CN107250378B - 癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障的药物传输系统 - Google Patents

癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障的药物传输系统 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于弄清脑转移中BBB的破坏机理，提供癌的脑转移的新型诊断/风险评估方法、以及治疗/预防方法。另外，本发明的目的在于提供新型的向脑输送药物的方法。进一步，本发明的目的在于提供在这些方法中使用的药物、组合物及试剂盒。因此，本发明涉及包括确定样本中的miR‑181c水平的脑转移的诊断或脑转移的发生风险的评价方法。另外，本发明涉及包括抑制癌患者的miR‑181c的表达或活性的治疗或预防脑转移的方法。进一步，本发明涉及利用了miR‑181c或PDPK1的使血脑屏障的透过性亢进的方法以及使期望的活性成分通过血脑屏障而到达脑内的方法。

Description

癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障 的药物传输系统
技术领域
本发明涉及血脑屏障的透过性控制，特别是使血脑屏障的透过性亢进(提高)的技术。进一步，本发明涉及癌的脑转移领域。更具体而言，本发明涉及脑转移的诊断或风险评估、以及脑转移的治疗或预防领域。
背景技术
已知癌症患者的脑转移关系到预后不良。另外已知，在脑转移中，癌细胞通过血脑屏障(BBB)是重要事件；BBB的主要构成细胞是脑微血管内皮细胞(BMECs)；BMECs通过细胞间的紧密连接(tight jynctions)而相互结合，并由此而具有极具选择性的透过性。另外，作为构成紧密连接的蛋白质，已知有交联粘附分子(junctional adhesion molecules:JAM-1、JAM-2及JAM-3)、闭合蛋白(occludin)、密蛋白(claudins)及粘膜闭合蛋白(zonulaoccludin proteins:ZO-1及ZO-2)。进一步，作为参与癌细胞侵袭BBB的介质，已被确定的有：环氧化酶-2(COX-2)、表皮生长因子受体(EGFR)配体HB-EGF、及α2,6-唾液酸转移酶(ST6GALNAC5)。然而，有关癌细胞通过BBB的初期阶段的分子机理尚不明确(非专利文献1)。在使用了作为高转移性乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞的研究中，已有报道，在乳腺癌细胞中高度表达的血管内皮细胞生长因子(VEGF)会在提高内皮细胞的透过性的同时使癌细胞相对于内皮细胞的粘附增加，因此VEGF参与脑转移(非专利文献2)。然而，也有虽然VEGF的表达对于脑转移而言是必要的、但并不是仅基于该原因就会发生脑转移的报道，VEGF并不是能够充分说明脑转移中BBB的破坏的物质(非专利文献3)。
另一方面，已进行了针对会感染中枢神经系统(CNS)的新型隐球菌如何通过BBB的研究，并有如下报道：通过隐球菌对人类BMECs的粘附，会发生丝切蛋白(cofilin)的去磷酸化，从而发生肌动蛋白的重组。在该报道中进一步显示，由隐球菌引起的丝切蛋白的去磷酸化在经过Rho激酶-LIM激酶-丝切蛋白通路后得到控制(非专利文献4)。
已知包含外来体的细胞外囊泡(EVs)通过对包封的蛋白质、mRNA及微RNA(miRNA)进行运输而居间地实现细胞间信息传递(非专利文献5)。另外，由癌细胞释放的细胞外囊泡会抑制NK细胞的功能(非专利文献6)、提高骨髓祖细胞的MET癌蛋白的表达而导致其转化为促转移性(pro-metastatic)的性状(非专利文献7)等，从各种观点考虑，其均会关系到癌细胞的恶性程度(非专利文献8)。这样，尽管已有EVs与癌转移之间的关系的启示，但是关于EVs及其中包封的物质与BBB之间的关系，还完全是未知的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Arshad、F.等、Patholog Res Int 2011:920509(2010).
非专利文献2：Lee、T.H.等、J Biol Chem 278:5277-5284(2003).
非专利文献3：Yano、S.等、Cancer Res 60:4959-4967(2000).
非专利文献4：Chen、H.M.Steven等、Journal of Medical Microbiology 52:961-970(2003).
非专利文献5：Valadi、H.等、Nat Cell Biol 9:654-659(2007).
非专利文献6：Liu、Cunren等、The Journal of Immunology 176:1375-1385(2006)
非专利文献7：Peinado、H.等、Nat Med 18:883-891(2012).
非专利文献8：Yang、C.等、Clin Dev Immunol 2011:842849(2011).
发明内容
本发明的目的在于弄清脑转移中BBB的破坏机理，提供癌的脑转移的新型诊断和/或风险评估方法、以及治疗和/或预防方法。另外，本发明的目的在于提供新型的利用了BBB破坏机理的向脑输送药物的方法。进一步，本发明的目的在于提供在这些方法中使用的药物、组合物及试剂盒等。
本发明人等为了弄清脑转移的机理而将转移能力高的人类乳腺癌细胞系移植给小鼠，并针对由发生了脑转移的癌细胞得到的EVs进行了解析。结果发现：癌细胞来源的EVs会被导入脑微血管内皮细胞，以及，会因导入了癌细胞来源的EVs而导致血脑屏障(BBB)受到破坏。进而，本发明人等针对EVs所包含的物质中与血脑屏障的破坏有关的物质进行了研究，结果发现，作为脑转移癌细胞来源的EVs中特异性地包含的微RNA的miR-181c，具有破坏血脑屏障的作用。为此，本发明人等针对miR-181c在脑微血管内皮细胞内的作用进行了研究，结果发现，miR-181c会与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(以下称为“PDPK1”)的非翻译区结合而减少其表达。进一步，本发明人等对PDPK1的表达减少与血脑屏障(BBB)破坏之间的关系进行了研究，结果发现，通过抑制PDPK1的表达，会改变紧密连接蛋白的定位。由此，本发明人等发现，癌细胞来源的EVs通过在脑微血管内皮细胞内释放其所包封的miR-181c而抑制PDPK1的表达，并由此改变紧密连接蛋白的定位而破坏血脑屏障。
就miR-181c而言，虽然已有报道显示其参与细胞的逐渐恶化，但迄今为止，其与血脑屏障的关系尚属未知。
另外，已知PDPK1主要以蛋白激酶B(PKB/AKT1、PKB/AKT2、PKB/AKT3)、p70核糖体蛋白S6激酶(RPS6KB1)、p90核糖体蛋白S6激酶(RPS6KA1、RPS6KA及RPS6KA3)、环AMP依赖性蛋白激酶(PRKACA)、蛋白激酶C(PRKCD及PRKCZ)、血清及糖皮质激素诱导性激酶(SGK1、SGK2及SGK3)、p21活性化激酶-1(PAK1)、蛋白激酶PKN(PKN1及PKN2)为靶标而参与细胞增殖和存活的调节、葡萄糖及氨基酸的摄取和存储，但迄今为止尚无关于其与血脑屏障的关系的报道。
因此，本发明是在弄清了脑转移癌细胞破坏血脑屏障的机理的基础上而完成的，具体涉及下述发明。
(1)提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。
(2)提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的方法，其包括：
确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、
根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的步骤，
其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者具有脑转移的信息。
(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，上述受试癌症患者是IV期癌症患者。
(4)提供用于诊断脑转移的信息的方法，其包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。
(5)提供用于评估受试癌症患者发生脑转移的风险的信息的方法，其包括：
确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、
根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的步骤，
其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者发生脑转移的风险高的信息。
(6)上述(4)或(5)所述的方法，其中，上述受试癌症患者是I～III期癌症患者。
(7)上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，上述受试癌症患者为乳腺癌患者。
(8)上述(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，上述阴性比较对象是没有发生脑转移的癌症患者或健康人。
(9)上述(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，上述样本为血液。
(10)上述(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，样本中的miR-181c是从样本中的EVs提取出的miR-181c。
(11)体外诊断用试剂或体外诊断用测定器，其用于在(1)～(10)中任一项所述的方法中使用，是通过测定miR181c而进行脑转移的诊断或风险评估的体外诊断用试剂或体外诊断用测定器。
(12)用于脑转移的诊断或风险评估的药物，其具备与miR-181c特异性结合的物质。
(13)上述(12)所述的药物，其中，上述与miR-181c特异性结合的物质是与miR-181c特异性结合的核酸。
(14)上述(13)所述的药物，其中，上述与miR-181c特异性结合的核酸是至少一部分具有人工设计的序列的核酸。
(15)上述(12)～(14)中任一项所述的药物，其中，与miR-181c特异性结合的物质经过了标记。
(16)用于抑制脑转移的药物组合物，其含有选自miR-181c的表达抑制剂、miR-181c的活性抑制剂、及外来体分泌抑制剂中的1种以上药物作为有效成分。
(17)上述(16)所述的药物组合物，其中，选自miR-181c的表达抑制剂、miR-181c的活性抑制剂、及外来体分泌抑制剂中的药物是选自下组中的药物：
(i)针对pri-miR-181c或pre-miR-181c的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；
(ii)miR-181c的反义寡核苷酸、与miR-181c特异性结合的适配子、针对miR-181c的siRNA、或miR-181c的miRNA模拟物；
(iii)针对nSMase2基因和/或RAB27B基因的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；或者，
(iv)针对nSMase2和/或RAB27B的抗体或其免疫反应性片段；与nSMase2和/或RAB27B特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者，nSMase2和/或RAB27B的拮抗剂。
(18)用于使血脑屏障的透过性亢进的药物组合物，其含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分。
(19)上述(18)所述的药物组合物，其中，上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂是针对PDPK1基因的反义寡核苷酸、与PDPK1基因特异性结合的适配子、针对PDPK1基因的siRNA、或能够抑制PDPK1基因的表达的miRNA；或者是针对PDPK1的抗体或其免疫反应性片段；与PDPK1特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者是PDPK1的拮抗剂。
(20)上述(19)所述的药物组合物，其中，上述能够抑制PDPK1基因的表达的miRNA是miR-181c。
(21)用于使期望的活性成分到达脑内的药物输送用组合物，其含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分。
(22)上述(21)所述的药物输送用组合物，其在含有上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂的同时含有上述期望的活性成分。
(23)上述(21)或(22)所述的药物输送用组合物，其中，上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂是针对PDPK1基因的反义寡核苷酸、与PDPK1基因特异性结合的适配子、针对PDPK1基因的siRNA、或能够抑制PDPK1基因的表达的miRNA；或者是针对PDPK1的抗体或其免疫反应性片段；与PDPK1特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者是PDPK1的拮抗剂。
(24)上述(23)所述的药物输送用组合物，其中，上述能够抑制PDPK1基因的表达的miRNA是miR-181c。
(25)癌症患者的脑转移判定装置，其是判定受试癌症患者的脑转移的装置，其中，该装置具备：
使用该受试癌症患者来源的样本对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定机构、
确定利用该miR-181c测定机构测定的样本中的miR-181c水平的miR-181c水平确定机构、以及
根据利用该miR-181c水平确定机构确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的转移判定机构，
上述转移判定机构在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，判定为上述受试癌症患者具有脑转移。
(26)癌症患者的脑转移风险判定装置，其是判定受试癌症患者发生脑转移的风险的装置，其中，该装置具备：
使用上述受试癌症患者来源的样本对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定机构、
确定利用该miR-181c测定机构测定的样本中的miR-181c水平的miR-181c水平确定机构、以及
根据利用该miR-181c水平确定机构确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的风险判定机构，
上述风险判定机构在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，判定为上述受试癌症患者发生脑转移的风险高。
(27)安装于提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的装置中的计算机程序，其中，
该计算机程序在癌症患者的脑转移诊断装置中执行下述过程：
使用上述受试癌症患者来源的样本对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定过程、
确定在该miR-181c测定过程中测定的样本中的miR-181c水平的miR-181c水平确定过程、
根据在该miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的转移判定过程、以及
输出基于该转移判定过程的判定结果的判定结果输出过程，
上述转移判定过程在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，判断为上述受试癌症患者具有脑转移。
(28)安装于进行受试癌症患者发生脑转移的风险判定的装置中的计算机程序，其中，
该计算机程序在癌症患者的脑转移诊断装置中执行下述过程：
使用该受试癌症患者来源的样本对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定过程、
确定在该miR-181c测定过程中测定的样本中的miR-181c水平的miR-181c水平确定过程、
根据在该miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的风险判定过程、以及
输出基于该风险判定过程的判定结果的判定结果输出过程，
上述风险判定过程在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，判断为上述受试癌症患者发生脑转移的风险高。
在本说明书中，技术用语“癌”包括上皮性恶性肿瘤、脊髓来源的造血系统恶性肿瘤等，特别是，包括：卵巢癌(非粘液性卵巢癌等)、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌(睾丸绒毛膜上皮癌等)、脑癌(室管膜瘤等)、咽喉癌、肺癌、肺腺癌、肾癌(肾细胞癌等)、肝癌、大肠癌(结肠癌等)、胸膜间皮瘤、肉瘤、慢性及急性骨髓性白血病、肺转移癌等各种转移癌。在本说明书中，所述“癌症患者”表示的是(在脑以外的部位)患有癌症、而不论有无转移的患者，例如，可以是白血病、淋巴瘤(何杰金氏病及非何杰金氏病淋巴瘤等)、多发性骨髓瘤等造血细胞恶性肿瘤；乳腺癌；子宫体癌；子宫颈癌；卵巢癌；食道癌；胃癌；阑尾癌；大肠癌(结肠癌、直肠癌等)；肝癌(肝细胞癌等)；胆囊癌；胆管癌；胰腺癌；肾上腺癌；胃肠道间质肿瘤；间皮瘤；喉癌、口腔癌(口底癌、牙龈癌、舌癌、颊粘膜癌等)等头颈癌；唾液腺癌；鼻窦癌(上颌窦癌、额窦癌、筛窦癌、蝶窦癌等)；甲状腺癌；肾癌；肺癌；骨肉瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤(睾丸癌)；肾细胞癌；膀胱癌；横纹肌肉瘤；皮肤癌；或肛门癌的患者。
癌的分期可通过分期分类(临床病期分类)来确定。分期分类例如可基于癌的大小(T)、向周围淋巴结的转移(N)、以及向远处脏器的转移(M)(TNM分类)等，针对各癌(脏器)确定详细的判定标准，其内容是本领域技术人员所广为公知的(参见美国国家癌症中心网站“Cancer staging”http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/detection/staging；AJCC Cancer Staging Manual(American Joint Commitee on Cancer)的最新版)。例如，对于乳腺癌的情况而言，其分期判定标准如下所述。0期:非浸润性癌:尚停留在发生了乳腺癌的乳腺中(包括佩吉特病)；I期：肿块在2cm以下且未向淋巴结转移；IIA期：肿块在2cm以下且已向腋窝淋巴结转移、或肿块为2.1～5cm且未向淋巴结转移；2B期：肿块为2.1～5cm且已向腋窝淋巴结转移、或肿块在5.1cm以上且未向淋巴结；IIIA期：肿块在5.1cm以上且已向腋窝淋巴结转移、或无论肿块大小如何已向腋窝淋巴结发生了强转移、或未发现向腋窝淋巴结的转移但已向胸骨旁淋巴结转移；IIIB期：无论肿块大小如何已发生了向皮肤、胸壁的浸润；IIIC期：无论肿块大小如何转移已扩散至向锁骨下淋巴结、锁骨上淋巴结；IV期：已转移到远离乳房的部位。
在癌的分期分类中为IV期的患者通常会确认到向远处的转移。因此，在这样的患者中，癌细胞已经侵入血管内，因此如果血液中(血液所含的EVs中)的miR-181c水平高、血脑屏障打开，则转移到脑的概率变得极高。另一方面，对于未确认到向远处转移的I～III期患者，癌细胞尚未侵入血管内的可能性高，即使血液中(血液所含的EVs中)的miR-181c水平高、血脑屏障打开，也不会立即发生脑转移，但在将来癌细胞侵入血液中的情况下，发生脑转移的可能性(风险)高。因此，本发明的方法、药物、装置、计算机程序等是用于脑转移的诊断、还是用于脑转移的风险判定，可以根据测定对象的样本所来自的患者的状态来确定。在利用癌的分期分类的情况下，对于I～III期的患者，可进行脑转移的风险判定，而对于IV期的患者，可进行脑转移的诊断。也可以代替癌的分期分类，利用有无向远处脏器的转移、或癌细胞有无向血液中的浸润来确定是用于脑转移的诊断、还是用于脑转移的风险判定。此时，在存在向远处脏器的转移的情况下、或存在癌细胞向血液中的浸润的情况下，可以作为脑转移的诊断来进行，在不存在向远处脏器的转移的情况下、或不存在癌细胞向血液中的浸润的情况下，可以作为脑转移的风险判定来进行。因此，在本说明书中，“IV期的患者”也可以替换为存在向远处脏器的转移的患者、或存在癌细胞向血液中的浸润的患者，“I～III期的患者”也可以替换为不存在向远处脏器的转移的患者、或不存在癌细胞向血液中的浸润的患者。
在本说明书中，所述“脑转移”以及“向脑的转移”表示的是癌细胞从在脑以外的部位发病的原发肿瘤脱离后浸润至脑内并在脑内增殖、或已在脑内发生了增殖的状态。而在脑以外的部位具有原发肿瘤的癌症患者是否发生了脑转移，可根据本领域技术人员公知的图像诊断方法来确定。例如，对在脑以外的部位具有原发肿瘤的癌症患者给药钆造影剂等并根据CT、MRI等的图像确认到了脑内的肿瘤形成的情况下，可确认为存在脑转移。
另外，在本说明书中，所述“健康人”指的是未患癌症的人。就本说明书中的健康人而言，并不是必须为未患有其它疾病的人，但优选未患有癌以外的疾病的健康的人。
根据本发明，在癌症患者中，miR-181c起着打开BBB、促进脑转移的作用。因此，通过测定癌症患者中的miR-181c水平，可以获得有关该癌症患者的脑转移的信息。在本说明书中，所述“miR-181c”指的是由约22个碱基构成的人来源的miRNA(序列编号1)(Lim LP等(2003)Science、299:1540；Landgraf P等(2007)Cell、129:1401-1414)。
miR-181c水平的测定可使用与miR-181c特异性结合的物质来进行。在本说明书中，所述“与miR-181c特异性结合的物质”，只要是能够与miR-181c特异性结合的物质则没有特殊限制。通常，核酸会与具有互补序列的核酸发生特异性的结合，因此，作为与miR-181c特异性结合的物质，优选为与miR-181c特异性结合的核酸。
所述“与miR-181c特异性结合的核酸”指的是能够与miR-181c特异性结合的核酸分子。通常，这样的核酸分子具有与miR-181c互补的序列。本说明书中的“核酸”包括DNA、RNA或人工合成的核酸(包括锁核酸(Locked Nucleic Acid)(2’,4’-BNA)等交联型核酸)、或者它们的组合。例如，与miR-181c特异性结合的核酸包括引物或探针，但并不限定于这些。所述“引物”通常是指用于核酸扩增的10～30mer(优选为17～25mer、15～20mer等)的核酸分子，其至少一部分(优选为、7mer以上、8mer以上、9mer以上、10mer以上、11mer以上、12mer以上、13mer以上、14mer以上、15mer以上、20mer以上、25mer以上、或30mer以上)具有与位于扩增对象序列的末端的序列互补的序列。另外，所述“探针”是指具有与靶序列互补的序列、能够与靶序列特异性结合的10～200mer(优选为、10～100mer、10～50mer、10～30mer、10～20mer等)的核酸分子，其至少一部分(优选为7mer以上、8mer以上、9mer以上、10mer以上、11mer以上、12mer以上、13mer以上、14mer以上、15mer以上、20mer以上、25mer以上、30mer以上、50mer以上、100mer以上)具有与位于扩增对象序列的末端的序列互补的序列。针对靶子序列的引物及探针的设计方法在本技术领域已被公知。优选与miR-181c特异性结合的核酸在至少一部分包含人工设计的序列(例如，用于标记化或标签化的序列等)。
在本说明书中，某一物质发生“特异性结合”是指，该物质以实质上高于相对于其它的核苷酸序列或氨基酸序列、或者这些结构的亲和性的相对于靶序列或其结构的亲和性而进行结合。这里，所述“实质上高于…的亲和性”是指，高至能够利用期望的测定装置或方法而将靶序列或其结构以区别于其它序列或结构而检测到的程度的亲和性。例如，实质上高于…的亲和性可以是：与miR-181c结合的与miR-181c特异性结合的物质的分子数为与其它序列或结构结合的与miR-181c特异性结合的物质的分子数的3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上。作为本发明的与miR-181c特异性结合的物质和miR-181c之间的结合的结合常数(Ka)，可列举例如：至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1。
本说明书中的“与miR-181c特异性结合的物质”(包括与miR-181c特异性结合的核酸)也可以根据需要而经过标记化。作为标记化的方法，可列举例如：放射性同位素(RI)标记、荧光标记及酶标记。作为进行RI标记的情况下的放射性同位素，可列举：32P、131I、35S、45Ca、3H、14C。另外，作为进行荧光标记的情况下的荧光色素，可列举：DAPI、SYTOX(注册商标)Green、SYTO(注册商标)9、TO-PRO(注册商标)-3、Propidium Iodide、Alexa Fluor(注册商标)350、Alexa Fluor(注册商标)647、Oregon Green(注册商标)、Alexa Fluor(注册商标)405、Alexa Fluor(注册商标)680、Fluorescein(FITC)、Alexa Fluor(注册商标)488、Alexa Fluor(注册商标)750、Cy(注册商标)3、Alexa Fluor(注册商标)532、Pacific Blue(商标)、Pacific Orange(商标)、Alexa Fluor(注册商标)546、Coumarin、Tetramethylrhodamine(TRITC)、Alexa Fluor(注册商标)555、BODIPY(注册商标)FL、TexasRed(注册商标)、Alexa Fluor(注册商标)568、Pacific Green(商标)、Cy(注册商标)5、及、Alexa Fluor(注册商标)594。作为酶标记，可利用生物素(biotin-16-dUTP、biotin-11-dUTP等)、地高辛(DIG:甾类天然物)(脱氧尿苷-5′-三磷酸)、碱性磷酸酶等。
根据本发明，PDPK1是在BBB的结构保持中起主要作用的物质之一，因此，通过抑制PDPK1的表达、或抑制活性，能够使BBB打开。因此，PDPK1表达抑制剂或PDPK1活性抑制剂可以用作以到达脑内为目的的药物的DDS用药物。在本说明书中，所述“PDPK1”是3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1的简称。PDPK1是将蛋白激酶的AGC家族磷酸化及激活的丝氨酸/苏氨酸激酶。作为PDPK1的mRNA及蛋白质，已知存在多种变体。将PDPK1 vulariant1的mRNA编码核酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别示为序列编号2及序列编号3。将PDPK1 vulariant2的mRNA编码核酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别示为序列编号4及序列编号5。将PDPK1 vulariant3的mRNA编码核酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别示为序列编号6及序列编号7。将PDPK1 vulariantX1的mRNA编码核酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别示为序列编号8及序列编号9。本说明书中的PDPK1可以是这些中的任一个的变体，也可以是能够在生物体内产生的它们的变体。
另外，根据本发明人等的发现，在癌症患者中，miR-181c被包埋在外来体中而向血液中移动、并在到达BBB时被导入构成该BBB的细胞，由此发挥出打开血脑屏障的作用。因此，通过在癌症患者中抑制外来体的分泌，可以抑制血脑屏障的打开，由此可以抑制脑转移。因此，在实施方式之一中，本发明涉及利用外来体分泌抑制剂来抑制脑转移。在本说明书中，所述“外来体分泌抑制剂”只要是能够抑制来自癌细胞的外来体分泌的药物则没有特殊限制。已知在外来体的分泌中有中性鞘磷脂(以下称为“nSMase2”)(序列编号10表示cDNA序列、序列编号11表示氨基酸序列)及RAB27B(序列编号12表示cDNA序列、序列编号13表示氨基酸序列)参与。因此，通过抑制这些nSMase2或RAB27B的表达、或抑制活性，可以抑制外来体的分泌。即，nSMase2或RAB27B的表达抑制剂或活性抑制剂可以作为本发明中的外来体分泌抑制剂使用。
在本说明书中，基因、蛋白质或miRNA的所述“表达抑制剂”只要是抑制该基因、蛋白质或miRNA的表达的药物则没有特殊限制。作为靶基因的表达抑制剂，本技术领域通常的理解是，可通过对下述这些加以设计和/或选择而取得及利用：例如，相对于该基因序列或通过转录该基因而生成的mRNA序列的反义链、相对于通过转录该基因而生成的mRNA的dsRNA、相对于通过转录该基因而生成的mRNA的适配子、或者能够与位于该基因的表达所必要的编码区的上游的核酸序列结合的miRNA(包括pri-miRNA及pre-miRNA)。
另外，作为靶蛋白的表达抑制剂，本技术领域通常的理解是，可通过对下述这些加以设计和/或选择而取得及利用：例如，相对于编码该蛋白质的基因序列或通过转录该基因而生成的mRNA序列的反义链、相对于通过转录编码该蛋白质的基因而生成的mRNA的dsRNA、相对于编码该蛋白质的基因或通过转录该基因而生成的mRNA的适配子、或者能够与位于编码该蛋白质的基因的表达所必要的编码区的上游的核酸序列结合的miRNA(包括pri-miRNA及pre-miRNA)。
作为miRNA的表达抑制剂，本技术领域通常的理解是，可通过对下述这些加以设计和/或选择而取得及利用：例如，编码该miRNA的基因、该miRNA的pri-miR、或相对于该miRNA的pre-miR的反义链、该miRNA的pri-miR、或相对于该miRNA的pre-miR的dsRNA、该miRNA的pri-miR、或相对于该miRNA的pre-miR的适配子、或者能够与位于编码该miRNA的基因的表达所必要的编码区的上游的核酸序列结合的miRNA(包括pri-miRNA及pre-miRNA)。
例如，本发明人等发现，PDPK1的表达抑制剂包含pri-miR-181c、pre-miR-181c、miR-181c及它们的衍生物。
在本说明书中，所述pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA的衍生物，是至少具有该miRNA的种子序列(从5’末端起的第2～第8碱基的7个碱基:ACUUACA)、且具有抑制目标基因(或蛋白质)(miR-181c的情况下为PDPK1)的表达的作用的分子。这样的衍生物的功能并不一定要定量地与原始的miRNA达到同等程度，只要能够实现本发明的目的，则可以具有比原始的miRNA强的作用或弱的作用。进一步，该衍生物具有与pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA具有约70％以上且低于100％、约75％以上且低于100％、约80％以上且低于100％、约85％以上且低于100％、约90％以上且低于100％、约95％以上且低于100％的同源性的核苷酸序列。序列同源性越高，该衍生物与pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA的结构越接近。pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA的衍生物也可以具有原始的pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA所不具有的序列。另外，就pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA的碱基长度而言，只要能够发挥出作为miRNA的功能则也可以与原始的碱基长度不同，例如，可以为10～50mer、15～30mer、20～25mer。
另外，上述pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA的衍生物是具有pri-miRNA、pre-miRNA及miRNA中的种子序列的核酸分子，包括(除种子序列以外)具有选自以下(i)～(iv)中的1种以上的加成、取代、缺失及修饰的核酸分子：
(i)1个以上(例如，1～10个、1～5个、1～3个、1～2个、或1个)核苷酸相对于pri-miR-181c、pre-miR-181c、miR-181c的天然序列的加成；
(ii)pri-miR-181c、pre-miR-181c、miR-181c的天然序列中的1个以上(例如，1～10个、1～5个、1～3个、1～2个、或1个)核苷酸被其它核苷酸取代；
(iii)pri-miR-181c、pre-miR-181c、miR-181c的天然序列中的1个以上(例如，1～10个、1～5个、1～3个、1～2个、或1个)核苷酸缺失；以及
(iv)pri-miR-181c、pre-miR-181c、miR-181c的天然序列中的1个以上(例如，1～10个、1～5个、1～3个、1～2个、或1个)核苷酸被修饰。
在本说明书中，蛋白质或miRNA的所述“活性抑制剂”只要是使该蛋白质或miRNA达到无法发挥其活性的状态的药物则没有特殊限制。例如，活性抑制剂可以是与该蛋白质或miRNA结合的物质，或者，也可以是与结合该蛋白质或miRNA的对象结合的物质。作为蛋白质的活性抑制剂，已知有mimetics(模拟物)、抗体或其免疫反应性片段、适配子、受体衍生物、或拮抗剂。另外，作为miRNA的活性抑制剂，已知有与mimetics、具有与该miRNA的至少一部分的序列互补的序列的反义DNA和/或RNA或dsRNA、或者相对于该miRNA的适配子。
在本说明书中，所述“反义链”指的是与靶向序列(例如，pri-miR-181c、pre-miR-181c或miR-181c的序列、或编码pri-miR-181c的DNA序列)具有互补序列的核酸，可以是DNA也可以是RNA。另外，反义链无需与靶序列100％互补，只要能够在严格条件下(Sambrook etal.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；and Ausubel et al.(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(JohnWiley&Sons.N.Y.)at Unit 2.10)进行特异性地杂交，则也可以包含不互补的碱基。反义链被导入细胞时，会与靶序列结合而抑制转录、RNA的加工、翻译或稳定性。另外，反义链除了反义多核苷酸以外，还包括多核苷酸模拟物、具备变异的骨架(modified back bone)的那些。这样的反义链可以基于靶序列信息、利用本领域技术人员公知的方法进行适当设计及制造(例如，化学合成)。
所述“dsRNA”是通过基于RNA干扰(RNAi)、和至少一部分与靶序列具有互补序列、具有靶序列的mRNA结合而将该mRNA分解，由此抑制靶序列的翻译(表达)的包含双链RNA结构的RNA。dsRNA包含siRNA(short interfering RNA)及shRNA(short hairpin RNA)。dsRNA只要抑制靶基因表达则无需与靶序列具备100％同源性。另外，出于稳定化以外的目的，dsRNA的一部分也可以被DNA取代。作为siRNA，优选为具备21～23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法、作为例如化学合成或天然存在RNA的类似物而得到。shRNA是采取发夹转角结构的RNA短链。shRNA可利用本领域技术人员公知的方法、例如化学合成或将编码shRNA的基因导入细胞而使其表达来得到。
所述“适配子”是与蛋白质或核酸等物质结合的核酸。适配子可以是RNA也可以是DNA。核酸的形态可以是双链也可以是单链。就适配子的长度而言，只要能够与钯分子发生特异性结合则没有特殊限制，例如为10～200个核苷酸、优选为10～100个核苷酸、更优选为15～80个核苷酸、进一步优选为15～50个核苷酸。适配子可以采用本领域技术人员公知的方法而进行选择，例如可采用SELEX法(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)(Tuerk、C.and Gold、L.、1990、Science、249:505-510)。
在本说明书中，所述“mimetics”是与该蛋白质或miRNA具有类似的结构，能够与该蛋白质或miRNA的结合对象结合、或者能够与该蛋白质或miRNA竞合，从而使该蛋白质或miRNA所具有的活性无法发挥出来的物质。
本说明书中的“抗体”可以是多克隆抗体或单克隆抗体，包括非人类动物的抗体、具有非人类动物的抗体的氨基酸序列和人来源的抗体的氨基酸序列的抗体(嵌合抗体及人源化抗体等)、及人类抗体。另外，抗体的免疫球蛋白类可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY中的任意的免疫球蛋白类(同种型)，另外，为IgG的情况下，可以是任意的亚类(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。进一步，抗体可以是单特异性的、双特异性的(双特异性抗体)、三特异性的(三特异性抗体)(例如，WO1991/003493号)。抗体的免疫反应性片段表示的是包含抗体的一部分(部分片段)的蛋白质或肽、保持抗体对抗原的作用(免疫反应性/结合性)的蛋白质或肽。作为这样的免疫反应性片段，可列举例如：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fab3、单链Fv(以下称为“scFv”)、(串联)双特异性单链Fv(sc(Fv)2)、单链三抗体、纳米抗体、二价VHH、五价VHH、迷你抗体、(双链)双抗体、串联双抗体、双特异性三链抗体、双特异性双链抗体、双亲和性重靶向分子(DART)、三抗体(或三链抗体)、四抗体(或[sc(Fv)2]2)、或(scFv-SA)4)二硫键稳定Fv(以下称为“dsFv”)、紧凑型IgG、重链抗体、或它们的聚合物(参见Nature Biotechnology、29(1):5-6(2011)；Maneesh Jain et al.、TRENDS in Biotechnology、25(7)(2007):307-316；及Christoph stein等、Antibodies(1):88-123(2012))。在本说明书中，免疫反应性片段可以是单特异性的、双特异性的(双特异性)、三特异性的(三特异性)、及多特异性的(多特异性)中的任意类型。所述适配子指的是能够与特定的核酸或蛋白质结合的核酸分子。另外，所述受体衍生物表示具有目标蛋白质所结合的受体中的结合区的结构的物质，可列举例如：使受体和抗体的恒定区结合的物质、使膜蛋白受体的跨膜区缺失而变得可溶的物质。拮抗剂广泛地包含与目标的蛋白质或miRNA竞合而抑制其功能的物质。
在本说明书中，在活性抑制剂与该蛋白质或miRNA结合的情况下、或者与该蛋白质或miRNA所结合的对象相结合的情况下，该结合优选是特异性的，作为结合常数(Ka)，可列举例如：至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1。
本说明书中，所述“药物”主要是指被用作有效成分的物质，包括低分子化合物、核酸分子(DNA和/或RNA)、蛋白质、及它们的融合物。另外，本说明书中，所述“组合物”至少包含成为有效成分的药物、且根据需要而包含水、溶剂、及其它添加物。本说明书中的组合物可以仅包含1种物质作为有效成分、也可以包含2种以上物质作为有效成分。在本说明书中，所述“有效成分”只要是能够发挥出期望的生物学作用的物质则没有特殊限制，除了能够发挥出治疗效果或预防效果的物质以外，还包括发挥出作为DDS的功能的物质。另外，某一物质是否为有效成分，并不仅仅根据该物质是否具有生物学作用，还可以根据该组合物中包含的该物质的量是否为能够发挥出由该物质带来的生物学作用的量来确定。
“用于脑转移的诊断或风险评估的组合物”是指，用于以下记载的诊断脑转移的方法或评价发生脑转移的风险的方法的组合物，包含诊断药(包括体外诊断药)。用于脑转移的诊断或风险评估的组合物可以是以体内(in vivo)用、离体(ex vivo)用、或体外(invitro)用中的任意方式进行的组合物，但优选为离体用或体外用。用于体内用的诊断或风险评估的组合物可以基于以下的药物组合物而制成能够向患者给药的制剂。作为本说明书中的用于诊断或风险评估的组合物，可列举例如：X射线造影剂、一般检查用试剂、血液检查用试剂、生化检查用试剂、免疫血清学检查用试剂、细菌学检查用试剂、及功能检查用试剂。另外，本说明书中的用于诊断或风险评估的组合物是以确定样本中的miR-181c水平为目的的，因此具备上述的与miR-181c特异性结合的物质。
