléico pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica comum e pode depender da condição sendo tratada e da via de administração. A via de administração preferida é por via parenteral de injeção no espaço intersticial dos tecidos. Contudo, outras vias parenterais podem também ser usadas, tais como, inalação de uma formulação em aerossol especificamente para liberação aos pulmões ou tecidos brônquicos, membranas da garganta ou mucosas do nariz. Além disso, construções de polinucleotídeo puro podem ser liberadas para as artérias durante angioplastia pelo cateter usado no procedimento.

Os efeitos da resposta de dose do polinucleotídeo injetado no músculo in vivo são determinados como se segue. DNA de gabarito apropriado para produção de RNAm codificando o polipeptídeo da presente invenção é preparado de acordo com a metodologia de DNA recombinante padrão. DNA de gabarito, que pode ser tanto circular quanto linear, é tanto usado como DNA puro ou complexado com lipossomas. Os músculos quadríceps dos camundongos são então injetados com várias quantidades do DNA de gabarito.

Camundongos Balb/C machos e fêmeas de cinco a seis semanas de idade foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 0,3 mL de 2,5% Avertina. Uma incisão de 1,5 cm é feita na coxa anterior e o músculo quadríceps exposto. O DNA de gabarito é injetado em 0,1 mL de veículo em uma seringa de 1 cm3 através de agulha calibre 27 por um minuto, aproximadamente 0,5 cm do sítio de inserção distai do músculo dentro do calcanhar e cerca de 0,2 cm de profundidade. Uma sutura é colocada sobre o sítio da injeção para localização futura e a pele é fechada com grampos de aço inoxidável.

Após um tempo de incubação apropriado (por exemplo, 7 dias) os extratos musculares são preparados por excisão de todo o quadríceps. Cada quinta seção transversal de 15 Mm dos músculos do quadríceps individual é colorida histoquimicamente quanto a expressão da proteína. Um curso de tempo pra a expressão da proteína de fusão pode ser realizado em um modo semelhante, exceto que o quadríceps de diferentes camundongos são colhidos em tempos diferentes. A persistência do DNA no músculo seguindo-se a injeção pode ser determinada por análise Southern blot após preparação de DNA celular total e sobrenadantes HIRT de camundongos injetados e de controle. O resultado da experimentação acima em camundongos pode ser usado para extrapolar dosagens apropriadas e outros parâmetros de tratamento nos seres humanos e outros animais usando DNA purificado.

EXEMPLO 63: Efeitos biológicos das proteínas de fusão da invenção Astrócito e ensaios neuronais

As proteínas de fusão da albumina da invenção podem ser testadas quanto a atividade na promoção da sobrevivência, crescimento da nefrite ou diferenciação fenotípica das célula neuronais corticais e para indução da proliferação das células imunopositivas da proteína ácida fibrilar glial, astrócitos. A seleção das células corticais para o bioensaio se baseia na expressão prevalente de FGF-1 e FGF-2 nas estruturas corticais e na melhora anteriormente reportada da sobrevivência neuronal cortical resultando do tratamento com FGF-2. Um ensaio de incorporação de timidina, por exemplo, pode ser usado para elucidar uma proteína de fusão da albumina da atividade da invenção nessas células. Além disso, relatórios anteriores descrevendo os efeitos biológicos de FGF-2 (FGF básico) nos neurônios corticais ou do hipocampo in vitro demonstraram aumentos em ambos sobrevivência do neurônio e superação da neurite (Walicke e outros, "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension." Proc. Natl. Acad. Sd. USA 53:3012-3016. (1986), ensaio incorporado aqui como referência em sua totalidade). Contudo, relatórios de experimentos realizados em células PC-12 sugerem que essas duas respostas não são necessariamente sinônimas e podem depender não apenas que FGF esteja sendo testado, porém também de qual (ais) receptor(ES) são expressos nas células alvo. Com o emprego do paradigma de cultura neuronal cortical primário, a capacidade de uma proteína de fusão da albumina da invenção para indução de superação da neurite pode ser comparada à resposta obtida com FGF-2 usando, por exemplo, um ensaio de incorporação de timidina.

Ensaios de fibroblastos e células endoteliais

Fibroblastos de pulmão humanos são obtidos da Conetics (San Diego, DA) e mantidos em meio de crescimento da Clonetics. Células endoteliais microvasculares dérmicas são obtidas na Cell Applications (San Diego, CA). Para ensaios de proliferação, os fibroblastos de pulmão humano e células endoteliais microvasculares dérmicas podem ser cultivados a 5.000 células/poço em uma placa de 96 poços por um dia em meio de crescimento. As células são então incubadas por um dia em meio basal 0,1% BSA. Após substituição do meio por um meio frasco 0,1% BSA, as células são incubadas com a proteína de fusão de teste das proteína da invenção por 3 dias. Alamar Blue (Alamar Bioscences, Sacramento, CA) é adicionado a cada poço a uma concentração final de 10%· As células são incubadas por 4 horas. A viabilidade da célula é medida por leitura no leitor de fluorescência CytoFIuor. Para o ensaio PGE2, os fibroblastos de pulmão humano são cultivados em 5.000 células/poço em uma placa de 96 poços por um dia. Após uma troca do meio para meio basal 0,1% BSA, as células são incubadas com FGF-2 ou proteína de fusão da invenção com ou sem IL-Ia por 24 horas. Os sobrenadantes são coletados e ensaiados quanto a PGE2 por kit EIA (Cayman, Ann Arbor, Ml. Para os ensaios com IL-6, os fibroblastos de pulmão humano são cultivados em 5.000 células/poço em uma placa de 96 30 poços por um dia. Após uma troca de meio para meio basal 0,1% BSA, as células são incubadas com FGF-2 ou com ou sem proteína de fusão da albumina da invenção e/ou IL-1a por 24 horas. Os sobrenadantes são coletados e ensaiados quanto a IL-6 por kit ELISA (endogen, Cambridge1 MA).

Os fibroblastos de pulmão humano são cultivados com FGF-2 ou proteína de fusão da albumina da invenção por 3 dias em meio basal antes da adição de Alamar Blue para avaliar os efeitos no crescimento dos fibroblastos. FGF-2 mostraria uma estimulação a 10-2.500 ng/mL que pode ser usada para comparar a estimulação com a proteína de fusão da invenção.

Proliferação celular com base na incorporação de [3Hltimidina

O ensaio de incorporação de [3H]timidina que se segue pode ser usado para medir o efeito das proteínas Terapêuticas, por exemplo, proteínas de fator de crescimento, na proliferação das células, tais como, células de fibroblasto, células epiteliais ou células musculares imaturas.

As culturas subconfluentes são paradas na fase G1 por uma incubação de 18 horas em meio isento de soro. As proteínas terapêuticas são então adicionadas por 24 horas e durante as últimas 4 horas, as culturas são marcadas com [3H]timidina e uma concentração final de 0, 33 μΜ (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). A [3H]timidina incorporada é precipitada com ácido tricloroacético a 10% resfriado em gelo por 24 horas. Subseqüentemente, as células são enxaguadas seqüencialmente com ácido tricloroacético a 10% resfriado em gelo e então com água gelada. Seguindo-se a Iise em 0,5 M NaOH, os Iisados e enxágües de PBS (500 mL) são agrupados e a quantidade de radioatividade é medida.

Modelos de Parkinson

A perda da função motora na doença de Parkinson é atribuída a uma deficiência da dopamina estriatal resultante da degeneração dos neurônios de projeção dopaminérgicos nigroestriatais. Um modelo animal para doença de Parkinson que foi extensivamente caracterizado envolve a administração sistêmica de 1-metil-4 fenil 1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). No CNS, MPTP é absorvida pelos astrocitos e catabolisada por monoamina oxidase B em 1-metil-4-fenil piridina (MPP+) e liberada. Subseqüentemente, MPP+ é ativamente acumulada nos neurônios dopaminérgicos por transportador de reabsorção de alta afinidade para dopamina. MPP+ é então concentrada nos mitocôndrios pelo gradiente eletroquímico e inibe seletivamente difosfato de nicotidamida adenina:ubiquinona oxidoreductionae (complexo I), pelo que, interferindo com o transporte do elétrodo e eventualmente gerando radicais de oxigênio.

Foi demonstrado nos paradigmas de cultura de tecido que FGF-2 (FGF básico) possui atividade trófica na direção dos neurônios dopaminérgicos nigrais (Ferrari e outros, Dev. Biol. 1989). Recentemente, o grupo do Dr. Unsicker demonstrou que a administração de FGF2 em implantes de espuma de gel no estriato resulta em proteção quase completa dos neurônios dopaminérgicos nigrais da toxicidade associada à exposição a MPTP (Otto and Unsicker, J. Neuroscience, 1990).

Com base nos dados com FGF-2, uma proteína de fusão da albumina da invenção pode ser avaliada para determinar se possui ação semelhante aquela de FGF-2 na melhora da sobrevivência neuronal dopaminérgica in vitro e pode também ser testada in vivo para proteção dos neurônios dopaminérgicos no estriato contra lesão associada ao tratamento com MPTP. O efeito em potencial de uma proteína de fusão da albumina da invenção e primeiro examinado in vitro em um paradigma de cultura de célula neuronal dopaminérgica. As culturas são preparadas por dissecação da placa de base do mesencéfalo de embriões de rato Wistar de 14 dias de gestação. O tecido é dissociado com tripsina e semeado em uma densidade de 200.000 células/cm2 em lâminas de revestimento de vidro cobertas com poliortinina-laminina. As células são mantidas em Meio de Eagle Modificado da Dulbecco e meio F12 contendo suplementos hormonais (N1). As culturas são fiadas com aldeído parafórmico aos 8 horas in vitro e são processados quanto a tirosina hidroxilase, um marcador específico para neurônios dopaminérgicos, coloração imunohistoquímica. As culturas de células dissociadas são preparadas de ratos embriônicos. O meio de cultura é trocado a cada três dias e os fatores são também adicionados nesse momento.

