CN110283826A - 一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents

一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用，该核酸适体包括第一核酸序列、第二核酸序列；第一核酸序列包括靶标受体特异性核酸适体和第一连接部分，第二核酸序列包括配对受体特异性核酸适体和第二连接部分；靶标受体特异性核酸适体可与靶标受体特异性结合，配对受体特异性核酸适体可与配对受体特异性识别；第一连接部分与第二连接部分形成连接结构。从而使两个核酸适体能够形成稳定的双特异性核酸适体结构。该双特异性核酸适体及其衍生物能够阻碍配体对靶标受体的结合与激活，从而进一步影响细胞功能。本发明的技术方案提高了核酸适体对受体及细胞功能的调控效率。

Description

一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及核酸适体领域、核酸适体药物、蛋白功能调控领域，具体为一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用，尤其涉及核酸适体作为药物在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
细胞膜表面的受体蛋白参与调控细胞的大多数生理和病理过程，如细胞周期、细胞交流、细胞分化、免疫应答、细胞凋亡、细胞增殖以及细胞迁移等。值得注意的是，在生物学的研究中，由于细胞膜表面的受体蛋白参与了许多疾病的发生和发展，例如补体受体常与炎症有关，蛋白酪氨酸激酶（PTKs）受体常与癌症有关，因此这些膜受体蛋白也常被用作药物作用的靶点，通过激活或者抑制这些靶点有助于相关疾病的治疗。
目前，已发展了许多用于调控细胞表面受体蛋白活性的技术，如利用超声、磁、光等都可以调控细胞的信号通路。但这些物理的调控方式往往是作用于整个细胞，缺乏分子特异性和时空分辨率，对细胞的损伤较大。为了克服这些缺陷，许多研究报道了利用小分子或者单克隆抗体代替物理刺激调控蛋白功能。但许多合成的小分子发挥作用的靶点都不止一个，会同时影响多个信号通路，产生副作用；而单克隆抗体成本高、免疫原性高、热稳定性差等缺点，也大大限制了其在生物医学等研究领域的应用。
因核酸适体与靶标作用的形式与抗体类似，也被称为“化学抗体”。有研究报道，核酸适体通过折叠成特殊的三维结构与靶标蛋白进行高亲和性结合，从而调控靶标蛋白的活性。但是这种单一的单受体蛋白调控方式效率较低，且一些疾病细胞上过表达的蛋白在正常细胞上也会有表达，易造成非靶标细胞的毒副作用。因此迫切需要发展一种新的策略，能够高效并特异性地调控受体蛋白的活性。
细胞表面会同时表达多种膜受体蛋白，因此同时靶向细胞表面多个受体蛋白能够提高对细胞功能调控的特异性，从而提高疾病诊断和治疗的准确性。本发明首次提出了利用双特异性核酸适体探针人工诱导蛋白配对，从而高效并特异性地调控受体蛋白的功能，最终调控细胞的迁移行为。此外，由于选用的配对受体是肿瘤细胞高表达的膜蛋白，因此所构建的双特异性核酸适体对于该蛋白表达量低或者不表达的细胞不会造成功能影响。总而言之，该双特异性核酸适体在细胞表面受体蛋白和细胞行为的调控效率和特异性方面有较大的提高，降低了非靶细胞毒性，对精准诊疗的推进具有重要意义，且具有作为蛋白功能和细胞行为抑制剂的潜能。
发明内容
本发明的技术构思在于：提供一种双特异性核酸适体，双特异性核酸适体由两个传统意义上的“核酸适体”复合而成，通过两个“核酸适体”形成连接结构，从而使两个“核酸适体”能够形成稳定的双特异性核酸适体结构。
本发明要解决的技术问题包括但不限于以下任一个或多个：如何实现核酸适体的双特异性；如何实现核酸适体对靶标受体的功能调控或达到干扰受体相关信号通路的效果；如何实现核酸适体对受体及细胞功能的调控作用；如何实现肿瘤细胞的治疗等。
为解决以上任一个或多个技术问题，本发明提供的具体技术方案如下。
本发明的第一方面提供了一种双特异性核酸适体，所述核酸适体包括第一核酸序列、第二核酸序列；所述第一核酸序列包括靶标受体特异性核酸适体和第一连接部分，所述第二核酸序列包括配对受体特异性核酸适体和第二连接部分；所述靶标受体特异性核酸适体可与靶标受体特异性结合，所述配对受体特异性核酸适体可与配对受体特异性识别；所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构。
对于靶标受体的分布，进一步的，本技术方案针对跨膜受体的作用更为明显和简易，所述靶标受体为第一跨膜受体、所述配对受体为第二跨膜受体。
对于靶标受体的激活方式，进一步的，所述靶标受体的受体激活方式为受体二聚化、寡聚化或多聚化。
更进一步的，所述靶标受体的受体激活方式为配体依赖的受体二聚化、寡聚化或多聚化。
更进一步的，为了进一步提高作用效果，尤其是竞争性阻碍的效果，所述配体、所述靶标受体特异性核酸适体与所述靶标受体的结合位点相同或接近。
