CN109312347A - 双特异性适配子 - Google Patents

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CN109312347A CN201780024817.4A CN201780024817A CN109312347A CN 109312347 A CN109312347 A CN 109312347A CN 201780024817 A CN201780024817 A CN 201780024817A CN 109312347 A CN109312347 A CN 109312347A
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Abstract

本发明涉及适配子和适配子组合物，特别是，但不仅仅涉及能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。

Description

双特异性适配子
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月19日提交的美国临时申请No.62/297,487的权益，其内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。
关于在联邦政府资助的研究和开发下发明的权利的声明
不适用。
用光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的参考
在2017年2月13日创建的文件48440-608001WO_ST25.TXT中编写的序列表(36,031字节，机器格式IBM-PC，MS Windows操作系统)，在此引入作为参考。
本发明背景
本发明涉及适配子和适配子组合物，特别是，但不仅仅涉及能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
胰腺导管腺癌(PDAC)是美国癌症死亡的第四大常见原因，在美国每年造成30,000例死亡(Jemal,A.等，癌症统计学(Cancer statistics),2009.CA Cancer J Clin 59,225-249(2009))。尽管为了改善胰腺癌患者的治疗已经付出了巨大的努力，但所取得的进展仍然有限(Stathis,A.&Moore,M.J.晚期胰腺癌：目前的治疗方法和未来的挑战(Advancedpancreatic carcinoma:current treatment and future challenges.)Nature reviews.临床肿瘤学(Clinical oncology)7,163-172(2010)；英国的胰腺癌(Pancreatic cancerin the UK)，柳叶刀(Lancet)378,1050(2011))。尽管已经进行了大量研究以开发改进的胰腺癌全身疗法，但术后给予吉西他滨作为单一药物仍然是目前的治疗标准。与其它化疗药物或生物制剂的组合，作为不可切除胰腺癌或切除术后辅助治疗的姑息治疗，其所达到的改善是有限的(Klinkenbijl,J.H.et al.胰腺和壶腹周围癌的根治性切除术后的辅助放疗和5-氟尿嘧啶：EORTC胃肠道癌症协作组的III期试验(Adjuvant radiotherapy and 5-fluorouracil after curative resection of cancer of the pancreas andperiampullary region:phase III trial of the EORTC gastrointestinal tractcancer cooperative group)，外科学年报(Annals of surgery)230,776-782；discussion782-774(1999)；Neoptolemos,J.P.等.胰腺癌切除术后放化疗和化疗的随机试验(Arandomized trial of chemoradiotherapy and chemotherapy after resection ofpancreatic cancer)，新英格兰医学杂志(The New England Journal of Medicine)350,1200-1210(2004)；Oettle,H.等.吉西他滨的辅助化疗与接受胰腺癌根治性切除术的患者观察：一项随机对照试验(Adjuvant chemotherapy with gemcitabine vs observationin patients undergoing curative-intent resection of pancreatic cancer:arandomized controlled trial)，JA1UA:美国医学协会杂志(the journal of theAmerican Medical Association)297,267-277(2007))。尽管进行了多次III期试验，但胰腺癌患者的切除术后5年生存率仍然低于5％(Vincent,A.,Herman,J.,Schulick,R.,Hruban,R.H.&Goggins,恶性胰腺癌(M.Pancreatic cancer).柳叶刀378,607-620(2011)；Alexakis,N.等.目前胰腺癌手术标准(Current standards of surgery for pancreaticcancer)，英国外科学杂志(The British Journal of Surgery)91,1410-1427(2004)；Ghaneh,P.,Costello,E.&Neoptolemos,J.P.胰腺癌生物学及其管理(Biology andmanagement of pancreatic cancer).Gut 56,1134-1152(2007))。大多数患者在切除术后2年内及术后辅助化疗后会出现局部或全身复发。
目前，最有效的单药吉西他滨可使1年生存率从16％提高到19％。在一项随机研究中加入(厄洛替尼)使总生存期中位数增加了11天。(Cunningham,D.等.晚期胰腺癌患者吉西他滨与吉西他滨联合卡培他滨的III期随机对照研究(Phase III randomizedcomparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patientswith advanced pancreatic cancer)，临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学会官方杂志(Journal of clinical oncology:official journal of the American Society ofClinical Oncology)27,5513-5518(2009).Heinemann,V.,Haas,M.&Boeck,S.晚期胰腺癌的系统性治疗(Systemic treatment of advanced pancreatic cancer.)癌症治疗回顾(Cancer treatment reviews)38,843-853(2012))。传统治疗的这种局限性是由于PDAC细胞对抗癌化疗药物的有效保护所产生的抗癌药物的巨大耐药性(Wong,H.H.&Lemoine,N.R.胰腺癌：分子发病机制和新的治疗靶点(Pancreatic cancer:molecular pathogenesisand new therapeutic targets.)Nat Rev Gastroenterol Hepatol 6,412-422(2009)；Fulda,S.胰腺癌细胞凋亡途径及其治疗进展。(Apoptosis pathways and theirtherapeutic exploitation in pancreatic cancer.)J Cell 1Uol 1Ued 13,1221-1227(2009))。因此，必须为这种破坏性疾病制定新的治疗策略。本发明提供了对本领域中的这些和其他问题的解决方案。
本发明概述
本发明人提供了能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的核酸组分。该双特异性适配子能够结合肿瘤细胞上存在的细胞表面蛋白，同时与免疫细胞(如，淋巴细胞、T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、白细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞，优选为T细胞)上的细胞表面蛋白结合。双特异性适配子在两种细胞类型之间形成桥接，并且能够增强对肿瘤细胞的免疫应答，改善T细胞的结合以及改善对肿瘤细胞的杀伤。双特异性适配子由可结合肿瘤细胞抗原的核酸化合物(适配子)以及可结合免疫细胞表面蛋白的核酸化合物(适配子)复合形成。两种适配子组分可通过共价或非共价结合方式形成的双特异性适配子复合物。本发明的双特异性适配子可包含肿瘤细胞结合适配子和免疫细胞结合适配子的复合物。
双特异性适配子可用于治疗、诊断和成像应用。提供了包含双特异性适配子的药物、诊断和成像组合物。还提供了治疗方法，特别是癌症的治疗方法，包括将双特异性适配子给予需要治疗的受试者。还提供了涉及使用双特异性适配子的诊断和成像方法。双特异性适配子还可以与化合物部分(moiety)结合，所述化合物部分可以是治疗、诊断或成像部分。
在本发明的一个方面，提供了能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
在一些实施例中，肿瘤细胞抗原是HSP70、波形蛋白、HSP90，TfR或PDGFR-a。
在一些实施例中，免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。三种HSP70结合适配子的核酸序列如图10中的SEQ ID NO:1、2和4所示。
在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。波形蛋白结合适配子的核酸序列如图10中的SEQ ID NO:3所示。
在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。三种HSP90结合适配子的核酸序列如图10中的SEQ ID NO:5、6和7所示。
在本发明的另一个方面，提供了能够结合TfR和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
在本发明的另一个方面，提供了能够结合癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。在一些实施例中，提供了能够结合胰腺癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。胰腺癌结合适配子的核酸序列如图10中的SEQ ID NOs：1-8所示。所述免疫细胞可以是淋巴细胞、白细胞、T细胞(胸腺细胞)、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、抑制性T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞、B细胞、自然杀伤细胞、白细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞。在一些实施例中，免疫细胞可以是T细胞，优选CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是细胞毒性T细胞。
在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CD3的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP70和CTLA4的双特异性适配子。在一些优选的实施方案中，HSP70是mHSP70。
在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CD3的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合波形蛋白和CTLA4的双特异性适配子。
在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CD3的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合HSP90和CTLA4的双特异性适配子。
在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CD3的双特异性适配子。在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一个方面，提供了能够结合胰腺癌细胞和CTLA4的双特异性适配子。
在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CD3的双特异性适配子。
在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合TfR和CTLA4的双特异性适配子。
在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CCR5的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CCR7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CD2的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CD3的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-α和CD4的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CD7的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CD8的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和PD-1的双特异性适配子。在本发明的另一方面，提供了能够结合PDGFR-a和CTLA4的双特异性适配子。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:1-8之一的核酸序列或与SEQ ID NO:1-8之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合HSP70、波形蛋白、HSP90或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ IDNO:1-8之一或与SEQ ID NO:1-8之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:1、2和4之一的核酸序列或与SEQ ID NO:1、2和4之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合HSP70或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:1、2和4之一或与SEQ ID NO:1、2和4之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:3所示核酸序列或与SEQID NO:3具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合波形蛋白或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:5、6和7之一的核酸序列或与SEQ ID NO:5、6和7之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合HSP90或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:5、6和7之一或与SEQ ID NO:5、6和7之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:28、29和30之一的核酸序列或与SEQ ID NO:28、29和30之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合TfR或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:28、29和30之一或与SEQ ID NO:28、29和30之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:31和32之一的核酸序列或与SEQ ID NO:31和32之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合PDGFR-a或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:31和32之一或与SEQ ID NO:31和32之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:9-16之一的核酸序列或与SEQ ID NO:9-16之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。能够结合CCR5或癌细胞(如胰腺癌细胞)的适配子区域的核酸序列，可以包含(或由其组成)SEQ ID NO:9-16之一或与SEQID NO:9-16之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
双特异性适配子可包含SEQ ID NO:17和18的复合物，优选非共价复合物，或为一复合物，其具有与SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性的核酸序列和与SEQ ID NO:18具有至少80％的序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含选自以下之一的核酸序列或由其组成：SEQ ID NO:1、2或4；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5、6或7；SEQ ID NOs：28、29或30；SEQ IDNO:31或32，或与所述序列之一具有至少80％序列同一性的核酸序列，和包含SEQ ID NO:9-16之一或由其组成的核酸序列，或与所述序列之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:17、19-24和33之一，或与所述序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在本发明的一些方面，双特异性适配子包含SEQ ID NO:18、37和38之一，或与所述序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在本发明的一些方面，双特异性适配子包含一复合物，所述复合物含有SEQ ID NO:17、19-24和33之一或与所述序列具有至少80％序列同一性的核酸序列，和SEQ ID NO:18、37和38或与所述序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在一些实施例中，一个或多个碱基或核苷酸是经过化学修饰的。在一些实施例中，一个或多个核苷酸在核糖的2'位置经化学修饰。本发明适配子的核酸序列可以是RNA和/或可以包含2'-氟代修饰的嘧啶和/或可以包含2'-O-甲基化的嘌呤。
在本发明的另一个方面，提供了一种复合物，优选非共价复合物，所述复合物为双特异性适配子和表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的复合物，所述肿瘤细胞抗原能够为双特异性适配子所结合。在本发明的另一个方面，提供了一种复合物，优选非共价复合物，所述复合物为双特异性适配子和表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞的复合物，所述免疫细胞表面蛋白能够为双特异性适配子所结合。在本发明的另一个方面，提供了一种复合物，优选为非共价复合物，所述复合物为双特异性适配子、表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞和表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞的复合物，所述肿瘤细胞抗原可以为所述双特异性适配子结合，且所述免疫细胞表面蛋白可以为所述双特异性适配子结合。免疫细胞可以是T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞或细胞毒性T细胞。在一些实施例中，所述复合物在体外形成，并任选地经分离。在其他实施方案中，所述复合物可以在体内形成。所述复合物优选包含与肿瘤细胞和免疫细胞中的一种或两种结合的双特异性适配子。如本文所述，所述肿瘤细胞可以是任何类型的癌症。在一些实施例中，它是胰腺癌细胞或成胶质细胞瘤细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含了本发明的双特异性适配子和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的双特异性适配子，其用于医学治疗方法。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的双特异性适配子，其用于治疗癌症的方法。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的双特异性适配子在制备用于医学治疗方法的药物中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的双特异性适配子在制备用于癌症治疗方法的药物中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了对需要治疗的受试者的癌症进行治疗的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的双特异性适配子。
在一些实施例中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施例中，所示癌症过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一种。
在本发明的另一个方面，提供了一种选择受试者的方法，所述受试者用治疗有效量的本发明双特异性适配子治疗癌症，所述方法包括：在体外确定该受试者的癌症细胞是否过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一种。
在一些实施例中，本发明的适配子或双特异性适配子能够在结合于细胞表面靶分子后被内化到细胞中。此类适配子可用于将化合物部分递送至细胞的方法，其中化合物部分与适配子偶联。
本发明的适配子和双特异性适配子还可以在体外或体内抑制细胞的增殖。这可能涉及抑制癌症/肿瘤细胞的增殖。这可能是细胞抑制作用，但也可能是细胞毒作用。因此，提供了本发明的适配子用于医学治疗方法，其中抑制细胞增殖可用于疾病治疗。
在一些实施例中，适配子、双特异性适配子或核酸化合物可进一步包含与所述核酸序列共价连接的化合物部分。化合物部分可以是治疗部分或成像部分。
治疗部分可以是核酸部分、抗体、肽部分或小分子药物部分。所述治疗部分可以是活化核酸部分或反义核酸部分。所述治疗部分可以是miRNA部分、mRNA部分、siRNA部分或saRNA部分。所述治疗部分可以是siRNA部分或saRNA部分。所述治疗部分可以是抗癌剂部分。所述治疗部分可以是C/EBPαsaRNA部分或KRAS siRNA部分。所述成像剂部分可以是生物发光分子、光活性分子、金属或纳米颗粒。
附图简述
图1：图示说明了包含CCR5适配子、间隔区和tP19适配子的双特异性适配子。
图2：图示说明了使用“粘性末端”互补核酸序列来连接tP19和CCR5适配子。
图3：照片显示了通过凝胶电泳分离tP19适配子、CCR5适配子和tP19-CCR5双特异性适配子。
图4：通过电泳显示的双特异性适配子偶联物。
图5：图示说明了使用Cy3和FAM标记来识别共聚焦显微镜中双特异性适配子的位置。
图6：显微照片显示了在没有双特异性适配子的情况下T细胞(小细胞)与PANC-1细胞(大细胞)之间缺乏关联。
图7：探测肿瘤细胞的T细胞的连续图像。在P19-CCR5双特异性适配子的存在下，将CD8T细胞与PANC-1一起孵育。箭头指向的较小细胞表示CD8T细胞。箭头指向的较大细胞表示PANC-1细胞。
图8：显示了免疫突触形成的显微照片。
图9：图表显示了双特异性适配子细胞毒性T细胞测定的结果。
图10：适配子截短的P19(tP19)、全长P19、P15、P1、P11、P7和P6的核酸序列以及共有序列SEQ ID NO:8。该系列适配子如WO2013/154735所述。P19和P1结合HSP70。P15与波形蛋白结合。P11、P7和P6结合HSP90。
图11：CCR5适配子的核酸序列。
图12A-12B：靶向于mHSP70和CCR5的双特异性适配子组分的核酸序列。双特异性适配子是(A)和(B)中描述序列的非共价复合物。(图12A)能与mHSP70结合的截短的P19适配子核酸序列，所述mHSP70能够与具有中间七个C3碳间隔子(或间隔区)(每个C3碳由“o”表示)的粘性序列(粗体)缀合。fC和fU表示2'-氟嘧啶修饰，mA和mG表示2'-OMe嘌呤修饰。(图12B)CCR5适配子的核酸序列与粘性序列(粗体)缀合，所述粘性序列具有中间5个C3间隔子(每个C3碳由“o”表示)。fC和fU表示2'-氟嘧啶，mA和mG表示2'-O-甲基化嘌呤。
图13：适配子tP19与具有中间七个C3碳间隔子的粘性末端(SE)核酸序列缀合，以及预测的结构。SE1-3-粘性末端序列和互补序列。
