EA022201B1 - Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к агенту, способному связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащему линкер на основе человеческого сывороточного альбумина. Также раскрываются наборы для диагностического и терапевтического применения агента, способы его получения и фармацевтические композиции и применение для лечения пролиферативных заболеваний.

Description

Изобретение включает агент, способный связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащий линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (Н8Л). В одном варианте изобретения Н8Л линкер включает две аминокислотные замены. Помимо этого, изобретение включает способы получения и применения конъюгатов Н8Л линкеров.

Предпосылки создания изобретения

Сывороточные альбумины принадлежат к семейству белков, которое включает альфа-фетопротеин и специфический компонент к человеческой группе, также известный как витамин-И-связывающий белок. Сывороточные альбумины представляют собой основные растворимые белки системы кровообращения (сердечно-сосудистой системы) и участвуют во многих жизненно важных физиологических процессах. Сывороточный альбумин обычно составляет около 50% массы сухого вещества всех компонентов крови. Альбумины и родственные им белки крови также играют важную роль в транспорте, распределении и метаболизме многих эндогенных и экзогенных лигандов в человеческом организме, включая множество разнообразных химических молекул, таких как жирные кислоты, аминокислоты, стероиды, кальций, металлы, такие как медь и цинк, и различные фармацевтические агенты. Полагают, что молекулы семейства альбуминов содействуют переносу многих из этих лигандов через поверхности раздела между органом, таким как печень, кишечник, почки и мозг, и сердечно-сосудистой системой. Таким образом, альбумины задействованы в широком диапазоне функций сердечно-сосудистой системы и метаболических функций.

Человеческий сывороточный альбумин (Н8А) представляет собой белок массой около 66500 кДа и содержит 585 аминокислот, включающих по меньшей мере 17 дисульфидных мостиков. Так же как многие члены семейства альбуминов, человеческий сывороточный альбумин играет важную роль в физиологии человека и локализуется практически во всех человеческих тканях и выделениях организма. Как указано выше, Н8А способен связывать и переносить широкий спектр лигандов по всей сердечнососудистой системе, включая длинноцепочечные жирные кислоты, которые в противном случае были бы нерастворимы в циркулирующей плазме.

Сущность изобретения

Изобретение относится к агенту, способному связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащему линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (Н8А), включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности 8ЕС ГО N0: 1 и содержащую первый связывающий элемент, связанный с аминоконцом Н8А линкера, и второй связывающий элемент, связанный с карбоксиконцом НА8 линкера, причем каждый из первого и второго связывающих элементов специфически связывает ЕтЬВ2 или ЕгЬВЗ и когда ί) первый связывающий элемент специфически связывает ЕтЬВЗ, второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2; и ίί) первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2, второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВЗ.

В другом варианте осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕС ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления агент дополнительно содержит полипептидные коннекторы на амино- и/или карбоксиконце НА8 линкера, которые ковалентно связывают первый и/или второй элемент с Н8А линкером, причем каждый из полипептидных коннекторов содержит от 2 до 20 аминокислотных остатков.

В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВЗ.

В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВЗ и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2.

В другом варианте осуществления первый или второй связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела Εν.

В другом варианте осуществления молекула одноцепочечного антитела Εν является молекулой человеческого или гуманизированного антитела.

В другом варианте осуществления в агенте первый связывающий элемент связывает ЕгЬВЗ с К_с от 1 до 50 нм.

В другом варианте осуществления в агенте второй связывающий элемент связывает ЕгЬВ2 с К_с от 0,01 до 10 нм.

В другом варианте осуществления К_с составляет около 16 нм.

В другом варианте осуществления К_с составляет около 0,З нм.

В другом варианте осуществления первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и представляет собой 5сЕу. содержащий аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 27, 29 или З2, и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВЗ и представляет собой 5сЕу. содержащий аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 26, 28, З0 или З1.

- 1 022201

В другом варианте осуществления первый связывающий элемент специфически связывает ЕтЬВЗ и представляет собой 5сЕу. содержащий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и представляет собой 8сРу, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, 29 или 32.

В другом варианте осуществления первый связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26 и второй связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 27.

В другом варианте осуществления период полужизни ίη νίνο составляет от 6 ч до 7 дней.

В другом варианте осуществления период полужизни ίη νίνο составляет более 8 ч.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит аминокислотные остатки 25-44 и аминокислотные остатки 494-513 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит аминокислотные остатки 25-70 и аминокислотные остатки 450-513 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит аминокислотные остатки 15-100 и аминокислотные остатки 400-520 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит аминокислотные остатки 10-200 и аминокислотные остатки 300-575 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит аминокислотные остатки 5-250 и аминокислотные остатки 275-580 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления Н8Л линкер содержит сериновый остаток в положении 34 последовательности 8Е0 ГО N0: 1 и глутаминовый остаток в положении 503 последовательности 8ЕО ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления первый связывающий элемент связывает ЕгЬВ3 с К_с от около 1 до около 50 нм и второй связывающий элемент связывает ЕгЬВ2 с К_с от около 0,01 до около 10 нМ.

В другом варианте осуществления первый связывающий элемент связывает ЕгЬВ3 с К_с равной около 16 нМ и второй связывающий элемент связывает ЕгЬВ2 с К_с равной около 0,3 нМ.

В другом варианте осуществления агент является стабильным, сохраняя сравнимую способность связывать как ЕгЬВ2, так и ЕгЬВ3 до и после инкубации в сыворотке человека при 37°С в течение 120 ч.

Изобретение также относится к набору, включающему агент в упаковке с инструкцией по приему агента пациентом.

Изобретение также относится к применению агента для лечения млекопитающего, имеющего пролиферативное заболевание.

В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ЕгЬВ2 и ЕгЬВ3.

В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.

В другом варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека.

Изобретение также относится к способу получения агента, включающему стадии:

(ί) обеспечение экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей агент, в бактериальной, дрожжевой или клетке млекопитающего, или в ткани, органе или организме млекопитающего, не являющегося человеком; и (ίί) выделение агента.

В другом варианте осуществления агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 1.

В другом варианте осуществления агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит первый связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, 29 или 32.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения пролиферативного заболевания, содержащей агент, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или растворителем.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции в растворе, содержащем 25 мг/мл агента.

Изобретение также относится к применению фармацевтической композиции для лечения человека, имеющего пролиферативное заболевание.

В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из ЕгЬВ2 и ЕгЬВ3.

В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль.

- 2 022201

В другом варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.

Определения

Термин антитело, употребляемый в данном описании взаимозаменяемо, включает полные антитела или иммуноглобулины и любой их антигенсвязывающий фрагмент или их одиночные цепи. Антитела по данному описанию могут представлять собой выделенные антитела млекопитающего (например, человека или мыши), гуманизированные, химерные, рекомбинантные, синтетические или природные антитела. У большинства млекопитающих, включая человека, антитела имеют по меньшей мере две тяжелые (Н) и две легкие (Ь) цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном описании Ун) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, С_н1, С_н2 и С_н3, и шарнирной области между С_н1 и С_н2. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном описании У_ъ) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, С_ь, У_н и У_ъ области могут далее подразделяться на гипервариабельные области (участки), называемые областями определения комплементарности (СОК), расположенные вперемежку с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (РК). Каждая У_н и У_ъ область состоит из трех СОК и четырех РК областей, расположенных от амино- к карбоксиконцу в следующем порядке: РК1, СЭКЕ РК2, СЭК2, РК3, СЭК3, РК4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулинов с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ц) классического пути системы комплемента. Антитела по настоящему изобретению включают все формы антител и другие белки скаффолда со свойствами, подобными свойствам антител. Например, антитело может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело, химерное антитело или другой белок скаффолда со свойствами, подобными свойствам антител, например фиборонектиновые или анкириновые повторы. Антитело может также представлять собой РаЬ, Р(аЬ')₂, 8сРу, 8ΜΙΡ, диатело, наноантитело, аптамеры или доменное антитело. Антитело может иметь любой из нижеприведенных изотипов 1§О (например, 1дО1, 1дО2, 1§С3 и Ι§04), Ι§Μ, 1§А (например, 1дА1, 1дА2 и 1§А вес), Ι§ϋ или 1дЕ. Антитела, которые можно использовать в качестве связывающих элементов по данному описанию, в комбинации с н§А линкером по данному изобретению, включают, но без ограничения, натализумаб, инфликсимаб, адалимумаб, ритуксимаб, алемтузумаб, бевацизумаб, даклизумаб, эфализумаб, голимумаб, сертолизумаб, трастузумаб, абатацепт, этанерцепт, пертузумаб, цетуксимаб и панитумумаб.

Термин фрагмент антител по данному описанию относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ЕгЬВ2). Антигенсвязывающую функцию антитела можно осуществлять, используя фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающий участок антитела, включают, но без ограничения, (ί) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из У_ъ, У_н, С_ь и С_н1 доменов; (ίί) фрагмент Р(аЬ')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент Рф состоящий из У_н и С_н1 доменов; (ίν) фрагмент Ру, состоящий из Уь и У_н доменов одной клешни (агт, плеча) антитела; (ν) бАЬ, включающее У_н, У_ь домены; (νί) фрагмент бАЬ (АУагб е! а1., №Циге, 341: 544-546 (1989)), который состоит из У_н домена; (νίί) бАЬ, которое состоит из У_н или У_ь домена; (νίίί) выделенную гипервариабельную область (СОК); и (ίχ) комбинацию двух или более выделенных СОК, которые, необязательно, могут быть связаны синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Ру фрагмента, Уь и У_н, кодируются отдельными генами, их можно связывать, с помощью методов рекомбинантной ДНК, синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой пары У_ъ и У_н областей объединяются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Ру (8сРу); см., например, Βίτά е! а1., Шепсе, 242: 423-426 (1988) и ИиЧоп е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 85: 5879-5883 (1988)). Эти фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и эти фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, что и интактные антитела. Фрагменты антител можно получать методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.

Под аутоиммунным заболеванием понимают заболевание, при котором вырабатывается ответ иммунной системы на собственные эпитопы или антигены. Примеры аутоиммунных заболеваний включают, но без ограничения, гнездную алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (СРГО8), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром ЧергаСтрауса, рубцовый пемфигоид, СКЕ8Т синдром, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дис- 3 022201 коидную красную волчанку, смешанную эссенциальную криоглобулинемию, фибромиалгиюфибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ΙΤΡ), 1§А нефропатию, инсулинзависимый диабет, ювенильный артрит, красный плоский лишай (лихен планус), болезнь Меньера, смешанную соединительнотканевую болезнь, рассеянный склероз, обыкновенную пузырчатку, злокачественную анемию, узелковый (нодозный) полиартериит, полихондрит, плюригландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку (ЗЬЕ), артериит Такаясу, артериит темпоральный/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит (например, хориоретинит ΒίτάδΕοΐ и саркоидозный увеит), васкулит, витилиго, гранулематоз Вегенера и тяжелую псевдопаралитическую миастению.

Под выражением связывающий элемент подразумевается любая молекула, которая специфически связывается с целевым эпитопом, антигеном, лигандом или рецептором. Связывающие элементы включают, но без ограничения, антитела (например, моноклональные, поликлональные, рекомбинантные, гуманизированные и химерные антитела), фрагменты антител (например, РаЪ фрагменты, (РаЪ')₂, 8сРу антитела, 3ΜΙΡ, диатела, мини-антитела, 8сРу-Рс, аффитела, наноантитела и доменные антитела), рецепторы, лиганды, аптамеры и другие молекулы, имеющие известного партнера по связыванию.

Под термином биологически активный понимают, что молекула, включая биологические молекулы, такие как нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды и белки, проявляет физическую или химическую активность по отношению к самой себе или к другой молекуле. Например, биологически активная молекула может обладать, например, ферментативной активностью, белок-связывающей активностью (например, взаимодействие антител) или цитотоксической активностью и является биологически активной.

Термин химерное антитело относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельные области которого происходят от (животного) первого вида, а константные области - от второго вида. Химерные антитела можно создавать, например, методами генетической инженерии, используя сегменты генов иммуноглобулинов, относящихся к различным видам (например, мыши и человека).

Под коннектором или полипептидным коннектором понимают аминокислотную последовательность длиной 2-20 остатков, которая связана ковалентной связью с одним из амино- или карбоксиконцов НЗА линкера по изобретению или с обоими этими концами или связана ковалентной связью с одним или более остатков НЗА линкера (например, с остатком между амино- или карбоксиконцевыми остатками). В предпочтительном варианте изобретения полипептидный коннектор, связанный с аминоконцом НЗА линкера, имеет аминокислотную последовательность ААЗ или ААС. а коннектор, связанный с карбоксиконцом, имеет аминокислотную последовательность ЛАЛЕ (ЗЕЦ ГО N0: 5).

Выражения эффективное количество, или количество, эффективное для, или терапевтически эффективное количество означают количество агента по изобретению (например, НЗА линкера, связанного с одним или более связывающих элементов или с диагностическим или терапевтическим агентами с коннекторной последовательностью или без нее), достаточное для того, чтобы получить нужный результат, например киллинг раковых клеток, снижение пролиферации опухолевых клеток, уменьшение воспаления в больной ткани или в больном органе или мечение специфической популяции клеток в ткани, органе или организме (например, человека).

Предполагается, что выражение человеческое антитело по данному описанию включает антитела или их фрагменты, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и СЭР области образованы с использованием последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов зародышевой линии, как описано, например, КаЪа1 с1 а1. (Зедиепсек οί ргоЮиъ οί 1ттипо1ощса1 1п1сгсь1, Ρίίΐΐι Εάίΐίοη, и.З. Эерайтей οί НеаЬЪ ;·ιηά Нитап Зегуюек, МН РиЪЪса1юп, Νο 91-3242 (1991)) Помимо этого, если антитело содержит константную область, константная область также образована с использованием последовательностей генов человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями генов человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайтнаправленным мутагенезом ίη νίΐτο или соматической мутацией ίη νινο). Не предполагается, однако, что выражение человеческое антитело по данному описанию включает антитела, в которых СЭР последовательности из зародышевой линии млекопитающего другого вида, такого как мышь, привиты к человеческим каркасным последовательностям (т.е. гуманизированное антитело или фрагмент антитела).

Термин гуманизированное антитело относится к любому антителу или фрагменту антитела, которое(ый) включает вариабельную каркасную область, в основном образованную из человеческого иммуноглобулина или антитела, а гипервариабельные области (например, по меньшей мере одна область СЭР) в основном образованы из иммуноглобулина или антитела нечеловеческого происхождения.

Выражение по данному описанию ингибитор передачи воспалительного сигнала или Ι3Ι означает агент, который ослабляет связывание между провоспалительным цитокином (например, ΤΝΡ-альфа, ΤΝΡ-бета или 1Ь-1) и его рецептором (например, ΤΝΡ рецептором 1 или 2 или 1Ь-1 рецептором соответственно); ослабляет связывание активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекула- 4 022201 ми клеточной поверхности (например, СЭ20, СЭ25, СТЬА-4, СЭ80/СЭ86 или СИ28) или снижает последующую активацию, или активность, внутриклеточных сигнальных молекул, которые активируются после связывания провоспалительных цитокинов со своими рецепторами, или связывание активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности (например, агент, который снижает активацию, или активность, сигнальных молекул на р38 МАРК сигнальном пути). Предпочтительно ослабление связывания между провоспалительным цитокином и его рецептором, ослабление связывания активирующей молекулы с провоспалительной сигнальной молекулой клеточной поверхности или уменьшение внутриклеточной передачи сигнала, которое происходит после связывания провоспалительных цитокинов со своими рецепторами или активирующих молекул с провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности, выражаются величиной по меньшей мере примерно 10%, предпочтительно 20, 30, 40 или 50%, более предпочтительно 60, 70, 80, 90% или более (вплоть до 100%). Ι8Ι может снижать количество провоспалительного цитокина (например, ΤΝΡ-альфа, ΤΝΡ-бета или 1Ь-1), легкодоступного для связывания рецептора. Например, Ι8Ι может представлять собой растворимый белок рецептора провоспалительного цитокина (например, растворимый слитый белок ΤΝΡ рецептора, такой как этанерцепт (ΕΝΒΚΕΡ®) или ленерцепт), или растворимую провоспалительную сигнальную молекулу клеточной поверхности (например, растворимый СТЬА-4 (абатацепт)), или антитело, специфическое к провоспалительному цитокину или к провоспалительной сигнальной молекуле клеточной поверхности (например, антитело к ΤΝΡ, такое как адалимумаб, цертолизумаб, инфликсимаб или голимумаб; антитело к СИ20, такое как ритуксимаб; или ТКП-015 (ΤΚυΒΙΘΝ®)). Помимо этого, Τ8Ι может нарушать способность эндогенного дикого типа провоспалительного цитокина или провоспалительной сигнальной молекулы клеточной поверхности связываться со своим рецептором (например, ΤΝΡ рецептором 1 или 2, Ш-1 рецептором или СИ11а (например, эфализумаб (ΚΑΡΤίνΑ®, СспсШсеН))). Примерами доминантно-негативных ΤΝΡ-альфа вариантов являются ΧΕΝΡ345 (пегилированная версия ΤΝΡ варианта Α145Κ/Ι97Τ) и ΧρτοΤΜ1595 и другие варианты, раскрываемые в опубликованных патентных заявках США № 20030166559 и 20050265962, вводимых в данное описание в качестве ссылки. Примером доминантно-негативного Ш-1 варианта является анакинра (ΚΙΝΕΚΕΤ®), представляющая собой растворимую форму 1Ь-1, которая связывается с Ш-1 рецептором, не вызывая активации внутриклеточных сигнальных путей. Ингибиторами передачи воспалительного сигнала, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются также низкомолекулярные соединения, которые ингибируют или нарушают (уменьшают активность) сигнальные пути, следующие за провоспалительными цитокинами или провоспалительными сигнальными молекулами клеточной поверхности (например, ΌΕ 096). Примеры Ι8Ι такого типа включают ингибиторы р38 МАР киназы, например производные 5-амино-2карбонилтиофена (описанные в международной патентной заявке νθ 04/089929, вводимой в данное описание в качестве ссылки), АККУ-797, ΒΙΚΒ 796 Β8, (1-5-трет-бутил-2-п-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[42-(морфолин-4-илэтокси)нафталин-1-ил]мочевина), СНК-3620, ΠΝΙ-1493, ΡΚ-167653 (Еирката РЬатшасеийсаф Окака, .Гараи), Ι8Ι8 101757 (Ιβΐβ РкагшасеийсаН), МЬ3404, ЯРС31145, ΡΌ169316, ΡΗΖ1112, Κΐν67657, (4-(4-(4-фторфенил)-1-(3-фторфенил)-5-(4-пиридинил)-1Н-имидазол-2-ил)-3-бутин-1-ол,

8СЮ-469, 8Β202190, 8Β203580, (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)-1Нимидазол), 8Β239063, транс-1-(4-гидроксициклогексил)-4-(4-фторфенилметоксипиримидин-4ил)имидазол, 8Β242235, 8И-282, 8ΚΡ-86002, ΤΑΚ 715, νΧ702 и νΧ745. Помимо этого, Ι8Ι может препятствовать переходу (процессированию) провоспалительного цитокина (например, ΤΝΡ-альфа и ΤΝΡ-бета) из его мембраносвязанной формы в растворимую форму. Ингибиторы ТАСЕ являются Ι8Ι этого класса. Примеры ингибиторов ТАСЕ включают ВВ-1101, ВВ-3103, ΒΜ8-561392, бутинилоксифенил β-сульфонпиперидин гидоксаматы, СН4474, ИРС333, ИРН-067517, СМ6001, О№3333, Ко 32-7315. ΤΑΡI-1, ΤΑΡI-2 и ЕМГ 005. Другие примеры Ι8Ι включают короткие пептиды, выделенные из белков теплового шока Ε^οΐί, созданных для специфической по отношению к заболеванию иммуномодулирующей активности (например, пептид йиа1Р1).

Под агонистом интегрина подразумевается любой агент, который снижает или ингибирует биологическую активность молекулы интегрина (например, снижает или ингибирует по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более по сравнению с биологической активностью в отсутствие антагониста интегрина), такой как α4 субъединица молекулы интегрина. Агент может действовать непосредственно (прямо) или опосредованно (косвенно) на субъединицу α4 интегрина (ΝΠΒΙ, Регистрационный Νο. Р13612; Τакаάа еГ а1., ΕΜΒО 1. 8: 1361-1368 (1989)), ингибируя активность или экспрессию субъединицы α4 интегрина, или может действовать на мишень, с которой связывается интактный интегрин, содержащий α4 субъединицу. Например, антитело или блокирующий пептид, которое(ый) связывается с молекулой клеточной адгезии сосудов 1 ЩСАМ-1). тем самым предупреждая связывание α4β1 интегрина с VСΑΜ-1, рассматривается как агонист интегрина для целей настоящего изобретения. Неограничивающие примеры агонистов интегрина, пригодных для применения в настоящем изобретении, могут включать белки, блокирующие пептиды, такие как натализумаб (ΤΥ8ΑΒΚI®), и низкомолекулярные ингибиторы. Примеры антагонистов α4 интегрина включают, но без ограничения, натализумаб (Ыап/Вюдеп Иес; см., например, патенты США № 5840299; 6033665; 6602503; 5168062; 5385839 и

- 5 022201

5730978; вводимые в данное описание в качестве ссылки), оМЕРИРА- (Вюдеп; патент США № 6495525; вводимый в данное описание в качестве ссылки), алефацепт, СОР-323 (СеШесН); фиратеграст (8В-68399; О1ахо8тйЬК1ше); ТК-9109 (РП/ег); ΙδΙδ-107248 (АпНкепке ТНегареиНск); К-1295 (КосНе) и ТВС-4746 (8сНег1пд-Р1оидЬ).

Другие неограничивающие примеры антагонистов α4 интегрина включают низкомолекулярные соединения, описанные в патентах США № 5821231; 5869448; 5936065; 6265572; 6288267; 6365619;

6423728; 6426348; 6458844; 6479666; 6482849; 6596752; 6667331; 6668527; 6685617; 6903128 и 7015216 (каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки); в опубликованных патентных заявках США № 2002/0049236; 2003/0004196; 2003/0018016; 2003/0078249; 2003/0083267; 2003/0100585; 2004/0039040; 2004/0053907; 2004/0087574; 2004/0102496; 2004/0132809; 2004/0229858; 2006/0014966; 2006/0030553; 2006/0166866; 2006/0166961; 2006/0241132; 2007/0054909 и 2007/0232601 (каждая из них вводится в данное описание в качестве ссылки); в европейских патентах № ЕР 0842943; ЕР 0842944; ЕР 0842945; ЕР 0903353; и ЕР 0918059; и в опубликованных международных заявках РСТ № №0 95/15973; №0 96/06108; №0 96/40781; №0 98/04247; №0 98/04913; №0 98/42656; №0 98/53814; №0 98/53817; №0 98/53818; №0 98/54207; №0 98/58902; №0 99/06390; №0 99/06431; №0 99/06432;

№0 99/06433; №0 99/06434; №0 99/06435; №0 99/06436; №0 99/06437; №0 99/10312; №0 99/10313;

№0 99/20272; №0 99/23063; №0 99/24398; №0 99/25685; №0 99/26615; №0 99/26921; №0 99/26922;

№0 99/26923; №0 99/35163; №0 99/36393; №0 99/37605; №0 99/37618; №0 99/43642; №0 01/42215 и №0 02/28830; каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки.

Другие примеры антагонистов α4 интегрина включают производные фенилаланина, описанные в патентах США № 6197794; 6229011; 6329372; 6388084; 6348463; 6362204; 6380387; 6445550; 6806365; 6835738; 6855706; 6872719; 6878718; 6911451; 6916933; 7105520; 7153963; 7160874; 7193108; 7250516 и 7291645 (каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки).

Производные других аминокислот, являющиеся антагонистами α4 интегрина, включают антагонисты, описанные, например, в опубликованных патентных заявках США № 2004/0229859 и 2006/0211630 (вводимых в данное описание в качестве ссылки) и в опубликованных международных патентных заявках РСТ № №0 01/36376; №0 01/47868 и №0 01/70670; все они вводятся в данное описание в качестве ссылок. Другие примеры антагонистов α4 интегрина включают пептиды и пептидные и полупептидные соединения, описанные, например, в опубликованных международных патентных заявках РСТ № №0 94/15958; №0 95/15973; №0 96/00581; №0 96/06108; №0 96/22966 (трипептид Ьеи-А5р-Уа1; Вюдеп, 1пс.); №0 97/02289; №0 97/03094 и №0 97/49731. Другим примером антагониста α4 интегрина является пегилированная молекула, описанная в опубликованной патентной заявке США № 2007/066533 (вводимой ссылкой в данное описание). Примеры антител, которые представляют собой антагонисты α4 интегрина, включают антитела, описанные, например, в опубликованных международных патентных заявках РСТ № №0 93/13798; №0 93/15764; №0 94/16094 и №0 95/19790. Другие примеры антагонистов α4 интегрина представлены в данном описании.

Под термином интерферон понимают интерферон млекопитающего (например, человеческий интерферон-альфа, -бета, -гамма или -тау), полипептид или его биологически активный фрагмент, например ΙΡΝ-α (например, ΙΡΝ-α-Ηι (см. патентную заявку США № 20070274950, вводимую в данное описание в качестве ссылки во всей полноте), ΙΡΝ-α-1Β, ΙΡΝ-α-2;·ι (см. международную заявку РСТ № №0 07/044083, вводимую в данное описание в качестве ссылки во всей полноте), ΙΡΝ-α-2Β), ΙΡΝ-β (описанный в патенте США № 7238344, вводимом в данное описание в качестве ссылки во всей полноте; ΙΡΝ-β-1;·ι (Αν0ΝΕΧ® и ΚΕΒΙΡ®), описанный в патенте США № 6962978, вводимом в данное описание в качестве ссылки во всей полноте, и ΙΡΝ-β-Ш (ΒΕΤΑδΕΚ0Ν®, описанный в патентах США № 4588585; 4959314; 4737462 и 4450103; вводимых в данное описание в качестве ссылки во всей полноте)), ΙΡΝ-γ и ΙΡΝ-τ (описанные в патенте США № 5738845 и в опубликованных патентных заявках США № 20040247565 и 20070243163; вводимых в данное описание в качестве ссылки во всей полноте).

Под конъюгатом ΗδΑ линкера понимают линкерный белок человеческого сывороточного альбумина (ΗδΑ) по изобретению в комбинации с одним или более связывающих элементов, полипептидных коннекторов, диагностических агентов или терапевтических агентов.

Термин моноклональное антитело по данному описанию относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных (естественных) мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, так как являются специфическими к единственному антигенному сайту. Помимо этого, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, включают различные антитела, специфические к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело является специфическим к единственной детерминанте на антигене. Моноклональные антитела можно получать, используя любой метод, принятый в данной области техники, например, такой как метод гибридом, описанный КоЫег е! а1., ШШге. 256: 495 (1975), трансгенное животное (например, ЬопЬегд е! а1., МШие. 368(6474): 856-859 (1994)), методы рекомбинантной ДНК (например, патент США № 4816567) или ис- 6 022201 пользование фаговых библиотек антител, библиотек дрожжевых антител или синтетических библиотек скаффолда антител с применением методов, описанных, например, С1аск§оп с1 а1., ЫаШге, 352: 624-628 (1991) и Магкк е! а1., 1. Мо1. Βΐο1. 222: 581-597 (1991).

Под выражением фармацевтически приемлемый носитель понимают носитель, который является физиологически приемлемым для проходящего лечение млекопитающего, в то же время сохраняет терапевтические свойства соединения, с которым он вводится. Примером фармацевтически приемлемого носителя является физиологический солевой раствор.

Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в руководстве-справочнике РепипдЮп'к РЬагтасеийса1 8с1еисе5, (18* еййюп), ей. А. Оеппаго, Маск РиЬНкПпд Сотрапу, ЕаЧоп. РА, вводимом в данное описание в качестве ссылки.

Под термином пролиферативное заболевание или рак понимают любое состояние, характеризующееся патологическим или неконтролируемым ростом клеток. Примеры пролиферативных заболеваний включают, например, солидные опухоли, такие как саркомы (например, светлоклеточная саркома), карциномы (например, почечно-клеточная карцинома) и лимфомы; опухоли молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого, мезофаринкса (ротоглотки), гипофаринкса, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря, желчного протока, тонкого кишечника, мочевыводящей системы (включая опухоли почки, мочевого пузыря и эпителия мочевых путей), женских половых органов (включая опухоли шейки матки, матки, яичника, хориому и трофобласт при беременности), мужских половых органов (включая опухоли предстательной железы, семенного пузырька и яичек), эндокринных желез (включая опухоли щитовидной железы, надпочечника и гипофиза), кожи (включая ангиому, меланому, саркому костной и мягкой ткани и саркому Калоши), мозга и мягких оболочек мозга (включая астроцитому, нейроастроцитому, спонгиобластому, ретинобластому, неврому, нейробластому и невриному), нервов, глаз, кроветворной системы (включая хлорлейкоз, плазмоцитому и кожную Т-клеточную лимфому/лейкоз) и иммунной системы (включая лимфому, например, ходжкинскую лимфому и неходжкинскую лимфому). Примером пролиферативного заболевания с несолидной опухолью является лейкоз (например, острый лимфобластный лейкоз).

Термин рекомбинантное антитело относится к антителу, полученному, экспрессированному, созданному или выделенному рекомбинантными методами, такому как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трансгенного или трансхромосомного по генам иммуноглобулина (например, генам человеческого иммуноглобулина), или полученной из него гибридомы; (б) антитела, выделенные при использовании клетки-хозяина, трансформированной таким образом, чтобы экспрессировать антитело, например, при использовании трансфектомы; (в) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител (например, содержащие человеческие последовательности антител) с применением фагового дисплея, визуализации библиотек дрожжевых антител и антител с синтетическим каркасом (скаффолдом); и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов (например, генов человеческого иммуноглобулина) с другими ДНК-последовательностями.

Под выражением специфически связывается понимают предпочтительную ассоциацию связывающего элемента (например, антитела, фрагмента антитела, рецептора, лиганда или низкомолекулярного участка агента по изобретению) с молекулой-мишенью (например, секретированной молекулоймишенью, такой как цитокин, хемокин, гормон, рецептор или лиганд) или с клеткой или тканью, несущей молекулу-мишень (например, антиген клеточной поверхности, такой как рецептор или лиганд), а не с нецелевыми клетками (клетками-немишенями) или тканями, не несущими молекулу-мишень. Общепризнано, что между связывающим элементом и нецелевой молекулой (молекулой, не являющейся мишенью) (присутствующей индивидуально или в комбинации с клеткой или тканью) может до некоторой степени происходить неспецифическое взаимодействие. Тем не менее, специфическое связывание можно отличить как опосредуемое специфическим распознаванием молекулы-мишени. Специфическое связывание приводит к более прочной ассоциации между связывающим элементом (например, антителом) и, например, клетками, несущими молекулу-мишень (например, антиген), чем между связывающим элементом, и, например, клетками, не содержащими молекулы-мишени. Специфическое связывание обычно вызывает более чем двукратное, предпочтительно более чем пятикратное, более предпочтительно более чем десятикратное и наиболее предпочтительно более чем стократное увеличение количества связывающего элемента, связывающейся (в единицу времени), например, с клеткой или тканью, несущей молекулу-мишень или маркер, по сравнению с клеткой или тканью, не несущей эту молекулу-мишень или маркер. Связывающие элементы связываются с молекулой-мишенью или маркером с константой диссоциа ции, например, менее чем 10^-6 М, более предпочтительно менее чем 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10 наиболее предпочтительно менее чем 10 таких условиях требуется связывающий элемент, который выбирают в соответствии с его специфичностью к конкретному белку. Для отбора связывающих элементов (например, антител), способных специфически связываться с конкретной молекулой-мишенью, имеются различные форматы. Например, для выбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных к белку, обычно используются

10^-11, 10^-12 М и

10^-14 или 10^-15 М. Для специфического связывания с белком в

- 7 022201 твердофазные иммуноанализы ЕЫ§Л. См. в Наг1оте & Ьаие, ЛийЬоФек, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й РнЬНсаПоп №ν Уогк (1988) описание форматов иммуноанализа и условий, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности.

Термин практическая идентичность или практически идентичный, используемый при сравнении полинуклеотидной или полипептидной последовательности с эталонной последовательностью, означает, что при оптимальном выравнивании двух последовательностей полинуклеотидная или полипептидная последовательность является такой же, как эталонная последовательность, или имеет определенное процентное содержание тех же нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые находятся в соответствующих положениях эталонной последовательности. Например, аминокислотная последовательность, практически идентичная эталонной последовательности, имеет процент идентичности с эталонной последовательностью (например, Н8А аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕС ГО N0: 1, или ее фрагментом) по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высокий процент идентичности (вплоть до 100%) при сравнении и выравнивании по максимальному соответствию по всей длине эталонной последовательности, определяемый с применением алгоритмов сравнения последовательностей ВЬА§Т или ВЬА§Т 2.0 с параметрами по умолчанию, или при выравнивании вручную и визуальном изучении (см. например, Νί'.ΈΙ \усЬ-сайт).

Под доступным (находящимся на поверхности, экспонированным на поверхности) аминокислотным остатком понимают аминокислотный остаток, находящийся на внешней поверхности складчатой и конформационно корректной третичной структуры Н8А полипептида. Такие остатки можно заменять, например, на другие, химически активные, аминокислоты (например, цистеин), чтобы содействовать сайт-специфической конъюгации диагностических или терапевтических агентов. Кроме того, доступные аминокислотные остатки можно заменять таким образом, чтобы способствовать гликозилированию (например, добавляя сериновый, треониновый или аспарагиновый остатки или мотивы гликозилирования) или предотвратить гликозилирование (например удаляя сериновый, треониновый или аспарагиновый остатки или мотивы гликозилирования). Доступные (на поверхности) аминокислотные остатки включают, но без ограничения, треонин в положении 496, серин в положении 58, треонин в положении 76, треонин в положении 79, треонин в положении 83, треонин в положении 125, треонин в положении 236, серин в положении 270, серин в положении 273, серин в положении 304, серин в положении 435, треонин в положении 478, треонин в положении 506 и треонин в положении 508 (нумерация аминокислот дается в соответствии, например, с последовательностью Н8А линкера, представленной в 8ЕС ГО N0: 1). Другие доступные (экспонированные на поверхности) остатки специалист в данной области техники может идентифицировать, используя Н8А кристаллическую структуру (8идю е! а1., Сгу81а1 81гис1иге оГ Ьишап кегит а1Ъитт а! 2.5 А ге8о1и1юп, Рго1еш Епд. 12: 439-446 (1999)).

Термины молекула-мишень (целевая молекула) или клетка-мишень означают молекулу (например, белок, эпитоп, антиген, рецептор или лиганд) или клетку, с которой может специфически связываться связывающий элемент (например, антитело) или Н§А-конъюгат, который содержит одну или более связывающих элементов (например, Н8А линкер, связанный с одним или более антител или фрагментов антител). Молекула-мишень может находиться на внешней стороне клетки-мишени (например, белок клеточной поверхности или секретируемый белок) или внутри клетки-мишени.

Предполагается, что термин лечение означает уменьшение (ослабление, снижение) (примерно, по меньшей мере на 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или даже 100%) прогрессирования или тяжести заболевания или расстройства у человека (например, аутоиммунного или пролиферативного заболевания) или прогрессирования, тяжести или частоты одного или более симптомов заболевания или расстройства у больного человека.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 схематически показан типичный конъюгат Н8А линкера. Коннектор между аминоконцевым связывающим элементом и Н8А линкером имеет последовательность: аланин, аланин и серин. Коннектор между Н8А линкером и карбоксиконцевым связывающим элементом имеет последовательность: аланин, аланин, аланин, лейцин (БЕС ГО N0: 5).

На фиг. 2 изображена диаграмма, показывающая, что В2В3 варианты ингибируют НКО-индуцированный рЕгЬВ3 в ΖΚ75-1 раковых клетках молочной железы.

На фиг. 3АГО даны графики (кривые), показывающие ингибирование фосфорилированного рЕгЪВ3 (гомолога вирусного онкогена эритробластомы) в раковых клетках ВТ474 молочной железы после 24 ч предварительной обработки В2В3 вариантами А5-Н8А-ВГО2 (фиг. 3А), Н3-Н8Л-В1Э2 (фиг. 3В), Н3-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 3С) и Р4-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 3Ό).

На фиг. 4АГО представлены графики, показывающие ингибирование фосфорилированного АКТ в ВТ474 раковых клетках молочной железы после 24-часовой предварительной обработки В2В3 вариантами А5-Н8А-ВГО2 (фиг. 4А), Н3-Н8А-ВГО2 (фиг. 4В), Н3-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 4С) и Р4-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 4Ό).

На фиг. 5АГО даны графики, показывающие ингибирование фосфорилированного ЕКК в ВТ474 раковых клетках молочной железы после 24-часовой предварительной обработки В2В3 вариантами

- 8 022201

Ά5-Η8Ά-Β1Ό2 (фиг. 5А), Η3-Η8Α-Β1Ό2 (фиг. 5В), Н3-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 5С) и Р4-Н8А-Р5В6Н2 (фиг. 5Ό).

На фиг. 6 представлен график, показывающий, что обработка ВТ474 раковых клеток В2В3-1 вариантами вызывает блок клеточного цикла в 01 фазе и снижение числа клеток в 8 фазе.

На фиг. 7 представлена гистограмма проточной цитометрии, показывающая, что преинкубация клеток ВТ-474-М3 с 1 мкМ В2В3-1 в значительной степени блокирует связывание НК0.

На фиг. 8Α-Ό представлены графики, показывающие, что В2В3-1 ингибирует фосфорилирование ЕгЪВ3 и АКТ в В-Т474-М3 и ΖΚ75-30 клеточных линиях. Раковые клетки молочной железы линий ВТ-474-М3 (фиг. 8А и 8С) и ΖΚ75-30 (фиг. 8В и 8Ό) предварительно обрабатывали титрованием дозы В2В3-1 в течение 24 ч, а затем стимулировали в течение 10 мин с помощью 5 нМ НК0 13 Е0Р домена. Статус фосфорилирования ЕгЪВ3 и АКТ изучают затем методом ЕЬ18А.

На фиг. 9 представлен снимок вестерн-блоттинга, который показывает действие обработки с помощью В2В3-1 на сигнальные белки в ВТ474 раковых клетках молочной железы.

На фиг. 10 представлен снимок вестерн-блоттинга, который показывает иммунопреципитацию обработанных В2В3-1 раковых клеток молочной железы ВТ474.

На фиг. 11А-С представлены диаграммы и график, показывающие, что обработка ВТ-474 линии клеток с помощью В2В3-1 вызывает блок клеточного цикла в 01 фазе и снижение популяции клеток в 8 фазе (фиг. 11А) и ингибирует образование колоний как ВТ-474, так и 8КВг3 клеток по сравнению с необработанными клетками (фиг. 11В). Помимо этого, В2В3-1 ингибирует пролиферацию ВТ-474-М3 клеток в импедансном анализе клетки (фиг. 11В).

На фиг. 12 представлена диаграмма, показывающая, что В2В3-1 не стимулирует фосфорилирование ЕгЪВ3 в ΖΚ75-1 клетках.

На фиг. 13А, В представлены графики, показывающие, что В2В3-1 специфически связывается с ЕгЪВ3 (фиг. 13А) и ЕгЪВ2 (фиг. 13В).

На фиг. 14 представлен график, показывающий, что авидность связывания В2В3-1 с МАЬМЕ-3 клетками приводит к заметному повышению кажущейся аффинности связывания по сравнению с ЕгЪВ2 только связывающий вариант, 8КО-3, и ЕгЪВ3 - только связывающий вариант, 8КО-2.

На фиг. 15А-С представлены графики, показывающие стабильность В2В3-1 в сыворотке мышей, обезьян циномолгус (Супото1ди5) и человека. 100 нМ В2В3-1 инкубируют в сыворотке мышей (фиг. 15А), обезьян циномолгус (фиг. 15В) или человека (фиг. 15С) при 37°С в течение 120 ч. Образцы отбирают через 0, 24, 48, 72, 96 и 120 ч и количественно определяют способность В2В3-1 связывать как ЕгЪВ2, так и ЕгЪВ3 методом ЕЬ18А (РЬИ - относительные световые единицы).

На фиг. 16 представлен график, показывающий эффект дозы В2В3-1 на модели ксенотрансплантата ВТ-474-М3 рака молочной железы. Влияние дозы В2В3-1 на реакцию опухоли оценивают в ВТ-474-М3 линии опухолевых клеток молочной железы при указанных дозах. Н8А дают в дозе 52,5 мг/кг, эквимолярной дозе 90 мг/кг В2В3-1.

На фиг. 17А-Е представлены графики, показывающие, что эффективность В2В3-1 на различных моделях ксенотрансплантата зависит от ЕгЪВ2. Показаны модели ксенотрансплантатов: Са1и-3 (аденокарцинома легкого человека; фиг. 17А), 8КОУ-3 (аденокарцинома яичника человека; фиг.17В), Νί'.Ί-Ν87 (карцинома желудка человека; фиг. 17С), ΑСΗN (аденокарцинома почки человека; фиг. 17Ό) и МОА-МВ-361 (аденокарцинома молочной железы человека; фиг. 17Е). Мышам вводили 30 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня или НА8 контроль в дозе, эквимолярной В2В3-1.

На фиг. 18А, В представлены графики, показывающие, что сверхэкспрессия ЕгЪВ2 превращает модель ксенотрансплантата АОКг рака молочной железы из не отвечающей на В2В3-1 в респондёра (отвечающую на лечение). ЕгЪВ2 сверхэкспрессирует в дикого типа АОКг ксенотрансплантатах (фиг. 18А) и АОКг-Е2 ксенотрансплантатах (фиг. 18В) при использовании ретровирусной системы экспрессии.

На фиг. 19А, В представлены графики, показывающие, что активность В2В3-1 позитивно коррелирует с уровнями экспрессии ЕгЬВ2 ίη νίίτο (фиг. 19А) и ш νίνο (фиг. 19В).

На фиг. 20А, В показано, что обработка с помощью В2В3-1 модифицирует клеточный цикл опухолевых клеток.

На фиг. 20А представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В2В3-1 опухолевых клеток молочной железы ВТ474-М3 в течение 6 ч приводит к транслокации ингибитора клеточного цикла р27^к1р1 в ядро. Для идентификации ядра используется окрашивание раствором Хехста (НоесНЧ).

На фиг. 20В показан вестерн-блоттинг ВТ-474-М3 клеток, обработанных В2В3-1 в течение 72 ч, что привело к снижению уровня регулятора клеточного цикла циклина Ό1. В данном эксперименте в качестве белка для контроля нанесения образца используют цитоскелетный белок винкулин.

На фиг. 21А, В показаны снимки, полученные с помощью электронного микроскопа (электронные микроснимки), показывающие, что обработка ксенотрансплантатов опухолей молочной железы ВТ474 с помощью В2В3-1 приводит к транслокации р27^к1р1 в ядро. Ксенотрансплантаты опухолей молочной железы ВТ474 обрабатывают с помощью В2В3-1 (фиг. 21А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой Н8А (фиг. 21В) каждые 3 дня, всего 4 дозы, и окрашивали на р27^к1р1.

- 9 022201

На фиг. 22А, В представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В2В3-1 приводит к уменьшению содержания маркера пролиферации Κί67 в ВТ474-М3 ксенотрансплантате рака молочной железы. Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ474-М3 обрабатывают с помощью В2В3-1 (фиг. 22А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой ΗδΑ (фиг. 22В) каждые 3 дня, всего 4 дозы.

На фиг. 23А, В представлены снимки, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показывающие, что обработка с помощью В2В3-1 приводит к снижению плотности сосудов в опухолевых ксенотрансплантатах ВТ474-М3 рака молочной железы (определяется снижением интенсивности окрашивания СЭ31). Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ474-М3 обрабатывают с помощью В2В3-1 (фиг. 23А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой ΗδΑ (фиг. 23В) каждые 3 дня, всего 4 дозы.

На фиг. 24А, В представлены диаграммы, показывающие, что В2В3-1 ингибирует фосфорилирование ЕгЬВ3 ίη νίνο. Лизаты отдельных ксенотрансплантатов ВТ-474-М3 опухолей, обработанные В2В3-1 (М1-М5) или контрольным ΗδΑ (Η1-Η2), подвергают δΌδ-РАСЕ электрофорезу и анализируют на рЕгЬВ3 и бета-тубулин с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 24А). Нормализация среднего сигнала рЕгЬВ3 по среднему сигналу бета-тубулина показывает, что опухоли, обработанные В2В3-1, содержат значительно меньше рЕгЬВ3, чем опухоли, обработанные ΗδΑ (фиг. 24В).

На фиг. 25А и В представлены кривые (графики), показывающие ίη νίνο активность В2В3-1 ВТ-474-М3 ксенотрансплантатах с пониженной РТЕЫ активностью. Культивированные ВТ-474-М3 опухолевые клетки трансфицируют контрольным вектором (фиг. 25А) или ретровирусным вектором, кодирующим кЬРТЕЫ (фиг. 25В), который нокаутирует ген РТЕЫ (активность). Раковые клетки молочной железы ВТ-474-М3, созданные (генная инженерия) таким образом, чтобы нокаутировать РТЕЫ активность, инъецируют в правый бок мышей, тогда как клетки, трансфицированные контрольным вектором, инъецируют тем же мышам в левый бок. Мышам вводят 30 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня или 10 мг/кг герцептина каждую неделю, а ΗδΑ инъецируют в качестве контроля в дозе, эквимолярной дозе В2В3-1. В2В3-1 и герцептин инициируют уменьшение размера опухолей, образованных контрольными раковыми клетками ВТ-474-М3 молочной железы (фиг. 25А), тогда как только В2В3-1 (а не герцептин) вызывает уменьшение размера опухолей, образованных раковыми клетками молочной железы ВТ-474-М3 в отсутствие экспрессии РТЕЫ (фиг. 25В).

На фиг. 26А, В показано, что В2В3-1 ингибирует фосфорилирование ΑΚΓ в ксенотрансплантатах ВТ-474-М3 с пониженной РТЕЫ активностью. Опухоли лизируют после завершения обработки (д3йх11) и тестируют на уровни экспрессии РТЕЫ, рЕгЬВ3 и ρΑΚΗ вестерн-блоттингом (фиг. 26А). Данные плотности (денситометрию) по интенсивности полос для ρΑΚТ, нормализованные по тотальному ΑΚΓ и тотальному белку, показывают, что В2В3-1 способен ингибировать фосфорилирование этого белка, тогда как герцептин не способен этого делать (фиг. 26В).

На фиг. 27Α-Ό представлены кривые (графики), показывающие фармакокинетические свойства разовых доз: болюсные дозы 5 (фиг. 27А), 15 (фиг. 27В), 30 (фиг. 27С) и 45 (фиг. 27Ό) мг/кг В2В3-1, вводимые пи/пи мышам. Сывороточные концентрации В2В3-1 сравнимы, как показывают измерения с помощью ΗδΑ анализа или ЕгЬВ2/ЕгЬВ3 анализа, это показывает, что антигенсвязывающая активность В2В3-1 в системе кровообращения сохраняется.

На фиг. 28 представлен график, показывающий зависимость доза-экспозиция для болюсных доз В2В3-1, 5, 15, 30 и 45 мг/кг, вводимых голым мышам. Повышение дозы вызывает линейное увеличение общей экспозиции с В2В3-1.

На фиг. 29 представлен график, показывающий сывороточные концентрации В2В3-1 у обезьян циномолгус, которым каждые три дня вводят 4 дозы по 4 мг/кг (п=2), 20 мг/кг (п=2) и 200 мг/кг (вплоть до 336 ч, п=4, для временных точек 384, 552 и 672 ч, п=2).

На фиг. 30 показана экспрессионная плазмида ρΜР10к4Η3-тΗδΑ-В1^2 для экспрессии В2В3-1.

На фиг. 31 показана плазмида резистентности к неомицину ρδV2-ηеο.

На фиг. 32 показана плазмида резистентности к гигромицину рТК-Иуд.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение включает человеческий сывороточный альбуминовый (ΗδΑ) линкер, который при использовании его для получения агента по изобретению (например, связывающего, диагностического или терапевтического агента) имеет, например, повышенный ш νίνο период полужизни между 6 ч и 7 днями и который не вызывает заметного гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа при введении его ш νίνο млекопитающему (например, человеку). В одном аспекте изобретение включает мутантный ΗδΑ линкер, который имеет две определенные аминокислотные замены (а именно, замены ’Ό34δ и N5030. как представлено в δΞΟ ΙΌ N0: 1). В другом аспекте изобретение включает ΗδΑ линкер, связанный с одним или более связывающих элементов (например, антителом, фрагментами антител, рецепторами/лигандами или низкомолекулярными соединениями) для применения в диагностике или терапии млекопитающего (например, человека) ш νίνο или для применения ш νίΐτο в клетках, тканях и органах млекопитающих. В другом аспекте ΗδΑ линкер может связываться с одним или более иммуномодулирующих агентов, иммуномодуляторов, цитотоксических или цитостатических агентов, детектируемых меток или радиоактивных агентов для целей диагностики или терапии млекопитающего

- 10 022201 (или для применения в клетках, тканях и органах млекопитающих). Агент по изобретению, который включает ΗδΑ линкер, может, необязательно, смешиваться с одним или более фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов и может быть приготовлен таким образом, чтобы его можно было вводить внутривенно, внутримышечно, перорально, в виде ингаляций, парентерально, интраперитонеально, интраартериально, трансдермально, сублингвально, назально, с помощью суппозиториев, трансбуккально (защечно), в виде липосом, в жировую ткань, в виде глазного препарата, в виде внутриглазного препарата, подкожно, интратекально (подоболочечно), наружно или местно. Агент по изобретению, который включает ΗδΑ линкер, может смешиваться или вводиться совместно с одним или более биологически активных агентов (например, биологических или химических агентов, таких как химиотерапевтические и противоопухолевые агенты). В другом аспекте изобретение включает набор, с инструкциями, для конъюгации связывающих элементов (например, антител, фрагментов антител, рецепторов или лигандов), иммуномодуляторов, цитотоксических или цитостатических агентов, детектируемых меток или радиоактивных агентов с ΗδΑ линкером по изобретению для получения агентов по изобретению, которые можно использовать для диагностических или терапевтических целей.