对于杂交部分的长度要求，进一步的，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离增加或缩小。
更进一步的，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小。
更进一步的，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小至靶标受体、配对受体形成阻碍所述靶标受体激活的空间位阻。
更进一步的，为使空间位阻的阻碍效果最大化，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小至靶标受体、配对受体形成异二聚体。
可选择的，针对连接部分形成连接结构的方式包括以下几种：所述第一连接部分与所述第二连接部分通过相互杂交形成双链结构、通过亲和作用形成的连接结构、通过共价键连接形成连接结构，或者所述第一核酸序列、第二核酸序列直接合成为一条核酸序列使得所述第一连接部分与所述第二连接部分直接形成连接结构。
针对特定的应用时，更优的，所述靶标受体为肿瘤细胞高表达受体。
针对特定的应用时，为进一步提高技术效果，所述配对受体为肿瘤细胞高表达受体。
本发明的第二方面提供了上述的双特异性核酸适体在制备药物或制备蛋白功能调控分子中的应用。
本发明的第三方面提供了上述的双特异性核酸适体的衍生物。
本方面中所谓的“衍生物”是指在不改变上述双特异性核酸适体的特异性识别性能的基础上，通过任意化学反应实现的对上述双特异性核酸适体的修饰。
本发明的第四方面提供了上述的双特异性核酸适体的衍生物在制备药物或制备蛋白功能分子调控中的应用。
本发明的第五方面提供了上述的双特异性核酸适体的制备方法，具体方法步骤为，
s1.合成所述第一核酸序列；
s2.合成所述第二核酸序列；
s3. 使所述第一连接部分与所述第二连接部分相互杂交形成双链结构、通过亲和作用形成的连接结构或者通过共价键连接形成连接结构；
s4.得到所述双特异性核酸适体。
本发明的第六方面提供了上述的双特异性核酸适体的另一制备方法，具体方法步骤为，
s1.确定所述第一核酸序列；
s2.确定所述第二核酸序列；
s3. 将所述第一核酸序列、第二核酸序列直接合成为一条核酸序列使得所述第一连接部分与所述第二连接部分直接形成连接结构；
s4.得到所述双特异性核酸适体。
尤其更进一步的，针对本发明提供的第一至第五方面的内容，列举相关更进一步的实例性内容如下：
所述肿瘤细胞为人前列腺癌细胞DU145、人宫颈癌细胞Hela、人胃癌MKN-45细胞、人肝癌细胞HepG2、人非小细胞肺癌A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM）等；具体的，以人前列腺癌细胞DU145为例。
所述靶标受体为肿瘤细胞表面高表达跨膜受体，间质表皮转化因子受体（Met）、表皮生长因子受体（EGFR）、人类表皮生长因子受体2（HER2）、血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）、转移生长因子β受体（TGFβR）、肿瘤坏死因子受体（TNFR）等；具体的，以间质表皮转化因子受体（Met）为例。
所述靶标受体的受体激活方式为配体依赖的受体二聚化、寡聚化或多聚化，其中配体为肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGFβ）、肿瘤坏死因子（TNF）等；具体的，以肝细胞生长因子（HGF）为例。
所述配对受体为肿瘤细胞表面高表达跨膜受体，转铁蛋白受体（TfR）、核仁素（Nucleolin）、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、粘蛋白（MUC1）、蛋白质酪氨酸激酶7（PTK7）、表皮生长因子受体（EGFR）等；具体的，以转铁蛋白受体（TfR）为例。
所述双特异性核酸适体（Apt-Met-TfR）中包括的第一核酸序列为ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATAAGTAGAACGTTATGACTAA，第二核酸序列为GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTAGTCATAACGTTCTAC；所述第一核酸序列包括的靶标受体特异性核酸适体和第一连接部分分别为ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT和GTAGAACGTTATGACTAA；所述第二核酸序列包括的配对受体特异性核酸适体和第二连接部分分别为GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCC和TTAGTCATAACGTTCTAC。