图14A-14B：靶向于mHSP70、波形蛋白或HSP90和CCR5之一的双特异性适配子组分的核酸序列。双特异性适配子是(图14A)中描述序列之一以及(图14B)中描述序列的非共价复合物。(图14A)(i)能够结合mHSP70的全长P19适配子核酸序列，所述其与粘性序列(粗体)相缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)，(ii)能够结合mHSP70的P1适配子，其与粘性序列(粗体)相缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)，(iii)能够结合波形蛋白的P15适配子，其与粘合序列(粗体)缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)，(iv)能够结合mHSP90的P11适配子，其与粘性序列(粗体)相缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)，(v)能够结合HSP90的P7适配子，其与粘性序列(粗体)相缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)，(vi)能够结合HSP90的P6适配子，其与粘性序列(粗体)相缀合，并具有中间七个C3碳间隔子(每个C3碳由“o”表示)；(图14B)与粘性序列(粗体)缀合的CCR5适配子核酸序列，其具有中间5个C3间隔子(每个C3碳由“o”表示)。fC和fU表示2'-氟嘧啶，mA和mG表示2'-O-甲基化嘌呤。
图15.：粘性末端(SE)序列。一对互补的SE序列用于形成双特异性适配子复合物。SE1与一个适配子的3'或5'末端缀合，并且一个或SE 2或SE 3与另一个适配子的3'或5'末端缀合。将适配子-SE偶联物混合并使其形成双特异性适配子复合物。SE1[SEQ ID NO:25]。SE2[SEQ ID NO:26]与SE1 3'-5'互补。SE3[SEQ ID NO:27]与SE1 5'-3'互补。
图16：图表显示了由双特异性适配子和癌细胞以及T细胞形成的免疫突触。
图17A-17D：二级结构和流式细胞术结合试验。(图17A)P15选自随机化的N40RNA库。使用NUPACK软件预测二级结构。(图17B和图17C)通过流式细胞术在PANC-1和对照Huh7细胞中评估Cy3标记的P19和P1适配子(200nM)的结合效率。数据显示了来自三次重复实验的阳性染色细胞百分比。误差线表示标准差(STD)。Huh7CC(Huh7未染色细胞对照)，PANC-1CC(PANC-1未染色细胞对照)，Huh7Lib(用Cy3标记的文库进行Huh 7染色对照)，PANC-1Lib(用Cy3标记的文库进行PANC-1染色对照)，Huh7P15(用P15染色的Huh7)，PANC-1P15(用P15染色的PANC-1)。Student t检验**：P<0.01。(图17D)使用浓度递增的经Cy3标记的适配子(15.6至500nM)，通过流式细胞术测量解离常数(KD)。使用用于非线性回归的单位点结合模型测量和计算平均荧光强度(MFI)。
图18：显示细胞内化的荧光显微照片。用100nM Cy3标记的P15适配子处理胰腺细胞系PANC-1、AsPC-1、CFPAC-1、MIA PaCa-2和BxPC-3，并通过共聚焦显微镜进行分析。所有胰腺癌细胞系均显示Cy3标记的点状区域。还用100nM Cy3标记的P15适配子处理Huh7阴性细胞以显示阴性染色。红色：Cy3标记的RNA。蓝色：Hoechst 33342。比例尺：10μm。
图19A-19C：串联MS/MS谱图。(图19A)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)被用于在生物素化P15和无关RNA拉下实验后对固定的蛋白质样品进行分离。显示考马斯染色的凝胶M(标记物)、总细胞裂解物(泳道1)、P15(泳道2)、NC(无关RNA，泳道3)。箭头指示出目标。(图19B)P15亲和纯化肽的肽匹配和MS/MS谱。插图：显示b-和y-离子系列覆盖的亲本肽的氨基酸序列。靶表位以黄色高亮显示。序列：SEQ ID NO:40。(图19C)使用适配子-抗体竞争性试验来验证靶标。采用Cy3标记的P15适配子与波形蛋白抗体竞争。定量荧光强度(AU：任意单位)。Student t检验*：P<0.05。
图20：TfR适配子的核酸序列。
图21：PDGF-a适配子的核酸序列。
图22：用于T细胞结合的双特异性适配子的示意结构。化学合成的CD3ε适配子(CD3e2)和tP19适配子通过互补的“粘性桥”序列非共价连接以产生双特异性偶联物。
图23A-23B：C3e2(图23A)和C3e3(图23B)均显示出多个茎-环结构。
图24A-24B：与CD3ε适配子C3e2和稳定表达EGFP-CD3ε融合蛋白的HEK细胞系的结合试验。(图24A)适配子C3e2结合表达人CD3ε的HEK细胞。可视化：红色通道(Cy3标记的适配子C3e2(100nM))；绿色通道(EGFP-人CD3ε)；蓝色通道(Hoechst 33342)。比例尺：10μm。(图24B)适配子C3e2结合表达小鼠CD3ε的HEK细胞。可视化：红色通道(Cy3标记的适配子C3e2(100nM))；绿色通道(EGFP-小鼠CD3ε)；蓝色通道(Hoechst33342)。比例尺：10μm。
图25A-25B：用CD3ε适配子C3e3和稳定表达EGFP-CD3ε融合蛋白的HEK细胞系进行结合试验。(图25A)适配子C3e3结合表达人CD3ε的HEK细胞。可视化：红色通道(Cy3标记的适配子C3e3(100nM))；绿色通道(EGFP-人CD3ε)；蓝色通道(Hoechst 33342)。比例尺：10μm。(图25B)适配子C3e3结合表达小鼠CD3ε的HEK细胞。可视化：红色通道(Cy3标记的适配子C3e3(100nM))；绿色通道(EGFP-小鼠CD3ε)；蓝色通道(Hoechst33342)。比例尺：10μm。
图26A-26B：CD3ε适配子与人T细胞的结合。(图26A)将人T细胞(1×105个细胞/mL)与500nM Cy3标记的适配子C3e2一起温育。洗涤后，进行流式细胞术分析。直方图移位表明了与C3e2的强结合性。(图26B)将人T细胞(1×105个细胞/mL)与500nM Cy3标记的适配子C3e3一起温育。洗涤后，进行流式细胞术分析。直方图移位表明了与C3e3的强结合性。
发明详述
定义
虽然本文示出并描述了本发明的各种实施例和各方面，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例和方面仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为对所描述的主题进行限制。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于：专利、专利申请、文献、书籍、手册和论文，出于所有目的通过引用明确地整体并入本文。
除非另行定义，本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义所相同的含义。参见，例如，Singleton等，微生物学和分子生物学字典(DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)第二版，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)；Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社(Molecular Cloning，A LABORATORYMANUAL，Cold Springs Harbor Press)(冷泉港(Cold Springs Harbor),NY1989)。
与本文描述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实践中。提供以下定义以便于理解本文中频繁使用的某些术语，但并不意味着限制本公开的范围。
本文使用的缩写在化学和生物学领域中具有其常规含义。本文所述的化学结构和化学式，根据化学领域中已知的化学价标准规则进行构建。
“核酸”是指单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，或其互补物。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文所述多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA混合物的杂合分子。核酸可以是直链或支链的。例如，核酸可以是核苷酸的线性链或核酸可以是支链的，例如，使得核酸包含一个或多个核苷酸的臂或分支。任选地，所述支链核酸可重复分支以形成更高级的结构，例如树枝状大分子等。
核酸，包括具有硫代磷酸酯骨架的核酸，可包括一个或多个反应性部分。如本文所用，术语“反应性部分”包括能够通过共价、非共价或其它相互作用与另一分子(例如核酸或多肽)反应的任何基团。举例来说，所述核酸可包括氨基酸反应性部分，其通过共价、非共价或其它相互作用与蛋白质或多肽上的氨基酸反应。
该术语还包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接物，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于：磷酸二酯衍生物，包括例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(也称为硫代磷酸)、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼或O-甲基亚磷酰胺键。(参见Eckstein，寡核苷酸及类似物：实用方法，牛津大学出版社(Oligonucleotides and Analogues：A PracticalApproach，Oxford University Press))；以及肽核酸骨架和连接物。其它类似物核酸包括具有正骨架的那些；非离子性骨架、经修饰的糖和非核糖骨架(例如磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或锁核酸(LNA))，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及ASC Symposium Series580第6章和第7章中描述的那些：反义研究中的碳水化合物修饰，Sanghui&Cook编辑。核酸的一种定义还包括了含有一个或多个碳环糖的核酸。可以出于多种原因进行核糖-磷酸骨架的修饰，例如，增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。在一些实施例中，DNA中核苷酸间的连接键是磷酸二酯、磷酸二酯衍生物或两者的组合。
术语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补性可以是部分互补，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或是完全互补，其中所有核酸根据碱基配对匹配。
本文提供的术语“适配子”是指寡核苷酸(例如短寡核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，其与蛋白质、肽和小分子(例如以高亲和力和特异性地)结合。适配子可以称为基于寡核苷酸的靶结合部分。适配子可以是RNA或DNA。适配子可具有二级或三级结构，因此可能能够折叠成多样且复杂的分子结构。
适配子可以通过指数富集的配体系统性进化过程(SELEX如Ellington AD，Szostak JW(1990)结合特异性配体的RNA分子体外筛选(In vitro selection of RNAmolecules that binding specific ligands))Nature 346：818-822；Tuerk C，Gold L(1990)通过指数富集系统进化性配体：RNA配体与噬菌体T4DNA聚合酶的结合(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophageT4DNA polymerase)Science 249：505-510))或通过开发SOMAmers(缓慢解离速率的修饰适配子)(Gold L等，(2010)基于适配子的多重蛋白质组学技术用于生物标志物发现(Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery)PLoSONE 5(12):e15004))，从非常大的随机序列文库中进行体外选择。应用SELEX和SOMAmer技术，包括例如添加模拟氨基酸侧链的官能团以扩展适配子的化学多样性。结果，可以富集和鉴定针对蛋白质的高亲和力适配子。适配子可以表现出许多用于靶向药物递送的所需性质，例如易于选择和合成、高结合亲和力和特异性、低免疫原性和通用的合成可行性。使用适配子可以在体外成功地将抗癌剂(例如化疗药物、毒素和siRNA)递送至癌细胞。
适配子是核酸分子，其特征在于具有高特异性和高亲和力地结合靶分子的能力。迄今，几乎鉴定的每种适配子都是非天然存在的分子。
适配子可以是DNA或RNA分子，可以是单链或双链的。适配子可包含经化学修饰的核苷酸或核苷，例如其中糖和/或磷酸和/或碱基经化学修饰。这些修饰可以改善适配子的稳定性或使适配子更耐降解。本发明的适配子可包括如本文所述的化学修饰，例如在核酸的糖位置、磷酸酯位置和/或碱基位置进行的化学取代，包括例如引入修饰的核苷酸、引入封端部分(例如3'封端)、与高分子量的非免疫原性化合物(例如聚乙二醇(PEG))的结合、与亲脂性化合物的结合、磷酸骨架中的取代。碱基修饰可包括5-位嘧啶修饰、环外胺修饰、4-硫尿苷取代、5-溴-或5-碘尿嘧啶取代、骨架修饰。糖修饰可包括2'-胺核苷酸(2'-NH2)，2'-氟核苷酸(2'-F)和2'-O-甲基(2'-OMe)核苷酸。各种不同的核苷酸、核苷、碱基和磷酸酯修饰是本领域普通技术人员已知的，例如，如Eaton等在Bioorganic&Medicinal Chemistry，第五卷，No.6，pp1087-1096,1997中所述。
适配子可以通过本领域技术人员熟知的方法合成。例如，适配子可以通过化学合成，例如，在固相载体上进行化学合成。固相合成可以使用亚磷酰胺化学法。简言之，将在固相载体上的核苷酸脱三苯甲基化，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸三酯键。然后可以进行封端，然后用氧化剂(通常是碘)氧化亚磷酸三酯。然后可以重复该循环以组装适配子(例如，参见Sinha，ND；Biernat，J.；McManus,J.；H.Nucleic AcidsRes.1984,12,4539；和Beaucage,SL；Lyer,RP(1992).Tetrahedron 48(12)：2223)。
适配子可以被认为是单克隆抗体的核酸等同物，并且通常具有nM或pM范围内的Kd，例如，小于500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM中的一个。与单克隆抗体一样，它们几乎可用于需要靶结合的任何情况，包括在体外或体内用于治疗和诊断应用。体外诊断应用可包括用于检测靶分子的存在或不存在。
本发明的适配子可以以纯化或分离的形式提供。本发明的适配子可以制成药物组合物或药物。
如本文所述，“肿瘤细胞抗原适配子”是对肿瘤细胞抗原具有高亲和力和特异性的适配子。WO2013/154735和图10描述了胰腺癌细胞结合适配子P19、P15、P1、P11、P7、P6和共有序列SEQ ID NO:8。截短的P19适配子的序列示于图10。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞抗原适配子是HSP70结合适配子。HSP70结合适配子如P19、tP19和P1描述于WO2013/154735和在审的美国临时专利申请No.62/141156中，其通过引用并入本文。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞抗原适配子是波形蛋白结合适配子。波形蛋白结合适配子如P15描述于WO2013/154735中，其通过引用并入本文。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞抗原适配子是HSP90结合适配子。HSP90结合适配子如P11、P7和P6描述于WO2013/154735中，其通过引用并入本文。
胰腺癌细胞结合适配子，包括HSP70、波形蛋白和HSP90的结合适配子，包括包含如SEQ ID NO 1-8之一所示的核酸序列的适配子，或包含与SEQ ID NO 1-8之一具有至少80％一级序列同一性的核酸序列的适配子。在一些实施例中，胰腺癌细胞、HSP70、波形蛋白或HSP90结合适配子可具有由SEQ ID NO 1-8之一组成的核酸序列。在本发明双特异性适配子中，胰腺癌细胞、HSP70、波形蛋白或HSP90的结合部分，例如，除任何接头或间隔子核酸序列或粘性桥接以外，均可具有包含如上文和在此所述的SEQ ID NO 1-8之一的核酸序列或由其组成。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞抗原适配子是转铁蛋白受体(TfR)结合适配子。TfR结合适配子如TR14和TR18(如图20所示)描述于PCT/US15/55792中，其通过引用并入本文。
TfR结合适配子包括包含如SEQ ID NO：28-30之一所示核酸序列的适配子，或具有与SEQ ID NO:28-30之一有至少80％一级序列同一性的核酸序列的适配子。在一些实施例中，TfR结合适配子可具有由SEQ ID NO:28-30之一组成的核酸序列。在本发明的双特异性适配子中，TfR结合部分，例如，除了任何接头或间隔子核酸序列或粘性桥接以外，均可具有包含如上文及在此所述的SEQ ID NO:28-30之一的核酸序列或由其组成。
在一些实施例中，所述肿瘤细胞抗原适配子是α型血小板衍生的生长因子受体(PDGFR-a)结合适配子。PDGFR-α结合适配子如PDR3和PDR9(图21中所示)描述于PCT/US15/55815中，其通过引用并入本文。
PDGFR-a结合适配子包括包含如SEQ ID NO:31和32之一所示核酸序列的适配子，或具有与SEQ ID NO31和32之一有至少80％一级序列同一性的核酸序列的适配子。在一些实施例中，PDGFR-a结合适配子可具有由SEQ ID NO:31和32之一组成的核酸序列。在本发明的双特异性适配子中，PDGFR-a结合部分，例如除了任何接头或间隔子核酸序列或粘性桥接以外，均可具有包含如上文及在此所述的SEQ ID NO:31和32之一的核酸序列或由其组成。
如本文定义，“免疫细胞表面蛋白适配子”是对免疫细胞表面蛋白具有高亲和力和特异性的适配子。
在一些实施例中，免疫细胞表面蛋白适配子是CCR5结合适配子。CCR5结合适配子描述于Zhou等人，2015，Chemistry&Biology 22,379-390 2015年3月19日和在审的美国专利申请No.14/801,710，每份文献都通过具体引用并入本文。CCR5结合适配子包括包含SEQID NO 9-16之一所示核酸序列的适配子，或具有与SEQ ID NO 9-16之一有至少80％的一级序列同一性的核酸序列的适配子。在一些实施例中，CCR5结合适配子可具有由SEQ ID NO9-16之一组成的核酸序列。在一些实施例中，每个嘧啶是2'-氟嘧啶。在本发明的双特异性适配子中，CCR5结合部分，例如，除了任何接头或间隔子核酸序列或粘性桥接以外，均可具有包含如上文和在此所述的SEQ ID NO 9-16之一的核酸序列或由其组成。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CCR7结合适配子。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CD2结合适配子。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CD3结合适配子。CD3结合适配子包括包含SEQ ID NO 37和38之一所示核酸序列的适配子，或具有与SEQ ID NO 37和38之一有至少80％一级序列同一性的核酸序列的适配子。在一些实施例中，CD3结合适配子可具有由SEQ ID NO 37和38之一组成的核酸序列。在一些实施例中，每个嘧啶是2'-氟嘧啶。在本发明的双特异性适配子中，CD3结合部分，例如，除了任何接头或间隔子核酸序列或粘性桥接以外，均可具有包含如上文和在此所述的SEQ ID NO 37和38之一的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，CD3结合适配子包括包含SEQ ID NO:34或35的核酸序列的适配子，其包含了接头或间隔子核酸序列或粘性桥接。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CD4结合适配子。CD4结合适配子描述于Zhou，Qing等人“用于选择性捕获CD4表达细胞的含有适配子的表面(Aptamer-Containing Surfaces for Selective Capture of CD4Expressing Cells)”Langmuir：:the ACS journal of surfaces and colloids 28.34(2012)：12544-12549.PMC Web.2016年2月8日；Zhang等人，American Journal of Clinical Pathology，第134卷，第4期，2010年10月1日；Wheeler等人，J Clin Invest.2011；121(6)：2401-2412，各文献通过具体引用并入本文。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CD7结合适配子。CD7结合适配子描述于WO2014/147559中，其通过具体引用并入本文。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CD8结合适配子。CD8结合适配子在以下文献中有描述：Wang等人，J Allergy Clin Immunol.2013年9月；132(3)：713-722；Oelkrug，C.，Sack，U.，Boldt，A.，Nascimento，I.C.，Ulrich，H和Fricke，S.(2015)，GVHD预防的抗体和适配子策略(Antibody-and aptamer-strategies for GVHDprevention)，细胞和分子医学杂志，19：11-20。各文献通过具体引用并入本文。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是PD-1结合适配子。PD-1结合适配子在以下文献中有描述：Prodeus等人，分子治疗核酸(Molecular Therapy NucleicAcids)(2015)4e237，Ti-Hsuan Ku Sensors 2015,15,16281-16313和WO2016/019270，各文献通过具体引用并入本文。
在一些实施例中，所述免疫细胞表面蛋白适配子是CTLA4结合适配子。CTLA4结合适配子在以下文献中有描述：Herrmann等人，J Clin Invest，2014；124(7)：2977-2987，Gilboa等，Clin Cancer Res；19(5)；1054-62，和Santulli-Marotto等，Cancer Res.2003年11月1日；63(21)：7483-9，各文献通过具体引用并入本文。
适配子通常是单特异性的，即对单个靶分子具有高亲和力和特异性。
本发明的单特异性适配子的核酸序列或双特异性适配子的单特异性部分可任选地具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸作为最小长度。
本发明的单特异性适配子的核酸序列或双特异性适配子的单特异性部分可任选地具有40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100个核苷酸作为最大长度。
本发明的单特异性适配子的核酸序列或双特异性适配子的单特异性部分可任选地具有10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的任一个长度。
本发明单特异性适配子的核酸序列或双特异性适配子的单特异性部分(包括当存在于双特异性适配子复合物中时)，可具有与SEQ ID NO：1-24或28-32一定程度的一级序列同一性，即80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的至少一种。
“双特异性适配子”是基于适配子的化合物或组分，其对两种或至少两种不同的靶分子具有高亲和力和特异性。双特异性适配子可以由两个单特异性适配子的核酸序列组成。双特异性适配子可以是两种单特异性适配子的复合物或偶联物。两个单特异性适配子的核酸序列可以结合在一起形成复合物，其可以是共价或非共价复合物。在一些实施例中，双特异性适配子可以包含与免疫细胞表面蛋白适配子的核酸序列复合的肿瘤细胞抗原适配子的核酸序列。
因此，双特异性适配子可以是肿瘤细胞抗原结合部分和免疫细胞表面蛋白结合部分的复合物。
可以通过在复合物的成员之间形成共价键来提供共价复合物。在一些实施例中，可以通过合成单个寡核苷酸分子来形成双特异性适配子，所述单个寡核苷酸分子包含第一单特异性适配子的核酸序列，接着是第二单特异性适配子的核酸序列，并且任选地在两个序列之间具有接头。所述接头可包含一种或多种寡核苷酸序列、烃间隔元件，例如任选取代的C1-30烷基或任选取代的C2-30烯基；或聚乙二醇分子。在一些实施例中，所述接头可以是聚碳(polycarbon)接头，与“粘性桥接”的形成一致。聚碳连接基可以是任选取代的C10-30烷基，任选取代的C10-15烷基，任选取代的C15-20烷基，任选取代的C20-25烷基，任选取代的C25-30烷基，任选取代的C10-30烯基，任选取代的C10-15烯基，任选取代的C15-20烯基，任选取代的C20-25烯基，任选取代的C25-30链烯基。