Мутантный человеческий сывороточный альбуминовый (ΗδΑ) линкер.

Мутантный ΗδΑ линкер по изобретению содержит две аминокислотные мутации, в положениях 34 и 503, по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа ΗδΑ, представленной в δΕΟ ГО N0: 3. Цистеиновый остаток в положении 34 (т.е. С34) может заменяться (мутация в) на любой аминокислотный остаток, отличный от цистеина (например, серин, треонин или аланин). Аналогично, аспарагиновый остаток в положении 503 (т.е. N503) может заменяться на любой аминокислотный остаток, отличный от аспарагина (например, глутамин, серин, гистидин или аланин). В одном варианте изобретения ΗδΑ линкер по изобретению имеет аминокислотную последовательность и соответствующую нуклеотидную последовательность, представленные в δΕΟ ГО N0: 1 и 2 соответственно. Этот мутантный ΗδΑ линкер по изобретению содержит две аминокислотные замены (т.е. замена цистеина на серин в положении аминокислотного остатка 34 (Ο34δ) и замена аспарагина на глутамин в положении 503 аминокислотного остатка (N5030)). ΗδΑ линкер при связывании с одним или более связывающих элементов (например, с антителами, фрагментами антител (например, одноцепочечными антителами) или другими нацеливающими или биологически активными агентами (например, рецепторами и лигандами)) сообщает этим конъюгатам и дополнительным также соединенным с ним диагностическим или терапевтическим агентам (например, иммуномодуляторам, цитотоксическим или цитостатическим агентам, детектируемым меткам или радиоактивным агентам) некоторые полезные фармакологические свойства по сравнению с фармакологическими свойствами этих агентов в отсутствие ΗδΑ линкера по изобретению. Эти полезные свойства могут включать пониженную иммуногенность (например, пониженную нейтрализацию антителами хозяина конъюгатов линкер-антитело), более легкую детекцию конъюгатов ΗδΑ линкера (например, масс-спектроскопией) и повышенный фармакологический период полужизни (например, период полужизни более 6, 8, 12, 24, 36 ч, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней) после введения млекопитающему (например, человеку). Конкретно, замена цистеина на серин в положении аминокислотного остатка 34 приводит к уменьшению окисления и пониженной гетерогенности белка ΗδΑ линкера. В ΗδΑ дикого типа аспарагин в положении аминокислотного остатка 503 чувствителен к дезаминированию, что, повидимому, уменьшает фармакологический период полужизни. Замена аспарагина на глутамин в аминокислотном положении 503 может повысить фармакологический период полужизни ΗδΑ линкера по изобретению и, соответственно, агентов-конъюгатов, которые включают ΗδΑ линкер, при введении млекопитающему (например, человеку) или в его клетки, ткани или органы.

В других вариантах изобретения мутантный ΗδΑ линкер по изобретению включает домен I ΗδΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 53; остатки 1-197 δΕΟ ΙΌ N0: 1), домен III ΗδΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 55; остатки 381-585 δΕΟ ГО N0: 1), комбинацию доменов I и III ΗδΑ или комбинацию домена I или III ΗδΑ с доменом II ΗδΑ (δΕΟ ГО N0: 54; остатки 189-385 δΕΟ ГО N0: 1). Например, ΗδΑ линкер по изобретению может включать домены I и II, I и III или II и III. Помимо этого, цистеиновый остаток в положении 34 (т.е. С34) домена I (δΕΟ ГО N0: 53) может быть заменен на любой аминокислотный остаток, отличный от цистеина (например, серин, треонин или аланин). Аналогично, аспарагиновый остаток в положении 503 (т.е. N503) домена III может заменяться на любой аминокислотный остаток, отличный от аспарагина (например, глутамин, серин, гистидин или аланин). Эти ΗδΑ линкеры можно вводить в конъюгат ΗδΑ линкера по изобретению, который включает один или более элементов из полипептидных коннекторов, связывающих элементов, терапевтических или диагностических агентов, каждый из этих элементов подробнее описан ниже.

Полипептидные коннекторы.

Чтобы упростить конъюгацию связывающих элементов по данному описанию с ΗδΑ линкером по изобретению, короткие (например, длиной 2-20 аминокислот) полипептидные коннекторы, которые могут быть связаны (например, ковалентной связью (например, пептидной связью), ионной связью или за счет гидрофобного взаимодействия, или за счет высокоаффинного белок-белкового связывающего взаимодействия (например, биотин и авидин)) с амино- или с карбоксиконцом ΗδΑ линкера. Эти коннекторы обеспечивают гибкие концы, с которыми могут связываться любые связывающие элементы по данному

- 11 022201 описанию. Полипептидный коннектор может иметь в длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот. В одном варианте изобретения коннектор представляет собой последовательность, например, остатков глицина, аланина, серина, глицина, глутамина, лейцина или валина. Хотя в данном описании конкретно не перечисляется, коннектор по изобретению может представлять собой только остатки глицина, аланина, серина, глутамина, лейцина или валина или он может представлять собой любую комбинацию этих остатков длиной примерно до 20 аминокислот. В предпочтительном варианте изобретения коннектор, связанный с аминоконцом Н8А линкера, имеет аминокислотную последовательность ΆΆ8 или АЛО, а коннектор, связанный с карбоксиконцом, имеет аминокислотную последовательность АААЬ (8ЕО ГО N0: 5). Коннектор может быть связан ковалентной связью с амино- или карбоксиконцевым остатком Н8А линкера, с аминокислотным остатком внутри Н8А линкера или может включаться между одним или более связывающими элементами при их наличии.

Получение Н8А линкера.

Н8А линкер по изобретению, который, необязательно, включает пептидные коннекторы, описанные выше, один или более связывающих элементов, описанных ниже, полипептидные детектируемые метки и другие полипептидные терапевтические агенты, можно получать методами рекомбинантной ДНК. Например, нуклеотидную последовательность, кодирующую Н8А линкер (и один или более необязательных элементов), можно экспрессировать (например, в плазмиде, вирусном векторе или трансгенно) в бактериальной клетке (например, Е.соП), клетке насекомого, дрожжевой клетке или клетке млекопитающего (например, в СНО клетке) либо в ткани, органе или организме млекопитающего (например, трансгенного грызуна, копытного (например, козы) или нечеловеческого примата). После экспрессии Н8А линкера в клетке, ткани или органе хозяина опытный специалист может выделить и очистить Н8А линкер стандартными методами очистки белков (например, РРЬС или аффинной хроматографией). Система экспрессии рекомбинантного белка для получения Н8А линкера в комбинации с двумя связывающими элементами показана на фиг. 1.

Н8А линкер по изобретению, который может включать один или более необязательных элементов, описанных выше, можно получать синтетическими методами. Например, Н8А линкер можно получать методами, общепринятыми в пептидном синтезе, такими как твердофазный синтез. Твердофазный синтез включает постадийное добавление аминокислотных остатков к растущей пептидной цепи, которая связана с нерастворимой подложкой или матрицей, такой как полистирол. С-концевой остаток пептида сначала прикрепляют (заякоривают) к продажной подложке, причем его аминогруппы защищены Ν-защитным агентом, таким как трет-бутилоксикарбонильная группа (ΐ-Вос), или флуоренилметоксикарбонильной (Ртос) группой. Аминозащитную группу удаляют с помощью подходящих агентов для снятия защитных групп, таких как ТФА (ТРА) в случае ΐ-Вос или пиперидин для Ртос, и добавляют следующий аминокислотный остаток (в Ν-защищенной форме) с конденсирующим агентом, таким как дициклокарбодиимид (ЭСС). После образования пептидной связи реагенты смывают с подложки. После добавления конечного остатка агент отщепляют от подложки с помощью соответствующего реагента, такого как трифторуксусная кислота (ТФА) или фтористо-водородная кислота (НР). При желании, Н8А линкер, который может включать один или более необязательных элементов, описанных выше, можно получать в виде одного, двух, трех или более сегментов, которые затем можно лигировать с образованием целой конструкции Н8А линкера.

Связывающие элементы НА8 линкера.

Н8А линкер по изобретению можно также получать как конструкцию, которая включает один или более связывающих элементов, таких как антитела, фрагменты антител (по определению в данном описанию, например, одноцепочечный Ру фрагмент (ксРу) или рецепторы/лиганды (т.е. белковые или гликопротеиновые лиганды или рецепторы)), которые способствуют связыванию конструкции Н8А линкера с клеткой-мишенью, тканью-мишенью или органом-мишенью. Связывающие элементы могут быть связаны с Н8А линкером (например, ковалентной связью (например, пептидной связью), ионной связью или за счет гидрофобного взаимодействия, или за счет высокоаффинного белок-белкового связывающего взаимодействия (например, биотин и авидин)). Как обсуждается выше, Н8А линкер по изобретению, который включает один или более полипептидных коннекторов или связывающих элементов, можно получать методами рекомбинантной ДНК или синтетическими методами.

С Н8А линкером по изобретению может быть связан один или более связывающих элементов. В одном варианте изобретения с Н8А линкером связаны два или более связывающих элемента (т.е. элементы, имеющие одинаковую структуру и одинаковую аффинность связывания), один или более (например, в тандеме) из них на амино- и карбоксиконцах, тем самым Н8А линкер предусматривает повышенную авидность связывающих элементов к их целевому антигену. Или же два или более различных связывающих элемента (например, антитело, такое как 5сРу с аффинностями связывания с двумя или более различными молекулами мишенями или 5сРу с аффинностями связывания с двумя или более различными эпитопами на одной и той же молекуле-мишени) могут связываться с Н8А линкером (например, биспецифическим конъюгатом Н8А линкера), содействуя тому, что конъюгат Н8А линкера может связываться с несколькими целевыми антигенами или эпитопами. В другом варианте изобретения различные виды связывающих элементов также могут связываться с Н8А линкером, придавая конъюгату линкера, на- 12 022201 пример, две или более различные специфичности связывания или агонистические/антагонистические биологические свойства. Комбинации пар связывающих элементов, применимые для получения биспецифических конъюгатов ΗδΑ линкера, раскрываются, например, в опубликованных международных патентных заявках \УО 2006/091209 и \УО 2005/117973, вводимых в данное описание в качестве ссылок. В других вариантах изобретения с ΗδΆ линкером могут связываться более двух связывающих элементов (например, одинаковых или различных связывающих элементов), образуя агент по изобретению.

Изобретение включает агент, имеющий, по меньшей мере, первый и второй связывающие элементы, каждый из которых может быть связан либо с амино-, либо с карбоксиконцом ΗδΑ линкерного белка, либо с полипептидными коннекторами, по определению в данном описании, находящимися на любом конце или на обоих концах. На фиг. 1 представлен типичный мутантный ΗδΑ линкер по изобретению, у которого два связывающих элемента (плечо 1 и плечо 2) связаны с мутантными ΗδΑ линкером аминоконцевым полипептидным коннектором ΑΑδ и карбоксиконцевым полипептидным коннектором ΑΑΑΚ (δΕΟ ГО N0: 5). Связывающие элементы (например, антитело или ксРу) могут быть связаны с другими локусами (например, внутренними аминокислотными остатками ΗδΑ линкера), например, ковалентной или ионной связью, например, с применением взаимодействий биотин-авидин. Биотинилирование амино- (например, лизиновых остатков) или сульфгидрильных (например, цистеиновых остатков) боковых цепей аминокислот известно в уровне техники и может быть использовано для присоединения связывающих элементов к ΗδΑ линкеру.

Связывающие элементы, которые можно включать в конъюгат ΗδΑ линкера по изобретению, включают антитела, фрагменты антител, рецепторы и лиганды. Связывающие элементы, связанные с ΗδΑ линкером по изобретению, могут быть рекомбинантными (например, человеческими, мышиными, химерными или гуманизированными), синтетическими или природными. Изобретение включает полные антитела, доменные антитела, диатела, биспецифические антитела, фрагменты антител, РаЬ фрагменты, Р(аЬ')₂ молекулы, одноцепочечные Ρν (ксРу) молекулы, тандемные 8сРу молекулы, слитые белки антител и аптамеры.

Антитела.

Антитела по изобретению включают 1§С, Ι§Α, 1дМ, 1§О и 1дЕ изотипы. Антитела и фрагменты антител по изобретению, используемые в данном описании, содержат одну или более гипервариабельных областей (СИК) или связывающие пептиды, которые связываются с целевыми белками, гликопротеинами или эпитопами, находящимися на внешней стороне или внутри клетки-мишени.

Многие антитела или их фрагменты по данному описанию могут претерпевать некритические (неответственные, неважные) замены, добавления или делеции как в вариабельной, так и в константной областях без утраты специфичности связывания или эффекторных функций или недопустимое снижение аффинности связывания (например, ниже примерно 10^-7 М). Обычно антитело или его фрагмент, в которые вводятся такие изменения, показывают практическую идентичность последовательности с последовательностью эталонного антитела или его фрагмента, из которой они получены. Иногда можно выбирать мутантное антитело или его фрагмент с той же специфичностью и повышенной аффинностью по сравнению с эталонным антителом или его фрагментом, из которого они получены. Метод фагового дисплея предоставляет мощный инструмент для селекции таких антител. См., например, е.д., Оо\\ег с1 а1., международная патентная заявка \УО 91/17271, МсСаПсПу е1 а1., международная патентная заявка \УО 92/01047 и ^ке, международная патентная заявка \УО 92/06204, вводимые в данное описание в качестве ссылки.

ΗδΑ линкер по изобретению может быть также связан с одним или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с целевым антигеном. Фрагменты антитела включают отдельные вариабельные области тяжелых цепей, вариабельные области легких цепей, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс и ксРу. Фрагменты можно получать ферментативными или химическими методами расщепления интактных иммуноглобулинов. Например, фрагмент Р(аЬ')2 можно получать из молекулы 1дС протеолитическим расщеплением пепсином при рН 3,0-3,5 стандартными методами, такими как методы, описанные в практикуме ΗηιΙολΥ апб Байе, ЛиПЬоФек: Α ЬаЬотаФту Мапиа1, Со1б δρτίη^ ИагЬог РиЬк., Ν.Υ. (1988). Фрагменты РаЬ можно получать частичным восстановлением фрагментов Р(аЬ')₂ или из целого антитела расщеплением папаином в присутствии восстановителя. Фрагменты можно также получать методами рекомбинантной ДНК. Сегменты нуклеиновых кислот, кодирующих выбранные фрагменты, получают расщеплением полноразмерных кодирующих последовательностей рестриктазами или синтезом бе ηονο. Часто фрагменты экспрессируются в виде слитых белков с оболочечным белком фага. Этот способ экспрессии имеет преимущество благодаря уточнению (сужению) антител по аффинности.

Гуманизированные антитела.

Помимо этого, изобретение включает гуманизированные антитела в комбинации с ΗδΑ линкером по изобретению, причем одна или более областей СОК антитела образованы из последовательности антитела нечеловеческого происхождения и одна или более, но предпочтительно все, СОК специфически связываются с антигеном (например, белком, гликопротеином или с другим подходящим эпитопом).

- 13 022201

Гуманизированное антитело содержит константные каркасные области практически человеческого антитела (называемого акцепторным антителом), а также в некоторых случаях преобладающую часть вариабельной области человеческого антитела. Включается одна или более областей СЭР (целиком или частично, а также отдельные аминокислоты, соседние с одной или более областями СЭР) антитела нечеловеческого происхождения, такого как мышиное антитело. Константная(ые) область(и) антитела может(гут) присутствовать или может(гут) отсутствовать.

Наиболее вероятно, что замена одной или более областей СИР мышиного антитела на человеческую последовательность каркасного участка вариабельного домена приведет к сохранению корректной пространственной ориентации, если человеческий каркасный участок вариабельной области примет ту же самую конформацию или конформацию, аналогичную конформации мышиного каркасного участка вариабельной области, из которого взяты СИР. Этого достигают, получая человеческие вариабельные домены из человеческих антител, каркасные последовательности которых показывают высокую степень идентичности последовательности и структурной идентичности с последовательностями каркасных участков мышиных вариабельных доменов, из которых образованы СЭР. Каркасные участки вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей могут быть образованы из одной и той же или из различных последовательностей человеческих антител. Человеческие последовательности антител могут представлять собой последовательности природных человеческих антител, консенсусные последовательности нескольких человеческих антител или могут являться последовательностями вариабельных доменов человеческой зародышевой линии. См., например, КеЙеЬотоидЬ с1 а1., Рто1ет Епдтеегшд, 4, 773 (1991), Ко1Ьшдег с1 а1., Рто1еш Епдшеегтд, 6, 971(1993).

Подходящие последовательности человеческих антител идентифицируют с помощью выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных областей мышиного антитела с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводят отдельно для тяжелой и легкой цепей, но принцип одинаков для каждой цепи.

Методы получения химерных и гуманизированных антител и фрагментов антител описаны, например, в патентах США № 4816567, 5530101. 5622701, 5800815, 5874540, 5914110, 5928904, 6210670, 6677436 и 7067313 и в патентных заявках США № 2002/0031508, 2004/0265311 и 2005/0226876. Помимо этого, получение антитела или его фрагментов описано в патентах США № 6331415, 6818216 и 7067313.

Рецепторы и лиганды.

Изобретение включает белковые или гликопротеиновые рецепторы или лиганды, связанные с Н8А линкером по изобретению. Н8А линкеры, связанные с рецептором или лигандом, можно использовать, например, для специфического нацеливания на секретированный белок, клетку (например, раковую клетку), ткань или орган. Помимо этого, специфическое связывание конъюгата Н8А линкер-рецептор или конъюгат с когнатными (своими) целевыми рецепторами или лигандами может вызвать агонистическую или антагонистическую биологическую активность на пути внутриклеточной или межклеточной передачи сигнала. Как и в случае других связывающих элементов по данному описанию, рецепторы и лиганды или их фрагменты могут соединяться с амино- и/или карбоксиконцом Н8А линкера по изобретению или с аминокислотным остатком внутри Н8А линкера.

Типичные рецепторы и лиганды, которые могут связываться с Н8А линкером по изобретению, включают, но без ограничения, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (ЮР1Р), ЮР2Р, инсулиноподобный фактор роста (ЮР), рецептор фактора мезенхимально-эпителиального перехода (с-шеЕ также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (НСРР)), фактор роста гепатоцитов (НОР), рецептор эпидермального фактора роста (ЕОРР), эпидермальный фактор роста (ЕОР), герегулин, рецептор фактора роста фибробластов (РОРР), рецептор фактора роста тромбоцитов (РЭСЕР), фактор роста тромбоцитов (РЭСР), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОРР), сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕОР), рецептор фактора некроза опухолей (ТИГР), фактор некроза опухолей альфа (ЮТ-а), ΤΜΕ-β, рецептор фолата (Р0ЬР), фолат, рецептор трансферрина (ТГР), мезотелин, Рс рецептор, с-РП рецептор, с-ΡίΙ, а4-интегрин, Р-селектин, рецептор-1 сфингозин-1-фосфата (81РР), рецептор гиалуроната, лейкоцитарный функциональный антиген типа 1 (ЬРА-1), СЭ4, СЭ11, СЭ18, СЭ20, СЭ25, СЭ27, СЭ52, СЭ70, СЭ80, СЭ85, СЭ95 (Раз рецептор), СЭ106 (молекулу клеточной адгезии сосудов 1 (УСАМ1), СЭ166 (активированную молекулу лейкоцитарной клеточной адгезии (АЬСАМ)), СИ 178 (Раз лиганд), СЭ253 (ТХР-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд (ТРАГЬ)), 1С08 лиганд, ССР2, СХСР3, ССР5, СХСЬ12 (фактор стромальных клеток 1 (8ЭР-1)), интерлейкин 1 (Ш-1), СТЬА-4, рецепторы альфа и бета, МАРТ-1, др100, МАОЕ-1, эфриновый (ЕрЬ) рецептор, молекулу клеточной адгезии слизистой оболочки-адрессин-1 (МАбСАМ-1), карциноэмбриональный антиген (СЕА), Ее\\)5^У, МИС-1, молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), раковый антиген 125 (СА125), простат-специфический мембранный антиген (Р8МА), ТАО-72 антиген и их биологически активные фрагменты.

Рецепторы и лиганды можно экспрессировать, выделять или связывать с Н8А линкером по изобретению любыми методами, описанными выше, относящимися к антителам или фрагментам антител.

- 14 022201

Диагностические агенты.

ΗδΑ линкер по изобретению или конъюгированный с ним любой связывающий элемент (например, антитело, фрагмент антитела, рецептор или лиганд) могут быть связаны с хелатирующим (комплексообразующим) агентом или с детектируемой меткой с образованием диагностического агента по изобретению. Также рассматриваются конъюгаты ΗδΆ линкера, которые включают детектируемую метку по данному описанию, а также один или более терапевтических агентов или связывающих элементов по данному описанию.

ΗδΑ линкер и хелатираующие (комплексообразующие) компоненты могут связываться с образованием конъюгата реакцией свободной аминогруппы остатка треонина ΗδΑ линкера с соответствующей функциональной группой хелатирующего вещества, такой как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа. Например, конъюгат может образовываться при введении комплексообразователя этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, ΕΌΤΑ), широко применяемой в координационной химии, функционализованной карбоксильной группой в этиленовой цепи. Синтез производных ΕΌΤΑ такого типа представлен в Αι-уа с( а1. (ВюеопщдЦс СНстМгу. 2, 321 (1991)), где описано блокирование каждой из четырех образующих координационные связи карбоксильных групп трет-бутильной группой, тогда как карбоксильный заместитель в этиленовой цепи свободен и может реагировать с аминогруппой пептидного участка агента по изобретению, при этом образуется конъюгат.

ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера могут включать металл-хелатирующий компонент, который является пептидным, т.е совместимым с твердофазным пептидным синтезом. В этом случае хелатирующий реагент может связываться с ΗδΑ линкером по изобретению таким же, описанным выше, способом, что и этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), или более обычно хелатирующий агент и ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера по изобретению синтезируют ίη ΐοΐο, начиная с С-концевого остатка ΗδΑ линкера или конъюгата ΗδΑ линкера и кончая Ν-концевым остатком хелатирующего агента.

Помимо этого, ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера может включать связывающую группу, которая служит для связывания ΗδΑ линкера по изобретению с хелатирующим агентом, но в то же время не оказывает вредного воздействия на биологические свойства ΗδΑ линкера, нацеливающую функцию участка(ов) связывающего(их) элемента (элементов) конъюгата ΗδΑ линкера или металлсвязывающую функцию хелатирующего агента. Подходящие связывающие группы включают аминокислотные цепи и алкильные цепи, функционализованные реакционноспособными группами для связывания ΗδΑ линкера или конъюгата ΗδΑ линкера с хелатирующим агентом. Аминокислотная цепь является предпочтительной связывающей группой, если хелатирующий агент имеет пептидную природу, так что ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера можно синтезировать полностью (ίη ΐοΐο) твердофазными методами. Связывающая группа с алкильной цепью может быть включена в ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера реакцией аминогруппы остатка треонина пептидного участка ΗδΑ линкера по изобретению с первой функциональной группой в алкильной цепи, такой как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа. Затем хелатирующий агент связывают с алкильной цепью, завершая образование ΗδΑ линкера или конъюгата ΗδΑ линкера, реакцией второй функциональной группы в алкильной цепи с соответствующей группой в хелатирующем агенте. Вторую функциональную группу в алкильной цепи выбирают из заместителей, которые реагируют с функциональной группой в хелатирующем агенте, но не реагируют с остатком треонина мутантного ΗδΑ линкерного белка. Например, если хелатирующий агент включает функциональную группу, такую как карбоксильная группа или активная сложноэфирная группа, второй функциональной группой в алкильной связывающей группе может быть аминогруппа. Понятно, что при образовании ΗδΑ линкера или конъюгата ΗδΑ линкера может потребоваться защита и депротекция (снятие защитной группы) присутствующих функциональных групп, чтобы избежать образования нежелательных продуктов. Защиту и депротекцию проводят, используя обычные в органическом синтезе защитные группы, реагенты и протоколы. В частности, можно применять описанные выше методы введения (защиты) и снятия (депротекции) защитных групп, используемые в твердофазном синтезе.

Альтернативной алкильной цепи химической связывающей группой является полиэтиленгликоль (ПЭГ), функционализованный так же, как описано выше для включения алкильной цепи в ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера. Понятно, что в качестве альтернативы связывающие группы могут сначала связываться с хелатирующим агентом, а затем с ΗδΑ линкером или конъюгатом ΗδΑ линкера по изобретению.

В соответствии с одним аспектом изобретения конъюгаты ΗδΑ линкер-хелатирующий агент по изобретению включают применимый для диагностики металл, способный образовывать комплекс. Подходящие металлы включают, например, радионуклиды, такие как технеций и рений, в различных формах (например, ^99тТсО³⁺, ^99тТсО2+, КеО³⁺ и КеО2⁺). Включение металла в ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера можно осуществлять различными методами, хорошо известными в координационной химии. Если металлом является технеций-99т, для получения комплекса технеция можно применять следующую общую методику. Сначала получают раствор конъюгата ΗδΑ линкер-хелатирующий агент, растворяя ΗδΑ линкер или конъюгат ΗδΑ линкера в водном спирте, таком как этанол. Затем раствор дегазируют с целью удаления кислорода с помощью подходящего реагента, например гидроксида натрия, депротекционируют тиольные группы и нейтрализуют органической кислотой (такой как уксусная кислота

- 15 022201 (рН 6,0-6,5). На стадии введения метки (мечения) стехиометрический избыток пертехнетата натрия, полученного с применением молибден-технециевого генератора, добавляют к раствору конъюгата с таким количеством восстановителя, такого как хлорид олова, которого достаточно для восстановления технеция, и нагревают. Меченый Н8А линкер или конъюгат Н8А линкера можно отделить от примесей ^99тТс04^- и коллоидного ^99тТс02, хроматографируя, например, с применением картриджа С-18 8ер Рак.

В альтернативном методе мечение Н8А линкера по изобретению можно осуществлять по обменной реакции хелатирования (трансхелатирования, перехелатирования, обменного комплексообразования). Источником технеция является раствор комплекса технеция с лабильными лигандами, способствующими обмену лиганда на выбранный хелатирующий агент. Лиганды, подходящие для обменной реакции хелатирования (трансхелатирования), включают тартрат, цитрат и гептаглюконат. В этом примере предпочтительным восстановителем является дитионат натрия. Понятно, что Н8А линкер или конъюгат Н8А линкера можно метить описанными выше методами или можно метить сам хелатирующий агент, а затем связывают с Н8А линкерным белком по изобретению с образованием конъюгата Н8А линкерхелатирующий агент; этот метод называется методом с предварительно меченым лигандом.

Другой метод введения метки в Н8А линкер по изобретению или любой агент, конъюгированный с ним, включает иммобилизацию конъюгата Н8А линкер-хелатирующий агент на твердофазной подложке за счет связи, которая расщепляется при образовании координационного комплекса с металлом (при хелатировании металла). Предпочтительно, чтобы комплексообразующий атом серы связывался с подложкой, которая функционализируется δ-защитной группой, такой как малеимидная.

При введении в качестве метки металла, используемого для диагностики, агент по изобретению, который включает конъюгат Н8Л линкер-хелатирующий агент, можно применять для обнаружения ткани, у которой повышен риск развития ракового заболевания (например, рака легкого, рака молочной железы, рака толстой кишки или рака предстательной железы), возрастных заболеваний (например, сердечнососудистого заболевания, цереброваскулярных заболеваний или болезни Альцгеймера), заболеваний, вызванных употреблением табака (например, эмфиземы, аневризмы аорты, рака пищевода или плоскоклеточного рака головы и шеи), обычными в диагностике методами. Агент по изобретению, который включает Н8А линкер, меченный радионуклидом, таким как технеций-99т, можно вводить млекопитающему, например человеку, внутривенной инъекцией в фармацевтически приемлемом растворе, таком как изотонический солевой раствор, или другими методами по данному описанию. Количество меченого агента по изобретению, требующееся для введения, зависит от профиля распределения выбранного Н8А линкера или конъюгата Н8А линкера в том смысле, что агент по изобретению, который включает быстровыводимый из организма Н8А линкер или конъюгат Н8А линкера, можно вводить в более высоких дозах, нежели агент, который включает медленнее выводимый из организма Н8А линкер или конъюгат Н8А линкера. Разовые (стандартные) дозы, приемлемые для визуализации тканей, составляют примерно 5-40 мКи при массе пациента 70 кг. За ίη νίνο распределением и локализацией агента по изобретению, который включает Н8А линкер или конъюгат Н8А линкера, можно следить стандартными методами по данному описанию в определенное время после введения, обычно через время З0-180 мин, примерно до 5 дней после введения, в зависимости от скорости аккумуляции в сайте-мишени с учетом скорости клиренса в нецелевой ткани.

Для применения в диагностике или терапии Н8А линкер по изобретению либо любую молекулу или элемент, конъюгированный с ним, можно также модифицировать или метить. Детектируемые метки, такие как радиоактивные, флуоресцентные или содержащие тяжелые металлы молекулы, могут быть связаны с любыми агентами по изобретению. Предпочтительным является введение в агент одной, двух или нескольких меток. Например, двойное мечение радиоактивным йодом одного или более остатков наряду с дополнительным связыванием, например Υ⁹⁰, с помощью хелатирующей группы, с аминсодержащим сайтом или с реакционноспособным группами, позволяет провести комбинированное мечение. Такое мечение может применяться для специализированных диагностических целей, таких как идентификация широко распределенных в организме небольших масс опухолевых клеток.

Н8А линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент по изобретению можно также модифицировать, например, галогенированием тирозиновых остатков пептидного компонента. Галогены включают фтор, хлор, бром, йод и астатин. Такие галогенированные агенты можно метить детектируемой меткой, если атом галогена является радиоизотопом, например, таким как ¹⁸Ε, ⁷⁵Вг, ⁷⁷Вг, ¹²²1, ^12З1, ¹²⁴1, ¹²⁵1, ¹²⁹1, ^1З11 или ²¹¹Л1. Галогенированные агенты по изобретению содержат атом галогена, связанный по меньшей мере с одной аминокислотой и предпочтительно с Ό-Тут остатками в каждой молекуле. Другие подходящие детектируемые модификации включают связывание других компонентов (например, флуорохрома, такого как флуоресцеин) с лизиновым остатком агента по изобретению или аналога, в частности агента или аналога, имеющего линкер, включающий лизиновые остатки.

Радиоизотопы для введения радиоактивной метки в Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент включают любой радиоизотоп, который может быть связан ковалентной связью с остатком пептидного компонента агента по изобретению или его аналога. Радиоизотопы можно также выбирать из радиоизотопов, испускающие при расщеплении бета- или гаммачастицы, любые агенты по изобретению можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали

- 16 022201 хелатирующие группы, которые, например, могут быть связаны ковалентной связью с лизиновым(и) остатком(амин) Н8А линкера или конъюгированного с ним пептидного агента. Хелатирующие группы можно затем модифицировать таким образом, чтобы они содержали несколько радиоизотопов, таких как изотопы галлия, индия, технеция, иттербия, рения или таллия (например, ¹²⁵1, ⁶⁷Оа, ¹¹¹1п, ^99тТс, ¹⁶⁹УЬ, ¹⁸⁶Ке).

Н8А линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно модифицировать присоединением радиоизотопа. Предпочтительными радиоизотопами являются такие радиоизотопы с периодом полураспада, соответствующим биологическому периоду полужизни используемого Н8А конъюгата или превышающим этот биологический период полужизни. Более предпочти122^ 123^ тельно, чтобы радиоизотопом являлся радиоизотоп атома галогена (например, радиоизотоп атома фтора хлора, брома, йода или астатина), еще более предпочтительно ⁷⁵Вг, ⁷⁷Вг, ⁷⁶Вг.

¹²⁴Ι,¹²⁵Ι,¹²⁹Ι, ¹³¹1 или ¹А1.

Агент по изобретению, который включает Н8А линкер либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно связывать с радиоактивными металлами и применять при радиографической визуализации или в радиотерапии. Предпочтительные радиоизотопы включают также ^99тТс, ⁵¹ Сг, ⁶⁷Оа, ⁸⁸Υ, ¹⁵³§т, ¹⁵⁶Но,

ΊΚ ⁶⁴Си, ⁹⁷Ки, ²¹¹Βί, ²¹²Βί, ²¹³Βί и ³Ки, Ке, Ке, ²⁰³РЬ.

⁸Оа, ¹¹¹1п, ¹⁶⁸ΥΧ ¹⁴⁰Ьа, ⁹⁰Υ, ²¹⁴Βί. Выбор металла определяется необходимым терапевтическим или диагностическим применением.

Н8А линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно связывать с металлическим компонентом, получая агент по изобретению, который можно применять в качестве диагностического или терапевтического агента. Детектируемая метка может представлять собой ион тяжелого или редкоземельного металла, такой как Ой³', Ре³⁺, Мп³⁴ или Сг²⁴. Агент по изобретению, который включает Н8А линкер, содержащий связанные с ним ионы парамагнитных (парамагнетиков) или суперпарамагнитных металлов, применимы в качестве диагностических агентов в МРТ. Парамагнетики, которые могут связываться с агентами по изобретению, включают, но без ограничения, хром(111), марганец(П), железо(11), железо(111), кобальт(11), никель(11), медь(11), празеодим(Ш), неодим(111), самарий(111), гадолиний(Ш), тербий(111), диспрозий(Ш), гольмий(Ш), эрбий(111) и иттербий(Ш).

Хелатирующие группы могут применяться для непрямого связывания детектируемых меток или других молекул с Н8А линкером по изобретению или с конъюгированным с ним агентом. Хелатирующие группы могут связывать агенты по изобретению с радиометками, такими как бифункциональный устойчивый хелатирующий агент (комплексообразователь), или с одной или более реакционноспособных концевых или внутренних аминокислотных групп. Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может связываться с помощью изотиоцианат-в-А1а или соответствующего не-а-аминокислотного линкера, который предупреждает расщепление (деградацию) по Эдману. Примеры хелатирующих агентов, известных в уровне техники, включают, например, иминокарбоксильные и полиаминополикарбоксильные реакционноспособные группы, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ЭТРА) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (РОТА).

НА§ линкер по изобретению в процессе рекомбинантной экспрессии можно связывать с пептидной детектируемой меткой или диагностическим агентом. Пептиды и белки, которые можно применять в качестве детектируемой метки с Н8А линкером, включают, но без ограничения, флуоресцентные белки, биолюминесцентные белки и эпитопные тэги (метки), все они подробнее обсуждаются ниже. Одну или более этих детектируемых меток можно также включать в Н8А линкер по изобретению, который также включает терапевтический, цитотоксический или цитостатический агент.

Флуоресцентные белки, или флуорохромы, такие как зеленый флуоресцентный белок (ОРР, 8Е0 ГО N0: 47), улучшенный ОРР (еОРР), желтый флуоресцентный белок (8Е0 ГО N0: 48, ΥΡΒ), циановый (голубой) флуоресцентный белок (8Е0 ГО N0: 49, СРР) и флуоресцентный белок красный (8Е0 ГО N0: 50, КРР или РкКей) можно использовать в качестве детектируемой метки, соединенной с Н8А линкером по изобретению. Флуоресцентные белки можно рекомбинантно экспрессировать в клетке (например, клетке крови, такой как лимфоцит) после трансфекции или трансдукции клетки экспрессирующим вектором, который кодирует нуклеотидную последовательность флуоресцентного белка. После экспозиции флуоресцентного белка при стимулирующей частоте световой волны (свете определенной длины волны) флуоресцентный белок испускает свет низкой, средней или высокой интенсивности, который можно наблюдать под микроскопом или с помощью оптического визуализирующего устройства. Типичные флуоресцентные белки, пригодные для применения в качестве диагностической последовательности в агентах по изобретению, описаны, например, в патентах США № 7417131 и 7413874, каждый из них вводится в данное описание в качестве ссылки.

Биолюминесцентные белки также можно использовать в качестве детектируемой метки, введенной в Н8А линкер по изобретению. Биолюминесцентные белки, такие как люцифераза (например, люцифераза светляков (5>Е0 ГО N0: 51), люцифераза коралла Кеш11а гешГогпик (8Е0 ГО N0: 52) и люцифераза грибов ОтрНа1о1ик о1еагшк) и экворин (аедиог1п, белок медуз), испускают свет при химической реакции с субстратом (например, люциферином и коэлентеразином). В одном варианте изобретения вектор, кодирующий ген люциферазы, позволяет ш γί\Ό, ш уйго или ех νί\Ό детектировать клетки (например, клетки

- 17 022201 крови, такие как лимфоциты), трансдуцированные или трансфицированные методами по изобретению. Типичные биолюминесцентные белки, применимые в качестве диагностической последовательности по изобретению и методы их применения описаны, например, в патентах США № 5292658, 5670356, 6171809 и 7183092, каждый из которых вводится в данное описание в качестве ссылки.

Эпитопные метки (тэги) представляют собой короткие аминокислотные последовательности, имеющие протяженность, например, 5-20 аминокислотных остатков, которые можно включать в Η8Ά линкер по изобретению в качестве детектируемой метки, чтобы содействовать обнаружению Η8Ά линкера, экспрессированного в клетке, секретированного клеткой или связанного с клеткой-мишенью. Агент по изобретению, который включает эпитопную метку в качестве диагностической последовательности, можно обнаружить посредством его взаимодействия с антителом, фрагментом антитела или другой связывающей молекулой, специфической к эпитопной метке. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эпитопную метку, получают либо клонированием соответствующих участков природных генов, либо синтезом полинуклеотида, который кодирует эпитопную метку. Антитело, фрагмент антитела или другая связывающая молекула, которые связывают эпитопную метку, могут непосредственно включать эпитопную метку (например, флуорохром, радиометку, тяжелый металл или фермент, такой как пероксидаза хрена) или сами служат в качестве мишени для вторичного антитела, фрагмента антитела или другой связывающей молекулы, которая включает такую метку. Типичные эпитопные метки, которые можно использовать в качестве диагностической последовательности, включают с-тус (8ЕЦ ГО N0: 33), гемагглютининовую (НА, 8ЕЦ ГО N0: 34) и гистидиновую метку (Ηίδ-6, 8ЕЦ ΙΌ N0: 35). Кроме того, флуоресцентные (например, СТР) и биолюминесцентные белки могут также служить в качестве эпитопных меток, так как антитела, фрагменты антител и другие связывающие молекулы для обнаружения этих белков являются доступными (выпускаются промышленно).

Ιη νίνο, ίη νίΐτο или ех νίνο обнаружение, визуализацию Η8Ά линкера по изобретению или слежение за Η8Ά линкером по изобретению, который включает диагностическую последовательность (например, флуоресцентный белок, биолюминесцентный белок или эпитопную метку), или обнаружение, визуализацию любой клетки или слежение за любой клеткой, экспрессирующей Η8Ά линкер или связанной с Η8Ά линкером, можно осуществлять с помощью микроскопа, проточного цитометра, люминометра или другого прибора для оптической визуализации, такого как ΙΥΙ8® 1тадшд 8у§1ет (СаПрег ЫГе8с1епсе5. ΗορΚίηΙοη. МА).

Терапевтические или цитотоксические агенты, связанные с Η8Α линкером по изобретению.

Η8Α линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может связываться с любым известным цитотоксическим или терапевтическим элементом с образованием агента по изобретению, который можно вводить для лечении, ингибирования, ослабления или облегчения заболевания. Примеры включают, но без ограничения, противоопухолевые агенты, такие как активицин, акларубицин, акодазола гидрохлорид; акронин; адозелезин; адриамицин; алдеслейкин; алтретамин; амбомицин; аметантрона ацетат; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; бисантрена гидрохлорид; биснафида димезилат; бизелезин; блеомицина сульфат; бреквинар натрия; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калустерон; камптотецин; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицина гидрохлорид; карзелезин; цедефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; комбретестатин А-4; криснатола мезилат; циклдофосфамид; цитарабин; дакарбазин; ЭАСА ^-[2-(диметиламино)этилакридин-4-карбоксамид]; дактиномицин; даунорубицина гидрохлорид; дауномицин; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанина мезилат; диазиквон; доцетаксел; доласатины; доксорубицин; доксорубицина гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифена цитрат; дромостанолона пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорид; эллиптицин; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; эстрамустина фосфат (динатриевая соль); этанидазол; этиодизированное масло I 131; этопозид; этопозида фосфат; этоприн; фадрозола гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; флуорурацил; 5-ΡάϋΜΡ; флуроцитабин; фоскидон; фостриецин натрий; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; золото Аи 198; гомокамптотецин; гидроксимочевина; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; илмофозин; интерферон альфа-2а; интерферон альфа-2Ъ; интерферон альфа-п1; интерферон альфап3; интерферон бета-1а; интерферон гамма-1Ъ; ипроплатин; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; лейпролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид, мазопрокол, майтанзин, мехлоретамина гидрохлорид, мегестрола ацетат, меленгестрола ацетат, меногарил, меркаптопурин, метотрексат, метотрексат натрия, метоприн, метуредепа, митиндомид, митокарцин, митокромин, митогиллин, митомалцин, митомицин, митоспер, митотан, митоксантрона гидрохлорид, микофенольная кислота, нокодазол, ногаламицин, ормаплатин, оксисуран, паклитаксел, пэгаспаргаза, пелиомицин, пентамустин, пеплоицина сульфат, перфосфамид, пипоброман, пипосульфан, пироксантрона гидрохлорид, пликамицин, пломестан, порфимер натрия, порфиромицин, преднимустин, прокарбазина гидрохлорид, пуромицин, пуромицина гидрохлорид, пиразофурин, ризоксин, ризоксин Ό, рибоприн, роглетимид, сафингол, сафингола гидрохлорид, семустин, симтразен, спарфосат натрия, спарсомицин, спирогермания гидрохлорид, спиромустин, спироплатин, стрептонигрин, стрептозоцин, строн- 18 022201 ция δτ 89 хлорид, сулофенур, тализомицин, таксан, таксоид, текогалан натрия, тегафур, телоксантрона гидрохлорид, темопорфин, тенипозид, тероксирон, тестолактон, тиамиприн, тиогуанин, тиотепа, тимитак, тиазофурин, тирапазамин, томудекс, ТОР53, топотекана гидрохлорид, торемифена цитрат, трестолона ацетат, трицирибина фосфат, триметрексат, триметрексата глюкуронат, трипторелин, тубулозола гидрохлорид, урацил мустард, уредепа, вапреотид, вертепорфин, винбластин, винбластина сульфат, винкристин, винкристина сульфат, виндезин, виндезина сульфат, винепидина сульфат, винглицината сульфат, винлейрозина сульфат, винорелбина тартрат, винрозидина сульфат, винзолидина сульфат, ворозол, зениплатин, зиностатин, зорубицина гидрохлорид, 3-хлордезоксиаденозин, 2'-дезоксиформицин, 9-аминокамптотецин, ралтитрексед, ^пропаргил-5,8-дидеазафолиевая кислота, 2-хлор-2'-арабинофтор2'-дезоксиаденозин, 2-хлор-2'-дезоксиаденозин, анизомицин, трихостатин Α, ЬРКЬ-С129К, СЕР-751, линомид, сернистый иприт, азотистый иприт (мехлорэтамин), циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфан, Ν-метил-нитрозомочевина (ΜΝυ), ^№-бис-(2-хлорэтил)^-нитрозомочевина (ΕϋΝϋ), ^(2-хлорэтил)-№-циклогексил-^нитрозомочевина (СС^и), ^(2-хлорэтил)-№-(транс-4метилциклогексил)-^нитрозомочевина (МсССии), ^(2-хлорэтил)-№-(диэтил)этилфосфонатнитрозомочевина (фотемустин), стрептозотоцин, диакарбазин (ОТ1С), митозоломид, темозоломид, тиотепа, митомицин С, ΑΖρ, адозелезин, цисплатин, карбоплатин, ормаплатин, оксалиплатин, С1-973, Ό\νΑ 2114К, ΪΜ216, ΪΜ335, бис-(платина), томудекс, азацитидин, цитарабин, гемцитабин, 6-меркаптопурин, 6тиогуанин, гипоксантин, тенипозид, 9 аминокамптотецин, топотекан, СРТ-11, доксорубицин; дауномицин; эпирубицин; дарубицин; митоксантрон; лозоксантрон; дактиномицин (актиномицин Ό); амсакрин; пиразолоакридин; полностью трансретинол; 14-гидроксиретроретинол; полностью транс-ретиноевая кислота; ^(4-гидроксифенил)ретинамид; 13-цис-ретиноевая кислота; 3-метил ТТNЕВ; 9-цис-ретиноевая кислота; флударабин (2-Ρ-αΓα-ΑΜΓ) или 2-хлордезоксиаденозин (2-Сйа).

Другие терапевтические соединения включают, но без ограничения, 20-р1-1,25 дигидроксивитамин Ό3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфульвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкин; антагонисты ΑΣΕ-ΕΚ; альтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновую кислоту; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист Ό; антагонист С; антареликс; антидорсализующий морфогенетический белок-1; антиандроген, карцинома простаты; антиэстроген; антиэстроген; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколина глицинат; модуляторы генов апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; а^а-С^Р-^^-РТВΑ; аргининдеаминазу; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азастерон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимустат; антагонисты ВСК/ΑβΕ; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные бета-лактамов; бета-алетин; бетакламицин В; бетулиновую кислоту; ингибитор ЬРСР; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен А; бизелезин; брефлат; блеомицин А2; блеомицин В2; бропиримин; будотитан; бутионин сульфоксимина; кальципотриол; кальфостин С; производные камптотецина (например, 10-гидрокси-камптотецин); канарипокс 1Ь-2; капецитабин; карбоксамид-аминотриазол; карбоксамидотриазол; СаРсЧ Μ3; СΑΚN 700; ингибитор из хрящевой ткани; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (Ιί'Όδ); кастаноспермин; цекропин В; цетрореликс; хлорины; хлорхиноксалина сульфонамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллимустин А; коллимустин В; комбрестатин А4; аналог комбрестатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина А; курацин А; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабина октосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин В; 2'-дезоксиформицин (ЭСР); деслорелин; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемин В; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5азацидин; дигидротаксол, 9-; диоксамицин; дифенилспиромустин; дискодермолид; докозанол; доласетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин δΑ; эбселен; экомустин; эдельфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпотилоны (Α, К=Н; В, Κ=Μβ); эпитилоны; эпирестид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; этопозид; этопозида 4'-фосфат (этопофос); экземестан; фадрозол; фазарабин; фенретидин; филгастим; финастерид; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтородаунорубицина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиния тексафирин; галлия нитрат; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; герегулин; гексаметилен бисацетамид; гомогаррингтонин (ННТ); гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; имидазоакридоны; имиквимод; иммуностимулирующие пептиды; ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; йоддоксорубицин; ипомеанол 4-; иринотекан; ироплакт; ирсогландин; изобенгазол; изогомогаликондрин В; итасетрон; жасплакинолид; кахалалид Р; ламелларина-Ν триацетат; ланреотид; леинамицин; ленограстин; лентинана сульфат; лептолстатин; летрозол; лейкоз-ингибирующий фактор; лейкоцитарный альфа-интерферон; лейпролид + эстроген + прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; линейный полиаминный аналог; липофильный дисахарид-пептид; липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; ловастатин; локсорибин; луртотекан; лютеция тексафирин; лизофиллин; литические пептиды; майтанзин; манностатин А; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матриксных металлопротеиназ; меногарил;

- 19 022201 мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор М1Р; мифепристон; милтефозин; миримостин; пивпиЛсНей двухцепочечную РНК (с мисматчами); митрацин; митогуазон; митолакол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксин фактор роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостин; моноклональное антитело, человеческий хорионный гонадотропин; монофосфориллипид А+вк клеточной стенки миобактерий; мопидамол; ингибитор гена множественной лекарственной устойчивости; терапию множественным опухолевым супрессором-1; противораковый агент мустин; микапероксид В; экстракт микобактериальных клеточных стенок; мириапорон; Ν-ацетилдиналин; Ν-замещенные бензамидины; нафарелин; нагрестип; налоксон + пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нейтральную эндопептидазу; нилутамид; низамицин; модуляторы оксида азота; нитроксидный антиоксидант; нитруллин; 06-бензилгуанин; октреотид, окиценон, олигонуклеотиды, онапристон, ондансетрон, орацин, пероральный индуктор цитокинов, ормаплатин, осатерон. оксалиплатин, оксауномицин, аналоги паклитаксела, производные паклитаксела, палауамин, пальмитоилризоксим, памидроновую кислоту, панакситриол, паномифен, парабацин, пазеллиптин, пегаспаргазу, пелдезин, пентозана полисульфат, натриевую соль, пентостатин, пентрозол, перфлуброн, перфосфамид, периллиловый спирт, феназиномицин, фенилацетат, ингибиторы фосфатаз, пицибанил, пилокарпина гидрохлорид, пирарубицин, плацетин А, плацетин В, ингибитор активатора плазминогена, комлексы платины, соединения платины, комплекс платина-триамин, подофиллотоксин, порфимер натрия, порфиромицин, пропил бис-акридон, простагландин ί2, ингибиторы протеасомы, иммуномодулятор на основе белка А, ингибиторы протеинкиназы С, микроалгал, ингибиторы протеинтирозинфосфатазы, ингибиторы пурин-нуклеозидфосфорилазы, пурпурины, пиразолоакридин, конъюгат пиродоксилированного гемоглобина с полиоксиэтиленом, антагонисты гаГ, ралтитрексед, рамосетрон, ингибиторы гав фарнезилпротеинтрансферазы, ингибиторы гав, ингибитор гав-САР, деметилированный ретеллиптин, рения Ке 186 этидронат, ризоксин, рибозимы, К11 ретинамид, роглетимид, рохитукин, ромуртид, роквинимекс, робугинон В1, робуксил, сафингол, саинтопин, 8агС.%и, саркофитол А, сарграмостим, миметики δάί I, семустин, (вепевсепсе йегйей) ингибитор старения 1, смысловые олигонуклеотиды, ингибиторы сигнальной трансдукции, модуляторы сигнальной трансдукции, одноцепочечный антигенсвязывающий белок, сизофиран, собузоксан, борокаптат натрия, фенилацетат натрия, солверол, соматомединсвязывающий белок, сонермин, спарфосовую кислоту, спикамицин Ό, спиромустин, спленопентин, спонгистатин 1, скваламин, ингибитор стволовых клеток, ингибиторы деления стволовых клеток, стипиамид, ингибиторы стромелизина, сульфонизин, антагонист суперактивного вазоактивного кишечного пептида, сурадисту, сурамин, сваинсонин, синтетические гликозаминогликаны, таллимустин, тамоксифена метйодид, тауромустин, тазаротен, текогалан натрия, тегафур, теллурапирилий, ингибиторы теломераз, темопорфин, темозоломид, тенипозид, тетрахлордекаоксид, тетразомин, талибластин, талидомид, тиокоралин, тромбопоэтин, миметик тромбопоэтина, тималфазин, агонист рецептора тимопоэтина, тимотринан, тиреоид-стимулирующий гормон, этилэтиопурпурин олова, тирапазамин, титаноцендихлорид, топотекан, топсентин, торемифен, фактор тотипотентных стволовых клеток, ингибиторы трансляции, третиноин, триацетилуридин, трицирибин, триметрексат, трипторелин, трописетрон; торустерид; ингибиторы тирозинкиназ; тирфостины; ингибиторы ИВС; убенимекс; фактор, ингибирующий рост урогенитального синуса; антагонисты урокиназных рецепторов; вапреотид; вариолин В; векторную систему, эритроцит-генную терапию; веларезол; верамин; вердины; вертепорфин; винорельбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб и зинастатин стималамер.

