KR101556339B1 - 페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물 - Google Patents

페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물 Download PDF

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Abstract

암 관련 단백질인 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 유효성분으로 함유하는 암 및/또는 암전이 억제용 조성물 및 암 및/또는 암전이 진단용 조성물이 제공되며, 상기 압타머는 기존의 항체와는 다른 결합 기작을 가짐으로써 보다 효과적으로 암/암전이를 억제하고 진단할 수 있다.

Description

페리오스틴에 대한 압타머 및 이를 포함하는 항암제 조성물{Aptamer against periostin and anticancer composition containing the same}
본 발명은 암 관련 단백질인 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 유효성분으로 함유하는 암 및/또는 암전이 억제용 조성물 및 암 및/또는 암전이 진단용 조성물과 관련된 것이다.
고형암의 침습성 종양(invasive tumor)으로의 진행은 전이에 있어서 주요한 선행 조건이고 이는 세포 형태와 운동성(motility) 등의 변화를 수반한다. 암 세포에서의 유전적 변형은 전이암의 유형에 따라서 달라지지만, 암세포가 원래의 발생 장기에서 떨어져 나와 다양한 장기들로 분산되는 공통적인 결과를 야기한다. 이러한 미세 환경하에서, 여러 성장인자, 혈관생성 인자, 그리고 단백질 가수분해 효소들이 암세포 및 암주변세포들에 의해 분비되고, 이들은 암성장 및 신생혈관 생성을 유도하고 세포외부기질을 분해하여 암세포의 침습과 전이를 촉진한다. 뿐만 아니라, 오스테오폰틴(osteopontin; OPN), 테나신 C(tenascin C), 및 matricellular 단백질들은 종양 전이에 일조하고 정상 또는 종양줄기세포와 전이 틈새(metastatic niches)의 유지 및 확장을 조절한다. 암 진행의 특정 단계를 표적화하는 것의 대안으로서 암발생의 복수의 단계에서 중요한 역할을 하는 분자를 선택하여 표적화하는 것을 고려할 수 있다. 이러한 분자들 중, 페리오스틴은 세포 부착 및 세포와 기질의 상호작용을 조절하는 중요한 단백질로 여겨지고 있다.
페리오스틴은 세포외기질단백질의 하나로 세포 부착 (cell adhesion)에 관여하고 사이토카인 (cytokine)으로 작용하여 세포 부착 분자인 인테그린 αvβ3와 αvβ5를 통해 신호를 전달하는 분비 단백질이다. 처음에는 골아세포(osteoblast) 특이적 인자로서 발견되었으며, 뼈조직의 골막에서 특히 발현이 높다. 페리오스틴은 유방암과 같은 다양한 상피암종에서 과발현되고, 그 기능이 전이 및 혈관신생과 같은 악성 진행의 결정적인 단계에 관련이 있기 때문에, 최근 들어 페리오스틴에 대한 관심이 높아지고 있다. 페리오스틴은 정상 유방 세포주에서는 발현이 되어 있지 않지만 유방암의 경우 특수적으로 발현이 증가되어 있다. 또한, 페리오스틴은 전이군락화(metastatic colonization), 세포 생존 촉진, 혈관신생 및 종양줄기세포 유지 동안의 중요한 제한 인자이다. 많은 임상 연구들에 따르면, 페리오스틴의 과발현 및 혈청 내 페리오스틴 농도 증가가 전이성 종양의 성장과 나쁜 예후와 관련되어 있음을 보여주고 있다. 뿐만 아니라, 페리오스틴은 전이군락화(metastatic colonization)동안, 세포 생존, 혈관신생 및 종양줄기세포 유지를 촉진하는 중요한 제한 인자이다. 따라서, 페리오스틴은 종양 성장 및 전이의 억제와 관련된 유망한 후보 물질로서 확인되었다.
생물학적으로 표적화된 치료법은 지난 20여년 동안 암치료의 주류가 되어 왔다. 정상 세포에도 독성을 나타내는 기존의 치료법과 비교하여, 표적 치료법은 보다 특이적이고 정상세포에 대한 독성이 적어서 보다 효과적인 치료법으로 주목받고 있다. 표적화된 치료 분자로서 새롭게 대두되는 분류가 핵산 계열 압타머(nucleic acid-based aptamers)이다. 압타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로 표적분자에 아주 밀접하고 특이적으로 결합하는 특성을 가지고 있다. 압타머는 SELEX (Systematic evlution of ligands by exponential enrichment)라고 불리는 반복 선택 방법에 의해 개발되며, 특이적인 3차원 구조를 사용하여 자신의 표적을 선택적으로 인식하고 결합하게 된다. 압타머는 단백질 표적에 직접 결합함으로써 표적의 기능을 조절할 수 있다. 짧은 핵산의 본질상, 압타머는 다른 치료 수단과 비교하여 증진된 안정성, 생성 및 변형의 편의성, 낮은 면역원성 및 낮은 독성 등의 이점을 갖는다. 따라서, 압타머는 저분자 및 항체 기반 치료 요법을 대안으로서 가치가 인정되고 있다.
따라서, 유망한 항암 표적으로서 대두되는 페리오스틴과 이에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이를 이용한 항암 치료 기술의 개발이 요구된다.
이에, 본 발명의 일례는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고, dU(deoxyuracil)의 5-위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 트립토판 등과 같은 소수성 작용기로 치환된 변형된 염기를 포함하는, 페리오스틴 압타머를 제공한다.
또 다른 예는 상기 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물, 상기 페리오스틴 압타머의 약학적 유효량을 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법, 및 상기 페리오스틴 압타머의 암 치료를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물, 상기 페리오스틴 압타머의 약학적 유효량을 암 전이 억제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제 방법, 및 상기 페리오스틴 압타머의 암 전이 억제를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 및 상기 페리오스틴 압타머의 암 진단을 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기 페리오스틴 압타머를 이용하여 암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 암세포로부터 분비되는 페리오스틴에 높은 친화성으로 결합할 수 있는 PNDA-3이라고 명명한 변형된 DNA-압타머를 개발하여 본 발명을 완성하였다. 또한, PNDA-3는 인테그린 (αvβ3 및 αvβ5)와 페리오스틴 간의 상호작용을 차단하고, 페리오스틴의 생물학적 기능을 억제하는 것으로 확인되었다. 본 명세서에서 제공되는 데이터는 페리오스틴에 결합하는 PNDA-3은 유방암 세포에서의 부착(adhesion), 이동(migration), 및 침습(invasion) 능력 및 인테그린 αvβ3- 및 αvβ5-의존적 신호 전달 경로의 활성화의 감소, 및 세포 표면의 수용체와의 상호작용을 차단 활성을 가짐을 보여준다. 또한, 유방암 전이 마우스 모델에서 PNDA-3의 투여가 유방암의 성장, 전이 및 신생혈관 형성을 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 압타머는 유방암과 같은 고형암의 성장 및/또는 전이를 억제하는 항암물질로서 유용하다.
본 발명의 목적은, 암의 발생 및 전이에 관여하는 페리오스틴 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 암 및/또는 암 전이를 억제하거나 암의 진단이 가능한 페리오스틴 압타머 및 이를 유효 성분으로하는 암 및/또는 암전이 억제제 및 암진단제를 제공하는 것이다.
본 발명은 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 암 전이 억제제 및 암 또는 암 전이 진단용 조성물, 및 이를 이용한 암 또는 암 전이 억제(치료) 방법 및 암 진단 방법이 제공된다.
상기 페리오스틴은 포유류, 바람직하게는 인간에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 등재번호 Accession no. NP_Q15063-human, NP_056599-mouse, NP_001102020.1-rat등일 수 있으며, 예컨대 NP_Q15063-human (인간 페리오스틴)일 수 있다.
상기 페리오스틴 압타머는 변형된 염기를 포함할 수 있으며, 변형된 염기를 포함하여 총 염기 길이가 25 내지 100개, 바람직하게는 30 내지 80개, 더욱 바람직하게는 35 내지 50개일 수 있고, 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 페리오스틴 압타머에서 상기 변형된 염기 이외에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태 (예컨대, 2'-deoxy 형태)의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 변형된 염기는 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태를 의미하는 것으로, 염기 'T'를 대체하여 사용되는 것일 수 있다. 소수성 작용기는 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 트립토판 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이와 같이 dU 염기의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 페리오스틴과의 친화력(affinity)이 현저하게 높아지는 이점이 있다.
페리오스틴 압타머 내의 상기 변형된 염기 개수는 5 내지 20개, 바람직하게는 10 내지 17개일 수 있다.
구체예에서 상기 페리오스틴 압타머는 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 40(염기서열 중 'n'은 상기 변형된 염기 또는 'T', 구체적으로 상기 변형된 염기임)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열을 포함하여 총 염기 길이가 25 내지 80개, 바람직하게는 30 내지 65개, 더욱 바람직하게는 35 내지 50개인 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 페리오스틴 압타머는 상기 SEQ ID NO: 5내지 SEQ ID NO: 40으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로만 이루어지거나, 상기 염기서열 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 3 내지 25개, 구체적으로 5 내지 20개의 염기로 이루어진 염기서열을 추가로 포함하여 총 길이가 30 내지 120개, 35 내지 100개, 또는 45 내지 90개의 염기인 것일 수 있다. 상기 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 추가로 포함되는 염기서열은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 예컨대, 페리오스틴 압타머는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 40으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열의 5' 말단에 ACGAG(SEQ ID NO: 1)를 갖고 3' 말단에 AACAA(SEQ ID NO: 2)를 갖는 것 또는 5' 말단에 GATGTGAGTGTGTGACGAG (SEQ ID NO: 3)를 갖고 3' 말단에 AACAACAGAACAAGGAAAGG(SEQ ID NO: 4)를 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 본 발명의 페리오스틴 압타머는 다음의 SEQ ID NO: 45 또는 SEQ ID NO: 46의 염기서열을 갖는 것일 수 있다:
5'-ACGAG-[N]-AACAA-3'(SEQ ID NO: 45)
(N은 압타머의 가변 중심 서열로서, 25 내지 80개, 바람직하게는 30 내지 65개, 더욱 바람직하게는 35 내지 50개의 염기로 이루어지며, 각 염기는 A, C, G, T, 이들의 deoxy 형태, 및 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기(예컨대, 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 트립토판로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)로 치환되어 변형된 염기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택됨)
5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO: 46)
(N은 압타머의 가변 중심 서열로서, 25 내지 80개, 바람직하게는 30 내지 65개, 더욱 바람직하게는 35 내지 50개의 염기로 이루어지며, 각 염기는 A, C, G, T, 이들의 deoxy 형태, 및 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기(예컨대, 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 트립토판로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)로 치환되어 변형된 염기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택됨).