Uma vez que os neurônios dopaminérgicos são isolados de animais no 14° dia de gestação, um tempo de desenvolvimento que passa o estágio no qual as células de precursor dopaminérgico estão em proliferação, um aumento no número de neurônios imunopositivos a tirosina hidroxilase representaria um aumento no número de neurônios dopaminérgicos que sobrevivem in vitro . Portanto, se uma proteína terapêutica da invenção atua para prolongar a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos, isso sugere que a proteína de fusão pode estar envolvida na doença de Parkinson.

EXEMPLO 64: Terapia combinatória de transplante de célula beta pancreática

O transplante é uma forma comum de tratamento da doença auto-imune, especialmente quando o tecido alvo propriamente foi gravemente lesionado. Por exemplo e não como limitação, o transplante do pâncreas e transplante de células de ilhota são opções de tratamento comuns para IDDM (vide, por exemplo, Stewart e outros, Journal of Clinicai Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984-988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138-40 (1996); Kendall & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157-163 (1996); Hamano e outros, Kobe J. Med. Sei. 42: 93-104 (1996); Larsen & Stratta, Diabetes Metab. 22: 139-146 (1996); and Kinkhabwala, e outros, Am. J. Surg. 171: 516-520 (1996)). Como com qualquer método de transplante, as terapias de transplante para pacientes com doença auto-imune incluem tratamentos para minimizar o risco de rejeição do hospedeiro em relação ao tecidotransplantado. Contudo, a doença auto-imune envolve o risco adicional e independente de que a resposta auto-imune do hospedeiro pré-existente que Iesionou o tecido original propriamente exerça o mesmo efeito de lesão no tecido transplantado. Conseqüentemente, a presente invenção engloba métodos e composições para o tratamento de doença pancreática auto-imune empregando as proteína de fusão da albumina da presente invenção, em combinação com imunomoduladores/imunossupressores em indivíduos que sofrem terapia de transplante em doença auto-imune.

De acordo com a invenção, as composições à base de fusão da albumina e formulações descritas acima são administradas para prevenir e tratar lesão no órgão transplantado, tecido ou células resultantes da resposta auto-imune do indivíduo hospedeiro inicialmente direcionada contra o tecido original propriamente. A administração pode ser realizada antes e após o transplante em 2 a 4 doses com uma semana de intervalo.

Os imunomoduladores/imunossupressores que se seguem incluem, porém não estão limitados ao AI-401, CDP-571 (anticorpo monoclonal anti-TNF), CG-1088, Diamyd (vacina para diabetes), ICM3 (anticorpo monoclonal anti-ICAM-3), Iinomida (Roquinimex), NBI-6024 (ligante de peptídeo alterado), TM-27, VX-740 (HMR-3480), inibidores de caspase 8 protease, talidomida, hOKT3gama1 (Ala-ala) (anticorpo monoclonal anti-CD3), Interferon Alfa oral, Iactobacilos oral e LinfoStat-B(TM) podem ser usados em conjunto com as proteínas terapêuticas de fusão da albumina da presente invenção no transplante de células de ilhota ou pâncreas.

EXEMPLO 65: Identificação e clonagem dos domínios VH e VL Um método para identificar e clonar os domínios VH e VL das linhagens de células expressando um anticorpo específico é realizar a PCR com iniciadores específicos para VH e VL no DNAc fabricado das linhagens de células expressando anticorpo. Em resumo, RNA é isolado das linhagens de células e usado como um gabarito para RT-PCR projetada para ampliar os domínios VH e VL dos anticorpos expressos pelas linhagens de células EBV. As células podem ser lisadas no reagente TRIzol® (Life Technologies, Rockville. MD) e extraídas com um quinto do volume de clorofórmio. Após adição do clorofórmio, a solução é deixada incubar a temperatura ambiente por 10 minutos e centrifugada a 14.000 rpm por 15 minutos a 4°C em uma centrífuga de balcão. O sobrenadante é coletado e o RNA é precipitado usando um volume igual de isopropanol. RNA precipitado é transformado em microesferas por centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos a 4°C em uma centrífuga de balcão. Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado e lavado com etanol a 75%. Seguindo-se a lavagem, o RNA é centrifugado novamente a 800 rpm por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado e a microesfera deixada secar ao ar. RNA é dissolvido em água DEPC e aquecido a 60°C por 10 minutos. Quantidade de RNA podem ser determinadas usando medições de densidade óptica.

DNAc pode ser sintetizado, de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica, a partir de 1,5-2,5 μg de RNA usando transcriptase reversa e iniciadora de hexâmero aleatórios. DNAc é então empregado como um gabarito para ampliação por PCR dos domínios VH e VL. Os iniciadores usados para ampliar os genes VH e VL são mostrados na Tabela 7. Tipicamente, uma reação da PCR faz uso de um iniciador 5' e de um iniciador 3'. Algumas vezes, quando a quantidade de gabarito de RNA disponível é limitante, ou para maior eficiência, grupos de iniciadores 5' e/ou 3' podem ser usados. Por exemplo, algumas vezes, todos os cinco iniciadores VH-5' e todos iniciadores JH3' são usados em uma reação de PCR simples. A reação de PCR é realizada em um volume de 50 pL contendo 1x de tampão PCR1 2 mM de cada dNTP, 0,7 unidades de Taq polimerase High Fidelity, mistura de iniciador 5', mistura de iniciador 3' e 7,5 pL de DNAc. A mistura de iniciador 5' e 3' de ambos VH e VL pode ser feita por agrupamento de 22 pmols e 28 pmols, respectivamente, de cada um dos iniciadores individuais. As condições da PCR são: 96°C por 5 minutos; seguido por 25 ciclos de 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto; seguido por um ciclo de extensão de 72°C por 10 minutos. Após a reação estar complete, os tubos de amostra são armazenados a 4°C.

Tabela 7: Seqüências do iniciador empregado para ampliar os domínios VH e VL

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HuVHl-5' 62 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG Hu VH2-5' 63 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG Hu VH3-5' 64 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG Hu VH4-5' 65 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG Hu VH5-5' 66 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC Hu VH6-5' 67 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG Hu JHl,2-5' 68 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC Hu JH3-5' 69 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC Hu JH4.5-5' 70 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC Hu JH6-5* 71 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC

Iniciadores VH Hu Vkappal-5' 72 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC Hu Vkappa2a-5' 73 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC Hu Vkappa2b-5' 74 GATATTGTGATGACTCAGTCTCC Hu Vkappa3-5' 75 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC Hu Vkappa4-5' 76 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC Hu Vkappa5-5' 77 GAAACGACACTCACGCAGTCTCC Hu Vkappa6-5' 78 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC Huyiambdal-Si 79 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC Hu Vlambda2-5' 80 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC Hu Vlambda3-5' 81 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC Hu Vlambda3b-5' 82 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC Hu Vlambda4-5' 83 CACGTTATACTGACTCAACCGCC Hu Vlambda5-5' 84 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC Hu Vlambda6-5' 85 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA Hu Jkappal-3' 86 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC Hu Jkappa2-3' 87 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC Hu Jkappa3-3' 88 ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC Hu Jkapp a4-3' 89 ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC Hn Jkapp a5-3' 90 ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC Hu Jlambdal -3' 91 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC Hu Jlambda2-3' 92 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC Hu Jlambda3—3' 93 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC Hu Jlambda3b-3' 94 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC Hu Jlambda4-3' 95 CACGTTATACTGACTCAACCGCC Hu Jlambda5-3' 96 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC Hu Jlambda6-3' 97 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA

Amostras de PCR são então eletroforesadas em um gel agarose a 1,3%. As faixas de DNA de tamanhos esperados (-506 pares de base para domínios VH e 344 pares de base para domínios VL) podem ser cortadas do gel e purificadas usando métodos bem conhecidos na arte. Os produtos PCR purificados podem ser ligados em um vetor de clonagem de PCR (Vetor TA da Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Produtos de PCR clonados individuais podem ser isolados após transfecção de E.coli e seleção de cor azul/branca. Os produtos PCR clonados podem então ser seqüenciados empregando os métodos conhecidos de modo geral na técnica. As faixas de PCR contendo domínio VH e os domínios VL podem também ser usadas para criar vetores de expressão de Ig de comprimento pleno. Os domínios VH e VL podem também ser clonados nos vetores contendo as seqüências de nucleotídeo de regiões constantes de cadeia pesada (por exemplo, IgGI humano ou IGG3 humano) ou cadeia leve (capa humano ou Iambda humano), tal que, uma molécula de cadeia pesada ou leve completa seria expressa desses vetores, quando transfectada em uma célula hospedeira apropriada. Adicionalmente, quando as cadeias pesada e leve são ambas expressas em uma linhagem de célula (tanto de um ou dois vetores) eles podem se agrupar em uma molécula de anticorpo funcional completa que é secretada no meio de cultura de célula. Os métodos que empregam polinucleotídeos codificando domínio de anticorpo VH e VL de modo a gerar vetores de expressão que codificam moléculas de anticorpo completas são bem conhecidos na técnica.

EXEMPLO 66: Preparação de proteínas de fusão de HA-citocina ou HA-fator de crescimento (tais como. NGF. BDNFa. BDNFh e BDNFr) O DNAc para a citocina ou fator de crescimento de interesse, tal como NGF, pode

ser isolado de várias formas incluindo de bibliotecas de DNAc, por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos usando métodos padrão. As seqüências de nucleotídeo para todas essas proteínas são conhecidas e estão disponíveis. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. DNAc de NGF (ou outra citocina) é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPCOOOõ (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35, de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos, é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 67: Preparação das proteína de fusão HA-IFN (tal como, IFNa).