н§А линкерные агенты по изобретению могут включать также сайт-специфически конъюгированные молекулы и элементы. Сайт-специфическая конъюгация способствует контролируемому стехиометрическому связыванию со специфическими остатками в н§А линкере цитотоксических, иммуномодулирующих или цитостатических агентов, включая, например, тубулинсодержащие агенты, связующие малых бороздок ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты, антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, сенсибилизаторы химиотерапии или лучевой терапии, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомераз и алкалоиды винка или любые другие молекулы или элементы по данному описанию.

Методы конъюгации терапевтических агентов с белками и, в частности, с антителами, общеизвестны (например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АпйЬоФев Рог 1ттипо1агдейпд ОГ Эгидв Ιη Сапсег ТЬегару, ίη Мопос1опа1 АпйЬоФев Апй Сапсег ТЬегару (Ке1вГе1й е! а1., ейв., А1ап К. Пвв, 1пс., 1985); Ие11в!гот е! а1., АпйЬоЛев Рог Эгид □екгегу, ш Сойго11ей Эгид Оейгегу (КоЬшвоп е! а1., ейв., Магсе1 Эеккег, 1пс., 2'¹ ей. 1987); ТЬогре, АпйЬойу Сатегв ОГ Су!о!ох1с Адеп!в 1п Сапсег ТЬегару: А Ре\ае\у, ш Мопос1опа1 АпйЬоФев '84: Вю1од1са1 Апй Сйтса1 Аррйсайопв (РшсЬега е! а1., ейв., 1985); Апа1ув1в, Кевийв, апй РиЛге РговресШе оГ !Ье ТЬегареийс Иве оГ Кайю1аЬе1ей АпйЬойу 1п Сапсег ТЬегару, ш Мопос1опа1 АпйЬоЛев Рог Сапсег Ое!ес!юп Апй ТЬегару (Ва1йтп е! а1., ейв., Асайепис Ргевв, 1985); ТЬогре е! а1., 1ттипо1 Кех. 62: 119-58 (1982) и Оогопта е! а1., ЭезПортеп! оГ ро!еп! топос1опа1 апйЬойу аипв!айп соп|ида!ев Гог сапсег Легару, №-1!иге ВШесЬ. 21: (7) 778-784 (2003)). См. также, например, международную опубликованную заявку РСТ \УО89/12624.

- 20 022201

Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с литическим пептидом с образованием агента по изобретению. Такие литические пептиды индуцируют клеточную смерть и включают, но без ограничения, стрептолизин О; стохастический токсин; фаллолизин; альфа-токсин стафилококка; голотурин А; дегитонин; мелиттин; лизоцитин; кардиотоксин; и токсин сегеЪга1и1и5 А (Кет е1 а1., I. Вю1. СЬет. 253(16): 5752-5757, 1978). Агент по изобретению может образовываться конъюгацией Н8А линкера по изобретению либо любой конъюгированной с ним молекулы или элементы (например, конъюгатов антитела или фрагментов антитела) с синтетическим пептидом, который имеет некоторую общую гомологию или некоторые химические характеристики, общие с любыми природными пептид-лизинами; такие характеристики включают, но без ограничения, линейность, положительный заряд, амфипатичность и образование альфа-спиральных структур в гидрофобной среде (ЬеизсЬпег е! а1., В|о1оду οί Кергойисйоп, 73: 860-865, 2005). Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с агентом, который индуцирует комплемент-опосредованный лизис клеток, например, таким как субъединица иммуноглобулина Р_с. Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с любым членом семейства ферментов фосфолипаз (включая фосфолипазу А, фосфолипазу В, фосфолипазу С или фосфолипазу Ό) или с его каталитически активной субъединицей.

Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также связываться с радиоактивным агентом с образованием агента, который можно использовать для детекции или в терапии. Радиоактивные агенты, которые можно использовать, включают, но без ограни125 18 18 125 131 чения, фибриноген I; флудезоксиглюкозу Р; флуородопу Р; инсулин I; инсулин I; лобенгуан 123 131 131 131 123

I; йодипамид натрия I; йодоантипирин I; йодохолестерин I; йодогиппурат натрия I; йодогип125 131 125 131 пурат натрия I; йодогиппурат натрия I; йодопирацет I; йодопирацет I; лофетамина гидрохлорид 123 125 131 125 131 131 125

I; лометин I; лометин I; иоталамат натрия I; иоталамат натрия I; тирозин I; лиотиронин I; лиотиронин I; меризопрола ацетат Нд; меризопрола ацетат Нд; меризопрол I Нд; селенометионин ⁷⁵8е; технеций ^99тТс коллоидный трисульфид сурьмы; технеций ^99тТс бицизат; технеций ^99тТс дизофенин; технеций ^99тТс этидронат; технеций ^99тТс экзаметазим; технеций ^99тТс фурифозим; технеций ^99тТс глюцептат; технеция ^99тТс лидофенин; технеций ^99тТс меброфенин; технеций ^99тТс медронат; технеций Тс медронат динатрий; технеций Тс мертиатид; технеций Тс оксидронат; технеций Тс пентетат; технеций ^99тТс пентетат кальций тринатрий; технеций ^99тТс сестамиби; технеций ^99тТс сибороксим; технеций Тс; сукцимер; технеций Тс коллоидную серу; технеций Тс тебороксим; технеций ^99тТс тетрофосмин; технеций ^99тТс тиатид; тироксин ¹²Й; тироксин ¹³¹Σ; толповидон ¹³¹Σ; триолеин ¹²Й или триблеин ¹³¹Σ.

Кроме того, радиоизотоп может сайт-специфически связываться с Н8А линкером или с конъюгатом Н8А линкера. Соответствующие реакционноспособные группы можно использовать для конъюгации с сайт-специфическими бифункциональными хелатирующими агентами для мечения радиоизотопами, включая ¹²³Σ,¹²⁴Σ, ²‘³В1 или ²²⁵Ас.

Терапевтические или цитотоксические агенты, включенные в Н8А линкер или в конъюгат Н8А линкера или связанные с ним, могут, помимо этого, включать, например, противораковые дополнительные потенцирующие агенты, включая, но без ограничения, трициклические антидепрессанты (например, имипрамин, дезипрамин, амитриптилин, кломипрамин, тримипрамин, доксепин, нортриптилин, протриптилин, амоксапин и мапротилин); нетрициклические антидепрессанты (например, сертралин, тразодон и циталопрам); антагонисты Са²' (например, верапамил, нифедипин, нитрендипин и кароверин); ингибиторы кальмодулина (например, прениламин, трифторперазин и кломипрамин); амфотерицин В; аналоги трипаранола (например, тамоксифен); лекарства против аритмии (например, квинидин); гипотензивные лекарства (например, резерпин); вещества, уменьшающие содержание тиолов (истощающие тиол) (например, бутионин и сульфоксимин); и агенты, снижающие множественную лекарственную устойчивость (резистентность), такие как кремафор ЕЬ.

Агент по изобретению, который включает Н8А линкер или любую конъюгированную с ним молекулу или элемент, можно также связывать или вводить совместно с цитокинами (например, с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, интерфероном-альфа или фактором некроза опухолейальфа). Н8А линкер по изобретению или любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно также связывать с антиметаболическим агентом. Антиметаболические агенты включают, но без ограничения, следующие соединения и их производные: азатиоприн, кладрибин, цитарабин, дакарбазин, флударабина фосфат, генцитабина хлоргидрат, меркаптопурин, метотрексат, митобронитол, митотан, прогуанила хлоргидрат, пирометамин, ралтитрексед, триметрексата глюкуронат, уретан, винбластина сульфат, винкристана сульфат и т.д. Более предпочтительно Н8А линкер или конъюгат по изобретению может также связываться с антиметаболитом типа фолиевой кислоты, агентами класса, который включает, например, метотрексат, прогуанила хлоргидрат, пириметамин, трометамин или триметрексата глукуронат, или производные этих соединений. Н8А линкер по изобретению либо любая конъюгированная с ним молекула или элемент может также быть связана с противоопухолевыми агентами семейства антрацик^99тТс, ^шТп, ⁶⁴Си, ⁶⁷Си, ¹⁸⁶Ке,

Л, ¹³Т.

⁸Ке, Ьи, ⁹⁰Υ, Аз, ^/2Аз, ⁸⁶Υ, ⁸⁹Ζγ, А1. ²‘²Вг

- 21 022201 линов, включая, но без ограничения, акларубицина хлоргидрат, даунорубицина хлоргидрат, доксорубицина хлоргидрат, эпирубицина хлоргидрат, идарубицина хлоргидрат, пирарубицин или зорубицина хлоргидрат, камптотецин или его производные или родственные соединения, такие как 10,11 метилендиоксикамптотецин, или член семейства майтанзиноидов, которое включает ряд родственных по структуре соединений, например, ансамитоцин Р3, майтанзин, 2'-^деметилмайтанбутин и майтанбициклинол.

ΗδΑ линкер по изобретению либо любую конъюгированную с ним молекулу или элемент можно также непосредственно связывать с цитотоксическим или терапевтическим агентом общеизвестными химическими методами или связывать опосредованно с цитотоксическим или терапевтическим агентом через непрямое связывание. Например, ΗδΑ линкер может связываться с хелатирующей группой, соединенной с цитотоксическим или терапевтическим агентом. Хелатирующие группы включают, но без ограничения, иминокарбоксильные или полиаминополикарбоксильные реакционноспособные группы, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ΌΤΓΑ) и 1,4,7,10-тетраазациклодекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (Ό0ΤΑ). Общие методы описаны, например, в Ыи е! а1., ВюсопщдаЮ СНет. 12(4): 653, 2001, СНепд е! а1., международная патентная заявка №0 89/12631, К1ейег е! а1., международная патентная заявка №0 93/12112, МЬей е! а1., патент США № 5753627 и международная патентная заявка №0 91/01144 (все они вводятся в данное описание в качестве ссылки).

Агент по изобретению, который включает ΗδΑ линкер, одну или более связывающих элементов (в присутствии или в отсутствие промежуточных связывающих полипептидных коннекторов по данному описанию) и терапевтический или цитотоксический агент, может быть специфически нацелен с помощью связывающего элемента (например, антитела, фрагмента антитела или рецептора/лиганда) на клетку или ткань, что делает возможной селективная деструкция клетки- или ткани-мишени, на которую нацелен связывающий элемент. Например, агент по изобретению можно использовать, чтобы нацелить на раковую клетку и разрушить раковую клетку легкого, молочной железы, предстательной железы и толстой кишки, чтобы предупредить, стабилизировать, ингибировать прогрессирование или лечить раковые заболевания в этих органах, если агент включает связывающий элемент, который специфически связывается с раковыми клетками в этих органах. Также, например, агенты по изобретению можно использовать, чтобы нацелить на и разрушить клетки сосудистой системы, головного мозга, печени, почки, сердца, предстательной железы, прямой кишки, носоглотки, ротовой части глотки, гортани, бронхов и кожи, с целью предупредить, стабилизировать, ингибировать прогрессирование или лечить возрастные, вызванные курением или аутоиммунные заболевания или состояния, связанные с этими органами, путем нацеливания, в случае аутоиммунного заболевания, на аутореактивные Т-клетки (например, связыванием с рецептором фактора некроза опухолей 2 (ΤΝΡΚ2), присутствующим на аутореактивных Т-клетках или выступая в качестве агониста этого рецептора).

При рекомбинантной экспрессии ΗδΑ линкер по изобретению может связываться с цитотоксическим полипептидом. Цитотоксические полипептиды при контакте их с клеткой-мишенью (например, раковой клеткой) оказывают на клетку цитотоксический или цитотоксический эффект. Например, цитотоксический полипептид, связанный с ΗδΑ линкером по изобретению, при связывании клетки-мишени может индуцировать события в клетке-мишени, которые ведут к клеточной гибели, например, за счет апоптоза, некроза или старения. Или же цитотоксический полипептид, связанный с ΗδΑ линкером по изобретению, может препятствовать нормальной клеточной биологической активности или ингибировать нормальную клеточную биологическую активность, такую как деление, метаболизм и рост, или патологическую клеточную биологическую активность, такую как метастаз.

Например, ΗδΑ линкер по изобретению, связанный с каспазой 3, связывает клетку-мишень (например, раковую клетку) и подвергает эндоцитозу. После интернализации клеткой-мишенью участок каспазы в конъюгате ΗδΑ линкера может инициировать проапоптотический каспазный каскад, в конечном счете приводящий к апоптозу клетки-мишени.

В предпочтительном варианте изобретения ΗδΑ линкер по изобретению включает цитотоксический полипептид, способный убивать раковую клетку (киллинг). В другом варианте изобретения цитотоксический полипептид ингибирует рост или метастаз раковой клетки. Цитотоксический полипептид, связанный с ΗδΑ линкером по изобретению, можно использовать также для киллинга или ингибирования роста клеток, ассоциированных с ростом, необходимых для роста или благотворно действующих на рост раковых клеток, таких как эндотелиальные клетки, которые образуют кровеносные сосуды, пронизывающие солидные опухоли.

В одном варианте изобретения ΗδΑ линкер по изобретению может включать два или более цитотоксических полипептида с тем, чтобы модулировать (например, повысить) специфичность, интенсивность или продолжительность цитотоксического или цитостатического действия на клетку-мишень (например, раковую клетку).

В другом варианте изобретения ΗδΑ линкер по изобретению связывается с активируемой формой цитотоксического полипептида (например, биологически инактивным проагентом, который способен активироваться при расщеплении ферментом или лекарством). В данном варианте изобретения экспозиция (например, ш У1уо) цитотоксического полипептидного проагента с ферментом или лекарством, способным расщеплять цитотоксический полипептид, делает цитотоксический полипептид биологически

- 22 022201 активным (например, цитотоксическим или цитостатическим). Примером биологически инактивного цитотоксического полипептида, который можно превратить в биологически активную форму для применения с НЗА линкером по изобретению, является прокаспаза (например, прокаспаза 8 или 3). Например, домен прокаспазы 8 НЗА линкера по изобретению можно отщеплять с помощью ΤΡΆΙΕ РакЬ после интернализации клеткой-мишенью (например, раковой клеткой). После отщепления биологически активная каспаза 8 может промотировать апоптоз клетки-мишени.

В одном варианте изобретения цитотоксический полипептид, связанный с НЗА линкером по изобретению, может включать полноразмерный пептид, полипептид или белок или его биологически активный фрагмент (например, домен смерти, άеаΐЪ άοπ^-πη, ΌΌ), заведомо имеющий цитотоксические или цитостатические свойства. Пептиды, полипептиды или белки с цитотоксическими или цитостатическими свойствами, можно изменять (например, с помощью аминокислотных замен, мутаций, усечения (процессирования) или добавления), чтобы способствовать включению цитотоксической последовательности в агент по изобретению. Желательные изменения включают, например, изменения в аминокислотной последовательности, которые способствуют экспрессии белка, продолжительности жизни белка, секреции белка из клетки и токсичности его по отношению к клетке-мишени.

Изобретение включает также нуклеотидную молекулу, кодирующую цитотоксический полипептид в виде слитого белка с НЗА линкером по изобретению, необязательно включающим связывающие элементы и полипептидные коннекторы.

Нуклеотидная молекула по изобретению может быть включена в вектор (например, экспрессирующий вектор) таким образом, что после экспрессии НЗА линкера по изобретению в клетке, трансфицированной или трансдуцированной вектором, цитотоксический полипептид, НЗА линкер и связывающие элементы, при их наличии, функционально связаны (например, слиты, образуют непрерывную цепь (непрерывно соединены) или связаны друг с другом). Примеры пептидов, полипептидов и белков, которые можно применять в качестве цитотоксических полипептидов по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, апоптоз-индуцирующие белки, такие как цитохром с (ЗЕЦ ГО N0: 39); каспазы (например, каспаза 3 (ЗЕЦ ГО N0: 36) и каспаза 8 (ЗЕЦ ГО N0: 37)); прокаспазы, гранзимы (например, гранзимы А и В (ЗЕЦ ГО N0: 38)); члены семейств фактора некроза опухолей (ΤΜ¹) и рецепторов ΤΜ¹, включая ΤNΡ-альфа (ΤΜα; ЗЕЦ ГО N0: 40)), ΤNΡ-бета, Рак (ЗЕЦ ГО N0: 41) и Рак лиганд; Ракассоциированный ΌΌ-подобный Ι0-1 β превращающий фермент (РЫСЕ); ΤΚΆI^/ΆΡ02^ (ЗЕЦ ГО N0: 45) и Τ\VΕΆI</ΆΡ03^ (см., например, опубликованную патентную заявку США № 2005/0187177, вводимую в данное описание в качестве ссылки); проапоптотические члены семейства Вс1-2, включая Вах (ЗЕЦ ГО N0: 46), Βίά, В1к, Βаά (ЗЕЦ ГО N0: 42), Вак и РГОК (см., например, опубликованную патентную заявку США № 2004/0224389, вводимую в данное описание в качестве ссылки); белки 1 и 2, индуцирующие апоптоз васкулярных клеток (УАР1 и УАР2; МакМа е1 а1., ВюсНет. ВюрНук. Рек. Сοттиη. 278: 197-204 (2000)); пиеризин (ЗЕЦ ГО N0:44; \7а1апаЪе е1 а1., ВюсНетЫгу 96: 10608-10613 (1999)); апоптозиндуцирующий белок (ЗЕЦ ГО N0: 43; АТО; Мига^ака е1 а1., №11иге, 8: 298-307 (2001)); прополипептид прокомпонента ΙΕ-1α (см., например, патент США 6191269, вводимый в данное описание в качестве ссылки); апоптин и апоптин-ассоциированные белки, такие как ААР-1 (см., например, европейскую опубликованную патентную заявку № ЕР 1083224, вводимую в данное описание в качестве ссылки); антиангиогенные факторы, такие как эндостатин и ангиостатин; и другие апоптоз-индуцирующие белки, включая такие белки, описанные в следующих международных опубликованных патентных заявках и опубликованных патентных заявках США, каждая из которых вводится в данное описание в качестве ссылки: ИЗ 2003/0054994, ИЗ 2003/0086919, ИЗ 2007/0031423, \\'0 2004/078112, \\'0 2007/012430 и \У0 2006/0125001 (внеклеточный домен Эека 1 и ^аддеά 1 белков).

Конъюгаты дикого типа НЗА линкера.

Настоящее изобретение охватывает также природный дикого типа НЗА линкер, аминокислотная и нуклеотидная последовательности которого представлены в ЗЕЦ ГО N0: 3 и 4 соответственно, участвующий в образовании связывающих, диагностических или терапевтических агентов по изобретению. Во всех вариантах изобретения, использующих НЗА линкер с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕО ГО N0: 3, один или более полипептидных коннекторов, описанных выше, связаны ковалентной связью с амино- и/или карбоксиконцами НЗА линкера или с аминокислотным остатком внутри НЗА линкерной последовательности с целью содействовать конъюгации одного или более связывающих элементов.

Процессирование (усечение).

Помимо этого, изобретение включает конъюгат, который образуется при использовании усеченного (процессированного) НЗА полипептида, который может быть связан с одним или более пептидных коннекторов или с одним или более связывающими элементами. Дикого типа НЗА полипептид, не содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200 или более аминокислот полноразмерной дикого типа НЗА аминокислотной последовательности (т.е. ЗЕЦ ГО N0: 3), можно связывать с любым из связывающих элементов или с любым диагностическим или терапевтическим агентом по данному описанию. Процессирование (усечение) может происходить по одному или по обоим концам НЗА линкера или может включать

- 23 022201 делецию внутренних остатков. Усечение более чем одного аминокислотного остатка необязательно должно быть линейным. Примеры дикого типа ΗδΑ линкеров по изобретению включают такие линкеры, имеющие в комбинации с одним (одной) или более полипептидных коннекторов или связывающих элементов один или более доменов, выбранных из домена I (δΕΟ ГО N0: 56; остатки 1-197 последовательности δΕΟ ГО N0: 3), домена II (δΕΟ ГО N0: 54; остатки 189-385 последовательности δΕΟ ГО N0: 3) или домена III (δΕΟ ГО N0: 57; остатки 381-585 последовательности δΕΟ ГО N0: 3) или их комбинации, например домены I и II, I и III и II и III.

Сывороточный клиренс конъюгата по изобретению (например, биспецифического ΗδΑ-лекарства или радиоизотоп-содержащего агента) можно оптимизировать, тестируя конъюгаты, содержащие усеченный дикого типа ΗδΑ линкер, по описанию выше.

Дополнительные модификации ΗδΑ линкера.

Далее изобретение включает сайт-специфическую химическую модификацию аминокислотных остатков в полипептиде ΗδΑ линкера. Корректно скрученная третичная структура ΗδΑ визуализирует некоторые аминокислотные остатки на внешней поверхности белка. Химически реакционноспособные аминокислотные остатки (например, цистеин) можно вводить вместо находящихся (экспонированных) на поверхности остатков, чтобы содействовать сайт-специфической конъюгации диагностического или терапевтического агента.

Изобретение включает также добавление или удаление аспарагинового, серинового или треонинового остатков из ΗδΑ линкерной полипептидной последовательности, чтобы изменить гликозилирование этих аминокислотных остатков. Сайты гликозилирования, добавляемые к ΗδΑ линкеру, предпочтительно экспонированы на поверхности, как обсуждается в данном описании. Гликозильные или другие углеводные элементы, введенные в ΗδΑ линкер, могут конъюгироваться непосредственно с диагностическими, терапевтическими или цитотоксическими агентами.

Конъюгация цистеина (тиола).

Изобретение включает замену экспонированных на поверхности аминокислотных остатков ΗδΑ линкера с цистеиновыми остатками на цистеиновые остатки, чтобы содействовать химической конъюгации диагностических, терапевтических или цитотоксических агентов. Цистеиновые остатки, экспонированные на поверхности ΗδΑ линкерного полипептида (который сложен в свою нативную третичную структуру), способствуют специфической конъюгации диагностического, терапевтического или цитотоксического агента с группой, реакционноспособной к тиольной группе, такой как малеимидная или галогенацетильная. Нуклеофильная реакционная способность тиольной функциональной группы цистеинового остатка по отношению к малеимидной группе примерно в 1000 раз выше, чем у любой другой аминокислотной функциональной группы аминокислоты в белке, такой как аминогруппа лизинового остатка или ^концевой аминогруппы. Тиол-специфическая функциональная группа в йодацетил- или малеимидсодержащих реагентах может реагировать с аминогруппами, но для этого требуются более высокие значения рН (>9.0) и более продолжительное время реакции (Оагтап, 1997, №п-КайюасЙуе ЬаЬеШпд: Α РгасОса1 ЛрргоасН. Лсайепис Рге88, Ьопйоп). Количество свободных тиольных групп в белке можно оценивать в стандартном анализе с помощью реактива Эллмана. В некоторых случаях для получения свободной реакционноспособной тиольной группы требуется восстановление дисульфидных связей таким реагентом, как дитиотреитол (ΌΤΤ) или селенол (δίπ^ΐι е1 а1., Α^1 ВюсНет. 304, 147-156 (2002)).

Сайты для замены на цистеин можно идентифицировать анализом поверхностной доступности ΗδΑ линкера (например, идентификация сериновых и треониновых остатков как подходящих для замены описана ниже в примере 1). Поверхностную доступность можно выражать как площадь поверхности (например, в квадратных ангстремах), которая может контактировать с молекулой растворителя, например воды. Пространство, занятое водой, аппроксимируют сферой с радиусом 1.4 ангстрем. Программы для расчета поверхностной доступности каждой аминокислоты белка являются легкодоступными или лицензируемыми. Например, кристаллографические программы ССР4 διιΑ, использующие алгоритмы для расчета поверхностной доступности каждой аминокислоты белка с известными из РСА координатами (ССР4 διιίΝ Ргодгат Гог Рго1ет Сгу81а11одгарйу, Дс1а Сгу81, Ό50, 760-763 (1994), \у\у\у.сср4.асл.ιк/ά^5ι/1ит1/IN^ΕX.1ит1). Доступность растворителя можно оценивать также как свободное программное обеспечение ОеерУ1е\у δ^ίδδ ΡΌΒ У1е\уег от δ^ίδδ !п8111и1е оГ ВютГогтаЕсх. Цистеиновые замены в поверхностных (экспонированных на поверхности) сайтах содействуют конъюгации реактивного цистеина с реакционноспособной тиольной группой с диагностическим или терапевтическим агентом.

Гликозилирование.

Помимо этого, изменение сывороточного клиренса можно осуществлять, вводя сайты гликозилирования в ΗδΑ линкер. В некоторых вариантах изобретения ΗδΑ линкер по изобретению является гликозилированным. Гликозилирование полипептидов обычно является либо ^связанным, либо О-связанным. Выражение '^-связанный относится к связыванию углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности узнавания для ферментативного связывания углеводного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Та- 24 022201 ким образом, присутствие этих трипептидных последовательностей в полипептидах создает потенциальный сайт гликозилирования. Выражение О-связанное гликозилирование относится к связыванию одного из сахаров, Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы с аминокислотой, содержащей гидроксиламиногруппу, чаще всего с серином или треонином, хотя можно также использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление к Н8А линкеру или делецию из него сайтов гликозилирования обычно проводят, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы создавалась одна или более вышеописанных трипептидных последовательностей (в случае Ν-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно также проводить с помощью добавления в последовательность, делеции или замены в последовательности первоначального Н8А линкера одного или более сериновых или треониновых остатков (для О-связанных сайтов гликозилирования). Полученные углеводные структуры в Н8А можно также использовать для сайт-специфической конъюгации вышеописанных цитотоксических, иммуномодулирующих или цитостатических агентов.

Комбинации Н8А линкерных агентов с терапевтическими агентами.

Помимо этого, изобретение предусматривает для применения Н8А линкерные агенты по данному описанию с одним или более терапевтических, цитотоксических или диагностических агентов по данному описанию. Например, пациентке, страдающей раком молочной железы, можно вводить Н8А линкер, содержащий ΕτϋΒ2 и ΕΛΒ3 ксЕук (например, В2В3-1), совместно с доксорубицином, циклофосфамидом и паклитакселом, обычной терапевтической схемой лечения рака молочной железы. Другие биологические и химические агенты, применимые для лечения рака, приводятся в приложении С (Аррепй1х С).

Сочетание Н8А линкерных агентов с лучевой терапией и хирургической операцией.

Изобретение предусматривает введение Н8А линкерного агента по изобретению до, во время или после лучевой терапии или хирургической операции. Например, пациент, страдающий пролиферативным расстройством (например, раком молочной железы), может получать Н8А линкерный агент, самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими, диагностическими или цитотоксическими агентами по данному описанию одновременно с нацеленной лучевой терапий или с хирургическим вмешательством (например, лампэктомией или мастэктомией) в месте расположения раковой опухоли. Лучевая терапия для применения в комбинации с Н8А линкерными агентами по изобретению включает брахитерапию и нацеленную интраоперативную лучевую терапию (ΤΑΚСIΤ).

Фармацевтические композиции.

Фармацевтические композиции по изобретению содержат терапевтически или диагностически эффективное количество конъюгата Н8А линкера по изобретению, который включает один или более агент из группы: связывающий элемент (например, антитела или фрагменты антител), диагностический агент (например, радионуклидные или хелатирующие агенты) или терапевтический агент (например, цитотоксические или иммуномодулирующие агенты). Активные ингредиенты, конъюгат Н8А линкера по изобретению (полученный с одним или более агентов, выбранных из связывающего элемента, диагностического агента или терапевтического агента) можно приготовить для применения в виде различных систем доставки лекарства. В состав соответствующей рецептуры можно включать один или более соответствующих эксципиентов или носителей. Подходящие рецептуры для применения в настоящем изобретении можно найти в КепйпдЮп'к Рйаттасеийса1 8аеисек, Маск РиЬйкЫпд Сотрапу, РЫ1айе1рЫа, РА, 17* ей (1985). Краткий обзор методов доставки лекарств представлен в Ьапдет 8иепсе, 249, 1527-1533 (1990).

Фармацевтические композиции предназначены для парентерального, интраназального, топического, перорального или локального введения, например, трандермальным способом для профилактического и/или терапевтического лечения. Обычно фармацевтические композиции вводят парентерально (например, с помощью внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции), или перорально, или с помощью местного нанесения (топически). Так, изобретение включает композиции для парентерального введения, которые включают Н8А линкер по изобретению, конъюгированный или не конъюгированный с одним из агентов - связывающим, диагностическим и/или терапевтическим, растворенный или суспендированный в подходящем, предпочтительно в водном носителе, например в воде, забуференной воде, солевом растворе, РВ8 и т.п. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, корректирующие рН, и буферизующие агенты, агенты, корректирующие тоничность, смачивающие агенты, детергенты и т.п. Изобретение также включает композиции для пероральной доставки, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как связующие или наполнители, для приготовления таблетки капсулы и т.п. Помимо этого, данное изобретение включает композиции для локального введения, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как растворители или эмульгаторы, для приготовления крема, мази и т.п.

Эти композиции можно стерилизовать обычными методами стерилизации или их можно подвергнуть стерильной фильтрации. Полученные водные растворы можно упаковывать как есть или в лиофилизированном виде, причем лиофилизированный препарат перед применением смешивают со стерильным водным носителем. рН препаратов обычно находится в интервале 3-11, более предпочтительно в интервале 5-9 или 6-8 и наиболее предпочтительно в интервале 7-8, например 7-7,5. Полученные композиции в твердом виде можно упаковывать в виде нескольких однократных доз, каждая из которых содержит фик- 25 022201 сированное количество конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в герметичной упаковке, содержащей, например, таблетки или капсулы. Композицию в твердом виде можно упаковывать в контейнер для меняющегося (гибкого) количества препарата, такой как мягкие тубы для крема или мази, предназначенных для местного нанесения.

Композиции, содержащие эффективное количество конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), можно вводить млекопитающему (например, человеку) для профилактического и/или терапевтического лечения. При профилактическом применении композиции по изобретению, содержащие конъюгат Н8А линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), вводят пациенту, восприимчивому к развитию или иным образом подверженному повышенному риску развития заболевания или состояния (например, рака, аутоиммунного заболевания или сердечно-сосудистого заболевания). Такое количество определяют как профилактически эффективную дозу. В этом случае точные количества опять же зависят от состояния здоровья пациента, но обычно находятся в интервале примерно 0,5-400 мг конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) на дозу (например, 10, 50, 100, 200, 300 или 400 мг/дозу) и примерно 0,1 мкг-300 мг одного или более иммуномодуляторов на дозу (например, 10, 30, 50 мкг/дозу, 0,1, 10, 50, 100 или 200 мг/дозу). Дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту с целью профилактики один или более раз в час, день, неделю, месяц или год (например, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз/ч, день, неделю, месяц или год). Чаще вводят разовую дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент).

Для применения в терапии дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) вводят млекопитающему (например, человеку), уже страдающему заболеванием или состоянием (например, раковым заболеванием, аутоиммунным заболеванием или сердечно-сосудистым заболеванием), в количестве, достаточном для исцеления (выздоровления) или по меньшей мере частичного прекращения или ослабления одного или более симптомов заболевания или состояния и их осложнений. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяют как терапевтически эффективную дозу. Эффективное количество для такого применения может зависеть от тяжести заболевания или состояния и общего состояния пациента, но обычно находится в интервале примерно 0,5-400 мг конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) на дозу (например, 10, 50, 100, 200, 300 или 400 мг/дозу). Дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту с целью терапии один или более раз в час, день, неделю, месяц или год (например, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз в час, день, неделю, месяц или год). Чаще вводят разовую дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент).

В некоторых вариантах изобретения пациент может получать дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в примерном интервале 0,5-400 мг/дозу один или более раз в неделю (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 раз в неделю), предпочтительно примерно 5-300 мг/дозу один или более раз в неделю, и еще более предпочтительно примерно 5-200 мг/дозу один или более раз в неделю. Пациент может также получать раз в две недели дозу конъюгата Н8А линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) в примерном интервале 50-800 мг или ежемесячную дозу Н8А линкера по изобретению, или в виде его конъюгата с любым конъюгированным с ним связывающим, диагностическим и/или терапевтическим агентом в примерном интервале 50-1200 мг.

В других вариантах изобретения конъюгат Н8А линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в стандартном интервале доз примерно 0,5-400 мг/неделю, примерно 1,0-300 мг/неделю, примерно 5-200 мг/неделю, примерно 10-100 мг/неделю, примерно 20-80 мг/неделю, примерно 100-300 мг/неделю или примерно 100-200 мг/неделю. Конъюгат Н8А линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в интервале примерно 0,5-100 мг/через день, предпочтительно примерно 5-75 мг/через день, более предпочтительно примерно 10-50 мг/через день и еще более предпочтительно примерно 20-40 мг/через день. Конъюгат Н8А линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить пациенту в интервале примерно 0,5-100 мг три раза/неделю, предпочтительно примерно 5-75 мг три раза/неделю, более предпочтительно примерно 10-50 мг три раза/неделю и еще более предпочтительно

- 26 022201 примерно 20-40 мг три раза/неделю.

В неограничивающих вариантах способов по настоящему изобретению конъюгат ΗδΑ линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) вводят млекопитающему (например, человеку) непрерывно в течение 1, 2, 3 или 4 ч; 1, 2, 3 или 4 раза в день; через день, через два, три, четыре дня или через пять дней; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз в неделю; каждые две недели; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 раз в месяц; каждые два месяца; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз каждые шесть месяцев; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз в год; или каждые два года. В соответствие с терапевтической схемой конъюгат ΗδΑ линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить с различной частотой. В других вариантах изобретения конъюгат ΗδΑ линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить с одной и той же частотой или с различной частотой.

Количество одного или более диагностических или терапевтических агентов и ΗδΑ линкера или любого конъюгированного с ним агента, необходимое для достижения нужного терапевтического эффекта, зависит от ряда факторов, таких как специфический(е) выбранный(е) диагностический(е) или терапевтический(е) агент(ы), способ введения и клиническое состояние реципиента. Специалист в данной области техники сможет определить соответствующие дозы одного или более диагностических или терапевтических агентов и ΗδΑ линкера или любого конъюгированного с ним агента, чтобы достичь желаемых результатов.

Однократное или многократное введение композиций, содержащих эффективное количество конъюгата ΗδΑ линкера (приготовленного с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент), можно осуществлять с уровнем и типом доз, выбранными лечащим врачом. Дозу и схему введения можно определять и корректировать с учетом тяжести заболевания или состояния млекопитающего (например, человека), которое можно контролировать в ходе всего лечения методами, обычно принятыми в клинической практике, или методами по данному описанию.

Конъюгат ΗδΑ линкера (приготовленный с одним или более агентов, выбранных из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент) можно вводить млекопитающему, такому как человек, непосредственно или в комбинации с любыми фармацевтически приемлемыми носителями или солью, известными в уровне техники. Фармацевтически приемлемые соли могут включать нетоксические соли присоединения кислоты или комплексы металлов, которые обычно применяются в фармацевтической промышленности. Примеры солей присоединения кислоты включают органические кислоты, такие как уксусная, молочная, пальмовая, малеиновая, лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, пальмитиновая, субериновая, салициловая, винная, метансульфоновая, толуолсульфоновая или трифторуксусная и т.п. кислота; полимерные кислоты, такие как дубильная, карбоксиметилцеллюлоза и т.п.; и неорганические кислоты, такие как хлористо-водородная (соляная) кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и т.п. Комплексы металлов включают комплексы цинка, железа и т.п. Типичным фармацевтически приемлемым носителем является физиологический солевой раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в КепипдЮпА РЬагтаееибса1 δ^ι^5, (18'¹' еббюп), еб. Α. Оеппато, 1990, Маек РиЬйккпд Сотрапу, ЕаЯоп, ΡΑ.

Применение в диагностике и терапии.

Конъюгаты ΗδΑ линкера по изобретению, представленные в данном описании, можно применять для диагностики и терапии человека, включая, например, диагностику или лечение пролиферативных заболеваний (например, раковых заболеваний, таких как меланома, светлоклеточная саркома или рак почки) и аутоиммунных заболеваний (например, рассеянного склероза, ревматоидного артрита и увеита). Предполагается, что нижеприведенное обсуждение пролиферативных и аутоиммунных заболеваний человека даст квалифицированному практику общее понятие о том, как применять конъюгаты ΗδΑ линкера по изобретению в диагностике и терапии, но не предполагается, что это обсуждение ограничит объем настоящего изобретения.

Пролиферативные заболевания (рак).

Конъюгат ΗδΑ линкера по изобретению можно применять для диагностики, лечения, предупреждения или прекращения пролиферативных заболеваний, таких, но без ограничения, как рак молочной железы, меланома, саркома, рак почки, рак легкого, рак желудка и рак яичника. Связывающие элементы, которые должны быть соединены с ΗδΑ линкером по изобретению для применения в диагностике или терапии пациента с подозрением на пролиферативное заболевание, можно выбрать с учетом их способности специфически связывать, оказывать агонистическое действие на, активировать, оказывать антагонистическое действие на или ингибировать молекулы-мишени (например, рецепторов клеточной поверхности, такие как рецепторы тирозинкиназ), ассоциированные с пролиферативным заболеванием. Связывающие элементы, которые нацелены, например, на рецептор инсулиноподобного фактора роста (ЮРК, например, ЮР1К и ЮР2К), рецептор фактора роста фибробластов (РОРК), рецептор тромбоцитарного

- 27 022201 фактора роста (РЭОРК), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОРК), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОР), рецептор фактора некроза опухолей (ΤΝΕΚ), рецептор эпидермального фактора роста (ЕОРК, например ЕгЬВ2 (НЕК2/пеи)), Рс рецептор, с-ΚίΙ рецептор или рецептор фактора мезенхимально-эпителиального перехода (с-тер также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (НОРК)), можно также соединять с Н8А линкером по изобретению для диагностики или лечения пролиферативного заболевания. Специфическое связывание раковой клетки с конъюгатом Н8А линкера может содействовать детекции (например, Н8А линкер, соединенный с детектируемой меткой по данному описанию) или деструкции (например, Н8А линкер, соединенный с цитотоксическим агентом) связанной раковой клетки. Специфическое применение конъюгатов Н8А линкера по изобретению для лечения рака молочной железы и рака почки описано ниже.

Рак молочной железы.

Обычные формы рака молочной железы включают инвазивный протоковый рак, злокачественную опухоль в протоках молочных желез и инвазивный дольковый рак, злокачественную опухоль в дольках молочных желез. Известно, что некоторые типы раковых клеток молочной железы экспрессируют высокие уровни рецепторов эпидермального фактора роста, в особенности ЕгЬВ2 (т.е. НЕК2/пеи). Аберрантную передачу сигналов или неконтролируемую активацию ЕОРК связывают с развитием и прогрессированием многих типов раковых заболеваний, включая рак молочной железы. Неконтролируемую клеточную пролиферацию, опосредуемую нарушением ЕОРК путей (дисфункциональные пути), можно обнаружить у широкого ряда солидных опухолей эпителиального происхождения, и результаты показывают связь экспрессии, сверхэкспрессии и дисрегуляции ЕОРК с запущенным заболеванием, метастатическим фенотипом, резистентностью к химиотерапии и общим неблагоприятным прогнозом.

Н8А линкер по изобретению, связанный с одним или более связывающих элементов, специфических к ЕОРК (например, антитело к ЕгЬВ2, трастузумаб), можно использовать с диагностическим (например, с детектируемой меткой) или с цитотоксическим, цитостатическим или терапевтическим агентом по данному описанию для диагностики или лечения рака молочной железы. Или же биспецифический конъюгат Н8А линкера, который содержит связывающие элементы, специфические к ЕгЬВ2 и ЕгЬВЗ, такие как В2В3-1, описанные подробно далее, можно использовать для диагностики или лечения раковых заболеваний, таких как рак молочной железы, почки, яичника и легкого.

Как описывается выше, конъюгат Н8А линкера по изобретению, применяемый для лечения рака молочной железы, можно вводить до (например, неоадъювантная химиотерапия), во время или после (например, неоадъювантная химиотерапия) лучевой терапии или хирургического вмешательства. Конъюгат Н8А линкера можно также вводить совместно с другими соединениями (например, противоопухолевыми агентами, такими как биологические или химические терапевтическими веществами), применимыми для лечения рака молочной железы. Например, известно, что противоопухолевые агенты, перечисленные в табл. 1, включающие митотические ингибиторы (например, таксаны), алкилирующие агенты (включающие, например, агенты на основе платины), селективные модуляторы рецепторов эстрогена (8ЕКМ), ингибиторы ароматазы, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики (например, антрациклиновые антибиотики), антитела против УЕОР, антитела против ЕгЬВ2 (НЕК2/пеи) и антитела против ЕгЬВЗ, особенно применимы для лечения рака молочной железы. Врач-клиницист может вводить конъюгат Н8А линкера по изобретению в комбинации с любым соединением, включая соединения, перечисленные в приложении С, заведомо или предположительно благотворные (подходящие) для лечения рака молочной железы.

- 28 022201

Таблица 1

Типичные противоопухолевые агенты для лечения рака молочной железы в комбинации с конъюгатами ΗδΑ линкера по изобретению.

Терапевтический класс	Типичный агент (Дженерик/Торговая марка)	Примерная дота
Митотические ингибиторы	паклитаксел (ТАХОЬ®; ΑΒΡΑΧΑΝΕ©)	175 мг/м
	доцетаксел (ТАХОТЕКЕ®)	60- 100 мг/м2
Ингибиторы топоиэо мераз	камитотецнн
	топоте кан гидрохлорид (ΗΥΓΑΜΤΙΝ®)
	этопозид (ΕΡΟ8ΙΝ®)
Алкилирующие агенты	циклофосфамид (ΟΥΤΟΧΑΝ®)	600 мг/м
Платиновые агенты	цисплатин	20- 100 мг/м2
	карбоилатин (РАКАРЬАТШ®)	300 мг/м2
	недаплатин (АОиРЬА®)
	оксалиплатин (ЕЬОХАТШ®)	65- 85 мг/м2
	сатраплатин (8РЕКА®)
	триплатин тетранитрат
Селективные модуляторы (рецепторов) эстрогена (5ЕКМ)	тамокснфен (ЪТОЬУАОЕХ®)	20- 40 мг/день
	ралоксифен (ЕУ18ТА®)	бОмг/день
	торемифен (ΡΑΚΕ5ΤΟΝ®)

Антиметаболиты	метотрексат	40 мг/м2
	флуорурацил (5-ПГ)	500 мг/м2
	ралгитрексед
Противоопухолевые антитела	доксорубицнн (ΑϋΚΙΑΜΥΟΙΝ®)	40- 75 мг/м2
	эпирубицин (ЕЬЬЕЫСЕ®)	60- 120 мг/м2
Ингибиторы ароматазы	амнноглутетимид (ΟΥΤΑΟΚΕΝ®)	250- 2000 мг/демь
	аыастрозол (АК1МГОЕХ®)	1 мг/день
	летрозол (РЕМАКА®)	2 5 мг/день
	ворозол
	экэеместан (ΑΚΟΜΑ81Ν®)	25- 50 мг/день
	тесто лактон
	фадрозол (АРЕМА®)
Антитела против УЕСР	бевацизумаб (ΑνΑδΤΊΝ®)	10 мг/кг
Антитела против ΕΛΒ2 (НЕК2/иеи)	трасту зумаб (НЕКСЕРТШ®	2- 8 мг/кг
	пертузумаб (ΟΜΝΙΤΑΚΟ®)
Антитела против ЕгЬВЗ (НЕКЗ)	ш-1287 (АМО888)

Рак почки (почечный рак).

Раковые заболевания почек, такие как почечно-клеточный рак, особенно устойчивы к традиционной лучевой и химиотерапии. Соответственно, применение биологических терапевтических средств, связанных с ΗδΑ линкером по изобретению, предоставляет привлекательную возможность пациентам, страдающих этими типами рака. Например, ΗδΑ линкер, соединенный со связывающими элементами, которые проявляют свойства, агонистические по отношению к рецепторам типа I интерферона или интерлейкина 2, можно использовать для лечения рака почки. Ввиду того что это солидная опухоль, связывающие элементы, которые нацелены на и ингибируют васкуляризацию опухоли (например, антитела против сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕСР)), также можно применять для достижения терапевтического эффекта.

Аутоиммунные заболевания.

Конъюгат ΗδΑ линкера по изобретению можно использовать для диагностики, лечения, предупреждения или стабилизации аутоиммунных заболеваний и расстройств, например, у человека, например, таких как рассеянный склероз (РС, Μδ), инсулинозависимый сахарный диабет (ИСЗД, ΙΌΌΜ), ревматоидный артрит (РА), увеит, синдром Съегрена, болезнь Грейвса и тяжелая псевдопаралитическая миастения. Аутоиммунные заболевания и расстройства вызываются аутореактивными элементами иммунной системы (например, Т-клетками. В-клетками и аутореактивными антителами). Соответственно, связывающие элементы, которые ингибируют, блокируют, действуют как антагонисты на аутореактивные иммунные клетки и антитела или истощают аутореактивные иммунные клетки и антитела (например, антилимфоцитарные или антитимоцитарные глобулины, моноклональные антитела базиликсимаб, даклизумаб или муромонаб-СЭ3), можно связывать с ΗδΑ линкером по изобретению для применения в терапии. Связывающие элементы, которые действуют как ингибиторы передачи сигналов воспаления (ΙδΙ), по данному описанию, можно связывать с ΗδΑ линкером по изобретению для лечения аутоиммунитета. Помимо этого, связывающие элементы, которые ингибируют функцию интегрина или противодействуют

- 29 022201 (антагонизм) функции интегрина (например, антагонист интегрина по данному описанию), могут улучшать состояние или останавливать прогрессирование заболевания.