앞서 설명한 바와 같이, 상기 N은 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 40로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 염기서열(SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 44)에 기재된 염기 서열에서, 'n'은, 특별한 언급이 없는 한, 'T' 또는 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태를 의미하며, 바람직하게는 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태이다. 상기 소수성 작용기는 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 트립토판 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다.
또한, 상기 페리오스틴 압타머는, 혈청 내 안정성 증진을 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두가 변형되어 혈청 내 안정성이 증진된 것일 수 있다 (실시예 2, 3 및 4 참조). 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 페리오스틴 압타머는 5' 말단에 PEG(polyethylene glycol; 예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되어 있거나, 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착되어 있거나, 5' 말단에 PEG(예컨대, 분자량 500-50,000 Da)가 부착되고 3' 말단에 idT(inverted deoxythymidine)가 부착된 것일 수 있다.
상기 'idT(inverted deoxythymidine)'는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-0H와 결합하여 사슬을 이루지만 idT는 앞 단위체의 3'-OH에 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제(3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
본 발명에 따른 페리오스틴 압타머는 암세포의 성장뿐 아니라, 부착, 이동 및 침습을 억제하는데 현저한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (실시예 5 내지 8 참조)
이에, 다른 예는 상기한 바와 같은 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 함유하는 암의 치료 및/또는 암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기한 바와 같은 페리오스틴 압타머의 약학적 유효량을 암 치료 및/또는 암 전이 억제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 암 전이 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 투여 단계 이전에 암 치료 및/또는 암 전이 억제를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기한 바와 같은 페리오스틴 압타머의 암 치료 및/또는 암 전이 억제를 위한 용도를 제공한다.
상기 페리오스틴 압타머 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
예를 들어, 정제, 환제, 경.연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
그리고, 상기 페리오스틴 압타머 또는 이를 포함하는 약학 조성물이 비경구 투여 형태로 제형화되는 경우, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분, 즉, 페리오스틴 압타머가 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
그리고, 용어 "약학적 유효량"은 소망하는 효과, 즉 암의 예방 및/또는 치료, 또는 암 전이 억제 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 양을 의미한다. 상기 유효 성분, 즉, 페리오스틴 압타머는 하루에 0.1 내지 500 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.5 내지 100 ㎎/㎏(체중)의 유효량으로 상기 약학 조성물에 포함될 수 있고, 이러한 약학 조성물이 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 페리오스틴 압타머 또는 이를 포함하는 약학 조성물에 의하여 치료 또는 전이 억제가 가능한 암은 페리오스틴과 관련된 모든 종류의 암일 수 있으며, 예컨대, 유방암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암, 자궁암, 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 전립선암, 아교모세포종(glioblastoma) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 페리오스틴 압타머 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여 대상은 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류, 또는 인간일 수 있다.
또한, 페리오스틴은 유방암과 대장암을 비롯하여 다양한 고형암 및 암 전이 환자에게서 과발현이 관찰되므로, 상기 페리오스틴 압타머는 암 및/또는 암전이 진단용 조성물로서 사용 가능하다.
또 다른 측면에서, 상기 페리오스틴 압타머의 암 및/또는 암 전이 진단을 위한 용도 및 페리오스틴 압타머를 이용하여 암 및/또는 암 전이 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공된다.
상기 암 진단에 정보를 제공하는 방법은
환자의 생물학적 시료에 페리오스틴 압타머를 반응시키는 단계; 및
상기 생물학적 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
환자의 생물학적 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 상기 환자를 암이 발생한 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 정상 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 환자는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류, 또는 인간으로서, 암의 발생 또는 암의 전이 여부를 판단할 대상을 의미한다.
상기 방법으로 진단에 정보를 제공할 수 있는 암 종류는 페리오스틴과 관련된 모든 종류의 암일 수 있으며, 예컨대, 유방암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암, 자궁암, 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 전립선암, 아교모세포종(glioblastoma) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 정상 시료는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류, 또는 인간으로부터 얻어진 것으로, 진단에 정보를 제공할 대상 암, 예컨대, 예컨대, 유방암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암, 자궁암, 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 전립선암, 아교모세포종(glioblastoma) 등으로 이루어진 군에서 선택된 암의 발생 및 상기 암의 전이가 없는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 의미한다.
상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 타액 등일 수 있다.
상기 생물학적 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 페리오스틴 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하거나 비오틴을 결합시켜 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 페리오스틴 압타머 중 페리오스틴과 결합부위가 상이하여 서로 결합에 방해하지 않는 한 쌍의 압타머를 선택하여, 하나는 기판에 고정시키고(capture aptamer), 다른 하나(detection aptamer)는 말단에 형광 물질 또는 방사성 물질 표지 (또는 형광 물질 또는 방사성 물질과 반응 가능한 물질 결합)하여, 그 세기를 측정함으로써, 시료 내 페리오스틴 존재 여부 또는 페리오스틴 과발현 여부를 측정할 수 있다.
이와 같이, 압타머를 사용하여 시료 내 페리오스틴 존재 여부 또는 과발현 여부를 확인하는 경우, 기존의 항체를 이용한 검출보다 현저하게 우수한 민감도를 보인다.
본 발명에서 제공되는 페리오스틴에 결합하고 그 활성을 억제하는 신규한 DNA 압타머는 종양 세포 표면에 발현된 페리오스틴 뿐 아니라 정제된 단백질에도 결합한다(Kd ≒ 1 nM). 본 발명의 압타머는 마우스 페리오스틴 및 βIG-H3와 같이 페리오스틴과 구조적 유사성을 갖는 다른 단백질과도 결합 가능하다. 본 발명의 압타머는 세포 표면에 페리오스틴을 발현하는 모든 종류의 세포에 특이적으로 결합가능하며, 페리오스틴-매개 신호 경로를 저해한다. 또한, 본 발명의 압타머는 유방암과 같은 고형암의 부착, 이동 및 침습을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다. 이러한 데이터는 페리오스틴 표적 요법 및 진단에 있어서의 본 발명의 압타머의 다양한 바이오의약적 적용성을 강력하게 보여주는 것이다.
유방암은 가장 흔한 암이며 여성 암사망의 두번째 원인이다. 암 전이는 암 관련 사망에 가장 주된 원인이다. 특히, 유방암 환자들은 대부분 전이가 진행된 후에 진단되는 경우가 많고 수술 및 화학요법에도 불구하고 약 80%의 재발률을 나타낸다. 따라서, 암전이의 치료는 암치료의 주요 목표이다. 새로운 기관의 미세환경에서 전이암이 성장하기 위해서, 암세포는 다양한 유형의 스트레스와 한계(rate-limiting steps)를 극복해야 한다. 페리오스틴과 같이 암세포에서 과도하게 발현하는 분자는 전이성 및 악성 종양으로의 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 페리오스틴은 혈관신생 및 암전이에 있어 중요한 역할을 수행하고, 세포외기질 단백지로서 접근성도 좋기 때문에 유방암과 같은 고형암의 치료를 위한 유력한 표적으로 생각되고 있다. 페리오스틴에 대한 몇몇 항체들이 전이를 포함하는 인간 암의 치료 전략뿐 아니라 항암제- 또는 방사성동위원소-캐리어로서 제안되어 왔다. 특히, 페리오스틴을 표적화하는 항체들은 시험관내(in vitro)에서 암세포 증식, 이동, 침습 및 부착에 영향을 미치며, 생체내(in vivo)에서 항증식 및 항전이 효과를 갖는다. 그러나, 이들 항체는 낮은 친화성(uM range Kd)과 바람직하지 못한 약물동태학적 성질(예컨대, 종양 침투성이 낮고 신속하게 제거됨)을 갖기 때문에, 표적 운반에 적용되는데 한계가 있고, 따라서 개선된 약물동태학적 성질 및 혈청 안정성을 갖는 고친화성 분자의 개발이 중요해지고 있다.
반면, DNA 압타머는 화학적으로 합성 가능하고 생체내 적용을 위한 변형이 용이하고 종양조직으로의 침투능이 우수하기 때문에 항암 분자로서 다양한 이점을 갖는다. 천연 올리고뉴클레오타이드는 뉴클리에이즈에 의한 가수분해에 민감하기 때문에, DNA 압타머를 바이오의약 적용하는데 있어서 포스페이트 백본을 안정화시키는 것이 주된 중점사항이 된다. DNA 압타머를 메틸 포스포네이트와 포스포라미데이트와 같은 중성기를 사용하여 변형시키면 뉴클리에이즈에 대한 저항성이 증가되지만, 이러한 DNA 압타머 유사체들은 비변형 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 낮은 결합 친화도를 나타낸다. 결합 친화도를 높이고 slow off-rate 감소시키기 위하여, 다양한 작용기를 사용한 변형 뉴클레오타이드를 사용하여 SELEX를 수행하였다. 그 결과 얻어진 데이터는 벤질기로 변형된 DNA 압타머가 페리오스틴(1nM)과 높은 친화도를 나타내고 교차반응성이 최소화됨을 보여준다. 정제된 단백질과 생체 내에 존재하는(endogenous) 단백질의 잠재적인 형태학적 차이 때문에, 정제된 단백질에 대하여 분리된 압타머들은 생체 내에 적용시에 그 표적 단백질에 항상 결합할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 생체 내에서 활성을 나타낼 수 있는 압타머의 동정을 위하여 생체 내 관련 조건을 스크리닝 과정에 통합시키는 것이 필요하다. 본 발명에서의 신규한 페리오스틴 DNA 압타머 (PNDA-3)는 유방암 세포 표면에서 발현하는 페리오스틴과 특이적으로 결합하는 반면 페리오스틴-음성 세포주에는 결합하지 않는다. 세포 기반 접근의 가장 주된 위험성은 스크리닝용 세포의 기원 생물의 종과 생체 내 결합 확인을 위한 시험 동물 모델의 종이 서로 다르다는 점이다. 리간드 스크리닝을 위하여 인간 세포 또는 인간 세포주를 사용하는 것은 궁극적 바이오의약 용도와 잘 맞지만, 표적 분자에 대한 리간드의 결합 특이성과 친화도는 시험 동물 모델에서 충분히 입증될 수 없고, 전임상 연구를 할 수 없게 한다. 따라서, 본 발명에서는 구조적 상동성을 갖는 다양한 단백질에 결합하는 압타머를 시험하였다. 인간과 마우스의 종(species) 차이에도 불구하고, 압타머는 두 종류 단백질에 모두 결합하였으며, 이는 인간 β페리오스틴과 마우스 페리오스틴 간 높은 서열 및 구조적 상동성 (92%) 때문인 것으로 생각된다. 이와 같이 압타머가 종 비의존적 페리오스틴에 결합하기 때문에 다양한 마우스 질병 모델에서의 이들 리간드의 특성을 확인하여 바이오의약 용도로 제공할 수 있다. 인간에서, fas-1 도메인을 포함하는 4개의 단백질이 알려져 있다. βIG-3H과 페리오스틴은 4개의 fas-1 도메인을 갖는 분비 단백질이고, stabilin-1과 stabilin-2은 7개의 fas-1 도메인을 갖는 막 단백질이다. 이들 단백질의 생물학적 작용은 완전히 밝혀지지 않았지만, 모든 fas-1 도메인은 인테그린-상호작용 타이로신-히스티딘(YH) 모티프를 포함하기 때문에, 세포-기질 상호작용을 조절하는 작용을 할 가능성이 제안된다. 본 발명의 압타머는 페리오스틴과 인테그린 간의 상호작용을 차단한다. 본 발명의 압타머가 페리오스틴이 세포주 표면의 인테그린에 결합하는 것을 완벽하게 저해하고 상호작용을 억제함으로써, 기능적으로 페리오스틴의 작용을 차단하는 물질임을 보여준다.