所述第一连接部分与所述第二连接部分相互杂交形成18bp双链结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体（Apt-Met-TfR）的靶标受体Met、配对受体TfR之间的空间距离缩小，形成Met与TfR的异二聚体，在Met受体周围形成空间位阻，阻碍HGF与Met结合并诱导形成Met二聚体。
所述双特异性核酸适体的制备方法为：
s1.合成所述第一核酸序列ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATAAGTAGAACGTTATGACTAA；
s2.合成所述第二核酸序列GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTAGTCATAACGTTCTAC；
s3.在磷酸缓冲液中按1：1的摩尔浓度比例混合第一核酸序列与第二核酸序列；
s4. 在25℃下反应15分钟得到所述双特异性核酸适体Apt-Met-TfR。
本发明提供了所述的双特异性核酸适体在制备药物中的应用，如抗肿瘤细胞增殖药物、抗肿瘤转移药物、诱导肿瘤细胞凋亡药物等。
本发提供了所述的双特异性核酸适体的衍生物，包括将双特异性核酸适体序列用人造碱基代替、将双特异性核酸适体骨架用硫代磷酸酯骨架代替、将双特异性核酸适体序列改造为肽核酸、将双特异性核酸适体序列用聚乙二醇修饰后仍具有与所述双特异性核酸适体相同功能的衍生物。
本发明的有益效果在于：首次开发双特异性核酸适体、衍生物的制备方法及应用。进一步的，将双特异性核酸适体药物用于调控肿瘤细胞表面高表达的受体功能。双特异性核酸适体能特异性识别两种肿瘤细胞高表达受体：靶标受体和配对受体。通过核酸适体末端互补序列形成的双链DNA结构等连接结构的形式将改变两个受体的空间距离。由于配对受体的靠近，在靶标受体周围形成明显的空间位阻，阻碍了配体对靶标受体的结合与激活，从而进一步影响细胞功能。该双特异性核酸适体提高了核酸适体对受体及细胞功能的调控作用。再进一步的，将双特异性核酸适体用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1为双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR调控受体功能的示意图。
图2为（A）双特异性核酸适体药物结构示意图。（B）不同核酸适体药物结构的PAGE胶成像图。Lane 1：Apt-Me针；lane 2：Apt-TfR；lane 3：Apt-Met-TfR。（C）不同核酸适体药物的荧光光谱图。
图3为（A）DU145细胞与不同的核酸适体药物孵育的流式细胞术分析图。（B）DU145细胞与不同的核酸适体药物孵育的激光共聚焦成像图。标尺：50 μm。
图4为蛋白质印迹分析DU145细胞Met和p-Met的表达水平。
图5为蛋白质印迹分析DU145细胞与不同浓度的双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR（0-50 nM）孵育后的Met和p-Met的表达水平。
图6为蛋白质印迹分析DU145细胞与不同浓度的Met 核酸适体（0-1000 nM）孵育后的Met和p-Met的表达水平。
图7为蛋白质印迹分析DU145细胞与不同浓度的Met抑制剂ARQ 197（0-3000 nM）孵育后的Met和p-Met的表达水平。
图8为蛋白质印迹分析（A）DU145细胞和（B）MKN-45细胞上Met、Akt、Erk、p-Met、p-Akt、p-Erk的表达水平。
图9为蛋白质印迹分析DU145细胞上Met和p-Met的表达水平。
图10为（A）蛋白质印迹和（B）激光共聚集成像分析L02细胞和DU145细胞上Met蛋白和TfR蛋白的表达水平。标尺：25 μm。
图11为蛋白质印迹分析L02细胞上Met和p-Met的表达水平。
图12为划痕修复实验分析核酸适体药物对HGF诱导的DU145细胞迁移行为的影响。
图13为散射实验分析核核酸适体药物对HGF诱导的DU145细胞迁移行为的影响。标尺：200 μm。
图14为Transwell细胞迁移实验分析核酸适体药物对HGF诱导的DU145细胞迁移行为的影响。
图15为对DU145细胞运动情况追踪的显微镜成像图。标尺：100 μm。
具体实施方式
以下，使用实施例和对比例更加详细地说明本发明的具体实施示例，本发明的技术范围不限于以下实施例。
为直观的表现本发明实施例与对比例的技术内容，参见图1做如下解释：
如图1所示，本发明实施例（图1中左侧部分）中选用参与肿瘤细胞发生发展过程的间质表皮转化因子（Met）受体蛋白作为靶标受体。Met受体是肝细胞生长因子（HGF）的同源受体，HGF通过与Met受体结合并促进Met受体形成二聚体从而激活Met受体，促进细胞发生迁移。此外，选用肿瘤细胞高表达的转铁蛋白受体（TfR）作为配对受体。构建双特异性核酸适体药物，命名为Apt-Met-TfR。该药物与细胞孵育后能够同时靶向Met受体和TfR受体，并将这两个受体拉近，诱导这两个受体形成人工受体异二聚体。值得注意的是，配对受体TfR的靠近，在靶标受体Me附近形成一个明显的空间位阻，阻碍了HGF配体与Met受体的结合，抑制了Met受体信号通路的激活，从而进一步抑制细胞的迁移行为，且该抑制效果较单条核酸适配体探针的效果更好。