В других вариантах изобретения связывающий элемент представляет собой растворимый ТОТ¹ рецептор, такой как этанерцепт или ленерцепт, антитело, специфическое к провоспалительному цитокину или сигнальной молекуле на поверхности воспалительной клетки, такое как адалимумаб, цертолизумаб, инфликсимаб, голимумаб и ритуксан, доминантно-негативный вариант провоспалительного цитокина, такой как ХЕЧРЗ45. ХРК0ТМ1595, анакинра и варианты, раскрываемые в опубликованных патентных заявках США № 200З0166559 и 20050265962, ингибитор сигнальных путей после (ниже, даунстрим) провоспалительного цитокина или сигнальных молекул на поверхности провоспалительных клеток, такой как ОЕ 096, производные 5-амино-2-карбонилтиофена (описанные в международной патентной заявке XV 0 2004/089929), АКОТ-797, В1КВ 796 В8, (1-5-трет-бутил-2-п-толил-2Н-пиразол-З-ил)-З-[4-2(морфолин-4-илэтокси)нафталин-1-ил]мочевина, СНК-З620, С№-149З, ЕК-16765З (Епр5а\уа РЬаттасеиЕса1, 0§ака, .Гараи), 1818 101757 (Ιδίδ РЬагтасеийсаН), МЬЗ404, МРСЗ1145, РП169З16, РН21112, КЖ67657, 4-(4-(4-фторфенил)-1-(З-фторфенил)-5-(4-пиридинил)-1Н-имидазол-2-ил)-З-бутин-1-ол, 8С10-469,

8В202190, 8В20З580, (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)1Н-имидазол),

8В2З906З, транс-1-(4-гидроксициклогексил)-4-(4-фторфенил-метоксипиримидин-4-ил)имидазол,

8В2422З5, 8Ό-282, 8КЕ-86002, ТАК 715, УХ702 и УХ745, или ингибитор ТЧЕ-альфа превращающего фермента (ТАСЕ), такой как ВВ-1101, ВВ-З10З, ВМ8-561З92, бутинилоксифенил β-сульфон пиперидин гидроксаматы, СН4474, ОРСЗЗЗ, ПРН-067517, СМ6001, О^ЗЗЗЗ, Ко З2-7З15, ТАР1-1, ТАР1-2 и ТМ1 005), или антиидиопатическое антитело, такое как моноклональные антитела. ШР З94 (абетимус, ΚΙОЕЕХТ®. Ьа 1о11а РЬаттасеиЕсаЦ).

В других вариантах изобретения связывающий элемент представляет собой интерферон по данному описанию. Связывающие элементы, которые могут соединяться с Н8А линкером по изобретению, включают, например, интерферон-бета (КЕВ1Е® (ШЫ-вЛа), АУ0ХЕХ® (ШЫ-в-1а) и ВЕТА8ЕК0N® (ШЫ-вЛЬ)), интерферон-τ (ТАиЕЕК0№^м), интерферон-альфа (например, К0ЕЕК0^А® (ШХ-а-2а), ЮТК0^А® (1Р№а-2Ъ), КЕВЕТК0N® (1Р№а-2Ъ), Л^ΕЕК0N-N® (1Р№а-пЗ), РЕΟ-INТКΟN® (1ЕЫ-а-2Ь, ковалентно конъюгированный с монометоксипролиэтиленгликолем), INΕЕКΟЕN® (неприродный типа 1 интерферон, на 88% гомологичный 1ЕХ-а-2Ь). или РЕΟА8Υ8® (пегилированный ШЫ-а1а)) и АСТ1ММи№® (4^-½).

Помимо этого, настоящее изобретение включает конъюгаты Н8А линкера со связывающими элементами, антагонистичные этим провоспалительным молекулам или их специфическим рецепторам, для лечения аутоиммунитета. Соответствующее применение конъюгатов Н8А линкера по изобретению для диагностики и лечения РС (М8) и РА (КА) описано ниже.

Рассеянный склероз.

Рассеянный склероз (РС, М8) представляет собой неврологическое заболевание, характеризующееся необратимой дегенерацией нервов центральной нервной системы (ЦНС, С№). Хотя основная причина остается неясной, нейродегенерация при РС (М8) является непосредственным результатом демиелинизации, или разрушение миелина, белка, который обычно выстилает внешний слой и предохраняет (изолирует) нервы. Т-клетки играют ключевую роль в развитии РС (М8). Воспаленные очаги М8, но не нормальное белое вещество, могут иметь инфильтрирующие ί'Ό4' Т-клетки, которые отвечают на аутоантигены, предоставляемые ГКГ (МНС) класса ΙΙ связанными молекулами, такими как человеческий антиген НЬА-ЭК2. Инфильтрирующие СЭ4 Т-клетки (Т_Н1 клетки) продуцируют провоспалительные цитокины Ш-2, ШЦ-у и ТОТ¹ -а, которые активируют антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как макрофаги, для продуцирования дополнительных провоспалительных цитокинов (например, ΙΗ-1β, Ш-6, Ш-8 и Ш-12. Ш-12 индуцирует последующий синтез ШЫ-у. Результатом является прогрессирующая демиелинизация оболочки нервных волокон, что приводит к заболеванию человека.

Конъюгаты Н8А линкера можно использовать для диагностики РС (М8). Диагностические конъюгаты Н8А линкера включают связывающие элементы по данному описанию, специфически нацеленные на один или более (например, биспецифические конъюгаты Н8А линкера) маркеров активации иммунных клеток (например, ί'Ό69. СЭ28. НЬА-ЭК и СЭ45). Дисбаланс одного или более этих медиаторов активации провоспалительных или иммунных клеток относительно других факторов или клеток можно измерять с помощью конъюгата Н8А линкера, связанного с диагностическим агентом (например, радиоизотопом или флуорохромом).

Конъюгат Н8А линкера по изобретению можно использовать для лечения человека с повышенным риском развития РС или страдающего РС или для предупреждения, ослабления или избавления от симптомов заболевания. Например, связывающие элементы по данному описанию, которые специфически нацелены на и антагонистичны действию а4 интегрина (например, натализумаб), СЭ52 (например, алемтузумаб), СЭ80. Р-селектина, сфингозин-1-фосфат рецептора-1 (81РК1), рецептора гиалуроната, лейкоцитарного функционального антигена-1 (ЬЕА-1), СЭ11 (например, эфализумаб), СЭ18. СЭ20 (например, ритуксимаб), ί'Ό85. 1С08 лиганда, ССК2, СХСКЗ или ССК5, можно применять в виде элементов, связанных с Н8А линкером по данному описанию, для терапии пациента, страдающего РС (М8). Аналогич- З0 022201 но, связывающие элементы, которые нейтрализуют типа I интерфероны (например, интерфероны-альфа и -бета или которые антагонизируют действие рецепторов типа I интерферонов (например, ШЛаК!), также можно связывать с Н8А линкером по изобретению для применения в терапии.

Ревматоидный артрит.

Ревматоидный артрит (РА, РА) представляет собой хроническое воспалительное аутоиммунное расстройство, которое вызывает атаку иммунной системы на суставы. Это инвалидизирующее и болезненное воспалительное состояние, которое может привести к заметной потере подвижности вследствие боли и разрушения суставов. РА представляет собой системное заболевание, часто поражающее внесуставные ткани всего тела, включая кожу, кровеносные сосуды, сердце, легкие и мышцы.

У пациентов, страдающих РА, часто наблюдается повышенный уровень экспрессии кластера НЬА-ОР4/ПР1 в клетках. Конъюгаты Н8А линкера, специфические к этим одной или обеим молекулам клеточной поверхности, применимы для диагностики РА.

Конъюгат Н8А линкера по изобретению можно применять для лечения человека с повышенным риском развития РА или страдающего РА для предупреждения, ослабления или избавления от симптомов заболевания. Например, связывающие элементы по данному описанию, которые специфически нацелены на и антагонистичны действию ТЫР-а (например, этанерцепт, инфликсимаб и адалимумаб), 1Ь-1 (например, анакинра) или СТЬА-4 (например, абатацепт), можно связывать с Н8А линкером по данному описанию для лечения и предупреждения РА. Связывающие элементы, которые специфически нацелены на и истощают В-клетки (например, антитело против СЭ20, такое как ритуксимаб), также можно связывать с Н8А линкером по данному описанию для лечения или предупреждения РА.

Увеит.

В конкретном плане увеиты относятся к воспалению среднего слоя глазного яблока, но могут относиться к любому воспалительному процессу, включающему внутреннюю структуру глаза. По своему происхождению увеиты могут быть аутоиммунными или идиопатическими.

Конъюгат Н8А линкера по изобретению можно использовать для лечения человека с повышенным риском развития увеита или страдающего аутоиммунным увеитом для предупреждения, ослабления или избавления от симптомов заболевания. Например, альфа-фетопротеин (например, человеческий АРР; NСВI Регистрационный № ХМ 001134) или его биологически активный фрагмент можно связывать с Н8А линкером по изобретению для ослабления или прекращения воспаления, ассоциированного с аутоиммунным или идиопатическим увеитом.

Наборы.

Изобретение предусматривает наборы, которые включают фармацевтическую композицию, содержащую Н8А линкер по изобретению и один или более связывающих элементов (например, антител или фрагментов антител), диагностический агент (например, радионуклидные или хелатирующие агенты) и терапевтический агент (например, цитотоксические или иммуномодулирующие агенты) с реагентами, которые можно применять, при необходимости, для их конъюгации с Н8А линкером, и включающую фармацевтически приемлемый носитель, в количестве, эффективном для лечения заболевания или состояния (например, ракового, аутоиммунного заболевания или сердечно-сосудистого заболевания). Наборы включают инструкции, позволяющие на практике (например, практикующему врачу, среднему медицинскому персоналу или пациенту) применять содержащуюся в них композицию.

Предпочтительно наборы включают несколько упаковок с одноразовой дозой фармацевтической(их) композиции(й), содержащей эффективное количество Н8А линкера по изобретению или его конъюгата с любыми агентами из группы: связывающие (например, антитела или фрагменты антител (например, 8сРν), диагностические (например, радионуклидные или хелатирующие) и/или терапевтические (например, цитотоксические или иммуномодулирующие) агенты. Дополнительно наборы могут включать приборы или устройства, необходимые для введения фармацевтической(их) композиции(й). Например, набор по данному изобретению может включать один или более предварительно заполненных шприцев, содержащих эффективное количество Н8А линкера по изобретению или его конъюгата с любым агентом из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент. Помимо этого, наборы могут включать также дополнительные компоненты, такие как инструкции или схемы применения, позволяющие пациенту, страдающему заболеванием или состоянием (например, раковым, аутоиммунным заболеванием или сердечно-сосудистым заболеванием), применять фармацевтическую(ие) композицию(и), содержащую(ие) Н8А линкера по изобретению или его конъюгата с любым агентом из группы: связывающий, диагностический и/или терапевтический агент.

Специалистам в данной области техники понятно, что в композициях, методах и наборах по настоящему изобретению можно сделать различные модификации или изменения, не отступая от сущности или объема изобретения. Так, предполагается, что настоящее изобретение охватывает модификации и изменения настоящего изобретения при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения, и их эквиваленты.

- 31 022201

Примеры

Нижеприведенные примеры приводятся с целью иллюстрации, а не с целью ограничения. Специалисты в данной области техники легко представят различные некритические характеристики, которые можно изменить или модифицировать для достижения тех же самых или аналогичных результатов.

Пример 1. Методы идентификации остатков в ΗδΑ линкере для сайт-специфической конъюгации цитотоксических или цитостатических лекарств.

Для определения сайтов специфической конъюгации лекарств с ΗδΑ изучают кристаллическую структуру и идентифицируют остатки серина и треонина, экспонированные на поверхности. Эти конкретные поверхностные аминокислоты можно затем заменить (мутация) на цистеин, способствующий конъюгации лекарства с цистеиновым остатком по реакции с тиол-специфическим конъюгирующим агентом, таким как малеимид. Перед конъюгацией лекарства может потребоваться мягкое восстановление. Количество конъюгированных лекарственных элементов контролируется числом поверхностных цистеиновых остатков, введенных в ΗδΑ. Серин и треонин выбирают как наиболее подходящие для мутации, так как они имеют наиболее высокую структурную идентичность с цистеином, однако другие поверхностные участки также могут заменяться на цистеин и затем конъюгироваться с цитостатическими или цитотоксическими лекарствами.

Кристаллическая структура ΗδΑ депонирована в банке данных Κδί',’Β Рго!еш Эа1а Вапк (1Ьт08идю е! а1., Сгук!а1 кйисШге оГ Нитап кегит а1Ьитш а! 2.5 А гекокЮоп. Рго!еш Епд. 12: 439-446 (1999)). Эту структуру анализируют, используя программу Иеер^ете δχνίκκ РЭВ ^етег, загружаемую с сайта Швейцарского Института Биоинформатики (δ^ίκκ ТпвЙиГе оГ ВютГогтаОск). Сериновые и треониновые остатки с поверхностной экспозицией 50, 40 и 30% идентифицируют как наиболее подходящие для мутации в цистеин (табл. 2). Мутации можно вводить, применяя стандартные методы молекулярной биологии. Конъюгацию тиол-реактивного лекарства или хелатирующего агента с введенным цистеиновым остатком можно проверять обычными химическими методами.

Таблица 2

% поверхностной экспозиции	Остаток
50	Т496
40	558
30	Т76, Т79, Т83, Т125, Т236, 8270, 5273, 8304, 8435, Т478, Т506, Т508

Пример 2. Методы идентификации остатков в ΗδΑ линкере для введения аспарагин-связанных сайтов гликозилирования.

Для идентификации областей введения аспарагин-связанных сайтов гликозилирования в ΗδΑ изучают кристаллическую структуру с целью идентификации экспонированных с поверхностью (>30%) остатков аспарагина, серина и треонина, подходящих для мутации. Гликозилирование идет по аспарагиновым остаткам, если имеется консенсусная последовательность аспарагин-х-серин/треонин, где х не может представлять собой пролин. В табл. 3 приводятся сайты предполагаемой мутации в ΗδΑ для введения аспарагин-связанной гликозильной группы.

- 32 022201

Таблица 3

*Сообщалось, что эти мутации в ΗδΑ встречаются очень редко (Саг1зоп е1 а1., т Вуебеп δίπχΐιιπιΐ з!ибу апб рНепо1ур1е сНзичЬииоп оГ пте а1Ьитт уапап!з,

Ргое. ΝΜ. Леаб. 8с1. υδΑ. 89, 8225-8229 (1992), Маб1зоп е! а1., Оепейе сапатз оГ Нитап зегит а1Ьитт т 1!а1у рот! ти!ап!з апб а еагЬоху1-!егтта1 уапап!, Ргое. №1. Леаб.

8с1. υδΑ. 91, 6476-6480 (1994), Ыи!еНтзоп е! а1., ТНе Ю!егтта1 зециепее оГ а1Ьитт КебНШ, а уапап! оГ Нитап зегит а1Ьитт, ΡΕΒδ Ьей. 193, 211-212 (1985), Вгеппап е! а1., .МЪитт КебНШ (-1 Αγ§, 320 Α1ι-ΤΗγ): а §1уеорго!ет уапап! оГ Нитап зегит а1Ьитт уНозе ргееигзог Наз ап аЬеггап! з1дпа1 рерНбазе е1еауаде зНе, Ргое. №1. Леаб. 8сл. υδΑ. 87, 26-30 (1990), МтеЫоШ е! а1., 81гис1шп1 еНагае1ег1/а11оп оГ Гоиг депеНе уапап!з оГ Нитап зегит а1Ьитт аззое1а!еб уНН а11оа1Ьиттет1а т 1!а1у, Еиг. I.

ВюеНет. 247, 476-482 (1997), РеаеН е! а1., 81πχΙηγ:ι1 еНагаеЗеп/аИоп оГ а д1уеорго!ет уапап! оГ Нитап зегит а1Ьитт: а1Ьитт СазеЬгоок (494 Лзρ-Лзη), ВюеЫт. ВюрНуз. Леΐа. 1097, 49-54 (1991)).

Пример 3.

В2В3-1 представляет собой биспецифическую слитую молекулу антитела зсРу, состоящую из ВГО2, человеческого зсРу антитела против ЕгЬВ2 (δΕΟ ΙΌ NО: 27), и Н3, человеческого зсРу антитела против ЕгЬВ3 (δΕΟ ΙΌ NО: 26). Два зсРу фрагмента связываются модифицированным человеческим сывороточным альбуминовым линкером (ΗδΑ). Антитело зсРу против ЕгЬВ3, Н3, рекомбинантно связывается с аминоконцом ΗδΑ линкера, включающего короткий коннекторный полипептид, а антитело зсРу против ЕгЬВ2, ВГО2, рекомбинантно связывается с карбоксиконцом модифицированного ΗδΑ линкера, включающего другой короткий коннекторный полипептид. Каждый коннекторный полипептид выбирают с учетом устойчивости к действию протеаз. Модифицированный ΗδΑ линкер содержит две аминокислотные замены. Цистеиновый остаток в положении 34 нативного ΗδΑ заменен на серин с целью понизить потенциальную гетерогенность белка вследствие окисления по этому сайту. Аспарагиновый остаток в положении 503 нативного ΗδΑ, который в нативном ΗδΑ является чувствительным к деамидированию и может способствовать снижению фармакологического периода полужизни, заменен на глутамин. В2В3-1 селективно связывается с опухолями, сверхэкспрессирующими ЕгЬВ2, за счет высокоаффинного анти-ЕгЬВ2 зсРу связывающего элемента, величина кО которого находится в интервале 10,0-0,01 нМ, более предпочтительно кЭ=0,3 нМ. Последующее связывание ЕгЬВ3 с помощью антиЕгЬВ3 зсРу (зсРу антителом против ЕгЬВ3), величина кЭ которого находится в интервале 50-1 нМ и более предпочтительно равна примерно 16 нМ, предупреждает ЖО-индуцированное фосфорилирование ЕгЬВ3. Модифицированный ΗδΑ линкер сообщает биспецифической молекуле более продолжительный период полужизни в кровотоке. В2В3-1 имеет молекулярную массу 119,6 кДа и не является гликозилированным.

В2В3-1 ингибирует лиганд-индуцированное фосфорилирование ЕгЬВ3 с субнаномолярной активностью за счет избыточной экспрессии его партнера по димеризации, ЕгЬВ2, специфически нацеливая на раковые клетки, которые экспрессируют оба рецептора.

Пример 4.

Как показано на фиг. 2, В2В3-1 ингибируют ЖО-индуцированный рЕгЬВ3 в 2К75-1 раковых клетках молочной железы. Раковые клетки молочной железы ΖΒ75-1 обрабатывают в интервале доз В2В3-1 вариантами в течение 24 ч с последующей Ж.О стимуляцией. Определяют уровни рЕгЬВ3 в клеточных

- 33 022201 лизатах и рассчитывают величины Ιί'.'₅₀ вместе с процентом ингибирования. Показаны средние значения Ю50 (ось Υ) с планками погрешностей, изображающих повторные эксперименты. Ингибирование в процентах показано над соответствующими столбцами.

Пример 5.

Ингибирование фосфорилированного БгЬВ3 (фиг. 3А-Э), АКЛ (фиг. 4А-Э) и ΕΚΚ (фиг. 5А-Э) после 24-часовой предварительной обработки В2В3-1 вариантами конъюгатов А5-Н8А-В1Э2 (панель А на фиг. 3-5), Н3-Н8А-В1Э2 (панель В на фиг. 3-5), Н3-Н8А-Б5В6Н2 (панель С на фиг. 3-5) и Е4-Η8Α-Е5Β6Η2 (панель Ό на фиг. 3-5). Раковые клетки молочной железы ВТ474 обрабатывают в интервале доз В2В3-1 вариантами в течение 24 ч после НК0 стимуляции. Уровни рНгЬВ3, рАКЛ и рБКК определяют в клеточных лизатах и значения Ιί\₀ рассчитывают наряду с ингибированием в процентах.

Пример 6.

Как показано на фиг. 6, обработка опухолевых клеток молочной железы ВТ474 вариантами В2В3-1 вызывает остановку фазы 01 клеточного цикла и снижение популяции клеток в 8 фазе. ВТ474 клетки обрабатывают, добавляя 1 мкМ Β2Β3-1 вариантов, и контролируют в течение 72 ч. По окончании обработки клетки обрабатывают трипсином, осторожно ресуспендируют в гипотоническом растворе, содержащем пропидия йодид, и одиночные клетки анализируют проточной цитометрией. Распределение клеток в 01 и 8 фазах клеточного цикла определяют с помощью алгоритмов для построения кривой, разработанных для анализа клеточного цикла (программа Ρίονίο для анализа клеточного цикла).

Пример 7.

В2В3-1 (8Ε0 ΙΌ Ν0: 16) ингибирует активацию БгЬВ3, используя обильную экспрессию своего партнера по димеризации, ΕιΤΒ2, для нацеливания на опухолевые клетки. Высокоаффинное ксГу антитело против ΕιΤΒ2, Β1Ό2, содействует нацеливанию Β2Β3-1 на опухолевые клетки, сверхэкспрессирующие БтЬВ2. Β1Ό2 связывается модифицированным Н8А линкером с имеющим более низкую аффинность ксГу антителом против БгЬВ3, Н3, которое блокирует связывание лиганда БгЬВ3, НК0, тем самым ингибируя фосфорилирование БгЬВ3 и последующую передачу сигнала АКР Связывающее БгЬВ2 антитело ксГу, Β1Ό2, образовано из исходного ксГу С6,5, которое не обладает ни агонистической, ни антагонистической активностью. Следовательно, по-видимому, Β1Ό2, функционирует только как нацеливающий агент. Более низкоаффинное связывание связывающего БтЬВ3 антитела ксГу предупреждает прочное связывание В2В3-1 с нормальными нераковыми клетками, которые экспрессируют БгЬВ3, но мало или совсем не экспрессируют БгЬВ2, тем самым снижая потенциальную неспецифическую токсичность. В опухолевых клетках, экспрессирующих как БгЬВ2, так и БгЬВ3, авидное действие связывания биспецифического Β2Β3-1 с обоими рецепторами превосходит низкую аффинность БтЬВ3 ксГу, что способствует усиленному ингибированию взаимодействия с НК0.

Способность В2В3-1 ингибировать связывание НК0 с БтЬВ3 изучают проточной цитометрией (БАС8). Клетки раковой клеточной линии молочной железы, ВТ-474-М3 (вариант клеток ВТ-474, которые сверхэкспрессируют БгЬВ2), предварительно обрабатывают, добавляя 1 мкМ В2В3-1, затем инкубируют с 10 нМ биотинилированного НК0 1β Ε0Ρ домена. После интенсивной отмывки определяют связывание, используя конъюгат стрептавидин-Α1еxаЕ1иο^ 647. Все инкубации проводят при 4°С. На фиг. 7 показано, что Β2Β3-1 может блокировать связывание НК0 с БтЬВ3.

Пример 8.

После демонстрации способности В2В3-1 блокировать связывание НК0 с БтЬВ3 было изучено влияние В2В3-1 на передачу сигнала БгЬВ3 ίη νίίτο на двух линиях клеток, которые экспрессируют БгЬВ3 и сверхэкспрессируют БтЬВ2. Линии клеток молочной железы ВТ-474-М3 и ΖΚ75-30 истощают сывороткой, предварительно обрабатывают, проводя титрование доз В2В3-1 в течение 24 ч, а затем стимулируют в течение 10 мин, добавляя 5 нМ НК0 1β Ε0Ρ домена. Затем изучают статус фосфорилирования БтЬВ3 и АКГ методом Ε^I8Α. Результаты показывают, что В2В3-1 эффективно ингибирует индуцированную НК0 активацию фосфорилирования как БгЬВ3, так и АКЛ в зависимости от дозы и с низкими (нМ) значениями Κ₅₀ в обеих клеточных линиях (фиг. 8А-Э).

Пример 9.

На фиг. 9 показано влияние обработки с помощью В2В3-1 на сигнальные белки в ВТ474 раковых клетках молочной железы. Клетки обрабатывают в интервале доз В2В3-1 в течение 24 ч с последующей стимуляцией герегулином. Уровни Г рБгЬВ2, рБгЬВ3, рБтк и рАКЛ и соответствующие уровни тотальных белков определяют на клеточных лизатах методом вестерн-блоттинга.

Пример 10.

На фиг. 10 показаны преципитация - вестерн-блоттинг обработанных с помощью В2В3-1 раковых клеток молочной железы ВТ474. Клетки обрабатывают в интервале доз В2В3-1 в течение 24 ч с последующей стимуляцией герегулином.

БгЬВ2-ассоциированные комплексы выделяют из клеточных лизатов с помощью антитела против БтЬВ2 с последующим вестерн-блоттингом для детекции уровней рБтЬВ2 и рБтЬВ3 и их соответствующих тотальных белков.

- 34 022201

Пример 11.

Противоопухолевую активность В2В3-1 изучают ίη νίΐτο несколькими методами анализа. В первом анализе изучают влияние В2В3-1 на аккумуляцию клеток ВТ-474 или 8КВК3 в С1 фазе и сопутствующее уменьшение в 8 фазе клеточного цикла. Коротко говоря, клетки обрабатывают, добавляя 1 мкМ В2В3-1 или носителя РВ8, в течение 72 ч. По окончании обработки клетки трипсинизируют, осторожно ресуспендируют в гипотоническом растворе, содержащем пропидия йодид, и одиночные клетки анализируют проточной цитометрией. Распределение клеток в С1 и 8 фазах клеточного цикла определяют, используя алгоритмы для построения кривой, разработанные для анализа клеточного цикла (программа Ηο\ν.ίο для анализа клеточного цикла). Найдено, что В2В3-1 слабо снижает процентное содержание клеток в 8 фазе и повышает популяцию клеток в С1 фазе (фиг. 11А). Во втором эксперименте изучают число колоний клеток, образующихся после обработки с помощью В2В3-1. Раковые клетки молочной железы ВТ-474 и 8КВК3 засевают в присутствии 1 мкМ В2В3-1 и сравнивают с клетками, засеянными в одной только (чистой) среде. Чистую среду и среду, содержащую компонент для обработки, добавляют каждые 3 дня. Через 14 дней считают число колоний и сравнивают с необработанными клетками. На фиг. 11В показано снижение 40-45% числа колоний, образующихся при обработке с помощью В2В3-1 по сравнению с контрольными клетками. Наконец, оценивают способность В2В3-1 ингибировать пролиферацию клеток в анализе сопротивления клетки, используя измерительную систему Кеа1-Т1те Се11 Е1ес1гошс 8еп5т§ 8уδΐет (КТ-СЕ8 АСЕА Вюзаепсез). Клетки ВТ-474 засевают в плашки с микроэлектронными сенсорными чипами и обрабатывают с титрованием доз В2В3-1 или средой в течение 72 ч. Данные, показывающие появление отклика сопротивления системы клетка-электрод, собирают каждый час в течение 72 ч и значения 1С₅₀ рассчитывают через 68 ч после обработки. На фиг. 11С показано, что В2В3-1 может ингибировать сопротивление клеток ВТ-474 с величиной 1С₅₀ 3 3 нМ.

Пример 12.

Авторы изобретения также изучали, проявляет ли В2В3-1 агонистическую активность на основании его способности одновременно связывать и перекрестно связывать (сшивать) ЕгЪВ2 и ЕгЪВ3 гесерЮгз. Раковые клетки молочной железы ΖΚ75-1 в бессывороточной среде (истощенной сывороткой) инкубируют с 1 мкМ В2В3-1 или с РВ8 носителем в течение 24 ч. Клетки обрабатывают также В2В3-1 или РВ8 носителем в течение 24 ч с последующей 10-минутной стимуляцией, добавляя 5 нМ ΗΚΟ 1β ЕСТ домена. Клетки лизируют и определяют содержание ЕгЪВ3 в лизатах методом ЕЫ8А. На фиг. 12 показано, что клетки, обработанные одним только В2В3-1, содержат уровни фосфорилированного ЕгЪВ3, сравнимые с его уровнями в необработанных клетках, это показывает, что В2В3-1 не оказывает агонистического действия.

Пример 13.

Способность В2В3-1 специфически связываться с ЕгЪВ2 и ЕгЪВ3, но не к родственным членам семейства ЕгЪВ, ЕОРК и ЕгЬВ4 изучают методом ЕЬ18А. На планшетах иммобилизуют рекомбинантный внеклеточный домен либо ЕгЪВ2, либо ЕгЪВ3. Планшеты блокируют и инкубируют половиной максимальной связывающей концентрации В2В3-1 в присутствии серийных разведений конкурентных рекомбинантных внеклеточных доменов ЕОРК, ЕгЪВ2, ЕгЪВ3 или ЕгЪВ4. Результаты показывают, что только растворимый ЕгЪВ2 внеклеточный домен блокирует связывание В2В3-1 с ЕгЪВ2-иммобилизованными планшетами (фиг. 13А). Аналогично, только растворимый ЕгЪВ3 внеклеточный домен блокирует связывание В2В3-1 с ЕгЪВ3-иммобилизованными планшетами (фиг. 13В). Эти результаты показывают специфичность плеча В1Ό2 антитела против ЕгЪВ2 к ЕгЪВ2 и специфичность плеча Н3 антитела против ЕгЪВ3 к ЕгЪВ3. Полагают, что усиленный сигнал, наблюдаемый когда растворимый внеклеточный домен ЕгЪВ2 инкубируют с В2В3-1 на планшете с иммобилизованным ЕгЪВ3, вызван образованием комплекса ЕгЪВ2, ЕгЪВ3, В2В3-1 на планшете.

Пример 14.

Изучалась способность В2В3-1 прочно (охотно) связываться с опухолевыми клетками, экспрессирующими как ЕгЪВ2, так и ЕгЪВ.3, 8К02 и 8К03 представляют собой варианты В2В3-1, лишенные способности взаимодействовать с ЕгЪВ2 или ЕгЪВ3 соответственно. Клетки меланомы МАЬМЕ-3М, которые экспрессируют приблизительно равные количества ЕгЪВ2 и ЕгЪВ3 рецепторов, инкубируют с серийными разведениями В2В3-1, 8К02 или 8К03 в присутствии насыщающих концентраций конъюгированного антитела козье анти-ЖА А1ехаП1ЮГ-647. Связывание клеток определяют проточной цитометрией и кажущуюся аффинность связывания определяют для каждой молекулы. Контрольные клетки инкубируют только с вторичным антителом. Никакого заметного связывания не наблюдают для 8К02, который сохраняет только низкоаффинное связывание с ЕгЪВ3 и не проявляет ЕгЪВ2 связывающей активности. 8К03, который сохраняет функциональный, высокоаффинный ЕгЪВ2-связывающий 8сРν, но не способен связывать ЕгЪВ3, имеет К_с 6,7 нМ. В2В3-1 связывает клетки с К_с 0.2 нМ, демонстрирует авидность связывания этой биспецифической молекулы (фиг. 14).

- 35 022201

Пример 15.

Стабильность В2В3-1 в физиологических условиях оценивают инкубацией 100 нМ В2В3-1 в человеческой, обезьяньей Циномолгус или мышиной сыворотке при 37°С в течение 120 ч. Образцы отбирают через 0, 24, 48, 72, 96 и 120 ч и определяют способность В2В3-1 связывать как ЕгЬВ2, так и ЕгЬВ3 методом ЕЫ8А. Этот анализ ЕЫ8А включает иммобилизацию рекомбинантного ЕгЬВ2 внеклеточного домена на 96-луночных планшетах в течение ночи с последующей стадией блокирования, а затем инкубации с серийными разведениями В2В3-1. Затем планшеты инкубируют со слитым белком Рс-ЕгЬВ3 внеклеточный домен, а затем с конъюгатом антитело козы против человеческого иммуноглобулина-Рс-НКР. Планшеты обрабатывают, добавляя дающий суперсигнал хемилюминесцентный субстрат. На фиг. 15А-С показано, что В2В3-1 остается устойчивым в сыворотке всех трех видов в физиологических условиях, сохраняя сравнимую способность связываться как с ЕгЬВ2, так и с ЕгЬВ3 во всех изученных временных точках.

Пример 16. Эффект дозы В2В3-1 на модели ксенотрансплантата опухоли ВТ-474-М3 рака молочной железы.

Активность В2В3-1 ίη У1уо оценивают на голых мышах, несущих ВТ-474-М3 ксенотрансплантаты. Мышам, по десять в группе, вводят 12 доз по 0,3, 1, 3, 10, 30 или 90 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня. Контрольным группам вводят носитель РВ8 или Н8А в дозе, эквимолярной дозе 90 мг/кг В2В3-1. Все дозы вводят интраперитонеально (и.п., 1.р.). Размер опухоли измеряют дважды в неделю и рассчитывают соответствующий объем опухоли. Результаты показывают, что обработка с помощью В2В3-1 приводит к заметному уменьшению размера ВТ-474-М3 опухоли по сравнению с контрольной группой (фиг. 16). Полная регрессия наблюдается в каждой из групп, получавших В2В3-1, за исключением мышей, получавших самую низкую дозу В2В3-1 (0,1 мг/кг).

Пример 17.

Как показано на фиг. 17А-Е, В2В3-1 проявляет активность на нескольких моделях ксенотрансплантатов, зависимую от ЕгЬВ2. В2В3-1 эффективен (активен) в моделях ксенотрансплантатов Са1и-3 (фиг. 17А), 8К0У-3 (фиг. 17В), ΝΟ-Ν87 (фиг. 17С) и МЭА-МВ-361 (фиг. 17Е), экспрессирующих ЕгЬВ2 с концентрацией >1х10⁵ рецепторов/клетка, но хуже работает в модели ксенотрансплантата АСΗN (фиг. 17Ό), который экспрессирует 45х10⁴ ЕгЬВ2 рецепторов/клетка. Мышам вводят 30 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня.

Пример 18.

Сверхэкспрессия ЕгЬВ2 превращает не отвечающую на В2В3-1 модель ксенотрансплантата ЛЭКг рака молочной железы в модель, отвечающую на В2В3-1 (фиг. 18А, В). ЕгЬВ2 сверхэкспрессируют в клетках рака молочной железы АЭКг, используя ретровирусную экспрессионную систему. Трансфицированные клетки, экспрессирующие высокие уровни ЕгЬВ2 (Л^К^-Е2), отбирают, используя РАС8, а затем инъецируют мышам пибе (голым), чтобы получить ксенотрансплантированные опухоли. Мышам вводят 30 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня. В то время как у ксенотрансплантатов АЭКг дикого типа не наблюдается отклик на В2В3-1 (фиг. 18А), ксенотрансплантаты АЭКг-ЕЗ (фиг. 18В) отвечают на В2В3-1.

Пример 19.

Как показано на фиг. 19А-В, активность В2В3-1 позитивно коррелирует с уровнями экспрессии ЕгЬВ2 ш убго (фиг. 19А) и ш У1уо (фиг. 19В). Ингибирование фосфорилирования ЕгЬВ3 с помощью В2В3-1 определяют в 9 линиях опухолевых клеток с уровнями экспрессии ЕгЬВ2 в интервале от 5х 10⁴ до 2,4х10⁶ рецепторов/клетка методом ЕЬ18А. Найдено, что степень (величина) способности В2В3-1 ингибировать фосфорилирование ЕгЬВ3 до базовых уровней (% ингибирования рЕгЬВ3) позитивно коррелирует с уровнями экспрессии ЕгЬВ2. Аналогично, активность В2В3-1 оценивали на 10 моделях опухолевых ксенотрансплантатах, экспрессирующих от низких до высоких уровней ЕгЬВ2. Отклик ксенотрансплантата также коррелирует с уровнями экспрессии ЕгЬВ2.

Пример 20.

Обработка ВТ474-М3 опухолевых клеток молочной железы с помощью В2В3-1 приводит к транслокации р27^к1р1 к ядру (фиг. 20А). Клетки ВТ474-М3 обрабатывают с помощью 1 мкМ В2В3-1 в течение 6 ч. Субклеточную локализацию р27^к1р1 оценивают иммунофлуоресцентными методами. Показано, что в клетках, обработанных В2В3-1, р27^к1р1, транслоцированные к ядру, вызывают ингибирование клеточной пролиферации. р27^к1р1 остаются в цитоплазме необработанных клеток.

Для более подробного изучения воздействия В2В3-1 на клеточный цикл ВТ-474-М3 клетки, обработанные с помощью В2В3-1 в течение 72 ч, исследуют с помощью регулятора клеточного цикла циклина Ό1, используя вестерн-блоттинг (фиг. 20В). Цитоскелетный белок винкулин используют в качестве контрольной белковой нагрузки в данном эксперименте. Обработка В2В3-1 приводит к снижению уровней циклина Ό1 по сравнению с необработанными клетками.

Пример 21.

Как показано на фиг. 21А-В, обработка ксенотрансплантатов опухоли молочной железы ВТ474-М3 с помощью В2В3-1 приводит к транслокации р27^к1р1 к ядру. Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ474 обрабатывают с помощью В2В3-1 ((фиг. 21А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой Н8А

- 36 022201 (фиг. 21В) каждые 3 дня, всего вводят 4 дозы. В опухолях, обработанных В2В3-1, наблюдают более интенсивное окрашивание ядер на р27^к1р1 по сравнению с НЗА контрольными опухолями, это указывает на противоопухолевый эффект В2В3-1 ίη νί\Ό.

Пример 22.

Обработка с помощью В2В3-1 приводит к снижению пролиферации маркера Κί67 в ксенотрансплантатах опухолей молочной железы ВТ474. Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ474-М3 обрабатывают с помощью В2В3-1 (фиг. 22А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой НЗА (фиг. 22В) каждые 3 дня, всего вводят 4 дозы. Последующее окрашивание срезов опухоли на Κί67 демонстрирует более слабое окрашивание (паттерн пониженной экспрессии) для опухолей, обработанных В2В3-1, по сравнению с опухолями, обработанными НЗА.

Пример 23.

Обработка вариантом В2В3-1 приводит к снижению плотности сосудов ксенотрансплантатов опухоли молочной железы ВТ474-М3, как показано анализом экспрессии СЭ31 (фиг. 23А-В). Ксенотрансплантаты опухоли молочной железы ВТ474 обрабатывают с помощью В2В3-1 (фиг. 23А) в дозе 30 мг/кг или эквимолярной дозой НЗА (фиг. 22В) каждые 3 дня, всего вводят 4 дозы. Опухоли окрашивают для определения сосудистого маркера СЭ31. В опухолях, обработанных В2В3-1, наблюдается заметное снижение плотности сосудов по сравнению с контрольными опухолями, обработанными НЗА.

Пример 24.

В2В3-1 ингибирует фосфорилирование ЕгЪВ3 ίη νί\Ό. Ксенотрансплантаты опухолей ВТ-474-М3 обрабатывают, добавляя 30 мг/кг В2В3-1 или 17,5 мг/кг НЗА каждые 3 дня, всего вводят 4 дозы и опухоли собирают через 24 ч после последней дозы. Опухоли лизируют и проводят δΌδ-РАОЕ с последующим вестерн-блоттингом, чтобы определить относительные уровни фосфорилирования целевого ЕгЪВ3 в присутствии В2В3-1. Равные количества белка наносят на каждую дорожку и уровни тотального белка контролируют пробой на бета-тубулин, вестерн-блоттинг с использованием антител, специфических к фосфорилированному ЕгЪВ3, показывает, что опухоли, обработанные В2В3-1, содержат меньше рЕгЪВ3, чем опухоли, обработанные НЗА (фиг. 24А). Денситометрия анализированных вестерн-блоттингом белков с последующей нормализацией средней интегральной интенсивности полосы рЕгЪВ3 по средней интегральной интенсивности полосы тубулина показывает, что опухоли, обработанные В2В3-1, содержат значительно меньше рЕгЪВ3, чем контрольные опухоли, обработанные НЗА (фиг. 24В). Эти результаты подтверждают, что В2В3-1 ингибируют фосфорилирование своей мишени ЕгЪВ3 ίη νί\Ό.

Пример 25. Ιη У1уо активность В2В3-1 в ксенотрансплантатах ВТ-474-М3 с пониженной ΡΤΕΝ активностью.

Для нокаутирования гена опухолевого супрессора гомолога фосфатазы и тензина (ΡΤΕΝ) в опухолевых клетках молочной железы ВТ-474-М3 применяют технологию короткой шпилечной РНК (кшРНК, δΙιΡΝΛ). Коротко говоря, культивированные клетки ВТ-474-М3 трансфицируют с помощью 5ΐι(^ι<)ΡΤΕΝ или шкКонтрольнойРНК, используя ротовирусную трансфекцию. Трансфицированные клетки с пониженной активностью ΡΤΕΝ отбирают методом РАСЗ, а затем инъецируют подкожно в правый бок голых (пийе) мышей с целью зафиксировать ксенотрансплантаты опухолей. Клетки, трансфицированные контрольным вектором, инъецируют в левый бок той же самой мыши. Мышам вводят по 30 мг/кг В2В3-1 каждые 3 дня или по 10 мг/кг герцептина каждую неделю. НЗА инъецируют в качестве контроля в дозе, эквимолярной дозе В2В3-1. Все инъекции делают интраперитонеально (1.р.).

В2В3-1 и герцептин инициируют уменьшение размера опухолей, образованных контрольными раковыми клетками молочной железы ВТ-474-М3 (фиг. 25А), тогда как только В2В3-1 (но не герцептин) вызывает уменьшение размера опухолей, образованных раковыми клетками молочной железы ВТ-474М3, не экспрессирующими ΡΤΕΝ (фиг. 25В).

Пример 26.

В2В3-1 ингибирует ЕгЪВ3 сигнал в раковых клетках молочной железы ВТ-474-М3 с пониженной ΡΤΕΝ активностью. Способность В2В3-1 ингибировать фосфорилирование ЕгЪВ3 сигнала в опухолевых ксенотрансплантатах изучают на ΡΤΕΝ-дефицитной модели ВТ-474-М3. В опухолевые ксенотрансплантаты опухолей полученной генной инженерией клеточной линии и контрольной клеточной линии вводят 30 мг/кг В2В3-1, 17,5 мг/кг НЗА каждые 3 дня или 10 мг/кг герцептина еженедельно и опухоли собирают через 24 ч после введения последней дозы. Опухоли лизируют и подвергают ЗОЗФАОБ с последующим вестерн-блоттингом для определения уровней фосфорилирования целевого для В2В3-1 Ει№3, АКГ и уровни общего ΡΤΕΝ. Равные количества белка наносят на каждую дорожку и уровни тотального белка контролируют пробой на ΡΟΝΆ. Анализ вестерн-блоттинг с применением антител, специфических к фосфорилированному Ει№3, показывает, что опухоли, обработанные В2В3-1, содержат меньше рАКТ чем опухоли, обработанные НЗА или герцептином (фиг. 26А). Денситометрия анализированных вестернблоттингом белков с последующей нормализацией средней интегральной интенсивности полосы ΡСNА по средней интегральной интенсивности полосы ΡСNА показывает, что опухоли, обработанные В2В3-1, содержат значительно меньше ΡСNА, чем контрольные опухоли, обработанные НЗА и герцептином (фиг. 26В).

- 37 022201

Пример 27.

Фармакокинетические характеристики В2В3-1 изучают на пи/пи мышах. Животных произвольно делят на группы и им вводят внутривенно (IV) разовую дозу 5, 15, 30 или 45 мг/кг В2В3-1 (фиг. 27А-Э соответственно). Образцы крови берут перед введением дозы и через 0,5, 4, 8, 24, 48, 72 и 120 ч после введения дозы. Для каждой временной точки берут по три мыши. Сывороточные уровни В2В3-1 определяют, применяя два метода ЕЫ8А. В первом методе требуется функциональное связывание В2В3-1 как с ΕΦΒ2, так и с ΕΦΒ3, тогда как во втором методе определяют только Н8А компонент В2В3-1 в сыворотке. В НА§ методе ЕЫ8А используют поликлональное иммобилизованное антитело против Н8А и НКР-конъюгированное поликлональное идентифицирующее антитело против Н8А. Снижение В2В3-1 сывороточной концентрации, определяемое по методу связывания ΕΦΒ2/ΕΦΒ3, по сравнению с Н8А методом, должно указывать на потерю функционального В2В3-1. На фиг. 27А-Э показано, что фармакокинетические свойства В2В3-1 аналогичны в обоих методах ЕЫ8А, что говорит об устойчивости В2В3-1 в кровотоке мышей.

Пример 28.

Сывороточные концентрации В2В3-1 находят, применяя двухкомпонентную биэкспоненциальную модель, они показывают, что фармакокинетика является двухфазной. Рассчитанные конечные периоды полужизни составляют 17, 16, 23 и 28 ч для доз 5, 15, 30 или 45 мг/кг соответственно, они показаны в табл. 4. Увеличение дозы В2В3-1 приводит к линейному увеличению экспозиции (фиг. 28).

Таблица 4

Фармакокинетические характеристики В2В3-1 у мышей и обезьян циномолгус

Доза (мг/кг)	Вид	N	Т1/2Р (час)	лис (час- мкг/мл)	Клиренс (мл/час/кг)
5	Мышь (разовая доза)	3	16.9	1.58Е + 03	3.19
15	Мышь (разовая доза)	3	16.2	6.10Е + 03	2.47
30	Мышь (разовая доза)	3	22.6	1.18Е + 04	2.54
45	Мышь (разовая доза)	3	17.5	1.84Е + О4	2.46
4	Обезьяна циномолгус (1'доза)	2	39.1	3.44Е + 03	1.17
4	Обезьяна циномолгус (4’ доза)	2	44.9	7.20Е + 03	0.60
20	Обезьяна циномолгус	2	33.1	2.29Е + 04	0.88
	(1’доза)
20	Обезьяна циномолгус (4* доза)	2	122.5	8.20Е + 04	0.25
200	Обезьяна циномолгус (1’доза)	4	68.8	3.18Е + 05	0.64
200	Обезьяна циномолгус (4’ доза)	2	69ю7	5.72Е + 05	0.35
200	Обезьяна циномолгус (4* доза)*	2	66.6	5.99Е + 05	0.34

*Итнечеииые животные.

Пример 29.

Образцы крови для фармакокинетического анализа получают также в токсикологическом исследовании в интервале доз на самках обезьян циномолгус. В данном исследовании мышам вводят (инфузия) 4, 20 или 200 мг/кг Β2Β3-1 каждые 3 дня, всего вводят 4 дозы. Отбор образцов проводят до и через 5 мин после введения доз в каждый день введения доз (дни эксперимента 1, 4, 7 и 10), чтобы получить предозовую (перед введением дозы) и максимальную/сквозные концентрации и через 1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч после окончания первого вливания (инфузии) в 1 день и через 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 и 120 ч после последнего вливания (инфузии) на 10 день. У излеченных животных, получавших дозу 200 мг/кг, берут также сывороточные образцы через 168, 336 и 457 ч после последнего вливания.

Сывороточные образцы обезьян циномолгус анализируют описанным выше методом ΕΦΒ2/ΕΦΒ3 ЕЫ8А. Динамика сывороточных концентраций для каждой дозы во времени показана на фиг. 29. Анализ показывает, что профили средняя концентрация - время для сывороточного В2В3-1 после введения дозы в дни 1 и 10 качественно сходны с профилями для концентраций, обычно убывающими со временем по сравнению с Стах. Средний период полужизни оценивается в интервале от 38,3-67,2 ч в день 1 до 45,0121,0 ч на 10 день (табл. 4).

Пример 30.

Плазмиду, кодирующую слитый белок В2В3-1 биспецифического зсРу антитела, получают, объединяя последовательности генов уникального человеческого зсРу антитела против ΕΦΒ3 (обозначенного Н3), человеческого зсРу антитела против ΕΦΒ2 (обозначенного Β1Ό2) и модифицированного сывороточного альбуминового (Н8А) линкера. Антитело зсРу против ΕΦΒ3, Н3, рекомбинантно связывают с

- 38 022201 аминоконцом ΗδΑ линкера с помощью соединяющего пептида (коннектора) (Α1Η-Α1Η-δθΓ), а 8сРу антитело против БгЬВ2, Β1Ό2, генетически связывают с карбоксиконцом ΗδΑ линкера с помощью соединяющего пептида (Α1а-Α1а-Л1а-^еи). Пептидные коннекторы получают введением сайтов рестрикции в процессе конструирования экспрессирующего вектора млекопитающих и синтезируют с применением оптимизированных кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих вместе с фрагментами одноцепочечного антитела и ΗδΑ линкером.

Β1Ό2 8сРу выбирают из комбинаторной библиотеки фагового дисплея, созданной мутагенезом БгЬВ2-связывающего 8сРу С6.5, который выбран из неиммунной (наивной) фаговой библиотеки. Н3 8сРу выбирают из неиммунной фаговой библиотеки, впервые полученной δΙ^Ν е1 а1. Последовательности генов, кодирующих фрагменты одноцепочечных антител Β1Ό2 и Н3, оптимизируют по предпочтениям кодонов в СНО клетках и синтезируют с целью последующего конструирования плазмиды, кодирующей В2В3-1.

Модифицированный ΗδΑ линкер содержит две аминокислотные замены. Цистеиновый остаток в положении 34 заменяют на серин с целью понизить потенциальную гетерогенность белка вследствие окисления в этом сайте. Аспарагиновый остаток в положении 503 заменяют на глутамин, который восприимчив к дезаминированию дикого типа ΗδΑ и может способствовать уменьшению фармакологического периода полужизни.

Последовательность гена, кодирующего модифицированный ΗδΑ линкер, синтезируют с использованием оптимизированного кодона для экспрессии в клетках млекопитающих с целью последующего конструирования плазмиды, кодирующей В2В3-1.

Пример 31.

Последовательность, кодирующую В2В3-1, клонируют в основной вектор рМР10к стандартными методами молекулярной биологии с целью создания плазмиды рМΡ10к4Η3-тΗδΑ-Β1^2, показанной на фиг. 30. По большей части в этой конструкции используются общеупотребительные генетические элементы. Экспрессия В2В3-1 запускается человеческим 0ЛΡ^ промотором. В этом векторе используются генетические элементы, называемые участками связывания ДНК с матриксом, или ΜΑΚ элементами. Генетические элементы ΜΑΚ. контролируют динамическую организацию хроматина и предохраняют ближайшие гены от действия соседнего хроматина, тем самым повышая зависящую от числа копий, независимо от положения, экспрессию генов. Показано, что элементы ΜΑΚ. увеличивают возможность выделения клона с заданным уровнем экспрессии для продуцирования рекомбинантного белка и повышают стабильность продуцирования. Элементы ΜΑΚ, используемые в конструкциях В2В3-1, являются некодирующими человеческими ΜΑΚ. элементами. Помимо В2В3-1 плазмиды, для селекции стабильных трансформантов используют также плазмиду резистентности к неомициновым антибиотикам (фиг. 31) и плазмиду устройчивости к гигромицину (фиг. 32).