在另一实施方式中，本说明书中的用于诊断或风险评估的组合物也可以以含有该组合物作为有效成分的用于诊断或风险评估的试剂盒的形式提供。该试剂盒只要能够确定miRNA水平则对其构成没有限定，例如，本说明书中的用于诊断或风险评估的试剂盒可以是具备能够与miR-181c结合的引物的试剂盒(可通过采用PCR等基因扩增技术而测定miRNA水平的试剂盒)、或具备能够与miR-181c结合的探针的试剂盒(可通过采用杂交等核酸结合检测技术而测定miRNA水平的试剂盒)。
或者，本说明书中的用于诊断或风险评估的试剂盒也可以是用于以基于miRNA的表达抑制作用为指标来确认miRNA水平的试剂盒。这种情况下，例如也可以制成具备对具有能够与miR-181c特异性结合的mRNA 3’UTR的标记物质(荧光素酶等)进行编码的核酸的试剂盒(可通过利用报告检测(reporter assay)等确认该标记物质的表达来测定miRNA水平的试剂盒)。
本说明书中，所述“药物组合物”是用于治疗或预防的组合物，包括治疗药及预防药。药物组合物适宜制备成可适合于活性成分的给药量的投药单位的剂型。另外，只要是能够向患者给药的制剂，则可采用口服或非口服的任何制剂。作为用于非口服给药的组合物，可列举例如，注射剂、滴鼻剂、栓剂、贴剂、软膏等，优选为注射剂。本发明的药物组合物的剂型可列举例如液剂或冻干制剂。将本发明的药物组合物以注射剂形式使用的情况下，可以根据需要而添加丙二醇、乙二胺等增溶剂、磷酸盐等缓冲材料、氯化钠、甘油等等渗剂、亚硫酸盐等稳定剂、酚等保存剂、利多卡因等无痛剂等添加物(参见“医药品添加物事典”药事日报社、“Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition”APhA Publications公司)。另外，将本发明的药物组合物以注射剂形式使用的情况下，作为保存容器，可列举安瓿、管形瓶、预填充式注射器、笔型针管注射器、及输液袋等。例如，每投药单位剂型的药物组合物中可以含有通常5～500mg、5～100mg、10～250mg的活性成分。
在本说明书中，用于抑制脑转移的药物组合物中可以含有选自miR-181c表达抑制剂、miR-181c活性抑制剂及外来体分泌抑制剂中的1种以上药物作为有效成分。另外，用于抑制脑转移的药物组合物既可以含有选自miR-181c表达抑制剂、miR-181c活性抑制剂及外来体分泌抑制剂中的1种或1种以上药物作为唯一的有效成分，也可以还含有组合使用的其它药物作为有效成分。作为这样的其它药物，可列举其它癌转移抑制剂、抗癌剂。
作为用于抑制脑转移的药物组合物中可以含有的其它癌转移抑制剂或抗癌剂，可列举例如：包含环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、塞替派等氮芥类、及尼莫司汀、雷莫司汀、氮烯唑胺、甲基苄肼、替莫唑胺、卡莫司汀、链脲佐菌素、苯达莫司汀等硝基脲类的烷化剂；顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂等铂化合物；依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷胶囊、替加氟、替加氟/尿嘧啶、替加氟/吉莫斯特/氧嗪酸钾、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯基嘌呤、氨甲喋呤等代谢拮抗药；伊立替康、依托泊苷、艾日布林、索布佐生、多西他赛、拓扑替康、紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱、长春地辛、长春花碱等植物生物碱或微管抑制药；放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁斯酯、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、多柔比星脂质体等抗癌性抗生物质；Sipuleucel-T等癌症疫苗；替伊莫单抗、伊马替尼、依维莫司、厄洛替尼、吉非替尼、吉妥单抗、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、达沙替尼、他米巴罗汀、曲妥珠单抗、维甲酸、帕尼单抗、贝伐单抗、硼替佐米、拉帕替尼、利妥昔单抗等分子靶向药；阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、醋酸戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、古民度、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲基睾丸素、醋酸甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、来曲唑等激素药；干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干燥BCG、香菇多糖等生物反应调节剂。
在本说明书中，用于使血脑屏障的透过性亢进的药物组合物可以含有1种或1种以上的PDPK1表达抑制剂或PDPK1活性抑制剂作为有效成分。另外，用于使血脑屏障的透过性亢进的药物组合物既可以含有PDPK1表达抑制剂和/或PDPK1活性抑制剂作为唯一的有效成分，也可以还含有组合使用的其它药物作为有效成分。作为这样的其它药物，除了作用于血脑屏障而提高其透过性的药物以外，还可以列举以输送至脑为目的的药物。本说明书中，用于使血脑屏障的透过性亢进的药物组合物特别是在以将期望的药物输送至脑为目的而利用的情况下，将这样的药物组合物称为“药物输送用组合物”。另外，在本说明书的药物输送用组合物中，为了与为了使BBB打开而包含的药物(PDPK1表达抑制剂或PDPK1活性抑制剂)相区别，将“以输送至脑为目的的药物”称为“活性成分”。
本说明书中，“药物输送用组合物”至少含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分。药物输送用组合物适宜制备成可适合于活性成分的给药量的投药单位的剂型。作为这样的投药单位的剂型，可示例出注射剂(安瓿、管形瓶、预填充式注射器)，每投药单位剂型中通常含有5～500mg、5～100mg、10～250mg的PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂。
另外，药物输送用组合物中除了PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂以外，还可以包含以到达脑为目的的药物、即活性成分。此时，PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂与活性成分可以包含在同一制剂中，也可以以用以组合使用的各自的制剂的形式提供。
在本说明书中，所述“活性成分”是以输送至脑内为目的的药物，包含以下述疾病为目标疾病的治疗药或预防药：例如，脑血管障碍(脑梗塞、脑出血、脑动脉瘤等)、脑肿瘤(脑膜瘤、垂体腺瘤等、包括脑转移)、感染性疾病(脑膜炎等)、功能性脑疾病(三叉神经痛等)、脊髓疾病(椎间盘突出、脊椎管狭窄等)等脑神经外科疾病；帕金森氏病、脊髓小脑变性、癫痫等神经疾病；及阿尔茨海默氏病、非阿尔茨海默氏退化性痴呆症、失眠症、抑郁症等精神疾病。例如，目标疾病为脑肿瘤的情况下，可以利用上述各种抗癌剂，特别是在神经胶质瘤的情况下，可优选利用阿瓦斯汀或格立得。
在另一实施方式中，本说明书中的药物输送用组合物也可以以含有该组合物作为有效成分的用于治疗或预防的试剂盒的形式提供。该试剂盒只要含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂则对其构成没有限定，例如，可以含有PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂、及活性成分。此时，PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂和活性成分可以以同时给药的形态提供，也可以以各自给药的形态提供。
在本说明书全体中，所述“水平”表示的是经过了数值化的与miR-181c的存在量相关的指标，包括例如浓度、量或能够替代其采用的可数值化的所有指标。因此，水平既可以是荧光等的测定值本身，也可以是换算成了浓度、量的值。另外，水平既可以是绝对的数值(存在量、每单位面积的存在量等)，或者，也可以是与根据需要而设定的比较对象相比较的相对的数值。进一步，在针对同一样品(同时或在不同时期)进行了多次测定的情况下，水平可以取其平均值或中间值。
本说明书中，“试剂盒”中除了上述的有效成分以外，还可以包含纸盒或塑料盒等储存试剂盒的构成物的包装、储存各成分的安瓿、管形瓶、管、或注射器等、以及操作说明书等。
在另一实施方式中，本发明涉及癌症患者的脑转移判定装置及脑转移风险判定装置、以及在这些装置中使用的计算机程序(图23)。这些装置为诊断是否发生了脑转移的人(通常为医生)提供用于诊断的信息。本发明的脑转移判定装置具备miR-181c测定机构。这里，“miR-181c测定机构”是执行受试者来源的样本中具有miR-181c(序列编号1)的碱基序列或其一部分的多核苷酸的测定的装置，通过对受试癌症患者来源的样本进行给定的处理而将样本中有关miR-181c水平的信息进行数字化或电信号化。miR-181c测定机构测定光(荧光、发光等)等参数，而该光所具有的强度反应了通过使上述用于脑转移的诊断或风险评估的药物和受试癌症患者来源的样本接触并根据需要发生反应而产生的miR-181c水平。用于脑转移的诊断或风险评估的药物与受试癌症患者来源的样本的接触通常在板、管等容器(反应槽)内进行。
本发明的计算机程序包含即使在上述癌症患者的脑转移判定装置及脑转移风险判定装置为在其它测定、判定中也能够使用的通用装置的情况下，通过安装在该通用装置中，也能够作为癌症患者的脑转移判定装置或脑转移风险判定装置使用的计算机程序。另外，本发明的计算机程序并不是一定要安装于脑转移判定装置及脑转移风险判定装置中，例如，本发明的计算机程序也可以存储于记录介质而提供。这里，所述“记录介质”，其本身是能够承载不会占据空间的程序的介质，包括例如软盘、硬盘、CD-R、CD-RW、MO(磁光盘)、DVD-R、DVD-RW、闪存等。另外，本发明的计算机程序还可以从存储该计算机程序的计算机通过通信线路而传送到其它计算机或装置。本发明的计算机程序也包括存储于这样的计算机中的计算机程序、以及传送中的计算机程序。
发明的效果
miR-181c通过破坏BBB而有利于脑转移、并且在脑转移癌症患者中会特异性地表达升高，因此可以用于脑转移的诊断或风险评估。另外，通过抑制miR-181c的表达或活性、或抑制(包含miR-181c的)EVs的分泌，可以抑制脑转移。进一步，包含miR-181c的PDPK1的表达抑制剂及PDPK1的活性抑制剂由于会提高BBB的透过性，因此可以用于期望传递至脑的药物的DDS。
附图说明
[图1](a)脑转移衍生物的体内选择的规则的示意图。(b)具有BMD2a细胞的脑转移的小鼠的生物发光成像的照片(左)。右是具有癌细胞转移的小鼠脑的生物发光成像的照片。(c)由小鼠大脑皮层及中脑得到的切片的苏木精及曙红(HE)染色的照片。上段是大脑皮层(Cerebral cortex)、下段是中脑(midbrain)的照片。左(Normal)表示未发生癌细胞转移的小鼠来源，中央(Metastasis)表示发生了癌细胞转移的小鼠来源。箭头表示转移癌细胞。右侧照片表示高倍率的照片。各照片的右下的比例尺表示100μm。
[图2](a)来自猴脑毛细血管内皮细胞、周细胞及星形胶质细胞的原代培养细胞的体外血脑屏障模型的建立的示意图。(b)示出了内皮细胞、周细胞及星形胶质细胞的代表性的照片。星形胶质细胞是使用荧光显微镜而实现可视化的。各照片的右下的比例尺表示100μm。(c)示出了紧密连接蛋白(tight junction proteins)(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白及ZO-1)及N-钙粘蛋白的免疫荧光染色的结果的照片。各照片的右下的比例尺表示20μm。(d)示出了解冻后直到实验开始之前的期间内TEER的变化的坐标图。在将BBB体外模型解冻后，TEER值最大增加到了869.55Ω×cm2。误差棒表示标准偏差(SD)。
[图3](a)侵袭了基质胶的MDA-MB-231-D3H1细胞(以下称为D3H1细胞)、MDA-MB-231-D3H2LN细胞(以下称为D3H2LN细胞)、以及作为建立的脑转移细胞系的BMD2a细胞及BMD2b细胞的代表性的照片。各照片的右下的比例尺表示100μm。(b)以相对于侵袭了基质胶的D3H2LN细胞数的比例(倍)示出了侵袭了基质胶的D3H1细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞的个数的坐标图。误差棒表示标准偏差(SD)、**表示P<0.01。(c)示出了D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞的代表性形态的照片。各照片的右下的比例尺表示100μm。
[图4](a)体外BBB模型中的PKH-67标记化各癌细胞的侵袭性试验的示意图。(b)左侧坐标图是以相对于通过了BBB模型的D3H1细胞的比例(倍)示出了通过了体外BBB模型的D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞的细胞数的坐标图。误差棒表示标准偏差(SD)、*表示P<0.01、**表示P<0.01。右侧照片表示通过了体外BBB模型的D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞的细胞照片。
[图5](a)上段表示利用相位差电子显微镜将EVs可视化了的照片。比例尺表示100nm。下段是示出了利用NanoSight测定EV尺寸的结果的坐标图。坐标图中的数值表示全部EVs的尺寸的平均值。(b)利用蛋白质印迹法确认作为EV标记物的CD63及CD9、以及细胞色素C的表达的结果的照片。自左侧起依次表示D3H1来源EVs(泳道1)、D3H2LN来源EVs(泳道2)、BMD2a来源EVs(泳道3)、及BMD2b来源EVs(泳道4)。(c)示出了利用NanoSight测定从D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞分离出的EVs的个数的结果的坐标图。横轴从左侧起依次表示D3H1来源EVs、D3H2LN来源EVs、BMD2a来源EVs、及BMD2b来源EVs。纵轴表示每1mL对应的EVs的粒子数(×109个/mL)。
[图6]示出了siRNA处理BMD2a细胞的实验结果的坐标图。在所有坐标图中，横轴表示经过了处理的siRNA，从左侧起表示阴性对照细胞(N.C.)、RAB27B siRNA(RAB27B)、nSMase2siRNA(nSMase2)、RAB27B siRNA及nSMase2siRNA(S+R)。(a)示出了从siRNA处理BMD2a细胞释放出的EVs数的坐标图。纵轴表示针对EVs粒子数(个/mL)，利用相对于EVs释放相关蛋白质的siRNA进行了处理的细胞的、相对于阴性对照细胞的比例(倍)。(b)关于侵袭了基质胶的各种siRNA处理BMD2a细胞的坐标图。纵轴表示针对侵袭了基质胶的细胞数，利用相对于EVs释放相关蛋白质的siRNA进行了处理的细胞的、相对于阴性对照细胞的比例(％)。(c)示出了siRNA处理BMD2a细胞的体外BBB通过活性试验的结果的坐标图。纵轴表示针对BBB通过细胞数，利用相对于EVs释放相关蛋白质的siRNA进行了处理的细胞的、相对于阴性对照细胞的比例(倍)。
[图7]示出了使用添加了BMD2a、BMD2b或D3H2LN细胞来源的EVs的体外BBB模型测定D3H1细胞的BBB通过能力的结果的坐标图。纵轴表示针对BBB通过细胞数，浸润有添加了BMD2a、BMD2b或D3H2LN细胞来源的EVs的体外BBB模型的D3H1细胞的、相对于阴性对照细胞的比例(倍)。横轴表示添加的EVs所来源的细胞，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞。
[图8](a)表示自添加EVs起24小时后的TEER测定结果的坐标图。纵轴表示TEER的测定值(Ω·cm2)，横轴表示添加的EVs所来源的细胞，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞、及BMD2b细胞。误差棒表示标准偏差(SD)，*表示P<0.05、**表示P<0.01。(b)示出了EVs添加前及EVs添加24小时后的TEER的变化的坐标图。纵轴表示EVs添加24小时后的TEER值相对于EVs添加前的TEER值的比例(倍)。(c)示出了利用NaF测定的BBB的透过性试验的结果的坐标图。纵轴表示表观透过系数(Papp)(10-6cms-1)。横轴表示添加的EVs所来源的细胞，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞、及BMD2b细胞。
[图9](a)示出了对EVs向构成体外BBB模型的内皮细胞的导入进行测定的结果的坐标图。纵轴表示相对于D3H2LN细胞来源，被导入其它细胞的内皮细胞的EVs的荧光强度的比率(倍)。横轴表示使用的EVs所来源的细胞，自左侧起表示D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞、及BMD2b细胞。误差棒表示标准偏差(SD)，**表示P<0.01。(b)利用荧光显微镜对构成体外BBB模型的内皮细胞(Endothelial cell)、周细胞(Pericyte)及星形胶质细胞(Astrocyte)的Hoechst33342染色(水色)及导入的EVs的PKH67(绿色)进行观察的照片。左侧照片表示所使用的EVs所来源的细胞。内皮细胞(Endothelial cell)及周细胞(Pericyte)的照片的比例尺表示20μm。星形胶质细胞(Astrocyte)的照片的比例尺表示100μm。
[图10](a)构成添加了D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs后的体外BBB模型的血管内皮细胞内的紧密连接蛋白(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、及ZO-1)(红色)及肌动蛋白丝(绿色)的共荧光免疫染色的照片。比例尺表示20μm。(b)构成添加了D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs后的体外BBB模型的血管细胞内的N-钙粘蛋白(红色)及肌动蛋白丝(绿色)的共荧光免疫染色的照片。比例尺表示20μm。(c)使用由利用PBS(阴性对照:N.C.)或D3H2LN细胞、BMD2a细胞或BMD2b细胞来源EVs进行了处理的内皮细胞回收的蛋白质对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白、肌动蛋白、及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。
[图11]给药了D3H2LN细胞(对照)或BMD2a细胞来源的EVs的小鼠脑的荧光图像照片。上段的荧光强度示出了导入小鼠脑的DiR-标记化EVs。下段的荧光强度示出了小鼠脑的血管透过性。
[图12](a)示出了小鼠脑内光子强度的分布的坐标图。纵轴表示光子强度(×105)。横轴表示各小鼠组，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、D3H2LN来源EVs给药组(D3H2LN)、及BMD2a来源EVs给药组(BMD2a)。*表示P<0.05、**表示P<0.01。(b)阴性对照(N.C.)(左)、给药了D3H2LN来源EVs(D3H2LN EVs)(中央)及BMD2a来源EVs(BMD2a EVs)(右)之后，向小鼠移植癌细胞、并以生物发光图像显示出癌细胞的转移的代表性的照片。上段为小鼠全身的生物发光图像，下段为小鼠脑的生物发光图像。(c)从小鼠大脑皮层得到的切片的照片。上段为苏木精及曙红(HE)染色的照片，箭头表示转移癌细胞。照片的右下的比例尺表示100μm。下段为抗人波形蛋白免疫荧光染色的图像照片，照片的右下的比例尺表示20μm。
[图13](a)癌细胞来源EVs中的miR-181c的表达水平的热图。(b)针对分离出的EVs中相对于全部RNA量的miR-181c的量(miR-181c/全部外来体RNA)，示出了BMD2a细胞及BMD2b细胞相对于D3H2LN细胞的比例(倍)的坐标图。纵轴表示在将从D3H2LN细胞中分离出的EVs中相对于全部RNA量的miR-181c的量设为1的情况下，分离出的EVs中相对于全部RNA量的miR-181c的量的比率(倍)。BMD2a细胞及BMD2b细胞误差棒表示标准偏差(SD)，**表示相对于D3H2LN细胞来源的EVs，P<0.01。
[图14](a)示出了体外BBB模型的血管内皮细胞内的miR-181c量的变化的坐标图。纵轴以相对于添加了D3H2LN细胞来源EVs的血管内皮细胞中包含的miR-181c的量的比例(倍)示出了对将癌细胞来源EVs添加到体外BBB模型之后从体外BBB模型的血管内皮细胞回收的RNA中包含的miR-181c的量利用RNU6进行补正而得到的值。横轴表示添加到体外BBB模型中的EVs所来源的细胞，自左侧起表示D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞。BMD2a细胞及BMD2b细胞的误差棒表示标准偏差(SD)，**表示D3H2LN细胞来源的EVs，P<0.01。(b)示出了相对于体外BBB模型的血管内皮细胞内转导miR-181c之后的24小时后的TEER测定结果的坐标图。纵轴表示TEER的测定值(Ω·cm2)，横轴表示转导的microRNA，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、miR-181c。误差棒表示标准偏差(S.D.)，**表示P<0.01。(c)构成转导了阴性对照(N.C.)或miR-181c之后的体外BBB模型的血管内皮细胞内的紧密连接蛋白(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、及ZO-1)、N-钙粘蛋白(红色)及肌动蛋白丝(绿色)的共荧光免疫染色的照片。比例尺表示20μm。(d)使用从构成转导了阴性对照(N.C.)或miR-181c之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白、肌动蛋白、及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。
[图15]示出了患者来源的血清中的EVs中包含的miR-181c的量的坐标图。纵轴表示miR-181c量相对于miR-16量的比。就横轴而言，左侧表示无脑转移(witiout brainmetastasis)(n＝46)，右侧表示有脑转移(Brain metastasis)(n＝10)。*表示P<0.05。miR-181c水平的检定通过T检验进行。
[图16]示出了乳腺癌患者血清中包含的miR-181c的量的分布的坐标图。纵轴表示将miR-181c的存在量利用miR-16的存在量进行了补正的值(ΔΔCt值)。横轴表示采用了TNM分类的乳腺癌的病期(分期)。*表示相对于3期及不具有脑转移的4期患者组而言的，使用了具有脑转移的患者组、Mann-Whitney U test的显著差异，P<0.05。
[图17](a)示出了通过微阵列分析得到的PDPK1的表达量的比率。对相对于构成体外BBB模型的血管内皮细胞转导了阴性对照(N.C.)及miR-181c之后从血管内皮细胞回收的RNA进行了微阵列分析。纵轴是将转导了阴性对照(N.C.)时的PDPK1的表达量设为1的值。横轴表示转导的microRNA，从左侧起为N.C.及miR-181c。(b)示出了构成体外BBB模型的血管内皮细胞的PDPK1 mRNA的表达量。对血管内皮细胞转导了阴性对照(N.C.)及miR-181c之后，从血管内皮细胞回收RNA，并对其中包含的PDPK1 mRNA的量利用RT-PCR进行了分析。纵轴表示将PDPK1 mRNA的量利用GAPDH mRNA的量加以补正后的值(ΔΔCt值)设为1的值。横轴表示转导的microRNA，从左侧起为N.C.及miR-181c。**表示P<0.01。(c)使用从构成转导了阴性对照(N.C.)或miR-181c之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对PDPK1及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。坐标图表示将进行蛋白质印迹解析时的PDPK1的发光强度利用GAPDH的发光强度加以补正而得到的值。(d)示出了通过微阵列分析得到的PDPK1的表达量的比率。对相对于构成体外BBB模型的血管内皮细胞添加阴性对照(N.C.)及D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs之后从血管内皮细胞回收的RNA进行了微阵列分析。纵轴是将对阴性对照(N.C.)进行了处理时的PDPK1的表达量设为1的值。横轴表示添加了阴性对照(N.C.)及D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs的情况。(e)示出了构成体外BBB模型的血管内皮细胞中的PDPK1 mRNA的表达量。对相对于血管内皮细胞添加阴性对照(N.C.)及D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs之后从血管内皮细胞回收的RNA，通过RT-PCR对其中包含的PDPK1mRNA的量进行了解析。纵轴表示将PDPK1 mRNA的量利用GAPDH mRNA的量加以补正后的值(ΔΔCt值)设为1的值。横轴表示添加了阴性对照(N.C.)及D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs的情况。**表示P<0.01。(f)使用从构成添加了阴性对照(N.C.)及D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对PDPK1及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。坐标图表示将进行蛋白质印迹解析时的PDPK1的发光强度利用GAPDH的发光强度加以补正而得到的值。
[图18](a)构成转导了阴性对照(N.C.)或PDPK1 siRNA之后的体外BBB模型的血管内皮细胞内中的紧密连接蛋白(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、及ZO-1)、N-钙粘蛋白(红色)及肌动蛋白丝(绿色)的共荧光免疫染色的照片。比例尺表示20μm。(b)使用从构成转导了阴性对照(N.C.)或PDPK1 siRNA之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白、肌动蛋白、及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。(c)示出了相对于体外BBB模型的血管内皮细胞内转导PDPK1 siRNA之后的24小时后的TEER测定结果的坐标图。纵轴表示TEER的测定值(Ω·cm2)，横轴表示转导的microRNA，自左侧起表示阴性对照(N.C.)、PDPK1 siRNA。误差棒表示标准偏差(S.D.)，**表示P<0.01。
[图19](a)3‘UTR报告检测的结果。是使用人(Human)和猕猴(Macaca)来源的PDPK1mRNA 3’UTR区进行的。将阴性对照(N.C.)的结果以黑色、miR-181c的结果以白色表示。数值分别是将阴性对照(N.C.)设为1时的比率。**表示P<0.01。(b)示出了人(Human)(序列编号14)及猕猴(Macaca)(序列编号15)来源的PDPK1 mRNA 3’UTR区的序列和miR-181c序列(序列编号1)及其结合区。
[图20](a)使用从构成添加了D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs及BMD2b细胞来源EVs之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对PDPK1、Cofilin(丝切蛋白)、磷酸化Cofilin(P-cofilin(P-丝切蛋白))及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。(b)使用从构成转导了阴性对照(N.C.)、miR-181c或PDPK1 siRNA之后的体外BBB模型的血管内皮细胞回收的蛋白质对PDPK1、Cofilin、磷酸化Cofilin(P-cofilin)及GAPDH(内源性对照)进行蛋白质印迹解析的照片。
[图21]示出了本发明的实施方式涉及的脑转移判定装置的构成示意图。
[图22]示出了本发明的实施方式涉及的脑转移风险判定装置的构成示意图。
[图23]示出了在执行脑转移判定装置用计算机程序时脑转移判定装置所进行的处理的流程。
[图24]示出了在执行脑转移风险判定装置用计算机程序时脑转移风险判定装置所进行的处理的流程。
[图25]本发明的装置及使用了该装置的脑转移判定方法(实线)或脑转移风险判定方法(虚线)的概念图。
具体实施方式
1.癌症患者的脑转移的诊断或风险评估方法
在实施方式之一中，本发明涉及包括对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定的脑转移的诊断方法、或发生脑转移的风险的判定方法。在实施方式之一中，本发明涉及对受试癌症患者的脑转移进行诊断(或对发生脑转移的风险进行判定)的方法，其中，该方法包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者有无脑转移(或发生脑转移的风险)的步骤，其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平的情况下，判定上述受试癌症患者发生了向脑的转移(或判定发生脑转移的风险高)。
或者，在实施方式之一中，本发明涉及提供用于诊断脑转移的信息的方法，该方法包括：对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。本发明涉及提供用于对受试癌症患者的脑转移进行诊断(或对脑转移进行风险评估)的信息的方法，其中，该方法包括：确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤、根据所确定的miR-181c水平提供用于判定上述受试癌症患者有无脑转移(或发生脑转移的风险)的信息的步骤，其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者具有脑转移(或发生脑转移的风险高)的信息。
确定miR-181c水平的步骤可通过对受试者来源的样本中的具有miR-181c(序列编号1)的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定而进行。上述多核苷酸的测定可以通过利用了杂交等核酸结合的检测的方法；利用了PCR等核酸扩增的方法；利用了报告检测等miR-181c的表达抑制功能的方法；或者对由miRNA或miRNA转录的cDNA的序列进行解码来进行。
作为利用了杂交的方法，可列举：Southern杂交、Northern杂交、斑点杂交、荧光原位杂交(FISH)、微阵列、ASO法。
例如，本发明中的“确定miR-181c水平的步骤”可以具备以下步骤：
(a)使至少1个与miR-181c(序列编号1)的碱基序列或其一部分结合的核酸构建体(探针)与受试癌症患者来源的样本接触的步骤；
(b)对上述探针与上述样本中的miR-181c的结合进行测定的步骤；以及
(c)根据所测定的该探针与miR-181c的结合确定该样本中的miR-181c水平的步骤。
上述中，所测定的“探针与miR-181c的结合”可以是这些物质的结合量、结合数或结合比例。另外，根据探针与miR-181c的结合确定该样本中的miR-181c水平的步骤例如可以通过以下方法进行。使用miR-181c的分级稀释系列作为标准样本，测定上述探针与标准样本中的miR-181c的结合，并由测定值制成标准曲线。通过将使用受试癌症患者来源的样本测定的与探针和miR-181c的结合相关的测定值套入上述标准曲线，由此可以作为受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平而计算。这样的标准曲线也可以通过在测定受试癌症患者来源的样本的同时测定标准样本来确定，还可以通过与受试癌症患者来源的样本分开地(在不同时期)测定标准样本来确定。由此，标准曲线可以是在对受试癌症患者来源的样本进行测定之前进行有关标准样本的测定，并根据该有关标准样本的测定值而预先得到的曲线。另外，也可以代替使miRNA与探针直接结合，而由患者来源的样品中的miRNA合成cDNA，并测定合成的cDNA与探针的结合。
另外，作为利用了PCR的方法，可列举ARMS(Amplification Refractory MutationSystem(扩增受阻突变系统))法、RT-PCR(Reverse transcriptase-PCR(逆转录PCR))法、Nested PCR(巢式PCR)法。
例如，本发明中的miR-181c水平的确定也可以具备以下步骤：
(a)使用至少1个与miR-181c(序列编号1)的碱基序列或其一部分结合的核酸构建体(引物)使受试癌症患者来源的样本中的具有miR-181c(序列编号1)或其一部分的核酸分子扩增的步骤:
(b)测定上述核酸分子的扩增量的步骤；以及
(c)根据所测定的该核酸的扩增量确定该样本中的miR-181c水平的步骤。
上述中，根据所测定的该核酸的扩增量确定该样本中的miR-181c水平的步骤例如可以通过以下方法进行。使用预先判明了拷贝数的核酸作为标准样本，由所得扩增量的值制作标准曲线。通过将受试癌症患者来源的样本中的与核酸的扩增有关的测定值套入该标准曲线而进行计算，可以确定受试癌症患者来源的样本中的miR-181c。这样的标准曲线也可以通过在测定受试癌症患者来源的样本的同时测定标准样本来确定，还可以通过与受试癌症患者来源的样本分开地(在不同时期)测定标准样本来确定。由此，标准曲线可以是在对受试癌症患者来源的样本进行测定之前进行有关标准样本的测定，并根据该有关标准样本的测定值而预先得到的曲线。另外，也可以代替使miRNA直接扩增，而由患者来源的样品中的miRNA合成cDNA，并使用合成的cDNA进行扩增。
作为利用miR-181c的表达抑制功能的方法，已被广为公知的有使用荧光蛋白质等(荧光素酶等)标记基因的方法。例如，设计在mRNA具有与miR-181c的种子序列(ACUUACA)结合的3’UTR序列(例如，序列编号14或序列编号15)的标记基因，并使用导入了该基因的细胞，在该基因可表达的条件下使样本共存，由此可以确定miR-181c水平。
例如，本发明中的miR-181c水平的确定也可以具备以下步骤：
(a)使导入有编码以下的(i)及(ii)的多核苷酸的细胞与受试癌症患者来源的样本接触的步骤：
(i)标记基因、
(ii)与miR-181c的种子序列(ACUUACA)结合的mRNA上的3’UTR序列；
(b)使上述多核苷酸在上述细胞中表达的步骤；以及
(c)根据表达的标记基因产物的量确定该样本中的miR-181c水平的步骤。
上述中，根据表达的标记基因产物的量确定该样本中的miR-181c水平的步骤可以如下地进行：例如，在使用了预先判明了量的标准样本的情况下，由标记基因产物的量制作标准曲线，并根据与标记基因产物的量有关的测定值和该标准曲线进行计算。
将miRNA或cDNA的序列进行解码的情况下，可以根据需要而由RNA合成cDNA，并利用定序器对所合成的cDNA的序列进行解码，由解码了的miR-181c的量确定miR-181c的水平。
上述中，由miRNA合成cDNA的情况下，可以使用cDNA合成试剂盒(RNA-Quant cDNASynthesis Kit、System Biosciences,LLC、旧金山、美国)等来进行。
本发明的诊断方法等中的“判定的步骤”及“包括提供用于判定的信息的步骤”(本段落中统称为“判定步骤”)可以利用所确定的miR-181c水平来进行。判定步骤可以通过将所确定的受试者的miR-181c水平与阴性比较对象的miR-181c水平加以比较来进行。在受试者来源的样本中的miR-181c水平比阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平高的情况下，可以判定为miR-181c水平高、存在脑转移(或发生脑转移的风险高)。另外，受试者来源的样本中的miR-181c水平不高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平(即同等或更低)的情况下，可以判定为miR-181c水平不高、不存在脑转移(或发生脑转移的风险低)。
本说明书中，所述“阴性比较对象”表示的是健康人或不具有脑转移的癌症患者(例如，1期和/或2期的癌症患者、和/或在3期和/或4期的癌症患者中不存在脑转移的癌症患者)。“阴性比较对象的miR-181c水平”可以通过按照上述方法测定这样的阴性比较对象中的miR-181c水平而得到。或者，如果已有关于针对这样的阴性比较对象测定的miR-181c水平的信息，则也可以利用这样的水平作为“阴性比较对象”的miR-181c水平。另外，还可以在对受试癌症患者来源的样本进行测定的同时对含有与“阴性比较对象”的miR-181c水平等量的miR-181c的标准比较样本进行测定。
在整个本说明书中，对于样本中的miR-181c水平是否高于成为比较对象的样本中的miR-181c水平，可以通过统计性的分析来确定。其统计学意义可以通过将2个以上样本加以比较并确定置信区间和/或p值来确定(Dowdy and Wearden、Statistics for Research、John Wiely&Sons、NewYord、1983)。本发明的置信区间可以为例如90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％。另外，本发明的p值可以为例如0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0002或0.0001。
在整个本说明书中，“诊断方法”及“风险判定方法”除了在那样地进行解释时不合理的情况以外，包括对脑转移或发生脑转移的风险的状态或变化进行监视的方法。因此，在本说明书中，“诊断”或“风险评估”的用语除了在特别地那样地进行解释时不合理的情况以外，也可以即使为对脑转移或发生脑转移的风险的状态或变化进行监视。另外，本说明书中的诊断方法及风险评估方法为进行监视的方法的情况下，该诊断或风险评估可以连续地或间断地进行。另外，本发明的诊断方法及风险判定方法可以是以体内、离体、或体外的任意方式进行的方法，但优选为以离体或体外进行。
本说明书中的“样本”可以根据使用目的而适当选择。例如，样本可以是细胞培养上清液、细胞溶解物、以活检方式采集自受试者的组织试样或采集自受试者的液体。例如，作为样本，可列举组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、粪便、血清、髓液、脑脊髓液、关节液、房水、泪液、唾液或它们的分馏物或加工物。优选样本为血液、血浆、血清、淋巴液。
脑转移的风险评估指的是由此来预测患者的状态的经过或转换期的方法，而并不是表示能够以100％的正确率预测状态的经过或转换期。发生脑转移的风险的判定是指发生某一经过或转换期的风险是否在增大，而并不表示以未发生该经过或转换期的情况为基准是容易发生的。即，发生脑转移的风险的判定结果表示下述含义：本发明的miR-181c水平上升了的患者，与未显示这样的特征的患者相比，更容易发生脑转移的经过或转换期。
在本说明书的诊断方法及风险评估方法中，所述“受试癌症患者”只要是上述的癌症患者则没有特殊限定。如上所述，对于脑转移的诊断方法的情况而言，由于脑转移主要是在癌的后期分期中产生，因此优选为IV期的癌症患者、发生向远处脏器的转移的患者、或发生癌细胞向血液中的浸润的患者。另一方面，对于脑转移的风险判定方法的情况而言，优选以尽管处于脑转移的风险高的状态但转移本身尚未发生的可能性高的I～III期的患者、未发生向远处脏器的转移的患者、或未发生癌细胞向血液中的浸润的患者为对象。另外，作为受试癌症患者，优选为乳腺癌患者。
2.癌症患者的脑转移的治疗或预防方法