O DNAc para o interferon de interesse, tal como IFNa pode ser isolado de várias formas incluindo porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc, por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão. As seqüências de nucleotídeo para interferons, tal como IFNa, são conhecidas e estão disponíveis, por exemplo, nas Patentes US 5.326.859 e 4.588.585, na EP 32 134, bem como nas bases de dados públicas, tal como GenBank. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que Iigantes de oligonucleotídeo possam ser usados para clonar o DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C da seqüência de HA, com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc de IFNa (ou outro interferon) é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35, de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

Máxima recuperação da proteína dos frascos

As proteínas de fusão da albumina da invenção possuem um alto grau de estabilidade, mesmo quando elas são acondicionadas em concentrações baixas. Também, a despeito da baixa concentração da proteína pode ser observada uma boa recuperação da proteína de fusão mesmo quando a solução aquosa não inclui outra proteína adicionada para minimizar a ligação às paredes do frasco. A recuperação das soluções de HA-IFN armazenadas em fracos foi comparada à da solução de estoque. 6 ou 30 pg/mL de soluções de HA-IFN foram colocados nos frascos e armazenados a 4°C. Após 48 ou 72 horas um volume originalmente equivalente a 10 ng da amostra foi removido e medido em um ELISA contendo camadas de IFN. Os valores estimados foram comparados aos da solução de estoque em concentração alta. Conforme mostrado, não existe essencialmente perda da amostra nesses fracos, indicando que a adição de material exógeno, tal como, albumina, necessariamente não impede a perda da amostra na parede dos frascos.

Estabilidade in vivo e biodisponibilidade das fusões de HA-ct-IFN De modo a determinar a estabilidade in vivo e a biodisponibilidade de uma molécula de fusão de ΗΑ-α-IFN, a molécula de fusão purificada (a partir da levedura) foi administrada aos macacos. As composições farmacêuticas formuladas das fusões de HA-a-IFN podem ser responsáveis pela meia vida longa em prateleira e biodisponibilidade do soro. Conseqüentemente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo a conter dosagens menores de atividade alfa-interferon em comparação á molécula de alfa-interferon nativa.

As composições farmacêuticas contendo fusões de ΗΑ-α-IFN podem ser usadas para tratar ou prevenir doenças em pacientes com qualquer doença ou estado de doença que possa ser modulado pela administração de α-IFN. Tais doenças incluem, porém não estão limitadas a leucemia da célula capilar, sarcoma de Kaposi, verrugas genitais e anais, hepatite B crônica, hepatite A não crônica, hepatite B não crônica, especificamente hepatite C, hepatite D, leucemia mielógena crônica, carcinoma de célula renal, carcinoma da bexiga, carcinoma cervical e ovariano, cânceres de pele, papilomatose respiratória recorrente, linfomas de célula T cutâneos e não Hodgkin, melanoma, mieloma múltiplo, AIDS, esclerose múltipla, glioblastoma, etc. (vide Interferon Alpha, In: AHFS Drug Information, 1997).

Conseqüentemente, a invenção inclui composições farmacêuticas contendo uma proteína de fusão ΗΑ-α-IFN, polipeptídeo ou peptídeo formulado com uma dosagem apropriada para administração aos seres humanos. A invenção também inclui métodos para tratamento de pacientes que necessitem de tal tratamento compreendendo, pelo menos, a etapa de administração de uma composição farmacêutica contendo pelo menos uma proteína de fusão ΗΑ-α-IFN, polipeptídeo ou peptídeo. Fusões de HA-a-IFN bifuncionais

Um vetor de expressão de ΗΑ-α-IFN pode ser modificado para incluir uma inserção para a expressão das proteínas de fusão ΗΑ-α-IFN bidirecionais. Por exemplo, o DNAc para uma proteína de interesse secundária pode ser inserido no quadro a jusante da seqüência "rHA-IFN" após o códon duplo de parada ter sido removido ou direcionado a jusante da seqüência de codificação.

Em uma versão de uma proteína de fusão ΗΑ-α-IFN bidirecional, um anticorpo ou fragmento contra proteína estimuladora de linfócito B (GenBank acesso número 4455139) ou polipeptídeo pode ser fundido a uma extremidade do componente HA da molécula de fusão. Essa proteína bifuncional é útil para modular qualquer resposta imune gerada pelo componente α-IFN da fusão.

EXEMPLO 68: Preparação da HA-proteina de fusão de hormônio

O DNAc para o hormônio de interesse pode ser isolado de várias formas incluindo porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc, por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de olígonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão. As seqüências de nucleotídeo para todas essas proteínas são conhecidas e estão disponíveis, por exemplo, em bases de dados públicas, tal como o GenBank. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que Iigantes de olígonucleotídeo possam ser usados para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc do hormônio é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumína secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 69: Preparação de HA-receptor solúvel ou HA-proteína de fusão de proteína de ligação

O DNAc para o receptor solúvel ou proteína de ligação de interesse pode ser isolado de várias formas incluindo, porém, não exclusivamente a partir de bibliotecas de DNAc, por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão. As seqüências de nucleotídeo para todas essas proteínas são conhecidas e estão disponíveis, por exemplo, no GenBank. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados, para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc do receptor é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 70: Preparação de HA-fatores de crescimento

O DNAc para o fator de crescimento de interesse pode ser isolado de várias formas incluindo, porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc, por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão (vide GenBank número de acesso NP_000609). O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc do fator de crescimento é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 71: Preparação de HA-proteínas de fusão de anticorpo de cadeia simples

Anticorpos de cadeia simples são produzidos por vários métodos incluindo, porém não limitado a: seleção a partir de bibliotecas de fago, clonagem da região variável de um anticorpo específico por clonagem de DNAc do anticorpo e emprego das regiões constantes de flanqueamento como o iniciador pra clonar a região variável ou por sintetização de um oligonucleotídeo correspondendo á região variável de qualquer anticorpo específico. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que Iigantes de oligonucleotídeo possam ser usados, para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc da célula é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura.

Nas moléculas de fusão da invenção, o Vh e o Vl podem ser ligados por um dos meios que se seguem ou uma combinação dos mesmos: um Iigante de peptídeo entre o término C de Vh e o término N de VL; um sítio de clivagem de protease Kex2p entre o Vh e o VL, tal que os dois sejam clivados e separados por secreção e então auto-associação; e resíduos de cisteína posicionados, tal que, o VH e o VL possam formar uma ligação dissuleto entre os mesmos de modo a ligá-los. Uma opção alternativa seria colocar o Vh no término N de HA ou o fragmento do domínio HA e o VI no término C de HA ou fragmento do domínio HA.

A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora a(vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos. O anticorpo obtido dessa maneira pode ser purificado e testado quanto a sua ligação ao seus antígeno empregando métodos imunoquímicos padrão. EXEMPLO 72: Preparação de HA-proteínas de fusão de molécula de adesão celular

O DNAc para a molécula de adesão celular de interesse pode ser isolado de várias formas incluindo, porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc1 por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão. As seqüências de nucleotídeo para as moléculas de adesão celular conhecidas estão disponíveis e são conhecidas, por exemplo, no GenBank. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc da molécula de adesão celular é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 73: Preparação de fatores inibidores e peptldeos como proteínas de fusão de HA (tais como, proteínas HA-antivirótica, HA-antibiótica, HA-inibidor de enzima e HA-antialérgica)

O DNAc para o peptídeo de interesse, tal como um peptídeo antibiótico pode ser isolado de várias formas incluindo, porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc1 por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos usando métodos padrão. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados, para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc do peptídeo é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

EXEMPLO 74: Preparação das proteínas de fusão de HA alvejadas O DNAc para a proteína de interesse pode ser isolado da biblioteca de DNAc ou pode ser obtido sinteticamente empregando vários oligonucleotídeos de sobreposição usando métodos padrão de biologia molecular. Os nucleotídeos apropriados podem ser construídos no DNAc para formar sítios de restrição convenientes e também permitir a anexação do DNAc da proteína ao DNAc da albumina. Também, uma proteína de alvejamento ou DNAc de peptídeo, tal como um anticorpo de cadeia simples ou peptídeos, tais como, sinais de localização nuclear que podem direcionar as proteínas dentro das células podem ser fundidos à outra extremidade da albumina. A proteína de interesse e o peptídeo alvo são clonados dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA o que permite a fusão do DNAc da albumina. Desse modo, ambas as extremidades do término N e C da albumina são fundidas às outras proteínas. O DNAc fundido é então excisado de PPC0005 e é inserido no plasmídeo, tal como pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. Todos os procedimentos acima podem ser realizados usando métodos padrão na biologia molecular. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica e sua atividade de alvejamento usando testes bioquímicos e biológicos apropriados.

EXEMPLO 75: Preparação de HA-enzimas de fusão

O DNAc para a enzima de interesse pode ser isolado de várias formas incluindo porém, não exclusivamente, a partir de bibliotecas de DNAc1 por RT-PCR e por PCR empregando uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de sobreposição, todos empregando métodos padrão. O DNAc pode ser talhado nas extremidades 5' e 3' de modo a gerar sítios de restrição, tal que ligantes de oligonucleotídeo possam ser usados para clonagem do DNAc em um vetor contendo o DNAc para HA. Isso pode ser feito no término N ou C com ou sem o uso de uma seqüência espaçadora. O DNAc da enzima é clonado dentro de um vetor, tal como, pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA ou pC4:HSA do qual o cassete de expressão completo é então excisado e inserido dentro do plasmídeo pSAC35 de modo a permitir a expressão da proteína de fusão da albumina na levedura. A proteína de fusão da albumina secretada da levedura pode então ser coletada e purificada dos meios e testada quanto a sua atividade biológica. Para expressão nas linhagens de célula de mamíferos é adotado um procedimento semelhante, exceto que o cassete de expressão usado emprega um promotor de mamífero, seqüência líder e terminadora (vide Exemplo 1). Esse cassete de expressão é então excisado e inserido em um plasmídeo apropriado para transfecção de linhagens de células de mamíferos.

A revelação completa de cada documento citado (incluindo patentes, pedidos de patente, publicações de patente, artigos de jornal, resumos, manuais de laboratório, livros ou outras revelações) bem como informações disponíveis através de Identificadores específicos para bases de dados, tais como, GenBank, GeneSeq ou o Registro CAS referidos nesse pedido são aqui incorporados como referência, em sua totalidade. <110> Rosen et al.