Пример 32. Первый раунд трансфекции гена.

Клетки яичника китайского хомячка СНО-К1 получают из АТСС (АТСС # ССБ-61). Клеточная линия СНО-К1 представляет собой сывороточный и пролинзависимый адгезивный субклон родительской СНО клеточной линии, полученный Т.Т. Риск. Клетки СНО-К1, используемые для трансфекции В2В3-1, перед трансфекцией преадаптируют к росту суспензии в бессывороточной среде. Для обработки В2В3-1 клеточной линии используют итеративную процедуру трансфекции. За 24 ч до трансфекции клетки СНО-К1 (суб)пересевают при плотности 1,0х10⁶ клеток/мл в δΡΜ4ί'.Ή0 (бессывороточной) среде (ИуС1опе, Бодап, ИТ), дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия и 0,016 мМ тимидина. В день трансфекции клетки ресуспендируют в среде 0ρΐίΜΕΜ Дпуйгодеп Согр, СагкЬай, СΑ) и 40000 клеток помещают в каждую лунку 24-луночного планшета. При первой трансфекции плазмаду экспрессии В2В3-1 (ρΜΡ10к4Η3-тИδΑ-Β1^2) и плазмиду резистентности к неомицину (фиг. 30; ρδV2-пео ^е1ех18, Шс., Маг1Ьогоидк, ΜΑ) смешивают в молярном соотношении 75:1 (В2В3-1:резистентности к неомицину). Затем смесь плазмид смешивают с катионным липидным агентом трансфекции (ЫроГес1атте БТХ, Шуйгодеп Согр, СагйЬай СΑ) и оставляют на 30 мин для образования комплекса липид/ДНК. Затем комплекс ДНК/липид прибавляют к клеткам СНО-К1 и 24-луночные планшеты помещают в термостат при 37°С, 5% СО₂.

Пример 33. Селекция и скрининг на клетки-суперпродуценты.

Содержимое лунки для трансфекции отмывают ΡΒδ, трипсинизируют и распределяют в два 96-луночных планшета. Используемая питательная среда содержит ΌΜΕΜ/Ρ12 Дпуйгодеп Согр, СагйЬай СΑ), 10% ΡΒδ Дпуйгодеп Согр, СагйЬай СΑ) и 500 мг/л генетицина (0418; Шуйгодеп Согр, СагйЬай СΑ). Среду в 96-луночных планшетах заменяют на 4 день на среду δΡΜ40Η0, дополненную 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия, 0,016 мМ тимидина и 500 мг/л генетицина. После культивирования еще в течение двух недель в среде для селекции выжившие клетки образуют хорошо очерченные колонии. Клоны оценивают количественным методом δρоΐ-Β1оΐ. Максимально продуцирующие колонии трипсинизируют и переносят для размножения в одну лунку 24-луночного планшета.

Для скрининга на колонии клеток-суперпродуцентов В2В3-1 используют семидневный анализ на продуктивность. После размножения клетки в 24-луночных планшетах оставляют для пролиферации в

- 39 022201 течение семи дней в среде 8РМ4СНО, дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия и 0,016 мМ тимидина. Определяют концентрацию В2В3-1 в отработанных средах. Клоны с максимальной продуктивностью переносят для размножения во встряхиваемые колбы на 125 мл с перегородками (на качалке). Семидневный эксперимент во встряхиваемой колбе в среде 8РМ4СНО, дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия и 0,016 мМ тимидина, используют для скрининга пула клеток для выращивания и продуцирования В2В3-1.

Пример 34. Второй раунд трансфекции гена.

Пул клеток-суперпродуцентов, установленный в первом раунде трансфекции (см. выше), трансфицируют второй раз с целью повышения продукции. За 24 ч до трансфекции пул клеток (суб)пересевают при плотности 1,0х10⁶ клеток/мл в 8РМ4СНО (бессывороточной) среде, дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия и 0,016 мМ тимидина. В день трансфекции клетки ресуспендируют в среде ОрйМЕМ ОпуЦгодеп Согр, СагкЪай, СА) и 40000 клеток помещают в каждую лунку 24-луночного планшета. При первой трансфекции плазмиду экспрессии В2В3-1 и плазмиду резистентности к гигромицину (фиг. 32; рТК-Нуд (С1оп1есЬ. МошИат У1е\у, СА)) смешивают в молярном соотношении 50:1 (В2В3-1:резистентности к гигромицину). Затем смесь плазмид смешивают с катионным липидным агентом трансфекции (ЫроГссЕшипе ЬТХ, [пуЦгодеп Согр) и оставляют на 30 мин для образования комплекса липид/ДНК. Затем комплекс ДНК/липид прибавляют к пулу клеток и 24-луночные планшеты помещают в термостат при 37°С, 5% СО₂.

Пример 35. Селекция и скрининг на клетки-суперпродуценты из второй трансфекции.

Содержимое каждой лунки для трансфекции отмывают РВ8, трипсинизируют и распределяют в два 96-луночные планшета. Используемая питательная среда содержит ЭМЕМ/Е12, дополненную 10% РВ8 (ЗпуЦгодеп Согр, СагкЪай, СА) и 400 мг/л гигромицина В (ЗпуПгодеп Согр). Среду в 96-луночных планшетах заменяют на 4 день на среду Нус1опе 8РМ4СНО, дополненную 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия, 0,016 мМ тимидина и 400 мг/л гигромицина В. После селекции еще в течение двух недель выжившие клетки образуют хорошо очерченные колонии. Клоны оценивают количественным методом 8ро1-В1о1. Максимально продуцирующие колонии трипсинизируют и переносят для размножения в одну лунку 24-луночного планшета.

Для скрининга на колонии клеток-суперпродуцентов В2В3-1 используют семидневный анализ на продуктивность. После размножения клетки оставляют для пролиферации в течение семи дней и определяют концентрацию В2В3-1 в отработанных средах.

Клоны с максимальной продуктивностью из 24-луночных планшетов переносят для размножения во встряхиваемые колбы на 125 мл с перегородками (на качалке) со средой Нус1опе 8РМ4СНО, дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 0,1 мМ гипоксантина натрия и 0,016 мМ тимидина. Семидневное исследование в колбе для встряхивания используют для скрининга пула клеток для выращивания и продуцирования В2В3-1. Отработанные среды анализируют количественно, используя Рго1еш Агезш и ВЭЖХ хроматограф.

Пример 36. Клонирование методом серийных разведений.

Характеризующуюся наилучшим ростом и наивысшей продуктивностью колонию клеток, продуцирующих В2В3-1, идентифицированную в анализе продуктивности, переносят из встряхиваемой колбы на 125 мл в пять 96-луночных планшетов с концентрацией клеток, рассчитанной так, чтобы получить одну клетку/лунка. 96-луночные планшеты помещают в термостат при 37°С и 5% СО₂. Лунки изучают каждые две недели, следя за образованием колоний. Колонии, образующиеся из одной клетки, идентифицируют на основании симметричной формы колонии. Лунки, содержащие такие колонии, отмечают для последующего скрининга с использованием 7-дневного анализа в 24-луночном планшете и 7-дневного анализа во встряхиваемой колбе на 125 мл.

Второй раунд клонирования методом серийных разведений проводят аналогично первому раунду. Проверку с дополнительной подпиткой 100 мл проводят для того, чтобы подтвердить выбор клона. Предпосевной фонд (банк) хранят в замороженном виде.

Пример 37. Приготовление В2В3-1.

В2В3-1 можно вводить раз в неделю с помощью внутривенного вливания (инфузии) в течение 60 или 90 мин в зависимости от переносимости пациентом. В2В3-1 можно приготовить в стерильном 20 мМ растворе Ь-гистидина гидрохлорида, 150 мМ натрия хлорида, рН 6,5 с концентрацией 25 мг/мл для введения пациенту (например, человеку).

Пример 38. Лечение рака молочной железы.

Н8А линкер по изобретению (например, В2В3-1; 8ЕЭ ГО NО: 16) можно вводить пациенту с диагностированным раком молочной железы. Например, пациента, у которого диагностирована раковая опухоль, экспрессирующая высокие уровни рецепторов эпидермального фактора роста, таких как ЕгЪВ2 (НЕК2/пеи), можно лечить НА8 линкером, соединенным с ЕгЪВ2-связывающим элементом. Врач, лечащий пациента с диагностированным раком молочной железы, может вводить Н8А линкер по изобретению, подходящий и способный принести наибольшую терапевтическую пользу пациенту. Отбор, например, связывающих элементов, соединенных с Н8А линкером по изобретению, можно проводить с учетом

- 40 022201 клинических показателей пациента и конкретного варианта рака. Например, генотипическое или гистологическое исследование материала, взятого при биопсии опухоли, может выявить повышенную экспрессию ЕгЪВ2, это показывает, что НЗА линкер по изобретению, который включает анти-ЕгЪВ2 связывающий элемент (например, В2В3-1), можно использовать для терапии.

В одном варианте изобретения В2В3-1 можно вводить пациенту с диагностированным раком молочной железы раз в неделю с помощью внутривенного вливания в течение 60 или 90 мин в зависимости от переносимости пациентом. В2В3-1 можно приготовить в стерильном 20 мМ растворе Ь-гистидина гидрохлорида, 150 мМ натрия хлорида, рН 6,5 с концентрацией 25 мг/мл для введения пациенту (например, человеку). Врач-клиницист, наблюдающий за введением В2В3-1 или любого НЗА линкера по изобретению, может руководствоваться обычной практикой приготовления и введения дозы, чтобы определить соответствующий курс лечения для любого данного пациента.

Помимо этого, изобретение включает совместное введение одного или более терапевтических лекарств или соединений в комбинации с НЗА линкером по изобретению (например, В2В3-1; ЗЕО ГО N0: 16), например обычная химиотерапевтическая схема лечения рака молочной железы включает доксорубицин, циклофосфамид и паклитаксел. Или же врач-клиницист может вводить НЗА линкер по изобретению (например, В2В3-1) в комбинации с хирургической операцией или лучевой терапией для лечения рака молочной железы нуждающегося в этом пациента.

Пример 39. Лечение рака яичника.

НЗА линкер по изобретению можно вводить пациенту с диагностированным раком яичника (карциномой яичника), например пациента, у которого диагностирована раковая опухоль, экспрессирующая высокие уровни рецепторов эпидермального фактора роста, таких как ЕгЪВ2 (НЕР2/пеи), можно лечить НАЗ линкером, соединенным с ЕгЪВ2-связывающим элементом. Врач, лечащий пациента с диагностированным раком яичника, может вводить НЗА линкер по изобретению, подходящий и способный принести наибольшую терапевтическую пользу пациенту. Отбор, например, связывающих элементов, соединенных с НЗА линкером по изобретению, можно проводить с учетом клинических показателей пациента и конкретного варианта рака. Например, генотипическое или гистологическое исследование материала, взятого при биопсии опухоли (биоптата), может выявить повышенную экспрессию ЕгЪВ2 или других молекул для нацеливания (например, сверхэкспрессирующих рецепторов или лигандов, специфических к раковой опухоли), на которые можно нацеливаться с помощью НЗА линкера по изобретению, это показывает, что НЗА линкер по изобретению, который включает анти-ЕгЪВ2 связывающий элемент (например, В2В3-1), можно использовать для терапии.

В одном варианте изобретения В2В3-1 можно вводить пациенту с диагностированным раком яичника раз в неделю с помощью внутривенного вливания в течение 60 или 90 мин в зависимости от переносимости пациентом. В2В3-1 можно приготовить в стерильном 20 мМ растворе Ь-гистидина гидрохлорида, 150 мМ натрия хлорида, рН 6,5 с концентрацией 25 мг/мл для введения пациенту (например, человеку). Врач-клиницист, наблюдающий за введением В2В3-1 или любого НЗА линкера по изобретению для лечения рака яичника, может руководствоваться обычной практикой приготовления и введения дозы (например, интраперитонеальной инъекцией), чтобы определить соответствующий курс лечения для любого данного пациента.

Помимо этого, изобретение включает совместное введение одного или более терапевтических лекарств или соединений в комбинации с НЗА линкером по изобретению (например, В2В3-1; ЗЕО ГО N0: 16). Или же врач-клиницист может вводить НЗА линкер по изобретению в комбинации с хирургической операцией или лучевой терапией для лечения рака яичника у нуждающегося в этом пациента.

Пример 40.

Конъюгаты НЗА линкера по изобретению можно конструировать, используя один или более элементов (группы А-Е), приведенных в табл. 5. В частности, НЗА линкер по изобретению, который показан как группа С в табл. 5, может включать один или более связывающих элементов, выбранных из групп А и Е, показанных в табл. 5. Помимо этого, конъюгаты НЗА линкера могут также включать один или более пептидных коннекторов, которые можно выбирать из групп В и Ό в табл. 5, на каждом амино- и карбоксиконце НЗА линкера. Пептидные коннекторы могут быть повторяющимися или усеченными, что делает коннекторную последовательность длиннее или короче.

- 41 022201

Таблица 5

Группа А Аминоконцевой связывающий элемент	Группа В Аминоконцевей пептидный коннектор	Группа С НЗА	Группа ϋ Карбокси концевой пептидный коннектор	ГруппаЕ Карбокси- концевой связывающий элемент
НЗ (5Е0 ГО N0.26) 6Ю2(5ЕО ГО N0:27) А5 (5Е0 ГО N0:26) М13.9 (5Е<2 ГО N0:29) В12(БЕО ГО N0:30) Р4 (8ЕО ГО N0:31) Р5В6Н2 (8Е0 ГО N0:32)	ΑΑΑί (ЗЕО ГО N0:5) ААЗ ААО	тНЗА (ЗЕО Ю N0:1) «4НЗА (ЗЕО ГО N0:3)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5) ААЗ ААО	НЗ (ЗЕО ГО N0:26) ВЮ2 (ЗЕО 10 N0:27) А5 (ЗЕО ГО N0:28) ми.9 (ЗЕО ГО N0:29) В12 (ЗЕО ГО N0:30) Е4 (ЗЕО ГО N0:31) Р5В6Н2 (ЗЕО ГО N0:32)

Изобретение включает конкретные варианты ΗδΑ линкеров, полипептидных коннекторов и связывающих элементов, обсуждавшихся выше. В табл. 6 приводятся десять конъюгатов ΗδΑ линкера с переменными ЕгЬВ2- или ЕгЬВ3-связывающими элементами, а также полипептидные коннекторы на амино- и карбоксиконцах ΗδΑ линкера по изобретению.

Таблица 6

Агент по изобретению	Амнноконцев ой связывающий элемент	Ν- кошдоой коннектор	НЗА	С- концевой коннектор	Карбоксиконце вой связывающий элемент
В2ВЗ-1 (ЗЕО ГО N0: 16)	НЗ (ЗЕО ГО N0:26)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО N0:1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	В 11)2 (ЗЕО ГО N0: 2Ώ
В2ВЗ-2 (ЗЕО ГО ΝΟ: 17)	А5 (ЗЕО ГО N0:28)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	ВЮ2 (ЗЕО ГО N0: 27)
Β2Β3-3 (ЗЕО ГО ΝΟ: 18)	А5 (ЗЕО ГО N0:28)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	Р5В6Н2 (ЗЕО ГО N0:32)
В2ВЗ-4 (ЗЕО ГО N0:19)	А5 (ЗЕО ГО ΝΟ: 28)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	МЬ3.9 (ЗЕО ГО N0: 29)
В2ВЗ-5 (ЗЕО ГО N0: 20)	В12 (ЗЕО ГО N0:30)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО N0:1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	ВГО2 (ЗЕО Ш ΝΟ: 27)
В2ВЗ-6 (ЗЕО ГО ΝΟ: 21)	В12 (ЗЕО ГО N0: 30)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	Р5В6Н2 (ЗЕО ГО N0:32)
В2ВЗ-7 (5Е(3 ГО МО: 22)	Р4 (ЗЕО ГО N0: 31)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	ВГО2 (ЗЕО ГО N0: 2ΖΪ
В2ВЗ-8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 23)	Г4 (ЗЕО ГО N0:31)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 1)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	Р5В6Н2 (ЗЕО ГО N0:32)
В2ВЗ-9 (ЗЕО ГО N0: 24)	НЗ (ЗЕО ГО N0:26)	ААЗ	НЗА (ЗЕО ГО ΝΟ: 3)	АААЬ (ЗЕО ГО N0:5)	ВГО2 (ЗЕО ГО N0: 27)
В2ВЗ-10 (5Е0ГОКО 25)	НЗ (ЗЕО ГО N0:26)	ААЗ	тНЗА (ЗЕО ГО N0:1)	АААЬ (ЗЕО П> N0:5)	Р5В6Н2 (ЗЕО ГО N0:32)

- 42 022201

Приложение А

Список последовательностей

ЗЕО ГО ΝΟ: 1

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменами С348 и

N5030 (шН8А)

Аминокислотная последовательность

ΟΑΗΚδΕνΑΗΚΏΦΕΟΕΕΝΡΚΑίνίΛΑΡΑΟΥΙ,ςίΟδΡΡΕΟΗνΚΙ,νΝΕνΤΕΡΑΚΤσνΑΒΕδΑΕ

1ЧСОК$ЕНТ1.ГСОКЕСТУАТЕКЕГУОЕМАОССАК<}ЕРЕ1<НЕСРЕОНКООМРМЕРКЕУКРЕУ

ОУМСТАРНОМЕЕТРЬККУЬУЕ1АККНРУРУАРЕЬЬРРАККУКААРТЕССрААОКААС1ХР

КЬОЕЬКОЕОКАЗЗАКОаЬКСАБЕСгКРОЕКАРКАТУАУАКЬЗОКРРКЛЕРАЕУЗКЬУГОЫК

УНТЕССНОПЕЕЕСАО0КАОЕАКУ1СЕЫ0О5188КЬКЕССЕКР1ХЕКЗНС1АЕУЕКОЕМРАО

ЕР5ЬААОРУЕЗКПУСКМУАЕАКОУРЕОМРЬУЕУАККНРОУ5УУи,ЬКЬАКТУЕТТЕЕКСС

ΑΑΑΟΡΗΕΟΥΑΚνΡΟΕΡΚΡΕνΕΕΡΩΝΕΙΚΟΝΟΕΕΡΕΟΕΟΕΥΚΡΟΝΑΕΕνΚΥΤΚΚνΡΟνδΤΡΤ

ЕУЕУ8КНЕОКУС8КССКНРЕАККМРСАЕОУ1,8УУЕП<}ЕСУЕНЕКТРУ5ОНУТКССГЕ5ЕУ ?МККРСР5АЕЕУОЕТУУРКЕР<гАЕТРТРНАО1СТЕ8ЕКЕК01КК0ТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕ0Е

КАУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕСККЕУАА8<ЗААЕОЕ

5ЕО ГО ΝΟ: 2

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменами С348 н N5030 (шН8А)

Нуклеотидная последовательность

САСССТСАСААСАСССААСТСССАСАТАССТТСАААОАТСТССССаААСАСААСТТТА

АОССССТСОТССТОАТСОСТТТСОСАСАаТАССТССАОСАОТСТСССТТТОААОАТСАС

ОТСАААСТССТСААТСАООТОАСССААТТТОССААбАСЛТОСОТООСТОАТОАОАОТа

САСААААСТОТСАСАААТСАСТССАТАСТСТСТТТООАСАТААССТСТССАСССТСССС

АСАСТСАСАОАОАСТГАТОСОСАААТООСТСАСТСТТССОСААААСАССАСССТОААС

ОСААТОАОТСТТТССТССАОСАСААССАТОАСААСССАААТСТСССССОССТССТОССА

ССТОАООТСОАТОТОАТОТОСАССОССТГГСАТСАСААСОААОАОАСАТТССТОААОА

ААТАССТСТАТОАААТТОСТСаТАааСАСССАТАСТТТТАТСССССССАОСТССТСТТСТ

ТТССАААСАСАТАСАААаСТОССТТСАСТОААТаТТСССАСОСАССТСАТААООССаС

АТОТСТССТОССТАААСТОСАСОАОСТССОООАТСААООТААОССТТССАСССССААА

САОСОССТСААОТОСОС'ПСГСГССАОААО'ПТОССаАОСОАОСАТТСАААОЕСТОООС

ТаТСаССССТСТСАОТСАаАСаТТТССАААООСАОААТТТОСТОАОСТСТСААААСТОС

ТОАСССАССТСАСАААСОТССАТАСТСАОТСТТОССАСССАСАТСТССТСОААТОТОСС <ЗАСОАТАОАОСА<ЗАССТСОСТАААТАТАТСТОССАОААТСА<ЗСАТТССАТТАОСТСТАА

ОСТОАААОААТОТТОСОАОААОССССТССТООААААОАОТСАТТОТАТССССОАООТО

ОААААСОАСОАОАТОССАОСАОАТСТОССАТСАСТСОСТОССОАСТТТСТООААТССЛ

ААОАТОТСТОСААОААТТАСГгСАОАЙОСТАААОАСОТСТТССТОСССАТСТТТСТОТАТ

САСТАСОСССОССОТСАССССОАТТАТАОСОТСОТОСТССТССТССОАСТООСАААОАС

СТАССАААСААСТСТССАОАААТОТТССаСТОССаСАСАСССТСАТОААТСТТАТССТА

АООТСТТССАТСАСТТГААОССАСТСОТСОААСАОССССАСААССТОАТТАААСАОАА

ТТОСОААСТОТТСОАОСАОСТСООТСААТАСААОТТТСАОААСОСССТОСТСОТОСОТТ атассааааасстссстсаостстстасассаастстсстссасстсастаооаатст соосааастсссатсааастоттосааасассссоаоосааасаоаатосстготсст

- 43 022201

СААСАТТАССТСТСССТССТОСТОААССАОСТСТССОТОСТОСАТСААААСАССССАОТ

САОСОАТССОСТСАСААААТСТТОСАССОААТСТСТСОТСААТСОСССАСССТОТТТСА

ОТОСССТССААСТСОАССАААСТТАТСТСССТААССАСТТТСАОССТСАААСАТГСАСС

ТТТСАСССССАТАТСТССАСТСТСТССОАОАААОАААОССАСАТТААОАААСАОАСАО

САСТССТСОАССТССТСААССАТАААССАААОССТАССААООАОСАОСТОАААОССОТ

САТСЮАСОАТТТСОСАССТТТТОТООААААОТОГГОСАААОССОАСОАТААООАОАСТ

ТОТТТСОСАОААОАООСЮАААААОСТСОТаОСТОССАОССАООСАОСТСТСЗООТСТО δΕ<2 ΙΟ ΝΟ: 3

Человеческий сывороточный альбумин (Н5А) Аминокислотная последовательность

ОАНК8ЕУАНКРКПТ,ОЕР^РКАЬУиАРАр\Ъ0рСРРЕОНУКЬУМБУТЕРАКТСУАОЕ8АЕ

КСОКЗЕНТЕРСОКЕСТУАТЕЯЕТУОЕМАОССАКОЕРЕЯМЕСРЕОНКПОНРМЕРЯЕУЯРЕУ

0УМСТАРН0НЕЕТРЕККУЕУЕ1АЯЯНРУРУАРЕЕЕРРАККУКААРТЕСС<ЗААПКААСЕЕР

КЕОЕЬ1ШЕСКА85АК0КкКСА5Е0КРСЕЮ\РКАШУАК1.5<)КРРКАЕРАЕУ5КЕ7ТС>ЕТК

УНТЕССНООЕЕЕСАОЭЯАОЕАКУ1СЕН005155КЕКЕССЕКР1ХБК$НС1АЕУБЮЕМРАО

ΕΡ5ΕΑΑΓ>ΡνΕ5Κθν€ΚΝΥΑΕΑΚ0νΡΕ0ΜΡΕΥΕΥΑΚ.ϊΙΗΡ0Υ5ννΕΙ,ΕΚΕΑΚΤΥΕΤΤΕΕΚ€€

ΑΑΑϋΡΗΕΟΥΑΚνΡΟΕΡΚΡΕνΕΕΡςΝΕΙΚίίΝΟΕΕΡΕρΕΟΕΥΚΡςΝΑΕΕνΚΥΤΚΚνΡρνδΤΡΤ

ЕУЕУ8ИМЕОКУ05КССКНРБАККМРСАЕО¥Е5УУЕМРЕСУЕНЕКТРУ5ПКУТКССТЕ8ЕУ

ΝΡΚΡ€Ρ5ΑΕΕνϋΕΤΥνΡΚΕΡΝΑΕΤΡΤΡ1ΙΑϋΐαΤΕ8ΕΚΕΚρΐΚΚΟΓΑΕνΕΕνΚΗΚΡΚΑΤΚΕ(3Ε

ΚΑνΜΟΟΡΑΑΡνΕΚ€€ΚΑΰϋΚΕΤ€ΡΑΕΕΟΚΚΕνΑΑ8θΑΑΕΟΕ δΕ<3 ΙΟ N0:4

Человеческий сывороточный альбумин (Η8Α) Нуклеотидная последовательность

САТОСАСАСААОАОТОАСОТТОСТСАТСООТТТАААСАТТТОСОАОААСААААТТТСА

ААОССТТаСТОТТСАТТОССПТССТСАОТАТСТГСАОСАОТСТССАГГТОААСАТСАТО

ТААААТТАСТСААТСААСТААСТСААТТТОСАААААСАТОТСТАССТСАТСАСТСАСС

ТОААААТГОТОАСАААТСАСТТСАТАСССГПТГССАСАСАААГГАТССАСАОТТОСАА

СТСТТСОТОАААССТАТООТОАААТООСТОАСТОСТОТОСААААСААОААССГОАОАО

АААТОААТССТТСТТССААСАСАААОАТСАСААСССАААССТССССССАТТОСТСАОА

ССАСАССТГСАТСТОАТОТОСАСТССТГГГСАТОАСАА'ЮААС1АОАСАТТТТТОААААА атасттататсаааттоссаоааоасатссттасттттатсссссооаастсстттгстт

ТОСТААААООТАТАААССТОСТТТТАСАСААТСТТСССААССТССТОАТАААССТ6ССТ

ОССГСТГОССАААОСТСОАТОААС1ТСССОАТОААСОСААООСТТСОТСТСССАААСА

ОЛОЛСТСАААТСТСССАСТСТССАААААТТТПОАОАААбАОСТТТСАААОСАТОООСА

СТСССТСОССТСАСССАОАОАТТТСССААЛСЗСТСАОТТТССАОААОТГТССААОТТАОТ

ОАСАОА']'С1'1АССАААОТССАСАСООААТС|СТОССАТООАОАТСТОСТТСААТСТССТС

АТОАСАОСЗССООАССТТОССААОТАТАТСТОТОААААТСАСОАТТССАТСТССАОТАА

АСТОААСОААТОСТОТСЛААААССТСТСТТООАААААТСССАСТССАТТаССОААСТС

ОААААТОАТОАС.АТСССТССТОАСТТСССТТСАТТАОСТОСТСАТТГГОГГОАААОТАА

- 44 022201

ООЛТОТТГСЮАААААСТАТССТаАООСАААООАТСТСТТССГОСССАТОтттСТАТа

ААТАТОСААСААООСАТССТаАТТАСТСТСТСОТССТССТОСТСЛСАСТТСССААОАСА

ТАТОАААССАСТСГАСАСААСТССТСТСССОСТССАСАТССТСАТСААТССТАТСССАА

АОТОТТСОАТОААТТТАААССТСТТОТСОААОАСССТСАОААТТТААТСАААСААААСТ

ОТСАОСТтТААОСАОСТТООАСАОТАСЛЛЛТТССАОААТСЮОСТАТГАОТТСОТТАС

АССААОАААОТАССССААОТОТСААСТССААСТСТТОТАОАОСТСТСААСАААССГАС

ОААААСТОООСАОСАААТОТТОТАААСАТССТОААОСАААААОААТОСССГОТОСАОА

ЛОЛСТАТСТАТСССТОСТССТСААССАСТТАТОТОТОТТССАТОАСААААССССАОТАА

ПТСАСАСАОТСАСААААТССТССАСАСАОТССТТСаТСААСАССССАССАТССТГТТС

АОСТСТССААОТСОАТОАААСАТАСОТТСССАААОАОТТТААТОСТОАААСАТТСАССТ

ТССАТОСАОЛТАТАТОСАСАСТТТСТСАОААООАОАОАСАААТСААСАААСАААСТОС

АСТТОТТСАОСТТСТСАААСАСААССССААОССААСААААСАССААСТСАААОСТСТТ

АТООАТОАТТТСОСАОСТТТТОТАОАОААОТОСТОСАЛООСТОАСОАТААООАОАССТ

ОСТТТОССОАООАСООТААААААСТТСТТОСТССААОТСААОСТОССТТАООСТТА

5Е0 ГО ΝΟ: 5

Нолипептидный коннектор Аминокислотная последовательность

АААЕ

8Е<? ГО N0:6

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменами С348 н N5030 (ιηΙΙδΑ) н нолипептидный коннектор Аминокислотная последовательность

АА5ОАНК5ЕУАНКРКОЕСЕЕ№КЛ1,УиАРА0¥Е(даРРЕ0НУК1ЛТ\1ЕУТЕРАКТСУА

ОЕ8АЕМСОК8ЕНТЕРСОКЕСТУАТЕКЕТУОЕМАОССАК<ЗЕРЕКМБСРЕ<}НКООЫРЖР

КЬУКРЕУОУМСТАРНОМЕЕТРТ.ККУЕУЫАНКНРУРУЛРЕЬЕРРАККУКААРТЕССОАА

ОКААСШРКЬОЕЬКВЕОКАЗКАКОНЬКСАКЬОКРОЕЕАРКАШУАкЬЗОКРРКАЕРАЕ

У8К1УТОЬТКУНТЕССНСОЫЕСАООКАОЬЛКУТСЕМ0О51Я8КЬКЕССЕКРЬЕЕК5НС1

ΑΕνΕΝΟΕΜΡΑυθ>8ΕΑΑΟΡνΕί>Κθνα<ΝΥΛΕΛΚΌνΡΙΧίΜΡΕΥΕΥΑίΙΕ<ΗΡΟΥ3ννΐ,ΕΕ

КЬА ΚΤΥΕΊΊ 1.ККССА А А ОРНЕС ΥΑ К УРОЕРКРЬУЕЕРОМГТКрМСЕЕРЕрЬСЕ ΥΚΡφΝΛ

ЕЕУЕУТККУР0УЗТРТЕУЕУ8ККЕСКУС.8КССКНРЕАККМРСАЕОУЕ8УУЬМ0ЕСУЕН

ΕΚΤΡν3ΟΚνΤΚ(ΧΤΕ5ΕνΝΚΚΡεΡδΑΙ.ΕνθΕΤΥνΡΚΕΡ<3ΑΕΤΡΤΡΗΑΟΙί;ΤΕ5ΕΚΕΚς>ΙΚ

КЧТАЕУЕЬУКНКРКАТКЕОЕКАУМООРААРУЕКССКАОПКЕТСРАЕЕОККЕУААЗрА

ΑίΟί

5ΕΟΠ>ΝΟ:7

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменами С348 и N5030 (тН5А) и нолипептидный коннектор Аминокислотная последовательность

ААрОАНКЗЕУАНЯРКОЕСЕЕЫРКАЕУЫАРАрУЕООЗРРЕОНУКЕУМЕУТЕРАКТСУА

ΟΕΚΑΕΝΟΟΚδΕΗΤΕΡΟηΚΕϋΤνΑΤΕΚΕΤΥΟΕΜΑΟΕΟΑΚρΕΡΕΚΝΕεΡΕφΗΚΟΟΝΡΝΕΡ

- 45 022201

КЬУКРЕУОУМСТАРНОМЕЕТРЬККУЬУЕ^ККНРУРУАРЕЫРРАККУКААРТЕССОАА

ОКААСЬЬРКЬОеЬК.ОЕОКА88АК<ЗКЬКСА81Х)КРОЕ11АРКААУАУАт8р1иФКАЕРАЕ

У5КХУТОЬТКУНТЕССНООЬЬЕСАП0КАОЬАКУ1СЕ«0О8155КЕКЕССЕКРЫ.ЕК,8НС1

АЕУЕШЕМРАОЬР8ЬААОГУЕ8ИЭУСККУАЕАКРУЕЕСМРЬУЕУАЕКНРОУ8УУИХ ωΑΚΤΥΕΤΤΕΕΚΟϋΑΑΑΟΡΗΕΌΥΑΚνΡΟΕΡΚΡΕνΕΕΡρΝΕΙΚΟιΝεΕΕΡΕΟΕΟΕΥΚΡΟΝΑ

и.УКУТККУРОУ5ТРТЬУЕУ5К\ТОКУа5КССКНРЕАККМРСАЕОУЬ5УУЬН<5ЬСУи[

РЛ1ТУ8ОКУТКССТЕ8ЕУМЖРСР8АЕЕУОЕТУУРКЕР<ЗАЕТГТРНАО1СТЕ8ЕКЕК<31К

КОТАЬУЕЬУКНКРКЛТКЕОЬКАУМООРААРУЕКССКАЕПКЕТСРАЕЕОККЬУААКрЛ

АЬОЬ

5Ε<3Ι»ΝΟ:8

Человеческий сывороточный альбуминовый (НЗА) линкер с заменами С348 н Ν503Ρ (тНЗА) и нолнпептндный коннектор Аминокислотная последовательность

ОАНКЗЕУАНКРКОЬСЕЕНРКАЬУиАРАОУЩОЗРРЕОНУКЬУМЕУТЕРАКТСУАЕЕЗ

АЕНСОККЬНТЕРООКЬСТУАТЬНЕТУеЕМАОССАКОЕРЕКЦР.СРЕОНКООМРМЕРКЬУ

ΚΡΕνονΜΟΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΕΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡΡΑΚΚΥΚΑΑΡΤΕΟΟΟΑΑυΚ

ААСЕЕРКЕОЕЕМ>ЕОКА38АК<)КЕКСАЗЕ<)КРСЕЕЕАРКА«АУАКЕ5<)КРРКАЕЕАЕУЗ

КЕУТОЕТКУНТЕССНСОЕЕЕСАООКАПЕАКУ1СЕК<)О515БКЕКЕССЕКРЕЕЕК8НС1АЕ

УЕШЕМРАОЕРЗЕААПРУЕЗКОУСКЛУАЕАКОУРЕСМРЕУЕУАККНРОУЗУУЕЕЕЯЕ

ΑΚΤΥΕΤΤΕΕΚΕΕΑΑΑϋΡΗΕεΥΑΚνΓΟΕΡΚΡΕνΕΕΡΟΝΕΙΚςίΝΟΕΕΓΕΟΕΟΕΥΚΡΓΙΝΑΕΕ

УКУТККУРОУЗТРТЕУЕУБЕИЕСКУОЗКССКНРЕАККМРСАЕОУЕЗУУЕМОЕСУЕНЕК

ТРУ8РКУТКССТЕЗЕУМККРСР8АЕЕУиЬТ¥УРКЕРРАЕТРТРНА01СТЕ8ЕКБК01ККО

ТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕ(ЗЕКАУМООРААГУЕКССКАООКЕТСРАЕЕОККЕУАА5<ЗААЕ

ОБЛАДЬ

5Ε<ίΠ)ΝΟ:!>

Человеческий сывороточный альбуминовый (НЗА) линкер с заменами С348 и N5030 (шНЗА) и полипептидный коннектор Аминокислотная последовательность

АА5ОАНК5ЕУАНКРКОЕОЕЕНРКАЕУЕ1АРА0УЕ0(35РРЕОНУКЕУНЕУТЕРАКТСУА

ΟΕδΑΕΝΟβΚΪΕΗΤΕΓΟΟΚΕΟΤνΑΤΕΚΕΤΥΟΕΜΑΙΧΧΑΚίίΕΡΕΚΝΕΟΡΕΟΗΚΟΟΝΡΝΕΡ

ΡΕνΕΡΕνΟνΜΟΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡΓΑΚΕΥΚΑΑΡΤΕΟΟςΑΑ □КААСЕЕРКЕОЕЕКТ)ЕОКА55АК.ОКЕКСА5ЕС>КРОЕКАРКА\УАУАКЕ50КРРКАЕРАЕ

У5КЕУТОЕТКУНТЕССНСОББЕСАПОКАШ.АКУ1СЕЦ<)ПЯ1ЯЗКЬКЕССЕКРЬЕЕК5НС[

АЕУЕШЕМРАОЕРЗЕААОРУЕЯКОУСКНУАЕАКОУРБОМРЕУЕУАКХНРОУЯУУЕЕБ

ΚΕΑΚΤΎΕΤΠ,ΕΚΟΟΑΑΑΟΡΗΕΟΥΑΚνΡΟΕΡΚΡΕνΕΕΡρΝΕΙΚΟΝΟΕΕΡΕΟΕαΕΥΚΡρΝΑ

ЕЕУЕУТККУР0У5ТРТЕУЕУ51ШЕОКУО8КССКНРЕАККМРСАЕОУЕ5УУЕЫ9ЕСУЕН

Ρ.ΚΤΡνδΟΚνΤΚΟΟΤΕΚΕνΝΕΗΡΟΡΚΑΕΕνΟΕΤΥνΡΚΕΡΟΑΕΤΡΤΡΗΑΕΗΟΤΕΒΕΚΕΚΟΙΚ

КОТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕЦЕКАУМиОРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕСККЕУАЛЗрА

АЕОЕАААЕ

- 46 022201

8Ε<ΪΠ)Ν0: 10

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменами С348 и К503(£ (тН8А) и полипептидный коннектор Аминокислотная последовательность

ΑΑ50ΑΗΚ5ΕνΑΗΚΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΙ,νΕΙΑΡΑς>Υ1,<3<33ΡΓΕΟΙΐνΚΧνΝΕνΤΕΡΑΚΤσνΑ □Ε5ΑΕΝΕΒΚ3ΕΗΤΕΓΟΟΚΕεΤνΑΤΕΚΕΤΥΟΕΜΑΙΧΧΑΚ(}ΕΡΕΚ.ΝΕΟΡΙ.<)ΗΚΟΟΝΡΝΕΡ

ΚΙ,νΚΡΕνονΜΟΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΐΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΐίΡΡΑΚΚΥΚΑΑΡΤΕεσρΑΑ

ОКААСЕЕРК1,ОЕЕК1>БСКА55АК<}КЕКСА5Е<ЗКРОЕКАРКАЧГАУАКЕ$<}КРРКАЕРАЕ

У8КЕУТОЕТКУНТЕССНСОЬЕЕСА1)ОКАОЕАКУ1СЕН<гП5188КЕКЕССЕКРЕЕЕК5НС1

ΑΕνΕΝΟΕΜΡΑΟΕΡ8ίΑΑΟΡνΕ5ΚθνθΚΝΥΑΕΑΚθνΡΕΟΜΡΕΥΕΥΑΚΚΗΡΟΥ5ννΕΕΕ

КЕАКТУЕТТЕЕКССАААОРНЕСУАКУГОЕРКР!ЕУЕЕР(3>(Е1КО(<СЕЕРЕ<}ЕСЕУКР(ДОА

ЕЕУРУТККУР9У5ТРП.УЕУЗРЧЕОКУС18КССКНРЕАКкМРСАЕОУЕ5УУЬНОЬСУЬН

ЕКТРУ5ОКУТКССТЕ5ЕУК1ЖРСР5АЕЕУОЕТУУРКЕР(ЗАЕТРТРНАО1СТЕ8ЕКЕК<}1К

КОТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕЦЕКАУМРЦРААГУЕКССКАООКЕТСРАБЕСККЕУААЗОА

АЕОЕАААЕ

8ΕΟΠ1ΝΟ: 11

Человеческий сывороточный альбуминовый (НЗА) линкер и полнпептндный коннектор

Аминокислотная последовательность

ААЗОАНКЗЕУАНКРКОЕСЕЕНРКАЬУЫАРАЧУЕХЗРСРРЕОНУКЫЦМЕУТЕРАКТСУА

ОЕ5АЕМСОК5ЕНТЕРСОЫ-СТУАТЕКЕТУОЕМА1>ССАКрЁРЕРМЕСГЕ<5НКООМРЦЕР

КЕУВРЕУОУМСТАРНОМЕЕТР1ЖКУЕУЕ1АККНРУРУАРЕЕ1,РРАККУКАА1ТЕСС<}АА

ОКААСЬЕРКЬОЕиШЕОКАЗЗАКОКЕКСАЗЬОКРОЕКАРКАТУАУАКЕЗОКРРКАЕРАЕ

У8КЬУТОЕТКУНТЕСС11ОПЕГ,ЕСАОЕ>КАГ)ЕАКУ1СЕЫ0О8135КЕКЕССЕКРШ;К8НС1

АЕУЕМОРА1РАГП,РЯ1,ААГ)РУР.ЗКОУСКЪ1УАЕАКПУРЕСМРЕ¥ЕУАККНРОУ5УУШ,

КЕАКТУЕТГЕЕКССАААОРНЕСУАКУРСЕРКРЬУЕЕРрЫиКОНСЕЕРЕОЬОЕУКРОМА

1.ЕУКУТККУР<5У5ТРТЕУЕУ5К№.ОКУСЗКССКНРЕЛККМРСЛЕОУЕ5УУЕМОЕСУЕН

Ρ.ΚΤΡν5ηκνΤΚΓσΤΡ.5Ι,νΝΚΒΡ€Ρ5ΛΕΕνθΕΤΥνΡΚΕΡΝΑΕΤΡΤΡΗΑθΐσΤ[.5Ρ.ΚΕΕρ1Κ

КрТАЕУЕЬУКНКРКАТКЕОЕКАУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕаККЕУААЗОА

АЕСЕ

8Ε<ΪΠ)ΝΟ: 12

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер н полнпептндный коннектор

Аминокислотная последовательность

ААООАНКЗЕУАНКРКОЕОЕЕМРКАЕУЫАРАОУЕОрСРРЕОНУКЬУИЕУТЕРАКТСУА

ОЕЗАЕМСОК5ЕНТ1,РСОКЕСТУАТЕЯЕТУОР.МАОССАКрЕРЕ1адЕСРЬ<}НКООМРМ,Р

КЬУКРЕУПУМСТАРНОЫЕЕТРЬККУЕУЕГАККНРУРУАРЕЕЕРРАККУКААРТЕССрАА

ОКЛЛ(Х1.РК1,ОЕ1,К1ЭЕОКА35АВД11ЕКСА51,(ЗКР<}ЕРАРКА1УАУАК1,8<ЗКРРКАЕРАЕ

У5КЕУТга.ТКУНТЕССНСОЕЕЕСАООКАОЬАКУ1СЕК003133КЕКЕССЕКРЕЕЕК£НС1

ΑΕνΕΝΟΕΜΡΑΟΕΡ3ΕΑΑΟΡνΕ5ΚΕ>νΐ;ΚΝΥΛΕΛΚΒνΡΕΟΜΡΕΥΕΥΑΚΚΗΡΕΙΥ5ννΕΕΕ

РЕАКТУЕТТЬЕКССАААОРНЕСУАКУРОЕРКРЬУЕЕРЧЯЕ1К0НСЕи^:ЕСЬСЕУКР0ЫА

ЕЕУКУТККУРЦУЗТРТЕУЕУЗЕМЕСКУСЗКССКНРЕАККМРСАЕОУЕЗУУШрЕСУЕН

- 47 022201

ΕΚΤΡν$ΟΚ.νΤΚ€€ΤΕ5ίνΝΚΚΡΟΡ8ΑΕΕνθΕΤΥνΡΚΕΓΝΑΕΤΤΤΡΗΑΟΙΟΤΕ8ΕΚΕΚρΐΚ

К(ЗТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕ(уЕКАУМООРААРУБКССКАОРКЕТСРАЕЕОККЬУАА5<ЗА

АЬОЬ

8Е<3 Ш140:13

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер и подипептидиый коннектор

Аминокислотная последовательность

ОАНКЗЕУАНКРКОЕСЕЕМККАЕУЫАРАОУЬиОСРРЕОЦУКЬУПЕУГЕЕАКТСУАОЕК

ΑΕΝεΟΚΪΕΗΤΕΡΟΟΚΕΕΤνΑΓΕΚΕΤΥΟΕΜΑϋεΟΑΚρΕΡΕΚΝΕΟΡΕζίΗΚΟΟΝΡΝΕΡΚΕν

ΗΡΕνΕ>νΜ€ΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕ1ΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΙΧΡΓΑΚΚΥΚΑΑΡΤΕ(ΧΧ2ΑΑΟΚ

ААСЕЬРКЕОЕ13и)ЕСКА55АК(гКЬКСА8Ь0КРОЕКАРКА№АУАКЕ50КРРКАЕРАЕУ8

КЕУТОЕТКУНТЕССНСОЬЬЕСАООКАВЬАКУ1СЕМ<ЗО5135К1,КЕССЕКРЦ.БК5НС1АЕ νΕΝΟΕΜΡΑΟΕΡ5ΕΑΑΟΡνΕ5Κθν€ΚΝΥΑΕΑΚΟνΡΕΟΜΡΕΥΕΥΛΡΡΗΡΟΥ5ννΕΕΕΡΕ

АКТУЕТТЕЕКССАААОРНЕСУАКУРОЕРКРЕУЕЕР0ЫиК<)]ЧСЕЕРЕ<}и5ЕУКР<}1ЧАЕЕ

УКУТККУРОУ8ТРТЕУЕУ8К№,ОКУ08КССКНРЕАККМРСАЕОУЕ5УУЪМРЬСУЕНЕК

ТРУ5ПКУТКССТЕ5ЕУМК1гРСР5АЕЕУОЕТУУРКЕРМАЕТРТРНЛО1СТЕ5ЕКЕК01КК9

ТАЬУЕЬУКНКРКАРКЕОЬКАУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАРР.СККЬУААЗОААЬ

ОЕАААЬ

8Е0ΙΟΝΟ: 14

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер и полнпептидный коннектор

Аминокислотная последовательность

АА5ОАНКЗЕУАНКРКОЕОЕЕ14РКА1ЛЫАРА()УЕ<30СРРЕОНУКЕУНЕУТЕРАКТСУА

ОЕ5АЕМСОК8ЬНТЕРООК1.СТУАТЕКЕТУОЕМАПССАК(5ЕРР.К>4ЕСР1.рНКШКРМЬР

КЬУКРЕУ0УМСТАРН014ЕЕТР1,ККУ1,УЕ1АКЙНРУРУАРЕЕЕРРАККУКААРТЕССрАА

ОКАЛС1.1.РК1.Г>Е1.ЕПЕОКА88АКрКЕКСА51.рКГОЕКАРКАУАУАКЕ50КРРКАЕРАЕ

У5КЕУТОЕТКУНТЕССНООЬЕЕСАООКАОЕАКУ1СЕК()05158КЕКЕССЕКРЕЕЕКЗ|1С1

АЕУРРЮРМРАП[РК1.ААПГУЕ5КПУСКЧУАЕАКОУРЕОМРЕУЕУАЯКНРОУ5УУЕЕ1.