本具体实施方式中涉及的实验用品及相关验证方法如下：
化学试剂：实验用水均为Milli-Q Integarl纯水/超纯水一体化系统净化的超纯水(18.2 MΩ•cm)。实验所用DNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化。GelRed核酸染色液、RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒均购买于碧云天生物技术有限公司。磷酸缓冲液（PBS）、MEM培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、双抗（青霉素/链霉素）、胎牛血清（FBS）、Lipofectamine 3000、Hoechst 33342以及ECL Plus超敏发光液购买于美国LifeTechnologies公司。蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂均购买自美国Roche公司。结晶紫和1%多聚甲醛购买于北京索莱宝科技有限公司。Met受体小分子抑制剂ARQ 197购买于美国AdooQBioscience公司。重组人HGF因子购买于美国PeproTech公司。抗Met抗体、抗磷酸化Met抗体、抗Erk抗体, 抗磷酸化Erk抗体、抗Akt抗体、抗磷酸化Akt抗体以及标记HRP的抗兔抗体均购买于美国Cell Signaling Technology公司。人前列腺癌细胞系DU145和人正常肝细胞系L02购买自中科院上海细胞库，人胃癌MKN-45细胞系购买自武汉大学细胞库。
实施例1
选用参与肿瘤细胞发生发展过程的间质表皮转化因子（Met）受体蛋白作为靶标受体，选用肿瘤细胞高表达的转铁蛋白受体（TfR）作为配对受体。Met的核酸适体和TfR的核酸适体末端分别添加互补DNA序列，即单特异性核酸适体Apt-Met与Apt-TfR，二者按1：1混合，室温振荡孵育15分钟，形成双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR。
本实施例1中Apt-Met和Apt-TfR的序列参见表1。
对比例1
直接以实施例1中的Apt-Met或Apt-TfR单独作为核酸适体药物，其余实验条件均相同。
表1 实施例1与对比例1中所用的DNA序列
实施例2
选用参与肿瘤细胞发生发展过程的间质表皮转化因子（Met）受体蛋白作为靶标受体，选用肿瘤细胞高表达的核仁素（Nucleolin）作为配对受体。Met的核酸适体和Nucleolin的核酸适体末端分别添加互补DNA序列，即单特异性核酸适体Apt-Met与Apt-Nucleolin，二者按1：1混合，室温振荡孵育15分钟，形成双特异性核酸适体药物Apt-Met-Nucleolin。
本实施例2中Apt-Met和Apt-Nucleolin的序列参见表2。
对比例2
直接以实施例2中的Apt-Met或Apt-Nucleolin单独作为核酸适体药物，其余实验条件均相同。
表2 实施例2和对比例2中采用的的DNA序列
（一）相关实验过程
将实施例1、对比例1、实施例2、对比例2中的相关核酸适体药物进行以下相关实验：
A. 荧光检测
50 nM的Apt-Met-Cy5与50 nM Apt-TfR-Cy3室温振荡孵育15分钟，用日立F-4600荧光分光光度计对Cy5荧光的变化情况进行检测。仪器设定的激发波长为520 nm，检测的发射波长为540-750 nm。
B. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析：
Apt-Met与Apt-TfR按1：1混合，室温振荡孵育15分钟。在1×TBE缓冲液中用PAGE胶进行电泳。电泳后凝胶用GelRed核酸染色液染色，并用凝胶成像仪进行成像分析。
C. 流式细胞术分析
DU145细胞提前在含有0.5% BSA的MEM饥饿液中饥饿培养24小时。饥饿后，弃除培养基，PBS洗涤细胞2次，用0.2% Na2EDTA消化细胞，并收集于1.5 mL离心管中，细胞计数，每个样细胞数约为3×105个细胞。细胞分别与50 nM Apt-Met-Cy5，Apt-TfR-Cy3探针以及Apt-Met-Cy5和Apt-TfR-Cy3室温振荡孵育30分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞3次，用FACS CantoTMⅡ流式细胞分析仪分析。实验数据用FlowJo 7.6软件进行分析处理。
D. 共聚焦荧光成像
