CN104411825B - 骨膜蛋白适配体及包含其的抗癌组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及特异性结合癌症相关蛋白骨膜蛋白的DNA适配体、包含其作为活性成分的用于抑制癌症和/或癌症转移的组合物和/或用于诊断癌症和/或癌症转移的组合物，其中所述适配体具有与现有抗体不同的结合机制，并因此，可更有效地抑制和诊断癌症/癌症转移。

Description

骨膜蛋白适配体及包含其的抗癌组合物
技术领域
本发明涉及特异性结合癌症相关蛋白骨膜蛋白的DNA适配体(aptamer)、包含其作为活性成分的用于抑制癌症和/或癌症转移的组合物和/或用于诊断癌症和/或癌症转移的组合物。
发明背景
实体癌向浸润性肿瘤的进展是转移的主要先决条件，并包括细胞形态和运动等的变化。尽管癌细胞的基因修饰取决于转移性癌症的类型而不同，但其导致的共同结果是癌细胞从其起源的器官分离并分散到不同器官。在这种肿瘤微环境下，癌细胞和癌症相关细胞分泌多种生长因子、血管生成因子和蛋白酶，且它们引起癌症生长和血管生成和分解胞外基质，以促进癌细胞侵袭和转移。另外，骨桥蛋白(OPN)、韧黏素-C和基质细胞蛋白有助于肿瘤转移，并调节正常或肿瘤干细胞的维持和扩张及肿瘤转移微环境(metastaticniche)。作为靶向癌症进展的特定阶段的替代选择，可以考虑选择在癌症发展的多个阶段执行重要功能的分子并靶向其。在这些分子中，骨膜蛋白被认为是调节细胞粘附以及细胞与基质相互作用的重要蛋白。
骨膜蛋白是一种胞外基质蛋白，且其是参与细胞粘附的分泌蛋白，作为细胞因子并通过细胞粘附分子整联蛋白αvβ3和αvβ5转导信号。最初，其被发现作为成骨细胞特异性因子，并在骨组织的骨膜中高表达。由于骨膜蛋白在多种上皮癌诸如乳腺癌中过表达，并且功能与恶性进展的关键阶段诸如转移和血管生成有关，最近骨膜蛋白日渐引起人们的兴趣。尽管骨膜蛋白在正常乳腺细胞系中不表达，但表达在乳腺癌的情况下特异性增加。并且，骨膜蛋白是转移性定殖、促进细胞存活、血管生成、以及肿瘤干细胞的维持过程中的重要限制因子。很多临床研究显示骨膜蛋白的过表达以及骨膜蛋白血清浓度的增加与转移性肿瘤生长和差的预后有关。另外，骨膜蛋白是转移性定殖过程中促进细胞存活、血管生成以及肿瘤干细胞维持的重要限制因子。因此骨膜蛋白被证实是与肿瘤生长和转移的抑制相关的有前景的候选物质。
近20年来，生物靶向疗法已成为癌症治疗的主流。与甚至对正常细胞也表现出毒性的现有疗法相比，靶向疗法作为更有效的疗法受到关注，因为其是更特异的且具有对正常细胞的低毒性。基于核酸的适配体作为靶向治疗分子正在不断增加。适配体是单链DNA或RNA，且非常紧密并特异性地结合靶分子。适配体通过被称作SELEX(指数富集的配基系统进化技术，Systematic evlution of ligands by exponential enrichment)的重复筛选方法发展，且其选择性地识别其靶，并使用特定的三维结构与其结合。适配体可通过与靶的直接结合来调节蛋白靶的功能。由于短的核酸的特性，与其他的治疗手段相比，适配体具有改善的稳定性、便于制备和修饰、低免疫原性和低毒性等方面的优势。因此，适配体的价值在于被识别为基于低分子和抗体的疗法的替代选择。
因此，对开发骨膜蛋白作为有前景的抗癌靶、与其特异性结合的适配体、以及使用所述适配体的抗癌治疗技术存在日益增加的需求。
公开内容
技术问题
因此，本发明的一个实施方案提供了与骨膜蛋白特异性结合并包含修饰的碱基的骨膜蛋白适配体，所述修饰的碱基在dU(脱氧尿嘧啶)的5-位置处被选自由以下组成的组的疏水性官能团取代：萘基、苄基、吡咯苄基、和色氨酸。
另一个实施方案提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含骨膜蛋白适配体作为活性成分；用于治疗癌症的方法，所述方法包含对需要治疗癌症的患者施用药学上有效量的骨膜蛋白适配体的步骤；以及骨膜蛋白适配体用于治疗癌症的用途。
又另一个实施方案提供了用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含骨膜蛋白适配体作为活性成分；以及骨膜蛋白适配体用于诊断癌症的用途。
又另一个实施方案提供了用于利用骨膜蛋白适配体提供关于癌症诊断的信息的方法。
技术方案
本发明人开发了称为PNDA-3的修饰的DNA适配体并完成了本发明，所述PNDA-3可以以高亲和力与癌细胞分泌的骨膜蛋白结合。还证实了PDNA-3阻断整联蛋白(αvβ3和αvβ5)与骨膜蛋白之间的相互作用，并抑制骨膜蛋白的生物功能。本文提供的数据显示结合骨膜蛋白的PNDA-3抑制乳腺癌细胞中的粘附、迁移、和侵袭能力，降低整联蛋白αvβ3-和αvβ5-依赖的信号转导途径的活化，并阻断细胞表面受体的相互作用。还证实了PNDA-3的施用降低了乳腺癌转移小鼠模型中乳腺癌的生长、转移和血管生成。因此，本发明的适配体可用作抗癌物质，用于抑制实体癌诸如乳腺癌的生长和/或转移。
本发明的一个目的是提供与同癌症发展和转移相关的骨膜蛋白高度特异性结合的骨膜蛋白适配体，从而抑制癌症和/或癌症转移或使得能够诊断癌症；以及包含所述适配体作为活性成分的癌症和/或癌症转移的抑制剂和癌症诊断剂。
本发明提供了特异性结合骨膜蛋白的DNA适配体、包含其作为活性成分的癌症或癌症转移的抑制剂或用于诊断癌症或癌症转移的组合物；以及利用其用于抑制(治疗)癌症或癌症转移的方法和用于诊断癌症的方法。
骨膜蛋白可来源于哺乳动物优选人类，并且例如其可以是登录号NP_Q15063-人类、NP_056599-小鼠、NP_001102020.1-大鼠等，例如NP_Q15063-人类(人类骨膜蛋白)。
骨膜蛋白适配体可包含修饰的碱基，其可具有25至100、优选30至80、更优选35至50的包含修饰的碱基的总的碱基长度，且其特异性结合骨膜蛋白。在本发明的骨膜蛋白适配体中，除非另有说明，除了修饰的碱基之外的碱基选自由以下组成的组：A、G、C、T、以及其脱氧形式(例如，2’-脱氧形式)。
修饰的碱基指dU(脱氧尿嘧啶)的5-位置处被疏水性官能团取代的修饰形式，并且其可被用于代替碱基‘T’。疏水性官能团可以是选自由以下组成的组的至少一种：萘基、苄基、吡咯苄基、和色氨酸等。如此，由于dU的5-位置被疏水性官能团取代并修饰，与骨膜蛋白的亲和力与未修饰的情况相比显著增加。
骨膜蛋白适配体中修饰的碱基数目可以是5至20、优选10至17。
在具体实施方案中，骨膜蛋白适配体可具有25至80、优选30至65、更优选35至50的总的碱基长度，包含选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:40(核酸序列中的‘n’是修饰的碱基或‘T’，特别地是修饰的碱基)组成的组的至少一个核苷酸序列。
在具体实施方案中，骨膜蛋白适配体可仅由选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:40组成的组的至少一个核苷酸序列组成，或者其还可在核苷酸序列的5’端、3’端或两端包括由3至25、特别地5至20个碱基组成的核苷酸序列，因此具有30至120、35至100或45至90的总的碱基长度。还被包含在5’端、3’端或两端的核苷酸序列可选自由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:4组成的组。例如，骨膜蛋白适配体可在选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:40组成的组的至少一个核苷酸序列的5’端包含ACGAG(SEQ ID NO:1)、在3’端包含AACAA(SEQ ID NO:2)，或者其可在5’端包含GATGTGAGTGTGTGACGAG(SEQ ID NO:3)并在3’端包含AACAACAGAACAAGGAAAGG(SEQ ID NO:4)，但并不仅限于此。