根据本发明人等发现的癌转移机理，由癌细胞分泌的EVs(包含外来体)中包含的miR-181c有助于脑转移，因此在另一实施方式中，本发明涉及治疗或预防癌症患者的脑转移的方法，其中，该方法包括对上述癌症患者的miR-181c的表达或活性进行抑制。在该方法中，miR-181c的表达或活性的抑制可以通过将miR-181c的表达抑制剂或活性抑制剂向需要其的患者给药来进行。因此，在某一实施方式中，本发明涉及治疗或预防癌症患者的脑转移的方法，其中，该方法包括向上述癌症患者给药miR-181c的表达抑制剂或活性抑制剂。
或者，miR-181c的表达或活性的抑制可以通过抑制包含miR-181c的EVs的分泌而间接地实现。因此，在实施方式之一中，本发明涉及治疗或预防癌症患者的脑转移的方法，其中，该方法包括对上述癌症患者的含有miR-181c的EVs的分泌进行抑制。EVs的分泌抑制例如可以通过抑制对于EVs的分泌而言必要的蛋白质(nSMase2及RAB27B)的表达或活性来实现。因此，在另一实施方式中，本发明涉及治疗或预防癌症患者的脑转移的方法，其中，该方法包括向上述癌症患者给药外来体分泌抑制剂。作为具体的实施方式，本发明涉及治疗或预防癌症患者的脑转移的方法，其中，该方法包括向上述癌症患者给药nSMase2的表达抑制剂或活性抑制剂、和/或RAB27B的表达抑制剂或活性抑制剂。
药物组合物(脑转移的治疗药或预防药)的给药可以是局部性的也可以是全身性的。给药方法没有特殊限制，如上所述，可以非口服地或口服地给药。作为非口服的给药途径，可列举皮下、腹腔内、向血液中(静脉内、或动脉内)或脊髓液中注射或输液等，优选为向血液中给药。另外，药物组合物(治疗药或预防药)既可以一次性地给药，也可以持续地或间断地给药。例如，给药也可以进行1分钟～2周的持续给药。
药物组合物(脑转移的治疗药或预防药)的给药量只要是可获得期望的治疗效果或预防效果的给药量则没有特殊限定，可根据癌的分期、脑转移的有无、症状、性别、年龄等而适当确定。本发明的药物组合物的给药量例如可以以脑转移的治疗效果或预防效果为指标来确定。例如，作为药物组合物的有效成分的1次量，将通常0.01～20mg/kg体重左右、优选0.1～10mg/kg体重左右、进一步优选0.1～5mg/kg体重左右以1月1～10次左右、优选1月1～5次左右通过静脉注射进行给药是适宜的。对于其它非口服给药及口服给药的情况，也可以将以此为基准的量进行给药。在症状特别严重的情况下，也可以根据其症状而增量或增加给药次数。
3.使血脑屏障的透过性亢进的方法、以及使期望的活性成分通过血脑屏障而到达脑内的方法
本发明人等发现，通过降低PDPK1的表达或活性，可以提高血脑屏障的透过性。因此，在另一实施方式中，本发明涉及使血脑屏障的透过性亢进的方法，其中，该方法包括对血管内皮细胞中的PDPK1的表达或活性进行抑制。在又一实施方式中，本发明涉及使期望的活性成分通过血脑屏障而到达脑内的方法，其中，该方法包括给药上述期望的活性成分和给药PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂。
例如，本发明的使血脑屏障的透过性亢进的方法包括以下方法：使患者的血脑屏障的透过性亢进的方法，其中，该方法包括抑制该患者的脑微血管内皮细胞(BMECs)中的PDPK1的表达、或抑制活性。PDPK1的表达的抑制、或活性的抑制可以利用PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂而实现。因此，在另一实施方式中，本发明涉及使患者的血脑屏障的透过性亢进的方法，其中，该方法包括进行PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂的给药。
使期望的活性成分通过血脑屏障而到达脑内的方法包括以下方法：使期望的活性成分通过患者的血脑屏障而到达脑内的方法，其中，该方法包括抑制该患者的脑微血管内皮细胞(BMECs)中的PDPK1的表达、或抑制活性，以及向该患者给药上述期望的活性成分。在该方法中，PDPK1的表达或活性的抑制可以通过将PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂分别向需要其的患者给药来进行。例如，PDPK1的表达的抑制可以通过给药miR-181c或包含miR-181c的EVs来实现。因此，在另一实施方式中，本发明涉及使期望的活性成分通过患者的血脑屏障而到达脑内的方法，其中，该方法包括进行上述期望的活性成分和PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂的给药。或者，本发明也可以是使期望的活性成分通过患者的血脑屏障而到达脑内的方法，其中，该方法包括通过对该患者给药PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂而提高该患者的血脑屏障的透过性、以及对血脑屏障的透过性得到了提高的患者给药上述期望的活性成分而使该药物通过血脑屏障而到达脑内。这里，上述期望的活性成分与上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂可以同时进行给药，也可以分别进行(例如，在上述PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂的给药前或给药后)给药。
本发明的PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂、或者药物输送用组合物的给药可以是局部性的也可以是全身性的。给药方法没有特殊限制，如上所述，可以非口服地或口服地给药。作为非口服的给药途径，可列举皮下、腹腔内、向血液中(静脉内、或动脉内)或脊髓液中注射或输液等，优选为向血液中给药。另外，PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂、或者药物输送用组合物既可以一次性地给药，也可以持续地或间断地给药，例如，也可以进行1分钟～2周的持续给药。另外，PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂、或者药物输送用组合物可以与活性成分同时给药，也可以分别给药，优选在活性成分给药前或与活性成分同时给药。
PDPK1的表达抑制剂或活性抑制剂、或者药物输送用组合物的给药量只要是可获得期望的血脑屏障的透过性或期望的活性成分的脑内传递效果的给药量则没有特殊限定，可根据治疗或预防的目标疾病、待给药的期望的活性成分的种类、量、及给药途径、患者的症状、性别及年龄等而适当确定。给药量例如可以以药物向脑的传递量、或由此带来的治疗效果或预防效果为指标来确定。例如，作为有效成分的1次量，将通常0.01～20mg/kg体重左右、优选0.1～10mg/kg体重左右、进一步优选0.1～5mg/kg体重左右以1月1～10次左右、优选1月1～5次左右通过静脉注射进行给药是适宜的。对于其它非口服给药及口服给药的情况，也可以将以此为基准的量进行给药。在症状特别严重的情况下，也可以根据其症状而增量或增加给药次数。
4.脑转移判定装置/脑转移风险判定装置
(脑转移判定装置)
在实施方式之一中，本发明涉及基于测定miR-181c水平的脑转移判定装置。如图21所示，该实施方式涉及的脑转移判定装置1是对受试癌症患者的脑转移进行判定的装置。更具体而言，脑转移判定装置1是对存在具有脑转移的可能性的癌症患者(通常为IV期的患者)是否已经发生了脑转移进行判定的装置。脑转移判定装置1具备后述的测定部21、水平确定部31及转移判定部32。在该实施方式中，脑转移判定装置1具备：至少具备测定部21的输入装置2、至少具备水平确定部31及转移判定部32的信息处理装置3、及输出装置4。需要说明的是，输入装置2、信息处理装置3及输出装置4也可以不是相互分离的装置，这些装置2、3、4的2个以上可以成为1个装置。
输入装置2具备作为miR-181c测定机构发挥功能的测定部21，优选还具备试样进出部22。其中，试样进出部22也可以独立于输入装置2而存在。输入装置2例如具备中央处理装置(CPU)、只读存储器(ROM)、读写存储器(RAM)及硬盘驱动器(HDD)的计算机、或包含该计算机的装置。测定部21的处理主要通过由CPU读取HDD内的计算机程序来执行。需要说明的是，该计算机程序也可以不是储存在HDD、而是存储在例如RAM或ROM的程序。
测定部21是作为使用样本23对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定机构发挥功能的构成部。试样进出部22优选具备：对包含样本23和试剂24的试样25加以保持的试样保持部26、对试样25照射激发光的发光部27、以及对从被照射了激发光的试样25发射的荧光28加以检测的光检知部29。其中，在不是从外部照射激发光、而是试样25自身能够发光的情况下，试样进出部22也可以不具备发光部27，光检知部29所检测的不是荧光、而是发光。
信息处理装置3至少具备水平确定部31和转移判定部32。信息处理装置3优选为具备CPU、ROM、RAM及HDD的计算机。水平判定部31及转移判定部32的两处理主要通过由CPU读取HDD内的计算机程序来执行。需要说明的是，该计算机程序也可以不是储存在HDD、而是存储在例如RAM或ROM的程序。另外，输入装置2及信息处理装置3也可以具备共同的CPU、共同的ROM、共同的RAM或共同的HDD。此时，计算机程序可以被存储于输入装置2及信息处理装置3所共同的HDD、RAM或ROM。
水平确定部31是作为从输入装置2的测定部21接收电信号、从而确定所测定的样本23中的miR-181c水平的miR-181c水平确定机构发挥功能的构成部。转移判定部32是作为根据在水平确定部31确定的miR-181c水平来判定受试癌症患者的脑转移的转移判定机构发挥功能的构成部。转移判定部32使用由受试癌症患者得到的样本作为样本23，在该样本中的miR-181c水平与作为阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平相比更高的情况下，判定为受试癌症患者存在脑转移。基于水平确定部31的确定优选通过由CPU读取预先存储在HDD或RAM等存储器中的信息(作为一例，为标准曲线数据)并参照该信息来进行。需要说明的是，该信息也可以不是预先存储在存储器中、而是使用预先判明了浓度的对照样本(例如，分级稀释系列的样本)作为样本23在对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的同时逐步存储而得到的。基于转移判定部32的判定优选通过由CPU读取预先存储在HDD或RAM等存储器中的信息(即，阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平的信息)并参照该信息来进行。需要说明的是，该信息也可以不是预先存储在存储器中、而是使用阴性比较对象来源的样本作为样本23在对该样本中的具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的同时逐步存储而得到的。
输出装置4是输出转移判定部32的判定结果的装置，例如为输出静止图像或视频的显示器。输出装置4与输入装置2或信息处理装置3同样，可以是例如具备CPU、ROM、RAM及HDD的计算机、或包含该计算机的装置。此时，计算机程序可以被存储于输入装置2、信息处理装置3及输出装置4所共同的、输入装置2和输出装置4所共同的、或者信息处理装置3和输出装置4所共同的HDD、RAM或ROM。
输出装置4并不限定于显示器，可以是以声音输出判定结果的扬声器、打印于纸等介质而输出的打印机、或者以发光的形态输出的发光装置等具有任意输出形态的装置。
(脑转移风险判定装置)
在另一实施方式中，本发明涉及基于测定miR-181c水平的脑转移风险判定装置。如图22所示，该实施方式涉及的脑转移风险判定装置1a是对受试癌症患者中尚未发生脑转移的患者(通常为I期、II或III的患者)发生脑转移的风险进行判定的装置。脑转移风险判定装置1a具备测定部21、水平确定部31及后述的风险判定部33。在该实施方式中，脑转移风险判定装置1a与前述说明的脑转移判定装置1具有类似的构成，具备输入装置2、信息处理装置3及输出装置4。需要说明的是，脑转移风险判定装置1a与脑转移判定装置1同样地，可以是分离为输入装置2、信息处理装置3及输出装置4的形式的装置。也可以使输入装置2、信息处理装置3及输出装置4中的2个以上成为1个装置。
脑转移风险判定装置1a代替脑转移判定装置1的转移判定部32而具备风险判定部33。脑转移风险判定装置1a的其它构成与脑转移判定装置1的除转移判定部32以外的构成相同，因此省略重复说明。
风险判定部33是作为根据由水平确定部31确定的miR-181c水平判定受试癌症患者发生脑转移的风险的风险判定机构而发挥功能的构成部。风险判定部33在受试癌症患者来源的样本23中的miR-181c水平与阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平相比更高的情况下，判定为受试癌症患者发生脑转移的风险高。基于风险判定部33的判定优选通过由CPU读取预先存储在HDD或RAM等存储器中的信息(即，阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平的信息)并参照该信息来进行。需要说明的是，该信息也可以不是预先存储在存储器中、而是使用阴性比较对象来源的样本作为样本23在对该样本中的具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的同时逐步存储而得到的。
5.脑转移判定用或脑转移风险判定用计算机程序
在实施方式之一中，本发明涉及在上述的脑转移判定装置或脑转移风险判定装置中被利用的计算机程序。
(脑转移判定装置用的计算机程序)
该实施方式涉及的计算机程序是被安装于提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的装置、即上述的脑转移判定装置1中的计算机程序。该计算机程序在作为癌症患者的脑转移诊断装置的脑转移判定装置1中执行下述过程：使用受试癌症患者来源的样本23对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定过程、确定在该miR-181c测定过程中测定的样本23中的miR-181c水平的miR-181c水平确定过程、根据在该miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平判定受试癌症患者的脑转移的转移判定过程、以及输出基于该转移判定过程而得到的判定结果的判定结果输出过程。通过转移判定过程，在受试癌症患者来源的样本23中的miR-181c水平与阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平相比更高的情况下，判断为受试癌症患者存在脑转移。
上述的miR-181c测定过程利用脑转移判定装置1的测定部21来执行。miR-181c水平确定过程利用脑转移判定装置1的水平确定部31来执行。转移判定过程利用脑转移判定装置1的转移判定部32来执行。判定结果输出过程利用输出装置4来执行。上述各过程例如可通过由CPU读取存储在HDD内的计算机程序来执行。需要说明的是，该计算机程序是通过CPU的处理而被读取，由此进行miR-181c测定过程、miR-181c水平确定过程及转移判定过程的程序，也可以不进行其后的判定结果输出过程。
该计算机程序是无法单独占用空间的程序，可通过存储在信息记录介质中而实现在市场上的流通。这里，所述“信息记录介质”为例如软盘、硬盘、CD-ROM、CD-R、CD-RW、MO(磁光盘)、MD、DVD-R、DVD-RW、闪存、IC卡等。可以将这些信息记录介质与脑转移判定装置1的数据输入输出部(未图示)连接而将计算机程序安装于脑转移判定装置1内的HDD等存储器。另外，也可以从存储有该计算机程序的另一计算机通过通信线路而将该计算机程序传送至脑转移判定装置1，并安装于其内部的HDD等存储器。
图23示出了执行脑转移判定装置用的计算机程序时脑转移判定装置所进行的处理的流程。脑转移判定装置1的CPU对存储于该装置1的HDD等存储器内的脑转移判定装置用的计算机程序进行读取，并使用受试癌症患者来源的样本23对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定(步骤101：miR-181c测定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从而确定所测定的样本23中的miR-181c水平(步骤102：miR-181c水平确定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从而根据在miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平来判定受试癌症患者有无脑转移(步骤103：转移判定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从输出装置4输出存在脑转移的结果及不存在脑转移的结果(步骤104：判定结果输出过程)。
(脑转移风险判定装置用的计算机程序)
另一实施方式涉及的计算机程序是被安装于判定受试癌症患者发生脑转移的风险的装置、即上述的脑转移风险判定装置1a的计算机程序。该计算机程序在作为癌症患者的脑转移诊断装置的脑转移风险判定装置1a中执行下述过程：使用受试癌症患者来源的样本23对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定的miR-181c测定过程确定、在该miR-181c测定过程中测定的样本23中的miR-181c水平的miR-181c水平确定过程、根据在该miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平判定受试癌症患者发生脑转移的风险的风险判定过程、以及输出基于该风险判定过程的判定结果的判定结果输出过程。通过风险判定过程，在受试癌症患者来源的样本23中的miR-181c水平与阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平相比更高的情况下，判断为受试癌症患者发生脑转移的风险高。
上述的风险判定过程利用脑转移风险判定装置1a的风险判定部33来执行。miR-181c测定过程、miR-181c水平确定过程及判定结果输出过程与前述说明的脑转移判定装置用的计算机程序同样地，分别利用测定部21、水平确定部31及输出装置4来执行。上述各过程例如可通过由CPU读取存储在HDD内的计算机程序来执行。需要说明的是，该计算机程序是通过CPU的处理而被读取，由此进行miR-181c测定过程、miR-181c水平确定过程及风险判定过程的程序，也可以不进行其后的判定结果输出过程。
该计算机程序还可以存储于前述示例出的信息记录介质。可以将这些信息记录介质与脑转移风险判定装置1a的数据输入输出部(未图示)连接而将计算机程序安装于脑转移风险判定装置1a内的HDD等存储器。另外，也可以从存储有该计算机程序的另一计算机通过通信线路而将该计算机程序传送至脑转移风险判定装置1a，并安装于其内部的HDD等存储器。
图24示出了执行脑转移风险判定装置用的计算机程序时脑转移风险判定装置所进行的处理的流程。脑转移风险判定装置1a的CPU对存储于该装置1a的HDD等存储器内的脑转移风险判定装置用的计算机程序进行读取，并使用受试癌症患者来源的样本23对具有miR-181c的碱基序列或其一部分的多核苷酸进行测定(步骤201：miR-181c测定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从而确定所测定的样本23中的miR-181c水平(步骤202：miR-181c水平确定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从而确定所测定的miR-181c水平确定过程中确定的miR-181c水平来判定受试癌症患者的脑转移风险的高低(步骤203：风险判定过程)。接着，上述CPU读取上述计算机程序，从输出装置4输出脑转移风险高的结果及脑转移风险低的结果(步骤204：判定结果输出过程)。
以下，为了对本发明进行更为详细的说明而示出了实施例，但本发明并不限定于此。需要说明的是，在本申请整体中被引用的全部文献作为参考而被直接援引于本申请。
实施例
在以下实施例中记载的实验中，全部使用了动物的实验均是按照得到了独立行政法人国立癌研究中心动物实验伦理委员会的认可的协议而进行的。在以下记载的实验中，数值全部以平均值±标准偏差(S.D.)表示。在Student’s T检验或Mann-Whitney U检验中，P值低于0.05的情况下视为有统计学意义。
(细胞培养)
在本实施例记载的实验中，MDA-MB-231-luc-D3H1细胞、MDA-MB-231-luc-D3H2LN细胞、BMD2a细胞、及BMD2b细胞的培养在含有10％热灭活胎牛血清(Invitrogen)及抗菌-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中，于37℃、5％CO2环境中进行。
(实施例1)脑转移乳腺癌细胞系的建立
使用作为肿瘤形成能力及转移能力高的人乳腺癌细胞的MDA-MB-231-luc-D3H2LN细胞(以下称为“D3H2LN细胞”)(Bos、P.D.等、Nature、459:1005-1009(2009))，新制作了脑高转移细胞系(图1a)。具体而言，将包含2×105个D3H2LN细胞的细胞悬浮液100μL经心内注射向作为7周龄的雌性免疫缺陷小鼠的C.B-17/Icr-scid/scid小鼠的左心室给药。对于由脑转移引起的肿瘤形成，通过每周进行荧光素的腹腔内注射、并使用IVIS Spectrum(Caliper Life Science、Hopkinton、MA、美国)进行生物发光体内成像而进行了观察。在26～30天后，对于癌细胞向脑的转移进行了观察(图1b)。
脑转移部位通过在解剖后进行组织分析而进行了确认。将组织的一半利用4％多聚甲醛进行固定、并通过苏木精-曙红(HE)染色而进行组织分析，由此对脑组织的癌细胞集落形成进行了确认(图1c)。
回收脑转移癌细胞，为了进行培养而将组织的其余的一半磨碎后，加入至含有抗菌-抗真菌剂及10％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco)。对细胞进行短时间的离心分离之后，使其再悬浮于0.025％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)，并于37℃进行了10分钟温育。将细胞再悬浮于含有50μg/mL Zeocin(Gibco)的培养基之后，接种于10cm培养皿，直到融合为止进行约30天培养以使其增殖。
使用增殖的细胞群(脑转移衍生物1a、以下称为“BMD1a细胞”)，利用与上述相同的方法进行第2次体内选择，得到了2种脑转移衍生物细胞群2a及2b(以下分别称为“BMD2a细胞”及“BMD2b细胞”)。
将所得BMD2a细胞及BMD2b细胞与D3H2LN细胞同样地向小鼠给药后，考察了脑转移活性。其结果，将D3H2LN细胞注入左心室时，15只中仅有1只(6.7％)小鼠确认到了向脑的转移，与此相对，将BMD1a细胞注入左心室时，在60％(5只中3只)小鼠中发生了向脑的转移。由此表明，与作为母细胞的D3H2LN细胞相比，BMD2a细胞及BMD2b细胞的脑转移活性显著增加。
(实施例2)体外血脑屏障(BBB)模型的建立
(1)体外血脑屏障模型
为了简便地测定对BBB的影响，建立了体外的BBB培养系统。传统的体外血脑屏障模型使用的是单层的细胞培养体系(Zhou、W.等、J.Biol.Chem、288:10849-10859)。然而，BBB是由三种不同的细胞构成的，这些细胞相互合作而保持BBB的结构。为此，使用了作为由脑毛细血管内皮细胞、脑周细胞及星形胶质细胞的原代培养形成的BBB模型系统的BBB试剂盒(TM)(#MTB-24H、PharmaCo-Cell株式会社、长崎、日本)(图2a)。脑毛细血管内皮细胞、脑周细胞及星形胶质细胞通过Hoechst33342染色而进行了确认。其结果，如图2b所示，确认到了在所建立的体外血脑屏障模型中存在脑毛细血管内皮细胞、脑周细胞及星形胶质细胞。
(2)内皮细胞中的紧密连接蛋白等的定位的确认
已知紧密连接对BBB的透过性降低进行调节，由内皮细胞内的特定蛋白质(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白及ZO-1等)构成。另一方面，作为钙依赖性细胞间粘附糖蛋白质、且通过具有5个胞外钙粘蛋白重复而介导强力的细胞间粘附的N-钙粘蛋白，在顶端膜及基底膜实现最强的表达。紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白经由与肌动蛋白细胞骨架网络之间的紧密的结合而控制细胞的极性。因此，通过对体外BBB模型的内皮细胞中的紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、ZO-1或N-钙粘蛋白进行免疫荧光染色而确认定位，可以确认紧密连接(tightjunction)形成及粘附连接(adherens junction)。
具体而言，将从体外BBB模型采集的内皮细胞在室温下放置10分钟、利用含有3％PFA的PBS使其固定，并利用含有Mg2+及Ca2+的PBS进行洗涤之后，利用含有0.1％Triton-X100的PBS进行10分钟处理，以使细胞成为透过性。固定后，将细胞连同含有3％BSA的PBS一起进行1小时温育，以封闭抗体的非特异性结合。其后，将内皮细胞连同针对紧密连接蛋白-5(Z43.JK、Invitrogen、CA、美国)、闭合蛋白(ZMD.467、Invitrogen)、ZO-1(ZMD.437、Invitrogen)或N-钙粘蛋白(3B9、Invitrogen)的兔多克隆抗体一起于37℃进行了1小时温育。利用含有Mg2+及Ca2+的PBS进行洗涤之后，连同Alexa Fluor 594-融合抗兔IgG(Invitrogen)一起于37℃进行了1小时温育。对于肌动蛋白，利用ActinGreenTM488ReadyProbesTN Reagent(R37110、Molecular Probes)进行了染色。将经过染色的细胞利用不含有Mg2+及Ca2+的PBS进行洗涤之后，固定于VECTASHIELD MountingMedium(防荧光淬灭封片剂)(H-1200、Vector Laboratories、CA、美国)，并利用共聚焦显微镜(FluoViewFV1000、奥林巴斯、东京、日本)进行了观察。
另外，如图2c所示，紧密连接蛋白(紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、及ZO-1)及N-钙粘蛋白均结合于细胞膜表面，构成了细胞间的紧密连接及粘附连接。
(3)跨上皮细胞电阻(TEER)的测定
对于基于脑毛细血管内皮细胞的紧密连接的形成，利用跨上皮细胞电阻(TEER)(Gaillard、P.J.等、Eur.J.Pharm.Sci.、12:215-222(2001)；Wilhelm、I.等、Acta.Neurobiol.Exp.(Wars)、71:113-128(2011))进行了测定。电阻值(Ω)通过欧姆计(Millicell ERS-2、Millipore)进行了测定。跨上皮细胞电阻(TEER)可通过以下计算式、作为每单位面积的电阻而算出。R＝(A-B)×0.33cm2(式中，R表示TEER(Ω·cm2)、A表示测定的电阻值(Ω)、B表示空白的电阻值(Ω))。设为n＝12。
利用跨上皮细胞电阻(TEER)对基于脑毛细血管内皮细胞的紧密连接的形成进行测定的结果如图2d所示。跨上皮细胞电阻(TEER)超过了150，因此可以确认该系统能够用作体外BBB模型。
(4)透过性评价(Permeability assay)
NaF尽管分子量低(分子量:376.27)，但不会通过BBB(Nakagawa、S等、Neurochem.Int.54:253-263(2009))。因此，通过利用荧光单色光分光器测定NaF的浓度而测定了BBB的透过性。具体而言，透过性评价是对已经报道的方法(B.Kis et al.、Adrenomedullin regulates blood-brain barrier functions in vitro.Neuroreport12、4139-4142(2001))加以改变而进行的。向腔室的上面侧添加200μL的NaF(10μg/mL、Sigma Aldrich)，向腔室的下面侧添加900μL的DPBS-H(10mM HEPES及含有4.5mg/mL D-葡萄糖的Dulbecco’s PBS(Mg+、Ca+))。对板在37℃进行了振荡培养。30分钟后，将腔室下面侧的DPBS-H分配至黑色板内(n＝8)，利用multi detection monochrometer microplatereader(全波长多功能酶标仪)(485/535nm、SAFIRE、Tecan)进行了测定。表观透过系数(Papp)利用以下计算式算出：
Papp＝(VA×[C]A)×A-1×[C]Luminal-1×t-1
式中的缩写表示如下：
VA：腔室的反管腔侧的容积(0.9cm3)
A：膜表面面积(0.33cm2)
[C]Luminal：初始管腔内示踪剂浓度(μg/mL)
[C]A：反管腔侧示踪剂浓度(μg/mL)
t：实验时间(分钟)
利用上述方法进行透过性试验的结果，显示出了极低的NaF的透过性。
(实施例3)使用Matrigel(商标)对脑转移癌细胞的浸润能力的考察
脑转移癌细胞被认为是极具侵袭性的。因此，利用使用了Matrigel(商标)的侵袭室法，确认到了与所建立的细胞系的转移能力相关的病理学意义。对BMD2a细胞、BMD2b细胞、D3H2LN细胞及D3H1细胞进行胰蛋白酶处理，并利用PKH26(Sigma Aldrich)进行了标记化。使2×104个细胞的各癌细胞悬浮于不含血清的RPMI1640培养基中，并添加至具有Matrigel(注册商标)涂膜的腔室(24孔细胞培养插入板、BD Biosciences、NJ、美国)的上面侧。向腔室的下面侧添加了含有作为迁移因子的10％血清的RPMI1640培养基。对细胞进行24小时培养，将未通过或侵入膜孔的细胞利用棉棒除去。将膜的下表面上的细胞使用Diff-Quick Staining Set(迪夫快速染色组)(Sysmex、兵库、日本)进行染色，并进行了计数。全部试验均重复进行三次。数据是按照制造商的说明书、以通过了Matrigel(商标)基质胶及膜的细胞相对于通过了对照膜的细胞的百分比来表示的。
BMD2a细胞及BMD2b细胞与D3H2LN细胞及转移能力更低的D3H1细胞相比，显示出了高浸润能力(图3a及图3b)。但是，BMD2a细胞及BMD2b细胞的形态与D3H2LN细胞未见不同(图3c)。
(实施例4)使用BBB模型对脑转移癌细胞的浸润能力的考察
为了确认BMD2a细胞及BMD2b细胞向脑实质细胞侧的进入，对BMD2a细胞、BMD2b细胞、D3H2LN细胞及D3H1细胞进行胰蛋白酶处理，并利用PKH26(Sigma Aldrich)进行了标记化。其后，使各2×104个的癌细胞悬浮于无血清的Ham’s F-12培养基(Gibco)中，并添加至在实施例2中制作的体外BBB模型的上侧腔室而进行了培养。2天(48小时)后，将非浸润细胞利用棉棒除去，并对核利用Hoechst33342(同仁化学研究所、熊本、日本)进行了染色。其后，对通过下面侧的浸润细胞的PKH26利用荧光显微镜进行了计数(图4a)。针对全部细胞，以各重复三次的方式进行了实验。
BMD2a细胞及BMD2b细胞与D3H2LN细胞及D3H1细胞相比，显示出了高浸润能力(图4b)。由此可确认，所建立的BMD2a细胞及BMD2b细胞通过BBB并进入脑实质细胞侧的能力高。
(实施例5)EVs的制备
将D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞在含有抗菌-抗真菌剂及2mM L-谷氨酰胺的Advanced RPMI培养基(以下称为“培养基A”)中进行了3次洗涤。向洗涤后的细胞加入新鲜的培养基A并培养2天之后，回收培养基，以4℃、2000×g进行了10分钟离心分离。为了将细胞碎片完全除去，将培养上清利用0.22μm Stericup(注册商标)(Millipore、MA、美国)过滤器进行了过滤。对所得调整培养基以4℃、110000×g实施了70分钟超离心。对所得颗粒利用11mL的磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行洗涤，并使其悬浮于PBS中。
对于包含EVs的组分，使用Micro BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo Scientific、MA、美国)对蛋白质含量进行了测定。另外，通过相位差显微镜观察而对所得EVs进行了观察。进一步，对EVs的尺寸及数量利用NanoSight进行了测定。
另外，利用蛋白质印迹法对作为标准的外来体的标记物的CD63及CD9的表达、以及已知在EVs中会发生缺失的线粒体跨膜蛋白细胞色素C的表达进行了测定。使用M-PER(Thermo Scientific、MA.美国)将由各细胞得到的样品以500ng/泳道(CD63及CD9)或3μg/泳道(细胞色素C)加载于Mini-PROTEAN(注册商标)TGX Gel(4-12％)(Bio-Rad)而将蛋白质分离之后，使其电泳转移至PVDF膜(Millipore)。所得膜在Blocking One(Nacalai Tesque、京都、日本)中进行封闭之后，与抗CD63抗体(纯化小鼠抗人CD63抗体、H5C6、1/200、BD)、抗CD9抗体(ALB6、sc-59140、1/200、BD)或抗细胞色素C抗体(纯化小鼠抗细胞色素C、7H8.2C12、1/200、BD)即第一抗体共同在室温下进行了1小时温育。将作为第二抗体的HRP-结合抗小鼠IgG抗体(NA931、GE Healthcare)或HRP结合抗兔IgG抗体(NA934、GEHealthcare)以1/2000倍稀释后使用。其后，利用ImmunoStar(注册商标)LD(Wako、大阪、日本)使膜发光。
关于蛋白质含量，D3H1细胞来源EVs、D3H2LN细胞来源EVs、BMD2a细胞来源EVs、BMD2b细胞来源EVs的蛋白质浓度不存在差异。相位差显微镜观察的结果的照片及EV的尺寸分析的结果如图5a所示。D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs的平均粒径分别为149nm、157nm、136nm及148nm。在任一EVs中，均发现了作为标准的外来体的标记物的CD63及CD9的表达，但未发现细胞色素C的表达(图5b)。进一步，关于EVs的释放数，在细胞间未观察到差异(图5c)。
(实施例6)EVs的分泌与癌细胞的浸润能力之间的关联的考察
为了考察在脑转移细胞的侵袭中EVs的参与，使用在作为参与EV的分泌的蛋白质的针对nSMase2及RAB27B的siRNA(Kosaka、N.等、J.Biol.Chem.、288:10849-10859(2013)；Ostrowski、M et al.、Nat.Cell Biol.、12:19-30(2010))中抑制EV的分泌的BMD2a细胞进行了基于体外BBB模型的浸润能力评价。
(1)siRNA转染
使用DharmaFECT转染试剂(Thermo Scientific)、按照制造商的规程将RAB27BsiRNA及nSMase2siRNA中的任意一者或两者的siRNA、或对照siRNA的各25nM导入PKH26标记化BMD2a细胞。将转化24小时后的细胞用于测定。
(2)基于siRNA导入细胞中的nSMase2及RAB27B的mRNA水平的表达确认
使用QIAzol试剂及miRNeasy Mini Kit(均由Quiagen提供)从细胞中提取出全部RNA。作为内标，使用RNU6按照描述的方法进行(Kosaka、N.et al.Net.Med.、18:883-891(2012))。各mRNA及RNU6的表达水平通过在96孔板内、使用Platinum Quantitative PCRSuperMix(Applied Biosystems)、利用7300Real-Time PCR System(全部由AppliedBiosystems、CA、美国提供)进行qRT-PCR而测定。全部反应均重复进行了三次。引物及探针为如下所述地定义的PAB27B(测定ID:Hs01072206_m1)、nSMase2(测试ID:Hs00920354_m1)。
(3)基于siRNA导入细胞中的nSMase2的蛋白质水平的表达确认
基于siRNA导入细胞中的nSMase2的蛋白质水平的表达利用蛋白质印迹法进行了确认。使用M-PER(Thermo Scientific、MA.美国)将由各细胞得到的样品加载于Mini-PROTEAN(注册商标)TGX Gel(4-12％)(Bio-Rad)而将蛋白质分离之后，使其电泳转移至PVDF膜(Millipore)。所得膜在Blocking One(Nacalai Tesque、京都、日本)中进行封闭之后，与抗nSMase2抗体(H-195、sc-67305、1/200、Santa Cruz Biotechnology Inc.)即第一抗体共同在室温下进行了1小时温育。将作为第二抗体的HRP-结合抗小鼠IgG抗体(NA931、GE Healthcare)或HRP结合抗兔IgG抗体(NA934、GE Healthcare)以1/2000倍稀释后使用。其后，利用ImmunoStar(注册商标)LD(Wako、大阪、日本)使膜发光。
(4)基于siRNA导入细胞的EVs释放数测定
使用NanoSight对基于siRNA导入细胞的EVs释放数进行了测定。
(5)使用BBB模型对脑转移癌细胞的浸润能力的考察
分别利用实施例3及实施例4中记载的方法对所制作的转化细胞的基质胶侵袭能力及BBB通过进行了考察。
(6)结果
在导入了nSMase2siRNA及RAB27B siRNA中的任一者的细胞、以及导入了这些siRNA的两者的细胞中，与对照siRNA导入细胞相比，nSMase2及RAB27B的表达量在mRNA水平及蛋白质水平均发生了降低(未图示)。对基于siRNA导入细胞的EVs释放数进行测定的结果，在导入了nSMase2 siRNA及RAB27B siRNA中的任一者的细胞、以及导入了这些siRNA的两者的细胞中，与对照siRNA导入细胞相比，EVs的释放数减少(图6a)。BBB通过能力试验的结果、利用对照siRNA进行了处理的细胞通过BBB后移动至下面侧，而就EVs的产生受到抑制的细胞而言，未能在下面侧确认到(图6c)。另一方面，在使用了基质胶的侵袭能力测定中，EVs的分泌抑制未对细胞的浸润能力造成影响(图6b)。由此表明，外渗不仅仅依赖于细胞的浸润能力。
(实施例7)EVs与癌细胞的BBB浸润能力之间的关联的考察
为了进一步对EVs是否参与癌细胞向脑实质细胞侧的外渗进行考察，针对转移能力低的D3H1细胞是否会通过添加BMD2a、BMD2b或D3H2LN细胞来源的EVs而通过BBB并发生外渗进行了考察。
将BMD2a、BMD2b或D3H2LN细胞来源的EVs添加至各孔之后进行了24小时培养。其后，加入PKH26标记化D3H1细胞。2天后，对通过了过滤器的细胞数进行了计数。
结果如图7所示。D3H1细胞在未添加EVs的状态下未能通过BBB，但通过添加BMD2a及BMD2b来源的EVs，向下面侧通过了BBB的细胞数显著增加。与BMD2a及BMD2b来源的EVs相比，D3H2LN细胞来源的EVs添加组未能有效地促进转移能力低的D3H1细胞在BBB中的通过。这些结果表明，脑转移乳腺癌细胞来源的EVs会对癌细胞超越BBB并外渗至脑实质侧带来影响。
(实施例8)Evs对BBB的透过性带来的影响的考察
为了确定脑转移癌细胞来源的EVs是否会对BBB的破坏带来直接影响，向体外BBB模型中添加EVs并对是否导致了BBB破坏进行了考察。EVs按照实施例5的记载进行了制备。在将体外BBB模型解冻4天后，添加D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的经过了纯化的EV或PBS(阴性对照)。在EVs添加前以及添加24小时后，按照实施例2中记载的方法测定跨上皮细胞电阻(TEER)，测定了脑毛细血管内皮细胞的紧密连接的强度。全部测定重复进行了三次。
进一步，按照实施例2(2)中记载的方法进行了使用NaF的透过性试验，从而测定了BBB的透过性。在添加D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的经过了纯化的EV的24小时后，添加了NaF。对通过了BBB的NaF利用荧光光度计进行了测定。按照实施例2(2)中记载的计算式计算出了表观透过系数(Papp)(10-6cms-1)。全部测定重复进行了三次。
所测定的TEER的值如图8a所示，TEER的添加EVs前后的相对变化如图8b所示。BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs给药组与D3H2LN细胞来源的EVs给药组(P<0.05)、及D3H1细胞来源的EVs给药组(P<0.01)相比，TEER实现了有意义的降低。