또한, 본 발명의 분리된 압타머는 페리오스틴-매개 전이의 진단 또는 분자 수준 영상화에 유용할 수 있다. 상기 압타머는 인간 페리오스틴 뿐 아니라 마우스 페리오스틴과도 특이적으로 결합한다. 페리오스틴 발현 수준은 정상 유방 조직 또는 정상 유방 상피 세포로부터 유도된 불멸화 세포주에서 탐지되지 않는다. 그러나, 유전자 어레이 데이터 및 프로테오믹 분석 데이터에 따르면, 대다수의 유방암 시료에서 페리오스틴의 발현이 정상 유방조직에 비해 20 배 이상 증가되어 있다. 또한, 뼈에 전이가 일어난 유방암 환자의 경우, 혈청내 페리오스틴 농도가 상당히 증가되어 있다. 따라서, 이 압타머는 암 환자의 전이 가능성 및 암 예후를 in vitro 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서, 바이오틴으로 표지된 압타머를 사용하여 다양한 단백질의 혼합물로부터 페리오스틴을 특이적으로 탐지할 수 있다. 또한, 형광물질 (Cy3-)를 결합한 형태의 압타머는 유방암전이 마우스모델과 실제 유방암 환자에서 분리한 조직에서 특이적으로 페리오스틴을 탐지 가능하다. 항체와 비교하여, 본 발명의 DNA 압타머는 보다 신속한 종양 흡수(uptake), 보다 신속한 혈액 제거 및 보다 지속적인 종양 정체 (tumor retention)을 나타냄으로써, 보다 높은 혈액에 대한 종양 비율로 현저한 이미지화가 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 압타머는, 특히 종양이 전이된 생체 미세 환경에서, 페리오스틴 분비 세포의 생체내 이미지화에 유용하게 사용될 수 있다.
분비된 페리오스틴은 세포 부착 단백질 및 세포 부착 분자(αvβ3 및 αvβ5 인테그린)를 통하여 신호전달하는 사이토카인으로서 작용한다. 페리오스틴은 EGFR (epidermal growth factor receptor)의 리쿠르트 또는 모집(recruitment) 및 Akt/PKB와 FAK-매개 신호화 경로의 활성화를 촉진시킨다. 본 발명의 압타머는 페리오스틴이 인테그린에 결합하는 것을 억제함을 통해 세포 내 하위 신호의 활성화를 저해한다. 본 발명에서 TIR 형광 현미경을 사용하여 상기 압타머가 세포 표면에 발현된 페리오스틴에 결합하고 인테그린과의 상호작용을 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 여러 도메인 삭제 변이단백질을 이용한 결합력을 확인해 본 결과 상기 압타머는 인테그린과의 결합에 중요한 fas-1 도메인에 결합하는 것을 알 수 있었다.
인테그린 αvβ3 및 αvβ5의 자극은 PI-3 카이네이즈와 FAK-매개 신호화 경로를 활성화시킨다. 일관적으로, 유방암 세포주 4T1, MDA-MB-231에서, 상기 압타머는 페리오스틴에 의하여 유도되는 FAK 및 Src 인산화를 강력하게 감소시킨다. 페리오스틴은 인테그린 αvβ3를 통하여 Akt/PKB 신호화 경로를 활성화시켜서 결장암에서의 암세포 생존을 증진시킴이 보고된 바 있다. 그러나, 본 발명의 압타머 처리는 Akt 인산화와 세포 생존에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 상기 압타머의 FAK 및 Src 인산화 억제 능력은 상기 압타머가 페리오스틴-인테그린 복합체의 형성을 저해하기 때문인 것으로 설명될 수 있을 것이다.
암세포 증식에 있어서의 페리오스틴의 역할과 관련하여 다양한 결과가 보고되어 있다. 재조합 페리오스틴의 첨가에 의하여 결장직장암 세포와 담관암(cholangiocanrcinoma) 세포의 증식이 유도된다. 반면, 난소암 세포주 및 유방암 세포주에서의 페리오스틴의 정상 범위를 벗어난 발현은 세포 증식에 영향이 없거나 오히려 세포증식을 억제한다. 췌장암세포를 이용한 최근 연구 결과는 페리오스틴이 종양 발생에 이중적(biphasic) 효과를 발휘할 수 있음을 제안한다. 본 발명에서 제시되는 in vitro 세포 증식 데이터는 본 발명의 압타머가 세포 증식에 영향을 미치지 않음을 보여주며, 이는 페리오스틴이 유방암에서 전-증식 인자 (pro-proliferation factor)가 아님을 의미하는 것이다.
페리오스틴의 과발현은 암성장 뿐 아니라 전이에 관련된 기능들에도 영향을 미친다. 임상적 데이터에서, 페리오스틴의 과발현이 말기암 환자에서 많이 발견되고, 환자의 나쁜 예후와도 관련성이 있음을 보여주고 있다, 또한, 페리오스틴을 과발현 하는 암세포주를 마우스 모델에 주입한 경우, 암전이가 촉진되는 것이 관찰되고 있다. 근래에 들어서, 암전이 단계의 시작에 해당하는 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 과정을 페리오스틴이 조절한다는 것이 보고되고 있다. 페리오스틴은 암전이의 주요 기능인 암세포 부착, 이동, 침습을 촉진한다. 본 발명에서 페리오스틴 압타머의 처리로 인해 페리오스틴에 의해 유도되는 암세포 부착, 이동, 침습 작용이 저해되는 것을 확인하였다. 즉, 상기 압타머는 암전이를 억제하는 기능을 가지고 있다.
결론적으로, 상기 압타머의 억제 특성은 상기 압타머가 새로운 부류의 항암제 설계를 위한 선두 화합물로서 유용함과 페리오스틴을 과발현하는 암을 표적화하는 억제제의 레퍼토리에 추가될 수 있다. 본 발명에서는 페리오스틴 작용을 저해하는 압타머가 유방암의 전이에 현저한 억제 효과를 가짐을 처음으로 제안한다.
본 발명에서 제공되는 페리오스틴 압타머는 페리오스틴과 인테그린과의 상호작용을 저해하여 신호화 경로를 차단하고, 암세포의 부착, 증식, 이동, 침습을 억제함으로써 항암제 및/또는 암진단 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 페리오스틴 DNA 압타머(PNDA)의 페리오스틴 단백질과의 결합력을 보여주는 것으로, 32P-표지된 PNDA와 다양한 농도의 인간 재조합 페리오스틴(up to 100nM)을 사용하여 측정된 결합 친화도 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 PNDA의 페리오스틴과의 특이적 상호작용을 보여주는 것으로, 2a는 재조합 인간 페리오스틴(rhPN)에 대한 PNDA의 경쟁적 결합을 보여주는 그래프이고, 2b는 구조적으로 유사한 단백질들과의 압타머 결합 특이성을 보여주는 결과이고, 2c와 2d는 biotin을 결합시킨 PNDA를 사용하여 다양한 풀(pool)의 단백질 복합체에서 페리오스틴만을 특이적으로 분리 가능함을 보여주고 이러한 반응이 농도 의존적임을 보여주는 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 PNDA가 세포 표면에 발현되는 페리오스틴의 결합과 인테그린과의 상호작용이 억제를 보여주는 것으로, 3a는 페리오스틴 양성 세포주인 4T1에 대한 압타머 결합을 나타내는 결과이고, 3b는 페리오스틴 음성 세포주인 MCF7에 대한 결과이고, 3c는 PNDA가 페리오스틴과 인테그린의 상호작용을 억제하는 것을 보여주는 TIR 형광 현미경 결과이다.
도 4a 및 4b는 일 실시예에 따른 PNDA가 페리오스틴의 fas-1 도메인에 결합하는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 유방암 세포에서의 부착, 이동 및 침습에 대한 일 실시예에 따른 PNDA의 억제 효과를 보여주는 것으로, 5a는 세포 부착 에세이 결과이고, 5b는 PNDA의 유방암 세포 이동에 대한 효과를 보여주는 결과이고, 5c는 Matrigel 침습 에세이 결과이고, 5d는 실험에 사용한 유방암 세포주에 대한 PNDA의 독성을 확인한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 PNDA에 의한 페리오스틴 의존적 신호 경로의 억제를 보여주는 것으로, 6a는 4T1 세포에서의 결과이고, 6b는 MDA-MB-231세포에서의 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 PNDA의 작용을 모식적으로 보여준다.
도 8a 내지 8e는 일 실시예에 따른 PNDA의 유방암 세포 성장 및 전이 저해 시험(in vivo) 결과를 보여주는 것으로, 8a는 PNDA 처리에 따른 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이고, 8b는 PNDA 처리에 따른 마우스모델의 체중변화를 보여주는 그래프이고, 8c는 PNDA 처리에 따른 유방암의 폐전이 억제를 보여주는 사진이고 (화살표는 nodules을 나타냄), 8d는 8c의 사진의 폐의 nodules을 수치화한 그래프이고, 8e는 PNDA 처리에 따른 폐조직의 H&E 염색 모습을 보여주는 현미경 사진이다.