在具体实施方案中，本发明的骨膜蛋白适配体可具有以下SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:46的核苷酸序列：
5’-ACGAG-[N]-AACAA-3’(SEQ ID NO:45)
(N是适配体的可变核心序列，并由25至80、优选30至65个、更优选35至50个碱基组成，且各碱基独立地选自由A、C、G、其脱氧形式以及修饰的碱基组成的组，所述修饰的碱基在dU(脱氧尿嘧啶)的5’-位置被疏水性官能团(例如选自由萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸组成的组中的至少一种)取代)。
5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO:46)
(N是适配体的可变核心序列，并由25至80、优选30至65个、更优选35至50个碱基组成，且每个碱基独立地选自由A、C、G、其脱氧形式以及在dU(脱氧尿嘧啶)的5’-位置被疏水性官能团(例如选自由萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸组成的组中的至少一种)取代)的修饰的碱基组成的组。
如以上说明的，N可选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:40组成的组。
在本文描述的核苷酸序列中以及在所附的核苷酸序列(SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:44)中，除非另有说明，‘n’指‘T’或在5’位置被疏水性官能团取代的dU(脱氧尿嘧啶)的修饰形式、优选在5-位置被疏水性官能团取代的dU(脱氧尿嘧啶)的修饰形式。疏水性官能团是选自由苄基、萘基、吡咯苄基、色氨酸等组成的组的至少一种。
而且，骨膜蛋白适配体可在5’端、3’端或两端被修饰以提高血清稳定性(参见实施例2、3和4)。骨膜蛋白适配体可通过在5’端、3’端或两端结合选自由以下组成的组的至少一种被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷，inverted deoxythymidine)、LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头(linker)、硫醇接头、和胆固醇等。在优选的实施方案中，骨膜蛋白适配体可包含附着于5’端的PEG(聚乙二醇；例如分子量为500-50,000Da)、附着于3’端的idT(反向脱氧胸苷)、或者附着于5’端的PEG(例如，分子量为500-50,000Da)和附着于3’端的idT(反向脱氧胸苷)。
idT(反向脱氧胸苷)是用于防止具有低核酸酶耐受性的适配体被核酸酶分解的分子之一。尽管核酸单位结合前一个单位的3’-OH与后一个单位的5’-OH而形成链，但是idT结合前一个单位的3’-OH与后一个单位的3’-OH，导致人工改变，使得5’-OH而非3’-OH外露，从而抑制了一种核酸酶3’外切核酸酶的分解。
证实了本发明的骨膜蛋白适配体表现出用于抑制癌细胞粘附、迁移和侵袭以及生长的显著效应(参见实施例5至8)。
因此，另一个实施方案提供了用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的药物组合物，该药物组合物包含上述骨膜蛋白适配体作为活性成分。药物组合物还可包含药学上可接受的载体。又另一个实施方案提供了用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的方法，该方法包括对需要治疗癌症和/或抑制癌症转移的患者施用药学上有效量的上述骨膜蛋白适配体的步骤。该方法还可在施用步骤前包括确认患者需要治疗癌症和/或抑制癌症转移的步骤。又另一个实施方案提供了上述骨膜蛋白适配体用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的用途。
骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物可被配制成不同的剂型，用于口服施用或肠胃外施用。
例如，其可被配制成任何剂型用于口服施用，诸如片剂、药丸、硬/软胶囊、液体、混悬剂、乳剂、糖浆、颗粒剂、酏剂等。用于口服施用的剂型除了包含活性成分之外，还可根据各剂型的常见组成包含药学上可接受的载体诸如稀释剂诸如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、和/或甘氨酸，或助滑剂(slip modifier)诸如二氧化硅、滑石、硬脂酸、和其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。
而且，如果用于口服施用的剂型是片剂，其可包含粘合剂诸如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮等，并且如果有必要，可包含崩解剂诸如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐、或恒沸混合物(a boiling mixture)和/或吸收剂、着色剂、增味剂、或甜味剂等。
而且，如果骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物被配制成用于肠胃外施用的剂型，其可通过肠胃外施用途径诸如皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸腔注射等被施用。为了配制为用于肠胃外施用的剂型，药物组合物可在水中与活性成分即骨膜蛋白适配体以及稳定剂或缓冲剂一起混合以制备溶液或悬液，并且溶液或悬液可被制备成安瓿或小瓶的单位剂型。
而且，药物组合物可被灭菌，或另外包含佐剂诸如防腐剂、稳定剂、水分散粉末(water dispersible powder)、或乳化剂、用于调节渗透压的盐、和/或缓冲液等，且还可包含其他治疗上有用的材料，且其可通过混合、制粒或包衣的常规方法来配制。
而且，术语“药学上有效量”指能够表现出预期作用即预防和/或治疗癌症、或抑制癌症转移的作用的活性成分的量。活性成分即骨膜蛋白适配体可以以每天0.1至500mg/kg(体重)、优选0.5至100mg/kg(体重)的有效量包含在药物组合物中，且药物组合物可被分成每天两次或更多次并通过口服或肠胃外途径施用。
通过本发明的骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物可被治疗的或其转移可被抑制的癌症可包括所有种类的癌症，并例如，其可以是选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、以及胶质母细胞瘤组成的组中的至少一种。
本发明的骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物的施用对象可以是哺乳动物包括人类，且优选地，其可以是啮齿动物或人类。