可以通过在复合物的成员之间形成一个或多个非共价键来提供非共价复合物。可以通过氢键、范德华力和任选的离子相互作用来维持非共价复合物。在一些实施例中，可以通过将一对接头部分中的一个连接至两个单特异性适配子中的每一个的核酸序列来形成双特异性适配子，其中接头部分彼此具有亲和力或互补性，并能使接头结合并形成非共价复合物的部分。合适的接头部分的实例包括一对单链寡核苷酸，其具有可以杂交的互补序列，或标签和捕获元件对，例如生物素和抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白。
如本文所用，术语“偶联物”，“生物偶联物”或“生物偶联物反应性基团”或“生物偶联物接头”是指原子或分子之间的连接。该连接可以是直接的或间接的。例如，本发明提供的第一部分(例如-NH2、-COOH、-N-羟基琥珀酰亚胺或-马来酰亚胺)与第二部分(例如，巯基、含硫氨基酸)之间的偶联物可以是直接的，例如通过共价键或接头，或间接的，例如，通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导偶极、London分散)，环堆积(pi效应)，疏水相互作用等)。在一些实施例中，使用缀合化学方式形成偶联物，包括但不限于：亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)，亲电取代(例如烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子的多键的加成(例如，迈克尔反应、Diels-Alder加成)。这些和其它有用的反应在以下文献中有论述：例如March，高级有机化学(ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY)，第三版，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，生物偶联技术(BIOCONJUGATE TECHNIQUES)，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，蛋白质修饰(MODIFICATION OF PROTEINS)；化学系列进展(Advancesin Chemistry Series)，第198卷，美国化学学会(American Chemical Society),华盛顿特区，1982。在一些实施例中，第一部分(例如，肿瘤细胞抗原结合部分)通过非共价化学接头或共价化学接头(由第一部分组分和第二部分组分之间的反应形成)非共价连接至免疫细胞表面蛋白的结合部分。在一些实施例中，所述第一部分(例如，肿瘤细胞抗原结合部分)包括一个或多个反应性部分，例如，如本文所述的共价反应性部分(如，炔烃、叠氮化物、胺、酯，N-羟基-琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或硫醇反应性部分)。在一些实施例中，所述第一部分(例如，肿瘤细胞抗原结合部分)包括具有一个或多个反应性部分的接头(例如，第一接头)，例如，如本文所述的共价反应性部分(如，炔烃、叠氮化物、胺、酯、N-羟基-琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或硫醇反应性部分)。在一些实施例中，所述第二部分(如，免疫细胞表面蛋白的结合部分)包括一个或多个反应性部分，例如，如本文所述的共价反应性部分(例如，炔烃、叠氮化物、胺、酯、N-羟基-琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或硫醇反应性部分)。在一些实施例中，所述第二部分(例如，免疫细胞表面蛋白的结合部分)包括具有一个或多个反应性部分的接头，例如，如本文所述的共价反应性部分(如，炔烃、叠氮化物、胺、酯、N-羟基-琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或硫醇反应性部分)。
在偶联物化学方式中有用的反应性部分或官能团包括，例如：(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、p-硝基苯酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯；(b)可以转化为酯、醚、醛等的羟基；(c)卤代烷基，其中卤化物随后可以用亲核基团(例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳阴离子或醇盐离子)取代，从而导致新基团在卤原子位点的共价连接；(d)能够参与Diels-Alder反应的亲双烯体基团，例如马来酰亚胺基；(e)醛或酮基团，其可以通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)，或通过格氏加成或烷基锂加成等机制进行后续的衍生化；(f)磺酰卤基团，用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺；(g)硫醇基团，可以转化为二硫化物、与酰卤反应、或与金属(如金)键合；(h)胺或巯基，其可以是例如酰化、烷基化或氧化的；(i)烯烃，其可进行例如环加成、酰化、迈克尔加成等；(j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应；(k)亚磷酰胺和其他可用于核酸合成的标准官能团；(l)金属氧化硅键合；(m)金属，其键合到活性磷基团(例如膦)以形成例如磷酸二酯键；和(n)砜，例如乙烯基砜。
可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰本文所述蛋白质的化学稳定性。举例来说，所述核酸可包括乙烯基砜或其它反应性部分。任选地，所述核酸可包括具有式S-S-R的反应性部分。R可以是例如保护基团。任选地，R是己醇。如本文所用，术语己醇包括具有式C6H13OH的化合物，并且包括1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇，4-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、3-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醇，2-甲基-3-戊醇、3-甲基-3-戊醇，2,2-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇和2-乙基-1-丁醇。任选地，R是1-己醇。
在一些实施例中，寡核苷酸，包括适配子、反义核酸等，可以通过使用“粘性桥接”形成非共价复合物。粘性桥接包含位于第一适配子寡核苷酸序列的3'或5'末端的寡核苷酸(“粘性序列”或“粘性末端”)。互补寡核苷酸(“粘性序列”或“粘性末端”)位于第二(优选不同的)适配子寡核苷酸序列的3'或5'末端。互补的粘性序列能够杂交并形成包含第一和第二适配子的非共价复合物。所述粘性序列可以是富含GC或AU的，并且每个粘性序列可以包含约16个核苷酸，例如14-20个核苷酸或14、15、16、17、18、19或20个核苷酸中的一个。互补的粘性序列对的实例是SEQ ID NO:25和26或SEQ ID NO:25和27(图15)。
可以在粘性序列和适配子寡核苷酸序列之间引入聚碳接头。所述聚碳接头为适配子提供了刚性，降低了包含额外粘性序列时干扰适配子合适折叠的可能性(例如参见ZhouJ，Swiderski P，Li H等，用于将剪切底物siRNA轻松递送到HIV感染细胞中的新RNAHIVgp120适配子的选择、表征和应用(Selection,characterization and application ofnew RNA HIV gp 120aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs intoHIV infected cells.))Nucleic Acids Res.2009；37(9)：3094-3109)。
聚碳接头可包含一种或多种寡核苷酸序列、烃间隔元件，例如任选取代的C1-30烷基或任选取代的C2-30烯基；或聚乙二醇分子。在一些实施例中，所述聚碳酸酯接头可以是一个与“粘性桥接”的形成一致的聚碳接头。所述聚碳接头可以是任选取代的C10-30烷基、任选取代的C10-15烷基、任选取代的C15-20烷基、任选取代的C20-25烷基、任选取代的C25-30烷基、任选取代的C10-30烯基、任选取代的C10-15烯基、任选取代的C15-20烯基、任选取代的C20-25烯基、任选取代的C25-30烯基。
因此，本发明的双特异性适配子可包含第一适配子组分，例如，其包含SEQ ID NO1-8、28、32之一，在3'或5'末端任选地通过聚碳酸酯接头间隔子共价缀合至粘性末端序列(例如SEQ ID NO:25-27之一)，并与第二适配子组分复合，例如，其包含SEQ ID NO 9-16之一，在3'或5'末端任选地通过聚碳酸酯接头间隔子共价缀合至互补的粘性末端序列(例如，SEQ ID NO 25-27之一)。
双特异性适配子的长度将反映引入双特异性适配子中的每个单特异性适配子的核酸序列的长度，以及任选地被引入的接头的长度。
因此，双特异性适配子可以定义为第一单特异性适配子和第二单体特异性适配子的复合物，其中第一单特异性适配子具有与SEQ ID NO:1-8或28-32之一具有确定的长度和一定程度的一级序列同一性，并且所述第二单体特异性适配子具有与SEQ ID NO:9-16之一具有确定的长度和一定程度的一级序列同一性。在一些实施例中，所述第一单特异性适配子是肿瘤细胞抗原适配子，且所述第二单特异性适配子是免疫细胞表面蛋白适配子。
本文提及的“反义核酸”是一核酸(例如DNA或RNA分子)，它与特定靶核酸的至少一部分(例如可翻译成蛋白质的mRNA)互补并且能够减少靶核酸(例如来自DNA的mRNA)转录或减少靶核酸(例如mRNA)翻译或改变转录物剪接(例如单链吗啉代寡核苷酸)。参见，例如，Weintraub，Scientific American，262：40(1990)。通常，合成的反义核酸(例如寡核苷酸)的长度常为15至25个碱基。因此，反义核酸能够与靶核酸(例如靶mRNA)杂交(例如选择性杂交)。在一些实施例中，反义核酸在严格杂交条件下与靶核酸序列(例如mRNA)杂交。在一些实施例中，反义核酸在中等严格杂交条件下与靶核酸(例如mRNA)杂交。反义核酸可包含天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和-异头糖(anomericsugar)-磷酸酯，骨架修饰的核苷酸。
在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸干扰mRNA的翻译，因为细胞不会翻译双链的mRNA。使用反义方法抑制基因的体外翻译是本领域熟知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，(1988))。此外，可以使用直接与DNA结合的反义分子。反义核酸可以是单链或双链核酸。反义核酸的非限制性实例包括：siRNA(包括它们的衍生物或前体，例如核苷酸类似物)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、saRNA(小活化RNA)和小核RNA(snoRNA)或其某些衍生物或前体。
如本文提供，“siRNA”，“小干扰RNA”，“小RNA”或“RNAi”是指一核酸，它可形成双链RNA，该双链RNA与基因或靶基因存在于相同的细胞中时能够降低基因或靶基因表达。杂交形成双链分子的核酸互补部分通常具有实质或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA或RNAi是与靶基因具有实质或完全同一性并形成双链siRNA的核酸。在一些实施例中，siRNA通过与细胞互补rnRNA相互作用抑制基因表达，从而干扰互补mRNA的表达。通常，所述核酸的长度为至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列长度为15-50个核苷酸，且所述双链siRNA的长度为约15-50个碱基对)。在其他实施方案中，长度为20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个或约24-29个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
本文提供的“saRNA”或“小活化RNA”是指一核酸，它可形成双链RNA，该双链RNA当与基因或靶基因存在于相同的细胞中时能够增加或激活基因或靶基因表达的能力。杂交形成双链分子的核酸互补部分通常具有实质或完全的同一性。在一个实施方案中，saRNA是一核酸，它与靶基因具有实质或完全同一性并形成双链saRNA。通常，核酸长度为至少约15-50个核苷酸(例如，双链saRNA的每个互补序列长度为15-50个核苷酸，双链saRNA长度为约15-50个碱基对)。在其它实施方案中，长度为20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个或约24-29个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示核酸或蛋白质基本上不含与天然状态相关的其它细胞组分。它可以是，例如，在均相状态下，并且可以是干燥或水溶液。纯度和均匀性通常使用分析性化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。
术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。在一些实施例中，核酸或蛋白质为至少为50％纯，任选至少65％纯、任选至少75％纯、任选至少85％纯、任选至少95％纯、和任选至少99％纯。
术语“分离的”还可以指细胞或样品细胞。分离的细胞或样品细胞是单细胞类型，其基本上不含在细胞处于其天然状态时或当它们最初从其天然状态移除时通常伴随细胞的许多组分。在某些实施方案中，分离的细胞样品保留那些天然状态下将细胞维持在需要状态的所需组分。在一些实施例中，分离的(例如纯化的、分离的)细胞或分离的细胞基本上是样品中唯一细胞类型的细胞。纯化的细胞样品可含有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的某种细胞。分离的细胞样品可以通过使用细胞标记物或细胞标记物的组合获得，其中任一种对于未纯化的细胞样品中的一种细胞类型是独特的。在一些实施例中，通过使用细胞分选仪分离细胞。在一些实施例中，抗细胞蛋白的抗体被用于分离细胞。
如本文所用，术语“约”是指包含了特定值的一系列值，本领域普通技术人员认为这些值与特定值合理相似。在一些实施例中，术语“约”是指使用本领域通常可接受的测量值在标准偏差内。在一些实施例中，约表示特定值延伸至+/-10％的范围。在一些实施例中，约表示指定值。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目测检查时(参见例如NCBI网站http：//wW'.v.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)，相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列(例如当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应性时，约60％同一性、优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，99％或更高的同一性)。然后，这些序列被称为“基本相同”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的互补。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可以考虑间隙等因素。优选地，同一性针对长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地，长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
对于序列比较，通常一个序列充当比较测试序列的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对于参考序列的序列的同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150中任一数字的邻接位数的片段，其中在两个序列最佳比对后，可以将其中的序列与相同数量的连续位数的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman，Adv.2：482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman&Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过寻找与Pearson&Lipman Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)相似的方法进行，并通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，575Science Madison博士，WI)，或通过手动对齐和目测检查(参见，例如，现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编辑，1995年增补版))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol 215：403-410(1990)。
对于本文所述的特定蛋白(例如，mHSP70)，所述蛋白包括任何蛋白质的天然存在形式、变体或同源物(例如，与天然蛋白质相比，至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性范围内)。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其他实施方案中，所述蛋白是通过其NCBI序列参照而确定的蛋白质。在其他实施方案中，所述蛋白是通过其NCBI序列参照、其同源物或功能片段而确定的蛋白。
术语“肿瘤细胞抗原”是指由肿瘤细胞异常表达或由具有异常结构的肿瘤细胞表达的任何蛋白、碳水化合物或其它成分。肿瘤细胞抗原可以通过相关肿瘤/癌症的肿瘤/癌症细胞在细胞表面表达。肿瘤细胞抗原可任选地引发免疫应答。肿瘤细胞抗原可以是通常在细胞内表达但在肿瘤细胞的细胞表面或细胞膜中/上呈现的蛋白、碳水化合物或其它成分。
肿瘤细胞抗原可以是肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原的异常表达可能与癌症的病因相关。肿瘤特异性抗原可以优先在肿瘤/癌症的细胞上表达，而不在相同类型的健康细胞上表达。因此，肿瘤细胞抗原可以是突变的癌基因或肿瘤抑制基因的产物。
肿瘤细胞抗原可以是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原也可能因为所涉及的细胞类型而出现异常。肿瘤相关抗原通常不与癌症的病因相关，它们的异常表达通常与癌症相关或由其引起。因此，肿瘤相关抗原可以是过表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的肿瘤抗原、癌胚抗原、细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。
肿瘤抗原在以下文献中有综述：Zarour HM，DeLeo A，Finn OJ等人，肿瘤抗原的分类。In：Kufe DW，Pollock RE，Weichselbaum RR，等编辑。Holland-Frei癌症医学，第6版，汉密尔顿(ON)：BC Decker；2003。肿瘤细胞抗原包括癌胚抗原：CEA，未成熟层粘连蛋白受体，TAG-72；肿瘤病毒抗原如HPV E6和E7；过表达的蛋白质：BING-4，钙激活的氯化物通道2，细胞周期蛋白B1，9D7，Ep-CAM，EphA3，Her2/neu，端粒酶，间皮素，SAP-1，存活素；癌症-睾丸抗原：BAGE，CAGE，GAGE，MAGE，SAGE，XAGE，CT9，CT10，NY-ESO-1，PRAME，SSX-2；谱系限制性抗原：MART1，Gp100，酪氨酸酶，TRP-1/2，MC1R，前列腺特异性抗原；突变抗原：β-连环蛋白(catenin)，BRCA1/2，CDK4，CML66，纤连蛋白，MART-2，p53，Ras，TGF-βRII；翻译后改变的抗原：MUC1，个体基因型抗原：Ig，TCR。其它肿瘤细胞抗原包括热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、波形蛋白、核仁蛋白、胎儿腺泡胰蛋白(FAPP)、碱性磷酸酶胎盘样2(ALPPL-2)、siglec-5、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、亲环蛋白B。
例如，在肿瘤细胞是乳腺癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：EpCAM(上皮细胞粘附分子)、Her2/neu(人表皮生长因子受体2)、MUC-1、EGFR(表皮生长因子受体)、TAG-12(肿瘤相关糖蛋白12)、IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)、TACSTD2(肿瘤相关钙信号转导物2)、CD318、CD340、CD104或N-钙粘蛋白。
例如，在肿瘤细胞是前列腺癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：EpCAM、MUC-1、EGFR、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSA(前列腺特异性抗原)、TACSTD2、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PCSA(前列腺细胞表面抗原)、CD318、CD104或N-钙粘蛋白。
例如，在肿瘤细胞是结直肠癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：EpCAM、CD66c、CD66e、CEA(癌胚抗原)、TACSTD2、CK20(细胞角蛋白20)、CD104、MUC-1、CD318或N-钙粘蛋白。
例如，在肿瘤细胞是肺癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：CK18、CK19、CEA、EGFR、TACSTD2、CD318、CD104或EpCAM。
例如，在肿瘤细胞是胰腺癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：HSP70、mHSP70、波形蛋白、HSP90、MUC-1、TACSTD2、CEA、CD104、CD318、N-钙粘蛋白或EpCAM1。
例如，在肿瘤细胞是卵巢癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：MUC-1、TACSTD2、CD318、CD104、N-钙粘蛋白或EpCAM。
例如，在肿瘤细胞是膀胱癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：CD34、CD146、CD62、CD105、CD106、VEGF受体(血管内皮生长因子受体)、MUC-1、TACSTD2、EpCAM、CD318、EGFR、6B5或叶酸结合受体。
例如，在肿瘤细胞是癌症干细胞的情况下，抗原可以是以下之一：CD133、CD135、CD117或CD34。
例如，在肿瘤细胞是黑色素瘤癌细胞的情况下，抗原可以是以下之一：黑素细胞分化抗原、癌胚抗原、肿瘤特异性抗原、SEREX抗原或其组合。黑素细胞分化抗原的实例包括但不限于酪氨酸酶、gp75、gp100、MART1或TRP-2。癌胚抗原的实例包括MAGE家族(MAGE-A1，MAGE-A4)、BAGE家族、GAGE家族或NY-ESO1中的抗原。肿瘤特异性抗原的实例包括CDK4和13-连环蛋白。SEREX抗原的实例包括D-1和SSX-2。
在一些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞抗原是HSP70或mHSP70。在一些实施例中，所述肿瘤细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞是成胶质细胞瘤细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞是结肠癌细胞。
术语“HSP70”是指本领域公知的约70千道尔顿的热休克蛋白家族。在一些优选的实施方案中，HSP70是mHSP70。如本文所述，术语“mHSP70”包括维持mHSP70活性(例如，与天然蛋白质相比，至少在50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的线粒体HSP70(mHSP70)蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，mHSP70蛋白是由NCBI序列参考NP_004125.3GI：24234688所确定的蛋白、其同系物或功能片段。mHSP70在本文中也可称为死亡蛋白(mortalin)、CSA、GRP-75、GRP75、HEL-S-124m、HSPA9B、MOT、MOT2、MTHSP75或PBP74。HSP70在癌症中的过度表达与预后不良有关，例如见Bagatell和Whitesell.，Mol Cancer Ther 2004年8月3；1021。
在一些优选的实施方案中，所述肿瘤细胞抗原是波形蛋白。在一些实施例中，所述肿瘤细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，所述肿瘤细胞是成胶质细胞瘤细胞。在一些实施例中，所述肿瘤细胞是结肠癌细胞。
术语“波形蛋白”是指在许多健康非上皮细胞(包括间充质干细胞)中发现的III类中间丝家族。本文提供的术语“波形蛋白”包括维持波形蛋白活性(例如，与天然蛋白质相比，至少在50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，波形蛋白是由UniProt登录号P08670、NCBI序列参考或Genbank登录号NP_003371.2GI：62414289所确定的蛋白。波形蛋白在各种不同的上皮癌中过度表达，包括前列腺癌、胃肠道肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤和肺癌(Satelli等，Cell mol Life Sci 2011Sep；68(18)：3033-46)。