透过性试验的结果如图8c所示。BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs给药组均显示出了与D3H2LN细胞来源的EVs给药组(P<0.05)及D3H1细胞来源的EVs给药组(P<0.01)相比明显高(P<0.01)的透过系数(Papp)。
(实施例9)EV向BBB构成细胞的导入的解析
为了确定EVs是否被导入了BBB构成细胞，向体外BBB模型中添加EVs，并对BBB构成细胞中的导入进行了考察。全部测定重复进行了三次。
(1)基于PKH67的EV的标记化
使用PKH67绿色荧光标记试剂盒(Sigma Aldrich、MO、美国)对利用实施例4的方法制备的D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的经过了纯化的EVs进行了标记化。使EV与2μM的PKH67进行5分钟反应，并使用100kDa过滤器(Microcon YM-100、Millipore)进行5次洗涤，从而将多余的染料除去。
(2)体外BBB模型中的EVs向细胞内的导入
按照实施例8中记载的方法，将标记化的EVs或PBS(阴性对照)添加至体外BBB模型的上面侧，在37℃、5％CO2环境中进行了24小时培养。脑毛细血管内皮细胞、脑周细胞及星形胶质细胞通过Hoechst33342染色进行了确认。
(3)结果
对EVs向BBB构成细胞的导入进行测定的结果如图9a及图9b所示。全部的癌细胞来源的EVs被导入了内皮细胞，但基本未发现向周细胞及星形胶质细胞的导入。在BMD来源的EVs中，内皮细胞内的荧光强度最强，由此可以明确BMD细胞来源的EVs相对于脑血管内皮细胞的指向性。
(实施例10)基于EVs的BBB破坏机理的解析
为了考察基于EVs的BBB破坏机理，向体外BBB模型中添加EVs，并对BBB构成细胞内的分子行为的变化进行了考察。全部测定重复进行了三次。
(1)添加EVs后的内皮细胞中的紧密连接蛋白等的定位
添加了按照实施例4的方法制备的D3H1细胞、D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的经过了纯化的EVs或PBS(阴性对照)并经过24小时后，针对在将体外BBB模型的内皮细胞中的紧密连接蛋白-5、闭合蛋白、ZO-1或N-钙粘蛋白连同肌动蛋白丝一起进行免疫荧光染色后定位是否发生了变化，采用与实施例2(2)相同的方法进行了考察。
(2)添加EVs后的内皮细胞中的紧密连接蛋白等的水平的变化
来自各细胞的蛋白质的分离是通过使用M-PER(Thermo Scientific、MA.美国)、利用Mini-PROTEAN(注册商标)TGX Gel(4-12％)(Bio-Rad)进行分离、并使其电泳转移至PVDF膜(Millipore)而进行的。所得膜在Blocking One(Nacalai Tesque、京都、日本)中进行封闭之后，与抗紧密连接蛋白-5抗体(Z43.JK、1/200、Invitrogen)、抗闭合蛋白抗体(ZMD.481、1/200、Invitrogen)、抗ZO-1抗体(H-300、sc-10804、1/100、Santa CruzBiotechnology)、抗N-钙粘蛋白抗体(3B9、1/500、Invitrogen)、或抗GAPDH抗体(6C5、1/1000、Millipore)即第一抗体共同在室温下进行了1小时温育。将作为第二抗体的HRP-结合抗小鼠IgG抗体(NA931、GE Healthcare)或HRP结合抗兔IgG抗体(NA934、GE Healthcare)以1/2000倍稀释后使用。其后，利用ImmunoStar(注册商标)LD(Wako、大阪、日本)使膜发光。
(3)结果
对体外BBB模型的内皮细胞中的紧密连接蛋白的定位进行确认的结果如图10a及图10b所示。紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白定位在了利用PBS或D3H2LN细胞来源的EVs进行了处理的内皮细胞的细胞膜表面上。然而，在利用BMD2a及BMD2b来源的EVs进行了处理的细胞中，紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白存在于细胞质内。另外，经脑血管内皮细胞的BMD2a及BMD2b来源的EVs进行的处理并未影响紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白的表达(图10c)。由此可以明确，癌来源的EVs不会对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白丝的表达造成影响，而是使定位发生变化。
(实施例11)体内的EVs对血脑屏障透过性的影响的考察
体外BBB模型试验的结果表明，癌细胞来源的EVs被导入内皮细胞而提高了BBB的透过性，因此，为了考察是否在体内也会对血脑屏造成影响，进行了体内透过性试验。利用XenoLight DiR荧光染色对D3H2LN细胞(对照)及BMD2a细胞来源的经过了纯化的EVs进行了标记化。将经过了标记化的EVs注入小鼠的尾静脉并经过6小时后，为了观察血脑屏障的崩溃，将作为体内血管透过性试验用色素的Tracer-653注入小鼠。
图11的上图示出了EVs的导入、下图示出了脑血管的透过性。如图11的上图所示，与D3H2LN来源的EVs相比，BMD2a来源的EVs更多地集中于小鼠的脑。另外，如图11的下图所示，与经D3H2LN来源的EVs处理过的小鼠相比，经BMD2a来源的EVs处理后的小鼠的脑血管的透过性增大。
(实施例12)体内的EVs对癌转移的影响
为了对上述实施例中确认到的由EVs引起的体内的脑血管透过性的增大是否会实际地影响到脑转移进行考察，对经EVs处理后的小鼠注入癌细胞后对脑转移的有无进行了考察。将D3H2LN细胞(对照)或BMD2a细胞来源的经过了纯化的EVs(各5μg/只)、或PBS(阴性对照)注入各组9只的C.B-17/Icr-scid/scid小鼠的尾静脉(第0天)。24小时后(第1天)，将D3H2LN乳腺癌细胞系(2×105细胞)注入各小鼠的左心室。在18天后(第19天)进行荧光素的腹腔内注射，并使用IVIS Spectrum(Caliper Life Science、Hopkinton、MA、美国)进行生物发光体内成像，由此对癌细胞的脑转移进行了观察。对于所得图像，通过测定脑内的光子强度而进行了评价。显著差异的评价通过Mann-Whitney的单侧检验而进行了确定。另外，通过苏木精及曙红(HE)染色以及对波形蛋白的免疫荧光染色而确认了脑转移。
在BMD2a来源EVs给药组中，9只中5只(55.6％)确认到了脑转移，确认到了明显多于D3H2LN细胞来源的EVs给药组(9只中1只发生了脑转移:11.1％)及PBS给药组(9只中0只发生了脑转移:0％)的脑转移。另外，对荧光强度进行测定的结果，在BMD2a来源的EVs给药组中，浸润/转移至脑内的癌细胞与其它组相比明显较多(图12a、b、p<0.05)。另外，通过HE染色而确认了脑转移(图12c)。如这些结果所示，可以明确，由EVs引起的脑血管透过性的增大导致脑转移增加。
(实施例13)由EVs引起的血脑屏障透过性变化的负责分子的解明
为了弄清由EVs引起的血脑屏障透过性变化的分子机理，针对D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs中包含的miRNA进行了分析。
使用QIAzol试剂及miRNeasy Mini Kit(均由Quiagen提供)从EVs提取出全部RNA。对于RNA的质量和数量，使用NanoDrop ND-1000spectrophotometer(Thermo FisherScientific Inc.)及Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies)、按照推荐的方法进行了确定。对于得到的全部RNA，使用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(AgilentTechnologies)、按照制造商的说明书、利用cyanine 3(Cy3)进行了标记化。即，通过对100ng的全部RNA使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)Master Mix于37℃进行30分钟反应而进行了去磷酸化。对去磷酸化RNA通过使用DMSO于100℃进行5分钟温育而使其变性，其后立即转移至冰上进行了2分钟温育。其后，将所得反应物与Ligation mastermix for T4 RNA Ligase及Cy3-pCp(Cyanine 3-Cytidine重磷酸盐)混合，并于16℃进行了2小时温育。对于经过了标记化的RNA，使用减压浓缩装置、于55℃进行了1.5小时干燥。使Cy3-pCp-标记化RNA在Agilent SurePrint G3Human miRNA 8×60K Rel.19微阵列(设计ID:046064)上、于55℃进行了20小时杂交。该微阵列上，除了对照以外，共搭载有2006种的miRNA探针。洗涤后，利用Agilent DNA微阵列扫描仪对微阵列进行了扫描。扫描得到的各特性的强度值利用进行背景扣除的Agilent Feature Extraction软件版本10.7.3.1进行了定量。仅采用显示为无错误(no error)的特征(Detected flags)、使用AgilentGeneSpring GX版本12.6.1进行了表达分析。非阳性(not positive)特征、不显著(notsignificant)特征、不均一(not uniform)特征、未超出背景(not above background)特征、达到饱和(saturated)特征及异常值(population outliers)除外(Not Detectedflags)。需要说明的是，在本实验中，基因表达的显著(significant)差异的鉴定采用在信号强度上发生2倍以上的变化而进行。
除了miRNA以外，对于D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs中包含的蛋白质也进行了分析，但在BMD2a细胞及BMD2b细胞中未发现特征性的候选蛋白质(未图示)。另一方面，miRNA分析的结果，与D3H2LN细胞来源的EVs相比，在BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs中发现了明显更高的miR-181c的表达(图13a、图13b)。基于此，为了确认在D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞内是否也有miR-181c的表达，对细胞内的miR-181c进行了检测。其结果，在D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞的任一细胞中均未在细胞内确认到miR-181c的显著的表达量的差异(未图示)。
(实施例14)miR-181c对BBB带来的影响的评价
以上结果表明，被导入内皮细胞的EVs中包含的miR-181c参与了由癌细胞来源的EVs引起的BBB破坏。基于此，为了考察miR-181c对BBB的影响，对添加EVs后内皮细胞中的miR-181c的存在量进行了确认。另外，使用包含导入了miR-181c的内皮细胞的体外BBB模型对透过性及紧密连接蛋白的行为的变化进行了考察。
(1)由添加EVs引起的内皮细胞中miR-181c存在量的变化
为了评价miR-181c对BBB带来的影响，将从BMD2a及BMD2b分离出的EVs添加至内皮细胞，并对miR-181c的存在量的变化进行了确认。EVs按照实施例5的记载进行了制备。在将体外BBB模型解冻4天后，添加D3H2LN细胞、BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的经过了纯化的EV或PBS(阴性对照)。在添加EVs的24小时后，对内皮细胞中的miR-181c表达进行了测定。全部测定重复进行了三次。
(2)内皮细胞中的miR-181c存在量变化的影响
进一步，为了考察miR-181c的存在量的变化对内皮细胞带来的影响，在构成体外BBB模型的内皮细胞中导入了合成miR-181c。按照实施例2(3)中记载的方法对跨上皮细胞电阻(TEER)进行了测定。另外，按照实施例10中记载的方法对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白的定位及表达水平进行了检测。作为阴性对照，使用了未导入miR-181c的内皮细胞。
(3)结果
由于BMD2a及BMD2b来源的EVs的添加，内皮细胞中miR-181c的存在量显著增加(图14a)。而由于miR-181c的转导，使体外BBB模型的TEER的值显著降低(图14b)。就紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白而言，在阴性对照组中定位在了膜上，与此相对，在转导了miR-181c的细胞中，定位在细胞质内发生变化(图14c)。此外还判明，miR-181c向脑血管内皮细胞的转导不会对紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白的表达量带来影响(图14d)。
(实施例15)脑转移乳腺癌患者的血清中的miR-181c的测定
为了实际地确认miR-181c是否存在于脑转移乳腺癌患者的血液中EVs，从脑转移乳腺癌患者的血清中纯化EVs，并对miR-181c的表达进行了确认。在国立癌研究中心采集了来自56个乳腺癌患者(脑转移患者10人、非脑转移患者46人)的血清(No.2013-111)。对于全部患者，取得了知情同意书。分配血清，并尽可能避开冷冻解冻，直至使用为止于-80℃保存。使用Total Exosome Isolation(来自血清)(Invitrogen)，从血清中分离出EVs。其后，从使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)得到的EVs分离出全部RNA。对于miRNA的表达，采用已经报道的方法、使用RNU6作为内标、通过qRT-PCT而进行了测定(Kosaka、N.et al.Net.Med.、18:883-891(2012))。即，miR-181c及RNU6的表达水平通过在96孔板内、使用TaqMan(注册商标)MicroRNA Assays、及TaqMan(注册商标)Universal PCR Master Mix、利用7300 Real-Time PCR System(全部由Applied Biosystems、CA、美国提供)进行qRT-PCR而测定。全部反应均重复进行了三次。
与非脑转移患者相比，在脑转移患者中，由血清得到的EVs中存在着显著多的miR-181c(P<0.05、T检验)(图15)。对于血清中的miR-181c存在量而言，未观察到由非脑转移乳腺癌患者的分期不同引起的差异(图16)。另外，在同样是4期的患者之间进行的比较中，在有无脑转移方面存在显著差异(P<0.05)，在发生了脑转移的患者中，血清来源的EVs中的miR-181c水平明显增高。由此表明，miR-181c向血液中的分泌对于实际的患者而言也有利于脑转移。
以上结果表明，脑转移癌细胞来源的EVs通过将miR-181c导入内皮细胞内而诱导紧密连接蛋白的异常定位，并由此而破坏了细胞间的接触。
(实施例16)内皮细胞内的miR-181c的靶标的探讨
为了弄清基于miR-181c的BBB崩溃机理，对内皮细胞内的miR-181c的靶标进行了探讨。对转导了阴性对照或miR-181c的内皮细胞内的基因表达、以及添加了BMD2a、BMD2b或D3H2LN细胞来源的EVs后的内皮细胞内的基因表达进行了分析。
使用QIAzol试剂及miRNeasy Mini Kit(均由Quiagen提供)从各内皮细胞提取出全部RNA。对于RNA的质量和数量，使用NanoDrop ND-1000spectrophotometer(ThermoFisher Scientific Inc.)及Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies)、按照推荐的方法进行了确定。对于得到的全部RNA，使用Low Input Quick Amp Labeling Kit、one-color(Agilent Technologies)、按照制造商的说明书，在使其扩增的同时利用cyanine 3(Cy3)进行了标记化。即，使用多聚dT-T7启动子引物，将100ng的全部RNA逆转录为双链的互补DNA(cDNA)。对于引物、模板RNA、及已知浓度及品质的品质管理转录产物，首先于65℃进行10分钟变性，其后，与5×第一链缓冲液、0.1M二硫苏糖醇、10mM三磷酸脱氧核苷酸、及AffinityScript RNase Block Mix共同于40℃进行了2小时温育。对AffinityScript酶于70℃进行了15分钟温育。以cDNA产物为模板，通过体外转录而产生了荧光互补RNA(cRNA)。使cDNA产物在T7RNA聚合酶及Cy3-标记化CTP(cytidine 5’-三磷酸盐)的存在下与transcription master mix(逆转录混合液)混合，并于40℃进行了2小时温育。将经过了标记化的cRNA使用RNeasy Mini Spin Columns(Qiagen)进行纯化，并使其在30mL的无核酸酶的水中溶出。扩增及标记化后，对于cRNA的量及cyanine的导入使用NanoDrop ND-1000spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific Inc.)及Agilent Bioanalyzer(AgilentTechnologies)进行了确定。在各杂交中，将0.6μg的Cy3-标记化cRNA进行片段化，并于65℃在Agilent Cynomolgus macaque Gene Expression Profiling Array(设计ID:028520)上杂交17小时。在该阵列中，除了对照以外，共搭载有12243种探针。对微阵列进行洗涤之后，利用Agilent DNA微阵列扫描仪进行了扫描。扫描得到的各特性的强度值利用进行背景扣除的Agilent Feature Extraction软件版本10.7.3.1进行了定量。仅采用显示为无错误(no error)的特征(Detected flags)、使用Agilent GeneSpring GX版本12.6.1进行了归一化(每个芯片：对第三个四分位数位移的归一化；每个基因：对全部样品的中央位置的归一化)。非阳性(not positive)特征、不显著(not significant)特征、不均一(notuniform)特征、未超出背景(not above background)特征、达到饱和(saturated)特征及异常值(population outliers)除外(Compromised及Not Detected flags)。对于发生了变化的转录产物，使用比较法进行了定量化。需要说明的是，在本实验中，基因表达的显著(significant)差异的鉴定采用在信号强度上发生2倍以上的变化而进行。
与阴性对照相比，在转导了miR-181c的脑血管内皮细胞内，3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDPK1)的表达得到抑制的事实在mRNA水平及蛋白质水平的任一者中均得到了确认(图17a～c)。进一步，在利用BMD2a细胞及BMD2b细胞来源的EVs进行了处理的内皮细胞中，与对照(利用D3H2LN细胞来源的EVs进行了处理的内皮细胞)相比PDPK1的表达得到了抑制的事实也在mRNA水平及蛋白质水平的任一者中均得到了确认(图17d～f)。这些结果表明，miR-181c会抑制脑血管内皮细胞中的PDPK1的表达。
(实施例17)PDPK1对紧密连接蛋白等的定位的影响
为了考察PDPK1对脑血管内皮细胞内造成的影响，对经PDPK1 siRNA处理后的跨上皮细胞电阻(TEER)及紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白、及肌动蛋白丝的定位及表达量进行了考察。
使用DharmaFECT转染试剂(Thermo Scientific)、按照制造商的规程将PDPK1siRNA(Ambion、ID:S10275)或对照siRNA的各25nM导入脑血管内皮细胞。使用24小时后的转化细胞对体外BBB模型中的跨上皮细胞电阻(TEER)按照实施例2(3)中记载的方法进行了测定。另外，按照实施例10中记载的方法对24小时后的转化细胞中的紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白丝的定位及表达量进行了测定。
通过导入PDPK1 siRNA，PDPK1蛋白质的表达量下降(参见图20b)。在利用对照siRNA进行了处理的细胞中，紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白定位于细胞膜，与此相对，在PDPK1siRNA处理细胞中，向细胞膜的定位消失(图18a)。紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白存在于细胞质内，这与在BMD2a细胞或BMD2b细胞来源的EVs给药细胞、或miR-181c转导细胞中观察到的结果一致。在PDPK1 siRNA处理内皮细胞内，观察到了肌动蛋白的凝聚，而该现象也与BMD2a细胞或BMD2b细胞来源的EVs给药细胞、或miR-181c转导细胞的结果一致(图10a、图10b、图14c及图18a)。另外，无论有无对PDPK1 siRNA的处理，紧密连接蛋白、N-钙粘蛋白及肌动蛋白的蛋白质表达量均未发生变化(图18b)。另外，跨上皮细胞电阻(TEER)因导入PDPK1 siRNA而发生了下降(图18c)。这些结果表明，PDPK1的抑制会使紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白的定位发生改变、从而提高BBB的透过性。
以上结果表明，脑转移癌细胞分泌的EVs在被导入内皮细胞之后，被封入EVs的miR-181c会抑制内皮细胞中的PDPK1的表达，并由此导致紧密连接蛋白及N-钙粘蛋白的定位发生改变、从而提高BBB的透过性。
(实施例18)基于miR-181c的PDPK1表达抑制的确认
进一步，对于在内皮细胞内miR-181c能否直接抑制PDPK1的表达，通过使用PDPK1基因的非翻译区(3’UTR)(Macaca:序列编号14；Human:序列编号15)的3’UTR荧光素酶报告检测进行了确认。
PDPK1的3’UTR是以从猕猴的脑血管内皮细胞中提取的全部RNA为模板进行PCR扩增而得到的。用于3’UTR扩增的PCR引物如下所述：
Forward:AACTCGAGAATGCTGGCTATTGTTGGCCTC(序列编号16)
Reverse:AAGCGGCCGCAAGATTAAATCACTGACCCAATAG(序列编号17)
将PCR产物克隆并引入至pGEM-T Easy Vector(Promega、WI、美国)。将经过了扩增的3’UTR克隆至psiCHECK-2TM(Promega)的海肾荧光素酶编码区的下游。另外，通过比对分析而在PDPK1的3’UTR中确认到了与miR-181c互补的序列(图19b)。
将HEK293细胞以5×104细胞/孔接种于96孔板并培养过夜。使用DharmaFECT Duotransfection reagent(Thermo Scientific)同时转导了100ng的报告基因质粒和100nM的pre-miRNA-181c。
自转导24小时后回收细胞，并使用EnVision(PerkinElmer、MA、美国)测定了荧光素酶活性。为了考察内源性miRNA的影响，作为阴性对照而同时转导了合成miRNA前体(pre-miR)(Ambion(注册商标)、Invitrogen)。全部实验重复进行了三次。
使用HEK293细胞的结果，因miR-181c而导致作为报告基因的荧光素酶的表达量发生了降低(图19a)。这些结果表明，PDPK1是miR-181c的直接的靶标。
(实施例19)对于丝切蛋白磷酸化的影响
已知PDPK1是位于控制丝切蛋白(cofilin)的磷酸化的路径上游的蛋白质之一(Lyle、A.N、et al.、Physiology(Bethesda)、21:269-280(2006)；Higuchi、M.、et al.、Nat.Cell Biol.、10:1356-1364(2008))。另外，丝切蛋白是肌动蛋白结合蛋白质家族的一员，其通过去磷酸化而活化从而分解肌动蛋白丝。由于在PDPK1 siRNA处理内皮细胞内观察到了肌动蛋白的凝聚，因而针对丝切蛋白是否参与由miR-181c引起的BBB破坏而进行了考察。
利用D3H2LN细胞、BMD2a细胞或BMD2b细胞来源的EVs对脑血管内皮细胞进行了处理。另外，向脑血管内皮细胞中导入了miR-181c。进一步，按照实施例17中记载的方法对脑血管内皮细胞利用PDPK1 siRNA进行了处理。对于各细胞中的磷酸化丝切蛋白的表达，利用蛋白质印迹分析进行了分析。
使用M-PER(Thermo Scientific、MA.美国)将由各细胞得到的样品加载于Mini-PROTEAN(注册商标)TGX Gel(4-12％)(Bio-Rad)而将蛋白质分离之后，使其电泳转移至PVDF膜(Millipore)。所得膜在Blocking One(Nacalai Tesque、京都、日本)中进行封闭之后，与抗PDPK1抗体(#3062、1/500、Cell Signaling)、抗丝切蛋白抗体(D3F9、#5157、1/1000、Cell Signaling)、抗磷酸化丝切蛋白抗体(Ser3)(#3311、1/500、Cell Signaling)、或抗GAPDH抗体(6C5、1/1000、Millipore)即第一抗体共同在室温下进行了1小时温育。将作为第二抗体的HRP-结合抗小鼠IgG抗体(NA931、GE Healthcare)或HRP结合抗兔IgG抗体(NA934、GE Healthcare)以1/2000倍稀释后使用。其后，利用ImmunoStar(注册商标)LD(Wako、大阪、日本)使膜发光。
与D3H2LN细胞来源的EVs给药细胞相比，在BMD2a细胞或BMD2b细胞来源的EVs给药细胞中，丝切蛋白的磷酸化发生了降低(图20a)。并且，与对照siRNA处理细胞相比，丝切蛋白的磷酸化在miR-181c或PDPK1 siRNA处理脑血管内皮细胞中发生了降低(图20b)。这些结果表明，EVs中的miR-181c在脑血管内皮细胞内会导致PDPK1的表达下降，其结果，丝切蛋白的磷酸化受到抑制，肌动蛋白的行为发生改变而凝聚，由此导致血脑屏障的透过性增大。
序列表
<110> 株式会社遗传科技（Gene Techno Science Co.,Ltd.）
独立行政法人国立癌症研究中心（National Cancer Center Research Institute）
特里奥科技株式会社（THEORIA Science Inc.）
<120> 癌的脑转移的诊断、预防及治疗方法、以及用于通过血脑屏障的药物传输系统
<130> PW15004GT
<141> 2015-02-24
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> RNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
cggaaaauuu gccaaggguu ugggggaaca uucaaccugu cggugaguuu gggcagcuca 60
ggcaaaccau cgaccguuga guggacccug aggccuggaa uugccauccu 110
<210> 2
<211> 7243
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (150)..(1820)
<400> 2
gcggcgccgg gggcgggggg cggcgggcga cggggcgggc gcaggatgag ggcggccatt 60
gctggggctc cgcttcgggg aggaggacgc tgaggaggcg ccgagccgcg cagcgctgcg 120
ggggaggcgc ccgcgccgac gcggggccc atg gcc agg acc acc agc cag ctg 173
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu
1 5
tat gac gcc gtg ccc atc cag tcc agc gtg gtg tta tgt tcc tgc cca 221
Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro
10 15 20
tcc cca tca atg gtg agg acc cag act gag tcc agc acg ccc cct ggc 269
Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly
25 30 35 40
att cct ggt ggc agc agg cag ggc ccc gcc atg gac ggc act gca gcc 317
Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala
45 50 55
gag cct cgg ccc ggc gcc ggc tcc ctg cag cat gcc cag cct ccg ccg 365
Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro
60 65 70
cag cct cgg aag aag cgg cct gag gac ttc aag ttt ggg aaa atc ctt 413
Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu
75 80 85
ggg gaa ggc tct ttt tcc acg gtt gtc ctg gct cga gaa ctg gca acc 461
Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr
90 95 100
tcc aga gaa tat gcg att aaa att ctg gag aag cga cat atc ata aaa 509
Ser Arg Glu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Glu Lys Arg His Ile Ile Lys
105 110 115 120
gag aac aag gtc ccc tat gta acc aga gag cgg gat gtc atg tcg cgc 557
Glu Asn Lys Val Pro Tyr Val Thr Arg Glu Arg Asp Val Met Ser Arg
125 130 135
ctg gat cac ccc ttc ttt gtt aag ctt tac ttc aca ttt cag gac gac 605
Leu Asp His Pro Phe Phe Val Lys Leu Tyr Phe Thr Phe Gln Asp Asp
140 145 150
gag aag ctg tat ttc ggc ctt agt tat gcc aaa aat gga gaa cta ctt 653
Glu Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Ser Tyr Ala Lys Asn Gly Glu Leu Leu
155 160 165
aaa tat att cgc aaa atc ggt tca ttc gat gag acc tgt acc cga ttt 701
Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Gly Ser Phe Asp Glu Thr Cys Thr Arg Phe
170 175 180
tac acg gct gag att gtg tct gct tta gag tac ttg cac ggc aag ggc 749
Tyr Thr Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Gly Lys Gly
185 190 195 200
atc att cac agg gac ctt aaa ccg gaa aac att ttg tta aat gaa gat 797
Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asn Glu Asp
205 210 215
atg cac atc cag atc aca gat ttt gga aca gca aaa gtc tta tcc cca 845
Met His Ile Gln Ile Thr Asp Phe Gly Thr Ala Lys Val Leu Ser Pro
220 225 230
gag agc aaa caa gcc agg gcc aac tca ttc gtg gga aca gcg cag tac 893
Glu Ser Lys Gln Ala Arg Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr
235 240 245
gtt tct cca gag ctg ctc acg gag aag tcc gcc tgt aag agt tca gac 941
Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp
250 255 260
ctt tgg gct ctt gga tgc ata ata tac cag ctt gtg gca gga ctc cca 989
Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro
265 270 275 280
cca ttc cga gct gga aac gag tat ctt ata ttt cag aag atc att aag 1037
Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys
285 290 295
ttg gaa tat gac ttt cca gaa aaa ttc ttc cct aag gca aga gac ctc 1085
Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu
300 305 310
gtg gag aaa ctt ttg gtt tta gat gcc aca aag cgg tta ggc tgt gag 1133
Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu
315 320 325
gaa atg gaa gga tac gga cct ctt aaa gca cac ccg ttc ttc gag tcc 1181
Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser
330 335 340
gtc acg tgg gag aac ctg cac cag cag acg cct ccg aag ctc acc gct 1229
Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala
345 350 355 360
tac ctg ccg gct atg tcg gaa gac gac gag gac tgc tat ggc aat tat 1277
Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr
365 370 375
gac aat ctc ctg agc cag ttt ggc tgc atg cag gtg tct tcg tcc tcc 1325
Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser
380 385 390
tcc tca cac tcc ctg tca gcc tcc gac acg ggc ctg ccc cag agg tca 1373
Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser
395 400 405
ggc agc aac ata gag cag tac att cac gat ctg gac tcg aac tcc ttt 1421
Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe
410 415 420
gaa ctg gac tta cag ttt tcc gaa gat gag aag agg ttg ttg ttg gag 1469
Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu
425 430 435 440
aag cag gct ggc gga aac cct tgg cac cag ttt gta gaa aat aat tta 1517
Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Trp His Gln Phe Val Glu Asn Asn Leu
445 450 455
ata cta aag atg ggc cca gtg gat aag cgg aag ggt tta ttt gca aga 1565
Ile Leu Lys Met Gly Pro Val Asp Lys Arg Lys Gly Leu Phe Ala Arg
460 465 470
cga cga cag ctg ttg ctc aca gaa gga cca cat tta tat tat gtg gat 1613
Arg Arg Gln Leu Leu Leu Thr Glu Gly Pro His Leu Tyr Tyr Val Asp
475 480 485
cct gtc aac aaa gtt ctg aaa ggt gaa att cct tgg tca caa gaa ctt 1661
Pro Val Asn Lys Val Leu Lys Gly Glu Ile Pro Trp Ser Gln Glu Leu
490 495 500
cga cca gag gcc aag aat ttt aaa act ttc ttt gtc cac acg cct aac 1709
Arg Pro Glu Ala Lys Asn Phe Lys Thr Phe Phe Val His Thr Pro Asn
505 510 515 520
agg acg tat tat ctg atg gac ccc agc ggg aac gca cac aag tgg tgc 1757
Arg Thr Tyr Tyr Leu Met Asp Pro Ser Gly Asn Ala His Lys Trp Cys
525 530 535
agg aag atc cag gag gtt tgg agg cag cga tac cag agc cac ccg gac 1805
Arg Lys Ile Gln Glu Val Trp Arg Gln Arg Tyr Gln Ser His Pro Asp
540 545 550
gcc gct gtg cag tga cgtggcctgc ggccgggctg cccttcgctg ccaggacacc 1860
Ala Ala Val Gln
555
tgccccagcg cggcttggcc gccatccggg acgcttccag accacctgcc agccatcaca 1920
aggggaacgc agaggcggaa accttgcagc atttttattt aaaagaaaag aagaaaaaaa 1980
acacccaacc acacaaagaa caaaaccagt aacaaacaca aaggaattca gggtcgcttt 2040
gcttgctctc tgtgctccgt ggaggcctcc gtgtgccctc gttgccgtgg ggacccagct 2100
ccatgcacgt caacccagtc ccgcccagac tagtggacag acctggtgtc accagttttt 2160