도 9a 내지 9c는 일 실시예에 따른 PNDA의 종양 세포 성장 및 혈관 신생에 대한 in vivo 효과를 보여주는 것으로, 9A는 PNDA 처리에 따른 원발 종양 섹션의 면역염색 결과를 보여주는 현미경 사진이고, 9b와 9c는 각각 Ki-67 항체 (9b) 및 CD31 항체 (9c)를 사용하는 면역조직화학 시험 결과를 정량적으로 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
참고예
항체 및 시약의 준비
인간 페리오스틴 단백질 및 마우스 페리오스틴 단백질은 R&D system (Minneapolie, MN)에서 구입해서 사용하였다. 인테그린 αvβ3와 αvβ5의 항체는 Millipore (Temecula, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 웨스턴 블랏시 사용한 항체는 다음과 같다: Anti-ERK, phosphor-ERK, AKT, phosphor-AKT, FAK, phosphor-FAK, SRC, phosphor-SRC Ab (cell signaling, Beverly, MA), beta-actin Ab (Santa Cruz Biotechmology, Snata Cruz, CA).
세포 배양
MCF7, MDA-MB-231 인간 유방암 세포주, 4T1 마우스 유방암 세포주 및 인간 배아 신장 세포 293T를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 얻었다. MCF7 세포를 10% fetal bovine serum (Gibco), penicillin (100 units/ml, Gibco), 및 streptomycin (100 units/ml, Gibco)가 보충된 RPMI-1640 (Lonza) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. MDA-MB-231, HEK 293T, 4T1 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco), penicillin (100 units/ml), 및 streptomycin (100 units/ml)가 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Lonza)에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 혈청을 결핍시키기 위하여, MCF7, MDA-MB 231, 및 4T1 세포를 1XPBS로 3회 세척하고 혈청 무함유 배지(DMEM 또는 RPMI-Lonza)에서 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 상기 준비된 페리오스틴, 인테그린 항체 및 하기하는 압타머를 아래의 각 실시예에 기재된 방법으로 처리하였다.
실시예 1: 항 페리오스틴 DNA 압타머의 in vitro 선별
SELEX에 필요한 single strand modified DNA library를 제조하기 위하여 5'에 바이오틴(biotin)이 들어간 antisense library [5'-biotin-d(CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT -N40-CTCGTCACACACTCACATC)-3' (SEQ ID NO: 47)]를 합성하였다. Antisense library를 가지고 50uM 5' primer (GATGTGAGTGTGTGACGAG; SEQ ID NO: 48)와, 0.5mM dNTP(ATP, GTP, CTP, Bz-dU), 0.25U/ul KOD XL(Invitrogen), 10X extension buffer(1.2M Tris-HCl pH7.8, 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 70mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1mg/ml BSA) 상에서 70℃ 1hr 반응하여 double strand DNA를 제조하였다. 여기에 20mM NaOH를 이용하여 single strand modified DNA library 를elution한 뒤 HCL 용액으로 중화하였다. 합성된 Library 1nmole을 선별 버퍼 (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시킨 후, Negative selection을 위하여 10X protein competition buffer(10μM prothrombin, 10μM casein, 0.1%(w/v) HSA (human serum albumin, SIGMA) 10μL를 혼합한 뒤, 상층액이 제거된 Hexa-His가 결합되어있는 Talon bead(50%(w/v) slurry, 10mg/ml Invitrogen)에 첨가하여 37℃에서 10분간 반응 시켰다.
Negative selection반응 후, 상층 액만을 취하여 새로운 tube에 옮긴 후, 페리오스틴과 결합시킨 Talon bead에 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. Selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) 100μL로 DNA와 페리오스틴 복합체와 결합한 Talon bead를 5번 세척하였다. 5번째 세척시에는 새로운 plate에 옮겨 세척하였다. 2mM NaOH 용액 85μL를 첨가하여 표적에 결합하는 library를 elution한 뒤 8mM HCl 용액 20μL로 neutralization하였다.
표적에 결합하는 library DNA를 QPCR(quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다. 앞서library제조에 사용된 5' primer (GATGTGAGTGTGTGACGAG (SEQ ID NO: 48)와 3' primer(Biotin-CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT, Biotin-SEQ ID NO: 49) 각각 5uM (5 X QPCR master Mix, Novagen), 0.075U/ul KOD(Novagen), 1mM dNTP(Roche Applied science), 25mM MgCl2 , 5XSYBR greenI(Invitrogen)를 총부피가 125μL가 되도록 혼합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1 cycle, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30 cycle을 반복하여 double strand library을 제조하였다.
상기 QPCR을 통하여 만들어진 DNA library를 25μL Myone SA bead(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 고정하였다. 이 때 혼합된 DNA 양은 QPCR product로 60ul로 하였다. 20mM NaOH 용액을 첨가하여 single strand DNA로 만들어주었다. 그리고 상기 Library 제조와 같은 방법으로 변형된 핵산을 포함하는 DNA를 합성하여 다음 round에 사용하였다. SELEX round는 총 8회 수행하였고 보다 선택적인 결합을 위하여 4회부터 6회까지 그리고 7회부터 8회까지 각각 DNA와 단백질 (페리오스틴) 복합체를 10mM DxSO4(sigma)용액에 1/200, 1/400로 희석하여 DNA aptamer를 선별하였다.
실시예 2: 페리오스틴과 상호작용하는 DNA 압타머 선별 및 상호작용 시험
SELEX 라운드를 성공적으로 수행한 후, 최종적으로 얻어진 DNA pool을 TA cloning kit(SolGent)을 이용하여 cloning하였다. 그리고 vector상에 존재하는 M13 primer(CAGGAAACAGCTATGAC; SEQ ID NO: 50)을 가지고 sequencing하여 다음과 같은 sequence를 얻었다. 얻어진 페리오스틴에 매우 특이적으로 결합하는 DNA aptamer는 5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[Core sequence]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO: 46)의 염기서열을 가지며, 여기서 Core Sequence는 아래의 표 1에 나타낸 바와 같고, 이 중에서 n은 Benzyl-dU를 나타낸다.
No of clone SEQ ID NOs. Core Sequence
1 SEQ ID NO: 5 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnnAGGnAnCGnC
2 SEQ ID NO: 5 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnnAGGnAnCGnC
3 SEQ ID NO: 6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGC
4 SEQ ID NO: 7 nCnGAnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCnnCAGGnAnCGnC
5 SEQ ID NO: 8 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGACAAC
6 SEQ ID NO: 9 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC
7 SEQ ID NO: 6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGC
8 SEQ ID NO: 10 nnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnAC
9 SEQ ID NO: 11 nCnGGnCCnnCCCAnAnnAGAnCAnAnCCnCGGGnAnCGnC
10 SEQ ID NO: 12 CCnGCGCGnnnCAAnnnAnnCCCACAnACCCnCAnAAGCC
11 SEQ ID NO: 13 nnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnGC
12 SEQ ID NO: 9 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC
13 SEQ ID NO: 14 nnGnCGAAAnnnGGnAnGAGnAGGnnGnAGGnAGAGCCCGC
14 SEQ ID NO: 15 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
15 SEQ ID NO: 9 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC
16 SEQ ID NO: 16 nCnGGnCCnnCCnnnGACnACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC
17 SEQ ID NO: 17 nCnGGnCCnnCCnCCCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnAC
18 SEQ ID NO: 18 nCCGGnCnGAnnnCCAACAnnnGnCCnAnCCCnGAnCGnCC
19 SEQ ID NO: 19 nCnGAnCCnnCCnCCCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnAC
20 SEQ ID NO: 20 nCnGGnCCnnCCnCnnnGnCCCCGAnAGGGnAnGGnAnCGC
21 SEQ ID NO: 21 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGGC
22 SEQ ID NO: 15 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
23 SEQ ID NO: 22 GGnCnGGnCCnnAAGAnGnnCGnAnCGnACGAGCnCCCnAC
24 SEQ ID NO: 15 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
25 SEQ ID NO: 23 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnC
26 SEQ ID NO: 6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGC
27 SEQ ID NO: 24 GCGACnGGGCGAGGCnnGGGAnGGGnnACGCCGnGCAGC
28 SEQ ID NO: 25 AAGCnnCGGnCnGGnCCnnCCCCCCnGGCnnnGGCnCnAAGGGGCCGCC
29 SEQ ID NO: 26 AAGGCACACCnCGCACAnGnnAACnACnACnGACACACnCC
30 SEQ ID NO: 27 nnGnCACAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCCGCACCGnAC
31 SEQ ID NO: 28 nnAnCACAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnGC
32 SEQ ID NO: 29 CnAnAAACnCGnnGCCCCCnCACAGCnGCAAnACACnCGGC
33 SEQ ID NO: 12 CCnGCGCGnnnCAAnnnAnnCCCACAnACCCnCAnAAGCCC
34 SEQ ID NO: 15 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
35 SEQ ID NO: 30 AAGCnnCGGnCnGGnCCnnCCCCCCnGGCnnnGGCnCnAAGGGGGCCGCn
36 SEQ ID NO: 31 nGnAAGnGnnnnCnAnCAnnnAAnGnnnGCAGACCGnnGAC
37 SEQ ID NO: 32 nGnGnGnGnnnnnnGnGGnCnnAAnCAnGCAGCnGnGnnGC
38 SEQ ID NO: 33 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGAnCAAC
39 SEQ ID NO: 14 nnGnCGAAAnnnGGnAnGAGnAGGnnGnAGGnAGAGCCCGC
40 SEQ ID NO: 15 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