在一些优选的实施方案中，肿瘤细胞抗原是HSP90。在一些实施例中，肿瘤细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞是成胶质细胞瘤细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞是结肠癌细胞。
术语“HSP90”是指本领域公知的约90千道尔顿的热休克蛋白的家族。本文提供的术语“HSP90”包括维持HSP90活性(例如，与天然蛋白质相比，至少在50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，HSP90蛋白质是由Genbank登录号NP_001017963.2GI：153792590或NP_005339.3GI：154146191所确定的蛋白质。HSP90在癌症中的过度表达与预后不良有关，例如见Bagatell和Whitesell，Mol Cancer Ther 2004年8月3；1021。
在一些优选的实施方案中，肿瘤细胞抗原是转铁蛋白受体。
本文提供的术语“TfR”包括维持TfR活性(例如，与天然蛋白质相比，至少在50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的转铁蛋白受体(TfR)蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考NP_003225.2GI：189458817所确定的蛋白。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考GI：189458816所确定的蛋白质。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考GI：189458818所确定的蛋白。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考GI：189458817所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考GI：189458816所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，TfR蛋白是由NCBI序列参考GI：189458818所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，TfR蛋白由对应于Gene ID：7037的核酸序列编码。
转铁蛋白受体(TfR)是在细胞表面上表达的膜糖蛋白，并介导从血浆糖蛋白转铁蛋白中的铁细胞摄取。转铁蛋白的铁吸收涉及转铁蛋白与TfR的结合。然后，结合的转铁蛋白通过内吞囊泡中受体介导的内吞作用被内化。转铁蛋白从TfR的释放是由内吞囊泡中pH的降低所引起的。TfR在多种细胞上呈不同水平的表达。例如，TfR在未成熟的红细胞、胎盘组织和快速分裂的细胞(正常的和恶性的)中高度表达。因此，能够结合TfR表达细胞表面上的TfR并内化到细胞中的化合物，对于这些化合物的靶向递送而言将会非常有用。
在一些优选的实施方案中，所示肿瘤细胞抗原包括α型血小板衍生的生长因子受体。
本文提供的术语“PDGFR-a”包括任何维持PDGFR-a的酪氨酸激酶活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的天然存在形式的α型血小板衍生的生长因子受体(PDGFR-a)蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，PDGFR-a蛋白是由NCBI序列参考NP_006197.1GI：5453870所确定的蛋白。在一些实施例中，PDGFR-a蛋白是由NCBI序列参考GI：5453870所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，PDGFR-a蛋白由对应于Gene ID：GI：172072625的核酸序列所编码。
血小板衍生的生长因子受体α(PDGFR-a)是涉及调节细胞增殖、细胞分化、细胞生长和发育的细胞表面酪氨酸激酶受体。PDGFR-a经常由肿瘤细胞表达，主要由恶性肿瘤细胞表达。PDGFR-a的表达水平与肿瘤生长、侵袭性、耐药性和不良临床结果相关。例如，PDGFR-a在成胶质细胞瘤(GBM)中高度过表达。因此，非常需要能够在PDGFR表达细胞的表面上结合PDGFR并内化入细胞中的化合物。
术语“免疫细胞表面蛋白”是指存在于免疫细胞的细胞表面的任何蛋白。在一些实施例中，它是T细胞表面蛋白、受体或共同受体。在一些实施例中，优选当存在于免疫细胞上时，它是分化簇(CD)细胞表面分子。在一些实施例中，优选当存在于免疫细胞上时，它是CC趋化因子受体(CCR)。在一些实施例中，优选当存在于免疫细胞上时，它是CXC趋化因子受体(CXCR)。
“免疫细胞”可以是淋巴细胞、白细胞、T细胞(胸腺细胞)、T-辅助细胞、细胞毒性T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、抑制性T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞、B细胞、自然杀伤细胞、白细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞。免疫细胞可在细胞表面或细胞膜之中/之上表达CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4中的任何一种。在一些优选的实施方案中，免疫细胞可以是T细胞，例如在其表面上表达T细胞受体。在一些优选的实施方案中，免疫细胞可以是CD8+T细胞。在一些优选的实施方案中，免疫细胞可以是CD4+T细胞。在一些优选的实施方案中，免疫细胞是细胞毒性T细胞。
在优选的实施方案中，所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
本文提供的术语“CCR5”包括维持CCR5活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的C-C趋化因子受体5型(CCR5)蛋白、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CCR5蛋白是由UniProt序列参考P51681所确定的蛋白。在一些实施例中，CCR5蛋白是由NCBI序列参考NP_000570.1GI：4502639所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，CCR5蛋白由对应于基因ID：GI：154091329的核酸序列所编码。
人CCR5(C-C趋化因子受体5型)是由T细胞和巨噬细胞表达的7重跨膜受体，其作为亲巨核细胞HIV-1的共同受体。CCR5的缺失与对HIV-1的抗性相关。因此，CCR5是亲巨核细胞的重要共同受体，包括HIV-1RS分离株。CCR5的变异与HIV-1的抗性或易感性相关。作为病毒进入的必需因子，CCR5代表了引人注目的HIV-1治疗细胞靶标。CCR5也称为CD195。
术语“CCR7”是指本领域熟知的C-7趋化因子受体7型(也称为CD197)。本文提供的术语“CCR7”包括维持CCR7活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CCR7蛋白是由NCBI序列参考NP_001288643.1GI：683523912所确定的蛋白、其同系物或功能片段。CCR7是G蛋白偶联受体家族的成员。
术语“CD2”指本领域中熟知的分化抗原簇2。本文提供的术语“CD2”包括维持CD2活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CD2蛋白是由Uniprot登录号P06729或NCBI序列参考NP_001758.2GI：156071472所确定的蛋白、其同系物或功能片段。CD2是通常在T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面上发现的细胞粘附分子。
术语“CD3”是指本领域熟知的分化抗原簇3，包括CD3γ、CD3δ或CD3ε链中的任何一个。本文提供的术语“CD3”包括维持CD3活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在的形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CD3γ蛋白是由NCBI序列参考NM_000073.2GI：166362738所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，CD3δ蛋白质是由NCBI序列参考NM_000732.4GI：98985799所确定的蛋白、其同源物或功能片段。在一些实施例中，CD3ε蛋白质是由NCBI序列参考NM_000733.3GI：166362733所确定的蛋白、其同系物或功能片段。Cd3是T细胞共受体，用于协助激活T细胞的细胞毒性。
术语“CD4”是指本领域熟知的分化抗原簇4。本文提供的术语“CD4”包括维持CD4活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CD4蛋白质是由UniProt登录号901730或NCBI序列参考NP_000607.1GI：10835167所确定的蛋白、其同系物或功能片段。CD4是在免疫细胞表面(例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)的糖蛋白。
术语“CD7”是指本领域熟知的分化抗原簇7。本文提供的术语“CD7”包括维持CD7活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CD7蛋白是由NCBI序列参考NP_006128.1GI：5453613所确定的蛋白、其同系物或功能片段。CD7是在胸腺细胞和成熟T细胞上发现的跨膜蛋白。
术语“CD8”是指本领域熟知的分化抗原簇8，并且包括CD8a或CD8b链中的任何一个。本文提供的术语“CD8”包括维持CD8活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CD8a蛋白质是由NCBI序列参考NM_001768.6GI：225007534所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，CD8b蛋白质是由NCBI序列参考AAI00912.1GI：71682667所确定的蛋白、其同系物或功能片段。CD8是T细胞受体的跨膜糖蛋白共受体。
术语“PD-1”是指本领域熟知的程序性细胞死亡蛋白1。程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，也称为CD279，是由PDCD1基因在人中编码的I型膜蛋白。它具有两个配体，PD-L1和PD-L2。本文提供的术语“PD-1”包括维持PD-1活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，PD-1蛋白质是由UniProt登录号Q15116或NCBI序列参考NP_005009.2GI：167857792所确定的蛋白、其同系物或功能片段。PD-1途径是T细胞衰竭的关键免疫抑制性介导物。阻断该途径可导致T细胞活化、扩增和效应子增强的功能。因此，PD-1负调节T细胞应答。已经将PD-1鉴定为慢性疾病状态中衰竭型T细胞的标志物，并且已经显示，阻断PD-1：PD-1L相互作用可部分地恢复了T细胞功能。(Sakuishi等，JEM第207卷，2010年9月27日，2187-2194页)。纳武单抗(Nivolumab)(BMS-936558)是抗PD-1抗体，其在2014年7月在日本被批准用于治疗黑色素瘤。其它抗PD-1抗体描述于WO2010/077634、WO2006/121168、WO2008/156712和WO2012/135408。
术语“CTLA4”是指本领域所熟知的细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(也称为CD152)。它是在T细胞表面发现作为免疫检查点的蛋白受体。本文提供的术语“CTLA4”包括维持CTLA4活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，CTLA4蛋白质是由UniProt登录号P16410或NCBI序列参考NP_001032720.1GI：83700231所确定的蛋白、其同系物或功能片段。
本文提供的术语“C/EBPa”或“C/EBPα”包括维持C/EBPα的转录因子活性(例如，与天然蛋白质相比，至少为50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性之内)的任何天然存在形式的CCAAT(胞嘧啶-胞嘧啶-腺苷-腺苷-胸苷)/增强子-结合蛋白α(C/EBPa)、同系物或变体。在一些实施例中，与天然存在的形式相比，变体或同系物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)中具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，C/EBPα蛋白质是由NCBI序列参考GI：551894998所确定的蛋白。在一些实施例中，C/EBPα蛋白是由NCBI序列参考GI：551894998所确定的蛋白、其同系物或功能片段。在一些实施例中，C/EBPα蛋白由对应于Gene ID：GI：551894997的核酸序列所编码。
如本文所用的“细胞”是指进行代谢或其它足以保持或复制其基因组DNA的细胞。细胞可以通过本领域熟知的方法鉴定，包括例如有完整的膜、特定染料的染色、产生子代的能力，或者在配子的情况下，与第二配子结合并产生具有活力的后代的能力。细胞可包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和源自植物和动物的细胞，例如哺乳动物，昆虫(例如夜蛾)和人细胞。
“抗癌剂”根据其普通的通用含义使用，并且是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的组分(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施例中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中有用的药剂。在一些实施例中，抗癌剂是由FDA或美国以外的其它国家类似管理机构批准用于治疗癌症的药剂。抗癌剂的实例包括但不限于：MEK(例如MEK1、MEK2或MEK1和MEK2)抑制剂(例如XL518、CI-1040、PD035901、司美替尼(selumetinib)/AZD6244、GSK1 120212/曲美替尼(trametinib)、GDC-0973、ARRY-162、ARRY-300、AZD8330、PD0325901、U0126、PD98059、TAK-733、PD318088、AS703026、BAY 869766)，烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、乌拉莫司汀(uramustine)、三胺硫磷(thiotepa)、亚硝基脲(nitrosoureas)、氮芥(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺、三胺硫磷)、烷基磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲佐菌素)、三氮烯(triazenes)(鸨烯咪胺(decarbazine))、抗代谢物(如5-咪唑硫嘌呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨、氟达拉滨、吉西他滨、培美曲塞、雷替曲塞、叶酸类似物(如甲氨蝶呤)、或嘧啶类似物(如氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷)、嘌呤类似物(如，巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁)等、植物生物碱(如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇、多西紫杉醇等)、拓扑异构酶抑制剂(如伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊甙等；抗肿瘤抗生素(如多柔比星、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普鲁卡霉素等)、铂类化合物(如顺铂、奥沙利铂、卡铂)、蒽醌(例如米托蒽醌)、取代的脲(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如丙卡巴肼)或肾上腺皮质抑制剂(例如米托坦、氨鲁米特)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷)。
抗癌剂的其它例子包括但不限于：抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、博来霉素)、酶(例如L-天冬酰胺酶)、丝裂原活化蛋白激酶信号传导抑制剂(例如U0126、PD98059、PD-184352、PD0325901、ARRY-142886、SB239063、SP600125、BAY43-9006、渥曼青霉素(wortmannin)或LY294002)、mTOR抑制剂、抗体(例如利妥昔单抗)、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、多柔比星、长春新碱、依托泊苷、吉西他滨、伊马替尼(格列卫TM)、格尔德霉素、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、硼替佐米、曲妥珠单抗、阿那曲唑；血管生成抑制剂；抗雄激素、抗雌激素；反义寡核苷酸；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；精氨酸脱氨酶；BCR/ABL拮抗剂；β-内酰胺衍生物；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；喜树碱衍生物；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；克罗米芬类似物；阿糖胞苷达昔单抗；地塞米松；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法屈唑；非那雄胺；氟达拉滨；氟代柔红霉素盐酸盐；钆特沙弗林；硝酸镓；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；七磺胺(hepsulfam)；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-I受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；醋酸亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；基质溶解素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；MIF抑制剂；米非司酮；错配的双链RNA；单克隆抗体；分枝杆菌细胞壁提取物；一氧化氮调节剂；奥沙利铂；帕诺米芬(panomifene)；喷妥唑(pentrozole)；磷酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；强的松；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；核酶；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；溶基质素抑制剂；合成糖胺聚糖；他莫昔芬甲碘化物；端粒酶抑制剂；促甲状腺激素；翻译抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；尿激酶受体拮抗剂；类固醇(如地塞米松)，非那雄胺，芳香酶抑制剂，促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)如戈舍瑞林或亮丙瑞林，肾上腺皮质激素(如泼尼松)，孕激素(如己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮)，雌激素(如，己烯雌酚、乙炔雌二醇)，抗雌激素(如他莫昔芬)，雄激素(如丙酸睾酮、氟甲睾酮)，抗雄激素(如氟他胺)，免疫刺激剂(如卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白细胞介素-2、α-干扰素等)，单克隆抗体(例如，抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR和抗VEGF单克隆抗体)，免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-加利车霉素偶联物)，抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素结合物等)，放射免疫疗法(例如，偶联于111In、90Y或131I的抗CD20单克隆抗体等)，雷公藤内酯醇、高三尖杉酯碱、放线菌素、多柔比星、表柔比星、拓扑替康、伊曲康唑、长春地辛、西立伐他汀、长春新碱、脱氧腺苷、舍曲林、匹伐他汀、伊立替康、氯法齐明、5-壬基氧色胺、维莫非尼、达拉非尼、埃罗替尼、吉非替尼、EGFR抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)靶向治疗或疗法(如吉非替尼(IressaTM)、埃罗替尼(TarcevaTM)、西妥昔单抗(ErbituxTM)、拉帕替尼(TykerbTM)、帕尼单抗(VectibixTM)、凡德他尼(CaprelsaTM)、阿法替尼/BIBW2992、CI-1033/卡奈替尼、来那替尼/HKI-272、CP-724714、TAK-285、AST-1306、ARRY334543、ARRY-380、AG-1478、达克替尼(dacomitinib)/PF299804、OSI-420/去甲埃罗替尼、AZD8931、AEE788、培利替尼/EKB-569、CUDC-101、WZ8040、WZ4002、WZ3146、AG-490、XL647、PD-153035、BMS-599626)、索拉非尼、伊马替尼、舒尼替尼、达沙替尼等。
“化疗剂”或“化学治疗剂”根据其通用的普通含义使用，并且是指具有抗肿瘤特性或抑制细胞生长或增殖能力的化学组合物或化合物。
另外，本文所述的核酸化合物可与常规免疫治疗剂共同施用或与其共价连接，所述免疫治疗剂包括但不限于免疫刺激剂(例如，卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白细胞介素-2、α干扰素等)、单克隆抗体(如抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR、抗PD-1和抗VEGF单克隆抗体)、免疫毒素(如抗CD33单克隆抗体-卡奇霉素偶联物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素偶联物等)和放射免疫疗法(例如，与111In、90Y或131I偶联的抗CD20单克隆抗体等)。
在另一个实施方案中，本文所述的核酸化合物可与常规放射治疗剂共同施用，所述放射治疗剂包括但不限于放射性核苷酸，例如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、211At和212Bi，任选地与针对肿瘤抗原的抗体偶联。
术语“样品”包括组织切片，例如活组织检查和尸检样品，以及用于组织学目的的冷冻切片。这些样品包括血液和血液成分或产品(例如，骨髓、血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、组织、培养细胞(例如，原代培养物、移植物和转化细胞)、粪便、尿液、其它生物流体(例如，前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊髓液等)等。样品通常从“受试者”(如真核生物)获得，最优选的是哺乳动物，例如灵长类动物，例如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿动物；例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔子；或者鸟；爬虫；或鱼。在一些实施例中，所述样品获自人。
“对照”样品或值是指作为参考的样品，通常是已知的参考，用于与测试样品比较。例如，测试样品可以来自测试条件，例如，在测试化合物的存在下，并与来自已知条件的样品比较，例如，在没有测试化合物(阴性对照)的情况下，或在已知化合物的存在下(阳性对照)。对照还可以表示从许多测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到，可以设计对照以评估任意数量的参数。例如，可以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗措施(例如，副作用的比较)设计对照以对治疗有益性进行比较。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的重要性也很有价值。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，则测试样本的变化将会被认为是不显著的。