cctagcatca gtccgaacca tgcgcccgcc ctgccccaac tgtgtgctgg tcctgctgtg 2220
gccgagggga ccgggtgtgt ttggctcttt atgcccctcc cgctgtggtc ctggaactct 2280
tcaccaggga gggagccctg cgggggccgc agctttgtgg agggagccgc cgtgcttctg 2340
tcacctgctc cctttcttgc gtctccctgt gatgggccct taggcctggc tgggcccatt 2400
acatatccct gtggtggctc tggtggcagc tttctgtggc ccctgctgtg ttggcaggca 2460
ggtttgcgtg gtgaggagcg ggaggggttg gagtggtgcg ggagcaggct gccgagtgga 2520
gggtgccatc gagggctccg gatcccttat cctacttagc agtgttggtc tctggggctg 2580
gaagccgagc gcatgctggg agcggtactg tcagaagtga gcccagttag taccccgctg 2640
gctcactgca cgagagagtc ctgccccgag ccctaggtgg ggccaggagg tgccttggag 2700
aagccagcca gagcagagag ggctgctgac ttccgtgtgg agcagagagg cctgagggcc 2760
tcctaaaagg tttaaatgtc cacgcctctc cagttgctga agtagggtct gagagaaccc 2820
tggcatcagc agacccaggg tgcttctgtc tcctgcagac cacgccaggg agtgcagaca 2880
ccaccgtcac acacgcccct tttgtgtttt ggttcaagtt tctcagagcc cctcagagct 2940
tctacatctg tgcatcagaa atctcacagc cttctcatgc tgccggctca tctgggccca 3000
tagagtgggc tttgccagtt gctgttgcac aggaggcgag aacagcacac ttcaacccca 3060
gcttgctggt cggctttcct ctagagagag ccggttttgg ggccatttcc ctttgatgct 3120
ttggtggcct tgccccgctc tgcagcacag acaggccaga tgcatttgtc ctttgcctag 3180
ctactcccca ggtagagagt gctcctggtg gcctggcagg tctgggccct tctctccctg 3240
cccaggttgt ccctggaggg cagccctcac tccctttggg ggagaggcag acattgctgc 3300
ccacagacct gcctctgact caactgtgtc caccctccct ggtccctacc cccaagtcac 3360
aggtgactca gcagtgaccc tgtgtgccag gccagatcca aactgagagg gaaggtgtcg 3420
tttttacact gctaatgacg agagtggctc tttttagcta ggcgagtaca gacggggcct 3480
gggagggggc agagatgttc cccaggccct gcctgtggtt cctgcctggg ccttggctgc 3540
tgctgtgtga gagctgcatg tgagcctgtg accgtgagct ggggtgagct gggccgcacc 3600
taccctgggg ccccagggag caggacgctc cggggcccag cacgttgccc tgggcctgtg 3660
gccggagtcg gagtcctctc tcctcctcct ggcttttgga aaggcttggc tgtgttgggg 3720
agtctctctt agccctttca ggaatttctg ttcaggcttc ctcctcctca tcagctattt 3780
tacccatctc agaacgtcct gtgtctccat gtaggagagt ggctctctca gatctctcag 3840
ggcgtctggt tatagggaaa caagtggagc agggacgtgg ctttaattgg agcactcggc 3900
tgggctgctt ggggagactc ttccgtgcgt tcttcctctg gatagaacca ccacctcctg 3960
ggcgtcactg acaagctcca tcttaacctc caaagccaca gaactagggg ctcagagcca 4020
gagctggcag ccgccagcca aaatgatgcc attgcctgag ctgacagcca agcccttctg 4080
tgggtcacct ttctcctcac ccagcccctt gctcttccct tttgaaaggc ccgtgtgttt 4140
tctttcctta ccctgtgctt gctcatgtct actccggttt tctctaccac atccttagag 4200
ccatcacctg gcacgcaggc gccttacatt ctacggtaga acgtggggta ctgtgtgtgc 4260
acatagacac acttacgtgg aattacagtt gtgggtttat ccaagatgag gaagatttca 4320
cctgctgttt aatagacttg gggccatgtg cctccccaca catgggcaag gacaggtgga 4380
atgtcgggac cacactgtgc ggcttctcgg cacaaagcgg agggaggctg tggtcgctgc 4440
cggcctaggt gtcccaggtg ccccgccttt ctctgggaca cagttggggg ctggcttctg 4500
agggattcct ttctcccctc tttgtgtggc cccagccagg gcggtgggca gtcctggtgt 4560
agagcacaag cctctccacc ctagagaaat gcctctgtac cacggctacc atgtggaacc 4620
ttaacttgca gaaggcttgt taacaattgt tttgagagag atggctggtc atgccacagc 4680
tgctggggac tccgcctact ccagccctct tgggacacac tgtgggattt gtggcccttc 4740
cccagaggaa ttgtggagac tgtcccatgg aacaaaccct caggcaccag cacagggctc 4800
tgggtgactc agtaaaacta acgtttgtct ctgacaagat cagctgtagg ctcaccggcc 4860
agagaagacc actgtgagca ttttgccgta tatcctgccc tgccatttgt tcacttttta 4920
aactaaaata ggaacatccg acacacaccg tttgcatcgt cttctccctt gatattttaa 4980
gcattttccc atgtcatgag tttctcagaa acatgttttt aacaattgta ctatttagtc 5040
attgtccatt tactataatt tatctgacca tttccctact gtaaaatact taagacggtt 5100
tctgattttt ccactattta aataatgctg tgatgaatat ctttaaaatc ttctgatttc 5160
ttactttttt cccccttaga tgcctggaag tggtattttg aggtgaaaga gtttgttcat 5220
tttgaagata tttctgtctc tctctcgacc tgatgtgtag acgctcactt ccagtagcag 5280
aaccacctta gttgtgtctt acagattctg aacaaatcgg tttctgataa gccatgtgtt 5340
ccaaagaatg tctgaataag accgctcttt atttaaatgc taagaggatg tcactactgc 5400
aatccatctg tggccgattt tttccaagag ccaatttcct tgttttggtt gcaagaacct 5460
ggctctgcct gcatgtcagc tctctgccct ccctgctgcc gtggctttca agcgcttggc 5520
agaatcttgt acttcgtgtc cacaatggta ctgaatttgc atctgcacag tcagcagaga 5580
taacaagtgt tgaactgacc ttgccacatg cttagtgagt gatttgtaat taagtttata 5640
gactcagaag gtatattagg acatttggaa tcagtagcag agcaaagcct ctttgaaaaa 5700
aaccacgtag ctgattgggt tttacaagag tgcatttgtc tcccccttcc acccgtgggg 5760
ccccaccttc aggtcttagt ggttcacaag agcccagcag ccaggctggc tttttcattg 5820
tagggcgtgg ttgtcccagc tggtgtagat ttcaggccgc cccccccaac tccctgccca 5880
cagtgttgca gattgcctgg ctggcagcaa gtccagacca cccaaatttg gttggattct 5940
tcatttctcc actgtagttg gggtccattg attgtgcagg ggaacgtgca ggaggttttt 6000
ctaggcaccg tgttcagtgc tgcttcactc taccagagat tatggccaaa ttgcacggaa 6060
tttggtttct tgccctctga agcctgaggg cccccccttg cctggctggt tgacagaccc 6120
ggggtggtca ctgctgagac ttcagagatc gcagctgctg tgagaatacg gtgaaggtac 6180
tttgttctgg aagatgttgt catacacttt tccccagtta ttttcaaact tgacatgagc 6240
ctatgttgac tcactgggtg ggggtccctt cttacgcagc acacgtggca agtgcctgaa 6300
tcggggctgg aggcacttca gagcctctga ggggccacca cttctggccc aaaattgcag 6360
ggttgtagat gaggctgcct gtggagaact ggtgtgagga ggaagctgtt tccaacaaag 6420
agcactttca tctgttgaga tggctgtggt gagcaactga acgagcctac gtgtgtacct 6480
gaattttccc cgtaactcat ttcttccata tgaagaaaca ccaaactatg tacagagaac 6540
tttttacaaa aggcagacct tttttaagct gtgtaaccca catagcctaa ccacctggca 6600
gaatgactac gaataggggt cattgtgctg gtaaaagcct ctattacgac tgtaagtaag 6660
ttggatgttg gcaaaattaa attgttacag tatttagagc tgctgtagct gttccttcac 6720
aacataaaat aggataaatg actagtacgt ctttcaggtg ggtggcaagc agaacatgcg 6780
taatattctc tacctggtct gtagctgtaa ctgtgatgta cagacaaagc aaaaattaaa 6840
agaacttatg aaaacaaatg caatgatact aggatataca cttttgtatt tttattctta 6900
tataaggtta tttgctggct attgttggcc tctagttcag tctgtgttat ttaaattcta 6960
atatatgaat tatttgaatt gaattcatgt tcggggccac gttgttgtat gtattgatgt 7020
acagccttga atgtgaataa ttattgtaaa ctatatttta caactttttt tctggcttta 7080
ttatataaat tttctattgg gtcagtgatt taatcatata atttaatgaa tctgtttatc 7140
cttttttttt ttccaaatac ttgtgcttta ggtgtagtta ccagatgatg aattttcctc 7200
gtatggtcag tagtcttgta ataaaaagca tgtagagtgt aga 7243
<210> 3
<211> 556
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 3
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln
20 25 30
Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly
35 40 45
Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val
85 90 95
Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr Ser Arg Glu Tyr Ala Ile Lys Ile
100 105 110
Leu Glu Lys Arg His Ile Ile Lys Glu Asn Lys Val Pro Tyr Val Thr
115 120 125
Arg Glu Arg Asp Val Met Ser Arg Leu Asp His Pro Phe Phe Val Lys
130 135 140
Leu Tyr Phe Thr Phe Gln Asp Asp Glu Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Ser
145 150 155 160
Tyr Ala Lys Asn Gly Glu Leu Leu Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Gly Ser
165 170 175
Phe Asp Glu Thr Cys Thr Arg Phe Tyr Thr Ala Glu Ile Val Ser Ala
180 185 190
Leu Glu Tyr Leu His Gly Lys Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro
195 200 205
Glu Asn Ile Leu Leu Asn Glu Asp Met His Ile Gln Ile Thr Asp Phe
210 215 220
Gly Thr Ala Lys Val Leu Ser Pro Glu Ser Lys Gln Ala Arg Ala Asn
225 230 235 240
Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu
245 250 255
Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile
260 265 270
Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr
275 280 285
Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys
290 295 300
Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp
305 310 315 320
Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu
325 330 335
Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln
340 345 350
Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp
355 360 365
Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly
370 375 380
Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser
385 390 395 400
Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile
405 410 415
His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu
420 425 430
Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Trp
435 440 445
His Gln Phe Val Glu Asn Asn Leu Ile Leu Lys Met Gly Pro Val Asp
450 455 460
Lys Arg Lys Gly Leu Phe Ala Arg Arg Arg Gln Leu Leu Leu Thr Glu
465 470 475 480
Gly Pro His Leu Tyr Tyr Val Asp Pro Val Asn Lys Val Leu Lys Gly
485 490 495
Glu Ile Pro Trp Ser Gln Glu Leu Arg Pro Glu Ala Lys Asn Phe Lys
500 505 510
Thr Phe Phe Val His Thr Pro Asn Arg Thr Tyr Tyr Leu Met Asp Pro
515 520 525
Ser Gly Asn Ala His Lys Trp Cys Arg Lys Ile Gln Glu Val Trp Arg
530 535 540
Gln Arg Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Ala Val Gln
545 550 555
<210> 4
<211> 6862
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (150)..(1439)
<400> 4
gcggcgccgg gggcgggggg cggcgggcga cggggcgggc gcaggatgag ggcggccatt 60
gctggggctc cgcttcgggg aggaggacgc tgaggaggcg ccgagccgcg cagcgctgcg 120
ggggaggcgc ccgcgccgac gcggggccc atg gcc agg acc acc agc cag ctg 173
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu
1 5
tat gac gcc gtg ccc atc cag tcc agc gtg gtg tta tgt tcc tgc cca 221
Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro
10 15 20
tcc cca tca atg gtg agg acc cag act gag tcc agc acg ccc cct ggc 269
Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly
25 30 35 40
att cct ggt ggc agc agg cag ggc ccc gcc atg gac ggc act gca gcc 317
Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala
45 50 55
gag cct cgg ccc ggc gcc ggc tcc ctg cag cat gcc cag cct ccg ccg 365
Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro
60 65 70
cag cct cgg aag aag cgg cct gag gac ttc aag ttt ggg aaa atc ctt 413
Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu
75 80 85
ggg gaa ggc tct ttt tcc acg gtt gtc ctg gct cga gaa ctg gca acc 461
Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr
90 95 100
tcc aga gaa tat gcg acc agg gcc aac tca ttc gtg gga aca gcg cag 509
Ser Arg Glu Tyr Ala Thr Arg Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln
105 110 115 120
tac gtt tct cca gag ctg ctc acg gag aag tcc gcc tgt aag agt tca 557
Tyr Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser
125 130 135
gac ctt tgg gct ctt gga tgc ata ata tac cag ctt gtg gca gga ctc 605
Asp Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu
140 145 150
cca cca ttc cga gct gga aac gag tat ctt ata ttt cag aag atc att 653
Pro Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile
155 160 165
aag ttg gaa tat gac ttt cca gaa aaa ttc ttc cct aag gca aga gac 701
Lys Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp
170 175 180
ctc gtg gag aaa ctt ttg gtt tta gat gcc aca aag cgg tta ggc tgt 749
Leu Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys
185 190 195 200
gag gaa atg gaa gga tac gga cct ctt aaa gca cac ccg ttc ttc gag 797
Glu Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Glu
205 210 215
tcc gtc acg tgg gag aac ctg cac cag cag acg cct ccg aag ctc acc 845
Ser Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr
220 225 230
gct tac ctg ccg gct atg tcg gaa gac gac gag gac tgc tat ggc aat 893
Ala Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn
235 240 245
tat gac aat ctc ctg agc cag ttt ggc tgc atg cag gtg tct tcg tcc 941
Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly Cys Met Gln Val Ser Ser Ser
250 255 260
tcc tcc tca cac tcc ctg tca gcc tcc gac acg ggc ctg ccc cag agg 989
Ser Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg
265 270 275 280
tca ggc agc aac ata gag cag tac att cac gat ctg gac tcg aac tcc 1037
Ser Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile His Asp Leu Asp Ser Asn Ser
285 290 295
ttt gaa ctg gac tta cag ttt tcc gaa gat gag aag agg ttg ttg ttg 1085
Phe Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu
300 305 310
gag aag cag gct ggc gga aac cct tgg cac cag ttt gta gaa aat aat 1133
Glu Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Trp His Gln Phe Val Glu Asn Asn
315 320 325
tta ata cta aag atg ggc cca gtg gat aag cgg aag ggt tta ttt gca 1181
Leu Ile Leu Lys Met Gly Pro Val Asp Lys Arg Lys Gly Leu Phe Ala
330 335 340
aga cga cga cag ctg ttg ctc aca gaa gga cca cat tta tat tat gtg 1229
Arg Arg Arg Gln Leu Leu Leu Thr Glu Gly Pro His Leu Tyr Tyr Val
345 350 355 360
gat cct gtc aac aaa gtt ctg aaa ggt gaa att cct tgg tca caa gaa 1277
Asp Pro Val Asn Lys Val Leu Lys Gly Glu Ile Pro Trp Ser Gln Glu
365 370 375
ctt cga cca gag gcc aag aat ttt aaa act ttc ttt gtc cac acg cct 1325
Leu Arg Pro Glu Ala Lys Asn Phe Lys Thr Phe Phe Val His Thr Pro
380 385 390
aac agg acg tat tat ctg atg gac ccc agc ggg aac gca cac aag tgg 1373
Asn Arg Thr Tyr Tyr Leu Met Asp Pro Ser Gly Asn Ala His Lys Trp
395 400 405
tgc agg aag atc cag gag gtt tgg agg cag cga tac cag agc cac ccg 1421
Cys Arg Lys Ile Gln Glu Val Trp Arg Gln Arg Tyr Gln Ser His Pro
410 415 420
gac gcc gct gtg cag tga cgtggcctgc ggccgggctg cccttcgctg ccaggacacc 1479
Asp Ala Ala Val Gln
425 430
tgccccagcg cggcttggcc gccatccggg acgcttccag accacctgcc agccatcaca 1539
aggggaacgc agaggcggaa accttgcagc atttttattt aaaagaaaag aagaaaaaaa 1599
acacccaacc acacaaagaa caaaaccagt aacaaacaca aaggaattca gggtcgcttt 1659
gcttgctctc tgtgctccgt ggaggcctcc gtgtgccctc gttgccgtgg ggacccagct 1719
ccatgcacgt caacccagtc ccgcccagac tagtggacag acctggtgtc accagttttt 1779
cctagcatca gtccgaacca tgcgcccgcc ctgccccaac tgtgtgctgg tcctgctgtg 1839
gccgagggga ccgggtgtgt ttggctcttt atgcccctcc cgctgtggtc ctggaactct 1899
tcaccaggga gggagccctg cgggggccgc agctttgtgg agggagccgc cgtgcttctg 1959
tcacctgctc cctttcttgc gtctccctgt gatgggccct taggcctggc tgggcccatt 2019
acatatccct gtggtggctc tggtggcagc tttctgtggc ccctgctgtg ttggcaggca 2079
ggtttgcgtg gtgaggagcg ggaggggttg gagtggtgcg ggagcaggct gccgagtgga 2139
gggtgccatc gagggctccg gatcccttat cctacttagc agtgttggtc tctggggctg 2199
gaagccgagc gcatgctggg agcggtactg tcagaagtga gcccagttag taccccgctg 2259
gctcactgca cgagagagtc ctgccccgag ccctaggtgg ggccaggagg tgccttggag 2319
aagccagcca gagcagagag ggctgctgac ttccgtgtgg agcagagagg cctgagggcc 2379
tcctaaaagg tttaaatgtc cacgcctctc cagttgctga agtagggtct gagagaaccc 2439
tggcatcagc agacccaggg tgcttctgtc tcctgcagac cacgccaggg agtgcagaca 2499
ccaccgtcac acacgcccct tttgtgtttt ggttcaagtt tctcagagcc cctcagagct 2559
tctacatctg tgcatcagaa atctcacagc cttctcatgc tgccggctca tctgggccca 2619
tagagtgggc tttgccagtt gctgttgcac aggaggcgag aacagcacac ttcaacccca 2679
gcttgctggt cggctttcct ctagagagag ccggttttgg ggccatttcc ctttgatgct 2739
ttggtggcct tgccccgctc tgcagcacag acaggccaga tgcatttgtc ctttgcctag 2799
ctactcccca ggtagagagt gctcctggtg gcctggcagg tctgggccct tctctccctg 2859
cccaggttgt ccctggaggg cagccctcac tccctttggg ggagaggcag acattgctgc 2919
ccacagacct gcctctgact caactgtgtc caccctccct ggtccctacc cccaagtcac 2979
aggtgactca gcagtgaccc tgtgtgccag gccagatcca aactgagagg gaaggtgtcg 3039
tttttacact gctaatgacg agagtggctc tttttagcta ggcgagtaca gacggggcct 3099
gggagggggc agagatgttc cccaggccct gcctgtggtt cctgcctggg ccttggctgc 3159
tgctgtgtga gagctgcatg tgagcctgtg accgtgagct ggggtgagct gggccgcacc 3219
taccctgggg ccccagggag caggacgctc cggggcccag cacgttgccc tgggcctgtg 3279
gccggagtcg gagtcctctc tcctcctcct ggcttttgga aaggcttggc tgtgttgggg 3339
agtctctctt agccctttca ggaatttctg ttcaggcttc ctcctcctca tcagctattt 3399
tacccatctc agaacgtcct gtgtctccat gtaggagagt ggctctctca gatctctcag 3459
ggcgtctggt tatagggaaa caagtggagc agggacgtgg ctttaattgg agcactcggc 3519
tgggctgctt ggggagactc ttccgtgcgt tcttcctctg gatagaacca ccacctcctg 3579
ggcgtcactg acaagctcca tcttaacctc caaagccaca gaactagggg ctcagagcca 3639
gagctggcag ccgccagcca aaatgatgcc attgcctgag ctgacagcca agcccttctg 3699
tgggtcacct ttctcctcac ccagcccctt gctcttccct tttgaaaggc ccgtgtgttt 3759
tctttcctta ccctgtgctt gctcatgtct actccggttt tctctaccac atccttagag 3819
ccatcacctg gcacgcaggc gccttacatt ctacggtaga acgtggggta ctgtgtgtgc 3879
acatagacac acttacgtgg aattacagtt gtgggtttat ccaagatgag gaagatttca 3939
cctgctgttt aatagacttg gggccatgtg cctccccaca catgggcaag gacaggtgga 3999
atgtcgggac cacactgtgc ggcttctcgg cacaaagcgg agggaggctg tggtcgctgc 4059
cggcctaggt gtcccaggtg ccccgccttt ctctgggaca cagttggggg ctggcttctg 4119
agggattcct ttctcccctc tttgtgtggc cccagccagg gcggtgggca gtcctggtgt 4179
agagcacaag cctctccacc ctagagaaat gcctctgtac cacggctacc atgtggaacc 4239
ttaacttgca gaaggcttgt taacaattgt tttgagagag atggctggtc atgccacagc 4299
tgctggggac tccgcctact ccagccctct tgggacacac tgtgggattt gtggcccttc 4359
cccagaggaa ttgtggagac tgtcccatgg aacaaaccct caggcaccag cacagggctc 4419
tgggtgactc agtaaaacta acgtttgtct ctgacaagat cagctgtagg ctcaccggcc 4479
agagaagacc actgtgagca ttttgccgta tatcctgccc tgccatttgt tcacttttta 4539
aactaaaata ggaacatccg acacacaccg tttgcatcgt cttctccctt gatattttaa 4599
gcattttccc atgtcatgag tttctcagaa acatgttttt aacaattgta ctatttagtc 4659
attgtccatt tactataatt tatctgacca tttccctact gtaaaatact taagacggtt 4719
tctgattttt ccactattta aataatgctg tgatgaatat ctttaaaatc ttctgatttc 4779
ttactttttt cccccttaga tgcctggaag tggtattttg aggtgaaaga gtttgttcat 4839
tttgaagata tttctgtctc tctctcgacc tgatgtgtag acgctcactt ccagtagcag 4899
aaccacctta gttgtgtctt acagattctg aacaaatcgg tttctgataa gccatgtgtt 4959
ccaaagaatg tctgaataag accgctcttt atttaaatgc taagaggatg tcactactgc 5019
aatccatctg tggccgattt tttccaagag ccaatttcct tgttttggtt gcaagaacct 5079
ggctctgcct gcatgtcagc tctctgccct ccctgctgcc gtggctttca agcgcttggc 5139
agaatcttgt acttcgtgtc cacaatggta ctgaatttgc atctgcacag tcagcagaga 5199
taacaagtgt tgaactgacc ttgccacatg cttagtgagt gatttgtaat taagtttata 5259
gactcagaag gtatattagg acatttggaa tcagtagcag agcaaagcct ctttgaaaaa 5319
aaccacgtag ctgattgggt tttacaagag tgcatttgtc tcccccttcc acccgtgggg 5379
ccccaccttc aggtcttagt ggttcacaag agcccagcag ccaggctggc tttttcattg 5439
tagggcgtgg ttgtcccagc tggtgtagat ttcaggccgc cccccccaac tccctgccca 5499
cagtgttgca gattgcctgg ctggcagcaa gtccagacca cccaaatttg gttggattct 5559
tcatttctcc actgtagttg gggtccattg attgtgcagg ggaacgtgca ggaggttttt 5619
ctaggcaccg tgttcagtgc tgcttcactc taccagagat tatggccaaa ttgcacggaa 5679
tttggtttct tgccctctga agcctgaggg cccccccttg cctggctggt tgacagaccc 5739
ggggtggtca ctgctgagac ttcagagatc gcagctgctg tgagaatacg gtgaaggtac 5799
tttgttctgg aagatgttgt catacacttt tccccagtta ttttcaaact tgacatgagc 5859