41 SEQ ID NO: 34 nCAACnnnnGGnGCCnGGnGGCnnnnACCGAnnGCGCACGC
42 SEQ ID NO: 17 nCnGGnCCnnCCnCCCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnAC
43 SEQ ID NO: 6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGC
44 SEQ ID NO: 35 nCAACnnnnGGnGCnnGGnGGCCnnnACCGAnnGCGCACGC
45 SEQ ID NO: 36 nCGACnAnCGAGnnnCAAnnnAnnCCCCCACnCACAAnCnC
46 SEQ ID NO: 5 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnnAGGnAnCGnC
47 SEQ ID NO: 9 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC
48 SEQ ID NO: 14 nnGnCGAAAnnnGGnAnGAGnAGGnnGnAGGnAGAGCCCGC
49 SEQ ID NO: 37 AAGCnnCGGnCnGGnCCnnCCCCCCnGGCnnnGGCnCnAAGGGGGCCGCC
50 SEQ ID NO: 38 ACAACCCCnCAACnGCnAnCACnCnnGGCnCAACnAAnnAC
51 SEQ ID NO: 39 nCnGGnCCnnCCnCnCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnAC
52 SEQ ID NO: 40 nnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGnACCGnAC
53 SEQ ID NO: 6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGC
본 실시예의 경우, n = Benzyl-dU [5-(N-Benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine]
Figure 112012092650470-pat00001
A = 2'-deoxyAdenosine
G = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidine
T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine)
상기 발굴된 페리오스틴 압타머들을 다음과 같이 유사 family로 분류하였다 (서열 상동성은 염기서열의 85% 상동성을 기준으로 함):
개수 Sequence Clones
10 nCnGGnCCnnCCnGnAnnAGAnCAnAnCCnCAGGnAnCGnC
(SEQ ID NO: 15)		 1, 2, 4, 9, 14, 22, 24, 34, 41, 46
2 CCnGCGCGnnnCAAnnnAnnCCCACAnACCCnCAnAAGCC (SEQ ID NO: 12) 10, 33
5 nnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnGC (SEQ ID NO: 13) 8, 11, 30, 31, 52
8 nCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGGnCAAC (SEQ ID NO: 9) 5, 6, 12, 15, 16, 25, 38, 47
3 nnGnCGAAAnnnGGnAnGAGnAGGnnGnAGGnAGAGCCCGC (SEQ ID NO: 14) 13, 39, 48
4 nCnGGnCCnnCCnCCCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnAC (SEQ ID NO: 17) 17, 19, 42, 51
6 nCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGGC (SEQ ID NO: 21) 3, 7, 21, 28, 43, 53
3 AAGCnnCGGnCnGGnCCnnCCCCCCnGGCnnnGGCnCnAAGGGGCCGCC (SEQ ID NO: 25) 28, 35, 49
2 nCAACnnnnGGnGCCnGGnGGCnnnnACCGAnnGCGCACGC (SEQ ID NO: 34) 41, 44
페리오스틴에 강력하게 결합하는 몇몇 무작위 서열을 분리하였다. 8번째 SELEX 라운드 후 53개 클론을 시퀀싱하였다; 페리오스틴에 대한 5개의 구별되는 DNA 시퀀스(DNA 압타머)를 선별하여 filter binding assay를 수행하였다. 이를 위하여 각 DNA 1μM, 0.25μM, α-P32ATP(5μM, perkinelmer), 0.25μL TdT, 및 10XNEB buffer4(NEB) 10μL reaction volume으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 incubation 하여, TdT를 불활성화시켰다. DNA 는Micro spin G-50 column(GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 표지된 DNA 20,000cpm을 100μL 1xSB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)에 넣고 95℃에서부터 1초에 0.1℃씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 그리고, buffer (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)를 이용하여 페리오스틴을 100nM에서 12 point로 serial dilution한 뒤, 상기 가열 및 냉각시킨 DNA pool 30μL를 각각 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. Nylon membrane(GE healthcare)에 DNA와 페리오스틴의 혼합물을 각각 2μL씩 spotting한 뒤 zorbax resin(Agilent) 5.5μL를 첨가하였다. 그리고 미리 1X SB buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) 50μL로 적셔놓은 Durapore filter(Millipore)에 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 membrane filter를 100μL의 1X selection buffer(200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2)로 씻어주었다. Filter plate를 image plate에 overnight expose한 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 image를 정량화 하였다. 상기 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 SigmaPlot 11(Systat Software Inc.)을 이용하여 구하였으며, 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
clone # (SEQ ID NO) 17 (SEQ ID NO: 17) 8 (SEQ ID NO: 10) 3 (SEQ ID NO: 6) 5 (SEQ ID NO: 8) 1 (SEQ ID NO: 5)
Bmax (%) 78±1 81±2 72±2 80±3 80±3
Kd(nM) 0.63±0.04 1.14±0.19 0.54±0.08 1.41±0.25 0.60±0.12
Bmax은 DNA:단백질 복합체의 외삽 (extrapolated) 최대량을 의미하고, 1에 가까울수록 좋은 성능을 의미하는 것이고, Kd(dissociation constant)는 친화력을 나타내는 수치로 수치가 낮을수록 결합력이 높음을 나타낸다.
전체 clone 중 4개의 압타머를 선별하여 결합 친화도와 특이성을 높이기 위하여, 길이를 80 뉴클레오타이드에서 50 뉴클레오타이드로 줄이고 'PNDAs'로 명명하였다. 이를 위하여 primer 위치의 각각 5mer씩 남겨두어 합성하였으며, 페리오스틴에 대한 결합력을 측정하였다. (표 4 참조).
Clone# 서열 B Max(%) Kd
(nM)
PNDA-1 ACGAGnCnGGnCCnnCCnnnGACGACnAnnGnnnGGnAnCGAnCAACAACAA
(SEQ ID NO: 41; Core seq - SEQ ID NO: 33)		 92 2.85
PNDA-2 ACGAGnCACACGnnGAnGACnGGAnGGnAGnnAAAGAGGGnGGGGCAACAA
(SEQ ID NO: 42; Core seq - SEQ ID NO: 6)		 78 7.41
PNDA-3 ACGAGnnGnCGCAnGnGCGGnnCAGnCnGGnCCnnCAGCACCGnACAACAA
(SEQ ID NO: 43; Core seq - SEQ ID NO: 10)		 95 1.07
PNDA-4 ACGAGnCnGGnCCnnCCnCCCnAAnnGCnGnnGAGGnAnCGGCnACAACAA
(SEQ ID NO: 44; Core seq - SEQ ID NO: 17)		 90 1
본 실시예에 있어서, 상기 서열에서 'n'은 Benzly-dU를 나타낸다. 압타머의 무작위 서열 부분(가변 서열, core sequence)은 굵은 글씨체로 표시하였다.
상기 표 4는 본 시험에 사용된 PNDA 서열과 각 서열에서의 시험 결과를 보여준다. 해리상수(Dissociation constants, Kd)와 Bmax는 값을 SigmaPlot 11(Systat Software Inc.)을 이용하여 구하였다. 선별된 압타머 중에서 PNDA-3의 K d 값과 B max값을 토대로, 결합력이 가장 높은 적절한 후보로 고려될 수 있다.
도 1는 32P-표지된 PNDA와 다양한 농도의 인간 재조합 페리오스틴(up to 100nM)을 사용하여 상기한 방법으로 측정된 결합 친화도 결과를 보여주는 것으로, 결합 에세이는 3번 반복 수행되었고, 페리오스틴 농도에 따른 평균값과 표준편차를 구하여 나타내었다. Y축의 fraction bound는 단백질을 넣어주지 않고 p32 labeling 한 압타머만의 signal을 0으로 했을 때, 단백질과 결합하는 압타머의 정도를 백분율로 나타낸 것이다.
한편 competition assay 를 통해 PNDAs와 페리오스틴 간의 특이적 상호작용을 추가로 분석하였다. 약 10nM의 [α-32 P]-ATP-표지된 PNDA-3을 방사능 표지하지 않은 PNDA-3의 특이적인 경쟁자 또는 비특이적 경쟁자 (컨트롤 압타머)와 함께 페리오스틴 단백질과 반응시키고, DNA-단백질 복합체의 결합 정도를 상기한 방법으로 측정하였다. 컨트롤(CTL) 압타머로 ACGAGGnACGGnGCnGAAGGACCAGACnGAACCGCACAnGCGACAAAACAA(SEQ ID NO: 51를 사용하였다(이하 실시예들에서도 동일). 그 결과, 컨트롤 압타머의 경우 PNDA-3와 페리오스틴의 결합에 영향을 미치지 못하지만, 비표지된PNDA-3는 표지된 PNDA-3와 페리오스틴간의 결합을 효과적으로 감소시킨다. 즉, PNDA-3 가 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 것을 도 2a 에 나타내었다. 도 2b에서는 인간 페리오스틴과 구조가 유사한 단백질들(마우스 페리오스틴, 인간 βIG-3H(R&D system), 인간 IgG (Sigma))에 대한 상기 압타머의 결합정도를 확인하여 비교하였다. PNDA-3 는 인간 IgG 단백질에는 결합을 하지 못하지만, 인간과 마우스 페리오스틴 모두에 결합한다. 뿐만 아니라 인간 βIG-3H 역시 적은 비율이긴 하지만 PNDA-3에 결합하는 것을 확인하였다.
인간 페리오스틴과 마우스 페리오스틴은 아미노산 서열에 있어서 90% 이상의 상동성을 보이기 때문에, 이들 간의 교차 결합은 예상 못한 바는 아니다.
생체 내 조건에서 DNA 압타머와 페리오스틴의 상호작용을 확인하기 위해 affinity purification 을 진행하였다. 10%(w/v) 혈청 버퍼(FBS solution, FBS-Gibco)에 10nM 페리오스틴을 첨가한 후, 상기 바이오틴화된 압타머와 1시간 반응시킨 후, streptavidin bead로 페리오스틴-PNDA-3 복합체를 분리하여 페리오스틴의 존재여부를 SYPRO ruby 염색과 이뮤노블로팅으로 확인하여 도 2c 및 2d에 나타내었다. 도 2c 와 2d에서 컨트롤 압타머는 혈청 내 존재하는 페리오스틴을 검출하지 못하지만, PNDA-3의 경우 특이적으로 페리오스틴을 확인할 수 있다. 도 2c에서 I는 input으로 실험에 사용된 페리오스틴의 양의 1/10을 컨트롤로 로딩한 결과이다. 또한, 이러한 압타머의 특이적 반응이 페리오스틴 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과들은 본 발명의 압타머가 페리오스틴을 특이적으로 인식하고 페리오스틴에 대하여 높은 친화도를 가짐을 보여준다.
실시예 3: 압타머의 페리오스틴의 세포 표면 결합 억제 시험
정제된 단백질과 세포에서 발현되는 단백질은 형태적 차이점 때문에, 정제된 단백질에 대하여 분리된 압타머가 모두 세포에 결합할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 압타머의 4T1 유방암 세포(페리오스틴 발현 세포)와 MCF7 세포 (페리오스틴 결핍 세포)와의 결합능을 시험하였다.
Cy3-표지된 PNDA-3을 페리오스틴-양성 세포 4T1 (ATCC에서 구입) 또는 페리오스틴 음성-세포 (MCF7; ATCC에서 구입) 와 반응시켰다. 상기 두 종류 세포를 각각 약 0.2 x106 세포의 양으로 선별 버퍼 (200mM HEPES, 510mM NaCl, 25mM KCl, 25mM MgCl2) 200uL에 100nM Cy3-표지된 PNDA-3와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 선별 버퍼 200uL로 3회 세척하고, 4%(w/v) 파라포름알데하이드 (PFA) 500uL에 재현탁시켰다. 이와 같이 준비된 샘플을 FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA)의 FL3-H channel 상에서 분석하였다.