细胞提前接种于35 mm的共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后，培养液换成含有0.5% BSA的MEM培养液饥饿培养24小时。对于细胞表面DNA探针发生FRET的成像分析实验，细胞饥饿培养后，分别与50 nM Apt-Met-Cy5探针，Apt-TfR-Cy3以及Apt-Met-Cy5和Apt-TfR-Cy3室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，用激光扫描共聚焦显微镜进行成像分析。
E. 蛋白质印迹分析
细胞提前24小时接种于6孔板中，随后在饥饿液（MEM培养基 + 0.5% BSA）中饥饿培养24小时。
对于核酸适体药物的抑制实验，细胞先与不同浓度的Apt-Met、Apt-TfR或者Apt-Met-TfR室温孵育15分钟，然后再加入30 ng/mL HGF室温再孵育30分钟。
对于Met受体的小分子抑制剂ARQ 197的抑制实验，细胞先与不同浓度的ARQ 197孵育24小时，然后再加入30 ng/mL HGF孵育30分钟。
孵育结束后，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）裂解细胞。细胞裂解后所提取的蛋白用8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离，并将分离后的蛋白转移到PVDF膜上，剪下相应的条带，用5%奶粉/TBST封闭2小时。封闭后，PVDF膜分别与Met的抗体、磷酸化Met的抗体、Erk的抗体、磷酸化Erk的抗体、Akt的抗体、磷酸化Akt的抗体在4 ℃中孵育过夜，1×TBST洗3次，再与标记HRP的抗兔抗体室温孵育1小时，1×TBST洗3次，加入ECL Plus超敏发光液，并用凝胶成像仪进行成像分析。
F. 细胞划痕修复实验
提前24小时将DU145细胞接种于12孔板中，培养至细胞完全贴壁并铺满孔底。在饥饿液中培养24小时后，用无菌的20 μL枪头尖端在孔底中央均匀地划一条直线，用D-PBS冲洗细胞3次，除去漂浮的细胞碎片，更换新鲜的饥饿液，并用倒置显微镜对划痕区域进行成像，该划痕面积即为t = 0时刻的划痕面积。随后对细胞进行不同的处理：1）细胞在饥饿液中继续培养；2）细胞与30 ng/mL HGF孵育12小时；3）细胞先与50 nM Apt-Met孵育15分钟，再加入30 ng/mL HGF继续孵育12小时；4）细胞先与50 nM Apt-Met-TfR孵育15分钟，再加入30 ng/mL HGF继续孵育12小时。细胞在孵育期间分别记录0小时，4小时和12小时的划痕区域变化图像，并用Image J图像分析软件进行划痕面积的分析。
G. Transwell细胞迁移实验
DU145细胞提前接种于Transwell的上室中，待细胞贴壁后，更换饥饿液，培养24小时。随后对细胞进行不同的处理：1）细胞在饥饿液中继续培养；2）细胞与30 ng/mL HGF孵育12小时；3）细胞先与50 nM Apt-Met孵育15分钟，再加入30 ng/mL HGF继续孵育12小时；4）细胞先与50 nM Apt-Met-TfR孵育15分钟，再加入30 ng/mL HGF继续孵育12小时。孵育结束后，用湿棉签轻轻擦拭除去上室内的细胞，PBS洗涤2次，1%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，PBS洗涤，用倒置荧光显微镜观察并计数，以迁移至滤膜下表面的细胞数目差异来区别DU145细胞的迁移能力。
H. 细胞散射实验
将DU145细胞接种于6孔板中，每个孔的细胞数约为1000个细胞，培养3天后，将完全培养液更换为饥饿液。饥饿培养24小时后，对细胞进行不同的处理：1）细胞在饥饿液中继续培养；2）细胞与30 ng/mL HGF孵育12小时；3）细胞先与50 nM Apt-Met孵育15分钟，再加入30ng/mL HGF继续孵育12小时；4）细胞先与50 nM Apt-Met-TfR孵育15分钟，再加入30 ng/mLHGF继续孵育12小时。孵育结束后，用倒置荧光显微镜观察细胞的分布情况。
J. 单细胞迁移实验
将DU145细胞接种于35 mm的共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后，继续饥饿培养24小时。用Hoechst 33342对细胞核进行染色。PBS洗2次后，细胞与50 nM Apt-Met或者50 nM Apt-Met-TfR孵育15分钟后，再加入30 ng/mL HGF继续孵育2小时，并用转盘式共聚焦进行实时成像，每隔20分钟成像一次。用尼康NIS-Elements软件对单细胞迁移轨迹进行统计和分析。
（二）相关实验结果
A. 双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR的构建和表征：