“疾病”或“病症”是指能够用本发明提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或受试者的生存状态或健康状态。在优选的实施方案中，所述疾病是癌症(例如胰腺癌、前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑色素瘤、去势抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤)、传染病(例如HIV感染)、炎性疾病(例如类风湿性关节炎)或代谢疾病(例如，糖尿病)。在一些实施例中，所述疾病是与HSP70(例如mHSP70)、HSP70(例如mHSP70)磷酸化或HSP70(例如mHSP70)途径活性或HSP70激活途径的活性异常相关(例如由其引起)的疾病。在一些实施例中，所述疾病是癌症(例如胰腺癌、前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑色素瘤、去势抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、新生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性的癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗耐药性、赫赛汀耐药性、HER2阳性、多柔比星耐药性、他莫昔芬耐药性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(如肝细胞癌)、肺癌(如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其它例子包括甲状腺、内分泌系统、脑、乳腺、子宫颈、结肠、头颈、食道、肝、肾、肺、非小细胞肺、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宫的癌症或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛细胞瘤、恶性类癌、膀胱癌、皮肤癌前病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺新生物、甲状腺髓样癌、甲状腺髓样癌、黑色素瘤、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、乳头Paget's病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
术语“白血病”泛指血液形成器官的进行性恶性疾病，通常其特征在于血液和骨髓中白细胞及其前体的异常增殖和发育。白血病通常根据以下依据进行临床分类(1)疾病的持续时间和特征——急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型；髓样(髓性)、淋巴样(淋巴性)或单核细胞；(3)血液白血病或白血病(亚白血病)中异常细胞数量的增加或不增加。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的白血病的例子包括例如急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、干细胞性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、Gross'白血病、毛细胞白血病、成血细胞白血病、成血细胞性白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微小髓细胞白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞白血病、骨髓性粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling's白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病或未分化细胞白血病。
术语“肉瘤”通常是指由诸如胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积细胞组成。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy氏肉瘤、脂肪肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯肉瘤、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen's肉瘤、卡波西肉瘤、枯否细胞肉瘤、血管肉瘤、白细胞肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网织红细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”是指由皮肤和其它器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑色素瘤包括，例如，肢端黑色素瘤、无色素黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克莱德曼黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、幼年黑色素瘤、恶性雀斑样痣性黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，其通常浸润周围组织并引起转移。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的癌症的例子包括，例如，甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺样癌、腺样囊性癌、囊腺癌、腺瘤性癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管肺癌、脑癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、导管性癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮癌、外生癌、癌前病变、纤维癌、凝胶样癌、凝胶状癌、巨细胞癌、巨型细胞癌、腺癌、颗粒细胞癌、毛细胞基质癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌(hematoidcarcinoma)、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、透明状癌、透明细胞癌(hypemephroidcarcinoma)、婴儿胚胎癌、原位癌、表皮内癌，上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪性癌、小叶癌、淋巴上皮癌、髓质癌、髓样癌、黑色素瘤、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液表皮样癌、粘膜癌，粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周围癌、浸润前癌、刺细胞癌、软糊状癌、肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、斯施耐德癌、硬化癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯性癌、小细胞癌、类索状癌、球形细胞癌、梭形细胞癌、海绵母细胞癌、鳞状细胞癌、鳞细胞癌、串细胞癌(string carcinoma)、毛细血管扩张性癌、毛细血管扩张癌、移行细胞癌、结节性皮癌、管状癌、结节癌、疣状癌或绒毛状癌。
如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可互换使用，并且指增殖性疾病或病症(例如癌症)从一个器官或另一个非相邻器官或身体部分的扩散。癌症发生在起源部位，例如乳房，该部位被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发肿瘤或起源部位的一些癌细胞具有穿透和浸润局部区域周围正常组织的能力和/或穿透系统内循环的淋巴系统或血管系统穿透系统到身体其它部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二种临床可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤相似。因此，如果肺癌转移到乳房，则乳房部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而非异常的乳腺细胞组成。乳腺中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指受试者患有或曾患有原发性肿瘤并且具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或具有非转移性癌症的受试者是指受试者具有原发性肿瘤但不具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指患有或曾具有原发性肺肿瘤病史且在第二位置或多个位置(例如乳房)具有一个或多个继发性肿瘤的受试者的疾病。
在与疾病相关的物质或物质活性或功能背景下的术语“相关的”或“与......相关联”(例如，糖尿病、癌症(例如前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑色素瘤、去势-抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(如头、颈或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤，或多发性骨髓瘤))意味着疾病(例如，糖尿病、癌症(例如前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑色素瘤、去势-抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(如头、颈或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤，或多发性骨髓瘤))或病毒性疾病(例如，HIV感染相关疾病))是由(全部或部分)，或疾病的症状是由(全部或部分)物质或物质活性或功能引起的。
如本文所用的术语“异常”是指与正常不同。当用于描述酶活性时，异常是指大于或小于正常对照的活性或正常非患病对照样品的平均值。异常活性可以指导致疾病的活性的量，其中将异常活性返回到正常或非疾病相关的量(例如通过使用本文所述的方法)，造成疾病或一个或多个疾病症状的减轻。
在一些实施例中，所述癌症是其中HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-α表达中的至少一种上调(过表达)的癌症。例如，HSP70在胰腺癌细胞中组成型过表达(Hyun等，GutLiver.2013年11月；7(6)：739-46)。
表达的上调包括表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一种(任选地，仅一种)，其水平高于给定类型的细胞或组织正常预期的水平。可以通过测定细胞或组织中HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中至少一种的表达水平来确定上调。可以在来自受试者的细胞或组织样品中的表达水平与例如参照水平之间进行比较。表示相同或相应细胞或组织类型的正常表达水平的值或值范围。在一些实施例中，参考水平可以通过检测对照样品中的表达来确定，例如，在来自健康受试者的相应细胞或组织中或来自相同受试者的健康组织中。在一些实施例中，可以从标准曲线或数据集获得参考水平。
可对表达水平进行定量以进行绝对比较，或者进行相对比较。
在一些实施例中，当测试样品中的表达水平是参考水平的至少1.1倍时，可认为存在表达上调。更优选地，所述表达水平可以选自以下中的一种：至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍、或至少10.0倍的参考水平。
表达水平可以通过许多已知的体外测定技术之一来确定，例如基于PCR的测定、原位杂交测定、流式细胞术测定、免疫学或免疫组织化学测定。
举例来说，合适的技术包括一种检测方法，该方法通过将样品与能够结合HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中至少一种的试剂相接触，并检测与HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一种所形成的复合物，来测定样品中HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中至少一种(任选地，仅一种)的水平。所述试剂可以是任何合适的结合分子，例如，抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适配子或小分子，并且可以任选地进行标记以便检测，例如，所形成复合物的可视化。合适的标记和检测方法是本领域技术人员熟知的，包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、曙红和NDB、绿色荧光蛋白(GFP)、稀土(如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm))的螯合物、四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3、Cy5)、同位素标记物、放射性同位素(如32P、33P、35S)、化学发光标记(如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)、酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶)、抗体、配体和受体。检测技术是本领域技术人员公知的，并且可以选择与标记试剂相对应。合适的技术包括寡核苷酸标签的PCR扩增、质谱、荧光或染色检测，例如，通过报告蛋白酶促转化底物，或放射性检测。
测定可以通过对一样品中的HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一种进行定量。来自测试样品的定量值可与参考值进行比较，并且该比较用于确定测试样品中的HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a的至少一种是否具有低于或高于(至具有统计学显著性的所选程度)其参考值的量。
检测HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a的检测定量可用于确定编码HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a的基因的上调或下调或扩增。
术语“接触”按照其一般通用含义使用，是指至少两种不同的物质(例如包括生物分子或细胞的化学化合物)能够变得足够近从而进行反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应理解，所得反应产物可以直接由所添加试剂之间的反应产生，或者由可以在一种或多种所添加试剂在反应混合物中产生的中间产物产生。接触可包括使两种物质反应、相互作用或物理接触，其中两种物质可以是如本文所述的核酸化合物和细胞(例如癌细胞)。
核酸化合物
本文(包括其实施例)提供的适配子，尤其能够结合细胞表面蛋白靶分子并内化到细胞中。例如，mHSP70、波形蛋白和HSP90在很多种不同癌细胞的表面上和内部表达(例如胰腺癌、肝癌、前列腺癌)。CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4在多种免疫细胞(包括T细胞)的表面上和内部表达。
因此，本文(包括其实施例)提供的化合物(例如，核酸化合物)，可用于将治疗或诊断分子递送到表达靶分子的癌细胞中。治疗或诊断分子可形成本文中，包括其实施方案中所提供的化合物(例如，核酸化合物)的一部分。
当治疗或诊断分子形成本文(包括其实施例)提供的化合物(例如，核酸化合物)的一部分(例如，通过共价连接)，所述治疗或诊断分子被称为“化合物部分”(例如，治疗性部分、成像部分)。或者，所述治疗或诊断分子可能不会形成本文(包括其实施例)提供的化合物(例如，核酸化合物)的一部分，但是，当本文提供的化合物(例如，核酸化合物)与所述细胞上的靶分子结合时，可它可通过表达靶分子的细胞独立地被内化。当所述治疗或诊断分子未形成本文提供的化合物(例如，核酸化合物)的一部分时，该分子被称为“第二化合物”。本文(包括其实施例)提供的化合物(例如核酸化合物)，为靶向癌症药物递送和分子成像提供高度特异性的和有效的手段。
当核酸序列与给定序列具有至少80％(80％或更多)序列同一性时，所述核酸序列与该序列(例如，适配子序列)可具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在一些实施例中，核酸序列与该序列的整个序列或该适配子序列的连续部分(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90个连续核苷酸部分)具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，所述核酸序列与同给定序列杂交的核酸具有至少80％(80％或更多)的序列同一性。
在一些实施例中，单特异性适配子的核酸序列或能够结合两种靶分子之一的双特异性适配子的区域的长度小于100(99或更少)个核苷酸。对于双特异性适配子，可以存在两个核酸序列，每个核酸序列均具有如本文所述的长度。所述长度的计算可任选地排除形成核酸分子一部分的任何间隔子、接头或粘性桥接的核苷酸或碳部分。所述长度的计算还可任选地排除与核酸偶联的任何化合物部分，例如，任何核酸部分，如siRNA、saRNA、miRNA等。
当核酸序列长度小于100(99或更少)核苷酸时，序列是长度为99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或20个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于90个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于80个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于70个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于60个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于50个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度小于40个核苷酸。
在一些实施例中，核酸序列的长度为20至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为25至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为30至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为35至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为40至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为45至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为50至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为55至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为60至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为65至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为70至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为75至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为80至99个核苷酸。在一些实施例中，核酸序列的长度为85至99个核苷酸。
在靶细胞表面上结合靶分子后，本文(包括其实施例)提供的核酸化合物可以被细胞内化。本文提供的术语“被内化”、“经内化”或“内化”是指进入细胞的细胞质(例如，被细胞膜吞噬后)中的组合物(例如，化合物、核酸化合物、治疗剂、成像剂)。在一些实施例中，所述细胞是恶性细胞。在一些实施例中，所述细胞是乳腺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是前列腺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是肺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是白血病细胞。在一些实施例中，所述细胞是成胶质瘤细胞。在一些实施例中，所述细胞是结肠癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是非恶性细胞。
在一些实施例中，适配子是脱氧核糖核酸。在一些优选的实施例中，所述适配子可以是核糖核酸。所述适配子可以是单链的。本发明的适配子可含有一种或多种经化学修饰的碱基。在一些实施例中，给定类型的每个碱基(例如A，T，C，G)可含有相同的化学修饰。
本发明所述的适配子可含有一个或多个在核糖2'位置经化学修饰的核苷酸。在一些实施例中，每种核糖含有相同的化学修饰。在一些其它实施例中，某些核苷酸(例如A，T，C，G)的核糖可以独立地被修饰。这些修饰可包括O-甲基修饰(2'-OMe)、氟化物修饰(2'-F)或胺修饰(2-NH2)。
本文(包括其实施例)提供的核酸化合物可包含化合物部分。当核酸化合物包含化合物部分时，所述化合物部分可与核酸序列共价连接(例如，直接或通过共价键合的中间体)(见例，在上述偶联化学物中有用的反应性部分或官能基团)。因此，在一些实施例中，所述核酸化合物还包括与核酸序列共价连接的化合物部分。在一些实施例中，所述化合物部分和核酸序列形成偶联物。在一些实施例中，所述化合物部分与核酸序列非共价结合(例如通过离子键、范德华键/相互作用、氢键、极性键，或其组合或混合)。
在一些实施例中，所述化合物部分是治疗部分或成像部分。
在一些实施例中，所述治疗部分与核酸序列共价结合。在一些实施例中，成像部分与核酸序列共价结合。本文提供的术语“治疗部分”根据其一般通用含义使用，是指当给予有需要的受试者时具有疗效(预防、根除、改善所治疗的相关病症)的单价化合物。本文提供的治疗部分可包括但不限于肽、蛋白质、核酸、核酸类似物、小分子、抗体、酶、前药、细胞毒性剂(例如毒素)，包括但不限于蓖麻毒素、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素和糖皮质激素。在一些实施例中，所述治疗部分是如本文所述的抗癌剂或化学治疗剂。在一些实施例中，所述治疗部分是核酸部分、肽部分或小分子药物部分。在一些实施例中，所述治疗部分是核酸部分。在一些实施例中，所述治疗部分是肽部分。在一些实施例中，所述治疗部分是小分子药物部分。在一些实施例中，所述治疗部分是核酸酶。在一些实施例中，所述治疗部分是免疫刺激剂。在一些实施例中，所述治疗部分是毒素。在一些实施例中，所述治疗部分是核酸酶。在一些实施例中，所述治疗部分是锌指核酸酶。在一些实施例中，所述治疗部分是转录激活因子样效应子核酸酶。在一些实施例中，所述治疗部分是Cas9。在一些实施例中，所述治疗部分是吉西他滨或其反应性片段。本文提供的“吉西他滨”是指化合物4-氨基-1-(2-脱氧-2,2-二氟-13-D-赤蒽呋喃糖基)嘧啶-2(1H)-酮。在通常意义上吉西他滨是指CAS登记号95058-81-4。
在一些实施例中，所述治疗部分是活化核酸的部分(包含活化核酸的单价化合物)或反义核酸部分(包含反义核酸的单价化合物)。活化核酸是指能够可检测地增加给定基因或蛋白质的表达或活性的核酸。与不存在活化核酸的对照相比，活化核酸可以增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的表达或活性。在某些情况下，表达或活性相比不存在活化核酸时的表达或活性高的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高。
在一些实施例中，所述治疗部分是miRNA部分(包含miRNA的单价化合物)，mRNA部分(包含mRNA的单价化合物)，siRNA部分(包含siRNA的单价化合物)或saRNA部分(包括saRNA的单价化合物)。在一些实施例中，所述治疗部分是miRNA部分。术语“miRNA”根据其一般通用含义使用，并且是指能够在转录后调节基因表达的小非编码RNA分子。在某一实施例中，miRNA是与靶基因具有基本相同或完全同一性的核酸。在一些实施例中，miRNA通过与互补的细胞mRNA的相互作用抑制基因表达，从而干扰互补mRNA的表达。通常，miRNA的长度至少约为15-50个核苷酸(例如，miRNA的每个互补序列长度为15-50个核苷酸，并且miRNA的长度约为15-50个碱基对)。在其它实施例中，长度为20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个或约24-29个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，所述治疗部分是如本文所述的siRNA部分或saRNA部分。在实施方例中，所述治疗部分是抗癌剂部分。在一些实施例中，所述治疗部分是mRNA部分。在一些实施例中，所述治疗部分是siRNA部分。在一些实施例中，所述治疗部分是saRNA部分。在一些实施例中，所述治疗部分是cDNA部分。在一些实施例中，所述治疗部分是C/EBPαsaRNA部分。本文提供的“C/EBPαsaRNA”是能够激活C/EBPα蛋白表达的saRNA。在一些实施例中，所述治疗部分是HSP70siRNA部分。