而且，由于在患有多种实体癌包括乳腺癌和结直肠癌以及癌症转移的患者中观察到骨膜蛋白的过表达，骨膜蛋白适配体可用作用于诊断癌症和/或癌症转移的组合物。
根据另一个实施方案，提供了骨膜蛋白适配体用于诊断癌症和/或癌症转移的用途，和用于利用骨膜蛋白适配体提供关于癌症和/或癌症转移的诊断的信息的方法。
用于提供关于癌症诊断信息的方法包括：
使患者的生物样品与骨膜蛋白适配体反应；以及
测量生物样品中骨膜蛋白适配体的结合程度，
其中如果患者生物样品中骨膜蛋白适配体的结合程度高于正常样品，则患者被判断为癌症患者。因此，该方法还可包括测量正常样品中骨膜蛋白适配体的结合程度的步骤。
患者可以是哺乳动物包括人类，优选地啮齿动物或人类，且这意味着其中癌症发展或癌症转移的受试者被判断出。
可由该方法提供其诊断信息的癌症可包括所有种类的癌症，并例如，其可以是选自由乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、以及胶质母细胞瘤组成的组中的至少一种。
正常样品可获自哺乳动物包括人类，优选地啮齿动物或人类，且这意味着从不具有其诊断信息被提供的癌症，例如选自由以下组成的组的癌症发展的受试者获得的生物样品：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、以及胶质母细胞瘤。
生物样品可以是除了人类以外的哺乳动物身体、从哺乳动物包括人类分离的细胞、组织、血液、唾液等。
在生物样品中测量骨膜蛋白适配体结合程度的步骤可通过相关技术领域内通常使用的DNA适配体结合测量技术进行，并例如，骨膜蛋白适配体的末端可用荧光或放射性物质标记或与生物素连接以测量荧光或放射性强度，或者可对其成像并观察，但并不限于此。
根据一个具体实施方案，在这些骨膜蛋白适配体中，选择具有与骨膜蛋白的不同结合区域并且不会妨碍彼此结合的一对适配体，将一个固定在基质上(捕获适配体(capture aptamer))，并将另一个(检测适配体(detection aptamer))的末端用荧光或放射性物质标记(或者与能够发生荧光或放射性反应的物质结合)，并测量强度，从而测量样品中是否存在骨膜蛋白或者骨膜蛋白是否过表达。
如此，当使用适配体证实样品中存在骨膜蛋白或骨膜蛋白过表达时，与使用现有抗体的检测相比，显示非常出色的灵敏度。本发明的结合骨膜蛋白并抑制活性的新DNA适配体，还结合纯化的蛋白以及癌细胞表面表达的骨膜蛋白(Kd≒1nM)。本发明的适配体还可结合小鼠骨膜蛋白和与骨膜蛋白具有结构相似性的其他蛋白诸如βIG-H3。本发明的适配体可特异性结合细胞表面的所有种类的细胞表达骨膜蛋白，并抑制骨膜蛋白介导的信号通路。而且，证实本发明的适配体有效抑制实体癌诸如乳腺癌的粘附、迁移和侵袭。数据强烈显示了本发明的适配体在骨膜蛋白靶向的治疗和诊断中的多种生物医学应用。
乳腺癌是最常见的癌症，并且是癌症死亡的第二原因。癌症转移是癌症相关死亡的主要原因。特别地，大部分乳腺癌患者通常在转移进展后才被诊断出，并且不管是手术还是化学疗法都显示约80％的复发率。因此，治疗癌症转移是癌症治疗的主要目标。癌细胞应克服多种压力和限速步骤，使得转移在新器官的微环境中生长。已知癌细胞中过表达的分子诸如骨膜蛋白促进转移和恶性肿瘤的进展。骨膜蛋白被认为是治疗实体癌诸如乳腺癌的重要靶，因为其在血管生成和转移中执行重要功能并作为胞外基质蛋白具有好的可及性。一些骨膜蛋白的抗体已被建议作为抗癌剂或放射性同位素载体以及人类癌症包括转移的治疗策略。特别地，靶向骨膜蛋白的抗体体外影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭和粘附，并且体内具有抗增殖和抗转移作用。然而，由于这些抗体具有低亲和力(uM范围的Kd)，以及不期望的药代动力学性质(例如，具有低的肿瘤侵袭能力并很快被清除)，它们在应用于靶向递送方面具有局限性，并因此，开发具有改善的药代动力学性质和血清稳定性的高亲和力分子变得越来越重要。
同时，DNA适配体可化学合成，并容易被修饰用于体内应用，并且具有出色的肿瘤组织渗透性。因此，DNA适配体作为抗癌分子具有多种优势。由于天然寡核苷酸对核酸酶的水解敏感，磷酸骨架的稳定性是DNA适配体生物医学应用的主要问题。尽管DNA适配体被中性基团诸如甲基磷酸酯和氨基磷酸酯修饰以提高核酸酶耐受性，但是相比未修饰的DNA适配体，修饰的DNA适配体显示较低的结合亲和力。为了提高结合亲和力并抵消缓慢的解离速率，使用多种官能团修饰的核苷酸进行SELEX。得到的数据显示用苄基修饰的DNA适配体显示与骨膜蛋白的高亲和力(1nM)，且交叉反应性被最小化。由于纯化的蛋白和内源蛋白之间潜在的形态差异，当体内应用时选择的适配体不能总是与靶蛋白结合。所以，为了鉴定显示体内活性的适配体，有必要将体内相关条件整合入筛选过程。本发明的新骨膜蛋白DNA适配体(PNDA-3)特异性结合乳腺癌细胞表面表达的骨膜蛋白，同时其不结合骨膜蛋白阴性的细胞系。基于细胞的方法的主要风险是用于筛选的细胞的起源生物体的物种，且用于确认体内结合的测试动物模型的物种彼此不同。尽管用于配体筛选的人类细胞或人类细胞系的使用符合最终的生物医学应用，配体与靶分子的结合特异性和亲和力未能在测试动物模型中充分证明，并且未能进行临床前研究。因此，在本发明中，测试了适配体与具有结构同质性(homogeneity)的不同蛋白的结合。尽管人类和小鼠之间存在物种差异，适配体结合两种类型的蛋白，其被认为是由于人类骨膜蛋白和小鼠骨膜蛋白之间的高序列和结构同质性(92％)。如此，由于适配体与骨膜蛋白的结合不依赖于物种，配体的性质可在多种小鼠疾病模型中被证实并提供用于生物医学使用。在人类中，已知四种蛋白包含fas-1结构域。βIG-3H和骨膜蛋白是具有4个fas-1结构域的分泌蛋白，且stabilin-1和stabilin-2是具有7个fas-1结构域的膜蛋白。尽管这些蛋白的生物学功能未被完全认知，由于所有fas-1结构域都包含整联蛋白相互作用的酪氨酸-组氨酸(YH)基序(integrin-interactive tyrosine-hystidine(YH)motif)，表明行使调节细胞-基质相互作用功能的可能性。本发明的适配体阻断骨膜蛋白与整联蛋白的相互作用。通过完全抑制骨膜蛋白与细胞系表面的整联蛋白的结合并抑制相互作用，本发明的适配体功能上阻断骨膜蛋白的作用。
而且，本发明的分离的适配体可用于诊断骨膜蛋白介导的转移或分子水平的成像。适配体特异性结合小鼠骨膜蛋白以及人类骨膜蛋白。在来源于正常乳腺组织或正常乳腺上皮细胞的永生化细胞系中，未检测到骨膜蛋白的表达。然而，根据基因阵列数据和蛋白质组分析数据，与正常乳腺组织相比，在大多数乳腺癌样品中骨膜蛋白的表达增加20倍或更多。而且，在具有骨转移的乳腺癌患者的情况下，骨膜蛋白的血清浓度显著增加。因此，该适配体可有效地用于癌症患者中转移可能性和癌症预后的体外测量。在本发明中，生物素标记的适配体可被用于从多种蛋白混合物中特异性检测骨膜蛋白。而且，荧光物质(Cy3-)结合的适配体可特异性检测从乳腺癌转移的小鼠模型和实际的乳腺癌患者分离的组织中的骨膜蛋白。与抗体相比，本发明的DNA适配体显示被肿瘤(＝>肿瘤细胞)的快速吸收、更快速的血液清除、和更持久的肿瘤保留，因此使能够以高的肿瘤与血液的比显著成像。因此，本发明的适配体可有效用于肿瘤转移的身体微环境中骨膜蛋白分泌细胞的体内成像。