<120> Proteínas de Fusão de Albumina <130> PF618PCT <150> 07-06-2006 <160> 492

<170> Patentin Versão. 2.0

<210> 1

<211> 585

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 15 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585

<210> 2

<211> 1782

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400>2

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaaatgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtggc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaggattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aactgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca caaaatgctg cacagagtcc 1440 ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataaca tctacattta aaagcatctc ag 1782

<210> 3 <211> 609 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605

Leu

<210> 4 <211> 15 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221> tum

<223> Peptídeo de ligação que pode ser usado para ligar domínios VH e VL em um scFv. <400>4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

<210> 5

<211> 394

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400>5

gcggccgccg gatgcaaggg ttcgaatccc ttagctctca ttattttttg ctttttctct 60 tgaggtcaca tgatcgcaaa atggcaaatg gcacgtgaag ctgtcgatat tggggaactg 120 tggtggttgg caaatgacta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta 180 acataataac cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa 240 aaaataagat atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt 300 cttgctctct tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca 360 tagatacaat tctattaccc ccatccatac aatg 394

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>6

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala 1 5 10 15

Leu Gly Ser Gln Ala 20

<210> 7 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptídeo sinal de estaniocalcina. <400>7 Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15

Ala

<210> 8

<211 >24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>8

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20

<210>9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>9

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15

Tyr Ser

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15

Tyr Ser

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 15 10 15

Ile SerAIa

<210> 12 <211> 86 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (84)

<223> Xaa igual a qualquer um de Glu ou Asp <400> 12

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser 1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30

Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45

Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60

Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75 80

Val Ser Leu Xaa Lys Arg 85

<210> 13

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

Tyr Ser Arg Ser Leu Glu Lys Arg 20

<210> 14

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg 20

<210> 15

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 15

Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly

1 5 10 15

Ser Leu Asp Lys Arg 20

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 17

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Glu Arg Ala Ala Pro Ser Arg Arg Val Pro Leu Pro Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Gly Val Asp Ala

20 25

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu

1 5 10 15

Ser Gly Gln Val Leu Gly 20

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Met Leu Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro

1 5 10 15

Gly Pro Ser Leu Gly

20

<210> 20 <211 >24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20

<210> 21 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<221 > MUTAGEN <222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal

<400> 21

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val 1 5 10 15

Leu Gly

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221 > MUTAGEN

<222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal

<400> 22

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Val 1 5 10 15

Leu Gly

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221 > MUTAGEN

<222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal

<400> 23 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

1 5 10 15

Leu Gly

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val

1 5 10 15

Ser Gly

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val

1 5 10 15

Ser Gly

<210> 26 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<221 > MUTAGEN <222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal

<400> 26

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ala Gly Val 1 5 10 15

Ser Gly

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal <400> 27

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Gly Val 1 5 10 15

Ser Gly

<210> 28 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<221 > MUTAGEN <222> (14) to (18)

<223> Variante de HSA selvagem principal <400> 28

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val 1 5 10 15

Ser Gly

<210> 29

<211> 23

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<221> MUTAGEN <222> (14) to (23)

<223> Variante de HSA selvagem principal <400> 29

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Gly Gly Val 1 5 10 15

Leu Gly Asp Leu His Lys Ser 20

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptídeo sinal sintético <400> 30

Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Trp Ala Pro Ala Arg Gly 20 <210> 31

<211>17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn

1 5 10 15

Ala

<210> 32

<211 >29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly

1 5 10 15

Leu Glu His Thr His Arg Arg Gly Ser Leu Asp Lys Arg

20 25

<210> 33

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Met Lys Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ala Gly Val Ser Ala

15 10 15

Ser Val Ile Asn Tyr Lys Arg

20

<210> 34

<211> 65

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15

Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Gln Thr Thr 20 25 30

Ser Val Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gln 35 40 45

Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Lys 50 55 60

Arg 65

<210> 35

<211> 70

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ser Gln Val Leu Gly Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Gln Thr Thr 20 25 30

Ser Val Asn Leu Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Ala Phe Ala Thr Gln 35 40 45

Thr Asn Ser Gly Gly Leu Asp Val Val Gly Leu Ile Ser Met Ala Glu 50 55 60

Glu Gly Glu Pro Lys Arg 65 70

<210> 36

<211> 58

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer usado para gerar posição de Xhol e Clal em pPPC0006

<400> 36

gcctcgagaa aagagatgca cacaagagtg aggttgctca tcgatttaaa gatttggg 58

<210> 37

<211> 59

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer usado na geração de posição de Xhol and Clal em pPPC0006

<400> 37

aatcgatgag caacctcact cttgtgtgca tctcttttct cgaggctcct ggaataagc 59

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer usado na geração de posição de Xhol and Clal em pPPC0006

<400> 38

tacaaactta agagtccaat tagc 24

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer usado na geração de posição de Xhol and Clal em pPPC0006

<400> 39

cacttctcta gagtggtttc atatgtctt 29

<210> 40 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<221 > Misc_Structure

<223> Oligonucleotídeo sintético usado para alterar posições de restrição em pPPC0007

<400> 40

aagctgcctt aggcttataa taaggcgcgc cggccggccg tttaaactaa gcttaattct 60

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<221 > Misc_Structure

<400> 41

agaattaagc ttagtttaaa cggccggccg gcgcgcctta ttataagcct aaggcagctt 60

<210> 42 <211> 32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer forward útil para geração de proteína de fusão de albumina em que metade da albumina é N-terminal da Proteína Terapêutica <220>

<221 > misc_feature

<222> (18)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (19)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (20)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (21)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (22)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature

<222> (24)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (25)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (26)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (27)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (28)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220> <221> misc_feature <222> (29)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature <222> (30)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (31)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (32)

<223> η igual a a,t,g, or c <400> 42

aagctgcctt aggcttannn nnnnnnnnnn nn 32

<210> 43 <211> 51 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer reverse útil para geração de proteína de fusão de albumina em que metade da albumina é N-terminal da Proteína Terapêutica

<220>

<221 > misc_feature <222> (37)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (38)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (39)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature <222> (40)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(41)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(42)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (43)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature <222>(44)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(45)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature <222> (46)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(47)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (48)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (49)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (50)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (51)

<223> η igual a a,t,g, or c <400> 43

gcgcgcgttt aaacggccgg ccggcgcgcc ttattannnn nnnnnnnnnn η <210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44 Leu Asp Lys Arg 1

<210> 45

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45 Leu Glu Lys Arg 1

<210> 46

<211 >33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer forward útil para geração de proteína de fusão de albumina em que metade da albumina é c-terminal da Proteína Terapêutica

<220>

<221> misc_feature <222> (19)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (20)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (21)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (22)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature <222> (23)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221>misc feature <222> (24)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (25)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (26)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (27)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (29)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (30)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature

<222> (31)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature

<222> (32)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)

<223> η igual a a,t,g, or c

<400> 46

aggagcgtcg acaaaagann nnnnnnnnnn nnn 33

<210> 47 <211> 52 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer reverse útil para geração de proteína de fusão de albumina em que metade da albumina é c-terminal da Proteína Terapêutica

<220>

<221 > misc_feature <222> (38)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(40)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(41)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (42)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222>(43)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(44)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature <222>(46)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature

<222>(48)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222>(49)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222>(50)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (52)

<223> η igual a a,t,g, or c

<400> 47

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nn

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His 1 5

<210> 49

<211> 11

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) to (11)

<223> seqüência Kozak

<400> 49

ccgccaccat g 11

<210> 50

<211> 46

<212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer forward útil para inserir Proteína Terapêutica no vetor pC4:HSA

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(30)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220> <221 > misc_feature

<222> (39)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221> misc_feature

<222> (41)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (42)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature

<222>(43)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature <222> (44)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(45)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222>(46)

<223> η igual a a,t,g, or c <400> 50

ccgccgctcg aggggtgtgt ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn 46

<210> 51 <211> 55 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> primer reverse útil para inserir Proteína Terapêutica no vetor pC4:HSA

<220>

<221 > misc_feature

<222> (38)

<223> η igual a a,t,g, or c <220>

<221 > misc_feature <222> (39)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature <222>(40)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (41)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(42)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (43)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(44)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (45)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (46)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (47)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(48)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(49)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220> <221 > misc_feature

<222> (50)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (51)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > mísc_feature

<222> (52)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222> (53)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221 > misc_feature

<222>(54)

<223> η igual a a,t,g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)

<223> η igual a a,t,g, or c

<400> 51

agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nnnnn 55

<210> 52

<211> 733

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<40» 52

gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat 733

<210> 53

<211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222>(3)

<223> Xaa igual a quaisquer dos vinte L-aminoácidos naturalmente ocorrentes

<400> 53

Trp Ser Xaa Trp Ser

1 5

<210> 54

<211> 86

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência sintética com 4 cópias arranjadas uma ao lado da outra do sítio de ligação GAS encontrado no promotor IRF1 (Rothman et al., Immunity 1:457-468 (1994)), 18 nucleotídeos complementares ao promotor inicial SV40 e um sítio de restrição Xho.

<400> 54

gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc 60

cccgaaatat ctgccatctc aattag 86

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência cintética complemenntar ao promoter SV40; inclui um sítio de restrição Hind III.

<400> 55

gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27

<210> 56

<211> 271

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<221> Protein_Bind

<223> Promotor Sintético para uso em exames biológicos; inclui sítios de ligação GAS encontrado no promoter IRF1

<400> 56

ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60

aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 120 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 180 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 240 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t 271

<210> 57

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer sintético complementar a seqüência de promoter EGR-1 genômica humana; inclui um sítio de restrição Xho I.

<400> 57

gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32

<210> 58 <211> 31 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer sintético complementar a seqüência de promoter EGR-1 genômica humana; inclui um sítio de restrição Hind III.

<400> 58

gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31

<210> 59

<211> 12

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 59

ggggactttc cc 12

<210> 60 <211> 73 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer sintético com 4 cópias arranjadas uma ao lado da outra do sítio de ligação NF-KB (GGGGACTTTCCC), 18 nucleotídeos complementares a extremidade 5' da seqüência do promotor inicial SV40, e um sítio de restrição Xhol.