本文提供的化合物部分可以是成像部分。如本文所提供的“成像部分”是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的单价化合物。在一些实施例中，成像部分与RNA序列共价连接。
成像部分的例子是(但不限于)：32P、放射性核素、发射正电子的同位素、荧光染料、荧光团、抗体、生物发光分子、化学发光分子、光活性分子、金属、电子致密试剂、酶(例如，通常在ELISA中所使用的)、磁造影剂、量子点、纳米颗粒、生物素、洋地黄毒苷、半抗原和蛋白质或可检测的其它实体，例如通过将放射性标记掺入肽或抗体与靶蛋白特异性反应。可以使用在本领域中已知的任何方法用于将抗体偶联至所述部分，例如，使用在赫曼森描述的方法，生物偶联技术1996，学术出版社公司，圣地亚哥(Hermanson,BioconjugateTechniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego)。示例性的荧光团包括荧光素、罗丹明、GFP、香豆素、FITC、Alexa氟、CY3、CY5、BODIPY和花青染料。示例性的放射性核素包括氟-18、镓-68、和铜-64。示例性磁性造影剂包括钆、氧化铁和铁铂，以及锰。在一些实施例中，成像部分是生物发光分子。
在一些实施例中，所述成像部分是光活性分子。在一些实施例中，所述成像部分是金属。在一些实施例中，所述成像部分是纳米颗粒。
本文提供的所述化合物(例如，核酸化合物)可以包括配体部分。如本文所用，“HSP70配体部分”是指能够结合(相互作用)到本文所述肿瘤细胞抗原或免疫细胞表面蛋白的单价化合物(例如取代基)。所述结合可以特异性相对于其它细胞表面蛋白。在一些实施例中，配体部分是核酸部分、肽部分或小分子部分(例如小分子药物部分)。在一些实施例中，所述配体部分构成RNA序列的一部分。在一些实施例中，所述配体部分包含SEQ ID NO:8或由其组成。在一些实施例中，本文提供的化合物结合到细胞受体。在一些实施例中，细胞受体是HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGF-a中的一个，或CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4中的一个。本文提供的“细胞表面”指的是在细胞(即在可与细胞外空间相通的细胞膜上)表面上表达(如存在)的蛋白。在一些实施例中，细胞受体表达于(如存在于)癌细胞(即在可与癌细胞外空间相通的细胞膜上)。在一些实施例中，所述癌细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，所述癌症细胞是胶质瘤细胞。在一些实施例中，所述癌细胞是肝癌细胞。在一些实施例中，所述癌细胞是前列腺癌细胞。在一些实施例中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。在一些实施例中，所述癌细胞是白血病细胞。在一些实施例中，所述细胞是结肠癌细胞。
药物制剂
本文所提供化合物(例如，核酸化合物)的药物组合物可包括具有治疗有效量(即达到预期目的有效量)的治疗部分的组合物。
本文所提供化合物(例如，核酸化合物)的药物组合物可包括具有有效量(即达到预期目的有效量)的成像部分的组合物。对特定应用有效的实际量尤其取决于所治疗、测试，检测或诊断的病症。当以治疗疾病的方法施用时，此类组合物将含有达到所需结果的有效量的活性成分，例如调节靶分子的活性，和/或减轻、消除或减缓疾病症状的进展。本文提供的治疗有效量的治疗部分的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文的详细公开内容。当以诊断或检测疾病的方法施用时，此类组合物将含有一定量的本文所述的成像部分，其有效地达到所需的结果，例如，检测受试者中靶分子、细胞或肿瘤的不存在或存在。本文提供的可检测量的成像部分的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文的详细公开内容。
施用于哺乳动物的剂量和频率(单剂量或多剂量)可以根据多种因素而变化，例如，哺乳动物是否患有另一种疾病，及其给药途径；接受者的大小、年龄、性别、健康、体重、体块指数和饮食；所治疗疾病症状的性质和程度、同时治疗的类型、所治疗疾病的并发症或其它与健康有关的问题。其它治疗方案或药剂可以与本文所述的方法和组合物(包括其实施方案)联合使用。已确定剂量(例如，频率和持续时间)的调整和操作完全在本领域技术人员的能力范围内。
对于本文所述的任何组合物(例如，所提供的核酸化合物、抗癌剂和所提供的核酸化合物的组合)，治疗有效量最初可以由细胞培养测定确定。目标浓度将是能够实现本文所述方法的那些活性化合物浓度，如使用本文所述的方法或本领域已知的方法所测定的。如本领域所熟知的，还可以从动物模型确定人用有效量。例如，可以将人用剂量配置成已经发现在动物中有效的浓度。如上所述，可通过监测有效性并向上或向下调节剂量来调节人用剂量。基于上述方法和其它方法调节剂量以在人体中实现最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
在另一个方面，提供了药物制剂，其包括本文(包括其实施例)提供的核酸化合物和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述核糖核酸包括与核酸序列共价连接的化合物部分。如上所述，所述化合物部分可以是共价连接于核酸序列的治疗部分或成像部分。
在另一方面，所述药物制剂包括本文提供的核酸化合物(包括其实施例)和治疗剂。在一些实施例中，所述核酸化合物和治疗剂为非共价连接。本文提供的治疗剂是指具有治疗效果的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在一些实施例中，所述治疗剂是抗癌剂。在一些实施例中，所述药物制剂包括药学上可接受的赋形剂。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于向受试者施用活性剂并由受试者吸收的物质，并且可以包含在本发明组合物中而不会在患者中引起显着的不良毒理学作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、常规蔗糖、常规葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(如林格氏液)、醇类、油、明胶、碳水化合物如乳糖、淀粉酶或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和颜料等。这些制剂可以经灭菌，并且如果需要，可以与辅助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等，它们不会与用本发明化合物发生有害反应。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂可用于本发明。
术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域熟知的各种有机和无机平衡离子的盐，仅举例来说，包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“制剂”旨在包括活性化合物的剂型，其中包封材料作为载体，如胶囊，其中活性成分与或不与其它载体一起被载体包围，因此与载体结合。同样，还包括扁囊剂(cachet)和锭剂。片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可作为适和口服给药的固体剂型。
药物制剂任选为单位剂型。在这种形式中，制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量。所述单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有单独量的制剂，例如包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。此外，所述单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是任意合适数量的这种包装形式。单位剂型可以是冷冻分散体。
递送方法
本文提供的向细胞递送化合物(例如，如本文所提供的核酸化合物)的方法，其通过所述化合物结合细胞表面靶标分子(例如HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR、PDGF-a、CCR5、CCR7、CD2CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4)并使化合物内化进入细胞。因此，在一个方面中，提供了一种将化合物递送入细胞的方法。所述方法包括使细胞表面靶分子与化合物接触，所述化合物包括能够结合所述靶分子的核酸序列。所述化合物能够进入细胞从而将所述化合物递送入细胞。可以通过在细胞表面靶分子来促进(介导)这种进入细胞。
在一些实施例中，细胞表面靶分子存在于细胞表面上。在一些实施例中，所述靶分子通过进入形成细胞囊泡的一部分。
在一些实施例中，所述化合物包括治疗剂或成像剂。在一些实施例中，所述化合物是治疗剂或成像剂。在一些实施例中，所述治疗剂是抗体、肽、核酸或小分子(例如药物)。在一些实施例中，所述成像剂是生物发光分子、光活性分子、金属或纳米颗粒。在一些实施例中，所述化合物是抗体、肽、核酸或小分子。在一些实施例中，所述化合物是抗体。在一些实施例中，所述化合物是如本文所提供的核酸化合物(包括其实施例)。在一些实施例中，该方法包括检测所述细胞中的核酸化合物，从而检测细胞。
如上所述，本发明(包括其实施例)提供的核酸化合物，可用于向细胞内递送化合物部分或化合物(例如，治疗剂或成像剂)。当化合物部分(例如，治疗性部分或成像部分)递送到细胞中时，所述化合物部分可以共价连接至本文所述核酸化合物(RNA序列)(包括其实施例)。一旦核酸化合物(RNA序列)结合到细胞上的配体，所述化合物部分与核酸化合物(RNA序列)共价连接并由细胞所内化。因此，在一个方面中，提供了将化合物部分递送入细胞的方法。所述方法包括：(i)将细胞与本文(包括其实施例)所述的核酸化合物接触，和(ii)使所述核酸化合物结合到细胞上的配体并进入细胞，从而将化合物部分递送入细胞。
或者，当化合物被递送到细胞中时，所述化合物(例如，治疗剂或成像剂)可以不与核酸化合物(核酸序列)共价连接。当本文提供核酸化合物(包括其实施例)与细胞上的目标分子结合时，所提供的核酸化合物和化合物在互相非共价连接的情况下被内化到细胞中。
因此，在另一个方面，提供了将化合物递送到细胞的方法。该方法包括(i)将细胞与化合物和本文(包括其实施例)提供的核酸化合物接触，和(ii)使所述核酸化合物与细胞上的靶分子结合，并使所述化合物进入细胞，从而将化合物递送入细胞。在一些实施例中，所述化合物是治疗剂或成像剂。在一些实施例中，所述化合物与核酸化合物非共价连接。
治疗方法
如本文所用，“疗法”或“治疗”或“减轻”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语是指一种方法，用于获得有益的或所期望的结果，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善需要治疗的所经受的病症。另外，治疗益处是通过根除或改善与经受病症有关的一种或多种生理学症状并可在患者中观察到改善而获得，尽管患者可能仍为所经受疾病所困。对于预防益处，所述组合物在发生特定疾病风险或患者报告疾病的一种或多种生理症状时给予患者，即使可能尚未作出这种疾病的诊断。治疗包括对这种疾病的预防，即，在疾病的诱发之前，通过施用保护性的组合物从而使疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即，在疾病的诱发之后但疾病具有临床表现或再现之前，通过施用保护性的组合物从而使疾病的临床症状不发展；遏制疾病，即在临床症状开始出现之后，通过保护性组合物而制止其发展；预防疾病的复发和/或减轻疾病，即在临床症状开始出现之后，通过施用保护性组合物而使临床症状消退。例如，本文某些方法治疗癌症(例如，前列腺癌、肾癌、转移性癌、黑色素瘤、去势-抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部、或食管)、结直肠癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤)。例如本文某些方法通过降低或减轻或预防癌症的发生、生长、转移、或进展而治疗癌症，或减轻癌症的症状而治疗癌症；癌症(例如，前列腺癌、肾癌、转移性癌、黑色素瘤、去势-抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部、或食管)、结直肠癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤)的症状可以为本领域普通技术人员所知或由其确定。
当准备进行组合治疗时，它并不意味着在此描述的药剂(即核酸的化合物)被这种组合的特定性质所限制。举例来说，本文所述的药剂可以通过简单混合以及化学混合而组合施用。后者的一个实例是将所述药剂共价连接到靶向载体或活性药物上。所述共价结合可以通过许多方法实现，例如但不限于，使用市售可得的交联剂。
“有效量”是足以实现所述目的(例如，达到施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、减轻疾病或病症的一种或多种症状、降低细胞中的病毒复制)的量。“有效量”的一个例子是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以被称为“治疗有效量”。一种或多种症状的“减轻”(以及这个短语在语法上等同的词)是指降低一种或多种症状的严重度或频率，或消除一种或多种症状。药物的“预防有效量”是指当施用给受试者时，药物所预期预防效果的量，例如，预防或延迟损伤、疾病、病理或病症的发作(或复发)，或降低损伤、疾病、病理、或病症或其症状发作(或复发)的可能性。完整的预防效果不一定通过一个剂量给药就发生，而可能只在一系列剂量给药后才出现。因此，预防有效量可以在一次或多次给药中获得。如本文所用，“活性降低量”是指降低酶或蛋白相对于不存在拮抗剂时的活性所需要的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”是指破坏酶或蛋白相对于不存在拮抗剂时功能的活性所需要的拮抗剂的量。对于特定药物产品类型，可在文献中找到合适的剂量。例如，对于给定的参数，有效量将显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、或至少100％的增加或降低。功效也通过“倍”来表达增加或减少。例如，治疗有效量相对于对照可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、或更高的效果。确切的量将取决于治疗的目的，并且由本领域技术人员使用已知的技术(参见，例如，Lieberman的药学剂量表(Pharmaceutical Dosage Forms)(卷1-3，1992)；Lloyd，药物配制的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)(1999)；Pickar，剂量计算(Dosage Calculations)(1999)；和Remington：制药科学和实践(TheScience and Practice of Pharmacy)，第20版，2003，Gennaro编，Lippincott,Williams&Wilkins)而确定。
“患者”或“有需要的受试者”是指遭受或易患用本发明所提供方法治疗的疾病或病症的活的生物体。该术语并不一定表明受试者已经被诊断患有具体的疾病，但一般指在医疗监督下的个体。非限制性的实施例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿、和其它非哺乳动物。在一些实施例中，所述患者是人。
如本文所用，术语“给药(施用)”是指口服给药、栓剂给药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下给药，或将缓释装置(例如微渗透泵)植入于受试者。给药是通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如，口腔、舌下、经腭、龈、鼻、阴道、直肠或透皮)。
肠胃外给药包括，例如，静脉内、肌内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。递送的其它模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。“共施用(或共给药)”是指本文中描述的组合物在相同的时间、在施用一种或多种额外治疗剂(例如癌症疗法，诸如化疗、激素疗法、放射疗法或免疫治疗)即刻之前或之后施用。本发明的化合物可以单独施用，或可以共施用给患者。共施用是指包括将化合物同时或序贯地单独或组合(一种以上的化合物)施用。因此，当需要时，该制剂也可与其它活性物质进行组合(例如，以减少代谢性降解)。本发明的组合物可以通过经皮递送、通过局部途径，配制成敷药棒、溶液、混悬剂、乳剂、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、胶冻、涂覆剂、粉末和气雾剂。
利用本文提供的教导，有效的预防性或治疗性治疗方案可被计划成基本不引起毒性、但可有效地治疗特定患者表现出的临床症状。这种计划应包含对活性化合物的仔细挑选，其通过考虑所选药剂的如化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的现状和严重程度、给药的优选方式和毒力情况而得。
在另一个方面，提供了治疗癌症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文(包括其实施例)提供的核酸化合物。在一些实施例中，所述核酸化合物还包括抗癌治疗部分。在另一个方面，提供了治疗癌症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文(包括其实施例)提供的抗癌剂和核酸化合物。
检测细胞的方法
本文所提供的核酸组合物也可用于将化合物和化合物部分递送至表达靶分子(例如HSP70、波形蛋白、HSP90、TFR、PDGF-A、CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4)的细胞。如上所述，所递送的化合物和化合物部分可以是有用于细胞检测的成像剂。因此，在一个方面，提供了一种检测细胞的方法。所述方法包括：(i)将本文(包括其实施例)所提供的核酸化合物与细胞接触，其中所述核酸化合物还包含成像部分，(ii)使所述核酸化合物结合到细胞上的靶分子并进入细胞，(iii)检测所述成像部分从而检测细胞。
在另一个方面，提供了一种检测细胞的方法。所述方法包括(i)将细胞与成像剂和本文(包括其实施例)提供的核酸化合物接触。(ii)使核酸化合物结合到细胞上的靶分子并使成像剂进入到细胞中。(iii)检测所述成像剂从而检测细胞。
在一些实施例中，所述细胞是恶性细胞。在一些实施例中，所述细胞是乳腺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是前列腺癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是胰腺癌细胞。在一些实施例中，所述癌症细胞是胶质瘤细胞。在一些实施例中，所述细胞是结肠癌细胞。在一些实施例中，细胞是非恶性细胞。在一些实施例中，所述细胞形成生物体的一部分。在一些实施例中，所述生物体是哺乳动物。在一些实施例中，所述细胞形成细胞培养物的一部分。
本发明包括了本发明各方面以及优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许的或当明确避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
本发明各方面和实施例现在将通过示例的方式参考附图示出。其它方面和实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。本文中提到的所有文献都通过引用并入本文。
除非上下文另有要求，本说明书、包括后附的权利要求全文中，词语“包含”及其变体如“包括”和“含有”将被理解为暗示纳入了所述的整数或步骤或成组的整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或成组的整数或步骤。
必须注意，如在说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文清楚地另有规定。范围可以表达本文为从“约”一个具体值，和/或到“约”另一个具体值。当这样的范围表达时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当数值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，应理解，特定值形成另一个实施例。
实施方案
本文所计划的实施方案包括以下P1到P41的实施方案。
实施方案P1：能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
实施方案P2：实施方案P1的双特异性适配子，其中所述肿瘤细胞抗原是热休克蛋白70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGF-a。
实施方案P3：实施方案P1或P2的双特异性适配子，其中所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
实施方案P4：能够结合癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。
实施方案P5：能够结合胰腺癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。
实施方案P6：实施方案P4或P5的双特异性适配子，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施方案P7：能够结合HSP70和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
实施方案P8：能够结合波形蛋白和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
实施方案P9：能够结合HSP90和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
实施方案P10：P4-P9任一实施方案的双特异性适配子，其中所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
实施方案P11：能够结合HSP70和CCR5的双特异性适配子。
实施方案P12：能够结合波形蛋白和CCR5的双特异性适配子。
实施方案P13：能够结合HSP90和CCR5的双特异性适配子。
实施方案P14：前述任一实施方案中的双特异性适配子，其中所述HSP70是mHSP70。
实施方案P15：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含SEQ ID NO:1-7中的一个核酸序列。
实施方案P16：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含与SEQ ID NO:1-7中的一个至少具有80％序列同一性的核酸序列。
实施方案P17：P1-P16任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
实施方案P18：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含SEQ ID NO:28-30中的一个核酸序列。
实施方案P19：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含与SEQ ID NO:28-30中的一个至少具有80％序列同一性的核酸序列。
实施方案P20：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含SEQ ID NO:31或32中的一个核酸序列。
实施方案P21：P1-P14任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含与SEQ ID NO:31或32中的一个至少具有80％序列同一性的核酸序列。
实施方案P22：P1-P21任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含SEQ ID NO:9-16中的一个核酸序列。
实施方案P23：P1-P21任一实施方案的双特异性适配子，其中，所述双特异性适配子包含与SEQ ID NO:9-16中的一个至少具有80％序列同一性的核酸序列。
实施方案P24：含有SEQ ID NO:17、或19-24中一个的双特异性适配子。
实施方案P25：含有SEQ ID NO:18的双特异性适配子。
实施方案P26：双特异性适配子，包含SEQ ID NO:17、或19-24以及SEQ ID NO:18的复合物之一。
实施方案P27：P1-P26任一实施方案的双特异性适配子，其中一个或多个碱基或核苷酸经化学修饰。
实施方案P28：P1-P27任一实施方案的双特异性适配子，其中一个或多个核苷酸在核糖的2'位经化学修饰。
实施方案P29：一种复合物，任选地为体外复合物，为P1-P28任一实施方案的双特异性适配子与能够为双特异性适配子结合并表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞。
实施方案P30：一种复合物，任选地为体外复合物，为P1-P28任一实施方案的双特异性适配子与能够为双特异性适配子结合并表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞。