分泌的骨膜蛋白作为用于通过细胞粘附蛋白和细胞粘附分子(αvβ3和αvβ5整联蛋白)进行信号转导的细胞因子。骨膜蛋白促进EGFR(表皮生长因子受体)的募集和Akt/PKB和FAK-介导的信号传导通路的激活。本发明的适配体通过抑制骨膜蛋白与整联蛋白的结合来抑制细胞内信号的激活。在本发明中，通过TIR荧光显微镜证实适配体结合细胞表面表达的骨膜蛋白，并抑制与整联蛋白的相互作用。而且，根据利用结构域缺失的突变体蛋白证实结合能力的结果，可以看出适配体结合fas-1结构域，其对与整联蛋白的结合是重要的。
整联蛋白αvβ3和αvβ5的刺激激活PI-3激酶和FAK介导的信号传导通路。一致地，在乳腺癌细胞系4T1和MDA-MB-231中，适配体强烈地减弱由骨膜蛋白引起的FAK和Src的磷酸化。已报道骨膜蛋白通过整联蛋白αvβ3激活Akt/PKB信号传导通路以促进结肠癌中癌细胞存活。然而，本发明适配体的治疗不会影响Akt磷酸化和细胞存活。因此，可以解释，适配体的FAK和Src磷酸化抑制能力是由于抑制骨膜蛋白-整联蛋白复合物的形成。
已报道了关于骨膜蛋白在癌细胞增殖中作用的多种结果。结直肠癌细胞和胆管癌细胞的增殖受重组骨膜蛋白的增加诱导。相反，卵巢癌细胞系和乳腺癌细胞系中骨膜蛋白的异常表达对细胞增殖无影响，或更确切地说抑制细胞增殖。最近利用胰腺癌细胞的研究结果表明，骨膜蛋白可在肿瘤发生过程中发挥双向影响。本发明展示的体外细胞增殖数据显示，本发明的适配体对细胞增殖无影响，其意味着骨膜蛋白在乳腺癌中并不是促增殖因子。
骨膜蛋白的过表达影响转移相关的功能以及癌症生长。临床数据显示在很多晚期癌症患者中发现骨膜蛋白的过表达，且这也与患者的差的预后相关。而且，如果向小鼠模型中注射骨膜蛋白过表达癌细胞系，则观察到癌症转移的促进。最近，有报道称，对应于转移起始的EMT(上皮-间质转化)过程受骨膜蛋白调节。骨膜蛋白促进癌细胞粘附、迁移和侵袭，其是癌症转移的主要功能。在本发明中，已证实骨膜蛋白诱导的癌细胞粘附、迁移和侵袭被骨膜蛋白适配体处理抑制。换言之，该适配体具有抑制癌症转移的功能。
总之，该适配体可用作设计新种类的抗癌剂的先导化合物，且其可被添加至靶向骨膜蛋白过表达癌症的抑制剂的储备(repertory)。本发明首次表明抑制骨膜蛋白功能的适配体在乳腺癌转移中具有显著的抑制作用。
发明的有益效果
本发明提供的骨膜蛋白适配体抑制骨膜蛋白和整联蛋白的相互作用，以阻断信号传导通路，并抑制癌细胞粘附、增殖、迁移、和侵袭，并因此，其可有效用作抗癌剂和/或用于诊断癌症。
附图说明
图1显示了根据一个实施例骨膜蛋白DNA适配体(PDNA)与骨膜蛋白的结合能力，并显示了利用32P-标记的PNDA和不同浓度的人类重组骨膜蛋白(直至100nM)测量的结合亲和力的结果。
图2显示了根据一个实施例PNDA与骨膜蛋白的特异性相互作用，其中2A是显示PNDA竞争性结合重组人类骨膜蛋白(rhPN)的图，2B是显示适配体与结构相似的蛋白的结合特异性的结果，以及2C和2D是显示利用生物素结合的PDNA只能从不同的蛋白复合物集合中特异性检测骨膜蛋白，并且这一反应是浓度依赖性的。
图3显示了根据一个实施例PNDA结合细胞表面上表达的骨膜蛋白并抑制与整联蛋白的相互作用，其中3A是显示适配体结合骨膜蛋白阳性细胞系4T1的结果，3B是骨膜蛋白阴性细胞系MCF7的结果，以及3C是显示PNDA抑制骨膜蛋白和整联蛋白相互作用的TIR荧光显微镜结果。
图4A和4B是显示根据一个实施例PNDA结合骨膜蛋白fas-1结构域的结果。
图5显示根据一个实施例PNDA对乳腺癌细胞粘附、迁移和侵袭的抑制作用，其中5A是细胞粘附测定的结果，5B是显示PNDA对乳腺癌细胞迁移的作用的结果，5C是Matrigel侵袭测定的结果，且5D是证实PNDA对用于实验的乳腺癌细胞系毒性的结果。
图6显示了根据一个实施例PNDA对骨膜蛋白依赖的信号通路的抑制，其中6A是在4T1细胞中的结果，且6B是在MDA-MB-231细胞中的结果。
图7示意性地显示了根据一个实施例的PNDA的功能。
图8A至8E显示了根据一个实施例PNDA的乳腺癌细胞生长和转移抑制的体内结果，其中8A是显示根据PNDA处理的肿瘤大小变化的图，8B是显示根据PNDA处理的小鼠模型的体重变化的图，8C是显示根据PNDA处理的乳腺癌向肺部转移的抑制的照片(箭头指示结节(nodule))，8D是定量8C的肺部结节的图，且8E是显示根据PNDA处理的肺组织H&E染色的显微镜照片。
图9A至9C显示了根据一个实施例PNDA对肿瘤细胞生长和血管生成的体内作用，其中9A是显示根据PNDA处理的原发性肿瘤切片的免疫染色结果的显微镜照片，且9B和9C是定量显示利用Ki-67抗体(9B)和CD31抗体(9C)的免疫组织化学实验结果的图。
实施发明的方式
下文将参考实施例、比较实施例和实验实施例详细解释本发明。然而，提供这些实施例、比较实施例和实验实施例仅帮助理解本发明，且本发明的范畴和范围不限于此。
参考实施例
抗体和试剂的准备
人类骨膜蛋白和小鼠骨膜蛋白购买自R&D system(Minneapolie,MN)。整联蛋白αvβ3和αvβ5抗体购买自Millipore(Temecula,CA,USA)。蛋白质印迹使用的抗体如下：Anti-ERK、phosphor-ERK、AKT、phosphor-AKT、FAK、phosphor-FAK、SRC、phosphor-SRC Ab(cellsignaling,Beverly,MA)、β-肌动蛋白Ab(Santa Cruz Biotechmology,Snata Cruz,CA)。
细胞培养
MCF7、MDA-MB-231人类乳腺癌细胞系、4T1小鼠乳腺癌细胞系、以及人类胚肾细胞293T从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(Manassas,VA,USA)获得。MCF7细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)、盘尼西林(100单位/ml，Gibco)、和链霉素(100单位/ml，Gibco)的RPMI-1640(Lonza)培养基中于37℃和5％CO2条件下培养。MDA-MB-231、HEK 293T、4T1细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)、盘尼西林(100单位/ml)、和链霉素(100单位/ml)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，Lonza)中于37℃和5％CO2条件下培养。为了去除血清，用1×PBS洗涤MCF7、MDA-MB 231和4T1细胞3次，并在无血清培养基(DMEM或RPMI-Lonza)中于37℃下培养20小时，以上准备的骨膜蛋白、整联蛋白抗体及以下的适配体通过以下各实施例中描述的方法处理。
实施例1：抗骨膜蛋白DNA适配体的体外选择
为了制备SELEX所需的单链修饰的DNA文库，合成了5’带有生物素的反义文库[5'-生物素-d(CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT-N40-CTCGTCACACACTCACATC)-3'(SEQ ID NO:47)]。将反义文库与50uM 5’引物(GATGTGAGTGTGTGACGAG；SEQ ID NO:48)、0.5mM dNTP(ATP、GTP、CTP、Bz-dU)、0.25U/ul KOD XL(Invitrogen)、10×延伸缓冲液(1.2MTris-HCl pH7.8、100mMKCl、60mM(NH4)2SO4、70mM MgSO4、1％Triton X-100,1mg/ml BSA)在70℃下反应1小时，来制备双链DNA。单链修饰的DNA文库用20mM NaOH洗脱，且然后用HCl溶液中和。将1nmol合成的文库加入选择缓冲液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)，分别在95℃、70℃、48℃、37℃下反应5分钟，且然后与10μL的10×蛋白竞争缓冲液(10μM凝血素、10μM酪蛋白、0.1％(w/v)HSA(人类血清白蛋白，SIGMA))混合用于阴性选择，且然后加入到移出的上清液Hexa-His结合至其的Talon珠(50％(w/v))浆并在37℃下反应10分钟。