ctatgttgac tcactgggtg ggggtccctt cttacgcagc acacgtggca agtgcctgaa 5919
tcggggctgg aggcacttca gagcctctga ggggccacca cttctggccc aaaattgcag 5979
ggttgtagat gaggctgcct gtggagaact ggtgtgagga ggaagctgtt tccaacaaag 6039
agcactttca tctgttgaga tggctgtggt gagcaactga acgagcctac gtgtgtacct 6099
gaattttccc cgtaactcat ttcttccata tgaagaaaca ccaaactatg tacagagaac 6159
tttttacaaa aggcagacct tttttaagct gtgtaaccca catagcctaa ccacctggca 6219
gaatgactac gaataggggt cattgtgctg gtaaaagcct ctattacgac tgtaagtaag 6279
ttggatgttg gcaaaattaa attgttacag tatttagagc tgctgtagct gttccttcac 6339
aacataaaat aggataaatg actagtacgt ctttcaggtg ggtggcaagc agaacatgcg 6399
taatattctc tacctggtct gtagctgtaa ctgtgatgta cagacaaagc aaaaattaaa 6459
agaacttatg aaaacaaatg caatgatact aggatataca cttttgtatt tttattctta 6519
tataaggtta tttgctggct attgttggcc tctagttcag tctgtgttat ttaaattcta 6579
atatatgaat tatttgaatt gaattcatgt tcggggccac gttgttgtat gtattgatgt 6639
acagccttga atgtgaataa ttattgtaaa ctatatttta caactttttt tctggcttta 6699
ttatataaat tttctattgg gtcagtgatt taatcatata atttaatgaa tctgtttatc 6759
cttttttttt ttccaaatac ttgtgcttta ggtgtagtta ccagatgatg aattttcctc 6819
gtatggtcag tagtcttgta ataaaaagca tgtagagtgt aga 6862
<210> 5
<211> 429
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 5
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln
20 25 30
Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly
35 40 45
Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val
85 90 95
Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr Ser Arg Glu Tyr Ala Thr Arg Ala
100 105 110
Asn Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr
115 120 125
Glu Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile
130 135 140
Ile Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu
165 170 175
Lys Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu Val Glu Lys Leu Leu Val Leu
180 185 190
Asp Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro
195 200 205
Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser Val Thr Trp Glu Asn Leu His
210 215 220
Gln Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu
225 230 235 240
Asp Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe
245 250 255
Gly Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Leu Ser Ala
260 265 270
Ser Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr
275 280 285
Ile His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser
290 295 300
Glu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro
305 310 315 320
Trp His Gln Phe Val Glu Asn Asn Leu Ile Leu Lys Met Gly Pro Val
325 330 335
Asp Lys Arg Lys Gly Leu Phe Ala Arg Arg Arg Gln Leu Leu Leu Thr
340 345 350
Glu Gly Pro His Leu Tyr Tyr Val Asp Pro Val Asn Lys Val Leu Lys
355 360 365
Gly Glu Ile Pro Trp Ser Gln Glu Leu Arg Pro Glu Ala Lys Asn Phe
370 375 380
Lys Thr Phe Phe Val His Thr Pro Asn Arg Thr Tyr Tyr Leu Met Asp
385 390 395 400
Pro Ser Gly Asn Ala His Lys Trp Cys Arg Lys Ile Gln Glu Val Trp
405 410 415
Arg Gln Arg Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Ala Val Gln
420 425
<210> 6
<211> 7032
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (150)..(1514)
<400> 6
gcggcgccgg gggcgggggg cggcgggcga cggggcgggc gcaggatgag ggcggccatt 60
gctggggctc cgcttcgggg aggaggacgc tgaggaggcg ccgagccgcg cagcgctgcg 120
ggggaggcgc ccgcgccgac gcggggccc atg gcc agg acc acc agc cag ctg 173
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu
1 5
tat gac gcc gtg ccc atc cag tcc agc gtg gtg tta tgt tcc tgc cca 221
Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro
10 15 20
tcc cca tca atg gtg agg acc cag act gag tcc agc acg ccc cct ggc 269
Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly
25 30 35 40
att cct ggt ggc agc agg cag ggc ccc gcc atg gac ggc act gca gcc 317
Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala
45 50 55
gag cct cgg ccc ggc gcc ggc tcc ctg cag cat gcc cag cct ccg ccg 365
Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro
60 65 70
cag cct cgg aag aag cgg cct gag gac ttc aag ttt ggg aaa atc ctt 413
Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu
75 80 85
ggg gaa ggc tct ttt tcc acg gtt gtc ctg gct cga gaa ctg gca acc 461
Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr
90 95 100
tcc aga gaa tat gcg att aaa att ctg gag aag cga cat atc ata aaa 509
Ser Arg Glu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Glu Lys Arg His Ile Ile Lys
105 110 115 120
gag aac aag gtc ccc tat gta acc aga gag cgg gat gtc atg tcg cgc 557
Glu Asn Lys Val Pro Tyr Val Thr Arg Glu Arg Asp Val Met Ser Arg
125 130 135
ctg gat cac ccc ttc ttt gtt aag ctt tac ttc aca ttt cag gac gac 605
Leu Asp His Pro Phe Phe Val Lys Leu Tyr Phe Thr Phe Gln Asp Asp
140 145 150
gag aag ctg tat ttc ggc ctt agt tat gcc aaa aat gga gaa cta ctt 653
Glu Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Ser Tyr Ala Lys Asn Gly Glu Leu Leu
155 160 165
aaa tat att cgc aaa atc ggt tca ttc gat gag acc tgt acc cga ttt 701
Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Gly Ser Phe Asp Glu Thr Cys Thr Arg Phe
170 175 180
tac acg gct gag att gtg tct gct tta gag tac ttg cac ggc aag ggc 749
Tyr Thr Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Gly Lys Gly
185 190 195 200
atc att cac agg gac ctt aaa ccg gaa aac att ttg tta aat gaa gat 797
Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asn Glu Asp
205 210 215
atg cac atc cag atc aca gat ttt gga aca gca aaa gtc tta tcc cca 845
Met His Ile Gln Ile Thr Asp Phe Gly Thr Ala Lys Val Leu Ser Pro
220 225 230
gag agc aaa caa gcc agg gcc aac tca ttc gtg gga aca gcg cag tac 893
Glu Ser Lys Gln Ala Arg Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr
235 240 245
gtt tct cca gag ctg ctc acg gag aag tcc gcc tgt aag agt tca gac 941
Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp
250 255 260
ctt tgg gct ctt gga tgc ata ata tac cag ctt gtg gca gga ctc cca 989
Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro
265 270 275 280
cca ttc cga gct gga aac gag tat ctt ata ttt cag aag atc att aag 1037
Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys
285 290 295
ttg gaa tat gac ttt cca gaa aaa ttc ttc cct aag gca aga gac ctc 1085
Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu
300 305 310
gtg gag aaa ctt ttg gtt tta gat gcc aca aag cgg tta ggc tgt gag 1133
Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu
315 320 325
gaa atg gaa gga tac gga cct ctt aaa gca cac ccg ttc ttc gag tcc 1181
Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser
330 335 340
gtc acg tgg gag aac ctg cac cag cag acg cct ccg aag ctc acc gct 1229
Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala
345 350 355 360
tac ctg ccg gct atg tcg gaa gac gac gag gac tgc tat ggc aat tat 1277
Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr
365 370 375
gac aat ctc ctg agc cag ttt ggc tgc atg cag gtg tct tcg tcc tcc 1325
Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser
380 385 390
tcc tca cac tcc ctg tca gcc tcc gac acg ggc ctg ccc cag agg tca 1373
Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser
395 400 405
ggc agc aac ata gag cag tac att cac gat ctg gac tcg aac tcc ttt 1421
Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe
410 415 420
gaa ctg gac tta cag ttt tcc gaa gat gag aag agg ttg ttg ttg gag 1469
Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu
425 430 435 440
aag cag gct ggc gga aac cct tgc cta aca gga cgt att atc tga 1514
Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Cys Leu Thr Gly Arg Ile Ile
445 450 455
tggaccccag cgggaacgca cacaagtggt gcaggaagat ccaggaggtt tggaggcagc 1574
gataccagag ccacccggac gccgctgtgc agtgacgtgg cctgcggccg ggctgccctt 1634
cgctgccagg acacctgccc cagcgcggct tggccgccat ccgggacgct tccagaccac 1694
ctgccagcca tcacaagggg aacgcagagg cggaaacctt gcagcatttt tatttaaaag 1754
aaaagaagaa aaaaaacacc caaccacaca aagaacaaaa ccagtaacaa acacaaagga 1814
attcagggtc gctttgcttg ctctctgtgc tccgtggagg cctccgtgtg ccctcgttgc 1874
cgtggggacc cagctccatg cacgtcaacc cagtcccgcc cagactagtg gacagacctg 1934
gtgtcaccag tttttcctag catcagtccg aaccatgcgc ccgccctgcc ccaactgtgt 1994
gctggtcctg ctgtggccga ggggaccggg tgtgtttggc tctttatgcc cctcccgctg 2054
tggtcctgga actcttcacc agggagggag ccctgcgggg gccgcagctt tgtggaggga 2114
gccgccgtgc ttctgtcacc tgctcccttt cttgcgtctc cctgtgatgg gcccttaggc 2174
ctggctgggc ccattacata tccctgtggt ggctctggtg gcagctttct gtggcccctg 2234
ctgtgttggc aggcaggttt gcgtggtgag gagcgggagg ggttggagtg gtgcgggagc 2294
aggctgccga gtggagggtg ccatcgaggg ctccggatcc cttatcctac ttagcagtgt 2354
tggtctctgg ggctggaagc cgagcgcatg ctgggagcgg tactgtcaga agtgagccca 2414
gttagtaccc cgctggctca ctgcacgaga gagtcctgcc ccgagcccta ggtggggcca 2474
ggaggtgcct tggagaagcc agccagagca gagagggctg ctgacttccg tgtggagcag 2534
agaggcctga gggcctccta aaaggtttaa atgtccacgc ctctccagtt gctgaagtag 2594
ggtctgagag aaccctggca tcagcagacc cagggtgctt ctgtctcctg cagaccacgc 2654
cagggagtgc agacaccacc gtcacacacg ccccttttgt gttttggttc aagtttctca 2714
gagcccctca gagcttctac atctgtgcat cagaaatctc acagccttct catgctgccg 2774
gctcatctgg gcccatagag tgggctttgc cagttgctgt tgcacaggag gcgagaacag 2834
cacacttcaa ccccagcttg ctggtcggct ttcctctaga gagagccggt tttggggcca 2894
tttccctttg atgctttggt ggccttgccc cgctctgcag cacagacagg ccagatgcat 2954
ttgtcctttg cctagctact ccccaggtag agagtgctcc tggtggcctg gcaggtctgg 3014
gcccttctct ccctgcccag gttgtccctg gagggcagcc ctcactccct ttgggggaga 3074
ggcagacatt gctgcccaca gacctgcctc tgactcaact gtgtccaccc tccctggtcc 3134
ctacccccaa gtcacaggtg actcagcagt gaccctgtgt gccaggccag atccaaactg 3194
agagggaagg tgtcgttttt acactgctaa tgacgagagt ggctcttttt agctaggcga 3254
gtacagacgg ggcctgggag ggggcagaga tgttccccag gccctgcctg tggttcctgc 3314
ctgggccttg gctgctgctg tgtgagagct gcatgtgagc ctgtgaccgt gagctggggt 3374
gagctgggcc gcacctaccc tggggcccca gggagcagga cgctccgggg cccagcacgt 3434
tgccctgggc ctgtggccgg agtcggagtc ctctctcctc ctcctggctt ttggaaaggc 3494
ttggctgtgt tggggagtct ctcttagccc tttcaggaat ttctgttcag gcttcctcct 3554
cctcatcagc tattttaccc atctcagaac gtcctgtgtc tccatgtagg agagtggctc 3614
tctcagatct ctcagggcgt ctggttatag ggaaacaagt ggagcaggga cgtggcttta 3674
attggagcac tcggctgggc tgcttgggga gactcttccg tgcgttcttc ctctggatag 3734
aaccaccacc tcctgggcgt cactgacaag ctccatctta acctccaaag ccacagaact 3794
aggggctcag agccagagct ggcagccgcc agccaaaatg atgccattgc ctgagctgac 3854
agccaagccc ttctgtgggt cacctttctc ctcacccagc cccttgctct tcccttttga 3914
aaggcccgtg tgttttcttt ccttaccctg tgcttgctca tgtctactcc ggttttctct 3974
accacatcct tagagccatc acctggcacg caggcgcctt acattctacg gtagaacgtg 4034
gggtactgtg tgtgcacata gacacactta cgtggaatta cagttgtggg tttatccaag 4094
atgaggaaga tttcacctgc tgtttaatag acttggggcc atgtgcctcc ccacacatgg 4154
gcaaggacag gtggaatgtc gggaccacac tgtgcggctt ctcggcacaa agcggaggga 4214
ggctgtggtc gctgccggcc taggtgtccc aggtgccccg cctttctctg ggacacagtt 4274
gggggctggc ttctgaggga ttcctttctc ccctctttgt gtggccccag ccagggcggt 4334
gggcagtcct ggtgtagagc acaagcctct ccaccctaga gaaatgcctc tgtaccacgg 4394
ctaccatgtg gaaccttaac ttgcagaagg cttgttaaca attgttttga gagagatggc 4454
tggtcatgcc acagctgctg gggactccgc ctactccagc cctcttggga cacactgtgg 4514
gatttgtggc ccttccccag aggaattgtg gagactgtcc catggaacaa accctcaggc 4574
accagcacag ggctctgggt gactcagtaa aactaacgtt tgtctctgac aagatcagct 4634
gtaggctcac cggccagaga agaccactgt gagcattttg ccgtatatcc tgccctgcca 4694
tttgttcact ttttaaacta aaataggaac atccgacaca caccgtttgc atcgtcttct 4754
cccttgatat tttaagcatt ttcccatgtc atgagtttct cagaaacatg tttttaacaa 4814
ttgtactatt tagtcattgt ccatttacta taatttatct gaccatttcc ctactgtaaa 4874
atacttaaga cggtttctga tttttccact atttaaataa tgctgtgatg aatatcttta 4934
aaatcttctg atttcttact tttttccccc ttagatgcct ggaagtggta ttttgaggtg 4994
aaagagtttg ttcattttga agatatttct gtctctctct cgacctgatg tgtagacgct 5054
cacttccagt agcagaacca ccttagttgt gtcttacaga ttctgaacaa atcggtttct 5114
gataagccat gtgttccaaa gaatgtctga ataagaccgc tctttattta aatgctaaga 5174
ggatgtcact actgcaatcc atctgtggcc gattttttcc aagagccaat ttccttgttt 5234
tggttgcaag aacctggctc tgcctgcatg tcagctctct gccctccctg ctgccgtggc 5294
tttcaagcgc ttggcagaat cttgtacttc gtgtccacaa tggtactgaa tttgcatctg 5354
cacagtcagc agagataaca agtgttgaac tgaccttgcc acatgcttag tgagtgattt 5414
gtaattaagt ttatagactc agaaggtata ttaggacatt tggaatcagt agcagagcaa 5474
agcctctttg aaaaaaacca cgtagctgat tgggttttac aagagtgcat ttgtctcccc 5534
cttccacccg tggggcccca ccttcaggtc ttagtggttc acaagagccc agcagccagg 5594
ctggcttttt cattgtaggg cgtggttgtc ccagctggtg tagatttcag gccgcccccc 5654
ccaactccct gcccacagtg ttgcagattg cctggctggc agcaagtcca gaccacccaa 5714
atttggttgg attcttcatt tctccactgt agttggggtc cattgattgt gcaggggaac 5774
gtgcaggagg tttttctagg caccgtgttc agtgctgctt cactctacca gagattatgg 5834
ccaaattgca cggaatttgg tttcttgccc tctgaagcct gagggccccc ccttgcctgg 5894
ctggttgaca gacccggggt ggtcactgct gagacttcag agatcgcagc tgctgtgaga 5954
atacggtgaa ggtactttgt tctggaagat gttgtcatac acttttcccc agttattttc 6014
aaacttgaca tgagcctatg ttgactcact gggtgggggt cccttcttac gcagcacacg 6074
tggcaagtgc ctgaatcggg gctggaggca cttcagagcc tctgaggggc caccacttct 6134
ggcccaaaat tgcagggttg tagatgaggc tgcctgtgga gaactggtgt gaggaggaag 6194
ctgtttccaa caaagagcac tttcatctgt tgagatggct gtggtgagca actgaacgag 6254
cctacgtgtg tacctgaatt ttccccgtaa ctcatttctt ccatatgaag aaacaccaaa 6314
ctatgtacag agaacttttt acaaaaggca gacctttttt aagctgtgta acccacatag 6374
cctaaccacc tggcagaatg actacgaata ggggtcattg tgctggtaaa agcctctatt 6434
acgactgtaa gtaagttgga tgttggcaaa attaaattgt tacagtattt agagctgctg 6494
tagctgttcc ttcacaacat aaaataggat aaatgactag tacgtctttc aggtgggtgg 6554
caagcagaac atgcgtaata ttctctacct ggtctgtagc tgtaactgtg atgtacagac 6614
aaagcaaaaa ttaaaagaac ttatgaaaac aaatgcaatg atactaggat atacactttt 6674
gtatttttat tcttatataa ggttatttgc tggctattgt tggcctctag ttcagtctgt 6734
gttatttaaa ttctaatata tgaattattt gaattgaatt catgttcggg gccacgttgt 6794
tgtatgtatt gatgtacagc cttgaatgtg aataattatt gtaaactata ttttacaact 6854
ttttttctgg ctttattata taaattttct attgggtcag tgatttaatc atataattta 6914
atgaatctgt ttatcctttt tttttttcca aatacttgtg ctttaggtgt agttaccaga 6974
tgatgaattt tcctcgtatg gtcagtagtc ttgtaataaa aagcatgtag agtgtaga 7032
<210> 7
<211> 454
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 7
Met Ala Arg Thr Thr Ser Gln Leu Tyr Asp Ala Val Pro Ile Gln Ser
1 5 10 15
Ser Val Val Leu Cys Ser Cys Pro Ser Pro Ser Met Val Arg Thr Gln
20 25 30
Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly
35 40 45
Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60
Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val
85 90 95
Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr Ser Arg Glu Tyr Ala Ile Lys Ile
100 105 110
Leu Glu Lys Arg His Ile Ile Lys Glu Asn Lys Val Pro Tyr Val Thr
115 120 125
Arg Glu Arg Asp Val Met Ser Arg Leu Asp His Pro Phe Phe Val Lys
130 135 140
Leu Tyr Phe Thr Phe Gln Asp Asp Glu Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Ser
145 150 155 160
Tyr Ala Lys Asn Gly Glu Leu Leu Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Gly Ser
165 170 175
Phe Asp Glu Thr Cys Thr Arg Phe Tyr Thr Ala Glu Ile Val Ser Ala
180 185 190
Leu Glu Tyr Leu His Gly Lys Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro
195 200 205
Glu Asn Ile Leu Leu Asn Glu Asp Met His Ile Gln Ile Thr Asp Phe
210 215 220
Gly Thr Ala Lys Val Leu Ser Pro Glu Ser Lys Gln Ala Arg Ala Asn
225 230 235 240
Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu
245 250 255
Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile
260 265 270
Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr
275 280 285
Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys
290 295 300
Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp
305 310 315 320
Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu
325 330 335
Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln
340 345 350
Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp
355 360 365
Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly
370 375 380
Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser
385 390 395 400
Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile
405 410 415
His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu
420 425 430
Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Cys
435 440 445
Leu Thr Gly Arg Ile Ile
450
<210> 8
<211> 7337
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (327)..(1916)
<400> 8
attgctgggg ctccgcttcg gggaggagga cgctgaggag gcgccgagcc gcgcagcgct 60
gcgggggagg cgcccgcgcc gacgcggggc ccatggccag gaccaccagc cagctgattc 120
ttgatgacag tggtcgggaa aactcgcctt tcacggcccg gccaaggggc atttgggtgc 180
ttttgctgcc cgtggctgtg ctcagcgttg tgggaagccc ctgggaggcc gaatgtgcag 240
gatcaccgag gggaaagtga gcttgacagt atgacgccgt gcccatccag tccagcgtgg 300
tgttatgttc ctgcccatcc ccatca atg gtg agg acc cag act gag tcc agc 353
Met Val Arg Thr Gln Thr Glu Ser Ser
1 5
acg ccc cct ggc att cct ggt ggc agc agg cag ggc ccc gcc atg gac 401
Thr Pro Pro Gly Ile Pro Gly Gly Ser Arg Gln Gly Pro Ala Met Asp
10 15 20 25
ggc act gca gcc gag cct cgg ccc ggc gcc ggc tcc ctg cag cat gcc 449
Gly Thr Ala Ala Glu Pro Arg Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln His Ala
30 35 40
cag cct ccg ccg cag cct cgg aag aag cgg cct gag gac ttc aag ttt 497
Gln Pro Pro Pro Gln Pro Arg Lys Lys Arg Pro Glu Asp Phe Lys Phe
45 50 55
ggg aaa atc ctt ggg gaa ggc tct ttt tcc acg gtt gtc ctg gct cga 545
Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Ser Phe Ser Thr Val Val Leu Ala Arg
60 65 70
gaa ctg gca acc tcc aga gaa tat gcg att aaa att ctg gag aag cga 593
Glu Leu Ala Thr Ser Arg Glu Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Glu Lys Arg
75 80 85
cat atc ata aaa gag aac aag gtc ccc tat gta acc aga gag cgg gat 641
His Ile Ile Lys Glu Asn Lys Val Pro Tyr Val Thr Arg Glu Arg Asp
90 95 100 105
gtc atg tcg cgc ctg gat cac ccc ttc ttt gtt aag ctt tac ttc aca 689
Val Met Ser Arg Leu Asp His Pro Phe Phe Val Lys Leu Tyr Phe Thr
110 115 120
ttt cag gac gac gag aag ctg tat ttc ggc ctt agt tat gcc aaa aat 737
Phe Gln Asp Asp Glu Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Ser Tyr Ala Lys Asn
125 130 135
gga gaa cta ctt aaa tat att cgc aaa atc ggt tca ttc gat gag acc 785