상기 세포들은 유동세포 분석법(flow cytometry)에 의하여 분석하였으며, 세포주 단독으로 배양한 것을 대조군으로 하였다. 얻어진 결과를 도 3a(4T1세포) 및 3b(MCF7 세포)에 나타내었다. 도 3a에서와 같이, Cy3-표지된 PNDA-3는 4T1 세포와는 결합하지만, 컨트롤 압타머(CTL)의 경우 세포주에 결합을 하지 않는다 (도 3a). 또한, 본 발명의 압타머는 음성 대조군 세포주인 MCF7 세포에는 배경 수준 이상으로 결합하지 않는 것으로 나타났다 (도 3b). 따라서, 본 발명의 압타머 PNDA-3는 세포 표면의 페리오스틴을 특이적으로 인식할 수 있는 것으로 나타났다.
PNDA-3의 페리오스틴과의 세포 표면 결합을 확인하기 위하여, 상기한 바와 같은 방법으로 Cy3-컨쥬게이티드PNDA-3 결합을 TIR(total internal reflection) 형광 현미경(Cell
Figure 112012092650470-pat00002
Olympus, final magnification 100x) 하에서 관찰하였다. 100nM Cy-3 PNDA-3를 4T1 세포주의 배양액에 첨가한 후, 붉은 형광 점들이 세포 표면에서 관찰되는 것을 확인하였다. 도 3c에서 세포 표면의 PNDA-3결합이 과량의 비표지된 PNDA-3의 첨가에 의해 완벽히 억제됨을 확인할 수 있다. 또한, 세포표면에 존재하는 인테그린의 작용을 억제하는 항체를 미리 반응시킨 후, cy-3 PNDA3를 첨가하게 되면, cy-3 PNDA-3의 결합이 감소하는 것을 알 수 있다. 즉, PNDA-3가 페리오스틴과 인테그린 간의 상호작용을 억제함을 확인할 수 있다.
실시예 4: 압타머의 결합부위 지도화
PNDA-3의 결합 부위를 찾기 위해, 도 4a에 나타낸 여러 변이체들을 subcloning을 통해 만들었다. 클로닝에 사용된 전체길이의 인간 페리오스틴 cDNA는 듀크대학의 Wang XF박사로부터 받아서 사용하였다. 각각의 변이체들을 293T 세포주(ATCC에서 구입)에 과발현시킨 후, 세포를 세포 용해 버퍼(50 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM sodium fluoride, 1 mM phenylmethysulfonyl fluoride, complete protease inhibitor cocktail (Roche))를 사용하여 용해시키고, 4℃ 14,000xg에서 10분 원심분리 하였다. 분리한 세포용해물의 농도를 Bio-rad protein assay kit 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay kit(biorad, # 500-0002)로 측정하였다. 동일량의 변이체 세포용해물을 20pmol의 biotin-PNDA-3와 4℃ 2시간 반응시킨 후, streptavidin bead를 첨가하여 압타머-단백질 복합체를 분리하여, 세포용해버퍼로 4번 세척 후, bead를 2X sample buffer로 용출하여, 6-16% SDS-PAGE 젤에서 분리하여 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 anti-GFP(santa cruze) 항체로 4℃ 에서 12시간 반응시켰다. 이들 항체는 대응하는 horseradish peroxidase-컨쥬게이티드 이차 항체 (Cell Signaling Technology, Inc)를 사용하여 검출하였다. 대응하는 단백질을 ECL 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)와 ImageQuantTM LAS 4000(GE Healthcare)를 사용하여 분석하고 가시화하였다.
도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 완전한 길이의 페리오스틴의 경우 PNDA-3와 복합체를 형성하여 웨스턴블랏으로 확인이 되지만, 이러한 결합은 4번 5번 변이체에서는 현저하게 감소되어 있다. 즉, PNDA-3가 페리오스틴에 결합하는 중요하고 필수적인 도메인은 세번째 fas-1 도메인이고, 이들은 인테그린과의 결합에 중요한 부분일 것으로 예상된다.
실시예 5: 페리오스틴 매개 유방암 세포 부착, 이동 및 전이 억제 시험( in vitro)
in vitro 에세이(부착, 이동 및 전이)에 의하여 MCF7, 4T1, 및 MDA-MB-231 세포와 같은 몇몇 유방암 세포주의 전이 가능성에 대한 페리오스틴 및 항-페리오스틴 압타머(PNDA-3)의 효과를 조사하였다.
10ug/ml type I Collagen(Sigma) 또는 10ug/ml 페리오스틴으로 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에서 부착 에세이를 수행하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위하여, 상기 플레이트를 0.2% BSA로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 세포를 트립신처리하고, 1x106 cells/ml 농도로 1% BSA, 1mM MgCl2, 0.5mM CaCl2를 포함하는 DMEM에 현탁시켰다. MCF7, 4T1, 및 MDA-MB-231 세포 (각각 1x106)를 100nM 압타머 또는 2ug Ab(αvβ3 또는 αvβ5의 항체)에 30분 동안 노출시켰다. 세포(1x105 cells, 100ul)를 각 웰에 첨가하고 37℃의 5% CO2 humidified air incubation에 30분 동안 두었다. 비부착 세포는 웰을 phosphate-buffered saline (PBS)으로 3회 세척하여 제거하였다. 부착 세포는 4% paraformaldehyde로 실온에서 10분간 고정시키고, PBS로 세척하고, 0.4% crystal violet으로 10분간 염색하였다. 염색시료를 30% acetic acid 용액으로 용출하여 microplate reader (Molecular Devices, Berkeley, California)로 590nm에서 분석하였다.
그 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 항-페리오스틴 압타머의 존재하에서, MDA-MB-231 세포에서 세포 부착이 현격하게 (60%) 감소한 반면, 비특이적 대조군 압타머 (CTL)는 아무런 영향이 없었다. 항 αvβ3 및 αvβ5 항체의 처리에 의하여 페리오스틴-코팅 웰에서 압타머와 유사한 정도의 유방암 세포의 부착 억제를 확인하였다 (50% of control, P<0.05).
이동(migration) 및 침습(invasion) 에세이는 변형된 Boyden Chamber system(BD falcon, # 354578)에서 수행하였다. 이동 에세이의 경우, 다공성 필터(8um)를 0.1M 아세트산에 녹인 20ug/ml type I Collagen (Sigma)으로 4℃에서 밤새 배양하여 type I Collagen의 수동 흡수에 의한 코팅을 수행하였다. MCF7, 4T1, 및 MDA-MB-231 세포(각각 2X104)를 혈청 무함유 배지(DMEM(Lonza)-4T1, MDA-MB-231 세포주; RPMI (Lonza)-MCF7) 50uL에 혼합하고 상단 챔버에 첨가한 후 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 이동하도록 두었다. 페리오스틴 (또는 BSA, 1ug/mL) 또는 PNDA-3 (또는 대조군 압타머, 100nM)을 하단 챔버에 첨가하였다. 필터 아랫면에 부착된 이동 세포는 4% PFA로 고정시키고, 비이동 세포는 면봉으로 제거하였다. 0.2% Triton X-100으로 세포 막을 침투시킨 후, Hoeschest 33342 용액(sigma)으로 세포핵을 염색하였다. 세포 이동 결과는 10배율에서의 서로 다른 6곳의 면적당 평균 세포 개수를 카운팅하여서 나타내었다. 상기 얻어진 결과를 도 5b에 나타내었다.
도5b에서 BSA를 사용한 음성 대조군과 비교했을때, 페리오스틴은 효과적으로 유방암세포주의 이동력을 증진시킨다 (MCF7: 3배, 4T1: 4배, MDA-MB-231: 5배). 비특이적 대조군 압타머의 첨가는 페리오스틴에 의해 유도되는 세포 이동에 별다른 영향을 미치지 않지만, PNDA-3 는 이러한 반응을 현저히 감소시킨다(MCF7: 40%, 4T1: 60%, MDA-MB-231: 67%, P<0.05).
침습 에세이에 있어서, MCF7, 4T1, 및 MDA-MB-231 세포를 growth factor reduced Matrigel (BD Biosciences)로 코팅된 내부 챔버에 1X105 세포주를 넣어주고, 24시간 후 하단 챔버에 도달한 세포들을 앞선 세포 이동 실험에서와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 5c에 나타내었다.
도 5c에서 보여지는 바와 같이, BSA 처리 대조군과 비교했을 때, 페리오스틴에 의해 유방암세포주의 침습 작용이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 컨트롤 압타머를 처리한 경우, 페리오스틴의 작용에 영향을 미치지 않지만, PNDA-3를 처리하면 유방암세포주의 세포 침습 작용이 상당히 억제되는 것을 알 수 있다 (MCF7: 40%, 4T1: 60%, MDA-MB-231 65%). BSA 처리군과 비교했을 때, 인테그린 αvβ3, αvβ5 억제항체를 처리한 군도 PNDA-3 압타머를 처리한 군과 유사한 수준으로 페리오스틴에 의해 유도된 세포 침습작용을 억제한다. 그러나, 인테그린 αvβ3 억제 항체를 처리한 군은 인테그린 αvβ5 억제 항체를 처리한 군에 비해 페리오스틴에 의해 유도되는 세포이동 및 침습을 억제하는 효과가 크지 않다. 이는 유방암 세포주에서 인테그린 αvβ5가 페리오스틴이 작용하는 주요 세포 표면 인자임을 알 수 있다.
PNDA-3의 독성을 유방암 세포주에서 확인해 보았다. 4T1 세포 (0.5X104)를 96-웰 플레이트에 넣고, 밤새 부착이 일어나도록 두었다. PNDA-3는 다양한 농도로 사용되었으며, 한 농도에 해당하는 실험당 적어도 6개의 well로 예시되었고, 각 실험은 3번 반복 실시하였다. 세포들을 표시된 농도의 PNDA-3 (또는 CTL )와 함께 DMEM 배지 200ul에서 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존률을 측정하기 위하여, MTT (5mg/mL, Sigma) 10 uL을 첨가하고 세포를 3시간 동안 배양하였다. 포르마잔(formazan)을 DMSO 50uL에 녹이고 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 sham-처리된 대조군 세포와 비교하여 상대적인 값을 도 5d에 나타내었다. 도 5d에서는 보듯이, 500nM의 압타머를 처리한 경우에도 눈에 띄는 세포 형태 변화나 세포의 생존능력에는 거의 영향이 없었다.