阴性选择后，只取上清液并转移到新的管中，且然后与骨膜蛋白结合的Talon珠于37℃下反应1小时。用100μL选择缓冲液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)洗涤结合有DNA-骨膜蛋白复合物的Talon珠5次。在第5次洗涤时，将其转移到新的平板并洗涤。加入85μL 2mM的NaOH溶液以洗脱靶结合文库(target-binding library)，且然后，用20μL 8mM HCl溶液中和。
使用QPCR(定量PCR，IQ5多色实时PCR检测系统，Bio-rad)扩增靶结合文库。将5’引物(GATGTGAGTGTGTGACGAG，SEQ ID NO:48)和3’引物(生物素-CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT，生物素-SEQ ID NO:49)(5XQPCR master Mix,Novagen)各5uM、0.075U/ul KOD(Novagen)、1mMdNTP(Roche Applied science)、25mM MgCl2、5×SYBR greenⅠ(Invitrogen)混合，使得总体积变为125μL，并重复96℃15秒、55℃10秒和68℃30分钟的1个循环，以及96℃15秒和72℃1分钟的30个循环以制备双链文库。
将通过QPCR制备的DNA文库与25μL Myone SA珠(Invitrogen)在室温下混合10分钟以固定。混合的DNA的量是60μl QPCR产物。加入20mMNaOH溶液，以制备单链DNA。并且，包括修饰的核酸的DNA通过与文库制备相同的方法合成，并用于下一轮。进行8轮SELEX，并且为了更多的选择性结合，从第4至第6轮以及第7至第8轮，将DNA-蛋白(骨膜蛋白)复合物在10mM DxSO4(Sigma)溶液中稀释至1/200、1/400，并选择DNA适配体。
实施例2：与骨膜蛋白相互作用的DNA适配体的选择以及相互作用测试
成功进行SELEX循环后，使用TA克隆试剂盒(SolGent)克隆最终获得的DNA集合。并使用存在于载体上的M13引物(CAGGAAACAGCTATGAC；SEQ ID NO:50)进行测序以获得以下序列。高度特异性结合获得的骨膜蛋白的DNA适配体具有核酸序列5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[核心序列]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO:46)，其中核心序列如以下表1所示，且n代表苄基-dU。
表1
在本实施例中，n＝苄基-dU[5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷]
A＝2’-脱氧腺苷
G＝2’-脱氧鸟苷
C＝2’-脱氧胞苷
T＝2’-脱氧胸苷(胸苷)
以上发现的骨膜蛋白适配体被归类为以下的相似家族(序列同质性基于核苷酸序列的85％同质性)：
表2
与骨膜蛋白强烈结合的若干随机序列被分离出。第8轮SELEX之后，对53个克隆进行测序。选择骨膜蛋白的5个不同的DNA序列(DNA适配体)，并进行滤器结合测定(filterbinding assay)。为此，1μM DNA、0.25μM、α-P32ATP(5μM，perkinelmer)、0.25μL TdT以及10μL 10×NEB缓冲液4(NEB)在37℃下反应30分钟，并在70℃下温育10分钟以使TdT失活。使用Micro spin G-50柱(GE healthcare)纯化DNA。将20,000cpm标记的DNA加入100μL 1×SB缓冲液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)，并以0.1℃/1秒从95℃缓慢冷却到37℃。并且，使用缓冲液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)将骨膜蛋白从100nM连续稀释到12点(points)，且然后分别加入30μL加热的和冷却的DNA集合并在37℃下反应30分钟。将每2μL DNA和骨膜蛋白的混合物点到尼龙膜(GE healthcare)上，且然后，添加5.5μL zorbax树脂(Agilent)。并且，将其放置在提前用50μL 1×SB缓冲液(200mMHEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)润湿的Durapore滤器(Millipore)中，并应用真空。并且，用100μL选择缓冲液(200mM HEPES、510mMNaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)洗涤膜滤器。将滤板暴露于图像板过夜，且然后用FLA-5100(Fuji)对图像进行量化。使用SigmaPlot11(SystatSoftware Inc.)从通过滤器结合测定获得的值计算结合亲和力，且结果显示在以下表3中。
表3
Bmax指DNA:蛋白复合物的最大外推量(maximum extrapolated amount)，且如果它接近于1，意味着良好的性能，且Kd(解离常数)是代表亲和力的值，且值越低意味着结合能力越高。
在所有克隆中，选择4个适配体，并且为了提高结合亲和力和特异性，将长度从80个核苷酸减到50个核苷酸，并将它们命名为‘PNDA’。为此，进行合成并在引物位置各留出5mer，并测量与骨膜蛋白的结合能力。(参见表4)。
表4
在本实施例中，序列中的‘n’代表苄基-dU。适配体的随机序列部分(可变序列，核心序列)以加粗字母表示。
表4显示了在该实验中使用的PNDA序列及每个序列的实验结果。使用SigmaPlot11(Systat Software Inc.)计算解离常数(Kd)和Bmax。在这些选择的适配体中，根据PNDA-3的Kd值和B max值，可认为其是具有最高结合能力的合适的候选物。
图1显示了利用32P标记的PNDA和不同浓度的人类重组骨膜蛋白(直至100nM)通过以上方法测量的结合亲和力的结果，其中结合测定重复进行3次，并根据骨膜蛋白的浓度计算平均值和标准偏差并显示。Y轴的结合分数(fraction bound)表示作为百分数的适配体和蛋白的结合程度，当P32标记的适配体不含蛋白时的信号被设置为0。
同时，通过竞争性测定另外分析了PNDA与骨膜蛋白之间的特异性相互作用。将约10nM[α-32P]-ATP标记的PNDA-3与骨膜蛋白以及无放射性同位素标记的PNDA-3的特异性竞争剂或非特异性竞争剂(对照适配体)一起反应，并通过上述方法测量DNA-蛋白复合物的结合程度。作为对照(CTL)适配体，使用了ACGAGGnACGGnGCnGAAGGACCAGACnGAACCGCACAnGCGACAAAACAA(SEQ ID NO:51)(以下实施例中也是如此)。结果，尽管对照适配体未影响PNDA-3与骨膜蛋白的结合，无标记的PNDA-3有效减少标记的PNDA-3与骨膜蛋白之间的结合。即，PNDA-3与骨膜蛋白的特异性结合显示在图2A中。在图2B中，确认并比较了适配体与具有与人类骨膜蛋白相似结构的蛋白(小鼠骨膜蛋白、人类βIG-3H(R&D system)、人类IgG(Sigma))的结合程度。尽管PNDA-3并不与人类IgG蛋白结合，其可与人类和小鼠骨膜蛋白结合。另外，确认了人类βIG-3H尽管以小比例但也与PNDA-3结合。