双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR是由靶向Met受体的aptamer（Apt-Met）和靶向TfR的aptamer（Apt-TfR）组成，这两条核酸适体的末端各延长出一段18个碱基能够相互互补的序列，从而使Apt-Met和Apt-TfR能够形成稳定的双特异性核酸适体Apt-Met-TfR（图2A）。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱考察了Apt-Met-TfR的形成。当两条核酸适体共同孵育后，形成杂交探针，DNA的迁移速率变慢（图2B），且能产生FRET信号（图2C），结果表明在溶液中Apt-Met和Apt-TfR能够相互杂交，形成稳定的Apt-Met-TfR，即双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR构建成功。为了考察构建的Apt-Met-TfR在细胞膜表面是否依然具有受体识别的能力，我们通过流式细胞术和共聚焦证实了当细胞与Apt-Met-TfR孵育时，在细胞上能够同时检测到Apt-Met的Cy5信号和Apt-TfR的Cy3信号（图3），说明我们构建的Apt-Met-TfR在细胞膜表面依然具有受体识别的能力。以上实验结果说明了我们设计的Apt-Met和Apt-TfR能够高效地杂交成Apt-Met-TfR，并且在细胞膜表面依然具有高特异性的靶向识别能力。
B. 双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对Met受体信号通路的抑制作用：
我们假设双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR将Met受体和TfR受体拉近形成人工诱导的受体异二聚体，能够抑制HGF引起的Met受体二聚化，从而抑制Met受体信号通路的激活。为了验证这个假设，我们首先通过蛋白质印迹分析考察了不同处理条件下Met磷酸化水平的差异。如图4所示，当细胞与Apt-Met-TfR预孵育后，再与HGF孵育，Met磷酸化的水平明显降低。而当细胞与Apt-Met或者Apt-TfR孵育后，再与HGF孵育，Met磷酸化水平与只用HGF处理的相当，没有起到抑制Met磷酸化的作用。同时，我们也对比了不同处理对Met磷酸化抑制的IC50值的差异。双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对Met磷酸化水平抑制的IC50值约为20 nM（图5），远远低于单特异性核酸适体药物Apt-Met（IC50约为750 nM）（图6）和ARQ 197（IC50约为1000 nM）（图7）对Met磷酸化水平抑制的IC50值。此外，我们还考察了该策略在其他表达Met和高表达TfR的细胞系（如Hela细胞系）上的可行性。以上实验结果说明，双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR能够高效地将Met受体和TfR受体拉近形成人工诱导的受体异二聚体，抑制HGF引起的Met受体二聚化，从而抑制Met受体信号通路的激活，且该抑制效果明显优于单特异性核酸适体药物Apt-Met起到的抑制效果。
接下来我们考察了双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对Met受体下游信号通路（如Akt和Erk）的抑制作用（图8A）。当DU145细胞与Apt-Met-TfR孵育后，细胞内Akt和Erk分子的磷酸化水平明显降低，而与单特异性核酸适体药物Apt-Met或者Apt-TfR孵育后，细胞内Akt和Erk分子的磷酸化水平几乎没有改变。另外，值得注意的是，Apt-Met-TfR不能抑制配体不依赖性的受体激活。在本研究中，我们选了MKN-45细胞作为模型细胞，该细胞高表达Met受体，在无配体HGF存在时，该Met受体便可发生自二聚，形成有活性的二聚体。如图8B所示，当MKN-45细胞与Apt-Met-TfR探针孵育后，细胞内Akt和Erk分子的磷酸化水平与没有加入核酸适配体探针的对照组相比没有区别，说明Apt-Met-TfR对配体不依赖型的受体的激活无抑制作用。以上实验结果表明，Apt-Met-TfR只适于抑制配体依赖型的信号通路的激活，而不适于对配体不依赖型的信号通路激活的抑制。同时，该结果也进一步证实了我们的假说，即Apt-Met-TfR通过将TfR受体与Met受体拉近，提高了Met受体的空间位阻，阻遏了HGF配体与Met受体的作用，从而抑制了Met受体信号通路的激活，而对于配体不依赖的受体的激活，无需配体与受体的相互作用，因此空间位阻不影响受体的活性。