КЬАКТУЕТТЕЕКССААА0РНЕСУАКУРПЕРКРЕУЕЕР9!ЧиК01'1СЕ1,РЕ0иЗЕУКР()КА

ЬЕУКУТККУРСУ8ТРТЕУБУ8КЖОКУ08КССКНРЕАКЙМРСАЕОУЪ8УУЕНОЬСУЬН

Р,КТРУ5ПРУТКССТЕ5ЬУМРКРСР5АЬЕУОЕТ¥УРКЕГЧАЕТРТТНАС1СТЕ5ЕКЕКр1К

КрТАЬУЕЕУКНКГКЛТКЕОЕКЛУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕСаККЕУЛЛЗДА

ЛЬСЬАААЬ

8Е0 И> ΝΟ: 15

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер н полнпептидный коннектор

Аминокислотная последовательность

ААрОАНКбЕУАНКРКОЕСЕЕНРКАЬУЫАРАОУЕрОСРРЕОНУКЬУМЕУТЕРАКТСУА

ОЕбАЕНСОКЗЕНТЕРОПК+СТУАТЕКЕТУОЕМАОССАКОЕРЕКЧЕСРЕрНКООЦРЖР

ЕЬУКРЕУОУМСТАРНОМЕЕТРЬККУЕУЕХАККНРУРУАРЕЬЬГРАККУКААРТЕССОАА

ОКААСЬЬРКЕОЕииЭЕаКА88АКрЫ,КСА81А}КРСЕКАРКА!УАУАКЬ59ЯРРКАЕРАЕ

У5КЬУТОЕТКУНТЕССНООЬЬЕСАООЙАОЕАКУ1СЕМРО5185КЬКЕССЕКРЬЕЕК8НС1

АЕУЕНОЕМРАОЬРЗЕААОРУЕЗКОУСКМУАЕАКРУРЬСМРЪУЕУАККНРОУЯУУЫ.Е

- 48 022201

ΚίΑΚΤΥΕΤΤΓΕΚΟΟΑΑΑΟΡΗΕΟΥΑΚνΡΟεΡΚΡυνΕΕΡρΝΙ,ΙΚςίΝΰΕΕΡΕςΕαΕΥΚΡζίΝΑ

ΕΕνκγτκκνρςινχτρπ,νΕν'ϊΚΝΓ.οκνοκκΰεκΗΡΕΑΚΚΜΡΟΑΕΟΥΕδννι.Νςπ-ενι.Η

ΕΚΤΡν5ΟΚνΤΚϋσΤΕ5ΕνΝΚΚΡαΡ8ΑΕΕν0ΕΤΥνΡΚΕΡΝΑΕΤΡΤΕΗΑ0ΐσΤί5ΕΚΕΚρΐΚ

КОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕОЬКАУМООГААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕОККЬУААЗРА

АЕСЕАААЬ

ЗЕО Ш ΝΟ: 1« ιιιΗ5Α линкер, полипептидные коннекторы, НЗ (антитело против ЕгЬВЗ) тсРЧ· и ВЮ2 (антитело против ЕгЬВ2> 8сРт (В2ВЗ-1)

Аминокислотная последовательность ην()Ε<3Ε5ΟθαΕνΚΡΟ(τ3ΕΕΕ8εΑΑ3ΟΡΤΡ53ΥΤνΜ3\ννΚ0ΑΡΟΚΟΕΕΐννΑΝΙΝΚΒΟ3Α

5ΥΥνθ5νΚΟΚΡΤ[5ΚΟΟΑΚΜ3ΕΥΕΟΜΝ3ΕΕΑΕΟΤΑνγΥΟΑΚΟΚθνθΥΡΟΕ\νθΡΟΤΕν

Τν53Α3Τ0<ΜΟ5000Ο50ΟΟΟ8<}5ΑΕΤ<}ΡΑ8ν8α5Ρα<351·Π8<;ΤΟΤ55θνθΟΥΝΡν5ΐνΥ

0<5ΗΡΟΚΑΡΚΕΜ1Υθν8ΟΚΡ5θν8ΟΚΡ5Ο5Κ8ΟΝΤΑ5Ε1Ι5ΟΕ(3ΑΟβΕΑΟΥΥ€55Υ<53δ8Τ

НУ1РОСОТКУТУЕСАА8ОАНК5ЕУАНКРКО1.ОЕЕ№КА1.У1,1АРА<УР1,0<38РРЕЕ>НУКЬ

УМЕУТЕРАКТСУАОЕЗАЕЫСОК5ЕНТЕРСОКЕСТУАТЕКЕТУСЕМАОССАК(ЗЕРЕ1ШЕ

ΕΓίΟΗΚΏΌΝΡΝΕΡΚΙ,νΚΡΕνϋνΜΟΓΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΙΧΡΡΑΚ

КУКААРТЕССРААСКААСЕЬРКЕОЕЕКОЕОКАЗЗАКОВЬКСАвЕрКРОЕКАРКААУАУ

АКЕ80КРРКАЕРАЕУЗКЕУТОЕТКУНТЕССНОЕ>ЕЕЕСАООКАОЕАКУ1СБМ<ЗП3133К.Е

ΚΕ(ΧεΚΡΕΕεΚ5ΗΟΑΕνεΝΟΕωρΑηΕΡ8ΕΑΑΟΡνΕ8ΚονΕΚΝΥΑΕΑΚθνΡΕΟΜΡΕΥΡ.

ΥΑΚΚΗΡΟΥ3ννΕΕΕΕΕΑΚΤΥΕΤΤΕΕΚεεΑΑΑΟΡΗΕεΥΑΚνΓϋΕΡΚΡΕνΕΕΡ<}ΝΕΙΚς>Νσ

ΕΕΡΕςΕΟΕΥΚΡρΝΑΕΕνΚΥΤΚΚνΡΟνδΤΡΤΕνΕνΚΚΝΕΟΚνΟδΚΟΟΚΗΡΕΑΚΚΜΡϋΑΕ

ΟΥΕδννΕΝςΕΟνΕΗΕΚΤΡνδΠΚΥΤΚεσΓΕδΕνΝΚΚΡΕΡδΑΕΕνΟΕΤΥνΡΚΡ.ΡΟΑΕΤΡΤΡ

НАО1СТЪ5ЕКЕКР1К.К0ТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕ<ЗЕКА.УМОЕ>РААРУЕКССКАЕШКЕТС

РАЕЕСККЕУАА8(гААЕСЕААА1.(}У<ЗЕУ<38САЕУККРОЕ81.К.18СКС5СУ5РТ5У¹|У1А’йГ νΚΟΜΡαΚΟΕΕΥΜΟΕΙΥΡΟΟδΟΤΚΥδΡ8Ρ009νΤ1δνθΚ5νδΤΑΥΕ(3»Κ8ΕΚΡδ03ΑνΥΡ

САКНОУОУСТОКТСАК^РЕУ/ЕОУТСС>ОТЕУТУЗЗСЮ0035аООЗ<ЗООа5<38УЕТС)РР

3ν3·ΑΑΡ<5ρκνΤΙ5α5Ο885ΝΙΟΝΝΥν5ν/ΥρςΕΡΟΤΑΡΚΕΕ[ΥΟΗΤΝΚΡΑ0νΡ0ΚΡ505Κδ

0Τ8ΑδΕΑΙ8ΟΡΚ8ΕυΕΑΟΥΥ€Α81ίν0Υπ,30ΐννΡ000ΤΚΙ.ΤνΕ0 δΕ<ΪΠ>ΝΟ:17

Β2Β3-2 (А5-тН8А-ВЮ2) <}У<}ЕУ<Э500еЕУКРеОЗЕКЕЗСААЗОР5Г?'4ТЛ)ММЧ'\Т«5АРСКОЕЕ'УУ5515£558У1У

ΥΑΟδνΚΟΚΡΤ[3ΚΟΝΑΚΝδΙ.ΥΙ.ρΜΝ3ΙΛΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΐκ!νΑΤΤΡΡΟΥνθΟΟΤΕνΤ ν550θαθ30000500005<33νΕΤ<?ΡΡ5ν5αΑΡας>ΚνΤΙ5εΤ0355Ν]αΛαΥθνΗ\νΥΟΟΕ

ΡΟΤΛΡΚΕΕΙΥσΝ5ΝΚΡ3<3νΡΟΚΡ803ΚδΟΤ8Α8ΕΑΠΌΕ<3ΑΕηΕΑΟΥΥ0(}8ΥΟ85Ε5ΛΙ,Ρ αΟΟΤΚΕΓΥταΑΑδΠΛίΚΒΕνΛΗΡΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΕνΕΙΑΡΑΟΥΕΟςεΡΡΕΟΗνΚΕνΝΕ

УТЕРАКТСУАОЕ5АЕ1'1СОК5ЕНТЕРООКЕСТУАТЕКЕТУОЕМАОССАК(ЗЕРЕЮ'1БСРЕ ζΐΗΚΟΌΝΡΝΕΡβΕνΡΡΕνονΜεΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΛΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΓΓΑΚΚΥΚ

ААРТЕССОААОКААСЕЕРКЕОЕЕКПЕСКА38АКСКЕКСА8ЕРКРСЕКАРКАЧ/АУАКЕ

50ВРРКАЕРЛЕУ5КЕУТОЕТКУНТЕССНООЕЕЕСАООЕАВЕАКУ1СЕЦ<303[5£КЕКЕС εΕΚΡΕΕΕΚ8Η0ΙΑΕνΕΝ0ΕΜΡΑΟΕΡ8ΕΑΑΟΡνΕ8Κ0ν0ΚΝΥΑΕΑΚ0νΡΕ0ΜΡΕΥΕΥΑΚ №ΡΟΥ5ννΕΕΕΚΕΑΚΤΥΕΤΤΕΕΚ(ΧΑΑΑΟΡΗΕΕΥΑΚνΓΟΕΡΚΡΕνΕΕΡ<3ΝΕ1Κ<3Ν€Ρ.!,Γ

ЕОЬаЕУКРО^ЬЕУРЛТККУРОУЗТРТЬУЕУККМЬОКУОЗКССКНРЕАККМРСАЕОУЬ

- 49 022201

5ννίΝ0ίενΕΗΕΚΤΡν5ΟΒ.νΤΚ<ΧΤΕ5ΕνΝΚΚΡ€Ρ5ΑΕΕνθΕΤΥνΡΚΕΡρΑΕΤΡΤΡΗΑΟΙ

СТЪЗЕКЕКр1КК()ТА1.УЕ1-УКНКРКАТКЕ01.КЛУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕ

0ККЕУАА8<?ААЬОЬААА1,<ЗУ<ЗЕУ(35(5АБУККРСЕ8ЕК18СКС8ОУ8РТ8¥>У1А1УУК(3

ΜΙΌΚαυ5ΥΜσΕΙΥΡθυ3ΟΤΚΥ8Ρ3Ρ0Ο<5νΤΙ5νϋΚ3ν3ΤΑΥ1Λρν83ΕΚΡ3Ο8ΑνΥΡεΑΚ

НОУСУСТОКТСАК1УРЕЖСУ\УСОСТ1,УТУ55СаСС58ССС5ССССЗ<}ЗУ1,Т(}РРЗУ5

ААРСОКУПЗСЗСЗЗЗНЮМЫУУЗ^ООЬРОТЛРКЬиУОНТЫКРАОУРОКРЗОЗКЗОТЗ

Α5ΕΑΙ50ΡΚ3ΕΟΕΑΓ>ΥΥ€Α5ΥΤ>ΥΤΕ50ν/νρθΟΟΤΚΕΤνΕΟ

8ΪΧ)Π)ΝΟ:18

В2ВЗ-Э <А5-тН5А-К5ВйН2)

0ν0Εν08ΟΟΟΕνΚΡ«ϊϊΕΚΕ50ΑΑ8ΟΡ8ΡΝτΥΟΜΝν/νκρΑΡαΚαΕΕ\νν55158355Υ1Υ

ΥΑ03νκαΚΡΤ18ΚΟΝΑΚΝ5ΕΥΕΟΜΝ5ΕΚΑΕΙϊΤΑνΥΥΟΑίωθνΑΤΤΡΡΟΥΨΟΟΟΤΕνΤ ν33ΟΟΟΩ5Ο0ΟΟ3ΟΟΟΟ5ρ5νΕΤςΡΡ3ν50ΑΡθςκνπ3σΤΟ535ΝΙΟΑαΥθνΗν.Ύ90Ε

ΡΟΤΑΡΚΕΕ!ΥΟΝ5ΝΚΡΚΟνΡΠΚΡ8α.;Κ80Τ3Α3ΕΑ[ΤΟΕΟΑΕΟΕΑΟΥΥ€08Υ03£Ε3ΑΕΡ

ССОТКЕТУЕОАА5ОАНК5ЕУАНКРКОЕОЁЕМРКАЕУЕ1АРА<ЗУЕр03РРЕОНУКЕУМЕ νΤΕΡΛΚΤΟνΑϋΕ5ΑΕΝΟΟΚ5ΕΗΤΕΡΟΟΚΕστνΑΤΕΚΕΤΥΟΕΜΑΙΧ:θΑΚ(ΪΕΡΕΕΝΕΟΡΕ <)ΗΚΠΙ)ΝΡΝΙ,ΡΒ1,νΚΡΕνθνΜ0ΤΑΡΗΒΝΕΕΤΏ,ΚΚΥΙ.ΥΕ1ΑΧΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΙ,ΡΡΑΚΚΥΚ

ААРТБССОААОКААСЕЬРКЕОЕШЭЕОКАЗЗАКОИЬКСАЗЕОКРОЕКАРКАТУАУАК!

5<ЭКРРКАЕРАЕУ8КЕУТЦЕТКУНТЕССНСОЕЕЕСАООКАОЕАКУ1СЕМ<Х>5]53КЕКЕС

СЕКРЕЕЕКЗНС1АЕУЕМОЕМРАОЕР5ЕААСРУЕЗКСУСКМУАЕАКОУРЕСМРЕУЕУАК.

КНГОУКУУЕЕЕРЕЛКТУЕТТЕЕКССАААОРНЕСУАКУРЕ1ЕРКР1,УР,ЕР<)М1.1К0МСЕЕР

Р.ОГ.СЕУКРОМАЕЕУРУТККУРрУеТРТЕУЕУЗККЕСКУСЗКССКНРЕАККМРСАЕОУЕ

3ννΕΝ0ΕϋνΕΗΕΚΤΡν3ΒΚνΤΚ0€ΤΕ3ΕνΝΕΕΡΰΡ$ΑΕΕνθΕΤΥνΡΚΕΡί}ΑΕΤΡΤΡΗΑΟ1

СТЕЗЕКЕКО1КК0ТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕ0ЕКАУМООРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕЕ

ОККЕУАА5<гААЕСЕАААЕ<ЗУ<}ЕУЕ8ОССЬУ(ЗРССЗии,5САА8арТРК8¥АМ5>УУК<}

ΑΡΟΚΟΕΕ«ν3Α[3ΟΚΟΒΝΤΥΥΑΟ3νκθΚΡΤΙ5ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€Α

ΚΜΤ5ΝΑνθΡΟΥΥ'σ0θπ.ντν55ΟΟΟ05ΟΟΟ3Ο0ΟΟ3Ο<ί5νΕτ0ΡΡ5ν5ΟΑΡΟ0Εν·Π5

СТСКНВРЛОЕСУСУНУ/УООЕРСТАРКЬиУСКТМКРЗОУРОКРЗОРКЗСТЗАЗЕАГГОЬО

ΑΕϋΕΑΒΥΥΟΟδΥΟΚΚΤΡΟ^νΡΟΟσΓΚΕΤνΕΟ

ЖЭ Ю N0:19

Β2Β3-4 (А5-тН8А-МЕ3.9)

0ν0Εν<)3ΟθσΕνΚΡαθ3ΕΚΕ5αΑΑ8ΟΡ5ΡΝΤΥΟΜΝν/νΚ<5ΑΡΟΚσΕΕ\νν58ί55558ΥΙΥ

ΥΑΏδνΚΟΗΡΤΙδΕΟΝΑΚΝδΕΥΙ,ΟΜΝΚΕΚΑΕΟΤΑνγΥίΑΚΟΟνΑτΤΡΡΟΥΐνοΟΟΤΕντ

УЗЗССООЗООСОЗССОаЗрЗУЕТОРРЗУЗСАРСОКУПЗСгаКЗЗМОЛйУОУНУ/УОО!,

ΡΟΤΑΡΚΕΠΥΟΝ5ΝΚΡ5ΰνΡ№Ρ8<35ΚδΟΤ3Α8Ι-ΑΙΤΟΙ.<3ΑΕΟΕΑΟΥΥ€<38ΥΒ88Ε8ΑΪ,Ρ

ОССТКЕТУЬОААВОАНКВЕУАНКРКВЬОЕЕМРКАЕУЫАРАРУЕООЗРРЕОНУКЬУМЕ

УТЕГАКТСУАПЕ5АЕМСОК51.НТЬГСПКЬСТУАТЬКЕТУОЕМАОССАК(ЗЕРЕРЬ1ЕСРЕ

ΟΗΚΟΟΝΡΝίΡΚίνΚΡΕνΒνΜεΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡΡΑΚΚΥΚ

ААРТЕСС{гААОКААСШ>КиЭЕЬКОЕСКЛ88ЛК(}1и,КСА31,(ЗКГСЕКАРКА№АУА1<Ь

ЗОЕРРКАЕРАЕУ8КЕУП)ЕТКУНТЕССНаОЕЕЕСАОПКАОЕАКУ1СЕМ003188КЕКЕС

ΕΕΚΡΕΙ,ΕΚ3ΗαΑΕνΕΝΟΕΜΡΑΟί,Ρ8Ι,ΑΑΟΡνΕ5ΚθναίΝΥΑΕΑΚθνΡΙ,ΟΜΡΙΛΈΥΑΚ

КНРОУ5УУШ.КЕАК.ТУет1ЕЕКССЛАА1)Р11ЕСУАКУРОЕРКРЬУЕЕР0КЫК0НСЕЕР

ЕРЬ«ЕУКР0НАЬЬУКУГККУР0У5ТРТ|,УЕУ8КМЕаКУС5КССКНРЕАКВМРСАЕВУЬ

- 50 022201

ЗУУЬКОЬСУЕПЕКТРУЗОКУТКССТБЗЕУМККРСРЗАЬЕУОЕТУУРКЕРОАЕТРТРНАО!

СТШЕКЕКрЖКрТАЬУЕЬУКИКРКАТКЕОЬКЛУМПОРААРУЕКССКАООКЕТСРАЕБ

ΟΚΚΕνΑΑ50ΑΑΕΟίΑΑΑΕ0ν0ΕνρίθΑΕνΚΚΡΟΕ5Ι.Κ.18€Κ05ΟΥδΡΤ5Υ%ΊΛ\ννκρ

ΜΡ0Κ<3ΕΕΥΜ0ΕΙΥΡ6ΟδΟΤΚΥ8Ρ8Ρ(!(Κ}νΤΙ5νθΚ8ν5ΤΑΥΕ0ν8δΕΚΡ505ΑνΥΡ€ΑΚ ]ГОУСУС555НСАК№РЕУР0тга<30ТЕУТУ55СССС53СС050ООО5(}5УЕТ<}РР5У5А

ΑΡ00ΚνΤΙ303Ο333ΝΙΟΝΝΥν3ΨΥ90ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΙΥϋΗΤΝΚΡΑθνΡΟΚΡ308Κ3ΟΤ3Α

5ΕΑΙ30ΡΕ5ΕΟΕΑΟΥΥΟΑ3\νθΥΤΕ50\ννΡΟΟΟΤΚΕΤνΕΟ

8Ε9 Ш N0:20

Β2Β3-5 (В12-ШНЗА-ВЮ2) ρν()1.ν<35Ο0<3Εν<3ΡΟΚ8Ι .ΚΙ АСА ΑΚΟΡΤΡϋΏΥ АМНУ/УКДЛРСКСЕЕ\\'У5С15У/Н5О51

ΟΥΑΟ3νΚΟΚΡΤ15ΚΟΝΑΚΝ3ΕΥΕ0ΜΝ3ΕΚΓΕΟΤΑνγΥ€ΑΚΟΕΟΑΚς>ΆΈΕαΡϋΥ%ΌΙ>3

ТЕУТУ55ЛЗТСООО5С<ЗО0300СО38УЕЕТ0ОРАУ8УАЕСДГУК1ТС0СО81.К8УУА8 ν/Υ<3()ΙίΡα0ΑΡνΕνΐΥαΚΝΝΚΡ5Ο[ΡΟΚΡ5Ο3Τ5ΟΝ5Α5ΕΤΠΌΑ0ΑΕ0ΕΑΟΥΥΟΝ5ΚΟ3

3ΟΝΗννΡ0ΟΟΤΚντνΕΟΑΑ8ΟΑΗΚ3ΕνΑΗΚΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΕνΕ1ΑΡΑ(}ΥΕ0<28ΡΓΕΟ

НУКЕУМЕУТЕРАКТСУАПЕ5ЛЕ>аСОК.5ЕНТЕРОГ>КЕСТУАТЕКЕТУОЕМАПССАКрЕР

ΕΚΝΕ€ΡΐΧ>ΗΚΓ>ΟΝΡΝΕΡΚΕνΚΡΕνονΜΟΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΙ,

РРАККУКААРТЕССОААОКААСЕЬРКШЕиЩЕОКАЗЗАКОКЕКСАЗЕрКРОЕКАРКА

ΆΆνΑΚΙΑςΚΡΡΚΑΕΡΑΕνδΚΕντΟΕΤΚνΗΤΕΟϋΠΟΟΕΕΕεΑΟΟΚΑΟΕΑΚΥΐαΕΝρΟδΙί

5КЕКЕССЕКРЕЕЕКЗНС(АЕУЕМЭЕМРАОЕРЗЕААОРУЕЗКОУСКМУАЕАКПУРЕСМР

ЕУЕУАККНРОУ$УУЕЕЕК1АК.ТУЕТТЕЁКССАААОРНЕС¥АКУГГ1ЕГКРСУЕЕРС№ТК

9Н<^РЕрЕОЕУКГ(}МАЬ1,УКУТКК.УРС>У8ТРТЕУЕУ5КНЬОКУС8КССКНРЕАК11МР

САЕОУЕ5УУЬМ<5ЬСУЬНЕКТРУ80КУТКССТЕ8ЕУ№КРСР8АЬЕУОЕТУУРКЕРрАЕТ

РТРНАО1СТЬЗЕКЕК01КК0ТАТ.УЕЬУКНКРКАТКЕС!ЕКАУМООГЛЛРУЕКССКАООК

ЕТСРАЕЕСККЕУААЗОААЕСЕАААЕ9УрЕУОЗОАЕУККРОЕ5ЕК13СК050У5РТЗУУ/[

ΑΐννκρΜΡ0ΚΟΕΕΥΜ0ΕΙΥΡΟΟ3ΟΤΚΥ8Ρ5Ρ<3Ο0νΤΙ8νοΚ8ν8ΤΑΥΕΡ\ν83ΕΚΡ5Ο3Α

УУРСАКНОУС¥СТОКТСАКЧФЕЖ,ОУТСДСТСУТУ55ССС658СС03С<ЗО05<25У1.

Τ0ΡΡ5ν5ΑΑΡΟ9ΚνΤΙ3€5Ο583ΝΙ0ΝΝΥν5νΥ00ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΓΥΟΗΤΝΚΡΑανΡΟΚΡ3

СЗкЗСТЗАЗЬАВОРКЗЕОЕАОУУСАЗТУОУТЬЗО^УРОООТКЬТУЕа

3Ε()Π>ΝΟ:21

Β2Β3-6 (В12-тН5А-РЗВ6И2)

0У0ЬУрЗСаСЕУ<ЭРОКЗЕКЕ5САА8ОРТРООУАМН1УУК0АРОКОЕЕ'«УЗС13ТЖ5О51 αΥΑΟ5νΚΟΚΡΤΙ5ΚϋΝΑΚΝ5ΕΥΕ0ΜΝ5ΕΚΡΕΟΤΑνΥΥσΑΚϋΕσΑΚ0ΎΕΕΟΡΕΥν/Ο(30

ТЕУТУЗЗАЗТООООЗОООСЗООООЗЗУЕЬТрОРАУЗУАЬООГУКПСрООЗЬКЗУУАЗ ΐνΥρρΚΡ0<}ΑΡνΕνΐΥΟΚΝΝΚΡ5ΟΙΡΟΚΡ568Τ5ΟΝ8Α5ΕΤΙΤαΑ<}ΑΕΟΕΑΟΥΥΓΝ5ΐω5

30ΝΗ\ννΡΟΟΟΤΚντνΕΟΑΑ30ΑΗΚ5ΕνΑΙ)ΚΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΕνΕΙΑΡΑ(3ΥΕ008ΡΡΕΟ

НУКЕУМЕУТЕРАКТСУАВЕЗАЕНСЦККЬНТЬРСОКЪСТУАТЕКЕТУСЕМАОССАКОЕР

ΕΚΝΕαΡΕΟΗΚΟΟΝΡΝΕΡΚΕνΚΡΕνηνΜεΤΑΡΗΟΝΕΓ.ΊΤΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡ

РАККУКААРТЕССйААОКААа,1,РК1.ОЕЬКВЕОКА53АК<ЗКЬКСАЗЕ<}КРСЕКАРКА

УМУАК1.50КГРКАЕРАЕУ5КЕУТОЬТКУНТЕССНеГ>Т,ЪЕСАШКАОЕАКУ1СЕМ<)0515

ЗКЬКЕССЕКИЛЕКЗНСЯАЕУЕ^ЕМРАОЬРЗЕААОРУЕЗКОУСККУАЕАКОУРЦЗМР

1Л'ЕУАККНРОУ5УУЬШи,АКТУЕ'ТТЕЕКССАААОРНЕСУЛКУРОЕРКРЕУЕЕР(ЗЦиК

ОЧСЕЬРЕОЕОЕУКРОНАЕЕУКУТККУРОУЗТРТЕУЕУЗКМЕОКУСЗКССКНРЕАККМР

- 51 022201

САЕОУЕ8УУШ0ЕСУЬНЕКТРУЗОКУТКССТЕ8ЬУЖКРСР5АЬЕУОЕТУУРКЕР<ЗАЕТ

РТРНАПГСТЬЗЕКЕКрПСКОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕОЕКАУМООРЛАРУЕКССКАООК

ЕТСРАЕЕОККЬУАА89ААЬОЬАААЬ0У0ЕУЕ5О0ОЬУ9РОО8ЬК1.8САА8ОРТГК8УА

Μ5\ννΚ(3ΑΡαΚΟΕΕλνν5ΑΙ3αΚΟϋΝΤΥΥΑΟ8νΚΟ[ίΡΤΙ3Μ>Ν8ΚΝΤίΥΕ0ΜΝ5Ε!<ΑΕΟ

ТАУУ¥САКМТ8НАУОРОУ№О0ОТЬУТУ83ОО<Ю8ОООЗС<ЗОО8СК5УЬТ0РР8У8ОА

РО<5КУТ18СГОКН8М<ЗЕОУаУН»УООЕРаТАРКЬЫУОМТМКР80УРОКР80РК50Т8А

5Г.А1ТОЕ(ЭАЕОЕЛОУУСОЗУОККТРО\\'УРСОСТКЦГ\ЕО

8ΕΟΙΟΝΟ:22

В2ВЗ-7 (Р4-тН8А-ВЮ2)

0УрЕрЕ80ОСЕУКРООЗГ.КЕ5САА8ОРТР35УАМ51У¥КСАРСКСЕЕ\УУ8Т13ОБООЗТ

ΥΥΑΟ5νΚΟΚΡΤΙ8ΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝεΕΚΑΕΟΤΑνΥΥεΑΚΟΥ855'ί/8ΕνΑ8ΟΥ'ίί00Ο

ТЕУТУ38ЛЗТСе<Ю80ССС8СССе8А1УМТС)8Р88Ь5АЗУСОКУТГГСКАЗОС11йГОЬа \УУООКАОКАРКЕЕГУАА83ЕОЗСУРЗКРЗС8а80ТОГТЕТ133ЕОРООРАТУРСО<ЗАН8Р

ΡΡΤΡ0ΟΟΤΚνΕΙΚΚΟΑΑ3ΟΑΗΚ5ΕνΑΗΚΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΕΥΕΙΑΡΑρΥΕ0Ρ5ΡΡΕϋΗνΚ.

ЕУНЕУТЕРАКТСУАОЕЗАЕНСОКЗЕНТЕРООКЬСГУАТЕКЕТУСЕМАОССАКЧЕРЕКМ

ΕΕΡίΟΗΚΟΟΝΡΝίΡΚΕνΚΡΕνβνΜΕ’ΤΑΡΗϋΝΕΕΤΡίΚΚΥΕΥΕΙΑΕΕΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΗΡΛ

ККУКААРТЕССОААОКААСЬЬРКЕОЕЦФЕСКА53АК<31и,КСА31ЛЗКРОЕКАРКА\УА

УАКЕКрКРРКАЕРАЕУ5КЕУТОЕТКУНТЕССНС1ИЕЕСАООКАОЕАКУ1СЕЦС)ОЗ[35К

ЬКЕССЕКР1ЕЕК8НС1АЕУЕНОЕМРАПЬР8ЕААОРУЕ8КОУСКМУАЕАКВУРЕСМРЕУ

ЕУАККНРОУЗУУЪийЕАКТГУЕТТЬЕКССАААОРНЕСУАКУРОЕРКРЬУЕЕРОНиКОМ

СЕЕРЕ9ЬОЕУКР<3«АЬЬУКУТККУР0УЗТРТЕУЕУЗКНЕОКУО8КССКНРБАККМРСА

ЕОУЬЗУУЕЫ<ЗЕСУЕНЕКТРУ8ВКУТКССТЕ8ЬУЖКРСР8АЕЕУОЕТУУРКЕР<гЛЕТРТ

РНАО1С1Ъ8ЕКЕК<ЖК0ТАЕУЕЕУКНКРКАТКЕ<)иСАУМООРААРУЕКССКАООКР,Т

СРАЕЕСККЬУАА5<ЗААЕСЬААА1Л)Уд1У<35аАБУККРОЕЗЕК15СКО5СУ5РТ5УОТА \ννβρΜΡ0Κ<3].ΕΥΜΟΕΙΥΡαο8ΟΤΚΥ$Ρ5Ρ<)0<)νΤ[3νθΙί5νδΤΑΥΕ9ν/38ΕΚΡδ08Αν

УРСАКНОУОУСТОКТСАКТОЕтаОУТОООТЬУТУБЗООСОБЗОООЗОССОЗОЗУЬТ (3ΡΡ5ν5ΑΑΡΟ<3ΚνΤΪ305Ο335ΝΙΟΝΝΥν3^Υ0()ΕΡ0ΤΑΡΚΙΧ1ΥΏΗΤΝΕΡΑθνΡΓ>ΕΡ8Ο

8КЗСТЗАЗЕА18СЕКЗЕОЕАОУУСАЗУЮУТЪ5С\тССС,теЪТУЕС

5ΕΟ№ΝΟ:23

В2ВЗ-8 (Г+КН8А-Р5ВАН2)

()У(}1.(ЗЕ5ССО[,УКРОС81Л1.8САА50РТР55УАМ5^УУК<5АРСгКОЕЕ^У5Т[5050С5Т

ΥΥΑΟ5νΚΟΒΡΤΤ3ΕΟΝδΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥσΑΚΟΥ888ΐνδΕΥΑ3ΰΥΐνθ0Ο

ТЕУТУ58А5ТСаООЗСОСЗО8ООСО5А1УМТ03Р85ЕЗАЗУОПКУТГТСЛА30О1КМОЕО \νΥ<3ρΚΑθΚΑΡΚΕί[ΥΑΛ85193θνΡ8ΚΡ5Ο3Ο8ΟΐΒΠΈΤΙ55ΕρΡΓ)ηΡΑΤΥΡ€0(}ΑΗ3Ε

РРТРССОТКУЕКК.ОАА8ОАНК8ЕУАНЙРКОЕСЕЕМРКАЬУиАРА0УЬ008РРЕПНУК

ЕУМЕУТЕЕАКТСУАОЕ5АЕ1ЧСОК5ЕНТЬЕСОКЕСТУАТЕКЕТУОЕМАОССАК<)ЕРЕКМ

Ε0ΡΙ,()ΗΚθηΝΡΝΕΡΚΕνΚΡΕνθνΜΕΤΑΡΗΠΝΕΕΤΡΙ,ΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΙ4,ΡΡΑ

ККУКААРТЕСС<ЗААОКААСкЕРКЕВЕЕЙВЕОКА88АК<5Ки:СА8ИЗКРСЕКАРКАУ/А

УАКЕ30КГРКАЕРАЕУ8КЕУТП(ТКУНТЕССНООи-ЕСАОПКАОЬАКУ1СЕЫ(ЗО3188К

1ЖЕССЕКРЕ1,ЕКЗНС[АЕУЕНОЕМРАОЕР5ЕААОРУЕ5КОУСКОТАЕАКОУРЕОМГЕУ

ЕУАККНРОУБУУЬЬЬКЬАКТУЕТТЕЕКССАААОРНЕСУАКУРОЕРКРЬУЕЕРрКЖрМ

СЕЬРЕ0ЬСЕУКР0МА]ЬУ1гУТККУР0У8ТРТЕУЕУ5МЙСКУС8КССКНРЕАККМРСА

- 52 022201

ЕОУЕЗУУЪНОЬСУЕНЕКТРУЗОКУТКССГЕЗЕУМККРСРЗАЕЕУОЕТУУРКЕРОАЕТРТ

РНАО1СТЬ5ЕКЕК01КК0ТАЕУЕЕУ»ШКРКАТКЕ01,КАУМ®РААРУЕКССКАООКЕТ

СРАЕЕОККЬУАА8ОААЕ01АААЬ0У0ЬУЕ8С.Г|О1,У0РСС8Ы1Ь8СААЗОРГРК8УАМЗ

4ίνΕΟΑΡΟΚΟΕΕλνν8Α180ΕαθΝΤΥΥΑΟδνΚΟΚΡτΐ8ΚΟΝ8ΚΝτΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑ

УУУСАКМТ8ЯАУСРОУЗУС0СТЬУТУ83ССОС8ССО8СС0С5О08УЬТ0РР5УЗОАР(5 рЕУТ18СТ0КН8М1Г1(.ОУСУНД/У00ЬРСТАРКШУСИТМКРЗОУРВКР8ОРК5СТ8А8Е

АПОЬрАЕОЕАОУУСрЗУОККТРОУУУРОООТКЕТУЕО

ЗЕО ГО N0:24

В2ВЗ-9 (НЭ-Н8А-ВГО2)

ΟνΟΕΟΕδΟΟΟΙ.νΚΡΟΟδΙΛΙ.δΟΑΑδΟΡΤΡδδΥ'νΜδννΚΟΑΡΟΚΟΕΕν/νΑΝΙΝΚΟΟδΑ δΥΥνθ5νΚΟΚΡΤΙ5ΗΟΟΑΚ^ΕΥΐΧ>ΜΝ5ίΚΑΕΟΤΑνΥΥΕΑΚηκανθΥΓΌΕ\νσκαΤΙ.ν

ΤνδδΑδΤΟΟαΟδΟΟΟΟδΟΟΟΟδΟδΑΕΤΟΡΑδνδΟδΡΟΟδΙΤΙδατΟΤδδΟνΟΟΥΝΡνδΨΥ

00ΗΡ6ΚΑΡΚΙ.ΜΙΥθνΒΟΚΡ3σν50ΚΓ305Κ3ΟΝΤΑ3Ι.ΙΙ8Ο1.0ΑηθΕΑΟΥΥ058Υ0δ88Τ

НУ1РС<ЮТКУТУ1.СААЗОАНК8ЕУАННРКМ.ОЕЕКРКАЕУПАРА0У1,00СРРЕОНУК

ЕУНЕУТЕРАКТСУАОЕЗАЕМСОКЗЬНТЬРООКЬСТУАТЬКЕТУОЕМАОССАКОЕРЕКН

ΕεΡΕΟΗΚΟΠΝΡΝΙ-ΡΚΙ,νΚΡΕνονΜΟΤΑΡΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΙ,ΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡΡΛ

ККУКААРТЕССОААОКААагРКЕПЕЕИЭЕОКА58АКОКЕКСАЗЕОКРСЕКАРКА»А

УАМ,80КРРКАЕРАЕУЗКЕУТОЬТКУНТЕССНООЬЬЕСАОПЕАОЬАК¥]СЕМ003135К

ЕКЕССЕКРЕЕЕКЗНаАЕУЕМВЕМРАОЕР5ЕААОРУЕ5КОУСКМУАЕАКОУРЕОМРЕУ

ЕУАККНРОУЗУУЫХКЬАКТУЕТГЕЕКССАААОРНЕСУАКУРОБРКРЕУЕЕРОНЫКОМ

СЕЬРЕОЬОЕУКРОЯАЕЬУКУТККУРОУЗТРТЬУЕУЗХМШКУОвКССКНРЕАККМРСА

ΕΟΥΕδννΕΝΟΕΟνί,ΗΕΚΤΡνδΠΚνΤΚαΤΓΕΒΕνΝίυίΡΕΤδΑΕΕνηΕΤΥνΡΚΒΡΝΑΕΤΡΤ

РНАШСТЕЗБКЕКОККОТАЬУЕЕУКНКРКАТКЕОЬКАУМООРААРУЕКССКАООКЕТ

СРАЕЕОККЕУАА30ААЬОЕАААЕ0У0ЬУ08САЕУККРОЕ8ЬК18СКСЗСУ5РТ5У991А λννκρΜΡΟκοΕΕΥΜΟΕίγροΕδσΓΚΥδΡδΡΟΟοντίδνρκδνδΤΛΥΕονδδΕΚΡδΟδΑν

УРСАЫГОУОУСТОЕТСАКУ/РЕЗУШУУ/ОООТЬУТУЗЗООООЗЗОООЗОаООЗОЗУЕТ

ΟΡΡδ-νδΑΑΡαςκντίδϋδΟδδδΜΟΝΝΥνδννγορΕΡατΑΡΚΕΕίγηΗΤΝΚΡΑονροκΡδΟ

8КЗОТЗА8ЕА150РКЗБОЕАОУ¥САЗЛГОУТЕЗС\УУГСООТКЬТУЕО δΕΟΙϋΝΟ.15

Β2Β3-10 (НЗ-тН8А-Р£В«Н2)

0ν0Ε0Ε3ΟΟΟΕνΚΡΟΟ81,ΚΕ30ΑΑ5ΟΡΤΡ33ΥΐνΜ5ΎνΚΟΑΡΟΚΟΕΕ\ννΑΝ1ΝΚΟΟ5Α ίΥΥνΟδνΚΟΡΡΤΙδΚηΟΛΚΝδΕΥΕΟΜΝδΓ.ΚΑΕηΤΑνΥΥΌΑΚΩΚαναΥΡΟΕν/ΟΚΟΤΕν

ΤνδδΑδΤΟΟΟαδΟίιΟΓ.ΚΓ.ΠΟΓ.δΟδΑΙ.ΤΟΡΑδνδβδΡΟΟδΙΤΙδΰΤΟΤδδΟνΟΓ,ΥΝΡνδΥ/Υ

00ΗΡ0ΚΑΡΚΕΜΙΥθνδΟΚΡδθν3ΟΚΡ8Ο8ΚδΟΝΤΑ3ϋΙδΟΕ0ΑϋΟΕΑΟΥΥΟ88ΥΟ588Τ

ΗνίΡΟΟΟΤΚνΤνΕΟΑΑδϋΑΗΚδΕνΑΗΚΡΚΟΕΟΕΕΝΡΚΑΕνΕΙΑΡΑΟΥΕΟΟδΡΡΕΟΗνΚΕ

УОТУТРЕАКТСУАОЕЗАЕЫСОКЗиПЪРСПКЕСТУАТЕКЕТУаЕМАЕЮСАКОЕРЕККБ εΓΕζΙΗΚΌΟΝΡΝΕΡΚΕνΚΡΕνονΜεΤΑΓΗΟΝΕΕΤΡΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΡΡΑΚ

КУКААРТЕССОААОКААСЕЬРКЬОЕифЕОКАЗВАКОтКСАЗЕОКРОЕВАРКАЗУАУ

АКЕ801ЩРКАЕРАЕУ8КЕУП>ЕТКУНТЕССНСШХЕСАПП11АОЕАКУ1СЕН0О3188КЕ

КЕССЕКРЕЕЕК5НС1АЕУЕИОЕМРАОЕРЗЕААОРУЕ5ЫЗУСККУАЕАК1>УРГ.СМРЪУЕ ¥АЫЩРОУЗУУЕШЩАКтаТТЪЕКССАААОРНЕСУАКУРОЕРКР1.УЕЕР<ЗМ.1К<гЕ1С

ЕЕРЕОЕСЕУКРОИАЬЬУКУТККУР(ЗУ8ТРТЕУЕУ$ЮЧЬСКУаЗКССКНРЕАККМРСАЕ

ОУЬЗУУЕНОЕСУЕНЕКТРУЗОЕУТКССТЕвЕУЦККРСРЗАЕЕУПЕТУУРКЕРОАЕТРТР

НАО1СТЕ8ЕКЕК01ККОГАЁУЕЬУКНКРКАТКЕ0ЕКАУМПОРААРУЕКССКАООКЕГС

РАЕЕОККЬУААЗрАА1ХЗЬАААЬ<ЗУ13ЕУЕ5С5ООЕУ<}РО<ЗЗии.5САА8ОРТРК8¥АМ8» νκςΑΡ0Κ0ΕΕνίν5ΑΙ5σΚ.<3ΟΝΤΥΥΑΟ8νΚαΚΡΤΙ5Μ3Ν5ΚΝΤΕΥΕ4ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥ

УСАКМТ5МАУСРОУТО0СТЬУТУ83ССОС8аОС8СОСО8О08У1.ТОРР8УЗСАРО0К νΤΙδσΤσΚΗδΝΙΟΕΟΥΟνΗλνΥΟΟΕΡΟΤΛΡΚΕΕΙΥΟΝΤΝΕΡδΟνΡϋΚΡδΟΡΚδΟΤδΑδΕΑΙ

ТС.Ь0АЕОЕАПУУС08УОКЛТРО»УРОСОТКЬТУЬС

ЗЕО ГО N0:26 НЗ (апй-ЕгЬВЗ) асРУ

ОУОЬОБЗСКЮЬУКГОСЗЕКЕЗСААЗОРТРЗЗУи'МбВДУКОАРОКОЕЕЧГУАМПШЗОЗА

5¥УУП8УКОКРП8КООАКИ5ЕУИ!ММ5ЕКАЕОТАУ¥¥САКПЕОУОУРПИУОКОТЕУ

ТУЗЗА5ТСС008СССС8ССССЗОЗА1,ТОРАЗУЗСЗРСОЗГП8СТСГЗЗОУООУМРУ35УУ

00НР0КАРКЬМ1УОУЧОРРЗСтУ5ПКРЗО5К5ОМТА5Ы15СЕ0АООЕАОУУС85УС835Т

ΗΥΐΡοσστκντνι/5

ЗЕО ГО N0:21 ВГО2 (аш!-ЕгЬВ2)

0У0ЬУ08ОАЕУККРОЕ8ЬК13СКОЗСУЗРТ8¥1У1А\УУЕ0МР0К0ЕЕУМСи¥Р0081УГ

КУБРЗРОСОУТЮУГЖЗУЗТАУЕОТОЗЕКРЗОЗАУУРСАЮГОУСУСТПКТСАК^РЕЗУЬ

ОУ№С0аП.УТУ83СС<К533ССОЗОСО0505УЕТ(ЗРР8У5ААРОрКУТ15С5О358тОМ

ΝΥν5Υ/Υ00ΕΡ0ΤΑΡΚΕΕ1ΥηΗ™ΚΡΑ0νΡΟΡΡ£Ο5Κ50Τ5Α5ίΑΙ50ΡΡ5ΕΟΕΑ0ΥΥεΑ δΆΟΥΤΕΞΟΆΎΡΟΟΟΤΚΕΤνΕΟ

ЗЕО ГО N0:28 А5 (апй-ЕгЬВЗ) 5сРУ

0ν0ίν0δ(ΜΟΕνΚΡΟΟ5ΕΚΕδ£ΑΑ3ΟΡ5ΡΝΤΥΟΜΝ3ννΚ0ΑΡΟΚΟΙ.Εΐνν58Ι58558Υ1Υ

ΥΑΟ3νΚ0ΚΡΤΙ8ΚΟΝΑΚΝ8ΕΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥσΑΚΟ0νΑΊΊ'ΡΡϋΥ\ν000ΤΕνΤ

У5БСССО8ОаСС5ОааО803У1.Т0РРВУ50АРО0ЕУП5СТ0383ТЛаАОУОУ1™У00Е

Ρ0ΤΑΡΚΕί1ΥΟΝδΝΚΡ50νΡ08Ρ508Κ80Τ8Α8ίΑΙΤ0Ε0ΑΕΟΕΑηΥΥ€0δΥ035Εί;ΑΕΡ оооткьтуео

ЗЕО ГО N0:29 М1.3.9 (ап(!-ЕгЬВ2) 5θΡν

0У0ЕУ08САЕУККРСЕЗЕК18СКО8ОУ8РТЗУУГООУУ1К)МРОКСЕЕУМОиУРОВЗОТ

КУЗРЗРОСОУПЗУОКЗУЗТАУЕОЖЗЗЬКРЗОЗАУУРСАКНПУСУСЗЗвМСАКЛУРЕУРО

Н\УО0С1ЪУТУ53ОСОС38ООО8ОСОО303УЕТ0РР8У8ААРС0КУЛЗС80333№0Ж

УУ8\9У00ЕРСТАРКЬЫУОН™КРЛОУРОКР8О8К8ОТЗА8ЬА13аРК8ЕОЕАОУУСАЗ тоуть5о\таостк1ЛУъо

- 53 022201

8ЕУ ГО ΝΟ: 30

В12 (анти- ЕгЬВЗ) зсГу <}У<}ЬУ<}8СССЬУ9РСВ5ЬВЕ:5САА$СРТГООУАМН№УК0АРСКеЬЕ\¥У8С15\\7\$С81

ΟΥΑΒ8νΚΟΒΡΤΙ8ΚΒΝΑΚΝ8ΕΥΕ<3ΜΝ8ΕΚΡΕΒΤΑνΥΥ€ΑΚΒΕΟΑΚ<ΪΥνΕΕ<;ΡΒΥΥνθΟ€

ТЕУТУЗЗАЗТССССЗССССЗССССЗЗУЕЕТОВРАУЗУАЕСОТУМТСОСВЗЕКЗУУАЗ \\УОУКРСОАРУЕУ1УСКХМГР8С1РРК1-’8С8Т8СХ8А5ЕТ1ТСАОАЕЦЕАОУ¥САУКП8

86ΝΗ\ννΓσοοτκντνΕθ

8Е<} ГО N0: 31 Е4 (анти- ЕгЬВЗ) 8сГу

УУОЕУЕЗСССЕУКРССЗЕКЕЗСААЗСГТРЗЗУАМЗтеУКОАРСКСЕЕтеУЗТВСЗСОЗТ

ΥΥΑΒ8νΚΟΚΓΤΙ3Κ0Ν8ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑννΥεΑΚΟΥ85«\ν5ΕνΑ3ΟΥΥν(;0Ο

ТЕУТУЗЗАЗТССССЗССССЗСССОЗАГУМТОЗРЗЗЕЗАЗУСВКУПТСКАЗОСИиЧВЕС \УУО<}КАСКАРКЕЕПЛА55Е<25СУР8КГ8С$СЗСТОГТЕТ155Е<ЗРООРАТ¥РС<ЭОАН5Г

РРТРСССТКУЕ1ККС

ЗЕО ГО N0:32 Г5В6Н2 (апЦ-ЕгЬВ2) зсРу

ОУОЕУЕЗСССЕУОРСОЗЕКЕЗСААЗСРТГКЗУАМЗтеУКОАРСКСЕЕтеУЗАБСКСВЭТ

ΥΥΑΒ5νκσΚΓΤΙ8ΚΒΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΒΤΑνΥΥΟΑΚΜΤ5ΝΑνθΓΒΥΥνθΟΟΤΕν

ТУЗЗССбСЗСССЗССССЗСУЗУЕТОРРЗУЗСАРСОКУПЗСТСКНЗтСЕСУСУНтеУО

0ΕΡΟΤΑΡΚΕΕ1ΥΟΝΤΝΗΡ80νΡΒΚΡ8ΟΕΚ8ΟΤ8Α8ΕΑ3ΓΟΕ0ΑΕΒΕΑΒΥΥε<38ΥΒΚΚΤΡΟ теугсссткьтУЕС

8Е0 ГО N0:33 с-тус

ЕОКЫЗЕЕОЬ

8Е<) ГО N0:34 гемагглютянин

ΥΡΥΙΐνΡϋΥΑ

8Е0 ГО N0:35

Гистидиновая метка (Н18б)

НННННН

8Е0 ТВ N0:3«

Каспаза 3

Нота нагнет

САС88866

ΜΕΝΤΕΝ8νΒ3Κ3ΙΚΝΕΕΡΚΙΙΗΟ8Ε5ΜΒ8ΟΜ8νΥΒΤΟΥΚΜΒΥΡΕΜΟΕ€ΠΙΝΝΚΝΡΗΚ3Τ

ΟΜΤ8Κ80ΤΒνΒΑΑΝΕΚΕΤΡΚΝΕΚΥΕνΚΝΚΝΒΕΤΚΕΕΐνΕΕΜΚΒνδΚΕΒΗ8ΚΚ38Ρν€ν

- 54 022201

ЬЬ8НСЕЕСПРСТНСРУ»ЬКК1Т«РП1СОНС118ЬТСКРКЬП1аАСНСТЕЬОСС1ЕТВ8СТ

ΒΟΟΜΑΟΗΚΙΡνΟΑΟΓΕΥΑΥδΤΑΡΟΥΥδίνΚΝδΚΟΟδννΡΚΪδΕΟΑΜΕΚΟΥΑΒΙίΕΕΡΜΗΙΙ,

ΤΚνΝΚΚνΑΤΕΡΕδΡδΓΒΑΤΓΗΑΚΚΟΙΡανδΜΕΤΚΕΙ,ΥΡΥΗ

8Е<2 ГО ΝΟ: 37

Каспаза 8

Ното 5ар1ет

ААВ24962

МПГ5КМЬУО1СЕ0ЬО8ЕОЬА8ЕКГЬ5Е0У1Р011К0ЕР1КОАЬМЕР0КЬ0ЕККМЬЕ1ЖМЬ8

ΡΕΚΕΕΕΓΜΝΚΕΒΕΕΙΤΥΕΝΤΕΚΕΕΜΕΚΕΕΟΤΡΟΚΑρίδΑΥΚνΜΕΥΟΙδΕΕνδΚδΕΕΚδΡΚ

ГЕЕОЕЕ15КСКЕВВВМ\'ЕЕВТРТЕМНКН\1ЕОЕСКЕВ1ЕКК\'САО1ГМК5ЕЕК11ХВУЕЕР

8ΚΕΚδ8δΕΕΟδΡΒΕΡδΝΟΕΕΕΕθνΜΤΙδΒδΡΚΕΟΒδΕδΟΤΕΒΚνΥ(ΪΜΚ8ΚΡΚ€ΥεΠΙΝΝ

ΗΑΤΑΚΑΕΕΚνΡΚΕΗδΙΚΒΗΝΟΤΠΕΒΑΟΑΕΤΤΤΓΈΕΕΙΙΓΕΙΚΡΗΒΒΕΤνΕΟΙΥΒΙΕΚΙΥΟΕ

МВН8«МВСГТСС1Е5НСВКСПУСТВСОЕРР[УЕЕТ8ОРТСЬКСР51,АСКРКЛТРГОАСО

ΟΒΝΥΟΚΟΙΡνΕΤΟδΕΕΟΡΥΕΕΜΒΕδδΡΟΤΚΥΙΡΒΕΑΒΡΕΕΟΜΑΤνΝΝΌνδΥΚΝΡΑΕΟΤνν

ΥΙΟδΕΟΟδΕΚΕΚεΡΚΟΟΒΙΕΤΙΕΤΕνΝΥΕνδΝΙΟΦΚΚΝΜΟΚΟΜΡΟΡΤΓΤΕΚΚΚΙΛΤΡδΒ ί-,Εί) ГО ΝΟ: 38

Гранзим В Ното заркпз ААА75490

М0Р1ЕЕЕЕАРЕЕЕРКАОАСЕПССНЕАКРН8КРУМАУЕМ1«Т>0К8ЕК11СССГЕ10ВВГУ

ΕΤΑΑΗΟ\ν€δδΙΝνΤΕΟΑΗΝΙΚΕ<}ΕΡΤ<}ζ>ΡΙΡνΚΙΙΑΙΡΗΡΑΥΝΡΚΝΡ5ΝΟΙΜΕΕ<}ΕΕΚΚΑΚ

КТН.\\'ОРЕКЕР5ХКЛО\КРООГС8\ЛС\ЗСОТЛРЕСКП8НТЕОЕ\КМТ\'ОЕВККСЕ5В

ΕΚΗΥΥΒδΤΙΕΕΟνΟΒΡΕΙΚΚΤδΓΚσΒδΟΟΡΕνεΝΚνΑΟσίνδΥΟΚΝΝΟΜΡΡΚΑΓΓΚνδδ

ΓνίΓννίΚΚΤΜΚΚΥ

5Е0 ГО N0:39

Цитохром с

Ното ίαρϊεηι ΝΡ_061820

ΜΟΒνΕΚΟΚΚΙΓΙΜΚΟδΟΟΗΤνΕΚΟΟΚΗΚΤΟΡΝΕΗΟΕΓΟΚΚΤΟΟΑΡΟΥδΥΓΑΑΝΚΝΚΟ 1 ΙΧνΟΕΒΤΕΜΕΥΕΕΝΡΚΚΥΙΡΟΤΚΜΙΓνΟΙΚΚΚΕΕΚΑΒΕΙΑΥΕΚΚΑΤΝΕ

8Ε() ГО ΝΟ: 40

Фактор некроза опухолей альфа (ΤΝΡα)