由于人类骨膜蛋白和小鼠骨膜蛋白显示90％或更高的氨基酸序列同质性，它们之间的交联并不意外。
为证实体内条件下DNA适配体与骨膜蛋白的相互作用，进行了亲和纯化。将10nM骨膜蛋白加入10％(w/v)的血清缓冲液(FBS溶液，FBS-Gibco)之后，将其与生物素化的适配体反应1小时，且然后用链霉亲和素珠分离骨膜蛋白-PNDA-3复合物，并通过如图2C和2D中显示的SYPRO ruby染色和免疫印迹证实骨膜蛋白的存在。如图2C和2D所示，尽管对照适配体未检测出血清中骨膜蛋白的存在，PNDA-3可特异性检测骨膜蛋白。在图2C中，I显示了上样实验中使用的骨膜蛋白量的1/10作为对照的结果。这也验证了骨膜蛋白和PNDA-3之间的特异性相互作用以剂量依赖的方式增加。
这些结果显示了本发明的适配体特异性识别骨膜蛋白并具有对骨膜蛋白的高亲和力。
实施例3：适配体与细胞表面骨膜蛋白的结合抑制测试
由于纯化的蛋白与细胞内表达的蛋白之间的形态差异，纯化的蛋白的分离的适配体并不总是与细胞结合。因此，测试了适配体与4T1乳腺癌细胞(骨膜蛋白表达细胞)和MCF7细胞(骨膜蛋白缺陷细胞)的结合能力。
将Cy3标记的PNDA-3与骨膜蛋白阳性细胞4T1(购自ATCC)或骨膜蛋白阴性细胞(MCF7；购自ATCC)反应。将每一种约0.2×106个的两种类型的细胞在200μL的选择缓冲液(200mM HEPES、510mM NaCl、25mMKCl、25mM MgCl2)中与100nM Cy3标记的PNDA-3一起于4℃下培养1小时。其后，用200μL选择缓冲液洗涤细胞3次，并重悬在500μL 4％(w/v)的多聚甲醛(PFA)中。将制备的样品在FACSCalibur(BD Biosciences,San Jose,CA)的FL3-H通道上分析。
通过流式细胞术分析细胞，且作为对照，单独培养细胞系。获得的结果显示在图3A(4T1细胞)和3B(MCF7细胞)中。如图3A所示，尽管Cy3标记的PNDA-3结合4T1细胞，对照适配体(CTL)未与细胞系结合(图3A)。并且，显示本发明的适配体没有超出背景水平与阴性对照细胞系MCF7细胞结合(图3B)。因此，显示本发明的适配体PNDA-3可特异性识别细胞表面的骨膜蛋白。
为了证实PNDA-3与细胞表面骨膜蛋白的结合，用TIR(全内反射)荧光显微镜(Olympus,最终放大率100×)通过上述方法观察cy3-PNDA-3的结合。将100nMCy3PNDA-3加入到4T1细胞系的培养基中之后，证实在细胞表面观察到红色荧光斑点。在图3C中，证实了PNDA-3与细胞表面的结合被加入的过量未标记的PNDA-3完全抑制。并且，可以看出，加入整联蛋白抗体显著减少PNDA-3与细胞表面的结合。即，证实了PNDA-3抑制骨膜蛋白与整联蛋白之间的相互作用。
实施例4：适配体结合区域的定位
为了找到PNDA-3的结合区域，通过亚克隆制备图4A所示的突变体。用于克隆的全长人骨膜蛋白cDNA由Duke大学的Wang XF博士提供。每个突变体都在293T细胞系(购自ATCC)中过表达，且然后，用细胞裂解缓冲液(50mM HEPES、pH 7.2、150mM NaCl、1mM EGTA、1mM EDTA、1％Triton X-100、10％甘油、1mM原钒酸钠、1mM氟化钠、1mM苯甲基磺酰氟、完全蛋白酶抑制剂混合物(complete protease inhibitor cocktail，Roche))溶解细胞，并在4℃下14,000×g离心10分钟。蛋白浓度用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(biorad，#500-0002)测量。将等量的突变体细胞裂解物与20pmol的生物素-PNDA-3在4℃反应2小时，并然后将链霉亲和素珠加入分离的用细胞裂解缓冲液洗涤4次的适配体-蛋白复合物，且然后将珠用2×样品缓冲液洗脱、用6-16％SDS-PAGE凝胶分离并转移至硝酸纤维素膜。将膜与抗GFP抗体(santa cruze)在4℃反应12小时。用相应的辣根过氧化物酶缀合的二抗(Cell SignalingTechnology，Inc)检测抗体。相应蛋白用ECL试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)检测，并通过ImageQuantTMLAS 4000(GE Healthcare)分析。
从图4B可以看出，尽管全长骨膜蛋白与PNDA-3形成复合物并通过蛋白质印迹证实，这种结合在突变体4和5中显著降低。即，对PNDA-3与骨膜蛋白结合重要且必要的结构域是第三fas-1结构域，其被预期是与整联蛋白结合的重要部分。
实施例5：骨膜蛋白介导的乳腺癌细胞粘附、迁移和转移抑制测试(体外)
通过粘附、迁移和转移的体外分析，研究了骨膜蛋白和抗骨膜蛋白适配体(PNDA-3)对若干乳腺癌细胞系诸如MCF7、4T1和MDA-MB-231细胞的转移可能性的影响。
在包被有10μg/ml I型胶原蛋白(Sigma)或10μg/ml骨膜蛋白的96孔微量滴定板上，进行粘附测定。为了阻断非特异性结合，将板用0.2％BSA在37℃封闭1小时。将细胞用胰蛋白酶处理，并以1×106细胞/ml的浓度悬浮在包含1％BSA、1mM MgCl2、0.5mM CaCl2的DMEM中。将MCF7、4T1和MDA-MB-231细胞(各1×106)暴露于100nM适配体或2μg Ab(αvβ3或αvβ5抗体)30分钟。将细胞(1×105细胞，100μl)加入各个孔，并经受37℃下CO2加湿的空气中培养30分钟。用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤孔3次，以除去未粘附的细胞。粘附的细胞用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟，用PBS洗涤，并用0.4％结晶紫染色10分钟。染色的样品用30％乙酸溶液洗脱，并用酶标仪(Molecular Devices,Berkeley,California)在590nm下分析。
结果显示在图5A中。如从图5A可以看出的，在抗骨膜蛋白适配体的存在下的MDA-MB-231细胞中，细胞粘附显著(60％)降低，而非特异性对照适配体(CTL)不具有任何影响。通过用抗αvβ3和αvβ5抗体的处理，证实在骨膜蛋白包被的孔中相似程度的乳腺癌细胞粘附抑制(对照的50％，p<0.05％)。
迁移和侵袭测定在改良的Boyden小室系统(BD falcon，#354578)中进行。在迁移测定的情况下，将多孔滤器(8μm)用溶解于0.1M乙酸的20μg/mlI型胶原蛋白(Sigma)于4℃下孵育过夜，以进行通过I型胶原蛋白的被动吸收的包被。将MCF7、4T1和MDA-MB-231细胞(各2×104)与50μL无血清培养基(DMEM(Lonza)-4T1、MDA-MB-231细胞系；RPMI(Lonza)-MCF7)混合，并加入上室，且然后，允许在37℃恒温箱中迁移4小时。将骨膜蛋白(或BSA，1μg/mL)或PNDA-3(或对照适配体，100nM)加入下室。将粘附在滤器下侧的迁移的细胞用4％PFA固定，并将未迁移的细胞用棉签除去。将0.2％Triton X-100渗透入细胞膜，且然后，将细胞核用Hoeschest 33342溶液(sigma)染色。通过在10倍放大率下计数6个不同位置的每个区域的细胞平均数目显示细胞迁移的结果。将获得的结果显示在图5B中。