实施方案P31：一种复合物，任选地为体外复合物，为P1-P28任一实施方案的双特异性适配子与能够为双特异性适配子结合并表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞、以及能够为双特异性适配子结合并表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞。
实施方案P32：实施方案P30或P31的复合物中，其中所述免疫细胞是T细胞。
实施方案P33：一种药物组合物，其包含P1-28任一实施方案的双特异性适配子，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
实施方案P34：P1-P28任一实施方案的双特异性适配子用于医学治疗的方法。
实施方案P35：P1-P28任一实施方案的双特异性适配子用于治疗癌症的方法。
实施方案P36：双特异性受体在实施方案P35治疗癌症的方法中的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
实施方案P37：双特异性受体在实施方案P35或P36治疗癌症的方法中的用途，其中所述癌症过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、Tfr或PDGF-a中的至少一种。
实施方案P38：治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的P1-P28任一实施方案中的双特异性适配子。
实施方案P39：实施方案P38的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
实施方案P40：实施方案P38或P39的方法，其中所述癌症过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、Tfr中或PDGF-a中的至少一个。
实施方案P41：选择受试者以接受癌症治疗的方法，所述治疗采用治疗有效量的P1-P28任一实施方案中的双特异性适配子，所述方法包括体外测定所述受试者中的癌症细胞是否过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGF-a中的至少一个。
实施例
实施例1：靶向于癌症的双特异性RNA适配子
我们研究了癌症特异性双特异性RNA适配子的构建以招募内源性T细胞。所述双特异性RNA适配子在癌细胞靶标和T细胞之间形成桥接，从而形成免疫“溶细胞突触”(图16)，从而导致癌症细胞的快速溶解。
1.序列
通过聚碳接头连接到粘性序列的tP19(截短的P19，胰腺癌适配子)：
fCfUfCAAfUGGfCGAAfUGfCfCfCGfCfCfUAAfUAGGGooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:17]
CCR5适配子(G3；T细胞表面标记物)：
GGGAGGAfCGAfUGfCGGGfCfCfUfUfCGfUfUfUGfUfUfUfCGfUfCfCAfCAGAfCGAfCfUfCGfCfCfCGAooooofCmAmAmAmAfUmGfUmAmAmAmAmAmAfCfU[SEQ ID NO:18]
粗体：粘性序列。fU和fC：2'F修饰的嘧啶。mA和mG：2'甲基化嘌呤，O：C3碳接头。
tP19(SEQ ID NO:1)是在结合于细胞表面的mHSP70后能够内化的mHSP70结合适配子，其描述于WO2013/154735。tP19是适配子P19的截短形式，其也结合mHSP70，并描述于WO2013/154735。WO2013/154735通过具体引用将其整体并入本文。tP19也被描述于在审的美国临时专利申请No.62/141156，其通过具体引用将其整体并入本文。
CCR5结合适配子G3(SEQ ID NO:9)在Zhou等人，2015，化学和生物(Chemistry&Biology)，22，379-390，2015年3月19日以及在审的美国专利申请No.14/801710中有所描述，通过具体引用将其整体并入本文。
2.能够结合mHSP70和CCR5的双特异性RNA适配子的形成
tP19在95℃下的结合缓冲液(无Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐溶液[DPBS]，5mM MgCl2)中折叠5分钟，并缓慢冷却。CCR5适配子在65℃下的结合缓冲液(含有MgCl2和CaCl2的DPBS)中折叠5分钟，并缓慢冷却。将相同浓度的tP19和CCR5适配子混合，并在37℃下温育20分钟，以利用“粘性序列“技术形成偶联物(图4；M：标记物，1：tP19适配子，2：CCR5适配子，3：tP19-CCR5双特异性RNA适配子)。“粘性序列“技术成功结合了TP19和CCR5适配子作为双特异性RNA适配子。
3.靶标结合测定
为了测试双特异性RNA适配子(tP19-CCR5适配子)所结合的靶细胞是PANC-1，进行了活细胞成像。tP19用Cy3标记而CCR5适配子用FAM标记。将500nM的双特异性RNA适配子与PANC-1孵育4小时，并用共聚焦显微镜成像(红色：CY3，绿色：FAM，蓝色：Hoechest核染色)。留于PANC-1表面上的双特异性RNA适配子未内化。
4.双特异性RNA适配子(tP19-CCR5)的细胞毒性T淋巴细胞测定(CTL)。
为了测试双特异性RNA适配子的肿瘤细胞裂解，采用CD8阳性选择试剂盒(干细胞，#18053)分离健康的人T细胞。分离后，用流式细胞仪确定CD8T细胞的富集物。
靶细胞PANC-1用钙黄绿素-AM(一种活细胞中的绿色荧光染料)标记。效应细胞是分离的CD8T细胞，靶细胞是PANC-1。将500nM的双特异性RNA适配子与细胞在不含酚红和FBS的培养基中温育8小时，E：T之比＝20：1。设立四个不同的实验组以测定分离的CD8T细胞是否攻击外来细胞。tP19；含tP19适配子的CD8T细胞：PANC-1(E：T之比＝20：1)。CCR5；含CCR5适配子的CD8T细胞：PANC-1(E：T之比＝20：1)。tP19-CCR5；含tP19-CCR5双特异性适配子的CD8T细胞：PANC-1(E：T之比＝20：1)。CC；不含适配子的CD8T细胞：PANC-1(E：T之比＝20：1)。
通过荧光读板仪测定所释放的荧光。
通过以下公式计算特异性裂解。
特异性裂解(％)＝(试验性释放-自发释放对照/最大释放对照-自发释放对照)×100。
双特异性RNA适配子诱导的PANC-1裂解可达80％(图9)。
实时视频显微镜表明，双特异性适配子能够吸引T-细胞至PANC-1细胞，产生T细胞、双特异性适配子和PANC-1细胞的复合物，从而进行快速和有效的PANC-1细胞裂解(例如，参见图7和图8)。
实施例2：mHSP70/CCR5双特异性适配子
通过聚碳接头连接至粘性序列的P19(SEQ ID NO.:2)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAfUGGfCGAAfUGfCfCfCGfCfCfUAAfUfAGGGfCGfUfUAfUGAfCfUfUGfUfUGAGfUfUfCGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:19]
通过聚碳接头连接至粘性序列的P1(SEQ ID NO.:4)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAfUGfCGfCfUGAAfUGfCfCfCAGfCfCGfUGAAAGfCGfUfCGAfUfUfUfCfCAfUfCfCfUfUfCGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:20]
CCR5适配子(G3)
GGGAGGAfCGAfUGfCGGGfCfCfUfUfCGfUfUfUGfUfUfUfCGfUfCfCAfCAGAfCGAfCfUfCGfCfCfCGAooooofCmAmAmAmAfUmGfUmAmAmAmAmAmAfCfU[SEQ ID NO:18]
粗体：粘性序列。fU和fC：2'F修饰的嘧啶。mA和mG：2'甲基化嘌呤，O：C3碳接头。
P19(SEQ ID NO:2)和P1(SEQ ID NO:4)是mHSP70结合适配子，每一个都能够在与细胞表面mHSP70结合后内化。其描述于WO2013/154735。
CCR5结合适配子G3(SEQ ID NO:9)在Zhou等人，2015年，化学和生物(Chemistry&Biology)，22，379-390，2015年3月19日以及在审的美国专利申请No.14/801710中有所描述。
能够结合mHSP70和CCR5的双特异性适配子的形成：
将通过聚碳接头连接至粘性序列的P19或P1，在95℃下的结合缓冲液(不含Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐溶液[DPBS]，5mM MgCl2)中折叠5分钟并缓慢冷却。将通过聚碳接头连接至粘性序列的CCR5适配子在65℃下的结合缓冲液(含有MgCl2和CaCl2的DPBS)中折叠5分钟，并缓慢冷却。将相同浓度的P19或P1和CCR5适配子混合，并在37℃下温育20分钟，以利用“粘性序列“技术形成偶联物。
实施例3：基于质谱对适配子结合的细胞表面蛋白进行的鉴定
癌症生物标志物发现的一个关键挑战，是识别那些在正常细胞内但在肿瘤细胞表面上暴露的靶标。具有这些特征的靶标可以增加候选标志物对癌细胞的治疗特异性和亲和力，从而达成抗癌治疗、诊断和治疗性诊断的发展。在此，使用盲法指数富集的配体系统进化技术(SELEX)和串联质谱，我们描述了用于鉴定活细胞上作为癌症生物标志物的肿瘤相关蛋白的方法。作为有力证据，已经利用RNA适配子开发了用于选择特异性表达于胰腺癌细胞质膜上误定位的靶标的蛋白组学平台。波形蛋白被鉴定为结合靶标。该技术可用于多种癌症类型。
1.介绍
适配子，作为小结构性单链RNA，是强有力的新兴癌症生物标志物鉴定分子工具，因为它们可以被选择用于识别各种靶标，包括蛋白、培养的细胞和整个生物体[1-6]。适配子是由指数富集的配体系统进化技术(SELEX)生成的，并通过明确的互补核酸序列保持其三维结构[7,8]。当适配子采用了复合物结构并以高亲和力和特异性结合于靶标时，它们提供了显著优于抗体的优点：更好的结构稳定性、低毒性、低免疫原性并且更安全[7,8]。此外，适配子的亲和力和特异性与抗体的亲和力和特异性相媲美，甚至更高[9]。相对抗体的另一种优点在于，适配子可进行微调，并在选择后通过化学合成在大小上进行缩减。
基于蛋白组学的质谱能够对蛋白图谱进行鉴定，提供了新的靶标治疗和诊断发展的重要来源[10]。串联质谱(MS/MS)的优点是，它通过一个单系列实验，提供了整个蛋白链长度上的大量序列信息，并可轻易实现寡肽片段的分离和纯化[10]。
选择性表达于癌细胞质膜上的蛋白可用于加深我们对肿瘤发展的理解。已经对肿瘤细胞上特异性表达的几个质膜相关蛋白进行了描述，包括如下：热休克蛋白70(HSP70)[11，12]、热休克蛋白90(HSP90)[13，14]、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)[15，16]、波形蛋白[17]、核仁蛋白[18，19]以及胚胎胰腺泡状蛋白(FAPP)[20]。自从Berezovski等开始了适配子协助的生物标志物发现技术(AptaBiD)[21]，这大幅增加了用于癌症治疗和诊断生物标志物的识别和验证。这一发展敞开了药物发现的大门。对于由适配子发现的癌症生物标志物，采用细胞SELEX方法以确定新的癌症表面蛋白。在肿瘤细胞上特异性表达的几个质膜相关蛋白已经由适配子鉴定，其包括如下：碱性磷酸酶胎盘样2(ALPPL-2)[22]、Siglec-5[23]、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)[24]、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)[25]。在胰腺癌中，胎盘碱性磷酸酶样2(ALPPL-2)和亲环蛋白B也被报道为由RNA适配子获得的新候选生物标志物[22,26]。
在此，我们提出了一个详细的方法，以通过在涉及串联MS/MS的盲法SELEX方法中，采用RNA适配子以确定在细胞质膜上的生物标记物蛋白。
2.方法和结果
2.1.化学品和材料
超纯化(Milli-Q)水，乙腈(CH3CN，Burdick&Jackson HPLC级)，碳酸氢铵(NH4HCO3，西格玛(Sigma)公司)，二硫苏糖醇(DTT，西格玛公司)，碘乙酰胺(IAA，西格玛公司)，胰蛋白酶(普洛麦格(Promega)改性胰蛋白酶，测序级)，三氟乙酸(TFA，西格玛公司)。
2.2.原始全细胞SELEX(盲法SELEX)
下面的细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)用作SELEX和内化测定的靶标；PANC-1(CRL-1469)、CFPAC-1(CRL-1918)、MIA PaCa-2(CRL-1420)、BXPC-3(CRL-1687)和ASPCA-1(HB-1682)。Huh-7细胞购自日本研究生物资源库(JCRB)。根据细胞库的说明书进行细胞培养。
基本根据Tuerk和Gold[8]的所述的方法，进行SELEX循环。大致根据[27]所描述进行体外选择，并针对本研究做了一些改进。人胰腺腺癌，PANC-1细胞用于作为适配子选择的靶细胞。肝癌细胞系Huh7用作反选步骤，从而去除背景/无关的结合。利用2'F RNA文库增加核酸酶抗性并提高适配子的折叠。为了分离与完整细胞结合的2'F RNA适配子，采用了约有440个不同2'F RNA分子的文库通过SELEX进行筛选，所述文库包含了经确定序列侧接的40nt长的随机序列。在第一轮中，6nmol的RNA库在37℃下与在1ml结合缓冲液(无Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐溶液[PBS]，5mm的MgCl2、0.01％BSA、酵母tRNA(100μg/ml)中的阴性(Huh7)细胞孵育30分钟。回收上清液，于37℃下在靶细胞上孵育1小时。将与靶细胞结合的RNA回收，用RT-PCR扩增并进行体外转录，用于后续几轮的选择。在随后的几轮中，RNA浓度降低10倍，并减少孵育时间以形成更严格的条件。进行了14个循环选择后对富集池进行克隆。
选择了一个高度富集的适配子，P15：GGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGTTGCGGCCCAACCGTTTAATTCAGAATAGTGTGATGCCTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC(SEQ ID NO:36)。用软件NUPACK(网址www.nupack.org)对所选择适配子的最小能量结构进行了分析(图17A)。如图所示，所计算出的RNA适配子二级结构包含了几个茎-环区。
2.3.基于流式细胞术的结合测定
还通过流式细胞术评估了适配子的结合。该测定中，使用非酶细胞解离溶液将PANC-1细胞和Huh7细胞解离，用PBS洗涤并悬浮在结合缓冲液中。接着，加入200nM Cy3标记的适配子，并在37℃下与2×105个细胞孵育30分钟。用结合缓冲液洗涤细胞，并立即通过Fortesss流式细胞术(BD)进行分析。各次流式细胞术测定，均一式三份进行。数据用FlowJo软件进行分析。P15的流式细胞术分析确认，相对于初始的未选择RNA文库，富集的细胞表面结合了PANC-1细胞。经以Cy3标记的P15适配子处理的PANC-1细胞，展示了更高水平的阳性染色细胞(P<0.01)(图17B-17C)。P15与PANC-1细胞的结合亲和力经测定为16.05nM。为了验证P15针对胰腺癌细胞的特异性，用经Cy3标记的P15适配子对四种不同的胰腺癌细胞系(ASPCA-1、CFPAC、MIA PaCa-2和BxPC-3)进行处理。令人感兴趣的是，在胰腺癌细胞系中观察到点状的细胞质染色，但在阴性对照细胞(Huh7细胞)中没有观察到染色(图18)。
为了确定适配子对PANC-1细胞的表观解离常数(KD)，计算了各浓度和未选择的对照库的平均荧光强度(MFI)。如先前Sefah等描述[28]，对照值被认为是背景荧光，并从适配子的值中减去。用单位点的结合模型计算出解离常数。使用Graph Pad Prism(Graph Pad软件，拉霍亚，加利福尼亚州，美国)进行非线性曲线回归。P15适配子的结合亲和力经测定为16.05nM(图17D)。
2.4.活细胞共聚焦成像
在适配子的内化研究中，将1×105个细胞接种于35mm玻璃底培养皿(MatTek，阿什兰，MA，美国)并在培养基中生长24小时。用Cy3沉默子siRNA标记试剂盒(Ambion，TX，USA)，将Cy3标记到RNA上。将100nM Cy3标记的RNA加入到细胞中，并孵育1小时。这些影像是用蔡司(Zeiss)LSM 510Meta倒置双光子共聚焦显微镜系统(使用C-APO40x/1.2NA水浸物镜)拍摄。
Cy3标记的P15适配子会被内化入靶细胞(PANC-1)，但在阴性细胞(Huh7细胞)中没有观察到染色。为了验证适配子针对胰腺癌细胞的特异性，用经Cy3标记的P15适配子对四种不同的胰腺癌细胞系(ASPCA-1、CFPAC、MIA PaCa-2和BxPC-3)进行处理。观察到Cy3标记适配子的点状细胞质染色。细胞质染色的图案表明，适配子发生了胞内吞性的内化。
2.5.利用RNA适配子对靶标膜蛋白进行亲和纯化
由于适配子被内化到细胞中，因此可从细胞中分离出细胞膜蛋白以识别适配子的靶表位。生物素化的适配子，与相关联的蛋白复合物一起，使用下拉法(pull－downprocess)进行固定。所选择的RNA适配子和不相关的RNA在它们的3“末端用生物素标记。靶标膜蛋白用由Daniel等人描述的方法进行分离[4]。简言之，用含有1mM CaCl2的PBS(pH为7.4)将单层细胞(平铺于培养皿，1×106个细胞/100mm)在4℃下洗涤三次。在刮擦收集细胞之前，在4℃下向单层细胞中加入3ml的低渗缓冲液(含5mM KCl和0.5mM MgCl2和蛋白酶抑制剂的10mM Tris·HCl[pH为7.5])30分钟。将取出的细胞在蔗糖溶液(0.25M)中，在冰上进行匀浆。通过离心(在4℃下1000×g，10分钟)除去全细胞和细胞核。将上清液重新离心以沉淀膜成分(在4℃下105,000×g，10分钟)。将沉淀物在4℃下旋转溶解于提取缓冲液(10mM的Tris·HCl[pH为7.5]，含有200mM NaCl、0.1％[v/v]Triton X-100、1mM MgCl2、1mM CaCl2和蛋白酶抑制剂)。将所提取的细胞表面膜在4℃下与生物素化的适配子(1nmol)、无关的RNA(1nmol)和链亲和珠，在亲和纯化缓冲液中孵育2小时(提取缓冲液含有0.5μg/μl BSA和4％[v/v]丙三醇)。在采用洗脱缓冲液洗脱结合蛋白之前，将微珠在4℃的提取缓冲液(10mMTris·HCl[pH 7.5]含有1M NaCl、5mM EDTA和0.1％[v/v]Triton X-100)中洗涤30分钟。
通过SDS-PAGE分离回收的蛋白，随后经考马斯染色来显现所溶解的蛋白质条带(图19A)。通过串联质谱(MASS-SPEC)图谱(图19B)，从经P15处理的细胞中收获的最高匹配峰与针对波形蛋白的已知峰相匹配。为了确认MASS-SPEC的结果，利用活细胞共聚焦和流式细胞仪对波形蛋白抗体进行竞争性测定。通过共焦显微镜测定荧光强度。针对波形蛋白的抗体显著降低了P15与靶细胞的结合，P<0.05(图19C)。这些结果有力地表明了，P15结合于在癌细胞上质膜表达的波形蛋白。
2.6.蛋白消化
采用凝胶或溶液内消化进行蛋白纯化，并经由质谱分析获得蛋白指纹。在进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，将经适配子回收的蛋白条带切出，并在凝胶内进行优化消化[29]。简要地说，将凝胶条带切成小片，并在37℃下用脱色液(200mM NH4HCO3的50％乙腈溶液)脱色20分钟。为了完成脱色，弃上清后重复脱色步骤。凝胶样品在真空浓缩器(SpeedVac中)进行干燥。向干燥的凝胶样品中加入还原缓冲液(10mM DTT的100mM NH4HCO3溶液，使用前即刻制备)并在56℃下孵育一小时。在除去过量的还原缓冲液后，室温下避光加入相同体积的烷基化溶液(100mM的IAA，使用前即刻制备)30分钟。除去上清液后，将凝胶片用200mM的NH4HCO3洗涤两次。在室温下加入乙腈10分钟以使样品脱水。当凝胶片变白，除去乙腈，并用200mM NH4HCO3在室温下重新溶胀凝胶片10分钟。除去上清液后，重复用乙腈脱水。然后将凝胶片在真空浓缩器中干燥。将消化缓冲液(含50ng/μl胰蛋白酶的1mM HCl/100mM NH4HCO3溶液，使用前即刻制备)加入到干燥的凝胶片中10分钟，以重新溶胀凝胶片。从样品中除去过量的胰蛋白酶溶液后，加入200mM的NH4HCO3至浸没所述凝胶片，并且将样品在37℃下孵育过夜。然后将样品用1/10体积的淬灭缓冲液(1：9TFA：Milli-Q水)来淬灭反应。保存上清液进行下一步。加入提取缓冲液(0.1％TFA的60％乙腈溶液)至浸没凝胶片，并在37℃下孵育40分钟。然后提取含有提取缓冲液的上清液，并与来自上述步骤中淬灭的上清溶液合并。将合并的上清液体积通过蒸发减少至20μl。
2.7.液相色谱法串联MS/MS(LC-MS/MS)Q-TOF
配备有芯片箱源的Agilent 6520Q-TOF质谱仪被用于LC/MS/MS分析。采用了具有43mm分析柱和40nl捕获柱的C18芯片(ProtID-芯片-43，安捷伦(Agilent)G4240-62005)。将99％缓冲液A(0.1％甲酸的水溶液)/1％缓冲液B(0.1％甲酸的乙腈溶液)中经消化的样品(10-15μl)，按6μl/分钟上样到柱上，另有8μl作为洗涤量。历时8分钟，缓冲液B的梯度从3％至35％。然后历时1分钟，缓冲液B的梯度从35％至90％。总过柱时间(包括灌注)为15分钟。电压调整为1850V-2000V的范围内。用X！串联搜索引擎(http://www.thegpm.org/TANDEM/index.html)来查询肽的MS/MS图谱。然后，使用骨架(Scaffold)程序(http://www.proteomesoftware.com)来处理数据集，以显示结果。利用SWISS Prot或NCBI获取蛋白的详细注解。从经P15处理的细胞中检测出的最高匹配峰，与针对波形蛋白的已知峰相匹配(图19B)。
2.8.验证靶标的竞争性测定。
对于适配子-抗体竞争性测定，采用Cy3标记的P15适配子与波形蛋白抗体(西格玛公司，V6630)进行竞争。将细胞(1×105)接种到35mm的玻璃底培养皿(MatTek，亚什兰，MA，美国)，并在培养基中生长24小时。在添加Cy3标记的P15(200nM)之前，将细胞与波形蛋白抗体预孵育(1uM)20分钟。将细胞在37℃下孵育2小时。这些影像是用蔡司(Zeiss)LSM510Meta倒置双光子共聚焦显微镜系统(使用C-APO 40x/1.2NA水浸物镜)拍摄的。在竞争剂的存在下，用共聚焦显微镜对任意的荧光强度进行定量并进行统计学分析。用Student t检验进行统计学显着性分析(P<0.05)(图19C)。
对于通过流式细胞术进行的竞争性测定，使用Accutase(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))对PANC-1细胞进行解离，用DPBS洗涤并悬浮在结合缓冲液(磷酸缓冲盐溶液[不含Ca2+和Mg2+的DPBS，康宁，Tewksbury，MA]，5mM MgCl2)中。接着，将PANC-1细胞与波形蛋白抗体(1μM)在冰上预孵育20分钟。在与波形蛋白抗体预孵育后，加入Cy3标记的适配子(终浓度200nM)，并与2×105个细胞在冰上孵育30分钟。细胞用DPBS洗涤三次，并立即用Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)进行分析。用4'6'二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1μg/ml)识别并除去死细胞。用FlowJo软件(FlowJo，亚什兰，OR)对数据进行分析。
3.讨论
我们已经提出了使用RNA适配子的蛋白生物标志物发现平台。目前的方法，其中包括针对细胞的适配子选择、细胞膜蛋白提取和串联MS/MS，已经能够鉴定出易位到质膜上的新蛋白。非靶向SELEX，称为“盲法SELEX”，能够生成针对靶细胞(如原代细胞、正常细胞、癌细胞，和组织特异性细胞)的高度富集的RNA。这一策略也使我们能够区分不同的癌细胞类型。富集的RNA适配子以高亲和力特异性地结合于细胞膜蛋白。利用RNA适配子、经亲和纯化回收细胞膜。然后通过串联MS/MS鉴定蛋白。因为串联MS/MS不需要将样品纯化到高度的均一性[10]，并且只要靶蛋白是该混合物[30]的主要成分，它就能起作用，它是用于发现蛋白生物标志物的最佳选择。当鉴定了候选靶蛋白后，RNA适配子与蛋白的相互作用可以通过表面等离子体共振(SPR)、凝胶移位测定或酶联免疫测定(ELISA)进行验证。
当前被鉴定出的癌细胞膜相关蛋白列表包括如下：HSP70、HSP90、GRP78、波形蛋白、核仁蛋白和FAPP。HSP70是一种具有ATP酶活性的伴侣蛋白，其发现于正常细胞中细胞内小室[31]，但易位到肿瘤细胞的质膜上[11,12]。HSP90是辅助蛋白正确折叠的分子伴侣蛋白；然而，它不仅定位于细胞内，还表达在肿瘤细胞的质膜上[13，14]。GRP78是一种参与蛋白折叠的内质网(ER)蛋白，其被上调并定位于肿瘤细胞表面[15，16]。核仁蛋白是参与调节细胞增殖、胞质分裂和复制的核仁蛋白[18，19]。核仁蛋白还表达在肿瘤相关的血管表面上，但不表达于成熟血管或毛细血管[18]。FAPP已被鉴定为胰腺癌[20，32]的另一种膜相关蛋白。波形蛋白属于中间丝蛋白组，其形成细胞骨架并与细胞核、线粒体和ER相关[33]。然而，波形蛋白的表达也与肿瘤进展中的上皮间充质转换(EMT)相关[34]。波形蛋白也被鉴定存在于胰腺癌中。尽管癌(细胞)表面上这些蛋白出现的分子机制仍是需要解决的问题，但用RNA适配子找到这些新的针对靶分子的膜相关蛋白，这是令人感兴趣的。本文所描述的方法能够利用RNA适配子鉴定出新的蛋白生物标志物。采用RNA适配子来发现针对抗体的生物标记物的主要优点在于，其针对靶蛋白的特异性，这使脱靶结合降到最少。
参考文献(实施例3).