Ното ιαρίεηι

САА26669

М8ТЕ5М1КВУЕЕАЕЕАЕРККТССРОС811КСЕГЕ8Т.Е5РЕ1¥АСАТТЕРСЕЕНГС¥1СРОК

ΕΕΓΡΚΒΕδΕΤδΡΙΑ0ΑνΚδδδΚΤΡ8ΒΚΡνΑΗννΑΝΡ0ΑΕΟ0Ε0№ΕΝΕΚΑΝΑΕΕΑΝ6νΕΕ

ΗΒΝΟΕννΡδΕΟΕΥΕΙΥδΟνΕΓΚΟΟΟεΡδΤΗνΕΕΤΗΤΙδΚΙΑνδΥΟΤΚνΝΕΕδΑΙΚδΡεΟΚΕ

ΤΡΕΟΑΕΑΚΡΧνΥΕΡΙΥΕίίΟνΓΟΕΕΚΟΒΚΕδΑΕΙΝΚΡΒΥΕΒΡΑΕδΟΟνΥΓΟΙΙΑΕ

- 55 022201

8Е0 ГО N0:41

Раз

Ното зар>ет САИ3871

МЬС1\МЬЬРЬУЫ8УАКЕ58К5\^АОУТО1М5КСЬЕЬККТУТТ¥ЕТ0МЕЕОкННЦС0РС

НКРСРРСЕККАКВСТУ1ЧСВЕРВСУРС0ЕСКЕ¥ТВКАНР88КСККСКЕСВЕСНСЕЕУЕ1

НСТНТОМТКСКСКРОТРСМЗТУСЕНСВРСТКСЕНСПКЕСТЬТвНТКСКЕЕУКККЕУОК

ΤεΗΚΗΚΚΕΝ0Ο8ΗΕ5ΡΤΕΝΡΕΤνΑΙΝΕ50ν0Ε8ΚΥΙΤΤΜθνΜΤΕ80νΚΟΡνΐΙΚΝ0νΝΕ

ΑΚΙΒΕΙΚΝηΝνΟηΤΑΕΟΚνΟΕΕΚΝλνΗΟΕΗΟΚΚΕΑΥΒΤΕΙΚΟΕΚΚΑΝΕεΤΕΑΕΚΙΟΤΠΕ

Κ1»ΙΤ8ϋ8ΕΝ8ΝΕΚΝΕΙΟ81.ν δΕΟ Π) ΝΟ: 42

Ва4 (Вс12 антагонист клеточной смерти)

Ното ίαριβηι

САС46757

МЕ01РЕГЕРЗЕ0ЕО858АЕКСи;Р8РАСПСР5С5СКННК0АРСЫАТОА8Н00Е0РТ838Н

ΗΟΟΑσΑνΕΙΚ8ΚΗ8δΥΡΑΟΤΕΒΒΕΟΜΟΕΕΡ8ΡΡΚΟΚδΚδΑΡΡΝΕ4ΆΑΟΚΥΟΚΕΕΚΚΜ8

ВЕГУВ8ЕККСЬРКРК5АСТАТОМКО533\УТКУГО8\¥№В1ШЕСКС88АР5О

8Е0 ГО ΝΟ: 43

Апоптоз- индуцирующий белок (ΑΙΡ)

Ното $ар1епл

ААК67626

МУОН1Л1УГЕ1М80ЮААУЕЗСЕСА8С0РЕАЕРСКУЕЕСЕСУЕТКЕСКККАКРК1ЕБЪГМ

О1ЕУ¥С81УЕЯКККУК5ОН11РЕЕЕУТЕЕЕЕРЕТ1,ОАКТ«1\¥М1КТА1£КЗГУУ8ААЗАТЕ11

ОЕ№ВН1ЕЕСУККОЕКАТСКРР8ТЕНААР№1РВКАТВ1СМКСТОТКР8АЕТ11КННСККС

СГУУСАЕС8КОНГЕЕРКЕ8РКРУКУС8ЕС¥КЕЕААООКОЕЕАЕЕОСАС8РКОРАНЕАКР

1ССА88СВВВВ8ВЕВКЕС8КВСВ1УР88УЕРУА8С¥А\¥8АРН8 δΕΟ И» ΝΟ: 44

Пиеризин-1

Ριεηί гарае (Репный мотылёк)

0911804

ΜΑΟΚΟΡΥΜΤΝΟΙΟΑΑννΕννίΚΑΕΟΕΕΙΤδΤ.ΕΕδΚΑννΡΜΑΙ,ΕΑΤδΕΕΙΗνΚΡΤνΕΤΟΤΟΝ ννΚΕϋΚΛΟΚΕνΗννΒΚΚΡΡΝΕΙΕΕΟΟΓνΡίνΤΚΕΝΡΟλνΕΕΤΟΕΥΟΡΑΚΝΝΗΡδΙΓνδΤΤΚ

ΤΟΚΝΚΚΚΥνίνΤΡΚΝΑΝΗΟϊνΥΟΥΕΤΥΑΡΟΟνΒνΝΠδΓδηΑδΡννΡΝΟΜΕνΑΓΡΟΟΙΟΝΙ

ΥΙΗδΑΚΕΕΗΝΟΚΙ0Μ3ΥΙΝΡΝΡΕΒΡ6ΒΕΕΡΐνδδ8ΚΤΡ0νΐ\νΗΜΝΗΡΒΟΟΗΙΙΒ0ΚδΕΕδΑ δδΥΒΒΕΜΥΟΟΤΟΝνΟΕΒΤΕΟΒΕΡΝΝΡΚΡΙΑΑΟΕΡΜΙΕδΙΚΒΚΝδΡΕΒΕδΚΝνΝΟΟνίΗδΝ

ΕΥδΟΟΒΝ0Τ\ννΓδΥΒΒΝΚΚΑΥΚΙ0δΥ0Ν5ΥΕΥΕδ\νΒ5ΝΑδδΚΕΜΙΕΚΟΥΤΝδΟ5ΝΝ0Υ

ΙνΟΙΕΟΤΟΚΝΥω,ΚΝΕΕΝΕΒΜΙΙΤΑΟΒΚΡδΑΡΟΟΚΕνίνΝΤΕΙδΝδΝΤΚΙδΟΕίνΚΜΙΡΓΒΓ

ΚΡΠΒΟΒΥΝΙΡΝνΒΕ8Ν0ννΒΡ5Ν0ΡΒΕΕνΗΟΗΙΓ€ΒΝΕΝ0Τ\νΗΡΤΥΝδΤΥΗΑΥΚΙ\νδΟ

ΒΙ€8ΝΕΙΕΤ\νΒ8ΝΑΑ5ΚΕΜννΚΑΥΤΕδΚδΚΝΟΥΐνΐυΕΟΤΟδΚδΥΚνΐΙΝΕΕΝ88ΜΙΕΟΕΤ

- 56 022201

ΚνβΤΡΥΟΟΕΝΕΜνΕΒΒδΒΟΗδΒΕΗδΒννΒΙΚΡΙΓΥΟΒΙΡΒΟΒΥΝΙΓΝΒΝΓΡΝΙΑΙΒΓΤΝΟΕ

ΕδΕΙΗΕΗΝΡΕδΝΝΝΟΚΧΥδΡνΡΒϋΚΚΚΑΥΚΙΚδΟνκδΝΕννΕδΥΥΒδΝΑδδΚΕΜνΕΚΑΥΤΕ

8Ο53^Υ\νΚΕΒΕΑΝΒΟ3νΚ1ΚΝΙΛ)ΒΥΥΚίΙΑΕΤΝΙίΝΤΡΥΟΟΚΕΙΑν$ΒΝΚΕ5ΟΝΤ\νΥΕ

ΚΚΕΟΕνΡΕΡΝΗΚΓΚΙΑΤΚΕΝΥΚΚνΐΒ58Τ5ΥΝυΐΤΗΒΕΝΓΑ58ηνΕΕνΥΒ38ΚΚΑΥΝΙΥ8 δΒΙΝΝΕβΧΥΙΥΟΝΚΝΪΤνΚΕΟΝΙΒΟΡΒΗΟΒΕΚΥΡΙίνΤΙΕΥδΜΟΤΟεΥΕΙΗδΕΗΒΡΑΝΑνΟΥ

ΤΒδΕδνίΤΒΤδΤΥδΒΝΟΕΓΗΕΙΕΜ

8Ε<) ΙΟ N0:45

ТКАН, (ΤΝΡ-связанный апоптоз- индуцирующий лиганд)

Ното ίαρίβηί

Р50591

ΜΑΜΜΕν<)<;θΡ8ΕΟ<)Τ€νΕΐνΐΓΤνΕΙ,<ϊ8ΙΛ:νΑνΤΥνΥΓΤΝΕΙ,Κ<ΪΜ<)ΒΚΥ3Κ8<;ΐΑ€ΓΕ

ΚΕΒΒβΥΥνΒΡΝΒΕΕδΜΝδΡεννΟνΚΥΥΟΕΚΟΕνκΚΜΙΕΚΤβΕΕΤΚΤνΟΕΚΟΟΝΙδΡΕνίΙΕ

ΚΟΡΟΚνΑΑΗΙΤΟΤΚΟΚδΝΤΕδδΡΝδΚΝΕΚΑΕΟΕίαΝδννΕδδΚδΟΗδΓΕδΝΕΗΕΚΝΟΕΕνΐ

ΗΕΚΟΓΥΥΙΥδΟΤΥΓΚΡΟΕΕΙΚΕΝΤΚΝΒΚΟΜνΟΥΙΥΚΥΤδΥΡΒΡΙΕΕΜΚδΑΚΝδΟνδΚΒΑ

ΕΥΟίΥδΙΥΟίΧϊΙΓΕΕΚΕΝΒΚΙΓνδνΤΝΕΗΕΙΒΜΒΗΕΑδΡΡβΑΡΕνΟ

ЗЕО Ю N0:46

Вах

Ното заргет 007812

МВС36Е0РКС6СРТ88Е01МКТСАЕЕЕ<гСП0ВКАСКМССЕАРЕЕАЕВРУР0ВА8ТКК ΕδΕΓΕΚΜΟΒΕΕΒδΝΜΕΕ0ΚΜΙΑΑνΐ)ΤΒδΡΗΕνΡΕΚνΑΑΒΜΡδΒΟΝΡΝ\νθΚννΑΕΓΥΓ ΑδΚΕνΕΚΑΕ€ΤΚνΡΕΕΙΚΤΙΜΟ\\^:ΤΕΒΡΕΚΕΚΕΕΟλνΐ0Β0ΟΟλΑ'ΒΟΕΕδΥΕ(τΤΡΤ\ν0ΤνΤ I ГУАСУЕТА8ЕТВ¥ККМС

5Ε0ΙΒ ΝΟ: 47

Зеленый флуоресцентный белок (ОРР) Аедиогеа νιοίοΠα (сезонная медуза) Р42212

МЗКСЕЕЕГТСУУИЕУЕЕВСВУЯСНКГЗУЗСЕСЕСВАТУСКЕТЕКЕГСТТСКЕРУРЧТТ

ΕνΤΤΓδΥΟνοεΓδΚΥΡΒΗΜΚΟΗΒΡΡΚδΑΜΡΕΟΥνΟΕΚΤΙΓΡΚΒΒΟΝΥΚΤΗΑΕνΚΕΕΟΒ

ΤΕνΝΚΙΕΕΚΟΙΒΡΚΕΒΟΝΙΕΟΗΚΕΕΥΝΥΝδΗΝνΥΙΜΑΒΚΟΚΝΟΙΚνΝΡΚΙΚΗΝΙΕΒΟδνΟ

ΕΑΒΗΥΟΟΝΤΡΙΟΒΟΡνΕΕΡΒΝΗΥΕδΤΟδΑΕδΚΒΡΝΕΚΚΒΗΜνΕΕΕΕνΤΑΑΟΙΤΗΟΜΒΕ

ΕΥΚ

- 57 022201

8Е<3 ГО ΝΟ: 48

Желтый флуоресцентный белок (ΥΡΡ)

Бактерии ΛΙιινώηο НнсРеп

Р21578

ΜΡΚΟΐνΕΌΙΟΙΙΕΚΙΟΙΥΤΟίΒΚΥΑΙΚΓΡΕΝΜΡΝί;ΐΚΚΕ5!5ΐΜΓΝ<ΧΤΕΤνΤ$νΝ:3ΝΓνννΡΟ

1РЕКЕАККЬВТГКЕ¥К¥СВКУ1ЧЬСТРРКГСАА5ССН1Ь5АКВСУА511Е11ЕКЕО¥0<}Мте

ΙΟΙΡΕΝΡΤΕΡΕΙΒΚΒΥΙΑνΒΟΙδΕΤΙΒΠΚΝΝΟΓΡΙδΕΡΕΙΟΑΟΝΤΝΜΚΥνΚΚΚΟΒΚνΝνΕΕδ

ΝΚΙΝΑΝ<Κ'\ν

8Е<} ГО ΝΟ: 49

Циановый флуоресцентный белок (СРР) МоШаМгаеа сауегпоза (Глазчатый коралл) ААЫ7905

МЗУПВУМЫКЕКМВСЩНСНКРЛПТСЕбЕСКРГЕСТНТИЬКУКЕССРЕРГАУМЬТТА

ГОУСККУГТКУРКШРВУГКОЗРРЕСУвтеЕКЗМТГЕВОСУСТУТЗВНаЕбВСРГУЕТКЕ

ΥϋνΝΚΡ33ΟΡνΜ0ΚΚΤΡΚ\νΕΡ5ΤΕΝΜΥΥΗΠθνίΕΟΒν3ΚΤΡΕΕΕΟΒΚΗΗΚΡ:ΝΡΚ8ΤΥ

ΟΑΚΚΟννΕΡΕΥΗΡνΒΗΜΕΙΕδΗΒΚΒΥΝΤνΕνΥΕΝΑΥΑΚΡδΜΕΡνΚΑΚ

8Ε<2Η>ΝΟ:50

Красный флуоресцентный белок (КРР) Грибы Онеохота 5р δδΑί-2000 ААО16224

М5СЗЮЧУ1КЕГМКГКУКМЕСТУ1ЧС11ЕГЕ1КСЕСЕСКРУЕСНС8УКЕМУТКССРЕРГАР

ΒΙ15ΡΟΡΟΥΟδΚνΥνΚΗΡΑΒΙΡΒΥΚΚΕ5ΡΡΕΟΡΚ«ΈΚνΜΝΡΕΒΟΟννΤνδΟΒδδΕΚΒΟ εΡΙΥΕνΚΓΙΟΥΝΡΡδΒΟΡνΜΟΙΙΚΤΚΟλνΕΑδδΕΚΕΥΡΚΒΟνΕΚΟΒΙΗΜΑΕΚΕΕΟΟΟΗΥΕ νΕΕ.Κ8ΙΥΜνΚΚΡ8ν<}ΕΡ<ϊνΥΥν08ΚΕηΜΤδΠΝΕΒΥΤννΕ9ΥΕΚΤ9ΟΚΗΗΡΓΓΚΡΕ<}

8Е0 ГО ΝΟ: 51

Люцифераза

Светляки Р]юИпиз ругайя САА59282

ΜΕΒΑΚΝΙΚΚΟΡΑΡΓΥΡΕΕΒΟΤΑΟΕΟΕΗΚΑΜΚΚΥΑΕνΡΟΤΙΑΓΤΒΑΗΙΕνΝΙΤΥΑΕΥΡΕ

ΜδνΒΕΑΕΑΜΚΚΥΟΕΝΤΝΗΚίννΟδΕΝδΕΟΡΡΜΡνΕΟΑΕΡΙΟνΑνΑΡΑΝΒΙΥΝΕΚΕΕΕΝδ

ΜΝ130ΡΤννΡ’νδΚΚΟΕρΚΙΕΝν<}ΚΚΕΡΙ19ΚΙΙΙΜΙ)8ΚΤΒνθΟΓρ8ΜΥΤΕνΤ8ΗΕΡΡΟΕΝΕ

ΥΒΡΥΡΕδΓΒΚΒΚΠΑΕΙΜΝδδΟδΤΟδΡΚΟνΑΕΡΗΚΤΑΓνΚΡδΗΑΚΒΡΙΡΟΝΟΗΡΒΤΑΙΕδν

УРГННСРбМГТТЕСУиССРКУУЕМУКРЕЕЕЕГЕКвЕуВУКНЗвАЕЕУРТЕРвРРАКБТЕ

ΒΚΥΒΕδΝΕΗΕΙΑ8ΟΟΑΡΕ8ΚΕνθΕΑνΑΚΚΓΗΕΡΟΙΚ0ΟΥΟΕΤΕΤΤδΑΙΕΙΤΡΕ6ΒΒΚΡΟΑ \ΌΚννΡΓΓΕΑΚννΒΕΟΤΚΚΤΕθνΝ(}ΚΟΕΕΓνΚΟΡΜΙΜ5ΕΥνΝΒΡΕΑΤΝΑΕΙΙ)ΚΒθννΐ,

ΗδΟΒΙΑΥΥνΒΕΒΕΗΡΡίνΒω,ΚδΕΙΚΥΚΟΕΟνΑΡΑΕΕΕδΙΕΕΟΗΡΝΙΡΒΑσνΑΟΕΡΟΒΒΑ

СЕЕРААУ\Л'ЕЕНСКТМТЕКЕ1АФ¥УАЗОУТТАККЕКСС\теГУВЕУРКСЕТСКЕВАКК1

КЕ1ЫКАККССК8КЕ

- 58 022201

8Ε0Ι0Ν0:52

Люцифераза

ΒεπϊΙΙα ηηί/οτηύϊ (Морские губки)

ААА29804

ΜΤ3Κνν0ΡΕ0ΚΚΕΜΙΤ0Ρ0\\ΤΑΑΕ€Κ9ΜΝνΕ05ΠΝΥΥΠ5ΕΚΗΑΕΝΑνΐΓΕΗΟΝΛΛ55

УПУКНУУРШЕРУАКСЦРВЫСМСКЗСКЗСМ.ЗУКЕШНУКУПЛиЕЕкЕАЕРККИЕУ

СНОЛ¥САСЬАГН¥8¥ЕН<ЗОК1КА1УНАЕ8УУПУ1Е8\УОЕ\т>1ЕЕО1А1ЛК8ЕЕСЕКМУ1,

ЕЪМГРУЕТМТ,Р8К1МККЬЕРЕЕРАА¥ЬЕРРКЕКСЕУККРТЬ8\УРКЕ1Р1,УКССКРПУУ0 ΐνΚΝΥΝΑΥΕΚΑδΒΟΕΡΚΜΡΙΕδΒΡΟΓΓδΝΑΐνΕΟΑΚΚΓΡΝΤΕΓνΚνΚΟΕΗΡδΟΕΟΑΡΟΕ

ΜϋΚΥ1Κ£>Γ\ΈΚνΕΚΝΕ0

ЗЕО ГО ΝΟ: 53

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменой С348 Домен 1

Аминокислотная последовательность

ПАНК5ЕУАНКГКВЕСЕЕ8РКА1Л1ЛАРАОУЕОО$РГЕВНУКЬУХЕУТЕГАКТСУАОЕЗА

ЕГМСВК8ЫПЪР(Л)КЕСТУАТ1,КЕТ¥СЕМАВССАК<}ЕРЕ1ЦЧЕСРЬ<2НК1)ВМРМЕРК1ЛТ1

ΡΕνΒνΜΟΤΑΓΗΟΝΕΕΤΓΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΡΥΑΡΕΕΕΓΡΑΚΚΥΚΑΑΓΤΕΓΓΟΑΑΟΚΑ

АС1ХРКЕОЕ1Л1)Е(;КА38АК<2К

8ЕО ГО ΝΟ: 54

Человеческий сывороточный альбуминовый (ΗδΑ) линкер с заменой С348 Домен И

Аминокислотная последовательность

СКАвЗАКОКЕКСАЗЕОКГСЕКАРКАХУАУАКЬЗСКЕРКАЕРАЕУЗКЕУТОЬТКУНТЕСС

НГтЦЬЕЕСАППКАВЬАКУ1СЕ80ВЯТ55КЬКЕССЕКРЬЬЕК8НС1АЕУЕ™ЕМРАОЬР5ЬА

АОГУЕЗКВУСКЛУАЕАКИУГЕСМИЛ'ЕУАМШРОУБУУЕЕЬКЬАКТУЕТТЕЕКССАА

АЦРПЕСУАКУГПЕРКРЕУЕЕРО

8ЕОГОРЮ: 55

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер с заменой N503(2 Домен Ш

Аминокислотная последовательность νΕΕΡΟΝΕΙΚ<2ΝσΕΕΓΕ<ίΙ.ΟΕΥΚΓ<ΪΝΑΕΙ,νΚΥΤΚΚνΡ<}ν.5ΤΡΤΕνΕν5ΚΝΕ(;Κνθ8Κ(Χ

КНРЕАККМРСАЕО¥Е8УУиЧ<2ЬСУЕНЕКТРУ8Ш1¥ТКССТЕ5ЕУКККРСЕ8АЕЕУ1)ЕТ¥

ΧΤΚΕΡΟΑΕΊΓΤΓΗΑΒΙΕΤΕΞΕΚΕΚΟΙΚΚΟΤΑΕνΈΕνΚΗΚΡΚΑΤΚΕΟΕΚΑνΜΟΟΡΑΑΓνΕ

КССКАООКЕТСГАЕЕекК1,УАА8<2АА1.С1.

ЗЕО ГО N0:56

Человеческий сывороточный альбуминовый (НЗА) линкер Домен I

Аминокислотная последовательность

1)А11К8ЕУАиКГ1уВЕСЕЕМКА1ЛМАЕЛ0У1.0(ДР11иНУКЕУАЕУТЕРАКТСУА1)Е8

ΑΕΝ(1Ί>Κ8ΕΗΤΙ_Ε(τΟΚΙΧ'ΤνΑΤΈΙ<ΕΊΎΟΕΜΑΠ(1'€ΑΚ<3ΕΡΕβΝΕ€ΕΕ<3ΗΚΌΟΝΡ[\ΈΡΚΕν

ΚΡΕνθνΜ€ΤΑΡΗΒΝΕΕΤΓΕΚΚΥΕΥΕΙΑΚΚΗΡΥΓΥΑΡΕΕΙΓΡΑΚΙΙΥΚΑΑΓΤΕ<Χ<}ΑΑηΚ

ААС1АРКЕОЕЫи)ЕСКА85АК<гК

ЗЕТ) ГО ΝΟ: 57

Человеческий сывороточный альбуминовый (Н8А) линкер Домен III

Аминокислотная последовательность

УЕЕРОМЫКОГЧСЕЕГЕОЕСЕУКГОХАЕЕУКУТККУРОУЗТРТЕУЕУЗТЖЕСКУСЗКСС

КНРЕАКНМРСАЕОУЬЗУУЕКОЕСУЕНЕКТРУЯВКУТКССТЕЗЕУНККРСРКАЕЕУОЕТУ

УРКЕР«АЕТРТРНАШСТЬ8ЕКЕК<21КК<}ТА1,¥Е1,УКНКРКАТКЕ<ЗЬКАУММ)ГААРУЕ

КССКА1НЖЕТСГАЕЕСККЕУАА89ААЕСЕ

5Е<2 ГО ΝΟ: 58

Человеческий альфа- фетопротенн

Аминокислотная последовательность

ΜΚΙΥνΕδΙΡΕΙΡΕίΝΓΤΕδΙΙΤΕΗΙΙΝΕΥβΙΑΚΙΕΒδΥίΚΤΑΕΙδΕΑηΐ,ΑΤΙΡΓΑΟΓνΟΕΑΤΥΚ

Е¥8КМУЫ>АЕТА1ЕКРТСВЕ055ССЕЕИ<2ЬРАГЕЕЕЬСНЕКЕ1ЕЕКУСН5»СС508ЕЕС

ΗΗΝ€ΡΕΑΗΚΚΡΤΡΑ8ΙΡΕΡ0νΡΕΡνΤ8σΕΑΥΕΕΒΚΕΤΡΜΝΚΓ1ΥΕΙΑΚΚΗΡΓΕΥΑΡΠΈΕ №ААКУПКПРЗССКАЕМАУЕСР<гТКААТУТКЕЕКЕЗЗЫ,НОНАСАУМЮЧГСТКТР<2А1Т

УТКЕ5<гКГТКУМГТЕИгКЕУи>УАНУНЕНССКСВУи)СЬ<2ПСЕК1М8У1С5<2<2ПТЕ8Г(К

ΙΤΕ€(;ΚΙ.ΪΠ,ΕΙΜκ}αΐΗΑΕΝΟΕΚΡΕ<ΪΕ5ΡΝΕΝΚΓΕσθΚΙ>ΓΝ<ΪΓ88ΟΕΚΝΤΓΕΑ5ΓνΗΕΥ5 (ии1Р<ЗЕАУ5У1ЕКУАКСУОЕЦ,ЕКСГ<ЗТЕМРЕЕС<}ПКСЕЕЕ1Л(КУК)Е5<ЗАЕЛКВ5СС]ГЦКЕСЕУУЕОХАГЕУАУТККАРОЕТ^ЕЕМАГГККМААТААТССОЬКЕВКЕЕАССЕСА

АВШСНЕС1КНЕМТРУМРСУС()ССТ38УА18ККРСЕ88ЕУУОЕТУУРРАк8ВОКГ1ЕНКОЕ

СрА9СУА1Л>ТМК<)ЕГЕтЕУК<2КР<21ТЕЕОЬЕАУ1АВР8СЕЬЕКСС(ЗС<2Е<)ЕУСРАЕЕС цкизкткллъсу

- 59 022201

Приложение В

Выравнивание последовательностей

В2ВЗ-1 (НЗ-тН5А-В11Э2)

101

151

201

251

301

351

401

451

501

551

601

651

701

751

8С1

851

901

951

1001

1051 ^УОЬОЕВССС ЬУКРССЗОКЬ 5САА5СГТРЗ ЗУИМЗИУКОА РеКбЬЕНУАК

ГННРОЗАЗУУ У03УКЯНРТ1 3ΚΡΡΑΚΝ3ΙΛ 1ДМН51КАЕР ТАУУУСАВРК етсутнса стьутуззаз ^еббЗйййе^ссеозозы· торазуз65р „Г ] днчмюнптп .

СЗД51Т15СТ6 ТЗЗПУССГЫЕ УЗМУООНР&К АРКЬШУО’/З ОКР56УЗОЯГ

ЗСЗКЗСНТЛЗ Ы15С1ЙАРР ЕАРУУСЗЗУО ЗЗЗТНУггбб бГКУТУЬСАА

ЗПАНКЗЕУАН КРКОЬСЕЕДР КАЬУЫАГАО УЬООЗРРЕРН УКХУМЕУТЕР

АКТСУАРВЗА ЕМСОКЗЬНТЪ ГСОКЬСТУАТ ЬРЕТУСЕМАО ССДК0ЕРЕИ1

ЕСГЬЭНКОСЫ ΡΝΙ,ΡΚΪ,νΚΡΕ УРУМСТАГНР НЕЕГРЪККУЬ ΪΕΙΑΚΚΗΡΪΡ

УАРЕЬЬГРАК ВУКААРТЕСС ОААРКААСЫ, РКЬРЕЬКРЕб КАЗЗАКОНЬК

СД5Ц}КГ6БР АГКДИАУАРЬ 50НГРКАБГА ЕУЗКЬУТРЬТ КУНТЕССНСР

ΙΙΕΟΑΡΡΚΑϋ ΕΑΚΥΙΟΕΝΟΡ Я13.3КГ.КГГГ ЕКР1Л.ЕКЙНС ΙΑΕνκΝΡΕΜΡ

I ЙЭфвМВфв МиИНН» I

АРЬРЗЬААОР УЕЗКОУСКНУ ДБАКРУРАбМ РЫГЕУДВИНР ОУЕУУЬЬЬКЬ

ЛКТУЕТТЬЕК ССАААРРНЕС УАКУГРБРКР ЬУЕЕРОНЫК йНСБЬГЕОЬС

ΕΥΚΓΟΝΑΙΧν КУТККУР0У5 ТРТЬУЕУЗР.Н ЬСКУСЗКССК ВРЕАККМРСА

ЕРУЬЗУУШЙ ЬСУЬКЕКТРУ ЗРКУТКССТЕ ЗЬУИККРСРЗ АЬЕУРЕТУУР

КЕГОАЕТГТГ НАО1СТЕ5ЕК ΕΕΟΙΚΚΟΤΑΕ УЕЬУКККРКА ТКЕОЬКАУМР

РГААРУЁКСС КАОРКЕТСРА ЕЕСККЬУААЗ ОААЬбЬАААЬ ОУОЬУСЗбАЕ УККРСЕБЬК1 ЗСКСЗСУЗРТ ΕΥΜΙΑΝνηΰΚ РСКбЬЕУМСЬ ΙΫΡ5Ρ3ΡΤΚΥ

ЗРЗРОСОУТТ ЗУШЗУЗТАУ ЬОНЗЗЪКРЗР ЗАУУГСАННП УСУСТРВТСА кмрекьсунс обтьугуззе сссззсвзас сзсвозууго ррзуздарсо дми,*«м*у*>|рц

КУ? Г ЯС Я ей 3 ЯМТС.ММУУЙИ' ТоОАРСТАРК Ϊ,Ϊ,ΙΥΟΗΤΗΗΡ АСУРОКРЗСЗ

К5СТЗА31А1 8СГКЗЕРЕЛР УУСДЗИРУТЬ 5СИУГСЖТК ЬТУЬС

СПК петли выделены в НЗ (синие с розовыми СБК) и ВГО2 (розовые с циановыми (голубыми) СОР.. Модифицированный человеческий сывороточный альбумин

- 60 022201

Выравнивание последовательностей для В2ВЗЛпН$А вариантов

А5-гвНЗА-МЬЭ, 9	(ί)
АЬ-гоНЗА-ВЮг	(31
А5-ШН5А-Г5В6Н2	(11
В12-тНЗА-ВЮ2	(1)
В12-ИН5А-Г5В6Н2	(1!
Р4-жНЗА-В1О2	(1)
Р4-тНЗА-Г5ВбН2	(11
НЗ-гаНЗА-ВЮ2	(11
НЭ-тНЗА-Г5ВбН2	(11

АЗ-тНЗА-МЬЗ.Э	(46)
А5-П*Н8А-В102	(46)
А5-ГОН5Д-Г5В6Н2	(46)
В12-тНЗА-В102	(46)
В12’тНЗА*Р5ВбН2	(46)
Г4-тНЗА-В102	146)
Р4-ГОН5А-Г5В6К2	(46)
НЗ-ШНЗА-В1О2	(46)
НЭ-тНЗА-б'ЗВбНг	(46)

А5-гаН5А-НЬЗ,Э	(91)
А5-тНЗА-ВЮ2	(91)
А5-тНЗА-Р5ВбН2	(91)
в1г-тнзА-в1ог	(91)
Э12-ЛКЗА-Р5В6Н2	(91)
Г4-тН$АВ1О2	(91)
Р4-1йН5А-Ь‘5В6Н2	(91)
ИЗ-тН$А-В1В2	(91)
НЗ-ЖНЗА-Р5В6Н2	(91)

А5-тН5А-МЬЗ.Э	(130)
А$-тН5А-В102	(130)
А5-ШНЗА-Г5В6Н2	(130)
В12-ГЛН5А-Ы1О2	(136)
В12-ГОНЗА-Г5В6Н2	(136)
Р4-тНЗА-ВЮ2	(136)
Р4-тН8А-Г5В6Н2	(136)
НЗ-ШЧ5А-В102	(132)
НЗ-ГОН5А-Г5В6Н2	(132)

АЬ-тКЗА-КЬЗ,9	(174)
А5-тН5А-В1О2	(174)
А5-ЯНЗА-Г5В6Н2	(174)
В12-ШН5А-ВЮ2	(177)
Β12··ίϊ»Η5Α- Р5В6Н2	(177)
Р4-тН$А*В102	(178)
Р4-Т&Н5А-Г5В6Н2	ί 17Я)
ЯЗ-тН5А-ВЮ2	(17 6)
НЗ-тНЗА-Г5В6Н2	(176)

45 №ОБ7й$б1МЕ7КРСе5ии5СДА$6Р51КТУ0МЫИУКОЛРСКбЬ ΟνςίνζϊδβΟαί-νκΡσβδΕΚΙ,δΟΑΑδΟΓδΓΝΤΥΟΗΝΗνΚΟΑΡΟΚββ θνθΕν05«ΚΐνΚΡΟΟ51Λ18ΟΑΑ8αΡ5ΡΗΤΥΠΜΝ|ϊνΚΟΑΡ0Κ€1 ОУОЬУОЗСбОЬУОРСВЗЬНЬЗСААЗбГТГООУАМНИУКОАРСКбЬ □УОБУОЗЦССЬУОРСЕЗЕКЪЗСААЗСГТГОСУАНННУЯОАРСКСЕ ОУОЬОЕЗеОСЬУКРОСЗЬКЬЗСААЗеГГРЗЗУАИЗИУКОАРСКЕЬ ОУОЬОВДбОСЬУКТССЗЬКЪЗСААЗеТТГЗДУАМаНУЯОАРСКеЬ ОУОЬ(1Е5СеСЬ7КРССЗЬКЬ5САА5еПГ55УИМЗНУКС1АР5КСЬ ОУОЬОЕЗеССЬТКРССЗЬАЬЗСЛАЗеГТГЗЗУИМЗГУКОАРСКСЬ

90

ΕΗν33Ι33533ΥΙΥΥΑΟ5νκαΐΓΤΙ5ΒΟΝΑΚΝ3ΕΥ£0ΜΝ31ΗΑΕΟ ΕΗν33Ι55538ΥΙΥΥΑ0&νΚθΗΓΤΙ3Κ0υΑΚΝ3ΕΥ1ΛΜΝ31ΑΑΕ0 ЕИУ381£3$55У1УУАОЗУКСКГ„5КОНАКЫ5ЕУЬ0ИМ31ЯАЕО ΕΗν5βΙ5νΗ50$Ι£ΥΑ&^(»ΓΤΙ5ΒηΝΑΚΝ5Ι.ΥΙ£ΜΝ5Ι,ΗΕΈ0 ЕИУЗСЕЗИ«ЗС31СУАОЗУКСВГТ13ВОМАКНЗЬУЬОМН31.ЙРЕО ΕΗν3Τ15<55βΟ8ΤΥΥΑΟ3νΚ<3ΒΓΤΙ5ΗΟΝ3ΚΝΤΙιΥΕιΟΜΝ51*ΒΑΕΟ Е>С/5Т15О5СС8ТУУА03УКСкт5АВЫЗКНТЬ¥Ь0«ИГ>ЬНАР.О ЕИУАКТНВГЙЗАЗУУУОЗтасКГПЗйСОАКНЗБУЬОКМЗБКАЕЭ 6ΜνΑΚΙΝΒΟΰ5Α5ΥΥνθ3νκ№ΓΤΙ3ΚΟΟΑΚΝ51Υΐ£ΜΝ5Ι,ίΐΑεθ

135

ΤΑνΥΥΟΑΒΟδ---νΑΤΤΡΓΟΥΚΟφΟΤΙΛΤνδ—ЗОС6С5СССЕЗ

ΤΑνΥΥΟΑΒΟΟ---νΑΤΤΡΡΟΥΜΰΟΟΤΕντνδ-—36ССЙ8О6СС5 τΛνγγοΑΒκ;—νΑττΡΓ0Υ«α06τυντν2 ·· ·· -зссбсзсоесз ТАТУУСАВОЫЗАКОЯЬЕбРОУЯбОбТЬУТУЗЗАЗТОбССЗСвССЗ ТАУУУСАКПГЙАКОМБЕСРОУМедСТБУТУЗЗАЗТ^ССЗССССЗ ТАУУУСАК<ЗУ583Н5БУА5СУН<ЙСТЬУТУ53А8Т<ЗеСе8ССОеЗ ТАУУУСАКаУЗЗЗ#5ЕУАЗСУИедСТЬУТ733А5Т«^5СаСС5 таууусанок----етеуроьтснстьттуддАЗТОССезсзсаз

ТАУУУСАНОК----<^СУГПЬНСВОТтУ55А5Теее<35С<ЗОС5

136 190

СвСС8О37ЬТаРРЗ’У$САР130НУТ13СТ(3553Н113АСУСУНИУО ССЙСЗОЗУТ.ТОРРЗ-УЗСАРСОКУТГЗСТОЗЗЗЫКЗАСУОУНИУО θα333Ο3νΐΤαΡΡ3-ν8<5ΑΡ0βΗνΤΙ$ΟΤ0335ΝΙ6ΑΟΥ0νΗΜΥ2

ССССЗЗУЕЬТ00РА-У5УА1Х5йТУН1ТС0бОЗЬНЗ---ΫΥΑ3ΗΥ0 ббССЗЗУЕЬТООРА-УЗУАЬеотУКГТСОСОЗЬКЗ—-ΎΥΑδΗΥφ

С6С65А1УМТО5Р58ЬЗАЭТСОВУТ1ТСКАЗО61К---ИМХЖУО

СеОСЗА17МТ05Р55ЬЗА5ЧС0КУТ1ТСНА5ОС1Н---НОЪСИУО <36Ο(3303ΛΙ.Τ01?Α5-ν303Κ303ΙΤΙ5ΰΤΘΪ3$0νααΥΝΕ·ν3ΗΪΟ

С£йС803АЬТ0РА5-УЗСЗРе0$1Т15СТСТБ507ССУИЕТ73МУ0

101 225

0ΕΡ6ΤΑΡΚβΟΙΥ6Η3ΝΚΡ3σνΡ0ΗΓ3δ5Κ5ΘΤ5Α31Λ1Τ51ΌΑΕ0 ОЕРСТАРКБЫ¥СЫЗМКРЗСУРОНРЗ«35К5СТЗА31Л1ТЗи5АЕО 0ΕΡ0ΤΑΡΐα0ΪΥ6Ν3ΗΗΡ5θνΡ0ΗΡ5σ3Κ3&Τ5Α3ΐΑ1ΤΒΐ0ΑΕΡ ОКРСОАРиЬУ1УСКМННРЗС1РОНГЗС5Т5СЫ.<?АЙ1.ТТТеАОАЕО ΟΚΡ<30ΑΡνΐ,νΐΥ6ί<ΝΝΚΡ3ΟΙΡ0ΚΡ3σ3Τ3ι3Ν5Α3ΒΤΙΤ5Α0ΑΕ0 ОКАеКАРКЬЫ¥АА35ЬО36УРЗВГ355С56Т0ГГЬТ1331Х}Р00 ОКА<ЗКАРК1Х1УАА35ЬОЗСУРЗНГ5СЗС5СТОГТ1.Т1351£РОО 3ΗΡ<3ΚΑΡΚΙ.ΜΙΥθν3ΡΚΡ5θν3ΟΚΓ363Κ56ΝΤΑ&υΐ36ϊ.0ΑΟ0 ОНРСКАРКЬМ1УОУ$ОНР5СУЗОНР5СЗК36ЫТА5Ы15СЮАОО

- 61 022201

А5-пНЗА-МЬЗ.9 А5-ПНЗА-В102	(219) (219)
А5-тН5А-Г5БбН2	(219)
В12-ШН5А-В102	(222)
В12-тпН5А-Г5В6Нг	(222)
Г4-ИН5А-В1О2	(22Э)
Г4’гоН5А-Г5ВбН2	(223)
нз-пизл-вюг	(221)
НЗ*|ПЧН5А-Е'5В6Н2	(221)
А5-ГОН5А-М13.9	(262)
А5-ШН5А-В102	(262)
А5-тНЗА-Г5ВбН2	(262)
В12-ГПН5А-В1.О2	(266)
В12-тН2Л-Г5В6Нг	(266)
Ь'4-тпНЗА-В1О2	<266)
Ρ4·'ΓήΗ3Α’Γ5Β6Η2	(266)
НЭ-тпНЗАВ1О2	(265)
НЗ-тНЗА-?5ВбК2	<265)
А5-ГОН5А-МЕ3.9	(307)
А5-ГОНЗА-В102	(307)
А5-тНЗА-Р5В6Н2	(307)
В12-ТПНЗА-ВЮ2	(311)
В12-ИНЗА-Р5В6Н2	(311)
Г4 -«ΙΗ5Α-Β102	(311)
Г4-ШЙ5А-Г5В6Н2	(311)
КЗ-ЩН5А-В1О2	(310)
НЗ-ШНЗА-Р5В6Н2	(310)
А5“шН5А’МЬЭ.9	(352)
А5-гоНЗА-В1П2	(Э52)
А5-ШН8А-Р5В6Н2	(352)
В12-тН5А-В102	(356)
В12-ШНЗА-Р5В6Н2	(356)
Γ4-ΛΗ3Α“Β1ϋ2	(356)
Р4-ГПН5А-Р5В6Н2	(3565
НЗ-гоНЗА ЭЮ2	(355)
ЙЗ-ШН8А-Г5Э6Н2	(355)
А5-шН5А-НЬЗ.9	(397)
А5-ШН5А-В1О2	(397)
А5-ПН5А-Р5В6Н2	(397)
В12-тй$А-ВЮ2	(401)
В12-ГПН5А-Г5В6Н2	(401)
Р4-ЛН8А-В1В2	(401)
Г4’ПНЗА-Г5В6Н2	(401)
НЗ-ПНЗА-В1О2	(400)
НЗ-шН5А-Г5ВбН2	(400)
А5-тНбА-МЬЗ.9	(442)

226 270

ЕАОУУС08УО38-Е5АЬР«ЗСТКЫ>Ьб-АА2ОАНК5ЕУАНРРКО ЕА0УУС05У1Э55-Е8А1,гееСТКЪТУЬС-АА50пНК5ЕУАНКГК0 ЕА9?УСОЗУСдЗ-ЬЗА1ПЗССТКЬТУиЗ-ААЗОАКК5ЕУАНЙБКЦ ΕΑΟΥΥ0»δΒ0535ΝΗβνΓ®3ΟΤΚντνΐΧ;-ΑΑ5θΑΗΚ5ΕνΑΗΧΓΚ0 ЕАС'УУСНЭЯС^ЗбЫННиГСССТКУТУЪС-ААгОАНКБЕУАНЙЕКО РАТУРСООАН5Г— РРТЮЗССТЮ/Б! КВСАА$ВАНКЗЕУАЦарК0 РАТУГСООАН5Г--РРТГбеСТЮ/Е1КВбААЗПАНК5ВУАНКРКО ЕАОУУС58УС8£8ТНУ1РССететТУЬС-ААЗОАНК5ЕУАНКРКО ЕАРУУС83У5535ТЙ71ГеСОТТ<УТУЬб-АА50АНК5В7АНАГК0

271 315

ЬеЕеМГКАЬТЫАРАОУЬООЗРРЕОНУКЬУМВУТЕГАКТСУАОЕЗ ТЙЕЕНГКАЪУЬ: АГАфУЕООЕРРЕОНУКЪУйЕУТБРАКТСУАОЕВ иЗБЕПЕКАЬУЫАРАОУЬООЗРГБОНУКЬУНЕУТЕГАКТСУАОЕЗ УЗББЙГКА1*УЕГАГАОУТ,005РРЕОНУКЬУМЕУТЕРАКТСУАОЕ5 1йСЗБеНГКАЬУЫАГАОУЦЮ5РГЕОНУКЬУНЕУТЕЕАКТСУАОЕЗ ЫЗЕЕНГКАЬУЫАГАОУЬООгРГЕОНУКЬУйЕУТЕРАКГСУАОЕв ЕСЕЕГ*ГКА1.УЫАГА(ЗУ1,023РГЕОНУКЬтаЕУТЕГАКГСУАОЕ5 иЗЕЕЦГКАЬУМАГАОУЬООЗРГЕОНУКЬУМБУТЕРАКТСУАОЕЗ ЬСЕЕКГКАЬУЫАГАОУЬООЗРГЕОНУКЕУЫЕУТЕРАКТСУАОЕЗ

316

АЕЦСОК5Т.НТЬГСОКЬСТУАТ1.КЕТУ<;ЕМА0ССДКОЕРЕВ.МЕСЕЪ

АВКСОКЗЬНТЬгеСКЪСТУАТЕВЕТУСБИАОССАКОВРЕКМЕСБЪ

АБМСОКЗЬНТЕТООКЬСТУА’ПЛВТУСЕМАОССАКОВРЕККЕСГЬ

АЕМСОКБЬНТЬГСРКЬСТУАТЬКЕТУбЕМАОССАКйЕРейМЕСГЬ

АЕНСОК81НТЬГСОКЬСТУАТ1ЛЕТУСЕМАОССАК0ЕРЕКНЕСРЕ

АЕМСОКЗЪНТЬГбВКТСТУАТЬКЕТУСВМАОССАКОВРЕКЫЕСРЬ

ЛЕНСПКВЬНТЬГООКЬСТУАТЪПЕТУСЕМАОССАКОЕРЕЙЫЕСЕЪ

АЕЫСВКЗЬНТЬГОРКЬСТУАТЬКЬ'ГУеЕМАВССАКОЕРЕЕМЕСГЬ

АВНС0К31,КТТ.ГС0КЬСГУАТЕКЕТУСЕМА0ССАК0ЕРЕРНЕСГЪ

361 405 вНКООиРКЬРВЬУВРДОЕЖМСТАРНЖЕЕТРЬККУЬУЕХАКЯНРУ ОНКООЫРВЬРКЪУЙРЕУЬУМСТАГНОИЕЕТГЬККУЬУЕУАКРНРУ ОНКООНРМЬРАЬУНРВУОТМСТАРНОНЕЕТРЬККУЬУВУАРКНРУ ОНКСОНРНЬРАЬУНРЕУОУМСТАРНОЫЕЕТРЬККУЬУЕЛАКЙНРУ ОНКОСЯРНЬтУйРБУОУМСТАВНОЫБЕТРЬККУЬУВХАайНРУ ОНКВОМРиЬРВТ.УДРЕУОУИСТАРНОИЕЕТРЬККУЬУЕЛАВКНРУ ОНХОСМРМЬРКЬУАРЕУВУМСТАГНйМЕЕТРЬККУЕУЕУАВЙЙрУ ОНКООЫРНЬРВЬУКРЕУОУНСТАГНОйЕБтККУЬУБИВКНРУ ОНКООМР»ЬРАЬУРРЕУОУМСТАГНС»1ЕЕТГЬККУХУЕ1ААкНРУ

466 450

ГУАРЕЬЬГГАКНУКААГТЕССОААОКААСЬЬРКЬОЕЬНОЕСКАЗЗ ГУАРЕЕЬГРАКР¥КААтСС0АА0КААСЬЬРК10БЬВО£СКА55 ГУАРЕЬЬРРАКВУКААГТЕССОААЬКААСЬЬРКЬОЕЬКОЕСКАЗЗ ГУАРЕЬЬГРАКВУКААГГЕССОААОКААСЬЪРКЬОЕЬВОЕСКАбЗ ГУАРЕЬЬЕТАКВ¥КААГТЕССОААОКААСЫ.РКЪОЕЬВОЕСКА55 ГУАРЕЕЪГРАКРУКААРТЕССОААОКААСЬЬРКЪВЕЬЙОЕСКАЗЗ ГУАРЕЕЬЕТАКНУКААГТЕССОААОКААЕЫгРКЪОВЬРОЕСКАЗЗ ПГАРЕЫ»БТАКВУКААГТЕСС0АА0КААСЬЬРК10Е1.РГ>ЕСКА35 РУЛРЕЬЬБТАКВУКААГТВССОААРКААСЫРГаОЕЬРСЕСКАЗЗ