<400> 60

gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg 60 ccatctcaat tag 73

<210>61 <211> 256

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<221> Protein_Bind

<223> Promotor sintético para uso em exames biológicos; inclui sítios de ligação NF-KB.

<400> 61

ctcgagggga ctttcccggg gactttccgg ggactttccg ggactttcca tctgccatct 60

caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 120

cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga

180 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 240

cttttgcaaa aagctt 256

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primerforward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 62

caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23

<210> 63

<211>23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 63

caggtcaact taagggagtc tgg 23

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primerforward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 64

gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 65

caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23

<210> 66 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 66

gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23

<210> 67 <211 >23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward VH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 67

caggtacagc tgcagcagtc agg 23

<210> 68 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse JH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos <400> 68

tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 24

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse JH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 69

tgaagagacg gtgaccattg tccc 24 <210> 70 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse JH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 70

tgaggagacg gtgaccaggg ttcc 24

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse JH degenerado útil para ampliar domínios VH humanos

<400> 71

tgaggagacg gtgaccgtgg tccc 24

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primerforward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 72

gacatccaga tgacccagtc tcc 23

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 73

gatgttgtga tgactcagtc tcc 23

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos <400> 74

gatattgtga tgactcagtc tcc 23

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 75

gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 76

gacatcgtga tgacccagtc tcc 23

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primerforward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 77

gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 78

gaaattgtgc tgactcagtc tcc 23

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 79

cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 80

cagtctgccc tgactcagcc tgc 23

<210> 81 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 81

tcctatgtgc tgactcagcc acc 23

<210> 82 <211 >23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 82

tcttctgagc tgactcagga ccc 23

<210> 83

<211 >23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 83

cacgttatac tgactcaacc gcc 23 <210> 84

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 84

caggctgtgc tcactcagcc gtc 23

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primerforward Vlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 85

aattttatgc tgactcagcc cca 23

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 86

acgtttgatt tccaccttgg tccc 24

<210> 87

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 87

acgtttgatc tccagcttgg tccc 24

<210> 88

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos <400> 88

acgtttgata tccactttgg tccc 24

<210> 89

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 89

acgtttgatc tccaccttgg tccc 24

<210> 90

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 90

acgtttaatc tccagtcgtg tccc 24

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 91

cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23

<210> 92

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jkappa degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 92

cagtctgccc tgactcagcc tgc 23

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 93

tcctatgtgc tgactcagcc acc 23

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 94

tcttctgagc tgactcagga ccc 23

<210> 95

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 95

cacgttatac tgactcaacc gcc 23

<210> 96

<211 >23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 96

caggctgtgc tcactcagcc gtc 23

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse Jlambda degenerado útil para ampliar domínios VL humanos

<400> 97

aattttatgc tgactcagcc cca 23 <210> 98

<211> 23

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo sinal sintético

<400> 98

Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Ala Pro Ala Arg Gly

20

<210> 99

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Pro Met Val Trp Ala

20

<210> 100

<211 >24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gly Ser Leu Asp Lys Arg

20

<210> 101

<211> 1497

<212> DNA

<213> Hypocreajecorina

<400> 101

tctagagttg tgaagtcggt aatcccgctg tatagtaata cgagtcgcat ctaaatactc 60 cgaagctgct gcgaacccgg agaatcgaga tgtgctggaa agcttctagc gagcggctaa 120 attagcatga aaggctatga gaaattctgg agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 180 cttcgacaag caaagcgttc cgtcgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240 attcctaagt agcgatggaa ccggaataat ataataggca atacattgag ttgcctcgac 300 ggttgcaatg caggggtact gagcttggac ataactgttc cgtaccccac ctcttctcaa 360 cctttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc gtacaagtcg taatcactat taacccagac 420 tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 480 ctgcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaatgtagg attgttatcc gaactctgct 540 cgtagaggca tgttgtgaat ctgtgtcggg caggacacgc ctcgaaggtt cacggcaagg 600 gaaaccaccg atagcagtgt ctagtagcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 660 aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaagaagtca tataccagcg 720 gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttgtggggt 780 tgcagaagca acggcaaagc cccacttccc cacgtttgtt tcttcactca gtccaatctc 840 agctggtgat cccccaattg ggtcgcttgt ttgttccggt gaagtgaaag aagacagagg 900 taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat acaaccaagg gcagtgatgg aagacagtga 960 aatgttgaca ttcaaggagt atttagccag ggatgcttga gtgtatcgtg taaggaggtt 1020 tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt cacttctggt gaagtggtcc atattgaaat 1080 gtaagtcggc actgaacagg caaaagattg agttgaaact gcctaagatc tcgggccctc 1140 gggccttcgg cctttgggtg tacatgtttg tgctccgggc aaatgcaaag tgtggtagga 1200 tcgaacacac tgctgccttt accaagcagc tgagggtatg tgataggcaa atgttcaggg 1260 gccactgcat ggtttcgaat agaaagagaa gcttagccaa gaacaatagc cgataaagat 1320 agcctcatta aacggaatga gctagtaggc aaagtcagcg aatgtgtata tataaaggtt 1380 cgaggtccgt gcctccctca tgctctcccc atctactcat caactcagat cctccaggag 1440 acttgtacac catcttttga ggcacagaaa cccaatagtc aaccgcggac tggcatc 1497

<210> 102 <211> 366 <212> DNA

<213> Aspergillus nidulans <400> 102

agatctggtt cctgagtaca tctaccgatg cgcctcgatc cccctcttag ccgcatgaga 60 ttcctaccat ttatgtccta tcgttcaggg tcctatttgg accgctagaa atagactctg 120 ctcgatttgt ttccattatt cacgcaatta cgatagtatt tggctctttt cgtttggccc 180 aggtcaattc gggtaagacg cgatcacgcc attgtggccg ccggcgttgt gctgctgcta 240 ttccccgcat ataaacaacc cctccaccag ttcgttgggc tttgcgaatg ctgtactcta 300 tttcaagttg tcaaaagaga ggattcaaaa aattataccc cagatatcaa agatatcaaa 360 gccatc 366

<210> 103 <211> 1646 <212> DNA

<213> Hypocreajecorina <400> 103

tctagagttg tgaagtcggt aatcccgctg tatagtaata cgagtcgcat ctaaatactc 60 cgaagctgct gcgaacccgg agaatcgaga tgtgctggaa agcttctagc gagcggctaa 120 attagcatga aaggctatga gaaattctgg agacggcttg ttgaatcatg gcgttccatt 180 cttcgacaag caaagcgttc cgtcgcagta gcaggcactc attcccgaaa aaactcggag 240 attcctaagt agcgatggaa ccggaataat ataataggca atacattgag ttgcctcgac 300 ggttgcaatg caggggtact gagcttggac ataactgttc cgtaccccac ctcttctcaa 360 cctttggcgt ttccctgatt cagcgtaccc gtacaagtcg taatcactat taacccagac 420 tgaccggacg tgttttgccc ttcatttgga gaaataatgt cattgcgatg tgtaatttgc 480 ctgcttgacc gactggggct gttcgaagcc cgaatgtagg attgttatcc gaactctgct 540 cgtagaggca tgttgtgaat ctgtgtcggg caggacacgc ctcgaaggtt cacggcaagg 600 gaaaccaccg atagcagtgt ctagtagcaa cctgtaaagc cgcaatgcag catcactgga 660 aaatacaaac caatggctaa aagtacataa gttaatgcct aaagaagtca tataccagcg 720 gctaataatt gtacaatcaa gtggctaaac gtaccgtaat ttgccaacgg cttgtggggt 780 tgcagaagca acggcaaagc cccacttccc cacgtttgtt tcttcactca gtccaatctc 840 agctggtgat cccccaattg ggtcgcttgt ttgttccggt gaagtgaaag aagacagagg 900 taagaatgtc tgactcggag cgttttgcat acaaccaagg gcagtgatgg aagacagtga 960 aatgttgaca ttcaaggagt atttagccag ggatgcttga gtgtatcgtg taaggaggtt 1020

tgtctgccga tacgacgaat actgtatagt cacttctggt gaagtggtcc atattgaaat 1080

gtaagtcggc actgaacagg caaaagattg agttgaaact gcctaagatc tcgggccctc 1140

gggccttcgg cctttgggtg tacatgtttg tgctccgggc aaatgcaaag tgtggtagga 1200

tcgaacacac tgctgccttt accaagcagc tgagggtatg tgataggcaa atgttcaggg 1260

gccactgcat ggtttcgaat agaaagagaa gcttagcctg cagcctctta tcgagaaaga 1320

aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1380

tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1440

cttagccaag aacaatagcc gataaagata gcctcattaa acggaatgag ctagtaggca 1500

aagtcagcga atgtgtatat ataaaggttc gaggtccgtg cctccctcat gctctcccca 1560

tctactcatc aactcagatc ctccaggaga cttgtacacc atcttttgag gcacagaaac 1620

ccaatagtca accgcggact ggcatc 1646

<210> 104

<211> 516

<212> DNA

<213> Aspergillus nidulans

<400> 104

agatctggtt cctgagtaca tctaccgatg cgcctcgatc cccctcttag ccgcatgaga 60

ttcctaccat ttatgtccta tcgttcaggg tcctatttgg accgctagaa atagactctg 120

ctcgatttgt ttccattatt cacgcaatta cgatagtatt tggctctttt cgtttggccc 180

aggtcaattc gggtaagacg cgatcacgcc attgtggccg ccggcgctgc agcctcttat 240

cgagaaagaa attaccgtcg ctcgtgattt gtttgcaaaa agaacaaaac tgaaaaaacc 300

cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt gattgcagct tccaatttcg tcacacaaca 360

aggtcctacg ccggcgttgt gctgctgcta ttccccgcat ataaacaacc cctccaccag 420

ttcgttgggc tttgcgaatg ctgtactcta tttcaagttg tcaaaagaga ggattcaaaa 480

aattataccc cagatatcaa agatatcaaa gccatc 516

<210> 105

<211> 117

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 105

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60

gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatcgc ctagtaa 117

<210> 106

<211> 117

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 106

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60

gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatcgc ctagtaa 117

<210> 107

<211> 117

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 107

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60 gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatcgc ctagtaa 117