实施例2中，为了进一步考察该策略对于其他配对蛋白的通用性，我们选用肿瘤细胞高表达的核仁素代替TfR作为另一配对受体的模型，设计双特异性核酸适体药物Apt-Met-Nucleolin。当Apt-Met-Nucleolin与DU145细胞一起孵育后，将核仁素与Met蛋白拉近，形成的人工受体异二聚体对Met磷酸化水平的抑制效果与Apt-Met-TfR对Met磷酸化水平的抑制效果相似（图9），说明了我们提出的策略对于其他配对受体的通用性。
C.双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对Met受体信号通路抑制的细胞特异性：
为了进一步考察双特异性核酸适体药物AA pt-Met-TfR对Met受体信号通路抑制作用的细胞特异性，我们选取了低表达TfR的人正常肝细胞系L02作为实验细胞。首先，我们利用蛋白质印迹法（图10A）和激光共聚焦成像（图10B）比较DU145细胞系和L02细胞系上Met和TfR表达量的差异，结果显示，L02细胞系TfR表达水平确实较DU145细胞系低。当Apt-Met-TfR探针与L02细胞孵育后，该探针对L02细胞Met磷酸化水平抑制作用的IC50值为250 nM（图11），约为高表达TfR的DU145细胞Met磷酸化水平抑制作用IC50的12倍，表明该探针只对配对蛋白（TfR）高表达的细胞的Met信号通路有较明显的抑制作用，而对配对蛋白低表达的细胞的Met信号通路影响较小，即该探针能够特异性地作用于靶标细胞，对其他细胞造成的毒副作用较小。
D. 双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对DU145细胞迁移行为的抑制：
HGF/Met信号通路参与调控细胞的迁移行为，而细胞的迁移往往与肿瘤细胞的转移有关。我们考察了双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR是否能够抑制Met信号通路激活引起的细胞迁移。首先，我们通过划痕实验对其进行验证，如图12所示，DU145细胞用Apt-Met-TfR处理后，划痕愈合的速度明显慢于用Apt-Met和未经探针处理的细胞。同时我们还利用散射实验对其进行考察，如图13所示，DU145细胞不进行任何刺激时，细胞形成团聚的群落；当细胞用HGF刺激后，细胞迁移能力增加，细胞团聚的群落散开，呈散射状；当细胞与Apt-Met-TfR孵育后再用HGF刺激，细胞群落依然呈团聚状，而用Apt-Met处理的细胞群落则呈散射状。另外，在Transwell实验中（图14），用Apt-Met-TfR处理后，迁移到膜另一侧的DU145细胞明显少于用Apt-Met处理处理的细胞。以上实验结果说明Apt-Met-TfR能够抑制HGF诱导的DU145细胞的迁移行为。为了进一步验证双特异性核酸适体药物Apt-Met-TfR对细胞迁移行为的抑制作用。我们利用转盘式共聚焦对单细胞的运动行为和迁移轨迹进行考察，如图15所示，相对于与孵育Apt-Met和未孵育核酸药物的细胞，与Apt-Met-TfR孵育后的细胞的运动距离明显更短。以上实验结果说明Apt-Met-TfR能够很好地抑制HGF诱导的细胞迁移行为，且具有作为新兴核酸抑制剂的潜能。
在发明中，我们构建了一种双特异性核酸适体药物，实现人为诱导受体配对，形成人工受体异二聚体，通过调控Met受体的信号通路进而调控细胞的迁移行为。该探针不仅比单特异性核酸适体药物更高效地抑制Met受体的信号通路，而且更特异性地作用于靶标细胞，避免对非靶标细胞的影响。且本研究用DNA作为调控元件，也使得该调控策略在设计上更简单，在应用上也具有更广泛的通用性，可以通过简单更换核酸适体的序列使其适用于各种类型的受体功能调控。因此，我们构建的双特异性核酸适体药物在细胞的信号通路和细胞行为的调控领域具有广泛的应用前景，有望成为细胞功能（如细胞生长、迁移和分化等）的潜在抑制剂。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctgat aagtagaacg 60
ttatgactaa 70
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatagggat tctgttggtc ggctggttgg tatcctttag tcataacgtt ctac 54
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctga 49
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtagaacgtt atgactaa 18
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatagggat tctgttggtc ggctggttgg tatcc 35
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttagtcataa cgttctac 18