451 495

АКОВЬКСА5ЫЗКГСЕРАРКА«АУАВЪЗОНРРКАЕГАЕУ5КЬУТОЬ

- 62 022201

А5*тН5А*В102	(442)
А5-ШНЗА-Р5В6Н2	(442)
В12-гаН5А~В102	(446)
В12-шН5А-Р5В6Н2	(446)
Γ4-ΙΒΗ3Α-Β102	(446)
Ρ4-όιΗ$Α-Ρ5Β6Η2	(446)
НЗ-ГОН5А-В1О2	(446)
НЗ-тН5А-Г5ВбН2	(44 6)
А5-тНЗА-МЕ3.9	(487)
А5-ШНЗА-В102	(487)
А5-тН8А-Г5В6Н2	(487)
В12-тН5А-В102	(481)
В12-ЛЖЗА-Г5В6Н2	(481)
Г4-ШН5А-В1О2	(491)
Г4-тН5А-Г5В«Н2	(491)
НЗ-тНЗА-В102	(490)
КЗ-ГйКЗА-Г5В6Н2	(490)
А5-гаНЗА-МЪЗ.Э	(532)
А5-ГОНЗА-ВЮ2	(532)
А5-тН£А-ГЬВ6Н2	(532)
В12-жН5А* В1О2	(536)
В12-тН8А-ГЬВ6Н2	(536)
Ρ4-σιΗ3Α-Β1ϋ2	(536)
Г4-ШНЗА-Г5В6К2	(536)
НЗ-ШН5А-В1О2	(535)
НЭ-ШНЗА-Г5В6Н2	(535)
А5-тНЗА-МЬЗ.9	(577)
А5-ГОНЗА-ВЮ2	(577)
А5-ШНЗА-Г5В6Н2	(577)
Βΐ2-ιτιΗ3λ-Β102	(581)
В12’ГОН5А~Г5В6Н2	(581)
Г4-тНЗА-В1В2	(581)
Р4-тН8А-Р5В0Н2	(581)
НЗ-тН5А-В102	(580)
НЗ-тН5А-Р5В6Н2	(580)
А5-л»НЗА-МЬЗ. 9	(672)
А5-тН5А-В1О2	(622)
А5чпН5А*Г5ВбИ2	1622)
В12-ШН5А'В1О2	(626)
Β1 2-ΙΛΗ3Α-Ρ5Β6Η2	(626)
Р4-тН5А-В1В2	(626)
Γ4~ιλΒ5Α-Ρ5Β$Η2	1626,
НЗ-ШНЗА-В1Р2	(625)
НЗ-ШНЗА-Р5В6Н2	1625)
А5-пНЗА-МЬ3.9	(667)
А5-тН$А-ВЮ2	(667)
А5ипН5А-Г5В6Н2	(667)

АКОШКС^.ЙЬОКГСЕКАГКАМАУАКЬЗайГРКАБГАЕУЗКЬУТОЬ

АКОКЬКСАЗЬОКРСБКАтЖАУАКЬЗОКГРКАБРАБУЗКЪУТОЬ

АК0М,КСА5ТОКГСЕВАГКАИАУА1Ч,50КГРКАБГАГУ5К1,Ут

АКОАЬКСМЬОКПЗСААРКАИАУАЙЬЗОЙГРКАЕРАЕУЭКЬУТОЬ

АКОКЬКСАеЬОКГСеЕ^АГКАМАУАЕЬЗОЙГРКАЕЕАЕЧЗКЬУТОЬ

АКОКЬКСАЗЦаКГСЕКАГКАНАУАКЬЗОКГРКАЕГАЕУЗКЬУТРЦ

АКдДБКСАЗЬОКГСЕВАРКАНАУАКЬЗОЙГРКАЕРАБУЗКЬУТЫ,

АКОКГКСАЗЬаКГСЕКАГКАНАУАКЬЗОВЕРКАЕГАЕУЗКГУТОЬ

496 540

ТКУН7ЕССНСОЬЬЕСАООДАВ1ЛКУ1СЕМйОЗ 155КЪКЕССЕК?Ь ТКУНТЕССН<ГОЪ1£СА0тиЮ1АтСБИ0ВД135КЬКБССЕКРЬ ТКУНТЕССНСОЫ*ЕСАО0ЯАВ1АК¥1СБ№О5155КЬКЕССВКРЬ ТКУНТЕССНСОЬЬЕСАООВА01АК¥1СЕМ005135КЬКЕССЕКРЬ Т(С/НТЕССН00ЬЬЕСА00НАОЕАК¥1СЕМ2Э3153КЬКЕССЕКРЪ ТК>/НТЕССНОСЪЬЕСАООИАОЬАКУ1СЕ№ОКТЯ5К1.ККССККРЬ ТКУНТВССН<5ОЬЬЕСАСФВА0ЬАК¥1СБИОО3133КЬКВССВКРЪ ТКУНТЕССНСОЬЬЕСАОСКАОЬАКУ1СБН005135КЬКЕССБКРЬ ТКУНТЕССНСОЬЬЕСАОСКАВЬАКУЮЕМООЗТЗЗКЬКБССЕКРЬ

541 535

1£К5НС1ЛЕУЕНОЕНРАОЬР5ЬААОГ7ЕЗК1Ж;КЫУАЕАКОУГ1.<3 ЬЕКЗНСГАЕУЕНОЕИРАС^РЗЬААОРУЕЗКОУСКЦУАЕАКОУРЕС ЬЕК8НСГАВУВК0ЕМРАВЕР31АА0РУЕЗК0УСКЫУАЕАКВУРЬ6 ЬЕКЗПСЕАЕУЕМГЖМРАВЕРЗЕААОРУЕЗКОУСКМУАЕАКОУРЬе ЬЕК8НС1АЕУЕЫВЕМРАОЕРЕ£ААОРУЕ$КОУСКЫУАЕАКСУГЬС ЬЕК5НС1АЕ7ЕМС>ЕМРАВЬрЗи^!А0Г\^,ЕЗХТУУСКМУАЕАХП7РЪС ЪЕКЗНС1АЕУЕНСЕМРАВЬР5ЕААйГУЕ£КОУСКИУАЕАКОУЕ1Х5 1.ЕКЗНС1АБУЕНОЕМРАВЬР31ААОРУЕЗК13УСКЫУАЕАЕ<ОУБЪС ЬЕКЗНСГАЕУЕНОЕМРАОЬРЗЬААОГУЕЗКОУСКНУАЕАКОУЕЪС

566 630

МРЪ¥В¥АНКЛРОУЗУУЬЬЬК1АКТУЕГП,ЕКССАААОРНЕСУАКУ НЕЪУЕУАКВНРОУЗУУЬЬШЬАКТУЕТТЪЕКССАААОРНЕСУАКУ МРЬУЕУДККНРВУЗУУЬЫЛЬАКТУЕТТЬЕКССАААОРНЕСГАКУ МГЬУЕУАРННРПУЗУУЬЫДЬАКТУЕТТЪЕКССАААОРНЕСУАКУ ΜΪΧΥΕΥΑΒΒΗΡΟΥδννΚίυΐΙΑΚΤΥΕΤΤΙΕΚίΧΑΑΑΟΡΗΒΟΥΑΚν МРЬУВУАВКНРВУЗУУЬЬЬРЬЛХТУЕТТЬВКССАААОРНЕСУАХУ ΗΡΕΥΕΥΑΡΒΗΡΟΥδννί^ΗΙΛΚΤγΕΤΉΒΚΟΟΑΑΑυΡΗΗΟΥΑΚν ΜΪΧΥΕΥΑΡΡΗΡΒΥ$ννΤΕΤ.ΙΠΑΚΤΥΡΤΤΤ,ΕΚεεΑΑΑηΡΗΕθΥηκν МЕХУЕУАНННРОУВУУЬЪЪНЬАКТУЕТТЬЕКССАААОРНЕСУАКУ

6Э1 675

ГОЕГКРЬ7ЕЕРОНЫКОМСЕЪГЕОЬСЕУКГОМАЬЪУ1гУТККУРОУ РОЕРКРЬУЕЕРОНЬЮСЕЬГЕОЬСЕУКГОЫАЬЬУРУТККУРОУ ΡΕΕΡΚ?ΕνΕ£Ρβϊ<1.ΙΚαΝεΕΕΡεθΕ6εΥΚΓΰΝΑ£Ί>νΒΥΤΚΚνΡΰν РОЁРКРЬУЕЕРСМЫКОМСЕЕРЕОЬСЕУКРОМАЬЬУХУТККУРОУ ΓΟΕΡΚΡΕνΕΕΡΟΝίΙΚΟΜΟΡϊ.ΡΕΟί-ΟΕΥΚΓΟΝΑΕΕνΛΥΤΚΚνρςν ГОЁРКРЬУЕЕРОЯЫКОНСЕЬРЕОиэЕУКГОИАЬЬУВУТККУРОУ ΓΟΕΡΚΡΒνΕΕΡΟΝΒΙΚζΙΜΟΕΕΒΈΟϋΞΕΥΚΓΟΝΑίΧνΡΥΤΚΚνΡΟν ΓΟΕΕ’ΚΡΙ.νΒΕΡΟΗΙΙΚΟΝΟΕΕΡΕΟίΛΕΥΚΓΟΝΑΕΕνκΛΚκνΡΟν РРБРКРЬУВЕР0НЫК0ИСЕЬТОЬСЕТКР0КАЬЬУК¥ТКЮ/Р2У

676 720

ЗТРТЬУЕУЗКИЬеКУбЗКССКНРБАККМРСАЕОУЬЗУУЕНдЬСУЕ 5ТРТ1.УГ.У8Ма<ЖУСбКССт£АКамРСАЕО¥Ь$УУЬН0ЬСУЬ 5ТРТЬУЕУЗКМЬ(ЖТСЗКССКНРБАКК№САЕОУЬЗУУЬН0ЬСУЬ

- 63 022201

В12-Л1Н5А-В102	{671)
В12-ШНЗА-Г5В6Н2	{671)
Г4-ШН5А-В102	1671)
РЧ-тН5А-Г5ВбН2	(671)
НЗ-ШН5А-БЮ2	1670)
НЗ-ШНЗА-Г5Н6Н2	{670)
А5-тН5А*МЬЗ. 9	{712)
А5-ШН5А-БЮ2	(712)
А5-л»Н5А*Г5В6Н2	(712)
В12-пН5А’В102	(716)
В1 2-чоНЗА-Г5В6Н2	(Л6)
Р4 -ШН5А-В102	(716)
Е4-ИЯ5А-Г5В6Н2	(716)
аз-ганзА-вю2	(715)
НЗ-ШН5А-Г5В6Я2	(715)
Α5-ΙΠΙΙ5Α· МЬЗ. 9	(757)
А5-ШН5А-В102	(757|
А5-1ПНЗА~Г5В6Н2	(757)
Б12-гаН5А-В102	(761)
В12-ГПН5А-Г5В6Н2	(761)
Г4-ГОНЭА-ВЮ2	(761)
Г4-Л1Н5А-Г5В6Н2	(761)
НЗ-ЮН5А-В1О2	(760)
«3 т1)ДА Г5В6Н2	(760)
А5-тпВЗА-НиЗ, 9	(802)
А5-ШН5А-В102	(802)
А5’ШЙЗА“Г5В6Н2	(802)
В12’ШН5А’В102	(806)
В1г-гаН5А-Р5В6Н2	(806)
ГЧ-тН5А’В1О2	(906)
Γ4-πιΗ3Α-Ε,5Β6Η3	(806)
НЗ-гаНЗА-В1О2	(305)
НЭ-тН5А-Г5ВбН2	(005)
А5“ШН5А-МЬЭ.9	(847)
А$-гаН5А-В1С2	(847)
Л5-тК5А-Г5ВбН2	(847)
В12-тН5А-В102	(851)
В12-тНЗА-Р5ВбН2	(851)
ЕЧ-ИПНЗА-В102	(851)
Г4-ШН5А-Р5В6Н2	(851)
НЗ-гаНЗА-ВЮ2	(850)
НЗ“ШЙЗА-Р5В6Н2	(850)
А5-тНЗА-МЬЗ.9	(892)
А5-гоН5А-В1О2	(892)
А5-ШН8А-Г5В6Н2	(892)
В12-ЖНЗА-В1О2	(896)
В12-тК5А-Г5ВбН2	(896)

ЗТРГЬУЕУЗМЛСКУСБКССКВРЕАКВИРСАБОУЕЙУУЬМОЬСУЬ

5ТРГЬУЕУ5НН1ХЗКУ55КССКНРЕАКЮ#САЕО¥Е5УУ1Ж?1,СУЬ

ЗТРТЬУЕУЗЯЩ^КУеЗКССКНРВМФМРСАЕОУЕЯТЛЛ.ЫОЪСУЬ

8ТРТЬУЕУ8НЫ1ЛКУС5КССКНРЕА(<КМРСАЕОУ1г5УУ1.НС21,СУ1.

ЗТРТЬУЕУ£РЫЬСКУВЗКССКНРЕАКЯМРСАБПУ1.5УУЪЫ0ЬСУ1.

ЙТРТЬУЕУЗНЯЬСКУСБКССИНРЕАКВМРСАЕОУЕЗУУЬНОЬСУЬ

721 765

НЕКТРУЗОВУТКССТЕЗЬУЫКАРСРЗАЬЕУВЕТУУРКЕГОАЕТГТ НБК?РУ30тКССТБ5ЬУ»йНтВАЬЕУВБТУУРКБГ0АБ!ГГ ИЕКТРУЗОВУТКССТЕЗТ.УЫККРСРЗАЬЕУОЕТУУРКЮГОАЕТРТ НЕКТРУЗСФУТКССТЕЗЬУЯ№РСРЗАБВУ0ЕТУУРКЕ ГОАЕТГТ НБКТРУ$0В.УТКССТЕ$ЬУЦ№РСР5АЬЕУ0БТУУРКЕПЗАБТРТ НЕКТРУЗОВУТКССТЕЗБУМРКРСРЗАЬЕУВЕТУУРКЕРОАЕТКТ НЕКТРУ50РУТКССТЕ51УМ№РС РЗАЬЕУОБТУУРКЕ ΓΟΑΕΤΕΤ НЕКТРУЗОРУТКССТЕЗЬУНЕШРСРЗАЬЕУВЕТУУРКЕРОАЕТРТ НЕКТРУЗОРУТЕСССТЕЗЬУНВНРСРЗАЪЕУОЕТУУРКЕГОАЕТГТ

736 010

ΓΗΑΟΙ СТЬЗЕКЕКОХККОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЖОЬКАУМООРАА ГНАОГСТЬбЕКЕНОИСКОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕОЬКАУМООРАА ГНАО1СТЬ$ЕКЕЯО1КК0ТАЬУЕЬУКНКРКА.ТКЕ01гКАУИ0РРЛА ГНА01СТЬЗЁКЕК01ККОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕОЬКАУМОВРАА ГНА0ГСТЬ5ЕКЕК01КК0ТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕаЬКАУМППРАА ГНАР1СТЬЗЕКЕед1ККдТАЬУВЬУХНКРКАТКЕОЪКАУМООРАА ЕНАО1СТЬ5ККЕК01КК0ТАЬУЕЪУКНКРКАТКЕ0ЪКА7М00РАА ГНДПТСТТ^ВКЕКОГККОТАЬУЕЬУКНКРКАТКЕОЬКАУМООРАА РНА01СТ15ЕКБВ0ХКК0тУЕ1.УКНХРКАТКЕ^ЬКАУМ00РАА

811 855

ГУЕКССЕСАООКЕТСГАЕЕеККЬУААЗОААЬСТЛААЬОУОЬУдЗСА ГУЕКССКАООКЕТСГАЕЕСККЬУААЗОААЬСЬАААЬОУОЬУОЗСА РУЕКССКАСОКЕТСЕАЕЕСККЬУАА5ОААЬО1АААЦгУ2ЬУЕ5ее ГУБКССКАООКЕТСГАЕЬСККЬУААЗЦААЬСЬАААЬОУОЬУОЗСА РУРКГСКАООКЕТСГАЕЕСККЬУААЗОААЬСЕААДЪОУОЬУЕЙСС ЕУБКССКАООКБТСГАБЕСККЬУААЗОААЬСЬАААЬОУОЬУОЗСА РУБКССКАООКЕТСГАЕЕСККЬУААЗОААХ-еЬАААЬОУОЬУЕЗСе РУЕКССКАСОКЕТСГАЕЕбККЬУААЗОААЬСЕАААЬОУОЪУОЗСА ГУБКССкАДОКЁТСЕАББЛШУААЗОААЬСЬАААЬОУОЬУВ&Яэ

856 900

ЕУККР0ЕЗЬК13СКС5С^ЗГ1'57«1АИУКЦМРСК(5ЬЕ¥НеЫ7РС ЕУККРСЕЗЕКГЗСК63СУ5РТ3^1АИУВ0МРСК€ЬЕУНСЫУРС СЬУОРОСЗЬРЕЗСААЗеГТРВЗТАМЗИУАОАРСКСдемУЗАЗЗСИ ЕУ«КРСЕЗБК13СКС8СУЗРТЗУ«1А^ОМРСКСЬВУМСЫУРС СЬУ0РСС51гКЬ5САА5СРТРНЗУАМЗНУЙ0Ар(ЗКСЬЕНУЗА13ЙВ ЕУККРСЕЗЕКХЗСКСЗСТЗГГЗгНХАгГУВДМРСКСЕЕУНбиУРС СЬУ0РССЗЩЬ8СААЗСРТРВЗ¥АМЗИУК0АРСКСЬ£НУЗАТЗ(ЗК £УККРСЕЗЬК1ВСК€5<Й5ГТ5УН1А9ГУА0НРСКСЬЕУН6Ь1УРС СЬУ0Р£НЗЗЬКЬЗСААЭЦГГРНЗУАМЗИУК0АР(ЖСЬЕИУ5А15СН

901 945

ОЗОТК¥ЗРЗГОСОУТ13УСКЗУЗТАУЬОИ55и<РЗОЗАУУРСАВН 050ТКУЗРЗГ0<фУТ15У0КЗУЗТАУЬОН£5ЬКР5О$ЛУУГСАВ,Н Ο0ΝΊΥΥΑΟ3νΚ0ΡΡτΐ5Β0Ν3ΚΝΤΙΥΜΜΝ3ΐ4ΒΑΕ0ΤΑνΥΥΰΑΚΜ озоткузрзгосоупзуокзузтаубояйзькрзпзауурсаян ООМТУУАРЗУКОВтЗВОКЗтьТЪйММЗЪКАБОТАУУУСАКМ

Г4-тН5А-В1С2	096)
Р4-тНЗА’Г5ВбН2	(896)
НЗ-тН5А-В1О2	1895)
НЗ-Я1Н5Л-Г5В6Н2	095)

А5-тН5А-МЬЗ. 9	037)
А5-тНЗА-ВЮ2	1937)
А5-тН5А-Г5ВбН2	037)
В12-ШН5А-В1Р2	(941)
В12-гаН5А-Г5ВбН2	(941)
Р4-ЮЙ5А-В1В2	(941)
Г4-тН5А“Г5ВбН2	(941)
НЗ~тНЗА-В1О2	(940)
НЗ-ШК5А-Г5В6Н2	(940)

А5-тН5А-МЬЗ»9	(962)
А5-ШЙЗА-В102	(982)
А5-ИНЗА-Г5В6Н2	(972)
В12-тЯЗА-ВЮ2	(936)
В12-ШН5А-Г5В6Н2	(976)
Г4-ЮНЗА-В102	(986)
Г4-ЛНЗА-Г5В6Н2	(97 6)
НЗ-ШНЗЛ-В1О2	(985)
НЗ-ПН5А-Г5В6Я2	(975)

АЬ-тНЗА-МЬЗ.9	(1026)
А5-тНЗА-ВЮ2	(1026)
А5-ПНЗД-Г5Э6Н2	(1017)
В12-ПН5А-ВЮ2	(1030)
В12-тН5А-Г5В6Н2	(1021)
Г4-ШН5А-В1О2	(1030)
Г4-ЯНЗА-Г5В6Н2	(1021)
НЗ-тИЗА-В102	(1029)
НЗ-ЛН5А-Г5В6Н2	(1020)
А5-гаН5А-МЬЗ,9	(1071)
А5-ПЙ5А-В102	(1071)
А5-ПШ5А-Г5В6Н2	(1062)
В1?-гвН5А-Б]В2	(1075)

[>5ПТКУЗРЗРС>С0УТТЗУОК$У8ТЛУЬ0М5$ЬКР5О5АУУГСАЙН еОНГУУАОЗУКСКГТГЗКОКЗККТЬУЬОММЗЬНАЕПТАУУУСАКМ

050ТКУЗР$Р060УТХЗУОК5УЗТАУЬОИ53ЫСР305АУУЕ*САКН <ЗОИТ¥УАОЗУКСЯтЗВОКЗКНТЬУ1ЛМНЗЬЯАЕ!ЭТАУУ¥САКН

946 990 оусусзззисАкирЕУГонисостьуТУззосеезэзоезаазсз оусустовтсАКирЕмьсиисостьУТУззесесззсссзссссз тзмауз---------роуисоетьутуззосеозазсзесесзс

0УСУСТЭНТ(^К^РЕИЬС’ЛС0СТ1,УТУ55СССС53ССС5СС&32 тзяаус----- ——ротмедстьуту&зссббзтасзссбсзс

ОУСУстовтсАкирЕмьсуиео&гьУТУдзесееезеесзсс^сз

Т5----------КАУСРОУИСОСТЬУТУЗМеОСЗООбЗСбССЗв

ШСУСТОКТСАСТРЕНЬСУНСОСТЬУТУ53ССОа35<3<ЗСЗСе<353 ТЗИАУС----— Г0УИС0СТЬУТУ530еОС5С5С5ССС05<5

9« 1035

23УЬТОРР5УЗААРаЗКУТ15СЗСЗЗЗВДекЫУ-У5»УООЬРСТА 08УЬТОРР8УЗААРСОКУТ13СЗ€ЗЗЗМ1СНМ?’УЗ«УООЬР6ТА СЗУЬТ0РР5УЗеАРО0НУТ1$СТСКН5Ы1СЬСЗ¥СУКЮТ0О1,РСТА ОЗУЬТОРРЗУЗААРСОКУТ18СЗС555131е»НУ-УЗИУООЬР<ЗТА ОЗУЬТОРРЗУЗ&АРСОЙУТ18СТСКНЗМ1СЬСУСУН»УООЬРСТА ОЗУЬТОРР5УЗААРСОКУТ13С5СЗЗЗН1еННУ-УЗ*?УООЬР<?ГА ОЗУЬТОРРЗУЗСАРСОВУТТЗСТПННЗМТСЬСУСУНЫУООЕРСТА ОЗУЪТОРРЗУЗААР50КУТ15Сб<;ЗЗЗН16ММ¥“УЗМУООЬРбГА цЗУЬТ0РРЗУ5САРСЯВУТ15СТеВНЗЫ1С1,С¥СУННТ00ЕРСТА

1036 1080

РК1*Ы ΥΟΗΤΝβΡΑΟΠ/ΡΟΚΓ563Κ5675Α5ΙΛΙ53ΓΚ3ΕΟΕΑΟΥΥσ РКЬЫУОНТЫВРАСУРОРГ5С5К8СТ5А5ЬА1еСГОЗЕОЕАОУ¥С РКЬ11УеМТТЖР5(5УР0КГ56ГКЗбТ5Л31АГГ<5БОАБ0БА£ПСУС РКЬЫУМТЫКРАСУРОНГЗСЗККСТЗАЙТАГЗаРРЗЕОЕАПТПГС РКЪЫУС«ТНКР30УРСНР5СРК5С73АБСА1ТС1д5АЕ0ЕАПУУС РКЬЫ Υ □Н'ЖМАСУтГЗСЗКЗСТЗАЩАГЗбГКЗВОЕАОУУС РКЬЫУЙЫтаАР5{5УРГЖГ5ОГК513Т5А51АГТ6Ь0АВОЕАС1УХС ΠαυΥ0ΗΤΝΒΡΑανΡ0ΑΓ3θ3Χ86ΐ3Α3ΐιΑΙ5ΰηΐ3ΕθεΑ£Υ¥0 РКЬЫУОМТИАРЗ^РОВГЗСГКЗеТЗАЗКАГТЙЬОАБОБАОУУС

1091 1104

АЗЮУТЬЗСИУРООбТКЬТУЬС—

А5М0УТЬЗСИУРС66ТКЬТУ1Л~

ОЗУ ОВАТИЗИУТСббТКЬТУЬС-’

АЗИОУТЬЗСИУРСССТКЕГУЬе—

- 64 022201

Приложение С

Противораковые агенты

Плотиволаковый агент для	Зарегнстциповапнос патентованное название, толговая	Пооизводитель /Владелец
комбинации с В1ВЗ-1
малка
Антитела плотив ЮПК АМС 479 (полностью гуманизированное тАЬ) 1МСА 12 (полностью гуманизированное тАЬ) 145С- 742460 19Э12 (полностью гуманизированное тАЬ) СР751-871 (полностью гуманизированное тАЬ) Н7С10 (гуманизированное тАЬ) альфа 1 КЗ (мышиное) 5сРУ/РС (химера мышиное/человеческое) ЕМ/164 (мышиное) МК-0646, Р50035		Ат£еп 1тС1о1в Оу ах РГЕгет Иетге РаЬге МеЛсатет, Мегск
Малые молекулы, нацеленные на		Νονατύδ Вп51о1-Муеге δςιιϊββ Вп51о1-Муег£ &|П|Ы>
1СР1К ΝνΡ-ΑΕ\ν541 ВМ5- 536924 (1Н- бензимидазол- 2ил)- 1Н- пиридин- 2- он) ΒΜ3-554417 Циклоглнкан ТАЕ226 РЦ401
Моноклональные антитела плотив	Ауаьбп Еййих® УесНЫх®	ПкуТе СепеШесЬ 1МСЬОКЕ Атреи
ЕСРК 1ЫСВ7839 Бевацизумаб Цетуксимаб тАЬ 806 Магузумаб (ЕМ072000) Нимотузумаб (ТЬегаСЕМ) Панигумумаб
Лекаоственные антитела ппотив		из РКатта/Ат^еп Метпшаск РЬапиасеиНсак
ЕгЬВЗ иЗ-1287/АМО888 ММ-121
Лекаостпепиые антитела ппотив	Герце птин Танеспимицин	ОепеШесЬ ЕУуеШ Козан Вюыжпссг
ЕгЬВ2 Трастузумаб ΗΚΙ-272 КОК- 953

- 65 022201

Ингибиторы днмеципшнн
Нег/ЕгЬВ 2С4Л1273	Пертузумаб, Оминтарг	ОепетесЬ, КосЬе
Малые молекулы, нацеленные на
ЕОРК С1-1ОЗЗ (Ρϋ 183805) ЕКВ-569		ΡζιΓετ, 1пс
Гефэтиниб	Жезаа®	ΑίΙταΖεηεεα
Лапатиниб (О\У57201б)		О1ахо5тЛ|1К1|не
Лапатиниба дитознлат	ТукегЪ®	ЗтйЬКЬпе ВеесНат
ЭрлотинибНС! (081-77+)	Тагсеуа®	031 РНагта
РР 158780 ΡΚΙ-166 Тирфостин АО 1478 (4-(3-хлор- анилино)- 6,7-диметоксихиназолин)		Νον,οΦδ
Антитела гтотнв сте1 АУЕО (АУ299)		АУЕО
АМС102		Ат^еп
5ϋ5 (ΟΑ-5Ώ5)		СепеШесЬ
Малые молекулы, нацеленные на
ете! РНА665752 АКО-650КР		АгОи1е
АКО197		АгОи1е
Алкнлнптюшие агенты.
ВСКи~> 1,3- 6нс (2- хлорэтил)шггрозомочевнна Бендамустин Бусульфан	Милераи	С1ахо5ппЬК1|Пе
Карбоплатин Карбоквон	Параллатин	Вп$1о1-Муеге 3ςιιΐ№
Карму стин ССНШ-> 1-(2- хлорэтил)- 3- циклегексил- 1-нитроэомочевина (метил секи) Хлорамбуцил Хлорметнн	Лейкеран®	ЗтпНКНое ВеесНат
Цисплатин (С15р1аП11И1П, СБОР)	Платннол	Впз1о1-Мусгз
	Цитоксан	Вп5(о1-Муег5 ЗцшЬЬ
Циклофосфамид	Неосар	Тсуя Рагеп1ега1
Дакарбазин (ОТ1С) Фотемустин Гексамегилмеламии (Алтрегамин, НММ)	Гексален®	МС1 РНагта, 1пс
Ифосфамнд Лому стан	Мнтоксана ®	А5ТА МеФса
Манносульфан Мелфилан Недоплатил	Алкеран®	С1ахоЗтцНК1ше
Нимустин Оксалиплатин	Элоксатнн®	ЗапоЯ- ΑνβΜκ ЦЗ

- 66 022201

Преднимустнн, Прокарбазин НС1 Ингибитор рнбонуклеотидредуктазы ΚΝΚ) РанимуСтин Сатраплатин Се му стнн Стрептозоцин Темозоломид Треосульфан Триазнквон Трнэтнленмеламкн ТиоТЕПА (ТЬюТЕРА) Триплатина трикнграт Трифосфамнд УрамуСтнн	Матулан	51§та- Таи РЬагтасеиТзсак, 1нс. Вес1Гогс1, АЬгах18, Теуа
Антиметаболиты 5- Азацидин Флуоруращгл (5- Ри/Калецитабин 6- Меркалто пурин (Меркаптопурин, 6- МР) 6-Тиогуанин (6- ТС) Цитозин-арабинозид (Цитарабин, Ата-С) Азагиопрнн Капецигабнн Кладрибин (2* СбА, 2-хлордезоксиаденозин) 5- Трифторметил-21 - дезоксиурндин Флударабина фосфат Флоксирнднн (5- йиого- 2) Метотрексат натрия Пеметрексед Пенгостатин Ралтигрексед Тегафур	Пурннето.т®1 Тиогуаннн® Азаран® КСЕЛОДА® Лейстатин® Флудара® ФУДР (ШОК®) ТгехаЛ Алимта® Ннпект® Тому деке®	Теуа ОахоЗтйЬКЪпе ΑΑΙΡΗΑΚΜΑ ЬЬС НЬК (КосЬе) ОлЬо В зоЛесЬ. Вауег Неа1(Ь Саге Ηοδρίπι, 2пс. Вал· ину Ноерйа, 1пс. А51га2епеса
Ингибитоп аооматозы Кетоконазол
Глюкоконти коиды Дексаметазон Пре дни золой Пре дни зон	Декадрон® Дексазон, Диодекс, Гекадрол, Максидекс Дельтазон, Оразон, кадиМ Рге4. Стералред©	νννοτϊι, 1пс.
Иммунотеоапевтические спелства	Авастнн® Пролейкнн®	СепептесЬ СЫгоп
Альфа- интерферон Ингибитор ангиогенеза 1Ь-12-> Интерлейкин 12 1Ь-2—> Интерлейкин 2 (Альдеслейкнн)

- 67 022201

Интбитоиы киназ	Рецентин 5р1усе1® Гливек Та$1§па® Армана Нексавар® Сутент® Зактима	Атп^еп РГсег, 1пс АУуеШ ВМ5 А5Иа2епеса Вп5(с1-Муег5 5сциЬЪ ИоуагСз СерЬа1оп Ат^еи/Такеда Νονΰΐίυ С5К РНаппасш Вауег ΡίϊζβΓ, 1пс А5(га2епеса ИоуаШк, Вауег 5сЬепп£ РЬагта ЕхеЬтк, С5К
АМОЗВ6 Акситнннб (АС-013736) Босутиниб (5ΚΙ-606) Брнваннба аланинат (ВМ8-582664) Цежраннб (ΑΖΟ2171) Дазатнниб (ВМ5-354825) Иматиниба мезилат Лестауртиниб (СЕР-701) Мотезаниба дифосфат (АМО-706) Моногидрат иматиниба гидрохлорида Пазопанид НС1 (САУ786О34) Семаксаниб (5С5416) Сорафениба тозилат Сунитиннба малат Вавдетаниб (ΑΖΏ647) Ваталаииб, РТК-787 ХЬЛ84, Ν5€718781
Агенты* нацеленные на	Таксотере® ΙΧΕΜΡΚΑ™ Абраксан® Таксол® Велбан® Онковнн® Элдизнн® Навелбнн®	5апоВ- Ανεηΐκ υδ Вп5(о1-Муег5 5фиЬЬ АЬгахк ВюЗсгепсе, 1нс Вп5(о1-Муег$ &|шЬЪ Ы1у Ы1у ЕлИу Р]егге РаЪге
микротрубочки Доцетаксел Иксабепнлон Лоратаксел Ортатаксел Паклитаксел, наночастицы (ΑΒΙ-007) Паклитаксел Тезетаксел Вннбластина сульфат Вннкрнстнн Виндезнна сульфат Вннфлунин Виноре льбнна тартрат
Ингнб итэдьмпТОК	Цертнкан®, Афннитор Рапамун® Торисел®	ΑΚΙΑΒ РЬ&ппасеийсаЕ, 1нс ΝονπΛίδ УУуеШ РЬагта \Ууе11| РЬагта
Дефоролимус (АР23573, МК 8669) Эверолимус (ΚΑϋΟΟΙ, КАО001С) Сиролимус (Рапамицнн) Темснролимус (СС1-779)
Ингибитор синтеза белка Ь-аспарагиназа	Элспар®	Мегск & Со
Аналог соматостатина Октреотида ацетат	Сандостатин®	ΝονΗΐΐδ
Ингибиторы топоюомераз Актиномицин О Камптогецин (СРТ) Белотекай Даунорубицина цитрат Доксорубнцина гидрохлорид Этопозид	Дау ноксом® Доксил® Вепезцд® Этопофос	Сйеаа А1 га Вп51о1-Муег£ ЗсциЪЬ НоБрна, ВесИогб. Теха РагеШега!, ею

- 68 022201

Ирннотеадн НС1 (СРТ-11) Митоксзитрон НС1 Рубитекан Теннпозид (УМ- 26) Топоте кан НС1	Кампгосар® Новантрон Вумон® Гикам ин®	РЬаппасза & ир}о1т ΕΜΏ 5егопо ВпьЮГМуегз 8фиЬЬ С1ахо5пР1кК1]Пе
Химиотерапевтические агенты Адриамицин, 5-фторурадит цигокснн, блеомнинк, митомицин С. даупомниин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, мнтомнцины, эсперамнцнны, клофарабин, меркапгопурин, пентостатнн, тиогуанин, цитарабин, децитабин, флоксуридин, гемцитабнн (гемзар), эношгтабин, сапацитабин
Гормональная терапия
Абарелнн	Пленаюис1”	Атееп
Абиратерона ацетат	СВ763О	ВТО р1с
Афнмоксифен	Тапюбе!	А$сегк1 ТЬетареи<1С5.1пс
Анастразол	Арнмидекс®	Аз1га2епеса
Ингибитор ароматазы	Атаместан плюс торемнфен	1п(агс1а ТЬегароШю, 1пс
	Арзоксифен	Ей Ьй1у & Со
Азектар, ΡΝ-101		Νονίΐτίΐ5, Огс£оп НеаКЬ & 8с1епсе ϋων
Бикалутамид	Каэодекс®	Айгагепеса
Бузерелнн	Супрефект®	8апоГ) ΑνεπΟδ
Цетрореликс	Цетротвд®	ЕМО Бегопо
Экс(з)еместан	Аромастин®	РГеег
Экс(з)еместан	Х(апе	Ыа(со РНагта 1лй
Фадроэол (СС5 16949А)
Флутамнд	Эулексии®	ЗсЬеппе
Флутамнд	Просгакур	ЬаЬога1опо& АНтгаП,5 А
фулвестрает	Фазлодехс®	Айга/епеса
г озерелина ацетат	Золадехс®	А$(1аХепеса
Летрозол	Фемара®	ΝονίιΑι$
Летрозол (СС520267)	Фе мара	СЬи£ш РЬалпасеиЦса! Со , Γΐά
Летрозол	□строчек	Юдолла] ПиппасеиПса! Ш
Летрозол	Летрозол	ШсЬепне НеаИЬ Зреиайиеь
Лейпролида ацетат	Элигард®	ЗапоЛ Ανεηϋδ
Лейпролида ацетат	Леопрнл	УНВ 1лГе Заепсез, 1нс
Лейпролид а ацетат	Ьиргоп®/Ъиргоп ϋβροΐ	ТАРРЬаппа
Лейпролида ацетат	Виадор	Вауег АС
Мегестрола ацетат	Медасе®	Вп51оЬМуеге 5ций»Ь
Мегестрола ацетат	Эстрадиола валерат (делестроген)	Ίίι^ίοηρ,-ιΙ РЬагшасеи(1са1 Ш
Медроксилрогестерона ацетат	Вераплекс	СотЫрНаг
МТ206		Μεύΐδγη ТесЬлсйощев,1пс
Нафарелнн
Нандролона деканоат	Зесгаболин	Малкин! РЬаппа, 1лй
Ннлутамцд	Ннлацдрон®	Ауепйз РЬагтасеийса]з
Ралоксифен НС1	Эвиста®	ЬШу
Тамоксифен	Таксифен	Уивд 51ш1 РЬаттасеиЖа!
Тамоксифен	Томифен	А1кет ЬаЬогаЮпеа, ЬМ
Тамокснфена цитрат	Нолвадекс	Айгагепеса

- 69 022201

Тамокснфена цитрат	Солтамокс	ΕΙΙ5Α РЬагта, 1вс.
Тамокснфена цитрат	Тамокснфена цитрат ЗОРНАКМА	ЗорЬагта ЗЗСо.
Торемнфена цитрат	Фарестон®	СТХДпс.
Трипторелнна памоат	Трелстар®	Ά';ι·»)ιι ЬаЬа
Трипторелнна памоат	ТтсЫагОсро!	РМайш ЕаЬз,1пс.
Ингибитор протеинкиназ В (РКВ)
Акт ингибитор А5ТЕХ		Аз1ех ТНегареи11С5
Ак! ингибитор ΝΕΚνίΑΝΟ		КепТапо Ме<Ьса1Заепсез
Ингибитор АКТ киназы ТЕЫК		ТеНк 1пс.
АКТОЕС1РНЕКА		ОесгрЬега РЬагтасеибсак, ЬЕС
Перифознн (ККХ0401,0-21266)		Ксгух ВюрЬаппасеибса18,1ис., АЕ1ета 2епиа1й, 1пс.
Перифознн с доцетакселом		Кегух ВюрЬагтасеийсаЬ, 1пс„ АЫета Ζβηίτπϋε. Ιικ.
Перифознн с гемцигабином		АЫсгпа Ζεηϋρΐίε, 1пс.
Перифознн с пакслитакселом		Кегух ВюрЬагтасеийсаК 1пс., АЕ<ета ΖεηΙπϋίδ. 1пс.
Ингибитор протеинкиназ В ПЕУЕЬООЕК		Оеуе1оСеп АС
РХ316		ОпсоШугеоп, 1пс.
ΚΧΟΙ83		КехаЬп РЬаппаоеибсаЬ, 1пс.
КХО201		КехаЬп РЬагтасеийсаЕ, 1гс
У<£>002		УгоОиеЯ РЬагтасеиисаК 1пс.
ХЬ418		Ехе1т&, 1пс.
ΖΈΝ027		АЕКтагсйгаОа. 1нс.
Ингибитор Фосфатидилинозитол 3-
киназы 1РТЗК)
ΒΕΖ235		Коуагба АО
ВСТ226		ЫоуагЙ5 АС
СЛЬ101		СаНзЮйа РНагтасеибсаК 1пс,
СНЕ4432		СЬгота ТЬегареиОсз, ЫЙ
Е1к/Р13К ингибиторы ΕΤΕΚΝΑ		АЕ1ета2еп1га1К 1пс.
ОРС0941		СенегйесЬ 1пс./Рггатей ЕгтИей/КосЬе Но1йтд5. Ий.
Энззстаурин НСЬ (1.Υ317615)	Энзастаурин	Е1г ЬШу
ίΥ294002/ν/οιΙπϊϊΐπϋΐι
Ингибиторы Р13К 5ЕМАР0КЕ		БетаГоге РЬагтасеШгсак
РХ866		ОпсоСкугеоп, 1пс.
5Р1126		ЗетаГоге РЬагтасеиГгсаЕ
УМО- 8000		УМО15СОУегу, 1пс.
ХЬ 147		Εχβΐίχίδ, 1йС.
ХЫ47сХЬ647		ЕхеНх15,Ιικ.
ХЬ765		ЕхеЬхгз, 1пс.
ΡΙ-103		КосЬе/Рпате<1
Ингибиторы циклин-зависимых	Селицнклнб Алвоцидиб	Сус1асе1 РЬагта МС1
киназ СУС200, г- росковитнн Ν5€-64989Ο, Ь86-8275, НМК-1275
ТЬг9. СО289 [МОхпге ΗΥΒ2Ο55 ΙΜΟ- 2055 1018133 РР-3512676		Мегск КСаА 1йега 1515 РЬагта Оугшуах ТесЬпо1о£ге5/иСЗР РГкег
Ингибитор Ферментов Лонафарниб (5СН66336)	Сарасар	ЗирегСеп, и Алгола
Антитела против ТКАТЬ АМС-6 55 Аро2Ь/ТКА1Ь, АМС951 АротаЪ (аломаб, полностью гуманизированное тАЬ)		АЕгета ΖέττΤτρΙις, Кегух ВюрЬагта СеггемесЬ, Ат§еп ОепетесН
Противораковые агенты для	Мишень	Пгюизводитель/Владелец
комбинации с В2ВЗ-1
Другие [гпрпте РСС СНК-2797 Ε78Ι0, ЫЗС 719239 ПУСВ007839 СЫР2024 ΒΙΙΒ021 МР470, НРК- 56 5Ν0Χ- 275/М5- 275 Зарнестра, Типпфарниб, Й115777 Волоксимаб, Ео5 200-4, М200 Априкоксиб (ТР2001)	Аминопептидаза Μ1 Интегрин- альфа2 АО АМ] 7,ТАСЕ Нар90 КЯ/МеУКе! НОАС Каа альфа581 интегрин Ингибитор СОХ- 2	ВюЛега СЬгота ТЬегареиВса Бгеаг 1псу1е Вю£еп Мес ЗЬепи£- ΡΙοοβΙι Зупйах Залзасп РЬагта ВюееиМес, ЕЬ Ы1у/иЗСР/РОЬ ВюРЬагта РапсЬт Запкуо, Тгздага РЬагта

- 70 022201

Другие варианты изобретения

Хотя изобретение описано по отношению к конкретным его вариантам, понятно, что возможны дальнейшие модификации, и предполагается, что данное изобретение охватывает любые варианты, применения или адаптации изобретения, следующие в целом принципам изобретения и включающие такие отклонения от настоящего раскрытия, которые соответствуют известной и обычной практике в уровне техники, к которой относится изобретение, и могут быть применены к основным признакам, представленным выше.

Все публикации и патентные заявки, указанные в данном описании, вводятся в данное описание ссылкой в той же степени, как если бы конкретно и индивидуально указывалось, что каждая независимая публикация или патентная заявка вводится ссылкой во всей полноте.

Claims (37)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Агент, способный связываться с опухолевой клеткой и убивать опухолевую клетку или ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, содержащий линкер на основе человеческого сывороточного альбумина (Н8А), включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности 8Е0 ГО N0: 1, и содержащий первый связывающий элемент, связанный с аминоконцом Н8А линкера, и второй связывающий элемент, связанный с карбоксиконцом НА8 линкера, причем каждый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 или ЕгЬВ3, где:

   ί) когда первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3, второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2; и ίί) когда первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2, второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3.
2. 2. Агент по п.1, где линкер содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1.
3. 3. Агент по п.1 или 2, дополнительно содержащий полипептидные коннекторы на амино- и/или карбоксиконце НА8 линкера, которые ковалентно связывают первый и/или второй элемент с Н8А линкером, причем каждый из полипептидных коннекторов содержит от 2 до 20 аминокислотных остатков.
4. 4. Агент по любому из пп.1-3, в котором первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3.
5. 5. Агент по любому из пп.1-3, в котором первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3 и второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2.
6. 6. Агент по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что первый или второй связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела Ру.
7. 7. Агент по п.6, отличающийся тем, что молекула одноцепочечного антитела Ру является молекулой человеческого или гуманизированного антитела.
8. 8. Агент по п.5, в котором первый связывающий элемент связывает ЕгЬВ3 с К_с от 1 до 50 нм.
9. 9. Агент по п.5, в котором второй связывающий элемент связывает ЕгЬВ2 с К_с от 0,01 до 10 нм.
10. 10. Агент по п.8, где К_с составляет около 16 нм.
11. 11. Агент по п.9, где К_с составляет около 0,3 нм.
12. 12. Агент по п.6, где первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и представляет собой зсРу, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, 29 или 32, и где второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3 и представляет собой зсРу, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26, 28, 30 или 31.
13. 13. Агент по п.6, где первый связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ3 и представляет собой зсРу, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26, 28, 30 или 31, и где второй связывающий элемент специфически связывает ЕгЬВ2 и представляет собой зсРу, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, 29 или 32.
14. 14. Агент по п.13, в котором первый связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 26 и второй связывающий элемент имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27.
15. 15. Агент по любому из пп.1-14, период полужизни которого ш У1уо составляет от 6 ч до 7 дней.
16. 16. Агент по п.15, период полужизни которого ш У1уо составляет более 8 ч.
17. 17. Агент по любому из пп.1-16, в котором Н8А линкер содержит аминокислотные остатки 25-44 и аминокислотные остатки 494-513 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
18. 18. Агент по любому из пп.1-16, в котором Н8А линкер содержит аминокислотные остатки 25-70 и аминокислотные остатки 450-513 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
19. 19. Агент по любому из пп.1-16, в котором Н8А линкер содержит аминокислотные остатки 15-100 и аминокислотные остатки 400-520 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
20. 20. Агент по любому из пп.1-16, в котором Н8А линкер содержит аминокислотные остатки 10-200 и аминокислотные остатки 300-575 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.
21. 21. Агент по любому из пп.1-16, в котором Н8А линкер содержит аминокислотные остатки 5-250 и аминокислотные остатки 275-580 аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

    - 71 022201
22. 22. Агент по п.1, где НЗА линкер содержит сериновый остаток в положении 34 последовательности 3ΕΡ ΙΌ Ν0: 1 и глутаминовый остаток в положении 503 последовательности 3ΕΡ ΙΌ Ν0: 1.
23. 23. Агент по любому из пп.1-3, где первый связывающий элемент связывает Εφβ3 с К_о от около 1 до около 50 нм и где второй связывающий элемент связывает Εφβ2 с К_о от около 0,01 до около 10 нМ.
24. 24. Агент по любому из пп.1-23, где первый связывающий элемент связывает Εφβ3 с К_о равной около 16 нМ и где второй связывающий элемент связывает Εφβ2 с К_о равной около 0,3 нМ.
25. 25. Агент по любому из пп.1-24, который является стабильным, сохраняя сравнимую способность связывать как Εφβ2, так и Εφβ3 до и после инкубации в сыворотке человека при 37°С в течение 120 ч.
26. 26. Набор, включающий агент по любому из пп.1-25 в упаковке с инструкцией по приему агента пациентом.
27. 27. Применение агента по любому из пп.1-25 для лечения млекопитающего, имеющего пролиферативное заболевание, которое ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из Ε^ЬВ2 и Ε^ЬВ3.
28. 28. Применение по п.27, при котором пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.
29. 29. Применение по любому из пп.27, 28, при котором млекопитающее представляет собой человека.
30. 30. Способ получения агента по любому из пп.1-25, включающий:

    (ί) обеспечение экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей агент, в бактериальной, дрожжевой или клетке млекопитающего или в ткани, органе или организме млекопитающего, не являющегося человеком; и (ίί) выделение агента.
31. 31. Способ по п.30, где агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит последовательность линкера 3ΕΟ ΙΌ Ν0: 1.
32. 32. Способ по п.30, где агент, кодируемый молекулой полинуклеотида, содержит первый связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность 3ΕΡ ΙΌ Ν0: 26, 28, 30 или 31, и второй связывающий элемент, имеющий аминокислотную последовательность 3ΕΡ ΙΌ Ν0: 27, 29 или 32.
33. 33. Фармацевтическая композиция для лечения пролиферативного заболевания, ассоциированного с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из Εφβ2 и Ε^ЬВ3, содержащая агент по любому из пп.1-25, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или растворителем.
34. 34. Фармацевтическая композиция по п.33, представляющая собой раствор, содержащий 25 мг/мл агента.
35. 35. Применение фармацевтической композиции по п.33 для лечения человека, имеющего пролиферативное заболевание, которое ассоциируется с передачей сигнала в клетках с помощью рецептора на поверхности клетки, выбранного из Ε^ЬВ2 и Ε^ЬВ3.
36. 36. Применение по п.35, где пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль.
37. 37. Применение по любому из пп.35, 36, где пролиферативное заболевание представляет собой меланому, светлоклеточную саркому, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак эндометрия, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак слюнной железы, рак легкого, рак печени, рак кожи или рак головного мозга.