Gly Glu Leu Leu Lys Tyr Ile Arg Lys Ile Gly Ser Phe Asp Glu Thr
140 145 150
tgt acc cga ttt tac acg gct gag att gtg tct gct tta gag tac ttg 833
Cys Thr Arg Phe Tyr Thr Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu
155 160 165
cac ggc aag ggc atc att cac agg gac ctt aaa ccg gaa aac att ttg 881
His Gly Lys Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu
170 175 180 185
tta aat gaa gat atg cac atc cag atc aca gat ttt gga aca gca aaa 929
Leu Asn Glu Asp Met His Ile Gln Ile Thr Asp Phe Gly Thr Ala Lys
190 195 200
gtc tta tcc cca gag agc aaa caa gcc agg gcc aac tca ttc gtg gga 977
Val Leu Ser Pro Glu Ser Lys Gln Ala Arg Ala Asn Ser Phe Val Gly
205 210 215
aca gcg cag tac gtt tct cca gag ctg ctc acg gag aag tcc gcc tgt 1025
Thr Ala Gln Tyr Val Ser Pro Glu Leu Leu Thr Glu Lys Ser Ala Cys
220 225 230
aag agt tca gac ctt tgg gct ctt gga tgc ata ata tac cag ctt gtg 1073
Lys Ser Ser Asp Leu Trp Ala Leu Gly Cys Ile Ile Tyr Gln Leu Val
235 240 245
gca gga ctc cca cca ttc cga gct gga aac gag tat ctt ata ttt cag 1121
Ala Gly Leu Pro Pro Phe Arg Ala Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Phe Gln
250 255 260 265
aag atc att aag ttg gaa tat gac ttt cca gaa aaa ttc ttc cct aag 1169
Lys Ile Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Phe Pro Glu Lys Phe Phe Pro Lys
270 275 280
gca aga gac ctc gtg gag aaa ctt ttg gtt tta gat gcc aca aag cgg 1217
Ala Arg Asp Leu Val Glu Lys Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Lys Arg
285 290 295
tta ggc tgt gag gaa atg gaa gga tac gga cct ctt aaa gca cac ccg 1265
Leu Gly Cys Glu Glu Met Glu Gly Tyr Gly Pro Leu Lys Ala His Pro
300 305 310
ttc ttc gag tcc gtc acg tgg gag aac ctg cac cag cag acg cct ccg 1313
Phe Phe Glu Ser Val Thr Trp Glu Asn Leu His Gln Gln Thr Pro Pro
315 320 325
aag ctc acc gct tac ctg ccg gct atg tcg gaa gac gac gag gac tgc 1361
Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Pro Ala Met Ser Glu Asp Asp Glu Asp Cys
330 335 340 345
tat ggc aat tat gac aat ctc ctg agc cag ttt ggc tgc atg cag gtg 1409
Tyr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Gln Phe Gly Cys Met Gln Val
350 355 360
tct tcg tcc tcc tcc tca cac tcc ctg tca gcc tcc gac acg ggc ctg 1457
Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Leu
365 370 375
ccc cag agg tca ggc agc aac ata gag cag tac att cac gat ctg gac 1505
Pro Gln Arg Ser Gly Ser Asn Ile Glu Gln Tyr Ile His Asp Leu Asp
380 385 390
tcg aac tcc ttt gaa ctg gac tta cag ttt tcc gaa gat gag aag agg 1553
Ser Asn Ser Phe Glu Leu Asp Leu Gln Phe Ser Glu Asp Glu Lys Arg
395 400 405
ttg ttg ttg gag aag cag gct ggc gga aac cct tgg cac cag ttt gta 1601
Leu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Gly Gly Asn Pro Trp His Gln Phe Val
410 415 420 425
gaa aat aat tta ata cta aag atg ggc cca gtg gat aag cgg aag ggt 1649
Glu Asn Asn Leu Ile Leu Lys Met Gly Pro Val Asp Lys Arg Lys Gly
430 435 440
tta ttt gca aga cga cga cag ctg ttg ctc aca gaa gga cca cat tta 1697
Leu Phe Ala Arg Arg Arg Gln Leu Leu Leu Thr Glu Gly Pro His Leu
445 450 455
tat tat gtg gat cct gtc aac aaa gtt ctg aaa ggt gaa att cct tgg 1745
Tyr Tyr Val Asp Pro Val Asn Lys Val Leu Lys Gly Glu Ile Pro Trp
460 465 470
tca caa gaa ctt cga cca gag gcc aag aat ttt aaa act ttc ttt gtc 1793
Ser Gln Glu Leu Arg Pro Glu Ala Lys Asn Phe Lys Thr Phe Phe Val
475 480 485
cac acg cct aac agg acg tat tat ctg atg gac ccc agc ggg aac gca 1841
His Thr Pro Asn Arg Thr Tyr Tyr Leu Met Asp Pro Ser Gly Asn Ala
490 495 500 505
cac aag tgg tgc agg aag atc cag gag gtt tgg agg cag cga tac cag 1889
His Lys Trp Cys Arg Lys Ile Gln Glu Val Trp Arg Gln Arg Tyr Gln
510 515 520
agc cac ccg gac gcc gct gtg cag tga cgtggcctgc ggccgggctg 1936
Ser His Pro Asp Ala Ala Val Gln
525 530
cccttcgctg ccaggacacc tgccccagcg cggcttggcc gccatccggg acgcttccag 1996
accacctgcc agccatcaca aggggaacgc agaggcggaa accttgcagc atttttattt 2056
aaaagaaaag aagaaaaaaa acacccaacc acacaaagaa caaaaccagt aacaaacaca 2116
aaggaattca gggtcgcttt gcttgctctc tgtgctccgt ggaggcctcc gtgtgccctc 2176
gttgccgtgg ggacccagct ccatgcacgt caacccagtc ccgcccagac tagtggacag 2236
acctggtgtc accagttttt cctagcatca gtccgaacca tgcgcccgcc ctgccccaac 2296
tgtgtgctgg tcctgctgtg gccgagggga ccgggtgtgt ttggctcttt atgcccctcc 2356
cgctgtggtc ctggaactct tcaccaggga gggagccctg cgggggccgc agctttgtgg 2416
agggagccgc cgtgcttctg tcacctgctc cctttcttgc gtctccctgt gatgggccct 2476
taggcctggc tgggcccatt acatatccct gtggtggctc tggtggcagc tttctgtggc 2536
ccctgctgtg ttggcaggca ggtttgcgtg gtgaggagcg ggaggggttg gagtggtgcg 2596
ggagcaggct gccgagtgga gggtgccatc gagggctccg gatcccttat cctacttagc 2656
agtgttggtc tctggggctg gaagccgagc gcatgctggg agcggtactg tcagaagtga 2716
gcccagttag taccccgctg gctcactgca cgagagagtc ctgccccgag ccctaggtgg 2776
ggccaggagg tgccttggag aagccagcca gagcagagag ggctgctgac ttccgtgtgg 2836
agcagagagg cctgagggcc tcctaaaagg tttaaatgtc cacgcctctc cagttgctga 2896
agtagggtct gagagaaccc tggcatcagc agacccaggg tgcttctgtc tcctgcagac 2956
cacgccaggg agtgcagaca ccaccgtcac acacgcccct tttgtgtttt ggttcaagtt 3016
tctcagagcc cctcagagct tctacatctg tgcatcagaa atctcacagc cttctcatgc 3076
tgccggctca tctgggccca tagagtgggc tttgccagtt gctgttgcac aggaggcgag 3136
aacagcacac ttcaacccca gcttgctggt cggctttcct ctagagagag ccggttttgg 3196
ggccatttcc ctttgatgct ttggtggcct tgccccgctc tgcagcacag acaggccaga 3256
tgcatttgtc ctttgcctag ctactcccca ggtagagagt gctcctggtg gcctggcagg 3316
tctgggccct tctctccctg cccaggttgt ccctggaggg cagccctcac tccctttggg 3376
ggagaggcag acattgctgc ccacagacct gcctctgact caactgtgtc caccctccct 3436
ggtccctacc cccaagtcac aggtgactca gcagtgaccc tgtgtgccag gccagatcca 3496
aactgagagg gaaggtgtcg tttttacact gctaatgacg agagtggctc tttttagcta 3556
ggcgagtaca gacggggcct gggagggggc agagatgttc cccaggccct gcctgtggtt 3616
cctgcctggg ccttggctgc tgctgtgtga gagctgcatg tgagcctgtg accgtgagct 3676
ggggtgagct gggccgcacc taccctgggg ccccagggag caggacgctc cggggcccag 3736
cacgttgccc tgggcctgtg gccggagtcg gagtcctctc tcctcctcct ggcttttgga 3796
aaggcttggc tgtgttgggg agtctctctt agccctttca ggaatttctg ttcaggcttc 3856
ctcctcctca tcagctattt tacccatctc agaacgtcct gtgtctccat gtaggagagt 3916
ggctctctca gatctctcag ggcgtctggt tatagggaaa caagtggagc agggacgtgg 3976
ctttaattgg agcactcggc tgggctgctt ggggagactc ttccgtgcgt tcttcctctg 4036
gatagaacca ccacctcctg ggcgtcactg acaagctcca tcttaacctc caaagccaca 4096
gaactagggg ctcagagcca gagctggcag ccgccagcca aaatgatgcc attgcctgag 4156
ctgacagcca agcccttctg tgggtcacct ttctcctcac ccagcccctt gctcttccct 4216
tttgaaaggc ccgtgtgttt tctttcctta ccctgtgctt gctcatgtct actccggttt 4276
tctctaccac atccttagag ccatcacctg gcacgcaggc gccttacatt ctacggtaga 4336
acgtggggta ctgtgtgtgc acatagacac acttacgtgg aattacagtt gtgggtttat 4396
ccaagatgag gaagatttca cctgctgttt aatagacttg gggccatgtg cctccccaca 4456
catgggcaag gacaggtgga atgtcgggac cacactgtgc ggcttctcgg cacaaagcgg 4516
agggaggctg tggtcgctgc cggcctaggt gtcccaggtg ccccgccttt ctctgggaca 4576
cagttggggg ctggcttctg agggattcct ttctcccctc tttgtgtggc cccagccagg 4636
gcggtgggca gtcctggtgt agagcacaag cctctccacc ctagagaaat gcctctgtac 4696
cacggctacc atgtggaacc ttaacttgca gaaggcttgt taacaattgt tttgagagag 4756
atggctggtc atgccacagc tgctggggac tccgcctact ccagccctct tgggacacac 4816
tgtgggattt gtggcccttc cccagaggaa ttgtggagac tgtcccatgg aacaaaccct 4876
caggcaccag cacagggctc tgggtgactc agtaaaacta acgtttgtct ctgacaagat 4936
cagctgtagg ctcaccggcc agagaagacc actgtgagca ttttgccgta tatcctgccc 4996
tgccatttgt tcacttttta aactaaaata ggaacatccg acacacaccg tttgcatcgt 5056
cttctccctt gatattttaa gcattttccc atgtcatgag tttctcagaa acatgttttt 5116
aacaattgta ctatttagtc attgtccatt tactataatt tatctgacca tttccctact 5176
gtaaaatact taagacggtt tctgattttt ccactattta aataatgctg tgatgaatat 5236
ctttaaaatc ttctgatttc ttactttttt cccccttaga tgcctggaag tggtattttg 5296
aggtgaaaga gtttgttcat tttgaagata tttctgtctc tctctcgacc tgatgtgtag 5356
acgctcactt ccagtagcag aaccacctta gttgtgtctt acagattctg aacaaatcgg 5416
tttctgataa gccatgtgtt ccaaagaatg tctgaataag accgctcttt atttaaatgc 5476
taagaggatg tcactactgc aatccatctg tggccgattt tttccaagag ccaatttcct 5536
tgttttggtt gcaagaacct ggctctgcct gcatgtcagc tctctgccct ccctgctgcc 5596
gtggctttca agcgcttggc agaatcttgt acttcgtgtc cacaatggta ctgaatttgc 5656
atctgcacag tcagcagaga taacaagtgt tgaactgacc ttgccacatg cttagtgagt 5716
gatttgtaat taagtttata gactcagaag gtatattagg acatttggaa tcagtagcag 5776
agcaaagcct ctttgaaaaa aaccacgtag ctgattgggt tttacaagag tgcatttgtc 5836
tcccccttcc acccgtgggg ccccaccttc aggtcttagt ggttcacaag agcccagcag 5896
ccaggctggc tttttcattg tagggcgtgg ttgtcccagc tggtgtagat ttcaggccgc 5956
cccccccaac tccctgccca cagtgttgca gattgcctgg ctggcagcaa gtccagacca 6016
cccaaatttg gttggattct tcatttctcc actgtagttg gggtccattg attgtgcagg 6076
ggaacgtgca ggaggttttt ctaggcaccg tgttcagtgc tgcttcactc taccagagat 6136
tatggccaaa ttgcacggaa tttggtttct tgccctctga agcctgaggg cccccccttg 6196
cctggctggt tgacagaccc ggggtggtca ctgctgagac ttcagagatc gcagctgctg 6256
tgagaatacg gtgaaggtac tttgttctgg aagatgttgt catacacttt tccccagtta 6316
ttttcaaact tgacatgagc ctatgttgac tcactgggtg ggggtccctt cttacgcagc 6376
acacgtggca agtgcctgaa tcggggctgg aggcacttca gagcctctga ggggccacca 6436
cttctggccc aaaattgcag ggttgtagat gaggctgcct gtggagaact ggtgtgagga 6496
ggaagctgtt tccaacaaag agcactttca tctgttgaga tggctgtggt gagcaactga 6556
acgagcctac gtgtgtacct gaattttccc cgtaactcat ttcttccata tgaagaaaca 6616
ccaaactatg tacagagaac tttttacaaa aggcagacct tttttaagct gtgtaaccca 6676
catagcctaa ccacctggca gaatgactac gaataggggt cattgtgctg gtaaaagcct 6736
ctattacgac tgtaagtaag ttggatgttg gcaaaattaa attgttacag tatttagagc 6796
tgctgtagct gttccttcac aacataaaat aggataaatg actagtacgt ctttcaggtg 6856
ggtggcaagc agaacatgcg taatattctc tacctggtct gtagctgtaa ctgtgatgta 6916
cagacaaagc aaaaattaaa agaacttatg aaaacaaatg caatgatact aggatataca 6976
cttttgtatt tttattctta tataaggtta tttgctggct attgttggcc tctagttcag 7036
tctgtgttat ttaaattcta atatatgaat tatttgaatt gaattcatgt tcggggccac 7096
gttgttgtat gtattgatgt acagccttga atgtgaataa ttattgtaaa ctatatttta 7156
caactttttt tctggcttta ttatataaat tttctattgg gtcagtgatt taatcatata 7216
atttaatgaa tctgtttatc cttttttttt ttccaaatac ttgtgcttta ggtgtagtta 7276
ccagatgatg aattttcctc gtatggtcag tagtcttgta ataaaaagca tgtagagtgt a 7337
<210> 9
<211> 529
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 9
Met Val Arg Thr Gln Thr Glu Ser Ser Thr Pro Pro Gly Ile Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Arg Gln Gly Pro Ala Met Asp Gly Thr Ala Ala Glu Pro Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln His Ala Gln Pro Pro Pro Gln Pro Arg
35 40 45
Lys Lys Arg Pro Glu Asp Phe Lys Phe Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly
50 55 60
Ser Phe Ser Thr Val Val Leu Ala Arg Glu Leu Ala Thr Ser Arg Glu
65 70 75 80
Tyr Ala Ile Lys Ile Leu Glu Lys Arg His Ile Ile Lys Glu Asn Lys
85 90 95
Val Pro Tyr Val Thr Arg Glu Arg Asp Val Met Ser Arg Leu Asp His
100 105 110
Pro Phe Phe Val Lys Leu Tyr Phe Thr Phe Gln Asp Asp Glu Lys Leu
115 120 125
Tyr Phe Gly Leu Ser Tyr Ala Lys Asn Gly Glu Leu Leu Lys Tyr Ile
130 135 140
Arg Lys Ile Gly Ser Phe Asp Glu Thr Cys Thr Arg Phe Tyr Thr Ala
145 150 155 160
Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Gly Lys Gly Ile Ile His
165 170 175
Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asn Glu Asp Met His Ile
180 185 190
Gln Ile Thr Asp Phe Gly Thr Ala Lys Val Leu Ser Pro Glu Ser Lys
195 200 205
Gln Ala Arg Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Ala Gln Tyr Val Ser Pro
210 215 220
Glu Leu Leu Thr Glu Lys Ser Ala Cys Lys Ser Ser Asp Leu Trp Ala
225 230 235 240
Leu Gly Cys Ile Ile Tyr Gln Leu Val Ala Gly Leu Pro Pro Phe Arg
245 250 255
Ala Gly Asn Glu Tyr Leu Ile Phe Gln Lys Ile Ile Lys Leu Glu Tyr
260 265 270
Asp Phe Pro Glu Lys Phe Phe Pro Lys Ala Arg Asp Leu Val Glu Lys
275 280 285
Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Lys Arg Leu Gly Cys Glu Glu Met Glu
290 295 300
Gly Tyr Gly Pro Leu Lys Ala His Pro Phe Phe Glu Ser Val Thr Trp
305 310 315 320
Glu Asn Leu His Gln Gln Thr Pro Pro Lys Leu Thr Ala Tyr Leu Pro
325 330 335
Ala Met Ser Glu Asp Asp Glu Asp Cys Tyr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu
340 345 350
Leu Ser Gln Phe Gly Cys Met Gln Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser His
355 360 365
Ser Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly Leu Pro Gln Arg Ser Gly Ser Asn
370 375 380
Ile Glu Gln Tyr Ile His Asp Leu Asp Ser Asn Ser Phe Glu Leu Asp
385 390 395 400
Leu Gln Phe Ser Glu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Leu Glu Lys Gln Ala
405 410 415
Gly Gly Asn Pro Trp His Gln Phe Val Glu Asn Asn Leu Ile Leu Lys
420 425 430
Met Gly Pro Val Asp Lys Arg Lys Gly Leu Phe Ala Arg Arg Arg Gln
435 440 445
Leu Leu Leu Thr Glu Gly Pro His Leu Tyr Tyr Val Asp Pro Val Asn
450 455 460
Lys Val Leu Lys Gly Glu Ile Pro Trp Ser Gln Glu Leu Arg Pro Glu
465 470 475 480
Ala Lys Asn Phe Lys Thr Phe Phe Val His Thr Pro Asn Arg Thr Tyr
485 490 495
Tyr Leu Met Asp Pro Ser Gly Asn Ala His Lys Trp Cys Arg Lys Ile
500 505 510
Gln Glu Val Trp Arg Gln Arg Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Ala Val
515 520 525
Gln
<210> 10
<211> 1968
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1968)
<400> 10
atg gtt ttg tac acg acc ccc ttt cct aac agc tgt ctg tcc gcc ctg 48
Met Val Leu Tyr Thr Thr Pro Phe Pro Asn Ser Cys Leu Ser Ala Leu
1 5 10 15
cac tgt gtg tcc tgg gcc ctt atc ttt cca tgc tac tgg ctg gtg gac 96
His Cys Val Ser Trp Ala Leu Ile Phe Pro Cys Tyr Trp Leu Val Asp
20 25 30
cgg ctc gct gcc tcc ttc ata ccc acc acc tac gag aag cgc cag cgg 144
Arg Leu Ala Ala Ser Phe Ile Pro Thr Thr Tyr Glu Lys Arg Gln Arg
35 40 45
gca gac gac ccg tgc tgc ctg cag ctg ctc tgc act gcc ctc ttc acg 192
Ala Asp Asp Pro Cys Cys Leu Gln Leu Leu Cys Thr Ala Leu Phe Thr
50 55 60
ccc atc tac ctg gcc ctc ctg gtg gcc tcg ctg ccc ttt gcg ttt ctc 240
Pro Ile Tyr Leu Ala Leu Leu Val Ala Ser Leu Pro Phe Ala Phe Leu
65 70 75 80
ggc ttt ctc ttc tgg tcc cca ctg cag tcg gcc cgc cgg ccc tac atc 288
Gly Phe Leu Phe Trp Ser Pro Leu Gln Ser Ala Arg Arg Pro Tyr Ile
85 90 95
tat tca cgg ctg gaa gac aag ggc ctg gcc ggt ggg gca gcc ctg ctc 336
Tyr Ser Arg Leu Glu Asp Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu
100 105 110
agt gaa tgg aag ggc acg ggg cct ggc aaa agc ttc tgc ttt gcc act 384
Ser Glu Trp Lys Gly Thr Gly Pro Gly Lys Ser Phe Cys Phe Ala Thr
115 120 125
gcc aac gtc tgc ctc ctg ccc gac tca ctc gcc agg gtc aac aac ctt 432
Ala Asn Val Cys Leu Leu Pro Asp Ser Leu Ala Arg Val Asn Asn Leu
130 135 140
ttt aac acc caa gcg cgg gcc aag gag atc ggg cag aga atc cgc aat 480
Phe Asn Thr Gln Ala Arg Ala Lys Glu Ile Gly Gln Arg Ile Arg Asn
145 150 155 160
ggg gcc gcc cgg ccc cag atc aaa att tac atc gac tcc ccc acc aat 528
Gly Ala Ala Arg Pro Gln Ile Lys Ile Tyr Ile Asp Ser Pro Thr Asn
165 170 175
acc tcc atc agc gcc gct agc ttc agc agc ctg gtg tca cca cag ggc 576
Thr Ser Ile Ser Ala Ala Ser Phe Ser Ser Leu Val Ser Pro Gln Gly
180 185 190
ggc gat ggg gtg gcc cgg gcc gtc ccc ggg agc att aag agg aca gcc 624
Gly Asp Gly Val Ala Arg Ala Val Pro Gly Ser Ile Lys Arg Thr Ala
195 200 205
tct gtg gag tac aag ggt gac ggt ggg cgg cac ccc ggt gac gag gct 672
Ser Val Glu Tyr Lys Gly Asp Gly Gly Arg His Pro Gly Asp Glu Ala
210 215 220
gcc aac ggc cca gcc tct ggg gac cct gtc gac agc agc agc ccg gag 720
Ala Asn Gly Pro Ala Ser Gly Asp Pro Val Asp Ser Ser Ser Pro Glu
225 230 235 240
gat gcc tgc atc gtg cgc atc ggt ggc gag gag ggc ggc cgg cca cct 768
Asp Ala Cys Ile Val Arg Ile Gly Gly Glu Glu Gly Gly Arg Pro Pro
245 250 255
gaa gct gac gac cct gtg cct ggg ggc cag gcc agg aac gga gct ggc 816
Glu Ala Asp Asp Pro Val Pro Gly Gly Gln Ala Arg Asn Gly Ala Gly
260 265 270
ggg ggc cca agg ggc cag acg ccc aac cat aat cag cag gac ggg gat 864
Gly Gly Pro Arg Gly Gln Thr Pro Asn His Asn Gln Gln Asp Gly Asp
275 280 285
tca ggg agc ctg ggc agc ccc tcg gcc tcc cgg gag tcc ctg gtg aag 912
Ser Gly Ser Leu Gly Ser Pro Ser Ala Ser Arg Glu Ser Leu Val Lys
290 295 300
ggg cga gct ggg cca gac acc agt gcc agc ggg gag cca ggt gcc aac 960
Gly Arg Ala Gly Pro Asp Thr Ser Ala Ser Gly Glu Pro Gly Ala Asn
305 310 315 320
agc aag ctc ctg tac aag gcc tcg gtg gtg aag aag gcg gct gca cgc 1008
Ser Lys Leu Leu Tyr Lys Ala Ser Val Val Lys Lys Ala Ala Ala Arg
325 330 335
agg agg cgg cac ccc gac gag gcc ttc gac cat gag gtc tcc gcc ttc 1056
Arg Arg Arg His Pro Asp Glu Ala Phe Asp His Glu Val Ser Ala Phe
340 345 350
ttc ccc gcc aac ctg gac ttc ctg tgc ctg cag gag gtg ttt gac aag 1104
Phe Pro Ala Asn Leu Asp Phe Leu Cys Leu Gln Glu Val Phe Asp Lys
355 360 365
cga gca gcc acc aaa ttg aaa gag cag ctg cac ggc tac ttc gag tac 1152
Arg Ala Ala Thr Lys Leu Lys Glu Gln Leu His Gly Tyr Phe Glu Tyr
370 375 380
atc ctg tac gac gtc ggg gtc tac ggc tgc cag ggc tgc tgc agc ttc 1200
Ile Leu Tyr Asp Val Gly Val Tyr Gly Cys Gln Gly Cys Cys Ser Phe
385 390 395 400
aag tgt ctc aac agc ggc ctc ctc ttt gcc agc cgc tac ccc atc atg 1248
Lys Cys Leu Asn Ser Gly Leu Leu Phe Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Met
405 410 415
gac gtg gcc tat cac tgt tac ccc aac aag tgt aac gac gat gcc ctg 1296
Asp Val Ala Tyr His Cys Tyr Pro Asn Lys Cys Asn Asp Asp Ala Leu
420 425 430
gcc tct aag gga gct ctg ttt ctc aag gtg cag gtg gga agc aca cct 1344
Ala Ser Lys Gly Ala Leu Phe Leu Lys Val Gln Val Gly Ser Thr Pro
435 440 445
cag gac caa aga atc gtc ggg tac atc gcc tgc aca cac ctg cat gcc 1392
Gln Asp Gln Arg Ile Val Gly Tyr Ile Ala Cys Thr His Leu His Ala
450 455 460
cca caa gag gac agc gcc atc cgg tgt ggg cag ctg gac ctg ctt cag 1440
Pro Gln Glu Asp Ser Ala Ile Arg Cys Gly Gln Leu Asp Leu Leu Gln
465 470 475 480
gac tgg ctg gct gat ttc cga aaa tct acc tcc tcg tcc agc gca gcc 1488
Asp Trp Leu Ala Asp Phe Arg Lys Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ala
485 490 495
aac ccc gag gag ctg gtg gca ttt gac gtc gtc tgt gga gat ttc aac 1536
Asn Pro Glu Glu Leu Val Ala Phe Asp Val Val Cys Gly Asp Phe Asn
500 505 510
ttt gat aac tgc tcc tct gac gac aag ctg gag cag caa cac tcc ctg 1584
Phe Asp Asn Cys Ser Ser Asp Asp Lys Leu Glu Gln Gln His Ser Leu
515 520 525