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实施例4：波形蛋白/CCR5双特异性适配子
通过聚碳接头偶联至粘性序列的P15(SEQ ID NO:3)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAAGfUfUGfCGGfCfCfCAAfCfCGfUfUfUAAfUfUfCAGAAfUAGfUGfUGAfUGfCfCfUfUfCGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:21]
CCR5适配子(G3):
GGGAGGAfCGAfUGfCGGGfCfCfUfUfCGfUfUfUGfUfUfUfCGfUfCfCAfCAGAfCGAfCfUfCGfCfCfCGAooooofCmAmAmAmAfUmGfUmAmAmAmAmAmAfCfU[SEQ ID NO:18]
粗体：粘性序列。fU和fC：2'F修饰的嘧啶。mA和mG：2'甲基化嘌呤，O：C3碳接头。
P15是波形蛋白结合适配子，一旦P15结合于细胞表面的波形蛋白，能够被内化，见实施例3。
CCR5结合适配子G3(SEQ ID NO:9)在Zhou等人，2015年，化学和生物(Chemistry&Biology)，22，379-390，2015年3月19日以及在审的美国专利申请No.14/801710中有所描述，通过具体引用将其整体并入本文。
能够结合波形蛋白和CCR5的双特异性适配子的形成：
通过聚碳接头偶联到粘性序列的P15，在95℃的结合缓冲液(无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水溶液[DPBS]，5mM MgCl2)中折叠5分钟并缓慢冷却。通过聚碳接头偶联到粘性序列的CCR5适配子，在65℃的结合缓冲液(含MgCl2和CaCl2的DPBS)中折叠5分钟并缓慢冷却。将相同浓度的P15和CCR5适配子混合，并在37℃下温育20分钟，以利用“粘性序列”技术形成双特异性适配子。
实施例5：HSP90/CCR5双特异性适配子
通过聚碳接头偶联至粘性序列的P11(SEQ ID NO:5)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAAfUGAfUfUGfCfCfCAfUfUfCGGfUfUAfUGfCfUfUGfCGfCfUfUfCfCfUAAAGAGfCfUfUfCfGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:22]
通过聚碳接头偶联至粘性序列的P7(SEQ ID NO:6)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAGGfCfCAfUGfUfUGAAfUGfCfCfCAAfCfUAAGfCfUfUfUGAGfCfUfUfUGGAGfCfUfUfCGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ ID NO:23]
通过聚碳接头偶联至粘性序列的P6(SEQ ID NO:7)：
GGGAGAfCAAGAAfUAAAfCGfCfUfCAAfCAAfUGGfAGfCGfUfUAAAfCGfUGAGfCfCAfUfUfCGAfCAGGAGGfCfUfCAfCAAfCAGGfCooooooomAmGfUfUfUfUfUfUmAfCmAfUfUfUfUmG[SEQ IDNO:24]
CCR5适配子(G3)：
GGGAGGAfCGAfUGfCGGGfCfCfUfUfCGfUfUfUGfUfUfUfCGfUfCfCAfCAGAfCGAfCfUfCGfCfCfCGAooooofCmAmAmAmAfUmGfUmAmAmAmAmAmAfCfU[SEQ ID NO:18].
粗体：粘性序列。fU和fC：2'F修饰的嘧啶。mA和mG：2'甲基化嘌呤，O：C3碳接头。
P11、P7和P6是能够在结合于细胞表面的HSP90后被内化的HSP90结合适配子。
CCR5结合适配子G3(SEQ ID NO:9)在Zhou等人，2015年，化学和生物(Chemistry&Biology)，22，379-390，2015年3月19日以及在审的美国专利申请No.14/801710中有所描述，具体通过引用将其整体并入本文。
能够结合HSP90和CCR5的双特异性适配子的形成：
通过聚碳接头偶联到粘性序列的P11、P7或P6，在95℃的结合缓冲液(无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水溶液[DPBS]，5mM MgCl2)中折叠5分钟并缓慢冷却。通过聚碳接头偶联到粘性序列的CCR5适配子，在65℃的结合缓冲液(含MgCl2和CaCl2的DPBS)中折叠5分钟并缓慢冷却。将相同浓度的P11、P7或P6以及CCR5适配子混合，并在37℃下温育20分钟，以利用“粘性序列”技术形成双特异性适配子。
实施例6：癌症免疫治疗中的双特异性适配子
为了构建针对致死蛋白的双特异性RNA适配子，将截短的致死蛋白适配子(tp19)通过互补粘性序列偶联至CD3ε适配子。
为了构建致死蛋白-CD3ε双特异性适配子，采用针对CD3ε重组蛋白的RNA适配子进行蛋白-SELEX。在5轮SELEX后，进行深度测序以鉴定出CD3ε适配子。鉴定出两条CD3ε适配子，并命名为C3e2和C3e3。预测的结构用NUPACK绘制(FIGS.23A-23B)。所鉴定的序列如下：
C3e2:
GGAGACAAGAAUAAACGCUCAAAUAGAAGCAGCAUCUUCCAAAUCAGUUUGUGUGUCCUCUAUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC(SEQ ID NO:37)
C3e3:
GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAAUGCCUGUAGUUCGUAGCGAUUUAACUGCGUCAGUGAGGCUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC(SEQ ID NO:38)
对于功能性测定，采用流式细胞术和共聚焦显微镜，对CD3ε适配子针对其靶标的结合进行了测定。在表达人CD3ε和小鼠CD3ε的HEK293细胞上进行了CD3ε适配子对人和小鼠CD3ε的结合测试。C3e2和C3e3表现出对于人CD3ε和小鼠CD3ε的交叉活性(图24A-24B以及25A-25B)。
为了再次测定CD3ε适配子对其靶标的结合性，将经Cy3标记的CD3ε适配子在新鲜分离的人T细胞上孵育，并利用流式细胞仪进行分析。两种适配子均结合于人T细胞，显示出柱状图的漂移(图26A-26B)。用于构建致死蛋白-双特异性适配子的序列如下。
tP19:
5'-GUGUAAUGUAGUAGUCoooooCUCAAUGGCGAAUGCCCGCCUAAUAGGG-3'(SEQ ID NO:33)
CD3e2；
5'GACUACUACAUUACACoooooGGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAAUAGAAGCAGCAUCUUCCAAAUCAGUUUGUGUGUCCUCUAUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC-3'(SEQ ID NO:34)粗体：粘性序列；o:C3碳接头
CD3e3:
5'GACUACUACAUUACACoooooGGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAAUGCCUGUAGUUCGUAGCGAUUUAACUGCGUCAGUGAGGCUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC-3'(SEQ ID NO:35)粗体：粘性序列；o:C3碳接头
材料和方法
CD3ε适配子的SELEX
对于分离的CD3ε适配子，所述靶标蛋白购自Creative biomart。从40个核苷酸(nt)的随机序列中选择2F'-RNA适配子，所述随机序列通过用合成DNA模板的体外转录以及NTP(2'F UTP、2'F CTP、GTP、ATP，震中生物技术公式，麦迪逊，WI)和T7RNA聚合酶构建。为了去除非特异性结合于琼脂糖珠的RNA，将1.44μM的RNA与20μl的Ni-NTA琼脂糖珠，在室温下于100μl的结合缓冲液(30mM的Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，5mM MgCl2，2mM二硫苏糖醇和1％的BSA，100μg/mL的酵母tRNA)中震荡预孵育30分钟，通过离心沉淀，并弃去。将预澄清的上清液转移到新的试管中，并与300nM His-标记的人CD3ε(hCD3ε)，在室温下孵育30分钟。回收与hCD3ε结合的RNA，用RT-PCR扩增并进行体外转录，并且在后续的选择回合中使用。在随后的几轮中，hCD3ε浓度每2轮降低2倍，以提供更严格的条件。经过5轮SELEX后，将得到的cDNA进行扩增。5轮SELEX后，进行深度测序以确定序列。选择了两个克隆的CD3ε适配子如下。适配子的结构用NUPACK进行预测，其中采用盐校正算法和25℃的温度校正。
CD3ε适配子的内化测定
表达人或小鼠CD3的稳定细胞系产生如下。构建了编码融合蛋白(由EGFP和人全长CD3ε或小鼠全长CD3ε之一构成的)慢病毒载体。慢病毒在HEK293细胞中扩增、收获并用于转染并产生稳定的HEK293细胞。对于结合研究，将1×105个表达人或小鼠CD3ε的HEK293细胞接种到35mm玻璃底培养皿(MatTek，亚什兰，MA)，并在合适的培养基中生长24小时。适配子RNA用Cy3荧光染料进行标记，其采用的是Cy3沉默子siRNA标记试剂盒(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA)。将在结合缓冲液(30mM Tris-HCL，pH 7.5，150mM NaCl，5mM MgCl2，100μg/ml酵母tRNA)中折叠的Cy3标记适配子，按200nM加入到细胞中，并温育2小时。成像前，将细胞用DPBS洗涤两次。活细胞共聚焦影像是用蔡司(Zeiss)LSM 510Meta倒置双光子共聚焦显微镜系统(使用C-APO 40x/1.2NA水浸物镜)和AIM4.2软件(卡尔蔡司，耶拿，德国)进行拍摄。赫斯特(Hoechst)33342用于细胞核反染色。
通过流式细胞术进行的CD3ε适配子结合测定
将使用EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞技术)新鲜分离的人T细胞(1×105细胞/ml)与500nM在结合缓冲液中折叠的Cy3标记CD3ε适配子，在冰上孵育30分钟。用DPBS洗涤后，加入DAPI(1μg/mL)以去除死细胞，然后立即通过流式细胞术对细胞进行分析。
序列表
<110> 希望之城
艾普特纳有限公司
J·J·罗西(Rossi, John J.)
S·尹(Yoon, Sorah)
N·哈比亚(Habib, Nagy)
<120> 双特异性适配子
<130> 48440-608001WO
<150> US 62/297,487
<151> 2016-02-19
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
cucaauggcg aaugcccgcc uaauaggg 28
<210> 2
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
gggagacaag aauaaacgcu caauggcgaa ugcccgccua auagggcguu augacuuguu 60
gaguucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 3
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
gggagacaag aauaaacgcu caaaguugcg gcccaaccgu uuaauucaga auagugugau 60
gccuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 4
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
gggagacaag aauaaacgcu caaugcgcug aaugcccagc cgugaaagcg ucgauuucca 60
uccuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 5
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
gggagacaag aauaaacgcu caaaugauug cccauucggu uaugcuugcg cuuccuaaag 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 6
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
gggagacaag aauaaacgcu caaggccaug uugaaugccc aacuaagcuu ugagcuuugg 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 7
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
gggagacaag aauaaacgcu caacaaugga gcguuaaacg ugagccauuc gacaggaggc 60
ucacaacagg c 71
<210> 8
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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gggaggacga ugcgggccuu cguuuguuuc guccacagac gacucgcccg a 51
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (52)..(52)
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<220>
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aaaaacu 67
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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uccuucgaca ggaggcucac aacaggcagu uuuuuacauu uug 103
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<400> 21
gggagacaag aauaaacgcu caaaguugcg gcccaaccgu uuaauucaga auagugugau 60
gccuucgaca ggaggcucac aacaggcagu uuuuuacauu uug 103
<210> 22
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(29)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(37)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<222> (51)..(56)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<222> (76)..(78)
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<220>
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<222> (88)..(88)
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<220>
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<220>
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<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
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<222> (97)..(97)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(98)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(102)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<400> 22
gggagacaag aauaaacgcu caaaugauug cccauucggu uaugcuugcg cuuccuaaag 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggcagu uuuuuacauu uug 103
<210> 23
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(32)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(40)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<222> (43)..(44)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(51)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(58)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(66)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(78)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(95)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
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<222> (96)..(96)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(98)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(102)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<400> 23
gggagacaag aauaaacgcu caaggccaug uugaaugccc aacuaagcuu ugagcuuugg 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggcagu uuuuuacauu uug 103
<210> 24
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(35)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(46)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(50)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(62)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(67)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (74)..(79)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(86)
<223> 用2'-F修饰的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> 用2'-O-甲基修饰的残基
<400> 24
gggagacaag aauaaacgcu caacaaugga gcguuaaacg ugagccauuc gacaggaggc 60
ucacaacagg caguuuuuua cauuuug 87
<210> 25
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
aguuuuuuac auuuug 16
<210> 26
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
caaaauguaa aaaacu 16
<210> 27
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
caaaauguaa aaaacu 16
<210> 28
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
gggagacaag aauaaacgcu caaugcguuc acguuuauuc acauuuuuga auugagcaug 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 29
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
gggagacaag aauaaacgcu caaugcguuu acguuuauuc acauuuuuga auugagcaug 60
agcuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 30
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
ggggcucaau gcguucacgu uuauucacau uuuugaauug agc 43
<210> 31
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
gggagagcgg aagcgugcug ggccugcucu uuaauaaacc cacuuucgaa caucagcgua 60
uguccauaac ccagagguga uggauccccc 90
<210> 32
<211> 90
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
gggagagcgg aagcgugcug ggccuauugc aucuuucugu uauuuccgaa uccgucccga 60
cugucauaac ccagagguga uggauccccc 90
<210> 33
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<400> 33
guguaaugua guaguccuca auggcgaaug cccgccuaau aggg 44
<210> 34
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<400> 34
gacuacuaca uuacacggga gacaagaaua aacgcucaaa uagaagcagc aucuuccaaa 60
ucaguuugug uguccucuau ucgacaggag gcucacaaca ggc 103
<210> 35
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<400> 35
gacuacuaca uuacacggga gacaagaaua aacgcucaaa ugccuguagu ucguagcgau 60
uuaacugcgu cagugaggcu ucgacaggag gcucacaaca ggc 103
<210> 36
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
gggagacaag aataaacgct caaagttgcg gcccaaccgt ttaattcaga atagtgtgat 60
gccttcgaca ggaggctcac aacaggc 87
<210> 37
<211> 86
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
ggagacaaga auaaacgcuc aaauagaagc agcaucuucc aaaucaguuu guguguccuc 60
uauucgacag gaggcucaca acaggc 86
<210> 38
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
gggagacaag aauaaacgcu caaaugccug uaguucguag cgauuuaacu gcgucaguga 60
ggcuucgaca ggaggcucac aacaggc 87
<210> 39
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 在3'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于3'位的残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 在5'位被修饰的残基，并且C3碳间隔序列连接于5'位的残基
<400> 39
cucaauggcg aaugcccgcc uaauagggag uuuuuuacau uuug 44
<210> 40
<211> 466
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Met Ser Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Arg Met Phe Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr
20 25 30
Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ala Leu Arg Pro Ser Thr
35 40 45
Ser Arg Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Pro Gly Gly Val Tyr Ala Thr Arg
50 55 60
Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Leu Leu
65 70 75 80
Gln Asp Ser Val Asp Phe Ser Leu Ala Asp Ala Ile Asn Thr Glu Phe
85 90 95
Lys Asn Thr Arg Thr Asn Glu Lys Val Glu Leu Gln Glu Leu Asn Asp
100 105 110
Arg Phe Ala Asn Tyr Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Lys Ile Leu Leu Ala Glu Leu Glu Gln Leu Lys Gly Gln Gly Lys Ser
130 135 140
Arg Leu Gly Asp Leu Tyr Glu Glu Glu Met Arg Glu Leu Arg Arg Gln
145 150 155 160
Val Asp Gln Leu Thr Asn Asp Lys Ala Arg Val Glu Val Glu Arg Asp
165 170 175
Asn Leu Ala Glu Asp Ile Met Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu
180 185 190
Met Leu Gln Arg Glu Glu Ala Glu Asn Thr Leu Gln Ser Phe Arg Gln
195 200 205
Asp Val Asp Asn Ala Ser Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Val
210 215 220
Glu Ser Leu Gln Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu His Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Glu Gln His Val Gln Ile
245 250 255
Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp Val
260 265 270
Arg Gln Gln Tyr Glu Ser Val Ala Ala Lys Asn Leu Gln Glu Ala Glu
275 280 285
Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg
290 295 300
Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg
305 310 315 320
Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr
325 330 335
Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala
340 345 350
Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp Glu
355 360 365
Ile Gln Asn Met Lys Glu Glu Met Ala Arg His Leu Arg Glu Tyr Gln
370 375 380
Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr
385 390 395 400
Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Ile Ser Leu Pro Leu Pro
405 410 415
Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser Leu Pro
420 425 430
Leu Val Asp Thr His Ser Lys Arg Thr Leu Leu Ile Lys Thr Val Glu
435 440 445
Thr Arg Asp Gly Gln Val Ile Asn Glu Thr Ser Gln His His Asp Asp
450 455 460
Leu Glu
465

Claims (42)

1.一种能够结合肿瘤细胞抗原和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
2.如权利要求1所述的双特异性适配子，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原是HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a。
3.如权利要求1或2所述的双特异性适配子，其特征在于，所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
4.一种能够结合癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。
5.一种能够结合胰腺癌细胞和免疫细胞的双特异性适配子。
6.如权利要求4或5所述的双特异性适配子，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞。
7.一种能够结合HSP70和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
8.一种能够结合波形蛋白和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
9.一种能够结合HSP90和免疫细胞表面蛋白的双特异性适配子。
10.如权利要求4-9中任一所述的双特异性抗体，其特征在于，所述免疫细胞表面蛋白选自下组：CCR5、CCR7、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、PD-1、CTLA4。
11.一种能够结合HSP70和CCR5的双特异性适配子。
12.一种能够结合波形蛋白和CCR5的双特异性适配子。
13.一种能够结合HSP90和CCR5的双特异性适配子。
14.一种能够结合HSP70和CD3的双特异性适配子。
15.如以上任一权利要求所述的双特异性适配子，其特征在于，所述HSP70是mHSP70。
16.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括SEQ ID NO:1-7之一的核酸序列。
17.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括与SEQ ID NO:1-7之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
18.如权利要求1-17中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括SEQ ID NO:8的核酸序列。
19.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括SEQ ID NO:28-30之一的核酸序列。
20.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括与SEQ ID NO:28-30之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
21.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括SEQ ID NO:31或32之一的核酸序列。
22.如权利要求1-15中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括与SEQ ID NO:31或32之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
23.如权利要求1-22中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括与SEQ ID NO:9-16之一的核酸序列。
24.如权利要求1-22中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，所述双特异性适配子包括与SEQ ID NO:9-16之一具有至少80％序列同一性的核酸序列。
25.一种双特异性适配子，其包含SEQ ID NO:17、19-24和33之一。
26.一种双特异性适配子，其包含SEQ ID NO:18、37和38之一。
27.一种双特异性适配子，其包含SEQ ID NO:17、19-24和33之一的核酸序列以及SEQID NO:18、37和38之一的核酸序列。
28.如权利要求1-27中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，一个或多个碱基或核酸是经化学修饰的。
29.如权利要求1-28中任一所述的双特异性适配子，其特征在于，一个或多个核酸在核糖的2'位置经化学修饰。
30.一种复合物，任选地为体外复合物，其为权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子以及表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的复合物，其中所述肿瘤细胞抗原能够为所述双特异性适配子结合。
31.一种复合物，任选地为体外复合物，其为权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子以及表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞的复合物，所述免疫细胞表面蛋白能够为所述双特异性适配子结合。
32.一种复合物，任选地为体外复合物，其为权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子、表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞以及表达免疫细胞表面蛋白的免疫细胞的复合物，其中所述肿瘤细胞抗原能够为所述双特异性适配子结合，且所述免疫细胞表面蛋白能够为所述双特异性适配子结合。
33.如权利要求31或32所述的复合物，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
35.权利要求1-29任一所述双特异性适配子在药物治疗方法中的应用。
36.权利要求1-29任一所述双特异性适配子在癌症治疗方法中的应用。
37.如权利要求36所述的特异性适配子在癌症治疗方法中的应用，其特征在于，所述癌症是胰腺癌。
38.如权利要求36或37所述的特异性适配子在癌症治疗方法中的应用，其特征在于，所述癌症过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGFR-a中的至少一个。
39.一种对受试者的癌症进行治疗的方法，其特征在于，所述方法包括：将治疗有效量的权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子施用于需要治疗的受试者。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述癌症是胰腺癌。
41.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，所述癌症过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、Tfr或PDGFR-a中的至少一个。
42.一种选择受试者以接受癌症治疗的方法，所述治疗采用治疗有效量的权利要求1-29中任一所述的双特异性适配子，所述方法包括：体外测定所述受试者的癌症细胞是否过表达HSP70、波形蛋白、HSP90、TfR或PDGF-a中的至少一个。
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