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggatagggat tctgttggtc ggctggttgg tatccttagt cataacgttc tac 53
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atcaggctgg atggtagctc ggtcggggtg ggtgggttgg caagtctgat ttactgtaga 60
acgttatcat a 71
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtaaa aaaatgataa cgttctacag ta 52

Claims (17)

1.一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述核酸适体包括第一核酸序列、第二核酸序列；所述第一核酸序列包括靶标受体特异性核酸适体和第一连接部分，所述第二核酸序列包括配对受体特异性核酸适体和第二连接部分；所述靶标受体特异性核酸适体可与靶标受体特异性结合，所述配对受体特异性核酸适体可与配对受体特异性识别；所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构。
2.根据权利要求1所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述靶标受体为第一跨膜受体、所述配对受体为第二跨膜受体。
3.根据权利要求1所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述靶标受体的受体激活方式为受体二聚化、寡聚化或多聚化。
4.根据权利要求3所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述靶标受体的受体激活方式为配体依赖的受体二聚化、寡聚化或多聚化。
5.根据权利要求4所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述配体、所述靶标受体特异性核酸适体与所述靶标受体的结合位点相同或接近。
6.根据权利要求1所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离增加或缩小。
7.根据权利要求6所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小。
8.根据权利要求6所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小至靶标受体、配对受体形成阻碍所述靶标受体激活的空间位阻。
9.根据权利要求6所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述第一连接部分与所述第二连接部分形成连接结构可使得分别与同一所述双特异性核酸适体的靶标受体特异性核酸适体、配对受体特异性核酸适体的靶标受体、配对受体的空间距离缩小至靶标受体、配对受体形成异二聚体。
10.根据权利要求1或6所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述第一连接部分与所述第二连接部分通过相互杂交形成双链结构、通过亲和作用形成的连接结构、通过共价键连接形成连接结构，或者所述第一核酸序列、第二核酸序列直接合成为一条核酸序列使得所述第一连接部分与所述第二连接部分直接形成连接结构。
11.根据权利要求1所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述所述靶标受体为肿瘤细胞高表达受体。
12.根据权利要求1所述的一种双特异性核酸适体，其特征在于，所述所述配对受体为肿瘤细胞高表达受体。
13.根据权利要求1-12任一项所述的双特异性核酸适体在制备药物或制备蛋白功能调控分子中的应用。
14.根据权利要求1-12任一项所述的双特异性核酸适体的衍生物。
15.根据权利要求14所述的双特异性核酸适体的衍生物在制备药物或制备蛋白功能调控分子中的应用。
16.根据权利要求1-12任一项所述的双特异性核酸适体的制备方法，其特征在于，
s1.合成所述第一核酸序列；
s2.合成所述第二核酸序列；
s3.使所述第一连接部分与所述第二连接部分相互杂交形成双链结构、通过亲和作用形成的连接结构或者通过共价键连接形成连接结构；
s4.得到所述双特异性核酸适体。
17.根据权利要求1-12任一项所述所述的双特异性核酸适体的制备方法，其特征在于，
s1.确定所述第一核酸序列；
s2.确定所述第二核酸序列；
s3. 将所述第一核酸序列、第二核酸序列直接合成为一条核酸序列使得所述第一连接部分与所述第二连接部分直接形成连接结构；
s4.得到所述双特异性核酸适体。
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