ttc acc cac tac agg gac ccc tgc cgc ctg ggg cct ggt gag gag aag 1632
Phe Thr His Tyr Arg Asp Pro Cys Arg Leu Gly Pro Gly Glu Glu Lys
530 535 540
ccg tgg gcc atc ggt act ctg ctg gac acg aac ggc ctg tac gat gag 1680
Pro Trp Ala Ile Gly Thr Leu Leu Asp Thr Asn Gly Leu Tyr Asp Glu
545 550 555 560
gat gtg tgc acc ccc gac aac ctg cag aag gtc ctg gag agt gag gag 1728
Asp Val Cys Thr Pro Asp Asn Leu Gln Lys Val Leu Glu Ser Glu Glu
565 570 575
ggc cgc agg gag tac ctg gcg ttt ccc acc agc aag agc tcg ggc cag 1776
Gly Arg Arg Glu Tyr Leu Ala Phe Pro Thr Ser Lys Ser Ser Gly Gln
580 585 590
aag ggg cgg aag gag ctg ctg aag ggc aac ggc cgg cgc atc gac tac 1824
Lys Gly Arg Lys Glu Leu Leu Lys Gly Asn Gly Arg Arg Ile Asp Tyr
595 600 605
atg ctg cat gca gag gag ggg ctg tgc cca gac tgg aag gcc gag gtg 1872
Met Leu His Ala Glu Glu Gly Leu Cys Pro Asp Trp Lys Ala Glu Val
610 615 620
gaa gaa ttc agt ttt atc acc cag ctg tcc ggc ctg acg gac cac ctg 1920
Glu Glu Phe Ser Phe Ile Thr Gln Leu Ser Gly Leu Thr Asp His Leu
625 630 635 640
cca gta gcc atg cga ctg atg gtg tct tcg ggg gag gag gag gca tag 1968
Pro Val Ala Met Arg Leu Met Val Ser Ser Gly Glu Glu Glu Ala
645 650 655
<210> 11
<211> 655
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 11
Met Val Leu Tyr Thr Thr Pro Phe Pro Asn Ser Cys Leu Ser Ala Leu
1 5 10 15
His Cys Val Ser Trp Ala Leu Ile Phe Pro Cys Tyr Trp Leu Val Asp
20 25 30
Arg Leu Ala Ala Ser Phe Ile Pro Thr Thr Tyr Glu Lys Arg Gln Arg
35 40 45
Ala Asp Asp Pro Cys Cys Leu Gln Leu Leu Cys Thr Ala Leu Phe Thr
50 55 60
Pro Ile Tyr Leu Ala Leu Leu Val Ala Ser Leu Pro Phe Ala Phe Leu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Phe Trp Ser Pro Leu Gln Ser Ala Arg Arg Pro Tyr Ile
85 90 95
Tyr Ser Arg Leu Glu Asp Lys Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu
100 105 110
Ser Glu Trp Lys Gly Thr Gly Pro Gly Lys Ser Phe Cys Phe Ala Thr
115 120 125
Ala Asn Val Cys Leu Leu Pro Asp Ser Leu Ala Arg Val Asn Asn Leu
130 135 140
Phe Asn Thr Gln Ala Arg Ala Lys Glu Ile Gly Gln Arg Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Ala Ala Arg Pro Gln Ile Lys Ile Tyr Ile Asp Ser Pro Thr Asn
165 170 175
Thr Ser Ile Ser Ala Ala Ser Phe Ser Ser Leu Val Ser Pro Gln Gly
180 185 190
Gly Asp Gly Val Ala Arg Ala Val Pro Gly Ser Ile Lys Arg Thr Ala
195 200 205
Ser Val Glu Tyr Lys Gly Asp Gly Gly Arg His Pro Gly Asp Glu Ala
210 215 220
Ala Asn Gly Pro Ala Ser Gly Asp Pro Val Asp Ser Ser Ser Pro Glu
225 230 235 240
Asp Ala Cys Ile Val Arg Ile Gly Gly Glu Glu Gly Gly Arg Pro Pro
245 250 255
Glu Ala Asp Asp Pro Val Pro Gly Gly Gln Ala Arg Asn Gly Ala Gly
260 265 270
Gly Gly Pro Arg Gly Gln Thr Pro Asn His Asn Gln Gln Asp Gly Asp
275 280 285
Ser Gly Ser Leu Gly Ser Pro Ser Ala Ser Arg Glu Ser Leu Val Lys
290 295 300
Gly Arg Ala Gly Pro Asp Thr Ser Ala Ser Gly Glu Pro Gly Ala Asn
305 310 315 320
Ser Lys Leu Leu Tyr Lys Ala Ser Val Val Lys Lys Ala Ala Ala Arg
325 330 335
Arg Arg Arg His Pro Asp Glu Ala Phe Asp His Glu Val Ser Ala Phe
340 345 350
Phe Pro Ala Asn Leu Asp Phe Leu Cys Leu Gln Glu Val Phe Asp Lys
355 360 365
Arg Ala Ala Thr Lys Leu Lys Glu Gln Leu His Gly Tyr Phe Glu Tyr
370 375 380
Ile Leu Tyr Asp Val Gly Val Tyr Gly Cys Gln Gly Cys Cys Ser Phe
385 390 395 400
Lys Cys Leu Asn Ser Gly Leu Leu Phe Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Met
405 410 415
Asp Val Ala Tyr His Cys Tyr Pro Asn Lys Cys Asn Asp Asp Ala Leu
420 425 430
Ala Ser Lys Gly Ala Leu Phe Leu Lys Val Gln Val Gly Ser Thr Pro
435 440 445
Gln Asp Gln Arg Ile Val Gly Tyr Ile Ala Cys Thr His Leu His Ala
450 455 460
Pro Gln Glu Asp Ser Ala Ile Arg Cys Gly Gln Leu Asp Leu Leu Gln
465 470 475 480
Asp Trp Leu Ala Asp Phe Arg Lys Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ala
485 490 495
Asn Pro Glu Glu Leu Val Ala Phe Asp Val Val Cys Gly Asp Phe Asn
500 505 510
Phe Asp Asn Cys Ser Ser Asp Asp Lys Leu Glu Gln Gln His Ser Leu
515 520 525
Phe Thr His Tyr Arg Asp Pro Cys Arg Leu Gly Pro Gly Glu Glu Lys
530 535 540
Pro Trp Ala Ile Gly Thr Leu Leu Asp Thr Asn Gly Leu Tyr Asp Glu
545 550 555 560
Asp Val Cys Thr Pro Asp Asn Leu Gln Lys Val Leu Glu Ser Glu Glu
565 570 575
Gly Arg Arg Glu Tyr Leu Ala Phe Pro Thr Ser Lys Ser Ser Gly Gln
580 585 590
Lys Gly Arg Lys Glu Leu Leu Lys Gly Asn Gly Arg Arg Ile Asp Tyr
595 600 605
Met Leu His Ala Glu Glu Gly Leu Cys Pro Asp Trp Lys Ala Glu Val
610 615 620
Glu Glu Phe Ser Phe Ile Thr Gln Leu Ser Gly Leu Thr Asp His Leu
625 630 635 640
Pro Val Ala Met Arg Leu Met Val Ser Ser Gly Glu Glu Glu Ala
645 650 655
<210> 12
<211> 7003
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (244)..(900)
<400> 12
actcgcagtc ctgacgggca ggggctgcgg accgcccggc cttggaccca tccggagcca 60
caggttggag gagataagta gctgtccccg tgctcatcgc cctgtggagc agatcctgtc 120
tccttgctga cggtggagcc cgggagttcc agggcttggg aaggggaagg aaacctctct 180
gaaatctgac acctgctctc ccggcaagga aacttcgcag gctgaccgac caagaccatc 240
act atg acc gat gga gac tat gat tat ctg atc aaa ctc ctg gcc 285
Met Thr Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Leu Ile Lys Leu Leu Ala
1 5 10
ctc ggg gat tca ggg gtg ggg aag aca aca ttt ctt tat aga tac aca 333
Leu Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Thr Thr Phe Leu Tyr Arg Tyr Thr
15 20 25 30
gat aat aaa ttc aat ccc aaa ttc atc act aca gta gga ata gac ttt 381
Asp Asn Lys Phe Asn Pro Lys Phe Ile Thr Thr Val Gly Ile Asp Phe
35 40 45
cgg gaa aaa cgt gtg gtt tat aat gca caa gga ccg aat gga tct tca 429
Arg Glu Lys Arg Val Val Tyr Asn Ala Gln Gly Pro Asn Gly Ser Ser
50 55 60
ggg aaa gca ttt aaa gtg cat ctt cag ctt tgg gac act gcg gga caa 477
Gly Lys Ala Phe Lys Val His Leu Gln Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln
65 70 75
gag cgg ttc cgg agt ctc acc act gca ttt ttc aga gac gcc atg ggc 525
Glu Arg Phe Arg Ser Leu Thr Thr Ala Phe Phe Arg Asp Ala Met Gly
80 85 90
ttc tta tta atg ttt gac ctc acc agt caa cag agc ttc tta aat gtc 573
Phe Leu Leu Met Phe Asp Leu Thr Ser Gln Gln Ser Phe Leu Asn Val
95 100 105 110
aga aac tgg atg agc caa ctg caa gca aat gct tat tgt gaa aat cca 621
Arg Asn Trp Met Ser Gln Leu Gln Ala Asn Ala Tyr Cys Glu Asn Pro
115 120 125
gat ata gta tta att ggc aac aag gca gac cta cca gat cag agg gaa 669
Asp Ile Val Leu Ile Gly Asn Lys Ala Asp Leu Pro Asp Gln Arg Glu
130 135 140
gtc aat gaa cgg caa gct cgg gaa ctg gct gac aaa tat ggc ata cca 717
Val Asn Glu Arg Gln Ala Arg Glu Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Ile Pro
145 150 155
tat ttt gaa aca agt gca gca act gga cag aat gtg gag aaa gct gta 765
Tyr Phe Glu Thr Ser Ala Ala Thr Gly Gln Asn Val Glu Lys Ala Val
160 165 170
gaa acc ctt ttg gac tta atc atg aag cga atg gaa cag tgt gtg gag 813
Glu Thr Leu Leu Asp Leu Ile Met Lys Arg Met Glu Gln Cys Val Glu
175 180 185 190
aag aca caa atc cct gat act gtc aat ggt gga aat tct gga aac ttg 861
Lys Thr Gln Ile Pro Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Ser Gly Asn Leu
195 200 205
gat ggg gaa aag cca cca gag aag aaa tgt atc tgc tag actctacata 910
Asp Gly Glu Lys Pro Pro Glu Lys Lys Cys Ile Cys
210 215
gaaactgaac atcaagaacc ccaccaaaat attactttta aaaacaatga caaaccacac 970
aattgttgtt gagtaaacca cgcacaatgg catgtctttc tttttctgcc agaaaatcta 1030
ttttaagaaa ccagaatagt caacagtgtt caaaagaatt gactagttat ccctgaggcc 1090
ctttcaaaca tgatcaaaga tttcccaatg tgatctcatc atcatggata ctcaatttgt 1150
tttttcttat agagaaaatg agtatataag acaatataca agaagaaata tcagtgagtt 1210
ttaaatcaga acaagttacc tgtcacattg aagaaaaggg taggcactaa agggagaaca 1270
cagaaagaag aatttctaaa atattggatt tacttcttat attgagtcag atgcatactt 1330
ttagatttgc attggggaaa atgtactagc taaaaatgga tacacaatga agaattctat 1390
ttggctaatt aagaatgata tactatgtac acccaataag ctgtactaga atgaataaat 1450
tactgataag gttacaaata ggtaaatgtc acacttctgt taaaatgcag gaggtagtgt 1510
cataatgccg tctttatatt cttaataaat agcactttga caagaacagg actgtaaatg 1570
atgaagtaca agacaaatac cctgggaaaa aaaatgaaag tatgagaaat tggcatttct 1630
acagctgaaa ttcaatgtat ctgttagaga tgtctggaag ggttacttag ccaaatttta 1690
ctcaagccaa ttaggagctg atattatcag ttggaattaa gagaactcca gaggtttcca 1750
tttcaaacaa aattttagaa attggtttgg tgttcagctt cacatttcat tttttcttag 1810
cacatgttga taaaatagtc acaaggagaa attaccagtt acggtttatt aaatctcttt 1870
taaaatgcag tcaaggaaaa ctagccttga atttttttta gataaaataa gatggtgata 1930
tgaaacaaaa agtggcaatt attgcaggtt tccttttagt ttacaaaagt actggaaact 1990
aaatcatatt tcttccctcc aaatttcacc cattcctgac tttgaatcaa ttgcagaaat 2050
gcaggtgtgt tactttgttg atcaataact ttggaacaat tatggatcaa ttctatggtc 2110
actctgaatt ttcatgtcat taatcacata aaaattgata atacctcatt ctgtattaca 2170
atatgatttt attttgccaa aggcaagaca cctatagttg agctgtattt tgggggattg 2230
ggtgaggaag gacttctgat cttatctcaa caaaaaactg gccagtattt ttgttaatgt 2290
aaagcttcct tttctttcta aaaaatagta acaaaattat ttttcattgg cctattctgt 2350
tcttgtgtct aaactaacat tacattaatt tttaatctta gtttctgata aacacaagcc 2410
attcctatca aaatattatt tatttcagtc aattttacca aataacaaag acaatatatt 2470
ttcgtttttt tttattatga gcatatgatt ttttgacagg ctgtttcctc gtcgtataga 2530
ttttttccaa tcaaacctac tttttccata ctctgtgcat attttttgtg aagttataca 2590
cattgaagac cctaaaaatc ccagtccatc attcagctta cctctgcgaa cttctatctg 2650
gtattgaatc agtttcagaa acacagacag atccaaggaa atgtctcttt ataatgttct 2710
taggatggac tagacccata aatgtgccat gaatcaaaat attaataatt tgaaagcttt 2770
catgctgtta gcccctgatg aaattctcag cattaactgg ccagctcctc tgatttctgc 2830
agcatcgcaa caggttcgaa gatgggttgt ggctgggtat tccctcccat ggtgtttcct 2890
ctgggatgct cttcattatc tcaatgcctg tgccatgaag atagaaaact gtaagctaac 2950
atttaagatg tttcttctgg aaggaaagtg agcaggaaca agttatattg ccactgctgt 3010
ggcaaatttt ggtgaacttt tggggtcatt atatcaattt tttctttgga ttcaaattgt 3070
aatgtcccct gcatttcctt aatagggaat gtgaaacctt tataaaactc taaaagtatt 3130
ctgttttgat atgtcttttt gtttctattc attttcagtt atatgattga tttacttatg 3190
ccaagattct gtcactgtca gttatttaat gagtgttttt tcagggtctg ttttaagatc 3250
attatttgat agctgtagca tgaagcagag gttgatgatg cccataattg caagactatt 3310
cctgtaaaaa taacaattat tgggtaataa cttcaagagg aatgagaagt gacaaaattg 3370
atttaaaata ttgttctact tataaataaa tgcttgatat aaaaaatttt ctccataaag 3430
tttgacatct gaccccagat tctatgtaat cattattaga aattccttct ctcattattt 3490
caggattagt agttctgtgt aattcatttt acaatttcaa attgttctgg tgccataaag 3550
tatacagact actttaaaga tttccaaatc ccctaattta ccccacaaca gcatgtaatt 3610
ttagccaaga tatgtcctgt tactaagtat ctcccaatgc tttagtaaaa cgtatttagg 3670
agaaatgttg aaaatgtaca tgaagctcct ttctgatata gaaaccattt ctggagtatt 3730
tacactggtt tgatgtttac attgctctaa ctcggtgcct cagatacctc tgtgaccaaa 3790
tttgtctcca accacatagc tcatttccta taatgttata tcataggaag ccctcacaga 3850
gacactaaca cagctaaaga tcttctgata ttatcagcaa gggatgcaag gactttattg 3910
gaatctggag agtttaactg ccttctcttg gtctcctcac ttacttctta tgaagttggc 3970
attacctgag actcttagct gtgattaggt acaagcttac cttttagggt agaaaaagaa 4030
agatcatttg aaaaatgtat ctaaaataat ccagagaaca taatgtttgt cttggtctga 4090
taatgataag aagtcaagga ttggcagaga aaatactaaa cgccaagagt tgagcctgtg 4150
ggtctctcca taagagtttt aaaactcttg ccagttacca ctttatccaa tttgctatca 4210
ttttcgtatt atcagctatc gccctgtaaa atattcaaaa ctagctattt ctaaagtaaa 4270
cattttatct gttactttta accagatagg tgtctttgtc atccttctac tataaattgt 4330
tctttgccaa cctgtacagg tagatgaacc aggcgagagt tttaatcagc cttttcttgt 4390
cccctttgta agaaagagat gcttgccata gagaaggaca tgagtacatt aaaaataatt 4450
taatagccac aatatgatgt tctttaagct gcaaattgag tacactggga atcaacaaat 4510
ttgatgaagc ctgtctgtct cttcaccagt ggagtgagtg cagcagttag aaagagaagc 4570
aatattgtgc aactggtgca gtggtgagtt aatcatagtg tataaccttg tgttcatgaa 4630
acaggttgtt cattgttctg catctctctt catttaaaaa ggatacacaa ttctttcctc 4690
attgcatatt acaccaaacg tttgagggaa aaatcctcat tcgtaaagga ttttggatgt 4750
ataatctaaa actcaacaat aaagaaataa tattccaagt ctctggtttc ctaagataca 4810
taataactgt ttataaagaa ggtctaagag ctgatatttg ccaaagtgat agaagagttg 4870
ttttttcctc tctactacca agctttaaga cattaaaaga agtctagtgt atttgaatat 4930
tttagagaaa gctttatcat tttttaagat gccaagatgc tgcctacgtt tgcaaaagtt 4990
gtctaagaat tcaccatgag ctatattttc ttctggatct ttgaccaagg tgatgtcagc 5050
ttatttctgg ggaaggtgtt gagctcttat acatgaaaat ggatataggc tattctctgg 5110
gatgagtgtc atttcaatgc tttataaatc catgaagctg cttgtctcat aaagtagaac 5170
tgatacaaat tttggttgga tatatagaga attttataaa tgtattgcct tagaatttct 5230
gggtggagac ccaactacaa tgacattgtc atgccagaac tataaagata attagagtta 5290
aaagttgttt aaattgtgcc cttaaataca gcagaacctg gagaaggtca tacttcaaag 5350
gtcgattttg agtccgaata aagaaagacc tagtaacaga tagttttttt ttgttcattt 5410
tcttctacca agtagaggtt tatgccctca gaactaaact agtaaaaata tctgaacaaa 5470
aaacctttcg ttgttggcat aaaaatgtga tacacttaga gacattttgt ttattgcata 5530
taaatctaat ttttccataa attagattta tgatattttc ataaagcact tgattagttt 5590
ttcaaggcgt accatcacaa agatgctttc ctgcagagtt ctttgtatca acagcctatg 5650
gttgagatgt tttctcattt cctgtagaga gagaatacca ctaacaaaca aacaaaaact 5710
ttagtgccaa aatagtggaa ctattttgtc atcttttgag aaaaaaatat acaaagaagt 5770
catcttttca ttaagtggat tccctggttc ctttccagct ggttgtggaa gtaatggcta 5830
acatccttca gctgactttg tctacaagga ttattagcaa attctgtagg agcaagcatg 5890
tctgacctta acttaatgga tcccttattc aatcagtggc ttctgtcttt atgtctgttg 5950
gcatatcaaa atggtttctg ttcctagaaa agtaataaca tatgcttatc tttattcttt 6010
ttccaggtga ttttgttttc aaatgctcct tgtgaaaaca cctagtgttg tagaaaggaa 6070
agtggccaga aagaacaact tgggaccatg agtaggtcat taaatagctt agtgatttat 6130
cctcatatag ggcttataaa ccctgtatgt gtttatatgt gcttcacaga gttcgtgtca 6190
ggctcaaagg agatatgtat aagaaagtgg tttgtaaatt atgttccatt tcataaatag 6250
acactattca caaactaaaa tctaataaaa aaccacagtt gtaatttaaa ctgcttgata 6310
taaaaagagg tatcatagca gggaaaacac actaattttc atacagtaga ggtattgaaa 6370
actgaaaatg ggaaggcaac ttgaagtcat tgtatttgat tgaaaatgtt taatacatct 6430
cattattgac aaaatatgtc atcttgtatt tatttcaagg aaaccaatga attctaggta 6490
gtatattaca agttggtcaa aatattccat gtacaaatag ggcttctgtg tccatagcct 6550
tgtaagagat actgattgta tctgaaatta ttttttaaaa aaataaatta tcctgcttta 6610
gttagtgtgt taaaagtaga cgatgttcta atataacact gaagtgcttc attgtatccc 6670
aacagtttac cttcaagtaa tattatcttt atttttaggc taagcacgtt tgattatttt 6730
gtctgtctcc tatatagatc tgttttgtct agtgctatga atgtaactta aaactataaa 6790
cttgaagttt ttattctata tgccccttaa tagactgtgg ttcctgacgc acactgttag 6850
gtcattattt tgttgtacca aagttctagt ggcttcagaa atcatagcat ccaatgattt 6910
tttggtgtct ggctatgaat actatggttg agaattgtat tcagtgattg tttctgcaca 6970
cttttcaaat aaaaaatgaa tttttatcaa tta 7003
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
Met Thr Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Leu Ile Lys Leu Leu Ala Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Gly Val Gly Lys Thr Thr Phe Leu Tyr Arg Tyr Thr Asp Asn
20 25 30
Lys Phe Asn Pro Lys Phe Ile Thr Thr Val Gly Ile Asp Phe Arg Glu
35 40 45
Lys Arg Val Val Tyr Asn Ala Gln Gly Pro Asn Gly Ser Ser Gly Lys
50 55 60
Ala Phe Lys Val His Leu Gln Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg
65 70 75 80
Phe Arg Ser Leu Thr Thr Ala Phe Phe Arg Asp Ala Met Gly Phe Leu
85 90 95
Leu Met Phe Asp Leu Thr Ser Gln Gln Ser Phe Leu Asn Val Arg Asn
100 105 110
Trp Met Ser Gln Leu Gln Ala Asn Ala Tyr Cys Glu Asn Pro Asp Ile
115 120 125
Val Leu Ile Gly Asn Lys Ala Asp Leu Pro Asp Gln Arg Glu Val Asn
130 135 140
Glu Arg Gln Ala Arg Glu Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Ile Pro Tyr Phe
145 150 155 160
Glu Thr Ser Ala Ala Thr Gly Gln Asn Val Glu Lys Ala Val Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Asp Leu Ile Met Lys Arg Met Glu Gln Cys Val Glu Lys Thr
180 185 190
Gln Ile Pro Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Ser Gly Asn Leu Asp Gly
195 200 205
Glu Lys Pro Pro Glu Lys Lys Cys Ile Cys
210 215
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 猕猴属(Macaca arctoides)
<400> 14
ttgatgtaca gccttgaatg tgaataatta ttgtaaacta tat 43
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 15
ttgatgtaca gccttgaatg tgaataatta ttgtaaacta tat 43
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 正向引物（forward primer）
<400> 16
aactcgagaa tgctggctat tgttggcctc 30
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> 反向引物（Reverse primer）
<400> 17
aagcggccgc aagattaaat cactgaccca atag 34

Claims (17)

1.一种与miR-181c特异性结合的核酸在用于提供用于诊断脑转移的信息的方法的试剂盒的制备中的用途，所述方法包括：
对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。
2.一种与miR-181c特异性结合的核酸在用于提供用于诊断受试癌症患者的脑转移的信息的方法的试剂盒的制备中的用途，所述方法包括：
确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤，
根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者的脑转移的步骤，
其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者具有脑转移的信息。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，上述受试癌症患者是IV期癌症患者。
4.根据权利要求2所述的用途，其中，上述受试癌症患者是IV期癌症患者。
5.一种与miR-181c特异性结合的核酸在用于提供用于评估脑转移的风险的信息的方法的试剂盒的制备中的用途，所述方法包括：
对受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平进行测定。
6.一种与miR-181c特异性结合的核酸在用于提供用于评估受试癌症患者发生脑转移的风险的信息的方法的试剂盒的制备中的用途，所述方法包括：
确定上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平的步骤；
根据所确定的miR-181c水平判定上述受试癌症患者发生脑转移的风险的步骤；
其中，在上述受试癌症患者来源的样本中的miR-181c水平高于阴性比较对象来源的样本中的miR-181c水平时，提供上述受试癌症患者发生脑转移的风险高的信息。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，上述受试癌症患者是I～III期癌症患者。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，上述受试癌症患者是I～III期癌症患者。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，上述受试癌症患者是乳腺癌患者。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，上述阴性比较对象是没有发生脑转移的癌症患者或健康人。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，上述样本为血液。
12.根据权利要求1～8中任一项所述的用途，其中，样本中的miR-181c是从样本中的细胞外囊泡提取出的miR-181c。
13.与miR-181c特异性结合的核酸在用于脑转移的诊断或风险评估的药物的制备中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，上述与miR-181c特异性结合的核酸是至少一部分具有人工设计的序列的核酸。
15.根据权利要求13～14中任一项所述的用途，其中，与miR-181c特异性结合的核酸经过了标记。
16.一种药物组合物在用于抑制脑转移的药物的制备中的用途，所述药物组合物含有miR-181c的表达抑制剂或miR-181c的活性抑制剂、且任选含有外来体分泌抑制剂作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述miR-181c的表达抑制剂或miR-181c的活性抑制剂是选自下组中的药物：
(i)针对pri-miR-181c或pre-miR-181c的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；
(ii)miR-181c的反义寡核苷酸、与miR-181c特异性结合的适配子、针对miR-181c的siRNA、或miR-181c的miRNA模拟物；
所述外来体分泌抑制剂是选自下组中的药物：
(iii)针对nSMase2基因和/或RAB27B基因的反义寡核苷酸、适配子、或siRNA；或者，
(iv)针对nSMase2和/或RAB27B的抗体或其免疫反应性片段；与nSMase2和/或RAB27B特异性结合的肽模拟物、或适配子；或者，nSMase2和/或RAB27B的拮抗剂。
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