실시예 6: 신호화 경로의 억제 시험
유방암 세포주(4T1, MDA-MB-231)를 6-웰 플레이트에 3x105개의 양으로 시딩하고 성장 배지(DMEM(Lonza)+10%FBS(Gibco)+antibiotics(gibco))에서 24시간 동안 배양한 후, 18시간 동안 혈청이 없는 배지(DMEM)에서 배양하였다. 그 후, 3시간 동안 100nM의 압타머와 5ug의 인테그린 중화 항체(인테그린 αvβ3 및 αvβ5의 항체)를 처리하였다. 세포를 세포 용해 버퍼(50 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM sodium fluoride, 1 mM phenylmethysulfonyl fluoride, complete protease inhibitor cocktail (Roche))를 사용하여 용해시키고, 4℃ 14,000xg에서 10분 원심분리 하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay kit(biorad, # 500-0002)로 측정하였고, 단백질 샘플은 6-16% SDS-PAGE 젤에서 분리하여 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다.
상기 멤브레인을 다음의 일차 항체로 4℃에서 반응시켰다:
FAK Ab, phospho-FAK Ab (Tyr925) (Cell Signaling, Beverly, MA),
Src Ab, phospho-Src Ab (Cell Signaling, Beverly, MA), 및
β-actin Ab (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
이들 항체는 대응하는 horseradish peroxidase-컨쥬게이티드 이차 항체 (Kirkegaard & Perry Laboratories, KPL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 검출하였다. 대응하는 단백질을 ECL 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)와 ImageQuantTM LAS 4000(GE Healthcare)를 사용하여 분석하고 가시화하였다.
상기 결과에서 PNDA-3가 세포표면에 존재하는 페리오스틴에 결합하고 인테그린과이 결합을 저해함으로써 페리오스틴에 의해 유도되는 전이 효과 (세포 부탁, 세포 이동, 및 세포 침습작용)를 억제하는 것을 확인하였다. 다음으로, PNDA-3가 페리오스틴 의존적 신호전달과정에 미치는 영향을 알아보기 위해, 이뮤노블럿팅을 수행하였다. 인테그린 신호전달과정과 세포 퍼짐(spreading)의 마커로써 알려진 FAK과 SRC의 인산화를 확인하여 그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다.
도 6a와 6b에서, 두 종류의 유방암세포주 (4T1 과 MDA-MB-231) 에서 PNDA-3는 페리오스틴에 의해 유도된 FAK과 SRC의 인산화를 현저히 감소시킴을 확인할 수 있었다. 그러나, 컨트롤 압타머를 처리한 경우에는 증가된 인산화에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 또한, FAK과 SRC 인산화는 PNDA-3 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 페리오스틴의 수용체로 작용하는 인테그린을 항체를 이용해 기능을 억제하였을 경우, 압타머를 처리한 경우와 유사하게 FAK과 SRC의 인산화가 감소되었다. 상기 결과를 토대로, 유방암세포주에서 페리오스틴에 의한 인테그린 하위 신호의 자극은 인테그린 αvβ5를 통해 일어난다는 것을 알 수 있다. 즉, 분자수준에서, 페리오스틴과 인테그린의 결합은 FAK과 SRC의 활성을 촉진하고, 이는 결론적으로 세포의 이동 및 침습작용을 활성화하여 유방암의 전이를 증가시킨다. 본 발명의 일 실시예에 따른 압타머는 이러한 작용을 억제하여 유방암 전이를 저해하는 효과를 가진다.
실시예 7: 종양 성장 및 전이 억제 시험 ( in vivo )
PNDA-3의 항종양 성장 및 전이 억제 효능을 동물모델에서 시험하였다.
6주령 암컷 BALB/c mice(Charles River Breeding Laboratories)를 포항공과대학교(Pohang University of Science and Technology, POSTECH)의 동물 사육 시설에서 pathogen-free 조건 하에서 사육하였다. 모든 동물 시험 과정은 POSTECH의 동물실험윤리위원회(institutional animal care and use committee)의 규정에 따랐다. 유방암 세포주 4T1(1x104 cells, ATCC에서 구입)를 Hank's balanced salt solution (HBSS, Gibco) 0.1mL에 현탁시키고 마우스 mammary fat pads의 L4 위치에 이식하였다 (10마리 per group). 약 0.5 cm3 크기의 30개의 비괴사성(non-necrotic) 종양 모델을 다음과 같이 임의로 10마리 마우스씩의 3개의 군으로 나누었다:
그룹 1: 비히클(HBSS);
그룹 2: CTL 압타머 처리;
그룹 3: PNDA-3 처리.
대조군 압타머, PNDA-3 압타머(500 μg/kg), 또는 비히클을 1주일에 3회씩 16일 동안 총 부피 50 μL로 원발 종양(primary tumor)에 종양내(intratumorally) 투여하였다. 각 시험 동안, 마우스의 병의 징후(signs of suffering)를 매일 모니터링하였다. 종양 크기는 캘리퍼를 이용하여 2일마다 측정하고, 종양 부피(V)를 다음의 식으로 계산하였다:
V = (1/2)x장축지름(long diameter)x단축지름(short diameter)2.
평균 종양 부피 ± SEM (n = 10)로서 성장 곡선을 플라팅하였다.
상기 얻어진 결과를 도 8a에 나타내었다. 도 8a는 페리오스틴 양성 4T1 세포를 갖는 syngeneic 유방암 모델에서의 PNDA-3-매개 종양 성장 억제를 보여준다 (42% at day 16 compared with CTL or the control group; *, P < 0.01 with a Mann-Whitney test). "Day 0"은 주입 첫 날을 의미한다. 데이터는 "mean±SEM" (n = 10 tumors)으로 나타내었다.
도 8a에 나타난 바와 같이, PNDA-3, 대조군 압타머 또는 비히클을 1주일에 3회 원발 종양(primary tumor)의 종양내 투여 하였을때, PNDA-3 처리군에서의 종양 성장은 대조군 및 비히클 투여군에 비교하여 현저한 감소를 보이고 특히, 투여 16일째에, 비히클 처리군 대비 58% 정도 종양 크기가 감소된 것을 확인하였다 (P < 0.02). 상기 3개 군의 체중을 측정하여 평균값을 도 8b에 나타내었다. 도 8b에서 확인되는 바와 같이, PNDA-3-투여군과 대조군 압타머 투여군 간의 체중 감소 차이는 없었으며, 이는 압타머가 치료중에 독성을 나타내지 않음을 의미하는 것이다.
또한, 압타머 투여 후 20일째에, 전이 여부와 원발 종양 크기를 측정하여 아래의 표 5에 나타내었다.
Figure 112012092650470-pat00003
표 5에서와 같이, 압타머 투여 후 20일째에, 조직 검시 결과 유방암 세포주가 이식된 모든 마우스에서 유사한 종양 분포가 나타났다. 즉, 종양 덩어리가 광범위하게 분포하였으며 림프절, 간, 비장 및 폐로의 전이가 관찰되었다. 그러나, PNDA-3 처리군에서는, 대조군 압타머 처리군 또는 비히클 처리군과 비교하여, 전이 부위에서 종양 병소(tumor foci)가 현저하게 적게 관찰되었다.
도 8c 및 8d는 상기 압타머 처리군 및 비처리군 마우스의 검시 결과를 보여주는 것으로, 도 8c는 적출된 폐의 모습을 보여주는 것이고 (화살표는 lung nodule을 나타냄), 도 8d는 lung nodules의 수를 막대그래프로 나타낸 것이다 (n = 10; *, P < 0.0001; **, P < 0.005). 또한, 도 8e는 H&E로 염색된 폐조직의 모습으로, 각 군(비히클 처리군, 대조군 압타머 처리군 또는 PNDA-3 압타머 처리군)에서의 전이 병소(metastatic foci)를 보여준다. 화살표와 점선의 원은 폐에서의 전이 병소를 나타낸다. Scale bars: 200 μm (상단); 100 μm (하단). 비히클 처리군과 대조군 압타머 처리군에서 몇몇 폐 조직으로의 전이 병소가 관찰된 반면, PNDA-3 처리군에서는 전이 병소가 현저하게 감소되어 있다.
실시예 8: 조직시험 및 면역조직화학 시험
PNDA-3 에 의한 종양 성장의 억제와 신생혈관생성 (angiogenesis) 또는 혈관 내피세포의 성장과 같은 혈관 내피 세포의 기능 억제와의 관련성을 확인하기 위해 혈관 마커인 CD31과 세포 성장 마커인 Ki-67 면역염색을 수행하였다. 파라핀으로 고정한 종양 조직을 4 μm 두께로 절단하였다. 내재적 퍼옥시데이즈(endogenous peroxidases)를 저해하기 위하여, 상기 얻어진 섹션을 0.5%(v/v) H2O2 (in 100%(v/v) methanol)로 15분 동안 실온에서 처리하였다. 조직 시험을 위하여, 파라핀 섹션 일부를 hematoxylin and eosin (H&E)로 염색하여 종양 진단을 확인하였다.
원발 종양에서의 혈관, 신생 세포의 증식 활성, 페리오스틴 발현을 각각 항-CD31 항체 (BD Pharmingen, San Diego, CA), Ki-67 (Dako Corporation, CA), 항-페리오스틴 항체 (Abcam)를 사용하여 검출하였다. 상기 준비된 섹션을 슬라이드 상에서 상기 1차 항체와 함께 하룻밤동안 4℃에서 인큐베이팅한 후, 이어서, 상기 슬라이드를 바이오틴화된 2차항체와 퍼옥시데이즈-표지된 스트렙타비딘 (Dako)와 함께 인큐베이팅하고, 발색 기질로서 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 사용하여 퍼옥시데이즈 활성을 측정하였다.
상기 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하고, 마운팅 시약(Dako)을 사용하여 마운팅하였다. 상기 슬라이드는 디지털 가상 현미경 (digital virtual microscope; dotSlide; Olympus, Tokyo, Japan)과 MetaMorph image software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 관찰하고 분석하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9a-9c에 나타내었다. 상기 얻어진 도 9a는 비히클 처리군, 대조군 압타머 처리군 및 PNDA-3 압타머 처리군으로부터 얻은 원발 종양 섹션의 면역염색 결과의 현미경 이미지를 보여준다. 도 9b 및 9c는 각각 증식 세포 및 내피 세포의 Ki-67 (9b) 염색 및 CD31 (9c) 염색을 정량화한 결과를 보여준다. 퍼센트 값은 10개의 임의로 선택된 필드에 대한 mean±S.D.를 나타낸다. *, P<0.05. 원 이미지는 디지털 캡쳐하였다. Scale bar: 100 μm.