<210> 108

<211> 117

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 108

<210> 109 <211> 108 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 109

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60 gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatc 108

<210> 110

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 110

gcctgtgaca ctgccacctg tgtgactcat cggctggcag gcttgctgag cagatcaggg 60 ggtgtggtga agaacaactt tgtgcccacc aatgtgggtt ccaaagcctt t 111

<210> 111

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 111

<210> 112

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 112

gcctgtgaca ctgccacctg tgtgactcat cggctggcag gcttgctgag cagatcaggg 60 ggtgtggtga agaacaactt tgtgcccacc aatgtgggtt ccaaagccttt 111

<210> 113 <211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 113

gcctgtgaca ctgccacctg tgtgactcat cggctggcag gcttgctgag cagatcaggg 60

ggtgtggtga agaacaactt tgtgcccacc aatgtgggtt ccaaagcctt t 111

<210> 114

<211> 462

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 114

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420

gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462

<210> 115

<211 >462

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 115

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420

gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462

<210> 116

<211> 108

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 116

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60

gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatc 108

<210> 117

<211> 1809

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 117

atgcatagca aagtcacaat catatgcatc agatttctct tttggtttct tttgctctgc 60 atgcttattg ggaagtcaca tactgaagat gacatcataa ttgcaacaaa gaatggaaaa 120 gtcagaggga tgaacttgac agtttttggt ggcacggtaa cagcctttct tggaattccc 180 tatgcacagc cacctcttgg tagacttcga ttcaaaaagc cacagtctct gaccaagtgg 240 tctgatattt ggaatgccac aaaatatgca aattcttgct gtcagaacat agatcaaagt 300 tttccaggct tccatggatc agagatgtgg aacccaaaca ctgacctcag tgaagactgt 360 ttatatctaa atgtatggat tccagcacct aaaccaaaaa atgccactgt attgatatgg 420 atttatggtg gtggttttca aactggaaca tcatctttac atgtttatga tggcaagttt 480 ctggctcggg ttgaaagagt tattgtagtg tcaatgaact atagggtggg tgccctagga 540 ttcttagctt tgccaggaaa tcctgaggct ccagggaaca tgggtttatt tgatcaacag 600 ttggctcttc agtgggttca aaaaaatata gcagcctttg gtggaaatcc taaaagtgta 660 actctctttg gagaaagtgc aggagcagct tcagttagcc tgcatttgct ttctcctgga 720 agccattcat tgttcaccag agccattctg caaagtggat cctttaatgc tccttgggcg 780 gtaacatctc tttatgaagc taggaacaga acgttgaact tagctaaatt gactggttgc 840 tctagagaga atgagactga aataatcaag tgtcttagaa ataaagatcc ccaagaaatt 900 cttctgaatg aagcatttgt tgtcccctat gggactcctt tgtcagtaaa ctttggtccg 960 accgtggatg gtgattttct cactgacatg ccagacatat tacttgaact tggacaattt 1020 aaaaaaaccc agattttggt gggtgttaat aaagatgaag ggacagcttt tttagtctat 1080 ggtgctcctg gcttcagcaa agataacaat agtatcataa ctagaaaaga atttcaggaa 1140 ggtttaaaaa tattttttcc aggagtgagt gagtttggaa aggaatccat cctttttcat 1200 tacacagact gggtagatga tcagagacct gaaaactacc gtgaggcctt gggtgatgtt 1260 gttggggatt ataatttcat atgccctgcc ttggagttca ccaagaagtt ctcagaatgg 1320 ggaaataatg cctttttcta ctattttgaa caccgatcct ccaaacttcc gtggccagaa 1380 tggatgggag tgatgcatgg ctatgaaatt gaatttgtct ttggtttacc tctggaaaga 1440 agagataatt acacaaaagc cgaggaaatt ttgagtagat ccatagtgaa acggtgggca 1500 aattttgcaa aatatgggaa tccaaatgag actcagaaca atagcacaag ctggcctgtc 1560 ttcaaaagca ctgaacaaaa atatctaacc ttgaatacag agtcaacaag aataatgacg 1620 aaactacgtg ctcaacaatg tcgattctgg acatcatttt ttccaaaagt cttggaaatg 1680 acaggaaata ttgatgaagc agaatgggag tggaaagcag gattccatcg ctggaacaat 1740 tacatgatgg actggaaaaa tcaatttaac gattacacta gcaagaaaga aagttgtgtg 1800 ggtctctaa 1809

<210> 118

<211> 1809

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 118

atgcatagca aagtcacaat catatgcatc agatttctct tttggtttct tttgctctgc 60 atgcttattg ggaagtcaca tactgaagat gacatcataa ttgcaacaaa gaatggaaaa 120 gtcagaggga tgaacttgac agtttttggt ggcacggtaa cagcctttct tggaattccc 180 tatgcacagc cacctcttgg tagacttcga ttcaaaaagc cacagtctct gaccaagtgg 240 tctgatattt ggaatgccac aaaatatgca aattcttgct gtcagaacat agatcaaagt 300 tttccaggct tccatggatc agagatgtgg aacccaaaca ctgacctcag tgaagactgt 360 ttatatctaa atgtatggat tccagcacct aaaccaaaaa atgccactgt attgatatgg 420 atttatggtg gtggttttca aactggaaca tcatctttac atgtttatga tggcaagttt 480 ctggctcggg ttgaaagagt tattgtagtg tcaatgaact atagggtggg tgccctagga 540 ttcttagctt tgccaggaaa tcctgaggct ccagggaaca tgggtttatt tgatcaacag 600 ttggctcttc agtgggttca aaaaaatata gcagcctttg gtggaaatcc taaaagtgta 660 actctctttg gagaaagtgc aggagcagct tcagttagcc tgcatttgct ttctcctgga 720 agccattcat tgttcaccag agccattctg caaagtggat cctttaatgc tccttgggcg 780 gtaacatctc tttatgaagc taggaacaga acgttgaact tagctaaatt gactggttgc 840 tctagagaga atgagactga aataatcaag tgtcttagaa ataaagatcc ccaagaaatt 900 cttctgaatg aagcatttgt tgtcccctat gggactcctt tgtcagtaaa ctttggtccg 960 accgtggatg gtgattttct cactgacatg ccagacatat tacttgaact tggacaattt 1020

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ggtctctaa 1809

<210> 119

<211> 641

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 119

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Leu

<210> 120

<211> 691

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 120

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<212> PRT

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<400> 121

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<210> 132

<211> 1137

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

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Leu

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<211> 37

<212> PRT

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<210> 135

<211> 37

<212> PRT

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<400> 135

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<211> 37

<212> PRT

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<400> 136

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35

<210> 137 <211> 36

<212> PRT

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<400> 137

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<211> 37

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<212> PRT

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<400> 139

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<212> PRT

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<211> 153

<212> PRT

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<211> 46

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 149

caagctgcct taggcttaca ctcccaaggt accttcacct ccgact 46

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<211> 59

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 150

gcgcgcgcct aaggttacta ggcgatgtta tttctgtttc tcttggtgtt catcaacca 59

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<212> DNA

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<400> 154

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35

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<212> DNA

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<211> 1494

<212> DNA

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gcccgcccct gcatccctaa aagcttcggc tacagctcgg tggtgtgtgt ctgcaatgcc 60 catactgtg actcctttga ccccccgacc tttcctgccc ttggtacctt cagccgctat 120 gagagtacac gcagtgggcg acggatggag ctgagtatgg ggcccatcca ggctaatcac 180 acgggcacag gcctgctact gaccctgcag ccagaacaga agttccagaa agtgaaggga 240 tttggagggg ccatgacaga tgctgctgct ctcaacatcc ttgccctgtc accccctgcc 300 caaaatttgc tacttaaatc gtacttctct gaagaaggaa tcggatataa catcatccgg 360 gtacccatgg ccagctgtga cttctccatc cgcacctaca cctatgcaga cacccctgat 420 gatttccagt tgcacaactt cagcctccca gaggaagata ccaagctcaa gatacccctg 480 attcaccgag ccctgcagtt ggcccagcgt cccgtttcac tccttgccag cccctggaca 540 tcacccactt ggctcaagac caatggagcg gtgaatggga aggggtcact caagggacag 600 cccggagaca tctaccacca gacctgggcc agatactttg tgaagttcct ggatgcctat 660 gctgagcaca agttacagtt ctgggcagtg acagctgaaa atgagccttc tgctgggctg 720 ttgagtggat accccttcca gtgcctgggc ttcacccctg aacatcagcg agacttcatt 780 gcccgtgacc taggtcctac cctcgccaac agtactcacc acaatgtccg cctactcatg 840 ctggatgacc aacgcttgct gctgccccac tgggcaaagg tggtactgac agacccagaa 900 gcagctaaat atgttcatgg cattgctgta cattggtacc tggactttct ggctccagcc 960 aaagccaccc taggggagac acaccgcctg ttccccaaca ccatgctctt tgcctcagag 1020 gcctgtgtgg gctccaagtt ctgggagcag agtgtgcggc taggctcctg ggatcgaggg 1080 atgcagtaca gccacagcat catcacgaac ctcctgtacc atgtggtcgg ctggaccgac 1140 tggaaccttg ccctgaaccc cgaaggagga cccaattggg tgcgtaactt tgtcgacagt 1200 cccatcattg tagacatcac caaggacacg ttttacaaac agcccatgtt ctaccacctt 1260 ggccacttca gcaagttcat tcctgagggc tcccagagag tggggctggt tgccagtcag 1320 aagaacgacc tggacgcagt ggcactgatg catcccgatg gctctgctgt tgtggtcgtg 1380 ctaaaccgct cctctaagga tgtgcctctt accatcaagg atcctgctgt gggcttcctg 1440 gagacaatct cacctggcta ctccattcac acctacctgt ggcatcgcca gtga 1494