在图5B中，与使用BSA的阴性对照相比，骨膜蛋白有效提高乳腺癌细胞系的迁移能力(MCF7：3倍；4T1：4倍；MDA-MB-231：5倍)。尽管非特异性对照适配体的加入未显著影响由骨膜蛋白引起的细胞迁移，PNDA-3显著减弱了这一反应(MCF7：40％；4T1：60％；MDA-MB-231：67％，p<0.05)。
在侵袭测定中，以1×105细胞系将MCF7、4T1和MDA-MB-231细胞系放入以生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences)包被的内室，且24小时后，通过与细胞迁移测试相同的方法测试到达下室的细胞。将获得的结果显示在图5C中。
如图5C中所示，证实了与BSA处理的对照相比，乳腺癌细胞系的侵袭被骨膜蛋白增强。可以看出的是，对照适配体未影响骨膜蛋白的作用，而PNDA-3显著抑制了乳腺癌细胞系(MCF7：40％；4T1：60％；MDA-MB-231：65％)的细胞侵袭。与BSA处理的组相比，整联蛋白αvβ3和αvβ5抑制抗体处理的组，也抑制由骨膜蛋白引起的细胞侵袭至与PNDA-3适配体处理的组的相似水平。然而，与整联蛋白αvβ5抑制抗体处理的组相比，整联蛋白αvβ3抑制抗体处理的组抑制由骨膜蛋白引起的细胞迁移和侵袭的效果并不显著。因此，可以看出，整联蛋白αvβ5是乳腺癌细胞系中骨膜蛋白作用的主要细胞表面因子。
PNDA-3的毒性在乳腺癌细胞系中证实。将4T1细胞(0.5×104)放入96孔板中，并允许过夜粘附。使用不同浓度的PNDA-3，示例了对应于一个浓度的至少6个孔，且每个试验重复进行3次。将细胞在200μL的DMEM培养基中与指示浓度的PNDA-3(或CTL)一起处理。为了测量细胞活力，加入10μL MTT溶液(5mg/mL，Sigma)，并培养3小时。将甲臜溶于50μLDMSO并在540nm处测量吸光度。在图5D中，将细胞活力显示为与假处理的对照细胞相比的相对值。如图5D中显示的，即使用500nM适配体处理，细胞形态或细胞活力也没有显著变化。
实施例6：信号传导通路抑制测试
将各3×105的乳腺癌细胞系(4T1、MDA-MB-231)接种于6孔板中，在生长培养基(Lonza)+10％FBS(Gibco)+抗生素(gibco))中培养24小时，且然后，在无血清培养基(DMEM)中培养18小时。其后，将它们用100nM适配体和5μg整联蛋白中和抗体(整联蛋白αvβ3和αvβ5抗体)处理3小时。用细胞裂解缓冲液(50mM HEPES、pH 7.2、150mM NaCl、1mM EGTA、1mMEDTA、1％Triton X-100、10％甘油,1mM原钒酸钠、1mM氟化钠、1mM苯甲基磺酰氟、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))溶解细胞，并于4℃14,000×g离心10分钟。蛋白浓度用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(biorad，#500-0002)测量，并将蛋白样品在6-16％SDS-PAGE凝胶中分离并转移至硝酸纤维素膜。
将膜与以下的一抗在4℃反应：
FAK Ab、phospho-FAK Ab(Tyr925)(Cell Signaling,Beverly,MA)、
Src Ab、phospho-Src Ab(Cell Signaling,Beverly,MA)、和
β-肌动蛋白Ab(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。
使用相应的辣根过氧化物酶缀合的二抗(Kirkegaard&PerryLaboratories,KPL,Gaithersburg,MD,USA)检测这些抗体。相应的蛋白用ECL试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)分析并用ImageQuantTMLAS 4000(GE Healthcare)可视化。
根据结果证实了PNDA-3与存在于细胞表面的骨膜蛋白结合，并抑制与整联蛋白的结合，从而抑制由骨膜蛋白引起的转移(细胞粘附、迁移和侵袭)。接着，为了检查PNDA-3对骨膜蛋白依赖的信号转导通路的影响，进行了免疫印迹。已知为整联蛋白信号转导通路和细胞扩散的标志物的FAK和SRC的磷酸化被证实，且结果显示在图6A和图6B中。
如图6A和6B所示，蛋白质印迹分析显示暴露于骨膜蛋白的细胞中增加水平的FAK和SRC磷酸化。PNDA-3或抗整联蛋白Ab(αvβ和αvβ5)处理大幅度降低了4T1和MDA-MB-231细胞中FAK和Scr的磷酸化水平，而在对照适配体的存在下没有观察到该效应。此外，FAK和Src磷酸化的剂量依赖的抑制与4T1和MDA-MB-231细胞中PNDA-3的浓度相关。根据这些结果，可以看出在乳腺癌细胞系中，整联蛋白子信号(sub-signal)通过骨膜蛋白的刺激通过整联蛋白αvβ5发生。即，在分子水平上，骨膜蛋白与整联蛋白的结合提高FAK和SRC的活性，其由此激活细胞迁移和侵袭，以促进乳腺癌转移。根据本发明一个实施方案的适配体具有抑制这些作用以抑制乳腺癌转移的作用。
实施例7：肿瘤生长和转移的抑制测试(体内)
在动物模型中测试了PNDA-3的抗肿瘤生长和转移的抑制功效。
在浦项科技大学(POSTECH)的动物饲养设施中在无病原体条件下饲养6个月龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River Breeding Laboratories)。所有动物测试遵循POSTECH实验动物护理和使用委员会的规程进行。将乳腺癌细胞系4T1(1×104细胞，购自ATCC)悬浮在0.1mL的汉克平衡盐溶液(HBSS，Gibco)中，并植入小鼠乳腺脂肪垫的L4位置(每组10只小鼠)。将30只约0.5cm3大小的非坏死性肿瘤模型随机分成如下3组，每组10只小鼠：
组1：媒介物(HBSS)；
组2：CTL适配体处理；
组3：PNDA-3处理。
每周3次持续16天分别将总体积为50μL的对照适配体、PNDA-3适配体(500μg/kg)和媒介物瘤内施用到原发性肿瘤中。在每一个测试期间，每天监测小鼠的痛苦迹象。用卡尺每隔一天测量肿瘤的大小，并将肿瘤的体积(V)通过以下等式计算：
V＝(1/2)×长径×(短径)2。
将生长曲线绘制为平均肿瘤体积±SEM(n＝10)。
将获得的结果显示在图8A中。图8A显示在具有骨膜蛋白阳性4T1细胞的同系乳腺癌模型中PNDA-3介导的肿瘤生长抑制(与CTL或对照组相比在第16天时42％；*，曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验P<0.01)。“第0天”表示注射第一天。数据显示为“平均值±SEM”(n＝10个肿瘤)。
如图8A所示，当每周3次分别将PNDA-3、对照适配体和媒介物瘤内注射入原发性肿瘤时，与对照和媒介物施用组相比，PNDA-3处理组显示肿瘤生长的显著下降，且特别地，在第16天，与媒介物处理组相比肿瘤大小减小约58％(P<0.02)。测量了三个组的重量并显示在图8B中。如图8B所示，PNDA-3施用组和对照适配体施用组之间的体重下降方面没有差异，这意味着适配体在处理期间没有表现出毒性。