PNDA-3 처리군에서 얻어진 종양세포는 비히클 처리군 및 대조군 압타머 처리군과 비교하여 혈관 및 증식중인 세포수가 현저하게 감소된 결과를 보여주었다. 또한, PNDA-3 처리된 유방암 이종이식편(xenografts)의 원발 종양 부위에서의 페리오스틴 발현량은 대조군 압타머 처리군 및 비히클 처리군보다 감소되어있다. 결론적으로, PNDA-3은 유방암 이종이식 마우스 모델에서 유방암의 진행 및 전이를 억제하고, 적어도 부분적으로 종양세포 또는 혈관 내피세포와 같은 종양 관련 세포의 성장의 억제를 통한 혈관신생을 저해하는 작용을 한다.
통계 분석
모든 데이터는 적어도 3번 반복 샘플의 mean±S.D.로서 제시되었다. 두 그룹 간의 차이는 Student's t-test를 사용하여 분석하였다. P < 0.05는 유의한 수치로 고려하였다.
<110> UNIST Academy-Industry Research Corporation POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Aptamer against periostin and anticancer composition containing the same <130> DPP20128199KR <150> KR10-2012-0071664 <151> 2012-07-02 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-end sequence 1 of aptamer <400> 1 acgag 5 <210> 2 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-end sequence 1 of aptamer <400> 2 aacaa 5 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-end sequence 2 of aptamer <400> 3 gatgtgagtg tgtgacgag 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-end sequence of aptamer <400> 4 aacaacagaa caaggaaagg 20 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 5 ncnggnccnn ccngnannag ancananccn 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which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 16 ncnggnccnn ccnnngacna cnanngnnng gnancggnca ac 42 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 17 ncnggnccnn ccncccnaan ngcngnngag gnancggcna c 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 18 nccggncnga nnnccaacan nngnccnanc ccngancgnc c 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 19 ncnganccnn ccncccnaan ngcngnngag gnancggcna c 41 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 20 ncnggnccnn ccncnnngnc cccganaggg nanggnancg c 41 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 21 ncacacgnng angacnggan ggnagnnaaa gagggngggg gc 42 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 22 ggncnggncc nnaagangnn cgnancgnac gagcncccna c 41 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 23 ncnggnccnn ccnnngacga cnanngnnng gnancggnc 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 24 gcgacngggc gaggcnnggg angggnnacg ccgngcagc 39 <210> 25 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 25 aagcnncggn cnggnccnnc cccccnggcn nnggcncnaa ggggccgcc 49 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 26 aaggcacacc ncgcacangn naacnacnac ngacacacnc c 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 27 nngncacang ngcggnncag ncnggnccnn ccgcaccgna c 41 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 28 nnancacang ngcggnncag ncnggnccnn cagcaccgng c 41 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 29 cnanaaacnc gnngcccccn cacagcngca anacacncgg c 41 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 30 aagcnncggn cnggnccnnc cccccnggcn nnggcncnaa gggggccgcn 50 <210> 31 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 31 ngnaagngnn nncnancann naangnnngc agaccgnnga c 41 <210> 32 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 32 ngngngngnn nnnngnggnc nnaancangc agcngngnng c 41 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 33 ncnggnccnn ccnnngacga cnanngnnng gnancganca ac 42 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 34 ncaacnnnng gngccnggng gcnnnnaccg anngcgcacg c 41 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 35 ncaacnnnng gngcnnggng gccnnnaccg anngcgcacg c 41 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 36 ncgacnancg agnnncaann nannccccca cncacaancn c 41 <210> 37 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 37 aagcnncggn cnggnccnnc cccccnggcn nnggcncnaa gggggccgcc 50 <210> 38 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 38 acaaccccnc aacngcnanc acncnnggcn caacnaanna c 41 <210> 39 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 39 ncnggnccnn ccncncnaan ngcngnngag gnancggcna c 41 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 40 nngncgcang ngcggnncag ncnggnccnn cagnaccgna c 41 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 41 acgagncngg nccnnccnnn gacgacnann gnnnggnanc gancaacaac aa 52 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 42 acgagncaca cgnngangac ngganggnag nnaaagaggg nggggcaaca a 51 <210> 43 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 43 acgagnngnc gcangngcgg nncagncngg nccnncagca ccgnacaaca a 51 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence of periostin aptamer, wherein n is 'T' or a modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 44 acgagncngg nccnnccncc cnaanngcng nngaggnanc ggcnacaaca a 51 <210> 45 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer sequence; n is core sequence of 25-80, 30-65, or 35-50 bases, each base is independently selected from A, C, G, T, their deoxy form, and modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 45 acgagnaaca a 11 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer sequence; n is core sequence of 25-80, 30-65, or 35-50 bases, each base is independently selected from A, C, G, T, their deoxy form, and modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 46 gatgtgagtg tgtgacgagn aacaacagaa caaggaaagg 40 <210> 47 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequences for antisense library; n is independently selected from A, C, G, T, their deoxy form, and modified dU in which 5-position is substituted with benzyl, naphthyl, pyrrolebenzyl, and/or tryptophan <400> 47 cctttccttg ttctgttgtt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 ctcgtcacac actcacatc 79 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' primer <400> 48 gatgtgagtg tgtgacgag 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' primer <400> 49 cctttccttg ttctgttgtt 20 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 primer <400> 50 caggaaacag ctatgac 17 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control aptamer <400> 51 acgaggnacg gngcngaagg accagacnga accgcacang cgacaaaaca a 51

Claims (15)

  1. 페리오스틴에 특이적으로 결합하고,
    SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 40으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 이루어지고,
    상기 염기서열 중 n은 dU(deoxyuracil)의 5-위치가 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기, 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 소수성 치환기로 치환되어 변형된 것인,
    페리오스틴 압타머(aptamer).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 페리오스틴 압타머는 염기서열 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 3 내지 25개의 염기로 이루어진 염기서열을 추가로 포함하고, 총 염기길이가 42 내지 100개의 염기로 이루어진 것인,
    페리오스틴 압타머.
  4. 제3항에 있어서, 상기 5' 말단, 3' 말단 또는 양 말단에 추가로 포함되는 염기서열은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군에서 선택된 것인,
    페리오스틴 압타머.
  5. 제4항에 있어서, 상기 페리오스틴 압타머는 다음의 SEQ ID NO: 45 또는 SEQ ID NO: 46의 염기서열로 표현되는 것인, 페리오스틴 압타머:
    5'-ACGAG-[N]-AACAA-3'(SEQ ID NO: 45) 또는
    5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'(SEQ ID NO: 46),
    상기 염기서열에서 'N'은 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 40으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열임.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 페리오스틴 압타머는 SEQ ID NO: 41 내지 SEQ ID NO: 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열로 표현되는, 페리오스틴 압타머.
  8. 삭제
  9. 제1항, 제3항 내지 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 페리오스틴 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것을 특징으로 하는,
    페리오스틴 압타머.
  10. SEQ ID NO: 43의 염기서열로 이루어진 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 함유하는,
    암 치료용 또는 암 전이 억제용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 페리오스틴 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것인,
    암 치료용 또는 암 전이 억제용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 담낭암, 췌장암, 위암, 자궁암, 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma), 전립선암, 및 아교모세포종(glioblastoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    암 치료용 또는 암 전이 억제용 약학 조성물.
  13. 제1항, 제3항 내지 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항의 페리오스틴 압타머를 유효성분으로 함유하는 암 또는 암 전이 진단용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 페리오스틴 압타머는 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것인,
    암 또는 암 전이 진단용 약학 조성물.
  15. 환자의 생물학적 시료에 제1항, 제3항 내지 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항의 페리오스틴 압타머를 반응시키는 단계; 및
    상기 생물학적 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
    환자의 생물학적 시료에서의 페리오스틴 압타머의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 상기 환자를 암 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는,
    암 또는 암 전이 진단에 정보를 제공하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2811060T3 (es) * 2013-03-08 2021-03-10 Univ Osaka Anticuerpo contra péptido codificado por exón-21 de periostina y composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación que contienen el mismo
KR101888193B1 (ko) * 2016-02-19 2018-08-13 이화여자대학교 산학협력단 유방암 전이 진단 지표로서의 혈중 페리오스틴
US10577609B2 (en) 2016-03-07 2020-03-03 Postech Academy—Industry Foundation Glypican-3 specific aptamer and use thereof
EP3655007A4 (en) * 2017-07-21 2021-04-28 The Cleveland Clinic Foundation SBE APTAMERE FOR THE TREATMENT OF IL-17A DISEASES AND DISEASES
CN107868786B (zh) * 2017-10-30 2021-03-23 淮安市第一人民医院 多药耐药结肠癌细胞的单链dna适配体
CN110373415B (zh) * 2019-06-12 2023-06-09 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 特异性结合pd-l1蛋白的核酸适配体及其用途
KR20210007894A (ko) * 2019-07-10 2021-01-20 주식회사 뉴클릭스바이오 Kras 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 이용방법
CN114836420B (zh) * 2022-05-07 2024-09-13 厦门大学 Periostin特异性干扰质粒和PD-1特异性干扰质粒的组合及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110104166A1 (en) 2008-01-18 2011-05-05 Stankovic Konstantina M Methods and Compositions for Treating Polyps

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017119B2 (en) 2005-12-28 2011-09-13 Daiichi Sankyo Company, Ltd. Antibody against periostin, and a pharmaceutical composition comprising it for preventing or treating a disease in which periostin is involved
CN101809167B (zh) * 2007-07-17 2015-04-01 私募蛋白质体公司 产生具有改良的解离速率的适配体的方法
WO2009075883A2 (en) 2007-12-12 2009-06-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoprotein cancer biomarker
US20110177613A1 (en) 2009-10-13 2011-07-21 Los Angeles Biomedical Research Institute at Harbor-UCLA- Medical Center Use of periostin as a novel biomarker
EP2558478B1 (en) 2010-04-12 2018-03-07 Somalogic, Inc. 5-position modified pyrimidines and their use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110104166A1 (en) 2008-01-18 2011-05-05 Stankovic Konstantina M Methods and Compositions for Treating Polyps

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Histol. Histopathol. 22(10): 1167-1174(2007. 10.)
Int. J. Mol. Med. 28(2): 181-186 (2011)
J. Biotechnol. 74(1): 5-13(2000. 3.)

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