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<212> PRT

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<400> 161

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Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg 130 135 140

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Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu 165 170 175

Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala 180 185 190

Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp 195 200 205

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Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu 275 280 285

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 162

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<400> 163

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Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350

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Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile 965 970 975

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Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp 995 1000 1005

Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro 1010 1015 1020

Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val 1045 1050 1055

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<210> 165

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<212> PRT

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<400> 165

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<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 237

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<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<212> DNA

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<210> 241

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 241

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<210> 242

<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 242

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120

ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180

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acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300

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gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480

tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540

gaggaagraa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600

catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660

gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720

cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780

cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840

cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900

cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960

ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020

aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080

aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140

gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200

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attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320

attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359

<210> 243 <211> 1359 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 243

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120

ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180

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cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780

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<210> 244

<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 244

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120

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cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900

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aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080

aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140

gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200 aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260

attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320

attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359

<210> 245

<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 245

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120

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gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720

cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780

cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840

cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900

cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960

ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020

aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080

aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140

gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200

aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260

attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320

attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359

<210> 246

<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 246

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

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ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180

aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240

acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300

gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360

ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420

gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480

tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540

gaggaagraa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600

catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660

gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720

cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780

cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840 cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900

cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960

ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020

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attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359

<210> 247

<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 247

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<210> 248

<211> 1359

<212> DNA

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<211> 1359

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 249

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<210> 250

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 250

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<211 >678

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

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<210> 252

<211 >683

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 252

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<210> 253

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<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 253

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<210> 254

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 254

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<210> 255

<211 >637

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 255

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

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<210> 256

<211> 1138

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 256

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Gly Leu

<210> 257

<211> 649

<212> PRT

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<400> 257

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<210> 258

<211> 689

<212> PRT

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<400> 258

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Val

<210> 259

<211> 649

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 259

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<210> 260

<211> 689 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 260

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His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 115 120 125

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Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

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Leu

<210> 261

<211 >647

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 261

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<211 >685

<212> PRT

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<400> 262

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<210> 263

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<212> PRT

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<400> 263

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<210> 264

<211> 685

<212> PRT

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<400> 264

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<211> 1138

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 265

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15

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Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80

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Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445

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Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510

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<212> PRT

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<400> 266

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Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320

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Leu

<210> 273

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<400> 273

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<211> 685

<212> PRT

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<400> 274

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Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 325 330 335

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<210> 275

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 275

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<400> 276

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<400> 279

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Leu

<210> 280

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<210> 281

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<212> PRT

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<400> 281

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<210> 282 <211> 639

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 282

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<400> 286

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<400> 291

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<210> 292

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<211>1106

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<400> 293

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<400> 294

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Leu 1105

<210> 295

<211> 1106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 295

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<212> PRT

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<400> 296

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Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe 260 265 270

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Leu

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Leu

<210> 302

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<212> PRT

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<400> 302

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<210> 305

<211> 1137

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 305

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<210> 310

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<213> Homo sapiens

<400> 310

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<212> PRT

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<211> 638

<212> PRT

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<210> 313

<211> 638

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 313

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<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (65)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly <400> 314

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<210> 322

<211 >922

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

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<211> 1037

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<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (207)

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<210> 326

<211> 1037

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<212> PRT

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<221 > MISC_FEATURE

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<212> PRT

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<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (691)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

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<220>

<221 > MISC FEATURE <222> (106)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

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<213> Homo sapiens

<400> 336

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<211 >28

<212> PRT

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<400> 338

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<211 >40

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<210> 347

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<212> PRT

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<210> 348

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 348

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<210> 349

<211>40

<212> PRT

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35 40

<210> 350

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<212> PRT

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Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala Glu Gln 20 25 30

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<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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1 5 10 15

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20 25 30 Arg Ile Leu Ala Arg Val 35

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<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 352

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<210> 353

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 353

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Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala Glu Gln 20 25 30

Asn Arg Ile Ile Phe Asp Ser Val 35 40

<210> 354

<211 >40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 354

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Leu Leu Glu Leu Ala Arg Thr Gln Ser Gln Arg Glu Arg Ala Glu Gln 20 25 30

Asn Arg Ile Ile Phe Asp Ser Val 35 40 <210> 355

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 355

Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu 1 5 10 15

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Arg Ile Leu Ala Arg Val 35

<210> 356

<211 >38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 356

Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu 1 5 10 15

Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala 20 25 30

Arg Ile Leu Ala Arg Val 35

<210> 357

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 357

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Gln

<210> 358

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 358

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Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80

Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95

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Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400

Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415

Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430

Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460

Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480

Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495

Gln

<210> 359

<211>153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 359

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<210> 360

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<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 360

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<210> 361

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 361

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<212> PRT

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35 <210> 363

<211> 37

<212> PRT

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<400> 363

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<210> 364

<211> 37

<212> PRT

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<400> 364

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<211> 37

<212> PRT

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<400> 365

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Gly Ser Lys Ala Phe

35

<210> 366

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<400> 366

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35

<210> 367

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<212> PRT

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<400> 367

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<210> 368

<211 >602

<212> PRT

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<400> 368

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<210> 369

<211 >602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 369

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595 600

<210> 370

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 370

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Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val Thr Leu Phe Gly 210 215 220

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595 600

<210> 371

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 371

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<210> 372

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 372

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30

Arg Asn Asn Ile Ala 35

<210> 373

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 373

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15

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Arg Asn Asn Ile Ala

35

<210> 374 <211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 374

Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15

Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30

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Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205

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Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240

Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255

Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285

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Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320

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Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460

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Gln

<210> 375

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 375

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Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140

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Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190

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Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240

Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255

Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270

His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285

Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300

Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320

Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335

Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350

Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365

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Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460

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Gln

<210> 376

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 376

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Gln

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<211 >497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gln

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<211> 37

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<400> 379

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<210> 380

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 380 439

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<210> 381

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<400> 381

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<212> PRT

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<210> 384

<211 >497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gln

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<211> 37

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<213> Homo sapiens

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35

<210> 386

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 386

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<210> 387

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 387

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<400> 388

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<210> 389

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 389

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<210> 390

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390

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Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys Pro Ala Leu Glu 420 425 430

Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala Phe Phe Tyr Tyr 435 440 445

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<210> 391

<211> 529

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 391

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515 520 525

Val

<210> 392

<211> 497

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 392

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130 135 140

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Gln

<210> 393

<211> 29

<212> PRT

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<400> 393

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<210> 394

<211> 29

<212> PRT

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20 25

<210> 395

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 395

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1 5 10 15

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20 25

<210> 396

<211> 452 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 396

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Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys 305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln 325 330 335

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450

<210> 397

<211> 29

<212> PRT

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<400> 397

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20 25 <210> 398

<211> 29

<212> PRT

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<400> 398

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<210> 399

<211> 602

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 399

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<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 400

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<211> 452

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<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MISC_FEATURE <222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 401

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<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 402

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<210> 403

<211 >452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 403

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<210> 404

<211 >452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MISC_FEATURE

<222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 404

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<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 405

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<210> 406

<211> 452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly <400> 406

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<210> 407

<211 >452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly <400> 407

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Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln 290 295 300

Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys 305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln 325 330 335

Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly 340 345 350

Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu 355 360 365

Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro 370 375 380

Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg 385 390 395 400

Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro 405 410 415

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Gln Lys Ile Lys 450

<210> 408

<211 >452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (183)

<223> Xaa igual a Glu ou Gly

<400> 408

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Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe 65 70 75 80

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<223> Xaa igual a Glu ou Gly

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (183)

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<220>

<221 > MISC_FEATURE

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<222> (183)

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<210> 454

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 454

catgatcttc aaatggacac t

<210> 455

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 455

tcccgcccgc ggcgaagatg acatcataa

<210> 456

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 456

catgatcttc aaatggacac t

<210> 457

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 457

tcccgcccgc ggcgaagatg acatcataa

<210> 458

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 458

catgatcttc aaatggacac t

<210> 459

<211> 40

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 459

cacgatacgc cttaggctta gaagatgaca tcataattgc

<210> 460

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 460

catatatggc gcgcctcatt agacttttgg aaaaaatgat gtcca

<210> 461

<211> 43

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 461

aagctgcctt aggcttaacc ttcagccgct atgagagtac acg

<210> 462

<211 >36

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 462

aggcgcgcct tatcctcctt cggggttcag ggcaag

<210> 463

<211> 59

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 463 gcttattccg gaagcctcga caaaagacat tcacaaggta cattcactag tgattattc 59

<210> 464

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 464

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcagt attcatcaac cattgaa 57

<210> 465

<211> 59

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 465

gcttattccg gaagcctcga caaaagacat tcacaaggta cattcactag tgattattc 59

<210> 466

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 466

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcagt attcatcaac cattgaa 57

<210> 467

<211> 50

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 467

gtcagagcct taggcttaca ttcacaaggt acattcacta gtgattattc 50

<210> 468

<211> 37

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 468

ccatccggcg cgccttaagt attcatcaac cattgaa 37

<210> 469

<211> 47

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 469

agacttccgg aagcctcgac aaaagatcac aaggtacatt cactagt 47 <210> 470

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 470

ctttaaatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcagt attcatcaac cattgaa

<210> 471

<211 >47

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 471

gtcagagcct taggcttatc acaaggtaca ttcactagtg attattc 47

<210> 472

<211> 37

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 472

ccatccggcg cgccttaagt attcatcaac cattgaa 37

<210> 473

<211> 40

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 473

cacgatacgc cttaggctta gaagatgaca tcataattgc 40

<210> 474

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 474

catatatggc gcgcctcatt agacttttgg aaaaaatgat gtcca 45

<210> 475

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 475

ttaacgtgct gccttaggct taattggtgc cactgtccat gagctttcac g 51

<210> 476 <211>43

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 476

aggcgcgcct tactgggtat tgtccaagac ctcaatcctt tgg 43

<210> 477

<211 >43

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 477

gcccccgccc gcggattggt gccactgtcc atgagctttc acg 43

<210> 478

<211> 68

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 478

agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcctg ggtattgtcc aagacctcaa tcctttgg 68