而且，在施用适配体后第20天，测量转移和原发性肿瘤的大小，并显示在以下表5中。
表5
使用Balb/C小鼠分析乳腺癌小鼠模型中转移和原发性肿瘤大小的总结。
“注意:与媒介物相比，用PNDA-3的处理不仅显著减轻肿瘤负荷(P＜0.02)，还降低了肿瘤的肺转移。使用学生t检验计算P值(双尾)。
**Cl:置信区间
如表5所示，在注射后的第20天，尸体剖检组织显示在植入乳腺癌细胞的所有小鼠中相似的肿瘤分布，包括在淋巴结、肝、脾和肺中的大量肿瘤团块和远端转移。明显地，在媒介物和对照适配体处理组的肺组织中观察到若干结节和较大的转移病灶(≥2mm)，而PNDA-3处理显著减少了结节和转移病灶(P<0,005))。
图8C和8D显示了适配体处理组和非处理组小鼠的检查结果，其中图8C显示了取出的肺(箭头表示肺结节)，且图8D通过条形图显示了肺结节的数目(n＝10；*，P<0.0001；**，P<0.005)。而且，图8C显示了H&E染色的肺组织，并显示了各组(媒介物处理组、对照适配体处理组、或PNDA-3适配体处理组)中的转移病灶。箭头和虚线圈表示肺中的转移病灶。比例尺：200μm(上部)；100μm(底部)。在媒介物处理组和对照适配体处理组中，观察到若干肺组织的转移病灶，而在PNDA-3处理组中，转移病灶显著减少。
实施例8：组织学测试和免疫组织化学测试
为证实PNDA-3对肿瘤生长的抑制和血管内皮细胞的功能诸如血管生成或血管内皮细胞生长的抑制之间的关系，进行血管标志物CD31和细胞生长标志物Ki-67的免疫染色。将石蜡包埋的肿瘤组织切成4μm厚。为了抑制内源性过氧化物酶，将获得的切片用0.5％(v/v)H2O2(于100％(v/v)甲醇中)在室温下处理15分钟。为了组织学测试，将一部分石蜡切片用苏木精和曙红(H&E)染色以证实肿瘤诊断。
进行血管标志物(CD31，BD Pharmingen，San Diego，CA)、Ki-67(DakoCorporation，CA)和抗骨膜蛋白抗体(Abcam)染色，以确定PNDA-3是否通过抑制肿瘤相关细胞的发生来抑制肿瘤生长。将制备的切片与一抗一起在载破片上4℃过夜培养，且然后，将载玻片与生物素化的二抗和过氧化物酶标记的链霉亲和素(Dako)一起培养，并使用二氨基联苯胺作为显色底物测量过氧化物酶活性。
将载玻片用苏木精复染，并用固封剂(Dako)固封。将载玻片用数字虚拟显微镜(dotSlide；Olympus，Tokyo，Japan)和MetaMorph图像软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)观察，并分析。
将获得的结果显示在图9A-9C中。图9A显示了从媒介物处理组、对照适配体处理组和PNDA-3适配体处理组获得的原发性肿瘤切片的免疫染色结果的显微图像。图9B和9C分别显示了增殖的细胞和内皮细胞的定量Ki-78(9B)染色和CD31(9C)染色的结果。百分数值代表任意选择的10个视场的平均值±S.D.。*，P<0.05。圆形图像为数码拍摄。比例尺：100μm。
与媒介物处理组和对照适配体处理组相比，PNDA-3处理组中获得的肿瘤显示增殖细胞数目和血管密度的显著降低。而且，与对照适配体处理组和媒介物处理组相比，当用PNDA-3处理肿瘤时，骨膜蛋白的表达量(->量)下降。总之，PNDA-3通过抑制肿瘤细胞或肿瘤相关细胞诸如血管内皮细胞的生长抑制乳腺癌异体移植小鼠模型中乳腺癌的进展和转移，并至少部分地抑制血管生成。
统计分析
所有数据都展示为至少3次重复样品的平均值±S.D.。两组之间的差异使用学生t-检验分析。P<0.05被认为是显著性的数值。

Claims (11)

1.一种骨膜蛋白适配体，所述骨膜蛋白适配体特异性结合骨膜蛋白且所述骨膜蛋白适配体由以下核苷酸序列SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46表示：
5'-ACGAG-[N]-AACAA-3'(SEQ ID NO:45)或
5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO:46)，
在所述核苷酸序列中，‘N’由25至80个碱基组成，每个碱基独立地选自由A、C、G、脱氧形式的A、脱氧形式的C、脱氧形式的G和在dU(脱氧尿嘧啶)的5-位置被萘基、苄基、吡咯苄基或色氨酸取代的修饰的碱基组成的组，且所述修饰的碱基的数目为5至20，其中所述‘N’为SEQID NO:10的核苷酸序列，
其中所述SEQ ID NO:10的核苷酸序列为nnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnAC，并且所述SEQ ID NO:10的核苷酸序列中的n是在5-位置具有萘基、苄基、吡咯苄基或色氨酸的修饰的dU(脱氧尿嘧啶)。
2.根据权利要求1所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体由SEQ ID NO:43的核苷酸序列表示且SEQ ID NO:43的核苷酸序列中的n是在5-位置具有萘基、苄基、吡咯苄基或色氨酸的修饰的dU(脱氧尿嘧啶)。
3.根据权利要求1所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5’端、3’端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
4.一种用于治疗癌症或抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或2所述的骨膜蛋白适配体作为活性成分，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5’端、3’端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
6.一种用于诊断癌症或癌症转移的药物组合物，包含权利要求1或2中任一项所述的骨膜蛋白适配体作为活性成分，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5’端、3’端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
8.根据权利要求1或2所述的骨膜蛋白适配体在制备用于癌症或癌症转移诊断的药物组合物的用途，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5’端、3’端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
10.权利要求1或2所述的骨膜蛋白适配体在制备用于治疗癌症或抑制癌症转移的药物组合物中的用途，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5’端、3’端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇)、idT(反向脱氧胸苷)、LNA(锁核酸)、2’-甲氧基核苷、2’-氨基核苷、2’F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
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