<210> 479

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 479

ttaacgtgct gccttaggct taattggtgc cactgtccat gagctttcac g 51

<210> 480

<211> 43

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 480

aggcgcgcct tactgggtat tgtccaagac ctcaatcctt tgg 43

<210> 481

<211> 42

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 481

gcccccggtc gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cg 42

<210> 482 <211> 68 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 482

agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcctg ggtattgtcc aagacctcaa 60 tcctttgg 68

<210> 483

<211 >44

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 483

cgtgctgcct taggagttga cacagtgccc tggttcccaa gaac 44

<210> 484

<211> 43

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 484

aggcgcgcct tactgggtat tgtccaagac ctcaatcctt tgg 43

<210> 485

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 485

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60

gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatcgc c 111

<210> 486

<211> 111

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 486

cactcccaag gtaccttcac ctccgactac tccaagtact tggactccag aagagcccaa 60

gacttcgtgc aatggttgat gaacaccaag agaaacagaa ataacatcgc c 111

<210> 487

<211> 708

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 487

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser 1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30

Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45

Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60

Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75 80

Val Ser Leu Glu Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr 85 90 95

Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu 100 105 110

Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Asp Ala His Lys Ser 115 120 125

Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala 130 135 140

Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu 145 150 155 160

Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys 165 170 175

Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu 180 185 190

Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly 195 200 205

Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys 210 215 220

Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg 225 230 235 240

Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr 245 250 255

Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe 260 265 270

Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 275 280 285

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys 290 295 300

Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg 305 310 315 320 Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala 325 330 335

Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala 340 345 350

Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys 355 360 365

Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala 370 375 380

Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu 385 390 395 400

Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val 405 410 415

Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe 420 425 430

Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 435 440 445

Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 450 455 460

Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu 465 470 475 480

Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 485 490 495

Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys 500 505 510

Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn 515 520 525

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro 530 535 540

Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys 545 550 555 560

Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 565 570 575

Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 580 585 590

Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg 595 600 605

Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 610 615 620 Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser 625 630 635 640

Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val 645 650 655

Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp 660 665 670

Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu 675 680 685

Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 690 695 700

Ala Leu Gly Leu 705

<210> 488

<211> 745

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 488

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser 1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala 20 25 30

Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp 35 40 45

Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu 50 55 60

Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly 65 70 75 80

Val Ser Leu Glu Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr 85 90 95

Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu 100 105 110

Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala His Ser Gln Gly Thr 115 120 125

Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp 130 135 140

Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala 145 150 155 160 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 165 170 175

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 180 185 190

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 195 200 205

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 210 215 220

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 225 230 235 240

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 245 250 255

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 260 265 270

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 275 280 285

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 290 295 300

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 305 310 315 320

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 325 330 335

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 340 345 350

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 355 360 365

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 370 375 380

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 385 390 395 400

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 405 410 415

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 420 425 430

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 435 440 445

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 450 455 460 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 465 470 475 480

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 485 490 495

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 500 505 510

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 515 520 525

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 530 535 540

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 545 550 555 560

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 565 570 575

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 580 585 590

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 595 600 605

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 610 615 620

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 625 630 635 640

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 645 650 655

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 660 665 670

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 675 680 685

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 690 695 700

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 705 710 715 720

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 725 730 735

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 740 745 <210> 489

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 489

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30

Arg Asn Asn Ile Ala 35

<210> 490

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 490

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30

Arg Asn Asn Ile Ala 35

<210> 491

<211> 1755

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 491

gatgctcaca agtctgaagt tgctcatcga ttcaaggatt tgggtgaaga aaacttcaag 60 gctttggttt tgattgcttt cgctcaatac ttgcaacaat gtccattcga agatcacgtt 120 aagttggtta acgaagttac tgaattcgct aagacttgtg ttgctgatga atctgctgaa 180

aactgtgata agtctttgca cactttgttc ggtgataagt tgtgtactgt tgctactttg 240 agagaaactt acggtgaaat ggctgattgt tgtgctaagc aagaaccaga aagaaacgaa 300 tgtttcttgc aacacaagga tgataaccca aacttgccaa gattggttag accagaagtt 360 gatgttatgt gtactgcttt ccacgataac gaagaaactt tcttgaagaa gtacttgtac 420 gaaattgcta gaagacaccc atacttctac gctccagaat tgttgttctt cgctaagaga 480 tacaaggctg ctttcactga atgttgtcaa gctgctgata aggctgcttg tttgttgcca 540 aagttggatg aattgagaga tgaaggtaag gcttcttctg ctaagcaaag attgaagtgt 600 gcttctttgc aaaagttcgg tgaaagagct ttcaaggctt gggctgttgc tagattgtct 660 caaagattcc caaaggctga attcgctgaa gtttctaagt tggttactga tttgactaag 720

gttcacactg aatgttgtca cggtgatttg ttggaatgtg ctgatgatag agctgatttg 780 gctaagtaca tttgtgaaaa ccaagattct atttcttcta agttgaagga atgttgtgaa 840 aagccattgt tggaaaagtc tcactgtatt gctgaagttg aaaacgatga aatgccagct 900 gatttgccat ctttggctgc tgatttcgtt gaatctaagg atgtttgtaa gaactacgct 960 gaagctaagg atgttttctt gggtatgttc ttgtacgaat acgctagaag acacccagat 1020 tactctgttg ttttgttgtt gagattggct aagacttacg aaactacttt ggaaaagtgt 1080 tgtgctgctg ctgatccaca cgaatgttac gctaaggttt tcgatgaatt caagccattg 1140 gttgaagaac cacaaaactt gattaagcaa aactgtgaat tgttcgaaca attgggtgaa 1200 tacaagttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggttccaca agtttctact 1260 ccaactttgg ttgaagtttc tagaaacttg ggtaaggttg gttctaagtg ttgtaagcac 1320 ccagaagcta agagaatgcc atgtgctgaa gattacttgt ctgttgtttt gaaccaattg 1380 tgtgttttgc acgaaaagac tccagtttct gatagagtta ctaagtgttg tactgaatct 1440 ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagttg atgaaactta cgttccaaag 1500 gaattcaacg ctgaaacttt cactttccac gctgatattt gtactttgtc tgaaaaggaa 1560 agacaaatta agaagcaaac tgctttggtt gaattggtta agcacaagcc aaaggctact 1620 aaggaacaat tgaaggctgt tatggatgat ttcgctgctt tcgttgaaaa gtgttgtaag 1680 gctgatgata aggaaacttg tttcgctgaa gaaggtaaga agttggttgc tgcttctcaa 1740 gctgccttag gctta 1755

<210> 492

<211> 585

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 492

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585

Claims

1. Proteína de fusão da albumina compreendendo um polipeptídeo de colinesterase sérica fundido a um polipeptídeo de albumina, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de colinesterase sérica é selecionado de: (a) uma colinesterase sérica de comprimento pleno; (b) uma colinesterase sérica madura; e (c) um fragmento de colinesterase sérica, onde o fragmento possui atividade de colinesterase sérica; e (d) um polipeptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à colinesterase sérica humana madura, onde o polipeptídeo possui atividade de colinesterase sérica; e onde o polipeptídeo de albumina é selecionado de: (i) uma albumina de comprimento pleno; (ii) uma albumina madura; (iii) um fragmento de albumina, onde o fragmento de albumina possuí a capacidade de prolongar a meia vida útil do soro do polipeptídeo de colinesterase sérica fundido em comparação ao polipeptídeo de colinesterase sérica não fundido; (iv) um polipeptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1, onde o polipeptídeo possui a capacidade de prolongar a meia vida útil do soro do polipeptídeo de colinesterase sérica fundido, em comparação ao polipeptídeo de colinesterase sérica não fundido; (v) amínoácidos 1 a 585 da SEQ ID N0:1; e (vi) amínoácidos 1 a 387 da SEQ ID N0:1.

2. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de colinesterase sérica é colinesterase sérica madura e o polipeptídeo de albumina é albumina madura.

3. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de albumina é pelo menos 99% idêntico à SEQ ID NO:1.

4. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de colinesterase sérica é pelo menos 99% idêntico à colinesterase sérica ,humana, madura.

5. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma seqüência líder secretora.

6. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição de acordo com a reivindicação 6.

8. Proteína de fusão da albumina compreendendo um polipeptídeo de glicocerebrosidase fundido a um polipeptídeo de albumina, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de glicocerebrosidase é selecionado de: (a) uma glicocerebrosidase de comprimento pleno; (b) uma glicocerebrosidase madura; e (c) um fragmento de glicocerebrosidase, onde o fragmento possui atividade de glicocerebrosidase; e (d) um polipeptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à glicocerebrosidase humana madura, onde o polipeptídeo possui atividade de glicocerebrosidase; e onde o polipeptídeo de albumina é selecionado de: (i) uma albumina de comprimento pleno; (ii) uma albumina madura; (iii) um fragmento de albumina, onde o fragmento de albumina possui a capacidade de prolongar a meia vida útil do soro do polipeptídeo de glicocerebrosidase fundido em comparação ao polipeptídeo de glicocerebrosidase sérica não fundido; (iv) um polipeptídeo consistindo em uma seqüência de aminoácido pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1, onde o polipeptídeo possui a capacidade de prolongar a meia vida útil do soro do polipeptídeo de glicocerebrosidase fundido, em comparação ao polipeptídeo de glicocerebrosidase não fundido; (v) aminoácidos 1 a 585 da SEQ ID NO:1; e (vi) aminoácidos 1 a 387 da SEQ ID NO: 1.

9. Produto de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de glicocerebrosidase é glicocerebrosidase madura e o polipeptídeo de albumina é albumina madura.

10. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de albumina é pelo menos 99% idêntico à SEQ ID NO:1.

11. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de glicocerebrosidase é pelo menos 99% idêntico à glicocerebrosidase, humana, madura.

12. Proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma seqüência líder secretora.

13. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a proteína de fusão da albumina de acordo com a reivindicação 8 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição de acordo com a reivindicação 13.